( PDF ) Análise da metilação dos genes DAPK e p16 e da infecção por vírus do papiloma humano e vírus Epstien-Barr em lesões precursoras e câncer do colo do útero

Download PDF

ads:

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Fernanda Lattario

ANÁLISE DA METILAÇÃO DOS GENES DAPK E P16 E DA INFECÇÃO POR

VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO E VÍRUS EPSTEIN-BARR EM LESÕES

PRECURSORAS E CÂNCER DO COLO DO ÚTERO.

Rio de Janeiro

2009

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Fernanda Lattario

ANÁLISE DA METILAÇÃO DOS GENES DAPK E P16 E DA INFECÇÃO POR

VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO E VÍRUS EPSTEIN-BARR EM LESÕES

PRECURSORAS E CÂNCER DO COLO DO ÚTERO.

Orientadora: Dra. Maria da Gloria da Costa Carvalho

Rio de Janeiro

2009

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Biofísica do Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho, da

Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de

Doutor em Ciências Biológicas

(Biofísica).

ads:

LATTARIO, Fernanda

Análise da metilação dos genes DAPK e p16 e da infecção por vírus do

papiloma humano e vírus Epstien-Barr em lesões precursoras e câncer do colo do

útero.

XIII, 134 f.

Tese: Doutor em Ciências.

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2009.

1. Metilação 2. Vírus do Papiloma humano

3. Vírus Epstein-Barr

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro.

II. Título

iii

Fernanda Lattario

ANÁLISE DA METILAÇÃO DOS GENES DAPK E P16 E DA INFECÇÃO POR

VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO E VÍRUS EPSTEIN-BARR EM LESÕES

PRECURSORAS E CÂNCER DO COLO DO ÚTERO.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Biofísica, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).

Rio de Janeiro, 08 de setembro de 2009.

_________________________________________________

Moacyr Alcoforado Rebello

_________________________________________________

Januário Bispo Cabral Neto

_________________________________________________

Robson de Queiroz Monteiro

À minha família,

pelo estímulo, generosidade,

atenção que deles

sempre recebi.

Ao meu marido, Marcel,

pelo companheirismo e paciência

durante a elaboração deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

À minha família por ser a base de tudo.

Ao Marcel, o mais novo integrante da família, por trazer mais alegria

para os meus dias e pelo incentivo, apoio e principalmente paciência.

À Dra. Maria da Gloria, mais que orientadora, amiga e conselheira, pelos

momentos agradáveis de convívio, pelo entusiasmo, pela atenção e dedicação

e por tudo que tem me ensinado.

Ao Marcelo Mota, por toda ajuda, paciência e disponibilidade sem as

quais o caminho teria sido muito mais difícil.

À Yara Furtado, Filomena Astes e Renata Fonseca pela coleta do

material. Sem vocês esse trabalho não seria possível. Obrigada.

Aos companheiros de laboratório pelo agradável convívio, em especial a

Samara Machado e Brenda Maiolino.

À Alessandra Macedo e toda equipe do CCP pela paciência e pelo

apoio.

A todos os meus amigos por entenderem os momentos de ausência e

por me incentivarem sempre.

Meu muito obrigado a todos aqueles que de alguma forma contribuíram

para a realização deste trabalho.

“A cada dia Deus nos dá uma tela nova,

quem escolhe as cores somos nós.”

Frei Clemente Kesselmerer

vii

RESUMO

Lattario, Fernanda. Análise da metilação dos genes DAPK e p16 e da

infecção por vírus do papiloma humano e vírus Epstein-Barr em lesões

precursoras e câncer do colo do útero.

Rio de Janeiro, 2009. Tese de Doutorado, Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

O câncer cervical é o segundo tipo de câncer mais comum entre as

mulheres. O vírus do papiloma humano (HPV) tem sido identificado na maioria

dos casos de câncer e em suas lesões precursoras. O vírus Epstein-Barr (EBV)

é outro vírus oncogênico que está presente em uma variedade de tipos de

câncer. A metilação da região promotora do DNA é o principal evento

epigenético durante a carcinogênese. A metilação dos genes DAPK e p16 têm

sido descrita como um evento importante na oncogênese cervical. O objetivo

deste estudo foi investigar o padrão de metilação da região promotora dos

genes DAPK e p16 e a presença de infecção por HPV e EBV em lesões

precursoras e câncer do colo do útero. As amostras foram obtidas de pacientes

que compareceram ao Departamento de Patologia Cervical do Instituto de

Ginecologia da UFRJ no período de junho de 2006 a junho de 2007. Um total

de 69 amostras foi analisado, sendo 20 de pacientes com citologia e

colposcopia normais (grupo controle), 24 de pacientes com lesão intra-epitelial

de alto grau (LIAG), 14 com carcinoma escamoso e 11 com adenocarcinoma. A

infecção viral foi avaliada utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR)

para detecção de sequencias virais e sequenciamento do DNA e o padrão de

metilação foi analisado através da modificação química com bissulfito de sódio,

seguido de PCR. A metilação aberrante de pelo menos um gene foi

encontrada em 45% da amostras do grupo controle, 58% das amostras de

LIAG, 79% das amostras de carcinoma escamoso e 64% de adenocarcinoma.

Pelo menos um vírus foi detectado em 40% do grupo controle, 50% das LIAG,

71% dos carcinomas escamosos e 36% dos adenocarcinomas. Também

avaliamos a relação entre a infecção viral e a metilação da região promotora e

encontramos que mais de 50% das amostras com metilação apresentam

infecção viral. Nossos resultados sugerem que a metilação da região promotora

é um evento frequente no carcinoma cervical.

PALAVRAS-CHAVES: câncer do colo do útero, metilação, DAPK, p16, HPV,

EBV.

viii

ABSTRACT

Lattario, Fernanda. Evaluation of DAPK and p16 genes methylatioon and

HPV and EBV infection in precancerous cervical lesion and in cervical

cancer. Rio de Janeiro, 2009. Tese de Doutorado, Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Cervical cancer is the second most common cancer among women

worldwide. Human Papillomavirus (HPV) has been identified in most cases of

cervical cancer and its precursors lesion. Epstein-Barr virus (EBV) is another

oncogenic virus present in a variety of cancers. Methylation of the DNA

promoter region is the main epigenetic change in humans. Methylation of the

DAPK and p16 gene has been described as a significant event in cervical

oncogenesis. The purpose of this study was to investigate the promoter

methylation status of DAPK and p16 genes and the presence of HPV and EBV

infection in precancerous lesion and in cervical cancer. Cervical samples were

obtained from patients from Cervical Pathology Unit of the Institute of

Gynecology at UFRJ from june 2006 to june 2007. A total of 69 samples were

analyzed, being 20 from patients with normal cytology and colposcopy (control

group), 24 from patients with high-grade intraepithelial lesion (HSIL), 14 from

patients with squamous cell carcinoma (SCC) and 11 from patients with

adenocarcinoma (AD). Viral infection was analyzed using polymerase chain

reaction (PCR) and DNA sequencing and promoter methylation status was

evaluated using chemical modification by sodium bisulfite followed by PCR.

Aberrant methylation of at least one gene was detected in 45% of control group,

58% of cases of HSIL, 79% of SCC and 64% of AD. At least one virus infection

was detected in 40% of control group, 50% in HSIL, 71% in SCC and 36% in

AD. We also evaluated the correlation between viral infection and promoter

methylation and found that more than 50% of infected samples were

methylated. Our results suggest that promoter methylation is frequent event in

cervical carcinoma and the pattern of promoter hypermethylation is distinctly

different between AD and SCC.

KEYWORDS: methylation, cervical cancer, DAPK, p16, HPV, EBV.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Progressão de uma lesão benigna até carcinoma invasor .... 15

Figura 2 Genoma do HPV mostrando região tardia e precoce ............ 19

Figura 3 Genoma do HPV durante o processo de iintegração .............

Figura 4 HPV e o ciclo celular .............................................................. 22

Figura 5 Esquema da junção escamo-lacunar mostrando a infecção

por HPV e a progressão do comprometimento do epitélio

escamoso ...............................................................................

Figura 6 Genoma do EBV .................................................................... 26

Figura 7 Representação esquemática da regulação transcricional em

células com e sem infecção por EBV......................................

Figura 8 Metilação do DNA .................................................................. 32

Figura 9 Esquema do ciclo celular mostrando a participação da

proteína p16 no controle do ciclo na passagem pelo ponto

de checagem G1-S ................................................................

Figura 10 Representação esquemática mostrando os vários motivos e

domínios da proteína DAPK ...................................................

Figura 11

Via de ativação da DAPK .......................................................

Tabela 1 Função das principais proteínas codificadas pelo EBV ......... 27

Tabela 2 Perfil da expressão das proteínas virais do EBV nos

diferentes tipos de latência ....................................................

Tabela 3 Genes frequentemente metilados em células cancerosas e

suas respectivas funções nas células ....................................

Tabela 4 Genes frequentemente metilados em câncer cervical ........... 36

Tabela 5 Análise da infecção viral nos diferentes tipos de lesão ..........

Tabela 6 Análise do padrão de metilação dos genes DAPK e p16 nos

diferentes tipos de lesão ........................................................

Gráfico 1 Perfil da infecção viral com a progressão da lesão do colo

do útero ..................................................................................

Gráfico 2 Perfil do padrão de metilação com a progressão da lesão da

patologia cervical ...................................................................

Gráfico 3 Correlação entre a infecção viral e o padrão de metilação ....

Gráfico 4 Correlação entre a infecção viral e o padrão de metilação

das amostras de carcinoma escamoso ..................................

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ....................... 78

Anexo 2 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa .........................

Anexo 3 Artigo publicado – “Evaluation of DAPK gene methylation

and HPV and EBV infection in cervical cells from patients

with normal cytology and colposcopy” ………………………...

Anexo 4 Artigo publicado – “Analysis of human papillomavirus and

Epstein-Barr vírus infection and aberrant death-associated

protein kinase methylation in high-grade squamous

intraepithelial lesions” …………………………………………...

Anexo 5 Artigo aceito para publicação – “The presence of

methylation of the p16

INK4A

gene and human papillomavirus

in high-grade cervical squamous intraepithelial lesions” …….

Anexo 6 Manuscrito em preparação – “Promoter hypermethylation of

death-associated protein kinase gene and p16 gene and

Human Papillomavirus and Epstein-Barr virus infection in

cervical cancer” …………………………………………………..

101

Anexo 7 Manuscrito em preparação – “Correlation of

imunohistochemistry of p16 protein and p16 gene

methylation in patients with high-grade intraepithelial lesion

from cervix uteri infected by Papillomavirus” …………………

117

Anexo 8 Artigos relacionados aceitos para publicação – “Epstein-Barr

vírus and Papillomavirus infection in vulvar lichen sclerous” .

130

Anexo 9 Artigos relacionados aceitos para publicação – “Promoter

hypermethylation patterns of death-associated kinase and

p16 in vulvar lichen sclerous” .................................................

132

LISTA DE ABREVIATURAS

AMP Adenosina monofosfato

CaM Calmodulina

CDK Cyclin-dependent kinase (Cinase dependente de ciclina)

CKI CDK inhibitor protein (Proteína inibidora de cinase ciclina-

dependente)

CpG Cytosine Phospho Guanine (Citosina fosfo guanina)

DAPK Death-associated protein kinase (Proteína cinase liga à apoptose)

DNA Desoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)

DNMT DNA metiltransferase

E Early region (Região precoce)

EBV Epstein-Barr Vírus

EDTA Ethylenediamine teraacetic acid (Ácido etilenodiamino tetra-acético)

HPV Human Papillomavirus (Papilomavirus humano)

INF Interferon

L Late region (Região tardia)

LIAG Lesão intra-epitelial de alto grau

LIBG Lesão intra-epitelial de baixo grau

NIC-I Neoplasia intra-epitelial cervical grau I

NIC-II Neoplasia intra-epitelial cervical grau II

NIC-III Neoplasia intra-epitelial cervical grau III

Ser Serina

TNF Tumor necrosis factor (Fator de necrose tumoral)

xii

LISTA DE SÍMBOLOS

nm nanômetro (um milionésimo de milímetro)

kb kilo (quilo) pares de base

kDa kilodalton (1000 daltons)

pb pares de base

rpm rotações por minuto

mg miligrama (um milionésimo de grama)

mL mililitro (um milionésimo de litro)

µL microlitro (um milionésimo de litro)

µM micromolar (um milionésimo de mol)

mM milimolar (um milésimo de um mol)

xiii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................. 14

1.1 CÂNCER DO COLO DO ÚTERO ................................................ 14

1.2 PAPILOMA VÍRUS HUMANO ...................................................... 17

1.2.1 DA INFECÇÃO POR HPV AO CÂNCER .................................. 22

1.3 EPSTEIN-BARR VIRUS ...............................................................

1.4 METILAÇÃO ................................................................................ 31

1.5 O GENE p16 ................................................................................ 37

1.6 O GENE DAPK ............................................................................ 40

2. OBJETIVOS ......................................................................................

2.1 OBJETIVOS GERAIS .................................................................. 44

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................ 44

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 45

3.1 MATERIAL ................................................................................... 45

3.2 MÉTODOS ................................................................................... 46

3.2.1 EXTRAÇÃO DO DNA ............................................................ 46

3.2.2 ANÁLISE DA INFECÇÃO VIRAL ........................................... 46

3.2.3 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS ........... 47

3.2.4 SEQUENCIAMENTO ............................................................. 48

3.2.5 METILAÇÃO .......................................................................... 49

4. RESULTADOS ................................................................................. 50

4.1 ANÁLISE DA INFECÇÃO VIRAL ................................................. 50

4.2 SEQUENCIAMENTO ................................................................... 52

4.3ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO .....................................

4.4 ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO X INFECÇÃO VIRAL . 55

5. DISCUSSÃO ..................................................................................... 57

5.1 INFECÇÃO VIRAL ....................................................................... 57

5.2 METILAÇÃO ................................................................................ 60

5.3 METILAÇÃO X INFECÇÃO VIRAL .............................................. 63

6. CONCLUSÃO ................................................................................... 66

7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 67

ANEXOS ............................................................................................... 76

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER DO COLO DO ÚTERO

O câncer do colo uterino apresenta enormes repercussões para as

mulheres de todo mundo, e em especial para as dos países em

desenvolvimento. A cada ano, em todo o mundo, são detectados 466.000

novos casos de câncer cervical. Aproximadamente 80% dos casos ocorrem em

países em desenvolvimento, onde os programas de prevenção e diagnóstico

são pouco eficazes (CASTELLSAGUÉ, et al., 2006). No Brasil, o câncer do

colo do útero é a terceira neoplasia maligna mais comum entre as mulheres,

sendo superado pelo câncer de pele (não melanoma) e pelo câncer de mama

(INCA, 2008). No ano de 2008, as estimativas de incidência de câncer do

Instituto Nacional do Câncer (INCA), apontam para a ocorrência de 18.860

novos casos de câncer do colo do útero, com risco estimado de 19 casos para

cada 100 mil mulheres (INCA, 2008).

Lesões intra-epiteliais cervicais, também designadas como neoplasias

intra-epiteliais cervicais (NIC), são lesões cervicais que podem progredir ao

câncer do colo do útero. Essas lesões cervicais são consideradas como um

fenômeno único, contínuo e progressivo, caracterizadas por diversos graus de

anomalias de diferenciação e maturação celular na espessura do epitélio

cervical, até o comprometimento total do mesmo (ANDERSON, et al., 1991; DE

PALO e VECCHIONE, 1996). Assim, lesões intra-epiteliais de baixo grau

(LIBG), que também podem ser chamadas de displasia leve ou NIC-I,

apresentam células com diferenciação alterada no terço inferior do epitélio. De

Normal

Pequena

displasia

Carcinoma

situ

Displasia

severa

Displasia

moderada

Carcinoma

invasor

Infec

ão por HPV,

produ

ção viral

Sem produ

ão

viral

Muito E6 e E7

Integra

ão do

DNA viral

Carcinoma

microinvasor

Citologia

Histologia

LIBG

LIAG

NIC

III

NIC

Normal

Pequena

displasia

Carcinoma

situ

Displasia

severa

Displasia

moderada

Carcinoma

invasor

Infec

ão por HPV,

produ

ção viral

Sem produ

ão

viral

Excesso de pr

oteínas virais E6 e E7

Integra

ão do

DNA viral

Carcinoma

microinvasor

Citologia

Histologia

LIBG

LIAG

NIC

III

NIC

modo similar, as lesões intra-epiteliais de alto grau (LIAG), também designadas

como displasia moderada ou acentuada, NIC-II ou NIC-III, ou ainda, carcinoma

in situ (BROSO e BUFFETTI, 1993), quando apresentam células com

diferenciação alterada nos 2/3 inferiores do estrato epitelial denominam-se

displasia moderada ou NIC-II, e quando ocupa mais de 2/3 ou toda a

espessura do epitélio cervical são designadas de displasia acentuada ou NIC-

III ou carcinoma in situ (Figura 1) (DE PALO e VECCHIONE, 1996).

Figura 1: Progressão de uma lesão benigna até carcinoma invasor. LIBG –

Lesão intra-epitelial de baixo grau; LIAG – Lesão intra-epitelial de alto grau;

NIC – Neoplasia intra-epitelial cervical (traduzida e adaptada de LOWY e

SCHILLER, 2006).

O conceito de lesões precursoras de câncer cervical data de muitos

anos. Os estudos foram evoluindo como uma combinação de observações

histológicas e análises clínicas retrospectivas, levando ao conceito de que o

carcinoma escamoso invasor se desenvolvia de lesões precursoras, que

poderiam ser identificadas pelos patologistas (FIDLER et al., 1968; RICHART e

BARON, 1969).

As lesões intra-epiteliais escamosas cervicais de alto grau são lesões

precursoras de câncer cervical. Nestas, as alterações arquiteturais e celulares

estão limitadas às camadas do epitélio escamoso, portanto, mantendo íntegra

a membrana basal (RICHART, 1968). O câncer acontece quando as células

invadem o tecido, atravessando a lâmina basal. Adenocarcinoma é a

denominação utilizada quando o tecido afetado é glandular e carcinoma

escamoso quando o tecido afetado é o epitélio escamoso (DE PALO e

VECCHIONE, 1996).

O carcinoma escamoso apresenta-se como uma lesão que altera a

morfologia do colo, sendo muitas vezes visíveis e palpáveis. O

adenocarcinoma origina-se de células do epitélio cilíndrico endocervical e sua

incidência vem aumentando nos últimos anos (DE PALO e VECCHIONE,

1996).

Mudanças no perfil das pacientes com câncer do colo do útero têm sido

observadas, como aumento da incidência e mortalidade nas mulheres com

menos de 35 anos de idade, aumento da incidência das neoplasias intra-

epiteliais nas adultas jovens e adolescentes e na existência de exame

citológico negativo em uma parcela significativa de pacientes com o diagnóstico

de carcinoma invasor. Essas tendências sugerem que as mulheres mais jovens

estão sendo expostas às causas do câncer em idades mais precoces (VISIOLI

et al., 2004).

Estudos epidemiológicos sobre o perfil do câncer do colo uterino têm

relacionado o seu desenvolvimento ao comportamento sexual das mulheres e a

transmissão de agentes infecciosos. Segundo a Organização Mundial da

Saúde, o principal fator de risco para a doença é a infecção pelo vírus do

Papiloma Humano (HPV). Porém, a infecção causada pelo HPV, isoladamente,

parece não ser fator suficiente para o aparecimento do câncer cervical. Fatores

endógenos relacionados ao hospedeiro (hormonais, genéticos e imunológicos)

e exógenos ambientais (anticoncepcional oral, tabagismo, dieta e

multiparidade) e virais (tipos oncogênicos e variantes do HPV) aumentam o

risco de aparecimento do câncer cervical (HO et al., 1995; ACLADIOUS, 2002;

CASTELLSAGUÉ e MUÑOZ, 2003; FRANCO et al., 2003; GUNNELL et al.,

2006).

1.2. VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO

O vírus do papiloma humano (HPV) é um vírus de dupla fita circular de

DNA com comprimento de 7900 kb pertencente a família Papillomaviridae (DE

VILLIERS et al., 2004). A partícula viral, vírion, consiste numa capa protéica, o

capsídeo que envolve o genoma. O HPV é vírus pequeno, não envelopado,

arredondado, com diâmetro em torno de 55 nm. Seu capsídeo, com

aproximadamente 2 nm de espessura, é composto por 72 unidades

morfológicas, os capsômeros, dispostos segundo uma simetria icosaédrica. Os

72 capsômeros são pentâmeros da proteína estrutural principal, L1. Uma outra

proteína, que aparece em menor proporção, L2, também compõe mais

internamente o capsídeo (DOORBAR, 2006).

O HPV é classificado conforme a espécie de hospedeiro natural e

subclassificado em tipos de acordo com a seqüência de nucleotídeos de DNA

(BURD, 2003; PEREYRA e PARELLADA, 2003).

Atualmente, são conhecidos mais de 100 tipos de HPV com base na

homologia do seu DNA, sendo que aproximadamente 40 possuem tropismo

pelo trato anogenital, e esses são classificados como grupos de alto e baixo

risco para o desenvolvimento do câncer, conforme o seu potencial oncogênico

(DE VILLIERS et al., 2004). Os HPVs dos tipos 6 e 11 induzem a condilomas

que afetam a pele anogenital e a parte inferior da vagina, sendo detectado em

lesões intra-epiteliais de baixo grau e são considerados de baixo risco pois

estão envolvidos em lesões benignas. Os HPVs tipos 16, 18, 30, 31, 33, 34, 39,

45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 e 70 são fortemente associados com câncer

cervical, sendo considerados de alto risco oncogênico (BURD, 2003;

KANESHIMA et al., 2003).

O mapa físico dos genomas de todos os HPVs é semelhante. O genoma

viral pode ser dividido em três regiões: a região “early” (precoce) contendo os

genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7 que são necessários à replicação viral e com

propriedades de transformação oncogênica; região “late” (tardia) contendo os

genes L1 e L2 que possuem códigos para a formação de proteínas do

capsídeo viral; a região regulatória (LCR) que contém a origem da replicação e

o controle dos elementos de transcrição e replicação (Figura 2) (BURD, 2003;

PEREYRA e PARELLADA, 2003; KANESHIMA et al., 2003).

Figura 2: Genoma do HPV mostrando a região tardia (laranja) e a precoce

(verde e vermelho). Em vermelho aparecem os genes E6 e E7 que são

relacionados com a transformação celular (Fonte: DOORBAR, 2006).

O gene E1 codifica proteínas envolvidas na replicação viral. O gene E2

codifica uma proteína de ligação envolvida na regulação da transcrição viral e

controle os genes E6 e E7. O gene E4 é responsável pela liberação do vírus,

pois está envolvido na ruptura do citoesqueleto celular. O gene E5 codifica uma

proteína que estimula a replicação viral (BEKKERS et al., 2004). Essa proteína

parece ser importante no estágio inicial da infecção, formando complexo com o

receptor do fator de crescimento epidermal e o receptor β do fator de

crescimento plaquetário. Recentemente tem sido demonstrado associação com

a prevenção da apoptose ativada por dano no DNA (zur HAUSEN, 2002). Os

genes E6 e E7 codificam proteínas que controlam a proliferação e a

transformação celular (PEREYRA e PARELLADA, 2003).

Os genes da região tardia codificam a proteína maior (L1) e a proteína

menor (L2) do capsídeo viral, as quais formam as partículas virais, chamadas

vírions (BEKKERS et al., 2004). A completa liberação dos vírions ocorre na

camada córnea do epitélio, durante o processo de descamação celular (BURD,

2003).

Os genes E1, E2, L1 e L2 estão nas regiões mais conservadas do

genoma dos diferentes tipos virais, sendo que o L1 é o mais estável e, por isso,

é utilizado para identificar novos tipos de HPV (DE VILLIERS et al., 2004).

O DNA viral dentro da célula do hospedeiro pode assumir duas formas: a

epissomal e a integrada. Na forma epissomal, o DNA viral permanece circular

no núcleo da célula do hospedeiro, não estando integrado ao DNA da mesma.

Essa forma é encontrada nas verrugas genitais e lesões de menor gravidade.

Para a integração do genoma circular ao DNA da célula hospedeira, esse deve

ser linearizado (Figura 3), pela quebra do DNA viral, resultando na ruptura ou

perda do gene E2, sendo encontrado nas lesões de maior gravidade

(PEREYRA e PARELLADA, 2003).

Após a integração dos HPVs de alto risco no genoma celular, esses

passam a expressar as oncoproteínas E6 e E7 que promovem o processo

maligno. A oncoproteína E6 interage com a proteína p53, promovendo sua

degradação, via ubiquitina-ligase, simulando o mesmo efeito da inativação, que

resulta na perda da função da p53 (SPINELLI, 2006). Também promove a

degradação da proteína pró-apoptótica BAK, um membro da família Bcl-2 (zur

HAUSEN, 2002), além de induzir a atividade da telomerase, evitando que a

célula entre em apoptose e induzindo ao processo de imortalização celular (zur

HAUSEN, 2000; BEKKERS et al., 2004). A oncoproteína E7 bloqueia a

proteína retinoblastoma (pRb), resultando na liberação do fator de transcrição

E2F, responsável para ativação de genes, importantes durante o ciclo celular

(BEKKERS et al., 2004).

Figura 3: Genoma do HPV. Durante o processo de integração ao genoma da

célula hospedeira, o genoma viral se torna linear. (traduzido de zur HAUSEN,

2002)

A integração do genoma do HPV ao DNA da célula hospedeira,

portanto, resulta na inativação e na degradação da p53 e pRb, duas proteínas

supressoras de tumor (Figura 4). Com isso, ocorre a instabilidade genética e a

perda do controle normal do ciclo celular, levando a transformação maligna das

células da mucosa cervical e posterior progressão para o câncer invasor

(DOORBAR, 2006).

Integração

Modulação dos

transcritos virais por

promotores da célula

hospedeira

Transcritos

quiméricos, aumento

da vida útil do mRNA

Frequentemente

deletados durante

a integração do

DNA

Durante a integração a

molécula circular se

abre

Infecção por HPV

TransativaçãoTransativação

Regulação

MDM

regulado

Muito p21

Pouco E7

Degradação

Inativação

MDM

Lâmina basal

e parabasal

Lâmina basal

Ciclina/cdk

Aumento

dos genes

necessários

para a

progressão

da fase S

Aumento

dos genes

necessários

para a

progressão

da fase S

Pouco p21

Muito E7

p21, E7 e ciclina E formam

um complexo. Ciclina E/cdk

inativa e presente em altos

níveis

p21 +E7 formam um complexo.

p21 inativada. Ciclina E/cdk ativa

e presente em baixos níveis

PROGRESSÃO DO CICLO

CELULAR INSTALADA

PROGRESSÃO

DA FASE S

Feedback

Sem

feedback

Regulação

Da p53

Infecção por HPV

TransativaçãoTransativação

Regulação

MDM

regulado

Muito p21

Pouco E7

Degradação

Inativação

MDM

Lâmina basal

e parabasal

Lâmina basal

Ciclina/cdk

Aumento

dos genes

necessários

para a

progressão

da fase S

Aumento

dos genes

necessários

para a

progressão

da fase S

Pouco p21

Muito E7

p21, E7 e ciclina E formam

um complexo. Ciclina E/cdk

inativa e presente em altos

níveis

p21 +E7 formam um complexo.

p21 inativada. Ciclina E/cdk ativa

e presente em baixos níveis

PROGRESSÃO DO CICLO

CELULAR INSTALADA

PROGRESSÃO

DA FASE S

Feedback

Sem

feedback

Sem

feedback

Regulação

Da p53

Figura 4: HPV e o ciclo celular (traduzida e adaptada de DOORBAR, 2006).

1.2.1 DA INFECÇÃO POR HPV AO CÂNCER

Os HPVs infectam a pele e a mucosa e iniciam o ciclo infeccioso no

momento em que penetram as camadas mais profundas do tecido epitelial da

cérvice uterina, em especial na junção escamo-colunar ou em regiões de

microlesões que podem ocorrer durante o intercurso sexual. Após um período

de incubação, que varia de meses a anos, podem ocorrer manifestações

clínicas como lesões vegetantes (verrugas) até o câncer cervical (Figura 5)

(BURD et al., 2003; PEREYRA e PARELLADA, 2003).

Epitélio escamoso estratificado

Partículas virais

Baixo grau

Neoplasia intra-epitelial cervical

Lesão intra-epitelial escamosa Câncer invasivo

Cervix normal

Alto grau

NIC-I NIC-II

NIC-III

Epitélio colunar simples

Epitélio escamoso estratificado

Partículas virais

Baixo grau

Neoplasia intra-epitelial cervical

Lesão intra-epitelial escamosa Câncer invasivo

Cervix normal

Alto grau

NIC-I NIC-II

NIC-III

Epitélio escamoso estratificado

Partículas virais

Baixo grau

Neoplasia intra-epitelial cervical

Lesão intra-epitelial escamosa Câncer invasivo

Cervix normal

Alto grau

NIC-I NIC-II

NIC-III

Epitélio colunar simples

Figura 5: Esquema da junção escamo-olunar mostrando a infecção por HPV e

a progressão do comprometimento do epitélio escamoso (traduzida e adaptada

de WOODMAN et al., 2007).

O reconhecimento de que a infecção por HPV, no trato genital, possa

estar associada com lesões pré-malignas é relativamente recente. Certas

anormalidades planas do epitélio da cérvice uterina, até o momento

considerado como lesões neoplásicas intra-epiteliais, apresentavam o mesmo

aspecto citológico das lesões verrucosas. Esse aspecto era a presença de

células conhecidas como coilócitos.

A coilocitose é o primeiro aspecto clínico da manifestação do HPV,

sendo uma célula escamosa intermediária que apresenta um grande vacúolo

citoplasmático ao redor do núcleo anormal. Outros aspectos citológicos são a

disqueratose, binucleação e multinucleação. Essas alterações caracterizam

uma lesão intra-epitelial de escamosa de baixo grau.

A progressão maligna, como dito anteriormente, resulta da integração do

HPV e da expressão de alguns genes, ocorrendo uma alteração na relação

hospedeiro-vírus. Esse processo é progressivo e se estende do epitélio normal

passando por lesão de baixo grau, lesões de alto grau antes de se tornar

câncer invasor. Nessa progressão, o vírus, anteriormente na forma epissomal,

passa para a forma linear, e se incorpora no DNA da célula epitelial hospedeira

(PEREYRA e PARELLADA, 2003).

As lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau são caracterizadas por

anormalidades no crescimento e diferenciação celular que tem sua origem na

replicação das células da camada basal que originam o epitélio. Esse

fenômeno produz distúrbios morfológicos em todas as camadas do epitélio e

apresenta células de tamanho menor do que aquelas vistas em lesão intra-

epitelial escamosa de baixo grau (ALBRING et al., 2006).

O HPV afeta entre 50 e 80% das mulheres sexualmente ativas pelo

menos uma vez na sua vida. As mulheres são mais afetadas, na maioria das

vezes, ainda na adolescência ou entre 20 e 30 anos de idade. Isso pode estar

associado a uma maior liberdade sexual entre os mais jovens e aumento do

número de parceiros nas idades mais avançadas (ACCP, 2004).

Aproximadamente 5 a 10% das mulheres infectadas por HPV de alto

risco oncogênico desenvolvem infecções persistentes. Evidências mostram que

essas mulheres têm risco aumentado de desenvolver lesões intra-epiteliais

cervicais de alto grau que podem evoluir, se não tratadas adequadamente,

para o câncer do colo do útero (ACCP, 2004).

O HPV é encontrado em 90% dos casos de carcinoma. Entretanto,

como dito anteriormente, o fato de apenas 5% a 10% das mulheres infectadas

desenvolverem a doença, sugere que outros eventos são necessários para a

carcinogênese (WALBOOMERS et al., 1999).

1.3 VÍRUS EPSTEIN-BARR

O vírus Epstein-Barr (EBV), ou Herpesvírus humano 4, pertence à

família Herpesviridae, subfamília Gammaherpervirinae. Esses vírus

apresentam tropismo por linfócitos B e tem propensão à oncogenicidade.

São vírus de DNA fita dupla, com genoma de aproximadamente 184 kb,

constituído por uma série de repetições terminais em cada extremidade e

seqüências internas repetidas que servem para dividir o genoma em domínios

curtos e longos que possuem a capacidade de codificar a maioria dos genes

(Figura 6) (THOMPSON e KURZROCK, 2004).

A partícula viral é bastante complexa. O capsídeo é icosaédrico,

constituído por 162 capsômeros, abrigando proteínas e enzimas. Possui

envelope lipoprotéico recoberto por inúmeras glicoproteínas. O EBV é um

agente infeccioso amplamente disseminado no ambiente. Mais de 90% dos

adultos acima de 30 anos são soropositivos para EBV e, nos países em

desenvolvimento, a soropositividade já é identificada antes dos 5 anos de idade

(COHEN, 2000; RICKINSON, 2002; KLUMB et al., 2004). O vírus é secretado

na saliva e a infecção ocorre por transmissão oral, geralmente no início da vida,

porém, quando a infecção é retardada até à adolescência ou vida adulta,

frequentemente resulta no quadro clínico da mononucleose infecciosa

(WILLIANS e CRAWFORD, 2006; SIXBEY et al., 1984). O EBV está

classicamente associado ao linfoma de Burkitt, principalmente à forma

endêmica, e tem sido associado à várias neoplasias em humanos incluindo

neoplasias hematopoiéticas (linfomas B, T/NK e linfoma de Hodgkin), epiteliais

(carcinoma de nasofaringe e carcinoma gástrico) e mesenquimais

(pseudotumor inflamatório de fígado e baço, e neoplasias de músculo liso

associadas ao vírus da imunodeficiência - HIV) (REZK e WEISS, 2007).

Figura 6: Genoma do EBV. É possível visualizar a localização e a transcrição

dos genes latentes do EBV no epissomo dupla fita de DNA (traduzida de

MURAY e YOUNG, 2003).

O EBV infecta linfócitos B e induz a proliferação policlonal de células B

linfoblastóides que são muito semelhantes a células de vários linfomas B

associados ao EBV (FARREL et al., 1997). São reconhecidos dois padrões de

EPISSOMO FITA DUPLA

infecção pelo EBV: a forma lítica, ou replicativa, ocorre esporadicamente e se

caracteriza pela liberação de vírions na circulação; e a forma latente, na qual o

EBV invade o núcleo dos linfócitos B, assumindo a forma epissomal, sem

produção viral (HSU E GLASER, 2000).

Durante a infecção latente, o vírus existe como um DNA circular

extracromossômico, expressando apenas alguns genes. Entre eles estão seis

antígenos nucleares (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3a, EBNA-3b, EBNA-LP e

EBNA-3c), três proteínas transmembranas (LMP-1, LMP-2a e LMP-2b), e dois

RNAs não poliadenilados que não são traduzidos (EBER-1 e EBER-2) (HSU E

GLASER, 2000). Suas funções estão resumidas na tabela 1.

Tabela 1: Função das principais proteínas codificadas pelo EBV (adaptado de

THOMPSON e KURZROCK, 2004).

Proteína Função

EBNA-1 Essencial para a imortalização celular, replicação do genoma

viral e segregação dos epissomos virais durante a mitose.

EBNA-2 É uma das primeiras proteínas expressas durante a infecção

viral. É essencial para a imortalização celular e regula a

expressão de genes virais e celulares.

EBNA-3a Essencial para a imortalização celular.

EBNA-3b Não é essencial para o processo de imortalização celular. Sua

função ainda é desconhecida.

EBNA-3c Essencial para a imortalização celular, se sobrepõe a pRb no

ponto de checagem do ciclo celular e aumenta a produção de

LMP-1.

EBNA-LP Interage com EBNA-2 para inativar p53 e pRb. É uma das

primeiras proteínas expressas durante a infecção viral, redistribui

EBNA-3A no núcleo, contribuindo para imortalização celular.

LMP-1 Essencial para imortalização celular. Mimetiza o sinal de ligação

da CD40.

LMP-2a e b Levam o EBV à latência. Parece ter papel na oncogênese na

doença de Hodkin e em carcinomas nasofaringeo.

EBER-1 e 2 Não são essenciais para o processo de transformação celular.

Participa no controle da síntese de proteína.

Alguns trabalhos têm sugerido que a interferência no ponto de

checagem do ciclo celular e as respostas a danos no DNA por oncoproteínas

codificadas do EBV têm papel essencial na carcinogênese (O’NIONS e

ALLDAY, 2004; YI et al., 2009). Estudos recentes têm demonstrado que o EBV

codifica antígenos que podem interferir com os pontos de checagem do ciclo

celular tanto em G1/S como em G2/M (KNIGHT et al., 2004; KNIGHT e

ROBERTSON, 2004; CHOUDHURI et al., 2007) para mediar a transformação

celular. Yi e colaboradores (2009) mostraram que o antígeno EBNA3C tem

potencial inibitório nas funções da p53. Na figura 7 é possível observar que o

antígeno EBNA3C inibe a apoptose mediada por p53 impedindo a interação

proteína-proteína entre a p53 e outros fatores celulares envolvidos na via da

apoptose ou a interação direta com as proteínas envolvidas (YI et al., 2009).

Todos os cânceres associados a EBV envolvem o ciclo de latência do

vírus. Foram observados diferentes tipos de expressão gênica durante a

latência. Em indivíduos saudáveis, o vírus persiste na forma epissomal nas

células B de memória. Neste caso, apenas a proteína LMP-2 é expressa e este

tipo de latência é denominado latência 0 (THOMPSON e KURZROCK, 2004).

Transcrição de

genes-alvo da p53

Apoptose

Ciclo celular parado

Bloqueio da apoptose

Proliferação celular

Transcrição de

genes-alvo da p53

Transcrição de

genes-alvo da p53

Apoptose

Ciclo celular parado

Bloqueio da apoptose

Proliferação celular

Transcrição de

genes-alvo da p53

Apoptose

Ciclo celular parado

Bloqueio da apoptose

Proliferação celular

Transcrição de

genes-alvo da p53

Figura 7: Representação esquemática da regulação transcricional em células

com e sem infecção por EBV. Em resposta a danos no DNA, a p53 atua como

um ativador da transcrição de genes envolvidos no controle do ciclo celular e

apoptose. Em células infectadas com EBV, o antígeno EBNA3C inibe a p53

através da formação de um complexo estável com esta proteína. p53 RE –

Elementos de resposta da p53 (traduzido e adaptado de YI et al., 2009).

Outros três tipos de latência caracterizam um grupo heterogêneo de

doenças malignas. Baseados no padrão de expressão gênica têm-se as

latências I, II e III. A latência do tipo I está classicamente associada ao linfoma

de Burkitt. A latência tipo II é observada em linfomas de Hodgkin, linfoma de

células T/NK e carcinomas indiferenciados de nasofaringe. Já a latência do tipo

III é observada em casos de doença linfoproliferativa pós-transplante (REZK e

Células sem EBV

Células

com

EBV

WEISS, 2007; DEYRUP, 2008). A tabela 2 apresenta o perfil de expressão

protéica viral do EBV em cada um dos tipos de latência.

Tabela 2: Perfil da expressão das proteínas virais do EBV nos diferentes tipos

de latência (adaptado de DEYRUP, 2008).

Latência tipo I Latência tipo II Latência tipo III

EBER-1

EBER-2

EBNA-1

EBER-1

EBER-2

EBNA-1

LMP-1

LMP-2

EBER-1

EBER-2

EBNA-1

EBNA-2

EBNA-3

LMP-1

LMP-2

Dois subtipos de EBV são conhecidos por infectarem humanos: EBV-1 e

EBV-2. EBV-1 e EBV-2 são diferentes na organização dos genes que codificam

o seu antígeno nuclear (EBNA-2, EBNA-3a, EBNA-3b e EBNA-3c). EBV-2

apresenta menor eficiência de transformação de células B do que o EBV-1 in

vitro, e a viabilidade das linhagens celulares linfoblastóides do EBV-2 são

menores do que as linhagens do EBV-1. As diferenças no potencial

transformante desses dois subtipos podem estar relacionadas com

divergências na sequencia de EBNA-2 (THOMPSON e KURZROCK, 2004).

Desde que foi descoberto como vírus oncogênico, a participação do EBV

tem sido demonstrada em uma série de tipos de cânceres. Entre eles

destacam-se o linfoma de Burkitt, doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin,

carcinoma de nasofaringe, câncer de mama, carcinoma gástrico, e doença

linfoproliferativa pós-transplante (ARRAND et al., 1981; TAKADA, 2000; KANG

et al., 2002; VO et al., 2002).

O papel do EBV no desenvolvimento do câncer do colo do útero ainda

não é claro. Esse vírus tem sido encontrado tanto em carcinomas como em

lesões precursoras do câncer (SASAGAWA et al., 2000). Wong e

colaboradores (1993) fizeram um estudo com pacientes com carcinoma

invasivo e encontraram EBV em 50% dos casos. O mesmo resultado foi

encontrado por Szkaradkiewicz e colaboradores (2004). Em seu trabalho, além

da presença do EBV, ele estudou a co-infecção de HPV e EBV mostrando que

pode existir uma relação da infecção viral com o desenvolvimento da patologia

cervical. Kim e colaboradores (2005) encontraram EBV em torno de 70% das

lesões cervicais analisadas e, estudando a metilação do p16, mostraram que,

em 60% das lesões EBV-positivas, o gene p16 estava metilado, sugerindo,

dessa forma, que o EBV não atua sozinho na carcinogênese, mas está

relacionado com as etapas iniciais do processo.

Alguns estudos têm demonstrado que a proteína de membrana LMP-1

ativa a enzima DNA metiltransferase celular promovendo a hipermetilação da

região promotora de genes importantes (TSAI et al., 2002; TSAI et al., 2006).

1.4 METILAÇÃO

A metilação é uma modificação química catalisada pela S-

adenosilmetionina (SAM), um co-fator enzimático encontrado em todas as

células eucarióticas, na qual são adicionados radicais metil (CH

) em regiões

específicas do DNA (Figura 8).

Figura 8: Metilação do DNA (traduzido e adaptado de Taylor, 2006).

A metilação ocorre no carbono 5 de resíduos de citosinas (C) seguidas

de guaninas (G), conhecidas como sítios CpGs, sendo mais da metade desses

sítios metilados (TYCKO,2000). Os que não estão metilados recebem a

denominação de Ilhas CpGs e encontram-se principalmente na região

promotora dos genes (HERMAN et al., 1996). O critério para se identificar uma

região como uma ilha CpG é que ela seja maior que 200bp, tenha um conteúdo

de citosina e guanina maior que 50% e que a proporção entre CG e GC seja

maior que 60% (Toyota et al., 1999; CLARK e MELKI, 2002).

A metilação é mediada por enzimas denominadas DNA metiltransferases

(DNMT). Três enzimas ativas já foram identificadas: DNMT1, DNMT3a e

DNMT3b. A DNMT1 é responsável pela manutenção dos níveis de metilação

durante a replicação e o reparo do DNA. A DNMT3a e a DNMT3b são

responsáveis pela metilação de novo durante a embriogênese (DUEÑAS-

GONZÁLEZ et al., 2005). A metilação das citosinas das ilhas CpG é

DNA metiltransferase

5-metilcitosina Citosina

SAM –

SAM

geralmente associada com repressão transcricional, tanto por inibir diretamente

a ligação de ativadores de transcrição como pela atração de uma família de

proteínas que contém domínio de ligação com metil-CpG. Essas proteínas

complexadas com moléculas co-repressoras podem recrutar histonas

deacetilases, e a desacetilação das histonas torna a cromatina mais

compactada nos sítios adjacentes a metilação tornando-os inacessíveis a

transcrição (SZALMÁS e KÓNYA, 2009).

A metilação é um processo que ocorre naturalmente dentro das células

sendo, portanto, um mecanismo essencial para o desenvolvimento normal das

células. Inicialmente, este processo estava associado apenas ao controle da

expressão gênica. Atualmente, as funções da metilação na célula normal já

estão bem estabelecidas (STRATHDEE e BROWN, 2004):

• Inativação do cromossomo X – fêmeas de mamíferos apresentam

dois cromossomos X enquanto o macho contém apenas uma

cópia. Esse problema de dosagem é compensado pela inativação

de um dos cromossomos X, na fêmea, durante os primeiros

estágios do desenvolvimento. A inativação do cromossomo X é

associada com a metilação generalizada das suas ilhas CpGs. A

metilação da citosina também é responsável pela inativação de

genes específicos no cromossomo X. Sabe-se que a inativação

do cromossomo X é um processo que ocorre nas fêmeas de

mamíferos e nas mulheres, resultando na inativação seletiva de

alelos em um dos dois cromossomos. A escolha do X inativado

na célula é aleatória, de modo que algumas células inativarão o X

paterno e outras, o X materno. O cromossomo X inativo pode ser

visto próximo à membrana do núcleo interfásico da célula como

corpúsculo de Barr ou corpúsculo de cromatina sexual

(MOMPARLER e BOVENZI, 2000).

• Imprinting – inúmeros genes de mamíferos são conhecidos por

apresentarem imprinting, ou seja, funcionam de maneira haplóide

expressando apenas um dos alelos herdados. A metilação do

DNA parece ser uma parte crítica neste processo já que uma

grande parte dos genes com imprinting está associada com

regiões diferencialmente metiladas. É um tipo de herança

epigenética, na qual os alelos de determinado gene são

expressos de formas diferentes, dependendo de que progenitor

foi herdado. Seu descontrole conduz a alterações no

desenvolvimento embrionário, doenças hereditárias e

carcinogênese (mola hidatiforme e teratomas ovarianos). A perda

do imprinting associada à perda de metilação alelo-específica

caracteriza um exemplo de variação epigenética, encontrada em

células tumorais, que atuam como facilitadoras da expressão de

proto-oncogenes e inativadoras de genes supressores tumorais

(FALLS et al., 1999; SCHOFIELD et al., 2001).

Em câncer, o funcionamento aberrante das enzimas modificadoras da

cromatina resulta num padrão de metilação alterado e modificação de histonas.

Numerosos estudos têm demonstrado que a metilação do promotor pode ser

um dos mecanismos da inativação de genes supressores de tumor em células

cancerosas (TYCKO, 2000). Muitos genes foram identificados por possuírem

metilação diferente em células tumorais, incluindo genes envolvidos em todos

os aspectos do desenvolvimento e progressão do tumor (TEODORIDIS et al.,

2004). Alguns genes frequentemente metilados e silenciados em tumores são

mostrados na tabela 3.

Tabela 3: Genes frequentemente metilados em células tumorais e seus

respectivos efeitos na célula (adaptado de TEODORIDIS et al., 2004).

Efeito na célula tumoral Gene

Potencial replicativo ilimitado

Rb, CDX1, GATA-4, GATA-5, Myf-3, SOES-3

Insensibilidade a sinais

anticrescimento

CyclinD2, ER

, INHA, Lot1, MB-Comt,p15INK4b,

p16INK4a, p21WAF1, p27KIP1, Pax5, PTEN, RAR

RASSF1, SFRPs, TGF

Angiogênese THBS1, THBS2, VHL

Evasão de apoptose

Apaf1, Casp8, DAPK, DLC-1, Fas, p14ARF, p53, P 73,

SHP1, Trail-R1, XAF1

Adesão intracelular e invasão

de tecido

ADAM23, E-Cadherin, H-Cadherin, Cav-1, CD44,

CLCA2, CLDN-7, gelsolin, laminin-5, OPCML, TIMP3,

SLIT2, TFF1, TSCL1

Reparo do DNA

MGMT, MLH1, BRCA1, FancF

Metabolismo

GSTP1, Cytp4501A1, MDR1, RFC

Em câncer do colo do útero, a metilação de genes tem sido bastante

estudada (REESINK-PETERS et al., 2004; YANG et al., 2004; KIM et al.,

2005). Na tabela 4 estão descritos alguns dos genes que estão sendo

estudados e que apresentam metilação aberrante em câncer cervical.

Tabela 4: Genes frequentemente metilados em câncer cervical (adaptado de

DUEÑAS-GONZÁLEZ et al., 2005).

Gene Taxa de metilação Função

p73 39% Apoptose

p16 10-100% Ciclo celular

MGMT 5-81% Reparo de DNA

BRAC1 6,1% Via FA-BRAC

DAPK 45-100% Metástase e morte celular

TSLC1 58-65% Supressor de tumor

FHIT 11-88% Reparo de DNA e morte celular

TIMP2 47% Inibidor de metaloproteínas

TIMP3 1-10% Inibidor de metaloproteínas

Muller e colaboradores (2004) desenvolveram um trabalho no qual foram

comparados os padrões de metilação em células normais e tumorais. Foi

verificado que pacientes cujo padrão de metilação das células tumorais era

semelhante ao padrão de células normais tiveram o tumor restrito ao colo do

útero e um prognóstico melhor quando comparados com pacientes cujo padrão

de metilação era muito diferente das células normais.

O prognóstico do câncer do colo útero pode ser derivado do padrão de

metilação das células tumorais, o que fornece uma informação importante para

a escolha do tratamento.

1.5 O gene p16

O gene p16, também referido como CDKN2, INK4A, CDK41 e MST1, é

um gene supressor de tumor, localizado no cromossomo humano 9p21, que

codifica uma proteína de 156 aminoácidos, designada p16, que

especificamente liga-se às cinases dependentes de ciclina (CDKs) CDK4 e

CDK6. Estas cinases são as principais parceiras catalíticas para as ciclinas D.

Colaboram com a ciclina E-CDK2 no controle da transição da fase G1 para S

do ciclo celular (HARA et al., 1996; GRAY-SCHOPFER et al., 2006).

No ciclo de divisão celular (Figura 9), a p16 se liga ao complexo ciclina

D-CDK4 ou 6, inibindo a fosforilação da pRb e retornando a formação do

complexo pRb/E2F. Com isso temos a finalização dos processos no ponto de

checagem G1-S. A perda funcional do p16 resulta na proliferação celular

anormal pela remoção do controle do ponto de checagem do ciclo celular, o

que permite que as células progridam para a fase S (CASTELLANO et al.,

1997).

A proteína p16 inibe as CDK4 e 6 no ponto de checagem G1, para que

a célula entre na fase G0 (quiescência) até que o dano do DNA seja corrigido.

A inativação desta proteína, ou a sua ausência (por metilação do gene p16),

permite que a célula entre na fase S após uma breve parada na fase G1

(SANO et al., 1998).

Ciclo

celular

Ciclo

celular

Figura 9: Esquema do ciclo celular mostrando a participação da proteína p16

no controle do ciclo na passagem pelo ponto de checagem G1-S. CCND1 –

ciclina D (traduzida e adaptada de SEKULIC et al., 2008).

A expressão da proteína p16 no tecido humano varia com a idade; na

infância, a expressão é confinada ao timo e na idade adulta é expressa no

endométrio proliferativo, nos ductos mamários, em células do antro gástrico, no

epitélio escamoso esofágico, nas glândulas salivares, e em algumas células

neuroendócrinas (NIELSEN et al., 1999).

Devido ao seu importante papel no controle do ciclo celular, o gene p16

tem sido alvo de diversos estudos que tem demonstrado que as anormalidades

neste gene ocorrem por deleção (33%), metilação (20%) ou mutação (10%)

(NUOVO et al., 1999).

A inativação na transcrição do gene p16, em associação com a

hipermetilação das ilhotas CpG na região promotora proximal, tem sido

relacionada com algumas formas de câncer e parece ser, particularmente,

comum em tumores de células escamosas (NUOVO et al., 1999). A metilação

do gene da p16 tem sido reportada tanto em câncer como em lesão pré-

maligna sugerindo um papel precoce desse gene no desenvolvimento de

tumores. Em câncer do colo do útero, a incidência da metilação desse gene em

pacientes varia entre 10% a 100%, dependendo da população em estudo

(DUEÑAS-GONZÁLEZ et al., 2005).

A hipermetilação da região promotora de seis genes, entre eles o p16,

foi avaliada através da técnica de PCR metilação-específico. Neste estudo,

foram avaliados 53 casos de câncer do colo do útero, sendo 31 casos de

carcinoma escamoso e 22 casos de adenocarcinoma. Os autores concluíram

que a freqüência de metilação é maior nos casos de carcinoma escamoso

(38%) do que nos casos de adenocarcinoma (18%) e não encontraram

metilação em tecidos de pacientes normais. Assim sendo, a metilação do gene

p16 poderia ser usado como um marcador tumoral (DONG et al., 2001).

Ainda utilizando a técnica de PCR metilação-específica, Yang e

colaboradores (2004), também detectaram uma maior freqüência de metilação

do gene da p16 em pacientes com carcinoma escamoso (29%) quando

comparado com adenocarcinoma (25%).

Em pacientes com lesões de alto grau, o p16 aparece metilado em 24%

dos casos, e em 42% dos casos de câncer (VIRMANI et al., 2004). Diversos

trabalhos observaram o aumento da freqüência de metilação com a progressão

da patologia cervical (NARAYAN et al., 2003; VIRMANI et al., 2004; LEA et al.,

2004; SZALMÁS e KÓNYA, 2009). Esse fato sugere que a metilação do p16 é

um evento precoce na progressão da patologia cervical.

1.6 O gene DAPK

A apoptose é um processo geneticamente controlado de morte celular

programada, sendo importante para a manutenção da homeostase dos tecidos.

O gene DAPK (death-associated protein kinase) codifica uma serina/treonina

cinase que atua com mediador positivo da apoptose (CHAN et al., 2005). Sua

atividade, relacionada a superexpressão de cinases, leva a alterações ligada a

morte celular incluindo alterações de membrana, desligamento da matriz

extracelular e formação de vesículas autofágicas (BIALIK e KIMCH, 2006).

A proteína DAPK tem estrutura complexa, com multi-domínios que

incluem um domínio cinase regulado por cálcio/calmodulina, uma série de

repetições anquirinas e um domínio carboxi-terminal de morte celular (Figura

10) (JIN et al., 2002).

DAPK pode ser ativado por vários mecanismos, incluindo ligação com

CaM, fosforilação da Ser735 pela ERK e fosforilação da Ser308. Outros

mecanismos que levam ao aumento da DAPK incluem a ativação da p53 no

ponto de checagem para apoptose dependente do complexo p19ARF/p53

(Figura 11). O DAPK também participa na morte celular induzida por INFγ e na

apoptose induzida por TNFα e Fas (BIALIK E KINCHI, 2006).

Domínio

quinase

Domínio

morte celular

Microfilamento de actina

Região

regulatória

CAM

Domínio de

ligação ao

microfilamento

“Loop”

Calda C-terminal

Anquirinas

Domínio

quinase

Domínio

morte celular

Microfilamento de actina

Região

regulatória

CAM

Domínio de

ligação ao

microfilamento

“Loop”

Calda C-terminal

Anquirinas

Figura 10: Representação esquemática mostrando os vários motivos e

domínios da proteína DAPK (traduzida e adaptada de KIMCHI, 2001).

O gene DAPK está localizado no cromossomo 9q34.1 e sua expressão é

frequentemente perdida em tumores humanos por metilação da região

promotora. O gene DAPK está associado à supressão de tumores por controlar

a apoptose e impedir o crescimento de células tumorais (INBAL et al., 2000).

Análises do padrão da metilação do gene DAPK mostraram alta

frequência de metilação em inúmeros tipos de cânceres: carcinoma escamoso

de cabeça e pescoço (HASEGAWA, et al., 2002), carcinoma de ovário (BAI et

al., 2004), carcinoma gástrico (CHAN et al., 2005), entre outros. Foi observado

que há um risco maior do paciente apresentar metástase quando este gene

encontra-se metilado (ESTELLER et al., 2001; HASEGAWA, et al., 2002;

GONZALEZ-GOMES et al., 2003).

Estímulo para apoptose

Desfosforilação

CaM

Formação de

autofagossomo

Alteração de

membrana

Desligamento

da matriz

Integrinas

sinalização

Morte celular

Fragmentação do DNA

corpos apoptóticos

Apoptose

Autofagia

Necrose

programada

Estímulo para apoptose

Desfosforilação

CaM

Formação de

autofagossomo

Alteração de

membrana

Desligamento

da matriz

Integrinas

sinalização

Morte celular

Fragmentação do DNA

corpos apoptóticos

Apoptose

Autofagia

Necrose

programada

Figura 11: Via de ativação da DAPK. DAPK regula numerosas funções através

da fosforilação de múltiplos substratos (setas azuis). Essas vias resultam em

diferentes fenótipos que culminam com a morte celular (setas vermelhas)

(traduzida e adaptada de BIALIK E KINCHI, 2006).

Em câncer cervical, a região promotora de gene DAPK pode estar

metilada entre 45 e 100% dos casos (DUEÑAS-GONZÁLEZ et al., 2005).

Henken e colaboradores (2007) avaliaram a hipermetilação da região

promotora de diversos genes em câncer do colo do útero. Com relação ao

DAPK, foi observado que este gene está metilado em 56% dos casos de

carcinoma escamoso e em nenhum caso de adenocarcinoma.

Ressink-Peters e colaboradores (2004) avaliaram a metilação do DAPK

em 48 amostras de câncer cervical e em 41 amostras controles e encontraram

metilação em 73% das amostras de câncer contra 2 % das amostras controles.

Das amostras de câncer com metilação, a grande maioria é de carcinoma

escamoso (61%). O mesmo resultado foi observado por Dong e colaboradores

(2001). Neste trabalho, os autores sugerem que a metilação da região

promotora do gene DAPK é um evento comum na carcinogênese cervical.

Alguns estudos têm demonstrado metilação neste gene não somente

em câncer, mas também em lesões precursoras. Cerca de 30% a 60% das

lesões precursoras de câncer do colo uterino apresenta DAPK metilado (DONG

et al., 2001; NARAYAN et al., 2003).

Esse fato sugere que a metilação desse gene pode ser um evento

precoce na carcinogênese cervical e que poderia ser utilizado como um

marcador de prognóstico.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o padrão de metilação da região promotora dos genes DAPK e

p16 e analisar a presença dos vírus HPV e EBV em células de pacientes

normais (controle, pacientes com citologia e colposcopia normais), com lesão

precursora e câncer do colo do útero.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar a participação dos vírus HPV e EBV na oncogênese

cervical.

• Verificar se a presença dos vírus altera o padrão de metilação das

amostras estudas.

• Relacionar a metilação com a progressão da doença.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL

Neste trabalho foram utilizadas células de colo uterino provenientes de

pacientes sem lesão no colo do útero (grupo controle), com lesão intra-epitelial

escamosa de alto grau e carcinoma (adeno e escamoso) com idades entre 19 e

86 anos que compareceram ao Ambulatório de Patologia Cervical do Instituto

de Ginecologia da UFRJ no período de junho de 2006 a junho de 2007.

As pacientes recrutadas apresentaram citologia prévia com diagnóstico

de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau ou carcinoma cervical. Também

foram selecionadas pacientes com citologia e colposcopia normais para

formarem o grupo controle.

Na primeira consulta, as pacientes foram esclarecidas quanto às

características do projeto e da não necessidade do aceite para que obtivessem

o tratamento adequado e, só então, assinaram o termo de Consentimento

Informado Livre e Esclarecido (Anexo 1).

As pacientes foram submetidas ao exame colposcópico de acordo com a

rotina do Ambulatório de Patologia Cervical para confirmação do exame

citológico e posterior encaminhamento.

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho sob o número 047/06 (Anexo 2).

Fizeram parte deste trabalho pacientes menacmes e climatéricas.

Pacientes grávidas ou que engravidaram durante o trabalho, com

procedimentos cervicais prévios e HIV positivas foram excluídas do trabalho.

O material foi coletado na forma de escovado em pacientes normais e

com e adenocarcinoma e de biópsia em pacientes com lesão de alto grau e

carcinoma escamoso. Ao todo foram analisadas 20 amostras de pacientes com

citologia e colposcopia normais (grupo controle), 24 pacientes com lesão intra-

epitelial de alto grau, 25 pacientes com câncer cervical, sendo 14 com

carcinoma escamos e 11 com adenocarcinoma.

3.2 MÉTODOS

3.2.1 EXTRAÇÃO DE DNA

As amostras coletadas das pacientes foram tratadas com 100 µL

proteinase K (10mg/mL), incubado durante 16 horas, a temperatura de 55º C.

Após esse período a mistura foi tratada com fenol:clorofórmio (1:1) por duas

vezes e, em seguida, precipitada com etanol absoluto a -20ºC por 16 horas. As

amostras foram lavadas com etanol 80% e ressuspendidas 20 µL de água

estocadas a -20ºC até serem utilizadas.

3.2.2 ANÁLISE DA INFECÇÃO VIRAL

O DNA extraído foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR)

para confirmação da sua integridade, usando iniciadores para o exon 5 do gene

codificante da proteína p53, que amplificam um fragmento de 274 pb segundo

descrito por Pestener e colaboradores.

A análise da infecção por HPV e por EBV foi realizada por PCR. A

detecção do HPV foi feita utilizando os iniciadores MY09 e MY11 (TING et

al.,1990), que amplificam uma região conservada do gene L1 de 450 pb. Para a

detecção do EBV foram utilizados os iniciadores TC67 e TC69 (SAITO et al.,

1989). Estes iniciadores amplificam um fragmento de 288 pb correspondente a

região Bam M que é repetida 10 vezes no genoma do EBV.

As reações de PCR foram realizadas utilizando 4 µL de DNA em volume

final de 50 µL de mistura de reação contendo 5 µL de tampão 10 x, 1,5 µL de

50 mM MgCl

, 1 µL de 10 mM dNTPs, 0,5 µL de Taq 5 U/µl, 1 µL de 10 µM de

iniciador direto, 1 µL de 10 µM de iniciador reverso e H

0 para 50 µL de reação.

Para HPV são utilizados 3µL de 50 mM MgCl

, 3 µL de 10 µM de iniciador

direto e 3 µL de 10 µM de iniciador reverso . As condições de amplificação

foram: 5 minutos de desnaturação a 95°C, seguido de 35 ciclos de 95°C

durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto e 72ºC durante 1 minuto. A extensão

final foi realizada por 10 minutos a 72°C e o produto amplificado foi mantido a

4°C. Em todas as reações foram utilizados controles positivo e negativo. Como

controle positivo da reação para detecção do HPV e EBV foram utilizadas as

linhagens celulares HeLa e Raji, respectivamente. No controle negativo o DNA

foi substituído por água destilada.

3.2.3 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS

Os produtos do PCR foram analisados por eletroforese em gel de

poliacrilamida a 10% (2,7 mL de H

O, 0,5 mL de TBE 5x, 1,7 mL de Acrilamida-

Bisacrilamida 30:0,8, 120 µL de 10% AMP, 2,6 µL de TEMED). Aos 11 µL do

produto da PCR foram adicionados 3 µL de tampão de amostra e a essa

mistura foi aplicada no gel. A eletroforese foi feita a 80 V.

Após a corrida, o gel foi corado por nitrato de prata. Inicialmente o gel é

imerso na solução fixadora (5 mL de etanol, 0,4 mL de ácido acético, 45 mL de

água destilada) por 10 minutos. Logo após, é feita imersão na solução de prata

(0,1 g de AgNO

, 50 mL de água destilada) por 10 minutos (coloração pela

prata) e por fim, após lavagem com 50 mL de água destilada, o gel é revelado

em solução de revelação (1,5g de NaOH, 0,4 mL de formaldeído 37%, 50 mL

de água destilada). A revelação é interrompida pela solução fixadora.

O tamanho aproximado dos fragmentos amplificados foi estimado

utilizando-se o marcador de peso molecular 100 Base Pair Ladder (Pharmacia

Biotech).

3.2.4 SEQUENCIAMENTO

Para confirmação da infecção por EBV, as amostras positivas foram

submetidas ao sequenciamento. O DNA foi purificado com o GFX PCR and Gel

Band Purification Kit (Amersham Biosciences), seguindo as instruções do

fabricante.

Nas reações de sequenciamento foi utilizado o kit DNA Sequencing Big

Dye

(Perkin Elmer). As reações foram constituídas de 400 ng de DNA, 2 µL

de mix Big Dye e 1 µL do iniciador (TC67 ou TC69). As condições de

amplificação foram: 96ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 5 minutos e 60ºC

durante 4 minutos em um total de 25 ciclos. Após a amplificação, as amostras

foram precipitadas através da adição de 80 µL de isopropanol 80%. As

amostras foram mantidas a - 20ºC até o momento do sequenciamento. O

sequenciamento foi realizado em um sequenciador automático ABI PRISM

377 (Perkin Elmer).

3.2.5 METILAÇÃO

A avaliação da metilação dos genes DAPK e p16 foi realizada em duas

etapas. A primeira consistiu na modificação química do DNA pelo método do

bissulfito como descrito por Rosas et al., 2001. Aproximadamente 5 µg de DNA

foi diluído em 50 µL de água destilada e desnaturado em 0.2 M NaOH por 10

minutos a 37ºC. O DNA desnaturado foi diluído em 550 µL de solução

contendo 10 mM de hidroquinona e 3 M de bissulfito de sódio pH 5,0. A

solução foi incubada por 16 horas a 50ºC. Depois desse período, a solução foi

desalinizada com o kit Wizard DNA Clean-Up System (Promega), tratada a

temperatura ambiente por 5 minutos com 0.3 M NaOH e precipitada com

etanol. O DNA modificado foi ressuspendido em 28 µL de água e armazenado

a – 20ºC até o uso.

Na segunda etapa, o DNA modificado foi submetido a PCR com

iniciadores específicos para os genes p16 e DAPK metilado e não metilado. As

condições de amplificação e a visualização do produto formando foram as

mesmas descritas acima.

4 RESULTADOS

No total foram analisadas 24 amostras de pacientes com lesão intra-

epitelial de alto grau, 11 pacientes com adenocarcinoma, 14 pacientes com

carcinoma escamoso e 20 pacientes com citologia e colposcopia normais que

constituíram o grupo controle.

4.1 ANÁLISE DA INFECÇÃO VIRAL

A análise da presença dos vírus HPV e EBV foi realizada por PCR com

iniciadores específicos para cada vírus e o os produtos das reações foram

visualizados em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. A

amplificação de um segmento do gene p53 foi utilizado para averiguar a

integridade do DNA extraído (Figura 1 do Anexo 3 e Figura 1 do Anexo 4).

Os resultados obtidos para os diferentes vírus, nos diferentes tipos de

lesão e controles, estão resumidos na tabela 5.

Tabela 5: Análise da infecção viral nos diferentes tipos de lesão e controle.

HPV

(%)

EBV

(%)

HPV + EBV

(%)

Sem

infecção (%)

Total

(%)

Grupo controle 0 (0) 5 (25) 3 (15) 12 (60) 20

(100)

Lesão intra-

epitelial de alto

grau

4 (17) 4 (17) 4 (17) 12 (50) 24

(100)

Carcinoma

escamoso

5 (36) 1 (7) 4 (29) 4 (29) 14

(100)

Adenocarcinoma 3 (27) 1 (9) 0 (0) 7 (64) 11

(100)

Total 12 (17) 11 (16) 11 (16) 35 (51) 69

(100)

Não encontramos apenas infecção por HPV em pacientes sem lesão no

colo do útero, mas encontramos o HPV associado ao EBV em 15% das

amostras. O EBV foi encontrado em 25% das pacientes com citologia e

colposcopia normais.

Nas amostras provenientes de pacientes com lesão precursora intra-

epitelial de alto grau encontramos pacientes com infecção por HPV (17%), com

infecção por EBV (17%) e com co-infecção viral (17%). Metade das amostras

analisadas não apresentou infecção viral.

Como era esperado, a grande maioria das pacientes com carcinoma

escamoso apresentam infecção por HPV (64%). O HPV sozinho aparece em

36% e, em associação com o EBV, em 29% das amostras analisadas.

Nas amostras de pacientes com adenocarcinoma não encontramos co-

infecção por HPV e EBV e apenas 27% das pacientes apresentaram infecção

por HPV. O EBV apareceu em 9% das pacientes e 64% não apresentaram

infecção.

No gráfico 1 é possível observar o perfil da infecção viral nos diferentes

grupos. O HPV não associado não aparece em pacientes do grupo controle,

mas sua freqüência vai aumentando à medida que a lesão progride, o que

sugere que o HPV é um fator associado ao câncer do colo do útero. A infecção

por EBV é mais comum em pacientes sem lesão e sua presença diminui com a

progressão da doença. Este fato pode sugerir que o EBV seja necessário para

a instalação da doença. A co-infecção por HPV e EBV aumentando com a

gravidade da lesão, corrobora a idéia anterior de que esses dois vírus estão

participando dos estágios iniciais do desenvolvimento da neoplasia cervical. O

adenocarcinoma, normalmente, apresenta taxa de infecção por HPV menor do

20%

40%

60%

80%

100%

Controle Lesão de alto grau Carcinoma

escamoso

Adenocarcinoma

HPV EBV HPV + EBV Sem infecção

que o carcinoma escamoso e não está intimamente ligado com a progressão

da doença como no caso do carcinoma escamoso. A co-infecção não foi

observada em adenocarcinomas.

Gráfico 1: Perfil da infecção viral com a progressão da lesão do colo do útero.

4.2 SEQUENCIAMENTO DO EBV

Para confirmar que as amostras apresentavam infecção viral por EBV, 6

amostras foram sequenciadas, sendo três de pacientes com lesão intra-epitelial

de alto grau e três de pacientes com citologia e colposcopia normais. Todas as

sequências apresentaram 100% de similaridade e 100% de identidade com a

sequência padrão do EBV, amplificada com os iniciadores TC67 e TC69. O

alinhamento da sequência padrão do EBV com diferentes amostras

sequenciadas encontra-se na figura 2 do anexo 4.

4.3 ANÁLISE DO PADRÃO DA METILAÇÃO

A análise da metilação foi realizada em duas etapas. A primeira etapa

constituiu na modificação química do DNA pelo método do bissulfito de sódio.

Esta técnica transforma as citosinas não metiladas em uracilas e não altera as

citosinas metiladas. Na segunda etapa, o DNA modificado foi submetido a PCR

com iniciadores específicos para os genes DAPK e p16 metilado e não-

metilado (Figura 2 do Anexo 3, Figura 3 do Anexo 4 e Figura 1 do Anexo 5).

Os resultados obtidos para os padrões de metilação dos genes DAPK e

p16, nos diferentes tipos de lesão, estão resumidos na tabela 6.

Tabela 6: Análise do padrão de metilação dos genes DAPK e p16 nos

diferentes tipos de lesão.

DAPK

metilado

(%)

P16

metilado

(%)

DAPK e p16

metilados (%)

Sem

metilação

(%)

Total

(%)

Grupo controle 5 (25) 3 (15) 1 (5) 11 (55) 20

(100)

Lesão intra-

epitelial de alto

grau

1 (4) 8 (33) 5 (21) 10 (42) 24

(100)

Carcinoma

escamoso

6 (44) 4 (27) 1 (8) 3 (21) 14

(100)

Adenocarcinoma 2 (18) 2 (18) 3 (27) 4 (36) 11

(100)

Total 14 (20) 17 (25) 10 (14) 28 (41) 69

(100)

A metilação é mais frequente em pacientes com algum tipo de lesão do

que em pacientes normais. No grupo controle, encontramos metilação em 45%

das amostras, sendo que 25% apresentavam metilação do gene DAPK, 15%

da p16 e 5% apresentavam ambos os genes metilados.

Em pacientes com lesão intra-epitelial de alto grau, a frequência de

metilação foi de 58%, sendo a metilação do p16 (33%) mais comum do que a

do DAPK (4%). Os dois genes foram encontrados metilados em 21% das

amostras.

Pacientes com câncer mostraram 72% de metilação. A metilação é mais

comum em pacientes com carcinoma escamoso (79%) do que em pacientes

com adenocarcinoma (64%). A metilação do DAPK foi encontrada em 44% das

amostras de carcinoma escamoso e a metilação do p16 e do DAPK

simultaneamente, em 27% das amostras de adenocarcinoma.

No gráfico 2 é possível visualizar o padrão de metilação dos genes

DAPK e p16 na progressão da doença. Quanto mais evoluída a doença, maior

a frequência de metilação.

20%

40%

60%

80%

100%

Controle Lesão de alto grau Carcinoma

escamoso

Adenocarcinoma

DAPK M p16 M DAPK e p16 M Sem metilação

Gráfico 2: Perfil do padrão de metilação com a progressão da patologia

cervical.

4.4 ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO X INFECÇÃO VIRAL

Para verificar se a infecção viral influencia no padrão de metilação,

avaliamos a correlação entre a metilação e a infecção viral (Tabela 1 do Anexo

3, Tabela 2 do Anexo 4, Tabela 3 do Anexo 5 e Tabela 2 do Anexo 6).

A grande maioria das amostras metiladas apresenta infecção viral

(Gráfico 3). Observando a metilação do DAPK, verificamos que 65% das

amostras apresentam infecção viral, sendo o HPV o vírus mais frequente

nestas amostras. No entanto, para o p16, cerca de 50% das amostras

apresentam infecção viral, sendo o EBV o vírus o mais frequente. Quando

avaliamos a metilação dos genes simultaneamente, encontramos 70% de

infecção viral, sendo que o HPV está presente em 40% das amostras.

20%

40%

60%

80%

100%

DAPK metilado p16 metilado DAPK e p16

metilados

Sem metilação

HPV EBV HPV + EBV Sem infecção

Gráfico 3: Correlação entre a infecção viral e o padrão de metilação. A

linha tracejada indica 50% das amostras, mostrando que a maioria das

amostras com metilação também apresentam infecção viral.

Analisando as amostras de carcinoma escamoso, a correlação entre a

infecção viral e a metilação fica mais evidente (Gráfico 4). Todas as amostras

que apresentam metilação também apresentam infecção por HPV e/ou EBV.

DAPK metilado p16 metilado DAPK e p16

metilados

Sem metilação

HPV EBV HPV + EBV Sem infecção

Gráfico 4: Correlação entre a infecção viral e o padrão de metilação das

amostras de carcinoma escamoso.

Dessa forma, parece haver uma correlação entre a infecção viral por

HPV e EBV e o padrão de metilação dos genes p16 e DAPK.

5 DISCUSSÃO

O câncer cervical é caracterizado por uma fase pré-maligna bem

caracterizada que pode ser detectada no exame citológico de esfoliados

cervicais e confirmados no exame histológico do material cervical. Apesar do

tratamento terapêutico das lesões pré-malignas ser eficiente, algumas vezes

são ineficazes. Essa situação acontece porque algumas incertezas estão em

torno da história natural das neoplasias intra-epiteliais cervicais. Os exames

citológicos e histológicos não podem distinguir com precisão quais mulheres

evoluirão para um câncer invasivo no meio de um vasto número de mulheres

que regridirão espontaneamente (WOODMAN et al., 2007).

5.1 INFECÇÃO VIRAL

A maioria das infecções por HPV é benigna, subclínica e limitada, sendo

uma grande parcela associada com lesão intra-epitelial de baixo grau que

regride espontaneamente. Por outro lado, a infecção cervical persistente com

um HPV oncogênico é o mais importante fator para a progressão para uma

lesão intra-epitelial de alto grau, a qual é reconhecida como lesão precursora

que pode ser tratada para prevenir o desenvolvimento do câncer invasivo

(LOWY e SCHILLER, 2006).

O HPV integrado é encontrado na grande maioria dos carcinomas e em

um número significativo de lesões intra-epiteliais de alto grau, mas também

pode ser encontrado em lesões de baixo grau. A integração do genoma viral no

cromossomo da célula hospedeira é um evento crítico no desenvolvimento da

maioria dos cânceres cervicais e, apesar de ocorrer de maneira randômica pelo

genoma, vários estudos indicaram a preferência para integração em alguns

sítios frágeis e sugeriram que mudanças na expressão dos genes próximos aos

locais de integração devem participar do desenvolvimento do câncer

(DOORBAR,2006).

Neste trabalho, encontramos HPV em todos os grupos avaliados (exceto

no grupo controle), sendo sua freqüência maior em amostras de pacientes com

lesão de alto grau (34%) e carcinoma escamoso (69%). O HPV já foi bem

caracterizado com um vírus oncogênico ligado ao câncer cervical. A maioria

dos trabalhos publicados encontra infecção por HPV em torno de 90% a 100%

dos casos de carcinoma escamoso, número acima do encontrado neste

estudo. Essa diferença pode ser explicada por uma baixa carga viral, por

perdas de parte do genoma durante a integração na célula hospedeira e ainda

pela deleção de L1 (parte do genoma que é amplificado pelos iniciadores MY09

e MY11) quando ocorre a integração do HPV ao genoma da célula hospedeira

(WALLBOOMERS et al., 1999; ZIELINSKI et al., 2003; SCHORGE et al., 2004).

Outra causa de baixa detecção de HPV pode ser explicada por meio do

processo de eliminação natural do vírus em lesões mais avançadas, onde se

observa baixo número de partículas virais, que torna o HPV indetectável pelos

métodos de biologia molecular (KLETER et al., 1999; QUINT et al., 2001).

Em geral, os vírus oncogênicos são capazes de bloquear os pontos de

checagem do ciclo celular induzidos por estresse genotóxico. Entre as

oncoproteínas de vírus que causam tumor em humanos, a oncoproteína E6 do

HPV forma um complexo com a p53 e bloqueia a atividade transcricional

dependente de p53, o que contribui para a oncogênese mediada por vírus (YI

et al., 2009).

O EBV é um vírus oncogênico já relacionado com diversos tipos de

cânceres. Mais de 90% dos adultos apresentam infecção persistente por este

vírus. O EBV tem sido encontrado no colo do útero, mas seu papel na

carcinogênese cervical não foi bem definido. Nossos resultados mostram

infecção por EBV em amostras de pacientes sem lesão (25%), com lesão

precursora de alto grau (17%) e em câncer cervical (24%). Landers e

colaboradores (1993) avaliaram a presença do EBV em tecidos normais, com

lesão precursora e câncer do colo do útero e encontraram infecção por EBV em

43% dos casos de câncer cervical, 8% dos casos de lesão precursora e em

nenhuma amostra sem lesão. Com isso, os autores sugeriram que o EBV pode

apresentar um papel na instalação da carcinogênese cervical. No entanto,

estes resultados são muito diferentes dos resultados obtidos por Wong e

colaboradores (1993), onde 50% das amostras de câncer e 51% das amostras

normais apresentaram infecção por EBV. Sasagawa e colaboradores (2000)

mostraram diferentes taxas de infecção viral por diferentes métodos de

detecção do vírus. Por PCR, método utilizado neste trabalho, os autores

encontraram 55% de EBV em amostras de câncer e 29% de EBV em amostras

normais. Essa diferença pode ser explicada pelo método de detecção da

infecção viral (SASAGAWA et al., 2000; SEO et al., 2005). É importante

lembrar que a população em estudo também é um fator importante para a

diferença dos resultados encontrados na literatura.

O EBV, quando em latência, codifica um antígeno, o EBNA3C, que inibe

a apoptose mediada por p53 impedindo a interação proteína-proteína entre a

p53 e outros fatores celulares envolvidos na via da apoptose ou a interação

direta com as proteínas envolvidas (YI et al., 2009). E pode ser esse o

mecanismo utilizado por esse vírus na carcinogênese cervical.

A co-infecção viral também foi encontrada nas amostras analisadas,

sendo mais freqüente em carcinoma escamoso (29%). Resultados

semelhantes foram encontrados por Szkaradkiewicz e colaboradores (2004).

Os autores avaliaram a co-infecção em câncer cervical e em amostras normais.

Nas amostras normais a co-infecção foi encontrada em 8% das amostras. Nas

amostras de câncer, o EBV e o HPV estavam presentes em 32% das amostras

analisadas.

Portanto, o HPV e o EBV são dois vírus encontrados tanto em lesão

precursora como em câncer do colo do útero que atuam, de maneira

semelhante, sobre as funções da proteína p53, promovendo, assim, a

oncogênese.

5.2 METILAÇÃO

Em contraste com a célula normal, o padrão de metilação das células

tumorais é alterado. As regiões que são frequentemente metiladas são as ilhas

CpG que estão na região promotora de genes house-keeping e de genes

supressores de tumor (CLARK e MELKI, 2002). A metilação aberrante da

região promotora das ilhas CpGs de genes supressores de tumor é uma das

várias mudanças epigenéticas que contribuem para a carcinogênese

(WOODMAN et al., 2007). Genes envolvidos em regulação do ciclo celular,

reparo do DNA, resistência a drogas, detoxificação, diferenciação, apoptose,

angiogênese e metástase foram identificados por serem suscetíveis a

metilação em diferentes tipos de cânceres (CLARK e MELKI, 2002).

Os genes estudados neste trabalho estão ligados a controle do ciclo

celular (p16) e a apoptose (DAPK) que são dois processos rigidamente

controlados na célula. Em células tumorais, esse controle é perdido e a célula

adquire a capacidade de se dividir indefinidamente e de fugir da apoptose.

Encontramos metilação dos dois genes em diferentes tipos de lesão e ainda

em amostras de pacientes sem lesão. Este último fato sugere que a metilação

seja um evento precursor no processo carcinogênico. No entanto, é necessário

o seguimento dessas pacientes para observar se apresentaram algum tipo

lesão e em quanto tempo. Muitos trabalhos de metilação não encontraram essa

alteração epigenética em amostras de pacientes sem lesão (DONG et al.,

2001). Entretanto, Jeong e colaboradores (2006) compararam a metilação em

pacientes com câncer de colo de útero e pacientes sem lesão e encontraram

DAPK e p16 metilados nos dois grupos. A freqüência de metilação do DAPK e

do p16 nas amostras de câncer cervical foram, respectivamente, 45% e 57% e

nas amostras do grupo controle foram 4% e 8%, respectivamente. Portanto, a

frequência de metilação do DAPK e da p16 é significativamente maior em

câncer do colo do útero, o que corrobora os nossos achados.

O aumento da metilação da p16 com a progressão da doença foi

observada por inúmeros autores. Wong e colaboradores (1999) mostraram que

a metilação do p16 é mais comum em estágios avançados dos tumores do que

em lesões precursoras. Lea e colaboradores (2004) mostraram que a metilação

da região promotora do gene p16 tende a aumentar de amostras sem lesão

(7%) para lesão precursora (20%) até carcinoma escamoso (61%). Com isso,

esses autores sugeriram que a metilação da p16 está mais envolvida na

progressão da doença do que na sua iniciação. No entanto, neste trabalho,

encontramos maior metilação do p16 nos estágios iniciais da patologia cervical.

Este resultado está em conformidade com o trabalho realizado por Nuovo et al

(1999) onde foi observado que a metilação do p16 é um evento precoce na

carcinogênese cervical. Essa diferença entre resultados pode ser devido a

influência de outros fatores na metilação dos genes, como infecção viral

(discutido adiante) e fatores ambientais, além da diversidade genética das

populações estudadas.

Nossos resultados mostraram que a metilação do gene DAPK é mais

freqüente em câncer (48%) do que em lesão precursora (4%). O mesmo

resultado foi encontrado por Narayan e colaboradores (2003) e Feng e

colaboradores (2005) que mostraram que a hipermetilação do DAPK aumenta

com a progressão da patologia cervical. No câncer cervical, a metilação do

gene DAPK foi avaliada por diversos autores e sua frequência de metilação

variou de 40% a 73% entre as amostras estudadas (DONG et al.,

2001;REESINK-PETERS et al., 2004; YANG et al., 2004; HENKEN et al.,

2007).

Entre as amostras de câncer cervical, 79% das amostras de carcinoma

escamoso e 64% das amostras de adenocarcinoma apresentaram metilação

para pelo menos um gene. Nossos resultados estão de acordo com o que

encontramos na literatura. A metilação dos genes DAPK e p16 é mais

frequente é carcinoma escamoso do que em adenocarcinoma (DONG et al.,

2001; YANG et al., 2004). Além disso, o padrão de metilação dos diferentes

genes é diferente nos dois tipos de cânceres (REESINK-PETERS et al., 2004).

No gráfico 2, é possível observar que a metilação de DAPK e p16,

separadamente, é mais frequente em amostras de carcinoma escamoso,

enquanto que a dupla metilação é mais comum em adenocarcinoma.

Tem sido demonstrado que a metilação do DAPK aumenta o potencial

de metástase (CHAN et al., 2005). Avaliando a metilação do DAPK e do p16

em câncer de cabeça e pescoço, Hasegawa e colaboradores (2002)

observaram que a metátase é mais frequente quando há metilação do DAPK

quando comparado com o p16. O DAPK metilado também foi encontrado em

90% das amostras de linfócitos periféricos de pacientes com metástase

cerebral (GONZALEZ-GOMES et al., 2003). Este fato sugere que a

hipermetilação da região promotora do gene DAPK é um evento comum no

processo de metástase.

O trabalho publicado por Muller e colaboradores (2004), onde o padrão

de metilação de 25 genes foi avaliado em câncer do colo do útero e em

amostras sem lesão, mostrou que quanto maior a similaridade do padrão de

metilação do tumor com o padrão de metilação da célula sem lesão, melhor o

prognóstico. Com isso, o padrão de metilação do DNA de um gene selecionado

pode ser um marcador atrativo de diagnóstico, e o potencial da metilação para

diagnóstico precoce, prognóstico e ajuste do tratamento já é reconhecido

(MELNIKOV et al., 2005).

5.3. METILAÇÃO X INFECÇÃO VIRAL

A metilação da região promotora de genes supressores de tumor varia

quantitativamente e qualitativamente entre carcinomas gástricos com infecção

por EBV e sem infecção por EBV. Também varia entre o câncer de vulva e o de

cabeça e pescoço com e sem infecção por HPV (WOODMAN et al., 2007).

Nossos resultados mostram que mais de 50% das amostras com metilação

apresentam infecção viral, sendo que 100% das amostras de carcinoma

escamoso, com metilação, apresentam infecção por HPV e/ou EBV.

Encontramos HPV em 67% das amostras com metilação e EBV em 75% das

amostras com metilação. A co-infecção foi encontrada em 60% das amostras

metiladas.

Estudos recentes têm demonstrado que a oncoproteína E7 de HPV pode

modular a maquinaria de metilação de DNA de modo a controlar os

mecanismos de proliferação celular. Burgers e colaboradores (2007)

demonstraram que a oncoproteína E7 se associa tanto in vitro como in vivo

com a DNA metiltransferase DNMT1 e estimula sua atividade enzimática. A

proteína E7 de HPVs oncogênicos também podem induzir alterações

epigenéticas através da família de supressores de tumor da família do

retinoblastoma. Uma das numerosas funções da pRb é recrutar as

deacetilases. No entanto, a E7 sozinha pode se associar diretamente com

deacetilasese recrutá-las para induzir a repressão transcricional.

Além disso, avaliando a expressão gênica de cultura de células de

câncer cervical com células normais, foi verificado um aumento na expressão

da DNMT1 nas culturas de células de câncer. Também foi verificado que há um

aumento da expressão da DNMT3b em células imortalizadas por HPV

(WOODMAN et al., 2007).

Vírus oncogênicos podem induzir a metilação de genes supressores de

tumor através da ativação das enzimas DNA metiltransferase. A proteína de

membrana (LMP1) do EBV é capaz de ativar a DNA metiltrasferases e metilar o

gene CDH1 (caderina) (TSAI et al. 2002). A proteína E7 do HPV se liga a

DNMT1 estimulando sua atividade enzimática (WOODMAN et al., 2007). Em

função do que foi exposto e dos nossos resultados, concluímos que parece

haver uma correlação entre os vírus HPV e EBV e o padrão de metilação das

amostras analisadas.

6 CONCLUSÃO

A partir dos resultados apresentados, conclui-se:

1. Este estudo demonstrou a presença de infecção por HPV e EBV e da

metilação da região promotora dos genes DAPK e p16 e a correlação

entre a infecção viral e a metilação.

2. A infecção das células cervicais por EBV foi confirmada por

seqüenciamento. Este vírus parece estar associado com a oncogênese

cervical.

3. O padrão de metilação mostrou-se diferente entre os diferentes tipos de

lesões avaliadas o que sugere que podem ser usados como marcadores

de prognóstico e tratamento.

4. A infecção viral parece influenciar no padrão de metilação dos genes

estudados.

7 BIBLIOGRAFIA

ACCP – ALIANCE FOR CERVICAL CANCER PREVENTION. Planning and

implementing cervical cancer prevention and control programs. A Manual for

Managers. ACCP, Seattle, 2004.

ACLADIOUS, NN; et al. Persistent human papillomavirus infection and smoking

increase risk of treatment of cervical intraepithelial neoplasia (CIN). Int J

Cancer, v. 98, p. 435-439, 2002.

ALBRING, L; et al. O câncer do colo do útero, o Papilomavírus humano (HPV)

e seus fatores de risco e as mulheres indígenas Guarani: estudo de revisão.

RBAC, v. 38, n. 2, p. 87-90, 2006.

ANDERSON, MC; et al. Current views on cervical intraepithelial neoplasia. J

Clin Pathol, v. 44, n. 12, p. 969-978, 1991.

ARRAND, JR; et al. Molecular cloning of the complete Epstein-Barr virus

genome as a set of overlapping restriction endonuclease fragments. Nucleic

Acid Res, n. 9, p. 299-3014, 1981.

BAI, T; et al. Reduced expression of death-associated protein kinase in human

uterine ans ovarian carcinoma cells. Oncol Rep,n. 11, p. 661-665, 2004.

BEKKERS, RLM; et al. Epidemiological and clinical aspects of human

papillomavirus detection in the prevention of cervical cancer. Rev Med Virol, v.

14, p. 95-105, 2004.

BIALIK, S e KIMCHI, A. The death-associated protein kinases: structure,

function and beyond. Ann Rev in Biochem, n. 75, p. 189-210, 2006.

BROSO, PR e BUFFETI, G. The Papanicolau classification in the Bethesda

system (Nationcal Câncer Institute, Bethesda, Maryland) Minerva Ginecol, v.

45, n. 11, p. 557-563, 1993.

BURD, ME. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clin Microbiol, n. 16,

p. 1-17, 2003.

BURGERS, WA; et al. Viral oncogenic proteins target the DNA

methyltransferase. Oncogene, n. 26, p. 1650-1655, 2007.

CASTELLANO, M; et al. CDKN2A/p16 is inactivated in most melanoma cell

lines. Cancer Res, n. 57, p. 4868-4875, 1997.

CASTELLSAGUÉ, X e MUÑOZ, N. Chapter 3- Cofactors in Human

papillomavirus carcinogenesis-Role of parity, oral contraceptives, and tobacco

smoking. J Natl Cancer Inst Monogr, n. 31, p. 20-28, 2003

CASTELLSAGUÉ, X e MUÑOZ, N. Chapter 3- Cofactors in Human

papillomavirus carcinogenesis-Role of parity, oral contraceptives, and tobacco

smoking. J Natl Cancer Inst. Monogr, n. 31, p. 20- 28, 2003

CASTELLSAGUÉ; X et al. Worldwide human papillomavirus etiology of cervical

adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and prevention.

JNCI, n. 5, p. 303-315, 2006.

CHAN, AW; et al. Promoter hypermethylation of Death-associated protein-

kinase gene associated with advance stage gastric cancer. Oncol Rep, n. 13,

p. 937-941, 2005.

CHOUDHURI, T; et al. The ATM/ATR signaling effector chk2 is targeted by

Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C to release the G2/M cell cycle block. J

Virol, n. 81, p. 6718-6730, 2007.

CLARK, SJ e MELKI, J. DNA methylation and gene silencing in cancer : which

is the guilty party ? Oncogene, n. 21, p. 5380-5387, 2002.

COHEN, JI. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med, n. 343, p. 481-492,

2000.

DE PALO, G e VECCHIONE, A. Neoplasia intra-epitelial do colo uterino. In : DE

PALO, G. Ed. Colposcopia e patologia do trato genital inferior. Rio de

Janeiro, Ed. Medsi. P. 265-311, 1996.

DE VILLIERS, EM; et al. Classification of papillomaviruses. Virology, v. 324, n.

1, p. 17-27, 2004.

DEYRUP, AT. Epstein-Barr virus-associated epithelial and mesenchymal

neoplasms. Hum Pathol, n. 39, p. 473-483, 2008.

DONG, SM; et al. Promoter Hypermethylation of Multiple Genes in Carcinoma

of the Uterine Cervix. Clin Cancer Res, v. 7, p. 1982-1986, 2001.

DOORBAR, J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical

cancer. Clin Science, n. 110, p-525-541, 2006.

DUEÑAS-GONZÁLEZ, A; et al. Epigenetics of cervical cancer. An overview and

therapeutic perspectives. Mol Cancer, v. 4, p. 38-61, 2005.

ESTELLER, M. Epigenetic lesions causing genetic lesions in human cancer:

promoter hypermethylation of DNA repair gene. Euro J Cancer, v. 31, p. 2294-

2300, 2000.

FALLS, JG; et al. Genomic Imprinting: Implications for Human Disease. Am J

Pathol, v. 154, n. 3, p. 635-647, 1999.

FARREL, PJ; et al. Epstein-Barr virus genes and cancer cells. Biomed

Pharmacother, n. 52, p. 258-267, 1997.

FENG, Q; et al. Detection of hypermethylation genes in women with and without

cervical neoplasia. J Natl Cancer Inst, v. 97, n. 4, p. 273-282, 2005.

FIDLER, HK; et al. Cervical cancer detection in British Columbia. J Obstet

Gynaec Brit Cwlth, v. 75, p. 392-404, 1968.

FRANCO, EL; SCHLECHT, NF; SASLOW, D. The epidemiology of cervical

cancer. Cancer J, v. 5, n.9, p. 348-359, 2003.

GONZALEZ-GOMEZ, P; et al. Frequent death-associated protein-kinase

promoter hypermethylation in brain metastases of solid tumors. Oncol Rep, n.

10, p. 1031-1033, 2003.

GRAY-SCHOPFER, VC; et al. Cellular senescence in naevi and imortalization

in melanoma: a role for p16? Br J Cancer, n. 95, p. 496-505, 2006.

GUNNELL, AS; et al. Synergy between cigarette smoking and Human

papillomavirus type 16 in cervical cancer in situ development. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev, v. 15, n. 11, p. 1-7, 2006.

HARA, E; et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implication for cell

immortalization and senescence. Mol Cell Biol, n. 16, p. 859-867, 1996.

HASEGAWA, M; et al. Patterns of gene methylation in squamous cell cancer of

the head and neck. Oncogene, n. 21, p. 4231-4236, 2002.

HENKEN, FE; et al. Sequential gene promoter methylation during HPV-induced

cervical carcinogeneis. Br J Cancer, n. 97, p. 1457-1464, 2007.

HERMAN, JG; et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for

methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 93, n. 18, p.

9821-9826, 1996.

HO, GYF; et al. Persistent genital Human papillomavirus infection as a risk

factor for persistent cervical dysplasia. J Natl Cancer Inst, v. 87, n. 18, p. 1365-

1371, 1995.

HSU, JL e GLASER, SL. Epstein-Barr virus-associated malignancies:

epidemiologic patterns and etiologic implications. Crit Rev Oncology, n. 34, p.

27-53, 2000.

INBAL, B; et al. Death-Associated Protein Kinase-Related Protein 1, a Novel

Serine/Threonine Kinase Involved in Apoptosis. Mol Cel Biol, n. 20, p. 1044-

1054, 2000.

INCA - Instituto Nacional do Cancer – Estimativa da Incidência e Mortalidade

por Câncer no Brasil 2006: Rio de Janeiro, INCA, 2006. Disponível em:<

http://www.inca.gov.br/estimativa/2006>. Acesso em: 15. jun. 2009.

JEONG, DH; et al. Promoter methylation of p16, DAPK, CDH1, and TIMP-3

genes in cervical cancer: correlation with clinopahologic characteristics. Int J

Gynecol Cancer, n. 16, p. 1234-1240, 2006.

JIN, Y; et al. A death associated protein kinase (DAPK)-interacting protein DIP-

1, is an ubiquitin ligase that promotes tumor necrosis factor induced apoptosis

and regulates the celular levels of DAPK. J Biol Chem, v. 227, n. 49, p. 46980-

46986, 2002.

KANESHIMA, EM; et al. Importância da aplicação de critérios morfológicos não

clássicos para diagnóstico de Papilomavirus humano (HPV) previamente

detectado por PCR. RBAC, n. 35, p. 29-33, 2003.

KANG, GH; et al. Epstein-Barr virus positive gastric carcinoma demonstrates

frequent aberrant methylation of multiple genes and constitute CpG island

methylator phenotype-positive gastric carcinoma. Am J Pathol, n. 160, p. 787-

794, 2002.

KIM, NR; et al. Epstein-Barr virus and p16INK4A methylation in squamous cell

carcinoma and precancerous lesion of cervix uteri. J Korean Med Science, n.

20, p. 636-642, 2005.

KIMCHI, A. A cell death-promoting kinase. Nature Struct Biol, v. 8, n. 10, p.

824-826, 2001.

KLETER, B; et al. Development and clinical evaluation of a highly sensitive

PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of

anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol, v. 37, p. 2508-2517, 1999.

KLUMB, CE; et al. p53 protein expression does not correlat with EBV status in

childhood B non-Hodgkin lymphomas. Pediatr Blood Cancer, n. 43, p. 115-

119, 2004.

KNIGHT, JS e ROBERTSON, ES. Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C

regulates cyclin A/p27 complexes and enhances cyclin A-dependent kinase

activity. J Virol, n. 4, p. 1981-1991, 2004.

KNIGHT, JS; et al. A cyclin-biding motif within the amino-terminal homology

domain of EBNA3C binds cyclin A and modulates cyclin A-dependent kinase

activity in Epstein-Barr virus infected cells. J Virol, n. 23. p. 12857-12867, 2004.

LANDERS, RJ; et al. Epstein-Barr virus in normal, pre-malignant, and malignant

lesions of the uteri cervix. J Clin Pathol, n. 46, p. 931-935, 1993.

LEA, JS; et al. Aberrant p16 methylation is a biomarker for tobacco exposure in

cervical squamous cell carcinogenesis. Am J Obstet Gynecol, v. 190, n. 3,p.

674-679, 2004.

LOWY, DR e SHILLER, JT. Prophylatic human papillomavirus vaccines. J Clin

Invest, v.116, n. 5, p 1167-1173, 2006.

MELNIKOV, AA; et al. MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA

methylation. Nucl Acid Res, v. 33, n. 10 p. 93-100, 2005.

MOMPARLER, RL e BOVENZI, V. DNA Methylation and Cancer. J Cell

Physiol, v. 183, p. 145-154, 2000.

MÜLLER, HM; et al. A DNA methylation pattern similar to normal tissue is

associated with better prognosis in human cervical cancer. Cancer Lett, n. 209,

p. 231-236, 2004.

MURAY, PG e YOUNG, LS. Epstein-Barr virus and oncogenesis: from latent

genes to tumors. Oncogene, n. 22, p. 5108-5121, 2003.

NARAYAN, G, et al. Frequent promoter methylation on CDHI, DAPK, RARB,

and HICI genes in carcinoma of cervix uteri: its relationshop to clinical outcome.

Mol Cancer, 2003. http://molecular-cancer.com/content/2/1/24.

NIELSEN, GP; et al. Immunohistochemical survey of p16INK4A expression in

normal hhuman adullt and infant tissues. Lab Invest, v. 9, n. 79, p. 1137-1143,

1999.

NUOVO, GJ; et al. In situ detection of the hypermetylation-induced inactivation

of p16 gene as an early event in oncogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, v. 96,

n. 22, p. 12754- 12759, 1999.

O’NIONS, J e ALLDAY, MJ. Deregulation of cell cycle by Epstein-Barr virus.

Adv Cancer Res, n. 92, p. 119-186, 2004.

PEREYRA, EAG e PARELLADA, CI. Entendendo melhor a infecção pelo

Papilomavirus humano. Manual Schering, 2003.

QUINT, WGV; et al. Comparative analyses of human papillomavirus infections

in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF10 PCR and HPV

genotyping. J Pathol, v. 194, p. 51-58, 2001.

REESINK-PETERS, N; et al. Detecting cervical cancer by quantitative promoter

hypermethylation assay on cervical scrapings: a feasibility study. Mol Cancer

Res, n. 2, p. 289-295, 2004.

REZK, SA e WEISS, LM. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative

disorders. Hum Pathol, n. 38, p. 1293-1304, 2007.

RICHART, RM. Natural history of cervical intraepithelial neoplasia. Clin Obstet

Gynecol. v. 10, p. 748-784, 1968.

RICHART, RM; BARON, BA. A follow-up study of patients with cervical

dysplasia. Am J Obst & Gynec, v. 105, n. 3, p. 386-393, 1969.

RICKINSON, A. Epstein-Barr virus. Virus Res, n. 82, p. 109-113, 2002.

ROSAS, SL; et al. Promoter hypermethylation patterns of p16, O6-

methylguanine-DNA-methyltransferase, and death-associated protein kinase in

tumors and saliva of head and neck cancer patients. Cancer Res, v. 61, n. 3, p.

939-42, 2001.

SANO, T; et al. Immunohistochemical overexpression of p16 protein associated

with intact retinoblastoma protein expression in cervical cancer and cervical

intraepithelial neoplasia. Pathol Int, v. 48, n. 8, p. 580-585, 1998.

SASAGAWA, T; et al. Epstein-Barr virus (EBV) genes expression in cervical

intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer: a comparative study with

human papillomavirus (HPV) infection. Human Pathol, n. 31, p. 318-326,

2000.

SCHOFIELD, PN; et al. Genomic imprinting and cancer: new paradigms in the

genetics of neoplasia. Toxicol Lett, v. 120, p. 151-160, 2001.

SCHORGE, JO; et al. p16 as the molecular biomarker of cervical

adenocarcinoma. Am J Obstet Gynecol, n. 190, p. 668-673, 2004.

SEKULIC, A; et al. Malignant melanoma in the 21

century: the emerging

moluclar landscape. Mayo Clin Proc, V. 83, n. 7, p. 825-846, 2008.

SEO, SS; et al. Epstein-Barr virus play little role in cervical carcinogenesis in

Korean women. Int J Gynecol Cancer, n. 15, p. 312-318, 2005.

SIXBEY, JW; et al. Epstein-Barr vírus replication in oropharyngeal epithelial

cells. N Engl J Med, n. 310, p. 1225-30, 1984.

SPINELLI, OM. HPV, p53, Apoptosis; una interacciòn peligrosa. In: Congresso

Latinoamericano, 12; Congresso Boliviano, 1; Reunión Iberoamericana, 10.

Bolivia. 2000. Disponível em: <http://.gineconet.com/articulos/460.htm> Acesso

em: 17 jan.2006.

STRATHDEE, G e BROWN, R. Control of gene expression by CpG island

methylation in normal cells. Bioch Society Trans, v. 32, n. 6, p. 913-915, 2004.

SZALMÁS, A e KÓNYA, J. Epigenetic alterations in cervical carcinogenesis.

Sem Cancer Biol, n.19, p. 144-152, 2009.

SZKARADKIEWICZ, A; et al. Human papillomavirus (HPV) and Epstein-Barr

virus (EBV) cervical infections in women with normal and abnormal cytology.

Pol J Microbiol, v. 2, n. 53, p. 95-99, 2004.

TAKADA, K. Epstein-Barr virus and gastric carcinoma. J Clin Pathol, n. 53, p.

255-261, 2000.

TAYLOR, SM; et al. p53 and deregulation of DNA methylation in cancer. Cell

Science Rev, v. 2, n. 3, 2006.

TEODORIDIS, JM; et al. CpG-island methylation and epigenetic control of

resistance to chemotherapy. Bioch Society Trans, n. 32, p 916-917, 2004.

THOMPSON, MP e KURZROCK, R. Epstein-Barr virus and cancer. Clin

Cancer Res, v. 10, n. 1, p. 803-821, 2004.

TOYOTA, M; et al. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc

Natl Acad, v. 96, p. 8681-8686, 1999.

TSAI, CL, Li et al. Activation of DNA methyltransferase 1 by EBV LMP1 involves

c-jun NH

-terminal kinase signaling. Cancer Res, n. 66, p. 11668-11676, 2006.

TSAI, CN; et al. The Epstein-Barr virus oncogene product, latent membrane

protein 1, induces the down-regulation of E-Cadherin gene expression via

activation of DNA methyltransferases. PNAS, n. 99, p. 10084-10089, 2002.

TYCKO, B. Epigenetic gene silencing in cancer. J Clinic Invest, n. 105, p. 401-

407, 2000.

VIRMANI, AK; et al. Aberrant methylation during cervical carcinogenesis. Clin

Cancer Res, v. 7, n. 3, p. 584-589, 2001.

VISIOLI, CB; et al. Increasing trends of cervical adenocarcinoma incidence in

Central Italy despite extensive screening programme, 1985-2000. Cancer Det

Prev, v. 28, n. 6, p. 461-464, 2004.

VO, QN; et al. Epstein-Barr virus in gastric adenocarcinomas: association with

ethnicity and CDKN2A promoter methylation. J Clin Path, n. 55, p. 669-675,

2002.

WALBOOMERS, JMM; et al. Human papillomavirus is a necessary cause of

invasive cervical cancer worldwide. J Pathol, v. 189, p. 12-19, 1999.

WILLIAMS, H e CRAWFORD, DH. Epstein-Barr virus: the impact of scientific

advances on clinical practice. Blood, n. 107, p. 862-869, 2006.

WONG KY; et al. Epstein-Barr virus in carcinoma of the cervix. I J Gynecol

Pathol, n. 12, p. 224-227, 1993.

WONG, YF; et al. Methylation of p16

INK4a

in primary gynecologic malignancy.

Cancer Lett, v. 136, p. 231-235, 1999.

WOODMAN, CBJ; et al. The natural history of cervical HPV infection:

unresolved issues. Nature Rev, n. 7, p. 11-22, 2007.

YANG, HJ; et al. Detection of hypermethylation genes in tumor and plasma of

cervical cancer patients. Gynecol Oncol, v. 93, p. 435- 440, 2004.

YI, F; et al. Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C targets p53 and modulates its

transcriptional and apoptotic activities. Virology, n. 388, p. 236-247, 2009.

YOUNG, LS e MURRAY, PG. Epstein-Barr virus and oncogenesis: from latent

genes to tumours. Oncogene, n. 22, p. 5108-5121, 2003.

ZIELINSKI, GD; et al. The presence of high-risk HPV combined with specific

p53 and p16INK4a expression patterns points to high-risk HPV as the main

causative agent for adenocarcinoma of the cervix. J Pathol , v. 201, n. 4, p.

535-453, 2003.

zur HAUSEN, H. Papillomaviruses and cancer from basic studies to clinical

application. Nat Rev Cancer, v. 2, p. 342-350, 2002.

zur HAUSEN, H. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell

control in early events in carcinogenesis. J Natl Cancer Inst, v. 92. n. 9, p. 690-

698, 2000.

ANEXO 1

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

TÍTULO DO PROJETO: Análise da infecção por HPV e EBV e da metilação da região

promotora dos genes DAPK e p16 em células cervicais de pacientes normais, com lesões

precursoras e câncer de colo de útero.

PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Fernanda Lattario – Laboratório de Expressão

Gênica do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ.

Prezada Paciente:

Você está sendo convidada a participar desta pesquisa, que estuda as alterações

genéticas e o polimorfismo de genes relacionados ao desenvolvimento de câncer do colo do

útero.

A aceitação em participar, uma vez que estejam preenchidos os critérios

estabelecidos, vai nos ajudar a entender melhor a evolução das lesões precursoras do câncer

do colo uterino e estabelecer melhores de avaliação, diagnóstico e tratamento desta patologia.

Se, em qualquer momento, você desejar sair do estudo, poderá fazê-lo e isto não

trará nenhum prejuízo ao seu diagnostico e tratamento.

Você não será identificada pessoalmente nem seu nome aparecerá em qualquer

circunstância, quando da avaliação destes dados em estudos médicos.

Não há pagamentos pela participação dos indivíduos neste projeto.

Você poderá ter acesso aos dados desta pesquisa a qualquer momento.

Declaro ter entendido as informações que me foram prestadas, que as dúvidas foram

esclarecidas e que concordo em participar. Caso sejam necessários maiores esclarecimentos

referentes a esta pesquisa, fui informada que poderei entrar em contato com a pesquisadora

responsável pelos telefones 2562-6511 ou 9855-3243 a qualquer momento.

Nome:_______________________________________________________RG: ____________

Telefone:___________________E-mail:____________________________________________

Rio de Janeiro, _____ de _________________ de _______.

________________________________________________

Assinatura

___________________________________ ___________________________________

Testemunha Pesquisador responsável

ANEXO 2

Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

ANEXO 3

Artigo publicado

“Evaluation of DAPK gene methylation and HPV and EBV infection in

cervical cells from patients with normal cytology and colposcopy.”

ANEXO 4

Artigo publicado

“Analysis of human papillomavirus and Epstein-Barr vírus infection and

aberrant death-associated protein kinase methylation in high-grade

squamous intraeoithelial lesions.”

ANEXO 5

Artigo aceito para publicação

“The presence of methylation of p16INK4A gene and human

papillomavirus in high-grade cervical squamous intraepithelial lesions.”

View Letter

Date: Apr 17, 2009

To: "Yara Furtado" yarafurtadorj@terra.com.br

From: "Diagnostic Molecular Pathology" diagmol[email protected]

Subject: Editor's decision on your submission to Diagnostic Molecular Pathology

Ref.: Ms. No. DMP09-429R1

THE PRESENCE OF METHYLATION OF GENE p16INK4A AND HUMAN

PAPILLOMAVIRUS IN HIGH-GRADE CERVICAL SQUAMOUS

INTRAEPITHELIAL LESIONS

Diagnostic Molecular Pathology

Dear Dr. Furtado,

I am pleased to inform you that your paper entitled above has been accepted for

publication in Diagnostic Molecular Pathology. The manuscript and illustrations will

be forwarded to our publishers. They will contact you concerning page proofs, reprints,

and a quote if you submitted color figures. When you receive the proofs, please review

them with care and return them to the publisher as promptly as possible. This will help

assure the overall quality and timely publication of your work.

I wish to thank you for your excellent contribution and look forward to receiving

additional work from you in the future.

Thank you for your interest and support of Diagnostic Molecular Pathology.

With kind regards,

Mark H. Stoler, M.D.

Editor in Chief

Diagnostic Molecular Pathology

100

ANEXO 6

Manuscrito em fase final de preparação

“Promotes hypermethylation of death-associated protein kinase and p16

gene and human papillomavirus and Epstein-Barr virus infection in

cervical cancer.”

101

Promoter hypermethylation of Death-associated protein kinase gene and

p16 gene and Human Papilloma virus and Epstein-Barr virus infection in

cervical cancer.

Fernanda Lattario

, Yara Lucia Furtado

, Renata Fonseca

, Filomena Aste

Silveira

, Isabel Cristina do Val

, Gutemberg Almeida

, Maria da Gloria da

Costa Carvalho

Gene Expression Control Laboratory, Carlos Chagas Filho Institute of

Biophysics, Federal University of Rio de Janeiro, Brazil.

Institute of Gynecology, Federal University of Rio de Janeiro, Brazil.

* Address

Correspondence to: Fernanda Lattario, Laboratório de Controle da

Expressão Gênica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, Centro de

Ciência da Saúde (CCS), Bloco G, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, RJ, CEP

21949-900, Brazil. Phone: + 55 21 2562-6511. Fax: + 55 21 2280-8193

E-mail: f[email protected]

102

Abstract

This study was conducted to investigate the presence of Epstein-Barr

virus (EBV) and human papillomavirus (HPV) and the promoter methylation

status of death-associated protein kinase (DAPK) and p16 gene in cervical

carcinoma. Twenty-five women, who had been patients at Institute of

Gynecology of the Federal University of Rio de Janeiro, which showed cervical

carcinoma, were selected for this work. Analysis of viral infection was done

using polymerase chain reaction and promoter methylation status was

evaluated using chemical modification by sodium bisulfite followed by PCR. Of

the 25 patients, 11 showed adenocarcinoma and 14 showed squamous cell

carcinoma. Methylation was found in more than 70% of samples analyzed. No

relationship between viral infection and promoter methylation was found. The

promoter methylation is an important event during carcinogenesis and may

have potential clinical application as a marker for the progression and prognosis

of cancer, and also for it treatment.

Keywords: DAPK, p16, methylation, EBV, HPV, cervical cancer.

103

Introduction

Cervical cancer is the second most common cancer among women

worldwide (1). The majority of cases occur in the developing world, where, in

most countries, it is leading cause of cancer mortality in women (2). In many

developed countries, the incidence of squamous cell carcinoma (SCC) of the

cervix has been falling for some time, although that of adenocarcinoma (AD) of

the cervix is now rising (1,3,4).

Human Papilloma virus (HPV) infect the stratified squamous epithelia of

skin and mucous membranes, where they cause benign lesions, some of which

have the potential to progress to invasive cancer (5). Most genital HPV infection

are benign, subclinical and self-limited, and a high portion of infections also

regress spontaneously. By contrast, persistent cervical infection with an

oncogenic HPV type, especially HPV 16 and 18, is the most important risk

factor for progression to cancer (6). Virtually, all cases of cervical cancer are

attributable to sexually acquired HPV infection (7).

Epstein-Barr virus (EBV) was the first human virus to be directly

implicated in carcinogenesis. Nearly 90% of adults are infected with EBV.

While almost all EBV infections are benign, a small percentage of infected

persons develop certain types of cancer like lymphomas, gastric cancer, breast

cancer, and nasal cancer (8). Recent studies suggest a link between EBV and

cervical cancer (9).

DNA methylation is a frequent epigenetic event in many human cancers.

A growing number of cancer-related genes are being recognized that harbor

dense methylation of CpGs islands of gene promoter (10). Many cellular

104

pathways are inactivated by this epigenetic event, including DNA repair, cell

cycle, apoptosis, cell adherence, and detoxification (11).

The p16 gene is one of the cell cycle regulating genes and encodes a

nuclear protein, p16, which inhibits the D-type cyclin/cyclin-dependent kinase

complexes that phosphorylate the retinoblastoma gene product (pRb), thus

blocking G1-S cycle progression. The inactivation of p16 tumor suppressor

gene promotes cell proliferation, and is found in many different types of

carcinoma such as gastric carcinoma, bladder tumor, glioma, breast cancer and

head and neck tumors (12-13).

Death-associated protein kinase (DAPK) is a pro-apoptotic

serine/threonine protein kinase which expression is frequently lost in human

cancer (14). Although its apoptosis-promoting mechanism is poorly understood,

DAPK seems to be involved in p53-dependent suppression of tumor

development and it participates in a number of death signaling pathways.

Moreover, DAPK is involved in the formation of autophagic vesicles and takes

part in mediation of membrane blebbing, presumably through phosphorilation of

its direct substrate myosin-II regulatory light chain (RLC). Promoter methylation

of DAPK gene has been demonstrated in a variety of tumors and tumors

derived cell lines including B-cell malignancies, non-small cell lung cancer, head

and neck cancer, thyroid lymphoma, advanced stage gastric cancer and other

adenocarcinomas of the upper gastrointestinal tract (15-16).

In this study, we explore HPV and EBV infection of the uterine cervix and

p16 and DAPK that are frequently methylated in cervical carcinomas. Moreover,

we investigated as to whether these factors play in independent or synergic role

during cervical carcinogenesis.

105

Material and Methods

Samples: This study was performed after approval by our Ethical Committee.

From June 2006 to June 2007, 25 patients with cervical cancer being 11

patients with adenocarcinoma (AD) and 14 with squamous cell carcinoma

(SCC) were draw from the Cervical Pathology Unit of the Institute of

Gynecology of Federal University from Rio de Janeiro.

DNA extraction: The biopsy samples and cervical brushings were treated with

100 µL of proteinase K (10 mg/mL) and incubated for 16 hours at a temperature

of 55

C. Following this period, the mixture was treated with phenol-chloroform

(1:1) twice and the DNA was then precipitated by using pure ethanol at -20

for 16 hours. The samples were washed with 80% ethanol, re-suspended in 20

µL of water and stored at -20º C until time of use.

The extracted DNA was submitted to polymerase chain reaction (PCR) in order

to confirm its integrity, using primers for the exon 5 of the coding gene of protein

p53 that amplify a fragment of 274 bp. The sequences of the primers used in

the reaction for gene p53 were as described by Pestaner et al (17).

Detection of HPV and EBV: The presence of HPV and EBV was detected using

PCR. Detection of HPV was done using the MY09 and MY11 (18) consensus

primers, which amplify a fragment of 450 bp. In order to detect EBV, we used

consensus primers TC67 and TC69 (19), whose product contains 288 bp. The

amplifications were done in a thermocycler using the following protocol: 5

minutes of denaturing at 95º C, 35 cycles at 95º C for 1 minute, at 60º C for 1

106

minute, and at 72º C for 1 minute and a final prolongation of 10 minutes at 72º

C. A HeLa and Raji cell line was used as a positive reaction control for HPV and

EBV, respectively. Samples containing distilled water were used as negative

control.

Bisulfite treatment: Genomic DNA was treated with sodium bisulfite as

described by Rosas et al (20). Briefly, 1 µg of genomic DNA was resuspended

in 50 µL of water and denatured in 0.2 M NaOH for 10 minutes at 37 oC. The

denatured DNA was then diluted in 550 ML of freshly prepared solution

containing 10 mM hydroquinone (Sigma) and 3 M of sodium bisulfite (Sigma) at

pH 5.0 and incubated for 16 hours at 50º C. After 16 hours, the DNA sample

was desalinated through a column (Wizard DNA Clean Up System, Promega),

treated with 0.3 M NaOH for 5 minutes at room temperature and precipitated by

ethanol. The bisulfite-modified genomic DNA was resuspended in 28 µL of

water and used immediately or stored at – 20º C.

PCR amplification of bisulfite-treated DNA: The modified DNA was used as a

template for PCR amplification using specific primers for either methylated or

modified unmethylated DNA. Because the bisulfite treatment converts

unmethylated cytosines to uracil but leaves methylation cytosines intact,

specific primers were designed to accommodate these changes. The primers

used for unmethylated reaction were: DAPK 5’-

GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3’ (sense) and 5’-

CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3’ (antisense); p16: 5’-

TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3’ (sense) and 5’-

107

CAACCCCAAACCACAACCATAA-3’ (antisense). The primers for methylated

reaction were: DAPK 5’-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3’ (sense) and

5’-CCCTCCCAAACGCCGA-3’ (antisense); p16 5’-

TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3’ (sense) and 5’-

GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3’ (antisense). For PCR amplification, 2 µL of

bisulfite-modified DNA were added to a final volume of 50 µL PCR mix

containing 1 X PCR buffer, dNTPs (each at 1.25mM), primers (300 ng each per

reaction), 3 mM MgCl2, and 1.25 units of Taq polymerase. All PCR

amplifications were performed for 40 cycles. Each cycle consisted of heating at

95º C for 1 min., 60º C for during 1 min., and 72º C for 1 min. The final

elongation step was prolonged for 10 minutes to ensure complete extension of

the amplified products.

Detection: Visualization of the PCR results was done in 10% polyacrylamide gel

stained with silver nitrate. The approximate size of the amplified fragments was

calculated by using the 100 Base Pair Ladder molecular weight marker

(Pharmacia Biotech, USA).

Results

HPV and EBV detection: The results are summarized in table 1. HPV was found

in 36% of SCC and 27% of AD while EBV was found in 7% of SCC and in 9% of

AD. Co-infection was found only in SCC (29%).

108

DAPK and p16 methylation: The status of promoter methylation of DAPK an

p16 genes were evaluated in 25 cervical cancers. As shown in table 2, p16 was

methylated in 18% of AD and in 29% of SCC. DAPK was methylated in 43% of

SCC and in 18% of AD. Both genes were methylated in 27% of AD and 7% of

SCC.

Discussion

Even with extensive screening programs, cervical cancer is still among

the five most common causes of cancer deaths in women (2). Epidemiological

and laboratory data suggest that the presence of HPV and the integration of

their genome into the host cell genome are important factors in the development

of cervical neoplasia. However, as the majority of patients with HPV infection do

not develop invasive lesions, HPV infection alone is probably insufficient for

complete neoplastic transformation of cervical cells, suggesting the involvement

of other genetic and epigenetic events in cervical carcinogenesis.

Since it was discovered as the first human tumor virus, EBV has been

implicated in the development of a wide range of cancers (21). The clinical

relevance of genital infection caused by EBV may be due to this virus capacity

for cellular transformation, thus possibly contributing as a co-factor to the

development of malignant neoplasias. EBV infection was found in patients with

normal cytology and colposcopy (22) and in patients with high grade

intraepithelial lesion (9), suggesting that this virus play a role in cervical

carcinogenesis.

109

Aberrant methylation of the promoter region of tumor suppressor genes

is one mechanism for gene inactivation that can eventually lead to loss of cell

cycle control.

In this study we found methylation of DAPK and p16 genes. From all

samples analyzed, 72% showed methylation for one or both genes (table 2). No

relationship between viral infection and promoter methylation was found.

Cervical adenocarcinomas had a trend towards lower incidence of p16

methylation when compared with squamous cancer. Dong et al (23) observed

that cervical adenocarcinomas had a significantly lower incidence of p16

methylation than squamous cancer. DAPK was shown to be methylated in 50%

of patients with squamous cell carcinoma and in 49% of patients with

adenocarcinoma. These results are consistent with those found in literature

(24). Inactivation of DAPK, mainly by promoter hypermethylation, has been

demonstrated in some tumor types and found to be associated with aggressive

and metastatic phenotype (25, 26). Thus, DAPK gene hypermethylation might

be a valuable marker for tumor diagnosis, and evaluation of treatment outcome

in cervical cancer. Because of its frequency of methylation in cervical cancer, it

might also be potentially used as therapeutic target for cervical treatment.

Bibliography

1. Parkin, DM, Bray, F. Chapter 2: the burden of HPV-related cancers.

Vaccine 24 [Suppl.3], S11-S25 (2006).

110

2. World Health Organization. International Agency for Research on

Cancer. GLOBOCAN database 2002. CANCERmondial [online]

http://www-dep.iarc.fr/ (acessado em maio de 2009).

3. Wang, SS, Sherman, ME, Hildesheim, A, Lacey, JVJr, Devesa, S.

Cervical adenocarcinoma and squamous cell carcinoma incidence trends

among white women and black women in the United States for 1976-

2000. Cancer 100, 1035-1044 (2004).

4. Bray, F et al. Incidence trends of adenocarcinoma of the cervix in 13

European countries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 14, 2191-2199

(2005).

5. Lowy, DR, Schiller, JT. Prophylatic human Papilloma virus vaccines. The

Journal of Clinical Investigation 5, 1167-1173 (2006).

6. Woodman, CBJ, Collins, SI, Young, LS. The natural history of cervical

HPV infection: unresolved issues. Nature Reviews Cancer 7, 11-22

(2007).

7. Doorbar, J. Molecular biology of human papillomavirus infection and

cervical cancer. Clinical Science 110, 525-541 (2006).

8. Thompson, MO, Kurzrock, R. Epstein-Barr virus and cancer. Clinical

Cancer Research 10, 803-821 (2004).

9. Lattario, F, Furtado, YL, Fonseca, R, Silveira, FA,, Do Val, IC, Almeida,

G, Carvalho, MGC. Analysis of human papillomavirus and Epstein-Barr

virus infection and aberrant death-associated protein kinase methylation

in high grade squamous intraepitheial lesions. International Journal of

Gtnecological Cancer 18, 785-789 (2008).

111

10. Momparler, RL, Bovenzi, V. DNA methylation and cancer. J. Cell

Physiol. 183, 145-154 (2000).

11. Dueñas-Gonzáles, A, Lizano, M, Candelaria, M, Cetina, L, Arce, C,

Cervera, E. Epigenetic of cervical câncer. Na overview and therapeutic

perspectives. Molecular Câncer 4, 38-61 (2005).

12. Herman, JC, Merlo, A, Mão, L, Lapidus, RG, Issa, JP, Davidson, NE,

Sidransky, D, Baylin, SB. Inactivation of the CDKN2/p16/MST1 gene is

frequently associated with aberrant DNA methylation in all common

human cancers. Cancer Research 55, 4525-30 (1995).

13. Kim, NR, Lin, Z, Kim, KR, Cho, HY, Kim, I. Epstein-Barr virus an

p16INK4A methylation in squamous cell carcinoma anp precancerous

lesions of the cervix uteri. Journal of Korean Medical Science 20, 636-42

(2005).

14. Chen, CH, Wang, WJ, Kuo, JC, Tsai, HC, Lin, JR, Chang, ZF, Chen, RH.

Bidirectional signal transduced by DAPK-ERK ineraction promote the

apoptotic effect of DAPK. The EMBO Journal 24, 294-304 (2005).

15. Christoph, F, Hinz, S, Kempkensteffen, C, Weikert, S, Krause, H,

Schostak, M, Schrader, M, Miller, K. A gene expression profile of tumor

suppressor genes commoly methylated in bladder cancer. Journal of

Cancer Reearch and Clinical Oncology 133, 343-349 (2007).

16. Christoph, F, Hinz, S, Kempkensteffen, C, Schostak, M, Schrader, M,

Miller, K. mRNA espression profiles of methylated APAF-1 and DAPK-1

tumor suppressor genes uncover clear cell renal carcinomas with

aggressive phenotype. The Journal of Urology 178, 2655-2659 (2007).

112

17. Pestaner, C, Bibbo, M, Bobroski, L, Seshamma, T, Bagasra, O.

Potential of the in situ polymerase chain reaction in diagnostic cytology.

Acta Cytol. 38, 676-80 (1994).

18. Sotlar, K, Diemer, D, Dethleffs, A, Hack, Y, Stubner, A, el al. Detection

and typing of Human Papillomavirus by E6 nested multiplex PCR. J. Clin.

Microbiol. 42, 3176-84 (2004).

19. Saito, I, Servenius, B, Compton, T, Fox, RI. Detection of Epstein-Barr

virus DNA by polymerase chain reaction in blood and tissue biopsies

from patients with Sjogren’s syndrome. J. Exp. Med 169, 2191-8 (1989).

20. Rosas, SLB, Caballero, OL, Dong, SM, Carvalho, MGC, Sidransky, D,

Jen, J. Methylation status in the promoter region of human PGP9.5 gene

in câncer and normal tissue. Cancer Lett. 170, 235-46 (2001).

21. Thompson, MP, Kurzrock, R. Epstein-Barr virus and cancer. Clincial

Cancer Research 10, 803-821 (2004).

22. Lattario, F, Furtado, YL, Silveira, FA,, Do Val, IC, Almeida, G, Carvalho,

MGC. Evaluation of DAPK gene methylation and HPV and EBV infection

in cervical cells from patients with normal cytology and colposcopy. Arch

Gynecol Obstet 277, 505-9 (2008).

23. Dong, SM, Kim, HS, Rha, SH, Sidransky, D. Promoter hypermethylation

of multiple genes in carcinoma of the uterine cervix. Clin Cancer Res 7,

1982-6 (2001).

24. Yang, HJ, Liu, VWS, Wang, Y, Tsang, PCK, Ngan, HYS. Differential

DNA methylation profiles in gynecological cancers and correlation with

clinico-pathological data. BMC Cancer 6, 212-22 (2006).

113

25. Toyooka, S, Toyooka, KO, Miyajima, K, Reddy, JL, Toyota, M,

Sathyanarayana, UG, Padar, A, Tockman, MS, Lam, S, Shivapurkar, N,

Gazdar, AF. Epigenetic down-regulation of death-associated protein

jinase in lung cancer. Clin Cancer Res 9, 3024-3041 (2003).

26. Kwong, J, Lo, KW, To, KF, Teo, PM, Johnson, PJ, Huang, DP. Promoter

hypermethylation of multiple genes in nasopharyngeal carcinoma. Clin

Cancer Res 8, 131-137 (2002).

114

Table 1: Presence of HPV and EBV in adenocarcinoma, squamous cell

carcinoma and in control group.

HPV (%) EBV (%) HPV and

EBV (%)

No infection

(%)

Adenocarcinoma

3 (27) 1 (9) 0 (0) 7 (64)

Squamous cell

carcinoma

5 (36) 1 (7) 4 (29) 4 (29)

115

Table 2: DAPK and p16 genes promoter methylation status.

Methylated

DAPK (%)

Methylated

p16 (%)

Methylated

DAPK and

p16 (%)

Unmethylated

(%)

Adenocarcinoma

2 (18) 2 (18) 3 (27) 4 (36)

Squamous cell

carcinoma

6 (43) 4 (29) 1 (7) 3 (21)

116

ANEXO 7

Artigos relacionados – Artigo em preparação

“Correlation of imunohistochemistry of p16 protein and p16 gene

methylation in patients with high-grade intraepithelial lesion from cervix

uteri infected by Papillomavirus”

117

Correlation of imunohistochemistry of p16 protein and p16 gene

methylation in patients with high-grade intraepithelial lesion from cervix

uteri infected by Papillomavirus

Brenda Maiolino, Fernanda Lattario, Yara Furtado, Gutemberg Almeida,

Nathalie Canedo, Roberto José Lima e Maria da Glória da Costa Carvalho.

Introduction

Cervical cancer is one of the most common malignant diseases in women

worldwide. Epidemiological and molecular researches have shown that the

Human papillomavirus (HPV) is considered the etiological agent for cervical

cancer. Therefore, it has been established that persistent infection with an

oncogenic type of HPV is a necessary condition for the development of

precursor lesions and cervical cancer [3-4]. However, an infection caused by

HPV alone is not a sufficient factor for the appearance of cervical cancer.

Genetic, exogenous environmental and viral factors increase the risk of cervical

cancer [3-4]. Some studies show high percentage of DNA-HPV (87-100%) in

squamous cervical carcinoma (SCC) and in cervical high-grade squamous

intraepithelial lesions (HSIL) [5-7]. So, understanding the natural history of

cervical cancer is important for optimal management of its precursor lesions.

Cervical cancer is characterized by uncontrolled proliferation of immortalized

cells. Abnormalities in genes that control the cell cycle can be found in various

types of human tumors [10,13-14]. Among the epigenetic events, methylation is

the main change in mammals, which is characterized by a chemical

modification where a methyl group is added to the cytosine in the CpG islands

118

in the promoter region of the gene. Abnormal increase in methylation status

leads to the inactivation of genetic transcription, alteration found in many human

cancers [14].

The p16 protein (coded by the p16INK4a gene) is an important tumor supressor

that regulate cell cycle, by inhibiting the CDK 4 protein (cyclin-dependent

kynase 4), which regulate the G1 checkpoint. In normal condition, CDK

phosphorylate the retinoblastoma (Rb) protein, which results in conformational

change and the release of E2F from Rb protein, which promotes activation of

cell cycle. Earlier research has shown that the p16 protein is overexpressed in

intraepithelial lesions and in cases of cervical cancer [15-18]. It is possible,

however, that lack of p16 immunoreactivity may not necessarily imply loss of pl6

expression; in other words, lack of pl6 immunoreactivity may not reflect gene

inactivation but may represent a physiological normal state. In most normal

cells, pl6 expression at both the mRNA and protein levels is known to be low. In

this regard, a diffuse and intense immunohistochemical result for p16 protein

might indicate the up-regulation of p16 gene expression. Thus, the intense p16

protein staining that is limited to cervical neoplasia not only suggests that the

deletion or mutational inactivation of the p16 gene is rare, but also that up-

regulation or overexpression of the p16 gene may occur in cervical

carcinogenesis.

The loss of transcription of the p16

INK4a

gene cancels out the negative control

mechanism of the p16 protein which removes DNA damaged cells from the cell

cycle. This may be considered one of the bases of human oncogenesis [14]. In

cervical carcinogenesis, besides the mutation in DNA induced by the integration

119

of HPV, hypermethylation of the p16

INK4a

gene has frequently been observed

[13].

This study aims at detecting the presence of methylation of the p16 gene and

detection of p16 protein by immunohistochemistry as well as the DNA-HPV in

patients with high grade squamous intraepithelial lesions of the cervix and

analyze the results found in both methods.

Materials and Methods

DNA extraction: Samples were incubated with 100 µL of proteinase K (10

mg/mL) for 16 hours at 55

C. Following this period, the mixture was treated with

phenol-chloroform (1:1) twice and, subsequently, precipitated using pure

ethanol at -20

C for 16 hours. The samples were washed with 80% ethanol, re-

suspended in 20 µL of water and stored at -20º C until time of use. In order to

confirm its integrity, the extracted DNA underwent polymerase chain reaction

using primers for p53 exon 5, that amplify a fragment of 274 bp. The sequences

of primers used in the reaction for gene p53 were as described by Pestaner et

al [20].

Detection of HPV: The presence of HPV was detected by PCR using the MY09

and MY11 consensus primers, which amplify a fragment of 450 bp [21]. The

amplifications were done in a thermocycler using the following protocol: 5

minutes of denaturing at 95ºC, 35 cycles at 95ºC for 1 minute, at 60ºC for 1

minute, and at 72ºC for 1 minute and a final elongation of 10 minutes at 72ºC. A

HeLa cell line was used as a positive reaction control for HPV detection. In the

negative control group, the DNA was replaced by distilled water. Visualization of

120

the PCR results was done in 10% polyacrylamide gel stained with silver nitrate.

The approximate size of the amplified fragments was calculated by using the

100 Base Pair Ladder molecular weight marker (Pharmacia Biotech, USA).

Methylation analysis: Evaluation of methylation of the p16

INK4a

gene was done in

two stages. The first consisted of chemical modification of the DNA using the

sodium bisulfite method. This process transforms the unmethylated cytosines

into uraciles and does not alter the methylated cytosines. Approximately 5 µL of

DNA were diluted in 50 µL of distilled water and denatured in 0.2 M of NaOH for

10 minutes at 37

C. The denatured DNA was diluted in 550 µL of solution

containing 10 mM of hydroquinone (Sigma, St. Louis, MO) and 3 M of pH 5.0

sodium bisulfate (Sigma, St. Louis, MO). The solution was covered with mineral

oil and incubated for 16 hours at 50

C. After that, the solution was desalinated

through a column (Wizard DNA Clean-Up System; Promega,Madison, WI),

treated at room temperature for 5 minutes with 3 M NaOH and precipitated

using ethanol. The modified DNA was re-suspended in 28 µL of water and

stored at -20

C until time of use. In the second stage, the modified DNA

underwent PCR using specific primers for the p16

INK4a

gene, methylated and

unmethylated [22-23]. For PCR amplification, 2 µL of modified DNA were added

to a final volume of 50 µL of mixture for PCR containing 1x PCR buffer,

deoxyribonucleotide triphosphates (1.25 mM each), primers (300 ng for each

reaction), 3 mM of MgCl

and 1.25 units of Taq polymerase. All the

amplifications of the PCR were done for 40 cycles. The amplification conditions

were the same as those described earlier. The primers used for unmethylated

DNA reaction were: Sense-5 TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3’ and

121

antisense- CAACCCCAAACCACAACCATAA-3’. the primers used for

methylated DNA reaction were: Sense-5’-

TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3’ and antisense

5’GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3’.

Results

Caso 77733_00: Segmento de canal endocervical exibindo epitélio escamoso

metaplásico, com imunorreatividade forte, principalmente em um foco de

ocupação glandular. Acima, nota-se lumens glandulares em meio a estroma

fibroso ( 0.10 X 4 ).

122

77733_01: Detalhe de foco de ocupação glandular, a onde se vê células com

citoplasmas e núcleos reativos, notar ainda, os núcleos volumosos e irregulares

(efeito citopático) fortemente corados (padrão nuclear de imunorreatividade)

predominantemente localizados nas camadas mais profundas ( 0.25 x 10 ).

123

77733_04: Panorâmica apresentando duas áreas de epitélio escamoso

metaplásico com imunorreatividade forte em células das camadas profundas,

demarcando nitidamente a camada basal (0.10 x 4).

124

7733_05: Detalhe camada basal (0.25 x 10).

125

7733_06: Detalhe da camada basal e intermediária, a onde se observa células

fortemente coradas com padrão nuclear e citoplasmático. Notar células com

psdrão de imunorretatividade nuclear volumosos e outras de padrão

citoplasmática com núcleos vesiculosos ( 0.65 x 40).

126

77733_07: Àrea de canal com glândulas ocupadas por epitélio escamoso

apresentando imunorreatividade forte (0.10 x 4.)

127

78176_01: Aumento de 0.25 x 10. Junção escamo-colunar (JEC).

128

Número do Paciente

Iniciais Diagnóstico

Inefção por

HPV

Metilação do

p16

Imunohitoquímica do

p16

78031 GCCC HSIL, displasia acentuada sim sim positivo

78000 MGSL HSIL, displasia acentuada sim não positivo

78176 JCO HSIL, displasia acentuada não sim positivo

78160 ADC HSIL, displasia acentuada não sim negativo

77808 LSC HSIL, displasia acentuada sim sim positivo

78057 ASS HSIL, displasia acentuada sim não positivo

78211 MJM HSIL, displasia acentuada não sim

78210 STS HSIL, displasia acentuada não sim positivo

78091 EEMB HSIL, displasia acentuada sim sim

78026 ASB HSIL, displasia acentuada sim sim positivo

78/77821 CBF HSIL, displasia acentuada sim sim

77733 EGS HSIL, displasia moderada sim sim positivo

77715 MFA HSIL, displasia moderada sim sim positivo

77719/3 LMS HSIL, displasia acentuada não não positivo

77990 SMS HSIL, displasia acentuada sim sim positivo

77954 SROF HSIL, displasia acentuada sim não positivo

77947 RSA HSIL, displasia moderada sim não

77861 LA HSIL, displasia acentuada sim sim

77688 LGS HSIL, displasia moderada não sim positivo

77704 MBJ HSIL, displasia acentuada não não positivo

77895 MGLS HSIL, displasia acentuada sim não positivo

77924 CLS NIC III não não

78020 DJMA NIC III sim sim

78121 ENT NIC III sim não

129

ANEXO 8

Artigos relacionados – Artigo aceito para exposição oral e posterior

publicação na revista da International Society for the Study of

Vulvovaginal Disease

“Epstein Barr Virus and Human Papillomavirus infection in Vulvar Lichen

Sclerosus”

130

Epstein Barr Virus and Human Papillomavirus infection in Vulvar Lichen

Sclerosus

Susana Aidé PhD, Fernanda Lattario PhD, Gutemberg Almeida PhD, Isabel Val PhD,

Maria Gloria Carvalho PhD.

Vulvar Pathology Unit, Gynecology Institute and Gene Expression Control Laboratory,

Carlos Chagas Filho Institute, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

Brazil

Background: Squamous cell carcinoma (SCC) of the vulva can originate from an usual

vulvar intraepithelial neoplasia (VIN) tied to oncogenic human papillomavirus (HPV);

or from a differentiated VIN tied to lichen sclerosus (LS). HPV has been investigated

for its possible association with LS. HPV is recognized as the major cause of cervical

and vulvar cancer. The Epstein-Barr virus (EBV), a member of the human herpes virus

group, has been suggested as another oncogenic virus related to cervical carcinogenesis,

by showing its presence in cervical carcinoma cells and in precancerous lesions of the

cervix. EBV has been demonstrated in oral lichen planus 11, however, until now, its

association with LS was not described.

Objective: To elucidate the relationship between EBV, HPV in patients with lichen

sclerosus.

Patients and Methods: We investigated the presence of HPV and EBV from 34 vulvar

biopsies of patients with LS who had had no previous treatment, and from 17 normal

vulvar brushings used as controls. We used PCR to amplify DNA sequences of these

viruses. HPV and EBV DNA detection was carried out using MY09/MY11 and

TC67/TC69 consensus primers, respectively. The amplified PCR products were

analyzed by 10% polyacrylamide gel.

Results: The average age of the patients was 57 years old, with the majority at

postmenopausal stage. HPV DNA was not found in the LS samples studied, but it was

found in 23.2% (4/17) of the controls. However, EBV DNA was found in 26.5% (9/34)

of the LS samples analyzed and it was not found in the controls.

Conclusion: Our results showed no relationship between HPV and LS. This result is in

accordance with other literature data. We have found 26.5% of EBV in our samples,

suggesting that EBV could either play a role in cases of LS or it could just be sheer

coincidence. This is a preliminary study and other molecular studies might elucidate

whether EBV is involved with the etiology of LS.

131

Mensagem original

De: Debbie Roepe <

[email protected] >

Para: Isabel Val <

[email protected]om.br >

Assunto: ISSVD Abstract

Enviada: 16/06/2009 17:54

June 16, 2009

Dear Isabel doVal, PhD:

The scientific committee is delighted to confirm the acceptance of your abstract "Epstein Barr

Virus and Human Papillomavirus infection in Vulvar Lichen Sclerosus " as an oral presentation

at the World Congress of the International Society for the Study of Vulvovaginal Disease in

Edinburgh, Scotland.

We will be in touch soon to let you know when you will be scheduled to make your presentation.

We have had an overwhelming response and have received a record number of abstract

submissions for this Congress.

We appreciate your patience and hope that this information will assist you in making your final

preparations for attending this excellent meeting.

If you have any questions, please do not hesitate to contact me.

If you would like a copy of this email posted to you by US Mail, please let me know and I will be

happy to send you an official copy.

Debbie Roepe

Executive Director

8814 Peppergrass Lane

Waxhaw NC 28173

PH: 704-814-9493

FAX: 704-814-9571

www.issvd.org

132

ANEXO 9

Artigos relacionados – Artigo aceito para exposição oral e posterior

publicação na revista da International Society for the Study of

Vulvovaginal Disease

“Promoter Hypermethylation patterns of Death-associated Protein Kinase

and p16 in Vulvar Lichen Sclerosus”

133

Mensagem original

De: Debbie Roepe <

[email protected] >

Para: Isabel Val <

[email protected]om.br >

Assunto: ISSVD Abstract

Enviada: 16/06/2009 17:42

June 16, 2009

Dear Gutemberg Almeida, PhD:

The scientific committee is delighted to confirm the acceptance of your abstract "Promoter

Hypermethylation patterns of Death-associated Protein Kinase and p16 in Vulvar Lichen

Sclerosus " as an oral presentation at the World Congress of the International Society for the

Study of Vulvovaginal Disease in Edinburgh, Scotland. We look forward to having you at our

World Congress and as a Fellow of our society.

We will be in touch soon to let you know when you will be scheduled to make your presentation.

We have had an overwhelming response and have received a record number of abstract

submissions for this Congress.

We appreciate your patience and hope that this information will assist you in making your final

preparations for attending this excellent meeting.

If you have not yet registered for the World Congress and or Postgraduate Course, please do

so by visiting the website at

http://www.issvd.org/world_congress.asp

If you have any questions, please do not hesitate to contact me.

Sincerely,

Debbie Roepe

Executive Director, ISSVD

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 