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MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEQUENOS MAMÍFEROS E IMPORTÂNCIA DE
ANIMAIS DOMÉSTICOS NA MANUTENÇÃO DOS CICLOS DE TRANSMISSÃO DE
TRIPANOSOMATÍDEOS: TRYPANOSOMA CRUZI, LEISHMANIA INFANTUM E
LEISHMANIA BRAZILIENSIS.
André Luiz Rodrigues Roque
Rio de Janeiro
Setembro de 2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Ministério da Saúde
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEQUENOS MAMÍFEROS E IMPORTÂNCIA DE
ANIMAIS DOMÉSTICOS NA MANUTENÇÃO DOS CICLOS DE TRANSMISSÃO
DE TRIPANOSOMATÍDEOS: TRYPANOSOMA CRUZI, LEISHMANIA INFANTUM
E LEISHMANIA BRAZILIENSIS.
ANDRÉ LUIZ RODRIGUES ROQUE
Orientadores:
Dra. Ana Maria Jansen
Dra. Elisa Cupolillo
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo
Cruz como requisito para obtenção do título
de Doutor em Ciências na área de Biologia
Parasitária, e desenvolvida nos
Laboratórios de Biologia de
Tripanosomatídeos e de Pesquisa em
Leishmanioses (Instituto Oswaldo Cruz –
FIOCRUZ).
SUPORTE FINANCEIRO: CNPq,
PAPES/FIOCRUZ e FIOCRUZ.
DBP-IOC
Rio de Janeiro – Setembro 2009
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ii
Ministério da Saúde
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Esta tese intitula-se:
“AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE PEQUENOS MAMÍFEROS E IMPORTÂNCIA
DE ANIMAIS DOMÉSTICOS NA MANUTENÇÃO DOS CICLOS DE
TRANSMISSÃO DE TRIPANOSOMATÍDEOS: TRYPANOSOMA CRUZI,
LEISHMANIA INFANTUM E LEISHMANIA BRAZILIENSIS”.
apresentada por:
ANDRÉ LUIZ RODRIGUES ROQUE
Orientadores: Dra. Ana Maria Jansen e Dra. Elisa Cupolillo
Local: Auditório do Museu da Vida Data: 15/09/09 – 14 hs
Banca avaliadora:
Dr. Reginaldo Peçanha Brazil – IOC/Fiocruz
Dr. Octavio Fernandes da Silva Filho – IOC/Fiocruz
Dr. Jeffrey Jon Shaw – USP
Dr. Rafael Veríssimo Monteiro – Autônomo
Dr. Adauto José Gonçalves de Araújo – ENSP/Fiocruz
“Não vai demorar que passemos adiante”.
uma grande e bela ciência,
que faz arte em defesa da vida
Carlos Chagas, 1928
__________________________________________________________________Agradecimentos
iv
A DEUS, sempre em primeiro lugar, pela oportunidade de aprendizado nos bons e maus
momentos e pelo amparo em toda caminhada.
À minha esposa JULIANA, por ser companheira, parceira, cúmplice, cara-metade e,
principalmente, por aceitar o “desafio” de casar enquanto ainda éramos apenas dois bolsistas de
doutorado. Nosso dia-a-dia comprova que não poderíamos ter feito melhor escolha do que tornarmos
“um só”. Te amo para toda a vida!!!
Aos meus pais NIVIO e NICIA pela base de educação e religião, por serem meus maiores
exemplos e ainda participarem de modo tão vibrante em cada vitória.
Às minhas famílias paulista (MARCO, PATRICIA, GIOVANNA e GUSTAVO) e carioca (OS
FORMIGUENTOS DA FAMÍLIA DA JU) pela torcida, carinho e alegria que é estar junto a vocês.
À Dra. ANA MARIA JANSEN, minha “fessora”, pelo carinho e dedicação maternal, pela
inspiração, exemplo e orientação que ultrapassam e muito as atividades dessa tese. Tudo que
conquistei profissionalmente devo a você e serei eternamente grato pelos desafios e confiança em
mim depositada.
À Dra. ELISA CUPOLILLO, pelo carinho, orientação, ensinamentos e apoio em todas as
situações. Ainda tenho muito que aprender e espero contar com sua parceria profissional por longos
anos.
Ao Dr. PAULO D’ANDREA, pela amizade, confiança e por estar sempre pronto a auxiliar em
qualquer momento que preciso.
À Dra. VERA BONGERTZ, com quem sempre podemos contar para revisão e discussão de
nossos trabalhos. Obrigado pelas sugestões que certamente engrandecem os trabalhos.
Ao Dr. RENATO MARCHEVSKY, pela colaboração no desenvolvimento e análise dos
exames histológicos. Profissional competente e pessoa agradabilíssima que tive oportunidade de
conhecer durante essa tese.
Ao Dr. REGINALDO BRAZIL, pela revisão da tese, mas principalmente pela generosidade e
carinho que sempre demonstrou comigo e com nosso trabalho desde os primeiros momentos de
desenvolvimento dessa tese.
Às Dras. SORAYA SANTOS e ELENILD GÓES, guerreiras de rara visão integrada em saúde
pública, pelas oportunidades e forte parceria nos últimos anos.
Aos parceiros JOICE RODRIGUES, MIGUEL FERNANDO OLIVEIRA, ANA CLÁUDIA
DUARTE e DANÚBIA LIMA pelo auxílio com dedicação e responsabilidade em diferentes momentos
dessa tese.
__________________________________________________________________Agradecimentos
v
Aos amigos do LABORATÓRIO DE BIOLOGIA DE TRIPANOSOMATÍDEOS que me
acompanham há 6 anos e foram fundamentais para a conclusão desse ciclo. Todos, sem exceção,
merecem o meu “Muito Obrigado”!
Aos amigos do LABORATÓRIO DE PESQUISA EM LEISHMANIOSES que me receberam e
me auxiliaram muito quando ainda não estava familiarizado com o laboratório. Obrigado pela
paciência e agradável convívio.
A todo o PESSOAL DE CAMPO do Ministério da Saúde e das Secretarias Municipais e
Estaduais, com quem tive a oportunidade de trabalhar. O trabalho fica muito melhor quando realizado
em clima agradável e descontraído como o que vocês proporcionaram.
À Família LBCE – BERNARDO, FABIANO, JÚLIO, MARCONNY e VANDERSON – pela
amizade verdadeira e apoio fraternal em todos os momentos. Como é bom poder unir trabalho e
diversão. Respeito todos vocês!!!
Ao curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, especialmente aos amigos LUCIANE e
EDUARDO, pessoas especiais que sempre me atenderam com eficiência e simpatia.
Ao suporte financeiro deste projeto: IOC/FIOCRUZ, VPPLR/FIOCRUZ, PAPES/FIOCRUZ,
FAPERJ, CNPq.
_______________________________________________________________________________índice
vi
1. Introdução......................................................................................................................... 01
1.1. Reservatórios.................................................................................................................. 01
1.2. Parasitos multi-hospedeiros............................................................................................ 04
1.3. Equilíbrio ambiental e efeito amplificador..................................................................... 06
1.4. Trypanosoma cruzi.......................................................................................................... 08
1.5. Leishmania sp.................................................................................................................. 10
1.6. Importância dos estudos da fauna silvestre..................................................................... 12
1.7. Roedores caviomorfos do gênero Thrichomys................................................................ 14
1.8. Papel dos mamíferos domésticos.................................................................................... 16
2. Justificativa........................................................................................................................ 18
3. Objetivos............................................................................................................................ 19
4. Bloco 1................................................................................................................................ 20
5. Bloco 2................................................................................................................................ 21
6. Bloco 3................................................................................................................................ 22
7. Discussão........................................................................................................................... 23
7.1. Diferentes perfis de transmissão da doença de Chagas................................................... 23
7.2. Animais domésticos sentinelas....................................................................................... 26
7.3. A manutenção de Leishmania sp. na natureza................................................................ 29
7.4. O modelo Thrichomys sp................................................................................................ 31
7.5. Considerações Finais....................................................................................................... 33
8. Conclusões.......................................................................................................................... 37
9. Referências bibliográficas................................................................................................ 38
10. Anexo 1.............................................................................................................................. 54
_____________________________________________________________________________RESUMO
vii
Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis e L. infantum são protozoários
tripanosomatídeos responsáveis, respectivamente, pela doença de Chagas, Leishmaniose
Tegumentar e Leishmaniose Visceral, doenças de alto impacto em saúde pública no Brasil.
A transmissão desses parasitos é sustentada por uma grande diversidade de hospedeiros
mamíferos silvestres e/ou domésticos e vetores hematófagos, envolvidos em complexos
ciclos de transmissão que se caracterizam por serem dinâmicos, multi-variáveis e
apresentarem particularidades ainda pouco conhecidas. Buscando aprofundar o
conhecimento da interação desses tripanosomatídeos com seus hospedeiros mamíferos,
avaliamos, em condições naturais e experimentais, o potencial de alguns pequenos
mamíferos silvestres e animais domésticos na manutenção dos ciclos de transmissão
desses parasitos. Em relação ao Trypanosoma cruzi, avaliamos o perfil da infecção em
mamíferos domésticos e silvestres em três áreas de surtos de doença de Chagas aguda por
via oral. O sistema reservatório responsável pela manutenção do parasito diferiu nas três
áreas, mas apresentou como ponto comum a alta abundância relativa e prevalência de
infecção por T. cruzi em mamíferos sinantrópicos. Casos humanos em Cachoeiro do Arari
(PA) resultaram da invasão do homem a áreas silvestres com alta transmissão do T. cruzi
entre mamíferos silvestres, enquanto em Navegantes e Redenção foram provavelmente
conseqüência da perda de diversidade de mamíferos silvestres e seleção de espécies que
são competentes fontes de infecção aos vetores. Em todas as áreas, animais domésticos
mostraram-se expostos à infecção (sorologia positiva) e refletem a presença da transmissão
o parasito em áreas peri-domiciliares. Nesse cenário, discutimos a importância de se definir
para cada área o papel que cada espécie de mamífero desempenha na manutenção do
parasito e a utilização de mamíferos domésticos sentinelas como medida de vigilância
epidemiológica. Em relação às Leishmanioses, avaliamos o perfil da infecção por
Leishmania infantum e L. braziliensis em roedores caviomorfos Thrichomys laurentius e
discutimos o papel que esses animais podem desempenhar no ciclo de transmissão desses
parasitos. Thrichomys sp. é um roedor disperso por diversas áreas no país e já foram
relatados naturalmente infectados por Leishmania sp. O perfil de infecção foi semelhante e
todos os roedores foram capazes de manter e controlar a infecção, independente da espécie
de Leishmania. Obtivemos o re-isolamento de parasitos após 12 meses de infecção e a
infecção por L. braziliensis resultou em visceralização dos parasitos e altos títulos
sorológicos. Esses resultados mostram a importância de se avaliar a fauna silvestre sem
levar em consideração o perfil de infecção dessas leishmânias em humanos, durante
programas de vigilância dessa parasitose. O conjunto desses trabalhos mostra que a
definição de reservatórios e o papel que cada hospedeiro mamífero desempenha no ciclo de
transmissão de T. cruzi e/ou Leishmania sp. depende da interpretação dos resultados
obtidos através de uma ampla abordagem metodológica. Apenas quando as ações
passarem a considerar todas as variáveis envolvidas na dinâmica de transmissão desses
parasitos, é que poderão ser definidas medidas mais efetivas de vigilância e controle da
doença de Chagas e Leishmanioses.
___________________________________________________________________________abstract
viii
Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and L. infantum are protozoan
trypanosomatids and the causative agents of, respectively, Chagas disease, Tegumentar
Leishmaniasis and Visceral Leishmaniasis, diseases of high impact on public health in Brazil.
The maintenance of these parasites in nature is supported by a wide variety of wild and/or
domestic mammalian hosts and hematophagous vectors, in transmission cycles that are
complex, dynamic, multi-variable and present several features that still need to be clarified.
Aiming to go further in the knowledge of the interaction of trypanosomatids with their
mammalian hosts, we evaluated, in experimental and natural conditions, the potential role of
small wild and domestic mammal species in the maintenance of these parasites`
transmission cycles. For a study of Trypanosoma cruzi, we evaluated the infection profile and
prevalence in wild and domestic mammals from three orally acquired Chagas disease
outbreak areas in Brazil. The reservoir system responsible for maintaining the parasite
transmission was different among the three areas, but displayed as common points the high
abundance and prevalence of T. cruzi infection of synanthropic mammals. Human cases in
Cachoeiro do Arari (PA) resulted from their exposition to the sylvatic T. cruzi transmission
cycle. In Navegantes (SC) and Redenção (CE), the cases were probably the consequence of
the loss of diversity of wild mammalian fauna and the selection of species that are competent
sources of T. cruzi infection to vectors. In all studied areas, domestic animals were found to
be exposed to infection (as demonstrated by positive serology) reflecting the presence of the
parasite transmission cycle in peri-domestic areas. In this scenario, the importance to define
for each area which role each mammal species plays in the parasite’s maintenance, and the
use of domestic mammals as sentinels in surveillance programs are discussed. Considering
leishmaniasis, we evaluated Leishmania infantum and L. braziliensis infection patterns in the
caviomorph rodent species Thrichomys laurentius and discussed its putative role in the
transmission cycle of Leishmania species. Thrichomys sp. is widely dispersed in Brazil and
naturally Leishmania infected specimens have already been reported. The rodents displayed
similar patterns of infection and all of them were able to maintain and control the infection,
independent of the Leishmania species. Re-isolation of parasites was achieved 12 months
post infection and L. braziliensis infection resulted in parasite visceralization and induction of
an important humoral response. These results emphasize the importance of assessing the
wild mammalian fauna without considering the Leishmania sp. infection patterns in humans,
during monitoring programs of this parasitosis. Taking together, these studies show that the
definition of reservoirs and the role played by each mammalian host in the transmission
cycles of T. cruzi and/or Leishmania sp. depends on the interpretation of results obtained by
an ample methodological approach. Only when the surveillance programs start to consider
all the variables involved in the transmission dynamics of these parasites, more effective
control measures for Chagas disease and Leishmaniasis could be introduced.
_______________________________________________________________________introdução
1
O presente estudo foca os protozoários das espécies Trypanosoma cruzi e
Leishmania spp (Kinetoplastida, Trypanosomatidae), de considerável importância médica
por serem os agentes etiológicos, respectivamente, da doença de Chagas e leishmaniose
americana, doenças emergentes e re-emergentes no Brasil.
Estes tripanosomatídeos, organismos eucariotas dos mais antigos, são um excelente
modelo para o entendimento não só de questões relacionadas com a saúde pública, mas do
fenômeno parasitismo de um modo geral. Ambos os gêneros apresentam ciclos de vida
heteroxeno, envolvendo uma grande variedade de espécies de hospedeiros mamíferos –
domésticos e silvestres – e insetos hematófagos vetores. Embora incluídos na mesma
família Trypanosomatidae, T. cruzi e Leishmania spp. apresentam estratégias biológicas
completamente distintas no que diz respeito aos vetores, sítios de colonização no
hospedeiro mamífero, transmissão e mecanismos de dispersão na natureza entre seus
vetores e hospedeiros.
1.1 Reservatórios
Ainda hoje, a conceituação de reservatórios que permeia na comunidade científica é
resultado de uma visão antropocêntrica do fenômeno parasitismo, uma vez que é referida
como “a espécie animal que é fonte de infecção de um determinado parasito para o
homem”. Dentre as diversas definições de reservatório descritas ao longo dos anos, Ashford
(1996; 1997) propõe a mais simples, clara e objetiva conceituação ao definir
RESERVATÓRIO não como uma única espécie, mas como um sistema formado pelo
conjunto de espécies que garantam a manutenção de um determinado parasito na natureza.
O autor define ainda que um sistema reservatório deve ser consistente, equilibrado e,
principalmente, que deve ser considerado sempre numa escala espaço-temporal única. São
características importantes desse sistema: a alta abundância relativa das espécies
mamíferas que sustentam a rede de transmissão (para permitir que cada componente seja
fonte de infecção a pelo menos outro animal) e alta longevidade – do sistema e não
necessariamente dos hospedeiros – para permitir a persistência do agente durante o
período de baixa transmissão (Ashford, 1996). Nesse caso é importante reconhecer os
hospedeiros que são essenciais à manutenção do parasito (reservatórios) daqueles que são
meramente incidentais (hospedeiros que se infectam, mas que apresentam baixa
transmissibilidade).
Uma interação reservatório-parasito pode ser considerada um sistema complexo na
medida em que inclui o homem e/ou animal doméstico, o parasito, o vetor e animais
_______________________________________________________________________introdução
2
silvestres dentro de um determinado ambiente, em um determinado recorte temporal, sendo
este conjunto uma unidade biológica, um sistema único, peculiar (Araújo et al., 2003). Do
mesmo modo que, ao longo de 3 – 4 bilhões de anos, os seres vivos têm se multiplicado e
evoluído, as interações que ligam suas histórias de vida e modelam seu processo evolutivo
também se multiplicam e evoluem. Embora interações reservatório–parasito sejam mais
efêmeras e certamente menos tangíveis do que espécies, elas são um produto da
associação e co-evolução dos seres vivos. Só muito raramente, se é que ocorre, a interação
interespecífica inclui apenas duas espécies, o que aumenta o grau de complexidade da
interação, e o resultado destas múltiplas interações devem obrigatoriamente ser levadas em
conta na tentativa de definir uma espécie como reservatório de um determinado parasito em
um dado ecossistema (revisto por Jansen & Cortez, 2007; Noireau et al., 2009).
Outro aspecto fundamental nos estudos dos ciclos de transmissão e da epidemiologia
de uma determinada zoonose é considerar o caráter temporal e espacial da condição de
reservatório. A complexidade da interação reservatório-parasito inclui o caráter dinâmico e
imprevisível desta unidade biológica que está em constante mudança em função das
alterações do meio ambiente (revisto por Noireau et al., 2009). As diferentes características
epidemiológicas e padrões de infecção se modificam de uma região para outra em função
de: (a) padrões ecológicos das áreas de ocorrência, incluindo variações na vegetação,
clima, diversidade e abundância, e diversidade de espécies de animais silvestres; (b) fatores
demográficos como emigração de pessoas e animais domésticos oriundos de regiões
endêmicas; (c) alteração do habitat original e antropofização dos hábitos alimentares dos
vetores, em conseqüência do crescimento das cidades e expansão das atividades agrícolas;
(d) condição sócio-econômica e cultural da população; (e) diferentes sub-populações de
parasitas e espécies de vetores; e (f) presença ou ausência de hospedeiros reservatórios,
domésticos e/ou silvestres (Desjeux, 2001; Guerin et al., 2002; Werneck e Maguire, 2002;
Werneck et al., 2003).
Cada interação parasito-reservatório apresenta particularidades determinadas por
fatores relacionados ao hospedeiro (sexo, idade, padrão comportamental, competência
imunológica), ao parasito (tempo de geração, potencial reprodutivo, ecletismo ambiental,
estratégias de dispersão, presença de outras espécies parasitas), ao vetor (hábitos,
comportamento, deslocamento, dispersão) e ao ambiente onde ocorre. Isto mostra que as
espécies não desempenham o mesmo papel como reservatório de um parasito em todos os
recortes temporais e espaciais.
Para definir uma determinada espécie animal como reservatório de um determinado
parasito, faz-se necessário a determinação dos seguintes parâmetros:
a) Distribuição geográfica do hospedeiro: define a área máxima de ocorrência da
parasitose (Mills & Childs, 1998). Assim é importante definir a composição faunística e a
representatividade de cada espécie dentro da comunidade de potenciais reservatórios, bem
_______________________________________________________________________introdução
3
como sua distribuição pelos estratos florestais. Muitas dessas espécies não estão restritas
apenas ao estrato florestal onde são mais comumente encontrados e seu deslocamento de
um a outro estrato significa a possibilidade de dispersão de seus parasitos, o que pode
contribuir para o estabelecimento de novos focos de transmissão (Jansen et al., 1999).
b) Identificação taxonômica dos hospedeiros => Interpretações epidemiológicas
equivocadas podem surgir a partir de dados taxonômicos imprecisos dos hospedeiros (Mills
& Childs, 1998). A correta identificação dos hospedeiros é de fundamental importância uma
vez que mesmo espécies crípticas podem ter diferentes papéis na manutenção e dispersão
de um parasito na natureza (Roque et al., 2005).
c) Perfil de infecção e sua distribuição nas diferentes populações de hospedeiros: a
prevalência da infecção numa mesma espécie de hospedeiro pode ser muito alta em
algumas localidades e muito baixa em outras áreas, que podem inclusive estar bem
próximas. Fica claro assim que em diferentes localidades uma mesma espécie de mamífero
pode desempenhar distintos papéis na manutenção do parasito na natureza (Herrera et al.,
2005). É possível, e até provável, que parasitos sejam extintos periodicamente em uma
determinada população de reservatórios sejam re-introduzidos algum tempo mais tarde
(Mills & Childs, 1998).
d) Análise regional do parasito e reservatórios em distintos ecossistemas dentro de
um mesmo bioma: Esta informação permite avaliar onde está acontecendo a transmissão,
ou seja, onde há maior risco de spillover da parasitose. Observa-se com freqüência que a
transmissão de parasitos é focal, ou seja, existem cenários, às vezes restritos a hot spots
(zonas quentes) em que a transmissão do parasito é extremamente bem sucedida, ao lado
de outros de outros onde a transmissão não acontece (Weiss & McMichael, 2004; Jones et
al., 2008).
e) Estimar a prevalência da infecção entre os distintos aspectos demográficos das
populações de hospedeiros: A saber: machos e fêmeas, adultos e jovens. Com esta
informação é possível determinar se a transmissão ainda está acontecendo (caso a
prevalência da parasitose seja elevada na população de animais jovens) ou a possibilidade
de dispersão do parasito. Tomando como exemplo (a) os gambás: estes são descritos como
animais nômades, no entanto, os machos têm um comportamento nômade muito mais
acentuado do que as fêmeas e assim são melhores dispersores de parasitos. (b) primatas:
vivem em grupos e tem um comportamento territorialistas. Essas diferenças demográficas
apontam para a dinâmica das populações de hospedeiros no tempo e espaço e nos ajudam
a prever oscilações na transmissão baseada nas flutuações sazonais populacionais dos
principais hospedeiros (Noireau et al., 2009).
f) Dinâmica das populações de hospedeiros no tempo: As redes de transmissão de
parasitos variam no tempo e espaço. A dinâmica e os fatores que controlam todos estes
processos são ainda desconhecidos, mas indicam que o estudo longitudinal é fundamental
_______________________________________________________________________introdução
4
para esclarecer o padrão temporal e espacial da parasitose e determinar: a) os efeitos de
um determinado parasito na população e/ou indivíduo; b) flutuação sazonal dessa
parasitose; c) estabilidade da infecção na população de reservatórios; d) transmissibilidade
desse parasito (Haydon et al., 2002).
Apesar de importantes, a maioria dos estudos de campo sobre reservatórios
silvestres se baseia em descrições pontuais, que não são complementadas com estudos
sobre a cinética da infecção. Assim sendo e, sempre que possível, estudos experimentais
com espécies consideradas possíveis reservatórios silvestres devem ser realizados como
forma de auxiliar a interpretação dos dados obtidos nas investigações a campo (Roque et
al., 2005).
Vale ressaltar que o encontro de uma espécie animal infectada ainda não define o
seu papel na rede de transmissão. Este atributo dependerá das peculiaridades desta
interação parasito-hospedeiro e é esta que vai resultar na competência da espécie animal
em questão com vistas a garantir a manutenção e/ou transmissão do parasito. Outro
aspecto que deve ser avaliado é a abundância relativa dos animais infectados. Em alguns
cenários uma espécie infectada que apresente uma alta abundância relativa tem maior
competência enquanto reservatório em um determinado local do que em outro, cujo número
e biomassa sejam pouco expressivos (revisto por Jansen & Cortez, 2007; Noireau et al.,
2009).
1.2 Parasitos multi-hospedeiros
O contato do homem com o ambiente silvestre e, portanto com os ciclos de
transmissão de diversos parasitas, ocorreu e ocorre em diversas e diferentes situações. A
expansão de fronteiras agrícolas, aquecimento global e popularização do eco-turismo são
apenas alguns exemplos de fatores que têm levado o homem a um maior contato com
esses ciclos de transmissão, permitindo a formação de um gradiente contínuo de
transmissão entre animais silvestres, domésticos e o homem (Deem et al. 2000, Fayer 2000;
Mayer 2000). Esses parasitos, que passam então a ser transmitidos entre humanos, animais
domésticos e silvestres (zoonoses) o que resulta em impacto na saúde pública, na economia
agropecuária e na conservação ambiental (Sutherst, 2001; Cleaveland et al., 2001; Kruse et
al., 2004); e reforçam a crescente preocupação de toda a comunidade com a emergência
e/ou re-emergência de várias doenças parasitárias (Spear, 2000; Daszak et al., 2000; 2001).
Essas doenças vêm reforçar a importância do estudo da macro e micro biota silvestre e sua
possível repercussão na saúde humana e animal, e nos projetos de manejo e conservação
ambiental.
_______________________________________________________________________introdução
5
Vários fatores associados às alterações ambientais, naturais ou não, corroboram
para acelerar o processo de intercâmbio de parasitos entre o homem e hospedeiros
silvestres, promovendo a dispersão dos parasitos para novas áreas e proporcionando o
contato destes com hospedeiros que possam vir a atuar como reservatórios (Daszak, 2000;
Dobson e Foufopoulos, 2001; Williams et al., 2002). Estes fenômenos são especialmente
importantes quando ocorrem com parasitos multi-hospedeiros, i.e. capazes de infectar uma
ampla gama de hospedeiros, como é o caso do Trypanosoma cruzi e das espécies do
gênero Leishmania envolvidas neste estudo (L. infantum e L. braziliensis). Esses
protozoários se caracterizam por apresentarem uma grande heterogeneidade genética e
ecletismo biológico no que se refere às diferentes ordens de mamíferos que são capazes de
infectar e, no caso específico do T. cruzi, aos tecidos que pode colonizar dentro de um
mesmo hospedeiro. Este ecletismo biológico resulta em que estes tripanosomatídeos são
encontrados em diferentes ciclos de transmissão com características e particularidades
regionalizadas (Ashford, 1996; Noireau et al., 2009).
A evolução de um parasito na direção de um expressivo ecletismo biológico resulta
em maior habilidade para explorar novos hospedeiros que, por sua vez, serão fonte de sua
dispersão (Woolhouse et al., 2001). Algumas características são comuns entre parasitos
multi-hospedeiros e comumente relacionadas aos tripanosomatídeos Trypanosoma cruzi,
Leishmania infantum e L. braziliensis:
a) altos índices de diversidade genética: Apesar de apresentarem um modo de
reprodução predominantemente clonal, esses parasitos apresentam grandes diferenças
genéticas e moleculares entre suas sub-populações (Tibayrenc, 2003; Cupolillo et al., 2003;
Kulhs et al., 2008). As diferentes linhagens e sub-populações de parasitos, sua
heterogeneidade genética e biológica são expressos em ciclos de transmissão que podem
ser independentes ou sobrepostos num mesmo ambiente.
b) capacidade de explorar novos hospedeiros: Uma vez que as relações naturais e o
ambiente onde mamíferos e vetores freqüentam estão em constante mudança, qualquer
alteração pode favorecer o encontro do parasito com novas espécies animais susceptíveis,
o que pode levar a uma expansão do focos de transmissão. Isso significa que um sistema
reservatório onde um dado parasito é mantido caracteriza-se por ser um sistema dinâmico
sempre sujeito à participação de novos hospedeiros (Ashford, 1996; Haydon et al., 2002).
c) transmissão por artrópodes generalistas: Triatomíneos (vetores do Trypanosoma
cruzi) e a maioria das espécies de flebotomíneos (vetores das leishmânias) são
reconhecidamente generalistas e oportunistas em relação à sua fonte alimentar,
considerando-se, entretanto, as limitações de distribuição e localização dos insetos,
preferência alimentar e capacidade de dispersão para cada espécie de vetor.
d) diferenças no curso da infecção: Cada animal irá interagir de modo diferente com o
parasito dependendo da espécie do mamífero envolvido, da espécie e sub-população do
_______________________________________________________________________introdução
6
parasito, do estado de saúde daquele animal, da presença de outros parasitos, entre outros
fatores. Aspectos como patogenicidade, ou seja, o quanto o animal sofre com a infecção e
virulência, que tem a ver com a multiplicação do parasito, estão sempre variando
dependendo das condições da interação parasito-hospedeiro (Araújo et al., 2003).
e) menor possibilidade de extinção: Independente de serem ou não patogênicos ou
virulentos, parasitos capazes de infectar múltiplos hospedeiros são menos propensos à
extinção porque seu destino não está atado a um único ou poucos hospedeiros e
representam, muitas vezes, exemplos bem sucedidos em termos evolutivos (Woolhouse et
al., 2001). Os mais de 80 milhões de anos de transmissão de T. cruzi e Leishmania sp. entre
mamíferos reforçam essa idéia (Stevens et al., 2001).
1.3 Equilíbrio ambiental e efeito amplificador
A modificação dos habitats e a consequente fragmentação da paisagem original vem
sendo responsabilizada pelo surgimento ou dispersão de parasitos que podem resultar na
emergência e re-emergência de doenças parasitárias (Dobson & Foufopoulos, 2001). A
ameaça às populações nativas e à saúde humana, assim como prejuízos econômicos no
caso de enzootias que afetem animais de valor produtivo é mais grave principalmente
quando a disseminação de parasitas é realizada em ambientes sem prévia exposição
(Daszak et al., 2000).
A perda da biodiversidade é uma conseqüência imediata das alterações ambientais,
especialmente as decorrentes da ação humana, pela velocidade e grau de devastação que
as caracterizam. Esse cenário cria uma série de situações que favorecem a emergência ou
re-emergência de infecções por parasitos, como o T. cruzi e algumas espécies de
Leishmania spp.por: (a) diminuição e fragmentação da cobertura vegetal original, resultando
em um maior contato entre os animais silvestres e os animais domésticos/homem; e (b)
modificação na ecologia do vetor, do parasito e de seu hospedeiro. Um aspecto importante a
ser considerado diz respeito às espécies de mamíferos de vida livre e seu contato com
animais domésticos e peri-domiciliares, o que pode propiciar que, em áreas enzoóticas,
casos humanos surjam a partir da expansão de um foco zoonótico (Ashford, 1996).
A perda de habitats leva à extinção aqueles animais mais susceptíveis a alterações e
restrições ambientais. Aquelas espécies mais generalistas em relação aos habitats e fontes
alimentares passam a ocupar novos nichos, aumentando sua biomassa. Vale ressaltar que,
nas comunidades com reduzido número de espécies de mamíferos, tendem a predominar
algumas poucas espécies de roedores e marsupiais que podem passar a assumir
expressiva importância nos ciclos de transmissão de parasitos caso apresentem um perfil de
infecção que resultem na maior possibilidade de infecção para o vetor, ou seja, na sua maior
_______________________________________________________________________introdução
7
transmissibilidade. A esta simplificação de fauna e seleção de hospedeiros competentes é
atribuído o termo “efeito amplificador”, numa relação oposta ao “dillution effect” proposto por
Ostfeld e Keesing (2000). Esse efeito foi primeiramente descrito para doença de Lyme
(Ostfeld e Keesing, 2000), e desde então utilizada para descrever surtos epizoóticos de
outros parasitos como Leishmaniose Tegumentar Americana (Chaves e Hernandez, 2004),
Hantaviroes (Dobson et al., 2006), Febre do West Nilo (Kilpatrick et al., 2006) e doença de
Chagas (Vaz et al., 2007).
Um ambiente preservado caracteriza-se pela alta riqueza de espécies animais, e
assim, o número de hospedeiros competentes é diluído entre aqueles que não têm a mesma
capacidade (competência) para transmitir um dado parasito. Quanto maior a abundância de
espécies de hospedeiros menos competentes menor o risco de um vetor vir a se alimentar
justamente num hospedeiro competente infectado. O resultado é uma prevalência de
infecção na fauna de vetores e mamíferos que, apesar de suficiente para manter o parasito,
se mantém em baixos níveis, sendo a transmissão restrita a endemias focais (Keesing et al.,
2006; Dobson et al., 2006).
Por outro lado, quando a perda de diversidade leva à seleção de hospedeiros
competentes na transmissão desse parasito, aumenta-se a probabilidade do encontro do
vetor com um hospedeiro competente infectado. Esse fenômeno é particularmente
importante quando se trata de parasitos generalistas como é o caso do T. cruzi, L. infantum
e L. braziliensis. Nesse cenário, a transmissão dos parasitos é aumentada devido: (i)
habilidade de manutenção e dispersão do parasito por parte desses competentes
reservatórios selecionados; (ii) restrição das fontes alimentares de insetos vetores a esses
animais parasitados; e, conseqüentemente, (iii) aumento da prevalência de vetores
infectados e maior probabilidade de outros mamíferos se infectarem durante repasto
sanguíneo do vetor. A resultante final são as maiores taxas de infecção na fauna de
hospedeiros mamíferos e vetores e maiores chances desse ciclo enzoótico se expandir para
áreas domiciliares ou peri-domiciliares, levando ao aparecimento de casos humanos
(Ostfeld & Keesing, 2000; Pedersen et al., 2007; Smith et al., 2009).
Quando se inicia um processo de simplificação de fauna, não há como prever qual a
resultante. A simplificação tanto pode levar para a seleção de hospedeiros competentes
como à seleção de hospedeiros menos competentes ou refratários e assim interromper o
ciclo de transmissão de uma determinada espécie de parasito. O conhecimento do ciclo
silvestre de transmissão e o monitoramento sistemático e periódico de animais silvestres
frente à infecção pelo T. cruzi, L. infantum e/ou L. braziliensis, antes e durante algum
empreendimento, são medidas importantes para a capacidade de previsão e tomada de
decisões profiláticas frente a possíveis alterações ambientais que levem ao aparecimento de
casos humanos dessas doenças.
_______________________________________________________________________introdução
8
1.4 Trypanosoma cruzi
Causador no homem da doença de Chagas, o Trypanosoma cruzi é um protozoário
flagelado digenético que circula na natureza entre mais de uma centena de espécies de
mamíferos distribuídos em oito diferentes ordens e dezenas de espécies de vetores,
triatomíneos da família Reduviidae (PAHO, 2009). Estima-se que haja atualmente cerca de
15 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi na América Latina (MSF, 2009).
Classicamente a doença se caracterizava por ser prevalente em populações rurais, onde
eram encontrados milhares de insetos vetores nas moradias de adobe (Dias, 2007). O
notável esforço para se eliminar a transmissão domiciliar por Triatoma infestans resultou que
o Brasil e outros países da América do Sul, fossem considerados livre desta modalidade de
infecção pela Comissão Intergovernamental do Cone Sul (Schofield et al., 2006). Entretanto,
há aspectos regionais importantes que não foram resolvidos. No nordeste brasileiro, por
exemplo, há espécies de triatomíneos silvestres que vêm se adaptando às moradias,
atraídos pelas luzes das casas. Com este perfil destacam-se Triatoma brasiliensis e T.
pseudomaculata (Dias et al., 2000; Ramos Jr & Carvalho, 2001; Borges-Pereira et al. 2002).
Estas espécies assumem uma importância grande porque são capazes de recolonizar o
ambiente doméstico a partir do ambiente silvestre o que nunca aconteceu com o T.
infestans, espécie exótica que foi introduzida no país provavelmente após a colonização das
Américas (Bargues et al., 2006). Ainda mais complexa é a situação na Amazônia, onde um
diferente perfil epidemiológico da doença de Chagas vem sendo observado, o que requer
um programa de vigilância epidemiológica cujo operacional ainda é desconhecido.
O Trypanosoma cruzi é caracterizado por apresentar uma estrutura populacional
multiclonal que resulta em uma extrema diversidade genética e ecletismo tanto no que se
refere aos seus hospedeiros mamíferos quanto aos nichos que nestes coloniza.
Caracterizações de sub-populações do parasito por diferentes marcadores biológicos,
bioquímicos, genéticos e moleculares apontam para a existência de duas linhagens
genéticas bastante distintas e filogeneticamente distantes, os quais foram denominadas T.
cruzi I e T. cruzi II (Anonymous, 1999). Estes grupos correspondem, respectivamente, aos
zimodemas Z1 e Z2 descritos por Miles e colaboradores (1977), mas não incluem um grupo
de subpopulações caracterizadas como zimodema Z3 (Miles et al., 1977) e outros
caracterizados como rDNA 1/2 (Souto et al., 1996). Atualmente, não há ainda um consenso
de como as subpopulações do T. cruzi podem ser agrupadas e são 3 as principais vertentes:
(i) T. cruzi é formado por 3 grandes e distintos grupos TCI, TCII e TCIII que correspondem
aos seus respectivos zimodemas (Miles et al., 1977), sendo todos os híbridos resultados de
eventos de recombinação entre TCII e TCIII (de Freitas et al., 2006; Pena et al., 2009); (ii) T.
cruzi é formado por seis diferentes linhagens do parasito, T. cruzi I, IIa, IIb, IIc, IId, e IIe. As
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9
linhagens ancestrais TCI e TCIIb teriam produzido híbridos heterozigotos que, mais tarde
tornar-se-iam o homozigoto ancestral das linhagens TCIIa e TCIIc. Um segundo processo de
hibridação entre sub-populações de parasitos das linhagens TCIIb e TCIIc teria originado as
linhagens híbridas TCIId e TCIIe (Brisse et al., 2000; Westenberger et al., 2005); (iiii) T. cruzi
é sinônimo para duas diferentes espécies monofiléticas, TCI e TCII e todos os demais
isolados são híbridos resultantes de diferentes combinações entre sub-populações desses
dois grupos (Tomazi et al., 2009).
A forma vetorial, descrita como a forma clássica de transmissão do parasito ao
homem, ocorre quando o inseto vetor, ao realizar seu repasto sanguíneo, elimina formas
tripomastigotas metacíclias junto com as fezes. Esses parasitos penetram pelo local da
picada ou mucosas ou quando a pessoa se coça ou esfrega o local da picada. No
hospedeiro vertebrado, esses parasitos invadem as células nucleadas de praticamente
todos tecidos, onde se multiplicam na forma amastigota. A saída da célula, após nova
diferenciação celular para forma tripomastigota, se dá pelo rompimento celular que ocorre
tanto de forma ativa (desencadeada pela multiplicação parasitária intra-celular) quanto
passiva (desencadeada pela própria célula). A transmissão para o inseto vetor ocorre
quando formas tripomastigotas circulantes no sangue do hospedeiro vertebrado são
ingeridas por outro triatomíneo em um novo repasto sanguíneo. No hospedeiro invertebrado,
o parasito diferencia-se para a forma epimastigota, que é a forma replicativa no trato
digestivo do inseto vetor. Na porção final do intestino do inseto, os parasitos sofrem nova
diferenciação para a forma tripomastigota metacíclica, que é a forma infectiva eliminada nas
fezes do barbeiro.
Esta clássica via de transmissão não reflete todas as formas possíveis de infecção no
homem e muito menos entre mamíferos silvestres. Das quatro formas evolutivas do parasito,
três (tripomastigota sanguícola, tripomastigota metacíclica e amastigota) são capazes de
infectar e essa infecção se dá por diferentes vias, mostrando quão efetivo são os
mecanismos de dispersão desse parasito. Infecções humanas podem ocorrer também por
transfusão sanguínea e transplante de órgãos, embora atualmente essa forma de
transmissão seja mais importante em áreas não endêmicas, como a Europa e EUA. Nesses
casos, as infecções estiveram relacionadas à presença do T. cruzi em tecidos oriundos de
imigrantes provenientes de áreas endêmicas dessa protozoonose (Schmunis, 2007). A
forma congênita, já descrita em humanos e em condições experimentais, ocorre, mas sua
importância epidemiológica é regionalizada e pouco conhecida.
Uma via de transmissão muito importante no ambiente silvestre e que tem sido
responsável pela maior parte das infecções humanas nos últimos anos é a via oral (Dias,
2006). Em humanos essa via está normalmente associada à ingestão de alimentos
contaminados por fezes de triatomíneos infectados, por material de glândula de cheiro de
Didelphis sp. infectados, ou mesmo por triatomíneos infectados triturados acidentalmente
_______________________________________________________________________introdução
10
junto com o alimento (PAHO, 2009). Na natureza a via oral é provavelmente a mais antiga e
eficiente via de dispersão do parasito e ocorre nas seguintes situações: (i) ingestão de fezes
de triatomíneos quando o animal coça com a boca o local da picada; (ii) ingestão de
barbeiros por mamíferos que se alimentam de insetos; (iii) predação de outro mamífero que
esteja infectado pelo T. cruzi; (iv) brigas entre animais, nas situações onde ocorrem
mordeduras com perfurações e contato do sangue infectado de um mamífero com a mucosa
oral de outro; e (v) ingestão de frutos e sementes contaminados por fezes de barbeiros ou
material de glândula de cheiro de Didelphis sp. (PAHO, 2009).
Essa plasticidade biológica do T. cruzi resulta em ciclos de transmissão na natureza
que se caracterizam por serem multivariáveis, complexos e peculiares para cada localidade.
Sendo encontrado nos mais diversos nichos ecológicos, esses ciclos de transmissão podem
ser distintos e independentes ou estarem sobrepostos contribuindo para formar modalidades
distintas de focos naturais de transmissão (PAHO, 2009). Assim, na natureza, não podemos
considerar o caminho vetor-mamífero-vetor como o único possível: um roedor que se infecte
após picada de um barbeiro em sua toca terrestre pode ser predado e infectar o predador
que, sendo um marsupial do gênero Didelphis, pode tanto eliminar formas metacíclicas do
parasito por sua glândula de cheiro e contaminar frutos, como infectar outra espécie de
triatomíneo que freqüente seu refúgio no topo de uma árvore. Exemplos como esse ilustram
bem como os ciclos de transmissão desse parasito na natureza representam um labirinto
enzoótico complexo e peculiar, que dependem das particularidades da cadeia trófica local.
1.5 Leishmania sp.
Causador no homem das diferentes formas clínicas de leishmanioses, o gênero
Leishmania é composto por mais de 20 espécies de tripanosomatídeos flagelados
digenéticos cujos hospedeiros vertebrados incluem mamíferos de pelo menos seis
diferentes ordens. Seus hospedeiros invertebrados são flebotomíneos (Diptera:
Psychodidae) dos gêneros: Lutzomyia (nas Américas) e Phlebotomus (Europa, Ásia e
África) (WHO, 2009). A leishmaniose é uma zoonose endêmica em 88 países do mundo,
sendo encontrada principalmente nas regiões tropicais e subtropicais das Américas do Sul e
Central, África, Ásia e Mediterâneo Europeu, afetando cerca de 12 milhões de pessoas em
todo o mundo, com 2 milhões de novos casos por ano e 350 milhões de pessoas sob risco
de infecção (WHO, 2009). Em humanos, as leishmanioses podem assumir diferentes formas
clínicas que, para melhor compreensão, foram divididas em tegumentar (cutânea, cutâneo-
mucosa e cutâneo-difusa) e visceral. As manifestações clínicas da doença humana variam
_______________________________________________________________________introdução
11
desde infecções auto-resolutivas brandas (principalmente em pele) até formas graves
viscerais, disseminadas, anérgicas ou hiperérgicas.
Leishmania spp podem infectar um amplo espectro de espécies de animais silvestres,
mas pouco se sabe sobre a importância dessas espécies nos ciclos de transmissão. Além
disso, as poucas descrições de reservatório foram realizadas com base apenas em achados
pontuais (WHO, 1990; Ashford, 1996). Os papéis desempenhados pelas diferentes espécies
de mamíferos silvestres na epidemiologia das leishmanioses nas diferentes regiões de sua
ocorrência são fatores ainda desconhecidos. A zoonose ocorre em focos descontínuos tanto
no tempo quanto no espaço o que torna fundamental um programa constante de vigilância
epidemiológica.
Os hospedeiros mamíferos vertebrados são infectados com formas promastigotas
metacíclicas, presentes na glândula salivar do inseto vetor, durante um repasto sanguíneo.
Ainda nos microvasos da pele, as formas promastigotas são fagocitadas por células do
sistema fagocítico mononuclear (SFM) onde diferenciam-se para a forma amastigota. Nessa
forma, o parasito multiplica-se e até a ruptura da célula, quando são liberadas e infectam
novas células. A infecção para o hospedeiro invertebrado ocorre pela ingestão de sangue de
mamíferos infectados contendo células SFM infectadas. Após o rompimento das células, as
formas amastigotas liberadas no tubo digestivo do vetor diferenciam-se em formas
flageladas (promastigotas) que multiplicam-se no intestino do vetor. Após nova diferenciação
para a forma promastigota metacíclica, esses parasitos migram para a parte alta do tubo
digestivo e são inoculadas no hospedeiro vertebrado durante um novo repasto sanguíneo.
As leishmanioses são atualmente consideradas doenças re-emergentes e importante
problema de saúde pública em função dos novos e complexos cenários epidemiológicos que
vem surgindo como conseqüência de fatores como o fluxo migratório descontrolado de
homens e animais e a interferência desordenada do homem na natureza, resultante do
processo crescente de urbanização no país (Kawa e Sabroza, 2002). Sua transmissão,
inicialmente silvestre ou concentrada em pequenas localidades rurais, vem ocorrendo em
centros urbanos de médio e grande porte. A adaptação de vetores e mamíferos
sinantrópicos, roedores e marsupiais, ao ambiente domiciliar ou peridomiciliar contribui para
que as leishmanioses sejam consideradas no Brasil uma endemia em franca expansão
geográfica (Werneck et al., 2003; Maia-Elkhoury et al., 2008).
No Brasil, a forma visceral da doença humana no Brasil é causada pela L. infantum
(=L. chagasi), sendo Lutzomyia longipalpis o principal hospedeiro invertebrado do parasita
(Ministério da Saúde, 2006). A Leishmaniose Visceral (LV) ocorre predominantemente nas
regiões Nordeste e Centro-Oeste do Brasil, embora desde a recente descrição do parasito
no Rio Grande do Sul (dados não publicados), não haja estados indenes no país. Já as
formas tegumentares da doença humana estão associadas a diversas espécies, incluindo
aquelas classificadas no sub-gênero Leishmania (Viannia), além de Leishmania (L.)
_______________________________________________________________________introdução
12
amazonensis. A Leishmaniose Tegumentar (LT) causada por Leishmania (V.) braziliensis,
principal agente etiológico no país, ocorre em todo o Brasil, em especial nos estado de
Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Espírito Santo e Ceará, sendo que diversas
espécies de vetores estão envolvidas no seu ciclo de transmissão (revisto por Lainson &
Shaw, 1987). Vale lembrar que a situação atual de expansão dos ciclos de transmissão vai
de encontro à maioria dos trabalhos da década de 90 que correlacionavam uma ocupação
intensa do homem do ambiente silvestre com a erradicação ou ao menos controle da
doença (Tolezano, 1994; Feliciangeli, 1997).
A categorização das espécies de Leishmania descrita para a doença humana não
deve ser levada em consideração quando se analisa a infecção desses tripanosomatídeos
nos outros mamíferos, onde raramente podem-se diferenciar as formas clínicas observadas
em humanos. Muitos animais silvestres já foram encontrados infectados pelas diferentes
espécies de Leishmania que circulam nas Américas, mas estudos da dinâmica da infecção
desses parasitos nos hospedeiros silvestres ainda são escassos ou inexistentes. A maioria
dos trabalhos ainda se restringe a apontar os reservatórios baseado apenas em prevalência
de achados pontuais de infecção, muitas vezes diagnosticados apenas através de
ferramentas moleculares (PCR) de alta sensibilidade, que não definem a real importância
epidemiológica daquele achado e nem a participação desse hospedeiro no ciclo de
transmissão do parasito. Nesse sentido, entender o papel que os hospedeiros/reservatórios
domésticos e silvestres desempenham na manutenção e expansão dos ciclos de
transmissão de Leishmania spp. na natureza demanda estudos à campo e experimentais, os
quais serão essenciais na definição de medidas efetivas de controle dessa parasitose.
1.6 Importância dos estudos de fauna silvestre
A importância de compreender a biologia e ecologia de hospedeiros naturais e seus
parasitos para a saúde humana, como forma de prevenir zoonoses, é reconhecida desde o
início do século passado. Já no fim da década de 50, muitos autores apontavam a falta de
conhecimento acerca da ecologia dos hospedeiros silvestres como a principal razão para o
insucesso das medidas de controle sanitárias da época chegando a propor a utilização de
hospedeiros naturais como alternativa nos estudos que utilizavam animais de laboratório
(Abdussalan, 1959). Desde então, estudos ecológicos vêm ganhando espaço crescente em
publicações científicas.
Outro ponto que deve ser enfocado e que reforça a necessidade de estudos da fauna
silvestre e sua interação com parasitos, refere-se ao parasitismo como regulador de
populações e seu papel na conservação de animais silvestres (Grenfell & Gulland, 1995;
_______________________________________________________________________introdução
13
Koella et al., 1998; Thomas et al., 2000; Agnew et al., 2000). O manejo para conservação da
fauna silvestre freqüentemente inclui introdução, retirada e translocação de animais sem que
sejam considerados os parasitas destes, bem como as peculiaridades desta interação. O
conhecimento mais detalhado da taxonomia, biologia e interação parasitária em animais
silvestres é de fundamental importância na determinação do potencial de reservatório e em
programas de manejo e conservação da fauna de um modo geral.
A importância da utilização de espécies silvestres como bioindicadores reside no fato
que estas podem refletir o impacto das alterações no ambiente, atuando como sentinelas da
saúde ambiental (Dobson et al., 2006). O aumento da abundância relativa de algumas
espécies de hospedeiros pode ser o reflexo de que o manejo daquela área tem levado à
extinção de outras espécies de mamíferos mais susceptíveis a mudanças ambientais. Do
mesmo modo, o aumento da prevalência e incidência de uma determinada zoonose numa
comunidade de mamíferos silvestres indica maior risco de exposição do homem aos ciclos
silvestres de transmissão. A definição de espécies-sentinela otimiza as ações, diminui
gastos e evita interferências desnecessárias (revisto por Dobson, 2004; Aguirre, 2009).
Pequenos mamíferos (principalmente roedores e marsupiais) são considerados bons
bioindicadores ambientais e modelos adequados para estudos do fenômeno parasitismo,
por: (i) apresentarem populações numerosas sendo, normalmente, o grupo de mamíferos
com maior biomassa em qualquer ecótopo silvestre; (ii) possuírem curto tempo de vida – o
que permite monitorar com mais rapidez novos casos de infecção; (iii) serem encontrados
em todos os biomas e ecótopos – naturais e modificados – e ocuparem todos os estratos
florestais, o que permite compreender em que nível acontece a transmissão; (iv) ter suas
densidades dependentes do habitat; (v) incluírem gêneros de comportamento nômade, o
que favorece a dispersão de parasitos; e (vi) serem alvos de predação pelos animais de
topo de cadeia, possibilitando uma via alternativa para dispersão de várias espécies de
parasitas (revisto por Mills & Childs, 1998). Todos esses fatores associados fazem com que
respondam rapidamente a alterações ambientais (Epstein et al., 1997). Além disso, muitas
espécies são freqüentemente apontadas como reservatórios de diversos parasitos de
caráter zoonótico (Mills & Childs, 1998; Pinho et al., 2000) e, embora silvestres, algumas
vivem em áreas peri-domésticas e/ou ambientes rurais e se adaptam bem à presença do
homem (Herrera et al., 2005).
A utilização experimental de pequenos mamíferos silvestres fornece informações
importantes no que diz respeito à dinâmica da interação parasito-hospedeiro. Aspectos
essenciais a serem obtidos, nesse tipo de estudo, incluem a ecologia do agente, a
susceptibilidade ou resistência do organismo, bem como os mecanismos dessa interação. O
conhecimento detalhado da biologia e estratégias de vida de um hospedeiro silvestre passa
pela necessidade do estabelecimento de uma colônia para criação e estudo destes animais
(D’Andrea et al., 2002). Dados biológicos obtidos em cativeiro, como longevidade e padrões
_______________________________________________________________________introdução
14
reprodutivos, são essenciais na avaliação do papel do hospedeiro no ciclo de transmissão
de um parasita e, conseqüentemente, na determinação do seu potencial como reservatório
(Roque et al., 2005).
Ainda são raros os estudos de interação parasito-hospedeiro que empregam como
modelo experimental hospedeiros silvestres (Maldonado et al., 1994; Travi et al., 2002;
Roque et al., 2005). Isto se deve, entre outras razões, às dificuldades de se padronizar o
manejo adequado para a manutenção de colônias de animais silvestres, resultando
invariavelmente em colônias efêmeras, mantidas somente durante o período de
experimentação, sem que se disponibilize para o meio científico as informações sobre a
criação dos animais. Ainda assim, algumas espécies de roedores silvestres (por seu
pequeno porte, tempo de geração curto e boa adaptabilidade ao cativeiro) têm sido objeto
de tentativas bem sucedidas na sua criação em laboratório, obtendo-se dados importantes
sobre seu desenvolvimento e crescimento pós-natal, parâmetros fisiológicos e biologia
reprodutiva (D’Andrea et al., 2002; Teixeira et al., 2005). Um melhor entendimento do papel
de um hospedeiro natural no ciclo silvestre de transmissão de um dado parasita pode
fornecer subsídios para o controle mais efetivo de endemias que afetam ao homem.
1.7 Roedores caviomorfos do gênero Thrichomys
Os roedores da sub-ordem Caviomorpha à qual pertencem os Thrichomys sp.
(Rodentia, Echimyidae) não são autóctones e os primeiros achados destes roedores na
América do Sul remotam ao Eoceno ou início do Oligoceno. Estes mais antigos roedores
sul-americanos parecem ter migrado a bordo de troncos e ilhas flutuantes, mas ainda se
discute se oriundos da América do Norte (Wood, 1973), da Ásia, através de uma rota de
colonização pela Austrália e Antártica (Huchon & Douzery, 2001) ou, na hipótese mais
aceita atualmente, oriundos da África, numa época em que os dois continentes não eram tão
afastados e as correntes marítimas favoreciam a migração, que podia acontecer num
período de 14 a18 dias (Lavocat, 1974; Flynn & Wyss, 1998).
As espécies do gênero Thrichomys compreendem alguns dos pequenos mamíferos
mais abundantes do Cerrado, Caatinga e Pantanal brasileiros, distribuindo-se por todo
cinturão de vegetação aberta do país (Bonvicino et al., 2002). Estão preferencialmente
associados a refúgios mésicos e habitats rochosos (serras, serrotes e lajeiros) na Caatinga
(Streilein, 1982). No Cerrado são encontrados em áreas abertas com extrato herbáceo,
arvoredos de cerrado fechado ou de árvores baixas e em matas invadidas por pastagens.
No Pantanal, são encontrados em matas secundárias, capoeiras e regiões de gramíneas e
pastagens.
_______________________________________________________________________introdução
15
O gênero Thrichomys foi, durante muito tempo, considerado monoespecífico, sendo
todos os exemplares pertencentes à espécies Thrichomys apereoides (Woods, 1993).
Apenas recentemente, a partir da análise em conjunto de dados moleculares, cariotípicos e
de distribuição geográfica, que Braggio & Bonvicino (2004) puderam concluir que o gênero
Thrichomys é, de fato, composto por um grupo complexo de espécies e populações
distribuídas em uma ampla área geográfica, cujos mecanismos de especiação ainda não
são totalmente compreendidos. As espécies recém-definidas para este gênero são
morfologicamente indistinguíveis e, por isso, consideradas crípticas. Essas espécies estão
assim localizadas: T. pachyurus na parte oeste do Brasil (Mato Grosso do Sul e norte de
São Paulo); T. apereoides do oeste de Minas Gerais a Goiás; T. laurentius do Ceará a
Bahia; T. inermis na Bahia e Thrichomys sp nov. na parte central do país (Goiás e
Tocantins) (Bonvicino et al., 2002; Braggio & Bonvicino, 2004; Borodin et al., 2006). As
diferenças inter-específicas são ainda corroboradas pelos estudos que demonstraram
diferenças nos parâmetros reprodutivos (Teixeira et al., 2005) e nos padrões de infecção por
Trypanosoma cruzi (Roque et al., 2005) entre T. laurentius e T. pachyurus. A identificação
específica passa pela necessidade da análise genética por cariótipo, uma vez que cada uma
dessas espécies apresentam diferentes números diplóides, podendo ser reconhecido um
padrão de redução do número diplóide, ao longo da distribuição do gênero, em uma direção
oeste-leste (Pessôa et al., 2004).
Diversos aspectos ressaltam a importância de se estudar os roedores caviomorfos do
gênero Thrichomys e sua interação com tripanosomatídeos. A entrada deste grupo de
roedores nas Américas, há 37 milhões de anos, é apontada como o marco da divergência
de Trypanosoma cruzi em grupos filogeneticamente distintos (TcI e TcII), sugerindo-se que
TcII tenha se adaptado a esses novos hospedeiros e com isso direcionado seu processo
evolutivo (Briones et al., 1999; Gaunt & Miles, 2000). Também já foi sugerida uma
associação entre a chegada destes roedores na América do Sul e a entrada de novas
espécies do sub-gênero Leishmania, provavelmente devido a roedores infectados que,
carreando os agentes etiológicos, estabeleceram novos ciclos de transmissão (Thomaz-
Soccol et al., 1993).
Estudos de campo (Herrera et al., 2005) e de laboratório (Herrera et al., 2004; Roque
et al., 2005) confirmaram a inserção de T. laurentius e T. pachyurus nos ciclos de
transmissão do Trypanosoma cruzi, embora com importantes diferenças no potencial de
manutenção e amplificação do foco enzoótico da doença. T. pachyurus também já foram
encontrados infectados por T. evansi no Pantanal e sua infecção experimental resultou em
altas e longas parasitemias, o que não fora observado em nenhum camundongo ou cobaio
infectado sob as mesmas condições (Jansen AM, comunicação pessoal). A participação
desses roedores no ciclo de transmissão das leishmânias foi demonstrado a partir do
encontro de T. apereoides naturalmente infectados por espécies de Leishmania dos
_______________________________________________________________________introdução
16
complexos L. mexicana e L. donovani, numa área endêmica de leishmaniose cutânea e
visceral em Minas Gerais (Oliveira et al., 2005).
1.8 Papel dos mamíferos domésticos
A domesticação de animais para fins de alimento, caça e trabalho data de mais de 10
mil anos, sendo a ovelha considerada o primeiro animal domesticado, há 14 mil anos. A
domesticação de cães e gatos data de 10 e 5 mil anos, respectivamente, e a utilização
destes, principalmente para fins de companhia, estende-se por todas as partes do globo
(Lobão, 1992; Sá, 2002). O manejo das diferentes espécies domesticadas varia de uma
para outra região. Assim, cães normalmente são criados soltos em áreas rurais, mas não
nos centros urbanos. Porcos são comumente criados confinados em chiqueiros, mas em
algumas áreas ribeirinhas Amazônicas, sua criação é semi-extensiva e esses animais
forrageiam seu próprio alimento na mata. A importância desse manejo está no fato de que
animais domésticos criados de forma não confinada podem atuar como elo entre os ciclos
de transmissão silvestre e domiciliar.
A destruição dos ecossistemas tem levado as populações de mamíferos silvestres a
uma restrição de área e alimentos, além de promover um maior contato com o homem e
seus dejetos. A escassez de fontes alimentares para vetores (perda de fauna silvestre) e
animais silvestres (destruição do ambiente) faz com que esses animais se aproximem de
áreas domiciliadas, onde os animais domésticos estão naturalmente mais expostos que os
homens. A infecção nesses animais pode ocorrer de diferentes formas, assim como no
homem: (i) eliminação do parasito durante repasto sanguíneo; (ii) ingestão (acidental ou
não) de vetores; (iii) predação (por cães) de pequenos mamíferos silvestres infectados,
como roedores e gambás; e (iv) alimentos contaminados por fezes de triatomíneos e/ou
gambás infectados (no caso específico do Trypanosoma cruzi).
No Brasil, cães, gatos, porcos e caprinos são principais mamíferos domésticos
investigados frente à infecção por Trypanosoma cruzi. Cães e gatos podem ser excelentes
reservatórios do T. cruzi, mas no Brasil muito raramente são obtidos hemocultivos ou
xenodiagnósticos positivos nesses animais (Noireau et al., 2009). Situação oposta pode ser
observada na região do Gran Chaco Argentino, onde esses animais representam os
principais amplificadores das populações parasitárias de T. cruzi (Gurtler et al., 2007).
Caprinos também se infectam com o parasito, como observado pelo diagnóstico sorológico
(Herrera et al., 2005). Em relação aos porcos, apesar de estarem expostos ao ciclo de
transmissão, há apenas um relato disponível de isolamento de parasitos em porcos
(Salazar-Schettino et al., 1997) e seu papel como reservatório ainda precisa ser mais bem
estudado.
_______________________________________________________________________introdução
17
O papel do cão doméstico como reservatório de Leishmania infantum é bastante
conhecido e é consenso entre a comunidade científica e as autoridades de saúde que a
presença de cães infectados que sejam transmissores ao inseto vetor (ou seja, apenas
aqueles com parasitos na pele) constitui fator de risco para a ocorrência de casos humanos
da doença (Ministério da Saúde, 2006). Apesar dos relatos serem mais escassos, a
participação dos gatos nos ciclos de transmissão de L. infantum também já foi sugerida
(Savani et al., 2004; da Silva et al., 2008; Maia et al., 2008). Além de L. infantum, os cães
também são hospedeiros de outras espécies, como L. braziliensis, L. amazonensis, L.
peruviana, L. panamensis e L. colombiensis (Delgado et al., 1993; Reithinger e Davies,
1999; Tolezano et al., 2007). Em relação a estas espécies, os cães são considerados
apenas hospedeiros incidentais. No caso da L. braziliensis, apesar de termos vistos em
vários locais o estabelecimento de um ciclo domiciliar de Leishmaniose Tegumentar, são
poucas as evidências de que abundância de cães na região ou ser dono ou não de cão
aumentem as chances de aparecimento de casos humanos (Reithinger e Davies, 1999).
A presença de cães infectados por Leishmania infantum numa área representa um
sinal de alerta importante, visto que casos de Leishmaniose Visceral Canina (LVC) são mais
prevalentes e geralmente precedem à ocorrência de casos humanos (Falqueto et al., 2009).
Os cães podem apresentar um caráter viscero-cutâneo da infecção, o que resulta na sua
competência como fonte de infecção para o vetor, o qual pode transmitir o parasito a outros
mamíferos, entre os quais o próprio homem. Nesses animais a LVC resulta em um espectro
de manifestações que variam desde infecções auto-resolutivas e circunscritas até formas
viscero-cutâneas graves e disseminadas (revisto por Dantas-Torres, 2007). Como em toda
parasitose a ocorrência de poucos ou muitos desses sintomas depende de outros fatores
que não são inerentes apenas ao parasito, como o estado imunológico do animal, a
presença de co-infecções e as condições do ambiente onde o cão está inserido (Falqueto et
al., 2009). Apesar da importância dos cães na epidemiologia da leishmaniose visceral ser
reconhecida há bastante tempo, muitos aspectos da LVC ainda representam um desafio,
tais como: a) a transmissibilidade do parasito não é diretamente relacionada à
sintomatologia ou titulação de anticorpos nos cães; b) não há ainda consenso da relação
custo-benefício e efetividade da vacina atualmente disponível; c) os fatores que levam ao
maior ou menor parasitismo na pele dos cães ainda são desconhecidos; e d) diferentes
regiões geográficas apresentam perfis completamente distintos da infecção canina (revisto
por Roque e Jansen, 2008a; Falqueto et al., 2009).
______________________________________________________________________justificativa
18
A proposição de efetivas medidas de controle para doença de Chagas e
Leishmanioses depende do conhecimento de todos os fatores envolvidos na transmissão de
seus agentes etiológicos, Trypanosoma cruzi e Leishmania spp. Conforme apresentado, os
ciclos de transmissão desses parasitos são complexos, multi-variáveis e envolvem uma
grande diversidade de hospedeiros mamíferos e vetores hematófagos em distintos biomas e
habitats. Este sistema complexo inclui o parasita e suas distintas subpopulações, as
diversas espécies de hospedeiros mamíferos e vetores hematófagos, e o ambiente onde
estão inseridos. Os componentes do sistema constituem os pilares que sustentam a
manutenção do ciclo de transmissão desses parasitos em um determinado ambiente.
Apesar de T. cruzi e Leishmania spp serem responsáveis por zoonoses antes
restritas apenas a animais silvestres, a maioria dos estudos nesses animais limita-se a
relatos pontuais da presença do parasito em uma determinada espécie de hospedeiro sem
que sejam fornecidas informações sobre as peculiaridades dessa interação e sua
importância, o papel que desempenham nos ciclos de transmissão ou o ambiente em que
este ocorre. A falta de estudos que considerem todos os componentes do sistema influencia
diretamente nas atuais medidas de vigilância e controle da doença de Chagas e
Leishmanioses, que certamente poderiam ser mais efetivas se levassem em consideração
as peculiaridades de cada área de ocorrência, os perfis de infecção e a participação dos
hospedeiros silvestres na manutenção dessas parasitoses.
Esta tese aborda a interação de T. cruzi e Leishmania spp. com seus hospedeiros
mamíferos e fundamenta-se na necessidade de compreender todos os elos da cadeia de
transmissão destes tripanosomatídeos, e, com isto, contribuir para o estabelecimento de
normas adequadas de vigilância epidemiológica e/ou controle.
___________________________________________________________________________OBJETIVOs
19
3. Objetivo Geral
Aprofundar o conhecimento da interação de Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum
e L. braziliensis (Trypanosomatidae; Kinetoplastida) com hospedeiros mamíferos domésticos
e silvestres em condições naturais e experimentais buscando avaliar o potencial destes na
manutenção dos ciclos silvestres de transmissão e gerando assim, conhecimentos que
possam nortear o estabelecimento de normas de vigilância epidemiológica das
Leishmanioses e da doença de Chagas.
3.1 Objetivos específicos
3.1.1. Diagnosticar e avaliar o perfil da infecção por Trypanosoma cruzi em
mamíferos domésticos e silvestres em áreas de surtos de doença de Chagas Aguda por via
oral no Brasil;
3.1.2. Caracterizar o cenário enzoótico em cada uma das áreas de surtos de doença
de Chagas aguda e identificar fatores comuns de risco que possam ser utilizados em
programas de vigilância sustentável;
3.1.3. Acompanhar a cinética da infecção experimental de Thrichomys laurentius
pelos principais agentes etiológicos das leishmanioses no Brasil (Leishmania braziliensis e
L. infantum);
3.1.4. Definir o papel que roedores do gênero Thrichomys podem desempenhar no
ciclo epidemiológico dessa doença;
3.1.5. Avaliar abordagens metodológicas distintas que são utilizadas no diagnóstico
da infecção de animais silvestres e domésticos por T. cruzi e Leishmania sp. e sua
interpretação na definição de reservatórios;
______________________________________________________________________________bloco 1
20
TRYPANOSOMA CRUZI TRANSMISSION CYCLE AMONG WILD AND DOMESTIC
MAMMALS IN THREE AREAS OF ORALLY TRANSMITTED CHAGAS DISEASE
OUTBREAKS.
A. L. R. Roque; S. C. C. Xavier, M. G. da Rocha, A. C. M. Duarte, P. S. D’Andrea,
A. M. Jansen
Artigo publicado na American Journal of Tropical Medicine and Hygiene
2008; 79(5): 742–749
Trypanosoma cruzi Transmission Cycle Among Wild and Domestic Mammals in Three
Areas of Orally Transmitted Chagas Disease Outbreaks
André Luiz R. Roque, Samanta C. C. Xavier, Marconny G. da Rocha, Ana Cláudia M. Duarte, Paulo S. D’Andrea,
and Ana M. Jansen*
Laboratory of Tripanosomatid Biology, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil; Laboratory of Leishmaniasis
Research, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil; Laboratory of Biology and Parasitology of Wild Reservoir
Mammals, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil
Abstract. We report Trypanosoma cruzi infection in wild and domestic mammals from three orally acquired Chagas
disease outbreak areas in Brazil. Cachoeiro do Arari (Pará) displayed a panzootic scenery (positive mammals in all
ecologic strata), and human cases were probably the consequence of their exposure within the sylvatic T. cruzi trans-
mission cycle. In Navegantes (Santa Catarina), Didelphis spp. was the main reservoir host, given that 93% were infected.
In Redenção (Ceará), Monodelphis domestica and Thrichomys laurentius were also important for parasite maintenance.
TCI was present in the three studied areas. Additionally, Z3 was detected in an armadillo from Pará and TCII in a
triatomine from Navegantes. Domestic animals showed a high seroprevalence and should be considered sentinels in
surveillance programs. The importance of a reduction in wild mammalian fauna diversity and selection of suitable T.
cruzi reservoir hosts are discussed as risk factors for the re-emergence of Chagas disease.
INTRODUCTION
Since June 2006, Brazil has been considered free from Cha-
gas disease transmission caused by Triatoma infestans. This
was the conclusion of the 15th annual meeting of the Inter-
governmental Commission of the Southern Cone Initiative
against Chagas disease.
1
Nevertheless, this statement is far
from descriptive of the possibility of Trypanosoma cruzi
transmission to humans. That is because intradomiciliary
transmission caused by T. infestans, an introduced exogenous
species,
2,3
represents an important, but not the only, mecha-
nism of human infection. The other forms of transmission
include organ transplantation, blood transfusion, congenital
routes, and oral transmission because of the ingestion of con-
taminated food.
4
The latter is currently acquiring an impor-
tant role in Brazil.
5,6
The causative agent of Chagas disease, T. cruzi, is a dige-
netic kinetoplastid, primarily an enzootic parasite that dis-
plays great genetic variability, mainly attributed to a long
clonal evolution process in its almost 100 wild mammal host
species.
7
In South America, T. cruzi has circulated in the
autochthonous mammalian fauna since its speciation.
8,9
Since
that time, it continuously spread into the fauna that arrived
from 40 to 5 million years (myr) ago in different migration
waves.
10,11
The first evidence of human infection by T. cruzi
came from Andean mummified human tissue, ∼9,000 years
ago.
12
Others also found T. cruzi DNA from mummified hu-
man tissue from 7,000 years ago in Brazil.
13
In fact, humans
probably entered in the T. cruzi transmission cycle immedi-
ately on their arrival in America.
Two main genotypes of the parasite (TCI and TCII) can be
distinguished, whereas the relatedness of a third one (Z3) is
still under debate.
14,15
Thus far, the three genotypes have
been described infecting wild mammals throughout the coun-
try, except in the Amazonian region where TCII has not been
described as yet. In the Pantanal region, TCI and TCII may
be found infecting mammals in a similar ratio, whereas Z3-
infected mammals are less numerous. Moreover, in this biome
that displays an impressive diversity of mammal hosts, these
genotypes may be observed in single or mixed infections in all
possible combinations.
16
Concerning human cases in Brazil, except for the Amazo-
nian region, they have always been associated with TCII, but
even this assumption has come into question. Parasites ob-
tained from infected patients in Icoaraci (Pará state [PA]) and
Catolé do Rocha (Paraíba state [PB]) were characterized as
TCI.
17
In contrast, all the isolates derived from humans in-
fected during the outbreak in Navegantes (Santa Catarina
state [SC]) in 2005 belonged to the TCII genotype.
18
Although ignored by the Southern Cone Initiative, orally
acquired infection is not a recent epidemiologic picture in
Chagas disease. The first description of this kind of transmis-
sion was attributed to, among others sources, food contami-
nated by opossum urine.
19
This was almost 20 years before
the description of the extracellular cycle of T. cruzi in the
opossum’s anal gland.
20
Almost 30 years passed before new
cases of human disease contracted by digestive infection were
reported, this time associated with sugar cane in the north-
eastern parts of Brazil in Paraíba state.
21
In recent years,
these oral outbreaks have become more frequent, and several
human cases have been reported. These cases occurred in
different localities of the country that were formerly not con-
sidered endemic for Chagas disease and were always associ-
ated with severe acute forms of the disease and human deaths.
These epidemic outbreaks were seen, among others, in 1)
Navegantes (SC, south Brazil), 2005, attributed to sugar cane
juice ingestion; 2) Santana (Amapá state [AP], Amazonian
basin), 2005, attributed to the ingestion of contaminated Açaí
juice, a regional fruit; 3) Redenção (Ceará state [CE], north-
eastern Brazil), 2006, attributed to ingestion of contaminated
soup; 4) Macaúbas (Bahia state [BA], northeastern Brazil),
2006; and 5) Santarém, Belém, and Cachoeiro do Arari (PA,
north Brazil), 2006, attributed to the ingestion of the regional
fruits, Açaí and Bacaba.
5,18,22,23
To understand the environmental changes that could be
implicated in these outbreaks, we studied the domestic and
wild mammalian fauna in the influence area of occurrence of
* Address correspondence to Ana M. Jansen, Laboratory of Tripa-
nosomatid Biology, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Av. Brasil
4365, Pav. Carlos Chagas, 3 andar, CEP 21040-900, Rio de Janeiro/
RJ, Brazil. E-mail: [email protected]
Am. J. Trop. Med. Hyg., 79(5), 2008, pp. 742–749
Copyright © 2008 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene
742
three Chagas disease outbreaks: Navegantes (SC), Redenção
(CE), and Cachoeiro do Arari (PA). Beyond the classic pic-
ture of the entrance of humans into the active transmission
cycle of the parasite, the reduction of wild mammalian fauna
diversity and the selection of suitable reservoirs were exam-
ined as risk factors for the outbreaks. The zoonotic sceneries
of each place are discussed.
MATERIALS AND METHODS
Study areas. Expeditions were conducted shortly after the
Chagas disease outbreaks in April 2005 (Navegantes/SC) and
May and November 2006 (Redenção/CE and Cachoeiro do
Arari/PA, respectively; Figure 1). In all of these places, wild
and domestic animals in the areas where the human cases
occurred were studied.
Navegantes is located around latitude 26°52Ј48Љ and longi-
tude 48°39Ј00Љ, at 2 m above sea level on the cost of the Santa
Catarina state. The population is estimated to be 45,000 in-
habitants and has a tropical climate, with temperatures rang-
ing between 10°C and 35°C. The predominant biome is the
Atlantic rainforest. In all collection areas, herbaceous and
forest fragments were surrounded by extensive areas of agri-
culture. Animals and bugs from the forest fragment behind
the shoal where human infections took place were examined,
as well as animals from a small town and forest fragments
near that shoal.
Redenção is located in the Baturité mountain range region,
around latitude 4°13Ј32Љ and longitude 38°43Ј50Љ,at89m
above sea level. The population is estimated to be ∼26,000;
the climate is semi-arid with scarce rainfall between January
and April and temperatures ranging between 24°C and 35°C.
The collection area, originally part of a tropical semi-humid
forest, is currently characterized by secondary vegetation con-
sisting of low trees (Յ 6 m), rocky formations, and remnant
patches of semi-humid forest near deforested areas occupied
by monoculture plantations or unplanned household occupa-
tion (slum).
Cachoeiro do Arari is one of the cities included in Marajó
Island, located around latitude 01°00Ј41Љ and longitude
48°57Ј48Љ, at 20 m above sea level. Only 17,000 inhabitants are
living in an area of 3,117 km
2
. The climate is characterized as
FIGURE 1. Map of the distribution of recent Chagas disease outbreaks in Brazil (Navegantes city—April 2005; Redenção and Cachoeiro do
Arari cities—May and November 2006, respectively) and their representative natural environments involved in the T. cruzi transmission cycle.
ⅥסT. cruzi–infected Didelphis spp. and Triatoma tibiamaculata were found in palm trees immediately behind the shoal where human infections
took place and in forest fragments that surround the shoal. Infected opossums and dogs were also found in a small town and in forest fragments
near that shoal. ᮡסAll collected small mammal species (N ס 4) were found to be infected by T. cruzi in the forest fragments behind the slum
where human infections took place. Three of these four species were also captured and found to be infected by T. cruzi in rural areas of this
municipality. ᭹ ס Panzootic scenery where T. cruzi–infected mammals were captured in all of the forest strata (terrestrial, arboreal, and flying
animals), in an Amazonian area characterized by an extensive Açaí fruit monoculture with a few remaining patches of the original vegetation. This
figure appears in color online at www.ajtmh.org.
T. CRUZI IN MAMMALS FROM HUMAN OUTBREAK AREAS 743
tropical humid, displaying regular rainfalls and winds, and
temperatures range between 27°C and 36°C. The area is
known as varzean, a freshwater swamp forest. In most of the
collection areas, the original native vegetation (Amazonian
forest) is being replaced by an extensive Açaí fruit monocul-
ture with a few remaining patches of the original vegetation at
the river banks.
Wild mammal studies. For each place, linear transects were
generated, and the capture points were established with
Tomahawk (Tomahawk Live Traps, Tomahawk, WI) and
Sherman (H. B. Sherman Traps, Tallahassee, FL) baited with
a mixture of peanut butter, banana, oat, and bacon and set 20
m apart along linear transactions in all kind of vegetation
formations and habitats. The total effort was 820 (SC), 960
(CE), and 1,100 traps/night (PA), and the capture success
was 2.6% (SC), 2.9% (CE), and 2.4% (PA). The trapped
animals were taken to the field laboratory, Յ 2 km from the
capture point, where the remaining procedures were under-
taken. All manipulators were adequately dressed with pro-
tective equipment, following protocols approved by the
FIOCRUZ Committees of Biosafety and of Bioethics (license
0179-03). The wild animal captures were licensed by the Bra-
zilian Institute of Environment and Renewable Natural Re-
sources (IBAMA) licenses 068-2005 and 225-2006 (IBAMA/
CGFAU/LIC). For each captured species, morphological
identification, reproductive condition, and age estimation
(body weight for rodents and degree of tooth eruption for
marsupials) were recorded. The identification of rodents and
bats was confirmed by karyriologic analyses as described else-
where.
24
Sample collection. Blood was collected from domestic ani-
mals (dogs and pigs) by puncture of the cephalic vein in hep-
arinized vacutainers, with the informed consent of their own-
ers. These blood samples were carried to the field laboratory
for further procedures. Wild animals were anesthetized (ke-
tamine, 100 mg/kg) and had their blood collected by cardiac
puncture in non-heparinized tubes. Fresh blood samples were
gathered and processed as follows: 0.2–0.4 mL of blood was
cultured in two tubes containing Novy-Mc Neal-Nicole me-
dium (NNN) with a liver infusion tryptose medium (LIT)
overlay. The remaining blood was centrifuged, and the serum
or plasma obtained was stored at −20°C. Although triatomine
collection was not the aim of our work, bugs from Naveg-
antes/SC, when observed in domestic or peridomestic areas,
were collected. If tripomastigote forms were seen, the ani-
mal’s feces were cultured in tubes containing NNN with a LIT
overlay. A total of nine insects were examined.
Parasitologic and serologic diagnostic procedures. The
fresh blood samples from all animals and the anal glands of
Didelphis specimens were microscopically examined in the
field laboratory for the presence of T. cruzi. In our laboratory,
the hemocultures were examined every other week for 5
months. Positive hemocultures were amplified for cryopres-
ervation and molecular characterization.
Serologic diagnoses were obtained using the indirect im-
munofluorescence antibody test (IFAT), performed with the
adapted IFI-Chagas Bio-Manguinhos Kit (Fiocruz, Rio de Ja-
neiro, Brazil).
25
Muridae rodents’ sera were tested with fluo-
rescein isothiocyanate (FITC) anti-rat, whereas domestic ani-
mals were tested with their respective anti-species IgG
(Sigma, St. Louis, MO) conjugate. Echimyidae rodent and
marsupial serologic diagnoses were performed with specific
intermediary antibodies anti-opossum and anti-Thrichomys
sera previously raised in rabbits, and the reaction was visual-
ized using the FITC-labeled anti-rabbit serum (Sigma). The
cut-off value for wild animals was 1:40 for marsupials and 1:10
for the others, as adopted in other studies. These cut-off val-
ues were based on the lowest serum dilution of an animal with
positive hemoculture in previous studies of our group.
26,27
For domestic animals, the cut-off value adopted was 1:40, as
suggested by the Ministry of Health.
28
The dogs were also
screened for Leishmania infection using an IFI-Leishmania
Bio-Manguinhos Kit (Fiocruz). Dogs with higher serologic
titers for Leishmania than T. cruzi were not considered in-
fected by T. cruzi. When the amount of blood was not suffi-
cient, priority was given to hemoculture. Animals were con-
sidered infected by T. cruzi when serologic analysis or hemo-
culture was positive. Hemoculture prevalence was calculated
considering the seropositive animals.
Molecular characterization of the parasites. The amplified
positive hemocultures derived from mammals (N ס 17) and
triatomines (N ס 3) were incubated at 56°C for 2 hours with
100 ␮g/mL proteinase K and 0.5% sodium dodecyl sulfate
(SDS). Genomic DNA was extracted from parasite lysates
using phenol-chloroform (1:1) and precipitated with sodium
acetate and ethanol.
29
A miniexon Multiplex PCR assay was
performed using the following primers: TCI, 5Ј-ACA-
CTTTCTGTGGCGCTGATCG-3Ј; TCII, 5Ј-TTGCTCGCA-
CACTCGGCTGATCG-3Ј; Z3, 5Ј-CCGCGWACAAC-
CCCTMATAAAAATG-3Ј; Trypanosoma rangeli, 5Ј-
CCTATTGTGATCCCCATCTTCG-3Ј; and the conserved
region of miniexon gene 5Ј-TACCAATATAGTACAGA-
AACTG-3Ј.
30
The amplified polymerase chain reaction
(PCR) products were analyzed in ethidium bromide–stained
agarose gel electrophoresis (2%) and visualized under UV
light.
RESULTS
Each one of the outbreak’s locations showed a unique epi-
demiologic scenery concerning the fauna composition in-
volved in parasite maintenance in the wild and the degree of
human disturbance (Figure 1). In Navegantes and Redenção,
the small mammalian fauna was predominantly composed of
synantropic animals. In Navegantes, the suitable reservoir
species were Didelphis aurita and D. albiventris, which dis-
played high parasitemia, as expressed by the high prevalence
of positive hemocultures. In Redenção, the small mammalian
fauna diversity was restricted to three species: D. albiventris,
Monodelphis domestica, and Thrichomys laurentius. The
more preserved area, Cachoeiro do Arari, displayed the
higher diversity of small mammalian fauna (N ס 8 species)
and a panzootic scenery, with positive hemocultures in mam-
mals captured in all of the forest strata (terrestrial, arboreal,
and flying mammals).
Trypanosoma cruzi infection in wild mammals and triatom-
ines. Trypanosoma cruzi infection in mammals was mainly
sub-patent because only two marsupial species (one D. albi-
ventris from Navegantes and one M. domestica from Re-
denção) displayed tripomastigote forms in fresh blood prepa-
rations and no parasites were observed in the anal glands.
Species of the synantropic marsupial genus Didelphis com-
prised the unique small mammalian host present in all areas
studied, displaying a high relative abundance. The overall
ROQUE AND OTHERS744
positive seroprevalence of this genus reached 88.5%, and
positive hemocultures were detected in 52.2% of the infected
animals (Tables 1–3).
In Navegantes (SC), only the synantropic genus Didelphis
represented the main reservoir system due to their high trans-
mission potential, as shown by the high prevalence of positive
hemocultures and high relative abundance of these species. In
addition, these mammals were the only two species infected
by T. cruzi, and 67% of them were captured in peridomestic
areas (Table 1). In Navegantes, the two main genotypes of the
parasite (TCI and TCII) were isolated from two infected bugs
collected in the palm trees, immediately beneath the area
where infected opossums were also collected and near the
shoal where humans became infected. Another bug was col-
lected inside a residence, and its isolate was characterized as
TCII.
In Redenção (CE), where only synantropic species were
collected, young animals prevailed throughout (64.3%). All
collected rodent species were involved in the maintenance of
the parasite transmission, because all of them were seropos-
itive (Table 2). Marsupials were involved not only in the
maintenance but also in the amplification of the T. cruzi
transmission cycle, because 56% of positive hemocultures
were obtained from 60% of the infected animals, with three
coming from seronegative animals (Table 2). One M. domes-
tica showed trypanosomatids in a fresh blood smear. An ac-
tive peridomiciliary transmission cycle could be observed,
given that representatives of the collected species (28.6%)
were found in peridomestic areas, showing 75% serum posi-
tivity and 33.3% positive hemocultures.
In comparison to the other outbreak areas, Cachoeiro do
Arari (PA) displayed the highest mammalian fauna diversity
(Table 3). All collected species except two showed high suit-
ability as reservoirs (high transmissibility) because positive
hemocultures were obtained from all of them. The most abun-
dant species were Proechimys goeldii, D. marsupialis, and
Hylaeamys spp. (סOryzomys spp.). Of these species, D. mar-
supialis displayed the higher serum and hemoculture preva-
lence (Table 3). It is worth mentioning that hemoculture-
positive–tested animals were captured in all of the forest
strata, pointing to a complex and well-established transmis-
sion cycle in this study area.
Altogether, 17 isolates were obtained from mammals. All
of them were characterized as TCI, except one from the Dasy-
pus novemcintus captured in Cachoeiro do Arari, which was
characterized as Z3.
Trypanosoma cruzi infection in the domestic mammals. In
all studied areas, domestic animals were exposed to infection,
as shown by the presence of anti-T. cruzi antibodies, but they
seem to play a minor role in the T. cruzi transmission net.
Actually, despite the high seroprevalence observed in dogs
and pigs (Table 4), all of them displayed low parasitemias
given that no positive hemoculture was achieved (N ס 37),
and fresh blood sample examinations (N ס 84) were nega-
tive.
The pigs from Cachoeiro do Arari, which were predomi-
nantly (63.6%) settled in sylvatic areas (disturbed ones) near
açaí plantations, were the domestic animals with highest se-
roprevalence (72.7%).
DISCUSSION
The oral route is probably the most ancient dispersion
strategy of T. cruzi among mammals (including humans). The
efficiency of this route is attested by several reports on ex-
perimental infection of mice and opossums by ingestion of T.
cruzi–infected triatomines and/or mice.
31,32
In addition, it was
recently observed that the gastric juice improves the infective
potential of the parasite.
33,34
Indeed, infection by the oral
route may better explain infection of predators (top of food
webs) rather than skin contamination with infected feces of
triatomines in the often dense animal fur. This is also prob-
ably the case with primitive hunting communities that were
recognized consumers of raw meat
35
and probably were not
very concerned about washing hands or foodstuffs.
All of the cited outbreaks resulted from the ingestion of
comestibles contaminated with infected non-domiciliated tri-
atomines that occasionally entered human dwellings because
of attraction to light and food sources.
5,23
In fact, the increase
of flying activity of the triatomine winged stages in warmer
seasons has already been described.
6
Fragmentation and the
resultant habitat loss are the primary causes of loss of biodi-
versity because of 1) reduction or elimination of some habitat
specialist species, and therefore, of diversity; and 2) positive
selection of generalist species that can adapt and survive in
the consequent degradated habitats.
36,37
The consequence of
this process is the increased opportunity for contact among
humans, domestic animals, and wildlife.
38
Empirical evidence shows that habitat fragmentation can
increase or decrease disease prevalence within a host species,
depending on the specific biology of the host–parasite rela-
tionship.
39
Increased species diversity could reduce human
disease risk by impeding dominance of particular species that
act as suitable reservoirs of a given parasite. Therefore, de-
pending on the ability of the selected species to maintain
and/or amplify a given parasite, transmission of this parasite
TABLE 1
Capture and prevalence of infection by T. cruzi in the small mammalian fauna in Navegantes (Santa Catarina state, Brazil), just after the
occurrence of a Chagas disease outbreak in April 2005
Capture of the small mammalian fauna Prevalence of infection
Order Species Capture prevalence (number of animals) Serology (positive animals) Hemoculture (parasite recovery) Parasite characterization
Rodentia Akodon montensis 13.6% (3) 0% 0% –
Euryoryzomys russatus 13.6% (3) 0% 0% –
Mus musculus 4.5% (1) 0% ND –
Sphiggurus spp. 4.5% (1) ND 0% –
Marsupialia Didelphis albiventris 40.9% (9) 88.9% (8) 25.0% (2) ND
Didelphis aurita 22.7% (5) 100% (5) 60.0% (3) TCI (2)
Total 100% (22) 59.1% (13) 38.5% (5) TCI (2)
ND ס not determined.
T. CRUZI IN MAMMALS FROM HUMAN OUTBREAK AREAS 745
may be enhanced. The herein described epidemiologic profile
seems to be associated with at least one of the following fac-
tors: 1) loss of food sources for triatomines caused by defor-
estation and human colonization
40
; 2) reduction of mamma-
lian diversity and selection of suitable reservoirs
41–43
; and 3)
high wild mammalian infection rates.
44
The marsupials D. albiventris, D. aurita, D. marsupialis, and
M. domestica and the rodent species P. goeldii and T. lauren-
tius prevailed overall (Tables 1–3). The epidemiologic impor-
tance of these mammals is increased because all of them (ex-
cept for P. goeldii) are recognized synanthropic animals and
can approach human dwellings, acting as a link between the
transmission in sylvatic and peridomestic areas.
26,45,46
Navegantes and Redenção are unpreserved areas where
loss of biodiversity and habitat destruction are shown by both
aspects: the low diversity of small mammal species collected
and the exclusive presence of synantropic animals. In both
outbreak areas, the reduced small mammalian diversity and
the selection of suitable reservoir hosts of T. cruzi were the
common traits observed and should be considered as one of
the possible factors that enhanced chances of human infec-
tion. A similar scenery was already described for other para-
sitic diseases, such as Lyme disease, American Cutaneous
Leishmaniasis, Hantavirus, and West Nile virus.
44,46–49
More-
over, and considering T. cruzi, it was reported that habitat
fragmentation and loss of small mammal diversity may favor
transmission among wild small mammals in an Atlantic Rain
Forest landscape.
27
Small mammalian diversity reduction as-
sociated with an increase of suitable T. cruzi hosts enhances
the chance of the vector (triatomines) feeding on an infected
animal. This causes an increase in the parasite population,
and, as a result, the transmission cycle is amplified. It is hard
to imagine that the triatomines only recently started to fall
down in soups or juices. More likely, they always were acci-
dentally ingested by humans, especially during the summer,
when high temperatures favor bug activity. The absence of
infection is probably explained by the fact that fewer insects
and uninfected insects were involved in these cases.
Species of the genus Didelphis, considered the classic and
most important reservoirs of T. cruzi, are basically synan-
thropic and are favored by human disturbance. For these rea-
sons, they are highly prevalent in disturbed areas, and their
higher abundance is strongly indicative of a loss of small
mammalian diversity.
45,50
Indeed, opossums were the most
abundant captured animals and displayed the highest serum
and hemoculture prevalence in all studied areas. The impor-
tance of these animals is increased by the fact that they may
eventually act as vectors of the parasite, allowing parasite
transmission through food contaminated with their scent
gland contents.
19,20,51
In Navegantes, the two species of Didelphis were highly
abundant (65% of the collected mammals), and 93% of these
were infected. The five isolates obtained were characterized
as TCI, whereas both genotypes of the parasite could be iso-
lated from local triatomines. These results are in accordance
with another study of that outbreak, which also characterized
nine isolates from humans, all of them belonging to the TCII
genotype.
18
Considering the genotype involved in human in-
fection and the fact that both T. cruzi genotypes could be
detected in triatomines, the absence of TCII found infecting
mammals in our study may be explained by 1) selection of the
TCI genotype by any component involved in that parasitic net
or 2) the relative abundance of the mammals infected with
TCII was too low to allow their capture.
In Redenção, the local transmission net of T. cruzi was
shown to be dependent on three small mammal species. Here,
TABLE 3
Capture and prevalence of infection by T. cruzi in the small mammalian fauna in Cachoeiro do Arari (Pará state, Brazil), just after the occurrence
of a Chagas disease outbreak in November 2006
Capture of the small mammalian fauna Prevalence of infection
Order Species Capture prevalence (number of animals) Serology (positive animals) Hemoculture (parasite recovery) Parasite characterization
Rodentia Hylaeamys spp. 22.6% (7) 28.6% (2) 50.0% (1) TCI (1)
Proechimys goeldii 35.6% (11) 18.2% (1 + 1*) 50.0% (1) TCI (1)
Marsupialia Didelphis marsupialis 22.6% (7) 100% (7) 85.7% (6) TCI (6)
Marmosops parvidens 3.2% (1) 100% (1) 0% –
Edentata Dasypus novemcinctus 3.2% (1) ND 100% (1) Z3 (1)
Chiroptera Artibeus fimbriatus 3.2% (1) ND 100% (1) TCI (1)
Epitesicus spp. 6.4% (2) ND 50.0% (1) TCI (1)
Noctilio albiventris 3.2% (1) ND 0% –
Total 100% (31) 38.7% (12) 91.7% (11) TCI (10)/Z3 (1)
* Seronegative animal where parasites could be recovered.
ND ס not determined.
TABLE 2
Capture and prevalence of infection by T. cruzi in the small mammalian fauna in Redenção (Ceará state, Brazil), just after the occurrence of a
Chagas disease outbreak in May 2006
Capture of the small mammalian fauna Prevalence of infection
Order Species Capture prevalence (number of animals) Serology (positive animals) Hemoculture (parasite recovery) Parasite characterization
Rodentia Rattus rattus 7.1% (2) 100% (2) 0% –
Thrichomys laurentius 39.3% (11) 100% (11) 0% –
Marsupialia Didelphis albiventris 17.9% (5) 60.0% (3) 33.3% (1) TCI (1)
Monodelphis domestica 35.7% (10) 60.0% (3 + 3*) 66.7% (1 + 3*) TCI (3)
Total 100% (28) 78.6% (22) 22.7% (5) TCI (4)
* Seronegative animal where parasites could be recovered.
ROQUE AND OTHERS746
T. laurentius was shown to be highly exposed to infection and
important in maintaining the parasite cycle in the wild, as
noted by the high seroprevalence observed, even in recently
weaned animals. It has already been shown that T. cruzi ex-
perimental infection of this species results in severe tissue
damage that may predispose these rodents (especially the
young) to be predated on by larger mammals (e.g., adult
opossums), fostering parasite transmission.
52
In Redenção,
seropositive rodents displayed low parasitemias, because no
positive hemoculture was achieved. In contrast, M. domestica
and D. albiventris displayed higher parasitemia and, there-
fore, T. cruzi transmissibility potential, as expressed by the
elevated rates of positive hemocultures and the fact that one
M. domestica displayed tripomastigote forms in fresh blood
preparation, the only animal in this study with a positive
blood smear. The T. cruzi recovery from seronegative M.
domestica probably occurred because of a recent infection,
where specific antibodies could not yet be detected. Alto-
gether, these data suggest two distinct roles played by the
marsupials in Redenção: maintaining and transmitting the
parasite when predated on (in the same way as T. laurentius)
and transmitting to the triatomine vector.
Navegantes and Redenção displayed good overall condi-
tions and an urban profile, so humans do not continuously
expose themselves to the wild environment. Despite the high
prevalence of infection in the small mammalian fauna, the
outbreaks reported in these places can be considered acci-
dents that may happen again, but only idiosyncratically. In
contrast, Cachoeiro do Arari, an Amazonian varzean region,
displayed a panzootic scenery, shown by the high prevalence
of infection and positive hemocultures of almost all captured
mammals and a tight human interaction with the wild
environment. T. cruzi infection was spread among terrestrial,
arboreal, and flying mammals, showing that parasite trans-
mission was occurring in all ecologic strata. In this sense,
all collected animal species were shown to be suitable hosts
for T. cruzi and participate in the transmission cycle. Here,
the reduction of small mammalian diversity was not so
obvious, but one important sign was observed: the expressive
abundance of the marsupial D. marsupialis (Table 3). Indeed,
the high relative abundance of this reservoir species is an
early sign of environmental disturbance caused by human
action.
45,50
It is worth mentioning that, in comparison to
the other studied areas, Cachoeiro do Arari presents the
highest degree of preserved original biota and, consequently,
the lowest degree of environmental disturbance. Hence,
Cachoeiro do Arari showed the classic picture of acquisition
of Chagas disease as a consequence of the entrance of hu-
mans in a very wide and active wild transmission cycle of T.
cruzi.
Besides dogs, the domestic animals in the T. cruzi trans-
mission net in Cachoeiro do Arari also included pigs (Table
4). However, in both species, the parasitosis seems to have
reached its dead-end hosts, because 1) infectivity of triatom-
ines is not probable given that hemocultures of these animals
were all negative; 2) these animals have no natural predators
in the area; and 3) they seem to not be the main food sources
for triatomines because of the high availability of blood
sources in the wild.
Areas that present a predominance of monocultures (habi-
tat loss), a reduction in mammalian fauna diversity, and/or
domestic areas in close proximity to the wild are significant
candidates to increase and spread the T. cruzi transmission
net beyond wild habitats. In these areas, domestic animals
represent the last obstacle before parasite populations reach
humans. Indeed, domestic animals should be considered sen-
tinels of a T. cruzi transmission net, which have to be sur-
veyed to identify risk areas.
The panzootic situation observed in Cachoeiro do Arari
showed a very well-established and broad transmission cycle
of T. cruzi to which humans are highly exposed. The impact of
açaí exploitation, common throughout the Amazonian region,
represents an important threat to human health because new
cases continue to appear in other localities. The absence of
domiciliary triatomines has excluded the Amazonian region
from the Brazilian Chagas disease map for a long time. Pres-
ently, however, special attention should be given to this re-
gion because 1) large areas continue to be deforested and
replaced by Açaí monoculture; 2) human infection rates are
increasing in that region; and 3) local health professionals are
not qualified to face this new problem.
Altogether, the outbreaks of Chagas disease in such distinct
ecologic scenarios reflect the significant biological versatility
of T. cruzi and point to its highly complex epidemiology,
which still needs to be clarified. These outbreaks also point to
the importance of human action as a risk factor for the emer-
gence of the characteristic epidemiologic picture of orally
transmitted Chagas disease.
Infection through an oral route reflects the disease’s an-
cient transmission strategy among humans. Ancient men
probably acquired the infection predominantly through the
oral route, through consumption of raw meat. The vectorial
transmission, already important when the ancient hunter and
gatherer men started to use caves as shelter, regained impor-
tance a long time thereafter, in the mud dwellings built after
European colonization, when transmission was caused by do-
miciliated T. infestans. Presently, with the control of this tri-
atomine species and because of forest devastation, the oral
route once more assumes epidemiologic importance. This is
not a new epidemiologic profile of the parasite transmission
but a re-emergence of an ancient one.
Received March 12, 2008. Accepted for publication June 20, 2008.
Acknowledgments: The authors thank the Secretary of Health from
Santa Catarina and Pará states and the Endemy Nucleus from Ceará
state and their staff technicians for making this work possible. The
authors also thank Dr. Vera Bongertz for insightful comments and
English correction and the CGLab and Chagas disease National Con-
trol Program of the Brazilian Health Ministry, the Direction of the
Oswaldo Cruz Institute, and the Vice-presidency of Reference Ser-
vice and Environment for investing in our research.
T
ABLE 4
Serum prevalence of T. cruzi infection by immunofluorescence assay
in domestic animals examinated in areas where Chagas disease
outbreaks occurred in Brazil (Navegantes–Santa Catarina state—
April 2005, Redenção–Ceará state—May 2006, and Cachoeiro do
Arari–Pará state—November 2006)
Species
Localities
(total of animals)
Positive
animals
Serological
titers range
Dog SC (40) 50% (20) 1:40–1:80
CE (16) 18.7% (3) 1:40–1:80
PA (12) 41.7% (5) 1:40–1:80
Pig PA (11) 72.7% (8) 1:40–1:160
SC ס Santa Catarina State; CE ס Ceará state; PA ס Pará state.
T. CRUZI IN MAMMALS FROM HUMAN OUTBREAK AREAS 747
Financial support: This study was supported by IOC/FIOCRUZ,
VPSRA/FIOCRUZ, CGLab/MS, PAPES/FIOCRUZ, CNPq, and
FAPERJ.
Authors’ addresses: André Luiz R. Roque, Samanta C. C. Xavier,
Ana Cláudia M. Duarte, and Ana M. Jansen, Laboratory of Tripa-
nosomatid Biology, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Av. Brasil
4365, Pav. Carlos Chagas, 3 andar, CEP 21040-900, Rio de Janeiro/
RJ, Brazil, Tel: 55-21-25984324, Fax: 55-21-25606572, E-mail:
[email protected]. André Luiz R. Roque, Laboratory of Leish-
maniasis Research, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Av. Brasil
4365, Pav. Leônidas Deane, sala 509, CEP 21040-900, Rio de Janeiro/
RJ, Brazil, Tel: 55-21-38658226, E-mail: [email protected]. Mar-
conny G. da Rocha and Paulo S. D’Andrea, Laboratory of Biology
and Parasitology of Wild Reservoir Mammals, Oswaldo Cruz Insti-
tute, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, Pav. Arthur Neiva, sala 14, CEP
21040-900, Rio de Janeiro/RJ, Brazil, Tel: 55-21-25984338, Fax: 55-
21-22803740, E-mail: [email protected].
Reprint requests: André Luiz R. Roque, Laboratory of Tripanoso-
matid Biology, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365,
Pav. Carlos Chagas, 3 andar, CEP 21040-900, Rio de Janeiro/RJ,
Brazil, E-mail: [email protected].
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T. CRUZI IN MAMMALS FROM HUMAN OUTBREAK AREAS 749
_____________________________________________________________________________bloco 2
21
IMPORTÂNCIA DOS ANIMAIS DOMÉSTICOS SENTINELAS NA IDENTIFICAÇÃO
DE ÁREAS DE RISCO DE EMERGÊNCIA DE DOENÇA DE CHAGAS.
A. L. R. Roque; A. M. Jansen.
Prêmio Emmanuel Dias de melhor trabalho tema-livre em doença de
Chagas da 24a Reunião de Pesquisa Aplicada em doença de
Chagas/12a de Pesquisa Aplicada em Leishmanioses – Uberaba –
Outubro de 2008.
Artigo publicado na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical 2008; 41 (Sup III): 191–193.
191
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical
Vol: 41 (Suplemento III), 2008
XXIV Reunião Anual de Pesquisa Aplicada em Doença de Chagas
XII Reunião Anual de Pesquisa Aplicada em Leishmanioses
1. Laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz,
Rio de Janeiro, RJ
Apoio Financeiro: IOC/FIOCRUZ, VPSRA/FIOCRUZ, CGLab/MS, PAPES/FIOCRUZ,
CNPq, FAPERJ.
Endereço para correspondência: Dra. Ana Maria Jansen. Laboratório de Biologia
de Tripanosomatídeos/IOC/Fiocruz. Av. Brasil, 4365 – Pavilhão Carlos Chagas, 3º
andar – Manguinhos, 21040-900, Rio de Janeiro/RJ.
Tel: 55 21 2598-4324; Fax: 55 21 2560-6572
e-mail: jansen@ioc.fiocruz.br
Importância dos animais domésticos sentinelas na identificação
de áreas de risco de emergência de doença de Chagas
The importance of sentinel domestic animals to identify risk areas to the
emergence of Chagas disease
André Luiz R. Roque
1
e Ana Maria Jansen
1
RESUMO
Apresentamos resultados da infecção de animais silvestres e domésticos por Trypanosoma cruzi em três áreas de surtos de doença de Chagas aguda
por via oral, além de uma área controle. O papel dos animais domésticos como sentinelas é discutida como medida de vigilância epidemiológica na
identificação de áreas de risco.
Palavras-chaves: Trypanosoma cruzi, Surtos orais de doença de Chagas, Reservatórios, Animais sentinelas.
ABSTRACT
We report results of Trypanosoma cruzi infection in wild and domestic mammals from three areas where orally acquired Chagas disease outbreaks
occurred in Brazil, moreover a control area. The importance of domestic animals as sentinels is discussed in order to identify risk areas.
Key-words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease oral outbreaks, Reservoirs, Sentinel animal species.
Classicamente a doença de Chagas se caracterizava por
ser prevalente em populações rurais, onde eram encontrados
numerosos insetos vetores nas casas de pau-a-pique. A
eliminação da transmissão domiciliar por Triatoma infestans
resultou que o Brasil, e outros países da América do Sul, fossem
considerados livre desta modalidade de infecção pela Comissão
Intergovernamental do Cone Sul
1
. Entretanto, a transmissão
vetorial extradomiciliar, transmissão vetorial domiciliar ou
peridomiciliar sem colonização do vetor, e a contaminação de
alimentos por triatomíneos infectados representam desafios para
os quais as medidas de controle adotadas contra o T. infestans
não são eficazes.
O Trypanosoma cruzi é um parasito multi-hospedeiro capaz
de infectar mais de uma centena de espécies de mamíferos e
nestes, quase todos os tecidos. Entre seus vetores estão incluídos
dezenas de espécies de triatomíneos da família Reduviidae. Quase
todas suas formas evolutivas são capazes de infectar (à exceção
da forma epimastigota) e essa infecção se dá por diferentes vias:
contaminação de pele e mucosas com fezes de triatomíneos
infectados, transfusional, congênita e oral. A plasticidade biológica
do T. cruzi resulta em ciclos de transmissão na natureza que se
caracterizam por serem multivariáveis, complexos e peculiares
em escala temporal e espacial.
Não é de hoje que surtos de doença de Chagas aguda (DCA)
pela ingestão de alimentos contaminados são documentados. Mas
apenas recentemente esse perfil epidemiológico de transmissão
deixou de ocorrer em casos esporádicos para adquirir um
importante papel na epidemiologia da doença de Chagas, em
especial após a morte de 3 pessoas durante surto ocorrido em
Navegantes/SC, em 2005
2
.
Nesse trabalho, avaliamos a infecção por Trypanosoma cruzi
em animais silvestres, sinantrópicos e domésticos imediatamente
após a ocorrência dos surtos em Navegantes/SC (2005), Redenção/
CE e Cachoeiro do Arari/PA (2006). Uma quarta área, Panacauera,
município de Igarapé-Mirim/PA (2007), que não apresentava
casos agudos, também foi avaliada. Nosso objetivo foi o de buscar
um melhor entendimento dos fatores enzoóticos envolvidos nesse
novo/primitivo perfil epidemiológico de transmissão, bem como a
identificação de fatores comuns de risco que possam ser utilizados
em programas de vigilância sustentável.
Os cenários encontrados nas três áreas de surtos agudos foram
descritas anteriormente
3
. A região de Panacauera caracteriza-se
por ser uma região Amazônica alagada que apresenta severa
substituição da vegetação original por palmeiras de açaí. Esta
região apresentou uma situação inteiramente distinta das demais
onde surgiram surtos: a população local não aponta para a
observação de fauna de mamíferos na região, com escassos relatos
de ocorrência do marsupial Didelphis marsupialis.
Nas 4 localidades, pequenos mamíferos silvestres e
sinantrópicos foram capturados utilizando-se armadilhas do tipo
“live-traps” Tomahawk® (Tomahawk Live Traps CO.) e Sherman®
(H.B. Sherman Traps Inc.) dispostas em transectos montados em
diferentes habitats. O esforço total de captura (armadilhas/noite)
foi de 820 (Navegantes), 960 (Redenção), 1100 (Cachoeiro do
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XXIV Reunião Anual de Pesquisa Aplicada em Doença de Chagas
XII Reunião Anual de Pesquisa Aplicada em Leishmanioses
Arari) e 650 (Panacauera). Todos os animais foram levados ao
laboratório montado em local próximo onde eram anestesiados
(100 mg/kg IM de Dopalen®, Vetbrands, Jacareí/SP) e tinham
seu sangue coletado. A busca ativa por animais domésticos (cães
e porcos) ocorreu nas casas no entorno das trilhas montadas para
coleta de pequenos mamíferos. A coleta de sangue foi realizada
através de punção de veia cefálica utilizando-se tubos vacutainer
contendo anticoagulante. As capturas de pequenos mamíferos
foram realizadas de acordo com as licenças 068/05 e 225/06
do IBAMA. Todos os procedimentos com animais seguiram
protocolo aprovado no Comitê de Ética do uso de Animais da
Fiocruz (0179/03).
O diagnóstico de infecção por T. cruzi foi baseado em:
1) Exame a fresco de sangue a fresco - através da montagem
de uma lâmina de sangue de cada espécime examinado; 2)
Hemocultivo - realizada pela inoculação de sangue em tubos
contento meio de NNN (Nicolle, Novy and Mc Neal) com LIT
(Liver Infusion Triptose), sendo os tubos de hemocultura
examinados quinzenalmente por até cinco meses; 3) Sorologia
- através da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI),
segundo Camargo
4
. Os soros foram diluídos serialmente em uma
proporção decrescente de 2x (1:10 – 1:1280) e testados com Kit
de Diagnóstico IFI-Chagas – Bio-Manguinhos adaptado. Os soros
de roedores da família Muridae foram testados com IgG anti- rato
conjugado a Isotiocianato de Fluoresceína da Sigma® (St. Louis,
MO, EUA). Os roedores da família Echimyidae e os marsupiais
foram testados com anticorpos intermediários específicos anti-Ig
de Thrichomys sp. e anti-Ig de Didelphis sp obtidos em coelhos,
sendo a reação revelada utilizando-se IgG anti-coelho conjugado a
Isotiocianato de Fluoresceína da Sigma®. Os cães e porcos foram
testados com IgG anti-dog ou anti-pig conjugado a Isotiocianato
de Fluoresceína da Sigma®.
A interpretação dos nossos resultados teve como base
os distintos perfis de infecção dos animais que refletem
transmissibilidade. Exame a fresco e hemocultivo quando positivos
(principalmente o primeiro), demonstram a parasitemia no
animal em questão, o que significa uma alta chance de transmissão
ao vetor. O teste sorológico aponta para a exposição do animal a
infecção. Portanto, um animal positivo apenas no teste sorológico,
demonstra estar exposto ao ciclo de transmissão, é um hospedeiro
do parasita, mas naquele momento não está envolvido na
amplificação das populações parasitárias, ou seja, seu potencial
de transmissão ao vetor é baixa.
O sucesso total de captura foi de 2.6% em Navegantes, 2.9% em
Redenção, 2.4% em Cachoeiro do Arari e 0,3% em Panacauera. O
ponto comum observado nas três áreas foi a simplificação da fauna
de pequenos mamíferos. A identificação taxonômica completa e
os resultados da infecção por Trypanosoma cruzi nos pequenos
mamíferos examinados nas 3 áreas de surto foram previamente
descritos
3
. Em Panacauera, apenas 2 roedores sinantrópicos
(Rattus rattus) foram capturados em trilhas montadas próximas
a habitações humanas. Os animais foram negativos nos 3 exames
diagnósticos realizados. De todos os animais, apenas duas
espécies de marsupiais (Didelphis albiventris em Navegantes e
Monodelphis domestica em Redenção) foram positivos no exame
à fresco. A prevalência de infecção por sorologia e hemocultivo de
todos os grupos de animais examinados nas 4 localidades estão
contidos na Tabela 1.
A destruição dos ecossistemas tem levado as populações de
mamíferos silvestres a uma importante restrição de área e alimentos,
além de promover um maior contato com o homem. Esse cenário
desfavorável resulta na diminuição de habitats e leva à extinção de
espécies que não suportam alterações ambientais. Nas três áreas de
surto, o risco de transmissão do parasito esteve direta ou indiretamente
relacionado à mudança de paisagem decorrente de ação antrópica
(mau uso da terra) e à simplificação da fauna e seleção de espécies de
mamíferos generalistas e competentes reservatórios do Trypanosoma
cruzi (apresentam parasitemia patente, refletida por hemocultivo
positivo)
3
. Nesse cenário, a transmissão do parasito é aumentada
devido: (i) amplificação da população parasitária pelas espécies
reservatórios favoravelmente selecionadas; (ii) maiores chances
de transmissão, devido ao perfil de infecção nesses competentes
reservatórios; (iii) restrição das fontes alimentares de triatomíneos
aos animais com parasitemias expressivas; e, conseqüentemente, (iv)
aumento da prevalência de triatomíneos infectados.
A escassez de fontes alimentares para triatomíneos (perda de
fauna silvestre) e animais silvestres (destruição do ambiente) faz
com que esses animais se aproximem de áreas domiciliadas, onde
os animais domésticos passam a estar mais expostos, sendo sua
infecção normalmente precedente à do homem. Nossos resultados
nas 4 localidades estudadas, bem como outros estudos anteriores
do nosso grupo
5;6
mostram que a infecção dos animais domésticos
esteve restrita à positividade nos testes sorológicos. Nesse cenário,
esses animais atuavam como barreiras biológicas visto que
estão expostos ao ciclo de transmissão, mas sem participação
ativa na amplificação do parasito, uma vez que não apresentam
hemocultivos positivos. Exatamente pelo fato da infecção desses
animais precederem a do homem, os animais domésticos atuam
como sentinelas de áreas com um sistema de transmissibilidade
do parasito altamente eficiente e, portanto, com risco iminente
de transmissão para o homem.
TABELA 1
Prevalência de infecção por Trypanosoma cruzi (sorologia – RIFI e hemocultivo) em animais provenientes de três áreas com ocorrência de surtos de doença de Chagas
Aguda (Navegantes/SC, Redenção/CE e Cachoeiro do Arari/PA) e uma área controle sem ocorrência de casos agudos (Panacauera/PA).
Navegantes Redenção Cachoeiro do Arari Panacauera
Sorologia Hemocultivo Sorologia Hemocultivo Sorologia Hemocultivo Sorologia Hemocultivo
Cães 50,0% 0,0% 18,7% 0,0% 41,7% 0,0% 4,0% 0,0%
Porcos n.e. n.e. n.e. n.e. 72,7% 0,0% 60,0% 0,0%
Animais Silvestres 59,1% 38,5% 78,6% 22,7% 38,7% 91,7% 0,0% 0,0%
ne: não examinado.
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Outro fator importante que deve ser levado em consideração
na definição de áreas de risco é a micro-regionalidade das
características de manejo dos animais domésticos. Em Cachoeiro
do Arari e Panacauera, os cães ficam mais restritos a áreas
domiciliares enquanto os porcos são criados de maneira semi-
extensiva. Por esse motivo, eles se expõem muito mais ao ciclo
silvestre de transmissão e apresentaram maiores prevalências
de infecção. O contrário pode ser observado em áreas rurais
onde os porcos são criados confinados e os cães circulam entre
as casas e os fragmentos de mata remanescentes. A presença
de cães de hábitos estritamente domiciliados sorologicamente
positivos, como observado em Navegantes, sinaliza a presença
de um ciclo de transmissão bem próximo ao domicílio. Por
outro lado, a prevalência de infecção maior em animais criados
de maneira semi-extensiva (porcos de Cachoeiro do Arari, por
exemplo) indica que a transmissão está ocorrendo longe das
casas, mas dentro das áreas de interface entre os ambientes
doméstico e silvestre. Em Panacauera, onde não foi capturado
nenhum animal silvestre, a prevalência de infecção em cães foi
insignificante.
A utilização de mamíferos domésticos como animais
sentinela já foi proposta na Argentina
7
, Venezuela
8
, México
9
e Estados Unidos
10
e é uma medida de fácil e imediata
implementação. Os cães em especial são animais de fácil
manuseio e rastreabilidade. Sua coleta de sangue e realização
de exame sorológico (ou envio do material a serviços centrais
de diagnóstico) não demandam grande custo e estruturação.
Além disso, pode-se realizar o exame a partir do soro que
já é coletado rotineiramente em áreas onde os cães já são
testados para Leishmania ou ainda aproveitar as campanhas
de vacinação anti-rábica para coletar sangue de uma amostra
representativa dos cães da área.
A presença de cães sorologicamente positivos reflete
exposição ao T. cruzi e apontam para a transmissão do parasito
em áreas onde esses animais circulam. Uma vez essa medida
implementada, teremos um eficiente sinalizador de áreas que
necessitam de um trabalho mais aprofundado de investigação
epidemiológica e de implementação de medidas de controle e
educação sanitária.
AGRADECIMENTO
Agradecemos a todos os envolvidos dos laboratórios de
Biologia de Tripanosomatídeos e de Biologia e Parasitologia
de Mamíferos Silvestres Reservatórios, Instituto Oswaldo Cruz,
da Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da Saúde e
Secretarias Estaduais de Saúde de Santa Catarina, Ceará e Pará.
REFERÊNCIAS
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in Parasitology 22: 583-588, 2006.
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o
35, 19 de junho de 2008.
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three areas of orally transmitted Chagas disease outbreaks. American Journal of
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São Paulo 8: 227-234, 1966.
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the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 99: 379-388, 2005.
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9. Estrada-Franco JG, Bhatia V, az-Albiter H, Ochoa-Garcia L, Barbabosa A,
Vazquez-Chagoyan JC, Martinez-Perez MA, Guzman-Bracho C, Garg N. Human
Trypanosoma cruzi infection and seropositivity in dogs, Mexico. Emerging
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10. Shadomy SV, Waring SC, Martins-Filho OA, Oliveira RC, Chappell CL. Combined use
of enzyme-linked immunosorbent assay and flow cytometry to detect antibodies
to Trypanosoma cruzi in domestic canines in Texas. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology 11: 313-319, 2004.
_____________________________________________________________________________bloco 3
22
THRICHOMYS LAURENTIUS (RODENTIA; ECHIMYIDAE) AS A BONA FIDE
RESERVOIR OF LEISHMANIA SPECIES: PATTERNS OF EXPERIMENTAL
INFECTION.
A. L. R. Roque; E. Cupolillo; R. Marchevsky; A. M. Jansen.
Artigo submetido à PLOS Neglected Tropical Diseases – 13/07/2009 e re-
submetido após revisão em 20/08/2009
PLOS
The importance of the genus Thrichomys in the maintenance and transmission of Leishmania species is supported by previous
studies that describe an ancient interaction between caviomorphs and lrYpanosomatids and report the natural infection of
Background Abstract Thrichomys sp. Moreover, these rodents are widely dispersed in Brazil and recognized as important hosts of other
tripanosomatids. Our main purpose was to evaluate the putative role ofT. laurentius in the maintenance and dispersion of
Leishmania infantum and L. braziliensis.
Male and female Thrichomys laurentius (n=24) born in captivity were investigated for the experimental infection with these
Leishmania species and followed up by parasitological, serological, hematological, biochemical, histological, and molecular
assays for 3, 6, 9 or 12 months post infection (mpi). Thrichomys laurentius showed its competence as maintenance host for the
MethodologylPrincipal Findings Abstract two inoculated Leishmania species. Four aspects should be highlighted: (i) re-isolation of parasites 12 mpi; (ii) the low
parasitic burden displayed by T. laurentius tissues; (iii) the early onset and maintenance of humoral response, and (iv) the
sintilar pattern of infection by the two Leishmania species. Both Leishmania species demonstrated the ability to colonize
viscera and skin of the T. laurentius and no rodent displayed any lesion, histological changes or clinical evidence of infection.
We also wish to point out the irrelevance of the adjective dermotropic or viscerotropic to qualifY L. braziliensis and L.
ID,
respectively, when these species are hosted by non-human hosts. Our data suggest that T. laurentius may act at least
intenance host
of both
tested Leishmania species since it maintained
long~lasting
infections. Moreover,
it
cannot be
onclusions/Significance Abstract d that Leishmania sp. infection in free ranging T. laurentius could result in higher parasite burden due the more
conditions in the wild. Therefore the tissular parasitism of the skin, infectiveness to the vector and amplification of
ission cycle of both Leishmania species could be expected.
s Diseases/Neglected Tropical Diseases, Infectious DiseaseslProtozoallnfections
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information.
o institution (Charge: $2,200.00, Accept: $1,100.00)
omments:
e are all employees from a governamental institution (Oswaldo Cruz Institute) in a emer develo ment coun
II research involving human participants must have been approved by the authors' institutional
ommittee(s) and that board must be named by the authors in the manuscript. For research involving human partici
'nformed consent must have been obtained (or the reason for lack of consent explained, e.g. the data were analyzed
onymously) and all clinical investigation must have been conducted according to the principles expressed in the
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i.
Authors should subntit a statement from their ethics committee or institutional review board indicating the
proval of the research. We also encourage authors to submit a sample of a patient consent form and may require submission
completed forms on particular occasions.
II anilllal work must have been conducted according to relevant national and international guidel4ies. In accordance with the
ecommendations of the Weatherall report, "The use of non-human primates in research." we specifically require authors to
.nclude details of animal welfare and steps taken to ameliorate suffering in all work involving non-human primates.
aving read the above, please select a statement below.:
es. an ethics statement is required.
lease enter your statement below, and place the same text at the beginning of the Methods section of your manuscript (with
he subheading Ethics Statement). Enter "N/A" if you do not require an ethics statement.:
he study design was carried out according to the protocol approved by the Institutional Committee for Experimentation and
are of Research Animals (CEUA-Fiocruz: P0076/01 and P0269/05) and animal facilities are supported by the Brazilian
Institute of Envrronment and Renewable Natutal Resources (IBAMA license 02022.002062/01-04).
o
Yes
I
Not Received
for assistance: please contact tl'le PLoS editorial
office: [email protected]..,.Qf.'9.
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AnenTrack bv Allen Press Ine.
PO\Nered by eJournalPress
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
1
Thrichomys laurentius (Rodentia; Echimyidae) as a bona fide reservoir
of Leishmania infantum and L. braziliensis: patterns of experimental
infection
André Luiz Rodrigues Roque,
a,b
Elisa Cupolillo,
b
Renato Sergio Marchevsky,
c
and Ana Maria
Jansen,
a,
*
a
Laboratory of Tripanosomatid Biology, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Av. Brasil 4365, CEP.
21045-360, Rio de Janeiro/RJ, Brazil
b
Laboratory of Leishmaniasis Research, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz
c
Laboratory of Neurovirulence, Institute of Technology on Immunobiological/Biomanguinhos, Fiocruz
* Corresponding author. Fax: +55 21 2560-6572.
E-mail address: [email protected]iocruz.br (A.M. Jansen)
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
2
Abstract
The importance of the genus Thrichomys in the maintenance and transmission of
Leishmania species is supported by previous studies that describe an ancient interaction
between caviomorphs and trypanosomatids and report the natural infection of Thrichomys
sp. Moreover, these rodents are widely dispersed in Brazil and recognized as important
hosts of other tripanosomatids. Our main purpose was to evaluate the putative role of T.
laurentius in the maintenance and dispersion of Leishmania infantum and L. braziliensis.
Male and female Thrichomys laurentius (n=24) born in captivity were investigated for the
experimental infection with these Leishmania species and followed up by parasitological,
serological, hematological, biochemical, histological, and molecular assays for 3, 6, 9 or 12
months post infection (mpi). Thrichomys laurentius showed its competence as maintenance
host for the two inoculated Leishmania species. Four aspects should be highlighted: (i) re-
isolation of parasites 12 mpi; (ii) the low parasitic burden displayed by T. laurentius tissues;
(iii) the early onset and maintenance of humoral response, and (iv) the similar pattern of
infection by the two Leishmania species. Both Leishmania species demonstrated the ability
to colonize viscera and skin of the T. laurentius and no rodent displayed any lesion,
histological changes or clinical evidence of infection. We also wish to point out the
irrelevance of the adjective dermotropic or viscerotropic to qualify L. braziliensis and L.
infantum, respectively, when these species are hosted by non-human hosts. Our data
suggest that T. laurentius may act at least as a maintenance host of both tested Leishmania
species since it maintained long-lasting infections. Moreover, it cannot be discarded that
Leishmania sp. infection in free ranging T. laurentius could result in higher parasite burden
due the more stressing conditions in the wild. Therefore the tissular parasitism of the skin,
infectiveness to the vector and amplification of the transmission cycle of both Leishmania
species could be expected.
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
3
Author Summary
For Leishmania, one genus among other genera belonging to the parasitic
Trypanosomatidae family, many non-human mammals are known to operate as one of the
Leishmania’ host population in addition to humans. Most studies that describes Leishmania
wild reservoirs are based on punctual descriptions of infection that can conduct to
misinterpretation of concepts. The definition of the epidemiological importance of a putative
reservoir host depends on additional data on the dynamics and peculiarities inherent to the
host-parasite interactions and their involvement in the transmission cycle of these parasites.
The objectives of the present investigators are to sort out features displayed by non human
mammal populations (the caviomorph rodent Thrichomys laurentius) which are co-inhabiting
with insects the perpetuation of Leishmania transmission cyclesThis rodent`s species
showed the ability to act as maintenance and/or amplifier host of both tested Leishmania
species. The similar pattern of infection displayed by T. laurentius infected by these two
Leishmania species demonstrates that the definition of dermotropic or viscerotropic based
on the clinical feature observed in humans should not be applied to natural hosts and
emphasizes that the search for Leishmania reservoir should consider all possibilities of the
infection course, independent of the current knowledge in other mammal hosts.
1. Introduction
Although recognized as one of the most important and widespread parasitic diseases
in the world, leishmaniasis prevention and control remains a challenge for health authorities
in some countries [1]. In Brazil, human cutaneous leishmaniasis occurs in association with
different Leishmania species, but Leishmania (Viannia) braziliensis is the most frequent and
widespread species in the country. The visceral form is exclusively associated with
Leishmania (Leishmania) infantum (syn. L. (L.) chagasi).
The Leishmania genus comprises more than 20 vector-borne species, primarily
enzootic parasites, which includes species capable to infect a broad range of mammalian
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
4
hosts and to be transmitted a variety of phlebotomine vectors. The transmission cycles of
Leishmania spp. involves a variety of phlebotomine vectors and mammalian hosts. Failure to
interrupt human transmission and prevent new epidemics are related, among others, to the
involvement of wild and synanthropic hosts, mainly rodents and marsupials, that can
colonize peri-urban areas[2–4].
Till now, the majority of studies that point out Leishmania spp. wild reservoirs are
based on punctual observations of infection, most of them by molecular methods (PCR)
rather than by parasite isolation and characterization. This can conduct to misinterpretation
of concepts since the mere finding of Leishmania DNA in a given mammal species is not
sufficient to consider this species a reservoir host[5]. Reservoir is better defined not as a
single species, but as an assemblage of species responsible for the long lasting
maintenance of a parasite in a given environment[6]. This concept does not include target
species (human or domestic mammals) neither does it consider the eventual symptoms
displayed by the reservoir hosts. Laboratory studies using natural hosts as experimental
models provide a suitable indication of the importance of these hosts as reservoirs, since it
allows a better understanding of the dynamics of infection, especially concerning the ability
to maintain and disperse the parasite. There are only rare studies that follow up
experimentally infected wild hosts by Leishmania species, mostly due to the difficulties of
managing wild mammals in captivity.
Thrichomys laurentius is a South American caviomorph rodent formerly included in a
monospecific genus. The formerly recognized species, Thrichomys apereoides, was recently
split into five species: T. apereoides, T. laurentius, T. pachyurus, T. inermis and T. sp[7,8].
The recently described species within this genus comprise crepuscular and scansorial
rodents that inhabit open vegetation in various Brazilian biomes: savannah (“Cerrado”),
white shrub (“Caatinga”) and marshland (“Pantanal”), widespread from western to northern
Brazil[9].
Some reasons point to the importance of the Thrichomys genus as a bona fide
reservoir for Leishmania species: 1) the probable ancient association between caviomorph
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
5
rodents and the trypanosomatids. It was proposed that the entry of new species of
Leishmania (Leishmania) subgenus was the consequence of the arrival of infected
caviomorph rodents during the Oligocene[10]; 2) the detection of Leishmania sp. DNA in free
ranging Thrichomys sp. These rodents were found infected by Leishmania species from
different complexes – L. mexicana and L. donovani – in an endemic area for both visceral
and tegumentar leishmaniasis in Minas Gerais state, Brazil [3]; 3) the importance of these
rodents as reservoirs of other trypanosomatids – Trypanosoma cruzi and T. evansi. This
feature is confirmed by both experimental[11,12] and field work studies[13,14]; and 4)
Thrichomys spp are widely dispersed throughout Brazil, comprising one of the most
abundant species in the three Brazilian biomes where they occur[9]. Moreover, they are
habitat generalists, found even in degraded areas, and can also frequent human
dwellings[13,15].
In the present work, we investigated the experimental infection of Thrichomys
laurentius with Leishmania infantum and L. braziliensis. Our main purpose was to evaluate
the putative role of T. laurentius for the maintenance and dispersion of these Leishmania
species. To achieve this aim, we: (i) studied the differences on the experimental infection of
T. laurentius with L. infantum and L. braziliensis; (ii) followed up the health status of
experimentally infected rodents by hematological and biochemical parameters, in order to
evaluate the impact of the experimental infection; and (iii) analyzed the parasitism dispersion
in the host. Furthermore, we evaluated the more effective methods for the diagnosis of
Leishmania sp. in free ranging wild rodents.
2. Materials and Methods
2.1. Experimental infection
Twenty-four Thrichomys laurentius of both sexes born in captivity were kindly
supplied by Dr. Paulo D’Andrea. The animals are free from other pathogens, provided from
food and water ad libitum and kept under conventional conditions (temperature 24 ± 2
o
C,
natural daylight) at animal facilities of the Laboratory of Biology and Parasitology of Small
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
6
Reservoir Mammals, Oswaldo Cruz Institute. Animals were individually housed in 41-34-17
cm polycarbonate cages with sawdust as bedding and fed with NUVILAB CR1 mouse pellets
(Nuvital® nutrients S.A., Colombo/PR, Brazil)[16].
The rodents were divided into two groups and intradermically inoculated into the right
ear pinna (0.05mL maximum volume) by either Leishmania infantum – MHOM/BR/2001/HP-
EMO = IOC-L2483 (n=12) or L. braziliensis – MHOM/BR/2000/LTCP13396 = IOC-L2504
(n=12) obtained from the Oswaldo Cruz Institute Leishmania collection (Coleção de
Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz, CLIOC). At 60 day-old, animals were infected with
10
6
promastigotes derived from stationary phase culture starting from freshly amastigotes
and followed up for 3, 6, 9 or 12 months post infection (mpi). The parasites (isolated no more
than 2 weeks before Thrichomys infection) were maintained by in vivo passage in golden
hamsters (Mesocricetus auratus) derived from the animal facilities of Oswaldo Cruz
Foundation. In this case, promastigotes were intradermically inoculated in hamsters footpads
and re-isolated from inoculation site (L. braziliensis) and spleen (L. infantum) 4-5 months
after infection. Hamsters were also used for control of the infectivity of the inocula.
The study design was carried out according to the protocol approved by the
Institutional Committee for Experimentation and Care of Research Animals (CEUA-Fiocruz:
P0076/01 and P0269/05) and animal facilities are supported by the Brazilian Institute of
Environment and Renewable Natural Resources (IBAMA license 02022.002062/01-04). The
present study was conducted from November 2005 to December 2008
.
2.2. Hematology
Blood samples were collected in
heparinized and nonheparinized tubes from the
retro-orbital plexus of animals previously intramuscularly (IM) anesthetized with 100 mg/kg
ketamine hydrochloride and 2 drops of local anesthesia with colirium (0.5% solution of
proximetacaine chloridrate) every 3 weeks. The following parameters were determined: (i)
red (RBC) and white (WBC) blood cell count, using a Neubauer hemocytometer; (ii)
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
7
hematocrit, by the centrifugation of microcapilar tubes; (iii) hemoglobin levels, using a
commercial test kit (Labtest, Lagoa Santa/MG, Brazil); (iv) percentage of leukocyte cells, by
microscopical observation of thin blood smears stained with Panótipo Rápido® (derived from
the Romanowski stain). Heparinized blood was also collected onto filter paper (Whatman
5®, Maidstone, UK) for the molecular assay, while the serum obtained from non-heparinized
blood samples was used for the biochemical and serological follow-up. Medium corpuscular
volume (MCV), medium corpuscular hemoglobin (MCH) and medium corpuscular
hemoglobin volume (MCHV) were also calculated. Values of all parameters obtained for
each group one-day before the inoculum were considered normal and used to calculate the
reference values.
2.3. Blood chemistry, serology and molecular follow-up
The ability to produce nitric oxide was evaluated by the nitrite level in rodent sera,
using the Griess Reagent System® (Promega, Madison, USA). Only for rodents infected by
L. infantum, albumin and total protein levels were determined using commercial test kits
(Labtest, Lagoa Santa/MG, Brazil). All of these assays were done according to the
manufacturers recommendations.
The kinetics of the humoral immune response was evaluated by indirect
immunofluorescence test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using
Leishmania antigen deriving from axenic promastigotes of the same strain used for the
experimental infection (homologous) and/or deriving from a mixture of L. infantum and L.
braziliensis formalin-treated promastigotes (mix), the latter only for the rodents followed for
more than 6 months. IFAT was performed assaying two-fold sera dilutions (1:10–1:1,280)
against Leishmania promastigotes and the reactions conducted using a specific in-house
intermediary antibody anti-Thrichomys sera produced in rabbits. The reaction was visualized
using a commercial anti-rabbit IgG-FITC (Sigma-Aldrich®, St. Louis, USA), according to
Camargo[17]. Standard micro-ELISA was conducted according to Rosario et al.[18], using a
commercial anti-rat IgG-peroxidase (Sigma-Aldrich®, St. Louis, USA). We established 1:20
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
8
and 1:30,000 for the sera and conjugate dilutions, respectively, after the analysis of different
serum dilutions derived from experimentally infected and non infected captivity Thrichomys
using the ROC Curve (BioStat 5.0® software). For each rodent, the cut-off value was
determined using sera collected before the experimental infections and the absorbance at
492 nm was measured in an EMax® Microplate Reader
(Molecular Devices, Ramsey, USA).
The DNA extraction from filter paper was conducted by boiled water, according to
Marques et al.[19]. The DNA product amplifications were conducted using pureTaq Ready-
To-Go PCR beads® (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) and primers directed
to the conserved region of the Leishmania kDNA minicircle, as follows: 150 (forward) 5’-
GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA-3’ and 152 (reverse) 5’-
(C/G)(C/G)(C/G)(A/T)CTAT(A/T)TTACACCAACCCC-3’. The PCR conditions were as
follows: initial denaturation at 94
o
C for 5 min, followed by 30 cycles at 94
o
C for 1 min, 60
o
C
for 1 min, 72
o
C for 30 s, and a final extension at 72
o
C for 5 min[20]. Blood from uninfected
rodents and uninfected blood samples to which promastigotes axenically cultured were
added, being used as control for both extraction and amplification processes. The amplified
polymerase chain reaction (PCR) products were analyzed in polyacrylamide gel
electrophoresis (4%) and the negative samples were re-analyzed by electrophoresis in
12.5% polyacrylamide gels using the Genephor electrophoresis system apparatus
(Pharmacia Biotech®). All of the gels were stained using the DNA Silver Staining Kit®
(GEHealthcare, Chalfont St. Giles, UK).
2.4. Necropsy procedures:
Euthanasia was performed by CO
2
inhalation on months 3, 6, 9 and 12 post
inoculation (n=3 for each batch). Procedures were undertaken in a Class II biosafety cabinet:
(i) inoculation of fragments of spleen, liver, inoculation site (right pinna skin) and bone
marrow in biphasic culture mediums (NNN/Schneider`s) supplemented with 10% fetal bovine
serum (v/v) and antibiotics (350 IU penicillin and 150 µg/mL streptomycin), which was
examined every 3-4 days for 1 month; (ii) slide imprints of spleen, liver and inoculation site,
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
9
which were Giemsa-stained and microscopically observed at x400 magnification; (iii)
collection of tissue fragments – spleen, liver, inoculation site, skin and bone marrow – in 1.5
mL tubes containing ethanol and stored at -20
o
C, which were used for the molecular
analyses; (iv) fixing of tissue fragments – spleen, liver, skin, lymph nodes and both ears
separately – in 10% neutral buffered formalin for histological studies. After dehydration and
paraffin-embedding, 4 μm sections in thickness were made, routinely stained with
hematoxylin and eosin (H&E), and the sections examined by light microscopy. For the slide
imprints, histological and molecular tests, liver tissue samples were performed considering
two fragments from different lobes.
For the molecular diagnosis, tissue fragments were washed three times with Milli-Q
water and the DNA extraction realized using the Wizard® Genomic DNA Purification Kit
(Promega, Madison, USA) according to the manufacturer’s recommendations. The PCR was
conducted as described above for the blood collected on filter paper.
2.5. Data analysis:
Normal ranges for the hematological and biochemical values were determined in
relation to medium values and two-fold standard errors obtained for each group one-day
before the inoculum. The differences on the hematological and biochemical kinetics between
rodents infected by either L. braziliensis or L. infantum were evaluated by the non-parametric
Mann-Whitney test. The differences between the normal values and each point of the
hematological and biochemical follow-up were evaluated by the Kruskal-Wallis and Student-
Newman-Keuls tests. All of the data were analyzed using the BioStat 5.0® software (Instituto
Mamirauá, Tefé, Brazil) and considering p<0.05 significant.
3. Results
For demonstrating the potential to act as a maintenance host, a given mammal species
must be able to control and maintain the parasite infection. In that case, Thrichomys
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
10
laurentius fit this criteria for both inoculated Leishmania species (L. braziliensis and L.
infantum), and four aspects should be highlighted: (i) the long-term maintenance of T.
laurentius infection, at least 12 months; (ii) the low parasitic burden displayed by T.
laurentius tissues on the necropsy; (iii) the early onset and maintenance of important
humoral response, demonstrated by significant serological titers; and (iv) the similar pattern
of infection displayed by T. laurentius infected by these two Leishmania species usually
associated to distinguishable manifestations of human disease. This latter aspect was
mainly demonstrated by the parasite recovery from internal viscerae and detection of
Leishmania DNA in all sampled tissues of L. braziliensis infected rodents. This is the first
report of an experimental infection in a bona fide wild rodent reservoir species, where L.
braziliensis and/or L. infantum could be re-isolated.
3.1. Kinetics of infection:
The Leishmania sp. inoculated were shown to be infective as demonstrated by the
parasite recovery from liver, spleen and inoculation site of hamsters. However, only L.
braziliensis could be isolated from the inoculation site. As expected for outbred animals, a
great individual variability among infected T. laurentius was noted. Despite that, all
Thrichomys rodents were able to efficiently control the infection without presenting lesion or
clinical evidence of disease. Growth development, determined by weekly body mass
measure, was not affected by the Leishmania infection and no expressive alterations of
health markers were observed. Amastigotes of Leishmania spp. were absent in the thin
blood smears and Leishmania DNA could not be detect in blood samples collected in filter
paper in 3 weeks interval.
Leishmania infection did not result in anemia and all of the rodents displayed values that
were inside the normal range during the complete follow-up. Nevertheless, L. infantum
infected T. laurentius tended to display lower red blood cell counts and hemoglobin levels
when compared to those infected by L. braziliensis. During the follow-up, most of the values
obtained for RBC counts and hemoglobin levels showed significant differences (p<0.05)
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
11
between T. laurentius infected by L. braziliensis and L. infantum (Figure 1). This same
feature was also observed for the hematocrit values (data not shown). Significant leucopenia
from the 120 dpi day on (p<0.05), was observed in rodents inoculated with L. braziliensis. A
similar, but not significant, picture was also observed in the rodents infected by L. infantum
(Figure 2). No differences before and after the inocula were observed for MCV, MCH, MCHV
and differential counts of WBC (data not shown).
Albumin and total protein levels were not affected by L. infantum infection, excepting for
the rodent (7548) where re-isolation of parasites was possible. This rodent displayed a
marked decrease in albumin levels and increase in total protein levels after 200 dpi, resulting
in declined in albumin/total protein level (Figure 3). The nitrite level in rodent sera displayed
a great variability and could not be correlated to any other hematological, serological or
parasitological parameter.
All infected T. laurentius were able to produce a humoral response that could be
detected during the three initial weeks by both IFAT and ELISA assays. The IFAT showed
no differences on serological titers among assays performed with homologous or a mixture
of antigens. The response onset and magnitude of titers were very homogeneous and
similar among the infected rodents. Rodents infected by L. braziliensis displayed serological
titers that were always slight higher than the observed for the rodents infected by L. infantum
(Figure 4). The ELISA assay revealed an individual variability on the response onset and
magnitude of titers that varied from negligible to strong responses. In common, infected T.
laurentius displayed a peak of absorbance values on 100 dpi that were in medium four times
higher than the day 0 and kept constant until the end of follow-up (data not shown).
3.2. Necropsy:
Both Leishmania species demonstrated the ability to colonize viscera and skin of the
infected T. laurentius, although this parasitism was not expressive since isolation of
parasites was rare: from liver, spleen and inoculation site 3 mpi from one rodent infected by
L. braziliensis; and from liver and spleen 12 mpi from one rodent infected by L. infantum.
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
12
Leishmania DNA was detected in all experimental batches, independent of the
Leishmania species (Table 1). Nevertheless, the low parasitic burden was evidenced by the
large amount of positive PCR (73%) observed only when electrophoresis was conducted on
the GenePhor™ electrophoresis system apparatus. Up to 77% and 50% of the L. braziliensis
and L. infantum infected T. laurentius, respectively, displayed Leishmania DNA in at least
one of the tissues collected on the necropsy. The individual variability, peculiarities of the
host, parasite and host-parasite interaction and the time of the infection seems to be the
major factors that influenced the different percentage of positive reactions. Parasite
distribution in viscera was not homogeneous and 30.4% of the tissues (spleen, liver and
inoculation site) that had two different fragments examined, displayed a positive and a
negative result for the presence of Leishmania DNA.
No sign of parasitism was observed in tissue imprints or histological sections.
Comparative histologic analysis did not detect any inflammatory or degenerative changes in
T. laurentius infected with L. infantum or L. braziliensis. Our study on the pathology of
Leishmania sp. in golden hamster (Mesocricetus auratus) demonstrated that this rodent
developed definite evidence of infection, characterized by extensive spleen necrosis and
inflammation associated to high number of amastigotes (Figure 5a). No histological
abnormalities or other histological differences were observed between positive and negative
culture tissues obtained from infected T. laurentius (Figure 5b-f). Discrete differences in the
cellularity of primary splenic follicles and periarterial lymphoid sheath seem not related to
infection and were seen in seven T. laurentius from both groups.
4. Discussion
The genus Thrichomys comprises recently described cryptic species that are undergoing
a process of allopatric and/or parapatric differentiation[7]. Within this widespread rodent
genus, T. laurentius is distributed in northeast Brazil, from Ceará to Bahia state, a region that
reports numerous cases of both visceral and tegumentar human leishmaniasis[21,22]. In our
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
13
experimental conditions this rodent species showed to be able to maintain long term
infections by the main etiological agents of human leishmaniasis in Brazil, Leishmania
infatum and L. braziliensis. This ability was undoubtedly demonstrated by the parasite re-
isolation in liver and spleen of rodents experimentally infected by both Leishmania species.
Asymptomatic infection is usually considered as an essential attribute to be considered a
reservoir host. This is currently not considered as a rule; in fact, it is the transmission
strategy of the parasite that is positively selected in a successful host-parasite system,
independent of the damage caused by the parasite or health status displayed by the host.
Even ancient host-parasite interaction may not necessarily evolve in the direction of less
damage or lower virulence, but instead of that, to the maximum transmissibility of the
parasite[23,24]. According to the concept proposed by McMichael[25] and Roque et al.[12],
maintenance host is the one where a given parasite persists while an amplifier host displays
an infection course that favors the transmissibility of the parasite. Taken together our data
suggest that T. laurentius may act at least as a maintenance host of both tested Leishmania
species since it maintained long-lasting infections. Moreover, it cannot be discarded that in
nature, infected rodents display higher parasite burden and tissular parasitism on skin,
acting then as an amplifier hosts of Leishmania species.
Anemia, a characteristic trait in L. infantum infected humans, dogs and laboratory
rodents[26–28], was not observed in the L. infantum infected T. laurentius. Although animals
infected by L. infantum displayed a significant decrease of the hematological parameters in
comparison to those infected with L. braziliensis, this decrease still did not characterize
anemia. Leucopenia, another common trait observed on L. infantum, but not on L.
braziliensis infections[29], was only observed in the L. braziliensis infected T. laurentius from
the 120 dpi onwards. This finding was not surprising in the light of the parasite disseminated
to liver and spleen. Surprising was (i) the absence of leucopenia in L. infantum infected T.
laurentius; and (ii) the later presence of that leucopenia, only after 120 dpi, while the L.
braziliensis isolation occurred before that.
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
14
Hypoalbuminemia and hypergamaglobulinemia, the most common biochemical
alterations in L. infantum symptomatic infection in humans and dogs[27,30], were only
observed on the rodent from which the re-isolation of parasites was possible, probably due
to a higher parasite burden in this animal. Considering that biochemical alterations are not
described as being associated to L. braziliensis infections, these parameters were not tested
in the animals infected by this Leishmania species. Moreover, given the similar pattern
observed in the rodents infected with both Leishmania species we question whether
analyses of further parameters could display alterations in the animal from which L.
braziliensis was isolated in the necropsy.
Experimental T. laurentius infection by two different Leishmania species did not result in
important damage for rodents, but this can be quite different for naturally infected T.
laurentius. Captivity rodents are free from other pathogens, are provided food and water ad
libitum and maintained in controlled environmental conditions. In nature, rodents are
constantly facing out stress (search for food and escape from predators), competitions (intra
and inter-specific), and infection by other parasites and Leishmania re-infections. All of these
factors will directly influence the course of any parasitic infection and be reflected by higher
virulence and/or host damage.
The effectiveness of the serological assays was demonstrated even for the rodents
infected by L. braziliensis, an infection usually not associated to an important humoral
response[29,31]. This is probably due to the visceralization of this parasite species in T.
laurentius. This data emphasizes that the search for Leishmania reservoir should consider
all possibilities of the infection course, which includes a broad range of diagnostic methods
independent of the current knowledge in other mammal hosts. The efficacy of the IFAT
assay for serological screening of Thrichomys sp. was already demonstrated for
Trypanosoma cruzi and T. evansi infections[12,32]. In the present study, ELISA showed to
be a promising tool, since it was able to detect a humoral response production in all of the
infected rodents. The use of an intermediate anti-Thrichomys antibody and the determination
of cut-off values based on a great number of positive and negative serum samples might
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
15
result in a standardized and efficient assay to diagnose Leishmania infection in wild
Thrichomys sp.
In this study, we were not able to detect Leishmania DNA in any of the blood samples
examined; even considering that 24 infected T. laurentius were analyzed and blood samples
were collected every 21 days post infection, totalizing 236 samples evaluated. These data
show that whole blood is not a reliable sample to detect Leishmania infection, at least in this
mammal host species. The persistence of both Leishmania species with an extremely low
burden in T. laurentius could only be demonstrated by the use of a more sensitive technique:
PCR targeting a high copy number DNA sequence coupled to a high resolution
electrophoresis (in this study, the Genephor electrophoresis system). Unfortunately, the
elevated cost of some commercial kits makes the routine use still unfeasible.
In T. laurentius, L. braziliensis can colonize other tissues in addition to the skin. The
parasite’s ability to colonize internal organs, such as spleen and liver, in non-human hosts
was described several times since the 1950
ths
[33,34]. Despite that, the description of L.
braziliensis as a dermotropic parasite is widespread throughout the scientific community.
Our results demonstrated that the definition of dermotropic or viscerotropic based on the
clinical feature observed in humans should not be applied to the natural hosts of that
Leishmania species.
Studies based only on molecular probes are successful to determine parasite hosts, but
lack the capacity to determine the transmissibility of that parasite, and thus the importance of
that putative reservoir host on the transmission cycle. Moreover, contamination in isolation
attempts in field conditions seriously hampers the successful isolations. For that reasons
only few studies were capable to isolate Leishmania parasites in naturally infected wild
rodents[2,35,36]. The polymerase chain reaction (PCR) methodology is undoubtedly a great
advance for the diagnosis of Leishmania infection, but it cannot be associated to parasite
transmissibility.
The scarce studies on the L. infantum experimental infection of wild rodents report the
failure to re-isolate the parasite[37–39], and only in one of them, parasite DNA could be
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
16
detected[39]. We were able to re-isolate L. braziliensis and L. infantum from experimentally
infected T. laurentius. Moreover, we detected L. infantum DNA in bone marrow samples of
another species of Thrichomys, T. pachyurus, one year after the experimental infection
(unpublished data). The ability to maintain and disseminate to different organs (which
include bone marrow, spleen, liver and skin) during long term infections by Leishmania
species and their wide and abundant distribution in Brazilian endemic leishmaniasis areas
point to the importance of Thrichomys spp. at least as maintenance host for Leishmania
species. Future studies concerning the natural infection of Thrichomys spp. becomes crucial
to understand the role of these caviomorph species on the wild transmission cycles of
Leishmania species.
Acknowledgments
The authors are thankful to Joice Rodrigues, Miguel Oliveira and Ana Cláudia Duarte for
help with the hematological and biochemical assay, to Vanderson Vaz for help with the
statistic analyses, to Dr. Vera Bongertz for many helpful comments on the English version of
the manuscript, and to the laboratories staff for technical support. Special thanks should be
conceded to Dr. Paulo Sérgio D’Andrea for the supply of the caviomorph rodents and
management of the animal facilities.
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T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
21
Figures:
Fig. 1: Kinetics of red blood cell counts and hemoglobin levels in Thrichomys laurentius
experimentally infected by Leishmania braziliensis (Lb) or Leishmania infantum (Li). Each
point represents the mean value and standard errors. The continuous lines indicate the
normal range defined by the medium values obtained for each group one-day before the
inoculum and two-fold standard errors. The * indicates the significant difference between
rodents infected either by L. braziliensis or L. infantum.
Fig.2: Kinetics of white blood cell counts in Thrichomys laurentius experimentally infected by
Leishmania braziliensis (Lb) or Leishmania infantum (Li). Each point represents the mean
values and standard errors. The * indicates the significant difference between values
obtained from non-infected rodents (day 0) and and rodents infected by L. braziliensis.
Fig.3: Kinetics of albumin and total protein levels and albumin/total protein ratio in a
Leishmania infantum infected Thrichomys laurentius (7548). Day 0 indicate the values
obtained before the experimental infection.
Fig.4: Kinetics of the humoral immune response (IFAT) in Thrichomys laurentius
experimentally infected by Leishmania braziliensis (Lb) or Leishmania infantum (Li). Each
point represents the mean value and standard errors of the IgG titers of infected rodents.
Fig.5: Photomicrographs of spleen and liver sections from Leishmania braziliensis or L.
infantum infected rodents stained with haematoxylin-eosin. a: L. braziliensis-infected golden
hamster (Mesocricetus auratus) 3 months post infection (mpi) – spleen revealed extensive
necrosis and inflammation. Note necrotic focus containing amastigotes (arrows). b: L.
braziliensis-infected Thrichomys laurentius (7289) 3 mpi – spleen showing architecture of
red and white pulp, lack of parasites; c: L. infantum-infected T. laurentius (7548) 12 mpi (liver
culture tissue positive) – panoramic view of the liver showing typical architecture with portal
(PV) and central vein (CV); d: L. infantum- infected T. laurentius (7538), 12 mpi (liver culture
tissue negative) – also illustrated liver showing normal architecture; e: L. infantum-infected T.
laurentius (7548), 12 mpi (liver culture tissue positive) – overview of white and red pulp from
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
22
spleen; f: L. infantum-infected T. laurentius (7538), 12 mpi (liver culture tissue negative) –
also illustrated spleen overview of red and white pulp.
T. laurentius as a bona fide Leishmania reservoir
23
Table 1
Detection of Leishmania sp. DNA by Polimerase Chain Reaction (PCR) in different tissues
sampled from Thrichomys laurentius experimentally infected by Leishmania braziliensis or
Leishmania infantum between months 3 and 12 post infection. Each point represents the
number of positive/total PCR reactions observed for all tissue samples in the different
experimental batches.
Infected group
Leishmania braziliensis Leishmania infantum
Tissue/Necropsy date 3mpi 6mpi 9mpi 12mpi 3mpi 6mpi 9mpi 12mpi
Spleen 4/6 1/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 1/3
Liver 6/8 4/6 3/6 2/6 2/6 0/4 0/6 1/6
Inoculation Site 4/6 1/3 0/3 0/3 0/3 0/2 0/3 1/3
Opposite Ear 1/2 0/2 0/3 1/3 0/3 0/2 0/3 0/3
Abdominal Skin 5/6 0/3 0/3 0/3 0/3 1/4 0/3 1/3
Bone Marrow 1/2 0/3 0/2 0/3 0/3 0/2 1/3 3/3
mpi – months post infection
___________________________________________________________________________discussão
23
7.1 Diferentes perfis de transmissão da doença de Chagas
Sugere-se que o Trypanosoma cruzi teve sua origem num super-continente ao Sul do
planeta, formado pela América do Sul, Antártica e Austrália, que permaneceu unido após
separação da África há 100 milhões de anos. Este parasita teria então se especiado em
marsupiais didelfídeos, que dominavam a fauna de mamíferos da época, ainda antes da
aquisição de hábitos hematofágicos pelos triatomíneos vetores, sendo transmitidos pelas
secreção de glândulas de cheiro de marsupiais didelfídeos (Stevens et al., 1998; 1999;
Gaunt & Miles, 2000).
Em relação à infecção humana, a hipótese clássica propunha que a entrada do
homem no ciclo de transmissão aconteceu quando este abandona seus hábitos de coletor-
caçador e passa a domesticar plantas e animais em áreas Andinas (Noireau et al., 2009;
Araújo et al., 2009). O triatomíneo da espécie Triatoma infestans teria se adaptado às
moradias humanas e abrigos dos animais recém domesticados e migrações posteriores
teriam resultado na dispersão passiva do T. infestans e da infecção pelo T. cruzi no homem
(Dias & Coura 1997). Atualmente, diversos estudos vêm sugerindo que a doença de Chagas
é, provavelmente, tão antiga quanto a presença humana nas Américas (Araújo et al., 2009).
Remanescentes orgânicos humanos mostraram que ambos, a infecção por Trypanosoma
cruzi e a doença de Chagas, encontrava-se em populações pré-colombianas tanto nas
regiões andinas como no cerrado brasileiro há 7000 anos, sendo encontrados tecidos
mumificados infectados por T. cruzi com datação de 9000 anos na costa do Pacífico
(Aufderheide et al. 2004; Lima et al. 2008; Fernandes et al., 2008). Esses achados datam de
muito antes da colonização ibérica e da construção da casa de pau-a-pique; antes ainda do
processo de domesticação do gênero Cavia, que se considera, ter ocorrido entre 6.000 a
8.000 anos atrás (Rothhammer et al., 1985).
Provavelmente, durante a sua história evolutiva nas Américas, o homem entrou em
contato com o T. cruzi em diversas situações, dependendo do modo como viviam e
interagiam com o ambiente e isso deve ter resultado, ao longo do tempo, em sucessivos e
diferentes perfis epidemiológicos de transmissão (Araújo et al., 2009). A via oral de infecção,
tão comum entre animais silvestres foi provavelmente também importante no homem pré
histórico que se alimentava freqüentemente de carne de caça não cozida (Reinhard et al.,
2005). Além disso, artrópodos diversos, ingeridos acidental ou intencionalmente, já foram
evidenciados em coprólitos humanos pré-históricos (Araújo et al., 2009). A transmissão
vetorial provavelmente teve papel importante quando as populações de caçadores e
coletores usavam cavernas como abrigo (Araújo et al., 2003). Sua importância ganhou ainda
maior destaque quando o vetor Triatoma infestans encontrou abrigo nas frestas das paredes
___________________________________________________________________________discussão
24
das casas de pau a pique que passaram a ser construídas a partir da colonização européia,
sendo essa a principal via de transmissão do parasito para o homem no momento da
descoberta da tripanosomíase americana por Carlos Chagas, em 1909. Com o controle
dessa espécie de triatomíneo e, consequentemente, da transmissão vetorial intradomiciliar,
a via oral assume mais uma vez importância epidemiológica. Mais do que um novo perfil
epidemiológico da transmissão do parasita, trata-se apenas da re-emergência de uma antiga
e importante via de dispersão do parasito.
Por sua complexa epidemiologia e história evolutiva que apresenta distintos perfis
epidemiológicos, a doença de Chagas deve ser avaliada através de um olhar abrangente, no
contexto da globalização e de um crescendo de mudanças antrópicas, considerando
particularmente a migração descontrolada e a invasão de ambientes naturais. Surtos de
Doença de Chagas Aguda (DCA) por ingestão de alimentos contaminados têm ocorrido com
freqüência no Brasil, principalmente na região Amazônica (Marcili et al., 2009). A descrição
de ciclos enzoóticos cada vez mais amplos e transmissão em áreas antes indenes no sul
dos Estados Unidos (Klotz et al., 2009) e os casos de doença de Chagas congênita e
transfusional na Europa (Riera et al., 2006; Schmunis, 2007) refletem um conjunto de fatos
novos relacionados à doença de Chagas que tem reacendido a preocupação das
organizações de saúde nacionais e internacionais.
No Brasil, a obrigatoriedade do teste sorológico para doença de Chagas em todas as
bolsas de sangue desde 1969 e os esforços que resultaram na eliminação do T. infestans
(Schofield et al., 2006) diminuíram drasticamente a incidência da doença do país (Dias,
2007). No entanto, a complexidade dos ciclos de transmissão e a plasticidade biológica do
parasito ficam evidenciadas pelos recentes surtos da doença de Chagas que aconteceram
em diversas regiões do Brasil (Dias, 2006). Nesse novo/antigo cenário, a transmissão
vetorial extradomiciliar, transmissão vetorial domiciliar ou peridomiciliar sem colonização do
vetor, e a contaminação de alimentos por triatomíneos infectados representam desafios para
os quais as medidas de controle adotadas para o controle do T. infestans não são eficazes.
Isto se traduz pelo surgimento de surtos epidêmicos da forma aguda da doença de Chagas,
os quais têm sua origem na transmissão oral quer seja (a) pela ingestão de alimentos ou
líquidos contaminados com formas metacíclicas do parasito presentes nas fezes de
triatomíneos infectados, aqui incluídos as situação onde os insetos são triturados junto a
alimentos; ou (b) pela ingestão de alimentos infectados com secreções de glândula de
cheiro de marsupiais Didelfídeos infectados. Torna-se essencial assim, examinar as
relações entre a diversidade de mamíferos potenciais reservatórios e sua função no
ecossistema.
Não é de hoje que surtos de doença de Chagas aguda (DCA) pela ingestão de
alimentos contaminados são documentados. Antes restrita a relatos mais raros e
espaçados, a transmissão deixou de ocorrer em casos esporádicos para adquirir um
___________________________________________________________________________discussão
25
importante papel na epidemiologia da doença de Chagas, em especial após a morte de 3
pessoas durante surto ocorrido em Navegantes/SC, em 2005 (Brasil, 2008). São vários os
fatores que podem estar envolvidos nesse aumento de relatos, entre os quais a melhoria no
diagnóstico, a diminuição de sub-notificações , a atuação de profissionais mais qualificados
e, principalmente a ação do homem destruindo habitats, alterando os ecossistemas e
promovendo um maior contato do ambiente sinantrópico com os ciclos silvestres de
transmissão (Roque et al., 2008).
Os ciclos silvestres de transmissão do parasito, já estabelecidos antes da ocupação
humana, são encontrados em todas as partes do país, o que fornece um caráter de
imprevisibilidade à ocorrência de surtos da doença associados à exposição do homem aos
ciclos silvestres de transmissão. O grau de devastação ambiental, a proximidade de áreas
peridomésticas com o ambiente silvestre e, principalmente, o nível de educação sanitária da
população são os fatores que, de fato, modulam o aparecimento dos casos. Nesse sentido,
a situação é extremamente preocupante na região Amazônica onde esses 3 fatores são
associados à complexidade de um bioma que representa um mosaico de perfis enzoóticos
distintos, composto por diferentes espécies de mamíferos e triatomíneos.
Desde o início do século 20 tem-se o conhecimento da abundância de hospedeiros
mamíferos potenciais reservatórios e vetores triatomíneos na Amazônia brasileira. Mais que
uma centena de espécies de mamíferos naturalmente infectados tem sido identificadas na
região. No entanto, o primeiro caso humano autóctone na região foi registrado somente em
1969, na cidade de Belém, estado do Pará (Shaw et al., 1969; Briceño-León 2007). Desde
então, casos autóctones foram relatados em número crescente. Um total de 205 casos de
doença de Chagas foi registrado até 2000, desses, 111 casos foram atribuídos a
microepidemias de transmissão oral. O estado do Pará concentrou a maior parte dos casos,
121. Nos últimos anos foram notificados mais de 500 casos, sendo 90% na região da
Amazônia Legal, com prevalência de infecções (75%) no Pará (Santos, 2009).
O processo de devastação ambiental e a alta atividade extrativista observada em
diversas regiões Amazônicas fornecem um cenário propício para que alterações na
diversidade e densidade de hospedeiros silvestres e vetores possam favorecer a
aproximação de animais e vetores infectados e assim, o aparecimento de casos humanos.
O perfil epidemiológico observado, único na história recente da doença de Chagas, exige
medidas de controle abrangentes e inéditas onde a educação sanitária tem papel principal e
contribui não só no controle da transmissão do T. cruzi, mas de enfermidades transmitidas
por alimentos de modo geral (PAHO, 2009). Um programa eficiente de educação sanitária
passa pela importância de direcionar as ações àquelas áreas com maior risco de
aparecimento de casos humanos. É nesse aspecto que ganha importância os estudos em
áreas de ocorrência recente de surtos de DCA e a proposta da utilização de animais
___________________________________________________________________________discussão
26
domésticos sentinelas no direcionamento de ações (Roque et al., 2008; Roque & Jansen,
2008b).
7.2 Animais domésticos sentinelas
Um dos principais objetivos de se identificar a mastofauna envolvida em surtos
epidêmicos de doenças causadas por parasitos multi-hospedeiros é a identificação de
fatores de risco que possam ser utilizados em programas de vigilância sustentável. Entre
esses fatores está a definição de espécies de mamíferos-alvo que possam atuar como bio-
indicadores (sentinelas) de risco de transmissão para o homem. No caso da doença de
Chagas e leishmanioses, em regiões com altas frequências de infecção em vetores e
hospedeiros silvestres, os animais domésticos e peri-domiciliares estão mais expostos à
infecção e a infecção desses animais normalmente precede a o homem. Nesse sentido,
cães, gatos e porcos são alguns dos mamíferos domésticos que podem atuar como
sentinelas para o aparecimento de casos humanos em áreas que apresentem um sistema
de transmissibilidade desses parasitos altamente eficiente.
As características de manejo dos animais domésticos mudam de uma para outra
região, o que resulta em que diferentes espécies possam apresentar maior ou menor
importância como sentinelas, dependendo da área. Em Cachoeiro do Arari/PA, os cães têm
como principal função a proteção da casa contra o ataque dos “piratas do rio” (bandidos que
chegam em pequenos barcos para assaltar as residências) e assim ficam mais restritos a
áreas domiciliares. Os porcos por sua vez são criados de maneira semi-extensiva, visto que
seus proprietários são pouco providos de recursos, o que resulta em que estes animais
forrageiem livremente no ambiente silvestre. Por esse motivo e nessa área, os porcos se
expõem muito mais ao ciclo silvestre de transmissão do Trypanosoma cruzi e apresentam
as maiores prevalências de infecção (Roque & Jansen, 2008b).
Situação oposta á observada nas periferias do centro urbano de Abaetetuba/PA.
Nessa localidade, os porcos são criados confinados em chiqueiros enquanto os cães são
criados como animais apenas de companhia e circulam livremente entre as casas (quase
todas sem muros) e os fragmentos de mata remanescentes. Nessa localidade, a importância
e a prevalência de infecção por T. cruzi é maior nos cães, reflexo de sua maior exposição
aos ciclos silvestres de transmissão (dados não publicados).
Os resultados dos testes diagnósticos realizados nos animais domésticos dessas
duas localidades refletem o provável local de exposição dos animais ao parasito e sua
proximidade com a residência humana. Porcos em Cachoeiro do Arari e cães de Abaetetuba
refletem a presença de um ciclo silvestre de transmissão próximo à áreas peri-domésticas.
Já os cães de Cachoeiro do Arari e os porcos de Abaetetuba refletem a presença do
parasito no próprio peri-domicílio e maior risco de infecção para o homem.
___________________________________________________________________________discussão
27
Nossos estudos em áreas de surtos de DCA (Roque et al., 2008), bem como outros
(Herrera et al., 2005; 2007) mostram que nos locais onde encontramos um ciclo silvestre
bem estabelecido, com alta prevalência de hemocultivos positivos, os animais domésticos
estão expostos e sua infecção provavelmente precede a do homem.
Na maioria das vezes, a infecção dos animais domésticos esteve restrita à
positividade nos testes sorológicos. Nesse cenário, esses animais atuam como barreiras
biológicas (ou “escudos”) visto que estão expostos ao ciclo de transmissão, mas sem
participação ativa na amplificação da população parasitária, uma vez que raramente
apresentam hemocultivos positivos. Isso significa que esses animais entraram em contato
com o T. cruzi, mas, na maioria das vezes, não são fontes de infecção para os triatomíneos.
Isso não significa que o perfil de infecção em animais domésticos é sempre esse. Na região
do Gran Chaco argentino, os cães e gatos apresentam altas parasitemias, confirmado pela
alta prevalência de xenodiagnósticos positivos, e são os principais amplificadores da
população parasitária (Gurtler et al., 2007). Aqui no Brasil, em apenas um cão da localidade
de Ajuaí, em Abaetetuba/PA, conseguimos isolar o parasito nas duas oportunidades que
tivemos oportunidade de examiná-lo, em abril e novembro de 2008 (dados não publicados).
De fato, hemocultivo positivo em animais domésticos no Brasil ainda é raro de se encontrar.
Uma proposta que nosso grupo tem discutido bastante nos últimos anos é o
acompanhamento longitudinal através de inquérito sorológico dos animais domésticos e
peri-domiciliares no sentido de determinar prevalências/incidências de infecção destes pelo
T. cruzi (Roque & Jansen, 2008b; PAHO, 2009). Isso porque áreas que apresentem maiores
prevalências de infecção entre esses animais são provavelmente as que apresentam as
maiores taxas de infecção entre mamíferos e vetores silvestres e conseqüentemente, maior
risco de aparecimento de casos humanos da doença. Essa proposta baseia-se no perfil
epidemiológico observado em áreas de surtos recentes de doença de Chagas e em estudos
prévios da prevalência de infecção em mamíferos domésticos, sendo uma medida que pode
ser imediatamente aplicada para identificação de áreas de risco.
Este tipo de estratégia já foi proposto e utilizado na Argentina (Gurtler et al., 2007),
Venezuela (Crisante et al., 2006), México (Estrada-Franco et al., 2006) e Estados Unidos
(Shadomy et al., 2004). A importância do cão nesse tipo de inquérito é maior que a dos
demais mamíferos domésticos, considerando que são animais de fácil manuseio e cujos
deslocamentos na maioria das vezes são rastreáveis. A coleta de sangue e, posterior
realização de exame sorológico, ou envio do material a serviços centrais de diagnóstico, não
demandam grande custo e estruturação. Pode-se ainda realizar o exame a partir de sangue
que já é coletado rotineiramente em áreas onde esses animais já são sorologicamente
avaliados para infecção por Leishmania sp., ou aproveitar as campanhas de vacinação anti-
rábica para coletar sangue de um amostra representativa dos cães da área.
___________________________________________________________________________discussão
28
O mais importante é que cães sorologicamente positivos refletem exposição ao T.
cruzi e apontam para a presença do parasito em áreas onde esses animais circulam. Uma
vez implementada essa medida, teremos um importante sinalizador para a seleção de áreas
que necessitam de um trabalho mais aprofundado de investigação epidemiológica – áreas
essas que apresentam maior risco de transmissão para o homem e por isso necessitam com
maior urgência da implementação de medidas de controle e educação em saúde e boas
práticas que informem e sensibilizem a população da área (Roque & Jansen, 2008b).
Em relação à transmissão de Leishmania infantum, os cães apresentam grande
importância epidemiológica, mas a eficácia das medidas de controle baseada na eutanásia
de cães sorologicamente positivos é bastante controversa (Courtenay et al., 2002; Nunes et
al., 2008). Assim como na infecção por T. cruzi, a sorologia reflete exposição ao agente
etiológico e não significa, necessariamente, transmissibilidade. Além disso, sabe-se que,
assim como em qualquer outra parasitose, o perfil de infecção e potencial de
transmissibilidade difere entre cães infectados, e abordagens baseadas em percentual de
células T CD4/TcRαβ
+
, CD5
+
e/ou CD8
+
(Guarga et al., 2000; Reis et al., 2009), perfil de
interleucinas (Pinelli et al., 1994; Guerra et al., 2009), e características de lesão
granulomatosa dérmica (dos-Santos et al., 2004; Verçosa et al., 2008) já foram propostas no
sentido de diferenciar cães resistentes e susceptíveis. Alguns fatores que questionam a
eficiência desse método para o controle dessa parasitose são: (i) O ponto de corte adotado
(1:40) não é suficiente para evitar as reações cruzadas que são comuns nesse tipo de
exame, e muitos cães acabam sendo eliminados mesmo sem estar parasitados (Dantas-
Torres, 2009); (ii) parte dos cães infectados nunca serão eliminados, visto que a
sensibilidade do teste não alcança 100% (de Paula et al., 2003); (iii) cães positivos são
detectados apenas após algum tempo de infecção, dado o período de janela imunológica,
onde ainda não há anticorpos detectáveis, e o lapso de tempo entre um inquérito sorológico
e outro (Moreira Jr. et al., 2004); (iv) cães eliminados são frequentemente substituídos por
novos susceptíveis (Nunes et al., 2008); (v) sorologia não distingue a espécie de Leishmania
ao qual o cão foi exposto e não há evidências que apontem para a necessidade da
eutanásia em cães infectados por L. braziliensis, por exemplo (Reithinger e Davies, 1999;
Dantas-Torres, 2007); e (vi) a eliminação dos cães não determina o fim da transmissão,
visto que outros animais também podem estar participando do ciclo.
Esses fatores mostram que a interpretação de como utilizar as informações obtidas
com o acompanhamento sorológico de animais domésticos sentinelas pode ser ampliada
também para áreas de transmissão de Leishmania sp. Nesse caso, além da eliminação dos
cães que apresentem títulos sorológicos mais altos (acima de 1:80), essas informações
serviriam como base para um programa mais amplo que incluísse: (i) estímulo à utilização
de produtos repelentes aos insetos nos cães; (ii) levantamento da composição faunística e
estudo local de prevalência e perfis de infecção por Leishmania sp. em mamíferos silvestres
___________________________________________________________________________discussão
29
e sinantrópicos; (iii) levantamento de habitats e diversidade de vetores, buscando identificar
as espécies de flebotomíneos da região e suas respectivas taxas de infecção; e (iv)
acompanhamento dos cães sorologicamente positivos, com baixa titulação (até 1:40),
através de exames parasitológicos que possam definir seu papel na transmissibilidade
desses parasitos. Apesar das dificuldades de implementação dessas medidas, elas são
essenciais para o efetivo controle da Leishmaniose que cada vez mais invade a periferia das
grandes cidades brasileiras.
7.3 A manutenção de Leishmania sp. na natureza
As leishmanioses, tanto a forma tegumentar (LT) como a visceral (LV), são zoonoses
que, na maioria das vezes, envolvem em seu ciclo de transmissão animais domésticos,
silvestres e o homem. As principais espécies de Leishmania sp. de interesse em saúde
pública são parasitos multi-hospedeiros, o que resulta em uma epidemiologia complexa e
peculiar nas áreas de ocorrência destes parasitos. A complexidade da eco-epidemiologia
das leishmanioses, associada à magnitude do problema sanitário que representam e ao
desconhecimento de muitos aspectos do ciclo enzoótico, impõe a necessidade de
esclarecer os elos da cadeia epidemiológica em todos os níveis como pré-requisito de definir
as novas estratégias efetivas de controle que se fazem necessárias (Tesh, 1995).
Em relação aos hospedeiros de Leishmania infantum, única espécie envolvida nos
casos de LV no Brasil, podem-se destacar os estudos que apontam os cães domésticos
(Canis familiaris) e outros canídeos (Lycalopex vetulus, Cerdocyon thous e Speothos
venaticus) como reservatórios do parasito (Lainson et al., 1969; Moreno e Alvar, 2002;
Figureiredo et al., 2008; Luppi et al., 2008). Outros animais também encontrados
naturalmente infectados foram: Didelphis marsupialis (Travi et al., 1994; Santiago et al.,
2007), Proechimys canicollis (Travi et al., 1998) e Thrichomys apereoides (Oliveira et al.,
2005).
Algumas espécies de Leishmania que nunca foram encontradas relacionadas à
infecção humana, estando estes relacionados apenas com um ciclo silvestre de
transmissão, envolvendo diferentes ordens de mamíferos (revisto em Lainson & Shaw, 1987
e Grimaldi & Tesh, 1993). No entanto, atribui-se à estas espécies grande potencial em
causar a doença humana (Rodriguez-Bonfante et al., 2003).
Com relação a Leishmania braziliensis, principal agente etiológico da LT no Brasil,
infecções naturais já foram observadas em roedores dos gêneros Proechimys, Oryzomys,
Rattus, Bolomys, Hollochilus, Akodon, Sigmodon, Neacomys, Nectomys e Dasyprocta, além
dos marsupiais Marmosa, Metachirus, Didelphis e Philander, e da raposa Cerdocyon
___________________________________________________________________________discussão
30
(Lainson & Shaw, 1998; De-Lima et al., 2002; Brandão-Filho et al., 2003). Com relação às
demais espécies causadoras da LT no Brasil, vários estudos demonstraram a presença de
infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis em diferentes espécies de roedores e
no marsupial Didelphis marsupialis (Grimaldi et al., 1991; Grimaldi & Tesh, 1993; Lainson &
Shaw, 1998). Tatus (Dasypus novemcinctus) foram até agora os únicos hospedeiros
encontrados infectados por L. (V.) naiffi (Lainson & Shaw, 1989; Naiffi et al., 1989). Com
relação à L. (V.) lainsoni, apenas pacas (Agouti paca) já foram apontadas como
reservatórios (Silveira et al., 1991). Preguiças (Choloepus hoffmani) e esquilos (Scirus
granatensis) já foram observados naturalmente infectados por L. equatorensis e/ou L.
colombiensis (Kreutzer et al., 1991, Grimaldi et al., 1992). A infecção por L. (V.) shawi já foi
descrita em preguiças Choloepus didactylus e Bradypus tridactylus, macacos Cebus apella e
Chiropotes satanas e quatis Nasua nasua (Shaw et al., 1991; Lainson & Shaw, 1998). Já a
infecção por L. (V.) guyanensis já foi diagnosticada em preguiças Choloepus didactylus,
gambás Didelphis marsupialis e tamanduás Tamandua tetradactyla (Grimaldi et al., 1991;
Lainson et al., 1981; Lainson & Shaw, 1987; Grimaldi & Tesh, 1993).
Na grande maioria desses casos, no entanto, a descrição de reservatórios e o
diagnóstico da infecção foram baseados apenas em descrições pontuais que não
esclarecem o potencial de transmissibilidade destes mamíferos sendo, portanto,
insuficientes para definir uma espécie como reservatório. Poucos foram os trabalhos onde
foi possível o isolamento e caracterização dos parasitas envolvidos (Corredor et al., 1989;
Dedet et al., 1989; De-Lima et al., 2002; Brandão-Filho et al., 2003).
Em animais, não se podem diferenciar as formas clínicas observadas em humanos e
o diagnóstico, como em qualquer outra parasitose, deve ser realizado, preferencialmente,
pela observação direta do agente etiológico. No caso de Leishmania spp o isolamento e
crescimento in vitro para visualização e posterior caracterização do parasita nem sempre é
possível dada às dificuldades inerentes do processo (escassez de parasitas, contaminação
bacteriana). Neste caso, o diagnóstico poderia ser realizado por inoculação de material de
tecidos do animal suspeito em animais experimentais, mas, por questões de Biossegurança,
essa metodologia não pode ser realizada durante as expedições de campo. Métodos
moleculares de reação em cadeia da polimerase (PCR) vêm sendo amplamente utilizados
para diagnóstico da infecção em animais silvestres (Brandão-Filho et al., 2003; Oliveira et
al., 2005; Kerr et al., 2006). É importante destacar que nesse caso, define-se um hospedeiro
do parasito, mas não seu potencial como reservatório ou sua importância epidemiológica,
uma vez que não caracterizam transmissibilidade.
De fato, ainda estamos muito longe de entender os fatores que envolvem a
manutenção dessas diferentes espécies de Leishmania na natureza, principalmente
considerando: (i) o caráter temporal e espacial de transmissão; (ii) a distribuição da
parasitose em focos descontínuos; (iii) a falta de estudos longitudinais; e (iv) a raridade dos
___________________________________________________________________________discussão
31
estudos de infecção experimental em potenciais reservatórios. Os problemas relacionados à
este último item refletem-se em tentativas frustradas de se infectar experimentalmente um
roedor silvestre (Lainson et al., 2002; Barbosa et al., 2008).
Nosso trabalho (bloco 3 dessa tese) é o primeiro que, utilizando os hospedeiros
naturais experimentalmente infectados em laboratório, obtém-se o re-isolamento de L.
infantum e L. braziliensis. Mais ainda, o longo acompanhamento da infecção em diferentes
tempos e por diferentes abordagens metodológicas nos mostraram quanto o perfil de
infecção dessas espécies de leishmânias em Thrichomys laurentius pode ser diferente se
comparados a modelos tradicionais ou à infecção humana. Estudos como este são
necessários porque nos sinalizam sobre como ocorre a manutenção do parasito em um
dado hospedeiro, e, principalmente porque enfatizam a necessidade de estudos mais
aprofundados dos ciclos silvestres de transmissão. Assim sendo, é essencial investir em
estudos que não se limitem apenas a descrever os hospedeiros infectados, mas que ajudem
a entender o papel de cada um na manutenção e amplificação das populações parasitárias
de Leishmania spp. e assim, auxiliar na predição de fatores que possam resultar na (re-)
emergência de casos humanos.
7.4 O modelo Thrichomys sp.
Estudos prévios mostraram que esses roedores, mantidos no laboratório, adaptam-se
bem às condições gerais de bioterismo, sendo necessários, para manutenção da colônia,
apenas procedimentos usuais (assepsia, ausência de ruídos) similares aos de qualquer
biotério de roedores (D’Andrea et al., 2002; Teixeira et al., 2005). A ausência de
enfermidades, facilidade no manuseio e produção de filhotes demonstraram sua boa
adaptabilidade às condições em cativeiro.
A infecção experimental de T. laurentius e T. pachyurus por isolados de T. cruzi
obtidos de Thrichomys sp. naturalmente infectados, além da cepa Y, mostraram que ambas
espécies de Thrichomys foram capazes de controlar os parasitas circulantes e manter a
infecção por T. cruzi (Roque et al., 2005). Em todos os parâmetros observados, T.
pachyurus apresentou maior susceptibilidade à infecção quando comparado ao T.
laurentius. Este trabalho mostra que ambas as espécies de Thrichomys podem atuar como
importantes reservatórios do T. cruzi, entretanto, o papel que cada um deles desempenha
na rede de transmissão do parasito na natureza é bem diferente. O padrão de infecção
observado em T. laurentius mostra que esses animais podem desempenhar importante
papel como hospedeiro mantenedor do parasito. Já em T. pachyurus, os maiores períodos
patentes e parasitemias, além do maior dano cardíaco, que o torna mais susceptível à
___________________________________________________________________________discussão
32
predação atestam sua maior capacidade de atuar como também como hospedeiro
amplificador das populações do T. cruzi (Roque et al., 2005).
A infecção experimental de Thrichomys laurentius (Bloco 3 dessa tese) mostrou que
esses roedores são capazes de manter a infecção por ambas as espécies de Leishmania
testadas (L. braziliensis e L. infantum) por longo tempo, sendo possível a recuperação de
parasitos em cultura de tecidos até 12 meses após a infecção. Nenhum animal apresentou
qualquer alteração clínica ou lesão no sítio de inoculação e todos foram capazes de produzir
uma resposta imune humoral, à qual pôde ser detectada tanto por RIFI quanto por ELISA.
A eficácia dos testes serológicos foi demonstrada até mesmo para os roedores
infectados por L. braziliensis, um parasito geralmente não associado a uma importante
resposta humoral. Esse dado enfatiza a importância de se considerar todas as
possibilidades de perfis de infecção na investigação de reservatórios de Leishmania sp., e
não partir de idéias pré-concebidas, o que torna imprescindível a inclusão de uma vasta
gama de métodos diagnósticos, independente do que atualmente se sabe sobre a infecção
em outros mamíferos hospedeiros.
DNA de Leishmania sp. foi detectado em todos os grupos experimentais e em todos
os tecidos amostrados, independente da espécie de Leishmania inoculada. Também
conseguimos detectar DNA de Leishmania em baço de outra espécie, T. pachyurus, 12
meses após a infecção, mostrando que outras espécies do gênero Thrichomys também
podem ter papel importante nos ciclos silvestres de transmissão de Leishmania sp. (dados
não publicados).
Leishmania braziliensis, espécie descrita como dermotrópica associada apenas a
formas cutâneas da doença humana, foi capaz de visceralizar e se multiplicar em órgãos
internos nessa espécie de roedor. Esse achado questiona a definição de leishmânia
dermotrópica ou viscerotrópica baseado apenas no quadro clínico observado em humanos,
uma vez que esta não pode ser aplicada aos hospedeiros naturais dessas espécies de
Leishmania.
A infecção experimental de T. laurentius não resultou em importantes prejuízos para
esses roedores, mas esse perfil pode ser bem diferente em animais naturalmente
infectados. Roedores nascidos em cativeiro são isentos de outros parasitos, recebem
alimentos e água ad libitum e são mantidos em condições ambientais controladas. Na
natureza, esses roedores estão constantemente enfrentando condições adversas, como
estresse (busca por alimento e fuga de predadores), competição (intra e inter-específica), e
re-infecções por Leishmania sp. e/ou outros parasitos. Todos esses fatores influenciam
diretamente no curso de qualquer infecção parasitária e se reflete numa maior virulência
e/ou danos ao hospedeiro. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que T. laurentius
podem atuar, pelo menos, como um hospedeiro mantenedor de ambas as espécies testadas
de Leishmania sp. Além disso, não podemos descartar que, na natureza, roedores
___________________________________________________________________________discussão
33
infectados apresentem maior carga parasitária e parasitismo tissular na pele, atuando assim
como um hospedeiro amplificador.
7.5 Considerações finais
Como já discutido, o entendimento do papel de qualquer espécie de mamífero
silvestre nos ciclos de transmissão de parasitos depende de conhecimentos prévios de sua
biologia e estratégias de vida. Além disso, um melhor entendimento das peculiaridades da
interação parasito-hospedeiro passa pela necessidade da realização de uma ampla
abordagem metodológica, visto que ela tem influência direta na interpretação dos
resultados. Essa interpretação deve ter como base os distintos perfis de infecção dos
animais, sua localização e área de vida, no sentido de abarcar o cenário onde ocorre a
transmissão e, portanto, inferir possíveis riscos.
No caso de investigação dos ciclos de transmissão do Trypanosoma cruzi, o
diagnóstico do parasito por hemoculturas ou xenodiagnóstico é considerado o padrão ouro
da abordagem metodológica, uma vez que permite o isolamento e caracterização do agente
etiológico e reflete a transmissibilidade do parasito ao vetor que nele venha se alimentar ou
ao mamífero que venha a predá-lo. A visualização do parasito em exame à fresco de
sangue mostra uma alta parasitemia no animal em questão, mas nesse caso a confirmação
da infecção deve vir acompanhada de caracterização do agente etiológico isolado em
cultura, uma vez que outros tripanosomatídeos que não o T. cruzi, indistinguíveis ao exame
à fresco, podem estar presentes. Esses testes, quando positivos, demonstram uma alta
transmissibilidade ao vetor ou predador. São provas muito específicas, porém, pouco
sensíveis e sua importância está em se detectar os animais que, além de infectados,
representam fonte de infecção. A detecção do parasito em tecidos do hospedeiro através de
exames histológicos não representa infectividade ao triatomíneo, mas mostra a
transmissibilidade do parasito pela via oral, em caso de predação por outro mamífero.
No caso das leishmanioses, o exame direto e cultura de sangue são muito pouco
efetivos no diagnóstico e isolamento de parasitos para caracterização do agente etiológico.
Nesse caso, as culturas de punções ou fragmentos de tecidos constituem o padrão ouro da
abordagem metodológica, mas não refletem transmissibilidade ao vetor em todas as
situações. Culturas de pele ou sangue e/ou xenodiagnóstico positivo representam a
infectividade ao vetor e confirmam a transmissibilidade da Leishmania sp. A visualização
direta do parasito em fragmentos de pele tem menor sensibilidade mas, associado à
confirmação do agente etiológico, também atestam sua transmissibilidade. Já a cultura
positiva apenas em órgãos internos (baço, fígado, medula, linfonodos e outros) mostra que a
população parasitária está ativa, mas a infectividade ao vetor é menor.
___________________________________________________________________________discussão
34
Em ambos os casos, os testes sorológicos apontam para a exposição do animal ao
agente etiológico. O animal foi exposto ao parasito em algum momento da sua vida, mas
isso não significa que ele transmite ou mesmo que continua mantendo esse parasito.
Portanto, um animal no qual apenas o teste sorológico resultou positivo, demonstra estar
exposto ao ciclo de transmissão, é um hospedeiro desse parasito, mas não está envolvido
na amplificação das populações parasitárias, i.e., seu potencial de transmissibilidade ao
vetor é baixa. Diagnóstico molecular por PCR qualitativos são amplamente utilizados e
considerados exames parasitológicos diretos enriquecidos, uma vez que detectam partes
constitutivas, no caso fragmentos de DNA, dos parasitos. Apesar de indicarem a presença
do parasito, à exceção das reações quantitativas (PCR em tempo real), a alta sensibilidade
desses testes não nos permite concluir se a carga parasitária detectada seria suficiente para
garantir a transmissibilidade daquele tripanosomatídeo.
Consideramos como reservatórios mantenedores aqueles capazes de se infectar e
manter a infecção por um determinado parasito. Reservatórios amplificadores são aqueles
que, além disso, apresentam um perfil de infecção que favorece a transmissibilidade desse
parasito. Essa conceituação deve ser considerada para cada espécie investigada, em cada
localidade e num dado recorte de tempo. Os gambás (Didelphis spp), freqüentemente
citados como principal reservatório do T. cruzi, exemplificam bem a questão. De fato essas
espécies podem ser excelentes reservatórios amplificadores em algumas áreas (Roque et
al., 2008), mas esta peculiaridade não se repete em todos os ecossistemas. No Pantanal sul
matogrossense, estudos apontam para importância dos quatis como reservatórios (Herrera
et al., 2008) enquanto que em alguns fragmentos de mata atlântica essa função é
desempenhada por primatas Callitriquideos (Lisboa et al., 2006). Outro aspecto importante é
que reservatórios mantenedores podem se transformar em amplificadores em situações
especiais, como quando sofrem doenças outras debilitantes, por exemplo, que podem
alterar o perfil da infecção e favorecer a transmissibilidade do parasito.
O manejo da fauna silvestre e alterações decorrentes de modificações ambientais
podem desencadear graves alterações na epidemiologia das parasitoses silvestres, ou até
na epidemiologia de doenças humanas, no caso de parasitos de caráter zoonótico. O
cenário observado nas três áreas investigadas de ocorrência recente de surtos de doença
de Chagas reforça a necessidade de avaliar o impacto das alterações ambientais na saúde
dos animais e seus parasitos como forma de antecipar e entender os fatores que levam ao
aparecimento de casos humanos.
Thrichomys laurentius demonstrou ser capaz de manter infecções pelas principais
espécies de Leishmania relacionada com a doença humana (L. braziliensis e L. infantum).
Estudos de campo sobre a prevalência e perfil de infecção não só de T. laurentius, como
também das demais espécies congêneres, poderá definir o papel que esses abundantes
___________________________________________________________________________discussão
35
roedores podem desempenhar na epidemiologia dos ciclos de transmissão em áreas
endêmicas e não endêmicas das leishmanioses no Brasil.
O conjunto desses estudos mostra a importância de uma visão abrangente,
despreconceituosa, na avaliação dos cenários envolvidos numa rede parasitária de
transmissão. Esse tipo de visão deve ser levado em consideração no direcionamento de
ações de vigilância e controle de parasitoses. As políticas nacionais de vigilância em doença
de Chagas e Leishmanioses direcionadas, respectivamente, a vetores domiciliados e cães
soropositivos, refletem bem como preconceitos resultam em ações que, por não
considerarem a pluralidade, são reducionistas e acabam por não ter a mesma eficácia em
todos os cenários em que ocorrem. Muito raramente, se é que ocorre, a transmissão está
atrelada a grupos restritos de hospedeiros, o que resulta em que essas ações geram uma
expressiva melhora na situação num primeiro momento, mas não eliminam focos residuais
de transmissão que podem ser responsáveis por surtos epidêmicos dessas parasitoses.
A adoção da estratégia da borrifação de inseticidas dentro nas casas no combate ao
Triatoma infestans, principal vetor da doença de Chagas até a década de 80, pode ser
comparado à descoberta da penicilina ou à vacinação em massa contra a febre amarela
promovida por Oswaldo Cruz no início do século passado, no que diz respeito ao impacto na
qualidade de vida e volume de pessoas beneficiadas. Essa medida, no entanto, não
erradicou a doença e a transmissão para o homem continua ocorrendo em cenários
diferentes, mas não menos importantes em termos de saúde pública. Das três áreas de
surtos de doença de Chagas avaliadas (Roque et al., 2008; Roque & Jansen, 2008b), em
duas as infecções humanas decorreram da invasão de triatomíneos infectados que habitam
o ambiente silvestre, enquanto a terceira foi o resultado da invasão do homem a áreas que
apresentavam um ciclo de transmissão do T. cruzi com alta transmissibilidade. Esses novos
cenários de transmissão demandam novas ações de controle. Incentivar e desenvolver
estudos sobre esses novos perfis de transmissão do T. cruzi são essenciais para a definição
não de uma, mas de um conjunto de diversas ações que, considerando as particularidades
de cada caso, possam ser aplicadas.
No caso da Leishmaniose Visceral, a idéia de que os cães são os principais
responsáveis pela transmissão resulta em que a eliminação dos cães soropositivos seja
considerada por muitos a única forma de controle, ignorando por completo, por exemplo, o
caráter vetorial da transmissão. Raramente se realiza, por exemplo, campanhas educativas
à população sobre como evitar os criadouros dos vetores e o que fazer para evitar o contato
com os insetos. A questão ainda é mais grave se considerarmos que a própria identificação
dos animais positivos é discutível uma vez que não distingue os animais resistentes dos
susceptíveis, os que estão infectados dos que estão infectando os vetores. O trabalho
apresentado no bloco 3 dessa tese mostra a potencialidade de T. laurentius, um roedor
abundante em algumas áreas endêmicas de leishmanioses, na manutenção e transmissão
___________________________________________________________________________discussão
36
das duas espécies de Leishmania (L. braziliensis e L. infantum) mais prevalentes em casos
humanos. Isso aponta para um aspecto essencial que não é levado em consideração nos
programas de vigilância: a participação de outros mamíferos que podem manter o ciclo de
transmissão e servir de constante fonte de re-infecção à população canina. A importância de
se ter uma visão holística em estudos ecológicos/parasitológicos é ressaltada pelo perfil de
infecção por L. braziliensis nesses roedores. A visceralização do parasito e produção de
importante resposta humoral em T. laurentius vai de encontro a dois conceitos bastante
difundidos, de que “L. braziliensis é uma espécies dermotrópica”, e que a “sorologia não é
importante no diagnóstico desse parasito”. Certamente, à medida que novos estudos sobre
a dinâmica da interação entre Leishmania sp. e seus hospedeiros silvestres forem sendo
realizados, muitas das observações realizadas durante a infecção humana e expandidas
como conceitos universais aos demais hospedeiros mamíferos, voltarão a ser contestadas.
A mudança de paradigmas na vigilância e controle desses agravos é necessária e
urgente. Essa mudança passa, entre outros, pela necessidade de compreendermos o papel
que cada hospedeiro desempenha na manutenção desses parasitos na natureza. Os fatores
envolvidos na amplificação dos focos enzoóticos são particulares para cada local e em cada
momento, e entender alguns desses fatores pode fornecer subsídios para a proposição de
efetivas e sustentáveis estratégias de vigilância e controle para doença de Chagas e as
Leishmanioses.
________________________________________________________________________conclusões
37
Áreas submetidas a ações que resultem em simplificação da mastofauna e seleção
de espécies generalistas que sejam competentes fontes de infecção do
Trypanosoma cruzi aos vetores, devem ser considerados como fatores de risco de
emergência de casos humanos.
A presença de mamíferos domésticos sorologicamente positivos para T. cruzi, na
ausência de ciclos domiciliares, sinaliza para a presença de um ciclo de transmissão
ocorrendo nas proximidades de áreas de ocupação humana.
Animais domésticos podem atuar como sentinelas de risco de transmissão do T.
cruzi para o homem. A soroprevalência da infecção nesses animais pode ser
utilizada na identificação de áreas prioritárias para o estabelecimento de ações de
vigilância, educação e controle.
Em condições experimentais, Thrichomys laurentius foi capaz de manter infecções a
longo prazo e atuar como hospedeiro mantenedor dos principais agentes etiológicos
das leishmanioses humanas no Brasil, Leishmania braziliensis e L. infatum.
O perfil de infecção de T. laurentius infectados por L. infantum ou L. braziliensis foi
semelhante, sendo que essa última, associada apenas a formas cutâneas da doença
humana, foi capaz de visceralizar e se multiplicar em órgãos internos de T.
laurentius.
A caracterização de um mamífero como reservatório T. cruzi e/ou Leishmania sp.
depende da interpretação de todo um conjunto de resultados obtidos através de
diferentes abordagens metodológicas de diagnóstico direto e indireto.
Entender as variáveis envolvidas na dinâmica de transmissão do T. cruzi e
Leishmania sp. entre mamíferos silvestres e sinantrópicos é condição essencial para
definição de efetivas medidas de vigilância e controle em doença de Chagas e
Leishmanioses.
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_____________________________________________________________________________ANEXO 1
54
GUIA PARA VIGILÂNCIA, PREVENÇÃO, CONTROLE E MANEJO
CLÍNICO DA DOENÇA DE CHAGAS AGUDA TRANSMITIDA POR
ALIMENTOS
A. L. R. Roque;A. M. Jansen
Elaboração da parte de reservatórios de um Guia OPAS/OMS de
doenças transmitidas por alimentos – Abril/2009.
Grupo Técnico Consultor para Elaboração do Guia
Responsáveis pelo Processo de Revisão e Edi-
toração do Guia
Universidade Federal do Ceará, Ceará,
Brasil
ANVISA, Brasília, Brasil
Coordenação de Vigilância das Doen-
ças de Transmissão Hídrica e Alimentar,
SVS/MS, Brasília, Brasil
Centro de Pesquisas René Rachou/FIO-
CRUZ, Minas Gerais, Brasil
Instuto Evandro Chagas, Pará, Belém,
Brasil
PNCDCh, SVS/MS, Brasília, Brasil
Organização Pan-Americana da Saúde,
Rio de Janeiro, Brasil
Alberto Novaes Ramos Jr.
Denise de Oliveira Resende Marques
Greice Madeleine do Carmo
João Carlos Pinto Dias
Sebasão Aldo Valente
Soraya Oliveira dos Santos
Enrique Perez Guerrez
Alberto Novaes Ramos Jr.
Alejandro Luque
Ana Maria Aparecida Guaraldo
Ana Maria Jansen
Ana Yecê das Neves Pinto
André Luiz Rodrigues Roque
Andréa Regina de Oliveira
Antônio Carlos da Silveira
Karina R. J. Cavalcante
Cléber Galvão
Denise de Oliveira Resende Marques
Universidade Federal do Ceará, Ceará,
Brasil
Universidade Federal de Goiás, Goiás,
Brasil
Universidade de Campinas, São Paulo,
Brasil
Instuto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de
Janeiro, Brasil
Instuto Evandro Chagas/FIOCRUZ,
Pará, Brasil
Instuto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de
Janeiro, Brasil
Gerência Geral de Alimentos, ANVISA,
Brasília, Brasil
Consultor Independente, Brasil
Coordenação Geral de laboratório, SVS/
MS – Gerência de Epidemiologia, Brasí-
lia, Brasil
Instuto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de
Janeiro, Brasil
ANVISA Gerencia Geral de Alimentos,
Brasília, Brasil
Secretariado Técnico
Diana Carmem Almeida Nunes de Oli-
veira
Elenild Góes
Emanuel Marns
Erica Tao
Fabiana Alves
Glória Melo
Greice Madeleine do Carmo
João Carlos Pinto Dias
Maria Aparecida Shikanai Yasuda
Maria Del Pilar Zambrano
Mauricio Javier Vera Soro
Patrícia Brito Sampaio
Pedro Ramon Salazar
Sandra Moreira
Sebasão Aldo Valente
Soraya Oliveira dos Santos
Suelene Mamede
ANVISA Gerencia Geral de Alimentos,
Brasília, Brasil
Coordenação Estadual do Programa de
Chagas, Pará, Brasil
Coordenação PNDCh, SVS/MS, Brasília,
Brasil
SMS de Caxias do Sul/RS, Rio Grande do
Sul, Brasil
Representação DNDI, Rio de Janeiro,
Brasil
Representante PROCAPE, Pernambuco,
Brasil
Coordenação de Transmissão de Do-
enças por Alimentos, SVS/MS, Brasília,
Brasil
Centro de Pesquisas René Rachou/FIO-
CRUZ, Minas Gerais, Brasil
Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brasil
Instuto Nacional de Saúde, Ministério
da Saúde, Colômbia
Ministério da Saúde, Colômbia
Vigilância Sanitária, SES/PA, Pará, Brasil
Ministério da Saúde, Venezuela
Vigilância Sanitária, SES/PA, Pará, Brasil
Instuto Evandro Chagas, Pará, Belém,
Brasil
PNCDCh, SVS/MS, Brasília, Brasil
HEMOBRÁS, Brasília, Brasil
Área de Vigilância Sanitária e Manejo de
Doenças, Inocuidade de Alimentos, VP-
Panaosa, OPAS, Rio de Janeiro, Brasil
Representação OPAS, Uruguai, Progra-
ma Regional de Chagas
Representação OPAS, Consultor Doen-
ças Transmissíveis, Brasília, Brasil
Representação OPAS, Consultor Saúde
Publica Veterinária, Brasília, Brasil
Representação OPAS, Consultor Doen-
ças Transmissíveis, Brasília, Brasil
Enrique Perez-Guerrez
Roberto Salvatella
Sérgio Sosa-Estani
Mauro Elkhoury
Rubén Figueroa
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
18
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
19
Palmeiras Mauria exuosa (Buri) Maximiliana regia (Inajá)
Figura 2: Ecótopos naturais de espécies do gênero Rhodnius
__________________________________________________________________________
Um triatomíneo, seja ninfa ou adulto, que tenha se alimentado em um mamífe-
ro infectado com o T. Cruzi pode adquirir a infecção que persiste em geral durante
toda a sua vida. Não existe transmissão transovariana do T. Cruzi.
Figura:3: Vetores
__________________________________________________________________________
Reservatórios
O Trypanosoma cruzi é um parasito de muitos hospedeiros capaz de infectar
dezenas de espécies de mamíferos silvestres e doméscos pertencentes a oito di-
ferentes ordens. As aves e os vertebrados de sangue frio são refratários ao parasi-
to. Esse agelado encontra-se distribuído em todas as regiões togeográcas do
país, sendo encontrado nos mais diversos nichos ecológicos contribuindo, em cada
po de ecótopo, para formar modalidades disntas de focos naturais de transmis-
são. Como parasito de animais silvestres, podemos encontrar diferentes espécies
de mamíferos sustentando disntos ciclos de transmissão os quais podem estar
isolados ou conectados. Este caráter é parcular e único para cada localidade.
Alguns mamíferos silvestres como quas, gambás (mucuras, cassacos ou sa-
rigues) e tatus aproximam-se das casas, freqüentando galinheiros, currais e de-
pósitos na zona rural e periferia das cidades. De fato os gambás são atualmente
considerados como uma espécie sinantrópica, muito mais do que silvestre. Outros
animais, como os morcegos, comparlham ambientes com o homem e animais
doméscos. Deste modo, essas espécies podem estar servindo como fonte de in-
fecção aos triatomíneos que ocupam os mesmos habitat dos humanos.
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
20
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
21
O contato do homem com o ambiente silvestre e, portanto com os ciclos de
transmissão natural do T. Cruzi, ocorre em diversas situações que em geral (mas
não necessariamente) são ou foram inuenciados direta ou indiretamente pelo
homem. Procurando uma explicação para a emergência ou re-emergência de para-
sitoses, os prossionais de saúde tentaram idencar as espécies animais que são
fontes de infecção para o homem e/ou animais doméscos. Nestes estudos, mui-
tas espécies de mamíferos são denominadas “reservatórios naturais” de parasi-
tos. A connuação destes estudos mostrou que em muitos casos não apenas uma,
mas diversas espécies animais poderiam ser apontadas como fonte de infecção do
homem em um determinado local. Passou-se a entender que determinados para-
sitos eram capazes de infectar um número grande de espécies de animais e que
estes apresentavam diferenças na sua importância como fonte de infecção para o
homem - este é o caso do T. Cruzi. Ficou claro que em diferentes localidades uma
mesma espécie de mamífero pode desempenhar disntos papéis na manutenção
do parasito na natureza. Mais ainda, começou-se a entender que cada área estuda-
da apresentava caracteríscas próprias e que variavam no tempo, ou seja, as ações
de saúde deveriam entender o que se passa em cada local para então estabelecer
a estratégia de atuação.
Dentro desta dinâmica, o conceito de reservatório como um “portador assin-
tomáco” que mantém o parasito passou a ser considerado ultrapassado, uma
vez que não reete a complexidade e temporalidade de seu ciclo de transmissão.
Assim sendo, representa muito mais do que uma simples interação parasito-hos-
pedeiro.
Reservatório é um sistema ecológico complexo (formado
por várias espécies) responsável pela manutenção de um
parasito na natureza. Este sistema deve ser consistente e
sempre considerado dentro de uma escala espaço-tempo-
ral único.
Figura 4: Potenciais reservatórios
__________________________________________________________________________
Fotos: Diversos colaboradores do Laboratório de Biologia de Tripanosomadeos – Instuto
Oswaldo Cruz/FIOCRUZ.
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
22
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
23
Estudo dos Reservatórios
A transmissão mais ancestral do T. cruzi para o homem ocorre por meio de veto-
res invertebrados – os triatomíneos. Porém estes triatomíneos apenas transmitem o
parasito se esverem infectados e isto acontece quando eles se alimentam sobre um
dos numerosos hospedeiros infectados. Ou seja, se os mamíferos de uma determinada
área apresentam altas taxas de infecção por T. cruzi, há maior probabilidade do vetor se
infectar e, portanto, infectar o próximo mamífero (incluindo o homem com o qual se irá
relacionar. A idencação do que é o reservatório de um parasito é um desao tanto
do ponto de vista teórico quanto práco. No entanto, é um ponto fundamental para a
denição de medidas que serão adotadas para o controle da transmissão do parasito
em questão. Esta tarefa torna-se um desao maior, um quebra cabeça no estudo de
um parasito generalista como o T. cruzi.
Quando se discutem os reservatórios do T. cruzi, é preciso ter em mente que o
simples fato de um indivíduo ser encontrado naturalmente infectado não quer dizer,
necessariamente, que ele venha a constuir um risco à saúde de sua população, de
outras espécies ou do homem. Ainda, o papel que cada espécie de hospedeiro desem-
penha na dispersão e/ou manutenção do parasito pode ser extremamente variável
devido à (a) complexidade dos processos e inter-relações ecológicas, e (b) espantosa
velocidade com a qual o homem modica os ambientes.
É importante lembrar que um ciclo de transmissão muitas vezes é imaginado como
nas ilustrações dos livros didácos, unidimensional e linear. No entanto é preciso com-
preendê-lo como uma teia, uma rede tróca de transmissão com a parcipação de
mamíferos de diferentes taxa, um sistema complexo, variável e dinâmico. Para denir
e desenvolver medidas de controle é necessário conhecer todos os elos da cadeia de
transmissão, o que inclui os reservatórios. Como denido anteriormente, a condição
de reservatório difere no tempo e no espaço, o que exige estudos locais realizados a
parr de metodologia especíca.
A condição de reservatório é dinâmica e difere no recorte temporo-espacial. É
classicamente armado que gambás são os reservatórios silvestres mais importantes
do T. cruzi. Na verdade os gambás podem sim ser excelentes reservatórios, mas isso
não acontece em todos os biomas e habitat que esses animais ocupam. Consideran-
do como reservatório do T. cruzi a espécie de mamífero capaz de sustentar, manter, e
também transmir este parasito, há que se conhecerem, na área que for o alvo dos
estudos, os seguintes aspectos:
1) O conjunto dos mamíferos existentes no local (composição faunísca e abun-
dância relava das espécies de mamíferos), o qual nos permite reconhecer o
papel que as diferentes espécies desempenham no ciclo de transmissão. Assim,
uma espécie de mamífero que apresentar altas prevalências da infecção por
T. Cruzi, mas que tenha baixa densidade populacional no local de estudo não
representará um risco de infecção muito expressivo.
2) A idencação correta do hospedeiro na qual se detectou a infecção, uma
vez que mesmo espécies próximas apresentam padrões de infecção bem dife-
rentes, a saber: maior ou menor quandade de parasitos no sangue (parasite-
mia) e tempo de duração desta parasitemia. Estas diferenças resultam na maior
ou menor possibilidade de infecção para o triatomíneo que for se alimentar
nestes animais, ou seja, na sua maior ou menor transmissibilidade.
3) A prevalência e o perl da infecção por T. cruzi na população de hospedei-
ros, ou seja, quantos animais (e de quais espécies) do total estão infectados e
quantos animais apresentam muitos parasitos no sangue. Esta informação vai
demonstrar quais as espécies que foram expostos à infecção e se estes animais
são ou não fontes de infecção para os triatomíneos. Assim, mamíferos nos quais
foram detectados ancorpos, certamente foram expostos à infecção. Se estes
mamíferos não apresentarem parasitos no sangue, isto sugere que naquele
momento estes não são fonte provável de infecção para os triatomíneos.
4) A distribuição dos hospedeiros nos disntos habitat do bioma, o permi-
te avaliar onde está acontecendo a transmissão, ou seja, onde há maior risco
de contaminação. Observa-se com freqüência que a transmissão do T. Cruzi é
agregada, não homogênea. Ou seja, podem-se encontrar animais infectados de
modo mais localizado em um determinado ecótopo e não em outro. Portanto
é sempre importante examinar um número representavo de animais de todos
os ambientes das áreas que estamos estudando (Figura 4). Esses animais não
estão restritos apenas ao estrato onde são mais comumente encontrados e os
parasitos são carreados por seus hospedeiros, os quais podem contribuir para
o estabelecimento de novos focos.
5) A prevalência da infecção entre as disntas sub-populações de hospedei-
ros (machos e fêmeas, adultos e jovens) sendo possível assim determinar se
a infecção ainda está acontecendo (caso a infecção seja muito freqüente em
animais jovens) ou a possibilidade da dispersão do parasito. Assim, gambás
machos têm um comportamento nômade muito mais acentuado do que as
fêmeas, enquanto primatas vivem em grupos e são muito terrirorialistas. Pro-
vavelmente as taxas de infecção irão variar entre os grupos e esse aspecto deve
ser considerado nos estudos destes animais. Essas diferenças podem ajudam a
prever oscilações na transmissão baseada nas utuações sazonais populacio-
nais dos principais hospedeiros.
6) A dinâmica das populações de hospedeiros no tempo e espaço (estudos lon-
gitudinais).
7) A isolamento e caracterização das sub-populações do parasito, o que vai per-
mir rastrear os ciclos de transmissão e entender quais os animais estão envol-
vidos no ciclo que inclui o homem.
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
24
01
EPIDEMIOLOGIA DA DOENÇA DE CHAGAS
POR TRANSMISSÃO ORAL
25
Sempre que possível deve ser construído um banco de dados com todas as
informações, para posterior análise espacial e denição das áreas de risco.
Figura 5: Estratos orestais
_________________________________________________________________________
Fonte: Apresentação de André Roque
Animais doméscos não connados podem atuar como elo entre os ciclos de
transmissão silvestre e domiciliar. Cães e gatos podem ser excelentes reservatórios
do
T. Cruzi.
Porcos também se infectam com o parasito, mas o seu papel como re-
servatório ainda precisa ser mais bem estudado. Assim como os mamíferos silves-
tres, a importância dos animais doméscos como reservatório varia nos diferentes
locais, mas eles estão sempre expostos e sua infecção normalmente precede a do
homem.
Uma proposta que vem sendo feita por prossionais de saúde de vários países
da América Lana é ulizar os animais doméscos como sennela da transmissão
do
T. Cruzi,
para serem monitorados por exames sorológicos .
Esta estratégia signica que a presença de ancorpos especícos nos animais do-
méscos em uma determinada área sinaliza que a transmissão do
T. Cruzi
está aconte-
cendo nas áreas onde esses animais circulam (nas proximidades do homem) e aponta
para a necessidade de ampliar as ações: aprofundando o estudo dos ciclos de transmis-
são, incluindo um programa de educação em saúde e boas prácas e, principalmente,
informando e sensibilizando a população da área.
Modalidades de Transmissão
da Doença de Chagas
A transmissão do T. cruzi para o ser humano pode ocorrer por diversas formas:
• Vetorial: ocorre por meio das fezes dos triatomíneos, também conhecidos
como “barbeiros” ou “chupões”. Esses, ao picarem os vertebrados, em geral
defecam após o repasto, eliminando formas infectantes de tripomasgotas me-
tacíclicos, que penetram pelo oricio da picada ou por solução de connuidade
deixada pelo ato de coçar, ou, mesmo, através de penetração ava em mucosas
como da boca e dos olhos.
• Transfusional / Transplante: ocorre pela passagem por transfusão de sangue
e/ou hemocomponentes ou transplante de órgãos de doadores infectados a
receptores sadios.
• Vercal ou congênita: ocorre pela passagem de parasitas de mulheres in-
fectadas pelo T. Cruzi, para seus bebês durante a gestação ou o parto.
• Acidental: ocorre pelo contato da pele ferida ou de mucosas com material
contaminado (sangue de doentes, excretas de triatomíneos, animais conta-
minados) durante manipulação em laboratório (acidental), em geral sem o
uso adequado de equipamentos de proteção individual.
• Oral: ocorre pela ingestão de alimentos contaminados com parasitas prove-
nientes de triatomíneos infectados ou, ocasionalmente, por secreções das
glândulas de cheiro de marsupiais (Didelphis sp: mucura ou gambá).
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