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JONAS ALENCAR DE MATOS
ALTERAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLICOGÊNIO DURANTE O
DIA EM GLÂNDULAS SUBMANDIBULARES
E PARÓTIDAS DE RATOS
São Paulo
2009
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Jonas Alencar de Matos
Alteração da concentração de glicogênio durante o dia em
glândulas submadibulares e parótidas de ratos
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade de São
Paulo, para obter o título de Mestre, pelo
Programa de Pós-Graduação em
Odontologia.
Área de Concentração: Materiais
Dentários
Orientador: Prof. Dr. Fernando Neves
Nogueira
São Paulo
2009
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Matos JA. Alteração da concentração de glicogênio durante o dia em glândulas
submadibulares e parótidas de ratos [Dissertação de Mestrado]. São Paulo:
Faculdade de Odontologia da USP; 2009.
São Paulo, ___/___/2009
Banca Examinadora
1) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________
Titulação: _________________________________________________________
Julgamento: __________________ Assinatura: ___________________________
2) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________
Titulação: _________________________________________________________
Julgamento: __________________ Assinatura: ___________________________
3) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________
Titulação: _________________________________________________________
Julgamento: __________________ Assinatura: ___________________________
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha esposa Helena pelo apoio, carinho, companheirismo e
amor que nunca me faltou.
Aos meus pais, João e Ana que sempre me cuidaram com muito amor e carinho, me
criaram e sempre me motivaram em minha vida profissional. Obrigado por tudo!
AGRADECIMENTOS
Ao meus irmãos, Caio e Vitor, e toda minha família que sempre me
acompanharam durante bons e não tão bons momentos de minha vida.
Ao meu professor, orientador e amigo Fernando Neves Nogueira por me
orientar durante a pós graduação e pelos bons anos de convivência no laboratório
de Biologia Oral.
Agradeço muito a essa grande pessoa que é o professor José Nicolau que me
acolheu em seu laboratório e com paciência e sabedoria me instruiu antes e durante
esse trabalho. A grandeza do senhor começa pelo time de futebol do coração, de
um grande corinthiano só poderíamos esperar coisas boas. O senhor é um exemplo
a ser seguido e sempre será nosso grande mestre.
Ao amigo Douglas por toda dedicação ao laboratório, pelos ensinamentos
laboratoriais e outros mais. Pela companhia e amizade que renderam boas risadas
e ótimos momentos juntos.
A todos meus colegas e amigos de laboratório Walter, Fausto, Mariana, Emily,
Alyne, Flávia, Paula, Marcela, Ana Paula e Luana por fazerem desse laboratório um
lugar bom e agradável para se trabalhar.
Aos meus colegas de pós graduação por terem compartilhado os momentos
bons e difíceis da pós graduação.
Ao André, Maico e Andreia pela companhia, amizade e paciência pois me
aguentaram 6 anos durante a faculdade, me toleraram por mais algum tempo
durante a pós graduação.
Agradeço a todos os professores do Departamento de Materiais Dentários, aos
técnicos e funcionários por toda a ajuda e paciência. Obrigado a Professora Rosa
Helena Miranda Grande por toda dedicação a pós graduação e a Rosinha por toda
ajuda durante todo meu mestrado, não só a mim como para todos os pós
graduandos.
A todos que posso ter esquecido e que de maneira direta ou indireta fizeram
parte desse trabalho.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por
todo apoio financeiro a pesquisa realizada no laboratório de Biologia Oral inclusive
no projeto que essa dissertação fez parte.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo auxílio a esta dissertação com a bolsa de estudos.
Matos JA. Alteração da concentração de glicogênio durante o dia em glândulas
submadibulares e parótidas de ratos [Dissertação de Mestrado]. São Paulo:
Faculdade de Odontologia da USP; 2009.
RESUMO
As glândulas salivares são glândulas exócrinas que vertem seus produtos para
cavidade oral. As principais glândulas são as parótidas, sublinguais e
submandibulares sendo elas as responsáveis pela contribuição do maior volume de
saliva durante o processo de secreção que, assim como todas as atividades que
nosso corpo exerce, também dependem de energia. A secreção salivar consome
glicose e mobiliza o glicogênio para adquirir energia, e este processo pode sofrer
influencia de alguns fatores dentre eles o estado diabético e o ritmo circadiano. O
diabetes altera todo o metabolismo de carboidratos e diminui o fluxo salivar. Já o
ritmo circadiano promove uma alteração fisiológica no fluxo e composição da saliva
de acordo com o horário do dia. Desta forma o objetivo deste trabalho foi em um
primeiro momento observar o comportamento da concentração de glicogênio em
glândulas parótidas e submandibulares de ratos com diferentes idades e condições
alimentares em um determinado período do dia. Em um segundo momento observar
as alterações que ocorrem na concentração de glicogênio em ratos diabéticos
durante o dia. Na primeira fase do estudo foram utilizados ratos saudáveis com 21,
30 e 60 dias de vida, divididos em grupos alimentado e alimentados com restrição.
No grupo com restrição de alimento os animais ficaram restritos a alimentação
noturna (19 – 7 horas) desde 2 dias antes do sacrifício. Na segunda fase do estudo,
com ratos diabéticos, foram utilizados animais com 60 dias de vida e a indução do
diabetes foi realizada através de uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (65
mg/Kg p.c.). 30 dias após a indução os animais foram sacrificados. Em todos os
grupos o sacrifício foi realizado nos seguintes horários - 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19
horas. As glândulas submandibulares e parótidas foram removidas imediatamente
para posterior análise da concentração de glicogênio. Os dados foram analisados
estatisticamente pelos testes ANOVA e o teste de Tukey (p<0.05). Os resultados
obtidos com os animais normais mostra uma variação da concentração de
glicogênio durante o período analisado nas duas glândulas, sendo mais evidente
quando os ratos não foram submetidos a restrição de alimento. Nesta condição a
variação da concentração de glicogênio em glândulas parótidas pouco alterou
independente da idade. Nos animais diabéticos observamos um acúmulo de
glicogênio nas glândulas parótidas e uma diminuição da concentração de glicogênio
em submandibulares. Durante o período analisado também houve pouca variação
da concentração de glicogênio, assim como nos animais não diabéticos, sendo
evidente a menor interferência do ritmo circadiano no estado diabético. Esse estudo
nos mostrou que o ritmo circadiano interfere na concentração de glicogênio das
glândulas salivares parótidas e submandibulares de ratos durante o período
analisado e que a restrição de alimento durante o dia alterou a concentração de
glicogênio principalmente nas glândulas parótidas. Observamos também que no
estado diabético ocorre um acúmulo do glicogênio em glândulas parótidas e uma
diminuição nas glândulas submandibulares.
Palavras-Chave: Glândulas salivares, glicogênio, diabetes mellitus, ritmo circadiano
Matos JA. Variation of glycogen concentration in parotid and submandibular gland of
rats during the day [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade de
Odontologia da USP; 2009.
ABSTRACT
The secretory process is very important for oral health. The majors salivary glands
(parotid, submandibular and sublingual) are the most important for secretion of
saliva, for this activity the glands needs energy and a common way obtain is using
glucose from the mobilization of glycogen during the fast period. Because of the
importance of glycogen in this process, this study aimed to analyze the behavior of
glycogen concentration during the day (7 to 19 hours) in parotid, and submandibular
glands of rats. In the first moment the study was made with health male rats in
different ages (21, 30 and 60 days old), divided in a group with free access to food
and other group fed only during the night (19 to 7 hours). The second part of the
study was made using diabetic male rats to search for alterations caused by this
disease in glycogen concentration. All animals were killed during the day in different
hours (7, 9, 11, 13, 15, 17,19 hours), their glands were removed and clamped
between aluminium plates pre-cooled in dry ice. The frozen glands were then stored
at -80
o
C until analysis of glycogen concentration. The statistical analyses was made
using ANOVA test and Tukey (p<0,5). In the group of health rats we observed a
variation of the glycogen concentration during the period analyzed in both glands,
but it became more evident when the animals had free access to food. When they
were fed during the night the variation of the glycogen concentration in parotid
glands were not so evident. The results with diabetics rats showed a higher
accumulation of glycogen in parotid glands and a lower concentration of glycogen in
submandibular glands. In this period we could not see the variation of glycogen that
happen in health rats. This study showed that circadian rhythm modify the
concentration of glycogen in parotid and submandibular glands in health rats and the
restriction of food made alterations in glycogen concentration of parotid glands. In
diabetic rats was possible to see a higher concentration of glycogen in parotid and
lower concentration in submandibular gland compared with health rats.
Keywords: Salivary glands, glycogen, diabetes mellitus, circadian rhythm
SUMÁRIO
p.
1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 13
2 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................. 16
2.1 Glândulas salivares e secreção salivar........................................ 16
2.2 Metabolismo de glicogênio e as glândulas salivares................. . 18
2.2.1 metabolismo de glicogênio........................................................ ..... 18
2.2.2 o glicogênio nas glândulas salivares....................................... ....... 22
2.3 Diabetes mellitus e sua influência na cavidade oral................... 24
2.3.1 diabetes mellitus......................................................................... ... 24
2.3.2 interferência do diabetes nas glândulas salivares.................. ....... 25
2.3.3 diabetes e o glicogênio.............................................................. .... 28
2.4 Ritmo circadiano e a secreção salivar......................................... . 29
2.4.1 ritmo circadiano......................................................................... ..... 29
2.4.2 ritmo circadiano no processo de secreção salivar................. ........ 31
3 PROPOSIÇÃO ................................................................................... 32
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 33
4.1 Animais............................................................................................ 33
4.1.2 indução do diabetes.................................................................... ... 34
4.2 Obtenção das amostras................................................................. 34
4.3 Determinações................................................................................. 35
4.3.1 determinação da glicemia.......................................................... .... 35
4.3.2 determinação do glicogênio glandular..................................... ...... 35
4.4 Análise estatística.......................................................................... . 36
5 RESULTADOS ................................................................................... 37
5.1 Resultados em ratos normais com diferentes idades................ . 37
5.2 Resultados em ratos diabéticos................................................... . 40
6 DISCUSSÃO ...................................................................................... 54
6.1 Experimentos em ratos normais com diferentes idades............ 54
6.2 Experimento em ratos diabéticos................................................. . 60
7 CONCLUSÕES .................................................................................. 63
REFERÊNCIAS ..................................................................................... 64
13
1 INTRODUÇÃO
As glândulas salivares são glândulas exócrinas que vertem seus produtos
para cavidade oral formando na cavidade oral a saliva total. Elas estão distribuídas
na cavidade oral e podem ser classificadas em glândulas salivares maiores e
glândulas salivares menores. As glândulas salivares maiores se apresentam em três
pares, as parótidas, sublinguais e submandibulares, e são elas as responsáveis pelo
maior volume de saliva secretado para cavidade oral.
Para toda atividade que nosso corpo exerce ocorre a demanda por energia,
cuja fonte principal é a glicose. Em nosso organismo ela é convertida em adenosina
trifosfato (ATP), sendo utilizada pelas células de nosso corpo durante suas
atividades. Para os períodos de jejum nosso organismo armazena glicose na forma
de glicogênio, que nada mais é do que um polímero de glicose que é quebrado
quando ocorre à demanda por energia disponibilizando certa quantidade dessa
molécula. O glicogênio pode ser usado tanto para manutenção dos níveis glicêmicos
como faz o fígado, ou como fonte própria de energia de um órgão como fazem os
músculos. As glândulas salivares não funcionam de maneira diferente, elas
necessitam de energia para o processo de secreção e também mobilizam glicogênio
durante esse processo (NICOLAU; SASSAKI, 1983; SCHRAMM; BEN-ZVI;
BDOLAH, 1965), porém o metabolismo de carboidratos entre as glândulas possuem
suas particularidades (NICOLAU; SASSAKI, 1976).
O processo de secreção das glândulas salivares pode ser alterado por
diversos fatores. Entre eles podemos citar o estado diabético e o ritmo circadiano. O
14
ritmo circadiano, entre as suas várias interferências em nosso organismo ele altera
o fluxo salivar e a composição da saliva ao longo das 24 horas do dia, ocorrendo um
aumento durante o dia e caindo durante a noite, chegando a níveis próximos de
zero neste período (DAWES, 1972; DAWES, 1974; DAWES, 1975; MILLS, 1966).
O diabetes mellitus é uma desordem metabólica resultante de uma
deficiência na secreção de insulina ou uma redução da efetividade biológica dela, ou
ambos, que provoca um aumento da glicemia dando origem a algumas
complicações sistêmicas no organismo (KUZUYA et al., 2002). Os dois tipos mais
comuns são o Tipo I e Tipo II. O diabetes Tipo I acomete principalmente crianças e
jovens, o Tipo II já acomete mais pessoas adultas e principalmente com sobre peso.
O diabetes tipo I é causado por uma reação auto-imune e destruição nas células
das ilhotas de Lagerhans do pâncreas. O tipo II é causado por uma deficiência de
sensibilidade dos receptores de insulina ou deficiência na produção de insulina, os
dois tipos de diabetes estão associados a fatores genéticos e ambientais como
fatores etiológicos.
Entre as manifestações bucais associadas ao diabetes está a hiposalivação,
xerostomia, gengivite, periodontite, abcessos dentais e freqüentemente lesões na
mucosa e língua (DARNELL; SAUNDERS, 1990). As manifestações crônicas do
diabetes são retinopatias, insuficiência renal crônica, disfunção autonômica
sensitiva, motora e outras neuropatias, dificuldade de oxigenação dos tecidos que
podem levar a gangrenas, arteriosclerose, microanginas e macroangiopatias
(BROWNLEE; CERAMI, 1981). A xerostomia é a manifestação bucal
freqüentemente relatada por pacientes diabéticos, por esse motivo muitos trabalhos
tem a finalidade de estudar a influência do diabetes em glândulas salivares.
15
Em estudos com ratos diabéticos já foi descrito uma alteração no
metabolismo de glicogênio das glândulas salivares desses animais (NICOLAU et al.,
2005). Devido à íntima relação da degradação de glicogênio como fonte de energia
para a secreção salivar, a alteração da concentração desse polímero em glândulas
de ratos diabéticos e a interferência do ritmo circadiano nesse processo, tivemos
como objetivo verificar a alteração da concentração de glicogênio em glândulas
salivares parótidas e submandibulares de ratos com livre acesso ao alimento, ratos
com alimentação noturna e ratos diabéticos, durante o período do dia.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Glândulas salivares e secreção salivar
As glândulas salivares são glândulas exócrinas que vertem seus produtos
para cavidade oral formando, junto aos restos alimentares e células epiteliais
descamadas, a saliva total. As glândulas salivares podem ser classificadas como
maiores e glândulas salivares menores. As glândulas salivares menores estão
distribuídas em quase toda a cavidade oral, só não estão presentes na porção
anterior do palato duro e na gengiva inserida. As glândulas salivares maiores se
apresentam aos pares, distribuídas simetricamente na face, são elas as glândulas
sublinguais, parótidas e submandibulares. As glândulas salivares maiores são
responsáveis pela produção e secreção de 90% da saliva da cavidade oral e cada
uma delas contribuem com volumes diferentes dependendo do tipo de estímulo. A
saliva não estimulada é derivada principalmente das glândulas submandibulares
(SM) e sublingual (SL), já a saliva estimulada tem uma grande contribuição das
glândulas parótidas (PA) (PEDERSEN et al., 2002).
A redução do fluxo salivar pode ser decorrente de diversos fatores entre eles
estão algumas patologias como o diabetes e a ingestão de medicamentos
(SREEBNY; VALDINI; YU, 1989; SREEBNY et al., 1992; SREEBNY; SCHWARTZ,
1997). Essa diminuição da quantidade de saliva provocada pela deficiência do
17
processo de secreção das glândulas salivares pode implicar em um prejuízo à
cavidade oral já que é ela a maior responsável pela proteção desse meio. A sua
ausência causa grandes danos aos tecidos duros e moles presentes na boca
(AMERONGEN; VEERMAN, 2002) pois é ela quem lubrifica os tecidos bucais,
participa do processo de remineralização do dente, protege contra microorganismos,
além de participar no processo digestório e ser essencial para que tenhamos o
paladar inalterado. O paladar que também colabora com a secreção salivar pois é
um estímulo para a sua secreção (SPEIRS, 1971).
A saliva secretada por cada uma das glândulas possui características
distintas dependendo da unidade secretora predominante em seus ácinos: serosa
ou mucosa. As SL são glândulas com unidades secretoras predominantemente
mucosas porém possuem semiluas serosas, portanto a saliva produzida por elas é
caracterizada por uma secreção com pouco conteúdo enzimático, mas com
bastante quantidade de glicoproteínas com grandes cadeias de carboidratos,
caracterizando o muco. As SM são glândulas mistas que possuem os dois tipos de
unidades secretoras, porém as unidades serosas são predominante em relação as
mucosas. As PA são glândulas com unidades secretoras serosas caracterizando
uma secreção rica em proteínas e mais fluida (KATCHBURIAN; ARANÃ-CHAVES,
1999). A saliva primaria quando secretada pelos ácinos passa por uma sequência
de ductos até chegar na cavidade oral, iniciando pelo ducto granular, passando pelo
ducto intercalar chegando até o ducto excretor. Durante esse percurso sua
composição é alterada, havendo principalmente uma reabsorção de água, sódio e
cloro.
A secreção salivar realizada pelas glândulas salivares é controlada por
impulsos nervosos simpáticos e parassimpáticos, além deles alguns hormônios
18
também podem exercer controle sobre as glândulas para dar início ao processo de
exocitose e secreção de saliva (BAUM; COLPO; FILBURN, 1981). O estímulo
simpático produz uma saliva rica em muco e enzimas, enquanto o estímulo
parassimpático a saliva produzida é rica em água e eletrólitos (GARRETT;
ANDERSON, 1991).
2.2 Metabolismo do glicogênio e as glândulas salivares
2.2.1 metabolismo do glicogênio
Para todo tipo de atividade que nosso corpo exerce, seja ela física ou
fisiológica, é necessário energia. A forma como obtemos energia é através da nossa
alimentação e, após a digestão, ficam presentes no sangue grandes concentrações
de glicose que serão utilizadas como fonte de energia.
A glicose é uma molécula constituída por 6 átomos de carbonos, 12 átomos
de hidrogênios e 6 átomos de oxigênios (C
6
H
12
O
6
) que quando metabolizada
fornece energia na forma de adenosina trifosfato (ATP). O armazenamento da
glicose é muito importante pois mesmo nos períodos de jejum nosso corpo
necessita de energia e por isso nós armazenamos glicose na forma de um polímero
19
chamado de glicogênio. Ele é mobilizado nos períodos de jejum para disponibilizar a
glicose as células do nosso organismo, além de manter a glicemia nos períodos de
jejum.
O órgão que mais armazena glicogênio é o fígado, pois é ele o responsável
pela regulação da glicemia. Os músculos também armazenam grandes quantidades
de glicogênio, porém a sua utilização é voltada para fins próprios durante atividades
físicas. (FERRER et al., 2003)
O glicogênio possui um peso molecular de aproximadamente 10
7
Da,
apresenta uma cadeia aproximada de 1-11 resíduos de glicosil, sendo que uma
molécula de glicogênio tem cerca de 4000 cadeias de glicosil (LOMAKO; LOMAKO;
WHELAN, 1991). As cadeias lineares são feitas por ligações alfa-1,4 e as
ramificações por ligações alfa-1,6 (DEVLIN, 1998).
A síntese (glicogênese) e degradação (glicogenólise) do glicogênio ocorre
principalmente pela ação de duas enzimas, a glicogênio sintase e a glicogênio
fosforilase, respectivamente. A síntese de glicogênio sempre é realizada a partir de
um agente iniciador que pode ser o próprio glicogênio ou na sua ausência a
glicogenina. A partir do agente iniciador a glicogênio sintase passa a unir resíduos
de glicosil ao glicogênio através de ligações alfa-1,4 formando uma cadeia de
glicosil que quando passa a constituir 11 resíduos a enzima ramificadora quebra
esse ramo e o transfere para outra cadeia ramificando a molécula de glicogênio,
formando ligações alfa-1,6 (DEVLIN, 1998).
O controle e a regulação de síntese e degradação do glicogênio são
realizados por efetores alostérico e modificações covalentes. O ATP é um inibidor
alostérico, enquanto, o AMPc é um ativador. Esses dois efetores vão regular a
20
atividade da glicogênio fosforilase convertendo para forma ativa ou inativa. Os
responsáveis por essa interconverção é a fosforilase quinase e a fosfoproteína
fosfatase que também são reguladas pelos mesmos mecanismos.
Figura 2.1 – Mecanismo de regulação da enzima glicogênio fosforilase. (DEVLIN, 1998)
A glicogênio sintase também possui as formas ativa (desfosforilada) e inativa
(fosforilada) e estão sujeitas a regulação alostérica. A forma inativa é convertida
através de quinases que realizam a sua fosforilação, que por sua vez são reguladas
por segundos mensageiros da ação hormonal, incluindo AMPc. A desfosforilação é
realizada pela fosfoproteína fosfatase que tem como ativador a insulina (DEVLIN,
1998).
21
Figura 2.2 – Mecanismo da regulação da enzima glicogênio sintase (DEVLIN, 1998)
Existem outros reguladores como a insulina e o glucagon que são hormônios
produzidos pelas células beta e alfa do pâncreas, respectivamente, que além de
reguladores da síntese e degradação de glicogênio também exercem ações
importantes no metabolismo dos carboidratos. A insulina no fígado inibe a
glicogenólise e a conversão de ácidos graxos e aminoácidos a cetoácidos, e
também estimula a síntese de glicogênio e de triglicerídeos.
A insulina tem um pico de liberação durante o período pós prandial com
aumento da glicemia, sendo ela o primeiro mensageiro responsável pela entrada de
glicose nas células. O aumento de glicose no interior das células aumentara a
concentração de glicose-6-P (G6P), que é o substrato para glicogênio sintetase,
22
ocorrendo a síntese de glicogênio. Nas glândulas salivares a insulina modula os
níveis de AMPc causando uma diminuição de fosforilação em enzimas dependentes
de AMPc, assim alterando a atividade enzimática por mecanismos ainda não
esclarecidos.
O glucagon vai agir de maneira inversa, sendo liberado pelo pâncreas
quando a glicemia estiver baixa, aumentando o AMPc no fígado que promove a
ativação da proteína quinase dependente de AMPc e a conseqüente fosforilação da
fosforilase quinase para a ativação da glicogênio fosforilase (GP) iniciando a
glicogenólise. (DEVLIN, 1998)
2.2.2 o glicogênio nas glândulas salivares
Alguns estudos já mostraram o consumo de glicogênio pelas glândulas
salivares durante o processo de secreção (FAVA-DE-MORAES; NICOLAU, 1975;
NICOLAU; DE SOUZA; MARTINS, 1992; ROSSIGNOL et al., 1974). Foi observada
também a mobilização do glicogênio na produção de saliva estimulada nos grânulos
de secreção dos ductos granulares da SM de ratos, (GARRETT et al., 1994;
THOMOPOULOS; GARRETT; PROCTOR, 2002). Outros estudos mostraram que a
degradação do glicogênio em glândulas salivares é diferente dependendo do tipo de
estímulo simpático ou parassimpático, ocorrendo uma maior mobilização no
estímulo parassimpático (GARRETT; KIDD, 1975; GARRETT; ANDERSON, 1991).
23
O metabolismo de glicogênio apresenta algumas diferenças entres as
glândulas salivares. Em camundongos tratados com isoproterenol (IPR-agonista -
adrenérgico) o conteúdo de glicogênio se comportou de maneira diferente nas
glândulas salivares maiores (SM, SL e PA), sendo que após a sua administração o
glicogênio atingiu um valor mínimo em 2 horas na PA e em 6 horas na SM e SL.
Após 12 e 24 horas o glicogênio retornou os valores normais na PA e SL. Na SM
após 18 horas o glicogênio alcançou o dobro do glicogênio controle (FAVA-DE-
MORAES; NICOLAU, 1975).
Na SM de ratos tratados com pilocarpina (agonista muscarínico) foi possível
verificar uma recuperação do conteúdo de glicogênio após o estímulo. No estudo se
verificou que após 30 minutos da injeção ocorreu uma diminuição de 60% no
conteúdo de glicogênio, sendo que com o passar do tempo, 60 e 120 minutos após
a injeção, a diminuição foi de 35 e 22%, respectivamente, mostrando a recuperação
do glicogênio degradado, embora ainda não tenha alcançado níveis semelhantes ao
controle (NICOLAU; DE SOUZA; MARTINS, 1992).
24
2.3 Diabetes mellitus e sua influência na cavidade oral
2.3.1 Diabetes Mellitus
A incidência do diabetes no mundo vem aumentando consideravelmente no
decorrer dos anos devido a vários fatores, entre eles estão o aumento populacional,
expectativa de vida aumentada, maior número de sedentários e obesos (WILD et al.,
2004). O diabetes mellitus é uma manifestação clínica resultante de uma deficiência
absoluta ou relativa da insulina, provocando um aumento da glicemia dando origem
a algumas complicações sistêmicas no organismo.
Existem vários tipos de diabetes, porém os dois principais tipos são o tipo I e
o tipo II. O diabetes tipo I é causado por uma reação auto-imune e destruição nas
células das ilhotas de Lagerhans do pâncreas. O tipo II é causado por uma
deficiência de sensibilidade dos receptores de insulina ou deficiência na produção
de insulina, os dois tipos de diabetes estão associados a fatores genéticos e
ambientais como fatores etiológicos (MASHARANI, 2001).
O diabetes pode apresentar diversas manifestações clínicas, sendo as
principais a polifagia, poliúria, polidipsia e hálito cetônico causado pela presença de
corpos cetônicos no sangue que são eliminados na respiração. As manifestações do
diabetes causados pela hiperglicemia crônica são retinopatias, insuficiência renal
25
crônica, disfunção autonômica sensitiva, motora e outras neuropatias, dificuldade de
oxigenação dos tecidos que podem levar a gangrenas, arteriosclerose,
microanginas e macroangiopatias (BROWNLEE, 1994).
Os tratamentos utilizados para o diabetes são diversos, podendo ser feito
através do controle da dieta, administração de insulina, uso de agentes
hipoglicemiantes, ou pela integração desses tratamentos (MASHARANI;
RUSHAKOFF, 2009).
Os estudos com diabetes utilizando animais são realizados com drogas que
induzem o diabetes destruindo as células β do pâncreas, são elas a
estreptozotocina e aloxana (LENZEN, 2008).
O diabetes provoca uma grande quantidade de desordens metabólicas. Uma
delas é o aumento do estress oxidativo que no diabético está muito aumentado
havendo relação com algumas das complicações associadas a essa doença
(ROLO; PALMEIRA, 2006).
2.3.2 interferência do diabetes nas glândulas salivares
O diabetes atinge diversos órgãos, entre eles estão as glândulas salivares
que são os órgãos responsáveis pela secreção salivar e possuem grande
importância na manutenção da saúde bucal além de colaborar em outras funções da
26
cavidade oral como na fala e alimentação. As manifestações bucais associadas a
essa moléstia estão a hiposalivação, xerostomia, disfunções salivares e glandulares,
gengivite, periodontite, abcessos dentais, candidiase e freqüentemente lesões na
mucosa e língua (CARDA et al., 2006; DARNELL; SAUNDERS, 1990; SHIP, 2003).
A xerostomia é um sintoma frequentemente relatado por pacientes diabéticos
que pode ou não estar associado a hiposalivação, por esse motivo muitos trabalhos
tem a finalidade de estudar a influência do diabetes em glândulas salivares. Em
1981, Anderson e colaboradores mostraram que após 40 dias da indução do
diabetes em ratos ocorreu uma diminuição do peso corpóreo e glandular, da
atividade da enzima peroxidase e da proteína total na parótida e a aplicação da
insulina restaurou os parâmetros alterados até próximos aos níveis encontrados nos
animais controle. (ANDERSON; JOHNSON, 1981)
Em estudos realizados em humanos, percebemos que os sintomas, como a
xerostomia, estão presentes nos diabéticos, porém quanto ao fluxo salivar não se
tem um consenso da sua alteração. Esses estudos nos mostra que os resultados
obtidos são conflitantes, alguns encontram uma hipofunção e diminuição da
secreção nos diabéticos (BANOCZY et al., 1987; BEN-ARYEH et al., 1988;
BOWEN, 1987; CHAVEZ et al., 2000; HARRISON; KJELLMAN, 1970;
THORSTENSSON et al., 1989) e outros não observaram alterações (DODDS;
DODDS, 1997; MARDER; ABELSON; MANDEL, 1975; MEURMAN et al., 1998;
LAMEY; DARWAZEH; FRIER, 1992; NARHI et al., 1996; SHARON et al., 1985).
Estudos com animais diabéticos nos mostra alterações nas glândulas
salivares, porém quanto ao fluxo salivar os resultados permanecem conflitantes. Em
camundongos, após 2 semanas da indução do diabetes, ocorreu uma diminuição da
27
secreção de saliva total de aproximadamente 50% quando estimulada com
pilocarpina ou isoproterenol e não alterou quando estimulada com felinefrina
(MURAI et al. 1996) concordando com os dados obtidos por Vatta et al. (2002)
(VATTA et al., 2002), porém alguns estudos encontraram um aumento
(ANDERSON; GARRETT, 2004) e outros não encontraram alteração (WATANABE;
YAMAGISHI-WANG; KAWAGUCHI, 2001) do fluxo salivar.
O sistema antioxidante das glândulas salivares e da saliva, assim como no
resto do organismo, parece ser bastante afetado pelo estado diabético, porém cada
glândula responde de maneira distinta. As glândulas SM apresentaram um aumento
do conteúdo de malondialdeído, indicativo da peroxidação lipídica, e aumento da
glutationa reduzida e oxidada, enquanto que as PA apresentaram um aumento da
atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase (NOGUEIRA et al., 2005).
Em estudo com a saliva de pacientes diabetes do tipo 1 foi encontrado um aumento
da atividade das enzimas peroxidase, superóxido dismutase (SOD) e o status total
de antioxidante (TAS), havendo uma correlação da severidade e tempo de doença
com o aumento do estress oxidativo (REZNICK et al., 2006).
O metabolismo de carboidratos em glândulas salivares de ratos diabéticos a
literatura já mostrou ser alterado. Em um estudo foi observado que a atividade da
hexoquinase de glândulas PA e SM de ratos diabéticos apresentaram redução 30
dias após a indução estreptozotocina (NOGUEIRA; SANTOS; NICOLAU, 2005). Em
SM foi relatada aumento da atividade da enzima fosfofrutoquinase-1 (PFK-1),
redução da atividade da enzima fosfofrutoquinase-2 (PFK-2), bem como metabólito
frutose-2,6 bifosfato (Fru 2,6 P2), neste mesmo período experimental. Nenhuma
diferença na atividade destas enzimas foi encontrada na PA (NICOLAU; SOUZA;
NOGUEIRA, 2006).
28
2.3.3 Diabetes e o glicogênio
A interferência do diabetes no metabolismo de carboidratos é bem evidente.
Estudos com adultos diabéticos tipo 1 e com controle moderado da doença mostrou
uma redução de 30% no armazenamento de glicogênio em fígado (HWANG et al.
1995), porém em outro estudo com jovens portadores do diabetes tipo 1, ocorreu
uma diminuição do armazenamento, porém sem diferença estatisticamente
significante (MATYKA et al., 2001), o que pode ser explicado pelas diferentes
metodologias adotadas, tempo do indivíduo com a doença e a própria diferença de
idade entre os participantes de cada estudo.
Nas glândulas salivares de ratos diabéticos sacrificados 60 dias após a
indução por estreptozotocina, foi observada uma maior concentração de glicogênio
nas PA (130%), e nas SM (27%) quando comparadas com os ratos controle. A
enzima glicogênio fosforilase em SM reduziu sua atividade em aproximadamente
68%, enquanto que nas PA essa redução foi de 79%. A glicogênio sintase
aumentou sua atividade em pelo menos 64% nas SM e 75% nas PA (NICOLAU et
al., 2005).
Na literatura não encontramos muitos trabalhos que mostrem uma alteração
no metabolismo de glicogênio em glândulas salivares com animais no estado
diabético, porém os poucos trabalhos que existem sugerem a existência de um
comprometimento.
29
2.4 Ritmo circadiano e a secreção salivar
2.4.1 ritmo circadiano
Devido aos movimentos da Terra somos submetidos a períodos de claro e
escuro que juntos compõem as 24 horas do dia. A variação desses períodos ocorre
em cada época do ano onde observamos dias mais longos durante o verão, que se
tornam gradualmente mais curtos conforme chega o inverno. Quando esses ciclos
de presença e ausência de luz são determinados por nosso organismo, é
estabelecido um ritmo biológico particular de cada indivíduo conhecido como ritmo
circadiano (MILLS, 1966).
A determinação do ritmo circadiano se dá pelo núcleo supraquiasmático,
localizado na porção anterior do hipotálamo através da sensibilização pela luz de
fotoreceptores localizados na retina (SKENE et al., 1999). Ao estabelecer esse ritmo
ele interfere na secreção de diversas substâncias endógenas do nosso organismo
entre elas estão a melatonina e o cortisol (BERRA; RIZZO, 2009; SKENE;
LOCKLEY; ARENDT, 1999), que também são usados em estudos como
marcadores de alterações no ritmo circadiano e do estresse, respectivamente.
Alguns trabalhos já mostraram a variação circadiana de alguns hormônios como
insulina, glucagon, interferindo assim no metabolismo dos carboidratos (RUITER et
al., 2003) e da própria glicemia (LA FLEUR, 2003).
30
Qualquer variação na duração dos ciclos de claro e escuro podem interferir
em nosso ritmo circadiano, por esse motivo povos que vivem próximos aos trópicos,
onde os períodos de dia e noite são praticamente iguais durante todo o ano
possuem um ritmo circadiano bem definido, sem grandes alterações entre as
diferentes estações climáticas do ano. Povos que vivem perto dos pólos, onde há
grandes mudanças durante o ano na duração do dia e da noite, possuem um ritmo
diferente que se ajusta conforme o dia vai aumentando ou diminuindo.
A alteração rápida desses ciclos é muito estudada e ocorre principalmente
quando viajamos longas distâncias, cruzando diversas faixas do fuso horário de
uma vez, não dando tempo para que nosso ritmo circadiano seja ajustado. Os
sintomas desse desajuste do nosso relógio biológico são insônia, preguiça,
distúrbios gastrointestinais entre outros. Essa desordem foi denominada jet lag
(SACK, 2009).
2.4.2 Ritmo circadiano no processo de secreção salivar
O ritmo circadiano atua em diversos processos fisiológicos. Na cavidade oral
podemos observar sua interferência na alteração da concentração de várias
substâncias da saliva (DAWES, 1974).
Uma das alterações de grande relevância na cavidade oral é a variação do
fluxo salivar, aumentando seu volume durante o dia, atingindo um pico durante à
31
tarde e caindo a níveis perto de zero durante a noite, quando estamos dormindo
(DAWES, 1974). A significativa diminuição da secreção salivar durante a noite pode
estar relacionada a variação circadiana de um outro hormônio, o hormônio anti-
diurético (KAKKAR et al., 1997), que Junqueira, Fava-de-Moraes e Toledo (1967)
mostraram que a sua injeção em humanos provoca a diminuição do fluxo salivar
(JUNQUEIRA; FAVA-DE-MORAES; TOLEDO, 1967). Outros estudos mostraram
que sua concentração é aumentada durante a noite (MILLS, 1966).
Dawes em 1972 mostrou que a composição salivar e a temperatura bucal,
assim como o fluxo salivar, também se altera conforme o ritmo circadiano, variando
conforme a hora do dia analisada (DAWES, 1972). Outro estudo mostra também
que o fluxo salivar também varia de acordo com a época do ano seguindo um ritmo
circanual (KARIYAWASAM; DAWES, 2005).
Esses trabalhos mostraram a importância da padronização de um horário nos
estudos que são realizados na cavidade oral e seus produtos.
32
3 PROPOSIÇÃO
O glicogênio é uma molécula utilizada para armazenar glicose e é utilizado
como fonte de energia durante os períodos de jejum. Nas glândulas salivares ele
está envolvido no processo de secreção salivar ocorrendo sua degradação para
obtenção de energia. Sabendo que o processo de secreção salivar é alterado
durante o dia devido ao ritmo circadiano, decidimos examinar a variação da
concentração de glicogênio em glândulas parótidas e submandibulares de ratos, no
primeiro momento com diferentes idades e em diferentes condições alimentares, e
em uma segunda etapa com ratos diabéticos.
33
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
O presente estudo foi realizado em duas etapas. Na primeira etapa foi
verificado a concentração de glicogênio em glândulas salivares de ratos normais,
durante o dia, com diferentes idades (21, 30 e 60 dias de vida), e em diferentes
condições alimentares. Na segunda etapa foi analisada a concentração de
glicogênio em glândulas salivares de ratos diabéticos durante 30 dias.
Foram usados ratos da raça wistar, os animais normais foram divididos em
21, 30 e 60 dias de vida. Dentro dessas idades, eles foram subdivididos em um
grupo com livre acesso ao alimento e outro grupo restrito a alimentação noturna,
onde 2 dias antes do sacrifício a alimentação dos ratos era restrita ao período
noturno (19 as 7 horas). O sacrifício de todos os grupos foi feito em um período de
12 horas (7 as 19 horas) com intervalo de 2 horas entre eles, obtendo assim grupos
das 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 horas.
34
4.1.2 indução do diabetes
No grupo diabético foram utilizados ratos com 60 dias de vida e a indução do
diabetes foi realizada através de uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (65
mg/Kg p.c.) dissolvido em tampão citrato de sódio 0,1M pH 4,5 após um jejum de
aproximadamente 15 horas. Foram considerados diabéticos os animais que
apresentaram glicemia em jejum igual ou superior a 250 mg de glicose/dL de
sangue. Após 30 dias os animais foram sacrificados e a glicemia mensurada no
momento do sacrifício. O sacrifício foi realizado as 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 horas.
4.2 Obtenção das amostras
Após a anestesia com pentobarbital sódico (50 mg/Kg p.c.) e hidrato de cloral
(400 mg/Kg p.c.) os ratos foram sacrificados por destroncamento cervical e as
glândulas salivares imediatamente removidas, limpas de tecido aderente, prensadas
em lâminas de alumínio previamente resfriadas em gelo seco e armazenadas em
freezer -80
o
C até o momento das análises.
35
4.3 Determinações
4.3.1 determinação da glicemia
A glicemia foi determinada através do glicosímetro Accu-Chek Advantage II
(Roche).
4.3.2 determinação do glicogênio glandular
A determinação da concentração do glicogênio glandular foi realizada de
acordo com o método proposto por Singh e Venkitasubramanin (1976). Foram
utilizados aproximadamente 60mg de tecido glandular para as análises, que foram
digeridas em hidróxido de potássio 30% em banho fervente por 30 minutos. Após a
digestão, o isolamento do glicogênio foi realizado através da adição de solução de
sulfato de sódio (Na
2
SO
4
) saturada em etanol 95%. A mistura foi mantida em
ambiente a 4
o
C por 15 minutos, centrifugada a 3020g (5000 RPM) por 20 minutos e
o sobrenadante desprezado. Durante o processo de purificação do glicogênio
isolado foi utilizado ácido tricloroacético (TCA) 5% como reagente desproteinizante,
etanol absoluto, solução etanol/éter 3:1 e finalmente éter sulfúrico. Entre cada
tratamento o material foi centrifugado a 3020g por 20 minutos sendo o sobrenadante
descartado e o precipitado utilizado. O sedimento de glicogênio foi diluído em água
36
e a dosagem do glicogênio foi realizada através de uma titulação com reagente de
antrona 0,2% em ácido sulfúrico concentrado e levado ao banho-maria em água
fervente por 10 minutos. Para todo o experimento foi utilizado um padrão de glicose
(1mg/mL) durante as análises. Após o banho a amostra foi resfriada e levada ao
espectrofotômetro Beckman DU 68, onde foi feita a leitura a 620 nm, utilizando
cubetas de 3 mL e caminho ótico de 1 cm. (SINGH; SINGH;
VENKITASUBRAMANIAN, 1976)
Para os cálculos foi utilizada a seguinte formula:
Concentração de glicogênio no tecido = Abs x padrão___
Mg tecido x 1,11 x Abs padrão
Onde “Abs” é o valor da absorbância obtida na leitura da amostra no
espectrofotômetro; “[ ] padrão” é a concentração usada no padrão (igual a 20); “Mg
tecido” foi a quantidade de tecido da amostra utilizada em miligramas; “1,11” é uma
constante para realização do cálculo; e “Abs padrão” é o valor obtido no
espectrofotômetro na leitura do padrão.
4.4 Análise estatística
As análises estatísticas da comparação das concentrações de glicogênio
entre os grupos foram feitas utilizando os testes t de Student, ANOVA e de Tukey,
foram considerados estatisticamente diferentes quando p<0,05.
37
5 RESULTADOS
5.1 Resultados em ratos normais com diferentes idades
A figura 5.1 nos mostra a variação da concentração de glicogênio nas
glândulas SM de ratos durante o dia (entre 7 e 19hs) nos 3 diferentes grupos
divididos por idade (21, 30 e 60 dias de vida) nas mesmas condições alimentares
(sem restrição alimentar). Nesta glândula, o fator idade influenciou na concentração
do glicogênio somente em 1 dos 7 períodos estudados, o das 15hs, onde foi
observada uma redução nos animais com 60 dias de vida, quando comparados aos
outros 2 grupos.
Além disso, os grupos com 21 e 30 dias se comportaram de forma
semelhante tendendo a uma queda da concentração de glicogênio após as 15 horas
até o final do dia (19 horas). Já o grupo de 60 dias exibiu uma oscilação da
concentração do glicogênio, caindo após as 11 horas até as 15 horas quando foi
encontrado o menor nível de glicogênio do período analisado. Voltou a subir as 17
horas e caiu as 19 horas.
No grupo de 21 dias a concentração de glicogênio oscilou até as 15 horas,
mas sem diferença significante. Após esse horário ela passa a cair alcançando seu
menor valor do dia as 19 horas, existindo uma variação de aproximadamente 50%
do maior para o menor valor encontrado.
Nos animais com 30 dias de vida a concentração do glicogênio começou o
dia com o maior valor encontrado, mas logo as 9 horas cai e passa a manter o nível
38
de glicogênio constante até as 15 horas. Depois desse período há uma nova queda
chegando ao menor valor do dia as 19 horas, variando aproximadamente 48% do
começo ao fim do dia.
No grupo de 60 dias a concentração do glicogênio oscilou durante a manhã
até 11 horas, quando alcançou a maior concentração do dia. Em seguida há uma
queda até as 15 horas quando foi obtido um valor semelhante ao observado as
19hs, porém inferior ao das 17hs.
A figura 5.2 nos mostra a variação da concentração de glicogênio nas
glândulas PA de ratos durante o dia (entre 7 e 19hs) nos 3 diferentes grupos
divididos por idade (21, 30 e 60 dias de vida) nas mesmas condições alimentares
(sem restrição alimentar). Diferente da glândula SM, observamos diferença
significante entre as idades as 9, 11, 13, 15 e 17 horas. Nos animais com 21 dias
existiu uma oscilação da concentração de glicogênio sendo significante essa
diferença entre os valores encontrados as 11 e 15 horas com o das 13 horas, onde
houve uma queda de 66% que logo se elevou subindo 149%. A variação da
concentração do início do dia (7hrs) para a concentração encontrada no final do dia
(19hrs) não houve diferença significante entre eles.
No grupo de 30 dias existiu uma variação ao longo do dia, tendo a
concentração mais elevada as 13 horas e as menores no início e final do dia. A
concentração de glicogênio no grupo de 60 dias apresentou queda constante das 7
as 15 horas, mas 17 horas ocorreu um aumentou significativo de 173% em relação
ao horário anterior que foi mantido até as 19 horas.
Quando imposta a restrição de alimento o metabolismo do glicogênio nas
glândulas submandibulares foram semelhante nos 3 grupos (21, 30 e 60 dias). Na
figura 3 observamos maiores valores de glicogênio nas primeiras horas (7 e 9 horas)
39
passando a cair gradualmente até as 19 horas, quando atingiu os menores valores.
A queda da concentração de glicogênio entre 7 e 19 horas foi de aproximadamente
52% no grupo de 21 dias, 71% no de 30 dias e 67% no de 60 dias. Foi encontrada
diferença significante entre os grupos as 7 horas, onde o grupo de 21 e 30 dias foi
diferente do de 60 dias. As 9 horas entre o grupo de 30 dias com o de 21 dias, as 13
e 19 horas houve uma diferença entre o grupo de 21 dias e de 60 dias.
Na figura 5.4 observamos que nas glândulas PA a oscilação da concentração
de glicogênio durante o dia nos grupos de 21 e 60 dias quase não ocorreu. No
grupo de 21 dias a concentração se mantém estável até as 15 horas, quando passa
a cair, ocorrendo um queda significativa de aproximadamente 35% após este
horário. No grupo de 60 dias a variação é pequena mantendo a concentração de
glicogênio em níveis semelhantes durante praticamente todo o dia.
Somente no grupo de 30 dias foi observado uma grande elevação da
concentração de glicogênio as 7 e 9 horas. Após esse período há uma tendência de
queda da concentração do glicogênio até as 19 horas, reduzindo aproximadamente
60% do glicogênio inicial. Entre as idades em uma mesma hora existiu uma
diferença, as 7 e 9 horas do gruo de 30 dias com os demais, sendo este mais
elevado. As 11 horas houve diferença entre o grupo de 21 dias com o de 30 dias, e
foi encontrado diferença entre o grupo de 30 com o de 60 dias as 13 e 19 horas.
As figuras 5.5, 5.6 e 5.7 ilustram a comparação entre os animais com e sem a
restrição de alimento em glândulas submandibulares dos ratos normais com 21, 30
e 60 dias. Nestas figuras observamos que a restrição de alimento interferiu somente
em alguns horários no conteúdo de glicogênio das glândulas salivares dos ratos
com 21 e 30 dias de vida, havendo diferença significante somente as 9 e 15 horas
no grupo com 21 dias, sendo que as 9 horas o grupo com restrição obteve valores
40
maiores do que os animais sem restrição e as 15 horas ocorreu o inverso. No grupo
de 30 dias somente as 17 horas ocorreu uma maior concentração nos animais sem
restrição de alimento. Já nos animais com 60 dias só não houve diferença as 7 e as
15 horas, onde foram encontradas as maiores concentrações de glicogênio nos
animais sem restrição de alimento as 11, 17 e 19 horas. As 9 e 13 horas as maiores
concentrações foram dos animais com restrição de alimento.
As figuras 5.8, 5.9 e 5.10 comparam as concentrações de glicogênio das
glândulas parótidas de ratos submetidos ou não a restrição alimentar nos diversos
períodos do dia, separados pela idade, mostrando que a condição alimentar
interferiu principalmente no grupo de 60 dias de vida, onde encontramos diferença
significante entre os grupos das 9, 11, 13, 15 e 19 horas, havendo sempre uma
maior concentração de glicogênio no grupo com restrição alimentar. No grupo de 21
dias a restrição influenciou, somente as 13 horas, onde encontramos uma diferença
significativa entre eles com maior valor encontrado nos animais com restrição
alimentar. Nos animais com 30 dias observamos uma maior concentração nos
períodos iniciais (7, 9 e 11 horas) nos animais submetidos a restrição alimentar.
5.2 Resultados em ratos diabéticos
Quando observamos os resultados das SM dos ratos diabéticos podemos ver
na figura 5.11 que o estado diabéticos levou a uma redução na concentração de
glicogênio significativa as 7, 9, 11 e 17 horas. Além disso, no grupo diabético não foi
observada a oscilação presente nos animais normais que chegou a ter uma
41
variação de 116% entre os horários com maior concentração para aqueles com
menor concentração.
Na figura 12 observamos que o estado diabético promoveu alterações
inversas nas glândulas parótidas quando comparadas as glândulas SM, com valores
superiores na concentração de glicogênio nos animais diabéticos quando
comparados aos dos ratos controles, existindo uma diferença significante as 9, 11,
13, e 15 horas. Quando observamos a oscilação da concentração durante o dia
verificamos que as 13 horas houve um grande aumento de aproximadamente 153%
em relação aos outros horários que ficaram em níveis semelhantes entre eles, todos
próximos de 0,33 µg de glicogênio/mg de tecido.
Quando comparamos a PA com as SM dos animais diabéticos observamos
que nas duas glândulas a maior concentração de glicogênio encontrada foi as 13
horas. Nas SM não houve uma discrepância tão significante como a observada nas
PA com as outras horas do dia, mas foi esse o horário com o maior valor encontrado
no período analisado. Já nas glândulas de ratos normais não existiu uma hora onde
as duas obtiveram as maiores concentrações, mas a menor concentração de
glicogênio encontrada ocorreu no mesmo horário, as 15 horas.
42
Figura 5.1 - Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 21, 30 e 60
dias de vida, sem restrição de alimento no período das 7 às 19 horas. Letras maiúsculas
fazem a comparação dos grupos em uma mesma hora, as letras minúsculas comparam
as horas em um mesmo grupo para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Variação da concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos controles
durante o dia sem restrição de alimento
21 dias
30 dias
60 dias
ab
ab
ab
ab
ab
abc
c
a
bd
ad a
a
bc
c
A
A
A
A
A
A
A
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A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
acd
def
c
bfg
b
adg
be
43
Figura 5.2 - Concentração de glicogênio em glândulas parótidas de ratos com 21, 30 e 60 dias de
vida, sem restrição de alimento no período das 7 as 19 horas. Letras maiúsculas fazem
a comparação dos grupos em uma mesma hora, as letras minúsculas comparam as
horas em um mesmo grupo para p<0,05
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Variação da concentração de glicogênio em glândulas parótida de ratos controles durante o dia
sem restrição de alimento
21 dias
30 dias
60 dias
A
A
A
A
A
B
A
AB
B
ab
ab
a
a
bc
ab
a
ab
ab
A
B
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A
B
A
B
B
A
A
A
b
a
a
ab
c
abc
a
b
a
a
b
a
44
Figura 5.3 - Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 21, 30 e 60
dias de vida, com restrição de alimento no período das 7 as 19 horas. Letras maiúsculas
fazem a comparação dos grupos em uma mesma hora, as letras minúsculas comparam
as horas em um mesmo grupo para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Variação da concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos controles
durante o dia com restrição de alimento entre o período das 7 as 19 horas
21 dias
30 dias
60 dias
A
A
B
A
B
AB
A
A
A
A
AB
B
A
A
A
A
AB
B
A
A
A
ab
a
a
c
c
c
c
a
b
b
b
b
c
c
ab
a
a
a
b
c
c
45
Figura 5.4 - Concentração de glicogênio em glândulas parótidas de ratos com 21, 30 e 60 dias de
vida, com restrição de alimento no período das 7 as 19 horas. Letras maiúsculas fazem
a comparação dos grupos em uma mesma hora, as letras minúsculas comparam as
horas em um mesmo grupo para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Variação da concentração de glicogênio em glândulas parótidas de ratos controles durante o
dia com restrição de alimento entre o período das 7 as 19 horas
21 dias
30 dias
60 dias
A
B
A
A
B
A
A
B
AB
AB
A
B
A A
A
A
A
A
AB
A
B
ab
ab
ab
ab
b
a
a
a a
bc
bc
bc
c
c
ab
a
ab
b
ab
ab
ab
46
Figura 5.5 - Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 21 dias com e
sem restrição de alimento durante o dia. O asterisco representa diferença
estatisticamente significante ente os grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos
com 21 dias
Com restrição alimento
Sem restrição alimento
*
*
47
Figura 5.6 - Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 30 dias com e
sem restrição de alimento durante o dia. O asterisco representa diferença
estatisticamente significante ente os grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 30 dias
Com restrição alimento
Sem restrição alimento
*
48
Figura 5.7 - Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 60 dias com e
sem restrição de alimento durante o dia. O asterisco representa diferença
estatisticamente significante ente os grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos com 60 dias
Com restrição de alimento
Sem restrição de alimento
*
*
*
*
*
49
Figura 5.8 - Concentração de glicogênio em glândulas parótida de ratos com 21 dias com e sem
restrição de alimento durante o dia. O astertisco representa diferença estatisticamente
significante ente os grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Concentração de glicogênio em glândulas parotidas de ratos com 21 dias
Com restrição alimento
Sem restrição alimento
*
50
Figura 5.9 - Concentração de glicogênio em glândulas parótida de ratos com 30 dias com e sem
restrição de alimento durante o dia. O asterisco representa diferença estatisticamente
significante ente os grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Concentração de glicogênio em glândulas parotidas de ratos com 30 dias
Com restrição alimento
Sem restrição alimento
*
*
*
51
Figura 5.10 - Concentração de glicogênio em glândulas parótida de ratos com 60 dias com e sem
restrição de alimento durante o dia. O asterisco representa diferença estatisticamente
significante ente os grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
ug de glicogênio/mg de tecido
Horas
Concentração de glicogênio em glândulas parotidas de ratos com 60 dias
Com restrição alimento
Sem restrição alimento
*
*
*
*
*
52
Figura 5.11 - Concentração de glicogênio em glândulas submandibulares de ratos normais e
diabéticos durante o dia. * representa diferença estatisticamente significante ente os
grupos em uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
SM Diabéticos
SM Normais
µg de glicogênio/mg de tecido
Hora
*
*
*
*
53
Figura 5.12 - Concentração de glicogênio em glândulas parótidas de ratos normais e diabéticos
durante o dia. * representa diferença estatisticamente significante ente os grupos em
uma mesma hora para p<0,05
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
07:00
09:00
11:00
13:00
15:00
17:00
19:00
PA Diabéticos
PA Normais
µg de glicogênio/mg de tecido
Hora
*
*
*
*
54
6 DISCUSSÃO
6.1 Experimento com ratos normais com diferentes idades
Estudos sobre o metabolismo de carboidratos em glândulas salivares ainda
são poucos e quando nos restringimos ao conteúdo e metabolismo do glicogênio há
um número ainda menor de trabalhos que abordam o tema, contudo, esses estudos
são importantes para a compreensão da forma como esse órgão, muito importante
para manutenção da saúde bucal, obtém e consome energia, e nos casos de
anormalidades se ocorre uma interferência nesse processo prejudicando seu
funcionamento natural.
Neste estudo analisamos o comportamento da concentração de glicogênio,
examinando a variação nas PA e SM de ratos normais e diabéticos observando
assim as particularidades de cada uma das glândulas, levando em consideração o
ritmo circadiano. Este ciclo interfere em diversas funções de nosso organismo, como
por exemplo, o fluxo salivar, diretamente relacionado com o processo de secreção
das glândulas, cujo processo envolve gasto de energia e consequentemente a
mobilização do glicogênio.
Alguns estudos já mostraram as particularidades do metabolismo de
carboidratos entre as glândulas parótidas e submandibulares, bem como a diferença
no armazenamento e uso do glicogênio por elas (NICOLAU; SASSAKI, 1976;
NICOLAU; GANZERLA; DE SOUZA, 2003).
55
Nesse estudo, ficou evidente a diferença do metabolismo de glicogênio entre
as glândulas ao observar a concentração de glicogênio armazenado por elas ao
longo do dia.
As glândulas parótidas tem discreta participação durante o repouso, mas
aumentam significantemente seu fluxo quando há um estímulo. Esse estímulo pode
ser mecânico, causado pela mastigação do alimento, gustativo quando sentimos o
sabor do alimento, ou ainda visual ou provocado pelo olfato. Em nosso estudo os
animais com 30 e 60 dias de vida tinham sua dieta baseada em ração, sendo
portanto a mastigação o principal estímulo para secreção salivar. No grupo de 21
dias, como em nosso biotério os animais ficam com a mãe após o nascimento até
completarem 21 dias, até essa idade eles ainda são amamentados iniciando a
alimentação por sólidos como a ração, ocorrendo pequena influência da
mastigação, predominando a sucção e o paladar como estímulos salivares.
Em nossos experimentos observamos diferenças de comportamento entre as
glândulas. Nas PA de animais restritos a alimentação noturna, onde praticamente
não ocorreu degradação do glicogênio ao longo do dia, devido provavelmente a
ausência do estímulo, se mantendo estável durante um longo período analisado
tendendo a uma queda nas horas finais do dia, as 17 e 19 horas. Somente nos
animais com 30 dias de vida que foi observada uma alta concentração de glicogênio
durante as horas iniciais, 7 e 9 horas que sofreram uma redução mais gradual
chegando no final do dia com uma diminuição de aproximadamente 59% do
conteúdo de glicogênio armazenado nas primeiras horas. Esses dados
provavelmente devem-se ao fato das PA não terem sofrido nenhum tipo de estímulo
para secreção, já que os animais não podiam se alimentar durante o dia. Já nos
animais de 30 dias de vida esses dados podem ter sido alterados pelo fato desses
56
ratos estarem no processo de transição da alimentação iniciando a alimentação com
comida sólida, pois a partir de 21 dias nós separamos eles da mãe e eles passam a
ter a disposição somente a ração para se alimentar e durante sete dias ele deve se
habituar a se alimentar exclusivamente dela. Outro fator, talvez mais significante, é
o fato de observarmos que nessa idade eles são mais ativos e verificamos que na
ausência de alimento eles roem objetos como a tampa da gaiola, provocando um
estímulo para as PA.
O grupo dos animais com livre acesso a comida reforça essa hipótese da
ausência de estímulos e manutenção dos níveis de glicogênio nas PA, pois foi
possível observar a oscilação da concentração do glicogênio nesse grupo, ficando
bem evidente que os animais se alimentavam durante o dia mobilizando o
glicogênio para o processo de secreção salivar e depois retorna a sintetizar essa
molécula para posterior utilização. Nesse grupo observamos que a idade dos
animais interferiu mais nos resultados. Nos animais com 30 e 60 dias é possível ver
que existem momentos de degradação e momentos de síntese de glicogênio,
ocorrendo alterações significantes entre as horas, o que foi menos evidente nos
animais com 21 dias que mantêm a concentração estável de glicogênio durante todo
o dia alterando somente as 13 horas tendendo a uma redução do glicogênio. Esses
resultados reforçam os achados da literatura os quais mostram que a glândula
parótida atinge a fase adulta depois dos 25 dias de idade (SIVAKUMAR et al.,
1998), com 21 dias ela ainda está na fase de maturação. Nessa fase ela armazena
glicogênio principalmente para seu desenvolvimento e não para secreção salivar
(NICOLAU; GANZERLA; DE SOUZA, 2003), talvez por isso não tenha ocorrido
variações significantes da concentração de glicogênio e a restrição alimentar não
teve influência nos animais com 21 dias ao contrário das outras idades. Também
57
não podemos deixar de levar em consideração que o leite materno, que é o principal
alimento desses animais nessa idade, possui menos carboidrato e a ingestão ocorre
por um estímulo diferente da mastigação.
Em humanos o ritmo circadiano é responsável por alterações do fluxo salivar
independente do estímulo, havendo um aumento do volume de saliva secretada
principalmente nos momentos de atividade e que antecedem a alimentação
(DAWES, 1972). Nas figuras 2 e 4, comparamos os valores dos conteúdos de
glicogênio na PA dos 3 grupos com e sem restrição de alimento e podemos
observar que em todos os grupos existiu uma tendência da concentração do
glicogênio ficar ao final do dia próximo dos menores valores, indicando uma possível
mobilização do glicogênio para secreção de saliva no início das atividades durante a
noite, já que os ratos possuem hábitos noturno. Comportamento semelhante é
relatado na literatura pela glicemia em humanos, onde se observa um aumento
antes dos horários de maior atividade como no período da manhã ao acordar
(CAILOTTO et al., 2008; LA FLEUR, 2003).
Os resultados obtidos com as SM mostram a diferença de comportamento do
metabolismo de carboidrato e obtenção de energia dessa glândula em relação as
PA. O metabolismo de energia entre as duas é diferente, sendo as PA
predominantemente aeróbia e as SM anaeróbia, em decorrência dessa
característica as PA tendem a mobilizarem menos glicogênio que as SM (NICOLAU;
SASSAKI, 1976).
Em nosso estudo podemos verificar que as características de secreção de
cada uma das glândulas ficaram bem evidentes. A SM mostra uma degradação do
glicogênio constante e gradual durante todo o dia, independente da restrição de
alimento, provavelmente pelo fato de contribuir com a secreção da saliva não
58
estimulada que se dá em volumes menores e constantemente. Nos animais com
restrição de alimento, como eles não tiveram estímulo salivar, pois estavam sem
alimento a disposição, ficou mais evidente a gradual e contínua degradação do
glicogênio durante o dia para suprir a energia necessária para o processo de
secreção da saliva não estimulada.
No grupo com livre acesso ao alimento os resultados mostram a degradação
do glicogênio, porém seguido de aumentos da concentração dessa molécula, o que
pode ser explicado pelo livre acesso ao alimento e a provável alimentação durante o
dia, sendo assim, há uma maior mobilização do glicogênio durante a alimentação
para a secreção de saliva e depois ocorre a sintetização e o armazenamento de
glicogênio devido a ingestão dos carboidratos (NICOLAU; SASSAKI, 1983). Nas
glândulas submandibulares a diferença de idade e alimentação não foi evidente
como ocorreu na parótida, já que com 21 dias a glândula submandibular já chegou a
fase adulta não ocorrendo a diferença da fase de desenvolvimento entre as idades
como ocorre na PA.
Semelhante ao ocorrido nas PA também foram obtidos valores da
concentração de glicogênio menores ao final do dia independente da restrição ou
não de alimento, o que pode indicar a influência do ritmo circadiano nessas
glândulas.
No início do estudo os animais não tinham restrição de alimento e o objetivo
era analisar a oscilação da concentração de glicogênio durante o dia em animais
normais pressupondo que os ratos se alimentassem durante a noite pois são
animais de hábitos noturnos (SUCKOW; WEISBROTH; FAKLIN, 2006). Porém os
resultados encontrados revelaram uma grande variação da concentração de
59
glicogênio, principalmente nos animais sem restrição de alimento, sugerindo que a
mobilização e síntese de glicogênio deve ter ocorrido devido a alimentação. Com
base nestes dados foi proposto um grupo com restrição de alimento no período do
dia, das 7 as 19 horas, e os resultados mostraram que houve diferença com o grupo
anterior, sugerindo que os animais se alimentavam também durante o dia.
O ritmo circadiano está presente em todos os mamíferos e altera a
concentração de diversas substâncias em nosso corpo de acordo com a hora do
dia. A secreção salivar é bastante alterada durante as 24 horas do dia, fazendo com
que estudos com saliva seja estabelecido um horário fixo de coleta para que os
resultados obtidos não sejam influenciados pelo ritmo circadiano. Como já vimos
alguns importantes componentes do metabolismo de carboidrato sofrem influencia
do ritmo circadiano, como a glicose, o glucagon e a insulina (CAILOTTO et al., 2008;
FROY, 2007; LA FLEUR et al., 1999; LA FLEUR, 2003; RUITER et al., 2003)
podemos extrapolar que o glicogênio em glândulas salivares pode sofrer influencia
do ritmo circadiano. Como nesse estudo analisamos somente 12 horas de um dia
não temos como afirmar a sua interferência nesse processo sendo necessário mais
estudos para comprovação desse fato, porém com os resultados obtidos podemos
observar alguns dados que podem ter sido influenciado pelo ritmo circadiano. Nos
animais com restrição de alimento durante o dia foi possível verificar que há
diferença de concentração do glicogênio dependendo da hora do sacrifício em todas
as idades estudadas. Nas PA de ratos com 21 dias há uma diferença significante
entre o horário das 15 horas como das 17 e 19 horas. Nos animais com 30 dias os
resultados obtidos as 7 e 9 horas foram diferentes do resto do dia, e os horários das
11, 13, e 15 horas também foram diferente entre os últimos horários, das 17 e 19
60
horas. Nos animais com 60 dias também houve uma pequena variação, sendo
diferente entre eles o horário das 9 com o das 13 horas.
6.2 Experimentos com ratos diabéticos
O diabetes se caracteriza pelo aumento da glicemia e, quando se torna
crônica causa diversas desordens metabólicas em nosso organismo. Um dos
principais sintomas causados por essas desordens são a poliúria, polidipsia e
apesar da polifagia ocorre a perda de peso (KUZUYA et al., 2002) que em nosso
estudo também ocorreu. Essa perda de peso que ocorre apesar da maior ingestão
de carboidratos, se deve a menor captação de glicose para o interior das células
devido a deficiência no seu transporte, causando uma redução de peso corporal e
em outros tecidos (ANDERSON, 1983; ANDERSON et al., 1993; MAHAY et al.,
2004).
A xerostomia é um dos principais sintomas relatados por pacientes diabéticos
(GONZALEZ-GUEVARA; LINARES-VIEYRA; RODRIGUEZ-DE MENDOZA, 2008;
LAMSTER et al., 2008). Em ratos diabéticos parece haver uma hipofunção das
glândulas salivares também está presente nas glândulas, pois foi encontrado uma
diminuição da concentração da amilase na saliva desses animais, o que indicaria
uma menor função das PA, já que a amilase pode ser usada como marcadora da
saliva secretada por ela (NEWRICK et al., 1991).
61
Em nosso estudo os resultados obtidos em PA de ratos diabéticos
corroboram com os dados obtidos em outros estudos que mostram um grande
acúmulo de glicogênio em PA em relação aos animais normais (NICOLAU et al.,
2005), assim nos rins (KANG et al., 1982), pâncreas (MALAISSE et al., 2001),
fígado (MATYKA et al., 2001), e retina (HORI; NISHIDA; MUKAI, 1980). Apesar
desse grande aumento de glicogênio em PA houve uma menor variação de suas
concentrações durante as horas do dia, não indicando um processo de síntese e
degradação dessa molécula que deveria ocorrer, pois os animais diabéticos por se
alimentam mais que os normais promovem um maior estímulo do fluxo salivar.
Esses dados sugerem que a síntese de glicogênio esta ocorrendo, porém o
processo de degradação parece estar deficiente levando o processo de obtenção de
energia para outra via, provavelmente a glicogenogênese. Essa via deve estar
sendo utilizada pelo fato da hexoquinase ter maior atividade em PA de diabéticos
disponibilizando desta forma a G-6P (NOGUEIRA; SANTOS; NICOLAU, 2005)
molécula precursora para a síntese de glicogênio, levando ao seu acúmulo.
Nas submandibulares a insulina interfere na síntese de proteínas e na
ausência pode causar uma deficiência nesse processo (ANDERSON, 1988), o que
nos indica alterações no processo de secreção em indivíduos diabéticos. Em SM de
ratos diabéticos quando submetidos a um jejum de 12 horas previamente ao
sacrifício foi observado um acúmulo de glicogênio nesses tecidos, porém mais
discreto que nas PA (NICOLAU et al., 2005). Em nosso estudo os animais tiveram
livre acesso ao alimento e o resultado que encontramos em SM de ratos diabéticos
foi uma redução do conteúdo de glicogênio em relação aos animais normais, e
semelhante ao que ocorreu nas PA a variação ao longo do dia quase não existiu. A
diminuição da concentração de glicogênio em SM de ratos diabéticos pode estar
62
ocorrendo talvez porque ela não foi tão afetada pelo estado diabético quanto a PA,
por isso ela ainda consegue degradar o glicogênio para secreção e pelo fato do
diabético mastigar mais devido a polifagia a concentração dessa molécula se
mantêm em níveis mais baixos que os ratos normais.
Nos animais diabéticos a variação da concentração de glicogênio ao longo do
dia, principalmente em PA, quase não ocorreu o que pode ser um indicativo de que
o ritmo circadiano esteja alterado, concordando com outros estudos que mostram
alterações no ritmo circadiano pelo estado diabético (YOUNG et al., 2002)
63
7 CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos é possível concluir que:
- Ocorre uma variação na concentração de glicogênio nas glândulas salivares
de ratos normais, quando estudadas ao longo do dia, influenciada provavelmente
pelo ritmo circadiano;
- A restrição alimentar imposta aos animais normais influenciou na variação
da concentração de glicogênio nas glândulas salivares estudadas;
- Somente nas glândulas PA dos animais com 21 dias de vida há um padrão
de variação da concentração do glicogênio diferente dos demais grupos;
- O estado diabético levou a um aumento no conteúdo de glicogênio das
glândulas PA e uma redução nas glândulas SM;
- Não há variação no conteúdo de glicogênio ao longo do dia nas glândulas
salivares estudadas nos animais diabéticos.
64
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