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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
“Clonagem e Expressão dos Domínios 2 e 3 do Receptor
KDR (VEGFR-2) Humano”
Leila Spínola e Castro
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da USP, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências,
Área: Química
2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
“Clonagem e Expressão dos Domínios 2 e 3 do Receptor
KDR (VEGFR-2) Humano”
Leila Spínola e Castro
Orientador: Prof. Dr. Richard John Ward
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da USP, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências,
Área: Química
2009
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da Coordenadoria
do Campus de Ribeirão Preto / USP
Castro, Leila Spínola e
Clonagem e Expressão dos Domínios 2 e 3 do Receptor KDR
(VEGFR-2) Humano
82p. : il. ; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de
concentração: Química.
Orientador: Richard John Ward.
1. KDR. 2. Lys49PLA2. 3. Proteína.
Dedico este trabalho
A Deus, “porque Dele e por Ele são todas as coisas.”
A minha mãezinha e ao meu paizinho por esse amor incondicional. Vocês são os
melhores pais que existem! Amo muito vocês!
Ao Danilo, meu socorro em meio ao tumulto, meu sorriso em meio às lágrimas. Você
é abençoadamente especial e eu te amo!
AGRADECIMENTOS
A Deus, Dono de toda a sabedoria, discernimento e criatividade. Só em Ti Senhor,
encontrei força suficiente para chegar até o fim.
Ao Prof. Dr. Richard John Ward, do Departamento de Química da Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto-FFCLRP/USP, pela oportunidade e
pela confiança. Muito obrigada professor, foi uma grandiosa experiência.
Ao Prof. Dr. Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira e ao Prof. Dr. Celso Teixeira
Mendes Junior, ambos do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto-FFCLRP/USP, pela participação e contribuição
em meu exame de qualificação.
Ao Prof. Dr. Tony Paulino Paiva, da UFTM-CEFORES e Universidade de Uberaba, e
ao Prof. Dr. Arthur Henrique Cavalcanti de Oliveira, da FFCLRP/USP, pela
disponibilidade em participarem e enriquecerem a banca avaliadora da minha
dissertação.
Ao Prof. Dr. Pietro Ciancaglini, da FFCLRP/USP, pela simpatia e por disponibilizar a
utilização de seu laboratório sempre que necessário.
A Profa. Dra. Aparecida Maria Fontes, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-
FMRP/USP, pela doação da amostra de cDNA (HUVEC) para a realização de
indispensáveis experimentos deste trabalho.
A Profa. Dra. Maria Helena Goldmann e a sua aluna Andréa, da FFCLRP/USP, pela
colaboração com o sequenciamento de amostras de DNA.
A Tânia Paula Aquino Defina, do Departamento de Biologia Celular e Molecular e
Bioagentes Patogênicos da FMRP/USP, pelo auxílio no sequenciamento das
amostras de DNA.
Aos técnicos Ivana Aparecida Borin e Milton Rosa Alves da FFCLRP/USP pelo
auxílio e disposição constantes.
Aos funcionários do Departamento de Química da FFCLRP-USP e aos secretários
Lâmia, Bel, Maria, Sônia, André e Jalmei pela atenção nos assuntos burocráticos.
Aos amigos do laboratório Carlinha, Paty, Lica, Lucas, Gilvan, Davi, Laila, Plínio,
Gisele, João e Vinícius pelos momentos de trabalho e pelas risadas.
A todos os professores, funcionários e colegas do Departamento de Química da
FFCLRP.
Aos funcionários do Laboratório de Resíduos Químicos (LRQ) do Campus da USP-
Ribeirão Preto pelo tratamento, recuperação e/ou descarte dos resíduos gerados
nesse trabalho.
Aos meus amados pais por permanecerem a meu lado mesmo sem concordarem
com minhas decisões. Sei que posso contar com vocês para tudo e a qualquer
momento. Muito obrigada por serem como são!
Aos meus irmãos Elyas e Bethel por serem meus amigos em tempo integral. Amo
vocês!
Aos meus fofíssimos sobrinhos: Mateus, Nelson, Gabriel, Ana Beatriz e Elyas Junior,
verdadeiros presentes que o Senhor concedeu para alegrar minha vida. Amo e sou
apaixonada por vocês!
Ao Danilo, meu companheiro amado e fiel ajudador.
A minha “mãedrinha” Evilásia pelo amor e incansável carinho.
A minha amiga e irmã Marie Chantal por me levar de volta ao Caminho que traz Vida
e pelos sábios ensinamentos.
A Tassi, Deza, Déa e todas as outras amadas primas e primos, pelo incentivo e
amizade.
Ao meu cunhadinho José Carrasco e a minha cunhadinha Gislaine Fiuza Bulgarelli
Spínola pelo apoio.
A Tati Lopes pela paciência em ensinar e esclarecer minhas dúvidas, até mesmo
nas madrugadas de trabalho. Tati, obrigada por ser amiga de verdade!
Ao Prof. Luiz Garcia por incomparável competência no ensinamento, pela atenção e
carinho. “You are so beautiful”!
Ao amigo Dr. Roberto Ruller pelas experientes dicas e críticas.
As minhas amigas Raquel e Renata “Vermelhinha” pela parceria, confiança mútua,
ajuda e também por me reprimirem quando necessário. Poderíamos escrever um
livro!
As amigas, Vivian Cipriano, Juzinha Alponti, Júlia Fonseca e Simone Barbosa por
dividirem momentos importantes e auxiliarem nessa caminhada.
A toda família Veiga e Spínola pelas orações e apoio.
SUMÁRIO
ABREVIATURAS.........................................................................................................iv
ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................................vii
ÍNDICE DE TABELAS..................................................................................................ix
NOMENCLATURA, CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DOS AMINOÁCIDOS...........x
RESUMO....................................................................................................................xiii
ABSTRACT................................................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO
1.1 Angiogênese.........................................................................................................15
1.2 Fator do Crescimento Endotelial Vascular (VEGF)..............................................16
1.3 Receptores do Fator do Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR)...................20
1.4 Inibidores do Fator do Crescimento Endotelial Vascular......................................21
1.5 Sequências codificadoras de proteínas................................................................23
1.6 Sequências codificadoras de proteínas sintéticas...............................................24
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................27
2.2 Objetivos Específicos...........................................................................................27
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 cDNA do transcrito que codifica para o VEGF.....................................................28
3.2 Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação do cDNA....29
3.3 Obtenção do DNA referente aos domínios 2 e 3 do KDR partindo do cDNA por
PCR............................................................................................................................29
3.4 Análise do produto de amplificação no gel de agarose........................................31
3.5 Purificação do produto de PCR............................................................................31
3.6 Clonagem no vetor pJET
TM
..................................................................................32
3.7 Preparo das células DH5 competentes..............................................................33
3.8 Transformação Bacteriana (E. coli DH5)............................................................34
3.9 Extração do DNA plasmidial.................................................................................36
3.10 Sequenciamento de nucleotídeos de DNA........................................................37
3.11 Digestão enzimática do vetor pJET
TM
+ domínios 2 e 3 do KDR com NdeI e
BamHI.........................................................................................................................38
3.12 Clonagem da sequência codificadora em vetor pET28a+ (Novagen) para
expressão em sistema bacteriano..............................................................................39
3.12.1 Características do vetor pET28a+...................................................................39
3.12.2 Preparo do vetor..............................................................................................40
3.12.2.1 Digestão do vetor.........................................................................................40
3.13. Ligação do DNA ao vetor pET28a+...................................................................41
3.14 Transformação e Extração de DNA....................................................................41
3.15 Sequenciamento de nucleotídeos de DNA........................................................42
3.16 Expressão de proteínas heterólogas em linhagem E. coli BL21........................42
3.16.1 Preparo de células BL21 competentes............................................................42
3.16.2 Expressão da proteína em função do tempo de indução................................43
3.16.3 Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE).................44
3.17 Criação da sequência in frame do DNA que codifica os domínios 2 e 3 do
KDR............................................................................................................................44
3.18 Alteração das regiões flanqueadoras do constructo 2 e 3 do KDR....................50
3.19 Proteína Verde Fluorescente (GFP)...................................................................51
3.20 Digestão do fragmento codificador do constructo 2 e 3 do KDR e ligação ao
vetor pGFPuv.............................................................................................................53
3.21 Multiplicação e extração do DNA da ligação (pGFPuv + constructo 2 e 3 do
KDR)...........................................................................................................................54
3.22 Reação de sequenciamento...............................................................................54
3.23 Mutagênese Sítio Dirigida..................................................................................54
4. RESULTADOS
4.1 Amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR............................................................57
4.1.1 Sub-clonagem para expressão da proteína resultante.....................................59
4.1.2 Expressão da proteína resultante em bactéria E. coli BL21.............................62
4.2 Montagem da sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR..............64
4.2.1 Seleção dos clones em pGFPuv.......................................................................66
4.2.2 Análise da sequência sintética..........................................................................69
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................72
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................78
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................79
iv
ABREVIATURAS
µg – Micrograma
µL – Microlitro
A – Adenina
AMP1 – Programa para amplificação de DNA, utilizando termociclador
AMP8 – Programa para amplificação de DNA, utilizando termociclador
APS – Persulfato de amônio
ASP – Aspartato
ATG – Adenina, timina, guanina
ATP – Adenosina trifosfato
BthTx-I – Bothropstoxina I
C – Citosina
cfu/mL – Unidade formadora de colônia/mililitro
Ca
2+
– Íon cálcio
CaCl
2
– Cloreto de cálcio
cDNA – DNA complementar
dATP – desoxiadenosina trifosfato
dCTP – desoxicitosina trifosfato
dGTP – desoxiguanosina trifosfato
DNA – Ácido desoxirribonucléico
dNTP – Desoxirribonucleotídeo trifosfato
DTT – Ditiotreitol
dTTP – desoxitimina trifosfato
ECM – Matriz extracelular
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
EXT – Programa para extensão de DNA, utilizando termociclador
Flk-1 – Fetal liver kinase
Flt-1 – Fms-like tyrosine kinase
fMol - Fentomol
G – Guanina
GET – tampão TRIS, glicose, EDTA
GFP – Proteína verde fluorescente
Glu – Glutamato
h – hora(s)
HCl – Ácido clorídrico
HDM – meio de cultura triptona + extrato de levedura
HUVEC – Humam Umbilical Vein Endothelial Cells
v
IPTG – Isopropil--D-1-tiogalactopiranosídeo
kb – kilo base
KC
2
H
3
O
2
– Acetato de potássio
KCl – Cloreto de potássio
KDR – Receptor domínio quinase
KDRbp – Proteína ligada ao KDR
L1 – Oligonucleotídeo 5’-ATGGCTAGCGTTATTTATGTG-3’
L147 – Oligonucleotídeo 5’-GAACGTTTCCCTGTGTGCGC-3’
L527 – Oligonucleotídeo 5’-CATTTCGCTACCGGACTGAG-3’
LB – Meio de cultura Luria-Bertani
Lys – Lisina
Lys49PLA2 – Fosfolipase A2 com uma lisina na posição 49
M-CSF – Fator estimulador de formação de colônias de macrófagos
mg/mL – Miligrama/mililitro
MgCl
2
– Cloreto de magnésio
min. – Minuto(s)
mL – Mililitros
mM – Milimol (ar)
mmol.L
-1
– Milimol/litro
mRNA – RNA mensageiro
NaCl – Cloreto de sódio
NaOH – Hidróxido de sódio
ng/L – nanograma/microlitro
ºC – Graus Celsius
OD
600
– Densidade Óptica em 600 nm
ORF – Open reading frame
pb – Pares de bases
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas
pET – Plasmídio para expressão pela T7 RNA Polimerase
pGFPuv – Plasmídeo proteína verde fluorescente
pH – Potencial hidrogeniônico
PIGF-1 – Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1
PIGF-2 – Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 2
PIPES –
Piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfônico)
pJET
TM
1.2 – Plasmídio termoestável para clonagem
PLA2 – Fosfolipase 2
pmol/µL – Picomol/microlitro
vi
RNA – Ácido ribonucléico
RNase – Ribonuclease
rpm – Rotação por minuto
RTK – Receptores tirosina quinase
RT-PCR – Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
s – Segundo(s)
SDS – Dodecilsulfato de sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida
svVEGF – O mesmo que VEGF-F
T – Timina
T.f – Trimeresurus flavoviridis
TBE – Tampão Tris-Borato-EDTA
TE – Tampão Tris, EDTA
TEMED – Tetrametiletilenodiamino
Tris – Tris[hidroximetil]aminometano
tRNA – RNA transportador
Trp – Triptofano
U – Unidade de enzima
U/L – Unidade/microlitro
VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular
VEGF121 – Isoforma 121 de VEGF
VEGF145 – Isoforma 145 de VEGF
VEGF165 – Isoforma 165 de VEGF
VEGF183 – Isoforma 183 de VEGF
VEGF189 – Isoforma 189 de VEGF
VEGF206 – Isoforma 206 de VEGF
VEGF-A – Fator de crescimento endotelial vascular tipo A
VEGF-B – Fator de crescimento endotelial vascular tipo B
VEGF-C – Fator de crescimento endotelial vascular tipo C
VEGF-D – Fator de crescimento endotelial vascular tipo D
VEGF-E – Fator de crescimento endotelial vascular tipo E
VEGF-F – Fator de crescimento endotelial vascular tipo F
VEGFR – Receptor de VEGF
VEGFR-1 – Receptor 1 de VEGF
VEGFR-2 – Receptor 2 de VEGF
VEGFR-3 – Receptor 3 de VEGF
VPF – Fator vascular de permeabilidade
ZnCl
2
– Cloreto de zinco
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Representações da fita dos domínios do receptor de VEGF-A.................19
Figura 2: Representação em fita da estrutura da proteína VEGFR-2.......................19
Figura 3: Família de VEGF e seus receptores (VEGFR)..........................................21
Figura 4: Vetor pJET
TM
1.2/blunt usado no sistema de seleção positiva para
clonagem de elevada eficiência de produtos de PCR gerados com a polimerase de
DNAPfu, a Taq Polimerase de DNA ou outras polimerases de DNA
termoestáveis.............................................................................................................33
Figura 5: Vetor pET28a+...........................................................................................40
Figura 6: Sequência nucleotídica do KDR retirada do GenBank AAC16450.1,
utilizada como referência para a criação do constructo 2 e 3 do KDR......................45
Figura 7: Alinhamento da sequência de nucleotídeos do cDNA com a sequência do
gene sintético proposto para os domínios 2 e 3 de KDR
12................................................................................................................................47
Figura 8: Esquema dos oligonucleotídeos utilizados para a construção da sequência
sintética dos domínios 2 e 3 do KDR.........................................................................48
Figura 9: Esquema simbolizando a sequência nucleotídica dos domínios 2 e 3 do
KDR............................................................................................................................49
Figura 10: Mapa do pGFPuv.....................................................................................52
Figura 11: Representação da ligação do constructo 2 e 3 do KDR ao vetor
pGFPuv......................................................................................................................53
Figura 12: Amplificação do cDNA de HUVEC utilizando os oligonucleotídeos KDR23
forward e KDR23 reverse...........................................................................................57
Figura 13: Banda purificada da amostra do DNA resultante da amplificação do cDNA
de HUVEC utilizando os oligonucleotídeos KDR23 forward e KDR23
reverse........................................................................................................................58
Figura 14: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do produto da digestão
pJET1.2 + domínios 2 e 3 do KDR.............................................................................59
Figura 15: Análise em banco de dados da sequência amplificada...........................60
Figura 16: Análise eletroforética em gel de agarose a 1%........................................61
Figura 17: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do produto da digestão do
clone pET28a + domínios 2 e 3 do KDR pelas enzimas NdeI e
BamHI.........................................................................................................................62
viii
Figura 18: Expressão da proteína recombinante domínios 2 e 3 do KDR em função
do tempo de indução com IPTG.................................................................................63
Figura 19: Teste de solubilidade da proteína recombinante.....................................64
Figura 20: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR..............................................................65
Figura 21: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR após alteração da temperatura de
anelamento.................................................................................................................66
Figura 22: Resultado da transformação do clone pGFPuv + constructo 2 e 3 do KDR
em bactérias DH5α na presença de ampicilina em meio de cultura..........................67
Figura 23: Análise eletroforética em gel de agarose a 1 %.......................................68
Figura 24: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% dos produtos da digestão
enzimática HindIII/XbaI de pGFPuv + constructo 2 e 3 do KDR................................69
Figura 25: Alinhamento da sequência projetada referente aos domínios 2 e 3 de
KDR com a sequência obtida no sequenciamento da clonagem do constructo 2 e 3
do KDR em vetor pGFPuv..........................................................................................70
Figura 26: Análise gráfica das deleções (A) e das substituições (B) apresentadas na
sequência sintética que codifica os domínios 2 e 3 do KDR......................................71
ix
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação por meio de
PCR............................................................................................................................29
Tabela 2: Oligonucleotídeos sintéticos baseados no GenBank AAC16450.1 que
codificam a sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR.........................46
Tabela 3. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a realização da mutagênese
sítio dirigida................................................................................................................55
x
Nomenclatura, classificação e estrutura dos 20 aminoácidos
encontrados em sistemas biológicos
Não polares
Glicina Alanina Valina Leucina Metionina Isoleucina
(Gly) (Ala) (Val) (Leu) (Met) (Ilo)
(G) (A) (V) (L) (M) (I)
Aromáticos
Fenilalanina Tirosina Triptofano
(Phe) (Tyr) (Trp)
(F) (Y) (W)
xi
Polares não carregados
Serina Treonina Cisteína Glutamina Prolina Asparagina
(Ser) (Thr) (Cys) (Gln) (Pro) (Asn)
(S) (T) (C) (Q) (P) (N)
Positivamente carregados
Histidina Lisina Arginina
(His) (Lys) (Arg)
(H) (K) (R)
xii
Negativamente carregados
Aspartato Glutamato
(Asp) (Glu)
(D) (E)
xiii
RESUMO
Em condições patológicas como o câncer, a angiogênese, ou seja, o
crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente, resulta
numa maior oxigenação e nutrição das células e, consequentemente, num rápido
crescimento do tumor [1]. Uma variedade de fatores estimulam a angiogênese, entre
eles o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e seus receptores
(VEGFR). O VEGF é uma proteína homodimérica cujas atividades biológicas são
reguladas através da ligação com seu próprio receptor domínio quinase (kinase
domain receptor – KDR). Dos sete domínios extracelulares de “Ig-like” no KDR,
apenas os domínios dois e três são necessários para uma ligação de alta afinidade
com o VEGF. Yamazaki e colaboradores, em 2005, relataram que um componente
protéico designado KDRbp (KDR-binding protein) da peçonha da serpente
Agkistrodon piscivorus piscivorus liga-se ao domínio extracelular de KDR com alta
afinidade, resultando no bloqueio subnanomolar de VEGF. Yamazaki et.al.
demonstrou que KDRbp exibe a sequência de aminoácidos da região N-terminal e
de fragmentos enzimaticamente digeridos da sequência peptídica de KDR-bp é
idêntica a Lys-49-fosfolipase A
2
, um homólogo inativo da fosfolipase A
2
, no qual a
Lys-49 substitui Asp-49. Diante disso, este trabalho teve por objetivo a síntese
funcional de uma sequência de nucleotídeos correspondente aos domínios 2 e 3 do
Receptor-2 do Fator do Crescimento Endotelial Vascular in vitro que, ao ser
expressa em bactéria Escherichia coli (E.coli).
O cDNA (HUVEC) de KDR que serviu de molde para a amplificação pela
reação em cadeia da polimerase para a obtenção do DNA de 675 pares de bases
(pb) que codificam 225 aminoácidos correspondentes aos domínios 2 e 3 de KDR.
Visando a otimização do uso de códons da construção do DNA que podem
prontamente aperfeiçoar os códons para a expressão da proteína em todo o
organismo do hospedeiro, no caso, a bactéria Escherichia coli (E.coli), foi desenhada
e sintetizada uma sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR (constructo
2 e 3 do KDR). O constructo 2 e 3 do KDR obtido por PCR foi expresso em E.coli
BL21 usando o vetor de expressão pET28a.
A técnica de obtenção de uma sequência de nucleotídeos partindo do cDNA
correspondente a sequência desejada é bastante utilizada por sua praticidade de
manipulação e rapidez no resultado. A ORF (open reading frame) que codifica para a
proteína de interesse foi clonada em vetor pET28a e a expressão foi induzida por
IPTG. A análise da expressão foi monitorada e observado o sucesso devido a
obtenção de proteína de 25 kDa expressos.
xiv
ABSTRACT
In pathologic conditions as cancer, angiogenesis can be stimulated with new
blood-vessel formation, oxygenation, and nutrition, leading to a rapid growth of tumor.
A variety of factors can stimulate angiogenesis. Among these factors, there is
vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors (VEGFR). VEGF is
homodimeric protein which biological activities are regulated by their kinase domain
receptor – KDR. From the seven KDR Ig-like domains, only domains 2 and 3 are
necessary for a VEGF high-affinity binding. Yamazaki et.al. 2005, report that a
protein component designated as KDR-binding protein (KDR-bp) from the venom of
eastern cottonmouth (Agkistrodon piscivorus piscivorus) binds to high affinity
extracellular KDR resulting in subnanomolar block of VEGF. Yamazaki et.al.
demonstrated that KDR-bp exhibits the N-terminal amino acid sequence region, and
enzymatically digested fragments of KDR-bp peptide sequence, which is identical to
Lys-49-fosfolipase A
2
, an inactive homologue of phospholipase A
2
where Lys-49
replaces Asp-49. Herein, this work aimed the functional synthesis of a nucleotide
sequence corresponding to domains 2 and 3 from Receptor-2 of vascular endothelial
growth factor in vitro expressed in Escherichia coli (E.coli).
The cDNA (HUVEC) of KDR was used as amplification model by polymerase
chain reaction to obtain the DNA of 675 base pairs that codify 225 amino acids
related to domains 2 and 3 of KDR. A codifying sequence for domains 2 and 3 of
KDR (construct 2/3 KDR) was designed and synthesized for optimal use of DNA
construction codons, which are readily able to improve the expression codons of the
proteins thorough the host organism, in this case bacteria Escherichia coli (E.coli).
The construct2/3 KDR obtained by PCR was expressed in E.coli BL21 with
expression vector pET28a.
The technique to obtain a nucleotide sequence from cDNA related to the
desired sequence is largely used due to easy manipulation and rapid time to results.
The codifying ORF (open reading frame) for the target protein was cloned in pET28a
vector and expression was induced by IPTG. The expression analysis was monitored
and success was observed due to 25 kDa of protein expressed.
I N T R O D U Ç Ã O
INTRODUÇÃO
15
1.1. Angiogênese
O sistema circulatório nos vertebrados consiste em uma rede de vasos
sanguíneos e é essencial para o desenvolvimento e manutenção de todos os tecidos
do corpo. Através dos vasos sanguíneos os tecidos recebem oxigênio e nutrição,
removem o dióxido de carbono (CO
2
) e metabólitos finais tais como uréia e ácido
lático. Em condições patológicas como o câncer, a angiogênese, ou seja, o
crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente resulta
numa maior oxigenação e nutrição das células e, consequentemente, num rápido
crescimento do tumor [1].
A angiogênese envolve diferenciação, proliferação e migração das células
endoteliais que conduzem a formação de uma nova rede de vasos [2]. A
angiogênese está associada a diversos processos patológicos que incluem não
somente o câncer, mas também a proliferação da retinopatia do diabético
(complicação ocular da Diabetes mellitus) e degeneração macular. A angiogênese
patológica necessária para a ativação do crescimento tumoral persiste com a
aquisição inicial do fenótipo angiogênico que é um traço comum no mecanismo para
o desenvolvimento de vários tipos de tumores sólidos e hematopoiéticos [3, 4]. Nas
últimas décadas, estudos revelaram uma variedade de fatores que estimulam a
angiogênese, entre eles o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e seus
receptores (VEGFR) [5].
O VEGF é um polipeptídeo que exerce potente efeito sobre o sistema
vascular, incluindo a habilidade de induzir o crescimento de novos vasos
sanguíneos, o aumento da permeabilidade vascular e de edema [6], resultando em
extensão do tecido atingido pela isquemia após um infarto do miocárdio [7]. VEGF
INTRODUÇÃO
16
consiste, portanto, num fator específico e crítico para as células endoteliais
vasculares que se derivaram de artérias, veias e vasos linfáticos, pois induz a
angiogênese, aumentando a oxigenação e a disponibilidade nutritiva para a
proliferação do tumor. A angiogênese, por sua vez, induz a microvascularização que
se expande pelos tecidos e forma estruturas capilares no colágeno.
No câncer, o rompimento da proteína VEGF da barreira vascular pode
potencializar o extravasamento das células cancerígenas, causando metástase
difundida. Dessa forma, a obstrução da permeabilidade vascular promove inibição
dos efeitos de VEGF que podem reduzir ferimentos do tecido após a doença
isquêmica e minimizar as propriedades invasoras das células do tumor [7].
Estudos mostram que a maioria dos agentes que inibem o VEGF ou seus
receptores são bem tolerados, tanto em monoterapias como em combinação com a
quimioterapia padrão [8]. Assim, os inibidores de VEGF e VEGFR são extensamente
usados para controle de uma variedade de tumores no mundo todo. Entretanto, após
tratamento extensivo, o tecido e os vasos do tumor podem sofrer mudanças e
adquirir resistência a estas drogas [9].
1.2. Fator do Crescimento Endotelial Vascular (VEGF)
O VEGF também estimula a vasculogênese, regula a vascularização, age
como um fator vascular de permeabilidade e remodelador angiogênico e promove a
sobrevida de células endoteliais, evitando a apoptose destas células e a regressão
dos vasos [10]. Além disso, tem um papel crítico no desenvolvimento e na
manutenção da rede vascular de tumores que, por sua vez, expressam o VEGF
promovendo o crescimento e a metástase tumoral. Embora o VEGF induza a
INTRODUÇÃO
17
angiogênese, ele também funciona como desobstruidor da barreira vascular em
doenças teciduais [11]. A mediação do VEGF na permeabilidade vascular direciona
o acúmulo de barreira de fibrina em torno do tumor e circunda com limites as
propriedades malignas desse tecido. O crescimento do tumor é atenuado in vivo por
antibióticos anti-VEGF, já que VEGF reduz a isquemia e o edema [7].
O fator do crescimento endotelial vascular, ao contrário de outros fatores de
crescimento, é capaz de induzir o extravasamento de proteína e, provavelmente,
suas propriedades angiogênicas são mediadas, em parte, como indução do escape
de proteínas do plasma, conforme proposto por investigações precedentes que
revelaram um aumento na permeabilidade microvascular como etapa crucial na
angiogênese associada a tumores e feridas [7]. A distribuição do tecido de
receptores de VEGF inclui células do músculo vascular liso, osteoblastos, miócitos
cardíacos, miofibroblastos, neurônios e várias células tumorais [12].
A família de VEGF pertence ao fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF) e os membros dessa família possuem estrutura homodimérica com 8
resíduos conservados de cisteína em um peptídeo monomérico. A família de VEGF
tem 7 membros: VEGF-A (também comumente conhecido como VEGF) [13], VEGF-
B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, fatores 1 e 2 do crescimento (PIGF-1 e PIGF-2) e
VEGFs derivados do veneno de serpentes, tal como “T.f.” (Trimeresurus flavoviridis)
svVEGF. Todos os membros, exceto VEGF-E e o svVEGF, são codificados no
genoma mamífero. VEGF-A desenvolve um papel importante na vasculogênese e na
formação de vasos sanguíneos de células progenitoras, assim como na
angiogênese [1]. VEGF-C e VEGF-D são os ligantes de VEGFR-3, o qual expressa
predominantemente no endotélio linfático. Estudos em modelos experimentais
INTRODUÇÃO
18
esclareceram que VEGF-C e VEGF-D promovem o linfangiogênese do tumor e a
metástase linfática. As famílias do VEGF e de VEGFR é o sistema responsável pela
regulação do endotélio vascular e linfático e igualmente exercem um papel chave na
formação do tumor com a ativação da angiogênese e da linfangiogênese [8].
O gene humano de VEGF-A é situado no cromossomo 6p21.3 e organizado
em 8 éxons, separados por 7 íntrons . O processamento do transcrito de um único
gene de VEGF pode resultar na produção de 6 isoformas: VEGF121, VEGF145,
VEGF165, VEGF183, VEGF189 e VEGF206 [8]. VEGF121 é deficiente na atividade
de ligação com heparina por causa de sua propriedade ácida, estando livre para
difundir no espaço extracelular. Devido à sua atividade e potência biológica,
VEGF165 é a isoforma predominante de VEGF. Embora VEGF165 seja segregado
igualmente, uma fração significativa está limitada à superfície da célula e à matriz
extracelular (ECM). A maior parte de VEGF189 e VEGF206 é destinada a ECM por
causa de sua afinidade elevada pela heparina. Outra isoforma biologicamente ativa,
VEGF145, tem sido identificada recentemente [8].
VEGF-A é produzido por células malignas e não-malignas em resposta a
hipóxia, inflamação, fatores de crescimento e citocinas [8] e consiste numa proteína
homodimérica (Figura 1) cujas atividades biológicas são reguladas através da
ligação com seu próprio receptor domínio quinase (kinase domain receptor - KDR)
[10].
INTRODUÇÃO
19
Figura 1: Representações da fita dos domínios do receptor de VEGF-A. Proteína homodimérica
da família dos fatores de crescimento da cistina, com homologia limitada da sequência do fator de
crescimento derivado de plaqueta (PDGF).
Os efeitos biológicos do VEGF-A parecem ser exercidos, principalmente, por
meio da ligação ao receptor-2, que é expresso, predominantemente, nas células
endoteliais vasculares (Figura 2).
A B
Figura 2: Representação em fita da estrutura da proteína VEGFR-2. Em ambas as figuras A e B,
azul e verde representam o dímero de VEGF-A, amarelo e roxo representam o domínio 2 de KDR
(cada monômero de VEGF-A contribui para a ligação ao KDR).
INTRODUÇÃO
20
1.3. Receptores do Fator do Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR)
Os receptores de VEGF pertencem a uma subfamília dos receptores tirosina
quinase (RTK) [14] e são classificados em três: VEGFR-1 (Flt-1), um fraco
estimulador da angiogênese; VEGFR-2 (KDR ou Flk-1), o mais importante para a
angiogênese e VEGFR-3, ligado à proliferação dos vasos linfáticos [5, 15].
Nos seres humanos, VEGFR-1 e VEGFR-2 são compostos por 1338 e 1356
aminoácidos, respectivamente, e são constituídos por quatro regiões: o domínio
ligante-ligante extracelular, o domínio transmembrana, o domínio da tirosina quinase
e a região carboxiterminal. VEGFR-1 e VEGFR-2 são homólogos em sua estrutura e
os domínios extracelulares dos VEGFR apresentam homologia às porções variáveis
das imunoglobulinas (“Ig-like”) [15, 16].
Fuh et al mostraram que duas moléculas de KDR ligam-se a um dímero de
VEGF e que a dimerização é o mecanismo clássico de ativação do receptor tirosina
quinase. Os receptores tirosina quinases interagem com o fator estimulador de
formação de colônias de macrófagos (M-CSF) e steel factor (fator de célula-tronco).
A interação ocasiona uma dimerização do receptor tirosina quinase, permitindo que
os seus dois domínios citoplasmáticos fosforilem-se, um ao outro, em múltiplos
resíduos tirosina. Quando VEGF-A tem somente uma região obrigatoriamente
funcional (hV-1), não pode dimerizar o receptor in vitro [17].
Experimentos com KDR indicaram que, dos sete domínios extracelulares de
“Ig-like”, apenas os domínios dois e três são necessários para uma ligação de alta
afinidade com o VEGF-A [18]. O segundo e o terceiro domínios extracelulares
semelhantes à imunoglobulina estão associados com a ligação ao VEGF-A,
INTRODUÇÃO
21
enquanto os domínios quatro a sete estão envolvidos na dimerização. A ligação do
VEGF-A ao receptor-2 e a consequente homodimerização do receptor são
essenciais para estimular a sinalização intracelular, o que é vital para a atividade do
VEGF-A. O receptor-2 do VEGF também é receptor do VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E
e VEGF-F embora o significado fisiológico destes ainda esteja pouco definido
(Figura 3) [16].
Figura 3: Família de VEGF e seus receptores (VEGFR). Os VEGFR são caracterizados por sete
imunoglobulinas (“Ig-like”) como domínios extracelulares e um domínio intracelular do tipo tirosina
quinase. VEGF-A liga-se e ativa VEGFR-1 e VEGFR-2, mas não VEGFR-3.
1.4. Inibidores do Fator do Crescimento Endotelial Vascular
O VEGF e seu receptor KDR são reguladores centrais para a formação de
vasos sanguíneos [19]. Várias alternativas terapêuticas para antagonizar ou inibir a
função do VEGF estão sendo atualmente investigadas. Algumas delas já estão na
fase III dos ensaios clínicos e sua combinação com agentes quimioterápicos também
está sendo estudada [8]. Os tratamentos incluem grandes moléculas, tais como
INTRODUÇÃO
22
anticorpos de inibição de VEGF e dos VEGFR, além de formas solúveis dos
VEGFR, peptídeos e moléculas pequenas, tais como inibidores do transporte de
transdução do sinal [8].
Yamazaki et al, em 2005, relataram que um componente protéico designado
KDRbp (KDR-binding protein) da peçonha da serpente Agkistrodon piscivorus
piscivorus liga-se ao domínio extracelular de KDR com alta afinidade, resultando no
bloqueio subnanomolar de VEGF. Neste estudo, Yamazaki demonstrou que a
sequência de aminoácidos da região N-terminal e os fragmentos enzimaticamente
digeridos da sequência peptídica de KDR-bp são idênticos aos da Lys49-fosfolipase
A2, um homólogo inativo da fosfolipase A2, no qual a Lys49 substitui Asp49 [19].
As fosfolipases A2
são enzimas interfaciais que catalisam especificamente a
hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando,
como produto da hidrólise, ácidos graxos e lisofosfolipídio [20]. As PLA2 são
encontradas na natureza tanto intra como extracelularmente, apresentando diversas
funções desde danificação das membranas celulares, como é o caso das PLA2 dos
venenos, até uma função no padrão da regulação da resposta inflamatória e
agregação de plaquetas como, por exemplo, as PLA2 de mamíferos [21]. A
bothropstoxina I (BthTx-I) é uma Lys49PLA2 isolada do veneno de Bothrops
jararacussu que apresenta uma substituição do aminoácido ácido aspártico por lisina
na posição 49 do sítio ativo, impedindo a ligação do co-fator Ca
2+
, com a
consequente perda do ciclo catalítico produtivo. As Lys49PLA2 existem na forma
homodimérica em solução no pH 7.0 [22, 23] e a estabilização do dímero são
devidas às interações hidrofóbicas e eletrostáticas entre os aminoácidos Glu12,
Trp77 e Lys80 de cada monômero [24].
INTRODUÇÃO
23
Considerando-se este fato, supõe-se que a ligação de Lys49PLA2 ao KDR
também não é diretamente dependente do aminoácido na posição 49, sendo,
portanto, independente da atividade fosfolipásica. Apesar da ausência da atividade
catalítica, as Lys49PLA2 apresentam propriedades farmacológicas variadas como
miotoxicidade [25], formação de edema, neurotoxicidade pré e pós-sináptica,
cardiotoxicidade, agregação de plaquetas [26] e atividade bactericida [11]. Embora
sejam ainda pouco conhecidos os mecanismos através dos quais as PLA2s causam
tais efeitos, sabe-se que a função catalítica não é necessária para algumas destas
propriedades farmacológicas. Embora seja desconhecido se KDR está envolvido na
manifestação de miotoxicidade e no efeito de edema das Lys49PLA2 [19], a
interação proteína/receptor pode ser estudada por métodos de clonagem de
proteínas.
1.5. Sequências codificadoras de proteínas
Em Genética Molecular, uma open reading frame (ORF) é uma porção do
organismo do genoma que contém uma sequência de bases que poderiam
potencialmente codificar uma proteína, ou seja, a região do gene que vai desde o
primeiro ATG a ser traduzido até o códon de terminação. Os pontos de início e fim
de uma dada ORF não são equivalentes as extremidades do RNA mensageiro
(mRNA), mas estão, normalmente, contidas na sequência do mesmo. Dentro de um
gene, ORFs estão localizadas entre o início (iniciação do códon) e o fim (terminal do
códon) do código sequencial [27].
A existência de uma ORF, especialmente quando extensa, geralmente é uma
INTRODUÇÃO
24
boa indicação da presença de um gene na sequência. Neste caso, a região terminal
é parte da sequência que será traduzida pelo ribossomo, e se o DNA for eucarioto, a
região terminal poderá apresentar lacunas chamadas íntrons. No entanto, ORF
curtas também podem ocorrer com pequena frequência fora dos genes.
Normalmente, ORF fora dos genes não são muito longas e terminam após alguns
códons [28].
É comum, nos eucariotos, que a ORF seja interrompida por um ou mais
trechos de DNA não posteriormente traduzidos, pois serão retirados do conjunto do
processo de maturação do mRNA. Este mecanismo de retirada de segmentos de
DNA não codificantes, chamados íntrons, é conhecido como splicing [27].
1.6. Sequências codificadoras de proteínas sintéticas
O DNA complementar (cDNA) é uma molécula de DNA sem íntrons,
diretamente transcrita de uma molécula de mRNA funcional. O processo de cDNA
passa pelo isolamento de uma molécula de mRNA funcional das células, adição de
transcriptase reversa (que cataliza a síntese de uma cadeia simples de DNA a partir
de um molde de mRNA) e nucleotídeos livres e a união de uma enzima que degrada
o mRNA que serviu de molde com DNA polimerase capaz de catalisar a formação da
cadeia complementar de DNA [29].
Em 1977, quando cientistas produziram a primeira proteína humana em uma
bactéria, a expressão das proteínas em sistemas heterólogos introduziu um papel
crucial na indústria biotecnológica. Até então, somente a sequência de aminoácidos
da somatostatina fora descoberta, o que ocorreu após a síntese do gene da
INTRODUÇÃO
25
somatostatina usando oligonucleotídeos em vez de clonagem de genoma humano
[30].
Anos mais tarde, a maioria dos genes passaram a ser clonados de bibliotecas
de cDNA ou diretamente por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) do
organismo de origem [28].
O DNA, como todas as outras formas de informação, pode ser escrito e lido.
Para o DNA, a leitura é feita por meio do arranjo da sequência de DNA e a escritura
é feita pela síntese do gene. Durante a última década, a Biologia Molecular focalizou
em ler e em analisar sequências naturais do DNA. Em contraste, o campo
emergente da Biologia Sintética busca descobrir informações genéticas, criando
desse modo genes artificiais, proteínas, processos biológicos e organismos [31].
O uso dos códons de uma ORF pode causar limitações na expressão
heteróloga de uma proteína, especialmente nos casos onde os genes externos são
expressos em um hospedeiro em que o uso dos códons em genes altamente
expressados em bactéria não se assemelha ao uso dos códons na espécie do qual o
gene estrangeiro foi originado [32]. Nesses casos, a substituição de códons raros no
gene introduzido pode aumentar o rendimento consideravelmente. Além disso, a re-
colocação de códons raros pode diminuir a possibilidade de incorporações
inadequadas e proteger a proteína do renovelamento precoce [32].
O nível de expressão de proteínas é uma causa determinante para o uso de
códons em todas as espécies estudadas até agora, já que os códons são sempre
utilizados na transcrição de mRNA; os genes que são altamente expressos tendem a
usar uma pequena quantidade de códons que correspondem a espécie mais
abundante do tRNA. Isto minimiza o risco de deleção do tRNA durante a tradução.
INTRODUÇÃO
26
Este fenômeno é de importância prática para a expressão, especialmente quando o
gene expresso tiver muitos códons que são usados raramente no anfitrião. Nesses
casos, os códons (ou a disponibilidade de tRNA) podem ser fatores limitantes para o
rendimento. Para superar este problema, os códons raros presentes no gene podem
ser substituídos por códons que correspondem à espécie mais abundante do tRNA,
aumentando, assim, o rendimento da expressão da proteína [32]. A espécie que
utiliza códon como estratégia de otimização provou ser útil para expandir a
expressão e inclui tanto procariotos quanto eucariotos uni e multicelulares. Além
disso, o uso de códons raros pode ter consequências negativas para a expressão, à
exceção apenas da quantidade de proteína obtida. A qualidade da proteína expressa
é dependente dos códons, porque os códons raros são associados a uma maior
possibilidade de incorporações errôneas. Diversas pesquisas relatam a qualidade
diminuída do produto expresso devido aos códons raros. Em resumo, existem
argumentos suficientes para substituir códons raros para expressão [32].
Visando a otimização dos códons para a expressão da proteína em bactéria
Escherichia coli (E.coli), foi desenhada e sintetizada uma sequência codificadora
para os domínios 2 e 3 do KDR (constructo 2 e 3 do KDR), com a finalidade de
atingir resultados experimentais similares aos obtidos com o produto da amplificação
do cDNA (HUVEC) do KDR.
O B J E T I V O S
OBJETIVOS
27
2.1. OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem por objetivo a síntese funcional de uma sequência de
nucleotídeos correspondente aos domínios 2 e 3 do Receptor-2 do Fator do
Crescimento Endotelial Vascular in vitro que, ao ser expressa em bactéria
Escherichia coli (E.coli), permita aplicações otimizadas de seus códons.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Amplificação da sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR, tendo
como respaldo a sequência de VEGFR-2 encontrada no GenBank
AAC16450.1;
Clonagem do produto da reação de amplificação correspondente a sequência
dos domínios 2 e 3 do KDR em vetor de clonagem pJET
TM
1.2;
Sub-clonagem da sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR em
vetor de expressão pET28a+;
Expressão da proteína correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR em E.coli;
Construção da sequência codificadora sintética correspondente ao DNA dos
domínios 2 e 3 do KDR;
Alteração das regiões flanqueadoras da sequência dos domínios 2 e 3 do
KDR para a inserção dos sítios de clivagem pelas enzimas de restrição HindIII
e XbaI;
Clonagem da sequência codificadora sintética dos domínios 2 e 3 do KDR em
vetor de expressão pET28a.
M A T E R I A I S E M É T O D O S
MATERIAIS E MÉTODOS
28
3.1. cDNA do transcrito que codifica para o VEGF
O processo se inicia pela extração do mRNA. Este processo é, do ponto de
vista bioquímico, semelhante ao processo de extração de DNA, porém o RNA é
muito lábil, sujeito a ação das RNAse do próprio organismo e de praticamente
qualquer fluído biológico, inclusive a água não auto-clavada. Tomadas as devidas
precauções, pode-se obter uma apreciável quantidade de RNA praticamente a partir
de qualquer célula eucariota.
O procedimento adotado pelo laboratório coordenado pela pesquisadora do
Centro Regional de Hemoterapia do Hemocentro de Ribeirão Preto e Professora
Doutora da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
– FMRP/USP, Aparecida Maria Fontes, para a produção de DNA de fita dupla a
partir de mRNA, a primeira etapa de construção envolve a produção de um DNA
complementar utilizando a técnica de RT-PCR. Neste procedimento, inicialmente foi
sintetizada a fita simples de cDNA, utilizando o kit ThermoScript RT-PCR System
(Invitrogen), com o iniciador oligo (dT), conforme resumidamente descrito abaixo:
Foram utilizados 4 µg de RNA total obtidos a partir de HUVEC (Humam
Umbilical Vein Endothelial Cells), 1 µL do oligo iniciador 50 pmol/µL, 10 mM de dNTP
e água livre de RNAse, para um volume final de 12 µL. Esta mistura foi incubada por
5 min. a 65 ºC, seguido de banho de gelo por 3 min. Em seguida, foi adicionado
tampão 5 vezes concentrado em relação a concentração final da enzima
transcriptase reversa, 0.1 M de DTT, RNA 40 U/µL e água livre de RNase.
Posteriormente, a amostra foi transferida para um termociclador, incubada por 60
min. a 50 ºC e a reação foi interrompida por incubação a 85 ºC durante 5 min. Por
MATERIAIS E MÉTODOS
29
fim, foi adicionada a amostra 1 µL de RNAse, seguido de incubação por 20 min.
a 37 ºC. A amostra foi armazenada a uma temperatura de -20 ºC até o momento de
uso.
3.2. Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação do
cDNA
Com base na sequência de DNA correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
que possui 225 aminoácidos, foram idealizados os oligonucleotídeos iniciadores,
tendo como referência a sequência encontrada no GenBank AAC16450.1 para
amplificar a matriz de leitura aberta (ORF) predita do gene a ser estudado (Tabela
1).
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação por meio de PCR.
Nome do
Primer
Sequência do primer
Temperatura de
anelamento
KDR23F 5’-TACCGGGAAACTCATATGGCCTCGGTC-3’ 73 °C
KDR23F 5’-GGCTTCCACCAGGGATCCTTAGCCACTTCC-3' 76 °C
Para a amplificação do cDNA foi utilizado o programa AMP1: desnaturação a
95 °C/1minuto; anelamento a 50 °C/1 minuto e extensão a 72 °C/2 min.
3.3. Obtenção do DNA referente aos domínios 2 e 3 do KDR partindo do
cDNA por PCR
Os componentes envolvidos nesta reação são basicamente os mesmos do
MATERIAIS E MÉTODOS
30
processo de replicação que ocorre no interior das células: DNA que contém o
segmento a ser amplificado, nucleotídeos (A, T, C e G), enzima DNA polimerase e
dois iniciadores (pequenos oligonucleotídeos complementares ao DNA alvo). A
reação ocorre em um termociclador que, por meio de sucessivas mudanças de
temperatura, direciona as três etapas da reação:
1. Desnaturação: ocorre a separação da dupla fita de DNA molde por meio
da elevação da temperatura para 94 ºC.
2. Anelamento: uma vez separadas as fitas de DNA, a temperatura da reação
é reduzida para 50 ºC e os iniciadores anelam-se um em cada fita molde, nas
respectivas sequências complementares vizinhas à região alvo da amplificação.
3. Extensão: eleva-se a temperatura para 72 ºC para que a enzima Taq DNA
polimerase posicione-se junto aos iniciadores que se anelaram anteriormente e inicie
a duplicação da fita molde, adicionando os nucleotídeos que contenham as bases
nitrogenadas complementares à fita molde.
Após o término destes passos, todo o ciclo é repetido (desnaturação a
extensão) por várias vezes até que se obtenha uma quantidade razoável do DNA a
ser amplificado.
Foram realizadas amplificações utilizando cDNA (HUVEC) de KDR,
combinado com os oligonucleotídeos específicos para a obtenção do gene em
estudo nesse trabalho (Tabela 1). Especificamente para a reação desta etapa, foi
utilizado um programa de amplificação com 30 ciclos, cada um composto de uma
etapa de desnaturação durante 1 min. a 95 °C, uma de anelamento durante 1 min. a
MATERIAIS E MÉTODOS
31
50 °C e uma de extensão durante 2 min. a 72 °C, utilizando a enzima Taq DNA
Polimerase (Invitrogen).
3.4. Análise do produto de amplificação no gel de agarose
O produto da reação de amplificação por meio de RT-PCR do DNA
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR foi aplicado em gel de agarose 1% e a
banda de DNA de interesse de 700 pb foi identificada através da marcação com
brometo de etídeo (0.5 mg/mL) e, com um corte usando bisturi, foi isolada do gel
para ser purificada.
3.5. Purificação do produto de PCR
Na solubilização do gel de agarose, para cada unidade (massa) de gel foram
adicionados três volumes de tampão de ligação (3:1 massa/volume) e a mistura foi
incubada por 15 min. a 55 °C, agitando-se levemente a cada minuto. Em seguida, foi
adicionado o volume de 500 mL de etanol anidro e o tubo de 2.0 mL, contendo uma
coluna de purificação, foi agitado várias vezes. Após a centrifugação por 1 minuto a
12000 rpm, o sobrenadante foi descartado. A coluna foi lavada com 700 L de
tampão de lavagem (solução tamponada), centrifugada novamente por 1 minuto a
10000 rpm e o processo repetido para a retirada do tampão de lavagem residual. A
coluna foi inserida em um novo tubo de 1.5 mL e a amostra de DNA foi eluída pela
adição de 30 L de tampão de eluição (10 mM Tris, pH 8.0). Após incubação por 1
minuto a temperatura ambiente, a amostra foi centrifugada por 1 minuto a 10000
rpm. O DNA eluído foi armazenado a -20 °C.
MATERIAIS E MÉTODOS
32
3.6. Clonagem no vetor pJET
TM
O kit de clonagem CloneJET™PCR é um sistema avançado de seleção
positiva para a clonagem de elevada eficiência de produtos de PCR gerados com a
polimerase de DNAPfu, a Taq Polimerase de DNA ou outras polimerases de DNA
termoestáveis. Adicionalmente, todos os outros fragmentos do DNA, “blunt” (corte
cego) ou “sticky-end” (corte coesivo), podem ser clonados com sucesso usando o
kit. A vantagem deste sistema é a clonagem feita de forma rápida e eficiente.
A reação de amplificação foi feita utilizando a Taq DNA Polimerase True Start
(Fermentas) que adiciona um nucleotídeo A ao final da extremidade 3’ (3’-dA). Para
a retirada de 3’-dA, foi realizada uma reação com por 10 L de tampão de reação
2X, 2 L do produto purificado de PCR (etapa 3.4), 1 L da enzima DNA blunting e
17 L de água esterilizada. Esta reação foi incubada a 70 °C por 5 min. e resfriada
brevemente em banho de gelo.
Para a realização da reação de ligação, utilizou-se 1 L do vetor de clonagem
pJET1.2/blunt (50 ng/L) e 1 L da enzima T4 DNA ligase (5 U/L), seguida de
incubação durante 5 min. a 22 °C por 5 min., cujo rendimento de clones positivos foi
superior a 99%. O kit caracteriza um vetor positivo pJET1.2/blunt de seleção de
clonagem. O vetor contém o gene letal da enzima limitante que é interrompido pela
ligação de uma inserção do DNA no local de clonagem. Em consequência, somente
as células com plasmídeo de recombinação podem propagar. Este vetor contém o
promotor T7 para a transcrição da inserção in vitro (Figura 4).
MATERIAIS E MÉTODOS
33
Figura 4: Vetor pJET
TM
1.2/blunt usado no sistema de seleção positiva para clonagem de
elevada eficiência de produtos de PCR gerados com a polimerase de DNAPfu, a Taq
Polimerase de DNA ou outras polimerases de DNA termoestáveis.
De acordo com tais características, visando otimizar a obtenção de clones
positivos, o fragmento de cDNA, devidamente purificado, foi ligado em vetor pJET
TM
,
conforme as especificações do fabricante. O volume de 30 µL da reação de ligação
foi utilizado no procedimento de transformação em células DH5.
3.7. Preparo das células DH5 competentes
Inicialmente uma amostra de um estoque de células foi inoculada em placa
contendo meio LB sólido (triptona 0.5%; extrato de levedura 0.5%; NaCl 1% e ágar
1.5%) e incubada por 12 h a 37 ºC. Uma colônia dessa placa foi lançada em 5 mL de
meio LB líquido (triptona 0.5%; extrato de levedura 0.5% e NaCl 1%) e incubada por
mais 12 h sob agitação de 180 rpm e 37 ºC, para o crescimento na forma de pré-
inóculo. O pré-inóculo foi lançado em 500 mL de meio LB líquido e incubado
novamente sob as mesmas condições de agitação e temperatura. O crescimento
MATERIAIS E MÉTODOS
34
das células foi monitorado em espectrofotômetro até a cultura ter atingido a
densidade óptica de 0.3 em 600 nm, o que corresponde uma densidade celular de
3x10
7
cfu/mL [33].
As células foram então transferidas para dois tubos de centrífuga, incubadas
em banho de gelo por 5 min., e centrifugadas a 4 ºC e 12000 rpm
por 10 min.
(Solwall 5C 5B). O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi re-suspenso em
100 mL de tampão de competência (CaCl
2
60 mM, PIPES 10 mM e glicerol 15%).
Seguiu-se, então, mais uma etapa de centrifugação e de re-suspensão do
precipitado sob as condições descritas anteriormente, sendo que, posteriormente,
as células foram incubadas em banho de gelo por 30 min. Após uma nova
centrifugação, o precipitado foi re-suspenso em 12 mL de tampão e as células foram
distribuídas em alíquotas de 300 L e estocadas a -70 ºC.
3.8. Transformação Bacteriana (
E. coli
DH5
)
O fenômeno conhecido como transformação bacteriana é de importância
central na Biologia Molecular. Por esse processo, é possível a introdução de
plasmídeos carregando genes de outros organismos fabricados ou naturais dentro
das bactérias, que podem então expressar estes genes [34]. O processo de
transformação envolve a introdução de DNA exógeno nas células bacterianas e este
DNA passa então a fazer parte do material genético da bactéria, podendo ser
herdado pelas novas células todas as vezes que a bactéria se multiplicar. Através da
manipulação genética pode-se criar um caráter presente na bactéria que passará a
ser hereditário. No entanto, para permitir que o DNA plasmidial seja inserido nas
MATERIAIS E MÉTODOS
35
células bacterianas, estas devem apresentar condições fisiológicas especiais. Este
estado fisiológico especial é chamado de competência. Uma bactéria competente é
aquela que está apta a receber DNA exógeno.
A competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida através de
diferentes técnicas. Estas técnicas envolvem tratamento com cloreto de cálcio e
mudanças bruscas de temperatura. Os íons de metal e as mudanças bruscas de
temperatura alteram a permeabilidade da parede celular fazendo com que estas
células permitam a entrada de DNA exógeno através da membrana celular. As
bactérias competentes são bastante frágeis e devem ser manuseadas com cuidado.
A quantidade de células transformadas por 1 µg de DNA é chamada eficiência da
transformação [34]. Na prática, pequena quantidade de DNA é usada (5 a 100 ng)
uma vez que muito DNA pode inibir a transformação.
A transformação celular foi feita conforme protocolo estabelecido pelo
Laboratório de Estrutura e Função de Proteína (LEFP) do Departamento de Química
da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo – FFCLRP/USP: para 200 L de células competentes foram adicionados
30 L da ligação pJET
TM
/domínios 2/3 do KDR. Outra reação foi realizada,
paralelamente, com a mesma mistura presente, exceto o DNA plasmidial, e esta foi
utilizada como controle negativo para o experimento.
Cada uma das misturas foi submetida a um ciclo térmico (30 min. em banho
de gelo, 90 s a 42 °C, 2 min. em banho de gelo) e, então, adicionou-se para cada
reação 900 L de meio LB líquido e 10 L de glicose 2 mM. As misturas foram
incubadas por 1 h a 200 rpm e 37 ºC, para regeneração das células. Após a
regeneração das células transformadas e centrifugadas, retirou-se 900 L do
MATERIAIS E MÉTODOS
36
sobrenadante, o pellet de bactéria foi re-suspenso e, enfim, lançado em placa
contendo meio LB sólido e 100 g/mL de ampicilina (para seleção do plasmídeo),
sendo incubados para crescimento por 12 h a 37 ºC.
3.9. Extração do DNA plasmidial
Após o crescimento das células transformadas em placa de Petri, uma colônia
foi inoculada em 3 mL de meio LB líquido com 100
µ
g/mL de ampicilina e cultivada
por 12 h. A cultura foi centrifugada por 5 min. a 12000 rpm e o sobrenadante foi
descartado. O precipitado celular foi re-suspendido em tampão GET (Tris 25 mM, pH
8.0, glicose 50 mM; EDTA 10 mM), seguido da adição de 200
µ
L da solução de lise
(NaOH 0.2 N e SDS, pH 7.2) e 150
µ
L de KC
2
H
3
O
2
3 M. Centrifugou-se a amostra
por 10 min. a 12000 rpm, transferiu-se o sobrenadante para tubos limpos, adicionou-
se 1 mL de etanol absoluto e, então, tais tubos foram deixados à -70 °C por 1 h.
Em seguida, centrifugou-se a amostra por 5 min. a 12000 rpm. Ao precipitado,
adicionou-se 1 mL de etanol 70%, centrifugou-se sob as mesmas condições, e mais
uma vez descartou-se o sobrenadante. Em seguida, esperou-se que o precipitado
secasse totalmente a temperatura ambiente, para então ser re-suspendido em 100
µ
L de RNase (200
µ
g/mL) e incubado a 37 °C por 3 h. Adicionou-se 50
µ
L de fenol
equilibrado com Tris-HCl pH 8,0 e, após centrifugação, por 10 min. a 12000 rpm
,
a
fase aquosa foi transferida para um novo tubo.
A precipitação do DNA foi realizada adicionando-se 10% de acetato de sódio
3 M (pH 5.2) correspondente a 10% do volume da amostra e 2.5 vezes o volume da
amostra de etanol absoluto gelado. A mistura foi deixada por 1 h a -70 °C, e
MATERIAIS E MÉTODOS
37
posteriormente foi centrifugada por 10 min. a 12000 rpm com descarte do
sobrenadante. O precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70%, centrifugado, e
após novo descarte do sobrenadante, secado por 5 min. a 65 ºC, sendo re-
suspendido em 20
µ
L de TE (Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM).
3.10. Sequenciamento de nucleotídeos de DNA
Após extração do DNA plasmidial foi realizado as reações para
sequenciamento automático (Sequenciador ABI 377-18) utilizando-se o kit (ABI
Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reacton, com AmpliTaq DNA
Polymerase, FS –
Perkin-Elmer
). Misturou-se 1
µ
L de solução “Big Dye” (mix
contendo; finalizador A-Dye marcado com dicloro[R6G], finalizador C-Dye marcado
com dicloro[ROX], finalizador G-Dye marcado com dicloro[R110], finalizador T-Dye
marcado com dicloro[TAMRA], desoxinucleosídeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e
dTTP), DNA polimerase AmpliTaq, com pirofosfatase termoestável), 3
µ
L de tampão
2.5X (200 mM Tris, 5 mM MgCl
2,
pH 9,0), 200 ng de DNA, 3-5 pMoles do iniciador
para seqüenciamento opcional 5´ ou 3´ do gene, completando o volume final de 10
µ
L com água esterilizada.
Em seguida, a solução foi deixada sob as seguintes condições em
termociclador: 1 – 96 ºC por 2 min., 2 – 96 ºC por 30 s, 3 – 50 ºC por 15 s e 4 – 60
ºC por 4 min. Os ciclos de 2 a 4 foram repetidos 40X, e após o final da
polimerização, a temperatura foi estabilizada a 10 ºC. As amostras foram
precipitadas e lavadas, para isso transferiu-se o volume das reações para
recipientes de maior volume (1.5 mL), onde foram adicionados 80
µ
L de isopropanol
MATERIAIS E MÉTODOS
38
75%, misturou-se e deixou-se incubando por 15 min. a temperatura ambiente. Fez-
se uma centrifugação por 20 min a 12000 rpm e descartou-se o sobrenadante e ao
precipitado foi adicionado 1 mL de etanol 70%, centrifugado novamente por 10 min a
12000 rpm descartando-se novamente o sobrenadante e o precipitado foi deixado
secar por alguns min., sendo re-suspendido em 4
µ
L de tampão “Loading 2x
formamida” (10X TBE, 90% formamida e 0.5% azul de bromofenol), e incubado a 96
ºC por 2 min. As amostras foram aplicadas em gel de sequenciamento padrão 4.25%
(18 g uréia, 5.3 mL acrilamida 40%, 0.5 g de resina, 5 mL TBE 10X, 250
µ
L APS
10% e 35
µ
L de TEMED) e analisadas, após corrida durante 2h no sequenciador
automático ABI 377-18.
Os plasmídeos foram sequenciados nas direções “
forward
” e “
reverse
” com o
auxílio dos oligonucleotídeos iniciadores pJET1.2 Forward Sequencing Primer 5’-
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ e pJET1.2 Reverse Sequencing Primer 5’-
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’.
3.11. Digestão enzimática do vetor pJET
TM
+ domínios 2 e 3 do KDR com NdeI e
BamHI
A digestão da dupla fita do fragmento amplificado e do vetor foi realizada a 37
°C durante 4 h com 5 U da enzima
Nde
I e 5 U da enzima
Bam
HI (Fermentas),
formando extremidades coesivas, isto é, deixando bases despareadas, em uma das
extremidades (
overhang
) 5´ [35]. Em seguida, foi inativada por aquecimento a 85 ºC
por 20 min. O DNA digerido foi aplicado em gel de agarose 1 % e purificada com uso
do
kit GENECLEAN – MP Biomedicals USA,
segundo as normas do fabricante, e re-
MATERIAIS E MÉTODOS
39
suspendida em 30 L de água esterilizada para, então, sub-clonar o fragmento em
vetor de pET28a+.
3.12. Clonagem da sequência codificadora em vetor pET28a+ (Novagen)
para expressão em sistema bacteriano
3.12.1. Características do vetor pET28a+
O vetor pET28a+ (Figura 5) possui duas sequências que codificam caudas de
histidina tanto na região N-terminal quanto na região C-terminal da proteína, uma
origem de replicação (455 pb), as regiões do promotor, a sequência referente ao
operon
da lactose,
lac
I (1079 pb) e o gene que confere resistência a Kanamicina
(812pb). Os promotores do T7 RNApolimerase consistem em uma sequência
altamente conservada de 23 pb que marca o local da iniciação da transcrição (+1) e
estende por 3’-17 a 5’+6. Além disso, apresenta também uma região com múltiplos
sítios de clonagem, que podem ser clivados por enzimas de restrição.
MATERIAIS E MÉTODOS
40
Figura 5: Vetor pET28a+. Note as sequências codificadoras do operon lac (lacI), a sequência que
confere resistência a Kanamicina (kan) e a origem de replicação (ori) As enzimas NdeI e BamHI
marcadas indicam a localização das sequências clivadas para a inserção do gene de interesse
(domínios 2/3 do KDR) juntamente a sequência da cauda de 6 Histidinas), também previamente
clivada com as mesmas enzimas (adaptado, Novagen).
3.12.2. Preparo do vetor
O vetor foi preparado segundo o protocolo comum para a maioria dos DNAs
preparados no LEFP:
1. Preparo das células competentes DH5, item 3.6;
2. Transformação bacteriana, nesse caso, em E.coli DH5 FSB – item 3.7;
3. Extração de DNA plasmidial utilizando o protocolo descrito no item 3.8.
3.12.2.1. Digestão do vetor
O vetor pET28a+ foi digerido a 37 °C durante 4 h com 5 U da enzima NdeI
e 5 U de BamHI (Promega) e inativou-se a digestão a 80 °C durante 20 min. Em
MATERIAIS E MÉTODOS
41
seguida, foi feita a desfosforilação das extremidades 5’ do vetor pET28a+ para
impedir a re-circularização do vetor linear durante a reação de ligação. Para isso,
utilizou-se 20 L do vetor linear (contendo 200 ng de DNA), 10 L do tampão de
reação 10X (50 mM Tris-HCl pH 9,3 a 25 ºC; 1 mM de MgCl
2
; 0,1 mM de ZnCl
2
;
1mM de espermidina), 5 U da enzima CIAP (Calf intestinal alcaline phosphatase) e
água esterilizada suficiente para completar o volume de 100 mL.
3.13. Ligação do DNA ao vetor pET28a+
O fragmento purificado, após a digestão da ligação pJET
TM
+ a sequencia
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR com as enzimas NdeI e BamHI, foi
ligado ao vetor pET28a+ desfosforilado. Para a ligação foi utilizada uma proporção
de 3 partes de fragmento para 1 parte de vetor na presença de 1U da enzima T4
DNA ligase (Promega) a 16 °C por 18 h. A solução de ligação foi usada na
transformação da bactéria E.coli da linhagem DH5 competentes, na presença de 10
µg/mL de kanamicina.
3.14. Transformação e Extração de DNA
A ligação pET28a+ + a sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
foi multiplicada e realizou-se a extração do DNA em células DH5 FSB (descrito
anteriormente), conforme protocolo estabelecido no LEFP.
MATERIAIS E MÉTODOS
42
3.15. Sequenciamento de nucleotídeos de DNA
As reações de sequenciamento foram realizadas conforme descrito anteriormente
no item 3.10. Os plasmídeos foram sequenciados nas direções “forward” e “reverse”
com o auxílio dos oligonucleotídeos iniciadores T7 promoter 5’-
TTATGCTGAGTGATATCCCTTAA-3’ e T7 terminator 5’-
GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’.
3.16. Expressão de proteínas heterólogas em linhagens
E. coli
BL21
3.16.1. Preparo de células BL21 competentes
As bactérias foram crescidas em uma placa contendo 34 µg/mL do antibiótico
cloranfenicol por 16 h. Posteriormente, inoculou-se uma colônia isolada em 3 mL de
meio HDM (15 g de triptona, 25 g de extrato de levedura pH = 7.5), a qual foi
mantida a 37 °C por 16 h (pré-inóculo).
Inicialmente, 400 µL do pré-inóculo foi inoculado em 40 mL de meio HDM e
deixado sob agitação de 200 rpm a 37 °C até atingir densidade óptica igual a 0.6
no
comprimento de onda de 600 nm. As bactérias foram centrifugadas a 3.500 rpm por
6 min., re-suspensas em 40 mL de MgCl
2
0.1 M; centrifugadas, re-suspensas em 20
mL de CaCl
2
0.1M e centrifugadas e re-suspendidas em 4 mL de CaCl
2
.
As bactérias permaneceram por 40 min. em banho de gelo e foram
aliquotadas com a adição de glicerol 80% até o momento do uso.
MATERIAIS E MÉTODOS
43
3.16.2. Expressão da proteína em função do tempo de indução
A linhagem de E. coli BL21 competente foi transformada com: pET28a+
(controle positivo), pET28a+ + domínios 2 e 3 do KDR e sem qualquer vetor
(controle negativo). Foram utilizados 100 µL de solução contendo E.coli BL21
competente. Os produtos foram introduzidos na bactéria por choque térmico de 30
min. em banho de gelo, seguido de 5 min. em banho maria a 37 °C. Após este
procedimento, as bactérias cresceram por 1 h a 37 ºC em 1.0 mL de meio de cultura
HDM. Em seguida, as células foram centrifugadas (Centrífuga Eppendorf, modelo
5415 R) a 2000 rpm por 5 min., o sobrenadante foi descartado e as bactérias re-
suspensas em 100 L de meio de cultura, que foram transferidas para placas de
Petri com meio de cultura HDM com 1.5% de ágar, 40 µg/mL de kanamicina e 34
µg/mL de cloranfenicol (Sigma) e mantidas por 16 h a 37 °C.
Após incubação por 16 h, uma colônia isolada foi pré-inoculada em 3 mL de
meio HDM que, após 16 h de crescimento, foi inoculada em 100 mL de meio HDM
com 10 µL de kanamicina 40 µg/mL e 10 µL de cloranfenicol 34 µg/mL, sob agitação
de 200 rpm a 37 °C até atingir a densidade óptica 0.6 no comprimento de onda de
600 nm, quando, então, 1 mL de cultura foi coletado (amostra sem indução) e o
restante induzido com 1 mM de isopropil--D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)
(Promega). Foi coletado 1 mL de cultura a cada h (até 6 h) e cada amostra foi
centrifugada a 12000 rpm por 3 min. O precipitado foi re-suspendido em 100 µL de
tampão de amostra para proteína (3.8 mL de água, 1 mL de Tris-HCl 0.5M, pH=6.8,
0.8 mL de glicerol, 1.6 mL de SDS 10%, 0.4 mL de 2-betamercaptoetanol, 0.4 mL de
azul de bromofenol 1%) e um volume correspondente à 0.15 unidades de OD
600
, foi
analisado por SDS-PAGE.
MATERIAIS E MÉTODOS
44
3.16.3. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese é um dos métodos mais convenientemente empregados para a
separação e análise qualitativa de moléculas. O gel mais comum para proteínas é o
de poliacrilamida (PAGE) com SDS (dodecilsulfato de sódio) adicionado. O gel é
composto por polímeros intercalados de acrilamida e bis-acrilamida para formar uma
fina malha cruzada dos compostos e, visto que suas cargas estão igualadas
negativamente pelo SDS, as proteínas são separadas pelo seu peso molecular.
Assim, as moléculas peptídicas menores atravessam a malha mais rapidamente que
as de maior tamanho em direção ao pólo positivo do campo elétrico.
Para análise em gel de poliacrilamida da proteína, foi feito um gel de 12%
desnaturante, o qual foi preparado por polimerização de uma mistura de
acrilamida/bis-acrilamida na razão 29:1, em uma tampão (0.3 M Tris-HCl, pH 6.8),
com 0.05% de persulfato de amônio + 0.007% TEMED. A polimerização foi feita em
cuba de eletroforese e as amostras das proteínas submetidas a um campo elétrico
de 30 V. A corrida durou em torno de 3 h e, no fim do processo, o gel foi corado com
Comassie Blue (Sigma), 0.1% Comassie R-250, 50% metanol, 7% ácido acético,
utilizados para a coloração de proteínas, otimizando a visualização das frações
eluídas da coluna de cromatografia.
3.17. Criação da sequência
in frame
do DNA que codifica os domínios 2 e
3 de KDR
Muitos estudos foram realizados para melhorar a expressão de genes
clonados, incluindo a otimização das condições do crescimento do hospedeiro.
MATERIAIS E MÉTODOS
45
Apesar dos avanços, não se conseguiu contornar um problema subjacente
significativo: a sequência do DNA usada para codificar uma proteína em um
organismo frequentemente difere no uso de códons que seria usada para codificar a
mesma proteína em outro organismo [31].
Dado que as proteínas são produzidas a partir da informação contida no DNA,
uma vez conhecido o gene, pode-se deduzir a sequência de aminoácidos que
codifica determinada proteína e, da mesma maneira, os códons correspondentes
aos mesmos aminoácidos. A opção por trabalhar com uma sequência sintética de
DNA justifica-se pela possibilidade de retirar códons raros, evitando a inserção de
íntrons, o que pode acontecer quando se utiliza DNA humano.
A sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR foi montada à partir
da sequência de aminoácidos de KDR encontrada no GenBank AAC16450.1 (Figura
6). A sequência sintética inicia no nucleotídeo 632 da sequência encontrada no
Genbank, que corresponde ao aminoácido A
110
e termina no nucleotídeo 1308,
correspondente ao aminoácido G
335
.
1-gcctcggtcatttatgtctatgttcaagattacagatctccatttattgc-50
51-ttctgttagtgaccaacatggagtcgtgtacattactgagaacaaaaaca-100
101-aaactgtggtgattccatgtctcgggtccatttcaaatctcaacgtgtca-150
151-ctttgtgcaagatacccagaaaagagatttgttcctgatggtaacagaat-200
201-ttcctgggacagcaagaagggctttactattcccagctacatgatcagct-250
251-atgctggcatggtcttctgtgaagcaaaaattaatgatgaaagttaccag-300
301-tctattatgtacatagttgtcgttgtagggtataggatttatgatgtggt-350
351-tctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgtct-400
401-taaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgg-450
451-gaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacct-500
501-aaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaacta-550
551-tagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatcc-600
601-agtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaa-650
651-accttttgttgcttttggaagtggc-675
Figura 6: Sequência nucleotídica do KDR retirada do GenBank AAC16450.1, utilizada como
referência para a criação do constructo 2 e 3 do KDR.
MATERIAIS E MÉTODOS
46
A ORF clonada é, em geral, incompleta e não contém o ATG inicial,
necessitando, portanto, acrescentar um ATG para garantir a síntese de proteína a
partir do mensageiro. A Tabela 2 mostra os oligonucleotídeos criados com o objetivo
de adquirir a sequência criada com base no GenBank AAC16450.1.
Tabela 2: Oligonucleotídeos sintéticos baseados no GenBank AAC16450.1 que codificam a
sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR.
Oligo
Sequência 5’
→
→→
→
3’
Pares de Bases
Na
ACTTCAAGCTTGGCCATGGGCCATATGGCTAGCGTTATTTATGTGTACGT 50
Nb TATTTATGTGTACGTTCAGGACTACCGTTCTCCGTTCATTGCAAGCGTAT 50
Nc CCGTTCATTGCAAGCGTATCCGATCAGCACGGCGTGGTGTACAT 44
Nd CAGCACGGCGTGGTGTACATCACCGAAAACAAAAACAAGACTGT 44
Ne CACCGAAAACAAAAACAAGACTGTGGTTATTCCTTGCCTGGGTTCCATTT 50
Nf TGCCTGGGTTCCATTTCTAACCTGAACGTTTCCCTGTGTGCGCGTTAT 48
N1 AAATACGATAGCCAACGACTACCACAATGTACATGATAGACTGGTAGGAT
50
N2 GATAGACTGGTAGGATTCATCATTGATCTTTGCTTCACAGAAGACCAT 48
N3 GCTTCACAGAAGACCATGCCCGCGTAGGAGATCATATAGGACGGGAT 47
N4 CATATAGGACGGGATGGTGAAACCTTTCTTGCTGTCCCAAGAAAT 45
N5 TCTTGCTGTCCCAAGAAATACGGTTACCATCCGGGACGAAGCGTTTT 47
N6 CCGGGACGAAGCGTTTTTCCGGATAACGCGCACACAGGGAAACGT 45
Ca CGTTGGCTATCGTATTTACGATGTGGTTCTGTCCCCGTCCCACGGCATT 49
Cb CCCCGTCCCACGGCATTGAGCTGTCCGTGGGTGAAAAACTGGTGCT 46
Cc GGGTGAAAAACTGGTGCTGAACTGTACGGCTCGCACCGAACTGAACGT 48
Cd CGCACCGAACTGAACGTCGGTATCGATTTCAATTGGGAATACCCGT 46
Ce CAATTGGGAATACCCGTCCAGCAAACACCAACATAAGAAACTGGT 45
Cf AAGAAACTGGTGAACCGCGACCTGAAAACTCAGTCCGGTAGCGAAAT 47
C1 CGATGGTCAGGGTGCTCAGGAACTTTTTCATTTCGCTACCGGACT 45
C2 ACAGGCCCTGGTCGCTGCGCGTCACGCCGTCGATGGTCAGGGTGCT 46
C3 CAGGCCGGAGGAAGCCGCGCAAGTATACAGGCCCTGGTCGCT 42
C4 ACACGCACGAAGGTAGAGTTTTTCTTGGTCATCAGGCCGGAGGAAGCCGC
50
C5 GCCGAATGCAACGAACGGTTTCTCGTGTACACGCACGAAGGTAGAG 46
C6 CCTCTCTAGAGCGGATCCGGTTCCGCCGCTGCCGAATGCAACGAACGG 48
STOP
TAGAGCGGATCCTCAGCCGC 20
MATERIAIS E MÉTODOS
47
A Figura 7 mostra esquematicamente estas propriedades do plasmídeo e a
consequente proteína recombinante gerada pela clonagem.
A sequência completa dos domínios 2 e 3 do KDR possui 225 aminoácidos
(675 pares de bases), porém, foram adicionados 51 pares de bases ao DNA sintético
do mesmo, referentes à região iniciadora e à região stop códon, totalizando 726 pb.
Figura 7: Alinhamento da sequência de nucleotídeos do cDNA e sequencia do gene sintético
proposto para os domínios 2 e 3 do KDR. Esta figura mostra os códons de nucleotídeos que foram
modificados para minimizar códons raros.
MATERIAIS E MÉTODOS
48
Foram sintetizados oligonucleotídeos para montar duas sequências (A-L e M-
Z) correspondentes às duas metades da sequência codificadora dos domínios 2 e 3
do KDR, obtidas com auxílio da reação em cadeia da polimerase. Cada uma das
sequências foi sub-dividida em sequências de 40 a 50 pares de bases (A-F e G-L;
M-R e S-Z). As sequências são apresentadas no sentido 5’ 3’, entretanto A-F e M-
R referem-se à região N-terminal e G-L e S-Z referem-se à região C-terminal (Figura
8).
I II
Figura 8: Esquema dos oligonucleotídeos utilizados para a construção da sequência sintética
dos domínios 2 e 3 do KDR. Sequências (A-L e M-Z) correspondentes às metades da sequência
codificadora. (I) Sequência A-L: sequência
A-F, referente a região N-terminal e sequência
G-L,
referente à região C-terminal. (II) Sequência M-Z: sequência
M-R
, referente à região N-terminal e
sequência
S-Z
, referente à região C-terminal.
MATERIAIS E MÉTODOS
49
A construção de uma sequência de DNA, em uma versão homóloga mais
resistente ou mais sensível a mutações, pode ser ensaiada, experimentalmente, por
meio de esquemas mutacionais derivados da análise de genes homólogos [36].
Desta maneira, a sequência nucleotídica dos domínios 2 e 3 do receptor-2 do VEGF
foi desenhada mediante informações do GenBank AAC16450.1 (Figura 9).
Figura 9: Esquema simbolizando a sequência nucleotídica dos domínios 2 e 3 do KDR. (A) A
sequência possui 726 pares de bases, incluindo 8 aminoácidos (nt) aleatórios e 1 Metionina
colocados como região iniciadora e a região stop códon, composta por 8 aminoácidos. (B)
Sequências (A-L e M-Z) correspondentes às metades da sequência codificadora dos domínios 2 e 3
do receptor-2 do VEGF.
A síntese da sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR foi
realizada com auxílio da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), onde
duplas de oligonucleotídeos (FG, EH, DI, CJ, BK, AL, RS, QT, PU, OV, NX, MZ)
foram adicionadas a cada cinco ciclos de PCR (um ciclo envolve três etapas: 1 min.
de desnaturação a 96 °C, 1 min. de hibridização a 55 °C e 1 min. de extensão ou
síntese a 72 °C).
Para a reação de amplificação do fragmento, contendo a sequência
codificadora para os domínios 2 e 3 do Fator do Crescimento Endotelial Vascular,
foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores (Invitrogen) inserindo-se sítios de
Sequência
A
-
L
5’
3’
Sequência M
-
Z
5’
3’
5’
3’
f
(726pb)
Sequência A-Z
MATERIAIS E MÉTODOS
50
clivagem pelas enzimas de restrição HindIII e XbaI, NdeI e BamHI. Utilizou-se, para
a reação de PCR, 1U de Taq polimerase Platinum (Invitrogen), 1µg de DNA
genômico, 5 µL de dNTP 10 pmol/µL, 5 µL de cada iniciador 5 pmol/µL e 5 µL MgCl
2
5 mmol.L
-1
. A reação foi feita da seguinte maneira: 2 min. a 94 °C, seguidos de 30
ciclos de 1 min. a 94 °C (desnaturação); 1 min. a 55 °C, temperatura específica do
iniciador (anelamento); e 2 min. a 72 °C (extensão). Os produtos de PCR foram
observados em géis de agarose 1%, corados com brometo de etídeo e purificados
com “kit” Geneclean (Q-BIOgene). As sequências nucleotídicas dos fragmentos
foram obtidas utilizando-se a reação de sequenciamento com sonda “Big Dye” v.2
(conforme instruções do fabricante, ver item 3.10) sendo determinadas com o
sequenciador “Genetic Analyzer” 3100 (Applied Biosystems). Para as clonagens, os
fragmentos foram digeridos com as enzimas HindIII e XbaI (Promega), segundo
protocolo do fabricante.
3.18. Alteração das regiões flanqueadoras do
constructo
2 e 3 do
KDR
A sequência codificadora para o constructo 2 e 3 do KDR, montada com base
na sequência genômica de DNA encontrada no GenBank AAC16450.1, contém 242
aminoácidos, portanto, 726 nucleotídeos. Para alterar a sequência do mapa de
restrição dos domínios 2 e 3 do KDR foram desenhados oligonucleotídeos
iniciadores contendo sítios de restrição para as enzimas HindIII (extremidade 5’) e
XbaI (extremidade 3’).
O desenho da sequência codificadora foi criado de forma a eliminar os códons
raros, já que estes podem inserir íntrons, o que pode causar alterações na
MATERIAIS E MÉTODOS
51
sequência nucleotídica desejada. Do mesmo modo, foram adicionados códons
específicos para que fossem transcritos os aminoácidos na mesma ordem que
aqueles encontrados na sequência encontrada no GenBank AAC16450.1.
Na região N-terminal foram adicionados sítios específicos das enzimas HindIII
(TTCGAA), NcoI (GGTACC) e NdeI (GGTATA). Uma sequência de oito nucleotídeos
(nt) aleatórios, TSSLAMGH mais uma Metionina (M), foi colocada como iniciadora
para evitar a quebra entre as regiões específicas das enzimas.
Na região 3’ da sequência codificadora dos domínios 2 e 3 do KDR foi
inserido um sítio de restrição para a enzima BamHI (GGATCC). Outra finalidade da
inserção do sítio de restrição é facilitar a exposição da região stop códon para
posterior retirada da mesma, permitindo a introdução do fragmento no plasmídeo
pET28a+.
3.19. Proteína Verde Fluorescente (GFP)
A proteína verde fluorescente, mais conhecida por GFP (abreviatura do inglês
green fluorescent protein), é uma proteína produzida pelo cnidário Aequorea victoria
que emite fluorescência na zona verde do espectro visível. O gene que codifica esta
proteína foi isolado e atualmente é utilizado na produção de proteínas de fusão,
constituídas por um gene de interesse fundido com o da GFP, de modo a
monitorizar, por exemplo, a localização dessa proteína in vivo. Desta forma, a GFP
funciona como um gene repórter, ou seja, como um marcador fluorescente. A GFP
do cnidário possui dois picos de excitação em 475 nm e 395 nm. O seu pico de
emissão é a 509 nm, na zona verde do espectro visível (Figura 10) [37].
MATERIAIS E MÉTODOS
52
Figura 10: Mapa do pGFPuv. A seta indica o local onde foram inseridos os sítios de clivagem para
as enzimas de restrição.
A presença da proteína GFP (produzida pelo gene GFP) faz com que a
colônia da bactéria que tem em seu interior este plasmídeo seja fluorescente. Os
sítios de restrição das enzimas utilizadas para cortar o plasmídeo se localizam
imediatamente ao 5’, região onde está o gene que codifica a proteína GFP. Assim,
quando um fragmento de DNA exógeno é introduzido nesta região e a fase de leitura
do fragmento é a mesma da GFP, uma proteína de fusão é produzida pela célula,
sendo constituída pela proteína codificada pelo fragmento clonado na região N-
terminal e a GFP na região C-terminal. Uma vez ligado um inserto ao plasmídeo, é
MATERIAIS E MÉTODOS
53
preciso averiguar se os clones obtidos estão em fase de leitura com a GFP. Cabe
ressaltar que os plasmídeos vazios conferem a mesma resistência ao antibiótico que
o plasmídeo ligado ao fragmento, por isso deve-se selecionar várias colônias
fluorescentes para o próximo passo. O procedimento do passo seguinte baseia-se
no crescimento de clones em placas de Petri na presença de ampicilina e posterior
reprodução em tubos de ensaio contendo meio LB líquido e ampicilina. Em seguida,
é realizada a extração do DNA plasmidial (item 3.9).
3.20. Digestão do fragmento codificador do
constructo
2 e 3
do KDR e
ligação ao vetor pGFPuv
Tanto o constructo 2 e 3 do KDR quanto o vetor pGFPuv foram digeridos com
as enzimas de restrição XbaI e HindIII para posterior sub-clonagem em vetor de
expressão pET28a+. A reação de digestão do fragmento sintético de DNA foi
realizada em volume final de 50 L com tampão E (6 mM de Tris-HCl, 6 mM de
cloreto de magnésio, 100 mM de cloreto de sódio, 1 mM de DTT, pH 7.5), 1 mM de
albumina do soro bovino (BSA) e 1 U de cada uma das enzimas de restrição (XbaI e
HindIII – Promega). A mistura foi incubada por 3 h a 22 °C, seguida de inativação da
atividade catalítica por 15 min. a 65 °C.
A reação de ligação foi feita na proporção molar 3:1 fragmento/vetor
respectivamente, anteriormente digeridos, na presença de 0.5 U de T4 DNA ligase e
1X do tampão apropriado (6 mM de Tris-HCl, 6 mM de cloreto de magnésio, 100 mM
de cloreto de sódio, 1 mM de DTT, pH 7.5) em volume final de 10 L (Figura 11).
Após a ligação, células DH5 foram transformadas usando o protocolo FSB
como descrito no item 3.8.
Figura 11:
Representação da l
3.21.
Multiplicação e extração do DNA da ligação (pGFPuv +
e 3 do KDR)
A ligação foi multiplicada e realizou
DH5
FSB (descrito anteriormente),
3.22. Reação de Sequ
enciamento
As sequ
ências obtidas
de dados GenBank
e o resultado final
confirmou, de fato, ser a origem de replicação pGFPuv.
3.23
. Mutagênese Sítio Dirigida
Todo o processo para gerar os muta
sequências de PCR
e monitorado
com brometo de etídio (0.
05
MATERIAIS E MÉTODOS
Representação da l
igação do constructo 2 e 3 do KDR
ao vetor
Multiplicação e extração do DNA da ligação (pGFPuv +
A ligação foi multiplicada e realizou
-se a extração do
DNA
FSB (descrito anteriormente),
conforme protocolo estabelecido
no LEFP.
enciamento
ências obtidas
foram alinhadas com a sequência fornecida pelo
e o resultado final
,
apresentado sob a forma de eletroferograma
confirmou, de fato, ser a origem de replicação pGFPuv.
. Mutagênese Sítio Dirigida
Todo o processo para gerar os muta
ntes necessários baseou
e monitorado
através de análise em gel de agarose
05
µg/mL).
MATERIAIS E MÉTODOS
54
ao vetor
pGFPuv.
constructo 2
DNA
em células
no LEFP.
foram alinhadas com a sequência fornecida pelo
banco
apresentado sob a forma de eletroferograma
,
ntes necessários baseou
-se em
através de análise em gel de agarose
1%, corados
MATERIAIS E MÉTODOS
55
Para todas as reações, utilizou-se pGFPuv +
constructo
2 e
3
do
KDR
como
molde para realizar as mutações nas posições diversas onde houve deleção ou
alteração de alguma base nitrogenada e/ou onde houve ou não troca de aminoácido.
Para a realização da mutagênese sítio dirigida foi preciso lançar mão de três
oligonucleotídeos: L1, L147 E L527 (
Tabela 3
).
Tabela 3. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a realização da mutagênese sítio
dirigida.
Nome do
Primer
Sequência do primer
Temperatura de
anelamento
L1 5’-ATGGCTAGCGTTATTTATGTG-3’ 55 °C
L147 5’-GAACGTTTCCCTGTGTGCGC-3’ 66 °C
L527 5’-CATTTCGCTACCGGACTGAG-3’ 61 °C
A reação em cadeia da polimerase foi realizada em três etapas:
Primeira Etapa
: nesta etapa, foi incorporada e amplificada à fita dupla de
DNA o oligo L1 e o oligo L527. Para tanto, foi utilizada a mistura de 10
µ
L tampão de
PCR (20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl ), 10 pMol do oligo L1
,
10 pMol do
oligo L527, 2.5 mM dNTPmix, 1 mM MgCl
2,
1 fMol do clone pGFPuv +
constructo 2
e 3
KDR linearizado, 2.5 U de Taq DNA Polimerase – (Platinium-Promega)
completando-se
o volume com água esterilizada para 50
µ
L.
A reação inicial ocorreu
em miniciclador (Mastercycle Gradient - Eppendorf) onde foi efetuado o programa
AMP8, que consistiu dos seguintes passos:
1
– 94 ºC por 2 min.;
2
– 94 °C por 1 min.;
3
– 50 °C por 1 min.;
MATERIAIS E MÉTODOS
56
4
– 72 °C por 2 min. com 25 ciclos de repetição a partir do passo 2.
O fragmento com o tamanho específico para cada mutação gerada foi
analisado e extraído do gel de agarose 1%, com posterior purificação com Kit
Geneclean (Q-BIOgene).
Segunda Etapa:
chamada de reação de extensão, pois consiste em estender
e completar a sequência do fragmento de DNA mutado gerado na etapa 1. Foi feita
a reação com 1 mM MgCl
2
, 1X tampão de PCR, 2.5 mM dNTPmix, 2.5 U de Taq
DNA polimerase, 1 fMol de vetor pGFPuv +
constructo
2 e 3 do KDR
linearizado, 1
pMol do fragmento mutante amplificado na primeira etapa, completando-se o volume
final para 50
µ
L com água esterilizada. A reação foi colocada novamente no
miniciclador, desta vez utilizando o programa EXT
para a extensão do DNA, que
consistiu em:
1
– 96 ºC por 2 min.;
2
– 96 ºC por 1 min.;
3
– 55 ºC por 30 s;
4
–
72 ºC por 1 min. sendo os ciclos repetidos 5x a partir do passo 2.
Terceira Etapa:
é a reação que seleciona e amplifica somente a fita de DNA
híbrido que contenha a mutação, utilizando, para tanto, o oligo que é complementar
a uma porção de L1
.
Na reação adicionaram-se dois oligos: 20 pMol de L1
(5’-
terminal) e 20 pMol de L527 (3’-terminal), quando, posteriormente, seguiu-se
novamente o programa de amplificação descrito na primeira etapa.
O fragmento, de aproximadamente 726 pb, foi extraído e purificado em gel de
agarose 1% com Kit Geneclean (Q-BIOgene). A amostra foi, então, digerida com
enzimas
HindIII
e
XbaI
(10 U cada) por 3 h a 37 °C e as enzimas inativadas
MATERIAIS E MÉTODOS
57
submetidas a uma temperatura de 65 °C por 15 min. Analisou-se o fragmento de 726
pb em gel nativo de agarose 1%, com posterior extração do fragmento com o Kit de
extração Kit Geneclean (Q-BIOgene) e quantificação em biofotômetro (Eppendorf).
R E S U L T A D O S
Os resultados foram divididos em duas etapas: a primeira mostra aqueles
obtidos por meio do produto da amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR e, em
seguida, os obtidos por meio da sequência sintética do DNA correspondente aos
domínios 2 e 3 do KDR.
4.1.
Amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR
A amplificação do cDNA (HUVEC)
KDR23R (
Tabela 1
),
foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase,
conforme descrito no item 3.3 e seu rendimento foi avaliado em gel de agarose a 1%
de acordo com a
Figura 12.
Figura 12: Amplificação do cDNA de HUVEC utilizando os oligonucleotídeos KDR23
KDR23
reverse
. (M)
Marcador de pares de bases de 1 kb plus (Invitrogen).
amplificado: apresenta tamanho esperado, de aproximadamente 700 pb, já que ainda apresenta
alguns nucleotídeos pertencentes aos oligonucleotídeos utilizados para a
KDR23R – Tabela 1).
RESULTADOS
Os resultados foram divididos em duas etapas: a primeira mostra aqueles
obtidos por meio do produto da amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR e, em
seguida, os obtidos por meio da sequência sintética do DNA correspondente aos
Amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR
A amplificação do cDNA (HUVEC)
,
usando os oligonucleotídeos KDR23F e
foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase,
conforme descrito no item 3.3 e seu rendimento foi avaliado em gel de agarose a 1%
Figura 12.
Figura 12: Amplificação do cDNA de HUVEC utilizando os oligonucleotídeos KDR23
Marcador de pares de bases de 1 kb plus (Invitrogen).
amplificado: apresenta tamanho esperado, de aproximadamente 700 pb, já que ainda apresenta
alguns nucleotídeos pertencentes aos oligonucleotídeos utilizados para a
amplificação (KDR23F e
RESULTADOS
57
Os resultados foram divididos em duas etapas: a primeira mostra aqueles
obtidos por meio do produto da amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR e, em
seguida, os obtidos por meio da sequência sintética do DNA correspondente aos
usando os oligonucleotídeos KDR23F e
foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase,
conforme descrito no item 3.3 e seu rendimento foi avaliado em gel de agarose a 1%
Figura 12: Amplificação do cDNA de HUVEC utilizando os oligonucleotídeos KDR23
forward e
Marcador de pares de bases de 1 kb plus (Invitrogen).
(1)
Fragmento
amplificado: apresenta tamanho esperado, de aproximadamente 700 pb, já que ainda apresenta
amplificação (KDR23F e
O número de pares de bases do fragmento amplificado resultou no tamanho
esperado de aproximadamente 700 pb, conforme a
oligonucleotídeos KDR23F e KDR23R
Este resultado de
monstra que o cDNA está intacto,
preparo do mRNA e que os oligonucleotídeos são específicos, apesar do
aparecimento de três bandas fracas (~1100 pb, ~2200 pb e ~4000 pb).
A banda referente à 700 pb foi
purificada conforme descrito no item 3.5 (
Figura 13: Banda purificada da amostra do DNA resultante da amplificação do cDNA de HUVEC
utilizando os oligonucleotídeos KDR23
bases de 1kb plus (Invitrogen).
(1)
PCR.
O DNA,
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
ligação ao vetor pJET
TM
1.2. Este vetor dispensa digestão anterior
(descrito no item 3.6).
A ligação pJET
TM
+ domínios 2 e 3 do KDR
RESULTADOS
O número de pares de bases do fragmento amplificado resultou no tamanho
esperado de aproximadamente 700 pb, conforme a
posição de anelamento dos
oligonucleotídeos KDR23F e KDR23R
q
ue flanqueiam o cDNA (HUVEC
monstra que o cDNA está intacto,
não houve degradação no
preparo do mRNA e que os oligonucleotídeos são específicos, apesar do
aparecimento de três bandas fracas (~1100 pb, ~2200 pb e ~4000 pb).
A banda referente à 700 pb foi
retirada do gel com auxílio de um bisturi e
purificada conforme descrito no item 3.5 (
Figura 13
).
Figura 13: Banda purificada da amostra do DNA resultante da amplificação do cDNA de HUVEC
utilizando os oligonucleotídeos KDR23
forward e KDR23 reverse. (M)
Marcador de pares de
(1)
Banda purificada do DNA resultante da amplificação do cDNA por
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
,
foi utilizado para a
1.2. Este vetor dispensa digestão anterior
à
etapa de ligação
+ domínios 2 e 3 do KDR
foi transformada em células DH5
RESULTADOS
58
O número de pares de bases do fragmento amplificado resultou no tamanho
posição de anelamento dos
ue flanqueiam o cDNA (HUVEC
) do KDR.
não houve degradação no
preparo do mRNA e que os oligonucleotídeos são específicos, apesar do
aparecimento de três bandas fracas (~1100 pb, ~2200 pb e ~4000 pb).
retirada do gel com auxílio de um bisturi e
Figura 13: Banda purificada da amostra do DNA resultante da amplificação do cDNA de HUVEC
Marcador de pares de
Banda purificada do DNA resultante da amplificação do cDNA por
foi utilizado para a
etapa de ligação
foi transformada em células DH5
e duas colônias foram
usadas para a
enzimas
Nde
I e
Bam
HI. A reação de digestão foi confirmada em gel de agarose a
1% (
Figura 14
), onde foi
domínios 2 e 3 do KDR,
e outra em 2974 pb
Figura 14:
Análise eletroforética
domínios 2 e 3 do KDR. (M)
Marcador de pares de bases de 1kb plus (Invitrogen).
domínios 2 e 3 do KDR, c
lone de aproximadamente 3.7 kb, sendo ~3 kb do vetor pJET
fragmento amplificado correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR.
4.1.1. Sub-clonagem
para e
Para a confirmação da provável região codificadora, a sequência resultante
da amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR
específicos (
Tabela 1
)
, foi submetida à
recuperada
do banco de dados
RESULTADOS
usadas para a
extração do DNA. Este foi digerido
HI. A reação de digestão foi confirmada em gel de agarose a
possível observar uma banda em 675 pb
,
e outra em 2974 pb
, referente ao vetor pJET
TM
Análise eletroforética
em gel de agarose a 1% do produto da digestão
Marcador de pares de bases de 1kb plus (Invitrogen).
lone de aproximadamente 3.7 kb, sendo ~3 kb do vetor pJET
fragmento amplificado correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR.
para e
xpressão da proteína resultante
Para a confirmação da provável região codificadora, a sequência resultante
da amplificação do cDNA (HUVEC) do KDR
,
combinado com oligonucleotídeos
, foi submetida à
análise comparativa com a sequência
do banco de dados
GenBank
AAC16450.1 (
Figura 15
).
RESULTADOS
59
extração do DNA. Este foi digerido
pelas
HI. A reação de digestão foi confirmada em gel de agarose a
uma banda em 675 pb
, referente aos
TM
1.2.
em gel de agarose a 1% do produto da digestão
pJET1.2 +
Marcador de pares de bases de 1kb plus (Invitrogen).
(1
e
2)
pJET
TM
+
lone de aproximadamente 3.7 kb, sendo ~3 kb do vetor pJET
TM
e 675 pb do
Para a confirmação da provável região codificadora, a sequência resultante
combinado com oligonucleotídeos
análise comparativa com a sequência
Figura 15: Análise em banco de dados da sequência amplificada.
nucleotídeos do KDR; cDNAamp: sequência de nucleotídeos resultante da amplificação do cDNA de
KDR).
Evidencia a identidade da sequência nucleotídica dos domínios 2 e 3 d
amplificação do cDNA e sub-
clonagem
Na
expectativa de produzir a proteína pura e
testes bioquímicos e biofísicos, o DNA correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
foi sub-clonado no vetor
pET28a+
Uma amostra do vetor
e, em seguida, foi realizada
RESULTADOS
Figura 15: Análise em banco de dados da sequência amplificada.
(KDR: sequência de
nucleotídeos do KDR; cDNAamp: sequência de nucleotídeos resultante da amplificação do cDNA de
Evidencia a identidade da sequência nucleotídica dos domínios 2 e 3 d
clonagem
no vetor pET28a+.
expectativa de produzir a proteína pura e
,
em quantidades suficientes para
testes bioquímicos e biofísicos, o DNA correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
pET28a+
.
Uma amostra do vetor
pET28a+
foi analisada em gel de agarose (
e, em seguida, foi realizada
a digestão com as enzimas
Nde
I e
Bam
HI deste mesmo
RESULTADOS
60
(KDR: sequência de
nucleotídeos do KDR; cDNAamp: sequência de nucleotídeos resultante da amplificação do cDNA de
Evidencia a identidade da sequência nucleotídica dos domínios 2 e 3 d
o KDR após
em quantidades suficientes para
testes bioquímicos e biofísicos, o DNA correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR
foi analisada em gel de agarose (
Figura 16A)
HI deste mesmo
vetor e de
uma amostra do DNA amplificado, sendo
1% (Figura 16 B).
A
Figura 16: Análise eletroforética em gel de agarose a 1%. (
kb plus (Invitrogen).
(A) (1 e 2) Vetor
correspondente a forma circular e uma correspondente a forma linear (~5369pb).
digestão do DNA amplificado correspondente aos domínios 2/3 do KDR pelas enzimas
(2)
Vetor pET28a+
digerido pelas e
As duas bandas do gel da figura 16B foram purificadas (item 3.5) e o DNA foi
ligado ao vetor de expressão
ligação foi transformado em bactéria
sequência, passou por uma digestão enzimática com
confirmação da obtenção do clone por meio da liberação de um fragmento com
tamanho correspondente ao da sequência de DNA dos domínios 2 e 3 do
(Figura 17).
RESULTADOS
uma amostra do DNA amplificado, sendo
avaliadas em gel de agarose a
A
B
Figura 16: Análise eletroforética em gel de agarose a 1%. (
M)
Marcador de pares de bases de 1
(A) (1 e 2) Vetor
pET28a+ sem digestão.
Observam-
se duas bandas: uma
correspondente a forma circular e uma correspondente a forma linear (~5369pb).
(B) (1)
digestão do DNA amplificado correspondente aos domínios 2/3 do KDR pelas enzimas
digerido pelas e
nzimas
Nde
I e
Bam
HI.
As duas bandas do gel da figura 16B foram purificadas (item 3.5) e o DNA foi
ligado ao vetor de expressão
pET28a+
na proporção 1:3 vetor/fragmento. O DNA da
ligação foi transformado em bactéria
E.coli
e foi realizada a extração do DNA que, na
sequência, passou por uma digestão enzimática com
Nde
I e
Bam
confirmação da obtenção do clone por meio da liberação de um fragmento com
tamanho correspondente ao da sequência de DNA dos domínios 2 e 3 do
RESULTADOS
61
avaliadas em gel de agarose a
Marcador de pares de bases de 1
se duas bandas: uma
(B) (1)
Produto da
digestão do DNA amplificado correspondente aos domínios 2/3 do KDR pelas enzimas
Nde
I e
Bam
HI;
As duas bandas do gel da figura 16B foram purificadas (item 3.5) e o DNA foi
na proporção 1:3 vetor/fragmento. O DNA da
e foi realizada a extração do DNA que, na
Bam
HI para a
confirmação da obtenção do clone por meio da liberação de um fragmento com
tamanho correspondente ao da sequência de DNA dos domínios 2 e 3 do
KDR
Figura 17: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do produto da digestão do clone
pET28a +
domínios 2 e 3 do KDR pelas enzimas
de 1 kb plus (Invitrogen).
(1)
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR (675 pb).
4.1.2
. Expressão da proteína resultante
As bactérias E. coli
linhagem BL21 foram transformadas com a construção de
pET28a +
domínios 2 e 3 do KDR
vetor pET28a+
na transformação
inoculadas com as colônias provenientes d
densidade óptica em 660nm, 1mM de IPT
indução da expressão da proteína recombinante. Na análise da expressão em
função do tempo, demonstrada na
banda correspondente à proteína heteróloga correspondente aos dom
KDR, cujo tamanho é de aproximadamente 25 kDa nos intervalos de 1 a 6
indução quando comparado com a cultura não induzida (NI). Para a expressão desta
proteína, o tempo estabelecido foi de 6
RESULTADOS
Figura 17: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do produto da digestão do clone
domínios 2 e 3 do KDR pelas enzimas
NdeI e BamHI. (M)
Marcador de pares de bases
(1)
Bandas referentes ao vetor pET28a+
(5369 pb) e ao DNA
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR (675 pb).
. Expressão da proteína resultante
em bactéria E.coli BL21
linhagem BL21 foram transformadas com a construção de
domínios 2 e 3 do KDR
e, como controle interno,
foi utilizado DNA do
na transformação
. As culturas de 100 mL de meio HDM foram
inoculadas com as colônias provenientes d
as transformações. Ao atingir 0.
densidade óptica em 660nm, 1mM de IPT
G foi adicionado às culturas para a
indução da expressão da proteína recombinante. Na análise da expressão em
função do tempo, demonstrada na
Figura 18, observa-
se o aumento considerável da
banda correspondente à proteína heteróloga correspondente aos dom
KDR, cujo tamanho é de aproximadamente 25 kDa nos intervalos de 1 a 6
indução quando comparado com a cultura não induzida (NI). Para a expressão desta
proteína, o tempo estabelecido foi de 6
h.
RESULTADOS
62
Figura 17: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do produto da digestão do clone
Marcador de pares de bases
(5369 pb) e ao DNA
linhagem BL21 foram transformadas com a construção de
foi utilizado DNA do
. As culturas de 100 mL de meio HDM foram
as transformações. Ao atingir 0.
6 de
G foi adicionado às culturas para a
indução da expressão da proteína recombinante. Na análise da expressão em
se o aumento considerável da
banda correspondente à proteína heteróloga correspondente aos dom
ínios 2 e 3 do
KDR, cujo tamanho é de aproximadamente 25 kDa nos intervalos de 1 a 6
h de
indução quando comparado com a cultura não induzida (NI). Para a expressão desta
Figura 18. Expressão da p
roteína recombinante domínios 2 e
indução com IPTG.
A ORF que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor
(Novagen) e a expressão foi induzida por 1mM de IPTG. A análise da expressão foi monitorada pela
retirada de alíquotas das bactérias em intervalos de 1
analisadas em gel SDS-
PAGE 12%. (
Aldrich). (
NI
) cultura não induzida. (
A visualiz
ação da proteína recombinante domínios 2 e 3 do KDR por meio da
coloração por Coomassie Blue confirmou a expressão dessa proteína. Em seguida,
foi testada a solubilidade da
revela se a proteína é solúvel
RESULTADOS
roteína recombinante domínios 2 e
3 do KDR em função do tempo de
A ORF que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor
(Novagen) e a expressão foi induzida por 1mM de IPTG. A análise da expressão foi monitorada pela
retirada de alíquotas das bactérias em intervalos de 1
h durante 6 h (1h-
6h), as quais foram
PAGE 12%. (
PM
) Marcador de peso molecular de proteína 6H (Sigma
) cultura não induzida. (
C-
) vetor pET28a+ vazio.
ação da proteína recombinante domínios 2 e 3 do KDR por meio da
coloração por Coomassie Blue confirmou a expressão dessa proteína. Em seguida,
foi testada a solubilidade da
proteína
em gel de poliacrilamida a 12%. Este teste
revela se a proteína é solúvel
ou forma corpo de inclusão (Figura 19
).
RESULTADOS
63
3 do KDR em função do tempo de
A ORF que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor
pET28a+
(Novagen) e a expressão foi induzida por 1mM de IPTG. A análise da expressão foi monitorada pela
6h), as quais foram
) Marcador de peso molecular de proteína 6H (Sigma
-
ação da proteína recombinante domínios 2 e 3 do KDR por meio da
coloração por Coomassie Blue confirmou a expressão dessa proteína. Em seguida,
em gel de poliacrilamida a 12%. Este teste
).
Figura 19: Teste de solubilidade da proteína recombinante. (S)
inclusão.
(M)
4.2
. Montagem da sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR
A sequência
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR foi montada a partir
da sequência de aminoácidos de KDR encontrada no
composta por 675 pb, porém, a sequência sintética possui 51 pares de bases
adicionais equivalentes aos 17 aminoácidos acr
(totalizando 726 pb) para incluírem os sítios para as enzimas de restrição
necessárias para separar a porção desejada para a clonagem e
As sequências A-
L e M
descrita no item 3.17 deste trabalho
duas bandas de aproximadamente 360 pb em gel de agarose a 1%, sendo que uma
banda está relacionada à
sequ
RESULTADOS
Figura 19: Teste de solubilidade da proteína recombinante. (S)
Proteína solúvel.
. Montagem da sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR foi montada a partir
da sequência de aminoácidos de KDR encontrada no
GenBank
AAC16450.1 e é
composta por 675 pb, porém, a sequência sintética possui 51 pares de bases
adicionais equivalentes aos 17 aminoácidos acr
escentados nas extremidades 3’ e 5’
(totalizando 726 pb) para incluírem os sítios para as enzimas de restrição
necessárias para separar a porção desejada para a clonagem e
sub-
clonagem
L e M
-Z,
obtidas após reação em cadeia da polimerase
descrita no item 3.17 deste trabalho
,
foram confirmadas por meio da visualização de
duas bandas de aproximadamente 360 pb em gel de agarose a 1%, sendo que uma
sequ
ência A-L e outra à sequência M-Z (
Figura
RESULTADOS
64
Proteína solúvel.
(C)
Corpo de
. Montagem da sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR foi montada a partir
AAC16450.1 e é
composta por 675 pb, porém, a sequência sintética possui 51 pares de bases
escentados nas extremidades 3’ e 5’
(totalizando 726 pb) para incluírem os sítios para as enzimas de restrição
clonagem
.
obtidas após reação em cadeia da polimerase
foram confirmadas por meio da visualização de
duas bandas de aproximadamente 360 pb em gel de agarose a 1%, sendo que uma
Figura
20).
Figura 20
: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético correspondente aos
domínios 2 e 3 do KDR. (M)
Marcador de pares de bases de 1kb plus (Invitrogen).
do DNA sintético (366 pb);
(2)
Sequência M
sintético (726 pb).
Na tentativa de otimizar a reação amplificada (
anelamento (etapa 2 do programa utilizado pela reação em cadeia da polimerase) foi
alterada de 55 °C para 34 °C no momento da adição da dupla “FG” de
oligonucleotídeos, já que o oligonucleotídeo denominado “F” apresenta temperatura
médi
a bastante distinta dos demais oligonucleotídeos.
RESULTADOS
: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético correspondente aos
Marcador de pares de bases de 1kb plus (Invitrogen).
Sequência M
-Z do DNA sintético (360 pb) ;
(3)
Sequência A
Na tentativa de otimizar a reação amplificada (
Figura 21
), a temperatura de
anelamento (etapa 2 do programa utilizado pela reação em cadeia da polimerase) foi
alterada de 55 °C para 34 °C no momento da adição da dupla “FG” de
oligonucleotídeos, já que o oligonucleotídeo denominado “F” apresenta temperatura
a bastante distinta dos demais oligonucleotídeos.
RESULTADOS
65
: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético correspondente aos
Marcador de pares de bases de 1kb plus (Invitrogen).
(1)
Sequência A-L
Sequência A
-Z do DNA
), a temperatura de
anelamento (etapa 2 do programa utilizado pela reação em cadeia da polimerase) foi
alterada de 55 °C para 34 °C no momento da adição da dupla “FG” de
oligonucleotídeos, já que o oligonucleotídeo denominado “F” apresenta temperatura
Figura 21
:
Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético correspondente aos
domínios 2 e 3 do KDR após alteração da temperatura de anelamento. (M)
bases de 1kb plus (Invitrogen).
DNA sintético (360 pb) ;
(3)
Sequência A
Após alteração das condições de PCR
de agarose a 1% (
Figura 21
ao DNA.
Separadamente,
foi realizada a digestão do vetor pGFPuv e do DNA
correspondente ao
constructo2/3
ligação entre eles.
4.2.1.
Seleção dos clones em pGFPuv
O vetor pGFPuv foi utilizado por apresentar a proteína GFP que faz com que
a colônia da bactéria,
a qual
auxiliando na seleção dos cl
Após a ligação entre o vetor pGFPuv +
a transformação em bactérias
RESULTADOS
Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético correspondente aos
domínios 2 e 3 do KDR após alteração da temperatura de anelamento. (M)
Marcador de pares de
bases de 1kb plus (Invitrogen).
(1)
Sequência A-L do DNA sintético (366 pb);
(2)
Sequência M
Sequência A
-Z do DNA sintético (726 pb).
Após alteração das condições de PCR
, observou-
se por eletroforese em gel
Figura 21
) um aumento da intensidade da banda correspondente
foi realizada a digestão do vetor pGFPuv e do DNA
constructo2/3
KDR pelas enzimas HindIII e
Xba
Seleção dos clones em pGFPuv
O vetor pGFPuv foi utilizado por apresentar a proteína GFP que faz com que
a qual
tem em seu interior este plasmídeo,
seja fluorescente,
auxiliando na seleção dos cl
ones.
Após a ligação entre o vetor pGFPuv +
constructo 2 e 3 do
KDR,
a transformação em bactérias
DH5
α
, selecionadas pela presença
de ampicilina no
RESULTADOS
66
Análise eletroforética em gel de agarose a 1% do DNA sintético correspondente aos
Marcador de pares de
Sequência M
-Z do
se por eletroforese em gel
) um aumento da intensidade da banda correspondente
foi realizada a digestão do vetor pGFPuv e do DNA
Xba
I e posterior
O vetor pGFPuv foi utilizado por apresentar a proteína GFP que faz com que
seja fluorescente,
KDR,
foi realizada
de ampicilina no
meio de cultura. A
Figura 2
apresentaram fenótipo branco e fluorescente. As colônias brancas
ocorrência de
mutação ou deleção na sequência nucleotídica causando alteração na
fase de leitura e, portanto, não
fluorescente revelam que: 1
alter
ada a fase de leitura da GFP ou
inserido o fragmento.
Figura 22: Resultado da
transformação do clone pGFPuv +
bactérias DH5
α
αα
α
na presença de ampicilina em meio de cultura.
fenótipo não fluorescente (brancas), o que indica a existência de clones ausentes da inserção do
fragmento
no vetor pGFPuv ou em fase de leitura incorreta.
Foram selecionados aproximadamente 20 clones da placa contendo o DNA
resultante da ligação vetor pGFP +
para a transformação e extração do DNA. Para a
amostra de cada clone foi aplicada em gel de agarose a 1% (
RESULTADOS
Figura 2
2
mostra o resultado do crescimento de colônias que
apresentaram fenótipo branco e fluorescente. As colônias brancas
mutação ou deleção na sequência nucleotídica causando alteração na
fase de leitura e, portanto, não
secretando a
proteína GFP. As colônias com fenótipo
fluorescente revelam que: 1
- o vetor pGFPuv ligou-
se ao fragmento sem que fosse
ada a fase de leitura da GFP ou
2- o vetor pGFPuv religou-
se sem que fosse
transformação do clone pGFPuv +
constructo
2 e
na presença de ampicilina em meio de cultura.
Note que existem colônias com
fenótipo não fluorescente (brancas), o que indica a existência de clones ausentes da inserção do
no vetor pGFPuv ou em fase de leitura incorreta.
Foram selecionados aproximadamente 20 clones da placa contendo o DNA
resultante da ligação vetor pGFP +
constructo 2 e 3 do KDR
(descrita no item 3.20)
para a transformação e extração do DNA. Para a
verificação do resultado, uma
amostra de cada clone foi aplicada em gel de agarose a 1% (
Figura 2
RESULTADOS
67
mostra o resultado do crescimento de colônias que
apresentaram fenótipo branco e fluorescente. As colônias brancas
evidenciam a
mutação ou deleção na sequência nucleotídica causando alteração na
proteína GFP. As colônias com fenótipo
se ao fragmento sem que fosse
se sem que fosse
2 e
3 do KDR em
Note que existem colônias com
fenótipo não fluorescente (brancas), o que indica a existência de clones ausentes da inserção do
Foram selecionados aproximadamente 20 clones da placa contendo o DNA
(descrita no item 3.20)
verificação do resultado, uma
Figura 2
3).
Figura 23:
Análise eletroforética em gel de agarose a 1%.
plus (Invitrogen);
(1)
constructo
pGFPuv digerido com HindIII e
Xba
KDR.
Em seguida,
foi realizada a digestão do clone pGFPuv +
KDR com as enzimas de restrição
3´, resultando em uma banda de aproximadamente 726 pares de bases, a qual,
após purificação, foi sub-
clon
24.
RESULTADOS
Análise eletroforética em gel de agarose a 1%.
(M)
Marcador de pares de bases 1 kb
constructo
2 e 3 do KDR digerido com HindIII e XbaI e
purificado;
Xba
I e purificado;
(3)
produto da ligação pGFP +
constructo
foi realizada a digestão do clone pGFPuv +
constructo
KDR com as enzimas de restrição
HindIII na extremidade 5´e Xba
I na extremidade
3´, resultando em uma banda de aproximadamente 726 pares de bases, a qual,
clon
ada em vetor pET28a+
, conforme observado na
RESULTADOS
68
Marcador de pares de bases 1 kb
purificado;
(2)
vetor
constructo
2 e 3 do
constructo
2 e 3 do
I na extremidade
3´, resultando em uma banda de aproximadamente 726 pares de bases, a qual,
, conforme observado na
Figura
Figura 24:
Análise eletroforética em gel de agarose a 1% dos produtos da digestão enzimática
HindIII/XbaI de
pGFPuv +
constructo
(Invitrogen).
(1, 2, 3)
Amostras referentes aos clones pGFPuv +
digestão com as enzimas de restrição
e 3 do KDR cerca de 726 pb.
4.2.2
. Análise da sequência sintética
A confirmação da presença do fragmento correspondente aos domínios 2 e 3
do KDR nos clones selecionados foi feita pelo sequenciamento automático de DNA
utilizando os oligonucleotídeos complementares
ATGACCATGATTACGCCAAGCTT
3’, nas regiões flanqueadoras do gene inserido
as sequências obtidas foram alinhadas com a sequência gênica d
do KDR presente no
GenBank
substituições indesejáveis quando comparada com a sequência gênica original dos
domínios 2 e 3 do KDR, além de deleções de algumas bases nucleotídicas
preservando, porém, a fase de leitura. Na
sequenciamento,
confirmando
RESULTADOS
Análise eletroforética em gel de agarose a 1% dos produtos da digestão enzimática
constructo
2 e 3 do KDR.
(M)
Marcador de pares de bases de 1 kb plus
Amostras referentes aos clones pGFPuv +
constructo 2
e
digestão com as enzimas de restrição
HindIII e Xba
I. O vetor pGFPuv possui 3300 pb e o
. Análise da sequência sintética
A confirmação da presença do fragmento correspondente aos domínios 2 e 3
do KDR nos clones selecionados foi feita pelo sequenciamento automático de DNA
utilizando os oligonucleotídeos complementares
à
extremidade 3’, pGFPuv
ATGACCATGATTACGCCAAGCTT
-3’ e DelNdeR 5’-
GCCGTTTCATGTGATCCGGA
3’, nas regiões flanqueadoras do gene inserido
anteriormente à
proteína GFP. Todas
as sequências obtidas foram alinhadas com a sequência gênica d
o
constructo 2
GenBank
AAC16450.1. O alinhamento
mostrou algumas
substituições indesejáveis quando comparada com a sequência gênica original dos
domínios 2 e 3 do KDR, além de deleções de algumas bases nucleotídicas
preservando, porém, a fase de leitura. Na
Figura 25
está o resultado do
confirmando
que a proteína e
stá em fase de leitura correta,
RESULTADOS
69
Análise eletroforética em gel de agarose a 1% dos produtos da digestão enzimática
Marcador de pares de bases de 1 kb plus
e
3 do KDR, após
I. O vetor pGFPuv possui 3300 pb e o
constructo 2
A confirmação da presença do fragmento correspondente aos domínios 2 e 3
do KDR nos clones selecionados foi feita pelo sequenciamento automático de DNA
extremidade 3’, pGFPuv
SeqN 5’-
GCCGTTTCATGTGATCCGGA
-
proteína GFP. Todas
constructo 2
e 3
mostrou algumas
substituições indesejáveis quando comparada com a sequência gênica original dos
domínios 2 e 3 do KDR, além de deleções de algumas bases nucleotídicas
está o resultado do
stá em fase de leitura correta,
RESULTADOS
70
iniciando-se com o aminoácido metionina (M) e terminando com o códon de parada
(TGA).
Figura 25: Alinhamento da sequência projetada referente aos domínios 2 e 3 do KDR com a
sequência obtida no sequenciamento da clonagem do constructo 2 e 3 do KDR em vetor
pGFPuv.
Os círculos azuis mostram os locais onde ocorreu deleção de nucleotídeos.
RESULTADOS
71
Apesar de a sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR ter sido
obtida com mutações e deleções de algumas bases, não houve alteração na fase de
leitura dos aminoácidos que codificam a proteína.
A Figura 26 representa o número de deleções e de substituições e a
frequência com a qual elas ocorrem. Por exemplo: no gráfico 26A, a primeira soma
de deleção ocorre próxima à posição 10 pb.
A B
0 100 200 300 400 500 600
0
5
10
15
20
25
30
Soma de deleções
Posição
0 100 200 300 400 500 600
0
2
4
6
8
10
Soma de substituições
Posição
Figura 26: Análise gráfica das deleções (A) e das substituições (B) apresentadas na sequência
sintética que codifica os domínios 2 e 3 do KDR.
Interessante observar que, embora tenham
ocorrido diversas deleções e/ou alterações dos nucleotídeos, não houve mudança na fase de leitura,
o que mantém a sequência in frame.
D I S C U S S Ã O
DISCUSSÃO
72
A Natureza tem o privilégio de criar novos seres por meio do processo
contínuo de mutação e seleção natural e por outros mecanismos de alteração do
DNA [38]. O DNA possui somente quatro bases nitrogenadas (A, T, C e G), já as
proteínas são compostas por aminoácidos, dos quais existem 20 tipos diferentes.
Além disso, muitos genes podem ser combinados de diversas formas para produzir
proteínas diferentes. O DNA está localizado no núcleo de qualquer célula, o que
facilita a sua obtenção e purificação; já as proteínas só estão presentes em alguns
tipos de células, e somente em certas fases de seu desenvolvimento. Portanto, não
basta enumerar a sequência de aminoácidos que forma a proteína, porque tão
importante quanto a sequência é a estrutura tridimensional que ela possui, o que
interfere no papel e/ou papel que ela desempenha [35].
A técnica de obtenção de uma sequência de nucleotídeos partindo do cDNA
correspondente à sequência desejada é bastante utilizada por sua praticidade de
manipulação e rapidez no resultado [39]. No entanto, a obtenção do cDNA de uma
proteína pode, por vezes, não ser tão fácil quanto se espera. Neste caso, torna-se
interessante o desenvolvimento de uma metodologia que permita a síntese de um
gene por meio da combinação de oligonucleotídeos que, amplificados e estendidos,
resultem em uma sequência nucleotídica que codifique uma proteína.
Um dos principais objetivos da clonagem é a expressão do segmento
clonado. Em geral, entendemos por expressão do gene a proteína que ele codifica.
Assim, ao clonarmos um gene qualquer, desejamos que ele possa ser expresso num
outro organismo. Neste estudo foi utilizada a bactéria E.coli para processar a
produção da proteína recombinante de forma que se possa obter grandes
quantidades.
DISCUSSÃO
73
A proteína alvo desse estudo é o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF), um elemento importante para muitos processos angiogênicos. A família de
VEGF inclui VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PIGF-1 e 2, e VEGF-F.
VEGF-A é o regulador chave do crescimento normal e patológico do vaso
sanguíneo. VEGF foi descrito, primeiramente, como um fator vascular da
permeabilidade (VPF). Nos 20 anos seguintes, houve uma grande evolução na
pesquisa sobre o VEGF, encontrando características moleculares deste fator que
tornaram compreensíveis suas atividades biológicas e, ao mesmo tempo,
delimitaram as funções de cada um de seus receptores VEGFR-1, VEGFR-2 (KDR)
e VEGFR-3. Estudos mostraram que o VEGF conduz ao desenvolvimento vascular
anormal e a mortalidade embrionária, enfatizando o papel crítico do VEGF no
desenvolvimento do vaso sanguíneo [13].
Os receptores de VEGF (VEGFR) apresentam características dos receptores
tirosina quinase, são homólogos, porém distintos. A expressão destes receptores
aumenta em circunstâncias patológicas nas quais ocorre hipóxia. VEGF liga a seus
receptores e estimula uma variedade de moléculas da sinalização, tendo como
resultado a promoção da neovascularização [4].
Estudos realizados por Yamazaki et al mostraram um fator exógeno que
antagoniza o KDR por meio de uma ligação externa com o receptor, além disso,
identificaram a molécula alvo da miotoxicidade básica da fosfolipase A2 em
peçonha.
As peçonhas das serpentes contêm diferentes toxinas de natureza protéica,
algumas com atividade enzimática que podem atuar conjuntamente e são
responsáveis pelos principais efeitos lesivos sistêmicos (como ações coagulante e
DISCUSSÃO
74
hemorrágica) e locais (como mionecrose e edema) [40]. A composição química
destas proteínas tóxicas é muito variável refletindo grandes alterações em efeitos
específicos e na toxicidade das peçonhas [41].
Com base nos estudos de Yamazaki, espera-se que a Lys49PLA2 seja um
ligante seletivo para os receptores de VEGF, especialmente para KDR [19], o que
motivou a busca por uma sequência de nucleotídeos correspondente aos domínios 2
e 3 do KDR de forma a permitir aplicações otimizadas de seus códons, ao ser
expressa em bactéria E. coli.
Após a obtenção da sequência correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR,
partindo do cDNA (HUVEC) de VEGF (Figura 12), esta foi clonada em vetor de
expressão pET28a+.
O vetor pET28a+ (Figura 5) carrega duas sequências
codificadoras para cauda de 6 Histidinas (17pb), uma origem de replicação (455pb),
regiões do promotor, a sequência referente ao operon da lactose, lac I (1079pb) e o
gene que confere resistência a Kanamicina (812pb). Além disso, existe também uma
região com múltiplos sítios de clonagem, que podem ser clivados pelas enzimas de
restrição (Novagen).
O clone foi expresso em bactéria E.coli da linhagem BL21, conforme
observado na Figura 18. Este resultado evidencia um aumento considerável da
banda correspondente à proteína heteróloga correspondente aos domínios 2 e 3 do
KDR, cujo tamanho é de 25 kDa nos intervalos de 1 a 6 h de indução quando
comparado com a cultura não induzida (NI). Proteínas que contêm afinidade por íons
metálicos podem ser separadas utilizando-se a cromatografia por afinidade a um
metal quelato. Os metais são imobilizados numa resina cromatográfica por quelação.
Certos aminoácidos, tais como a histidina e a cisteína, formam complexos com os
DISCUSSÃO
75
metais quelatos próximos a pH neutro.
Antes do uso, a resina é carregada com a solução de um íon metálico
bivalente como Ni
2+
, Zn
2+
, Cu
2+
, Ca
2+
, Co
2+
ou Fe
2+
. O níquel e mais utilizado para
proteínas com cauda de histidina. A retenção com a proteína-alvo é dependente do
pH. A Sepharose, a resina usada para este tipo de cromatografia, é formada ligando-
se um metal quelato a agarose.
O ácido nitriloacético (NTA) é um adsorvente quelato tetradentado, que ocupa
quatro dos seis sítios ligantes na esfera de coordenação do íon metálico, deixando
somente dois sítios livres para interação com a cauda de Histidina.
Quando um extrato de proteína é passado através da Sepharose, a proteína
com a cauda de Histidina liga-se a ela e outras proteínas são lavadas com o tampão
apropriado. A proteína desejada pode então ser recuperada numa forma altamente
purificada por eluição, (quando esta é solta da matriz cromatográfica), com tampão
contendo imidazol. O imidazol possui uma estrutura semelhante ao aminoácido
histidina e libera, por competição, as proteínas ligadas na resina por esse
aminoácido.
A etapa seguinte foi a realização de um teste de solubilidade para verificar se
a proteína resultante é solúvel ou se forma corpo de inclusão. A Figura 19 revela que
a proteína é solúvel, pois a banda correspondente a 25 kDa aparece na fase solúvel
da cultura em meio de cultura HDM,
Com todos os resultados esperados da proteína originada partindo da
amplificação do cDNA (HUVEC), iniciou-se a etapa de síntese do DNA,
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR.
A proteína foi utilizada para monitorizar a expressão temporária da sequência
DISCUSSÃO
76
codificadora dos domínios 2 e 3 do KDR, substituindo genes repórteres ou fazendo
seleção com base em antibióticos. O fato de a atividade da GFP poder ser
monitorizada in vivo, a expressão da proteína em estudo pode ser acompanhada ao
longo do tempo. Por exemplo, as proteínas fluorescentes são comumente utilizadas
para determinar a localização e a dinâmica de proteínas, organismos e outros
compartimentos celulares, assim como para avaliar a capacidade de expressão de
diversos promotores [42].
A metodologia adotada para a obtenção dos clones, usando a sequência
sintética que codifica os domínios 2 e 3 do KDR, foi a mesma usada para o produto
amplificado por PCR (digestão, purificação, ligação, transformação, extração de DNA
plasmidial, sequenciamento).
Os vários clones, obtidos no decorrer deste trabalho, apresentaram as
mesmas características: tamanhos semelhantes em gel de agarose e deleções ou
mutações quando analisadas por alinhamento dos resultados de sequenciamento.
Tais eventos foram investigados e, visando evitar novos erros, oligonucleotídeos
correspondentes as regiões que sofreram mutação ou deleção foram adquiridos e
utilizados em mutagênese sítio dirigida através da reação em cadeia de polimerase.
Porém, ainda assim, permaneceram apresentando uma sequência muito próxima,
mas não idêntica aquela encontrada no banco de dados GenBank AAC16450.1.
Conforme observado na figura 23, apesar da permanência de trocas e
deleções de alguns pares de bases, não houve alteração dos códons, mantendo a
fase de leitura dos aminoácidos.
A figura 24 enfatiza a ocorrência das deleções e das substituições das bases
nos clones criados com a sequência sintética correspondente aos domínios 2 e 3 do
DISCUSSÃO
77
KDR. Na mesma figura, fica evidente que não há permanência de tais
acontecimentos em determinada posição. Esse foi o motivo para a tentativa de se
obter um clone com a sequência correta de nucleotídeos por meio de mutação sítio
dirigida.
C O N S I D E R A Ç Õ E S F I N A I S
CONSIDERAÇÕES FINAIS
78
A
s principais contribuições deste trabalho, bem como perspectivas futuras, estão
descritas a seguir:
A amplificação do cDNA (HUVEC) e a clonagem da sequência
correspondente aos domínios 2 e 3 do KDR em vetor de expressão pET28a+
foram bem sucedidas.
A proteína foi observada no extrato solúvel de E. coli, não formando, portanto,
corpo de inclusão.
A sequência sintética que codifica os domínios 2 e 3 do KDR foi obtida com
algumas alterações quando comparadas com a sequência original,
encontrada no GenBank
AAC16450.1.
Pretende-se obter novas construções da sequência de DNA que codifica os
domínios 2 e 3 do KDR utilizando mutagênese sítio dirigida, para posterior
clonagem em vetor de expressão pET28a+ e aplicações otimizadas de seus
códons.
R E F E R Ê N C I A S
B I B L I O G R Á F I C A S
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