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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
YDIA MARIELE VALADARES
Remijia ferruginea D.C., Jacaranda caroba D.C. e
Solanum paniculatum L: fitoquímica, atividades
biológicas e síntese de derivados dos ácidos
ursólico e oleanólico.
Belo Horizonte -MG
2009
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YDIA MARIELE VALADARES
Remijia ferruginea D.C., Jacaranda caroba D.C. e
Solanum paniculatum L: fitoquímica, atividades
biológicas e síntese de derivados dos ácidos
ursólico e oleanólico.
Tese, como requisito parcial, para obter o grau de doutor
em Ciências Farmacêuticas, submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Orientador: Prof. Dr. Fernão Castro Braga - UFMG
Co-orientadores: Profa. Dra. Alaíde Braga de Oliveira –
UFMG
Prof. Dr. Jose Maria Miguel Santana Del Corral - USAL,
ES.
Belo Horizonte - MG
2009
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Dedico este trabalho às pessoas mais importantes e especiais da minha vida:
À minha mãe, Ana, meu exemplo de fortaleza, espiritualidade e bondade em
uma só pessoa. Sem suas palavras de sabedoria eu não teria chegado até aqui. Por
isso, o mérito de tudo que eu conquistei e vier a conquistar talvez seja muito mais
dela do que meu, em função de tudo que passou e renunciou para oferecer às filhas
algo essencial: a educação. Assim, serei eternamente grata pela sua existência.
Ao meu pai Walter, pela herança de disciplina e seriedade. Os valores e
princípios transmitidos por ele proporcionaram não apenas minha formação como
ser humano, mas também foram e serão essenciais para a minha conduta
profissional.
Ao Leo, por acreditar em mim até nos momentos em que mais fraquejei. Sem
dúvida, meu maior incentivo, meu companheiro incondicional, meu apoio. Com
desprendimento e coragem “largou seus projetos” e embarcou nos meus. Estou
certa que foram “os anjos que te colocaram no meu caminho”, TE AMO.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, companhia e força constantes em todos os momentos.
Ao Prof. Fernão Castro Braga pela orientação lúcida e coerente. Pelo
incentivo, críticas, puxões de orelha que colaboraram para o meu amadurecimento.
Pelas inúmeras discussões, sempre valiosas. Pela confiança em mim depositada.
Por mostrar-me a necessidade de paciência, e, ao mesmo tempo, a seriedade do
que é fazer um doutorado. Pela amizade além dos limites do laboratório.
Ao Prof. José Maria Miguel Santana Del Corral pelo carinho, dedicação e
incansável paciência. Com sua simpatia, seu jeitinho meigo e imensa sabedoria me
estimulou e me guiou no mundo da química orgânica. Pelo aconchego e segurança
encontrados em cada conversa e, sobretudo pela inestimável amizade.
Ao Prof. Pablo Anselmo Garcia, pelo carinho, atenção e disponibilidade. Pela
amizade que foi muito além das fronteiras do laboratório de Química Farmacêutica
da USAL. Mais do que me orientar no desenvolvimento das sínteses, me ha
enseñado mucho sobre España y la tradición Salmantina.
Aos Profs. Maria Angeles Castro Gonzalez e Arturo San Feliciano, pela
atenção e por me receberem com tanto carinho.
Ao “Peixe” ><> (Prof. José Dias de Sousa Filho) pela obtenção dos inúmeros
espectros de ressonância magnética nuclear e pela paciência a mim sempre
dedicada. Valeu!
À Profa. Leida Maria Botion pelo grande auxílio na execução dos
experimentos biológicos.
A todos os professores, funcionários e alunos do laboratório de Química
Farmacêutica da Universidade de Salamanca, pela amizade desenvolvida durante o
estágio sanduíche e pelas conversas otimistas e revigorantes.
Às minhas irmãs Ywia e Anna Flávia pela torcida, incentivo, descontração,
risos, conversas, choros. Ao Fernandóvisk pelo carinho e pelos inúmeros momentos
de deleite e criatividade gastronômica.
Ao Padre Libério, tenho certeza que seu apoio foi essencial.
Às minhas chuchucas Pitty e Kika, pela companhia e amor incondicional de
sempre. Por terem me esperado com paciência todo o tempo em que ficamos
afastadas e principalmente por não terem se esquecido de mim.
A todos do laboratório de Química farmacêutica da FAFAR, principalmente
Dani e Marilda, pelos inúmeros favores prestados.
Às minhas grandes amigas Raquel e Carla pela disponibilidade, bom humor,
pelas inúmeras conversas recheadas de papos-cabeça ou sem nenhuma utilidade
aparente, mas que desanuviaram muitas vezes minhas angústias. Pessoas
especiais, admiráveis e amigas que guardarei para sempre.
Aos meus queridos amigos Cris, Priscila, Keller, Jussara, Suzan, Patrícia,
Francisca, Claiton, Denise, Gorette, Graça, Ana Bárbara, Célio, Eliana, pelo
companheirismo, amizade, cumplicidade e alegria durante todo o nosso período de
convivência diária. Às ex-alunas de iniciação científica que trabalharam comigo
Luciana e Bruna, pela dedicação e seriedade com que executaram cada etapa do
trabalho. Aos demais amigos que passaram pelo laboratório de Fitoquímica.
A todos os familiares que, sempre perguntavam: “já acabou os estudos?”
mesmo sem saber ao certo o que é um doutorado, torceram e rezaram por mim.
A todos os funcionários da FAFAR, em especial Soninha, Rose e Batista, pelo
carinho e atenção.
A cidade de “Salamanca que enhechiza a voluntad de volver a ella todos los
que de la apacibilidad de su vivienda han gustado”.
A CAPES pela bolsa concedida e pela oportunidade de realizar o estágio de
doutorado sanduíche em Salamanca, Espanha.
Eu vejo a vida melhor no futuro
Eu vejo isso por cima do muro
De hipocrisia que insiste em nos rodear
Eu vejo a vida mais farta e clara
Repleta de toda a satisfação
Que se tem direito
Do firmamento ao chão
Eu quero crer no amor numa boa
E que isso valha prá qualquer pessoa
Que realizar a força que tem uma paixão
Eu vejo um novo começo de era
De gente fina, elegante e sincera
Com habilidade pra dizer mais sim do que não
Hoje o tempo voa amor
Escorre pelas mãos
Mesmo sem se sentir
E não há tempo que volte amor
Vamos viver tudo o que há prá viver
Vamos nos permitir
(Tempos Modernos - Lulu Santos)
RESUMO
Jacaranda caroba D.C. (Bignoniaceae), Remijia ferruginea D.C. (Rubiaceae) e
Solanum paniculatum L. (Solanaceae) são espécies vegetais empregadas
popularmente como tônico e amargo, entre outros usos. Os objetivos do presente
trabalho foram isolar e identificar os constituintes micromoleculares majoritários
dessas espécies, avaliar suas atividades biológicas relacionadas ao uso tradicional e
realizar transformações químicas em triterpenos obtidos das espécies. O triterpeno
ácido ursólico foi isolado como constituinte comum aos extratos etanólicos de J.
caroba (partes aéreas) e R. ferruginea (galhos), além de β-sitosterol. Ácido
oleanólico foi obtido da primeira espécie e estigmasterol da segunda, sendo a
ocorrência desses metabólitos inédita em ambas. O fracionamento do extrato
etanólico de folhas de S. paniculatum resultou na obtenção da saponina
espirostânica inédita 3-O-
β-D-glicopiranosídeo ∆
25(27)
-tigogenina (1), identificada por
métodos espectroscópicos usuais como uma mistura epimérica em C-22, além da
sapogenina neotigogenina, e de uma mistura de β-sitosterol e estigmasterol. A
administração individual dos extratos vegetais na dose de 1,0 mg/Kg de peso
corpóreo a ratos tratados com dieta hiperlipídica induziu aumento nos níveis de
triglicérides plasmáticos, em comparação ao grupo controle (p<0,05). Observou-se,
também, incremento na atividade enzimática da lipase lipoprotéica quando da
administração dos extratos na dose de 0,1 mg/Kg de peso corpóreo, em relação ao
grupo controle (p<0,05). Esses dados sugerem o potencial das espécies no
tratamento de dispepsias. S. paniculatum é também utilizada tradicionalmente para
tratar infecções virais, incluindo herpes. O extrato etanólico de folhas da espécie
apresentou atividade antiviral in vitro frente aos vírus da herpes humana tipo 1 (EC
50
= 428,9 ± 19,2 µg/ml) e encefalomiocardite murina (EC
50
= 298,0 ± 11,2 µg/ml). A
saponina (1) exibiu significativa atividade antiherpética (EC
50
= 170,8 ± 1,7 µg/ml) e
anti-vaccinia linhagem Western Reserve (EC
50
= 177,0 ± 3,3 µg/ml), além de baixa
citotoxicidade (CC50 > 400 µg/ml). Os ácidos ursólico e oleanólico, isolados em
grandes quantidades de J. caroba, foram submetidos a transformações químicas
nas posições C-3, C-11 e C-28. Foram obtidos 5 derivados do ácido oleanólico e 21
derivados do ácido ursólico, sendo 6 inéditos. A atividade citotóxica de alguns
derivados do ácido ursólico foi avaliada in vitro frente às linhagens celulares
tumorais de mama MDA-MB-231, cólon HT29 e pulmão A549. Um derivado
hidroxilado em C-3 e C-28 foi cerca de nove vezes mais potente que o ácido
ursólico. A atividade antiplasmódica de alguns dos produtos sintetizados a partir do
ácido ursólico foi avaliada in vitro frente ao Plasmodium falciparum, e somente um
derivado contendo grupo ceto em C-3 foi parcialmente ativo (CI
50
42 µg/mL).
Palavras-chave: Jacaranda caroba, Remijia ferruginea, Solanum paniculatum, ácido
ursólico, ácido oleanólico, derivados sintéticos, atividade anti-tumoral, 3-O-β-D-
glicopiranosídeo ∆
25(27)
-tigogenina, atividade anti-viral.
ABSTRACT
Jacaranda caroba D.C. (Bignoniaceae), Remijia ferruginea D.C. (Rubiaceae) and
Solanum paniculatum L. (Solanaceae) are plant species traditionally employed as
tonic and bitter, among other uses. The main goals of the present study were to
isolate and identify the major micromolecular compounds of these species, to
evaluate their biological activities related to the traditional uses and to undertake
chemical transformations on triterpenes obtained from the species. Ursolic acid was
isolated from the ethanol extracts of J. caroba aerial parts and R. ferruginea stems,
along with β-sitosterol, whereas oleanolic acid was obtained from the first and
stigmasterol from the second species, being their occurrence in both here described
for the first time. The fractionation of the ethanol from S. paniculatum leaves resulted
in the new spirostanic saponin
∆
25(27)
-tigogenin-3-O-β-D-glucopyranoside (1),
identified by spectrometric data as an epimeric mixture at C-22, along with
neotigogenin and a mixture of β-sitosterol and stigmasterol. The administration of
each extract at the dose of 1.0 mg/kg body weight to rats fed with high-fat diet
increased the plasmatic triglycerides in comparison to the control group (p<0.05).
Extracts administration at the doses of 0.1 mg/kg body weight increased the
lipoprotein lipase activity, as compared to the control group (p<0.05). These results
suggest the potential of the species for treating dyspepsia. S. paniculatum is also
traditionally used for treating viral infections, including herpes. The ethanol extract
from its leaves exhibited in vitro antiviral activity against Human Herpes Virus type 1
(EC
50
= 428.9 ± 19.2 µg/mL) and murine Encephalomyocarditis Virus (EC
50
= 298.0 ±
11.2 µg/mL). The saponin 1 presented significant antiherpes (EC
50
= 170.8 ± 1.7
µg/mL) and anti-vaccinia virus effects (EC
50
= 177.0 ± 3.3 µg/mL), with low
cytotoxicity (CC
50
> 400 µg/mL). Ursolic and olenaolic acids, obtained in bulk
amounts from J. caroba aerial parts, were submitted to chemical transformations at
C-3, C-11 and C-28 positions, resulting in 5 oleanolic derivatives and 21 ursolic
derivatives, among them 6 new compounds. The cytotoxic activity of some selected
ursolic derivatives was evaluated in vitro against tumor cell lines of breast MDA-MB-
231, colon HT29 and lung A549. A derivative containing hydroxyl groups at C-3 and
C-28 was about nine-fold more potent than the parent compound ursolic acid. Some
selected ursolic derivatives were assayed in vitro against Plasmodium falciparum and
only a compound containing a keto group at C-3 was partially active (IC
50
42 µg/mL).
Key-words: Jacaranda caroba, Remijia ferruginea, Solanum paniculatum, ursolic
acid, oleanolic acid, chemical transformations, anti-tumor activity, ∆
25(27)
-tigogenin 3-
O-β-D- glucopyranoside, antiviral activity.
LISTA DE FIGURAS
1
Remijia ferruginea............................................................................................................
31
2
Solanum paniculatum......................................................................................................
33
3
Jacaranda caroba............................................................................................................
38
4
Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico
bruto de partes aéreas de
Jacaranda caroba ...........................................................................................................
51
5
Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto de caules e cascas de
Remijia ferruginea..........................................................................................................
57
6
Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto de folhas de Solanum
paniculatum...................................................................................................................
63
7
Fracionamento do extrato bruto de Solanum paniculatum visando a obtenção de
fração alcaloídica...........................................................................................................
64
8
Perfis cromatográficos obtidos por RP-HPLC para o extrato (A) e frações FHX (B),
FDCM/EtOAC (C) de Jacaranda caroba, bem como para os sólidos isolados Jc2 (D)
e Jc3 (E).........................................................................................................................
72
9
Perfis cromatográficos obtidos por RP-HPLC para o extrato (A) e frações FDCM (B)
e FDCM/EtOAC (C) de Remijia ferruginea, bem como para os sólidos isolados Rf1
(D) e Rf2 (E)...................................................................................................................
73
10
Perfis cromatográficos obtidos por RP-HPLC para o extrato (A) e frações FHX (B)e
FDCM (C) de S, paniculatum, bem como para o sólido isolado Sp2 (D)......................
74
11
Estruturas parciais de triterpenos das séries olean-12-enos (a) e urs-12-enos (b).......
78
12
Espectro de RMN de
13
C obtido para Jc2 (100 MHz, CDCl
3 +
CDOD
3)
).........................
79
13
Subespectro DEPT-135 obtido para Jc2 (100 MHz, CDCl
3 +
CDOD
3)
)..........................
81
14
Espectro de RMN de
1
H obtido para Jc2 (400 MHz, CDCl
3
).........................................
81
15
Seção expandida do mapa de contornos HMQC obtido para Jc2 (400 MHz, CDCl
3
+
CDOD
3
)..........................................................................................................................
83
16
Espectro de RMN de
13
C obtido para Jc3 (50 MHz, CDCl
3
)..........................................
84
17
Subespectro DEPT-135 obtido para Jc3 (50 MHz, CDCl
3
)............................................
85
18
Espectro de RMN de
1
H obtido para Jc3 (200 MHz, CDCl
3
).........................................
87
19
Espectro de RMN de
13
C obtido para Rf3 (100 MHz, CDCl
3
)........................................
91
20
Subespectro DEPT-135 obtido para Rf3 (100 MHz, CDCl
3
)..........................................
91
21
Espectro de RMN de
1
H obtido para Rf3 (400 MHz, CDCl
3
).........................................
93
22
Espectro de RMN de
13
C obtido para Sp2 (50 MHz, CDCl
3
).........................................
99
23
Subespectro DEPT-135 obtido para Sp2 (50 MHz, CDCl
3
)...........................................
99
24
Espectro de RMN de
1
H obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
)........................................
100
25
Seção expandida do mapa de contornos COSY obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
)...
101
26
Seção expandida do mapa de contornos HMQC obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
)..
103
27
Hidrólise ácida de ∆
25(27)
-tigogenina 3-O-β-D-glicopiranosídeo e conseqüente
formação da mistura de isômeros R e S...........................................................
109
28
Espectro de RMN de
13
C e DEPT-135 obtidos para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
).................
110
29
Espectro de RMN de
1
H obtido para Sp3 (400 MHz, CDCl
3
)........................................
110
30
Mapa de contornos COSY obtido para Sp3 (400 MHz, CDCl
3
)....................................
111
31
Mapa de contornos NOESY obtido para Sp3 (400 MHz, CDCl
3
)..................................
111
32
Espectro de massas de alta resolução e seção expandida do mapa de contornos
HSQC-TOCSY obtidos para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
).....................................................
112
33
Seções expandidas do espectro de HSQC obtido para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
)...........
113
34
Concentração de triglicérides (mmol/mL) determinada no experimento com alças
intestinais evertidas para o grupo controle (G1) e grupos tratados com volumes
crescentes do fitoterápico (G2, 1 µL; G3, 3 µL; G4, 10 µL; G5 30 µL; G6, 100 µL)......
118
35
Efeito dos extratos avaliados no nível de TAG plasmático e na atividade da LPL.
Extratos: E1, Remijia ferruginea; E2, Solanum paniculatum; E3, Jacaranda
caroba;C, grupo controle...............................................................................................
122
36
Esquema de síntese proposto para obtenção de derivados do ácido ursólico.............
135
37
Esquema de síntese proposto para obtenção de derivados do ácido ursólico.............
136
38
Esquema de síntese proposto para obtenção de derivados do ácido oleanólico..........
137
39
Esquema de síntese para a obtenção dos derivados do ácido ursólico........................
180
40
Mecanismo proposto para a formação de 79................................................................
183
41
Mapa de contornos HMQC obtido para 80 (100 MHz, CDCl
3
)......................................
185
42
Mapa de contorno HMBC obtido para 80 (100 MHz, CDCl
3
).........................................
186
43
Mecanismo proposto para a redução de 79 com LiAlH
4
,
.
segundo Carey e Sunberg...
188
44
Espectro de RMN de
1
H obtido para o derivado 81 (200 MHz, CDCl
3
).........................
189
45
Mecanismo proposto para a isomerização do álcool alílico 81.....................................
190
46
Espectro de RMN de
1
H obtido para 102 (400 MHz, CDCl
3
).........................................
191
47
Espectro de RMN de
13
C obtido para 102 (100 MHz, CDCl
3
)........................................
191
48
Mapa de contorno COSY obtido para 102 (100 MHz, CDCl
3
).......................................
192
49
Mapa de contornos HMQC obtido para 102 (100 MHz, CDCl
3
)....................................
193
50
Proposta de mecanismo de formação de 85.................................................................
194
51
Mapa de contornos HMQC obtido para 85 (100 MHz, CDCl
3
)......................................
196
52
Mapa de contorno COSY obtido para 85 (400 MHz, CDCl
3
).........................................
198
53
Mapa de contornos HMQC obtido para 85 (100 MHz, CDCl
3
)......................................
199
54
Mapa de contornos HMBC obtido para 85 (100 MHz, CDCl
3
)......................................
200
55
Proposta de mecanismo para a formação do produto de rearranjo 83.........................
202
56
Seção expandida do mapa de contornos HMQC de 83 (400 MHz, CDCl
3
)...................
207
57
Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 83 (400 MHz, CDCl
3
)...................
208
58
Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 83 (400 MHz, CDCl
3
)...................
209
59
Mapa de contorno COSY obtido para 83 (400 MHz, CDCl
3
).........................................
210
60
Proposta de mecanismo para a formação de 84...........................................................
210
61
Mapa de contorno COSY obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
)........................................
214
62
Mapa de contornos HMQC obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
)......................................
215
63
Mapa de contornos HMBC obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
).......................................
216
64
Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 84 (400 MHz, CDCl
3
)...................
217
65
Esquema de síntese para a obtenção dos derivados 90, 91, 92, 93, 94, 95 e 96.........
219
66
Esquema de síntese para obtenção do derivado 89.....................................................
221
67
Proposta de mecanismo para a formação de 90, segundo Carey e Sundberg ............
222
68
Proposta de mecanismo para a formação de 91 segundo Carey e Sundberg .............
223
69
Mapa de contorno COSY obtido para 94 (400 MHz, CDCl
3
).........................................
229
70
Mapa de contornos HMQC obtido para 94 (100 MHz, CDCl
3
)......................................
230
71
Mecanismo proposto para a formação da lactona 95, segundo Carey e Sundberg......
231
72
Mapa de contornos HMQC obtido para 95 (100 MHz, CDCl
3
)......................................
232
73
Esquema de síntese de derivados do ácido oleanólico.................................................
236
LISTA DE TABELAS
1
Sistema de eluição empregado para obtenção de perfis cromatográficos por RP-
HPLC.................................................................................................................................
47
2
Fracionamento preliminar do extrato etanólico de Jacaranda caroba por filtração em
sílica gel............................................................................................................................
48
3
Fracionamento de FHX (C1), em coluna de sílica gel......................................................
49
4
Fracionamento de FDCM:EtOAC (C2), em coluna de sílica gel.......................................
50
5
Fracionamento preliminar do extrato etanólico de Remijia ferruginea em coluna de
sílica gel............................................................................................................................
52
6
Fracionamento de FDCM/EtOAc (C1), em coluna de sílica gel........................................
53
7
Fracionamento de F 209-234 (C2), em coluna de sílica gel.............................................
54
8
Fracionamento de FDCM (C3), por cromatografia em coluna de sílica gel......................
54
9
Fracionamento de F 6-46 (C4), em coluna de sílica gel...................................................
55
10
Fracionamento de F 7-18 (C5), em coluna de sílica gel...................................................
56
11
Fracionamento preliminar do extrato etanólico bruto de folhas de Solanum
paniculatum por filtração em sílica gel..............................................................................
58
12
Fracionamento de FHX (C1), em coluna de sílica gel......................................................
59
13
Fracionamento de F281-362 (C2), em coluna de sílica gel..............................................
59
14
Fracionamento de FDCM (C3), em coluna de sílica gel...................................................
60
15
Fracionamento de F42-102 (C4), em coluna de sílica gel................................................
60
16
Fracionamento do resíduo da fase DCM (C6) em coluna de sílica gel.............................
61
17
Fracionamento de F F182-194 (C7) em coluna de sílica gel............................................
62
18
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Jc1 (50 MHz, CDCl
3
) e
comparação com dados da literatura para o β-sitosterol..................................................
76
19
Deslocamentos químicos e constantes de acoplamento escalar (J) de alguns sinais do
espectro de RMN de
1
H obtido para Jc1...........................................................................
76
20
Atribuições dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Jc2 (100 MHz, CDCl
3
+
CDOD
3
) e comparação com dados da literatura para o ácido ursólcio............................
80
21
Atribuição de alguns sinais do espectro de RMN de
1
H para Jc2 (400 MHz, CDCl
3
+
CDOD
3
).............................................................................................................................
82
22
Correlações heteronucleares (
1
H-
13
C) observadas no mapa de contorno HMQC obtido
para Jc2............................................................................................................................
82
23
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Jc3 (100 MHz, CDCl
3
) e
dados da literatura para o ácido ursólico..........................................................................
86
24
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Rf3 (100 MHz, CDCl
3
) e
dados da literatura para β-sitosterol e estigmasterol........................................................
92
25
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
1
H obtido para Rf1 (400 MHz, CDCl
3
) e
dados da literatura para β-sitosterol e estigmasterol........................................................
94
26
Posições e vibrações das bandas de Sp2 no espectro no IV...........................................
95
27
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Sp2 (50 MHz, CDCl
3
) e
dados da literatura para as sapogeninas das séries 25R (tigogenina) e 25S
(neotigogenina).................................................................................................................
98
28
Atribuição de alguns sinais do espectro de RMN de
1
H obtido para Sp2 (200 MHz,
CDCl
3
) e dados da literatura para neotigogenina.............................................................
101
29
Correlações heteronucleares (
1
H -
13
C) observadas no mapa de contorno HMQC
obtido para Sp2.................................................................................................................
102
30
Posições e vibrações das bandas de Sp3 no espectro no IV...........................................
104
31
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
) e
dados da literatura para a ∆
25(27)
-tigogenina.....................................................................
106
32
Correlações do espectro HSQC-TOCSY obtido para Sp3................................................
107
33
Correlações heteronucleares (
1
H -
13
C) observadas no mapa de contorno HSQC
obtido para Sp3.................................................................................................................
108
34
Citotoxicidade (CC
50
) e atividade antiviral (CI
50
) in vitro do extrato bruto e substâncias
isoladas de S. paniculatum...............................................................................................
116
35
Concentrações de triglicérides absorvidos (mmol/mL) em alças intestinais evertidas,
determinadas para o grupo controle (G1) e para os grupos tratados com o fitoterápico
(G2, G3, G4, G5 e G6)......................................................................................................
118
36
Condições avaliadas no tratamento de 81 com BF
3
-Et
2
O (0,19 mmol)............................
148
37
Condições avaliadas no tratamento de 81 (0,11 mmol) com HI 57%...............................
151
38
Condições avaliadas na oxidação do produto 90 (42 mg; 0,09 mmol) com
SeO
2
..................................................................................................................................
158
39
Condições avaliadas nas tentativas de oxidação de 90 com t-BuOOH/SeO
2
..................
159
40
Condições avaliadas na oxidação de 90 com NaClO
2
/t-BuOOH......................................
160
41
Condições avaliadas na oxidação de 90 com MCPBA, catalisada por 5,10,15,20-
tetrakis(pentafluorofenil) porfirina......................................................................................
168
42
Condições avaliadas no tratamento de 81 com BF
3
-Et
2
O (0,19 mmol) visando obter o
produto de rearranjo 83 ....................................................................................................
203
43
Correlações de HMBC obtidas para 83 (400 MHz, CDCl
3
)...............................................
204
44
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
1
H obtidos para 83 (400 MHz, CDCl
3
)......
205
45
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) obtidos para 83....
206
46
Atribuição do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) obtido para 84.........................
212
47
Atribuição do espectro de RMN de
13
C obtido para 84 (100 MHz, CDCl
3
).......................
213
48
Correlações observadas no mapa de contorno HMBC obtido para 84 (400 MHz,
CDCl
3
)...............................................................................................................................
213
49
Atividade citotóxica do ácido ursólico e derivados frente a linhagens tumorais
humanas...........................................................................................................................
242
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
[α]
D
Poder rotatório específico
CCD Cromatografia em camada delgada
CI
50
Concentração inibitória 50%
COSY
Correlation spectroscopy
d Dupleto
DAD Detecção por arranjo de diodos
DCM Diclorometano
dd Dupleto duplo
DEPT
Distortionless enhancement by polarization transfer
DL
50
Dose letal 50%
EtOAc Acetato de etila
EtOH Etanol
F.M Fórmula molecular
GuHCl Hidrocloreto de guanidina
HAc Ácido acético
HMBC
Heteronuclear multiple bond correlation
HMQC
Heteronuclear multiple quantum coherence
HPLC
High performance liquid chromatography
HRMS
High resolution mass spectrometry
HSQC
Heteronuclear single quantum coherence
HX
n-hexano
I.V Infravermelho
J Constante de acoplamento escalar
LPL Lipase lipoprotéica
m Multipleto
M.M Massa molecular
M Molar (número de moles por litro)
MCPBA Ácido meta-cloroperbenzóico
MHz Megahertz
MeOH Metanol
MTT Brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NOESY
Nuclear overhauser enhancement spectroscopy
OMS Organização mundial de saúde
PDC Dicromato de piridínio
Rf Fator de retenção
RMN Ressonância magnética nuclear
RP-HPLC
Reverse fase high performance liquid chromatography
s Simpleto
SRB Sulforodamina B
t Tripleto
TAG Triglicérides
TGF-β
Fator de crescimento transformador-beta
THF Tetraidrofurano
TOCSY
Total Correlation Spectroscopy
TMS Tetrametilsilano
TR Tempo de retenção
U.V Ultravioleta
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................19
PARTE 1
2 OBJETIVOS ........................................................................................22
2.1 Objetivo Geral ..................................................................................22
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................22
3 REVISÃO DA LITERATURA...............................................................23
3.1 Metabolismo lipídico.........................................................................23
3.2 Produtos fitoterápicos empregados no tratamento de distúrbios
digestivos .............................................................................................24
3.3 Remijia ferruginea: usos populares, composição química e atividades
biológicas .............................................................................................29
3.4 Solanum paniculatum: usos populares, composição química e
atividades biológicas ............................................................................32
3.5 Jacaranda caroba: usos populares, composição química e atividades
biológicas .............................................................................................37
4 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................43
4.1 Equipamentos ..................................................................................43
4.2 Reagentes e Materiais .....................................................................44
4.3 Coleta e identificação do material vegetal........................................46
4.4 Preparo dos extratos ........................................................................46
4.5 Análises por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
(RP-HPLC) ...........................................................................................47
4.5.1 Preparo das amostras..................................................................47
4.5.2 Condições Cromatográficas.........................................................47
4.6 Estudo fitoquímico............................................................................47
4.6.1 Jacaranda caroba ........................................................................48
4.6.1.1 Fracionamento preliminar do extrato bruto............................48
4.6.1.2 Fracionamento de FHX (coluna 1 - C1).................................49
4.6.1.3 Fracionamento de FDCM:EtOAC (coluna 2 – C2).................49
4.6.2 Remijia ferruginea........................................................................52
4.6.2.1 Fracionamento preliminar do extrato bruto............................52
4.6.2.2 Fracionamento de FDCM/EtOAc (coluna 1 - C1) ..................53
4.6.2.3 Fracionamento de F209-324 (coluna 2 – C2)........................53
4.6.2.4 Fracionamento de FDCM (coluna 3 – C3).............................54
4.6.2.5 Fracionamento de F6-46 (coluna 4 – C4)..............................55
4.6.2.6 Fracionamento de F7-18 e precipitado de FDCM (coluna 5 -
C5)..........................................................................................55
4.6.3 Solanum paniculatum...................................................................58
4.6.3.1 Fracionamento preliminar do extrato bruto............................58
4.6.3.2 Fracionamento de FHX (coluna 1 – C1) ................................58
4.6.3.3 Fracionamento de F281-362 (coluna 2 – C2)........................59
4.6.3.4 Fracionamento de FDCM (coluna 3 – C3).............................60
4.6.3.5 Fracionamento de F42-102 (coluna 4 – C4)..........................61
4.6.3.6 Marcha para obtenção de alcalóides e fracionamento de
FDCM ...................................................................................61
4.6.3.7 Fracionamento de F182-194 (coluna 6 – C6)........................62
4.7 Ensaios biológicos............................................................................65
4.7.1 Ensaios in vitro de atividade antiviral ...........................................65
4.7.1.1 Avaliação da citotoxicidade ...................................................65
4.7.1.2 Avaliação da atividade antiviral .............................................65
4.7.1.3 Análise dos dados .................................................................66
4.7.2 Ensaio ex vivo de absorção de lipídeos.......................................66
4.7.2.1 Preparo das soluções............................................................66
4.7.2.2 Protocolo experimental..........................................................67
4.7.3 Análises estatísticas.....................................................................69
4.7.4 Ensaios in vivo de absorção de lipídeos ......................................69
4.7.4.1 Protocolo experimental..........................................................69
4.7.5 Medida da atividade da lipase lipoprotéica ..................................70
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................71
5.1 Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (RP-HPLC).....71
5.1.1 Jacaranda caroba ........................................................................71
5.1.2 Remijia ferruginea........................................................................72
5.1.3 Solanum paniculatum...................................................................73
5.2 Elucidação estrutural das substâncias isoladas ...............................74
5.2.1 Elucidação estrutural das substâncias isoladas de Jacaranda
caroba ..........................................................................................74
5.2.1.1 Jc1.........................................................................................74
5.2.1.2 Jc2.........................................................................................77
5.2.2 Jc3 ...............................................................................................83
5.2.2.1 Jc4.........................................................................................87
5.2.3 Discussão sobre a composição micromolecular de J. caroba......88
5.2.4 Elucidação estrutural das substâncias isoladas de Remijia
ferruginea.....................................................................................89
5.2.4.1 Rf1.........................................................................................89
5.2.4.2 Rf2.........................................................................................90
5.2.4.3 Rf3.........................................................................................90
5.2.5 Discussão sobre a composição química micromolecular de
Remijia ferruginea........................................................................94
5.2.6 Elucidação estrutural das substãncias isoladas de Solanum
paniculatum..................................................................................94
5.2.6.1 Sp1 ........................................................................................94
5.2.6.2 Sp2 ........................................................................................95
5.2.6.3 Sp3 ......................................................................................104
5.2.7 Discussão sobre a composição química de S. paniculatum ......114
5.3 Ensaios biológicos..........................................................................115
5.3.1 Ensaios in vitro de atividade antiviral .........................................115
5.3.2 Ensaio ex vivo de absorção de lipídeos.....................................117
5.3.3 Ensaios in vivo de absorção de lipídeos ....................................119
6 CONCLUSÕES .................................................................................123
PARTE 2
7 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................125
7.1 Transformações químicas dos ácidos ursólico e oleanólico...........127
8 OBJETIVOS ......................................................................................134
8.1 A proposta do trabalho ...................................................................134
9 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................138
9.1 Procedimentos gerais.....................................................................138
9.2 Transformações químicas do ácido ursólico ..................................139
9.2.1 Síntese do 3
β-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (77).............139
9.2.2 Síntese do 3β-acetóxi-urs-12-en-28-oato de metila (78)............140
9.2.3 Síntese do 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (79) e
do 3β-acetóxi-urs-9,12-dien-28-oato de metila (80) ...................141
9.2.4 Síntese do 3β,11,28-triidróxi-urs-12-eno (81) ............................143
9.2.5 Síntese do 3β,28-diacetóxi-urs-11,13(18)-dieno (85).................144
9.2.6 Síntese do 3β,11,28β-triacetoxi-urs-12-eno (82)........................145
9.2.7 Síntese do 3β-hidróxi-urs-12-en-28-al (83) e do 3β-hidróxi-urs-11-
en-28,13β-eter (84) ....................................................................147
9.2.8 Tentativas de epoxidação de 81 ................................................149
9.2.9 Tentativas de isomerização de 57 com HI .................................150
9.2.10 Síntese do 3β,28-diidróxi-urs-12-eno (86)................................151
9.2.11 Síntese do ácido 3β-acetóxi-urs-12-en-28-óico (87) ................152
9.2.12 Tentativas de oxidação de 87 com MCPBA catalisada por
5,10,15,20-tetrakis(pentaflorofenil) porfirina.............................153
9.2.13 Síntese do ácido 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-óico (88)....153
9.2.14 Síntese de 3β-acetóxi-urs-12-en-28,13β-lactona (89)..............154
9.2.15 Síntese do 3-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (90) .................155
9.2.16 Síntese do 3-hidroxi-oxima-urs-12-en-28-oato de metila (91)..156
9.2.17 Tratamento de 77 com HI 57% ................................................157
9.2.18 Tentativa de oxidação de 90 com SeO
2
...................................158
9.2.19 Tentativa de oxidação de 90 com t-BuOOH/SeO
2
...................158
9.2.20 Síntese do 3,11-dioxo-urs-12-en-28-oato de metila (92)..........159
9.2.21 Tentativa de oxidação de 78 com SeO
2
/AcOH ........................160
9.2.22 Tentativa de oxidação de 90 com SeO
2
/AcOH ........................161
9.2.23 Tentativa de rearranjo de 90 com BF
3
-Et
2
O.............................161
9.2.24 Tentativas de redução de 92....................................................162
9.2.24.1 Redução de 92 com NaBH
4
/CeCl
3
.7H
2
O...........................162
9.2.24.2 Redução de 92 com NaBH
4
/alumina .................................163
9.2.24.3 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
/GuHCl................164
9.2.24.4 Tentativa de redução de 92 com InCl
3
/NaBH
4
...................164
9.2.24.5 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
...........................164
9.2.25 Síntese de 3
β,28-diidroxi-urs-9,12-dieno (94) e 3β-hidroxi-urs-11-
en-28,13β-eter (84) ..................................................................165
9.2.26 Síntese do 3,4-seco-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (95).166
9.2.27 Síntese do 3-oxo,11-hidroxi-urs-12-en-28-oato de metila (96).167
9.2.28 Tentativa de oxidação de 31 com NaClO
2
/t-BuOOH................169
9.2.29 Esterificação de 88 com CH
3
I/K
2
CO
3
.......................................170
9.2.30 Tentativas de epoxidação de 79 com H
2
O
2
/NaOH...................170
9.2.31 Tentativas de epoxidação de 79 com MCPBA.........................170
9.3 Transformações químicas do ácido oleanólico...............................171
9.3.1 Síntese do 3β-hidróxi-olean-12-en-28-oato de metila (97).........171
9.3.2 Síntese do 3-oxo-olean-12-en-28-oato de metila (98)................172
9.3.3 Síntese do 3-hidroxi-oxima-olean-12-en-28-oato de metila (99) 173
9.3.4 Acetilação de 99.........................................................................174
9.3.5 Síntese do 3-acetóxi-olean-12-en-28-oato de metila (101)........175
9.4 Ensaios Biológicos .........................................................................176
9.4.1 Avaliação da atividade citotóxica das substâncias obtidas a partir
do ácido ursólico ........................................................................176
9.4.2 Linhagens celulares empregadas ..............................................176
9.4.3 Culturas celulares ......................................................................176
9.4.4 Ensaios de Citotoxicidade..........................................................176
9.4.5 Avaliação da atividade antiplasmódica dos derivados obtidos...177
10 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................178
10.1 Transformações químicas do ácido ursólico ..................................180
10.1.1 Síntese do 3β-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (77)...........180
10.1.2 Síntese de 3β-acetóxi-urs-12-en-28-oato de metila (78)..........180
10.1.3 Síntese de 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (79) e
3β-acetóxi-urs-9,12-dien-28-oato de metila (80) ......................181
10.1.4 Síntese de 3β,11,28-triidroxi-urs-12-eno (81) ..........................185
10.1.5 Síntese de 3β,11,28-triacetóxi-urs-12-eno (82)........................197
10.1.6 Síntese de 3β-hidróxi-urs-12-en-28-al (83) e 3β-hidróxi-urs-11-
en-28,13β-éter (84) ..................................................................200
10.1.7 Tentativas de epoxidação de 81 ..............................................217
10.1.8 Tratamento de 81 com HI 57% ................................................217
10.1.8.1 Síntese do 3β,28β-diidróxi-urs-12-eno (86).......................217
10.1.9 Síntese de 87...........................................................................218
10.1.10 Tentativas de oxidação de 87 com MCPBA catalisado por
5,10,15,20-tetrakis(pentaflorofenil) porfirina ............................220
10.1.11 Síntese do ácido 3
β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-óico (88)..220
10.1.12 Síntese de 3β-acetóxi-urs-11-en-28,13β-lactona (89)............220
10.1.13 Síntese de 3-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (90) ...............222
10.1.14 Síntese de 3-hidroxi-oxima-urs-12-en-28-oato de metila (91) 223
10.1.15 Tratamento de 77 com HI 57% ..............................................224
10.1.16 Tentativa de oxidação de 90 com SeO
2
.................................224
10.1.17 Tentativa de oxidação com t-BuOOH/SeO
2
...........................224
10.1.18 Síntese de 3,11-dioxo-urs-12-en-28-oato de metila (92)........224
10.1.19 Tentativas de oxidação de 78 e 90 com SeO
2
/AcOH.............225
10.1.20 Tentativa de rearranjo de 92 com BF
3
-Et
2
O...........................225
10.1.21 Tentativas de redução de 92..................................................226
10.1.21.1 Redução de 92 com NaBH
4
/CeCl
3
.7H
2
O.........................226
10.1.21.2 Redução de 92 com NaBH
4
/alumina ...............................227
10.1.21.3 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
/GuHCl..............227
10.1.21.4 Tentativa de redução de 92 com InCl
3
/NaBH
4
.................227
10.1.21.5 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
.........................227
10.1.22 Síntese de 3β,28-diidróxi-urs-9,12-dieno (94) e 3β-hiiróxi-urs-11-
en-28,13β-éter (84)..................................................................228
10.1.23 Síntese de 3,4-seco-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (95).....
...............................................................................................230
10.1.24 Síntese de 3-oxo,11-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (96).....
...............................................................................................232
10.1.25 Tentativa de oxidação de 31 com NaClO
2
/t-BuOOH..............233
10.1.26 Esterificação de 88 com CH
3
I/K
2
CO
3
.....................................234
10.1.27 Tentativas de epoxidação de 79 com H
2
O
2
/NaOH.................234
10.2 Transformações químicas do ácido oleanólico...............................235
10.2.1 Síntese de 3β-hidróxi-olean-12-en-28-oato de metila (97).......236
10.2.2 Síntese de 3-oxo-olean-12-en-28-oato de metila (98)..............237
10.2.3 Síntese de 3-hidroxi-oxima-olean-12-en-28-oato de metila (99)
237
10.2.4 Acetilação de 99.......................................................................238
10.2.5 Síntese de 3-acetóxi-olean-12-en-28-oato de metila (101) ......238
10.3 Ensaios biológicos..........................................................................239
10.3.1 Avaliação da atividade citotóxica dos produtos obtidos ...........239
10.3.2 Avaliação da atividade antiplasmódica ....................................242
11 CONCLUSÕES .................................................................................243
APÊNDICE ...................................................................................................244
Introdução
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
19
1 INTRODUÇÃO
Desde os primórdios da civilização, os vegetais estão associados ao
desenvolvimento humano, sendo utilizados como fonte de alimentos, de habitação,
para a produção de meios de transporte e como meio restaurador da saúde. Com o
passar do tempo, um número cada vez maior de produtos naturais de origem vegetal
foi incorporado ao arsenal terapêutico humano, através de conhecimentos
tradicionais de práticas de cura de enfermidades de diversas populações espalhadas
pelo mundo (SCHENKEL et al., 2003).
Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), atualmente cerca
de 80% da população mundial utiliza a medicina tradicional para o tratamento de
suas necessidades primárias de saúde e a maior parte da terapia tradicional envolve
o uso de extratos de plantas ou de seus princípios ativos. As plantas medicinais
constituem o único recurso terapêutico de parcela significativa da população
brasileira, e de mais de dois terços da população do planeta (LUI; WANG, 2008). A
OMS estima que aproximadamente 20.000 espécies de plantas superiores sejam
empregadas como medicamento em todo o mundo (KHAN, 2006; SIMÕES;
SCHENKEL, 2002). O mercado mundial de fitoterápicos movimenta cerca de US$60
bilhões por ano e vem angariando, a cada ano, mais adeptos nos países
desenvolvidos (LUI; WANG, 2008). No Brasil, esse mercado movimenta algo em
torno de R$ 400 milhões, com uma taxa de crescimento anual entre 5 e 15%
(FREITAS, 2007; LUI, WANG, 2008).
Tradicionalmente, espécies vegetais desempenham um papel relevante na
descoberta de substâncias bioativas. Estudos de diversas espécies resultaram na
introdução de substâncias como atropina, digoxina, morfina, quinina, reserpina,
taxol, vincristina e vimblastina, entre diversas outras, na terapêutica moderna
(GILANI; RAHMAN, 2005).
Apesar da relevância do conhecimento popular, resultado de observações
sistemáticas de práticas tradicionais, é imprescindível empregar métodos científicos
para avaliar a eficácia das espécies vegetais. Neste sentido, é fundamental associar
estudos químicos/farmacológicos com as informações obtidas junto às comunidades
tradicionais, visando comprovar o efeito terapêutico das espécies.
Introdução
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
20
O Brasil é um dos países com megadiversidade vegetal, contando com um
total estimado de 55.000 espécies de plantas superiores. Essa riqueza vegetal,
associada à ampla tradição no uso de plantas medicinais no país, representa uma
oportunidade única para a pesquisa fitoquímica e de atividades biológicas, com
vistas ao desenvolvimento futuro de fármacos e fitoterápicos. No entanto, a despeito
das diversas espécies medicinais catalogadas no país, com usos
etnofarmacológicos diversos, a grande maioria delas carece de estudos químicos e
biológicos que comprovem as atividades alegadas.
Nesse contexto se insere o presente trabalho, cuja parte 1 visa fornecer
dados sobre a composição fitoquímica e de atividades biológicas para três espécies
medicinais brasileiras, amplamente utilizadas, Jacaranda caroba, Remijia ferruginea
e Solanum paniculatum. A parte 2 foi realizada durante o período de estágio de
doutorado sanduíche na Universidade de Salamanca, Espanha e relata as
transformações químicas dos ácidos ursólico e oleanólico bem como a avaliação das
atividades antitumoral e antiplasmódica de derivados obtidos.
PARTE 1
Estudo fitoquímico e de atividades biológicas de Solanum
paniculatum L., Remijia ferruginea D.C. e Jacaranda caroba D.C.
Objetivos
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22
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Isolar constituintes micromoleculares majoritários de Solanum paniculatum L.,
Remijia ferruginea D. C. e Jacaranda caroba D. C., e avaliar as atividades biológicas
das espécies relacionadas ao seu uso tradicional.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a atividade de extratos de S. paniculatum, R. ferruginea e J. caroba
sobre a absorção de lipídeos, em ensaios in vivo com animais tratados com
dieta hiperlipídica.
Avaliar a atividade dos extratos supracitados sobre a absorção de lipídeos em
modelo ex vivo (preparações isoladas de alça intestinal de ratos).
Isolar constituintes micromoleculares abundantes dos extratos das três
espécies.
Avaliar a potencial atividade antiviral in vitro do extrato de S. paniculatum e
substâncias isoladas deste.
Elucidar a estrutura química das substâncias isoladas utilizando métodos
espectrométricos usuais (U.V, I.V, RMN de
1
H e de
13
C, E.M).
Revisão da Literatura
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23
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Metabolismo lipídico
Os lipídeos constituem aproximadamente 40% da ingestão calórica da
população ocidental, equivalendo a um consumo diário de 60-120g (adultos). Os
componentes lipídicos quantitativamente mais importantes da dieta humana são os
triglicérides ou triglicérides (TAG), seguidos de fosfolipídeos, colesterol e ésteres de
colesterol (GEEVENBROEK; BRUIN, 1998). Em condições fisiológicas normais, o
sistema digestivo pode digerir e absorver mais de 95% do total de triglicérides
ingeridos (MU; HOY, 2004).
A digestão e absorção de triglicérides são processos dinâmicos e eficientes,
mas compreendidos apenas parcialmente a nível molecular. As principais fases da
absorção de triglicérides são: emulsificação, hidrólise, dispersão aquosa dos
produtos lipolíticos e absorção, que ocorre principalmente no jejuno proximal (ROS,
2000, SINGH et al., 2009). Os lipídeos da dieta não são prontamente absorvidos,
pois se apresentam como óleos na temperatura corporal; portanto, o processo de
digestão consiste em transformá-los em moléculas mais polares que possam ser
solubilizadas no meio aquoso intestinal e absorvidas. Assim, a primeira etapa na
digestão das gorduras é a emulsificação, que ocorre no duodeno e jejuno, na qual o
conteúdo lipídico é emulsionado em pequenas gotas por ação das lecitinas
presentes nos sais biliares secretados na bile.
Os sais biliares atuam como detergentes, reduzindo a tensão superficial dos
glóbulos de gordura. Sob a ação da lipase pancreática, cada molécula de triglicéride
é hidrolisada originando uma molécula de 2-monoglicerídeo e duas de ácido graxo,
parcialmente solúveis no meio aquoso intestinal. A dispersão destes produtos no
meio aquoso requer sua incorporação em micelas, agregados polimoleculares de
sais biliares, que transportam ácidos graxos e monoglicerídeos até as
microvilosidades, onde difundem passivamente para os enterócitos. Posteriormente,
as células intestinais reesterificam 2-monoglicerídeos e ácidos graxos para formarem
novamente triglicérides e os incorporam em quilomícrons que são secretados para a
linfa, atingem o ducto toráxico e chegam até tecidos periféricos (GEEVENBROEK;
BRUIN, 1998; MU; HOY, 2004; ROS, 2000).
Revisão da Literatura
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24
A digestão e a absorção de lipídeos são fenômenos de maior complexidade
do que para as outras classes de nutrientes, estando mais freqüentemente sujeitas a
alguma disfunção. Por isto, o tratamento ideal para distúrbios digestivos é incerto, e
terapias empíricas, sem diagnósticos prévios, vêm sendo empregadas, utilizando-se
antiácidos (trissilicato de magnésio, bicarbonato de sódio, hidróxido de alumínio),
antagonistas dos receptores histaminérgicos H
2
(cimetidina, ranitidina, nizatidina,
famotidina) e, mais recentemente, inibidores da bomba de próton (omeprazol,
lansoprazol, pantoprazol) e gastrocinéticos (metoclopramida, domperidona,
cisaprida) (MILOSAVLJEVIC; JOVANOVIC, 2000). Por se tratar de uma terapia
crônica, o custo do tratamento pode ser elevado. Estima-se que, somente nos EUA,
sejam gastos US$2 milhões por ano em medicações para o alívio dos sintomas
(HOHENESTER et al., 2004).
3.2 Produtos fitoterápicos empregados no tratamento de distúrbios
digestivos
Os distúrbios digestivos são clinicamente caracterizados por dor recorrente
e/ou desconforto persistente ou episódico na parte superior do estômago, sem
evidências de patologia que explique os sintomas, com exames clínicos normais
(JAN TACK; LEE, 2005; OUDENHOVE; TACK, 2009; QUIGLEY, 2008). Podem ser
ocasionados por alterações em um ou vários fatores fisiológicos, tais como tônus e
motilidade intestinal, secreção enzimática e hormonal, reabsorção e digestão.
Alterações neuronais e sensoriais na motilidade, além de fatores psicológicos como
estresse ou depressão, também podem levar ao desencadeamento de distúrbios
digestivos (SAAD; CHEY, 2006). Porém, ainda não é possível definir exatamente o
mecanismo desencadeador dos sintomas (JAN TACK; LEE, 2005).
Os sintomas comumente relatados nos casos de distúrbios digestivos são:
saciedade precoce, regurgitamento ácido, gases, distensão abdominal, náuseas e
vômito (HOLTMANN et al., 2004; TALLEY, 2008). Cerca de 75% dos pacientes
afirmam que os sintomas se agravam após a ingestão de dieta gordurosa
(BISSCHOPS et al., 2008; MILOSAVLJEVIC; JOVANOVIC, 2000). Segundo
Thompson et al. (2002), cerca de 40% da população adulta apresenta um ou dois
episódios dispépticos no decorrer de um ano.
Revisão da Literatura
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25
Além da terapia medicamentosa disponível, com resultados nem sempre
satisfatórios e de custo elevado, espécies vegetais vêm sendo utilizadas como
alternativa para o tratamento e alívio dos sintomas dispépticos, seja isoladamente ou
em associação. Este é o caso de espécies ricas em óleos essenciais, tais como
Foeniculum vulgare (funcho), Pimpinella anisum (erva-doce), Matricaria chamomilla
(camomila), Mentha piperita (hortelã), com propriedades espasmolíticas,
carminativas e ação anestésica, cujos mecanismos de ação podem estar
relacionados com a modulação da atividade da musculatura lisa do trato
gastrointestinal (MELZER et al., 2004).
Várias espécies vegetais usadas no tratamento de distúrbios digestivos foram
estudadas e algumas tiveram seus possíveis mecanismos de ação e constituintes
ativos identificados. Assim, a espécie Mentha piperita atua inibindo a contração da
musculatura lisa através da interação do mentol (1) e da mentona (2) com os canais
de cálcio (HILLS; AARONSON, 1991; MCKAY; BLUMBERG, 2006). Grigoleit e
Grigoleit (2005) relataram o potencial efeito espasmolítico observado para o óleo de
Mentha piperita em 9 estudos clínicos empregando pessoas saudáveis e pacientes
com distúrbios digestivos, que fizeram uso do óleo em dose única por duas
semanas.
Chelidonium majus possui em sua composição alcalóides, flavonóides e
substâncias fenólicas, identificados como possíveis constituintes ativos, que atuam
como antiespasmódicos, colagogos e coleréticos. Dois extratos etanólicos da
espécie, com concentração definida dos principais alcalóides chelidonina (3),
protopina (4) e coptisina (5), foram avaliados em modelos espasmolíticos de íleo
isolado de ratos. Os extratos produziram 50% de relaxamento na dose de 5 x 10
-4
g/mL (HILLER et al., 1998). Estudo duplo-cego com 60 pessoas, empregando a
associação dos extratos de Chelidonium majus e Peumus boldos ou placebo,
mostrou que a associação das espécies melhora os sintomas da indigestão após 14
dias de tratamento (KUPKE et al., 1991).
Gentiana lutea tem sua ação antidispéptica atribuída ao estímulo das
secreções gástrica e salivar por compostos “amargos” como o secoiridóide
gentiopricosídeo (6) (BLUMENTHAL, 2002). Já a ação de Peumus boldos Mol.
Revisão da Literatura
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26
(boldo) no alívio dos sintomas dispépticos pode ser explicada pela presença do
alcalóide boldina (7), cuja ação relaxante da musculatura lisa foi identificada in vitro
(THOMPSON; ERNST, 2002).
1 2 3
4 5
6 7
Formulações contendo individualmente caules de quassia (Quassia amara),
folhas de trevo aquático (Menyanthes trifoliata), estróbilos de lúpulo (Humulus
lupulus), partes aéreas de cardo-santo (Carduus benedictus), casca de condurango
(Marsdenia condurango), casca de laranjeira amarga (Citrus aurantium), partes
aéreas de centáurea menor (Erythraea centaurium), raízes de Taraxacum officinale
Weber (Asteraceae), óleo essencial de Marrubium vulgare L. (Lamiaceae), raízes de
Zingiber officinale, sumidades floridas de Angelica archangelica, cascas de Cinchona
pubecens e frutos de Emblica officinalis também são comumente recomendados
para o tratamento de distúrbios digestivos (THOMPSON; ERNST, 2002).
O fitoterápico Iberogast
, produzido pelo laboratório Steigerwald
Arzneimittelwerk GmbH, em Darmstadt, Alemanha, é constituído pela associação de
extratos de nove espécies (Mentha piperita, Carum carvi, Iberis amara, Glycyrhiza
glabra, Melissa officinalis, Angelica archangelica, Chelidonium majus, Silybum
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CH
3
Revisão da Literatura
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27
marianus, Matricaria recutita). O produto foi avaliado em estudos clínicos que
comprovaram um efeito significativo no alívio e diminuição dos sintomas da má
digestão, sem relato de efeitos adversos sérios ou alterações relevantes nos exames
clínicos laboratoriais dos pacientes, bem como ausência de toxicidade aguda e
crônica (MELZER, 2004; PILICHIEWICZ et al., 2007). O efeito superior do
fitoterápico em relação à cisaprida, droga procinética empregada no alívio dos
sintomas dispépticos, também foi constatado (RÖSCH et al., 2006), sugerindo ser
vantajosa a combinação de extratos com vários componentes ativos para o
tratamento de uma patologia multifatorial como a dispepsia.
O fitoterápico Iberogast
apresentou boa absorção em modelos in vivo (sacos
intestinais evertidos) e in vitro (células Caco-2). Segundo os autores, a rápida
absorção do medicamento poderia explicar seus efeitos farmacológicos e eficácia
clínica (KELBER et al., 2006).
Schemann et al. (2006) sugeriram que o mecanismo de ação do fitoterápico
Iberogast no alívio dos sintomas da má digestão se dê através da alteração na
motilidade gástrica, promovendo relaxamento do fundo e corpo do estômago, e
contração do antro. A diminuição da sensitividade aferente vagal e espinal no
intestino delgado também foi observada por Liu et al. (2004). Schemann et al. (2006)
também avaliaram a ação da cada extrato isoladamente concluindo que a alteração
na motilidade do estômago é resultante da combinação de ações isoladas de cada
extrato. Alguns são responsáveis pela ação no fundo e corpo, enquanto outros
atuam no antro. O efeito espasmolítico e carminativo de alguns extratos como
Mentha piperita e Carum carvi também são importantes para a ação do fitoterápico
(TALLEY; VAKIL, 2005).
Michael et al. (2009) sugeriram que processos inflamatórios também podem
desencadear eventos dispépticos, através de alterações sensoriais e motoras no
trato gastrointestinal. Os autores demonstraram que o fitoterápico Iberogast
®
é
capaz de reduzir a inflamação in vitro, avaliada em modelo de segmentos de jejuno
e íleo. De acordo com Germann et al. (2006), a ação antioxidante dos constituintes
da formulação também é responsável pelo efeito antiinflamatório. Muller et al. (2006)
observaram a redução de sensitividade intestinal aferente in vivo, frente a estímulos
Revisão da Literatura
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28
mecânicos e químicos, após o tratamento com Iberogast
®
, o que explicaria a ação
do fitoterápico no alívio de sintomas dispépticos.
Estudo clínico com o fitoterápico chinês Shenxiahewining, composto da
associação de Ginseng radix, Pinelliae tuber, Coptidis rhizoma, Zingiberis rhizoma
exsiccatum e Glycyrrhizae radix na proporção de 3:9:3:3:3, demonstrou a diminuição
dos sintomas dispépticos em 92% dos pacientes, em comparação com 20% no
grupo tratado com o fármaco procinético cisaprida (CHEN, 2002).
Em outro estudo clínico com 96 pacientes, a associação dos óleos essênciais
das espécies Mentha piperita (270 mg/dia) e Carum carvi (150 mg/dia) ou placebo
foi administrada durante 4 semanas a pacientes com diagnóstico de dispepsia
funcional. No grupo tratado com a associação das espécies, 94,7% dos pacientes
apresentou melhora dos sintomas, comparado a 55% no grupo placebo (MAY et al.,
1996).
Os sistemas tradicionais de medicina Ayurveda e Unani da Índia incluem o
uso de várias espécies vegetais para o tratamento e alívio de sintomas dispépticos.
A avaliação clínica de uma preparação contendo extratos dos frutos de Aegle
marmelos e Bacopa monniere, utilizada nesses sistemas tradicionais, comprovou a
eficácia in vivo na diminuição dos sintomas dispépticos, quando comparada ao
grupo tratado com placebo (GHOSH; PLAYFORD, 2003).
Alguns fitoterápicos estão disponíveis no mercado brasileiro para o tratamento
de distúrbios digestivos. Este é o caso do produto Ierobina (Laboratório Belfar, Belo
Horizonte), constituído pelos extratos fluidos das espécies nativas Jacaranda
caroba, Remijia ferruginea e Solanum paniculatum, além da espécie exótica
Erythraea centaurium. O fitoterápico produziu um aumento significativo na
concentração plasmática de triglicérides in vivo e provocou a ativação da lipase
lipoprotéica, enzima localizada no endotélio dos capilares de vários tecidos,
responsável pela hidrólise de triglicérides. Também foi demonstrada a atividade
espasmolítica in vitro do produto sobre preparações isoladas de íleo. Em conjunto,
estes resultados subsidiam a eficácia do fitoterápico no alívio dos sintomas
causados por distúrbios digestivos (BOTION et al., 2005). O produto também foi
avaliado em estudos de toxicidade aguda e crônica, que indicaram ausência de
efeitos tóxicos (TAGLIATI et al., 2008).
Revisão da Literatura
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29
As espécies nativas empregadas na composição do fitoterápico (Jacaranda
caroba, Remijia ferruginea e Solanum paniculatum) são utilizadas popularmente
como tônico e amargo, entre outros usos. Segundo Saller e Reichiling (2001),
drogas vegetais com constituintes amargos apresentam importância secular na
terapia de distúrbios digestivos. O mecanismo de ação não está completamente
entendido, mas há indicações de que substâncias amargas possam, em pequenas
concentrações, estimular as secreções gástricas e a força de contração da
musculatura lisa do trato gastrointestinal, via sistema gustatório, nervo vago e
sistema nervoso entérico. É difícil estabelecer um modelo para avaliar o mecanismo
de ação de extratos vegetais no alívio dos sintomas dispépticos, principalmente
porque a fisiopatologia dos distúrbios não é bem definida (THOMPSON; ERNEST,
2002).
Nos últimos anos, estudos clínicos foram realizados com preparações
fitoterápicas contendo drogas vegetais contendo compostos amargos, tais como os
presentes em Iberis amara, Mentha piperita, Zingiber officinalis e Carum carvi. A
associação das drogas mostrou ser mais eficaz que o grupo tratado com placebo e,
tão efetiva quanto o grupo controle, que recebeu medicação gastrocinética
(SALLER; REICHILING, 2001). Diversos outros resultados indicam que associações
de extratos são mais eficazes que o uso de espécies isoladas (THOMPSON;
ERNEST, 2002). O fato de pequenas doses de alguns extratos serem hábeis em
produzir efeitos terapêuticos benéficos são indícios da ocorrência de interações
sinérgicas entre os componentes de extratos vegetais usados em associações
(SCHEMPP et al., 2004).
3.3 Remijia ferruginea: usos populares, composição química e atividades
biológicas
Remijia ferruginea D.C. (Rubiaceae), sinonímia Cinchona ferruginea St.Hill, é
uma espécie arbustiva de aproximadamente 2 metros de altura, denominada
popularmente de quina da serra ou quina mineira (Figura 1, página 31). Ocorre em
regiões de clima quente e úmido, sendo encontrada na Amazônia, e da Bahia até
São Paulo (CORRÊA, 1974). As cascas da espécie são utilizadas tradicionalmente
Revisão da Literatura
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30
como tônico, amargo, vermífugo e no tratamento de febres e malária (ANDRADE-
NETO, 2003; HIRSCHMANN, 1990).
Caules de outras espécies de Remijia são fontes reconhecidas de alcalóides,
como R. pedunculata, considerada pela Farmacopéia dos Estados Unidos (USP)
fonte de quinidina (8). A espécie também contém cupreína (9). Nos caules de
Remijia purdiena não se encontra a quinidina, mas os alcalóides cinchonina (10) e
cinchonamina (11) (EVANS, 1989). A espécie Remijia peruviana é fonte dos
alcalóides quinina (12) e também de cupreína e cinchonina, já descritos em R.
purdiena (DIAZ et al., 2004; RUIZ-MESIA et al., 2005). A presença de saponinas
triterpênicas também é freqüentemente relatada na família Rubiaceae (ITOH et al.,
2003; SHI; MIN, 2003).
8 9 10
11 12
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Revisão da Literatura
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31
Figura 1 -
Remijia ferruginea. Fonte: http://www.flora brasiliensis.cria.org.br
Botsaris (2007), em seu estudo etnofarmacológico sobre espécies utilizadas
tradicionalmente no tratamento de malária no Brasil, relatou o uso R. ferruginea
como sucedâneo da “quina verdadeira” (Cinchona calisaya)
no tratamento da
malária. A atividade antimalárica do extrato etanólico das cascas de R. ferruginea foi
avaliada in vivo. Doses de 500 e 1000 mg/kg reduziram a parasitemia em 34 e 48%,
respectivamente (ANDRADE NETO et al., 2003).
As fontes tradicionais de alcalóides quinolínicos, como a quinidina (8) e a
quinina (12), são as cascas de outras espécies de Rubiaceae. Preparações
galênicas de cascas de Remijia são, há muito, utilizadas como tônico, amargo,
estimulante digestivo e do apetite, febrífugo, em casos de anemia, distúrbios
gastrointestinais, fadiga e malária (ANDRADE-NETO et al., 2003; EVANS, 1989).
Merschjohann et al. (2001) avaliaram a atividade antimalárica in vitro dos
alcalóides quinina (12), cupreína (9) e cinchonamina (11), isolados de R. peruviana.
Estes compostos possuem ainda atividade tripanossomicida frente às formas
Revisão da Literatura
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sanguíneas de T. brucei e T. congolensis, enquanto somente a quinina foi ativa
frente ao T. cruzi.
No levantamento bibliográfico realizado não foram encontradas referências
sobre estudos fitoquímicos de R. ferruginea.
3.4 Solanum paniculatum: usos populares, composição química e
atividades biológicas
Solanum paniculatum L. (sinonímias Solanum belfort Vand, Solanum
belfortianum Dun e Solanum Manoelii Moric) é uma planta da família Solanaceae,
conhecida popularmente como jurubeba verdadeira, jurupeba, juripiba, jurubebinha,
jupeba, juvena e juuína (CORRÊA, 1974; MATOS FILHO, 1997; RODRIGUES;
CARVALHO, 2001; SANTOS, 1996). O nome vulgar jurubeba não corresponde a
uma única espécie, mas a diversas espécies de Solanum, utilizadas como
medicinais: S. paniculatum L., S. variabile Mart., S. insidiosum Mart., S. juripeba
Rich. e S. fastigatum Wild. (FURLAN, 1999). A Farmacopéia Brasileira 2ª edição
considera, entretanto, Solanum paniculatum L. como droga oficial, indicando o uso
do caule e da raiz como tônico, amargo e hepatoprotetor. A droga vegetal é
constituída por caule, folhas, frutos e flores (SIQUEIRA, 1981).
A espécie possui porte arbustivo, com até 3 metros de altura, apresentando
acúleos no caule e nas folhas, de onde provavelmente veio o nome jurubeba, cuja
etiologia da palavra seria yu = espinho e peba = chato (Figura 2) (SIQUEIRA, 1981).
É encontrada na zona tropical do continente americano, ocorrendo das Guianas até
Minas Gerais e São Paulo, principalmente em lavouras, pastagens, beiras de
estradas, rios e terrenos baldios (COSTA, 1975).
Revisão da Literatura
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33
Figura 2 -
Solanum paniculatum. Fonte: http://www.geocites.com
S. paniculatum possui vários usos populares, sendo empregada como
estimulante do aparelho digestivo, ação atribuída aos seus princípios amargos
(SIQUEIRA, 1981). Oliveira (1947), em ensaio com pacientes submetidos à
intubação duodenal, demonstrou que a tintura e o extrato fluido de raízes de S.
paniculatum possuem propriedades colagogas e coleréticas. Popularmente, a
espécie é usada como chá, tintura ou vinho, para o tratamento de afecções do
fígado, icterícia e hepatite crônica. É recomendada, também, como febrífugo,
antianêmica, cicatrizante, ememagogo, colerético, protetor hepático, tônico, amargo,
em casos de má digestão, falta de apetite, flatulência e azia (CORREA, 1974). A
infusão das folhas é indicada em casos de bronquite e tosse; o macerado das raízes
para o tratamento de artrite, e o dos frutos para anemia (CORREA, 1974; MATOS
FILHO, 1997; RODRIGUES, 2001).
Estudos fitoquímicos das raízes de S. paniculatum revelaram a presença da
sapogenina nitrogenada esteroidal paniculidina (13), da saponina jurubina (14)
(SCHREIBER; RIPPERGER, 1966), e dos alcalóides solamargina (15), solanina (16)
e solanidina (17) (RIPPERGER et al., 1967). Das folhas da espécie foram isolados
dois glicosídeos espirostânicos denominados paniculonina A (18) e B (19)
(RIPPERGER; SCHREIBER, 1968), e as geninas neoclorogenina (20) e
Revisão da Literatura
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paniculogenina (21) (RIPPERGER et al., 1967). O alcalóide solanina (16),
característico do gênero Solanum, foi encontrado nas folhas e flores
(BLANKEMEYER, 1998).
13 14
15 16
17
18 19
20 21
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HO
H
O
H
Revisão da Literatura
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35
No que se refere às atividades biológicas de constituintes de Solanum,
Michalska et al. (1985) relataram a ação inibitória do transporte de cálcio para o
alcalóide α-solanina (16), em experimentos in vitro e in vivo, no duodeno de ratos.
Outra atividade biológica relatada para diversos alcalóides de Solanum é sua ação
anticolinesterásica. Faucher e Monnet citados por Santos (1996) demonstraram a
importância do esqueleto esteroidal para esta atividade. Por sua vez, Patil et al.
(1972) demonstraram a ação tóxica da α-solanina. A α-solanina (16) e outros
alcalóides inibiram a biossíntese de colesterol em estudos in vitro e in vivo (DIXIT et
al., 1992). Os efeitos tóxicos produzidos por 16 e outros alcalóides esteroidais
podem ser explicados pela atividade anticolinesterásica e, também, por alterações
na permeabilidade de membranas biológicas (KEUKENS et al., 1992; RODDICK,
1990).
Alguns trabalhos demonstraram a potencial atividade antitumoral dos
glicoalcalóides solamargina (15) e solasonina (22), isolados de S. sodomaeum, S.
nigrum, S. incanum e S. crinitum. Solamargina apresentou atividade frente a
linhagens tumorais humanas de hepatoma (Hep3B) e solasonina (22) em células de
leucemia humana (K562); α-chaconina (23) e α-solanina (16) apresentaram maior
efeito inibitório de células de hepatoma humano (HepG2) do que doxorubicina e
camptotecina, fármacos empregados no tratamento deste tipo de câncer. α-Solanina
(16) também foi capaz de inibir células tumorais humanas de linfoma (U937) e
estômago (AGS e KATO III) (DAUNTER et al., 1990; ESTEVES-SOUZA et al., 2002;
FRIEDMAN et al., 2005; HU et al., 1999; KUO et al., 2000; LEE et al., 2004).
Dois novos glicosídeos espirostânicos denominados torvosídeo M (24) e N
(25), isolados de S. torvum
,
mostraram significativa atividade citotóxica frente a
linhagens tumorais gástrica (MGC-803), de fígado (HepG2), pulmão (A549) e mama
(MCF-7) (LU et al., 2009).
Algumas saponinas isoladas de Solanum apresentam potencial atividade
antifúngica. Zamilpa et al. (2002) relataram a atividade da saponina 26, isolada de S.
chrysotrichum, frente a Trichophyton mentagrophytes (CIM = 12,5 µg/mL),
Trichophyton rubrum (CIM = 12,5 µg/mL), Aspergillus niger (CIM = 100 µg/mL) e
Candida albicans (CIM = 200 µg/mL). Gonzales et al. (2004) isolaram várias
saponinas esteroidais de S. hispidum, todas com atividade antifúngica, dentre elas a
Revisão da Literatura
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36
substância 27, que foi a mais ativa (CIM = 25 µg/mL para T. mentagrophytes e T.
rubrum).
22 23
24 - ∆
5
; R
1
= β-D-glu(1→6)-O-β-D-glu; R
2
= H
25 - 5α-H; R
1
= β-D-glu(1→6)-O-β-D-glu; R
2
= OH
26 - R
1
= H; R
2
= Xil(1→3)Quinovopiranose; R
3
= CH
3
; R
4
= H
27 - R
1
= H; R
2
= Xil(1→3)Quinovopiranose; R
3
= H; R
4
= CH
3
Várias atividades biológicas já foram descritas para extratos de S.
paniculatum. O extrato alcoólico de folhas da espécie promoveu depressão
respiratória e redução da pressão arterial em gatos; já o extrato aquoso também
produziu queda da pressão arterial, porém com estimulação respiratória. Ambos os
extratos exerceram ação estimulante sobre preparações isoladas de coração de
sapos e foram tóxicos para camundongos (BARROS et al., 1967 e 1970). Mesia-
Vela et al. (2002) relataram atividade inibitória in vivo da secreção gástrica para o
extrato aquoso de raízes, galhos e flores de S. paniculatum. Segundo os autores,
este efeito fornece subsídios para comprovar o uso popular da planta no tratamento
O
H
N
O
O
O
HO
HO
HO
HO
O
O
O
HO
HO
OH
O
H
OH
H
H
H
H
H
N
O
O
O
O
HO
HO
HO
O
O
OH
HO
HO
OH
H
H
H
H
H
H
O
O
R
1
O
H
H
H
R
2
H
H
H
H
O
R
1
O
H
H
H
H
H
O
R
3
R
4
H
OR
2
Revisão da Literatura
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37
de distúrbios digestivos, sugerindo potencial atividade antiúlcera. Extratos aquosos
de caules e raízes da espécie inibiram a secreção ácida gástrica de roedores em
estudos in vivo (SANTOS, 1996). A potencial atividade antiulcerogênica do extrato
etanólico de partes aéreas de Solanum variabile Mart. foi demonstrada em estudos
in vivo, para úlceras duodenais agudas e crônicas (ANTÔNIO et al., 2004).
Em decorrência da grande utilização de S. paniculatum pela população com
finalidades medicinais, as atividades mutagênica, antimutagênica e citotóxica foram
avaliadas in vivo empregando-se extratos etanólicos de folhas e frutos. O extrato de
folhas não apresentou ação mutagênica, no entanto, em doses elevadas (300
mg/kg), exibiu atividade citotóxica. Já o extrato de frutos apresentou atividade
mutagênica na dose de 200 mg/kg e ação citotóxica na dose de 300 mg/kg (VIEIRA,
2007). O potencial citotóxico também foi avaliado in vitro, empregando células
somáticas de Drosophila melanogaster, sendo a espécie classificada como de baixa
citotoxicidade (taxa de sobrevivência de 84% para S. paniculatum e 87% para
controle negativo) (RIBEIRO et al., 2008).
Ribeiro et al. (2007) relataram a atividade anitioxidante in vitro para os
extratos etanólico e aquoso de folhas de S. paniculatum.
Burger et al. (2008) descreveram a atividade coagulante in vitro para as
frações em acetato de etila e metanólica dos frutos de S. paniculatum, empregando
a peçonha da serpente Bothrops pauloensis. Segundo os autores, a atividade
apresentada pelas frações está relacionada à presença dos alcalóides
característicos da família Solanaceae.
3.5 Jacaranda caroba: usos populares, composição química e atividades
biológicas
A espécie Jacaranda caroba D.C. (Bignoniaceae) é ocorrente no cerrado,
denominada vulgarmente de caroba ou carobinha (Figura 3). Atinge 2,5 a 10 metros
de altura, possui casca cinzenta e fina, flores arroxeadas e frutos elípticos (CESAR
et al., 2004). O gênero possui 49 espécies nativas nas Américas do Sul, Central e
Caribe, das quais 39 são endêmicas do Brasil (GACHET; SCHÜHLY, 2009). J.
caroba é encontrada em São Paulo, Minas Gerais, Goiás e Mato Grosso (GACHET;
SCHÜHLY, 2009).
Revisão da Literatura
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38
Suas cascas são utilizadas popularmente como amargo, adstringente,
depurativo, diurético e anti-sifilítico; já suas folhas são empregadas como tônico,
anti-sifilítico e em banhos para o tratamento de infecções (CORRÊA, 1974;
SIQUEIRA, 1981). O uso do macerado das folhas em cachaça é empregado como
cicatrizante e internamente para o tratamento de úlceras (DI STASI; HIRUMA-LIMA,
2002).
Figura 3 -
Jacaranda caroba. Fonte: http://www.panoramio.com
Bacchi et al. (1999; 1986) relataram a atividade antiulcerogênica in vivo para
as folhas de J. caroba. O extrato hidroalcoólico e a fração diclorometânica oriunda
deste, se mostraram ativos na redução de úlceras induzidas por etanol e ácido
clorídrico (70% e 100% de redução, respectivamente).
Uma formulação fitoterápica contendo J. caroba, Casearia sylvetris Swartz. e
Peschiera fuchsiaefolia Miers., comercializada no mercado nacional, e com uso
indicado como “regulador da absorção de alimentos” e hipolipemiante, entre outros,
teve sua toxicidade pré-clínica avaliada em ratos e coelhos. Os resultados indicaram
ausência de efeitos tóxicos. Porém, foi observado um aumento no nível de colesterol
sérico nos animais tratados com o produto, e os autores recomendaram estudos
Revisão da Literatura
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39
farmacológicos adicionais para confirmar os resultados obtidos (GOMES et al., 2003;
MANENTI et al., 2003).
No levantamento bibliográfico realizado não foram encontrados relatos de
estudos fitoquímicos para a espécie J. caroba. Outras espécies de Jacaranda, no
entanto, foram objeto de estudos fitoquímicos e/ou de atividades biológicas, os quais
fornecem indícios sobre a química e as atividades do gênero, descritos a seguir.
O extrato diclorometânico de galhos de J. filicifolia apresentou inibição in vitro
da 5-lipoxigenase e seu fracionamento biomonitorado levou ao isolamento de três
substâncias ativas: ácido 2α,3α-diidroxi-urs-12-en-28-óico (28), β-sitosterol (29) e 2-
(4-hidroxifenil)etil-1-trioctanoato (30), um composto inédito (ALI; HOUGHTON, 1999).
Estudos fitoquímicos de J. caucana levaram ao isolamento dos ácidos
ursólico (31), 2α-hidroxiursólico (32), betulínico (33), jacarândico (34) e jacumárico
(35), sendo os dois últimos inéditos (LORENÇO et al., 2002; OGURA et al., 1976;
OGURA et al., 1977; VARANDA et al., 1992). De J. caucana também foram isolados
o derivado quinoídico jacaranona (36) (OGURA et al.,1976) e de J. decurrens,
flavonóides como luteolina (37) e quercetina-3-O-glicosídeo (38) (BLATT et al.,
1998).
O fracionamento do extrato metanólico dos caules de J. mimosefolia levou à
obtenção de dois glicosídeos fenil etanóides (39 e 40) e do ácido procatecúnico (41),
inédito na espécie (MARTIN et al., 2009).
A atividade antitumoral de jacaranona (36), isolada de J. copaia e J. caucana
foi demonstrada frente à células P-388 de leucemia. O composto também mostrou
atividade antimicrobiana e propriedades inseticidas; porém, estudos de toxicidade in
vivo demonstraram moderada neurotoxicidade com DL
50
= 150-200 mg/kg
(GACHET; SCHÜHLY 2009; TAYLOR et al., 2006; XU et al., 2003).
Revisão da Literatura
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
40
28 29 30
31 32 33
34 35
36 37 38
HO
COOH
HO
HO
COOH
H
O
O (CH
2
)
28
CH
3
O
O
H
HO
HO
COOH
HO
COOH
HO
HO
COOH
HO
HO
COOH
O
HO
O
O
HO
CH
2
CO
2
CH
3
O
O
O
H
HO
OH
OH
O
OOH
HO
OH
OH
O
O
OH
OH
O
H
OH
Revisão da Literatura
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
41
39
40
41
42
Com relação às atividades biológicas de espécies de Jacaranda, a atividade
antitumoral do extrato hidroalcóolico de J. caucana foi relatada em modelos in vivo e
in vitro (OGURA et al, 1977). O extrato etanólico de J. micrantha apresentou
atividade antioxidante em ensaios in vitro (MENEZES et al., 2002).
O extrato metanólico das folhas de J. puberula mostrou atividade frente a
formas promastigotas de Leishmania amazonensis, com CI
50
= 88,0 µg/mL. O
fracionamento biomonitorado do extrato metanólico da espécie levou à obtenção de
uma fração ativa frente às formas amastigotas, com CI
50
= 14,0 µg/mL (PASSERO et
al., 2007).
O efeito hipotensor do extrato hidrometanólico de folhas de J. mimosifolia foi
demonstrado in vivo. Observou-se uma redução dose dependente da pressão
HO
OH
O
O
O
OH
HO
O
O
OH
HO
O OH
OH
O
OH
O
H
O
H
HO
OH
O
O
O
OH
HO
O
O
OH
O
O OH
OH
O
OH
O
H
O
H
COOH
HO
OH
O
H
H
O
O
C
Revisão da Literatura
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
42
arterial e da freqüência cardíaca (doses de 100 a 400 mg/kg). Estudos in vitro
sugeriram que a ação hipotensora esteja relacionada ao bloqueio de receptores α-
adrenérgicos (NICASIO; MECKES, 2005).
Rojas et al. (2006) relataram a atividade antimicrobiana in vitro para o extrato
de folhas de J. mimosifolia frente à Bacillus cereus (CIM = 2,9 µg/mL), Escherichia
coli (CIM = 2,3 µg/mL) e Staphylococcus aureus (CIM = 2,8 µg/mL).
Dentre os compostos isolados do gênero, jacaranona (36) é o que tem
despertado maior interesse científico, devido seu potencial anticancerígeno. Porém,
outros compostos também merecem atenção, como o ácido oleanólico (42) que
apresentou atividade cicatrizante in vivo e moderada atividade antileishmania in vitro
(MOURA-LETTS et al., 2006; TORRES-SANTOS et al., 2004).
Segundo Gachet e Schühly (2009) existem relatos de estudos de atividade
biológica para 12 das 49 espécies do gênero Jacaranda, mas apenas para 6 destas
espécies (J. caucana, J. acutifolia, J. copaia, J. decurrens, J. filicifolia, J. mimosifolia)
foram realizados estudos fitoquímicos.
Não foram encontrados relatos de ensaios biológicos dessas substâncias
sobre o metabolismo de lipídeos.
Materiais e Métodos
43
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Equipamentos
• Balança analítica Micronal, modeloAB 204.
• Balança eletrônica Micronal, modelo B 160.
• Balança eletrônica Helmac, modelo HM 10.
• Banho-maria Fanem, modelo 120/4.
• Banho de ultra-som Thornton, modelo T14.
• Chapas para aquecimento Fisatom, modelo 752 A e Corning, modelo V-092.
• Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência Waters, modelo 2695,
constituído de injetor automático AS-2000A, detector Photodiode Array 2996,
bomba L-6200A, integrador modelo C-R4A e coluna Lichrosper 100RP-18 (5µm,
250x4mm d.i.).
• Evaporador rotatório Buchi, modelo B-480.
• Moinho de facas Marconi, modelo 6294.
• Estufa ventilada Fanem, modelo 315/9.
• Ultra-som Thornton, modelo T14.
• Micro centrífuga Cientec, modelo 14000D.
• Micropipetas Oxford, volume ajustável de 200µL – 1000mL.
• Micropipetas Transferpette-Brand, volume ajustável de 1-20 µL, 5-50 µL e 20-200
µL.
• Soprador serigráfico Sternel, modelo HL 500.
• Centrífuga Fanem, modelo 205-N.
• Fonte de luz UV Spectroline, modelo 977 C.
• Sistema de purificação de água Millipore, Milli-Q plus.
• Espectrofotômetro de ultravioleta-visível Shimadzu, modelo UV-160A (Laboratório
de Controle de Qualidade, FAFAR).
Materiais e Métodos
44
• Espectrofotômetro de infravermelho Perkin-Elmer, modelo Spectrum One
(Laboratório de Química Farmacêutica, FAFAR), acoplado a acessório de
refletância difusa.
• Espectrômetros de ressonância magnética nuclear Brucker Avance DPX200 e
DRX400 (LAREMAR, Departamento de Química, ICEX, UFMG), Brucker WP
200SY e Brucker Advance DRX400 (Laboratório de Ressonância Magnética
Nuclear da Universidade de Salamanca, USAL).
• Espectrômetro de massas Applied Biosystems, modelo QSTAR XL (Laboratório de
Espectrometria de Massa da Universidade de Salamanca, USAL).
• Polarímetro Perkin-Elmer, modelo 241 (Laboratório de Química Farmacêutica da
Universidade de Salamanca).
4.2 Reagentes e Materiais
• Etanol grau comercial.
• Acetonitrila e metanol grau HPLC, Merck.
• Solventes grau P.A: n-hexano, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila,
acetona, n-butanol, metanol, tetrahidrofurano (THF) (marcas Merck, Quimex e
Grupo Química).
• Dimetilformamida, piridina, anidrido acético, benzeno (marcas Sigma e Merck).
• Reagentes: carbonato de potássio, iodeto de metila, clorito de sódio, ter-butil
hidroperóxido, trifluoreto de boro em éter etílico, nitrato de prata, iodeto de
hidrogênio, ácido meta-cloroperbenzóico (MCPBA), hidreto de lítio e alumínio,
cloreto de hidroxilamina, dióxido de selênio, tricloreto de cério hepta hidratado, ,
5,10,15,20-tetrakis(pentaflorofenil) porfirina [Fe(PFPP)Cl porfirina], hidreto de
sódio, cloreto de guanidina, tricloreto de índio, água oxigenada, hidróxido de
sódio, ácido deoxicólico, trioleína, albumina, cloreto de sódio, cloreto de potássio,
fosfato de potássio diidratado, fosfato di-sódico mono-hidratado, sulfato de
magnésio diidratado, glicose, triton (marcas Fluka, Sigma, Synth e Merck).
Materiais e Métodos
45
• Soluções reveladoras para cromatografia em camada delgada: preparadas
segundo Morita & Assumpção (1981) e Wagner et al. (1984).
• Solução aquosa ácida de sulfato cérico;
• Solução metanólica a 5% de cloreto de alumínio;
• Solução de vanilina e ácido sulfúrico;
• Solução ácida de anisaldeído;
• Solução metanólica a 50% de ácido sulfúrico;
• Reagente de Liebermann-Burchard;
• Reativo de Draggendorff.
• Ácidos grau P.A: ácido fosfórico, ácido acético glacial, ácido fórmico e ácido
sulfúrico, Merck.
• Sílica gel Merck, 70-230 mesh.
• Sílica gel 60G Merck.
• Cromatofolhas de sílica gel 60, 20 x 20cm, Merck.
• Coluna para HPLC ODS Lichropher (250 × 4,0 mm i.d., partículas de 5µm), Merck.
• Solução metanólica de hidróxido de sódio 2M.
• Solução aquosa de ácido clorídrico a 50%.
• Ácido bórico, P.A, Reagen.
• Acetato de sódio tri-hidratado, Merck.
• Frascos plásticos do tipo safe lock Netheler e Hinz, 3810.
• Frascos de vidro com tampa e septos de teflon para HPLC, Merck.
• Cubas de vidro Pirex.
• Vórtex Marconi, modelo MA162.
• Kit para dosagem de triglicérides, Analisa Diagnóstica.
Materiais e Métodos
46
4.3 Coleta e identificação do material vegetal
Jacaranda caroba D.C.
As partes aéreas de J. caroba foram coletadas em Belo Horizonte, em
setembro de 2005. A identificação do material foi realizada pelo botânico Marco
Antônio Sobral, ICB, UFMG. Uma exsicata da espécie foi depositada no herbário do
ICB/UFMG, sob número 51460.
Remijia ferruginea D.C.
Galhos e cascas de R. ferruginea foram coletados no Parque Estadual do Rio
Preto, São Gonçalo do Rio Preto, Minas Gerais, em abril de 2004. A coleta e
identificação do material foram realizadas pelo Prof. Júlio Antônio Lombardi, na
ocasião locado no ICB, UFMG. Uma exsicata da espécie foi depositada no herbário
do ICB/UFMG, sob número 3833.
Solanum paniculatum L.
As folhas de S. paniculatum foram coletadas em Divinópolis, Minas Gerais,
em agosto de 2005. A identificação da espécie foi realizada pelo Prof. José Renato
Stehmann, ICB, UFMG. Uma exsicata da espécie foi depositada no herbário do
ICB/UFMG, sob número 69902.
4.4 Preparo dos extratos
Os materiais vegetais foram lavados em água corrente e secos,
separadamente, em estufa ventilada, à aproximadamente 40 ºC. Após a secagem e
moagem, em moinho de facas, foram obtidos 6800 g, 616 g e 1510,62 g de pó de J.
caroba, R. ferruginea e S. paniculatum, respectivamente. O material vegetal
pulverizado foi, então, submetido à extração por percolação exaustiva com etanol a
96ºGL. Os extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotatório a
temperatura máxima de 70°C, sob pressão reduzida, fornecendo 1585,10 g, 131,77
g e 254,63 g de resíduos de J. caroba, R. ferruginea e S. paniculatum,
respectivamente.
Materiais e Métodos
47
4.5 Análises por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
(RP-HPLC)
4.5.1 Preparo das amostras
As amostras foram pesadas diretamente em frascos eppendorf e solubilizadas
em metanol grau HPLC, na concentração de 10 mg/mL para extratos e frações
oriundas dos fracionamentos preliminares e 1 mg/mL para substâncias isoladas. As
amostras foram solubilizadas com auxílio de sonicação, durante 15 min, seguida de
centrifugação a 10.000 giros por 10 min. Empregaram-se os sobrenadantes para
análise por HPLC. Para tanto, foram injetadas alíquotas de 20 µL dos
sobrenadantes, de modo automático, em sistema de HPLC. Obtiveram-se perfis por
RP-HPLC para todas as frações resultantes dos fracionamentos dos extratos brutos
e algumas frações resultantes dos demais fracionamentos em colunas de sílica gel.
4.5.2 Condições Cromatográficas
Para a obtenção dos perfis cromatográficos empregou-se coluna LiChrospher
100 RP-18 (5 µm, 250 × 4 mm d.i.), detecção no UV
220nm
, fluxo de 1 mL/min e
temperatura de 40 ºC. Empregou-se eluição em gradiente de acetonitrila e água,
conforme apresentado na Tabela 1. Foram empregados solventes grau HPLC e
água destilada, filtrada em sistema Milli-Q.
Tabela 1 -
Gradiente de eluição empregado para obtenção de perfis cromatográficos por RP-
HPLC.
Tempo (min) Água (%) Acetonitrila (%)
0 95 5
60 10 90
65 95 5
70 95 5
4.6 Estudo fitoquímico
Os fracionamentos foram monitorados por CCD de sílica gel, observando-se
os cromatogramas sob luz visível e ultravioleta, antes e após a revelação com
solução de anisaldeído, Liebermann-Burchard e Dragendorf.
Materiais e Métodos
48
Foram obtidos perfis por RP-HPLC e por CCD de sílica gel para todas as
frações resultantes do fracionamento preliminar dos três extratos. A seleção das
frações para refracionamento foi realizada a partir dos perfis cromatográficos obtidos
(menor complexidade e/ou predomínio de constituintes), bem como da massa da
fração disponível, visando viabilizar o isolamento dos constituintes.
4.6.1 Jacaranda caroba
4.6.1.1 Fracionamento preliminar do extrato bruto
O extrato de partes aéreas de Jacaranda caroba foi submetido a
fracionamento preliminar em sílica gel. Para tanto, foram utilizados 925 g de extrato
etanólico seco para 1000 g de sílica gel.
Utilizou-se como série eluotrópica, n-hexano, DCM, DCM:EtOAc (1:1), EtOAc
e MeOH. Foram coletadas frações de 1000 mL. As frações recolhidas foram
concentradas em evaporador rotatório a 50 ºC, sob pressão reduzida, até resíduo.
Estes foram transferidos para frascos previamente tarados e mantidos em
dessecador, sob vácuo, para completa eliminação do solvente por, no mínimo, 72
horas. Na Tabela 2, encontram-se listadas as frações cromatográficas obtidas, os
respectivos eluentes e as massas obtidas. O fracionamento do extrato de Jacaranda
caroba está representado no fluxograma da Figura 4 (pág 51).
Tabela 2 -
Fracionamento preliminar do extrato etanólico de Jacaranda caroba por filtração
em sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Massa (g)
F HX n-hexano 10 46,02
F DCM DCM 25 202,85
F DCM/EtOAc DCM:EtOAc 12 211,59
F EtOAc EtOAc 10 85,17
F MeOH MeOH 10 149,54
Total 67 695,17
Materiais e Métodos
49
4.6.1.2 Fracionamento de FHX (coluna 1 - C1)
Uma porção da fração FHX (45,0 g), obtida do fracionamento preliminar do
extrato bruto, eluída com n-hexano, foi submetida à cromatografia em coluna aberta
de sílica gel (mesh: 0,063-0,200 mm, 450 g, 35 × 7,2 cm). Empregou-se a série
eluotrópica descrita na Tabela 3, sendo coletadas frações de 300 mL. O grupo de
frações reunidas 117-138 (4,27 g) foi identificado como Jc1.
Tabela 3 -
Fracionamento de FHX (C1) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L)
Frações
reunidas
Massa (g)
F1-17 HX 5,1 1-2 0,05
F18-32 HX:DCM (95:5) 4,2 3 0,50
F33-51 HX:DCM (85:15) 5,4 4-9 0,15
F52-66 HX:DCM (75:25) 4,2 10-31 0,63
F67-80 HX:DCM (65:35) 3,9 32-36 0,59
F81-113 HX:DCM (50:50) 9,6 37-46 8,95
F114-125 HX:DCM (35:65) 3,3 47-54 1,48
F126-162 HX:DCM (75:25) 10,8 55-69 2,47
F163-178 HX:DCM (85:15) 4,5 70-79 0,66
F179-199 DCM 6,0 80-91 2,53
F200-240 DCM:EtOAc (95:5) 12,0 92-106 5,03
F241-255 DCM:EtOAc (85:15) 4,2 107-116 2,47
F256-266 DCM:EtOAc (25:75) 3,0 117-138 4,27
F267-281 DCM:EtOAc (35:65) 3,9 139-161 0,85
F282-294 DCM:EtOAc (50:50) 3,6 162-171 0,59
F295-304 DCM:EtOAc (65:35) 2,7 172-186 0,47
F305-311 DCM:EtOAc (80:20) 1,8 187-205 1,94
F312-321 EtOAc 2,7 206-209 0,62
F322-343 EtOAc:MeOH (90:10) 6,3 210-266 1,57
F344-354 EtOAc:MeOH (50:50) 3,0 267-336 0,89
F355-364 MeOH 2,7 337-360 0,32
361-364 0,10
Total 102,9 37,13
4.6.1.3 Fracionamento de FDCM:EtOAC (coluna 2 – C2)
Uma porção da fração FDCM:EtOAc (70,0 g), obtida do fracionamento
preliminar do extrato bruto, e eluída com DCM:EtOAc (1:1), foi cromatografada em
coluna de sílica gel (mesh: 0,063-0,200 mm, 600 g, 47 × 6,5 cm). Empregou-se a
série eluotrópica descrita na Tabela 4, sendo coletadas frações de 500 mL. Os
grupos de frações reunidas 81-136 (9,58 g), 137-156 (0,56 g) e 177-264 (27,63 g)
foram identificados como Jc2, Jc3 e Jc4, respectivamente.
Materiais e Métodos
50
Tabela 4 -
Fracionamento de FDCM:EtOAC (C2) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L)
Frações
reunidas
Massa (g)
F1-27 HX 13,5 1-12 0,67
F28-38 HX:DCM (80:20) 5 13-17 0,01
F39-57 HX:DCM (50:50) 9 18-80 0,10
F58-73 HX:DCM (35:65) 7,5 81-136 0,56
F74-102 HX:DCM (20:80) 14 137-156 9,58
F103-123 DCM 10 157-176 13,1
F124-507 DCM:EtOAc (97,5:2,5) 191 177-264 27,63
F508-516 DCM:EtOAc (90:10) 4 265-297 2,44
F517-534 DCM:EtOAc (82,5:17,5) 8,5 298-523 5,93
F535-564 DCM:EtOAc (70:30) 14,5 524-553 0,03
F565-584 DCM:EtOAc (50:50) 9,5 554-577 0,79
F585-605 DCM:EtOAc (25:75) 10 578-624 2,36
F606-614 EtOAc 4 625-686 0,82
F615-631 EtOAc:MeOH (95:5) 8 687-712 0,95
F632-652 EtOAc:MeOH (85:15) 10 713-719 0,476
F653-687 EtOAc:MeOH (70:30) 17 720-721 0,09
F688-701 EtOAc:MeOH (50:50) 6,5
F702-721 MeOH 9,5
Total 351,5 65,55
Materiais e Métodos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
51
Figura 4 -
Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto de partes aéreas de Jacaranda caroba.
EXTRATO BRUTO
Jacaranda caroba (925g)
FHX
(46,02 g)
FDCM
(202,85 g)
FDCM:EtOAc
(211,59 g)
FEtOAc
(85,17 g)
FMeOH
(149,54 g)
C1 – FHX
(45,00 g)
JcC1 117-138
Jc1 (4,27 g)
JcC2 81-136
Jc2 (9,58 g)
JcC3 137-156
Jc3 (0,56 g)
JcC2 177-264
Jc4 (27,63 g)
Fracionamento preliminar
CCS
CCS
CCS
HX:DCM (35:65)
HX:DCM (20:80)
DCM:EtOAc (97,5:2,5)
CCS – DCM: EtOAc (25:75)
HO
HO
COOH
COOH
HO
HO
COOH
COOH
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
52
4.6.2 Remijia ferruginea
4.6.2.1 Fracionamento preliminar do extrato bruto
O extrato de caules e cascas de R. ferruginea foi submetido a fracionamento
preliminar em coluna aberta de sílica gel (mesh: 0,2-0,5 mm, 700 g, 51 × 6,5 cm).
Para tanto, foram utilizados 131,77 g de extrato etanólico seco. Utilizou-se a série
eluotrópica descrita na Tabela 5, sendo coletadas frações de 300 mL.
As frações recolhidas foram concentradas em evaporador rotatório a 50ºC,
sob pressão reduzida, até resíduo. Estes foram transferidos para frascos
previamente tarados e mantidos em dessecador, sob vácuo, para a completa
eliminação do solvente por, no mínimo, 72 horas. Na Tabela 5 encontram-se listadas
as frações cromatográficas, os respectivos eluentes e massas obtidas. O
fracionamento cromatográfico de R. ferruginea está representado no organograma
da Figura 5 (pág. 57).
Tabela 5 -
Fracionamento preliminar do extrato etanólico de Remijia ferruginea em coluna de
sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Massa (g)
F HX
n-hexano
2,1 0,08
F DCM DCM 18,7 2,40
Pptado FDCM DCM 2,0 1,51
F DCM/EtOAc DCM:EtOAc 37,8 6,76
F EtOAc EtOAc 5,7 4,67
F EtOAc:MeOH EtOAc:MeOH 81,0 45,46
F MeOH MeOH 43,5 23,70
F MeOH:HAc MeOH:HAc (95:5) 25,5 4,00
Total 216,3 88,58
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
53
4.6.2.2 Fracionamento de FDCM/EtOAc (coluna 1 - C1)
Uma porção da fração FDCM/EtOAc (6,50 g), obtida do fracionamento
preliminar do extrato bruto, foi submetida à cromatografia em coluna aberta de sílica
gel (mesh: 0,063-0,200 mm, 200 g, 35 × 6,5 cm). Empregou-se a série eluotrópica
descrita na Tabela 6, sendo coletadas frações de 300 mL.
Tabela 6 -
Fracionamento de FDCM/EtOAc (C1), em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Frações reunidas Massa (g)
F1-95 DCM 28,5 1-21 0,12
F96-170 DCM:EtOAC (90:10) 22,2 22-28 0,04
F171-208 DCM:EtOAC (75:25) 11,4 29-97 0,16
F209-234 DCM:EtOAC (60:40) 7,5 98-123 1,08
F235-245 DCM:EtOAC (35:65) 3,0 124-208 0,79
F246-257 DCM:EtOAC (20:80) 3,3 209-324 2,80
F258-264 DCM:EtOAC (10:90) 1,8 325-331 0,96
F265-274 EtOAC 2,7
F275-279 EtOAC:MeOH (98:2) 1,2
F280-283 EtOAC:MeOH (95:5) 0,9
F284-288 EtOAC:MeOH (85:15) 1,2
F289-301 EtOAC:MeOH (75:25) 2,4
F302-306 EtOAC:MeOH (60:40) 0,9
F307-311 EtOAC:MeOH (40:60) 1,2
F312-315 EtOAC:MeOH (20:80) 1,2
F316-324 EtOAC:MeOH (10:90) 0,9
F325-328 MeOH 2,4
F329-331 MeOH:HAc (95:5) 0,9
Total 93,6 5,95
4.6.2.3 Fracionamento de F209-324 (coluna 2 – C2)
O grupo de frações reunidas F209-324 (2,8 g), resultante da coluna C1, foi
submetido à cromatografia em coluna aberta de sílica gel (mesh: 0,063-0,200 mm,
200 g, 36 × 3,5 cm). Empregou-se a série eluotrópica descrita na Tabela 7, sendo
coletadas frações de 200 mL. O grupo de frações reunidas 51-58 foi identificado
como Rf1.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
54
Tabela 7 -
Fracionamento de F 209-324 (C2), em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Frações reunidas Massa (g)
F1-16 DCM 3,2 1-10 0,02
F17-33 DCM:EtOAC (97,5:2,5) 3,2 11-34 0,01
F34-46 DCM:EtOAC (95:5) 2,4 35-36 0,01
F47-130 DCM:EtOAC (92,5:7,5) 16,6 37-48 0,02
F131-135 DCM:EtOAC (90:10) 0,8 49-50 0,08
F136-141 DCM:EtOAC (85:15) 1,0 51-58 0,11
F142-146 DCM:EtOAC (75:25) 0,8 59-70 0,93
F147-150 DCM:EtOAC (65:35) 0,6 71-122 0,41
F151-159 DCM:EtOAC (50:50) 1,6 123-162 0,73
F160-167 DCM:EtOAC (35:65) 1,4 163-176 0,06
F168-175 DCM:EtOAC (20:80) 1,4 177-199 0,01
F176-181 DCM:EtOAC (10:90) 1,0 200-202 0,03
F182-191 EtOAC 1,8 203-213 0,03
F192-195 EtOAC:MeOH (98:2) 0,6 214-222 0,10
F196-201 EtOAC:MeOH (90:10) 1,0
F202-217 EtOAC:MeOH (75:25) 3,0
F218-222 EtOAc:MeOH (50:50) 0,8
Total 41,2 2,55
4.6.2.4 Fracionamento de FDCM (coluna 3 – C3)
Uma porção da fração FDCM (1,28 g), obtida do fracionamento preliminar do
extrato bruto, foi submetida à cromatografia, sob pressão, em coluna de sílica gel
(mesh: 0,040-0,063 mm, 150 g, 56 × 3,0 cm). Empregou-se a série eluotrópica
descrita na Tabela 8, sendo coletadas frações de 15 mL.
Tabela 8 -
Fracionamento de FDCM (C3), por cromatografia em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (mL) Frações reunidas Massa (mg)
F1-3 HX 45 1-5 62,0
F4-46 HX:DCM (50:50) 630 6-46 272,4
F47-62 HX:DCM (35:65) 225 47-53 14,2
F63-76 HX:DCM (25:75) 195 54-62 17,8
F77-84 HX:DCM (15:85) 105 63-71 24,6
F85-94 DCM 135 72-94 24,4
F95-113 DCM:EtOAc (97,5:2,5) 270 95-108 114,2
F114-117 DCM:EtOAc (90:10) 45 109-123 31,6
F118-122 DCM:EtOAc (80:20) 60 124-131 31,7
F123-127 DCM:EtOAc (70:30) 60 132-160 254,6
F128-134 DCM:EtOAc (50:50) 90 161-168 55,7
F135-139 DCM:EtOAc( 30:70) 60
F140-144 DCM:EtOAc (10:90) 60
F145-151 EtOAc 90
F152-156
EtOAc:MeOH
(97,5:2,5)
60
F157-163 EtOAc:MeOH (90:10) 60
F164-168 EtOAc:MeOH (50:50) 60
Total 2250 903,2
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
55
4.6.2.5 Fracionamento de F6-46 (coluna 4 – C4)
O grupo de frações reunidas F6-46 (272,4 mg), resultante da coluna C3 e
eluído com HX:DCM (50:50), foi submetido à cromatografia, sob pressão positiva,
em coluna de sílica gel (mesh: 0,040-0,063 mm, 30 g, 42 × 3,5 cm). Empregou-se a
série eluotrópica descrita na Tabela 9, sendo coletadas frações de 50 mL. O grupo
de frações reunidas 19-23 foi identificado como Rf2.
Tabela 9 -
Fracionamento de F 6-46 (C4), em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (mL) Frações reunidas Massa (mg)
F1-2 HX 100 1-6 19,5
F3-17 HX:EtOAc (97:3) 700 7-18 28,8
F18-35 HX:EtOAc (94:6) 850 19-23 97,2
F36-44 HX:EtOAc (92:8) 400 24-48 43,9
F45-50 HX:EtOAc (90:10) 250 49-58 15,4
F51-67 HX:EtOAc (87:13) 800 59-60 17,4
F68-76 HX:EtOAc (83:17) 400 61 2,3
F77-93 HX:EtOAc (75:25) 800 62-63 2,0
F94-101 HX:EtOAc (60:40) 350 64-92 18,4
F102-115 HX:EtOAc (40:60) 650 93-104 7,8
F116-120 HX:EtOAc (10:90) 200 105-113 5,4
F121-125 EtOAc:MeOH (97,5:2,5) 200 114-127 7,8
F126-127 EtOAc:MeOH (80:20) 100
Total 5800 259,8
4.6.2.6 Fracionamento de F7-18 e precipitado de FDCM (coluna 5 - C5)
O grupo de frações reunidas F7-18 (28,8 mg), obtido da eluição da coluna C4
com HX:EtOAc (97:3), e o precipitado FDCM (1516,6 mg), resultante do
fracionamento preliminar do extrato bruto (Figura 5, página 57), foram reunidos
devido à semelhança de seus perfis cromatográficos. A massa total reunida (1,54 g)
foi submetida à cromatografia sob pressão positiva, em coluna de sílica gel (mesh:
0,040-0,063 mm, 130 g, 32 × 6,0 cm). Empregou-se a série eluotrópica descrita na
Tabela 10, sendo coletadas frações de 50 mL. O grupo de frações 19-25 foi
identificado como Rf3.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
56
Tabela 10 -
Fracionamento de F 7-18 (C5), em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (mL) Frações reunidas Massa (mg)
F1-5 HX 250 1-5 62,0
F6-14 HX:DCM(90:10) 400 6-18 121,7
F15-21 HX:DCM(85:15) 300 19-25 310,8
F22-55 HX:DCM(80:20) 1650 26-37 178,7
F56-62 HX:DCM(75:25) 300 38-52 67,9
F63-68 HX:DCM(65:35) 250 53-68 36,7
F69-130 HX:DCM(50:50) 3050 69-82 113,0
F131-138 HX:DCM(35:65) 350 83-111 177,9
F139-150 HX:DCM(25:75) 550 112-177 289,2
F151-155 HX:DCM(10:90) 200
F156-160 DCM 200
F161-171 DCM:EtOAc (95:5) 500
F172-177 DCM:EtOAc (80:20) 250
Total 8250 1357,9
Materiais e Métodos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
57
Figura 5 -
Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto de caules e cascas de Remijia ferruginea.
EXTRATO EtOH BRUTO
Remijia ferruginea
(caules e cascas) (131,77 g)
FHX
(0,08 g)
FDCM
(2,40 g)
FDCM:EtOAc
(6,76 g)
FEtOAc
(4,67 g)
FEtOAc:MeOH
(45,46 g)
FMeOH
(23,70 g)
FMeOH:Ac.
ACÉTICO
(4,00 g)
C3 – FDCM
(1,28 g)
C4 – F6-46
(0,27 g)
C5 – F7-18 +
Pptado FDCM
(1,54 g)
RfC4 19
-
23
Rf2
(0,09 g)
RfC5 19
-
25
Rf3
(0,31 g)
C1 – FDCM:EtOAc
(6,50 g)
C2 – F209-
234 (2,8 g)
RfC2 51
-
58
Rf1
(0,10 g)
Pptado FDCM
(1,51 g)
F
racionamento preliminar
CCS
CCS – DCM:EtOAc (20:80)
DCM:EtOAc (
92,5
:
7,
5)
CCS
CCS
CCS
HX:DCM (85:15)
HO
COOH
HO
HX:EtOAc (94:6)
HO
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
58
4.6.3 Solanum paniculatum
4.6.3.1 Fracionamento preliminar do extrato bruto
O extrato das folhas de Solanum paniculatum foi submetido a fracionamento
preliminar por filtração em sílica gel. Foram utilizados 231 g de extrato etanólico seco
para 500 g de sílica gel, sendo a operação realizada em percolador. Utilizou-se a
série eluotrópica descrita na Tabela 11, sendo coletadas frações de 1000mL.
As frações recolhidas foram concentradas em evaporador rotatório a 50ºC,
sob pressão reduzida, até resíduo. Estes foram transferidos para frascos
previamente tarados e mantidos em dessecador, sob vácuo, para completa
eliminação do solvente por, no mínimo, 72 horas. Na Tabela 11, encontram-se
listadas as frações cromatográficas, os respectivos eluentes e as massas obtidas. O
fracionamento cromatográfico de S. paniculatum está representado no fluxograma
da Figura 6 (pág. 63).
Tabela 11 -
Fracionamento preliminar do extrato etanólico bruto de folhas de Solanum
paniculatum por filtração em sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Massa (g)
F HX
n-hexano
6 20,15
F DCM DCM 17 21,81
F EtOAc EtOAc 12 26,44
F EtOAc/MeOH EtOAc:MeOH 8 91,74
F MeOH MeOH 10 4,15
Total 53 164,30
4.6.3.2 Fracionamento de FHX (coluna 1 – C1)
Uma porção da fração FHX (18 g), obtida do fracionamento preliminar do
extrato bruto, foi submetida à cromatografia em coluna aberta de sílica gel (mesh:
0,063-0,200 mm, 360 g, 31 × 7,0 cm). Empregou-se a série eluotrópica descrita na
Tabela 12, sendo coletadas frações de 500 mL.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
59
Tabela 12:
Fracionamento de FHX (C1) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Frações reunidas Massa (g)
1-91 HX 45,5 1-17 0,06
92-97 HX:DCM (95:5) 2,5 18-45 0,06
98-150 HX:DCM (90:10) 26 46-61 0,28
151-191 HX:DCM (85:15) 20 62-65 0,09
192-388 HX:DCM (80:20) 98 66-98 0,28
389-422 HX:DCM (65:35) 16,5 99-111 0,88
423-487 HX:DCM (45:55) 32 112-165 2,51
488-520 HX:DCM (30:70) 16 166-187 0,74
521-537 HX:DCM (15:85) 8 188-231 1,00
538-583 DCM 22,5 232-280 2,43
584-591 DCM:EtOAc (95:5) 3,5 281-362 1,35
592-615 DCM:EtOAc( 90:10) 11,5 363-385 0,16
616-628 DCM:EtOAc (80:20) 6 386-432 0,66
629-640 DCM:EtOAc (50:50) 5,5 433-499 0,79
641-654 DCM:EtOAc (25:7 5) 6,5 500-538 0,36
655-663 EtOAc 4 539 0,27
664-671 EtOAc:MeOH (95:5) 3,5 540-548 0,90
672-683 EtOAc:MeOH (90:10) 5,5 549-555 0,34
684-689 EtOAc:MeOH (75:25) 2,5 556-559 0,08
690-694 EtOAc:MeOH (50:50) 2 560-610 0,71
695-696 MeOH 0,5 611-694 2,14
695-696 1,25
Total 338 16,64
4.6.3.3 Fracionamento de F281-362 (coluna 2 – C2)
O grupo de frações reunidas F281-362 (1,35 g), resultante da coluna C1,
eluído com HX:DCM (80:20), foi submetido à cromatografia em coluna aberta de
sílica gel (mesh: 0,063-0,200 mm, 135 g, 31 × 4,0 cm). Empregou-se a série
eluotrópica descrita na Tabela 13, sendo coletadas frações de 125 mL. O grupo de
frações reunidas 84-120 foi identificado como Sp1.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
60
Tabela 13 -
Fracionamento de F281-362 (C2) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Frações reunidas Massa (mg)
1-10 HX:DCM (85:15) 1,25 1-12 141,3
11-17 HX:DCM (82:20) 0,75 13-24 40,8
18-25 HX:DCM (75:25) 0,87 25-42 39,8
26-37 HX:DCM (70:30) 1,37 43-48 90,9
38-62 HX:DCM (68:32) 3,00 49-70 74,4
63-77 HX:DCM (61:39) 1,75 71-80 27,4
78-143 HX:DCM (55:45) 8,12 81-83 24,5
144-149 HX:DCM (50:50) 0,62 84-120 453,4
150-153 HX:DCM (45:55) 0,37 121-136 11,6
154-163 HX:DCM (35:65) 1,12 137-165 25,6
164-172 HX:DCM (25:75) 1,00
173-180 DCM 0,87
Total 21,12 929,7
4.6.3.4 Fracionamento de FDCM (coluna 3 – C3)
Uma porção da fração FDCM (20 g), obtida do fracionamento preliminar do
extrato bruto, foi cromatografada em coluna aberta de sílica gel (mesh: 0,063-0,200
mm, 200 g, 22,5 x 6,5 cm). Empregou-se a série eluotrópica descrita na Tabela 14,
sendo coletadas frações de 300 mL.
Tabela 14 -
Fracionamento de FDCM (C3) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L) Frações reunidas Massa (g)
1-15 HXDCM (50:50) 4,5 1-22 0,06
16-34 HX:DCM (25:75) 5,4 23-41 0,35
35-138 DCM 30,9 42-102 2,10
139-169 DCM:EtOAc (95:5) 9,0 103-146 0,76
170-189 DCM:EtOAc( 85:15) 5,7 147-157 0,58
190-201 DCM:EtOAc (70:30) 3,3 158-171 0,38
202-213 DCM:EtOAc (50:50) 3,3 172-174 1,12
214-241 DCM:EtOAc (25:75) 8,1 175-182 1,18
242-255 EtOAc 3,9 183-217 4,27
256-283 EtOAc:MeOH (95:5) 8,1 218-228 1,77
284-296 EtOAc:MeOH (85:15) 3,6 229-237 1,47
297-308 EtOAc:MeOH (70:30) 3,3 238-250 0,35
309-315 EtOAc:MeOH (50:50) 1,8 251-265 1,28
316-319 EtOAc:MeOH (25:75) 0,9 266-273 0,44
320-324 MeOH 1,2 274-285 0,75
325-328 MeOH: HAc (90:10) 0,69 286-299 1,79
300-328 1,09
Total 93,6 17,94
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
61
4.6.3.5 Fracionamento de F42-102 (coluna 4 – C4)
O grupo de frações reunidas F42-102 (2,1 g), resultante da coluna C3, eluído
com DCM, foi cromatografado em coluna aberta de sílica gel (mesh: 0,063-0,200
mm, 50 g, 35 × 4,0 cm). Empregou-se a série eluotrópica descrita na Tabela 15,
sendo coletadas frações de 200 mL.
Tabela 15 -
Fracionamento de F42-102 (C4) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (L)
Frações
reunidas
Massa (mg)
1-8 HX:DCM (50:50) 1,6 1-32 0,01
9-19 HX:DCM (25:75) 2,0 33-61 0,20
20-83 HX:DCM (12,5:87,5) 12,6 62-105 0,12
84-104 DCM 4,0 106-111 1,36
105-108 DCM:EtOAc (95:5) 0,6
109-111 EtOAc:MeOH (50:50) 0,4
Total 21,2 1,74
4.6.3.6 Marcha para obtenção de alcalóides e fracionamento de FDCM
A 25,0 g do extrato etanólico de folhas de S. paniculatum foram adicionados
200 mL de solução aquosa de HCl 0,5 N, seguindo-se sonicação em banho de ultra-
som por 15 min. A porção solúvel foi então transferida para um funil de separação,
sendo alcalinizada com NH
4
OH concentrado até pH 10-11, seguindo-se extração
com DCM (3 × 200 mL). Na seqüência, a fase diclorometânica foi seca em sulfato de
sódio anidro e o solvente eliminado em evaporador rotatório, obtendo-se 1,93 g de
resíduo. A fase aquosa foi submetida à extração com EtOAc (3 × 200 mL). As fases
EtOAc e aquosa foram concentradas até resíduo em evaporador rotatório,
resultando em resíduos de 0,37 g e 18,7 g, respectivamente.
Na seqüência, uma porção do resíduo da fase diclorometânica (FDCM; 1,73
g) foi cromatografado em coluna aberta de sílica gel (C5) (mesh: 0,063-0,200 mm,
200 g, 55 × 4,0 cm), empregando-se a série eluotrópica descrita na Tabela 16.
Recolheram-se frações de 100 mL. O grupo de frações reunidas 62-105 foi
identificado como Sp2. O fracionamento do extrato bruto de S. paniculatum, visando
obter frações enriquecidas em alcalóides, está representado no organograma da
Figura 7 (pág. 64).
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
62
Tabela 16 -
Fracionamento do resíduo da fase DCM (C5) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (mL)
Frações
reunidas
Massa (mg)
1-8 HX 0,80 1-45 16,3
9-17 HX:DCM (90:10) 0,80 46-59 34,9
18-43 HX:DCM (85:15) 2,50 60-69 103,7
44-89 HX:DCM (60:40) 4,50 70-92 14,1
90-108 HX:DCM (40:60) 1,80 93-114 389,7
109-111 HX:DCM (15:85) 0,20 115-123 53,4
112-123 DCM 1,10 124-167 164,2
124-138 DCM:EtOAc (90:10) 1,40 168-181 359,7
139-156 DCM:EtOAc (75:25) 1,70 182-194 264,9
157-167 EtOAc 1,00 195-202 170,8
168-189 EtOAc:MeOH (50:50) 2,10
190-202 MeOH 1,20
Total 19,10 1571,7
4.6.3.7 Fracionamento de F182-194 (coluna 6 – C6)
Uma porção da fração reunida F182-194 (109,6 mg), obtida da coluna C5, foi
cromatografada em coluna de sílica gel (mesh: 0,063-0,200 mm, 30 g, 60 × 2,0 cm).
Empregou-se a série eluotrópica descrita na Tabela 17, sendo coletadas frações de
5 mL. O grupo de fraões reunidas 12-26 foi identificado como Sp3.
Tabela 17 -
Fracionamento de F F182-194 (C6) em coluna de sílica gel.
Fração Eluente Volume (mL) Frações reunidas Massa (mg)
1-15 EtOAc 75 1-11 2,5
16-28 EtOAc:MeOH (97,5:2,5) 70 12-26 46,8
29-41 EtOAc:MeOH (95:5) 60 27-39 15,3
42-48 EtOAc:MeOH (90:10) 30 40-46 13,4
49-63 EtOAc:MeOH (80:20) 70 47-58 10,3
64-73 EtOAc:MeOH (65:35) 45 59-73 4,5
Total 350 92,8
Materiais e Métodos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
63
Figura 6 -
Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto de folhas de Solanum paniculatum.
Extrato EtOH bruto
Solanum paniculatum
(folhas) (231,00 g)
FHX
(20,15 g)
FDCM
(21,81 g)
FEtOAc
(26,44 g)
FEtOAc:MeOH
(91,74 g)
FMeOH
(4,15 g)
C2 – F281-262
(1,35 g)
C4 – F42-102
(2,00 g)
SpC5 62-105
Sp2 (0,12 mg)
SpC2 84-120
Sp1 (0,45 g)
C3 – FDCM
(20,00 g)
Fracionamento preliminar
CCS
CCS
CCS
HX:DCM (1:1)l
C1 – FHX
(18 g)
CCS
HX:DCM (12,5:87,5)l
O
O
H
H
HO
H
H
H
H
H
HO
HO
Materiais e Métodos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
64
Figura 7 -
Fracionamento do extrato bruto de Solanum paniculatum visando à obtenção de fração alcaloídica.
EXTRATO EtOH BRUTO
Solanum paniculatum
(fo
lhas) (25,00 g)
Fase solúvel Resíduo insolúvel
Fase DCM
Fase aquosa
Fração DCM
(C5)
(1,93 g)
C6 – F12-26
(1,73 g)
Sp3
SPC7 12-26
(0,0468 g)
Fase EtOAc
Fase aquosa
alcalina
Fração EtOAc
(0,37 g)
Fração aquosa
(18,70 g)
HCl 0,5 N/sonicação
NH
4
OH (pH 10-11)
DCM (2 x 200 mL)
Evaporação
EtOAc (3 x 200 mL)
Evaporação
CCS
Evaporação
CCS
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
65
4.7 Ensaios biológicos
4.7.1 Ensaios in vitro de atividade antiviral
Os ensaios foram realizados pelo doutorando Geraldo Célio Bandrão, sob
supervisão da Profa. Erna Geessien Kroon, no Laboratório de Vírus, ICB, UFMG.
4.7.1.1 Avaliação da citotoxicidade
Para avaliação da citotoxicidade celular, atividade antiviral e determinação
dos títulos virais foram empregadas Células VERO, oriundas de rim de macaco
verde (Cercopthecus aeothiops), multiplicadas em meio MEM (meio mínimo
essencial Eagle). A citotoxicidade celular foi avaliada segundo metodologia descrita
por Kumar & Das (1996), Mosmann (1983) e Twentnan & Luscombe (1987). Foram
realizadas 4 replicatas dos experimentos para todas as amostras testadas, sendo os
resultados expressos como citotoxicidade a 50 % (CC
50
).
4.7.1.2 Avaliação da atividade antiviral
4.7.1.2.1 Vírus
Cepas dos vírus HHV-1 (isolado clínico proveniente de herpes labial em
adulto saudável), Encefalomiocardite murina (EMC; cedida pelo Dr. I. Kerr, Londres,
Reino Unido) e Vaccinia vírus Western Reserve (VACV-WR; cedida pelo Dr. C.
Jungwirth, Universidade de Würzburg, Alemanha) foram empregadas nos ensaios.
Os estoques de vírus foram obtidos em cultivos de fibroblastos de camundongos (L-
929).
4.7.1.2.2 Título viral
O título viral foi determinado pelo método TCID
50
(diluição de vírus exigida
para infectar 50% de um determinado grupo de células inoculadas) segundo Reed &
Muench (1938).
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
66
4.7.1.2.3 Avaliação da atividade antiviral
A atividade antiviral do extrato bruto de S. paniculatum e das substâncias Sp2
e Sp3 foi determinada pelo ensaio colorimétrico do MTT (BETANCUR-GALVIS et al.,
1999; MOSMANN, 1983). Foram preparadas soluções estoque das amostras em
DMSO, as quais foram ensaiadas em concentrações não citotóxicas. Aciclovir e
interferon α foram empregados como controle positivo (BETANCUR-GALVIS et al.,
2002; 1999). A concentração eficaz que representa 50% de efeito antiviral (CI
50
) foi
expressa como a concentração que promoveu a proteção de 50% das células
tratadas da destruição causada pelo vírus.
4.7.1.3 Análise dos dados
Os valores de CC
50
e CI
50
para cada amostra foram obtidos de curvas
concentração-resposta. Os valores obtidos correspondem à média de 4 ensaios
realizados em 4 concentrações distintas. O índice terapêutico IT, foi definido como
CC
50
/CI
50
.
4.7.2 Ensaio ex vivo de absorção de lipídeos
Os ensaios foram executados pela autora, sob orientação da Profa. Leida
Maria Botion, Departamento de Fisiologia, ICB, UFMG.
4.7.2.1 Preparo das soluções
4.7.2.1.1 Tampão fosfato 0,1M
Tomou-se uma alíquota de 62,7 mL de uma solução de KH
2
PO
4
a 13,55 g/L,
transferiu-se para um béquer e adicionaram-se 37,3 mL de uma solução de
Na
2
HPO
4
.2H
2
O a 17,73 g/L. Ajustou-se o pH na faixa entre 6,6 e 6,8 com solução de
KOH 0,1 M. A solução foi acondicionada em geladeira, até o momento do uso.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
67
4.7.2.1.2 Tampão experimento
Tomaram-se 100 mL de solução salina (NaCl 0,9%) livre de Ca
2+
, 4 mL de
solução de KCl a 1,15%, 1 mL de solução de MgSO
4
.7H
2
O a 3,82%, 20 mL de
tampão fosfato 0,1 M e acrescentou-se glicose (62,5 mg). Homogeneizou-se e
gaseificou-se por uma hora com carbogênio (5% CO
2
e 95% O
2
). A solução foi
mantida em geladeira até o momento do uso.
4.7.2.1.3 Solução mucosa
Misturaram-se 100 mL da solução tampão experimento, 0,884 g de trioleína
(triglicéride) e 0,52 g de ácido deoxicólico (ácido biliar). A suspensão foi sonicada
por 5 min, com intervalos seriados de 30 s. A emulsão obtida foi mantida em
geladeira, homogeneizada e gaseificada por uma hora antes do uso.
4.7.2.1.4 Solução serosa
Ao tampão experimento acrescentou-se 1% de albumina deslipidada. A
solução foi mantida em geladeira até o momento do uso.
4.7.2.1.5 Triton
Preparou-se uma solução a 0,2% de triton em água destilada, seguindo-se
homogeneização por 20 min. A solução foi mantida em geladeira.
4.7.2.2 Protocolo experimental
Ratos Wistar machos (180-200 g), em jejum alimentar de 24 h, foram
sacrificados por decapitação em guilhotina, sendo o abdome imediatamente aberto
por incisão na parte mediana. O intestino delgado foi, então, lavado in situ com
solução isotônica gelada de NaCl. A porção do intestino imediatamente distal ao
duodeno, logo após o ligamento de Treitz, foi retirada e evertida rapidamente, com o
auxílio de um microbastão de vidro (BENNETT, 1971; WILSON; WISEMAN, 1954).
Transferiu-se a alça intestinal de jejuno para uma placa de petri gelada, contendo o
tampão experimento. Uma das porções terminais da alça intestinal foi amarrada com
linha e a alça foi completamente preenchida com a solução serosa (0,2 mL/cm),
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
68
amarrando-se, na seqüência, a outra extremidade. Com o auxílio de pinça cirúrgica,
foram amarrados intervalos regulares na alça, obtendo-se cerca de 18 sacos por
alça, medindo entre 1,5 e 2 cm e com massa de 200 a 300 mg. Estes foram então
divididos em seis grupos: grupo controle G1, e grupos experimento G2, G3, G4, G5
e G6, aos quais foi inoculada a solução fitoterápica [G2 (1 µL), G3 (3 µL), G4 (10
µL), G5 (30 µL) e G6 (100 µL)]. Uma alíquota (3,0 mL) da solução mucosa foi
transferida para frascos de penicilina aos quais se adicionou a solução fitoterápica
no volume correspondente a cada grupo. Efetuou-se a pesagem dos frascos e na
seqüência adicionou-se um saco intestinal a cada frasco, que foi novamente pesado.
Os frascos foram incubados em banho-maria por 1 hora, a 37ºC, sob agitação de 90
rpm. Após incubação, os sacos foram retirados dos frascos de penicilina, lavados
com a solução de triton, seguida de solução salina e alíquotas das soluções serosas
e mucosas foram retiradas para a dosagem de triglicérides.
A dosagem de triglicérides foi realizada com kits enzimáticos comerciais
(Analisa Diagnóstica). Para os ensaios, as amostras foram preparadas em tubos de
ensaio. Alíquotas de 10 µL da solução mucosa de cada frasco de penicilina foram
adicionadas aos tubos de ensaio correspondentes e, em seguida, diluiu-se com 90
µL de solução salina. Das soluções serosas foram coletadas alíquotas de 50 µL, que
foram diluídas com 50 µL de salina. Preparou-se, também, uma amostra da solução
mucosa estoque (controle), adicionando 10 µL da solução e 90 µL de salina. O
branco foi preparado adicionando-se 100 µL de salina ao tubo de ensaio
correspondente. Os padrões de triglicérides foram preparados em duplicata. Para o
padrão 1, adicionou-se 10 µL de solução comercial padrão de triglicérides a 90 µL de
solução salina, enquanto para o preparo do padrão 2 adicionaram-se 20 µL de
solução padrão de triglicérides a 80 µL de solução salina. A todos os tubos foi
adicionado 1,0 mL de solução enzimática. Os tubos foram agitados em vórtex e
incubados em banho-maria por 10 min, a 37ºC. Após incubação, efetuou-se a leitura
das absorbâncias a 540 nm.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
69
Para o cálculo da concentração de triglicérides em cada amostra utilizou-se a
seguinte equação:
Ap
Cp
Fc =
AtFcCt
×
=
0113,0)/(
)/(
××=
×
=
AtFcmLmmolCt
AtFcdLmgCt
Onde: Fc = fator de correção
Cp = concentração do padrão
Ap = absorbância do padrão
Ct = concentração do teste
At = Absorbância do teste
Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram
expressos em mmol/mL. O procedimento foi aprovado pelo comitê de ética da
Universidade Federal de Minas Gerais.
4.7.3 Análises estatísticas
Utilizou-se a estatística
t
de Student para se comparar a concentração média
de triglicérides (H
0
:
µ
1
=
µ
n;
H1:
µ
1
≠
µ
n
) do grupo controle (G1) com as médias de
cada um dos grupos experimento, G2, G3, G4, G5, e G6, considerando um nível
de significância de 95%.
4.7.4 Ensaios in vivo de absorção de lipídeos
Os ensaios foram realizados pelas doutorandas Érika Guilhen Mario e Laura
Cristina Jardim Porto, sob orientação da Profa. Leida Maria Botion, Departamento de
Fisiologia, ICB, UFMG.
4.7.4.1 Protocolo experimental
Utilizaram-se ratos Wistar machos provenientes do centro de bioterismo
(CEBIO) do ICB, UFMG, pesando entre 250 e 300 g. Os animais foram divididos em
4 grupos: grupo controle e grupos experimento, nos quais foram administrados os
extratos das três espécies estudadas (R. ferruginea, S. paniculatum e J. caroba). Os
animais foram mantidos em gaiolas individuais, com temperatura (~25
o
C) e umidade
controladas e ciclo claro/escuro de 14/10 horas.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
70
Inicialmente, os animais foram tratados com dieta padrão constituída por
ração peletizada (41% carboidratos, 4% gordura, 22% proteína). Três dias antes do
experimento, a ração peletizada foi removida as 14:00 horas, sendo administrada
dieta hiperlipídica (56% carboidratos, 25% gordura, 15% proteína) nas manhãs
seguintes, no período entre 10:00 – 12:00 horas. Durante este período, água foi
fornecida ad libitum. No dia do experimento e, imediatamente antes do fornecimento
da dieta, administraram-se aos animais pertencentes aos grupos amostra, via
gavage, 20 µL dos extratos nas doses de 0,1, 1,0 e 5,0 mg/mL, diluídos em 500 µL
de solução fisiológica. Ao grupo controle foi fornecido somente o veículo. Na
seqüência, a dieta hiperlipídica foi fornecida ad libitum por 2 horas (BOTION et al.,
2005). Após este período, foram realizadas coletas de sangue da veia caldal de
todos os animais para determinar a concentração de triglicérides plasmáticos. A
dosagem de triglicérides foi realizada com o emprego de kits enzimáticos comerciais
(Analisa Diagnóstica) e a leitura das absorbâncias foi efetuada a 540 nm. Após o
sacrifício dos animais, coletaram-se amostras do tecido adiposo epididimal para
determinar a atividade da enzima lipase lipoprotéica. Os ensaios foram realizados
com n = 6 animais. O procedimento foi aprovado pelo comitê de ética da
Universidade Federal de Minas Gerais.
4.7.5 Medida da atividade da lipase lipoprotéica
As amostras de tecido adiposo epididimal (50 mg) foram homogeneizadas
com 500
µ
L de tampão Tris, pH 8,5, contendo 0,05 mg/mL de heparina, 10,0 mg/mL
de BSA e 2,0 mg/mL de deoxicolato de sódio. Centrifugou-se a 2500 rpm por 15
minutos e coletou-se a camada intermediária para a medida da atividade enzimática
(IVERIUS; ÖSTLUND-LINDQVIST, 1986). O substrato foi preparado a partir da
sonicação de 12-
µ
Ci [9,10-3H]-trioleina em tampão Tris, usando lecitina (3,6 mg) e
glicerol (5 mL) como emulsionantes, sendo incubado a 37ºC, por 45 min (NILSSON-
EHLE;
SCHOTZ, 1976). A reação foi interrompida pela adição de 3,25 mL de
metanol:clorofórmio:heptana 1,41:1,25:1 (v/v/v), seguido de 1,05 mL de tampão
potássio carbonato-borato 0,1 M (pH 10,5). Os [
3
H]-ácidos graxos livres, resultantes
da hidrólise enzimática, foram quantificados por espectrometria de cintilação líquida
(n = 6) e a atividade da LPL foi expressa em mU (1mU = 1 nmol de ácido oléico
livre/min) (BELFRAGE; VAUGHAN, 1969).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (RP-HPLC)
As análises por RP-HPLC objetivaram obter perfis cromatográficos
exploratórios dos extratos vegetais (“impressão digital”), visando à avaliação
preliminar de sua complexidade e a polaridade dos constituintes. Os cromatogramas
obtidos por RP-HPLC também foram utilizados para monitorar os processos de
fracionamento e para avaliar a pureza das substâncias isoladas.
Assim, foram obtidos perfis cromatográficos, por RP-HPLC, para os extratos
etanólicos das três espécies vegetais, para as frações resultantes do fracionamento
preliminar e para as substâncias isoladas, empregando as condições
cromatográficas descritas no item 4.5.2.
5.1.1 Jacaranda caroba
O perfil cromatográfico obtido para o extrato bruto de J. caroba (Figura 8)
mostrou-se complexo, com o predomínio de picos relativos a constituintes de
elevada polaridade (Tr de 0 a 20 min). Observou-se, também, a presença de alguns
picos referentes a substâncias de menor polaridade (Tr entre 38 e 61 min), com
destaque para o pico intenso, com Tr = 48,06 min.
Este extrato foi submetido a fracionamento preliminar em coluna de sílica gel
(item 4.6.1.1) resultando em cinco frações. Observou-se o predomínio da(s)
substância(s) com Tr = 48,25 min na fração FDCM/EtOAc (Figura 8), sendo esta
selecionada para fracionamento posterior, resultando no isolamento de Jc2 (Tr =
47,52 min), Jc3 (Tr = 47,59 min) e Jc4 (mistura, Tr = 47,62 min), todos de natureza
triterpênica. A fração FHX também foi refracionada, obtendo-se Jc1 (Tr = 48,14 min).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
72
Figura 8
- Perfis cromatográficos obtidos por RP-HPLC para o extrato (A) e frações FHX (B),
FDCM/EtOAC (C) de J. caroba, bem como para os sólidos isolados Jc2 (D) e Jc3 (E) (condições
cromatográficas: vide item 4.5.2).
5.1.2 Remijia ferruginea
O perfil cromatográfico obtido para o extrato bruto de R. ferruginea (Figura 9),
também revelou o predomínio de picos correspondentes a substâncias de elevada
polaridade (Tr entre 0 e 20 min). Cabe ressaltar, ainda, a presença do pico com Tr =
48,24 min, tempo de retenção semelhante àquele detectado no extrato de J. caroba.
O fracionamento preliminar do extrato resultou em cinco frações. Observou-se a
concentração do pico com TR = 48,24 min nas frações FDCM e FDCM/EtOAc
(Figura 9). O refracionamento de FDCM/EtOAc em coluna de sílica gel resultou no
isolamento de Rf1 (Tr = 48,09 min), enquanto Rf2 (Tr = 48,18 min) e Rf3 (mistura)
originaram-se do refracionamento de FHX.
A
B
C
D
E
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
73
Figura 9 -
Perfis cromatográficos obtidos por RP-HPLC para o extrato (A) e frações FDCM (B)
e FDCM/EtOAC (C) de R. ferruginea, bem como para os sólidos isolados Rf1 (D) e Rf2 (E)
(condições cromatográficas, item 4.5.2).
5.1.3 Solanum paniculatum
O perfil cromatográfico obtido para o extrato bruto de S. paniculatum
apresentou predomínio de picos com Tr entre 0 e 13 min, correspondentes a
substâncias de elevada polaridade, e menor complexidade em relação aos perfis
obtidos para as demais espécies (Figura 10). Seu fracionamento preliminar (item
4.6.3) resultou em cinco frações, sendo FHX e FDCM posteriormente
cromatografadas em coluna de sílica gel, levando ao isolamento de Sp1 (Tr = 48,14
min) da primeira e Sp2 (pico não detectado pelo DAD) da segunda. FDCM, obtida da
partição do extrato bruto entre solventes imiscíveis (página 64), também foi
cromatografada em coluna de sílica gel (item 4.6.3.4) e resultou no isolamento de
Sp3 (pico não detectado pelo DAD).
A
B
C
D
E
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
74
Figura 10 -
Perfis cromatográficos obtidos por RP-HPLC para o extrato (A) e frações FHX (B)
e FDCM (C) de S. paniculatum, bem como para o sólido isolado Sp1 (D) (condições
cromatográficas, item 4.5.2).
5.2 Elucidação estrutural das substâncias isoladas
J. caroba, R. ferruginea e S. paniculatum foram submetidas a estudo
fitoquímico preliminar, visando isolar os constituintes majoritários de cada espécie e
avaliar a atividade biológica das substâncias isoladas.
5.2.1 Elucidação estrutural das substâncias isoladas de Jacaranda caroba
5.2.1.1 Jc1
Jc1 (4,27g), oriunda de FHX de J. caroba, apresentou-se como um sólido
cristalino acicular branco, com temperatura de fusão na faixa entre 130,0 – 131,9 ºC.
Sua análise por CCD de sílica gel sugeriu uma substância esteroidal, após revelação
com reagente de Liebermann-Burchard.
A
B
C
D
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
75
O espectro no IV de Jc1 evidenciou sua natureza alifática pela presença de
absorções intensas em 2931 e 2850 cm
-1
, atribuídas à deformação axial C-H, e
ausência de absorções nas regiões características de aromáticos. A banda larga
centrada em 3428 cm
-1
foi atribuída à deformação axial de OH livre. A presença de
hidroxila foi confirmada pela absorção em 1375 cm
-1
, atribuída à deformação angular
no plano de OH. A banda em 1463 cm
-1
foi atribuída à deformação angular simétrica
no plano de ligação CH (CH
2
). A banda em 1053 cm
-1
foi atribuída à deformação
axial de CO de álcool secundário (SILVERSTEIN; WEBSTER, 2000).
O espectro de RMN de
13
C revelou a presença de 29 sinais de carbono. A
análise dos espectros de IV, RMN de
1
H e de
13
C e do subespectro DEPT-135, e a
comparação com dados da literatura (NES et al., 1992) possibilitaram identificar Jc1
como β-sitosterol (29). A atribuição dos sinais dos espectros de RMN de
13
C e
1
H
obtidos para Jc1 e a comparação com dados da literatura encontram-se nas Tabelas
18 e 19.
29
HO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
76
Tabela 18 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Jc1 (50 MHz, CDCl
3
)
e comparação com dados da literatura para o β-sitosterol.
Carbono β-sitosterol (δ, ppm)* Jc1 (δ, ppm) Tipo
1 37,2 37,4 CH
2
2 31,6 31,8 CH
2
3 71,8 72,0 CH
4 42,5 42,5 CH
2
5 140,7 140,9 C
6 121,7 121,9 CH
7 31,8 32,1 CH
2
8 31,9 31,8 C
9 50,1 50,3 CH
10 36,5 36,7 C
11 21,1 21,3 CH
2
12 39,7 40,0 CH
2
13 42,3 42,5 C
14 56,7 56,9 CH
15 24,3 24,5 CH
2
16 28,2 28,4 CH
2
17 56,0 56,2 CH
18 11,9 12,0 CH
3
19 19,4 19,5 CH
3
20 36,1 36,3 CH
21 18,8 18,9 CH
3
22 33,9 34,1 CH
2
23 26,0 26,3 CH
2
24 45,8 46,0 CH
25 29,2 29,3 CH
26 19,8 20,0 CH
3
27 19,1 19,2 CH
3
28 23,0 23,2 CH
2
29 12,0 12,1 CH
3
Nota: * Nes et al., 1992 (50 MHz, CDCl
3
).
Tabela 19 -
Deslocamentos químicos e constantes de acoplamento escalar (J) de alguns
sinais do espectro de RMN de
1
H obtido para Jc1 CDCl
3
).
Hidrogênio β-sitosterol (δ, ppm)
*
Jc1 (δ, ppm) Multiplicidade
H-18 0,68 0,67 s
H-21 0,92 (J = 7 Hz) 0,92 (J= 6,3 Hz) d
H-19 1,01 1,00 s
H-4 2,28 2,31 m
H-3 3,52 3,52 m
H-6 5,36 (J = 5 Hz) 5,34 (J= 4,5 Hz) dl
Nota: * Nes et al., 1992 (200 MHz, CDCl
3
).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
77
5.2.1.2
Jc2
Jc2 (9,58 g), isolado da fração FDCM/EtOAc de J. caroba, foi obtido como um
sólido amorfo branco, com temperatura de fusão na faixa entre 250,4–252,2ºC. Sua
análise por CCD de sílica gel sugeriu um triterpeno, devido ao aparecimento de uma
mancha violácea após revelação com reagente de Liebermann-Burchard.
O espectro no IV de Jc2 indicou sua natureza alifática com absorções
intensas em 2900, 2860 cm
-1
e ausência de absorções nas regiões características
de aromáticos. As bandas em 3400 e 1689 cm
-1
confirmaram a presença de hidroxila
e carbonila de ácido carboxílico. A banda em 1029 cm
-1
foi atribuída à deformação
axial de CO de álcool secundário (SILVERSTEIN; WEBSTER, 2000).
No espectro de RMN de
13
C e subespectro DEPT-135 obtidos para Jc2
(Figuras 12 e 13) foram identificados sinais referentes a trinta átomos de carbono,
sendo sete carbonos metílicos, nove metilênicos, sete metínicos e sete carbonos
não hidrogenados (Tabela 20). Esses dados e os valores de deslocamentos
químicos dos carbonos olefínicos C-12 (δ 125,8) e C-13 (δ 138,5) sugeriram que Jc2
é um triterpeno pentacíclico da série ursano (MAHATO; KUNDU, 1994). O espectro
de RMN de
13
C também permitiu identificar o carbono carbinólico C-3 (δ 79,0) e um
sinal de carbonila de ácido carboxílico (δ 181,0).
O espectro de RMN de
13
C é uma ferramenta bastante útil para distinguir
triterpenos das séries oleanano e ursano (Figura 11). Um dos fatores a serem
considerados é o número de carbonos não hidrogenados, seis nos ursanos e sete
nos oleananos; nos urs-12-enos o valor do deslocamento químico de C-12 encontra-
se geralmente 2 ppm mais afastado do TMS, e o de C-13 cerca de 5 ppm mais
próximo do TMS, em comparação com os sinais correspondentes em olean-12-enos.
Portanto, nos urs-12-enos os deslocamentos químicos de C-12 e C-13 encontram-se
em torno de δ 125 e δ 140, enquanto nos olean-12-enos estes deslocamentos
encontram-se em torno de δ 123 e δ 145, respectivamente (MAHATO; SEN, 1997).
Esta diferença se deve ao fato de que, na série ursano, o grupo metila em C-19 está
espacialmente próximo à dupla ligação, o que afeta os deslocamentos químicos dos
carbonos olefínicos, em relação àqueles da série oleanano, que não apresentam o
grupo metila em C-19 (Figura 11). Esta variação nos deslocamentos químicos
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
78
aparece como uma proteção γ em C-13 e uma desproteção δ em C-12 (DODRELL
et al., 1974).
Observa-se, também, uma variação nos deslocamentos químicos de C-11 e
C-27 entre as duas séries. Na série ursano, esses sinais são, respectivamente,
cerca de 6,0 e 3,0 ppm mais próximos do TMS que aqueles da série oleanano e,
portanto, mais protegidos. Estas diferenças também podem ser explicadas pela
mudança conformacional no anel E, causada pela proximidade espacial do grupo
metila C-29 com C-12, C-13 e C-27 na série dos ursanos (Figura 11). Outra
diferença pode ser observada no deslocamento químico do sinal de C-18, na série
oleanano, a metila axial em C-20 exerce efeito protetor sobre C-18 (interação γ
gauche). Na série ursano, ocorre efeito de desproteção β do grupo metila equatorial
do C-19 sobre C-18. Nos olean-12-enos, o sinal de C-18 encontra-se em torno de
11,5 ppm mais próximo do TMS (valores em torno de δ 41,3 nos oleananos e δ 52,8
nos ursanos) (MAHATO; KUNDU, 1994).
(a) (b)
Figura 11 -
Estruturas parciais de triterpenos das séries olean-12-enos (a) e urs-12-enos (b).
H
11
12
13
14
18
19
20
21
22
29
30
28
27
17
E
H
11
12
13
14
18
19
20
21
22
29
30
28
27
17
E
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
79
Figura 12 -
Espectro de RMN de
13
C obtido para Jc2 (100 MHz, CDCl
3
+ CDOD
3
).
Com base nas atribuições anteriormente discutidas, e comparação com dados
da literatura, Jc2 foi identificado como sendo o ácido 3β-hidróxi-urs-12-en-28-óico
(ácido ursólico) (31). A atribuição dos sinais do espectro de RMN de
1
H (Figura 14),
e sua comparação com dados da literatura, encontra-se listada na Tabela 21.
31
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
80
Tabela 20 -
Atribuições dos sinais do espectro de RMN de
13
C para Jc2 (100 MHz, CDCl
3
+
CDOD
3
) e dados da literatura para o ácido ursólico.
Carbono Ácido ursólico (δ, ppm)* Jc2 (δ, ppm) Tipo
1 38,67 39,00 CH
2
2 27,26 27,02 CH
2
3 79,03 79,00 CH
4 38,77 38,96 C
5 52,27 53,30 CH
6 18,34 18,59 CH
2
7 33,01 33,35 CH
2
8 39,53 39,77 C
9 47,60 47,87 CH
10 37,00 37,21 C
11 23,32 23,54 CH
2
12 125,60 125,80 CH
13 138,17 138,50 C
14 42,02 42,35 C
15 28,06 28,20 CH
2
16 24,26 24,49 CH
2
17 48,12 48,10 C
18 52,92 53,10 CH
19 39,08 39,38 CH
20 38,90 39,22 CH
21 30,68 30,95 CH
2
22 36,66 37,11 CH
2
23 28,16 28,20 CH
3
24 15,45 15,61 CH
3
25 15,63 15,81 CH
3
26 16,93 17,11 CH
3
27 23,63 23,73 CH
3
28 180,96 181,00 C
29 16,93 17,20 CH
3
30 21,18 21,30 CH
3
Nota: * Takeoka et al., 2000 (50 MHz, CDCl
3
).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
81
Figura 13 -
Subespectro DEPT-135 obtido para Jc2 (100 MHz, CDCl
3
+ CDOD
3
).
Figura 14 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para Jc2 (400 MHz, CDCl
3
+ CDOD
3
).
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
82
Tabela 21 -
Atribuição de sinais do espectro de RMN de
1
H para Jc2 (400 MHz, CDCl
3
+
CDOD
3
) e dados da literatura para o ácido ursólico.
Jc2 Ácido ursólico*
Hidrogênio
Multiplicidade
δ (ppm) J (Hz) δ (ppm) J (Hz)
C
2
-H
2
m 1,51 1,51 -
C
3
-H m 3,19 - 3,05 -
C
3
-OH s 4,27 - - -
C
5
-H m 0,71 11,2 0,70 10,0
C
12
-H t 5,24 3,4 5,17 3,5
C
16
-H
2
m 1,60 - 1,55; 1,96 -
C
18
-H d 2,19 11,2 2,15 11,5
C
19
-H m 1,37 - 1,34 -
C
27
-H
3
s 1,09 - 1,08 -
C
29
-H
3
d 0,86 6,8 0,85 6,5
C
30
-H
3
d 0,95 6,0 0,96 6,5
Nota: * Tkachev et al., 1994 (200 MHz, CDCl
3
).
O mapa de contornos HMQC (Figura 15) possibilitou confirmar as atribuições
dos sinais do espectro de RMN de
1
H e as principais correlações observadas estão
listadas na Tabela 22.
Tabela 22
- Correlações heteronucleares (
1
H-
13
C) observadas no mapa de contornos HMQC
obtido para Jc2.
Carbono
1
H δ (ppm)
13
C δ (ppm)
C-2 1,51 27,02 (CH
2
)
C-3 3,19 79,00 (CH)
C-5 0,71 53,30 (CH)
C-12 5,24 125,80 (CH)
C-16 1,60 24,49 (CH
2
)
C-18 2,19 53,10 (CH)
C-19 1,37 39,38 (CH
2
)
C-23 0,98 28,20 (CH
3
)
C-24 0,77 15,81 (CH
3
)
C-25 0,93 15,61 (CH
3
)
C-26 0,86 17,11 (CH
3
)
C-27 1,09 23,73 (CH
3
)
C-29 0,86 17,20 (CH
3
)
C-30 0,95 21,30 (CH
3
)
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
83
Figura 15:
Seção expandida do mapa de contornos HMQC obtido para Jc2 (100 MHz, CDCl
3
+
CDOD
3
).
5.2.2 Jc3
Jc3 (560 mg), obtido do fracionamento de FDCM:EtOAc (item 4.6.1.3),
apresentou-se como um sólido amorfo branco, com ponto de fusão na faixa entre
293-294,8 ºC. Sua análise por CCD de sílica gel indicou tratar-se de um triterpeno,
evidenciado pelo surgimento de mancha violácea, quando revelada com reagente de
Liebermann-Burchard.
A análise do espectro de RMN de
13
C e do subespectro DEPT-135 (Figuras
16 e 17) indicou ser Jc3 um triterpeno da série olean-12-eno, pela presença de sete
carbonos não hidrogenados (seis em urs-12-enos) e pelos deslocamentos químicos
característicos dos carbonos olefínicos C-12 e C-13, (δ 122,3 e δ 143,8,
respectivamente) (MAHATO; KUNDU, 1984). Os sinais em
δ 78,7 e δ 180,9 são
C18/H18
C1
7
/H1
7
C1
9
/H1
9 e C20/H20
C10/H10
C
2
1/H
2
1
C8/H8
C1
5
/H1
5
C
7
/H
7
C18/H18
C
2
/H
2
C
27
/H
27
C
23
/H
23
C
30
/H
30
C
24
/H
24
C
25
/H
25
C
26
/H
26 e C29/H29
C
6
/H
6
C
4
/H
4
C
5
/H
5
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
84
característicos, respectivamente, dos carbonos carbinólico C-3 e carbonílico C-28. A
comparação dos dados espectrais de RMN de
13
C (Tabela 23) com dados da
literatura permitiram identificar Jc3 como sendo o ácido 3β-hidróxi-olean-12-en-28-
óico (ácido oleanólico) (42).
42
Figura 16 -
Espectro de RMN de
13
C obtido para Jc3 (50 MHz, CDCl
3
).
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
85
Figura 17 -
Subespectro DEPT-135 obtido para Jc3 (50 MHz, CDCl
3
).
O espectro de RMN de
1
H obtido para Jc3 (Figura 18) apresentou a maioria
dos sinais com deslocamentos químicos entre δ 0,70 e δ 2,05, característicos de
substância de natureza triterpênica. Observou-se, também, um sinal largo em δ
5,27, atribuído a H-12. O multipleto em δ 4,14 foi atribuído ao hidrogênio da hidroxila
em C-3, acoplado com o H-3. Este sinal seria originalmente um dupleto; porém,
aparece no espectro como um sinal largo, resultado da sobreposição com o sinal de
traços de metanol encontrados na amostra. O sinal em δ 3,19 foi atribuído a H-3. O
dupleto duplo em δ 2,80 foi atribuído a H-18 (J = 14 e 4 Hz) em acoplamento vicinal
com os dois hidrogênios H-19a e H-19b. Os sete simpletos, correspondendo a 21
hidrogênios em δ 0,77; δ 0,84; δ 0,97; δ 1,14; δ 1,22; δ 1,26 e δ 1,30 foram
atribuídos aos hidrogênios dos grupos metila ligados a C-24, C-26, C-29, C-30, C-
23, C-25 e C-27, respectivamente (DAVID et al., 2001).
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
86
Tabela 23:
Atribuições dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Jc3 (100 MHz,
CDCl
3
) e comparação com dados da literatura para o ácido ursólico.
Carbono Ácido oleanólico (δ)* Jc3 (δ) Tipo
1 38,5 38,51 CH
2
2 27,4 26,74 CH
2
3 78,7 78,79 CH
4 38,7 38,67 C
5 55,2 55,22 CH
6 18,3 18,32 CH
2
7 32,6 32,74 CH
2
8 39,3 39,25 C
9 47,6 47,64 CH
10 37,0 36,98 C
11 23,1 23,01 CH
2
12 122,1 122,30 CH
13 143,4 143,84 C
14 41,6 41,70 C
15 27,7 27,67 CH
2
16 23,4 23,38 CH
2
17 46,6 46,31 C
18 41,3 41,22 CH
19 45,8 45,98 CH
2
20 30,6 30,61 C
21 33,8 33,86 CH
2
22 32,3 32,54 CH
2
23 28,1 27,96 CH
3
24 15,6 15,50 CH
3
25 15,3 15,21 CH
3
26 16,8 16,79 CH
3
27 26,0 25,81 CH
3
28 181,0 180,99 C
29 33,1 32,99 CH
3
30 23,6 23,46 CH
3
Nota: * David et al., 2001 (100 MHz, CDCl
3
).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
87
Figura 18 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para Jc3 (200 MHz, CDCl
3
).
5.2.2.1
Jc4
Jc4 foi obtido como um sólido branco (27,63g), com temperatura de fusão na
faixa entre 248-251ºC. Sua análise por CCD de sílica gel revelou mancha de
coloração violácea após revelação com reagente de Lieberman-Burchard,
característico de triterpenos (MATOS, 1997).
O espectro no IV de Jc4 indicou sua natureza alifática com absorções
intensas em 2926, 2871 cm
-1
e ausência de absorções nas regiões características
de aromáticos. As bandas centradas em 3500 e 1698 cm
-1
confirmaram a presença
de hidroxila e carbonila de ácido carboxílico. A banda em 1029 cm
-1
foi atribuída à
deformação axial de CO de álcool secundário (SILVERSTEIN; WEBSTER, 2000).
Os espectros de RMN de
13
C obtidos para Jc4 permitiram identificar sinais
correspondentes a quatro carbonos olefínicos em
δ
144,10 (C),
δ
122,50 (CH),
δ
138,4 (C) e
δ
125,80 (CH). Os valores de deslocamentos químicos são semelhantes
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
88
àqueles dos carbonos olefínicos dos ácidos oleanólico e ursólico, respectivamente
(MAHATO; SEN, 1997). A comparação dos dados espectrométricos obtidos para Jc4
com dados da literatura possibilitou concluir que Jc4 corresponde a uma mistura dos
ácidos ursólico (31) e oleanólico (42).
Segundo Maia (2000), triterpenos são facilmente encontrados na natureza e
quando se utilizam técnicas cromatográficas usuais, raramente consegue-se o
isolamento destas moléculas puras, sendo estes quase sempre obtidos em misturas
de difícil separação.
31 42
5.2.3 Discussão sobre a composição micromolecular de J. caroba
No levantamento bibliográfico realizado não foram encontrados relatos de
estudos fitoquímicos para a espécie J. caroba. O gênero Jacaranda, no entanto, já
foi objeto de vários estudos fitoquímicos que resultaram no isolamento de alguns
tritepenos como os ácidos 2
α
,3
α
-diidroxi-urs-12-en-28-óico (28), ursólico (31), 2
α
-
hidroxiursólico (32), betulínico (33), jacarândico (34), jacumárico (35), oleanólico
(42), além do esteróide
β
-sitosterol (29) (Página 40).
No presente trabalho, os ácidos oleanólico (554,6 mg), ursólico (9,58 g) e
uma mistura destes (27,63 g) foram obtidos em quantidades significativas de J.
caroba. Os ácidos ursólico e oleanólico juntos representam aproximadamente 4% da
composição total do extrato bruto de partes aéreas de J. caroba.
Algumas espécies vegetais que contém os ácidos oleanólico e ursólico em
sua composição como Sambucus incanum, Calendula officinalis, Rosamarinus
officinalis, Ligustrum lucidum e Panax ginseng são utilizadas popularmente como
antiinflamatório, analgésico, cardiotônico, sedativo, hepatoprotetor e tônico
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
HO
COOH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24 23
25
27
28
29
30
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
89
(DZUBAK, 2006; KOWALSKI, 2007; YIM et al., 2001). Os triterpenos isolados já
foram avaliados em diversos modelos biológicos, sendo relatadas as atividades
hepatoprotetora, antiinflamatória, hipolipidêmica, antiaterosclerótica,
tripanossomicida, imunomodulatória, anti-HIV e antitumoral, revistas por Liu (2005).
O ácido oleanólico é indicado na China no tratamento de distúrbios hepáticos,
hepatites crônicas e outras hepatopatias, com resultados promissores (LIU; 1995).
Sua extração de Beta vulgaris L. para o tratamento de hepatopatias foi patenteada
por um grupo do Japão (YABUCHI et al., 1988). Os ácidos ursólico e oleanólico são
empregados no Japão, sob a forma de preparações cosméticas, em terapias de
câncer de pele (LIU, 1995).
β-sitosterol, um dos esteróides de distribuição mais ampla, anteriormente
descrito no gênero, também foi obtido de J. caroba. Várias atividades biológicas já
foram relatadas para este metabólito tais como antiinflamatória,
hipocolesterelomiante, antimicrobiana, antibacteriana, antifúngica e
anticarcinogênica (SOTIROUDIS; KYRTOPOULOS, 2008; WANG, 1999). Suas
atividades antitumoral e quimiopreventiva também foram alvo de estudos (OVESNÁ
et al., 2004). Além das diversas atividades biológicas relatadas, a ausência de
toxicidade (LING; JONES, 1995; OVESNÁ et al., 2004) contribui para o interesse
científico crescente nesta classe de metabólitos.
Os usos etnofarmacológicos relatos para J. caroba possuem relação com as
atividades biológicas relatadas para os ácidos ursólico, oleanólico e β-sitosterol,
isolados da espécie. Assim, pode-se supor que o uso da espécie como cicatrizante,
no tratamento de infecções e úlceras estaria relacionado aos efeitos antiinflamatório
e antimicrobiano relatados para os ácidos ursólico, olenólico e β-sitosterol (IKEDA et
al., 2008; LIU, 1995; MÁÑEZ et al., 1998), bem como à ação antiulcerogênica
relatada para esses ácidos (FARINA et al., 1998).
5.2.4 Elucidação estrutural das substâncias isoladas de Remijia ferruginea
5.2.4.1 Rf1
Rf1 (101,8 mg) foi obtido como um sólido amorfo branco, com ponto de fusão
na faixa entre 250,0 e 252ºC. Sua análise por CCD de sílica gel revelou uma
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
90
mancha violácea após revelação com reagente de Liebermann-Burchard,
característica de triterpenos (MATOS, 1997).
A análise dos dados espectrais de RMN de
1
H e de
13
C obtidos para Rf1, seu
ponto de fusão e a comparação com dados da literatura, permitiram identificar Rf1
como sendo o ácido ursólico (31).
5.2.4.2 Rf2
Rf2 (97,3 mg) apresentou-se como um sólido cristalino branco, com
temperatura de fusão na faixa de 129,5-130,8ºC. Sua análise por CCD revelou uma
mancha esverdeada, após revelação com reagente de Liebermann-Burchard,
indicando a natureza esteroidal da substância.
A análise dos dados espectrais obtidos para Rf2 e a comparação com dados
da literatura (GOULART et al., 1993) permitiram identificar Rf2 como sendo β-
sitosterol (32), também isolado de J. caroba (item 5.2.1.1).
5.2.4.3 Rf3
Rf3 (310,8mg) apresentou-se como um sólido cristalino branco, com
temperatura de fusão na faixa entre 129,5-131,8ºC.
O espectro no IV obtido para Rf3 evidenciou a natureza alifática da
substância (bandas em 2932, 2849 e 1463 cm
-1
) e a presença de hidroxila de alcoóis
(bandas em 3428 cm
-1
). A banda de absorção fraca em 960 cm
-1
e as bandas em
840 e 800 cm
-1
, características de deformação angular de CH de alcenos sugeriram
a presença de olefina dissubstituída trans e trissubstituída (SILVERSTEIN;
WEBSTER, 2000).
A análise do espectro de RMN de
13
C (Figura 19) e do subespectro DEPT-135
(Figura 20) possibilitou identificar Rf3 como uma mistura de β-sitosterol e
estigmasterol, evidenciada pelos deslocamentos químicos característicos dos
carbonos olefínicos em δ 141,00, δ 121,70, δ 138,50 e δ 129,40 (GOULART et al.,
1993). A identificação foi confirmada pela análise por CCD de sílica gel de Rf3 e
comparação com substâncias de referência
β-sitosterol e estigmasterol. As
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
91
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
atribuições dos dados espectrais de RMN de
13
C obtidos para Rf3 e valores
relatados na literatura para a mistura de β-sitosterol e estigmasterol estão listadas na
Tabela 24.
Figura 19 -
Espectro de RMN de
13
C obtido para Rf3 (100 MHz, CDCl
3
).
Figura 20 -
Subespectro DEPT-135 obtido para Rf3 (100 MHz, CDCl
3
).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
92
Tabela 24 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Rf3 (100 MHz,
CDCl
3
) e dados da literatura para β-sitosterol e estigmasterol.
Carbono
β-sitosterol
(δ, ppm)*
Rf3 (δ, ppm)
Estigmasterol
(δ, ppm)**
Rf3
(δ, ppm)
1 37,2 37,42 37,3 37,42
2 31,6 31,39 31,7 30,43
3 71,8 71,70 71,8 71,5
4 42,5 42,07 42,5 42,24
5 140,7 141,00 140,8 141,00
6 121,7 121,70 121,7 121,70
7 31,8 32,05 31,9 30,73
8 31,9 32,07 31,9 31,61
9 50,1 50,34 50,2 51,40
10 36,5 36,67 36,6 36,67
11 21,1 21,22 21,1 21,22
12 39,7 39,94 39,7 39,85
13 42,3 42,47 42,4 42,37
14 56,7 56,94 56,9 57,03
15 24,3 24,43 24,4 24,48
16 28,2 28,37 29,0 29,04
17 56,0 56,29 56,1 56,14
18 11,9 11,95 12,1 12,14
19 19,4 19,46 19,4 19,06
20 36,1 36,29 40,5 40,63
21 18,8 18,87 21,1 21,14
22 33,9 34,11 138,4 138,50
23 26,0 26,26 129,3 129,40
24 45,8 46,02 51,3 51,40
25 29,2 29,33 31,9 31,61
26 19,8 19,87 21,3 21,30
27 19,1 19,11 19,0 18,98
28 23,0 23,22 25,4 25,52
29 12,0 12,05 12,3 12,29
Nota: * Nes et al., 1992, (50 MHz, CDCl
3
); ** Goulart et al., 1993, (50 MHz, CDCl
3
).
O espectro de RMN de
1
H (Figura 21) obtido para Rf3 apresentou diversos
sinais na região entre δ 0,68 e δ 2,25, característicos de hidrogênios metílicos,
metilênicos e metínicos de esteróides. O sinal largo em δ 5,34 e o multipleto em δ
5,09 foram atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-6, H-22 e H-23, respectivamente,
enquanto o multipleto em δ 3,63 foi atribuído ao hidrogênio de OH, e aquele em δ
3,48 ao hidrogênio carbinólico (H-3). Os dados espectrais de RMN de
1
H obtidos
para Rf3 e os valores relatados na literatura para a mistura de β-sitosterol e
estigmasterol estão listados na Tabela 25.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
93
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
HO
H
H
20
23
22
24
25
26
27
28
29
5
6
18
19
3
21
Figura 21 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para Rf3 (400 MHz, CDCl
3
).
O isolamento de misturas de β-sitosterol e estigmasterol é comum para
espécies vegetais de diferentes gêneros e famílias. A proporção de β-sitosterol e
estigmasterol em Rf3 foi estimada a partir do espectro de RMN de
1
H. A
porcentagem dos dois constituintes foi calculada com base na integração dos sinais
correspondentes aos hidrogênios H-6 (β-sitosterol + estigmasterol, integral de 1,0) e
H-22 e H-23 (estigmasterol, integral de 0,38), segundo proposto por Goulart et al.
(1993). Com base nesses valores, pôde-se concluir que a mistura é composta por
81% de β-sitosterol (29) e 19% de estigmasterol (43).
32 43
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
94
Tabela 25 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
1
H obtido para Rf3 (400 MHz, CDCl
3
)
e dados da literatura para β-sitosterol e estigmasterol.
H
β-sitosterol* δ
(ppm)
Estigmasterol** δ (ppm) Rf3 δ (ppm)
H-3 3,5 (m) 3,5 (m) 3,48 (m)
H-6 5,2 (m) 5,2 (m) 5,34 (sl)
H-22 - 5,18 (dd, J = 14,8 e 7,0 Hz)
5,16 (dd, J = 15,2 e 8,4
Hz)
H-23 - 5,03 (dd, J = 14,8 e 7,0 Hz) 5,04 (d, J =8,4 Hz)
Nota:* Macari et al., 1990, (200 MHz, CDCl
3
); ** Bezerra et al., 1994, (200 MHz, CDCl
3
).
5.2.5 Discussão sobre a composição química micromolecular de Remijia
ferruginea
No levantamento bibliográfico realizado não foram encontradas referências
sobre estudos fitoquímicos de R. ferruginea. O gênero Remijia, no entanto, é fonte
reconhecida de alcalóides como quinidina (8), cupreína (9), cinchonina (10) e
cinchonamina (11) (RUIZ-MESIA et al., 2005). A presença de saponinas
triterpênicas, ácido ursólico (31) e β-sitosterol (29) também foi relatada na família
Rubiaceae (ITOH et al., 2003; KANG et al., 2005; KANOKMEDHAKUL, 2005);
porém, o isolamento de ácido ursólico (0,08% da composição do extrato bruto) e β-
sitosterol (0,26% da composição do extrato bruto), descrito no presente trabalho, é
inédito no gênero Remijia.
O uso popular de R. ferruginea como antimalárico pode estar relacionado à
presença do ácido ursólico. Steele et al. (1999) relataram a atividade antiplasmódica
do ácido ursólico in vitro frente ao Plasmodium falciparum resistente K1 (CI
50
= 36,5
µ
g/mL) e sensível T9-96 (CI
50
= 28
µ
g/mL) à cloroquina.
5.2.6 Elucidação estrutural das substãncias isoladas de Solanum
paniculatum
5.2.6.1 Sp1
Sp1 (453,4 mg) foi obtido como um sólido branco cristalino, com temperatura
de fusão na faixa entre 129,6-130,6 ºC. Sua revelação com reagente de Liebermann-
Burchard, em CCD de sílica gel, resultou em uma mancha esverdeada,
característica de substâncias esteroidais.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
95
Os sinais obtidos nos espectros de RMN de
1
H,
13
C e no IV para Sp1
indicaram tratar-se de uma mistura de β-sitosterol (29) e estigmasterol (43),
confirmada a partir dos valores característicos de deslocamento químico dos
carbonos olefínicos (δ 140,96, δ 121,98, δ 138,51 e δ 129,49), segundo relatado por
Goulart et al. (1993).
A relação percentual entre o β-sitosterol e o estigmasterol em Sp1 foi obtida
com base na integração dos sinais correspondentes aos hidrogênios H-6 (β-
sitosterol + estigmasterol, integral de 0,946) e H-22/H-23 (estigmasterol, integral de
0,500), segundo proposto por Goulart et al., (1993). Essa análise possibilitou inferir
que Sp1 é constituído por 74% de β-sitosterol e 26% de estigmasterol.
5.2.6.2 Sp2
Sp2 foi obtido como um sólido cristalino branco (121,3 mg), com temperatura
de fusão na faixa entre 152,0 e 153,8ºC. Sua análise por CCD de sílica gel e
revelação com reagente de Liebermann-Burchard revelou uma mancha esverdeada,
característica de substância esteroidal.
As posições e vibrações características das bandas de absorção observadas
no espectro obtido para Sp2 na região do IV estão listadas na Tabela 26.
Tabela 26 -
Posições e vibrações das bandas de Sp2 no espectro no IV.
Posição (cm
-1
) Vibração
3553 Estiramento O-H de alcoóis (OH livre)
3266 Estiramento O-H de alcoóis (ligação de H)
2949, 2918, 2848 Estiramento C-H simétrico e assimétrico de alcanos
1447 Deformação C-H de alcanos
1368 Deformação O-H de alcoóis
1054 Estiramento C-OH de alcoóis
1174-1055 Estiramento C-O-C simétrico de éter
952-849 Estiramento C-O-C assimétrico de éter
No espectro de RMN de
13
C desacoplado de Sp2 (Figura 22) foram
identificados sinais referentes a 27 carbonos (Tabela 27). A natureza dos carbonos
foi determinada pela análise do subespectro DEPT-135 (Figura 23), que indicou 4
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
96
carbonos metílicos, 11 metilênicos, 9 metínicos e 3 carbonos não hidrogenados. A
natureza, os valores de deslocamento químico característicos encontrados para os
carbonos do anel E [C-16 (δ 81,15); C-17 (δ 62,23); C-20 (δ 42,33); C-22 (δ 109,93)],
para C-26 (65,33) e sua comparação com dados da literatura sugeriram que Sp2 é
uma sapogenina espirostânica (AGRAWAL et al., 1985).
Sapogeninas podem ocorrer naturalmente ou como resultado de hidrólise
ácida ou enzimática de saponinas. Sua classificação depende do esqueleto dos
carbonos constituintes, podendo ser encontrados núcleos esteroidais furostânicos
(44) e espirostânicos (45), além de triterpênicos (ex.: β-amirina 46, α-amirina 47 e
lupeol 48). As sapogeninas esteroidais espirostânicas possuem um núcleo
espirocetal em C-22 e são classificadas nas séries 25R (metila em C-25 em posição
equatorial) e 25S (metila em C-25 em posição axial). Em relação ao esqueleto
esteroidal, a fusão dos anéis A e B pode ser cis (H-5 em posição β) ou trans (H-5 em
posição α). Já a fusão dos anéis B/C e C/D é trans, enquanto a junção dos anéis D/E
é cis (AGRAWAL et al., 1985).
Segundo Bernardo et al. (1996), os valores de deslocamento químico
encontrados para os carbonos C-5 (δ 45,05) e C-6 (δ 28,82) indicam a fusão trans
dos anéis A/B, de acordo com a configuração espacial relatada para a sapogenina
neotigogenina (49).
44 45
46 47 48
HO
HO
HO
CH
2
OH
O
O
H
H
HO
H
H
H
H
H
O
OH
OH
HO
H
H
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
97
Nas sapogeninas espirostânicas da série 25R, os valores de deslocamento
químico dos sinais de C-23, C-24, C-25 e C-26 normalmente aparecem em δ 31,3 ±
0,3; δ 28,8 ± 0,3; δ 30,3 ± 0,3 e δ 66,9 ± 0,2, respectivamente, enquanto o sinal de
C-22 é observado em δ 109,5 ± 0,1. Já para aquelas da série 25S, os valores
característicos para os deslocamentos dos carbonos C-23, C-24, C-26 e C-27 são δ
27,3 ± 0,3, δ 26,1 ± 0,3, δ 65,1 ± 0,1 e δ 16,2 ± 0,2, respectivamente. O carbono C-
23, em particular, encontra-se cerca de 5,4 ppm mais próximo do TMS, devido ao
efeito γ-gauche (AGRAWAL et al., 1985). Wu et al. (1996) consideram os valores de
deslocamento químico dos carbonos C-23 e C-27 particularmente importantes na
determinação da estereoquímica das sapogeninas. Segundo os autores, na série
25R estes se encontram em δ 27,0 e δ 16,0, respectivamente, e na série 25S em δ
30,1 e δ 17,1.
A análise dos deslocamentos químicos dos sinais referentes aos carbonos
supracitados e a comparação dos demais sinais com valores da literatura
(AGRAWAL et al., 1985) sugeriu que Sp2 é a sapogenina espirostânica da série 25S
neotigogenina (49). A Tabela 27 lista os deslocamentos químicos obtidos para Sp2 e
a comparação com dados da literatura para as sapogeninas espirostânicas da série
25S (neotigogenina; 49) e 25R (tigogenina; 50).
49 50
O
O
HO
H
H
H
H
H
H
H
O
O
HO
H
H
H
H
H
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
98
Tabela 27 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Sp2 (50 MHz, CDCl
3
)
e dados da literatura para as sapogeninas das séries 25R (tigogenina) e 25S (neotigogenina).
Carbono
Tigogenina
(δ, ppm)*
Neotigogenina
(δ, ppm)*
Sp2 (δ, ppm) Tipo
1 37,0 37,0 37,19 CH
2
2 31,4 31,4 31,68 CH
2
3 71,2 71,2 71,49 CH
4 38,2 38,2 38,37 CH
2
5 44,9 44,9 45,05 CH
6 28,6 28,6 28,82 CH
2
7 32,2 32,2 32,46 CH
2
8 35,1 35,1 35,32 CH
9 54,4 54,4 54,58 CH
10 35,6 35,6 35,78 C
11 21,1 21,1 21,27 CH
2
12 40,1 40,1 40,28 CH
2
13 40,6 40,6 40,75 C
14 56,3 56,3 56,51 CH
15 31,8 31,8 31,91 CH
2
16 80,8 80,8 81,15 CH
17 62,3 62,3 62,23 CH
18 16,5 16,5 16,70 CH
3
19 12,3 12,3 12,56 CH
3
20 41,6 42,2 42,33 CH
21 14,5 14,3 14,51 CH
3
22 109,6 109,7 109,93 C
23 31,4 27,1 26,15 CH
2
24 28,8 25,8 25,98 CH
2
25 30,3 26,0 27,28 CH
26 66,8 65,2 65,33 CH
2
27 17,1 16,1 16,25 CH
3
Nota: * Agrawal et al., 1985, (50 MHz, CDCl
3
); Xu et al. 1998 (100 MHz, CDCl
3
).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
99
Figura 22 -
Espectro de RMN de
13
C obtido para Sp2 (50 MHz, CDCl
3
).
Figura 23 -
Subespectro DEPT-135 obtido para Sp2 (50 MHz, CDCl
3
).
O
O
HO
H
H
H
1
2
3 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
4
O
O
HO
H
H
H
1
2
3 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
4
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
100
O espectro de RMN de
1
H obtido para Sp2 (Figura 24) apresentou um padrão
típico de esteróides, com a maioria dos sinais na região de δ 0,75 a δ 2,32 e nenhum
sinal com deslocamento químico na região de hidrogênios aromáticos. Os simpletos
em δ 0,75 e δ 0,81 foram atribuídos aos hidrogênios metílicos ligados a carbonos
não hidrogenados (H-18 e H-19, respectivamente) e os dois dupletos em δ 0,98 (3H,
J = 6,4 Hz) e δ 1,07 (3H, J = 7,0 Hz) foram atribuídos, respectivamente, aos grupos
metila 21-CH
3
e 27-CH
3
, (Tabela 28). O dupleto largo em δ 3,29 (1H, J = 10,8 Hz) foi
atribuído a um dos hidrogênios H-26 e o dupleto duplo em δ 3,94 ao outro (J = 10,8
e 2,4 Hz). Os valores das constantes de acoplamento escalar encontrados para os
hidrogênios H-26 (J
gem
=10,9 Hz e J
ax/eq(H26a/H25)
=2,4 Hz) permitiram confirmar a
localização axial do grupo metila em C-25. O multipleto em δ 3,58 foi atribuído a H-3,
ligado a carbono carbinólico e o multipleto em δ 4,39 corresponde a H-16.
Figura 24 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
).
O
O
HO
H
H
H
1
2
3 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
4
H
H
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
101
Tabela 28 -
Atribuição de sinais do espectro de RMN de
1
H obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
)
e dados da literatura para neotigogenina.
H Neotigogenina* (δ, ppm) Sp2 (δ, ppm)
H-19 0,63 (s) 0,76 (s)
H-18 0,90 (s) 0,81 (s)
H-21
1,0 (d; J=6,6 Hz) 0,98(d; J=6,4 Hz)
H-27
1,0 (d; J=6,6 Hz) 1,07(d; J=7,0 Hz)
H-26’
3,23 (d; J=11 Hz) 3,29 (dl; J=10,9 Hz)
H-26’’
3,91 (dd; J=11,0 e 3,0 Hz) 3,94 (dd; J=10,9 e 2,4 Hz)
H-3 3,5 (m) 3,58 (m)
H-16 4,38 (m) 4,39(m)
Nota: * Chakravarty et al., 1978; Wu et al., 1996; Xu et al., 1998.
A observação da conectividade entre alguns sinais dos hidrogênio H-16/H-17
(δ 4,39/ δ 1,81), H-16/H-15 (δ 4,39/ δ 1,25) e H-26’/H-26’’ (δ 3,29/ δ 3,94) no mapa
de contornos COSY (Figura 25) possibilitou confirmar as atribuições feitas a partir do
espectro de RMN de
1
H monodimensional.
Figura 25 -
Seção expandida do mapa de contornos COSY obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
).
H
-
26
’’
/H
-
26
’
H
-
1
6/H
-
17
H
-
1
6
/H
-
15
O
O
HO
H
H
H
1
2
3 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
4
H
H
H
H
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
102
Por sua vez, o espectro bidimensional de correlação heteronuclear
1
H-
13
C
obtido pelo experimento HMQC (Figura 26) foi utilizado para confirmar algumas
atribuições dos espectros monodimensionais. Assim, evidenciou-se a conectividade
do sinal do hidrogênio em δ 0,76 (H-19) com o sinal do carbono em δ 12,56 (C-19),
do simpleto em δ 0,81 (H-18) com o sinal do carbono em δ 16,70 (C-18), dos
dupletos centrados em δ 0,98 (H-21) e δ 1,07 (H-27) com os sinais de carbono em δ
14,51 (C-21) e δ 16,25 (C-27), respectivamente. O dupleto centrado em δ 3,29 e o
dupleto duplo em δ 3,94 atribuídos aos hidrogênios metilênicos H-26 apresentaram
manchas de correlação com o sinal de carbono em δ 65,33 (C-26). Observou-se,
também, a correlação entre o sinal do carbono carbinólico C-3 (δ 71,49) e o
multipleto em δ 3,58 (H-3), bem como do multipleto em δ 4,39 (H-16) ao carbono em
81,15 (C-16). Finalmente, os simpletos em δ 1,81 (H-17) e δ 1,25 (H-15)
apresentaram conectividade com os sinais dos carbonos em 62,23 (C-17) e 31,91
(C-15). As correlações identificadas no experimento HMQC encontram-se listadas na
Tabela 29.
Tabela 29 -
Correlações heteronucleares (
1
H -
13
C) observadas no mapa de contornos HMQC
obtido para Sp2.
Deslocamentos Químicos Correlações
(
1
H -
13
C)
13
C (δ, ppm)
1
H (δ, ppm)
C-19/H-19 12,56 0,76
C-21/H-21 14,51 0,98
C-27/H-27 16,25 1,07
C-18/H-18 16,70 0,81
C-15/H-15 31,91 1,25
C-17/H-17 62,23 1,81
C-26/H-26 65,33 3,94; 3,29
C-3/H-3 71,49 3,58
C-16/H-16 81,15 4,39
A análise dos dados espectrais obtidos possibilitou identificar Sp2 como a
sapogenina esteroidal (25S)-5α-espirostan-3
β
-ol (neotigogenina) (49).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
103
C16/H16
C26/H26b
C26/H26a
C17/H17
C3/H3
C19/H19
C18/H18
C15/H15
C21/H21
C27/H27
Figura 26 -
Seção expandida do mapa de contornos HMQC obtido para Sp2 (200 MHz, CDCl
3
).
O
O
HO
H
H
H
1
2
3 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
4
H
H
H
H
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
104
5.2.6.3 Sp3
Sp3 foi obtido como um sólido cristalino branco (46,8 mg) com temperatura de
fusão na faixa entre 246,5 e 248,5 ºC. Sua reação com reagente de Liebermann-
Burchard revelou uma mancha esverdeada, característica de compostos esteroidais.
As posições e vibrações características das bandas de absorção observadas
no espectro obtido para Sp3 na região do IV estão listadas na Tabela 30.
Tabela 30 -
Posições e vibrações das bandas de Sp3 no espectro no IV.
Posição (cm
-1
) Vibração
3400 Estiramento O-H de alcoóis (OH livre)
2950 Estiramento C-H simétrico e assimétrico de alcanos
1445 Deformação C-H de alcanos
1380 Deformação O-H de alcoóis
1100-1000 Estiramento C-O-C simétrico de éter
No espectro de RMN de
13
C de Sp3 (Figura 28, pag 110) foram identificados
sinais referentes a 40 carbonos (Tabelas 31 e 33). A natureza dos carbonos foi
determinada pela análise do subespectro DEPT-135 (Figura 28), que indicou 3
carbonos metílicos, 12 metilênicos, 14 metínicos e 4 carbonos não hidrogenados. A
comparação dos dados espectrométricos de Sp3 com aqueles obtidos para a
sapogenina Sp2 mostraram deslocamentos similares para a maioria dos sinais,
exceto para os sinais do anel F. Segundo Agrawal et al. (1995), os sinais em δ
143,92 e δ 108, 78 no anel F indicam a presença de uma ligação dupla exocíclica e
foram atribuídos aos carbonos C-25 e C-27, respectivamente. A diferença de
deslocamento químico encontrada para os demais carbonos do anel F (C-23, δ
32,65 e C-24, δ 29,01) em relação àqueles de Sp2 (C-23, δ 26,15 e C-24, δ 25,98) é
devida à presença da ligação dupla. Os demais sinais (C-22 e C-26) encontram-se
com valores de deslocamento químico semelhantes.
O deslocamento paramagnético do sinal correspondente a C-3 (δ 74,37) em
relação ao sinal correspondente em sp2 (δ 71,49) sugeriu a presença de um açúcar
ligado nesta posição. A presença dos sinais em δ 41,81, 54,27 e 11,54, referentes
aos carbonos C-5, C-9 e C-19 no espectro de RMN de
13
C, permitiu identificar a
fusão trans entre os anéis A e B, indicando que Sp3 é um derivado esteroidal 5
α
-
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
105
espirostânico. Valores de deslocamento químico de δ 36,5, δ 40,3 e δ 24,2 para os
carbonos C-5, C-9 e C-19, respectivamente, indicam a fusão cis entre os anéis A e B
e conseqüentemente, um núcleo 5
β
-espirostânico (ACHARYA et al., 2009;
BERNARDO et al., 1996; ZAMILPA et al., 2002). Outra evidência da estereoquímica
trans entre os anéis A e B é a presença de manchas de correlação entre os
hidrogênios H-3 (δ 3,96) e H-5 (δ 1,86) no mapa de contornos NOESY obtido para
Sp3 (Figura 31). A genina de Sp3 foi então identificada como sendo a 5α,25(27)-en-
espirostan-3β-ol (∆
25(27)
-tigogenina) pela comparação de seus dados
espectrométricos com aqueles relatados na literatura para uma saponina contendo a
mesma aglicona (ACHARYA et al., 2009).
A existência de um glicosídeo foi confirmada pelo espectro de massas de alta
resolução, a partir do pico da molécula cationizada com Na
+
(Figura 32). Os valores
de [M+Na]
+
calculado em m/z 599,3559 e encontrado em m/z 599,3699, permitira
deduzir a fórmula molecular C
33
H
52
O
8
para Sp3, compatível com um monoglicosídeo
da ∆
25(27)
-tigogenina (51).
51
A duplicidade dos sinais dos carbonos do anel espirostânico observada no
espectro de RMN de
13
C (Figura 28), a saber C-16 (δ 81,37/81,06), C-17 (δ
62,46/62,36), C-20 (δ 41,81/41,71), C-21 (14,47/17,36), C-22 (δ 109,43/109,53), C-
23 (δ 32,65/32,41) e C-24 (δ 29,01/28,71), sugeriu que Sp3 foi obtido como uma
mistura dos isômeros R e S em C-22. Além disso, os dois dupletos centrados em δ
0,94 e 0,74 (J = 6,0 Hz), atribuídos aos hidrogênios metílicos H-21 dos isômeros, no
espectro de RMN de
1
H, apresentaram correlação com os sinais em δ 14,51 e δ
17,36 (C-21) no espectro HSQC (Figura 33), confirmando o isolamento da mistura
epimérica.
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
2
3
4
5
1
6
7
8
9
11
10
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
26
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
106
Tabela 31 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para Sp3 (100 MHz,
CDCl
3
) e dados da literatura para a ∆
∆∆
∆
25(27)
-tigogenina.
Carbono
∆
∆∆
∆
25(27)
-tigogenina* (δ) ppm
Sp3 (δ) ppm Tipo
1 37,20 34,50 CH
2 30,00 25,47 CH
2
3 77,00 74,37 CH
4 34,40 32,41 CH
2
5 44,60 41,81 CH
6 28,90 28,71 CH
2
7 32,20 31,58 CH
2
8 35,30 35,31 CH
9 54,60 54,27 CH
10 35,50 40,77 C
11 21,40 20,84 CH
2
12 40,20 40,29 CH
2
13 40,90 40,77 C
14 56,50 56,75 CH
15 32,00 32,14 CH
2
16 81,30 81,37/81,06 CH
17 63,20 62,46/62,36 CH
18 16,80 16,70 CH
3
19 12,40 11,54 CH
3
20 42,00 41,81/41,71 CH
21 15,00 14,47/17,36 CH
3
22 109,20 109,53/109,46 C
23 32,00 32,65/32,41 CH
2
24 29,00 29,01/28,71 CH
2
25 144,00 143,92 C
26 65,00 65,11 CH
2
27 108,80 108,78 CH
2
Nota: * Acharya et al., 2009 (600 MHz, CDCl
3
).
O espectro de RMN de
1
H (Figura 29) apresentou um padrão típico de
esteróides com sinais entre δ 0,79 e 2,26. Os simpletos em δ 4,74 e 4,78 foram
atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-27a e H-27b. O multipleto em δ 4,42 foi
atribuído à H-16, os dois dupletos em δ 4,30 e 3,87, com constante de acoplamento
escalar de 12,0 Hz, foram atribuídos aos hidrogênios H-26a e H-26b,
respectivamente. O simpleto largo em δ 3,96 foi atribuído ao hidrogênio H-3, os
dupletos em δ 0,94 e 0,76, com constante de acoplamento escalar de 6,0 Hz, foram
atribuídos aos hidrogênios epiméricos H-21 e o simpleto em δ 0,79 foi atribuído aos
hidrogênios H-19.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
107
Os sinais entre δ 3,28 e 4,41 foram atribuídos aos hidrogênios do açúcar; o
dupleto em δ 4,36 (J = 8,0 Hz) foi atribuído à H-1’, os dupletos em δ 3,84 e 3,80 (J =
12,0 Hz) foram atribuídos à H-6’a e H-6’b, os tripletos em δ 3,64 e 3,56 foram
atribuídos aos hidrogênios H-4’ e H-3’, o multipleto centrado em δ 3,41 foi atribuído à
H-2’ e o dupleto em δ 3,29 (J = 8,0 Hz) foi atribuído à H-5’.
A conectividade entre os sinais de hidrogênio atribuídos ao açúcar no mapa
de contornos COSY (Figura 30) possibilitou confirmar as atribuições efetuadas no
espectro de RMN de
1
H. Assim, foram observadas correlações entre os hidrogênios
H-2’/H-1’ (δ 3,41/4,36); H-4’/H-3’ (δ 3,64/3,56); H-2’/H-3’(δ 3,41/3,56) e H-5’/H-4’ (δ
3,29/3,64). As atribuições dos sinais do resíduo de açúcar também foram
confirmadas pelo mapa de contornos HSQC-TOCSY (Figura 32), que indicou a
conectividade entre todos os hidrogênios do sistema de spins e cada átomo de
carbono correspondente (Tabela 32).
A partir dos dados espectrométricos de RMN de
1
H e de
13
C e comparação
com dados da literatura para glicosídeos (BERNARDO et al., 1996), bem como pela
análise conjunta dos espectros obtidos pelos experimentos HSQC-TOCSY e COSY
o açúcar constituinte de sp3 foi definido como glicose. Por sua vez, o dupleto
centrado em δ 4,36, (J = 8,0 Hz), correspondente ao hidrogênio anomérico, indicou a
configuração β da unidade de glicose.
Tabela 32 -
Correlações do mapa de contornos HSQC-TOCSY obtido para Sp3.
CARBONO (δ)
ppm
HIDROGÊNIO (δ)
ppm
C-6’ (61,75) H-3’ (3,56); H-4’ (3,64); H-5’ (3,29); H-6’ (3,84; 3,80)
C-4’ (69,76)
H-1’ (4,36); H-2’ (3,41); H-3’ (3,56); H-4’ (3,64);
H-5’ (3,29); H-6’ (3,84, 3,80)
C-2’ (73,56) H-1’ (4,36); H-2’ (3,41); H-3’ (3,56); H-4’ (3,64); H-5’ (3,29)
C-5’ (75,71) H-2’ (3,41); H-3’ (3,56); H-4’ (3,64); H-5’ (3,29); H-6’ (4,36)
C-3’ (76,63) H-1’ (4,36); H-2’ (3,41); H-3’ (3,56); H-4’ (3,64); H-5’ (3,29)
O mapa de contornos HSQC (Figura 33) confirmou as atribuições dos
espectros monodimensionais de RMN de
1
H e de
13
C. Assim, evidenciou-se a
conectividade do sinal dos hidrogênios em
δ 4,74 (H-27a) e δ 4,78 (H-27b) com o
sinal do carbono em δ 108,78 (C-27), dos dupletos centrados em δ 4,30 (H-26a) e δ
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
108
3,87 (H-26b) com o sinal em δ 65,11 (C-26), do multipleto em δ 4,42 (H-16) com os
sinais de carbono em δ 81,37 e δ 81,06, e dos dupletos em δ 0,94 (CH
3
-21) e δ 0,76
(CH
3
-21) com os sinais de carbono em δ 14,47 e 17,36. As correlações dos sinais
atribuídos à glicose nos espectros monodimensionais, assim como demais
correlações observadas no mapa de contornos HSQC estão listadas na Tabela 33.
A análise espectrométrica permitiu definir a estrutura de Sp3 como 3-O-β-D-
glicopiranosídeo de ∆
25(27)
-tigogenina (51).
Tabela 33 -
Correlações heteronucleares (
1
H –
13
C) observadas no mapa de contornos HSQC
obtido para Sp3.
Deslocamentos Químicos
Carbono
13
C (δ) ppm
1
H (δ) ppm
C-27 108,78 4,74; 4,78
C-16 81,37; 81,06 4,42
C-26 65,11 4,30; 3,87
C-3 74,37 3,96
C-21 14,47; 17,36 0,94; 0,76
C-19 11,54 0,79
C-1’ 101,04 4,36
C-6’ 61,75 3,84
C-4’ 69,76 3,64
C-3’ 76,63 3,56
C-2’ 73,56 3,41
C-5’ 75,71 3,29
Sp3 foi isolado a partir do refracionamento da fração diclorometânica,
resultante do procedimento clássico de extração de alcalóides (item 4.6.3.7). A
análise da fração por CCD de sílica gel revelou várias manchas de coloração laranja
em presença do reagente de Draggendorf porém, não foi possível isolar nenhum
alcalóide dessa fração.
O isolamento de Sp3 como mistura epimérica pode ser explicado pela
hidrólise do cetal correspondente ao produto natural 22R nas condições ácidas de
extração, o que resultaria na δ-hidróxicetona de cadeia aberta e sua espontânea
reciclização originaria a mistura de diasteroisômeros R e S (Figura 27). A
manutenção da estereoquímica cis entre os anéis D e E após a reciclização foi
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
109
confirmada a partir do mapa de contornos NOESY (Figura 30), que indicou manchas
de correlação entre os sinais correspondentes a H-16 (δ 4,42, m) e H-17 (δ 1,78, m).
O
O
H
H
H
H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
H
O
O
H
H
H
H
H
HO
O
OH
HO
HO
OH
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
+
OH
OH
O
H
H
H
H
H
HO
O
OH
HO
HO
OH
OH
O
H
H
H
OH
O
H
H
H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
OH
O
H
H
H
Figura 27 -
Hidrólise ácida de 3-O-β-D-glicopiranosídeo ∆
25(27)
-tigogenina e conseqüente
formação da mistura de diasteroisômeros R e S.
De acordo com a revisão bibliográfica realizada, sp3 3-O-β-D-glicopiranosídeo
de ∆
25(27)
-tigogenina (51) é uma substância inédita.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
110
Figura 28 -
Espectro de RMN de
13
C e DEPT-135 obtidos para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
).
Figura 29 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para Sp3 (400 MHz, CDCl
3
).
1520253035404550556065707580859095100105110
ppm
16.70
17.36
20.84
25.47
28.71
29.01
29.95
30.51
31.58
31.95
32.14
32.41
32.65
33.04
34.50
35.31
36.12
39.56
40.29
40.77
41.81
54.27
56.65
61.75
62.46
65.11
67.04
69.76
73.56
74.37
75.71
76.63
81.06
81.37
101.04
108.78
109.43
109.53
C
-
22
C
-
27
C
-
C
-
16
Current Data Parameters
NAME fernaosp1novo
EXPNO 7
PROCNO 1
F2 - Acquisition Parameters
Date_ 20090212
Time 13.59
INSTRUM spect
PROBHD 5 mm BBI 1H-BB
PULPROG zg30
TD 65536
SOLVENT CDCl3
NS 32
DS 0
SWH 8012.820 Hz
FIDRES 0.122266 Hz
AQ 4.0894966 sec
RG 90.5
DW 62.400 usec
DE 6.50 usec
TE 295.6 K
D1 1.00000000 sec
TD0 1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1 1H
P1 5.50 usec
PL1 3.00 dB
SFO1 400.1328010 MHz
F2 - Processing parameters
SI 65536
SF 400.1300194 MHz
WDW EM
SSB 0
LB 0.30 Hz
GB 0
PC 1.00
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
0.0
0.79
1.02
1.12
1.14
1.20
1.25
1.36
1.37
1.42
1.45
1.51
1.60
1.64
1.66
1.69
1.72
1.74
1.76
1.78
1.80
1.84
1.86
1.87
1.89
1.91
1.92
1.97
1.99
2.05
2.07
2.23
2.26
2.57
3.28
3.30
3.34
3.37
3.40
3.41
3.43
3.45
3.47
3.54
3.56
3.58
3.62
3.64
3.66
3.79
3.81
3.83
3.86
3.88
3.96
4.09
4.29
4.32
4.33
4.35
4.37
4.39
4.41
20.60
10.64
20.75
38.70
2.83
1.06
0.90
2.32
5.16
5.01
5.92
1.96
5.97
2.00
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
2
3
4
5
1
6
7
8
9
11
10
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
111
Figura 30 –
Mapa de contornos COSY obtido para Sp3. (400 MHz, CDCl
3
).
Figura 31 –
Mapa de contornos NOESY obtido para Sp3 (400 MHz, CDCl
3
).
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
H-16/H-17
H-3/H-5
H5’/H4
’
H2’/H1’
H2’/H3
’
H4’/H3’
ppm
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
4.0
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
ppm
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
4.0
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
2
3
4
5
1
6
7
8
9
11
10
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
112
Figura 32 –
Espectro de massas de alta resolução e seção expandida do mapa de contornos
HSQC-TOCSY obtidos para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
).
ppm
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
ppm
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
2
3
4
5
1
6
7
8
9
11
10
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
113
Figura 33 - Seções expandidas do mapa de contornos HSQC obtido para Sp3 (100 MHz, CDCl
3
).
ppm
0.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.6
ppm
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
C-21/H-21a
C-21/H-21b
C-19/H-19
C-17/H-17
C-14/H-14
C-9/H-9
C-27/H-27a e b
C-1’/H-1’
C-16/H-16
C-3’/H-3’
C-5’/H-5’
C-3/H-3
C-2’/H-2’
C-4’/H-4’
C-26/H-26a e b
C-6’/H-6’a e b
ppm
3.23.33.43.53.63.73.83.94.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.0
ppm
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
O
O
H
H
H H
H
H
O
O
OH
HO
HO
OH
2
3
4
5
1
6
7
8
9
11
10
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
26
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
114
5.2.7 Discussão sobre a composição química de S. paniculatum
Não há relatos do isolamento da sapogenina esteroidal (25S)-5α-
espirostânica, neotigogenina (49) na família Solanaceae e a saponina 3-O-β-D-
glicopiranosídeo ∆
25(27)
-tigogenina (51) é uma substância inédita. Por outro lado, a
presença de saponinas esteroidais nitrogenadas e alcalóides esteroidais já foi
anteriormente descrita para a espécie S. paniculatum, incluindo a sapogenina
paniculidina (13), a saponina jurubina (14) (RIPPERGER et al., 1967) e os alcalóides
solamargina (15), solanina (16) e solanidina (17) (SCHREIBER; RIPPERGER ,
1966). Das folhas da espécie foram isolados dois glicosídeos espirostânicos
denominados paniculonina A e B (18 e 19) (RIPPERGER; SCHREIBER, 1968), e as
geninas neoclorogenina (20) e paniculogenina (21) (RIPPERGER et al., 1967). O
alcalóide solanina (16), característico do gênero Solanum, foi encontrado nas folhas
e flores (BLANKEMEYER, 1998).
A presença de β-sitosterol (29) em S. indicum já foi relatada por Chiang et al.,
(1991).
Com relação à atividade biológica de substâncias dessa classe, saponinas
esteroidais isoladas de Paris polyphylla mostraram potencial atividade
gastroprotetora e foram capazes de inibir úlceras induzidas por etanol. Segundo os
autores, a presença de anel espirostânico e a ligação do açúcar na posição 3 são
essenciais para a atividade (MATSUDA et al., 2003). Yoshikawa et al. (2005)
também relataram a atividade gastroprotetora de saponinas esteroidais isoladas de
Camela sinensis.
Glicosídeos esteroidais isolados de espécies de Solanum apresentaram
atividade antiviral frente à HHV-1 e atividade citotóxica frente a linhagens tumorais
humanas de pulmão (PC-12) e cólon (HCT-116). Os autores sugerem que a
potência da atividade está relacionada com a natureza do núcleo esteroidal, sendo
os compostos de núcleo espirostânico os mais potentes. A natureza do açúcar
ligado à aglicona também pode influenciar as atividades antiviral e citotóxica (IKEDA
et al., 2003; 2000; NAKAMURA et al., 1996).
Esses dados sugerem que a saponina e a sapogenina esteroidais isoladas de
S. paniculatum no presente trabalho podem estar relacionadas com seu uso popular
como gastroprotetor, antiviral e em casos de distúrbios gastrointestinais.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
115
5.3 Ensaios biológicos
5.3.1 Ensaios in vitro de atividade antiviral
Espécies de Solanum são empregadas tradicionalmente para o tratamento de
câncer e como antiherpética em diversos países (NAKAMURA et al., 1996). Neste
contexto, o extrato bruto de S. paniculatum e as substâncias Sp2 (49) e Sp3 (51)
isoladas deste, no presente trabalho, foram avaliados in vitro frente aos vírus HHV-1
(vírus da herpes humano tipo 1), EMC (vírus da encefalomiocardite murina) e VACV-
WR (vírus da vaccinia), cujo título viral frente à células VERO foi HHV-1 = 2,5 x 10
6
TCID
100
/ml em 48 horas, EMC = 1,0 x 10
6
TCID
100
/ml em 48 horas e VACV-WR = 1,0
x 10
6
TCID
100
/ml em 72 horas.
O extrato bruto de S. paniculatum mostrou atividade antiherpética (CI
50
=
298,0 ± 11,2
µ
g/ml) e citotóxica (CC
50
= 428,9 ± 19,2
µ
g/ml). A sapogenina
neotigogenina Sp2 (49) não foi ativa frente às cepas virais ensaiadas, no entanto
mostrou-se altamente citotóxica frente às células VERO (CC
50
= 2,03 ± 0,03
µ
g/ml),
sugerindo potencial atividade antitumoral. Dados da literatura indicam que esta
substância foi ensaiada in vivo e in vitro frente a linhagens tumorais de leucemia
(P388), carcinoma de pulmão (Lewis) e melanoma (B16) em estudo realizado pelo
Instituto Nacional de Câncer dos EUA; porém, foi inativa em todos os modelos
(Developmental Therapeutics Program NCI/HIH, 2008). Por outro lado, a saponina
Sp3 (51) mostrou significativa atividade antiherpética (CI
50
= 170,8 ± 1,7
µ
g/ml) e
anti-vaccinia (EC
50
= 177,0 ± 3.3
µ
g/ml), além de baixa citotoxicidade (CC
50
> 400
µ
g/ml). A tabela 34 mostra as concentrações do extrato bruto e das substâncias
isoladas de S. paniculatum necessárias para produzir a redução de 50% da
viabilidade celular nos ensaios antivirais e de citotoxicidade.
Os resultados indicam que o extrato bruto de S. paniculatum constitui uma
fonte promissora de substâncias com atividade antiherpética e anti-vaccinia, sendo a
saponina 51, um dos compostos responsáveis pela atividade antiviral do extrato. Os
resultados de atividade biológica aqui relatados fornecem evidências para corroborar
o uso tradicional de S. paniculatum como antiviral. Estudos posteriores in vivo são
necessários para comprovar esta potencialidade.
O efeito antiviral de glicosídeos esteroidais como 52 e 53 isolados de
espécies de Solanum (S. nigrum, S. dulcamara) foi demonstrado frente ao vírus da
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
116
herpes humana tipo 1 (HHV-1) e a citotoxicidade relatada para linhagens de células
tumorais humanas de pulmão (PC-12) e cólon (HCT-116) (IKEDA et al., 2003;
IKEDA et al., 2000; NAKAMURA et al., 1996). Segundo IKEDA et al. (2003), a
potência da atividade antiviral apresentada pelos glicosídeos esteroidais de Solanum
está relacionada com a natureza da aglicona, sendo as de núcleo espirostânico as
mais potentes. Os autores também sugerem que a estereoquímica de C-25 é um
fator importante para a atividade citotóxica, sendo os compostos com configuração
25R dez vezes mais potentes do que a cisplatina (CDDP) empregada como controle
positivo.
52: R = H; 25R
53: R = H; 25 S:R (2:1)
Tabela 34 -
Citotoxicidade (CC
50
) e atividade antiviral (CI
50
) in vitro do extrato bruto e
substâncias isoladas de S. paniculatum.
CC
50
(µ
µµ
µg/ml)
CI
50
(µ
µµ
µg/ml)
Amostras
Células
Vero
HHV-1
a
IT
b
EMCv
c
VACV-WR
d
IT
b
Extrato
428,9 ± 19,2
298,0 ± 11,2
1,4 NA
e
NA
e
Sp2 (49)
2,03 ± 0,03 NA
e
NA
e
NA
e
Sp3 (51)
> 400 170,8 ± 1,7 > 2,3
NA
e
177,0 ± 3,3 > 2,2
Aciclovir
f
40
α
αα
α-2a Interferon
fg
1,5 ×
10
2
fg
2,0 ×
10
3
Nota:
b
IT, índice terapêutico;
a
título viral 2,5 x 10
6
TCID
100
/ml em 48 h;
c
título viral 1,0 x 10
6
TCID
100
/ml
em 48 h;
d
título viral 1,0 x 10
6
TCID
100
/ml em 72 h;
e
NA: não ativo nas concentrações ensaiadas;
f
80 a
100% de inibição do efeito citopático;
g
concentração em UI/ml.
O
O
H
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
HO
OH
OH
HO
OH
R
HO
HO
OH
OH
O
H
HO
H
H H
H
H
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
117
5.3.2 Ensaio ex vivo de absorção de lipídeos
Uma das propostas iniciais do trabalho era empregar um ensaio in vitro, de
simples execução, para monitorar o fracionamento dos extratos, visando isolar os
constituintes bioativos, responsáveis pelo efeito das espécies sobre o metabolismo
de lipídeos. A revisão da literatura indicou o ensaio in vitro com alças intestinais
evertidas como adequado ao nosso propósito. Neste modelo, o jejuno dos animais é
retirado, lavado in situ, evertido, preenchido com solução serosa e então separado
em sacos de aproximadamente 2 cm. Os sacos são mergulhados em solução
mucosa contendo a substância ensaiada. É um modelo simples e bastante
empregado para avaliar a absorção intestinal de diferentes moléculas tais como
AZT-Ac e AZT-Iso, duas novas pro-drogas derivadas do AZT (QUEVEDO; BRIÑÓN,
2009); midazolan, enzima do citrocromo P450 (ARELLANO et al., 2007) e do
fármaco antiarrítmico amiodarona (SHAYEGANPOUR et al., 2008).
Previamente à avaliação dos extratos no modelo escolhido, decidiu-se
ensaiar o fitoterápico que contém os extratos das três espécies em estudo, além de
uma espécie exótica (E. centaurium), já que ele apresentou atividade nos modelos in
vivo (BOTION et al, 2005). Os experimentos foram realizados utilizando-se um grupo
controle G1 (sem a adição do fitoterápico à solução mucosa), e cinco grupos
experimento, G2, G3, G4, G5 e G6, nos quais se adicionou à solução mucosa
volumes da formulação fitoterápica (1, 3, 10, 30 e 100 µL, respectivamente). Todos
os grupos (G1, G2, G3, G4, G5 e G6) foram ensaiados em triplicata.
Os resultados obtidos mostraram que a administração da formulação
fitoterápica à solução mucosa, em volumes crescentes, não resultou em aumento
estatisticamente significativo, a um nível de confiança de 95%, nos triglicérides
absorvidos pela membrana intestinal nos grupos experimento, em relação ao grupo
controle (Tabela 35, Figura 34).
Os resultados obtidos sugerem que a formulação não atua no mecanismo de
absorção intestinal de lipídeos, ou seja, provavelmente não é este o mecanismo de
ação pelo qual a administração do fitoterápico resulta no alívio dos sintomas de má
digestão. Este resultado sugere a participação de outros mecanismos possíveis
como a formação e liberação de quilomícrons, a secreção hormonal ou a síntese e
liberação de bile, como responsáveis pela atividade do fitoterápico. Modelos in vivo
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
118
para avaliação de fluxo biliar e secreção hormonal podem fornecer indícios sobre o
mecanismo de ação (LEWIS et al., 1995; MANSBACH; NEVIN, 1998). Assim,
considerando os resultados obtidos, os extratos das espécies em estudo não foram
ensaiados no modelo in vitro de absorção de lipídeos. Optou-se, então, pela
avaliação somente em ensaios in vivo.
Tabela 35 -
Concentrações de triglicérides absorvidos (mmol/mL) em alças intestinais
evertidas, determinadas para o grupo controle (G1) e para os grupos tratados com o
fitoterápico (G2, G3, G4, G5 e G6).
Grupos
(volume de fitoterápico µL)
Concentração de triglicérides (mmol/mL)
G1 - Controle 2,16 ± 0,74
G2 (1) 1,83 ± 0,61
G3 (3) 1,75 ± 0,58
G4 (10) 1,92 ± 0,79
G5 (30) 1,82 ± 0,62
G6 (100) 1,92 ± 0,65
Nota: Para o cálculo da estatística
t
de Student (p > 0,05), utilizada no teste de igualdade de
médias, foi considerado que as amostras são independentes e têm variâncias diferentes.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
G1 G2 G3 G4 G5 G6
Grupos
Concentração de Triglicérides (mmol/mL)
Figura 34 -
Concentração de triglicérides (mmol/mL) determinada no experimento com alças
intestinais evertidas para o grupo controle (G1) e grupos tratados com volumes crescentes do
fitoterápico (G2, 1 µL; G3, 3 µL; G4, 10 µL; G5 30 µL; G6, 100 µL).
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
119
5.3.3 Ensaios in vivo de absorção de lipídeos
Experimentos anteriores com uma formulação fitoterápica contendo os
extratos fluidos das três espécies em estudo (J. caroba, R. ferruginea, S.
paniculatum), além de Erythraea centaurium, mostraram que o produto não afeta os
níveis plasmáticos de glicose, colesterol total e HDL de animais tratados com o
fitoterápico, em relação ao grupo controle. Porém, o nível plasmático de triglicérides
(TAG) do grupo tratado mostrou um aumento dose-dependente (2,59 ± 0,18
mmol/mL), em relação ao grupo controle (2,00 ± 0,18 mmol/mL). (BOTION et al.,
2005). No mesmo estudo, a atividade da lipase lipoprotéica (LPL) do tecido adiposo
epididimal de animais tratados apresentou um aumento de 35,29% na atividade em
relação ao grupo controle (BOTION et al., 2005). Segundo os autores, o aumento da
concentração de TAG nos animais tratados com dieta hiperlipídica poderia ser
explicado pelo incremento na absorção de lipídeos ou pela redução de partículas
ricas em TAG, principalmente quilomícrons, no estado pós-prandial. Os resultados
obtidos indicaram que a administração do fitoterápico, anteriormente à ingestão de
dieta hiperlipídica, produz um aumento de lipídeos no plasma, demonstrando o efeito
da associação dos extratos sobre a absorção de triglicérides.
O nível plasmático de TAG é determinado pelo balanço entre a absorção
dietética deste macronutriente, sua síntese endógena e utilização pelos tecidos
periféricos. Dentre as enzimas relacionadas ao metabolismo lipídico, a LPL exerce
papel chave. A LPL é uma enzima responsável pelo clearance das lipoproteínas
circulantes, estando localizada no endotélio vascular de tecidos extra-hepáticos,
como tecido adiposo, coração e músculo esquelético. Sua atividade pode ser
alterada rapidamente em resposta ao estado nutricional (BOTHAM et al, 1997).
No presente trabalho, a fim de avaliar o efeito de cada uma das espécies no
metabolismo de TAG, previamente demonstrado para o fitoterápico composto de R.
ferruginea, S. paniculatum e J. caroba, os extratos de cada uma das espécies foram
ensaiados in vivo em ratos submetidos a dieta hiperlipídica, nas concentrações de
0,1, 1,0 e 5,0 mg/Kg de peso corporal (PC). A atividade da LPL foi avaliada em
amostras de tecido adiposo epididimal dos animais de cada grupo.
Na dose de 0,1 mg/Kg de PC, nenhum dos extratos administrados provocou
alteração significativa nos níveis plasmáticos de TAG, em relação aos animais do
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
120
grupo controle (p < 0,05) (Figura 35). Por outro lado, o aumento da dose
administrada para 1,0 mg/Kg de PC induziu aumento significativo nos níveis de TAG
plasmático para R. ferruginea, S. paniculatum e J. caroba. Na dose de 5,0 mg/Kg de
PC, os níveis de TAG plasmático permaneceram aumentados para R. ferruginea e J.
caroba, porém equipararam-se novamente ao grupo controle com a administração
de S. paniculatum. A administração dos extratos de cada uma das espécies na dose
de 10 mg/Kg de PC não apresentou qualquer efeito significativo sobre os níveis de
TAG plasmático.
A administração dos extratos de R. ferruginea, S. paniculatum e J. caroba
(0,1 mg/Kg de PC) em animais tratados com dieta hiperlipídica resultou em aumento
significativo (p < 0,05) na atividade da enzima LPL para todos os grupos em relação
ao grupo controle. Entretanto, quando administrados na dose de 1,0 mg/Kg de PC,
nenhum dos extratos alterou a atividade da LPL em relação ao grupo controle. A
administração dos extratos na dose de 5,0 mg/Kg de PC resultou no aumento da
atividade da LPL apenas para o grupo tratado com S. paniculatum (p < 0,05). A
Figura 35 ilustra os efeitos observados para os extratos sobre o nível de TAG
plasmático e sobre a atividade da LPL.
Os resultados obtidos indicam uma correlação inversa entre o aumento da
atividade da LPL (enzima responsável pela hidrólise dos TAG circulantes) e o nível
de triglicérides plasmático para os animais tratados com R. ferruginea, S.
paniculatum e J. caroba na dose de 1,0 mg/Kg de PC. Maiores doses dos extratos
não alteraram a atividade da LPL, com exceção de S. paniculatum, cuja
administração de 5,0 mg/Kg de PC promoveu aumento na atividade enzimática.
Estudos prévios corroboram os resultados obtidos no presente trabalho e
indicam uma correlação inversa entre os níveis de TAG plasmático e a atividade da
enzima LPL. Baroukh et al (2004) demonstraram que camundongos que
superexpressam a apolipoproteína A5 apresentam um decréscimo no nível de TAG
plasmático, induzido pela aceleração do catabolismo de TAG, resultante da ativação
direta da LPL. Xie et al (2007) atribuíram o efeito hipolipidêmico da espécie Ananas
comosus à ativação seletiva da LPL, resultando na redução dos níveis de lipídeos
circulantes.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
121
As espécies J.caroba, R.ferruginea e S. paniculatum, são constituintes de um
produto fitoterápico empregado no tratamento de dispepsias, como previamente
mencionado. A administração do fitoterápico a ratos tratados com dieta hiperlipídica
promoveu um aumento dos níveis de TAG plasmático (BOTION et al., 2005). Os
experimentos realizados com cada espécie isoladamente mostraram que o efeito
dos extratos no metabolismo de lipídeos deriva da indução da absorção intestinal de
TAG e do clearance, dose-dependente, dos TAG’s circulantes, resultante da
ativação da LPL. Os resultados do presente trabalho comprovam a participação dos
extratos no efeito relatado previamente para o fitoterápico.
A atividade anti-hiperlipidêmica dos ácidos ursólico e oleanólico foi
demonstrada em ratos geneticamente hipertensos (Dahl, DSS), observando-se um
decréscimo superior a 50% nos níveis de TAG plasmático e LDL após seis semanas
de tratamento (SOMOVA et al., 2003). Estes dados sugerem a participação do ácido
ursólico no efeito dos extratos de J. caroba e R. ferruginea sobre o metabolismo de
lipídeos, visto que este triterpeno foi isolado de ambas as espécies no presente
trabalho. Estudos adicionais são necessários para confirmar a participação deste
composto e de outros triterpenos no efeito observado.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
122
Dose resposta - E2
C 0.1 mg 1.0 mg 5.0mg
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
*
*
LPL (mU)
Dose resposta - E3
C 0.1 mg 1.0 mg 5.0 mg
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
*
LPL (mU)
Dose resposta - E1
C 0.1 mg 1.0 mg 5,0 mg
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
*
LPL (mU)
LPL
TAG
Dose-resposta - E1
C 0.1 mg 1.0 mg 5.0 mg
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
*
*
Triacilglicerol
(mmol/L)
Dose resposta - E2
C 0.1 mg 1.0 mg 5.0 mg
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
*
Triacilglicerol
(mmol/L)
Dose resposta - E3
C 0.1 mg 1.0 mg 5.0 mg
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
*
*
Triacilglicerol
(mmol/L)
Figura 35 -
Efeito dos extratos avaliados no nível de TAG plasmático e na atividade da LPL.
C: grupo controle.
R. ferruginea
R. ferruginea
S. paniculatum
S. paniculatum
J. caroba
J. carob
a
Conclusões
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
123
6 CONCLUSÕES
•
O fracionamento de J. caroba levou ao isolamento dos ácidos ursólico e
oleanólico, que correspondem a aproximadamente 4% da composição total do
extrato, além de
β
-sitosterol. De R. ferruginea foram obtidos ácido ursólico,
β
-
sitosterol e estigmasterol, inéditos na espécie. O fracionamento de S.
paniculatum resultou no isolamento da sapogenina espirostânica neotigogenina,
inédita no gênero, e da saponina inédita 3-O-β-D-glicopiranosídeo ∆
25(27)
-
tigogenina, além de uma mistura de
β
-sitosterol e estigmasterol.
•
S. paniculatum apresentou atividade antiviral in vitro frente aos vírus HHV-1 e
EMCv, e a saponina 3-O-β-D-glicopiranosídeo ∆
25(27)
-tigogenina foi identificada
como substância bioativa frente a ambas linhagens virais.
•
Os extratos de S. paniculatum, R. ferruginea e J. caroba induziram aumento da
absorção de lipídeos em animais tratados com dieta hiperlipídica. Os extratos
promoveram aumento da atividade da lipase lipoprotéica, observando-se uma
correlação inversa entre os níveis de triglicérides plasmáticos e a atividade
enzimática.
•
Um produto fitoterápico contendo extratos de S. paniculatum, R. ferruginea e J.
caroba não resultou em aumento significativo na absorção de triglicérides em
preparações ex vivo de alça intestinal evertida.
PARTE 2
Transformações Químicas dos Ácidos Ursólico e Oleanólico
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
125
7 REVISÃO DA LITERATURA
Triterpenos são compostos com 30 átomos de carbono, derivados
biossinteticamente da ciclização do esqualeno. Os triterpenos compreendem um
grande número de substâncias naturais, observando-se uma expressiva variedade
de grupos funcionais (HONDA, 2000).
Os ácidos ursólico (31) e oleanólico (42) são isômeros constitucionais,
distinguindo-se apenas quanto à localização de dois grupos metila no anel E: no
ácido ursólico eles se localizam em C-20 e em C-19, enquanto no ácido oleanólico
ambos estão em C-20. São triterpenos de ampla distribuição, sendo encontrados em
espécies alimentícias, medicinais e outras, seja na sua forma livre (agliconas) ou
como heterosídeos (saponinas). Durante as últimas décadas, diversos trabalhos
relatando o isolamento, modificações estruturais, avaliação de atividades
farmacológicas, toxicidade e ensaios clínicos foram publicados para estes dois
triterpenos, refletindo o grande interesse científico e as potencialidades dessas
substâncias na terapêutica (LIU; 1995; LIU, 2005; MA et al., 2005; SULTANA; ATA,
2009).
Entre as diversas atividades biológicas já relatadas para os ácidos ursólico e
oleanólico destacam-se as ações hepatoprotetora (SARAVANAN et al., 2006),
antiinflamatória (IKEDA et al., 2008; SINGH et al., 1992), hipolipidêmica e
antiaterosclerótica (MA, 1986; SARAVANAN et al., 2006; SOMOVA et al., 2003),
hipocolesterolemiante (LIN et al., 2009), tripanossomicida (CUNHA et al., 2003;
LEITE et al., 2006), imunomoduladora (RAPHAEL; KUTTAN, 2003), antimicrobiana,
(MALLAVADHANI et al., 2004), anti-HIV (KASHIWADA et al., 2000; LEE et al.,
2008), antibacteriana (FONTANAY et al., 2008), antiúlcera gástrica e gastroprotetora
(GOMES et al., 2009), hipoglicêmica (LIU et al., 1995), antiosteoporótica (LEE et al.,
2008), antidiabética (JANG et al., 2009) e anticoncepcional (LIU., 1995).
Os ácidos ursólico e oleanólico também apresentam atividade antitumoral in
vitro e in vivo, atuando como agentes antimutagênicos, inibidores da iniciação,
diferenciação e proliferação de células tumorais (HSU et al., 2000; RESENDE et al.,
2006). Ambos os triterpenos apresentam atividade inibitória da angiogênese e da
proliferação tumoral, bloqueando a diferenciação das células tumorais, processos
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
126
envolvidos na formação de metástases. Portanto, esses compostos podem
potencialmente inibir diversos estágios do desenvolvimento de tumores. O ácido
ursólico mostrou atividade in vitro contra leucemia, melanoma, hepatoma e
carcinomas de pulmão, ovário, cólon, cérvix e cérebro. Por sua vez, o ácido
oleanólico foi ativo in vitro contra leucemia e carcinomas de pulmão, ovário, cólon,
pâncreas, rim e mama (ANDERSSON et al., 2003; LI et al., 2002; OVESNÁ et al.,
2004).
A atividade antiplasmódica in vitro também foi previamente relatada para os
ácidos ursólico e oleanólico (STEELE et al., 1999), bem como para os triterpenos
lupeol (ALVES et al., 1997) e ácido betulínico (STEELE et al., 1999). Foram obtidos
diversos derivados sintéticos do lupeol, incluindo X4Y10 (54), o qual se mostrou
nove vezes mais ativo in vitro contra o Plasmodium falciparum (CI
50
= 13,07
µ
g/mL)
que a substância de origem (CI
50
= 117
µ
g/mL), indicando a potencialidade de
derivados de triterpenos como fonte de novos agentes antimaláricos (KAUR et al.,
2009).
54
Os dados sobre a composição química de R. ferruginea relatados no presente
trabalho, incluindo o isolamento de ácido ursólico e de outros triterpenos (Capítulo I,
item 5.1.2), permitem-nos supor que o uso tradicional da espécie como antimalárico
esteja associado à presença de substâncias dessa classe. Além disso, a espécie
Jacaranda caroba também constitui uma fonte abundante desses triterpenos
(Capítulo I, item 5.1.1), especialmente dos ácidos ursólico e oleanólico, o que
motivou sua utilização como material de partida para a síntese de derivados, no
presente trabalho. Tendo em vista relatos anteriores sobre a potencial atividade
antitumoral dos ácidos oleanólico e ursólico, bem como sobre a atividade
antiplasmódica de derivados do lupeol, os produtos de transformação química
obtidos no presente estudo foram avaliados in vitro frente a linhagens tumorais
O
Br
O
NH
2
OO
)(
6
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
127
humanas e, também, frente a Plasmodium falciparum, um dos agentes etiológicos da
malária.
7.1 Transformações químicas dos ácidos ursólico e oleanólico
Diversos derivados sintéticos dos ácidos ursólico e oleanólico encontram-se
descritos na literatura, os quais tiveram suas atividades biológicas avaliadas em
modelos variados, indicando a potencialidade dessas substâncias como fonte de
novas moléculas bioativas. Assim, derivados do ácido ursólico com substituintes em
C-3 e C-28 apresentaram potente atividade antiúlcera in vivo (55, DE
50
= 3,7 mg/Kg;
56, DE
50
= 16,8 mg/Kg peso corporal), 5 a 20 vezes superior à carbenoxolona
utilizada como controle positivo (DE
50
= 62 mg/Kg peso corporal) (FARINA et al.,
1998; SÁNCHEZ et al., 2006).
A atividade anti-HIV dos ácidos oleanólico (42) e ursólico (31) foi descrita em
ensaios in vitro com linfócitos H9 [42, CI
50
= 3,7
µ
g/mL e IT (Índice Terapêutico) =
12,9; 31, CI
50
= 4,4
µ
g/mL e IT = 3,3] (KASHIWADA et al., 2000). Esses resultados
motivaram a síntese de derivados do ácido oleanólico, os quais foram avaliados in
vitro, empregando-se AZT como controle positivo (CI
50
= 0,01
µ
g/mL e IT = 50000) e
possibilitaram identificar o composto 57 com elevada atividade (CI
50
= 0,0039
µ
g/mL
e IT = 3570) (ZHU et al., 2001). Derivados do ácido ursólico também foram
avaliados; porém, estes não se mostraram tão promissores.
55 56
57
O
O
CO
2
Na
O
O
CO
2
Na
O
O
CO
2
Na
O
O
CO
2
Na
COOHH
O
H
H
HOOC
O
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
128
A atividade antimicrobiana in vitro de derivados do ácido ursólico foi avaliada
frente à bactéria gram negativa Pseudomonas syringae, sendo o composto 58 cerca
de 1,6 vezes mais ativo que a tetraciclina empregada como controle
(MALLAVADHANI et al., 2004). Cunha et al. (2007) avaliaram a atividade
antimicrobiana dos ácidos ursólico e oleanólico, bem como de seus derivados
sintéticos modificados nas posições 3 e 28 frente a Streptococcus mutans,
Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius,
Streptococcus sobrinus e Enterococcus faecalis, microorganismos responsáveis pela
formação de cáries dentais em humanos. Todos os triterpenos ensaiados mostraram
atividade frente aos microorganismos, indicando sua potencialidade como agentes
anti-placa e anti-cárie. Porém, os derivados sintéticos foram menos ativos que seus
precursores, sugerindo que a hidroxila livre em C-3 e a carboxila em C-28 são
importantes para a atividade.
Chen et al., (2006) identificaram o ácido oleanólico e alguns derivados
sintéticos (contendo grupos 3-oxo, 3-O-acila, 28-ésteres e 28-amino) como uma
nova classe de agentes hipoglicemiantes que atuam através da inibição da
glicogênio fosforilase, enzima responsável pela quebra de glicogênio e conseqüente
produção de glicose. A inibição α-glicosidase, presente no intestino delgado e
responsável pela hidrólise da glicose, também foi descrita por Ali et al., (2002) para o
ácido oleanólico e alguns derivados sintéticos. Todos os derivados foram ativos,
sugerindo promissora atividade hipoglicemiante, sendo que o ácido oleanólico (42) e
as lactonas 59 e 60 apresentaram atividade (42, CI
50
= 11,16
µ
M; 59: CI
50
= 7,97
µ
M;
60: CI
50
= 21,63
µ
M) superior ao controle positivo desoxinojirimicina (CI
50
= 353
µ
M).
58 59
60
HO
O
O
OH
O
O
O
O
COOH
H
OOC
H
H
CH
3
(CH
2
)
12
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
129
Zhang et al. (2006) demonstraram que o ácido ursólico e seu derivado
sintético UA0713 (61) são promissores para o tratamento de diabetes tipo II e
obesidade através da inibição competitiva da enzima proteína tirosina fosfatase 1B
(PTP1B), associada à resistência à insulina. O derivado UA0713 (CI
50
= 570 nM) foi
dez vezes mais potente que o ácido ursólico (CI
50
= 3,08
µ
M) e eqüipotente a uma
molécula monofosfatada (CI
50
= 614 nM) cujos testes pré-clínicos já se encontram na
fase II.
Ursanos e oleananos com modificações nos anéis A e C apresentam elevada
atividade inibitória da produção de óxido nítrico, induzido por interferon-
γ
, sugerindo
o potencial destes compostos como agentes quimiopreventivos de câncer, visto que
a produção excessiva de NO está relacionada ao processo de carcinogênese
(HONDA et al., 2000a). Derivados ursan-1-en-3-ona e olean-1-en-3-ona (62) com a
presença de grupos nitrila em C-2 (63) (CI
50
= 0,01 – 0,1
µ
M) foram de 10 a 100
vezes mais potentes que os precursores ácido ursólico e oleanólico. Os derivados
ursan-9(11)-en-12-ona, 12-en-11-ona e 13(18)-en-11-ona e olean-9(11)-en-12-ona,
12-en-11-ona e 13(18)-en-11-ona foram de 2 a 10 vezes mais potentes que os
precursores. Quando foram realizadas modificações nos anéis A e C, obteve-se o
derivado 64 (2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9(11)-en-12-ona; CDDO), extremamente
potente (CI
50
= 0,1 nM) (HONDA et al., 2000b).
61 62
63 64
HO
N
N
COOH
H
(
)
8
O
H
O
COOH
O
COOH
O
CN
COOH
O
O
C
N
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
130
Place et al. (2003) observaram que o derivado 1[2-ciano-3,12-dioxolean-
1,9(11)-dien-28-oil] imidazol (65) (CI
50
= 10 nM) possui maior atividade citotóxica in
vitro quando comparado com o derivado estruturalmente relacionado 64 (CI
50
= 200
nM), frente às linhagens de células tumorais THP-1, U960 e HL-60. Estes resultados
também se reproduziram in vivo, sendo 65 mais potente, inibindo 75% do
crescimento de tumores de melanoma B16 na dose de 100
µ
g por dia. Segundo os
autores, este é um derivado altamente potente e bastante promissor para o
tratamento do câncer e como agente quimiopreventivo.
Tendo como base estudos prévios que relataram a potente atividade
citotóxica do derivado do ácido oleanólico (64), associada à presença do grupo
eletronegativo ciano na posição 2, Chadalapaka et al. (2008) sintetizaram análogos
esterificados na posição 28 e avaliaram a atividade citotóxica in vitro frente às
linhagens de células tumorais de bexiga (253JB-V e KU7) e pâncreas (Panc 1 e
Panc 28). O derivado 66 foi empregado como controle positivo, com valores de CI
50
variando entre 5,9 e 7,3
µ
M para as distintas linhagens celulares. Dentre os
derivados ensaiados, os compostos 67 e 68 se mostraram promissores, com valores
de CI
50
variando entre 0,17 e 1,13
µ
M.
65 66
67 68
O
O
C
N
N
N
O
COOCH
3
O
O
C
N
COOCH
3
O
NC
COOCH
3
F
3
C
O
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
131
A atividade citotóxica in vitro do ácido ursólico e derivados sintéticos com
modificações nas posições C-3, C-28 e C-11 foi relatada por Ma et al. (2005) para
linhagens de células tumorais HL-60, BGC, Bel-7402 e Hela. O derivado 3β-amino
69 (CI
50
= 2,5
µ
g/mL) foi cerca de trinta e seis vezes mais potente que o precursor
ácido ursólico (CI
50
= 72,0
µ
g/mL) frente à linhagem HL-60 e cerca de vinte vezes
mais potente frente às demais linhagens celulares.
A atividade citotóxica dos ácidos ursólico, oleanólico e derivados foi avaliada
in vitro frente a linhagens de células tumorais de próstata NRP.152 e NRP.154,
sendo TGF-
β
empregado como controle positivo. Os derivados 70 e 71 foram os
mais ativos (70, CI
50
= 0,7
µ
M; 71, CI
50
= 0,3
µ
M; TGF-
β
, CI
50
= 0,000014
µ
M)
(FINLAY et al., 1997). Assefa et al. (1999) avaliaram a citotoxicidade do ácido
oleanólico e derivados frente cultura de células tumorais humanas de melanoma SK-
MEL. Entre os derivados ensaiados, a cetona 72 (CI
50
= 54
µ
M) se mostrou o mais
promissor, sendo 3,6 vezes mais potente que o precursor ácido oleanólico (CI
50
=
112
µ
M).
69 70
71 72
Derivados do ácido ursólico (31) contendo grupamentos amina, amida e éster
nas posições C-3 e C-28 foram avaliados in vitro frente a linhagens de células
tumorais humanas gástricas BGC-823 e de ovário SKOV3. Paclitaxol foi empregado
COOCH
3
H
2
N
COOH
H
2
N
COOH
H
2
N
COOH
O
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
132
como controle positivo (BGC-823 CI
50
= 0,018
µ
M e SKOV3 CI
50
= 0,016
µ
M). Os
derivados 73 (BGC-823 CI
50
> 10
µ
M e SKOV3 CI
50
= 6,09
µ
M) e 74 (BGC-823 CI
50
= 8,53
µ
M e SKOV3 CI
50
= 2,24
µ
M) foram os mais ativos para as linhagens
ensaiadas (MENG et al., 2009).
Os ceto-derivados (75 e 76) do ácido oleanólico foram selecionados dentre 80
derivados dos ácidos ursólico e oleanólico como os mais promissores com potencial
atividades quimiopreventiva do câncer e antiinflamatória. Ambos os derivados foram
capazes de suprimir in vitro a formação das enzimas NO sintase (75, CI
50
= 3,9
µ
M;
76, CI
50
= 4,2
µ
M) e COX-2, sendo a formação desta suprimida pelo derivado 76 na
concentração de 10
µ
M. Estes resultados indicam a potencialidade de emprego
destes derivados como agentes quimiopreventivos do câncer ou outras doenças
crônicas com um componente inflamatório (câncer de cólon, esclerose múltipla,
Parkinson e Alzheimer), nas quais se observa produção exacerbada de NO ou
prostaglandinas (SUH et al., 1998).
73 74
75 76
Alguns estudos relatam a baixa toxicidade dos ácidos ursólico e oleanólico.
Singh et al. (1992) administraram 1g/kg de ácido oleanólico em ratos e
camundongos, via subcutânea, durante 5 dias, sem nenhuma mortalidade. A
administração, por via oral de 180 mg/Kg de peso corporal, durante 10 dias não
CONHCH
2
CH
2
OCOCH
3
H
3
CCOO
CONH(CH
3
)CH
2
OCOCH
3
H
3
CCOO
COOH
O
O
COOH
O
O
Revisão da Literatura
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
133
provocou nenhuma alteração no cérebro, coração, pulmão, fígado, rins, tireóide,
estômago ou intestino. O emprego clínico também já foi avaliado e nos setenta
casos nos quais se empregou o ácido oleanólico na dose de 60 – 90 mg/dia, durante
53 dias, para o tratamento de hepatites, demonstrou sua eficiência terapêutica e
ausência de efeitos colaterais (XU; WAN, 1980). O uso crônico (mais de 3 meses)
também foi avaliado em 188 casos de hepatites crônica, indicando a segurança do
triterpeno (XU, 1985 apud LIU, 1995).
Tendo em vista as diversas atividades biológicas já relatadas para os ácidos
ursólico e oleanólico, bem como para seus derivados sintéticos, além da baixa
toxicidade dessas substâncias, é grande o interesse na síntese de derivados dos
ácidos ursólico e oleanólico, visando obter substâncias bioativas que poderão
viabilizar estudos futuros de relação estrutura química-atividade biológica,
constituindo o ponto de partida para o desenvolvimento de novos fármacos.
Segundo dados da literatura, apresentados nessa breve revisão, as posições
3, 11 e 28, e os anéis A, C e D do esqueleto triterpênico são alvos potenciais para
transformações químicas, visando o incremento das atividades quimiopreventiva de
câncer e citotóxica. Assim, tendo como objetivo a obtenção de substâncias
biologicamente ativas, no presente trabalho foram sintetizados derivados do ácido
ursólico e do ácido oleanólico, com modificações nas posições C-3, C-11 e C-28 do
esqueleto triterpênico.
Objetivos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
134
8 OBJETIVOS
8.1 A proposta do trabalho
O isolamento dos ácidos ursólico e oleanólico em grandes quantidades (Parte
1, item 4.6.1) possibilitou sua utilização como substrato para a obtenção de
derivados por transformações químicas. Esta parte do trabalho foi realizada na
Universidade de Salamanca (USAL), Espanha, durante o período de estágio de
doutorado sanduíche. As substâncias obtidas foram avaliadas em ensaios in vitro de
atividade antitumoral e antiplasmódica, tendo em vista relatos na literatura dessas
atividades biológicas para os ácidos ursólico, oleanólico e derivados.
Os principais objetivos desta parte do trabalho foram:
•
Obter derivados dos ácidos ursólico e oleanólico através de
transformações químicas nas posições C-3, C-11 e C-28 do esqueleto
triterpênico.
•
Caracterizar os produtos obtidos por métodos espectrométricos usuais
(infravermelho, espectrometria de massas, ressonância magnética
nuclear de hidrogênio e de carbono-13).
•
Avaliar in vitro a potencial atividade antitumoral dos derivados frente a
linhagens celulares tumorais humanas.
•
Avaliar in vitro a potencial atividade antiplasmódica dos derivados
frente a culturas de Plasmodium falciparum.
As Figuras 36, 37 e 38 representam o esquema de síntese proposto no
presente trabalho para a obtenção dos derivados.
Objetivos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
135
CH
3
I/K
2
CO
3
Piridina/anidrido
acético NaClO
2
t-BuOOH
NaBH
4
/CeCl
3
COOCH
3
HO
CH
2
OH
HO
HO
CH
2
OH
HO
Figura 36 -
Esquema de síntese proposto para obtenção de derivados do ácido ursólico.
31
LiAlH
4
Piridina/anidrido
acético
Porfirina/MCPBA
COOH
HO
COOH
H
3
CCOO
COOH
H
3
CCOO
HO
COOCH
3
H
3
CCOO
COOCH
3
H
3
CCOO
O
Objetivos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
136
CH
3
I/K
2
CO
3
PDC
NH
2
OH.HCl
SeO
2
COOCH
3
HO
COOCH
3
O
COOCH
3
O
O
COOCH
3
N
OH
Figura 37 -
Esquema de síntese proposto para obtenção de derivados do ácido ursólico
.
NaClO
2
/
t-BuOOH
COOH
HO
31
COOCH
3
O
O
Objetivos
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
137
PDC
Piridina/anidrido
acético
NaClO
2
t-BuOOH
COOH
HO
COOCH
3
HO
COOCH
3
O
COOCH
3
N
OH
NH
2
OH.HCl
Figura 38 -
Esquema de síntese proposto para obtenção de derivados do ácido oleanólico.
CH
3
I/K
2
CO
3
COOCH
3
O
O
42
COOCH
3
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
138
9 MATERIAIS E MÉTODOS
9.1 Procedimentos gerais
Os valores de poder rotatório específico [
α
]
D
, foram medidos em polarímetro
Perkin-Elmer 241 (Laboratório de Química Farmacêutica, USAL, ES), a 20ºC.
Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos em
espectrômetros WP 200 SY e Avance DRX 400, ambos da Bruker (Laboratórios de
Ressonância Magnética Nuclear, Departamento de Química, USAL, ES; Laboratório
de Ressonância Magnética Nuclear, Departamento de Química, UFMG). Foram
empregados como padrão interno o tetrametilsilano ou o próprio solvente deuterado.
Os valores de deslocamento químico foram descritos em ppm.
Os espectros no IV foram obtidos em aparelho Spectrum One, Perkin-Elmer
(Laboratório de Química Farmacêutica, FAFAR, UFMG), acoplado ao acessório de
refletância difusa.
Os espectros de massa da alta resolução foram obtidos em espectômetro de
quadrupolo-tempo modelo QSTAR XL (Applied Biosystems), empregando
eletrospray como modo de ionização a 5500 V e um analisador de tempo de vôo
ESI-Q-TOF (Laboratório de Espectroscopia de Massas, Departamento de Química,
USAL, ES).
A evolução das reações foi acompanhada por cromatografia em camada
delgada de sílica, empregando-se lâminas de poliéster Polychrom Si F
254
de 0,25
mm de espessura, com cobertura de sílica gel com indicador fluorescente UV
254
nm.
As purificações por cromatografia em coluna de sílica (CCS) foram realizadas
com sílica gel 60 (0,063-0,200 mm / 70-230 mesh, Merck) e os eluentes empregados
estão descritos em cada procedimento. Como reveladores foram empregados
solução etanólica de ácido fosfomolíbdico 20% e, eventualmente solução etanólica
de ácido sulfúrico 15%, ambos com aquecimento.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
139
9.2 Transformações químicas do ácido ursólico
9.2.1 Síntese do 3β-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (77)
Método I
A uma suspensão de 100 mg (0,22 mmol) de ácido ursólico (31) em acetona
anidra (5,0 mL) adicionaram-se 122 mg de K
2
CO
3
(0,88 mmol) e 0,5 mmol de CH
3
I.
A mistura reacional foi mantida sob agitação, em atmosfera inerte e temperatura
ambiente por 4 horas, sendo monitorada por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc
7:3). Adicionou-se acetona ao produto de reação, filtrou-se, secou-se com Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em evaporador rotatório. Foram obtidos 92 mg de 77
com um rendimento de 89%. A fim de obter quantidades adicionais de 77, o
procedimento foi repetido 21 vezes com diferentes massas de 31, obtendo-se
rendimentos na faixa de 75 a 90%.
Método II
A uma suspensão de 200 mg (0,44 mmol) de ácido ursólico (31) em
dimetilformamida anidra (4,0 mL) adicionaram-se 244 mg de K
2
CO
3
(1,76 mmol) e
1,0 mmol de CH
3
I. A mistura reacional foi mantida sob agitação, em atmosfera inerte
e temperatura ambiente por 4 horas, sob monitoramento por CCD de sílica gel (n-
hexano:EtOAc 7:3). Adicionou-se água ao produto da reação, extraiu-se
vigorosamente com EtOAc e lavou-se a fase orgânica com solução aquosa saturada
de NaCl. A fase orgânica foi filtrada e seca em Na
2
SO
4
anidro, sendo o solvente
eliminado em rotavapor. Foram obtidos 179 mg de 77 com um rendimento de 87%.
Este procedimento foi realizado 9 vezes com diferentes massas de 31 e rendimento
entre 85 e 90%.
Dados físico-químicos do 3β-hidroxi-urs-12-en-28-oato de metila (77)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
31
H
50
O
3
M.M.: 470,74 g.mol
-1
COOCH
3
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
140
HRMS calculado para C
31
H
50
O
3
[M + Na]
+
: 493,3658, encontrado: 493,3610.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3525 (O-H); 2969 (C-H); 1718 (C=O); 1384 (C-O-H); 1230 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+ 41,16 (c 1, MeOH)
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,25 (t, 1H; J 3,5 Hz, H-12); 3,61 (s, 1H,
COOCH
3
); 3,22 (m, 1H, H-3); 2,23 (d, 1H, J 12,0 Hz, H-18); 1,08 (s, 3H, C-27H
3
);
0,99 (s, 3H, C-25H
3
); 0,93 (d, 3H, J 6,3 Hz, C-30H
3
); 0,92 (s, 3H, C-23H
3
); 0,86 (d,
3H, J 6,3 Hz, C-29H
3
); 0,78 (s, 3H, C-26H
3
); 0,74 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,09 (C-28); 138,18 (C-13); 125,61 (C-12); 79,04
(C-3); 55,26 (C-18); 52,91 (C-5); 51,51 (COOCH
3
); 44,13 (C-17); 47,62 (C-9); 42,03
(C-14); 39,53 (C-8); 39,09 (C-19); 38,91 (C-20); 38,80 (C-4); 38,69 (C-1); 37,00 (C-
10); 36,67 (C-22); 33,03 (C-7); 30,71 (C-21); 28,18 (C-23); 28,07 (C-15); 27,26 (C-2);
24,28 (C-16); 23,66 (C-27); 23,36 (C-11); 21,23 (C-30); 18,36 (C-6); 17,08 (C-26);
16,97 (C-29); 15,68 (C-25); 15,50 (C-24).
9.2.2 Síntese do 3β-acetóxi-urs-12-en-28-oato de metila (78)
A um balão de fundo redondo (25 mL) adicionaram-se 252 mg de 77 (0,54
mmol), 1,0 ml de piridina e 1,0 ml de anidrido acético. A mistura reacional foi deixada
em repouso, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por 24 horas. Adicionou-se
gelo moído e manteve-se em agitação durante 10 minutos. Extraiu-se com EtOAc e
lavou-se com HCl 2N. Secou-se sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em
rotavapor rotatório. O produto reacional foi monitorado por CCD de sílica gel (n-
hexano:EtOAc 7:3). Obtiveram-se 236,1 mg de 78 (86%). Esta reação foi repetida 17
vezes com o rendimento variando entre 84 e 89%.
Dados físico-químicos do 3β-acetóxi-urs-12-en-28-oato de metila (78)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
33
H
52
O
4
M.M.: 512,77 g.mol
-1
COOCH
3
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
141
HRMS calculado para C
33
H
52
O
4
[M + Na]
+
: 535,3763; encontrado: 535,3686.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2978 (C-H); 1726 (C=O); 1706 (C=O); 1229 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+57,2 (c 1, CHCl
3
)
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,20 (t, 1H, J 3,6 Hz, H-12); 4,46 (m, 1H, H-3);
3,57 (s, 3H, COOCH
3
); 2,17 (d, 1H, J 11 Hz, H-18); 2,02 (s, 3H, OCOCH
3
); 1,01 (s,
3H, C-27H
3
); 0,88 (s, 3H, C-25H
3
); 0,81(s, 3H, C-23H
3
); 0,79 (s, 3H, C-26H
3
); 0,68
(s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 177,99 (C-28); 170,90 (OCOCH3); 138,15 (C-13);
125,43 (C-12); 55,27 (C-5); 52,85 (C-18); 51,41 (COOCH3); 47,48 (C-9); 44,04 (C-
17); 41,97 (C-14); 39,47 (C-8); 39,03 (C-19); 38,88 (C-20); 38,26 (C-1); 37,67 (C-4);
36,86 (C-10); 36,64 (C-22); 32,89 (C-7); 30,65 (C-21); 28,00 (C-15); 28,00 (C-23);
24,18 (C-16); 23,56 (C-27); 23,30 (C-2); 21,20 (C-30); 21,20 (OCOCH3); 18,19 (C-6);
17,09 (C-29); 16,90 (C-26); 16,75 (C-25); 15,50 (C-24).
9.2.3 Síntese do 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (79) e do
3β-acetóxi-urs-9,12-dien-28-oato de metila (80)
A um balão de fundo redondo (25 mL) contendo 288 mg de 78 (0,56 mmol)
dissolvido em 10 mL de EtOAc adicionaram-se 0,35 mL de t-BuOOH 6M em n-
decano (2,10 mmol) e 162,7 mg de NaClO
2
(1,80 mmol). A mistura reacional foi
mantida sob agitação magnética e refluxo, sendo monitorada por CCD de sílica gel
(n-hexano:EtOAc 7:3). Após 20 horas de reação, adicionou-se solução aquosa de
sulfito de sódio a 10% e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica
sucessivamente com solução aquosa saturada de NaHCO
3
e água; secou-se sobre
Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em rotavapor. O produto bruto da reação
(290 mg) foi submetido à cromatografia em coluna de sílica gel (dimensões da
coluna empacotada: 17 × 250 mm) empregando-se n-hexano:EtOAc
(9:1) como
eluente. Recolheram-se 20 frações de aproximadamente 5 mL, que foram reunidas
de acordo com os perfis obtidos por CCD de sílica gel e dados de RMN de
1
H. O
dieno 80 foi obtido nas frações 5-6 (26,6 mg, 9%) e a cetona 79 nas frações 10-15
(196,84 mg, 67%).
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
142
Dados físico-químicos do 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (79)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
33
H
50
O
5
M.M.: 526,76 g.mol
-1
HRMS calculado para C
33
H
50
O
5
[M + Na]
+
: 549,3556; encontrado: 549,3541.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2971 (C-H); 1726 (C=O); 1654 (C=O); 1620 (C=O); 1233 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+45,15 (c 2, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,60 (s, 1H, H-12); 4,51 (dd, 1H, J 10 e 5,3; H-3);
3,61 (s, 3H, COOCH3); 2,41 (d, 1H, J 10,8, H-18); 2,05 (s, 3H, OCOCH3); 1,29 (s,
3H, C-25H
3
); 1,14 (s, 3H, C-26H
3
); 0,98 (s, 3H, C-27H
3
); 0,91 (s, 3H, C-29H
3
); 0,89
(s, 3H, C-30H
3
); 0,87 (s, 3H, C-23H
3
); 0,86 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 199,75 (C-11); 177,22 (C-28); 171,01 (OCOCH3);
162,96 (C-13); 130,65 (C-12); 80,60 (C-3); 61,37 (C-9); 55,05 (C-5); 52,74 (C-18);
51,89 (COOCH3); 47,67 (C-14); 44,69 (C-14); 43,74 (C-8); 38,81 (C-1); 38,59 (C-19);
38,59 (C-20); 38,04 (C-4); 37,01 (C-10); 35,98 (C-22); 32,97 (C-21); 28,37 (C-15);
28,11 (C-23); 23,93 (C-16); 23,56 (C-2); 21,35 (C-27); 21,02 (C-30); 18,85 (C-26);
17,34 (C-6); 17,16 (C-29); 16,76 (C-25); 16, 28 (C-24).
Dados físico-químicos do 3β-acetóxi-urs-9,12-dien-28-oato de metila (80)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
33
H
51
O
4
M.M.: 511,77 g.mol
-1
HRMS calculado para C
33
H
51
O
4
[M + Na]
+
: 534,6885; encontrado: 533,3603.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2924 (C-H); 1732 (C=O); 1723 (C=O); 1026 (C-H).
[
α
αα
α
]
D
+158,60 (c 0,5, CHCl
3
).
COOCH
3
H
3
CCOO
O
COOCH
3
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
143
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,58 (d, 1H, J 6,0 Hz, H-11); 5,51 (d, 1H, J 6,0 Hz;
H-12); 4,51 (dd, 1H, J 10,4 e 5,7 Hz, H-3); 3,62 (s, 3H, COOCH
3
); 2,35 (d, 1H,J 11,2
Hz, H-18); 2,04 (s, 3H, OCOCH
3
); 0,97 (s, 3H, C-27H
3
); 0,93 (d, 3H, J 5,4 Hz, C-
30H
3
); 0,92 (s, 3H, C-25H
3
); 0,90 (s, 3H, C-23H
3
); 0,88 (s, 3H, C-26H
3
); 0,86 (s, 3H,
C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,10 (C-28); 171,12 (OCOCH3); 154,54 (C-9);
139,44 (C-13); 123,30 (C-12); 115,55 (C-11); 80,63 (C-3); 51,67 (COOCH
3
); 51,23
(C-18); 51,23 (C-5); 47,52 (C-17); 42,67 (C-8); 40,68 (C-14); 38,73 (C-10); 38,62 (C-
19); 38,33 (C-20); 37,89 (C-4); 36,90 (C-1); 36,49 (C-22); 31,97 (C-7); 30,57 (C-21);
28,15 (C-23); 27,08 (C-15); 25,21 (C-25); 24,62 (C-16); 21,35 (C-26); 21,35
(OCOCH
3
); 20,94 (C-27); 20,94 (C-30); 18,15 (C-6); 17,01 (C-29); 16,79 (C-24).
9.2.4 Síntese do 3β,11,28-triidróxi-urs-12-eno (81)
A um balão de duas bocas (50 mL) contendo 345 mg de LiAlH
4
(9,08 mmol)
adicionaram-se 2,0 mL de éter seco. Manteve-se a suspensão sob agitação
magnética e então adicionaram-se 230 mg de 79 (0,45 mmol), solubilizados em 8,0
mL de éter seco. A mistura reacional foi mantida à temperatura ambiente e sob
agitação magnética por 20 horas. O excesso de LiAlH
4
foi consumido com o
gotejamento de éter úmido e, em seguida com o gotejamento de água. Extraiu-se
com solução saturada de NaCl, secou-se a fase orgânica sobre Na
2
SO
4
anidro e
eliminou-se o solvente em evaporador rotatório. Obtiveram-se 179 mg de 81 (87%).
Este procedimento foi realizado 19 vezes, obtendo-se rendimentos entre 83 e 87%.
As reações foram monitoradas por CCD de sílica gel, empregando-se como eluente
n-hexano:EtOAc (1:1).
O produto obtido da oitava repetição da reação (134 mg) foi submetido à
cromatografia em coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 25 × 244
mm), empregando-se como eluentes misturas de n-hexano:EtOAc (7:3 e 1:1).
Coletaram-se 18 frações de aproximadamente 5 mL. As frações 3-9 foram reunidas
de acordo com as semelhanças nos perfis por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc
7:3) e dados de RMN de
1
H, fornecendo 102,6 mg do éter cíclico 84 (80%).
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
144
Dados físico-químicos do 3β,11,28-trihidroxi-urs-12-eno (81)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
30
H
50
O
3
M.M.: 458,73 g.mol
-1
HRMS calculado para C
30
H
50
O
3
[M + Na]
+
: 481,3657; encontrado: 481,3651.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3676 (O-H); 2921 (C-H); 1045 (C-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,22 (d, 1H, J 4,2 Hz, H-12); 4,35 (dl, 1H, J 4,2, H-
11); 3,33 (d, 1H, J 10 Hz, H-28a); 3,19 (m, 1H, H-3); 3,17 (d, 1H, J 10 Hz, H-28b);
2,00 (m, 1H, H-18); 1,37 (s, 3H, C-27H
3
); 1,22 (s, 3H, C-25H
3
); 1,01 (s, 3H, C-23H
3
);
0,95 (s, 3H, C-30H
3
); 0,93 (s, 3H, C-29H
3
);0,78 (s, 3H, C-26H
3
); 0,76 (s, 3H, C-
24H
3
).
9.2.5 Síntese do 3
β
ββ
β
,28-diacetóxi-urs-11,13(18)-dieno (85)
O resíduo contendo 102 (321 mg) foi submetido à cromatografia em coluna de
sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 25 × 244 mm), empregando-se como
eluentes misturas de n-hexano:EtOAc (8:2 e 1:1). Coletaram-se 20 frações de
aproximadamente 5 mL. As frações 4-10 (81 mg) foram reunidas de acordo com as
semelhanças nos perfis por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3) e dados de
RMN de
1
H. As frações 12-18 (202 mg), cujo perfil cromatográfico indicou a
presença de 102, também foram reunidas,. As frações 4-10, foram transferidas para
um balão de fundo redondo (25 mL), adicionaram-se, 0,5 mL de piridina e 0,5 mL de
anidrido acético. A mistura reacional foi deixada em repouso, à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz, por 24 horas. Adicionou-se gelo moído e manteve-se
sob agitação durante 10 minutos. Extraiu-se com EtOAc, lavou-se a fase orgânica
com HCl 2N, sendo esta seca sobre Na
2
SO
4
anidro e o solvente eliminado em
rotavapor. Obtiveram-se 68,2 mg de produto, sendo este submetida à cromatografia
em coluna de sílica gel impregnada com 20% de AgNO
3
(dimensões da coluna
empacotada: 20 × 220 mm), empregando-se como eluente n-hexano:EtOAc (95:5).
Recolheram-se 8 frações de aproximadamente 5 mL, as quais foram reunidas de
CH
2
OH
HO
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
145
acordo com os perfis obtidos por CCD de sílica gel. No grupo de frações reunidas 3-
6 (54,7 mg) obteve-se o dieno 85 (17%).
Dados físico-químicos do 3
β
ββ
β
,28-diacetóxi-urs-11,13(18)-dieno (85)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
33
H
50
O
4
M.M.: 510,76 g.mol
-1
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2940 (C-H); 1728 (C=O); 1237 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
-25,00 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 6,41 (dd, 1H, J 3,0 e 11,0 Hz, H-11); 5,60 (d, 1H, J
11,0 Hz, H-12); 4,51 (dd, 1H, J 6,2 e 10,0, H-3); 4,28 (d, 1H, J 11,2 Hz, H-28a); 3,87
(d, 1H, J 11,2 Hz, H-28b); 2,06 (s, 3H, OCOCH
3
); 2,05 (s, 3H, OCOCH
3
); 1,02 (s, 3H,
C-27H
3
); 0,94 (s, 3H, C-25H
3
); 0,91 (d, 3H, J 6,8 Hz; C-29H
3
); 0,89 (s, 3H, C-23H
3
);
0,86 (s, 3H, C-26H
3
);0,85 (s, 3H, C-30H
3
); 0,76(s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 171,19 (OCOCH
3
); 171,08 (OCOCH
3
); 138,37 (C-
18); 136,86 (C-13); 126,98 (C-12); 125,25 (C-11); 80,89 (C-3); 66,26 (C-28); 54,98
(C-5); 54,21 (C-9); 42,74 (C-17); 40,68 (C-14); 38,44 (C-10); 37,89 (C-1); 37,89 (C-
22); 37,78 (C-8); 36,56 (C-19); 36,49 (C-4); 34,62 (C-20); 32,12 (C-21); 29,95 (C-16);
29,95 (C-7); 27,82 (C-23); 24,36 (C-15); 23,44 (C-2); 22,67 (C-27); 21,39 (C-30);
21,35 (OCOCH
3
); 21,35 (OCOCH
3
); 20,65 (C-26); 18,15 (C-29); 16,72 (C-25); 16,20
(C-24).
9.2.6 Síntese do 3β,11,28β-triacetoxi-urs-12-eno (82)
A um balão de fundo redondo (25 mL) adicionaram-se 76 mg de 81
(0,17mmol), 0,5 ml de priridina e 0,5 ml de anidrido acético. A mistura reacional foi
deixada em repouso, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por 24 horas. A
reação foi monitorado por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 8:2). Adicionou-se
gelo moído e manteve-se por agitação durante 10 minutos. Extraiu-se com EtOAc e
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
146
lavou-se com HCl 2N, sendo a fase orgânica seca sobre Na
2
SO
4
anidro e o solvente
removido em rotavapor. Obtiveram-se 70 mg do produto bruto da reação, o qual foi
cromatografado em coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 18 × 170
mm), utilizando como eluente misturas de n-hexano:EtOAc (85:15 e 50:50).
Recolheram-se 20 frações de aproximadamente 5 mL, cujos perfis foram
comparados por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 8:2). As frações 8-12 foram
reunidas, obtendo-se o triol acetilado 82 (35,6 mg), com rendimento de 37%.
Dados físico-químicos do 3β,11,28β-triacetoxi-urs-12-eno (82)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
36
H
56
O
6
M.M.: 584,84g.mol
-1
HRMS calculado para C
36
H
56
O
6
[M + Na]
+
: 607,3975, encontrado: 607,3988.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2928 (C-H); 1728 (C=O); 1232 (C-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 5,43 (dd, 1H, J 8,6 e 3,6, H-11); 5,17 (d, 1H, J 3,6,
H-12); 4,46 (dd, 1H, J 10 e 5,6, H-3); 3,97 (d, 1H, J 11,0 Hz, H-28a); 3,58 (d, 1H, J
11,0 Hz, H-28b); 2,04 (s, 3H, OCOCH
3
); 2,03 (s, 3H, OCOCH
3
); 1,94 (s, 3H,
OCOCH
3
); 1,19 (s, 3H, C-27H
3
); 1,05 (s, 3H, C-25H
3
); 1,03 (s, 3H, C-23H
3
); 0,92 (s,
3H, C-30H
3
); 0,86 (s, 3H, C-26H
3
); 0,85 (s, 3H, C-24H
3
); 0,80 (d, 3H, J 5,8 Hz, C-
29H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 171,23 (OCOCH
3
); 171,12 (OCOCH
3
); 171,12
(OCOCH
3
); 144,10 (C-13); 124,29 (C-12); 80,52 (C-3); 70,77 (C-11); 54,93 (C-9);
52,91 (C-18); 51,92 (C-5); 43,18 (C-8); 41,75 (C-14); 39,11 (C-19); 39,11 (C-20);
38,73 (C-1); 37,85 (C-10); 37,85 (C-17); 36,60 (C-4); 35,36 (C-22); 32,71 (C-7);
30,39 (C-21); 28,00 (C-23); 26,24 (C-15); 23,59 (C-2); 23,30 (C-16); 22,49 (C-27);
21,68 (C-30); 21,68 (OCOCH3); 21,35 (OCOCH3); 21,02 (OCOCH3); 18,19 (C-6);
17,82 (C-26); 17,31 (C-29); 16,79 (C-25); 16,53 (C-24).
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
147
9.2.7 Síntese do 3β-hidróxi-urs-12-en-28-al (83) e do 3β-hidróxi-urs-11-en-
28,13β-eter (84)
Condição A
A uma solução de 458 mg de 81 (0,99 mmol) em 25 mL de CH
2
Cl
2
(seco com
CaCl
2
e filtrado sobre NaHCO
3
), em atmosfera inerte, adicionaram-se 54 µL de BF
3
-
Et
2
O bidestilado (0,42 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob agitação e
temperatura ambiente durante 2 horas, com monitoramento por CCD de sílica gel (n-
hexano:EtOAc 6:4). Após este período, realizou-se extração com EtOAc, sendo a
fase orgânica lavada com solução saturada de NaCl, seca sobre Na
2
SO
4
e o
solvente removido em evaporador rotatório. O resíduo obtido (398 mg) foi submetido
à cromatografia em coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 20 × 300
mm), utilizando como eluente misturas de n-hexano:EtOAc (8:2 e 1:1). Foram
recolhidas 35 frações de aproximadamente 5 mL. As frações 9-10, eluídas com n-
hexano:EtOAc (8:2) foram reunidas de acordo com os perfis obtidos por CCD de
sílica gel e dados de RMN de
1
H, fornecendo 42,9 mg de 83 (11% de rendimento).
Dados físico-químicos do 3β-hidroxi-urs-12-en-28-al (83)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
30
H
49
O
2
M.M.: 441,72g.mol
-1
HRMS calculado para C
30
H
44
O
2
[M + Na]
+
: 464,3630; encontrado: 464,3633.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3413 (O-H); 2928 (C-H); 1716 (C=O).
[
α
αα
α
]
D
+23,40 (c 1,5, MeOH).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 9,29 (s, 1H, H-28); 5,60 (d, 1H, J 10,4 Hz, H-12);
5,42 (d, 1H, J 10,4, H-11); 3,21 (dd, 1H, J 10,4 e 5,8 Hz, H-3); 2,0 (sl, 1H, H-9); 1,03
(d, 3H, J 6,3 Hz, C-30H
3
); 0,99 (d, 3H, J 5,2 Hz, C-29H
3
); 0,96 (s, 3H, C-23H
3
); 0,91
(s, 3H, C-26H
3
); 0,82 (s, 3H, C-25H
3
); 0,75 (s, 3H, C-24H
3
); 0,71(s, 3H, C-27H
3
).
C
H
HO
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
148
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 206,35 (C-28); 133,81 (C-12); 123,54 (C-11); 78,93
(C-3); 54,61 (C-5); 52,61 (C-13); 52,18 (C-18); 47,29 (C-17); 44,28 (C-9); 41,04 (C-
10); 39,87 (C-14); 39,46(C-19); 39,35 (C-20); 38,83 (C-8); 37,99 (C-1); 36,38 (C-4);
32,19 (C-7); 30,34 (C-21); 30,11 (C-15); 27,74 (C-23); 27,02 (C-2); 25,72 (C-16);
20,43 (C-25); 18,56 (C-30); 18,26 (C-6); 17,01 (C-26); 16,38 (C-29); 16,06 (C-27);
14,97 (C-24).
Condição B
A uma solução de 213 mg de 81 (0,44 mmol) em 10 mL de CH
2
Cl
2
(seco em
CaCl
2
e filtrado sobre NaHCO
3
), em atmosfera inerte, adicionaram-se 24 µL de BF
3
-
Et
2
O bidestilado (0,19 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob agitação à
temperatura de -78ºC, durante 2 horas, com monitoramento por CCD de sílica gel (n-
hexano:EtOAc 7:3). Após este período, extraiu-se EtOAc, sendo a fase orgânica
lavada com solução aquosa saturada de NaCl, seca sobre Na
2
SO
4
e o solvente
eliminado em evaporador rotatório. O resíduo obtido (172,4 mg) foi submetido à
cromatografia em coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 20 × 210
mm), utilizando como eluente misturas de n-hexano:EtOAc (7:3 e 1:1), sendo
recolhidas 20 frações de 5 mL. As frações 6-8, eluídas com n-hexano:EtOAc (7:3)
foram reunidas de acordo com perfis obtidos por CCD de sílica gel e dados de RMN
de
1
H, fornecendo 79,8 mg do éter cíclico 84 (39%).
Também foram avaliadas 5 outras reações com BF3-Et
2
O, variando-se a
temperatura e o tempo de reação, conforme descrito na Tabela 36. Em todas as
condições ensaiadas foram obtidos a mistura de aldeído, éter e dienos, em
diferentes proporções.
Tabela 36 -
Condições reacionais avaliadas no tratamento de 81 com BF
3
-Et
2
O (0,19 mmol).
Reação Temperatura (ºC) Tempo (horas)
A ambiente 2
B -78 2
C 0 1
D 0 2
E 50 1
F ambiente 20
G ambiente 4
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
149
Dados físico-químicos do 3β-hidróxi-urs-11-en-28,13β-eter (84)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
30
H
44
O
2
M.M.: 436,68 g.mol
-1
HRMS calculado para C
30
H
44
O
2
[M + H]
+
: 436,3341; encontrado: 436,3716.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3306 (O-H); 2920 (C-H); 1022 (C-O-C); 989 (C-O-C).
[
α
αα
α
]
D
+94,6 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,73 (d, 1H, J 10,3 Hz, H-12); 5,48 (dd, 1H, J 10,3
e 3,2 Hz, H-11); 3,66 (d, 1H, J 6,5 Hz, H-28a); 3,21 (d, 1H, J 6,5, H-28b); 3,20 (dd,
1H, J 11,3 e 4,9 Hz, H-3); 1,07 (s, 3H, C-26H
3
); 1,03 (s, 3H, C-27H
3
); 1,00 (s, 3H, C-
23H
3
); 0,98 (d, J 6,4 Hz, 3H, C-29H
3
); 0,96 (d, J 5,7 Hz, 3H, C-30H
3
); 0,89 (s, 3H, C-
25H
3
); 0,77 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 132,99 (C-12); 129,62 (C-11); 84,97 (C-13); 79,01
(C-3); 77,06 (C-28); 61,37 (C-18); 54,83 (C-5); 53,03 (C-9); 44,32 (C-14); 42,45 (C-
17); 41,71 (C-8); 40,83 (C-19); 38,95 (C-4); 38,29 (C-1); 37,78 (C-20); 36,42 (C-10);
35,06 (C-22); 31,46 (C-21); 31,46 (C-7); 27,82 (C-23); 27,12 (C-15); 25,43 (C-16);
25,43 (C-2); 19,51 (C-27); 19,29 (C-30); 18,26 (C-29); 17,78 (C-6); 17,78 (C-26);
17,23 (C-25); 14,99 (C-24).
9.2.8 Tentativas de epoxidação de 81
A uma solução de 50 mg (0,11 mmol) de 81 em 4 mL de CH
2
Cl
2
, adicionaram-
se 32,54 mg de MCPBA (0,19 mmol) e 155 mg de NaHCO
3
(1,85 mmol). A mistura
reacional foi mantida sob agitação à temperatura ambiente, durante 2 horas. Após
este período adicionou-se água à mistura reacional e extraiu-se com EtOAc,
lavando-se a fase orgânica sucessivamente com solução aquosa saturada de
Na
2
S
2
O
3
, solução aquosa saturada de NaHCO
3
e solução aquosa saturada de NaCl.
A fase orgânica foi então seca em Na
2
SO
4
anidro e o solvente eliminado em
evaporador rotatório, resultando na obtenção de 41 mg do produto de partida 81.
HO
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
150
A reação foi repetida utilizando-se as mesmas condições anteriormente
descritas e 26 mg do produto 81. Após elaboração da reação, foram obtidos 21 mg
do produto de partida 81.
9.2.9 Tentativas de isomerização de 57 com HI
A 50 mg de 81 (0,11 mmol) dissolvidos em 5,0 mL de benzeno, adicionaram-
se 0,26 mL de HI 57% (1,97 mmol) (MARCOS et al., 2003). Manteve-se a mistura
reacional em atmosfera inerte, sob agitação à temperatura ambiente, por 2 horas,
sendo a evolução da reação monitorada por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc
7:3). Após esse período, extraiu-se a mistura reacional com EtOAc, lavando-se a
fase orgânica sucessivas vezes com soluções aquosas saturadas de NaHCO
3
e
NaCl, até pH neutro. A fase orgânca foi seca sobre Na
2
SO
4
anidro e o solvente
evaporado em evaporador rotatório, resultando em 47 mg de um sólido.
A reação foi repetida variando-se as condições reacionais de temperatura,
tempo de reação e concentração de reagentes, conforme descrito na Tabela 37.
Tabela 37 -
Condições reacionais avaliadas no tratamento de 81 (0,11 mmol) com HI 57%.
Reação HI 57% (mmol/mL) Temperatura (ºC) Tempo (min.)
A 1,90/0,26 ambiente 120
B 1,90/0,26 100 30
C 1,90/0,26 100 15
D 1,90/0,26 100 10
E 1,90/0,26 50 10
F 0,36/0,05 50 30
G 0,36/0,05 50 60
H 0,36/0,05 100 30
Realizaram-se três repetições da reação na condição E. O sólido obtido (125
mg) foi submetido à cromatografia em coluna de sílica gel (dimensões da coluna
empacotada: 20 × 310 mm), empregando-se como eluente n-hexano:EtOAc (8:25).
Foram recolhidas 30 frações de aproximadamente 5 mL, que foram reunidas de
acordo com os perfis obtidos por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3) e dados de
RMN de
1
H. As frações reunidas 17-23 forneceram 58,7 mg de 83 (47%).
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
151
9.2.10 Síntese do 3β,28-diidróxi-urs-12-eno (86)
A um balão de duas bocas (50 mL) adicionaram-se 90 mg de LiAlH
4
(2,37
mmol) e 1,0 mL de éter etílico seco. Manteve-se a suspensão sob agitação
magnética e então adicionaram-se 60 mg de 77 (0,13 mmol) solubilizados em 4,0
mL de éter etílico seco. A mistura reacional foi mantida à temperatura ambiente, sob
agitação, por 20 horas. Ao término deste período, o excesso de LiAlH
4
foi consumido
com o gotejamento de éter úmido e, em seguida com o gotejamento de água.
Extraiu-se a mistura reacional com solução saturada de NaCl; a fase orgânica foi
seca em Na
2
SO
4
anidro e o solvente eliminado em evaporador rotatório. A evolução
da reação foi monitorada por CCD de sílica gel, empregando-se como eluente n-
hexano:EtOAc (7:3). Obtiveram-se 50 mg de 86 (89%). A reação foi realizada outra
vez, nas mesmas condições, obtendo-se o rendimento de 87%.
Dados físico-químicos do 3β,28-diidróxi-urs-12-eno (86)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
30
H
50
O
2
M.M.: 442,3 g.mol
-1
HRMS calculado para C
30
H
50
O
2
[M + Na]
+
: 465,3708; encontrado: 465,3730.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3642 (O-H); 2921 (C-H); 1045 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+71,10 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,13 (t, 1H, J 3,6, H-12); 3,54 (d, 1H, J 10,9 Hz, H-
28a); 3,20 (d, 1H, J 10,9 Hz, H-28b); 3,18 (m, 1H, H-3); 1,10 (s, 3H, C-27H
3
); 1,00 (s,
3H, C-25H
3
); 0,99 (s, 3H, C-23H
3
); 0,95 (s, 3H, C-26H
3
); 0,93 (s, 3H, C-30H
3
);0,82
(s, 3H, C-24H
3
); 0,79(s, 3H, C-29H
3
).
CH
2
OH
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
152
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 138,77 (C-13); 125,06 (C-12); 79,04 (C-3); 69,93
(C-28); 55,19 (C-5); 54,05 (C-18); 47,70 (C-9); 42,08 (C-14); 40,06 (C-8); 39,39 (C-
20); 39,39 (C-19); 38,81 (C-1); 38,03 (C-4); 36,90 (C-10); 36,90 (C-17); 35,24 (C-22);
32,85 (C-7); 30,68 (C-21); 28,18 (C-23); 27,27 (C-15); 26,05 (C-2); 23,33 (C-11);
23,33 (C-16); 26,33 (C-27); 21,39 (C-30); 18,37 (C-6); 17,42 (C-29); 16,83 (C-26);
15,69 (C-25); 15,69 (C-24).
9.2.11 Síntese do ácido 3β-acetóxi-urs-12-en-28-óico (87)
Submeteram-se 200 mg de 31 (0,44 mmol) à acetilação com 1,0 mL de
piridina e 1,0 mL de anidrido acético. Após 24 horas de reação, acrescentou-se gelo
moído e deixou-se sob agitação por 15 min. Extraiu-se a mistura reacional com
EtOAc e lavou-se com HCl 0,5N. A fase orgânica foi seca em Na
2
SO
4
anidro e o
solvente eliminado em evaporador rotatório, resultando na obtenção de 194,8 mg de
87 (89,2%). A reação foi repetida outras 4 vezes, com rendimentos variando entre 89
e 94%.
Dados físico-químicos do ácido 3β-acetóxi-urs-12-en-28-óico (87)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
32
H
50
O
4
M.M.: 498,75 g.mol
-1
HRMS calculado para C
30
H
50
O
2
[M + Na]
+
: 521,3606; encontrado: 521,3730.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3661 (O-H); 2924 (C-H); 1733 (C=O); 1694 (C=O); 1242 (C-O);
1455 (C-O-H); 1369 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+54,30 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,29 (t, 1H, J 3,6, H-12); 4,49 (m, 1H, H-3); 2,17
(d, 1H, J 11,5 Hz, H-18); 2,04 (s, 1H, OCOCH
3
); 1,08 (s, 3H, C-27H
3
); 0,94 (s, 3H, C-
25H
3
); 0,86 (d, 3H, J 6,1 Hz, C-30H
3
); 0,86 (s, 3H, C-23H
3
); 0,83 (s, 3H, C-26H
3
);
0,80 (s, 3H, C-24H
3
).
COOH
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
153
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 180,00 (C-28); 172,96 (C-28); 171,12 (OCOCH
3
);
137,42 (C-13); 126,24 (C-12); 80,96 (C-3); 55,35 (C-5); 52,70 (C-18); 49,35 (C-17);
47,52 (C-9); 42,22 (C-14); 39,65 (C-8); 39,14 (C-19); 38,77 (C-20); 38,40 (C-1);
37,74 (C-4); 36,90 (C-10); 35,83 (C-22); 33,04 (C-7); 30,50 (C-21); 28,11 (C-23);
28,11 (C-15); 24,25 (C-16); 23,59 (C-11); 23,59 (C-2); 23,37 (C-27); 21,39
(COCOCH
3
); 21,16 (C-30); 18,22 (C-6); 17,27 (C-29); 17,01 (C-26); 16,79 (C-25);
15,62 (C-24).
9.2.12 Tentativas de oxidação de 87 com MCPBA catalisada por 5,10,15,20-
tetrakis(pentaflorofenil) porfirina
A uma solução de 87 (50 mg; 0,10 mmol) em 4,0 mL de CH
2
Cl
2
, adicionou-se
5,10,15,20-tetrakis(pentaflorofenil) porfirina (3,3 mg; 3 mol%) e MCPBA 55% (20,71
mg; 0,07 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob agitação e atmosfera inerte, a
-78ºC, durante 4 horas. Ao término deste período, adicionou-se ao meio reacional as
soluções aquosas saturadas de NaHCO
3
e Na
2
S
2
O
3
, realizando-se então extração
com EtOAc. A fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaCl e seca sobre
Na
2
SO
4
, sendo o solvente eliminado em evaporador rotatório. Foram obtidos 45 mg
do produto de partida.
9.2.13 Síntese do ácido 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-óico (88)
A um balão de fundo redondo (25 mL) contendo 54 mg de 87 (0,10 mmol)
dissolvidos em 5 mL de EtOAc, adicionaram-se 0,1 mL de t-BuOOH 6M em n-
decano (0,6 mmol) e 58,8 mg de NaClO
2
(0,65 mmol). A mistura reacional foi
mantida sob agitação magnética e refluxo (100-110ºC), sendo a evolução da reação
monitorada por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3). Após 12 horas de reação,
adicionou-se solução aquosa de Na
2
SO
3
a 10% e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a
fase orgânica sucessivamente com solução aquosa saturada de NaHCO
3
e água;
secou-se sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em rotavapor, obtendo-se
50 mg de 88 (90,1%). A reação foi repetida outras 3 vezes, com o rendimento
variando entre 90 e 95%.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
154
Dados físico-químicos do ácido 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-óico (88)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
32
H
44
O
5
M.M.: 508,70 g.mol
-1
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,57 (s, 1H, H-12); 4,47 (dd, 1H, J 10,9 e 5,5 Hz,
H-3); 3,58 (s, 3H, COOCH
3
); 2,29 (s, 1H, H-9); 2,02 (s, 3H, OCOCH
3
); 1,13 (s, 3H,
C-27H
3
); 0,96 (s, 3H, C-25H
3
); 0,91 (s, 3H, C-23H
3
); 0,90 (s, 3H, C-30H
3
); 0,88 (s,
3H, C-26H
3
); 0,86 (s, 3H, C-24H
3
); 0,84 (d, 3H, J 5 Hz, C-29H
3
).
9.2.14 Síntese de 3
β
ββ
β
-acetóxi-urs-12-en-28,13
β
ββ
β
-lactona (89)
A um balão de duas bocas (25 mL) adicionaram-se 58 mg de LiAlH
4
(1,53
mmol) e 1,0 mL de éter seco. Manteve-se a suspensão sob agitação magnética e
adicionou-se 58 mg de 88 (0,11 mmol), solubilizados em 4,0 mL de éter etílico seco.
A mistura reacional foi mantida sob agitação a 0ºC, durante 1 hora. A evolução da
reação foi monitorada por CCD de sílica gel, empregando-se como eluente n-
hexano:EtOAc (7:3 e 1:1). Ao término deste período, eliminou-se o excesso de
LiAlH
4
com o gotejamento de éter úmido e, em seguida, com o gotejamento de água.
Adicionou-se HCl 2N, extraiu-se com EtOAc e lavou-se com solução aquosa
saturada de NaCl. A fase orgânica foi seca sobre Na
2
SO
4
anidro e o solvente
eliminado em evaporador rotatório, resultando em 44,9 mg de uma mistura de
substâncias.
A mistura obtida (44,9 mg) foi submetida à acetilação com piridina/anidrido
acético e o resíduo resultante foi em seguida cromatografado em coluna de sílica gel
(dimensões da coluna empacotada: 15 × 270 mm), empregando-se como eluentes
misturas de n-hexano:EtOAc (9:1; 8:2; 6:4). Recolheram-se 28 frações, de
aproximadamente 3 mL, as quais foram reunidas de acordo com seus perfis por
CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3) e dados de RMN de
1
H. As frações 9–18 (10
mg) foram reunidas e forneceram o derivado 89 (16%). As demais frações
apresentaram-se como misturas, cuja massa disponível inviabilizou o isolamento dos
componentes.
COOH
H
3
CCOO
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
155
Dados físico-químicos do 3β-acetóxi-urs-11-en-28,13β-lactona (89)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
32
H
48
O
4
M.M.: 496,73 g.mol
-1
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2923 (C-H); 1755 (C=O); 1728 (C=O); 1238 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+41,00 (c 0,5, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,95 (d, 1H, J 10,4 Hz, H-12); 5,54 (dd, 1H, J 10,4
e 3,0 Hz, H-11); 4,50 (m, 1H, H-3); 3,61 (s, 3H, COOCH
3
); 2,06 (s, 3H, OCOCH
3
);
1,16 (s, 3H, C-27H
3
); 1,05 (s, 3H, C-25H
3
); 1,02 (d, 3H, J 6,1 Hz, C-30H
3
); 0,99 (s,
3H, C-23H
3
); 0,94 (s, 3H, C-26H
3
); 0,92 (d, 3H, J 5,3 Hz, C-29H
3
); 0,86 (s, 3H, C-
24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 180,01 (C-28); 171,12 (OCOCH
3
); 133,37 (C-12);
128,96 (C-11); 89,71 (C-13); 80,66 (C-3); 60,60 (C-18); 54,86 (C-5); 52,96 (C-9);
45,13 (C-17); 41,97 (C-14); 41,75 (C-8); 40,31 (C-19); 38,70 (C-20); 38,00 (C-1);
37,89 (C-4); 36,31 (C-10); 31,35 (C-7); 31,20 (C-22); 30,87 (C-21); 27,78 (C-23);
25,58 (C-15); 23,37 (C-2); 22,86 (C-16); 21,39 (OCOCH
3
); 19,22 (C-30); 18,96 (C-
26); 18,04 (C-25); 17,93 (C-29); 17,60 (C-6); 16,09 (C-27 e C-24).
9.2.15 Síntese do 3-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (90)
A uma solução contendo 500 mg de 77 (1,06 mmol) em CH
2
Cl
2
anidro (20
mL), acrescentaram-se 716 mg de PDC (3,3 mmol). Manteve-se a mistura reacional
sob agitação e temperatura ambiente, durante 3 horas. Monitorou-se a evolução da
reação por CCD de sílica gel empregando-se n-hexano:EtOAc (8:2) como eluente.
Ao final das 3 horas, evaporou-se o solvente em rotavapor, sendo o resíduo obtido
cromatografado em coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 30 × 310
mm), empregando-se CH
2
Cl
2
e CH
2
Cl
2
:EtOAc (1:1) como eluentes, resultando em
371,9 mg de 90 (75% de rendimento). A reação foi realizada 9 vezes, com
rendimentos entre 72 e 89%.
H
3
CCOO
O
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
156
Dados físico-químicos do 3-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (90)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
31
H
44
O
3
M.M.: 464,69 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
44
O
3
[M + Na]
+
: 487,3188; encontrado: 487,3449.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2978 (C-H); 1726 (C=O); 1706 (C=O); 1241 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+89,20 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,26 (t, 1H, J 3,4, H-12); 3,60 (s, 3H, COOCH
3
);
2,23 (d, 1H, J 11,0 Hz, H-18); 1,07 (s, 3H, C-27H
3
); 1,03 (s, 3H, C-25H
3
); 0,94 (s, 3H,
C-23H
3
); 0,94 (sl, 3H, C-30H
3
); 0,94 (s, 3H, C-26H
3
); 0,85 (d, 3H, J 6,2 Hz, C-29H
3
);
0,78 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 217,75 (C-3); 178,02 (C-28); 138,29 (C-13); 125,35
(C-12); 55,26 (C-5); 52,95 (C-18); 51,49 (COOCH
3
); 48,14 (C-17); 47,41 (C-4); 46,78
(C-9); 42,15 (C-14); 39,47 (C-8); 38,47 (C-10); 39,32 (C-1); 39,06 (C-19); 38,88 (C-
20); 36,64 (C-22); 34,21 (C-2); 32,52 (C-7); 30,68 (C-21); 28,04 (C-15); 26,57 (C-23);
24,22 (C-16); 23,44 (C-27); 23,44 (C-11); 21,53 (C-24); 21,20 (C-30); 19,62 (C-6);
17,09 (C-29); 16,90 (C-26); 15,21 (C-25).
9.2.16 Síntese do 3-hidroxi-oxima-urs-12-en-28-oato de metila (91)
A uma solução contendo 100 mg de 90 (0,21 mmol) em EtOH absoluto (10
mL) acrescentou-se piridina anidra (0,1 mL) e (NH
3
OH)Cl (25 mg; 0,36 mmol).
Manteve-se o meio reacional sob agitação magnética e refluxo, à temperatura de
95–100ºC, durante 3 horas. Monitorou-se a evolução da reação por CCD de sílica
gel, empregando-se n-hexano:EtOAc (8:2) como eluente. Ao final deste período,
evaporou-se o EtOH e acrescentou-se EtOAc, seguindo-se lavagem com solução
aquosa saturada de NaCl. A fase orgânica foi seca em Na
2
SO
4
anidro e, após
eliminação do solvente em evaporador rotatório, foram obtidos 98 mg de 91 (95% de
rendimento).
COOCH
3
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
157
Dados físico-químicos do 3-hidroxi-oxima-urs-12-en-28-oato de metila (91)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
31
H
49
O
3
N
M.M.: 483,73 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
49
O
3
N
[M + Na]
+
: 506,3610; encontrado: 507,3305.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3660 (O-H); 2945 (C-H); 1721 (C=O); 931 (N-O).
[
α
αα
α
]
D
+22,00 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,24 (sl, 1H, H-12); 3,59 (s, 3H, COOCH
3
); 3,06
(m, 1H, H-2b); 2,22 (m, 1H, H-2a); 2,22 (d, 1H, J 11 Hz, H-18); 1,14 (s, 3H, C-27H
3
);
1,04 (s, 3H, C-25H
3
); 1,02 (d, 3H, C-23H
3
); 0,93 (sl, 3H, C-30H
3
); 0,84 (d, 3H, J 6,2
Hz, C-29H
3
); 0,76 (s, 3H, C-26H
3
); 0,76 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,10 (C-28); 166,85 (C-3); 138,26 (C-13); 125,51
(C-12); 55,82 (C-18); 52,96 (C-5); 51,52 (COOCH
3
); 44,14 (C-17); 47,11 (C-9); 42,11
(C-14); 40,35 (C-4); 39,58 (C-8); 39,06 (C-19); 38,88 (C-20); 38,66 (C-1); 37,04 (C-
10); 36,64 (C-22); 32,74 (C-7); 30,68 (C-2); 30,68 (C-21); 28,00 (C-15); 27,34 (C-23);
24,25 (C-16); 24,25 (C-11); 23,33 (C-27); 21,20 (C-24); 21,20 (C-30); 19,07 (C-6);
17,01 (C-26); 17,01 (C-29).
9.2.17 Tratamento de 77 com HI 57%
Em um balão de fundo redondo (25 mL) contendo 44 mg de 77 (0,10 mmol)
adicionou-se C
6
H
6
(4 mL) e HI 57% (0,25 mL; 1,89 mmol). Manteve-se a mistura
reacional sob agitação magnética e refluxo (80ºC), por 75 minutos, monitorando-se a
evolução da reação por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 8:2) em intervalos de 15
min. Após os 75 minutos, acrescentou-se EtOAc e lavou-se, sucessivamente, com
soluções aquosas saturadas de NaHCO
3
e de NaCl. A fase orgânica foi seca em
Na
2
SO
4
anidro, seguindo-se eliminação do solvente em evaporador rotatório.
Obtiveram-se 35 mg do próprio produto de partida (77).
COOCH
3
N
O
H
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
158
9.2.18 Tentativa de oxidação de 90 com SeO
2
A uma solução de 42 mg de 90 (0,09 mmol) em EtOH absoluto (3 mL)
adicionaram-se 35,5 mg de SeO
2
(0,32 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob
agitação magnética, a 60ºC, durante 20,5 horas. A evolução da reação foi
monitorada por CCD de sílica gel, empregando-se n-hexano:EtOAc (1:1) como
eluente. Ao término deste período evaporou-se o EtOH e acrescentou-se éter etílico,
seguindo-se lavagem com solução aquosa saturada de NaCl. Secou-se a fase
orgânica sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em evaporador rotatório,
resultando em 40,4 mg do produto de partida (90).
Foram realizadas 4 outras tentativas com a reação, alterando-se o tempo
e a temperatura, conforme descrito na Tabela 38. Porém, não foi possível obter o
produto de oxidação em nenhuma das condições avaliadas.
Tabela 38 -
Condições reacionais avaliadas na oxidação do produto 90 (42 mg; 0,09 mmol)
com SeO
2
Condição Temperatura (ºC) Tempo (horas)
A 60 20,5
B 110 2
C 110 4
D
60
110
20,5
2
E 110 8
9.2.19 Tentativa de oxidação de 90 com t-BuOOH/SeO
2
A uma solução contendo 45 mg de 90 (0,10 mmol) em CH
2
Cl
2
(3 mL),
adicionou-se SeO
2
(8,5 mg; 0,075 mmol). A mistura reacional foi mantida em
atmosfera inerte, adicionando-se gota a gota, com auxílio de um funil de adição, t-
BuOOH 6M (0,1mL; 0,6 mmol) em CH
2
Cl
2
(1,7 mL). Manteve-se a mistura reacional
sob agitação e temperatura ambiente, por 5 horas. Ao término deste período,
acrescentou-se CH
2
Cl
2
, lavou-se com solução aquosa saturada de NaCl e secou-se
sobre Na
2
SO
4
anidro. A eliminação do solvente em evaporador rotatório resultou em
38 mg de uma mistura, não identificada.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
159
Este procedimento foi realizado outras 3 vezes, alterando-se o tempo de
reação, conforme descrito na Tabela 39. Porém, não se alcançou o sucesso na
obtenção do produto de oxidação em nenhuma das condições experimentadas.
Tabela 39 -
Condições reacionais avaliadas nas tentativas de oxidação de 90 com
t-BuOOH/SeO
2.
Condição Temperatura (ºC) Tempo (horas)
A ambiente 5
B ambiente 24
C ambiente 1
D ambiente 3
9.2.20 Síntese do 3,11-dioxo-urs-12-en-28-oato de metila (92)
Em um balão de fundo redondo (25 mL) contendo 100 mg de 90 (0,21 mmol)
dissolvidos em 5 mL de EtOAc adicionaram-se 0,2 mL de t-BuOOH 6M em n-decano
(1,20 mmol) e 66 mg de NaClO
2
(0,73 mmol). A mistura reacional foi mantida em
agitação magnética sob refluxo (100 - 110ºC), sendo monitorada por CCD de sílica
gel (n-hexano:EtOAc 7:3). Após 12 horas de reação, adicionou-se solução aquosa
de Na
2
SO
3
a 10% e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica
sucessivamente com solução aquosa saturada de NaHCO
3
e água; secou-se sobre
Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em evaporador rotatório, resultando em 91
mg de 92 (88% de rendimento).
Esta condição reacional foi encontrada após várias tentativas de otimização
da reação, com alterações no tempo e temperatura, conforme descrito na Tabela 40.
Tabela 40
- Condições reacionais avaliadas na oxidação de 90 com NaClO
2
/t-BuOOH.
Condição Temperatura (ºC) Tempo (horas)
A 50 168
B 50 24
C 50 12
D 100 16
E 100 10
F 100 12
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
160
Dados físico-químicos do 3,11-dioxo-urs-12-en-28-oato de metila (92)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
31
H
44
O
4
M.M.: 480,69 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
44
O
4
[M + Na]
+
: 503,3137; encontrado: 503,3442.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2928 (C-H); 1726 (C=O); 1658 (C=O); 1199 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+57,10 (c 1, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,61 (s, 1H, H-12); 3,60 (s, 3H, COOCH
3
); 2,95 (m,
1H, H-2a); 2,89 (m, 1H, H-2b); 2,37 (s, 1H, H-9); 1,13 (s, 3H, C-27H
3
); 1,12 (d, 3H,
C-25H
3
); 1,01 (s, 3H, C-23H
3
); 0,84 (d, 1H, J 5,0 Hz, C-29H
3
); 0,74 (s, 3H, C-26H
3
);
0,74 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 217,35 (C-3); 199,23 (C-11); 177,26 (C-28); 163,44
(C-13); 130,62 (C-12); 60,79 (C-9); 55,42 (C-18); 52,81 (C-5); 51,96 (COOCH3);
47,70 (C-17); 47,70 (C-4); 44,54 (C-14); 43,88 (C-8); 39,76 (C-1); 38,66 (C-19);
38,66 (C-20); 36,79 (C-10); 35,94 (C-22); 34,29 (C-2); 32,41 (C-7); 30,32 (C-21);
28,44 (C-15); 26,44 (C-23); 23,88 (C-16); 23,88 (C-6); 21,44 (C-27); 21,02 (C-30);
21,02 (C-24); 18,78 (C-26); 15,58 (C-25).
9.2.21 Tentativa de oxidação de 78 com SeO
2
/AcOH
A uma solução de 78 (43 mg; 0,08 mmol) em ácido acético (3,0 mL)
adicionou-se SeO
2
(27 mg; 0,24 mmol). A mistura reacional foi mantida sob agitação
magnética e temperatura ambiente, durante 72 horas. Monitorou-se a evolução da
reação por CCD de sílica gel, empregando-se n-hexano:EtOAc (8:2) como eluente.
Ao término deste período, acrescentou-se água e extraiu-se com EtOAc, seguindo-
se lavagem da fase orgânica com soluções aquosas saturadas de NaHCO
3
e de
NaCl. Secou-se a fase orgânica sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em
evaporador rotatório, sendo recuperados 40,2 mg do composto de partida.
COOCH
3
O
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
161
9.2.22 Tentativa de oxidação de 90 com SeO
2
/AcOH
A uma solução de 90 (50,6 mg; 0,11 mmol) em ácido acético (3,0 mL)
adicionou-se SeO
2
(32 mg; 0,29 mmol). A mistura reacional foi mantida sob agitação
magnética e refluxo (130-135ºC), durante 2 horas, sendo sua evolução monitorada
por CCD de sílica gel, empregando-se n-hexano:EtOAc (8:2) como eluente. Ao
término desse período, acrescentou-se água e extraiu-se com EtOAc, seguindo-se
lavagem da fase orgânica com soluções aquosas saturadas de NaHCO
3
e de NaCl.
Secou-se a fase orgânica sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em
evaporador rotatório, sendo recuperados 44,1 mg do composto de partida.
O mesmo procedimento reacional também foi empregado para outros 50 mg
de 66, mantendo-se as mesmas concentrações dos reagentes e temperatura. porém
alterando-se o tempo para 8 horas. Nessas condições foram obtidos 47 mg do
composto de partida.
9.2.23 Tentativa de rearranjo de 90 com BF
3
-Et
2
O
A uma solução de 54 mg de 90 (0,11 mmol) em 5 mL de CH
2
Cl
2
(seco sobre
CaCl
2
), mantida sob atmosfera inerte e a -20ºC, adicionaram-se 50 µL de BF
3
-Et
2
O
bidestilado (0,39 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob agitação, nas
condições descritas acima, durante 1,5 horas, com monitoramento por CCD de sílica
gel (n-hexano:EtOAc 8:2). Após este período, adicionou-se CH
2
Cl
2
e lavou-se com
solução saturada de NaCl. A fase orgânica foi seca em Na
2
SO
4
anidro e, após
eliminação do solvente em evaporador rotatório, foram recuperados 47,9 mg do
produto de partida.
Realizaram-se outras duas tentativas, empregando-se porções de 50 mg de
66. Na primeira, empregou-se temperatura de 0ºC, 100 µL de BF
3
-Et
2
O e tempo de
reação de 1,5 horas. Adicionaram-se, então, outros 50 µL de BF
3
-Et
2
O e manteve-se
a reação por mais 1,5 horas. Após elaboração da reação foram recuperados 40mg
do produto de partida.
Na segunda tentativa utilizaram-se 100 µL de BF
3
-Et
2
O, mantendo-se a
mistura reacional sob agitação, à temperatura ambiente, durante 3 horas.
Recuperaram-se 47,2 mg do produto de partida.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
162
9.2.24 Tentativas de redução de 92
9.2.24.1 Redução de 92 com NaBH
4
/CeCl
3
.7H
2
O
A uma solução de 92 (56 mg; 0,12 mmol) em MeOH/THF (1:1; 5 mL),
adicionou-se CeCl
3
7H
2
O (82 mg; 0,22 mmol) e NaBH
4
(10,90 mg; 0, 28 mmol).
Manteve-se a mistura reacional sob agitação magnética a 0ºC, durante 45 minutos e,
em seguida, à temperatura ambiente por 3 horas. Monitorou-se a evolução da
reação por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 8:2). Ao término deste período,
evaporou-se o solvente, adicionou-se Et
2
O e lavou-se com solução de HCl 2N e
solução aquosa saturada de NaCl. A fase orgânica foi seca em Na
2
SO
4
anidro e o
solvente foi removido em evaporador rotatório, resultando em 43,6 mg do produto de
partida.
Na segunda tentativa, 50 mg de 92 (0,10 mmol) foram dissolvidos em 5 mL da
mistura MeOH/THF (1:1). Adicionaram-se 164 mg de CeCl
3
7H
2
O (0,44 mmol) e 22
mg de NaBH
4
(0,57 mmol), mantendo-se a mistura reacional sob agitação à
temperatura ambiente por 6 horas. Monitorou-se a evolução da reação por CCD de
sílica gel (n-hexano:EtOAc 8:2), em intervalos de 1 hora. Empregou-se o mesmo
procedimento de extração, sendo obtidos 38,7 mg de produto bruto.
Na terceira tentativa, o produto bruto da segunda tentativa foi (38,7 mg)
utilizado como produto de partida. Solubilizou-se na mistura de MeOH/THF (1:1), e
adicionou-se 127 mg de CeCl
3
7H
2
O (0,34 mmol) e 16,8 mg de NaBH
4
(0,44 mmol).
Manteve-se a mistura reacional sob agitação e temperatura ambiente durante 6
horas, seguindo-se o mesmo procedimento de extração empregado nas tentativas
anteriores e resultando na obtenção de 32,25 mg do produto 93 (83% de
rendimento).
Dados físico-químicos do 3
β
ββ
β
-hidróxi-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (93)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
31
H
44
O
4
M.M.: 480,69 g.mol
-1
COOCH
3
HO
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
163
HRMS calculado para C
31
H
44
O
4
[M + Na]
+
: 503,3137; encontrado: 503,3442.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3675 (O-H); 2970 (C-H); 1725 (C=O); 1659 (C=O).
[
α
αα
α
]
D
+108,57 (c 0,7, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,60 (s, 1H, H-12); 3,61 (s, 3H, COOCH
3
); 3,22 (m,
1H, H-3); 2,80 (m, 1H, H-2a); 2,75 (m, 1H, H-2b); 2,42 (d, 1H, J 11,2 Hz, H-18); 2,30
(s, 1H, H-9); 1,12 (s, 3H, C-27H
3
); 0,99 (s, 3H, C-25H
3
); 0,96 (d, 3H, J 5,0 Hz, C-
30H
3
); 0,90 (s, 3H, C-23H
3
); 0,86 (d, 1H, J 6,1 Hz, C-29H
3
); 0,79 (s, 3H, C-26H
3
);
0,79 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 200,01 (C-11); 177,29 (C-28); 162,96 (C-13);
130,73 (C-12); 78,83 (C-3); 61,52 (C-9); 55,01 (C-18); 52,76 (C-5); 51,92 (COOCH3);
47,70 (C-17); 44,72 (C-14); 43,77 (C-8); 39,17 (C-1); 38,66 (C-19); 38,66 (C-20);
37,19 (C-10); 37,19 (C-4); 36,01 (C-22); 33,07 (C-7); 30,35 (C-21); 28,44 (C-15);
28,15 (C-23); 27,34 (C-2); 23,99 (C-16); 21,05 (C-30); 21,05 (C-27); 18,89 (C-26);
17,49 (C-6); 17,16 (C-24); 16,28 (C-29). 15,65 (C-25).
9.2.24.2 Redução de 92 com NaBH
4
/alumina
A uma solução de 92 (50 mg; 0,10 mmol) em 4,0 mL de CH
2
Cl
2
, acrescentou-
se alumina neutra (180 mg) e levou-se ao evaporador rotatório até a completa
incorporação, resultando em um pó amarelado. Acrescentou-se NaBH
4
(20mg; 10%
em relação à alumina) e homogeneizou-se manualmente, com o auxílio de um
bastão de vidro. A mistura foi transferida para um béquer contendo
aproximadamente 2 cm de sílica gel e submetida à radiação de microondas (990
watts de potência). Foram realizadas 2 irradiações de 30 segundos, seguidas de 4
irradiações de 60 segundos, procedendo-se ao monitoramento da mistura reacional
por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3) após cada irradiação. Então, dividiu-se a
amostra em duas partes e à primeira adicionou-se EtOAc, agitou-se, filtrou-se e
eliminou-se o solvente em evaporador rotatório. A segunda porção da mistura
reacional foi novamente irradiada em microondas (5 × 120 segundos), seguindo-se
extração com EtOAc. Ambas as frações foram monitoradas por CCD e RMN de
1
H e
forneceram o mesmo derivado reduzido 93 com 68% de rendimento.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
164
9.2.24.3 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
/GuHCl
O produto 92 (50 mg; 0,10 mmol) foi adicionado a uma solução de cloridrato
de guanidina (GuHCl, 5,0 mg; 5% mol) em água (4,0 mL). Agitou-se a mistura
reacional vigorosamente por 30 minutos e, em seguida, adicionou-se NaBH
4
(4,0
mg; 0,11 mmol), seguindo-se a agitação por mais 20 minutos. Após este período,
extraiu-se com EtOAc, secou-se a solução em Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o
solvente em evaporador rotatório, sendo obtidos 43,2 mg do produto de partida.
9.2.24.4 Tentativa de redução de 92 com InCl
3
/NaBH
4
O derivado 92 (80 mg; 0,17 mmol) foi solubilizado em CH
3
CN (2,0 mL) e
mantido em atmosfera inerte, sendo então adicionados, com auxílio de um funil de
adição, InCl
3
(11,06 mg; 0,05 mmol) e NaBH
4
(18,4 mg; 0,49 mmol) dissolvidos em
2,0 mL de CH
3
CN. Manteve-se a mistura reacional sob agitação e temperatura
ambiente durante 3 horas, sendo a evolução da reação monitorada por CCD de
sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3), em intervalos de 30 minutos. Findas 3 horas,
acrescentou-se água e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se com solução aquosa
saturada de NaCl, secou-se sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em
evaporador rotatório, resultando em 75,4 mg do produto de partida.
Realizou-se uma nova tentativa de redução, empregando-se 75,4 mg de 92
como produto de partida e as mesmas condições reacionais, alterando-se o tempo
para 19 horas. Nessas condições, recuperaram-se 62,1 mg do produto de partida
(92).
9.2.24.5 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
A uma suspensão de NaBH
4
(50 mg; 1,33 mmol) em EtOH (2,0 mL)
acrescentaram-se 50 mg de 92 (0,10 mmol) dissolvidos em MeOH (3,0 mL).
Manteve-se a mistura reacional sob agitação e à temperatura ambiente, durante 24
horas. Monitorou-se a evolução da reação por CCD de sílica gel, empregando-se n-
hexano:EtOAc (7,5:2,5) como eluente. Ao final de 24 horas, o perfil cromatográfico
foi idêntico ao obtido para o material de partida. Adicionou-se, então, CeCl
3
.7H
2
O
(38,7 mg; 0,10 mmol) e manteve-se as mesmas condições reacionais por 24 horas
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
165
adicionais. Ao final deste período não se observou evolução da reação por CCD de
sílica gel e então aqueceu-se a mistura reacional em banho de silicone, elevando a
temperatura para 35-40ºC, por 4 horas. Após esse período, extraiu-se a mistura
reacional com EtOAc, lavou-se com H
2
O e solução aquosa saturada de NaCl. Em
seguida, secou-se a fase orgânica em Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em
evaporador rotatório, sendo recuperados 40,9 mg do composto de partida.
9.2.25 Síntese de 3β,28-diidroxi-urs-9,12-dieno (94) e 3β-hidroxi-urs-11-en-
28,13β-eter (84)
Em um balão de duas bocas (25 mL) adicionaram-se 62 mg de LiAlH
4
(1,63
mmol) e 2,0 mL de éter etílico seco. Manteve-se a suspensão sob agitação
magnética e então adicionaram-se 62 mg de 92 (0,13 mmol), solubilizados em 4,0
mL de éter etílico seco. A mistura reacional foi mantida sob agitação à temperatura
ambiente, durante 4 horas. A reação foi monitorada por CCD de sílica gel,
empregando-se como eluentes as misturas de n-hexano:EtOAc (7:3 e 1:1). Ao
término deste período, eliminou-se o excesso de LiAlH
4
com o gotejamento de éter
úmido, seguido do gotejamento de água. Adicionou-se HCl 2N, extraiu-se com
EtOAc e lavou-se a fase orgânica com solução aquosa saturada de NaCl. Secou-se
a fase orgânica em Na
2
SO
4
anidro e após eliminar o solvente em evaporador
rotatório foram obtidos 44 mg de um resíduo. Este foi submetido a fracionamento em
coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 10 × 186 mm), empregando-
se as misturas de n-hexano:EtOAc (8:2 e 1:1) e EtOAc como eluentes. Recolheram-
se 13 frações de aproximadamente 3 mL, que foram reunidas de acordo com os
perfis obtidos por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 1:1) e dados de RMN de
1
H. O
dieno 94 foi obtido das frações reunidas 3-6 (5,2 mg, 9%) e o éter 84 das frações 10-
13 (16,2 mg, 29%).
Dados físico-químicos do 3β,28-diidroxi-urs-9,12-dieno (94)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
30
H
44
O
2
M.M.: 436,68 g.mol
-1
CH
2
OH
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
166
HRMS calculado para C
30
H
44
O
2
[M + Na]
+
: 459,3239; encontrado: 459,3553.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3662 (O-H); 2941 (C-H); 1690 (C=C); 1240 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+7,80 (c 3,5, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,58 (d, 1H, J 6,0 Hz, H-11); 5,51 (d, 1H, J 6,0 Hz,
H-12); 3,60 (d1 3H, J 11 Hz, H-28a); 3,24 (d, 1H, J 11 Hz, H-28b); 3,22 (m, 1H, H-3);
1,21 (s, 3H, C-27H
3
); 1,16 (s, 3H, C-25H
3
); 1,03 (s, 3H, C-23H
3
); 0,94 (d, 3H, J 5 Hz,
C-30H
3
); 0,95 (s, 3H, C-26H
3
); 0,83 (d, 3H, J 5 Hz, C-29H
3
); 0,82 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 155,09 (C-9); 140,19 (C-13); 123,45 (C-12); 115,29
(C-11); 78,76 (C-3); 70,21 (C-28); 52,37 (C-18); 51,12 (C-5); 43,11 (C-8); 40,72 (C-
14); 39,36 (C-19); 38,73 (C-20); 38,07 (C-4); 38,07 (C-17); 37,30 (C-22); 35,17 (C-1);
31,93 (C-7); 30,61 (C-21); 29,77 (C-15); 28,26 (C-23); 27,93 (C-2); 25,47 (C-16);
25,47 (C-27); 21,53 (C-30);18,33 (C-6); 17,66 (C-26); 17,31 (C-29). 15,69 (C-25);
15,69 (C-24).
9.2.26 Síntese do 3,4-seco-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (95)
A uma solução do derivado 92 (50 mg; 0,10 mmol) em 5 mL de CH
2
Cl
2
,
acrescentou-se MCPBA (55,3 mg; 0,25 mmol) e NaHCO
3
(147,2 mg; 1,75 mmol).
Manteve-se a mistura reacional sob agitação à temperatura ambiente por 24 horas
e, então, acrescentou-se quantidade adicional de MCPBA (47,3 mg; 0,21 mmol).
Manteve-se a mistura reacional sob as mesmas condições por mais 16 horas. A
evolução da reação foi monitorada por CCD de sílica gel, empregando-se n-
hexano:EtOAc (7:3) como eluente. Ao término das 40 horas de reação, acrescentou-
se EtOAc e lavou-se sucessiva e exaustivamente com soluções aquosas saturadas
de Na
2
S
2
O
3
, NaHCO
3
e NaCl. A fase orgância foi seca em Na
2
SO
4
anidro e o
solvente eliminado em evaporador rotatório, resultando em 40,4 mg de um sólido.
Este foi submetido à filtração em coluna de sílica gel (10 × 170 mm) empregando-se
misturas de n-hexano:EtOAc (8:2 e 1:1) e EtOAc como eluentes. Recolheram-se 3
frações de 25 mL; aquela eluída com n-hexano:EtOAc (1:1) forneceu 24,9 mg da
lactona 95 (44% de rendimento) e as demais frações foram descartadas.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
167
A reação também foi realizada empregando-se 0,12 mmol de MCPBA,
durante 24 horas, resultando no mesmo produto de reação, porém em menor
rendimento (38%).
Dados físico-químicos do 3,4-seco-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (95)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
31
H
44
O
5
M.M.: 496,69 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
44
O
5
[M + Na]
+
: 519,3086; encontrado: 519,3265.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2923 (C-H); 1721 (C=O); 1654 (C=O); 1232 (C-O); 1030 (C-O).
[
α
αα
α
]
D
+135,00 (c 0,5, CHCl
3
).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,65 (s, 1H, H-12); 3,61 (s, 3H, COOCH
3
); 2,61 (m,
2H, H-2a e H-2b); 2,51 (s, 1H, H-9); 2,44 (d, 1H, J 12 Hz, H-18); 1,435(s, 3H, C-
27H
3
); 1,31 (s, 3H, C-25H
3
); 0,98 (s, 3H, C-23H
3
); 0,94 (s, 3H, C-24H
3
); 0,93 (s, 3H,
C-26H
3
); 0,88 (s, 3H, C-30H
3
); 0,82 (d, 3H, J 6,5 Hz, C-29H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 198,53 (C-11); 177,22 (C-28); 175,67 (C-3); 163,21
(C-13); 130,79 (C-12); 85,67 (C-4); 61,11 (C-9); 54,46 (C-5); 52,73 (C-18); 51,96
(COOCH
3
); 47,74 (C-17); 44,61 (C-14); 43,99 (C-8); 39,69 (C-10); 38,88 (C-1); 38,70
(C-20); 38,70 (C-19); 35,98 (C-22); 32,34 (C-7); 32,34 (C-2); 30,35 (C-21); 28,37 (C-
15); 26,05 (C-24); 23,92 (C-16); 23,92 (C-6); 22,12 (C-27); 20,98 (C-30); 18,41 (C-
25); 17,49 (C-29); 17,12 (C-26).
9.2.27 Síntese do 3-oxo,11-hidroxi-urs-12-en-28-oato de metila (96)
A uma solução de 90 (50 mg; 0,11 mmol) em 4,0 mL de CH
2
Cl
2
adicionou-se
5,10,15,20-tetrakis(pentafluorofenil) porfirina (3,5 mg; 3 mol%) e MCPBA 55% (44,32
mg; 0,26 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob agitação e atmosfera inerte, a
-78ºC, durante 30 horas. Ao término deste período, adicionaram-se soluções
COOCH
3
O
O
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
168
aquosas saturadas de NaHCO
3
e Na
2
S
2
O
3
, seguindo-se extração com EtOAc. A fase
orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de NaCl, seca sobre Na
2
SO
4
anidro e o solvente eliminado em evaporador rotatório, resultando na obtenção de
44,9 mg de um resíduo. Este foi cromatografado em coluna de sílica gel (dimensões
da coluna empacotada: 10 × 220 mm), empregando-se misturas de n-hexano:EtOAc
(9:1; 8:2; 1:1) como eluentes. Recolheram-se 15 frações de aproximadamente 3 mL,
que foram reunidas de acordo com os perfis obtidos por CCD de sílica gel e dados
de RMN de
1
H. O produto de partida 90 (17,4 mg) foi recuperado das frações
reunidas 2-5; já as frações 6-10 forneceram 13,3, mg (30%) de 92, enquanto das
frações 11-13 foram obtidos 25,1 mg da mistura de isômeros 96 (56%).
Outras 7 tentativas de otimizar a obtenção do produto 96 foram realizadas,
alterando-se a concentração do MCPBA, o tempo e temperatura da reação,
conforme descrito na Tabela 41. O produto da reação obtido na condição G, também
foi submetido a fracionamento cromatográfico em coluna de sílica gel, empregando-
se as mesmas condições e eluentes. Obtiveram-se 3 grupos de frações reunidas
nas quais também puderam ser identificados os alcoóis alílicos 96 (46%), o produto
92 (24%) e o material de partida 90 (30%).
Tabela 41 -
Condições avaliadas na oxidação de 90 com MCPBA, catalisada por 5,10,15,20-
tetrakis(pentafluorofenil) porfirina.
Condição Temperatura (ºC) Tempo (horas) MCPBA (mmol)
A -78 4 0,13
B -78 20 0,13
C 0 4 0,13
D ambiente 36 0,13
E -20 24 0,13
F ambiente 4 0,13
G ambiente 7 0,13
H -78 30 0,26
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
169
Dados físico-químicos do 3-oxo,11-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (96)
Sólido amorfo branco
F.M.: C
31
H
44
O
4
M.M.: 480,69 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
44
O
4
[M + Na]
+
: 503,3137; encontrado: 503,3453.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3646 (O-H); 2921 (C-H); 1726 (C=O); 1706 (C=O); 1241 (C-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,30 (d, 1H, J 3,6 Hz, H-12); 4,29 (dd, J 3,6 e 8,8
Hz, 1H, H-11); 3,61 (s, 3H, COOCH
3
); 2,27 (d, 1H, J 10,4 Hz, H-18); 1,10 (s, 3H, C-
27H
3
); 1,06(s, 3H, C-25H
3
); 0,96 (d, 3H, J 5,3 Hz, C-30H
3
); 0,94 (s, 3H, C-23H3);
0,91 (s, 3H, C-26H
3
); 0,88 (d, 3H. J 6,4 Hz, C-29H3); 0,84 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 217,91 (C-3); 178,03 (C-28); 139,88 (C-13); 129,55
(C-12); 68,27 (C-11); 55,62 (C-9); 52,18 (C-5); 51,78 (C-18); 51,71 (COOCH3); 47,74
(C-17); 47,37 (C-4); 42,89 (C-8); 42,89 (C-14); 40,68 (C-1); 38,73 (C-19); 38,73 (C-
20); 38,26 (C-10); 36,42 (C-22); 34,54 (C-7); 34,43 (C-2); 30,57 (C-21); 28,07 (C-15);
26,94 (C-23); 24,14 (C-16); 23,44 (C-27); 21,31 (C-30); 19,69 (C-6); 18,78 (C-29);
18,22 (C-26); 17,16 (C-24); 17,01 (C-25).
9.2.28 Tentativa de oxidação de 31 com NaClO
2
/t-BuOOH
A um balão de fundo redondo (25 mL) contendo 53 mg de 31 (0,12 mmol)
dissolvidos, sob aquecimento, em 6 mL de EtOAc, adicionaram-se 0,1 mL de
t-BuOOH 6M em n-decano (0,6 mmol) e 32 mg de NaClO
2
(0,35 mmol). A mistura
reacional foi mantida sob agitação magnética e refluxo, durante 12 horas. Após este
período, adicionou-se solução aquosa de Na
2
SO
3
a 10% e extraiu-se com EtOAc.
Lavou-se a fase orgânica sucessivamente com solução aquosa saturada de
NaHCO
3
e água; secou-se sobre Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em
rotavapor, obtendo-se 45,7 mg de um sólido. Sua análise por CCD de sílica gel,
utilizando-se n-hexano:EtOAc (7:3) como eluente, e os dados de RMN de
1
H
indicaram a obtenção de uma mistura complexa, impossibilitando o isolamento.
COOCH
3
O
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
170
9.2.29 Esterificação de 88 com CH
3
I/K
2
CO
3
A uma solução do derivado 88 (101,2 mg; 0,20 mmol) em acetona anidra (3,0
mL), adicionou-se K
2
CO
3
(131,3 mg; 0,95 mmol) e CH
3
I (3,0 mL). Manteve-se a
mistura reacional sob agitação e atmosfera inerte, à temperatura ambiente, durante
12 horas. Ao final deste período, adicionou-se acetona, filtrou-se e eliminou-se o
solvente em evaporador rotatório, obtendo-se 91 mg do produto 79 (rendimento de
88%).
9.2.30 Tentativas de epoxidação de 79 com H
2
O
2
/NaOH
A uma solução de 79 (68 mg; 0,13 mmol) em MeOH (0,5 mL), adicionou-se
H
2
O
2
33% (410µL) e solução recém preparada de NaOH 6M (100 µL), gota a gota,
durante 2 minutos. A reação foi mantida em banho de gelo e sob agitação durante 2
horas. A reação foi monitorada por CCD de sílica gel, empregando-se n-
hexano:EtOAc (7:3) como eluente. Ao final deste período, acrescentou-se H
2
O e
extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica com solução saturada de NaCl,
secou-se em Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em evaporador rotatório,
resultando em 57,7 mg do produto de partida.
Foram realizadas ainda outras duas tentativas de epoxidação. Na primeira,
empregaram-se as mesmas condições descritas acima, aumentando-se o tempo de
reação para 4 horas. Na segunda, dobraram-se os volumes das soluções de H
2
O
2
e
NaOH, matendo-se o tempo da reação em 2 horas. Em ambas as tentativas não se
obteve sucesso, obtendo-se o próprio produto de partida.
9.2.31 Tentativas de epoxidação de 79 com MCPBA
Na tentativa de epoxidar o produto 79, este (44,3 mg; 0,09 mmol) foi
solubilizado em CH
2
Cl
2
(5,0 mL), seguindo-se adição de NaHCO
3
(147 mg; 1,75
mmol) e MCPBA 77% (102,78 mg; 0,45 mmol). Manteve-se a mistura sob agitação à
temperatura ambiente, por 69 horas. Ao final deste período, acrescentou-se EtOAc
ao meio e lavou-se sucessiva e exaustivamente com soluções aquosas saturadas de
Na
2
S
2
O
3
, NaHCO
3
e NaCl. A fase orgânica foi seca em Na
2
SO
4
anidro e o solvente
eliminado em evaporador rotatório, resultando na recuperação de 36,7 mg do
produto de partida.
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
171
9.3 Transformações químicas do ácido oleanólico
9.3.1 Síntese do 3β-hidróxi-olean-12-en-28-oato de metila (97)
A uma suspensão de 100 mg (0,22 mmol) de ácido oleanólico (42) em
acetona anidra (5,0 mL) adicionaram-se 121 mg de K
2
CO
3
(0,88 mmol) e 0,5 mmol
de CH
3
I. A mistura reacional foi mantida sob agitação, em atmosfera inerte e
temperatura ambiente, por 4 horas, sendo a evolução da reação monitorada por
CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 7:3), em intervalos de 30 minutos. Ao final do
período, adicionou-se acetona, filtrou-se, secou-se a solução com Na
2
SO
4
e
eliminou-se o solvente em evaporador rotatório. Foram obtidos 91,9 mg de 97 (89%
de rendimento). Este procedimento foi repetido outras 4 vezes com diferentes
massas de 42, com rendimentos entre 74 e 94%.
Dados físico-químicos do 3β-hidróxi-olean-12-en-28-oato de metila (97)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
31
H
50
O
3
M.M.: 470,74 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
50
O
3
[M + Na]
+
: 493,3657; encontrado: 493,3635
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3331 (O-H); 2944 (C-H); 1726 (C=O); 1162 (C-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,30 (m, 1H, H-12); 3,63 (s, 3H, COOCH
3
); 3,22
(dd, 1H, J 9,7 e 5,7 Hz, H-3); 2,86 (dd, 1H, J 13,5 e 3,7 Hz, H-18); 1,13 (s, 3H, C-
27H
3
); 0,99 (s, 3H, C-25H
3
); 0,92 (s, 3H, C-23H
3
); 0,90 (s, 3H, C-30H
3
); 0,90 (s, 1H,
C-29H
3
); 0,78 (s, 1H, C-26H
3
); 0,72 (s, 3H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,32 (C-28); 143,77 (C-13); 122,38 (C-12); 78,94
(C-3); 52,27 (C-5); 51,60 (COOCH
3
); 47,63 (C-9); 46,75 (C-17); 45,90 (C-19); 41,64
(C-14); 41,31 (C-18); 39,28 (C-8); 38,77 (C-4); 38,44 (C-1); 37,04 (C-10); 33,88 (C-
21); 33,18 (C-29); 32,67 (C-7); 32,41 (C-22); 30,72 (C-20); 28,15 (C-23); 27,71 (C-
15); 25,98 (C-27); 23,66 (C-30); 23,44 (C-16). 23,08 (C-11); 18,37 (C-6); 16,86 (C-
26); 15,69 (C-24); 15,36 (C-25).
COOCH
3
HO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
172
9.3.2 Síntese do 3-oxo-olean-12-en-28-oato de metila (98)
A uma solução de 97 (405 mg; 0,86 mmol) em CH
2
Cl
2
anidro (15 mL)
acrescentou-se PDC (610 mg; 2,83 mmol). Manteve-se a mistura reacional sob
agitação e temperatura ambiente, durante 3 horas. Monitorou-se a evolução da
reação por CCD de sílica gel, empregando-se n-hexano:EtOAc (8:2) como eluente.
Ao final das 3 horas, evaporou-se o solvente em rotavapor, sendo o resíduo obtido
cromatografado em coluna de sílica gel (dimensões da coluna empacotada: 30 × 315
mm), empregando-se CH
2
Cl
2
e CH
2
Cl
2
:EtOAc (1:1) como eluentes. Obtiveram-se
387 mg de 98 (96% de rendimento). Este procedimento foi realizado outras 4 vezes,
com o rendimento variando entre 89 e 96%.
Dados físico-químicos do 3-oxo-olean-12-en-28-oato de metila (98)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
31
H
44
O
3
M.M.: 464,69 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
44
O
3
[M + Na]
+
: 487,3188; encontrado: 487,3437.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2988 (C-H); 1724 (C=O); 1702 (C=O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,30 (dd, 1H, J 7,1 e 3,5 Hz, H-12); 3,63 (s, 3H,
COOCH
3
); 2,87 (dd, 1H, J 14,0 e 3,8 Hz, H-18); 1,14 (s, 3H, C-27H
3
); 1,08 (s, 3H, C-
25H
3
); 1,04 (s, 3H, C-23H
3
); 1,04 (s, 3H, C-30H
3
); 0,92 (s, 3H, C-29H
3
); 0,90 (s, 1H,
C-26H
3
); 0,77 (s, 1H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 217,71 (C-3); 178,24 (C-28); 143,88 (C-13); 122,15
(C-12); 55,34 (C-5); 51,59 (COOCH
3
); 47,44 (C-4); 44,88 (C-9); 44,74 (C-17); 45,82
(C-19); 41,78 (C-14); 41,37 (C-18); 39,28 (C-8); 39,13 (C-1); 36,78 (C-2); 34,17 (C-
21); 33,87 (C-29); 33,14 (C-22); 32,37 (C-7); 32,18 (C-20); 30,71 (C-15); 27,70 (C-
23); 26,45 (C-27); 25,86 (C-11); 23,66 (C-16); 23,51 (C-30). 23,07 (C-11); 21,52 (C-
24); 19,61 (C-6); 16,78 (C-26); 15,02 (C-25).
COOCH
3
O
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
173
9.3.3 Síntese do 3-hidroxi-oxima-olean-12-en-28-oato de metila (99)
A uma solução de 98 (100 mg; 0,21 mmol) em EtOH absoluto (10 mL)
acrescentou-se piridina anidra (0,1 mL) e NH
2
OH.HCl (25 mg; 0,36 mmol). Manteve-
se o meio reacional sob agitação magnética e refluxo (95–100ºC), por 4 horas.
Monitorou-se a evolução da reação por CCD de sílica gel, empregando-se n-
hexano:EtOAc (8:2) como eluente. Após este período, acrescentou-se EtOAc ao
meio, lavou-se com solução aquosa saturada de NaCl, secou-se a fase orgânica em
Na
2
SO
4
anidro. Após eliminar o solvente em evaporador rotatório foram obtidos 97,3
mg de 99 (94%). A reação foi realizada mais uma vez, obtendo-se um rendimento de
89%.
Dados físico-químicos do 3-hidroxi-oxima-olean-12-en-28-oato de metila (99)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
31
H
50
O
3
N
M.M.: 484,74 g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
50
O
3
N
[M]
+
: 484,3790; encontrado: 484,3785.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 3661 (O-H); 2926 (C-H); 1726 (C=O); 1163 (C-O), 940 (N-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,25 (m, 1H, H-12); 3,61 (s, 3H, COOCH
3
); 3,08
(d, 2H, J 3,3 Hz, H-2); 2,86 (dd, 1H, J 13 e 4,5 Hz, H-18); 1,14 (s, 3H, C-27H
3
); 1,09
(s, 3H, C-25H
3
); 1,04 (s, 3H, C-23H
3
); 1,01 (s, 3H, C-30H
3
); 0,90 (s, 3H, C-29H
3
);
0,87 (s, 1H, C-26H
3
); 0,74 (s, 1H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,32 (C-28); 166,82 (C-3); 143,85 (C-13); 122,27
(C-12); 55,93 (C-5); 51,60 (COOCH
3
); 47,22 (C-9); 45,83 (C-19); 41,75 (C-14); 41,34
(C-18); 40,42 (C-4); 39,36 (C-8); 38,55 (C-1); 37,15 (C-10); 33,88 (C-21); 33,18 (C-
29); 32,41 (C-7); 32,41 (C-22); 32,41 (C-2); 30,72 (C-20); 27,71 (C-15); 27,12 (C-23);
25,87 (C-27); 23,70 (C-30); 23,52 (C-16). 23,08 (C-11); 19,03 (C-6); 17,12 (C-26);
16,90 (C-24); 14,95 (C-25).
COOCH
3
N
O
H
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
174
9.3.4 Acetilação de 99
Em um balão de fundo redondo (25 mL) contendo 40,2 mg de 99 (0,08 mmol)
adicionaram-se 0,5 ml de piridina e 0,5 ml de anidrido acético. A mistura reacional foi
deixada em repouso à temperatura ambiente, sob abrigo da luz, por 24 horas. A
evolução da reação foi monitorado por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 9:1). Ao
término deste período, adicionou-se gelo moído e manteve-se sob agitação durante
10 minutos. Extraiu-se com EtOAc, lavou-se com HCl 2N e com solução aquosa
saturada de NaCl. Secou-se a fase orgânica em Na
2
SO
4
e eliminou-se o solvente
em evaporador rotatório, sendo obtidos 37 mg de 100 (rendimento de 85%).
Dados físico-químicos do 3-acetóxi-imino-olean-12-en-28-oato de metila (100)
Sólido cristalino branco.
F.M.: C
33
H
52
O
4
N.
M.M.: 526,789g.mol
-1
HRMS calculado para C
31
H
50
O
3
N
[M + Na]
+
: 549,3794; encontrado: 549,3713.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2929 (C-H); 1726 (C=O); 1654 (C=N); 1163 (C-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,27 (dd, 1H, J 3,8 e 7,1 Hz, H-12); 3,61 (s, 3H,
COOCH
3
); 2,97 (dd, H, J 4,0 e 5,3 Hz, H-2b); 2,84 (dd, 1H, J 4,0 e 5,5 Hz, H-2a);
2,17 (s, 3H, OCOCH
3
); 1,24 (s, 3H, C-27H
3
); 1,11 (s, 3H, C-25H
3
); 1,10 (s, 3H, C-
23H
3
); 1,01 (s, 3H, C-30H
3
); 0,91 (s, 3H, C-29H
3
); 0,88 (s, 1H, C-26H
3
); 0,75 (s, 1H,
C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,28 (C-28); 174,72 (OCOCH
3
); 169,87 (C-3);
143,99 (C-13); 122,09 (C-12); 55,86 (C-5); 51,60 (COOCH
3
); 47,19 (C-9); 46,75 (C-
17); 45,83 (C-19); 41,75 (C-14); 41,38 (C-18); 39,32 (C-8); 39,32 (C-4); 38,73 (C-1);
37,01 (C-10); 33,88 (C-21); 33,15 (C-29); 32,37 (C-7); 32,37 (C-22); 32,37 (C-2);
30,76 (C-20); 27,71 (C-15); 27,08 (C-23); 25,87 (C-27); 23,66 (C-30); 23,52 (C-16).
23,15 (C-11); 20,10(OCOCH
3
); 19,47 (C-26); 19,00 (C-6); 16,86 (C-24); 15,14 (C-
25).
COOCH
3
N
OOCCH
3
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
175
9.3.5 Síntese do 3-acetóxi-olean-12-en-28-oato de metila (101)
Em um balão de fundo redondo contendo 200 mg de 97 (0,44 mmol)
adicionaram-se 1,0 ml de piridina e 1,0 ml de anidrido acético. A mistura reacional foi
deixada em repouso à temperatura ambiente, sob abrigo da luz, por 24 horas. A
evolução da reação foi monitorada por CCD de sílica gel (n-hexano:EtOAc 8:2).
Adicionou-se gelo moído e manteve-se sob agitação durante 10 minutos. Extraiu-se
o meio com EtOAc, lavou-se com HCl 2N e com solução aquosa saturada de NaCl.
Secou-se a fase orgânica em Na
2
SO
4
anidro e eliminou-se o solvente em rotavapor,
resultando em 180 mg de 101 (rendimento de 83%).
Dados físico-químicos do 3-acetóxi-olean-12-en-28-oato de metila (101)
Sólido cristalino branco
F.M.: C
33
H
52
O
4.
M.M.: 512,77 g.mol
-1
HRMS calculado para C
33
H
52
O
4
[M + Na]
+
: 535,3763; encontrado: 535,3721.
IV (
ν
νν
ν
max
, cm
-1
): 2938 (C-H); 1724 (C=O); 1287 (C-O).
RMN de
1
H (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 200 MHz): 5,26 (dd, 1H, J 7,2 e 3,6 Hz, H-12); 4,48 (m, 1H,
H-3); 3,61 (s, 3H, COOCH
3
); 2,85 (dd, 1H, J 13,3 e 4,3 Hz, H-18); 2,04 (s, 3H
OCOCH
3
); 1,12 (s, 3H, C-27H
3
); 0,93 (s, 3H, C-25H
3
); 0,92 (s, 3H, C-23H
3
); 0,89 (s,
3H, C-30H
3
); 0,85 (s, 3H, C-29H
3
); 0,84 (s, 1H, C-26H
3
); 0,71 (s, 1H, C-24H
3
).
RMN de
13
C (
δ
δδ
δ
; CDCl
3
; 50 MHz): 178,29 (C-28); 171,01 (OCOCH
3
); 143,81 (C-13);
122,31 (C-12); 80,93 (C-3); 55,31 (C-5); 51,56 (COOCH
3
); 47,55 (C-9); 44,75 (C-17);
45,86 (C-19); 41,64 (C-14); 41,31 (C-18); 39,28 (C-8); 38,11 (C-1); 37,70 (C-4);
36,93 (C-10); 33,88 (C-21); 33,15 (C-29); 32,63 (C-7); 32,41 (C-22); 30,72 (C-20);
28,07 (C-23); 27,71 (C-2); 27,71 (C-15); 25,91 (C-27); 23,66 (C-30); 23,55 (C-16).
23,44 (C-11); 21,35 (OCOCH
3
); 18,22 (C-6); 16,86 (C-26); 16,75 (C-24); 15,39 (C-
25).
COOCH
3
H
3
CCOO
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
176
9.4 Ensaios Biológicos
9.4.1 Avaliação da atividade citotóxica das substâncias obtidas a partir do
ácido ursólico
O ácido ursólico (31) e os derivados 80, 83, 84, 85, 86, 89, 92 e 95 tiveram
sua atividade citotóxica avaliada em linhagens de células tumorais humanas. Os
ensaios foram realizados na empresa BIOMAR S.A., sediada em Madrid, Espanha,
em colaboração com o Departamento de Química Farmacêutica da Faculdade de
Farmácia da Universidade de Salamanca, Salamanca, Espanha. A metodologia
empregada foi aquela descrita por Castro et al. (2004) e
Skehan et al. (1990).
9.4.2 Linhagens celulares empregadas
As células tumorais empregadas nos experimentos foram adquiridas de ATCC
(American Type Culture Collection). Uitlizaram-se linhagens celulares humanas de
carcinoma de pulmão A-549 (ATCC # CCL-185), adenocarcinoma colo-retal HT-29
(ATCC # HTB-38) e adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 (ATCC # HTB-26).
9.4.3 Culturas celulares
As linhagens celulares foram multiplicadas em meio DMEM (meio Dulbecco's
Eagle's modificado) suplementado com 10% de plasma fetal bovino, penicilina e
streptomicina (100 U/mL), em ambiente com 5% de CO
2
, a 37ºC. As culturas foram
incubadas em triplicata por 72 horas na presença (grupos experimento) ou ausência
(grupo controle) dos compostos ensaiados.
9.4.4 Ensaios de Citotoxicidade
O ensaio colorimétrico empregando sulforodamina B (SRB) foi adaptado para
mensurar quantitativamente o crescimento e a viabilidade celular, como descrito por
Skehan et al. (1990).
As suspensões celulares foram distribuídas em microplacas de 96 cavidades
contendo 5x10
3
células/cavidade. As culturas foram incubadas em atmosfera úmida,
por 24 horas e uma placa de cada linhagem celular foi corada e empregada como
referência para o número de células do grupo controle no tempo zero. As demais
Materiais e Métodos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
177
células foram tratadas com veículo (grupo controle) ou com os compostos ensaiados
(grupos experimento) nas concentrações de 10 a 0,0026
µ
g/mL e em seguida
incubadas por 72 horas. A citotoxicidade foi evoluída segundo análise colorimétrica e
comparação com o controle.
Para mensurar o crescimento celular, as células foram lavadas por duas
vezes com tampão fosfato, fixadas por 15 minutos em solução de glutaraldeído 1% e
novamente lavadas em tampão fosfato. Em seguida, foram mantidas em solução
SRB 0,4%, em temperatura ambiente. Após 30 min, as células foram lavadas com
solução de ácido acético 1% e a SRB extraída com 10 mM de trizma. A absorbância
foi mensurada a 490 nm. As células sobreviventes foram expressas como
porcentagem do crescimento das células do grupo controle, onde CI
50
=
concentração que provoca 50% de inibição do crescimento celular.
9.4.5 Avaliação da atividade antiplasmódica dos derivados obtidos
Os ensaios foram realizados pela Profa. Dra. Maria Fâni Dolabela, Faculdade
de Farmácia, UFPA e pelo Dr. Fernando de Pilla Varoti, Laboratório de Fitoquímica,
FAFAR, UFMG.
A atividade antiplasmódica in vitro foi avaliada para o ácido ursólico 31 e para
os derivados sintéticos 79, 80, 83, 84, 86, 89, 90, 91, 92 e 95. Foram preparadas
soluções estoque em DMSO para todas as substâncias ensaiadas (10 mg/mL);
estas foram diluídas para a concentração de 0,002% e estocadas a -20ºC.
Para a realização dos ensaios empregou-se a linhagem de Plasmodium
falciparum. Os parasitas foram cultivados em eritrócitos humanos, suspendidos em
meio RPMI suplementado com 10% de plasma humano de acordo com Trager e
Jensen (1976). A sincronização dos parasitas foi realizada por tratamento em
sorbitol (LAMBROS et al., 1979) e a parasitemia foi determinada microscopicamente
em esfregaços corados com Giemsa.
A atividade antimalárica dos compostos ensaiados foi determinada com a adição de
[
3
H]-hipoxantina como descrito por Andrade et al. (2007) e Desjardins et al. (1979).
Empregou-se cloroquina como controle. Os valores de CI
50
foram estimados por
comparação com o grupo controle e interpolação linear (HUBER et al., 1993). Todos
os experimentos foram realizados em triplicata.
Resultados e Discussão
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
178
10 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A massa disponível dos ácidos ursólico e oleanólico (item 4.6.1) e o amplo
espectro de atividades biológicas já descritas para ambos os triterpenos e seus
derivados, apresentada na revisão da literatura, motivou o emprego dessas
substâncias como material de partida para transformações químicas no presente
trabalho, visando obter novas substâncias bioativas. Alguns dos derivados obtidos
foram posteriormente avaliados em ensaios in vitro de atividade citotóxica e
antiplasmódica.
Todos os derivados sintetizados (Figuras 39, 65 e 73) tiveram como material
de partida os ácidos ursólico ou oleanólico e, portanto, os dados espectrométricos
obtidos para esses produtos se assemelham bastante àqueles dos precursores
(Itens 5.2.1.2 e 5.2.1.3). Dessa forma, visando simplificar a apresentação dos dados
espectrométricos de cada produto obtido, a discussão dos espectros será focada
nas características que possibilitaram definir inequivocamente as transformações
químicas observadas e as diferenças em relação aos produtos de partida.
Resultados e Discussão
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
179
HO
O
Figura 39 -
Esquema de síntese para a obtenção dos derivados do ácido ursólico. i) K
2
CO
3
/CH
3
I, t amb, 90%; ii) piridina/anidrido acético, t
amb, 89%; iii) NaClO
2
/t-BuOOH, 100°C, 66% (79), 9% (80); iv) LiAlH
4
, t amb, 88%; v) piridina/anidrido acético, t amb, 37%; vi) BF
3
-Et
2
O, t amb,
11%; vii) BF
3
-Et
2
O, -78°C, 39%; viii) piridina/anidrido acético, t amb, 17%; ix) HI57%, t amb, 47%; x) H
+
, t. amb.
CHO
HO
dieno
COOCH
3
H
3
CCOO
O
COOH
HO
COOCH
3
HO
79
84
81
83
82
85
83
31
77
78
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
ix
80
+
+
CH
2
OH
HO
OH
102
x
CHO
HO
COOCH
3
H
3
CCOO
CH
2
OH
HO
HO
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
3
CCOO
COOCH
3
H
3
CCOO
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
180
10.1 Transformações químicas do ácido ursólico
10.1.1 Síntese do 3β-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (77)
O tratamento de 31 com CH
3
I/K
2
CO
3
, em presença de acetona ou
dimetilformamida em temperatura ambiente, conduziu à formação do derivado
esterificado 77 (Figura 39). A reação foi realizada segundo metodologia descrita por
Zhu et al. (2004), na qual a base K
2
CO
3
promove a ionização do hidrogênio ácido e
o ânion carboxilato formado atua como nucleófilo na reação de substituição via SN
2
.
A acetona utilizada como solvente nas primeiras reações foi substituída por
dimetilformamida em algumas reações posteriores, para garantir a total solubilização
do ácido ursólico; porém, não se obteve aumento expressivo do rendimento da
reação, possivelmente devido às sucessivas lavagens para eliminação da
dimetilformamida (rendimentos de 75 a 90% em acetona e 85 a 90% em
dimetilformamida). Optou-se, então, pelo uso da acetona como solvente da reação.
A identificação de 77 como produto da reação foi confirmada pelo
aparecimento das bandas de deformação axial de C=O em 1718 cm
-1
e C─O entre
1230 e 1028 cm
-1
. A observação da banda de deformação axial de OH livre em 3525
cm
-1
sugeriu a presença da hidroxila em C-3. O espectro de RMN de
1
H obtido para
77 apresentou como principal diferença em relação ao ácido ursólico a presença do
simpleto em δ 3,61, atribuído aos hidrogênios do grupo metoxila (vide apêndice, pag.
275). No espectro de RMN de
13
C (vide apêndice, pag. 276), a presença dos sinais
em δ 51,51 e δ 178,09, atribuídos respectivamente aos carbonos dos grupos
metoxila e carbonila, confirmaram a formação do derivado esterificado, e estão de
acordo com os dados relatados por Zaprutko et al. (2004).
10.1.2 Síntese de 3β-acetóxi-urs-12-en-28-oato de metila (78)
A introdução do grupo acetila pelo tratamento com anidrido acético em
piridina é um método rotineiro em síntese orgânica (GARCÍA-GRANADOS et al.,
2004). A obtenção de 78 (Figura 39) foi confirmada pelo espectro de IV onde se
observou o desaparecimento da banda de deformação de OH livre em 3525 cm
-1
e o
aparecimento das bandas de deformação axial de C=O e C─O de éster em 1726
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
181
cm
-1
e 1229 cm
-1
, respectivamente. No espectro de RMN de
1
H observou-se o
deslocamento do sinal em δ 3,22, atribuído a H-3 no ácido ursólico, para δ 4,46 em
78, devido à desproteção induzida pela carbonila (vide apêndice, pag. 277). A
formação do produto também foi confirmada a partir dos dados obtidos do espectro
de RMN de
13
C (vide apêndice, pag. 278), no qual a presença dos sinais em δ
170,90 e 21,20 foram atribuídos, respectivamente, aos carbonos carbonílico e
metílico do grupo acetato (HONDA et al., 1997).
10.1.3 Síntese de 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (79) e 3β-
acetóxi-urs-9,12-dien-28-oato de metila (80)
O recente interesse no uso de NaClO
2
em oxidações alílicas é devido, entre
outras razões, ao seu baixo custo e às pequenas quantidades utilizadas, comparado
a outros agentes oxidantes (SILVESTRE; SALVADOR, 2007). O mecanismo da
reação envolve a formação de radicais livres. Segundo Geng et al. (2005), o
aquecimento de NaClO
2
leva à formação de radicais ClO
2
˙ e estes iniciam o
processo através da clivagem homolítica do t-BuOOH, originando radicais t-BuOO˙
extremamente reativos, os quais abstraem o hidrogênio alílico, levando à formação
do radical olefina que é posteriormente oxidado à enona correspondente (Figura 40)
(MARWAH et al., 2004; SILVESTRE; SALVADOR, 2007).
O perfil cromatográfico em CCD de sílica gel do produto evidenciou a
presença da mancha característica do produto principal e de uma mancha
secundária, com valor de Rf superior. Uma amostra da mistura (110,2 mg) foi, então,
submetida à cromatografia em coluna de sílica gel, resultando na obtenção de dois
sólidos, um deles correspondente ao derivado 79 obtido como produto principal da
reação, e outro (10,1 mg) cuja elucidação estrutural possibilitou identificar o dieno
homoanular 80.
A formação do derivado 79 foi evidenciada pela análise de seu espectro no IV
onde se observou a presença de banda de deformação axial de C=O de cetona α,β-
insaturada em 1654 cm
-1
, inexistente em 78. No espectro de RMN de
13
C dessa
substância foram observados sinais em δ 199,75, δ 130,65 e δ 162,96, atribuídos ao
carbono carbonílico C-11 e aos carbonos olefínicos C-12 e C-13, respectivamente. A
formação do derivado 79 também foi confirmada por dados do espectro de RMN de
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
182
1
H (vide apêndice, pag. 279), no qual, em comparação com o espectro do precursor
78, a principal diferença se deu na multiplicidade do sinal obtido para o hidrogênio
olefínico H-12. Pôde-se observar o desaparecimento do tripleto em δ 5,18, presente
no espectro do ácido ursólico e o surgimento do simpleto em δ 5,60, condizente com
a presença de carbonila cetônica em C-11 e com dados relatados na literatura para
o derivado estruturalmente relacionado do ácido oleanólico (ZAPRUTKO et al.,
2004).
2 ClO
2
•
+ 2 t-BuOOH 2 t-BuO
•
+ 2 OH + 2 O
2
+ Cl
2
t-BuO
•
+ t-BuOOH t-BuOO
•
+ t-BuOH
78
79
Figura 40: Mecanismo proposto para a formação de 79 (MARWAH et al., 2004).
COOCH
3
H
3
CCOO
COOCH
3
H
3
CCOO
t-BuOO
.
H
H
COOCH
3
H
3
CCOO
H
.
COOCH
3
H
3
CCOO
H
O
OtBu
t-BuOO
.
COOCH
3
H
3
CCOO
O
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
183
No espectro de RMN de
1
H obtido para 80 (vide apêndice, pag. 281), os
dupletos em
δ
5,58 e 5,51, com constante de acoplamento de 6,0 Hz, foram
atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-11 e H-12, respectivamente. No espectro de
RMN de
13
C (vide apêndice), os valores de deslocamento químico encontrados para
C-9 (
δ
154,54), C-11 (
δ
115,55), C-12 (
δ
123,30) e C-13 (
δ
139,44) são condizentes
com os deslocamentos esperados para carbonos de um sistema olefínico conjugado
(GARCIA-GRANADOS et al., 2004).
A análise do mapa de contornos HMQC (Figura 41, pag. 184) apontou as
correlações entre os carbonos e hidrogênios C-12/H-12 (
δ
123,30/5,51), C-11/H-11
(
δ
115,55/5,58), C-3/H-3 (
δ
80,63/4,51), C-18/H-18 (
δ
51,23/2,35),
COOCH
3
/COOCH
3
(
δ
51,67/3,62) e OCOCH
3
/OCOCH
3
(
δ
21,35/2,05). Os carbonos
olefínicos não hidrogenados não apresentaram manchas de correlação, confirmando
as atribuições efetuadas nos espectros monodimensionais.
Entre as correlações heteronucleares observadas no mapa de contornos
HMBC (Figura 42, pag. 185), as correlações entre C-12/H-18 (
δ
123,30/2,35), C-
13/H-18 (
δ
139,44/2,35), C-13/H-11 (
δ
139,44/5,58) e C-9/H-12 (
δ
154,54/5,51),
permitiram confirmar a obtenção do dieno homoanular e, conseqüentemente a
localização das duplas entre os carbonos C-9/C-11 e C12/C-13 do anel C.
A massa molecular obtida por espectrometria de massas de alta resolução
permitiu confirmar a estrutura proposta para o derivado inédito 80.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
184
Figura 41 -
Mapa de contornos
HMQC obtido para 80 (100 MHz, CDCl
3
).
C
-
12/H
-
12
C
-
1
1
/H
-
1
1
C
-
3
/H
-
3
C
OO
C
H
3
/COOC
H
3
O
C
O
C
H
3
/OCOC
H
3
C
-
18/H
-
18
COOCH
3
H
3
CCOO
11
12
13
18
9
27
2625
3
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
185
ppm
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
ppm
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Figura 42 –
Mapa de contornos HMBC obtido para 80 (100 MHz, CDCl
3
).
10.1.4 Síntese de 3β,11,28-triidroxi-urs-12-eno (81)
Na tentativa de se obter o álcool alílico a partir da cetona 79, foram avaliados
vários reagentes e condições de reação distintas, tais como CeCl
3
e NaBH
4
, NaBH
4
em microondas, GuHCl e NaBH
4
(HEYDARI et al., 2007; MATSUMOTO et al., 1996;
VARMA; SAINI, 1997). Como todas as condições ensaiadas foram insatisfatórias,
optou-se pelo emprego de LiAlH
4
como agente redutor.
O LiAlH
4
é um poderoso agente doador de hidretos, reduzindo rapidamente
ésteres, ácidos, nitrilas, amidas, aldeídos e cetonas. O mecanismo da redução
C
-
9/H
-
12
C
-
13/H
-
11
C
-
13
/H
-
1
8
C
-
12
/H
-
1
8
C
-
13/H
-
2
6
C
-
9/H
3
-
2
5 e 26
C
-
3
/H
3
-
2
3 e 24
COOCH
3
H
3
CCOO
11
12
13
18
9
27
2625
3
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
186
envolve a transferência nucleofílica do hidreto à carbonila correspondente, sendo
possível a transferência dos quatro hidretos (CAREY; SUNDBERG, 1993). Os
produtos de redução são liberados por hidrólise do alcóxido de alumínio ao final da
reação. O LiAlH
4
reage muito rapidamente com solventes próticos para captar
hidrogênio; portanto, as reduções com este reagente devem ser feitas em solventes
apróticos como éter ou tetrahidrofurano. A Figura 43 ilustra o mecanismo para a
obtenção do derivado 81, segundo proposto por Carey e Sundberg (1993).
A obtenção do derivado 81 como produto de redução de 79 foi sugerida pela
presença das bandas de deformação axial de OH livre em 3676 cm
-1
e deformação
axial de C-O de alcoóis em 1045 cm
-1
. A ausência de bandas na região de absorção
de carbonila (1870 a 1500 cm
-1
) indicou a redução tanto da cetona quanto dos
ésteres.
A redução dos três grupos também foi indicada pelos dados do espectro de
RMN de
1
H de 81, obtido imediatamente após a elaboração da reação. O
desaparecimento do simpleto em δ 5,60, atribuído a H-12 no precursor 79, e a
presença do dupleto em δ 5,22 e do dupleto largo em δ 4,35 (J = 4,2 Hz) atribuídos,
respectivamente, aos hidrogênios H-12 e H-11 confirmaram a obtenção do derivado
reduzido, bem como a presença do hidrogênio carbinólico H-3 (δ 3,19), com valor de
deslocamento químico semelhante àqueles descritos para outros derivados
hidroxilados (TAKEOKA et al., 2000; TKACHEV et al., 1994). Por fim, o multipleto
centrado em δ 3,26 e δ 3,17, referentes aos hidrogênios metilênicos
diasteroisotópicos H-28a e H-28b, com constante de acoplamento de 10 Hz,
confirmaram a redução total do derivado 79 (Figura 44).
A presença de um pequeno dupleto próximo ao sinal atribuído a H-12 e a
possibilidade de formação de mistura de isômeros em reduções empregando LiAlH
4
,
sugeriram a obtenção de uma mistura de epímeros em C11.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
187
C
O
O
O
OCH
3
C
CH
3
O
AlH
3
H
AlH
3
H
AlH
3
H
C
O
O
AlH
3
H
O
H
OCH
3
AlH
3
HC CH
3
O
AlH
3
C
O
O
AlH
3
H
O
H
AlH
3
AlH
2
OCH
3
H
CH
O
O
AlH
3
H
OAlH
2
OCH
3
H
AlH
3
CH
2
OH
HO
OH
H
H
2
O
CH
2
OH
HO
HO
H
+
Li
Li
Li
Li
Li
Li
Li
Li
Li
Li
Li
Li
LiOH + Al(OH)
3
Figura 43 -
Mecanismo proposto para a redução de 79 com LiAlH
4
, segundo Carey e
Sundberg (1993).
79
81
81
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
188
7.2662
5.2390
5.2193
4.3671
3.3374
3.2620
3.2028
3.1526
1.3766
1.2259
1.0196
0.9550
0.9030
0.7882
0.7630
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 44 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para o derivado 81 (200 MHz, CDCl
3
).
Conforme mencionado anteriormente, o derivado 81 foi caracterizado pelo
espectro de RMN de
1
H, obtido imediatamente após a elaboração da reação. O
espectro de RMN de
13
C do produto foi obtido 10 dias após a síntese e os dados
obtidos não foram compatíveis com o álcool alílico previamente identificado. Foi
então obtido o espectro de RMN de
13
C para outra amostra do derivado 81 que
estava armazenada há 5 dias e ambos os espectros se mostraram idênticos. A
análise dos espectros sugeriu que, durante o armazenamento, ocorreu a
isomerização do álcool alílico 81 na presença de traços de ácido clorídrico oriundos
do clorofórmio deuterado, empregado como solvente para dissolução da amostra
para obtenção dos espectros de RMN, resultando no álcool terciário 102 (Figura 45).
Foram obtidos espectros de RMN de
1
H para estas amostras do derivado 81
armazenadas em tempos variados e estes se mostraram distintos daqueles obtidos
logo após a elaboração da reação. Os dados de RMN de
1
H foram condizentes com
a obtenção do álcool terciário 102.
H
-
12
H
-
1
1
H
-
3
H
-
28a
H
-
28b
CH
2
OH
HO
HO
11
12
13
18
28
3
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
189
CH
2
OH
HO
HO
CH
2
OH
HO
H
2
O
H
CH
2
OH
HO
H
2
O
CH
2
OH
HO
CH
2
OH
HO
OH
2
H
2
O
CH
2
OH
HO
OH
H
Figura 45 -
Mecanismo proposto para a isomerização do álcool alílico 81
.
O álcool terciário 102 originário da isomerização do derivado 81 foi
caracterizado por dados espectrais de RMN. Assim, no espectro de RMN de
1
H
(Figura 46), o dupleto centrado em δ 5,74 (J = 10,3 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-
12 em acoplamento com H-11. A presença do dupleto duplo centrado em δ 5,48 (J =
10,3 e 3,3 Hz), atribuído ao hidrogênio H-11 em acoplamento com os hidrogênios H-
12 e H-9, indicou a isomerização da ligação dupla de C-12/C-13 para C-11/C-12. A
multiplicidade e o valor de deslocamento químico encontrados para H-9 (d, δ 1,80)
foram condizentes com valores relatados na literatura para triterpenos com dupla
ligação entre C-9 e C-11 (GARCIA-GRANADOS ET AL., 2004).
No espectro de RMN de
13
C o sinal em δ 85,16 foi atribuído ao carbono não
hidrogenado C-13, de acordo com dados relatados na literatura para os triterpenos
rubiprasin A e B, também hidroxilados nesta posição (MAHATO; KUNDU, 1994). Os
sinais em δ 129,73 e δ 133,08 atribuídos aos carbonos olefínicos C-12 e C-11,
também estão de acordo com dados relatados na literatura (TKACHEV et al., 1994).
A ausência do sinal em δ 168,36, referente ao carbono carbonílico C-28, bem como
dos sinais em δ 51,89 e δ 21,02, confirmam a redução dos grupos dos grupos carbo
metoxila e acetila, respectivamente (Figura 47).
A confirmação das atribuições efetuadas nos espectros de RMN de
1
H e de
13
C foi obtida pela análise do mapa de contorno COSY (Figura 48), onde se pôde
observar a conectividade entre os hidrogênios H-12/H-11 (δ 5,74/δ 5,48) e H-28a/H-
81
102
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
190
28b (δ 3,66/δ 3,20), assim como a superposição dos sinais dos hidrogênios H-3 (δ
3,21) e H-28b (δ 3,20).
7 . 2 6 5 1
5 . 7 6 1 2
5 . 7 5 8 0
5 . 7 3 5 3
5 . 7 3 2 1
5 . 5 0 1 0
5 . 4 9 2 8
5 . 4 7 5 2
5 . 4 6 6 9
3 . 6 6 8 8
3 . 6 5 1 8
3 . 2 1 6 1
3 . 2 1 2 3
3 . 2 0 0 3
1 . 8 1 3 2
1 . 8 0 3 8
1 . 0 7 7 1
1 . 0 3 8 5
0 . 9 9 2 4
0 . 9 7 9 2
0 . 9 2 6 8
0 . 8 9 4 6
0 . 7 7 6 5
( p p m )
1 . 02 . 03 . 04 . 05 . 06 . 07 . 0
Figura 46 -
Espectro de RMN de
1
H obtido para o derivado 102 (400 MHz, CDCl
3
).
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
ppm
15.15
15.86
17.43
17.47
17.85
17.93
17.98
18.41
18.51
19.48
19.67
21.67
22.19
23.74
25.63
25.75
27.31
27.32
28.01
28.12
28.45
29.91
30.78
31.67
31.75
32.13
35.26
35.32
36.60
37.49
37.99
38.27
38.50
38.89
38.93
39.14
39.54
40.91
41.02
41.90
42.63
43.29
44.50
51.32
52.55
53.24
55.05
61.58
70.38
76.96
77.43
78.91
79.21
85.16
115.48
123.64
129.73
133.08
140.18
Figura 47 -
Espectro de RMN de
13
C obtido para 102 (100 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OH
HO
OH
3
9
11
12
13
28
18
CH
2
OH
HO
OH
3
9
11
12
13
28
18
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
191
ppm
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
Figura 48 -
Mapa de contornos COSY obtido para 102 (100 MHz, CDCl
3
).
A análise do mapa de contornos HMQC (Figura 49), permitiu observar
manchas de correlação entre os sinais dos carbonos em δ 133,08 (C-12); δ 129,73
(C-11); δ 79,21(C-3) e δ 76,96 (C-28) e os hidrogênios em δ 5,74 (H-12); δ5,48 (H-
11); δ 3,66/ δ 3,20 (H-28a/H-28b). O sinal atribuído ao carbono não hidrogenado C-
13 (δ 85,16), no qual se encontra o álcool terciário, não apresentou mancha de
correlação.
H-11/H-12
H-11/H-9
H-28a/H-28b
H-3/H-2
CH
2
OH
HO
OH
3
9
11
12
13
28
18
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
192
ppm
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
ppm
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
Figura 49 –
Mapa de contornos HMQC obtido para 102 (100 MHz, CDCl
3
).
A presença de sinais de intensidade inferior àqueles atribuídos ao derivado
(102) no espectro de RMN de
13
C evidenciou a obtenção de um produto secundário.
O derivado 102 foi cromatografado em coluna de sílica, levando à obtenção de uma
mistura de dienos e do próprio derivado 102. Esta mistura foi acetilada, visando
facilitar a separação dos dienos, porém, as várias tentativas de separação
cromatográfica não foram bem sucedidas. Optou-se então pelo emprego de
cromatografia em coluna de sílica impregnada com AgNO
3
, método usado para a
separação de compostos de polaridade semelhante. O processo resultou no
isolamento do dieno heteroanular 85, derivado inédito do ácido ursólico, e na mistura
C
-
1
1
/H
-
1
1
C
-
1
2
/H
-
1
2
C
-
3
/H
-
3
C
-
28
/H
-
28a
C
-
28
/H
-
28b
C
-
18
/H
-
18
C
-
5
/H
-
5
C
-
9
/H
-
9
CH
2
OH
HO
OH
3
9
11
12
13
28
18
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
193
dos dienos 80, já obtido anteriormente e 85. A figura 50 ilustra o mecanismo
proposto para a formação do dieno 85.
CH
2
OOCH
3
H
3
CCOO
HO
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
2
O
H
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
2
O
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
Figura 50 -
Proposta de mecanismo de formação do dieno 85.
O espectro de UV obtido para 85 apresentou um máximo de absorção em 252
nm, indicativo da existência de um sistema dieno heteroanular (KOBAYASHI et al.,
1981; SHIMIZU et al., 1985).
O espectro de RMN de
1
H obtido para 85 (vide apêndice) apresentou dois
simpletos em δ 2,06 e δ 2,05, atribuídos aos hidrogênios metílicos dos grupos acetila
introduzidos na molécula. O dupleto duplo centrado em δ 6,41 foi atribuído ao
hidrogênio H-11 (J = 11,0 e 3,0 Hz), sendo a multiplicidade resultante de seu
acoplamento com H-12 e H-9. Já o dupleto centrado em δ 5,60 foi atribuído ao
hidrogênio H-12 (J = 11,0 Hz). Os dupletos centrados em δ 4,28 e δ 3,87, atribuídos
aos hidrogênios metilênicos diastereotópicos H-28a e H-28b (J = 11,2 Hz),
apresentam valores de deslocamento químicos mais afastados do TMS do que
aqueles obtidos para 81, devido à proximidade da carbonila.
No espectro de RMN de
13
C, os sinais em δ 125,25, δ 126,98, δ 136,86 e δ
138,37 foram atribuídos aos carbonos olefínicos C-11, C-12, C-13 e C-18,
respectivamente. Essas atribuições basearam-se na comparação com dados da
literatura relatados para um dieno estruturalmente relacionado do ácido oleanólico
81
85
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
194
(GARCIA GRANADOS et al., 2004). Por sua vez, os sinais em δ 171,19, δ 171,08 e
δ 21,35 foram atribuídos aos carbonos carbonílicos e metílicos dos grupos acetila
introduzidos na molécula (vide apêndice).
O mapa de contornos COSY (Figura 51) obtido para 85 confirmou algumas
das atribuições efetuadas nos espectros de RMN de
1
H, a partir das manchas de
correlação entre os hidrogênios H-11/H-12 (δ 6,41/ δ 5,60), H-11/H-9 (δ 6,41/ δ 1,90)
e H-28a/H-28b (δ 4,28/ δ 3,87). De maneira semelhante, as manchas de correlação
heteronuclear observadas no mapa de contornos HMQC (Figura 52) permitiram
confirmar algumas das atribuições dos espectros monodimensionais, destacando-se
as correlações entre C-12/H-12 (δ 126,98/δ 5,60), C-11/H-11 (δ 125,25/δ 6,41), C-
3/H-3 (δ 80,89/δ 4,51), C-28/H-28a e H-28b (δ 66,26/δ 4,28 e δ 3,87) e C-9/H-9 (δ
54,21/δ 1,90).
As correlações heteronucleares observadas no mapa de contornos HMBC
(Figura 53), destacando-se as correlações entre C-18/H-12 (
δ
138,37/5,60) e
C-12/H-9 (
δ
126,98/1,93), permitiram confirmar a obtenção do dieno heteroanular e,
conseqüentemente a localização das duplas entre os carbonos C-11/C-12 e C13/C-
18.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
195
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
Figura 51 -
Mapa de contornos COSY obtido para 85 (400 MHz, CDCl
3
).
H
-
11/H
-
12
H
-
11/H
-
9
H
-
28a
/H
-
2
8b
H
-
3
/H
-
2
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
3
9
11
12
13
18
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
196
Figura 52 –
Mapa de contornos HMQC obtido para 85 (100 MHz, CDCl
3
).
C
-
3
/H
-
3
C
-
28
/H
-
28a
C
-
28
/
H
-
28b
C
-
9
/H
-
9
C
-
11/H
-
11
C
-
1
2
/H
-
1
2
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
3
9
11
12
13
18
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
197
ppm
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
ppm
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Figura 53
– Mapa de contornos HMBC obtido para 85 (100 MHz, CDCl
3
).
10.1.5 Síntese de 3β,11,28-triacetóxi-urs-12-eno (82)
Em vista do exposto, a fim de confirmar inequivocamente a obtenção do
álcool alílico 81 como produto de redução de 79, procedeu-se à sua acetilação,
imediatamente após sua síntese, e realizou-se sua caracterização por dados de
RMN de
1
H e de
13
C. Como a acetilação proporciona maior estabilidade à molécula,
não ocorre isomerização em meio ácido.
C
-
18/H
-
12
C
-
1
2
/H
-
9
C
-
18/H
3
-
2
9
C
-
1
3
/H
3
-
2
7
C
-
3
/H
3
-
2
3 e 24
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
3
9
11
12
13
18
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
198
A mistura de diasteroisômeros 81 foi submetida à acetilação empregando-se
anidrido acético em piridina, resultando na obtenção de 82 (Figura 39, pag. 179). O
sucesso da acetilação foi constatado pela análise do espectro no IV obtido para 82,
no qual se observou a ausência de bandas de deformação axial de hidroxila de
alcoóis, na região de 3500 cm
-1
e a presença de bandas de absorção em 1728 e
1232 cm
-1
, atribuídas a deformações axiais de C=O e C-O de ésteres,
respectivamente.
A análise do espectro de RMN de
1
H (vide apêndice) confirmou a formação do
derivado acetilado e os simpletos em δ 2,04, δ 2,03 e δ 1,94 foram atribuídos aos
carbonos metílicos dos grupos acetila introduzidos na reação. Os dupletos centrados
em δ 3,97 e δ 3,58, atribuídos aos hidrogênios metilênicos H-28a e H-28b (J = 11,0
Hz), encontram-se mais afastados do TMS em relação aos sinais correspondentes
obtidos para 81, devido ao efeito de ressonância da carbonila do grupo acetila. A
localização da dupla ligação entre as posições 12 e 13 foi confirmada pela presença
do dupleto duplo em δ 5,43, atribuído a H-11 (J = 8,6 e 3,6 Hz) em acoplamento com
H-9 e H-12 e do dupleto em δ 5,17 (J = 3,6 Hz) atribuído a H-12 (vide apêndice).
Neste caso, o sinal correspondente ao hidrogênio H-11 se encontra mais afastado
do TMS, devido à presença do grupo acetila. O dupleto duplo centrado em δ 4,46 (J
= 10,0 e 5,6 Hz) foi atribuído a H-3.
A introdução dos grupos acetila na molécula também foi evidenciada ao se
analisar o espectro de RMN de
13
C (vide apêndice), no qual os sinais em δ 171,23 e
δ 171,12 foram atribuídos aos carbonos carbonílicos e os sinais em δ 21,68, δ 21,35
e δ 21,02 aos metílicos. O sinal do carbono não hidrogenado em δ 144,10, atribuído
a C-13 e dos carbonos olefínico e metínico, respectivamente em δ 124,29 e δ 70,77,
atribuídos a C-12 e C-11, confirmaram a localização da ligação dupla em C-12/C-13
e a acetilação na posição 11. Os valores de deslocamentos encontrados foram
condizentes com valores descritos na literatura (MAHATO; KUNDU, 1994).
A comparação com os dados espectrais obtidos para 102, os valores de
deslocamento químico e as respectivas multiplicidades dos sinais permitiram
identificar o número e a posição dos grupos acetila introduzidos na molécula,
confirmando a obtenção do derivado 82.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
199
O mapa de contornos HMQC (Figura 54) permitiu confirmar as atribuições
efetuadas nos espectros de RMN de
1
H e de
13
C. O sinal de carbono em δ 124,29
(C-12) apresentou mancha de correlação com o sinal de hidrogênio em δ 5,17 (H-
12). O sinal em δ 70,77, atribuído aos carbonos C-11 e C-28, correlacionou-se com o
sinal de hidrogênio em δ 5,43 (H-11) e também com os sinais em δ 3,97 (H-28a) e δ
3,58 (H-28b), confirmando a atribuição efetuada no espectro de RMN de
13
C.
Figura 54 –
Mapa de contornos HMQC obtido para 82 (CDCl
3
, 100 MHz).
ppm
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
ppm
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
C
-
12/H
-
12
C
-
1
1
/H
-
1
1
C
-
2
8a
/H
-
2
8a
C
-
3
/H
-
3
C
-
2
8b
/H
-
2
8b
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
3
CCOO
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
200
10.1.6 Síntese de 3β-hidróxi-urs-12-en-28-al (83) e 3β-hidróxi-urs-11-en-
28,13β-éter (84)
Alcoóis alílicos podem facilmente sofrer rearranjo na presença de um ácido de
Lewis, levando, várias vezes, à formação de um novo esqueleto. Esta clivagem pode
gerar consideráveis quantidades de produtos anômalos, ou seja, aqueles que
contêm um átomo de carbono a menos que o esperado (DOS SANTOS;
MAGALHÃES, 1991). As reações de rearranjo envolvendo espécies contendo pares
de elétrons não compartilhados são processos altamente eficientes e rápidos,
requerendo quase sempre um tempo de reação bem pequeno (TONDER; TANNER,
2003).
O triol 81 foi submetido a tratamento com BF
3
-Et
2
O em CH
2
Cl
2,
imediatamente
após sua síntese, segundo procedimento descrito por Halterman e McEvoy (1990) e
Marson (2000), empregando diferentes condições experimentais, visando obter
derivados distintos, resultantes de possíveis rearranjos da molécula.
Quando a reação foi realizada à temperatura ambiente, por duas horas,
obteve-se como produto uma mistura complexa contendo o aldeído 83, como
produto principal, isolado por técnicas cromatográficas usuais e caracterizado como
um derivado inédito.
A formação do aldeído espirânico 83 pode ser explicada através de
sucessivas migrações de elétrons de C-11 para C-13 e para C-18. A aptidão
migratória depende do caráter doador de elétrons e determina se o produto será
anômalo ou não. A contração do anel E resultou em carga positiva em C-17, a qual
foi estabilizada pela migração de hidreto, levando a C-28 carregado positivamente,
sendo este estabilizado pelo par de elétrons do oxigênio adjacente. A perda
subseqüente de H
+
resultou na oxidação da função alcoólica correspondente a
aldeído (BHATTACHARYA et al., 1997). A Figura 55 ilustra esta proposta de
mecanismo para a formação de 83.
Resultados e Discussão
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
201
CH
2
OH
HO
HO
BHF3
CH
2
OH
HO
CH
HO
CH
2
OH
HO
CH
2
OH
HO
H
C
HO
H
H
O
H
O
H
H
C
HO
O
H
Figura 55 -
Proposta de mecanismo para a formação do produto de rearranjo 83.
81
83
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
202
Visando analisar a influência da temperatura e do tempo de reação na
formação dos produtos, foram realizadas várias repetições da reação, empregando
as condições descritas na Tabela 42. Quando a reação foi efetuada a -78ºC for 2h
(condição B), obteve-se o éter cíclico 84, caracterizado como um novo derivado do
ácido ursólico. As demais variações das condições reacionais avaliadas não levaram
à obtenção de produtos distintos, resultando sempre na mesma mistura constituída
do derivado 83 como produto principal.
Tabela 42 -
Condições reacionais avaliadas no tratamento de 81 com BF
3
-Et
2
O (0,19 mmol)
visando obter o produto de rearranjo 83.
Condição
Temperatura (ºC)
Tempo (horas)
A ambiente 2
B -78 2
C 0 1
D 0 2
E 50 1
F ambiente 20
G ambiente 4
A análise dos espectros de RMN de
1
H, de
13
C e subespectro DEPT obtidos
para 83 possibilitaram confirmar a estrutura proposta para o derivado. No espectro
de RMN de
1
H (vide apêndice, pag. 286) observou-se a presença de um simpleto em
δ
9,29, sendo este valor de deslocamento químico afastado do TMS resultante do
efeito de anisotropia diamagnética, característica de hidrogênio de aldeído e,
portanto, atribuído à H-28. Os dupletos largos centrados em
δ
5,60 e
δ
5,42, com
constante de acoplamento de 10,4 Hz, foram atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-
12 e H-11, respectivamente. O dupleto duplo centrado em
δ
3,21 (J = 10,4 e 5,8 Hz)
foi atribuído a H-3. Os sinais dos hidrogênios metílicos foram atribuídos a partir da
análise dos mapas de contornos HMQC e HMBC (Figuras 56, 57 e 58). Os dupletos
centrados em
δ
1,03 e
δ
0,99 (J = 6,3 e 5,2 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios
metílicos de C-30 e C-29, respectivamente. Já os simpletos em
δ
0,96,
δ
0,91,
δ
0,82,
δ
0,75 e
δ
0,71 foram atribuídos aos hidrogênios metílicos em C-23, C-26, C-
25, C-24 e C-27, respectivamente.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
203
A análise dos mapas de contornos HMQC e HMBC (Figuras 56, 57 e 58)
permitiu atribuir inequivocamente os sinais de RMN de
13
C de 83. Assim, o mapa de
contornos HMBC indicou correlação entre o sinal do carbono em
δ
78,93 (C-3) e os
sinais de hidrogênio em
δ
0,75 (H-24) e 0,96 (H-23) que, por sua vez, apresentaram
correlação com os sinais de carbono em
δ
36,38 (C-4) e 54,61 (C-5). A Tabela 43
mostra as principais correlações do mapa de contornos HMBC obtido para 83.
A presença do sinal de carbono metínico em
δ
47,29, atribuído a C-17, no
espectro de RMN de
13
C e as correlações entre os sinais em
δ
52,18 (C-18),
δ
39,46
(C-19) e
δ
39,35 (C-20) e
δ
1,63 (H-17), no mapa de contornos HMBC, confirmaram
a contração do anel E. No espectro do precursor 81, C-17 aparece como um sinal de
carbono não hidrogenado em
δ
36,42. As Tabelas 44 e 45 apresentam as principais
atribuições do espectro de RMN de
13
C e de
1
H feitas para o aldeído 83 a partir das
correlações observadas no mapa de contornos HMBC.
Tabela 43 -
Correlações observadas no mapa de contornos HMBC obtido para 83 (400 MHz,
CDCl
3
).
Carbono
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
H
1 37,99 0,82 (H-25)
4 36,38 0,96 (H-23), 0,75 (H-24)
5 54,61 1,99 (H-9), 0,96 (H-23), 0,75 (H-24), 0,82 (H-25)
8 38,83 0,91 (H-26)
9 44,28 5,42 (H-11), 5,60 (H-12), 0,91 (H-26)
10 41,04 5,42 (H-11), 0,82 (H-25)
11 123,54 5,60 (H-12), 1,99 (H-9)
12 133,81 5,42 (H-11), 1,99 (H-9), 1,63 (H-17)
13 52,61 5,42 (H-11), 5,60 (H-12), 9,29 (H-28)
14 39,87 5,60 (H-12), 0,91 (H-26), 0,71 (H-27)
18 52,18
9,29 (H-28), 5,42 (H-11), 5,60 (H-12),
1,63 (H-17), 0,99 (H-29)
19 39,45 1,63 (H-17), 0,99 (H-29), 1,03 (H-30)
20 39,35 1,63 (H-17), 0,99 (H-29), 1,03 (H-30)
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
204
Tabela 44 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
1
H obtido para 83 (400 MHz, CDCl
3
).
Hidrogênio
δ
δδ
δ
H
(J
Hz)
3 3,21 dd (10,4 e 5,8)
9 1,99 sl
11 5,42 dl (10,4)
12 5,60 dl (10,4)
23 0,96 s
24 0,75 s
25 0,82 s
26 0,91 s
27 0,71 s
28 9,29 s
29 0,99 d (5,2)
30 1,03 d (6,3)
A análise do mapa de contornos COSY (Figura 59) permitiu confirmar
algumas atribuições do espectro de RMN de
1
H monodimensional, a partir das
manchas de correlação entre os hidrogênios H-12/H-11 (
δ
5,60/
δ
5,42), H-12/H-13 (
δ
5,60/
δ
1,82) e H-11/H-9 (
δ
5,42/
δ
1,99).
No espectro obtido na região do IV, a presença da banda em 1716 cm
-1
,
característica de vibração de deformação axial de aldeído, confirmou a obtenção do
produto de rearranjo 83.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
205
Tabela 45 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CDCl
3
) de 83.
Carbono
δ
δδ
δ
C
Tipo
1 37,99 CH
2
2 27,02 CH
2
3 78,93 CH
4 36,38 C
5 54,60 CH
6 18,25 CH
2
7 32,19 CH
2
8 38,82 C
9 44,28 CH
10 41,04 C
11 123,54 CH
12 133,81 CH
13 52,61 CH
14 39,87 C
15 30,10 CH
2
16 25,72 CH
2
17 47,28 CH
18 52,18 C
19 39,45 CH
20 39,35 CH
21 30,33 CH
2
22 32,19 CH
2
23 27,74 CH
3
24 14,96 CH
3
25 20,45 CH
3
26 17,01 CH
3
27 16,06 CH
3
28 206,35 CH
29 16,38 CH
3
30 18,55 CH
3
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
206
Figura 56 -
Seção expandida do mapa de contornos HMQC de 83 (400 MHz, CDCl
3
).
C29/H29
C25/H25
C24/H24
C30H30
C19/H19
C20/H20
C1/H1
C7/H7
C23/H23
C21/H21
C16/H16
C9/H9
C1/H1
C7/H7
C15/H15
C5/H5
C13/H13
C17/H17
C
H
HO
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25 26
27
28
29
30
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
207
Figura 57 -
Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 83 (400 MHz, CDCl
3
).
C13/H28
C18/H28
C13/H12
C13/H11
C9/H11
C9/H12
C10/H11
C14/H12
C8/H11
C
H
HO
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25 26
27
28
29
30
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
208
Figura 58 -
Seção expandida do mapa de contornos HMBC de 83 (400 MHz, CDCl
3
).
C5/H25
C18/H29
C5/H23
C5/H24
C13/H27
C17/H30
C9/H26
C14/H27
C13/H26
C18/H17
C5/H9
C19/C20/H17
C14/H26
C10/H25
C4/H24
C19/C20/H30
C4/H25
C1/H25
C
H
HO
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25 26
27
28
29
30
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
209
Figura 59 -
Mapa de contornos COSY obtido para 83 (400 MHz, CDCl
3
).
Quando a reação foi conduzida à temperatura de -78 ºC por 2 horas (condição
B) obteve-se como produto o éter cíclico 84. A Figura 60 ilustra a proposta de
mecanismo para a formação de 84.
CH
2
OH
HO
HO
CH
2
OH
HO
O
HOBF
3
CH
2
OH
HO
HO
CH
2
HO
HO
H
O
BF
3
H
-
-
Figura 60 -
Proposta de mecanismo para a formação de 84.
H-11/H-12
H-11/H-9
H-12/H-13
H-3/H-2
81
84
C
H
HO
O
3
2
9
11
12
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
210
A análise dos espectros obtidos para o produto de reação na condição B
possibilitou caracterizar o derivado inédito 84. No espectro de IV dessa substância
pôde-se observar a presença de bandas entre 1022 e 989 cm
-1
características de
deformação axial assimétrica de C-O-C de éter. No espectro de RMN de
1
H (vide
apêndice) pôde-se atribuir os dupletos centrados em δ 3,21 e δ 3,66 (J = 6,5 Hz) aos
hidrogênios metilênicos H-28a e H-28b. O dupleto duplo centrado em δ 3,20 (J =
11,3 e 4,9 Hz), parcialmente superposto ao sinal de H-28a, foi atribuído ao
hidrogênio H3. O dupleto em δ 5,73 (J = 10,3 Hz) foi atribuído a H-12 em
acoplamento com H-11, com orientação sinclinal, enquanto o dupleto duplo centrado
em δ 5,48 foi atribuído a H-11, sendo a multiplicidade do sinal resultante de seu
acoplamento com H-12 e H-9 (J = 10,3 e 3,2 Hz, respectivamente).
A conectividade entre alguns sinais de hidrogênio no mapa de contornos
COSY (Figura 61) possibilitou confirmar as atribuições feitas a partir do espectro de
RMN de
1
H monodimensional. Assim, evidenciou-se a conectividade entre os
dupletos centrados em δ 3,21 e δ 3,66, atribuídos aos hidrogênios metilênicos em C-
28. A conectividade entre o dupleto em δ 5,73, atribuído a H12, e o dupleto duplo em
δ 5,48, atribuído a H-11, também foi identificada através de análise do mapa de
contorno COSY.
O espectro de RMN de
13
C (vide apêndice) obtido para 84 apresentou 30
sinais cuja análise do subespectro DEPT possibilitou identificá-los como 7CH
3
,
9CH
2
, 8CH e 6C. A atribuição dos sinais baseou-se na comparação com o espectro
da substância de origem 81 e na análise detalhada dos mapas de contornos HMBC
e HMQC (Figuras 62 e 63). As Tabelas 46 e 47 resumem as atribuições dos
espectros de RMN de
13
C e de
1
H feitas para 84.
O mapa de contornos HMQC (Figura 62) permitiu confirmar as atribuições
efetuadas nos espectros de RMN de
1
H e de
13
C, as correlações entre o sinal em δ
77,06 (C-28) e os hidrogênios metilênicos H-28a e b (δ 3, 66 e δ 3,21), bem como
entre o sinal em δ 61,37 (C-18) e o sinal correspondente ao hidrogênio H-18 (δ 1,20)
foram identificadas no espectro. Também se observou a correlação entre o sinal em
δ 79,01, atribuído a C-3 e o sinal do hidrogênio H-3 (δ 3,20).
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
211
Tabela 46 -
Atribuição do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) obtido para 84.
Hidrogênio
δ
δδ
δ
H
(J Hz)
3 3,20 dd (11,3 e 4,9)
9 1,88
11 5,48 dd (10,3 e 3,2)
12 5,73 d (10,3)
23 0,98 s
24 0,77 s
25 0,89 s
26 1,07 s
27 1,03
28a
28b
3,66 d (6,5)
3,21 d (6,5)
29 0,99 d (6,4)
30 0,94 d (5,7)
A análise do mapa de contornos HMBC (Figuras 63 e 64) indicou as
correlações de longa distância entre os carbonos do ciclo formado e os hidrogênios
de átomos vizinhos, confirmando a estrutura proposta para 84. Assim, o sinal em δ
84,96, atribuído a C-13, apresentou manchas de correlação com os sinais de
hidrogênio em δ 5,73 (H-12), δ 3,66 (H-28a), δ 1,2 (H-18) e δ 1,03 (H-27). Por sua
vez, o sinal de carbono em δ 61,36, atribuído a C-18, mostrou correlação com os
sinais de hidrogênio em δ 0,99 (H-29), δ 1,58 (H-21/H-22) e δ 3,66 (H-28a). Já para
o sinal correspondente a C-17, em δ 42,45, foram observadas correlações com os
sinais de hidrogênio em δ 3,66 (H-28a), 3,21 (H-28b) e δ 1,2 (H-18). A Tabela 48
lista as principais correlações heteronucleares
1
H-
13
C de longa distância observadas
no mapa de contornos HMBC para 84.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
212
Tabela 47 -
Atribuição dos sinais do espectro de RMN de
13
C obtido para 84 (100 MHz,
CDCl
3
).
Carbono
δ
δδ
δ
C
Tipo
1 38,29 CH
2
2 25,43 CH
2
3 79,01 CH
4 38,95 C
5 54,83 CH
6 17,78 CH
2
7 31,46 CH
2
8 41,71 C
9 53,03 CH
10 36,42 C
11 129,62 CH
12 132,99 CH
13 84,97 C
14 44,32 C
15 27,12 CH
2
16 25,43 CH
2
17 42,45 C
18 61,37 CH
19 40,83 CH
20 37,78 CH
21 31,46 CH
2
22 35,06 CH
2
23 27,82 CH
3
24 14,99 CH
3
25 17,23 CH
3
26 17,78 CH
3
27 19,51 CH
3
28 77,06 CH
2
29 18,26 CH
3
30 19,29 CH
3
Tabela 48 -
Correlações observadas no mapa de contornos HMBC obtido para 84 (400 MHz,
CDCl
3
).
Carbono
δ
δδ
δ
C
δ
δδ
δ
H
3 79,01 0,98 (H-23), 0,77 (H-24)
4 38,95 0,98 (H-23), 0,77 (H-24)
5 54,83 0,98 (H-23), 0,77 (H-24), 0,89 (H-25)
8 41,71 1,88 (H-9), 5,73 (H-12), 1,03 (H-27)
9 53,03 5,48 (H-11), 5,73 (H-12)
10 36,42 1,88 (H-9), 5,48 (H-11)
11 129,62 1,88 (H-9)
12 132,99 1,88 (H-9), 1,20 (H-18)
13 84,97 5,73 (H-12), 3,66 (H-28a), 1,20 (H-18), 1,03 (H-27)
14 44,32 1,88 (H-9), 5,48 (H-11), 1,20 (H-18)
17 42,45 3,66 (H-28a), 3,21 (H-28b), 1,20 (H-18)
18 61,37 3,66 (H-28a), 1,58 (H-21/H-22), 0,99 (H-29)
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
213
Figura 61 -
Mapa de contornos COSY obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
).
H
-
12/H
-
11
H
-
28a/H
-
28b
H
-
1
1
/H
-
9
H
-
3
/H
-
2
HO
O
3
9
11
12
13
18
17
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
214
Figura 62 -
Mapa de contornos HMQC obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
).
C12/H12
C11/H11
C3/H3
C28/H28
C18/H18
C5/H5
C9/H9
HO
O
3
9
11
12
13
18
17
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
215
Figura 63 -
Mapa de contornos HMBC obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
).
C11/H9
C12/H9
C12/H18
C14/H11
C8/H12
C13/H12
C13/H28a
C18/H28a
C9/H12
C17/H28a e b
C9/H11
C13/H18
C13/H27
C10/H12
C14/H18
C18/H21/H22
HO
O
3
9
11
12
13
18
17
28
C18/H29
C3/H23
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
216
Figura 64 -
Seção expandida do mapa de contornos HMBC obtido para 84 (400 MHz, CDCl
3
).
C14/H9
C14/H27
C17/H18
C8/H9
C17/H21/H22
C19/H21/H22
C19/H29 e H30
C4/H24
C4/H23
C10/H9
C23/H24
C24/H23
C18/H21/H22
C18/H29
C5/H23
C5/H25
C5/H24
C9/H27
C9/H25
C4/H9
C10/H25
C10/H24
C8/H27
C14/H18
HO
O
3
9
11
12
13
18
17
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
217
10.1.7 Tentativas de epoxidação de 81
Na tentativa de se obter um epóxido a partir de 81, este produto foi submetido
ao tratamento com MCPBA, durante 2 horas. Porém, não se obteve sucesso no
procedimento e o produto obtido após elaboração da reação foi o próprio material de
partida 81.
Avaliou-se, também, a possibilidade de formação do epóxido a partir do éter
cíclico 84, submetendo-o ao mesmo tratamento com MCPBA, alterando o tempo de
reação para 4,5 horas. A reação não levou à formação do epóxido desejado,
resultando na recuperação do próprio produto de partida. Possivelmente o
impedimento estérico das substâncias utilizadas como produto de partida, 81 e 84,
foi o fator limitante para o sucesso da epoxidação, segundo observado por Tkachev
et al. (1994).
10.1.8 Tratamento de 81 com HI 57%
O triol 81 foi submetido a tratamento com HI 57% em presença de benzeno,
visando obter derivados com a ligação dupla isomerizada de acordo com Marcos et
al. (2003a e 2003b). Foram empregadas diversas condições reacionais, variando-se
a temperatura, tempo de reação e concentração de reagentes. Todas as condições
avaliadas resultaram na mesma mistura de produtos, porém em diferentes
proporções. Esta mistura foi cromatografada em coluna de sílica gel, resultando na
obtenção do aldeído 83, anteriormente identificado como produto do tratamento de
81 com BF
3
-Et
2
O (Condição A), como produto principal, além de uma mistura
complexa de vários compostos minoritários que devido à pequena massa não
puderam ser identificados.
10.1.8.1 Síntese do 3β,28β-diidróxi-urs-12-eno (86)
Para a síntese do diol 86, o produto 77 foi submetido à redução com LiAlH
4
em éter etílico seco. Após elaboração da reação obteve-se o derivado 86. A
confirmação da estrutura química desse produto de redução foi realizada a partir da
análise dos espectros de IV e de RMN de
1
H e de
13
C.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
218
No espectro de IV observou-se a presença de banda característica de
deformação axial de OH em 3642 cm
-1
e ausência de bandas na região
característica de absorção de carbonila de éster em 1750-1735 cm
-1
, indicando o
sucesso da redução. A mesma conclusão pôde ser obtida a partir do espectro de
RMN de
1
H (vide apêndice, pag. 292), no qual os dupletos centrados em δ 3,54 e δ
3,20 foram atribuídos aos hidrogênios metilênicos H-28a e H-28b (J = 10,9 Hz), e o
multipleto em δ 3,18 ao hidrogênio carbinólico H-3. Cabe ressaltar, o
desaparecimento do simpleto em δ 3,61, atribuído à metoxila do grupo acetila
presente no precursor 77. Os demais sinais apresentaram valores de deslocamento
químico semelhantes aos obtidos para o produto de partida.
No espectro de RMN de
13
C obtido para 86 (vide apêndice, pag. 293)
observaram-se sinais em δ 79,04 e δ 69,93, atribuídos aos carbonos carbinólicos C-
3 e C-28, respectivamente. Os valores de deslocamento químico desses carbonos
são bastante próximos aos descritos para o diol correspondente do ácido oleanólico
(GARCIA-GRANADOS et al., 2003).
10.1.9 Síntese de 87
O tratamento do ácido ursólico (31) com anidrido acético em piridina resultou
na obtenção do derivado acetilado 87 (Figura 65). O espectro no IV obtido para 87
apresentou bandas em 1733 cm
-1
e 1694 cm
-1
, características de deformações axiais
de C=O de ésteres e ácidos carboxílicos, respectivamente. Ao se analisar o espectro
de RMN de
1
H (vide apêndice, pag. 294), pôde-se observar sinais referentes ao
grupamento acetila introduzido na molécula. Assim, o simpleto em δ 2,04, atribuído
ao grupo metila e o multipleto em δ 4,49, referente ao hidrogênio H-3, com valor de
deslocamento químico mais afastado do TMS do que seu precursor 31, resultante do
efeito de ressonância exercido pela carbonila, possibilitaram caracterizar a obtenção
do derivado 87. No espectro de RMN de
13
C (vide apêndice, pag. 295) os sinais em
δ 171,12 e δ 21,39 foram atribuídos, respectivamente, aos carbonos carbonílico e
metílico do grupo acetila. Os valores de deslocamento químico dos sinais de RMN
de
1
H e de
13
C apresentam correspondência com os relatados por Garcia-Granados
et al. (2007).
Resultados e Discussão
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................._________________________________________________________________________________
219
Figura 65 -
Esquema de síntese para a obtenção dos derivados 90, 91, 92, 93, 94, 95 e 96. i) PDC/CH
2
Cl
2
, t. amb, 75%; ii) (NH
3
OH)Cl/EtOH/piridina,
95ºC, 95%; iii) NaClO
2
/t-BuOOH, 100ºC, 88%; iv) NaBH
4
/CeCl
3
, MeOH/THF, t. amb; NaBH
4
/alumina, microondas, 83%; v) LiAlH
4
/éter seco, t. amb, 84%
(84), 9% (94); vi) MCPBA/NaHCO
3
, t. amb, 44%; vii) MCPBA/porfirina, -78ºC, 56% (96).
COOCH
3
HO
77
COOCH
3
N
OH
COOCH
3
O
90
91
COOCH
3
O
O
92
COOCH
3
O
HO
93
COOCH
3
O
O
O
95
CH
2
OH
HO
HO
O
94
84
92
+
i
iii
iv
v
vi
ii
vii
96
+
COOCH
3
O
O
COOCH
3
O
HO
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
220
10.1.10 Tentativas de oxidação de 87 com MCPBA catalisado por
5,10,15,20-tetrakis(pentaflorofenil) porfirina
Na tentativa de se obter o álcool alílico, o derivado 87 foi submetido a
tratamento com MCPBA catalisado por 5,10,15,20-tetrakis(pentaflorofenil) porfirina,
empregando-se as mesmas condições reacionais descritas por Konoike et al (1999)
para o mesmo material de partida (Figura 65). Porém, a reação não evoluiu, mesmo
aumentando-se o tempo de reação para 6 e 9 horas. Em ambas as tentativas não se
obteve o produto desejado sendo que, na primeira, o produto de partida foi
recuperado e na segunda, obteve-se uma mistura complexa constituída
majoritariamente pelo produto de partida e por vários outros compostos minoritários,
inviabilizando o isolamento dos constituintes.
10.1.11 Síntese do ácido 3β-acetóxi-11-oxo-urs-12-en-28-óico (88)
O tratamento de 87 com NaClO
2
/t-BuOOH (Figura 65) resultou na obtenção
do produto de oxidação 88 (Figura 65). No espectro de RMN de
1
H (vide apêndice,
pag. 296) observou-se a presença de dois simpletos em δ 5,57 e δ 2,02, ausentes
no espectro do precursor 87, os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-12 e H-9,
e possibilitaram confirmar a obtenção de 88. De maneira geral, os dados
espectrométricos obtidos foram semelhantes àqueles relatados por Siddiqui et al.
(1990) para o mesmo derivado. Não foram obtidos espectros de RMN de
13
C para
este derivado.
10.1.12 Síntese de 3β-acetóxi-urs-11-en-28,13β-lactona (89)
O derivado 88 foi submetido à redução com LiAlH
4
, porém obteve-se como
produto uma mistura de vários compostos, impossibilitando a separação. Optou-se,
então, por acetilar a mistura, visando o isolamento de seus constituintes. A mistura
acetilada foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel, levando ao
isolamento do constituinte majoritário, o derivado 89. A Figura 66 ilustra o esquema
de síntese para a obtenção do derivado 89.
O espectro de IV obtido para 89 mostrou a presença de bandas em 1728 cm
-1
e 1238 cm
-1
, bem como em 1755 cm
-1
características de deformações axiais de C=O
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
221
e C-O de ésteres e C=O de lactonas, respectivamente. Não se observaram bandas
referentes a grupos hidroxila.
A formação do derivado 89 pôde ser confirmada pela análise do seu espectro
de RMN de
1
H (vide apêndice). Observou-se um dupleto centrado em δ 5,95,
atribuído ao hidrogênio H-12 (J = 10,4 Hz) e um dupleto duplo centrado em δ 5,54,
atribuído a H-11 (J = 10,4 e 3,0 Hz). O multipleto em δ 4,50 foi atribuído ao
hidrogênio H-3, enquanto o simpleto em δ 2,04 foi atribuído aos hidrogênios
metílicos do grupo acetila
No espectro de RMN de
13
C (vide apêndice) dessa substância os sinais em δ
89,71, δ 45,13, δ 60,60 e δ 180,01 foram atribuídos aos carbonos do anel
pirolactônico, C-13, C-17, C-18 e C-28, respectivamente. O sinal em δ 80,66 foi
atribuído ao carbono C3 e os sinais em δ 128,96 e δ 133,37 aos carbonos olefínicos
C-11 e C-12. Os sinais em δ 171,12 e δ 21,39 referem-se aos carbonos carbonílico e
metílico do grupo acetila. A análise dos dados espectrométricos obtidos e sua
comparação com valores descritos na literatura para o mesmo composto, permitiram
identificar 89 como a 3β-acetóxi-urs-11-en-28,13β-lactona (TKACHEV et al., 1994).
31 87
89 88
Figura 66 -
Esquema de síntese para obtenção do derivado 89. i) piridina/anidrido acético, t
amb; ii) NaClO
2
/t-BuOOH, 100°C; iii) LiAlH
4
, 0°C; piridina/anidrido acético, t. amb.
i
i
i
i
ii
COOH
HO
COOH
H
3
COCO
COOH
H
3
CCOO
O
H
3
CCOO
O
O
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
222
10.1.13 Síntese de 3-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (90)
A oxidação de 77 empregando-se PDC como agente oxidante foi realizada
segundo metodologia descrita por Gordaliza et al. (1995). A reação resultou na
obtenção do derivado 90 (Figura 65). O mecanismo proposto para a oxidação de 77
com o dicromato de piridínio, segundo Carey e Sundberg (1993), está representado
na Figura 67.
O espectro no IV obtido para 90 apresentou bandas de deformação axial de
C=O de cetonas em 1726 cm
-1
. A análise dos espectros de RMN de
1
H e de
13
C
(vide apêndice) possibilitou atestar a oxidação em C-3, a partir do desaparecimento
do sinal referente à H-3 em δ 3,22, presente no espectro do precursor 77 e
surgimento do sinal em δ 217,75, referente ao carbono carbonílico de cetona C-3.
Os demais sinais apresentam valores de deslocamento químico semelhantes
àqueles relatados por Ma et al. (2005) para a mesma substância.
Figura 67 -
Proposta de mecanismo para a formação do derivado 90, segundo Carey e
Sundberg (1993).
77
90
COOCH
3
HO
Cr
OO
O
O
Cr O
O
O
Pyr
Pyr
H
HO
Cr O
O
O
Pyr
COOCH
3
OH
Cr OO
O
Pyr
Cr
O
OH
O
Pyr
COOCH
3
O
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
223
10.1.14 Síntese de 3-hidroxi-oxima-urs-12-en-28-oato de metila (91)
O tratamento de 90 com cloridrato de hidroxilamina resultou na formação da
oxima 91 (Figura 65). A reação, realizada segundo Chen et al. (2006), ocorre através
de uma adição nucleofílica à carbonila. A rápida transferência do próton gera um
intermediário que geralmente não é isolado; em seguida, ocorre a desidratação
induzida pelo ácido e a eliminação da água produz a oxima (Figura 68).
COOCH
3
O
N
OH
COOCH
3
HO
H
2
N
OH
COOCH
3
O
HN
OH
COOCH
3
N
OH
H
2
O
H
H
+
H
Cl
-
H
H
Figura 68 -
Proposta de mecanismo para a formação de 91.
A obtenção da oxima 91 como produto da reação pôde ser confirmada
através da análise dos dados espectrais de RMN de
1
H e de
13
C (vide apêndice). No
espectro de RMN de
13
C de 91 observou-se um sinal em δ 166,85, que foi atribuído
a C-3, com valor de deslocamento químico condizente com o relatado na literatura
para a oxima do ácido ursólico (MA et al., 2005). Já os multipletos centrados em
δ
90
91
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
224
2,22 e δ 3,06 presentes no espectro de RMN de
1
H foram atribuídos aos hidrogênios
metilênicos H-2.
A formação do produto 91 também foi evidenciada pelo espectro de IV, no
qual se observou banda em 3660 cm
-1
atribuída ao estiramento O-H e banda em 931
cm
-1
característica de estiramento N-O de oxima e distinta das vibrações
características de C-O de alcoóis entre 1200 e 1000 cm
-1
.
10.1.15 Tratamento de 77 com HI 57%
Na tentativa de se obter um derivado isomerizado da dupla ligação em C-12 e
C-13, o derivado 77 foi submetido a tratamento com HI 57% em benzeno. Porém,
devido ao impedimento estérico da molécula, a reação não evoluiu, sendo obtido o
próprio produto de partida.
10.1.16 Tentativa de oxidação de 90 com SeO
2
O composto 90 foi tratado com SeO
2
, buscando-se obter um derivado
oxidado. Porém, mesmo com as várias tentativas de otimização realizadas,
variando-se condições de tempo e temperatura, não se obteve sucesso na reação.
Em todas as condições experimentadas, obteve-se uma mistura de três ou mais
compostos, sendo sempre o precursor 90 o majoritário. Devido à diferença de
proporção entre os produtos obtidos, não foi possível identificar os componentes
minoritários.
10.1.17 Tentativa de oxidação com t-BuOOH/SeO
2
Ainda na tentativa de se obter um derivado oxidado, 90
foi tratado com
t-BuOOH/SeO
2
,
sob diferentes condições de reação. Mais uma vez, não se
conseguiu sucesso e somente o material de partida foi isolado.
10.1.18 Síntese de 3,11-dioxo-urs-12-en-28-oato de metila (92)
Devido às dificuldades encontradas nas tentativas de oxidação de 90, optou-
se por uma metodologia distinta e o derivado foi então tratado com NaClO
2
/t-BuOOH
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
225
segundo Silvestre e Salvador (2007). Após diversas variações nas condições de
tempo e temperatura, visando à otimização da reação, obteve-se a dicetona 92
como produto da reação (Figura 65, pag. 219).
O espectro obtido no IV mostrou a presença de bandas de deformação axial
de C=O de cetonas em 1726 cm
-1
e 1658 cm
-1
, referentes, respectivamente, ao
grupo ceto em C-3 e em C-11. A diferença nas absorções se dá pelo fato da cetona
em C-11 ser α,β-insaturada, com conseqüente deslocalização dos elétrons π e
redução do caráter de ligação dupla, levando à absorção em menor número de
ondas (SILVERSTEIN; WEBSTER, 2000).
A estrutura foi confirmada com base na análise dos espectros de RMN de
1
H
e de
13
C (vide apêndice, pag. 303 e 304) e comparação com dados da literatura
(HONDA et al., 2000). O surgimento do simpleto em δ 5,61, atribuído ao hidrogênio
H-12, e dos sinais de carbono em δ 199,23, δ 130,62 e δ 163,44, atribuídos,
respectivamente, aos carbonos carbonílico C-11 e olefínicos C-12 e C-13,
confirmaram a obtenção da cetona em C-11. Os demais sinais encontram-se com
valores de deslocamento químicos semelhantes aos obtidos para a cetona de
partida 90.
10.1.19 Tentativas de oxidação de 78 e 90 com SeO
2
/AcOH
Visando obter derivados oxidados das substâncias 78 e 90, estas foram
submetidas a tratamento com SeO
2
/AcOH. Porém, mesmo aumentando o tempo de
reação, não se obteve sucesso e os próprios derivados empregados como materiais
de partida foram obtidos como produto final.
10.1.20 Tentativa de rearranjo de 92 com BF
3
-Et
2
O
A dicetona 92 foi submetida a tratamento com BF
3
-Et
2
O, empregando as
condições descritas por Srikrishna e Ramasastry (2003). Porém, a reação não
evoluiu, recuperando-se o próprio produto de partida. Na tentativa de se encontrar
as condições ideais para a reação, alterou-se a temperatura e as concentrações de
BF
3
-Et
2
O foram aumentadas. No entanto, também não se obteve sucesso no
procedimento.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
226
10.1.21 Tentativas de redução de 92
Na tentativa de se obter alcoóis como produtos de redução da dicetona 92,
esta foi submetida a tratamento com vários agentes redutores, sob distintas
condições.
O álcool alílico, produto almejado da redução de 92, é considerado um bom
produto de partida para reações de rearranjo devido à presença de pares de elétrons
livres, podendo atuar como base de Lewis e então reagir com ácidos de Lewis como
BF
3
, empregado no presente trabalho (TONDER; TANNER, 2003). Esperava-se que
esta reação gerasse um carbocátion resultando em transposições na molécula,
como aquela ocorrida na formação do aldeído 83, isso não ocorreu nas condições
ensaiadas para 92.
10.1.21.1 Redução de 92 com NaBH
4
/CeCl
3
.7H
2
O
A dicetona 92 foi submetida a tratamento com NaBH
4
/CeCl
3
.7H
2
O em
MeOH/THF (1:1) segundo Matsumoto et al. (1996). Realizaram-se algumas
alterações na concentração dos reagentes e na temperatura, buscando-se as
condições ideais para a reação; porém, não foi possível a obtenção do álcool alílico.
Obteve-se, no entanto, o álcool 93, produto de redução de 92 na posição 3 (Figura
65, pag. 219). As demais posições não foram reduzidas.
Ao se analisar os espectros de RMN de
1
H e de
13
C (vide apêndice) pôde-se
constatar a redução da posição 3, pelo surgimento do multipleto em δ 3,22 e do sinal
em δ 78,83, atribuídos ao hidrogênio e carbono carbinólico em 3. Por outro lado, a
presença dos simpletos em δ 5,60, δ 2,30 e δ 3,61, atribuídos respectivamente aos
hidrogênios H-12, H-9 e OCH
3
, bem como dos sinais em δ 200,01 e δ 177,29,
atribuídos aos carbonos C-11 e C-28, confirmaram a manutenção das funções
cetona e éster, posicionadas em C-11 e C-28, respectivamente. No espectro obtido
no IV para essa substância pôde-se notar o surgimento da banda larga relativa à
deformação axial de grupo hidroxila em 3675 cm
-1
. A presença das bandas em 1725
e 1659 cm
-1
, características de deformação axial de C=O de ésteres e cetonas
conjugadas, confirmaram a manutenção da função cetona em C-11.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
227
10.1.21.2 Redução de 92 com NaBH
4
/alumina
O derivado 92 foi também submetido à redução com NaBH
4
em alumina e
exposição a microondas, conforme relatado por Varma e Saini (1997) para a
redução de compostos carbonilados. Porém, não se obteve o álcool almejado e o
produto obtido da redução foi o derivado 93 também obtido como produto de
redução de 92 com NaBH
4
/CeCl
3
.7H
2
O.
10.1.21.3
Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
/GuHCl
Ainda na tentativa de se obter o produto de redução alílica, a dicetona 92 foi
submetida à redução com NaBH
4
/GuHCl em água, segundo metodologia empregada
na redução de carbonilas α,β insaturadas descrita por Heydari et al. (2007).
Novamente a reação esperada não ocorreu e nenhum produto de redução foi obtido,
recuperando-se somente o derivado 92 empregado como produto de partida.
10.1.21.4
Tentativa de redução de 92 com InCl
3
/NaBH
4
O derivado 92 também foi submetido a tratamento com InCl
3
/NaBH
4
em
CH
3
CN, segundo descrito por Brindaban e Sampak (2003). Porém, mesmo
aumentando-se o tempo de reação, a redução não ocorreu, obtendo-se somente o
material de partida 92.
10.1.21.5 Tentativa de redução de 92 com NaBH
4
Em mais uma tentativa, o derivado 92 foi submetido a tratamento utilizando-se
NaBH
4
segundo método descrito por Dos Santos et al. (2005) para a redução de
carbonilas
α
,
β
insaturadas. Ao final de 24 horas de reação, como não havia ocorrido
redução, adicionou-se CeCl
3
.7H
2
O e promoveu-se o aquecimento do meio reacional.
Porém, não se obteve sucesso e o produto obtido foi o próprio derivado 92,
empregado como produto de partida.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
228
10.1.22 Síntese de 3β,28-diidróxi-urs-9,12-dieno (94) e 3β-hiiróxi-urs-11-en-
28,13β-éter (84)
Devido às dificuldades encontradas na obtenção do produto de redução
alílica, optou-se por uma redução inespecífica, empregando-se LiAlH
4
em éter etílico.
A redução de 92 com LiAlH
4
resultou na obtenção de dois compostos inéditos, o
dieno homoanular 94 e o éter cíclico 84 (Figura 65, pag. 219), também obtido no
tratamento de 81 com BF
3
-Et
2
O.
O espectro no IV obtido para o dieno 94 mostrou a presença de banda larga
centrada em 3662 cm
-1
, característica de deformação axial de OH e banda em 1690
cm
-1
característica de deformação axial de C=C de dienos conjugados. No espectro
de RMN de
1
H dessa substância, os dupletos centrados em
δ
5,58 e
δ
5,51 (J = 6,0
Hz) foram atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-11 e H-12. O surgimento do
multipleto em
δ
3,22, atribuído ao hidrogênio H-3 e dos dupletos centrados em
δ
3,60
e
δ
3,24 (J = 11,0 Hz) atribuídos aos hidrogênios metilênicos diasteroisotópicos H-
28a e H-28b, confirmaram a redução da molécula nas posições 3 e 28 (vide
apêndice). Valores de deslocamento químico muito semelhantes foram descritos por
García-Granados et al (2004) para um dieno estruturalmente relacionado do ácido
oleanólico.
O espectro de RMN de
13
C (vide apêndice, pag. 308) obtido para 94
confirmou a análise anterior, sendo os sinais em
δ
155,09,
δ
115,29,
δ
123,45 e
δ
140,19 atribuídos aos carbonos olefínicos do sistema conjugado C-9, C-11, C-12 e
C-13, respectivamente. Já os sinais em
δ
70,21 e
δ
78,76 foram atribuídos aos
carbonos carbinólicos C-28 e C-3.
Algumas das atribuições realizadas a partir dos espectros de
monodimensionais de RMN de
1
H e de
13
C foram confirmadas por espectros 2D.
Assim, o mapa de contornos COSY (Figura 69) apontou as correlações entre os
hidrogênios H11/H-12 (
δ
5,58/
δ
5,51) e H-28a/H-28b (
δ
3,60/
δ
3,24). Já o mapa de
contornos HMQC (Figura 70) indicou as correlações entre os carbonos e hidrogênios
olefínicos C-11/H-11 (
δ
115,29/
δ
5,58) e C-12/H-12 (
δ
123,45/
δ
5,51), bem como
aquelas entre os carbonos e hidrogênios carbinólicos C-3/H-3 (
δ
78,76/
δ
3,22) e C-
28/H-28a e H-28b (
δ
70,21/
δ
3,60 e
δ
3,24).
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
229
ppm
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
Figura 69 -
Mapa de contornos COSY obtido para 94 (400 MHz, CDCl
3
).
H11/H12
H28a/H28b
CH
2
OH
HO
3
9
11
12
13
18
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
230
ppm
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
ppm
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Figura 70 –
Mapa de contornos HMQC obtido para 94 (100 MHz, CDCl
3
).
10.1.23 Síntese de 3,4-seco-11-oxo-urs-12-en-28-oato de metila (95)
A dicetona 92 foi submetida a tratamento com MCPBA em CH
2
Cl
2
e obteve-se
como produto a lactona inédita 95 (Figura 65, pag. 219). A formação da lactona se
deu através de rearranjo de Baeyer-Villiger, no qual cetonas cíclicas são
transformadas em lactonas, segundo mecanismo proposto por Carey e Sundberg
(1993) (Figura 71).
C
-
12/H
-
12
C
-
1
1
/H
-
1
1
C
-
3
/H
-
3
C
-
28
/H
-
28a
C
-
28
/H
-
28b
C
-
18
/H
-
18
C
-
5
/H
-
5
CH
2
OH
HO
3
9
11
12
13
18
28
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
231
COOCH
3
O
O
H
O
O
H
OH
HO
O
HO
O
COOCH
3
O
O
O
HO
OH
COOCH
3
O
O
O
Figura 71 -
Mecanismo proposto para a formação da lactona 95, segundo Carey e Sundberg
(1993).
No espectro de RMN de
1
H obtido para 95 (vide apêndice, pag. 310)
observou-se o multipleto em δ 2,61 referente aos hidrogênios metilênicos H-2, mais
protegidos do que os hidrogênios correspondentes do precursor 92, devido ao efeito
de desproteção da carbonila de éster, inferior ao exercido pela carbonila cetônica de
92. Os demais sinais do espectro apresentaram deslocamentos químicos muito
semelhantes aos obtidos para o produto de partida.
A análise do espectro de RMN de
13
C (vide apêndice, pag. 311) indicou o
surgimento de novos sinais que possibilitaram confirmar a formação da lactona no
anel A. Assim, os sinais em δ 38,88, δ 32,34, δ 175,67, δ 85,67, δ 54,46 e δ 39,69
foram atribuídos, respectivamente, aos carbonos C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 e C-10 do
anel lactônico. Esses valores são semelhantes àqueles descritos na literatura para a
lactona estruturalmente relacionada do ácido oleanólico (SHIRANE et al., 1996). No
espectro obtido no IV para essa substância pôde-se observar a presença da banda
em 1721 cm
-1
, característica de deformação axial de C=O de lactonas.
A análise do mapa de contornos HMQC (Figura 72) possibilitou confirmar
algumas das atribuições, a partir das manchas de correlação entre os sinais de
carbono e hidrogênio do anel lactônico, a saber C-1/H-1 (δ 38,88/δ 1,06), C-2/H-2 (δ
32,34/δ 2,61), C-5/H-5 (δ 54,46/δ 1,62).
92
95
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
232
ppm
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
ppm
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Figura 72 –
Mapa de contornos HMQC obtido para 95 (100 MHz, CDCl
3
).
10.1.24 Síntese de 3-oxo,11-hidróxi-urs-12-en-28-oato de metila (96)
Na tentativa de se obter o álcool alílico, o derivado 90 foi submetido à
oxidação com MCPBA catalisada por 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorofenil) porfirina,
de acordo com método descrito por Konoike et al. (1999) para a oxidação alílica de
olefinas estericamente impedidas. Foram realizadas diversas alterações nas
condições originalmente descritas buscando-se otimizar a reação e,
conseqüentemente, obter o álcool alílico como produto de redução. Nas diferentes
C
-
5/H
-
5
C
-
1
/H
-
1
C
-
2
/H
-
2
COOCH
3
O
O
O
1
3
4
5
2
10
11
12
13
28
18
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
233
condições avaliadas (tempo, temperatura e concentração de MCPBA) obteve-se
êxito no aumento do rendimento do produto desejado; porém, não foi possível
eliminar a formação de subprodutos. Em todas as condições avaliadas obteve-se
uma mistura de três ou mais substâncias em diferentes proporções e a melhor
condição encontrada foi à temperatura de -78ºC, tempo de reação de 30 horas e
concentração de MCPBA de 0,26 mM, que após cromatografia em coluna de sílica
gel, resultou na obtenção da mistura de isômeros 96 em maior proporção (56%) do
que os demais compostos (90, 15%; 92, 30%).
No espectro obtido no IV para 96 pôde-se notar a presença de banda larga
característica de deformação axial de OH livre centrada em 3646 cm
-1
, a qual indicou
a oxidação da posição alílica. A obtenção do produto de redução alílica foi
confirmada a partir do espectro de RMN de
1
H (vide apêndice), no qual se observou
o surgimento de dois sinais: um dupleto em δ 5,30 (J = 3,6 Hz), atribuído à H-12 em
acoplamento com H-11, e o dupleto duplo em δ 4,29 (J = 8,8 e 3,6 Hz), atribuído à
H-11 em acoplamento com H-9 e H-12. O surgimento de sinais duplicados, porém de
menor intensidade, referentes aos hidrogênios olefínicos, confirmou a obtenção da
mistura de isômeros em C-11. A presença do simpleto em δ 5,64, atribuído ao
hidrogênio H-12 da dicetona 92, indicou a presença de traços deste derivado como
contaminante do produto 96.
No espectro de RMN de
13
C (vide apêndice), obtido para 96, os sinais em δ
139,88 e δ 129,55 foram atribuídos aos carbonos olefínícos C-13 e C-12, com
valores de deslocamento químico mais afastados do TMS em relação aos mesmos
sinais obtidos para o precursor 90, devido à presença da hidroxila em C-11.
10.1.25 Tentativa de oxidação de 31 com NaClO
2
/t-BuOOH
O ácido ursólico 31 foi submetido à oxidação com NaClO
2
/t-BuOOH, seguindo
as mesmas condições otimizadas para a obtenção de 92, na qual se empregou a
cetona 90 como produto de partida. Porém, nas condições empregadas, 31 foi
degradado, resultando em uma mistura complexa de produtos não identificados.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
234
10.1.26 Esterificação de 88 com CH
3
I/K
2
CO
3
O tratamento de 88 com CH
3
I/K
2
CO
3
resultou na obtenção do derivado
esterificado 79 já obtido como produto da reação de 78 com t-BuOOH/NaClO
2
.
10.1.27 Tentativas de epoxidação de 79 com H
2
O
2
/NaOH
Os epóxidos estão entre os intermediários mais versáteis em síntese
orgânica. A polaridade e tensão do anel de três membros faz com que substâncias
dessa classe sejam susceptíveis a reações com um grande número de reagentes
(SHIKRISHNA; RAMASASTRY, 2005). A pronunciada eletrofilia dos epóxidos é
atribuída à combinação da natureza polarizante do oxigênio e à tensão do anel de
três membros, o que facilita a abertura do mesmo (SHIKRISHNA; RAMASASTRY,
2005).
A grande variedade de reações com epóxidos deriva da possibilidade de
abertura nucleofílica do anel, inter ou intramolecular, resultando em alcoóis, que
podem sofrer desidratação produzindo alquenos e também rearranjos, levando a
compostos carbonilados e alcoóis alílicos. Produtos derivados da abertura de
epóxido seguido de ciclizações, iniciadas com ácidos de Lewis, são extensivamente
estudados (MARSON, 2000).
Com o intuito de se obter um derivado epoxidado, a substância 79 foi
submetida a tratamento com H
2
O
2
/NaOH. Embora tenham sido avaliadas
modificações nas condições reacionais, com alterações nas concentrações dos
reagentes e no tempo de reação, não se obteve o epóxido desejado. Em todas elas
obteve-se somente o derivado 79, empregado como produto de partida.
Optou-se, então, pelo emprego de outro método também utilizado na
epoxidação de compostos orgânicos, o tratamento com MCPBA. Porém, a reação
também não evoluiu, não sendo possível obter o derivado desejado.
Nas reações com MCPBA, devido ao excesso de ácido perbenzóico no meio
reacional, o epóxido se abre após sua formação, levando a formação de compostos
com hidroxila e grupo benzoato. O uso de NaHCO
3
evita que o anel se abra,
neutralizando o excesso de ácido benzóico e evitando a protonação do epóxido e
sua posterior abertura.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
235
Segundo Tkachev et al. (1994) um dos fatores limitantes desta reação com
derivados do ácido ursólico é a presença da metila em C-29, que impede o ataque
pela face α à dupla ligação, posição de ataque predominante do ácido perbenzóico,
reagente empregado nas tentativas de reação. Ainda segundo o autor, o uso de
peróxido de hidrogênio, reagente também empregado na reação, considerado por
ele um agente epoxidante fraco, também não é um bom método para a obtenção de
epóxidos do ácido ursólico. Majumder e Bagchi (1983) concluíram que a presença
do grupamento ácido carboxílico em C-28 é condição essencial para a epoxidação
da dupla ligação em derivados do ácido ursólico. Alguns derivados como metil
ésteres poderão reagir, mas muito lentamente em presença de peróxido de
hidrogênio, com o uso de ácido acético como solvente e temperaturas elevadas.
Esta dificuldade é devida ao impedimento estérico causado pela introdução do grupo
metila consideravelmente mais volumoso do que o hidrogênio do ácido carboxílico
precursor (SIDDIQUI et al., 1989).
Diante da dificuldade de se obter epóxidos derivados do ácido ursólico, o triol
81 foi selecionado como produto de partida para as reações de rearranjo com BF
3
-
Et
2
O (Página 200).
10.2 Transformações químicas do ácido oleanólico
O ácido oleanólico (42) também foi submetido a transformações químicas
visando à obtenção de derivados bioativos (Figura 73). O ácido oleanólico
empregado como material de partida para essas reações encontrava-se em mistura
com o ácido ursólico (31). Dessa forma, os derivados 97, 98, 99, 100 e 101 foram
obtidos em mistura com os derivados correspondentes do ácido ursólico, e mesmo
após tentativas de separação cromatográfica não foi possível a separação dos
isômeros. Tendo em vista a dificuldade para a separação cromatográfica dessas
substâncias, com rendimento adequado para as transformações químicas
posteriores, optou-se por concentrar o trabalho na obtenção dos derivados do ácido
ursólico.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
236
i
ii
iii
v
iv
42
97
98
99
101
100
Figura 73 -
Esquema de síntese de derivados do ácido oleanólico. i) K
2
CO
3
/CH
3
I, t amb, 89%;
ii) PDC, t amb, 96%; iii) (NH
3
OH)Cl, 95°C, 94%; iv) piridina/anidrido acético, 85%; v)
piridina/anidrido acético, 83%.
10.2.1 Síntese de 3β-hidróxi-olean-12-en-28-oato de metila (97)
O tratamento do ácido oleanólico (42) com CH
3
I/K
2
CO
3
, em presença de
acetona, conduziu à formação do derivado esterificado 97 (Figura 73).
A estrutura do éster foi confirmada pela análise dos espectros de IV, de RMN
de
1
H e de
13
C obtidos para 97 (vide apêndice), bem como pela comparação com
dados da literatura (ZAPRUTKO et al., 2004). No espectro de RMN de
1
H pôde-se
observar o surgimento do simpleto em δ 3,63, atribuído ao grupo metoxila
introduzida na molécula. O mesmo foi observado no espectro de RMN de
13
C, no
qual os sinais em
δ 178,32 e δ 51,60, inexistentes no precursor, foram atribuídos aos
COOCH
3
O
COOCH
3
HO
COOH
HO
COOCH
3
N
O
H
COOCH
3
H
3
CCOO
COOCH
3
N
OOCCH
3
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
237
carbonos carbonílico e metílico do éster. No espectro obtido no IV para a substância,
observou-se a presença da banda característica de carbonila de éster em 1726 cm
-1
.
10.2.2 Síntese de 3-oxo-olean-12-en-28-oato de metila (98)
A oxidação de 97 empregando-se PDC como agente oxidante foi realizada
segundo metodologia descrita por Gordaliza et al. (1995). A reação resultou na
obtenção do derivado 98 (Figura 73).
No espectro obtido no IV para essa substância observou-se a presença da
banda característica de deformação axial de C=O de cetonas em 1724 cm
-1
. A
análise conjunta dos espectros de RMN de
1
H e de
13
C (vide apêndice), bem como a
comparação com dados da literatura (ZAPRUTKO et al., 2004), confirmaram a
obtenção do derivado oxidado 98. No espectro de RMN de
1
H pôde-se observar o
desaparecimento do dupleto duplo em δ 3,22 atribuído à H-3, bem como o
surgimento do sinal em δ 217,71 no espectro de RMN de
13
C, caracterizando a
presença na carbonila cetônica na posição 3.
10.2.3 Síntese de 3-hidroxi-oxima-olean-12-en-28-oato de metila (99)
A oxima 99 foi obtida como produto da reação de 98 (Figura 73) com
cloridrato de hidroxilamina, segundo metodologia descrita por Chen et al. (2006).
No espectro de RMN de
1
H (vide apêndice), os sinais centrados em δ 3,22 e δ
2,86 foram atribuídos aos hidrogênios metilênicos H2a e b, respectivamente. No
espectro de RMN de
13
C, a presença do sinal em δ 166,81, atribuído a C-3 e com
valor de deslocamento químico característico de carbono de oxima, confirmou o
sucesso da reação. Os demais sinais apresentaram valores de deslocamento
químico semelhantes aos descritos por Zaprutko et al. (2004) para esta substância.
No espectro de IV de 99 observaram-se, também, bandas em 3661 e 940 cm
-1
características de estiramento de OH e N-O de oximas, respectivamente.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
238
10.2.4 Acetilação de 99
A oxima 99 foi submetida à acetilação com piridina e anidrido acético,
resultando na obtenção do derivado acetilado 100 (Figura 73).
A estrutura foi confirmada com base na análise dos espectros de RMN de
1
H
e de
13
C (vide apêndice). O simpleto em δ 3,61 foi atribuído aos hidrogênios
metílicos do grupo acetila el os sinais em δ 169,87 e δ 21,10 foram atribuídos aos
carbonos carbonílico e metílico, respectivamente. Bandas características de
deformação C=O e C─O de ésteres em 1726 e 1163 cm
-1
também foram observadas
no espectro obtido no IV para 100.
10.2.5 Síntese de 3-acetóxi-olean-12-en-28-oato de metila (101)
O derivado 101 foi obtido como produto da acetilação de 97 com piridina e
anidrido acético (Figura 73). A análise dos espectros de IV e de RMN de
1
H e de
13
C
(vide apêndice), bem como a comparação com dados da literatura (ZAPRUTKO et
al., 2004) confirmaram a obtenção do produto acetilado. A presença dos sinais em δ
171,01 e δ 21,35, referentes aos carbonos carbonílico e metílico no espectro de
RMN de
13
C; o sinal em δ 4,48, atribuído ao hidrogênio H-3 no espectro de RMN de
1
H; o desaparecimento da banda de deformação de OH livre em 3500 cm
-1
e o
aparecimento das bandas de deformação axial de C=O e C─O de éster em 1724 e
1287 cm
-1
evidenciaram a introdução do grupo acetila.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
239
10.3 Ensaios biológicos
10.3.1 Avaliação da atividade citotóxica dos produtos obtidos
Alguns dos derivados do ácido ursólico sintetizados no presente trabalho
foram avaliados quanto à atividade citotóxica in vitro frente a diferentes linhagens de
células tumorais humanas A-549 (carcinoma de pulmão), HT-29 (adenocarcinoma
colo-retal) e MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama). Os resultados obtidos são
apresentados em valores de CI
50
(
µ
M) e referem-se à concentração necessária para
inibir 50% do crescimento das células tumorais em relação ao grupo controle.
Os derivados ensaiados foram selecionados de acordo com os diferentes
grupos químicos introduzidos nas posições C-3, C-11 e C-28. Assim, foram
avaliados ácido ursólico (31), os derivados inéditos 80, 83, 84, 85 e 95 e os
derivados 86, 89 e 92. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 49.
31 80 83
84 85 86
89 92 95
COOH
HO
C
H
HO
O
HO
O
CH
2
OH
HO
COOCH
3
O
O
COOCH
3
O
O
O
COOCH
3
H
3
CCOO
CH
2
OOCCH
3
H
3
CCOO
H
3
CCOO
O
O
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
240
A maioria dos derivados ensaiados não apresentou atividade citotóxica nas
concentrações avaliadas (10 a 0,026
µ
g/mL). Apenas o ácido ursólico (31) e o
derivado 86 foram citotóxicos frente às linhagens de células tumorais empregadas.
Observou-se um considerável aumento na potência para o derivado 86,
especialmente frente às linhagens celulares MDA-MB231 (31 CI
50
= 18,6 µM; 86 CI
50
= 1,99 µM) e HT-29 (31 CI
50
= 19 µM, 86 CI
50
= 2,94 µM). Estes resultados indicam
que a presença de grupo carboxila ou hidroxila na posição 28, bem como de
hidroxila na posição 3 são importantes para a atividade citotóxica. A introdução de
diferentes funcionalizações no anel C do esqueleto triterpênico (derivados 80, 83,
84, 85, 89, 92 e 95) resultou em derivados inativos. De maneira semelhante,
transformações químicas da hidroxila em C-3 forneceram compostos inativos
(derivados 80, 85, 89, e 92). Por outro lado, a redução do grupo carboxila na posição
28 para hidroxila, observada no derivado 86, aumentou significativamente a
citotoxicidade em relação ao precursor ácido ursólico. A importância deste grupo na
atividade fica evidente ao se analisar os derivados inativos 83 e 84 que, apesar da
presença da hidroxila na posição 3, possuem outros grupos funcionais na posição
28.
Os resultados obtidos indicam que os substituintes afetam claramente a
potência da atividade citotóxica dos derivados triterpênicos e apontam para a
necessidade de futuros estudos com compostos desta classe, visando obter novos
produtos de transformação química do ácido ursólico e de outros triterpenos, com
potencial para o desenvolvimento de novos fármacos antitumorais.
A influência de grupos funcionais distintos na atividade citotóxica de derivados
do ácido ursólico também foi investigada anteriormente por alguns grupos.
Kashiwada et al. (2000) e Ma et al. (2005) relataram que a presença de função ácido
carboxílico ou hidroxila nas posições 3 e 28 são importantes para a atividade
citotóxica frente a linhagens de células tumorais HL-60, BGC e Bel-7402. Os autores
também relataram que a esterificação das posições 3 e 28 leva à perda da atividade
citotóxica, indicando que a presença de grupo doador de hidrogênio em ambas as
posições, ou em uma delas, é essencial para a atividade citotóxica nas linhagens
tumorais ensaiadas. No mesmo trabalho, também foram sintetizados derivados
aminados na posição 3, sendo os isômeros com orientação
β
em C-3 cerca de 20
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
241
vezes mais potentes do que os isômeros 3
α
correspondentes, revelando que a
estereoquímica da posição 3 também é importante para a atividade citotóxica.
Tabela 49 -
Atividade citotóxica do ácido ursólico e derivados frente a linhagens tumorais
humanas.
Linhagens celulares (CI
50
µ
µµ
µM)
Substâncias
Ensaiadas
MDA-MB231 HT-29 A-549
31
18,6 19,0 10,9
80
n.d. n.d. n.d.
83
n.d. n.d. n.d.
84
n.d. n.d. n.d.
85
n.d. n.d. n.d.
86
1,99 2,94 4,52
89
n.d. n.d. n.d.
92
n.d. n.d. n.d.
95
n.d. n.d. n.d.
n.d: não ativo nas concentrações ensaiadas.
Meng et al. (2009) também relataram a atividade citotóxica de derivados
sintéticos do ácido ursólico frente a linhagens de células tumorais HeLa, SKOV3 e
BGC-823. Tendo como ponto de partida as observações de relação estrutura
química/atividade biológica relatados por Kashiwada et al. (2000) e Ma et al. (2005),
os autores introduziram grupamentos amino-alcoóis ou benzilaminas nas posições 3
e 28 e os derivados obtidos apresentaram potência bastante superior, com valores
de CI
50
6 vezes menores que os obtidos para o ácido ursólico. Os autores sugeriram
que o mecanismo pelo qual estes derivados atuam inibindo o crescimento celular é
através da indução de apoptose e inibição do ciclo de progressão celular na fase S.
Chadalapaka et al. (2008) relataram que a introdução de grupos doadores de
elétrons na posição 2 aumenta consideravelmente a potência de derivados do ácido
ursólico 1-en-3-ona, já relatados como compostos citotóxicos.
Os resultados encontrados no presente trabalho corroboram os resultados
relatados por Ma et al. (2005), visto que a presença de hidroxila na posição 3
também se mostrou necessária para a atividade citotóxica nos derivados ensaiados.
Resultados e Discussão
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
242
O mesmo pôde ser observado para a posição 28, sendo o derivado diidroxilado 62
mais potente que o precursor ácido ursólico frente às linhagens celulares ensaiadas.
Além disso, a introdução de grupos volumosos na posição 28 também não forneceu
derivados ativos, condizente com o relatado por Kashiwada et al. (2000). Isto indica
que os derivados do ácido ursólico contendo grupos hidroxila em C-3 e C-28, ou
seja, grupos com caráter doador de hidrogênio são moléculas promissoras para o
desenvolvimento futuro de fármacos antitumorais. Porém, estudos adicionais com
um número maior de derivados são necessários para uma melhor avaliação da
relação estrutura química/atividade biológica, visando à síntese de produtos mais
ativos, potencialmente úteis para o desenvolvimento futuro de fármacos
antitumorais.
10.3.2 Avaliação da atividade antiplasmódica
Diversos triterpenos e derivados apresentam pronunciada atividade
antiplasmódica (BAREN et al. 2006; SRINIVASAN et al., 2002). Assim, no presente
trabalho, a potencial atividade antiplasmódica do ácido ursólico e dos derivados 79,
80, 83, 84, 86, 89, 90, 91, 92 e 95, foi ensaiada in vitro em culturas de Plasmodium
falciparum resistente à cloroquina.
Somente o derivado 90 (CI
50
= 42
µ
g/mL) apresentou atividade moderada
frente ao P. falciparum quando comparado ao controle (CI
50
= 0,023
µ
g/mL), sendo
os demais derivados ensaiados inativos.
Derivados esterificados do lupeol na posição 3, assim como derivados
esterificados e acetilados do ácido betulínico nas posições 3 e 28, mostraram
atividade antimalárica in vitro (DE SA et al., 2009; SRINIVASAN et al., 2002). Porém,
esta é a primeira vez em que se relata a atividade antiplasmódica para um ceto
derivado nesta posição. Os resultados apontam a necessidade de estudos visando a
obtenção de novos derivados triterpênicos com atividade antiplasmódica.
Conclusões
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
243
11 CONCLUSÕES
•
As transformações químicas nas posições 3, 11 e 28 do ácido ursólico, isolado
de J. caroba e R. ferruginea, levaram à obtenção 21 derivados sendo 6 destes
substâncias inéditas: 80, 83, 84, 85, 94 e 95.
•
O derivado diidroxilado em C-3 e C-28 foi cerca de nove vezes mais potente que
o ácido ursólico nos ensaios de atividade citotóxica em culturas de células
tumorais humanas de mama MDA-MB-231, cólon HT29 e pulmão A549.
•
A introdução de diferentes funcionalizações no anel C do esqueleto triterpênico e
transformações químicas da hidroxila em C-3 resultaram em compostos inativos
nos ensaios com células tumorais.
•
Entre os derivados avaliados para atividade antiplasmódica in vitro, somente o
derivado 90 contendo um grupo ceto em C-3 apresentou atividade moderada
frente ao Plasmodium falciparum, sendo os demais inativos.
Referências Bibliográficas
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244
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APÊNDICE
ESPECTROS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
275
7.2701
5.2686
5.2504
5.2339
3.6122
3.2616
3.2360
3.2123
3.1831
2.2645
2.2042
2.1805
1.0811
0.9935
0.9551
0.9241
0.8784
0.7871
0.7487
(ppm)
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 74 -
Espectro de RMN de
1
H de 77 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
276
COOCH
3
HO
Figura 75 -
Espectro de RMN de 13C de 77 (50 MHz, CDCl3).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
277
7.2680
5.2354
5.2175
5.1995
4.5106
4.4730
4.4317
3.5778
2.2323
2.1767
2.0206
1.0465
0.9191
0.8402
0.8294
0.7182
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 76 -
Espectro de RMN de
1
H de 78 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
278
COOCH
3
H
3
COCO
177.9965
170.9031
138.1558
125.4392
80.8574
77.8068
77.1820
76.5205
55.2770
52.8513
51.4179
48.0366
47.4853
41.9723
39.4731
39.0320
38.8850
38.2602
37.6722
36.8636
36.6431
32.8942
30.6523
28.0060
24.1837
23.5589
23.3016
21.2067
18.1929
17.0903
16.9065
16.7595
15.5099
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 77 -
Espectro de RMN de
13
C de 78 (50 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
279
7.2733
5.6085
4.5573
4.5286
4.5017
4.4748
3.6119
2.8297
2.7633
2.4494
2.3956
2.3202
2.0547
1.2994
1.1487
0.9855
0.9119
0.8922
0.8725
0.8617
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 78 -
Espectro de RMN de
1
H de 79 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
H
3
CCOO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
280
COOCH
3
H
3
CCOO
O
199.7544
177.2246
171.0133
162.9643
130.6581
80.6001
77.8068
77.1820
76.5205
61.3781
55.0565
52.7410
51.8957
47.6691
44.6921
43.7365
38.8115
38.5910
38.0397
37.0106
35.9815
32.9677
30.3215
28.3736
28.1163
23.9264
23.5589
21.3537
18.8545
17.3476
17.1638
16.7595
16.2817
(ppm)
0
20406080100120140160180200
Figura 79 -
Espectro de RMN de
13
C de 79 (50 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
281
7.2733
5.6121
5.5816
5.5386
5.5081
4.5573
4.5053
4.4766
3.6298
2.3938
2.3381
2.0655
2.0565
1.9847
1.2618
1.2528
1.2456
1.2079
0.9711
0.9514
0.9245
0.9012
0.8814
0.8671
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 80 -
Espectro de RMN de
1
H de 80 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
282
178.1067
171.1236
154.5478
139.4422
123.3075
115.5525
80.6368
77.6966
77.0718
76.4470
51.6752
51.2342
47.5221
42.6706
40.6859
38.6278
38.3337
37.8927
36.9004
36.4961
31.9754
30.5788
28.1531
27.0872
25.2128
24.6247
24.2572
21.3537
20.9494
18.1561
17.0168
16.7963
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 81 -
Espectro de RMN de
13
C de 80 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
283
7 . 2 6 6 2
5 . 2 3 9 0
5 . 2 1 9 3
4 . 3 6 7 1
3 . 3 3 7 4
3 . 2 6 2 0
3 . 2 0 2 8
3 . 1 5 2 6
2 . 0 1 8 8
1 . 3 7 6 6
1 . 2 2 5 9
1 . 0 1 9 6
0 . 9 5 5 0
0 . 9 0 3 0
0 . 7 8 8 2
0 . 7 6 3 0
( p p m )
1 . 02 . 03 . 04 . 05 . 06 . 07 . 08 . 09 . 0
Figura 82 -
Espectro de RMN de
1
H de 81 (200 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OH
HO
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
284
CH
2
OCOCH
3
H
3
COCO
H
3
COCO
7.2715
5.4525
5.4345
5.4094
5.3915
5.1726
5.1547
4.5053
4.4694
4.4604
4.4245
4.0029
3.9473
3.6101
3.5975
3.5867
3.5545
2.0403
2.0314
1.9435
1.1954
1.0519
1.0393
0.9227
0.8689
0.8545
0.8151
0.7864
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 83 -
Espectro de RMN de
1
H de 82 (200 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
285
171.2338
171.1236
144.1099
124.2998
80.5266
77.7701
77.1085
76.4837
70.7869
54.9462
52.9248
51.9325
43.1852
41.7518
39.1056
38.7380
37.8559
36.6063
35.3567
32.7105
30.3950
28.0060
26.2419
23.5956
23.3016
22.4930
21.6845
21.3537
21.0229
18.1929
17.8254
17.3108
16.7963
16.5390
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 84 -
Espectro de RMN de
13
C de 82 (50 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OCOCH
3
H
3
COCO
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
286
Figura 85 -
Espectro de RMN de
1
H de 83 (400 MHz, CDCl
3
).
C
H
HO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
287
Figura 86 -
Espectro de RMN de
13
C de 83 (100 MHz, CDCl
3
).
C
H
HO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
288
7.2715
5.7736
5.7216
5.5188
5.5027
5.4668
5.4507
3.6818
3.6477
3.2297
3.2208
3.1975
3.1867
3.1723
1.0770
1.0393
1.0016
0.9819
0.9694
0.9263
0.8958
0.7774
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 87 -
Espectro de RMN de
1
H de 84 (200 MHz, CDCl
3
).
HO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
289
132.9001
129.6290
84.9737
79.0197
77.6966
77.0718
76.7777
76.4470
61.3781
54.8360
53.0351
44.3245
42.4501
41.7150
40.8330
38.9585
38.2970
37.7824
36.4226
35.0627
31.4609
27.8223
27.1240
25.4333
19.5160
19.2955
18.2664
17.7886
17.2373
14.9954
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 88 -
Espectro de RMN de
13
C de 84 (50 MHz, CDCl
3
).
HO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
290
CH
2
OCOCH
3
H
3
COCO
7.2680
6.4607
6.4463
6.4069
6.3925
5.6319
5.6229
5.5709
4.5573
4.5142
4.4748
4.3241
4.2685
3.9079
3.8505
2.7274
2.7041
2.6916
2.0673
2.0565
1.0662
1.0286
0.9478
0.9281
0.9084
0.8940
0.8814
0.8671
0.8581
0.7648
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 89 -
Espectro de RMN de
1
H de 85 (200 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
291
CH
2
OCOCH
3
H
3
COCO
171.1971
171.0868
138.3763
136.8695
126.9828
125.2554
80.8941
77.7333
77.1085
76.4470
66.2663
54.9830
54.2112
42.7441
40.6859
38.4807
37.8927
37.7824
36.5696
36.4961
34.6216
32.1224
29.9540
27.8223
24.3675
23.8897
23.4854
22.6768
21.3904
21.1332
20.6554
18.1561
16.7228
16.2082
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 90 -
Espectro de RMN de
13
C de 85 (50 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
292
7.2698
5.1618
5.1439
5.1260
3.5688
3.5132
3.2728
3.2459
3.2280
3.1939
3.1741
1.9506
1.9309
1.9058
1.8879
1.1093
1.0052
0.9945
0.9550
0.9335
0.8294
0.7989
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 91 -
Espectro de RMN de
1
H de 86 (200 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OH
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
293
138.7806
125.0716
79.0564
77.7333
77.1085
76.4837
69.9416
55.2035
54.0642
47.7058
42.0826
40.0611
39.3996
38.8115
38.0397
36.9004
35.2465
32.8575
30.6890
28.1898
27.2710
26.0581
23.3384
21.3904
18.3767
17.4211
16.8330
15.6937
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 92 -
Espectro de RMN de
13
C de 86 (50 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OH
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
294
7.2733
7.2698
5.3090
5.2910
5.2731
4.5322
4.4963
4.4532
2.0421
1.0860
0.9478
0.8617
0.8509
0.8312
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 93 -
Espectro de RMN de
1
H de 87 (200 MHz, CDCl
3
).
COOH
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
295
172.9612
171.1236
137.4208
126.2477
80.9676
77.7333
77.1085
76.4837
55.3505
52.7043
49.3597
47.5221
42.2296
39.6569
39.1423
38.7748
38.4072
37.7457
36.9004
35.8345
33.0413
30.5053
28.1163
24.2572
23.5956
23.3751
22.6768
21.3904
21.1699
18.2297
17.2741
17.0168
16.7963
15.6202
(ppm)
020406080100120140160180200
(ppm)
020406080100120140160180200
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 94 -
Espectro de RMN de
13
C de 87 (50 MHz, CDCl
3
).
COOH
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
296
7.2644
5.5727
4.4999
4.4730
4.4461
3.5850
2.0350
2.0260
1.2725
1.2492
1.2367
1.2241
1.1308
0.8814
0.8671
0.8420
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 95 -
Espectro de RMN de
1
H de 88 (200 MHz, CDCl
3
).
COOH
H
3
COCO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
297
7.2715
5.9781
5.9620
5.9261
5.6085
5.5745
5.5601
5.5242
5.5081
4.5429
4.5017
4.4622
3.6137
2.0655
1.1631
1.0590
1.0232
0.9927
0.9406
0.8689
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 96 -
Espectro de RMN de
1
H de 89 (200 MHz, CDCl
3
).
H
3
COCO
O
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
298
180.0179
171.1236
133.3779
128.9675
89.7149
80.6736
77.7333
77.0718
76.4470
60.6063
54.8727
52.9616
45.1331
41.9723
41.7518
40.3184
38.0030
36.3123
31.2036
30.8728
27.7855
25.5803
23.3751
22.8606
21.3904
19.2220
18.9647
17.9356
17.6048
16.0980
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 97 -
Espectro de RMN de
13
C de 89 (50 MHz, CDCl
3
).
H
3
COCO
O
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
299
7.2720
5.2777
5.2613
5.2430
3.6031
2.2645
2.2097
1.0756
1.0355
0.9423
0.8674
0.8364
0.7871
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 98 -
Espectro de RMN de
1
H de 90 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
300
217.7636
178.0332
138.3028
125.3657
77.7701
77.1453
76.5205
55.2770
52.9616
51.4914
48.1469
47.4118
46.7870
42.1561
39.4731
39.3261
39.0688
38.8850
36.6431
34.2174
32.5267
30.6890
28.0428
26.5727
24.2204
23.4854
21.5375
21.2067
19.6263
17.0903
16.9065
15.2159
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 99 -
Espectro de RMN de
13
C de 90 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
301
COOCH
3
N
O
H
7.2738
5.2449
3.5995
3.0991
3.0224
2.2517
2.1969
1.1487
1.0482
1.0263
0.9350
0.8583
0.8273
0.7688
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 100 -
Espectro de RMN de
1
H de 91 (200 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
302
COOCH
3
N
O
H
178.1055
166.8591
138.2652
125.5118
77.7328
77.1080
76.4464
55.8280
52.9612
51.5278
48.1466
47.1175
42.1191
40.3549
39.5831
39.0685
38.8848
38.6643
37.0471
36.6428
32.7470
30.6888
28.0059
27.3443
24.2570
23.3382
21.2065
19.0749
17.0167
15.1055
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 101 -
Espectro de RMN de
13
C de 91 (50 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
303
7.2698
5.6193
3.5957
2.3740
1.2851
1.2367
1.2277
1.0680
1.0303
0.9586
0.9209
0.8635
0.8312
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 102 -
Espectro de RMN de
1
H de 92 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
304
217.3593
199.2399
177.2614
163.4421
130.6214
77.7333
77.1085
76.4837
60.7900
55.4240
52.8146
51.9692
47.7058
44.5450
43.8835
39.7671
38.6645
36.7901
35.9448
34.2909
32.4164
30.3215
29.1822
28.4838
26.4624
23.8897
21.4639
21.0229
18.7810
17.1271
15.5834
14.1133
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 103 -
Espectro de RMN de
13
C de 92 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
305
7.2680
5.6032
3.6101
3.2620
3.2262
3.1813
2.8225
2.8082
2.7561
2.7382
2.4494
2.3938
2.3005
1.3030
1.1218
0.9945
0.9801
0.9084
0.8814
0.8509
0.7971
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 104 -
Espectro de RMN de
1
H de 93 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
HO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
306
200.0117
177.2981
162.9643
130.7316
78.8359
77.7333
77.0718
76.4470
68.0304
61.5251
55.0198
52.7778
51.9325
47.7058
44.7288
43.7732
39.1791
38.6645
37.1944
36.0183
33.0780
30.3583
29.7702
28.4471
28.1531
27.3445
25.6538
23.9999
22.7503
21.0597
18.8912
17.4946
17.1638
16.2817
15.6569
14.1868
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 105 -
Espectro de RMN de
13
C de 93 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
HO
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
307
7.2715
5.6139
5.5852
5.4686
5.4399
3.6406
3.5867
3.2854
3.2297
1.2133
1.1685
1.0339
0.9532
0.9281
0.8456
0.8205
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 106 -
Espectro de RMN de
1
H de 94 (200 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OH
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
308
123.4545
115.2952
77.6966
77.0718
76.4470
52.3735
51.1239
43.1117
39.3628
38.7380
38.0765
37.3046
35.1729
31.0198
29.7702
27.9325
25.4701
21.5375
18.3399
17.6784
17.3108
15.6937
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 107a -
Espectro de RMN de
13
C de 94 (50 MHz, CDCl
3
).
CH
2
OH
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
309
Figura 107b -
Espectro de RMN de
13
C de 94 (50 MHz, CDCl
3
).
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
ppm
25.64
25.76
26.81
27.32
28.14
28.45
29.38
29.48
29.58
29.68
29.92
30.26
30.79
32.15
32.73
34.03
34.35
35.34
37.50
38.28
38.95
39.15
39.56
40.58
40.92
43.31
51.33
52.56
70.42
75.49
78.93
115.50
123.66
140.19
155.09
CH
2
OH
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
310
7.2698
5.6516
3.6172
2.6431
2.5839
2.5104
2.4709
2.4117
1.4752
1.4412
1.3712
1.3174
0.9855
0.9460
0.9335
0.8850
0.8527
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 108 -
Espectro de RMN de
1
H de 95 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
O
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
311
198.5416
177.2246
175.6810
163.2216
130.8052
85.6720
77.7333
77.1085
76.4470
61.1208
54.4685
52.7410
51.9692
47.7426
44.6186
43.9937
39.6936
38.8850
38.7013
35.9815
32.3429
30.3583
28.3736
26.0581
23.9264
22.1255
20.9862
18.4134
17.4946
17.1271
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 109 -
Espectro de RMN de
13
C de 95 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
O
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
312
7.2698
5.3287
5.3107
4.3241
4.3061
4.2792
4.2631
3.6262
2.3202
2.2646
1.3138
1.2600
1.1882
1.1721
1.1075
1.0662
0.9729
0.9460
0.9137
0.8420
(ppm)
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 110 -
Espectro de RMN de
1
H de 96 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
313
217.9106
178.0332
152.8939
139.8832
77.7333
77.1085
76.4837
68.2877
55.5343
51.7120
51.3077
47.5221
47.3751
38.7380
38.4072
38.2602
37.8927
36.4226
34.5481
31.2403
30.5788
27.1975
26.9402
25.2128
24.6247
21.3169
21.1332
20.5084
19.5528
18.1194
17.1638
17.0168
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 111 -
Espectro de RMN de
13
C de 96 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
314
7.2683
5.3070
5.2869
5.2686
3.6305
3.2580
3.2306
3.2105
3.1813
2.8872
2.8379
2.8215
1.2619
1.1341
0.9916
0.9295
0.9076
0.9021
0.8766
0.7834
0.7469
0.7250
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 112 -
Espectro de RMN de
1
H de 97 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
HO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
315
COOCH
3
HO
178.3272
143.7791
122.3886
78.9462
77.8068
77.1820
76.5205
55.2770
51.6017
47.6323
46.7502
45.9049
41.6415
41.3108
39.2893
38.7748
38.4807
37.0474
33.8866
33.1883
32.6737
32.4164
30.7258
28.1531
27.7120
27.1975
25.9846
23.6691
23.4486
23.0811
18.3767
16.8698
15.6937
15.3629
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 113 -
Espectro de RMN de
13
C de 97 (50 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
316
7.2701
5.3271
5.3088
5.2905
3.6342
2.9201
2.9018
2.8507
2.8306
1.1414
1.0866
1.0446
0.9295
0.9003
0.7798
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 114 -
Espectro de RMN de
1
H de 98 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
317
Figura 115 -
Espectro de RMN de 13C de 98 (50 MHz, CDCl3).
COOCH
3
O
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
318
7.2683
5.2723
5.2558
5.2394
3.6104
3.1192
3.0425
2.8708
2.8215
1.1414
1.0902
1.0409
1.0117
0.9076
0.8784
0.7414
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 116 -
Espectro de RMN de
1
H de 99 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
N
O
H
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
319
178.3272
166.8234
143.8526
122.2784
77.7701
77.1453
76.5205
55.9386
51.6017
47.2280
46.7502
45.8314
41.7518
41.3475
40.4287
39.3628
38.5543
37.1576
33.8866
33.1883
32.4164
30.7258
27.7120
27.1240
25.8743
23.7059
23.5221
23.2649
23.0811
19.0382
17.1271
16.9065
14.9586
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 117 -
Espectro de RMN de
13
C de 99 (50 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
N
O
H
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
320
7.2683
5.2796
5.2631
5.2430
3.6195
2.9785
2.9603
2.9292
2.9018
2.8818
2.8105
2.1732
1.2473
1.1195
1.1085
1.0154
0.9168
0.8894
0.7506
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 118 -
Espectro de RMN de
1
H de 100 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
N
OCOCH
3
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
321
COOCH
3
N
OCOCH
3
178.2905
174.7254
169.8740
143.9996
122.0946
77.7333
77.1085
76.4837
55.8651
51.6017
47.1913
46.7502
45.8314
41.7518
41.3843
39.3261
38.7380
37.0106
33.8866
33.1515
32.3797
30.7625
27.7120
27.0872
25.8743
23.6691
23.5221
23.1546
20.1041
19.4793
19.0015
16.8698
15.1424
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 119 -
Espectro de RMN de
13
C de 100 (50 MHz, CDCl
3
).
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
322
7.2698
5.2928
5.2749
5.2569
4.5268
4.4891
4.4478
3.6172
2.8979
2.8781
2.8333
2.0403
1.1218
0.9227
0.8940
0.8599
0.8492
0.7182
(ppm)
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5
Figura 120 -
Espectro de RMN de
1
H de 101 (200 MHz, CDCl
3
).
COOCH
3
H
3
COCO
Apêndice
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
323
COOCH
3
H
3
COCO
178.2905
171.0133
143.8158
122.3151
80.9309
77.7701
77.1453
76.5205
55.3138
51.5649
47.5588
46.7502
45.8682
41.6415
41.3108
39.2893
38.1132
37.7089
36.9371
33.8866
33.1515
32.6370
32.4164
30.7258
28.0795
27.7120
25.9111
23.6691
23.5589
23.4486
23.0811
21.3537
18.2297
16.8698
16.7595
15.3996
(ppm)
020406080100120140160180200
Figura 121 -
Espectro de RMN de
13
C de 101 (50 MHz, CDCl
3
).
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