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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
APLICADAS
DENISE NEVES NUNES
ANÁLISE COMPARATIVA DA MORFOLOGIA E DO PERFIL DE ESTERÓIS DE
FUSARIUM SPP, COMO EXPRESSÃO DA ADAPTAÇÃO TÉRMICA.
NITERÓI
2009
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ii
DENISE NEVES NUNES
ANÁLISE COMPARATIVA DA MORFOLOGIA E DO PERFIL DE ESTERÓIS DE
FUSARIUM SPP, COMO EXPRESSÃO DA ADAPTAÇÃO TÉRMICA.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Microbiologia e
Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense como requisito para
obtenção do grau de Mestre em
Microbiologia e Parasitologia Aplicadas.
Orientadora: Profª. Dra. DIANA BRIDON DA GRAÇA SGARBI
NITERÓI
2009
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iii
DENISE NEVES NUNES
ANÁLISE COMPARATIVA DA MORFOLOGIA E DO PERFIL DE ESTERÓIS DE
FUSARIUM SPP, COMO EXPRESSÃO DA ADAPTAÇÃO TÉRMICA.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Microbiologia e
Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense como requisito para
obtenção do grau de Mestre em
Microbiologia e Parasitologia Aplicadas.
.
Aprovado em abril de 2009
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________
Prof. Dr. Jeferson Carvalhaes de Oliveira
Universidade Federal Fluminense
___________________________________________________________
Prof. Dr. Leonardo Nimrichter
Universidade Federal do Rio de Janeiro
__________________________________________________________
Pqª Dra. Lucimar Ferreira Kneipp
Fundação Oswaldo Cruz
Niterói
2009
iv
À minha mãe, Maria Helena, que representa o maior exemplo de vida, amor
e perseverança que eu poderia seguir.
v
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus; por todas as oportunidades que me
foram concedidas e por todas que ainda serão; pois sei que “Tudo posso n‟Aquele
me fortalece”.
Agradeço, também, a toda minha família que sempre foi minha base e minha
fortaleza. Em especial, a minha mãe, Maria Helena Neves Nunes, que sempre me
apoiou em todos os momentos da minha vida.
À professora Diana Bridon da Graça Sgarbi, que me orientou nesse trabalho
e tem contribuído para o meu aprendizado desde a época da graduação; aos amigos
do laboratório que sempre estiveram dispostos a ajudar.
Um agradecimento especial ao Prof. Dr. Antônio Jorge Ribeiro da Silva e a
sua equipe do Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, por toda ajuda e colaboração de fundamental importância neste
estudo.
Agradeço as minhas amigas, Lília Carreiro dos Santos e Líllian Kelly Pereira,
com as quais dividi muito mais do que apenas um “teto”; a todos os meus amigos
que sempre estiveram ao meu lado durante essa caminhada, em especial Bruno
Giorno, Cecília Matheus Guimarães e Matheus F. L. de Barros, com os quais sempre
pude contar dentro e fora desta universidade.
Agradeço aos funcionários técnico-administrativos do Instituto Biomédico –
UFF pelo carinho e por toda prestatividade. Em especial a Lúcia Cavalieri.
vi
“De tudo, ficaram três coisas:
a certeza de que ele estava sempre começando,
a certeza de que era preciso continuar
e a certeza de que seria interrompido antes de terminar.
Fazer da interrupção um caminho novo.
Fazer da queda um passo de dança,
do medo, uma escada,
do sonho, uma ponte,
da procura, um encontro.”
Fernando Sabino
vii
SUMÁRIO
Página
1
INTRODUÇÃO
18
1.1
Características gerais e biologia de Fusarium
19
1.2
Toxigenicidade de Fusarium
22
1.3
Infecções causadas pelo gênero Fusarium
24
1.3.1
Ceratite fúngica
25
1.3.2
Onicomicoses
28
1.3.3
Infecções cutâneas
29
1.3.4
Infecções Sistêmicas
30
1.3.5
Micetomas
31
1.4
Componentes da membrana
32
2
OBJETIVOS
37
2.1
Objetivos gerais
37
2.2
Objetivos específicos
37
3
MATERIAIS E MÉTODOS
38
3.1
Microcultivo modificado
38
3.2
Identificação das espécies
39
3.3
Microrganismos, condições de cultivo e obtenção
de massa de células
39
3.4
Extração de lipídios totais
40
3.5
Dosagens químicas
42
3.5.1
Dosagem química de açúcar total
43
3.5.2
Dosagem química de esteróis
44
3.5.3
Dosagem química de fosfato
44
3.6
Cromatografia em camada fina
45
3.7
Saponificação, fracionamento em coluna e
acetilação de esteróis
48
3.8
Cromatografia gasosa e CG acoplada ao espectro
50
viii
de massas (GC/MS)
4
RESULTADOS
51
4.1
Morfologia
51
4.2
Identificação de espécies
52
4.3
Dosagens químicas
56
4.3.1
Dosagem de açúcar
56
4.3.2
Dosagem de esteróis
58
4.3.3
Dosagem de fosfato
60
4.4
Cromatografia em camada fina
63
4.4.1
CCF de esteróis
63
4.4.2
CCF de glicolipídios
65
4.5
Identificação dos esteróis pelo tempo de retenção
67
4.6
Caracterização dos esteróis por GC/MS
70
4.6.1
Ergosta-tetraenol 5, 7, 9 (11), 22
70
4.6.2
Brassicasterol
71
4.6.3
Zymosterol
72
4.6.4
Ergosterol
73
4.6.5
Episterol
74
4.6.6
Lanosterol
75
4.6.7
Sitosterol
76
4.6.8
“m/e 398”, provável Sitostanol
78
4.6.9
“Eburicol + 14”, suposto Etilideno- 24 (28)- lanosterol
79
4.6.10
Eburicol (metileno- 24 (28)- lanosterol)
80
5
DISCUSSÃO
81
6
CONCLUSÕES
94
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
96
8
ANEXOS
107
ix
Lista de Ilustrações:
Página
Figura 01
Colônia de Fusarium verticillioides, após 7 dias de
incubação a 25°C. O fungo apresenta micélio de cor
branca com pigmento púrpura (B). Colônia de Fusarium
dimerum, após 15 dias de incubação a 25°C. O fungo
apresenta micélio de cor laranja (C). Todos os cultivos
foram realizados em ágar batata-dextrose (PDA). Colônia
de Fusarium solani, após 7 dias de incubação a 25°C. O
fungo apresenta micélio de cor branca a creme, com
reverso de cores variadas (ágar batata, PDA).
20
Figura 02
Macroconídio de Fusarium equiseti (A), microconídio de
Fusarium moniliforme (B) e clamidoconídio de Fusarium
oxysporum (C).
22
Figura 03
Ceratite causada por Fusarium solani, com uma área de
necrose elevada próxima a superfície da córnea.
27
Figura 04
Lesões papulares eritematosas e placas de necrose na
parte inferior da perna direita (a). Visão aumentada de
uma placa necrótica (b).
29
Figura 05
Macroconídio (A) e microconídios (B) de Fusarium,
cultivados a temperatura ambiente. Foram feitas lâminas
diretas, coradas com azul de algodão e fotografadas ao
microscópio óptico com aumento de 40x.
51
Figura 06
Conídios de Fusarium, com formas semelhantes à
pseudo-hifas, cultivados a temperatura de 37º. Foram
feitas lâminas diretas, coradas com azul de algodão e
fotografadas ao microscópio óptico com aumento de 40x.
52
Figura 07
Fusarium cultivado a temperatura ambiente, em placas de
Petri com agar batata-dextrose. A e B representam,
respectivamente, a frente e o reverso de uma colônia da
seção Martiella enquanto as fotos C e D representam,
respectivamente, a frente e o reverso de uma colônia da
seção Elegans.
53
Figura 08
Conídios dispostos em falsas cabeças. Fotos tiradas a
partir da observação direta das placas em microscópio
óptico, com objetiva de 10x.
54
Figura 09
Clamidoconídios fotografados a partir da observação de
lâminas diretas, coradas com azul de algodão, em
microscópio óptico com objetiva de 40x. Podem estar
sozinhos (A) ou em pares (B).
54
Figura 10
Diferenciação das espécies através da observação do
tamanho das fiálides. Na foto A, fiálides longas,
características de Fusarium solani (seção Martiella). Na
55
x
foto B, fiálides curtas, características de Fusarium
oxysporum (seção Elegans).
Figura 11
Microconídios em cadeias (A) e falsas cabeças (B),
característicos da seção Liseola. Fotos tiradas a partir da
observação direta das placas em microscópio óptico, com
objetiva de 10x.
55
Figura 12
Percentual de açúcar obtido a partir de dosagem química
realizada nos lipídios extraídos das duas temperaturas de
cultivo; separados por espécies.
58
Figura 13
Percentual de esterol obtido a partir de dosagem química
realizada nos lipídios extraídos das duas temperaturas de
cultivo; separados por espécies.
60
Figura 14
Percentual de fosfato obtido a partir de dosagem química
realizada nos lipídios extraídos das duas temperaturas de
cultivo; separados por espécies.
62
Figura 15
Cromatografia em camada fina dos esteróis das amostras
de Fusarium solani (A, B, C e D), reveladas com ácido
sulfúrico a 50%. Os padrões utilizados foram ergosterol
(ERG) e lanosterol (LAN).
63
Figura 16
Cromatografia em camada fina de esteróis das amostras
de Fusarium oxysporum (E, F e G) e Fusarium
moniliforme (H e I), revelada com ácido sulfúrico a 50%.
Os padrões utilizados foram ergosterol (ERG) e lanosterol
(LAN).
64
Figura 17
Cromatografia em camada fina dos glicolipídios das
amostras de Fusarium solani (A, B, C e D), reveladas com
ácido sulfúrico a 50%. Os padrões utilizados foram lipídio
de batata (LB) e lipídio de cérebro bovino (LCB).
65
Figura 18
Cromatografia em camada fina de glicolipídios das
amostras de Fusarium oxysporum (E, F e G) e Fusarium
moniliforme (H e I), revelada com ácido sulfúrico a 50%.
Os padrões utilizados foram lipídio de batata (LB) e lipídio
de cérebro bovino (LCB).
66
xi
Lista de quadros:
Página
Quadro 01
Identificação de seções e espécies, segundo critérios
de Nelson et al.
56
Quadro 02
Tempo de retenção e porcentagem relativa dos
esteróis das amostras de Fusarium solani (A, B, C e
D). OBS: a amostra CA só apresentou um pico em
33,384.
67
Quadro 03
Tempo de retenção e porcentagem relativa dos
esteróis das amostras de Fusarium oxysporum (E, F e
G).
68
Quadro 04
Tempo de retenção e porcentagem relativa dos
esteróis das amostras de Fusarium moniliforme.
69
xii
Lista de Abreviaturas e Unidades
BDA: agar batata-dextrose
CCF: cromatografia em camada fina
CG: cromatografia gasosa
CHCl
3
: clorofórmio
C:M: clorofórmio:metanol
cm: centímetro
DMAP: 4- (dimetilamino) piridina
D.O.: densidade óptica
g: grama
GC/ME: cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massas
HCl: ácido clorídrico
H
2
O: água
H
2
SO
4
: ácido sulfúrico
KH
2
PO
4
: fosfato monobásico de potássio
µg: micrograma
mg: miligrama
Mg(NO
3
)
2
: nitrato de magnésio
mL: mililitro
µL: microlitro
mm: milimetro
N: normal
N
2
: nitrogênio
NaCl: cloreto de sódio
nm: nanômetro
NaOH: hidróxido de sódio
p/p: peso/peso
p/v: peso/volume
RPM: rotações por minuto
xiii
RT: tempo de retenção
v/v: volume/volume
v/v/v: volume/volume/volume
14
RESUMO
As micoses emergentes são definidas como aquelas que têm aumentando em
incidência, principalmente associadas a fatores predisponentes do hospedeiro. Os
fungos oportunistas são considerados com menor grau de virulência, mas podem
expressar esses fatores em condições de baixa de defesa do hospedeiro. O gênero
Fusarium, com diversas espécies e ampla distribuição na natureza, na dependência
do grau de integridade do hospedeiro, tem potencial como agente etiológico de
micoses cutâneas, subcutâneas e sistêmicas. Um importante fator de virulência,
essencial para que um fungo seja capaz de causar micose sistêmica, é a habilidade
de se adaptar à temperatura corpórea humana. As mudanças nas condições
ambientais são determinantes para eliminar o fungo ou desencadear mudanças que
levem à adaptação para sobrevivência desse e conseqüentes danos para o
hospedeiro. O presente estudo teve como objetivos comparar a micromorfologia em
função da temperatura de cultivo, identificar as espécies das amostras estudadas,
verificar o conteúdo de esterol, açúcar e fosfato por dosagens químicas dos lipídios
obtidos das amostras nas duas temperaturas de cultivo, identificar e caracterizar os
esteróis presentes nas amostras. Foram analisadas 09 amostras de Fusarium,
oriundas de nossa coleção de culturas e de casos clínicos. Os microcultivos e a
obtenção de massas de células foram realizados em meio líquido de batata-dextrose
a 25 e 37 graus Celsius. A identificação das espécies foi feita através das chaves de
classificação de Nelson, 1983. Os lipídeos foram extraídos da massa de células com
solventes orgânicos. Esteróis e glicolipídeos foram analisados por cromatografia em
camada fina. Foram realizadas dosagens químicas de esterol, açúcar e fosfato. A
identificação dos esteróis foi realizada através de cromatografia gasosa e esses
foram caracterizados por espectrometria de massas (GC/MS). Em todas as amostras
foram observadas mudanças na micromorfologia em função da temperatura de
cultivo. Em 25ºC, há predominância de hifas hialinas septadas com macroconídios e
microconídios; já em 37ºC, hifas mais espessas, pseudohifas e estruturas
leveduriformes com gemulações. Dentre as amostras, foram identificas as seguintes
espécies: F. solani, F. oxysporum e F. moniliforme. Todas as amostras, em ambas
as temperaturas, apresentaram glicolipídeos com características de mono-glucosil-
ceramídeos. Por dosagens químicas, as amostras apresentaram em sua
composição: de 2,09 a 5,83% de açúcar; de 2,31 a 6,22% de esterol e de 0,06 a
0,9% de fosfato, sendo que este último, apresentou maior percentual nas amostras
cultivadas a 37ºC. Foram identificados os seguintes esteróis: ergosta-tetra- 5, 7, 9
15
(11), 22; brassicasterol, zymosterol, ergosterol, episterol, lanosterol, sitosterol e
eburicol. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir ao conhecimento do
gênero Fusarium na relação parasita-hospedeiro e patogênese, assim como nas
estratégias antifúngicas.
Palavras-chave: Fusarium, esteróis, adaptação térmica.
16
ABSTRACT
The emerging mycoses are defined as those that are increasing in incidence,
mainly associates the predisponent factors of the host. The opportunistic
fungal pathogens are considered with lesser degree of virulence, but that they
can express these factors in conditions of low of defense of the host. The
genus Fusarium, with diverse species and ample distribution in the nature, in
the dependence of the degree of integrity of the host, has potential as
cutaneous, subcutaneous and sistemical agent of micoses. An important factor
of virulence, essential so that one fungus either capable to cause mycose
sistemical, is the ability of if adapting to the corporal temperature human being.
The changes in the ambient conditions are determinative to eliminate fungus
or to unchain changes that lead to the adaptation for survival of this and
consequent damages for the host. The present study it had as objective to
compare the micromorphology in function of the temperature of culture, to
identify the species of the studied samples, to carry through qualitative
analysis of the lipid profile and chemical dosages of sterols, sugar and fosfato
of the samples in the two temperatures of culture, to identify and to
characterize the sterols presents in the samples. Nine samples of Fusarium,
deriving of our collection of cultures and clinical cases had been analyzed. The
microcultures and the attainment of masses of cells had been carried through
in liquid media potato-dextrose the 25 and 37 Celsius degrees. The
identification of the species was made through the keys of classification of
Nelson, 1983. The lipids had been extracted of the mass of cells with organic
solvents. Sterols and glycolipids had been analyzed by thin layer
chromatography. Chemical dosages of sterol, sugar and phosphate had been
made. The identification of the sterols was made through gas chromatography
and these had been characterized by mass spectrometry (GC/MS). In all the
samples had been observed changes in the micromorphology in function of
the temperature of culture. At 25ºC, it has predominance of hyalinum hyphae,
septa, with macroconidia and microconidia; already at 37ºC, thicker hyphae,
pseudohyphas and cellular yeast forms. Amongst the samples, the following
species had been identified: F.solani, F.moniliforme and F. oxysporum. All the
17
samples, in both the temperatures, had presented glycolipids with
characteristics of monohexosylceramide. In the chemical dosages, the
samples had presented in its composition: of 2,09 to 5,83% of sugar; of 2,31 to
6,22% of sterol and 0,06 to 0.9% of phosphate, being that this last one,
presented percentile greater in the cultivated samples 37ºC. The following
sterols had been identified: ergo-tetra 5, 7, 9 (11), 22; brassicasterol,
zymosterol, cholesterol, ergosterol, episterol, lanosterol, sitosterol and
eburicol. We believe that our results can contribute to the knowledge of the
genus Fusarium in the relation parasite-host and phatogenecity, as well as the
antifungal strategies.
Key-words: Fusarium, sterols, termic adaptation.
18
1 INTRODUÇÃO
As micoses emergentes são definidas como aquelas que têm aumentado em
incidência, principalmente associadas a fatores predisponentes do hospedeiro, de
especial importância em indivíduos imunodebilitados.
Espécies de Fusarium são conhecidas por serem de distribuição mundial,
mesmo considerando as variações climáticas, com espécies sapróbias comuns do
solo e patógenos para plantas, como exemplo, Fusarium solani que é o causador da
síndrome da morte súbita em soja (PARK et al, 1999).
O gênero Fusarium compreende diversas espécies, sendo que muitas podem
desencadear processos micóticos importantes, principalmente em indivíduos
imunodeprimidos. Esse fungo, de difícil classificação ao nível de espécie, já é
considerado entre os mais importantes agentes de micoses emergentes.
Algumas infecções por Fusarium já foram descritas com alto índice de
mortalidade, especialmente por demora no diagnóstico. Visto que a infecção por
esse fungo pode ser confundida com aspergilose, muitos pacientes são usualmente
tratados com anfotericina B, um agente com baixa atividade contra fusariose.
Conseqüentemente, um diagnóstico precoce da fusariose é de suma importância.
19
Também já foram descritos casos de doença de base, hematológicas, onde
pacientes desenvolveram infecção por Fusarium durante o curso da doença
(BOUTATI & ANAISSIE, 1997). Apesar do crescente número de publicações a
respeito de infecções fatais por esse fungo, é muito escasso o conhecimento de sua
patogênese, características clínicas, ou do tratamento dessas micoses
(KONTOYIANNIS et al, 2003).
1.1 Características gerais e biologia de Fusarium
O gênero Fusarium é composto por uma grande quantidade de espécies que
em geral são fitopatógenas e sapróbias do solo, sendo a minoria patogênica para o
homem. Sua posição sistemática é definida como pertencente ao Reino Fungi,
Divisão Eumycota, Subdivisão Deuteromycotina, Classe Hyphomycetes, Ordem
Moniliales, Família Moniliaceae, Gênero Fusarium segundo LACAZ et al, 1998.
No ambiente, estes fungos dispersam seus propágulos por ação da água de
chuva, ventos e insetos. A maior parte das espécies do gênero parasita sementes de
cereais e outros frutos do campo, causando danos à agricultura. (MILLS, 1989).
As culturas de Fusarium spp. apresentam crescimento rápido da colônia,
micélio aveludado, opacos ou levemente brilhantes. Após um período de incubação
de aproximadamente 10 dias, em torno de 25°C, o fungo pode apresentar pigmentos
de diversas cores, como rosa, púrpura, cinza ou amarela, sendo estas
características importantes para identificação das espécies (GUARRO & GENE,
1992). Para a determinação das espécies, os meios de cultivo mais utilizados são o
ágar aveia (OAT) e ágar batata (PDA), sendo que alguns autores sugerem o uso de
20
meios pobres em nutrientes como o ágar folha de cravo (CLA) com o objetivo de
estimular a conidiogênese (FISCHER et al, 1982; LACAZ et al, 1998).
A B C
Figura 1: Colônia de Fusarium solani, após 7 dias de incubação a 25°C. O
fungo apresenta micélio de cor branca a creme, com reverso de cores variadas (A).
Colônia de Fusarium verticillioides, após 7 dias de incubação a 25°C. O fungo
apresenta micélio de cor branca com pigmento púrpura (B). Colônia de Fusarium
dimerum, após 15 dias de incubação a 25°C. O fungo apresenta micélio de cor
laranja (C). Todos os cultivos foram realizados em ágar batata-dextrose (PDA).
Fonte: GODOY, 2004.
A principal característica deste gênero é a produção de macroconídios em
forma de foice com extremidades afiladas (levemente curvos ou inclinados). Eles
emergem a partir de fiálides (células conidiogênicas), que podem apresentar-se
isoladamente ou agrupadas em massas, crescendo diretamente do micélio
vegetativo, sendo conhecidas como esporodóquios. Algumas espécies apresentam
macroconídios com uma estrutura pronunciada designada como célula pé. Os
macroconídios podem ter até 10 septos transversais (GUARRO & GENÉ, 1995).
21
Os microconídios são pequenos, podendo ter forma elipsóide, alantóide,
piriforme, ovóides ou subglobosos. São produzidos no micélio aéreo sobre
monofiálides ou polifiálides e organizados em cabeças mucóides ou cadeias e
possuem a base truncada (NELSON et al, 1994).
O termo mesoconídio tem sido usado para designar os blastoconídios. Estes
são parecidos com os macroconídios; no entanto, são menores, não possuem célula
basal em forma de pé, apresentam-se isolados e não formam cabeças mucóides,
sendo a base do mesoconídio truncada (PASCOE, 1990).
Algumas espécies podem produzir clamidoconídios, quando em condições
desfavoráveis. Esses são estruturas de resistência, que podem estar isolados ou
agrupados em cadeias. Apresentam paredes grossas, lisas ou rugosas, e podem
estar localizados na região apical, intercalar ou terminal (NELSON et al, 1994).
A morfologia dos macroconídios é peça chave para identificação das espécies
desse gênero. Por isso, quando os macroconídios não são produzidos em cultivo, a
identificação se torna extremamente difícil. GAMS & NIREMBERG (1989)
estabeleceram alguns critérios de identificação fenotípicas baseados numa
combinação de características, o que permite o reconhecimento do gênero Fusarium
exclusivamente pelos seus microconídios, tomando-se em conta a cor das colônias
e a morfologia dos conidióforos e microconídios. Existe grande dificuldade para
diferenciar as espécies de Fusarium de outras espécies que produzem conídios
multisseptados fusiformes como, Cylindrocarpon spp. e Acremonium spp. (KWON-
CHUNG et al, 1992). Testes baseados em características fenotípicas têm sido
utilizados para a classificação taxonômica, análise da patogenicidade e
principalmente estudos epidemiológicos (GUARRO & GENÉ, 1995).
22
A B C
Figura 2: Macroconídio de Fusarium equiseti (A), microconídio de Fusarium
moniliforme (B) e clamidoconídio de Fusarium oxysporum (C). Fonte: NELSON et al,
2004.
1.2 Toxigenicidade de Fusarium
Alguns fungos sintetizam substâncias tóxicas denominadas micotoxinas, que
quando ingeridas ou inoculadas no homem ou em outros animais, podem produzir
distúrbios orgânicos. Micotoxicose é o nome dado ao quadro patológico (intoxicação)
que ocorre por ingestão de alimentos contaminados por estas substâncias tóxicas
produzidas e liberados pelos fungos. Os sintomas de uma micotoxicose dependem
do tipo de micotoxina, da quantidade desta que foi ingerida, do tempo de exposição,
do estado nutricional, sexo e idade do indivíduo que foi exposto. Acredita-se ainda
que fatores como genética, dietas e interações com outras toxinas atuem de maneira
sinérgica na evolução da intoxicação (BENNET & KLICH, 2003). Na maioria dos
23
casos, não existe tratamento para micotoxicoses, apenas terapia de suporte, como
reidratação oral, por exemplo.
Os principais fungos produtores de micotoxinas exógenas pertencem a 3
gêneros: Aspergillus, Fusarium e Penicillium. Esses fungos são sapróbios, ubíquos,
e benéficos em diversos aspectos, pois, entre as vantagens que nos oferecem,
participam da reciclagem da matéria orgânica no solo. Mas, esses mesmos fungos,
sob circunstâncias determinadas, podem produzir e excretar essas substâncias
tóxicas em alimentos.
As principais micotoxinas produzidas pelo gênero Fusarium são: antibiótico Y,
butenolida, culmorina, beauvericina, eniatina, fumonisina, fusaproliferina,
moniliformina, tricotecenos, deoxinivalenol e seus derivados, toxina T-2,
diacetoxiscirpenol e zearalenona, sendo esta última, juntamente com a fumonisina,
as mais estudadas (FRISVAD et al, 2006).
A zearalenona é uma micotoxina produzida principalmente pelas espécies: F.
avenaceum, F. culmorum, F. equiseti, F graminearum, F. lateritium, F. moniliforme,
F. oxysporum. De modo geral, os alimentos freqüentemente contaminados são:
milho, trigo, nozes, cevada. O suíno é o animal doméstico mais sensível, mas já foi
observada intoxicação natural em gado leiteiro e aves (sendo o peru a ave mais
sensível). Os leitões podem ser afetados através do leite materno, com o
conseqüente desenvolvimento de síndrome estrogênica. Esta micotoxina pode
provocar diversos efeitos, como: hiperestrogenismo, aborto, natimortos, falso cio,
prolapso retal e vaginal, efeminização dos machos com desenvolvimento de mamas,
etc. A zearalenona tem afinidade pelos receptores de estrógenos do organismo
animal, os quais irão mediar suas atividades como ocorre com o estrógeno natural
24
(17β-estradiol). Desse modo, os órgãos de animais intoxicados podem conter essa
micotoxina, o que representa risco para o consumo humano.
A fumonisina é produzida pelas espécies F. moniliforme, F. proliferatum e F.
nygami. Foi caracterizada em 1988 e é responsabilizada por alguns processos
patológicos como a leucoencefalomalácia equina (ROSS et al, 1993) e edema
pulmonar e hidrotórax em suínos (HARRISON et al, 1990). Para ratos, é
hepatotóxica e hepato-carcinogênica (GELDERBLOM et al, 1988) e também é
correlacionada com risco de câncer esofageano em populações da África e China
(BENNET & KLICH, 2003). Já foram caracterizados 28 análogos de fumonisinas,
produzidas em milho contaminado. As fumonisinas são micotoxinas com estrutura
semelhante à base de cadeia longa esfingosina, fato que indica uma possível
interferência dessas no metabolismo de esfingolipídeos.
1.3 Infecções causadas pelo gênero Fusarium
O gênero Fusarium era considerado como agente de micotoxicose e de
infecções superficiais. No entanto, desde a década de 70, infecções disseminadas
por este agente têm sido descritas com maior frequência, principalmente em
pacientes imunodeprimidos (GUARRO & GENE, 1995). Os representantes desse
gênero apresentam difícil classificação ao nível de espécie, e já estão entre os mais
importantes agentes de micoses emergentes. As espécies que provocam doença no
homem e se apresentam com maior freqüência são: Fusarium solani, Fusarium
oxysporum, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, Fusarium chladosporum,
25
Fusarium roseum (Fusarium concocolor), Fusarium equiseti, Fusarium semitectum,
Fusarium anthophilum e Fusarium graminearum. (KWON-CHUNG & BENNET,
1992).
1.3.1 Ceratite fúngica
As micoses oculares, incluindo as ceratites, manifestam-se clinicamente
devido a fatores que propiciam a modificação da microbiota conjuntival (por
medicações tópicas ou condições climáticas favoráveis), a destruição das defesas
locais (trauma, cirurgias ou doenças oculares prévias) ou a diminuição da resistência
do hospedeiro devido à doenças sistêmicas ou drogas imunossupressoras. Esses
fatores irão influenciar o início do processo infeccioso micótico, seu prognóstico e
sua evolução (HÖFLING-LIMA
et al, 2005). Esse tipo de infecção já foi descrito em
diversos locais do olho, como pálpebras, vias lacrimais, conjuntiva, córnea, esclera,
úvea, órbita, nervo óptico e estruturas intra-oculares, sendo a ceratite a doença
fúngica mais freqüente.
A epidemiologia da ceratite fúngica depende de fatores climáticos. Em climas
temperados (Europa Central, Inglaterra, norte dos EUA), Candida sp é o fungo
isolado com mais freqüência, seguido pelo Aspergillus sp. Já em regiões tropicais
(Sul da Flórida, América do Sul, Japão, Nigéria, África do Sul), o fungo mais
freqüentemente encontrado é o Fusarium spp (SALERA et al, 2002). Em um estudo
realizado no Laboratório de Doenças Externas Oculares da Universidade Federal de
São Paulo, os casos de ceratite corresponderam a aproximadamente 90% das
26
doenças micóticas identificadas no laboratório. Dentre os casos de ceratite, 58,8 %
foram causados por Fusarium (HÖFLING-LIMA
et al, 2005).
As espécies de Fusarium mais freqüentes que causam ceratite são Fusarium
solani e Fusarium oxysporum (VISMER et al, 2002; ZAPATER, 1986). Mais
recentemente, Fusarium dimerum, Fusarium verticillioides, Fusarium sacchari e
Fusarium polyphialidicum (GARRO et.al, 2003) também foram descritos. Ceratite é
mais comum em áreas tropicais e subtropicais. Sua incidência está relacionada com
a época de colheita e aumentos na temperatura e umidade. O trauma da córnea por
material vegetal pode introduzir o fungo diretamente no epitélio ou lesar o tecido
tornando-o propício para colonização e infecção por patógenos ambientais (KLOTZ
et al, 2000).
As ceratites micóticas possuem evolução clínica lenta e a lesão pode ser
única ou associada a lesões satélites, com bordas irregulares e projeções
semelhantes a espículas, com abscessos no estroma com intensidade variável. Uma
grande quantidade dos polimorfonucleares pode levar a sua precipitação na câmara
anterior e formação da área branca (GODOY, 2004). Espécies do gênero Fusarium
podem invadir a câmara anterior formando uma massa fúngica na lente e na área da
pupila, interferindo na drenagem de humor aquoso e aumentando a pressão
intraocular. Esta complicação é única e característica das ceratites produzidas por
espécies do gênero Fusarium (KURIAKOSE & THOMAS, 1991; THOMAS, 2003).
27
Figura 3: Ceratite causada por Fusarium solani, com uma área de necrose
elevada próxima a superfície da córnea. Fonte: THOMAS, 2003.
Os pacientes com esse quadro apresentam lacrimejamento, dor, desconforto,
irritação, acuidade visual, fotofobia, olho vermelho, sensação de corpo estranho
durante 5 a 10 dias. O exame do olho revela úlcera de córnea elevada, com
margens bem definidas irregulares brancas e infiltrada profundo no estroma da
córnea, sob a úlcera (GODOY, 2004).
As ceratites podem evoluir de maneira desfavorável se não forem
diagnosticadas e tratadas precocemente (WONG et al, 1997; VEMUGANTI et al,
2002). Sob o aspecto clínico, a ceratite causada por Fusarium é similar àquelas
causadas por outros fungos, porém apresenta um prognóstico pior, pois rapidamente
ocorrem alterações da córnea que levam à perda da visão, podendo ser necessária
a realização de transplante (RICHARDSON & WARNOCK, 1997). Glaucoma maligno
se apresenta como uma complicação relativamente freqüente em pacientes que
apresentam ceratite por Fusarium (KURIAKOSE & THOMAS, 1991).
28
1.3.2 Onicomicoses
Onicomicose é uma infecção que ocorre nas unhas, provocada por diferentes
tipos de fungos que invadem a lâmina ungueal. Eventualmente, pode ser causada
por outros agentes que atingem a unha secundariamente, podendo chegar até esta
por diversos mecanismos, inclusive auto-inoculação.
As micoses das unhas podem ser causadas por três tipos de fungos:
dermatófitos, leveduras e fungos filamentosos não dermatófitos. Porém existem
diferenças geográficas na epidemiologia e etiologia das onicomicoses,
especialmente na freqüência em que cada grupo se apresenta como responsável
pela infecção (HANEKE, 1991).
Os dermatófitos são os mais freqüentes causadores das onicomicoses. Entre
os fungos não dermatófitos, os principais são o Fusarium solani e o F. oxysporum,
que produzem, também, outras doenças como dermatomicoses e infecções
sistêmicas. O Fusarium solani e F. oxysporum provocam comprometimento proximal
da unha associado à dor e inflamação periungueal. A unha afetada apresenta cor
branca amarelada e, freqüentemente, superfície opaca. A dobra proximal da unha e
a cutícula tomam cor branca-amarelada, indicando a origem proximal da infecção. A
unha distal pode tomar coloração amarelada quando há progressão da micose
(ARAÚJO et al, 2003). A evolução da onicomicose por Fusarium é de 1 mês a 15
anos, com média em torno de 3 anos (TOSTI et al, 2000).
As onicomicoses provocadas por Fusarium requerem atenção especial,
devido ao poder de invasão do fungo, que pode se manifestar quando o hospedeiro
apresenta debilidade imunológica (MATSUMOTO et al, 1994). Há relatos de casos
29
onde a fungemia por Fusarium em pacientes com câncer teve a sua origem a partir
de celulite periungual, relacionada a Fusarium (GIRMENIA et al 1992; NUCCI &
ANAISSIE, 2002).
1.3.3 Infecções cutâneas
O gênero Fusarium também já foi identificado como causador de infecções
cutâneas, que podem servir como sítio primário de infecção ou sítio de metástase
decorrente de fungemia. Pacientes com doenças cutâneas relacionadas ao gênero
Fusarium podem apresentar lesões de tipos variados, como pápulas eritematosas e
nódulos com necrose central. Além disso, espécies desse fungo podem colonizar
feridas, queimaduras e úlceras. Tanto a forma superficial como a profunda já foram
descritas em pacientes saudáveis e imunocomprometidos. Um caso de fusariose
cutânea localizada causada por Fusarium solani foi descrita em um paciente que
sofreu transplante renal (COCUROCCIA et al, 2003).
Figura 4: Lesões papulares eritematosas e placas de necrose na parte inferior da
perna direita (a). Visão aumentada de uma placa necrótica (b).
Fonte: COCUROCCIA et al, 2003
30
1.3.4 Infecções sistêmicas
O número de infecções invasivas causadas pelo gênero Fusarium vem
aumentando gradativamente ao longo dos anos, principalmente em pacientes
imunocomprometidos. Essas infecções podem se apresentar de forma localizada ou
disseminada. Casos de infecção localizada por Fusarium incluem osteomielite, artrite
por inoculação do fungo por trauma, bem como quadro de peritonites em pacientes
em programa de diálise contínua (GODOY, 2004).
Entre pacientes imunocomprometidos, Fusarium spp também é reconhecido
como um importante agente etiológico envolvido em infecções disseminadas,
especialmente aqueles que apresentam neoplasias hematológicas e queimaduras
extensas. As espécies mais freqüentes são F. solani, F. oxysporum, F. moniliforme
e, menos comumente, F. anthophilum, F. chlamydosporum, F. dimerum, F. equiseti,
F. lichenicola, F. napiforme, F. proliferatum, F. semitecum e F. verticilloides. A
infecção geralmente se apresenta como uma febre persistente, refratária a agentes
antimicrobianos e antifúngicos. Outras manifestações podem ser encontradas, como
sinusite, endoftalmite, dolorosas lesões na pele, pneumonia, miosite e infecções no
sistema nervoso central. Praticamente qualquer órgão pode estar envolvido, mas a
pele, pulmões e seios nasais são os mais freqüentemente afetados. O prognóstico
da infecção disseminada por Fusarium é bastante desfavorável, sendo a mortalidade
muita elevada, da ordem de 70 a 80% apesar da terapêutica antifúngica (MUSA et
al, 2000; NUCCI et al, 2002).
A porta de entrada de Fusarium ainda não foi bem estabelecida, mas
acredita-se que o acesso do fungo pode ocorrer por via respiratória, pelo trato
31
gastrointestinal, cateteres e pele. A infecção pode ocorrer pelo contato direto com
solo ou plantas contaminadas, inalação de conídios ou ingestão de alimentos
contaminados (COCUROCCIA et al, 2003).
Também já foi descrito um caso de infecção mista causada por duas espécies
de Fusarium em um paciente HIV positivo com linfoma que apresentava quadro de
neutropenia devido à quimioterapia. O paciente mostrou os sinais típicos da infecção
sistêmica. As espécies F. solani e F. verticillioides foram isoladas da pele e do
sangue, respectivamente (GUARRO et al, 2000).
1.3.5 Micetomas
O termo micetoma refere-se às infecções crônicas, da pele e tecido
subcutâneo, bacterianas ou micóticas, que se caracteriza inicialmente por lesões
nodulares subcutâneas, que com o passar do tempo, fistulizam e drenam uma
secreção sanguinolenta ou seropurulenta, contendo grãos parasitários
(microcolônias do agente infeccioso). Os micetomas são classificados de acordo
com o agente etiológico, como actinomicóticos (de origem bacteriana) ou
eumicóticos (de origem fúngica). Actinomicetomas têm com principais agentes, os
gêneros: Actinomadura, Streptomyces e Nocardia. Os agentes de eumicetomas
podem ser divididos de acordo com a coloração dos grãos e têm como agentes
principais: Madurella spp, Acremonium spp, Aspergillus, Scedosporium
apiospermum e Curvularia lunata. Apesar de raros, também já foram descritos na
literatura, casos de eumicetomas causados por Fusarium solani, provocando
32
múltiplas lesões crostosas nas mãos e nos pés. (LUQUE et al, 1991; TOMIMORI-
YAMASHITA et al, 2001).
1.4 Componentes da membrana
A célula fúngica é essencialmente eucariótica e compartilha semelhanças
entre células animais e vegetais. A membrana citoplasmática dos fungos apresenta
estrutura e funções similares às das membranas das células de mamíferos, sendo
constituída por uma camada dupla de fosfolipídios e um arranjo de proteínas
embebidas na bicamada lipídica, com proteínas de superfície fracamente ligadas à
membrana e pequenas quantidades de carboidratos. A estrutura lipoprotéica da
membrana é uma barreira efetiva para muitos tipos de moléculas, que a atravessam
por difusão ou transporte ativo (THEVISSEN et al, 2003). A membrana plasmática é
envolvida por uma parede celular rígida responsável pela forma e integridade
estrutural do organismo (MORETTI, 2006).
A membrana plasmática dos fungos difere das membranas animais por
apresentar o ergosterol em vez de colesterol, como principal esterol. Os esteróides
da membrana conferem estrutura, modulação da fluidez e possivelmente controlam
alguns eventos fisiológicos. O ergosterol é responsável por inúmeras características
físicas importantes das membranas, inclusive as citadas acima. Sua ausência causa
alterações na permeabilidade da membrana plasmática e inibição do crescimento
(SANTOS & CARVALHO, 2001; THEVISSEN et al, 2003).
33
Ergosterol é o esterol primário nas membranas celulares de fungos
filamentosos e pode estar presente em vegetais superiores. Também está presente
em membranas de fungos leveduriformes e nas mitocôndrias (AXELSSON et al,
1995; MATILE et al, 1969). Ele é um dos constituintes de membrana tanto no micélio
como em esporos e células vegetativas (NEWELL, 1992). Ele também é largamente
utilizado para estimar a biomassa de fungos em vários ambientes, como solo e
sistemas aquáticos, pois existe uma forte correlação entre a quantidade de
ergosterol e a massa seca de células (MATCHAN et al,1985; NEWELL,1994;
SCHNÜRER,1993; SUBERKROPP et al,1993).
No entanto, a quantidade de ergosterol na massa celular não é constante.
Existem relações entre essa quantidade e a espécie do fungo, idade da cultura,
estágio de desenvolvimento (fase de crescimento, de formação da hifa e
esporulação) e condições de crescimento, como meio utilizado, pH e temperatura
(PASANEN et al,1999). No entanto, ainda não foi totalmente esclarecida qual a
conexão entre o conteúdo de ergosterol e os fatores acima relatados. (GESSNER, et
al,1993). Em hifomicetos e ascomicetos, as concentrações variam de 2,3 a 11,9 mg
de ergosterol por mg de micélio seco (GESSNER et al, 1993; NEWELL et al, 1994).
O conteúdo de ergosterol para espécies de Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Rhizopus, Cladosporium, Candida, e Alternaria estão entre 0,4 a 14,3 mg/mg
(AXELSSON, 1995; SCHNÜRER, 1993; SEITZ, 1979).
O ergosterol pode também estar envolvido na regulação da síntese da quitina.
A inibição da síntese do ergosterol por agentes antifúngicos pode causar a ativação
da enzima quitina sintetase, causando excessiva produção de quitina e crescimento
anormal (LOGUERCIO-LEITE, 2006).
34
As estruturas superficiais dos fungos, por serem as estruturas mais externas,
são as primeiras a entrar em contato com o hospedeiro, portanto tem recebido uma
atribuição especial no reconhecimento e nos eventos decorrentes dessa
apresentação. Além disso, os componentes da membrana e parede celular recebem
atenção especial, pois frequentemente são alvos das drogas antifúngicas.
Entre os agentes que atuam na membrana celular, temos aqueles que
interferem na biossíntese de esteróis, como os derivados alilamínicos e azólicos
(imidazólicos e triazólicos). Outros atuam diretamente na membrana celular, como
os derivados poliênicos, combinando-se com os esteróis.
As alilaminas (Terbinafina e Naftifina) inibem a ação da enzima escaleno
epoxidase, importante na formação do ergosterol. O acúmulo de escaleno leva à
ruptura da membrana e conseqüente morte celular. A terbinafina liga-se fortemente
às proteínas plasmáticas e não causa prejuízos nos processos metabólicos e
químicos do paciente. A droga tem penetração rápida através da derme e pode ser
encontrada na camada lipofílica da epiderme (DIOGO, 2007).
Os azólicos são classificados como imidazólicos (cetoconazol e miconazol) ou
triazólicos (itraconazol e fluconazol), respectivamente. Eles interferem na síntese do
ergosterol através da inibição da enzima 14-α-demetilase, a qual é dependente do
citocromo P-450 (CHIOU et al, 2000). Os derivados azólicos complexam-se com
essa enzima, na porção protoporfirínica (átomo de nitrogênio do azólico liga-se ao
átomo de ferro do grupamento heme da enzima), impedindo a etapa de demetilação
do lanosterol. Sem essa etapa, não será formado o ergosterol, e haverá acúmulo de
esteróis metilados. Esses produtos “anômalos” formados (esteróis metilados em C-
14), dependendo do fungo, não tem a capacidade de estabilizar a membrana, tal
como o ergosterol.
35
Diferentes intermediários metabólicos metilados em C-14 foram observados
em fungos tratados com derivados imidazólicos em concentração de inibição mínima
do crescimento, dependendo do fungo analisado (BOSSHE et al, 1990); o efeito
resultante na inibição do crescimento e divisão celular dos fungos depende do
intermediário metabólico formado ser capaz de suportar o crescimento, e tal
sensibilidade deve ser um reflexo das propriedades inerentes da enzima 14 -
demetilase em diferentes fungos (QUAIL et al, 1993).
Os poliênicos são antimicóticos produzidos por várias espécies de
Streptomyces (actinomicetos) e são altamente tóxicos para a membrana
citoplasmática dos fungos, pois se ligam de forma irreversível. Essas substâncias
combinam-se com esteróides, tendo maior afinidade pelo ergosterol e por isso
atuam mais em fungos do que em células de humanos e de animais, que contêm
colesterol. Amostras de Candida resistentes à Nistatina contêm menos ergosterol do
que as amostras sensíveis (GHANNOUM et al, 1990; MACURA,1991). A interação
de poliênicos com ergosterol, presente na membrana fúngica, resulta na formação
de poros, causando alteração na permeabilidade celular e levando a perda de
constituintes essenciais (potássio, açúcares, proteínas, fosfatos inorgânicos, ácidos
carboxílicos e ésteres de fosfatos).
O sítio de ação dos agentes antifúngicos mais utilizados é o ergosterol na
membrana ou sua via biossintética. A anfotericina B liga-se ao ergosterol formando
complexos que permitem a rápida saída de íons celulares como o potássio e
moléculas menores; a perda de potássio resulta na inibição da glicólise e da
respiração celular. O derivados imidazólicos e triazólicos inibem a atividade de uma
das enzimas da via biossintética do ergosterol, impedindo sua síntese. A ausência
36
de ergosterol causa alterações na permeabilidade da membrana plasmática e
inibição do crescimento (MORETTI, 2006).
37
2 OBJETIVOS
Objetivos gerais: Neste estudo, dedicamos nossa atenção ao gênero
Fusarium, grupo de fungos filamentosos, hialinos, de hifa septada e buscamos
avaliar sua morfologia, a capacidade de crescimento a 37ºC, o perfil de esteróis e
glicoconjugados de amostras cultivadas a 25 C e 37 C, que representa a adaptação
térmica à temperatura corporal humana e possível papel na virulência em micoses
sistêmicas.
Objetivos específicos:
Comparar a micromorfologia das amostras em relação à temperatura de
cultivo, por microscopia óptica;
Identificar as espécies das amostras estudadas;
Comparar o perfil de esteróis e glicolipídeos das amostras, em função da
temperatura de crescimento, por cromatografia em camada fina;
Quantificar esteróis, açúcares e fosfato por dosagens químicas;
Obter a composição de esteróis por cromatografia gasosa (GC) e confirmação
pelo GC-massas, para comparação entre espécies de Fusarium e possíveis
mudanças de perfil em função da temperatura de cultivo.
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Microcultivo modificado
O microcultivo foi realizado em lamínulas, previamente colocadas em placas
de Petri forradas com papel de filtro, as quais foram autoclavadas por 20 minutos.
De forma asséptica, as lamínulas foram organizadas com auxílio de uma pinça na
superfície do papel de filtro, de modo a ficarem equidistantes uma das outras. Com
pipeta Pasteur, foi adicionada água destilada estéril, suficiente para umedecer o
papel de filtro. A partir do cultivo em meio sólido, foi feita uma suspensão dos
conídios com meio de batata líquido. Desta suspensão, foi retirada uma gota para
cada lamínula. Foram confeccionadas duas placas para cada amostra, uma ficando
em temperatura ambiente e outra a 37°C. Após incubação por 7 dias, foi colocado
um pequeno chumaço de algodão embebido em formaldeído dentro da placa de
Petri, por 24h, para matar o fungo. Em seguida, foi feita a montagem das lâminas
utilizando-se o azul de algodão como corante. A micromorfologia foi observada em
microscópio
39
óptico, com objetiva de 40x, e fotografada com câmera digital Sony, com definição
de 7 MegaPixels.
3.2 Identificação das espécies
A identificação das espécies foi feita seguindo as chaves de classificação
propostas por Nelson, Toussoun e Marasas, 1983. Esse método baseia-se na
análise macro e micromorfológica, sendo utilizados os seguintes critérios: aspecto e
coloração das colônias; forma, tamanho e quantidade de macroconídios e
microconídios; ausência ou presença de clamidosporos. Os fungos foram cultivados
em placas e tubos contendo ágar batata-dextrose, nos quais eram observadas as
características macroscópicas das colônias. Para análise da micromorfologia, as
placas foram observadas ao microscópio, com objetiva de 10x, e foram
confeccionadas lâminas diretas (ou pela técnica de microcultivo), usando-se azul de
algodão como corante, para observação das estruturas também em microscópio
óptico, com objetiva de 40x.
3.3 Microrganismos, condições de cultivo e obtenção da massa de
células
Foram analisadas 09 amostras de Fusarium, sendo essas cultivadas à
temperatura ambiente e a 37 C por 7 dias. Primeiramente, foram cultivadas em 8
40
erlenmeyers cada de 1L contendo 100ml de meio Batata-dextrose, com incubação à
temperatura ambiente e também a 37 C por 7 dias. A seguir, foi adicionado 400ml
de meio Batata-dextrose em cada erlenmeyer e deixados sob as mesmas condições
por mais 7 dias. Após esse período, as respectivas massas de células dos fungos
foram separadas por filtração a vácuo em funil de Buchner acoplado a Kitazato, e
lavadas por 3 vezes com solução de NaCl a 0,85%. Algumas amostras já faziam
parte de nossa coleção de culturas, sendo isoladas do meio ambiente, de alimentos
ou de material clínico. Outras foram obtidas no Laboratório de Micologia do Instituto
Biomédico, isoladas de casos clínicos de humanos, e a utilização destas foi
submetida a uma avaliação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Medicina / HUAP, para o projeto “Onicomicoses por fungos emergentes: análise
clínica e diagnóstico laboratorial”, o qual foi aprovado. As amostras estão sendo
mantidas em meio Agar Batata-dextrose, através de repiques bimestrais. O meio
Batata-Dextrose foi confeccionado no próprio laboratório, utilizando-se um infuso
obtido a partir do cozimento de 200g de batatas descascadas, 20g de dextrose e
água destilada em quantidade suficiente para um litro.
3.4 Extração de lipídeos totais
Para essa etapa, foi seguido o procedimento descrito por GALIARD (1968a e
1968b), utilizando-se álcool isopropílico em vez de extrações iniciais com misturas
de clorofórmio e metanol. Esse procedimento foi o escolhido em nosso laboratório,
41
pois o isopropanol, ao contrário do clorofórmio, não ataca materiais plásticos, como
o caso do liquidificador que usamos, que é do tipo doméstico.
A partir das massas de células obtidas, foram realizadas 5 extrações
sucessivas com adição dos solventes e posterior filtração a vácuo. As três extrações
iniciais foram realizadas com 10 volumes (ml/grama de células) de álcool
isopropílico, por trituração em liquidificador por dois minutos e seguido por filtração a
vácuo. As duas extrações subsequentes, foram realizadas com 5 volumes de
clorofórmio e metanol (1:1, v/v), passando-se o resíduo de células para um becher, e
agitação manual com auxílio de espátula por cerca de três minutos, seguindo-se
então à filtração. Desse processo, foi obtido o resíduo seco de células e o extrato
lipídico bruto. O resíduo seco de células foi pesado e o extrato lipídico bruto foi
concentrado até a secura em evaporador rotatório.
Ao extrato lipídico bruto seco foi adicionada uma solução de clorofórmio-
metanol (2:1), e esse conteúdo foi centrifugado a 3000 RPM por 5 minutos. Esse
processo foi repetido cerca de 4x, até que todo extrato presente no balão, tivesse se
dissolvido. O sobrenadante foi transferido para outro balão e concentrado a vácuo
em evaporador rotatório. Com esse procedimento, foram obtidas duas frações: uma
solúvel em C:M 2:1 (a que foi armazenada no balão) e outra insolúvel em C:M 2:1
(os precipitados retidos nos tubos de centrífuga, os quais não foram analisados). O
lipídio solúvel em C:M 2:1 foi utilizado para as dosagens químicas e cromatografia
em camada fina.
42
3.5 Dosagens químicas
Para a realização das dosagens químicas, porções de lipídeos, com peso
conhecido, foram dissolvidos em C:M (2:1), suficientes para concentração final de 5-
10mg/ml. A partir desta “solução mãe” foram obtidas as concentrações ideais para
dosagem de esteróis, açúcar ou fosfato. Para possibilitar as melhores leituras em
espectrofotômetro, que correspondam principalmente às densidades ópticas na faixa
0,1 - 0,9, as dosagens foram feitas em triplicatas, com alíquotas de 0,2ml, 0,3ml e
0,4ml para cada amostra, de cada temperatura. O conteúdo dos tubos foi seco com
fluxo de N
2
ou deixado secar naturalmente por 24 horas e guardados em geladeira
para o dia da dosagem. Foi utilizado o espectrofotômetro da marca QUIMIS, Q-
108D, operando na faixa visível (340 a 950nm).
Toda a vidraria utilizada nas dosagens químicas foi tratada com solução
sulfocrômica ou ácido sulfúrico a 50%: a vidraria seca, lavada com detergente
neutro, é imersa na solução de escolha (sulfocrômica ou H
2
SO
4
) por pelo menos 2
horas; após esse tempo, é lavada por no mínimo 20 vezes com água corrente, e
depois por 3 vezes com água destilada (ou, pelo menos, água filtrada).
As curvas padrões (sempre preparadas para o conjunto de dosagens do dia)
foram construídas em papel milimetrado, densidade óptica (D.O.) no eixo da
ordenada e a quantidade em microgramas na abscissa; o traçado da curva foi feito
manualmente, considerando-se o maior número de pontos, e respeitando-se as
linearidades das curvas. As quantidades (em g) dos componentes analisados das
amostras, foram obtidas pela plotagem dos pontos na curva, a partir das densidades
ópticas lidas em espectrofotômetro. Os percentuais ( g%) de componentes das
43
amostras foram calculados por “regra de 3”. Dos valores em D.O obtidos de 3
mensurações para cada amostra (3 concentações distintas), foram selecionados
aqueles que correspodiam à faixa de maior confiabilidade das curvas padrões
(especialmente entre 0,2-0,8), sempre descartando-se qualquer valor sugestivo de
erro de pipetagem.
3.5.1 Dosagem química de açúcar total
A dosagem química de açúcar total foi feita de acordo com DUBOIS et al,
1956. Foram utilizados como reagentes uma solução aquosa de fenol a 5% p/v e
ácido sulfúrico concentrado. Primeiro, foi preparada a curva padrão (em duplicata)
com uma solução de glucose 0,1mg/ml. Esta foi construída com as quantidades em
μg de glucose no eixo das abscissas (10, 20, 40, 60 e 80) e valores da D.O. no eixo
das ordenadas. Nos tubos com amostras, foi adicionado: 1 ml de água destilada;
0,5ml da solução de fenol; 2,5ml do H
2
SO
4
concentrado “em jato”, através de uma
pipeta com a ponta cortada, seguido de agitação em vortex depois de cada
reagente. Após o preparo de todos os tubos, foi feita a leitura em espectrofotômetro
a 490nm. Os valores de D.O. obtidos são então colocados no gráfico da curva
padrão e a partir disto, é calculada a quantidade em μg de cada amostra.
44
3.5.2 Dosagem química de esteróis
A dosagem química de esteróis foi feita pela reação de LIEBERMANN-
BURCHARD, adaptada para cubetas de 3ml. Os reagentes utilizados foram
clorofórmio puro e solução recém-preparada de anidrido acético: ácido sulfúrico
(19:1, v/v). Primeiramente, foi realizada a curva padrão, com uma solução de
ergosterol e outra de lanosterol, ambas com concentração de 0,25mg/ml (2,5mg em
10ml de clorofórmio puro). Nos tubos que continham as amostras, foram adicionados
1,5mL de clorofórmio puro seguidos de agitação em vortex para homogeneizar. Em
seguida, foi adicionado “em jato” (usando seringa) 1ml da mistura de anidrido
acético: H
2
SO
4
(19:1, v/v), seguido de agitação em vortex e imediatamente colocou-
se os tubos (um a um) ao abrigo da luz por, pelo menos, 15 minutos. Depois de
preparar todos os tubos, e findados os 15 minutos no escuro, foi realizada a leitura
em espectrofotômetro a 430 nm.
3.5.3 Dosagem química de fosfato
A dosagem química de fosfato foi feita segundo Ames, 1966. Foram utilizados
como reagentes os seguintes compostos: Nitrato de magnésio, Mg(NO
3
)
2
.6H
2
O, a
10% em etanol 95%; Ácido clorídrico 0,5N; Ácido ascórbico a 10% aquoso;
Molibdato de amônia a 0,42% em H
2
SO
4
1N. Na hora do uso, foi preparada a
45
mistura reagente usando as soluções de ácido ascórbico a 10% com o molibdato de
amônia a 0,42% em H
2
SO
4
1N na proporção 1:6.
A curva padrão foi construída a partir de uma solução de fosfato monobásico
de potássio. A solução padrão foi obtida através da diluição 1:10 de uma solução
mãe de 7,2mg de KH
2
PO
4
com água destilada
;
resultando numa solução com
concentração de 0,072mg/ml. Os tubos tanto dos padrões como de amostras foram
preparados em duplicatas.
Procedimento: foram adicionados aos tubos, já contendo os padrões ou
amostras, 0,1 ml da solução de nitrato de magnésio; em seguida, foi feito
aquecimento dos tubos diretamente em chama de bico de Bunsen, até o
desaparecimento da fumaça marrom; o resíduo que se forma foi dissolvido em 0,9
mL de HCl 0,5N, e aquecido a 100 C por 15 minutos; depois desse tempo,
adicionou-se 2 mL da mistura reagente (ácido ascórbico com molibdato de amônia)
seguido por incubação a 37 C por 1 hora; por fim, foi a realizada a leitura em
espectrofotômetro a 820 nm.
3.6 Cromatografia em camada fina
Confecção das placas:
Para cada placa de vidro de 16,4 x 6,2 cm, foi preparada uma suspensão de 3g de
sílica gel 60G em 6,7ml de água destilada, que foi homogeneizada e adicionada ao
centro da placa, que foi então deixada escorrer rápida e cuidadosamente sobre toda
a superfície, pela ação dos movimentos manuais. As placas foram deixadas secar
46
naturalmente em superfície plana por 24-48 horas e depois armazenadas como
prateleiras em caixas de isopor com abertura frontal. Antes do uso, as placas foram
ativadas pelo aquecimento por cerca de uma hora.
Sistema para aquecimento das placas (ativação e revelação):
Foi utilizada uma forma de alumínio contendo areia e coberta com papel de
alumínio, que é aquecida com fogareiro elétrico. Esse sistema é mantido dentro da
capela.
Desenvolvimento cromatográfico:
Os lipídeos foram aplicados a 1,5 cm da borda inferior da placa, em dois spots, um
referente à amostra cultivada a 25°C e outro a 37°C. As cromatografias ascendentes
foram realizadas em potes de vidro com tampa de rosca, contendo um retângulo de
papel de filtro para melhor saturação do solvente. Foram adicionados cerca de 30
mL de sistema eluente para cada pote.
Revelação e registro dos resultados:
Após a corrida cromatográfica as placas foram deixadas na capela para secagem e
depois reveladas utilizando um borrifador de vidro acoplado a um pulverizador e,
dependendo do tipo de revelação, era realizado o aquecimento como descrito, e
acompanhado todo o desenvolvimento de cor. O reagente de revelação utilizado foi
a solução aquosa de H
2
SO
4
a 50% (p/p), já que além de ser um revelador geral, nos
proporcionando a verificação da homogeneidade dos lipídeos, fornece uma
coloração variada, que é característica para determinados componentes, que
47
associada ao comportamento de corrida e ao tempo de desenvolvimento de cor com
o decorrer do aquecimento, nos auxilia na identificação da substância.Após a
revelação, as placas foram colocadas sobre superfície plana e fotografadas, com
câmera digital.
Sistemas solventes:
Os sistemas de corrida cromatográfica mais utilizados em nossa pesquisa foram o
clorofórmio puro e misturas desses em diferentes proporções com metanol, em
geral, C:M (9:1, v/v) e (95:15, v/v). Os sistemas eluentes utilizados para os esteróis
foram misturas de ciclohexano e acetato de etila, em geral nas proporções 85:15
(v/v) ou 65:35 (v/v). Os diferentes sistemas solventes utilizados seguiram os
procedimentos clássicos para esteróides (NEHER, 1969; LISBOA, 1969; HEFTMAN
et al, 1966; KREBS et al, 1969) e glicolipídeos (SKIPSKI & BARCLAY, 1970;
KLENK, 1969; FUJINO & OHNISHI, 1979; WERTZ et al,1986).
Obtenção de lipídeos de referência (padrões de lipídeos):
Lipídios de batata inglesa (GALLIARD, 1968):
As batatas foram lavadas por escovação, descascadas, cortadas em cubos, imersas
em água e escorridas antes da extração dos lipídeos. Neste projeto, foi utilizada
como fonte de lipídeos vegetais, na obtenção de esterol (sitosterol), esteril-
glicosídeos (sitosteril-glucosídeo), e mono-hexosilceramídeos (glucocerebrosídeos).
Lipídios de cérebro bovino:
48
Porções de cérebro bovino liofilizado (livres de coágulos e membranas aderentes)
foram submetidos à extração de lipídeos. Neste projeto, foi utilizado como fonte de
lipídeos animais, na obtenção de esterol (colesterol) e mono-hexosilceramídeos
(galactocerebrosídeos).
3.7 Saponificação, fracionamento em coluna e acetilação de esteróis
Para realizar a cromatografia gasosa, os esteróis obtidos foram submetidos à
saponificação branda, partição de Folch (1957), fracionamento em coluna e
acetilação.
Para a saponificação, foi preparada uma mistura de NaOH 1N em metanol, a
qual foi mantida sob refrigeração. Nos tubos contendo as amostras, foram
adicionados 2ml da solução de NaOH 1N em metanol e 2ml de clorofórmio puro,
obtendo-se dessa forma, uma solução final de NaOH 0,5N em C:M (1:1). Os tubos
foram deixados em repouso, a temperatura ambiente por 24h.
Em seguida foi realizada a Partição de Folch, com a adição de 6ml, 2ml e 3ml
de clorofórmio, metanol e água respectivamente, para que fosse mantida a
proporção 8:4:3 (v/v/v). Os tubos foram agitados em vórtex e deixados em repouso a
temperatura ambiente por mais 24h. Após esse tempo, ocorre a formação de duas
fases: a fase superior é retirada e descartada; a fase inferior é lavada no próprio
tubo, com cerca de 3ml da parte superior de uma solução previamente preparada de
clorofórmio, metanol e água. Os tubos foram então deixados em repouso por mais
49
24h. Após esse período, a parte aquosa (superior) foi descartada e a fase inferior foi
seca no evaporador rotatório.
O fracionamento em coluna foi realizado em seringas de vidro de 5ml, com
algodão de vidro no fundo. Foi utilizado 1g de sílica gel para coluna e essa
misturada em cerca de 15ml de clorofórmio puro. Essa mistura foi então adicionada
lentamente com o auxílio de uma pipeta Pasteur a seringa, evitando a formação de
bolhas de ar. Em seguida, sem deixar que o leito da coluna seque completamente, a
amostra foi dissolvida no mínimo de clorofórmio e aplicada sobre a sílica. Depois
disso, passou-se 20ml de clorofórmio puro na coluna, o qual foi recolhido num tubo
(fração A) e 20ml de clorofórmio e metanol, na proporção 1:1 (fração B).
Posteriormente, ambas as frações foram concentradas no evaporador rotatório.
Para o processo de acetilação, foi utilizada apenas a fração A. Colocou-se
2ml de anidrido acético e 1 cristal de DMAP nos tubos com as amostras. Esses
tubos foram agitados em vórtex e fechados com papel alumínio e tampa de rosca,
ficando no banho-maria, a 100ºC por 1h. Depois disso, esperou-se cerca de 15
minutos para o resfriamento dos tubos e foi adicionado 2ml de água nos tubos.
Estes ficaram em repouso a temperatura ambiente por 24h. Após esse período, foi
adicionado 2mL de clorofórmio em cada tubo, seguido de agitação. Formaram-se
duas fases, a superior de anidrido acético e a inferior de clorofórmio. A parte
superior foi desprezada e a inferior foi lavada com 2ml de água destilada por 5 vezes
consecutivas. Finalmente, a parte inferior foi seca com N
2
e guardada em frascos
previamente pesados, os quais serão utilizados na cromatografia gasosa. O
processo de acetilação também foi realizado com os padrões ergosterol, lanosterol,
colesterol e estigmasterol.
50
Para confirmar a completa acetilação das amostras, foi realizada
cromatografia em camada fina das amostras e padrões, tendo como sistema de
corrida o ciclo-hexano/acetato de etila, na proporção 85:15 e também o clorofórmio
puro.
3.8 Cromatografia gasosa (GC) e cromatografia gasosa acoplada ao
espectro de massas (GC/MS).
A GC e o GC/MS foram realizados no Núcleo de Pesquisas de Produtos
Naturais (NPPN) da UFRJ. A GC foi realizada em todas as amostras, em ambas as
temperaturas, e feita nas seguintes condições: 60ºC por 10ºC/min, 290ºC por 20
min, em coluna Optima5 (5% fenil silicone).
O GC/MS foi realizado nas amostras emb 37 (E), F12 37 (D), F60 25 (H) e
F63 25 (I) e feito em coluna ZB - 5 ms, injetor a 270ºC, interface a 230ºC e
temperatura da coluna de 60 a 290ºC (10ºC/min).
51
4 RESULTADOS
4.1 Morfologia
Todas as amostras apresentaram importantes diferenças morfológicas,
quando comparadas as temperaturas de crescimento. A temperatura ambiente, as
amostras apresentaram a forma clássica, com hifas septadas hialinas e conídios
multisseptados em forma de fuso. Já a 37ºC, as colônias apresentaram aspecto
gemulante, ou ainda, semelhantes à pseudohifas.
Figura 5: Macroconídio (A) e microconídios (B) de Fusarium, cultivados a
temperatura ambiente. Foram feitas lâminas diretas, coradas com azul de algodão e
fotografadas ao microscópio óptico com aumento de 40x.
A
B
52
Figura 6: Conídios de Fusarium, com formas semelhantes à pseudo-hifas, cultivados
a temperatura de 37º. Foram feitas lâminas diretas, coradas com azul de algodão e
fotografadas ao microscópio óptico com aumento de 40x.
4.2 Identificação de espécies
Nesse estudo, todas as amostras foram classificadas dentro das seções
Liseola, Elegans e Martiella, de acordo com os critérios de identificação descritos por
Nelson et al, 1983. Os fatores determinantes para essa classificação foram: o
aspecto e a coloração dos cultivos, a identificação de microconídios em cadeias e
falsas cabeças (ou apenas em falsas cabeças) e presença/ausência de
clamidoconídios. Para classificação das espécies, também foram consideradas a
forma, a quantidade e o tamanho dos macro e microconídios, além do tipo de
fiálides.
As três seções apresentam crescimento rápido, micélio aéreo presente, com
coloração que varia de branca a violeta, cujo pigmento pode se difundir pelo meio. A
seção Liseola possui como características conídios dispostos em cadeias e/ou falsas
cabeças e ausência de clamidoconídios. Os principais representantes são: F.
53
moniliforme, F. proliferatum, F. subglutinans e F. anthophilum. Já as seções Elegans
e Martiella apresentam conídios somente em falsas cabeças e possuem
clamidoconídios. Possuem como representantes apenas as espécies Fusarium
oxysporum e Fusarium solani, respectivamente. A diferenciação entre essas
espécies é feita pelo tamanho da fiálide. A primeira apresenta fiálide longa, enquanto
a segunda apresenta fiálide curta.
Figura 7: Fusarium cultivado a temperatura ambiente, em placas de Petri com agar
batata-dextrose. A e B representam, respectivamente, a frente e o reverso de uma
colônia da seção Martiella enquanto as fotos C e D representam, respectivamente, a
frente e o reverso de uma colônia da seção Elegans.
B
C
D
A
54
Figura 8: Conídios dispostos em falsas cabeças. Fotos tiradas a partir da
observação direta das placas em microscópio óptico, com objetiva de 10x.
Figura 9: Clamidoconídios fotografados a partir da observação de lâminas diretas,
coradas com azul de algodão, em microscópio óptico com objetiva de 40x. Podem
estar sozinhos (A) ou em pares (B).
A
B
55
Figura 10: Diferenciação das espécies através da observação do tamanho das
fiálides. Na foto A, fiálides longas, características de Fusarium solani (seção
Martiella). Na foto B, fiálides curtas, características de Fusarium oxysporum (seção
Elegans).
Figura 11: Microconídios em cadeias (A) e falsas cabeças (B), característicos da
seção Liseola. Fotos tiradas a partir da observação direta das placas em
microscópio óptico, com objetiva de 10x.
A
B
A
B
56
Amostra
Seção
Espécie identificada
CA (A)
Martiella
F. solani
927 (B)
Martiella
F. solani
254 (C)
Martiella
F. solani
F12 (D)
Martiella
F. solani
EMBRAPA (E)
Elegans
F. oxysporum
UFPE (F)
Elegans
F. oxysporum
F194 (G)
Elegans
F. oxysporum
F60 (H)
Liseola
F. moniliforme
F63 (I)
Liseola
F. moniliforme
Quadro 1: Identificação de seções e espécies, das nove amostras estudadas,
segundo critérios de Nelson et al.
4.3 Dosagens químicas
Dosagem de açúcar: primeiro foi feita uma curva padrão, utilizando-se uma
solução 0,1 mg/mL de glucose. Depois, foi medida a densidade óptica (ou
absorbância) de cada amostra, em ambas as temperaturas. Posteriormente, foi
realizada a dosagem nos tubos já preparados previamente com as amostras. Com
valor da densidade óptica, achamos o percentual de açúcar a partir da curva padrão.
57
Nos gráficos a seguir, temos a comparação entre o percentual de açúcar de
cada amostra, de acordo com a temperatura. As letras de A até I representam
respectivamente, as amostras: CA, 927, 254, F12, EMB, UFPE, 194, F60 e F63.
2,98
2,7
3,11
2,63
3,17
3,12
2,09
2,54
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
A
B
C
D
Dosagem de açúcar
Fusarium solani
25ºC
37ºC
5,83
4,42
3,9
5,33
3,71
3,78
0
1
2
3
4
5
6
7
E
F
G
Dosagem de açúcar
Fusarium oxysporum
25ºC
37ºC
58
Figura 12: Percentual de açúcar obtido a partir de dosagem química realizada nos
lipídios extraídos das duas temperaturas de cultivo; separados por espécies.
Dosagem de esterol: primeiro foi feita uma curva padrão, utilizando-se uma
solução 0,25 mg/mL de ergosterol. Depois, foi medida a densidade óptica (ou
absorbância) de cada amostra, em ambas as temperaturas. Posteriormente, foi
realizada a dosagem nos tubos já preparados previamente com as amostras (os
valores das dosagens estão expressos nos gráficos).
Nos gráficos a seguir, temos a comparação entre o percentual de esterol de
cada amostra, de acordo com a temperatura. As letras de A até I representam
respectivamente, as amostras: CA, 927, 254, F12, EMB, UFPE, 194, F60 e F63.
4,23
2,76
4,91
5,22
0
1
2
3
4
5
6
H
I
Dosagem de açúcar
Fusarium moniliforme
25ºC
37ºC
59
3,55
3,94
4,37
2,52
5,28
4,09
6,22
3,19
0
1
2
3
4
5
6
7
A
B
C
D
Dosagem de esterol
Fusarium solani
25ºC
37ºC
5,47
2,96
4,61
4,37
4,48
3,54
0
1
2
3
4
5
6
E
F
G
Dosagem de esterol
Fusarium oxysporum
25ºC
37ºC
60
Figura 13: Percentual de esterol obtido a partir de dosagem química realizada nos
lipídios extraídos das duas temperaturas de cultivo; separados por espécies.
Dosagem de fosfato: primeiro foi feita uma curva padrão, utilizando-se uma
solução 0,072 mg/mL de KH
2
PO
4
. Depois, foi medida a densidade óptica (ou
absorbância) de cada amostra, em ambas as temperaturas. Posteriormente, foi
realizada a dosagem nos tubos já preparados previamente com as amostras.
Nos gráficos a seguir, temos a comparação entre o percentual de fosfato de
cada amostra, de acordo com a temperatura. As letras de A até I representam
respectivamente, as amostras: CA, 927, 254, F12, EMB, UFPE, 194, F60 e F63.
4,01
4,15
3,83
3,81
3,6
3,7
3,8
3,9
4
4,1
4,2
H
I
Dosagem de esterol
Fusarium moniliforme
25ºC
37ºC
61
0,06
0,34
0,2
0,15
0,12
0,79
0,54
0,68
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
A
B
C
D
Dosagem de fosfato
Fusarium solani
25ºC
37ºC
0,48
0,06
0,51
0,9
0,35
0,74
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
E
F
G
Dosagem de fosfato
Fusarium oxysporum
25ºC
37ºC
62
Figura 14: Percentual de fosfato obtido a partir de dosagem química realizada nos
lipídios extraídos das duas temperaturas de cultivo; separados por espécies.
0,41
0,35
0,38
0,34
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
H
I
Dosagem de fosfato
Fusarium moniliforme
25ºC
37ºC
63
4.4 Cromatografia em camada fina
4.4.1 CCF de esteróis
Foi realizada a CCF para análise do perfil de esteróis, a partir do lipídeo bruto
intacto, utilizando-se ergosterol e lanosterol como padrões. Todas as amostras
apresentaram esses esteróis, em ambas as temperaturas.
Figura 15: Cromatografia em camada fina dos esteróis das amostras de Fusarium
solani (A, B, C e D), reveladas com ácido sulfúrico a 50%. Os padrões utilizados
foram ergosterol (ERG) e lanosterol (LAN).
A B C D
(25/37) (25/37) (25/37) (25/37)
ERG LAN
64
Figura 16: Cromatografia em camada fina de esteróis das amostras de Fusarium
oxysporum (E, F e G) e Fusarium moniliforme (H e I), revelada com ácido sulfúrico a
50%. Os padrões utilizados foram ergosterol (ERG) e lanosterol (LAN).
E F G
(25/37) (25/37) (25/37)
ERG LAN
H I
(25/37) (25/37)
65
4.4.2 CCF de glicolipídios
Foi realizada também a CCF para análise do perfil de glicolipídios, a partir do
lipídeo bruto intacto, utilizando-se lipídio de batata e lipídio de cérebro bovino como
padrões.
Figura 17: Cromatografia em camada fina dos glicolipídios das amostras de
Fusarium solani (A, B, C e D), reveladas com ácido sulfúrico a 50%. Os padrões
utilizados foram lipídio de batata (LB) e lipídio de cérebro bovino (LCB).
Galacto
cerebrosídeo
Sitosteril
glicosídeo
Gluco
cerebrosídeo
LB LCB
A B C D
(25/37) (25/37) (25/37) (25/37)
66
Figura 18: Cromatografia em camada fina de glicolipídios das amostras de Fusarium
oxysporum (E, F e G) e Fusarium moniliforme (H e I), revelada com ácido sulfúrico a
50%. Os padrões utilizados foram lipídio de batata (LB) e lipídio de cérebro bovino
(LCB).
Sitosteril
glicosídeo
Gluco
cerebrosídeo
Galacto
cerebrosídeo
LB LCB
E F G
(25/37) (25/37) (25/37)
H I
(25/37) (25/37)
67
4.5 Identificação dos esteróis pelo tempo de retenção.
Os esteróis foram identificados pelo tempo de retenção (RT) na cromatografia
gasosa e caracterizados pelos espectros de massas obtidos na cromatografia
gasosa acoplada (GC-MS) de algumas amostras (as que estão marcadas com um *).
TR
(± 0,20)
Esterol
identificado
A (25)
A (37)
B (25)
B (37)
C (25)
C (37)
D (25)
*D (37)
31,61
Ergo-tetra
6,19
31,73
Brassicasterol
7,11
32,56
Zymosterol
2,48
2,82
3,57
3,80
32,70
Colesterol
34,52
Ergosterol
44,19
39,82
59,54
85,07
75,52
34,03
1,80
34,54
Episterol
35,14
Lanosterol
9,2
0,83
1,20
6,51
35,43
Sitosterol
1,25
0,68
2,47
35,86
“m/e 398”
0,01
7,04
36,09
“Eburicol + 14”
30,90
3,78
65,97
9,06
36,36
Estigmasterol
36,73
Eburicol
4,55
29,28
11,93
4,60
4,71
37,67
Quadro 2: Tempo de retenção e porcentagem relativa dos esteróis das amostras de
Fusarium solani (A, B, C e D). OBS: a amostra A só apresentou um pico em 33,384.
68
TR
(± 0,20)
Esterol
identificado
E (25)
E (37)*
F (25)
F (37)
G (25)
G (37)
31,61
Ergo-tetra
10,57
31,73
Brassicasterol
32,56
Zymosterol
3,01
32,70
Colesterol
34,52
Ergosterol
28,93
10,65
75,26
38,83
34,54
Episterol
10,37
40,62
7,40
12,12
35,14
Lanosterol
7,00
35,43
Sitosterol
37,61
19,67
18,67
35,86
“m/e 398”
17,35
15,72
36,09
“Eburicol + 14”
8,87
6,80
36,36
Estigmasterol
36,73
Eburicol
23,09
13,50
35,50
5,04
10,10
Quadro 3: Tempo de retenção e porcentagem relativa dos esteróis das amostras de
Fusarium oxysporum (E, F e G).
69
TR
(± 0,20)
Esterol
identificado
*H (25)
H (37)
* I (25)
I (37)
31,61
Ergo-tetra
2,22
0,88
6,87
31,73
Brassicasterol
8,06
32,56
Zymosterol
7,59
32,70
Colesterol
34,52
Ergosterol
83,02
80,18
34,54
Episterol
25,42
35,14
Lanosterol
1,66
1,23
10,27
35,43
Sitosterol
18,53
7,31
35,86
“m/e 398”
22,33
36,09
“Eburicol + 14”
19,12
36,36
Estigmasterol
36,73
Eburicol
4,74
4,73
33,73
8,81
Quadro 4: Tempo de retenção e porcentagem relativa dos esteróis das amostras de
Fusarium moniliforme.
70
4.6 Caracterização dos esteróis por GC/MS.
Esteróis na forma acetato, respectivos MS e principais íons (m/e) obtidos.
4.6.1 Ergosta-tetraenol 5, 7, 9 (11), 22
O
O
PM= 436
FM= C
30
H
44
O
2
O
O
H
m/e = 376 e 251
Perda de acetato:
436 – 60 = 376
Perda de acetato e cadeia lateral:
436 – 60 – 125 = 251
O
O
H
Cisão do anel D, com perda de
acetato:
m/e 209
71
4.6.2 Brassicasterol
O
O
PM= 440
FM= C
30
H
48
O
2
C
9
H
17
O
O
H
m/e = 380 e 255
Perda de acetato:
440 – 60 = 380
Perda de acetato e cadeia lateral:
440 – 60 – 125 = 255
C
9
H
17
O
O
H
Cisão do anel C, com perda de
acetato:
m/e 145
+
72
4.6.3 Zymosterol
O
O
PM= 426
FM= C
29
H
46
O
2
O
O
H
Perda de acetato:
426 – 60 = 366
O
O
H
Dupla em C24 (25), gera cisão na
cadeia lateral, entre C22 e C23:
m/e 69 (C
5
H
9
)
73
4.6.4 Ergosterol
O
O
PM= 438
FM= C
30
H
46
O
2
O
O
H
C
9
H
17
M+ = 438
Perda de acetato e cadeia lateral:
438 – 60 – 125 = 253
O
O
H
C
9
H
17
Cisão do anel D com perda de
acetato:
m/e 211
O
O
H
C
9
H
17
Cisão do anel C, com perda de
acetato:
m/e 143
74
4.6.5 Episterol
O
O
PM= 440
FM= C
30
H
48
O
2
O
O
Dupla em C24 (28): perda de 84 da
cadeia lateral: 440 – 84
m/e 356
O
O
Dupla no núcleo, característico
para dupla em C7:
m/e 313
O
O
H
Cisão do anel C com perda de
acetato= m/e 145
313
2H
75
4.6.6 Lanosterol
O
O
PM= 468
FM= C
32
H
52
O
2
O
O
M+ = 468
Perda de metila: 468 – 15
m/e 453
Perda de metila e acetato:
468 – 15 – 60
m/e 393
O
O
Dupla em C24 (25), gera cisão na
cadeia lateral, entre C22 e C23:
m/e 69 (C
5
H
9
)
76
4.6.7 Sitosterol
O
O
PM= 456
FM= C
31
H
52
O
2
O
O
H
Perda de acetato: 456 – 60
m/e 396
Perda de acetato e metila:
456 – 60 – 15
m/e 381
Perda de cadeia lateral e
grupamento acetato:
m/e 255
C
10
H
21
O
O
H
Dupla em C5: Cisão do anel D com
perda de acetato:
m/e 213
77
Continuação do sitosterol:
C
10
H
21
O
O
H
C
10
H
21
O
O
H
Dupla em C5, cisão do anel B:
Origem de 2 fragmentos, partes
diferentes:
PM – 181 (perde anel A e parte do
B): m/e 275
Perde a outra parte da molécula,
restando o anel A e parte do B:
m/e 119
C
10
H
21
O
O
H
Dupla em C5 cisão do anel C:
m/e 145
78
4.6.8 “m/e 398”, provável Sitostanol
O
O
PM= 458
FM= C
31
H
54
O
2
C
10
H
21
O
O
H
Perda de acetato: 458 - 60
m/e 398
C
10
H
21
O
O
H
Cisão do anel D, sem e com perda
de acetato:
m/e = 275 e 215
79
4.6.9 “Eburicol + 14”, suposto Etilideno- 24 (28)- lanosterol
O
O
PM= 496
FM= C
34
H
56
O
2
Perda de metila: 496 – 15
m/e 481
80
4.6.10 Eburicol [metileno- 24 (28)- lanosterol]
O
O
PM= 482
FM= C
33
H
54
O
2
O
O
M+ = 482
Perda de metila: 482 – 15
m/e 467
Perda de metila e acetato:
482 – 15 – 60 =
m/e 407
O
O
Cisão do anel D com perda de
acetato:
m/e 241
81
4 DISCUSSÃO
Os fungos patogênicos utilizam diferentes mecanismos para se
estabelecerem em um hospedeiro e causar doença. As condições de crescimento
fornecidas pelo hospedeiro geralmente diferem muito do nicho ecológico do fungo.
Para sobreviver nesse novo meio, o fungo necessitará adaptar-se à temperatura
corpórea, ao baixo potencial de oxirredução e ao ataque de células fagocitárias.
Portanto, a manifestação da doença está associada a vários fatores, alguns de
competência do hospedeiro e outros relacionados ao fungo.
É de conhecimento, que fungos ditos “verdadeiramente patogênicos” podem
adaptar-se ao parasitismo pelo fenômeno de dimorfismo, modificando a morfologia,
esta, associada a modificações bioquímicas ainda não muito bem compreendidas, e
sendo que as mais conhecidas, de difícil generalização. Alguns dos fungos
considerados como dimórficos são: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis,
Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii e
Penicillium marneffei (NEMECEK et al., 2006). Alguns autores também consideram
a Candida albicans como fungo dimórfico (NICKERSON et al, 2001; HORNBY et al,
2003). A 37ºC, a temperatura corporal de humanos, geralmente ocorre a
82
mudança da forma filamentosa para a forma patogênica (leveduriforme), a qual é
induzida por genes de virulência específicos. Poucos desses genes já foram
identificados; os mais estudados até hoje são BAD1 de Blastomyces dermatitidis,
CBP1 e AGS1 de Histoplasma capsulatum e também AGS1 de Paracoccidioides
brasiliensis (MARQUES, 2005; SEBGHATI et al, 2000).
No entanto, alguns fungos considerados “filamentosos monomórficos”
também podem expressar mudanças na morfologia ao serem cultivados em
temperatura 36-38 C, e flagrados com gemulações típicas de fase leveduriforme de
fungos dimórficos. No ano de 1973, Kidd e Wolf relataram a ocorrência de
dimorfismo numa amostra de Fusarium moniliforme, oriunda de um caso de ceratite
fúngica. Também é interessante notar que a morfologia que o fungo apresenta
quando ocorre a interação com um macrófago humano é semelhante à morfologia
encontrada no cultivo a 37ºC (TONIONI, 2008).
De fato, a adaptação térmica para o crescimento na temperatura corpórea
humana, já é, por si só, um importante fator de virulência, que pode possibilitar uma
micose sistêmica em um indivíduo com algum fator predisponente, o que de certo irá
refletir em mudanças bioquímicas no fungo, suficientes para essa adaptação,
principalmente de componentes estruturais, por exemplo, no grau de insaturação de
ácidos graxos e até de esteróis, esse último, observamos no fungo dimórfico
patogênico Paracoccidioides brasiliensis (SILVA et al, 1997). Mas, sempre fica a
pergunta: O que diferencia um fungo “verdadeiramente patogênico” dos demais? O
quanto uma adaptação ao parasitismo em humanos estaria diretamente relacionada
à adaptação ao crescimento na temperatura corpórea humana e, o quanto isso
acarretaria em mudanças estruturais detectáveis por análise química, e se esses
seriam marcadores de “dimorfismo” ou adaptação térmica? Essas questões ainda
83
são difíceis de se responder, mas se elucidadas, poderiam significar um grande
avanço para o conhecimento da interação fungo-hospedeiro e possíveis estratégias
de tratamento.
As espécies do gênero Fusarium são altamente variáveis por causa de suas
características genéticas, além disso, mudanças no ambiente no qual essas
espécies crescem, causam também mudanças morfológicas. De modo tradicional,
os fungos são classificados em espécies de acordo com as suas características
morfológicas. No entanto, muitas vezes, essas características não permitem
diferenciar a homologia e a convergência das espécies, principalmente no caso de
fungos mitospóricos (LEAL-BERTIOLI, 1998).
O gênero Fusarium foi proposto por Link em 1809 e, até os dias atuais, não
existe um sistema completo que permita a identificação das espécies de Fusarium.
Atualmente, todos os sistemas de taxonomia têm como base a publicação de
Wollenweber & Reinking (1935), combinando as informações complementares de
outros sistemas, como o de Toussoun & Nelson, de 1975; Nelson et al, de 1983 e
Burguess et al, de 1994.
A identificação de espécies de Fusarium é realizada, tradicionalmente, com
base na morfologia do patógeno, através dos macro e microconídios, conidióforos,
clamidoconídios e na disposição dos conídios no conidióforo. Além de constituir uma
tarefa difícil de ser executada, também pode gerar controvérsias devido à
variabilidade dos caracteres fenotípicos empregados na classificação taxonômica
desse gênero. Mais de mil espécies já foram descritas para o gênero, muitas delas
indevidamente. Especialistas utilizam meios de cultura e condições padronizadas
para identificação.
84
A publicação de Wollenweber & Reinking, em 1935, foi o mais importante
trabalho clássico, organizando as espécies de Fusarium em 16 seções, que incluem
65 espécies, 55 variedades e 22 formas. Para isso, os autores levaram em
consideração um conjunto de características, para separar em cada grupo de
seções: presença e ausência de microconídios, forma de microconídios, presença
ou ausência de clamidosporos, localização dos clamidosporos (terminais e
intercalares), formas dos macroconídios e forma da célula apical e basal dos
macroconídios. As seções, por sua vez, foram divididas em espécies, variedades e
formas, com base na cor dos estromas, presença ou ausência de esclerócios,
número de septos e largura e comprimento dos macroconídios.
Outro fato importante é que as características morfológicas podem sofrer
influência do ambiente e das condições nutricionais do substrato. A variabilidade da
cultura é comum em algumas espécies, como F. oxysporum, F. solani e F. equiseti,
estando possivelmente associada a sua ampla adaptação em diferentes ambientes,
enquanto que outras de menor variabilidade, como F. decemcellullar, F. beomiforme
e F. longipes, teriam uma distribuição mais restrita a ambientes específicos.
Nesse estudo, as amostras analisadas foram classificadas nas seções
Liseola, Elegans e Martiella. A seção Liseola apresenta como características: rápido
crescimento das culturas (cerca de 7 dias); micélio aéreo presente, podendo ser
branco ou levemente roxo; macroconídios com tamanho médio a longo (de 3 a 7
septos); microconídios presentes e abundantes, de forma ovóide, riniforme ou
fusiforme, dispostos em cadeias e falsas cabeças; ausência de clamidosporos. Os
principais representantes são: F. verticillioides, F. proliferatum, F. subglutinans, F.
moniliforme e F. anthophilum.
85
As seções Elegans e Martiella apresentam várias características comuns a
Liseola, como rápido crescimento das culturas; micélio aéreo também presente, de
cor branca ou levemente roxa; macroconídios de tamanho médio a longo, sem
marcada curvatura dorsi-ventral; no entanto, os microconídios (que estão presentes
e em abundância) estão dispostos apenas em falsas cabeças. Além disso, há a
presença de clamidosporos, que podem estar dispostos em pares. Os principais
representantes são: F. oxysporum e F. solani. A diferenciação entre essas duas
espécies pode ser feita facilmente através da observação do tamanho das
monofiálides: a primeira apresenta monofiálides curtas, enquanto a segunda,
apresenta monofiálides longas.
Esse processo de identificação baseado nas chaves de classificação se
mostrou eficaz, no entanto apresentou como limitações a variação em função do
meio de cultura utilizado, a instabilidade devido às alterações ambientais de cultura
e a variabilidade do isolado (principalmente quando as culturas não são
monospóricas).
As ferramentas para a identificação de fungos foram incrementadas ao longo
dos últimos anos e incluem a utilização da microscópia óptica e eletrônica, o
desenvolvimento de meios de cultura seletivos e diferenciais, a comparação de
enzimas e metabólitos secundários, o uso de tecnologias imunológicas e mais
recentemente, a utilização de diversas técnicas moleculares. Os critérios
morfológicos são o primeiro passo na identificação das espécies de Fusarium, mas
podem ser complementados com a utilização de métodos mais acurados, como, por
exemplo, os baseados nas características genéticas.
Os esteróis estão presentes na maioria dos organismos eucarióticos. Nos
fungos, geralmente, o principal esterol, tanto em distribuição como
86
quantitativamente, é o ergosterol. Plantas vasculares possuem predominantemente
sitosterol, estigmasterol e o 24-metilcolesta-5-eno-3 -ol presentes como epímeros
24 - (campesterol) ou o 24 -(diidrobrassicasterol). Colesterol, originalmente
associado somente a tecidos animais, é, no presente, conhecido ocorrer em
quantidades traço em plantas superiores e também em fungos de vários grupos
taxonômicos (BURDEN et al, 1989).
Epidioxiesteróis são esteróides naturais que têm sido frequentemente
isolados de fontes marinhas, observados em diversos fungos, leveduras e liquens e
são também os principais constituintes de membrana de uma alga halotolerante
(GUNATILAKA et al, 1981; JIMENEZ et al, 1989; SHEFFER et al, 1986). A partir de
massa de células de levedura de S. schenckii, foi isolado e caracterizado ergosterol
peróxido (5 -8 -epidioxiergosta-6,22-dieno-3 -ol), que se sugere ser um produto de
reações de detoxicação, podendo representar um fator de virulência, já que também
foi detectado, em extrato enzimático de Sporothrix schenckii, atividade de reversão
do ergosterol-peróxido em ergosterol (SGARBI et al, 1996a; SGARBI et al, 1997).
Os esteróis estão presentes na forma livre, esterificados com ácidos graxos,
ou nas formas glicosiladas como esteril-glicosídeos ou acil-esteril-glicosídeos; e, em
plantas, qualquer uma dessas classes pode ser dominante dependendo da espécie
ou do tipo de tecido (BURDEN et al, 1989). Esteril-glicosídeos e acil-esteril-
glicosídeos também têm sido descritos em fungos, embora sejam provavelmente as
formas de menor ocorrência (TAKAISHI et al, 1989). GHANNOUM et al (1986)
analisando as variações na composição lipídicas associada ao dimorfismo de
Candida albicans, observaram que formas micelianas apresentaram um conteúdo
muito superior de esteróis e que estes predominavam na forma de esteril-
glicosídeos, acil-esteril-glicosídeos e esteril-ésteres; formas de levedura
87
apresentavam predominantemente esterol livre e cerebrosídeos. Em Candida
albicans esses glicolipídeos estão provavelmente envolvidos na aderência a células
epiteliais bucais (GHANNOUM et al, 1987; GHANNOUM & EDWARDS, 1992).
Cerebrosídeos (mono-hexoxil-ceramídeos) de fungos têm sido caracterizados
e algumas de suas funções ou propriedades têm sido investigadas. Esses
esfingolipídeos fúngicos, diferem dos encontrados em mamíferos, pois exibem várias
modificações estruturais na porção ceramida (LEVERY et al, 2000). Embora diversos
aspectos da estrutura fina desses glicoesfingolipídeos fúngicos ainda sejam
desafiantes e necessitem de maiores investigações, algumas generalizações podem
ser feitas: o principal açúcar é a glucose, a base de cadeia longa, geralmente, é uma
esfingodienina com insaturações
4,8
e presença de grupamento metil na posição C-
9, o ácido graxo é comumente -hidroxilado podendo apresentar insaturação na
cadeia (DICKSON, 1998; DICKSON & LESTER, 1999; LEVERY et al, 1998;
TOLEDO et al, 1999; TOLEDO et al, 1995; VILLAS-BOAS et al, 1994).
Particularmente, a estrutura esfingóide, constitui importante papel biológico de
diferenciação celular em fungos, a exemplo do estímulo observado na formação de
corpos frutificantes em basidiomicetos (KAWAI, 1989; KAWAI & IKEDA, 1982;
KAWAI & IKEDA, 1983; KAWAI & IKEDA, 1985). Em 1987, foi isolado e
caracterizado um mono-glucosilceramídeo, a partir de formas de levedura de S.
schenckii (CARDOSO et al, 1987). Posteriormente, pela utilização de técnicas mais
sensíveis, TOLEDO et al (2000) caracterizaram dois cerebrosídeos das formas de
levedura de S. schenckii, e relataram que a expressão do dimorfismo, nesse fungo,
está correlacionada ao tipo de hexose presente no cerebrosídeo das fases de
transição, em que a forma miceliana apresenta somente -glucopiranosil-ceramida,
enquanto que a fase leveduriforme expressa -gluco- e -galactopiranosil-ceramidas
88
em quase iguais proporções; entretanto, essa diferença no tipo de hexose, não foi
observada para outros fungos dimórficos como Paracoccidioides brasiliensis e
Histoplasma capsulatum (TAKAHASHI et al, 1996; TOLEDO et al, 2000).
Outros destaques têm sido dados às estruturas dos cerebrosídeos em fungos,
de particular interesse relacionados à interação com o hospedeiro, por exemplo, a
verificação de que anticorpos humanos contra uma glucosil-ceramida purificada de
Cryptococcus neoformans, inibe o brotamento e o crescimento desse fungo
(RODRIGUES et al, 1999). De fato, é cada vez mais evidente que os glicolipídeos
estejam envolvidos na diferenciação morfológica e conseqüentemente, na
patogenicidade, principalmente relacionada à propriedade do dimorfismo. Estudos
com Sporothrix schenckii, mostraram a participação de diversos componentes
estruturais na resposta imunológica (CARLOS et al, 2009).
No nosso estudo, realizado com 9 amostras em duas temperaturas de cultivo,
utilizamos como parâmetros para identificação o tempo de retenção na
cromatografia gasosa, derivados acetilados dos esteróis padrões (colesterol,
ergosterol, lanosterol, sitosterol e estigmasterol), em seguida foram feitas análises
dos esteróis, também na forma acetato, de todas as amostras, observando-se o
tempo de retenção. Foram selecionados 4 cromatogramas de amostras para a
realização do GC-MS, com a finalidade de caracterizar esteróis não relacionados
com o tempo de retenção dos padrões.
Os espectros de massas foram comparados aos da literatura visando
elucidação estrutural dos esteróis encontrados. A fragmentação de amostras
apresenta características que são típicas para um dado esterol, embora nem sempre
apresente todos os rearranjos e fragmentos que possam ser esperados, o que exige
dedução se menores dados espectrais são obtidos. Nem sempre é possível a
89
observação do íon molecular (M+), que representa o peso molecular (PM) subtraído
de 1 eléctron, mas esse pode ser deduzido pela perda esperada para determinados
esteróis, dependendo de sua estrutura. Dos mais citados na literatura, são comuns:
perda de: metila (M – 15) e/ou de acetato (M – 60), mas além do íon molecular,
vários íons (m/e) são característicos e podem ser usados na dedução de estruturas.
(FRIEDLAND et al, 1959; McCLOSKEY, 1970; VON UNRUH & SPITELLER, 1970)
As estruturas propostas, assim como os íons (rearranjos ou fragmentos),
foram verificados para os pesos e fórmulas moleculares (PM e FM) usando cálculos
básicos para a composição de elementos (C, H e O), e grau de insaturação. Alguns
isômeros moleculares são possíveis, mas nos detivemos aos estritamente já
observados em fungos, especialmente se já descritos no gênero Fusarium ou sua
fase sexuada Gibberella.
Ergosta-tetraenol- 5, 7, 9 (11), 22, detectado por NES & HEUPEL (1986) em
Gibberella fujikuroi, foi caracterizado pelo m/e 376 (perda de acetato, para PM=
436), e fragmentação típica para o núcleo de anéis com 3 ligações duplas (m/e 251
e 209) (FRIEDLAND et al, 1959).
Brassicasterol, detectado por NES & HEUPEL (1986) em Gibberella fujikuroi,
foi caracterizado pelo m/e 380 (perda de acetato para PM= 440), e fragmentos de
m/e 255 e 145, característicos de uma dupla na posição C5 (RUBINSTEIN & GOAD,
1974).
Zymosterol foi reconhecido pelo m/e 366 (perda de acetato para PM= 426) e
pelo m/e 69 (UNRUH & SPITELLER, 1970), formado pela cisão entre C22 e C23 de
esteróis com dupla C24 (C25). Esse esterol é um intermediário na biossíntese de
esteróis em fungos (NES et al, 1999; NES et al, 2008).
90
Ergosterol foi reconhecido pelo íon molecular, M+= 438, e pelos íons
característicos de m/e 253, 211 e 143 (SHAPIRO & GEALT, 1982), e é o mais citado
na literatura como esterol de fungos e conhecida sua presença em Fusarium (NES &
HEUPEL, 1986; VERDIN et al, 2006).
Episterol é um importante intermediário para biossíntese de esteróis com 28
átomos de carbono, encontrado em Fusarium solani (VERDIN et al, 2006), foi
caracterizado pelo m/e 356, que representa a perda típica de 84 unidades de massa,
pela cisão da cadeia lateral entre C22 e C23, comum em esteróis com dupla C24
(C28). O intenso m/e 313 é indicativo da dupla ligação em C7, e o m/e 145 confirma
a presença de apenas uma dupla no conjunto de anéis (ELLIS et al, 1991; FUJINO &
OHNISHI, 1979)
Lanosterol, intermediário na biossíntese de esteróis no reino Animal e Fungi,
conhecido ocorrer em Fusarium (VERDIN et al, 2006), foi caracterizado pelo M+=
468, assim como perda de metila (m/e 453) e perda simultânea de metila e acetato
(m/e 393), apresentou íon intenso de m/e 69 da cisão entre C22 e C23 (dupla em
C24-C25) (HERBER et al, 1983; SHAPIRO & GEALT, 1982).
Sitosterol, conhecida sua ocorrência no reino vegetal, foi detectado em F.
solani por VERDIN et al (2006) mas citado com a denominação 24-etil-colesterol.
Esse esterol de 29 átomos de carbono foi caracterizado pelo m/e 396 (perda de
acetato para PM= 456), e pelos m/e 381 (perda de acetato e metila) e m/e: 275, 255,
213, 145 e 119 (todos característicos de dupla em C5) (ZHANG et al, 2006).
Sitostanol foi identificado pelo m/e 398 (perda de acetato do PM= 458), os
íons m/e 275 e 215 indicaram estrutura de anéis e cadeia lateral sem ligações
duplas, já que o grau de insaturação igual a 5 só é pertinente para 4 anéis e a dupla
91
ligação no grupamento acetato e fórmula molecular C
31
H
54
O
2
(BRIGHT & CHEN,
1983).
O “eburicol + 14”, suposto etilideno- 24 (28)- lanosterol, foi identificado apenas
pelo m/e 481 (provável perda de metila do PM= 496), associado ao eburicol pela
diferença de 14 unidades de massas (HERBER et al, 1983). Embora sem maiores
informações para elucidação estrutural, a presença desse esterol é condizente com
o trabalho de NES et al (1999), para a formação de esteróis com grupamento etil no
C24 em fungos, e pode substanciar nossos achados de sitosterol e sitostanol.
Eburicol, também conhecido como metileno- 24 (28)- lanosterol, foi
caracterizado pelo M+ = 482, como também pelos típicos m/e 467 (perda de metila),
m/e 407 (perda de metila e de acetato) e m/e 241 (cisão do anel D, com perda de
acetato) (HERBER et al, 1983). Esse esterol já foi descrito como componente de F.
solani (VERDIN et al, 2006), e proposto como intermediário metabólico para a
formação de esteróis com etil no C24 em fungos NES et al (1999).
No estudo realizado por Howell e colaboradores, foram identificados 5 tipos
de esteróis em adição aos que já eram conhecidos em dermatófitos, que foram:
colesterol, campesterol, fecosterol, episterol e sitosterol. Sitosterol é considerado
como o principal esterol de vegetais superiores e colesterol é o principal esterol de
mamíferos, embora ambos já tenham sido identificados em outros organismos:
colesterol foi identificado em Aspergillus flavus e Ustilago maydis e sitosterol em
Candida utilis. No entanto, a possibilidade de ter ocorrido contaminação do meio
pelo colesterol não pode ser descartada. Esses esteróis (colesterol, campesterol,
fecosterol, episterol e sitosterol), além de ergosterol e brassicasterol, também foram
identificados em extratos de Hendersonula toruloidea e Scytalidium hyalinum
(HOWELL et al, 1990).
92
A maioria dos esteróis presentes em fungos, como o ergosterol, contém 28
átomos de carbono (PARKS & WEETE, 1991). Ergosterol, 22-diidroergosterol, 24-
metil colesterol, colesterol e desmosterol foram detectados como principais esteróis
dentre seis ordens do filo Zygomycota. Ergosterol foi predominante em
Dimargaritales, Zoopagales e em 13 famílias da ordem Mucorales. Desmosterol
parece ser o esterol característico de Mortierellaceae (Mucorales). 24-metil-
colesterol foi o principal esterol de Entomophthorales, gêneros Entomophthora,
Conidiobolus e Basidiobolus, mas colesterol foi o único esterol detectado em
Delacroixia coronatus (WEETE & GANDHI, 1997). Recentemente, seis novos tipos
do grupo ergostano foram isolados a partir de Rhizopus sp, são eles: 3β-hidroxil-
(22E, 24R)-ergosta-5,8,22-trieno-7,15-diona; 3β-hidroxil-(22E, 24R)-ergosta-
5,8,14,22-tetraeno-7-ona; 3β,15β-dihidroxil-(22E, 24R)- ergosta-5,8(14),22-trieno-7-
ona; 3β,15β-dihidroxil-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22-trieno-7-ona; 3β-hidroxil-
(22E,24R)-ergosta-5,8(14),22-trieno-7,15-diona e 5β,8β-epidioxi- 23,24(R)-
dimetilcolesta-6,9(11),22-trieno-3β-ol (WANG et al, 2008).
Embora o ergosterol esteja presente no fungo que se desenvolve a
temperatura ambiente, nossos resultados mostraram que existem diferenças entre
as amostras, que podem sofrer alteração no metabolismo levando a uma menor
expressão no conteúdo de ergosterol, quando cultivados em temperatura
correspondente a corporal humana, situação encontrada em micoses sistêmicas.
Acreditamos que nossos resultados sejam de bastante interesse, pois
direcionam para a importância da pesquisa de antifúngicos alternativos ao uso de
poliênicos, em micoses sistêmicas, pois esses têm como alvo estratégico a ligação
direta ao ergosterol, considerado o de maior conteúdo em fungos. A adaptação para
sobrevivência em temperatura corpórea humana facilitaria o desenvolvimento do
93
fungo no hospedeiro, e a flagrante constatação de gemulação, poderia favorecer
uma disseminação pelo fluxo na corrente sanguínea (forma ovalada), mais do que a
morfologia típica miceliana (que levaria a formação de trombos), atingindo diversos
órgãos no hospedeiro. As proporções de esterol e açúcar variaram nas amostras e
comparações quanto à temperatura, mas o aumento na proporção de fosfato pode
indicar maior síntese de fosfoglicerídeos e maior atividade desses para compensar a
membrana plasmática para mudança na morfologia. Os esteróis identificados e suas
proporções alertam para a importância do diagnóstico micológico, a não
generalização do uso de antifúngicos poliênicos em micoses sistêmicas e estímulo a
pesquisas básicas de bioquímica e de novas estratégias.
94
6 CONCLUSÕES
Podemos notar que quando cultivadas a temperatura de 37ºC, as
amostras de Fusarium apresentam mudanças em sua morfologia, exibindo
estruturas com aspecto gemulante.
As proporções de esteróis e açúcares variaram entre as amostras e
temperatura de cultivo, mas não observamos correlações.
Dos esteróis encontrados, os que são considerados produtos finais de
biossíntese são: brassicasterol, ergosterol e sitosterol. Todos esses já foram
descritos em Fusarium solani ou na sua forma sexuada Gibberella fujikuroi, que
engloba variadas espécies do gênero Fusarium, mas sempre com predomínio
de ergosterol.
Em todas as amostras aqui classificadas como F. solani (CA, 927, 254
e F12) encontramos predomínio de ergosterol, com mudança na proporção
quando amostras comparadas entre as duas temperaturas de cultivo.
De 2 amostras classificadas como F. moniliforme, F60 e F63, apenas a
F60 apresentou ergosterol.
95
Das amostras classificadas como F. oxysporum (EMB, 194 e UFPE),
todas apresentaram ergosterol, mas com flagrante diminuição ou ausência
desse esterol a partir do cultivo a 37ºC.
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