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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
FISIOLOGIA VEGETAL
Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas de
Soja submetidas à Hipoxia
PABLO GERZSON BADINELLI
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Pelotas, sob orientação do
Prof. Luciano do Amarante, como parte
das exigências do Programa de Pós-
graduação em Fisiologia Vegetal, para
obtenção do título de Mestre em Ciências
(M.S).
PELOTAS
Rio Grande do Sul - Brasil
2008
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PABLO GERZSON BADINELLI
Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas de
Soja submetidas à Hipoxia
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Pelotas, sob orientação do
Prof. Luciano do Amarante, como parte
das exigências do Programa de Pós-
graduação em Fisiologia Vegetal, para
obtenção do título de Mestre em Ciências
(M.S).
APROVADA: 05 de dezembro de 2009
Banca Examinadora:
____________________________ __________________________
Prof. Dr. Nei Fernandes Lopes Prof. Dr. Antonio Costa Oliveira
____________________________
Prof. Dr. Luciano do Amarante
(Orientador)
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Dados de catalogação na fonte:
( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744 )
B114r Badinelli, Pablo Gerzson
Respostas bioquímicas e fisiológicas de plantas noduladas de
soja submetidas à Hipoxia / Pablo Gerzson Badinelli. - Pelotas,
2008.
100f. : graf.
Dissertação ( Mestrado ) –Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal. Instituto de Biologia. Universidade Federal de
Pelotas. - Pelotas, 2008, Luciano do Amarante, Orientador.
1. ADH 2. Glycine max 3. AlaAT 4. Deficiência de oxigê-
nio 5. Carboidratos 6. Aminoácidos 7. Ureídeos 8. Crescimento
I Amarante, Luciano do (orientador) II .Título.
CDD 633.34
iii
Aos meus pais Guilmen Edson Gonçalves Badinelli e Nelma Rosana Gerzson
Badinelli, por seu exemplo de vida, empenho e dedicação para comigo, durante a
minha formação moral e intelectual.
A minha companheira e meu amor Lilian Madruga de Tunes, pelo seu apoio,
compreensão e por estar sempre presente nos momentos mais difíceis.
Aos meus avós Darci Carlos Ferreira Badinelli, Eunice Gonçalves Badinelli, Edgar de
Moura Gerzson e Lia Daufollo Gerzson, pelo seu exemplo de sabedoria e
humildade.
Aos poucos e verdadeiros amigos, simplesmente por sua amizade.
Dedico
iv
É melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo
expondo-se a derrota, do que formar fila com os pobres de espírito que nem gozam
muito nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra cinzenta sem conhecer o
sabor da vitória nem da derrota.
Theodore Roosevelt
v
Agradecimentos
A Deus, por ser minha fonte de inspiração e sabedoria para transpor meus
obstáculos.
À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) por proporcionar-me a obtenção do título
de mestre em Ciências.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de estudos.
À Embrapa - Terras Baixas, em especial ao pesquisador Francisco de Jesus Vernetti
Júnior, por sua colaboração durante a fase de experimentação.
Ao professor, orientador e amigo Luciano do Amarante, por me incluir na essência
de sua profissão, por acreditar no meu potencial, por sua amizade e principalmente
pela sua persistência e humildade.
Aos professores Antonio Carlos de Souza Albuquerque Barros, Antonio Costa
Oliveira, Beatriz Helena Gomes Rocha, Denise dos Santos Colares, Nei Fernandes
Lopes, Massako Takahashi Dourado e Ronaldo do Nascimento, pelo apoio e
conhecimento transmitido.
Aos amigos Géri Eduardo Meneghello, Suzi Braga, Rérinton Joabél, em especial aos
amigos Lúcio Kerber Canabarro, Simone Pohl e Vera Borges.
A todos os demais amigos e demais pessoas que acreditaram e me apoiaram
durante minha formação acadêmica e profissional.
vi
Resumo
BADINELLI, Pablo Gerzson, M.S., Universidade Federal de Pelotas, novembro de
2008. Respostas Bioquímicas e Fisiológicas de Plantas Noduladas de Soja à
Hipoxia. Orientador: Prof. Dr. Luciano do Amarante.
A deficiência de oxigênio causada por chuvas e irrigações, pode-se tornar
freqüente em regiões de solos hidromórficos, onde a drenagem é deficiente,
limitando o cultivo de espécies economicamente importantes e em conseqüência o
desenvolvimento sócio-econômico destas regiões. A soja [Glycine max (L). Merril] é
uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China e apresenta
variabilidade genética para tolerar o excesso de umidade no solo. Quando as
plantas são submetidas à hipoxia o metabolismo fermentativo é ativado com a
finalidade de manter a produção de energia e agentes redutores, embora com menor
eficiência, até a planta retornar ao estado de normoxia. Este trabalho teve como
objetivo esclarecer algumas variações metabólicas e adaptações morfofisiológicas
em dois cultivares de soja nodulada contrastantes em relação às condições de
alagamento, durante o estado de hipoxia e pós-hipoxia dos sistemas radiculares. Os
genótipos BRS-153 (suscetível) e BRS-154 (tolerante) foram cultivados em casa de
vegetação, em vasos contendo vermiculita lavada como substrato, inoculadas com
Bradyrhizobium elkanii estirpe SEMIA 587 e nutridas com solução nutritiva
desprovida de N. O tratamentos foram dispostos em delineamento experimental
inteiramente casualizado com 4 repetições, tendo como unidade experimental duas
plantas por vaso. Aos dados quantitativos aplicou-se análise de variância e, nos
casos significativos, aplicou-se análise de regressão. Quando não houve ajuste de
curva, comparou-se as médias pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
O tratamento hipóxico foi aplicado no estádio de desenvolvimento R2, mantendo-se
as plantas inundadas por até 12 dias. As plantas foram coletadas aos 3, 6, 9 e 12
vii
dias de inundação e após 1, 2, 3 e 9 dias após drenagem dos vasos com plantas
sob nove dias de inundação. Avaliaram-se os parâmetros de crescimento: diâmetro
do caule, massa seca de raiz, caule, folhas e vagens, volume de raiz, número de
vagens e parâmetros bioquímicos: atividades das enzimas alanina aminotransferase
(AlaAT; EC 2.6.1.2) e álcool desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1) e teor de metabólitos:
açúcares solúveis totais, sacarose, polissacarídeos solúveis em água, amido,
aminoácidos totais e proteínas totais em nódulos e raízes e ureídeos em seiva de
xilema. Conclui-se que houve diferença de resposta entre os dois cultivares quanto a
maioria dos parâmetros avaliados em relação aos períodos de hipoxia e pós-hipoxia.
As atividades das enzimas ADH e AlaAT elevaram-se durante o alagamento, tanto
para raízes como para nódulos e retornaram a níveis pré-hipóxicos durante o
período de recuperação. Nos nódulos as atividades das duas enzimas foram mais
expressivas do que em raízes.
Palavras-chave: deficiência de oxigênio, ADH, AlaAT, carboidratos, Glycine max,
aminoácidos, ureídeos, crescimento
viii
Abstract
BADINELLI, Pablo Gerzson, M.S., Universidade Federal de Pelotas, novembro de
2008. Biochemical and Physiological Responses of Nodulated Soybean to
Hypoxia. Orientador: Prof. Dr. Luciano do Amarante.
Oxygen deficiency caused by rains and irrigations can be frequent in
hydromorphic soils. In these areas, deficient drainage can limit growth of
economically important species and in consequence can result in areas with restrict
socioeconomic development. Soybean [Glycine max (L). Merril] is originated from the
northern chinese waterlogged areas and consequently of its genetic variability of this
specie for soil humidity excess tolerance. When plants are subjected to hypoxic
conditions, the fermentative metabolism is activated with the purpose of maintaining
the energy production and reducing agents, although of smaller efficiency, until the
plant return to the normoxia state. In this work, some metabolic variations and
morphophysiological adaptations were studied in two nodulated soybean cultivars,
contrasting for tolerance to flooding conditions, during the hypoxia and post-hypoxia
state of the root system. The genotypes BRS-153 (susceptible) and BRS-154
(tolerant) were grown under green house conditions, in pots containing washed
vermiculite, inoculated with the SEMIA 587 strain of Bradyrhizobium elkanii and N-
free nutrient solution. The experimental design was completely randomized with four
replicates, considering two plants in a pot as a repetition. Quantitative data were
subjected to an analysis of variance, and when the means were significant,
regression analysis was applied. In the cases that no adjustment was possible, the
means were compared by the Tukey’s test (P
≤0,05). The hypoxic treatment was
applied at stage R2, during 12 days. Plants were collected at 3, 6, 9 and 12 days
after flooding and 1, 2, 3 and 9 days after the drainage of the pots which plants were
flooded during nine days. Morphological parameters such diameter of the stem,
dried mass of roots, leaves and green pods, root volume, green pods number and
ix
biochemical analysis as alanine aminotransferase (AlaAT; EC 2.6.1.2) and alcohol
desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1) activities and total content of soluble sugars,
sucrose, water-soluble polyssacharides, starch, free amino acids and proteins in
nodules and roots and ureides in the xylem sap were analysed. Hypoxia and post-
hypoxia condictions caused different effects among the two cultivars in relation to the
most of the parameters studied. Activities of the ADH and AlaAT were stimulated by
flooding in roots and in nodules and returned to pre-hypoxic treatments during the
recovery period. In the nodules the activities of the two enzymes were more
expressive than in the roots.
Key words: deficiency of oxygen, ADH, AlaAT, carbohydrates, Glycine max, amino
acids, ureides, growth
x
Lista de Figuras
Capítulo I:
Figura 1. Diâmetro do caule de cultivares de soja nodulada, e BRS-153(A e B) e
BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e
drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação. *P≤0,05;
n=4........................................................................................................31
Figura 2. Volume do sistema radicular de cultivares de soja nodulados, BRS-153
(A) e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de inundação e
recuperação do sistema radicular após nove dias de inundação.
*P
≤0,05; n=4.........................................................................................32
Figura 3. Massa seca de raízes de dois cultivares de soja nodulados, submetidos
a diferentes períodos de inundação do sistema radicular (A) e dos
cultivares BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes
períodos de recuperação do sistema radicular, após nove dias de
inundação. *P≤0,05;n=.........................................................................33
Figura 4. Massa seca de folhas de cultivares de soja nodulados, BRS-153 e
BRS-154, submetidos a diferentes períodos de inundação (A) e de
recuperação do sistema radicular após nove dias de inundação (B). Os
valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e
letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P
≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4........................................................................................................34
xi
Figura 5. Razão entre a massa seca da parte aérea e do sistema radicular de
dois cultivares de soja nodulados submetidos a diferentes períodos de
inundação do sistema radicular (A) e dos cultivares BRS-153 (B) e
BRS-154 (C) em diferentes períodos de recuperação do sistema
radicular após nove dias de inundação. *P
≤0,05;
n=4........................................................................................................35
Figura 6. Massa seca de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e
B) e BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação
e drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação. (A e C)
Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e
letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P
≤0,05) para período e regime hídrico respectivamente. (B e D)
*P≤0,05; n=4. .......................................................................................36
Figura 7. Número de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B) e
BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e
drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação. *P
≤0,05;
n=4.............................................................................................................38
Capítulo II:
Figura 1. Teores de ureídeos totais em seiva de xilema de genótipos de soja
nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após
nove dias de déficit de O
2
. *P≤0,05, n=4..............................................50
Figura 2. Teores de aminoácidos totais em raízes de genótipos de soja nodulada,
BRS-153 (A) e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de
hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular, após nove dias de déficit de
xii
O
2
. (A e B) *P≤0,05. (C) Os valores de médias, seguidos da mesma
letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem
entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico
respectivamente; =4.............................................................................51
Figura 3. Teores de aminoácidos totais em nódulos de genótipos de soja, BRS-
153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de
hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit
de O
2
.
Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na
linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.....................................................................................................53
Figura 4. Teores de proteínas totais em raízes de genótipos de soja nodulada,
BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia do
sistema radicular. *P≤0,05, n=4............................................................54
Figura 5. Teores de proteínas totais em nódulos de genótipos de soja nodulada,
BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia (A)
e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O
2
(B).
Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e
letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
a P≤0,05, para período e regime hídrico respectivamente. *P≤0,05,
n=4........................................................................................................55
Figura 6. Atividade da enzima alanina aminotransferase em raízes de genótipos
de soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B) sob hipoxia e pós-
hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O
2
(C). (A e
B) *P≤0,05. (C) Valores de médias, seguidos da mesma letra
maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre
si pelo teste de Tukey (*P≤0,05), para período e regime hídrico
respectivamente; n=4...........................................................................57
xiii
Figura 7. Atividade da enzima alanina aminotransferase em nódulos de genótipos
de soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B), sob hipoxia e pós-
hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O
2
(C).
Valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e
letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(*P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente, n=4.
..............................................................................................................58
Capítulo III:
Figura 1. Fluxograma da extração Álcool desidrogenase e Alanina
aminotransferase...............................................................................67
Figura 2. Fluxograma da extração de metabólitos, sendo TCA (ácido tricloro
acético), MCW (metanol : clorofórmio : água), WSP (polissacarídeos
solúveis totais) e PCA (ácido perclórico)..............................................68
Figura 3. Atividade da enzima álcool desidrogenase em raízes de genótipos de
soja nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular, após
nove dias de déficit de O
2
. (A e C) *P≤0,05. (B e D) Os valores de
médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;
n=4........................................................................................................71
Figura 4. Atividade da enzima álcool desidrogenase em nódulos de genótipos de
soja, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes
períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias
de déficit de O
2
. (A e C) *P≤0,05. (B e D); Os valores de médias,
seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre
linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P
≤0,05), para período
e regime hídrico respectivamente; n=4.................................................73
xiv
Figura 5. Teores de sacarose em raízes de genótipos de soja nodulada, BRS-153
(A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de
hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de
O
2
. (A e C) *P≤0,05 (B e D); Os valores de médias, seguidos da
mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não
diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime
hídrico respectivamente; n=4................................................................75
Figura 6. Teores de sacarose em nódulos de genótipos de soja, BRS-153 (A e B)
e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e e
pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O
2
(B e
D). Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha
e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;
n=4........................................................................................................76
Figura 7. Teores de açúcares solúveis totais em raízes de genótipos de soja
nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após
nove dias de déficit de O
2
. (A e C) *P≤0,05 (B e D); Os valores de
médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;
n=4........................................................................................................78
Figura 8. Teores de açúcares solúveis totais em nódulos de genótipos de soja,
BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de
hipoxia (A) e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit
de O
2
(B e C). Os valores de médias, seguidos da mesma letra
maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem entre
si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico
respectivamente, n=4...........................................................................79
xv
Figura 9. Teores de polissacarídeos solúveis em água de raízes de genótipos de
soja nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após
nove dias de déficit de O
2
. (A e C) *P≤0,05 (B e D); Os valores de
médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P
≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;
n=4........................................................................................................81
Figura 10. Teores de polissacarídeos solúveis em água em nódulos de genótipos
de soja nodulada, BRS-153(A e B) BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após
nove dias de déficit de O
2.
Os valores de médias, seguidos da mesma
letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas, não diferem
entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico
respectivamente, n=4...........................................................................82
Figura 11. Teores de amido em nódulos de genótipos de soja nodulada, BRS-153
(A) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e pós-
hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O
2
.Os valores
de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4........................................................................................................83
xvi
Índice
Resumo...................................................................................................................... vi
Abstract .....................................................................................................................viii
Lista de figuras............................................................................................................x
Abreveaturas............................................................................................................xvii
1. Introdução geral ....................................................................................................19
2. Crescimento de cultivares de soja nodulada sob influência de diferentes períodos
de inundação e drenagem do sistema de cultivo....................................................25
2.1 Introdução........................................................................................................26
2.2 Material e métodos ..........................................................................................28
2.3 Resultados e discussão...................................................................................30
2.4 Conclusões......................................................................................................40
3. Atividade da alanina aminotransferase e teor de compostos nitrogenados em
raízes e nódulos de genótipos de soja submetidos a diferentes periodos de hipoxia e
pós-hipoxia.................................................................................................................41
3.1 Introdução ...........................................................................................................42
3.2 Material e métodos ..........................................................................................44
3.3 Resultados e discussão...................................................................................48
3.4 Conclusão........................................................................................................59
4. Atividade da enzima álcool desidrogenase e alocação de carboidratos no sistema
radicular de soja nodulada durante período de hipoxia e retorno a
normoxia..................................................................................................................60
4.1 Introdução........................................................................................................61
4.2 Material e métodos ..........................................................................................63
4.3 Resultados e discussão...................................................................................69
4.4 Conclusões......................................................................................................84
5. Referências bibliográficas ....................................................................................86
xvii
Abreviaturas
Ala – L-alanina
AlaAT – alanina aminotransferase
ADH – álcool desidrogenase
AST – açúcares solúveis totais
ATP – adenosina trifosfato
BSA – soroalbumina bovina / fração V
DAD – dias após a drenagem
DAE – dias após a emergência
DAI – dias após a inundação
DO – densidade óptica
DTT – Ditiotreitol
EROs – espécies reativas ao oxigênio
FAD – flavina adenosina dinucleotídeo
LDH – lactato desidrogenase
NAD
+
– β-nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma oxidada
NADH – β-nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma reduzida
PCA – ácido perclórico
PDC – piruvato descarboxilase
PVPP – polivinilpolipirrolidona
TCA – ácido tri-cloro acético
WSP – polissacarídeos solúveis totais
α-KG – 2-oxoglutarato
INTRODUÇÃO GERAL
Estima-se que 6% da superfície terrestre são ocupados por áreas alagadas
ou sujeitas ao alagamento temporário (MALTBY, 1991), onde a difusão de gases da
atmosfera até o solo é fortemente afetada (ARMSTRONG et al., 1994).
No Brasil, estima-se que haja cerca de 28 milhões de hectares de solos
sujeitos ao encharcamento (solos aluviais e hidromórficos) (MAGALHÃES et al.,
2005). Grande parte dessas áreas encontram-se na região dos Cerrados e outra
parcela (6,8 milhões de ha) na região sul do Brasil, sendo que cerca de 5,4 milhões
de hectares estão no RS e poderiam ser incorporadas ao sistema de rotação de
culturas (soja-arroz-pecuária). A diversificação e ou incorporação de novas culturas
às áreas de várzea (solos hidromórficos), geralmente destinadas à produção de
arroz irrigado, é uma forma de aumentar a eficiência do sistema produtivo. Esta
prática vem sendo implementada nos EUA, na região baixa do Delta do Mississipi,
com a incorporação das culturas do milho e da soja em rotação com o arroz irrigado
(SCOTT e NORMAN, 2000).
O cultivo de arroz irrigado constitui a principal forma de exploração dos solos
de várzea na região sul do Brasil e vários trabalhos têm sido conduzidos com a
finalidade de buscar alternativas para cultivos nas várzeas arrozeiras,
proporcionando maior retorno econômico dessas áreas (BARNI et al., 1985;
GASTAL et al., 1998). O grande problema é a difícil adaptação de culturas em solos
alagados, uma vez que a maior parte das culturas produtoras de grãos são
mesófitas. Buscam-se, como alternativas, espécies que permitam a utilização da
mesma estrutura empregada no arroz, que apresentem tolerância às condições
impostas pela inundação do solo e possuam elevado potencial de rendimento.
20
A soja é uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China
(EVANS, 1996), que apresenta variabilidade genética para tolerar o excesso de
umidade no solo (VAN TOAI et al., 1994; THOMAS et al., 2000; PIRES et al., 2002).
Nas condições brasileiras, a cultura da soja, principal produtora de óleo
vegetal, além do consumo alimentício é matéria prima para a produção de biodiesel,
apresenta-se como alternativa extremamente interessante e potencialmente viável
para ocupar esse segmento. Ainda, a rotação de culturas em solos de várzea é uma
prática recomendada para aumentar o rendimento de grãos de arroz, quer pelo
efeito direto de quebrar o ciclo de insetos e pragas, moléstias e de plantas daninhas
que prejudicam o desenvolvimento do arroz, ou pelo efeito indireto na melhoria das
condições químicas e físicas do solo (IRGA, 2001).
O avanço do cultivo da soja em áreas de várzea tem como conseqüência o
aumento da demanda do desenvolvimento de cultivares adaptados a esses
ambientes, impulsionado pela baixa rentabilidade do arroz nos últimos anos em
relação à soja, em vista dos menores custos de produção dessa cultura e o valor
das terras do planalto do Estado do Rio Grande do Sul, onde é cultivada, serem
muito mais elevadas que as terras de produção de arroz.
O efeito do estresse por saturação hídrica do solo sobre as plantas é
complexo e dependente do estádio de desenvolvimento da planta (VAN’T WOUT e
HAGAN, 1974; MOMEN et al., 1979; TAIZ e ZEIGER, 1991; SALISBURY e ROSS,
1992) e do período de exposição a esse estresse (BARNI e COSTA, 1975; GOMES
et al., 1992). A saturação hídrica do solo, aplicada às leguminosas, prejudica o
desenvolvimento das raízes e da parte aérea e também a fixação de nitrogênio pelo
sistema radical, em virtude de reduzir o oxigênio para os nódulos, resultando numa
redução do número de nódulos por área de raízes (BARNI e COSTA, 1975; DE WIT,
1978). A tolerância ao encharcamento para a cultura da soja foi demonstrada por
COSTA (1973), submetendo as plantas à saturação hídrica do solo por um período
de quatro meses, as quais permaneceram vivas, completaram o ciclo e produziram
grãos. Ainda, a falta de O
2
no sistema radicular da planta de soja, além de inibir a
fixação simbiótica, também inibe a absorção de nitrogênio e outros minerais, inibindo
o crescimento das raízes e a nodulação (SALLAM e SCOTT, 1987). Então, o
transporte de N ou outros minerais para a parte aérea pode ser inadequado,
resultando em plantas raquíticas e cloróticas (NATHANSON et al., 1984). A
21
diminuição das taxas de assimilação líquida e expansão foliar provocam a
diminuição da taxa de crescimento da cultura da soja e, consequentemente,
proporcionam menor rendimento de grãos (LINKEMER et al., 1998).
O encharcamento modifica a atmosfera do solo, pois promove deficiência de
O
2
, acúmulo de CO
2
, metano, etileno, gás sulfídrico (H
2
S), hidrogênio e redução da
respiração aeróbica. O crescimento das raízes paralisa em poucos minutos, com o
limite de tolerância das raízes de soja em relação ao CO
2
, que é 20% na atmosfera
do solo (COSTA, 1996). Esse ambiente provoca alterações no metabolismo das
raízes, passando de aeróbico para anaeróbico devido à falta de aceptor final de
elétrons, levando a paralisação do ciclo de Krebs (KENNEDY et al., 1992). Apesar
do estresse, existem espécies que conseguem sobreviver ao alagamento, devido a
mecanismos de adaptações morfológicas, metabólicas e anatômicas
(VARTAPETIAN e JACKSON, 1997).
As leguminosas são geralmente sensíveis às inundações e o alagamento do
solo, limitando seu crescimento, pois os nódulos precisam de O
2
para manter a
respiração aeróbica necessária para suprir a grande quantidade de ATP
indispensável à atividade da nitrogenase. Apesar de terem adaptações como a
proteína condutora de O
2
para otimizar o suprimento de O
2
, a maioria das
leguminosas terrestres não é suficientemente capaz de aumentar o fornecimento de
O
2
para dentro de seus nódulos enquanto inundadas (LOUREIRO et al., 1995).
Entretanto, a fixação simbiótica de N
2
na soja pode se aclimatar à inundação e a
recuperação da fixação coincide com a formação de aerênquima e raízes
adventícias (BACANAMWO e PURCELL, 1999a, THOMAS et al., 2005).
O suprimento de carboidratos e a regulação do metabolismo de carboidratos
e de energia são importantes na superação do estresse hipóxico (ANDREEV et al.,
2001; SCHUSSLER et al., 2000). Porém, em aparente contradição ao aumento no
consumo de carboidratos sob hipoxia, muitas plantas acumulam açúcares
(ALBRECHT e BIEMELT, 1998), aminoácidos e reservas, como amido (BARTA,
1987), quando submetidas á deficiência de O
2
.
Com a inundação, o segmento submerso do caule da planta de soja
apresenta hipertrofia e formação de um tecido esponjoso na base do caule, com
rompimento da epiderme (PIRES et al., 2002). Nesse segmento, ocorre o
desenvolvimento de raízes adventícias que apresentam aerênquima lisígeno. Nas
22
raízes laterais há o desenvolvimento de aerênquima no córtex, também ocorre o
rompimento da epiderme (BACANAMWO e PURCELL, 1999a; PIRES et al., 2002).
Nos nódulos submetidos à baixa pressão parcial de O
2
ou inundação, por períodos
prolongados, ocorre a hipertrofia de lenticelas com formação de aerênquima
(PANKHURST e SPRENT, 1975; DAKORA e ATKINS, 1989; PARSON e DAY, 1990;
THOMAS et al., 2005).
De uma maneira geral, as plantas para se desenvolverem necessitam de um
ponto de equilíbrio entre a quantidade de água disponível no solo e o espaço
ocupado pelo ar no solo. O oxigênio é vital no fornecimento de energia para as vias
celulares, e sua presença ou ausência determina a atividade metabólica e produção
de energia. Ele serve como um aceptor de elétrons na fosforilação oxidativa que
regenera o ATP, principal fonte de energia para o metabolismo celular, por meio da
regeneração do NAD
+
, viabilizando o poder de sustentação das vias bioquímicas,
como por exemplo a glicólise (DENNIS et al., 2000). Sem O
2
a respiração
mitocondrial cessa por falta de um aceptor de elétron. Isso resulta na queda de 36
para 2 mols de ATP por mol de glicose metabolizada.
As plantas respondem à deficiência de oxigênio alterando seu metabolismo
energético, de modo que a energia necessária à sua sobrevivência passa a ser
obtida, predominantemente, por meio do processo fermentativo, tanto em plantas
tolerantes como não tolerantes. Em tecidos hipóxicos/anóxicos, o conteúdo de
piruvato aumenta assim como o de enzimas glicolíticas. Sob hipoxia/anoxia as
enzimas fermentativas piruvato descarboxilase (PDC), álcool desidrogenase (ADH) e
lactato desidrogenase (LDH) são induzidas em conseqüência da necessidade em
aumentar a glicólise para compensar a baixa produção de ATP devido à inativação
da fosforilação oxidativa (SAGLIO et al., 1999; SATO et al., 2002). Os produtos da
fermentação, acetaldeído, etanol e lactato acumulam, permitindo a regeneração de
NAD
+
a partir de NADH. A regeneração de NAD
+
pelas enzimas fermentativas ADH
e LDH é vital para a tolerância à hipoxia/anoxia porque, na ausência de NAD
+
, a
glicólise cessa (ISMOND et al., 2003; KURSTEINER et al., 2003). O acúmulo
limitado de lactato e maior controle do pH citoplasmático constituem também parte
da estratégia que confere tolerância à hipoxia e anoxia. Além desses produtos pode
ocorrer o acúmulo de alanina (PUIATTI e SODEK, 1999; SOUZA e SODEK, 2003;
THOMAS et al., 2005), a qual pode ter grande importância no retorno à normoxia
23
pela conversão em piruvato por meio da reação de transaminação catalisada pela
atividade da enzima alanina aminotransferase (SOUZA e SODEK, 2003;
MIYASHITA et al. 2007).
Em plantas sob condições normais de oxigenação, essas vias estão
ausentes ou com atividade bastante reduzida, mas são rapidamente induzidas em
baixa concentração de O
2
, o que sugere um papel no mecanismo de sobrevivência
das plantas, embora não se conheça qual a extensão da contribuição e como elas
se relacionam em baixo teor de O
2
(DENNIS et al., 2000).
A injúria e morte das raízes é atribuída ao acúmulo de metabólitos tóxicos
produzidos durante a fermentação (principalmente o etanol), a falta de substratos
para a respiração e a diminuição no metabolismo energético (DREW, 2000).
Observou-se em abóbora após 10-15 h de anoxia que a baixa carga de energia,
levou as células à morte porque ocorreu degradação da ultra-estrutura da
mitocôndria (VARTAPETIAN et al., 2003). Esse fenômeno não pode ser revertido
mesmo sendo restabelecida a aeração. A ultra-estrutura mitocondrial pode ser
preservada por intermédio da hidrólise do amido de reserva e ativação de enzimas
da fermentação que limitam esses efeitos (BAXTER-BURRELL et al., 2002).
O período de recuperação é de extrema importância, pois mesmo após a
drenagem do ambiente hipóxico, a re-oxigenação do meio pode causar uma
segunda condição estresse, causado pela formação de espécies reativas de
oxigênio e pode ser um fator limitante quanto a sobrevivência das plantas. Este
estresse é gerado nos primeiros minutos da restauração da oxigenação do meio
provocando injúrias pós-anóxicas, como a peroxidação de lipídeos em espécies
intolerantes, o que tem sido amplamente documentado (BIEMELT et al., 1998;
BLOKHINA et al., 1999; BLOKHINA et al., 2003).
A exploração de áreas alagadas com espécies de importância econômica
depende da identificação não somente de plantas que sobrevivam à inundação do
solo, mas que também possam apresentar rendimentos capazes de trazer retorno
econômico nessas condições ambientais. Para tanto, devem ser identificados os
genótipos mais tolerantes em experimentos em casa de vegetação e a campo que
reproduzam condições e períodos diferenciados de inundação. Posteriormente, as
razões que levam à melhor adaptação, no aspecto anatômico, morfológico,
metabólico e fisiológico devem ser conhecidas, possibilitando a transferência dessas
24
características para cultivares que não as possuem, por meio de técnicas de
melhoramento (PIRES et al., 2002).
Nas décadas de 70 e 80, vários cultivares de soja testadas tiveram
excelentes rendimentos de grãos em solos hidromórficos, destacando-se: Planalto,
Bragg, Ipagro-20 e BR7 (BARNI, 1980; SACCOL, 1986), porém, nos últimos anos,
esses cultivares não são mais recomendadas para o cultivo no Estado do Rio
Grande do Sul.
Os cultivares atualmente recomendados são pouco conhecidos no que tange
a adaptação ao encharcamento do solo, estabelecendo dificuldades para semea-los
nessas condições. O presente trabalho teve como objetivos avaliar respostas
bioquímicas e fisiológicas dos cultivares BRS 153 e BRS 154 frente a diferentes
períodos de hipoxia e de recuperação pós-hipoxia.
25
CAPÍTULO I
CRESCIMENTO DE CULTIVARES DE SOJA NODULADA SOB INFLUÊNCIA DE
DIFERENTES PERÍODOS DE INUNDAÇÃO E DRENAGEM DO SISTEMA DE
CULTIVO
26
INTRODUÇÃO
A soja possui grande importância na agricultura mundial, produz proteína de
alta qualidade (BALESTRASSE et al., 2001) utilizada na formulação de rações para
animais produtores de carne e seu óleo é um dos mais baratos, podendo ser
utilizado tanto para o consumo humano, quanto para produção de biodiesel ou para
a indústria química (DALL`AGNOL, 2008). Ao ser cultivada com Bradyrhizobium,
forma associações simbióticas contribuindo para o aumento da entrada de nitrogênio
combinado no solo, o que resulta numa economia superior a 3 bilhões de dólares
por safra em fertilizantes nitrogenados no país (DOBEREINER, 1997).
No Rio Grande do Sul os solos de várzea ocupam uma área de
aproximadamente 5,5 milhões de hectares (IBGE, 2007) e, dos 3,2 milhões
destinados ao cultivo do arroz irrigado, anualmente utilizam-se aproximadamente 1
milhão de hectares com a cultura. Neste contexto, a cultura da soja surge como uma
alternativa de cultivo às áreas de pousio e/ou drenagem deficiente, uma vez que
utiliza praticamente a mesma infra-estrutura da lavoura de arroz (IRGA, 2001). Desta
forma, contribuirá para o manejo adequado destas áreas, visto que a rotação de
culturas é uma prática recomendada para aumentar o rendimento de grãos de arroz,
quer pelo efeito direto de quebrar o ciclo de pragas, moléstias e plantas daninhas, ou
pelo efeito indireto na melhoria das condições químicas e físicas do solo (IRGA,
2001). Entretanto, para que se obtenham esses benefícios, é necessário estudar
espécies e cultivares que se adaptem às condições de excesso de água no solo e
que proporcionem retorno econômico ao produtor.
Durante períodos prolongados de chuva ou de intensidade pluvial elevada, é
possível que mesmo em locais bem drenados ocorra o alagamento temporário,
tornando esses ambientes hipóxicos. Sob deficiência de O
2
, o metabolismo aeróbico
é substituído pelo anaeróbico levando à paralisação do Ciclo de Krebs (COLLINS e
27
KENNEDY et al., 1992) e da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial
(BLOKHINA, 2000), tornando a glicólise e o metabolismo fermentativo o principal
meio de obtenção de ATP pelas células vegetais (DENNIS et al, 2000).
A deficiência de O
2
causa a paralisação do crescimento dos nódulos
(SALLAM e SCOTT, 1987), das raízes em poucos minutos, limitando sua tolerância
em relação ao CO
2
(COSTA, 1996) e causando, também, a diminuição das taxas de
assimilação líquida e expansão foliar, provocando a diminuição da taxa de
crescimento da cultura da soja e, consequentemente, proporcionando menor
rendimento de grãos (LINKEMER et al., 1998).
A tolerância ao estresse por alagamento em soja e outras espécies pode
envolver adaptações morfológicas, anatômicas e metabólicas (THOMAS et al., 2005;
VARTAPETIAN e JACKSON, 1997, SOUSA e SODEK, 2002; SOUSA e SODEK,
2003; BAILEY-SERRES e VOESENEK, 2008). No entanto, após o retorno das
condições normais de O
2
, a recuperação do estresse hipóxico é dependente da
espécie, do estádio da planta, da duração, da intensidade do estresse e do tempo de
recuperação (SCOTT et al., 1989; OOSTERHUIS et al., 1990; FUKAO e BAILEY-
SERRES, 2004). É importante considerar que a injúria pós-hipóxica pode ser mais
prejudicial à planta do que a própria hipoxia, em decorrência da geração de radicais
livres e produtos oxidativos tóxicos, como acetaldeído (VAN TOAI e BOLLES, 1991;
BIEMELT et al. 1998), o que certamente influencia na retomada do crescimento da
planta e produtividade.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar parâmetros de crescimento
em dois genótipos de soja contrastantes quanto à tolerância ao alagamento durante
diferentes períodos de inundação e drenagem do sistema de cultivo.
28
2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em casa de vegetação da Embrapa Clima
Temperado – Estação Experimental Terras Baixas, situada no município do Capão
do Leão, RS, entre dezembro de 2006 e março de 2007. Sementes de soja [(Glycine
max (L.) Merril)] dos cultivares BRS-154 (tolerante) e BRS-153 (suscetível) foram
semeadas em vasos de polietilieno furados, de três litros (5 sementes), contendo
vermiculita como substrato. Duas inoculações das plântulas com Bradyrhizobium
elkanii, estirpe SEMIA 587, fornecida pela FEPAGRO e reproduzida no
DMP/IB/UFPel. Foram efetuadas aos 14 e 21 dias após a emergência,
respectivamente nos estádios VC e R2 da classificação de FEHR et al. (1971),
constituindo na pipetagem de 2,5mL de meio líquido de NORIS e DATE (1976) ao
redor da plântula. No estádio V0 foi efetuado o desbaste deixando duas plantas por
vaso. A partir da queda dos cotilédones e até o final do experimento, as plantas
foram nutridas com solução de Hoagland e Arnon (1938) sem nitrogênio mineral, na
proporção de 250 mL vaso
-1
, duas vezes por semana e irrigado com água sempre
que necessário.
No estádio de desenvolvimento R2 - flor no nó imediatamente abaixo do nó
mais alto com uma folha completamente desenrolada (FEHR et al.,1971) - procedeu-
se a inundação do sistema radicular, submetendo as raízes à deficiência de O
2
. O
tratamento foi realizado ao impedir-se a drenagem natural dos vasos por meio do
encaixe do vaso contendo as plantas em outro, de mesmo modelo e não perfurado,
aplicando-se a solução nutritiva diluída a 1/3 da concentração original, de forma a se
manter uma lâmina de 20 mm sobre a superfície do substrato. O teor de O
2
foi
29
monitorado com o uso de um oxímetro (Handylab OX1), na solução nutritiva e na
solução drenada dos vasos.
Os vasos dos experimentos de inundação e de recuperação foram
inundados simultaneamente e as coletas para análise de crescimento foram
realizadas aos 3, 6, 9 e 12 dias após a inundação (DAI). Aqueles destinados à
avaliação de recuperação foram drenados no 9º DAI e as plantas foram coletadas no
1º, 2º, 3º e 9º dia após a drenagem (DAD). Para as variáveis diâmetro do caule e
altura de planta foram realizadas medidas referentes ao dia de implantação do
experimento (dia zero).
As medidas de altura de planta foram obtidas por de meio de uma régua
metálica milimetrada, entre o colo da planta até a inserção da folha mais jovem,
enquanto o diâmetro do caule foi mensurado com paquímetro digital marca
Panambra, modelo Pantec: 0-150mm/6’’, em milímetros, ao nível da lâmina da
solução de inundação. Após a coleta das plantas, as raízes foram lavadas em água
corrente para a remoção das partículas de vermiculita aderidas e enroladas em
papel toalha para a retirada do excesso de umidade. Após, o volume do sistema
radical foi determinado em proveta graduada pelo deslocamento da coluna de água
devido a submersão das raízes.
A massa seca de raízes, caules, folhas e vagens foi determinada em
balança analítica após desidratação dos tecidos em estufa de ventilação forçada a
65
o
C até que apresentassem massa constante. Entretanto, o número de vagens por
planta foi obtido por contagem.
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema
fatorial 2 x 4 x 2 (regime hídrico x dias de inundação ou de drenagem x genótipos)
com quatro repetições. As médias obtidas foram submetidas à análise de variância e
de regressão. Quando não houve adequação de curva de regressão, aplicou-se
teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade (GOMES, 1990). A análise
estatística foi realizada com auxílio do pacote estatístico SAS (SAS, 2002).
30
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O teor de oxigênio, monitorado ao longo do experimento de inundação,
variou entre 84 e 96% na solução nutritiva utilizada para inundação das plantas e
entre 7 e 13%, 24h após tratamento, variando nesse intervalo ao longo de todo o
experimento, demonstrando a condição de hipoxia do sistema utilizado.
No decorrer do experimento, a variável diâmetro do caule foi influenciada
pela interação entre os fatores regime hídrico, período de tratamento e genótipos. As
condições de hipoxia o diâmetro de ambos os cultivares logo aos três dias de
inundação (Fig. 1A e 1C), sendo este efeito mais expressivo no cultivar BRS – 154
que continuou aumentando até o nono dia de inundação, tendendo à estabilidade no
período posterior (Fig. 1C). O cultivar BRS – 153, por outro lado, respondeu de
forma diferenciada, aumentando o caule em diâmetro até o sexto dia de inundação,
tendendo à estabilidade nos demais períodos de tratamento (Fig. 1A). Em relação à
resposta dos genótipos durante o período de recuperação após nove dias de
inundação, houve um decréscimo contínuo no diâmetro da BRS - 153, com
tendência a igualar aos valores do controle (Fig. 1B). Em contrapartida, a redução no
diâmetro do caule do cultivar BRS - 154 até o terceiro dia de recuperação, ficando
estável nos demais períodos, mas sempre maior que o controle (Fig. 1 D). Pires et
al. (2002) ao estudarem adaptações morfofisiológicas de soja em solo inundado,
concluíram que o diâmetro do caule sob a lâmina de água foi a característica mais
importante na diferenciação de cultivares com vistas à tolerância à inundação, em
decorrência da formação de rachaduras na região submersa, hipertrofia e formação
de região esponjosa na base do caule, confirmando os resultados obtidos neste
experimento.
31
Figura 1- Diâmetro do caule de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B) e
BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e
drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação, sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
O volume do sistema radical foi influenciado pela interação entre o regime
hídrico e período de tratamento, não ocorrendo diferença de resposta entre
genótipos. Os três primeiros dias de alagamento induziram o aumento do volume
das raízes, possivelmente devido a modificações morfológicas como o
desenvolvimento de raízes adventícias e formação de aerênquima. Assim, é
possível que tais alterações tenham possibilitado a reversão parcial do metabolismo
anaeróbico para aeróbico desencadeando a retomada da fixação do nitrogênio,
através da utilização do oxigênio armazenado nas câmaras aerênquimáticas,
provido da difusão do O
2
da água, buscando a sobrevivência da planta por mais
tempo sob condições desfavoráveis ou até o retorno às condições de normoxia,
conforme
Thomas et al., (2005). A partir daí, ocorreu um decréscimo do volume das
I = -0.0161x
2
+ 0.3004x +0.3107
*R
2
C = -0.0034x
2
+ 0.1113x + 8143
*R
2
= 0,67
2
5
8
0
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
A
B
Rec = -0.0066x
2
+0.0757x + 0.1012
*R
2
= 0,96
2
5
8
1
2
3
9
Período de Recuperação (Dias)
I = -0.0206x
2
+ 0.4776x + 2.5686
*R
2
= 0,88
C= -0.0093x
2
+ 0.1694x + 2.6321
*R
2
= 0,55
2
5
8
0
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
C
D
Rec = -0.0039x
2
+0.0463x +0.1195
*R
2
= 0,87
2
5
8
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
/
/
32
raízes quando comparado com as plantas controle (Fig. 2A). Esses dados parecem
concordar com os obtidos por Fox et al., (1994) que atribuíram a paralisação de
crescimento por conta da diminuição na produção de ATP, conduzindo ao declínio
da integridade e deterioração dos tecidos radiculares.
O volume do sistema radical aumentou com o passar dos dias, após a
drenagem dos vasos, tendendo igualar-se ao das plantas controle no nono dia (Fig.
2B).
Figura 2 - Volume do sistema radicular de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A)
e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de inundação e
recuperação do sistema radicular após nove dias de inundação, sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
O regime hídrico influenciou a massa seca de raízes durante o período de
tratamento, não ocorrendo resposta diferenciada entre cultivares. Em relação ao
controle, houve grande decréscimo nos valores de massa seca de raízes a partir do
nono dia de inundação (Fig. 3A). Durante a recuperação, ambos os cultivares
apresentaram elevação de massa seca (Fig. 3B e 3C), embora BRS-154 tenha
demonstrado melhor resposta, atingindo níveis semelhantes ao do controle (Fig. 3B).
I = 0.0025x
2
-0.0720x + 1.1352
*R
2
= 0,79
4
7
10
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
A
Re
c = 0,3364x + 5.2942
*R
2
= 0,69
4
7
10
1
2
3
9
Periodo de Recueração (Dias)
//
//
B
33
Figura 3 - Massa seca de raízes de dois cultivares de soja nodulados, submetidos a
diferentes períodos de inundação do sistema radicular (A) e dos cultivares
BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de
recuperação do sistema radicular, após nove dias de inundação, sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
Em relação à variável massa seca de folhas (Wf), não houve ajuste de curva
de regressão, tampouco diferença entre os cultivares de soja para os tratamentos de
inundação e recuperação. A comparação de médias entre os dias de inundação
demonstrou que houve redução significativa somente aos 12 DAI. Por outro lado,
aos nove e 12 DAI, os valores observados foram inferiores aos do controle,
evidenciando um efeito prejudicial da hipoxia sobre Wf (Fig. 4A). Os resultados
obtidos concordam com os trabalhos de Sá et al., (2004), que avaliaram o efeito da
velocidade de rebaixamento do nível freático no desenvolvimento e na produtividade
I = -0.039283x +0.9544
*R
2
= 0,76
0.30
0.75
1.20
3
6
9
12
P
eriodo de Inundação (Dias)
A
C = 0.0279x - 0.1920
*R
2
= 0,95
REC = 0.0353x - 0.2851
*R
2
= 0,92
0.2
0.9
1.6
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
//
//
//
B
C = 0.0456x - 0.4153
*R
2
= 0,92
REC = 0.0417x - 0.4190
*R
2
= 0,87
0.2
0.9
1.6
1
2
3
9
Periodo de Rcuperação (Dias)
//
//
//
C
34
de plantas de ervilha e Costa (2004) que comparou o comportamento do capim-
angola (Brachiaria mutica) e canarana verdadeira (Echinochloa polystachya) sob
alagamento e Dias-Filho (2006), que avaliou as respostas morfológicas de Brachiaria
spp. ao alagamento do solo. Após drenagem dos vasos, houve incremento da
massa seca das folhas com o avanço do período de recuperação, equivalendo ao
controle nos primeiros dias de supressão do estresse hipóxico (Fig. 4B), mostrando
ganho de massa seca de folhas assim como Fries, (2003) observaram em plântulas
de milho.
Figura 4 – Massa seca de folhas de cultivares de soja nodulados, BRS-153 e BRS-
154, submetidos a diferentes períodos de inundação (A) e de recuperação
do sistema radicular após nove dias de inundação (B).
(controle) e (inundado ou recuperação).
*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.
O déficit de oxigênio também influenciou a razão entre a massa seca da
parte aérea e a massa seca do sistema de raízes (PA/SR) no período de inundação,
não ocorrendo diferença de resposta entre os cultivares. O aumento da razão PA/SR
ocorreu após o terceiro dia de inundação, intensificando-se com o avanço do
período de tratamento hipóxico (Fig. 5A), o que demonstra maior efeito inibitório do
crescimento do sistema radicular em relação à parte aérea. Após a drenagem dos
vasos, houve decréscimo da razão PA/SR ao longo dos dias. O cultivar BRS – 154
teve razão PA/SR equivalente ao controle no terceiro dia de retorno à normoxia, ao
passo que BRS – 153 foi equivalente às plantas controle somente no nono dia de
1.2
1.4
1.6
1.8
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Ab
Bb
Aa
A
1.2
1.5
1.8
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Bb
//
//
Aa
Aa
//
B
35
recuperação (Fig. 5B e 5C). Segundo Jackson e Drew (1984) a redução da taxa de
crescimento radicular é a primeira resposta ao estresse por excesso de água no
solo. O metabolismo das raízes é rapidamente restringido quando a concentração de
oxigênio no solo diminui a níveis críticos, o que não ocorre na parte aérea das
plantas. Na parte aérea, a assimilação e o metabolismo respondem lentamente à
inundação do solo (MUSGRAVE; VANHOY, 1989).
Figura 5 - Razão entre a massa seca da parte aérea (PA) e do sistema de raízes de
dois cultivares de soja nodulados submetidos a diferentes períodos de
inundação (A) e dos cultivares BRS-153 (B) e BRS-154 (C) em diferentes
períodos de recuperação do sistema de raízes após nove dias de
inundação, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
I = 0.4588x + 2.7288
*R
2
= 0,81
C = 0.2415x +
3.0888
*R
2
= 0,59
3
7
11
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
A
REC = -0.0271x +0.9968
*R
2
= 0,71
C = -0.0139x +
0.8917
*R
2
= 0,78
3
7
11
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
//
//
//
B
REC = -0.0258x + 1.0112
*R
2
= 0,79
C = -0.0275x +
1.0200
*R
2
= 0,92
3
7
11
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
//
//
//
C
36
O caráter massa seca de vagens (Wv) foi influenciado pela interação entre o
fator inundação ou drenagem, período de tratamento e cultivar. Não houve ajuste de
curva de regressão para o período de inundação, de modo que foi realizado teste de
médias para comparar, entre si, os dias de alagamento e os regimes hídricos. Aos
três e seis DAI ocorreu acréscimo em Wv das plantas inundadas em relação ao
controle para os dois genótipos. Entretanto, aos nove DAI, a Wv de BR-153 foi
inferior ao controle, o que se repetiu aos 12 DAI, ao passo que, para BR-154, essa
resposta só foi observada no período mais alto de inundação (Fig. 6A e 6C). Com a
drenagem das plantas foi pequena diminuição do acúmulo de Wv em BRS-153,
sendo este efeito mais acentuado em BRS-154 nos tempos iniciais de drenagem,
revertendo-se até o nono dia de recuperação da inundação (Fig. 6B e 6D).
Figura 6 – Massa seca de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B)
e BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e
drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação, sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
0.0
1.5
3.0
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
Bb
Bb
Ab
Ab
Aa
Aa
Aa
Ba
A
C = 0.1149x + 2.3649
*R
2
= 0,79
REC = 0.1402x + 2.1823
*R
2
= 0,97
0.5
2.5
4.5
1
2
3
9
Periodos de Recuperação (Dias)
//
//
//
B
0.0
1.5
3.0
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
Aa
Aa
Ab
Ca
Cb
Cb
Ba
Ba
C
C = 0.1472x + 1.4610
*R
2
= 0,91
REC = 0.1762x + 0.9104
*R
2
= 0,91
0.5
2.5
4.5
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
//
//
//
D
37
* Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05) para período e regime hídrico respectivamente. (B
e D) *P≤0,05; n=4.
A variável número de vagens por planta foi influenciada, em ambos os
experimentos, pela interação entre o fator inundação ou drenagem, período de
tratamento e genótipo. Aos três DAI, BR-153 aumentou o número de vagens em
relação ao controle, com posterior decréscimo, principalmente aos nove e 12 DAI.
Enquanto isso, BR-154 teve redução no número aos três DAI com subseqüente
incremento que permitiu alcançar valores próximos ao controle até os nove DAI,
apresentando, aos 12 DAI, severa diminuição na quantidade de vagens por planta
(Fig. 7A e 7C). No primeiro dia de recuperação pós-hipoxia, os dois cultivares
atingiram os valores do controle. Entretanto, o aumento nos dias após a drenagem
dos vasos causou redução do número de vagens, efeito intensificado no cultivar
BRS – 154 (Fig. 7B e 7D). Os resultados obtidos estão de acordo com Barni e Costa
(1975) que ao estudarem efeitos de períodos de inundação do solo sobre o
rendimento grãos de soja, perceberam que o componente de rendimento que mais
decresceu foi o número de vagens por planta e neste mesmo trabalho evidenciaram
que o período mais sensível ao alagamento foi o florescimento.
38
Figura 7 – Número de vagens de cultivares de soja nodulados, BRS-153 (A e B) e
BRS- 154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de inundação e
drenagem do sistema radicular após nove dias de inundação, sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
Os resultados obtidos no presente trabalho revelam que dependendo do
período de exposição ao estresse hipóxico e recuperação pós-hipóxia, existe
diferenciação no comportamento das plantas, sendo influenciado pelo genótipo de
cada espécie. Em função disso, as características de crescimento como diâmetro do
caule, volume do sistema de raízes, massas secas de raiz, massa seca de folhas,
massa seca de vagens, número de vagens e razão da parte aérea e sistema radical
foram eficientes para diferenciar a adaptação dos cultivares submetidos a estas
condições desfavoráveis.
I = -0.0142x + 1.0344
*R
2
= 0,69
C = 0.0098x + 0.8406
*R
2
= 0,50
2
9
16
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
A
Rec = -0.0449x
2
- 0.7019x + 10.6898
*R
2
= 0,82
6
11
16
1
2
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
//
//
B
I = -0.0051x
2
+ 0.0931x + 0.5440
*R
2
= 0,72
C = 0.0418x + 0.5982
*R
2
= 0,85
2
9
16
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
C
C= -0.808x
2
+0.9695x + 9.6587
*R
2
= 0,66
REC = 0.0512x
2
- 0.7424x + 10.7974
*R
2
= 0,73
6
11
16
1
2
3
9
Periodo de Recuração (Dias)
//
//
//
D
39
No que concerne a influência do tratamento hipóxico sobre as diferentes
características de crescimento, as relacionadas ao sistema radical sofreram maior
inibição em relação às pertinentes à parte aérea, não ocorrendo diferença
expressiva nas respostas dos genótipos analisados frente ao tratamento hipóxico ou
período de recuperação pós-hipoxia para a maioria dessas carcterísticas.
O alagamento por sete dias no estádio R2 em dois genótipos de soja reduz
significativamente o acúmulo de massa seca durante o período de tratamento e a
retomada do crescimento das plantas após supressão da hipoxia. O efeito inibitório
desse curto período de tratamento reflete na produção de grãos, que oscila entre 40
e 52% para os genótipos testados (OOSTERHVIS et al., 1990).
O período de nove dias de inundação foi suficiente para causar redução do
crescimento dos genótipos BRS-153 e BRS-154. No entanto, o efeito inibitório sobre
as características avaliadas foi revertido após três dias de drenagem para a maioria
das variáveis. O número de vagens por planta consistiu na característica mais
influenciada negativamente, durante o período de drenagem. No entanto, não é
possível afirmar se tal influência pode refletir em diferenças de rendimento,
sobretudo em BRS-154, onde o efeito inibitório foi mais intenso. Diferentemente
deste trabalho, Scott et al., (1990) afirma que ocorreu a recuperação do crescimento
de oito genótipos de soja, após sete dias de inundação, iniciada no estádio R2,
sendo retomada após um período superior a 14 dias, resulta em grande decréscimo
da produção de grãos, inclusive quando comparado à inundação por igual período,
nos estádios V1 e V4.
40
4 CONCLUSÕES
Os resultados permitiram concluir que a recuperação do estresse hipóxico
depende do estádio de desenvolvimento em que as plantas são submetidas ao
alagamento e esta resposta é dependente do cultivar, indicando que alguns
cultivares são mais tolerantes ao alagamento do que outras quando o tratamento é
aplicado sob determinado estádio.
As características de crescimento avaliadas são influenciadas pelo
tratamento de inundação e de recuperação quando conduzidos no estádio R2 nos
cultivares BRS-153 e BRS-154.
O cultivar BRS-154 é mais eficiente na produção de estruturas adaptativas
no caule, quando comparada com o cultivar BRS–153
Ambos os genótipos tem períodos críticos para início de resposta inibitória
por inundação ou de recuperação após drenagem, seis e três dias, respectivamente.
41
CAPÍTULO II
ATIVIDADE DA ALANINA AMINOTRANSFERASE E TEOR DE
COMPOSTOS NITROGENADOS EM RAÍZES E NÓDULOS DE GENÓTIPOS DE
SOJA SUBMETIDOS A DIFERENTES PERIODOS DE HIPOXIA E PÓS-HIPOXIA
42
1 INTRODUÇÃO
A soja é uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China
(EVANS, 1996) e apresenta variabilidade genética para tolerar o excesso de
umidade no solo (THOMAS et al., 2000; PIRES et al., 2002).
A deficiência de O
2
no sistema radicular causa uma série de efeitos em
processos bioquímicos e fisiológicos, como inibição da fixação de N
2
(AMARANTE e
SODEK, 2006), diminuição do transporte de fotoassimilados às raízes e redução da
taxa fotossintética (HSU et al., 1999) e inibição da absorção de N e outros minerais
(SALLAM e SCOTT, 1987).
As diferentes espécies vegetais podem dispor de mecanismos adaptativos
para suportar ou mesmo superar o estresse hipóxico causado pelo
alagamento,
devido aos mecanismos de adaptações morfofisiológicas como formação de
aerênquima (VARTAPETIAN e JACKSON, 1997; THOMAS et al., 2005), e
adaptações metabólicas como interconversões de aminoácidos (REGGIANI et al.,
1988; SOUSA e SODEK, 2003), síntese de polipeptídeos anaeróbicos (SACHS,
1980) e regulação do metabolismo de carboidratos (BAILEY-SERRES e
VOESENEK, 2008).
O metabolismo de aminoácidos é severamente alterado durante anoxia
(RICARD et al., 1994) e a habilidade das raízes para tolerar o ambiente anaeróbio,
quando o oxigênio não pode ser transportado da atmosfera, está associada com a
capacidade de modificar seu metabolismo. Durante a hipoxia, as composições de
aminoácidos nos tecidos de raízes e em seiva do xilema de plantas de soja
mudaram substancialmente, onde a alanina foi produzida relativamente em grandes
quantias, tornando-se um dos mais abundantes aminoácidos em raízes (SOUSA e
SODEK, 2003).
43
A principal via de síntese da alanina sob hipoxia não é inteiramente
entendida. Vários estudos demonstram aumentos expressivos na atividade da
alanina aminotransferase (AlaAT; E.C 2.6.1.2) sob deficiência de oxigênio (GOOD e
CROSBY 1989; SOUSA e SODEK, 2003; MIYASHITA et al., 2007). A AlaAT catalisa
a reação reversível da interconversão do piruvato e glutamato à alanina e 2-
oxoglutarato, participando então tanto do metabolismo do carbono quanto do
metabolismo do nitrogênio (VEDAVATHI et al., 2004) sendo atribuído à esta enzima
grande importância na adaptação metabólica da planta para tolerância à deficiência
de oxigênio (RICOULT et al., 2005).
O período inicial da recuperação após o estresse por falta de oxigênio pode
ser crucial na sobrevivência das plantas. Apesar da maioria das injúrias acontecer
durante o período de estresse, danos também ocorrem no retorno das plantas às
condições normais de oxigênio (VAN TOAI e BOLLES, 1991).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar as variações dos teores de
compostos nitrogenados e a atividade da enzima alanina aminotransferase (AlaAT)
em raízes e nódulos de genótipos de soja submetidos a diferentes períodos de
hipoxia
e retorno à normoxia
.
44
2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em casa de vegetação da Embrapa Clima
Temperado – Estação Experimental Terras Baixas, situada no município do Capão
do Leão, RS, entre dezembro de 2006 e março de 2007. Sementes de soja [(Glycine
max (L.) Merril)] dos cultivares BRS-154 (tolerante) e BRS-153 (suscetível) foram
semeadas em vasos de polietilieno furados, de três litros (5 sementes), contendo
vermiculita como substrato. Duas inoculações das plântulas com Bradyrhizobium
elkanii, estirpe SEMIA 587, fornecida pela FEPAGRO e reproduzida no
DMP/IB/UFPel. Foram efetuadas aos 14 e 21 dias após a emergência,
respectivamente nos estádios VC e R2 da classificação de FEHR et al. (1971),
constituindo na pipetagem de 2,5mL de meio líquido de NORIS e DATE (1976) ao
redor da plântula. No estádio V0 foi efetuado o desbaste deixando duas plantas por
vaso. A partir da queda dos cotilédones e até o final do experimento, as plantas
foram nutridas com solução de Hoagland e Arnon (1938) sem nitrogênio mineral, na
proporção de 250 mL vaso
-1
, duas vezes por semana e irrigado com água sempre
que necessário.
O tratamento de inundação do sistema de raízes, foi efetuado no estádio de
desenvolvimento R
2
(FEHR et al.,1971) procedeu-se à aplicação, impedindo-se a
drenagem natural dos vasos por meio do encaixe de um segundo vaso não
perfurado sob o vaso contendo as plantas e aplicando-se solução nutritiva diluída
três vezes, de forma a se manter uma lâmina de 20mm sobre a superfície do
substrato. As plantas permaneceram inundadas por 12 dias, porém, aquelas
destinadas à avaliação do período pós-hipoxia foram drenadas no nono dia após
inundação (DAI), pela retirada dos vasos não perfurados. O teor de O
2
foi
monitorado na solução nutritiva e na solução drenada dos vasos, usando um
oxímetro (Handylab OX1).
45
No experimento de inundação foram coletados material para análise aos
três, seis, nove e doze dias de tratamento. No experimento de recuperação, as
coletas do material foram feitas após um, três e nove dias de tratamento.
A seiva do xilema foi coletada para a dosagem de ureídeos, após cortar o
caule da planta em forma de bisel, logo abaixo do nó cotiledonar conforme descrito
por McCLURE e ISRAEL (1979). Os exsudatos foram coletados por até uma hora,
com o uso de microcapilares de vidro, e transferidos para tubos eppendorf em banho
de gelo até o armazenamento final sob temperatura de -18ºC. Os tecidos foram
coletados do terço inferior do sistema radicular, lavados em água corrente e em
água destilada gelada, retirando-se o excesso de umidade com papel toalha.
As amostras de raízes (2g) e de nódulos (0,5g) foram armazenadas sob
temperatura de aproximadamente -86ºC, para posterior dosagem da atividade de
AlaAT e determinação da concentração de proteínas totais e aminoácidos totais.
A extração da AlaAT de amostras dos tecidos de raízes e nódulos foi
realizada a 4ºC, sendo maceradas em almofariz previamente resfriado. A maceração
de raízes foi realizada na presença de aproximadamente 100mL de N
2
líquido,
utilizando PVPP a 5% p/pMF, 10mL de tampão extração (Tris-HCL 50mM, pH7,5
contendo DTT 1mM). Após serem maceradas, foram filtradas em 8 camadas de
gaze umedecidas com tampão de extração e centrifugadas a 10.000g, entre 2 e 4ºC
por 20min. Do sobrenadante centrifugado retirou-se uma alíquota de 2,5mL para
dessalinização por cromatografia de exclusão em coluna de Shephadex G-25 médio
(PD 10; Amersham Pharmacia Biotech).
O extrato eluído foi utilizado para os
ensaios enzimáticos.
A atividade da enzima AlaAT (EC 2.6.1.2) foi determinada no sentido da
formação do piruvato, por meio do acoplamento de duas reações (alanina →
piruvato→lactato), utilizando cubetas descartáveis de 4mL de polimetilmetacrilato. O
meio de reação em volume final de 3mL continha: Ala 10mM; α-KG 5mM; β-NADH
0,2mM; Tris - HCL - pH7,5 - 50mM e 5 unidades da proteína LDH. As cubetas
contendo tampão de dosagem, Ala, α-KG e β-NADH, foram previamente incubadas
no sistema de aquecimento Peltier a 30 ºC. A reação era iniciada pela adição do
extrato enzimático e da LDH no meio de reação. As leituras de queda de
absorbância a 340nm foram registradas em intervalos de 10seg em
espectrofotômetro PG - Instruments
.
46
A extração dos metabólitos de raízes e de nódulos foi realizada conforme
BIELESKI e TUNER (1966). Os tecidos das raízes (com N
2
líquido) e nodulares
foram macerados em almofariz e homogeneizados com solução extratora “MCW”
(metanol: clorofórmio: água; proporção 12:5:3), empregando 10mL g
-1
, e transferidos
para frascos âmbar, permanecendo em repouso por 24h. Posteriormente, as
amostras foram centrifugadas a 2.000rpm por 30min. A fração do sobrenadante foi
recuperada em proveta e por 4mL, acrescentando 1,0mL de clorofórmio e 1,5mL de
água pura (Milli-Q), sendo agitadas em seguida e deixadas em repouso por 24h
para a separação das fases. A fase aquosa (superior) foi coletada e evaporada em
banho-maria a 38,8 ºC por 15h para eliminação do resíduo de clorofórmio e
concentração das amostras. A fase do clorofórmica (inferior) foi descartada. As
amostras concentradas tiveram seu volume mensurado e armazenadas em tubos
eppendorf sob temperatura de
-18 ºC. O precipitado foi resuspenso em 10mL de
NaOH 0,1 N e homogeneizado em vórtex. Após 24h em repouso, estes extratos
foram centrifugados a 2.000rpm por 30min e coletado o sobrenadante contendo a
porção protéica (BUENO, 1989), sendo armazenado a -20 ºC para posterior
dosagem de proteínas.
A detrminação de proteínas totais foi realizada conforme metodologia
descrita por BRADFORD, (1976). Em nódulos as proteínas totais foram dosadas
pelo método padrão, utilizando amostras e padrão BSA (soroalbumina bovina, fração
V) em quantidades variando entre 0 e 100µg em volume de 0,1mL, acrescidos de
5,0mL de reagente de cor (Coomasie Brilliant G 250, 100mg em 50mL de etanol
95% e 100mL de H
3
PO
4
85% p/v ). Para raízes foi utilizado o micrométodo, com o
padrão de BSA em quantidades variando de 0 a 20 µg de proteína /0,1mL, por 1mL
de reagente de cor. Após a adição do reagente de cor sobre as amostras e padrões,
os tubos foram agitados para posterior leitura das densidades ópticas (D.O.) a
595nm.
A dosagem de aminoácidos solúveis totais (AA) foi realizada pelo método de
YEMM e COCKING (1955), usando 1mL de cada amostra de raízes e nódulos e/ou
dos padrões de leucina (0-200nmol mL
-1
), devidamente diluídas, de um branco
(água) em tubos de ensaio, acrescentando-se 0,5mL de tampão citrato 0,2M pH5,0,
0,2mL de reativo de ninhidrina 5% em metil-celusolve, 1mL KCN-2% em metil-
celusolve e após agitação, cobrindo-se os tubos com bolas de vidro, sendo
47
incubados em banho-maria a 100 ºC por 20min e posteriormente transferidos para o
escuro até atingir temperatura ambiente. Após resfriamento foi acrescentado 1,3mL
de etanol 60% por tubo, sendo novamente agitados para posterior leitura de D.O. a
570nm.
A dosagem de ureídeos do exsudatos de xilema foi realizada pelo método
VOGELS e van der DRIFT, (1970). O volume 250µL de amostras de seiva ou dos
padrões de alantoína (0-150nmol mL
-1
), devidamente diluídos, um branco (água)
foram transferidos para tubos de ensaio, acrescentando-se 0,5mL de água destilada
0,25mL de NaOH 0,5N. Em seguida os tubos foram tampados com bolas de vidro e
levados ao banho-maria a 100 ºC por 8min e resfriados em água corrente,
posteriormente foi acrescentado 0,25mL de HCl 0,65N. Os tubos foram então
aquecidos a 100 ºC por 4 min e novamente resfriados para a adição de 0,25mL de
tampão fosfato (Na
2
HPO
4
-KH
2
PO
4,
0,4M pH7,0) mais 0,25mL de fenilhidrazina
0,33%. Após repouso por 5 min, os tubos foram submetidos a banho de gelo para
adição de 1,25mL de HCl concentrado a 0 ºC, 0,25mL K
3
Fe(CN)
6
1,65% e agitados
em vórtex. Após 15min, as amostras foram lidas em D.O de 535nm.
O delineamento adotado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2
x 2 x 4 (genótipos; regime hídrico, períodos de inundação) ou 2 x 2 x 3 (genótipos;
regime hídrico, períodos de drenagem após inundação) com quatro repetições,
sendo a unidade experimental constituída de um vaso com duas plantas. Após
análise de variância dos dados referentes ao experimento de inundação, nos casos
significativos, foram ajustadas equações de regressão e quando não houve ajuste,
as médias foram comparadas pelo teste de médias de Tukey, a 5% de probabilidade
(GOMES, 1990). A análise estatística foi realizada com auxílio do pacote estatístico
SAS (SAS, 2002). Este último procedimento foi adotado para os dados referentes ao
experimento de drenagem.
48
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O teor de oxigênio foi monitorado ao longo do experimento de inundação,
sendo obtidos valores entre 84 e 96% na solução nutritiva utilizada para inundar as
plantas, e entre 7 e 13% na solução drenada dos vasos 24h após alagamento,
permanecendo em níveis próximos durante todo o experimento, caracterizando a
condição de hipoxia no sistema em estudo.
A inundação do sistema radicular causou decréscimo do transporte de
ureídeos na seiva de xilema, mostrando efeitos distintos entre os genótipos durante
o período de alagamento e drenagem dos vasos (Fig. 1A e 1C). Aos três dias de
tratamento, houve pequena queda no transporte de ureídeos no cv. BRS 153 e
acentuada no cv. BRS 154. O efeito mostrou-se intensificado aos seis dias de
tratamento, aumentando a partir do nono dia de inundação até o último dia de
avaliação. Em soja nodulada, o transporte de N no xilema é caracterizado pelos
ureídeos, ácido alantóico e alantoína, que representam até cerca de 80% do N
translocado (McCLURE e ISRAEL, 1979), considerados produtos específicos da
fixação de N
2
(McCLURE et al., 1980), sendo usados como indicadores da eficiência
da fixação de N
2
, sendo que altas concentrações em leguminosas estão usualmente
associadas à nodulação efetiva e elevadas taxas de fixação de N
2
(BERKUM et al.,
1985; HERRIDGE et al., 1990). Os ureídeos dosados na seiva do xilema
decresceram significativamente em soja nodulada sob alagamento por um período
de cinco dias (PUIATTI e SODEK, 1999), confirmando os resultados deste
experimento. Períodos inferiores a uma hora de alagamento do sistema de raízes
foram suficientes para reduzir em mais de 90 % o teor de ureídeos totais na seiva,
mantendo estes teores durante as 96h de avaliação (AMARANTE e SODEK, 1999).
49
O grande decréscimo do transporte de ureídeos ao longo do experimento deve estar
relacionado à inibição da fixação de N
2
devido à deficiência de O
2
nos nódulos, uma
vez que a difusão do O
2
na água é cerca de 1.000 vezes menor do que no ar
(ARMSTRONG et al., 1994) e a barreira de difusão de O
2
presente no nódulo
(GUASH et al., 2001) potencializa esse efeito. Por outro lado, o pequeno aumento
nos ureídeos totais na seiva observado no nono dia de tratamento foi propiciado
possivelmente por meio da formação de aerênquimas, facilitando as trocas gasosas
e com isso a fixação de N
2
(THOMAS et al., 2005), porém diferente do observado
nesse trabalho, onde a formação de aerênquima tornou possível a reversão do
processo de fixação de N
2
entre sete e dez dias após inundação das plantas.
A drenagem dos vasos possibilitou a retomada da fixação de N
2
em ambos
os genótipos, em níveis equivalentes ao controle, em período superior a 24h de
tratamento, demonstrando que nove dias de inundação são capazes inibir
severamente a atividade fixadora dos nódulos, não sendo entretanto, um processo
irreversível. A forma de recuperação da fixação de N
2
foi diferenciada entre
genótipos, uma vez que no cv. BRS-154 as concentrações de ureídeos totais
permaneceram superiores ao controle durante todo o período de drenagem avaliado
e em BRS 153 os teores foram aquivalentes ao controle no nono dia de avaliação
(Fig. 1C e 1D).
50
Figura 1 – Teores de ureídeos totais em seiva de xilema de genótipos de soja
nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes
períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias
de déficit de O
2,
sendo (controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05;
n=4.
O teor de aminoácidos totais em raízes aumentou com o tratamento
hipóxico, sendo um efeito comum em ambos os genótipos, porém diferenciado ao
longo do período de inundação. No cv. BRS-153 aumentos expressivos foram
detectados no sexto dia de inundação, ao passo que em BRS-154 esse efeito foi
prolongado até nove DAI (Fig. 2A e 2B). Em raízes de plantas de arroz o aumento
dos níveis de aminoácidos totais ocorre das primeiras oito horas de exposição ao
estresse por anoxia até as 48h, caracterizando-se um mecanismo adaptativo, onde a
alanina é o aminoácido majoritário em raízes nestas condições (REGGIANI et al.,
2000).
I = 0.1851x
2
- 3.1232x + 14.0603
*R
2
= 0,82
C = 0.0455 x
2
- 0.8818x + 9.2312
*R
= 0,75
-5
25
55
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
A
I = -1.7945x
2
+19.5239x -6.5479
*R
2
= 0,78
0
23
45
1
2
3
9
Período de Recuperação (Dias)
//
//
B
I = 0.1150x
2
- 1.8073x + 8.0056
*R
2
= 0,75
C = 0.0539x
2
- 0.9612x + 9.1759
*R
2
= 0,90
-5
25
55
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
C
I = -1.4650x
2
+17.7680x + 0.0231
*R
2
= 0,75
0
23
45
1
2
3
9
Período de Recuperação (Dias)
//
//
D
51
O acúmulo de aminoácidos totais em tecidos de plantas submetidas a
estresse por deficiência do oxigênio é descrito em vários trabalhos (STREETER e
THOMPSON, 1971; BERTANI e BRAMBILLA,1982 e REGGIANI et al., 1985).
A maioria dos estudos conduzidos com plantas nas quais as raízes são
submetidas à deficiência de O
2
tem revelado aumentos nos teores e interconversão
entre os aminoácidos (FAN et al., 1997; REGGIANI et al., 2000). Entre estes a
Alanina (Ala) é fortemente acumulada em respostas à anaerobiose, alcançando 31-
32% da fração de aminoácidos solúveis em arroz, sendo o terceiro principal produto
da fermentação (REGGIANI et al., 1985) e o principal aminoácido transportado e
acumulado em raízes de soja sob deficiência de oxigênio (PUIATTI e SODEK, 1999;
SOUZA e SODEK, 2003; THOMAS et al., 2005).
A interconversão entre aminoácidos auxilia na regulação do pH celular em
órgãos de plantas sob deficiência de O
2
, sendo esta característica considerada
determinante na sobrevivência das espécies à anoxia (STREETER e
THOPMPSON,1972a,b; FAN et al., 1988; REGGIANI et al., 1988; CRAWGORD et
al., 1994; FAN et al., 1997 e REGGIANI, 1999).
No período de recuperação não houve diferença nos teores de aminoácidos
totais em raízes entre cultivares, nem ao longo do tempo de recuperação pós-
hipoxia nas plantas submetidas à inundação (Fig. 2C).
Figura 2 – Teores de aminoácidos totais em raízes de genótipos de soja nodulada,
BRS-153 (A) e BRS-154 (B), submetidos a diferentes períodos de
hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical (C), após nove dias de déficit de
O
2
, sendo (controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05; n=4.
C = -0.0045x
2
+ 0.0762x + -0.3000
*R
2
= 0,91
I = -0.0041x
2
+ 0.0529x -0.0808
*R
2
= 0,73
0.50
1.00
1.50
3
6 9
12
Período de Inundação (Dias
A
C = - 0.0005x
2
+ 0.0160x - 0.14491
*R
2
= 0,45
I = - 0.0064x
2
+ 0.0935x - 0.2708
*R
2
= 0,74
0.50
1.00
1.50
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
B
0.80
0.90
1.00
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Aa
Aa
Aa
Bb
ABa
C
52
*P≤0,05. (C) Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas
entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico
respectivamente; n=4.
A condição de hipoxia causou decréscimo da concentração de aminoácidos
nos nódulos, sugerindo ser este resposta resultante da diminuição de seu
metabolismo (Fig. 3A e 3C). O nódulo é muito mais sensível à disponibilidade de
oxigênio do que as raízes, devido à presença de uma barreira variável à difusão de
oxigênio, que deixa o teor interno de oxigênio praticamente no limite para o
funcionamento eficiente da fixação de N
2
(SODEK, 2001).
Os nódulos da soja podem suportar a inundação até 21 dias (PANKHURST
e SPRENT, 1975; DAKORA e ATKINS, 1989) devido também ao desenvolvimento
de aerênquima e a recuperação parcial do metabolismo do nitrogênio em nódulos do
sistema radical da soja, após um prolongado período de inundação (THOMAS et al.,
2002)
O efeito de diferentes concentrações de O
2
sobre a atividade da nitrogenase
em nódulos de tremoço é atribuído à concentração interna de O
2
no nódulo, sendo o
fator limitante à fixação de N
2
e podendo manter sua atividade nos nódulos sob
condições hipóxicas, caso não seja muito prolongada (GUASH et al., 2001).
No período de retorno à normoxia a quantidade de aminoácidos totais em
nódulos não foram superiores ao seu controle, sugerindo rápida exportação do N
recém fixado, pois, grande parte dos aminoácidos sintetizados nos nódulos da soja
são destinados à produção de ureídeos, que correspondem à cerca de 80 % do N
exportado via xilema (McCLURE e ISRAEL, 1979, McCLURE et al., 1980) (Fig. 3B e
3D).
53
Figura 3 – Teores de aminoácidos totais em nódulos de genótipos de soja, BRS-153
(A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia
e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de déficit de O
2
,
sendo (controle) e (inundado ou recuperação). *P≤0,05; n=4.
*
Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.
A variação do teor de proteínas totais em raízes durante o período de
tratamento hipóxico foi equivalente entre os cultivares avaliados. Nos primeiros três
dias de hipoxia foi verificado um acréscimo da síntese de proteínas totais em raízes,
seguido de decréscimo aos seis e retornando a concentrações superiores ao seu
controle nos demais períodos de tratamento (Fig. 4A). No entanto, em duas
cultivares contrastantes de milho, a cultivar Saracura (tolerante) apresenta teores de
proteína total mais elevada nas raízes que seu controle por até 48h, sugerindo que
2
5
8
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Ca
Cb
Aa
Ab
Ba
Bb
A
4
7
10
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Cb
Ab
Aa
Aa
Ba
Bb
//
//
//
B
2
5
8
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Aa
Ca
Ba
Cb
Bb
Ab
B
4
7
10
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Cb
Ba
Bb
Ba
Ab
//
//
//
D
54
algum mecanismo é acionado, favorecendo a síntese ou protegendo as proteínas da
degradação (LOPES et al., 2005).
Por outro lado, o teor de proteínas no sistema radical da soja nutrida com
nitrato aumenta significativamente após 4 dias de tratamento, tanto em normoxia
como durante a hipoxia. Porém, em condições de hipoxia o aumento é bem mais
expressivo e na recuperação, a concentração de proteínas cai para um valor
próximo aos das plantas sob normoxia (BRANDÃO, 2005).
O estresse anaeróbico induz mudanças tanto no teor quanto no padrão de
proteínas (SACHS et al., 1980). Dessa maneira, geralmente espécies tolerantes ao
déficit de oxigênio conseguem manter o nível protéico, mediante a síntese de
polipepetídeos anaeróbicos, compensando, com isso, a repressão de proteínas
aeróbicas (ZHANG et al., 1994; SACHS et al., 1996).
Figura 4 – Teores de proteínas totais em raízes de genótipos de soja nodulada,
BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia do
sistema radical, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
Em nódulos a resposta das plantas em relação ao acúmulo de proteínas foi
similar ao ocorrido em raízes, não ocorrendo diferenças entre genótipos (Fig. 5A).
Após a drenagem dos vasos, no primeiro dia, houve um decréscimo da
concentração de proteínas totais, atingindo no sexto dia concentrações equivalentes
ao seu controle (Fig. 5B).
I = 0.0131x
2
- 0.2166x + 0.6263
*R
2
= 0,93
C = -0.0097 x
2
+ 0.1623x -0.7959
*R
2
= 0,68
0.0
0.8
1.5
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
A
55
Figura 5 – Teores de proteínas totais em nódulos de genótipos de soja nodulada,
BRS-153 e BRS-154, submetidos a diferentes períodos de hipoxia (A) e
pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O
2
(B), sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey a P≤0,05, para período e regime hídrico respectivamente.
*P≤0,05, n=4.
A atividade da alanina aminotransferase (AlaAT) em raízes foi estimulada
pelo tratamento hipóxico, variando ao longo do período e entre os cultivares
avaliados. Nos primeiros dias de hipoxia houve incremento na atividade da AlaAT
em raízes. O cultivar BRS–153 teve ncremento da atividade no terceiro dia de
inundação, seguido de grande elevação no sexto DAI em relação às plantas sob
normoxia. No entanto, aos nove DAI a atividade decresceu a níveis equivalentes ao
seu controle. Em cevada (GOOD e CROSBY, 1989a) e soja não-nodulada (SOUSA
e SODEK, 2003), também ocorre a máxima atividade da AlaAT aos seis dias de
tratamento. Da mesma forma a atividade da AlaAT em raízes de milho, trigo e
centeio aumenta sob condição de anaerobiose (GOOD e CROSBY, 1989b). O
cultivar BRS-154 também incrementou a partir dos 3 dias DAI, porém, com menor
atividade de AlaAT que em BRS-153, atingindo elevação máxima no sexto dia de
alagamento, e pequeno decréscimo nos tempos posteriores, mas sempre superior
ao seu controle até os 12º dia de inundação (Fig. 6B). A indução de AlaAT em
resposta a condições de baixo teor de oxigênio é constatada também em plantas
milho (MUENCH et al., 1998) e Araibdopsis thaliana (MIYASHITA et al., 2007).
1.0
1.8
2.5
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Aa
Aa
ABa
Ba
Ba
Cb
A
1.2
1.5
1.8
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Ab
Aa
Ba
Aa
Ba
Ca
B
56
Durante o período de pós-hipoxia não houve diferença da atividade da AlaAT
entre os cultivares, mas ocorreu interação entre o tratamento de recuperação e
período, demonstrando no primeiro dia de drenagem, atividade superior ao controle
das plantas previamente submetidas à hipoxia (Fig. 6C).
A atividade da AlaAT em plantas mutantes de Arabidopsis thaliana, com o
intuito de identificar os potenciais benefícios em se alterar a expressão desta enzima
sob hipoxia através do uso de mutantes para a isoforma AlaAT1, buscaram
identificar o papel dessa enzima na produção da alanina, relacionando com a
sobrevivência das plantas ao estresse por hipoxia. Estes pesquisadores sugeriram
que a síntese de alanina independe da atividade da AlaAT, mas que sua atividade é
de extrema importância para a rápida conversão da alanina acumulada a piruvato
durante o período pós-hipóxico (MIYASHITA et al., 2007).
Em cevada a enzima AlaAT é a principal responsável pela produção de
alanina sob condições de hipoxia (MUENCH e GOOD, 1994). As raízes de plantas
de soja nutridas com nitrato, a atividade da AlaAT induzida durante a inundação não
está relacionada com o aumento da síntese de alanina, sendo foi atribuída a função
de reciclar a alanina acumulada no período de drenagem, suge que o papel principal
da enzima ocorre durante o período de recuperação (SOUSA e SODEK, 2003), o
mesmo ocorre em Arabodpsis (MIYASHITA et al., 2007).
Após o primeiro dia de recuperação ao estresse por hipoxia, ocorreu um
decréscimo, chegando ao nono dia com atividade inferior ao controle (Figura 4C).
Em plantas de soja não-noduladas ao retornarem à normoxia depois de 120h de
hipoxia reduz a atividade da AlaAT em 24h, alcançando valores de atividade a níveis
pré-hipóxicos em 96h (SOUSA e SODEK, 2003).
57
Figura 6 – Atividade da enzima alanina aminotransferase em raízes de genótipos de
soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B) sob hipoxia e pós-hipoxia do
sistema radical após nove dias de déficit de O
2
(C), sendo (controle) e
(inundado ou recuperação).
*P≤0,05. (C) Valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas
entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (*P≤0,05), para período e regime hídrico
respectivamente; n=4.
A atividade da AlaAT em nódulos aumentou fortemente com o período de
hipoxia, sendo essa resposta diferenciada entre os genótipos. Dentre os períodos
avaliados, houve incremento na atividade em períodos superiores a três dias de
tratamento, sendo que a atividade da AlaAT no sexto dia de hipoxia foi mantida até o
nono dia de inundação para o genótipo BRS 153. No genótipo BRS 154 ocorreu um
acréscimo de atividade após seis dias de alagamento (Fig. 7A e 7B), diferente da
resposta observada em raízes durante o período de hipoxia. No entanto, no decorrer
do período pós-hipoxia a variação da atividade em nódulos foi similar ao das raízes
(Fig. 7C), não diferindo entre genótipos. A atividade da AlaAT em nódulos foi muito
superior ao encontrado nas raízes, em torno de 120 vezes mais elevadas no período
de inundação e 150 vezes superior no período de recuperação.
I = -0.0201x
2
+ 0.2412x -1.7850
*R
2
= 0,74
C = 0.0224x
2
+ 0.03321x-2.3694
*R
2
= 0,93
0.00
0.10
0.20
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
A
C = -0.0224x
2
+ 0.3311x -2.3706
*R
2
= 0.9461
I = -0.0140x
2
+ 0.2374x - 1.9821
*R
2
= 0,84
0.00
0.10
0.20
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
B
0.00
0.04
0.08
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Bb
Ba
Aa
Aa
Ba
Cb
C
58
Figura 7 – Atividade da enzima alanina aminotransferase em nódulos de genótipos
de soja nodulada BRS-153 (A) e BRS-154 (B), sob hipoxia e pós-hipoxia
do sistema radical após nove dias de déficit de O
2
(C), sendo (controle)
e (inundado ou recuperação).
*Valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (*P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.
3
9
15
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Aa
Ab
Ba
Ab
Aa
Aa
A
3
9
15
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Aa
Ca
Bb
Bb
Aa
Ba
B
3
6
9
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Ab
Ba
Ca
Ba
Ba
C
59
4 CONCLUSÕES
A fixação simbiótica de N
2
é severamente inibida em plantas de soja dos
cultivares BRS-153 e BRS-154 sob alagamento, não sendo possível sua reversão
em níveis do controle via formação de aerênquima durante o período de nove dias
de tratamento, porém é plenamente restabelecida após 24h de drenagem.
A condição de hipoxia estimula fortemente o acúmulo de aminoácidos em
raízes e diminuição em nódulos.
A deficiência de oxigênio causa o aumento do teor de proteínas em raízes e
nódulos nos primeiros dias de alagamento nos genótipos BRS-153 e BRS-154, de
forma equivalente.
A atividade da enzima alanina aminotransferase é estimulada pelo
tratamento hipóxico em raízes e nódulos de soja dependendo do N fixado
simbioticamente, sendo bem mais intensa em nódulos e dependente de genótipos.
60
CAPÍTULO III
ATIVIDADE DA ENZIMA ÁLCOOL DESIDROGENASE E ALOCAÇÃO DE
CARBOIDRATOS NAS RAÍZES DE SOJA NODULADA DURANTE PERÍODO DE
HIPOXIA E RETORNO À NORMOXIA
61
1 INTRODUÇÃO
Na natureza as plantas são constantemente expostas a condições
ambientais desfavoráveis ao seu desenvolvimento. A deficiência de oxigênio
ocasionada por inundações temporárias devido a chuvas e irrigações pode-se tornar
freqüente em regiões de solos hidromórficos, também conhecidos como solos de
várzea, onde a drenagem é deficiente. Sua principal característica é o relevo
predominantemente plano e com freqüência associado a um perfil de camada
superficial pouco profunda e seguida de uma praticamente impermeável (PINTO et
al., 1999). A condição de hipoxia nesses ambientes impõe severas restrições ao
cultivo de espécies de importância econômica, uma vez que a maioria daquelas que
produzem grãos são mesófitas (PIRES et al., 2002). Neste contexto, enquadra-se a
cultura da soja, que, embora introduzida e melhorada para áreas bem drenadas no
Brasil, é uma espécie originária de áreas alagadiças do norte da China (EVANS,
1996), porém com variabilidade genética para tolerar o excesso de umidade no solo
(VAN TOAI et al., 1994; THOMAS et al., 2000; PIRES et al., 2002).
O déficit de O
2
causado pelo excesso hídrico causa a repressão da síntese
de polipeptídios aeróbicos e a indução da síntese de polipeptídios anaeróbicos
(SACHS et al., 1980), sendo a maioria desses polipeptídios identificada como
enzimas envolvidas na fermentação e metabolismo de açúcares-fosfatados, cuja
síntese é regulada em nível de transcrição e de pós-transcrição (DREW, 1997). O
oxigênio serve como aceptor de elétrons na fosforilação oxidativa que regenera o
ATP, principal fonte de energia para o metabolismo aeróbico celular e na sua
ausência, o metabolismo fermentativo é ativado com o propósito de manter a
produção de energia e agentes redutores através da regeneração do NAD
+
(DENNIS
62
et al, 2000), que junto à alocação de açúcares tem função crucial na sobrevivência
de plantas sob anoxia (BOUNY e SAGLIO, 1996; DREW, 1997).
Durante o alagamento, a enzima lactato desidrogenase (LDH;EC) é ativada
produzindo lactato. Em estudos com ressonância magnética foi mostrado que o pH
citosólico acidifica-se durante o alagamento em raízes de milho (FOX et al, 1995). O
acúmulo do piruvato que iria ser metabolizada no ciclo de Krebs, induz a ativação da
lactato desidrogenase (LDH) produzindo lactato e o seu acúmulo vai reduzir o pH do
citossol de 7,2 a 6,8 e com o citossol mais ácido, a LDH é inibida e a enzima
piruvato descarboxilase (PDC) ativada produzindo acetaldeído que por sua vez é
extremamente reativo a membranas, sendo convertido pela álcool desidrogenase
(ADH) em etanol, principal produto da fermentação (DREW, 1997; HOLE et al.,1992;
SERRES, 2008 e TADEGE et al., 1999). Plantas que são mais tolerantes ao
alagamento têm a via de fermentação alcoólica mais ativa (DREW, 1997).
A enzima álcool desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1) é uma das principais
enzimas fermentativas, que converte o acetaldeído em etanol, considerado menos
tóxico à planta por não causar danos à bicamada lipídica das membranas celulares
e por ser permeável, sendo translocado para fora da célula até a rizosfera. A
adaptação às condições de falta de oxigênio não requer somente um rápido
aumento nos níveis de enzimas da rota fermentativa, uma vez que a tolerância está
relacionada à capacidade de sustentar a fermentação sob períodos prolongados de
escassez de O
2
(BOUNY e SAGLIO, 1996; CHANG et al., 2000).
Embora a maioria dos estudos são focados sobre os efeitos bioquímicos e
fisiológicos da hipoxia em relação à recuperação pós-hipoxia, o entendimento de
como os tecidos vegetais recuperam-se da deficiência de O
2
é igualmente
importante para o entendimento da tolerância ao alagamento (FAN et al., 1988).
O objetivo deste trabalho foi analisar a alocação de carboidratos, junto à
atividade da enzima álcool desidrogenase no sistema de raízes de genótipos de soja
nodulada em condições de déficit de O
2
e retorno às condições normais de
disponibilidade de O
2.
63
2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em casa de vegetação da Embrapa Clima
Temperado – Estação Experimental Terras Baixas, situada no município do Capão
do Leão, RS, entre dezembro de 2006 e março de 2007. Sementes de soja [(Glycine
max (L.) Merril)] dos cultivares BRS-154 (tolerante) e BRS-153 (suscetível) foram
semeadas em vasos de polietilieno furados, de três litros (5 sementes), contendo
vermiculita como substrato. Duas inoculações das plântulas com Bradyrhizobium
elkanii, estirpe SEMIA 587, fornecida pela FEPAGRO e reproduzida no
DMP/IB/UFPel. Foram efetuadas aos 14 e 21 dias após a emergência,
respectivamente nos estádios VC e R2 da classificação de FEHR et al. (1971),
constituindo na pipetagem de 2,5mL de meio líquido de NORIS e DATE (1976) ao
redor da plântula. No estádio V0 foi efetuado o desbaste deixando duas plantas por
vaso. A partir da queda dos cotilédones e até o final do experimento, as plantas
foram nutridas com solução de Hoagland e Arnon (1938) sem nitrogênio mineral, na
proporção de 250 mL vaso
-1
, duas vezes por semana e irrigado com água sempre
que necessário. A partir da queda dos cotilédones e até o final do experimento, as
plantas foram nutridas com solução de Hoagland e Arnon (1938) sem nitrogênio
mineral, na proporção de 250 mL vaso
-1
, duas vezes por semana.
No estádio de desenvolvimento R2 - flor no nó imediatamente abaixo do nó
mais alto com uma folha completamente desenrolada (FEHR et al.,1971) – foi
efetuada a inundação do sistema radical, submetendo as raízes à deficiência de O
2
.
Para tal a drenagem natural dos vasos por meio do encaixe do vaso contendo as
plantas em um outro, de mesmo modelo e não perfurado e irrigando com uma
solução nutritiva Hoagland diluída a 1/3 da concentração original, de forma a se
manter uma lâmina de 20mm sobre a superfície do substrato. O teor de O
2
foi
64
monitorado na solução nutritiva e na solução drenada dos vasos por meio de um
oxímetro (Handylab OX1).
Os vasos dos experimentos de inundação e de recuperação foram
inundados simultaneamente e as coletas de raízes e nódulos para determinações
analíticas foram realizadas aos 3, 6, 9 e 12 dias após a inundação (DAI). Aqueles
destinados à avaliação de recuperação foram drenados no 9º DAI e o material
vegetal foi coletado no 1º, 2º, 3º e 9º dia após a drenagem (DAD).
As amostras foram coletadas do terço inferior do sistema radical, duas
amostras de 2g de raízes e duas amostras de nódulos, uma de 1g e outra de 0,5g e
foram lavadas com água destilada gelada para diminuir a atividade do metabolismo
do tecido. Após retirar o excesso de água com papel toalha, foram armazenadas sob
temperatura de aproximadamente -86 ºC, para posterior determinação da atividade
de ADH e das concentrações de sacarose, açúcares solúveis totais, polissacarídeos
solúveis em água e amido.
A extração da ADH foi realizada conforme descrito por Good e Crosby
(1989), com algumas modificações, e a dosagem com base na metodologia de Kato-
Noguchi e Watada (1997). A extração de ADH a partir de tecidos de raízes e nódulos
realizada a temperatura de 4 ºC, iniciada com a maceração das amostras em
almofariz e pistilo previamente resfriados. Foi adicionado cerca de 100mL de
nitrogênio (N
2
) líquido apenas nas amostras de raízes para facilitar a maceração,
seguido de PVPP (5% MF) e 5mL de tampão extração tris-HCl 50mM – pH 7,5,
contendo DTT 1mM para nódulos (0,5 g) e 10mL, do mesmo tampão para raízes
(2g). Após homogeneização, as amostras foram filtradas em 8 camadas de gaze
umedecidas com tampão de extração e centrifugadas a 10.000g, sob temperatura
oscilando entre 2 e 4 ºC por 20min. Do sobrenadante centrifugado foi retirado uma
alíquota de 2,5mL para dessalinização por cromatografia de exclusão em coluna de
sephadex G-25 M (PD-10), conforme instruções do fabricante (Amersham
Pharmacia Biotech) (Fig. 1).
Os tecidos destinados à extração de metabólitos foram inicialmente imersos
em N
2
líquido, macerados em almofariz com auxílio de pistilo e em seguida
transferidos para vidros âmbar
, onde foi adicionado 20mL de MCW
(metanol:clorofórmio:água; proporção de 12:5:3) em cada frasco (BIELESKI e
TUNER, 1966) e homogeneizados, permanecendo em repouso por 24h. Decorrido
65
esse tempo, as amostras foram centrifugadas a 2000rpm por 30min. A fração do
sobrenadante foi recuperada em proveta e para cada 4mL, acrescentou-se 1,0mL de
clorofórmio e 1,5mL de água Milli-Q, seguido de agitação e posterior repouso por
mais 24h para a separação das fases. A fase aquosa (superior) foi coletada e
evaporada em banho-maria a 38,8ºC por 15h para eliminação do resíduo de
clorofórmio e concentração das amostras. A fase clorofórmica (inferior) foi
descartada. As amostras concentradas foram armazenadas em tubos de Eppendorf
sob temperatura de
- 18ºC até a dosagem de sacarose e açúcares solúveis em
água. Os precipitados foram resuspensos em 10mL de ácido tricloroacético (TCA)
10% (p/v) e após, homogeneizados em vórtex e deixados em repouso por 24h. Após
esse período, foram centrifugados a 2000rpm por 30min. Os sobrenadantes foram
coletados e armazenados a - 20ºC para posterior dosagem de polissacarídeos
solúveis em água. Os precipitados obtidos desta centrifugação foram destinados à
extração do amido. Cada pélete foi ressuspenso em 10mL de ácido perclórico (PCA)
30%(v/v) e deixado sob agitação contínua por 30min em agitador orbital, para
digestão do amido, com posterior centrifugação a 2000rpm por 30min (Fig. 2).
A dosagem da atividade da enzima ADH (EC 1.1.1.1) foi realizada no sentido
da formação do etanol (acetaldeído → ADH→ Etanol), no qual o meio de reação
com volume final de 3000µL, foi composto pelo extrato enzimático previamente
dessalinizado em coluna sephadex G-25 M,
β-NADH (0,2mM), tampão de dosagem
(Tris-HCl 50mM pH 7,5) e acetaldeído ( 5mM). Os ensaios foram conduzidos em
cubetas descartáveis de 4mL de metil-metacrilato. As cubetas contendo o meio de
reação sem acetaldeído foram previamente incubadas no sistema de aquecimento
Peltier, sob 30ºC. A reação era iniciada pela adição de extrato dessalinizado e de
acetaldeído ao meio de reação, a qual foi registrada pela queda de absorbância a
340nm, correspondendo à oxidação de NADH. As leituras foram registradas em
intervalos de 30s, por um período de 10min, conforme previamente estabelecido em
ensaios para a determinação do intervalo de tempo e volume de extrato necessários
à linearidade da reação (BADINELLI et al., 2006).
Os teores de sacarose foram determinados de acordo com o método
proposto por Handel (1986). Alíquotas de 100µL de amostras, padrões (20-150µg de
sacarose) e branco foram pipetadas em tubos de ensaio e em seguida adicionado
100µL de KOH 30%, em solução aquosa por tubo. Os tubos foram tapados com
66
bolas de vidro e incubados em banho-maria sob temperatura de 100 ºC/10min. Após
atingirem temperatura ambiente, foi adicionado 3mL do reagente de antrona
(antrona 0,15% em H
2
SO
4
70%) por tubo, sendo agitados e novamente incubados
em banho-maria a 40 ºC/15min. Após alcançar temperatura ambiente foram
registradas as densidades ópticas a 620nm, das amostras contra o branco.
As dosagens dos teores de açúcares solúveis totais (AST), de
polissacarídeos solúveis totais (WSP) e de amido foram realizadas com base na
metodologia descrita por Grahmam e Smydzuk (1965). Alíquotas de 1mL de cada
amostra, devidamente diluídas, e de um branco e padrões (15-200µg de glicose/mL),
foram pipetadas em tubos de ensaio previamente aclimatados em banho de gelo.
Em seguida, foi adicionado 3mL de solução de antrona resfriada (0,15% em H
2
SO
4
70%) por tubo. Os tubos foram imediatamente tapados com bolas de vidro e, após
15min de incubação, agitados e levados a banho-maria a temperatura de 90
ºC/20min. Posteriormente foram transferidos para ambiente sem luz até atingirem
temperatura ambiente, quando foram agitados e então, realizadas as leituras da
densidade óptica (D.O.) a 620nm, contra um branco. Os teores de amido foram
determinados multiplicando os valores obtidos pelo fator de correção 0,9
(McCREADY et al., 1960).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema
fatorial 2 x 2 x 4 para experimento com inundação (genótipos x tratamento hipóxico x
tempo) e 2 x 2 x 3 para experimento com recuperação (genótipos x tratamento pós-
hipoxia x tempo), com quatro repetições. A unidade experimental composta por duas
plantas por vaso, após análise de variância foi ajustado equações de regressão para
os dados provenientes do experimento de inundação. Quando não houve ajuste, as
médias foram comparadas pelo teste de médias de Tukey, a 5% de probabilidade.
Este procedimento foi adotado para análise das médias obtidas no experimento de
recuperação.
67
Figura 1 - Fluxograma da extração Álcool desidrogenase e Alanina
aminotransferase.
68
Figura 2 – Fluxograma da extração de metabólitos, sendo TCA (ácido tricloro
acético), MCW (metanol : clorofórmio : água), WSP (polissacarídeos
solúveis totais) e PCA (ácido perclórico).
69
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os teores de oxigênio na solução nutritiva aplicada para inundar as plantas
oscilaram entre 84 e 96% de O
2
, decrescendo para valores entre 7 e 13% na
solução drenada dos vasos, registrados 24h após início do tratamento de inundação,
permanecendo nesse intervalo no decorrer do experimento de inundação,
caracterizando a baixa disponibilidade de oxigênio no sistema em estudo.
Durante o período de inundação, a atividade da enzima álcool
desidrogenase (ADH) aumentou nas raízes do cultivar BRS-153 no terceiro dia de
exposição ao déficit hídrico, atingindo o máximo aos nove DAÍ, e valores próximos
ao do controle aos 12 DAI (Fig. 3A). Esta queda abrupta da atividade possivelmente
esteja relacionada ao estádio avançado de degradação do tecido das raízes,
observado durante as coletas. Razão pela qual não foi possível avaliar a atividade
da ADH nos nódulos, pois estavam em estado avançado de senescência ou
desprendidos do sistema radical. O genótipo BRS-154 teve atividade da ADH similar
ao genótipo BRS-153 nos primeiros períodos de inundação, porém a atividade da
ADH atingiu maiores valores no sexto dia de inundação, reduzindo somente após o
nono DAI, permanecendo ainda com sua atividade bem superior ao controle até o
final do experimento (Fig. 3C). A desidrogenase alcoólica (ADH) que catalisa a
redução do acetaldeído tóxico a etanol, é transcricionalmente induzida em hipoxia e
anoxia (PREISZNER at al., 2001). Em raízes de milho ocorre aumento de 50 vezes
no mRNA dessa enzima, após 5 a 8h de hipoxia (GERLACH et al., 1982).
O aumento na atividade da ADH em função da deficiência de oxigênio
permite reciclar o NAD
+
de maneira a manter a via glicolítica ativa (BLOKHINA et al.,
2003; TADEGE et al., 1999). Dessa forma, a produção de ATP durante a
permanência das plantas nessas condições está relacionada à capacidade das
70
mesmas em manter essa rota por períodos mais prolongados, embora essa possa
ser uma característica do cultivar estudado, tendo em vista que certos cultivares de
soja, sob hipóxia, não aumentam a atividade da enzima ADH, que converte
acetaldeído em etanol (KENNEDY et al, 1992).
Os dois cultivares de soja tiveram tendências similares no que tange a
atividade da ADH nas raízes, durante o período de inundação (Fig. 3A e 3C), mas
diferiram estatisticamente no período de recuperação pós-hipoxia (Fig. 3B e 3D). Em
relação ao período de inundação, a atividade da ADH foi reduzida substancialmente
já no primeiro dia após drenagem (DAD), com valores aproximadamente quatro
vezes menores do que os das plantas aos nove DAI. No entanto, a condição de
normoxia não foi suficiente para reverter a atividade da ADH a níveis equivalentes
ao controle, mesmo nove dias após drenagem, mostrando valores significativamente
elevados em relação ao controle em ambos os genótipos. Porém, o genótipo BRS-
154 teve redução significativa da atividade da ADH aos nove DAI em relação ao
primeiro dia de recuperação (Fig. 3D), sugerindo melhor recuperação do estresse
hipóxico em relação ao genótipo BRS-153 (Fig. 3B).
71
Figura 3 – Atividade da enzima álcool desidrogenase em raízes de genótipos de soja
nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes
períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical, após nove dias de
déficit de O
2,
sendo (controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05; n=4.
*P≤0,05. (B e D) Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime
hídrico respectivamente; n=4.
A atividade da ADH em tecidos nodulares foi semelhante ao das em raízes,
porém significativamente maior que o controle desde o primeiro DAI, em ambos os
genótipos. A atividade aumentou com o tempo de inundação, sendo esta resposta
distinta entre os genótipos BRS-153 e BRS-154, com maior atividade aos nove e
seis DAI, respectivamente (Fig. 4A e 4C). As maiores atividades da ADH nos
nódulos registradas durante a inundação das plantas foram aproximadamente dez
A
I = - 0.0629x
2
+ 0.8328x -1.9711
*R
2
= 0,93
C = 0.0108x
2
+ 0.1765x -1.8833
*R
2
= 0,72
0
3
6
3
6
9
12
Periodo de Inundaç
ão (Dias)
B
0.0
0.7
1.4
1
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
Aa
Ab
Ba
ABb
Aa
Bb
/
//
//
C
C = -0.0053x
2
+ 0.0978x -
1.6385
*R
2
= 0,81
I = - 0.0190x
2
+ 03164x -0.6309
*R
2
= 0,88
0
3
6
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
D
0.0
0.7
1.4
1
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
Aa
Ab
Ca
Ba
Ab
Ab
//
//
//
72
vezes maiores que as máximas obtidas nas raízes, evidenciando maior atividade
fermentativa nesse órgão.
Em arroz, os cultivares tolerantes à anoxia FR13A e Calrose, possuem altas
taxas de fermentação etanólica em relação aos que são intolerantes, IR22 e IR42
(SETTER et al., 1994). O aumento da taxa de fermentação alcoólica em arroz
quando submerso aumenta sua sobrevivência nessa condição (QUIMIO et al.,
2000).
Durante o primeiro dia de recuperação pós-hipoxia, a atividade da ADH
aumentou grandemente em relação à registrada aos nove DAI, período de
drenagem. Este efeito foi mais acentuado para o genótipo BRS-154, embora
atividades mais elevadas foram registradas em BRS-153. Com o decorrer do
período após drenagem, a atividade da ADH decresceu, atingindo valores
equivalentes ao controle aos 9 DAD (Fig. 4B e 4D). O retorno das plantas às
condições normais de O
2
, após três dias de alagamento,
promove a restauração do
metabolismo aeróbico e a conseqüente redução na atividade de enzimas
fermentativas, no entanto em milho cv. BRS – 4154, 30min de re-aeração não foram
suficientes para o completo restabelecimento da via aeróbica, uma vez que a
atividade da enzima não atingiu o nível do controle (FRIES, 2003).
O período inicial da recuperação após o estresse por falta de oxigênio pode
ser crucial para a sobrevivência das plantas. Apesar da maioria das injúrias
acontecerem durante o período de estresse, danos também ocorrem no retorno das
plantas às condições normais de oxigênio (VAN TOAI & BOLLES, 1991), ocorrendo,
também, a formação de espécies reativas de oxigênio e de produtos oxidativos
tóxicos, como acetaldeído (CRAWFORD, 1992) que é produzido pela ADH ou
catalase, após a re-aeração (ZUCKERMANN et al., 1997).
A catalase
provavelmente oxida o etanol por meio da redução de H
2
O
2
que é produzido durante
a re-aeração (MONK et al., 1987; PAVELIC et al., 2000).
É possível que os mecanismos de tolerância induzidos por um pré-
tratamento hipóxico sejam mais eficazes após o retorno às condições aeradas que
durante o próprio período de estresse (ELLIS et al., 1999). Também, a re-exposição
das plantas ao ar pode gerar radicais superóxidos e o sucesso do retorno se deve à
ação das enzimas superóxido dismutase, catalases, peroxidases e à presença de
antioxidantes naturais, como a glutationa e o ácido ascórbico (ALBRECHT e
73
WIEDENROTH, 1994).
Ainda, a oxidação de acetaldeído a acetato pela enzima
acetaldeído desidrogenase torna possível a sua metabolização durante o período
pós-hipoxia, aliviando o estresse causado pelo acetaldeído (TSUJI et al., 2003).
Figura 4 – Atividade da enzima álcool desidrogenase em nódulos de genótipos de
soja, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes
períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de
déficit de O
2
, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05. (B e D); Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime
hídrico respectivamente; n=4.
O tratamento de inundação causou um grande incremento da
concentração de sacarose em raízes, no terceiro dia de tratamento, aumentando no
sexto dia e decrescendo nos períodos posteriores, resultando em teores abaixo do
controle no 12 DAI. Essa resposta ocorreu nos dois genótipos testados, porém foi
A
0
25
50
3
6
9
Periodo de Inundação (Dias)
Aa
Ba
Bb
Ba
Bb
B
0
45
90
1
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
Aa
Ba
Ca
Ab
Ab
Ba
//
//
//
C
0
25
50
3
6
9
Periodo de Inundação (Dias)
Aa
Ab
Bb
Ba
Ba
B
Ab
D
0
45
90
1
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
Ab
Aa
Ba
Ca
ABb
Ba
//
//
//
74
mais expressiva no genótipo BRS-153 (Fig. 5A e 5C). Baixas concentrações de O
2
promovem aumento nos teores de sacarose em ápices de raízes de cevada e arroz
(LIMPINUNTANA e GREENWAY, 1979). Do mesmo modo, ocorre maior taxa
respiratória no genótipo de trigo sensível ao alagamento e maior concentração de
sacarose no genótipo tolerante (HUANG e JOHNSON, 1995), sugerindo que a
combinação entre a redução na respiração das raízes e os altos níveis de sacarose
são responsáveis pela tolerância das plantas à condição de hipoxia.
Aumento no conteúdo de sacarose de quase três vezes durante os nove
dias de inundação em raízes de cana-de-açúcar (INDRA DENI e SUGI HARTO,
2001) sustentam os resultados obtidos neste trabalho.
Durante o período de recuperação, a concentração de sacarose em
raízes aumentou grandemente no primeiro dia. Em seguida houve diminuição,
chegando ao terceiro dia de tratamento a teores próximos aos das plantas controle e
inferiores aos nove DAI (Fig. 5B e 5D), evidenciando com isso sua utilização em
função da retomada do metabolismo aeróbico. Ainda em plantas de milho a
sacarose é a principal fonte de carbono sob privação de O
2,
logo disponibilidade de
sacarose pode contribuir para a adaptação de plântulas sob anaerobiose (RICARD
et al., 1998).
75
Figura 5 – Teores de sacarose em raízes de genótipos de soja nodulada, BRS-153
(A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e
pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O
2
, sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05 (B e D); Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime
hídrico respectivamente; n=4.
A concentração de sacarose em nódulos foi influenciada positivamente pelo
tratamento hipóxico, semelhante ao obtido em raízes. Houve um acréscimo no
terceiro dia de inundação, elevando significativamente no sexto dia de hipoxia e
reduzindo a concentração da sacarose drasticamente aos 9 DAI. Essa resposta foi
mais acentuada para o genótipo BRS-153, onde aos 9 DAI, os teores decresceram a
níveis inferiores ao controle (Fig. 6A e 6 C).
No primeiro dia de retorno às condições de normoxia, ocorreu uma
diminuição do teor de sacarose nos tecidos nodulares do genótipo BRS-153,
A
C = 0.0072x
2
-0.0653x +1.8303
*R
2
= 0,99
I = -0.0150x
2
+ 0.1385 x + 2.0928
*R
2
= 0,98
0
150
300
3
6
9
12
Período de Inundação (Dias)
B
50
150
250
350
1
3
9
Periodo de Recuperação (Dias)
Ab
Aa
Aa
Ba
Ba
Cb
//
//
//
C
C = 0.0164x
2
-0.2393x + 2.5973
*R
2
= 0,87
I = -0.0119x
2
+ 0.1006x + 2.0873
*R
2
= 0,95
0
150
300
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
D
50
150
250
350
1
3 9
Periodo de Recuperação (Dias)
Aa
Bb
Aa
Ba
Ba
Cb
//
//
//
76
permanecendo inferior ao seu controle por todo o período de recuperação, sugerindo
um grande consumo desse açúcar pela respiração aeróbica. De forma diferenciada,
em BRS-154 ocorreu um acréscimo da concentração de sacarose no primeiro DAD,
seguido de diminuição no terceiro dia de recuperação, atingindo níveis
significativamente menores do que o controle, permanecendo assim até o fim do
experimento. Este efeito foi mais intenso para o genótipo BRS-153 (Fig. 6B e 6 D).
Figura 6 – Teores de sacarose em nódulos de genótipos de soja, BRS-153 (A e B) e
BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e pós-
hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O
2
(B e D), sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente;
n=4.
A deficiência de O
2
refletiu em aumento da produção de açúcares solúveis
totais em raízes, sendo obtidos teores muito elevados em relação às plantas sob
normoxia, no terceiro e sexto dia de inundação, especialmente no genótipo BRS-153
A
0
200
400
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Ba
Bb
Aa
Cb
Cb
Aa
B
0
150
300
1
3 9
Período de Recuperação (Dias)
Ba
Ab
Aa
Bb
Cb
Aa
//
//
//
C
0
200
400
3
6
9
Periodo de Inundação (Dias)
Bb
Ba
Cb
Aa
ABa
Aa
D
0
150
300
1
3
9
Período de Recuperação
(
Dias
)
Bb
Ba
Cb
Bb
Aa
Aa
//
//
//
77
(Fig. 7A e 7C). Por outro lado, a translocação de açúcares solúveis das folhas para
as raízes é bastante afetada pelo alagamento, e, drasticamente reduzida em
numerosas espécies não-tolerantes (KOZLOWSKI e PALLARDY, 1984; PEZESHKI,
1994; KOZLOWSKI, 1997). Em plantas jovens de Bactris gasipaes Kunth, durante o
tratamento de anoxia, aumenta os teores de açúcares solúveis nas raízes
(CARVALHO, 2002). Em muitos trabalhos, o acúmulo de açúcares solúveis em
raízes de plantas sob alagamento é descrito como forma de tolerância a esse
estresse (LIAO e LIN, 2001). O aumento de açúcares solúveis observado no início
do período de estresse por deficiência hídrica ocorre por causa da paralisação do
crescimento e certa manutenção da atividade fotossintética e com o avanço desse
período, devido à hidrólise de amido (McCREE et al. 1984; PIMENTEL e
ROSSIELO, 1995;), semelhante aos resultados obtidos por excesso hídrico neste
trabalho.
Após seis dias de tratamento hipóxico, os teores de AST foram diminuindo
até atingirem concentrações equivalentes aos seus respectivos controles (Fig. 7A e
7C), possivelmente devido à elevada atividade respiratória sob hipoxia, evidenciada
pela grande atividade da ADH em raízes nesse período (Fig. 3A e 3C).
Durante o período de recuperação, o teor de AST nas raízes foi muito
superior ao controle no primeiro dia de drenagem dos vasos em ambos os
genótipos, e tendeu a se equivaler aos teores pré-hipóxicos, a medida em que as
plantas se recuperaram dos efeitos do estresse (Fig. 7B e 7D). A diminuição de AST
com o aumento do período de drenagem, provavelmente esteja relacionada à maior
atividade metabólica da planta sob normoxia, estimulando o processo respiratório
aeróbico e a utilização de esqueletos carbônicos produzidos para retomada do
crescimento.
78
Figura 7 – Teores de açúcares solúveis totais em raízes de genótipos de soja
nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a diferentes
períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radicular após nove dias de
déficit de O
2
, sendo (controle) e (inundado ou recuperação).
*P≤0,05 (B e D); Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime
hídrico respectivamente; n=4.
A variação dos teores de AST em nódulos durante o período de inundação
foi semelhante em ambos os cultivares, não havendo influência do fator genótipo. No
entanto, em relação ao efeito do tratamento de inundação nessa variável, produziu
uma diminuição no terceiro DAI em relação às plantas controle, com posterior
elevação significativa aos seis dias e grande decréscimo aos nove dias de
tratamento (Fig. 8A). Sob drenagem, os genótipos diferiram na resposta à
recuperação dos teores de AST. Acompanhando o decréscimo aos nove DAI,
A
I = -0.1821x
2
+ 1.3879x + 2.145
*R
2
= 0,96
C = -0.0091 x
2
+ 0.0538x + 2.5435
*R
2
= 0,83
0
260
520
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
B
50
150
250
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Ab
Ab
Aa
Bb
Aa
//
//
//
C
I = -0.0086x
2
+ 0.0786x +2.3509
*R
2
= 0,89
C = -0.0009x
2
+ -0.0105x + 2.3662
*R
2
= 0,75
0
260
520
3
6
9
12
Periodo de Inundação (Dias)
D
50
150
250
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Bb
Aa
Aa
Ba
Cb
//
//
//
79
mesmo após o retorno à condição aeróbica, as plantas tiveram dificuldade em
retomar os níveis iniciais equivalentes aos seus respectivos controles. Embora para
o genótipo BRS-154 os teores foram equivalentes ao controle no primeiro DAD, com
o avanço do período de drenagem ficaram inferiores, sendo este efeito menos
intenso quando comparado ao genótipo BRS-153 (Fig. 8B e 8C). Os teores de AST
inferiores aos obtidos no controle, sugerem maior respiração e consumo de
carboidratos na retomada da fixação e reconstituição dos tecidos e órgãos
prejudicados pela anaerobiose.
Figura 8 – Teores de açúcares solúveis totais em nódulos de genótipos de soja,
BRS-153 (B) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de hipoxia
(A) e pós-hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O
2
(B e
C), sendo (controle) e (inundado ou recuperação).
*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.
Os teores de polissacarídeos solúveis em água (WSP) em tecidos das raízes
de ambos os genótipos aumentaram significativamente com o tratamento hipóxico,
demonstrando ser uma resposta comum de raízes sob deficiência de O
2
. Aos três
dias de inundação houve elevação significativa em WSP em relação ao controle,
intensificando esse efeito com o decorrer do tempo de inundação. No genótipo BRS
-153 o maior acréscimo foi obtido no sexto dia, enquanto que para o genótipo BRS -
154 aos nove dias de tratamento. Com o aumento do período de inundação os
teores de WSP diminuíram drasticamente em ambos os genótipos, atingindo valores
A
300
650
1000
3
6
9
Periodo de Inundação (Dias)
Aa
Aa
Ca
Cb
Bb
Bb
B
250
750
1250
1750
2250
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Cb
Ba
Bb
Ba
Ab
//
//
//
C
250
750
1250
1750
2250
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Aa
Cb
Ba
Ba
Ba
Ab
//
//
//
80
inferiores aos das plantas controle em BRS-153 ou equivalente, em BRS-154 (Fig.
9A e 9C).
O aumento do WSP é atribuído a um decréscimo da hidrólise, o mesmo
efeito regulatório, em que o incremento da concentração de açucares solúveis induz
ao aumento na síntese de amido (BARTA, 1987). Entretanto, em raízes de soja
nutrida com nitrato sob hipoxia ocorre um aumento das concentrações de WSP,
antes do incremento dos açúcares solúveis em água (SOUSA e SODEK, 2002),
diferentemente dos resultados obtidos neste trabalho em que houve aumentos
concomitantes destes carboidratos.
Durante o período após drenagem, foi observada resposta diferenciada entre
os genótipos para a variável WST. No primeiro dia de recuperação ao estresse
hipóxico o genótipo BRS – 153 teve acréscimo muito superior ao seu controle, sendo
essa resposta bem menos expressiva em BRS-154. No terceiro dia de recuperação,
houve diminuição significativa em BRS-153 e grande aumento em BRS-154 e aos 12
DAD, os teores aproximaram-se aos das plantas controle em ambos os cultivares,
embora significativamente mais baixos (Fig. 9B e 9D).
81
Figura 9 – Teores de polissacarídeos solúveis em água de raízes de genótipos de
soja nodulada, BRS-153 (A e B) e BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical após nove
dias de déficit de O
2
, sendo (controle) (inundado ou recuperação).
*P≤0,05 (B e D); Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras
minúsculas entre linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime
hídrico respectivamente; n=4.
Por outro lado, em tecidos nodulares, a produção de polissacarídeos
solúveis em água foi bem diferente do obtido em raízes, pois ambos os genótipos
tiveram decréscimos nos teores de WSP durante o período de inundação (Fig. 10A e
10C), sendo mais acentuado no genótipo BRS-154. Durante a drenagem das
plantas, os teores de WSP de ambos genótipos, não superaram os valores de seus
A
I =-0.0222x
2
+0.3023x-1.6690
*R
2
= 0,97
C = -0.0088x
2
+0.1496x -
1.5808
*R
2
= 0,89
0.00
0.15
0.30
3
6
9
12
Período de Inundação
(
Dias
)
B
0.00
0.15
0.30
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Bb
Aa
Aa
Aa
Bb
Cb
//
//
//
C
I = -0.0139x
2
+ 0.1907x -1.4008
*R
2
= 0,82
C = -0.0011x
2
+ 0.0149x -
1.1220
*R
2
= 0,05
0.00
0.15
0.30
3
6
9
12
Período de Inundação
(
Dias
)
D
0.00
0.15
0.30
1
3
9
Período de Recuperação
(
Dias
)
Aa
Aa
Cb
Bb
Bb
Ba
//
//
//
82
respectivos controles (Fig. 10B e 10D), sugerindo um redirecionamento do
metabolismo de carboidratos para síntese de outros compostos essenciais.
Figura 10 – Teores de polissacarídeos solúveis em água em nódulos de genótipos
de soja nodulada, BRS-153(A e B) BRS-154 (C e D), submetidos a
diferentes períodos de hipoxia e pós-hipoxia do sistema radical após nove
dias de déficit de O
2,
sendo (controle) (inundado ou recuperação).
*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.
Os teores de amido nos nódulos foram reduzidos significativamente ao longo
de todo o tratamento hipóxico, ocorrendo diferença de teores entre genótipos. A
inundação causou maior redução em BRS-154, porém a tendência em atingir teores
próximos ao controle foi mais evidente que em BRS-153 (Fig. 11A e 11C). A grande
diminuição do teor de amido especialmente nos períodos iniciais de inundação pode
A
0.02
0.05
0.08
3
6
9
Período de Inundação
(
Dias
)
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Ab
B
0.02
0.05
0.08
1
3
9
Período de Recuperação
(
Dias
)
Ba
Ba
Aa
Ab
Bb
Ab
//
//
//
C
0.02
0.05
0.08
3
6
9
Período de Inundação
(
Dias
)
Ba
Ba
Aa
Bb
Ab
Bb
D
0.02
0.05
0.08
1
3
9
Período de Recuperação
(
Dias
)
Aa
ABa
Aa
Ab
Ba
Ab
//
//
//
83
estar relacionada ao acúmulo de sacarose, evidenciada no sexto dia de tratamento
hipóxico em ambos os genótipos (Fig. 6A e 6C). O aumento da concentração de
amido nos demais tempos de inundação podem indicar a sua menor degradação
devido à inibição da α-amilase, (PERATA et al., 1993). A variação dos teores de
amido em nódulos durante o tratamento de recuperação foi semelhante em ambos
os genótipos, porém inferior aos das plantas mantidas sob normoxia, incrementando
ao longo do período de recuperação e atingindo teores próximos ao controle aos
nove dias de tratamento (Fig. 11B).
Figura 11 – Teores de amido em nódulos de genótipos de soja nodulada, BRS-153
(A) e BRS-154 (C), submetidos a diferentes períodos de hipoxia e pós-
hipoxia do sistema radical após nove dias de déficit de O
2,
sendo
(controle) e (inundado ou recuperação).
*Os valores de médias, seguidos da mesma letra maiúscula na linha e letras minúsculas entre linhas,
não diferem entre si pelo teste de Tukey (P≤0,05), para período e regime hídrico respectivamente,
n=4.
A
1000
2250
3500
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Bb
Cb
Ab
Aa
Ba
Ca
B
2000
3500
5000
1
3
9
Período de Recuperação (Dias)
Bb
Cb
Ab
Aa
Ba
Ca
//
//
//
C
1000
2250
3500
3
6
9
Período de Inundação (Dias)
Cb
Ba
Ab
Aa
Aa
Bb
84
4 CONCLUSÕES
Os genótipos de soja BRS-153 e BRS-154 são capazes de manter elevadas
taxas de fermentação alcoólica por um período de nove dias em nódulos e raízes em
condição de hipoxia por alagamento do sistema radical.
O período de nove dias de drenagem não é suficiente para reverter a
atividade da ADH a níveis pré-hipóxicos em raízes, sendo o tempo requerido para
em nódulos reduzir o metabolismo fermentativo aos níveis do controle.
O grande aumento das concentrações de sacarose, açúcares solúveis totais
em raízes e nódulos e de amido em nódulos, sobretudo nos períodos iniciais de
hipoxia em ambos os genótipos é devido a redução da atividade metabólica desses
tecidos em função da pouca disponibilidade de oxigênio.
No período de recuperação pós-hipoxia os teores de sacarose e de açúcares
solúveis totais em raízes tendem a ser restabelecidos após o período compreendido
entre três e nove dias de normoxia. Em nódulos, por outro lado, os teores de
sacarose, de açúcares solúveis totais e de amido não atingem as concentrações das
plantas controle nesse mesmo período, permanecendo baixos, em virtude da alta
taxa de utilização de carboidratos nas raízes, em conseqüência da retomada de sua
atividade metabólica.
85
A hipoxia aumenta a concentração de polissacarídeos solúveis em água em
raízes e diminui nos nódulos, sugerindo existir mecanismo diferenciado de
adaptação desses órgãos à baixa disponibilidade de O
2
. O retorno às condições de
normoxia favorece o restabelecimento da concentração desses carboidratos em
raízes em relação aos nódulos.
86
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