ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
FLÁVIO SANTOS LOPES
MORFOGÊNESE IN VITRO COMO AUXÍLIO AO
MELHORAMENTO DA MANDIOQUINHA-SALSA
(Arracacia xanthorrhiza Bancroft)
ALEGRE-ES
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
FLÁVIO SANTOS LOPES
MORFOGÊNESE IN VITRO COMO AUXÍLIO AO
MELHORAMENTO DA MANDIOQUINHA-SALSA
(Arracacia xanthorrhiza Bancroft)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Produção Vegetal do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal do
Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção
do título de Mestre em Produção Vegetal, na área de
concentração Fitotecnia.
Orientador: Prof. Dr. Frederico de Pina Matta
Co-orientadores: Profa. Dra. Andreia Barcelos
Passos Lima
Prof. Dr. Edilson Romais Schmildt
ALEGRE-ES
2009
ads:
3
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Setorial de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Lopes, Flávio Santos, 1979-
L864m
Morfogênese in vitro como auxílio ao melhoramento da mandioquinha-
salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft) / Flávio Santos Lopes. – 2009.
102 f. : il.
Orientador: Frederico de Pina Matta.
Co-orientadores: Andreia Barcelos Passos Lima, Edilson Romais
Schmildt.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Espírito Santo, Centro
de Ciências Agrárias.
1. Batata-baroa – Propagação in vitro. 2. Batata-baroa – Morfogênese. 3.
Hortaliças – Melhoramento genético. I. Matta, Frederico de Pina. II. Lima,
Andreia Barcelos Passos. III. Schmildt, Edilson Romais. IV. Universidade
Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências Agrárias. V. Título.
CDU: 63
4
FLÁVIO SANTOS LOPES
MORFOGÊNESE IN VITRO COMO AUXÍLIO AO
MELHORAMENTO DA MANDIOQUINHA-SALSA
(Arracacia xanthorrhiza Bancroft)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal, na área de
concentração Fitotecnia
.
Aprovada: 25 de Março de 2009.
Prof. Dr. Wagner Campos Otoni Dr. José Mauro de Souza Balbino
UFV INCAPER
Profa. Dra. Andreia Barcelos Passos Lima
Dr. Edílson Romais Schmildt
CCA - UFES CEUNES - UFES
(Co-orientador) (Co-orientador)
Prof. Dr. Frederico de Pina Matta
CCA - UFES
(Orientador)
5
DEDICO
À minha amada Família, meus pais Otacílio e Expedita, que sempre
acreditaram e me apoiaram em tudo.
meus irmãos Neuber, Franklin e Quézia, com quem sempre pude contar
nesta conquista.
À minha mãe de Alegre, Ana Starling, que previu este momento em
2001 e que muito contribuiu,
e a todos que acreditaram e colaboraram para este momento.
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me sustentar até aqui, pelas vitórias alcançadas, pelo conforto nos
momentos difíceis, pela fé, por ter me concedido saúde e perseverança.
Ao Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, pela
oportunidade oferecida à realização do curso e a FAPES/FUNCITEC, pela bolsa
concedida.
Ao professor e amigo Frederico de Pina Matta, por ter aceitado me orientar quando
“o certo se tornou incerto”, pelos ensinamentos, por me incentivar e pela amizade.
À professora e amiga Andreia Barcelos Passos Lima, pela co-orientação, pelas
sugestões, incentivos, pela disponibilidade sempre e pelos momentos que me
socorreu nas dúvidas.
À Professora Maria Lúcia Carneiro Vieira que disponibilizou o Laboratório de
Biologia Celular e Molecular de Plantas, do Departamento de Genética, da Escola
Superior de Agronomia Luiz de Queiroz, da Universidade de São Paulo
(ESALQ/USP) para a realização da caracterização molecular dos acessos de
mandioquinha-salsa usados neste trabalho. Ao Dr. Hanai, ao Carlinhos e aos alunos
do laboratório que acompanharam e deram toda atenção.
Ao Instituto Capixaba de Pesquisa e Extensão Rural do Espírito Santo (INCAPER),
em especial ao pesquisador Carlos Alberto Simões, que há anos vem trabalhando
com a cultura da mandioquinha-salsa e que colocou à disposição as informações
acumuladas em anos de pesquisa e os materiais para as pesquisas bibliográficas.
Aos professores do programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, pelos
conhecimentos compartilhados, e ao professor Adésio Ferreira pelo auxilio nas
analises estatísticas.
Aos demais professores e funcionários, com os quais muito aprendi.
Aos amigos do MEPES e aos ex-alunos das EFAs de Olivânia e Castelo.
Aos colegas e amigos do mestrado, pelos momentos de descontração e estudos.
Aos estagiários do laboratório, aos funcionários e a todos que contribuíram de
alguma forma, para que este trabalho se concretizasse.
7
"Nunca desista de um sonho apenas porque
levaria muito tempo para realizá-lo. O tempo
passará de uma maneira ou de outra."
(H. J. Brown Jr.)
"O aumento do conhecimento é como uma
esfera dilatando-se no espaço: quanto maior a
nossa compreensão, maior o nosso contacto
com o desconhecido."
(Blaise Pascal)
"A percepção do desconhecido é a mais
fascinante das experiências. O homem que não
tem os olhos abertos para o misterioso passará
pela vida sem ver nada."
(Albert Einstein)
8
BIOGRAFIA
Flávio Santos Lopes, filho de Otacílio de Sousa Lopes e Maria Expedita dos Santos
Lopes, nasceu em 01 de outubro de 1979, em Timóteo, Minas Gerais.
Estudou até a sétima série no colégio Pedro Calmon, em Coronel Fabriciano, MG,
em 1994, quando se mudou para o Espírito Santo. Em 1995, concluiu o ensino
fundamental na escola Helio Ferraz.
Em 1998, concluiu o curso Técnico em Administração na Escola de 1º e 2º graus
Jardim Limoeiro.
Em 2001, iniciou o curso de Agronomia, na Universidade Federal do Espírito Santo,
concluindo no 2º semestre de 2005.
No período de março de 2006 a maio de 2007, atuou como professor de disciplinas
da área técnica nas Escolas Famílias de Olivânia e Castelo, ligadas à rede MEPES.
Em 2007, iniciou o curso de Mestrado em Produção Vegetal, no Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, como bolsista da
FAPES/FUNCITEC.
9
RESUMO GERAL
Este trabalho teve como objetivo gerar subsídios para a realização de outras
pesquisas tendo como foco o melhoramento genético da mandioquinha-salsa. Essa
cultura apresenta grande importância para as regiões produtoras, principalmente por
empregar, em seu manejo, mão-de-obra familiar, contribuindo para a redução do
êxodo rural. Neste trabalho foram realizados diversos experimentos partindo de
estudos de descontaminação envolvendo diferentes explantes, a germinação in vitro
de sementes, a resposta in vitro por via de organogênese direta e indireta de três
cultivares de mandioquinha-salsa (Branca, Amarela de Senador Amaral e Amarela
de Carandaí) cultivadas no Espírito Santo e a análise, por meio de marcadores
moleculares, de acessos coletados em cultivos comerciais da região produtora. Nos
estudos com as sementes foi observado que os frutos apresentam uma alta taxa de
contaminação e que a retirada dos tecidos envoltórios da semente proporcionaram
aumento na taxa de descontaminação. A germinação foi desuniforme, sendo que as
sementes que apresentaram protusão da radícula não chegaram a formar plântulas,
mas sim um agregado de células não organizadas. A desinfestação das raízes
possibilitou a utilização de discos radiculares como explantes para a organogênese
indireta, proporcionando a indução de calo para as três cultivares. Em meio MS
suplementado com doses de 0, 2, 4 e 6 mg L
-1
de citocininas (Cinetina ou BAP) é
possível obter raízes a partir de calos. A descontaminação de ápices caulinares e de
brotações laterais possibilita realizar os experimentos de organogênese direta. No
experimento com doses de BAP e ANA são constatadas respostas diferentes para
as três cultivares. O uso dos marcadores moleculares permite diferenciar os grupos
de cultivares de raízes brancas e amarelas sendo que, dentro de cada grupo, isso
não é possível. Existe viabilidade das técnicas biotecnológicas, empregadas neste
trabalho, para auxiliar os programas de melhoramento da mandioquinha-salsa.
Palavras chave: Arracacia xanthorrhiza. Organogênese. Rizogênese. Germinação in
vitro. Divergência genética.
10
GENERAL ABSTRACT
This study had as objective to generate data for other research focusing on the
genetic improvement of arracacha (Arracacia xanthorrhiza). This culture has great
importance for the producing regions, mainly by the use of family labor in its
management, contributing to the reduction of rural exodus. In this work was carried
out several experiments from studies of decontamination involving different explants,
in vitro germination of seeds, the response in vitro via direct and indirect
organogenesis of three cultivars of arracacha (“Branca”, “Amarela de Senador
Amaral” e “Amarela de Carandaí”) cultivated in the Espírito Santo State and analysis
by means of molecular markers from accessions collected in commercial crops
producing region. In studies with the seeds was observed that the fruits have a high
rate of contamination and that the removal of tissue wraps seed provides an increase
in the rate of decontamination. Germination was uneven, and the seeds showing
radicle protrusion not come to form seedlings, but an aggregate of cells not
organized. The disinfestation of roots allowed the use of root disks as explants for
indirect organogenesis, providing callus induction for the three cultivars. MS medium
supplemented with doses of 0, 2, 4 and 6 mg L-1 of cytokinins (Kinetin or BAP) is
possible to obtain roots from calluses. The decontamination of apical shoots and
sprouting lateral allows perform the experiments direct organogenesis. In the
experiment with doses of BAP and NAA are found different answers to the three
cultivars. The use of molecular markers allows the differentiating between groups of
cultivars of white and yellow roots being that within each group this is not possible.
There is viability of biotechnological techniques, employed in this work, to help the
breeding programs of the arracacha.
Key words: Arracacha (Arracacia xanthorrhiza). Organogenesis. Rhizogenesis.
Germination in vitro. Genetic divergence.
11
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico I.1 – Porcentagem de contaminação por bactérias em
sementes de mandioquinha-salsa em 3 avaliações em função do
tratamento de descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008 .........
61
Gráfico I.2 – Porcentagem de contaminação por fungos em sementes
de mandioquinha-salsa em 3 avaliações em função do tratamento de
descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008 ................................
62
Gráfico I.3 – Efeito dos tratamentos de embebição sobre a
porcentagem de protusão de radícula nas sementes e a porcentagem
de protusão radicular em função do tratamento de imersão. CCA-
UFES, Alegre, ES,
2008............................................................................
63
Gráfico II.1 – Comparação da porcentagem de contaminação
bacteriana, aos 15 dias após a inoculação, de ápices caulinares de
mandioquinha-salsa, entre as cultivares dentro de cada tratamento.
Médias plotadas com os seus erros em um intervalo de confiança de
95%. CCA-UFES, Alegre,ES, 2008......................................................
81
Gráfico II.2 – Comparação da porcentagem de contaminação fúngica,
aos 15 dias após a inoculação, em ápices caulinares de
mandioquinha-salsa, entre as cultivares dentro de cada tratamento.
Médias plotadas com os seus erros em um intervalo de confiança de
95%.CCA-UFES, Alegre,ES, 2008........................................................
82
Gráfico II.3 – Porcentagem de contaminação bacteriana em discos
radiculares de mandioquinha-salsa em função do tratamento de
descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.................................
94
Gráfico II.4 – Massa fresca de calos originados a partir de discos
radiculares de diferentes acessos de mandioquinha-salsa. CCA-
UFES, Alegre, ES, 2008........................................................................
95
Gráfico II.5 – Número médio de raízes da cultivar Branca de
mandioquinha-salsa em função de doses de Cinetina. CCA-UFES,
Alegre, ES, 2008....................................................................................
97
Gráfico II.6 – Número médio de raízes da cultivar Branca de
mandioquinha-salsa em função de doses de BAP. CCA-UFES,
Alegre, ES, 2008....................................................................................
98
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Planta de mandioquinha-salsa.................................................
22
Figura 2 – Gráficos da variação mensal da quantidade em Kg e do
valor em R$/Kg de mandioquinha-salsa comercializada mensalmente
na CEASA/ES no período de 2005 a 2008. Ao multiplicar o índice
lateral do gráfico por 20000 obtém-se a quantidade comercializada.......
25
Figura I. 1 – Sementes de mandioquinha-salsa apresentando
diferentes padrões de germinação. (A) Embrião rompendo o
tegumento da semente e se desenvolvendo sem estar ligado aos
cotilédones; (B) Embrião saindo da semente pela região de protusão
da radícula e se desenvolvendo sem estar ligado aos cotilédones; e
(C) Germinação epígea característica. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008....
64
Figura I.2 - Dendrograma obtido pelo método UPGMA a partir das
medidas de similaridade genética entre 19 acessos de mandioquinha-
salsa caracterizadas por marcadores AFLP. CCA-UFES, Alegre, ES,
2008..........................................................................................................
65
Figura II.1 - Procedimento para a obtenção de discos radiculares de
mandioquinha-salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008 ...............................
79
Figura II.2 - Plântulas de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza
Bancroft) obtidas in vitro a partir de ápices caulinares e brotações
laterais cultivados em meio MS suplementado com 3% de sacarose,
100 mg L
-1
de mio-inositol, 0,1 mg L
-1
de ANA e 0,2 mg L
-1
de BAP.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008..................................................................
86
Figura II.3 - Desenvolvimento de calos a partir de segmentos
radiculares de mandioquinha-salsa cultivados na presença de 10 µM
de 2,4-D. CCA-UFES, Alegre, ES,
2008......................................................
93
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais Citocininas e Auxinas utilizadas na cultura de
tecidos de plantas...................................................................................
33
Tabela I.1 - Combinação dos fatores dos tratamentos do experimento de
germinação dos frutos de mandioquinha-salsa. CCA-UFES, Alegre, ES,
2008..........................................................................................................
51
Tabela I.2 – Tratamentos de desinfestação dos frutos maduros. CCA-
UFES, Alegre, ES, 2008................................................................................
52
Tabela I.3 – Tratamentos de desinfestação das sementes. CCA – UFES,
Alegre, ES, 2008. ..........................................................................................
53
Tabela I.4 - Combinação dos fatores dos tratamentos de indução de
germinação de sementes de mandioquinha-salsa na presença de GA
3
.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008..................................................................
54
Tabela I.5 - Programação do termociclador para realização de pré-
amplificação..............................................................................................
58
Tabela I.6 - Programação do termociclador para realização da
amplificação seletiva...............................................................................
58
Tabela II.1 - Tratamentos de desinfestação de ápices caulinares de
mandioquinha-salsa. Alegre, CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.........................
77
Tabela II.2 - Tratamentos de desinfestação de raízes de mandioquinha-
salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008...........................................................
80
Tabela II.3 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca da Parte
Aérea (MFPA), da Massa Seca da Parte Aérea (MSPA), Número Médio
de Raízes (NMR), da Massa Fresca de Raízes (MFR) e da Massa Seca
de Raízes (MSR) de plântulas das cultivares Branca, Amarela de
Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-salsa em
função da combinação de diferentes concentrações de ANA e BAP.
Alegre, CCA-UFES, Alegre, ES, 2008........................................................
83
Tabela II.4 - Número Médio de Raízes (NMR) das cultivars Branca,
Amarela de Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-
salsa em função da combinação de diferentes doses de ANA e BAP.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008..................................................................
84
Tabela II.5 - Massa Fresca de Raízes (MFR) das cultivares Branca,
Amarela de Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-
salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008..........................................................
84
14
Tabela II.6 - Massa Seca de Raízes (MSR) das cultivares Branca,
Amarela de Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-
salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008..........................................................
84
Tabela II.7 - Resumo da análise de variância do Número Médio de
Brotações (NMB) e Comprimento de Parte Aérea (CPA) em função do
genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008....................................................
87
Tabela II.8 - Número Médio de Brotações (NMB) e Comprimento de
Parte Aérea (CPA) em função do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES,
2008............................................................................................................
88
Tabela II.9 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca de Calos
(MFC) em função de genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008 .................
88
Tabela II.10 - Massa Fresca de Calo (MFC) em função do genótipo.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008...................................................................
88
Tabela II.11 - Resumo da análise de variância da Massa Seca de Calo
(MSC) em função de genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.................
89
Tabela II.12 - Massa Seca de Calos (MSC) em função do genótipo.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008...................................................................
89
Tabela II.13 - Resumo da análise do Número Médio de Raízes (NMR)
em função de genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008............................
90
Tabela II.14 - Número Médio de Raízes (NMR) em função do genótipo.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008...................................................................
90
Tabela II.15 - Resumo da análise de variância do Comprimento de Raiz
(CR) e Massa Fresca de Raiz (MFR) em função do genótipo. CCA-
UFES, Alegre, ES, 2008............................................................................
91
Tabela II.16 - Comprimento de raiz (CR) e Massa Fresca de Raiz (MFR)
em função do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.............................
92
Tabela II.17 - Resumo da análise de variância da contaminação
bacteriana em segmentos radiculares de três cultivares de
mandioquinha-salsa em reposta aos tratamentos de descontaminação.
CCA-UFES, Alegre, ES, 2008....................................................................
93
Tabela II.18 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca de
Calos (MFC) em função do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008........
95
Tabela II.19 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca e Seca
de Calos e Raízes (MFCR e MSCR) de mandioquinha-salsa em reposta
a Cultivar e doses de Cinetina. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.................
96
15
Tabela II.20 - Massa Fresca de Calo e Raiz (MFCR)(g) de
mandioquinha-salsa em função da Cultivar e doses de Cinetina. CCA-
UFES, Alegre, ES, 2008.............................................................................
96
Tabela II.21 - Massa Seca de calo e Raiz (MSCR)(g) de mandioquinha-
salsa em função da Cultivar e doses de Cinetina. CCA-UFES, Alegre,
ES, 2008. ................................................................................................
97
Tabela II.22 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca e Seca
de Calos e Raízes (MFCR e MSCR) de mandioquinha-salsa em reposta
a Cultivar e doses de BAP. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.......................
98
16
SUMÁRIO
RESUMO GERAL .......................................................................................................9
GENERAL ABSTRACT .............................................................................................10
LISTA DE GRÁFICOS...............................................................................................11
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................12
LISTA DE TABELAS .................................................................................................13
1 INTRODUÇÃO GERAL ..........................................................................................18
1.1 OBJETIVO ..................................................................................................19
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................20
2.1 ORIGEM, DOMESTICAÇÃO E BOTÂNICA DA MANDIOQUINHA-SALSA.....20
2.2 IMPORTÂNCIA E CARACTERÍSTICAS DA MANDIOQUINHA-SALSA ..........23
2.3 ESTRUTURA GENÉTICA DA MANDIOQUINHA-SALSA................................27
2.4 VANTAGENS E DESVANTAGENS DA PROPAGAÇÃO VEGETATIVA .........28
2.5 IMPORTÂNCIA DA CULTURA DE TECIDOS .................................................30
2.6 MEIOS DE CULTURA E REGULADORES DE CRESCIMENTO NO CULTIVO
IN VITRO ...............................................................................................................31
2.7 PROCEDIMENTOS DE ASSEPSIA DOS EXPLANTES..................................34
2.8 CULTIVO IN VITRO DA MANDIOQUINHA-SALSA.........................................35
2.9 RECUPERAÇÃO DE EMBRIÕES IMATUROS ...............................................37
3 REFERÊNCIAS......................................................................................................38
4 CAPÍTULO I – GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE MANDIOQUINHA-
SALSA (Arracacia xanthorrhiza BANCROFT) E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE CULTIVARES......................................................................................................44
RESUMO...................................................................................................................44
ABSTRACT ...............................................................................................................45
4.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................46
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................49
4.2.1 Primeiro experimento: teste de germinação in vitro utilizando frutos em
estádios diferentes de maturação ......................................................................51
4.2.2 Segundo experimento: teste de desinfestação de frutos...........................52
4.2.3 Terceiro experimento: testes visando a desinfestação das sementes ......53
4.2.4 Quarto experimento: uso de Ácido giberélico na germinação de sementes
...........................................................................................................................54
4.2.5 Quinto experimento: caracterização com marcadores moleculares..........55
4.2.5.1 Extração do DNA genômico................................................................55
4.2.5.2 Quantificação do DNA genômico........................................................56
4.2.5.3 Técnica de AFLP ................................................................................57
4.2.5.4 Preparo do gel e corrida das amostras...............................................59
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................60
4.3.1 Desinfestação das sementes ....................................................................60
4.3.3 Uso de GA
3
na germinação de sementes .................................................63
4.3.4 Marcadores Moleculares ...........................................................................64
4.4 CONCLUSÕES................................................................................................66
4.5 REFERÊNCIAS ...............................................................................................67
17
5. CAPÍTULO II – ORGANOGÊNESE DE MANDIOQUINHA-SALSA (Arracacia
xanthorrhiza BANCROFT).........................................................................................69
RESUMO...................................................................................................................69
5. CHAPTER II - ORGANOGENESIS OF ARRACACHA (Arracacia xanthorrhiza)
ABSTRACT ...............................................................................................................70
5.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................71
5.1.1 Organogênese direta.................................................................................71
5.1.2 Organogênese Indireta..............................................................................73
5.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................74
5.2.1 Material Vegetal ........................................................................................74
5.2.2 Organogênese direta.................................................................................74
5.2.2.1 Desinfestação de ápices caulinares ...................................................75
5.2.2.2 Combinações de ANA e BAP X Cultivares .........................................76
5.2.2.3 Resposta de ápices caulinares e brotações laterais in vitro ...............76
5.2.3 Organogênese Indireta..............................................................................77
5.2.3.1 Desinfestação dos discos radiculares.................................................77
5.2.3.2 Indução de calos.................................................................................79
5.2.3.3 Indução de organogênese indireta .....................................................80
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................81
5.3.1 Organogênese direta.................................................................................81
5.3.1.1 Descontaminação de ápices caulinares .............................................81
5.3.1.2 Combinação de ANA e BAP X Cultivares...........................................83
5.3.1.3 Resposta de ápices caulinares e brotações laterais in vitro ...............85
5.3.2 Organogênese Indireta..............................................................................92
5.3.2.1 Desinfestação dos discos radiculares.................................................93
5.3.2.2 Indução de calo ..................................................................................94
5.3.2.3 Indução de organogênese indireta .....................................................95
5.4 CONCLUSÕES................................................................................................99
5.5 REFERÊNCIAS .............................................................................................100
18
1 INTRODUÇÃO GERAL
A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft) é uma dicotiledônea da família
Umbelliferae, de porte herbáceo. É conhecida no Brasil como batata-baroa, baroa,
batata-cenoura, batata-salsa dentre outros.
É uma cultura que apresenta grande importância para as regiões produtoras,
principalmente por empregar, em seu manejo, mão-de-obra familiar, contribuindo para
a redução do êxodo rural. Embora apresente grande potencial, atualmente tem sido
marginalizada por falta de trabalhos nas áreas de pesquisa e da extensão. Para que o
seu cultivo possa ser mais difundido, essa cultura carece de pesquisas nas áreas
fitotécnica e de melhoramento genético, apesar de ser considerada uma planta
rústica.
Em geral, são poucas as cultivares de mandioquinha-salsa utilizadas pelos
produtores, o que representa um risco ao considerar ataques de pragas, doenças e
condições climáticas adversas. Uma solução seria a obtenção de plantas originadas
de cruzamentos direcionados. No entanto, na maioria das condições brasileiras,
essa espécie apresenta problemas sérios de germinação de suas sementes, o que
dificulta a obtenção de novas cultivares. Nesse contexto, o resgate in vitro de
embriões pode representar uma alternativa para a obtenção de plantas originadas
desses cruzamentos.
Na literatura existem poucos trabalhos abordando aspectos do processo de
germinação das sementes desta cultura. No Brasil foram realizados somente 14
trabalhos, nas décadas de 80 e 90, com sementes provenientes de cultivos
comerciais de mandioquinha-salsa. Entretanto, não existem trabalhos, utilizando a
técnica de resgate de embriões, a fim de obter plantas a partir das sementes
originadas de campos de cultivo ou de cruzamentos direcionados. Portanto, é um
assunto que requer atenção dos setores de pesquisa, por se tratar de um ponto
básico para o avanço no melhoramento genético dessa cultura.
19
1.1 OBJETIVO
Os objetivos deste trabalho foram:
- avaliar a germinação in vitro de sementes de mandioquinha-salsa;
- avaliar a resposta in vitro pela via da organogênese direta e indireta de três
cultivares de mandioquinha-salsa cultivadas no Espírito Santo;
- distinguir as cultivares por meio de marcadores moleculares.
20
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ORIGEM, DOMESTICAÇÃO E BOTÂNICA DA MANDIOQUINHA-SALSA
A mandioquinha-salsa tem a sua origem na América do Sul, no entanto, segundo
Seminário (2004), não se sabe ao certo o País, pois uma grande variabilidade
genética é encontrada na área que compreende a Venezuela, a Colômbia, o
Equador, o Peru e a Bolívia.
Existem poucas informações acerca da domesticação da mandioquinha-salsa.
Segundo Bustamante e outros (1997), a planta já era amplamente utilizada pelos
Incas, sendo a sua domesticação realizada pelos povos andinos antecessores aos
mesmos. Nesse período, a percepção dominante era a instintiva e traduzia-se em
atitudes conservacionistas norteadas pela sobrevivência e o culto aos antepassados.
O surgimento do império Inca se deu com a formação de agregados urbanos e,
principalmente, da presença de uma consciência de um sistema de abastecimento,
de controle de valores e de autoridade. Nesse contexto, os responsáveis pela
agricultura obedeciam aos sacerdotes e se tornaram os primeiros “melhoristas” da
mandioquinha-salsa. No entanto, não há registros de como essa espécie era antes
da sua domesticação devido à falta de escrita do povo Inca e de seus antepassados
(BUSTAMANTE e outros, 1997).
No Brasil, as informações sobre quando, e em que circunstâncias, a mandioquinha-
salsa foi introduzida são imprecisas. Há relatos, de acordo com Balbino e outros
(1990) e Souza (1992), de ter sido o Barão de Friburgo, em data desconhecida, no
início do século passado, quem trouxe a planta para o País. Daí o nome popular
pelo qual é conhecida no Estado do Rio de Janeiro: “baroa” ou “batata-baroa”. Por
outro lado, segundo Santos e outros (2000), a planta era desconhecida no País até o
início do século, tendo sido introduzida por ocasião de uma reunião da Sociedade de
Geografia, em julho de 1907, por oferta do general colombiano Rafael Uribe Uribe. A
partir desse fato, foram feitos os primeiros cultivos em Nova Friburgo, colônia suíça
21
instalada na região serrana do Estado do Rio de Janeiro, provavelmente em terras
que pertenceram ao Barão de Friburgo.
Disseminou-se, então, pelos Estados de Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Espírito Santo, em regiões de clima ameno, à semelhança de seu hábitat,
com altitudes superiores a 800 m. Mais recentemente, a cultura expandiu-se para o
Planalto Central, especialmente no Distrito Federal, em locais com altitude entre
1.000 e 1.200 m, obtendo-se rendimentos da ordem de 34710 Kg ha
-1
, muito
superior à média nacional, estimada em 9.200 kg ha
-1
(SANTOS et al., 1991).
A mandioquinha-salsa é uma planta dicotiledônea, da ordem Umbellales, família
Apiaceae (Umbelliferae), gênero Arracacia, espécie Arracacia xanthorrhiza descrita
por Bancroft em 1825, a partir de material cultivado introduzido na Jamaica em
princípios do século XIX de acordo com Hermann (1997). A família das apiáceas
compreende também a cenoura, a salsa, o coentro, o aipo, o funcho entre outras.
É considerada uma planta perene que raramente atinge a fase reprodutiva, pois a
colheita é realizada antes do florescimento, ao final do estágio vegetativo
(HERMANN, 1997). O caule é cilíndrico e rugoso, compõe-se de uma estrutura cuja
parte superior saem ramificações curtas, denominadas rebentos, filhotes ou
propágulos, em número de 10 a 30, de onde nascem as folhas, de formato
pinatisecto (ZANIN e CASALI, 1984a). Esse conjunto é chamado comumente de
coroa, touça ou touceira. Da parte inferior da estrutura saem as raízes tuberosas,
que constituem a parte comercializável (Figura 1), as quais podem ser alongadas,
cilíndricas ou cônicas, com coloração que varia de branco a amarelo intenso ou
púrpura-escuro, conforme o clone. As raízes tuberosas da mandioquinha-salsa têm
película brilhante e tamanho variando de 5 a 25 cm, sendo produzidas em número
de seis ou mais por planta (FILGUEIRA, 2000). O mercado brasileiro tem preferência
por raízes de formato cônico alongado e de coloração amarela intensa.
Quanto ao desenvolvimento das raízes de reserva, sua emissão ocorre a partir de
70 dias após o plantio, verificando-se duas fases distintas. O crescimento primário
ocorre em comprimento até aproximadamente o quarto mês. A partir de então, dá-se
o crescimento das tuberosas (crescimento secundário), ocorrendo nessa fase a
diferenciação quanto ao formato e tamanho das raízes produzidas.
22
Figura1 - Planta de mandioquinha-salsa.
Fonte: Tradução e adaptação a partir de Blas e outros (2008).
A inflorescência é composta por um conjunto de umbelas que são formadas em
épocas diferentes. Sob algumas condições ambientais, a cultura floresce e produz
sementes em quantidades razoáveis, podendo-se utilizá-las em trabalhos de
melhoramento genético. Deve-se deixar claro que, em mandioquinha-salsa, a
propagação sexuada, com o uso de sementes botânicas em plantios comerciais, é
absolutamente inviável, pelos baixos índices de germinação, vigor da planta e pela
desuniformidade fenotípica da população oriunda de sementes (BUSTAMANTE et
al.,1997).
Embora não seja interessante, do ponto de vista produtivo, é comum se observar um
elevado percentual de florescimento de plantas de mandioquinha-salsa em campo
de produção da região sudeste em plantios de julho a setembro. Madeira e Benites
Fruto Flor
Umbela
Umbela composta
Haste Floral
Raiz de reserva
Rebentos
Folha Composta
Caule
Touceira
23
(2000) citam que existe interação com o frio, mas que o estresse hídrico, em plantas
ou mudas maduras, é preponderante na indução ao florescimento precoce, antes do
período considerado para colheita das raízes. Essa situação coincide com o fato de
que, nas condições climáticas de seu local de origem, onde ocorrem baixas
temperaturas, é rara, quase desconhecida, a inflorescência, em razão de um regime
hídrico bem distribuído (BUSTAMANTE et al., 1997). No entanto, Vásquez e outros
(2004) afirmam que muitas comunidades na Colômbia cultivam a mandioquinha-
salsa como uma planta perene, permitindo que as plantas floresçam e obtenham
sementes, que irão dar origem a indivíduos segregantes geneticamente,
desenvolvendo ao redor da planta matriz. Essa situação é importante, pois
dispersam sementes, criando novas combinações genéticas que resultarão em
novos clones, o que pode explicar a variabilidade genética da espécie nessa região.
A produção de mudas na coroa merece atenção quanto à biologia da planta e
quanto ao seu desenvolvimento, pois, na touceira, existem mudas com idades
fisiológicas variadas. As primeiras mudas formadas encontram-se, no ponto de
colheita, extremamente lignificadas e com grande quantidade de reservas. As
últimas mudas formadas, ou em formação, possuem pequena quantidade de
reservas e por serem mais novas, podem estar menos sujeitas ao florescimento
(SEDIYAMA e CASALI, 1997).
2.2 IMPORTÂNCIA E CARACTERÍSTICAS DA MANDIOQUINHA-SALSA
O cultivo da mandioquinha-salsa é de grande importância social e econômica para as
regiões produtoras tradicionais. De acordo com Sediyama (1988), a sua maior
importância na alimentação está relacionada com o sabor e o valor nutricional.
Entretanto, apesar dessas características favoráveis, o seu cultivo não está totalmente
difundido por todo Brasil.
Esta cultura tem grande importância por ser fonte de cálcio, fósforo e ferro. Segundo
Pereira (1997), o consumo diário de 100 g de mandioquinha-salsa é suficiente para
suprir as necessidades diárias desses minerais para crianças, adultos, gestantes e
24
nutrizes. De acordo com dados apresentados por Luengo e outros (2000), a
mandioquinha-salsa apresenta o segundo maior teor de niacina entre as hortaliças
(3,400 mg/100 g de raízes cruas). A necessidade de ingestão diária de niacina
recomendada pela FAO/OMS varia de 2 a 18 mg/dia para indivíduos entre 0 a 70
anos.
A maior fração de carboidratos presentes nas raízes de mandioquinha-salsa
corresponde ao amido, com cerca de 80%, e os açúcares totais, 6% (PEREIRA,
1997). De acordo com Kibuuka e Mazzari, citados por Pereira (1997), o amido da
mandioquinha-salsa contém amilose em torno de 23%, e os grânulos arredondados
variam de 5 a 27 µm, que colaboram para a sua grande digestibilidade.
Basicamente, a produção de mandioquinha-salsa está destinada ao consumo
caseiro, devido aos inconvenientes e dificuldades de armazenamento dessas raízes
(PEREIRA e SANTOS, 1997). No entanto, a oferta de produtos semiprocessados e
processados tem aumentado o leque de consumo dessa hortaliça. De acordo com
Pereira e Santos (1997), a sua comercialização pode ser feita principalmente como
“chips”, flocos, farinhas, amido e purê desidratado. Outra forma bastante utilizada
para a comercialização desse produto é a comercialização de sopas prontas.
Bueno (2004) relata que a mandioquinha-salsa é uma das culturas que apresentam
pouca oscilação de preço. De acordo com Rodrigues e outros (2002), isso é devido à
possibilidade de plantio por praticamente o ano todo e pela sua perecibilidade.
Os dados de comercialização de mandioquinha-salsa na CEASA/ES entre os anos de
2005 e 2008 estão plotados na figura 2. A redução do volume de raízes ofertada em
2006 e 2008 pode ser explicada pela ocorrência de fatores climáticos adversos nesses
anos o que acarretou em alto índice de florescimento e redução de produtividade. O
florescimento, segundo Zanin e Casali (1984b), reduz a produção de raízes, sendo
que, em tais situações, produtores realizam a eliminação da inflorescência, não
assegurando que as plantas voltem a produzir normalmente (ZANIN e CASALI,
1984b).
Em virtude dos problemas climáticos, alguns produtores deixaram de cultivar
mandioquinha-salsa, contribuindo para a redução da quantidade comercializada e para
25
o aumento de preço médio de R$ 1,23/Kg em 2007 para R$ 2,03/Kg em 2008
(CEASA/ES, 2008).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
J
A
N
FE
V
MAR
ABR
MAIO
JUN
J
U
L
AG
O
SET
OUT
N
O
V
DEZ
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
2006 - Kg x 20000 2006 - R$/Kg
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
JAN
FEV
M
A
R
AB
R
M
AIO
J
U
N
JUL
AGO
S
ET
OUT
N
O
V
D
EZ
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
2007 - Kg x 20000 2007 - R$/Kg
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
J
AN
FEV
MAR
ABR
M
AIO
JUN
J
UL
AGO
SET
O
U
T
NOV
DEZ
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
2008 - Kg x 20000 2008 - R$ /Kg
Figura 2 – Gráficos da variação mensal da quantidade em Kg e do valor em R$/Kg de
mandioquinha-salsa comercializada mensalmente na CEASA/ES no período de 2005 a 2008.
Ao multiplicar o índice lateral do gráfico por 20000, obtém-se a quantidade comercializada.
Fonte: CEASA/ES (2008).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
JAN
FEV
MAR
ABR
MAIO
JUN
JUL
AGO
SET
OUT
NOV
DEZ
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
2005 - Kg x 20000
2005 - R$/Kg
2005
2006
2007
2008
26
De acordo com Muniz e Machado (1995), o cultivo de mandioquinha-salsa, no
Espírito Santo, estava em expansão no início dos anos 90 tendo, basicamente, a
CEASA-MG como principal mercado atacadista. Nesse período, a cultura
representava cerca de 2% (180 milhões de reais) do Produto Interno Bruto (PIB)
estadual de 9 bilhões de reais e 1% da produção agrícola.
De acordo com dados disponibilizados pela CEASA/ES (2008), em 2008 foi
comercializado um volume próximo de 681000 Kg de mandioquinha-salsa e os
municípios que apresentaram maior produção foram: Alfredo Chaves com 76,36%,
Marechal Floriano com 15,97% e Santa Maria de Jetibá com 3,14%. Nas CEASAs
de Minas Gerais foi comercializado, em 2008, um volume próximo de 325000 Kg de
mandioquinha-salsa produzidas nos municípios do Espírito Santo. Os municípios
que apresentaram maiores volumes comercializados em Minas Gerais foram: Venda
Nova do Imigrante com 66,99 %, Cariacica com 15,78 %, Domingos Martins com
7,19% e Santa Maria de Jetibá com 5,30 % (CEASA-MG, 2008).
Dentre os materiais cultivados nas regiões produtoras do Espírito Santo, a cultivar
Amarela de Carandaí ou Amarela Antiga é o material tradicionalmente produzido e
consumido, caracterizando-se pelo alto nível de produtividade, raízes de formato
cônico-cilíndrico, coloração amarela intensa, sabor e odor característicos.
Em menor escala, verifica-se o cultivo de clones de raízes brancas. Seu cultivo é
restrito devido à baixa aceitação comercial, em função do odor e sabor menos
intensos. Contudo, mais recentemente, sua área de plantio tem aumentado em
consequência da maior produtividade, resistência a pragas e doenças, inclusive
nematóides, o que se reflete em preços mais baixos para o consumidor.
A cultivar Amarela de Senador Amaral vem sendo cultivada desde 1998, quando foi
obtida por meio da seleção de clones originários de sementes botânicas do material
tradicionalmente cultivado, coletadas no município de Senador Amaral, sul de Minas
Gerais, com produtores locais (SANTOS, 1998). Essa cultivar tem como
características: alta produtividade, superior a 25 t ha
-1
, raízes de qualidade superior
quanto ao formato, coloração e precocidade de colheita a partir de oito meses. Não
é recomendada para frituras, por causa do baixo teor de sólidos solúveis e dos altos
teores de açúcares totais (SANTOS, 2008). De acordo com Santos e outros (2000),
27
no Estado do Paraná, a cultivar Amarela de Senador Amaral tem apresentado
vantagens quando comparada à Amarela de Carandaí, considerando a qualidade
das raízes, a precocidade e a produtividade.
2.3 ESTRUTURA GENÉTICA DA MANDIOQUINHA-SALSA
A estrutura genética de uma espécie pode ser definida como a distribuição da
variabilidade genética entre e dentro de populações. Em populações naturais, a
distribuição da variabilidade genética é influenciada pelo modo de reprodução,
sistema de acasalamento, tamanho da população, distribuição geográfica e fluxo
gênico, além de ser estruturada no tempo e no espaço (HAMRICK apud WADT,
2001).
A endogamia, cruzamento entre indivíduos aparentados, leva à homozigosidade, o
que geralmente causa a perda de adaptabilidade. Os mecanismos que controlam a
relação entre heterozigosidade e adaptabilidade tem sido objeto de intensiva
pesquisa. Muitas espécies animais e vegetais exibem heterose, na qual a maioria
dos indivíduos heterozigotos tem melhor desempenho que os homozigotos. Existem
duas hipóteses principais que explicam a heterose: a sobredominância, quando o
heterozigoto por si só explica esse fenômeno; e a dominância, que sugere que a
maioria dos homozigotos endogâmicos expressa simplesmente uma alta proporção
de alelos recessivos deletérios sendo, por isso, inferiores (GRIFFIN, 1990).
A mandioquinha-salsa, assim como a cenoura e a salsa, é uma planta alógama que
necessita de um polinizador para transferir o pólen até o estigma, pois a estrutura
floral previne a autogamia (KNUDSEN et al., 2006).
A contagem de cromossomos em pontas de raiz de mandioquinha-salsa cultivada
tem demonstrado que na mitose as células apresentam um número de 44
cromossomos, em materiais originários do Peru (BLAS e ARBIZU, citados por
HERMAN,1997; BLAS, citado por HERMAN,1997).
28
O gênero Apiacea tem a maior parte dos indivíduos haplóides com 11 cromossomos
(DARLINGTON e WYLIE 1955). De acordo com Salazar, citado por Hermann (1997),
foi observada a formação de tetravalentes na meiose de plantas de mandioquinha-
salsa cultivadas no Equador, demonstrando, portanto, se tratar de plantas
autotetraplóides.
Vale relatar que, pelo fato da propagação dessa planta ser assexuada, a geração de
sementes em um campo formado por clones pode fazer com que as plantas obtidas
dessas sementes apresentem depressão endogâmica, acarretando possível redução
na taxa de germinação e a restrita sobrevivência das plantas (BUSTAMANTE et al.,
1997).
2.4 VANTAGENS E DESVANTAGENS DA PROPAGAÇÃO VEGETATIVA
A propagação vegetativa ou reprodução assexuada é uma técnica bastante utilizada
para a propagação de plantas. A multiplicação da mandioquinha-salsa para fins
comerciais é feita exclusivamente pelo processo vegetativo, utilizando-se para isso
os rebentos ou mudas retirados da parte aérea da planta (SEDIYAMA e CASALI,
1997).
Se determinada característica presente em uma planta estiver diretamente ligada à
sua constituição genética, a propagação vegetativa é de suma importância para que
grande número de indivíduos com esse genótipo possa ser obtido. De acordo com
Bueno (2004), as mudas produzidas via propagação vegetativa, ao contrário das
obtidas por sementes botânicas, tendem a manter a uniformidade e as
características das plantas das quais se originaram.
Dentre os tipos existentes de propagação vegetativa, a técnica de micropropagação
tem sido bastante utilizada por permitir a produção em larga escala de mudas sadias
em espaço físico reduzido, além de ser altamente conveniente para a manutenção
de coleções de germoplasma. Para tanto, a aplicação dessas técnicas depende de
fatores associados à indução e ao controle da morfogênese em suas duas rotas
29
possíveis de regeneração: organogênese (regeneração de brotos e raízes) e
embriogênese (regeneração de plantas a partir de embriões somáticos) (FLORES,
2006).
Na preservação de germoplasma, assim como na micropropagação, é desejável a
manutenção da identidade genética. No entanto, alguns sistemas de cultivo são
suscetíveis à criação e ao acúmulo de genótipos variantes por meio do fenômeno da
variação somaclonal. Esse fato acarreta um grande problema para o produtor
quando este deseja uma uniformidade genética de seu plantio. Esse fenômeno pode
ser definido como uma variabilidade genética gerada durante a cultura in vitro. A
variação somaclonal corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o
processo de multiplicação, principalmente relacionado à sua estatura, cor, forma e
arquitetura das folhas (ISRAELI et al., 1991).
Outro problema relacionado com a propagação vegetativa é devido justamente à
uniformidade genética dos plantios, principalmente em áreas de extensos
monocultivos. O plantio de grandes lavouras, uniformes geneticamente, gera um
grande desequilíbrio ecológico ao considerar que a cultura passa a ser fonte de
alimentos para certos insetos e microrganismos. Com a disponibilidade de
alimentos, ocorre crescimento acentuado da população desse inseto ou
microrganismos, podendo ocasionar grande prejuízo ao produtor que, para não
sofrer danos econômicos, realiza o controle dessa praga através da aplicação de
agrotóxicos.
Vale relatar neste ponto que, apesar de receber denominações conforme a região, o
cultivo da mandioquinha-salsa no Brasil foi restringido a poucas cultivares, com
características semelhantes e grande uniformidade genética. Esse fato representa
um risco em relação ao ataque de pragas e doenças (SANTOS, 1997).
30
2.5 IMPORTÂNCIA DA CULTURA DE TECIDOS
A cultura de tecidos vegetais é um conjunto de ferramentas biotecnológicas que tem
sido cada vez mais utilizado para diversos fins na área agronômica e biológica.
Nesse contexto, um conjunto de técnicas é utilizado para, a partir da obtenção de
segmentos da planta (folha, caule, raiz, semente e células), denominados explantes,
isolá-los, sob condições assépticas, e cultivá-los em meio nutritivo artificial visando à
recuperação e multiplicação de plântulas (PASQUAL et al., 2001).
Diferentes técnicas de cultura de tecidos são utilizadas visando solucionar
problemas em diferentes segmentos da área agrícola, ornamental e florestal
(TEIXEIRA, 2001). De acordo com Rogalski e outros (2003), através dessa
ferramenta é possível propagar, de forma rápida, espécies e/ou cultivares de
interesse e, ainda, podem servir como ferramenta auxiliar na eliminação de
patógenos, obtendo assim matrizes com qualidade genética e sanitária comprovada.
Além disso, o desenvolvimento de protocolos de propagação in vitro possibilita a
produção de uma maior quantidade de mudas a serem disponibilizadas aos
produtores, em tempo reduzido, se comparado aos métodos de propagação
convencionais.
A propagação in vitro, compreende o cultivo asséptico de explantes em condições
controladas de nutrição, luminosidade, fotoperíodo e temperatura. É uma alternativa
para a regeneração de plantas que apresentam dificuldades de reprodução natural e
em situações em que os métodos convencionais de propagação vegetativa não se
tornam viáveis (THORPE et al., 1991).
Neste ponto, vale ressaltar que o cultivo in vitro também tem sido utilizado para
manutenção de bancos de germoplasma, contribuindo para redução nos custos,
espaço físico e mão-de-obra necessários (SOUZA SOBRINHO et al., 2007). Como
exemplo, de acordo com Talledo e Escobar (2004), a importância do cultivo in vitro
para raízes andinas resume-se principalmente na possibilidade de propagação,
conservação e para facilitar a exportação do germoplasma.
31
2.6 MEIOS DE CULTURA E REGULADORES DE CRESCIMENTO NO CULTIVO IN
VITRO
Por serem considerados como parte fundamental do cultivo in vitro, os meios
nutritivos de cultivo artificial têm evoluído juntamente com a própria cultura de
tecidos vegetais. Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e
órgãos de plantas fornecem substâncias essenciais como água, nutrientes minerais,
fonte de carboidratos e reguladores de crescimento para o desenvolvimento dos
explantes (CALDAS et al., 1998).
O fornecimento de elementos essenciais às plantas, na quantidade e na forma que
estas possam aproveitá-lo, é uma condição importante para se estabelecer um
cultivo in vitro, pois, na falta desses elementos, as plantas não sobrevivem.
Devido ao fato das células, tecidos e plantas cultivadas in vitro não receberem
condições adequadas de iluminação e concentração de CO
2
e não apresentarem
teores de clorofila suficientes para realizar uma taxa fotossintética necessária para
suprir a suas necessidades (CALDAS et al., 1998), torna-se necessário adicionar ao
meio uma fonte de carboidrato, sendo a sacarose a fonte mais utilizada (COHEN,
1995), além de outras substâncias como vitaminas, aminoácidos e reguladores de
crescimento (PASQUAL et al., 1998).
Em geral, os meios nutritivos ainda podem conter o mio-inositol um composto cíclico
ligado com grupos
–
OH em seus seis carbonos, que atua dobrando ou triplicando a
massa fresca do calo (CALDAS et al., 1998), além de ser importante para o
crescimento de plantas e diferenciação de calos (MROGINSKI e ROCA, 1991).
Outro componente fundamental no cultivo in vitro são as vitaminas, sendo a tiamina
(vitamina B1), o ácido nicotínico (niacina) e a piridoxina (vitamina B
6
) as mais
utilizadas (CALDAS et al., 1998). Os meios nutritivos são, em geral, solidificados
com ágar, um polissacarídeo extraído de algas marinhas. O pH da maioria dos
meios semi-sólidos é ajustado entre 5,5 e 5,9 (CALDAS et al., 1998) para evitar a
precipitação de micronutrientes.
32
Grande parte da pesquisa realizada com o cultivo in vitro de plantas está relacionada
aos efeitos dos reguladores de crescimento (auxina, citocinina, giberelinas, etileno,
ácido jasmônico e ácido abcísico) e suas interações. De acordo com Grattapaglia e
Machado (1998), os reguladores de crescimento são adicionados ao meio para
suprir as deficiências dos teores endógenos do próprio explante, de maneira a
estimular respostas para a diferenciação, o crescimento, o alongamento e a
multiplicação, considerando suas concentrações e o estado fisiológico dos
explantes.
As giberelinas são hormônios vegetais cujas atividades principais estão relacionadas
ao crescimento caulinar, à quebra de dormência e a outros processos bioquímicos.
Existem várias giberelinas nas sementes imaturas, maduras e em germinação. Elas
promovem a quebra da dormência de sementes (MATSUMOTO, 2000).
As auxinas, juntamente com as citocininas, são consideradas como os mais
importantes grupos de substâncias reguladoras de crescimento e da morfogênese
de tecidos e órgãos vegetais (PASQUAL, 2001; TAIZ e ZEIGER, 2004).
A concentração ideal dos reguladores de crescimento depende dos padrões de
absorção, translocação e metabolismo na planta. Assim, as concentrações efetivas
de cada regulador de crescimento podem variar e necessitam ser ajustadas de
acordo com o tipo de tecido ou órgão, via de regeneração, do estádio da cultura e
respondem diferentemente a espécie e/ou genótipo dentro de uma espécie.
De acordo com Trewavas (1991), as respostas induzidas pelos hormônios vegetais
são atribuídas a alterações na sensibilidade dos tecidos. A sensibilidade das células
a um determinado hormônio vegetal depende do número de receptores, do grau de
afinidade do hormônio com os receptores e da capacidade de resposta.
Skoog e Miller (1957) desenvolveram um diagrama de acordo com a relação
auxina/citocinina requerida para a obtenção de diferentes respostas no cultivo in
vitro. Quando a relação auxina/citocinina é elevada ocorre o enraizamento em calos,
quando esta relação é intermediária há uma tendência à formação de calos e
quando esta relação é baixa ocorre a formação e o crescimento de parte aérea.
Entretanto, George e Sherrington (1984) afirmaram que nem sempre os resultados
33
obtidos obedecem a essa relação. Diferentes resultados são observados tanto no
cultivo de diferentes espécies, como de diferentes genótipos de uma mesma
espécie, mostrando que as respostas in vitro são genótipo-específicas (CASTRO e
ANDRADE, 1995). Além disso, as respostas são influenciadas pela interação entre
hormônios, estádio de desenvolvimento, tipo de explante e condições fisiológicas do
mesmo (BARENDSE e PEETERS, 1995).
As várias auxinas promovem respostas diferentes in vitro, que podem ser explicadas
pelas diferenças no metabolismo e estabilidade das mesmas (CALDAS et al., 1998).
O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é uma auxina que estimula a formação de
calos (KRIKORIAN; KELLY; SMITH, 1987) mesmo em baixas concentrações e, no
entanto, altas concentrações podem estimular a formação de embriões. O ácido
naftalenoacético (ANA) é a auxina mais utilizada nos meios de multiplicação com o
intuito de estimular o crescimento das brotações (HU e WANG, 1983). Porém, altas
concentrações dessa auxina podem induzir a calogênese. Na Tabela 1 estão
apresentadas as principais auxinas e citocininas.
Tabela 1 - Principais Citocininas e Auxinas utilizadas na cultura de tecidos de plantas
CITOCININAS AUXINAS
6- furfurilaminopurina (Cinetina-CIN) Ácido 3-indolacético (AIA)
6-benziloaminopurina (BAP) Ácido naftalenoacético (ANA)
Isopenteniladenina (2iP) Ácido indolbutírico (AIB)
Zeatina (ZEA) Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
Picloram
Ácido naftoxiacético (ANOA)
De acordo com Haberer e Kieber (2002), as citocininas são muito importantes na
regulação do crescimento e da morfogênese em cultura de tecidos, pois estimulam a
divisão das células, a indução e a proliferação de brotações. De acordo com Zaerr e
Mapes (1985), a BAP é a citocinina mais eficaz para promover a multiplicação de
partes aéreas da maioria das espécies. No entanto, inibem a formação de raízes e
reduzem o crescimento das brotações (KRIKORIAN; KELLY; SMITH, 1987).
As citocininas também são importantes para a indução de embriões somáticos.
Raemakers et al. (1995) ressaltaram que, em várias espécies, a combinação entre
34
auxina e citocinina é favorável para indução de células embriogênicas e embriões
somáticos, sendo a BAP a citocinina mais utilizada na maioria das espécies.
Além do balanço auxina/citocinina, o desenvolvimento vegetal é regulado por outros
tipos de hormônios vegetais: giberelinas, ácido abscísico, etileno, poliaminas e
brassinoesteróides (KENDE e ZEEVAART, 1997). Outras moléculas sinalizadoras
também têm sido identificadas em plantas, como o ácido jasmônico, o ácido
salicílico e a sisteína (TAIZ e ZEIGER, 2004), as quais participam dos processos de
resistência à patógenos e de defesa contra herbívoros. Tais moléculas podem
também apresentar respostas vantajosas para tecidos vegetais cultivados in vitro.
Portanto, de modo geral, o cultivo in vitro de plantas está diretamente ligado ao
balanço ideal dos compostos do meio nutritivo, ao explantes, genótipos (devido a
genótipo especificidade) e condições do ambiente de cultivo (FLORES, 2006).
2.7 PROCEDIMENTOS DE ASSEPSIA DOS EXPLANTES
Um dos maiores entraves ao cultivo in vitro é a alta incidência de contaminação
fúngica e/ou bacteriana, proveniente do explante ou do ambiente de manipulação.
Portanto, o sucesso no estabelecimento de uma cultura in vitro está diretamente
relacionado com a assepsia do material, do ambiente e das condições de sua
manipulação.
Castilho, citado por Madeira (2004), relatou que o cultivo in vitro da mandioquinha-
salsa apresentava problemas como a elevada contaminação dos explantes por
bactérias endógenas. Nesse sentido, Grattapaglia e Machado (1998) recomendam o
uso de fungicidas e antibióticos tanto para a desinfestação quanto para o controle da
contaminação por fungos e bactérias endógenos. No entanto, um dos grandes
problemas quanto ao uso de antibióticos, é que os mais utilizados em cultura de
tecidos vegetais possuem ação bacteriostática e não bactericida.
Para a desinfestação dos explantes, George e Sherrington (1984) recomendaram o
uso de hipoclorito de sódio entre 0,5 e 2,0% e, no entanto, não especificaram o
35
tempo necessário de exposição ao agente desinfestante para a obtenção de uma
assepsia eficiente.
De acordo com Senna Neto (1991), os melhores resultados encontrados para
desinfestar os explantes de mandioquinha-salsa foram 10, 15 ou 20 minutos em
solução de hipoclorito de sódio de 0,6 a 0,9%.
Para o cultivo in vitro da mandioquinha-salsa, Senna Neto (1991) constatou que tem
sido freqüentemente observado contaminações por fungos e bactérias no meristema
e outros explantes da cultura. Trabalhando com germinação de sementes botânicas
de mandioquinha-salsa em areia, Sediyama (1988) descreveu alta contaminação por
microrganismos, principalmente fungos do gênero Alternaria sp. Luz (1993)
encontrou uma alta contaminação por bactérias em cultivo de meristemas, onde
cerca de 80% do material estava contaminado. Tal fato demonstra a necessidade de
utilização de agentes desinfestantes para o controle desses microrganismos.
Portanto, verifica-se que, para qualquer recomendação para o tratamento de
desinfestação, devem ser considerados o tipo de infestação fúngica e/ou bacteriana
e o respectivo método de aplicação, levando-se sempre em consideração o binômio
tempo de descontaminação e concentração do descontaminante.
2.8 CULTIVO IN VITRO DA MANDIOQUINHA-SALSA
Na busca do estabelecimento de protocolos de micropropagação para
mandioquinha-salsa alguns trabalhos já foram realizados com as cultivares
comerciais de raízes amarelas.
O primeiro trabalho encontrado na literatura relatando o cultivo in vitro da
mandioquinha-salsa foi realizado por Senna Neto em 1991. Trabalhando com o
clone BGH 5746 cv. Amarela de Carandaí, do Banco de Germoplasma da
Universidade Federal de Viçosa. Nesse trabalho foi avaliada a resposta morfogênica
em diferentes meios de cultura como o meio B
5
(proposto por GAMBORG et al.,
1968), meio MS (proposto por MURASHIGE e SKOOG, 1962), meio Knudson
36
(proposto por KNUDSON, 1946) e meio de White (proposto por WHITE, 1943) e
também a concentração de reguladores de crescimento visando induzir a
diferenciação celular. O meio que apresentou as melhores respostas para as
condições de cultivo foi o meio B
5
, sendo que o acréscimo de 0,02 mg L
-1
de ANA +
0,1 mg L
-1
de BAP e 0,02 mg L
-1
de ANA + 0,2 mg L
-1
de BAP foram mais eficientes
para promover o crescimento de plantas.
De acordo com Castilho, citado por Madeira (2004), a utilização do meio MS
adicionado de sacarose 3%, ágar 0,8%, 2 mg L
-1
de sulfato de adenina e 2 ppm de
pantetonato de cálcio e 0,25 ppm de GA
3
+ 0,05 ppm de AIA ou 5 mg L
-1
de BAP
+
0,05 mg L
-1
de AIB ou 0,25 ppm de GA
3
+ 0,05 ppm de AIA + 0,01 ppm de BAP
pode ser utilizado para proporcionar a introdução in vitro de ápices caulinares.
Luz (1993), trabalhando com meristema da cultivar Amarela de Carandaí em meio
B
5
,
obteve o melhor desenvolvimento de plantas na combinação de 0,1 mg L
-1
de
ANA + 0,2 mg L
-1
de BAP. Para a multiplicação, os melhores resultados encontrados
foram com as doses de 0,1 e 0,2 mg L
-1
de BAP e, para o enraizamento, os
melhores resultados foram obtidos com 0,1 mg L
-1
de ANA.
Trabalhando com ápices caulinares das cultivares Amarela de Carandaí e Amarela
de Senador Amaral, visando a obtenção de plântulas, Madeira e outros (2005)
concluíram que os melhores resultados foram obtidos com concentrações em torno
de 0,3 mg L
-1
de BAP e 0,25 mg L
-1
de GA
3
adicionados ao meio B5 e que a
elevação da concentração de GA
3
promoveu aumento na altura média e máxima das
brotações.
Da mesma forma, no cultivo in vitro da mandioquinha-salsa também são descritos
problemas encontrados com contaminações por bactérias e fungos (SEDIYAMA,
1988; LUZ, 1993; SENNA NETO, 1991; PESSOA, 1993) e, muito embora esse fator
seja fundamental para o sucesso dessa técnica, existem poucos estudos realizados
com essa cultura abordando protocolos de descontaminação.
37
2.9 RECUPERAÇÃO DE EMBRIÕES IMATUROS
Para Sediyama (1988), a propagação da mandioquinha-salsa é feita exclusivamente
de forma vegetativa, através dos rebentos, uma vez que suas sementes apresentam
problemas de germinação, mesmo quando estratificadas ou submetidas a
tratamentos físicos e químicos, além de aumentar o tempo necessário para a
produção de raízes.
Portanto, o interesse pela propagação sexuada desta planta está relacionado aos
trabalhos de melhoramento genético e ao estudo da variabilidade genética do clone
produtor de sementes e na obtenção de novos clones (SEDIYAMA,1988).
O cultivo in vitro tem sido largamente utilizado para a germinação de sementes de
diversas espécies que apresentem problemas de germinação por impedimento
físicos e/ou químicos, ou que o embrião tenha se originado de cruzamentos
interespecíficos e apresentem barreiras genéticas para o desenvolvimento da
semente.
As técnicas de resgate de embrião têm sido utilizadas para diversos fins, como
obtenção de híbridos interespecíficos e intergenéricos. Essa técnica possibilita que
sementes imaturas, sementes que possuem período de dormência muito longo e
sementes apresentam germinação heterogênea, possam gerar plantas em
condições de cultivo in vitro. De acordo com Dantas e outros (2001), o resgate de
embriões pode assegurar a superação da dormência e a obtenção e clonagem de
plantas através da micropropagação.
Dantas e outros (2001) também relatam que o resgate de embriões pode assegurar
a superação da dormência e a obtenção e clonagem de plantas através da
micropropagação, o que torna possível a redução do período para testes das plantas
em programas de melhoramento. Vale salientar, no entanto, que para a cultura da
mandioquinha-salsa nenhum trabalho foi encontrado na literatura, utilizando esta
ferramenta, a fim de obter plantas a partir das sementes originadas de campos de
cultivo ou de cruzamentos direcionados.
38
3 REFERÊNCIAS
BALBINO, J. M. S.; PREZOTTI, L. C.; FORNAZIER, M. J.; COSTA, H.; HOLZ FILHO,
F. Cultura da batata-baroa. Vitória: EMCAPA, 1990. 27 p. Manual de Cultura, 2.
BARENDSE, G.W.M.; PEETERS, T.J.M. Multiple hormonal control in plants. Acta
botanica Neerlandica, 1:3-17, 1995.
BUENO, S.C.S. Produção de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza B.)
utilizando diferentes tipos de propágulos. 2004, 93f. Tese (Doutorado em
Produção Vegetal) Pós-Graduação em Produção Vegetal, Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2004.
BUSTAMANTE, P. G.; CASALI, V.W.D.; SEDIYAMA, M.A.N. Melhoramento genético
da mandioquinha-salsa. Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v.19, n. 190, p.16-
18. 1997.
CALDAS, L. S. HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos. In: TORRES, A.
C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de
plantas. Brasília: Embrapa-SPI, 1998, v.1, p. 87-132.
CASTRO, A.O.A.; ANDRADE, A.G. Cultura in vitro de meristemas de batata-doce
(Ipomoea batatas (L.) Lam). Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília: 1995,
v.30, p.917-922.
CEASA/ES Centrais de abastecimento de Minas Gerais. Disponível em:
<http://minas.ceasa.mg.gov.br/detec/Oferta_preco/prc_medio_prd/prc_medio_prd.ph
p>. Acesso em 20 de fev. 2009.
CEASA/ES Centrais de abastecimento do Espírito Santo. Disponível em:
<http://www.ceasa.es.gov.br/precos/precos.php>. Acesso em: 30 de jan. 2009.
COHEN, D. The culture medium. Acta Horticulturae, n. 393, p. 15-24, 1995.
DANTAS, A. C. de M.; NUNES, J. C. de O.; MORAES, L. K. A. de; PEDROTTI, E. L.;
NODARI, R. O. Rescue of immature embryos in vitro of rootstock of apple (malus
spp.). Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.23, n. 2, p. 246-249 ,2001.
DARLINGTON, C. D., WYLEI, A. P. Chromosome atlas of flowering plants.
London: Allen and Unwin, 1955. 519 p.
FILGUEIRA, F. A. R. Apiáceas: Cenoura e outras culturas. In:______ (Org). Novo
Manual de Olericultura: agrotecnologia moderna na produção e
comercialização de hortaliças. 2ª ed. Viçosa:UFV, 2003.p.302-315.
39
FLORES, R. Cultura de tecidos e produção de β-ecdisona em Pfaffia glomerata
e Pfaffia tuberosa (Amaranthaceae). 2006 188f. Tese (Doutorado em Agronomia)
Pós-Graduação em Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria,
2006.
GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K. Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, n.50, p.151-158, 1968.
GEORGE, E. F.; SHERRINGTON, P. D. Plant propagation by tissue culture.
Eversley: Exegetics Limited, 1984.
GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.:
CALDAS, L.S. (Eds.). Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas.
Brasilia. ABCTP/EMBRAPA- CNPH, 1990. 433p., p. 99-169.
GRIFFIN, A.R. Effects of inbreeding on growth of forest trees and implications for
management of seed suplies for plantation programmes. In: BAWA, K.S.; HADLEY,
M. (Eds.) Reprodutive ecology of tropical forest plants. Paris: UNESCO, p.355-
374, 1990.
HABERER, G.; KIEBER, J.J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone.
Plant Physiology. v. 128, p. 354-362, 2002.
HERMANN, M. Arracacha (Arracacia xanthorrhiza Bancroft). In: HERMANN, M.;
HELLER, J. (Eds). Andean roots, tubers: Ahipa, arracacha, maca and yacon.
Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops. Rome,
International Plant Genetic Resources Institute, 1997. p.75–172.
HU, C. Y.; WANG, P. J. Meristem, shoot tip and bud culture. In: EVANS, D. A. et al.
(Eds.) Handbook of plant cell culture. New York: Macmillan Publishing Company,
1983. p. 117-227.
ISRAELI, Y.; REUVENI, O.; LAHAV, E. Qualitative aspects of somaclonal variation
by in vitro techniques. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 48, p. 71-88, 1991.
KENDE, H.; ZEEVAART, J.A.A.; The five classical plant hormones. The Plant Cell,
v. 9, p.1197-1210, 1997.
KNUDSEN, S. R.; ORTING, B.; SORENSEN, M. Multiplicación y conservación de
arracacha (Arracacia xanthorrhiza Bancroft) y ajipa (Pachyrhyzus ahipa (Wedd.)
Parodi). Botânica Econômica de los Andes Centrales. La Paz, Universidad de
San Andrés, 2006. p.483-508.
KNUDSON, L.A. new nutrient solution for the germination of orchid seed. American
Orchid Society Bulletim, West Palm Beach, v.14, p.214- 217, 1946.
KRIKORIAN, A. D.; KELLY, K; SMITH, D. L. Hormones in tissue culture and
micropropagations. In: DAVIES, P. J. (Ed.) Plant hormones: and their role in plant
growth and development. Dordrecht: Kluwer Academic, 1987. p.593 – 613.
40
LUENGO, R. de F. A.; PARMAGNANI, R. M.; PARENTE, M. R.; LIMA, M. F. B. F.
Tabela de composição nutricional das hortaliças. Brasília Embrapa Hortaliças,
2000. Documento 26.
LUZ, J. M. Q. Obtenção in vitro de plantas de mandioquinha-salsa (Arracacia
xanthorrhiza Bancroft) via cultura de meristemas. 1993, 51p. Dissertação.
(Mestrado em Fitotecnia) Pós-Graduação em Agronomia, Escola Superior de
Agricultura de Lavras, Lavras, 1993.
MADEIRA, N. R. Micropropagação e indexação de mandioquinha-salsa. 2004,
139f. Tese. (Doutorado em Fitotecnia). Pós-Graduação em Agronomia, Universidade
Federal de Lavras, Lavras, 2004.
MADEIRA, N. R.; BENITES, F. R. G. Armazenamento de mudas de mandioquinha-
salsa sob estresse hídrico e térmico e sua relação com o pendoamento precoce. In:
Anais do 40 congresso Brasileiro de Olericultura, 2000, São Pedro. Horticultura
Brasileirav. 18. p. 584-585, 2000.
MADEIRA, N.R.; TEIXEIRA, J.B.; ARIMURA, C.T.; JUNQUEIRA, C.S. Influência da
concentração de BAP e AG
3
no desenvolvimento in vitro de mandioquinha-salsa,
Horticultura Brasileira. Campinas, v. 23, n.4, p. 982 – 985, 2005
MATSUMOTO, K. Giberelinas. In CID, L. P. B.(Ed.) Introdução aos hormônios
vegetais. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2000. 83-105.
MROGINSKI, L. A.; ROCA, W. M. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetables
in vitro. In: ROCA, W. M.; MROGINSKI, L. A. (Eds.) Cultivo de tejidos en la
agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali, 1991, p. 19-40.
MUNIZ, J.M.; MACHADO, N.D. Visão prospectiva da cadeia produtiva da
mandioquinha-salsa no Estado do Espírito Santo. In: Encontro nacional de
mandioquinha-salsa, 5.1995, Venda Nova do Imigrante. Palestras e trabalhos
técnicos. Venda Nova do Imigrante: SOB, 1995. p.10-14.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. v. 15, p. 473-497, 1962.
PASQUAL M; HOFFMANN A; RAMOS J.D. Cultura de tecidos - tecnologia e
aplicações. Introdução: situação e perspectivas. Lavras: UFLA/FAEPE, 72 p. 2001.
PASQUAL, M. Meios de cultura, cultura de tecidos: tecnologia e aplicações.
Lavras: UFLA/FAEPE, 74 p. 2001.
PASQUAL, M.; RAMOS, J. D.; HOFFMAN, A.; CARVALHO, G. R. Componentes e
propriedades dos meios de cultura: meio de cultura. Lavras: UFLA/FAEPE, 127
p.1998.
PEREIRA, A. S. Valor nutritivo da mandioquinha-salsa. Informe Agropecuário. Belo
Horizonte, v. 19, p. 11-12, 1997.
41
PEREIRA, A. S.; SANTOS, F. dos F. Processamento industrial da mandioquinha-
salsa. Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v. 19, p. 56-59, 1997.
PESSOA, A. C. da S. Desenvolvimento de calos e organogênese de
mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza). 1993, 97f. Dissertação. (Mestrado
em Ciências Biológicas) – Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica),
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Rio de Janeiro, 1993.
RAEMAKERS, C. J. J. M.; JACOBSEN, E.; VISSER, R. G. F. Secondary somatic
embryogenesis and applications in plant breeding. Euphytica, v. 81, p. 93-107,
1995.
RODRIGUES, J. P.; PEDRO NETO, M.; DIAS FILHO, P.H.; MALUF, W.R. A cultura
da mandioquinha-salsa. Lavras: Universidade Federal de Lavras, 2002. 15p. Boletim
Técnico de Hortaliças, 76.
ROGALSKI, M.; GUERRA, M. P.; SILVA, A. L. da. In vitro multiplication of 'Santa
Rosa' plum: effect of cytokynin BAP. Revista Brasileira de Fruticultura.
Jaboticabal, vol.25, n. 2, p. 365-367, 2003.
SANTOS, F. F. dos. Clima, Cultivares e época de plantio da mandioquinha-salsa.
Informe Agropecuário.Belo Horizonte, V. 19, n. 190, p. 35-37, 1997.
SANTOS, F. F. dos. Mandioquinha-salsa “Amarela de Senador Amaral.
Disponível em: <http:www.cnph.embrapa.br/cultivares/Mandioquinha.htmL>.
Acesso em: 14 de jul. 2008.
SANTOS, F. F. dos; COSTA, G. P. da; MACEDO, P. de; KRIECK, R. da S.
Mandioquinha-salsa no agronegócio do estado do Paraná. Curitiba: 2000. 56 p.
Informação Técnica, 51.
SANTOS, F.F.; VIEIRA, J.V.; PEREIRA, A.S.; LOPES, C.A.; CHARCHAR, J.M.
Cultivo da mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft). Brasília:
EMBRAPA-CNPH, 1991. n.p. (EMBRAPA-CNPH. Instruções técnicas, 10).
SEDIYAMA, M. A. N. Métodos de Propagação da batata-baroa (Arracacia
xanthorrhiza Bancroft). 1988, 114f. Tese (Doutorado em Fitotecnia) Pós-
Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1988.
SEDIYAMA, M. A. N.; CASALI, V. W. D. Propagação da mandioquinha-salsa por
sementes. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, V. 19, n. 190, p. 21 - 24 1997.
SEMINARIO, J. Origen de las Raíces Andinas (1). In: J. SEMINARIO (ed.). Raíces
Andinas: Contribuciones al conocimiento y a la capacitación. Serie: Conservación y
uso de la biodiversidad de raíces y tubérculos andinos: Una década de investigación
para el desarrollo (1993-2003). Lima: Universidad Nacional de Cajamarca, Centro
Internacional de la Papa, Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación. 2004.
p. 1-38.
42
SENNA NETO, N. Micropropagação de mandioquinha-salsa (Arracacia
xanthorrhiza Bancroft). 1991, 53f. Dissertação. (Mestrado em Fitotecnia) Pós-
Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1991.
SKOOG, F.; MILLER, F.O. Chemical regulation of growth and organ formation in
plant tissues cultured "in vitro". Symposium Society Experimental Biology, v.11,
p.118-131, 1957.
SOUZA SOBRINHO, F. de; PEREIRA, A. V.; LÉDO, F. J .da S.; OLIVEIRA, J. S.;
VARGAS, S. M. Aclimatização de germoplasma de capim-elefante, pós cultivo in
vitro. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, vol. 31, n. 1, p. 11-15, 2007.
SOUZA, R. J. Cultura da mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza). Lavras:
ESAL, 1992. 8 p. Circular, v. 1, n. 1.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2004.
TALLEDO, D., ESCOBAR, C., Genética de las células somáticas de raíces y
tuberosas andinas In: SEMINARIO, J. Raices Andinas: Contribuciones al
conocimiento y a la capacitación. Serie: Conservación y uso de la biodiversidad de
raices y tubérculos andinos: Una decada de investigación para el desarrollo (1993-
2003) No. 6. Lima: Universidad Nacional de Cajamarca, Centro Internacional de la
Papa, Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación. 2004: p.77-94.
TEIXEIRA, J. B. Limitações ao processo de cultivo in vitro de espécies lenhosas.
Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia, simpósios, Brasília, 2001.
Disponível em: <http://www.redbio.org>. Acesso em: 30 nov. 2008.
THORPE, T. A., HARRY, I. S., KUMAR, P. P. Application of micropropagation to
forestry. IN: DEBERGH, P. C., ZIMMERMAN, R. H. (Eds.) Micropropagation:
technology and aplication. Dordrecht: Kluwer Academic Press, 1991. p. 311-336
TREWAVAS, A. How do plant growth substance work? II. Plant, Cell and
Environment, v. 14, p. 1-12, 1991.
VÁSQUEZ, N.; MEDINA, C.; LOBO, M. Caracterización morfológica de la colección
colombiana (Tolima, Huila, Boyacá, Cauca) de arracacha (Arracacia xanthorrhiza) In:
SEMINARIO, J. Raices Andinas: Contribuciones al conocimiento y a la
capacitación. Serie: Conservación y uso de la biodiversidad de raices y tubérculos
andinos: Una decada de investigación para el desarrollo (1993-2003) Lima:
Universidad Nacional de Cajamarca, Centro Internacional de la Papa, Agencia Suiza
para el Desarrollo y la Cooperación. 2004. p. 165-178.
WADT, L.H. de O. Estrutura genética de populações naturais de pimenta longa
(Piper hispidinervum c.dc.) visando seu uso e conservação.2001, 95f. Tese
(Doutorado em Genética e Melhoramento) Pós-Graduação em Agronomia, Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 2001.
WHITE, P. R. A handbook of plant tissue culture. Lancaster: Costel, 1943. 273 p.
43
ZAERR, J. B.; MAPES, M. O. Action of growth regulators. In: BONGA, J. M.;
DURZAN, D. J. (Eds.) Tissue culture in forestry. Dordrech: Martinus Nijhoff, 1985.
p. 231-255.
ZANIN, A.C.W.; CASALI, V.W.D. Efeitos climáticos sobre a mandioquinha-salsa.
Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v. 10, n. 120, p. 13-16, 1984b.
ZANIN, A.C.W.; CASALI, V.W.D. Origem distribuição geográfica e botânica da
mandioquinha-salsa. Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v. 10, n. 120, p. 9-11,
1984a.
44
4 CAPÍTULO I – GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE MANDIOQUINHA-
SALSA (Arracacia xanthorrhiza BANCROFT) E CARACTERIZAÇÃO
MOLECULAR DE CULTIVARES
RESUMO
A mandioquinha-salsa é propagada exclusivamente de forma assexuada, portanto, é
importante obter informações sobre a propagação sexuada dessa cultura com a
finalidade de se realizar trabalhos de melhoramento para a obtenção de novas
cultivares. O objetivo do trabalho, apresentado neste capítulo, foi realizar a
caracterização molecular através de marcadores AFLP e obter plantas a partir de
sementes de mandioquinha-salsa germinadas in vitro. A comparação entre acessos,
usando marcadores moleculares, possibilitou diferenciar as cultivares de raiz branca
e amarela. Entre as cultivares amarelas não foi possível detectar diferenças com as
combinações de marcadores utilizadas. Na germinação de sementes, verificou-se
que os tecidos que as envolvem propiciam a contaminação por microrganismos. Ao
se realizar um experimento para a desinfestação, adotando-se a retirada dos tecidos
envoltórios, o tratamento que possibilita a melhor desinfestação é o que as
sementes são submetidas a procedimentos na seguinte sequência: imersas em
álcool 92,8% por um minuto; em seguida, imersas em solução de hipoclorito de
sódio a 2,5%; após três enxágues em água destilada, introduzidas em câmara de
fluxo laminar; imersas por cinco minutos em solução de hipoclorito de sódio a 2,5%;
imersas por três minutos em solução de sulfato de gentamicina a 20 mg L
-1
,
finalizando com três enxágues em água destilada estéril. A imersão das sementes
por uma hora em solução de GA
3
a 1 mg L
-1
proporciona maior porcentagem de
protusão da radícula.
45
4 CHAPTER I - IN VITRO GERMINATION OF ARRACACHA (Arracacia
xanthorrhiza) SEEDS AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF CULTIVARS
ABSTRACT
The arracacha (Arracacia xanthorrhiza) is propagated only asexually, so it is
important to get information about the sexual propagation of this culture with the
purpose of carrying out improvement work to obtain new cultivars. The objective of
the work presented in this chapter was to accomplish the molecular characterization
by AFLP markers and obtain plants from arracacha (Arracacia xanthorrhiza) seeds
germinated in vitro. The comparison among accesses using molecular markers,
allowed differentiating the cultivars of white and yellow root. Among the yellow
cultivars was not possible to detect differences with the combinations of markers
used. In the seeds germination, it was found that the tissues wrapper facilitates
contamination by microorganisms. When conducting an experiment for disinfestation,
adopting the removal of tissue wrappers, treatment that provides the best
disinfestation is that in which seeds are subjected to procedures in the following
sequence: immersed in alcohol, 92.8% for a minute, then immersed in a solution of
sodium hypochlorite 2.5%, and after three rinses in distilled water, introduced into
laminar flow, immersed for five minutes in a solution of sodium hypochlorite 2.5%,
immersed for three minutes in solution of gentamicin sulfate 20 mg L-1, finishing with
three rinses in sterile distilled water. Immersion of seeds for an hour in a solution of
GA3 at 1 mg L-1 provides a higher percentage of radicle protrusion.
46
4.1 INTRODUÇÃO
A propagação comercial da mandioquinha-salsa é realizada exclusivamente de
forma assexuada. No entanto, é necessário estudar a propagação sexuada dessa
cultura a fim de obter plantas em programas de melhoramento e propagá-las para a
obtenção de novas cultivares. De acordo com Sediyama e Casali (1997), a principal
função da semente é a preservação da espécie e a sua utilização favorece a
diversidade genética.
O ciclo de vida das plantas superiores compreende o desenvolvimento de uma
semente seguido por sua germinação e o desenvolvimento pós-germinativo por meio
do crescimento da planta (CASTRO et al., 2004). A semente é uma estrutura na qual
o embrião de uma planta, em geral, totalmente desenvolvido, é disperso. Essa
estrutura permite ao embrião sobreviver durante o período compreendido entre a
maturação da semente e o estabelecimento da plântula (PEREZ, 2004).
De acordo com Cardoso (2004), a partir do momento em que a semente se dispersa
da planta-mãe ela se torna um organismo autônomo, e a germinação do embrião irá
depender de fatores intrínsecos à semente e ao ambiente de propagação. Quando
as sementes, mesmo em condições favoráveis de ambiente, não iniciam nem
completam seu ciclo germinativo elas são denominadas dormentes. Para as
sementes de mandioquinha-salsa, Sediyama e Casali (1997) evidenciaram uma
baixa porcentagem de germinação e atribuíram tal fato ao fenômeno de dormência.
Uma alternativa para se obter plantas a partir de sementes dormentes é a utilização
de uma técnica de cultura de tecidos denominada resgate de embriões. Segundo Hu
e Ferreira (1998), o cultivo de embriões in vitro tem sido utilizado para: I) superar
dormência de sementes, em virtude da imaturidade do embrião ou da presença de
substâncias inibidoras no endosperma; II) estudos de aspectos nutricionais e
fisiológicos do desenvolvimento do embrião; III) testar a viabilidade de sementes; IV)
recuperar híbridos raros de cruzamentos incompatíveis; e V) como fonte de
explantes com tecidos de elevada totipotência.
47
No melhoramento, cruzamentos interespecíficos e intergenéricos são
frequentemente realizados para transferir genes de interesse de espécies silvestres
para espécies cultivadas. No entanto, incompatibilidades são muitas vezes
detectadas nesses cruzamentos, o que resulta em sementes com embriões
abortivos. De acordo com Hu e Ferreira (1998), a excisão e a cultura in vitro dos
embriões antes do aborto podem superar essa barreira pós-zigótica, recuperando
plantas híbridas.
Diversos fatores podem afetar o potencial germinativo das sementes e promoverem
a formação de plântulas anormais, dentre eles, a presença de microrganismos,
especialmente fungos e bactérias (CORDER E BORGES JUNIOR, 1999). Sendo
assim, para que as plântulas formadas a partir de sementes germinadas in vitro
possam ser fontes de explantes confiáveis, os métodos de desinfestação devem ser
eficazes, proporcionando total ausência de microrganismos.
Na propagação sexuada, o conhecimento da estrutura da semente e dos fatores que
afetam sua geminação e crescimento inicial é fundamental para o estabelecimento
da plântula e a produção eficiente das mudas. A germinação começa com a
embebição e termina com o início do crescimento do eixo embrionário, usualmente a
protusão da raiz primária (LABOURIAU, 1983).
As sementes botânicas da mandioquinha-salsa têm merecido atenção de
pesquisadores, principalmente com vistas ao melhoramento genético. Entretanto,
existem poucas informações quanto à capacidade de sua germinação. As Regras
para Análise de Sementes – (Brasil, 1992) não contemplam informações dessa
cultura para testes de germinação. Os poucos trabalhos existentes são testes
adaptados de outras apiáceas. Para essas espécies, temperaturas entre 20 e 25ºC
tem sido as mais indicadas para a sua germinação (SEDIYAMA, 1988; MENÊZES e
SANTOS, 1994).
48
Marcadores Moleculares
Existe diferentes cultivares de mandioquinha-salsa sendo plantadas na região
produtora do Espírito Santo e, no entanto, pouco se conhece a respeito da
variabilidade genética desses materiais. Por ser uma planta de propagação
vegetativa, a expectativa é que exista pouca ou nenhuma variabilidade dentro de
uma mesma cultivar e que, entre essas cultivares, possa existir variabilidade.
Os marcadores moleculares podem ser utilizados para estudos de variabilidade
genética. Os principais tipos de marcadores podem ser classificados em dois
grupos, conforme a metodologia utilizada para identificá-los: hibridização ou
amplificação de DNA. Dentre os identificados por hibridização estão os marcadores
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e minissatélites ou locos VNTR
(Variable Number of Tandem Repeats). Já aqueles revelados por amplificação
incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA);
Microssatélite e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (BORBA, 2009).
As utilizações dos marcadores moleculares, visando à comparação entre genótipos
de interesse, permitem obter informações relacionadas à variabilidade genética e a
identificação de genótipos. Blas e outros (2008) utilizaram a caracterização com
marcador AFLP em espécies do gênero Arracacia no Peru com o objetivo de
selecionar características úteis para a identificação das espécies e estudar a
diversidade intra e interespecíficas entre as espécies de Arracacia. Os resultados
apontaram grande diversidade entre espécies e dentro das populações.
O objetivo do trabalho descrito neste capítulo foi obter plântulas a partir de sementes
de mandioquinha-salsa germinadas in vitro e comparar as cultivares utilizando
marcadores moleculares.
49
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
A etapa do cultivo in vitro foi conduzida no Laboratório de Biotecnologia Vegetal do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCA-UFES),
localizado no município de Alegre, Sul do estado do Espírito Santo; a etapa de
caracterização molecular com marcadores AFLP foi realizada no Laboratório de
Biologia Celular e Molecular de Plantas, do Departamento de Genética, da Escola
Superior de Agronomia Luiz de Queiroz da Universidade de São Paulo (ESALQ/USP).
Etapa do cultivo in vitro
Para a realização deste trabalho, foi necessário propor um procedimento para
desinfestação de material obtido a partir do campo e o estudo da germinação e do
desenvolvimento de plântulas. Foram realizados quatro experimentos no período de
outubro de 2007 a agosto de 2008: I) teste de germinação utilizando frutos em estádios
diferentes de maturação; II) testes para a desinfestação de frutos; III) testes para
desinfestação de sementes; e IV) teste da influência do ácido giberélico (GA
3
) na
germinação de sementes.
Foram utilizados frutos de mandioquinha-salsa da cultivar Branca, coletados nas
regiões produtoras do estado em duas épocas, devido a disponibilidade:
- em outubro de 2007, os frutos foram inicialmente classificados conforme o grau de
maturação, ou seja, em verdes, maduros e secos;
- em maio de 2008, os frutos foram coletados quando ainda estavam maduros. Esses
foram secos à sombra e armazenados em geladeira.
Os meios de cultura continham 3% de sacarose, 100 mg L
-1
de mio-inositol e pH
ajustado em 5,7 ± 0,1 antes da adição do solidificante Ágar da marca Vetec (7,0 g/L)
em todos os experimentos realizados. Foram usados 30 mL de meio de cultura por
50
frasco e 10 mL por tubo de ensaio. A esterilização dos meios de cultura foi feita por
autoclavagem, a uma temperatura de 121 ºC e pressão de 1,05 kg cm
-2
, durante 20
minutos. As condições da sala de crescimento foram ajustadas para temperatura de 25
± 2 ºC e sob intensidade luminosa de 50 µmol m
-2
s
-1
(lâmpadas do tipo luz do dia) com
fotoperíodo de 16 horas. Os dados obtidos foram plotados em gráficos utilizando o
programa Statistica 6.0 (STATSOFT INC, 1995).
Etapa da caracterização molecular
As amostras de folhas de mandioquinha-salsa foram coletadas na região serrana do
Espírito Santo (municípios de Muniz Freire, Domingos Martins e Castelo) em maio
de 2008. Foram coletadas plantas das cultivares Amarela de Senador Amaral,
Amarelo de Carandaí, Branca e um material denominado popularmente, no meio
rural, de “Roxa”. Vale relatar que esses materiais foram coletados em localidades
produtoras distintas. Durante as coletas, as plantas foram devidamente
acondicionadas, identificadas e, em seguida, transportadas para o Laboratório de
Biotecnologia Vegetal do CCA-UFES no município de Alegre, ES, em caixa de isopor
contendo gelo. No laboratório, após uma rápida assepsia com água destilada e
papel toalha, as folhas foram embrulhadas em folhas de papel alumínio e liofilizadas
em nitrogênio líquido sendo, em seguida, transferidas para um freezer a 20 ºC
negativos.
Para transportar ao Laboratório de Biologia Celular e Molecular de Plantas, do
Departamento de Genética, da Escola Superior de Agronomia Luiz de Queiroz, da
Universidade de São Paulo (ESALQ/USP), o material foi acondicionado em uma caixa
de isopor, entre camadas de gelo seco, para evitar a degradação do DNA.
51
4.2.1 Primeiro experimento: teste de germinação in vitro utilizando frutos em
estádios diferentes de maturação
Este experimento foi realizado visando estudar o efeito do estádio de maturação dos
frutos de mandioquinha-salsa na germinação das sementes. Vale salientar que, de
acordo com Sediyama e outros (1991a), não existe definição de um ponto de
maturação fisiológica e época de colheita ideal para sementes dessa cultura.
Os frutos verdes, maduros e secos foram lavados em água corrente e submetidos ao
tratamento de desinfestação em álcool 70% por 1 minuto, sob agitação. Em seguida,
foram imersas em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% por 5 minutos. As sementes
foram lavadas por 3 vezes em água destilada e transferidas para câmara de fluxo
laminar onde foram enxaguadas por mais 3 vezes em água destilada estéril.
O experimento foi conduzido sob esquema fatorial 3 X 4 (3 estádios de maturação da
semente e 4 meios de cultura (B
5
meio descrito por Gamborg e outros em 1968, MS
descrito por Murashige e Skoog em 1962 e B
5
com metade da concentração de sais e
MS com metade da concentração de sais) conforme observado na Tabela I.1, com 3
repetições, contendo 4 sementes cada frasco, num Delineamento Inteiramente
Casualizado (DIC).
Tabela I.1 - Combinação dos fatores dos tratamentos do experimento de germinação
dos frutos de mandioquinha-salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Estádio de maturação dos frutos Maturação
Meios
Verde Maduro Seco
MS A B C
MS/2 D E F
B
5
G H I
B
5
/2 J L M
Após o processo de desinfestação, as sementes foram então inoculadas em frascos
contendo os meios de cultura (MS, MS/2, B5 e B5/2).
Os resultados deste experimento demonstraram que a contaminação independe do
estado de maturação da semente. Três dias após a inoculação no meio de cultura,
55% dos frascos apresentavam contaminação fúngica do gênero Fusarium, sendo
52
que após cinco dias, aproximadamente 83% dos frascos estavam contaminados.
Esse problema de contaminações não foi novidade na literatura, pois Sediyama
(1988) também encontrou grande contaminação, principalmente por fungos do
gênero Alternaria.
Devido à contaminação de aproximadamente 94% do experimento, não foi possível
avaliar o percentual de germinação em diferentes estádios fisiológicos, o que
também impossibilitou a avaliação do efeito dos diferentes meios de cultura na
emergência de plântulas e a interação entre esses dois fatores.
4.2.2 Segundo experimento: teste de desinfestação de frutos
Este experimento foi realizado com o objetivo de obter um procedimento eficiente de
desinfestação dos frutos de mandioquinha-salsa, visando à obtenção de plântulas
sadias.
Os frutos secos foram lavados em água corrente e submetidos ao tratamento de
desinfestação de acordo com a Tabela I.2. O experimento foi realizado em DIC, com 5
tratamentos, 4 repetições e 4 sementes por frasco.
Tabela I.2 – Tratamentos de desinfestação dos frutos maduros. CCA-UFES, Alegre,
ES, 2008
Procedimentos
Tratamento
1
Tratamento
2
Tratamento
3
Tratamento
4
Tratamento
5
Imersão em
solução de
Hipoclorito
1% por 10
min
2,5% por 5
min
2,5% por 10
min
2,5% por 10
min
2,5% por 10
min
Enxágue por 3 X em água destilada e introdução em câmara de fluxo laminar
Imersão em
solução de
Hipoclorito
- - -
1% por 5
min
2,5% por 5
min
Enxágue por 3 X em água destilada estéril e inoculadas em meio de cultura
Os resultados indicaram que os tratamentos não proporcionaram a desinfestação
dos frutos. Após cinco dias, os frascos apresentavam, em média, 60% de
53
contaminação para todos os tratamentos. Aos sete dias após a inoculação em meio
de cultura, todos os frascos estavam contaminados. Foram encontradas bactérias de
coloração amarelo e creme e fungos do gênero Fusarium.
Uma explicação para esse fato é a possibilidade de que os agentes contaminantes
já estejam presentes nos tecidos que envolvem a semente. Dessa forma, procurou-
se realizar novos trabalhos de desinfestação na ausência do tecido envoltório.
4.2.3 Terceiro experimento: testes visando a desinfestação das sementes
Este experimento foi realizado a fim de obter um procedimento eficiente de
desinfestação das sementes de mandioquinha-salsa, visando à obtenção de
plântulas sadias.
Os frutos foram lavados em água corrente e imersos sob agitação por 10 minutos
em hipoclorito de sódio a 2,5%. Em seguida, foram embebidos em água por duas
horas para facilitar a retirada dos tecidos que recobrem a semente.
Após a retirada desses tecidos, procederam-se os tratamentos de desinfestação,
conforme Tabela I.3.
Tabela I.3 – Tratamentos de desinfestação das sementes. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Procedimentos Tratamento 1
Tratamento 2
Tratamento 3
Tratamento 4
Tratamento 5
Imersão em
solução de álcool
92,8%
- 1 min 1 min 1 min 1 min
Imersão em
solução de
Hipoclorito 2,5 %
- 5 min 10 min 10 min 10 min
Enxágue por 3 X em água destilada e introdução em câmara de fluxo laminar
Imersão em
solução de
Hipoclorito 2,5%
- - - - 5 min
Imersão em
solução de Sulfato
de Gentamicina a
20 mg L
-1
- - - 3 min 3 min
Enxágue por 3 X em água destilada estéril e inoculadas em meio de cultura
54
O experimento foi conduzido sob DIC com 5 tratamentos, 5 repetições e 5 tubos por
parcela.
4.2.4 Quarto experimento: uso de Ácido giberélico na germinação de sementes
Como a mandioquinha-salsa apresenta problemas germinativos devido ao seu embrião
imaturo, devem-se tomar certas medidas para aumentar a taxa de germinação. De
acordo com Ferreira e Borghetti (2004), a embebição promove o aumento no conteúdo
de água da semente devido à iniciação do crescimento do embrião. Portanto, a
embebição potencializa a atividade de germinação.
Este experimento foi realizado a fim estudar o efeito da indução de ácido giberélico
na indução da germinação de sementes de mandioquinha-salsa, visando à obtenção
de plântulas.
Os frutos foram inicialmente lavados em água corrente e, posteriormente, imersos sob
agitação em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% por dez minutos. Em seguida,
foram submetidas a um processo de embebição por 2 horas a fim de facilitar a retirada
dos tecidos que envolvem a semente. As sementes foram divididas em dois grupos:
Grupo I) imerso em água destilada por uma hora; e Grupo II) imerso em solução de
GA
3
a 1mg L
-1
por uma hora.
As sementes foram, então, introduzidas em câmara de fluxo laminar onde foram
tratadas com hipoclorito de sódio a 2,5% por 5 min, enxágue em água destilada e
autoclavada e imersas em solução de sulfato de gentamicina a 20 mg L
-1
por 3 minutos
sob agitação.
O experimento foi realizado em um esquema fatorial 2 X 5 (2 embebições e 5 doses de
GA
3
no meio - antes da solidificação foi acrescentado ao meio de cultura 0,00; 0,25;
0,50; 0,75 e 1,00 mg L
-1
de GA
3
devidamente esterilizada em membrana de milipore de
0,22
µm), conforme Tabela I.4, com 3 repetições e 3 tubos por repetição, num
Delineamento Inteiramente Casualizado.
55
Tabela I.4 - Combinação dos fatores dos tratamentos de indução de germinação de
sementes de mandioquinha-salsa na presença de GA
3
. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Embebição Dose de GA
3
no meio
mg L
-1
Grupo I – H
2
O Grupo II - 1mg L
-1
de GA
3
0,00 A B
0,25 C D
0,50 E F
0,75 G H
1,00 I J
4.2.5 Quinto experimento: caracterização com marcadores moleculares
4.2.5.1 Extração do DNA genômico
A extração do DNA genômico das folhas de mandioquinha-salsa foi utilizado o
método do CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio), conforme proposto por Doyle e
Doyle (1990) e adaptado e padronizado pelo CIP (1998).
Aproximadamente 300 mg de folhas foram maceradas em almofariz utilizando-se
nitrogênio líquido. Em seguida, o pó foi transferido para um tubo Eppendorf de 2 mL
e adicionado solução extratora CTAB pré-aquecida a 65 ºC. O material foi incubado
a 65 ºC por 30 minutos e agitado suavemente a cada 10 minutos. Em seguida foi
acrescentado 500 µL de solução de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). Após
homogeneização da mistura, os tubos foram centrifugados a 13000 rpm por 15
minutos, o sobrenadante foi coletado e transferido para novos tubos de 2 mL. Em
seguida, foi adicionado 1 µL de RNAse (10 µg/mL) homogeneizado e deixado
descansar por 2 horas a temperatura ambiente.
Após esse período, foram adicionados 350 µL de isopropanol gelado e mantido a -20
ºC por 20 minutos. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 10000 rpm por 15
minutos. Descartado o sobrenadante, os tubos foram colocados para secar. O
precipitado foi, então, lavado em 1mL de etanol 70% e centrifugado por 5 minutos a
10000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o tubo colocado para secar. O DNA foi
56
ressuspenso com 300 µL de TE (Tris-EDTA), permanecendo a 4 ºC por 2 horas. Em
seguida foram adicionados 300 µL de fenol: clorofórmio: álcool isomílico na
proporção de 25:24:1 e, então, homogeneizado e centrifugado a 13000 rpm por 10
minutos. O sobrenadante foi recuperado e adicionado 300 µL de clorofórmio: octanol
(24:1) e homogeneizado. Foi realizada uma nova centrifugação e recuperado o
sobrenadante.
O DNA foi novamente precipitado em solução de acetato de amônio 7,5 M gelado
(50 µL /100 µL de solução a ser precipitada) e etanol absoluto (3750 µL /100 µL de
solução a ser precipitada). Depois de homogeneizado, o DNA precipitado foi
recuperado através de centrifugação a 10000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante
foi descartado e o DNA foi lavado em álcool 70%. Os tubos foram novamente
centrifugados a 10000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e os tubos
foram mantidos voltados para baixo até que o pellet estivesse bem seco.
O DNA purificado foi ressuspenso em 200 µL de TE (10:1) e armazenado a 0 ºC.
4.2.5.2 Quantificação do DNA genômico
Uma corrida das alíquotas em gel de agarose a 1% (p/v) acrescidos de corante
Syber Green foi realizada para a verificação da integridade e quantificação do DNA.
Para cada amostra de DNA foram aplicados 5 e 10 µL acrescidos de 35 µL de Azul
de Bromofenol e, para a comparação, foram utilizadas quantidades pré-
estabelecidas de DNA (50, 100, 150, 200 e 250 ng de fago λ).
A concentração de DNA foi estimada a partir da comparação visual da intensidade
de fluorescência das bandas, reveladas pela exposição à radiação UV.
A partir da quantificação foi realizada a diluição das amostras para uma
concentração de DNA de 20 ng/µL.
57
4.2.5.3 Técnica de AFLP
Para a utilização do marcador AFLP foram realizadas as seguintes etapas:
Digestão do DNA: para cada reação foram utilizadas 200 ng de DNA genômico; 2
µL de tampão (OPA; Amersham); 0,2 µL de solução de BSA; 0,5 µL de enzima Eco
RI (corte raro); e 0,6 µL de enzima Mse I (corte frequente). O volume foi completado
para 20 µL com água Milli-Q autoclava. As reações de restrição foram realizadas a
37 ºC por 4 horas e a inativação das enzimas foi realizada a 70 ºC por 10 minutos.
Ligação dos adaptadores: para cada ligação dos fragmentos de DNA com os pares
de adaptadores foi preparado um mix contendo 2,0 µL de tampão T4 DNA ligase
(Invitrogen); 1,0 µL de adaptador Eco RI {contendo 3,4 µL de Eco RI –oligo 1(5’ CTC
GTA GAC TGC GTA CC3’) + 3,0 µL de Eco RI –oligo 2 (5’AAT TGG TAC GCA GTC
TAC3’) + 6,0 µL de tampão (OPA/Amersham) e 107,6 µL de água Milli-Q
autoclavada}; 1,0 µL de adaptador Mse I {contendo 32,0 µL de Mse I –oligo 1(5’ GAC
GAT GAG TCC TGA G3’) + 28,0 µL de Mse I –oligo 2 (5’TAC TCA GGA CTC AT3’)
+ 7,0 µL de tampão (OPA/Amersham) e 53 µL de água Milli-Q autoclavada}; 0,17 µL
de T4 DNA ligase; e 15,83 µL de água Milli-Q autoclavada. Esse mix foi
acrescentado à reação de digestão e incubado a 16 ºC por 3 horas, realizando
agitações a cada intervalo de uma hora. A enzima foi inativada por 20 minutos a 65
ºC e, as amostras foram armazenadas a -20 ºC.
Pré-amplificação: a reação de pré-amplificação do DNA foi realizada utilizando
iniciadores de Eco RI e Mse I com extensão de um nucleotídeo seletivo na
extremidade 3’. Para cada reação foi utilizado 3,0 µL de tampão; 0,9 µL de MgCl
2
;
1,2 µL de dNTP; 0,375 µL de Primer E+A; 0,375 µL de Primer M+C; 0,4 µL de Taq
DNA polimerase; e 5,75 µL de água Milli-Q e 3,0 µL de DNA ligado aos
adaptadores.
58
A pré-amplificação foi realizada de acordo com a Tabela I.5.
Tabela I.5 - Programação do termociclador para realização da pré-amplificação
Temperatura Tempo
94 ºC 2 min
94 ºC 1 min
56 ºC 1 min
72 ºC 1 min
72 ºC 5 min
Amplificação Seletiva: a amplificação seletiva foi realizada utilizando a combinação
de Primers Eco RI e Mse I, sendo que estes apresentavam três bases adicionais ao
adaptador na extremidade 3’ ( E-ACC / M-CTC; E-ACT / MCTC e E-AAA / M-CTC).
Para cada reação foi utilizado 3,0 µL de tampão; 0,9 µL de Mg Cl
2
; 1,2 µL de dNTP;
0,300 µL de Primer E+NNN; 0,375 µL de Primer M+NNN; 0,2 µL de Taq DNA
polimerase; e 4,025 µL de água Milli-Q e 5,0 µL de DNA pré-amplificado diluído 10
X.
A amplificação seletiva foi realizada de acordo com a Tabela I.6.
Tabela I.6 - Programação do termociclador para realização da amplificação seletiva
Temperatura Tempo
94 ºC 2 min
94 ºC 30 min
65 ºC 30 min
72 ºC 1 min
94 ºC 30 min
56 ºC 30 min
72 ºC 1 min
72 ºC 3 min
Após a amplificação seletiva, a reação foi mantida sob 4 ºC para posterior realização
da corrida em eletroforese.
26X
12X
23X
59
4.2.5.4 Preparo do gel e corrida das amostras
Para o preparo do gel de sequenciamento foi utilizado 120 mL de solução matriz,
120 µL de TEMED (Invitrogen) e 800 µL de persulfato de amônio (Sigma) 10%. O gel
foi cuidadosamente introduzido entre as placas de vidro da cuba, previamente limpa
e montada. A cuba foi mantida na posição horizontal por 3 horas para que o gel
pudesse polimerizar.
Para o preparo da corrida das amostras, na parte superior da cuba vertical foi
utilizado 1L de TEB 1X pré-aquecido e na parte inferior TEB 1X mais acetato de
sódio 0,5 M. A cuba foi ligada à fonte em uma potência constante de 75 W, por 1
hora para a pré-corrida e, após uma hora, com o auxilio de uma seringa, foi feita a
limpeza das canaletas para evitar a presença de bolhas. O pente, tipo tubarão, foi
colocado de forma que apenas as suas pontas penetrassem no gel.
Para a corrida, foram aplicados 20 µL do produto final da reação de amplificação
adicionados a 10 µL de tampão desnaturante. Depois de misturadas, as amostras de
DNA amplificadas foram desnaturadas a 95 ºC por 5 minutos e mantidas em gelo
durante a aplicação. Foram aplicados 5 µL de cada amostra no gel.
A corrida foi realizada a uma potência constante de 75 W por 3,5 horas. Após a
corrida, a coloração do gel foi realizada de acordo com o protocolo proposto por
Creste et al., (2001). Seguindo a secagem do gel, foi realizada a leitura das bandas
presentes. O peso molecular dos locos foi determinado por regra de 3 com base nas
distâncias de migração dos fragmentos de DNA de um padrão de peso molecular de
50 pb (Ladder 50). Os dados foram analisados através da técnica UPGMA, com o
auxílio do programa GENES (CRUZ, 2008)
60
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 Desinfestação das sementes
A desinfestação dos frutos de mandioquinha-salsa, independente do estádio de
maturação, não foi satisfatória em função do alto percentual de contaminação
apresentado. Na busca por uma técnica que proporcionasse a descontaminação,
sementes que ficaram imersas em solução de antibiótico por tempo superior a duas
horas facilitaram a retirada dos tecidos envoltórios da semente. Dessa forma, a
retirada desses tecidos, associada aos tratamentos de descontaminação
proporciona a obtenção de materiais sem contaminação conforme pode ser
observado nos Gráficos I.1 e I.2.
Com base nos resultados apresentados no Gráfico I.1 para a contaminação por
bactérias, verifica-se que todos os tratamentos não apresentam diferenças para as
avaliações realizadas. Entretanto, ao se avaliar a contaminação por fungos, os
efeitos dos tratamentos 1, 2 e 3 apresentam elevadas taxas de contaminação, além
dos desvios-padrão também serem altos. Portanto, recomenda-se a utilização dos
tratamentos 4 e 5, em função da menor taxa de contaminação por fungos (Gráfico
I.2).
61
Gráfico I.1 – Porcentagem de contaminação por bactérias em sementes de mandioquinha-salsa em 3
avaliações, em função do tratamento de descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
(A – 1ª avaliação aos 3 dias, B – 2ª avaliação aos 5 dias e C – 3ª avaliação aos 10 dias).
Os gráficos foram plotados com base nas médias, sendo os erros apresentados com intervalo de
confiança de 95 %.
T1 - Tratamento 1, T2 - Tratamento 2, T3 - Tratamento3, T4 - Tratamento 4 e T5 - Tratamento 5.
A
B
C
62
Gráfico I.2 – Porcentagem de contaminação por fungos em sementes de mandioquinha-salsa em 3
avaliações, em função do tratamento de descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
(A – 1ª avaliação aos 3 dias, B – 2ª avaliação aos 5 dias e C – 3ª avaliação aos 10 dias).
Os gráficos foram plotados com base nas médias, sendo os erros apresentados com intervalo de
confiança de 95 %.
T1 - Tratamento 1, T2 - Tratamento 2, T3 - Tratamento3, T4 - Tratamento 4 e T5 - Tratamento 5.
C
B
A
63
4.3.3 Uso de GA
3
na germinação de sementes
Os resultados demonstram que em 32% das sementes ocorreram a protusão da
radícula, sendo que em 57,2 % ± 7,2 ocorreram em de sementes embebidas em GA
3
e 42,8% ± 7,2 embebidas em H
2
O (Gráfico I.3).
68%
32%
Sem protusão da radícula Com protusão da radícula
Imersas em GA3 Imersas em água
57,2%
42,8%
Gráfico I.3 – Efeito dos tratamentos de embebição sobre a porcentagem de protusão de radícula nas
sementes e a porcentagem de protusão radicular em função do tratamento de imersão. CCA-UFES,
Alegre, ES, 2008.
Das sementes que apresentaram protusão da radícula, foram obtidas duas
plântulas. Neste ponto, vale relatar que essa baixa porcentagem de germinação
também foi observada por Sediyama e outros (1991).
Uma explicação para a baixa porcentagem de germinação pode ser o fato de as
sementes serem originadas de plantio comercial/clonal, o que, segundo Bustamante
e outros (1997), caracteriza-se como resultado de auto-fecundação. Knudsen;
Orting; Sonrensen (2006) verificaram que em Arracacia xanthorrhiza silvestre, o
menor percentual de germinação se deu em sementes obtidas por autofecundação.
Portanto, o resultado é um baixo percentual de germinação, caracterizando-se ainda
64
como uma germinação lenta e desuniforme (SEDIYAMA e CASALI, 1997). Na Figura
I.1, visualiza-se uma germinação desuniforme.
Contudo, a intensa formação de calo sobre a estrutura das sementes pode ter
colaborado para que as sementes em que houve protusão da radícula não
formassem plântulas, pois o desenvolvimento de calo impedia o desenvolvimento da
parte aérea.
Figura I. 1 – Sementes de mandioquinha-salsa apresentando diferentes padrões de germinação. (A)
Embrião rompendo o tegumento da semente e se desenvolvendo sem estar ligado aos cotilédones;
(B) Embrião saindo da semente sem romper o tegumento e se desenvolvendo sem estar ligado aos
cotilédones; e (C) Germinação epígea característica. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
4.3.4 Marcadores Moleculares
Para as combinações de primers utilizadas neste trabalho, verifica-se que há
diferença entre o grupo de raízes amarelas e o grupo de raízes brancas.
De acordo com o dendrograma apresentado na Figura I.2 as cultivares de
mandioquinha-salsa apresentam diferenças entre os grupos de raiz amarela e
branca. Considerando o grupo de raízes brancas (subgrupo A:7 brancas e subgrupo
B:2 “roxas”) há apenas diferenças entre os subgrupos A e B. No entanto, dentro do
subgrupo A (Branca 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7) não há diferenças, confirmando a hipótese
da uniformidade clonal dentro desta cultivar.
A
B
C
65
Dentre as cultivares amarelas não foi possível distinguir as cultivares Amarela de
Carandaí e Amarela de Senador Amaral por não apresentarem diferenças
considerando as combinações de primers utilizadas. Esses dados levam a pressupor
que a cultivar Amarela de Senador Amaral obtida por seleção de plantas originadas
de sementes botânicas de plantios clonais de Amarelas de Carandaí possam ser
produtos de autofecundação, conforme descrito por Bustamante e outros (1997).
Figura I.2 - Dendrograma obtido pelo método UPGMA a partir das medidas de similaridade
genética entre 19 acessos de mandioquinha-salsa caracterizadas por marcadores AFLP. CCA-
UFES, Alegre, ES, 2008
Neste ponto, nota-se o fato dessa cultura se tratar de um cultivo restrito a poucas
cultivares com características semelhantes e grande uniformidade genética. Dessa
forma de acordo com Santos (1997), existe um maior risco de que ocorra ataque de
pragas ou doenças. Portanto, esse fato pode levar os produtores a terem maiores
risco de perda da lavoura, aumento das despesas, e o risco de intoxicação ao
aplicar agroquímicos.
66
4.4 CONCLUSÕES
Para as condições em que os experimentos foram conduzidos, os resultados nos
permitem concluir que:
• os agentes contaminantes dos frutos de mandioquinha-salsa possivelmente
estão associados aos tecidos que envolvem a semente. A retirada desses
tecidos envoltórios, associada a um tratamento eficiente de desinfestação
promovem a descontaminação satisfatória das sementes;
• a embebição das sementes de mandioquinha-salsa em solução de giberelina
promove maior protusão da radícula quando comparadas a sementes
embebidas em água;
• a adição de GA3 ao meio não interfere na germinação das sementes de
mandioquinha-salsa;
• as combinações de primers utilizados permitem a diferenciação entre os
materiais, proporcionando o agrupamento de raízes de cor semelhante;
• com base nas combinações de primers utilizadas, com a técnica de AFLP,
não é possível diferenciar as cultivares de raízes amarelas.
67
4.5 REFERÊNCIAS
BLAS, R., GHISLAIN,M., HERRERA, M. del R., BAUDOIN, J.P., Genetic diversity
analysis of wild Arracacia species according to morphological and molecular
markers. Genet Resour Crop Evol, v. 55, p.625–642, 2008
BORBA, V. S. Marcadores moleculares classificação e aplicações. Disponivel
em: <http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL005.htm>. Acesso em: 30 jan.
2009.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para Análise de
Sementes. Brasília: SNDA / DNDV / CLAV, 1992. 365p.
BUSTAMANTE, P. G.; CASALI, V.W.D.; SEDIYAMA, M.A.N. Melhoramento genético
da mandioquinha-salsa. Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v.19, n. 190, p.16-
18. 1997.
CARDOSO, V. J. M. Dormência: estabelecimento do processo. In: FERREIRA, A. G.;
BORGHETTI, F. (Orgs) Germinação: do básico ao aplicado. Porto Alegre: Artmed,
2004. p.109-146.
CASTRO, R. D.; BRADFORD, K. J.; HILHORST, H. W. M. Desenvolvimento de
sementes e conteúdo de água. In: FERREIRA, A. G. e BORGHETTI, F. (Orgs)
Germinação: do básico ao aplicado. Porto Alegre: Artmed, 2004. p.51-68.
CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) Molecular biology laboratory
protocols: plant genotyping. In: HERRERA M.R.; ZHANG, D.; GHISLAIN, M. (eds)
Genetic Resources Department: training manual, Lima, 40 p. 1998.
CORDER, M. P. M.; & BORGES JUNIOR, N. Desinfestação e quebra de dormência
de sementes de Acacia mearnsii de Will. Ciência Florestal, v. 9, n. 2, p. 1-7, 1999.
CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of single sequence
repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver
staining. Plant Molecular Biology Reporter. v. 19, p. 299-306, 2001.
CRUZ, C. D. Programa Genes - Diversidade Genética. 1. ed. Viçosa, MG: Editora
UFV, 2008. v. 1. 278 p.
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus v.12,
p.13–15,1990.
FERREIRA, A.G.; BORGHETTI, F. Germinação: do básico ao aplicado. Porto
Alegre: Artmed, 2004. 323p.
GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K. Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, n.50, p.151-158, 1968.
68
HU, C. Y.; FERREIRA, A. G. 1998. Cultura de embriões. In: TORRES, A. C.;
CALDAS, L. S. (Eds.) Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas.
Brasília: Embrapa/CNPH. p.371-393.
KNUDSEN, S. R.; ORTING, B.; SORENSEN, M. Multiplicación y conservación de
arracacha (Arracacia xanthorrhiza Bancroft) y ajipa (Pachyrhyzus ahipa (Wedd.)
Parodi). Botânica Econômica de los Andes Centrales. La Paz, Universidad de
San Andrés, 2006. p.483-508.
LABOURIAU, L.G. A germinação das sementes. Washington, D.C.: Secretaria
Geral da OEA, 1983. 174p.
MENEZES, J.E.:M.; SANTOS, F.F. Efeito da temperatura na germinação de
sementes de mandioquinha salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft). In: Symposium
of the international society for tropical root crops 10., 1994, Salvador, BA.
Abstracts… Salvador. ISTRC, 1994. p.26.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. v. 15, p. 473-497, 1962.
PEREZ, S. C. J. G. de A. Envoltórios. 2004 In: FERREIRA, A. G. e BORGHETTI, F.
(Orgs) Germinação: do básico ao aplicado. Porto Alegre: Artmed, 2004. p. 125-134.
SANTOS, F. F. Clima, cultivares e épocas de plantio da mandioquinha-salsa.
Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v.19, n. 190, p.35-37. 1997.
SEDIYAMA, M. A. N. Métodos de propagação da batata-baroa (Arracacia
xanthorrhiza Bancroft). Viçosa: UFV, 1988. 114p. Tese Doutorado.
SEDIYAMA, M. A. N.; CASALI, V. W. D. Propagação da mandioquinha-salsa por
sementes. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 19, n. 190, p. 21 - 24 1997.
SEDIYAMA, M. A. N.; CASALI, V. W.; SILVA, E. A. M. da; CARDOSO, A. A.;SILVA,
R. F. Influencia da época de colheita e estádio de maturaçãona germinação de
semente de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft). Revista
Brasileira de Sementes , Pelotas, v. 13, n. 2, p. 69 - 71. 1991a.
SEDIYAMA, M. A. N.; CASALI, V. W.; SILVA, E. A. M. da; CARDOSO, A. A.;SILVA,
R. F. Influencia da origem e do tamanho da semente de mandioquinha-salsa
(Arracacia xanthorrhiza Bancroft). Revista Brasileira de Sementes, Pelotas, v. 13,
n. 2, p. 127-129. 1991b.
STATSOFT INC. Statistica for windows, (Computer program manual) release 6.0,
copyright 1995.
69
5. CAPÍTULO II – ORGANOGÊNESE DE MANDIOQUINHA-SALSA (Arracacia
xanthorrhiza BANCROFT)
RESUMO
A organogênese por via direta ou indireta é uma técnica que, além de outros usos,
permite também acelerar métodos convencionais de melhoramento de plantas, pois
possibilita a obtenção de grande número de plantas em curto espaço de tempo.
Dentre os objetivos deste capítulo, procurou-se estudar as resposta morfogênica das
diferentes cultivares de mandioquinha-salsa in vitro, tanto via de organogênse direta
quanto pela via de organogênese indireta, além de estudar as respostas das
cultivares de mandioquinha-salsa in vitro. Após obter um protocolo eficiente de
desinfestação dos ápices caulinares e brotações laterais, foi realizado um
experimento para estudar a interferência de ANA e BAP na organogênese direta,
sendo adotado meio MS suplementado com 0,1 mg L
-1
de ANA e 0,2 mg L
-1
de BAP.
No experimento seguinte, utilizando 18 genótipos, envolvendo as três cultivares
comerciais e um não comercial, foi obtido organogênese tanto para a parte aérea
quanto para o sistema radicular, podendo ser observado a tuberização in vitro. Para
os estudos de organogênese indireta, foram utilizados discos radiculares como
explantes. Depois de obtido eficiente protocolo de desinfestação foi realizada a
indução de calo, para as três cultivares, com 10 µM de 2,4 D. Foi constatado que a
partir dos calos é possível induzir o enraizamento em meio contendo doses de 0, 2,
4 e 6 mg L
-1
de citocinina (Cinetina ou BAP).
70
5. CHAPTER II - ORGANOGENESIS OF ARRACACHA (Arracacia xanthorrhiza)
ABSTRACT
Organogenesis by direct or indirect via is a technique that, in addition to other uses,
also accelerates conventional plant breeding, because allows obtaining large number
of plants in a short time. Among the objectives of this chapter, it was sought to study
the morphogenic response of different cultivars of arracacha (Arracacia xanthorrhiza)
in vitro, both via direct and indirect organogenesis, in addition to studying the
responses of cultivars of arracacha (Arracacia xanthorrhiza) in vitro. After obtaining
an efficient protocol for disinfestation of the apical and lateral shoots, an experiment
was conducted to study the interference of NAA and BAP on direct organogenesis,
adopting a medium supplemented with 0.1 mg L-1 NAA and 0.2 mg L-1 BAP. In the
following experiment using 18 genotypes, involving the three cultivars and a non-
commercial, organogenesis was obtained for both the aerial part and for the root
system being observed in vitro tuberization. For studies of indirect organogenesis,
root disks were used as explants. After obtained effective disinfestation protocol was
accomplished callus induction, for the three cultivars, with 10 µM of 2,4 D. It was
noted that from the callus is possible to induce rooting in medium containing doses of
0, 2, 4 and 6 mg L-1 of cytokinin (Kinetin or BAP).
71
5.1 INTRODUÇÃO
A importância da técnica de cultivo in vitro tem sido ressaltada pela possibilidade de
se obter plantas inteiras regeneradas a partir de órgãos, tecidos e células vegetais.
A aplicação de técnicas de cultura de tecidos vegetais, como a micropropagação,
tem como principais vantagens o aumento rápido do número de indivíduos e a
possibilidade de conservação de germoplasmas, garantindo a manutenção da
biodiversidade (ECHEVERRIGARAY et al., 2001).
A técnica de micropropagação é muito utilizada para a multiplicação de plantas livres
de doenças viróticas, podendo ser usada, também, para acelerar métodos
convencionais de propagação vegetativa. Assim, permite não só fornecer mudas
micropropagadas diretamente ao produtor, mas, também, abastecimento de viveiros,
pois, pode ser utilizado para multiplicar plantas ornamentais, lenhosas, fruteiras e
essências florestais, além das espécies herbáceas (GRATTAPAGLIA e MACHADO,
1998).
A organogênese pode ser dividida em duas vias: a via direta e a via indireta. Skoog
e Miller (1957) constataram que a direção da organogênese, ou seja, a indução de
raízes ou brotos é determinada pela relação auxina/citocinina. Estas regulam o
crescimento e a morfogênese (GEORGE e SHERRINGTON, 1984; TAIZ e ZEIGER,
2004).
5.1.1 Organogênese direta
Apesar da organogênese direta ser uma técnica bastante utilizada para culturas de
maior expressão econômica, como a batata-inglesa, o morango, o abacaxi, a
banana entre outras, alguns estudos já foram realizados com a propagação in vitro
da mandioquinha-salsa, visando o aperfeiçoamento da técnica para a sua utilização
em programas de melhoramento, obtenção de novas cultivares e limpeza clonal.
72
Senna Neto (1991), trabalhando com o clone BGH 5746 cv. Amarela de Carandaí,
do Banco de Germoplasma da Universidade Federal de Viçosa, avaliou o binômio
tempo X concentração de hipoclorito de sódio para realizar a desinfestação dos
explantes (ápices caulinares). Também avaliou a resposta morfogênica em
diferentes meios, como o meio B
5
(GAMBORG, 1968), o MS (MURASHIGE e
SKOOG, 1962), Knudson (KNUDSON, 1946) e o White (WHITE, 1943), e também a
concentração de reguladores de crescimento visando induzir a diferenciação dos
explantes.
De acordo com Castilho, citado por Madeira (2004), a utilização do meio MS
adicionado de sacarose 3%, ágar 0,8%, 2 mg L
-1
de sulfato de adenina e 2 ppm de
pantotenato de cálcio e 0,25 ppm de GA
3
+ 0,05 ppm de AIA ou 5 mg L
-1
de BAP
+
0,05 mg L
-1
de AIB ou 0,25 ppm de GA
3
+ 0,05 ppm de AIA+ 0,01 ppm de BAP pode
ser utilizado para proporcionar a introdução ápices caulinares de mandioquinha-
salsa in vitro.
Luz (1993), trabalhando com meristemas da cultivar Amarela de Carandaí em meio
B
5
,
obteve o melhor desenvolvimento de plantas na combinação de 0,1 mg L
-1
de
ANA + 0,2 mg L
-1
de BAP. Para a multiplicação, os melhores resultados encontrados
foram com as doses de 0,1 e 0,2 mg L
-1
de BAP e para o enraizamento os melhores
resultados foram obtidos com 0,1 mg L
-1
de ANA.
Trabalhando com ápices caulinares das cultivares Amarela de Carandaí e Amarela
de Senador Amaral, Madeira e outros (2005) concluíram que os melhores resultados
foram obtidos com concentrações em torno de 0,3 mg L
-1
de BAP e 0,25 mg L
-1
de
GA
3
adicionados ao meio B
5
e que a elevação da concentração de GA
3
promoveu
aumento na altura média e máxima das brotações.
Não foram encontrados trabalhos publicados com cultivo in vitro da mandioquinha-
salsa da cultivar de raiz branca. No entanto, esse clone tem sido cultivado em
algumas regiões visando atender consumidores que preferem raiz com uma
coloração mais clara e com odor característico da espécie menos intenso. Esse
clone apresenta-se com aspecto vegetativo vigoroso no campo, com um porte maior
e raízes mais desenvolvidas, além de apresentar características importantes para
utilização em programa de melhoramento dessa espécie.
73
5.1.2 Organogênese Indireta
A obtenção de uma planta ou um órgão vegetal através da organogênese indireta se
dá a partir de um tecido vegetal utilizado como explante que, ao ser submetido à
ação de um novo balanço hormonal, é induzido a formar um conjunto de células
caracterizadas por um crescimento desordenado e com certo grau de diferenciação,
denominado calo (TORRES e CALDAS, 1990).
A organogênese indireta não é desejável para a propagação clonal devido à
possibilidade de ocorrência de variação somaclonal. No entanto, desperta o
interesse dos melhoristas como uma nova fonte de variabilidade genética,
fornecendo perspectivas de seleção in vitro ou ex vitro de plantas superiores
(TABARES et al., 1991). Segundo Pessoa (1993), as características variantes de
plantas regeneradas são herdáveis e transmitidas aos descendentes com grande
frequência, constituindo-se em fonte de variabilidade de grande importância a ser
introduzida em programa de melhoramento de plantas.
Pessoa (1993), trabalhando com raízes, meristemas, folíolos, inflorescências
imaturas e pecíolos de mandioquinha-salsa da cultivar amarelo de Carandaí, afirma
que os pecíolos são os melhores explantes para a produção de calos em meio
contendo auxina. No entanto, a partir de tecidos do câmbio das raízes tuberosas não
foi possível estabelecer cultivo in vitro devido à alta contaminação bacteriana
endógena.
Os objetivos deste trabalho foram: i) estudar as respostas morfogênicas das
diferentes cultivares de mandioquinha-salsa in vitro, por organogênese indireta
utilizando como explantes discos radiculares e, por organogênse direta, a partir de
ápices caulinares e brotações laterais; e ii) estudar as resposta das cultivares de
mandioquinha-salsa in vitro.
74
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1 Material Vegetal
Este trabalho foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCA-UFES).
Para a obtenção do material vegetal foram realizadas três coletas na região serrana
do Espírito Santo: a primeira, realizada em junho de 2007, nos municípios de Muniz
Freire e Castelo, a segunda em Castelo e Domingos Martins, em novembro de 2007,
e a terceira em Muniz Freire, em maio de 2008. Foram coletadas plantas das
cultivares Amarela de Senador Amaral, Amarelo de Carandaí e Branca. Vale relatar
que os acessos foram coletados em localidades produtoras distintas. Durante as
coletas as plantas foram devidamente acondicionadas e identificadas sendo, em
seguida, transportadas para o laboratório.
5.2.2
Organogênese
direta
Foram realizados três experimentos no período de outubro de 2007 a agosto de 2008:
I) descontaminação de ápices caulinares e brotações laterais das três cultivares
(Branca, Amarela de Carandaí e Amarela de Senador Amaral); II) estudo da interação
das combinações de ANA e BAP X cultivares ; e III) cultivo in vitro de 18 acessos de
mandioquinha-salsa.
Os dados obtidos foram plotados em gráficos utilizando o programa Statistica 6.0
(STATSOFT INC, 1995), e as análises de variância e os testes de média foram
realizados utilizando o programa Genes (CRUZ, 2008).
75
5.2.2.1 Desinfestação de ápices caulinares
Inicialmente foram retirados os excessos de folhas dos rebentos. Estes foram lavados
em água corrente e, em seguida, em água destilada estéril para realizar a pré-
desinfestação. Após essa lavagem, os explantes receberam os tratamentos de
desinfestação, conforme Tabela II.1.
Tabela II.1 - Tratamentos de desinfestação de ápices caulinares de mandioquinha-
salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Procedimentos
Tratamento
1
Tratamento
2
Tratamento
3
Tratamento
4
Imersão em álcool
a 92,8%
0,5 min 0,5 min 0,5 min 0,5 min
Imersão em
Hipoclorito de
Sódio a 2,5% e
Tween 20
10 min 5 min 5 min 10 min
Imersão em
solução de Sulfato
de Gentamicina a
20 mg L
-1
- 3 min - 3 min
Enxágue 3X em água destilada
Transferência para câmara de Fluxo Laminar
Imersão em
álcool 70%
0,5 min 0,5 min 0,5 min 0,5 min
Imersão em
Hipoclorito de
Sódio a 1,5%
5 min - 5 min 5 min
Imersão em
solução de
Sulfato de
Gentamicina a 10
mg L
-1
- 3 min 3 min 3 min
Enxágue 3X em água destilada
Os explantes foram inoculados em meio MS suplementado com 0,1 mg L
-1
de ANA e
0,2 mg L
-1
de BAP, conforme proposto por Luz (1993). As condições do meio de cultura
e da sala de cultivo foram ajustadas conforme item 4.2.
76
5.2.2.2 Combinações de ANA e BAP X Cultivares
Inicialmente foram retiradas as folhas externas das plantas coletadas, lavados em água
corrente e, posteriormente, lavados em água destilada. Os explantes foram submetidos
à seguinte sequência de procedimentos: imersos em solução de hipoclorito de sódio a
2,5% + detergente Tween 20 e mantidos sob agitação por dez minutos, seguido por 3
enxágues e imersão em solução de Cefotaxima 260 mg L
-1
: posteriormente,
enxaguados e transferidos para câmara de fluxo laminar para a desinfestação; e
imersos em solução de álcool 92,8% por 1 minuto sob agitação, transferidos para
solução de hipoclorito de sódio a 1,5% onde permaneceram sob agitação por 10
minutos sendo, então, imersos em solução de Cefotaxima 130 mg L
-1
. A desinfestação
foi finalizada com 3 enxágues em água destilada estéril.
Para a inoculação foi utilizado o meio MS e as combinações de ANA e BAP
constituídas das seguintes concentrações: 0 de ANA e 0 de BAP; 0,6 mg L
-1
de ANA e
0,2 mg L
-1
de BAP; e 0,1 mg L
-1
de ANA e 0,2 mg L
-1
de BAP. As condições do meio de
cultura e da sala de cultivo foram ajustadas conforme item 4.2.
O experimento foi realizado em um esquema fatorial 3 X 3, três cultivares de
mandioquinha-salsa (Branca, Amarela de Senador Amaral (ASA), Amarela de
Carandaí (AC)) e as três combinações de ANA e BAP, com 3 repetições e 5 tubos por
repetição, em Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC).
5.2.2.3 Resposta de ápices caulinares e brotações laterais in vitro
As plantas de todos os acessos coletados foram transportadas para o laboratório
mantendo-se a identificação da planta e do local de coleta.
Os explantes (ápices caulinares) foram retirados, imediatamente lavados em água
corrente e em seguida lavados em água destilada para realizar a pré-desinfestação, de
acordo com a seguinte sequência: os explantes foram imersos em álcool 92,8% por 0,5
77
minutos, imersos então em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% + detergente Tween
20 e mantidos sob agitação por 10 minutos, seguido por 3 enxágues e imersão em
solução de sulfato de gentamicina 20 mg L
-1
por 3 minutos; enxaguados e transferidos
para câmara de fluxo laminar; imersos em solução de álcool 70% por 0,5 minutos sob
agitação; e, em seguida, transferidos para solução de hipoclorito de sódio a 1,5%, onde
permaneceram sob agitação por 5 minutos, sendo a seguir imersos em solução de
sulfato de gentamicina 10 mg L
-1
por 3 minutos. A desinfestação foi finalizada com 3
enxágues em água destilada estéril. Os explantes desinfestados foram inoculados em
tubos de ensaio contendo meio MS. Os tratamentos constituíram-se dos 18 acessos de
quatro cultivares de mandioquinha-salsa (7 Brancas, 5 Amarelas de Senador Amaral e
5 Amarelas de Carandaí, 1 Roxa). O experimento foi realizado num Delineamento
Inteiramente Casualisado com 3 repetições e 3 tubos por repetição.
O meio utilizado foi o MS e a combinação de concentrações de 0,1 mg L
-1
de ANA e
0,2 mg L
-1
de BAP. As condições do meio de cultura e da sala de cultivo foram
ajustadas conforme item 4.2.
5.2.3 Organogênese Indireta
Foram realizados três experimentos no período de junho de 2007 a agosto de 2008: I)
descontaminação de discos radiculares das três cultivares (Branca, Amarela de
Carandaí e Amarela de Senador Amaral); II) indução de calo em discos radiculares dos
17 acessos ; e III) indução da organogênese indireta em calos para as três cultivares.
5.2.3.1 Desinfestação dos discos radiculares
As raízes utilizadas como explantes foram inicialmente lavadas em água corrente e
submetidas aos tratamentos de desinfestação conforme Tabela II.2. Em seguida,
utilizando um furador de rolhas foram retirados roletes de 1,28 cm de diâmetro da
região cambial e floemática dos seguimentos das raízes. Os roletes foram, então,
seccionados em discos de 1 mm. Os discos foram, em seguida, inoculados no meio de
78
cultura MS, acrescido de 10 µM
de 2,4-D (Figura II.1). As condições do meio de
cultura e da sala de cultivo foram ajustadas conforme item 4.2.
O experimento foi realizado em um esquema fatorial 3 X 4 (3 cultivares e 4 tratamentos
de desinfestação) com 3 repetições e 5 tubos por repetição, em um Delineamento
Inteiramente Casualizado.
Tabela II.2 - Tratamentos de desinfestação de raízes de mandioquinha-salsa. CCA
-
UFES, Alegre, ES, 2008
Procedimentos
Tratamento
1
Tratamento
2
Tratamento
3
Tratamento
4
Imersão em álcool a
92,8%
1 min 1 min 1 min 1 min
Flambagem 1,5 min 1,5 min 1,5 min 1,5 min
Segmentação da raiz com ± 11cm
Imersão em Hipoclorito de
Sódio a 2,5% e Tween 20
5 min 5 min 10 min 10 min
Imersão em solução de
Sulfato de Gentamicina a
20 mg L
-1
- - 1 min 5 min
Enxágue 3X em água destilada
Transfência para câmara de Fluxo Laminar
Segmentação da raiz com ± 5cm
Imersão em álcool 70% 0,5 min 0,5 min 0,5 min 0,5 min
Imersão em Hipoclorito de
Sódio a 2,5%
5 min 5 min 5 min 5 min
Imersão em solução de
Sulfato de Gentamicina a
20 mg L
-1
- 3 min 3 min 3 min
Enxágue 3X em água destilada
79
Figura II.1 - Procedimento para a obtenção de discos radiculares de mandioquinha-salsa. (A)
obtenção de roletes a partir de segmentos de raízes, (B) roletes, (C) seccionamento dos roletes
para obtenção dos discos e (D) inoculação dos discos em meio MS. CCA -UFES, Alegre, ES,
2008.
5.2.3.2 Indução de calos
Raízes de mandioquinha-salsa foram submetidas ao tratamento 4 de desinfestação,
apresentado na Tabela II.2. Em seguida, utilizando um furador de rolhas, foram
retirados roletes de 1,28 cm de diâmetro da região cambial e floemática dos
seguimentos das raízes. Os roletes foram então seccionados em discos de 1 mm.
Os discos foram em seguida inoculados no meio de cultura MS acrescido de 10 µM
de
2,4-D. As condições do meio de cultura e da sala de cultivo foram ajustadas conforme
item 4.2.
A
C
B
D
80
O experimento foi realizado sob Delineamento Inteiramente Casualizado com 17
amostras de mandioquinha-salsa, envolvendo três cultivares: Amarela de Carandaí (5),
Amarela de Senador Amaral (5) e Branca (7). O experimento foi realizado com três
repetições com três frascos por repetição e quatro discos por frasco.
5.2.3.3 Indução de organogênese indireta
Os explantes utilizados nestes experimentos foram massas de calos originadas no
experimento de indução de calo. Aproximadamente 400 mg de massa de calo foram
inoculadas em placas de petri contendo meio MS acrescido de doses
de Citocinina
(Cinetina 0, 2, 4 e 6 mg L
-1
ou BAP 0, 2, 4 e 6 mg L
-1
) que constituíram os
tratamentos. As condições do meio de cultura e da sala de cultivo foram ajustadas
conforme item 4.2.
Dois experimentos com diferentes citocininas (Cinetina e BAP) foram realizados num
esquema fatorial 3 X 4 (3 cultivares e 4 doses de Citocinina) com 3 repetições e 3
placas por repetição, em um Delineamento Inteiramente Casualizado.
81
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.3.1
Organogênese
direta
5.3.1.1 Descontaminação de ápices caulinares
Os resultados obtidos nos experimento de descontaminação de ápices caulinares
estão demonstrados nos Gráficos II.1e II.2.
Gráfico II.1 – Comparação da porcentagem de contaminação bacteriana, aos 15 dias após a inoculação,
de ápices caulinares de mandioquinha-salsa, entre as cultivares dentro de cada tratamento. Médias
plotadas com os seus erros em um intervalo de confiança de 95%. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
B – Branca; ASA – Amarela de Senador Amaral; AC – Amarela de Carandaí.
B ASA AC
B ASA AC
Tratamento 1
Tratamento 2
B ASA AC
Tratamento 3
B ASA AC
Tratamento 4
82
Avaliando o Gráficos II.1, pode-se observar que a mandioquinha-salsa da cultivar
Branca apresenta o menor percentual de contaminação para os tratamentos 1 e 2. O
ideal é que o protocolo de descontaminação proporcione condições assépticas para
o desenvolvimento do explante, pois no cultivo in vitro o microclima no interior do
frasco de cultura e no ambiente da sala de cultivo favorece a proliferação dos
microrganismos (disponibilidade de nutrientes, fonte de carbono prontamente
disponível, umidade alta e as condições ideais temperatura e luminosidade).
Avaliando a contaminação fúngica no Gráfico II.2, o resultado dos tratamento não
são conclusivos para os tratamentos analisados dentro de cada cultivar pois, as
médias são muito próximas e os erros observados não permitem identificar o melhor
tratamento.
Gráfico II.2 – Comparação da porcentagem de contaminação fúngica, aos 15 dias após a inoculação, em
ápices caulinares de mandioquinha-salsa, entre as cultivares dentro de cada tratamento. Médias plotadas
com os seus erros em um intervalo de confiança de 95%. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
B – Branca; ASA – Amarela de Senador Amaral; AC – Amarela de Carandaí.
B ASA AC
B ASA AC
Tratamento 1
Tratamento 2
B ASA AC
Tratamento 3
B ASA AC
Tratamento 4
83
Os Tratamentos 1 e 2 proporcionaram melhores efeitos de desinfestação de ápices
caulinares da cultivar Branca. Esse tratamento aliado à pulverização de antibióticos
e fungicidas em plantas cultivadas em ambiente controlado, conforme recomendado
por Luz (1993), podem reduzir o percentual de contaminação.
5.3.1.2 Combinação de ANA e BAP X Cultivares
Com base nas três combinações de ANA e BAP, envolvendo as três cultivares de
mandioquinha-salsa e suas possíveis interações, foram obtidos os resultados
apresentados na Tabela II.3.
Tabela II.3 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca da Parte Aérea
(MFPA), da Massa Seca da Parte Aérea (MSPA), Número Médio de Raízes (NMR),
da Massa Fresca de Raízes (MFR) e da Massa Seca de Raízes (MSR) de plântulas
das cultivares Branca, Amarela de Senador Amaral e Amarela de Carandaí de
mandioquinha-salsa em função da combinação de diferentes concentrações de ANA
e BAP. Alegre, CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
MFPA MSPA NMR MFR MSR
Balanço ANA x BAP 2 12,2812*
0,0037
ns
12,4508*
0,0308
ns
0,0005
ns
Cultivares 2 0,6785
ns
0,0209* 17,3369*
0,1564* 0,0070*
Balanço x Cultivares 4 0,4097
ns
0,0043* 11,0786*
0,0651
ns
0,0018
ns
Resíduo 18 1,7105 0,0001 2,0730 0,0308 0,0001
Total 26
CV(%) 134,26 31,95 51,73 123,00 123,00
* Significativo a 5% de probabilidade,
ns
não signifitativo a 5% de probabilidade.
Dentre as variáveis avaliadas, apenas o MSPA e o NMR apresentam interação
significativa, justificando, portanto, realizar inferências quanto ao efeito de um fator
dentro dos níveis do segundo fator (Tabela II.4).
Os resultados da Tabela II.4 mostram que o maior número de raízes desenvolveu-se
nas cultivares amarelas, na ausência de reguladores de crescimento. Entretanto,
quando o balanço hormonal é alterado há uma redução no número de raízes. Já
para a cultivar Branca o mesmo não acontece.
84
Tabela II.4 - Número Médio de Raízes (NMR) das cultivares Branca, Amarela de
Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-salsa em função da
combinação de diferentes doses de ANA e BAP. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Cultivar
ANA-BAP
mg L
-1
Branca
Amarela de
Senador Amaral
Amarela de
Carandaí
0,0 – 0,0 0,33Ba 7,30Aa 4,75Aa
0,6 – 0,2 1,5Aa 2,83Ab 2,5Aa
0,1 – 0,2 1,83Aa 1,50Ab 2,5Aa
Médias seguidas por letras distintas, minúsculas na vertical e maiúscula na horizontal, diferem entre
si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
Ao se comparar os resultados apresentados pelas variáveis MFPA e MSPA (Tabela
II.5), verifica-se que os mesmos são discrepantes. Não foi encontrado nada que
justificasse tais respostas apenas com a retirada da água dos tecidos. Portanto, não
foram realizadas inferências quanto a essas variáveis por acreditar que seriam
inconsistentes. Nesse sentido, sugere-se realizar novos experimentos envolvendo
um número maior de explantes por parcela.
Conforme mostrado na Tabelas II.5 e II.6 para as variáveis MFR e MSR, verifica-se
que apenas as variedades apresentam resultados significativos estatisticamente.
Tabela II.5 - Massa Fresca de Raízes (MFR) das cultivares Branca, Amarela de
Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-salsa. CCA-UFES,
Alegre, ES, 2008
Cultivars M FR
Branca 0,0348b
Amarela de Senador Amaral 0,2897a
Amarela de Carandaí 0,1037ab
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
Tabela II.6 - Massa Seca de Raízes (MSR) das cultivares Branca, Amarela de
Senador Amaral e Amarela de Carandaí de mandioquinha-salsa. CCA-UFES,
Alegre,ES, 2008
Cultivares MSR
Branca 0,0031b
Amarela de Senador Amaral 0,0198a
Amarela de Carandaí 0,0063b
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
85
Para as demais variáveis avaliadas [Comprimento de Raiz (CR), Comprimento de
Parte Aérea (CPA), Massa Fresca de Calo (MFC) e Massa Seca de Calo (MSC)] não
há diferença estatística para nenhuma fonte de variação.
5.3.1.3 Resposta de ápices caulinares e brotações laterais in vitro
A utilização de ápices caulinares e brotações laterais de mandioquinha-salsa
proporcionam a recuperação de plantas inteiras in vitro, na Figura II.2 pode se
observar a tuberização in vitro ocorrida em todas as cultivares.
Após 20 dias de inoculação, observou-se que em alguns explantes havia a formação
de raízes. A partir dos 30 dias da inoculação houve uma ligeira alteração no formato
de algumas raízes indicando o início da tuberização in vitro. Nas Figuras II.2 C, D, E,
F, G e H, visualiza-se nitidamente a presença de raízes tuberiformes. Entretanto,
pode-se verificar que nem todas as raízes tuberizaram (Figura II.2 E, F e G). De
acordo com a Figura II.2, pode-se verificar que as plantas com maior tuberização,
apresentam menor desenvolvimento de parte aérea.
86
Figura II.2 - Plântulas de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft) obtidas in vitro a partir
de ápices caulinares e brotações laterais cultivados em meio MS suplementado com 3% de sacarose,
100 mg L
-1
de mio-inositol, 0,1 mg L
-1
de ANA e 0,2 mg L
-1
de BAP. (A) Início da emissão de raízes em
ápices caulinares da cultivar Branca aos 20 dias após a inoculação. (B) Início da emissão de raízes
em ápices caulinares da cultivar Amarela de Senador Amaral aos 20 dias após a inoculação. (C)
Tuberização aos 30 dias após a inoculação em plântulas da cultivar Amarela de Senador Amaral. (D)
Tuberização aos 45 dias após a inoculação em plântulas da cultivar Amarela de Senador Amaral. (E)
Tuberização aos 45 dias após a inoculação em plântulas da cultivar Branca. (F) Tuberização aos 45
dias após a inoculação em plântulas da cultivar Amarela de Senador Amaral. (G) Tuberização aos 60
dias após a inoculação em plântulas da cultivar Branca. (H) Tuberização aos 60 dias após a
inoculação em plântulas da cultivar Amarela de Carandaí. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
87
Observa-se, na Tabela II.7, que há diferença significativa a 5% de probabilidade
para o Número Médio de Brotações (NMB) e Comprimento de Parte Aérea (CPA).
De acordo com os dados apresentados para NMB, há diferença apenas entre as
plantas de raiz amarela ASA4 que apresentam média de 4 brotações e as plantas de
raiz branca Branca 4 e 6. As demais não diferem destas nem entre si.
Tabela II.8 - Número Médio de Brotações (NMB) e Comprimento de Parte Aérea
(CPA) em função do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Acesso NMB CPA (cm)
ASA 4 4,0000 a 4,8000 a
ASA 5 3,3333 ab 5,4666 a
ASA 1 3,0000 ab 5,1000 a
Branca 2 2,6666 ab 10,5666 a
Roxa 2,6666 ab 9,7333 a
Branca 3 2,5000 ab 11,0000 a
AC 2 2,5000 ab 6,4000 a
Branca 1 2,3333 ab 9,1666 a
ASA 3 2,3333 ab 5,4666 a
Branca 7 2,0000 ab 10,7000 a
ASA 2 2,0000 ab 6,9000 a
AC 5 2,0000 ab 5,3000 a
AC 4 2,0000 ab 4,8000 a
AC 1 1,7666 ab 5,1333 a
Branca 5 1,6666 ab 9,3666 a
Branca 4 1,3333 b 10,1000 a
Branca 6 1,3333 b 9,1333 a
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
AC – Amarela de Carandaí e ASA – Amarela de Senador Amaral.
Tabela II.7 - Resumo da análise de variância do Número Médio de Brotações (NMB)
e Comprimento de Parte Aérea (CPA) em função do genótipo. CCA-UFES, Alegre,
ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
NMB CPA
Acessos 16 1,3991* 14,3167*
Resíduo 26 0,5869 3,3335
Total 42
CV (%) 32,5199 23,6333
* Significativo a 5% de probabilidade.
88
Considerando a formação de calo na base dos explantes, pode-se observar que há
diferença entre as médias apresentadas pelos tratamentos, a 5% de probabilidade,
para a variável MFC (Tabela II.9). Essa formação de calos na base dos explantes foi
observada por Senna Neto (1990) e Luz (1993). Segundo Madeira (2004), a
formação de calos pode ser reduzida com o aumento da concentração de BAP no
meio e, no entanto, proporcionalmente ocorre a redução do desenvolvimento da
parte aérea.
Para o teste de média do MFC apresentado na Tabela II.10, pode-se notar que há
uma tendência de agrupamento entre as plantas de raízes brancas e plantas de
raízes amarelas. Esse fato pode ser explicado por essas plantas serem clones e
apresentarem respostas semelhantes in vitro.
Tabela II.10 - Massa Fresca de Calo (MFC) em função do genótipo. CCA-UFES,
Alegre, ES, 2008
Acesso MFC (g)
Branca 3 2,2500 a
Branca 1 2,2333 a
Branca 2 1,8666 ab
Branca 4 1,8633 ab
Branca 5 1,6066 ab
ASA 4 1,5400 abcd
Branca 6 1,1500 abcde
ASA 5 1,1200 abcde
ASA 2 0,9750 abcde
Branca 7 0,8850 abcde
ASA 1 0,7656 bcde
ASA 3 0,7233 cde
AC 4 0,4200 de
AC 3 0,3500 de
AC1 0,3466 e
Roxa 0,3233 e
AC 2 0,2750 e
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade. AC – Amarela de Carandaí e ASA – Amarela de Senador Amaral.
Tabela II.9 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca de Calos (MFC) em
função de genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
MFC
Acessos 16 0,1226*
Resíduo 25 0,1292
Total 41
CV (%) 30,8057
* Significativo a 5% de probabilidade.
89
O resumo da análise de variância para a variável MSC está apresentado na Tabela
II.11. Os dados mostram que existem diferenças significativas entre as médias dos
tratamentos a 5% de probabilidade.
As médias entre os resultados dos tratamentos para a variável MSC pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade são comparadas na Tabela II.12. Pelos resultados
apresentados, o material AC2 apresenta-se significativamente diferente dos demais.
Tabela II.12 - Massa Seca de Calos (MSC) em função do genótipo. CCA-
UFES, Alegre, ES, 2008
Acesso M S C (g)
AC 2 0,3300 a
Branca 3 0,1655 ab
Branca 1 0,1603 b
ASA 4 0,1420 b
Branca 2 0,1416 b
Branca 4 0,1400 b
Branca 6 0,1243 b
ASA 2 0,1165 b
Branca 5 0,1133 b
ASA 5 0,1133 b
ASA 3 0,0816 b
ASA1 0,0686 b
Branca 7 0,0605 b
AC 1 0,0310 b
AC 4 0,0310 b
Roxa 0,0306 b
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade. AC – Amarela de Carandaí e ASA – Amarela de Senador Amaral.
Tabela II.11 - Resumo da análise de variância da Massa Seca de Calo (MSC) em
função de genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
MSC
Acessos 15 0,0112*
Resíduo 25 0,0023
Total 40
CV (%) 41,3589
* Significativo a 5% de probabilidade.
90
O resumo da análise de variância em relação ao Número Médio de Raízes (NMR),
apresenta diferença significativa a 5% para médias entre os acessos, está
apresentado na Tabela II.13.
Observando os resultados apresentados na Tabela II.14, o material coletado
designado de “Roxa” apresenta número médio de raízes superior aos demais, não
diferindo estatisticamente a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey apenas dos
materiais AC4, e ASA3 e ASA1.
Tabela II.13 - Resumo da análise do Número Médio de Raízes (NMR) em função de
genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
NMR
Acessos 16 8,5032*
Resíduo 25 2,3237
Total 41
CV (%) 41,7638
* Significativo a 5% de probabilidade.
Tabela II.14 - Número Médio de Raízes (NMR) em função do genótipo. CCA-UFES,
Alegre, ES, 2008
Acessos NMR
Roxa 9,3333 a
AC 4 5,0000 ab
ASA 3 4,6666 ab
ASA1 4,6666 ab
Branca 4 3,6666 b
AC 2 3,5000 b
Branca 1 3,3333 b
Branca 2 3,3333 b
Branca 5 3,3333 b
ASA 4 3,0000 b
ASA 5 3,0000 b
Branca 3 2,5000 b
ASA 2 2,5000 b
Branca 6 2,4333 b
AC 1 2,0000 b
AC 5 2,0000 b
Branca 7 1,0000 b
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade. AC – Amarela de Carandaí e ASA – Amarela de Senador Amaral.
91
Os resumos da análise de variância para CR e MFR estão apresentados na Tabela
II.15, e para as duas variáveis há diferença significativa entre os materiais coletados
(acessos) comparados.
Com base na Tabela II.16, verifica-se que para CR há uma tendência ao
agrupamento pela coloração da raiz e o agrupamento entre acessos de uma mesma
cultivar.
Com exceção do acesso denominado “Roxa”, que apresenta raízes de coloração
branca, todos os outros acessos se agruparam pela coloração da raiz. O acesso
roxa apresenta maior comprimento de raiz e, no entanto, não difere estatisticamente
do Acesso ASA2.
Para o MFR, o Acesso ASA5 difere estatisticamente apenas para o acesso Roxa,
AC4 e Branca 1, para os demais acessos não há diferença significativa entre si.
Tabela II.15 - Resumo da análise de variância do Comprimento de Raiz (CR) e
Massa Fresca de Raiz (MFR) em função do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
CR MFR
Acessos 16 11,18472* 0,009*
Resíduo 26 1,3753 0,0023
Total 42
CV (%) 31,2246 22,2444
* Significativo a 5% de probabilidade.
92
5.3.2 Organogênese Indireta
Resultados dos testes preliminares, analisando baixas concentrações de 2,4-D (0,0;
0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 e 15,0 µM), mostraram que meio MS contendo 10
µM
de 2,4-D apresentam maior formação de calos em explantes provenientes de
segmentos radiculares, conforme Figura II.3.
Pessoa (1993), utilizando meristemas axilares como explantes em meio MS
contendo 2,3 µM de 2,4-D, obteve calos entre 10 e 15 dias. Entretanto, foi verificado
que após 4 semanas os calos apresentavam se duros, pequenos e de cor creme.
Quando foram utilizados folíolos como explantes em meio contendo 2,4-D e BAP, as
doses de 9,0 µM
de 2,4-D e 4,5 µM de BAP promoveram a formação de calo na
superfície da lâmina foliar. Portanto, para os experimentos de descontaminação e de
indução de calos, o meio MS foi suplementado com 10
µM
de 2,4-D (na FiguraII.3).
Tabela II.16 - Comprimento de Raiz (CR) e Massa Fresca de Raiz (MFR) em função
do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Acesso
CR
(cm)
M FR
(g)
Roxa 9,6666 a 0,1566 bc
ASA 2 6,0000 ab 0,2400 abc
ASA 3 5,5666 b 0,2633 abc
ASA 4 4,5000 bc 0,2366 abc
ASA 5 4,4333 bc 0,3133 a
ASA 1 4,1333 bc 0,3050 ab
AC 4 3,6000 bc 0,1100 c
AC 5 3,2000 bc 0,3020 ab
AC 1 3,2000 bc 0,1710 abc
AC 2 2,9500 bc 0,2005 abc
Branca 1 2,8000 bc 0,1250 c
Branca 3 2,7000 bc 0,1615 abc
Branca 4 2,6333 bc 0,1756 abc
Branca 7 2,2000 bc 0,2615 abc
Branca 6 1,9000 c 0,2633 abc
Branca 2 1,9000 c 0,1990 abc
Branca 5 1,6000 c 0,2143 abc
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade. AC – Amarela de Carandaí e ASA – Amarela de Senador Amaral.
93
Os calos desenvolveram-se sobre a superfície do disco radicular, preferencialmente
da região de transição entre o córtex e a região cambial. Em alguns casos na borda
dos discos houve formação de massa de calo. Os calos formados apresentavam
coloração creme e se destacavam com facilidade do disco radicular.
Figura II.3 - Desenvolvimento de calos a partir de segmentos radiculares de
mandioquinha-salsa cultivados na presença de 10 µM
de 2,4-D. CCA-UFES, Alegre, ES,
2008
5.3.2.1 Desinfestação dos discos radiculares
Os resultados mostraram que há diferença significativa entre os tratamentos de
descontaminação, conforme pode ser observado na Tabela II.17. Entretanto, não há
interação entre os tratamentos de desinfestação e as cultivares.
Tabela II.17 - Resumo da análise de variância da contaminação bacteriana em
segmentos radiculares de três cultivares de mandioquinha-salsa em reposta aos
tratamentos de descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
Contaminação Bacteriana
Cultivar 2 211,11
ns
Desinfestação 3 16307,41*
Cultivar x Desinfestação 6 107,40
ns
Resíduo 24 211,11
Total 35
CV (%) 31,51
* Significativo a 5% de probabilidade; e
ns
não significativo a 5% de probabilidade.
94
Conforme apresentado no Gráfico II.5, os Tratamentos 1 e 2, proporcionam a menor
taxa de contaminação não diferindo estatisticamente entre si.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T1 T2 T3 T4
Tratamentos
Contaminação (%)
Gráfico II. 3 – Porcentagem de contaminação bacteriana em discos radiculares de mandioquinha-salsa
em função do tratamento de descontaminação. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
Letras diferentes sobre as colunas diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
O Tratamento 2 apresenta menos de 5% de contaminação, resultado satisfatório em
comparação aos obtidos por Pessoa (1993). De acordo com este pesquisador, após
exaustivas tentativas de descontaminação, persistiu um alto índice de contaminação
bacteriana, inviabilizando o cultivo in vitro, por organogênese direta ou indireta e
embriogênese somática, utilizando como fonte de explantes segmentos radiculares.
5.3.2.2 Indução de calo
Por ter apresentado alto índice de contaminação, os acessos AC3, 4 e 5 da cultivar
Amarela de Carandaí, ASA4 e 5 da cultivar Amarela de Senador Amaral e Branca 7
da cultivar Branca não entraram na análise de variância.
Para a avaliação da Massa Fresca de Calos, não há diferença significativa entre os
acessos (Tabela II.18).
a
a
b
b
95
No Gráfico II.4 estão plotadas as médias, seus respectivos erros com intervalo de
confiança de 95%, demonstrando que, para as cultivares, o comportamento é
semelhante. Mas verificou-se que os acessos B5, AS2 e AS3 apresentam erros
maiores que os demais.
Gráfico II.4 – Massa fresca de calos originados a partir de discos radiculares de diferentes
acessos de mandioquinha-salsa. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
5.3.2.3 Indução de organogênese indireta
Dois experimentos com diferentes Citocininas (Cinetina e BAP) foram realizados
com o objetivo de induzir a organogênese indireta, visando obter um protocolo para
a regeneração de plantas a partir de explantes radiculares.
No experimento com Cinetina considerando as variáveis massa fresca de calos e
raízes, há interação entre Cultivar e dose de Cinetina para a massa fresca e massa
Tabela II.18 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca de Calos (MFC) em
função do genótipo. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
MFC
Acessos 11 0,7871
ns
Resíduo 18 0,3753
Total 29
CV (%) 19,2442
ns
não significativo a 5% de probabilidade.
B1 B2 B3 B4 B5 B6 AS1 AS2 AS3 AS4 AC1 AC2
Acessos
Massa
em g
96
seca de calos e raízes (Tabela II.19), confirmando a hipótese de que a dose de
Cinetina interfere na resposta da Cultivar.
A Tabela II.20 apresenta os dados para a variável massa fresca de calos e raízes.
Para as cultivares amarelas não há diferença significativa entre as doses. Já para a
cultivar branca, a dose de 2 mg L
-1
apresenta o melhor resultado. As doses de 2, 4 e
6 mg L
-1
apresentam diferenças entre as cultivares, sendo que para a dose de 2 mg
L
-1
, a cultivar Branca apresenta a melhor massa fresca de calos e raízes. Para a
dose de 4 mg L
-1
, as cultivares Branca e Amarela de Senador Amaral apresentam os
melhores resultados e a cultivar Branca apresenta a melhor resposta para a dose de
6 mg L
-1
.
Para as variáveis massa seca de calos e raiz, o material foi seco em estufa a 65ºC
por 48 horas. Os dados estão apresentados na Tabela II.21.
Tabela II.19 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca e Seca de Calos e
Raízes (MFCR e MSCR) de mandioquinha-salsa em reposta a Cultivar e doses de
Cinetina. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
MFCR MSCR
Cultivar 2 0,3280* 0,0066*
Dose 3 0,0643
ns
0,0007
ns
Cult. X Dose 6 0,0945* 0,0022*
Resíduo 15 0,0120 0,0005
Total 26
CV (%) 39,0901 62,3154
* Significativo a 5% de probabilidade; e
ns
não significativo a 5% de probabilidade.
Tabela II.20 - Massa Fresca de Calo e Raiz (MFCR) (g) de mandioquinha-salsa em
função da Cultivar e doses de Cinetina. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Cultivar
Dose
(mg L
-1
)
Amarela de
Carandaí
Amarela de
Senador Amaral
Branca
0 0,2760 Aa 0,2170 Aa 0,2205 Ba
2 0,1335 Ab 0,1713 Ab 1,1380 Aa
4 0,1740 Ab 0,2950 Aa 0,4330 Ba
6 0,1760 Ab 0,1590 Ab 0,4590 Ba
Médias seguidas por letras distintas, maiúsculas na vertical e minúsculas na horizontal, diferem entre
si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
97
Não há diferença significativa entre as doses para as cultivares amarelas. Já para a
cultivar branca, a dose de 2 mg L
-1
apresenta o melhor resultado. As doses de 2 e 6
mg L
-1
são as que apresentam diferença entre as cultivares, sendo que a cultivar
Branca apresenta o melhor resultado para a dose de 2 mg L
-1
. Para a dose de 6 mg
L
-1
, as cultivares Branca e Amarela de Carandaí apresentam os melhores resultados.
Os resultados referentes ao número médio de raízes estão apresentados no Gráfico
II.5. Somente a cultivar Branca apresenta enraizamento em todas as doses. Os
Tratamentos 1 e 2 podem proporcionar com maiores probabilidades, falsas
inferências quanto à produção média de raízes por planta.
Gráfico II.5 – Número médio de raízes da cultivar Branca de mandioquinha-salsa em função
de doses de Cinetina. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
T1 = 0 mg L
-1
, T2 = 2 mg L
-1
, T3 = 4 mg L
-1
e T4 = 6 mg L
-1
.
Tabela II.21 - Massa Seca de Calo e Raiz (MSCR)(g) de mandioquinha-salsa em
função da Cultivar e doses de Cinetina. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Cultivar
Dose
(mg L
-1
)
Amarela de Carandaí Amarela de Senador Amaral Branca
0 0,0260 Aa 0,0350 Aa 0,0290 Ba
2 0,0090 Ab 0,0133 Ab 0,1510 Aa
4 0,0120 Aa 0,0390 Aa 0,0585 Ba
6 0,0495 Aa 0,0115 Ab 0,0660 Ba
Médias seguidas por letras distintas, maiúsculas na vertical e minúsculas na horizontal, diferem entre
si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade
98
No experimento com BAP, como pode ser, considerando a variável massa fresca de
calos e raízes, não houve interação entre os fatores Cultivar e Dose de BAP, não foi
verificada também diferença significativa entre os níveis dentro dos fatores. Como
observado na Tabela II.22, há diferença significativa entre as cultivares para a
massa seca de calos e raízes.
Os números médios de raízes para as cultivares em função das doses de BAP estão
apresentados no Gráfico II.6. Verifica-se que somente a cultivar Branca apresenta
enraizamento. Os Tratamentos 1 e 2 podem proporcionar com maiores
probabilidades, falsas inferências quanto à produção média de raízes por planta.
.
Gráfico II.6 – Número médio de raízes da cultivar Branca de mandioquinha-salsa em função de doses
de BAP. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008.
T1 = 0 mg L
-1
, T2 = 2 mg L
-1
, T3 = 4 mg L
-1
e T4 = 6 mg L
-1
.
Tabela II.22 - Resumo da análise de variância da Massa Fresca e Seca de Calos e
Raízes (MFCR e MSCR) de mandioquinha-salsa em reposta a Cultivar e doses de
BAP. CCA-UFES, Alegre, ES, 2008
Quadrado Médio
FV GL
MFCR MSCR
Cultivar 2 0,3226
ns
0,0062*
Dose 3 0,0549
ns
0,0013
ns
Cult. X Dose 6 0,0578
ns
0,0008
ns
Resíduo 21 0,1041 0,0016
Total 32
CV (%) 96,4945 116,4515
* Significativo a 5% de probabilidade; e
ns
não significativo a 5% de probabilidade.
99
5.4 CONCLUSÕES
Para as condições em que os experimentos foram conduzidos, os resultados nos
permitem concluir que:
• a descontaminação de ápices caulinares e brotação lateral são influenciadas
pelas condições da planta no campo;
• em meio sem a adição de ANA e BAP ocorre enraizamento para as três
cultivares comerciais;
• em meio suplementado com 0,1 mg L
-1
de ANA e 0,2 Mg L
-1
de BAP há
enraizamento e tuberização para as três cultivares comerciais;
• a combinação de agentes descontaminantes físicos e químicos proporcionam
uma descontaminação eficiente em raízes;
• entre os acessos das cultivares Branca, Amarela de Carandaí e Amarela de
Senador Amaral não há diferença quanto à produção de calos a partir de
discos radiculares;
• as doses de 0, 2, 4 e 6 mg L
-1
Cinetina e BAP proporcionam enraizamento
em calos provenientes de discos radiculares de mandioquinha-salsa da
cultivar Branca.
100
5.5 REFERÊNCIAS
Cruz, C.D. Programa Genes: Estatística experimental e matrizes. Editora UFV.
Viçosa (MG). 285p. 2006
ECHEVERRIGARAY, S.; ANDRADE, L. B.; DELAMARE, A. P. L.; ZENI, A. L. B.;
CARRER, R. Cultura de tecidos e micropropagação de plantas aromáticas e
medicinais. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Biotecnologia na
agricultura e na agroindústria. Guaíba: Agropecuária, 2001. p. 257-276.
GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K. Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, n.50, p.151-158, 1968.
GEORGE, E.F., SHERRINGTON, P.D. Plant propagation by tissue culture.
Eversley : Exegetics, 1984. 709p.
GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In : TORRES, A. C.;
CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformação genética
de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/ Embrapa-CNPH, 1998. p. 183-260.
KNUDSON, L.A. new nutrient solution for the germination of orchid seed. American
Orchid Society Bulletim, West Palm Beach, v.14, p.214- 217, 1946.
LUZ, J. M. Q. Obtenção in vitro de plantas de mandioquinha-salsa (Arracacia
xanthorrhiza Bancroft) via cultura de meristemas. 1993, 51p. Dissertação.
(Mestrado em Fitotecnia) Pós-Graduação em Agronomia, Escola Superior de
Agricultura de Lavras, Lavras, 1993.
MADEIRA, N. R. Micropropagação e indexação de mandioquinha-salsa. 2004,
139f. Tese. (Doutorado em Fitotecnia). Pós-Graduação em Agronomia, Universidade
Federal de Lavras, Lavras, 2004.
MADEIRA, N.R.; TEIXEIRA, J.B.; ARIMURA, C.T.; JUNQUEIRA, C.S. Influência da
concentração de BAP e AG
3
no desenvolvimento in vitro de mandioquinha-salsa,
Horticultura Brasileira. Brasília: v. 23, n.4, p. 982-985 . 2005
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-497,
1962.
PESSOA, A. C. da S. Desenvolvimento de calos e organogênese de
mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza). 1993, 97f. Dissertação. (Mestrado
em Ciencias biológicas) – Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica),
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Rio de Janeiro, 1993.
101
SENNA NETO, N. Micropropagação de mandioquinha-salsa (Arracacia
xanthorrhiza Bancroft). 1991, 53f. Dissertação. (Mestrado em Fitotecnia) Pós-
Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1991.
SKOOG, F. ; MILLER, F.O. Chemical regulation of growth and organ formation in
plant tissues cultured "in vitro". Symposium Society Experimental Biology, v.11,
p.118-131, 1957.
STATSOFT INC. Statistica for windows, (Computer program manual) release 6.0,
copyright 1995.
TABARES, E.; PACHÓN, I.; ROCA, W.M. Variación somaclonal y su aplicatión al
mejoramiento de cultivos. In: ROCA, W.M.; MROGINSKI, L.A. (Eds.) Cultivo de
tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT, 1991. cap. 14.
p.339-60
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2004.
TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de
plantas. Brasília: ABCTP/Embrapa-CNPH, 1990. 433p.
WHITE, P. R. A handbook of plant tissue culture. Lancaster: Costel, 1943. 273 p.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
