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CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE ECOSSISTEMAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
A EFICÁCIA DO ÓLEO DE CRAVO COMO ANESTÉSICO EM
TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus Linnaeus, 1758)
LARISSA NOVAES SIMÕES
Orientador
Prof. Dr. Levy de Carvalho Gomes
VILA VELHA
2009
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CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE ECOSSISTEMAS
A EFICÁCIA DO ÓLEO DE CRAVO COMO ANESTÉSICO EM
TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus Linnaeus, 1758)
Dissertação apresentada ao Centro
Universitário Vila Velha, como pré-requisito
do Programa de Pós-Graduação em
Ecologia de Ecossistemas, para obtenção
do título de Mestre em Ecologia.
LARISSA NOVAES SIMÕES
Orientador
Prof. Dr. Levy de Carvalho Gomes
VILA VELHA
2009
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Dedico à meu avô Walter (in memoriam)
aos ensinamentos herdados, apoio
moral e financeiro aos meus estudos, o
maior responsável pela minha formação
profissional.
"Descobri como é bom chegar quando
se tem paciência. E para se chegar,
onde quer que seja, aprendi que não é
preciso dominar a força, mas sim a
razão. É preciso, antes de qualquer
coisa, querer."
Autor desconhecido
Catalogação na publicação elaborada pela Biblioteca Central / UVV-ES
S593e Simões, Larissa Novaes.
A eficácia do óleo de cravo como anestésico em
tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) / Larissa Novaes
Simões. – 2009.
84 f. : il.
Orientador: Levy de Carvalho Gomes.
Dissertação (mestrado em Ecologia de Ecossistemas) -
Centro Universitário Vila Velha, 2009
.
Inclui bibliografias
.
1. Tilápia (Peixe). 2. Cravo-da-índia. 3. Anestésicos – Efeito
Fisiológico. 5. Piscicultura. I. Gomes, Levy de Carvalho. II.
Centro Universitário Vila Velha. III. Título
.
AGRADECIMENTOS
Ao meu grande Deus, por todos os momentos intensos de alegria e tristeza,
por ser o meu melhor amigo e por me abençoar, com mais esta conquista.
Agradeço ao meu orientador o Prof. Dr. Levy de Carvalho Gomes pela
confiança, amizade, paciência, rigidez e dedicação ao meu trabalho.
À minha família, pelo grande incentivo, apoio, compreensão e amor. Ao meu
namorado, por estar sempre ao meu lado, pela imensa compreensão,
dedicação, carinho e amor.
Agradeço ao José Maria, e ao Dalton da Aques (Associação dos Aqüicultores
do Espírito Santo), à Bioalevinos (Ibiraçú), Fazenda Barra do Mangaraí (Santa
Leopoldina), Agro Estância Lombardi - Ibiraçú (funcionários e familiares) por
toda facilidade estrutural e apoio, aos funcionários do Complexo de Atividades
Biopráticas da UVV, pela colaboração e apoio aos meus experimentos, ao
Paulo Roberto (da microbiologia), e a Adriana Canal (da bioquímica).
Aos Professores Genilson de Paiva, Ary Gomes, Andrea Tassis, e Dominik
Lenz. Muito obrigado também, aos professores do curso de gastronomia: Prof.
Bianca, Prof. Andréa Souto, Prof. Mariuza, Prof. Alessandro (Coordenador do
curso), pela ajuda e disponibilidade e a todos os julgadores da análise
sensorial. Agradeço ao Dr. Adalberto Val e equipe pela estrutura e apoio no
INPA (Manaus).
Aos amigos que caminharam comigo durante a realização desse trabalho,
Danielle Lombardi, Frederico Eutrópio, Michel Galão, Fátima Mariante, Luciano
Rodrigues, Paula Uchoa, e em especial ao Bruno Ferreira e a todos que me
incentivaram de alguma forma a concretizar esse trabalho. A todos os amigos
que me acompanharam nesta grande e difícil jornada, o meu muito obrigada!
7
SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................ 9
ABSTRACT ...................................................................................................... 10
CAPÍTULO 1
1.1 APRESENTAÇÃO ...................................................................................... 12
1.2 REFERÊNCIAS .......................................................................................... 14
CAPÍTULO 2
Eficácia do óleo de cravo como anestésico durante o manejo e o transporte de
juvenis de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) .............................................. 15
RESUMO.......................................................................................................... 16
ABSTRACT ...................................................................................................... 17
2.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 18
2.2 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 19
2.2.1 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE O MANEJO ........................................... 19
2.2.2 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE TRANSPORTE ..................................... 21
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 23
2.3.1 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE O MANEJO ........................................... 23
2.3.2 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE O TRANSPORTE ................................ 25
2.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................... 31
2.5 REFERÊNCIAS .......................................................................................... 32
CAPÍTULO 3
O uso do óleo de cravo como anestésico em juvenis avançados de tilápia do
nilo (Oreochromis niloticus) durante o manejo: determinação da concentração e
do tempo de exposição ideal e respostas de estresse ..................................... 37
RESUMO.......................................................................................................... 38
ABSTRACT ...................................................................................................... 39
3.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 40
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 41
3.2.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E DO TEMPO DE ANESTESIA IDEAL... 41
3.2.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTRESSANTE DO ANESTÉSICO ......................... 43
3.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 44
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 45
3.3.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL ........................................................... 45
8
3.3.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTRESSANTE DO ANESTÉSICO ......................... 47
3.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................... 53
3.5 REFERÊNCIAS .......................................................................................... 54
CAPÍTULO 4
Óleo de cravo como anestésico para adultos de tilápia do nilo (Oreochromis
niloticus): determinação da concentração ideal e avaliação sensorial do filé de
peixes anestesiados ......................................................................................... 60
RESUMO.......................................................................................................... 61
ABSTRACT ...................................................................................................... 62
4.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 63
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 64
4.2.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL ........................................................... 64
4.2.2 VERIFICAÇÃO DA MARGEM DE SEGURANÇA DO ANESTÉSICO ............... 65
4.2.3 ANÁLISE SENSORIAL .............................................................................................. 66
4.2.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ...................................................................................... 68
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 68
4.3.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL ........................................................... 68
4.3.2 VERIFICAÇÃO DA MARGEM DE SEGURANÇA DO ANESTÉSICO ............... 70
4.3.3 ANÁLISE SENSORIAL .............................................................................................. 71
4.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................... 74
4.5 REFERÊNCIAS .......................................................................................... 75
CAPÍTULO 5
5 CONCLUSÃO GERAL................................................................................... 80
ANEXO 1
Eficácia do óleo de cravo como anestésico durante o manejo e o transporte de
juvenis de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) .............................................. 81
ANEXO 2
O uso do óleo de cravo como anestésico em juvenis avançados de tilápia do
nilo (Oreochromis niloticus) durante o manejo: determinação da concentração e
do tempo de exposição ideal e respostas de estresse ..................................... 83
ANEXO 3
Óleo de cravo como anestésico para adultos de tilápia do nilo (Oreochromis
niloticus): determinação da concentração ideal e avaliação sensorial do filé de
peixes anestesiados ......................................................................................... 85
9
RESUMO
É comum o relato de prejuízos econômicos devido a mortalidade de peixes
decorrente das deficiências gerais em procedimentos de estações de
piscicultura. Desta forma, foram realizados três diferentes trabalhos, cada um
abordando o óleo de cravo como anestésico em uma determinada fase do ciclo
de criação da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). O primeiro estudo teve por
objetivo avaliar a eficiência do óleo de cravo da índia como anestésico em
juvenis (≈1,5 g) de tilápia, durante o manejo e o transporte. O segundo estudo
teve o objetivo de avaliar a eficiência do óleo de cravo como anestésico para
juvenis avançados (≈ 55 g) de tilápia durante o manejo. O terceiro estudo teve
como objetivo testar a eficiência do óleo de cravo como anestésico em adultos
(≈ 670 g) de tilápia, durante o manejo e avaliar, sensorialmente, o aroma e o
sabor do filé, após a anestesia. Para o manejo de juvenis, a concentração 90
mg.L
-1
de óleo de cravo é a mais adequada para indução de anestesia
cirúrgica. Para anestesia de juvenis avançados 250 mg.L
-1
de óleo de cravo é a
concentração mais adequada para indução de anestesia cirúrgica. A anestesia
na concentração ideal por 10 minutos, não foi estímulo suficiente para causar
um estresse severo, ocorrendo alterações somente após a anestesia na glicose
e no hematócrito. Em adultos 250 mg.L
-1
de óleo de cravo é a concentração
mais adequada para a indução de anestesia cirúrgica. Os filés de tilápia
previamente anestesiados com óleo de cravo apresentaram uma diferença
moderada no aroma e no sabor logo após a anestesia, e a partir de 12 h após a
anestesia não apresentam nenhuma diferença no aroma e no sabor em relação
aos peixes não anestesiados. Os resultados obtidos com peixes de três
diferentes tamanhos indicam que o óleo de cravo é um anestésico eficaz para o
manejo de tilápia, devendo ser evitado apenas no transporte de juvenis.
PALAVRAS-CHAVE: análise sensorial, estresse, manejo, óleo de cravo,
Oreochromis niloticus, transporte.
10
ABSTRACT
Economic losses due to fish mortality in hatchery stations are quite common.
The aim of this study was to evaluate clove oil as anaesthetic in different stages
of the lifecycle of Nile Tapia (Oreochromis niloticus). A first group of fishes was
juvenile (≈ 1,5 g) and the clove oil was used as anaesthetic for handling and
transport. A second group of fishes was advanced juvenile (≈ 55 g), the clove oil
in this group was used for handling purposes. A third group of fishes was adult
(≈ 670 g), here the clove oil was used for anesthesia. Later it was tested, if the
clove oil has impact on sensory, aroma and flavor of the steak. For the handling
of juveniles, a dose of 90 mg.L
-1
clove oil has proven most suitable for the
induction of surgical anesthesia. For anesthesia of juvenile fishes, a dose of 250
mg.L
-1
of clove oil is most appropriate for the induction of surgical anesthesia.
The duration of anesthesia when using the ideal dose lasted 10 minutes. A
short anesthesia does not expose the fishes to severe stress. In adults 250
mg.L
-1
of clove oil is the most appropriate dose for the induction of surgical
anesthesia. The meat of Nile Tapia formerly anesthesized with clove oil showed
a moderate difference in aroma and flavor. However, 12 hours after anesthesia
no differences in taste could be detected when comparing to untreated fishes.
The results of this study indicate, that clove oil is an effective anesthetic for the
management of tilapia and should be avoided only for the transport of juveniles.
KEYWORDS: clove oil, handling, Oreochromis niloticus, sensory analysis,
stress, transport.
11
CAPÍTULO 1
Apresentação
12
1.1 APRESENTAÇÃO
É bastante comum o relato de prejuízos econômicos expressivos devido a
mortalidade de peixes decorrente das deficiências gerais em procedimentos de
estações de piscicultura. A anestesia pode ser utilizada para facilitar o manejo
e reduzir o estresse ou danos físicos, tanto aos peixes como ao operador
(BOLASINA, 2006). Dentre os anestésicos comumente utilizados em peixes, o
óleo de cravo, cuja substância majoritaria é o eugenol, tem se destacado em
várias partes do mundo, por apresentar várias características de um anestésico
adequado como: baixo custo, facilidade de aquisição, alto grau de eficiência e
pouca propriedade tóxica aparente (GRIFFITH, 2000; ROSS; ROSS, 2008).
Nesta dissertação, estudamos o uso do óleo de cravo como anestésico para a
espécie Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758). Esta espécie foi escolhida por
ser o peixe mais criado no Espírito Santo, no Brasil e o terceiro mais criado no
mundo. Mesmo sendo um dos peixes mais criados no Brasil e no mundo, a
literatura referente à anestesia de tilápia ainda é bastante reduzida. Os poucos
trabalhos que abordam o uso do eugenol nesta espécie (DERIGGI ET AL,
2006; VIDAL ET AL, 2008), utilizam tamanhos diferentes de peixe, ou utilizam
concentrações diferentes das avaliadas neste trabalho. Os resultados destes
estudos não podem ser extrapolados para espécie toda, uma vez que, é
amplamente conhecido que a eficiência de anestésico tem relação direta com a
concentração e o tamanho do peixe (ROUBACH ET AL, 2005; ROSS; ROSS,
2008).
Para tornar a dissertação de uso prático no meio produtivo e padronizar o uso
do óleo de cravo para as diferentes fases do ciclo de criação da espécie,
procuramos realizar os procedimentos de anestesia de acordo com o que é
realizado normalmente em estações de piscicultura. Desta forma, foram
realizados três diferentes trabalhos (capítulos), cada um abordando uma fase
do ciclo de criação e analisando questões relevantes para cada fase. No
primeiro capítulo, foi estudada a anestesia de juvenis com aproximadamente
1,5 g. Para este tamanho de peixe foi determinada concentração ideal do
13
anestésico para o manejo, o tempo máximo de exposição, além de ser avaliada
a viabilidade de uso deste durante o transporte. No segundo capítulo, foi
estudada a anestesia de juvenis avançados (≈ 55 g), sendo determinada a
concentração ideal do anestésico, o tempo máximo de exposição e se o
anestésico tem efeito estressante nos animais. No terceiro capítulo, foi
estudada a anestesia de adultos (≈ 670 g). Para esta fase foi determinada a
concentração ideal do anestésico, o tempo máximo de exposição e as
características organolépticas do filé após a anestesia.
14
1.2 REFERÊNCIAS
BOLASINA, S. N. Cortisol and hematological response in Brazilian codling,
Urophycis brasiliensis (Pisces, Phycidae) subjected to anesthetic treatment.
Aquacult. Int., v. 14, p. 569-575, 2006.
DERIGGI, G. F.; INOUE, L. A. K. A.; MORAES, G. Stress responses to
handling in nile tilápia (Oreochromis niloticus) (Linuacus): Assessment of
eugenol as an alternative anesthetic. Acta Sci. Biol. Sci., v. 28, n. 3, p. 269-
274, 2006.
GRIFFITH, S. P. The use of clove oil as an anaesthetic and method for
sampling intertidal rockpool fishes. J. Fish Biol., v.57, p.1453-1464, 2000.
ROSS, L. G.; ROSS, B. Anaesthetic & sedative techniques for aquatic
animals. 3° ed. Oxford: Blackwell Science, 2008. 240 p.
ROUBACH, R.; GOMES, L. C.; FONSECA, F. A. L.; VAL, A. L. Eugenol as an
efficacious anaesthetic for tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier).
Aquacult. Res., v.36, p.1-6, 2005.
VIDAL, L. V. O.; ALBINATI, R. C. B.; ALBINATI, A. C. L.; LIRA, A. D.;
ALMEIDA, T. R.; SANTOS, G. B. Eugenol como anestésico para a tilápia-do-
nilo. Pesq. Agropec. Bras., v.43, n.8, p.1069-1074, 2008.
15
CAPÍTULO 2
Eficácia do óleo de cravo como anestésico durante o manejo e
o transporte de juvenis de tilápia do nilo (Oreochromis
niloticus)
16
RESUMO
Durante práticas realizadas em estações de larvicultura, como o manejo e o
transporte a anestesia é um processo indispensável. Objetivou-se com este
estudo avaliar a eficiência do óleo de cravo da índia (Syzygium aromaticum)
como anestésico em juvenis de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus), durante o
manejo e o transporte. Para avaliar o óleo de cravo durante o manejo, no
primeiro experimento os peixes foram expostos a banhos anestésicos em 6
diferentes concentrações e avaliado o tempo de indução aos diferentes
estágios de anestesia. No segundo experimento, avaliou-se diferentes tempos
de exposição à anestesia, sendo verificada a margem de segurança do
anestésico. Para avaliar o óleo de cravo durante o transporte, foi realizado um
experimento com 24 h de duração, sendo avaliadas duas concentrações de
anestésico. Para o manejo, a concentração 90 mg.L
-1
de óleo de cravo é a
mais adequada para indução de anestesia cirúrgica, pois o tempo de indução
da perda total de equilíbrio é menor do que a concentração de 80 mg.L
-1
. Para
anestesia voltada para biometria e breve manejo, a concentração recomendada
é 50-60 mg.L
-1
, pois apesar de demorar a induzir no peixe diferentes estágios
de anestesia, provoca uma recuperação rápida. O tempo máximo de anestesia
deve ser de 10 minutos. Os peixes transportados com a maior concentração de
anestésico apresentaram uma mortalidade significativamente maior que a do
controle em 24 h de transporte e em 96 h após o transporte. Os peixes
transportados com óleo de cravo apresentaram um distúrbio de sódio e
potássio significativamente maior que o dos peixes controle. O óleo de cravo é
um anestésico eficaz para o manejo de tilápia em procedimentos de rotina na
piscicultura, porém este anestésico deve ser evitado durante o transporte desta
espécie.
PALAVRAS-CHAVE: Comportamento, manejo, Oreochromis niloticus, sedação,
transporte.
17
ABSTRACT
In fish hatchery anesthesia is of essential importance for procedures like fish
handling and transportation. The objective of this work was test to the efficiency
of clove oil as anesthetic in Nile tilapia juveniles (Oreochromis niloticus) during
handling and transportation. The efficiency of clove oil was tested in two
experiments. For the first experiment, fish were exposed to six different oil
concentrations in anesthetic batches to measure induction times for the various
anesthesia stages in order to assess a safe concentration of clove oil for
anesthetic purposes. The second experiment evaluated different exposure
times of fishes to clove oil. Efficiency of clove oil during transportation was
evaluated in a 24 hours experiment using two different concentrations of the
anesthetic (9 and 18 mg.L
-1
). In Nile tilapia handling, 90 mg.L
-1
clove oil is the
most appropriate concentration to induce surgical anesthesia, since the
induction time to total loss of equilibrium is lower than at 80 mg.L
-1
. As for fish
biometry and brief handling procedures, the recommended concentration is 50
– 60 mg.L
-1
, as it allows fast recovery. On the other hand the lower dosage will
result in longer induction times for the anesthesia stages. The maximal time of
anesthesia should not exceed 10 minutes. The mortality rate of fish transported
using 18 mg.L
-1
of anesthetic was significantly higher as compared to the
control group at 24 h of transportation and in the measurement conducted after
96 h of transportation. Fish exposed to clove oil during transport presented
significant higher sodium and potassium disorders as compared to the control
group. As an anesthetic, clove oil is efficient in handling Nile tilapia in routine
fish hatchery procedures, although it should be avoided for the transportation of
the species.
KEYWORDS: Behavior, handling, Oreochromis niloticus, sedation, transport.
18
2.1 INTRODUÇÃO
A tilapicultura no Brasil é normalmente realizada em dois estágios diferentes: 1)
estação de larvicultura, que realiza a reprodução, a reversão sexual e produz
juvenis de até cerca de 5 cm e 2) estação de engorda que cria o peixe de 5 cm
até o tamanho para abate. Durante as diversas práticas realizadas nas
estações de larvicultura e engorda é necessária a anestesia dos indivíduos,
devido à movimentação excessiva que apresentam, quando acuados nas
redes, puçás e caixas de manejo, ou mesmo quando manuseados para
pesagem, coleta de gametas, marcação, diagnóstico, tratamento, transporte e
outros (ROSS; ROSS, 2008).
Em estações de larvicultura, o manejo de grandes quantidades de peixes e o
transporte, são os principais procedimentos nos quais é necessário o uso de
anestésico. O manejo dos peixes é normalmente intenso e tem curta duração,
caracterizando um estresse agudo (KIESSLING ET AL, 2009). O transporte é
um manejo inevitável no processo produtivo, também sendo considerado um
estresse intenso, podendo ser caracterizado como agudo ou crônico, de acordo
com a sua duração. Estes estressores expõem os peixes a uma série de
estímulos que desencadeiam respostas fisiológicas de adaptação (GOMES ET
AL, 2002). Apesar dos avanços nas técnicas de criação, a tilapicultura ainda
contabiliza prejuízos durante a larvicultura com a mortalidade de peixes
causada por manejo e transporte inadequados (MEINERTZ ET AL, 2006).
A obtenção dos anestésicos sintéticos mais utilizados para peixes é difícil no
Brasil, além disso, o custo é proibitivo para muitos produtores (ROUBACH ET
AL, 2005). Desta forma, o uso de óleos essenciais, derivados de plantas, tem
se mostrado uma alternativa viável frente a tais dificuldades de aquisição dos
anestésicos sintéticos utilizados para anestesia (FAÇANHA; GOMES, 2005;
PALIC ET AL, 2006). O principal produto natural utilizado é o óleo de cravo
extraído das folhas, do caule, das flores e brotos da árvore Eugenia
caryophyllata e E. aromatica, cujo constituinte majoritário é o eugenol, que
representa de 70 a 90% do óleo. Muito utilizado na odontologia, o eugenol
19
apresenta várias características de um anestésico adequado para peixes como:
baixo custo e facilidade de aquisição, alto grau de eficiência e pouca
propriedade tóxica aparente (ROSS; ROSS, 2008). O óleo de cravo tem sido
intensivamente estudado para várias espécies de peixes, e os resultados
obtidos demonstram que é uma ótima alternativa aos produtos sintéticos
normalmente utilizados (INOUE ET AL, 2003; COOKE ET AL, 2004;
ROUBACH ET AL, 2005; INOUE ET AL, 2005; KAISER ET AL, 2006).
A tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) é o peixe mais criado no Brasil e um
dos mais criados no mundo (FAO, 2007), porém a literatura referente aos
anestésicos para esta espécie é bastante limitada, havendo referência para a
benzocaína (GONTIJO ET AL, 2003; ROSS; ROSS, 2008), para o eugenol
(VIDAL ET AL, 2008) e para o mentol (SIMÕES; GOMES, 2009). Entretanto,
nesses estudos, foram utilizados peixes em fase de engorda, sendo necessário
avaliar anestésicos alternativos para auxiliar no desenvolvimento da criação da
espécie nas estações de larvicultura. O objetivo deste estudo foi avaliar a
eficiência do óleo de cravo como anestésico para o manejo e o transporte de
juvenis de tilápia do Nilo.
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE O MANEJO
Foram utilizados 90 juvenis de tilápia (1,46 ± 0,38 g e 4,33 ± 0,30 cm; média ±
desvio padrão) obtidos na piscicultura da Associação dos Aqüicultores do
Espírito Santo (AQUES), Cariacica - ES, onde foram colocados para
aclimatação em dois tanques de 150 L cada, com fluxo contínuo de água e
sistema de aeração constante. Os peixes foram aclimatados por 10 dias e
durante este período a qualidade da água foi monitorada a cada três dias
(oxigênio dissolvido: 5,99 ± 1,23 mg.L
-1
; temperatura: 26,7 ± 0,96 ºC;
condutividade: 66,49 ± 3,09 µS.cm
-1
; dureza: 23,62 ± 3,29 mgCaCo
3
.L
-1
; vazão
da água: 1,43,20 ± 0,41,13 L.min
-1
; e pH: 6,70±0,15). Durante a aclimatação,
20
os peixes foram alimentados diariamente com ração comercial para peixes
contendo 36% de proteína bruta (Nutriave, Propeixe 36% E).
Os ensaios foram realizados em aquários estáticos de 6 L, contendo 2 L de
água e a recuperação sempre realizada em aquários plásticos (45 L) contendo
20 L de água, com aeração constante. A qualidade da água durante os
ensaios, o oxigênio dissolvido: 8,15 ± 0,44 mg.L
-1
; temperatura: 27,5 ± 0,34 ºC;
condutividade: 63,73 ± 1,00 µS.cm
-1
; dureza: 25,02 ± 1,42 mgCaCo
3
.L
-1
; e pH:
6,52.
O lote do óleo de cravo adquirido em uma farmácia de manipulação passou por
ensaios, um do próprio fabricante (Petite Marie, Brasil) e outro pela farmácia de
manipulação, seguido critério da Farmacopéia Brasileira. Antes de ser utilizado,
o óleo de cravo (densidade de 1,03 g.cm
-
³) foi diluído em uma concentração de
1mL/10mL em etanol a 95% para o preparo da solução mãe. A água do aquário
foi trocada ao término de cada ensaio.
No primeiro experimento, foram avaliadas seis diferentes concentrações de
óleo de cravo (50; 60; 70; 80; 90 e 100 mg.L
-1
). Para cada concentração foram
utilizados 10 peixes, sendo expostos ao anestésico de forma individual, para se
observar o tempo de indução a cada estágio, em segundos. Após 10 minutos
de exposição ao óleo de cravo, o peixe era removido para o aquário de
recuperação. Os diferentes estágios de indução a anestesia avaliados
seguiram critério proposto por Stoskopf (1993), conforme a Tabela 1. Foi
considerado recuperado o peixe que recuperava totalmente os movimentos e
nadava ativamente no aquário.
21
Tabela 1. Definição dos estágios de anestesia
Estágio de anestesia
Evento comportamental
1
Perda de reação a estímulos
2
Perda parcial de equilíbrio
3
Perda total de equilíbrio
4
Redução dos batimentos operculares
5
Parada dos batimentos operculares
FONTE: Adaptado de Stoskopf (1993)
No segundo experimento, foi verificada a margem de segurança do anestésico.
Para isso foi tomado por base o resultado do primeiro experimento, sendo
selecionada a concentração de 90 mg.L
-1
, por ter sido a concentração que
induziu nos peixes o estágio de parada dos batimentos operculares em menor
tempo, além de induzir nos peixes todos os estágios de anestesia. Então foi
analisado o tempo de recuperação, após indução a concentração de 90 mg.L
-1
de óleo de cravo por diferentes tempos. Os peixes previamente aclimatados
foram dispostos de maneira individual ao anestésico por 10, 20 e 30 minutos
(n=10 para cada tempo de exposição). Após a exposição, o peixe era removido
para o aquário de recuperação e o tempo de recuperação monitorado.
Os dados estão expressos em média e desvio padrão. Os tempos para atingir
os diferentes estágios de anestesia para as diferentes concentrações de óleo
de cravo, assim como o tempo de recuperação após a exposição a diferentes
tempos de anestesia, foram analisados por uma análise de variância, seguida
do teste de Tukey (p<0,05) (ZAR, 1999).
2.2.2 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE TRANSPORTE
Foram utilizados 2700 juvenis de tilápia (0,43 ± 0,11 g e 3,27 ± 0,21 cm; média
± desvio padrão) obtidos na piscicultura Bioalevinos, Ibiraçú, ES. Os peixes
foram capturados em um tanque de criação e transferidos para um tanque (500
L) de depuração, com fluxo contínuo de água, por 24 h. A qualidade da água
no tanque de depuração, o oxigênio dissolvido: 6,85 mg.L
-1
; temperatura: 25,3
22
ºC; condutividade: 45,8 µS.cm
-1
; dureza: 10,01 mgCaCo
3
.L
-1
; vazão da água:
4,94 L.min
-1
; CO
2
: 8,8 mg.L
-1
; amônia: indetectável; e pH: 7,58.
Para o transporte foram utilizados 27 sacos plásticos de 6 L contendo 2 L de
água e injetados com oxigênio puro, que ocupou cerca de 75% do volume do
saco plástico e posteriormente lacrados. A densidade foi de 50 peixes/L (100
peixes por saco). Foi realizado um experimento fatorial com três tratamentos: 0,
9 e 18 mg.L
-1
de óleo de cravo e três tempos de transporte: 6, 12 e 24 h. Foram
realizadas três repetições para cada combinação de tempo e tratamento. O
transporte foi simulado e teve duração total de 24 h.
Ao final do transporte, os sacos foram abertos e a mortalidade, a qualidade da
água e o fluxo iônico de Na
+
e K
+
verificados. Os peixes de cada saco de
transporte foram transferidos para um aquário de 30 L com aeração constante
e monitorados por 96 h para avaliar a mortalidade acumulada.
O oxigênio dissolvido, a temperatura e a condutividade foram medidas com um
multiparâmetro YSI 85. O pH foi monitorado com potenciômetro digital Quimis
Q-400. A dureza da água foi medida por titulação conforme APHA (1998), a
amônia pela técnica de endofenol e o CO
2
por titulação, sendo todos de acordo
com a American Public Health Association (1998).
As concentrações de Na
+
e K
+
da água foram medidos diretamente em um
fotômetro de chama Analyser 910, São Paulo - Brasil. O fluxo iônico (Jnet) foi
calculado de acordo com Gonzales et al (1998), a partir da mudança de
concentração de íon da água do transporte durante os diferentes tempos de
amostragem. A fórmula utilizada foi: Jnet = V([íon]
1
– [íon]
2
).(Mt)
-1
, onde [íon]
1
e
[íon]
2
são as concentrações de um determinado íon no início e no final do fluxo,
respectivamente, V é o volume de água em litros, M é a massa de peixe em Kg
e t é a duração do fluxo em horas. As concentrações iniciais de Na
+
e K
+
na
água do transporte era: (média em µmol.L
-1
) Na
+
350, 315,6 e 317,8; K
+
18,
12,1 e 12, para os peixes transportados com 0, 9 e 18 mg.L
-1
de óleo de cravo,
respectivamente.
23
Os resultados de mortalidade, mortalidade acumulada, qualidade da água e
fluxo iônico foram calculados por uma análise de variância de dois fatores e
teste de Tukey (p<0,05) (ZAR, 1999).
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.3.1 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE O MANEJO
As concentrações de 80, 90 e 100 mg.L
-1
de óleo de cravo induzem os peixes a
todos os estágios de anestesia, porém, os peixes anestesiados com 90 mg.L
-1
alcançam os estágios de perda total de equilíbrio e parada dos batimentos
operculares em um tempo significativamente menor. A concentração de 100
mg.L
-1
provocou mortalidade de 20% dos peixes anestesiados. A concentração
indicada para indução cirúrgica em juvenis de tilápia é 90 mg.L
-1
(Tabela 2).
As concentrações de óleo de cravo, assim como de outros anestésicos,
necessárias para a indução anestésica variam conforme a espécie e devem
estar relacionadas ao metabolismo animal (ROSS; ROSS, 2008). Em bagre do
canal e bluegill (Lepomis macrochirus) (STEHLY; GINGERICH, 1999), salmão
do Atlântico (Salmo salar) (IVERSEN ET AL, 2003), truta arco-íris
(Oncorhynchus mikiss) (KEENE ET AL, 1998), pacu vermelho (Piaractus
brachypomus) (SLADKY ET AL, 2001), Chinook salmon (Oncorhynchus
thawytscha) (CHO; HEATH, 2000), largemouth bass (Micropterus salmoides)
(COOKE ET AL, 2004), Gilthead sea bream (Sparus aurata) (MYLONAS ET
AL, 2005), Fathead minnows (Pimephales promelas) (PÁLIC ET AL, 2006) as
concentrações de óleo de cravo ficam na faixa de 10-50 mg.L
-1
. Por outro lado,
espécies como o tambaqui (Colossoma macropomum) (ROUBACH ET AL,
2005) e Anguilla reinhardtii (WALSH; PEASE, 2002) necessitam de
concentrações maiores, entre 65 - 80 mg.L
-1
, para indução a anestesia
cirúrgica.
A concentração adequada com finalidade de um breve manejo não necessita
induzir a todos os estágios de anestesia, sendo necessário alcançar apenas a
24
perda total de equilíbrio. Os peixes anestesiados com 50, 60, 70 e 80 mg.L
-1
de
óleo de cravo apresentam rápida recuperação e um tempo similar de indução
ao estágio de perda total de equilíbrio. Sendo assim 50-60 mg.L
-1
é a faixa
ideal para uma anestesia voltada para o manejo (Tabela 2).
Tabela 2. Tempos, em segundos, de indução aos estágios de anestesia de tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus) expostos a diferentes concentrações de óleo de cravo (mg.L
-1
) por 10
minutos. Médias seguidas por letras diferentes na coluna diferem entre as concentrações no
mesmo estágio por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05); os resultados são média ± erro
padrão. † mortalidade de 20% dos peixes. – concentração não alcançou ao estágio de
anestesia
Óleo de
cravo
(mg.L
-1
)
Eventos comportamentais (segundos)
Perda de
reação à
estímulos
Perda
parcial de
equilíbrio
Perda
total de
equilíbrio
Redução dos
batimentos
operculares
Parada dos
batimentos
operculares
Recuperação
50
24,7±1,0a 43,7±2,3a 90,9±7,0a 344,1±14,2a
-
177,4±21,2a
60
20,2±1,0b 32,0±1,7b 90,0±9,8a 219,0±12,4b
-
163,0±15,9a
70
16,9±1,1bc 28,8±1,4bc 83,6±4,8ab 348,7±6,7a
-
287,5±18,1ab
80
17,5±0,5b 34,0±1,5b 95,6±5,3a 212,5±7,7b 545,0±25,0a 220,0±15,5a
90
13,4±0,8cd 23,5±2,1cd 86,6±10,8ab 147,0±14,0c 281,0±15,1b 379,0±71,8b
100
9,6±0,7d 17,6±1,2d 56,6±3,7b 126,8±6,9c 199,2±6,5c 377,1±35,6b †
O tempo de recuperação após a exposição por 10 e 20 minutos a 90 mg.L
-1
de
óleo de cravo, foi de 359,1 ± 41,9s e 560,8 ± 123,35s, respectivamente, não
havendo diferença significativa, entretanto 50% dos peixes anestesiados por 20
minutos morreram. Houve mortalidade de 100% dos peixes expostos ao
anestésico por 30 minutos. Waterstrat (1999) obteve resultado semelhante
anestesiando juvenis de bagre do canal com 100 mg.L
-1
de óleo de cravo, onde
tempos superiores à 20 minutos de exposição prolongam o tempo de
recuperação e aumentam a mortalidade.
25
ROSS; ROSS (2008) descreveram que 10 minutos deve ser o tempo máximo
de anestesia, e os resultados obtidos no presente estudo corroboram com esta
afirmação. Costa et al (in press) mostra que juvenis de 2 g de piauçu
(Leporinus macrocephalus) também apresentam mortalidade elevada quando
expostos ao anestésico por 20 minutos. Porém, resultados contrários foram
observados para o tambaqui (50 e 500 g) (ROUBACH ET AL, 2005) e para a
truta arco-íris (20 g) (KEENE ET AL, 1998), onde peixes expostos ao eugenol
por até 30 minutos não apresentaram mortalidade. Esta diferença parece estar
relacionada ao tamanho de peixe anestesiado.
2.3.2 USO DE ÓLEO DE CRAVO DURANTE O TRANSPORTE
O transporte como prática de manejo em piscicultura intensiva pode ter
duração variada, dependendo da distância percorrida. Quando saem da
estação de larvicultura, os juvenis vivos são transportados principalmente para
estabelecimentos de criação de engorda. Em todos os casos, os animais
devem chegar em boas condições fisiológicas para satisfazer os critérios
exigidos pelo comprador (CARNEIRO ET AL, 2002).
Em todas as concentrações avaliadas, observou-se que os peixes
apresentaram maior reação de hiperatividade ao primeiro contato com o
anestésico em relação ao controle, evidenciada pela rápida movimentação nos
sacos plásticos, que diminuía à medida que o efeito do anestésico se instalava.
Após seis horas de transporte, os peixes expostos a 9 mg.L
-1
de óleo de cravo,
apresentavam perda de reações à estímulos, caracterizando uma leve
sedação, diferente dos peixes transportados com 18 mg.L
-1
, onde a maioria
alcançou perda total de equilíbrio. Após 12 e 24 h de transporte, os peixes
transportados com anestésico nas duas concentrações testadas apresentavam
perda de reação a estímulos. De acordo com Cooke et al (2004), os estágios
de anestesia desejado durante o transporte são perda de reação a estímulos e
perda parcial de equilíbrio. Os mesmos autores, pesquisando diferentes
concentrações de óleo de cravo em Largemouth bass (Micropterus salmoides)
descrevem que concentrações entre 5 e 8,5 mg.L
-1
são ideais para o transporte
destes peixes.
26
A temperatura da água foi similar entre os tratamentos nos tempos 6 e 12 h de
transporte. Em 24 h de transporte, a temperatura foi igual entre os tratamentos,
mas significativamente maior que nos tempos 6 e 12 h (Tabela 3). A variação
de temperatura durante o trabalho foi inferior a 1
o
C.
O oxigênio dissolvido apresentou forte variação na água do transporte do
tratamento com 18 mg.L
-1
de óleo de cravo, sendo significativamente menor em
6 h de transporte quando comparado aos demais tempos. No tratamento
controle e no tratamento com 9 mg.L
-1
de óleo de cravo, o oxigênio teve um
comportamento esperado, com uma maior concentração em 6 h de transporte
e uma diminuição progressiva até 24 h de transporte. A concentração de
oxigênio dissolvido ao final do transporte foi significativamente maior no
controle quando comparado aos tratamentos com anestésico. Houve um forte
consumo de oxigênio dos peixes dos tratamentos com anestésicos entre os
tempos 12 e 24 h de transporte. Este maior consumo pode estar relacionado
com uma maior demanda metabólica do animal para recuperar a sua
homeostase após o distúrbio causado pelo anestésico principalmente no
tratamento com 18 mg.L
-1
de óleo de cravo. Para os peixes anestesiados com
9 e 18 mg.L
-1
de óleo de cravo, na densidade de 50 peixes/L, o tempo máximo
de transporte deve ser 24 h, uma vez que o oxigênio atingiu concentrações
próximas as críticas para a sobrevivência dos peixes e não é possível renovar
o oxigênio com freqüência uma vez que o saco de transporte é lacrado. O
mesmo resultado foi verificado por Cooke et al (2004) durante o transporte de
largemouth bass (Micropterus salmoides) com óleo de cravo em sistema
fechado, onde a concentração de oxigênio dissolvido foi decrescente durante o
transporte.
A condutividade elétrica aumentou significativamente entre os tempos de
transporte em todos os tratamentos (Tabela 3). De acordo com Gomes et al
(2009) este aumento está relacionado com o efluxo de íons e com o aumento
da concentração de amônia na água. Este padrão de aumento de
condutividade ao longo de transporte já havia sido observado durante o
transporte de cardinal (Paracheirodon axelrodi) (GOMES ET AL, 2009).
27
O pH e o CO
2
apresentaram comportamento contrário, com uma diminuição
significativa do pH durante o transporte em todos os tratamentos e um aumento
do CO
2
(Tabela 3). Ao final do transporte o pH foi significativamente maior no
tratamento controle quando comparado ao tratamento com 18 mg.L
-1
de óleo
de cravo e o CO
2
, apresentou resultado contrário, sendo significativamente
maior no tratamento com 18 mg.L
-1
de óleo de cravo quando comparado com o
controle. Inoue et al (2005) relataram que o pH da água decresceu após 4 h de
transporte, de juvenis de matrinxãs anestesiados com 5 mg.L
-1
de óleo de
cravo, provavelmente como resultado de acúmulo de CO
2
. Porém, resultados
obtidos por Gomes et al (2003) durante transporte de tambaqui confirmou que
esta relação não acontece na água transportada da Amazônia, onde o pH (≈ 5)
permaneceu relativamente estável até mesmo com o aumento nas
concentrações de CO
2
.
Não houve diferença significativa na concentração de amônia entre os
tratamentos, em nenhum dos diferentes tempos de transporte. A concentração
de amônia no tratamento controle não apresentou diferença significativa entre
os diferentes tempos de transporte. Nos tratamentos com anestésico, a
concentração de amônia foi significativamente maior em 24 h de transporte
(Tabela 3). As concentrações de amônia obtidas em 24 h de transporte (10-11
mg.L
-1
), estão abaixo da concentração letal para juvenis desta espécie (BENLI;
KÖKSAL, 2005). Juvenis de tilápia suportam altas concentrações de amônia na
água (BENLI; KÖKSAL, 2005; BENLI ET AL, 2008), desta forma, esta variável
não deve ter afetado negativamente a sobrevivência dos animais.
28
Tabela 3. Médias dos parâmetros da água após diferentes tempos de transporte de
tilápias do nilo (Oreochromis niloticus) nos distintos tratamentos com óleo de cravo.
Letras minúsculas indicam diferença significativa dos diferentes tratamentos no
mesmo tempo de transporte por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05). Letras
maiúsculas indicam diferença significativa nos diferentes tempos de transporte em um
mesmo tratamento por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05).
Tempo de transporte
(horas)
Concentrações de óleo de cravo (mg.L
-1
)
0 9 18
Temperatura (
o
C)
6
25,3±0,09
aA
25,3±0,06
aA
25,3±0,15
aA
12
25,3±0,09
aA
25,2±0,13
aA
25,3±0,12
aA
24
25,8±0,03
aB
25,8±0,06
aB
25,7±0,09
aB
Oxigênio dissolvido (mg.L
-1
)
6
16,1±1,25
aA
13,2±0,73
aA
3,6±0,24
bA
12
13,4±1,44
aAB
9,2±0,56
bA
13,7±1,14
aB
24
10,9±1,97
aB
5,0±0,48
bB
4,1±1,03
bA
Condutividade (µs.cm
-1
)
6
94,2±1,87
aA
98,9±0,74
aA
104,9±2,24
aA
12
129,9±3,80
abB
126,7±2,49
aB
145,2±4,38
bB
24
198,8±3,99
aC
178,9±0,28
bC
162,0±12,89
bB
pH
6
6,4±0,10
aA
6,6±0,08
bA
6,7±0,04
bA
12
6,1±0,02
aB
6,1±0,01
aB
6,2±0,03
aB
24
6,0±0,02
aB
5,9±0,04
abB
5,7±0,11
bC
CO
2
(mg.L
-1
)
6
58,7±1,47
aA
51,3±5,29
abA
41,9±2,10
bA
12
48,4±6,60
aA
50,6±0,00
aA
41,8±1,27
aA
24
80,7±0,73
aB
90,2±5,54
abB
98,3±1,94
bB
Amônia total (mg.L
-1
)
6
4,8±1,42
aA
4,7±0,84
aA
3,1±3,37
aA
12
6,3±0,84
aA
4,7±0,65
aA
6,9±0,26
aAB
24
10,1±3,37
aA
11,7±0,20
aB
9,3±1,23
aB
29
Não foi observada mortalidade em nenhum dos tratamentos em 6 h de
transporte. A mortalidade dos peixes do controle e do tratamento com 9 mg.L
-1
de óleo de cravo, após 12 e 24 h de transporte foi de apenas 0,67% (Tabela 4).
No tratamento com 18 mg.L
-1
de óleo de cravo, a mortalidade em 24 h (3,67%)
foi significativamente maior que a dos demais tratamentos. A mortalidade
acumulada de 96 h apresentou padrão similar ao da mortalidade após o
transporte e foi significativamente maior nos peixes transportados em 18 mg.L
-1
de óleo de cravo por 24 h. Nos peixes controle e nos anestesiados com 9 mg.L
-
1
, a mortalidade acumulada foi de apenas 1,33%. Juvenis de tambaqui com 2 g
de peso corporal, transportados em sacos plásticos com benzocaína também
apresentaram mortalidade significativamente maior que a dos peixes controle
(GOMES ET AL, 2006).
Tabela 4. Mortalidade (%) após o transporte e mortalidade acumulada 96 horas após o
transporte. Letras minúsculas indicam diferença significativa dos diferentes tratamentos
no mesmo tempo de transporte por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05). Letras
maiúsculas indicam diferença significativa nos diferentes tempos de transporte em um
mesmo tratamento por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05).
Tratamento
Mortalidade após o transporte Mortalidade acumulada de 96 h
Tempo de transporte Tempo de transporte
6
h
12
h
24
h
6
h
12
h
24
h
Controle 0
aA
0,67
aA
0,67
aA
0, 67
aA
1
aA
1,33
aA
9 mg.L
-1
0
aA
0
aA
0,67
aA
1
aA
0,67
aA
1,33
aA
18 mg.L
-1
0
aA
0
aA
3,67
bB
0,33
aA
0,33
aA
5,67
bB
Os peixes transportados em todos os tratamentos e em todos os tempos de
transporte apresentaram efluxo de Na
+
e K
+
. Os peixes transportados com 18
mg.L
-1
de óleo de cravo, nos diferentes tempos de transporte (6, 12 e 24 h),
apresentaram o efluxo de Na
+
significativamente maior que os demais
tratamentos (Figura 1). A única exceção foi em 24 h de transporte, onde os
peixes transportados com 9 mg.L
-1
apresentaram efluxo significativamente igual
30
ao dos peixes transportados com 18 mg.L
-1
de óleo de cravo. Os peixes do
controle e transportados com 9 mg.L
-1
de óleo de cravo apresentaram um
efluxo de Na
+
duas a três vezes menor que o dos peixes transportados com 18
mg.L
-1
de óleo de cravo. Juvenis de pirarucu (Arapaima gigas) transportados
sem aditivos na água também possui o fluxo de Na
+
estável e próximo de zero
(GOMES ET AL, 2006). O maior efluxo ocorreu em 6 h de transporte em todos
os tratamentos, nos demais tempos de transporte os peixes tenderam para
uma situação de homeostase. Os peixes de todos os tratamentos
apresentaram um efluxo de K
+
. O padrão de fluxo de K
+
foi similar ao
observado para o fluxo de Na
+
. O tratamento controle teve um maior efluxo em
6 h de transporte e nos tempos seguintes tendeu ao zero, como observado
anteriormente para o pirarucu por Gomes et al (2006). Os tratamentos com
anestésico apresentaram um maior efluxo em 6 horas, no tempo 12 h houve
uma diminuição no efluxo, que voltou a aumentar no tempo 24 h (Figura 2).
Resultado similar foi obtido por Gomes et al (2008), onde no início do
transporte do peixe borboleta (Carnagiela strigata) os animais apresentaram
um alto efluxo de Na
+
e K
+
, e após 24 h de transporte este efluxo diminuiu
significativamente chegando a valores próximos de zero.
Figura 1. Fluxo de Na
+
durante 6, 12 e 24 horas de transporte de juvenis de tilápia do nilo
expostos a 9 e 18 mg.L
-1
de óleo de cravo e controle. Letras maiúsculas indicam
diferença significativa dos diferentes tratamentos no mesmo tempo de transporte por uma
Anova e teste de Tukey (p<0,05). Letras minúsculas indicam diferença significativa nos
diferentes tempos de transporte em um mesmo tratamento por uma Anova e teste de
Tukey (p<0,05).
-1600,0
-1400,0
-1200,0
-1000,0
-800,0
-600,0
-400,0
-200,0
0,0
6
12
24
Fluxo de Na
+
(µmol.kg
-1
h
-1
)
Tempo de transporte (h)
0mg/L
9mg/L
18mg/L
a A
a B
ab A
ab A
b B
b A
b AB
c B
a A
31
Figura 2. Fluxo de K
+
durante 6, 12 e 24 horas de transporte de juvenis de tilápia do
nilo expostos a 9 e 18 mg.L-1 de óleo de cravo e controle. Letras maiúsculas indicam
diferença significativa dos diferentes tratamentos no mesmo tempo de transporte por
uma Anova e teste de Tukey (p<0,05). Letras minúsculas indicam diferença
significativa nos diferentes tempos de transporte em um mesmo tratamento por uma
Anova e teste de Tukey (p<0,05).
2.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O óleo de cravo é um anestésico eficaz, para até 10 minutos de anestesia, no
manejo de juvenis de tilápia (4,33 ± 0,3 cm) em procedimentos de rotina na
piscicultura, sendo sua melhor concentração, para uma indução cirúrgica 90
mg.L
-1
e para uma sedação com finalidade de biometria a melhor concentração
é 50-60 mg.L
-1
. Nas concentrações avaliadas, este anestésico deve ser evitado
durante o transporte de juvenis de tilápia, e em exposições superiores à 10
minutos.
-300,0
-250,0
-200,0
-150,0
-100,0
-50,0
0,0
6 12 24
Fluxo de K
+
(µmol.kg
-1
h
-1
)
Tempo de transporte (h)
0mg/L 9mg/L 18mg/L
a A
a A
ab A
b A
b AB
a B
b A
ab A
b B
32
2.5 REFERÊNCIAS
APHA (American Public Health Association, American Water Works
Association, Water Environment Federation). Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater. 18.ed. New York: American Public
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29, p. 339-344, 2005.
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macrocephalus) em diferentes temperaturas. B. Instit. Pesca, 2009. (In press).
33
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tambaqui (Colossoma macropomum, Characiformes: Characidae). Acta Amaz.,
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37
CAPÍTULO 3
O uso do óleo de cravo como anestésico em juvenis avançados
de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) durante o manejo:
determinação da concentração e do tempo de exposição ideal e
respostas de estresse
38
RESUMO
A inevitável manipulação de peixes vivos em piscicultura causa uma série de
reações fisiológicas adversas, o que exige o uso de anestésicos. Os
anestésicos mesmo tendo o propósito de sedação, podem causar estresse em
peixes. Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência do óleo de cravo
como anestésico para juvenis avançados de tilápia do nilo durante o manejo.
Para avaliar o óleo de cravo, no primeiro experimento os peixes foram expostos
a banhos anestésicos em seis diferentes concentrações e avaliado o tempo de
indução aos diferentes estágios de anestesia. No segundo experimento,
avaliou-se diferentes tempos de exposição à anestesia (10, 20 e 30 minutos),
sendo verificada a margem de segurança do anestésico. Por último, avaliou-se
as respostas de estresse após a anestesia à 250 mg.L
-1
. Os parâmetros
avaliados foram o cortisol, a glicose, o hematócrito, a hemoglobina e o sódio e
potássio plasmático. A concentração 250 mg.L
-1
de óleo de cravo é a mais
adequada para indução de anestesia cirúrgica, pois os peixes alcançam o
estágio de perda total de equilíbrio e parada dos batimentos operculares em
tempo significativamente menor do que os expostos as demais concentrações.
Para a anestesia voltada para biometria e breve manejo, a concentração mais
adequada é 150 mg.L
-1
pois, os peixes apresentam um tempo de indução ao
estágio de perda total de equilíbrio significativamente menor do que os peixes
expostos a concentrações menores. O óleo de cravo possui uma boa margem
de segurança, pois não houve mortalidade para até 30 minutos de anestesia. A
anestesia na concentração ideal por 10 minutos, não foi estímulo suficiente
para causar um estresse severo, ocorrendo alterações somente após a
anestesia na glicose e no hematócrito. Sendo assim, o óleo de cravo é um
anestésico eficaz para o manejo de juvenis avançados de tilápia em
procedimentos de rotina da piscicultura.
PALAVRAS-CHAVE: Estresse, manejo, óleo de cravo, Oreochromis niloticus,
sedação.
39
ABSTRACT
Handling of live fish is inevitable in fish farms and cause a number of adverse
physiological reactions, hence requiring the use of anesthetics. Anesthetics as a
side effect can cause stress in fish. This study aimed to evaluate the efficiency
of clove oil as anesthetic for juvenile tilapia during handling. To test the clove oil
in a first experiment, fish were exposed to an anesthetic bath in six different
concentrations. Subsequently, the induction time for different stages of
anesthesia was assesed. In the second experiment, different times of exposure
to anesthesia (10, 20 and 30 minutes) were tested, aiming to assess the safety
margin of the anesthetic. Finally, the response to stress after anesthesia with
250 mg.L
-1
was evaluated. Evaluated parameters were cortisol, glucose,
hematocrit, hemoglobin, serum sodium and potassium. The concentration of
250 mg.L
-1
of clove oil is the most appropriate to induce surgical anesthesia, as
the fish reach the state of total loss of equilibrium and a stop of the opercular
movements in substantial less time than those exposed to other concentrations.
For anesthesia focused on biometrics and brief management, the most
appropriate concentration is 150 mg.L
-1
because the fish reach the state of a
total loss of equilibrium significantly faster than fish exposed to lower
concentrations. Clove oil has a good safety margin, because there was no
mortality for up to 30 minutes after anesthesia. Anesthesia at the ideal
concentration for 10 minutes, did not cause a severe stress, changes occur only
after anesthetic on fish blood glucose and hematocrit. Based on the results of
this study we conclude, that clove oil is an effective anesthetic for handling
juvenile tilapia.
KEYWORDS: Clove oil, handling, Oreochromis niloticus, sedation, stress.
40
3.1 INTRODUÇÃO
Procedimentos em estações de pisciculturas normalmente têm um forte
impacto sobre a fisiologia e comportamento dos peixes, e a anestesia pode ser
utilizada para facilitar o manejo e reduzir os danos físicos, tanto aos peixes
como ao operador (ROSS; ROSS, 2008). De forma geral, os anestésicos
atuam nos peixes deprimindo as funções neurossensoriais. A maior parte dos
anestésicos afeta o sistema nervoso central e atua primeiro sobre o córtex
cerebral. O aumento da concentração ou do tempo de exposição difunde os
seus efeitos através do tronco cerebral para o centro respiratório medular e da
medula espinhal (SUMMERFELT; SMITH, 1990). Desta forma, para que um
anestésico seja utilizado com eficiência é importante estabelecer a sua
concentração e o tempo de exposição ideal (INOUE ET AL, 2003).
Normalmente os anestésicos causam a supressão de diversas respostas de
estresse, o que facilita com que o peixe mantenha a sua homeostase mesmo
sendo intensamente manejado (MARTINEZ-PORCHAS ET AL, 2009).
Entretanto, alguns anestésicos, dependendo da concentração ou do tempo de
exposição, podem ser causadores de estresse em peixes. O estresse pode ser
entendido como a reação biológica do peixe a estímulos ameaçadores, a qual
pode variar de acordo com a severidade e duração do estímulo (IWAMA ET AL,
2004). As respostas de estresse são divididas em três categorias: primária,
secundária e terciária. As respostas primárias são as hormonais, as
secundárias são mudanças nos parâmetros fisiológicos e bioquímicos e as
terciárias são o comprometimento no desempenho, mudanças no
comportamento e aumento da suscetibilidade a doenças (WENDELAAR
BONGA, 1997).
O óleo de cravo como anestésico, tem sido intensivamente estudado para
várias espécies de peixes, e os resultados obtidos demonstram que é uma
ótima alternativa aos produtos sintéticos normalmente utilizados (COOKE ET
AL, 2004; ROUBACH ET AL, 2005; INOUE ET AL, 2005; KAISER ET AL, 2006;
VIDAL ET AL, 2006; VIDAL ET AL, 2008; HISANO ET AL, 2008). Este
41
anestésico é eficiente em suprimir respostas de estresse em algumas espécies
de peixes como o bagre do canal (Ictalurus punctatus) (SMALL, 2003) e a truta
arco-íris (Oncorhyncus mykiss) (HOLLOWAY ET AL, 2004), mas não em outras
como a carpa (Cyprinus carpio) (VELISEK ET AL, 2005b), o matrinxã (Brycon
cephalus) (BARBOSA ET AL, 2007) e o salmão do Atlântico (Salmo salar)
(KIESSLING ET AL, 2009).
A tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) é o peixe mais criado no Brasil e é o
terceiro mais criado no mundo (FAO, 2007). Alguns trabalhos demonstraram a
eficácia do uso de eugenol para juvenis desta espécie (DERIGGI ET AL, 2006;
VIDAL ET AL, 2008), mas nenhum deles avaliou a concentração ideal deste
anestésico para juvenis avançados e nem se esta concentração é estressante.
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi determinar a concentração e o tempo
de exposição ideal do óleo de cravo como anestésico para juvenis avançados
de tilápia do nilo durante o manejo, além de verificar as respostas de estresse
dos peixes expostos a concentração ideal deste anestésico.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E DO TEMPO DE ANESTESIA
IDEAL
Juvenis avançados de tilápia foram obtidos na estação de piscicultura da
Associação dos Aquicultores do Espírito Santo (AQUES), Cariacica-ES, sendo
o 1º e 2º experimento realizados na própria estação. Noventa peixes (55,35 ±
15,68 g e 13,87 ± 1,23 cm) foram colocados para aclimatação em 3 tanques de
150 L, com sistema de aeração constante, por dez dias. Durante a aclimatação,
a cada três dias, 30% da água foi trocada e a qualidade da água foi
monitorada. Neste período, os peixes foram alimentados diariamente com
ração comercial para peixes contendo 28% de proteína bruta (Nutriave,
Propeixe 28% E).
42
Os ensaios foram realizados em aquários estáticos de 6 L, contendo 3 L de
água e a recuperação sempre realizada em aquários plásticos (45 L) contendo
20 L de água, com aeração constante (oxigênio dissolvido: 7,04 ± 1,3 mg.L
-1
;
temperatura: 25,37 ± 1,34 ºC; condutividade: 59,68 ± 2,83 µS.cm
-1
; dureza:
18,01 ± 4,32 mgCaCo
3
.L
-1
; e pH: 6,95 ± 0,26).
Antes de ser utilizado o óleo de cravo foi diluído em uma concentração de 1
mL/ 10 mL em etanol a 95% para o preparo da solução mãe. A água do aquário
foi trocada ao término de cada ensaio.
Foram avaliadas seis diferentes concentrações de óleo de cravo (80; 100; 150;
200; 250 e 300 mg.L
-1
), para se avaliar o tempo de indução à anestesia. Para
cada concentração foram utilizados 10 peixes, sendo expostos ao anestésico,
de forma individual, para se observar o tempo de indução a cada estágio. Após
10 minutos de exposição ao óleo de cravo, o peixe era removido para o aquário
de recuperação.
Os diferentes estágios de indução a anestesia avaliados seguiram critério
proposto por Stoskopf (1993), conforme a Tabela 1. Foi considerado
recuperado o peixe que recuperava totalmente os movimentos e nadava
ativamente no aquário.
Tabela 1. Definição dos estágios de anestesia
Estágio de anestesia
Evento comportamental
1
Perda de reação a estímulos
2
Perda parcial de equilíbrio
3
Perda total de equilíbrio
4
Redução dos batimentos operculares
5
Parada dos batimentos operculares
FONTE: Stoskopf (1993)
Foi realizado um segundo ensaio com o objetivo de se verificar a margem de
segurança do anestésico. Para isso, tendo por base o resultado do primeiro
43
experimento, a concentração de 250 mg.L
-1
foi selecionada como a mais
adequada para atingir a parada total dos movimentos operculares.
Analisou-se o tempo de recuperação após indução a concentração de 250
mg.L
-1
de óleo de cravo por diferentes tempos. Os peixes previamente
aclimatados foram dispostos de maneira individual ao anestésico por 10, 20 e
30 minutos (n=10 para cada tempo de exposição). Após a exposição, o peixe
era removido para o aquário de recuperação (45 L) contendo 20 L de água,
com aeração constante. Foram avaliadas a recuperação ou a mortalidade.
3.2.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTRESSANTE DO ANESTÉSICO
Juvenis avançados foram obtidos na Fazenda Barra do Mangaraí, Santa
Leopoldina – ES, e então transportadas para o Laboratório de Ecotoxicologia
Aquática do Centro Universitário Vila Velha (UVV), Espírito Santo, Brasil.
Noventa peixes (47,94 ± 10,42 g e 13,87 ± 0,82 cm) foram colocados para
aclimatação em um tanque de 500 L, com sistema de aeração constante, por
dez dias. Durante a aclimatação, a cada três dias, 30% da água foi trocada.
Neste período, os peixes foram alimentados diariamente com ração comercial
para peixes contendo 28% de proteína bruta (Nutriave, Propeixe 28% E).
Os peixes foram dispostos de maneira individual em 90 aquários de 30 L,
contendo 25 L de água, com aeração constante e mantidos para aclimatação
por 72 h. Neste período, os peixes foram alimentados diariamente com ração
comercial com 28% de proteína bruta (Nutriave, Propeixe 28% E) e a metade
da água dos aquários foi cuidadosamente trocada uma vez, em 48h de
aclimatação. Os peixes foram mantidos sem alimentação por 24 h antes do
experimento. Foi realizado um experimento fatorial com três diferentes
tratamentos: Controle (peixes mantidos no aquário sem manuseio e exposição
ao anestésico); Anestesia Simulada (peixes submetidos a uma simulação do
banho anestésico, porém sem adição do anestésico); e Anestesiado (peixes
expostos a 250 mg.L
-1
de óleo de cravo) e seis tempos de amostragem: 0, 6,
12, 24, 48 e 96 h após a anestesia. Para cada combinação de tratamento com
tempo foram amostrados 5 peixes. Nos tratamentos Anestesia Simulada e
44
Anestesiado os peixes foram expostos individualmente em aquários de ensaio
de 6 L, contendo 3 L de água, (oxigênio dissolvido: 7,04 ± 1,3 mg.L
-1
;
temperatura: 25,37 ± 1,34 ºC; condutividade: 59,68 ± 2,83 µS.cm
-1
; dureza:
18,01 ± 4,32 mgCaCo
3
.L
-1
; e pH: 6,95 ± 0,26), por 10 minutos - tempo que foi
eleito, no segundo experimento, o mais adequado para exposição à anestesia.
Após o período de anestesia, foi coletado sangue da veia caudal, nos
diferentes tempos de amostragem, para realizar as análises de cortisol, glicose,
hematócrito, hemoglobina e íons plasmáticos. A glicose sanguínea foi medida
com aparelho digital Accu-Chek Active (Roche ™). Para análise de hematócrito
o sangue foi colocado em capilares e centrifugado a 3000 rpm (935 .g) por 10
minutos, e a leitura realizada em escala de hematócrito. A hemoglobina foi
realizada com teste colorimétrico Bioclin K023 e a leitura feita em
espectrofotômetro. O restante do sangue foi centrifugado a 3000 rpm (1026 .g)
por 10 minutos e posteriormente congelado para futura medida de cortisol e
íons. A análise do cortisol foi realizada pela técnica de imunoensaio enzimático
por competição (EIA, Kit 55050, Human®) com leitura realizada em leitor de
placa Biotrack. As concentrações plasmáticas de Na
+
e K
+
foram medidos
diretamente em um fotômetro de chama Analyser 910, (Analyser, São Paulo,
Brasil).
3.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os tempos para atingir os diferentes estágios de anestesia e a recuperação,
assim como, o tempo de recuperação após diferentes tempos de exposição à
anestesia foram avaliados para as diferentes concentrações de óleo de cravo
por uma análise de variância, seguida do teste de Tukey (P<0,05). Os
parâmetros de estresse foram analisados por uma análise de variância de dois
fatores e teste de Tukey (ZAR, 1999), tendo o tratamento e o tempo como
fatores. As análises estatísticas foram realizadas com o programa Sigma Stat
3.0.
45
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL
De acordo com Ross; Ross (2008) é essencial o conhecimento da
concentração ideal do anestésico que é necessária para a indução ao estágio
de anestesia desejado, uma vez que, estas concentrações variam conforme a
espécie e o tamanho do peixe. Durante a engorda, os juvenis avançados são
na maioria das vezes anestesiados por dois principais motivos: 1) biometria e
2) procedimento cirúrgico e inspeção visual. O estágio de indução necessário
para uma biometria é a parada total dos movimentos (= leve sedação), já para
uma cirurgia ou inspeção visual é necessário que o peixe atinja o estágio de
mínimo movimento opercular (= anestesia profunda). Somente a concentração
de 80 mg.L
-1
de óleo de cravo não induziu os peixes a todos os estágios de
anestesia. Os peixes anestesiados com 250 e 300 mg.L
-1
alcançam os estágios
de perda total de equilíbrio e parada dos batimentos operculares em tempos
significativamente menores que os demais. Os peixes anestesiados em ambas
as concentrações não apresentaram diferença significativa na recuperação.
Desta forma, esta faixa de concentração (250-300 mg.L
-1
) pode ser
considerada ideal para anestesia cirúrgica. Do ponto de vista econômico, a
concentração de 250 mg.L
-1
é a mais adequada pois é a menor concentração
que causa o efeito desejado (Tabela 2).
Diferente do observado neste estudo, Waterstrat (1999) relatou a concentração
de 100 mg.L
-1
de óleo de cravo-da-índia a mais segura para anestesia de bagre
do canal (Ictalurus punctatus). Peixes tropicais (como a tilápia) apresentam
uma maior resistência ao anestésico, por isso concentrações superiores são
descritas como as mais adequadas. A necessidade de uma maior
concentração de anestésico pode estar relacionada com a maior capacidade
destes animais em metabolizar estes compostos o que é proporcionado pela
maior temperatura corporal. Segundo Baldisserotto (2009) a temperatura
corporal afeta a fisiologia e a velocidade das reações químicas, havendo uma
maior taxa metabólica em peixes de clima tropical, e uma menor taxa
metabólica em peixes de clima temperado (como o bagre).
46
Os peixes anestesiados com 80, 100, 150 e 200 mg.L
-1
de óleo de cravo
apresentam rápida recuperação, porém apenas os peixes expostos a 150 e
200 mg.L
-1
apresentam um tempo significativamente menor de indução ao
estágio de perda total de equilíbrio. Sendo assim, 150 mg.L
-1
é a concentração
ideal para uma anestesia voltada para o breve manejo (Tabela 2). Esta
concentração representa apenas 60% da concentração adequada para
anestesia cirúrgica. Simões; Gomes (2009) avaliaram o mentol como
anestésico em juvenis de tilápias e obtiveram resultados semelhantes onde a
concentração para breve manejo (150-200 mg.L
-1
) foi de 60-80% da
concentração selecionada para anestesia cirúrgica (250 mg.L
-1
).
Tabela 2. Tempos, em segundos, de indução aos estágios de anestesia de juvenis avançados
de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) expostos a diferentes concentrações de óleo de cravo
(mg.L-1). Médias seguidas por letras diferentes na coluna diferem entre as concentrações no
mesmo estágio pelo por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05); os resultados são média ± erro
padrão. – concentração não alcançou ao estágio de anestesia
Além da concentração, o tempo de exposição adequado é essencial para a
eficácia do anestésico, uma vez que, exposições prolongadas podem
eventualmente causar mortalidade dos peixes (INOUE ET AL, 2003). Houve
Óleo de
cravo
(mg.L
-1
)
Eventos Comportamentais (segundos)
Perda de
reação à
estímulos
Perda
parcial de
equilíbrio
Perda
total de
equilíbrio
Redução
dos
batimentos
operculares
Parada dos
batimentos
operculares
Recuperação
80
30,2±1,4a 48,4±3,4a 158,9±7,3a 234,8±9,9a
-
282,8±15,2a
100
17,3±0,7b 30,9±2,1b 131,7±5,7b 223,6±10,4a 489,1±23,1a 268,3±14,5a
150
13,4±0,8c 23,8±1,4c 67,5±4,9c 87,9±5,1b 127,0±5,7b 245,4±11,6b
200
10,7±0,6c 23,5±1,4c 68,6±2,4c 83,5±2,6b 117,4±4,2b 331,1±17,9c
250
12,7±0,7c 22,2±0,9c 49,6±5,3d 63,8±5,2c 79,5±4,3c 433,0±37,0d
300
12,4±0,7c 21,1±0,7c 38,3±2,1e 47,7±2,1d 60,0±2,9d 477,3±42,6d
47
diferença significativa no tempo de recuperação dos peixes após a exposição,
a 250 mg.L
-1
de óleo de cravo, por diferentes tempos (Figura 1). O óleo de
cravo demonstrou uma boa margem de segurança para juvenis avançados de
tilápia, pois não foi observada mortalidade dos peixes expostos ao anestésico
em nenhum dos tempos avaliados. Este resultado é semelhante ao estudo
realizado por Roubach et al (2005) onde a concentração ideal (65 mg.L
-1
) não
provocou mortalidade em juvenis avançados de tambaqui (Colossoma
macropomum) em até 30 minutos de exposição ao eugenol e ao relatado por
Keene et al (1998) com truta de arco-íris (Oncorhyncus mykiss), onde não foi
observada mortalidade para até 20 minutos de anestesia. Em conjunto com os
resultados observados neste estudo, sugere-se que este anestésico é seguro
para anestesias prolongadas em juvenis avançados de peixes tropicais.
Figura 1. Tempo de recuperação de juvenis avançados de tilápia nilótica após a
exposição por diferentes tempos a 250mg.L
-1
de óleo de cravo. Letras diferentes nas
colunas significam diferença significativa por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05).
3.3.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTRESSANTE DO ANESTÉSICO
A resposta ao estresse é um mecanismo que permite ao peixe preservar sua
saúde frente à ameaça de estressores. Dependendo da severidade do
estressor, o mecanismo de resposta pode se tornar disfuncional e impactar
negativamente a fisiologia do animal (LIMA ET AL, 2006). Apesar da anestesia
aparentemente minimizar o impacto de agentes estressores, é importante a
determinação de concentrações ótimas de fármacos com características
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
10
20
30
Tempo de recuperação (segundos)
Tempo de exposição (minutos)
a
b
c
48
anestésicas para se evitar os efeitos negativos da prática, pois a utilização de
quantidade excessiva de anestésicos pode promover alterações metabólicas
detectadas somente horas após a exposição, ou ainda após a morte dos peixes
(PARK ET AL, 2008).
As concentrações de cortisol encontradas nos peixes do tratamento controle ao
longo deste experimento (entre 1,1 ± 0,1 e 3,83 ± 2,44 ng.mL
-1
) estão dentro da
faixa basal para peixes de acordo com Barton et al (2002). Apenas os peixes
do tratamento anestesia simulada apresentaram uma elevação significativa na
concentração deste hormônio no tempo 0 h. De toda forma, o estresse do
manejo necessário para anestesia (= tratamento anestesia simulada) é de
baixa intensidade, uma vez que 6 h após a anestesia, os peixes deste
tratamento já apresentavam a concentração de cortisol significativamente igual
ao do controle (Tabela 3).
O óleo de cravo foi eficiente em suprimir as respostas de cortisol durante o
manejo da anestesia, uma vez que não houve alteração deste hormônio nos
peixes anestesiados em nenhum tempo de amostragem. Este resultado é
similar ao obtido com o salmão do Atlântico (IVERSEN ET AL, 2003) e bagre
do canal (SMALL, 2003), que mesmo expostos ao óleo de cravo, por 10 e 30
minutos, respectivamente não apresentaram alteração no cortisol plasmático.
Não se sabe como este anestésico afeta a dinâmica do cortisol em peixes
(IVERSEN ET AL, 2003; KING ET AL, 2005; PALIC ET AL, 2006). Entretanto, é
relatado que o óleo de cravo deprime as funções neurossensoriais, causando
um bloqueio a estimulação nervosa das células interrenais, suprimindo assim, a
liberação de cortisol na corrente sanguínea (SUMMERFELT; SMITH, 1990),
por analogia esse seria o mecanismo de ação na tilápia.
A glicose sanguínea foi significativamente maior logo após a anestesia (tempo
0 h) no tratamento anestesiado (85,2 mg.dL
-1
) e controle (46,0 mg.dL
-1
) quando
comparada aos outros tempos de amostragem. Não foi observado diferença
significativa no tratamento anestesia simulada, nos diferentes tempos
amostrados. No tempo 0 h, a glicose dos peixes anestesiados foi
49
significativamente maior quando comparada aos demais tratamentos. As
concentrações de glicose voltam para os valores basais 6 h após anestesia em
todos os tratamentos (Tabela 3), apresentando apenas uma pequena
diminuição nos peixes controle, no tempo 48 h. Deriggi et al (2006)
anestesiando juvenis avançados de tilápia do nilo com concentrações de
eugenol abaixo (20 e 80 mg.L
-1
) das avaliadas neste estudo (250 mg.L
-1
),
também observaram um aumento da glicose logo após a anestesia e um
retorno a valores basais 6 h após a anestesia. Esta rápida elevação na glicose
de juvenis avançados de tilápia anestesiados com eugenol parece ser um
padrão e independente da concentração do anestésico utilizada. Outras
espécies como a carpa comum (Cyprinus carpio) (VELISEK ET AL, 2005b), a
truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) (HOLLOWAY ET AL, 2004; VELISEK ET
AL, 2005a) e o mero (Epinephelus bruneus) (PARK ET AL, 2008) também
apresentam elevação na concentração de glicose após exposição ao óleo de
cravo.
Nos peixes, as células interrenais produzem cortisol, hormônio este que
provoca imunossupressão, estimula o catabolismo protéico no músculo e a
síntese de glicose no fígado a partir de aminoácidos e ácidos graxos
(gliconeogênese), levando a uma hiperglicemia (BALDISSEROTTO, 2009).
Entretanto, o aumento da glicose nos peixes anestesiados não deve ter sido
causada pela gliconeogênese, pois não houve alteração no cortisol nestes
peixes. A glicogenólise que é a formação de glicose a partir da quebra de
glicogênio do fígado, provavelmente foi a rota metabólica que levou ao
aumento da glicose nos peixes anestesiados, uma vez que a mesma é
intermediada pelas catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e não pelo
cortisol (BARTON ET AL, 2002; BALDISSEROTTO, 2009).
Segundo Martins et al (2004) e Morgan; Iwama (1997), o hematócrito e a
hemoglobina também sofrem variações sob condições de estresse. Os valores
de hematócrito foram significativamente maiores logo após a anestesia (0 h)
em todos os tratamentos avaliados (controle – 27,2%; anestesia simulada –
30,7%; e anestesiado – 33,4%). O hematócrito dos peixes do tratamento
50
controle foi significativamente menor, enquanto o hematócrito dos peixes do
tratamento anestesiado foi significativamente maior logo após a anestesia
(tempo 0 h). O tratamento de anestesia simulada apresentou menores valores
de hematócrito nos tempos 12, 48 e 96 h após a anestesia simulada (Tabela 3).
Os valores da hemoglobina dos peixes do tratamento controle (3,15 g.dL
-1
) e
anestesia simulada (3,89 g.dL
-1
) apresentaram valores significativamente
menores no tempo 48 h após a anestesia. Enquanto que, a hemoglobina dos
peixes do tratamento anestesiado foi maior (10,35 g.dL
-1
) no tempo 6 h após a
anestesia. A hemoglobina dos peixes do tratamento controle foi
significativamente maior (7,79 g.dL
-1
), enquanto a hemoglobina dos peixes do
tratamento anestesiado foi significativamente menor (4,27 g.dL
-1
) no tempo 24
h após a anestesia (tabela 3).
O aumento do hematócrito, como observado, indica uma hemoconcentração
ocasionada pelo aumento da demanda de oxigênio, e tem a finalidade de
auxiliar o peixe a retornar a situação de estresse (MORALES ET AL, 2005).
Esta hemoconcentração deve ter sido ocasionada pelo aumento no número de
hemoglobina circulante observado nos peixes anestesiados, uma vez que, a
hemoglobina é a proteína responsável pelo transporte de oxigênio. Estudos
realizado por Tort et al (2002) e Davidson et al (2000) corroboram com o
observado neste trabalho, onde a truta arco-íris (Oncorhyncus mykiss) sofre
aumento nos valores de hematócrito quando exposta ao óleo de cravo e seus
derivados.
51
Tabela 3. Valores do cortisol, glicose, hematócrito e hemoglobina de tilápia nilótica, em
diferentes tempos amostrais após a anestesia, com 250mg.L
-1
de óleo de cravo. Letras
minúsculas indicam diferença significativa dos tratamentos nos diferentes tempos de
recuperação por uma Anova e teste Tukey (P<0,05). Letras maiúsculas indicam
diferença significativa entre os tratamentos em cada tempo de recuperação por uma
Anova e teste Tukey (P<0,05).
TEMPO DE
RECUPERAÇÃO
(Horas)
TRATAMENTOS
Controle
Anestesia
Simulada
Anestesia
Cortisol (ng.mL
-1
)
0
1,1±0,1
aA
75,0±6,85
bB
1,1±0,1
aA
6
3,83±2,44
aA
5,25±2,14
aA
1,29±0,17
aA
12
1,1±0,1
aA
3,66±2,22
aA
1,1±0,1
aA
24
1,1±0,1
aA
2,66±1,39
aA
3,67±2,29
aA
48
1,1±0,1
aA
5,69±2,25
aA
2,69±1,42
aA
96
1,35±0,22
aA
1,12±0,2
aA
2,01±0,58
aA
Glicose (mg.dL
-1
)
0
46,0±2,3
aA
49,2±1,59
aA
85,2±5,99
aB
6
34,8±1,16
b
A
43,0±4,85
aA
43,0±2,59
b
A
12
34,4±3,53
b
A
39,6±3,11
aA
41,8±3,44
b
A
24
37,8±1,8
a
b
A
43,2±2,18
aA
41,8±1,32
b
A
48
35,4±0,6
a
b
A
47,0±2,7
a
B
44,2±3,02
bB
96
38,0±3,7
a
b
A
36,8±2,31
aA
39,2±1,5
b
A
Hematócrito (%)
0
27,2±0,95
aA
30,70±1,19
aA
B
33,4±1,13
a
B
6
23,0±1,21
bc
A
23,5±1,19
bc
A
23,9±0,6
b
A
12
21,56±1,08
bc
A
21,56±0,44
c
A
21,78±1,22
b
A
24
24,89±0,75
a
c
A
26,44±0,6
b
A
26,33±1,2
ab
A
48
20,11±0,89
b
A
20,0±0,75
c
A
21,8±0,77
b
A
96
20,13±1,01
b
A
21,4±0,95
c
A
21,4±0,37
b
A
Hemoglobina (g.dL
-1
)
0
9,67±1,93
aA
7,47±1,25
aA
5,39±0,71
aA
6
7,42±0,78
aA
7,89±0,86
aA
10,35±1,44
b
A
12
4,84±0,48
aA
5,47±0,98
a
b
A
6,01±0,68
aA
24
7,79±1,35
aA
5,41±0,79
a
b
A
B
4,27±0,49
a
B
48
3,15±0,3
b
A
3,89±0,62
b
A
3,96±0,34
aA
96
4,62±0,48
aA
5,74±0,71
a
b
A
5,05±0,1
aA
52
Os valores plasmáticos de sódio (Na
+
) nos peixes em diferentes tratamentos,
não apresentaram diferenças significativas, o que indica que os procedimentos
experimentais aparentemente não tiveram intensidade nem duração suficientes
para induzir alterações no balanço eletrolítico deste íon na tilápia (Tabela 4).
Por outro lado, os valores do K
+
plasmático dos peixes da anestesia simulada
nos tempos de 6 e 12 h foi significativamente menor quando comparado ao
tratamentos controle e anestesiado. O potássio (K
+
) plasmático sofreu aumento
significativo nos peixes da anestesia simulada (2,0 mEq.L
-1
) no tempo de 48 h
após a anestesia, quando comparado aos demais tempos amostrados. Os
peixes expostos ao anestésico não apresentaram nenhuma alteração no K
+
plasmático (Tabela 4). O K
+
é um íon intracelular e seu aumento no plasma
significa um rompimento das células (MARTINEZ ET AL, 2004), o que deve ter
ocorrido com os peixes da anestesia simulada no tempo 48 h. A saída de K
+
provoca, e em muitas espécies, a redução do hematócrito em função desta
redução do volume das hemácias, como foi observado neste estudo. Esta
alteração do volume das hemácias também contribui para reduzir a afinidade
da hemoglobina, prejudicando o transporte de oxigênio no sangue
(BALDISSEROTTO, 2009). Deriggi et al (2006) relatam que as concentração
de íons plasmáticos em tilapia do nilo não foi afetado pela exposição ao
eugenol. Isto sugere que o uso de óleo de cravo e dos seus derivados não
ocasionam um distúrbio osmorregulatório em juvenis avançados de tilápia.
53
Tabela 4. Valores do sódio e potássio plasmático de tilápia nilótica, em diferentes
tempos amostrais após a anestesia, com 250 mg.L
-1
de óleo de cravo. Letras
minúsculas indicam diferença significativa dos tratamentos nos diferentes tempos de
recuperação por Anova e teste Tukey (P<0,05). Letras maiúsculas indicam diferença
significativa entre os tratamentos em cada tempo de recuperação por uma Anova e
teste Tukey (P<0,05).
TEMPO DE
RECUPERAÇÃO
(Horas)
TRATAMENTOS
Controle
Anestesia
Simulada
Anestesia
Sódio (mEq.L
-1
)
0
58,7±5,72
aA
59,8±4,42
aA
54,0±3,19
aA
6
74,6±5,49
aA
66,4±5,18
aA
69,8±9,45
aA
12
56,0±2,12
aA
55,5±2,77
aA
54,2±7,48
aA
24
62,8±5,11
aA
47,8±5,02
aA
61,4±3,41
aA
48
53,4±5,56
aA
52,2±3,06
aA
50,6±5,12
aA
96
55,0±7,09
aA
52,2±4,03
aA
52,2±6,3
aA
Potássio (mEq.L
-1
)
0
1,2±0,11
aA
1,08±0,07
aA
0,86±0,07
aA
6
2,16±0,19
aA
1,56±0,27
a
b
A
1,68±0,33
aA
12
1,5±0,13
aA
1,2±0,31
a
b
A
1,34±0,2
aA
24
1,18±0,39
aA
0,88±0,16
aA
1,38±0,17
aA
48
1,42±0,17
aA
2,08±0,32
b
A
1,52±0,32
aA
96
1,42±0,24
aA
1,22±0,13
aA
2,04±0,32
aA
3.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O óleo de cravo é um anestésico eficaz para o manejo de juvenis avançados
de tilápia do Nilo, em procedimentos de rotina na piscicultura. Este anestésico
apresenta uma boa margem de segurança, uma vez que, não ocasionou
mortalidade de peixes em até 30 minutos de exposição. A concentração 250
mg.L
-1
de óleo de cravo é a mais adequada para indução de anestesia
cirúrgica. Para a anestesia voltada para biometria e breve manejo, a
concentração mais adequada é 150 mg.L
-1
. Entretanto, a anestesia na
concentração ideal por 10 minutos, causa alterações na glicose e no
hematócrito logo após a anestesia (tempo 0 h) caracterizando um estresse de
baixa intensidade e duração.
54
3.5 REFERÊNCIAS
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60
CAPÍTULO 4
Óleo de cravo como anestésico para adultos de tilápia do nilo
(Oreochromis niloticus): determinação da concentração ideal e
avaliação sensorial do filé de peixes anestesiados
61
RESUMO
Um procedimento de grande importância em estações de pisciculturas é a
anestesia, utilizada para facilitar o manejo, entretanto, existem preocupações
nos possíveis resíduos do anestésico deixados na carne do peixe. Objetivou-se
neste estudo, testar a eficiência do óleo de cravo como anestésico em adultos
de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus), durante o manejo e avaliar,
sensorialmente, o aroma e o sabor do filé, após a anestesia. No primeiro
experimento os peixes foram expostos a banhos anestésicos em cinco
diferentes concentrações e avaliado o tempo de indução aos diferentes
estágios de anestesia. No segundo experimento, avaliou-se diferentes tempos
de exposição à anestesia, sendo verificada a margem de segurança do
anestésico. Por último, testou-se o aroma e o sabor dos filés de tilápia, por
meio de análise sensorial (método de comparação múltipla), quando expostas
a concentração ideal de óleo de cravo encontrada no primeiro experimento. A
concentração 250 mg.L
-1
de óleo de cravo é a mais adequada para a indução
de anestesia cirúrgica em adultos de tilápia, e para a anestesia voltada para
biometria e breve manejo, a concentração recomendada é 150 mg.L
-1
. O óleo
de cravo possui uma boa margem de segurança, pois não houve mortalidade
para até 30 minutos de anestesia. Os filés de tilápia previamente anestesiados
com óleo de cravo apresentaram uma diferença moderada no aroma e no
sabor logo após a anestesia, e a partir de 12 h após a anestesia não
apresentam nenhuma diferença no aroma e no sabor em relação aos peixes
não anestesiados. Sendo assim, o óleo de cravo é um anestésico eficaz para o
manejo de adultos de tilápia em procedimentos de rotina na piscicultura, porém
o abate de tilápias deve ser realizado a partir de 12 h após a exposição a este
anestésico, para que não tenha alteração nas características organolépticas
dos filés dos peixes anestesiados.
PALAVRAS-CHAVE: Análise sensorial, comportamento, filés, Oreochromis
niloticus, sedação.
62
ABSTRACT
An important procedure in fish farms is the anesthesia used to facilitate fish
handling. However, there are concerns on the possible anesthetic waste left in
the flesh of fish. The objective of this study was to test efficiency of clove oil as
an anesthetic for adult tilapia (Oreochromis niloticus) during fish handling and to
evaluate its impact on sensory, aroma and flavor of the steak after exposure. In
a first experiment the fish were exposed to anesthetic bath in 5 different
concentrations, subsequently, the induction time for different stages of
anesthesia was assessed. In a second experiment, different times of exposure
to anesthesia were tested in order to assess the safety margin of the anesthetic.
Finally, the aroma and flavor of the tilapia fillets by means of sensory analysis
(multiple comparison method) was tested after having been exposed to the
optimal concentration of clove oil found in the first experiment. The
concentration of 250 mg.L
-1
of clove oil is the most suitable for the induction of
surgical anesthesia, and anesthesia focused on biometrics and brief
management, the recommended concentration was 150 mg.L
-1
. Clove oil has a
good safety margin, because there was no mortality for up to 30 minutes of
anesthesia. The fillets of fish previously anesthetized with clove oil showed a
moderate difference in aroma and flavor, 12 h after anesthesia presented no
difference in aroma and flavor when compared to fish not anesthetized. Based
on the results of this study, clove oil is an effective anesthetic for fish handling
of adult tilapia during routine procedures in fish farming, but slaughtering of
tilapia until 12 h after exposure should be avoided in order to not change the
organoleptic characteristics of fish fillets.
KEYWORKS: Behavior, filet, Oreochromis niloticus, sedation, sensory analysis.
63
4.1 INTRODUÇÃO
A tilapicultura foi desenvolvida visando à produção de alimentos para o
consumo local, mas atualmente, os pesquisadores desenvolveram novas
tecnologias e, com a especialização dos tilapicultores, a produção anual de
tilápias cresceu, representando a terceira espécie de maior importância
econômica na aqüicultura mundial (WATANABE ET AL, 2002). O Brasil está
em sexto lugar na escala mundial dos maiores produtores de tilápia,
responsável por 3,3% do total da produção (FAO, 2007). A piscicultura é
reconhecida como uma importante atividade agroindustrial, capaz de gerar
grande retorno financeiro para os produtores e hoje, está voltada para a
produção de carne, especialmente em filés (PINHEIRO ET AL, 2006).
O aumento na produção da tilápia se deve às características relativas à carne,
ao elevado valor nutricional, excelentes características organolépticas,
ausência de espinhos intermusculares em forma de Y (SOUZA; MARANHÃO,
2001). Do ponto de vista da criação, é um peixe de rápido desenvolvimento
corporal, facilmente reproduzido em cativeiro, e que atinge tamanho comercial
em poucos meses de criação, o que pode proporcionar mais de um ciclo de
produção por ano (SOUZA; MARANHÃO, 2001).
Um dos procedimentos mais importante em estações de pisciculturas é a
anestesia, utilizada para facilitar o manejo, evitar a possibilidade de ferimentos
e, possivelmente, reduzir o estresse dos peixes (SMALL, 2004). A anestesia de
tilápia durante o manuseio também é importante, uma vez que, os raios duros
que formam a nadadeira dorsal desta espécie facilmente ocasionam ferimentos
aos operadores e aos outros peixes, caso não estejam anestesiados (SIMÕES;
GOMES, 2009). De acordo com Bosworth et al (2007), o peixe sedado dentro
do processo de captura, antes do abate, evita o estresse que supostamente
ocorreria durante o manejo e abate, conseqüentemente, melhorando a
qualidade da carne. Entretanto, existem preocupações nos resíduos
anestésicos possivelmente deixados na carne, que possa alterar as
características organolépticas (aroma e sabor) natural do peixe, podendo
64
resultar na rejeição pelos consumidores (OLSEN ET AL, 2006; RIBAS ET AL,
2007).
O óleo-de-cravo é um produto natural resultado da destilação das folhas, do
caule, das flores e brotos da árvore Eugenia caryophyllata e E. aromatica, cujo
constituinte majoritário é o eugenol, que representa de 70 a 90% do óleo
(MAZZAFERA, 2003). Diversos estudos têm demonstrado a eficiência do óleo
de cravo e do eugenol em anestesiar peixes de clima tropical como o tambaqui
(ROUBACH ET AL, 2005) e o matrinxã (VIDAL ET AL, 2008) e de clima
temperado, como a truta (VELISEK ET AL, 2005) e o salmão (IVERSEN ET AL,
2003), além disso, estudos conduzidos com perca prateada (Bidyanus
bidyanus) demonstraram que o tempo residual destes produtos no filé do peixe
é inferior a 24 h (KILDEA ET AL, 2004). Estas características fazem com que o
eugenol, na forma de AQUI-S
TM
, seja liberado para anestesia de peixes em
alguns países como a Austrália, Nova Zelândia, Chile e o EUA (BOSWORTH
ET AL, 2007; ROSS; ROSS, 2008). Conduziu-se este trabalho dentro do
objetivo de testar a eficiência do óleo de cravo como anestésico em adultos de
tilápia do nilo (Oreochromis niloticus), durante o manejo e avaliar,
sensorialmente, os parâmetros organolépticos (aroma e sabor) do filé, após a
anestesia.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL
Setenta adultos de tilápia (670 ± 75,28 g e 28,32 ± 0,92 cm) foram obtidos na
Fazenda Barra do Mangaraí, Santa Leopoldina – ES, e então transferidos para
a AQUES (Associação dos Aquicultores do Espírito Santo), Cariacica-ES, onde
foram colocados para aclimatação em viveiros de 20 m
2
, com troca de água
constante, por aproximadamente dez dias. Durante a aclimatação, a cada três
dias, a qualidade da água foi monitorada. Neste período, os peixes foram
alimentados diariamente com ração comercial para peixes contendo 22% de
proteína bruta (Nutriave, Propeixe 22% E).
65
Os ensaios foram realizados em aquários plásticos de 45 L, contendo 20 L de
água e a recuperação sempre realizada em aquários plásticos (45 L) contendo
25 L de água, com aeração constante (oxigênio dissolvido: 6,53 ± 0,92 mg.L
-1
;
temperatura: 26,98 ± 1,41 ºC; condutividade: 63,34 ± 2,87 µS.cm
-1
; dureza:
20,69 ± 6,43 mgCaCo
3
.L
-1
; pH: 7,00 ± 0,32; e amônia: 0,04 ± 0,01 mg.L
-1
).
Antes de ser utilizado, o óleo de cravo foi diluído em uma concentração de 1
mL/ 10mL em etanol a 95% para o preparo da solução mãe. A água do aquário
foi trocada ao término de cada ensaio.
Foram avaliadas cinco diferentes concentrações de óleo de cravo (100; 150;
200; 250 e 300 mg.L
-1
), para se avaliar o tempo de indução à anestesia. Para
cada concentração foram utilizados oito peixes, sendo expostos ao anestésico,
de forma individual, para se observar o tempo de indução a cada estágio. Após
10 minutos de exposição ao óleo de cravo, o peixe era removido para o aquário
de recuperação. Os diferentes estágios de indução a anestesia avaliados
seguiram critério proposto por Stoskopf (1993), conforme a Tabela 1. Foi
considerado recuperado o peixe que recuperava totalmente os movimentos e
nadava ativamente no aquário.
Tabela 1. Definição dos estágios de anestesia
Estágio de anestesia Evento comportamental
1
Perda de reação a estímulos
2
Perda parcial de equilíbrio
3
Perda total de equilíbrio
4
Redução dos batimentos operculares
5
Parada dos batimentos operculares
FONTE: Stoskopf (1993)
4.2.2 VERIFICAÇÃO DA MARGEM DE SEGURANÇA DO ANESTÉSICO
Foi realizado um ensaio com o objetivo de se verificar a margem de segurança
do anestésico. Para isso foi tomado por base o resultado do primeiro
66
experimento, sendo a concentração de 250 mg.L
-1
selecionada como a mais
adequada para atingir todos os estágios de anestesia, pois o tempo para atingir
o estágio de perda total de equilíbrio é menor que as demais concentrações,
com exceção da concentração de 300 mg.L
-1
, sendo então a menor
concentração que induz ao estágio de perda total de equilíbrio mais
rapidamente, dentre as concentrações avaliadas.
Analisou-se o tempo de recuperação após indução a concentração de 250
mg.L
-1
de óleo de cravo por diferentes tempos. Os peixes previamente
aclimatados foram dispostos de maneira individual ao anestésico por 10, 20 e
30 minutos (n=8 para cada tempo de exposição) em aquários plásticos de 45 L,
contendo 20 L de água e a recuperação realizada em aquários plásticos (45 L)
contendo 25 L de água, com aeração constante (oxigênio dissolvido: 6,64 ±
0,41 mg.L
-1
; temperatura: 27,2 ± 0,95 ºC; condutividade: 62,98 ± 2,93 µS.cm
-1
;
dureza: 17,02 ± 1,41 mgCaCo
3
.L
-1
; pH: 7,25 ± 0,17; e amônia: 0,03 ± 0,01
mg.L
-1
). Após a exposição, o peixe era removido para o aquário de
recuperação (45 L) contendo 25 L de água, com aeração constante. Foram
avaliadas a recuperação ou mortalidade.
4.2.3 ANÁLISE SENSORIAL
Quarenta e dois peixes (515,47 ± 135,21 g e 28,97 ± 3,44 cm) foram colocados
para aclimatação em tanques de 4 m
2
, com sistema de aeração constante, por
aproximadamente dez dias, na Agro Estância Lombardi, Ibiraçú – ES. Durante
a aclimatação, a qualidade da água foi monitorada (oxigênio dissolvido: 6,32
mg.L
-1
; temperatura: 25,8 ºC; condutividade: 82,5 µS.cm
-1
; dureza: 24,52
mgCaCo
3
.L
-1
; e pH: 6,4). Neste período, os peixes foram alimentados
diariamente com ração comercial para peixes contendo 22% de proteína bruta
(Nutriave, Propeixe 22% E).
Os peixes foram mantidos sem alimentação 24 h antes do experimento. Antes
da anestesia foram amostrados 6 peixes, para serem utilizados como controle
(sem exposição ao anestésico). Após amostragem dos peixes controles, 36
peixes foram anestesiados, com a concentração de 250 mg.L
-1
de óleo de
67
cravo por 10 minutos em aquários plásticos de 45 L, contendo 20 L de água
(oxigênio dissolvido: 6,61 ± 0,41 mg.L
-1
; temperatura: 26,1 ± 0,42 ºC;
condutividade: 81,2 ± 1,84 µS.cm
-1
; dureza: 24,52 ± 0,71 mgCaCo
3
.L
-1
; pH:
6,55 ± 0,21; e amônia: 0,04 ± 0,01 mg.L
-1
). Após a anestesia os peixes foram
transferidos para um tanque de 4 m
2
com água corrente (vazão = 1 L.min
-1
), e
abatidos nos tempos 0 (logo após a anestesia) e 12, 24, 48, 96 e 168 h após a
anestesia (6 peixes em cada tempo).
Após a captura, as tilápias, foram abatidas por hipotermia (caixas isotérmicas
com gelo e água), filetadas e embaladas, individualmente, em sacos plásticos
transparentes e acondicionadas em uma caixa isotérmica (isopor) contendo
gelo, posteriormente, transportados para o Complexo Biopráticas do Centro
Universitário de Vila Velha (UVV), ES, onde as amostras foram refrigeradas a -
20°C, até o momento da análise sensorial.
Inicialmente, foi realizada uma seleção de 20 pessoas que costumam consumir
peixes, que receberam um treinamento prévio, para reconhecimento dos
diferentes aromas e sabores, que estariam em questão. No treinamento foi
utilizado um peixe de cada tratamento. Para a análise sensorial, foi utilizado o
Método de Comparação Múltipla, conforme Ferreira (2002), onde cada
provador recebeu 4 amostras de peixes, um controle (sem anestésico) e as
outras (3) com anestésicos. Os provadores foram solicitados a provarem as
amostras codificadas (com números aleatórios de três dígitos) e identificarem a
intensidade da diferença (nenhuma, pequena, moderada e grande) em relação
ao controle. Para tal, foram empregadas duas fichas de avaliação (ficha em
relação ao aroma e outra ao sabor), nas quais a intensidade dos atributos
sensoriais, de cada amostra, foram registradas em escalas de intensidade.
Após a avaliação, as fichas de respostas foram ranqueadas, com pontos, de
acordo com a intensidade da diferença (nenhuma- 0, pequena- 1, moderada- 2
e grande- 3).
Os peixes anestesiados e os controles (n=5 para cada tratamento) foram
servidos aos provadores para a análise de aroma e sabor. Os filés, depois de
68
descongelados, foram cortados em pedaços de aproximadamente 3 cm
2
,
embrulhados em folha de papel alumínio, submetidos ao forno à 180°C, por 5
minutos, sem qualquer tempero, e servido aos provadores. Para as análises do
aroma o embrulho era aberto e cheirado, e em seguida degustado, para ser
analisado o sabor. As amostras foram apresentadas simultaneamente, em
bandejas de fundo claro e codificadas, sob condições laboratoriais e iluminação
natural, para julgadores, que não interagiam entre si.
4.2.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados estão expressos em média e erro padrão. Os tempos para atingir os
diferentes estágios de anestesia para as diferentes concentrações de óleo de
cravo, assim como o tempo de recuperação após a exposição a diferentes
tempos de anestesia, e a análise sensorial (aroma e sabor), foram analisados
por uma análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey (p<0,05)
(ZAR, 1999). Para o experimento de análise sensorial foram seguidos os
critérios conforme Ferreira (2002).
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 DEFINIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL
Com exceção da concentração de 100 mg.L
-1
de óleo de cravo, todas as
demais concentrações avaliadas induzem os peixes a todos os estágios de
anestesia. Entretanto, os peixes anestesiados com 250 mg.L
-1
alcançam os
estágios de perda de reação aos estímulos e parada dos batimentos
operculares em um tempo significativamente menor que as demais
concentrações. A única exceção foi a concentração de 300 mg.L
-1
, porém, esta
possui uma recuperação significativamente mais lenta quando comparada a
concentração de 250 mg.L
-1
de óleo de cravo (Tabela 2). Desta forma, a
concentração de 250 mg.L
-1
é considerada mais adequada para indução
cirúrgica em adultos de tilápia. De acordo com Vidal et al (2008), 75 mg.L
-1
de
eugenol são suficientes para a rápida indução anestésica em juvenis de tilápia-
do-nilo de peso aproximadamente 5 g. A necessidade de uma maior
69
concentração de anestésico para indução a anestesia em adultos de tilápia,
como observado neste estudo, tem relação com o tamanho do peixe, sendo
que peixes menores normalmente necessitam de uma concentração menor de
anestésico do que peixes maiores (ROSS; ROSS, 2008).
A concentração adequada com finalidade de um breve manejo não necessita
induzir a todos os estágios de anestesia, sendo necessário alcançar apenas a
perda total de equilíbrio. Os peixes anestesiados com 150 e 300 mg.L
-1
de óleo
de cravo apresentaram um menor tempo de indução ao estágio de perda total
de equilíbrio, porém os peixes anestesiados com 150 mg.L
-1
a recuperação é
significativamente mais rápida, tornando-se ideal para uma anestesia voltada
para um breve manejo (Tabela 2).
Tabela 2. Tempos, em segundos, de indução aos estágios de anestesia de adultos de tilápia do
Nilo (Oreochromis niloticus) expostos a diferentes concentrações de óleo de cravo (mg.L
-1
).
Médias seguidas por letras diferentes na coluna diferem entre as concentrações no mesmo
estágio por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05); os resultados são média ± erro padrão. -
concentração não alcançou aos estágios de anestesia
Óleo de
cravo
(mg.L
-1
)
Eventos Comportamentais (segundos)
Perda de
reação à
estímulos
Perda
parcial de
equilíbrio
Perda
total de
equilíbrio
Redução
dos
batimentos
operculares
Parada dos
batimentos
operculares
Recuperação
100
13,1±0,6a 23,9±1,0a 92,1±4,4ab 151,3±7,2a
-
503,9±35,5a
150
14,3±1,0a 27,6±1,2b 68,4±2,9b 100,8±1,7bc 524,0±18,3a 587,4±34,1ab
200
10,1±0,4a 16,8±0,7cd 97,4±9,6a 127,1±8,7ac 229,5±11,8b 580,6±42,2ab
250
8,9±0,4b 14,1±0,6c 71,4±8,7ab 94,4±9,9b 192,5±15,6b 653,5±47,5ab
300
10,4±0,8b 18,5±0,9d 67,1±6,5b 81,8±6,7b 134,8±8,7c 1063,3±247,9b
70
Em nenhuma das concentrações avaliadas foi observada mortalidade dos
peixes, semelhante ao encontrado por Gonçalves et al (2008) onde não houve
mortalidade de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) submetidos a até
100 mg.L
-1
de eugenol, e ao estudo de Bosworth et al (2007) em que não foi
observada mortalidade de bagres do canal (Ictalurus punctatus) a uma
exposição prolongada de até 60 minutos de AQUI-S™. Estes trabalhos são
diferentes do estudo de Woody et al (2002) onde adultos de salmão
(Oncorhynchus nerka) em concentrações de 110 mg.L
-1
de óleo de cravo-da-
índia não recuperaram equilíbrio e morreram. A maior resistência de peixes
tropicais ao anestésico deve estar relacionada a maior capacidade destes
animais em metabolizar os componentes do óleo de cravo, que é
proporcionado pela maior temperatura corporal. De acordo com Baldisserotto
(2009) a temperatura corporal afeta a fisiologia e a velocidade das reações
químicas, havendo uma maior taxa metabólica em peixes de clima tropical
(como a tilápia), e uma menor taxa metabólica em peixes de clima temperado
(como o salmão).
4.3.2 VERIFICAÇÃO DA MARGEM DE SEGURANÇA DO ANESTÉSICO
O tempo de recuperação após a exposição por 10 minutos (616,1 ± 26,1s), a
250 mg.L
-1
de óleo de cravo, foi significativamente menor do que a recuperação
dos peixes expostos ao anestésico por 30 minutos (2070,0 ± 229,9s). Os
peixes anestesiados por 20 minutos (918,4 ± 32,6s) não apresentaram
diferença significativa dos demais tempos de anestesia, como apresentado na
Figura 1. Não foi observada mortalidade dos peixes, expostos ao anestésico,
em nenhum dos tempos avaliados, corroborando com o estudo de Roubach et
al (2005) onde adultos de tambaqui (Colossoma macropomum) expostos a
concentrações de até 100 mg.L
-1
de eugenol, não apresentaram mortalidade
para até 30 minutos de exposição.
Alguns autores como Roubach; Gomes (2001) e Ross; Ross (2008) relatam
que 10 minutos deve ser o tempo máximo de anestesia em peixes, sendo
corroborado por outros estudos com juvenis de tilápia (SIMÕES ET AL, IN
PRESS). Entretanto, estudos com adultos de algumas espécies de peixes
71
tropicais como o tambaqui (ROUBACH ET AL, 2005) e a tilápia neste estudo,
demonstram que o óleo de cravo é seguro para um tempo de até 30 minutos de
anestesia. Entretanto, este tempo de anestesia deve ser evitado, pois a
recuperação dos peixes é muito lenta, chegando a demorar duas vezes mais
tempo do que os peixes anestesiados por 20 minutos e três vezes mais do que
os peixes anestesiados por 10 minutos (Figura 1).
Figura 1. Tempo de recuperação de adultos de tilápia nilótica após a exposição por
diferentes tempos a 250 mg.L
-1
de óleo de cravo. Letras diferentes nas colunas
significam diferença significativa por uma Anova e teste de Tukey (p<0,05).
4.3.3 ANÁLISE SENSORIAL
Os ensaios sensoriais discriminativos ou de diferença são considerados
métodos objetivos utilizados em análise sensorial de alimentos, bebidas e
água, com os efeitos das opiniões dos indivíduos minimizados. Medem
atributos específicos, pela discriminação simples, indicando por comparações,
se existem ou não diferenças estatísticas entre amostras. O ensaio de
comparação múltipla ou diferença do controle avalia, simultaneamente, uma ou
mais amostras quanto a um atributo específico, no caso deste estudo aroma e
sabor, determinando a diferença e o grau da diferença em relação a um
controle (ZENEBON ET AL, 2008). Os resultados da análise sensorial, de
acordo com o aroma e sabor, estão descritos na Tabela 2 e 3,
respectivamente.
0
500
1000
1500
2000
2500
10
20
30
Tempo de recuperação (s)
Tempo de exposição (minutos)
ab
b
a
72
Tabela 2 - Análise de Variância de acordo com o aroma e o sabor de filés de tilápia
após a anestesia com 250 mg.L
-1
de óleo de cravo. GL – grau de liberdade; SQ –
soma dos quadrados; QM – quadrados médios; Fcal – razão de variância calculado;
Ftab – razão de variância tabelado
Fonte de
variação GL SQ QM Fcal Ftab(0,05) Ftab(0,01)
Aroma
Julgador
9 4,15 0,46
Amostra
5 14,28 2,86 6,93 4,04 4,93
Resíduo
45 18,55 0,41
TOTAL
59 36,98
Sabor
Julgador
9 1,44 0,16
Amostra
5 14,8 2,96 8,67 4,04 4,93
Resíduo
45 15,36 0,34
TOTAL
59 31,6
Neste estudo o F calculado (razão de variância) foi maior que o F tabelado aos
níveis de 5 e 1%, o que conforme Ferreira (2002), determina que há diferença
significativa entre as amostras tanto no atributo aroma quanto ao sabor. As
características organolépticas (aroma e sabor) de filés de tilápias expostas a
250 mg.L
-1
de óleo de cravo, foram significativamente diferentes apenas após a
anestesia (tempo 0 h), sendo considerada moderadamente diferente pelos
julgadores. Entretanto, houve uma boa aceitabilidade em relação ao sabor das
amostras, pelos julgadores, diferente do estudo de Cunha et al (2007), que
demonstrou que esse anestésico piora o sabor do filé do jundiá, tornando seu
uso não recomendado logo antes do abate. A partir de 12 h após a anestesia
não se observou diferença significativa com relação a nenhuma das
características avaliadas, indicando que não há nenhuma diferença no aroma e
no odor dos filés, em relação a peixes não anestesiados. Muito semelhante a
este estudo, Kildea et al (2004) relataram a eliminação do eugenol do tecido de
percas prateadas (Bidyanus bidyanus) 12 h após a exposição a este
anestésico. Em contrapartida, Guénette et al (2007) demonstraram que a
administração sucessiva de eugenol pode levar à acumulação do produto em
trutas.
73
Segundo Gomes et al (2001), não há legislação no Brasil quanto à utilização de
anestésicos em peixes para consumo humano. Porém, países como os
Estados Unidos e a Nova Zelândia já possuem regulamentação quanto ao uso
do MS-222, benzocaína e Aqui-S
TM
. Nos EUA, os animais anestesiados com
MS-222 e benzocaína devem ser depurados por 21 dias; na Nova Zelândia,
para o MS-222 são necessários 10 dias de depuração e não existe período
específico para a benzocaína. Os peixes anestesiados com Aqui-S
TM
, cujo
principio ativo é o eugenol, não necessitam de depuração (ROSS; ROSS,
2008). Provavelmente essa liberação para abate após a anestesia se baseia no
fato deste produto não deixar resíduos tóxicos na carne (SLADKY ET AL, 2001)
e ser rapidamente metabolizado e excretado (CHO; HEATH, 2000). Os
resultados obtidos neste e em outros estudos com espécies criadas no Brasil
indicam que o óleo de cravo e seus derivados são candidatos a liberação para
uso em peixes, entretanto deve haver rigor em relação ao tempo de abate após
exposição ao anestésico.
Apesar de ser amplamente conhecido que o tempo residual do anestésico no
tecido animal é baixo, os resultados obtidos neste estudo mostram que a
anestesia com óleo de cravo altera a palatabilidade dos peixes logo após a
anestesia. De acordo com Santos et al (2007), a palatabilidade (análise
sensorial) do filé é também de extrema importância, para que os consumidores
fiquem satisfeitos com o produto. Ribas et al (2007) relatam que o óleo de
cravo é o melhor método de atordoamento para Senegal sole (Solea
senegalensis), porque não só garante uma boa qualidade final do produto, mas
também é aceitável para o consumo humano direto. Sendo assim, recomenda-
se, com base em critérios sensoriais, que adultos de tilápia destinados a
filetagem, que foram anestesiados com a concentração ideal (250 mg.L
-1
) só
sejam abatidos 12 h após a exposição ao óleo de cravo.
74
4.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O óleo de cravo é um anestésico eficaz para o manejo de adultos de tilápia em
procedimentos de rotina na piscicultura. A concentração 250 mg.L
-1
de óleo de
cravo é a mais adequada para indução de anestesia cirúrgica, e para a
anestesia voltada para biometria e breve manejo, a concentração recomendada
é 150 mg.L
-1
. O abate de tilápias pode ser realizado a partir de 12 h após a
exposição a este anestésico, pois após este período os peixes não apresentam
nem aroma e nem sabor diferenciado.
75
4.5 REFERÊNCIAS
BALDISSEROTTO, B. Fisiologia de peixes aplicada à piscicultura. 2.ed.
Santa Maria: UFSM, 2009. 352 p.
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and clove oil anesthesia effects on the physiology of juvenile chinook salmon
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2000.
CUNHA, M. A. Anestesia em jundiás (Rhamdia quelen) expostos a
substâncias isoladas de plantas. Dissertação de mestrado – Programa de
Pós-Graduação em Produção Animal, Universidade Federal de Santa Maria.
Rio Grande do Sul, 2007.
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Plus: universal software for fishery statistical time series: version 2.32. Rome,
2007.
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coletiva I. São Paulo: Livraria Varela, 2002. 173 p.
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431, 2001.
76
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of metomidate, clove oil, Aqui-S
TM
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OLSEN, D. H.; SORENSENA, N. K.; STORMOA, S. K.; ELVEVOLLA, E. O.
Effect of slaughter methods on blood spotting and residual blood in fillets of
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RIBAS, L.; FLOS, R.; REIG, L.; MACKENZIE, S.; BARTON, B. A.; TORT, L.
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269, p. 250–258, 2007.
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de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v. 61,
n. 3, p. 613-620, 2009.
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SLADKY, K. K.; SWANSON, C. R.; STOSKOPF, M. K.; LOOMIS, M. R.;
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78
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VIDAL, L. V. O.; ALBINATI, R. C. B.; ALBINATI, A. C. L.; LIRA, A. D.;
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WATANABE, W. O.; LOSORDO, T. M.; FITZSIMMONS, K.; HANLEY, F. Tilapia
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WOODY, C. A.; NELSON, J.; RAMSTAD, K. Clove oil as an anaesthetic for
adult sockeye salmon: Field trials. J. Fish Biol., v. 60, p. 340-347, 2002.
ZAR, J. H. Biostatiscal Analysis. 4.ed. Upper Saddler River: Prentice Hall,
1999. 663 p.
ZENEBON, O.; PASCUET, N. S.; TIGLEA, P. Métodos físico-químicos para
análise de alimentos. 4.ed. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020 p.
79
CAPÍTULO 5
Conclusão Geral
80
5 CONCLUSÃO GERAL
- A melhor concentração para uma indução cirúrgica em juvenis de tilápia de
aproximadamente 1,5 g é de 90 mg.L
-1
e em juvenis avançados (≈ 55 g) e
adultos (≈ 670 g) é 250 mg.L
-1
.
- A concentração adequada para biometria e breve manejo em juvenis é de 50-
60 mg.L
-1
e em juvenis avançados e adultos é de 150 mg.L
-1
.
- Independente do tamanho do peixe a concentração ideal para anestesia para
breve manejo é aproximadamente 40% menor que a concentração necessária
para uma anestesia cirúrgica,
- Para juvenis, o óleo de cravo é um anestésico seguro, por até 10 minutos de
anestesia. Para juvenis avançados e adultos a anestesia pode ter duração de
até 30 minutos de exposição.
- Nas concentrações avaliadas, este anestésico deve ser evitado durante o
transporte de juvenis.
- Em juvenis avançados a anestesia na concentração ideal por 10 minutos,
causa poucas respostas de estresse, ocorrendo alterações apenas na glicose e
no hematócrito, somente após a anestesia (tempo 0h).
- O abate de tilápias pode ser realizado 12 h após a exposição ao óleo de
cravo, pois a partir deste período os peixes não apresentam nem aroma e nem
sabor diferenciado.
81
ANEXO 1
Eficácia do óleo de cravo como anestésico durante o manejo e
o transporte de juvenis de tilápia do nilo (Oreochromis
niloticus)
ANEXO 1
Figura 1. Juvenil de tilápia nilótica
(Oreochromis niloticus)
Figura 3. Sacos plásticos de transporte
Figura 4.
Após o transporte
transferidos para um aquário d
82
Figura 1. Juvenil de tilápia nilótica
Figura 3. Sacos plásticos de transporte
Após o transporte
os peixes de cada saco de transporte foram
transferidos para um aquário d
e 30L com aeração constante (
saco/aquário)
Figura 2. Adicionamento de
oxigênio puro nos sacos de
transporte dos juvenis de t
os peixes de cada saco de transporte foram
saco/aquário)
Figura 2. Adicionamento de
oxigênio puro nos sacos de
transporte dos juvenis de t
ilápia
83
ANEXO 2
O uso do óleo de cravo como anestésico em juvenis avançados
de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) durante o manejo:
determinação da concentração e do tempo de exposição ideal e
respostas de estresse
ANEXO 2
Figura 6. Exemplar de juvenil avançado de tilápia do Nilo
Figura 7. Peixes aclimatando, individualmente, antes do início do experimento
Figura 8. Coleta de sangue por punção caudal, de juvenis avançados
84
Figura 6. Exemplar de juvenil avançado de tilápia do Nilo
Figura 7. Peixes aclimatando, individualmente, antes do início do experimento
Figura 8. Coleta de sangue por punção caudal, de juvenis avançados
Figura 6. Exemplar de juvenil avançado de tilápia do Nilo
Figura 7. Peixes aclimatando, individualmente, antes do início do experimento
Figura 8. Coleta de sangue por punção caudal, de juvenis avançados
85
ANEXO 3
Óleo de cravo como anestésico para adultos de tilápia do nilo
(Oreochromis niloticus): determinação da concentração ideal e
avaliação sensorial do filé de peixes anestesiados
ANEXO 3
Figura 9. Adulto de tilápia do Nilo (
Figura 10. Tilápia nilótica sendo filetada
Figura
11. Amostras de filé de tilápia entregues aos julgadores
86
Figura 9. Adulto de tilápia do Nilo (
Oreochromis niloticus
Figura 10. Tilápia nilótica sendo filetada
11. Amostras de filé de tilápia entregues aos julgadores
Oreochromis niloticus
)
11. Amostras de filé de tilápia entregues aos julgadores
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