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TAÍZIA DUTRA SILVA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS E DE FORMULAÇÕES
PARA ESTATINAS
Dissertação, como requisito parcial, para
obter o grau de mestre em Ciências
Farmacêuticas, submetida ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal de Minas Gerais.
Orientadora Profa. Dra. Cristina Duarte
Vianna Soares - UFMG
Co-orientadora Profa. Dra. Renata
Barbosa de Oliveira
Belo Horizonte
2009
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Silva, Taízia Dutra
S586d
Desenvolvimento de métodos analíticos e de formulações para
estatinas
/
Taízia Dutra Silva.
- 2009.
144 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Cristina Duarte Vianna Soares
Co-Orientadora: Profª. Drª. Renata Barbosa de Oliveira
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais.
Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas.
1.Estatinas - Teses. 2.Cromotografia líquida de alta eficiência -
Teses. 3. Espectrofotometria - Teses. 4. Colesterol - Tese. I.
Soares, Cristina Duarte Vianna. II. Oliveira, Renata Barbosa de III.
Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. VI.
CDD 544.92
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser tão presente em minha vida e conceder a mim e a minha família inúmeras
bênçãos.
A minha orientadora, Profa. Dra. Cristina, pelos ensinamentos passados, conselhos valiosos
e pela confiança depositada em mim.
A minha co-orientadora, Profa. Dra. Renata, pela orientação e por ter me passado sempre
força e entusiasmo na execução do nosso trabalho.
Ao meu amor Christophe que me incentivou a fazer mestrado e sempre me deu força e
carinho, sempre acreditando em meu potencial mais do que eu mesma. Pela compreensão
e pela ajuda nos momentos difíceis.
À minha tia Nizinha por ter me acolhido em sua casa por tantos anos, pelo tratamento
carinhoso e por ter me ajudado diversas vezes.
Aos meus pais, Altair e Marízia e à minha irmã, Lorena, pelo amor incondicional, pela força,
apoio e pela compreensão da nossa distância. Tudo o que eu conquisto é pensando em
vocês.
À minha avó e às minhas tias, Cláudia, Maria Nilse e Raquel, por sempre torcerem por mim,
acreditar em meu potencial e por tantas vezes ter me ajudado imensamente.
Ao Antônio, Geralda e Emmanuelle pela força e por terem me acolhido com tanto carinho na
família.
Aos colegas de laboratório Aline, Amanda, Ana Gabriela, André Lima, André Nascimento,
Écio, Diego, Fernando, Flávia, Gustavo, Isabela, Leonardo, Lúcia, Luciano, Márcia, Paula e
Tiago pelas contribuições e convívio agradável.
Ao Leonardo, funcionário do CEDAFAR, pelas análises importantes e pela disponibilidade
em ajudar.
Às graduandas de farmácia, Alessandra e Valquíria, pela colaboração valiosa na execução
desse trabalho.
Ao Jackson pela importante colaboração e ensinamentos valiosos sobre difração de raios X.
À Flávia Dias M. Marinho por ter me ajudado na execução de inúmeras análises no final
desse trabalho.
À Adriana Martins Godin por ter me auxiliado, com sua experiência, na execução do
experimento em camundongos e pelas dicas valiosas. Muito obrigada!
À professora Dra. Leida Botion pela instrução e colaboração com o experimento em
camundongos.
À Farmácia Universitária, à Indústria Farmacêutica Cifarma, à Medley e ao Laboratório
Globo pelo fornecimento de matéria-prima e comprimidos de sinvastatina, materiais
essenciais para a execução desse trabalho. Muito obrigada pela colaboração.
RESUMO
As estatinas são fármacos utilizados no tratamento da hiperlipidemia. As mais utilizadas na
terapêutica são a sinvastatina e a lovastatina, que tem baixa solubilidade. A pravastatina
sódica é um sal solúvel e, também usada na terapêutica para redução do colesterol. Neste
estudo desenvolveram-se e validaram-se dois métodos analíticos para determinação dessas
estatinas. O método por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa foi
desenvolvido utilizando coluna C-8, fase móvel acetonitrila:ácido fosfórico 0,1% (65:35),
fluxo 1,0 ou 1,5 mL/min, temperatura 30 ºC com detecção em λ 238 nm. No método por
espectrofotometria derivada no ultravioleta utilizou-se a segunda ordem de diferenciação em
λ 247 nm em metanol. Ambos os métodos demonstraram seletividade, precisão e exatidão
para determinação das estatinas. Uma formulação de sinvastatina comprimidos foi
preparada por meio de dispersão sólida utilizando os polímeros PEG ou PVP. Os
comprimidos de dispersões sólidas de sinvastatina e PVP apresentaram heterogeneidade
nos ensaios de rotina para o controle de qualidade. Os comprimidos de dispersões sólidas
de sinvastatina e PEG cumpriram com os testes de determinação de peso, uniformidade de
conteúdo, doseamento e dissolução de acordo com as especificações da Farmacopéia
Brasileira e USP32. Teste in vivo em camundongos com dieta hiperlipidêmica foi realizados
utilizando sinvastatina sob diferentes formas: (a) sinvastatina, (b) dispersão sólida com PEG,
(c) comprimidos de dispersão sólida com PEG e (d) comprimidos Zocor
®
. Os resultados do
teste in vivo apresentaram elevada variabilidade quanto a redução do colesterol para todos
os grupos utilizados e não podem ser conclusivos.
Palavras-chave: estatinas hipolipêmicas, colesterol, desenvolvimento analítico, dispersões
solidas, caracterização, cromatografia liquida de alta eficiência, espectrofotometria derivada
no ultravioleta, controle de qualidade, dissolução, Zocor®.
ABSTRACT
The statins are hypolipemic drugs used in the control of hypercholesterolemia. Simvastatin
and lovastatin, low water soluble drugs and soluble sodium pravastatin are among the most
prescribed statins for the reduction of cholesterol. In this study two methods were developed
and validated for the determination of these statins. A reverse phase high performance liquid
chromatographic method was developed using a C-8 column, mobile phase composed of
acetonitrile: 0.1% phosphoric acid (65:35), 1.0 or 1.5 mL/min flow rate, column oven 30 ºC
and UV detection 238 nm. A second order ultraviolet derivative spectrophotometric method
was developed at λ 247 nm using methanol. Both methods demonstrated to be selective,
precise and accurate for the statins determination. A tablet simvastatin formulation was
developed by means of a solid dispersion using the polymers PEG or PVP. Simvastatin
tablets dispersions using PVP showed to be heterogeneous regarding the quality control
routine tests. Simvastatin tablets dispersions using PEG showed good results for the weight
determination, content uniformity and dissolution and met the requirements according to the
Brazilian Pharmacopeia and USP32 specifications. In vivo tests using mice submitted to a
hyperlipemic diet were performed using simvastatin in different forms: (a) simvastatin, (b)
powder solid dispersions with PEG, (c) tablets solid dispersions with PEG, and (d) Zocor®
tablets. The in vivo results showed a great variability in the experiment regarding the
cholesterol reduction for all groups tested, hence, were not conclusive.
Keywords: hypolipemic statins, cholesterol, analytical development, solid dispersions,
characterization, high performance liquid chromatography, ultraviolet derivative
spectrophotometry, quality control, dissolution, Zocor®.
LISTA DE FIGURAS
1 - Estruturas químicas da lovastatina, sinvastatina, pravastatina sódica, fluvastatina sódica
e atorvastatina cálcica. ....................................................................................................... 20
2 - Representação simplificada da biossíntese de colesterol a partir de ácido mevalônico. 22
3 - Espectro de absorção na região do IV de lovastatina matéria-prima por reflectância
atenuada............................................................................................................................. 45
4 - Espectro de absorção na região do IV de pravastatina sódica matéria-prima por
reflectância atenuada.......................................................................................................... 45
5 - Espectro de absorção na região do IV de sinvastatina padrão de trabalho por reflectância
atenuada............................................................................................................................. 46
6 - Espectro de absorção na região do UV de lovastatina matéria-prima (8 µg/mL, ACN). . 47
7 - Espectro de absorção na região do UV de pravastatina sódica matéria-prima (10 µg/mL,
metanol).............................................................................................................................. 47
8 - Espectro de absorção na região do UV de sinvastatina matéria-prima (8 µg/mL, ACN). 47
9 - Cromatograma de lovastatina (fator de cauda 0,981) e sinvastatina (fator de cauda 0,967)
(40 µg/mL, em ACN)........................................................................................................... 48
10 - Cromatograma de pravastatina sódica (fator de cauda 1,184) (40 µg/mL, em ACN). .. 49
11 - Cromatograma obtido após hidrólise ácida de lovastatina (5,203 min, R= 8,50). Picos
correspondentes a produtos de degradação (PD) em tr=1,182 min e tr=6,623 min.
Condições: HCl 1 N em banho-maria a 100 ºC por 4 h. ...................................................... 50
12 - Cromatograma obtido após hidrólise ácida de sinvastatina (tr=6,611 min, R= 13,55).
Pico principal correspondente a produto de degradação (PD) em tr=1,185 min Condições:
HCl 1 N em banho-maria a 100 ºC por 4 h.......................................................................... 50
13 - Cromatograma obtido após hidrólise básica de lovastatina. Possível hidroxiácido em
tr=3,494 min (Lov-HA) e outro produto de degradação (PD) em 1,610 min. Condições: NaOH
1 N em banho-maria a 100 ºC por 4 h................................................................................. 50
14 - Cromatograma obtido após hidrólise básica de sinvastatina. Possível hidroxiácido em
tr=4,235 min (Sinv-HA) e outro produto de degradação (PD) em tr=1,571 min. Condições:
NaOH 1 N em banho-maria a 100 ºC por 4 h...................................................................... 51
15 - Cromatograma obtido após hidrólise neutra de lovastatina (tr=5,184 min, R= 10,00).
Possível hidroxiácido em tr=3,438 min (Lov-HA). Condições: banho-maria a 100 ºC por 4 h.
........................................................................................................................................... 51
16 - Cromatograma obtido após hidrólise neutra de sinvastatina (tr=6,551 min, R= 6,53).
Possível hidroxiácido em tr=4,230 min (Sinv-HA). Condições: banho-maria a 100 ºC por 4 h.
........................................................................................................................................... 51
17 - Cromatograma obtido após aquecimento de lovastatina (tr=5,183 min, R= 3,29).
Condições: calor seco a 105 ºC, por 4 h............................................................................. 53
18 - Cromatograma obtido após aquecimento de sinvastatina (tr=6,544 min, R= 12,80).
Condições: calor seco a 105 ºC, por 4 h............................................................................. 53
19 - Cromatograma obtido após exposição à radiação UV de lovastatina (tr=5,158 min).
Condições: exposição à radiação de luz ultravioleta em λ 254 nm por 4 h.......................... 54
20 - Cromatograma obtido após exposição à radiação UV de sinvastatina (6,546 min).
Condições: exposição à radiação de luz ultravioleta em λ 254 nm por 4 h.......................... 54
21 - Cromatograma obtido após oxidação de lovastatina (5,189 min). Condições: H
2
O
2
30%
V/V, em banho-maria a 100º C por 4 h. O pico em 1,350 min corresponde ao branco (H
2
O
2
).
........................................................................................................................................... 54
22 - Cromatograma obtido após oxidação de sinvastatina (6,566 min). Condições: H
2
O
2
30%
V/V, em banho-maria a 100º C por 4 h. O pico em 1,350 min corresponde ao branco (H
2
O
2
).
........................................................................................................................................... 55
23 - Cromatogramas de soluções de placebos A, B C e D (concentração equivalente a 40
µg/mL, em ACN)................................................................................................................. 56
/continua.
LISTA DE FIGURAS (continuação)
24 - Curvas analíticas médias para a determinação de (a) lovastatina (b) pravastatina sódica
e (c) sinvastatina (28 a 52 µg/mL, ACN, λ 238 nm) por CLAE............................................. 60
25 - Espectros na região do UV em zero ordem de sinvastatina 10 µg/mL, em metanol e
placebos C e D na concentração equivalente a 10 µg/mL de sinvastatina, metanol. .......... 70
26 - Espectro de absorção da sinvastatina em segunda derivada (8 µg/mL, metanol)........ 71
27 - Curvas analíticas médias para a determinação de lovastatina (a), sinvastatina (c)
(ambas de 4 a 12 µg/mL, metanol) e (b) de pravastatina sódica (6 a 14 µg/mL, metanol) por
EDU.................................................................................................................................... 75
28 - Padrão de difração de raios X de sinvastatina. ............................................................ 96
29 - Padrão de difração de raios X de PEG6000 (a), PVP (b) e das respectivas MF (1:1,
estatina:polímero)............................................................................................................... 96
30 - Padrão de difração de raios X de sinvastatina, PEG4000 e das DS de sinvastatina e
PEG4000 (1:1, 1:3 e 1:5) preparadas pelo método de fusão. ............................................. 97
31 - Padrão de difração de raios X das MF de sinvastatina e PEG6000 (a) e das respectivas
DS preparadas pelo método de fusão (b). .......................................................................... 97
32 - Padrão de difração de raios X da MF de sinvastatina e PEG6000 e das respectivas DS
preparadas pelo método de fusão (dispersão) e pelo método de fusão-evaporação de
solvente (misto), na proporção 1:5 (estatina:polímero). ...................................................... 98
33 - Padrão de difração de raios X das MF de sinvastatina e PVP (a) e das respectivas DS
preparadas pelo método de fusão (b). ................................................................................ 99
34 - Curvas DSC de sinvastatina (d) e suas misturas físicas com PEG4000 nas proporções
(sinvastatina: PEG4000): 1:1 (a), 1:3 (b) e 1:5 (c)............................................................. 100
35 - Curvas DSC de sinvastatina (c) e suas dispersões sólidas com PEG4000 preparadas
por meio do método de fusão, nas proporções (sinvastatina: PEG4000): 1:1 (a), 1:3 (b) e 1:5
(d)..................................................................................................................................... 100
36 - Curvas DSC de sinvastatina e suas misturas físicas com PEG6000 nas proporções
(sinvastatina:PEG6000): 1:1, 1:3 e 1:5. ............................................................................ 101
37 - Curvas DSC de sinvastatina e suas dispersões sólidas com PEG6000 preparadas por
meio do método de fusão, nas proporções (sinvastatina:PEG6000): 1:1, 1:3 e 1:5. ......... 101
38 - Curvas DSC das DS de sinvastatina e PEG6000 preparadas por meio do método de
fusão (a) e por meio do método de fusão-evaporação de solvente (b), na proporção 1:5
(estatina:polímero)............................................................................................................ 102
39 - Curvas DSC das misturas físicas de sinvastatina com PVP nas proporções
(sinvastatina:PVP): 1:1, 1:3 e 1:5...................................................................................... 102
40 - Curvas DSC das dispersões sólidas de sinvastatina com PVP preparadas por meio do
método de evaporação de solvente, nas proporções (sinvastatina:PVP): 1:1, 1:3 e 1:5. .. 103
41 - Comparação do aumento de solubilidade da sinvastatina nas DS preparadas com
polímeros e proporções diferentes.................................................................................... 107
42 - Curva analítica para avaliação da solubilidade de sinvastatina por UV, λ 239 nm. .... 109
43 - Cromatograma da DS de sinvastatina (tr=7,215 min) e PEG4000 (1:5) preparada pelo
método de fusão............................................................................................................... 110
44 - Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal) e PVP (1:1). A seta indica o pico
referente a produto de degradação................................................................................... 110
45 - Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal) e PVP (1:3). As setas indicam
picos referentes a produtos de degradação...................................................................... 110
46 - Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal) e PVP (1:5). As setas indicam
picos referentes a produtos de degradação...................................................................... 111
47 - Curva analítica para avaliação do perfil de dissolução da sinvastatina por EDU........ 118
48 - Curva de perfil de dissolução dos comprimidos preparados com DS de sinvastatina e
PEG e do Zocor® (10 mg), em tampão de NaH
2
PO
4
pH 7,40, sem adição de LSS. ......... 119
LISTA DE FIGURAS (conclusão)
49 - Curva de perfil de dissolução de comprimidos preparados com DS de PEG ou PVP e do
Zocor® (10 mg), em tampão de NaH
2
PO
4
pH 7,40 com 0,3% de LSS.............................. 120
50 - Comparação dos perfis de dissolução do medicamento referência (a) e dos
comprimidos com DS de PEG (b) em tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40 e 0,3% de LSS com os
respectivos perfis de dissolução em tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40 e 0,5% de LSS. .............. 121
51 - Média de porcentagem de alteração de colesterol plasmático após 7 dias com
tratamento hipolipêmico para cada grupo avaliado. .......................................................... 127
LISTA DE TABELAS
1 - Resultados obtidos, em triplicata, para temperaturas de fusão de sinvastatina e
lovastatina matérias-primas. ............................................................................................... 43
2 - Resultados para determinação do poder rotatório de lovastatina, sinvastatina (0,5% p/V
em ACN, triplicata) e pravastatina sódica (0,5% p/V em água, triplicata)............................ 44
3 - Atribuições de posições das principais bandas de absorção de lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina na região do IV.................................................................................. 46
4 - Resultados da avaliação da linearidade do método para determinação de lovastatina por
CLAE, em triplicata. ............................................................................................................ 57
5 - Resultados da avaliação da linearidade do método para determinação de pravastatina
sódica por CLAE, em triplicata............................................................................................ 58
6 - Resultados da avaliação da linearidade do método para determinação de sinvastatina por
CLAE, em triplicata. ............................................................................................................ 59
7 - Resultados obtidos para análise da regressão linear para determinação de lovastatina,
pravastatina sódica e sinvastatina por CLAE...................................................................... 61
8 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de lovastatina
por CLAE, em triplicata....................................................................................................... 62
9 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de pravastatina
sódica por CLAE, em triplicata............................................................................................ 62
10 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de sinvastatina
por CLAE, em triplicata....................................................................................................... 64
11 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de lovastatina por CLAE,
em triplicata. ....................................................................................................................... 65
12 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de pravastatina sódica por
CLAE, em triplicata. ............................................................................................................ 66
13 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de sinvastatina por CLAE,
em triplicata. ....................................................................................................................... 67
14 - Resultados obtidos para robustez do método aplicado à determinação de lovastatina
por CLAE............................................................................................................................ 68
15 - Resultados obtidos para robustez do método aplicado à determinação de pravastatina
sódica por CLAE................................................................................................................. 68
16 - Resultados obtidos para robustez do método aplicado à determinação de sinvastatina
por CLAE............................................................................................................................ 69
17 - Resultados da avaliação da linearidade do método para a determinação de lovastatina
por EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata. ............................................................... 72
18 - Resultados da avaliação da linearidade do método para a determinação de pravastatina
sódica por EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata. .................................................... 73
19 - Resultados da avaliação da linearidade do método para a determinação de sinvastatina
por EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata. ............................................................... 74
20 - Resultados obtidos para análise da regressão linear para a determinação de
lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina por EDU, segunda ordem........................... 76
21 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de lovastatina
por EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata e por analistas diferentes........................ 77
22 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de pravastatina
sódica por EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata e por analistas diferentes............. 78
23 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de sinvastatina
por EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata e por analistas diferentes........................ 79
/continua.
LISTA DE TABELAS (conclusão)
24 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de lovastatina por EDU,
segunda ordem, avaliada em triplicata................................................................................ 80
25 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de pravastatina sódica por
EDU, segunda ordem, avaliada em triplicata. ..................................................................... 81
26 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de sinvastatina por EDU,
segunda ordem, avaliada em triplicata................................................................................ 82
27 - Resultados obtidos para avaliação de robustez do método aplicado ao doseamento de
lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina por EDU, segunda ordem........................... 83
28 - Resultados comparativos para o doseamento de sinvastatina em comprimidos obtidos
entre os métodos CLAE e EDU, segunda ordem................................................................ 84
29 - Excipientes e proporções utilizadas na fabricação dos comprimidos contendo DS
a
..... 90
30 - Grupos de animais (n = 6) e tratamentos utilizados na comparação da eficácia
terapêutica de sinvastatina sob formas diversas................................................................. 94
31 - Resultados obtidos para avaliação das DS e MF de sinvastatina por DSC................ 105
32 - Aumento porcentual da concentração de sinvastatina liberada em solução tampão
NaH
2
PO
4
pH 7,40, após 1 h de teste de solubilidade parcial. ........................................... 106
33 - Resultados de peso médio
a
e de variação para os comprimidos com DS de sinvastatina
e PEG6000 ou PVP. ......................................................................................................... 114
34 - Resultados obtidos para os testes de dureza e friabilidade para os comprimidos
preparados com DS de sinvastatina e PEG6000 ou PVP. ................................................ 115
35 - Resultados obtidos no doseamento por CLAE dos comprimidos preparados com DS de
sinvastatina e PEG6000 ou PVP, em sextuplicata. ........................................................... 115
36 - Porcentagens de valor rotulado para o teste de uniformidade de conteúdo dos
comprimidos preparados com DS de sinvastatina e PEG6000 ou PVP. ........................... 116
37 - Resultados
a
das porcentagens de liberação de sinvastatina, em tampão pH 7,4, sem
adição de tensoativo, por EDU, 2ª ordem. ........................................................................ 119
38 - Resultados
a
das porcentagens de liberação de sinvastatina, em tampão NaH
2
PO
4
pH
7,40 com 0,3% de LSS ou com 0,5% de LSS................................................................... 120
39 - Resultados de ASC e de porcentagem de ED dos perfis de dissolução calculados de 0 a
60 minutos........................................................................................................................ 121
40 - Concentração plasmática de colesterol em camundongos em três períodos: colesterol
basal (antes de iniciar o estudo), colesterol após 7 dias com dieta hiperlipêmica e após 7
dias com tratamento hipolipêmico e dieta continuada....................................................... 125
41 - Porcentagem de alteração de colesterol
a
após 7 dias com tratamento hipolipêmico com
sinvastatina sob diferentes formas (n=6). ......................................................................... 126
42 - Porcentagem de alteração de colesterol
a
após 7 dias com tratamento hipolipêmico com
sinvastatina sob diferentes formas (n=4). ......................................................................... 126
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
ACN acetonitrila
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASC área sob a curva
C
8
coluna de sílica quimicamente ligada a grupos octilsilano
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
C
s
concentração de saturação
CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal
CT colesterol total
DAD detector de arranjo de diodos
DPR desvio padrão relativo
DRXP difração de raios X de pó
DS dispersão sólida
DSC calorimetria exploratória diferencial
EDU espectrofotometria derivada na região ultravioleta
ED eficiência de dissolução
EP erro padrão da média
GL graus de liberdade
HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase
IV infravermelho
IC intervalo de confiança
k fator de retenção
LD limite de detecção
LQ limite de quantificação
MF mistura física
P coeficiente de partição octanol/água
PEG polietilenoglicol
PVP polivinilpirrolidona
R resolução
RENAME relação nacional de medicamentos essenciais
rpm rotações por minuto
s desvio padrão
SCB sistema de classificação biofarmacêutica
tr tempo de retenção
UV ultravioleta
UV-Vis ultravioleta-visível
VR valor rotulado
|
o
25
D
α
|
poder rotatório específico
∆H variação de entalpia
λ comprimento de onda
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................................. 19
2.1 Características físico-químicas e propriedades farmacológicas das estatinas ............... 19
2.2 Métodos quantitativos para determinação de estatinas.................................................. 23
2.3 Sistema de classificação biofarmacêutica e dissolução ................................................. 25
2.4 Dispersões sólidas......................................................................................................... 27
3 OBJETIVOS...................................................................................................................... 29
3.1 Gerais............................................................................................................................ 29
3.2 Específicos .................................................................................................................... 29
4 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA
QUANTIFICAÇÃO DE ESTATINAS HIPOLIPÊMICAS ........................................................ 30
4.1 Material.......................................................................................................................... 30
4.1.1 Substâncias químicas de referência e amostras ......................................................... 30
4.1.2 Material e Reagentes.................................................................................................. 30
4.1.3 Equipamentos............................................................................................................. 31
4.2 Métodos......................................................................................................................... 32
4.2.1 Identificação de matéria-prima.................................................................................... 32
4.2.2 Desenvolvimento e validação de método analítico por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina...... 33
4.2.3 Desenvolvimento e validação de método analítico por espectrofotometria derivada na
região do UV (EDU) para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina . 38
4.2.4 Comparação dos métodos desenvolvidos: EDU e CLAE ............................................ 41
4.3 Resultados e discussão ................................................................................................. 43
4.3.1 Identificação da matéria-prima.................................................................................... 43
4.3.2 Desenvolvimento e validação de método analítico por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina...... 48
4.3.3 Desenvolvimento e validação de método analítico por espectrofotometria derivada na
região do UV para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina ............ 70
4.3.4 Comparação entre os métodos desenvolvidos: EDU e CLAE ..................................... 83
5 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DISPERSÕES SÓLIDAS E
DESENVOLVIMENTO DE COMPRIMIDOS DE SINVASTATINA ........................................ 85
5.1 Material.......................................................................................................................... 85
5.1.1 Substâncias químicas e amostras............................................................................... 85
5.1.2 Material e reagentes ................................................................................................... 85
5.1.3 Equipamentos............................................................................................................. 86
5.2 Métodos......................................................................................................................... 87
5.2.1 Desenvolvimento de dispersões sólidas de sinvastatina............................................. 87
5.2.2 Caracterização das dispersões sólidas ....................................................................... 87
5.2.3 Avaliação da solubilidade parcial das DS.................................................................... 88
5.2.4 Avaliação de degradação das DS por CLAE............................................................... 89
5.2.5 Desenvolvimento farmacotécnico de comprimidos contendo DS de sinvastatina........ 89
5.2.6 Controle de qualidade dos comprimidos contendo DS de sinvastatina ....................... 91
5.2.7 Teste in vivo................................................................................................................ 93
5.3 Resultados e discussão ................................................................................................. 95
5.3.1 Desenvolvimento de dispersões sólidas de sinvastatina............................................. 95
5.3.2 Caracterização das dispersões sólidas ....................................................................... 95
5.3.3 Avaliação da solubilidade parcial das DS.................................................................. 105
5.3.4 Avaliação de degradação das DS por CLAE............................................................. 109
5.3.5 Desenvolvimento farmacotécnico de comprimidos contendo DS de sinvastatina...... 112
5.3.6 Controle de qualidade dos comprimidos contendo DS de sinvastatina ..................... 113
5.3.7 Teste in vivo.............................................................................................................. 123
6 CONCLUSÕES............................................................................................................... 129
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................130
APÊNDICE A........................................................................................................................138
APÊNDICE B........................................................................................................................141
ANEXO A..............................................................................................................................143
16
1 INTRODUÇÃO
A hiperlipidemia ou hipercolesterolemia, elevação da concentração de lipídios no plasma, é
a manifestação de um distúrbio na síntese e na degradação de lipoproteínas plasmáticas. A
hiperlipidemia é a principal causa de aterosclerose e patologias a ela associadas, tais como
doença cardíaca coronariana, doença cerebrovascular isquêmica e doença vascular
periférica (CARVALHO e CAMPO, 2007; ERTÜRK et al., 2003; MOGHADASIAN, 1999).
Estas doenças são responsáveis pela maior parte da mortalidade e da morbidade entre
adultos. De acordo com estatísticas da Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da
Saúde, em 2004, as doenças do aparelho circulatório foram a principal causa de óbito no
Brasil, correspondendo a 32,5% da mortalidade proporcional por causas definidas (BRASIL,
2006).
O colesterol possui papéis fisiológicos essenciais no nosso organismo como, por exemplo,
participar na manutenção da integridade das membranas celulares e constituir um percussor
importante na síntese de hormônios esteróides (NELSON e COX, 2005). Existe sob duas
formas principais, a lipoproteína de baixa densidade (LDL) e a lipoproteína de alta
densidade colesterol (HDL). Entretanto, concentrações plasmáticas elevadas de LDL (≥ 160
mg/dL) e/ou triglicérides (≥ 200 mg/dL) e concentrações baixas de HDL (< 40 mg/dL) estão
associadas a distúrbios e condições patológicas como a hiperlipidemia e a aterosclerose
(GOODMAN e GILMAN, 2003).
De acordo com levantamento realizado em 2006 pela American Heart Association (2009),
45,1% da população americana apresentavam valores de colesterol total (CT) iguais ou
superiores a 200 mg/dL (limite aceitável) e 15,7% apresentavam valores de CT iguais ou
superiores a 240 mg/dL, concentração considerada elevada. Em 2005, nos EUA foram
relatados 864.480 óbitos devido às doenças cardiovasculares e 445.687 devido à doença
cardíaca coronariana (DCC), representando 35,3% e 18,2% do total de óbitos registrados
nesse ano, respectivamente.
Esses dados revelam a importância da identificação e do controle dos fatores de risco para
DCC. Os principais fatores de risco são LDL colesterol elevado, HDL colesterol reduzido,
fumo, hipertensão, diabetes, obesidade, idade avançada e história familiar de eventos de
DCC prematuros (PARODI, 2009; WOOD et al., 1998).
O tratamento de pacientes com distúrbios lipídicos depende do nível de colesterol e
triglicérides plasmáticos, da presença ou não de DCC estabelecida, na gravidade dos
17
fatores de riscos quando presentes e na avaliação baseada nos níveis de risco de
Framinghan, uma escala quantitativa em que objetiva-se prever a probabilidade de um
paciente, sem história prévia de DCC ou outra doença aterosclerótica, desenvolvê-la em 10
anos (NCEP, 2001, WOOD et al., 1998).
Para todos os casos de pacientes hiperlipidêmicos, recomendam-se mudanças no estilo de
vida, como dieta hipolipêmica, exercício físico, controle de peso e controle da pressão
arterial. Entretanto, quando a mudança no estilo de vida não é suficiente e quando há mais
fatores de risco associados torna-se necessária a terapia medicamentosa (NCEP, 2001,
WOOD et al., 1998).
O reconhecimento da hipercolesterolemia como um dos principais fatores de risco para
doenças cardiovasculares levou ao desenvolvimento de fármacos que reduzem os níveis de
colesterol. O principal grupo de agentes hipolipidêmicos são os derivados do ácido fíbrico,
derivados do ácido nicotínico, resinas biliares, inibidores da absorção do colesterol biliar e
dietético (ezetimibe) e as estatinas. As estatinas são os agentes mais bem tolerados e mais
efetivos para o tratamento da dislipedemia (GOODMAN e GILMAN, 2003; NCEP, 2001;
STUDER et al., 2005).
As estatinas são inibidores competitivos da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA)
redutase, que cataliza uma etapa mais precoce e limitante da biossíntese do colesterol. Os
cinco agentes hipolipêmicos mais importantes, clinicamente, dentro desse grupo são a
atorvastatina, a fluvastatina, a lovastatina, a pravastatina e a sinvastatina
(CARVALHO e
CAMPO, 2007).
Por serem medicamentos de uso contínuo e de grande importância para a saúde pública,
duas estatinas, a sinvastatina e a atorvastatina, estão presentes na Relação Nacional de
Medicamentos Essenciais (RENAME, 2002) estabelecida pela política nacional de
medicamentos do governo brasileiro. A diretriz estabelecida na política nacional de
medicamentos relativa à adoção de medicamentos constantes na RENAME se baseia nas
prioridades nacionais de saúde, bem como na segurança, na eficácia terapêutica
comprovada, na qualidade e na disponibilidade dos produtos considerados essenciais
(BRASIL, 2006; RENAME, 2002).
Existem muitas especialidades farmacêuticas à base de estatinas no mercado e, apesar de
existirem métodos farmacopéicos em compêndios estrangeiros, não há métodos descritos
para tal grupo de fármacos na Farmacopéia Brasileira quarta edição (FARMACOPÉIA,
18
2005). Os métodos de doseamento descritos nas monografias das estatinas são por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e, diferentes para cada uma delas. Assim, é
essencial o desenvolvimento de métodos de doseamento alternativos, acessíveis,
econômicos, simples e rápidos para as estatinas a fim de obter uniformidade na avaliação
de matérias-primas e produtos acabados desse grupo de fármacos.
Como as estatinas são a classe de fármacos mais usados para o tratamento da
hipercolesterolemia, é necessário, além do desenvolvimento de métodos alternativos
simples para determinação quantitativa desses fármacos; a contínua pesquisa no
desenvolvimento de formulações melhoradas para garantir a disponibilidade e eficácia do
fármaco.
A sinvastatina, a segunda estatina mais potente e a mais prescrita no Brasil, é um fármaco
de baixa solubilidade aquosa e de alta permeabilidade de acordo com o sistema de
classificação biofarmacêutica (SCB). A sua solubilização in vivo é um fator limitante para a
sua absorção e para o aparecimento do efeito farmacológico (BUDAVARI, 2006; GRAESER
et al., 2008). Dessa forma, é de grande importância o desenvolvimento de formulações que
aumentem sua solubilidade e melhorem sua biodisponibilidade.
Existem vários recursos técnicos que podem ser utilizados na tentativa de melhorar a
solubilidade e, portanto, aumentar a biodisponibilidade de fármacos de baixa solubilidade
aquosa como a sinvastatina. Esses recursos incluem a micronização, o preparo de
dispersões sólidas, a complexação com ciclodextrinas, a conversão de fármacos do estado
cristalino para o estado amorfo, a incorporação de surfactantes, a inclusão em lipossomas, a
formação de sais solúveis e a utilização de excipientes que ajudam na solubilização e
liberação do fármaco (FORD, 1986; LEUNER e DRESSMAN, 2000, KALÁSZ e ANTAL,
2006; BREWSTER e LOFTSSON, 2007; CARRIER et al., 2007; GRAESER et al., 2008;
PATEL e PATEL, 2008; CHEN et al., 2009).
19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Características físico-químicas e propriedades farmacológicas das
estatinas
As estatinas foram isoladas a partir de uma cultura da colônia Penicillium citrinium. A
primeira estatina estudada foi a mevastatina, que demonstrou o potencial terapêutico dessa
classe de fármacos (GOODMAN e GILMAN, 2003). Algumas estatinas são produtos
naturais, isoladas a partir do metabolismo de fungos, como a mevastatina, a lovastatina, a
pravastatina e a sinvastatina (derivado semi-sintético), outras são completamente sintéticas
como a atorvastatina, a cerivastatina e a fluvastatina
(BASTARDA et al., 2005). As estruturas
químicas das estatinas são apresentadas na Figura 1.
Dentre os fármacos citados, a sinvastatina e a atorvastatina estão entre as estatinas mais
potentes, sendo recomendadas pela Heart Association and the American College of
Cardiology como a terapia de primeira escolha para reduzir os níveis de colesterol
plasmáticos. Em estudos realizados para comparar os efeitos das estatinas na redução do
colesterol plasmático demonstrou-se que a dose de 20 mg de sinvastatina equivale à dose
de 10 mg de atorvastatina. A atorvastatina é a estatina mais potente, seguindo a
sinvastatina, a lovastatina e a pravastatina com potências semelhantes e a fluvastatina com
menor potência (JONES et al., 1998; GOODMAN e GILMAN, 2003).
A atorvastatina na forma de sal de sódio tem peso molecular 1192,4 g/mol, pKa 4,46, com
solubilidade em água (30 ºC) de 20,4 mg/mL em pH 2,1 e, de 1,23 g/L em pH 6,0. Na forma
de sal de cálcio apresenta absorção máxima na região do ultravioleta (UV
máx
, acetonitrila ou
metanol) em λ 248 nm. A atorvastatina como lactona possui ponto de fusão na faixa de
159,2-160,7 ºC, poder rotatório específico, I
o
25
D
α
I, igual a +26,05
º
(1% em clorofórmio) e
solubilidade de 1,34 ± 0,53 mg/L em pH 2,3 a 7,7 (30 ºC) (AKTAS et al., 2003; BUDAVARI,
2006; MARTINDALE, 1999).
A fluvastatina sódica é um pó amarelo-acastanhado, higroscópico com ponto de fusão na
faixa de 194 a 197 ºC, solúvel em água, em etanol e em metanol. Possui pKa 4,6 e
coeficiente de partição (octanol:água), log P, igual a 4,85. Apresenta máximos de absorção
na região do ultravioleta (UV
máx
, solução aquosa ácida) em λ 235 e 305 nm (BUDAVARI,
2006; MOFFAT et al., 2004).
20
Figura 1
- Estruturas químicas da lovastatina, sinvastatina, pravastatina sódica, fluvastatina sódica e
atorvastatina cálcica.
A lovastatina é um pó branco cristalino com ponto de fusão de 174,5 ºC, insolúvel em água
(0,4x10
-3
g/L), solúvel em acetona, acetonitrila, metanol (28 g/L), etanol (16 g/L) e
isopropanol (20 g/L). Essa estatina possui poder rotatório, I
o
25
D
α
I, igual a +323º (0,5% em
acetonitrila), coeficiente de partição (octanol:água), log P, igual a 4,26 na forma de lactona e
máximos de absorção na região do ultravioleta (UV
máx
, acetonitrila) em λ 231, 238 e 247 nm
(BUDAVARI, 2006; MOFFAT et al., 2004).
A pravastatina, na forma de sal de sódio, é um pó cristalino, higroscópico e apresenta
coloração branco-amarelada. É facilmente solúvel em água e em metanol e praticamente
insolúvel em acetona, acetonitrila e clorofórmio. Possui coeficiente de partição
(octanol:água), log P, igual a -0,23. Na sua forma de lactona possui poder rotatório, I
o
25
D
α
I,
igual a +194º (0,51% em metanol), ponto de fusão na faixa de 138 a 142 ºC e máximos de
absorção na região do ultravioleta (UV
máx
, metanol) em λ 230, 237, e 245 nm (EUROPEAN,
2008; MARTINDALE, 1999; MOFFAT et al., 2004).
21
A sinvastatina é um pó branco com ponto de fusão na faixa de 135 a 138 ºC, insolúvel em
água (0,03 g/L) e ácido clorídrico 0,1 M (0,06 g/L) e solúvel em clorofórmio (610 g/L),
metanol (200 g/L), etanol (160 g/L), polietilenoglicol (70 g/L) e hidróxido de sódio 0,1 M (70
g/L). Possui poder rotatório, I
o
25
D
α
I, igual a + 292 (0,51% em acetonitrila), coeficiente de
partição (octanol/água), log P, igual a 4,68 e máximos de absorção na região do ultravioleta
(UV
máx
, acetonitrila) em λ 231, 238 e 247 nm (BUDAVARI, 2006; MOFFAT et al., 2004).
As estatinas abaixam o LDL colesterol em 25-45%, dependendo da dose e da estatina
empregada. As doses recomendadas de cada estatina são: 10-80 mg/dia de atorvastatina,
20-40 mg/dia de pravastatina e 20-80 mg/dia de fluvastatina, lovastatina e sinvastatina
(CARVALHO e CAMPO, 2007; NCEP, 2001). Pacientes hipertrigliceridêmicos que utilizam
as doses mais altas (80 mg/dia) de sinvastatina ou atorvastatina apresentam uma redução
de 35-45% do LDL colesterol e uma redução semelhante nos níveis de triglicerídios em
jejum (GOODMAN e GILMAN, 2003).
Esse grupo de fármacos são inibidores competitivos muito potentes da 3-hidroxi-3-
metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase que sintetiza o ácido mevalônico, um
importante precurssor na síntese de colesterol, por meio de redução do substrato HMG-
CoA. A afinidade das estatinas pela enzima está na faixa nanomolar, enquanto que a
afinidade do substrato natural, o HMG-CoA, está na faixa micromolar, ou seja, 3 ordens de
magnitude menor. A síntese de colesterol, simplificada, a partir do ácido mevalônico, está
representada na Figura 2 (CARVALHO e CAMPO, 2007; MOGHADASIAN, 1999).
Vários estudos relatam benefícios clínicos associados à terapia com as estatinas que são
independentes da redução de colesterol, são os chamados efeitos pleiotrópicos. Esses
efeitos incluem promoção de síntese de óxido nítrico endotelial, redução na produção de
espécies reativas de oxigênio, estabilização das placas ateroscleróticas, redução no
crescimento de células musculares lisas que ocorre no processo aterosclerótico, efeitos
relacionados com atividade antiinflamatória como redução na liberação de citocinas
inflamatórias, redução na adesão leucocitária, e redução na proliferação de macrófagos.
Todas essas ações são importantes na atenuação do processo de aterosclerose via
limitação da lesão e disfunção endotelial (MARON et al., 2000; TERASAKA et al., 2008;
SPARROW et al., 2001; CHOUDHURY et al., 2004; MOLČÁNYIOVÁ et al., 2006, CHOPRA
et al., 2007).
22
Figura 2
- Representação simplificada da biossíntese de colesterol a partir de ácido mevalônico.
A lovastatina e a sinvastatina são administradas na forma inativa, lactona, e no fígado são
hidrolisadas para a forma ativa, o α-hidroxiácido correspondente. As demais estatinas são
administradas na forma ativa. A lipofilicidade dos pró-fármacos, lovastatina e sinvastatina,
confere aos mesmos maior seletividade pelo fígado, o maior sítio de síntese de colesterol,
em comparação com as demais estatinas administradas na forma ativa (MOGHADASIAN,
1999).
23
Esses fármacos estão sujeitos a extenso metabolismo de primeira passagem pelo fígado.
Mais de 95% das estatinas (formas lactonas e ativas) estão ligadas às proteínas
plasmáticas, com exceção da pravastatina que apresenta taxa de ligação mais baixa, cerca
de 50%. São excretadas nas fezes por meio da bile e uma pequena proporção é excretada
na urina
(ERTÜRK et al., 2003; GOODMAN e GILMAN, 2003).
Cerca de 30% de lovastatina, 34% de pravastatina sódica e 85% da sinvastatina são
absorvidas, sendo que a atorvastatina cálcica e a fluvastatina sódica são quase
completamente absorvidas. Devido ao extenso metabolismo de primeira passagem, as
estatinas possuem valores baixos de biodisponibilidade sendo 40,7% para a atorvastatina
cálcica, 25% para a fluvastatina sódica, até 5% para lovastatina, de 10 a 26% para a
pravastatina sódica e até 5% para a sinvastatina (MOFFAT et al., 2004; MOGHADASIAN,
1999).
Os principais efeitos adversos devido ao uso das estatinas são elevação na transaminase
hepática, miopatia, catarata, distúrbios gastrintestinais, tonteira e visão embaçada
(MARTINDALE, 1999; NCEP, 2001). Dentre eles, o de maior significância, é a miopatia
associada com a elevação de creatinocinase sendo caracterizada por mialgia intensa e
fadiga. Não há diferenças significativas no potencial de causar efeitos adversos entre as
estatinas.
São contra-indicadas, principalmente, na presença de doenças hepáticas
(MARON et al., 2000; PASTERNAK et al., 2002).
Devido ao aumento do risco de causar miopatia, as estatinas não são usadas em
associação com outras estatinas
(MARTINDALE, 1999; PASTERNAK et al., 2002), mas são
usadas em associação com inibidores da absorção do colesterol (ezetimibe) ou outras
classes de fármacos como anti-hipertensivos (valsartana) e antitrombóticos (ácido
acetilsalicílico).
2.2 Métodos quantitativos para determinação de estatinas
Apesar da similaridade estrutural das estatinas (Figura 1), há diferentes métodos analíticos
descritos na literatura para determinação quantitativa desse grupo de fármacos, entretanto
são diferentes e desenvolvidos individualmente para cada substância, com base em suas
propriedades físico-químicas como solubilidade, pKa e coeficiente de partição octanol/água.
24
São vários os métodos de doseamento por CLAE descritos para as estatinas e que utilizam
detecção por espectrofotometria na região do UV, por fluorescência, por espectrometria de
massas e outros recursos (ERTÜRK et al., 2003; ARAYNE et al., 2007; NIROGI et al., 2007;
BASAVAIAH e DEVI, 2008). Para a sinvastatina, há descrição de método por meio de
espectrofotometria derivada na região do UV (EDU). Esse método mostrou-se mais viável
financeiramente e mais rápido em comparação com métodos de quantificação por meio da
CLAE
(GOMES et al., 2009; WANG e ASGHARNEJAD, 2000).
As estatinas lovastatina, pravastatina e sinvastatina possuem monografias em alguns
compêndios estrangeiros, por exemplo as Farmacopéia Americana, Britânica e Européia,
com diferentes doseamentos por CLAE utilizando detecção na região do UV em λ 238 nm.
As colunas cromatográficas recomendadas são de octilsilano (C
8
) ou octadecilsilano (C
18
) e
fase móvel variável. Para a pravastatina sódica também há monografia na Farmacopéia
Japonesa (JPXV) (JAPANESE, 2006; BRITISH, 2007; EUROPEAN, 2008; EUROPEAN,
2009; THE UNITED, 2008).
Nos métodos de doseamento descritos para lovastatina matéria-prima nas Farmacopéias
Americana (USP31), Britânica (BP2007) e Européia (EP2008) utilizam-se condições
semelhantes, como fase móvel constituída por solução de ácido fosfórico 0,1% V/V e
acetonitrila (ACN) (35:65) como fase móvel, fluxo 1,5 mL/min, coluna C
8
. A principal
diferença é que no método da USP31 utiliza-se eluição isocrática e nos métodos da BP2007
e EP2008 emprega-se eluição em gradiente com tempo de análise de 20 minutos (BRITISH,
2007; EUROPEAN, 2008; THE UNITED, 2008).
Para a pravastatina sódica matéria-prima, as condições cromatográficas descritas para o
doseamento na BP2007, EP2008 e na JPXV são: fase móvel constituída de ácido acético
glacial, trietilamina, metanol e água (1:1:450:550 V/V/V/V), eluição isocrática, 1,3 mL/min de
fluxo e coluna C
18
. Entretanto, na USP31 a fase móvel, em gradiente, é constituída por
proporções variáveis de solução de ácido fosfórico 0,08 M pH 5,0 e ACN, fluxo 1,0 mL/min e
eluição em 20 minutos (JAPANESE, 2006; BRITISH, 2007; EUROPEAN, 2008; THE
UNITED, 2008).
Os métodos de doseamento descritos para sinvastatina matéria-prima na USP31, BP2007 e
EP2008 utilizam coluna C
18
, proporções variáveis de uma mistura de solução de ácido
fosfórico 0,1% V/V e ACN (50:50) e solução de ácido fosfórico 0,1% V/V em ACN como fase
móvel, 1,5 mL/min (USP31),1,3 mL/min (EP2008) e 3,0 mL/min de fluxo (EP2009) e eluição
25
em gradiente por 13 minutos (BRITISH, 2007; EUROPEAN, 2008; EUROPEAN, 2009; THE
UNITED, 2008).
Percebe-se que há variação nos métodos e na Farmacopéia Brasileira quarta edição, não
há métodos descritos para tal grupo de fármacos (FARMACOPÉIA, 2005). Assim, é
importante o desenvolvimento de métodos mais uniformes e até alternativos para o
doseamento para as estatinas como, por exemplo, a espectrofotometria na região
ultravioleta (UV) e suas variações (derivada), de modo a proporcionar procedimentos mais
viáveis financeiramente, mais simples e rápidos de serem realizados.
Gomes e colaboradores (2009) desenvolveram método por EDU para determinação de
sinvastatina em comprimidos. As medidas foram realizadas em λ 255 nm, em segunda
derivada e utilizando-se mistura de metanol e água como solvente. Apesar da menor
interferência em comparação com as medidas no modo convencional, zero ordem, a
sinvastatina apresenta baixa absorção no comprimento de onda λ 255 nm, originando um
pico satélite que pode comprometer a precisão e a reprodutibilidade do método.
Em outro estudo conduzido por Wang e Asgharnejad (2000) foi desenvolvido um método por
EDU para a determinação de sinvastatina dissolvida, em tampão fosfato de sódio pH 6,8, a
partir de comprimidos. As medidas foram realizadas em λ 243 nm, também em segunda
derivada. Wang e Asgharnejad (2000) investigaram apenas a interferência do ácido
ascórbico presente nas formulações.
Devido ao grande número de indústrias farmacêuticas que produzem medicamentos à base
de estatinas, é necessário desenvolver métodos alternativos padronizados, seletivos,
simples e rápidos para uma avaliação mais uniforme dessas substâncias e que sejam
compatíveis com a realidade da rotina industrial.
2.3 Sistema de classificação biofarmacêutica e dissolução
No SCB relacionam-se os fármacos em quatro classes, de acordo com a solubilidade
aquosa e com a permeabilidade intestinal. Os quatro casos possíveis são: alta solubilidade e
alta permeabilidade (classe I), baixa solubilidade e alta permeabilidade (classe II), alta
solubilidade e baixa permeabilidade (classe III) e fármacos que apresentam baixa
solubilidade e baixa permeabilidade (classe IV) (U.S. FOOD, 1997; KASIM et al., 2003; YU
et al., 2002).
26
Um fármaco é classificado como altamente solúvel se sua dose mais alta é solúvel em 250
mL, ou menos, de meio aquoso com pH na faixa de 1,0 a 7,5 ou se a razão: dose mais
alta/250 mL/solubilidade em água é inferior ou igual a 1. A classificação da permeabilidade é
baseada em dados experimentais de absorção intestinal humana, em estudos de
transferência de massa através da membrana intestinal ou, ainda, na correlação do
coeficiente de partição (P) n-octanol/água do fármaco na forma não ionizada e a medida da
sua permeabilidade jejunal (KASIM et al., 2003; YU et al., 2002).
Uma substância é considerada altamente permeável quando a extensão de absorção
intestinal é igual ou maior do que 90%. Entretanto, Yu e colaboradores (2002) sugerem que
esse critério é inadequado, pois a fração de dose absorvida determinada experimentalmente
para a maioria dos fármacos consideradas completamente ou bem absorvidas não atinge
90%. Assim, os autores sugerem um novo critério, 85%. Outro critério para classificar a
permeabilidade é o valor de log P (n-octanol/água), sendo que uma substância é
considerada altamente permeável se log P é maior do que 1,72 (KASIM et al., 2003).
A sinvastatina é um pó branco, cristalino, não higroscópico e insolúvel em água (0,03
mg/mL), seu coeficiente de partição entre octanol e tampão acetato pH 7,2 é maior do que
1995 e o seu valor de log P (n-octanol/água) é igual a 4,68 (MOFFAT et al., 2004; AMBIKE
et al., 2005; PATEL e PATEL, 2008). Devido a essas propriedades físico-químicas, a
sinvastatina faz parte da classe II do SCB, ou seja, é uma substância de baixa solubilidade e
alta permeabilidade (GRAESER et al., 2008).
É bem estabelecido que para fármacos com baixa solubilidade e alta permeabilidade a sua
liberação e dissolução in vivo a partir de uma forma farmacêutica de dosagem oral é uma
etapa crítica e limitante para sua absorção, distribuição e, portanto, para o aparecimento do
efeito farmacológico. Assim, pelo aumento da velocidade de dissolução desses fármacos é
possível aumentar sua biodisponibilidade e eficácia terapêutica (AMBIKE et al., 2005;
LEUNER e DRESSMAN, 2000; PATEL e PATEL, 2008; VASCONCELOS et al., 2007).
A dissolução é, entre outros fatores, controlada pela área superficial que o fármaco
apresenta, pelo grau de cristalização, pelo grau de hidratação e por sua solubilidade em
água. Sabe-se que a redução do tamanho de partícula resulta num aumento na velocidade
de dissolução, assim como fármacos na forma amorfa apresentam maior energia livre e
maior solubilidade do que na sua forma cristalina. Fármacos anidros são, em geral, mais
solúveis e, portanto, apresentam maior velocidade de dissolução. Excipientes também
podem ser usados para aumentar a dissolução, promovendo a solubilização do fármaco
27
como no caso de excipientes hidrofílicos ou reduzindo a tensão superficial, no caso de
surfactantes. Outra alternativa para o aumento na velocidade de dissolução de um fármaco
é o preparo de dispersões sólidas (ANSEL, 2000; FORD, 1986; KALÁSZ E ANTAL, 2006).
2.4 Dispersões sólidas
O desenvolvimento de dispersões sólidas (DS) é uma das estratégias mais promissoras
para o aumento da biodisponibilidade oral de fármacos pouco solúveis em água devido à
sua fácil produção e alta aplicabilidade. Podem ser definidas como dispersão de um
princípio ativo em um carreador inerte ou matriz em estado sólido, formando uma mistura
eutética, com pequenos cristais de princípio ativo imersos nesses carreadores e cuja
liberação dependerá da solubilização da matriz. Nessas preparações o fármaco pode estar
parcialmente disperso a nível molecular. As DS podem ser preparadas por processo de
fusão, evaporação de solvente ou processo misto (FORD, 1986; LEUNER e DRESSMAN,
2000; VASCONCELOS et al., 2007).
Os carreadores preferencialmente utilizados são polímeros como polivinilpirrolidona (PVP),
polietilenoglicol (PEG) e derivados da celulose, por possibilitarem a formação de dispersões
sólidas amorfas ou reduzirem o tamanho de partícula, em ambos os casos, a energia
necessária para dissolução é menor (FORD, 1986; VASCONCELOS et al., 2007).
DS preparadas com PVP podem alterar ou inibir a cristalização de fármacos nas DS
resultando em formas amorfas, as quais são menos estáveis termodinamicamente e liberam
o fármaco mais rapidamente. A inibição da cristalização pode ser atribuída às ligações de
hidrogênio entre o polímero e o fármaco e à incorporação de moléculas do fármaco dentro
da matriz polimérica durante o preparo da DS (FORD, 1986; MATSUMOTO e ZOGRAFI,
1999; MOOTER et al., 2001).
As principais vantagens e possíveis características da dispersão sólida que explicam o
aumento da biodisponibilidade são o tamanho de partícula reduzido e aumento da área de
superfície, o aumento da umectabilidade devido à presença de carreadores hidrofílicos, a
alta porosidade das partículas, às interações carreador-fármaco, à redução ou ausência de
aglomeração e agregação e à possível presença do fármaco na forma amorfa (PATEL e
PATEL, 2008; VASCONCELOS et al., 2007).
28
Há relatos, na literatura, de produção de DS de sinvastatina com PVP K30 preparadas pelo
método de evaporação de solvente e com PEG4000 preparadas pelo método de
evaporação ou fusão. As DS aumentaram a solubilidade da sinvastatina em solução aquosa
em até 11,3 vezes em relação ao fármaco apenas. Entretanto, as proporções de polímero
utilizadas foram muito altas (90,9%) e dessa forma, o desenvolvimento de comprimidos e
cápsulas com essas proporções é dificultado, principalmente no caso de medicamentos com
doses mais altas de sinvastatina (40 mg e 80 mg). Nesse estudo, não relata-se a
possibilidade de degradação da sinvastatina que venha a ocorrer durante o preparo das DS
(AMBIKE et al., 2005; PATEL e PATEL, 2008).
29
3 OBJETIVOS
3.1 Gerais
• Propor métodos alternativos para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e
sinvastatina em matérias-primas e em produtos acabados;
• propor formulações melhoradas para sinvastatina.
3.2 Específicos
• Desenvolver métodos alternativos por CLAE e EDU para doseamento de lovastatina,
pravastatina sódica e sinvastatina em matérias-primas e produtos acabados;
• elaborar propostas de monografias de sinvastatina matéria-prima e comprimidos para
serem incluídas em edição futura da Farmacopéia Brasileira.
• preparar DS de sinvastatina com diferentes tipos de polímeros e diferentes proporções
dos mesmos;
• desenvolver estudos de solubilidade das DS de sinvastatina para a seleção da
dispersão mais efetiva;
• desenvolvimento farmacotécnico de comprimidos com DS para a realização de
estudos de perfil de dissolução e comparação com o medicamento referência;
• propor condições para a realização de testes de dissolução para os comprimidos
formulados com DS;
• avaliar a eficácia da redução de colesterol da DS selecionada por meio da avaliação
em camundongos.
30
4 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA
QUANTIFICAÇÃO DE LOVASTATINA, PRAVASTATINA SÓDICA E
SINVASTATINA
4.1 Material
4.1.1 Substâncias químicas de referência e amostras
• Sinvastatina matéria-prima doada por Laboratório Globo Ltda. (São José da Lapa, MG),
lote 2113002/2007, teor 99,2% declarado pelo fabricante Biocon Limited (Bangalore, Índia),
sinvastatina matéria-prima doada por Cifarma Científica Farmacêutica Ltda. (Santa Luzia,
MG), lote IF 880902, teor 98,9% declarado pelo fabricante Valdequímica Produtos
Farmacêuticos Ltda. (São Paulo, SP) e sinvastatina padrão de trabalho doado por Medley
S/A Indústria Farmacêutica (Campinas, SP), lote 0080/00348, teor 99,1%, fabricante Biocon
Limited (Bangalore, Índia);
• lovastatina matéria-prima, lote 07061205A, teor 99,9% declarado pelo fabricante Pharma
Nostra Comercial Ltda. (Rio de Janeiro, RJ) e lovastatina padrão de trabalho lote
0703064709, teor 100,8 % declarado pelo fabricante Galena Química e Farmacêutica Ltda.
(Campinas, SP), doados pela Farmácia Universitária da Faculdade de Farmácia da UFMG
(Belo Horizonte, MG);
• pravastatina sódica matéria-prima, lote 06081546A01, teor 99,76% declarado pelo
fabricante Pharma Nostra Comercial Ltda. (Rio de Janeiro, RJ) e pravastatina sódica padrão
de trabalho, lote IF070102, teor 98,8% declarado pelo fabricante Deg Importação de
Produtos Químicos Ltda. (São Paulo, SP), doados pela Farmácia Universitária da Faculdade
de Farmácia da UFMG (Belo Horizonte, MG).
4.1.2 Material e Reagentes
• Água destilada e água ultrapurificada (Milli-Q Millipore, Milford, MA, EUA);
• coluna cromatográfica de fase reversa LiChrospher 100 RP-C
8
e de 250 mm de
comprimento e 4 mm de diâmetro, empacotada com sílica quimicamente ligada a grupo
octilsilano (C
8
) e tamanho de partícula 5 µm (Merck, Darmstadt, Alemanha);
• dispositivos filtrantes de celulose 15 mm, 0,45 µm (Minisart, Sartorius, Goettingen,
Alemanha);
31
• excipientes ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, EUA), ácido cítrico (Henrifarma, São Paulo,
SP), celulose microcristalina Microcel
®
MC102 (Blanver, Taboão da Serra, SP), dióxido de
silício coloidal Aerosil
®
(Emelffar, São Bernardo do Campo, SP), estearato de magnésio
(Ipiranga Química, Santos, SP), glicolato de amido sódico (Henrifarma, São Paulo, SP),
hidróxitolueno butil (BHT) (Indukern do Brasil Química Ltda., Osasco, SP), lactose Tabletose
100 (Ipiranga Química, Santos, SP), lauril sulfato de sódio (Pharmacopéia - Attivos
Magistrais, Barueri, SP), polietilenoglicol 4000 e 6000 (Labsynth, Diadema, SP),
polivinilpirrolidona K15 (Sigma-Aldrich, EUA) e talco (Proquímios, Bangu, RS);
• membrana de celulose com diâmetro de 47 mm e poros de 0,45 µm (Sartorius,
Goettingen, Alemanha);
• solventes e reagentes grau analítico ou cromatográfico: acetonitrila (J. T. Baker,
Philipsburg, MT, EUA), ácido clorídrico 1 M, ácido fosfórico (Merck, Darmstadt, Alemanha),
hidróxido de sódio 1 M, metanol (Tedia Company, Fairfield, Lowa, EUA), peróxido de
hidrogênio 30% V/V (Labsynth, Diadema, SP).
4.1.3 Equipamentos
• Aparelho de ultra-som MaxiClean 1400 (Unique
®
, Indaiatuba, SP);
• balança analítica BP210D (Sartorius, Goettingen, Alemanha) com precisão de 0,01 mg;
• banho-maria 120/2 (Fanem
®
, São Paulo, SP);
• centrífuga Jouan B4i (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA);
• cromatógrafo a líquido de alta eficiência HP1100 equipado com desgaseificador, bomba
quaternária, forno, injetor automático e detector de arranjo de diodos (DAD) (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, EUA);
• espectrofotômetro infravermelho Perkin Elmer precisely Spectrum One B (Perkin Elmer,
Waltham, MA, EUA);
• espectrofotômetro ultravioleta-visível (UV-Vis) HP 8453 com programa automático de
derivação interno Agilent (HP, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA);
• espectrofotômetro UV-Vis UV 1800 com programa UV Probe versão 2.33 (Shimadzu,
Tokyo, Japão);
• estufa 306/1 (Fanem
®
, São Paulo, SP);
• estufa a vácuo 091 (Fanem
®
, São Paulo, SP);
• lâmpada UV ENF-240C com cabine CM-10 (Spectroline, Nova York, NY, EUA);
• medidor de ponto de fusão PF62 (Mettler Toledo, Columbus, OH, EUA);
• polarímetro ADP 220 (Bellingham Stanley, Atlanta, GA, EUA).
32
4.2 Métodos
4.2.1 Identificação de matéria-prima
A identificação das matérias-primas lovastatina, pravastatina sódica e padrão de trabalho de
sinvastatina foi realizada por determinação de temperatura de fusão, de poder rotatório
específico, |α
D
25
|, por espectrofotometria de absorção nas regiões do infravermelho e do
ultravioleta.
4.2.1.1 Temperatura de fusão
A temperatura de fusão das matérias-primas de lovastatina e de sinvastatina foi
determinada, em triplicata, pelo método do capilar.
4.2.1.2 Poder rotatório específico
As matérias-primas lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina foram previamente
dessecadas a 60 ºC em estufa a vácuo por três horas. O poder rotatório específico foi
determinado em triplicata, na concentração 5 mg/mL em ACN para lovastatina e sinvastatina
e 5 mg/mL em água para pravastatina, conforme descrito nas respectivas monografias das
matérias-primas da USP31. Utilizou-se um tubo de 1 dm de comprimento para medida (THE
UNITED, 2008).
4.2.1.3 Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho
Foram traçados os espectros no infravermelho das matérias-primas lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina, na faixa 3600 a 650 cm
-1
, por meio do modo reflectância atenuada.
4.2.1.4 Espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta
Prepararam-se soluções de lovastatina e sinvastatina em ACN na concentração 8 µg/mL e
solução de pravastatina sódica em metanol na concentração 10 µg/mL. Os espectros foram
traçados na faixa de λ 200 a 400 nm e comparados com os máximos de absorção e
espectros registrados na literatura.
33
4.2.2 Desenvolvimento e validação de método analítico por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação de lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina
Por meio de adaptação do método descrito na monografia de lovastatina da USP31 (THE
UNITED, 2008), desenvolveu-se um método por CLAE para quantificar lovastatina,
pravastatina sódica e sinvastatina. Utilizou-se coluna C
8
, temperatura do forno controlada
em 30 ºC, eluição isocrática, fase móvel constituída de ACN e solução de ácido fosfórico
0,1% (65:35), fluxo 1,5 mL/min para lovastatina e sinvastatina e 1,0 mL/min para
pravastatina sódica, volume de injeção de 10 µL e detecção UV em λ 238 nm.
O método analítico por CLAE para quantificação de estatinas foi validado com base na
Resolução RE nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA (BRASIL, 2003). Os parâmetros de
validação avaliados foram seletividade, linearidade, precisão intra-ensaio e inter-ensaio,
exatidão, limite de detecção e quantificação e robustez.
Para a validação do método foram utilizadas amostras de sinvastatina matéria-prima com
teor 99,2% e padrão de trabalho com teor 99,1%, fabricante Biocon Limited, lovastatina
matéria-prima e padrão de trabalho com teores 99,9% e 100,8% declarados pelos
fornecedores Pharma Nostra e Galena, respectivamente e pravastatina sódica matéria-
prima e padrão de trabalho com teores 99,76% e 98,8% declarados pelos fornecedores
Pharma Nostra e Deg, respectivamente. Essas matérias-primas e padrões de trabalho foram
previamente identificados. A validação do método para os três fármacos foi realizada
separadamente.
4.2.2.1 Estudo de estabilidade
A degradação acelerada para lovastatina e sinvastatina foi realizada para avaliar a
seletividade do método desenvolvido por CLAE e para conhecer o comportamento químico
das duas estatinas sob diferentes condições (BAKSHI e SINGH, 2002).
Todas as amostras submetidas às condições de estresse por hidrólises neutra, ácida e
básica, calor seco, exposição à luz UV e por oxidação foram analisadas pelo método
desenvolvido por CLAE.
34
4.2.2.1.1 Hidrólise neutra, ácida e básica
Para avaliação da hidrólise neutra, transferiram-se, exatamente, cerca de 30 mg de
lovastatina e sinvastatina para balões volumétricos de 100 mL, separadamente.
Adicionaram-se 10 mL de acetonitrila para a solubilização e 50 mL de água destilada. Após
aquecimento, em banho-maria a 100 ºC, por 4 h e esfriamento a temperatura ambiente,
completou-se o volume com ACN. A concentração final obtida foi 300 µg/mL. O mesmo
procedimento foi repetido, separadamente, para as hidrólises ácida e básica, porém com
adicição de 50 mL de ácido clorídrico 1 mol/L e 50 mL de hidróxido de sódio 1 mol/L,
respectivamente, em substituição à adição de água destilada para a hidrólise neutra.
4.2.2.1.2 Calor seco
Transferiram-se, exatamente, cerca de 30 mg de lovastatina e de sinvastatina,
separadamente, para um pesa-filtro. As amostras foram colocadas em estufa 105 ºC por 4 h.
Transferiu-se, quantitativamente, cada amostra para balão volumétrico de 100 mL,
completou-se o volume com ACN. A concentração final obtida foi 300 µg/mL para cada
estatina.
4.2.2.1.3 Exposição à radiação UV
Pesaram-se, exatamente, cerca de 30 mg de lovastatina e de sinvastatina, separadamente,
em vidros-relógios. As amostras foram expostas à radiação de luz ultravioleta em
comprimento de onda curto (λ 254 nm) por 4 h, a temperatura ambiente. As amostras foram
transferidas, quantitativamente, para balões volumétricos de 100 mL, o volume foi
completado com ACN. A concentração final obtida para as estatinas foi 300 µg/mL
4.2.2.1.4 Oxidação
Transferiram-se, exatamente, cerca de 30 mg de lovastatina e de sinvastatina,
separadamente, para balões volumétricos de 100 mL. Adicionaram-se 10 mL de ACN para a
solubilização, 50 mL de água destilada e 10 mL de solução de peróxido de hidrogênio 30%
V/V. Após aquecimento, em banho-maria a 100 ºC, por 4 h, as amostras esfriaram a
temperatura ambiente e completou-se o volume com ACN. A concentração final obtida foi
300 µg/mL para cada estatina.
35
4.2.2.2 Seletividade
Para lovastatina e sinvastatina, a seletividade foi verificada quanto aos seus produtos de
degradação por meio da CLAE. Para esta finalidade, foram utilizadas soluções de
lovastatina e de sinvastatina submetidas às condições de degradação acelerada citadas no
item 4.2.2.1.
A seletividade foi demonstrada pela separação de todos potenciais compostos interferentes
frente ao pico de interesse com uma resolução adequada (geralmente, R ≥ 2) (SNYDER et
al., 1997). A pureza dos picos de interesse foi avaliada por meio de detector UV/DAD.
Para pravastatina sódica a seletividade foi verificada em relação a quatro diferentes
placebos (A, B, C e D), manipulados com excipientes comumente utilizados na fabricação
de comprimidos. Os placebos, fabricados no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da
Faculdade de Farmácia da UFMG (LTF/FAFAR/UFMG), continham as seguintes
constituições:
• placebo A: ácido ascórbico (0,1%), aerosil (0,5%), BHT (0,02%), lactose (73,55%),
lauril sulfato de sódio (1,5%) e manitol (11%);
• placebo B: ácido ascórbico (0,1%), aerosil (0,5%), amido (32%), celulose
microcristalina (43,57%), estearato de magnésio (0,5%), lauril sulfato de sódio (1%) e talco
(9%);
• placebo C: ácido ascórbico (0,05%), ácido cítrico (0,85%), aerosil (0,5%), BHT (0,5%),
celulose microcristalina (41,35%), estearato de magnésio (0,5%), glicolato de amido sódico
(2%), lactose (37,75%), lauril sulfato de sódio (0,5%), PEG (12,5%) e talco (1%);
• placebo D: mesmos constituintes do placebo C, exceto PEG. O PEG foi substituído por
PVP (7,5%) e as quantidades de celulose microcristalina e lactose foram ajustadas para
43% e 41%, respectivamente.
Para avaliação da seletividade quanto aos placebos, foram preparadas soluções de
placebos correspondentes a 40 µg/mL de estatina (100% da concentração de trabalho),
conforme descrito no item 4.2.2.5, com exceção da adição de pravastatina sódica.
36
4.2.2.3 Linearidade
Foram preparadas três soluções estoques de cada estatina na concentração 400 µg/mL em
ACN para lovastatina e sinvastatina e em água ultrapurificada para pravastatina sódica. As
diluições foram preparadas, em triplicata, tomando-se alíquotas de 3,5; 4,25; 5,0; 5,75 e 6,5
mL das soluções estoques e transferindo-se para balões volumétricos de 50 mL. Os
volumes foram completados com ACN. As concentrações finais obtidas foram 28, 34, 40, 46
e 52 µg/mL.
As soluções foram injetadas em triplicata. As condições cromatográficas estão descritas no
item 4.2.2.
As áreas dos picos foram medidas e usadas para a construção da curva analítica. A
regressão linear foi verificada por meio do método dos mínimos quadrados utilizando o
programa computacional Microsoft Excel
®
2003. Foram avaliados os coeficientes de
determinação (r
2
) e correlação (r), os fatores de resposta e a distribuição dos resíduos por
meio do teste de Ryan-Joiner.
4.2.2.4 Precisão intra-ensaio e inter-ensaio
A avaliação da precisão intra-ensaio do método foi realizada por meio de três determinações
de soluções de baixa, média e alta concentração. Foram preparadas três soluções estoques
na concentração 400 µg/mL, em ACN para lovastatina e sinvastatina e em água
ultrapurificada para pravastatina sódica. Alíquotas de 3,5; 5,0 e 6,5 mL das soluções
estoques foram transferidas, em triplicatas, para balões volumétricos de 50 mL e os volumes
completados com ACN. As concentrações finais obtidas foram 28, 40 e 52 µg/mL,
respectivamente.
Para a determinação da precisão inter-ensaio, o mesmo procedimento descrito para
precisão intra-ensaio para lovastatina, pravastatina sódica e para sinvastatina foi repetido,
no dia seguinte. A média, o intervalo de confiança (IC) a 95% e o desvio padrão relativo
(DPR) foram obtidos como resultado de avaliação da precisão.
37
4.2.2.5 Exatidão
A determinação da exatidão para as três estatinas foi realizada em três níveis de
concentração (70%, 100% e 130% da concentração de trabalho) por meio da adição de
placebo, formulado no LTF/FAFAR/UFMG, às matérias-primas. A constituição do placebo A
utilizado está descrita no item 4.2.2.2.
Para avaliação da exatidão, foram preparadas três soluções estoques pesando-se,
separadamente e exatamente, cerca de 20 mg de lovastatina, de pravastatina sódica e de
sinvastatina matérias-primas e mais quantidade de placebo correspondente ao conteúdo de
20 mg de cada estatina. Transferiu-se para balões volumétricos de 50 mL e adicionaram-se
cerca de 35 mL de ACN para lovastatina e sinvastatina e 35 mL de água ultrapurificada para
pravastatina sódica. As amostras foram submetidas ao ultra-som por 15 minutos e os
volumes dos balões completados com os respectivos solventes. Centrifugou-se por quatro
minutos a 4000 rotações por minuto (rpm). Alíquotas de 3,5; 5,0 e 6,5 mL das soluções
estoques foram transferidas, em triplicata, para balões volumétricos de 50 mL e os volumes
foram completados com ACN. As concentrações finais obtidas foram 28 µg/mL, 40 µg/mL e
52 µg/mL. Foi preparada, também, uma solução a 100% da concentração de trabalho de
cada estatina padrão de trabalho do mesmo modo que as soluções das matérias-primas,
exceto para a adição de placebo e a etapa de centrifugação.
Os resultados da exatidão foram expressos em porcentagem de recuperação do fármaco
adicionado ao placebo A.
4.2.2.6 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)
A determinação do LD e do LQ foi realizada por meio da equação que utiliza os valores de
estimativa do desvio padrão da resposta e a inclinação da curva, como a seguir:
b
s
LD
a
×= 3
b
s
LQ
a
×= 10
,
em que: s
a
, desvio padrão do intercepto com o eixo y; b, inclinação da curva analítica
(BRASIL, 2003).
38
4.2.2.7 Robustez
A robustez do método analítico foi avaliada modificando-se deliberadamente as condições
cromatográficas estabelecidas e verificando-se a sua influência nos resultados
apresentados. Foram preparadas, separadamente, soluções de 6 amostras e uma solução
padrão de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina, separadamente, na concentração
40 µg/mL em ACN (100% da concentração de trabalho). Os parâmetros modificados foram
porcentagem de modificador orgânico na fase móvel (± 2%), fluxo (± 0,1 unidade) e
temperatura (± 5 ºC).
A partir dos resultados de teores obtidos, foram realizadas análise de variância (ANOVA) e
comparação de médias pelo teste de Tukey, a fim de verificar a influência de cada
parâmetro na resposta fornecida pelo método analítico.
4.2.3 Desenvolvimento e validação de método analítico por espectrofotometria
derivada na região do UV (EDU) para quantificação de lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina
Inicialmente, foram traçados os espectros das soluções de lovastatina, pravastatina sódica
e, sinvastatina e dos placebos C e D, fabricados utilizando-se excipientes comumente
encontrados nos produtos acabados de estatinas (constituição descrita no item 4.2.2.2). Os
espectros foram avaliados na faixa de comprimento de onda λ 200 nm a 400 nm no modo
convencional (zero ordem) e primeira, segunda, terceira e quarta ordens. Com base no perfil
de espectros obtidos foram selecionados a menor ordem de derivada e o comprimento de
onda que resolvessem a interferência devido ao placebo. Desse modo, os parâmetros
espectrofotométricos selecionados e utilizados para a determinação de lovastatina,
pravastatina sódica e de sinvastatina por EDU foram: velocidade baixa de varredura na faixa
de λ 200 nm a 400 nm e absorção máxima no comprimento de onda λ 247 nm, em segunda
derivada, método zero pico, com diferenciação automática. Soluções a 100% da
concentração de trabalho foram preparadas para cada estatina em metanol.
O método analítico por EDU para quantificação de estatinas foi validado, separadamente
para cada uma delas, com base na resolução RE nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA
(BRASIL, 2003). Os parâmetros de validação avaliados foram seletividade, linearidade,
precisão intra-ensaio e inter-ensaio, exatidão, limite de detecção e quantificação e robustez.
39
As replicatas das amostras e padrões de trabalho utilizados para a validação do método de
doseamento por EDU foram as mesmas utilizadas para validação do método por CLAE,
descritos no item 4.2.2 para as três estatinas.
4.2.3.1 Seletividade
A seletividade do método foi verificada quanto à interferência de excipientes comumente
presentes em comprimidos de estatinas, por meio dos placebos C e D. Foram traçados os
espectros das estatinas e dos placebos, separadamente e sobrepostos, em segunda
derivada na faixa λ 200 a 400 nm, e avaliou-se a interferência no comprimento de onda
estabelecido para o desenvolvimento do método, λ 247 nm.
Os espectros das três estatinas e dos placebos foram traçados utilizando-se metanol como
solvente, nas concentrações 4 µg/mL e 10 µg/mL das estatinas e soluções de placebos
preparadas de modo a conter o equivalente a 4 µg/mL e 10 µg/mL de lovastatina,
pravastatina sódica ou sinvastatina.
4.2.3.2 Linearidade
Preparou-se solução estoque, para cada estatina separadamente, na concentração 100
µg/mL, pesando-se, exatamente, cerca de 10 mg de lovastatina, pravastatina sódica e
sinvastatina e transferindo-se para balões volumétricos de 100 mL. O volume foi completado
com metanol. Para lovastatina e sinvastatina tomaram-se alíquotas de 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0
mL das respectivas soluções estoques e, para pravastatina sódica, tomaram-se alíquotas de
3,0; 4,0; 5,0; 6,0; e 7,0 mL. Os volumes foram completados com metanol para balão
volumétrico de 50 mL. As concentrações finais obtidas foram 4, 6, 8, 10 e 12 µg/mL para
lovastatina e sinvastatina e, 6, 8, 10, 12 e 14 µg/mL para pravastatina sódica.
As medidas de absorvância (A/nm
2
) das soluções preparadas em triplicatas foram
realizadas, também em triplicata, em λ 247 nm, segunda derivada.
A regressão linear foi verificada por meio do método dos mínimos quadrados utilizando o
programa computacional Microsoft Excel
®
2003. Foram avaliados os coeficientes de
determinação (r
2
) e de correlação (r), os fatores de resposta e a distribuição dos resíduos
por meio do teste de Ryan-Joiner.
40
4.2.3.3 Precisão intra-ensaio e inter-ensaio
A avaliação da precisão intra-ensaio do método foi realizada por meio de determinação de
três soluções em baixa, média e alta concentração. Soluções estoques foram preparadas,
separadamente, pesando-se, exatamente, cerca de 10 mg de lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina e transferindo-se para balões volumétricos de 100 mL. Os volumes
foram completados com metanol. Para lovastatina e sinvastatina tomaram-se alíquotas de
2,0; 4,0 e 6,0 mL das respectivas soluções estoques e, para pravastatina sódica, tomaram-
se alíquotas de 3,0; 5,0 e 7,0 mL para balões volumétricos de 50 mL. Os volumes foram
completados com metanol. As concentrações finais obtidas foram 4, 8 e 12 µg/mL para
lovastatina e sinvastatina e 6, 10 e 14 µg/mL para pravastatina sódica.
Para a determinação da precisão inter-ensaio, repetiu-se o mesmo procedimento, descrito
para precisão intra-ensaio para lovastatina, pravastatina sódica e para sinvastatina, em dois
dias consecutivos por analistas diferentes. A média e o intervalo de confiança (IC) a 95% e o
desvio padrão relativo (DPR) foram obtidos como resultado de avaliação da precisão.
As medidas de absorvância (A/nm
2
) das soluções preparadas em triplicata foram realizadas,
também em triplicata, em λ 247 nm, em segunda derivada.
4.2.3.4 Exatidão
A determinação da exatidão para as três estatinas foi realizada em três níveis de
concentração (4, 8 e 12 µg/mL para lovastatina e sinvastatina e 6, 10 e 14 µg/mL para
pravastatina sódica) com adição de placebo às matérias-primas. A constituição do placebo
utilizado (placebo C) está descrita no item 4.2.2.2.
Foram preparadas três soluções estoques pesando-se, exatamente, cerca de 10 mg de
lovastatina, de pravastatina sódica e de sinvastatina matérias-primas e quantidade de
placebo equivalente a 10 mg de cada estatina. Transferiu-se para balões volumétricos de
100 mL e adicionaram-se cerca de 70 mL de metanol. As amostras foram submetidas ao
ultra-som por 15 minutos e os volumes dos balões foram completados com metanol.
Centrifugou-se por quatro minutos a 4000 rpm. Alíquotas de 2,0; 4,0 e 6,0 mL das soluções
estoques centrifugadas por 4000 rpm, 4 minutos, de lovastatina e de sinvastatina e,
alíquotas de 3,0; 5,0 e 7,0 mL das soluções estoques centrifugadas de pravastatina sódica
foram tomadas dos sobrenadantes e transferidas para balões volumétricos de 50 mL. Os
41
volumes foram completados com metanol. Preparou-se, também, uma solução de cada
estatina padrão de trabalho do mesmo modo que as soluções de estatinas matérias-primas,
exceto para a adição de placebo e a etapa de centrifugação. Os resultados da exatidão
foram expressos em porcentagem de recuperação do fármaco adicionado ao placebo C.
As medidas de absorvância (A/nm
2
) das soluções preparadas em triplicatas foram
realizadas, também em triplicata, em λ 247 nm da segunda derivada.
4.2.3.5 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)
Os cálculos para determinação do LD e do LQ foram realizados por meio das equações
descritas no item 4.2.2.6.
4.2.3.6 Robustez
A robustez do método analítico foi avaliada quantificando-se as amostras a 100% da
concentração de trabalho, em dois espectrofotômetros de fabricantes diferentes, HP 8453
Agilent e UV-Vis Shimadzu 1800. Para essa finalidade, foram preparadas, separadamente,
soluções de 6 amostras e uma solução padrão, em metanol, na concentração 8 µg/mL para
lovastatina e sinvastatina e, na concentração 10 µg/mL para pravastatina sódica.
A partir dos resultados de teores obtidos, foi realizada comparação das médias por meio do
teste de hipóteses (teste t), a fim de verificar diferenças estatísticas nas médias dos teores
obtidos por meio dos dois espectrofotômetros.
4.2.4 Comparação dos métodos desenvolvidos: EDU e CLAE
Para a comparação entre os dois métodos de quantificação desenvolvidos foram preparadas
cinco soluções a 100% da concentração de trabalho, a partir de um mesmo pool de 20
comprimidos de sinvastatina e analisadas por CLAE e por EDU, cujos parâmetros estão
descritos nos itens 4.2.2 e 4.2.3, respectivamente.
Para a avaliação por meio do método de quantificação por CLAE, foram pesadas cinco
alíquotas de pó de sinvastatina comprimidos contendo o equivalente a 10 mg de sinvastatina
42
e transferidas para balões volumétricos de 50 mL. Adicionaram-se cerca de 35 mL de ACN e
submeteu-se ao ultra-som por 15 minutos. Completaram-se os volumes com ACN e
centrifugou-se por quatrominutos a 4000 rpm. Alíquotas de 5,0 mL do sobrenadante foram
transferidas para balões volumétricos de 25 mL e os volumes foram completados com o
mesmo solvente. A concentração final obtida foi 40 µg/mL. Preparou-se, também, uma
solução de padrão sinvastatina na mesma concentração e com o mesmo solvente. As
amostras preparadas em quintuplicata e a solução padrão foram injetadas em triplicata.
Para a avaliação por meio do método de quantificação por EDU procedeu-se como descrito
para o método por CLAE, exceto para a utilização de um balão volumétrico de 100 mL na
primeira diluição e pela transferência de alíquotas de 4,0 mL para balões volumétricos de 50
mL. Utilizou-se metanol como solvente. A concentração final obtida das amostras e da
solução padrão foi 8 µg/mL.
A partir dos resultados de teores obtidos, a comparação das médias por meio do teste de
hipóteses (teste t) foi realizada, a fim de verificar diferenças estatísticas nas médias dos
teores obtidos com os dois métodos de quantificação.
43
4.3 Resultados e discussão
4.3.1 Identificação da matéria-prima
4.3.1.1 Temperatura de fusão
Moffat e colaboradores (2004) descrevem uma faixa de fusão para sinvastatina de 135 a
138 ºC, enquanto que para a lovastatina descrevem um valor único de temperatura de
fusão, 174,5 ºC.
Em um estudo de estabilidade térmica de lovastatina e de sinvastatina conduzido por Souza
e colaboradores (2007), o ponto de fusão das duas estatinas foi determinado por meio da
técnica de calorimetria exploratória diferencial (DSC). Ambas as estatinas apresentaram
duas transições endotérmicas: a primeira transição correspondente à fusão, em 172 ºC
(lovastatina) e 142 ºC (sinvastatina) e a segunda, em 285 ºC (lovastatina) e 302 ºC
(sinvastatina), referente à decomposição térmica (SOUZA et al., 2007).
A temperatura de fusão da sinvastatina foi determinada, também, por DSC no presente
trabalho (item 5.3.2.2). A temperatura do evento endotérmico referente à fusão foi 142,5 ºC.
Este resultado é condizente com o encontrado no estudo conduzido por Souza et al. (2007).
As temperaturas de fusão da lovastatina e da sinvastatina matérias-primas estão
apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Resultados obtidos, em triplicata, para temperaturas de fusão de sinvastatina e
lovastatina matérias-primas, por meio do método capilar.
Temperatura de fusão (º C)
Determinação Lovastatina Sinvastatina
1 170,4 137,7
2 170,3 139,5
3 169,5 137,4
Média 170,1 138,2
DPR (%) 0,30 0,82
A temperatura de fusão média para lovastatina e para sinvastatina estão de acordo com os
dados descritos na literatura (MOFFAT, et al., 2004; SOUZA et al., 2007).
44
4.3.1.2 Poder rotatório específico
O poder rotatório específico, |
o
25
D
α
|, para as soluções de lovastatina, de pravastatina sódica
e de sinvastatina (5 mg/mL em ACN, água e ACN, respectivamente) foi determinado
conforme a equação:
lc
D
α
α
100
25
=
o
,
em que: α, ângulo de rotação medido sob comprimento de onda da lâmpada de sódio a 25
ºC; l, comprimento em decímetros do tubo do polarímetro; c, concentração da substância
expressa em porcentagem peso por volume (%p/V).
Os valores obtidos e calculados de α e |
o
25
D
α
| para lovastatina, pravastatina sódica e para
sinvastatina estão listados na Tabela 2.
Tabela 2 - Resultados para determinação do poder rotatório de lovastatina, sinvastatina
(0,5% p/V em ACN, triplicata) e pravastatina sódica (0,5% p/V em água, triplicata).
Lovastatina Pravastatina sódica Sinvastatina
Conc.
(%p/V)
α
|
o
25
D
α
|
Conc.
(%p/V)
α
|
o
25
D
α
|
Conc.
(%p/V)
α
|
o
25
D
α
|
Média
0,52 +1,69º
+324,48º
0,52 +0,81º
+155,23º
0,52 +1,52º
+293,95º
DPR
(%)
2,5 +4,2 +1,7 1,96 +3,3 +1,34 3,5 +4,6 +2,3
As faixas especificadas para o poder rotatório específico, I
o
25
D
α
I, descritas nas respectivas
monografias contidas na USP31, são +324º a +338º para lovastatina, +150º a +160º para
pravastatina sódica e +285º a +298º para sinvastatina (THE UNITED, 2008). As médias
obtidas para as três estatinas estão dentro das respectivas faixas especificadas.
4.3.1.3 Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho
As principais bandas na região do infravermelho (IV) descritas para lovastatina estão
localizadas nos seguintes números de ondas: 1725, 1460, 1260 e 1072 cm
-1
, para
pravastatina sódica em 1727, 1579, 1187 cm
-1
e para sinvastatina em 1718, 1459, 1389 e
1267 cm
-1
(MOFFAT et al., 2004). Essas bandas podem ser observadas nos espectros
45
obtidos (Figuras 3 a 5) para as três estatinas, em número de ondas aproximado. As
atribuições das principais bandas estão apresentadas na Tabela 3.
Figura 3
- Espectro de absorção na região do IV de lovastatina matéria-prima por reflectância
atenuada.
Figura 4
- Espectro de absorção na região do IV de pravastatina sódica matéria-prima por
reflectância atenuada.
46
Figura 5
- Espectro de absorção na região do IV de sinvastatina padrão de trabalho por reflectância
atenuada.
Tabela 3 - Atribuições de posições das principais bandas de absorção de lovastatina,
pravastatina sódica e sinvastatina na região do IV.
Número de onda aproximado (cm
-1
) Atribuição
3500 Deformação axial O-H
1720, 1700 Deformação axial C=O de éster e lactona
1567 Deformação axial de C=O de carboxilato
1460, 1389 Deformação angular de metil e metileno
1260, 1070, 1080
Deformação axial de C-O-C de éster e
lactona
1160, 1182 Deformação angular de O-H
4.3.1.4 Espectrofotometria de absorção na região do ultraviloleta
Os espectros na região do ultravioleta foram traçados na faixa de comprimento de onda λ
200 a 400 nm, utilizando-se soluções de lovastatina e de sinvastatina matérias-primas 8
µg/mL em ACN e, solução de pravastatina 10 µg/mL em metanol. Os máximos de absorção
foram comparados com os descritos na literatura. Os espectros obtidos na região do UV
estão representados nas Figuras 6 a 8.
47
Os espectros são condizentes com os espectros descritos na literatura com máximos de
absorção em λ 231 nm, 238 nm e 247 nm, tanto para lovastatina quanto para sinvastatina e
λ 230 nm, 237 nm e 245 nm para pravastatina sódica (BUDAVARI, 2006; MOFFAT et al.,
2004). Os espectros das três estatinas são muito semelhantes, pois possuem o mesmo
grupo cromóforo representado pelas duplas conjugadas heterocíclicas (Figura 1).
Figura 6
- Espectro de absorção na região do UV de lovastatina matéria-prima (8 µg/mL, ACN).
Figura 7
- Espectro de absorção na região do UV de pravastatina sódica matéria-prima (10 µg/mL,
metanol).
Figura 8
- Espectro de absorção na região do UV de sinvastatina matéria-prima (8 µg/mL, ACN).
48
4.3.2 Desenvolvimento e validação de método analítico por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação de lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina
As condições cromatográficas utilizadas foram coluna C
8
, fase móvel constituída de
ACN:H
3
PO
4
0,1% (65:35), fluxo 1,5 mL/min para lovastatina e sinvastatina ou 1,0 mL/min
para pravastatina sódica, temperatura 30 ºC, detecção UV λ 238 nm e volume de injeção 10
µL. Nessas condições cromatográficas, os fatores de retenção (k) obtidos foram 4,6 (tr
5,6minutos) para lovastatina, 1,3 (tr 2,3minutos) para pravastatina sódica e 5,4 (tr
6,4minutos) para sinvastatina (Figuras 9 e 10). Esses valores estão dentro da faixa
recomendada (0,5<k<20) por Snyder e colaboradores (1997), bem como os fatores de
cauda obtidos dos respectivos picos foram menores que 2, valor limite recomendado pelo
FDA (U.S FOOD, 1994).
Figura 9 -
Cromatograma de lovastatina (fator de cauda 0,981) e sinvastatina (fator de cauda 0,967)
(40 µg/mL, em ACN).
min
0 1 2 3 4 5 6 7 8
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Lovastatina
Sinvastatina
49
Figura 10 -
Cromatograma de pravastatina sódica (fator de cauda 1,184) (40 µg/mL, em ACN).
4.3.2.1 Estudo de estabilidade
O estudo de estabilidade foi realizado a fim de verificar presença de possíveis produtos de
degradação, de modo a permitir a avaliação da figura de mérito, seletividade, para o método
desenvolvido.
4.3.2.1.1 Hidrólises neutra, ácida e básica
Os cromatogramas apresentados nas Figuras 11 a 16 foram obtidos após hidrólise ácida,
básica e neutra da lovastatina e da sinvastatina. O estudo de estabilidade não foi realizado
para pravastatina devido à sua menor retenção na coluna cromatográfica.
Pravastatina s
ó
dica
50
Figura 11
- Cromatograma obtido após hidrólise ácida de lovastatina (5,203 min, R 8,50). Picos
correspondentes a produtos de degradação (PD, tr 1,182 min e tr 6,623 min). Condições: HCl 1 N em
banho-maria a 100 ºC por 4 h.
Figura 12
- Cromatograma obtido após hidrólise ácida de sinvastatina (tr 6,611 min, R 13,55). Pico
principal correspondente a produto de degradação (PD, tr 1,185 min). Condições: HCl 1 N em banho-
maria a 100 ºC por 4 h.
Figura 13
- Cromatograma obtido após hidrólise básica de lovastatina. Possíveis produtos de
degradação (hidroxiácido, Lov-HA, tr 3,494 min e não identificado, PD, tr 1,610 min). Condições:
NaOH 1 N em banho-maria a 100 ºC por 4 h.
Lov-HA
PD
sinvastatina
PD
Lovastatina
PD
PD
51
Figura 14
- Cromatograma obtido após hidrólise básica de sinvastatina. Possíveis produtos de
degradação (hidroxiácido, Sinv-HA, tr 4,235 min e não identificado, PD, tr 1,571 min). Condições:
NaOH 1 N em banho-maria a 100 ºC por 4 h.
Figura 15
- Cromatograma obtido após hidrólise neutra de lovastatina (tr 5,184 min, R 10,0).
Possível produto de degradação (hidroxiácido, Lov-HA, tr 3,438 min). Condições: banho-maria a 100
ºC por 4 h.
Figura 16
- Cromatograma obtido após hidrólise neutra de sinvastatina (tr 6,551 min, R 6,53).
Possível produto de degradação (hidroxiácido, Sinv-HA, tr 4,230 min). Condições: banho-maria a 100
ºC por 4 h.
Sinv-HA
Sinvastatina
Lov-HA
Lovastatina
PD
Sinv-HA
52
Tanto a lovastatina quanto a sinvastatina foram mais sensíveis à hidrólise básica (Figuras
13 e 14) com degradação completa. Esse resultado está de acordo com o estudo relatado
por Alvarez-Lueje e colaboradores (2005) que avalia a estabilidade da lovastatina frente a
diferentes meios e temperaturas. Segundo os pesquisadores os valores de energia de
ativação e da constante hidrolítica calculados para o meio básico (NaOH 0,1 N) permitiram
concluir que a degradação é maior neste meio, no qual se observou degradação instantânea
à temperatura ambiente.
Em um estudo conduzido por Yang e Hwang (2006) relatou-se que a conversão de estatinas
na forma lactona para a forma de hidroxiácido é quase completa em meio alcalino (NaOH
0,1 N preparado com 25 ou 50% de ACN, a 45 ºC) e ocorre em menor proporção em meio
neutro (70% ACN em água por até 48 h à temperatura ambiente ou somente água a 100 ºC
por até 2 h). Assim, os picos com tr 3,494minutos (Figura 13) e tr 4,234minutos (Figura 14)
e com espectros na região do UV idênticos ao da lovastatina e ao da sinvastatina,
respectivamente, presentes nos cromatogramas obtidos após hidrólise básica, podem ser
considerados suas formas hidroxiácidas. Os mesmos picos, com tr próximos aqueles
previamente citados, também estão presentes nos cromatogramas referentes à hidrólise
neutra (Figuras 15 e 16), porém, com áreas maiores devido à degradação parcial da
lovastatina e da sinvastatina.
A maior conversão das formas lactonas de lovastatina e sinvastatina observada para as
suas formas hidroxiácidas, no presente trabalho, após hidrólise neutra da lovastatrina e
sinvastatina em comparação com a hidrólise básica das mesmas, está em contradição ao
estudo relatado por Yang e Hwang (2006). Esse fato pode ser explicado pelas condições de
degradação utilizadas. Yang e Hwang (2006) realizaram a hidrólise alcalina em solução de
NaOH 0,1 M preparada com 25% ou 50% de ACN, a 45 ºC por apenas 1 h e a hidrólise
neutra foi realizada em água com 70% de ACN, à temperatura ambiente por até 48 h ou em
água a 100 ºC por até 2 h. Tais condições são menos drásticas do que as utilizadas no
presente trabalho (NaOH 1 M para hidrólise alcalina e água para hidrólise neutra, ambos os
meios com 17% de ACN e a 100 ºC por 4 h). Assim, as formas hidroxiácidas formadas
durante as drásticas condições de hidrólise alcalina podem ter sido degradadas
posteriormente, justificando os menores valores de áreas. Já as condições mais brandas de
hidrólise neutra levaram à conversão das formas lactonas para as formas ácidas, porém
sem degradação posterior das mesmas.
Os picos principais presentes nas Figuras 13 e 14 (hidrólise básica) com tempos de
retenção próximos a 1,56minutos apresentam espectros idênticos aos das duas estatinas,
53
sendo também produtos de degradação das mesmas. No cromatograma obtido após
hidrólise ácida da lovastatina (Figura 11) há um pico referente à um possível produto de
degradação não identificado (tr 6,623minutos) menos polar que a lovastatina e com espectro
diferente da mesma.
4.3.2.1.2 Calor seco, exposição à radiação UV e oxidação
Os cromatogramas apresentados nas Figuras 17 a 22 foram obtidos após as seguintes
condições: calor seco, exposição à radiação UV ou oxidação da lovastatina e da
sinvastatina.
Figura 17
- Cromatograma obtido após aquecimento de lovastatina (pico principal, tr 5,183 min, R
3,29). Condições: calor seco a 105 ºC, por 4 h.
Figura 18
- Cromatograma obtido após aquecimento de sinvastatina (pico principal, tr 6,544 min, R
12,80). Condições: calor seco a 105 ºC, por 4 h.
54
Figura 19
- Cromatograma obtido após exposição à radiação UV de lovastatina (tr 5,158 min).
Condições: exposição à radiação UV, em λ 254 nm, por 4 h.
Figura 20
- Cromatograma obtido após exposição à radiação UV de sinvastatina (tr 6,546 min).
Condições: exposição à radiação UV, em λ 254, nm por 4 h.
Figura 21
- Cromatograma obtido após oxidação de lovastatina (tr 5,189 min). Condições: H
2
O
2
30%
V/V, em banho-maria a 100º C por 4 h. O pico em tr 1,350 min corresponde ao solvente (H
2
O
2
).
55
Figura 22
- Cromatograma obtido após oxidação de sinvastatina (tr 6,566 min). Condições: H
2
O
2
30% V/V, em banho-maria a 100º C por 4 h. O pico em tr 1,350 min corresponde ao solvente (H
2
O
2
).
Comparando-se as condições de degradação, calor seco, exposição à radiação UV e
oxidação (Figuras 17 a 22) a maior degradação ocorreu no meio oxidativo. Entretanto, não
foi observado nenhum pico de degradação. Isso pode ser explicado pela formação de
produto de baixo peso molecular que não apresenta cromóforo em sua estrutura. As duas
estatinas apresentaram menor sensibilidade à exposição ao calor seco e à luz (Figuras 17 a
20) em comparação aos meios hidrolíticos ácido, básico e neutro (Figuras 11 a 16).
A resolução entre os picos de possíveis interferentes e os picos de interesse (lovastatina ou
sinvastatina) foi adequada (R ≥ 2) (SNYDER et al., 1997) e a pureza dos fármacos
comprovada com auxílio de detector UV/DAD.
4.3.2.2 Seletividade
A seletividade de um método pode ser investigada pela resposta do analito na presença de
possíveis interferentes como produtos de degradação, impurezas de síntese, intermediários
e excipientes (RIBANI et al., 2004; GREEN, 1996). Um método analítico que seja capaz de
separar o fármaco frente a seus produtos de degradação é de grande importância para
monitorar a qualidade de um medicamento (ÁLVAREZ-LUEJE et al., 2005).
Os cromatogramas obtidos após a análise das soluções degradadas de lovastatina e de
sinvastatina não apresentaram picos de substâncias interferentes nos tempos de retenção
56
das mesmas, nas condições empregadas, conforme ilustrado nas Figuras 11 a 22 no item
4.3.2.1.
Os cromatogramas dos placebos A. B, C e D (Figura 23) também não apresentaram picos
no mesmo tempo de retenção da pravastatina sódica (tr 2,3minutos).
Figura 23
- Cromatogramas de soluções de placebos A, B C e D (concentração equivalente a 40
µg/mL do fármaco, em ACN).
4.3.2.3 Linearidade
A linearidade é a capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à
concentração do analito dentro de uma faixa especificada (BRASIL, 2003, RIBANI et al.,
2004).
Para a determinação da linearidade do método para lovastatina, pravastatina sódica e para
sinvastatina foram preparadas, separadamente, soluções correspondentes a 70%, 85%,
100%, 115% e 130% da concentração de trabalho (40 µg/mL). Os resultados do teste de
linearidade para lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina estão apresentados nas
Tabelas 4, 5 e 6, respectivamente.
D
A
B
C
57
Tabela 4 - Resultados da avaliação da linearidade do método para determinação de
lovastatina por CLAE, em triplicata.
Faixa
porcentual
analítica (%)
n
Lovastatina (X)
(µg/ml)
Área do pico
(Y)
Fator de resposta
(Y/X)
1 615,53 21,87
2 628,95 22,26
70
3
28,0
619,70 22,00
1 749,94 21,93
2 761,05 22,18
85
3
34,0
755,84 22,10
1 893,92 22,22
2 891,42 22,09
100
3
40,0
886,26 22,02
1 1028,23 22,23
2 1025,43 22,09
115
3
46,0
1022,97 22,10
1 1158,97 22,16
2 1163,50 22,17
130
3
52,0
1158,80 22,15
Média 22,10
DPR (%) 0,50
58
Tabela 5 - Resultados da avaliação da linearidade do método para determinação de
pravastatina sódica por CLAE, em triplicata.
Faixa
porcentual
analítica (%)
Replicata
Pravastatina sódica
(X) (µg/ml)
Área do pico
(Y)
Fator de resposta
(Y/X)
1 817,89 28,32
2 817,89 28,26
70
3
28,0
809,08 27,95
1 1002,90 28,60
2 979,82 27,88
85
3
34,0
994,54 28,29
1 1175,47 28,49
2 1147,67 27,76
100
3
40,0
1159,97 28,05
1 1340,90 28,26
2 1331,53 28,01
115
3
46,0
1335,13 28,07
1 1525,23 28,44
2 52,0 1495,93 27,84
130
3 1512,23 28,12
Média 28,15
DPR (%) 0,88
59
Tabela 6 - Resultados da avaliação da linearidade do método para determinação de
sinvastatina por CLAE, em triplicata.
Faixa
porcentual
analítica (%)
Replicata
Sinvastatina (X)
(µg/ml)
Área do pico (Y)
Fator de
resposta (Y/X)
1 602,60 21,52
2 597,76 21,35
70
3
28,0
594,41 21,23
1 737,10 21,68
2 728,30 21,42
85
3
34,0
722,17 21,24
1 865,31 21,63
2 868,13 21,70
100
3
40,0
852,24 21,30
1 996,73 21,67
2 985,29 21,42
115
3
46,0
980,03 21,30
1 1127,16 21,68
2 1115,18 21,44
130
3
52,0
1108,66 21,32
Média 21,46
DPR (%) 0,77
As curvas analíticas para lovastatina, pravastatina sódica ou para sinvastatina construídas
com os resultados das Tabelas 4, 5 e 6, respectivamente, estão representadas na Figura 24.
60
y = 6,0535 + 28,001x
r = 0,9992
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
25 30 35 40 45 50 55
Concentração de pravastatina sódica (µ
µµ
µg/mL)
Área do pico
Figura 24
- Curvas analíticas médias obtidas (28 a 52 µg/mL, ACN, λ 238 nm) para a determinação
de (a) lovastatina (b) pravastatina sódica e (c) sinvastatina por CLAE.
y = -7,9791 + 22,315x
r = 0,9998
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
25 30 35 40 45 50 55
Concentração de lovastatina (
µ
µµ
µ
gmL)
Área do pico
y = - 5,0218 + 21,594x
r = 0,9994
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
25 30 35 40 45 50 55
Concentração de sinvastatina (
µ
g/mL)
Área do pico
(a)
(b)
(c)
61
O método dos mínimos quadrados foi utilizado para cálculo da regressão linear. As
equações das retas e os valores de DPR obtidos foram y = -7,9791 + 22,315x e 0,4% para
lovastatina, y = 6,0535 + 28,001x e 0,9% para pravastatina sódica e y = -5,0218 + 21,594x e
0,8% para sinvastatina. Os coeficientes de correlação de Pearson (r) obtidos foram
satisfatórios (r > 0,999) (BRASIL, 2003). A linearidade do método foi confirmada para os três
fármacos, pois os valores de coeficiente de correlação foram superiores a 0,99. Os
interceptos não foram diferentes de zero no nível de significância de 5%.
Plotando-se concentração versus fator de resposta ao quadrado (FR
2
) de cada estatina
obtém-se uma linha reta por toda faixa de concentração. A análise de regressão linear desta
curva revela que não há correlação significativa entre concentração e FR
2
no nível de
significância de 5%, indicando, assim, que há uma resposta linear para toda faixa de
concentração de lovastatina, pravastatina sódica e de sinvastatina. Os valores de DPR dos
fatores de resposta das três estatinas foram menores que 1%, indicando homogeneidade
entre a relação dos valores de área dos picos de cada estatina e seus respectivos valores
de concentração (GREEN, 1996).
Os resíduos seguem à distribuição normal no nível de significância de 5%, de acordo com a
análise estatística realizada, por meio do teste de normalidade de Ryan-Joiner, para os
resultados obtidos de cada estatina,.
Na Tabela 7 estão listados os parâmetros obtidos para regressão linear para quantificação
de cada fármaco.
Tabela 7 - Resultados obtidos para análise da regressão linear para determinação de
lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina por CLAE.
Parâmetros Lovastatina
Pravastatina
sódica
Sinvastatina
Intercepto (a) -7,9791 6,0535 -5,0218
Coeficiente angular (b) 22,315 28,001 21,594
Coeficiente de correlação (r) 0,9998 0,9992 0,9994
Coeficiente de determinação (r
2
) 0,9997 0,9984 0,9987
Erro padrão da regressão 3,5388 10,6742 7,0853
Valor p - intercepto
0,0931
a
0,6560
a
0,5786
a
Valor p - inclinação
2,66.10
-24
b
1,69.10
-19
b
3,67.10
-20
b
a
não significativo para α = 0,05.
b
significativo para α = 0,05.
62
4.3.2.4 Precisão intra-ensaio e inter-ensaio
A precisão é a dispersão dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma
amostragem múltipla de uma mesma amostra (BRASIL, 2003). A precisão foi avaliada em
dois níveis: precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio.
Para avaliar a precisão intra-ensaio e inter-ensaio do método foram preparadas soluções de
baixa, média e alta concentração correspondendo a 70%, 100% e 130% da concentração de
trabalho (40 µg/mL) de cada estatina. Este procedimento foi realizado em dois dias
consecutivos. Os valores de DPR para precisão intra e inter-dia estão apresentados nas
Tabelas 8, 9 e 10 para lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina, respectivamente. O
intervalo de confiança da média a 95% foi calculado por meio do erro padrão da média (EP)
e da estatística t Student. O valor de t Student tabelado (t
α/2;2 G.L
) é 4,30 no nível de
significância de 5% (α = 0,05) e n-1 graus de liberdade (G.L).
Tabela 8 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de
lovastatina por CLAE, em triplicata.
Precisão DPR (%)
Lovastatina
(µg/mL)
Dia
Área do
pico
Intervalo de confiança
a 95%
(Média ± t
(α/2;G.L)
x EP*)
Intra-ensaio Inter-ensaio
615,53
628,95
1
619,70
621,40 ± 17,06 1,10
620,85
629,64
28,0
2
623,98
624,824 ± 11,07 0,71
0,88
893,92
891,42
1
886,26
890,53 ± 9,71 0,44
901,11
893,91
40,0
2
893,50
896,17 ± 10,64 0,48
0,54
1158,97
1163,50
1
1158,80
1160,42 ± 6,62 0,23
1162,00
1161,93
52,0
2
1163,30
1162,41 ± 1,91 0,07
0,18
*erro padrão da média.
63
Tabela 9 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de
pravastatina sódica por CLAE, em triplicata.
Precisão DPR (%)
Pravastatina
sódica
(µg/mL)
Dia
Área do
pico
Intervalo de confiança
a 95%
(Média ± t
(α/2;G.L)
x EP*)
Intra-ensaio Inter-ensaio
792,89
781,26
1
782,47
785,54 ± 15,89 0,81
794,58
784,51
28,0
2
781,94
787,01 ± 16,59 0,85
0,75
1139,55
1110,45
1
1121,81
1123,94 ± 36,43 1,30
1147,43
1112,77
40,0
2
1123,00
1127,74 ± 44,24 1,58
1,31
1478,63
1447,42
1
1462,49
1462,85 ± 38,76 1,07
1487,44
1451,65
52,0
2
1458,85
1465,98 ± 47,02 1,29
1,06
*erro padrão da média.
64
Tabela 10 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de
sinvastatina por CLAE, em triplicata.
Precisão DPR (%)
Sinvastatina
(µg/mL)
Dia
Área do
pico
Intervalo de confiança
a 95%
(Média ± t
(α/2;G.L)
x EP*)
Intra-ensaio Inter-ensaio
602,60
597,76
1
594,41
598,26 ± 10,24 0,69
601,96
591,16
28,0
2
586,34
593,16 ± 19,87 1,35
1,06
865,31
868,13
1
852,24
861,89 ± 21,07 0,98
865,18
844,02
40,0
2
843,07
850,76 ± 31,04 1,47
1,32
1127,16
1115,18
1
1108,66
1117,00 ± 23,30
0,84
1118,20
1102,34
52,0
2
1096,84
1105,80 ± 27,55 1,00
0,99
*erro padrão da média.
Os valores de DPR encontrados para a precisão intra-dia e inter-dia para quantificação de
lovastatina, pravastatina sódica e de sinvastatina são satisfatórios e estão de acordo com o
especificado pela ANVISA (nenhum valor acima de 2%) (BRASIL, 2003).
4.3.2.5 Exatidão
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em
estudo em relação a um valor referência aceito como verdadeiro (BRASIL, 2003, RIBANI et
al., 2004).
65
Para avaliar a exatidão do método foram adicionadas quantidades conhecidas de cada
estatina em placebo. As concentrações finais avaliadas correspondem a 70%, 100% e 130%
da concentração de trabalho (40 µg/mL). A porcentagem de recuperação foi calculada por
meio da razão entre a concentração média experimental e a concentração teórica. As
Tabelas 11, 12, e 13 apresentam os resultados obtidos para exatidão do método aplicado ao
doseamento de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina, respectivamente.
Tabela 11 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de lovastatina
adicionada ao placebo, por CLAE, em triplicata.
Faixa de
concentração
Amostra
Concentração
adicionada de
lovastatina
(µg/ml)
Concentração
observada de
lovastatina
(µg/ml)
*
Recuperação
(%)
Média
(%)
1
28,04 28,65
102,19
2
28,14 28,37
100,82
70%
3
28,10 28,59
101,76
101,59
1
40,06 40,40
100,85
2
40,20 40,66
101,15
100%
3
40,14 40,79
101,63
101,21
1
52,08 52,57
100,94
2
52,26 52,75
100,95
130%
3
52,18 53,59
102,69
101,53
Média 101,44
DPR (%) 0,66
*
concentração corrigida de acordo com o padrão utilizado.
66
Tabela 12 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de pravastatina
sódica adicionada ao placebo, por CLAE, em triplicata.
Faixa de
concentração
Amostra
Concentração
adicionada de
pravastatina
(µg/ml)
Concentração
observada de
pravastatina
(µg/ml)
*
Recuperação
(%)
Média
(%)
1
28,21 28,071 99,50
2
28,23 28,094 99,53
70%
3
28,30 28,689 101,39
100,14
1
40,30 40,170 99,67
2
40,32 40,371 100,12
100%
3
40,42 40,723 100,74
100,18
1
52,39 52,119 99,47
2
52,42 52,335 99,84
130%
3
52,55 52,603 100,10
99,80
Média 100,04
DPR (%) 0,65
*
concentração corrigida de acordo com o padrão utilizado.
67
Tabela 13 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de sinvastatina
adicionada ao placebo, por CLAE, em triplicata.
Concentração
de trabalho
n
Concentração
adicionada de
sinvastatina
(µg/ml)
Concentração
observada de
sinvastatina
(µg/ml)
*
Recuperação
(%)
Média
(%)
1
27,94 27,59 98,76
2
27,81 27,84 100,10
70%
3
27,80 27,91 100,41
99,75
1
39,91 39,23 98,29
2
39,73 39,69 99,91
100%
3
39,71 39,91 100,50
99,57
1
51,88 51,46 99,20
2
51,65 51,98 100,64
130%
3
51,62 52,17 101,06
100,30
Média
99,87
DPR (%)
0,93
*
Concentração corrigida de acordo com o padrão utilizado.
As médias das porcentagens de recuperação encontradas para lovastatina (101,44%), para
pravastatina sódica (100,04%) e para sinvastatina (99,87%) estão dentro da faixa
especificada de 98,0% a 102,0% (BRASIL, 2003; GREEN, 1996).
4.3.2.6 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)
Os valores teóricos de LD e LQ estimados pelas equações dadas no item 4.2.2.6 foram 0,59
µg/mL e 1,97 µg/mL para lovastatina; 1,42 µg/mL e 4,74 µg/mL para pravastatina sódica e
1,22 µg/mL e 4,08 µg/mL para sinvastatina.
4.3.2.7 Robustez
A capacidade do método de resistir a pequenas alterações nos parâmetros analíticos que,
eventualmente, possam ocorrer na rotina foi verificada alterando-se a proporção de fase
68
móvel (±2% modificador orgânico), o fluxo da fase móvel (±0,1 unidade), a temperatura do
forno (±5 ºC) e verificando-se a influência dessas alterações nos resultados de teores
obtidos de 6 soluções a 100% da concentração de trabalho. Para a pravastatina sódica não
foi testada a temperatura 35 ºC (+5 ºC), pois nessa temperatura a mesma não é retida na
coluna. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 14, 15 e 16 para lovastatina,
pravastatina sódica e sinvastatina, respectivamente.
Tabela 14 - Resultados obtidos para robustez do método aplicado à determinação de
lovastatina, a 100% da concentração de trabalho (40 µg/mL), por CLAE.
Lovastatina (40 µg/mL)
Condiçao
Amostra
Nominal*
63%
ACN
67%
ACN
1,4 mL/min 1,6 mL/min 25 ºC 35 ºC
1 40,77 40,78 40,80 40,80 41,04 40,75
40,86
2 40,32 40,29 40,76 40,25 40,54 40,36
40,56
3 40,80 40,65 40,57 40,75 40,98 40,75
40,80
4 39,94 39,96 39,72 39,95 41,17 39,74
40,02
5 39,89 39,94 39,67 40,06 41,26 39,70
39,95
6 39,85 39,75 39,74 39,82 41,07 40,40
39,99
Média 40,26 40,23 40,24 40,27 41,01 40,28
40,36
*Fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min, 30 ºC.
Tabela 15 - Resultados obtidos para robustez do método aplicado à determinação de
pravastatina sódica, a 100% da concentração de trabalho (40 µg/mL), por CLAE.
Pravastatina sódica (40 µg/mL)
Condiçao
Amostra
Nominal 63% ACN 67% ACN 0,9 mL/min 1,1 mL/min 25 ºC
1 38,77 38,98 39,00 43,15 35,40 39,13
2 36,94 37,04 37,12 40,99 33,64 37,17
3 36,91 37,03 37,10 41,06 33,64 37,21
4 36,56 36,78 36,80 40,06 33,35 37,01
5 37,90 38,01 38,02 42,15 34,51 38,24
6 38,64 38,87 38,83 42,96 35,23 39,11
Média 37,62 37,79 37,81 41,73 34,30 37,98
*Fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,0 mL/min, 30 ºC.
69
Tabela 16 - Resultados obtidos para robustez do método aplicado à determinação de
sinvastatina, a 100% da concentração de trabalho (40 µg/mL), por CLAE.
Sinvastatina (40 µg/mL)
Condiçao
Amostra
Nominal
63%
ACN
67%
ACN
1,4
mL/min
1,6
mL/min
25 ºC 35 ºC
1 37,85 37,99 37,80 37,84 37,88 37,89 37,93
2
38,49 38,49 38,76 38,52 38,53 38,54 38,69
3
38,36 39,06 38,57 38,54 38,67 38,71 38,80
4
38,70 39,39 38,72 38,84 38,84 38,83 38,92
5
38,75 39,13 38,97 38,71 38,74 38,73 38,88
6
38,32 38,63 38,44 38,40 38,37 38,36 38,46
Média
38,41 38,78 38,54 38,47 38,50 38,51 38,61
*Fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min, 30 ºC, detecção UV em λ 238 nm.
A comparação das médias obtidas utilizando o teste de Tukey após a análise de variância
(ANOVA) não mostrou diferença estatisticamente significativa entre as médias obtidas de
teores de lovastatina e de sinvastatina, nas condições testadas. Entretanto, para a
pravastatina sódica houve diferença estatisticamente significativa entre a média obtida com
a condição nominal e as médias obtidas com o fluxo alterado para 0,9 mL/min e para 1,1
mL/min. Isto indica que o fluxo da fase móvel é crítico para o doseamento dessa estatina
empregando o método proposto, já que o fármaco é um sal, possui alta polaridade e é
rapidamente eluído.
O método proposto por eluição isocrática apresenta as vantagens de menor consumo de
reagentes, reduzido tempo de análise, boa resolução e única variação de fluxo possível para
pravastatina sódica na mesma faixa de concentração, mesmo λ, solvente e eluente, frente
àquele descrito para sinvastatina matéria-prima na USP31, que difere pela coluna de
octadecilsilano (C
18
), eluição gradiente por meio de soluções A (ACN: H
3
PO
4
0,1% na
proporção 50:50) e B (H
3
PO
4
0,1%) a 3,0 mL/min (THE UNITED, 2008). O método também
demonstrou que pode ser utilizado para avaliar a estabilidade para sinvastatina e
lovastatina, pois não há interferências dos produtos de degradação, quando submetidas a
condições de degradação forçada (oxidação, hidrólise ácida, básica e neutra, exposição à
radiação UV e calor seco).
70
4.3.3 Desenvolvimento e validação de método analítico por espectrofotometria
derivada na região do UV para quantificação de lovastatina, pravastatina
sódica e sinvastatina
Os espectros de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina, na região do UV, foram
traçados em zero ordem e sobrepostos com os placebos. Entretanto, devido à semelhança
entre os espectros apresenta-se somente o espectro da sinvastatina (Figura 25).
Figura 25
- Espectros na região do UV em zero ordem de sinvastatina 10 µg/mL e placebos C e D
na concentração equivalente a 10 µg/mL de sinvastatina, em metanol.
A constituição dos placebos C e D difere apenas pela presença de PEG6000 e PVP,
respectivamente. A banda de absorção do PVP, presente no placebo D, se estende,
sobrepondo-se os máximos de absorção das estatinas. As porcentagens de interferência
espectral na região UV, zero ordem λ 238 nm, dos placebos C e D sobre solução de
sinvastatina a 50% da concentração de trabalho (4 µg/mL, em metanol) foi 1,15% e 1,16%,
respectivamente. Em relação à sinvastatina a 125% da concentração de trabalho (10 µg/mL,
em metanol) essa interferência foi 1,34% devido ao placebo C e 3,18% devido ao placebo D.
A Figura 26 apresenta o espectro, em segunda ordem, de uma solução de sinvastatina, a
100% da concentração de trabalho (8 µg/mL, em metanol), sobreposto com os espectros,
também em segunda ordem, de soluções dos placebos C e D (concentração
correspondente a 8 µg/mL de sinvastatina, em metanol). O espectro em segunda derivada
da sinvastatina, na faixa λ 200 nm a 400 nm, é caracterizado por três picos e três vales,
cada qual com sua respectiva absorção. Em λ 255 nm há um pico satélite, em que não é
adequado para medidas. Idealmente, deve-se buscar um comprimento de onda com
71
absorção máxima e maior amplitude, no qual não existam interferências. Portanto, a menor
interferência e a maior sensibilidade para a detecção da sinvastatina foram verificadas nos
espectros obtidos em segunda derivada e no comprimento de onda de máxima absorção
situado em λ 247 nm, pelo método zero pico (ZP) (Figura 26). A mesma conclusão é válida
para lovastatina e pravastatina sódica por apresentarem espectros idênticos ao da
sinvastatina.
Figura 26 -
Espectro de absorção da sinvastatina e placebo (linha de base), em segunda derivada
(8 µg/mL, metanol).
Na literatura, há dois métodos descritos para quantificação de sinvastatina em comprimidos
por EDU em segunda ordem de derivada e método de quantificação ZP, entretanto os
comprimentos de onda selecionados diferem entre os estudos. Wang e Asgharnejad (2000)
selecionaram λ 243 nm e Gomes e colaboradores (2009) selecionaram λ 255 nm. Nos
máximos λ 243 nm e 255 nm, segunda derivada, detectou-se, experimentalmente,
interferência de até 2,29% e até 2,90%, respectivamente. O λ 255 nm tem a desvantagem
adicional de ser um pico satélite podendo levar a resultados com baixa precisão e, portanto,
baixa repetitividade.
4.3.3.1 Seletividade
Em λ 247 nm, a interferência dos placebos C e D nas leituras de absorvância das três
estatinas estudadas em baixa e média concentração é de apenas 0,15% em 50% da
concentração de trabalho (4 µg/mL, metanol) e, de até 0,53% em 100% da concentração de
trabalho (8 µg/mL, metanol).
72
4.3.3.2 Linearidade
A avaliação da linearidade do método de quantificação de estatinas por EDU foi realizada
utilizando-se soluções de lovastatina e sinvastatina que correspondem a 50 a 150% da
concentração de trabalho (8,0 µg/mL, em metanol) e soluções de pravastatina sódica que
correspondem a 60 a 140% da concentração de trabalho (10 µg/mL, em metanol). Os
resultados da avaliação da linearidade por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, para
lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina estão apresentados nas Tabelas 17, 18 e 19,
respectivamente.
Tabela 17 - Resultados da avaliação da linearidade do método para a determinação de
lovastatina por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, em triplicata.
Faixa analítica
(%)
Lovastatina
(µg/mL) (X)
Replicata
A/nm
2
λ 247 nm
(Y)
Fator de
resposta
(Y/X)
0,0179 0,00446
4,0
0,0180 0,00449
50
1
2
3
0,0180 0,00449
0,0271 0,00451
6,0
0,0270 0,00448
75
1
2
3
0,0269 0,00448
0,0366 0,00456
8,0
0,0367 0,00457
100
1
2
3
0,0367 0,00458
0,0457 0,00455
10,0
0,0456 0,00455
125
1
2
3
0,0457 0,00456
0,0553 0,00459
12,0
0,0552 0,00459
150
1
2
3
0,0549 0,00456
Média 0,00453
DPR (%) 0,99
73
Tabela 18 - Resultados da avaliação da linearidade do método para a determinação de
pravastatina sódica por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, em triplicata.
Faixa
analítica (%)
Pravastatina
sódica (µg/mL)
(X)
Replicata
A/nm
2
λ 247 nm (Y)
Fator de
resposta (Y/X)
0,0123 0,00205
6,0
0,0123 0,00205
60
1
2
3
0,0121 0,00202
0,0164 0,00205
8,0
0,0163 0,00204
80
1
2
3
0,0164 0,00205
0,0204 0,00204
10,0
0,0204 0,00204
100
1
2
3
0,0204 0,00204
0,0245 0,00204
12,0
0,0245 0,00204
120
1
2
3
0,0246 0,00205
1
0,0287 0,00205
14,0 2
0,0288 0,00206
140
3
0,0284 0,00203
Média 0,00204
DPR (%) 0,48
74
Tabela 19 - Resultados da avaliação da linearidade do método para a determinação de
sinvastatina por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol , em triplicata.
Faixa
analítica (%)
Sinvastatina
(µg/mL) (X)
Replicata
A/nm
2
λ 247 nm (Y)
Fator de
resposta (Y/X)
1
0,0181
0,00454
4,0 2
0,0175
0,00440
50
3
0,0176
0,00442
1
0,0269
0,00450
6,0 2
0,0271
0,00453
75
3
0,0271
0,00452
1
0,0360
0,00451
8,0 2
0,0359
0,00451
100
3
0,0360
0,00451
1
0,0448
0,00449
10,0 2
0,0449
0,00450
125
3
0,0443
0,00445
1
0,0542
0,00453
12,0 2
0,0542
0,00453
150
3
0,0536
0,00448
Média
0,00450
DPR (%) 0,94
As curvas analíticas para lovastatina, pravastatina sódica ou para sinvastatina construídas
com os resultados das Tabelas 17, 18 ou 19, respectivamente, estão representadas na
Figura 27.
75
y = 0,0046x - 0,0007
r = 0,9999
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
0,045
0,050
0,055
0,060
2 4 6 8 10 12 14
Lovastatina (
µ
µµ
µ
g/mL)
2
a
derivada 247 nm
(a)
y = 0,0045x - 0,0002
r = 0,9998
0,01
0,02
0,02
0,03
0,03
0,04
0,04
0,05
0,05
0,06
0,06
2 4 6 8 10 12 14
Sinvastatina (
µ
µµ
µ
g/mL)
2a derivada 247 nm
y = 0,002x - 3E-05
r = 0,9998
0,010
0,012
0,014
0,016
0,018
0,020
0,022
0,024
0,026
0,028
0,030
4 6 8 10 12 14
Pravastatina sódica (
µ
µµ
µ
g/mL)
2
a
Derivada 247 nm
Figura 27
- Curvas analíticas médias obtidas para a determinação de (a) lovastatina, (c) sinvastatina
(ambas 4 a 12 µg/mL, metanol) e de (b) pravastatina sódica (6 a 14 µg/mL, metanol) por EDU,
segunda derivada, λ 247.
As equações das retas e os valores de DPR obtidos foram y = -0,00071 + 0,004636x; 0,47%
para lovastatina, y = -3,0.10
-5
+ 0,002x; 0.52% para pravastatina sódica e y = -0,00016 +
(c)
(b)
76
0,004519x; 0.73% para sinvastatina. Todos os coeficientes de correlação de Pearson (r)
obtidos foram satisfatórios (r > 0,999) (BRASIL, 2003). A linearidade do método foi
confirmada para os três fármacos, pois, os valores de coeficiente de correlação foram
superiores a 0,99 e os valores p da inclinação foram significativos. Os interceptos obtidos
para sinvastatina e para pravastatina sódica não foram estatisticamente diferentes de zero
no nível de significância de 5%. Para lovastatina o intercepto foi diferente de zero, entretanto
não foi superior a 2% da resposta obtida a 100% da concentração de trabalho, conforme
recomendado por Green (1996).
Os valores de DPR dos fatores de resposta para as três estatinas foram menores que 1%,
indicando homogeneidade entre a relação dos valores de área dos picos de cada estatina e
seus respectivos valores de concentração (GREEN, 1996).
Os resíduos seguem a distribuição normal no nível de significância de 5%, de acordo com a
análise estatística realizada, por meio do teste de normalidade de Ryan-Joiner, para os
resultados obtidos de cada estatina.
A Tabela 20 lista os parâmetros obtidos para regressão linear para quantificação de cada
fármaco.
Tabela 20 - Resultados obtidos para análise da regressão linear para a determinação de
lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol.
Parâmetros Lovastatina
Pravastatina
sódica
Sinvastatina
Intercepto (a) -0,71.10
-3
-3,0.10
-5
-0,16.10
-3
Coeficiente angular (b) 0,0046 0,0020 0,0045
Coeficiente de correlação (r) 0,9999 0,9998 0,9998
Coeficiente de determinação (r
2
)
0,9998 0,9997 0,9996
Erro padrão da regressão 0,17.10
-3
0,11.10
-3
0,26.10
-3
Valor p - intercepto
0,14.10
-3
b
0,77
a
0,45
a
Valor p - inclinação
2,68.10
-26
b
2,33.10
-24
b
1,04.10
-23
b
a
não significativo para α = 0,05.
b
significativo para α = 0,05.
77
4.3.3.3 Precisão intra-ensaio e inter-ensaio
Avaliou-se a precisão preparando-se soluções de baixa, média e alta concentração
correspondentes a 60%, 100% e 150% da concentração de trabalho (8 µg/mL) de
lovastatina e sinvastatina e, correspondentes a 60%, 100% e 140% da concentração de
trabalho de pravastatina sódica (10 µg/mL). Esse procedimento foi realizado em três dias
consecutivos por analistas diferentes. Os valores de DPR para precisão intra e inter-ensaio
estão apresentados nas Tabelas 21, 22 e 23 para lovastatina, pravastatina sódica e
sinvastatina, respectivamente. O intervalo de confiança da média a 95% foi calculado
conforme descrito no item 4.3.2.4.
Tabela 21 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de
lovastatina por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, avaliada em triplicata e por
analistas diferentes.
Precisão DPR (%)
Lovastatina
(µg/mL)
Dia
A/nm
2
λ 247 nm
Intervalo de confiança a
95%
(média ± t
(α/2;G.L)
x EP*)
Intra-ensaio Inter-ensaio
0,0178
0,0180
1
0,0180
1,79.10
-2
± 1,88.10
-4
0,42
0,0186
0,0187
2
0,0187
1,87.10
-2
± 8,75.10
-5
0,19
0,0184
0,0183
4,0
3
0,0182
1,83.10
-2
± 2,78.10
-4
0,60
1,81
0,0364
0,0365
1
0,0364
3,64.10
-2
± 1,62.10
-4
0,18
0,0381
0,0380
2
0,0382
3,81.10
-2
± 2,85.10
-4
0,30
0,0370
0,0370
8,0
3
0,0371
3,70.10
-2
± 1,13.10
-4
0,12
1,94
0,0551
0,0551
1
0,0547
1,79.10
-2
± 5,16.10
-4
0,38
0,0576
0,0572
2
0,0574
1,87.10
-2
± 5,14.10
-4
0,36
0,0560
0,0559
12,0
3
0,0557
1,83.10
-2
± 3,95.10
-4
0,28
1,93
*erro padrão da média.
78
Tabela 22 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de
pravastatina sódica por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, avaliada em triplicata e
por analistas diferentes.
Precisão DPR (%)
Pravastatina
sódica
(µg/mL)
Dia
A/nm
2
λ 247 nm
Intervalo de confiança a
95%
(média ± t
(α/2;G.L)
x EP*)
Intra-ensaio Inter-ensaio
0,0123
0,0123
1
0,0121
1,22.10
-2
± 2,58.10
-4
0,85
0,0122
0,0122
2
0,0121
1,22.10
-2
± 1,04.10
-4
0,34
0,0120
0,0119
6,0
3
0,0118
1,19.10
-02
± 1,96.10
-4
0,66
1,41
0,0204
0,0204
1
0,0204
2,04.10
-2
± 6,70.10
-5
0,13
0,0204
0,0205
2
0,0203
2,04.10
-2
± 3,36.10
-4
0,66
0,0197
0,0197
10,0
3
0,0197
1,97.10
-2
± 3,88.10
-5
0,08
1,79
0,0287
0,0288
1
0,0284
2,86.10
-2
± 5,74.10
-4
0,81
0,0286
0,0286
2
0,0287
2,86.10
-2
± 1,70.10
-4
0,24
0,0276
0,0275
14,0
3
0,0275
2,75.10
-2
± 1,67.10
-4
0,24
1,97
*erro padrão da média.
79
Tabela 23 - Resultados da precisão intra-ensaio e inter-ensaio para a determinação de
sinvastatina por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, avaliada em triplicata e por
analistas diferentes.
Precisão DPR (%)
Sinvastatina
(µg/mL)
Dia
A/nm
2
λ 247 nm
Intervalo de confiança a
95%
(média ± t
(α/2;G.L)
x EP*)
Intra-ensaio Inter-ensaio
0,0182
0,0176
1
0,0177
1,78.10
-2
± 7,78.10
-4
1,76
0,0174
0,0173
2
0,0174
1,74.10
-2
± 7,19.10
-5
0,17
0,0175
0,0174
6,0
3
0,0173
1,74.10
-2
± 1,90.10
-4
0,44
1,52
0,0361
0,0360
1
0,0361
3,61.10
-2
± 6,96.10
-5
0,08
0,0353
0,0351
2
0,0351
3,52.10
-2
± 3,60.10
-4
0,41
0,0344
0,0351
10,0
3
0,0347
3,47.10
-2
± 8,46.10
-4
0,98
1,75
0,0544
0,0543
1
0,0538
5,42.10
-2
± 7,99.10
-4
0,59
0,0530
0,0528
2
0,0529
5,29.10
-2
± 1,97.10
-4
0,15
0,0521
0,0527
14,0
3
0,0529
5,26.10
-2
± 9,85.10
-4
0,75
1,44
*erro padrão da média.
80
Os valores de DPR encontrados para a precisão intra e inter-ensaio para quantificação de
lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina são satisfatórios e estão abaixo do limite de
2%.
4.3.3.4 Exatidão
A exatidão do método foi avaliada adicionando-se quantidades conhecidas de cada estatina
ao placebo D. As concentrações finais avaliadas correspondem a 50%, 100% e150% da
concentração de trabalho para lovastatina e sinvastatina e, 60%, 100% e 140% para
pravastatina sódica. As Tabelas 24, 25 e 26 apresentam os resultados obtidos para
exatidão, expressos em porcentagem de recuperação, para lovastatina, pravastatina sódica
e sinvastatina, respectivamente.
Tabela 24 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de lovastatina
adicionada ao placebo por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, em triplicata.
Faixa de
concentração
Amostra
Concentração
adicionada de
lovastatina
(µg/ml)
Concentração
observada
lovastatina
(µg/ml)
*
Recuperação
(%)
Média
(%)
1
4,03 3,97 98,54
2
4,03 3,99 99,04
50%
3
4,03 4,02 99,79
99,12
1
8,06 8,07 100,20
2
8,06 8,14 101,04
100%
3
8,06 8,12 100,80
100,68
1
12,08 12,30 101,76
2
12,08 12,29 101,68
150%
3
12,08 12,27 101,51
101,65
Média
100,49
DPR (%) 1,16
*
Concentração corrigida de acordo com o padrão utilizado.
81
Tabela 25 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de pravastatina
adicionada ao placebo sódica por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, em triplicata.
Faixa de
concentração
porcentual
Amostra
Concentração
adicionada de
pravastatina
(µg/ml)
Concentração
observada
pravastatina
(µg/ml)
*
Recuperação
(%)
Média
(%)
1
6,03 5,90 97,85
2
6,03 5,92 98,10
60%
3
6,03 5,96 98,83
98,26
1
10,06 10,02 99,67
2
10,06 9,95 98,91
100%
3
10,06 9,84 97,91
98,83
1
14,08 13,89 98,64
2
14,08 14,10 100,14
140%
3
14,08 13,97 99,24
99,34
Média
98,81
DPR (%) 0,80
*
Concentração corrigida de acordo com o padrão utilizado.
82
Tabela 26 - Resultados da exatidão do método aplicado à determinação de sinvastatina
adicionada ao placebo por EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol, em triplicata.
Faixa de
concentração
Amostra
Concentração
adicionada de
sinvastatina
(µg/ml)
Concentração
observada
sinvastatina
(µg/ml)
*
Recuperação
(%)
Média
(%)
1
3,99 3,92 98,31
2
3,99 3,94 98,77
50%
3
3,99 3,94 98,59
98,56
1
7,98 7,83 98,11
2
7,98 7,88 98,77
100%
3
7,98 7,86 98,49
98,45
1
11,97 11,75 98,13
2
11,97 11,77 98,32
150%
3
11,97 11,90 99,40
98,62
Média
98,54
DPR (%) 0,41
*
Concentração corrigida de acordo com o padrão utilizado.
As médias de porcentagens de recuperação encontradas para lovastatina (100,49%), para
pravastatina sódica (98,81%) e para sinvastatina (98,54%) estão dentro da faixa
especificada de 98,0% a 102,0% (BRASIL, 2003; GREEN, 1996) e o método pode ser
considerado exato nas condições estudadas.
4.3.3.5 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)
Os valores teóricos de LD e LQ estimados utilizando-se os valores de desvio padrão da
resposta e de inclinação da curva analítica foram menores para lovastatina, 0,086 µg/mL e
0,29 µg/mL e, maiores para pravastatina sódica, 0,15 µg/mL e 0,49 µg/mL, e 0,13 µg/mL e
0,45 µg/mL para sinvastatina.
83
4.3.3.6 Robustez
A robustez foi avaliada comparando-se os teores obtidos de seis amostras a 100% da
concentração de trabalho em dois equipamentos diferentes. Os resultados estão
apresentados na Tabela 27.
Tabela 27 - Resultados obtidos para avaliação de robustez do método aplicado ao
doseamento de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina por EDU, segunda ordem, λ
247 nm, metanol.
Lovastatina Pravastatina sódica Sinvastatina
Condiçao
Amostra
HP 8453
UV 1800 HP 8453 UV 1800 HP 8453 UV 1800
1
8,05 7,92 9,73 9,67 7,49 7,57
2
8,06 7,90 9,59 9,69 7,55 7,72
3
8,01 7,92 9,76 9,69 7,57 7,64
4
8,39 8,16 10,21 10,07 7,79 7,81
5
8,40 8,13 10,15 10,13 7,73 7,76
6
8,49 8,18 10,02 10,00 7,75 7,75
Média
8,234 8,035 9,91 9,88 7,65 7,71
A comparação das médias obtidas por meio do teste de Tukey após a análise de variância
(ANOVA) não mostrou diferença estatisticamente significativa entre as médias de teores
obtidas para lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina em dois equipamentos
diferentes.
4.3.4 Comparação entre os métodos desenvolvidos: EDU e CLAE
Os resultados de teores de amostras, a 100% da concentração de trabalho, preparadas a
partir de um mesmo pool de comprimidos de sinvastatina e analisadas pelos dois métodos
desenvolvidos estão representados na Tabela 28.
84
Tabela 28 - Resultados comparativos para o doseamento de sinvastatina em comprimidos
obtidos entre os métodos CLAE* e EDU, segunda ordem, λ 247 nm, metanol.
Massa de sinvastatina (mg)
Amostra CLAE EDU
1 10,80 10,90
2 10,36
11,01
3 10,81
11,24
4 10,50
11,22
5 11,27
11,12
Média 10,73
11,10
DPR (%) 3,26 1,31
*Fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min, 30 ºC, detecção UV em λ 238 nm.
O teste t realizado para comparação das médias de teor obtidos por meio dos métodos
CLAE e EDU (segunda ordem,
λ 247 nm, metanol) não mostrou diferença estatisticamente
significativa entre as médias de teor obtidas por meio de análise realizada com os dois
métodos propostos a 5% de significância. O teste de comparação dos métodos CLAE e
EDU para lovastatina e pravastatina sódica não foi realizado.
85
5 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DISPERSÕES SÓLIDAS E
DESENVOLVIMENTO DE COMPRIMIDOS DE SINVASTATINA
5.1 Material
5.1.1 Substâncias químicas e amostras
• Sinvastatina matéria-prima doada por Laboratório Globo Ltda. (São José da Lapa, MG),
lote 2113002/2007, teor 99,2% declarado pelo fabricante Biocon Limited (Bangalore, Índia) e
sinvastatina padrão de trabalho doado por Medley S/A Indústria Farmacêutica (Campinas,
SP), lote 0080/00348, teor 99,1%, fabricante Biocon Limited (Bangalore, Índia).
5.1.2 Material e reagentes
• Água destilada e água ultrapurificada (Milli-Q Millipore, Milford, MA, EUA);
• carboximetilcelulose (Purifarma, São Paulo, SP);
• coluna cromatográfica de fase reversa LiChrospher 100 RP-C
8
e de 250 mm de
comprimento e 4 mm de diâmetro, empacotada com sílica quimicamente ligada a grupo
octilsilano (C
8
) e tamanho de partícula 5 µm (Merck, Darmstadt, Alemanha);
• dieta hiperlipêmica: amido 27%, caseína 2%, colesterol 2%, colina 0,2%, mistura de
sais 5%, mistura de vitaminas 0,8%, sacarose 27% e óleo de milho 20%;
• dispositivos filtrantes de celulose 15 mm; 0,45 µm (Minisart, Goettingen, Alemanha);
• excipientes ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, EUA), ácido cítrico (Henrifarma - São
Paulo, SP), celulose microcristalina Microcel
®
MC102 (Blanver, Taboão da Serra, SP),
dióxido de silício coloidal Aerosil
®
(Emelffar, São Bernardo do Campo, SP), estearato de
magnésio (Ipiranga Química, Santos, SP), glicolato de amido sódico (Henrifarma, São
Paulo, SP), hidróxitolueno butil (BHT) (Indukern, Osasco, SP), lactose Tabletose 100
(Ipiranga Química, Santos, SP), lauril sulfato de sódio (Pharmacopéia, Attivos Magistrais -
Barueri, SP), polietilenoglicol 4000 e 6000 (Labsynth, Diadema, SP), polivinilpirrolidona K15
(Sigma-Aldrich, EUA) e talco (Proquímios, Bangu, RS);
• fitas reagentes para colesterol Acctrend (Roche
®
, São Paulo, SP).
• membrana de celulose com diâmetro de 47 mm, 0,45 µm (Sartorius, Goettingen,
Alemanha);
• solventes e reagentes graus analítico ou cromatográfico: acetonitrila (J. T. Baker,
Philipsburg, MT, EUA), ácido fosfórico (Merck, Darmstadt, Alemanha), fosfato de sódio
86
monobásico (F. Maia Indústria e Comércio, Cotia, SP) e metanol (Tedia Company, Fairfield,
Iowa, EUA);
• solução salina a 0,9%.
5.1.3 Equipamentos
• Aparelho de ultra-som MaxiClean 1400 (Unique
®
, Indaiatuba, SP);
• aparelho para determinação de colesterol Accutrend GCT (Roche
®
, São Paulo, SP);
• aparelho para determinação de densidade de pós Erweka SVM GWF;
• balança analítica BP210D com precisão de 0,01 mg (Sartorius, Goettingen, Alemanha);
• banho-maria 120/2 (Fanem
®
, São Paulo, SP);
• banho-maria B.M.A 12 com 12 tubos de nessler (Thelga, Belo Horizonte, MG)
• calorímetro Modulate DSC 2910 (TA Instruments, New Castle, DE, EUA);
• centrífuga Jouan B4i (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA);
• compressora rotativa com 10 punções (Riva Piccola,
Aldershot, Inglaterra);
• cromatógrafo a líquido de alta eficiência HP 1100 e equipado com desgaseificador,
bomba quaternária, forno, injetor automático e detector de arranjo de diodos (DAD) (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, EUA);
• desintegrador ZT3 (Erweka, Hamburg, Alemanha);
• difratômetro Geigerflex
(
Rigaku Corporation, Tokyo, Japan);
• dissolutor DT80 (Erweka, Hamburg, Alemanha);
• durômetro TBH 30 (Erweka, Hamburg, Alemanha);
• espectrofotômetro ultravioleta-visível (UV-Vis) HP8453 com programa interno de
diferenciação automático (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA);
• friabilômetro TA3R Boeckel e Co (Erweka, Hamburg, Alemanha);
• medidor de compressibilidade de pós GWF(Erweka, Hamburg, Alemanha);
• rotavapor Heating Bath B - 441 (Buchi Labortechnik, Flawil, Suíça).
87
5.2 Métodos
5.2.1 Desenvolvimento de dispersões sólidas de sinvastatina
As dispersões sólidas (DS) de sinvastatina foram preparadas com três carreadores
poliméricos: PEG4000, PEG6000 ou PVP, em diferentes proporções de sinvastatina e
polímero: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 e 1:5. Foram preparadas, também, misturas físicas (MF) nas
mesmas proporções, para fins de comparação.
As DS de sinvastatina com PVP foram preparadas pelo método de evaporação de solvente
que consistiu em solubilizar o PVP e a sinvastatina em quantidade suficiente de etanol, levar
a solução obtida ao rotavapor com banho a ± 58 ºC até total eliminação do solvente com
obtenção de um filme viscoso. A mistura obtida foi deixada em dessecador de sílica-gel até
completa eliminação de resíduos de etanol e obtenção de produto sólido. A DS foi, então,
pulverizada a pó fino, em gral de vidro.
As DS de sinvastatina com PEG4000 ou 6000 foram preparadas, em todas as proporções,
por meio do método de fusão que consistiu em fundir o polímero em banho-maria a 58 ± 2
ºC, incorporar a sinvastatina, gradualmente e sob constante agitação manual. Após a adição
de sinvastatina ao PEG previamente fundido, as DS foram resfriadas em banho de gelo e
pulverizadas a pó fino, em gral de vidro.
Adicionalmente, preparou-se uma DS de sinvastatina e PEG6000 na proporção de 1:5 pelo
método misto “fusão-evaporação”. Nesse caso, a sinvastatina foi dissolvida em etanol, em
seguida, acrescentou-se PEG6000 sólido e a mistura foi aquecida no rotavapor a 58 ºC.
Nessa temperatura ocorre a evaporação do solvente e fusão do carreador polimérico e
formação de uma mistura homogênea. Após remoção do solvente e formação de uma
mistura homogênea, o balão foi resfriado em congelador durante 10 minutos. A DS
resultante foi pulverizada em gral de vidro.
5.2.2 Caracterização das dispersões sólidas
As DS foram caracterizadas por calorimetria diferencial exploratória e por difração de raios X
de pó.
88
5.2.2.1 Difração de raios X de pó (DRXP)
Os padrões de difração de raios X (pó ou policristal) de sinvastatina, dos polímeros, das MF
e das DS, nas proporções 1:1, 1:3 e 1:5, foram coletados com intervalo angular 2θ entre 5º e
50º, passo de 0,05º e comprimento de onda 1,5418 Å (radiação CuK
α
).
5.2.2.2 Calorimetria diferencial exploratória (DSC)
A análise térmica da sinvastatina e suas DS e MF foi realizada por DSC com ajuste
modulado de temperatura a ± 1 ºC por 60 s. A calibração do equipamento foi realizada
utilizando-se safira. As amostras foram colocadas em cadinhos de alumínio e aquecidas a
uma temperatura constante (5 ºC/min) na faixa de 25 ºC a 250 ºC e utilizando nitrogênio
como gás de purga (50 mL/min).
5.2.3 Avaliação da solubilidade parcial de sinvastatina em DS
O teste de solubilidade foi realizado para avaliar o aumento de solubilidade da sinvastatina
presente nas DS em relação à sinvastatina apenas. Para esse fim, quantidades de DS e de
MF equivalentes a 4 mg de sinvastatina (correspondente a 5,3 vezes sua concentração de
saturação em água) foram, exatamente, pesadas e adicionadas a 25 mL de solução tampão
fosfato de sódio monobásico (NaH
2
PO
4
) pH 7,40 ± 0,20. Após agitação magnética por 1 h,
em banho-maria a 37 ºC, as soluções foram filtradas em unidades filtrantes de 0,45 µm e
analisadas por espectrofotometria de absorção na região UV, em λ 239 nm. O mesmo
procedimento foi realizado para sinvastatina. A concentração de saturação da sinvastatina,
após 1 h de teste e a quantidade de sinvastatina liberada a partir das DS e MF foram
comparadas (AMBIKE et al., 2005; PATEL e PATEL, 2008).
O teste foi realizado em triplicata para todas as amostras, utilizando solução tampão
NaH
2
PO
4
, pH 7,40 ± 0,20 para ajuste do zero.
5.2.3.1 Curva analítica para avaliação da solubilidade da sinvastatina em DS
Para avaliação do aumento da solubilidade de sinvastatina em DS em relação à sinvastatina
apenas, foi construída uma curva analítica pesando-se, exatamente, cerca de 10 mg de
sinvastatina padrão de trabalho e transferindo para balão volumétrico de 100 mL. O volume
89
foi completado com solução tampão NaH
2
PO
4
,
pH 7,40 contendo LSS 0,3%. As diluições
foram preparadas tomando-se alíquotas de 1,0, 2,5, 4,0, 5,5, 7,0 e 8,5 mL para balões
volumétricos de 50 mL e completando-se o volume com a mesma solução. As
concentrações finais obtidas foram 2,0, 5,0, 8,0, 11,0, 14,0 e 17,0 µg/mL. Todas as diluições
foram feitas em triplicata e analisadas por espectrofotometria de absorção no UV, em λ 239
nm e utilizando solução tampão NaH
2
PO
4
, pH 7,40 e LSS 0,3% para ajuste do zero.
5.2.4 Avaliação de degradação de sinvastatina em DS por CLAE
Para verificar possível degradação de sinvastatina durante o processo de preparo das DS
ou MF, as mesmas foram analisadas pelo método desenvolvido para quantificação de
estatinas por CLAE, descrito no item 4.3.2.
As amostras foram preparadas na concentração 28 µg/mL de sinvastatina em ACN (70% da
concentração de trabalho).
5.2.5 Desenvolvimento farmacotécnico de comprimidos contendo DS de
sinvastatina
Com base na avaliação da solubilidade e na avaliação de degradação de sinvastatina por
CLAE descritos nos itens 5.2.3 e 5.2.4, respectivamente, foram selecionadas duas DS que
proporcionaram maior liberação e menor degradação de sinvastatina durante o seu preparo
para a fabricação de comprimidos na dosagem de 10 mg de sinvastatina.
Os comprimidos foram fabricados no LTF/FAFAR/UFMG, utilizando os excipientes e
proporções apresentadas na Tabela 29 (mesma constituição dos placebos C e D, item
4.2.2.2).
Os comprimidos foram produzidos por compressão direta; os constituintes da formulação
foram pesados e tamisados separadamente. Em seguida, procedeu-se a mistura de pós,
adicionou-se o lubrificante e, finalmente, a mistura de pós foi comprimida.
90
Tabela 29 - Excipientes e proporções utilizadas na fabricação dos comprimidos contendo
DS
a
.
Constituição Porcentagem (%)
Àcido ascórbico 0,05 0,05
Ácido cítrico 0,85 0,85
Aerosil 0,50 0,50
BHT 0,50 0,50
Celulose microcristalina 41,35 43,00
Estearato de magnésio 0,50 0,50
Glicolato de amido sódico 2,00 2,00
Lactose 41,00 37,75
Lauril sulfato de sódio 0,5 0,5
DS sinvastatina:PEG6000
(1:5)
b
15,00
DS sinvastatina:PVP (1:3) 10,10
b
Talco 1,00 1,00
a
peso teórico: 400 mg.
b
ausente.
A fluidez da mistura de pós para a fabricação dos comprimidos com DS foi avaliada,
indiretamente, pela determinação do índice de compressibilidade. As medidas de
densidades aparentes (antes da compactação) e compactadas (após compactação) foram
determinadas pesando-se quantidade de massa que ocupasse metade do volume de uma
proveta de 100 mL. Realizou-se a medida do volume aparente ocupado pelo pó. A
densidade aparente foi calculada dividindo-se a massa pesada pelo volume inicial ocupado.
Em seguida, a proveta foi encaixada no aparelho e submetida a batidas até que o volume
ocupado permanecesse constante (1.250 batidas a uma velocidade de 250 batidas/minuto).
Após as batidas, o volume ocupado final foi medido para cálculo da densidade compactada
(massa pesada/volume final ocupado). O índice de compressibilidade foi calculado conforme
a equação (AULTON, 2005):
( )
100×
−
=
Dc
DaDc
IC
o
o
,
em que: IC (%), índice de compressibilidade em porcentagem; Da, densidade aparente; Dc,
densidade compactada.
91
5.2.6 Controle de qualidade dos comprimidos contendo DS de sinvastatina
Os seguintes testes foram realizados para a avaliação da qualidade dos comprimidos
desenvolvidos: determinação de peso, determinação da resistência mecânica por dureza e
friabilidade, desintegração, doseamento e uniformidade de doses unitárias. Realizou-se,
também o perfil de dissolução.
5.2.6.1 Determinação de peso
A determinação de peso foi realizada de acordo com o procedimento descrito no método
geral V.1.1 da F. Bras. IV (FARMACOPÉIA, 1988). Pesaram-se individualmente 20
comprimidos e determinaram-se o peso médio e os desvios individuais.
5.2.6.2 Determinação de resistência mecânica e friabilidade
Os testes de resistência mecânica, dureza e friabilidade foram avaliados de acordo com os
métodos gerais V.1.3.1 e V.1.3.2, respectivamente, de acordo com a F. Bras IV
(FARMACOPÉIA, 1988). A dureza, medida em Newton, foi avaliada em 10 comprimidos
submetidos à uma força aplicada diametralmente, capaz de quebrá-los. A friabilidade foi
avaliada em 20 comprimidos submetendo-os à ação abrasiva gerada por 100 rotações no
equipamento.
5.2.6.3 Desintegração
O teste de desintegração foi realizado de acordo com o método geral V.1.4 da F. Bras. IV
(FARMACOPEIA, 1988). Utilizaram-se 6 comprimidos para o teste. Cada comprimido foi
colocado em um dos seis tubos de aparelho de desintegração, sob os discos de acrílicos. O
meio de desintegração utilizado foi água destilada a 37 ± 1 ºC. Os comprimidos foram
observados durante todo o processo de desintegração e o tempo de desintegração foi
registrado.
92
5.2.6.4 Doseamento
O método de doseamento utilizado para a quantificação dos comprimidos de DS de
sinvastatina foi o método desenvolvido e validado por CLAE, descrito no item 4.2.2.
As amostras foram preparadas, em sextuplicata, conforme procedimento descrito no item
4.2.2.5 para preparação de amostras a serem quantificadas por CLAE, na concentração 40
µg/mL (100% da concentração de trabalho, em ACN).
5.2.6.5 Uniformidade de doses unitárias
O teste de uniformidade de conteúdo de doses unitárias foi avaliado pelo método
uniformidade de conteúdo, de acordo com o método geral V.1.6 da F. Bras. IV
(FARMACOPÉIA, 1996). O método utilizado para quantificação de estatinas foi aquele
desenvolvido por CLAE (4.2.2). As amostras foram preparadas conforme descrito no item
4.2.2.5 a 100% da concentração de trabalho (40 µg/mL).
5.2.6.6 Perfil de dissolução
Os estudos de perfis de dissolução dos comprimidos desenvolvidos e do medicamento
referência (Zocor® - 10 mg de sinvastatina) foram conduzidos em 900 mL de meio de
dissolução e utilizando pás na velocidade de rotação 50 rpm por 60 minutos e 150 rpm por
mais 15 minutos. Os meios de dissolução testados foram solução tampão NaH
2
PO
4
, pH 7,40
± 0,20, a mesma solução tampão com LSS 0,3% ou com LSS 0,5%. Este último meio de
dissolução é o meio preconizado na monografia de sinvastatina comprimidos da USP32
(THE UNITED, 2009). As amostras foram coletadas nos tempos: 5, 10, 15, 30, 60 e 75
minutos, sem reposição de meio.
Os perfis de dissolução foram realizados com seis comprimidos, em dois dias diferentes
para os comprimidos desenvolvidos e, em apenas um dia para o medicamento referência
quando utilizou-se a solução tampão pH 7,40 sem adição de tensoativo ou tampão com LSS
0,3%. No meio de dissolução tampão com LSS 0,5%, avaliou-se o perfil em apenas um dia.
Alíquotas de 5 mL foram retiradas com o auxílio de pipeta volumétrica, filtradas por meio de
seringa contendo unidade filtrante (poros de 0,45 µm) na extremidade. Após retirada de
alíquota em 60minutos, a velocidade das pás foi aumentada para 150 rpm por mais
15minutos e a última alíquota foi realizada em 75minutos.
93
As alíquotas foram analisadas pelo método de quantificação desenvolvido por EDU, descrito
no item 4.2.3. Devido ao pequeno deslocamento no comprimento de onda provocado pelo
meio de dissolução em relação ao metanol, utilizado com solvente na validação do método
por EDU, as leituras foram realizadas em segunda derivada, λ 248 nm, ao invés de λ 247
nm.
A curva analítica para quantificação de sinvastatina liberada no meio de dissolução por EDU
foi construída conforme descrito no item 5.2.3.1, entretanto, as leituras foram realizadas em
segunda derivada, λ 248 nm.
Os valores de absorvância obtidos foram lançados na equação da reta analítica e expressos
como porcentagem de liberação de sinvastatina. As curvas dos perfis foram construídas
plotando-se a porcentagem de fármaco dissolvido em função do tempo. Os valores de área
sob a curva (ASC) e eficiência de dissolução (ED) foram calculados a partir das curvas de
dissolução, no intervalo compreendido entre 0 e 60 minutos, pelo programa computacional
GraphPad Prism Software Inc
®
versão 4 considerando a ASC total do retângulo igual a
6000%min. A ED foi calculada conforme a equação:
( )
( )
( )
100×=
−
ret
tto
ASC
ASC
ED
o
o
,
em que: ED(%), eficiência de dissolução em porcentagem; ASC
(to-t)
, área sob a curva de
dissolução do tempo zero até um determinado tempo; ASC
(ret)
, área do retângulo
correspondente a 100% de dissolução no mesmo período de tempo.
5.2.7 Teste in vivo
Realizou-se teste in vivo para comparar a eficácia terapêutica de: a) sinvastatina, b) DS de
sinvastatina e PEG6000 1:5, preparadas por meio do método misto fusão-evaporação, c)
medicamento referência (Zocor
®
) e d) comprimidos fabricados com DS. O teste consistiu na
avaliação da redução de colesterol plasmático em 30 camundongos da raça Swiss com 50
dias. O protocolo referente a esse estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal (CETEA/UFMG) (ANEXO A).
O estudo foi delineado com base em estudos relatados na literatura que investigam outros
efeitos da sinvastatina, além do efeito de redução de colesterol estabelecido (SACALIA et
al., 2001; CHOUDHURY et al., 2004; CIBYCKOVA et al., 2009) ou comparam o efeito da
sinvastatina com extratos vegetais (LUO et al., 2008). Há também descrito, um estudo
94
conduzido por Ambike e colaboradores (2005) que compara a eficácia terapêutica da
sinvastatina e de uma DS de sinvastatina contendo PVP e aerosil na proporção de 1:2:2 em
12 ratos alimentados com óleo de coco, por meio de três grupos, controle, referência e teste.
Inicialmente, os 30 animais receberam dieta hiperlipêmica por uma semana sem receberem
nenhum tipo de tratamento. Após 7 dias, os animais foram divididos em 5 grupos com 6
animais cada, como mostrado na Tabela 30. Iniciou-se o tratamento dos animais com
sinvastatina apenas e contida em diferentes formulações (medicamento referência, DS
sinvastatina:PEG6000 1:5 ou comprimidos contendo DS pulverizados). A estatina, sob
qualquer uma das formas, foi administrada, na dose 12 mg/kg, por gavagem oral, dispersa
em solução de carboximetilcelulose (CMC) a 1% em solução salina. O tratamento foi
conduzido diariamente, por uma semana. Durante todo o período de tratamento, os animais
continuaram recebendo a dieta hiperlipídica. O colesterol total foi dosado aplicando de 3 a 4
gotas de sangue, obtido após pequeno corte na cauda dos camundongos, em fita reagente
para colesterol. A leitura foi realizada em um aparelho sensível a colesterol. A dosagem de
colesterol foi realizada 3 vezes durante todo o estudo, ou seja, no início, antes de começar a
dieta hiperlipêmica, após a primeira semana com a dieta hiperlipêmica sem tratamento e, no
final do estudo após os 7 dias de tratamento hipolipêmico.
Tabela 30 - Grupos de animais (n = 6) e tratamentos utilizados na comparação da eficácia
terapêutica de sinvastatina sob formas diversas.
Grupo Dieta/Tratamento
1 (controle) Hiperlipêmica/veículo (CMC a 1% em solução salina)
2 (referência) Hiperlipêmica/sinvastatina
3 Hiperlipêmica/DS de sinvastatina e PEG6000
4 Hiperlipêmica/Zocor®
5 Hiperlipêmica/comprimidos fabricados com DS
Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias obtidas foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
95
5.3 Resultados e discussão
5.3.1 Desenvolvimento de dispersões sólidas de sinvastatina
Com o objetivo de aumentar a solubilidade da sinvastatina e melhorar seu perfil de liberação
foram manipuladas DS e MF constituídas de sinvastatina e PVP, PEG4000 ou PEG6000
como carreadores hidrofílicos nas proporções 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 e 1:5. Preparou-se, também,
DS de sinvastatina e PEG6000 (1:5) pelo método misto “evaporação-fusão” a fim de verificar
a influência do método de preparo na solubilidade da estatina. O PEG6000 foi selecionado
para o preparo dessa DS, pois já existe descrita na literatura DS de sinvastatina e PEG4000
(1:10) preparada por fusão ou pelo método de evaporação (PATEL e PATEL, 2008).
5.3.2 Caracterização das dispersões sólidas
5.3.2.1 Difração de raios X de pó (DRXP)
As análises por difração de raios X foram realizadas para avaliar possíveis alterações na
estrutura cristalina da sinvastatina, forma cristalina ou amorfa dos constituintes, interações
polímero-fármaco, ou o efeito de redução de partículas na dispersão sólida.
Os padrões de DRXP para a sinvastatina e para as suas respectivas DS e MF estão
apresentados nas Figuras 28 a 33.
Dos diversos picos de difração da sinvastatina na forma cristalina, três são característicos
nos padrões estudados, com valores de 2θ iguais a 8,10º, 9,60º e 11,14º (Figura 28). Estes
auxiliam com clareza a confirmação da presença desse composto na forma cristalina. Os
polímeros PEG4000 e 6000 também exibem padrão de difração típico de material cristalino
(Figura 29-a), entretanto o padrão de difração de raios X para o PVP é típico de material
amorfo, caracterizado pela completa ausência de picos de difração (Figura 29-b). A Figura
29 ilustra a sobreposição dos picos da sinvastatina com misturas físicas contendo 50% de
PVP ou PEG6000.
96
1 0 2 0 3 0 40 5 0
Intensidade Relativa
2
θ
(º)
Figura 28
- Padrão de difração de raios X de pó para sinvastatina.
10 20 30 40
Intensidade Relativa
2
θ
(º)
PEG6000
Sinvastatina
Sinvast/PEG 1:1
10 20 30 40
PVP
Sinvastatina
Intensidade Relativa
2
θ
(º)
Sinvast/PVP 1:1
Figura 29
- Padrão de difração de raios X de pó para (a,b) sinvastatina, para os polímeros (a)
PEG6000, (b) PVP e para as respectivas MF (1:1, estatina:polímero).
(a)
(b)
97
Figura 30
- Padrão de difração de raios X de pó para sinvastatina, PEG4000 e para DS de
sinvastatina e PEG4000 (1:1, 1:3 e 1:5) preparadas pelo método de fusão.
10 20 30 40
Sinv-PEG6000 1:1
10 20 30 40
Contagem Relativa
Sinv-PEG6000 1:3
10 20 30 40
2
θ
(º) - CuK
α
Sinv/PEG6000 - Mistura Física
Sinv-PEG6000 1:5
10 20 30 40
2
θ
(º) - CuK
α
Contagem relativa
Sinv-PEG6000 1:1
10 20 30 40
Sinv/PEG6000 - Método de Fusão
Sinv-PEG6000 1:3
10 20 30 40
Sinv-PEG6000 1:5
Figura 31
- Padrão de difração de raios X de pó para (a) MF de sinvastatina e PEG6000 e para (b)
respectivas DS preparadas pelo método de fusão.
(a)
(b)
98
10 15 20 25 30 35
9,0 9,5 10,0
2
θ
(º)
Contagem relativa
2
θ
(º)
Mistura Física
Método Evaporação
Método Dispersão
Figura 32
- Padrão de difração de raios X de pó para MF de sinvastatina e PEG6000 e para as
respectivas DS preparadas pelo método de fusão (dispersão) e pelo método misto “fusão-
evaporação”, na proporção 1:5 (estatina:polímero).
A análise dos padrões de DRXP das DS e MF de sinvastatina com PEG4000 ou 6000
(Figuras 30 e 31) revela apenas a coexistência das duas fases cristalinas em todas as
amostras, sem diferenças nas posições dos máximos de difração. As diferenças de
intensidades e largura dos picos de difração são pouco significativas, quando se compara as
MF com as DS. Também, não se observa alterações nos padrões de DRXP entre as DS de
sinvastatina e PEG6000 (1:5) preparadas pelo método de fusão e fusão-evaporação de
solvente (Figura 32). Não foi possível confirmar a presença de sinvastatina na forma amorfa
ou em interação com PEG.
Em diversos estudos (MOORE e WILDFONG, 2009; FORD, 1986, VASCONCELOS, 2007)
relatam-se que um dos vários fatores que explicam o aumento da solubilidade do fármaco
pode ser a redução do tamanho de partícula por meio da redução da energia necessária
para a solubilização, favorecendo, assim a liberação do fármaco. Entretanto, no presente
trabalho, não constatou-se alteração significativa da largura dos picos de sinvastatina e,
portanto, não é possível concluir se houve redução do tamanho de partícula da sinvastatina
após o tratamento de preparo das dispersões (Figura 32).
Os padrões de DRXP das MF preparadas com PVP K15 indicaram a presença de
sinvastatina cristalina, com alteração somente na intensidade dos picos devido às diferentes
proporções da estatina entre as preparações. Nas DS, os picos de difração da sinvastatina
estão presentes na proporção 1:1 (estatina:PVP), mas, estão ausentes ou bastante
99
atenuados na DS 1:3 e 1:5 (Figura 33). Este fato indica que a estatina pode estar, em
grande proporção, amorfa ou incorporada dentro da matriz polimérica. Resultados
semelhantes também foram relatados por Patel e Patel (2008) para DS de sinvastatina e
PVP K30 na proporção estatina:polímero de 1:10. Nesse estudo também foi relatada a
presença de sinvastatina amorfa em uma DS preparada com PEG4000, pelo método de
evaporação de solvente, na proporção 1:10 (estatina:polímero).
10 20 30 40 50
0
250
500
750
1000
1250
1500
Sinvastatina/PVP - Mistura Física
Sinvastatina/PVP 1:1
Contagem
2
θ
(º)
0
100
200
300
400
500
600
700
Sinvastatina/PVP 1:3
Contagem
0
100
200
300
400
500
Sinvastatina/PVP 1:5
Contagem
10 20 30 40 50
0
250
500
750
1000
1250
1500
Sinvastatina/PVP - Dispersão
Sinvastatina/PVP 1:1
Contagem
2
θ
(º)
0
100
200
300
400
Sinvastatina/PVP 1:3
Contagem
0
100
200
300
400
Sinvastatina/PVP 1:5
Contagem
Figura 33
- Padrão de difração de raios X de pó para (a) MF de sinvastatina e PVP e para as
respectivas (b) DS preparadas pelo método de fusão.
Para a confirmação da presença de sinvastatina como material amorfo seria necessária a
caracterização por técnicas adicionais como a microscopia eletrônica, termomicroscopia e
análise em conjunto para se chegar a uma conclusão.
(a)
(b)
100
5.3.2.2 Calorimetria diferencial exploratória (DSC)
Pela análise das curvas DSC foi possível avaliar a cinética térmica do fármaco nas DS e nas
MF e sua compatibilidade com os polímeros. As curvas DSC da sinvastatina e de suas DS e
MF, nas proporções (sinvastatina:polímero) 1:1, 1:3 e 1:5 são apresentadas nas Figuras 34
a 40.
Figura 34
- Curvas DSC de (d) sinvastatina e suas misturas físicas com PEG4000 nas proporções
(sinvastatina:PEG4000) (a) 1:1, (b) 1:3 e (c) 1:5.
Figura 35
- Curvas DSC de (c) sinvastatina e suas dispersões sólidas com PEG4000 preparadas por
meio do método de fusão, nas proporções (sinvastatina:PEG4000) (a) 1:1, (b) 1:3 e (d) 1:5.
101
Figura 36
- Curvas DSC de sinvastatina e suas misturas físicas com PEG6000 nas proporções
(sinvastatina:PEG6000) 1:1, 1:3 e 1:5.
Figura 37
- Curvas DSC de sinvastatina e suas dispersões sólidas com PEG6000 preparadas por
meio do método de fusão, nas proporções (sinvastatina:PEG6000) 1:1, 1:3 e 1:5.
102
Figura 38
- Curvas DSC das DS de sinvastatina e PEG6000 preparadas por meio do (a) método de
fusão e por meio do (b) método de fusão-evaporação de solvente, na proporção 1:5
(estatina:polímero).
Figura 39
- Curvas DSC das misturas físicas de sinvastatina e PVP nas proporções
(sinvastatina:PVP) 1:1, 1:3 e 1:5.
103
Figura 40
- Curvas DSC das dispersões sólidas de sinvastatina e PVP preparadas por meio do
método de evaporação de solvente, nas proporções (sinvastatina:PVP) 1:1, 1:3 e 1:5.
A sinvastatina foi caracterizada por um pico endotérmico (fusão) em 142,5 ºC com uma
variação de entalpia (∆H) de 706,5 J/g (Figura 34 a 37). As curvas DSC das DS e das MF
com PEG4000 ou 6000 (Figuras 34 a 38), em todas as proporções, apresentaram pico
endotérmico próximo a 60 ºC correspondente a fusão dos polímeros. As curvas DSC das MF
de sinvastatina e PEG4000 ou PEG6000 e das respectivas DS, na proporção 1:1, (Figuras
34 e 36) apresentaram pico de fusão da sinvastatina com deslocamento para temperaturas
inferiores e uma redução significativa na entalpia de fusão conforme apresentado na Tabela
31. O evento endotérmico referente à fusão da sinvastatina não é observado nas curvas
DSC das MF com PEG4000 e 6000, na proporção 1:3, na MF com PEG6000 na proporção
1:5 e, também, não está presente nas DS 1:3 e 1:5 com os dois polímeros (Tabela 31). Não
houve diferença nas curvas de DSC das DS de sinvastatina com PEG6000 (1:5) preparadas
por meio dos métodos de fusão e fusão-evaporação de solvente.
A ausência de pico de fusão de uma substância, em uma curva de DSC, pode indicar a
existência da substância amorfa, como relatado previamente por Ambike e colaboradores
(2005) e por Patel e Patel (2008). Entretanto, apesar do pico de fusão da sinvastatina estar
ausente nas curvas DSC de algumas DS e MF preparadas com PEG4000 ou PEG6000
(Tabela 31), os resultados da caracterização das mesmas por DRXP (item 5.3.2.1) indicam
104
que a sinvastatina presente nesses materiais continua cristalina, apesar do tratamento
realizado. Assim, a redução ou ausência do pico endotérmico característico da sinvastatina
nas curvas DSC das preparações com PEG4000 ou PEG6000 estudadas pode ser devido
ou a sua solubilização parcial ou total no polímero fundido ou a um efeito de diluição do
fármaco.
O deslocamento do pico de fusão da sinvastatina observado nas curvas DSC de algumas
DS e MF preparadas com PEG4000, 6000 ou com PVP pode ser indicativo de interações
entre o polímero e a estatina, as quais poderiam favorecer a solubilização da sinvastatina
em meio aquoso.
A curva DSC de PVP apresenta uma banda larga na faixa de 60 ºC a 120 ºC devido à perda
de água (Figuras 39 e 40). Como observado para algumas MF e DS de sinvastatina e
PEG4000 ou 6000, as curvas DSC das MF de sinvastatina e PVP nas proporções 1:1 e 1:3
e da DS 1:1 apresentaram pico de fusão da sinvastatina com deslocamento para
temperaturas inferiores e uma redução significativa na entalpia de fusão (Tabela 31). O
mesmo pico está ausente nas curvas DSC da MF 1:5 e das DS 1:3 e 1:5 (estatina:PVP). A
ausência do pico de fusão da sinvastatina na curva DSC de DS 1:3 e 1:5 (estatina:PVP)
confirma os resultados apresentados por DRXP (item 5.3.2.1), que revelam que a
sinvastatina está presente na sua forma amorfa ou está incorporada dentro da matriz
polimérica nessas DS. Entretanto, o mesmo não pode ser afirmado para a MF 1:5, que
apesar da curva DSC não apresentar o pico endotérmico da sinvastatina, o seu espectro
DRXP revela a presença de sinvastatina cristalina. Resultados semelhantes foram obtidos
por Ambike e colaboradores (2005), os quais caracterizaram DS e MF de sinvastatina,
aerosil e PVP (1:1:1 e 1:2:2), dentre outras técnicas, por DSC e por DRXP e relataram a
ausência do pico de fusão da estatina nas curvas DSC e ausência de picos característicos
de material cristalino nos padrões de DRXP para as DS.
105
Tabela 31 - Resultados obtidos para avaliação das DS e MF de sinvastatina por DSC.
Sinvastatina
Amostra
Temperatura de fusão (ºC) ∆H de fusão (J/g)
Sinvastatina 142,50 706,50
MF de Sinvastatina:PEG4000 (1:1) 124,74 83,37
MF de Sinvastatina:PEG6000 (1:1) 131,84 47,91
MF de Sinvastatina:PVP (1:1) 132,63 293,1
MF de Sinvastatina:PEG4000 (1:3)
a a
MF de Sinvastatina:PEG6000 (1:3)
a
a
MF de Sinvastatina:PVP (1:3) 117,37 179,2
MF de Sinvastatina:PEG4000 (1:5) 152,10 212,2
MF de Sinvastatina:PEG6000 (1:5)
a
a
MF de Sinvastatina:PVP (1:5)
a
a
DS de Sinvastatina:PEG4000 (1:1) 126,69 91,13
DS de Sinvastatina:PEG6000 (1:1) 128,85 128,00
DS de Sinvastatina:PVP (1:1) 99,57 571,1
DS de Sinvastatina:PEG4000 (1:3)
a
a
DS de Sinvastatina:PEG6000 (1:3)
a
a
DS de Sinvastatina:PVP (1:3)
a
a
DS de Sinvastatina:PEG4000 (1:5)
a
a
DS de Sinvastatina:PEG6000
(1:5 – método de fusão)
a
a
DS de Sinvastatina:PEG6000
(1:5 – método de evaporação)
a
a
DS de Sinvastatina:PVP (1:5)
a
a
a
não observado.
Dispersões sólidas com fármacos amorfos apresentam a vantagem de favorecer a
dissolução pelo aumento da superfície de contato, mas podem ser instáveis devido a
cristalização gradual do fármaco durante o armazenamento e estocagem (FORD, 1986).
5.3.3 Avaliação da solubilidade parcial de sinvastatina em DS
Para investigar o aumento da dissolução das preparações em relação à sinvastatina, os
valores de absorvância obtidos foram lançados na equação da reta analítica (5.3.2.3.1) e
106
calculada a quantidade de sinvastatina liberada no meio. A concentração de saturação de
sinvastatina encontrada após 1 h de teste foi 3,03 µg/mL, determinada em sextuplicta (DPR
2,76%). Os resultados do teste, em triplicata, expressos em aumento porcentual da
concentração de saturação para as preparações em relação à estatina, estão apresentados
na Tabela 32.
Tabela 32 - Aumento porcentual da concentração de sinvastatina liberada em solução
tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40, a partir de DS e MF, após 1 h de teste de solubilidade parcial.
Aumento porcentual da concentração de sinvastatina (± s)
a
PEG6000 PEG4000 PVP
Método/proporção
MF DS MF DS MF DS
Fusão/1:1
b
21,67
(0,06)
1,68
(0,02)
24,13
(0,03)
11,32
(0,03)
39,94
(0,0028)
Fusão/1:2
5,89
(0,01)
50,58
(0,02)
9,43
(0,04)
89,07
(0,06)
30,85
(0,01)
146,35
(0,05)
Fusão/1:3
17,82
(0,03)
46,63
(0,04)
34,25
(0,03)
91,23
(0,03)
60,38
(0,03)
305,04
(0,03)
Fusão/1:4
31,47
(0,06)
51,89
(0,05)
34,60
(0,01)
111,79
(0,0032)
108,42
(0,08)
251,56
(0,11)
Fusão/1:5
88,66
(0,07)
113,99
(0,04)
273,31
(0,20)
Misto/1:5
42,54
(0,06)
147,51
(0,01)
44,30
(0,04)
_
52,13
(0,02)
_
a
desvio padrão
b
não observado.
Com os dados apresentados na Tabela 32, foram construídas as curvas ilustradas na Figura
41.
107
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
45 50 55 60 65 70 75 80 85
% de polímero
aumento porcentual da solubilidade da
sinvastatina
DS PEG 4000
DS PEG 6000
DS PVP
Figura 41
- Comparação do aumento de solubilidade da sinvastatina em DS preparadas com
polímeros e proporções diferentes.
Pela análise dos resultados obtidos foi possível observar uma relação direta entre a
proporção de polímero nas MF e DS com PEG4000 ou 6000 e a solubilidade da sinvastatina
(Tabela 32 e Figura 41). Observa-se, também, que o aumento na solubilidade da
sinvastatina é maior nas DS do que nas MF correspondentes, o que comprova que a
formação de DS não se trata apenas de uma simples mistura entre fármaco e polímero.
O aumento da dissolução da sinvastatina a partir das DS com PEG4000 ou 6000 pode ser
explicado pela formação de cristais de tamanhos reduzidos do fármaco ou a inibição de
crescimento dos mesmos pela solução de alta viscosidade gerada pelos polímeros (FORD
1986; ANGUIANO-IGEA et al., 1995).
Apesar dos resultados obtidos nas análises das DS com PEG4000 e 6000 por DRXP e DSC
(itens 5.3.2.1 e 5.3.2.2) não revelarem nenhuma diferença significativa entre as mesmas, foi
possível, por meio do teste de solubilidade, apontar a DS com PEG4000 como a mais eficaz
no aumento da liberação de sinvastatina. Esse resultado pode ser explicado pela dissolução
mais rápida do PEG de baixo peso molecular (PEG4000).
O efeito do tamanho da cadeia na solubilidade de fármacos pouco solúveis ainda não é
totalmente conhecido e deve ser mais cuidadosamente investigado. A hipótese geral é que
quanto menor o peso molecular do polímero mais rápida é a dissolução. Entretanto, há
exemplos descritos na literatura em que a utilização de PEG de maior peso molecular
aumentou a velocidade de dissolução de fármacos como clofibrato, meprobamato,
sulfametoxidiazina e papaverina. Também há relatos na literatura de que o tamanho da
108
cadeia polimérica não influenciou na velocidade de dissolução (SALIB e EBIAN, 1978;
DRAGUET-BRUGHMANS et al., 1979; FORD 1986; ANGUIANO-IGEA et al., 1995).
A DS sinvastatina:PEG6000 (1:5) preparada pelo método fusão-evaporação mostrou ser
mais eficaz no aumento da liberação de sinvastatina (Tabela 32) em comparação com a
mesma DS preparada pelo método de fusão. No método de fusão-evaporação, o fármaco
dissolvido no solvente orgânico é totalmente miscível no polímero fundido, o que leva à
formação de uma mistura mais homogênea, resultando em uma maior interação carreador-
fármaco. Ao contrário, no método de fusão, uma parte considerável do fármaco não se
dissolve no polímero fundido, o que dificulta a sua dispersão e, conseqüentemente, a
formação de uma suspensão homogênea.
Para as MF e DS com PVP a concentração de saturação da sinvastatina aumenta somente
até a proporção 1:4 e 1:3 (estatina:polímero), respectivamente (Figura 41). Esse dado
sugere uma concentração ótima de PVP na DS na qual as interações polímero e
sinvastatina são máximas. Uma avaliação mais detalhada utilizando quantidades de PVP
superiores às investigadas, torna-se necessária para comprovação do exposto.
As DS preparadas com PVP apresentaram maior efeito na solubilidade da sinvastatina em
relação às demais DS, observa-se um aumento de até 305% na concentração de estatina
liberada (Tabela 32 e Figura 41). Esse aumento significativo pode ser explicado pela
presença de sinvastatina como material amorfo conforme indicado pelos experimentos de
DRXP ou incorporado dentro da matriz polimérica formando um complexo solúvel.
Vários estudos relatam que o PVP inibe a cristalização de fármacos em DS levando ao
aparecimento de suas formas amorfas que são, geralmente, mais solúveis. Esse efeito do
PVP pode ser explicado pela sua capacidade em formar ligações de hidrogênio com o
fármaco (TAYLOR e ZOGRAFI, 1997; MATSUMOTO e ZOGRFI, 1999; MOOTER et
al.,2001; SQUILLANTE e SETHIA, 2004; PATEL e PATEL, 2008).
As MF sinvastatina:PVP foram menos efetivas para o aumento da solubilidade do fármaco
em comparação com as respectivas DS, em concordância com o que já foi discutido em
relação às MF contendo PEG.
Os resultados do teste de solubilidade indicam que os fatores proporção de fármaco e
polímero, método de preparo das DS e tipo de carreador polimérico são importantes na
determinação da solubilidade do fármaco.
109
5.3.3.1 Curva analítica para avaliação da solubilidade de sinvastatina em DS
A equação da reta e o DPR da regressão obtidos para o teste de solubilidade por UV, λ 239
nm, em NaH
2
PO
4
pH 7,40, foram y = 0,0629x - 0,0018 e 0,47%, respectivamente. O
coeficiente de correlação de Pearson (r) obtido, 0,9999, foi satisfatório (r>0,99). O valor p da
inclinação (1,01x10
-34
) foi significativo a 5% de probabilidade (p<0,05), e, portanto, a
resposta é linear na faixa de concentração estudada. O intercepto obtido não foi
estatisticamente diferente de zero (valor p do intercepto igual a 0,21). A curva analítica
resultante está apresentada na Figura 42.
y = 0,0629x + 0,0018
r = 0,9999
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 5 10 15
Concentração (
µ
g/mL)
Absorvância 239 nm
Figura 42
- Curva analítica para avaliação da solubilidade de sinvastatina por UV, λ 239 nm, em
NaH
2
PO
4
, pH 7,40
.
5.3.4 Avaliação de degradação de sinvastatina em DS por CLAE
Verificou-se a possível degradação da sinvastatina após preparo das DS. O cromatograma
da DS sinvastatina:PEG6000 (1:5), preparada pelo método misto “fusão-evporação”,
(correspondente a 28 µg/mL de sinvastatina, em ACN) é apresentado na Figura 43.
As demais DS e respectivas MF com PEG4000 ou PEG6000 apresentaram cromatogramas
semelhantes e não observaram-se picos referentes a produtos de degradação. Pela análise
das DS de sinvastatina com PEG4000 ou 6000 preparadas pelo método de fusão ou pelo
método de fusão-evaporação, foi possível confirmar que o processo de preparo das mesmas
não acarretou em degradação da estatina e que não há incompatibilidades entre as
substâncias.
110
min
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
5
10
15
20
25
30
Figura 43
- Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal, tr 7,215 min) e PEG6000 (1:5)
preparada pelo método misto (fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min, 30 ºC,
detecção UV em λ 238 nm).
Os cromatogramas das DS de sinvastatina:PVP 1:1, 1:3 e 1:5 (correspondente a 28 µg/mL
de sinvastatina, em ACN) estão apresentados nas Figuras 44, 45 e 46, respectivamente.
Figura 44
- Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal) e PVP (1:1). A seta indica o pico
referente a um produto de degradação (fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min, 30
ºC, detecção UV em λ 238 nm).
Figura 45
- Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal) e PVP (1:3). As setas indicam
picos referentes a produtos de degradação (fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min,
30 ºC, detecção UV em λ 238 nm).
min
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
10
20
30
40
min
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
111
Figura 46 -
Cromatograma da DS de sinvastatina (pico principal) e PVP (1:5). As setas indicam
picos referentes a produto de degradação (fase móvel ACN:ácido fosfórico 0,1%, fluxo 1,5 mL/min, 30
ºC, detecção UV em λ 238 nm).
Todas as DS de sinvastatina e PVP apresentaram picos referentes a produtos de
degradação (Figuras 44 a 46). O cromatograma da DS 1:5 (estatina:PVP) apresentou o
mesmo pico de degradação, próximo a 7,6 minutos, presente no cromatograma da DS 1:1 e
um pico adicional próximo a 4,4 minutos (Figura 46) (possível hidroxiácido relatado no item
4.3.2.1). A DS 1:3 apresentou além do pico em 4,4 minutos, um pico em 9,7 minutos
referente a um produto de degradação menos polar que a sinvastatina (Figura 45).
Em um estudo de degradação de lovastatina e sinvastatina conduzido por Yang e Hwang
(2006) foi relatada a conversão das estatinas em suas formas hidroxiácidas e posterior
formação de um éster metílico, menos polar que as correspondentes estatinas. O estudo foi
conduzido por uma hora a 45 ºC, em solução alcalina com porcentagens diferentes de
metanol. A formação desses produtos de degradação aumentava com a concentração de
metanol na solução alcalina. Com base nessas informações, acredita-se que os produtos de
degradação menos polares que a sinvastatina, presentes nos cromatogramas das DS com
PVP, podem ter sido formados após reação da estatina com etanol utilizado no preparo das
mesmas (solubilização da sinvastatina e PVP em etanol e posterior evaporação do solvente
a ± 58 ºC em rotavapor).
A área do produto de degradação encontrado no cromatograma da DS 1:1 (estatina:PVP)
corresponde a menos que 1% da área da sinvastatina. O somatório dos dois produtos
encontrados nas DS 1:3 e 1:5 correspondem a 6,81% e 10,46% da área de sinvastatina,
respectivamente. Portanto, a degradação das DS contendo PVP foi crescente com o
min
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
112
aumento da quantidade de PVP. Esses resultados podem ser devido a volumes crescentes
de etanol necessário para a solubilização do PVP durante o preparo das DS e,
conseqüentemente maior tempo necessário para a evaporação do mesmo em rotavapor a
uma temperatura elevada (± 58 ºC), favorecendo a degradação. Além disso, a presença de
PVP na DS parece ser importante para catalisar a formação desses produtos, já que na DS
contendo PEG6000 preparada pelo método fusão-evaporação não detectou-se a formação
de produtos de degradação. Entretanto, a possibilidade de incompatibilidade entre
sinvastatina e PVP, independente da presença ou não de etanol, não pôde ser descartada.
Um método comum para detectar possíveis incompatibilidades é por meio da análise da por
DSC da MF fármaco-carreador. Nesse caso, pela análise das curvas DSC da mistura
sinvastatina-PVP (item 5.3.2.2) não se observou a presença de eventos térmicos
relacionados à formação de produtos de degradação. Esse resultado sugere que não há
incompatibilidade direta entre os constituintes da DS e, portanto, é mais um indício de que a
presença da mistura etanol-PVP é o fator que desencadeia a degradação do fármaco. Além
disso, os cromatogramas das MF de sinvastatina com PVP não apresentaram nenhum pico
adicional ao da sinvastatina.
Diante dos resultados apresentados, pode-se concluir que apesar da maior solubilidade da
sinvastatina nas DS preparadas com PVP, as mesmas apresentam a desvantagem de
promover a degradação da sinvastatina, em relação às DS com PEG.
Esse estudo de avaliação de degradação das DS por CLAE não é relatado nos estudos
conduzidos por Patel e Patel (2008) e por Ambike et al. (2005) nos quais DS de sinvastatina
também são preparadas. Esses autores analisaram as DS por espectrofometria no UV e,
por meio dessa técnica, não é possível diferenciar a sinvastatina de seus produtos de
degradação.
5.3.5 Desenvolvimento farmacotécnico de comprimidos contendo DS de
sinvastatina
Com base nos resultados da avaliação de solubilidade (5.2.3) e da avaliação de degradação
das DS por CLAE (5.2.4), foram selecionadas, para utilização na preparação dos
comprimidos, as DS que apresentaram maior aumento na solubilidade e menor tendência à
degradação do fármaco.
113
Nenhuma das DS de sinvastatina com PEG6000 ou com PEG4000 apresentou degradação
na avaliação por CLAE (5.2.4), entretanto observou-se uma maior solubilização da
sinvastatina a partir da DS sinvastatina:PEG6000 (Tabela 32), na proporção 1:5, preparada
por meio do método misto “fusão-evaporação”. Portanto, selecionou-se essa DS para
fabricação de comprimidos.
Apesar da DS de sinvastatina:PVP (1:1) ter apresentado menor degradação na avaliação
por CLAE, a mesma não resultou em um aumento significativo na solubilização do fármaco
(Tabela 32). Portanto, foi selecionada a DS 1:3 que apresentou maior efeito positivo na
solubilidade e menor degradação.
A fluidez das misturas de pós para a fabricação dos comprimidos com DS foi avaliada,
indiretamente, por meio da determinação do índice de compressibilidade. A avaliação da
fluidez é um parâmetro importante para a previsão do comportamento da mistura de pós
durante a etapa de enchimento da matriz. Uma boa fluidez garante um preenchimento
homogêneo e constante da matriz, resultando na formação de comprimidos com menor
variação de peso e maior uniformidade de conteúdo. O índice de compressibilidade
calculado para as misturas de pós contendo as DS de PEG6000 e PVP foi 16,0% e 21,0%,
respectivamente.
Segundo Aulton (2005), a faixa de compressibilidade de 12% a 16% corresponde a um fluxo
bom, comparável a grânulos de fluxo livre. A faixa de 18 a 21% corresponde a um fluxo
escasso para grânulos, mas aceitável para pós. Portanto, a mistura de pós contendo a DS
sinvastatina:PEG6000 apresentou um fluxo ideal. Ao contrário, o resultado da fluidez obtido
para a mistura de pós contendo a DS sinvastatina:PVP está no limite da faixa considerada
satisfatória.
5.3.6 Controle de qualidade dos comprimidos contendo DS de sinvastatina
5.3.6.1 Determinação do peso
Os resultados da determinação de peso médio e as variações obtidas para os comprimidos
fabricados com DS de sinvastatina e PEG6000 (1:5) ou com PVP (1:3) estão apresentados
na Tabela 33.
114
Tabela 33 - Resultados de peso médio
a
e de variação para os comprimidos com DS de
sinvastatina e PEG6000 ou PVP.
Comprimidos DS sinvastatina:PEG6000 DS sinvastatina:PVP
Peso médio (n = 20) 411,2 405,4
Desvio (%) -2,69 a 4,46 -7,14 a 6,96
a
peso médio teórico: 400,0 mg.
De acordo com a F. Bras IV (FARMACOPEIA, 1988), pode-se tolerar uma variação de peso
com não mais que duas unidades fora do limite de ±5,0 % em relação ao peso médio (acima
de 250 mg) e nenhuma unidade com desvio de ± 10,0 %.
Os comprimidos com DS de sinvastatina e PEG6000 (1:5) apresentaram porcentagens de
desvios em relação ao peso médio dentro do limite especificado pela F. Bras. IV
(FARMACOPEIA, 1988). Entretanto, os comprimidos com DS de sinvastatina e PVP (1:3)
apresentaram sete unidades com desvios superiores ao limite estabelecido. Essa grande
variação de peso obtida para tais comprimidos pode ser explicada pela fluidez escassa
encontrada (item 5.3.3) para a mistura de pós utilizada na preparação dos mesmos. Uma
baixa fluidez pode acarretar em um preenchimento não uniforme das matrizes da
compressora e, conseqüentemente, em grandes variações de peso.
5.3.6.2 Determinação de resistência mecânica e friabilidade
A dureza e a friabilidade são parâmetros importantes na avaliação da qualidade de formas
farmacêuticas sólidas, indicativos da resistência a rupturas provocadas por golpes e à
fricção durante os processos de revestimento, embalagem, transporte e armazenamento
(FARMACOPÉIA, 1988).
O valor médio de dureza, sua variação e o resultado do teste de friabilidade para os
comprimidos desenvolvidos estão apresentados na Tabela 34.
115
Tabela 34- Resultados obtidos para os testes de dureza (n=10) e friabilidade (n=20) para os
comprimidos preparados com DS de sinvastatina e PEG6000 ou PVP.
Comprimidos Dureza (variação) (N) Friabilidade (%)
DS sinvastatina:PEG6000 49,80 (47 a 60) 0,16
DS sinvastatina:PVP 58,30 (50 a 65) 0,02
De acordo com a F. Bras. IV, a dureza mínima aceitável é 30 N e a perda máxima de pó é
1,5% relativa ao valor do peso inicial, (FARMACOPEIA, 1988). Os comprimidos
desenvolvidos apresentaram valor médio de dureza superior ao limite mínimo especificado e
perda de pó inferior ao limite máximo estabelecido.
5.3.6.3 Desintegração
O limite de tempo estabelecido pela F. Bras. IV como critério geral para o teste de
desintegração de comprimidos é de 30 minutos em água (FARMACOPEIA, 1988). Todos os
comprimidos avaliados apresentaram tempo de desintegração inferior a 5 minutos.
5.3.6.4 Doseamento
Os comprimidos de sinvastatina devem conter no mínimo 90,0%, e, no máximo 110,0% da
quantidade declarada conforme a monografia do produto descrita na USP32 (THE UNITED,
2009). Os resultados de teor para os comprimidos preparados com DS
sinvastatina:PEG6000 ou PVP estão apresentados na Tabela 35.
Tabela 35 - Resultados obtidos no doseamento de sinvastatina por CLAE a partir dos
comprimidos preparados com DS de sinvastatina e PEG6000 ou PVP, em sextuplicata.
Comprimidos
DS com PEG6000 DS com PVP
Teor (% VR
a
) 102,96
b
88,09
b
Variação (% VR
a
) 100,14 a 104,56
b
83,34 a 93,66
b
a
valor rotulado.
b
faixa especificada (USP32): 90,0% a 110,0% VR.
116
O teor médio obtido para os comprimidos preparados com DS de sinvastatina e PEG6000
estão de acordo com os limites especificados na monografia de sinvastatina comprimidos
(THE UNITED, 2009). Entretanto, o teor médio encontrado para os comprimidos com DS de
PVP está fora da faixa especificada na monografia (90,0 a 110,0% VR). A variação de teor
encontrada para os comprimidos com DS de PVP foi maior do que a variação encontrada
para os comprimidos preparados com DS de PEG6000 (Tabela 35).
O baixo teor de sinvastatina obtido nos comprimidos com DS de PVP pode ser explicado
pela degradação da estatina que ocorre durante a fabricação da DS de sinvastatina com
PVP (item 5.3.4).
5.3.6.5 Uniformidade de doses unitárias
Os resultados de teor (%VR, n = 10) encontrados para o teste de uniformidade de conteúdo
para os comprimidos desenvolvidos estão apresentados na Tabela 36.
Tabela 36 - Porcentagens de valor rotulado para o teste de uniformidade de conteúdo dos
comprimidos preparados com DS sinvastatina e PEG6000 ou PVP.
Comprimidos
Uniformidade de conteúdo
(%VR)
DPR (%)
DS sinvastatina:PEG 86,78 a 104,22 5,43
DS sinvastatina:PVP 81,26 a 98,68 6,69
De acordo F. Bras. IV, o produto passa no teste de uniformidade de conteúdo se a
quantidade do fármaco em cada um das 10 unidades testadas estiver entre 85,0% e 115,0%
VR e o DPR for menor ou igual a 6,0%. Se uma unidade estiver fora da faixa compreendida
entre 85,0% e 115,0% VR e nenhuma estiver fora da faixa de 75,0% a 125,0% VR, ou se
ambas as condições foram observadas, testar mais 20 unidades. O produto passa no teste
se não mais que uma unidade em 30 estiver fora da faixa entre 85,0% e 115,0% VR e
nenhuma unidade estiver fora da faixa entre 75,0% a 125,0% VR e, o DPR das 30 unidades
testadas não exceder 7,8% (FARMACOPÉIA, 1988).
Os valores de porcentagem de VR e DPR encontrados para os comprimidos preparados
com DS de sinvastatina e PEG testados estão de acordo com os limites especificados na F.
Bras. IV. Entretanto, os comprimidos com DS de PVP não passaram no teste, pois duas
117
unidades estavam fora da faixa especificada e o DPR encontrado foi maior que 6,0%
(Tabela 36).
Os resultados obtidos, em desacordo com as especificações, nos testes de determinação de
peso, de doseamento e de uniformidade de conteúdo para os comprimidos de DS de
sinvastatina com PVP eram esperados devido à degradação da sinvastatina durante o
preparo da DS e devido à baixa compressibilidade e fluidez da mistura de pós utilizada na
preparação de tais comprimidos.
5.3.6.6 Perfil de dissolução
Os estudos de dissolução são ferramentas importantes para prever a performance in vivo,
para assegurar a qualidade lote a lote de medicamentos, para o desenvolvimento e seleção
de novas formulações e para assegurar a contínua qualidade e performance do
medicamento depois de certas alterações na formulação ou no processo de fabricação (U.S.
FOOD, 1997; MANADAS, 2002).
Para o processo de desenvolvimento e seleção de novas formulações deve-se trabalhar
com condições que apresentam poder discriminativo e que sejam capazes de apontar
diferenças entre as formulações. No caso de fármacos pouco solúveis como a sinvastatina,
pode ser necessária a adição de surfactantes para favorecer a solubilização. Embora a
concentração de surfactante seja adequada para o propósito de controle de qualidade do
produto, isso claramente, não é suficiente para prever sua dissolução in vivo. Há
necessidade de mais pesquisas para o desenvolvimento uniforme de meios de dissolução
que mimetizem as condições fisiológicas (YU et al.; 2002; PHARMACOPEIAL, 2004).
Para avaliação dos perfis de dissolução, além dos parâmetros mais freqüentes como a
determinação do tempo necessário para dissolução uma fração do teor rotulado e a
determinação da fração liberada após um período de tempo pré-estabelecido, a ASC e a
porcentagem de ED também são parâmetros úteis, uma vez que determina-se não apenas a
quantidade liberada ao fim de um determinado tempo, mas também a cinética de liberação
(MANADAS, 2002).
A curva analítica para quantificação de sinvastatina liberada no meio de dissolução (solução
tampão de fosfato de sódio monobásico pH 7,40 com 0,3% de LSS) por EDU (2ª derivada, λ
248 nm) está apresentada na Figura 47.
118
y = 0,0047x - 0,0004
r = 0,9999
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Concentração (
µ
µµ
µ
g/mL)
2
a
derivada 248 nm
Figura 47 - Curva analítica para avaliação do perfil de dissolução da sinvastatina por EDU
(2ª
derivada, λ 248 nm, solução tampão de fosfato de sódio monobásico pH 7,40 com 0,3% de LSS).
A equação da reta e o DPR da regressão obtidos para o perfil de solubilidade foram y =
0,0047x - 0,0004, 0,40%, respectivamente. O coeficiente de correlação de Pearson (r)
obtido, 0,9999, foi satisfatório (r>0,99). O valor p da inclinação (2,07x10
-29
) foi significativo no
nível de 5% de significância, indicando que a resposta é linear na faixa de concentração
estudada. O intercepto obtido foi significativo (valor p do intercepto igual a 0,0008), porém
corresponde a, apenas, 0,97% da resposta média da concentração de trabalho. Em uma
revisão sobre validação realizada por Green (1996), recomenda-se que o valor de
intercepto, quando o mesmo é significativo, corresponda a menos que 2,0% da resposta
média alvo.
Os limites de detecção e quantificação obtidos para a equação da reta estimados de acordo
com a fórmula apresentada no item 4.2.2.6 foram 0,057 µg/mL e 0,174 µg/mL.
Os perfis de dissolução foram realizados em tampão fosfato, pH 7,40, sem adição de LSS
no meio, a fim de verificar o efeito da DS no aumento da solubilidade da sinvastatina, sem a
interferência do tensoativo que, por si só, já facilitaria a dissolução. Os perfis de dissolução
foram realizados, também, em solução tampão com acréscimo de 0,3% ou 0,5% de LSS
para verificar possíveis diferenças nas porcentagens de estatina dissolvida entre as duas
concentrações de tensoativo.
Para os comprimidos preparados com DS de sinvastatina e PVP foi realizado o perfil de
dissolução apenas em tampão fosfato, pH 7,40 com 0,3% de LSS, sem o acréscimo de 15
minutos com velocidade das pás elevada por 15 minutos. A avaliação completa do perfil de
dissolução nos outros dois meios diferentes (tampão com 0,3% de LSS e com 0,5% de LSS)
119
não foi realizada, uma vez que os comprimidos preparados estavam em desacordo com os
testes de determinação de peso, doseamento e uniformidade de conteúdo.
Os resultados de porcentagem dissolvida de sinvastatina nos diferentes tempos e a curva do
perfil de dissolução nos três meios estudados estão apresentados nas Tabelas 37 e 38 e
nas Figuras 48 a 50, respectivamente.
Tabela 37 - Resultados
a
das porcentagens de liberação de sinvastatina, em tampão pH 7,4,
sem adição de tensoativo, por EDU, 2ª ordem, λ 248 nm.
% média sinvastatina dissolvida (DPR %)
5 min 10 min 15 min 30 min 60 min 75 min
Comprimidos DS
sinvastatina:PEG6000
(n = 12)
1,91
(21,59)
3,15
(19,94)
4,14
(17,35)
6,11
(18,66)
9,17
(17,25)
12,68
(21,17)
Zocor® (n = 6)
b
2,04
(29,19)
3,02
(13,90)
3,87
(19,73)
4,25
(9,75)
4,97
(3,98)
a
condições
:
pás, 50 rpm de 0 a 60 minutos e 150 rpm de 60 minutos a 75 minutos.
b
valor abaixo do limite de quantificação.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
tempo (min)
% de sinvastatina dissolvida
Zocor
comprimidos DS
sinvastatina:PEG6000
Figura 48 - Curva de perfil de dissolução dos comprimidos preparados com DS
sinvastatina:PEG6000 (10 mg) e do Zocor® (10 mg), em tampão de NaH
2
PO
4
pH 7,40, sem adição
de LSS.
120
Tabela 38 - Resultados
a
das porcentagens de liberação de sinvastatina, em tampão
NaH
2
PO
4
pH 7,40 com 0,3% de LSS ou com 0,5% de LSS.
% média sinvastatina dissolvida (DPR %)
Comprimidos DS
sinvastatina:PEG6000
Comprimidos DS
sinvastatina:PVP
Zocor®
Tempo
(min)
LSS 0,3%
(n = 12)
LSS 0,5%
(n = 6)
LSS 0,3%
(n = 6)
LSS 0,3%
(n = 6)
LSS 0,5%
(n = 6)
5
13,64
(14,14)
13,34
(24,19)
12,16
(7,86)
11,70
(64,17)
14,50
(24,03)
10
23,03
(10,17)
23,51
(14,46)
22,70
(4,08)
58,21
(18,72)
60,10
(14,76)
15
30,36
(10,81)
33,47
(11,87)
30,96
(1,86)
83,91
(6,79)
84,57
(5,28)
30
49,49
(16,26)
49,73
(11,6)
51,02
(4,85)
90,41
(1,53)
92,37
(2,29)
60
79,88
(14,26)
83,56
(20,11)
77,30
(3,72)
91,16
(3,02)
93,74
(1,66)
75
b
95,77
(5,88)
105,25
(9,50)
b
91,36
(1,47)
93,55
(1,09)
a
condições do perfil de dissolução conforme descrito na Tabela 37.
b
etapa não realizada para os comprimidos DS sinvastatina:PVP.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
tempo (min)
% de sinvastatina dissolvida
Zocor
Comprimidos DS sinvastatina:PEG
Comprimidos DS sinvastatina:PVP
Figura 49
- Curva de perfil de dissolução de comprimidos preparados com DS de PEG ou PVP e do
Zocor® (10 mg), em tampão de NaH
2
PO
4
pH 7,40 com 0,3% de LSS.
121
Os resultados de ASC e ED estão apresentados na Tabela 39.
Tabela 39 - Resultados de ASC e porcentagem de ED dos perfis de dissolução calculados
de 0 a 60 minutos de comprimidos contendo sinvastatina (10 mg).
Comprimidos DS
sinvastatina:PEG
Comprimidos DS
sinvastatina:PVP
Zocor®
1 2 3 2 1 2 3
ASC 341,7 2799,0 2891,0 2791,0 196,3 4590,0 4703,0
ED (%) 5,69 46,65 48,18 46,52 3,27 76,50 78,38
1: Tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40, sem adição de tensoativo.
2: Tampão com 0,3% de LSS.
3: Tampão com 0,5% de LSS.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
tempo (min)
% de sinvastatina dissolvida
Zocor (LSS 0,3%)
Zocor (LSS 0,5%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
tempo (min)
% de sinvastatina dissolvida
Comprimidos DS
sinvastatina:PEG
(LSS 0,3%)
Comprimidos DS
sinvastatina:PEG
(LSS 0,5%)
Figura 50
- Comparação dos perfis de dissolução do (a) medicamento referência e dos (b)
comprimidos com DS de PEG em tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40 e 0,3% de LSS com os respectivos perfis
de dissolução em tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40 e 0,5% de LSS.
(a)
(b)
122
A maior velocidade de rotação (150 rpm) provocou um acréscimo de 38% para os
comprimidos com DS de PEG e de 17% para o medicamento referência em tampão sem
surfactante e, de 20% e 26% para os comprimidos com DS de PEG nos meios com 0,3% e
0,5% de LSS, respectivamente. Esse aumento na porcentagem de dissolução com o
aumento da velocidade de rotação das pás não foi observado para o medicamento
referência nos meios com 0,3% ou 0,5% de LSS, uma vez que em 60 minutos 93,74% do
valor rotulado de sinvastatina já havia dissolvido (Tabela 38).
Nos perfis de dissolução realizados em tampão NaH
2
PO
4
pH 7,40, sem adição de LSS
(Figura 48) observaram-se liberação maior de sinvastatina a partir dos comprimidos
preparados com DS de PEG, assim como maiores valores de ASC e porcentagem de ED
(Tabela 39) do que aqueles obtidos para o medicamento referência. Esses resultados
indicam que a DS, por si só, favoreceu a solubilização da sinvastatina sem a influência de
surfactante.
Nos perfis de dissolução com 0,3% de LSS observou-se maior liberação de sinvastatina a
partir do medicamento referência e perfis semelhantes dos comprimidos com DS de PVP e
com DS de PEG6000. A ASC e porcentagem de ED para os comprimidos contendo DS de
PVP ou PEG6000 foram semelhantes entre si (ASC: 2791 e 2799; ED: 46,52% e 46,65%,
respectivamente) e menores quando comparados com o Zocor® (4590, 76,50%,
respectivamente) (Figura 49 e Tabela 39).
A baixa porcentagem de ED dos comprimidos com DS de PVP pode ser explicada (Tabela
38), entre outros fatores, devido ao seu teor abaixo do limite especificado na monografia de
sinvastatina comprimidos da USP32 (90,0% a 110,0% VR) (THE UNITED, 2009).
A velocidade de dissolução de sinvastatina a partir dos comprimidos com DS de PVP e
PEG6000, em tampão com 0,3% ou com 0,5% de LSS, é praticamente constante durante
todo o tempo estudado, enquanto que para o medicamento referência foi observado uma
liberação rápida da sinvastatina com mais de 80% em 15 minutos e máximo de liberação em
30 minutos nos dois meios citados (Figuras 49 e 50; Tabela 39).
Apesar dos comprimidos contendo DS de PEG6000 não terem atingido o mínimo de
liberação especificado na monografia de sinvastatina comprimidos da USP32 (mínimo de
75% + 5% em 30 minutos), os mesmos apresentaram, em 60 minutos, 83,56% de
dissolução em tampão com 0,5% de LSS (Figura 50 e Tabela 39), resultado explicado pelo
perfil de liberação mais lento. Sugere-se a realização de coletas em dois tempos, uma coleta
123
em 15 minutos para incluir uma faixa de dissolução e outra em 30, 45 ou 60 minutos para
assegurar 85% de dissolução, de acordo com recomendações do FDA para fármacos pouco
solúveis ou insolúveis em água e de alta permeabilidade (U.S. FOOD, 1997; THE UNITED,
2009).
A liberação gradual da sinvastatina observada a partir dos comprimidos contendo DS de
PEG6000 nos três meios estudados pode estar relacionada à formação de uma solução
viscosa em razão da presença de PEG de alto peso molecular, conforme relatado por
Anguiano-Igea e colaboradores (1995) na dissolução de DS de clofibrato com PEG de
diferentes pesos moleculares. Apesar da alta viscosidade do meio retardar a liberação do
fármaco, esse fenômeno pode reduzir a velocidade de cristalização do fármaco e/ou
favorecer a formação de cristais de tamanho muito reduzido, o que, em ambos os casos,
facilita a sua dissolução (FORD, 1986; ANGUIANO-IGEA, 1995).
Não foram observados incrementos significativos entre as porcentagens de liberação de
sinvastatina a partir do medicamento referência no meio com 0,3% de LSS, em relação ao
meio contendo 0,5% de LSS. Em contrapartida, observaram-se incrementos significativos da
porcentagem de liberação de sinvastatina a partir dos comprimidos com DS de PEG6000 no
meio contendo 0,5% de LSS, em comparação com o meio contendo 0,3% de LSS nos
tempos 60 e 75 minutos (Tabela 39 e Figura 50).
Considerando-se que em 60 minutos os comprimidos com DS de PEG atingem o mínimo de
dissolução especificado na monografia de sinvastatina da USP32, em tampão LSS 0,5%, os
mesmos apresentam a vantagem em relação ao medicamento referência de liberarem a
sinvastatina de forma gradual, conseqüentemente, proporcionar manutenção mais
prolongada do pico plasmático.
5.3.7 Teste in vivo
O teste in vivo foi realizado para fins de comparação da eficácia terapêutica da sinvastatina,
da DS de sinvastatina e PEG6000 (1:5), do medicamento referência (Zocor
®
) e dos
comprimidos fabricados com a mesma DS, por meio da verificação da redução de colesterol
plasmático em camundongos alimentados com dieta rica em colesterol (2%).
No presente estudo, os camundongos foram divididos em cinco grupos conforme o
tratamento aplicado. O grupo controle recebeu apenas o veículo, solução de
124
carboximetilcelulose a 1% em solução salina, o grupo referência foi tratado com sinvastatina
pura, o terceiro grupo foi tratado com DS (grupo DS), o quarto grupo foi tratado com o
medicamento referência (grupo Zocor®) e o quinto grupo recebeu tratamento com os
comprimidos desenvolvidos (grupo comprimidos DS). As concentrações plasmáticas de
colesterol total (CT), medidas por meio de fitas especificas, estão apresentadas na Tabela
40.
Os resultados de CT obtidos, nas três dosagens realizadas, foram homogêneos e
apresentaram valores de DPR até 9,67% (Tabela 40). Após sete dias com dieta
hiperlipêmica e sem tratamento, os níveis de CT aumentaram na faixa de 4,85% a 7,67%. A
porcentagem de aumento de CT obtida após dieta hiperlipêmica foi baixa comparada aos
valores encontrados na literatura de até 47% como relatado por Ambike e colaboradores
(2005).
A Tabela 41 foi construída com base nas porcentagens de alteração de CT após sete dias
com tratamento hipolipêmico em relação ao CT inicial (com dieta e sem tratamento). A
porcentagem de alteração foi calculada conforme a fórmula:
( ) ( )
( )
100x
CT
CTCT
antes
antesapós
−
,
em que: CT
(após)
, concentração plasmática de colesterol total após tratamento hipolipêmico;
CT
(antes)
, a concentração de colesterol plasmático total antes do tratamento hipolipêmico.
A comparação das médias por meio do teste de Tukey após a análise de variância (ANOVA)
não mostrou diferença estatisticamente significativa entre as médias de CT obtidas para os
grupos antes e após os tratamentos hipolipêmicos ou administração de veículo, no caso do
grupo controle (Tabela 41).
Apesar dos valores baixos de DPR apresentados para as médias de colesterol plasmático
nas três dosagens realizadas (Tabela 40), houve grande variação nos resultados de
porcentagens de alteração de colesterol (Tabela 41). Em todos os grupos foram observados
efeitos de redução e de aumento de CT, o que gerou uma grande variação nos resultados e,
consequentemente, valores de DPR muito altos. Essa grande variação pode ser explicada
pela variabilidade de metabolismo entre os camundongos e pelo fato da dieta não ter sido
eficaz em aumentar o CT dos animais nos 7 dias antecedentes ao tratamento.
125
Tabela 40 - Concentração plasmática de colesterol em camundongos em três períodos:
colesterol basal (antes de iniciar o estudo), colesterol após 7 dias com dieta hiperlipêmica e
após 7 dias com tratamento hipolipêmico e dieta continuada.
CT basal (mg/dL)
n Controle Referência DS
Zocor
®
Comprimidos DS
1 183,0 183,0 179,0 185,0 184,0
2 186,0 178,0 185,0 186,0 187,0
3 179,0 184,0 177,0 180,0 188,0
4 181,0 189,0 175,0 186,0 185,0
5 174,0 184,0 176,0 186,0 173,0
6 181,0 187,0 188,0 178,0 181,0
Média 180,7 184,2 180,0 183,5 183,0
DPR 2,5 2,0 2,9 1,9 3,0
CT (mg/dL) após 7 dias com dieta hiperlipêmica
1 189,0 192,0 181,0 188,0 191,0
2 189,0 187,0 186,0 192,0 196,0
3 186,0 183,0 190,0 194,0 192,0
4 181,0 187,0 191,0 188,0 188,0
5 232,0 221,0 229,0 199,0 195,0
6 188 189 181,0 193,0 191,0
Média 194,0 193,2 193,0 192,0 192,1
DPR 9,67 7,2 9,4 2,15 1,52
CT (mg/dL) após 7 dias com tratamento hipolipêmico
1 194,0 195,0 191,0 194,0 192,0
2 204,0 192,0 196,0 198,0 213,0
3 192,0 192,0 189,0 193,0 174,0
4 193,0 198,0 195,0 198,0 186,0
5 200,0 213,0 193,0 191,0 196,0
6 179,0 185,0 181,0 168,0 193,0
Média 193,67 195,8 190,8 190,33 192,3
DPR 4,4 4,8 2,9 5,9 6,6
126
Tabela 41 - Porcentagem de alteração de colesterol
a
após 7 dias com tratamento
hipolipêmico com sinvastatina sob diferentes formas (n=6).
Porcentagem de alteração de CT basal após tratamento hipolipêmico (%)
n Controle Referência DS Zocor
Comprimidos DS
sinvastatina:PEG
1 2,65 1,56 5,52 3,19 0,52
2 7,94 2,67 5,38 3,13 8,67
3 3,23 4,92 -0,53 -0,52 -9,38
4 6,63 5,88 2,09 5,32 -1,06
5 -13,79 -3,62 -15,72 -4,02 0,51
6 -4,79 -2,12 0,00 -12,95 1,05
Média 0,31 1,55 -0,54 -0,98 0,05
DPR 2651,90 244,04 1451,79 690,30 10862,47
a
valores negativos significam que houve redução do CT após o tratamento.
A fim de minimizar essa variação foram retirados dois camundongos de cada grupo com
valores extremos de porcentagem de redução (valores negativos de CT) ou de aumento
(valores positivos de CT) após tratamento hipolipêmico. Os resultados apresentados após
esse tratamento estão apresentados na Tabela 42 e Figura 51.
Tabela 42 - Porcentagem de alteração de colesterol
a
após 7 dias com tratamento
hipolipêmico com sinvastatina sob diferentes formas (n=4).
Porcentagem de alteração de CT após tratamento hipolipêmico (%)
n Controle Referência DS Zocor
Comprimidos
de DS
1 2,65 1,56
b
b
0,52
2
b
2,67 5,38 3,13
b
3 3,23 4,92 -0,53 -0,52
b
4 6,63
b
2,09 5,32 -1,06
5
b b
b
-4,02 0,51
6 -4,79 -2,12 0,00
b
1,05
Média 1,93 1,76 1,74 0,98 0,25
Desvio
padrão
4,81 2,94 2,68 4,11 0,91
DPR 249,31 167,21 154,48 420,59 357,74
a
valores negativos significam que houve redução do CT após o tratamento.
b
valores extremos retirados para reavaliação.
127
Controle Referência DS Zocor
Comprimidos com DS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Controle
Referência
DS
Zocor
Comprimidos com DS
% de alteração de colesterol
Após a exclusão dos valores extremos em cada grupo, as médias continuam iguais, a 5% de
probabilidade, devido aos altos valores de desvios padrões obtidos. Entretanto, pela análise
do gráfico de médias de porcentagens de alteração e respectivos desvios padrões,
apresentado na Figura 51, observou-se uma tendência dos comprimidos com DS de
sinvastatina e PEG apresentarem uma maior eficácia terapêutica. Todas as porcentagens
de alteração foram positivas, ou seja, houve um aumento do CT após o tratamento
hipolipêmico, porém o grupo dos comprimidos com DS apresentou uma menor média de
alteração o que pode indicar que os mesmos foram eficazes em manter o CT, mesmo com
dieta hiperlipêmica contínua. Além disso, esse grupo apresentou um menor desvio padrão
(0,91) conferindo maior homogeneidade entre os resultados obtidos.
Figura 51
- Média de porcentagem de alteração de colesterol plasmático após 7 dias com
tratamento hipolipêmico para cada grupo avaliado.
O efeito esperado da sinvastatina em reduzir o CT em 25% a 45% dependendo da dose não
foi observado, possivelmente, devido ao fato da dieta hiperlipêmica não ter sido capaz de
aumentar significativamente o CT dos animais (GOODMAN, GILMAN, 2003). No estudo
conduzido por Ambike e colaboradores (2005) observou-se uma redução no CT, após 14
dias de tratamento, de 12,4% para o grupo tratado com sinvastatina e, de 24,12% para o
grupo tratado com DS (sinvastatina, PVP e aerosil), uma redução duas vezes maior em
relação a sinvastatina apenas.
128
Para um resultado conclusivo sobre a comparação da eficácia terapêutica da sinvastatina
em relação à DS sinvastatina:PEG6000 e do medicamento referência em relação aos
comprimidos desenvolvidos com DS, seria necessário repetir o estudo com um número
maior de animais por grupo, validar uma dieta que aumente consideravelmente o CT de
animais e investigar mais a respeito do tempo de tratamento.
129
6 CONCLUSÕES
O método analítico para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina por
CLAE apresentou seletividade, linearidade, precisão, exatidão e robustez na faixa de
concentração estudada e pode ser utilizado como indicativo de estabilidade.
O método analítico proposto para quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e
sinvastatina por EDU permitiu eliminar interferências de até 3% devido à excipientes.
Apresentou, também, seletividade, linearidade, precisão, exatidão e robustez adequados
com a vantagem de ser mais rápido, simples e de menor custo para a aplicação na rotina de
controle de qualidade de uma indústria farmacêutica.
Os métodos propostos por CLAE e EDU demonstraram ser estatisticamente equivalentes
para a quantificação de lovastatina, pravastatina sódica e sinvastatina.
As DS desenvolvidas com PVP, PEG4000 ou PEG6000 aumentaram a velocidade de
dissolução de sinvastatina com um efeito maior observado para a DS preparada com PVP
na proporção de 1:3 (estatina:polímero). Dentre as DS produzidas com PEG4000 ou 6000, o
efeito maior na solubilidade da sinvastatina foi observado com a DS 1:5 (estatina:PEG6000)
preparada pelo método misto.
Nos comprimidos desenvolvidos com DS sinvastatina:PEG6000 houve dissolução gradual
da sinvastatina durante o tempo estudado. Apesar da liberação mais lenta em relação ao
medicamento referência, os comprimidos atingiram o mínimo especificado para o teste de
dissolução, descrito na monografia de sinvastatina comprimidos da USP32, em 60 minutos.
Os resultados do teste in vivo não foram conclusivos e há necessidade de um novo
delineamento de estudo para posterior avaliação.
130
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138
APÊNDICE A -
Proposta de monografia de sinvastatina matéria-prima para a Farmacopeia
Brasileira
SINVASTATINA
Simvastatinum
H
CH
3
O
H
3
C
O
H
3
C
H
3
C
CH
3
O
H
HO
H
O
C
25
H
38
O
5
418,57
79902-63-9
Ácido 2,2-dimetilbutanoico (1S, 3R, 7S, 8S, 8aR)-1,2,3,7,8,8a-hexahidro-3,7-dimetil-8-[2-
[(2R, 4R)-tetrahidro-4-hidróxi-6-oxo-2H-piran-2-il]-etil]-1-naftalenil éster.
Contém, no mínimo, 98,0% e, no máximo, 102,0% de C
25
H
38
O
5
, em relação à substância
dessecada (THE UNITED, 2009).
DESCRIÇÃO
Características físicas.
Pó cristalino branco ou quase branco (EUROPEAN, 2009).
Solubilidade.
Praticamente insolúvel em água, muito solúvel em clorofórmio e
diclorometano, facilmente solúvel em metanol e etanol, muito pouco solúvel em n-hexano
(BUDAVARI, 2006; EUROPEAN, 2009).
Constantes físico-químicas
Faixa de fusão
(V.2.2):
135 ºC a 138 ºC (BUDAVARI, 2006).
139
Poder rotatório específico
(V.2.8): +285º a + 298º, em relação à substância dessecada
(THE UNITED, 2009).
Determinar em solução a 0,5% (p/V) em acetonitrila.
IDENTIFICAÇÃO
A.
O espectro de absorção no infravermelho (V.2.14) da amostra, dispersa em cloreto de
potássio, apresenta máximos de absorção somente nos mesmos comprimentos de onda e com
as mesmas intensidades relativas daqueles observados no espectro de sinvastatina SQR,
preparado de maneira idêntica (EUROPEAN, 2009; THE UNITED, 2009).
B.
O tempo de retenção do pico principal do cromatograma da
solução amostra
, obtida no
método B de
Doseamento
, corresponde àquele do pico principal da
solução padrão
.
(EUROPEAN, 2009; THE UNITED, 2009).
ENSAIOS DE PUREZA
Metais pesados
(V.3.2.3).
Método II
. No máximo 0,002% (20 ppm) (THE UNITED,
2009).
Perda por dessecação
(V.2.9). Determinar em 1 g da amostra, em estufa a vácuo a 60 ºC,
por 3 horas, até peso constante. No máximo 0,5% (THE UNITED, 2009).
Cinzas sulfatadas
(V.2.10).
Determinar em 1 g da amostra. No máximo 0,1% (THE
UNITED, 2009).
DOSEAMENTO
A.
Proceder conforme descrito em
Espectrofotometria de absorção no ultravioleta
(V.2.14). Pesar, exatamente, cerca, de 40 mg da amostra e dissolver em metanol. Completar o
volume para 100 ml com o mesmo solvente. Diluir, sucessivamente, em metanol, até
concentração 0,0008% (p/V). Preparar solução padrão na mesma concentração, utilizando o
mesmo solvente. Medir as absorvâncias das soluções resultantes em 238 nm, utilizando
metanol para ajuste do zero. Calcular o teor de C
25
H
38
O
5
. Alternativamente, considerar A
(1%, 1 cm) = 604, em 238 nm, em metanol.
140
B.
Proceder conforme descrito em
Cromatografia líquida de alta eficiência
(V.2.17.4).
Utilizar cromatógrafo provido de detector ultravioleta a 238 nm; coluna de 250 mm de
comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, empacotada com sílica quimicamente ligada a
grupo octilsilano (5
µ
m), mantida a 30 ºC; fluxo da fase móvel de 1,5 ml/minuto.
Fase móvel
: acetonitrila e ácido fosfórico 0,1% (V/V) (65:35).
Solução amostra
: dissolver quantidade exatamente pesada da amostra em acetonitrila para
obter solução a 0,4 mg/ml. Transferir 5 ml dessa solução para balão volumétrico de 50 ml e
completar o volume com acetonitrila, obtendo solução a 40
µ
g/ml.
Solução padrão
: dissolver quantidade exatamente pesada de sinvastatina SQR em
acetonitrila para obter solução a 0,4 mg/ml. Transferir 5 ml desta solução para balão
volumétrico de 50 ml e completar o volume com acetonitrila, obtendo solução a 40
µ
g/ml.
Procedimento
: injetar, separadamente, 10
µ
l das
soluções padrão
e
amostra
, registrar os
cromatogramas e medir as áreas dos picos. Calcular o teor de C
25
H
38
O
5
na amostra a partir das
respostas obtidas com as
soluções padrão
e
amostra
.
EMBALAGEM E ARMAZENAMENTO
Em recipientes bem fechados.
ROTULAGEM
Observar a legislação vigente.
CLASSE TERAPÊUTICA.
Antihiperlipidêmico.
141
APÊNDICE B -
Proposta de monografia de sinvastatina comprimidos para a Farmacopéia
Brasileira
SINVASTATINA COMPRIMIDOS
Contém, no mínimo, 90,0% e, no máximo, 110,0% da quantidade declarada de C
25
H
38
O
5
.
Os comprimidos podem ser revestidos.
IDENTIFICAÇÃO
A.
O tempo de retenção do pico principal do cromatograma da
solução amostra
, obtida no
método B de
Doseamento
,
corresponde àquele do pico principal da
solução padrão
.
CARACTERÍSTICAS
Determinação de peso
(V.1.1). Cumpre o teste.
Dureza
(V.1.3.1). Cumpre o teste.
Friabilidade
(V.1.3.2). Cumpre o teste.
Teste de desintegração
(V.1.4.1). Cumpre o teste.
Uniformidade de doses unitárias
(V.1.6). Cumpre o teste.
Procedimento para uniformidade de conteúdo
. Pesar, individualmente, e transferir cada
comprimido para balão volumétrico de 50 ml, adicionar não mais que 2 ml de água (não mais
que 4% da capacidade do balão volumétrico). Agitar até desintegração do comprimido.
Adicionar 35 ml de metanol, deixar em ultra-som por 15 minutos e completar o volume com o
mesmo solvente. Prosseguir conforme descrito no método A de
Doseamento
, a partir de
“Centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm...”.
142
TESTE DE DISSOLUÇÃO (V.1.5)
Meio de dissolução
: solução contendo lauril sulfato de sódio a 0,5% p/V e fosfato de sódio
0,01
M
. Dissolver 30 g de lauril sulfato de sódio e 8,28 g de fosfato de sódio monobásico em
6000 ml de água e ajustar o pH para 7,0 com solução de hidróxido de sódio 50% (p/V), 900
ml.
Aparelhagem
: pás, 50 rpm.
Tempo
:
30 minutos.
Procedimento
: após o teste, retirar alíquota do meio de dissolução, filtrar e diluir, se
necessário, com o meio de dissolução, até concentração adequada. Obter o espectro em
segunda derivada, automaticamente, por meio de software de diferenciação interno e medir a
amplitude máxima das soluções em 248 nm, utilizando meio de dissolução para ajuste do
zero. Alternativamente, obter o espectro na faixa de 200 a 300 nm, registrar as absorvâncias
com incrementos de 1 nm. Calcular a derivada em segunda ordem e medir a absorvância em
248 nm, utilizando o mesmo solvente para ajuste do zero. Calcular a quantidade de C
25
H
38
O
5
dissolvida no meio, comparando as leituras obtidas com a da solução de sinvastatina SQR na
concentração 0,0008% (p/V), preparada no mesmo solvente.
Tolerância
: não menos que 75% (T) da quantidade declarada de C
25
H
38
O
5
se dissolvem em
30 minutos (USP32).
DOSEAMENTO
A.
Proceder conforme descrito em
Espectrofotometria de absorção no ultravioleta
(V.2.14). Pesar e pulverizar 20 comprimidos. Transferir quantidade do pó para balão
volumétrico de capacidade adequada, adicionar metanol, até cerca de 70% da capacidade total
do balão volumétrico, e deixar em ultra-som por 15 minutos. Completar o volume com o
mesmo solvente. Centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm. Diluir volume adequado do
sobrenadante até concentração 0,0008% (p/V), utilizando metanol como solvente. Preparar
solução padrão na mesma concentração. Obter o espectro em segunda derivada,
automaticamente, por meio de software de diferenciação interno e medir a amplitude máxima
das soluções em 247 nm, utilizando metanol para ajuste do zero. Alternativamente, obter o
espectro na faixa de 200 a 300 nm, registrar as absorvâncias com incrementos de 1 nm.
Calcular a derivada em segunda ordem e medir a absorvância em 247 nm. Calcular a
quantidade de C
25
H
38
O
5
nos comprimidos, a partir das leituras obtidas.
B.
Proceder conforme descrito no método B de
Doseamento
da monografia de
sinvastatina
. Preparar a
solução amostra
como descrito a seguir.
Solução amostra
: pesar e pulverizar 20 comprimidos. Transferir quantidade do pó para
balão volumétrico de capacidade adequada, adicionar acetonitrila, cerca de 70% da
143
capacidade total do balão volumétrico, e deixar em ultra-som por 15 minutos. Completar o
volume com o mesmo solvente, homogeneizar e centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm. Diluir
volume adequado do sobrenadante até concentração 40
µ
g/ml, utilizando acetonitrila como
solvente.
Procedimento
: injetar, separadamente, 10
µ
l das
soluções padrão
e
amostra
, registrar os
cromatogramas e medir as áreas dos picos. Calcular a quantidade de C
25
H
38
O
5
nos
comprimidos a partir das respostas obtidas com as
soluções padrão
e
amostra
.
EMBALAGEM E ARMAZENAMENTO
Em recipientes bem fechados.
ROTULAGEM
Observar a legislação vigente.
ANEXO A -
Certificado de aprovação do CETEA
144
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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