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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
TATIANA PRIETO
HEMOPROTEÍNAS E HEMOPEPTÍDEOS COMO
AGENTES INDUTORES DE MORTE CELULAR: ESTUDO
COMPARATIVO DE ENTREGA POR LIPOSSOMOS DE
DODAB E MICROINJEÇÃO
Mogi das Cruzes, SP
2009
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
TATIANA PRIETO
HEMOPROTEÍNAS E HEMOPEPTÍDEOS COMO
AGENTES INDUTORES DE MORTE CELULAR: ESTUDO
COMPARATIVO DE ENTREGA POR LIPOSSOMOS DE
DODAB E MICROINJEÇÃO
Tese de doutorado apresentado ao
programa de pós-graduação com base
nos requisitos para obtenção do grau
de doutor em biotecnologia
Orientador: Prof
a
. Dr
a
. Iseli Lourenço Nantes
Co-orientador: Prof. Dr. Ivarne Luis dos Santos Tersariol
Mogi das Cruzes, SP
2009
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F
ICHA
C
ATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Prieto, Tatiana
Hemoproteínas e hemopeptídeos como agentes
indutores de morte celular : estudo comparativo de
entrega por lipossomos de DODAB e microinjeção /
Tatiana Prieto. – 2009.
150 f.
Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade de
Mogi das Cruzes, 2009
Área de concentração: Bioquímica
Orientador: Profª. Drª. Iseli Lourenço Nantes
1. Citocromo C 2. Microperoxidase 3. Apoptose 4.
Microinjeção 5. Ressônancia Paramagnética Eletrônica
(EPR) 6. Lipossomo de DODAB I. Nantes, Iseli
Lourenço
CDD 572
Aos meus pais, muito obrigada por
apoiarem, incentivarem e acreditarem
nas minhas decisões. Obrigada por
sempre estarem presente. Amo vocês.
Ao destino por ter colocado o Breno no
meu caminho. Obrigada por dividir a
vida comigo.
À minha orientadora e amiga, Prof
a
Dr
a
Iseli Lourenço Nantes, obrigada por ter
contribuído para o meu crescimento
profissional e pessoal. Que este bom
convívio nos acompanhe.
Ao meu querido co-orientador e amigo,
Prof. Dr. Ivarne L. S. Tersariol, pelas
idéias, dedicação, paciência, broncas e
risadas. A convivência esses anos todos
fizeram a diferença. OBRIGADA.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Otaciro Rangel do Nascimento, pela atenção e ajuda. Obrigada
por me ensinar um pouco de tudo, pela amizade e carinho.
Às técnicas Isabel e Andressa, e a todos do Instituo de Física da USP- São
Carlos que sempre me auxiliam com carinho.
Aos demais pesquisadores do grupo: Prof. Antônio C. F. Caíres, Prof. Flávio A.
Rodrigues, Prof. Sérgio Brochsztain, Prof. Dr. Tiago Rodrigues pela amizade, exemplo
e dedicação.
Aos amigos do CIIB: Bárbara, Carol, César, Cíntia, Daiane, Daniel, Débora,
Érica, Fabiane, Fabrício, Felipe, Guilherme, Juliana Casares, Juliana Conrado,
Juliana Mafra, Kátia, Keila, Marcela, Marcelo, Natália, Priscila, Rafael, Roberto,
Rodrigo, Vanessa, Vivian e Zaiane, obrigada pelo apoio, amizade e por toda ajuda que
foi dada.
À Prof
a
Dr
a
Soraya Smaile, pela ajuda e sugestões e a todos os amigos do
departamento de Farmacologia da UNIFESP: Ana, Ana Paula, Cícero, Cleber,
Fernanda, Gustavo, Hanako, Jú, Karen, Lourdes, Mari, Priscila, Regiane, Rodrigo e a
técnica Fernanda pela ajuda e compreensão.
Ao Prof. Dr. Valerian Kagan, e a todos do seu laboratório pela oportunidade de
estagiar no exterior e conviver com tantas culturas diferentes em um mesmo espaço.
À todos que não foram mencionados, mas que de alguma forma contribuíram e
ajudaram na elaboração deste trabalho.
RESUMO
Tendo em vista o papel do citocromo c no disparo da apoptose somado a relatos da
literatura onde a apoptose foi induzida mediante entrega de citocromo c exógeno a
células por diversas vias, o objetivo deste trabalho de doutorado foi desenvolver um
estudo com hemoproteínas e hemopeptídeos metais substituídos como agentes indutores
da apoptose, utilizando duas vias de entrega, microinjeção e lipossomos de brometo de
dioctadecildodecilamônio (DODAB). Os testes foram realizados para duas linhagens
celulares: uma linhagem normal a MLAC (músculo liso de aorta de coelho) e a
linhagem leucêmica K562. Desse estudo pode-se determinar que lipossomos de
DODAB não são bons carreadores de hemoproteínas e hemopeptídeos para as linhagens
celulares testadas. Já o estudo da eficiência e mecanismo dos agentes: citocromo c
nativo (Fe
3+
), citocromo c base livre (sem o átomo de Fe), citocromo c zinco substituído
(Zn
3+
), microperoxidase-11 (Fe
3+
), microperoxidase-11 base livre e microperoxidase-11
manganês substituída (Mn
3+
), revelou que nem todos os agentes são eficientes em
induzir morte de forma tão eficiente quanto citocromo c nativo, porém a proteína metal
substituída que mantém sua estrutura mais próxima ao citocromo c nativo, no caso
citocromo c zinco substituído, foi capaz de ativar caspase-3. Outros eventos que fazem
parte do programa de apoptose como condensação e fragmentação nuclear, alterações na
membrana plasmática e concomitante exposição de fosfatidilserina foram observadas
após microinjeção de todos os agentes, porém em porcentagem e/ou intensidade
diferentes dos resultados obtidos com citocromo c nativo. Utilizamos a técnica de
ressonância paramagnética eletrônica (EPR) para acompanhar o perfil radical da
apoptose induzida por citocromo c e microperoxidase-11 entregues por lipossomos de
DODAB, a formação de radicais livres foi observado apenas para as células tratadas
com microperoxidases. Também foi realizado um estudo da reatividade do
hemopeptídeo MP-11 manganês substituído com peróxido de hidrogênio em meios
homogêneo e heterogêneo, na presença e ausência de histidina, deste estudo
determinamos que micelas de CTAB (brometo de cetiltrimetiamônio) aumentam a
velocidade de reação de MnMP-11 com peróxido de hidrogênio, e neste meio, o efeito
da histidina como catalisador ácido-base é mais acentuado.
Palavras-chave: citocromo c, microperoxidase, apoptose, lipossomos de DODAB,
EPR.
ABSTRACT
Considering the role of cytochrome c in apoptosis and literature reports where apoptosis
was induced by exogenous cytochrome c delivery to cells by various delivery systems,
the objective of this work was to develop a study with hemoproteins and hemopeptides
metal substituted as inducers agents of apoptosis, using two delivery systems,
microinjection and dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) lipossomes. The
experiments were performed for two cell lines: rabbit aortic smooth muscle cells
(SMCs) and K562 leukemic cells line. This study showed that DODAB lipossomes are
not good hemoprotein and hemopeptide carriers for the cell lines tested. On the other
hand, the study of efficiency and mechanism of the inducers agents: native cytochrome
c (Fe
3+
), cytochrome c iron free, cytochrome c zinc substituted (Zn
3+
), microperoxidase-
11 (Fe
3+
), microperoxidase-11 iron free and microperoxidase-11 manganese substituted
(Mn
3+
), showed that not all agents are so efficiently as native cytochrome c, but the
metal substituted protein that remains its structure similar to native form, the
cytochrome c zinc substituted, was able to activate caspase-3. Other events that make
part of the apoptosis program as nuclear condensation and fragmentation, changes in
plasma membrane and concomitant exposure of phosphatidylserine were observed after
microinjection of all agents, but in percentage and / or intensity different from the
results obtained with native cytochrome c. We used the electron paramagnetic
resonance (EPR) technique to monitor the apoptosis radical profile induced by
cytochrome c and microperoxidase-11 delivered by DODAB lipossomes, the formation
of free radicals was observed only for cells treated with microperoxidases. A reactivity
study of microperoxidase-11 manganese substituted with hydrogen peroxide, in
homogeneous and heterogeneous media, in the presence and absence of histidine,
showed that micelles of cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) increases reaction
rate of MnMP -11 with hydrogen peroxide, and in this medium, the effect of histidine as
a catalytic acid-base is strongest.
Keywords: cytochrome c, microperoxidase, apoptosis, DODAB lipossome, EPR.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Representação esquemática da estrutura do citocromo c e do grupo
hemínico
...................................................................................................................................................... 15
Figura 2
Esquema da interação do citocromo c com bicamada lipídica
........................... 17
Figura 3
Desenho esquemático da mitocôndria
.................................................................................. 18
Figura 4
Esquema simplificado de moléculas que controlam a morte celular
programada em C. elegans ............................................................................................................ 22
Figura 5
Atividade da caspase mediada por receptor
..................................................................... 24
Figura 6
Ativação da apoptose mediada pela via mitocondrial
............................................... 25
Figura 7
Sinalização e controle da apoptose pela via mitocondrial
..................................... 29
Figura 8
Descrição do ciclo catalítico da HRP
.................................................................................... 36
Figura 9
Estruturas das microperoxidases
............................................................................................... 37
Figura 10
Esquema representativo das utilizações dos lipossomos e inter-relação
entre os parâmetros que os caracterizam
............................................................................ 41
Figura 11
Esquemas ilustrativos de lipossomas unilamelares (LUV) e
multilamelares (MLV)
...................................................................................................................... 42
Figura 12
Espectro de diferentes espécies de MP-11
........................................................................ 60
Figura 13
Espectro de Mn(III)MP-11 em meio homogêneo e heterogêneo
..................... 61
Figura 14
Espectro da reatividade de Mn(III)MP-11 em meio homogêneo com
H
2
O
2
, na presença e ausência de histidina ......................................................................... 62
Figura 15
Espectro da reatividade de Mn(III)MP-11 em meio heterogêneo com
H
2
O
2
, na presença e ausência de histidina .............................. 64
Figura 16
Esquema proposto para o ciclo catalítico de Mn(III)MP-11 com
peróxido de hidrogênio
..................................................................................................................... 65
Figura 17
Viabilidade celular obtida da incubação das células K562 com
citocromo c ................................................................................................................................................ 67
Figura 18
Determinação da IC 50% de lipossomos de DODAB para a linhagem
MLAC
........................................................................................................................................................... 69
Figura 19
Viabilidade celular por MTT das células MLAC tratadas com
lipossomos de DODAB
.................................................................................................................... 72
Figura 20
Capacidade de fusão dos lipossomos de DODAB às células MLAC
........... 74
Figura 21
Análise da morfologia nuclear através de microscopia de fluorescência
... 75
Figura 22
Porcentagem de núcleos com características apoptóticas após incubação
com lipossomos de DODAB carregados de porfirinas
............................................ 76
Figura 23
Imagens do experimento controle de microinjeção
.................................................... 77
Figura 24
Porcentagem de núcleos com características apoptóticas após
microinjeção das porfirinas ........................................................................................................... 79
Figura 25
Ativação da caspase-3 por hemoproteínas e hemopeptídeos
............................... 81
Figura 26
Imagens de células MLAC tratadas com anexina V após microinjeção
de hemoproteínas .................................................................................................................................. 83
Figura 27A
Espectros de EPR das células mononucleadas incubadas com
DODAB/cit c ........................................................................................................................................... 85
Figura 27B
Espectros de EPR das células mononucleadas incubadas com
DODAB/MP-11
..................................................................................................................................... 86
Figura 28
Viabilidade celular de células mononucleadas incubadas com
DODAB/cit c e DODAB/MP-11 na presença de t-BuOOH
........................... 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Comparação das características morfológicas de apoptose e necrose ............. 21
Tabela 2
Semelhanças entre genes de C. elegans e mamíferos
.................................................. 22
Tabela 3
Grupos da Família Bcl-2
................................................................................................................... 28
Tabela 4
Teste t-Independente entre células pré-incubadas com citocromo c e
controle positivo
...................................................................................................................................... 67
Tabela 5
Liberação de LDH após tratamento de 5 horas com lipossomos de
DODAB ......................................................................................................................................................... 70
LISTA DE ABREVIATURAS
AIF Apoptosis inducing factor
ATP Adenosina trifosfato
CAD Caspase activated DNAse
CL Cardiolipina
CL-OOH Hidroperoxi-cardiolipina
Composto 0 PorFe(III)-OOR
Composto I
Por
+ •
Fe(IV)=O
Composto II PorFe(IV)=O
Composto III
PorFe(III)O
2
-
•
↔ PorFe(II)O
2
COX Ciclo oxigenase
CTAB Brometo de cetil trimetil amônia
CTL Citotoxicidade do linfócito T
DISC Death inducing signaling complex
DMPO N-óxido 5,5 dimetil pirrolina
DNA Ácido desoxirribonucléico
DODAB Brometo de dioctadecil dodecil amônio
DPAA Difenil acetaldeído
EPR Ressonância paramagnética eletrônica
EROs Espécies reativas de oxigênio
FRET Técnica de ressonância fluorescente de transferência de energia
HF Ácido fluorídrico
HPLC Cromatogrofia líquida de alta performance
HPTS 1,3,6-ácido trisulfônico 8-hidroxipireno
HPV Papiloma vírus humano
HRP Peroxidase de raiz forte
Hsp Heat shock protein
IAP Inhibitor of apoptosis proteins
IC Concentração máxima inibitória
ICAD Inhibitor of caspase activated DNAse
LDH Lactato desidrogenase
LiP Lignina de peroxidase
MCL Monoliso-CL
MLAC Linhagem músculo liso de aorta de coelho
MP Microperoxidase
MPT Transição de permeabilidade mitocondrial
PC Fosfatidilcolina
PCPECL Lipossomo de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e
cardiolipina
PE Fosfatidiletanolamina
PS Fosfatidilserina
RNA Ácido ribonucléico
SK-1 Esfingosina quinase-1
t-BuOOH tert-butil hidroperóxido
TNF Tumor necrosis factor
TNF-R1 TNF receptor-1
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
.......................................................................................................................................................
1.1. Estrutura do citocromo c
.......................................................................................................................
1.1.1. Papel biológico do citocromo c
.......................................................................................
1.2. Morte celular programada
.....................................................................................................................
1.2.1. Mecanismos de apoptose
.....................................................................................................
1.2.1.1. Via extrínseca de apoptose
................................................................................................
1.2.1.2. Via perforina/granzima
........................................................................................................
1.2.1.3. Via intrínseca de apoptose
.................................................................................................
1.2.2. Mecanismos regulatórios de sinalização apoptótica
.........................................
1.2.3. Os lisossomos são modificados durante a transformação e a
imortalização celular
.................................................................................................................
1.2.4. Ácidos graxos como sinalizadores de apoptose
...................................................
1.3. Importância biológica do citocromo c
.........................................................................................
1.4. Peroxidases
.......................................................................................................................................................
1.4.1. Atividade catalítica da HRP
................................................................................................
1.4.2. Estrutura das microperoxidases
........................................................................................
1.4.3. Atividade catalítica das microperoxidases
...............................................................
1.5. Apoptose disparada pela entrega de citocromo c exógeno para células
............
1.6. Lipossomos.............
....................................................................................................................................
14
14
17
20
23
23
25
26
27
31
33
34
34
35
36
38
39
40
2. OBJETIVOS.........
................................................................................................................................................
43
3. MÉTODO
.....................................................................................................................................................................
3.1. Desmetelação de hemoproteínas e hemopeptídeos e de citocromo c Zinco
substituído
........................................................................................................................................................
3.2. Síntese de MP-11 Manganês substituída
..................................................................................
3.3. Dosagem de hemoproteínas e hemopeptídeos
.......................................................................
3.4. Preparo do lipossomo de DODAB...........
...............................................................................
3.5. Linhagem de células..................
.....................................................................................................
3.5.1. Determinação da IC
50
promovida por lipossomos de DODAB................
3.5.2. Determinação do efeito surfactante das preparações de lipossomos
de DODAB carregados de hemoproteínas e hemopeptídeos através
da atividade da enzima
.........................................................................................................
3.5.3. Avaliação da eficiência de entrega das preparações de lipossomos
de DODAB carregados de hemoproteínas e hemopeptídeos
.....................
3.5.4. Microinjeção das hemoproteínas e hemopeptídeos..
......................................
3.5.5. Capacidade das hemoproteínas e hemopeptídeos de dispararem
apoptose via microinjeção..............
...............................................................................
3.5.6. Investigação de sinalizações celulares após microinjeção de
hemoproteínas e hemopeptídeos
......................................................................................
3.5.7. Estudo radicalar das linhagens K562 e células mononucleadas após
incubação com lipossomos de DODAB carregados com citocromo c
e MP-11
..........................................................................................................................................
3.6. Estudo da reatividade da MnMP-11 com peróxidos..
......................................................
3.6.1. Purificação e preparo de micelas de CTAB.......
.................................................
44
44
44
45
45
45
46
48
49
50
51
52
53
54
55
55
3.6.2. Estudo da reatividade das porfirinas - manganês substituída com
peróxidos........
..............................................................................................................................
3.6.3. Ressonância paramagnética eletrônica (EPR)....
.................................................
55
57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.
.............................................................................................................
4.1. Estudo da reatividade de microperoxidase-11 manganês substituída
................
4.2. Desenvolvimento de sistemas de entrega de hemoproteínas e
hemopeptídeos para células e determinação do sítio de ação no disparo da
apoptose.........................................................................................................
58
59
66
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES .....
........................................................................................................ 89
6. REFERÊNCIAS .....
.............................................................................................................................................. 91
ANEXO 1....................................................................................................................................................................
1
104
ANEXO 2........
............................................................................................................................................................ 127
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. Estrutura do Citocromo c
O termo citocromo c refere-se a uma classe de hemoproteínas com um grupo heme
covalentemente ligado a uma cadeia polipeptídica através de pontes tioéter com um ou dois
resíduos de cisteína. Os citocromo c eucarióticos são proteínas pequenas, contendo de 103 a
113 resíduos de aminoácidos, que se localizam na face externa da membrana interna das
mitocôndrias (NICHOLLS, 1974). Como já está bem determinado na literatura, no estado de
oxidação III, o ferro hemínico do citocromo c apresenta-se hexacoordenado, sendo a quinta e
a sexta posição de coordenação, ocupadas pela histidina 18 e metionina 80, respectivamente.
O enxofre da Metionina 80 ocupa a sexta posição na faixa de pH de 3 a 9 (MARGOLIASH,
1966; WUTHRICH, 1971). A proteína possui uma massa molecular em torno de 12 KDa,
potencial de redução de +260 mV, tem caráter básico devido ao alto teor de lisinas, e possui
ponto isoelétrico = 10,5.
Na estrutura do citocromo c, o grupo prostético heme é o centro funcional e reativo da
proteína, o qual é mantido em um ambiente hidrofóbico através das ligações covalentes de
seus grupos vinil com as cisteínas 14 e 17 e pela coordenação de seu íon ferro com o
nitrogênio da histidina 18 e o enxofre da metionina 80 (NICHOLLS, 1974), o esquema
ilustrativo do grupo heme e da sua inserção no interior da proteína estão representados na
Figura 1.
15
N
N
N
N
CH
3
COO-
COO-
CH
3
CH
3
CH
3
S
Cys
S
Cys
Fe
3+
FIGURA 1: Representação Esquemática da Estrutura do Citocromo c e do grupo hemínico. O
grupo heme está representado em azul claro, e a estrutura secundária - α hélice, em azul escuro
(NELSON, 2000).
A associação de citocromo c com a membrana interna mitocondrial é um ponto crucial
na atividade da proteína. O desligamento de citocromo c da membrana interna mitocondrial
envolve interações reversíveis entre a proteína e a bicamada lipídica que também são
influenciadas por mudanças conformacionais na proteína. Portanto, a natureza e
especificidade da interação de citocromo c com bicamadas lipídicas têm sido o foco de vários
estudos (KIMELBERG, 1969; VANDERKOOI, 1973; SPOONER, 1992; PINHEIRO, 1994).
Dois tipos de interação, eletrostática e hidrofóbica, têm sido descritas como importantes
fatores na associação de citocromo c com membranas fosfolipídicas.
A interação de citocromo c com modelos de membrana, vesículas lipídicas e
monocamadas carregadas negativamente, promove alterações conformacionais no conteúdo
de α-hélice, no estado de spin do ferro hemínico e levam algumas vezes à perda da sexta
coordenação do ferro com o resíduo Met80 (NANTES, 2001; ZUCCHI, 2003;
HILDETRANDT, 1989; PINHEIRO, 1997). Estudos utilizando vesículas fosfolipídicas têm
indicado a existência de dois sítios distintos na estrutura de citocromo c, denominados como
sítio A e sítio C, que são responsáveis pela associação com bicamadas lipídicas. O sítio A é
um sítio de interação eletrostática, constituído de resíduos de aminoácido básicos Lys72 e
Lys73, enquanto que o sítio C envolve alta afinidade por fosfolipídios acídicos protonados
(RYTÖMAA, 1992, 1994, 1995; TUOMINEN, 2002), no qual o resíduo de aminoácido
16
invariável, Asn52, se liga a fosfolipídios acídicos protonados via pontes de hidrogênio.
Enquanto os sítios A e C estão envolvidos na interação de citocromo c com o grupo fosfato da
cabeça do fosfolipídio, uma cauda acil do fosfolipídio pode enterrar no canal hidrofóbico da
proteína, o qual é formado por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, estendidos de forma
linear a partir da superfície da proteína em direção a cavidade do heme. Resultados do nosso
grupo de pesquisa demonstraram a existência de um novo sítio eletrostático de interação pH-
dependente de citocromo c com membranas de PCPECL (sítio L) e que envolve os resíduos
de Lys-22, 25 e 27 bem como His-26 e 33 da proteína (KAWAI, 2005), ilustrado na Figura 2.
O efeito de pH na interação com membranas foi observado na faixa de 7,4 a 6,2 que
corresponde a variação de pH esperada no espaço intermembrana conforme haja dissipação
ou geração do gradiente eletroquímico. No caso do estudo feito em membranas modelo de
PCPECL, a protonação do sítio L pelo abaixamento do pH gerou dois sítios carregados
positivamente em lados opostos da proteína. Cada lado, uma vez dotado de carga, pode se
ligar a uma vesícula e assim, citocromo c pode “catalisar” a aproximação de duas vesículas
levando à fusão das mesmas (KAWAI, 2005). Nas mitocôndrias, o sítio A deve estabelecer
ligação com as redutases e oxidases enquanto o sítio L interage com a superfície da
membrana. Estudos subseqüentes que estão sendo conduzidos com mitoplastos estão
corroborando a participação do sítio L na interação de citocromo c com a fração lipídica da
membrana mitocondrial interna.
17
FIGURA 2: Esquema da interação do citocromo c com bicamada lipídica. Interação das Lys-22,
Lys-27 e Lys-33 (sítio L) e Lys-86, Lys-72 e Lys-73 (sítio A) do citocromo c de coração de cavalo
com duas vesículas formadas por bicamada lipídica (KAWAI, 2005).
1.1.1 Papel Biológico do Citocromo c
O citocromo c é uma proteína periférica da membrana mitocondrial interna. A sua
localização, na face externa da membrana mitocondrial interna, esta vinculada a sua função
como transportador de elétrons da cadeia respiratória. A explicação para esta função
específica como transportador de elétrons está em sua capacidade de oxidação reversível,
onde o ferro do seu grupo heme é oxidado a Fe
3+
ou reduzido a Fe
2+
, alternadamente,
promovendo assim o transporte de elétrons.
18
FIGURA 3: Desenho Esquemático da Mitocôndria. (CÉSAR & SEZAR, 2002)
Além de controlar o metabolismo energético celular, como carreador móvel na cadeia
de transporte de elétrons da mitocôndria, o citocromo c respiratório foi identificado como
regulador da apoptose celular. A translocação do citocromo c da membrana mitocondrial
interna para o citoplasma é tida como evento central no disparo da apoptose celular. O
citocromo c no citoplasma interage com a proteína Apaf-1 e inicia a formação do
apoptossomo, que por sua vez promove a ativação da caspase-9 ativando uma cascata
proteolítica que culmina com a morte celular (KAGAN, 2004).
Outro papel importante do citocromo c foi demonstrado por Mueller e colaboradores,
onde citocromo c catalisa amidação de ácidos graxos dando origem a importantes reguladores
fisiológicos, como oleoilglicina a partir de oleoil-CoA e glicina e oleoamida a partir de oleoil-
CoA e amida, ambos na presença de peróxido de hidrogênio, porém por mecanismos ainda
não compreendidos (MUELLER, 2007; DRISCOLL, 2007). Todas as atividades exercidas
pelo citocromo c são realizadas na sua estrutura nativa e estudos de vários grupos têm
mostrado que o desdobramento de sua estrutura protéica revela uma nova função como
peroxidase (GEBICKA, 2001). Esta desestabilização da estrutura protéica pode ser induzida
por modificação química, como oxidação e nitração, ou por sua associação a ânions
hidrofóbicos, incluindo fosfolipídios aniônicos. Kagan e seu grupo descobriram mecanismos
pelo qual a atividade peroxidásica do citocromo c oxida um fosfolipídio específico de
mitocôndria, a cardiolipina (CL), assim como o papel desta união na execução da apoptose
(KAGAN, 2005; BELIKOVA, 2007).
Através da técnica de ressonância fluorescente de transferência de energia (FRET)
foram confirmadas interações do tipo eletrostática, (GORBENKO, 2006) sendo que tais
19
interações são provenientes das cargas negativas dos grupos fosfato da CL e das cargas
positivas das lisinas do citocromo c. Outro tipo de interação que ocorre na formação do
complexo, é interação hidrofóbica, oriunda da cadeia alifática do lipídio com o domínio
hidrofóbico da proteína. Ambas as interações são dependentes de pH, força iônica e razão
molar entre CL/cit c. Outro fator que influencia no complexo é o número de insaturações,
quanto maior o número de insaturações mais estável é a interação entre cit c/lipídio (KAGAN,
2009).
O desdobramento da proteína provocado pelas associações com lipídio favorece a
atividade peroxidásica do complexo cit c/CL, pois ocorre um afastamento entre os atómos de
Fe-S(Met 80) no centro ativo da proteína, e esta pequena perturbação é suficiente para
permitir a substituição do enxofre por uma molécula de H
2
O
2
ou NO.
Na mitocôndria, essa atividade peroxidásica possui uma especificidade marcante pela
cardiolipina, promovendo oxidação e hidrólise da hidroperoxi-cardiolipina (CL-OOH). Em
células, esta especificidade é utilizada durante a execução do programa apoptótico disparado
pelo acúmulo de CL-OOH. Normalmente a regulação da atividade do citocromo c como
peroxidase ocorre pela baixa disponibilidade de CL, prevenindo assim a formação do
complexo cit c/CL. Durante o estímulo apoptótico, a fosforilação e ativação da enzima
scramblase-3, provocam a redistribuição da CL, ou seja, migração da CL da membrana
mitocondrial interna para externa. Assim, sua interação com citocromo c e conseqüentemente
formação do complexo cit c/CL é facilitada (ESPOSTI, 2002).
Duas reações metabólicas, peroxidação e hidrólise, são participantes importantes do
processo de translocação da CL, de permeabilização da membrana mitocondrial e lançamento
de fatores pro-apoptóticos no citosol. A reação de peroxidação está associada à especificidade
da atividade peroxidásica do complexo cit c/CL, e resulta no acúmulo de hidroperoxi-CL e
hidroxi-derivados (KAGAN, 2005; TYRIN, 2008; TYRINA, 2008). Já a reação de hidrólise
leva a formação de monoliso-CL (MCL), detectado durante processo apoptótico (ESPOSTI,
2002, 2003; CHICCO, 2007).
20
1.2. Morte Celular Programada
Desde metade do século XIX, muitas observações indicaram que a morte celular
possui uma importância considerável durante os processos fisiológicos de organismos
multicelulares, particularmente durante embriogênese e metamorfose (GLUECKSMANN,
1951; LOCKSHIN, 2001).
O termo morte celular programada foi introduzido em 1964,
propondo que a morte celular durante o desenvolvimento não é acidental e segue uma
seqüência de etapas controladas resultando em uma autodestruição local e temporária
(LOCKSHIN, 1964).
O termo apoptose foi criado para descrever o processo morfológico que leva a morte
celular controlada. Este processo participa de forma integral e necessária do ciclo de vida
celular dos organismos. O processo apoptótico é determinante no desenvolvimento de
organismos multicelulares, na regulação e manutenção de populações celulares em tecidos
sob condições fisiológicas e patológicas. Pode-se enfatizar que apoptose é a mais bem
definida e, possivelmente, a forma mais freqüente de morte celular programada (LEIST,
2001). São exemplos de processos apoptóticos em células eucarióticas:
Desenvolvimento e morfogênese - Durante a formação dos dedos, morte do tecido
mesenquimal da membrana interdigital; formação dos órgãos reprodutores.
Homeostase - Sistema imunológico: células B e T são geradas todos os dias e a
maioria delas morre durante a maturação.
A morte fisiológica é caracterizada por algumas mudanças estereotípicas, como,
arredondamento celular; condensação, fragmentação e depósito da cromatina na periferia da
membrana nuclear; degradação DNA; perda da adesão celular; formação de protusões
citoplasmáticas. A célula apoptótica fragmenta-se em inúmeros corpos apoptóticos, que são
vesículas que contém no seu interior fragmentos da membrana celular e organelas intactas
(ARENDS, 1990; KERR, 1972). Os corpos apoptóticos são englobados por macrófagos e
eliminados dos tecidos sem provocar resposta inflamatória. Essas mudanças morfológicas são
conseqüência de características moleculares e eventos bioquímicos, controlados por enzimas
proteolíticas pertencentes à família C14 das cisteíno-proteínases denominadas caspases. Por
outro lado, a necrose, morte celular provocada por lesões é caracterizada por um aumento de
volume celular, perda de integridade da membrana plasmática e das organelas, seguida de
desorganização citoplasmática e dissolução nuclear. Durante a necrose os conteúdos celulares
21
são extravasados para o meio extracelular resultando em resposta inflamatória no tecido
(LOCKSHIN, 1964). A Tabela 1 compara as principais diferenças morfológicas entre os
processos de apoptose e necrose.
Apesar dos mecanismos e morfologias dos processos de apoptose e necrose diferirem,
há uma repetição entre esses dois processos, chamado por alguns autores de “apoptose-
necrose continuada” (ZEISS, 2004). Por exemplo, dois fatores que irão converter um processo
apoptótico em um processo necrótico: (i) diminuição da disponibilidade de caspase e (ii)
diminuição de ATP intracelular (LEIST, 1997; DENECKER, 2001). Portanto a rota de morte
ser por necrose ou apoptose depende em parte da natureza do sinal de morte celular, o tipo de
tecido, o estágio de desenvolvimento de tecido e do meio fisiológico (KERR, 1972; FIERS,
1999).
Histologicamente não é sempre fácil distinguir apoptose de necrose, e eles podem
ocorrer simultaneamente dependendo de fatores como, intensidade e duração dos estímulos,
depleção de ATP e de caspases. Necrose é um processo incontrolável que geralmente afeta
vários campos celulares, enquanto apoptose é controlado e pode afetar células individuais ou
um grupo de células.
Tabela 1 - Comparação das características morfológicas de apoptose e necrose
Apoptose Necrose
Células individuais ou pequenos grupos de
células
Geralmente células contíguas
Arredondamento celular Inchamento celular
Picnose e cariorrexe Cariólise, picnose e cariorrexe
Membrana celular intacta Membrana celular rompida
Citoplasma retido em corpos apoptóticos Vazamento citoplasmático
Ausência de processo inflamatório Presença de processo inflamatório
O estudo genético de morte celular em nematóide C. elegans, contribuiu para o
entendimento da apoptose em mamíferos. Foram encontrados quatro genes, correspondentes a
cisteíno-proteinases envolvidas na morte celular programada do C. elegans (HENGARTNER,
1999). O esquema abaixo (Figura 4) ilustra a ação das proteínas codificadas pelos genes “ced”
na propagação da apoptose em C. elegans:
22
ced-9
ced-3
Apoptose
e
g
l-1
ced-4
FIGURA
4: Esquema simplificado de moléculas que controlam a morte celular programada em
C. elegans. Onde ced-3 é o gene efetor da apoptose, ced-4 é de indutor de ced-3, ced-9 é inibidor de
ced-3 e egl-1 é inibidor de ced-9, ou seja, de maneira indireta induz ced-3.
Genes semelhantes aos ced-3, ced-4, ced-9 foram identificados em células de
mamíferos e considerados responsáveis pela codificação de proteínas que atuam como
efetores e reguladores de apoptose, induzidos por uma variedade de estímulos (Tabela 2).
Tabela
2 - Semelhanças entre genes de C. elegans e mamíferos.
C. elegans Mamíferos Função
ced-3 Caspases Execução da apoptose
ced-4 apaf-1 Indutor de caspases
ced-9 família bcl-2 Indutor e inibidor de apoptose
Em células de mamíferos as caspases são os principais iniciadores e executores de
apoptose. Caspases são cisteíno-aspartato-proteínases, que exibem o domínio catalítico
QACXO, onde a cisteína é o aminoácido ativo. Foram identificados 14 membros da família
de caspases nos mamíferos, entre elas, as caspases-3, -9, -8, -2, -6, -7 e -10 têm sido
reconhecidas por possuírem um importante papel de sinalização no maquinário apoptótico. As
caspases pró-apoptóticas podem ser divididas em dois grupos (CHANG, 2000; EARNSHAW,
1999):
• Caspases iniciadoras: pró-caspases-2, -8, -9 e –10
• Caspases executoras: pró-caspases-3, -6 e –7
As caspases iniciadoras são recrutadas e ativadas em resposta aos receptores de morte
da membrana celular (via extrínseca de apoptose) ou em resposta a sinais intracelulares (via
intrínseca de apoptose) (GEWIES, 2003).
23
1.2.1 Mecanismos de Apoptose
Os mecanismos de apoptose são complexos e sofisticados, envolvendo uma cascata de
eventos moleculares dependentes de energia. Pesquisas indicam que há dois principais
mecanismos apoptóticos: o extrínseco ou via receptor de morte e o intrínseco ou via
mitocondrial. Entretanto, há evidências de comunicação entre as duas vias, e moléculas de
uma via pode influenciar na outra (IGNEY, 2002). Há uma via adicional que envolve células
T, mediada por citotoxicidade e morte dependente de perforina-granzima, a qual pode induzir
apoptose tanto por granzima B ou A. As vias extrínseca, intrínseca e granzima B convergem
para o mesmo final, a via de execução celular.
1.2.1.1. Via extrínseca de apoptose
Tipo I: A sinalização desta via envolve interações com receptor transmembrana. O
envolvimento de receptores de morte, que são membros da família de receptores TNF (do
inglês, Tumor Necrosis Factor) (LOCKSLEY, 2001). Membros da família do receptor TNF
possuem domínio extracelular rico em cisteína, e um domínio citoplasmático de
aproximadamente 80 resíduos de aminoácidos chamado de “domínio de morte”
(ASHKENAZI, 1998). Esse domínio citoplasmático possui um papel importante na
transmissão dos sinais de morte da superfície celular para as vias de sinalização intracelular.
Na via extrínseca (Figura 5), quando ocorre a ligação entre ligante e seu respectivo receptor
de membrana (FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 e Apo2L/DR5...),
moléculas adaptadoras são recrutadas pelo domínio citoplasmático do receptor, os
adaptadores recrutam as pró-caspases iniciadoras, formando um complexo - DISC (do inglês,
Death Inducing Signaling Complex) que permite a clivagem autoproteolítica da pró-caspase
iniciadora em caspase, a ativação da caspase iniciadora ativa a caspase executora, a qual
executa a apoptose (DENAULT, 2002).
24
FIGURA 5: Ativação da Caspase Mediada por Receptor. O complexo de sinalização indutor de
morte (DISC) é o responsável pela ativação da caspase iniciadora. O DISC é composto por ligante,
receptor, adaptador e pró-caspase iniciadora (GEWIES, 2003).
Tipo II: Os sinais oriundos da ativação dos receptores não são fortes o suficiente para
executar a morte celular e, neste caso, os sinais precisam ser amplificados pela via apoptótica
dependente de mitocôndria (Figura 6). A ligação entre sinais da cascata de caspase e
mitocôndria é realizada pela proteína Bid, membro da família de proteínas Bcl-2. A proteína
Bid é clivada pela caspase-8 e gera a forma t-Bid, a qual é translocada para a mitocôndria. Na
presença de outros fatores pró-apoptóticos da família Bcl-2, Bax e Bak, a proteína t-Bid induz
a translocação do citocromo c e dos outros fatores pró-apoptóticos para o citosol (LUO,
1998). Citocromo c citosólico interage à proteína Apaf-1 monomérica, que na presença de
dATP, muda sua conformação, oligomeriza e forma o apoptossomo, o qual induz a
autoclivagem da pró-caspase-9 iniciadora (ACEHAN, 2002). Uma vez ativada a caspase-9,
inicia-se a subseqüente cascata de ativação das caspases efetoras, caspases-3, -6 e –7,
resultando em morte celular.
25
FIGURA 6: Ativação da Apoptose Mediada pela Via Mitocondrial. A formação do apoptossomo
(união de 7 complexos Apaf-1 e citocromo c) é responsável pela ativação da caspase iniciadora
(EARNSHAW, 1999).
1.2.1.2. Via Perforina/Granzima
Citotoxicidade mediada por células T de hipersensibilidade do Tipo IV, onde células
CD8+ sensibilizadas matam células hospedeiras de antígeno. Essa citotoxicidade dos
linfócitos T (CTL) é capaz de matar células alvo através da via extrínseca de apoptose e
interação FasL/FasR é a forma predominante dos CTL induzirem apoptose (BRUNNER,
2003). Entretanto, eles também são capazes de exercer seus efeitos citotóxicos em células
tumorais e células infectadas por vírus através de uma nova via que envolve uma molécula
formadora de poro transmembrânico, a perforina, que após formação dos poros lança grânulos
citoplasmáticos dentro da célula alvo (TRAPANI, 2002). As serino-proteases granzima A e B,
são tão importante quanto os grânulos (PARDO, 2004). A granzima B cliva proteínas nos
resíduos de aspartato, com subseqüente ativação da pro-caspase-10 e pode vir a clivar fatores
como ICAD (do inglês, Inhibitor of Caspase activated DNAse) (SAKAHIRA, 1998). Alguns
relatos mostram que a granzima B pode utilizar a via mitocondrial para amplificar os sinais de
morte, através da clivagem de Bid e indução da liberação de citocromo c, (BARRY, 2002;
RUSSELL, 2002) ou pode ativar caspase-3 diretamente, dessa maneira não há ocorrência da
sinalização upstream, e sim indução e execução da apoptose. Granzima A também é
importante na indução de apoptose e ativação das caspases por vias independentes, uma vez
26
dentro da célula a granzima A ativa um gene supressor de tumor, o NM23-H1, o qual
geralmente está inibido por um complexo protéico do nucleossomo chamado de SET. Este
complexo parece ter função de reparo do DNA tumoral, com a sua destruição pela granzima
A e subseqüente liberação do gene NM23-H1, ocorre então, a indução da apoptose nas células
tumorais (FAN, 2003).
1.2.1.3. Via Intrínseca de Apoptose
A sinalização da via intrínseca responsável pelo início da apoptose envolve vários
mecanismos independente de interação com receptores de morte, os sinais atingem
diretamente a célula e são eventos inicializados na mitocôndria. Portanto, além de amplificar e
mediar a via extrínseca de apoptose, a mitocôndria possui um papel importante na integração
e propagação de sinais de morte originados dentro da célula, tais como: ausência de alguns
fatores de crescimento, hormônio e citocinas, que quando não suprimem os programas de
morte acabam disparando a apoptose. Outros estímulos como radiação, alteração da estrutura
do DNA, toxinas, hipóxia, hipertermia, infecções virais, estresse oxidativo e drogas
quimioterapêuticas. Todos esses estímulos provocam mudanças na membrana mitocondrial
interna resultando: (i) na abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial
(MPT), (ii) perda do potencial da membrana interna da mitocôndria (∆ψ) (BERNARDI, 1999;
LOEFFER, 2000) e (iii) lançamento de dois grupos de proteínas pro-apoptóticas do espaço
intermembranas para o citosol (SAELENS, 2004). O primeiro grupo é formado por citocromo
c, Smac/DIABLO (do inglês, segundo ativador de caspase mitocondrial/ proteína de ligação
IAP direta com baixo pI), e a serino protease HtrA2/Omi (ELMORE, 2007). A translocação
do citocromo c da membrana mitocondrial interna para o citoplasma, por sua vez, induz a
formação do apoptossomo (união de 7 complexos de citocromo c e Apaf-1). A interação de
moléculas de pro-caspase-9 (iniciadora) com o apoptossomo favorece a autoclivagem da pro-
caspase-9, por conseqüência, ativa a caspase-9. Smac/DIABLO e HtrA2/Omi são descritas
por promoverem a apoptose através da atividade das IAP (do inglês Inhibitors of Apoptosis
Proteins) (VAN LOO, 2002; SCHIMMER, 2004).
O segundo grupo de proteínas pro-apoptóticas, AIF (do inglês, Apoptosis Inducing
Factor), endonuclease G e CAD (do inglês, Caspase Activated DNAse), são lançadas da
mitocôndria durante a apoptose, mas este evento ocorre depois que a célula já disparou a
morte. A translocação das AIF para o núcleo provoca a fragmentação do DNA em pedaços de
27
50-300 kb e condensação da cromatina nuclear na parte periférica do núcleo (JOZA, 2001).
Esta forma inicial da condensação nuclear é referenciada como “Estágio I” da condensação
(SUSIN, 2000), o evento é seqüenciado pela translocação da endonuclease G para o núcleo,
responsável pela clivagem da cromatina nuclear produzindo fragmentos oligonucleossomal de
DNA (LI, 2001). Tanto AIF quanto endonuclease G possuem atividade independente de
caspase, o que já não ocorre com CAD, que após lançado ao citosol, sofre clivagem pela
caspase-3 e no núcleo intensifica a fragmentação do DNA e condensação da cromatina
(ENARI, 1998). Essa condensação pronunciada da cromatina é referenciada como “Estágio
II” da condensação (SUSIN, 2000).
Vimos que o aumento da transição de permeabilidade e a dissipação do potencial de
membrana são os mais importantes eventos indutores da apoptose, esses eventos por sua vez
são diretamente controlados por proteínas pertencentes à família Bcl-2, conforme mostrado a
seguir.
1.2.2. Mecanismos Regulatórios da Sinalização Apoptótica
Todas as células de um animal multicelular devem estar intrinsecamente programadas
para se autodestruir e então morrer espontaneamente, a menos que a morte celular seja
constantemente reprimida por sinais de sobrevivência oriundos de outras células do
organismo, por exemplo, fatores de crescimento, hormônios e nutrientes. Estes fatores de
sobrevivência aumentam a expressão e/ou atividade de moléculas regulatórias antiapoptóticas
(AMEISEN, 2002).
Entre essas moléculas regulatórias, inclui-se a família Bcl-2. Membros dessa família
são divididos em três grupos e estão apresentados na tabela 3.
28
Tabela 3
- Grupos da Família Bcl-2 (GUPTA, 2003)
Proteínas antiapoptóticas Proteínas pró-apoptóticas
(BH-3)
Proteínas pró-apoptóticas
(BH-123)
Bcl-2 Bid* Bax*
Bcl-x Bim* Bak*
Mcl-1 Bik Bok
Bcl-w Bmf
Al Bad*
Bcl-XL Hrk
BAG BNIP
3
Essas proteínas possuem um significado especial, pois são elas que determinam se a
célula cometerá apoptose ou abortará o processo. Há hipóteses na literatura de que o principal
mecanismo de ação das proteínas da família Bcl-2 é a regulação da saída do citocromo c da
mitocôndria, através do controle da permeabilidade da membrana mitocondrial externa
(ZAMZAMI, 2001; LIU, N., 2003).
As proteínas assinaladas (*) na tabela 3 representam as proteínas pró-apoptóticas que
iniciam a alteração da permeabilidade da membrana mitocondrial por intermédio de canais.
Durante a apoptose, a proteína Bax, que se encontra na forma monomérica, quando chega no
citosol é dimerizada; a proteína Bad é desfosforilada no citosol e se torna ativa. A proteína
Bad ativa bloqueia a ação antiapoptótica da proteína Bcl-xl; a proteína Bid, que já esta
presente no citosol, após ser clivada pela caspase-8 interage com as proteínas Bax ou Bak da
membrana mitocondrial tornando-as ativas (GUPTA, 2003).
Puma e Noxa são dois membros pro-apoptóticos da família Bcl-2. Puma possui um
papel importante na apoptose mediado por p53, foi mostrado, in vitro, que a superexpressão
de Puma é acompanhada de vários eventos, como: aumento de expressão da Bax, mudança
conformacional da Bax, liberação de citocromo c e redução do potencial de membrana (LIU,
F.T., 2003). Noxa também é um candidato a mediador de apoptose induzida por p53, estudos
mostraram que a proteína pode estar localizada na mitocôndria e interagir com membros anti-
apoptóticos da família Bcl-2, resultando na ativação da caspase-9 (ODA, 2000). Como ambas
as proteínas Puma e Noxa são induzidas por p53, elas devem mediar apoptose através de
danos genotóxicos ou ativação oncogênica. A oncoproteína Myc também foi reportada por
29
potencializar apoptose através de mecanismos tanto dependentes quanto independentes de p53
(MEYER, 2006).
A figura 7 mostra algumas sinalizações que provocam mudanças no potencial de
membrana e na elevação da permeabilidade mitocondrial, que resulta na translocação do
citocromo c da mitocôndria para o citoplasma. O desprendimento do citocromo c da
membrana interna mitocondrial é facilitado pelas proteínas Bax e Bid, e esse desprendimento
é bloqueado pelas proteínas Bcl-2 e Bcl-xl.
FIGURA 7: Sinalização e controle da apoptose pela via mitocondrial (GEWIES, 2003).
Outra família de proteína antiapoptótica que não esta listada na tabela é a IAP, todas as
proteínas IAPs possuem o domínio BIR, os quais são essenciais para sua função. Membros
dessa família inibem diretamente as caspase-3, -7 e –9 (SALVESEN, 2002).
Ambas as vias extrínseca e intrínseca terminam na fase de execução, considerada o
final da via de apoptose. É a ativação de caspases efetoras que dispara esta fase da apoptose.
Caspases executoras ativam endonucleases citoplasmáticas, as quais degradam material
nuclear, e proteases que degradam núcleo e proteínas do citoesqueleto. Portanto as caspases-
3, -6 e -7, clivam vários substratos incluindo citoqueratinas, alfa-fodrina, proteínas nucleares
entre outras que resultam nas mudanças morfológicas e bioquímicas vistas nas células
apoptóticas (SLEE, 2001).
30
A caspase-3 é considerada a mais importante das caspases efetoras, é ativada pelas
caspases iniciadoras, caspase-8, -9, -10. Caspase-3 ativa especificamente a endonuclease
CAD, a qual nas células em proliferação encontra-se complexada com seu inibidor ICAD,
porém nas células apoptóticas, a caspase-3 ativa, cliva o inibidor ICAD liberando assim a
endonuclease CAD (SAKAHIRA, 1998). O DNA cromossomal é então degradado sem a
ocorrência da condensação de núcleo e cromatina. A caspase-3 também é responsável pela
reorganização do citoesqueleto e desintegração da célula em corpos apoptóticos.
No processo de reorganização do citoesqueleto a proteína gelsolina foi identificada
como um dos substratos da caspase-3 ativa. Esta proteína atua como um núcleo para a
polimerização da actina, ligando-se também a molécula de bifosfato fosfatidilinositol,
coordena, portanto dois eventos: organização de actina e transdução de sinal. A caspase-3
cliva a proteína gelsolina e fragmentos de gelsolina clivam filamentos de actina de uma
maneira independente de cálcio, provocando alterações no citoesqueleto, transporte
intracelular, divisão celular e na transdução de sinal (KOTHAKOTA, 1997).
A sinalização de fagocitose das células apoptóticas é o último evento do processo
apoptótico. Esta etapa é caracterizada pela assimetria dos fosfolipídios, externalização da
fosfatidilserina (PS) na superfície das células apoptóticas e fragmentos celulares. Entretanto, o
mecanismo de translocação da fosfatidilserina para a membrana externa da célula durante a
apoptose, ainda não é bem esclarecido, isto esta associado à perda de atividade da
aminofosfolipídio translocase e ao flip-flop inespecífico dos fosfolipídios (BRATTON, 1997).
Alguns pesquisadores sugerem o envolvimento de Fas, caspase-8 e -3 na regulação da
externalização da fosfatidilserina durante estresse oxidativo de eritrócitos, porém a exposição
de PS foi detectada durante o processo apoptótico de linfócitos T primários de maneira
independente de caspase (FERRARO-PEYRET, 2002; MANDAL, 2005).
O aparecimento de PS na porção externa das células apoptóticas, facilita o
reconhecimento fagocitário sem ocorrência de inflamação, permitindo um rápido
aproveitamento e disposição dos constituintes celulares, conforme mencionado anteriormente.
31
1.2.3. Os Lisossomos São Modificados Durante a Transformação e a Imortalização
Celular
As células tumorais possuem vários defeitos na suas vias de morte celular, tais como:
exacerbação da expressão gênica de proteínas antiapoptóticas, Bcl-2, Bcl-xL, Akt/PKB e
inibidores, bem como, apresentam mutações em proteínas pró-apoptóticas, com: Bax, Apaf-1
e p53. Essas alterações favorecem o desenvolvimento tumoral por bloquear e interferir
negativamente na ativação das caspases e, dessa forma, bloquear a apoptose pelas vias
clássicas. Por outro lado, durante os estágios iniciais da tumorogênese, muitas células
transformadas podem ser sensibilizadas por vários estímulos de morte e, freqüentemente,
muitas delas podem entrar em apoptose espontânea (JAATTELA, 2004).
Alterações marcantes observadas no compartimento lisossomal das células tumorais e o
direto envolvimento das enzimas lisossomais no controle da apoptose tumoral, sugerem que a
via lisossomal de disparo da morte celular pode contribuir, significantemente, para a
sensibilização do programa de morte em células tumorais. Dentre essas alterações lisossomais
promovida pela imortalização celular podemos destacar: i) a elevação da sensibilidade da
membrana lisossomal a agentes lisossomotrópicos; ii) o aumento do volume dos lisossomos e
iii) a elevação da sensibilidade da morte celular pela via lisossomal. Também, pode-se notar
as alterações lisossomais promovidas pela transformação celular: i) elevação na expressão
gênica das catepsinas lisossomais; ii) alteração do tráfego celular dos lisossomos; iii) elevação
na taxa de secreção das catepsinas e iv) aparecimento da Hsp70 (do inglês, heat shock
protein) na membrana lisossomal induzindo maior estabilidade da membrana lisossomal para
as células tumorais (FEHRENBACHIER, 2005).
Tem sido mostrado que a imortalização e a transformação, em fibroblastos embrionários
murinos, sensibilizam essas células para a indução de morte celular pela via lisossomal
disparada por TNF. Por si mesmo, a espontânea imortalização observada nessas células,
gerada pela inativação do seu sistema de p53, foi suficiente para sensibilizar em mais de 1000
vezes os fibroblastos embrionários murinos à ação apoptótica induzida pelo TNF. Essa
sensibilização foi altamente dependente da atividade da enzima lisossomal catepsina B. Foi
mostrado que o nocaute do gene da catepsina B nessas células de fibroblasto embrionárias
imortalizadas geram células resistentes à indução de apoptose pelo TNF, de modo semelhante
à ação do TNF nas células selvagens não imortalizadas. A reintrodução da catepsina B nessas
células mutantes defectivas de catepsina B foi suficiente para promover a ressensibilização ao
32
TNF, enquanto que a inibição farmacológica da catepsina B ou a depressão da expressão
gênica dessa enzima por RNA de interferência, significativamente protegeram as células
imortalizadas contra a apoptose induzida por TNF. Ainda, a transformação dos fibroblastos
embrionários murinos imortalizados induzida por v-Ha-ras ou c-Src promoveu uma grande
elevação na taxa de expressão gênica das catepsinas B e L (FEHRENBACHIER, 2005).
Dessa forma, os autores especularam que a sensibilização destas células para o estímulo
apoptótico disparado pelo TNF se deve à exacerbação da via lisossomal presentes em células
transformadas.
Além de sua função de degradar proteínas da matriz extracelular e de garantir
capacidade de invasão de células tumorais, a catepsina B tem sido implicada no controle de
apoptose. A catepsina B possui atividade de protease ativadora de morte celular dependente e
independente de caspases, disparando os mecanismos de apoptose em células tumorais (FU,
1998). Foi demonstrado que a ativação de apoptose em células infectadas por HPV (papiloma
vírus humano), induzidas pelo complexo inibitório da oncoproteína E7 de HPV e p21, está
associada à ativação da catepsina B, e este poderia ser um mecanismo alternativo para garantir
a morte celular das células infectadas. Também foi observado que a ativação da catepsina B
ocorre em células tumorais com mutações de caspases, bem como superexpressão de
proteínas Bcl-2 e p21 (KAZNELSON, 2004). Drogas antitumorais que induzem a
permeabilização da membrana lisossomal liberam catepsinas B e D para o citoplasma que, por
sua vez, podem induzir apoptose dependente de Bax (ERDAL, 2005). Compostos que
promovem a translocação de enzimas lisossomais para o citoplasma induzem morte celular
independentemente de p53. Tem sido observado que TNF via receptor-1 (TNF-R1), além de
ativar caspases, também promove apoptose mediada pela mobilização de enzimas lisossomais
para o citoplasma. Antagonicamente, NF-kappaB é capaz de bloquear o efeito pró-apoptótico
do TNF pela indução de uma proteína inibidora da atividade de catepsina B, denominada
Spi2A (LIU, N., 2003). Dados da literatura têm mostrado que a catepsina B é capaz de ativar
a proteína Bid na sua forma pró-apoptótica tBid (CIRMAN, 2004) e degradar a enzima
esfingosina quinase-1 (SK-1) que é inibidora de apoptose (TAHA, 2005), pois como a enzima
SK-1 regula os níveis de ceramida intracelular, o seu bloqueio leva a um aumento na síntese
de ceramida que induz a oligomerização da Bax, responsável por aumentar a permeabilização
da membrana mitocondrial favorecendo o lançamento do citocromo c no citosol e disparando
a cascata de caspases (TAHA, 2006). Desta forma, as enzimas lisossomais, em especial a
catepsina B, tem sido diretamente implicadas no controle da apoptose.
33
1.2.4. Ácidos Graxos como sinalizadores de Apoptose
A importância de metabólitos de ácidos graxos em vários aspectos da sinalização
celular é bem documentada. Prostaglandinas derivadas da oxidação de ácido araquidônico foi
uma das primeiras espécies sinalizadora a ser identificada, e atualmente há um interesse
crescente nos produtos de oxidação do ácido araquidônico, assim como de outros ácidos
graxos saturados e insaturados, por possuírem potencial de serem produtos bioativos que
afetam o processo de apoptose (TANG, 2002).
Os ácidos graxos são importantes para o funcionalismo de células normais, participa
da estrutura e sinalização celular. Os ácidos graxos dentro das células encontram-se na forma
esterificada (ex: fosfolipídios, mono-, di- e triglicerídeos, ésteres de colesterol) e não
esterificada. Os ácidos graxos não esterificados, referidos como ácidos graxos livres, atuam
como transportadores ou encontram-se ligados a outras proteínas, dificilmente encontram-se
“livres” devido a sua solubilidade e possível toxicidade. A oxidação de ácidos graxos envolve
reações metabólicas com produção de energia e a adição de moléculas de oxigênio nas duplas
ligações dos ácidos graxos insaturados gera espécies oxidadas bioativas.
Estudos antigos já demonstravam que células tumorais produzem níveis mais elevados
de metabólitos de ácido araquidônico ou eicosanóides que células normais, devido à
proliferação de células tumorais ser mais rápida que a proliferação de células normais. Há
relatos em literatura que ácido araquidônico e outros ácidos graxos influenciam na inibição de
crescimento tumoral tanto na supressão da proliferação quanto na indução de apoptose (IP,
1999; EVANS, 2000). Como estas moléculas disparam a morte ainda não esta claro, mas
sabe-se que inclui produção de peroxidolipídio, indução do ligante Fas, diminuição da
expressão de Bcl-2 ou aumento da expressão de Bax, lançamento de citocromo c e clivagem
de Bid, inibição de PI3K e ativação de fosfatases. Nota-se que os efeitos dos ácidos graxos
são diversos e podem afetar vários caminhos, mas todos parecem ser dependentes da enzima
ciclo oxigenase (COX) (TANG, 2002).
34
1.3. Importância biológica do citocromo c
A participação da hemoproteína citocromo c em eventos biológicos de suma
importância como transportador de elétrons durante o processo de respiração celular,
envolvimento no disparo do processo de apoptose quando ocorre sua translocação da
membrana mitocondrial interna para o citosol, podendo essa translocação ser facilitada por
reações metabólicas de peroxidação e hidrólise relacionada à sua atividade peroxidásica, é
responsável pela sua relevância biológica. O seu envolvimento em eventos relacionados à
vida da célula torna a proteína alvo de muitos estudos, pois a elucidação do mecanismo de
reação de cada um desses processos levará a ciência a avanços tecnológicos.
Com o intuito de tentar entender alguns desses mecanismos, o nosso grupo de pesquisa
vem estudando estrutura e reatividade de hemoproteínas e hemopeptídeos em meios
homogêneo e heterogêneo, relacionados ao aspecto básico e aplicado a nanotecnologia. O fato
dos hemopeptídeos serem obtidos a partir da digestão proteolítica da hemoproteína citocromo
c, permanecendo com o grupo heme, ou seja, o centro ativo da proteína, e apenas alguns
resíduos de aminoácidos, torna os hemopeptídeos ótimos modelos de estudo tanto para
citocromo c quanto para peroxidases. Uma descrição mais detalhada sobre peroxidases e
hemopeptídeos faz-se necessária para melhor entendimento deste trabalho.
1.4. Peroxidases
As peroxidases constituem uma importante classe de enzimas cuja especificidade é
clivar peróxidos orgânicos ou o peróxido de hidrogênio (GASPAR, 1982). Todas as
peroxidases possuem um grupamento hemínico no centro ativo, porém a natureza do ligante
axial e alguns detalhes do mecanismo de reação são bastante diferentes de acordo com a
peroxidase (LIPPARD, 1994).
A geração de peróxido de hidrogênio, assim como de outras espécies reativas de
oxigênio (EROs), ocorre no metabolismo normal das células vegetais e animais, podendo ser
potencializado frente a um estresse celular. As peroxidases, junto com outras enzimas, como a
superóxido dismutase, combatem as espécies reativas de oxigênio de modo a livrar a célula
dos seus efeitos deletérios (
ZEHNDER, 2001; QUINN, 1969).
35
1.4.1. Atividade Catalítica da HRP
A Peroxidase de Raiz Forte (HRP) possui características comuns a outras peroxidases,
como por exemplo, a estrutura protéica e sítios específicos, como os resíduos catalíticos
essenciais de histidina e arginina, nos centros ativos. Devido às semelhanças esta classe
enzimática foi subdividida em três classes (HINER, 2002):
• Classe I são enzimas intracelulares, incluindo citocromo c peroxidase e ascorbato
peroxidase de plantas.
• Classe II inclui a peroxidase de secreção de fungo como a lignina peroxidase (LiP),
possuindo como principal função degradar a lignina.
• Classe III inclui peroxidases secretoras de plantas, como a HRP, essas peroxidases são
enzimas biossintéticas envolvidas no processo de formação da parede celular e lignificação.
Todas as peroxidases já estudadas possuem como base um mesmo ciclo catalítico
consistindo de três etapas distintas e irreversíveis, chamado de ciclo das peroxidases
(DUNFORD, 1991). A enzima no estado férrico liga-se de forma reversível a um peróxido
ROOH, forma o complexo conhecido como Composto 0 (PorFe(III)-OOR) (BAEK, 1989), o
qual cliva o peróxido em um processo de dois elétrons, gera o intermediário conhecido como
Composto I (Por
+ •
Fe(IV)=O). O Composto I pode abstrair um único elétron oxidando uma
segunda molécula de peróxido ou qualquer outro agente redutor para formar o Composto II
(PorFe(IV)=O) (HINER, 2002). A reação do Composto II com mais HOOH forma Composto
III, um complexo entre peroxidase férrica e íon superóxido, conhecido como oxiperoxidase
(PorFe(III)O
2
-
•
↔ PorFe(II)O
2
). O Composto II também pode receber um elétron e voltar a
sua forma nativa (PorFe(III), completando o chamado ciclo das peroxidases. A atividade
catalítica e formação do Composto III resultam no turnover da enzima na ausência de um
substrato redutor normal; entretanto, quando reage com mais ROOH ocorre a inativação da
enzima de maneira irreversível. A figura 8, demonstra as etapas do ciclo catalítico da HRP.
36
Composto 0
Composto I
Composto II
Composto III
Por
.
Fe(IV)=O
+
PorFe(IV)=O
PorFe(III)
PorFe(III)OOH
PorFe(III) - O
2
-
ou
PorFe(II) - O
2
HOOH
H
2
O
HOOH ou AH
HOO
.
+ H
+
ou A
.
H
2
O
HOOH ou AH
FIGURA 8 - Descrição do ciclo catalítico da HRP, utilizando HOOH como agente redutor e oxidante.
Onde AH, pode ser qualquer substrato redutor como aldeído e fenóis.
É sabido que, prótons no sítio ativo do heme distal influenciam na formação de
espécies reativas catalíticas tanto para peroxidases quanto citocromos P450 (MUKAI, 1997).
Em peroxidases, um resíduo distal de histidina atua como catalisador ácido/base que favorece
a desprotonação do substrato hidroperóxido no sítio ativo da enzima (Composto 0) e sua
subseqüente clivagem heterolítica (ORTIZ, 1992; SAVENKOVA, 1998; SMITH, 1998).
Portanto, a desprotonação do hidroperóxido no Composto 0 é uma etapa crucial no ciclo
catalítico das peroxidases e citocromo P450.
1.4.2. Estrutura das Microperoxidases
Microperoxidase é um hemopeptídeo obtido pela digestão peptídica e tríptica do
citocromo c de coração de cavalo. Como o citocromo c, este peptídeo exibe o grupo heme
covalentemente ligado a dois resíduos de cisteína através de pontes tioéter. Existe no estado
férrico, contendo histidina como quinto ligante do ferro hemínico, porém não possui um
resíduo de metionina na posição de sexta coordenação. Esta posição é ocupada por uma
molécula de água em pH neutro (ARON, 1986; WANG, 1989; MUNRO, 1996). Quando a
hidrólise digestiva do citocromo c é feita com pepsina, o produto da digestão é um
undecapeptídeo, ou seja, o grupo heme ligado a uma cadeia de 11 aminoácidos. Os resíduos
37
de aminoácidos correspondem à seqüência de aminoácidos de 11-21 do citocromo c (Val –
Glu – Lys – Cys – Ala – Gln – Cys – His – Thr –Val – Glu), e é comumente chamada de
microperoxidase 11 (ARON, 1986).
Quando a enzima tripsina é utilizada para digerir o citocromo c, a microperoxidase
resultante, é constituída de 9 resíduos de aminoácidos, os quais correspondem à seqüência de
aminoácidos de 13-21 do citocromo c (Lys – Cys – Ala – Gln – Cys – His – Thr –Val – Glu)
(BALDWIN, 1986). Porém quando se utiliza a mesma enzima, tripsina, para hidrolisar a MP-
11, a microperoxidase resultante é formada de 8 resíduos de aminoácidos, correspondentes a
seqüência de aminoácidos de 14-21 da proteína nativa (Cys – Ala – Gln – Cys – His – Thr –
Val – Glu) (BALDWIN, 1986). A figura 9 ilustra alguns tipos de microperoxidases.
NH
2
O
N
O
N
N
O
S
O
O
NH
3
+
N
O
S
Fe
3+
N
N
N
N
O
O O
O
CH
3
CH
3
CH
3
N
O
N
N
N
O
OH
N
O
N
O
O
O
O
N
N
O
NH
2
O
N
O
Cadeia peptídica
Grupo Heme
Peptídeo preto = MP-6
Peptídeo preto + vermelho = MP-8
Peptídeo preto + vermelho + azul = MP-9
Peptídeo preto+ vermelho + azul + verde = MP-11
FIGURA 9 – Estruturas das Microperoxidases
38
1.4.3. Atividade Catalítica das Microperoxidases
Devido a suas características estruturais, MP-8 é capaz de converter uma grande
variedade de compostos orgânicos através de reações do tipo peroxidase (DUNFORD, 1975).
Intermediários de MP-8 de alta valência têm sido detectados durante a reação com peróxidos
de hidrogênio com Nα-acetil microperoxidase-8, o que torna este hemoctapeptídeo um bom
modelo para Compostos 0, I e II de peroxidase de raiz forte (BAEK, 1989; WANG, 1991).
Foi demonstrado um efeito competitivo dos prótons na reação de Fe(III) ou
Mn(III)MP-8 com peróxido de hidrogênio, sugerindo que o Composto 0 precede a formação
de intermediários de alta valência de Fe(III)- ou Mn(III)-MP-8 (PRIMUS, 2002). Na
comparação com HRP, MP-8 em meio aquoso não exibe um sítio contendo um resíduo distal
básico capaz de promover a desprotonação do peróxido e favorecer a clivagem da ponte O-O
do peróxido. Estas características poderiam, de algum modo, ser responsáveis pela baixa
reatividade da MP-8 em pH ácido. Em meio aquoso, pH alcalino conduz a desprotonação da
água ligada a MP-8, a qual subseqüentemente, também auxilia a desprotonação do peróxido
de hidrogênio e a coordenação do hidroperóxido ao centro metálico ou é diretamente oxidado
pelo peróxido de hidrogênio em hidroperóxido-metal MP-8 (PRIMUS, 2002).
Estudos demonstraram que a associação de Fe(III)MP-8 com um ambiente micelar,
como CTAB, promove um microambiente com uma interface alcalina e um núcleo
hidrofóbico, que dá características especiais para o Fe(III)MP-8/peróxido (t-BuOOH e
HOOH) quando comparada ao meio homogêneo. Este agregado micela/hemopeptídeo
funciona como uma lipoenzima com especificidade para diferentes substratos (PRIETO,
2004a).
A formação dos radicais hidroxil e alcoxil, oriundos dos peróxidos t-BuOOH e
HOOH, respectivamente, foram identificados como sendo os radicais iniciais produzidos pela
clivagem homolítica da ponte O-O por Fe(III)MP-8/CTAB. Resultados espectrais apontaram
para a formação de Composto II, uma espécie que exibe um subseqüente bleaching,
dependente do meio. Estudos subseqüentes mostraram que a presença de histidina no meio
contendo Fe(III)MP-8 promoveu alterações espectrais indicativas da conversão do ferro
hemínico da forma alto spin para baixo spin, sugerindo uma coordenação do ferro hemínico
com a histidina. Em micelas de CTAB, em pH 7,4, a presença de histidina na sexta
coordenação do ferro causa um impedimento estérico para a ligação de peróxidos, fazendo
com que ocorra aumento de K
M
da reação. Contudo, a histidina na sexta coordenação não atua
39
apenas como inibidor competitivo, pois leva concomitantemente à diminuição da velocidade
máxima, o que sugere interferência no mecanismo de reação.
Também foi demonstrada a ocorrência de um ciclo catalítico de peroxidase durante a
reação de MP-9/CTAB com t-BuOOH, mostrando que este agregado se comporta como uma
lipoenzima, bem como o complexo MP-8/CTAB. Quando o t-BuOOH é o único substrato
disponível, este funciona tanto como agente oxidante na formação do Composto I, quanto
como agente redutor na formação do Composto II, e regeneração da forma nativa (PRIETO,
2004b).
A razão molar micela de CTAB/MP influencia nos produtos de reação (PRIETO,
2006). Quando t-BuOOH é adicionado ao meio, converte Fe(III)MP-9/CTAB para MP-
9/CTAB Composto II, a subseqüentemente adição de DPAA leva a regeneração da forma
nativa da enzima, neste caso Fe(III)MP-9/CTAB, o que caracteriza a ocorrência de um ciclo
peroxidase. A forma nativa regenerada durante o ciclo das peroxidases reage com um resíduo
de DPAA no meio para formar Fe(II)MP-9/CTAB, que indica que ambos Fe(III)MP-9/CTAB
e o oxiferril podem utilizar o aldeído como doador de elétrons, sendo assim um agente
redutor. Na reação de MP-9/CTAB com DPAA, o ferro hemínico pode reagir com DPAA, e
produzir benzofenona como produto final, ou pode reagir com os amino grupos presentes na
estrutura da MP-9 formando adutos do tipo base de Schiff (PRIETO, 2006).
No trabalho atual utilizamos Fe(III)MP-11como um dos objetos de estudo, assim
como MP-11 manganês substituída, o fato de não haver relatos na literatura sobre Mn(III)MP-
11 nos levou a estudar o mecanismo de reação do hemopeptídeo metal substituído em meios
homogêneo e heterogêneo.
1.5. Apoptose disparada pela entrega de citocromo c exógeno para células
Vários trabalhos da literatura relatam que a apoptose pode ser disparada em diferentes
tipos celulares pela internalização de citocromo c exógeno no citosol celular. O mecanismo
mais utilizado para induzir a apoptose desta forma é a microinjeção de citocromo c em células
(FRANK, 2005). Alternativamente, a eletroporação e a captação de nanotubos contendo
citocromo c também têm sido utilizadas com sucesso (EKSIOGLU-DEMILRALP, 2003; SHI
KAM, 2005). Contudo, a microinjeção de citocromo c em células que apresentam mutação
em p53 não teve a mesma eficiência observada para células com p53 selvagem (DEMING,
2004). A razão disto é que a mutação em p53 leva ao aumento de Bcr-Abl a qual inibe a
40
apoptose upstream e downstream, isto é, inibe a saída de citocromo c endógeno da
mitocôndria e inibe a formação do apoptossomo pela ligação em Apaf-1. Desta forma, mesmo
internalizado diretamente no citosol, citocromo c torna-se inócuo em disparar a apoptose por
meio do processo envolvendo ativação de caspase-9 no apoptossomo.
O disparo da apoptose por entrega de citocromo c exógeno para células por veículos
que são internalizados por endocitose traz o aparente inconveniente de direcionar citocromo c
para lisossomos onde a proteína, supostamente seria degradada. Com relação a isto, Shi Kam
e Dai (2005) relatam a indução de apoptose em células HeLa, NIH-3T3, HL60 e células
Jurkat por meio da entrega de citocromo c associado a nanotubos. Neste caso, os nanotubos
foram endocitados, mas os autores impediram a fusão dos endossomos formados após a
internalização dos nanotubos com os lisossomos, pelo uso de cloroquina. Cloroquina promove
a ruptura dos endossomos e a liberação de citocromo c no citosol. Contudo, os efeitos de
cloroquina sobre lisossomos são bem conhecidos e no caso deste trabalho esta e outras
questões relacionadas à liberação de citocromo c no citosol ficam sem resposta deixando
dúvidas sobre a real participação de citocromo c no processo apoptótico observado após a
captação dos nanotubos contendo citocromo c.
Tendo em vista o papel do citocromo c no disparo da apoptose somado a relatos da
literatura onde a apoptose foi induzida mediante entrega de citocromo c exógeno a células por
diversas vias, resolvemos investigar se hemoproteínas e hemopeptídeos metais substituídos
também são capazes de induzir apoptose. Para isso utilizamos citocromo c nativo (Fe
3+
),
citocromo c base livre (sem o átomo de Fe), citocromo c zinco substituído (Zn
3+
),
microperoxidase-11 (Fe
3+
), microperoxidase-11 base livre (sem o átomo de Fe) e
microperoxidase-11 manganês substituída (Mn
3+
). Paralelo a técnica de microinjeção,
utilizamos lipossomos de brometo de dioctadecildodecil amônio (DODAB) como via de
internalização de hemoproteínas e hemopeptídeos as células.
1.6. Lipossomos
Os lipossomos podem ser definidos como associações coloidais de lipídeos
anfipáticos, que se organizam espontaneamente em estruturas fechadas tipo concha esférica.
Podem ser preparados a partir de misturas lipídicas naturais extraídas e purificadas, ou a partir
de lipídeos sintéticos, disponíveis comercialmente. Conforme é indicado na figura 10, os
41
lipossomos podem ser classificados em termos de tamanho, número de lamelas (e sua posição
relativa), constituição lipídica (o que também condiciona a sua carga), estabilidade e modo de
preparação (LICHTENBERG, 1988).
FIGURA 10: Esquema representativo das utilizações dos lipossomos e inter-relação entre os
parâmetros que os caracterizam (SANTOS, 2002)
.
Os lipossomos variam conforme seu tamanho, número de lamelas e posição relativa e
podem ser identificados em diferentes tipos como: MLV – vesículas multilamelares; SUV –
vesículas unilamelares pequenas; LUV – vesículas unilamelares grandes; GUV – vesículas
unilamelares gigantes; MVL – lipossomos multivesiculares; SOV – vesículas oligolamelares
pequenas; LOV - vesículas oligolamelares grandes; GOV - vesículas oligolamelares gigantes,
a figura 11 ilustra dois tipos de vesículas: unilamelar e multilamelar. O tipo de lipossomo é
condicionado pelo seu método de preparação, o qual pode ser dividido em três fases
consecutivas: preparação das fases aquosa e lipídica, hidratação do lipídeo e ainda, para a
maioria dos sistemas, um processamento secundário, necessário para a obtenção do produto
final (WOODLE, 1989).
Lipossomos
42
FIGURA 11: Esquemas ilustrativos de lipossomas unilamelares (LUV) e multilamelares (MLV)
(ARAUJO, 2003).
Lipossomos podem ser formados por vários tipos de lipídios, que diferem em número
de carga, número e composição de cadeias de ácidos graxos, assim como grau de saturação
(FELGNER, 1987; AUDOUY, 2002). Os lipossomos possuem utilização em diversas áreas,
com aplicações biomédicas (incluindo testes diagnósticos, transfusões sanguíneas,
desintoxicação através de agentes quelantes), aplicações cosméticas, agrícolas (estabilização
de fertilizantes), pecuárias (maturação de lacticínios), em processos de purificação,
recuperação, catálise ou conversão de energia.
Lipossomos catiônicos formados por moléculas de DODAB vêm sendo utilizados em
estudos de sistemas de entrega de drogas e vacinas (KORSHOLM, 2007; CARMONA, 1997).
Há relatos na literatura de lipossomos de DODAB participando na indução de imunidade
mediada por células (HILGERS, 1992; MILLER, 2003; CARMONA, 2000a), como agente
antimicrobiano (LINCOPAN, 2003), além da utilização de lipossomos catiônicos para
melhorar a eficiência de transfecção em terapia gênica, por mecanismo ainda não elucidado
(FELGNER, 1987; DASS, 2004), contudo com duas hipóteses de mecanismo: (i) sugere um
processo passivo onde o lipossomo catiônico se funde a membrana celular externa lançando
seu conteúdo no citosol (FELGNER, 1987) e (ii) sugere um processo ativo, onde os
lipossomos são endocitados seguido de ruptura ou fusão com membrana celular interna
(FRIEND, 1996; LIN, 2003).
Em relação às vacinas, os lipossomos podem ser utilizados como veículos de entrega
de antígenos, assumindo que os lipossomos são capazes de entregar antígenos para células
que já contém antígenos e então aumentar a resposta imune antígeno específica (COX, 1997).
Também podem ser aplicados como adjuvante para algumas vacinas de via parenteral e oral
(DZATA, 1991).
Mediante essas aplicações do lipossomo catiônico de DODAB somado aos fatos do
lipossomo de DODAB possuir diâmetro de 400 nm, dependendo do procedimento de preparo
43
(CARMONA, 2000b) e da interação destes compostos catiônicos com superfícies
negativamente carregadas ou biomoléculas como as que se apresentam em células
procariontes ou eucariontes (MARTINS, 1997), escolhemos o lipossomo catiônico de
DODAB como sistema de entrega de hemoproteínas e hemopeptídeos para células, como via
alternativa a microinjeção.
2. OBJETIVOS
Avaliar se as espécies de citocromo c metal substituído e citocromo c base livre, assim
como os hemopeptídeos derivados dos citocromos c são capazes de induzir o processo de
apoptose de forma tão eficiente quanto o citocromo c nativo, foi o objetivo principal deste
trabalho.
Associado ao objetivo principal, outras questões foram avaliadas: (i) se lipossomos de
DODAB carregados de hemoproteínas e hemopeptídeos são veículos apropriados para a
entrega de hemoproteínas e hemopeptídeos diretamente no citosol como ocorre com a técnica
de microinjeção, (ii) se o estado redox do átomo de Fe da molécula do citocromo c é
fundamental para o disparo da apoptose, (iii) se os hemopeptídeos oriundos da digestão
proteolítica do citcromo c são capazes de disparar apoptose de forma tão eficiente quanto o
citocromo c.
O estudo foi caracterizar os seguintes aspectos: (i) comparação da eficiência da
entrega de hemoproteínas e hemopeptídeos quando estes foram transportados por lipossomos
de DODAB contendo diâmetros diferentes, 100 e 400 nm, (ii) capacidade das hemoproteínas
e hemopeptídeos, entregues via lipossomos de DODAB e microinjeção, em disparar apoptose,
(iii) perfil radicalar da apoptose promovida pela entrega de citocromo c e microperoxidase-11
por lipossomo de DODAB, (iv) estudar o mecanismo de disparo de morte celular e (v) estudar
a reatividade do hemopeptídeo Mn(III)MP-11 com peróxidos em meios homogêneo e
heterogêneo.
44
3. MÉTODOS
3.1. Desmetalação de hemoproteínas e hemopeptídeos
A retirada do ferro hemínico foi feita pelo método de HF, utilizando a proporção de 6
ml do ácido para cada 100 mg de proteína, a reação teve duração média de 10 minutos (sob
agitação e resfriamento), após evaporação do ácido, 3 ml do tampão acetato de amônio 10
mM pH 5.5 foi adicionado à proteína já na sua forma base livre, a qual passou por diálise em
tampão fosfato de sódio 0,01 M pH 7,4, seguido de liofilização.
• Citocromo c base livre
404nm
= 0,81 X 10
5
M
-1
CM
-1
Citocromo c de coração de cavalo foi adquirido da Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO, EUA);
• Microperoxidase-11 base livre
A desmetalação foi confirmada por espectroscopia, com o aparecimento das bandas nos
respectivos comprimentos de onda: 508, 542, 574 e 623 nm.
Microperoxidase-11foi adquirida da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).
3.2. Síntese de citocromo c Zinco substituído
Uma solução de fosfato de sódio 10 mM, contendo citocromo c sem Fe, teve seu pH
acertado para o valor de 1,5 com acido acético 10 % (v/v), e um excesso de 10 vezes do sal
ZnCl
2
em relação ao citocromo c, foi adicionado. Após 1 hora de agitação sob aquecimento
(50 ºC) a incorporação estava concluída, confirmada por espectroscopia. A purificação
ocorreu através de diálises contra ácido acético, água e tampão fosfato de sódio
respectivamente, seguido de liofilização (VANDERKOOI, 1976).
• Citocromo c Zinco
423nm
= 2,43 x 103 M
-1
cm
-1
45
3.3. Síntese de MP-11 Manganês substituída
Em uma solução de cloreto ou sulfato de manganês 10 mM o hemopeptídeo MP-11
base livre, ou seja, sem o íon ferro, foi dissolvido. A reação de incorporação ocorreu sob
agitação constante, aquecida a 40 °C com o meio reacional protegido da luz por 37 horas, em
atmosfera inerte (três ciclos vácuo/argônio). O aparecimento da banda 463 nm e deslocamento
da banda Soret para 368 nm identificam a metalação do hemopeptídeo (ε
368 nm
= 110 mM
-1
cm
-1
em pH 2). A purificação foi feita por cromatografia líquida de alta performace (HPLC),
com coluna semipreparativa C-18 (PRIMUS, 2002; LOW, 1998).
3.4. Dosagem das hemoproteínas e hemopeptídeos
Todas as hemoproteínas e hemopeptídeos utilizadas nesse trabalho foram dosadas
utilizando espectroscopia UV-vis, através de um fotodiodo Shimadzu Modelo 1501
MultiSpec (Tóquio, Jp).
3.5. Preparo do Lipossomo de DODAB
Uma solução de DODAB 2mM em água MilliQ, foi obtida através de 3 ciclos de
agitação a 60° C, por 10 minutos seguidos de agitação no vortex por 5 minutos. Este
procedimento origina lipossomo de aproximadamente 400 nm de diâmetro (CARMONA,
2000b).
A padronização dos diâmetros dos lipossomos foi feita utilizando um mini extrusor
Avanti adiquirido da Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) e membranas de policarbonato
(Millipore®) com poros 0,4 µm e 0,1 µm. Já para os lipossomos carregados de hemoproteínas
e hemopeptídeos, uma solução de DODAB 4 mM em água MilliQ foi adicionado ao mesmo
volume de uma solução de hemoproteínas ou hemopeptídeos 0,5 mM, para chegar a uma
solução de de DODAB 2 mM contendo hemoproteínas ou hemopeptídeos 0,25 mM, e o
procedimento descrito acima foi repetido para todas as hemoproteínas e hemopeptídeos
utilizados neste trabalho.
46
3.6. Linhagens de células
• Linhagem de células K562
Células da leucemia humana mielogênica expressam a proteína oncogênica com
atividade tirosina-quinase Bcr/abl (NINNANAPALLI, 2003). Esta proteína modificada
origina-se da translocação entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22, t(9;22)(q34:q11),
resultando num cromossomo 22 encurtado, denominado cromossomo Filadélfia Ph
1
. Esta
proteína com intensa atividade tirosina-quinase interfere no processo apoptótico induzido por
diferentes estímulos. Vale ressaltar que esta linhagem não expressa o gene supressor de tumor
p53, o que a torna um modelo de estudo para identificação de drogas que induzem apoptose
via p53 independente. Esta linhagem celular foi adquirida do Banco de Células sob a
coordenação do Prof. Dr. Radovan Borojevic da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A
manutenção da cultura celular foi realizada a cada 3 dias, após centrifugação de 450 g por 10
minutos a 20°C a viabilidade celular foi determinada, e 1 x 10
6
células foram distribuídas em
frascos de 75 cm
3
e cultivada em meio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co.) suplementado com
10 % de soro fetal bovino (SFB) (Gibco, BRL-USA), mantidas em estufa com 5% de CO
2
a
37ºC.
• Linhagem Músculo Liso de Aorta de Coelho - MLAC
A linhagem estabelecida de músculo liso de aorta de coelho foi doada pelo
departamento de farmacologia sob coordenação da Prof. Dra. Soraya Smaili da Universidade
Federal de São Paulo. A manutenção da cultura celular foi realizada a cada 3 dias, a retirada
das células dos frascos, quando confluentes, foi realizada pelo processo de tripsinização
(descrito a seguir), após determinada a viabilidade celular, 1 x 10
6
células foram distribuídas
em frascos de 75 cm
3
e cultivada em meio DMEM (Sigma Chemical Co.) suplementado com
10 % de soro bovino fetal (Gibco, BRL-USA), mantidas em estufa com 5% de CO
2
a 37ºC.
• Isolamento de células mononucleadas
Estes experimentos foram realizados utilizando amostras de sangue doadas por mim
mesma. O sangue foi coletado em tubos de coleta (BD
®
Bioscience) contendo anticoagulante
EDTA, a amostra de sangue foi diluída na proporção de 1:2 no próprio meio de cultura RPMI
(Sigma Chemical Co.).
Em outro tubo de ensaio já contendo Ficoll-Paque Plus (GE
47
Healthcare, Sueden) a amostra de sangue foi adicionada delicadamente evitando a mistura das
soluções. A proporção utilizada foi de 3 ml de Ficoll para 4ml de sangue já diluído. Após
adicionar toda a amostra, o tubo foi submetido à centrifugação de 400 g por 40 minutos a 18
°C. Como o método consiste em separação por densidade, após os 40 minutos o tubo
apresentou a seguinte separação, descrito do mais denso para o menos denso: eritrócitos,
Ficoll, células mononucleadas e plasma. Com auxilio de uma pipeta Pasteur, as células
mononucleadas foram retiradas e transferidas para um tubo limpo. A amostra foi então
submetida a três lavagens com meio RPMI (Sigma Chemical Co.), em um volume 3X maior
ao da amostra coletada, as lavagens foram feitas a uma centrifugação de 100 g por 10 minutos
a 18°C. Ao término da terceira lavagem o sedimento (sedimento) foi homogeneizado em 1
mL de meio RPMI e a densidade celular determinada pelo método de exclusão por azul de
tripan (Gibco, BRL-USA).
• Tripsinização
Processo realizado para remoção das células aderentes dos frascos de cultivo. Após
desprezar o meio de cultura do frasco a ser manipulado, e lavagem das células, por pelo
menos duas vezes, com solução PBS, uma solução de tripsina 2,5 % contendo EDTA 0,25%
foi adicionada ao frasco e mantida por 2 minutos a 37°C, para inativar a reação, meio de
cultura suplementado com SFB foi adicionado em um volume 2 vezes maior ao de tripsina
utilizado. Depois que as células desprenderam do frasco, a solução foi centrifugada em uma
rotação de 450 g por 10 minutos a 20°C e a viabilidade celular foi determinada.
• Viabilidade celular
Para avaliar a viabilidade celular, após a centrifugação das células já tripsinizadas, as
células foram solubilizadas em 1 ml de meio de cultura, e diluídas em uma solução de azul de
tripan 0,4% na proporção de 1:10 e colocadas em uma câmara de Newbauer para contagem
celular. A técnica de exclusão por azul de tripan consiste no fato de células viáveis serem
capazes de bombear para fora do citosol o corante azul de tripan ao qual a membrana celular é
permeável enquanto as células inviáveis não possuem essa capacidade e ficam coradas de
azul. A porcentagem de células mortas foi calculada em relação ao total de células presente no
campo.
48
3.6.1. Determinação da DE
50
promovida por lipossomos de DODAB
A particularidade do lipossomo de DODAB de ser formado por moléculas que contém
um grupo quaternário de amônio na sua porção hidrofílica, atribuindo um caráter surfactante
ao veículo escolhido, tornou imprescindível determinar qual a metade da concentração
máxima efetiva (DE
50
), ou seja, qual a concentração de DODAB que mata metade do número
de células tratadas. Pois trabalhando com uma concentração inferior a DE
50
, os efeitos de
morte detectados são atribuídos ao conteúdo do interior do lipossomo e não ao seu efeito
surfactante. Para determinação da DE
50
foram utilizados dois métodos, MTT e azul de tripan.
• Viabilidade celular via redução de MTT
Medida de viabilidade celular e proliferação é base para vários ensaios in vitro da
resposta de uma população celular a fatores externos. A redução de sais de tetrazol é bem
aceita como uma medida confiável de examinar proliferação celular. O tetrazol amarelo MTT
(3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2, brometo de 5-difeniltetrazol) é reduzido metabolicamente por
células vivas, em parte pela ação de enzimas desidrogenase, para gerar equivalentes reduzidos
como NADH e NADPH. No meio intracelular de células viáveis a redução do sal tetrazol
amarelo origina o sal formazan roxo, o qual pode ser solubilizado e quantificado por medidas
espectroscópicas.
O ensaio para determinação da DE
50
foi realizado em placa Elisa de 96 poços, em cada
poço foi adicionado 2 x 10
5
células, para a linhagem K562 o experimento foi realizado no
mesmo dia, e para a linhagem MLAC, pelo menos 12 horas depois da distribuição das células,
período mínimo para as células aderirem a placa. Foram avaliadas nove concentrações
diferentes de DODAB, variando de 0 a 400 µM com intervalos de 50 µM. As placas contendo
células e lipossomos de DODAB recheados de hemoproteínas e hemopeptídeos nas
concentrações mencionadas anteriormente foram encubadas em dois tempos 5 e 17 horas.
Após decorrido o tempo de incubação, 10 µl da solução de MTT (5mg/ml) (Invitrogen Co.,
USA) foi adicionada em cada poço e a placa incubada por mais 4 horas, todo o procedimento
foi realizado no escuro devido a fotossensibilidade de algumas hemoproteínas e do reagente
MTT. Decorrido o tempo de incubação, 100 µl de uma solução SDS 10% em HCL 0,01 M foi
adicionada em cada poço, e após incubação de 9 a 12 horas as absorbâncias em 570 e 650 nm
de cada poço foi lida utilizando um leitor de placa de Elisa (Biotek ELX800). Todas as
incubações ocorreram em estufa de cultivo celular, protegidas de luz, com 5% de CO
2
e na
temperatura de 37ºC. Cabe ressaltar que o valor apresentado é a media de uma triplicata.
49
• Azul de tripan
A determinação da DE50 por esta metodologia foi uma maneira de confirmar o ensaio
realizado por MTT. O ensaio foi realizado em placas de petri 25 x 13 mm, contendo 5 x 105
células, e em cada placa um concentração diferente de DODAB foi adicionada. As
concentrações testadas foram de 0, 50, 100, 150 e 200 µM. Após incubação por 5 horas,
foram adicionados 200 µl da solução de azul de tripan 0,4% e quatro campos/placa foram
analisados, 100 células/campo foram contadas, em um total de duas placas por concentração.
De acordo com o princípio da técnica já detalhado, as células inviáveis apresentam-se coradas
em azul. A porcentagem de células mortas foi calculada em relação ao total de células
presente no campo.
3.6.2. Determinação do efeito surfactante das preparações de lipossomos de DODAB
carregados de hemoproteínas e hemopeptídeos através da dosagem da atividade da
enzima LDH
Medir a atividade da enzima citosólica lactato desidrogenase (LDH), foi uma maneira
indireta de quantificar o poder surfactante da porção quaternário de amônio constituinte da
molécula de DODAB. A enzima lactato desidrogenase participa da conversão de piruvato em
lactato, com concomitante oxidação do NADH. O acompanhamento da diminuição da
absorbância em 340 ou 365 nm por 5 minutos corresponde à oxidação do NADH. Para este
ensaio utilizamos um Kit laboratorial UV cod 08B, adquirido da KATAL Biotecnológica Ind.
Com. Ltda, constituído de reagente de trabalho (solução de piruvato) e coenzima NADH
(diluída em 1,3 ml de H
2
O).
O ensaio foi realizado adicionando 100 µM de lipossomo carregado com
hemoproteína (concentração abaixo da DE
50
) em placas já contendo 1 x10
6
células; após
incubação de 5 horas, as células foram transferidas para tubos tipo eppendorfs® e
centrifugadas por 10 minutos a 400 g, o sobrenadante foi retirado e mantido no gelo para
posterior dosagem da atividade da enzima LDH. Do controle foram retirados apenas 400 µl e
ao restante contendo sedimento (sedimento) celular e sobrenadante, foi adicionado 0,1 %
(v/v) de Triton-X -100 10 %. Após homogeneizado e repouso de 10 minutos, a amostra foi
submetida a outra centrifugação e o sobrenadante reservado.
50
Para cada 10 ml de tampão contendo piruvato, 0,1 ml de coenzima foram adicionados,
uma alíquota de 900 µl desta solução foi separada e 100 µl do sobrenadante que estava
reservado em gelo, foi adicionado e a absorbância em 340 nm foi acompanhada por 5
minutos. As medidas foram realizadas em um espectrofotômetro Varian-Cary UV-vis
(Australia) conectado a um banho-maria o qual manteve a temperatura de 25 ºC. O valor
obtido do ∆ absorbância foi então multiplicado pelos respectivos fatores de diluição e pelo
coeficiente de extinção molar 
340 nm
= 8090 cm
-1
.M
-1
. Estes resultados foram então
normalizados pela quantidade de proteína total das amostras.
LDH =
∆ abs x Fd x 
Proteína total
3.6.3. Avaliação da eficiência de entrega das preparações de lipossomos de DODAB
carregados de hemoproteínas e hemopeptídeos
Para este fim utilizamos duas metodologias: MTT e estudo da morfologia nuclear após
tratamento com os lipossomos.
• Viabilidade celular via redução de MTT
As linhagens celulares MLAC, K562 e células mononucleadas foram distribuídas em
placas de ELISA, incubadas com lipossomos de DODAB 100 µM pelos períodos de 2, 5, 16
e 24 horas. Os lipossomos foram preparados com soluções de hemoproteínas e hemopeptídeos
0,25 mM. Decorrido o tempo de incubação a metodologia de redução de MTT foi utilizada
para determinar a viabilidade celular após tratamento com os lipossomos.
• Construção de lipossomos de DODAB fluorescentes
Lipossomos fluorescentes de DODAB foram preparados utilizando 1,3,6-ácido
trisulfônico 8-hidroxipireno (HPTS) (Moleular Probes). HPTS é um marcador de pH
fluorescente, que utilizamos apenas para efeito qualitativo da fusão do lipossomo com a
membrana celular. Após preparo dos lipossomos de DODAB na presença do fluoróforo 30
mM, HEPES 5 mM e pH 7,0, a solução foi dialisada em meio osmoticamente equilibrado por
51
um período aproximado de 12 horas. As células da linhagem MLAC cultivadas em lamínulas
de vidro previamente tratadas com poli-L-ornitina foram incubadas por um período de 5 horas
com DODAB fluorescente 0,15 mM, nas mesmas condições de cultivo celular. Decorrido o
tempo de incubação as células foram lavadas com solução tampão de fluorescência e através
de filtros de ex/em: 380/510 nm obtivemos as imagens.
• Avaliação da morfologia nuclear
Para esta metodologia apenas a linhagem MLAC foi utilizada. As células aderentes
foram repicadas em uma densidade de 5 x 10
4
células/ml em lamínulas redondas de 25 mm de
diâmetro, previamente tratadas com poli-L-ornitina (1 mg/ml) e deixadas em estufa por no
mínimo 14 horas antes do experimento, como garantia de uma boa adesão celular. Na mesma
placa de petri contendo a lamínula já com as células aderidas uma solução de DODAB 0,1
mM carregada de hemoproteínas ou hemopeptídeos na concentração de 0,25 mM foi
adicionada. Decorrido o período de incubação de 5 horas, a lamínula foi lavada pelo menos 2
vezes com tampão de fluorescência antes de ser adaptada à câmara de Leiden. Para podermos
analisar a morfologia nuclear, a placa foi incubada por 15 minutos com uma solução aquosa
Hoechst 33342 (1µg/ml) (Invitrogen Co. USA), lavada mais algumas vezes com tampão de
fluorescência e levada ao microscópio de fluorescência invertido de alta resolução acoplado a
uma câmera CCD (uma câmara CCD tem um sinal de saída linear sobre uma faixa de
intensidade muito maior, tem menor distorção geométrica, e sua eficiência quântica pode
chegar a 80%) e controlado por um software de computador. Utilizando filtros de ex/em:
350/450 nm a morfologia dos núcleos puderam ser analisadas. Nove campos por placa foram
analisados, 50-70 células/campo de quatro placas foram analisados. As médias foram
expressas como porcentagem do total de núcleos analisados.
3.6.4. Microinjeção das hemoproteínas e hemopeptídeos
As células aderentes da linhagem estabelecida MLAC foram repicadas em uma
densidade de 50.000 células/ml em lamínulas redondas de 25 mm de diâmetro, previamente
tratadas com poli-L-ornitina (1 mg/ml) e deixadas em estufa por no mínimo 14 horas antes do
experimento, como garantia de uma boa adesão celular. A lamínula foi lavada pelo menos 2
vezes com tampão de fluorescência antes de ser adaptada à câmara de Leyden e levada ao
microscópio de fluorescência invertido de alta resolução acoplado a uma câmera CCD e
52
controlado por um software de computador. Um micromanipulador semi-automático
programável InjectMan NI 2 (Eppendorf, Hamburg, Germany), especial para microinjeção em
células aderentes, foi utilizado sobre a mesma plataforma utilizada para a obtenção das
imagens. O injectMan foi acoplado a um injetor FemtoJet (Eppendorf, Hamburg, Germany),
que permitiu um ajuste preciso dos parâmetros para a microinjeção nas células (50 hPa de
pressão compensatória, 100 hPa de pressão de injeção para 0,3 segundos) e volume injetado
de aproximadamente 40-70 fl (fentolitros) através de um microcapilar (Femtotips II,
Eppendorf ®) com diâmetro interno de 0,5 µm. Antes do início do experimento foi escolhido
um campo óptico em que fosse possível a obtenção de células isoladas e em seguida, o
microcapilar foi posicionado sobre uma única célula em um ângulo de 30° para microinjeção
em citoplasma. Em seguida foi disparada a microinjeção de uma solução contendo 0,25 mM
de hemoproteínas ou hemopeptídeos (citocromo c, citocromo c base livre, citocromo c zinco
substituído, microperoxidase-11, microperoxidase-11base livre e microperoxidase-11
manganês substituída), adicionado de um marcador de cálcio intracelular fluorescente, o Fura-
2 (Invitrogen Co. USA), dissolvidos em H
2
O milli Q. As imagens foram obtidas utilizando
dois filtros de excitação nos comprimentos de onda de 340 e 380 nm e emissão de 510 nm.
3.6.5. Capacidade das hemoproteínas e hemopeptídeos de dispararem apoptose via
microinjeção
• Avaliação da morfologia nuclear
Células da linhagem MLAC foram microinjetadas com soluções de hemoproteínas e
hemopeptídeos 0,25 mM conforme descrito no item anterior, decorridas pelo menos 2 horas
de incubação em meio de cultura fresco a 37°C, uma solução de solução aquosa Hoechst
33342 (1µg/ml ) (Invitrogen Co. USA) foi adicionada à placa, já contendo tampão de
fluorescência e mantida por 15 minutos. Decorridos os 15 minutos, a placa foi submetida a
algumas lavagens, retirando assim o excesso do fluoróforo. Utilizando um microscópio de
fluorescência invertido de alta resolução e através de filtros de ex/em: 350/460 nm os núcleos
das células microinjetadas foram analisados, e os núcleos que se apresentavam condensados
e/ou fragmentados (picnóticos) foram tido como núcleos apoptóticos. A porcentagem foi
obtida em relação ao número total de células injetadas. Os valores apresentados são uma
média de pelo menos duas placas.
53
3.6.6. Investigação de sinalizações celulares após microinjeção de hemoproteínas e
hemopeptídeos
• Exposição de Fosfatidilserina (PS)
Apoptose celular é caracterizada por algumas variações morfológicas como perda de
integridade de membrana plasmática, condensação de citoplasma e núcleo, assim como
fragmentação do DNA. Um dos primeiros eventos indicativo de apoptose é a translocação de
um fosfolipídio de membrana, a fosfatidilserina (PS) da membrana plasmática interna para a
externa, ou seja, da porção do citosol para a porção extracelular. Uma vez exposto, sítios de
ligação do fosfolipídio estão disponíveis para proteína anexina V. A existência de anexina V
conjugada a moléculas fluorescentes, faz dessa proteína uma ótima ferramenta de estudo para
identificação de eventos iniciais do processo de apoptose celular.
Para avaliar se as soluções de hemoproteínas e hemopeptídeos provocam a
externalização da PS, células da linhagem MLAC foram plaqueadas em lamínulas
previamente tratadas com poli-L-ornitina, acopladas à câmara de Leyden. Praticamente todas
as células presentes no campo visual da lente objetiva do microscópio invertido foram
microinjetadas com soluções 0,25 mM das respectivas hemoproteínas e hemopepetídios.
Imediatamente após a microinjeção, o tampão de fluorescência foi substituído pelo tampão do
Kit de Anexina, adquirido da BD
®
Biosciense, adicionado de anexina V (5 µL/ml), com
auxilio do microscópio de fluorescência invertido de alta resolução e utilizando filtros de
ex/em: 480/510 nm, imagens foram obtidas por um período de 90 minutos, permitindo assim
uma análise temporal do evento.
• Ativação de caspase-3
A atividade de caspase foi medida através da reação enzimatica utilizando como
substrato um peptídeo fluorogênico, Z-DEVD-AMC, componente do kit EnzCheck®
Caspase-3 Assay Kit (Molecular Probes, USA). Para realização deste ensaio utilizamos
apenas a fração do citosol. O fracionamento celular foi obtido com digitonina, pois há relatos
em literatura que a digitonina em baixas concentrações é capaz de solubilizar a membrana
plasmática sem permeabilizar a mitocôndria (BROOKS, 2005). Esta permeabilização seletiva
é importante por não extrair ou solubilizar o citocromo c mitocondrial, evitando assim que
caspases sejam ativadas durante o procedimento de lise celular.
Após processo de tripsinização (para MLAC) e centrifugação, as células foram
homogeneizadas em 1 ml de tampão isotônico (sacarose 250 mM, HEPES 10 mM, KCl 10
54
mM, MgCl
2
1,5 mM, EDTA 1mM, EGTA 1 mM e pH 6,3); uma solução de digitonina 0,01%
foi adicionada; após 2 minutos de reação a temperatura ambiente a suspensão foi centrifugada
(600 g, 20 °C por 10 minutos) e o sobrenadante foi então reservado em banho de gelo. Para a
reação: 25 µl do lisado, hemoproteína ou hemopeptídeo 25 µM, dATP 1 mM, MgCl
2
10 mM
e substrato 100 µM são homogeneizados, o delta de fluorescência da reação foi acompanhado
em um Espectrofluorímetro Hitachi F2500 (Tóquio, Japão). As mesmas reações também
foram realizadas na presença de 20 µM de inibidor de caspase (Ac-DEVD-CHO). Os
parâmetros utilizados no equipamento: fendas ex/em: 10/10 nm, ex: 342 nm e em: 360 -500
nm. As amostras foram diluídas 20 vezes para detecção e a fluorescência final obtida após
incubação overnight. Os resultados foram normalizados pela quantidade de proteína total das
amostras. Cabe ressaltar que tivemos os resultados deste ensaio otimizados após correção do
valor de pH do tampão de reação para 6,3 (MATSUYMA, 2000).
3.6.7. Perfil radicalar das linhagens K562 e células mononucleadas após incubação com
lipossomos de DODAB carregados com citocromo c e MP-11
A tentativa de detectar a geração de radicais livres oriundos da presença do citocromo
c e MP-11 no interior de células das linhagens K562 e mononucleadas, foi realizada com
auxílio da técnica de ressonância paramagnética eletrônica (EPR).
Relatos de literatura mencionam que a realização de experimentos de EPR com células,
demanda uma densidade celular muito alta para uma boa detecção de sinais eletrônicos. Essa
necessidade foi um dos fatores que inviabilizou os experimentos com MLAC, pois por serem
células aderentes o crescimento celular é limitado pelo próprio espaço da garrafa de cultivo
celular, além da etapa de tripsinização das células, para poderem ser analisadas. Uma
alternativa foi o isolamento de células mononucleares como controle da linhagem leucêmica
K562.
Os experimentos foram realizados com 7 x 10
6
células/experimento, DODAB 0,1 mM
carregado com cit c 2 mM ou MP-11 1 mM. Após contagem do número de células, estas
foram transferidas para placas de petri de 25 mm e incubadas por 2 horas com as soluções
mencionadas anteriormente. Ao término da incubação as células foram centrifugadas por 10
minutos a 400 g. O sobrenadante contendo DODAB/cit c ou DODAB/MP-11 foi descartado,
e o sedimento celular homogeneizado em 200 µl de meio de cultura RPMI. A solução
contendo células e DMPO 255 mM (Sigma Chemical Co.) foi transferida para a cubeta de
55
quartzo, e a primeira medida realizada. DMPO é um spin trapping (trapeador de spin)
utilizado para detecção de radicais livres, quanto maior a sua concentração maior a
probabilidade de detectar radicais primários (LEDWITH, 1973; BARR, 1975). Adição de
substrato exógeno para as peroxidases, supostamente no interior das células, foi realizada em
concentrações crescentes, de 25 µM e 50 µM de tert-butil hidroperóxido (t-BuOOH) (Sigma
Chemical Co.). A adição de peróxido exógeno foi uma alternativa para amplificar os sinais
celulares.
Os experimentos de EPR foram executados com amplitude de modulação 0,05 mT,
microondas 20 mW, temperatura ambiente, tempo de leitura 2 min, escala de 100 Gauss e
ganho de 1.6 x 10
4
e realizados no laboratório do Prof. Dr. Otaciro Rangel Nascimento do
Grupo de Biofísica do Instituto de Física da USP de São Carlos.
3.7. Estudo da reatividade de MnMP-11 com peróxidos
3.7.1. Purificação e preparo de micelas de CTAB
Foram dissolvidos 5,0 g de CTAB (Merck - Darmstadt, Alemanha) em 42,5 mL de
acetona, sob aquecimento e agitação; no momento de refluxo, foram adicionados 7,5 mL de
etanol em alíquotas até obter uma solução translúcida, após filtrada, a solução ficou em
repouso para evaporação do solvente. O precipitado foi filtrado a vácuo, e lavado com
acetona, após filtrado o CTAB estava cristalizado e purificado (DEARDEN and WOOLLEY,
1987).
O preparo das soluções de micelas de CTAB foi feito através da dissolução do CTAB
purificado no tampão apropriado sob agitação a 37 °C.
3.7.2. Estudo da reatividade das porfirinas- Manganês substituída com peróxidos
Soluções de Mn(III)MP-11 e soluções de HOOH (Sigma-Aldrich), foram tamponadas
com HEPES 5 mM (pH 10,4) ou Histidina 5 mM (pH 10,4). A concentração do doador de
oxigênio, HOOH, foi de 352 µM. A concentração das porfirinas foi de 1,13 µM e foi
verificada utilizando o coeficiente de extinção molar ε
368 nm
= 110 mM
-1
cm
-1
em pH 2, para
Mn(III)MP-11(PRIMUS, 2002).
Os espectros das reações da porfirina manganês substituída com peróxido de
hidrogênio em diferentes meios, na presença e ausência de histidina foram registrados em um
56
fotodiodo Shimadzu Modelo 1501 MultiSpec (Tóquio, Japão). A resolução espectral foi em
torno de 0,5 nm e as cinéticas foram realizadas com intervalo de leitura de 1 segundo. O
caminho óptico foi de 1 cm para todas as medidas.
A linha base foi feita somente com a solução micelar, ou solução de lipossomos ou
solução homogênea. Após adição do hemopeptídeo ou da porfirina sintética com uma pipeta
automática, e concomitante homogeneização, a leitura cinética foi acionada (com
acompanhamento em 463 nm, região característica de absorbância do metal manganês). Com
objetivo de ter um tempo zero de reação real, 30s foram acompanhados antes da adição do
peróxido com auxilio de uma micro-seringa, a própria seringa foi utilizada para homogeneizar
a solução. O tempo máximo de adição e homogeneização do peróxido foi de
aproximadamente 3s. O tempo total de medida da cinética foi de 15 min. No final da cinética,
um espectro em 3 dimensões foi apresentado, e deste pode-se extrair espectros nos tempos
desejados, e cinéticas nos comprimentos de onda desejados. Os dados apresentados são uma
média de três medidas independentes.
A velocidade de conversão do Mn(III)MP-11/CTAB a Composto II/CTAB obedece
uma relação exponencial que pode ser ajustada a uma equação de primeira ordem mostrada
abaixo,
P = P
∞
( 1 – e
– k obs
.t
) (Eq. 1)
onde, P e P
∞
são a concentração de produto em um determinado tempo e em um tempo
infinito, respectivamente, e k
obs
é a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem
observada na conversão de Mn(III)MP-11 a Composto II.
A influência da concentração do peróxido na velocidade de conversão do Mn(III)MP-
11 a Composto II, obedece a Equação 2,
Kobs = k
2
. [ROOH] / K
m app
+ [ROOH] (Eq. 2)
onde k
obs
é a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem de conversão de Mn(III)MP-
11 a Composto II, k
2
é a velocidade máxima, [ROOH] é a concentração de peróxido e K
mapp
é
a constante de pseudo-primeira ordem ou dinâmica aparente para que ocorra interação entre
Mn(III)MP-11/CTAB e peróxidos. K
mapp
é definido na Equação 3,
Km
aap
= ( 1 + [H
+
]/Ka)( k
-1
+ k
2
/k
1
) (Eq. 3)
onde, K
m
app
é a constante de pseudo-primeira ordem de interação entre Mn(III)MP-11/CTAB
e peróxidos, K
a
é a constante de inibição, já que o desprotonamento é uma etapa crucial, k
1
é a
constante de associação do Mn(III)MP-11/CTAB com peróxidos, k
-1
é a constante de
57
dissociação do Mn(III)MP-11/CTAB com peróxidos, e k
2
a constante de formação do
Composto II.
3.7.3. Ressonância Paramagnética eletrônica (EPR)
As medidas de EPR foram obtidas com Mn(III)MP-11 100 µM e CTAB 60 mM. Os
experimentos foram feitos em um equipamento de ressonância paramagnética eletrônica de
onda contínua com banda X da linha Elexsys da Bruker, com acessório da Oxford para
variação de temperatura, desde da ambiente até a de hélio líquido (4 K) sob as seguintes
condições: campo 5 x 10
3
, amplitude de modulação 1.0 mT, microondas 4 mW, temperatura
11K, constante de tempo de 10,24 s e tempo de conversão de 81,92 s. Após mistura, as
soluções foram rapidamente introduzidas em um tubo de quartzo especial para EPR, o qual foi
previamente resfriado com nitrogênio líquido. Depois de congelada a amostra foi introduzida
na cavidade de microondas, submetida à baixa temperatura e as medidas de EPR foram então
realizadas.
Os experimentos de EPR foram executados no laboratório do Prof. Dr. Otaciro Rangel
Nascimento do Grupo de Biofísica do Instituto de Física da USP de São Carlos.
58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente trabalho o tópico Resultados e Discussão será apresentado em duas partes.
A primeira aborda o estudo da reatividade de porfirinas manganês substituída, pois o
entendimento da sua ação nas células requer um prévio entendimento do seu mecanismo de
reação. As análises cinéticas ficaram a cargo da aluna de iniciação científica Marcela de
Siqueira Cardoso Silva, que trabalhou sob a orientação da Prof
a
. Dr
a
. Iseli Lourenço Nantes e
minha co-orientação. Tais resultados estão publicados na revista Inorganic Biochemistry
(MUGNOL, 2008) e em anexo 1 deste trabalho.
Já a segunda parte discute os resultados obtidos durante a maior parte do período de
doutoramento, que compara a efetividade do lipossomo de DODAB como carreador de
hemoproteínas e hemopeptídeos com a técnica de microinjeção, assim como a capacidade das
hemoproteínas e hemopeptídeos em disparar o processo de morte celular. Para tal estudo
utilizamos duas linhagens celulares estabelecidas, a K562 e MLAC, e em alguns
experimentos, utilizamos células mononucleadas como controle da K562.
Cabe ressaltar que durante o doutorado realizei um estágio de 5 meses no laboratório
do Prof. Dr. Valerian Kagan, da University of Pittsburgh, PA, EUA. Neste período trabalhei
em sua linha de pesquisa, particularmente em um projeto de estudo de uma nova função do
citocromo c na apoptose: atividade fosfolipase A2 específica para cardiolipina oxidada.
Resultados desta colaboração foram suficientes para elaboração de um manuscrito, o qual esta
submetido para publicação, ver anexo 2.
59
4.1. Estudo da reatividade de microperoxidase-11 manganês substituída
A espectroscopia de absorção UV-Vis foi a técnica utilizada nos estudos de interação
entre microperoxidase-11 manganês substituída com micelas de CTAB na presença e ausência
de histidina e na interpretação do estado de spin do manganês hemínico.
A incorporação do metal Mn(III) ao centro do anel porfirínico da microperoxidase-11,
pode ser observado pelo deslocamento hipsocrômico da banda Soret da porfirina base livre de
396 nm (ERECINSKA, 1978) para 371 nm, além do aparecimento da banda 463 nm, que é
característico do metal manganês no centro de porfirinas (LOW, 1998). A banda Soret de
porfirinas de Mn sofre um desdobramento em um componente resultante de transições
HOMO (do inglês, high occupied molecular orbital) → LUMO (do inglês, low unoccupied
molecular orbital) do anel porfirínico com pico em 371 nm e um componente correspondente
a banda de transferência de carga resultante de transições elétrons d do Mn → LUMO do anel
porfirínico com pico em 463 nm (BOUCHER, 1968; VANATTA, 1987). As MnMP-11
também exibem a banda Q com pico em 550 nm. Os espectros característicos das
microperoxidases Fe(III), base livre e Mn(III) estão representados na figura 12.
60
250 300 350 400 450
0,00
0,04
0,08
0,12
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
450 500 550 600 650
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
FIGURA 12 – Espectro de diferentes espécies de MP-11. Linha pontilhada: Fe(III)MP-11. Linha
grossa: MP-11 base livre. Linha fina: Mn(III)MP-11. Os espectros foram obtidos em Hepes pH 10,4,
com MP-11 1µM, a temperatura ambiente.
A atividade catalítica da MnMP-11 com peróxido de hidrogênio foi estudada em meio
homogêneo e em micelas de CTAB, ambos na presença e ausência de histidina. A figura 13
mostra os espectros de MnMP-11 em meio homogêneo na ausência (linha pontilhada) e na
presença (linha preta fina) de histidina, e na presença de micelas de CTAB na ausência de
histidina (linha grossa). A análise dos espectros mostra que na presença de histidina não
promoveu mudanças significativas no espectro do hemopeptídio sugerindo que o aminoácido
não esta coordenado com Mn(III) (figura 13, linha fina). A associação de MnMP-11 com
micelas de CTAB levou ao desdobramento da banda de transferência de carga em dois picos,
463 e 480 nm, com deslocamento batocrômico das banda Q, de 550 para 559 nm (linha
grossa) e da banda Soret de 367 para 370 nm. Na presença de micelas de CTAB, a adição de
histidina também não promoveu alterações significativas no espectro da MnMP-11.
61
300 350 400 450 500
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
525 550 575 600
0,000
0,005
0,010
0,015
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
FIGURA 13 – Espectro de Mn(III)MP-11 em meio homogêneo e heterogêneo. Linha pontilhada:
Mn(III)MP-11 1µM em Hepes pH 10,4. Linha fina: Mn(III)MP-11 1µM na presença de histidina 5
mM pH 9,1. Linha grossa: Mn(III)MP-11 1µM em CTAB 20 mM pH 9,1 na ausência de histidina.
Quando Fe(III)-MP é substituída por Mn(III)-MP, a adição de peróxido de hidrogênio,
na presença e na ausência de histidina, leva a mudanças espectrais sugestivas da conversão do
catalisador para Composto II (LOW, 1998), com subseqüente bleaching parcial do cromóforo.
Entretanto, a presença de histidina acelerou a reação em ambos os meios homogêneo e
heterogêneo (figuras 14B e 15B), provavelmente porque, nestas condições, a histidina pode
atuar como catalisador ácido/base. A velocidade de conversão da Mn(III)MP-11 para
Composto II (k
obs
) em meio homogêneo foi monitorada pela diminuição da banda de
transferência de carga em 463 nm, que aumentou de 2,5 ms
-1
para 4,2 ms
-1
(figura 14 A e B).
62
300 375 450
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
520 560 600
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
A
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
300 375 450
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
525 550 575 600
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
B
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
FIGURA
14 – Espectro da reatividade de Mn(III)MP-11 em meio homogêneo com H
2
O
2
, na
presença e ausência de histidina. (A) Espectros de absorbância de Mn(III)MP-11 1,13µM durante a
reação com 352 vezes de excesso de H
2
O
2
em hepes pH 10,4. Tempo zero (linha grossa), 38 s (linha
fina), 180 s (linha pontilhada) e 5 min (linha tracejada) depois da adição de H
2
O
2
. (B) Espectros de
absorbância de Mn(III)MP-11 1,13µM durante a reação com 352 vezes de excesso de peróxido de
hidrogênio em 5 mM histidina pH 10,4. Tempo zero (linha grossa), 62 s (linha fina), 123 s (linha
pontilhada) e 15 min (linha tracejada) depois da adição de HOOH.
63
A velocidade de conversão da MnMP-11 a Composto II (k
obs
) em micelas de CTAB,
monitorada pelo bleaching da banda de transferência de carga a 463 nm aumentou de 5 ms
-1
a
25 ms
-1
, os espectros das reações na ausência e presença de histidina estão representados nas
figuras 15 A e B. Portanto, micelas de CTAB aumentaram a velocidade de reação de MnMP-
11 com peróxido de hidrogênio e, neste meio, o efeito da histidina foi mais acentuado. Este
resultado é coerente, desde que, em micelas de CTAB a histidina coordena com o ferro
hemínico em uma posição que impede o acesso de peróxidos ao centro metálico, entretanto,
devido à substituição do ferro por manganês que possui menor afinidade pelo grupo imidazol
da histidina, minimizou a ação inibitória da histidina na reação entre Fe(III)MP-11 e HOOH
(SOUSA, 2006), mas ao contrário, a histidina favoreceu a reação devido a sua proximidade ao
centro catalítico, atuando como um catalisador ácido-base mais eficiente.
64
300 350 400 450 500
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
525 550 575 600
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
A
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
300 375 450
0,00
0,03
0,06
0,09
0,12
520 560 600
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
B
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
FIGURA 15 – Espectro da reatividade de Mn(III)MP-11 em meio heterogêneo com peróxido de
hidrogênio, na presença e ausência de histidina. (A) espectros de absorbância de Mn(III)MP-11
1,13µM durante a reação com 352 vezes de excesso de peróxido de hidrogênio em CTAB 20 mM, pH
10,4. Tempo zero (linha grossa), 92 s (linha fina), 166 s (linha pontilhada) e 15 min (linha tracejada)
depois da adição de H
2
O
2
. (B) espectros de absorbância de Mn(III)MP-11 1,13µM durante a reação
com 352 vezes de excesso de peróxido de hidrogênio em 20 mM CTAB preparado em 5 mM histidina
pH 10,4. Tempo zero (linha grossa), 102 s (linha fina), 170 s (linha pontilhada) e 15 min (linha
tracejada) depois da adição de H
2
O
2
.
65
A figura 16 representa uma proposta para o ciclo catalítico e da redução do manganês
durante a reação da Mn(III)MP-11 com peróxido de hidrogênio. A adição do peróxido leva a
conversão da Mn(III)MP-11 em Composto I (etapa 1). O Composto I oxida uma segunda
molécula de peróxido de hidrogênio, formando o Composto II com a concomitante formação
do íon superóxido (etapa 2). O Composto II oxida uma terceira molécula de peróxido de
hidrogênio que é convertida também em íon superóxido, completando o ciclo catalítico, no
qual, a Mn(III)MP-11 abstrai os elétrons dos íons superóxido e é convertida a Mn(II)MP-11.
A oxidação dos íons superóxido conduz a formação do oxigênio molecular como indicado
pelas setas.
Através deste ciclo catalítico proposto foi possível perceber algumas peculiaridades
entre o ciclo da Mn(III)MP-11 e o ciclo catalítico de todas as peroxidases já estudadas. No
ciclo das peroxidases a conversão do Composto O para Composto I, ocorre em uma reação de
dois elétrons, promovendo a formação de um π-cátion, uma vez que, ocorre a abstração de um
elétron do metal (ferro) e outra dos elétrons das ligações duplas do grupo heme, no qual
ocorre a mudança do estado de valência Fe
+3
(Composto O) para Fe
+4
(Composto I)
(DUNFORD, 1991). No ciclo da Mn(III)MP-11 proposto, não ocorre a formação do π-cátion
já que a abstração dos dois elétrons ocorre do metal manganês, no qual este passa do estado
de valência Mn
+3
para Mn
+5
.
FIGURA 16 – Esquema proposto para o ciclo catalítico de Mn(III)MP-11 com peróxido de hidrogênio
(MUGNOL, 2008)
O
O
O
O
O
O
O
O
MPMn
+3
MPMn
+5
=O
HOOH
HOH
HOOH
MPMn
+4
=O
MPMn
+2
1
2
3
HOOH
4
66
4.2. Desenvolvimento de Sistemas de Entrega de Hemoproteínas e Hemopeptídeos para
Células e determinação do Sítio de Ação no Disparo da Apoptose
A etapa inicial experimental deste projeto consistiu na realização de experimentos
controles, ou seja, utilizando citocromo c livre e o produto de sua digestão tríptica,
microperoxidases, na ausência de veículos, para caracterizar seu comportamento com as
linhagens celulares e técnicas a serem utilizadas.
Avaliação da citotoxicidade das preparações de citocromo c ⎯ As células leucêmicas
K562 mantidas em meio de cultura RMPI foram incubadas na densidade celular de 8 x 10
4
células/ml com citocromo c ou microperoxidase-11, nas concentrações: 0, 15, 20, 30, 40 e 50
µM, além dos controles negativo (ausência de citocromo c e Fe(III)MP-11) e positivo
(citocromo c 50 µM e Fe(III)MP-11 50 µM foram aplicados apenas na etapa de
solubilização). Após período de incubação de 5 horas nas condições de cultivo celular, MTT
0,1 mM e solução solubilizadora (SDS 10% e HCl 0,01%) foram adicionados e a absorbância
em 560 nm do conteúdo de cada experimento foi obtida após incubação overnight. A
descrição detalhada da metodologia está na seção 3.0 de Materiais e Métodos. Os dados
obtidos para citocromo c livre em comparação com o controle positivo com a mesma proteína
(figura 17 e tabela IV) demonstraram, que o grau de redução de MTT foi significativamente
menor para citocromo c pré-incubado com as células do que aquele obtido no controle
positivo (veja Estudo do Teste T na tabela 4).
67
0 1020304050
0
20
40
60
80
100
Viabilidade celular (%)
Concentracao (µM)
FIGURA 17 - Viabilidade celular obtida da incubação das células K562 com citocromo c. A
viabilidade celular determinada através do método de MTT, para linhagem K562 (8 x 10
4
células/ml)
submetida a várias concentrações de citocromo c. Bola cheia corresponde ao citocromo c incubado
com células da linhagem K562 e bola vazia corresponde ao citocromo c adicionado no mesmo
momento que a solução de MTT, ou seja, nosso controle positivo.
TABELA 4 - Teste t-Independente entre células pré-incubadas com citocromo c e controle positivo
Dados Média Variância N
Células pré-incubadas 67,48667 60,01653 3
Controle positivo 85,27333 38,40893 3
t = 3.10528 p = 0.03604 citocromo c 50 µM nas duas condições
em nível 0.05, as duas médias são significativamente diferentes.
Contudo, citocromo c pré-incubado com as células não foi capaz de induzir a morte
de mais de 50% destas mesmo na concentração de 50 µM. Estes resultados sugerem que
citocromo c livre não é eficiente para atravessar a membrana plasmática para acessar o citosol
e disparar a morte celular após a associação com o apoptossomo. O experimento utilizando
Fe(III)MP-11 resultou baixo teor de MTT reduzido o que a princípio poderia indicar
68
ocorrência de morte celular. Porém, a análise do controle positivo mostrou que Fe(III)MP-11
era capaz de reoxidar o MTT, e para contornar este artefato as células de todas as linhagens
testadas que receberam tratamento com hemoproteínas e hemopeptídeos foram lavadas pelo
menos 3 vezes com o próprio meio de cultura antes da adição do sal de formazan MTT.
Escolha das concentrações de trabalho do lipossomo ⎯ Para escolher uma concentração na
qual o lipossomo de DODAB que não conseguisse provocar a morte de 50% ou mais da
população celular em estudo, submetemos as linhagens de célula normal MLAC e leucêmica
K562 à incubação com várias concentrações de DODAB (partindo do pressuposto que 1 mM
representa a DL
50
em células de mamífero) (CARMONA, 2003).
O ensaio para determinação
da DE
50
de lipossomos de DODAB para linhagens estabelecidas de MLAC foi realizado
conforme descrito no tópico Materiais e Métodos. Foram avaliadas nove concentrações
diferentes de DODAB, variando de 0 a 400 µM com intervalos de 50 µM. As placas contendo
células e DODAB nas concentrações mencionadas foram incubadas em dois intervalos 5 e 17
horas. Em ambos os intervalos de incubação a concentração de 0,2 mM foi suficiente para
matar 50 % das células MLAC, demonstrado na figura 18. O mesmo experimento foi
realizado com a linhagem K562, porém apenas no tempo de incubação de 5 horas, já que o
resultado anterior mostrou não haver diferença significativa entre 5 e 17 horas de incubação.
O valor da DE
50
encontrado para esta linhagem foi de 0,15 mM nas duas metodologias
utilizadas, redução de MTT e permeabilidade da membrana plasmática ao corante azul de
tripan (resultados não mostrados). A partir desses resultados optamos por trabalhar com a
concentração 0,1 mM, pois após 5 horas de incubação ambas as células testadas apresentavam
viabilidade celular próxima de 90 %.
69
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
25
50
75
100
% Viabilidade Celular
[DODAB]
µ
M
FIGURA 18 - Determinação da DE
50
de lipossomos de DODAB para a linhagem MLAC.
Viabilidade celular determinada por redução de MTT para linhagem MLAC (2 x 10
5
células/poço)
submetida a várias concentrações de lipossomo de DODAB. Bola cheia corresponde a 5 horas de
incubação e bola vazia corresponde a 17 horas de incubação.
Determinação do poder surfactante das preparações do lipossomo de DODAB –
durante a realização dos experimentos de viabilidade celular utilizando o corante azul de
tripan, uma quantidade considerável de fragmentos celulares foi observada, associada à
diminuição da densidade celular inicial do experimento e do experimento controle. Isso nos
levou a investigar qual característica do lipossomo de DODAB era a predominante,
fusogênica ou surfactante. Para isso utilizamos uma metodologia que determina a atividade
de uma enzima citoplasmática, a lactato desidrogenase (LDH). Portanto, uma forma indireta
de dosar o vazamento celular, ou seja, a ruptura da membrana plasmática das células tratadas
com lipossomos de DODAB.
O ensaio foi realizado com adição de lipossomo 0,1 mM carregado com
hemoproteínas (nas concentrações especificadas na tabela 5) em placas já contendo 1 x10
6
células K562. Após incubação de 5 horas, as células foram transferidas para tubos tipo
eppendorf® e centrifugadas por 10 minutos, o sobrenadante foi retirado e mantido no gelo
70
para posterior dosagem da atividade da enzima LDH. Do controle foram retirados apenas 400
µl e ao restante contendo sedimento celular e sobrenadante, foi adicionado Triton-X -100 0,1
%, para obtenção do controle 100%. A descrição detalhada da metodologia encontra-se na
seção de Materiais e Métodos.
TABELA 5 - Liberação de LDH após tratamento de 5 horas com lipossomos de DODAB
Amostra % LDH
Controle com Triton 100,0
Controle sem Triton 7,7
DODAB 0,1 mM 10,9
DODAB 0,1 mM contendo Citocromo c 1 mM 8,4
DODAB 0,1 mM contendo Citocromo c 2 mM 11,9
DODAB 0,1 mM contendo Citocromo s/Fe 2 mM 7,5
DODAB 0,1 mM contendo Citocromo Zinco 1 mM 10,9
Os dados da tabela 5 mostram que o lipossomo de DODAB utilizado na concentração
de 0,1 mM contendo ou não hemoproteínas, leva a um pequeno aumento na liberação de LDH
(máximo de 4,2 %) quando comparado ao valor do controle sem a presença de Triton, ou seja,
o efeito surfactante do lipossomo não inviabiliza a sua utilização. Resultados similares foram
obtidos para a linhagem celular MLAC (resultados não mostrados).
DODAB como veículo de entrega de hemoproteínas e hemopeptídeos – para
estimar a eficiência de entrega dos lipossomos de DODAB, utilizamos duas metodologias:
sendo uma delas a redução do sal de formazan MTT para avaliar a viabilidade celular, e a
outra utilizando microscopia de fluorescência para detectar a presença de núcleos picnóticos
após período de incubação das células com DODAB carregado de hemoproteínas e
hemopeptídeos.
Para ambos os experimentos utilizamos soluções estoque de lipossomo de DODAB 2
mM carregado com soluções de hemoproteínas e hemopeptídeos 0,25 mM. As hemoproteínas
testadas foram citocromo c nativo, citocromo c base livre e citocromo c zinco substituído, já
os hemopeptídeos foram microperoxidase-11, microperoxidase-11 base livre e
microperoxidase-11 manganês substituída. O diâmetro do lipossomo foi padronizado
71
utilizando membranas de policarbonato de 0,1 µm e 0,4 µm. Para maiores detalhes consultar
seção Materiais e Métodos.
Durante o estudo de efetividade de entrega das hemoproteínas e hemopeptídeos através
de lipossomos de DODAB, algumas questões como: tamanho do lipossomo e tempo de
incubação também foram abordadas, pois saber se essas diferenças favoreciam ou não as
entregas, precisavam ser esclarecidas. Para tentarmos responder às questões referentes ao
tamanho do lipossomo, padronizamos lipossomos nos diâmetros de 0,1 e 0,4 µm com auxílio
de um mini extrusor Avanti. A questão referente a tempo foi solucionada com incubações em
dois intervalos de tempo 2 e 5 horas.
Os lipossomos de DODAB com diâmetros de 0,1 e 0,4 µm, carregados com as
soluções descritas anteriormente, foram adicionados à placa de ELISA já contendo células
aderidas de MLAC, na concentração final de 0,1 mM, incubados por um período de 2 e 5
horas sob as mesmas condições de cultivo celular, decorrido o período de incubação, os
reagentes MTT e SDS foram adicionados nos devidos tempos como descrito detalhadamente
em Materiais e Métodos. Analisando os resultados pode-se notar maior redução do MTT em
intervalos maiores de incubação utilizando lipossomos de 0,4 µm. A figura 19 mostra os
índices de redução de MTT no intervalo de incubação de 5 horas para os dois tamanhos de
lipossomo utilizado.
72
Controle
DODA
B
Ci
t
c
Cit s/Fe
Cit
zinco
MP
-1
1
MP s/Fe
M
n M
P
-11
0
20
40
60
80
100
*
*
Viabilidade celular (%)
FIGURA 19 - Viabilidade celular por MTT das células MLAC tratadas com lipossomos
de DODAB. Densidade utilizada de 4 x 10
4
células/ experimento, incubadas com soluções de
DODAB 0,1 mM, carregados de soluções das proteínas e peptídeos 0,25 mM pelo período de
5 horas. Barras pretas: lipossomos de 0,4 µm. Barras cinzas: lipossomos de 0,1 µm. A
ausência de lipossomos 0,1 µm carregado de MP-11 é justificada por incompatibilidade
metodológica. * significativamente diferentes
Os dados obtidos para todas as variáveis em comparação com o controle negativo
(apenas lipossomos de DODAB), demonstraram que o grau de redução de MTT determinado
foi significativamente menor apenas para lipossomos carregados de MP-11 e MnMP-11,
quando entregues por DODAB 0,4 µm (figura 19). Cabe ressaltar que os resultados são uma
média de três experimentos para cada variável; que antes da adição do reagente MTT os poços
foram lavados pelo menos duas vezes com meio de cultura DMEM, na tentativa de remover
hemoproteínas e hemopeptídeos que não tenham entrado nas células e poderiam vir a reoxidar
o MTT, falseando os resultados obtidos.
A análise do experimento leva a duas hipóteses: (i) os lipossomos de DODAB não
foram eficazes na entrega das soluções as células MLAC, ou (ii) os lipossomos são eficazes
na entrega, porém as soluções não são capazes de promover a morte celular.
73
O ensaio de viabilidade celular por redução de MTT também foi realizado com outras
linhagens celulares, linhagem de células normais mononucleares e células tumorais K562. E
nessas outras duas linhagens os resultados obtidos utilizando lipossomos de 0,4 µm durante o
período de 5 horas, foram semelhantes aos obtidos para MLAC, ou seja, apresentaram
diferença significativa para MP-11 e MnMP-11.
Para complementar os estudos da efetividade dos lipossomos de DODAB como
veículos de entrega de algumas proteínas, realizamos alguns experimentos utilizando
microscopia de fluorescência. Estes experimentos foram feitos com colaboração da Prof
a
Dr
a
Soraya Soubhi Smaili, do Departamento de Farmacologia da UNIFESP.
Lipossomos fluorescentes de DODAB foram preparados utilizando HPTS. HPTS é um
marcador de pH fluorescente, que utilizamos apenas para efeito qualitativo da fusão do
lipossomo com a membrana celular. Após preparo dos lipossomos de DODAB na presença de
do fluoróforo 30 mM, HEPES 5 mM e pH 7,0, a solução foi dialisada em meio
osmoticamente equilibrado por um período aproximado de 12 horas. As células da linhagem
MLAC cultivadas em lamínulas de vidro previamente tratadas com poli-L-ornitina foram
incubadas por um período de 5 horas com DODAB 0,1 mM fluorescente, nas mesmas
condições de cultivo celular. Decorrido o tempo de incubação as células foram lavadas com
solução tampão de fluorescência e através de filtros de ex/em: 380/510 nm imagens de
algumas células fluorescentes foram obtidas, demonstrando a capacidade do lipossomo de
DODAB em fundir a fosfolipídeos de membrana. Essa hipótese de fusão da membrana celular
foi sugerida por Felgner e colaboradores (FELGNER, 1987). A imagem da figura 20A
corresponde ao experimento controle, ou seja, células MLAC sem tratamento com DODAB e
fotografadas utilizando os mesmos filtros de ex/em que foram utilizados quando células de
MLAC foram tratadas com DODAB e o agente fluorescente (figura 20B).
74
FIGURA 20 – Capacidade de fusão dos lipossomos de DODAB as células MLAC. (A)
corresponde a imagem das células controle, ou seja, sem o tratamento com DODAB, B) células após
tratamento de 5 horas com 0,15 mM de Lipossomo de DODAB carregado com HTPS. As imagens
foram obtidas com as células submersas em tampão de fluorescência, a temperatura de 37 °C, filtros
de ex/em: 380/510 nm.
Uma vez confirmado a capacidade de fusão, partimos para a análise morfológica do
núcleo das células tratadas com DODAB carregado de hemoproteínas e hemopeptídeos. As
células aderentes MLAC foram transferidas para as lamínulas de vidro onde ocorreram as
incubações com DODAB 0,1 mM contendo no seu interior soluções hemoproteínas e
hemopeptídeos 0,25 mM. Após período de incubação de 5 horas e tratamento com solução
aquosa de Hoechst 33342 (1µg/ml), imagens de núcleos apoptóticos (com características de
condensação e fragmentação) foram visualizadas e contadas na placa. Analisando as imagens
da figura 21A e 21B, correspondentes a células controle e células tratadas com DODAB
carregado de citocromo c, respectivamente, podemos ver nitidamente as diferenças
morfológicas nucleares. Estas mudanças nucleares provavelmente são decorrentes da presença
de hemoproteínas e hemopeptídeos entregues a célula via lipossomo de DODAB.
A
75
FIGURA 21 – Análise da morfologia nuclear através de microscopia de fluorescência. Células
MLAC cultivadas em lamínulas de vidro. (A) controle, células não tratadas com DODAB e (B) células
tratadas com lipossomo de DODAB, carregado de citocromo c. Após 5 horas de incubação as células
foram lavadas e incubadas por 15 minutos com solução aquosa de Hoechst 33342, lavadas novamente
e através de filtros de ex/em: 350/460 nm as imagens acima foram obtidas.
A técnica de microscopia de fluorescência permitiu a quantificação de núcleos com
características apoptóticas das células MLAC tratadas com lipossomos de DODAB carregado
com citocromo c e suas variáveis, e com MP-11 e suas variáveis, após tratamento de 5 horas.
Para quantificar padronizamos a contagem de 50 células em nove campos diferentes da placa,
adotando os quadrantes da câmara de Newbauer como referência, porém uma referência
imaginária. Mas esta alternativa permitiu a contagem de 450 células/placa de uma maneira
menos aleatória. A figura 22 mostra a porcentagem de núcleos com características apoptóticas
das células após tratamento de 5 horas com os respectivos lipossomos de DODAB.
76
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C
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M
P
-
1
1
0
2
4
6
8
10
12
Núcleos apoptóticos (%)
FIGURA
22 – Porcentagem de núcleos com características apoptóticas após incubação com
lipossomos de DODAB carregados de porfirinas. Células MLAC cultivadas em lamínulas de vidro,
previamente tratadas com poli-ornitina, incubadas por 5 horas com DODAB 0,1 mM carregado com
0,25 mM das respectivas porfirinas. Os núcleos foram corados com solução aquosa de Hoechst 33342
1µg/ml durante 15 minutos, e imagens analisadas por microscopia de fluorescência utilizando filtros
de ex/em: 350/460 nm. Um total de 450 células/ placa foram analisadas.
A análise dos dados obtidos por MTT (figura 19) e dos dados obtidos por microscopia
de fluorescência (figura 22), mostra uma pequena taxa de morte para todas as variáveis
entregues às células via lipossomos de DODAB. Tentar responder se esta baixa taxa de morte
quando utilizamos lipossomos de DODAB deve-se a barreira de entrega e/ou a baixa
eficiência intrínseca do agente causador de morte, foram as próximas etapas do trabalho,
utilizando para isso a técnica de microinjeção das mesmas porfirinas.
Microinjeção das hemoproteínas e hemopeptídeos - Os experimentos de microinjeção
foram realizados com a linhagem de células aderentes MLAC, cultivadas em lamínulas de
vidro previamente tratadas com poli-L-ornitina. Após selecionar uma área da lamínula
77
contendo condições apropriadas ao experimento, uma solução constituída de porfirina (0,5
mM) e marcador fluorescente (Fura-2) foi microinjetada no citoplasma das células escolhidas,
aproximadamente 30 células/experimento. O tampão de fluorescência foi trocado por meio de
cultura termostatizado a 37°C, para favorecer a incubação de no mínimo 2 horas antes da
adição do marcador nuclear Hoechst 33342. No momento da adição deste fluoróforo o meio
de cultura foi substituído novamente pelo tampão de fluorescência, decorridos 15 minutos de
contato células e marcador Hoechst, as células foram lavadas e os núcleos das células
microinjetadas foram analisados através dos filtros de ex/em: 350/460 nm. Cabe ressaltar que
o marcador utilizado para identificar as células microinjetadas (Fura-2), não é o mais
indicado, pois ocorre difusão do mesmo durante longos períodos de incubação. Para contornar
este artefato, a lente objetiva do microscópio permaneceu no mesmo campo em que as células
foram injetadas, evitando assim, analisar núcleos de células que não receberam o tratamento.
As figuras 23A e 23B mostram respectivamente imagens controle de células microinjetadas
apenas com Fura-2, e a análise dos núcleos das mesmas células após 2 horas de incubação.
FIGURA 23 – Imagens do experimento controle de microinjeção. (A) Células MLAC
microinjetadas com Fura-2 como marcador fluorescente, visualizados através de filtros de ex: 340 e
380 nm e em: 510 nm. (B) núcleos das mesmas células corados com marcador nuclear Hoechst 33342
após 2 horas de incubação, visualizados com filtros de ex/em: 350/460 nm. As setas indicam os
núcleos das células microinjetadas.
As porcentagens de núcleos com características apoptóticas após microinjeção das
respectivas porfirinas e incubação de 2 horas estão apresentadas na figura 24. A análise da
morfologia dos núcleos das células injetadas com citocromo c e suas variáveis mostrou alguns
dados interessantes. Como já visualizado em publicações do nosso grupo de pesquisa, das
78
células injetadas com citocromo c nativo, 65 % apresentavam núcleos com características de
núcleo picnótico após 2 horas de incubação (RODRIGUES, 2007). Já quando a proteína
citocromo c base livre e citocromo c zinco substituída foram injetadas, as porcentagens de
núcleos com características apoptóticas diminuíram em relação ao citocromo c nativo, e os
núcleos apresentavam-se apenas condensados e não fragmentados. Associamos às diferenças
de porcentagens e de morfologia nuclear a questão temporal, pois o fato das variáveis de
citocromo c, não serem moléculas nativas e terem átomos do centro ativo removidos ou
substituídos, poderiam levar a uma alteração temporal nos eventos apoptóticos. Para tirar esta
dúvida, repetimos o experimento com tempo de incubação de 5 horas, onde a fragmentação
nuclear foi detectada, mas a porcentagem de núcleos com características apoptóticas não
aumentou. Portanto, a questão de tempo parece estar associada apenas a morfologia nuclear,
investigações com períodos de incubação maiores são necessárias para uma interpretação
mais conclusiva.
Já as microperoxidases que possuem atividade peroxidásica e que supostamente no
interior da célula promoveriam um estresse celular devido ao aumento da propagação radicar
(DUNFORD, 1975), ao contrário do esperado, resultaram nos mais baixos índices de morte
celular.
79
Co
n
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l
e
Cit c
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c
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1
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0
20
40
60
80
100
Núcleos apoptóticos (%)
FIGURA 24 – Porcentagem de núcleos com características apoptóticas após microinjeção das
porfirinas. Células MLAC microinjetadas com porfirinas na concentração 0,25 mM no capilar, após 2
horas as células tiveram seus núcleos corados com solução aquosa Hoechst 33342 e visualizados com
filtros de ex/em: 350/460 nm. As porcentagens foram calculadas em relação ao total de células
microinjetadas.
Núcleo apoptótico é apenas uma das caracterizações do evento apoptótico, portanto
esses dados permitem especular que a cadeia polipeptídica da proteína citocromo c é
fundamental para sua participação no disparo da apoptose, visto que, o hemopeptídeo oriundo
da sua digestão proteolítica, ou seja, permanecendo apenas com 11 resíduos de aminoácidos
porém ainda contendo o centro ativo da proteína (grupamento heme) não foi capaz de induzir
apoptose de forma tão eficiente quanto citocromo c quando microinjetado no citosol das
células MLAC.
Os experimentos descritos até o momento nos permitem identificar a ocorrência ou
não de eventos que compõem o programa de morte celular. Entender quais mecanismos
celulares são ativados ou inibidos quando entregamos as hemoproteínas e hemopeptídeos às
80
células, requer outros estudos. A partir deste momento estudamos alguns dos sinais
envolvidos no processo apoptótico.
Sinalizações celulares durante a exposição celular à hemoproteínas e hemopeptídeos -
De acordo com a via clássica de apoptose intrínseca e/ou extrínseca, a execução do programa
apoptótico somente ocorre mediante ativação de um grupo de proteases, as caspases. Na via
intrínseca ocorre liberação do citocromo c da membrana mitocondrial, e ao chegar ao citosol,
ativa caspase-9 mediante união com proteína Apaf-1 e moléculas de dATP. Uma vez ativada
caspase-9, a cascata de caspases é acionada, ativando as capases efetoras, ou seja, caspase-3, -
6 e -7. Portanto, dosar a atividade da caspase-3 é uma maneira de saber se apoptose é
dependente de caspase ou não, visto que morte celular pode ocorrer sem o envolvimento de
caspases, possivelmente como resultado da disfunção mitocondrial (BOTTON, 2002;
PERFETTINI, 2003).
A capacidade das hemoproteínas e hemopeptídeos, em ativar a caspase-3, foi testada
na fração citosólica das células MLAC. A atividade de caspase foi medida enzimaticamente
utilizando como substrato um peptídeo fluorogênico, Z-DEVD-AMC. O fracionamento
celular foi obtido utilizando digitonina (ver materiais e métodos). Os resultados apresentados
na figura 25 correspondem aos deltas fluorescência da reação, normalizados pela quantidade
de proteína total das amostras e pelo tempo total de reação. Cabe ressaltar que os dados
apresentados tiveram descontados os valores obtidos na presença do inibidor de caspase.
81
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0,2
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1,2
*
*
Atividade de caspase
(
µ
M /mg /hr)
FIGURA 25 – Ativação da caspase-3 por hemoproteínas e hemopeptídeos. Fração citosólica das
células MLAC extraída com o uso de digitonina 0,01%, tratada com 25 µM das respectivas
hemoproteínas e hemopeptídeos. A atividade de caspase foi verificada utilizando substrato
fluorogênico, Z-DEVD-AMC. Os resultados expressam média de n=2 e são normalizados por
quantidade de proteína total e tempo de reação. * corresponde a diferenças significativas obtidas por
Teste T.
A análise dos dados da figura 25 mostra que o controle é constituído de caspase-3
ativa, isso pode ser atribuído (i) ao processo de tripsinização, que é um procedimento
agressivo para a célula, (ii) a digitonina não ter sido seletiva somente para membrana
plasmática, podendo assim ter solubilizado ou extraído citocromo c mitocondrial, além (iii)
das células MLAC já possuírem uma quantidade de caspase-3 ativa, visto que caspase-3 ativa
não é necessariamente sinônimo de morte celular (PERFETTINI, 2003). Em relação às
hemoproteínas e hemopeptídeos testados na fração citosólica das células MLAC, foram
capazes de aumentar a ativação da enzima caspase-3, apenas citocromo c e citocromo c zinco
substituído. Esses resultados permitem especular que a ativação de caspase-3 por citocromo c
é dependente da estrutura nativa da proteína, visto que, somente a forma modificada de
citocromo c que mais preserva sua estrutura nativa, o citocromo c zinco substituído
(VANDERKOOI, 1997) foi capaz ativar caspase-3 de forma tão eficiente quanto o citocromo
82
c nativo. Apesar da figura 25 mostrar maior efetividade para citocromo c zinco substituído, a
diferença não é significativa quando comparado com a atividade da caspase-3 induzida por
citocromo c nativo.
A atividade de caspase-3 também foi testada para fração citosólica de células da
linhagem K562, e surpreendentemente os resultados revelaram que esta linhagem tumoral
possui caspase-3 já no estado ativo.
Outra sinalização celular do processo apoptótico, já bem conhecida e definida, é a
externalização do fosfolipídeo de membrana, fosfatidilserina (PS), da membrana plasmática
interna para a externa. A capacidade das hemoproteínas e hemopeptídeos estudados neste
trabalho de induzirem a externalização do fosfolipídio de membrana PS após microinjetadas
nas células, foi avaliada utilizando a técnica de microscopia de fluorescência. A técnica usual
para quantificar PS é citometria de fluxo, sua utilização foi inviabilizada pois o número de
células microinjetadas é menor que o número de células necessário para detecção no
citometro.
Células da linhagem MLAC foram microinjetadas com soluções 0,25 mM das
respectivas hemoproetínas e hemopepetídeos. Imediatamente após a microinjeção, anexina V-
FITC foi adicionada e imagens sucessivas foram obtidas por um período de 90 minutos,
permitindo assim uma análise temporal do evento. A figura 26 mostra imagens do tempo final
de incubação dos experimentos: controle (A), citocromo c (B), citocromo c zinco substituído
(C) e citocromo c sem o átomo de Fe (D).
83
FIGURA 26 – Imagens de células MLAC tratadas com anexina V - FITC após microinjeção de
hemoproteínas. As células MLAC foram microinjetadas com soluções 0,25 mM das respectivas
proteínas, imediatamente após a microinjeção anexina V – FITC (5µl/ml) foi adicionado ao tampão do
kit de anexina. As imagens foram obtidas com auxilio do
microscópio de fluorescência com filtros
de ex/em:480/510 nm, no final do período de incubação de 90 minutos. Figuras: (A) controle,
(B) citocromo c, (C) citocromo c zinco substituído e (D) citocromo c sem o átomo de Fe.
A análise comparativa das imagens acima mostra algumas mudanças decorrentes da
microinjeção de hemoproteínas. Enquanto a imagem do controle apresenta marcações
pontuais na membrana plasmática, as outras imagens apresentam uma emissão de luz mais
intensa e homogeneamente distribuídas, acompanhado do aparecimento de bolhas e de
marcação nuclear (exceto para citocromo c zinco).
A ocorrência de algum evento celular é nítida levando em consideração as diferenças
observadas nas imagens, como o aparecimento de bolhas, marcação nuclear e a substituição
das marcações pontuais visualizadas no controle por uma emissão de luz mais intensa e
homogeneamente distribuída. As características observadas podem ser atribuídas aos
respectivos eventos celulares: formação de possíveis corpos apoptóticos; perda de
permeabilidade de membrana associada à presença de receptores nucleares de PS (CUI, 2004)
e externalização da PS. Estes experimentos devem ser repetidos e o evento acompanhado por
microscopia confocal, para obtenção de melhores imagens, além da possibilidade de utilizar
outros marcadores fluorescentes na tentativa de elucidar eventos simultâneos a externalização
de PS.
Dos resultados obtidos para as microperoxidases, as mesmas alterações foram
observadas: imagem com emissão de luz mais intensa e homogeneamente distribuída,
84
acompanhado do aparecimento de bolhas, e marcação intensa de núcleos (exceto para MnMP-
11). O fato das microperoxidases não serem capazes de ativar caspase-3, induzirem baixos
índices de núcleos apoptóticos após introduzidos no citosol de células da linhagem MLAC,
além das características observadas com tratamento de anexina V - FITC, leva a hipótese de
que eventos como necrose ou subapoptose podem estar ocorrendo, de acordo Perfettini e
colaboradores, tais eventos ocorrem mesmo quando caspase-3 está inibida. Essa necrose
geralmente envolve vacuolização citoplasmática, ausência de corpos apoptóticos e
condensação de cromatina intensificada (PERFETTINI, 2003).
Talvez com os experimentos futuros possamos correlacionar os baixos índices de
núcleos apoptóticos das microinjeções à ausência de marcação dos núcleos no experimento
com anexina V - FITC, obtidos quando a hemoproteína e hemopeptídeo metais substituídos,
cit- zinco e MnMP-11, foram injetados diretamente no citosol.
Perfil radicalar da apoptose promovida pela entrega de citocromo c e microperoxidase-
11 por lipossomo de DODAB - A tentativa de detectar a geração de radicais livres oriundos
da presença do citocromo c e MP-11 no interior de células das linhagens K562 e
mononucleares entregues via lipossomos de DODAB, foi realizada com auxílio da técnica de
Ressonância Paramagnética Eletrônica.
Após período de incubação de 2 horas das células com DODAB carregado de
citocromo c ou microperoxidase, medidas de EPR foram realizadas na presença de DMPO. A
figura 27A mostra os sinais obtidos da incubação de células mononucleares com lipossomos
carregados de citocromo c, o espectro da primeira medida de EPR contendo células tratadas e
DMPO (linha A) não apresentou sinais de espécies radicalares. Esses resultados indicam que
a quantidade de citocromo c entregue as células não aumentou a produção radicalar
intracelular a ponto de ser detectável. Já a eficiência de entrega do citocromo c às células, foi
verificada testando a atividade peroxidásica do citocromo c fornecendo t-BuOOH como
substrato exógeno (figura 27A linhas B e C).
As medidas de EPR obtidas da incubação de células mononucleares com DODAB
contendo microperoxidase-11 estão na figura 27B.
85
3340 3360 3380 3400 3420 3440
-400
0
400
C
B
A
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (mT)
FIGURA
27A – Espectros de EPR das células mononucleares incubadas com DODAB/cit c.
Células mononucleares na densidade (7 x 10
6
células/ml) foram incubadas por 2 horas, com e DODAB
0,1mM contendo cit c 2 mM no seu interior. Após incubação, as células foram centrifugadas e
ressuspendidas em 200 µl de meio RPMI. Linha A: solução contendo células e DMPO 255 mM.
Linha B: células, DMPO 255 mM e t-BuOOH 25 µM. Linha C: células, DMPO 255 mM e t-BuOOH
75 µM. As condições do espectrômetro foram, amplitude de modulação 0,05 mT, microondas 20 mW,
temperatura ambiente, tempo de leitura 2 min, escala de 100 Gauss e ganho de 1.6 x 10
4
.
86
3340 3360 3380 3400 3420 3440
-600
0
600
1200
C
B
A
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (mT)
FIGURA 27B – Espectros de EPR das células mononucleares incubadas com DODAB/MP-11.
Células mononucleares na densidade (7 x 10
6
células/ml) foram incubadas por 2 horas, com e DODAB
0,1mM contendo MP-11 1 mM no seu interior. Após incubação, as células foram centrifugadas e
ressuspendidas em 200 µl de meio RPMI. Linha A: solução contendo células e DMPO 255 mM.
Linha B: células, DMPO 255 mM e t-BuOOH 25 µM. Linha C: células, DMPO 255 mM e t-BuOOH
75 µM. As condições do espectrômetro foram, amplitude de modulação 0,05 mT, microondas 20 mW,
temperatura ambiente, tempo de leitura 2 min, escala de 100 Gauss e ganho de 1.6 x 10
4
.
A figura 27A mostra que após as células mononucleares terem sido incubadas com
DODAB contendo moléculas de citocromo c, nenhuma espécie radicalar foi encontrada com
altas concentrações do spin trapping DMPO (linha A), e mesmo após sucessivas adições de
substrato exógeno (linhas B e C). O que já não ocorreu quando as células foram incubadas
com DODAB carregado de MP-11, pois espectro de espécie radicalar foi detectado quando t-
butil foi adicionado (figura 27B, linha B) e sua intensidade aumentada com concomitante
aumento de substrato exógeno (figura 27B, linha C). A espécie radicalar detectada na linha C
da figura 27B corresponde a uma mistura de radicais como metiloxil e butiloxil proveniente
da clivagem homolítica do peróxido, a mesma espécie foi detectada em estudo da reatividade
de microperoxidase com peróxidos na presença de micelas de CTAB (PRIETO,2004a).
Resultados semelhantes foram obtidos para a linhagem leucêmica K562.
87
Para auxiliar no esclarecimento dos resultados obtidos com a técnica de EPR,
estudamos a viabilidade celular por redução de MTT, das linhagens K562 e mononucleares
quando submetidas as mesmas condições experimentais utilizadas nos ensaios de EPR.
O experimento teve período total de incubação de 5 horas, com adição do peróxido t-
BuOOH no tempo de 3 horas de incubação. A figura 28 contém as porcentagem de células
viáveis após incubação com lipossomos de DODAB carregados com citocromo c e
microperoxidases seguida da adição de peróxido.
C
on
trole
D
ODA
B
C
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MP-11
0
20
40
60
80
100
*
% Viabilidade Celular (MTT)
FIGURA 28 – Viabilidade celular de células mononucleares incubadas com DODAB/cit c e
DODAB/MP-11 na presença de t-BuOOH. Células mononucleares na densidade 1 x 10
5
células/poço foram incubadas por 3 horas com DODAB 0,1 mM contendo MP-11 (1 mM) e cit c
(2mM). Após 3 horas de incubação t-BuOOH 75 µM foi adicionado e mais 2 horas de reação foram
esperadas antes da adição de MTT. Barras preta: células não lavadas. Barras cinza: células lavadas.
* teste T - diferença significativa comparada ao controle negativo, DODAB.
Os resultados do ensaio de viabilidade celular realizado nas mesmas condições
experimentais que o ensaio de EPR, mostram que apenas lipossomos de DODAB carregado
de MP-11 foram capazes de induzir morte celular na presença de peróxido nas células
mononucleadas. Esses resultados somados aos resultados de EPR, em que o radical t-butiloxil
88
foi identificado apenas nas incubações das células com DODAB/MP-11, permite a
interpretação de que uma vez dentro das células, citcromo c e microperoxidase-11 possuem
comportamentos diferentes. Citocromo c provavelmente não exerce sua atividade
peroxidásica de forma tão eficiente quanto microperoxidase, visto que, a clivagem de
peróxido ocorre somente após sua prévia coordenação com o átomo de ferro do centro ativo
das peroxidases (DUNFORD, 1991; BAEK, 1989), e o fato das microperoxidases não
possuírem a metionina como sexto ligante favorece essa coordenação e subseqüente clivagem
do peróxido. Outro fator que corrobora para diminuição da atividade peroxidásica do
citocromo c no interior das células, é ter o ferro no seu estado reduzido Fe(II) no citosol.
Dados da literatura mostram que citocromo c Fe(II) não é capaz de ativar caspase-3 (LI,
2008), isso ajuda a explicar os resultados de viabilidade celular, onde apenas células incubas
com DODAB/MP-11 foram afetadas, provavelmente devido a geração de radicais livres
oriundos da reação de MP-11 com t-BuOOH.
89
5.
CONCLUSÕES E SUGESTÕES
Dos estudos comparativos feitos com lipossomos e microinjeção em diferentes
linhagens de células: K562, MLAC e mononucleares, concluímos que a causa de baixa taxa
de morte celular observada para todas as hemoproteínas e hemopeptídeos estudados decorre
da baixa eficiência do DODAB como carreador para as células estudadas.
A análise comparativa dos resultados obtidos com hemoproteínas e hemopeptídeos
microinjetados nos revela que nem todos são eficientes em induzir morte de forma tão
eficiente quanto citocromo c nativo. Dessa forma, núcleos com características apoptóticas
foram visualizados para todas as espécies microinjetadas, porém nenhuma delas induziu altos
índices de núcleos apoptóticos comparado ao citocromo c nativo. Já ativação de caspase-3
somente foi significativa com a estrutura nativa ou muito próxima da nativa de citocromo c,
neste caso, citocromo c zinco substituído. Por outro lado, alterações na membrana plasmática
com formação de bolhas, e marcação de PS foram visualizadas para todas as espécies, mas a
presença de metais diferente ao metal nativo que é o ferro, tanto na hemoproteína como no
hemopeptídeo, impediu a visualização de eventos nucleares. Isso pode estar relacionado ao
potencial redox do Fe sinalizar eventos nucleares, os quais são inibidos com a substituição do
metal no centro ativo, para melhor esclarecimento novos estudos são necessários.
O fato das microperoxidases não ativarem caspase-3, induzirem baixos índices de
núcleos apoptóticos e permanecerem com atividade peroxidásica inalterada, levam a acreditar
que a atividade peroxidásica é a principal causa de morte celular.
90
Sugestões
Levando em consideração os resultados obtidos durante o período de doutoramento,
algumas propostas futuras para a continuidade do trabalho:
• Acompanhar as microinjeções por microscopia confocal, para obter imagens melhores
e tentar acompanhar eventos simultâneos com diferentes marcadores celulares;
• Estudar novos carreadores;
• Testar outros agentes de morte, como citocromo c cobre substituído;
• Testar porfirinas sintéticas como agentes de morte;
• Estabelecer análises de EPR para linhagens celulares.
91
6.
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104
ANEXO I - Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins Modulated by Different
Microenvironments: Interesting Devices for Nanotechnology
In: Inorganic Biochemistry: Research Progress ISBN 978-1-60456-708-3
Editors: J. G. Hughes and A. J. Robinson, pp. © 2008 Nova Science Publishers, Inc.
First pate affiliation: Country missing
Chapter 3
CATALYTIC ACTIVITY OF IRON AND MANGANESE
PORPHYRINS MODULATED BY DIFFERENT
MICROENVIRONMENTS: INTERESTING DEVICES
FOR NANOTECHNOLOGY
Katia C. U. Mugnol
1
, Tatiana Prieto
1
, Clemerson F. B. Dias
1
,
Marcela S. C. Silva
1
, Juliana C. Araújo
1
, Francisco L. Souza
1
, Ana
Maria Carmona-Ribeiro
2
, Yassuko Iamamoto
3
,
Otaciro R. Nascimento
4
and Iseli L. Nantes
1,*
1
Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica – CIIB, Universidade de Mogi das
Cruzes
2
Depto de Bioquímica Universidade de São Paulo
3
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras da USP de Ribeirão Preto
4
Grupo de Biofísica, Instituto de Física, Universidade de São Paulo, São Carlos
ABSTRACT
In living cells, different biological functions such as molecular oxygen transport,
hydroxylation of organic compounds, peroxide homolytic and heterolytic cleavages and
electron transport are performed by one exclusive moiety: iron protoporphyrin IX. This
multiplicity of functions is possible due to the different microenvironments and heme
iron ligands provided by different apoproteins. In this study, it is described a mimicking
of Nature strategy, in which, different iron or manganese porphyrins had catalytic
properties modulated by the hydrophobic microenvironment of micelles, liposomes, the
mesoporous silica MCM-41 and apocytochrome c. The association to micelles, liposomes
*
Corresponding author: [email protected], Phone: +55-11-4798-7103, FAX: +55-11-4798-7102, Centro
Interdisciplinar de Investigação Bioquímica – CIIB, Universidade de Mogi das Cruzes – UMC. Av. Dr. Cândido
Xavier Almeida Sousa, 200 CEP 08780-911, Mogi das Cruzes – SP, Brazil.
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 2
and protein and the activity of these catalysts were probed for hydrogen peroxide, tert-
butylhydroperoxide (t-BuOOH) and diphenylacetaldehyde (DPAA) and analyzed by
electronic absorption spectra, EPR measurements and atomic force microscopy (AFM).
The Fe(III) protoporphyrin IX, in homogeneous medium, exhibited catalase-like
activity on hydrogen peroxide and peroxidase activity on t-BuOOH and exclusively
peroxidase activity when associated to cationic micelles of CTAB and DODAB
liposomes. In SDS liposomes, protoporphyrin IX became more buried in the micelle core
than in CTAB micelles and exhibited a more intense bleaching during the reaction with
peroxides. Besides peroxides, DPAA was also used as the reducing agent for these
systems and accelerated the completion of the peroxidase catalytic cycle. Peroxidase and
oxidase activities were also exhibited by the non-covalent complex of protoporphyrin IX
with apocytochrome c. The peroxidase activity of heme c in microperoxidases and native
cytochrome c, was modulated in micelles and liposomes by the partition of the substrates
in the lipid aggregates. For cytochrome c, the limiting catalytic step was the access of the
peroxide to the heme pocket. The capacity of histidine to act as an acid-base catalyst in
the peroxidase cycle of microperoxidases was favored in conditions in which the
coordination with the metal was disfavored, i.e., in DODAB liposomes and replacing iron
by manganese. The catalytic activity of the meso-tetrakis(2,6-dichloro-3-
sulfonatophenyl) porphyrin (Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP) was also investigated. This
porphyrin exhibited peroxidase but not catalase activity in homogeneous and
heterogeneous media. In DODAB liposomes the addition of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP led
the vesicles to assembly in a wire-like manner. The Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP and its
Zn2
+
- substituted form were extremely efficient to induce folding of apocytochrome c
that did not exhibit peroxidase activity. The peroxidase activity of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP was also studied in CTAB micelles and DODAB liposomes in the absence and in
the presence of histidine that significantly favored the catalytic activity.
INTRODUCTION
The Porphyrins
The term porphyrin has the origin in the ancient Greece and it was used to describe the
color purple used by the kings and very rich persons for to tincture his clothes. Because the
color of these compounds, this term was also used to name one class of organometalic
molecules: the porphyrins. Porphyrins are defined as a “large class of deeply colored or
purple, fluorescent crystalline pigments, of natural or synthetic origin, having in common a
substituted aromatic macrocycle ring consisting of four pyrrole-type residues, linked together
by four methane bridging groups” [
1]. Variations of the basic structural theme of this
tetrapyrrolic macrocycle including different metal centers and further different
microenvironments are able to provide a wide diversity of biochemical functions for the
porphyrins. The biological importance of the porphyrins is unquestionable. In the living
organisms, they are essential, for the molecular oxygen transport, prevention of the oxidative
stress, respiratory chain, apoptosis and biological synthesis, including the photosynthesis in
plants. Interestingly, all the biological functions cited above are played by metalloporphyrins
associated to proteins that provide appropriate microenvironments for specific activities.
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 3
Hemoglobin, myoglobin, catalase, NO sinthase and cytochromes are examples of
hemeproteins.
By mimicking Nature, scientists have manipulated the properties of porphyrins for
applications in medicine and nanotechnology. In this regard, water-soluble synthetic
porphyrins are structurally simpler than native porphyrins derivatives making easier the
interpretation of the structure-function relationship [2]. Therefore, synthesis of porphyrins has
gained special attention in recent years because of their importance in bioorganic and
bioinorganic chemistry and their applications in biomedical sciences. These porphyrins are
used, for example, to mimic the function of hemeproteins such as cytochrome P-450 in
oxidative catalysis, as photosensitizers in photodynamic therapy of cancer (PDT), in electron
transport chains and as building blocks in molecular devices. Each research area requires
porphyrins with different and specific structural features, bearing a variety of different
substituents [3].
In recent years, it has been observed a growing interest in the use of porphyrins and
related compounds as therapeutic drugs. They have been applied in important areas of
medicine as oncology, angiology, parasitology and infectology. In oncology, porphyrins have
been used in the diagnosis and treatment of cancer, especially as photosensitizers in
photodynamic therapy [
4]. More recently, porphyrins have exhibited potential to be applied
also in the treatment of nonmalignant conditions such as psoriasis, blocked arteries, and viral
and bacterial infections.
Besides medicine, the photochemical properties of porphyrins allow them to be applied in
the treatment of effluents to degrade chlorinated phenolic compounds. These compounds are
frequently found as pollutants in wastewater and originate from sources as diverse as the
wood-pulp industry, water purification and production of synthetic pesticides, polymers,
detergents, and others. The impact caused on environment by these compounds has led to an
increasing interest not only in developing new methods for promoting the decomposition of
such materials in aqueous medium but also in the identification of their products. Phenolic
compounds can be degraded by several catalytic systems, but frequently, the catalysts and the
main products of oxidation are more toxic than the starting materials. Photochemical
oxidation, particularly using molecular oxygen, is undoubtedly one of the most important of
these methodologies, since it does not liberate any additional pollutant. Porphyrins,
metalloporphyrins and phthalocyanines have been shown to be highly effective triplet state
photosensitizers able to produce singlet oxygen in high quantum yield.
A water soluble metal
complex, iron meso-tetrakis(2,6-dichloro-3-sulfonatophenyl)porphyrin, has been used as
photosensitiser for the degradation of 4-chlorophenol [
5].
Not only photochemistry but also the catalytic activity of porphyrins has also large
application in medicine and nanotechnology. In medicine, the use of porphyrins and related
compounds exhibiting manganese as metal center revealed potential to be used as antioxidant
catalysts. In nanotechnology, the peroxidase activity of porphyrins can be used in devices
such as electrodes, biosensors and degradation of waste products of effluents.
The comprehension of the role played by porphyrins in physiological and pathological
processes as well as their application in medicine and nanotechnology requires the knowledge
of the catalytic strategies used by these compounds to cleave peroxides.
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 4
The Peroxidase Activity of Porphyrins
As commented above, in living organisms, different biological functions such as
molecular oxygen transport, hydroxylation of organic compounds, peroxide homolytic and
heterolytic cleavage, electron transport, O
2
sensing and nitric oxide transport are performed
by one exclusive moiety: iron Protoporphyrin IX, the heme group. The different
microenvironments and the heme iron ligands provided by different apoproteins are the
responsible for this multiplicity of Protoporphyrin IX functions [
6]. Particularly, the cleavage
of peroxides is promoted by a class of enzymes known as peroxidases. Peroxidase is the
enzyme class that contain the heme group, usually the protoporphyrin IX as the catalytic
center. These enzymes are activated by peroxides to high valence states that are able to
oxidize a wide variety of substrates. The peroxidases are classified in the two super families.
The first one includes plant, fungal and bacterial peroxidases and the second one the
mammalian peroxidases, that exhibit a peculiar characteristic, the presence of covalent bonds
between the heme group and the apoprotein [
7]. In myeloperoxidases, lactoperoxidase and
eosinophil peroxidase these covalent links are two ester bonds between aspartic or glutamic
amino acid residues and hydroxyl groups on the 1- and 5- methyl groups of the heme. The
mieloperoxidase exhibits also a third covalent bond between one of its vinyl groups and the
methionine residue [8,9]. Also the nature of the proximal iron ligand present in the peroxidase
and some structural characteristics influence directly the properties of the peroxidases
[
10,11]. The proximal ligands of the heme iron including a histidine in peroxidase, a
tyrosinate in the catalase and a cysteinate in cytochrome P450 respond for the different
catalytic mechanisms exhibited by these enzymes.
Hydrogen peroxide and organic peroxides are frequently generated in cells; the former by
the dismutation of superoxide ion, a side product generated by the incomplete reduction of
molecular oxygen in the respiratory chain and, the latter, by the oxidation of organic
molecules such as the unsaturated lipid acyl chains. The peroxides can be homolytically
cleaved by transition metal ions such as Cu(II) and Fe(II) generating the highly reactive
hydroxyl and alkoxyl free radicals prone to damage biomolecules such as lipids, proteins and
DNA. To avoid the generation of these deleterious reactive species, cells rely on the activity
of catalase and gluthatione peroxidase. Glutathione peroxidase is not a hemeprotein and so, it
is not the focus of the present discussion. Catalase is a hemeprotein that, in physiological
conditions, degrades exclusively hydrogen peroxide according the following catalytic cycle.
PorFe(III) + HOOH Por+Fe(IV)=O + HOH (1)
PorFe(IV)=O + HOOH PorFe(III) + HOH + O
2
(2)
In the first step, the native enzyme is oxidized by hydrogen peroxide to the high valence
intermediate oxoferryl π-cation (Compound I, Eq. 1). The highly oxidant enzyme
intermediate promotes a two electron oxidation of a second hydrogen peroxide molecule to
molecular oxygen and is converted to the native valence state (Eq.2). However, the use of
hydrogen peroxide as a two electron reducing agent of Compound I is an exclusive
characteristic of catalase. The other peroxidases use hydrogen peroxide as an activator to
become able to oxidize a wide variety of organic compounds. The first step of the peroxide
cleavage promoted by peroxidases is the formation of Compound 0 in which the deprotonated
ligand at the sixth coordination position was replaced by the hydroperoxide (Eq. 3). After the
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 5
formation of Compound 0, there are two possible mechanisms for the cleavage of peroxides
(ROOH): a heterolytic cleavage generating the alcohol derivative (ROH) and Compound I
(Eq.4), which reacts another peroxide molecular generating Compound II and the peroxyl
radical (ROO
.
) (Eq.6) or a hemolytic cleavage of ROOH to form Compound II directly
(Eq.5). Whatever the mechanism for peroxide cleavage, the porphyrins native form can be
regenerated after the reaction of Compound II with another ROOH molecular or another
reducing agent (Eq.7) [
12,13].
PorFe(III)-OH
Por
+
Fe(IV)=O
PorFe(IV)=O
ROOH
ROH
ROO
.
ROO
.
(heterolytic cleavage)
(3)
+
+
+
+
RO
.
(homolytic cleavage)
(4)
PorFe(III)MP-9
Por
+
Fe(IV)=O
+
PorFe(IV)=O
+
PorFe(III)MP-9
-
OOR
PorFe(III)
-
OOR
+
(5)
(6)
PorFe(IV)=O
+
PorFe(III)
+
(7)
ROOH
ROOH
ROOH
HOH
The horseradish peroxidase, the more extensively peroxidase studied, has the ability to
act on a wide variety of substrates and also due to the innumerous applications in
nanotechnology [
14,15,16]. Horseradish peroxidase is a generic term because the root of
horseradish (Armoracia rusticana) contains a number of distinctive isoenzymes. The C type
(HRP C) is the most abundant and comprises a single polyeptide chain with 308 amino acid
residues and five possible oxidation states formed during the peroxidase and oxidase cycles of
the enzyme: ferrous, ferric, compounds I and II and oxy-ferrous [
17]. In the peroxidase cycle,
the Fe(III) heme iron of the resting enzyme coordinates a desprotonated hydrogen peroxide
molecule to form Compound 0. Literature data suggest, in this step, that His42 acts, at neutral
pH, as a proton acceptor and then as a proton donor (base and acid catalyst respectively). This
mechanism is consistent with the observed slower rate and lower efficiency of heterolytic
cleavage exhibited by HRP at acid pH. Arg38 is influential in lowering the pKa of His42, as
well as in aligning HOOH in the active site, but it does not play a direct role in proton
transfer. After the formation, Compound 0 is converted in Compound I (oxoferryl π-cation
radical) by the heterolytic cleavage of HOOH and generates the reduced form of the peroxide
(water for HOOH and alcohol-derived for ROOH). Compound I is converted to Compound II
(oxoferryl heme iron) by attacking another peroxide molecule or another reducing agent as
depicted by Scheme 1. The peroxidase cycle is completed when Compound II attacks another
molecule of the reducing agent and the enzyme returns to the native form. In the oxidase
cycle the ferric enzyme can be reduced to the ferrous form and, in the presence of molecular
oxygen, converted to Compound III. The electronic structure of Compound III of HRP is
similar to that of oxymyoglobin and oxyhemoglobin and can be described as Fe(II)-O
2
or the
isoelectronic Fe(III)-O
2
•-
. The dioxygen bound to HRP has a significant superoxide character
and is highly reactive. Compound III can also be generated by the reaction of Compound II
with excess of peroxide and can return to the native form by the detachment of the superoxide
ion [
18,19].
Besides, peroxidases, other hemeproteins such as cytochrome c, myoglobin, neuroglobins
and cytoglobins also exhibit peroxidase activity in cells. Regarding cytochrome c, the
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 6
peroxidase activity of this hemeprotein on cardiolipin should be involved in its detachment
from the inner mitochondrial membrane to attain the cytosol and trigger apoptosis [
20]. Also
in the apoptosis event, the oxidation of the plasmatic membrane lipid, phosphatidylserine, by
cytochrome c seems to be important for the externalization of the phospholipid and signaling
for macrophage fagocitosis [
21]. More recently, it has been demonstrated that SOD1 controls
cytochrome c-catalyzed peroxidation in vitro when superoxide is available. The presence of
SOD1 promoted a significant increased in the rate of ROS production in mitoplasts, which are
devoid of outer membrane, and in the intermembrane space. In this study, superoxide ion
production was increased by inhibition of respiration promoted by antimycin A. Besides
SOD, cytochrome c can also efficiently oxidize superoxide to oxygen and thus, act as a true
antioxidant by scavenging superoxide without production of secondary ROS [
22]. The
authors hypothesized that, upon mitochondrial stress, SOD1 might compete with cytochrome
c for superoxide in the intermembrane space. The SOD1 activity generates hydroperoxide,
which then could react with cytochrome c and form the peroxidase compound I-type
intermediate able to cleave peroxides and increase ROS production and cell injury [
23].
Peroxidase Models
The study and use of peroxidases comprise natural enzymes and peroxidase models. The
models discussed in the present work are: different types of porphyrins in homogeneous and
heterogeneous media, microperoxidases obtained by tryptic digestion of cytochrome c also in
homogeneous and heterogenous media, non-covalent complex of cytochrome c with
protoporphyrin IX and synthetic porphyrins and native cytochrome c. Catalytic properties
modulated by the metal center are also discussed. The catalytic activity of two types of
porphyrins: iron and manganese protoporphyrin IX and iron and manganese mesotetrakis
tetraphenyl sulfonated porphyrins was studied in different microenvironments.
RESULTS
The Catalytic Activity of Protoporphyrin IX Modulated by the
Microenvironment and Ligands of the Metal Center
The peroxidase and oxidase activities of iron and manganese protoporphyrin IX was
probed in homogeneous medium and compared with that exhibited in different
microenvironments provided by micelles, liposomes and associated proteins.
Free Protoporphyrin IX in Homogeneous and Heterogeneous Medium
Figure 1A shows the spectral changes of Fe(III) protoporphyrin IX observed after the
addition of hydrogen peroxide. Before the addition of hydrogen peroxide, Fe(III)
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 7
protoporphyrin IX presents a broad band at 300-400 nm region that encompass Soret and N
bands. After the addition of hydrogen peroxide, it was observed a progressive decrease and
blue shift of the broad band. A multi peaks fit revealed that the spectral changes come from
the decrease of Soret and N band intensities accompanied by ~ 10 nm blue shift of the N band
(not shown). Fe(III) protoporphyrin IX revealed also oxidase activity on
diphenylacetaldehyde (DPAA) (Figure 1B). The addition of DPAA in a buffered solution of
Fe(III) protoporphyrin IX resulted in spectral changes suggestive of porphyrin iron reduction
in the presence of axial ligands, since Soret band exhibited around 20 nm red shift and the Q
bands α and β became marked. However, in this condition, the peaks of β and α bands are
significantly red shifted (533 and 563 nm, respectively) as compared with ferrous cytochrome
c and this spectral characteristic is discussed bellow. Figure 1C shows the spectral changes of
Fe(III) protoporphyrin IX after hydrogen peroxide addition followed by DPAA addition after
the formation of Compound I. The spectral features of the intermediates are suggestive of the
formation of Compound I (dotted line) and ferrous protoporphyrin IX (thick solid lines). To
clarify the reaction mechanism of peroxide cleavage exhibited by protoporphyrin IX in the
absence and in the presence of DPAA, it was run the kinetic of the changes in the oxygen
concentration occurred in the course of the reactions (Figure 1D). Figure 1D shows that, in
the absence of DPAA, the reaction of protoporphyrin IX with hydrogen peroxide led to
oxygen evolving that is compatible with a catalase mimetic mechanism in which the
heterolytic cleavage of hydrogen peroxide resulted in the formation of water and
protoporphyrin IX Compound I. In the following, the high valence species of protoporphyrin
IX abstracts two electron of a second hydrogen peroxide molecule leading to molecular
oxygen evolving, formation of a second water molecule and the regeneration of Fe(III)
protoporphyrin IX (Figure 1D, closed balls). The low rate of Compound I reduction by
hydrogen peroxide led to a steady state in which the high valence state of protoporphyrin IX
is detected. When DPAA is added in the system, it promotes one electron reduction of
Compound I leading to the formation of Compound II. Compound II is reduced to Fe(III)
protoporphyrin IX that is converted in ferrous protoporphyrin IX by two subsequent one
electron abstractions of DPAA. Being DPAA an efficient reducing agent for Compound I, II
and Fe(III) protoporphyrin IX, it was detected only the conversion of Compound I to ferrous
protoporphyrin IX. In this condition, the abstraction of electrons from DPAA molecules
generates free radicals responsible for the oxygen consumption observed after the addition of
the aldehyde (Figure 1D, openned balls). Furthermore, when hydrogen peroxide was replaced
by t-BuOOH, from which it is not possible two concomitant electron abstractions, only the
Compound II spectrum was detected and the protoporphyrin IX completed a peroxidase
catalytic cycle by using the peroxide also as a reducing agent for Compound II (Figure 1E).
Binding of porphyrins and metalloporphyrins to the simplest models of membranes (ionic
surfactants) has attracted much interest due to the possibility of understanding many of their
biological and photochemical processes such as photosynthesis, oxygen transport, oxidation–
reduction, and electron transport. High affinity and phototoxicity of sulfonated meso-
tetraphenylporphyrins (TPPS) to tumor cells points out these compounds as promising
compounds for possible use in photodynamic therapy (PDT) [
24,25].
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 8
250 300 350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
500 550 600 650
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
A
Wavelength (nm)
A
250 300 350 400 450
0.0
0.3
0.6
0.9
500 550 600 650
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
B
A
Wavelength (nm)
300 350 400 450
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
520 585
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
C
A
Wavelength (nm)
Figure 1. (Continued)
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 9
0 1020304050607080
0
40
80
120
160
200
240
D
DPAA
O
2
(nmol)
Time (min)
300 350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
450 500 550 600 650
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
E
A
Wavelength (nm)
Figure 1. A – Spectral changes of 100 µM Fe(III) protoporphyrin IX during the reaction with 150 µM
hydrogen peroxide in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 and. B – Spectral changes of 100 µM Fe(III)
protoporphyrin IX during the reaction with 100 µM DPAA in 5mM phosphate buffer pH 7.4. C –
Spectral changes of 100 µM Fe(III) protoporphyrin IX during the reaction with 150 µM hydrogen
peroxide in 5mM phosphate buffer pH 7.4 and (dotted line) followed by 100 µM DPAA addition (thin
solid line). D – Kinetic of the changes in the oxygen concentration in the course of the reaction with
hydrogen peroxide (closed balls) and the same reaction followed by DPAA addition (open balls). E –
Spectral changes of 100 µM Fe(III) protoporphyrin IX during the reaction with t-BuOOH in 5mM
phosphate buffer pH 7.4 (dotted line), 60 min after t-BuOOH addition (dashed line) and 100 and 120
min after t-BuOOH addition (low and up thin solid lines, respectively).
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 10
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and dioctadecyldimethylamonium bromide
(DODAB) (Scheme 2, A and B, respectively) are surfactant that, in aqueous media, form
micelles and liposomes, respectively. The properties of these surfactants have been
extensively studied and include the ability to provide special environmental conditions for
catalysis [
26,27,28,29].
CH
3
N
CH
3
CH
3
CH
3
+
Br
A
N
H
3
C
H
3
C
CH
3
CH
3
Br
+
B
Scheme 2. A – CTAB molecular structure. B – DODAB molecular structure.
To mimic the hydrophobic microenvironment pocket provided by the proteins in the
structure of hemeproteins, Fe(III) protoporphyrin IX was associated to CTAB and SDS
micelles. Figure 2A shows the spectrum of Fe(III)
protoporphyrin IX in aqueous buffered
solution (black dotted line), associated to CTAB (thin solid line) and SDS (thick solid line)
micelles. The spectral changes, i.e., red shift and ε increase of Soret band, are indicative that,
in the presence of micelles, the porphyrin is buried in the micelle core. Considering that
protoporphyrin IX exhibits negative net charge due to the presence of two propionate groups,
the spectral differences exhibited by the porphyrin in positively and negatively charged
micelles could be assigned to the fact that in CTAB micelles the porphyrin ring could be more
exposed out of the micelle than in SDS micelles, in which it should be completely buried to
avoid the negative charge in the surface.
Figure 2B and C shows the spectral changes that accompany the reaction of Fe(III)
protoporphyrin IX with respectively, t-BuOOH and hydrogen peroxide, both in CTAB
micelles. In this condition, after t-BuOOH addition, it was observed a slight (2 nm) red shift
and decrease of the Soret band assigned to the formation of Compound II accompanied by
bleaching of the chromophore. The Soret band bleaching occurred probably due to attack of
the porphyrin ring by the free radicals generated from the peroxide cleavage. Similar results
were obtained with hydrogen peroxide (Figure 2C) suggesting that the association with
CTAB micelles precludes the porphyrin to act as a catalase.
The association of protoporphyrin IX with CTAB micelles does not preclude the oxidase
activity of the catalyst on DPAA. Figure 2D shows the spectra of protoporphyrin IX before
and at different times after the addition of DPAA in CTAB micelles. In this condition,
similarly to that was observed in homogeneous medium, despite the absence of a peptide
chain to provide heme iron ligands, the Q bands α and β were well defined. This fact suggests
that the products of DPAA oxidation such as peroxides or carboxylic acids could coordinate
with the heme iron. Another possibility is the coordination of reduced heme iron with
molecular oxygen since, the reduction of protoporphyrin IX by dithionite that depleted
molecular oxygen of the medium led to the formation of a high spin form of heme iron (not
shown). However, considering that in DODAB liposomes, the spectrum of the reduced heme
iron in low spin form was not present even in the presence of oxygen, the coordination of
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 11
heme iron with DPAA derivatives is the most reasonable possibility (see bellow). Similarly,
the association of protoporphyrin IX with DODAB liposomes does not preclude the oxidase
activity of the catalyst on DPAA. Figure 2E shows the spectral changes that accompany the
reduction of protoporphyrin IX by DPAA in DODAB liposomes. In this condition, the
spectral changes are suggestive of the formation of reduced heme iron in the high spin state.
This result suggests that DPAA oxidation generates a hydrophilic compound that in CTAB
micelles could coordinate with heme iron without complete burying inside micelle, while in
the large hydrophobic core of DODAB bilayer the complete burying of the porphyring could
preclude the coordination. The nature of the heme iron ligand produced during the DPAA
oxidation remains a challenge. In comparison with DPAA-reduced protoporphyrin IX,
literature data [
30] shows that this porphyrin coordinated with imidazole exhibited very
similar Q bands with maximal at 532 and 566 nm, but in this condition the electronic
absorption spectrum exhibited a double Soret band peaking at 417 and 442 nm. A narrow
Soret band peaking at 406 nm was observed only for ferric microperoxidase coordinated with
imidazole and tryptophan. Future studies of Raman spectroscopy can elucidate the nature of
heme iron ligand after protoporphyrin reduction by DPAA.
250 300 350 400 450
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
500 550 600 650 700 750
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
A
A
Wavelength (nm)
300 375 450
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
525 600
0.000
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.10
B
A
Wavelength (nm)
Figure 2. (Continued)
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 12
300 350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
450 525 600
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
C
A
Wavelength (nm)
320 360 400 440
0.00
0.2
0.4
0.6
480 520 560 600 640
0.000
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
D
A
Wavelength (nm)
320 360 400 440 480
0.000
0.008
0.08
0.12
0.16
500 550 600
0.000
0.02
0.04
0.06
E
A
Wavelength (nm)
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 13
Figure 2. A – Spectral differences of Fe(III) protoporphyrin IX in homogeneous and heterogeneous
medium. Protoporphyrin IX in 200 mM Tris-HCl pH 8,5 (dotted line), in CTAB micelles (thin solid
line) and in SDS micelles (thick solid line). B – Spectral changes of Fe(III)
protoporphyrin IX due to
the association with CTAB micelles and the conversion to Compound II. Fe(III)
protoporphyrin IX in 5
mM phosphate buffer, pH 7.4 (dotted line), Fe(III)
protoporphyrin IX associated to 60 mM CTAB
micelles in 5 mM phosphate buffer, pH 7.4 (dashed line) and 100 min after the addition of 0.3 mM t-
BuOOH (thick solid line). C – Spectral changes of Fe(III)
protoporphyrin IX in CTAB micelles during
the reaction with hydrogen peroxide. Fe(III)
protoporphyrin IX associated to 60 mM CTAB micelles in
5 mM phosphate buffer, pH 7.4 (dashed line) and 100 min after the addition of 0.3 mM hydrogen
peroxide (thick solid line). D – Spectral changes that accompany the reduction of Fe(III)
protoporphyrin IX by DPAA in the presence of CTAB micelles. Fe(III) protoporphyrin IX associated to
60 mM CTAB micelles in 5 mM phosphate buffer, pH 7.4 (dashed line), 30 min (thin solid line) and 50
min (thick solid line) after the addition of 20 mM DPAA. E – Spectral changes that accompany the
reduction of Fe(III)
protoporphyrin IX by DPAA in the presence of DODAB vesicles. Fe(III)
protoporphyrin IX associated to 1mM DODAB vesicles in 5 mM HEPES buffer, pH 7.4 (dashed line)
and 3600 s after the addition of 20 mM DPAA (solid line).
A different microenvironment for heme iron was provided by the association of
protoporphyrin IX with apocytochrome c that leads to the formation of a cytochrome c non-
covalent complex [
31]. Previously we have characterized that the cytochrome c non-covalent
complex, folded at pH 7.4, exhibited pentacoordinated heme iron in the high spin state [
32].
Differently of protoporphyrin IX in homogeneous polar medium (Figure 1A) but similarly to
the same porphyrin inside the hydrophobic core of micelles and liposomes, cytochrome c
non-covalent complex did not work as a catalase since exhibited spectral changes suggestive
of the conversion to Compound II (Figure 3A, thick solid line). Further, the catalyst returned
to the ferric form and completed a peroxidase cycle after the addition of DPAA (Figure 3B,
thick solid line).
300 350 400 450
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
500 550 600 650
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
A
A
Wavelength (nm)
Figure 3. (Continued)
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 14
300 360 420 480
0.00
0.06
0.12
0.18
0.24
0.30
0.36
0.42
480 560 640
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
B
A
Wavelength (nm)
Figure 3. A – Spectral changes that accompany the reaction of cytochrome c non-covalent complex, a
prothoporphyrin IX incorporated by apocytochrome c in 5 mM phosphate buffer pH 7.4, with hydrogen
peroxide. Cytochrome c non-covalent complex (dotted line), 100 (thin solid line) and 6000 s (thick
solid line) after the addition of 150 µM hydrogen peroxide. B – Spectral changes of cytochrome c non-
covalent complex with a prothoporphyrin IX in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 during the reaction with
hydrogen peroxide and DPAA. Cytochrome c non-covalent complex (dotted line), 2600 s after the
addition of 150 µM hydrogen peroxide (thin solid line) and immediately (thick solid line) after the
addition of 100 µM DPAA.
The catalysts discussed above exhibited a common characteristic: the protoporphyrin IX
was not covalently bound to a chemical group. Thus, the comparison was extended to heme c,
i.e., protoporphyrin IX with vinil groups covalently bound to a peptide chain via tioether
bridges with two cysteine residues. Heme c is present both in cytochrome c and in
microperoxidases that are water-soluble peptides obtained by sequential pepsin and trypsin-
catalyzed hydrolysis of horse-heart cytochrome c. Microperoxidases are interesting models of
peroxidases used for studying the reaction mechanism of these enzymes. This heme peptide is
able to form the same enzyme intermediates during the reaction with peroxides. Four
microperoxidases types were identified according to the sequence of native cytochrome c
from which these peptide fragments are derivated, MP-6, 8, 9 and 11. These peptides retains
the heme group covalently, in the ferric resting state, attached to cysteine residues 14 and 17
and histidine as the fifth heme iron ligand but not methionine at the sixth coordination
position which, at neutral pH, is occupied by a water molecule and due to the absence of
methionine 80 at the sixth coordination position exhibit peroxidase activity. Because these
structural characteristics, the microperoxidases have been used to study to the peroxidases, as
well to the development of electrode sensors and another biotechnological applications
[
33,34,35,36]. Microperoxidases were studied in homogeneous and heterogeneous media. In
phosphate buffered homogeneous medium, microperoxidases-8 exhibited Soret band
bleaching after the addition of both hydrogen peroxide (Figure 4) and t-BuOOH (not shown).
In this condition, the Soret band bleaching was a biphasic process with k
obs
values around 80
ms
-1
and 5 ms
-1
for both hydrogen peroxide and t-BuOOH (Table I). The bleaching was not
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 15
accompanied by shift of the Soret band peak (not shown) and could be attributed to free
radical attack to the heme group. Thus, the covalent bind to a peptide chain and the presence
of histidine as the proximal heme iron ligand accelerated significantly the peroxide cleavage
but prevented microperoxidase catalase activity.
0 50 100 150 200 250 300
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0.75
HOOH
A
407nm
Time (s)
Figure 4. Soret band bleaching of microperoxidase-8 in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 during the
reaction with hydrogen peroxide.
The association of microperoxidase 8 with SDS micelles promoted two principal changes
in the catalysis process: the catalyst passed to discriminate the peroxide type and the Soret
band bleaching became slower. The k
obs
values for hydrogen peroxide obtained in this
condition were 27 ms
-1
and 5 ms
-1
and for t-BuOOH were 46 and 12 ms
-1
(Table I).
Table 1. Rate of microperoxidase-8 Soret band bleaching in the course of the reaction
with peroxides
t-BuOOH HOOH
Medium
k
obs1
(ms
-
1) k
obs2
(ms
-
1) k
obs1
(ms
-
1) k
obs2
(ms
-
1)
Phosphate buffer 80 5 80 5
SDS micelles 46 12 27 5
DCP liposomes 33 5 10 1.2
The decrease of the rate of Soret band bleaching observed in SDS micelles could be
attributed to the partial partitioning of peroxides inside micelles while EPR measurements
suggested that microperoxidases-8 is completely buried inside micelles, in the monomeric
form. In homogeneous media, low temperature EPR measurements of microperoxidases-8
heme iron exhibited signals of high and low spin forms due to the presence of inter-chain
coordinations between the peptide molecules. In the presence of excess of SDS molecules, the
heme iron low spin signal disappeared suggesting that each microperoxidase molecule is
buried inside a SDS micelle and so, inaccessible to establish interactions with another
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 16
hemepeptide molecule (not shown). In comparison with homogeneous medium, the more
remarkable decrease of the rate of the Soret band bleaching promoted by hydrogen peroxide,
observed when microperoxidase was assayed in SDS micelles, could be attributed to a high
partitioning of hydrogen peroxide outside the micelle, since this peroxide type is more
hydrophilic than t-BuOOH [26]. Interesting results were obtained with the negatively charged
DCP liposomes. In this condition, the rate of Soret band bleaching for both hydrogen
peroxide and t-BuOOH was even more low than in SDS liposomes (k
obs
for HOOH = 10 and
1.2 ms
-1
and for t-BuOOH = 33 and 5 ms
-1
, Table I). The rate values obtained in DCP
liposomes are compatible with differential partitioning of the different peroxides inside the
bilayer associated with a dilution of the reagents in all bilayer extension contrary to micelles
in which both catalyst and substrates become constrained inside the micelle core. Table 1 and
Scheme 3 bellow summarizes the effect of negatively charged micelles and liposomes on the
reaction of microperoxidases-8 with peroxides. The association of microperoxidases-8 to
negatively charged micelles and liposomes promoted changes in the rate of Soret band
bleaching.
HOOH
t-BuOOH
Microperoxidase 8
Scheme 3. Effect of negatively charged micelles and liposomes on the reaction of microperoxidases-8
with hydrogen peroxide and t-BuOOH.
The catalyst formed by the association of microperoxidases with CTAB micelles has
been well characterized regarding the reactivity with peroxides and DPAA. Our research
group have demonstrated that the association of Fe(III)MP-8 with CTAB micelles provides a
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 17
microenvironment with an alkaline interface and a hydrophobic core that gives special
characteristics to the Fe(III)MP-8/peroxide (tert-butylhydroperoxide or hydrogen peroxide)
reaction in comparison with homogeneous medium. EPR measurements using the spin
trapping 5,5-dimetyl-1-pyrroline N-oxide and computer simulations of the experimental
spectra were run to elucidate the reaction mechanism. It was demonstrated that alkoxyl and
hydroxyl radicals of t-BuOOH and HOOH, respectively, were the initial radicals produced,
presumably by homolytic scission of the O-O bond by Fe(III)MP-8/CTAB. The UV-vis
spectral changes for Fe(III)MP-8 pointed to the formation of Compound II as the species that
exhibits subsequent bleaching. The peculiarity of the CTAB micellar microenvironment
allowed circumvention of rapid kinetics, permitting the reaction to be accompanied on the
scale of seconds. For the reaction with peroxides in 20 mM CTAB, at pH 7.4 and 9.1, it was
determined the K
m
e and the maximal conversion rate (k
2
) of CTAB-bound Fe(III)MP-8 into
the corresponding Compound II. For both substrates, the K
m
values increased at pH 9.1
without significant changes in k
2
values, indicating alteration on the affinity of the substrates
for CTAB-bound Fe(III)MP-8 [
37]. Thus, the association of microperoxidases-8 with CTAB
micelles also led the catalyst to discriminate the types of peroxides used as substrate.
Furthermore, in this work it was demonstrated that the bleaching is a consequence of the free
radical production in the course of the reaction. In a subsequent work, we have demonstrated
that CTAB micelles provide a microenvironment with an alkaline interface and a hydrophobic
core that also favors the peroxidase activity of microperoxidase-9 (MP-9). The addition of
tert-butylhydroperoxide to a system containing MP-9/CTAB micelles led to the occurrence of
a peroxidase cycle, indicating that this aggregate behaves as a true enzyme. This lipoenzyme
is an interesting model for studies of peroxidase reaction mechanism and for application in
nanotechnology. The oxidase activity of microperoxidases on DPAA was also studied. The
microenvironment provided by CTAB micelles shifts positively ~100 mV the redox potential
of microperoxidases (MP-9 and MP11). Tert-butylhydroperoxide (t-BuOOH) added to the
medium, converted Fe(III)MP-9/CTAB to MP-9/CTAB Compound II, a high valence
oxidized intermediate of the heme peptide. Subsequent addition of diphenylacetaldehyde
(DPAA) to MP-9/CTAB Compound II regenerated the native form of the enzyme, Fe(III)MP-
9/CTAB, what characterizes the occurrence of a peroxidase cycle. Fe(III)MP-9/CTAB
regenerated during the peroxidase cycle reacted with reminiscent DPAA in the medium to
form Fe(II)MP-9/CTAB, which indicates that similarly to that was observed for hemin
(Figure 2D) both Fe(III)MP-9/CTAB and its oxyferryl form can use aldehydes as reducing
agents. According to the determined reduction potential, Fe(III)MP-9 and Fe(III)MP-9/CTAB
should be able to oxidize DPAA (reduction potential -630 mV). The reaction of MP-9/CTAB
with DPAA produced benzophenone as final product, detected by infrared spectroscopy and
mass spectrometry. Interestingly, a significant difference in the benzophenone yield according
to the micelle/MP-9 molar ratio was observed. Interesting differences were observed by
comparing the reaction carried out in the presence of micelle/MP-9 molar ratio ~ 66.0 with
the reaction in the presence of micelle/MP-9 molar ratio ~ 6.0. In the presence of the
micelle/MP-9 molar ratio ~ 66.0, the addition of DPAA led to a fast increase in the
absorbance at 254 nm accompanied by a concomitant increase in the fluorescence of the
sample. In the presence of the micelle/MP-9 molar ratio ~ 6.0, the addition of DPAA led to
the enhancement of the absorbance at 260 nm [27] with a kinetic profile similar to that
observed for the heme iron reduction. The decrease of the micelle/hemepeptide ratio led to
the red shift of Soret and Q bands, suggesting the formation of aggregates with at least one
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 18
pair of MP-9 per micelle. The parameters obtained from the EPR spectra corroborated that
different MP-9/CTAB high spin states are favored in different micelle/MP-9 ratios. These
results suggested that benzophenone production was predominant in the presence of
micelle/MP-9 molar ratio ~ 6.0, whereas Schiff base adduct was predominant in the presence
of micelle/MP-9 molar ratio ~ 66.0. In fact, during the reaction of MP-9 CTAB with DPAA,
when the micelle/MP-9 molar ratio was ~ 6.0, it was evident the precipitation of crystals at
the bottom of the tube, by infrared spectroscopy and mass spectrometry analysis [27]. The
lipoenzyme MP-CTAB presented low catalytic efficiency in the reaction with peroxides and
pointed out the challenge to improve this enzymatic model. The low efficiency was attributed
to the impairment of the access of proton donors to the micelle core. We tried to circumvent
this limitation by the association of histidine to the lipoenzyme MP-CTAB. However, the
coordination of the imidazol ring with heme iron promoted a steric impairment for the
peroxide access [
38]. Promising results have been obtained with the catalytic device formed
by MP associated to cationic liposomes in the presence of histidine (unpublished results). In
this system, the large extension of the hydrophobic microenvironment allowed histidine
residues to act as acid base catalyst without impair the access of the substrate to the heme
iron.
Besides micelles and liposomes, the mesoporous silica MCM-41 provided also a
microenvironment able to modulate the activity of microperoxidases. MCM-41 is a molecular
sieve synthesized by using surfactant micelles as templates [
39,40]. This nanostructure
material consists of highly ordered hexagonal arrays of one-dimensional channels, with large
surface area and narrow pore size distribution. Owing to the large pore size, ranging from 1.5
to 10 nm, MCM-41 has the ability to encapsulate large aromatic organic molecules, such as
phythalocyanines, methylene blue and ferrocene [
41,42,43], and even small proteins, like
cytochrome c [
44,45]. Ferric microperoxidase-11 (MP-11) entrapped in the mesoporous silica
MCM-41 resulted in a catalyst (Fe(III)MP11-MCM41) with catalase and monooxygenase
properties. The catalyst Fe(III)MP11-MCM41 exhibited specificity for hydrogen peroxide to
be converted to Compound II. Also similarly to catalase, the cleavage of hydrogen peroxide
by MP11-MCM41, resulted in O
2
production detected by Clark electrode. This catalyst was
able to use phenol, an undesirable waste product in effluents, as a reducing agent of
Compound II leading to the completion of the peroxidase cycle and the production of 2,4-
dihydroxyphenol. This result suggested that the catalyst MP11-MCM41 exhibits also
monooxygenase activity. The capacity to conjugate two subclasses of the enzyme
oxidoreductase class, peroxidases and monooxygenases, was possible because MP-11 heme
iron promotes homolytic cleavage of the hydrogen peroxide generating hydroxyl radical that
attacked the 2 and 4 positions of the phenol ring to produce the hydroxylated product.
Hydroxyl radical could also attack reminiscent hydrogen peroxide leading to molecular
oxygen evolution, mimicking catalase activity (Scheme 4). Therefore, the catalyst MCM-41-
entrapped MP-11 mimics the hepatic detoxifying cytochrome P450 system that catalyzes the
hydroxylation of aromatic rings and play a central role in the metabolism of medicinal drugs
and steroids. The most striking difference between MCM-41-entrapped MP-11 mechanism to
promote hydroxylation of aromatic compounds and cytochrome P450 system is that the
former uses hydrogen peroxide and the latter uses molecular oxygen as the activating agent of
heme iron.
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 19
OH
OH
OO
OH
OH
OH
OH
OH
H
+
OH
OH
OH
OH
MCM-41PorFe(III)
MCM-41PorFe(IV)=O
+
+
HOOH 2
2
+
HOOH
+
2
4
+
+
2
+
or
+
2
+
oxidized
products
+
HOH
HOH
HOH
MCM-41PorFe(III)
MCM-41PorFe(IV)=O
(8)
(9)
(10)
(11)
Scheme 4. Reaction of the MCM-41-incorporated Fe3
+
microperoxidase 11 with peroxides and phenol.
The catalyst MP-11 entrapped in MCM-41 also exhibits another important characteristic:
the resistance to the attack of free radicals. Despite the fact that MCM-41-entrapped MP-11
also cleaves hydrogen peroxide by homolytic scission, extensive bleaching and significant
enzyme inactivation was not observed in this condition. Furthermore, the entrapment of MP-
11 in MCM-41 permits easy separation from the water, i.e. decantation, a procedure that is
not possible by using free microperoxidases. From the above, we consider that MP-11
entrapped in MCM-41 is a promising nanobiotechnological device.
The study of the peroxidase and oxidase activity of heme c has also been extended to
cytochrome c that, differently of microperoxidases, exhibits hexacoordinated heme iron.
Differently of hemin that was efficient to react with almost equimolar amount of hydrogen
peroxide, any significant spectral change was observed when cytochrome c was assayed with
equimolar amounts of hydrogen peroxide or t-BuOOH (not shown). This result is coherent
with the low accessibility of the heme iron buried inside the protein crevice and with the
distal position of heme iron blocked by the coordination with methionine 80 (not shown).
However, in the presence of excess of peroxides (twenty fold the amount assayed with
microperoxidase and showed in Figure 4), cytochrome c promoted cleavage of the substrate
via homolytic scission [
46,47]. The catalytic mechanism as well as the bleaching exhibited by
cytochrome c is modulated by the association of the protein with lipid bilayers and micelles
[47]. In order to compare the efficiency of the peroxidase activity of cytochrome c with that
exhibited by microperoxidases (Table 1), the hemeprotein was assayed with hydrogen
peroxide and t-BuOOH in the same conditions described in Table 1 (Table 2).
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 20
Table 2. Rate of cytochrome c Soret band bleaching in the course of the reaction with
peroxides
t-BuOOH HOOH
Medium
k
obs
(ms
-
1) k
obs
(ms
-
1)
Phosphate buffer 2.7 7.3
SDS micelles 5.5 23
DCP liposomes 6.6 21
The Soret band bleaching of cytochrome c exhibited in the course of the reaction with
peroxides was not a biphasic process and fitted well with a first order exponential decay
(Figure 5).
0 50 100 150 200 250 300
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
HOOH
A
409nm
Time (s)
Figure 5. Soret band bleaching of cytochrome c exhibited in the course of the reaction with hydrogen
peroxide.
In general the rates of peroxide cleavage exhibited by cytochrome c were one order
lower than that exhibited by microperoxidase, a result coherent with the catalytic center less
accessible to the substrates. In homegeneous medium, the higher efficiency exhibited by
cytochrome c as the catalyst of hydrogen peroxide cleavage could be assigned to the fact that
hydrogen peroxide molecule is smaller than the t-BuOOH one. Contrary to microperoxidases,
the association of cytochrome c to negatively charged liposomes favored the peroxidase
activity of the protein especially for hydrogen peroxide. The association of cytochrome c with
negatively charged interfaces opens the heme crevice favoring the access of the substrates to
the catalytic center. However, as cytochrome c is a peripheral protein, its peroxidase activity
is not disfavored by the preferential partitioning of hydrogen peroxide outside micelles and
liposomes. Scheme 5 summarizes this proposal.
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 21
Scheme 5. Effect of negatively charged micelles and liposomes on the reaction of cytochrome c with
hydrogen peroxide and t-BuOOH.
The oxidase activity of cytochrome c on DPAA and 3-methylacetoacetone (MAA) was
well characterized by Nantes et al. [
48] and Rinaldi et al. [49]. Cytochrome c exhibits the
ability to oxidize DPAA and MAA and this activity was probed in solution or in the
negatively charged dicetylphosphate (DCP), phosphatidylcoline /phosphate
dylethanolamine/cardiolipin (PC/PE/CL) liposomes. The oxidase activity of cytochrome c on
these substrates is a chemiluminescent reaction greatly affected by the presence and nature of
charged liposome or micelle interfaces interacting with the protein but always leads to heme
iron reduction. The reaction with DPAA is accelerated when cytochrome c is bound to
negatively charged interfaces while the reaction with MAA occurs exclusively when the
protein is bound to DCP liposomes. Contrary to DPAA oxidation, the MAA reaction is
followed by two significant cytochrome c spectral changes: Soret band bleaching and
disappearance of the charge transfer absorption band at 695 nm. Thus, the catalytic activity of
cytochrome c involves substrate-induced loss of the methionine ligand at the iron sixth
coordination position, which is favored by interaction of cytochrome c with negatively
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 22
charged interfaces. Accordingly, a decrease and blue shift of the charge transfer band could
be observed in cytochrome-c-containing negatively charged DCP, PC/PE/CL liposomes or
lysophosphatidylethanolamine micelles in the presence of DPAA or MAA. In a subsequent
study it was characterized that diphenlacetaldehyde (DPAA) is able to promote mitochondrial
∆Ψ disruption accompanied by damage in mitochondrial DNA, lipids, and proteins [
50].
Since it was characterized that DPAA was a good model to study the deleterious effects of
triplet carbonyls on biological molecules it was important to determine the mechanism
involved in the oxidation of DPAA by cytochrome. Therefore, in the following study [49],
DPAA was used as a model of carbonyl reagent for cytochrome c. The results suggest that
DPAA is a redox cytochrome c modifier in a pH-dependent manner. The second-order rate
determined for heme iron reduction (k
2
) is 698 M
-1
s
-1
and this process occurs with an
activation energy of 8.5 ± 0.8 kcal/mol. Analysis of the pH profile suggests the presence of
two ionizable cytochrome c groups with pK
a1
= 8.9 and pK
a2
= 11.4 that are related to the
electron transfer from DPAA to heme iron. It was also determined the heats of ionization of
the two prototropic groups, pK
a1
(∆H
ion
= 6.5 kcal/mol, ∆S
ion
= -29.0 cal/mol⋅K), and pK
a2
(∆H
ion
= 5.0 kcal/mol, ∆S
ion
= -24.0 cal/mol⋅K). These values are compatible with the
involvement of two tyrosine residues, probably Y67 and Y74, related to DPAA-promoted
heme iron reduction. The participation of tyrosine groups was corroborated by cytochrome c
chemical modification. The iodination of tyrosine groups significantly decreased the
reduction rate promoted by DPAA, and shifted the pH
optmal
value from 10.0 to 9.25. EPR
measurements by using the 3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonate (DBNBS) spin trapping
revealed that the DPAA electron abstraction promoted by cytrochrome c quickly produces the
expected enol-derived radical that reacts with molecular oxygen, producing a peroxyl
intermediate radical that is converted to a putative dioxetane intermediate. The dioxetane
suffers thermal decomposition and generates benzophenone as the main final product of this
reaction, detected by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry.
The Effect of the Protoporphyrin IX Metal Center
The catalytic mechanism of a porphyrin is modulated by the microenvironment and the
axial ligands of the metal center, however, it is also strongly dependent of the nature of the
metal center. Thus, for a complete investigation of the factors that influences the catalytic
activity of porphyrins, the studies of the effect of the microenvironment on the catalytic
activity of protoporphyrin IX has been extended to the manganese-substituted derivative of
microperoxidase-11 (MnMP-11).
The Catalytic Activity of Manganese-substituted Derivative of
Microperoxidase-11 Modulated by the Microenvironment and the Ligands of
the Metal Center
The catalytic activity of MnMP-11 on hydrogen peroxide was investigated in
homogeneous medium and in CTAB micelles, both in the presence and in the absence of
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 23
histidine. Figure 6 shows the spectra of MnMP-11 in homogeneous medium in the absence
(dotted line) and in the presence (thin solid line) of histidine and in CTAB micelles in the
absence of histidine (thick solid line). The replacement of Fe(III) by Mn(III) in the center of
microperoxidase porphyrin ring promoted hypsochromic Soret band shift (from 396 to 371
nm) and the appearance of a 463 nm band, that is a characteristic of Mn as the metal center of
porphyrins [
51]. Therefore, Mn porphyrins exhibits splitting Soret band due to a HOMO
(high occupied molecular orbital) → LUMO (low unoccupied molecular orbital) transition
(370 nm) and due a Mn d orbital → LUMO transition (charge transfer band at 463 nm, Figure
6, dotted line). The Mn MP-11 exhibits also a Q band peaking at 550 nm. The presence of
histidine promoted no significant change in the Mn hemepeptide spectrum suggesting that the
amino acid was not able to coordinate with Mn(III) (Figure 6, thin solid line). The association
of Mn MP-11 with CTAB micelles leads to a splitting of the charge transfer band in two
components peaking at 463 and 480 nm and red shift of the Q band from 550 to 559 nm
(thick solid line). In this condition, the addition of histidine also promoted no significant
change in the Mn MP-11 spectrum (not shown).
300 350 400 450 500
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
525 550 575 600
0.000
0.005
0.010
0.015
A
Wavelength (nm)
Figure 6. Spectra of Mn(III)MP-11 in homogeneous and heterogeneous medium. 1 µM Mn(III)MP-11
in HEPES buffer pH 10.4 (dotted line), in 5 mM histidine buffer pH 9.1 (thin solid line) and in 20 mM
CTAB micelles pH 9.1 in the absence of histidine (thick solid line).
The peroxidase activity of Manganese-Microperoxidase-11 and meso-tetrakis(2,6-
dichloro-sulfonatophenil porphyrin), MnTDC(SO
3
-
Na
+
)PP, was investigated at pH 7.4 and
9.1, in homogeneous and heterogeneous media (CTAB micelles and DODAB liposomes) and
in the presence and absence of histidine.
As described above, in CTAB micelles, histidine coordinated with the heme iron at distal
position and impaired the access of peroxides to the metal center. When Fe(III)-MP was
replaced by Mn(III)-MP the addition of hydrogen peroxide, in the absence and in the presence
of histidine, led to spectral changes suggestive of the conversion of the catalyst to Compound
II followed by partial bleaching of the chromophore. However, the presence of histidine
accelerated the reaction both in homogeneous and heterogeneous media (Figure 7A, B, C and
D), probably because, in this condition, it can act as an acid-base catalyst. The rate of the
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 24
conversion of Mn(III)MP-11 to Compound II (k
obs
) in homogeneous medium and monitored
by the decrease of the charge transfer 463 nm band increased from 2.5 ms
-1
to 4.2 ms
-1
.
The rate of the conversion of Mn(III)MP-11 to Compound II (k
obs
) in CTAB micelles,
and monitored by the decrease of the charge transfer 463 nm band, increased from 5 ms
-1
to
25 ms
-1
. Thus, CTAB micelles increased the reaction rate of MnMP-11 with hydrogen
peroxide and, in this medium, the effect of histidine was more accentuated. This result is
coherent since, in CTAB micelles, histidine should be remained in the proximity of the
catalytic center and became a more efficient acid-base catalyst.
300 375 450
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
520 560 600
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
A
A
Wavelength (nm)
300 375 450
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
525 550 575 600
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
B
A
Wavelength (nm)
Figure 7. (Continued)
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 25
300 350 400 450 500
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
525 550 575 600
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
C
A
Wavelength (nm)
300 375 450
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
520 560 600
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
D
A
Wavelength (nm)
Figure 7. A –Absorbance spectra of 1.13 µM Mn(III)MP-11 during the reaction with 352-fold excess
HOOH in homogeneous medium (HEPES buffer pH 10.4) at initial time (thick solid line), 38 s (thin
solid line), 180 s (dotted line) and 5 min (dashed line) after hydrogen peroxide addition. B –
Absorbance spectra of 1.13 µM Mn(III)MP-11 during the reaction with 352-fold excess HOOH in 5
mM Histidine buffer pH 10.4 at initial time (thick solid line), 62 s (thin solid line), 123 s (dotted line)
and 15 min (dashed line) after hydrogen peroxide addition. C – Absorbance spectra of 1.13 µM
Mn(III)MP-11 during the reaction with 352-fold excess HOOH in 20 mM CTAB pH 10.4 at initial time
(thick solid line), 92 s (thin solid line), 166 s (dotted line) and 15 min (dashed line) after hydrogen
peroxide addition. D –Absorbance spectra of 1.13 µM Mn(III)MP-11 during the reaction with 352-fold
excess HOOH in 20 mM CTAB in 5 mM Histidine buffer pH 10.4, at initial time (thick solid line), 102
s (thin solid line), 170 s (dotted line) and 15 min (dashed line) after hydrogen peroxide addition.
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 26
Catalytic Activity of Meso-tetrakis(2,6-dichloro-sulfonatophenyl porphyrin)
– Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+)
PP and Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
The effect of microenvironment and metal ligand on the peroxidase activity of porphyrins
was also investigated for the non-biological Fe(III) and Mn(III) meso-tetrakis (2,6-dichloro-
sulfonatophenyl porphyrin) – Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP and Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP (Figure
8).
Me+
N
Cl
SO
3
-Na+
Cl
NN
Cl
SO
3
-Na+
Cl
Cl
Cl
SO
3
-Na+
N
Cl
SO
3
-Na+
Cl
Figure 8. Structure of Fe(III) and Mn(III) meso-tetrakis(2,6-dichloro-sulfonatophenyl porphyrin).
The peroxidase and oxidase activities of Fe3
+
TDC(SO
3
-
Na
+)
PP on t-BuOOH and DPAA,
respectively, was investigated by electronic absorption spectroscopy. Figure 9 shows the
spectra of the porphyrin in the course of the reaction with t-BuOOH in homogeneous
medium. The spectra obtained at different times shows that the catalyst behaves as a
peroxidase by using t-BuOOH as both oxidizing and reducing agents in such way that the
porphyrin completes a catalytic cycle 25 min after incubation with the peroxide. The non
occurrence of a significant bleaching of the porphyrin, after the completion of the catalytic
cycle, suggests that the mechanism does not involves high production of highly reactive free
radicals able to attack the porphyrin ring.
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 27
300 350 400 450
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
500 550 600 650 700
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
A
Wavelength(nm)
Figure 9. Spectral changes that accompany the Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP conversion to Compound II.
100 µM Fe(III)
TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 (dotted line), and 20, 320, 560 (thin
solid lines) and 1400 s (thick solid line) after the addition of 1.5 mM t-BuOOH.
The oxidase activity on DPAA was also investigated for Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+)
PP. Figure
10 shows the spectral changes that accompanies the reduction of the porphyrin iron by
DPAA. The reduction of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP by DPAA changes the broad Soret band
peaking at 412 nm to 418 nm and the Q bands at 525 and 578 nm were replaced by 538 and
614 nm bands. The spectra obtained in the course of the reaction exhibited an isosbestic point
at 360 nm compatible with a first order reaction. In this condition, similarly to that was
observed for protopophyrin IX, the reaction of the porphyrin with DPAA was accompanied
by the appearance of a band peaking at 258 nm that could be attributed to benzophenone, an
expected product of the oxidation of DPAA in aerobic conditions.
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 28
250 300 350 400 450 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
500 550 600 650
0.04
0.08
0.12
0.16
A
Wavelength (nm)
Figure 10. Spectral changes that accompany the Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP conversion to iron II. 100 µM
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 (dotted line), 500 and 1000 (thin solid line)
and 2500 s (thick solid line) after the addition of 0.5 mM DPAA.
Figure 11 shows the spectra of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in the course of the reaction with
t-BuOOH followed by the addition of DPAA after complete conversion of the porphyrin to
Compound II. The conversion of the porphyrin to Compound II led to a red shift of the Soret
band from 412 to 421 nm and to a blue shift of Q bands from 525 and 578 nm to 522 and 562
nm. The addition of DPAA led to a very fast completion of the catalytic cycle followed by
immediate reduction of the Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP.
350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
500 550 600 650
0.00
0.04
0.08
0.12
A
Wavelength (nm)
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 29
Figure 11. Spectral changes that accompany the Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP conversion to Compound II by
hydroperoxide and the reduction by DPAA. 100 µM Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 5 mM phosphate buffer
pH 7.4 (dotted line), 164 and 300 s (dashed lines) after the addition of 1.5 mM t-BuOOH and 2000 s
(thick solid line) after the addition of 0,5 mM DPAA.
The peroxidase catalytic cycle of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP was also investigated by EPR
spectrometry (Figure 12). The disappearance of the porphyrin iron signal in the course of the
reaction is compatible with conversion of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP to Compound II (Figure
12, line c). Simultaneously with the conversion of the porphyrin to Compound II, it was
evident the appearance of a signal at g = 2 assigned to t-BuOOH-derived peroxyl radical
(inset of Figure 12). This radical has been previously detected during the reaction of
cytochrome c with t-BuOOH [47,52,53]. The species were monitored at different
temperatures in order to corroborate that the signal at g around 6 corresponds to the pophyrin
iron high spin state.
100 200 300 400
-40
-20
0
20
40
60
320 330 340 350
19.0
19.5
20.0
20.5
i
h
g
f
e
d
c
b
Intensity (a.u.)
Field
(
mT
)
a
Magnetic Field (mT)
Peroxyl
Radical
Figure 12. EPR spectra of 100 µM Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in the presence of 1.5 mM tert-
butylhydroperoxide. The EPR measurements were carried out using an EPR Bruker (Oxford, U.K.)
system ELEXSYS E-580 model, equipped with a helium cryostat and temperature controller. Line a:
porphyrins Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP at 4.2 K; lines b, c and d: less than 10 s after the addition of t-
BuOOH measured at 4.2, 10 and 13 K, respectively; lines e, f, g, h and i correspond, respectively, to the
signal obtained at 10, 100, 200, 300 and 600 s after t-BuOOH addition. The inset shows a zoom of the
peroxyl radical signal.
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 30
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in Heterogeneous Media
Similarly to that was investigated for protoporphyrin IX, the effect of heterogeneous
media, such as micelles and liposomes, on the catalytic activity of Fe(III)TDC(SO3
-
Na
+
)PP
on peroxides and DPAA was also analyzed by spectroscopic techniques.
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in Micelles
The association of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with CTAB micelles led to spectral changes
compatible with the porphyrin buried inside the micelle core. In CTAB micelles
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP exhibited a red shift of the Soret band from 412 to 418 nm as well as
of Q bands from 525 and 578 nm to a relative narrower band peaking at 582 nm. The addition
of t-BuOOH led to a progressive slight bleaching of Soret and Q bands suggesting a very fast
completion of a peroxidase catalytic cycle and consequent generation of free radicals (Figure
13). However, the possibility of an inefficient peroxidase activity of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
in CTAB micelles can not be also discarded since DPAA was not able to reduce the porphyrin
in this medium (not shown). For microperoxidases, the association to CTAB micelles,
although had provided an alkaline interface with low amount of H
+
that is a competitive
inhibitor for the enzyme, led also to a decrease of the catalytic efficiency of catalyst due to the
absence of a proton donor to the completion of the catalytic cycle. The decrease of the
efficiency was circumvented in the presence of histidine only in conditions in which the
coordination of the amino acid with the metal center was impaired, i.e., by replacing CTAB
micelles by DODAB vesicles or iron by manganese as the porphyrin metal center. In
homogeneous medium (Figure 9) it was observed the occurrence of a peroxidase catalytic
cycle of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP detected in the seconds scale and maybe, in CTAB micelles,
the alkaline interface favored the desprotonation of the water molecule coordinated with the
porphyrin iron, while the negatively charged meso ligands could retain protons to donate
them at the end of the catalytic cycle.
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 31
300 375 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
480 540 600 660
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
A
Wavelength (nm)
Figure 13. Spectral changes that accompany the reaction of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with peroxide in
the presence of CTAB micelles. 100 µM Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 5 mM phosphate buffer pH 7.4
(dotted line), in 15 mM CTAB micelles prepared in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 (thin solid line) and
1800 s after the addition of 1.5 mM t-BuOOH (thick solid line).
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in SDS Micelles
The presence of SDS micelles in a medium containing Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP did not
promote any significant spectral change indicating that the porphyrin did not associated to the
micelles (not shown). This result was expected since both, the porphyrin and the SDS
micelles, are negatively charged. In this condition, the addition of hydrogen peroxide led also
to the occurrence of a peroxidase catalytic cycle but with a slower rate (Figure 14). This was
expected since part of the added peroxide was partitioned into the micelles while the catalyst
remained outside the micelle. Surprisingly the bleaching of the chromophore was
significantly more intense in this condition and the cause remains to be investigated.
The Oxidase Activity of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP on DPAA was also disfavored in SDS
micelles (not shown).
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 32
300 350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
500 550 600 650 700
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
A
Wavelength (nm)
Figure 14. Spectral changes that accompany the reaction of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with peroxide in
the presence of SDS micelles. 100 µM Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 15 mM SDS micelles in 5 mM
phosphate buffer pH 7.4 (dotted line), 80 (thin solid line), 500, 2000 (dashed lines) and 3600 s (thick
solid line) after the addition of 1.5 mM t-BuOOH.
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in Liposomes
The association and catalytic activity of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP to the cationic
dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) giant vesicles was also investigated by
electronic absorption and electronic paramagnetic spectra (EPR) and the results pointed out
that the porphyrin was buried inside the bilayer (Figure 15) and exhibited catalytic properties
(not shown). However, the most interesting result obtained in this condition was the fact that
the association of TDC(SO
3
-
Na
+
)PP to DODAB vesicles promoted increase of the medium
viscosity suggesting the formation of a polymeric-like structure. Analysis of the complex
TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/DODAB image by atomic force microscopy (AFM) revealed the formation
of a nanowire net composed by DODAB vesicles lined by the intercalation Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP rings into adjacent vesicles. The Zn-substituted TDC(SO
3
-
Na
+
)PP did not exhibit
catalytic properties but remained able to induce the formation of the nanowire net as attested
AFM images (Figure 16 A and B). The structural and catalytic characteristics of the nanowire
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP /DODAB described above point out this supramolecular assembly as
a promising device to be applied in nanotechnology.
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 33
50 100 150 200 250 300 350 400 450
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
b
a
Intensity (a.u.)
Magnetic Field (mT)
Figure 15. EPR spectra of 100 µM Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 5 mM phosphate buffer pH 7.4 (line a)
and in the presence of 500 µM DODAB giant vesicles (line b). Temperature controller at 4
K and
9.47273 GHz. Spectrometer conditions: gain 5.103, modulation amplitude 1.0 mT, microwave power 4
mW, time constant 10.24 ms and conversion time 81.92 ms.
A B
94.11
[nm]
0.00
2.00 um 5.00 x 5.00 um
DODAB 600uM + P1 20uM - suporte l穃ina de sil兤io
Figura 16. Visualization by Atomic Force Microscopy (AFM), contact mode, of the nanostructure
composed by DODAB vesicles lined by the intercalation Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP rings into adjacent
vesicles. A. Images by a contact mode of the DODAB vesicles. B. Images of the nanostructures. A
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 34
droplet of constant volume (10 µl) was deposited onto a small plate of silicon (about 0.5 cm2)
previously stringent cleaning and after two minutes the excess was removed using paper filter and the
dry was completed at refrigeration (4
o
C). Conditions: scan size, 10 µm; scan rate, 1.0 Hz and sampling
frequency, 200 Hz.
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in Apocytochrome c
The Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP is not a biological porphyrin and thus, it is not found in a
pocket of a protein. However, in vitro, this porphyrin was highly efficient to induce the
association and folding of apocytochrome c around its structure. Figure 17 shows the spectral
changes that accompanies the formation of a non-covalent complex between Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP and apocytochrome c. Figure 17 shows the spectra of Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, the
non-covalent complex of apocytochrome c with Fe(III) protoporphyrin IX (thin solid line)
and the non-covalent complex of apocytochrome c with Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP. Contrary to
the non-covalent complex of apocytochrome c with Fe(III) protoporphyrin IX that exhibits a
broad Soret band peaking at 395 nm and so, compatible with a low compacted tertiary
structure of the cytochrome c polypeptide chain, the non-covalent complex of apocytochrome
c with Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP exhibits a narrow 8 nm red shifted Soret band. Furthermore,
contrary to native cytochrome c and its non-covalent complex, the non-covalent complex of
apocytochrome c with Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP did not exhibit spectral changes indicative of
peroxidase and oxidase activities after addition of t-BuOOH and DPAA. This result suggests
that this complex does not exhibit a labile porphyrin iron ligand at the sixth coordination
position of the metal impairing the access of substrates. However, similarly to that was
considered for the porphyrin associated to CTAB, the occurrence of an extremely rapid
catalytic cycle can not be discarded. Further investigations by circular dichroism and EPR are
necessary to completely characterizes the structure and activity of the non-covalente complex
of apocytochrome c with Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP.
300 350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
500 550 600 650
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
A
Wavelength (nm)
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 35
Figure 17. Spectra of the Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP (dotted line), of the non-covalent complex of
apocytochrome c with Fe(III) protoporphyrin IX (thin solid line) and with Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
(thick solid line).
The Manganese MnTDC(SO
3
-
Na
+
)PP
The manganese porphyrins have been used as redox catalysts in several model systems
relevant to biochemistry, for instance, as superoxide dismutase and catalase mimics [54].
Manganese porphyrins (MnPorphyrins) have been successfully used to treat a number of
models of acute pathologies related to oxidative stress. MnPorphyrins have also a chemical
reactivity that enables fast redox reactions. For instance, they catalyze quite efficiently the
dismutation of superoxide; they react, though slowly, with hydrogen peroxide in a catalase-
like cycle; they are among the fastest reducing agents for peroxynitrite and they react very
rapidly with carbonate radicals. This property may be associated with interactions with
biomolecules and subcellular structures [55].
Figure 18 shows the spectra of MnTDC(SO
3
-
Na
+
)PP in homogeneous medium (thin solid
line) and in CTAB micelles (thick solid line). The replacement of Fe(III) by Mn(III) in the
center of porphyrin ring promoted one nanometer Soret band red shift (from 412 to 413 nm)
and the appearance of a 467 nm band due to the electronic transition from metal d orbital to
the HOMO of the porphyrin ring. This band exhibits a splitting peaking at 517 nm. The
MnTDC(SO
3
-
Na
+
)PP exhibits also a Q band peaking at 560 nm with a shoulder at 597 nm. In
this condition, the addition of histidine did not promote any significant spectral change (not
shown). The association of MnTDC(SO
3
-
Na
+
)PP with CTAB micelles led to red shift of all
absorption bands (thick solid line).
350 420 490
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
550 600 650 700
0.000
0.004
0.008
0.012
0.016
0.020
A
Wavelength (nm)
Figure 18. Spectra of MnTDC(SO
3
-
Na
+
)PP in homogeneous medium (thin solid line) and in 20 mM
CTAB micelles (thick solid line).
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 36
The reaction of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with hydrogen peroxide was investigated in
homogeneous medium in the absence and in the presence of histidine (Figure 19, A and B,
respectively). Figure 19A shows the spectra of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in the course of the
reaction with hydrogen peroxide, in the absence of histidine. Differently of MnMP-11 that
exhibited progressive spectral changes compatible with the formation of Compound II
associated to bleaching of the chromophore, Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP exhibited, in the course
of the reaction, narrowing of the Soret band, disappearance of the charge transfer 467 nm
band concomitant the appearance of overlapped bands with peaks at 553, 580, 633 and 667
nm bands (Figure 19A thin solid and dotted lines). In the presence of histidine, similar
spectral changes were observed but without contributions of the more intense band peaking at
667 nm. These spectral changes were suggestive of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP conversion to
the reduced form. EPR spectra run out in the course of the reaction of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with peroxide, in the absence of histidine (Figure 19 C lines a, b and c) and in the
presence of histidine (lines d and e), corroborated the formation of Mn(II)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
(the six lines at g ~ 2). Once more, the presence of histidine increased the rate of the reaction
since a larger amount of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP was detected in this condition after 15 min
of incubation. In the absence of histidine, the EPR spectra detected after 15 min and one hour
of reaction exhibited one more species with spectral contribution at g around 2 (Figure 18C
and D). On the other hand, in the presence of histidine, besides the EPR bands at g ~ 2 that
are typical of Mn(II), a broad band was detected at g around 4 and should be attributed to
Compound II (Mn(IV)=O, Figure 19C, line e). Figure 19 D (line b) shows the EPR signal that
should be assigned to the Compound I (Mn(V)=O). This spectrum was obtained by
subtracting probable contributions of porphyrin Mn(II) and Mn(III) (light gray and gray lines,
respectively) signals from the EPR spectrum obtained after 90 min incubation of
Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with hydrogen peroxide, in the absence of histidine (Figure 19C
and D lines c and a, respectively).
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 37
300 375 450 525
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
600 675
0.00
0.01
0.02
0.03
A
A
Wavelength (nm)
300 375 450 525
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
540 600 660
0.00
0.01
0.02
0.03
B
A
Wavelength (nm)
100 200 300 400
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
Mn(II) signal
Species with g ~ 4
C
e
d
c
b
a
Intensity (a.u.)
Field (mT)
Figure 19. (Continued)
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 38
100 200 300 400
-2
0
2
b
a
D
Intensity (a.u.)
Magnetic Field (mT)
Figure 19. A - Spectral changes of 1.13 µM Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in HEPES buffer pH 7.4 with
hydrogen peroxide. Initial time (thick solid line), 15 min (thin solid line) and 2 hours after 352-fold
excess of hydrogen peroxide addition (dotted line). B - Spectral changes of 1.13
µM Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in 5 mM Histidine buffer pH 7.4 with hydrogen peroxide. Initial time (thick solid line), 15 min
(thin solid line) and 2 hours after 352-fold excess of hydrogen peroxide addition (dotted line). C – EPR
spectral of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in the course of reaction with peroxide in the absence of histidine
(lines a, b and c, zero, 15 and 90 min after the peroxide addition) and in the presence of histidine (lines
d and e, zero and 15 min after peroxide addition). D - EPR spectra of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 90 min
after hydrogen peroxide addition in the absence of histidine (lower line) overlapped by spectra of
Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP before peroxide addition and its reduced form (lines a and d of panel C). The
upper line corresponds to the lower line minus the overlapped spectra and assigned to Compound I
spectrum. The experiment were carried out at Hepes buffer pH 7.4, with MnTDC 100 µM and 352-fold
excess of HOOH at 4.2 K and 9.485501 GHz. Spectrometer conditions: gain 5.103, modulation
amplitude 1.0 mT, microwave power 4 mW, time constant 10.24 ms and conversion time 81.92 ms.
The elucidation of the mechanism used by Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP to cleave hydrogen
peroxide remains a challenge. The direct reduction of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP by hydrogen
peroxide is not compatible with the other intermediate species detected by EPR in the absence
and in the presence of histidine. Thus, a probable reaction route should be the conversion of
Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP to Compound I (Mn(V)=O TDC(SO
3
-
Na
+
)PP) with reduction of
hydrogen peroxide to water (Scheme 6, step 1). This step should be followed by reduction of
Compound I to Compound II (Mn(IV)=O TDC(SO
3
-
Na
+
)PP) and Compound II to
Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP by successive one electron abstraction from hydrogen peroxide
molecules (Scheme 6, steps 2 and 3). The one electron oxidation of hydrogen peroxide
generates superoxide ion (O
2
-•
) that should be responsible by one electron reduction of
Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP (Scheme 6, step 4).
Catalytic Activity of Iron and Manganese Porphyrins … 39
Mn
3+
TDC(SO
3
)PP
Mn
5+
O
TDC(SO
3
)PP
Mn
4+
O
TDC(SO
3
)PP
O
O
Mn
2+
TDC(SO
3
)PP
O
O
OO
OO
HOOH
HOH
HOOH
HOOH
1
2
3
4
Scheme 6. Proposed catalytic cycle and manganese reduction during the reaction of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with hydrogen peroxide. The addition of hydrogen peroxide to Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP leads
to the formation of Compound I (step 1). Compound I oxidizes a second peroxide molecule to be
converted to Compound II concomitant with the formation of superoxide ion (step 2). Compound II
oxidizes a third hydrogen peroxide molecule that is converted also in superoxide ion and complete the
catalytic cycle with the recovering of Mn(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP that in turn abstract electrons from
superoxide ions to be converted to Mn(II)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP (step 4). The oxidation of superoxide ion
leads to the evolving of molecular oxygen as indicated by the arrows.
This putative mechanism requires further investigations such as evolving of molecular
oxygen and the production of free radicals intermediates by using spin trapping.
CONCLUSION
The modulation of the catalytic activity of porphyrins by changing the microenvironment
and the metal center is a strategy largely used in biological systems. Only one porphyrin
group, the iron protoporphyrin IX is able to play completely different roles such as: molecular
oxygen transport, hydroxylation of organic compounds, peroxide homolytic and heterolytic
cleavage and electron transport at the expenses of the different microenvironments and heme
iron ligands provided by different apoproteins. By mimicking this strategy of Nature it is
possible to develop an infinity of catalysts and nanostructured materials. Furthermore, the
construction of new catalysts and materials can use not only protoporphyrin IX but also
different porphyrin structures and metal centers. In this regard, this is also a strategy used by
biological systems and exemplified by the use of clorophyl (a magnesium porphyrin) in
Katia C. U. Mugnol, Tatiana Prieto, Clemerson F. B. Dias et al. 40
photosinthesis and ciacobalamin (a cobalt porphyrin) in the lipid metabolism. In this study,
we presented a screening of the effects of different microenvironments and metal centers on
the peroxidase and oxidase activities of two porphyrins: protoporphyrin IX and
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP. The main objective of this study was not completely characterizes
the structures and catalytic mechanisms of these complexes but to present the multiplicity of
mechanisms obtained by varying microenvironment and metals. Some interesting
peculiarities deserve to be highlighted: i) the capacity of histidine to act as a competive
inhibitor or an efficient acid-base catalyst by favoring or disfavoring its coordination with the
metal center; ii) the fine modulation of microperoxidases activity by micelles and liposomes
due to different partitions of substrates and catalysts; iii) the multiply enzymatic activities
exhibited by microperoxidase 11 in the mesoporous silica MCM-41; iv) the capacity of a non-
biological porphyrin to induce a high compact folding of apocytochrome c and v) the capacity
of the same porphyrin to form a nanowire net by interacting with giant DODAB vesicles.
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127
ANEXO II - A New Enzymatic Function of Cytochrome c in Apoptosis: Phospholipase A Activity
Specific for Oxidized Cardiolipin.
A New Enzymatic Function of Cytochrome c in Apoptosis:
Phospholipase A Activity Specific for Oxidized Cardiolipin.
.
Vladimir A. Tyurin
1, 2
, Mi-Yeon Jung
1, 2
, Yulia Y. Tyurina
1, 2
, Qing Zhao
1, 2
,
Tatiana Prieto
1, 2, 3
, Muhammad A. Tungekar
1, 2
, Alexander A. Kapralov
1, 2
,
Iseli L. Nantes
3
, and Valerian E. Kagan
1, 2
1
Center for Free Radical and Antioxidant Health,
2
Department of Environmental and
Occupational Health, University of Pittsburgh, Pittsburgh PA,
3
Centro Interdisciplinar de
Investigação Bioquímica-CIIB Universidade de Mogi das Cruzes-UMC, Mogi das Cruzes-SPF
Brazil
*Corresponding authors:
Valerian E. Kagan, PhD, DSci.,
Center for Free Radical and Antioxidant Health,
Department of Environmental and Occupational Health,
University of Pittsburgh,
Bridgeside Point 100 Technology Drive, Suite 350,
Pittsburgh, PA, USA.
Tel: 412-624-9479
Fax: 412-624-9361
E-mail: [email protected]
Vladimir A. Tyurin, PhD
Center for Free Radical and Antioxidant Health
Department of Environmental and Occupational Health
University of Pittsburgh
Bridgeside Point, 100 Technology Drive, Suite 323
Pittsburgh, PA, USA
Tel: 412-383-5099
Fax: 412-624-9361
E-mail: [email protected]
1
Abstract
Apoptotic collapse of trans-membrane phospholipid asymmetry and migration of
cardiolipin from the inner to the outer mitochondrial membrane is associated with its
peroxidation and hydrolysis. We report that cyt c fulfills both enzymatic functions -
peroxidase and phospholipase A - activated in cells during apoptosis. The phospholipase A
activity is specific for peroxidized molecular species of cardiolipin and yields non-oxidized
monolyso-cardiolipins and oxygenated free fatty acids as the reaction products.
Collapse of trans-membrane phospholipid asymmetry and migration of cardiolipin (CL) from the
inner to the outer mitochondrial membrane is one of the central and early events of apoptotic
program
1,2
. Two metabolic reactions – peroxidation and hydrolysis – are likely important
participants of the CL translocation process, mitochondrial membrane permeabilization and
release of pro-apoptotic factors into the cytosol
3-10
. The first is associated with the CL-specific
peroxidase activity of cytochrome c (cyt c)/CL complexes and results in the accumulation of CL
hydroperoxy- and hydroxy-derivatives
7,10,11
. The second causes the formation of mono-lyso-CL
(MCL) - known to build-up in apoptosis
3,12,13
– through yet to be identified biochemical
pathways. Here, we report that cyt c displays a phospholipase A (PLA)-like activity that is
specific for peroxidized molecular species of CL and yields MCL and hydroperoxy-/hydroxy
free fatty acids (FFA-OOH/FFA-OH).
2
In a model system, containing cyt c/tetra-linoleyl-CL (TLCL) complex and H
2
O
2
, we found that
accumulation of TLCL-hydroperoxides (TLCL-OOH)
7
was accompanied by simultaneous
formation of MCL and FFA (Fig.1). Detailed analysis of the reaction products by consecutive
2D-HPTLC (Fig.1a, i,ii) and electro-spray ionization mass spectrometry (ESI-MS) established
the presence of non-oxidized TLCL, as well as hydroxy- [(C
18:2
)
3
/(C
18:2+O
)
1
], di-hydroxy-
[(C
18:2
)
3
/(C
18:2+O+O
)
1
], [(C
18:2
)
2
/(C
18:2+O
)
1
/(C
18:2+O
)
1
]; hydroperoxy- [(C
18:2
)
3
/(C
18:2+OO
)
1
] and
hydroxy-hydroperoxy- [(C
18:2
)
2
/(C
18:2+O
)
1
/(C
18:2+OO
)
1
] molecular species of TLCL (Fig.1b, i,ii;
Fig.1d). The molecular ion of MCL was also detected in the MS spectrum (Fig.1e, i,iii) and
identified as a species with three non-oxidized linoleic acid (C
18:2
) residues formed from
oxidized TLCLs (C
18:2
)
3
/(C
18:2+O
)
1
and (C
18:2
)
3
/(C
18:2+OO
)
1
(Fig.1e, iv). In contrast, the fraction of
FFA mainly included hydroxy-, di-hydroxy- and hydroperoxy-C
18:2
(Fig.1e, ii). Only trace
amounts of non-oxidized C
18:2
were present among the reaction products. Using LC/MS we
established that oxygenated C
18:2
and MCL were produced at a molar ratio of 1:1 and yielded up
to 150-200 pmol/nmol TLCL (Fig.1e, v) while the amount of oxidized non-hydrolyzed TLCL
was about 200 pmol/nmol TLCL. The reaction was Ca
2+
independent (data not shown). When
mono-unsaturated and non-oxidizable tetra-oleoyl-CL (TOCL) was used in place of TLCL,
neither accumulation of TOCL-OOH nor production of MCL and oxygenated FFA was observed
after incubation with cyt c/H
2
O
2
(Fig.1c). Note that cyt c has very similar binding constants with
TOCL and TLCL and cyt c/TOCL complex exerts a high peroxidase activity
7
.
Expectedly, zwitter-ionic phospholipids – phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine –
were neither oxidized nor hydrolyzed by cyt c/H
2
O
2
. Several anionic phospholipids –
phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid – did not
3
induce PLA-like activity of cyt c in the presence of H
2
O
2
, although significant accumulation of
their oxidized molecular species was observed (data not shown). Finally, neither TLCL-OOH nor
MCL and FFA-OOH were formed upon incubation of Fe-free cyt c/TLCL complex with H
2
O
2
(Fig. 1c).
To verify the association of PLA-like activity with the peroxidase function of cyt c, we
performed several experiments. Inhibition of peroxidase activity of the cyt c/TLCL complex by a
nitric oxide donor, NOC-15
14
, resulted in a significant decrease of H
2
O
2
–induced TLCL
oxidation and reduced accumulation of MCL and FFA (Fig.1c). Although, non-enzymatic
oxidation of TLCL by Fe
2+
/ascorbate/H
2
O
2
or by an azo-initiator of peroxyl radicals, AMVN,
caused accumulation of TLCL-OOH, these oxidation reactions were not accompanied by the
formation of MCL and oxidized FFA (in excess of 1-2 % of the total TLCL) (Fig.1b). In contrast,
microperoxidase-11 that contains heme surrounded by 11 amino acids effectively catalyzed both
TLCL peroxidation and hydrolysis to MCL and FFA-OOH (Fig.1c). Repeated incubations of cyt
c with pre-oxidized TLCL revealed significantly reduced formation of MCL and oxygenated
FFA (Fig.1c) suggesting the two activities – peroxidative and hydrolytic were concomitant.
Next we utilized C57BL/6J mouse heart mitochondria in which CL was accountable for 15% of
total phospholipids (Fig.2a). ESI-MS demonstrated that C
18:2
residues were present in all
molecular species of CL. Treatment of mitochondria with t-BuOOH resulted in accumulation of
CL containing hydroxy-, di-hydroxy-, hydroperoxy-, and hydroxy-hydroperoxy C
18:2
(Fig.2b).
These oxidation products were derived from CL containing four, three and two molecules of
C
18:2
. Significantly increased amounts of non-oxidized MCL – [(C
18:2
)
3
, (C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
1
,
4
(C
18:2
)
1
/(C
18:1
)
2
, (C
18:2
)
2
/(C
22:6
)] and oxygenated species of C
18:2
, containing one and two oxygen
molecules were found in t-BuOOH treated mitochondria (Fig.2c).
Previous studies have demonstrated that endogenous mitochondrial PLA
2
activity selective
towards CL may be increased during oxidative stress
15,16
. Further, the activity of PLA
2
is mostly
confined to the mitochondrial contact sites
17
ie, compartments enriched with CL
18
. To control for
possible contribution of endogenous PLA
2
in the detected hydrolysis of peroxidized CL
S
upon
exposure of mitochondria to t-BuOOH, we used several specific PLA
2
inhibitors. The
accumulation of MCL in t-BuOOH-treated mitochondria (174±23 pmol MCL/nmol CL) was not
statistically different from that detected upon addition of 1) a general PLA
2
inhibitor -
aristolochic acid I (195±89 pmol MCL/nmol CL), 2) inhibitor of Ca
2+
-independent PLA
2
–
bromoenol lactone (189±103 pmol MCL/nmol CL), 3) inhibitor of cytosolic PLA
2
–
arachidonyltrifluoromethyl ketone (228±74 pmol MCL/nmol CL), and 4) inhibitor of both Ca-
dependent and Ca
2+
-independent PLA
2
- methyl arachidonyl fluorophosphonate (242±45 pmol
MCL/nmol CL)
19
. Treatment of mitochondria with exogenously added PLA
2
produced a mixture
of MCL and dilyso-CL (DCL) (at a ratio of 1:2) as well as non-oxidized FFAs. Similarly,
exposure of peroxidized TLCL to PLA
2
lead to accumulation of MCL, DCL and peroxidized
MCL, DCL as well as a mixture of non-oxidized and oxidized C
18:2
as the major reaction
products. Thus, specificity and reaction products of cyt c- and PLA
2
-catalyzed hydrolysis of
peroxidized TLCL are dissimilar.
To examine whether cyt c exerts PLA-like activity in cells, we monitored production of MCL
and FFA in cyt c
+/+
and cyt c
-/-
cells during apoptosis triggered by non-oxidant (actinomycin D,
5
ActD) or oxidant (t-BuOOH) stimuli (Fig.2d,e). LC/ESI-MS analysis showed that the amounts
and the diversity of CL molecular species were similar and included several molecular species:
(C
14:0
)
1
/(C
16:1
)
2
/(C
20:0
)
1
, (C
16:0
)
2
/(C
18:1
)
2
, (C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
1
/(C
16:0
)
1
, (C
18:2
)
4
, (C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
2
,
(C
18:1
)
3
/(C
18:2
)
1
, and (C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
1
/(C
20:3
)
1
(Fig. 2d). In line with our earlier findings
7
, treatment
of cyt c
+/+
cells – but not cyt c
-/-
cells – with ActD or t-BuOOH triggered apoptosis as evidenced
by a 12-fold activation of caspase-3 and 6.1-fold PS externalization (Fig.2f, i). No significant
differences in the content of CL (approximately 3% of total phospholipids) were observed
between cyt c
+/+
and cyt c
-/-
cells (31.1+4.9 and 33.7+7.1 pmol CL/nmol total phospholipids,
respectively).
Apoptosis induced by ActD or t-BuOOH in cyt c
+/+
cells was associated with 6-7-fold
accumulation of CL-OOH (vs control) (Fig.2f, ii). No significant CL oxidation was detected in
cyt c
-/-
cells treated with either ActD or t-BuOOH (Fig.2f, ii). ESI-MS analysis of hydrolysis
products revealed the presence of non-oxidized MCL [(C
18:2
)
3
, C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
1
, and
C
18:2
)
1
/(C
18:1
)
2
] as well as oxygenated species of C
18:2
(Fig.2e, 2f, iv,v,). Essentially, no CL
hydrolysis products were detected in cyt c
-
/
-
cells treated with ActD or t-BuOOH (Fig.2f, iii,iv,v).
Overall, these results demonstrate for the first time that cyt c/CL complex displays not only an
oxygenase function specific for polyunsaturated molecular species of CL but simultaneously
exerts PLA-like activity which is specific for oxidized molecular species of CL and generates
FFA-OOH/ FFA-OH and non-oxidized MCL as the hydrolysis products. Moreover cyt c can act
– upon binding with CL and unfolding – as a PLA with the activity detectable in model systems
as well as in mitochondria and cells undergoing apoptosis.
6
The discovery of this new catalytic mechanism of cyt c fills the gap in previously known but
poorly understood pathway leading to the formation of lyso-CL in mitochondria of cells
undergoing apoptosis
3,9,12
. While the participation of MCL in trans-membrane migration of CL
in mitochondria has been long considered
3,5
, the role of oxygenated FFA in the process remains
to be elucidated. Our recent findings indicate that FFA-OOH are potent sources of oxidizing
equivalents for the peroxidase function of cyt c/CL complexes with the activity almost 1,000
times that achieved in the presence of H
2
O
2
(unpublished results). Thus, it is possible that once
initiated by disrupted electron transport and production of O
2
.
->H
2
O
2
, the peroxidase activity of
cyt c/CL complexes generates FFA-OOH that effectively fuel the peroxidase cycle and CL
peroxidation. In this way, cyt c/CL complexes self-propel conversion of CL into its peroxidized
and/or hydrolyzed derivatives both of which display much lower affinity towards cyt c binding.
As a result, the released cyt c can promptly and uninterruptedly interact with Apaf-1 hence
propagate the apoptotic program. It is possible that oxygenated FFA fulfill additional signaling
functions that need further characterization. For example, FFA-OH – identified in the current
work among the CL hydrolysis products - are not utilizable for the peroxidase function of cyt c
but are well known important regulators of cellular functions
20
.
The current study emphasized that non-oxidizable monounsaturated (eg, TOCL) and saturated
species of CL are not substrates of peroxidase or PLA functions of cyt c. These CL species are
likely candidates for alternative possibly structural functions in mitochondria. The essential role
of monounsaturated CL has been established in structural organization of respirasomes,
supercomplexes of electron-carriers
21
.
7
The catalytic mechanisms of PLA activity of cyt c remain to be elucidated. Biochemical and
crystallographic studies of PLA
2
indicate that a His
48
-Asp
99
doublet and conserved water
molecule that donates proton to His
48
and performs nucleophilic attack on the sn-2 ester bond of
the phospholipid substrate are essential participants
22
. Thus, the central events in the catalytic
reaction are protonation and deprotonation of the imidazole ring of His
48
22
. Appearance of
hydroperoxy-groups – known as weak acids
22
– can participate in protonation of His hence
facilitate the emergence of PLA activity of cyt c complexes towards peroxidized CL. Deficiency
of oxidizing equivalents will favor this pathway whereas excess of oxidizing equivalents (H
2
O
2
,
FFA-OOH) will be associated with the propagation of CL peroxidation.
Acknowledgments
Supported by NIH HL70755, NIAID U19AI068021, Pennsylvania Department of Health SAP
4100027294, Human Frontier Science Program.
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9
Figure legends
Figure 1. Peroxidase and phospholipase A
2
-like activities of cyt c/TLCL complexes produce – in
the presence of H
2
O
2
- oxidized TLCL as well as non-oxidized MCL and oxygenated FFA.
(a) 2D-HPTLC separation of TLCL-derived products before (i) and after (ii) incubation of
TLCL/DOPC liposomes (1:1, mol:mol) with cyt c/H
2
O
2
. Time-course of accumulation of CL-
OOH and non-oxidized MCL induced by cyt c/H
2
O
2
(iii), *p < 0.05 versus control, n = 6.
(b) Typical ESI-MS of non-oxidized TLCL (i) and TLCL-derived products formed in cyt c/H
2
O
2
driven reaction (ii). ESI-MS revealed the presence of non-oxidized TLCL (m/z 1447), its
sodium salt (m/z 1469) as well as hydroxy- [(C
18:2
)
3
/(C
18:2+O
)
1
], di-hydroxy- [(C
18:2
)
3
/(C
18:2+O+O
)
1
],
[(C
18:2
)
2
/(C
18:2+O
)
1
/(C
18:2+O
)
1
] and/or hydroperoxy- [(C
18:2
)
3
/(C
18:2+OO
)
1
] and hydroxy-
hydroperoxy- [(C
18:2
)
2
/(C
18:2+O
)
1
/(C
18:2+OO
)
1
] molecular species of TLCL with corresponding
molecular ions at m/z 1463, 1479, 1495, respectively. PLA
2
–like function of cyt c is activated
during CL oxidation.
(c) -Enzymatic TLCL oxidation is accompanied by its hydrolysis resulting in the formation of
MCL and oxygenated FFA. 1- TLCL/cyt c/H
2
O
2
; 2 – TLCL/microperoxidase 11/ H
2
O
2
; 3 –
TLCL/Fe-free cyt c/ H
2
O
2
; 4 – TLCL/cyt c/H
2
O
2
/NOC-15; 5 – TLCL/Fe
2+
/ascorbate/H
2
O
2
; 6 -
TLCL/AMVN; 7 – TOCL/cyt c/H
2
O
2
. *p<0.05, #p<0.05 vs TLCL/cyt c/H
2
O
2
or
TLCL/microperoxidase 11/ H
2
O
2
. Inhibition of peroxidase function of cyt c by removal of Fe
(3) or by and NO-donor, NOC-15 (4) as well as non-enzymatic induction of TLCL oxidation (5,
6) or employment of mono-unsaturated TOCL (7) are not associated by the formation of MCL.
10
(d) Structural identification and quantitative assessment of oxidized molecular species of CL
formed in cyt c catalyzed reaction in the presence of H
2
O
2
. Typical re-constructed LC-MS
profiles of non-oxidized TLCL (m/z 1447) and oxidized species of TLCL, containing hydroxy-
(m/z 1463), hydroperoxy- and/or dihydroxy- (m/z 1479) and hydroxy-hydroperoxy- (m/z 1495)
(i) groups. Tetra-myristoyl-CL (TMCL) (2 µM, m/z 1239) was used as an internal standard.
Tandem MS
n
analysis confirmed the structures of non-oxidized and oxidized TLCL species.
Typical MS
2
spectrum of non-oxidized (m/z 1447) (ii) and oxidized molecular species of TLCL
at m/z 1479 (iii). MS
2
fragmentation of the molecular ion with m/z 1447.9 yielded ions with m/z
695, 751, 831, 433, 415 and 279 corresponding to (C
18:2
)
2
-phosphatidic acid (C
18:2
)
2
-PA),
[(C
18:2
)
2
-PA),+56]
−
, [(C
18:2
)
2
-PA),+136]
−
, lyso-PA, lyso-PA minus water and C
18:2
. (ii).
Molecular ions with m/z 695, 727, 783, 863, formed after fragmentation of parent ion with m/z
1479, corresponding to (C
18:2
)
2
-PA), (C
18:2-OOH
/C
18:2
)-PA or (C
18:2-OH
)
2
-PA, [(C
18:2-OOH
/C
18:2
)-PA
+56]
−
or [(C
18:2-OH
)
2
-PA+56]
−
, [(C
18:2-OOH
/C
18:2
)-PA+136]
−
or [ (C
18:2-OH
)
2
-PA+136]
−
. Molecular
ions of C
18:2
(m/z 279), C
18:2-OH
(m/z 295) and C
18:2-OOH
(m/z 311) were detected in MS
2
spectrum
after fragmentation (iii). MS
n
analysis demonstrated that oxidized TLCL with m/z 1479 was
represented by its species with one molecule of dihydroxy-linoleic acid or two molecules of
monohydroxy-linoleic acid or one molecule of hydroperoxy-linoleic acid. Content of hydroxy-
(m/z 1463), hydroperoxy- and/or dihydroxy- (m/z 1479) and hydroxy-hydroperoxy- (m/z 1495)
molecular species of CL formed in the course of cyt c/H
2
O
2
driven reaction as assessed by
LC/MS, (n = 8) (iv).
(e) Structural identification and quantitative assessment of MCL and FFA formed in cyt c
catalyzed reaction in the presence of H
2
O
2
. Typical re-constructed LC-MS profiles of MCL (i)
and FFA (ii) formed during incubation of TLCL with cyt c/H
2
O
2
. (C
14:0
)
3
-CL (m/z 1239) and
11
C
17:0
(m/z 269) were used as internal standard for MCL and FFA, respectively. (C
14:0
)
3
-CL was
prepared as described in Supplementary Methods. Full ESI-MS (iii) and MS
2
spectra (iv) of
MCL (m/z 1185). MS
2
analysis of the molecular ion with m/z 1185 revealed the formation of
ions with m/z 695, 751, 831, 433, 415 and 279 corresponding to (C
18:2
)
2
-phosphatidic acid
(C
18:2
)
2
-PA), [(C
18:2
)
2
-PA),+56]
−
, [(C
18:2
)
2
-PA),+136]
−
, lyso-PA, lyso-PA minus water and C
18:2
.
Accumulated MCL did not contain oxidized fatty acid residues and it was identified as a species
with three linoleic acid residues (C
18:2
)
3
and originated from oxidized CLs with m/z 1463 and
1479. Amounts of MCL (m/z 1185) and FFA, FFA-OOH, FA-OH molecular species formed in
the course of cyt c/H
2
O
2
driven reaction (v) assessed by LC/MS ,*p < 0.001 versus non-oxidized
C
18:2
, n = 6.
Figure 2. Detection, identification and quantitation of products formed via peroxidase and
phospholipase A2 activities of cyt c in mouse heart mitochondria (a-c) as well as in embryonic
cyt c
+/+
and cyt c
-/-
cells (d-f) triggered to apoptosis by t-BuOOH (200 µM) or ActD (100
ng/mL).
(a) Typical negative ESI-MS spectrum of CL and MS
2
spectra of non-oxidized (m/z 1447) and
oxidized (m/z 1495) molecular species of CL isolated from heart mitochondria treated with t-
BuOOH (150µM). ESI-MS analysis demonstrated that CL was represented by at least 8
molecular clusters with m/z 1398, (0.3%), m/z 1424, (1.5%), m/z 1447, (19.8%), m/z 1449,
(28.8%), m/z 1451, (4.1%), m/z 1476 (4%), m/z 1495 (27.5%) and m/z 1497 (14%) corresponding
to CL molecular species (C
18:2
)
2
/(C
16:0
)
1
/(C
16:1
)
1
, (C
18:2
)
3
/(C
16:0
)
1
, (C
18:2
)
4
, (C
18:2
)
3
/(C
18:1
)
1
,
(C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
2
, (C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
1
/(C
20:3
)
1
, (C
18:2
)
3
/(C
22:6
)
1
, and (C
18:2
)
2
/(C
18:1
)
1
/(C
22:6
)
1
, respectively.
12
(b) Typical re-constructed LC/MS profiles of products from mitochondria after t-BuOOH
treatment: (i) - non-oxidized CL (m/z 1447, 1449), oxidized CL, containing hydroxy- (m/z 1463),
hydroperoxy- and/or dihydroxy- (m/z 1479) molecular species (i), non-oxidized MCL (m/z 1185,
1187, 1189, 1233) (ii) as well as oxygenated FFA (m/z 311 and 279) (iii). CL-(C
14:0
)
4
, MCL-
(C
14:0
)
3
, FA-C
17:0
were used as internal standards for CL, MCL and FFA, respectively.
Molecular species of MCL with m/z 1185, 1187, 1189, 1191 and 1233 were formed as oxidation
products of CL species with m/z 1447, 1449, 1452, 1454 and 1495, respectively.
(c) Quantitative assessment of MCL and oxygenated FFA in mitochondria exposed to t-BuOOH
(150µM). *p < 0.05 versus control n = 6.
(d) Typical negative ESI-MS spectra of CL isolated from cyt c
+/+
and cyt c
-/-
cells.
(e) Typical re-constructed LC/MS profiles of non-oxidized CL (m/z 1427, 1449) and oxidized
CL, containing hydroxy- (m/z 1443), hydroperoxy- and/or dihydroxy- (m/z 1479) molecular
species (i), non-oxidized MCL (m/z 1185, 1187, 1189, 1191) (ii) and oxygenated FFA (m/z 311)
(iii) obtained from cyt c
+/+
mouse embryonic cells treated with t-BuOOH (200µM). Non-
oxygenated FFA (C
18:0
, C
18:1
, C
18:2
, m/z 283, 281 and 279, respectively) were also detected on
MS spectra; however their contents in treated cells vs control cells were not statistically different.
CL-(C
14:0
)
4
, MCL-(C
14:0
)
3
, FA-C
17:0
were used as internal standards for CL, MCL and FFA,
respectively. Molecular species of MCL with m/z 1183, 1185, 1187, 1189 and 1191 were
formed as oxidation products from CL species with m/z 1427, 1447, 1449, and 1454, respectively.
(f) Assessments of a biomarker of apoptosis, externalized PS, in cyt c
+/+
and cyt c
-/-
cells by
annexin V binding (i). Insert – Flow cytometry data from a representative experiment after
treatment of cells with ActD: the number of annexin V/FITC-positive cells is shown in log scale.
*p < 0.01 versus control, n = 4. Accumulation of CL-OOH (ii), non-oxidized MCL (iii) and
13
oxygenated FFA (iv,v) in ActD (100 ng/mL) and t-BuOOH (200 µM) treated cyt c
+/+
and cyt c
-/-
cells. *p < 0.05 versus control, (n = 6). The contents of FFA-OOH were assessed by Amplex Red
protocol (iv) and LC/MS analysis (v).
14
a
iii
iii
bc
Figure 1
150
CL-OOH,
pmol/nmol CL
0
MCL,
% from total CL
15
30
*
#
*
#
#
#
#
300
12
345 6 7
1
2
CL-OOH,
pmol/nmol CL
*
*
0204060
Time, min
0
100
200
300
0
100
200
300
MCL, pmol/nmol CL
d
ii
iii
iv
0
50
100
150
200
250
m/z
1463
CL
ox
,
pmol/nmol CL
m/z
1479
m/z
1495
m/z 1447
+3O
+2O
+O
e
1445 1465 1485 m/z
1447.9
1479.9
1463.9
1495.9
1469.9
1447.9
1469.9
[M-H]
-
[M-H+Na]
-
i
ii
i
Relative Abundance
0
100
812
Time, min
m/z 1239.9
m/z 1447.9
m/z 1463.9
m/z 1479.9
m/z 1495.9
16
CL
400 800 1200 m/z
727.4
415.2
279.2
447.2
695.4
311.2
863.5
767.2
78.8
153.0
1479.9
[M-H]
-
295.1
279.3
400 800 1200 m/z
415.3
695.5
433.3
831.4
751.7
152.9
1447.9
[M-H]
-
TLCL
DOPC
Origin
Control
Origin
DOPC
TLCL
MCL
FFA
H
2
O
2
0
100
Relative Abundance
i
ii
iii
iv
1180 1200
m/z
1185.7
1207.7
[M-H]
-
[M+Na-H]
-
1160
279.3
200 600 1000
m/z
415.3
152.9
695.6
831.4
78.6
1185.7
[M-H]
-
Time, min
m/z 295.1
m/z 311.1
m/z 279.1
12 20 28
m/z 269.1
FFA
m/z 1029.7
14 18 22
Time, min
m/z 1185.7
MCL
v
0
50
100
150
200
FFA
30 min
MCL or FFA, pmol/nmol CL
C
18:2
C
18:2-O
C
18:2-OO
FFA-Sum
MCL
15 min
MCL
MCL FFA
v
Figure 2
a
iii
Time, min
m/z 1029.7
m/z 1185.7
m/z 1187.7
m/z 1189.7
MCL
14 18 22
m/z 1233.7
0
100
Relative
Abundance
Time, min
m/z 1239.9
m/z 1447.9
m/z 1449.9
m/z 1465.9
10 14
m/z 1479.9
18
CL
FFA
Time, min
10 18 26
C
17:0
m/z 269.1
C
18:2
m/z 279.1
C
18:2-OO
m/z 311.1
C
18:1
m/z 281.1
C
20:4
m/z 303.1
400 800 1200
m/z
279.2
415.2
695.6
831.5
152.9
1447.9
[M-H]
-
MS
2
279.2
400 800 1200
m/z
415.2
743.7
327.2
463.4
153.0
879.6
1495.9
[M-H]
-
1460 m/z
1495.8
1473.9
1519.9
1423.9
1447.9
1420 1500
MS
1
iii
b
c
d
18
m/z 1029.7
m/z 1185.7
m/z 1187.7
m/z 1189.7
14 18 22
Time, min
m/z 1191.7
MCL
Time, min
10 14
m/z 1239.9
m/z 1427.9
m/z 1449.9
m/z 1443.9
CL
m/z 1479.9
0
100
Relative Abundance
Time, min
10 18 26
FFA
C
17:0
m/z 269.1
C
18:2
m/z 279.1
C
18:1
m/z 281.1
C
18:0
m/z 283.1
C
18:2-OO
m/z 311.1
e
iii iii
1380 1400 1420 1440 1460 1480
m/z
1427.9
1452.0
1403.9
1400.0
1476.0
1376.9
Cyt c
-/-
ActD
1427.9
1452.0
1400.0
1476.0
1376.9
1403.9
Cyt c
+/+
ActD
f
i
ii
iii
iv
v
Annexin V (+)
cells,
%o f total
0
*
*
25
50
Cyt c
-/-
ActDCyt c
+/+
ActD
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H FL1-H
FL3-H
FL3-H
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H FL1-H
FL3-H
FL3-H
*
*
0
40
FFA-OOH
pmol/nmol
CL
*
80
0
40
CL-OOH,
pmol/nmol
CL
80
*
*
100
0
50
MCL
pmol/nmol
CL
*
100
*
Cyt c
+/+
cells Cyt c
-/-
cells
0
Control ActD t-BuOOH Control ActD t-BuOOH
50
FFA
pmol/nmol
CL
C
18:2
C
18:2-OO
*
Control t-BuOOH
*
0
100
200
300
MCL or FFA,
pmol/nmol CL
C
18:2
Sum
C
18:2=O
C
18:2=OO
FFAMCL FFAMCL
#
Supplementary Methods
Reagents 1,1’,2,2’-tetramyristoyl-cardiolipin (sodium salt), TMCL, 1,1’,2,2’-tetraoleoyl-
cardiolipin (sodium salt), TOCL, 1,1’,2,2’-tetralinoleoyl- cardiolipin (sodium salt), TLCL, 1,2-
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,
DLPC, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DLPE, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-
phosphate, DLPA, 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-1-glycerol (Sodium Salt), DLPG, 1-
stearoyl-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (Sodium Salt), SDPS, 1-palmitoyl-
2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (Sodium Salt), PAPS, 1-heptadecanoyl-2-
eicosatetraenoyl-sn-glycero-3-phospho-1'-myo-inositol (ammonium salt), PI, were from Avanti
Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA). Chloroform, methanol, acetone, ammonium hydroxide,
acetic acid glacial, CaCl
2
, EDTA, EGTA, diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), sodium
dodecyl sulfate, cytochrome c (cyt c), microperoxidase- 11, butylated hydroxytoluene, BHT,
porcine pancreas PLA
2
, inhibitors of PLA
2
: 1) general inhibitor of PLA
2
- aristolochic acid I
(AA1), and 2) inhibitor of Ca
2+
-independent PLA
2
- bromoenol lactone (BEL), were from
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Two additional inhibitors of PLA
2
: inhibitor of cytosolic
PLA
2
–arachidonyltrifluoromethyl ketone, AACOCF3, and selective inhibitor of both Ca
2+
-
dependent and Ca
2+
-independent PLA
2
- methyl arachidonyl fluorophosphonate, MAFP, were
purchased from Calbiochem (Darmstadt, Germany). HPTLC silica G plates were purchased from
Whatman (Schleicher & Schuell, England). N-acetyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red)
resorufin were from Molecular Probes (Eugene, OR, USA).
Model System. TLCL (200 µM)/DOPC (200 µM) lyposomes were prepared by sonication
(30 sec at 4
o
C) and incubated in 50 mM disodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 100 µM
DTPA in the presence of cyt c (40 µM) and H
2
O
2
(100 µM). At the end of incubation, lipids
1
were extracted using Folch procedure
2
and 2D-HPTLC; LC/MS and ESI-MS analysis were
performed. In several experiments, to verify PLA2-like activity of cyt c, Fe-free cyt c (40 µM);
NOC-15 (1 mM); AMVN (500 µM) and Fe
2+
(40 µM)/ascorbate (500 µM)/H
2
O
2
(100µM) were
used. In some experiments TLCL was substituted by TOCL (200 µM).
Mitochondria
were isolated from C57BL/6J mouse hearts using differential centrifugation
1
.
Mitochondria (1 mg protein per mL) were exposed to t-BuOOH (150 µM) for 1 h at 37
o
C.
Cell culture Mouse embryonic cyt c
-/-
cells (ATCC) and cyt c
+/+
cells (courtesy of Dr.
Xiaodong Wang, Department of Biochemistry, University of Texas, Southwestern Medical
Center, Dallas, Texas) were cultured in DMEM supplemented with 15% FBS, 25 mM HEPES,
50 mg/L uridine, 110 mg/L pyruvate, 2 mM glutamine, 1×nonessential amino acids, 2′-
mercaptoethanol, 0.5×10
6
U/L mouse leukemia inhibitory factor and 100 U/ml penicillin and
streptomycin. Cyt c
-/-
and cyt c
+/+
mouse embryonic cells were exposed to either ActD (100 ng
per mL) for 16 h at 37
o
C or t-BOOH (200 µM) for 16 h at 37
o
C. Caspase 3/7 activity was
measured with a luminescence Caspase-GloT/M 3/7 assay kit (Promega). PS externalization was
determined with the Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision, Mountain View,
CA). Cells and mitochondria were treated by 4 different inhibitors of PLA
2
: 1) general inhibitor
of PLA
2
- 50 µM AAI, 2) inhibitor of Ca-independent PLA
2
- 20 µM BEL, 3) inhibitor of
cytosolic PLA
2
- 15 µM AACOCF3, and 4) selective inhibitor of both Ca-dependent and Ca-
independent PLA
2
- 10 µM MAFP (Han et al., 2008).
Lipid extraction, 2D-HPTLC separation and lipid phosphorus determination.
Total lipids
were extracted from samples by Folch procedure
2
. Lipid extracts were separated and analyzed by
2D-HPTLC
3
. Prior to separation of phospholipids by HPTLC, plates were treated with methanol
containing 1 mM EDTA, 100 µM DTPA to bind transition metals from silica. The first solvent
2
system included chloroform:methanol:28% ammonium hydroxide (65:25:5 v/v). To remove the
solvent plates were dried with a forced N
2
blower and then they were developed in the second
dimension with a solvent system included chloroform:acetone:methanol:glacial acetic acid:water
(50:20:10:10:5 v/v). The phospholipids were visualized by exposure to iodine vapors and
identified by comparison with authentic phospholipid standards. Lipid phosphorus was
determined after mineralization of the residue by HClO
4
at 180
◦
C for 30 min by sodium
molybdate/ascorbate micro-assay
4
. For Amplex Red and ESI-MS-direct infusion analyses of
phospholipid hydroperoxides the phospholipid spots were visualized by spraying the plates with
deionized water. Then spots were scraped from the TLC plates and phospholipids were extracted
by choloroform:methanol:water (20:10:2 v/v).
ESI-MS analysis
. Phospholipids after 2D-HPTLC were subjected to direct infusion into
linear ion-trap mass spectrometer (Finnigan
TM
LXQ
TM
with the Xcalibur operating system
(Thermo Electron, San Jose, CA)). Phospholipids after 2D-HPTLC separation were evaporated
under N
2
, re-suspended in chloroform:methanol 1:1 v/v (20 pmoL/µL) and directly utilized for
acquisition of negative-ion ESI mass spectra at a flow rate of 5 µL/min. The ESI probe was
operated at a voltage differential of 5.0 kV. Capillary temperature was maintained at 70 or
150
o
C. MS/MS analysis of individual PL species was employed in full range zoom (200-1800
m/z) in negative ion mode. MS
n
analysis was carried out with relative collision energy ranging
from 20 to 40% and with activation q value at 0.25 for collision-induced dissociation (CID) and
q value at 0.7 for pulsed-Q dissociation technique (PQD). CL and MCL molecular species were
quantified by comparing the peak area after its normal phase LC-MS separation with that of
internal standards TMCL (C
14:0
)
4
and MCL (C
14:0
)
3
which were added to the sample before MS
analysis. MCL (C
14:0
)
3
was obtained after hydrolysis of TMCL by porcine pancreas PLA
2
3
(0.5U/µmol TMCL for 30 min at 37
o
C) and followed 2D-HPTLC purification. FFAs were
quantified their reverse phase LC-MS separation with C
17:0
as an internal standard.
LC/ESI-MS analysis
. LC/ESI-MS analysis was performed on a Dionex HPLC system
(utilizing the Chromeleon software) consisting of a Dionex UltiMate 3000 mobile phase pump,
equipped with an UltiMate 3000 degassing unit; UltiMate 3000 autosampler (sampler chamber
temperature was set at 4
o
C), 5 µL sample loop. Dionex HPLC system was coupled to ion trap
mass spectrometer (FinniganTM LXQ
TM
with the Xcalibur operating system, Thermo Electron,
San Jose, CA). The instrument was operated in the negative ion mode. For optimization of MS
conditions and preparation of tune files, standards (2 pmol/µL) were injected by direct infusion
through a syringe pump (flow rate 10 µL/min) into the HPLC solvent flow (flow rate 0.2
mL/min).
Normal phase column separation of phospholipids. Phosholipids (5 µL) were separated on
a normal phase column (Luna 3 µm Silica (2) 100A, 150x2 mm, (Phenomenex, Torrance, CA))
with flow rate 0.2 mL/min. The column was maintained at 30
o
C. The analysis was performed
using gradient solvents (A and B) containing 5 mM ammonium acetate. Solvent A was
hexane:propanol:water, 43:57:1 (v/v/v). Solvent B was hexane:propanol:water, 43:57:10 (v/v/v).
The column was eluted during the first 3 min isocratic at 10% solvent B, 3– 15 min with a linear
gradient from 10% solvent B to 37% solvent B, 15–23 min linear gradient to 100% solvent B,
and then 23–45 min isocratic at 100% solvent B, 47-57 min isocratic at 10% solvent B for
equilibrium column.
Reverse phase column separation of FFA
. Prior to LC-ESI-MS analysis, FFA were
separated by 2D-HPTLC during phospholipid separation, evaporated under N
2
, re-suspended in
methanol and separated on a reverse phase column (Luna 3 µm C18 (2) 100A, 150x2 mm,
4
(Phenomenex)) at a flow rate of 0.2 mL/min. The column was maintained at 30
o
C. The analysis
was performed using gradient solvents (A and B) containing 5 mM ammonium acetate. Solvent
A was tetrahydrofuran/methanol/water/CH
3
COOH, 25:30:44.9:0.1 (v/v/v). Solvent B was
methanol/water, 90:10 (v/v). The column was eluted during the first 3 min isocratically at 50%
solvent B, from 3 to 23 min with a linear gradient from 50% solvent B to 98% solvent B, then
23–40 min isocratically using 98% solvent B, 40-42 min with a linear gradient from 98% solvent
B to 50% solvent B, 42-48 min isocratically using 50% solvent B for equilibration of the column.
Fluorescence HPLC assay of phospholipid hydroperoxides.
Phospholipid hydroperoxides
were quantitatively determined by fluorescence HPLC of products formed in microperoxidase
11-catalyzed reaction with a fluorogenic substrate, Amplex Red, as previously described
5
.
Phospholipids were hydrolyzed by porcine pancreatic PLA
2
(0.1 U/µl) in 25 mM phosphate
buffer containing 0.8 mM Ca, 0.5 mM EGTA and 0.5 mM SDS (pH 8.0 at RT for 30 min), prior
to exposure to reagents for the peroxidase reaction (microperoxidase-11/Amplex Red). Amplex
Red (50 µM) and microperoxidase-11 (1.0 µg/µl) were added to hydrolyzed lipids, and the
samples were incubated at 4
o
C for 40 min. The reaction was terminated by addition of 100 µl of
a stop reagent (solution of 10 mM HCl, 4 mM BHT in ethanol). Shimadzu LC-100AT vp HPLC
system equipped with fluorescence detector (RF-10Axl) and auto-sampler (SIL-10AD vp) were
used for the analysis of products separated by HPLC. Sample (5 µl) was injected into a column
(Eclipse XDB-C18, 5 µm, 150 x 4.6 mm). The column was eluted by a mobile phase composed
of 25 mM KH
2
PO
4
(pH 7.0)/methanol (60:40 v/v) with 1 ml/min flow rate. The resorufin
(Amplex red oxidation product) fluorescence was measured at 590 nm after excitation at 560 nm.
5
Statistics. The results are presented as means ± SD values from at least three independent
experiments, and statistical analyses were performed by one-way ANOVA. The statistical
significance of differences was set at p < 0.05.
Supplementary References
1. Ott, M., Robertson, J.D., Gogvadze, V., Zhivotovsky, B. & Orrenius, S.
Cytochrome c release from mitochondria proceeds by a two-step process. Proc Natl Acad Sci U
S A. 99, 1259-1263 ( 2002).
2. Folch, J., Lees, M. & Sloan-Stanley, G.H. A simple method for isolation and
purification of total lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
3. Rouser, G., Fkeischer, S. & Yamamoto, A. Two dimensional then layer
chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus
analysis of spots. Lipids 5, 494-496 (1970).
4. Böttcher, C.S.F., Van Gent, C.M. & Fries, C. A rapid and sensitive sub-micro
phosphorus determination. Anal Chim Acta 24, 203-204 (1961).
5. Tyurin, V.A. et al. Mass-spectrometric characterization of phospholipids and their
primary peroxidation products in rat cortical neurons during staurosporine-induced apoptosis. J.
Neurochem. 107, 1614-1633 (2008).
6
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