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Desenvolvimento de metodologias analíticas usando
FIA com detecção amperométrica: análise de
dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico
Denise Tofanello Gimenes
Uberlândia
Julho/2009
Universidade Federal de
Uberlândia
Instituto de Química
Programa de Pós-Graduação em
Química
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Universidade Federal de Uberlândia
Instituto de Química
Programa de Pós-Graduação em
Química
Desenvolvimento de metodologias analíticas usando
FIA com detecção amperométrica: análise de
dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação do Instituto de Química da
Universidade Federal de Uberlândia, como requisito
para obtenção do título de Mestre em Química
Mestranda:
Denise Tofanello Gimenes
Orientador:
Prof. Dr. Eduardo Mathias Richter
Área de Concentração:
Química Analítica
Uberlândia
Julho/2009
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
G491d
Gimenes, Denise Tofanello, 1980-
Desenvolvimento de metodologias analíticas usando FIA com detec-
ção amperométrica : análise de dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico /
Denise Tofanello Gimenes. - 2009.
101 f. : il.
Orientador: Eduardo Mathias Richter.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Uberlândia, Pro-
grama de Pós-Graduação em Química.
Inclui bibliografia.
1. Química analítica - Teses. 2. Dopamina - Teses. 3. Vitamina C -
Teses. 4. Ácido úrico - Teses. I. Richter, Eduardo Mathias. II. Universi-
dade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Química.
III. Título.
CDU: 543
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
AGRADECIMENTOS
Este trabalho não poderia ter sido concluído sem prestar uma breve homenagem às
pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização e êxito do mesmo:
A Deus pela força e coragem concedida nos momentos de fraqueza e por estar sempre
comigo.
Aos meus sogros: Reginaldo e Marlene por tudo o que fizeram e fazem por mim.
Também aos meus cunhados Márcia e Thiago pelos momentos de distração e
conhecimentos que passamos juntos.
Ao meu Orientador em especial, Prof. Dr. Eduardo Mathias Richter, pela orientação,
sabedoria, oportunidade, paciência e apoio para que a realização deste trabalho
tivesse sucesso.
Em especial ao Wallans, que durante todo o tempo contribuiu para realização deste
trabalho.
Em especial também a minha prima e amiga Sabrina, pelos conselhos e momentos de
distração e alegria.
Todos os colegas e amigos de laboratório: Joyce, Rodrigo Amorim, Thiago, Jhonys,
Abílio, Rafael, Adriana, Juliana e todos os demais que não estão reportados aqui,
mas que com certeza ficaram guardados na memória.
A Mayta, secretária do curso de Pós-Graduação, pela paciência e colaboração.
Aos mestres, Yaico, Rodrigo Muñoz, Sebastião, Nívea e aos outros docentes não
relatados, mas que nunca serão esquecidos, pelos conhecimentos adquiridos, meu
muito obrigada.
A CAPES pela concessão da bolsa de estudos, meu muito obrigada.
Ao Instituto de Química da Universidade Federal de Uberlândia pelo espaço físico
concedido.
Aos membros das bancas pela aceitação e valiosa contribuição para o aprimoramento
deste trabalho.
“Hoje levantei cedo pensando no que tenho a fazer antes que o
relógio marque meia noite. É minha função escolher que dia vou ter
hoje.
Posso reclamar porque está chovendo ou agradecer ás águas por
lavarem a poluição. Posso ficar triste por não ter dinheiro ou me
sentir encorajado para administrar minhas finanças, evitando o
desperdício. Posso reclamar sobre minha saúde ou dar graças por
estar vivo.
Posso me queixar dos meus pais por não terem me dado tudo o que eu
queria ou posso ser grato por ter nascido. Posso reclamar por ter que
ir trabalhar ou agradecer por ter trabalho. Posso sentir tédio com o
trabalho doméstico ou agradecer a Deus por ter um teto para morar.
Posso lamentar decepções com amigos ou me entusiasmar com a
possibilidade de fazer novas amizades. Se as coisas não saíram como
planejei posso ficar feliz por ter hoje para recomeçar.
O dia está na minha frente esperando para ser o que eu quiser. E aqui
estou eu, o escultor que pode dar forma.
Tudo depende só de mim.”
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i
No presente trabalho foi investigada uma metodologia simples, sensível e seletiva para
a determinação de espécie analíticas de interesse farmacêutico e biológico. Os estudos foram
direcionados para a determinação de dopamina (DA) na presença de altas concentrações de
ácido ascórbico (AA), dopamina na presença de AA e ácido úrico (AU) e determinação
simultânea de AA e AU usando Análise por Injeção em Fluxo (FIA) com detecção
amperométrica de múltiplos pulsos (AMP) e carbono vítreo como eletrodo de trabalho (sem
modificação química).
Inicialmente, um estudo do comportamento eletroquímico das espécies analíticas foi
avaliado em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. A opção por este eletrólito se deve ao fato de que a
cinética de reação entre a o-dopaminoquinona (o-DQ) e AA ser muito lenta nesta condição.
Em seguida foram otimizados os potenciais de oxidação e redução para a determinação
indireta de DA e AU em sistema FIA com detecção por AMP. Para a análise de dopamina na
presença de altas concentrações de ácido ascórbico, os seguintes pulsos de potenciais em
função do tempo foram utilizados:
(a) +0,8V / 700 ms: oxidação simultânea de DA e AA;
(b) +0,35V / 30 ms: determinação indireta de DA através da redução da o-DQ
gerada no pulso de potencial anterior;
(c) 0,00V / 500ms para limpeza e/ou regeneração do eletrodo de trabalho.
Testes de repetibilidade apresentaram um DPR de 1,2% (n=24), o que demonstra um
bom desempenho do método, principalmente em relação à eficácia do pulso de potencial
relacionado com a limpeza eletroquímica. A faixa linear para a análise de DA na presença de
1,0 mmol L
-1
de ácido ascórbico ficou entre 1,0 e 100,0 µmol L
-1
com coeficiente de
correlação calculado em 0, 998 e limites de detecção e quantificação em 50 e 170 nmol L
-1
,
respectivamente. Estudos de adição/recuperação em uma amostra farmacêutica contendo DA
geraram recuperações na ordem de 96,3%.
Na determinação de DA na presença de AA e AU, o potencial referente ao processo de
oxidação (geração da o-DQ) necessitou ser modificado para +0,65V / 700ms (não ocorre
oxidação do AU), mantendo-se o mesmo potencial correspondente ao processo de redução e o
potencial para limpeza do eletrodo necessitou de um tempo maior (800ms). Estudos de
repetibilidade nas análises de DA na presença de AA e AU mostraram-se eficientes para a
ii
técnica proposta, com DPR calculado em 0,25% para 15 injeções sucessivas de solução
contendo AA (1,0 mmol L
-1
), AU (0,50 mmol L
-1
) e DA (50,0 µmol L
-1
). Neste caso, a faixa
linear para análise de DA também ficou entre 1,0 e 100,0 µmol L
-1
, com coeficiente de
correlação em 0, 998 e os limites de detecção e quantificação calculados em 11 e 37 nmol L
-1
,
respectivamente.
Nas análises simultâneas de AA e AU, a seguinte sequência de pulsos de potenciais foi
utilizada:
(a) +0,6V / 100ms: oxidação e quantificação do AA;
(b) +0,8V / 100ms: oxidação do AA e AU;
(c) +0,1V / 30ms: redução do produto de oxidação do AU e sua respectiva
quantificação;
(d) 0,00V/ 1s: limpeza eletroquímica do eletrodo de trabalho;
Na análise simultânea de AA e AU, o DPR para injeções sucessivas (n=25) de uma
solução contendo AA+AU (100,0 e 200,0 µmol L
-1
) foi calculado em 0,3 e 0,6 %,
respectivamente. A curva analítica apresentou linearidade na faixa de concentração entre
100,0 a 300,0 e 50,0 a 150,0 µmol L
-1
para AA e AU, respectivamente. Baseado nos
resultados experimentais obtidos, foram calculados os coeficientes de correlação (R = 0,997 e
0,995), limites de detecção (82 e 273 nmol L
-1
) e de quantificação (169 e 563 nmol L
-1
) para
AA e AU, respectivamente.
Palavras-chave: Detecção Amperométrica de Múltiplos Pulsos, Análise por Injeção em
Fluxo, Dopamina, Ácido Ascórbico, Ácido Úrico.
iii
In the present work a simple, sensitive and selective method for determination of
compounds of pharmaceutical and biological interest was investigated. The studies were
addressed for analysis of the following analytes: (1) dopamine (DA) in the presence of high
concentrations of ascorbic acid (AA); (2) dopamine in the presence of ascorbic and uric acid
(UA) and (3) ascorbic and uric acid simultaneously. In all cases, Flow Injection Analysis
(FIA) with Multiple Pulse Amperometry (MPA) technique and glassy carbon as work
electrode (without chemical modification) were used.
Initially, the electrochemical behavior of the analytes in sulfuric acid medium (0.20
mol L
-1
) was evaluated. The choice of this electrolyte was due to the fact that the chemical
reaction between the o-dopaminoquinone (o-DQ) and AA in this condition is very slow. For
dopamine analysis, in the presence of high concentrations of ascorbic acid, the following
potential pulses in function of the time were used:
(a) +0.8V / 700ms : simultaneous oxidation of DA and AA;
(b) +0.35V / 30ms: indirect determination of DA through the reduction of o-DQ
generated in the previous potential pulse;
(c) 0.0V / 500ms: cleaning or regeneration of the electrode surface.
Repeatability tests presented a RSD of 1.2% (n=24), which demonstrates a good
performance of the proposed method in relation to the technique efficiency to avoid electrode
surface contamination. The linear range for DA analysis in the presence of 1 mmol L
-1
of
ascorbic acid was found to be from 1,0 to 100,0 µmol L
-1
. The correlation coefficient was
calculated as R=0.9988. The detection and quantification limits were 50 and 170 nmol L
-1
,
respectively. Recovery studies were carried out by adding standard DA to a pharmaceutical
sample. Good recovery values were obtained (96.3%).
For DA determination in the presence of AA and UA, it was necessary to change the
oxidation potential pulse (generation of o-DQ) from 0.80 V to +0.65V (the UA oxidation does
not occur). The same reduction and cleaning potential pulses were used and only the time of
application for the cleaning potential pulse needed to be increased (800ms). Repeatability
studies for DA analysis in the presence of AA and UA presented good results, with RSD
calculated in 0.25% for 15 successive injections of solution containing simultaneously AA
(1.0 mmol L
-1
),UA (0.50 m
mol L
-1
) and DA (50.0 µmol L
-1
). In this last case, the linear range
for DA analysis was also between 1.0 to 100.0 µmol L
-1
, with correlation coefficient,
iv
detection and quantification limits calculated, respectively, as 0.998, 11 nmol L
-1
and 37 nmol
L
-1
.
Simultaneous analysis of AA and UA were carried out using the following sequence
of potential pulses:
a) +0.6V / 100ms: oxidation and quantification of ascorbic acid;
b) +0.8V / 100ms: oxidation of AA and UA;
c) +0.1V / 30ms: reduction of the oxidation product of UA and respective
quantification;
d) 0.0V/ 1s: cleaning and/or regeneration of the electrode surface.
In the simultaneous analysis of AA and UA, the RSD for successive injections (n=25) of a
solution containing AA+UA (100.0 and 200.0 µmol L
-1
) was calculated in 0.3 and 0.6 %,
respectively. The analytical curve presented linear behavior (current vs concentration)
between 100.0 to 300.0 and 50.0 to 150.0 µmol L
-1
for AA and UA, respectively. Based on
these results, other parameters were calculated, respectively, for AA and AU analysis:
correlation coefficients (R = 0.997 and 0.995), detection limits (82 and 273 nmol L
-1
) and
quantification limits (169 and 563 nmol L
-1
).
Keywords: Multiple Pulse Amperometry, flow injection analysis, dopamine, ascorbic acid,
uric acid.
v
!*
Figura 1.1: Fórmula estrutural da Dopamina.
Figura 1.2: Etapas do processo de biossíntese da dopamina.
Figura 1.3: Estrutura do cérebro.
Figura 1.4: Fórmula Estrutural do Ácido Ascórbico.
Figura 1.5: Fórmula Estrutural do Ácido Úrico.
Figura 1.6: (a) perfil apresentado momentos após a introdução da amostra. (b) perfil da
amostra, após o processo de dispersão.
Figura 1.7: (A) Esquema da varredura do potencial vs tempo. (B) Voltamograma da corrente
obtido em função do potencial.
Figura 2.1: Esquema de montagem para utilização da pressão gerada por uma coluna de água
para controle de vazão de sistemas em fluxo.
Figura 2.2: Célula eletroquímica de três eletrodos (tipo “wall- jet”).
Figura 2.3: Esquema do sistema FIA empregado nos estudos.
Figura 3.1: Mecanismo da oxidação eletroquímica da DA e do AA e a reação química entre o
AA e a o-DQ e entre o AA e a água.
Figura 3.2: Voltamogramas cíclicos obtidos para soluções contendo H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sem
(a) e com a adição de (b) 1,0 mmol L
-1
de AA ou (c) 1,0 mmol L
-1
de DA. ]
Figura 3.3: Mecanismo das etapas eletroquímicas e possíveis etapas químicas para a reação
de oxidação da DA.
Figura 3.4: Mecanismo de oxidação eletroquímica do AA e da reação química entre o ADA e
a água.
Figura 3.5: Efeito da velocidade de varredura usando VC para DA 1,0 mmol L
-1
sobre ECV
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
.
Figura 3.6: Dependência linear das correntes de pico (µA) em função da raiz quadrada da
velocidade de varredura (mV s
-1
)
1/2
.
Figura 3.7: Intensidade de corrente obtida da injeção de 300µL de solução de dopamina 10,0
µmol L
-1
em função do tempo de aplicação do pulso de potencial de oxidação da
dopamina.
Figura 3.8: Intensidade dos sinais de corrente de redução em função do potencial.
vi
Figura 3.9: Intensidade dos sinais de corrente de redução em função da vazão da solução
carregadora.
Figura 3.10: Intensidade do sinal amperométrico em função do volume da amostra injetada.
Figura 3.11: (A
1
) Amperogramas para injeções de soluções contendo 90 µmol L
-1
de AA (a),
90 µmol L
-1
de DA (b) e uma mistura de ambos os espécie analíticas na mesma
concentração anterior (c).
(A2) Escada de potenciais aplicados.
Figura 3.12: (A
1
) Amperogramas de múltiplos pulsos com injeção de soluções em de
duplicata contendo 100,0 µmol L
-1
de DA (a), 1,0 mmol L
-1
de AA (b) e mistura
de ambos os espécie analíticas nas mesmas concentrações de a e b (c). (A
2
)
Escada de aplicação dos pulsos de potenciais.
Figura 3.13: Respostas amperométricas após 24 injeções consecutivas de 300 µL de solução
contendo simultaneamente DA e AA (100,0 µ mol L
-1
e 1,0 mmol L
-1
,
respectivamente).
Figura 3.14: Resposta amperométrica em fluxo para injeções de soluções contendo 100,0 µ
mol L
-1
de DA (exceto a) e aumento da concentração de AA: a=b= 0,25; c= 0,5;
d= 1,0; e=2,0; f=4,0; g=8,0 e h= 16,0 mmol L
-1
em meio de H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
.
Figura 3.15: Amperograma para redução de o-DQ para a injeção de soluções de
concentrações crescentes de DA (a=1,0; b=10; c=20; d=30; e=40; f=50; g=60;
h=70; i=80; j=90 e l=100 µmol L
-1
) na presença de 1,0 x10
-3
mol L
-1
de AA.
Figura 3.16 Curva analítica obtida para concentrações crescentes de DA.
Figura 3.17: Voltamogramas cíclicos obtidos para H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
sem (a) e com a adição
de (b) AA 1,0 x10
-3
mol L
-1
, (c) DA 1,0 x10
-3
mol L
-1
ou (d) AU 0,5 x10
-3
mol L
-
1
, sobre ECV.
Figura 3.18: Mecanismo de oxidação do ácido úrico.
Figura 3.19: Intensidade da corrente amperométrica de redução monitorada no potencial de
redução em função da variação do potencial de oxidação para uma solução
contendo 100 µmol L
-1
de dopamina ou 2,0 mmol L
-
1 de ácido úrico.
Figura 3.20: Intensidade do sinal amperométrico de oxidação, obtida da injeção de 300 µL de
solução contendo DA (10,0 µmol L
-1
) e AU (2,0 x10
-3
mol L
-1
) em função do
tempo de aplicação do potencial de +0,65 V.
Figura 3.21: Amperograma de múltiplos pulsos com injeção de soluções em triplicata
contendo 100,0 µmol L
-1
de dopamina (a), 1,0 mmol L
-1
de ácido ascórbico (b),
0,5x10
-3
mol L
-1
de ácido úrico (c)
ou mistura de todas as espécies analíticas nas
mesmas concentrações dos itens anteriores (d).
vii
Figura 3.22: Resposta amperométrica após 15 injeções consecutivas de 300 µL de solução
contendo simultaneamente DA, AA e AU (50,0 µmol L
-1
; 1,0 mmol L
-1
; 0,5 mmol
L
-1
,
respectivamente).
Figura 3.23: Resposta amperométrica em fluxo obtidas para injeções em duplicatas de
soluções contendo 100,0 µ mol L
-1
de DA e aumento da concentração de AU:
a=0,05; b= 0,1; c= 0,2; d= 0,50; e=1,0; f=2,0 e g=4,0 mmol L
-1
em meio de
H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
.
Figura 3.24: Amperograma obtido para a injeção de soluções com concentrações crescentes
de DA em µmol L
-1
(a=1,0; b=10; c=20; d=30; e=40; f=50; g=60; h=70; i=80;
j=90 e l=100) na presença de 1,0 x10
-3
mol L
-1
de AA e 0,5 x10
-3
mol L
-1
de AU.
Figura 3.25: Curva de calibração para a dopamina.
Figura 3.26: Efeito da velocidade de varredura usando VC de 1,00 x10
-3
mol L
-1
de AA em
meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sobre eletrodo de carbono vítreo.
Figura 3.27: Dependência linear das correntes de pico anódico (µA) em função da raiz
quadrada da velocidade de varredura (mV s
-1
)
1/2
para o ácido ascórbico em meio
de H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
.
Figura 3.28: Efeito da velocidade de varredura usando VC para 0,5 mmol L
-1
de ácido úrico
em meio de H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
sobre ECV.
Figura 3.29: Dependência linear das correntes de pico anódica (µA) em função da raiz
quadrada da velocidade de varredura.
Figura 3.30: Amperogramas para injeção em fluxo em soluções em triplicata de 100 x10
-3
mol L
-1
de AU ou 200 x10
-3
mol L
-1
de AA nos seguintes potenciais: +0,3 V; +0,4
V; +0,5 V; +0,6 V; +0,7 V; +0,8 V; +0,9 V; +1,0 V sobre eletrodo de carbono
vítreo.
Figura 3.31: Intensidade de corrente em função da vazão da solução carregadora (H
2
SO
4
0,2
mol L
-1
) obtida nos seguintes pulsos de potenciais: () +0,6 V / 100ms (oxidação
do AA), +0,8 V /100ms (não apresentado) e () +0,1V / 30ms (redução do
produto da oxidação do AU).
Figura 3.32: Intensidade dos sinais amperométricos em função da alíquota de amostra
injetada no sistema FIA. () +0,6 V / 100ms (oxidação do AA) e () +0,1V /
30ms (redução do produto de oxidação do AU). Solução de AA= 200 µmol L
-1
e
AU = 100 µmol L
-1
.
viii
Figura 3.33: Amperograma de múltiplos pulsos com injeção em fluxo (n=3) de soluções
contendo 100,0 µmol L
-1
de AU (a), 200,0 µmol L
-1
de AA (b) ou AU e AA nas
mesmas concentrações anteriores (c).
Figura 3.34: Amperograma de múltiplos pulsos obtido para 25 injeções consecutivas de
alíquotas de 300 µL de solução contendo simultaneamente 100,0 µmol L
-1
de AU
e 200,0 µmol L
-1
de AA respectivamente.
Figura 3.35: Respostas amperométricas em fluxo para injeções em duplicatas de soluções
contendo 200,0 µmol L
-1
de AA e aumento da concentração de AU (a = somente
AA): b= 100; c= 200; d= 400 e e=800 µmol L
-
1, em meio de H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
.
Figura 3.36: Respostas amperométricas em fluxo para injeções em duplicatas de soluções
contendo 200,0 µmol L
-1
de AU e aumento da concentração de AA (a = somente
AU; b= 100; c= 200; d= 400 e e=800 µmol L
-
1), em meio de H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
.
Figura 3.37: Amperograma para oxidação do AA (+0,6V / 100ms) e redução do produto da
oxidação do AU (+0,1V / 30ms) para injeções (n=3) de soluções com
concentrações crescentes de AA e AU (a=100/50; b=150/75; c=200:100;
d=250/125; e=300:150 µmol L
-1
).
Figura 3.38: (A) Curva de calibração obtida na análise de AA no pulso de potencial +0,60V /
100ms. (B) Curva de calibração obtida na análise do AU no pulso de potencial
+0,1V / 30ms.
ix
Tabela 3.1: Valores de corrente anódica (I
a
) e catódica (I
c
) e potencial de pico anódico (E
a
) e
catódico (E
c
) para DA em diferentes velocidades de varredura ().
Tabela 3.2: Resultados obtidos na determinação de dopamina em amostra de fármaco na
ausência e após a adição de AA.
Tabela 3.3: Valores de corrente anódica (I) e potencial de pico (E) para oxidação do AA para
diferentes velocidades de varredura ().
Tabela 3.4: Valores de corrente anódica (I) e potencial de pico (E) para oxidação do ácido
úrico para diferentes velocidades de varredura ().
Tabela 3.5: Intensidade das correntes amperométricas para redução do produto da oxidação
do AU e oxidação do AA em meio de H
2
SO
4
0,2 mol L
-1
.
Tabela 3.6: Coeficientes de Correlação, limites de detecção e de quantificação do AA e AU.
Tabela 3.7: Resultados obtidos na determinação de AA e AU em amostra padrões.
x
&+ *
AA............................................Ácido Ascórbico
ADA.........................................Ácido Dehidroascórbico
AMP ........................................Amperometria de Múltiplos Pulsos
AU............................................Ácido Úrico
CLAE.......................................Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CV.............................................Carbono Vítreo
DA............................................Dopamina
EA............................................Eletrodo Auxiliar
EDTA.......................................Ácido etilenodiamino tetra-ácetico
ER............................................Eletrodo de Referência
ET............................................Eletrodo de Trabalho
FIA...........................................Análise por Injeção em Fluxo
I
red
............................................Corrente de redução
I
oxi
............................................Corrente de oxidação
LD ...........................................Limite de Detecção
LQ ...........................................Limite de Quantificação
ms ............................................milisegundos
SDS..........................................Dodecil Sulfato de Sódio
USP..........................................Farmacopéia dos Estados Unidos
o-DQ.........................................o-dopaminoquinona
VC...................................................voltametria cíclica
xi
; &&
Artigo submetido para publicação: Flow-injection amperometric method for
indirect determination of dopamine in the presence of a large excess of
ascorbic acid, 2009.
Wallans T. P. dos Santos, Denise T. Gimenes, Edimar G.N. de Almeida, Sebastião
de P. Eiras, Yaico D. T. de Alburquerque, Eduardo M. Richter, Simple Flow
Injection Amperometric System for Simultaneous Determination of Dipyrone
and Paracetamol in Pharmaceutical Formulation, Journal of the Brazilian
Chemical Society, 2009 (disponível online).
Wallans T. P. dos Santos, Edimar G.N. de Almeida, Humberto E. A. Ferreira,
Denise T. Gimenes, Eduardo M. Richter, Simultaneous Flow Injection Analysis
of Paracetamol and Ascorbic Acid with Multiple Pulse Amperometric
Detection , Eletroanalysis, 20, 1878-1883, 2008.
Denise T. Gimenes, Wallans T. P. dos Santos, Thiago F. Tormin, Joyce T. Miranda,
Eduardo M. Richter, Determinação indireta de dopamina na presença de altas
concentrações de ácido ascórbico usando FIA com detecção amperométrica,
Livro de resumos do XVII simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica,
Fortaleza-CE, 2009.
Thiago F. Tormin, Denise T. Gimenes, Wallans T. P. dos Santos, Eduardo M.
Richter, Estudos iniciais para determinação simultânea de diclofenaco e
paracetamol em fármacos utilizando Fia com detecção amperométrica, Anais
do XXII Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química, Belo Horizonte-
MG, 2008.
Denise T. Gimenes, Edimar G.N. de Almeida, Wallans T. P. dos Santos, Eduardo
M. Richter, Estudos para determinação eletroquímica de Dopamina (DP) na
presença de Ácido Ascórbico (AA) em sistema FIA, Anais do XXI Encontro
Regional da Sociedade Brasileira de Química, Uberlândia, 2007.
Denise T. Gimenes, Wallans T. P. dos Santos, Eduardo M. Richter, investigação
para determinação de Ácido Acetilsalicílico (AAS) e Ácido Ascórbico (AA) em
formulações farmacêuticas, Anais do XXI Encontro Regional da Sociedade
Brasileira de Química, Uberlândia, 2007.
P
ARTE
1
I
NTRODUÇÃO E OBJETIVOS DO
T
RABALHO
2
Introdução
1.1 ESPÉCIES ANALITICAS ESTUDADAS
Dopamina
A Dopamina (DA), 2-(3,4-dihidroxi-fenil)etilamina, com a fórmula estrutural
apresentada na Figura 1.1, é uma catecolamina (apresenta os grupos catecol e amino). Existe
no cérebro e serve para conduzir a transmissão de uma célula nervosa (neurônio) para outra,
sendo precursora de outras catecolaminas, como por exemplo, a noradrenalina e a adrenalina.
OH
OH
NH
2
Figura 1.1: Fórmula estrutural da Dopamina.
A síntese da dopamina ocorre nos neurônios a partir do aminoácido tirosina, que é
hidrólisado pela enzima tirosina hidroxilase a L-Dopa. Em seguida, a L-Dopa é
descarboxilada e forma a dopamina pela ação da enzima dopa carboxilase. É armazenada nas
vesículas dos terminais pré-sinápticos [1]. A Figura 1.2 descreve a síntese.
A dopamina é utilizada no tratamento de diversos tipos de choques e da hipotensão
grave após infarto agudo do miocárdio, pois atua dilatando os vasos sanguíneos renais,
aumentando, dessa forma, o fluxo sanguíneo. Como medicamento, é administrada pela via
endovenosa, não podendo ser administrada oralmente devido à sua oxidação e metabolização
pelo fígado ou rins, sendo, assim, nulo o seu efeito [2]. É medicamento restrito ao uso
hospitalar.
3
Introdução
HO
CH
2
NH
3
+
H
COO-
Tirosina
Hidroxilase
+
OH
HO
CH
2
C
NH
3
+
H
COO-
OH
-COO-
Dopa
Descarboxilase
HO
CH
2
CH
2
OH
NH
2
Dopamina
L-DOPATirosina
-
Figura 1.2: Etapas do processo de biossíntese da dopamina.
Baixos níveis de dopamina estão relacionados com problemas neurológicos, tais como,
Mal de Alzheimer e a doença de Parkinson [3]. Devido à influência da DA e de seus produtos
de oxidação nestas doenças neurodegenerativas e por estas estarem presentes em nosso meio,
cabe enfatizar as mesmas com o objetivo de maior esclarecimento do mecanismo de ação e/ou
alteração deste mecanismo.
Mal de Alzheimer
Esta doença foi descrita pela primeira vez em 1970, pelo médico alemão Alois
Alzheimer. O Mal de Alzheimer é caracterizado como uma doença cerebral degenerativa,
lenta e progressiva que produz um declínio nas habilidades de pensar, raciocinar, memorizar,
juntamente com alterações no comportamento.
Depois das doenças cardiovasculares e do
câncer, a doença de Alzheimer é a terceira maior causa de morte nos países desenvolvidos.
Estima-se que 8% da população acima de 65 anos tenha a doença. No Brasil, são mais de 600
mil portadores [4].
Os sintomas iniciais, tais como, falta de memória, diminuição do tempo de atenção,
problemas matemáticos, dificuldade de expressar pensamentos, humor inconstante, variável e
imprevisível, menos desejo de fazer as coisas ou de conhecer pessoas são difíceis de serem
identificados, sendo que a deterioração nas habilidades cognitivas pode progredir por cerca de
10 anos em alguns pacientes, levando a um sério quadro de demência [5]. Análises
4
Introdução
microscópicas feitas da superfície cerebral de pessoas com o Mal de Alzheimer mostraram
uma perda das células nervosas em certas regiões do cérebro, como no hipocampo e no córtex
cerebral, região associada ao raciocínio, memória e linguagem. Um dos fatores estudados
como causa do aparecimento do Mal de Alzheimer está baseado no metabolismo do cobre,
onde este promove a oxidação da DA. Quando isto ocorre, há um aumento no fluxo de
espécies de oxigênio reativo, que vem a ser o fator de doenças neurodegenerativas [6].
1.1.1.2 Mal de Parkinson
A doença de Parkinson foi descrita em 1817 pelo médico inglês James Parkinson. Os
sinais apresentados pelo portador são tremor, rigidez e diminuição dos movimentos. É comum
ser diagnosticada em pessoas com 50 e 60 anos de idade. O conjunto de manifestações da
doença se deve a uma perda de células numa estrutura muito pigmentada designada substância
negra. Esta envia para o striatum um neurotransmissor: a dopamina (Figura 1.3). Em doentes
parkinsonianos há uma falta de dopamina neste circuito neural [7, 8].
Na doença de Parkinson, a deficiência de dopamina no nível striatum perturba o
funcionamento harmonioso dos núcleos cinzentos centrais, reforçando a atividade do núcleo
subtalâmico indiretamente, agindo como um freio sobre a motricidade [9]. Pessoas que
apresentam esta doença são tratadas com uma substância denominada Dopa. Ao chegar ao
cérebro transforma-se em DA reforçando a DA endógena que as células da substância negra,
degenerada, fabricam em quantidade insuficiente. Outro grupo de fármacos utilizados são os
agonistas da dopamina: a bromocriptina, o pergolide, o ropinirole. Estes fármacos controlam
os sintomas não por substituírem a DA, mas porque estimulam as células sobreviventes. É
importante salientar que a doença de Parkinson ainda não tem cura.
5
Introdução
Figura 1.3: Estrutura do cérebro.
Ácido Ascórbico (AA)
O Ácido Ascórbico (AA) ou vitamina C, 3-oxo-L-gulofuranolactona, representado pela
Figura 1.4, é uma cetolactona de seis carbonos, estruturalmente relacionada à glicose e
outras hexoses.
O
OH OH
O
OH
OH
Figura 1.4: Fórmula Estrutural do Ácido Ascórbico.
O AA é uma molécula utilizada na hidroxilação de várias outras reações bioquímicas
nas células, sendo relacionada à síntese de colágenos, proteoglicanos e outros constituintes
orgânicos da matriz intercelular em diversos tecidos, como os dentes, tendões, paredes dos
vasos sanguíneos, ossos e endotélio capilar. Além disso, é antioxidante, sendo usado para
6
Introdução
transformar radicais livres de oxigênio em formas inertes. Altas concentrações de AA no
sistema nervoso explicam-se pela provável necessidade de ascorbato (forma ionizada do AA)
na síntese de neurohormônios e de noradrenalina. A vitamina C participa no metabolismo do
triptofano e dos neurotransmissores, serotonina e DA [10].
Ácido Úrico (AU)
O AU é um ácido fraco (pKa 5,75), representado estruturalmente na Figura 1.5, sendo
que sua forma ionizada, o urato monossódico, é a forma encontrada no plasma humano, no
líquido extra-celular e na sinóvia (líquido viscoso, que preenche as cavidades articulares). É o
principal produto final produzido pelo metabolismo das purinas.
N
N
H
N
H
NH
O
H
O
O
Figura 1.5: Fórmula Estrutural do Ácido Úrico.
A taxa de uratos no organismo humano é de 68 mg L
-1
, a qual encontra-se no seu limite
de solubilidade na temperatura normal do corpo humano. O urato de sódio é solúvel a 37° C,
mas pode depositar-se provocando inflamações nas articulações periféricas, joelhos,
tornozelos, calcanhares e artelhos do pé, onde a temperatura do corpo é mais baixa. Quando o
ácido úrico atinge taxas superiores a 80 mg L
-1
no plasma sanguíneo, ele pode depositar-se em
qualquer tecido do organismo. Quando isso ocorre, podem surgir processos inflamatórios
como gota, artrite ou nefrite. A quantificação de AU no sangue e na urina é de grande valor
para o diagnóstico das alterações do metabolismo do AU estando a hiperuricemia relacionada
a diversas doenças como, por exemplo, a leucemia, hipertiroidismo, hipertensão e diabetes
[11].
7
Introdução
1.2 DETERMINAÇÃO DE DOPAMINA E ÁCIDO
ASCÓRBICO
A determinação analítica de DA tem sido fonte de diversos estudos, tendo em vista a
sua importância biológica e farmacêutica, porém, sua determinação é dificultada pela
coexistência com outros compostos interferentes. Dentre estes compostos, destaca-se o AA. A
DA e o AA estão presentes em amostras biológicas, como por exemplo, no sistema nervoso
central e no fluido extracelular [3]. O AA está presente nestas amostras em altas
concentrações (10
-4
a 10
-3
mol L
-1
) para proteger neurotransmissores catecolamínicos de sua
oxidação espontânea [12], enquanto que a DA apresenta concentrações baixas (10
-8
a 10
-6
mol
L
-1
) [13], o que dificulta ainda mais a sua determinação, pois o AA normalmente é um
interferente. Por isso, seletividade e sensibilidade são importantes no desenvolvimento de
qualquer procedimento para a determinação de DA.
Para a determinação da DA, a farmacopéia dos Estados Unidos “USP” recomenda o uso
da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção espectrofotométrica a
280nm [14]. Métodos alternativos localizados na literatura para quantificação da DA
envolvem técnicas como a cromatografia [15-17], fluorescência molecular [18],
quimiluminescência [19-21], potenciometria [22, 23], amperometria [14, 24, 25] e
espectrofotometria [26, 27]. Como a DA pode ser eletroquimicamente oxidada sobre diversos
materiais eletródicos com a obtenção de valores que apresentam sensibilidade considerada, as
técnicas eletroquímicas são constantemente exploradas para sua quantificação. No entanto,
um problema já citado anteriormente, também persiste usando estas técnicas: o AA também
oxida na mesma região de potencial que a dopamina. Para contornar este problema e
quantificar seletivamente a dopamina, vários artifícios podem ser localizados na literatura,
como, por exemplo, o uso de eletrodos modificados [28-30] ou o uso de surfactantes em
solução [31-33].
Explicitar todos estes exemplos se tornaria um assunto vasto e fugiria do intuito deste
trabalho. Entretanto, uma breve revisão bibliográfica foi feita destacando-se alguns destes
métodos eletroanalíticos.
A determinação de dopamina em formulações farmacêuticas foi estudada por Bezerra
et al. [14]. Eles utilizaram a análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica. Um
eletrodo de pasta de carbono foi modificado enzimaticamente constituído por 25% (m/m) de
polifenol oxidase obtido de tecido de Annona muricata L., 30 % grafite (m/m), 30 % (m/m)
8
Introdução
de silicone e 15% (m/m) de 7,7,8,7 tetracianoquinodimetano. A detecção foi feita no potencial
de 0,10 V (vs Ag/AgCl) com volume injetado de 250 µL. Como solução carregadora utilizou-
se tampão fosfato (pH 7,8) a uma vazão correspondente a 2,5 mL min
-1
. Segundo os autores, o
biossensor desenvolvido apresentou uma considerada estabilidade e reprodutibilidade,
permitindo até 500 determinações em 60 dias, sem perda significativa da atividade
enzimática. O sistema FIA apresentou resposta linear com concentrações de DA no intervalo
de 2,0 x 10
-2
a 2,0 x 10
-4
com desvio padrão relativo menor que 1,5 % (n = 10).
Utilizando voltametria, análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica e
uma célula de camada delgada com dois eletrodos de trabalho, Yeh [24] e co-autores
determinaram DA indiretamente. DA é pré-oxidada no primeiro eletrodo formando
imediatamente um aduto com um nucleófilo, eletricamente inativo (o 4-
aminobenzenosulfonato de sódio) presente no eletrólito. A corrente de redução obtida no
segundo eletrodo de trabalho (carbono vítreo) a partir do aduto formado foi utilizada para
monitorar a DA. A adição do nucleófilo tem a função de evitar a reação química entre o
produto de oxidação da dopamina (o-DQ) e o AA presente em solução. Segundo os autores, o
método apresenta um baixo valor para o limite de detecção (0,05 µmol L
-1
) e desvio padrão
relativo (0,2%) com 10 consecutivas injeções de 4,0 µmol L
-1
de padrão de dopamina e o
sistema se mantêm estável por 5 horas sem tratamento. Apesar do uso do nucleófilo, o método
continuava apresentando problemas na presença de concentrações mais elevadas de AA e a
curva analítica apresentada no trabalho foi obtida sem a presença de AA.
Matos e colaboradores [34] quantificaram simultaneamente ácido ascórbico, dopamina,
epinefrina e dipirona usando microeletrodos modificados pela eletrodeposição de diferentes
metais nobres. Quatro grupos de microeletrodos foram utilizados incluindo um eletrodo de
ouro sem modificação e eletrodos modificados com platina, paládio ou mistura de platina e
paládio. Os eletrodos foram inseridos em uma célula em fluxo e a aquisição dos dados foi
feita amperometricamente a potencial constante, com um potenciostato de quatro canais
(multipotenciostato). A interpretação dos dados foi feita quimiometricamente por calibração
multivariada, utilizando um grupo de 16 padrões com misturas selecionadas por dois níveis de
fatorial. A análise de amostras sintéticas e farmacêuticas contendo ácido ascórbico e dipirona
conduziu a valores próximos aos obtidos por iodimetria clássica.
Kachoosangi e Compton [35] descrevem um procedimento simples para a determinação
de dopamina, serotonina e ácido ascórbico utilizando um eletrodo de grafite pirolítico e
voltametria de pulso diferencial. Segundo os autores, o desempenho deste eletrodo é superior
a outros não modificados à base de carbono e também aos eletrodos modificados, em termos
9
Introdução
de limite de detecção e separação de picos (resolução) para determinação de dopamina,
serotonina e ácido ascórbico. Com o uso deste método, os autores conseguiram um limite de
detecção de 90, 60 e 200 nmol L
-1
para dopamina, serotonina e ácido ascórbico,
respectivamente. O eletrodo foi utilizado na determinação das substâncias citadas acima tanto
em amostras padrão como em amostras reais.
Em outro trabalho, a técnica de voltametria de pulso diferencial foi utilizada para
determinação do comportamento eletroquímico da dopamina e ácido ascórbico [32]. Um
eletrodo de pasta de carbono foi utilizado em solução contendo o surfactante dodecil sulfato
de sódio (SDS) com concentração próxima à concentração micelar crítica. Os autores
descrevem que, quando as análises são feitas em solução sem SDS, os potenciais de pico do
AA e DA são completamente sobrepostos. No entanto, quando a concentração de SDS é
maior que a concentração micelar crítica há uma separação entre as duas espécie analíticas (∼
240 mV). O potencial de pico da DA se torna menos positivo do que o do AA. Assim, o
método permite a determinação seletiva de DA mesmo na presença de AA. A otimização dos
parâmetros experimentais permitiu obter uma curva de calibração para a DA na presença de
AA na faixa de 0,01-0,20 mmol L
-1
, um limite de detecção de 5,0 mol L
-1
e 0, 04812 A
mol L
-1
de sensibilidade. De acordo com os autores, esta nova abordagem se mostrou eficaz
para a determinação de DA em amostras reais.
Vários outros métodos são citados na literatura para a determinação de DA, mas em
geral, todos apresentam inconveniências, tais como, necessidade de pré-tratamento da amostra
ou etapas dispendiosas para modificação prévia do eletrodo de trabalho ou ainda adição de
substâncias ao eletrólito para promover a separação entre o potencial de oxidação da
dopamina e de seus interferentes.
1.3 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS ASCÓRBICO E ÚRICO
Assim como a DA e o AA, o AU também está presente em fluidos fisiológicos. Em
alguns fluidos coexistem AA e AU. Como exemplo, podemos citar a urina, cujo nível de
concentração de AU [36] é próximo a 450,0 µmol L
-1
e de AA entre 570,0-3400,0 µmol L
-1
.
Devido à importância biológica destes dois compostos, e considerando o fato de ambos se
oxidarem em potenciais muito próximos, o desenvolvimento de novas metodologias sensíveis
e seletivas são requeridas para quantificação de AU e AA.
Na literatura, alguns trabalhos podem ser localizados onde a determinação de AA e
AU é o foco do trabalho.
10
Introdução
Usando análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica, Angnes et al [37]
demonstraram a possibilidade de quantificar o teor de AA e AU em amostras de urina.
Alíquotas da amostra foram injetadas sem e com tratamento enzimático com uricase (remoção
do AU) e/ou ascorbato oxidase (remoção de AA). A diferença entre as intensidades dos sinais
de corrente para a amostra com e sem tratamento enzimático é usado para a quantificação dos
compostos. A quantificação foi possível usando o método de adição de padrão.
Um sensor fabricado pela eletropolimerização de 4-(2-piridilazo)-resorcinol [38] sobre
um eletrodo de carbono vítreo foi usado para quantificação de AU na presença de AA, usando
voltametria de pulso diferencial. Segundo os autores, utilizando este sensor os dois
compostos podem ser separados, apresentando uma diferença de potencial de 345 mV a uma
taxa de varredura de 100 mV s
-1
. O pico de corrente de oxidação do AU aumenta linearmente
na faixa de concentração de 1,0 x 10
-8
– 5,0 x 10
-5
mol L
-1
e o limite de detecção do AU
calculado foi 1,0 x 10
-9
mol L
-1
. O método também foi aplicado para determinação de ácido
úrico em amostras de urina humana.
Eletrodos de carbono vítreo modificados com ácido glutâmico [39] foram aplicados na
oxidação catalítica de ácido úrico e ácido ascórbico. Segundo os autores, o eletrodo
modificado resolveu o problema da sobreposição dos sinais das espécies analíticas,
apresentando picos voltamétricos bem definidos, tanto por voltametria cíclica quanto por
pulso diferencial. A faixa de linearidade obtida para AU e AA foi de 2,0 x 10
-6
a 4,0 x 10
-4
mol L
-1
(R=0,996) e de 1,0 x10
-6
a 4,0 x 10
-4
mol L
-1
(R=0,997), respectivamente. O eletrodo
modificado mostrou melhora nos valores de sensibilidade, seletividade e estabilidade.
Em outro trabalho, Polímeros de N,N-dimetilalanina foram eletroquimicamente
depositados [40] sobre eletrodos de pasta de carbono, formando filmes positivamente
carregados devido ao grupo amônio quaternário presente no polímero. Com esta característica
catiônica, o filme pré-concentrava AA e AU, que em pH 7,0, encontram-se carregados
negativamente, facilitando o processo de oxidação para regiões mais negativas de potencial.
Concomitantemente, foram observados maiores níveis de corrente e ausência de
envenenamento, sendo que o efeito foi mais pronunciado para o AU. A determinação deste
último foi efetuada com bons resultados de reprodutibilidade e sensibilidade. O limite de
detecção do AU na presença de um excesso de AA (160 vezes mais) foi calculado,
encontrando-se o valor de 1,25 mol L
-1
.
A quantificação de AA [41] na presença de AU também foi realizada usando um
sistema com eletrodo de pasta de carbono modificado com um filme polimérico de 3,4
dihidroxibenzaldeído. A curva de calibração apresentou-se linear na faixa de concentração de
11
Introdução
0,7 mol L
-1
a 1,0 mmol L
-1
. Foi obtida melhora da sensibilidade, associada à diminuição de
sobrepotencial de oxidação do AA.
Retornando-se à questão da importância do monitoramento da DA, tanto em sistemas
biológicos, como em amostras farmacêuticas, assim como o monitoramento do AA e do AU
em amostras biológicas, o desenvolvimento de metodologias de fácil execução, de custo
moderado e com alta freqüência analítica para a determinação da destes compostos é de
fundamental importância. Neste âmbito, a Análise por Injeção em Fluxo associada com
Amperometria de Múltiplos Pulsos representa uma ferramenta útil na busca destas
metodologias.
1.4 ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO (FIA)
Os sistemas de Análise por Injeção em Fluxo - FIA (do inglês “Flow Injection
Analysis”) tiveram sua proposta e desenvolvimento inicial a partir de uma criativa
combinação de características de métodos analíticos já existentes tais como técnicas
eletroquímicas, espectroscopia de absorção atômica, espectrofotometria, fluorescência,
quimiluminescência, bem como, aperfeiçoamento do método de análise em fluxo segmentado.
Em pouco tempo, mostrou-se uma ferramenta muito útil para diversas determinações
analíticas [2].
Esta técnica foi desenvolvida por Rüzicka & Hansen em 1975 e tornou-se uma das mais
populares técnicas analíticas para aplicações dentro de um curto período de tempo devido às
suas diversas vantagens, como simplicidade na instrumentação, economia no consumo de
amostra e reagente, eliminação de algumas possibilidades de contaminação, diminuição da
manipulação das amostras por parte do analista, melhor precisão, diminuição do custo
operacional e aumento na velocidade de processamento [42].
O processo de análise por injeção em fluxo pode ser dividido em três partes: propulsão
dos fluidos, injeção da amostra e detecção. Para fazer a propulsão em sistemas FIA
comumente se utiliza bombas peristálticas. Esta deve possuir um torque suficiente para
manter a vazão constante, mesmo que ocorram alterações (de percurso, por exemplo) no
sistema [43]. O uso das bombas peristálticas apresenta limitações devido ao seu alto custo e a
sensibilidade a vazão quando se deseja trabalhar com detectores voltamétricos e
amperométricos, pois há uma intensa geração de ruídos na linha base proveniente do sistema
de roletes de propulsão (pulsação) fornecido pela bomba [44]. Uma alternativa para diminuir
os ruídos da linha base é o uso de amortecedores de pulsos ou a utilização de bombas tipo
12
Introdução
seringa [45, 46] ou gravidade [47, 48]. Entre estas opções, o uso da gravidade é inconveniente
quando se deseja alterar a vazão de um valor preciso a outro. Uma alternativa de baixo custo
foi desenvolvida por Matos e colaboradores [44]. Os autores descrevem o uso de um mini-
compressor de ar do tipo bomba de diafragma, cuja função primeira era destinada a
oxigenação de aquários domésticos. Segundo os autores, este sistema é uma alternativa
versátil, de baixo custo, que permite ajuste continuo da vazão em largo intervalo, assim como
operação com vários canais, sempre com a vantagem da ausência de pulsação do fluido
carregador. Este sistema apresenta algumas desvantagens tais como: necessidade de pausa na
operação para preenchimento do frasco; necessidade de reajuste da vazão após modificações
no circuito (alteração da vazão hidrodinâmica); obstrução da válvula de ajuste de vazão por
partículas maiores; necessidade de válvula adicional para operação no modo stopped flow;
maior susceptibilidade a flutuações na tensão da rede elétrica, na temperatura ambiente ou na
viscosidade dos fluidos injetados. Outro trabalho disponibilizado na literatura recentemente
[49] faz uso da resistência gerada por uma coluna de água para controlar a vazão em sistemas
em fluxo. O sistema se mostra eficiente quanto à linearidade entre a vazão e a altura da coluna
de água utilizada.
Outro sistema que é parte integrante do sistema FIA é o injetor. Sua função é introduzir
um volume definido e reprodutível de uma amostra em um fluxo de reagentes ou de um
transportador adequado. Diversos tipos de injetores são relatados na literatura, sendo os mais
comuns os de válvula rotatória desenvolvido por Ruzicka e Hansen [50] e o injetor
desenvolvido por pesquisadores do CENA/USP [51]. Esse injetor é constituído por três peças
de acrílico, sendo duas fixas e uma peça central móvel, que por meio de movimentos para
frente e para trás, coleta e insere a amostra no percurso analítico.
Após a injeção da amostra em um fluxo transportador tem-se um perfil de concentração
retangular (Figura 1.6a). Conforme uma alíquota da amostra flui em direção ao detector, ela
se dispersa através do fluido transportador (Figura 1.6b). O processo de dispersão ocorre
como resultado do processo de convecção, ou seja, o fluxo laminar faz com que o centro do
fluido se movimente mais rápido do que sua fração próxima às paredes dos tubos. Outro fator
é a difusão por concentração, que também provoca alterações no perfil de concentração da
alíquota injetada [2].
13
Introdução
Figura 1.6: (a) perfil apresentado imediatamente após a introdução da amostra. (b) perfil
da amostra, após o processo de dispersão.
O ultimo processo do sistema FIA compreende a detecção analítica. Vários sistemas de
detecção são empregados em sistemas FIA. Como exemplo, podemos citar absorção atômica
[52, 53], fluorescência [54], quimiluminescência [55-57], amperometria [58, 59], voltametria
[60, 61], entre outros.
1.5 TÉCNICAS VOLTAMÉTRICAS
As técnicas voltamétricas abrangem um conjunto de técnicas eletroquímicas onde o
controle do potencial é feito no eletrodo de trabalho. Para que este controle seja possível, uma
diferença de potencial é aplicada entre o eletrodo de trabalho (ET) e um eletrodo de referência
(ER) cujo potencial químico é conhecido e constante. Para que o potencial se mantenha
constante no eletrodo de referência durante os experimentos, a corrente gerada pelo sistema
flui entre os eletrodos de trabalho e auxiliar (arranjo eletrônico).
O potencial aplicado entre o ET e o ER é em forma de varredura, isto é, varia-se o
potencial em função do tempo. O potencial e a corrente resultante são registrados
simultaneamente. A curva de corrente vs potencial obtida é denominada voltamograma.
Dentre as técnicas voltamétricas podemos destacar as lineares (voltametria linear e cíclica) e
as de pulsos (pulso normal, diferencial e de onda quadrada). Estas técnicas baseiam-se nos
fenômenos que ocorrem na interface entre a superfície do ET e a camada fina da solução
adjacente a essa superfície, denominada camada de Nernst. Esta camada surge de um
gradiente de concentração próximo à superfície do eletrodo devido ao consumo ou origem de
espécies eletroativas nesta área. Portanto, a concentração nesta camada difere da concentração
existente no seio da solução. Para que a relação entre o sinal eletroquímico medido e
concentração da espécie analítica de interesse seja linear é indispensável que a velocidade do
transporte de massa nesta camada seja constante. O artifício usado para atingir este objetivo é
o uso de um eletrólito inerte cuja concentração seja pelo menos 50 vezes superior ao das
espécies analíticas de interesse, sendo que este eletrólito deve estar presente nas amostras e
14
Introdução
nas soluções padrão. Com isso, a mesma força iônica é mantida, minimizando variações na
região da dupla camada elétrica e garantindo que o sinal transiente registrado possa ser
atribuído ao processo faradaico preferencialmente controlado por difusão e minimizando o
efeito de migração.
Existem três formas pelo qual o transporte de massa pode ocorrer: difusão, migração e
convecção [62]. A difusão é criada pela diferença de concentração entre as espécies próximas
a superfície do eletrodo e o seio da solução; a migração deve-se à movimentação de espécies
iônicas devido à ação de um campo elétrico e a convecção consiste na movimentação de
espécies iônicas ou neutras devido à agitação mecânica da solução (sistemas hidrodinâmicos)
ou em função de um gradiente de temperatura.
Dois tipos de processos podem conduzir corrente através da interface eletrodo/solução:
a corrente faradaica e a corrente não faradaica ou capacitiva [63]. A origem da corrente
faradaica está na transferência de elétrons entre o ET e as espécies eletroativas da solução.
Este processo obedece à lei de Faraday, a qual determina que a corrente é proporcional a
quantidade de reagentes formados ou consumidos no eletrodo. A corrente capacitiva é gerada
pela dupla camada elétrica formada na interface eletrodo/solução devido a uma variação de
potencial ou até mesmo a potencial constante, caso a capacitância do eletrodo estiver
mudando por alguma razão, que pode ser pela mudança de área do eletrodo ou pela variação
de temperatura. Esta corrente não depende de nenhuma reação química.
A seguir um breve resumo sobre as duas técnicas eletroquímicas utilizadas neste
trabalho.
1.5.1 Voltametria Cíclica
Os principais atributos responsáveis pela popularização, em diversas áreas de aplicação,
da técnica de voltametria cíclica são facilidade de utilização e versatilidade. Frequentemente,
a voltametria cíclica é o primeiro experimento a ser realizado quando se deseja estudar o
comportamento eletroquímico de um composto ou a superfície de um eletrodo [64], pois
permite verificar rapidamente o comportamento redox de um sistema em um intervalo de
potencial.
A voltametria cíclica é uma técnica em que se estuda a relação potencial-corrente
(Figura 1.7B), em uma célula voltamétrica apropriada quando submetida a uma varredura de
potencial cíclico e linear (Figura 1.7A).
15
Introdução
Figura 1.7: (A) Esquema da varredura do potencial vs tempo. (B) Voltamograma da corrente
obtida em função do potencial.
Normalmente, a célula voltamétrica é constituída por três eletrodos: um eletrodo de
trabalho (polarizável, ou seja, assume o potencial que lhe é aplicado), um eletrodo de
referência (Ag/AgCl ou de calomelano) e um eletrodo auxiliar ou contra-eletrodo (fio ou
placa de platina). Esses eletrodos se encontram imersos em uma solução da espécie eletroativa
de interesse (espécie analítica) contendo um excesso de um eletrólito inerte (eletrólito
suporte) responsável por diminuir a resistência da solução e garantir o controle difusional das
espécies. Esses três eletrodos são conectados a um potenciostato que aplica potenciais num
intervalo pré-definido e faz a aquisição do sinal de corrente. A análise dos voltamogramas
cíclicos indica em que região de potencial ocorre determinada reação de oxidação e/ou
redução de compostos eletroativos, além de indicar informações a respeito da reversibilidade
destes compostos, da quantidade de elétrons envolvidos, da possível formação de espécies
intermediarias e se o sistema é controlado por processos difusionais ou adsortivos. Deve-se
enfatizar, porém, que a técnica gera em muitas situações somente resultados qualitativos de
diagnósticos das reações eletroquímicas. Medidas quantitativas mais precisas são comumente
obtidas com o emprego de técnicas de pulso [65].
1.5.2 Amperometria
Um sensor amperométrico mede uma corrente a um potencial aplicado fixo, isto é, para
um ponto na curva de corrente-potencial. Um sensor voltamétrico registra vários pontos em
uma região selecionada do perfil corrente-potencial. Portanto, um sensor amperométrico é um
sensor voltamétrico para um potencial fixo [66].
16
Introdução
Na detecção amperométrica a potencial constante, um potencial é aplicado no eletrodo
de trabalho e, uma reação de oxidação ou de redução de uma espécie analítica em solução
ocorre. Este tipo de detecção é amplamente utilizada, conforme relatado na literatura [67-74].
Uma limitação desta técnica é a falta de repetibilidade devido à adsorção de alguns
subprodutos e/ou impurezas na superfície do eletrodo. Como por exemplo, na determinação
eletroquímica de fenóis e de derivados fenólicos [75], onde ocorre a contaminação ou a
passivação do eletrodo, comprometendo, assim, a taxa de transferência de carga entre o
eletrodo e a espécie analítica de interesse. Além disto, também podem aparecer sinais
eletroquímicos provenientes de subprodutos de reações que interferem no sinal de interesse na
análise. Para a obtenção de resultados reprodutíveis durante a análise, a superfície do eletrodo
deve ser limpa com frequência, quer pelo polimento mecânico ou por um procedimento de
limpeza eletroquímica [42].
Na literatura, diversas estratégias são apresentadas para promover a limpeza da
superfície do eletrodo de trabalho ou impedir sua contaminação ou passivação, tais como,
adição de EDTA ao eletrólito suporte [75], o uso de eletrodos modificados [76, 77] ou
regeneração da superfície do eletrodo realizada constantemente (“on line”) [78]. O sistema
FIA acoplado à detecção amperométrica, em muitos casos, minimiza o problema da
contaminação da superfície do eletrodo, uma vez que pequenos volumes da amostra são
injetados (em geral na ordem de alguns L). Assim, a contaminação pode levar mais tempo
para ocorrer. Além disto, a amostra não permanece em contato com o eletrodo em tempo
integral (sinais transientes), o que contribui para que o eletrodo permaneça limpo por um
período de tempo maior.
Este modo de detecção (amperometria a E
constante
) não é viável quando o objetivo é a
determinação simultânea de compostos eletroativos em potenciais redox distintos. Quando a
diferença de potencial envolvida entre os compostos de interesse é suficientemente grande,
superior a 0,1 V [79], é possível contornar esta limitação realizando-se medidas do sinal
amperométrico em dois pulsos de potenciais distintos:
1
0
) em E
1
, somente uma das espécies é reduzida ou oxidada, sendo o sinal de corrente
proporcional à concentração desta espécie eletroativa.
2
0
) em E
2
, ambas as espécies sofrem processo de oxidação ou redução.
A diferença entre o sinal de corrente obtido em ambos os potenciais permite a
quantificação da 2
a
espécie eletroativa. Essa medida pode ser também realizada
simultaneamente utilizando-se uma célula em fluxo com dois eletrodos de trabalho (ou
17
Introdução
sensores) em paralelo. Nesse caso, um bi-potenciostato é normalmente exigido para controlar
o potencial de cada eletrodo de trabalho [80].
A Amperometria de Múltiplos Pulsos (AMP) acoplada a um sistema FIA representa
uma alternativa para prevenir a contaminação do eletrodo e analisar compostos eletroativos
[81, 82]. Esta técnica permite a aquisição seqüencial de até 10 amperogramas vs tempo em até
10 potenciais diferentes com pulsos de curta duração (mínimo de 30 ms) usando, por
exemplo, o software GPES comercializado pela empresa Metrohm - Autolab.
Conforme descrito na literatura, este tipo de detecção quando acoplada à CLAE é
basicamente utilizada para manter a reprodutibilidade de sinal (constante limpeza
eletroquímica da superfície do eletrodo) durante uma análise cromatográfica [83, 84].
Ultimamente, este tipo de detecção também vem sendo explorada no modo gerador-coletor
[85]. Este modo consiste em aplicar pulsos de potencial em sequência e monitorar
simultaneamente o sinal eletroquímico da espécie analítica em um potencial, assim como de
seu produto formado na reação eletroquímica em outro potencial. Além disso, pode-se ainda
aplicar um terceiro E para constante limpeza eletroquímica do eletrodo. Esta técnica
possibilita também a quantificação seletiva de dois compostos eletroativos presentes em uma
mesma amostra [81, 82]. Um composto é diretamente detectado em um primeiro pulso de
potencial (sem interferência da outra espécie). Em um segundo pulso de potencial (de maior
energia), ambos os compostos presentes na amostra são oxidados e o segundo composto é
detectado indiretamente (3º pulso de potencial) pela redução do produto eletroquimicamente
gerado no potencial anterior (detecção seletiva da segunda espécie).
A corrente amperométrica monitorada durante a aplicação de um pulso de E é
governada por dois componentes de corrente, a saber: a corrente capacitiva, I
C
(referente ao
carregamento da dupla camada elétrica quando um potencial é aplicado e não envolve a
ocorrência de nenhuma reação química) e a corrente faradaica, I
F
(referente a processos
eletroquímicos que ocorrem na interface eletrodo-solução) [86]. Quando há na solução
espécies que podem ser oxidadas ou reduzidas no eletrodo há a geração da I
F
. Assim, numa
detecção amperometrica em fluxo, quando apenas a solução carregadora inerte estiver
passando através da célula eletroquímica, a magnitude de I
F
dependerá da concentração de
impurezas eletroativas presentes na solução, que em geral são baixas. Por outro lado, quando
a zona da amostra passa através da célula eletroquímica, a magnitude de I
F
é governada pela
quantidade de espécie analítica que chega a superfície do detector eletroquímico.
A dependência da I
F
e de I
C
com o tempo de aplicação do pulso de potenciais são
diferentes. A I
C
é alta no inicio da aplicação do pulso de potencial, mas diminui
18
Introdução
exponencialmente com o tempo de aplicação do pulso (I
C
α e
-t
). Em uma solução que contém
um espécie analítica eletroativa, a dependência da corrente faradaica com o tempo de
aplicação do pulso depende das condições do transporte de massa do espécie analítica em
direção ao eletrodo. Em condições estacionárias, a corrente faradaica diminui mais lentamente
com o tempo de aplicação do pulso (I
F
α t
1/2
) quando comparada com a corrente capacitiva. Já
em fluxo contínuo e constante, a corrente faradaica mantém-se constante. Portanto, se a vazão
da solução carregadora contendo a alíquota da amostra é mantida constante, a taxa do
transporte de massa será constante, e por conseqüência, a magnitude da corrente faradaica
dependerá somente da concentração da espécie analítica na zona de amostra que alcança o
eletrodo. Considerando-se a dependência da corrente faradaica e da corrente capacitiva com o
tempo de aplicação do pulso, tem-se que, quanto maior o tempo de aplicação do pulso de
potencial, menor será a contribuição de I
C
na corrente amperométrica total monitorada.
Entretanto, deve-se ressaltar que, apesar da contribuição de I
C
ser maior quando pulsos de
potenciais são aplicados por curtos períodos de tempo, esta contribuição não afetará o sinal
amperométrico de interesse, pois, a corrente amperométrica está sendo medida
continuamente, antes, durante e após a passagem da zona da amostra. Dessa forma, a
contribuição de I
C
será a mesma antes, durante e após a passagem da zona da amostra, que
contém a espécie analítica de interesse. Por conseqüência, durante a passagem da zona da
amostra, monitora-se somente a contribuição da I
F
(devido à espécie analítica) para o sinal
amperométrico. Como a corrente faradaica depende somente da concentração da espécie
analítica no fluido de solução que passa através do eletrodo, o tempo de aplicação do pulso de
E governará a quantidade da espécie analítica que reagirá no eletrodo.
Levando em consideração o potencial na AMP acoplada a sistemas FIA, o
desenvolvimento de novas metodologias de análise se torna vantajosa, uma vez que custo
reduzido, bons resultados de reprodutibilidade, seletividade e sensibilidade, menor tempo de
análise e maior simplicidade na execução da metodologia são algumas características desta
detecção.
19
Introdução
1.6 PARÂMETROS DE MÉRITO UTILIZADOS NA
METODOLOGIA PROPOSTA
Os procedimentos analíticos são caracterizados por inúmeros parâmetros de mérito, tais
como sensibilidade, limite de detecção e quantificação, dentre outros. A seguir uma breve
descrição dos parâmetros
[87-90]
utilizados no presente trabalho.
Sensibilidade
A definição mais frequentemente utilizada de sensibilidade é a sensibilidade da
calibração, ou a variação no sinal de resposta pela variação da unidade de concentração da
espécie analítica. A sensibilidade da calibração é, portanto a inclinação da curva analítica. Se
a curva analítica for linear, a sensibilidade será constante e independente da concentração. Se
a curva analítica não for linear, a sensibilidade variará com a concentração e não tem um valor
único.
A sensibilidade da calibração não indica as diferenças de concentração que podem ser
detectadas. O ruído presente nos sinais de resposta precisa ser considerado a fim de que se
possam expressar quantitativamente as diferenças passíveis de serem detectadas. Por essa
razão, algumas vezes o termo sensibilidade analítica é utilizado.
A sensibilidade depende da natureza da espécie analítica e da técnica de detecção
utilizada.
Especificidade e Seletividade
Uma amostra, de maneira geral, consiste nas espécies analíticas a serem medidas, da
matriz e de outros componentes que podem ter algum efeito na medição, mas que não se quer
quantificar. A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao evento da detecção. Um
método que produz resposta para apenas um analito é chamado específico. Um método que
produz respostas para vários analitos, mas que pode distinguir a resposta de um analito da de
outros, é chamado seletivo. Entretanto, os termos especificidade e seletividade são
freqüentemente utilizados indistintamente ou com diferentes interpretações.
Na prática, a seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de
avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de componentes que
podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade avalia o
20
Introdução
grau de interferência de espécies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e
produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades similares que possam
estar, porventura, presentes. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente
do composto de interesse
Linearidade
Linearidade corresponde à capacidade de um método analítico em produzir resultados
que sejam diretamente proporcionais à concentração da espécie analítica em uma dada faixa
de concentração.
A correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a massa ou concentração
da espécie a ser quantificada muito raramente é conhecida a priori. Na maior parte dos casos,
a relação matemática entre o sinal e a concentração ou massa da espécie de interesse deve ser
determinada empiricamente, a partir de sinais medidos para massas ou concentrações
conhecidas dessa espécie.
Essa relação matemática, muitas vezes, pode ser expressa como
uma equação de reta chamada de curva analítica.
A equação da reta que relaciona as duas variáveis é:
y = ax + b
Onde:
y = resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc.);
x = concentração;
a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x=0.
O coeficiente de correlação linear (R) permite uma estimativa da qualidade da curva
obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor é a dispersão do conjunto de pontos
experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.
A relação linear descrita pela equação da reta só é válida em um determinado intervalo
de massa ou concentração da espécie medida. Este intervalo de massas ou concentrações, no
qual se pode construir uma curva analítica linear, é a faixa linear dinâmica.
Para definição da faixa linear de resposta necessita-se de pelo menos cinco níveis
crescentes de concentração, no mínimo três análises de cada concentração, com estimativa do
desvio padrão relativo inferior a 5%.
21
Introdução
Limite de Detecção
Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis da espécie analítica ou
de uma propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o menor
valor de concentração da espécie analítica ou da propriedade que pode ser detectado pelo
método. Portanto, o limite de detecção (LD) é a menor concentração da espécie analítica que
pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais
estabelecidas. Toda técnica analítica tem um limite de detecção. Para os métodos que
empregam uma curva analítica, o limite de detecção pode ser expresso como:
onde,
S
b
= desvio padrão relativo do branco;
a= coeficiente angular da curva analítica ou sensibilidade da calibração.
Limite de Quantificação
O Limite de Quantificação (LQ) é a menor concentração da espécie analítica que pode
ser determinada com um nível aceitável de precisão (concordância entre os vários resultados
obtidos da mesma forma) e exatidão (é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em
estudo em relação ao valor verdadeiro).
A determinação do LQ representa um compromisso entre a concentração, a precisão e a
exatidão. Isto significa que, quando decresce o nível de concentração do LQ, a medição torna-
se menos precisa. Se houver necessidade de maior precisão, uma concentração maior deve ser
registrada para o LQ.
O LQ pode ser calculado multiplicando o LD por 3,33.
Repetibilidade
É o grau de concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo
mensurando, efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas de condições de
repetitividade a seguir: mesmo procedimento de medição; mesmo observador; mesmo
22
Introdução
instrumento usado sob mesmas condições; mesmo local, e repetições em curto espaço de
tempo.
A repetibilidade do método é verificada contemplando uma faixa de concentração
dentro do intervalo linear do método e pode ser expressa como o desvio padrão ou desvio
padrão relativo de uma série de medidas. O desvio padrão relativo é calculado pela razão
entre o desvio padrão das respostas analíticas pela media das medidas e o resultado
multiplicado por 100.
Recuperação
A recuperação (ou fator de recuperação) é definida como a proporção da quantidade da
substância de interesse, presente ou adicionada (Spike) na porção analítica do material teste,
que é extraída e passível de ser quantificada.
A limitação do procedimento de recuperação é a de que a substância adicionada não
está, necessariamente, na mesma forma que a presente na amostra. Isso pode implicar, por
exemplo, a presença de substâncias adicionadas em uma forma que proporcione melhor
detecção, ocasionando avaliações excessivamente otimistas da recuperação. Pelo fato de
outros componentes da matriz em interferir na separação, detecção ou na quantificação da
substância, efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados.
É importante considerar como a eficiência do método varia em função da concentração
da substância. Na maioria dos casos, a dispersão dos resultados aumenta com a diminuição da
concentração e a recuperação pode diferir substancialmente a altas e baixas concentrações.
Por esse motivo, a recuperação deve ser avaliada na faixa de concentração esperada para o
composto de interesse. Isto pode ser feito adicionando a substância em pelo menos três
diferentes concentrações, por exemplo, próximo ao limite de quantificação, próximo à
concentração máxima permitida pelo método em teste e em uma concentração próxima à
média da faixa de uso do método.
23
Objetivos
1.7 OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi aplicar a técnica AMP acoplada a sistemas FIA para
análise de espécies sem a necessidade de etapas morosas para a preparação da amostra ou
modificação química/eletroquímica da superfície do eletrodo. Neste contexto, o foco do
trabalho foi direcionado para espécies analíticas de interesse farmacêutico e/ou biológico:
• Determinação de dopamina na presença de altas concentrações de ácido
ascórbico;
• Determinação de dopamina na presença de ácido ascórbico e ácido úrico;
• Determinação simultânea de ácido ascórbico e ácido úrico;
Diversos parâmetros foram estudados para que os objetivos fossem alcançados:
- Comportamento eletroquímico das espécies analíticas de interesse.
- Sistema FIA: vazão e volume de amostra a ser injetado.
- Detecção amperométrica: pulsos de potenciais a serem aplicados e tempos de
aplicação de cada pulso.
- Seletividade e estabilidade dos métodos.
P
ARTE
2
P
ROCEDIMENTO
E
XPERIMENTAL
25
Procedimentos Experimentais
2.1. REAGENTES
Todos os reagentes utilizados nos experimentos são de pureza analítica (Merck , Sigma-
Aldrich, Synth, Vetec, Reagen) e foram utilizados sem purificação prévia.
2.2. SOLUÇÕES
Todas as soluções foram preparadas com água deionizada (resistividade superior a 18
cm
-1
) obtida de sistema de purificação Milli-Q.plus (Millipore).
Solução tampão de ácido acético / acetato 0,10 mol L
-1
: a solução foi preparada a
partir de 4,10 g de acetato de sódio anidro e 3,0 mL de ácido acético. Os reagentes foram
transferidos quantitativamente para um balão volumétrico de 1000,0 mL e o volume
completado com água deionizada.
Solução de ácido sulfúrico 0,20 mol L
-1
: transferiram-se 22,0 mL de H
2
SO
4
concentrado para um balão volumétrico de 2000,0 mL e completou-se o volume com água
deionizada.
Solução de Hidróxido de Sódio 0,10 mol L
-1
: pesou-se 0,40 g do hidróxido de sódio e
completou-se o volume de 100,0 mL de um balão volumétrico com água deionizada. Esta
solução foi utilizada para fazer o estoque da solução de ácido úrico.
Solução estoque de Dopamina 0,01 mol L
-1
: foi preparada pesando-se 0,0115 g de
hidrocloreto de dopamina, transferiu-se quantitativamente a massa para um balão
volumétrico de 5,0 mL e completou-se o volume com água deionizada para posterior diluição
no tampão ou eletrólito correspondente.
Solução estoque de ácido ascórbico 0,10 mol L
-1
: pesaram-se 0,18 g de ácido
ascórbico, transferiu-se quantitativamente a massa para um balão volumétrico de 10,0 mL e
completou-se o volume com água deionizada para posterior diluição em solução tampão ou
eletrólito correspondente.
26
Procedimentos Experimentais
Solução estoque de ácido úrico 0,02 mol L
-1
: pesou-se a massa de 0,0336 g e
transferiu-se para um balão volumétrico de 10,0 mL e completou-se o volume com uma
solução de NaOH 0,10 mol L
-1
. Posteriormente, a solução foi diluída em eletrólito ou solução
tampão.
Solução estoque da amostra de Dopamina: Determinou-se dopamina na amostra do
medicamento genérico injetável Cloridrato de Dopamina da marca Hipolabor. A solução foi
preparada dissolvendo-se diretamente 385,0 L do medicamento em um balão volumétrico de
10,0 mL e completou-se o volume com água deionizada, obtendo-se assim uma solução
estoque com concentração final de 1,0 mmol L
-1
, de acordo com o rótulo. A solução
posteriormente foi diluída em eletrólito.
Amostra padrão de ácido ascórbico e ácido úrico: uma amostra padrão contendo
simultaneamente ácido ascórbico e ácido úrico foi gerada no próprio laboratório. A amostra
foi preparada pesando-se 0,09 g de ácido ascórbico e 0,0168 g de AU (dissolvida em 5,00 mL
de NaOH 0,10 mol L
-1
), transferiu-se quantitativamente a massa de AA e a solução de AU
para um balão volumétrico de 10,0 mL e completou o volume com água deionizada, obtendo-
se assim uma solução de 0,50 mol L
-1
de AA e 0,01 mol L
-1
de AU. Para a análise diluiu-se
quantidade adequada desta amostra em eletrólito.
2.3. INSTRUMENTAÇÃO
Equipamentos utilizados
Para a realização das medidas voltamétricas e amperométricas foi utilizado o
equipamento Potenciostato/Galvanostato da Autolab modelo AUTOLAB tipo III,
interfaceado a um micro computador através do software GPES 4.9.
Nas medidas em fluxo, utilizou-se um sistema de controle de vazão da solução
carregadora (H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
) desenvolvido no próprio laboratório [91] que consiste em
um mini-compressor de ar acoplado a uma coluna d’água apresentado na Figura 2.1. Um
injetor manual (Cena/USP) e um detector eletroquímico (construído no próprio laboratório)
27
Procedimentos Experimentais
também foram utilizados. Antes da detecção analítica, eventuais bolhas de ar eram removidas
por uma célula de permeação gasosa [92].
Os dados obtidos foram tratados com uso do software Origin Lab 5.0.
Figura 2.1
: Esquema de montagem para utilização da pressão gerada por uma coluna de água
para controle de vazão de sistemas em fluxo. (A) Mini-compressor de ar; (B, C) Válvulas
usadas em aquarismo para divisão e controle de fluxo de ar; (D) Junção de acrílico tipo T; (E)
Tubo de PVC – coluna de água; (F) Reservatório do carregador; (G) Vista ampliada da
conexão do tubo de polietileno ao reservatório com eletrólito.
Células Eletroquímicas
Nas medidas eletroquímicas estacionárias utilizou-se uma célula eletroquímica
convencional de acrílico com capacidade para 7,0 mL. Nas medidas amperométricas em fluxo
utilizou-se uma célula eletroquímica do tipo “wall-jet” com três eletrodos, a qual foi
construída no próprio laboratório (Figura 2.2).
Figura 2.2: Célula eletroquímica de três eletrodos (tipo “wall- jet”). (EA) eletrodo auxiliar;
(ER) eletrodo referência;
(ET)
eletrodo de trabalho.
28
Procedimentos Experimentais
Eletrodo de Trabalho
Utilizou-se um eletrodo de carbono vítreo comercial adquirido da empresa Metrohm
com 3,0 mm de diâmetro para as medidas voltamétricas e amperométricas.
Na limpeza deste eletrodo usou-se o polimento manual com alumina (granulometria 0,3
µm). O eletrodo foi lavado exaustivamente com água deionizada e posteriormente levado ao
ultra-som imerso em água deionizada (∼ 30 minutos) para retirada de resíduos de alumina.
Como teste para análise da superfície de resposta do eletrodo, assim como para sua ativação,
voltamogramas cíclicos sucessivos foram registrados em meio do eletrólito de interesse (até
obtenção de estabilidade), na faixa de potencial de -0,8 a +1,5 V e velocidade de varredura 50
mV s
-1
.
Eletrodo de Referência
Em todos os experimentos utilizou-se mini eletrodo de referência Ag/AgCl (KCl
sat.
)
[93], preparado no próprio laboratório pela eletrodeposição de AgCl em um fio de Ag através
da eletrólise de uma solução de HCl 0,10 mol L
-1
, sob corrente constante de 0,2 mA, durante 2
h, utilizando o Potenciostato/Galvanostato da Autolab modelo AUTOLAB tipo III.
% Eletrodo Auxiliar
Utilizou-se como eletrodo auxiliar, um fio de Platina.
2.4. METODOLOGIA
Voltametria cíclica
2.4.1.1 Comportamento eletroquímico da Dopamina, Ácido
Ascórbico e Ácido Úrico
A técnica de voltametria cíclica foi empregada para o estudo preliminar do
comportamento eletroquímico da Dopamina (DA), Ácido Ascórbico (AA) e Ácido Úrico
(AU). A varredura foi registrada na faixa de trabalho de -0,2 a 1,0 V vs Ag/AgCl sobre
eletrodo de carbono vítreo com velocidade de varredura de 50 mV s
-1
em meio de H
2
SO
4
29
Procedimentos Experimentais
0,20 mol L
-1
, vide item 2.2. Um estudo do comportamento de cada espécie analítica também
foi realizado com diferentes velocidades de varreduras, com taxa de variação de 10, 20, 50,
100, 200 e 500 mV s
-1
.
Amperometria de múltiplos pulsos acoplada ao sistema FIA para
determinação de dopamina na presença de altas concentrações de
ácido ascórbico
2.4.2.1 Estudo da interferência do AA na análise de DA em tampão
acetato 0,10 mol L
-1
(pH 4,7)
Para estes estudos, soluções contendo apenas DA ou apenas AA ou simultaneamente
DA e AA (90,0 µmol L
-1
de cada espécie analítica) foram injetadas em duplicata. Utilizou-se
como eletrólito suporte o tampão ácido acético/acetato 0,10 mol L
-1
, uma vazão de 2,0 mL
min
-1
, alça de amostragem de 150 µL e eletrodo de trabalho de carbono vítreo.
2.4.2.2 Estudo para otimização dos pulsos potenciais a serem
utilizados para detecção de DA na presença de AA por FIA com
detecção AMP
Tomando-se como base os resultados obtidos usando voltametria cíclica e H
2
SO
4
0,20
mol L
-1
como eletrólito para as espécies analíticas DA e AA, um estudo foi realizado para a
escolha do melhor tempo de aplicação do pulso de potencial de oxidação. Este estudo foi
realizado fixando o potencial para oxidação e variando o tempo de aplicação do mesmo
utilizando CV como eletrodo de trabalho. Uma solução contendo 10,0 µmol L
-1
de DA, foi
usada nestes estudos. O estudo do tempo foi feita na faixa entre 300 e 800ms.
Outro estudo realizado foi com o intuito de verificar o melhor potencial para redução
para análise indireta de DA usando uma solução contendo 10,0 µmol L
-1
do composto. Neste
estudo, foi utilizado o pulso de potencial referente a oxidação da DA e o tempo de aplicação
otimizado no estudo anterior. O tempo de aplicação deste pulso (redução) foi de 30 ms, pois a
intenção era de obter a melhor sensibilidade possível.
Para estes estudos utilizou-se a técnica AMP acoplada ao sistema FIA, com alça de
amostragem de 300 µL e vazão 1,0 mL min
-1
(H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
). O sistema FIA utilizado
30
Procedimentos Experimentais
em todos os estudos foi de linha única com tubos de polietileno de 0,5 ou 1,0 mm de diâmetro
interno. O sistema de análise em fluxo utilizado durante os experimentos é mostrado na
Figura 2.3.
Figura 2.3: Esquema do sistema FIA empregado nos estudos.
2.4.2.3 Otimização dos parâmetros hidrodinâmicos
Os parâmetros hidrodinâmicos analisados foram: volume injetado e vazão da solução
transportadora. Em ambos os parâmetros, analisou-se a intensidade da corrente obtida na
redução de uma solução contendo 10,0 µmol L
-1
de DA em meio de H
2
SO
4
, detectada no
potencial para redução otimizado no item 2.4.2.2..
2.4.2.4 Análise da Seletividade da Técnica AMP acoplada ao sistema
FIA para análise de DA na presença de AA
Após a otimização dos parâmetros hidrodinâmicos e potenciais de oxidação e redução,
assim como os respectivos tempos de aplicação, uma serie de injeções em duplicata de
soluções contendo somente DA, somente AA e simultaneamente DA e AA (0,1 e 1,0 mmol
L
-1
, respectivamente), foram injetadas no sistema FIA com objetivo de verificar a seletividade
do método proposto e a possibilidade da determinação de DA na presença de altas
concentrações de AA (1,0 mmol L
-1
).
31
Procedimentos Experimentais
2.2.4.5 Estudos de repetibilidade do método e interferência de AA na
análise de DA
Para avaliar a repetibilidade do método, uma série de 24 injeções sucessivas de soluções
contendo 1,0 e 0,1 mmol L
-1
de AA e DA, respectivamente, foram realizadas usando as
condições otimizadas anteriormente. O desvio padrão relativo foi calculado dividindo-se o
desvio padrão absoluto pela média dos valores das medidas de intensidade de corrente e o
resultado multiplicado por 100.
Para avaliar a concentração máxima de AA que pode estar presente em solução para
que a análise seletiva de DA continue sendo possível, partiu-se de uma solução de 100,0 µmol
L
-1
de dopamina e soluções crescentes de AA (0,25 a 16,0 mmol L
-1
) em meio de H
2
SO
4
0,2
mol L
-1
.
2.4.2.6 Estudos de quantificação, recuperação e limite de detecção
para Dopamina em amostras farmacêuticas
A potencialidade do método para análise de dopamina foi avaliada, inicialmente, com
uma curva de calibração com soluções de concentrações crescentes (n = 3) de DA (1,0-100,0
µmol L
-1
) contendo 1,0 mmol L
-1
de AA usando os parâmetros otimizados anteriormente.
Uma amostra de um fármaco contendo cloridrato de Dopamina foi analisada usando a curva
analítica gerada a partir dos dados deste experimento. Estudos de adição/recuperação também
foram realizados. O cálculo do limite de detecção (LD) foi efetuado multiplicando o desvio
padrão do branco (n = 10) por três e então dividindo o resultado pelo coeficiente angular da
curva de calibração [79]. O limite de quantificação (LQ) foi obtido multiplicando o LD por
3,33 [79].
2.4.3 Amperometria de Múltiplos Pulsos acoplada ao sistema FIA para
determinação de Dopamina na presença de AA e AU.
2.4.3.1 Estudo da I
red
para DA e da I
red
para o AU aplicando-se
diferentes potenciais de oxidação.
Estes estudos foram realizados com a injeção de soluções contendo ora 100,0 µmol L
-1
de DA e ora 2,0 mmol L
-1
de AU. Os pulsos de potenciais de oxidação foram avaliados na
32
Procedimentos Experimentais
faixa entre 0,50 e 0,80 V (700 ms). A corrente de redução foi adquirida no pulso de potencial
de 0,35 V (30 ms). O objetivo para este estudo é identificar, em meio de H
2
SO
4
, um potencial
capaz de oxidar a DA sem promover a oxidação do AU. Desta forma, também poder
quantificar DA na presença de AU. O potencial usado para este fim na presença de somente
AA (0,80 V) também promove a oxidação do AU e o produto gerado também apresenta um
sinal de redução em 0,35 V.
O tempo de aplicação do pulso de potencial para oxidação de DA na presença de AA e
AU selecionado anteriormente também foi objeto de estudo, com o objetivo de obter um
maior sinal analítico (melhor sensibilidade). Os tempos estudados variaram de 100 a 700ms.
Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram os mesmos otimizados para determinação de
DA na presença de altas concentrações de AA.
2.4.3.2 Seletividade da Técnica AMP acoplada ao sistema FIA para
determinação de DA na presença de AA e AU
Para demonstrar a potencialidade da técnica, uma serie de injeções (em triplicatas) de
soluções contendo: (a) 0,1 mmol L
-1
de DA; (b) 1,0 mmol L
-1
de AA; (c) 0,5 mmol L
-1
de AU
e (d) as três espécies analíticas nas mesmas concentrações citadas anteriormente foram
realizadas com objetivo de verificar a seletividade do método proposto e a consequente
possibilidade da determinação de DA na presença de AA e AU.
2.4.3.3 Estudo da repetibilidade do método
Para avaliar a repetibilidade do método, uma série de 15 injeções consecutivas de soluções
contendo simultaneamente 50,0 µmol L
-1
de DA, 1,0 mmol L
-1
de AA e 0,5 mmol L
-1
de AU
foram injetadas e avaliadas usando os pulsos de potenciais otimizados anteriormente. O
desvio padrão relativo foi calculado dividindo-se o desvio padrão absoluto pela média dos
valores das medidas de intensidade de corrente e o resultado multiplicado por 100.
2.4.3.4 Curva analítica para quantificação de DA na presença de AA
e AU
A curva analítica foi obtida a partir de injeções, em triplicata, no sistema FIA, de
soluções de concentrações crescentes de DA (1,0-100,0 µmol L
-1
) na presença de 1,0 mmol
L
-1
de AA e 0,5 mmol L
-1
de AU.
33
Procedimentos Experimentais
Amperometria de Múltiplos Pulsos acoplada ao sistema FIA para
determinação simultânea de AA e AU.
Analisando os voltamogramas obtidos para uma solução contendo separadamente AA e
AU em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
, apresentados no item 2.4.1.1, foram realizado estudos
para definição dos pulsos de potencial a serem utilizados para quantificação simultânea AA e
AU usando FIA com detecção por AMP. Os pulsos de potenciais estudados foram: 0,3; 0,4;
0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 e 1,0 V (por 100 ms cada). Neste estudo, soluções contendo ora 200,0
µmol L
-1
AA e ora 100,0 µmol L
-1
de AU foram injetadas a uma vazão 2,2 mL min
-1
.
Outro estudo foi realizado com o objetivo de definir o potencial onde há redução para o
produto de oxidação gerado a partir do AU (detecção indireta). Neste caso, o potencial de
oxidação otimizado anteriormente foi mantido constante e o potencial de redução com tempo
de aplicação de 30 ms (melhor sensibilidade) foi estudado em uma faixa pré-definida (+0,5;
+0,4; +0,3; +0,2; +0,1V).
2.4.4.1 Avaliação dos parâmetros hidrodinâmicos
Neste estudo parâmetros como volume injetado e vazão da solução carregadora foram
avaliados. Os volumes relacionados neste estudo foram: 50, 100, 200, 300 e 400 µL. As
vazões estudadas foram a s seguintes: 0,5, 1,0, 2,0 e 3,0 mL min
-1
. Nestes experimentos,
soluções de 200,0 µmol L
-1
de
AA e 100,0 µmol L
-1
de AU foram injetadas separadamente.
2.4.4.2 Seletividade da Técnica AMP acoplada ao Sistema FIA para
determinação de AA e AU simultaneamente
Após as otimizações dos pulsos de potenciais (oxidação e redução) e demais parâmetros
(vazão e volume injetado), um estudo para evidenciar a seletividade do método para análise
simultânea de AA e AU foi realizado. Para tanto, uma série de soluções em triplicatas foram
injetadas contendo, respectivamente, 100,0 µmol L
-1
de AU, 200,0 µmol L
-1
de AA e uma
solução contendo ambas as espécies analíticas na mesma concentração das soluções
individuais.
A fim de avaliar a repetibilidade do método proposto, uma série de 21 injeções
consecutivas de uma solução contendo simultaneamente 100,0 µmol L
-1
de AU e 200,0 µmol
L
-1
de AA foram injetadas no sistema FIA. Para este estudo calculou-se o desvio padrão
34
Procedimentos Experimentais
relativo dividindo-se o desvio padrão absoluto pela média dos valores das medidas de
intensidade de corrente e o resultado multiplicado por 100.
Outro estudo realizado foi com intuito de verificar a probabilidade de interferência de AA
na análise do AU, assim como a interferência de AU nas análises de AA. Para tanto, fixou-se
a concentração de AA em 200,0 µmol L
-1
e variou-se a concentração de AU (100,0; 200,0;
400,0 e 800,0 µmol L
-1
). O inverso também foi feito, ou seja, fixou-se a concentração de AU
em 200,0 µmol L
-1
e variou-se a concentração de AA (100,0; 200,0; 400,0 e 800,0 µmol L
-1
).
2.4.4.3 Estudos de quantificação, recuperação e limite de detecção
para AA e AU em amostras padrão
Para estes estudos partiu-se de uma curva analítica com injeções em triplicatas de
soluções contendo AA e AU nas seguintes razões de concentração (todas em µmol L
-1
)
respectivamente: 100/50; 150/75; 200/100; 250/125; 300/150. Em seguida foram injetadas 3
amostras padrão contendo simultaneamente AA e AU nas seguintes razões de concentração
(todas em µmol L
-1
), respectivamente: 110/110; 110/55; 220/55. A equação da reta calculada
a partir da curva analítica foi utilizada para determinar a concentração presente nas amostras
padrão. O cálculo do LD e LQ foi realizado de acordo com o citado no item 2.4.2.6.
P
ARTE
3
R
ESULTADOS E
D
ISCUSSÕES
36
Resultados e Discussões
3.1 ESTUDOS PARA DETERMINAÇÃO DE DOPAMINA NA
PRESENÇA DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO
ASCÓRBICO
Conforme já descrito na literatura [24], a DA pode ser quantificada seletivamente
usando uma célula de camada delgada com dois eletrodos de trabalho. A DA é oxidada no
primeiro eletrodo e quantificada no segundo através da redução do produto gerado na etapa de
oxidação. Porém, na presença de AA ocorre uma reação química (oxi-redução) entre o AA e o
produto de oxidação da DA (o-dopaminoquinona), causando um desvio negativo na curva de
analítica, impedindo a quantificação da DA. O mecanismo da oxidação eletroquímica do AA
e da DA, assim como, a reação química entre o AA e a o- dopaminoquinona (o- DQ) gerada
eletroquimicamente estão apresentados na Figura 3.1.
Figura 3.1: Mecanismo da oxidação eletroquímica da DA e do AA e a reação química entre o
AA e a o-DQ e entre o AA e a água.
37
Resultados e Discussões
Um fenômeno parecido ao descrito acima já foi relatado na literatura [94], onde há a
demonstração que existe um desvio significante do comportamento ideal da curva de
calibração catódica quando o catecol é quantificado pela redução do dehidrocatecol
eletroquimicamente gerado no primeiro eletrodo (célula de camada delgada com dois
eletrodos). Segundo este trabalho, o fenômeno ocorre devido à reação química entre
dehidrocatecol (gerado eletroquimicamente) e ascorbato presente em solução (interferente).
Segundo a literatura pode-se usar meio ácido [94] ou a adição de um nucleófilo [24, 95]
a fim de minimizar a reação entre o ascorbato e a o-DQ. Avaliando as alternativas
disponíveis, a que parece ser mais simples e acessível financeiramente é a utilização de uma
solução ácida, uma vez que está disponível em um laboratório químico comum e ser de custo
reduzido.
Comportamento eletroquímico da dopamina e do ácido ascórbico
em meio de ácido sulfúrico 0,20 mol L
-1
O comportamento eletroquímico da DA e do AA sobre eletrodo de carbono vítreo foi
estudado por voltametria cíclica. Os voltamogramas cíclicos referentes a estes dois compostos
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
são apresentados na Figura 3.2.
Figura 3.2: Voltamogramas cíclicos obtidos para soluções contendo H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sem
(a) e com a adição de (b) 1,0 mmol L
-1
de AA ou (c) 1,0 mmol L
-1
de DA. ET: CV; Faixa de
trabalho: -0,2 V a 1,0 V vs Ag/AgCl; v = 50 mV s
-1
.
Observa-se pelos voltamogramas da Figura 3.2 que as respostas voltamétricas da DA e
do AA estão bem definidas. Podemos observar que para a DA há dois picos: um em
aproximadamente +700 mV referente à sua oxidação e outro em +400 mV referente à redução
38
Resultados e Discussões
do produto gerado na etapa de oxidação (o-DQ). Com AA observa-se apenas um pico de
oxidação em torno de +800 mV.
Segundo a literatura [96], a oxidação eletroquímica da DA ocorre em solução aquosa
com um processo de transferência de dois elétrons, formando inicialmente o-
dopaminoquinona (o-DQ). Em seqüência, a amina é desprotonada, podendo ocorrer a reação
de ciclização, formando a leucodopaminocromo (LDC). Estas espécies são mais facilmente
oxidadas que DA e podem oxidar-se com uma etapa que envolve a transferência de dois
elétrons para dopaminocromo (DC).
O mecanismo do comportamento eletroquímico da DA é apresentado na Figura 3.3, onde
estão resumidas as etapas eletroquímicas e químicas citadas acima.
Figura 3.3: Mecanismo das etapas eletroquímicas e possíveis etapas químicas para a reação
de oxidação da DA.
Pelo voltamograma apresentado na Figura 3.2 não é possível observar os dois processos
de oxidação da DA descritos pelo esquema da Figura 3.3: o processo representado pelo
mecanismo da oxidação da dopamina a o-dopaminoquinona (Figura 3.3 a) e o processo
representado pelo mecanismo da oxidação da leucodopaminocromo a dopaminocromo (Figura
3.3 c), pois o potencial eletroquímico de todas as etapas depende da concentração de íons H
+
presente na solução. Analisando a equação (a) observa-se que na oxidação da dopamina a o–
DQ há a liberação de dois elétrons e dois íons H
+
. Levando em consideração o principio de Lê
39
Resultados e Discussões
Chatelier [97], este processo é difícil de ocorrer em meio ácido onde o equilíbrio é deslocado
no sentido desfavorável a oxidação da DA. No entanto, o esquema representado pela oxidação
da dopamina a o-dopaminoquinona pode ser visualizado no voltamograma apresentado na
Fig. 3.2. Já o segundo processo de oxidação, devido ao meio fortemente ácido, não ocorre
neste meio. Os processos de oxidação da dopamina e da leucodopaminocromo podem ser
visualizados por exemplo, quando se trabalho em meio de tampão acetato (pH 4,7).
A oxidação anódica do AA é conhecido por ser um processo irreversível, com a
transferência de 2 elétrons [98]. O AA é oxidado a ácido dehidroascórbico (ADA) e os grupos
carbonílicos deste ácido podem hidratar-se gerando um composto eletricamente inativo. As
etapas deste processo estão descritas na Figura 3.4.
Figura 3.4: Mecanismo de oxidação eletroquímica do AA e da reação química entre o ADA e
a água.
Estudo da variação da velocidade de varredura da Dopamina por
Voltametria Cíclica
Um estudo relacionado à variação de velocidade de varredura para a DA foi
realizado no intervalo de 10 a 500 mV s
-1
. Os voltamogramas cíclicos deste estudo estão
apresentados na Figura 3.5. Analisando os resultados observa-se que com o aumento da
velocidade de varredura, ocorre um aumento na intensidade de corrente, de acordo com a
Tabela 3.1
40
Resultados e Discussões
Figura 3.5: Efeito da velocidade de varredura usando VC para DA 1,0 mmol L
-1
sobre ECV
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
.
Tabela 3.1: Valores de corrente anódica (I
a
) e catódica (I
c
) e potencial de pico anódico (E
a
) e
catódico (E
c
) para DA em diferentes velocidades de varredura ().
(mVs
-
1
) I
a
/µA E
a
/mV I
c
/µA E
a
/mV
10
14,3 630 -5,3 450
20
19,7 649 -8,7 420
50
30,2 664 -15,4 396
100
40,7 679 -22,0 380
200
56,8 694 -29,7 366
500
88,0 708 -45,4 347
De acordo com a equação de Randles-Sevick [63] (eq. 1), quando há uma relação linear
entre as correntes de pico e a raiz quadrada da velocidade de varredura, o processo
eletroquímico é preferencialmente controlada por difusão. Os outros termos da equação são
constantes.
Onde,
i
p
– corrente de pico em ampere (positiva: corrente anódica e negativa: corrente catódica).
n – número de elétrons envolvidos na reação redox.
A – área do eletrodo
AvDCnxi
p
2/12/1
0
2/35
10686,2±=
Equação 1
41
Resultados e Discussões
D – coeficiente de difusão (cm
2
s
-1
)
C
0
– concentração das espécies eletroativas
– velocidade de varredura (V s
-1
)
Figura 3.6: Dependência linear das correntes de pico (µA) em função da raiz quadrada da
velocidade de varredura (mV s
-1
)
1/2
para: [] pico de oxidação da DA e [] pico de redução
da DA.
Analisando o gráfico da Figura 3.6, obtido a partir dos voltamogramas da Figura 3.5,
podemos observar que há uma linearidade entre as duas variáveis descritas no gráfico. Isto
indica que a transferência de massa no processo de oxidação da DA em meio de H
2
SO
4
0,20
mol L
-1
é preferencialmente controlado por difusão.
Uso da detecção amperométrica acoplada a FIA para análise de
DA
Para detecção de DA na presença de altas concentrações de AA (1,0 mmol L
-1
), o uso da
técnica de amperometria convencional (medida de corrente com a aplicação de um E
constante) não é eficaz, pois conforme voltamogramas apresentados da Figura 3.2, há uma
sobreposição dos potenciais de oxidação da DA e AA, impossibilitando a análise seletiva de
DA. A alternativa proposta neste trabalho é usar a técnica amperometria de múltiplos pulsos
(AMP) para a determinação indireta de DA na presença de altas concentrações de AA. Esta
técnica permite a aplicação de pulsos de potenciais rápidos e sequenciais, podendo, desta
forma, operar de forma semelhante a um sistema gerador-coletor, conforme descrito na
literatura [80-82].
42
Resultados e Discussões
3.1.3.1 Escolha do potencial de oxidação da DA
Para obtenção da melhor sensibilidade na análise de DA, o pulso de potencial a ser
selecionado (oxidação) deve estar localizado na região de potencial onde ocorre a taxa
máxima de conversão de DA em o-DQ. Conforme apresentado na Figura 3.2, a DA gera um
pico de oxidação próximo a +700 mV vs Ag/AgCl. Portanto, o pulso de potencial
correspondente a +800 mV foi adotado para a oxidação da DA. Vale lembrar que neste
potencial também ocorre a oxidação do AA.
3.1.3.2 Estudo para definição do tempo de aplicação do pulso de
potencial para oxidação da DA (geração da o-DQ)
Conforme já descrito na literatura, a dependência de corrente faradaica e da corrente
amperométrica com o tempo de aplicação do pulso de potencial é diferente. Considerando
isto, um estudo do tempo de aplicação do potencial de oxidação da dopamina (+800 mV) foi
avaliado.
Na Figura 3.7 encontra-se o gráfico de intensidade de corrente de oxidação para uma
solução de 10,0 µmol L
-1
de DA em função do tempo de aplicação do pulso de potencial
(+800 mV).
Figura 3.7: Intensidade de corrente obtida da injeção de 300µL de solução de dopamina 10,0
µmol L
-1
em função do tempo de aplicação do pulso de potencial de oxidação da dopamina.
Eletrólito suporte: H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
, vazão: 1,0 mL min
-1
.
A corrente de oxidação da DA aumenta com o tempo de duração do pulso de potencial
estabilizando para tempos superiores a 700 ms. Portanto o tempo de aplicação de 700 ms para
o pulso de potencial de oxidação da DA foi adotado. Apesar de estudos demonstrarem que o
43
Resultados e Discussões
fenômeno de oxidação da DA é controlado preferencialmente por difusão, um provável
fenômeno de adsorção deve estar presente.
3.1.3.3 Escolha do potencial de redução para o produto de oxidação
da DA
Considerando o fato de que a detecção da DA será monitorada de forma indireta, uma
avaliação do melhor potencial de redução também se faz necessário. A Figura 3.8 apresenta o
gráfico do potencial de redução em função da intensidade de corrente. Cabe ressaltar que
neste estudo, dois pulsos de potenciais foram aplicados: o pulso E
1
de +800 mV/700 ms para
oxidar a DA e um segundo pulso, E
2
, para redução do produto formado. Os valores de E
2
avaliados foram: +0,10; +0,15; +0,20; +0,25; +0,30; +0,35; +0,40 e +0,45 V. A aplicação
destes pulsos foi realizada por um tempo de 30 ms devido ao produto gerado na oxidação ser
consumido e/ou removido da interface eletrodo/solução em função do tempo. Tempos
menores não foram estudados devido à limitação do equipamento.
Figura 3.8: Intensidade dos sinais de corrente de redução em função do potencial aplicado
durante 30 ms para uma solução de dopamina 10,0 µmol L
-1
. Eletrólito suporte: H
2
SO
4
0,20
mol L
-1
; vazão 1,0 mL min
-1
.
Pelo gráfico da Figura 3.8 observa-se que em potenciais mais positivos a partir de
+0,35 V, a intensidade da corrente de redução é máxima. O potencial de +0,35 V foi utilizado
para determinar a DA no modo gerador-coletor. Não temos explicação teórica do motivo da
corrente de redução diminuir em potenciais menos positivos que +0,30 V.
44
Resultados e Discussões
3.1.3.4 Investigação da sensibilidade obtida na detecção AMP para
análise de DA em função da vazão da solução carregadora e do
volume injetado
Inicialmente, estudos foram realizados para verificar o efeito da vazão da solução
carregadora (H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
) sobre as intensidades dos sinais transientes obtidos usando
FIA com detecção AMP. Neste experimento, os dois pulsos de potenciais otimizados
anteriormente foram utilizados: +0,80 V/700ms e +0,35 V/30ms. A Figura 3.9 mostra os
respectivos sinais obtidos no pulso de potencial de +0,35 V/30ms com solução de 10,00 µmol
L
-1
de DA obtidos usando o sistema FIA de linha única com alça de amostragem fixada em
300 µL.
Figura 3.9: Intensidade dos sinais de corrente de redução em função da vazão da solução
carregadora (H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
), no pulso de potencial +0,35V / 30ms. Alça de amostragem
= 300µL. Solução de dopamina = 10,0 µmol L
-1
.
Os resultados apresentados na Figura 3.9 indicam que o sinal adquirido (redução da o-
DQ) vai aumentando com a vazão da solução carregadora até 1,5 ml min
-1
. Inicialmente, a
corrente vai aumentando devido ao aumento gradativo da quantidade da espécie gerada no
potencial de oxidação. Com vazões superiores, o sinal analítico decresce devido à remoção da
espécie eletroquimicamente gerada na proximidade (nanômetros) do eletrodo se tornar mais
rápida do que a detecção no potencial coletor. A vazão de 1,5 ml min
-1
foi a que apresentou
melhor sensibilidade para detecção de DA em sistema FIA com detecção por AMP.
45
Resultados e Discussões
Estudou-se também a dependência dos sinais amperométricos no pulso de potencial de
redução (+0,35V/30ms) em função do volume de amostra injetado. Os resultados obtidos são
apresentados na Figura 3.10 (DA = 10,0 µmol L
-1
).
Figura 3.10: Intensidade do sinal amperométrico em função do volume da amostra injetada
no sistema FIA em +0,35 / 30ms. Vazão (H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
): 1,50 mL min
-1
. Solução de
DA: 10,0 µmol L
-1
.
Observa-se pelos dados da Figura 3.10, que a intensidade do sinal amperométrico
aumenta para alíquotas injetadas de até 300µL. Com volumes maiores, o sinal amperométrico
mantém-se constante. Isto se deve ao fato de a dispersão (diluição) da amostra, que ocorre no
percurso entre o ponto da injeção da amostra e o detector eletroquímico, não atingir o centro
da zona da amostra a partir deste volume. Portanto, o volume de amostra a ser injetado no
sistema FIA com detecção por AMP foi de 300µL.
3.1.3.5 Uso da técnica AMP acoplada ao sistema FIA para análise de
DA na presença de altas concentrações de AA
Um estudo foi efetuado para demonstrar o fenômeno da interação química entre o AA e
a o-DQ eletroquimicamente gerada a partir de soluções contendo DA em meio de tampão
acetato 0,10 mol L
-1
(pH 4,7). A Figura 3.11 apresenta uma série de injeções no sistema FIA
com detecção amperométrica com aplicação de três pulsos de potenciais (+0,7V / 100ms;
-0,09V / 30ms e -0,15V / 500ms) de soluções contendo (a) DA, (b) AA e (c) DA e AA.
46
Resultados e Discussões
Como pode ser observado, a reação química entre o AA e o produto de oxidação da DA
(o-DQ) gera uma diminuição acentuada no sinal de redução deste composto. Isto pode ser
observado pelos sinais adquiridos com solução contendo somente DA (Figura 3.11 A
1
a) em
comparação aos sinais obtidos para a solução contendo DA e AA (Figura 3.11 A
1
c).
Figura 3.11: (A
1
) Amperogramas de múltiplos pulsos para injeções de soluções contendo
90,0 µmol L
-1
de AA (a), 90,0 µmol L
-1
de DA (b) e uma mistura de ambos os espécie
analíticas na mesma concentração anterior (c), em meio tampão ácido acético/acetato 0,10
mol L
-1
. Eletrodo: CV; Vazão: 2,0 mL min
-1
; Volume injetado: 150,0 µL; (A
2
) Escada de
potenciais aplicados.
Para verificar a potencialidade da solução de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
na determinação de
DA na presença de altas concentrações de AA, injeções em duplicata de 3 soluções contendo
(a) DA, (b) AA e (c) DA e AA também foram realizadas. A Figura 3.12 mostra os
amperogramas obtidos com aplicação de três pulsos de potenciais (+0,80V / 700ms; +0,35V /
30ms e 0,0V / 500ms).
47
Resultados e Discussões
Figura 3.12: (A
1
) Amperogramas de múltiplos pulsos com injeção de soluções em duplicata
contendo 100,0 µmol L
-1
de DA (a), 1,0 mmol L
-1
de AA (b) e mistura de ambas as espécies
analíticas nas mesmas concentrações de a e b (c). O amperograma de 0,0V / 500ms não foi
apresentado. (A
2
) Escada de aplicação dos pulsos de potenciais. Eletrólito: H
2
SO
4
0,20 mol
L
-1
. Vazão: 1,5 mL min
-1
. Volume injetado: 300µL. Eletrodo: CV.
Observando-se a Figura 3.12, dois pontos importantes podem ser observados. O
primeiro é que a cinética da reação entre o produto da oxidação da DA e o AA diminuiu
significantemente em meio de H
2
SO
4
0, 20 mol L
-1
, em relação às intensidades de corrente.
Isto pode ser observado analisando os dados obtidos no pulso de potencial de +0,35V/30ms
na injeção de uma solução contendo somente DA (a) em comparação à injeção de uma
solução contendo DA e AA (c). Estes resultados diferem aos obtidos quando o eletrólito
usado foi o tampão acetato 0,10 mol L
-1
(Figura 3.11) onde houve significativa interação entre
a o-DQ (eletroquimicamente gerada) e o AA presente na solução (desvio negativo).
É
necessário ressaltar ainda que a concentração de AA em meio de H
2
SO
4
é 11 vezes maior que
a concentração usada em meio de tampão acetato.
O segundo ponto importante é que se pode determinar seletivamente DA na presença de
AA em meio de H
2
SO
4
(Fig. 3.12A
1
b). A alternativa consiste em aplicar, portanto, três pulsos
de potenciais continuamente em função do tempo:
(a) +0,80 V / 700 ms: ambas as espécies (AA e DA) são oxidadas gerando ácido
dehidroascórbico (que reage com a água formando um composto eletroinativo – Figura
3.4) e o-dopaminoquinona (o-DQ).
48
Resultados e Discussões
(b) +0,35V / 30 ms: quantificação indireta de DA através da redução de seu produto de
oxidação (o-DQ) gerado no pulso de potencial anterior;
(c) 0,00 V / 500 ms: limpeza eletroquímica da superfície do eletrodo de carbono vítreo. A
aplicação deste pulso de potencial é essencial para obtenção de resultados estáveis em
função do tempo.
A investigação da repetibilidade do método foi verificada pela comparação da
magnitude da corrente de redução para injeções sucessivas de soluções contendo
simultaneamente 100,0 µmol L
-1
de DA e 1,0 mmol L
-1
de AA. A Figura 3.13 indica que o
método proposto apresenta uma boa repetibilidade para o sinal amperométrico monitorado. O
desvio padrão relativo foi calculado em 1,2 % (n = 24), mostrando um bom desempenho do
método.
Figura 3.13: Respostas amperométricas após 24 injeções consecutivas de 300 µL de uma
solução contendo simultaneamente DA e AA (100,0 µmol L
-1
e 1,0 mmol L
-1
,
respectivamente). Condições experimentais conforme Figura 3.12.
Outro estudo realizado foi com o intuito de verificar qual é a concentração máxima de
AA que pode estar presente em solução para que a análise de dopamina ainda seja possível.
Neste estudo a concentração de dopamina foi fixada em 100,0 µmol L
-1
e a de AA foi variada
na faixa de 0,25 a 16,0 mmol L
-1
. A Figura 3.14 mostra os amperogramas obtidos no estudo.
49
Resultados e Discussões
Figura 3.14: Resposta amperométrica em fluxo com injeções de soluções contendo 100,0
µmol L
-1
de DA (exceto a) e aumento da concentração de AA: a=b= 0,25; c= 0,5; d= 1,0;
e=2,0; f=4,0; g=8,0 e h= 16,0 mmol L
-1
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. Pulsos de potencial
aplicados: +0,80V / 700ms para oxidação do AA e DA; +0,35 V /30ms para redução da o-DQ
e 0,0 V/ 500ms, não apresentado, para limpeza do eletrodo. Vazão: 1,5 mL min
-1
. Volume
injetado: 300 µL.
Segundo trabalhos publicados na literatura [3, 99], a concentração de AA em fluidos
biológicos não é superior a 1,0 mmol L
-1
e pelo resultado experimental da Figura 3.14, o sinal
de redução da o-DQ é relativamente constante na presença de até 2,0 mmol L
-1
de AA.
Portanto, pode-se empregar o método proposto com uma margem de segurança com relação a
concentração de AA. Na presença de concentrações superiores, uma queda no sinal pode ser
observada.
3.1.3.6 Curva analítica para determinação de DA em amostras de
fármacos
A Figura 3.15 apresenta um amperograma de redução da o-DQ com a aplicação de 3
pulsos de potencial em função do tempo com a injeção em triplicata de soluções com
concentrações crescentes de DA todas em µmol L
-1
(a = 1,0; b = 10,0; c = 20,0; d = 30,0; e =
40,0; f = 50,0; g = 60,0; h = 70,0; i = 80,0; j = 90,0 e l = 100,0) na presença de 1,0 mmol L
-1
de AA. A curva analítica obtida a partir do amperograma apresentou um excelente coeficiente
de correlação linear (R=0,998). A curva foi linear no intervalo de 1,0 a 100,0 µmol L
-1
, como
representado pela Figura 3.16.
50
Resultados e Discussões
Figura 3.15: Amperograma para redução de o-DQ para a injeção de soluções de
concentrações crescentes de DA (a=1,0; b=10,0; c=20,0; d=30,0; e=40,0; f=50,0; g=60,0;
h=70,0; i=80,0; j=90,0 e l=100,0 µm L
-1
) na presença de 1,0 mmol L
-1
de AA. Condições
experimentais, conforme Figura 3.12.
Figura 3.16: Curva analítica obtida para concentrações crescentes de DA no pulso de
potencial de +0,35V / 30ms.
O limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ) da DA foram obtidos de acordo com
o descrito no procedimento experimental. Os valores foram respectivamente: 50 e 170 nmol
L
-1
. O mesmo amperograma da Figura 3.15 e sua respectiva curva de calibração foi utilizada
na determinação da concentração de DA presente em uma formulação farmacêutica do
Hidrocloreto de Dopamina
®
. Esta análise foi repetida após a adição de 1,0 mmol L
-1
de AA ao
medicamento, simulando uma amostra biológica. Um estudo de adição e recuperação também
foi realizado. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 3.2.
Tabela 3.2: Resultados obtidos na determinação de dopamina em amostra de fármaco na
51
Resultados e Discussões
ausência e após a adição de AA.
Amostra Tabelado
(mg)
Encontrado (mg)
a
Diferença
relativa (%)
Amostra 1 50,0 43,5 ± 1,0 -13%
Amostra 1 +1,0 mmol L
-
1
de AA 50,0 43,0 ± 0,5 -14%
Amostra 1 +1,0 mmol L
-
1
de AA +50 mg de DA 100,0 96,3 ± 1,0 -3,7%
a
= resultado ± desvio padrão (n=3)
Os resultados apresentados neste trabalho mostraram que a metodologia baseada em FIA
com detecção AMP pode ser utilizada para determinação de DA em amostras farmacêuticas e
também na presença de altas concentrações de AA.
3.2 ESTUDOS PARA DETERMINAÇÃO DE DA NA PRESENÇA DE
ALTAS CONCENTRAÇÕES DE AA E AU
Ultimamente, tem-se observado um grande interesse no desenvolvimento de metodologias
para determinação de DA na presença de AA e AU pelo fato de coexistirem em amostras
biológicas. Utilizando técnicas eletroanalíticas, duas limitações podem ser identificadas:
oxidação dos três compostos na mesma região de potencial e contaminação da superfície do
eletrodo de trabalho. Além disto, a DA, em amostras biológicas, normalmente está presente
em baixas concentrações, enquanto que AA e AU em concentrações mais elevadas.
O comportamento voltamétrico do AU foi estudado em meio H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
, com
intuito de observar o perfil voltamétrico desta espécie neste eletrólito. A Figura 3.17 mostra o
perfil voltamétrico do AU, da DA e do AA.
52
Resultados e Discussões
Figura 3.17: Voltamogramas cíclicos obtidos para H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sem (a) e com a
adição de (b) AA 1,0 mmol L
-1
, (c) DA 1,0 mmol L
-1
ou (d) AU 0,5 mmol L
-1
, sobre ECV.
Faixa de Trabalho de -0,20 V a 1,00 V vs Ag/AgCl; v = 50 mV s
-1
.
Observa-se pelo voltamograma da Figura 3.17 que o AU apresenta um comportamento
irreversível sobre eletrodo de carbono vítreo em meio de acido sulfúrico 0,20 mol L
-1
, com
um pico de oxidação por volta de 740 mV. Segundo a literatura [40, 100, 101], o ácido úrico
se oxida em um processo que envolve 2e
-
e 2H
+
para formar uma diimina. O mecanismo da
reação está representado na Figura 3.18.
Figura 3.18: Mecanismo de oxidação do ácido úrico.
O ácido úrico em eletrodo de carbono vítreo ou eletrodos metálicos apresenta um
comportamento irreversível, mas apresenta um comportamento quase reversível em eletrodo
de pasta de carbono [100]. Isto está de acordo com o voltamograma apresentado pela Figura
3.17. No entanto, quando se tenta determinar a DA na presença de altas concentrações de AA
e AU usando as mesmas condições experimentais da seção anterior, ou seja, +0,80V / 700ms
para oxidação das três espécies analíticas, +0,35V/30ms para determinação e quantificação da
DA, aparece uma interferência (pico de redução) proveniente do ácido úrico. Apesar deste
processo de redução não estar presente no voltamograma, quando se utiliza pulsos rápidos (30
ms) em amperometria pode-se obter processos redutivos originários do produto da oxidação
do ácido úrico que interferem no potencial de determinação indireta da DA, impossibilitando
a sua análise.
53
Resultados e Discussões
Para contornar este problema, estudos foram direcionados para identificação de um
potencial que promovesse a oxidação da DA onde a interferência do AU fosse mínima e desta
forma, o sinal de redução detectado em +0,35V / 30ms permitiria a análise seletiva de DA na
presença de AA e AU. Os resultados destes estudos são apresentados na Figura 3.19.
Figura 3.19: Intensidade da corrente amperométrica de redução monitorada no potencial de
redução (+0,35V / 30ms) em função da variação do potencial de oxidação: 0,5; 0,55; 0,6;
0,65; 0,7; 0,75; 0,8 V, todos os pulsos com tempo de aplicação de 700ms para uma solução
contendo 100,0 µmol L
-1
de dopamina () ou 2,0 mmol L
-1
de ácido úrico (). Eletrólito:
H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. Vazão: 1,5 mL min
-1
. Volume injetado: 300µL. ET: CV.
Pelos dados experimentais da Figura 3.19, tanto o produto de oxidação da DA quanto
do AU apresentam sinais de redução no potencial de +0,35V / 30ms se o pulso de potencial de
oxidação for de +0,80 V. Porém, se o potencial de oxidação de +0,65 V for utilizado, a DA
será oxidada e o AU apresenta uma pequena intensidade de corrente e consequentemente no
pulso de E = +0,35V / 30ms uma corrente de redução seletiva para DA é adquirida. Neste
potencial (+0,65 V), o sinal para oxidação da DA diminui em apenas 5,6 %. Portanto, na
analise de DA na presença de altas concentrações de AA e AU, o potencial de oxidação
selecionado foi de +0,65V. Neste potencial também foi estudado o tempo de aplicação,
conforme apresentado na Figura 3.20.
Resultados e Discussões
Figura 3.20:
de solução contendo
aplicação do potencial de
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
+0,35V / 30ms.
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
os mesmos da seção anterior: 300µ
min
-
1
de injeções de so
simultaneamente DA,
Figura 3.21 mostra os resultados obtidos, com aplicação de
700ms; +0,35V / 30ms
Resultados e Discussões
Figura 3.20:
Intensidade do sinal amperométrico
de solução contendo
aplicação do potencial de
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
+0,35V / 30ms.
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
os mesmos da seção anterior: 300µ
1
.
Uso da técni
altas concentrações de AA e AU
Após a otimização do
de injeções de so
simultaneamente DA,
Figura 3.21 mostra os resultados obtidos, com aplicação de
700ms; +0,35V / 30ms
Resultados e Discussões
Intensidade do sinal amperométrico
de solução contendo
DA (10,0 µmol L
aplicação do potencial de
+
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
+0,35V / 30ms.
Esta Figura está de aco
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
os mesmos da seção anterior: 300µ
Uso da técni
altas concentrações de AA e AU
Após a otimização do
de injeções de so
luções (em triplicata) contendo individualmente
simultaneamente DA,
AA
Figura 3.21 mostra os resultados obtidos, com aplicação de
700ms; +0,35V / 30ms
e 0,0V / 800ms.
Resultados e Discussões
Intensidade do sinal amperométrico
DA (10,0 µmol L
+
0,65 V.
Condições experimentais: confo
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
Esta Figura está de aco
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
os mesmos da seção anterior: 300µ
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
Uso da técni
ca AMP em FIA para análise de DA
altas concentrações de AA e AU
Após a otimização do
potencial
luções (em triplicata) contendo individualmente
e
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
Figura 3.21 mostra os resultados obtidos, com aplicação de
e 0,0V / 800ms.
Intensidade do sinal amperométrico
DA (10,0 µmol L
-1
) e AU (2,0
Condições experimentais: confo
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
Esta Figura está de aco
rdo com o tempo otimizado para a aplicação do E =
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
ca AMP em FIA para análise de DA
altas concentrações de AA e AU
de oxidação e respectivo tempo de aplicação, uma série
luções (em triplicata) contendo individualmente
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
Figura 3.21 mostra os resultados obtidos, com aplicação de
e 0,0V / 800ms.
Intensidade do sinal amperométrico
de oxidação,
) e AU (2,0
m
mol L
Condições experimentais: confo
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
rdo com o tempo otimizado para a aplicação do E =
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
ca AMP em FIA para análise de DA
altas concentrações de AA e AU
de oxidação e respectivo tempo de aplicação, uma série
luções (em triplicata) contendo individualmente
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
Figura 3.21 mostra os resultados obtidos, com aplicação de
três pulsos de potenciais
de oxidação,
obtida d
mol L
-1
) em f
Condições experimentais: confo
rme Figura 3.19.
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
rdo com o tempo otimizado para a aplicação do E =
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
ca AMP em FIA para análise de DA
de oxidação e respectivo tempo de aplicação, uma série
luções (em triplicata) contendo individualmente
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
três pulsos de potenciais
obtida d
a
injeção de 300
) em f
unção do tempo de
rme Figura 3.19.
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
rdo com o tempo otimizado para a aplicação do E =
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
ca AMP em FIA para análise de DA
na presença de
de oxidação e respectivo tempo de aplicação, uma série
luções (em triplicata) contendo individualmente
DA, AA, AU e
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
três pulsos de potenciais
54
injeção de 300
µL
unção do tempo de
rme Figura 3.19.
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
amperométrico de oxidação e, consequentemente, um maior sinal de coleta no potencial
de
rdo com o tempo otimizado para a aplicação do E =
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
na presença de
de oxidação e respectivo tempo de aplicação, uma série
DA, AA, AU e
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
três pulsos de potenciais
: +0,65V /
54
µL
unção do tempo de
Como pode ser observado pela Figura 3.20, o tempo de 700ms propicia o maior sinal
de
rdo com o tempo otimizado para a aplicação do E =
+0,8V. Portanto, o tempo de 700ms também foi adotado para determinar a dopamina na
presença de altas concentrações de AA e AU. Os parâmetros hidrodinâmicos utilizados foram
L para o volume de amostra injetada e vazão de 1,5 mL
na presença de
de oxidação e respectivo tempo de aplicação, uma série
DA, AA, AU e
AU foi avaliada no sistema FIA com detecção por AMP. A
: +0,65V /
55
Resultados e Discussões
Figura 3.21: Amperograma de múltiplos pulsos com injeção de soluções em triplicata
contendo 100,0 µmol L
-1
de dopamina (a), 1,0 mmol L
-1
de ácido ascórbico (b), 0,5 mmol L
-1
de ácido úrico (c)
ou mistura de todas as espécies analíticas nas mesmas concentrações dos
itens anteriores (d). O amperograma de 0,0 V/800ms não é apresentado. Eletrólito: H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. Vazão: 1,5 mL min
-1
. Volume injetado: 300µL. ET: CV.
Analisando a Figura 3.21 podemos dizer que no pulso de potencial de +0,65V / 700ms
há a oxidação das três espécies e no potencial de +0,35V / 30ms apenas a DA apresentou
resposta. Portanto, nas condições otimizadas, a determinação seletiva de DA é possível sem a
interferência do AA e do AU. A aplicação do potencial de limpeza de 0,0V necessitou de um
tempo maior de aplicação quando comparado à determinação de DA na presença de altas
concentrações de AA (0,0V / 500ms), para garantir uma total regeneração ou limpeza
eletroquímica do eletrodo sem que este aumento de tempo prejudicasse a análise de DA.
Após a otimização destes potenciais, um estudo de repetibilidade para o método
proposto (Figura 3.22) foi efetuada com 15 injeções consecutivas de soluções contendo
simultaneamente DA, AA e AU (50,0 µmol L
-1
; 1,0 mmol L
-1
; 0,5 mmol L
-1
,
respectivamente)
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. Segundo o amperograma apresentado na Figura 3.22, o
método para esta análise demonstra uma boa estabilidade, com desvio padrão relativo de
0,25% (n = 15), o que está relacionado, principalmente, com a capacidade do pulso de E 0,0V
/ 800ms em evitar a contaminação do eletrodo de trabalho.
56
Resultados e Discussões
Figura 3.22: Resposta amperométrica após 15 injeções consecutivas de 300 µL de solução
contendo simultaneamente DA, AA e AU (50,0 µmol L
-1
; 1,0 mmol L
-1
; 0,50 mmol L
-1
,
respectivamente). Condições experimentais conforme Figura 3.21.
Outro estudo realizado foi com o intuito de verificar a concentração máxima de AU que
pode estar presente em uma amostra para que o método ainda permita a análise seletiva de
DA. Para tanto, fixou-se a concentração de DA em 100,0 µmol L
-1
e a concentração de AU foi
aumentada progressivamente: 0,05; 0,10; 0,20; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 mmol L
-1
. A Figura 3.23
mostra esta sequência de injeção neste estudo. Pode-se observar que a partir de 1,0 mmol L
-1
de AU
há um declínio da corrente amperométrica monitorada para a DA no potencial de
+0,35V / 30ms indicando que a técnica está limitada a análise seletiva de DA na presença de
AU até este valor. Portanto, a concentração de AU utilizada nos demais testes foi de 0,50
mmol L
-1
.
57
Resultados e Discussões
Figura 3.23: Resposta amperométrica em fluxo obtidas para injeções em duplicatas de
soluções contendo 100,0 µmol L
-1
de DA em função do aumento da concentração de AU:
a=0,05; b= 0,10; c= 0,20; d= 0,50; e=1,0; f=2,0 e g=4,0 mmol L
-1
em meio de H
2
SO
4
0,20
mol L
-1
. Pulsos de potencial aplicados: +0,35 V /30ms para redução da o-DQ; +0,65V /
700ms para oxidação do AA e DA; e 0,0 V/ 800ms para limpeza eletroquímica do eletrodo.
Vazão: 1,5 mL min
-1
. Volume injetado: 300µL.
Curva de Calibração para DA, limite de detecção e limite de
quantificação
Para construção da curva analítica, realizaram-se injeções em triplicatas de soluções
com concentrações crescentes de DA na presença de AA (1,0 mmol L
-1
) e AU (0,50 mmol
L
-1
). Para a construção da curva usou-se o valor médio das três medidas adquiridas para cada
solução (Fig. 3.24). A curva apresentou-se linear na faixa de concentração entre 1,0 e 100,0
µmol L
-1
com um excelente coeficiente de correlação (R = 0,998). O limite de detecção
calculado foi de 11 nmol L
-1
e o limite de quantificação igual a
37
nmol L
-1
.
58
Resultados e Discussões
Figura 3.24: Amperograma obtido para a injeção de soluções com concentrações crescentes
de DA em µmol L
-1
(a=1,0; b=10,0; c=20,0; d=30,0; e=40,0; f=50,0; g=60,0; h=70,0; i=80,0;
j=90,0 e l=100,0) na presença de 1,0 mmol L
-1
de AA e 0,50 mmol L
-1
de AU. Condições
experimentais conforme Figura 3.21.
Figura 3.25: Curva de calibração para a dopamina obtida a partir do amperograma da Fig.
3.24.
3.3 AMPEROMETRIA DE MÚLTIPLOS PULSOS ACOPLADA AO
SISTEMA FIA PARA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE AA
E AU
3.3.1 Estudo de Variação da Velocidade de Varredura
Inicialmente, estudos de variação de velocidade de varredura (10 a 500 mV s
-1
) usando
a técnica de voltametria cíclica foram realizados para o AA. A Figura 3.26 representa os
59
Resultados e Discussões
voltamogramas cíclicos obtidos para uma solução de AA em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. A
Tabela 3.3 apresenta os potenciais de pico anódico e suas respectivas correntes para este
estudo.
Figura 3.26: Efeito da velocidade de varredura usando VC de 1,0 mmol L
-1
de AA em meio
de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sobre eletrodo de carbono vítreo.
Tabela 3.3: Valores de corrente anódica (I) e potencial de pico (E) para oxidação do AA para
diferentes velocidades de varredura ().
(mVs
-
1
) I
anódico
/ µA E
pico anódico
/
mV
10
8.3 0.49
20
12.5 0.50
50
19.6 0.52
100
25.8 0.54
200
31.3 0.56
500
51.3 0.58
Analisando os voltamogramas cíclicos da Figura 3.26 e os dados da Tabela 3.3,
observa-se que com o aumento da velocidade de varredura há um aumento na intensidade de
corrente. Conforme a equação 1, quando o processo é controlado preferencialmente por
difusão há uma relação linear entre as correntes de pico e a raiz quadrada da velocidade de
varredura. Este fenômeno é observado no gráfico da Figura 3.27, o que demonstra que a
oxidação do ácido ascórbico em meio de H
2
SO
4
é governado principalmente pelo fenômeno
da difusão.
60
Resultados e Discussões
Figura 3.27: Dependência linear das correntes de pico anódico (µA) em função da raiz
quadrada da velocidade de varredura (mV s
-1
)
1/2
para o pico de oxidação do ácido ascórbico
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sobre eletrodo de carbono vítreo.
Analisou-se também o comportamento do AU nas mesmas condições experimentais. A
Figura 3.28 apresenta os voltamogramas cíclicos de uma solução de 0,50 mmol L
-1
AU com
velocidades de varreduras no intervalo de 10 a 500 mV s
-1
sobre eletrodo de carbono vítreo.
Os dados das intensidades de corrente anódica versus velocidade de varredura constam na
Tabela 3.4
Figura 3.28: Efeito da velocidade de varredura usando VC para 0,50 mmol L
-1
de ácido úrico
em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sobre ECV.
61
Resultados e Discussões
Tabela 3.4: Valores de corrente anódica (I) e potencial de pico (E) para oxidação do ácido
úrico sob diferentes velocidades de varredura ().
De acordo com os voltamogramas cíclicos da Figura 3.28 e os dados da Tabela 3.4,
observa-se que com o aumento da velocidade de varredura, há um aumento na intensidade de
corrente. A Figura 3.29 apresenta o gráfico da intensidade de corrente em função da raiz
quadrada da velocidade de varredura. Como também há uma relação linear entre estas
variáveis o fenômeno que governa a oxidação do ácido úrico nestas condições é
preferencialmente difusional.
Figura 3.29: Dependência linear das correntes de pico anódica (µA) em função da raiz
quadrada da velocidade de varredura para o ácido úrico em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
sobre
eletrodo de carbono vítreo.
3.3.2 Identificação do potencial de oxidação do AA e AU
Voltando ao fato da impossibilidade de se usar a amperometria a potencial constante
acoplada a FIA para análise simultânea de AU e AA devido à sobreposição dos picos de
oxidação de ambas as espécie, estudos para contornar esta limitação são desejáveis. Na
(mVs
-
1
) I
pico
anódico
/µA
E
pico
anódico
/mV
10
9.5 0.71
20
13.1 0.72
50
20.5 0.72
100
26.8 0.73
200
40.0 0.74
500
61.2 0.74
62
Resultados e Discussões
literatura há relatos do uso de eletrodos modificados [102-104] ou o uso de meio micelar
[105, 106] para obter a separação dos picos e conseguir assim determinar AA e AU. O
propósito deste estudo é otimizar uma sequência de pulsos de potenciais a serem aplicados
para a determinação simultânea de AU e AA usando FIA. A Figura 3.30 apresenta vários
amperogramas obtidos com a injeção de 100,0 µmol L
-1
de AU ou 200,0 µmol L
-1
de AA em
potenciais que variaram de +0,3 V a +1,0 V sobre eletrodo de carbono vítreo e em meio de
H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
.
Figura 3.30: Amperogramas para injeção em fluxo em soluções em triplicata de 100,0 mmol
L
-1
de AU ou 200,0 mmol L
-1
de AA nos seguintes potenciais: +0,3 V; +0,4 V; +0,5 V; +0,6
V; +0,7 V; +0,8 V; +0,9 V; +1,0 V sobre eletrodo de carbono vítreo. Eletrólito: H
2
SO
4
0,20
mol L
-1
. Vazão: 2,2 mL min
-1
. Volume injetado: 300µL.
Observa-se pelos amperogramas da Figura 3.30 que no potencial de +0,3 V / 100ms,
tanto o AU quanto o AA não apresentam nenhum sinal. Entre os potenciais +0,4 V a +0,6V
(100ms) apenas o AA apresenta sinal amperométrico de oxidação e a partir deste potencial, a
intensidade de corrente se torna praticamente constante, indicando que a taxa máxima de
oxidação foi alcançada. Portanto, pode-se analisar o AA sem a interferência de AU neste
intervalo de potencial, sendo que o potencial de +0,6V/100ms foi adotado para a
determinação de AA, pois apresentou maior intensidade de corrente dentre os que poderiam
ser utilizados para este fim.
63
Resultados e Discussões
Seguindo o mesmo raciocínio, observa-se que a partir do potencial de +0,7V / 100ms,
tanto o AA quanto o AU apresentam sinal amperométrico de oxidação e a partir do potencial
de +0,8V / 100ms, a intensidade de corrente se torna praticamente constante. Portanto, o
potencial de +0,8 V / 100ms foi adotado para oxidação simultânea de AA e AU.
3.3.3 Identificação do potencial de redução do produto de oxidação do
AU
Observando os amperogramas da Figura 3.30 percebe-se que não há a possibilidade de
determinar o AU diretamente através do processo de oxidação. Para tanto, os estudos foram
direcionados para identificação de um pulso de potencial que permitisse a quantificação
indireta de AU sem a interferência do AA. Neste estudo, soluções contendo 100,0 µmol L
-1
de
AU ou 200,0 µmol L
-1
de AA foram injetadas em sistema FIA com detecção AMP. Aplicou-
se o pulso de +0,8V / 100ms para oxidação de AU e AA e uma série de pulsos de E de
redução foram avaliados: +0,1 V; +0,2 V; +0,3 V; +0,4 V e +0,5 V, uma vez que em pulsos
rápidos de potenciais é possível visualizar processo de redução do produto de oxidação do
ácido úrico. O tempo de aplicação de cada pulso foi de 30ms para que o sinal de coleta
(redução do produto da oxidação do AU) fosse máximo. Os valores de intensidade de corrente
estão apresentados na Tabela 3.5.
Tabela 3.5: Intensidade das correntes amperométricas para redução do produto da oxidação
do AU e oxidação do AA em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
.
549
I
549
/ µA
I
ox AA
/ µA
G<3$H< <3. >
G<3$H< <3.< >
G<3$H< <3, >
G<3$H< <3,< <3
G<3 $H< <3#< 3<
Observando os dados da Tabela 3.5, observa-se que o produto de oxidação do AU
pode ser detectado na faixa de potencial entre +0,1 V e +0,3 V. No potencial de +0,4 V e
+0,5V, o AA apresenta sinal anódico, não sendo possível optar por nenhum desses potenciais
para a analise de AU. Portanto, optou-se pelo potencial de +0,1 V / 30ms para analise indireta
de AU, uma vez que nos potenciais +0,2 V e +0,3 V a intensidade de corrente é menor.
64
Resultados e Discussões
3.3.4 Investigação do sinal amperométrico obtido por FIA com
detecção AMP para AA e AU em função da vazão e do volume de
amostra injetado
Estudos do efeito da vazão da solução carregadora (H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
) sobre os sinais
amperométricos foram investigados. Neste estudo, os pulsos de potenciais aplicados foram os
otimizados anteriormente, ou seja, +0,6 V / 100ms; +0,8 V / 100ms e +0,1 V / 30ms e 0,0V /
1 s (potencial de limpeza e regeneração do eletrodo). A Figura 3.31 mostra os respectivos
sinais amperometricos de oxidação do AA (+0,6 V / 100ms) e redução do produto de
oxidação do AU (+0,1V / 30ms) obtidos pelo sistema FIA.
Figura 3.31: Intensidade de corrente em função da vazão da solução carregadora (H
2
SO
4
0,20
mol L
-1
) obtida nos seguintes pulsos de potenciais: () +0,6 V / 100ms (oxidação do AA),
+0,8 V /100ms (não apresentado) e () +0,1V / 30ms (redução do produto da oxidação do
AU), 0,0 V / 1 s (não apresentado). Solução de AA= 200,0 mmol L
-1
e AU = 100,0 mmol L
-1
.
Os resultados apresentados na Figura 3.31 indicam que na medida que a vazão da
solução carregadora vai aumentando, maior é a intensidade dos sinais, tanto de oxidação do
AA, quanto para a redução do produto de oxidação do AU. Na vazão de 2,0 mL min
-1
, o sinal
no potencial de redução (coleta) para o produto da oxidação do AU alcança um valor máximo,
sofrendo um pequeno decréscimo em vazões superiores, fenômeno já abordado no item
3.1.3.4. A sensibilidade para análise de AA seria maior para vazões maiores, mas o inverso é
verdadeiro para o produto coletado no potencial de redução. Considerando, portanto, os sinais
amperométricos dos processos eletroquímicos envolvidos, a vazão de 2,0 mL min
-1
foi o que
apresentou a melhor condição para a detecção simultânea de AA e AU em sistema FIA com
65
Resultados e Discussões
detecção por AMP.
Estudos da dependência dos sinais amperométricos com o volume da amostra injetada
também foram realizados. Os resultados para injeção de uma solução de AA = 200,0 µmol
L
-1
e AU = 100,0 µmol L
-1
em função do volume injetado estão apresentados na Figura 3.32.
Conforme pode ser observado, as intensidades dos sinais amperométricos, em +0,6 V e em
+0,1V, aumentam para alíquotas de até 300µL. Após este volume, ambos os sinais
amperométricos mantêm-se constantes. Isto pode ser explicado pelo efeito da dispersão da
amostra, desde o ponto de injeção até o detector eletroquímico, que a partir deste volume faz
mais efeito no centro da zona de amostra. Se o volume da amostra for menor, a dispersão se
estende por toda a zona de amostragem, diminuindo assim a intensidade do sinal
amperométrico. Assim, a opção foi de trabalhar com um volume de amostra injetado de 300
µL.
Figura 3.32: Intensidade dos sinais amperométricos em função da alíquota de amostra
injetada no sistema FIA. () +0,6 V / 100ms (oxidação do AA) e () +0,1V / 30ms (redução
do produto de oxidação do AU). Solução de AA= 200,0 µmol L
-1
e AU = 100,0 µmol L
-1
.
Vazão: 2,0 mL min
-1
.
%
Uso da técnica AMP acoplada ao sistema FIA para análise
simultânea de AA e AU
Após a identificação dos melhores potenciais para análise de AA e AU e otimização dos
parâmetros hidrodinâmicos, o desempenho do método foi avaliado com uma série de injeções
em duplicata das seguintes soluções: 100,0 µmol L
-1
de AU (a), 200,0 µmol L
-1
de AA (b) e
(c) AU e AA nas mesmas concentrações das soluções anteriores (Figura 3.33). De acordo
com os amperogramas apresentados, pode-se observar que os pulsos aplicados permitem boa
66
Resultados e Discussões
seletividade para análise simultânea de AA e AU. No pulso de potencial de +0,6 V / 100ms
(Fig. 3.33 a), apenas o AA apresenta sinal amperométrico anódico e em +0,1 V / 30ms (Fig.
3.33 b), apenas o produto de oxidação eletroquímica do AU apresenta sinal amperométrico
catódico. Quando a solução contendo as duas espécies na mesma concentração das soluções
anteriores é injetada (Fig. 3.33 c), os sinais (anódico e catódico) apresentam a mesma
intensidade, sendo, portanto, possível analisar simultaneamente AU e AA usando a
metodologia proposta.
Figura 3.33: Amperograma de múltiplos pulsos com injeção em fluxo (n = 3) de soluções
contendo 100,0 µmol L
-1
de AU (a), 200,0 µmol L
-1
de AA (b) ou AU e AA nas mesmas
concentrações das soluções anteriores (c). Eletrólito: H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
. Vazão: 2,0 mL min
-
1
. Volume injetado: 300µL. ET: CV. Sequência dos pulsos de potenciais aplicados:+0,6V /
100ms oxidação e quantificação do AA; +0,8 V / 100ms oxidação do AA e AU; +0,1 V /
30ms redução do produto da oxidação do AU e conseqüente quantificação; 0,0 V / 1s limpeza
do eletrodo.
Investigações foram realizadas sobre a repetibilidade dos sinais amperométricos obtidos
para injeções sucessivas de soluções contendo simultaneamente AA e AU usando FIA com
detecção AMP, nas condições definidas anteriormente. A Figura 3.34 indica uma boa
estabilidade da técnica com desvio padrão relativo calculado em 0,3% para o AA e em 0,6%
para análise indireta de AU.
67
Resultados e Discussões
Figura 3.34: Amperograma de múltiplos pulsos obtidos para 25 injeções consecutivas de
alíquotas de 300µL de solução contendo simultaneamente 100,0 µmol L
-1
de AU e 200,0
µmol L
-1
de AA. Condições experimentais conforme Figura 3.33.
Ciente de que tanto AA como o AU estão presentes em amostras biológicas, como
urina, por exemplo, e considerando os níveis normais presentes nesta amostra, estudos foram
realizados para determinar até que concentração (AA e AU) presente na amostra, a análise
não seria mais viável, seja por contaminação do eletrodo, devido à grande quantidade presente
ou por reação química entre os compostos como no caso entre o-DQ e AA ou ainda
interferência de sinal no potencial aplicado. Para este estudo fixou-se a concentração de AA
em 200,0 µmol L
-1
e aumentou-se gradativamente a concentração de AU partindo de uma
concentração inicial de 100,0 µmol L
-1
(Figura 3.35). O sinal obtido para uma solução de
200,0 µmol L
-1
de AA (Fig. 3.35 a) se mantém constante na presença de até 200,0 µmol L
-1
de
AU (Fig. 3.35 c). A partir de soluções contendo 400,0 µmol L
-1
de AU (Fig. 3.35 d) ou mais, a
análise não pode mais ser realizada, uma vez que há um decréscimo do sinal de intensidade de
corrente para o AA. Provavelmente (não estudado), com o aumento de concentração de AU,
um sinal de oxidação passou a existir para AU em 0,60 V.
68
Resultados e Discussões
Figura 3.35: Respostas amperométricas em fluxo para injeções em duplicata de soluções
contendo 200,0 µmol L
-1
de AA em função do aumento da concentração de AU (a = somente
AA): b= 100,0; c= 200,0; d= 400,0; e=800,0 µmol L
-1
, em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
.
Condições experimentais conforme Fig. 3.34.
O mesmo estudo foi repetido mantendo a concentração de AU fixa com um aumento
gradativo da concentração de AA (Figura 3.36). Podemos observar que a análise de 200,0
µmol L
-1
de AU pode ser realizada sem interferência do AA até uma concentração de 400,0
µmol L
-1
de AA. No entanto, na presença de concentrações superiores de AA, a intensidade
de corrente para AU passa a diminuir consideravelmente, inviabilizando a análise. A partir
dos resultados apresentados nas Figuras 3.35 e 3.36 podemos concluir que a análise
simultaneamente AA e AU somente é possível numa faixa de concentração relativamente
pequena.
69
Resultados e Discussões
Figura 3.36: Respostas amperométricas em fluxo para injeções em duplicata de soluções
contendo 200,0 µmol L
-1
de AU em função do aumento da concentração de AA (a = somente
AU; b= 100,0; c= 200,0; d= 400,0; e=800,0 µmol L
-1
), em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
.
Condições experimentais conforme Figura 3.34.
' Curva de Calibração para AA e AU, limite de detecção e limite de
quantificação e recuperação da amostra analisada
Considerando os resultados obtidos nas Figuras 3.35 e 3.36, uma curva de calibração
para análise simultânea de AA e AU foi implementada através de injeções, em triplicatas, de
soluções com concentrações crescentes de ambos os espécie analíticas. O valor médio das três
medidas de intensidade de corrente para cada concentração foi utilizado para construir a curva
de calibração. O amperograma para estas medidas é apresentado na Figura 3.37. A curva
proporcionou uma relação linear entre corrente medida e concentração na faixa de 100,0 a
300,0 µmol L
-1
para o AA e de 50,0 a 200,0 µmol L
-1
para o AU. Dados como coeficientes de
correlação, limites de detecção e quantificação calculados para o método proposto são
apresentados na Tabela 3.6.
70
Resultados e Discussões
Figura 3.37: Amperograma para oxidação do AA (+0,6V / 100ms) e redução do produto da
oxidação do AU (+0,1V / 30ms) para injeções (n = 3) de soluções com concentrações
crescentes de AA e AU (a=100/50; b=150/75; c=200:100; d=250/125; e=300:150 µmol L
-1
).
Condições experimentais conforme Figura 3.34.
Figura 3.38: (A) Curva de calibração obtida na análise de AA no pulso de potencial +0,60V /
100ms. (B) Curva de calibração obtida na análise do AU no pulso de potencial +0,1V / 30ms.
Tabela 3.6: Coeficientes de Correlação, limites de detecção e de quantificação do AA e AU.
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# =
>
71
Resultados e Discussões
Três amostras padrões contendo simultaneamente AA e AU foram analisadas usando o
método proposto. Os resultados obtidos estão descritos na Tabela 3.7
Tabela 3.7: Resultados obtidos na determinação de AA e AU em amostra padrões.
Amostra Conc. adicionada
AA / AU (µmol L
-1
)
Conc. analisada
AA / AU (µmol L
-
1
)
Recuperação
%
1 110 / 110 104,2 / 127,4 95 / 127
2 110 / 55 105,4 / 61,1 96 / 111
3 220 / 55 200,6 / 61,1 91 / 111
Os resultados apresentados neste trabalho mostraram que a metodologia baseada em
FIA com detecção AMP pode ser utilizada para determinação simultânea de AA e AU em
amostras padrões com boa probabilidade de obtenção de sucesso na análise de amostras reais
(urina, por exemplo).
P
ARTE
4
CONCLUSÕES
E
PERSPECTIVAS
73
Conclusões e Perspectivas
4.1 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos permitem concluir que a técnica de Amperometria de Múltiplos
Pulsos acoplada a sistema FIA é uma metodologia eficiente na determinação de dopamina na
presença de altas concentrações de ácido ascórbico ou de ácido úrico, como para
determinação simultânea de ácido ascórbico e ácido úrico. Estes resultados foram atingidos
usando H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
como eletrólito suporte e eletrodo de carbono vítreo como
eletrodo de trabalho.
A quantificação de dopamina na presença de altas concentrações de ácido ascórbico
(1,00 mmol L
-1
) é possível com a aplicação de pulsos de potenciais rápidos e seqüenciais
sobre um eletrodo de trabalho com a aquisição de corrente em cada potencial em função do
tempo. A dopamina é quantificada através da redução do produto gerado numa etapa prévia
de oxidação. O método consiste na aplicação dos seguintes pulsos de potenciais:
• +0,80V / 700ms: oxidação da dopamina e ácido ascórbico gerando o-
dopaminoquinona (o-DQ) e ácido dehidroascórbico;
• +0,35 / 30ms: redução da o-DQ e quantificação da dopamina;
• 0,0V / 500ms: limpeza e regeneração do eletrodo de trabalho. Este pulso de potencial
é importante para obtenção de resultados reprodutíveis com o tempo.
Em meio de H
2
SO
4
0,20 mol L
-1
há uma diminuição significativa na velocidade de
reação entre o ácido ascórbico e a o-DQ, o que possibilitou a quantificação da dopamina pela
redução da o-DQ utilizando a técnica AMP acoplada a sistema FIA.
A dopamina também foi determinada na presença de ácido ascórbico (1,0 mmol L
-1
) e
ácido úrico (0,50 mmol L
-1
) com aplicação de pulsos de potencial seqüenciais. A sequência de
pulsos aplicados foi a seguinte:
• +0,65V / 700ms: oxidação da dopamina e do ácido ascórbico;
• +0,35V / 30ms: redução da o-DQ e quantificação da dopamina;
• 0,00V / 800ms: limpeza e regeneração do eletrodo de trabalho;
O método também foi aplicado para a análise simultânea de ácido úrico e ácido
ascórbico com a aplicação dos seguintes pulsos de potenciais:
• +0,60 V / 100ms: o ácido ascórbico é detectado e quantificado seletivamente pela
reação de oxidação;
• +0,80V / 100ms: oxidação simultânea de ácido ascórbico e ácido úrico;
74
Conclusões e Perspectivas
• +0,10V / 30ms: determinação de ácido úrico através da redução do produto gerado no
pulso de potencial anterior;
• 0,00V / 1s: limpeza e regeneração do eletrodo de trabalho.
Em todas as analises, a técnica AMP acoplado a FIA apresentou bons resultados em
relação a repetibilidade de sinal em função do tempo, indicando que o potencial aplicado para
limpeza da superfície do eletrodo, assim como o tempo de sua aplicação foram eficientes.
Variáveis relacionadas com o método, tais como: volume de amostra injetado, vazão da
solução carregadora, pulsos de potenciais de oxidação e redução, assim como os tempos de
aplicação destes pulsos foram estudados e otimizados com a obtenção de condições
adequadas, considerando os seguintes parâmetros analíticos: sensibilidade, coeficiente de
correlação, desvio padrão relativo, faixa linear de concentração e limites de detecção e
quantificação.
A metodologia proposta é simples e apresenta alta freqüência analítica. Não há a
necessidade de etapas de pré-concentração e pré-tratamento das amostras ou ainda etapas de
modificação química ou eletroquímica da superfície do eletrodo de trabalho utilizado.
75
Proposta de Continuidade
4.2 PROPOSTAS DE CONTINUIDADE
Completar a validação da metodologia para determinação de dopamina na presença de
altas concentrações de ácido ascórbico e na presença de ácido úrico assim como a
determinação simultânea de ácido ascórbico e ácido úrico, utilizando a técnica CLAE com
detecção UV.
Utilizar a metodologia utilizada para analisar dopamina, ácido ascórbico e ácido úrico em
amostras biológicas tais como urina e fluido cerebrospinal.
Verificar possíveis interferências causadas pelo efeito de matriz de amostras biológicas
assim como aumento da força iônica provenientes dos sais dissolvidos nestas amostras.
P
ARTE
5:
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
77
Referências Bibiográficas
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eletroanalíticas para a determinação de antidepressivos tricíclicos e neurotransmissores,Tese de
Doutorado; Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2006.
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em fármacos,Dissertação de Mestrado; Química, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2004.
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presence of high concentration of ascorbic acid by using gold cysteamine self-assembled
monolayers as a nanosensor, Sensors and Actuators B-Chemical, 115, 2006, 614-621.
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2+
induces Ca
2+
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cateccholaminergic nerve terminals, European Journal of Pharmacology, 373, 1999, 163.
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Interesse Biológico, Dissertação de Mestrado; Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São
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