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Complexo transtirretina
humana e zinco: caracterização
estrutural, funcional e
termodinâmica
Orientadora Prof.ª Debora Foguel
Leonardo de Castro Palmieri
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Bioquímica Médica
Rio de Janeiro
2009
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Leonardo de Castro Palmieri
Complexo transtirretina humana e zinco: caracterização estrutural, funcional e termodinâmica
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Química Biológica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Química
Biológica.
Orientador: Prof.ª Dra. Débora Foguel
Co-orientador: Prof. Dr. Luis Mauricio Trambaioli da Rocha e Lima
Rio de Janeiro, 28 de abril de 2009.
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Palmieri, Leonardo de Castro.P..
Complexo transtirretina humana e zinco: caracterização
estrutural, funcional e termodinâmica / Leonardo de Castro
Palmieri. Rio de Janeiro, 2009.
xiii, 132 fls., il.
Tese (Doutorado em Química Biológica) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
de Bioquímica Médica, 2009.
Orientador: Prof.ª Debora Foguel
1. Transtirretina. 2. Zinco
3.Amiloidoses – Teses.
I. Foguel, Débora (Orient.). II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto
de Bioquímica Médica. III. Título.
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Leonardo de Castro Palmieri
Complexo transtirretina humana e zinco: caracterização estrutural, funcional e termodinâmica
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Química Biológica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Química
Biológica.
Rio de Janeiro, 28 de abril de 2009.
Banca examinadora
Prof. João Alexandre Ribeiro Gonçalvez Barbosa
Pesquisador ajunto do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS)
Professor da UNICAMP, SP
Prof.ª. Luzineide Wanderley Tinoco
Professora Adjunta do Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ, RJ
Prof. Pedro Geraldo Pascutti
Professor Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, RJ
Prof. Marcius da Silva Almeida
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ, RJ (Revisor)
Prof.ª Yraima Moura Lopes Cordeiro
Professora adjunta da Faculdade de Farmácia da UFRJ, RJ (Suplente)
5
Dedicatórias
“QUE STENDHAL confessasse haver escrito um de seus livros para cem leitores,
cousa é que admira e consterna. O que não admira, nem provavelmente consternará é se este
outro livro não tiver os cem leitores de Stendhal, nem cinquenta, nem vinte, e quando muito,
dez. Dez? Talvez cinco.”
Machado de Assis, Memórias Póstumas de Brás Cubas (1881).
6
Agradecimentos
Agradeço à Prof.ª Debora Foguel, por me orientar com maestria e brilhantismo e por
me dar uns puxões de orelha sempre que apropriado, além de, nas horas vagas, ser a então
Diretora do Instituto de Bioquímica Médica.
Ao Prof Maurício Trambaioli, pela co-orientação, por acreditar em mim e em minhas
ideias, por me ensinar cristalografia de raio-X e por não me deixar desistir.
Ao Prof Fábio Almeida, pela colaboração, por me ensinar RMN e por continuar
acreditando em mim e no projeto quando tudo mais parecia não estar dando certo.
À minha aluna Juliana Freire, por ter asas, por aguentar uma pressão que eu próprio
não aguentava. Saiu das mãos da Jú o cristal que originou a primeira estrutura do complexo
Zn
2+
:M-TTR.
Ao Prof Marcius Almeida, pela constante revisão da minha tese e de minhas atitudes,
por ter me ensinado a lecionar e por me repassar várias dicas importantes que o Prof Kurt
Wüthrich deu a ele.
Aos amigos do laboratório, por aturarem o maluco do Léo todo dia (e toda noite).
Ao técnico Emerson Gonçalves “Garotinho”, pelo apoio técnico e pelas piadas.
Aos membros da banca por aceitarem participar desta tese.
Aos meus pais por sempre incentivarem meus estudos.
À minha esposa Carolina Braga, que eu amo muito e que sempre me ajudou muito
com o meu trabalho.
7
The Cosmos is all that is, or ever was, or ever will be.
Carl Sagan - Cosmos, 1980.
8
Resumo
A transtirretina (TTR) humana é uma proteína homotetramérica rica em folhas-β que
transporta o hormônio tiroxina e a proteína ligadora de retinol (holo-RBP) no plasma e no
fluido cerebroespinhal. A TTR está também envolvida em diversas amiloidoses e já foi
mostrado que a acidificação do meio ou a adição de Zn
2+
aumentam a sua agregação in vitro.
O Zn
2+
foi encontrado como o principal componente mineral de fibras amiloides de TTR
extraídas de pacientes. Nesta tese nós determinamos as estruturas cristalográficas da TTR
complexada com Zn
2+
em uma ampla faixa de pHs (4,5, 5,5, 6,5 e 7,5). Todas as estruturas
revelam 3 sítios clássicos de ligação de Zn
2+
por monômero, específicos para este íon. A
ligação de Zn
2+
também induz a várias mudanças estruturais na TTR, a maioria localizadas na
região de reconhecimento da holo-RBP, porém não provocam mudanças nas interfaces de
oligomerização da TTR, não causando sua dissociação. A afinidade da TTR pela holo-RBP
diminui em torno de 5 vezes na presença de Zn
2+
. Estudos de RMN revelaram que esses sítios
de ligação de Zn
2+
estão presentes em solução, bem como as mudanças estruturais associadas.
Devido às mudanças estruturais, a ligação de Zn
2+
causa também uma diminuição na
estabilidade e um aumento na área acessível ao solvente do monômero da TTR. O composto
resveratrol, conhecido inibidor da agregação da TTR não se mostrou capaz de reverter as
modificações estruturais causadas pelo Zn
2+
, em ensaios de cristalização. Os dados mostrados
aqui enfatizam o papel estrutural e funcional do Zn
2+
nas amiloidoses causadas por TTR, bem
como no reconhecimento da holo-RBP e a homeostase de retinol.
Palavras-chave: transtirretina. zinco. Proteína ligadora de retinol, RPB.
9
Abstract
Transthyretin (TTR) is a human homotetrameric β-sheet rich protein which
transports thyroxine hormone and retinol binding protein (holo-RBP) in serum and in
cerebrospinal fluid. TTR is also related to several amyloidosis and it was shown that
acidification or Zn
2+
addition causes TTR aggregation in vitro. Zn
2+
is found as a major
mineral component of amyloid fibrils extracted from patients. Here we show crystallographic
structures of TTR complexed with Zn
2+
in a broad pH range (4.5, 5.5, 6.5 e 7.5). All structures
revealed 3 canonical Zn
2+
bind sites per monomer, specific to this metal ion. Zn
2+
binding to
these sites causes several structural modifications on TTR, mostly located in the region of
holo-RBP recognition. These structural modifications do not induce changes in the
oligomerization interfaces of TTR, thus not causing its dissociation. Affinity of TTR to holo-
RBP is decreased 5-fold in presence of Zn
2+
. NMR studies showed that these Zn
2+
binding
sites are also present in solution, as well as the structural changes associated to it. Zn
2+
binding causes structural changes leading to destabilization and increase in solvent accessible
area of TTR monomers. Resveratrol, a drug known to inhibit TTR aggregation is not able to
revert the structural modifications caused by Zn
2+
, in crystallization assays. The data
presented here highlight the structural and functional role of Zn
2+
ions in TTR-related
amyloidosis, as well as in holo-RBP recognition and vitamin A homeostasis.
Keywords: transthyretin. Zinc. retinol bind protein, RPB.
10
Lista de Figuras
Figura 1- Diagrama de fitas do tetrâmero da TTR. ............................................................................. 14
Figura 2- Diagrama de fitas do complexo holo-RBP:TTR. ................................................................. 15
Figura 3- Diagrama de fitas do monômero da TTR. ........................................................................... 17
Figura 4- Diagrama esquemático de ligações de hidrogênios do monômero da TTR. ........................ 18
Figura 5- Diagrama de fitas do dímero AB da TTR. ........................................................................... 19
Figura 6- Organização das interfaces de tetramerização da TTR. ....................................................... 19
Figura 7: Vista do espaço extracelular nas vizinhanças de um nervo mielinizado de um paciente de
PAF. .................................................................................................................................................... 22
Figura 8- Estrutura química da genisteína (A), do resveratrol (B) e do hormônio T4 (C). .................. 24
Figura 9- Diagrama de fitas do dímero da TTR, visualizando a interface hidrofóbica de tetramerização.
............................................................................................................................................................. 24
Figura 10- Microscopias eletrônicas de transmissão (MET) de fibras amiloides ................................ 30
Figura 11- Crio-eletro microscopia (CEM) de uma única fibra amiloide ............................................ 31
Figura 12- Esquema e imagens de difração de raio-X de fibras amiloides .......................................... 32
Figura 13- Estrutura atômica da fibra amiloide da Sup35p. ................................................................ 33
Figura 14- Modelo estrutural para o protofilamento de fibras do peptídio Aβ1-40. ............................ 35
Figura 15- Estrutura química da sonda 1,8-ANS ................................................................................ 57
Figura 16- Especificidade dos sítios de ligação de Zn
2+
encontrados na TTR. .................................... 91
Figura 17- Efeito do pH sobre a supressão da fluorescência do Trp pela adição de Zn
2+
na WT-TTR 3,5
μM. .................................................................................................................................................... 93
Figura 18- Avaliação da mudança no estado oligomérico da WT-TTR induzida por Zn
2+
. ................. 95
Figura 19- Avaliação das mudanças na topologia da WT-TTR induzidas por Zn
2+
. ............................ 96
Figura 20- Efeito do Zn
2+
sobre a afinidade da WT-TTR pelo 1,8-ANS. ............................................ 99
Figura 21- Efeito do Zn
2+
na desnaturação do M-TTR induzida por ureia em pH7,5. ....................... 101
Figura 22- Efeitos de ligação de Zn
2+
sobre o ΔG
unf
e sobre o parâmetro “m
unf
” do M-TTR. ............ 102
Figura 23- Esquema da variação da área acessível ao solvente no M-TTR e no complexo Zn
2+
:M-TTR.
........................................................................................................................................................... 103
Figura 24- Diagrama de fitas do complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6, ligado ao composto resveratrol. ....
105
Figura 25- Canal hidrofóbico da TTR mostrando a ligação do composto resveratrol ao complexo
Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6. ................................................................................................................... 106
Figura 26- Desorganização da região da fita-β E - α-hélice - fita-β F do complexo Zn
2+
:M-TTR em pH
4,6, ligado ao resveratrol. ................................................................................................................. 107
11
Lista de Tabelas
Tabela 1- Contatos significativos (de até 4Å de distância) do complexo holo-RBP:TTR. .................. 16
Tabela 2- Principais amiloidoses humanas. ......................................................................................... 27
Tabela 3- Sumário das estatísticas dos dados de difração e refinamento. ............................................ 50
Tabela 4- Sumário dos parâmetros I(q) e p(r) derivados dos dados de SAXS. .................................... 95
Tabela 5- Interação do 1,8-ANS com a WT-TTR na ausência e presença de Zn
2+
. ............................. 99
Tabela 6- Valores de ΔG
unf
, ΔΔG
unf
e do parâmetro “m
unf
” do M-TTR para concentrações crescentes de
Zn
2+
. .................................................................................................................................................. 102
12
Lista de Abreviaturas
1,8-ANS 1-sulfonato-8-(1')anilinonafitaleno
AL Amiloidose Leptomeningeal
ASS Amiloidose Sistêmica Senil
CAF Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar
CEM crio-eletro microscopia
CLET cromatografia líquida de exclusão por tamanho
CM centro de massa
CR Vermelho do Congo (em inglês, Congo Red)
CS células de Schwann
holo-RBP holo proteína ligadora de retinol
HSQC-TROSY Coerência heteronuclear de quantum simples, com relaxação transversa otimizada (em inglês,
heteronuclear single quantum coherence - transverse relaxation optimized spectroscopy)
LCE líquido cerebroespinhal
M-TTR Duplo Mutante Phe87Met / Leu110Met - TTR
MET microscopia eletrônica de transmissão
NSAIDS drogas anti-inflamatórias não esteroidais (em inglês, non-steroidal anti-inflammatory drugs)
PAF Polineuropatia Amiloidótica Familiar
PDQ perturbações nos deslocamentos químicos
RMN Ressonância Magnética Nuclear
SAXS espalhamento de raio-X a baixo ângulo (em inglês, small angle X ray scattering)
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
T4 hormônio tiroxina
ThT tioflavina T
troca D - H troca de deutério por hidrogênio
TTR transtirretina
ZBS Sítio de ligação de zinco (em inglês, zinc bind site)
ΔASA variação da área acessível ao solvente
ΔG
unf
variação da energia livre de Gibbs de desenovelamento
ΔΔASA variação do ΔASA
ΔΔG
unf
variação de ΔG
unf
13
Sumário
1 Introdução ....................................................................................................... 14
1.1 Transtirretina (TTR) ......................................................................................... 14
1.1.1 Estrutura, Função e Amiloidoses .......................................................................... 14
1.1.2 Estratégias Terapêuticas Para as Amiloidoses Causadas por TTR ....................... 22
1.1.3 O Duplo Mutante Phe87Met / Leu110Met - TTR (M-TTR) ................................ 24
1.2 Mau Enovelamento Proteico e Amiloidoses .................................................... 25
1.3 Características Comuns das Fibras Amiloides ................................................. 29
1.3.1 Microscopia Eletrônica de Fibras Amiloides ........................................................ 29
1.3.2 Difração de Raio-X de Fibras Amiloides ............................................................. 31
1.3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de Sólidos de Fibras Amiloides ........... 33
1.3.4 Ligação de Cromóforos a Fibras Amiloides ......................................................... 35
1.3.5 Deflagração das Amiloidoses Associadas a TTR ................................................. 36
1.3.6 Íons Metálicos nas Amiloidoses ........................................................................... 39
1.3.7 A TTR Humana como Metaloproteína ................................................................. 40
1.4 Fibras Amiloides Funcionais ............................................................................ 41
2 Objetivos ......................................................................................................... 43
3 Materiais e Métodos ....................................................................................... 45
3.1 Reagentes e Tampões ....................................................................................... 45
3.2 Expressão e Purificação de TTR ...................................................................... 45
3.3 Cristalização e Coleta de Dados Cristalográficos ............................................ 46
3.3.1 Solução, Refinamento e Qualidade das Estruturas ............................................... 48
3.4 Espectroscopia de RMN .................................................................................. 51
3.5 Espalhamento de Raio-X a Baixo Ângulo (SAXS) .......................................... 52
3.6 Análise de Correlação Posicional ..................................................................... 53
3.7 Interação Entre holo-RBP e TTR ..................................................................... 53
3.8 Medidas de Fluorescência Intrínseca do Triptofano ......................................... 54
3.9 Medidas de Fluorescência da Sonda 1,8-ANS ................................................. 56
3.10 Cromatografia Líquida de Exclusão por Tamanho (CLET) ........................... 58
4 Resultados e Discussão ................................................................................... 59
4.1 Manuscrito “Novel Zn
2+
-binding sites in human transthyretin: implications for
amyloidogenesis and retinol binding protein recognition” .................................... 59
4.2 Caracterização dos Sítios de Ligação de Zn
2+
da TTR ..................................... 90
4.3 Estado Oligomérico do Complexo Zn
2+
:WT-TTR ............................................ 94
4.4 Estabilidade Termodinâmica do Complexo Zn
2+
:M-TTR .............................. 100
4.5 Caracterização do Complexo Zn
2+
:M-TTR Ligado ao Resveratrol ................ 104
5 Conclusão ..................................................................................................... 109
6 Referências ................................................................................................... 112
7 Anexos .......................................................................................................... 125
7.1 Curriculum Vitae Lattes ................................................................................. 125
7.2 Declaração de Defesa de Tese ........................................................................ 131
7.3 Histórico Oficial ............................................................................................ 132
14
1 Introdução
1.1 Transtirretina (TTR)
1.1.1 Estrutura, Função e Amiloidoses
A transtirretina humana (TTR) é uma proteína globular homotetramérica de 55 kDa,
com monômeros de 14 kDa e 127 resíduos de aminoácidos cada, encontrada no plasma e no
líquido cerebroespinhal (LCE) em concentrações de 0,2 a 0,3 mg/ml e 0,02 mg/ml,
respectivamente. Na sua forma tetramérica, ela está envolvida no transporte do hormônio
tiroxina (T4) (Palha, 2002) e na ligação à holo proteína ligadora de retinol (holo-RBP),
formando um complexo ternário, prevenindo a perda tanto da RBP quanto do retinol a ela
ligado, por filtração glomerular (Monaco, 2000).
A TTR transporta 15 a 20% do hormônio T4 presente no plasma e até 80% deste no
sistema nervoso central (SNC). Dois canais hidrofóbicos internos, presentes na interface entre
os dois dímeros da TTR, servem de ligação para duas moléculas do hormônio T4 (Figura 1).
Figura 1- Diagrama de fitas do tetrâmero da TTR.
A TTR mostra-se ligada a duas moléculas do hormônio T4 (estruturas químicas verdes). Figura gerada pelo
programa Pymol (DeLano, 2008) usando-se o PDB ID 2ROX (Wojtczak et al., 1996).
15
Cada molécula do hormônio T4 faz interações hidrofóbicas com os resíduos Leu17,
Ala108 e Leu110 e pontes de hidrogênio com as cadeias laterais da Lis15 e Glu54 (Wojtczak
et al., 1996).
A estrutura cristalográfica do complexo holo-RBP:TTR mostra que a superfície das
voltas 63 - 67 e 92 - 98 da RBP penetram em uma cavidade formada pelo arranjo de três
subunidades da TTR, podendo acomodar duas moléculas por tetrâmero, como mostrado na
Figura 2 (Monaco et al., 1995). A estabilidade do complexo se dá pela interação entre cadeias
laterais de ambas proteínas, como listado na Tabela 1 e a afinidade da RBP pela TTR é maior
quando aquela está ligada ao retinol (forma holo) (Monaco, 2000).
Figura 2- Diagrama de fitas do complexo holo-RBP:TTR.
A TTR (em verde) mostra-se ligada a duas moléculas da holo-RBP (em laranja, molécula de retinol em
vermelho). Figura gerada pelo programa Pymol (DeLano, 2008) usando-se o PDB ID 1QAB (Naylor and
Newcomer, 1999).
16
Tabela 1- Contatos significativos (de até 4Å de distância) do complexo holo-RBP:TTR.
Contatos determinados pela análise de estruturas de cristalográficas. Adaptado de (Zanotti et al., 2008).
RBP cadeia E TTR cadeia A TTR cadeia B TTR cadeia C
W91 S100
V93 R103
a
S95 V122
K99 D99
a
, S100
a
L35 L82, G83
L63 L82, G83, I84
L64 L82
a
, R21
S95 Y114
b
F96 I84, S85
b
, Y114
a
R21
L97 S85
a
Q98 S85
a
K99 S85
b
W67 G83, I84
Retinol G83
b
a Denota a participação de resíduos da TTR em pelo menos um contato polar.
b Denota a provável existência de uma ligação de hidrogênio entre pelo menos dois átomos de resíduos que
interagem na RBP e TTR.
Anteriormente chamada de pré-albumina por sua banda se posicionar à frente da
banda da albumina em um gel de eletroforese das proteínas do plasma humano, a TTR foi
isolada e caracterizada na década de 1960 (Oppenheimer et al., 1965) e teve seu peso
molecular, estado oligomérico e a identidade entre as subunidades determinadas na década de
1970 (Rask et al., 1971). Em uma série de estudos cristalográficos também realizados na
década de 1970, a estrutura da TTR foi determinada por cristalografia de raios X e refinada a
1,8 Å (Blake et al., 1971, 1974, 1978), sendo a primeira proteína do plasma humano a ter sua
estrutura determinada.
Os quatro monômeros da TTR são nomeados de A a D e possuem 127 resíduos de
aminoácidos cada, arranjados em 8 fitas-β anti-paralelas (fitas-β A a H) e uma pequena α-
hélice entre as fitas-β E e F, como mostrado na Figura 3. Duas fitas-β subsequentes conectam-
se por voltas chamadas pelas duas letras das fitas-β que conectam (ex.: volta AB é a volta que
17
conecta as fitas-β A e B). As fitas-β CBEF unem-se lateralmente por ligações de hidrogênio,
formando uma folha-β; o mesmo ocorre com as fitas-β DAGH, como mostrado na Figura 3 e
Figura 4, formando um barril-β ou chave Grega (Blake et al., 1978; Hörnberg et al., 2000).
Figura 3- Diagrama de fitas do monômero da TTR.
Cada fita-β encontra-se representada por uma letra de A a H, na ordem da sequência primária. Observe as folhas-
β CBEF e a ADGH e a pequena α-hélice, presentes em cada monômero. Figura gerada pelo programa Pymol
(DeLano, 2008) usando-se o PDB ID 1F41 (Hörnberg et al., 2000).
18
Figura 4- Diagrama esquemático de ligações de hidrogênios do monômero da TTR.
As fitas-β estão nomeadas de A a H e as setas indicam ligações de hidrogênio de cadeia principal, apontando do
resíduo doador para o resíduo aceptor. As posições sublinhadas em preto possuem mutantes patogênicos e as
sublinhados em vermelho, mutantes não-patogênicos. A fita-β H de outra subunidade é mostrada como H',
indicando algumas das interações responsáveis pela dimerização. Adaptado de (Liu et al., 2000b).
Dois monômeros da TTR dimerizam-se (Figura 5) através de interações
intermoleculares de cadeia principal, envolvendo os resíduos da fita-β H (resíduos Ser115 a
Thr123) de cada monômero, para formar um sanduíche-β de 8 fitas. Duas fitas-β F (resíduos
His90 a Val94) também interagem, predominantemente através de duas ligações de
hidrogênio entre a carbonila da Val94 e a amina do Glu89 (de ambos monômeros). Estas
interações estão representadas na Figura 6 por setas pequenas entre as fitas-β H (Hörnberg et
al., 2000).
19
Figura 5- Diagrama de fitas do dímero AB da TTR.
Cada fita-β encontra-se representada por uma letra de A a H. Figura gerada pelo programa Pymol Pymol usando-
se o PDB ID 1F41 (Hörnberg et al., 2000).
Figura 6- Organização das interfaces de tetramerização da TTR.
Apenas as regiões envolvidas na formação do dímero e do tetrâmero estão mostradas. As fitas-β H, voltas AB e
GH de cada uma das subunidades estão mostradas, sendo em azul os componentes da subunidade A; em verde,
B; em amarelo C e em vermelho D, mesmas cores mostradas na Figura 1. As setas pequenas representam as
ligações de hidrogênio de cadeia principal, apontando do resíduo doador para o resíduo receptor.
Os dímeros AB e CD associam-se para formar o tetrâmero Figura 1, através de
diversas interações hidrofóbicas mediados por resíduos das voltas AB e GH. Além disso, a
volta AB está ancorada por duas ligações de hidrogênio à fita-β H e à volta GH de outros dois
monômeros do dímero vizinho na estrutura do tetrâmero (Figura 6) (Hörnberg et al., 2000;
Liu et al., 2000a).
20
A montagem do tetrâmero da TTR requer primeiramente o enovelamento dos
monômeros, seguido da associação destes em dímeros AB e CD. Os dímeros se associam e,
então, formam o tetrâmero. A dissociação segue a ordem inversa (Foss et al., 2005).
A TTR está relacionada a quatro amiloidoses: a Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), a
Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), a Amiloidose Leptomeningeal (AL) e a
Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF).
As amiloidoses são um subgrupo dentro das doenças do mal-enovelamento proteico
e serão discutidas mais profundamente na seção 1.2 (Mau Enovelamento Proteico e
Amiloidoses, pág. 26).
A ASS resulta da deposição de fibras amiloides compostos pela WT-TTR em
diversos tecidos, principalmente no coração. Estudos de autópsias revelaram que ao menos
25% de todos os indivíduos com mais de 80 anos possuíam tais depósitos, sendo fatal em
10% desses casos (Kingsbury et al., 2007).
A CAF é observada majoritariamente em homens negros com idade média de 60
anos e resulta, principalmente, da deposição de amiloides da TTR mutante V122I, mutação
encontrada em 3.9% de afro-americanos (Jacobson et al., 1997). O acúmulo de fibras
amiloides no tecido cardíaco causa diversos sintomas que evoluem para uma disfunção
sistólica levando à falência cardíaca congestiva. Interessantemente, portadores desta patologia
não apresentam acúmulos de fibras em nervos periféricos e não apresentam disfunções
associadas aos nervos periféricos (Hesse et al., 1993), local de depósito da maior parte dos
variantes de TTR associados à PAF.
Já a AL é causada por acúmulo leptomeningeal e meningovascular de fibras
amiloides formadas de mutantes de TTR, como o A25T-TTR ou D18G-TTR (Vidal et al.,
1996; Sekijima et al., 2003). Este acúmulo gera infarto cerebral, hemorragia, hidrocefalia e
21
páreses, que causam sintomas como demência, espasticidade, ataxia e perda de audição, com
ausência de sinais clínicos de disfunções nos nervos periféricos ou no coração (Yamada,
2000).
A PAF está associada à deposição de fibras amiloides formadas por um de mais de 90
mutantes pontuais de TTR, sendo os mutantes mais amiloidogênicos o L55P-TTR e o V30M-
TTR. A neuropatia geralmente começa com disfunções associadas às fibras-curtas nas
extremidades dos pés, sendo a perda de sensação térmica o primeiro sintoma a aparecer.
Disestesia pode ocorrer com vários graus de dor. O nível de perda sensória progride
lentamente dos pés para os tornozelos e daí para as pernas e joelhos, com sintomas similares
nas extremidades superiores. As funções motoras se mantem até a neuropatia sensória estar
bem avançada. Ocorre também neuropatia autonômica, cedo no curso da doença, causando
impotência nos homens, problemas na mobilidade gastrointestinal e retenção na bexiga.
Alguns homens têm a impotência como primeiro sintoma da patologia (Merrill D. Benson and
Kincaid 2007).
Materiais de biopsia e autopsia de pacientes de PAF portadores da mutação V30M-
TTR possuem um mesmo padrão de deposição de fibras de TTR, distribuídas difusamente no
Sistema Nervoso Periférico (SNP), localizando-se em feixes de nervos, plexos, gânglios
sensórios e autonômicos. Nos nervos periféricos, os depósitos acham-se no epineuro,
perineuro e mais proeminentemente no endoneuro, onde as fibras estão presentes nas
proximidades da membrana basal das células de Schwann (CS) (Figura 7), porém sem nunca
penetrar a membrana ou o citoplasma dessas células ou o corpo celular dos neurônios ou
axônios (Sousa and Saraiva, 2003).
22
Figura 7: Vista do espaço extracelular nas vizinhanças de um nervo mielinizado de um paciente de PAF.
My, mielina; BM, membrana basal; SC célula de Schwann; asteriscos indicam o local de acúmulo de fibras
amiloides. Magnificação de 25.000X. Barra de 1 μm. Adaptado de (Inoue et al., 1998).
Em nervos severamente afetados, apenas algumas fibras nervosas continuam viáveis
e o conteúdo endoneural é substituído por fibras amiloides, agregados de colágeno e CS sem
os axônios. Já no perineuro, as fibras encontram-se próximo ao envelope perineural, enquanto
que no epineuro apenas pequenos depósitos são encontrados em alguns casos. A neuropatia
parece estar associada a danos a bainha de mielina e à degeneração axonal relacionada a esses
danos (Sousa and Saraiva, 2003).
1.1.2 Estratégias Terapêuticas Para as Amiloidoses Causadas por TTR
O único tratamento conhecido para a PAF é o transplante de fígado, uma vez que este
órgão é o principal responsável pela produção de TTR (Suhr et al., 2000). Este procedimento,
além das diversas complicações associadas ao transplante, não bloqueia o desenvolvimento
das desordens oculares, causadas pelo depósito das fibras amiloides no humor vítreo, nem os
sintomas no Sistema Nervoso Central (SNC), em consequência da amiloidose leptomeningeal,
devido à produção de TTR mutante pela retina e plexo coroide, respectivamente (Ando,
2005).
Já foi visto que o hormônio T4 estabiliza a estrutura quaternária da TTR, diminuindo
23
sua taxa de dissociação (Miroy et al., 1996). A via de agregação da TTR prevê a dissociação
das subunidades para que haja a formação de fibras amiloides, como veremos adiante e uma
possível abordagem terapêutica seria o desenvolvimento de drogas baseadas na estrutura do
hormônio T4 que estabilizassem a estrutura tetramérica (Miroy et al., 1996).
Após vários testes in vitro com compostos análogos ao T4, chegou-se a classe de
drogas anti-inflamatórias não esteroidais, (em inglês non-steroidal anti-inflammatory drugs,
NSAIDS) que parecem ser os melhores estabilizadores da estrutura quaternária da TTR, com
algumas drogas inibindo até 99% da agregação in vitro (Baures et al., 1998, 1999).
Apesar de funcionarem bem como inibidores da agregação in vitro, esses compostos
teriam de ser usados ao longo de toda a vida do paciente e com isso a inibição constante da
ciclooxigenase se tornaria um efeito colateral indesejável (Julius et al., 2007). Diversos
produtos naturais têm sido testados com intuito de se inibir a agregação da TTR in vivo,
porém com menos efeitos colaterais associados, como a genisteína e o resveratrol (Green et
al., 2005; Klabunde et al., 2000).
A genisteína (Figura 8 A) é uma isoflavona encontrada em abundância na soja, que
se mostrou um excelente inibidor tanto da dissociação quanto da agregação da TTR induzida
pela acidificação do meio, reduzindo em 90% a formação de fibras da WT-TTR, V30M-TTR
e V122I-TTR. Além disso, a genisteína apresenta alta seletividade de ligação para a TTR em
relação a outras proteínas do plasma (Green et al., 2005).
Já o resveratrol (trans-3,4',5-trihidroxistilbeno) (Figura 8 B), um composto fenólico
antioxidante encontrado no vinho tinto e no suco de uva, reduz a formação de fibras de TTR
induzida pela acidificação do meio em 98% (Klabunde et al., 2000).
24
A B C
Figura 8- Estrutura química da genisteína (A), do resveratrol (B) e do hormônio T4 (C).
1.1.3 O Duplo Mutante Phe87Met / Leu110Met - TTR (M-TTR)
O M-TTR é um mutante construído da TTR, i.e., sem ocorrência natural, onde foram
inseridas duas mutações, F87M e L110M. Este mutante apresenta uma constante de
dissociação aumentada, se comparada com a da WT-TTR, uma vez que as mutações inibem a
tetramerização das subunidades por impedimento estérico (Jiang et al., 2001). A fenilalanina
87 está posicionada no início da fita-β F (diretamente abaixo da fita-β H na estrutura
secundária), enquanto a leucina 110 está no final da fita-β G, próxima à interface hidrofóbica
mediada pela volta GH, como mostrado na Figura 9.
Figura 9- Diagrama de fitas do dímero da TTR, visualizando a interface hidrofóbica de tetramerização.
As posições dos dois resíduos, fenilalanina 87 e leucina 110, que foram trocados por metioninas para construir o
M-TTR, mutante monomérico, estão mostradas. Figura gerada pelo programa Pymol (DeLano, 2008) usando-se
o PDB ID 1GKO (Jiang et al., 2001).
25
Como explicamos anteriormente, as fitas H e H’ e F e F’ de dois monômeros
adjacentes formam a interface de ligações de hidrogênio que resulta no dímero. Dois dímeros
formam um tetrâmero através de interações hidrofóbicas entre as voltas AB e GH.
O resíduo de metionina que substitui a fenilalanina 87 tem sua cadeia lateral
apontada para a interface de dimerização, gerando assim um impedimento estérico nesta
interface. Já o resíduo de metionina que substitui leucina 110 tem sua cadeia lateral apontada
para a interface de tetramerização, novamente gerando um impedimento estérico que diminui
as interações hidrofóbicas que uniriam os dímeros. Estas mutações não alteram a estrutura
secundária e terciária da proteína, bem como sua capacidade de agregar em pHs ácidos (Jiang
et al., 2001).
O M-TTR é encontrado na forma monomérica na faixa micromolar (Jiang et al.,
2001), enquanto a WT-TTR e seus mutantes naturais só se dissociam por diluição na faixa
nanomolar (Quintas et al., 1997a). Como a acidificação requerida para a dissociação das
subunidades também gera uma modificação nas estruturas terciárias e secundárias das
subunidades da TTR, este mutante foi construído para permitir que o
enovelamento/desenovelamento do monômero fosse estudado, sem a interferência do
processo de associação/dissociação. Foi demonstrado que este monômero agrega em meios
ácidos e não agrega em meios neutros (Jiang et al., 2001), demonstrando que outras mudanças
estruturais (e não só a dissociação) são necessárias para o processo de agregação da TTR.
1.2 Mau Enovelamento Proteico e Amiloidoses
As Doenças do Mau-enovelamento Proteico são um amplo conjunto de doenças que
surgem da incapacidade de um peptídio ou proteína em adotar ou permanecer em sua
26
conformação estrutural nativa e funcional durante seu tempo de vida (Uversky et al., 2006). O
maior subgrupo dentro desse grupo de doenças é o das amiloidoses, que estão associadas com
a conversão de mais de 20 peptídios ou proteínas diferentes, que saem de seus estados
funcionais e solúveis para gerar agregados proteicos fibrilares, encontrados em inclusões
intracelulares ou placas extracelulares. As sequências primárias e estruturas tridimensionais
dos peptídios ou proteínas precursoras não se relacionam entre si e o seu acúmulo se dá em
órgãos ou tecidos que diferem de doença para doença (Serpell et al., 1997; Kelly, 1998;
Dobson, 1999; Chiti, 2006).
Para que ocorra a amiloidogênese, i.e., formação de fibras amiloides, uma cadeia
polipeptídica deve sofrer alterações estruturais, assumindo um estado parcialmente enovelado.
Neste estado, ocorre a exposição de ligações de hidrogênio de cadeia principal ao solvente, o
que pode gerar interações interproteicas mais favoráveis que as interações intraproteicas do
estado enovelado nativo (Uversky et al., 2006).
Além disso, as interações hidrofóbicas são particularmente importantes para o
processo de agregação, uma vez que sítios hidrofóbicos expostos podem servir como
promotores da amiloidogênese, iniciando a agregação de uma cadeia polipeptídica e
facilitando sua estruturação em fibras amiloides (Chiti, 2006).
Dá-se então a formação de fibras amiloides (Uversky et al., 2006), que são estruturas
formadas pelo empilhamento de fitas-β, como será mostrado na seção 1.3 (Características
Comuns das Fibras Amilóides, pág. 30).
As amiloidoses podem ser neurodegenerativas, se o acúmulo das fibras amiloides
ocorrer no SNC; amiloidoses localizadas, se o acúmulo ocorrer em um único órgão ou tecido,
com exceção do SNC; amiloidoses sistêmicas, se o acúmulo ocorrer em diversos órgãos ou
tecidos. A Tabela 2 mostra uma lista das principais amiloidoses humanas conhecidas, bem
como suas proteínas ou peptídios precursores.
27
Tabela 2- Principais amiloidoses humanas.
Adaptado de (Chiti and Dobson, 2006).
Doença Peptídio ou proteína
agregante
Número de
resíduos
a
Estrutura nativa
b
Amiloidoses
Neurodegenerativas
Mal de Alzheimer
c
Peptídio β Amiloide 40 ou 42
f
Nativamente desenovelada
Encefalopatias Espongiformes
c,e
Proteína do príon ou
fragmentos
253 Nativamente desenovelada
(resíduos 1–120)
e α-hélice (resíduos 121–230)
Mal de Parkinson
c
α-Sinucleína 140 Nativamente desenovelada
Mal de Huntington
d
Huntingtina com
expansões poli Q
3144
g
Nativamente desenovelada
Amiloidoses localizadas
Diabetes do tipo II
c
Amilina, também
conhecida como peptídio
precursor amiloide da
ilhota (IAPP)
37 Nativamente desenovelada
Catarata
c
γ-Cristalinas Variável Todo-β, como as γ-Cristalinas
Amiloidoses sistêmicas
Amiloidose Sistêmica Senil
c
Transtirretina (TTR) tipo
selvagem
127 Toda-β, como a TTR
Polineuropatia Amiloidótica
Familiar
d
Mutantes pontuais da TTR 127 Toda-β, como a TTR
Amiloidose AL
c
Imunoglobulina de cadeia
leve ou fragmentos
90 ∼
f
Toda-β, como Ig
Amiloidose de Lisozima
d
Mutantes da lisozima 130 α+β, como lisozima
a. Dado referente ao número de resíduos da cadeia polipeptídica processada depositada no agregado, não à
proteína precursora.
b. De acordo com o banco de dados “Structural Classification Of Proteins” (SCOP), esses são as classes
estruturais e enovelamentos dos estados nativos dos peptídios processados ou proteínas depositadas
antes da agregação.
c. Predominantemente esporádica; entretanto alguns casos hereditários associados a algum mutante
específico estão bem documentadas.
d. Predominantemente hereditárias, entretanto alguns casos esporádicos estão bem documentados.
e. Transmitidas em 5% dos casos (ex.: transmissão iatrogênica).
f. Relatam-se presença de fragmentos de vários tamanhos em fibras ex vivo.
g. Tamanho da sequência normal, com partes repetições de glutamina não patogênicas.
28
Os depósitos proteicos encontrados em pacientes que sofrem de amiloidoses sempre
possuem um núcleo fibrilar principal formado pela proteína precursora (fibra amiloide
propriamente dita) e outros componentes não-fibrilares associados não-covalentemente, como
íons metálicos, glicosaminoglicanas, componente amiloide P do soro, apolipoproteína E e
colágeno, entre outros. Esses componentes parecem contribuir para a estabilidade das fibras
amiloides e podem também contribuir para a citotoxicidade desses depósitos proteicos
(Hirschfield and Hawkins, 2003; Alexandrescu, 2005).
A fibra amiloide pode ser isolada dos depósitos proteicos ex vivo e também pode ser
produzida in vitro usando-se a proteína ou peptídio precursor de fontes naturais ou
recombinante. Nesse caso, uma suave desnaturação ou algum outro tratamento específico é
requerido para que a fibra amiloides seja formada (Chiti and Dobson, 2006).
A hipótese de que a simples presença dos depósitos proteicos nos tecidos dos
pacientes com amiloidoses seria a causa destas patologias vem perdendo força, com recentes
achados mostrando que espécies de baixo peso molecular e precursores das fibras ou
protofibrilas seriam os agentes patogênicos, ao menos nas amiloidoses neurodegenerativas
(Glabe, 2008). Por exemplo, para o Mal de Alzheimer, descobriu-se que oligômeros do
peptídio precursor Aβ, com tamanhos que podem variar de tetrâmeros a dodecâmeros (Klein,
2002; Chromy et al., 2003), seriam capazes de inibir a potenciação de longo termo (PLT) no
hipocampo de ratos, tanto em fatias de tecido quanto in vivo (Lambert et al., 1998; Wang et
al., 2002; Walsh et al., 2002). A PLT é um indicador eletrofisiológico da formação sináptica,
que é essencial na manutenção da memória (Malenka, 2003). Tais espécies oligoméricas de
baixo peso molecular formariam estruturas parecidas com poros que, ao se inserirem em
membranas celulares, causariam um fluxo iônico responsável pela despotenciação da
membrana nas sinapses (Arispe et al., 1993, 1994; Rhee et al., 1998; Lashuel et al., 2003;
Chromy et al., 2003). Essas espécies oligoméricas podem também se ligar em receptores da
29
superfície celular, como os receptores de insulina, comprometendo seu funcionamento (Zhao
et al., 2008).
Esses mecanismos poderiam ser comuns a maioria das amiloidoses
neurodegenerativas, sendo o extravasamento iônico causado pela formação de poros nas
membranas das células a causa da citotoxicidade que levaria ao dano tecidual e não o simples
dano mecânico causado pelo acúmulo das fibras (Kagan, 2006).
1.3 Características Comuns das Fibras Amiloides
O “Committee of the International Society of Amyloidosis” definiu para fins
diagnósticos “amiloide” como sendo “os depósitos extracelulares de fibras proteicas com
aparência característica na microscopia eletrônica, padrão de difração de raio-X típico e que
apresentam afinidade por Vermelho do Congo, com concomitante birrefringência verde-
maçã” (Westermark et al., 2005; Pepys, 2006).
1.3.1 Microscopia Eletrônica de Fibras Amiloides
As primeiras caracterizações estruturais de baixa resolução de fibras amiloides
deram-se através da microscopia eletrônica de transmissão (MET) que mostraram fibras de
aproximadamente 60 a 120 Å de diâmetro, com comprimento indeterminado, lineares, rígidas,
não ramificadas e, geralmente, porém nem sempre, compostas de protofibrilas trançadas
(Figura 10) (Fändrich, 2007; Serpell et al., 2000).
30
Figura 10- Microscopias eletrônicas de transmissão (MET) de fibras amiloides
A,B,C- MET de fibras amiloides contrastadas negativamente com acetato de uranila, de Aβ
1-40
(A); amilina (B) e
Aβ
11-25
(C). As barras vermelhas tem 100 nm. Reproduzido de (Tycko, 2006).
D,E- MET de fibras amiloides de Aβ
1-40
mostrando o trançado de protofibrilas (D, setas); esquema do trançado
de 2, 3 ou 4 protofibrilas e MET de fibras amiloides de Aβ
1-40
contrastadas com platina, mostrando quiralidade no
trançado para a mão esquerda (E). Reproduzido de (Fändrich, 2007).
F- MET de fibras amiloides ex vivo de V30M-TTR, retiradas do humor vítreo e contrastadas com acetato de
uranila. Barra de 200 nm. Reproduzido de (Serpell et al., 1997).
G- MET de fibras amiloides de amilina, negativamente contrastadas. Barra de 100 nm. Reproduzido de (Makin
and Serpell, 2005).
Mesmo não revelando a estrutura molecular das fibras amiloides, a crio-eletro
microscopia (CEM) chegou a revelar a estrutura secundária de fibras de Aβ
11-25
, confirmando a
presença de fitas-β perpendiculares ao eixo da fibra (Figura 11) (Serpell and Smith, 2000),
que haviam sido previstas a partir dos dados de difração de raios-X.
31
Figura 11- Crio-eletro microscopia (CEM) de uma única fibra amiloide
A- CEM de uma única fibra amiloide de Aβ
11-25
.
B- Projeção das imagens de difração eletrônica filtradas em 9.6 Å e 4.76 Å de resolução, mostrando as fitas-β
perpendiculares ao eixo principal da fibra.
C- Detalhe de uma única fibra gerada acumulando-se diversas imagens da mesma fibra. Reproduzido de (Serpell
and Smith, 2000).
1.3.2 Difração de Raio-X de Fibras Amiloides
Maiores detalhes sobre a organização molecular das fibras amiloides foram obtidos
com a difração de raio-X. Se uma amostra de fibras amiloides for exposta a um feixe de raio-
X com o seu eixo principal (aproximadamente) perpendicular ao feixe, duas reflexões são
distinguíveis por suas direções em relação ao eixo da fibra e suas distâncias do centro da
imagem de difração. São elas: as reflexões meridionais, paralelas ao eixo principal das fibras e
as reflexões equatoriais, que formam ângulos retos com o eixo das fibras (Serpell et al.,
1997). As reflexões meridionais possuem espaçamento de 4,6 a 4,8 Å e as reflexões
equatoriais com espaçamento mais variado, de 5 a 12 Å, sendo essas orientações e
espaçamentos associados à estruturas β-cruzadas, o que significa que as fibras amiloides
possuem fitas-β orientadas transversalmente (e suas ligações de hidrogênio paralelas) ao eixo
principal da fibra (Figura 12) (Fändrich, 2007).
32
Figura 12- Esquema e imagens de difração de raio-X de fibras amiloides
A- Padrões de difração de raio-X de várias fibras amiloides, da direita para esquerda: TTR-V30M; TTR-G47V;
cadeia leve de imunoglobulina; apolipoproteína A-1; peptídio 20-29 da amilina; peptídio com a sequência da
fita-β A da TTR humana; lisozima D67H; amiloide A do soro. O eixo meridional (paralelo ao eixo principal da
fibra) é o eixo vertical na figura. Adaptado de (Serpell et al., 1997).
B- Representação esquemática do padrão de difração de raio-X da estrutura β-cruzada e sua interpretação,
mostrando a origem das reflexões meridionais (fitas-β, mostradas em barras pretas e cinzas, com linhas
pontilhadas representando as ligações de hidrogênio) e das reflexões equatoriais (folhas-β justapostas). Adaptado
de (Fändrich, 2007).
Uma vez que o espaçamento de 4,6 a 4,8 Å das reflexões meridionais surgem da
distância entre duas fitas-β ligadas por ligações de hidrogênio, este seria então o espaçamento
existente entre as cadeias principais das fitas-β que formam a fibra. Este espaçamento, que
depende primariamente da geometria das cadeias polipeptídicas, varia pouco entre fibras
compostas de diferentes proteínas precursoras.
Já o espaçamento das reflexões equatoriais de 5 a 12 Å surge da justaposição de duas
folhas-β, que tem sua distância variada, dependendo do empacotamento das cadeias laterais
dos resíduos formadores das fitas-β. Esse espaçamento depende da proteína precursora, pois
33
as cadeias laterais de seus resíduos projetam-se ortogonalmente ao plano das folhas-β (Figura
12) (Salemme, 1983).
Posteriores experimentos de difração de raio-X de microcristais de fibras amiloides
revelaram a sua organização molecular e atômica. Fibras amiloides do peptídio NNQQNY da
proteína Sup35p foram microcristalizadas e difratadas à resolução atômica, mostrando, pela
primeira vez, duas folhas-β face a face, com suas cadeias laterais empacotadas umas contra as
outras, formando um zíper estérico auto complementar extremamente compacto (Figura 13)
(Nelson et al., 2005). Outros peptídios de proteínas, como o Aβ, a Tau, o PrP, a insulina, a
IAPP, a lisozima, a mioglobina, a α-Sinucleína e a β2-microglobulina já foram também
cristalizados e tiveram suas estruturas atômicas reveladas por cristalografia de raio-X,
mostrando zíperes estéricos complementares, o que sugere uma característica estrutural
comum à diversas amiloidoses a nível molecular (Sawaya et al., 2007).
Figura 13- Estrutura atômica da fibra amiloide da Sup35p.
A- Está representado um par de folhas-β, mostrando a cadeia principal de cada fita-β como setas, com as cadeias
laterais dos resíduos de aminoácidos apontando para fora ou para dentro, perpendicularmente.
B- Ampliação do zíper estérico, mostrando a complementaridade das cadeias laterais dos resíduos de
aminoácidos. Adaptado de (Nelson et al., 2005).
1.3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de Sólidos de Fibras Amiloides
Detalhes sobre a estrutura atômica das fibras amiloides compostas da molécula
inteira da proteína só puderam ser determinados com estudos de Ressonância Magnética
34
Nuclear (RMN) de sólidos, sendo possível, em alguns casos, a construção de modelos
estruturais, como o da estrutura do protofilamento da fibra da peptídio Aβ
1-40
. Diversos
estudos mostraram que o segmento 1 a 10 do N-terminal deste peptídio é estruturalmente
desordenado e que os resíduos de 10 a 22 e de 30 a 40 formam fitas-β, enquanto resíduos
entre esses dois trechos, como G25, S26 e G29, possuem conformação não β (Petkova et al.,
2005; Antzutkin et al., 2003).
Além disso, diversas medidas com o protofilamento da fibra da peptídio Aβ
1-40
.
usando RMN de sólidos mostraram que:
1. Cadeias vizinhas apresentam alinhamento paralelo em registro entre os resíduos 12-39
(Antzutkin et al., 2000; Balbach et al., 2002; Petkova et al., 2005);
2. As cadeias laterais dos resíduos K28 e D23 apresentam uma ligação salina (Petkova et
al., 2002, 2006);
3. Existem contatos entre as cadeias laterais dos resíduos L17 e F19; I32, L34 e V36; I31
e G37 e entre as cadeias laterais e a cadeia principal de M35 e G33 (Jaroniec et al.,
2002; Petkova et al., 2006).
A reunião desses dados estruturais de alta resolução, com dados de baixa resolução
como restrições para os modelos possíveis, a medida do diâmetro do protofilamento (5 nm) e
a medida da massa por comprimento (211 kDa) calculados por MET, indica que as fibras de
Aβ
1-40
possuem duas camadas de folhas-β, conforme o modelo estrutural mostrado na Figura
14 (Petkova et al., 2005).
35
Figura 14- Modelo estrutural para o protofilamento de fibras do peptídio Aβ
1-40
.
A- Representação de todos os átomos, mostrando que os resíduos de 10 a 22 e de 30 a 40 possuem conformação
em fita-β, formando duas folhas-β paralelas em registro. As setas azuis e roxas indicam as interações de cadeia
lateral ou principal, determinados por medidas de acoplamentos dipolares.
B- Estrutura média resultante de 10 minimizações de energia independentes com restrições de distâncias
interatômicas e ângulos de torção determinados por RMN de sólidos.
C e D- Representação em fita da fibra, com resíduos de 12 a 21 em vermelho e de 30 a 40 em azul. Adaptado de
(Tycko, 2006).
1.3.4 Ligação de Cromóforos a Fibras Amiloides
Uma outra característica comum às fibras amiloides é a ligação de sondas
cromofóricas específicas, como a tioflavina T (ThT) e o Vermelho do Congo (em inglês,
Congo Red, CR). Originalmente usadas para a detecção de depósitos amiloides em tecidos
para fins diagnósticos, essas sondas são também utilizadas para a quantificação de fibras
amiloides in vitro, devido a sua especificidade de ligação e a baixa afinidade por proteínas
solúveis nativas ou parcialmente enoveladas e espécies não fibrilares (Hawe et al., 2008).
Na presença de fibras amiloides, a ThT apresenta um aumento na absorção de luz em
450 nm e uma emissão de fluorescência com máximo em 480 nm, apontando uma interação
36
entre a sonda e a fibra (LeVine, 1999).
Similarmente a ThT, o CR tem sido usado para a marcação de depósitos amiloides
em tecidos e também para a quantificação de fibras in vitro. Essa sonda difere da ThT pois
não apresenta aumento na fluorescência quando ligada às fibras amiloides e sim um desvio no
espectro de absorbância, de 490 nm para 540 nm, além de birrefringência maçã-verde sob luz
polarizada e, em alguns casos, a indução de dicroísmo circular entre 300 e 600 nm. A
proporção entre a diminuição de absorbância em 490 nm e o aumento em 540 nm pode ser
usada para o cálculo da quantidade de CR ligado à fibra e, consequentemente, a determinação
da quantidade de proteína solúvel que foi convertida em fibra amiloide (Klunk et al., 1999).
1.3.5 Deflagração das Amiloidoses Associadas a TTR
A hipótese mais aceita para explicar a amiloidogênese da TTR pressupõe a
dissociação do tetrâmero em monômeros com estrutura alterada, altamente amiloidogênicos.
Esses eventos podem ser disparados por acidificação do meio in vitro (pH de 4 a 5) e poderia
ocorrer in vivo, dentro de lisossomas durante a reciclagem da TTR (Colon and Kelly, 1992;
Lai et al., 1996). Entretanto, não há estudos mostrando a TTR ou fibras de TTR co-localizadas
com lisossomas. Além disso, nunca se relatou achados de depósitos de fibras nem marcadores
de TTR, intracelulares no axônio, no corpo celular neuronal ou dentro das CS (Sousa and
Saraiva, 2003), levantando a possibilidade de algum outro fator estar envolvido nas
modificações conformacionais que deflagram a agregação desta proteína.
Uma série de estudos usando troca de deutério por hidrogênio (troca D-H) mapearam
regiões da TTR que poderiam ser desestabilizadas por mutações ou condições que
favorecessem a agregação, tais como pH ácido. Medindo-se os fatores de proteção contra a
troca de D-H de ligações de hidrogênio de cadeia principal, descobriu-se que a TTR possui,
37
em pH neutro, uma região de maior estabilidade que consiste nas fitas-β A, B, E, F e a volta
AB (Figura 5) e que a região da interface entre as subunidades (Figura 6) apresenta uma
mobilidade maior que a esperada. Além disso, não foi possível medir os fatores de proteção
dos resíduos da pequena α-hélice, uma vez que a troca D-H total nesta região ocorria no
tempo de preparação da amostra, indicando flexibilidade (Liu et al., 2000a).
Estudos posteriores mostraram que a acidificação do meio resultava na
desestabilização das fitas-β B, E e F e parte da fita-β C (Liu et al., 2000b). Além disso,
mostrou-se que as fitas-β A, B, E e G e a volta entre as fitas-β A e B estariam desestabilizadas
nos mutantes associados a PFA, como o V30M e L55P, e que a mesma região apresentava-se
estabilizada na variante não-amiloidogênica T119M. Além disso, a interface de dimerização
apresentava maior taxa de troca D-H no variante L55P, porém não no V30M ou T119M (Liu
et al., 2000b). Tais trabalhos de RMN resultaram também no assinalamento sequencial dos
deslocamentos químicos dos resíduos da WT-TTR (BMRB ID 5507) e de seus mutantes L55P,
V30M e T119M (Liu et al., 2000b, 2002).
A preponderância de variantes associadas a PAF em um lado do sanduíche de folhas-
β, em conjunto os dados de troca D-H, sugere que mudanças conformacionais que envolvam
as fitas β C, B, E e F, bem como o deslocamento de toda essa folha-β, podem estar associadas
a exposição de ligações de hidrogênio e porções hidrofóbicas, causadoras da amiloidogênese
da TTR (Liu et al., 2000b).
Uma vez que a PAF é causada por diversos mutantes pontuais da TTR (Saraiva et al.,
1988), vários estudos surgiram na tentativa de determinar que modificações estruturais (se
existentes) essas substituições de aminoácidos provocariam na molécula da proteína e se tais
modificações seriam suficientes para explicar o processo de agregação. A estrutura do V30M-
TTR, variante mais frequente em pacientes de FAP de Portugal e do Brasil (Palácios et al.,
1999), revelou que a cadeia lateral do resíduo mutado forçava o distanciamento das folhas-β
38
dos monômeros em 1 Å da posição original, causando distorções nos canais de ligação do
hormônio T4, o que causaria uma afinidade diminuída por este ligante (Hamilton et al., 1993).
No entanto, não foram encontradas maiores modificações na estrutura que pudessem explicar
a maior amiloidogenicidade do V30M-TTR.
Apesar de mais de 30 destes mutantes já terem suas estruturas resolvidas por
cristalografia de raio-X, em vários tampões e ligantes, uma análise comparativa de 23
estruturas de TTR (incluindo 3 estruturas de WT-TTR, 3 mutantes não amiloidogênicos, 7
mutantes amiloidogênicos e 9 estruturas de TTR complexada com ligantes), mostrou que as
diferenças entre estas diversas estruturas não geravam modificações estruturais que
provinham uma explicação sobre a maior taxa de agregação dos mutantes amiloidogênicos
(Hörnberg et al., 2000). Entretanto, diversos estudos mostram que tais mutações pontuais
poderiam afetar a estabilidade da estrutura quaternária da TTR, aumentando a constante de
dissociação, o que facilitaria a agregação via população do intermediário monomérico
amiloidogênico (McCutchen et al., 1995; Miroy et al., 1996; Quintas et al., 1997a; Lashuel et
al., 1998).
A primeira estrutura cristalográfica de TTR a mostrar diferenças importantes foi a do
mutante I84S, cristalizado em pH 4,0 (Pasquato et al., 2007). Nesta condição, este variante
apresenta a α-hélice desfeita em uma de suas subunidades, além de mudanças na conformação
da volta que conecta a α-hélice à fita-β F (Pasquato et al., 2007). Estudos de RMN com um
peptídio mutante com a sequência da região da α-hélice, I84S.TTR (c71-93), já apontava para
essa mudança conformacional (Wilce et al., 1999). Interessantemente, a estrutura da WT-TTR
em pH 4,6 e a estrutura desse mesmo mutante em pH neutro não apresentaram tais alterações
(Pasquato et al., 2007).
Obteve-se então a estrutura da WT-TTR em pH 4,0 e 3,5 (Palaninathan et al., 2008).
Em pH 4,0, a estrutura da WT-TTR possui a subunidade A muito pouco perturbada,
39
apresentando estrutura muito similar a da subunidade A da WT-TTR em pH 7.4. Em contraste,
sua subunidade B exibe mudanças conformacionais significativas na α-hélice, bem como nas
voltas que a conectam às fitas-β E e F. Os resíduos ácidos nessa região, Glu72, Asp74, Glu89
e Glu92, sofrem mudanças conformacionais que induzem o movimento de toda a região,
fazendo com que os resíduos Lis70, Lis76, His88 e His90 orientem suas cadeias laterais em
direção àqueles resíduos ácidos. Em pH 3,5, esta região encontra-se totalmente desorganizada
(Palaninathan et al., 2008), sugerindo que ela pode estar envolvida de alguma forma na
amiloidogênese induzida pelo pH ácido.
A hipótese da agregação ocorrer em lisosomas ácidos nunca se confirmou, uma vez
que nenhum estudo mostrou co-localização de TTR ou fibras amiloides de TTR com tais
compartimentos celulares e a maioria das análises de cortes histológicos mostram acúmulos
de fibras de TTR extracelulares (Sousa and Saraiva, 2003). Levantamos a questão de que um
ligante adicional poderia ter participação na alteração estrutural que a TTR precisa sofrer para
ter sua fibrilação disparada.
1.3.6 Íons Metálicos nas Amiloidoses
Já foi demonstrada a interação de íons metálicos com diversas proteínas
amiloidogênicas, o que leva à formação de fibras amiloides Por exemplo, o peptídio Aβ tem
sua agregação promovida pela a ligação de Cu
2+
, Zn
2+
ou Fe
3+
(Atwood et al., 1998). Além
disso, as espécies reativas de oxigênio geradas devido à redução de íons Cu
2+
ou Fe
3+
pelo Aβ
poderiam ter um papel na patologia do Mal de Alzheimer (Huang et al., 1999a, b; Opazo et
al., 2002).
Similarmente, vários cátions divalentes induzem a formação de fibras amiloides da
α-Sinucleína, proteína associada ao Mal de Parkinson (Uversky et al., 2001; Rasia et al.,
40
2005). Tais cátions também induzem a agregação patogênica da imunoglobulina de cadeia
leve (Davis et al., 2001) e modulam a agregação e neurotoxidade da proteína do príon humano
(Brown et al., 1997; Jobling et al., 2001; Bocharova et al., 2005).
Estudos estruturais e de dinâmica molecular conduzidos com a β2-microglobulina,
proteína causadora da amiloidose associada à hemodiálise, mostraram que íons Cu
2+
catalizariam uma alteração conformacional e estabilizariam oligômeros pré-fibrilares desta
proteína (Eakin et al., 2006; Deng et al., 2006).
O mecanismo pelo qual a ligação de íons metálicos promovem a formação de fibras
amiloides ainda não é compreendido. A importância das interações entre proteínas
amiloidogênicas e íons metálicos têm sido cada vez mais evidenciada, uma vez que a
quelação específica desses íons ligados a tais proteínas por moléculas desenhadas com base
em suas estruturas tridimensionais poderá vir a ser usado como uma abordagem terapêutica
(Molina-Holgado et al., 2007).
1.3.7 A TTR Humana como Metaloproteína
Existem muitas evidencias de que a TTR interage com cátions divalentes, entre eles
o Zn
2+
e o Cu
2+
(Okunewick et al., 1963; Scott and Bradwell, 1983). Se considerarmos a faixa
de concentração de Zn
2+
no plasma de indivíduos saudáveis, de 12 a 15 μM (Gibson et al.,
2008) e a constante de dissociação aparente da TTR por Zn
2+
de 1 μM em pH 7,5 (Wilkinson-
White and Easterbrook-Smith, 2007), a TTR e o Zn
2+
estariam ligados no plasma em
condições fisiológicas. O Zn
2+
pode disparar a agregação da TTR e agentes quelantes, como o
EDTA, podem dissolver essas fibras in vitro (Herbert and Martone, 1993; Martone and
Herbert, 1993; Wilkinson-White and Easterbrook-Smith, 2007). O Zn
2+
também já foi
encontrado como sendo o principal mineral a compor fibras amiloides oculares extraídas de
41
pacientes portadores da mutação V30M (Susuki et al., 2008). Em conjunto, esses dados
sugerem um papel constitutivo para o Zn
2+
na TTR, da proteína circulante até a fibra amiloide
1.4 Fibras Amiloides Funcionais
Tem se mostrado um crescente aumento no número de proteínas sem envolvimento
em amiloidoses que possuem a capacidade de formar agregados com características de fibras
amiloides (Uversky et al., 2001; Stefani and Dobson, 2003). Em teoria, todas as proteínas
poderiam formar fibras amiloides, sendo essa uma característica química intrínseca primitiva
de todos os polímeros de aminoácidos. As estruturas proteicas teriam evoluído no sentido de
evitar a exposição de ligações de hidrogênio de cadeia principal e regiões hidrofóbicas ao
solvente, tornando desfavoráveis as interações interproteicas de cadeia principal e favoráveis
as interações intraproteicas do estado enovelado (Dobson, 1999, 2003).
Diversos organismos, durante seu ciclo de vida normal, convertem alguma proteína
solúvel em fibras amiloides, aproveitando a arquitetura dessas fibras para o desempenho de
funções celulares não patológicas. Como exemplo, podemos citar as fibras formadas pela
proteína curli usadas pela bactéria E. coli, para colonizar superfícies inertes e mediar a ligação
a proteínas hospedeiras (Chapman et al., 2002) e a classe de proteínas chaplinas, da bactéria
filamentar Streptomyces coelicolor, formadoras de fibras amiloides que cooperam no
desenvolvimento de sua hifa aérea (Claessen et al., 2003). Em mamíferos, foi descoberto que
o domínio intraluminal da proteína de membrana Pmel17, quando clivado por uma pró-
proteína convertase, tem a capacidade de formar fibras amiloides sobre as quais se depositam
os grânulos de melanina na produção deste pigmento dentro dos melanosomos (Berson et al.,
2003).
Em todos esses sistemas, a formação de fibras amiloides é altamente regulada. A
42
formação de fibras amiloides pela curli, por exemplo, envolve diversas outras proteínas,
incluindo uma proteína formadora de um núcleo, sobre o qual a proteína curli forma a fibra
amiloide (Chapman et al., 2002).
43
2 Objetivos
Diversas evidências apontam para a interação da TTR humana com Zn
2+
no seu
ambiente biológico (Okunewick et al., 1963; Scott and Bradwell, 1983). Mostrou-se também
que a formação in vitro de amiloides de TTR pode ser disparado por Zn
2+
ou Cu
2+
(Wilkinson-
White and Easterbrook-Smith, 2007; Martone and Herbert, 1993) e agentes quelantes, como o
EDTA, poderiam romper tais fibras (Herbert and Martone, 1993). Além disso, o Zn
2+
é o
principal componente mineral de depósitos amiloides oculares extraído de pacientes
portadores de PAF, causada pela mutação V30M-TTR (Susuki et al., 2008).
Em conjunto, essas evidências relatadas na literatura sugerem que a ligação de Zn
2+
pela TTR poderia causar mudanças estruturais, representando passo importante na
amiloidogênese desta proteína. A dissecção de tais modificações estruturais, suas implicações
para a fisiologia, amiloidogênese e estabilidade termodinâmica da TTR são os principais
objetivos deste estudo.
A determinação estrutural da M-TTR complexada com Zn
2+
foi nosso principal
objetivo, uma vez que poderíamos identificar não só os sítios de ligação de Zn
2+
na proteína,
bem como identificar as alterações estruturais que pudessem explicar sua amiloidogênese.
Uma vez obtidas essas estruturas em diversos pHs, objetivamos corroborar a correta posição
dos sítios na WT-TTR e seus resíduos formadores, bem como a hierarquia de ligação do Zn
2+
e a confirmação das modificações estruturais que encontramos no complexo Zn
2+
:M-TTR.
Além disso, objetivamos saber se os sítios de ligação de Zn
2+
e as mudanças estruturais
associadas ocorreriam também em solução, eliminando a possibilidade de ligação inespecífica
do íon Zn
2+
. Objetivamos também confirmar a especificidade dos sítios ligadores para o cátion
divalente em questão.
Confirmada a hipótese de que a WT-TTR também ligava Zn
2+
em solução e esta
44
ligação causava modificações estruturais em sua α-hélice, região ligadora da holo-RBP,
decidimos caracterizar as consequências dessas mudanças sobre a afinidade da WT-TTR pela
holo-RBP em solução.
Tivemos como objetivo também analisarmos se a ligação de Zn
2+
na WT-TTR
causava mudanças em seu estado oligomérico, bem como mudanças no equilíbrio
tetrâmeros/monômero, em solução. Além disso, investigamos se a mudança estrutural
encontrada nos complexos Zn
2+
:M-TTR mudaria sua estabilidade estrutural.
45
3 Materiais e Métodos
3.1 Reagentes e Tampões
Todos os reagentes usados são de grau analítico. Água MilliQ foi obtida de um
sistema de purificação MilliPore. Todas as soluções e tampões foram filtrados em membrana
de éster de celulose de poro de 0.22 μM. Estoques de ureia foram preparados no tampão com
o pH desejado e sua concentração foi aferida por medidas de índice de refração.
3.2 Expressão e Purificação de TTR
Os plasmídios com as construções da WT-TTR e do M-TTR (Jiang et al., 2001)
foram gentilmente cedidos pelo Prof. Jeffery W. Kelly, do Department of Chemistry and
Skaggs Institute for Chemical Biology, The Scripps Research Institute.
A TTR foi purificada de fontes recombinantes seguindo protocolos previamente
descritos (Lashuel et al., 1999) com modificações. Em resumo, bactérias competentes E. coli,
cepa BL21 DE3, foram transformadas com método de choque térmico com o plasmídio em
questão e plaqueadas em LB sólido com ampicilina (100 μg/mL); um pré-inóculo de 10 ml de
LB com ampicilina (100 μg/mL) foi inoculado com uma colônia crescida por uma noite em
LB sólido; com o volume desse pré-inóculo, 1 L de meio LB adicionado de ampicilina (100
μg/mL) foi inoculado e mantido a 37 °C a 200 rpm de agitação até DO
600nm
de 0,8 a 1,0 (UA);
a expressão da TTR em questão foi então induzida com 1 mM IPTG; após 12 h de
crescimento pós-indução a 37 °C a 200 rpm de agitação, as bactérias foram colhidas por
centrifugação a 7000 x g por 10 min, ressuspensas em tampão TrisHCl 20 mM, EDTA 1 mM,
NaCl 500 mM, pH 7,5, e lisadas por um ciclo de congelamento-descongelamento seguido de
sonicação em gelo (20 min, 80% de potência, 50% de pulso); após a remoção dos debris por
46
centrifugação (10 min a 7000 x g), a TTR em questão foi precipitada por centrifugação (10
min a 8000 rpm) em sulfato de amônio 2 vezes (50% e 90%) e o pellet foi resuspenso em 10
ml de tampão TrisHCl 25 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0; a suspensão foi dessalinizada por diálise
contra o mesmo tampão durante a noite (membrana de diálise com corte de peso molecular
em 15 kDa para a WT-TTR e 3,5 kDa para o M-TTR) e carregada em uma coluna com 20 ml
de resina Source 30Q (GE Lifescience) equilibrada com TrisHCl 25 mM, EDTA 1 mM, NaCl
50 mM, pH 8,0; a coluna foi lavada para a remoção das frações não ligadas e a TTR em
questão eluída com um gradiente linear de 50 mM até 350 mM de NaCl de 30 ml; o eluído foi
concentrado em um sistema Centricon Plus 20 a 5 kDa (Amicon Bioseparations) e o passo
final de purificação foi completado por uma cromatografia de exclusão por tamanho em uma
coluna SD-75 (GE Lifescience) equilibrada com Tris 10 mM, KCl 50 mM, NaN
3
5 mM, pH
7,5. A pureza foi aferida por SDS-PAGE e por cromatografia líquida de exclusão por tamanho
(CLET). O estoque de proteína teve sua concentração determinada espectrofotometricamente
usando-se coeficiente de extinção molar em 280 nm (ε
280nm
) para o M-TTR de 19400 M
-1
cm
-1
e
para a WT-TTR ε
280nm
= 77600 M
-1
cm
-1
(Jiang et al., 2001).
3.3 Cristalização e Coleta de Dados Cristalográficos
A varredura de condições de cristalização do M-TTR foi feita pelo método de matriz
esparsa, usando kits de cristalização da Hampton Research (Hampton, USA). Tipicamente, 2
μL de M-TTR (~250 μM) em Tris 10 mM, KCl 50 mM, NaN
3
5 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5 foi
misturado com 1 µL de cada solução do kit em lamínula siliconada. A gota foi equilibrada
contra 300 μL da solução, usando-se o método de gota suspensa e difusão de vapor, em
temperatura de 20 °C.
As condições que geraram precipitados cristalinos ou microcristais foram refinadas
47
variando-se as concentrações dos componentes dos tampões, porém não obtivemos cristais de
boa qualidade. Usando os componentes dos tampões que geraram precipitados cristalinos ou
microcristais, preparamos nossos próprios tampões, porém compondo condições diferentes
dos encontrados nos kits de cristalização da Hampton Research (Hampton, USA).
Novamente, obtivemos condições que ainda não eram ideais, mas geravam cristais maiores e
mais perfeitos. Refinamos novamente, variando as concentrações dos componentes dos
tampões e os cristais que melhor difrataram cresceram em aproximadamente 5 dias em 200
mM de acetato de zinco, 100 mM citrato de sódio, 2.0 M sulfato de amônio.
Interessantemente, os cristais crescem da mesma forma, velocidade e qualidade,
independentemente do pH, o que nos permitiu determinar estruturas em diversos pHs, com a
mesma composição do tampão de cristalização, apenas ajustando o pH ao valor desejado.
A mistura dos tampões de cristalização e do tampão de estoque da TTR, nas mesmas
proporções usadas nos ensaios de cristalização, não apontaram variações de pH, conforme
medimos usando um peagômetro de eletrodo, de precisão.
Tentativas de obter-se cristais usando-se outros cátions divalentes, como o Cu
2+
,
Mg
2+
, Mn
2+
e Ca
2+
, seja na forma de cloretos, acetatos ou sulfatos, também foram feitas,
usando-se tampões com os outros componentes semelhantes ou diversos aos que geraram os
cristais do complexo Zn
2+
:M-TTR, mas todas mostraram-se infrutíferas. Mostrou-se
infrutífero também a localização de íons Cu
2+
ou Mn
2+
em estruturas determinadas da WT-
TTR a partir de cristais crescidos na ausência de qualquer metal, porém incubados por 3h em
CuSO
4
ou MnCl
2
Além disso, essas estruturas não apresentaram as modificações estruturais
encontradas no complexo Zn
2+
:M-TTR.
Os cristais foram tratados rapidamente com a solução de cristalização suplementada
de 10% de glicerol (v/v), de modo a evitar a formação de gelo, e foram resfriado em
nitrogênio líquido. Cristais complexados com compostos farmacológicos foram obtidos
48
incubando-se os mesmos em seu tampão de cristalização suplementado com o composto em
questão, por mais de 3 h, anteriormente ao tratamento com glicerol.
Imagens de difração de raio-X foram coletadas de cristais únicos, a 100 K, na linha
MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas, Brasil (Guimarães et
al., 2009). Para todos os cristais usamos passos de 1° de rotação para cada imagem, coletando
a rotação total de 360°, com comprimento de onda de 1,458 Å, com exceção do cristal de pH
4,6, que foi coletado com 1,305 Å. Todos os cristais foram coletados com tempo de exposição
dos cristais ao feixe de raio-X inferior a 40 min. As intensidades de difração foram medidas
usando-se um detector MarMosaic 225 e o software proprietário (Mar Research, USA). As
imagens foram indexadas e processadas com Mosflm v. 7.0.3 (Leslie, 1992) e escalonadas
com SCALA v. 3.2.25 (Evans, 1993). Todas as estruturas do M-TTR resolvidas pertencem ao
grupo espacial P2
1
.
3.3.1 Solução, Refinamento e Qualidade das Estruturas
Resolvemos o complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6 por substituição molecular usando
MolRep v. 10.2.9 (Vagin and Teplyakov, 1997) usando como modelo de busca a estrutura de
WT-TTR (PDB ID 1F41 (Hörnberg et al., 2000)).
Após tentativas com diversas estruturas de TTR, conseguimos o faseamento por
substituição molecular, usando apenas um monômero da estrutura da WT-TTR (cadeia A),
com apenas os átomos de Cβ das cadeias laterais, sem água. Esse monômero foi refinado e,
em seguida, geramos um dímero por operação de simetria com ele e refizemos o faseamento
por substituição molecular. O dímero obtido sofreu o mesmo processo de refinamento e
geramos, novamente, um tetrâmero por operação de simetria com ele. Refizemos o
faseamento por substituição molecular, resultando em solução bem definida para as 4
49
subunidades do tetrâmero na unidade assimétrica. Só então reconstruímos as cadeias laterais
dos resíduos. As demais estruturas em outros pHs foram resolvidas com a estrutura do
Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6 como modelo de busca.
As estruturas foram então refinadas usando-se o programa Refmac5 v. 5.5.0059
(Murshudov et al., 1997). O refinamento em espaço real foi conduzido por inspeção visual de
ambos mapas de densidade eletrônica e do modelo, usando-se o programa COOT v. 0.5, 64
bits (Emsley and Cowtan, 2004), também usado para a adição das moléculas de água.
Um resumo dos parâmetros dos cristais e das estatísticas de refinamento estão
apresentados na Tabela 3. As coordenadas atômicas e fatores de estrutura foram depositados
no PDB (www.pdb.org) (Berman et al., 2000) e possuem os IDs 3DGD (pH 4,6), 3DID
(pH4,6 incubado), 3GPS (pH 5,5), 3GRB (pH 6,5), 3GRG (pH 7,5).
A validação estrutural dos modelos foi feita com o programa SFCHECK v. 7.2.02
(Vaguine et al., 1999), mostrando que os ângulos de diedro estão em sua maioria em regiões
permitidas do mapa de Ramachandran, como detalhado na Tabela 3. Mapas de omissão foram
gerados usando-se o programa Omit v. 11-APR-1997 (Bhat, 1988; Vellieux and Dijkstra,
1997) da suite de programas CCP4 v. 6.0.2 (Collaborative Computational Project, 1994).
Alinhamentos estruturais foram obtidos usando-se o algoritmo de sobreposição de estruturas
secundárias (SSM) (Krissinel and Henrick, 2004) embutido no programa COOT v. 0.5, 64 bits
(Emsley and Cowtan, 2004) ou no programa PyMol v. 1.0r2 (DeLano, 2008). Todas as figuras
das estruturas cristalográficas foram geradas usando-se o programa PyMol v. 1.0r2 (DeLano,
2008). Diagramas de estrutura secundária foram calculados com o programa SFCHECK v.
7.2.02 (Vaguine et al., 1999). Estatísticas dos processamentos, refinamentos e validações das
estruturas estão mostradas na Tabela 3.
50
Tabela 3- Sumário das estatísticas dos dados de difração e refinamento.
Os valores em parênteses são para a camada de mais alta resolução.
Dados
cristalográficos
pH 7,5 6,5 5,5 4,6 4,6 incubado
4,6 +
resveratrol
PDB ID 3GRG 3GRB 3GPS 3DGD 3DID -
Grupo espacial P2
1
P2
1
P2
1
P2
1
P2
1
P2
1
Parâmetros
da unidade de
célula
a= 47,30Å
b= 61,92Å
c= 83,32Å
a= 47,34Å
b= 62,19Å
c= 83,80Å
a= 47,26Å
b= 61,61Å
c= 83,49Å
a= 46,95Å
b= 60,69Å
c= 82,98Å
a= 48,67Å
b= 63,47Å
c= 86,03Å
a= 48,31Å
b= 62,26Å
c= 83,47Å
Processamento e
refinamento
Reflexões totais 150500 397441 251787 92482 48268 571791
Reflexões únicas 36135 46093 43051 33121 48266 45115
Reflexões
R-free
1892 2882 2697 5424 2711 2076
Completeza
99,81 %
(100 %)
99,47 %
(99,16 %)
99,18 %
(100 %)
97,2 %
(94,7%)
96,1 %
(93,7 %)
99,8 %
(100 %)
Faixa de resolução
24,72 - 1,90 Å
(1,94 - 1,90 Å)
26,00 - 1,75Å
(1,79 - 1,75Å)
28,92 - 1,78Å
(1,82 - 1,78Å)
19,37 - 1,38Å
(1,42 - 1,38Å)
86,07 - 1,78Å
(1,78 - 1,88Å)
26,00 - 1,80 Å
(1,80 - 1,90 Å)
Rmerge 0,063 (0,394) 0,063 (0,383) 0,061 (0,488) 0,056 (0,774) 0,052 (0,506) 0,082 (0,332)
Fator R (%) 19,38 (22,3) 20,6 (22,8) 20,5 (22,6) 15,9 (23,3) 18,1 (25,0) 18,0 (22,0)
R livre (%) 25,4 (30,2) 25,9 (32,5) 25,3 (34,3) 20,2 (34,6) 24,2 (34,0) 25,0 (27,0)
I / sigma(I) 13,7 (2,7) 21,0 (4,0) 8,1 (3,0) 7,1 (1,0) 7,1 (1,5) 20,2 (5,1)
B fator geral 35,28 Ų 30,39 Ų 28,89 Ų 25,1 Ų 43,5 Ų 24,27 Ų
Moléculas de água 229 326 261 392 299 -
rmsd da
geometria ideal
Comprimento das
ligações (Å)
0,018 0,015 0,021 0,030 0,035 -
Ângulo das
ligações (°)
1,89 1,67 1,90 2,63 2,165 -
Mais favoráveis no
Ramachandran 96,5 % 98,7 % 96,4 % 99,2 % 98 % -
Permitidas no
Ramachandran 3,5 % 1,3 % 2,7 % 0,8 % 1,8 % -
Não permitidas no
Ramachandran 0 % 0 % 0,9 % 0 % 0,2 % -
51
Para o cálculo de área acessível ao solvente de estruturas cristalográficas usamos o
servidor PISA-EBI (Krissinel and Henrick, 2007) (http://www.ebi.ac.uk/msd-
srv/prot_int/pistart.html).
3.4 Espectroscopia de RMN
Todos os experimentos de RMN foram realizados a 25 °C em um espectrômetro
Bruker Avance III 800 MHz equipado com uma sonda de gradiente pulsátil de
1
H[
13
C/
15
N]
(Bruker Corp., GmbH). Foi usado o assinalamento sequencial já depositado no BMRB
(www.bmrb.wisc.edu) (Ulrich et al., 2008) para a WT-TTR (BMRB ID 5507) (Liu et al.,
2002).
Espectros de coerência heteronuclear de quantum simples, com relaxação transversa
otimizada (em inglês heteronuclear single quantum coherence - transverse relaxation
optimized spectroscopy, HSQC-TROSY) da WT-TTR totalmente marcada com H
2
com N
15
(WT-TTR H
2
/N
15
) foram adquiridos usando-se a sequência de pulsos 2D de correlação H
1
/X
via TROSY, usando sensibilidade aumentada (sequência TROSYETF3GPSI, versão-avance
de 14/12/2007, Bruker Corp., GmbH) (Rance et al., 1999). Por se tratar de um HSQC, X é
N
15
. Nesses experimentos usamos para a dimensão do H
1
8 transientes, com resolução de 1024
pontos e para a do N
15
, 16 transientes e resolução de 256 pontos.
Inicialmente, 3 amostras foram medidas, sendo elas WT-TTR H
2
/N
15
25 μM, em
MES 25 mM, KCl 50 mM, pH 5.7 (tampão usado no assinalamento), MES 25 mM, KCl 50
mM, pH 6,5 e TrisD 25 mM, KCl 50 mM, pH 7,5 (tampão usado nos experimentos
subsequentes) foram medidas e os assinalamentos foram ajustados, quando necessário, uma
vez que a diferença entre os pHs por si só poderia causar perturbações nos deslocamentos
químicos (PDQ).
Os experimentos de titulação foram realizados adicionando-se 5 μL de um estoque de
52
6,1 mM de ZnCl
2
em uma amostra de WT-TTR H
2
/N
15
100 μM em TrisD 25 mM, KCl 50
mM, 7,5 (300 μL) até as concentrações de ZnCl
2
de 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 900
μM. Após a medida da amostra com 900 μM de ZnCl
2
, 5 μL de um estoque de 66 mM de
EDTA foi adicionado, alcançando-se a concentração de 1 mM de EDTA. Todos os espectros
foram processados usando-se o pacote de programas TopSpin (Bruker Corp., GmbH) e
analisados usando-se o programa Computer Aided Resonance Assignment (CARA) (Keller,
2004).
As PDQ foram calculadas usando-se as ressonâncias da WT-TTR na ausência de Zn
2+
e em pH 7,5 como referência e a equação 1 (Ghosh et al., 2004),
PDQ=
δNH−δNH
ref
2
δN−δN
ref
10
2
equação 1
onde δX
ref
são as frequências de ressonância do espectro de referência e δX dos
espectros em cada concentração de ZnCl
2
, de cada próton amídico (H) ou nitrogênio amídico
(N).
3.5 Espalhamento de Raio-X a Baixo Ângulo (SAXS)
Dados de espalhamento de raio-X a baixo ângulo (em inglês small angle X ray
scattering, SAXS) foram coletados a 25 °C na linha SAXS2 no Laboratório Nacional de Luz
Síncrotron (LNLS), Campinas, Brasil (Polikarpov et al., 1998) com comprimento de onda de
1,488 Å e as intensidades de difração foram registradas usando um detector MARCCD (Mar
Research, USA). As curvas de espalhamento das soluções de proteínas e tampões foram
coletadas em várias imagens sucessivas de 300 s cada. O processamento dos dados incluiu a
normalização da corrente da CCD na ausência de luz, dados de espalhamento da intensidade
53
de transmissão do feixe incidente, correção para a intensidade do feixe, absorção da amostra,
concentração da amostra e subtração do branco. Medidas foram feitas usando-se dois lotes
diferentes de proteína. O estado oligomérico da WT-TTR nas medidas de SAXS foi
confirmado com a extrapolação dos valores de intensidade de espalhamento no ângulo zero
(I
0
) e normalizados pela concentração da amostra, C, de acordo com I
0
/C, usando-se como
referência um padrão de lisozima de clara de ovo (Mylonas and Svergun, 2007).
3.6 Análise de Correlação Posicional
Um alinhamento de múltiplas sequências de homólogos de TTR foi obtida do
servidor PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/) (Finn et al., 2008). Após a remoção de sequências
redundantes e fragmentos, um total de 262 sequências foram usadas para se verificar a
ocorrência de intercorrelação entre os resíduos componentes dos sítios de ligação de Zn
2+
, um
indicador de possível coevolução dos sítios (Lockless and Ranganathan, 1999).
3.7 Interação Entre holo-RBP e TTR
O ensaio de titulação da interação da WT-TTR com a holo-RBP foi realizado a 25 °C
por medidas de anisotropia de fluorescência, como descrito anteriormente (Zanotti et al.,
2008), em um espectrofluorímetro ISS-PC1 (ISS Inc, Champaign, IL), equipado com
polarizadores Glan-Thompson. Usou-se o retinol ligado a RBP como sonda fluorescente,
excitando-se a 330 nm e colendo-se a emissão de fluorescência a 460 nm. Os experimentos
foram realizados em tampão Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5, 400 nM de holo-RBP e
concentrações variadas de ZnCl
2
. As constantes de dissociação foram calculadas como
previamente descrito (Lima and Silva, 2004), de acordo com a equação 2
54
α=(((n*TTR
t
+RBP
t
+Kd)-((((n*TTR
t
+RBP
t
+Kd)2)-(4*RBP
t
*n*TTR
t
))0.5))/(2*RBP
t
));
equação 2
onde α é a fração de complexo holo-RBP:WT-TTR formada, n é o número de sítios
de ligação de holo-RBP presentes na molécula de WT-TTR, TTR
t
é a concentração total de
WT-TTR, RBP
t
é a concentração total de holo-RBP usada no experimento e o K
d
é a constante
de dissociação. A fração de complexo holo-RBP:WT-TTR foi calculada de acordo com a
equação 3
α = (A
obs
- A
i
) / (A
f
- A
i
)
equação 3
onde A
obs
é a medida de anisotropia em um dado TTR
t
, e A
i
e A
f
são os limites
iniciais e finais de valor de anisotropia.
3.8 Medidas de Fluorescência Intrínseca do Triptofano
A fluorescência intrínseca do triptofano foi medida a 25 °C em um
espectrofluorímetro JASCO FP-6300 (Jasco Inc., Japan), com excitação em 280 nm e a
emissão varrida de 300 a 400 nm, com fenda de emissão e excitação de 2,5 nm, amostragem a
cada 1 nm e 5 acumulações. A coleta dos espectros e análise foi realizada com programa
Spectra Manager v 1.53.04, proprietário da JASCO (Jasco Inc., Japan). A intensidade da
emissão de fluorescência foi calculada a partir da área sobre a curva do gráfico de
fluorescência e normalizada usando-se como 100% a fluorescência de uma amostra em estado
nativo (WT-TTR em pH 7,5), com a concentração compatível com o experimento.
Os dados obtidos da supressão de fluorescência do Trp da WT-TTR foram analisados
usando-se a equação 4
F = F
0
- (ΔF [M]) / (K
d(app)
+ [M])
equação 4
55
onde F é a medida de intensidade de fluorescência, F
0
é a intensidade de
fluorescência inicial, ΔF é a variação máxima de intensidade de fluorescência, [M] é a
concentração do íon metálico e K
d(app)
é a constante de dissociação aparente (Jackson et al.,
2001).
Para os experimentos de titulação, usamos amostras de WT-TTR 3,5 μM, em
TrisHCl 50 mM, KCl 100 mM ou MES 50 mM, KCl 100 mM, dependendo do pH desejado.
O experimento foi realizado adicionando-se 1 μL de um estoque de 6 mM de ZnCl
2
, MgCl
2
,
CaCl
2
, ou MnCl
2
na amostra de WT-TTR (300 μL) até as concentrações do íon desejadas.
Após a medida da amostra com a maior concentração do íon, 5 μL de um estoque de 66 mM
de EDTA foi adicionado, alcançando-se a concentração de 1 mM de EDTA.
Os espectros dos experimentos de desnaturação por ureia foram analisados e
comparados pela quantificação do centro de massa (CM), que é o valor de comprimento de
onda onde o espectro poder ser divido em duas regiões de áreas iguais. O CM, em cada
concentração de ureia, é diretamente proporcional à energia de emissão, sendo calculado de
acordo com a equação 5
CM = (Σ F
i
WL) / Σ F
i
equação 5
onde F
i
é a intensidade de fluorescência emitida em um comprimento de onda WL,
sendo o somatório realizado a partir de valores apreciáveis de F.
Para os experimentos de desnaturação, usamos amostras de M-TTR 3,5 μM, em
TrisHCl 50 mM, KCl 100 mM pH 7,5. O experimento foi realizado incubando-se por 24 h
diferentes amostras em diferentes concentrações de ureia e adicionando-se 1 μL de um
estoque de 6 mM de ZnCl
2
, na amostra até as concentrações do íon desejadas. Após a medida
56
da amostra com a maior concentração do íon, 5 μL de um estoque de 66mM de EDTA foi
adicionado, alcançando-se a concentração de 1 mM de EDTA. Os resultados foram analisados
e os valores dos parâmetros termodinâmicos calculados pelo método da extrapolação linear
(Santoro and Bolen, 1988), comumente usado para o cálculo de energia livre associada a
conversão de uma proteína do estado nativo para o desenovelado, na ausência de desnaturante
(ΔG
unf
). Em resumo, o método consiste em converter-se as constantes de equilíbrio
observadas, calculadas na região de transição dos dados de energia livre (ΔG
obsd
), plotando-se
esses dados em função da concentração do desnaturante e extrapolando-se os dados para a
concentração zero de desnaturante. Isso pode ser expresso matematicamente pela equação 6,
ΔG
obsd
= ΔG
unf
+ m
G
[D]
equação 6
onde ΔG
unf
, o intercepto, é a variação de energia livre de Gibbs para o
desenovelamento na ausência do desnaturante M, m
G
é a inclinação da curva dos dados em
função da concentração do desnaturante e ΔG
obsd
é descrito pela equação 7
ΔG
obsd
= - RT ln K
obsd
equação 7
onde K
obsd
representa a razão de equilíbrio entre as espécies desnaturadas/nativas em
dada concentração de desnaturante.
3.9 Medidas de Fluorescência da Sonda 1,8-ANS
As medidas de fluorescência da sonda 1,8-ANS (1-sulfonato-8-(1')anilinonaftaleno)
(Figura 15) foram realizadas em um espectrofluorímetro de placa SpectraMax M5 (Molecular
Devices Division, MDS Inc., Toronto, Canada) com excitação em 360 nm e emissão em 480
nm.
57
Figura 15- Estrutura química da sonda 1,8-ANS
Para a ligação do 1,8-ANS a WT-TTR, nós consideramos o equilíbrio reversível de
dois estados, entre os seguintes componentes:
TTR + 2 L [TTR:L
2
]
Assim, consideramos a constante de dissociação K
d
da reação acima de acordo com a
equação 8,
K
d
= ( P L
n
) / PL
2
equação 8
onde P é a concentração molar da TTR livre, L é a concentração molar do 1,8-ANS
livre, PL
2
é a concentração molar do complexo formado entre a TTR e o 1,8-ANS e “n” é um
parâmetro que leva em conta o número de sítios de ligação, cooperatividade e diferenças no
rendimento quântico do composto ligado em diferentes sítios.
A formação do complexo PL
2
se relaciona a intensidade de fluorescência pela
equação 9
PL
2
= Pt * α
equação 9
onde α é descrito pela equação 10
α = fração de TTR (ou 1,8-ANS) associado = (F
obs
– A) / (B – A)
equação 10
onde F
obs
é a intensidade de fluorescência observada, A e B são os limites inferiores e
58
superiores de intensidade de fluorescência assintóticos obtidos do ajuste das curvas.
Para um modelo de ligação interativo, segue a equação 11
F
obs
= A + (B – A)*(( Kd
n
+ Lt
n
+ Pt) – ((Kd
n
+ Lt
n
+ Pt)
2
– 4*Lt
n
*Pt)
0.5
)/(2*Pt)
equação 11
onde Lt é a concentração total de 1,8-ANS e Pt, o número total de sítios de ligação
de 1,8-ANS na TTR (2 por molécula), corresponde à soma das concentrações de TTR livre
(P) e ligada (PL
2
). O parâmetro “n” de cooperatividade torna-se unitário caso um modelo de
dois sítios de ligação independentes seja aplicado. A equação 11 foi ajustada aos dados por
regressão não-linear usando o programa SigmaPlot (version 10.0, Jandel Scientific Co).
3.10 Cromatografia Líquida de Exclusão por Tamanho (CLET)
A Cromatografia Líquida de Exclusão por Tamanho (CLET) foi realizada em uma
coluna TSK3000 (Tosoh Bioscience) a 25 °C. Amostras de 3,5 μM WT-TTR foram injetadas
na coluna pré equilibrada com tampão Tris 50 mM, KCl 100 mM, pH 7.5 e a concentração
indicada de ZnCl
2
. Os tetrâmeros e monômeros de TTR eluem respectivamente em 7,5 min e
9 min (Quintas et al., 1997b), confirmado com a calibração prévia da coluna com padrões de
ribonuclease A e albumina.
59
4 Resultados e Discussão
Parte dos resultados desta tese encontram-se no manuscrito mostrado abaixo.
4.1 Manuscrito “Novel Zn
2+
-binding sites in human transthyretin: implications for
amyloidogenesis and retinol binding protein recognition”
Leonardo de Castro Palmieri
a,1
, Luis Mauricio T. R. Lima
b,1,2
, Juliana Batista
Barros Freire
a
, Lucas Bleicher
c
, Igor Polikarpov
c
, Fabio C. L. Almeida
a,d
and Debora
Foguel
a,1,2
a
Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Biologia Estrutural, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil;
b
Faculdade de Farmácia, Departamento de Medicamentos,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil;
c
Instituto de Física de São Carlos,
Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, 13560-970, Brazil;
d
Centro Nacional de
Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas Jiri Jonas, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, 21941-590, Brazil.
1
L.C.P and L.M.T.R.L contributed equally to this work.
2
To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]j.br or
Author Contributions
60
L.C.P, J.B.B and L.M.T.L performed research and analyzed data; L.B and I.P.
analyzed MSA data; F.C.L.A. performed NMR research and analyzed data and D.F. and
L.M.T.L analyzed data and wrote the paper.
Abbreviations: FAP, familial amyloidotic polyneuropathy; holo-RBP, holo-retinol
bind protein; MSA, multiple sequence alignement; TTR, transthyretin; ZBS, zinc-binding site.
Data deposition: The atomic coordinates have been deposited in the Protein Data
Bank, www.pdb.org (PDB ID codes 3GRG; 3GRB; 3GPS; 3DGD).
61
Abstract
Human transthyretin (TTR) is a homotetrameric protein involved in several amyloidoses. Zn
2+
enhances TTR aggregation in vitro, and is a component of ex vivo TTR amyloid fibrils. We
report the first crystal structure of human TTR in complex with Zn
2+
at pH 4.6 - 7.5. All four
structures reveal three tetra-coordinated Zn
2+
-binding sites (ZBS 1-3) per monomer, plus a
fourth site (ZBS4) involving amino acid residues from a symmetry-related tetramer that is not
visible in solution by NMR. Zn
2+
binding perturbs loop E-α-helix-loop F, the region involved
in holo-retinol binding protein (holo-RBP) recognition; TTR affinity for holo-RBP decreases
~five-fold in the presence of Zn
2+
. Interestingly, this same region is disrupted in the crystal
structure of the amyloidogenic intermediate of TTR formed at acidic pH in the absence of
Zn
2+
. These data highlight structural and functional roles of Zn
2+
in TTR-related amyloidoses,
as well as in holo-RBP recognition and vitamin A homeostasis.
62
Human transthyretin (TTR) is a 55 kDa, β-sheet-rich homotetramer found in serum and
cerebrospinal fluid. It participates in thyroxine (T4) transport (1) and in the binding of holo
retinol binding protein (holo-RBP), and is believed to reduce the glomerular filtration of the
relatively small (21 kDa) holo-RBP (2). In humans, TTR and its more than 100 variants are
involved in amyloid diseases such as senile systemic amyloidosis (SSA) and familial
amyloidotic polyneuropathy (FAP), among others (3). In SSA, deposits composed of the wild-
type TTR (WT-TTR) are found in the heart. Autopsies show that at least 25% of all
individuals over 80 years have such deposits, which prove fatal in 10% of these cases (4).
FAP is caused by the accumulation of amyloid fibrils formed by TTR mutants, mainly around
basal membranes of Schwann cells, inside the endoneurium of peripheral nerves (5, 6). Onset
typically occurs in the third decade, with a life expectancy of approximately 10 years (6).
Several drugs are being tested against TTR amyloidosis(3), but so far, the only treatment for
FAP is liver transplantation (7).
A widely accepted hypothesis for TTR amyloidogenesis presupposes tetramer
dissociation into a misfolded monomer which aggregates, giving rise to amyloid fibrils. In
vitro these events can be triggered by mild acidification (pH 5.0 - 4.0), although amyloid
formation takes several days for completion (8). In vivo these events might occur inside
lysosomes during TTR turnover (8). Recently, J.W. Kelly and coworkers described an
engineered monomer of TTR (M-TTR) in which the introduction of two bulky amino acid
residues in the protein interface (Phe87Met/Leu110Met) avoids oligomerization into dimers
or tetramers (9). M-TTR aggregates in solution in the same pH range as WT-TTR, although
on a time scale of minutes since tetramer dissociation into monomers is the rate-limiting step
in TTR aggregation (9).
Monomers (A-D) of TTR are composed of eight anti-parallel β-strands (A-H) arranged
as a β-barrel (Greek key) with a short α-helix following strand E. The dimer (AB) is held
63
together by hydrogen bonds involving the H and F strands located along the edge of each
monomer. Two dimers (AB, CD) associate back-to-back via hydrophobic interactions between
residues of loops connecting strands AB and GH (10)
(Fig. 1A, B).
Numerous studies with WT and variants of TTR have attempted to unravel the
structural rearrangements that precede amyloid formation (10-13). Only minor global and
local changes are observed in most of these structures (10), providing no conclusive structural
clues for the possible mechanisms behind TTR structural conversion and amyloidogenesis.
Recently, the X-ray structures of WT-TTR and two variants, I84A and I84S, under acidic
conditions (and without Zn
2+
) revealed structural disorder in the loop E-α-helix-loop F region
in relation to the structure solved at pH 7.0, indicating a possible participation of this segment
of the protein in fibril formation (14, 15).
Five decades of evidence support the interaction of TTR with Zn
2+
in the biological
milieu but nothing is known of the accompanying structural correlates (16, 17). The
observation that concentrations of Zn
2+
in the plasma of healthy individuals are approximately
12-15 μM (18), while the Zn
2+
:TTR apparent dissociation constant (Kd
app
) is 1 μM (19),
suggests that TTR may circulate as a complex with Zn
2+
in plasma. High concentrations of
Zn
2+
and Cu
2+
can trigger TTR amyloid formation in vitro (19, 20), and chelating agents
disrupt these amyloid structures (21). Zn
2+
was found to be the main mineral in ex vivo ocular
amyloid deposits from FAP patients bearing the V30M mutation (22). Altogether, these data
suggest that binding of Zn
2+
(or Cu
2+
) might induce structural changes that lead to TTR
amyloidogenesis. The aims of this study are to dissect the structural modifications caused by
Zn
2+
binding and to explore their implications for TTR-mediated physiological recognition of
holo-RBP and TTR amyloidogenesis.
RESULTS
64
Crystallographic determination of Zn
2+
-binding sites in TTR
We solved the crystal structures of M-TTR in complex with Zn
2+
at pH 7.5, 6.5, 5.5 and 4.6 at
resolutions of 1.9, 1.7, 1.8 and 1.3 Å, respectively, with Cα r.m.s.d. among them less than 0.4
Å (Fig. 1A). Our attempts to solve the structure of WT-TTR in the presence of Zn
2+
failed due
to the fragility of the crystals. M-TTR, which at the concentrations used crystallizes as a
tetramer (9), forms robust crystals in the presence of Zn
2+
.
The Zn
2+
:M-TTR complex presented the typical fold of TTR at all pH values (Fig. 1A,
B). However, despite their close resemblance, the structural alignment of Zn
2+
:M-TTR with
Zn
2+
-free M-TTR shows large conformational differences in both secondary and tertiary
structures, achieving 5 Å in some segments of the monomer (Fig. 1C). Fluctuating
conformations in the loops connecting β-strands BC, DE and FG were previously described
(10). The more prominent structural modifications, apart from local changes in residues
involved in Zn
2+
coordination, is the disruption of the loop E-α-helix-loop F region (Fig. 1B,
C and Fig. 3A), which now forms an extended segment. These modifications occur in all four
subunits of the tetramer and at all four pH values (Fig. 1A, C).
Zn
2+
ions were coordinated at three Zn
2+
-binding sites (ZBS 1 to 3) in each monomer.
All three sites displayed coordination spheres based on tight interactions of Zn
2+
with the
imidazole nitrogen from His, a thiol group from Cys, and carboxylic acid groups from Glu or
Asp side chains (Fig. 2). These elements are typical of selective Zn
2+
-binding sites in proteins
(23). In fact, the structures revealed the presence of a forth ZBS (ZBS 4), which involves
residues from the symmetry-related tetramer as explained bellow, and thus we assumed it was
generated by crystallographic contacts (Fig. 1B and Fig. 2). NMR experiments confirmed the
inexistence of ZBS4 in solution.
In ZBS1, Zn
2+
is coordinated by the thiol group of Cys10 (Sγ atom), the imidazole
nitrogen from His56 (Nδ1 atom) and two water molecules (Fig. 2, upper left structure). In
65
ZBS2, Zn
2+
is bound to the imidazole nitrogens of His88 (Nε2 atom) and His90 (Nδ1 atom),
the carboxylic acid group of Glu92 side chain (Oε1 atom) and one water molecule (Fig. 2,
upper right structure). ZBS1 and ZBS2 presented this organization at all pH values.
ZBS3 consist of one water molecule, the imidazole nitrogen of His31 (Nδ1 or Nε2
atom), the carboxylic acid group of Asp74 (Oδ1 or Oδ2 atom) and the carboxylic acid group
of Glu72 ([Oε1 or Oε2 atom], Fig. 2, lower left structure). However, in some subunits of
structures obtained at pH 7.5, 6.5, 5.5 and the structure obtained at pH 4.6, Glu62
replaces
either Glu72 or the water molecule (ZBS3’, Fig. 2, lower middle structure). In ZBS3, His31,
Glu72 and Asp74 are from the same asymmetric unit (H31
AU
, E72
AU
, D74
AU
, Fig. 2, lower
middle structure). In ZBS3’, His31 and Asp74 are both from the same monomer in the
asymmetric unit (H31
AU
and D74
AU
, Fig. 2, lower middle structure), while Glu62 is from a
symmetry-related TTR molecule (E62
symm
, Fig. 2, lower middle structure). In solution, ZBS3
might be composed of His31
AU
, Asp72
AU
, Glu74
AU
and solvated accordingly.
ZBS4 is composed of two residues from the symmetry-related tetramer (H31
symm
and
D74
symm
, Fig. 2, lower right structure), while the carboxylic acid group of the Glu61 side
chain is from the asymmetric unit (E61
AU
, Fig. 2, lower right structure). Because it includes
two residues from a symmetry-related tetramer, ZBS4 is unlikely to exist as a functional Zn
2+
-
binding site in TTR in solution, since stable Zn
2+
coordination typically involves at least two
amino acid interactions from the same molecule (23). Moreover, ZBS4 is occupied in all four
monomers exclusively at pH 4.6, being vacant in some of the monomers of the pH 5.5, 6.5
and 7.5 structures.
Analysis of multiple sequence alignments (MSA) (24, 25) for all non-redundant, non-
fragmented TTR sequences obtained from Protein Families database (Pfam,
http://pfam.sanger.ac.uk/) (26) shows that the amino acids that we identify with each ZBS are
among the least conserved regions of TTR (e.g., Cys in position 10 is present in only 12.9%
66
of sequences, while His occupies position 56 in only 14.8% ) (Table S1).
An analysis of the amino acids occupying two distinct positions in a given protein
family, if these residues vary and are not completely conserved, tells us if for some reason,
normally related to the structure or function of the protein, these two positions coevolved
(25). Most of the residues that form ZBS1, ZBS2 and ZBS3 tend to appear simultaneously for
a subset of the sequences (e.g., all sequences presenting a Cys in position 10 have His in
positions 56 and 88, and most of them have an Asp in position 74) (Table S1). Interestingly,
the TTR sequences which simultaneously exhibit these correlated positions are predominantly
from mammals (Fig. S1).
Structural details of Zn
2+
:TTR complex
In addition to the local changes in the amino acids that coordinate Zn
2+
, the binding of Zn
2+
to
the M-TTR structure causes striking structural modifications compared to the Zn
2+
-free state.
The loops connecting β-strand E, the α-helix and β-strand F, a region involved in the
recognition of holo-RBP by TTR (2), are those that are most perturbed by Zn
2+
binding (Fig.
3A). ZBS2 and ZBS3 flank this region.
The Zn
2+
:M-TTR structure shows a complete disruption of the α-helix into a
disordered loop comprising residues 74-90, but with a well defined electron-density map (Fig.
S2). In the crystallographic structure of WT-TTR at pH 3.5 in the absence of Zn
2+
, the electron
density of the amino acids from this region is completely disordered and not visible in the
electron density map (15). In our structures, the side chain of Asp74 turns toward His31,
forming ZBS3. The His90 side chain turns toward the consolidated ZBS2, accompanied by an
almost 180° flipping of the His88 side chain, resulting in a novel, extended loop (Fig. 3A) in
all four subunits and at all pH values. Various main-chain hydrogen bonds of the α-helix are
disrupted (Thr75→Ile73, Tyr78→Asp74, Trp79→Thr75, Lys80→Lys76, Ala81→Ser77,
67
arrows point from donator to acceptors), leading to loss of the α-helix stability and structure.
Affinity of WT-TTR for holo-RBP in the absence and presence of Zn
2+
The crystal structure of the TTR-holo-RBP complex indicates that surface loops 63-67 and
92-98 of RBP penetrate into a crevice formed by the arrangement of three monomers in the
tetramer of TTR (2). Point mutations in the α-helix of TTR lead to a decrease in its affinity for
holo-RBP (27). Thus, we envisioned that the structural changes induced by Zn
2+
binding in the
region delimited by ZBS2 and ZBS3 could disrupt this topological complementarity between
TTR and holo-RBP. Indeed, the extended segment of TTR resulting from the α-helix
unwinding upon Zn
2+
binding clashes with RBP (Fig. S3), a conformational change that might
compromise the affinity of TTR for holo-RBP.
To address this issue, the affinities of WT-TTR for holo-RBP in the absence and
presence of Zn
2+
were measured using fluorescence anisotropy (Fig. 3B). In the absence of
Zn
2+
, the dissociation constant of holo-RBP:WT-TTR complex was 227 ± 43 nM, in
agreement with previous measurements (27, 28). In the presence of Zn
2+
, the binding curves
shift to higher WT-TTR concentrations (Fig. 3B and inset), indicating a decrease in affinity of
WT-TTR for holo-RBP. The dissociation constants obtained in the presence of 15 μM and 50
μM Zn
2+
were 566 ± 105 nM and 1,000 ± 223 nM, respectively (± s.d.). Size-exclusion
chromatography demonstrates that the oligomeric state of TTR is not affected by the
interaction with Zn
2+
, as indicated by the prevalence of tetramers at Zn
2+
concentrations as
high as 100 μM (Fig. 3C). This rules out the possibility that the decrease in the affinity of
TTR for holo-RBP is due to TTR aggregation or changes in tetramer-monomer equilibrium.
Mapping the Zn
2+
-binding sites by TROSY-HSQC NMR measurements
To confirm that the Zn
2+
binding sites and the structural changes involving the α-helix
68
previously observed in the crystal structure of M-TTR are also present in solution and in the
tetrameric WT-TTR, a stepwise titration of Zn
2+
was performed using TROSY-HSQC
experiments (
2
H and
15
N-labeled WT-TTR) (Fig. 4 and Fig. S4). These experiments also
allowed for the hierarchical identification of each ZBS in WT-TTR and the accompanying
structural modifications evoked by Zn
2+
binding to each one. Significant chemical-shift
perturbations (CSP) were observed in several regions of WT-TTR upon stepwise additions of
Zn
2+
.
As seen in Fig. 4A, incubating 100 μM WT-TTR (equivalent to 400 μM monomeric
subunits) with 100 μM Zn
2+
leads to significant changes in Cys10 and in the adjacent amino
acid residues of β-strand A, suggesting that ZBS1 is likely the first Zn
2+
-binding site to be
filled. Unfortunately, the resonance of His56, the other coordinating residue of ZBS1, was not
localized in the spectrum (red bar) at any concentration of Zn
2+
added. A comparison with
panels of Fig. 4B and C shows that 100 μM Zn
2+
is not enough to saturate ZBS1.
Increasing the concentration of Zn
2+
to 200 μM (Fig. 4B) eliminates the resonance
signal from Gly57 (blue bar), adjacent to His56. This might be related to Zn
2+
binding to
His56. At this concentration of Zn
2+
, a prominent CSP occurs in the resonance of Glu92, a
residue that contributes to ZBS2. Some of the residues of β-strands G and H are also
perturbed, reflecting the fact that β-strands A, G and H are anchored to each other by a
network of backbone hydrogen bonds (29). With a further increase to 300 μM Zn
2+
(Fig. 4C),
the saturation of ZBS2 is nearly complete (see residues His88 and Glu92) (Fig. 4C). His90 is
only slightly perturbed at higher Zn
2+
concentrations (Fig. 4D, E). These data suggest that
ZBS2 is the second Zn
2+
-binding site to be occupied in solution.
At 400 μM Zn
2+
(Fig. 4D), significant changes appear in ZBS3 and in the residues in
its vicinity, resulting in CSPs for Ile73, Thr75, Lys76 and Trp79, a segment that encompasses
the end of β-strand E and the subsequent α-helix. The resonance signals from the other
69
coordinating residues of ZBS3, Asp74 and Glu72, vanish from the spectrum along with Val71
(blue bars), indicating the induction of conformational change due to Zn
2+
binding. Altogether,
these modifications suggest a rearrangement in the vicinity of ZBS2 and ZBS3, in order to
allow a proper spatial orientation for Zn
2+
coordination. All these binding events lead to a
reorganization of the secondary structure elements of TTR, which includes the unwinding of
the α-helix, resulting in the consolidation of the Zn
2+
:TTR complex, as observed in the
crystallographic structure (Fig. 3). Interestingly, the resonance from Glu62, a possible
component of ZBS3, does not undergo CSP even at the higher concentrations of Zn
2+
(Fig.
4E). In the crystallographic structures, as mentioned, ZBS3 was formed by Glu72
AU
at higher
pH values or by Glu62
symm
at pH 4.6 (Fig. 2, ZBS3 and ZBS3’); the latter resonance is
perturbed and vanishes from the spectrum. Thus, we postulate that ZBS3 in solution
comprises residues His31, Glu72, Asp74 and one water molecule.
At 900 μM Zn
2+
(Fig. 4E), CSPs propagate throughout the whole WT-TTR structure.
Nevertheless, the resonance of Glu61, which contributes to ZBS4, does not undergo
perturbation, reinforcing the idea that ZBS4, which involves residues from a symmetry-
related subunit, cannot be formed stably in solution. The reversibility of all structural changes
induced by Zn
2+
binding was confirmed by the addition of 1 mM EDTA, a condition that was
found to restore the original values of chemical shifts of the Zn
2+
-free protein (Fig. 4F).
DISCUSSION
The first human TTR crystallographic structure (PDB ID 2PAB (30)) revealed metal
coordination involving Cys10 and His56, residues from ZBS1, since the thiol group of Cys10
underwent mercurization due to treatment with heavy metal for isomorphous derivatization.
The crystals were then washed with chelating agent, thus the other ZBS were not detected
(30). Occupation of ZBS1 alone does not induce any global conformational changes, nor any
70
modification in the α-helix or the EF loops, as presented here (Fig. 1 and 3). ZBS1, the first
site to be filled in low Zn
2+
concentrations, might be permanently occupied in circulating
TTR. This occupancy could prevent TTR aggregation by committing Cys10 to the task of
Zn
2+
coordination and thereby avoiding SH-modifications (such as TTR-Cys, TTR-GSH, and
TTR-CysGly), which have been implicated in TTR destabilization and amyloidogenesis in
vitro (31).
In solution, Zn
2+
binding to ZBS2 and ZBS3 results in a large structural rearrangement
in the EF loops and the α-helix, which unwinds to form an extended segment (Fig. 3). These
structural rearrangements involve the holo-RBP binding region in TTR, leading to a decrease
in holo-RBP:WT-TTR affinity(27) (Fig. S3; Fig. 3A, B). The demonstration of the reversible
interplay between structured and unstructured α-helix and EF loop suggests that variations in
Zn
2+
homeostasis in the TTR biological milieu might participate in the modulation of the
holo-RBP:TTR balance and consequently influence the fate of these proteins. This
modulation was accomplished by the co-evolution of the residues that form ZBS in TTR. The
data presented here suggest that Zn
2+
behaves as a heterotropic, allosteric modulator of TTR
interaction with one of its molecular partners, and thus may lead to changes in the protein’s
inherent functional and pathological features (28).
Most holo-RBP circulates in serum bound to TTR (2), resulting in an interaction with
mutual benefits such as the avoidance of RBP clearance, the stabilization of the retinol:RBP
complex (2), and prevention of TTR dissociation and amyloid formation (28). Any imbalance
in Zn
2+
homeostasis could perturb this interaction, canceling the benefits of holo-RBP:TTR
association and, as a consequence, creating vitamin A imbalance and TTR amyloidogenesis
(19, 22, 28). Interventions to control metal homeostasis in addition to proteostasis (32) might
constitute a useful strategy to prevent or ameliorate TTR amyloidoses.
Interestingly, a recently solved structure of TTR at acidic pH in the absence of metal
71
ions, a condition that triggers TTR aggregation due to the formation of a misfolded
amyloidogenic intermediate, also displayed α-helix unwinding (15). Thus, we suggest that
Zn
2+
binding to TTR at neutral pH induces structural modifications that resemble those
observed under acidic conditions, where TTR forms amyloid fibrils. Zn
2+
binding might
trigger TTR aggregation by disrupting the α-helix and exposing a segment of the protein rich
in hydrophobic and aromatic residues (78YWKALGISF87 - Tyr78, Trp79 and Phe87), which
may form hydrophobic and π-π stacking interaction with adjacent protein molecules, leading
to aggregation. ZBS4, which involves amino acids from adjacent subunits, might recruit more
Zn
2+
, which could then bind and stabilize the quaternary structure of the amyloid fibril.
In FAP patients, the amyloid deposits of TTR variants are found mainly around basal
membranes of Schwann cells, inside the endoneurium of peripheral nerves (5, 6). The myelin
sheath accumulates a high concentration of Zn
2+
(about 50 μM) (33). Thus, the high
concentration of Zn
2+
in the region in conjunction with the enhanced tetramer instability
caused by FAP mutations (34, 35), might explain the tropism of TTR amyloids to this specific
site. Mutations predispose tetramer to dissociation and Zn
2+
might trigger amyloidosis by
occupying its binding sites in TTR, provoking the structural rearrangement described here.
The same scenario could be envisioned in the vitreous humor of the eye, where the
concentration of Zn
2+
is also high (2.4 ± 0.95 mg/L; 36 ± 14 μM) (36), and is associated with
Zn
2+
rich TTR amyloid deposits (22) that cause vitreous opacity (37).
Evidence for the importance of metal ions in amyloidogenic diseases such as
Alzheimer’s (38) and Parkinson’s disease (39) is growing (40-42); it may be that metal
binding is a common feature of amyloids. Thus, a better characterization of the role and
control of metal homeostasis in such pathologies could emerge as a general therapeutic
approach to ameliorate amyloid diseases (43).
72
METHODS
Proteins. Recombinant human WT-TTR and M-TTR were expressed and purified as
previously described (44), using plasmids kindly provided by Dr. Jeffery W. Kelly (9) (The
Scripps Institute, San Diego, California, USA). Retinol binding protein (RBP4) was obtained
from Phoenix Pharmaceuticals (Burlingame, CA, USA).
X-ray crystallography. For crystallographic experiments, we used the double mutant
Phe87Met/Leu110Met (M-TTR), a construct which displays a decreased self-association
constant compared to WT-TTR (9). M-TTR crystals were obtained by the hanging-drop
vapor-diffusion method at 20 °C. Crystals were grown in approximately 5 days in 200 mM
zinc acetate, 100 mM sodium citrate, 2.0 M ammonium sulfate, adjusted to the desired pH. X-
ray diffraction images were collected in steps of 1° of rotation per frame from single crystals
cooled at 100 K. We used a wavelength of 1.458 Å (1.305 Å for the crystal obtained at pH
4.6, PDB ID 3DGD) at the MX2 beam line at LNLS (National Synchrotron Light Laboratory,
LNLS, Campinas, Brazil (45)) and diffraction intensities were measured using a MarMosaic
225 detector (MAR Research GmbH, Norderstedt, Germany). Images were indexed,
processed and integrated with Mosflm v. 7.0.3 (46). All M-TTR structures solved here belong
to space group P2
1
. We scaled experimental intensities, solved and refined the structure with
the CCP4 v. 6.0.2 suite (47). The complex was solved by molecular replacement, using
monomer A with only Cα and Cβ atoms of PDB ID 1F41 (10) as search model, resulting in a
solution for four monomers in the asymmetric unit. Model building and refinement were
performed with Coot v. 0.5 (48) and the CCP4 v. 6.0.2 suite (47). Water molecules were added
using Coot v. 0.5 (48).
Structural validation of the model performed with the CCP4 v. 6.0.2 suite (47) showed
that almost all dihedral angles are within the favored region (for 3GRG [pH 7.5], 97.4% of
residues are in favored regions, 2.0% are in allowed regions and 0.6% are in outlier regions;
73
for 3GRB [pH 6.5], 98.5% of residues are in favored regions, 1.5% are in allowed regions and
0.0% are in outlier regions; for 3GPS [pH 5.5], 97.3% of residues are in favored regions,
2.0% are in allowed regions and 0.7% are in outlier regions; for 3DGD [pH 4.6], 99.1% of
residues are in favored regions, 0.9% are in allowed regions and 0.0% are in outlier regions).
Omit maps were generated with the CCP4 v. 6.0.2 suite (47). All crystallographic figures were
generated with PyMol (49). Selected crystallographic parameters are found in Error:
Reference source not found.
Multiple sequence alignment and conservation analysis. A multiple sequence alignment
(MSA) for the TTR family was obtained from the Pfam server (26). After the elimination of
redundant and fragmented sequences, a total of 262 sequences remained. Overall site
conservation and site-dependent conservation were calculated using C++ routines designed
for statistical coupling analysis (SCA) (50).
NMR spectroscopy. All NMR experiments were performed at 25 °C on an 800 MHz
Bruker III Avance spectrometer equipped with a
1
H[
13
C/
15
N] pulsed-field gradient probe
(Bruker Corp., GmbH). Deposited sequential assignments of WT-TTR described elsewhere
(BMRB 5507) (51) were used with adjustments due to differences between pH used in
deposited assignment and pH used in our experiments. To adjust assignment, we collected
heteronuclear single-quantum coherence, transverse relaxation optimized spectroscopy
(HSQC-TROSY) spectra using samples of WT-TTR
2
H/
15
N (25 μM) at pH 5.7, 6.5 (buffer
MES 25 mM, KCl 50 mM, pH 5.7 or pH 6.5) and 7.5 (buffer TrisD 25 mM, KCl 50 mM, pH
7,5). We used the pulse sequence TROSYETF3GPSI, the Avance version 12142007 (Bruker
Corp., GmbH) (52), with 8 transients in
1
H dimension with 1024 points of resolution and 16
transients in
15
N dimension with 256 points of resolution.
For titration, the same HSQC-TROSY spectra were recorded using WT-TTR
2
H/
15
N
(100 μM) in deuterated TrisHCl 25 mM, KCl 50 mM, pH 7.5. Titration experiments were
74
performed by adding ZnCl
2
to the sample to attain final concentrations of 100, 200, 300, 400
and 900 μM Zn
2+
. To the sample with 900 μM ZnCl
2
, a small volume of a concentrated stock
of EDTA was added, reaching 1 mM EDTA. All spectra were processed using the TopSpin
suite (Bruker Corp., GmbH) and were analyzed using Computer Aided Resonance
Assignment (CARA) (53). CSP values were calculated using assignments of the zinc-free
WT-TTR spectrum as reference, and using Equation 1 (54):
( )
2
ref
2
ref
10
δNδN
δNHδNHCSP
−
+−=
where δX
ref
is the chemical shift of the reference spectrum and δX the chemical shift of the
spectrum at each concentration of ZnCl
2
for each amidic proton (NH) or amidic nitrogen (N).
We chose 0.025 ppm as a threshold for considering a CSP to be significant.
Holo-RBP interaction with TTR. Titrimetric assays of WT-TTR interaction with RBP bound
to retinol (holo-RBP) were performed by fluorescence anisotropy measurements in an ISS-
PC1 spectrofluorimeter (ISS Inc, Champaign, IL, USA) equipped with Glan-Thompson
polarizers in L-format as previously described (27). Excitation and emission wavelengths
were set at 330 and 460 nm, respectively. Assays were performed in 10 mM Tris-HCl, 150
mM NaCl, pH 7.2, 400 nM holo-RBP, and at the indicated ZnCl
2
concentrations. Dissociation
constants were calculated as previously described (55), according to Equation 2,
α=(((n*TTR
t
+RBP
t
+Kd)-((((n*TTR
t
+RBP
t
+Kd)2)-(4*RBP
t
*n*TTR
t
))0.5))/(2*RBP
t
));
where α is the fraction of holo-RBP:WT-TTR formed, TTR
t
is the total WT-TTR
concentration, Kd is the dissociation constant, n is the number of holo-RBP binding sites
present on the WT-TTR molecule and RBP
t
is the total RBP concentration used in the assay.
The fraction of holo-RBP:WT-TTR formed was calculated according to Equation 3,
α = (A
obs
- A
i
) / (A
f
-A
i
)
where A
obs
is the measured anisotropy at a given TTR
t
, and A
i
and A
f
are the limiting initial
75
and final anisotropies.
Size-exclusion chromatography (SEC). SEC was performed in a TSK3000 (Tosoh
Bioscience, Tokyo, Japan) column pre-equilibrated with 50 mM Tris-HCl, 100 mM KCl at pH
7.5 and with the indicated concentration of ZnCl
2
. Samples of 3.5 μM WT-TTR diluted in the
absence or in the presence of ZnCl
2
were injected into the column. TTR tetramers and
monomers eluted at 7.5 min and 9 min, respectively, as confirmed by previous column
calibrations with RNAse and bovine serum albumin as standards.
ACKNOWLEDGEMENT
We thank Emerson Gonçalves for technical assistance and Prof Martha Sorenson for her
careful and critical reading of this manuscript. This work was supported by CNPq (INCT -
Bioimagem e Biologia Estrutural), CAPES and FAPERJ to D.F. and to L.M.T.L.. L.C.P. was
supported by a fellowship from CNPq.
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80
Figure and legends
Fig. 1. Crystallographic structure of TTR complexed with Zn
2+
.
(A) Cα alignment of Zn
2+
:M-TTR structures at pH 7.5 (red), 6.5 (magenta), 5.5 (blue) and 4.6
(orange) (PDB IDs 3GRG, 3GRB, 3GPS and 3DGD, respectively). Note the nearly perfect
overlap among the four subunits (A-B) of the four structures. (B) Ribbon diagrams showing
the overall crystal structure of Zn
2+
-free M-TTR (green, PDB ID 1GKO (9)) aligned with the
Zn
2+
:M-TTR complex at pH 7.5 (red, PDB ID 3GRG). Zn
2+
ions are shown as gray spheres.
(C) Plots of the Cα r.m.s.d. for the four monomeric subunits (A-D) of M-TTR, comparing
equivalent subunits of Zn
2+
-free M-TTR (PDB ID 1GKO (9)) with Zn
2+
-bound M-TTR at pH
7.5 (PDB ID 3GRG). Major Zn
2+
-dependent differences are seen in the region of the α-helix
and F-loop (residues 74 to 90).
81
Fig. 2. Details of the three Zn
2+
-binding sites in TTR (ZBS 1-3), and a fourth site (ZBS4) that
is formed by amino acid residues from a symmetry-related tetramer.
Close-up views of Zn
2+
-binding sites and schematic diagrams of Zn
2+
coordination spheres.
ZBS1 is composed of Cys10, His56 and two water molecules (red spheres). ZBS2 is
composed of His88, His90, Glu92 and one water molecule. ZBS3 involves His31
AU
, Asp74
AU
and Glu72
AU
(at higher pH values) or Glu62
symm
(at pH4.6, ZBS3’). ZBS4 involves His31
symm
,
Asp74
symm
and Glu61
AU
in addition to water molecules (AU=asymmetric unit; symm=
symmetry- related unit). Meshes are electron densities from 2|F
obs
-F
calc
| omit maps contoured
at 1σ. The electron density displayed is limited to within 1.5 Å of the residues. Orange
residues in ZBS3 and ZBS4 represent residues from neighboring of symmetrically-related
molecules in the crystal. The Zn
2+
-binding sites described here present the canonical
constitution of other Zn
2+
-binding sites found in proteins (23).
82
Fig. 3. A close-up view of the loop E-loop F region flanked by ZBS2 and ZBS3 shows major
structural modifications when Zn
2+
is bound.
(A) The Zn
2+
-free structure is shown in green and the Zn
2+
-bound structure in red. Note the
unwinding of the α-helix, which results in the formation of an extended loop. Residues in pink
are those that undergo major reorientation upon Zn
2+
binding. Zn
2+
atoms are shown as gray
spheres. (B) Zn
2+
binding to WT-TTR decreases its affinity for holo-RBP. Isothermal holo-
RBP:WT-TTR binding assays performed by measuring anisotropy changes that take place
upon TTR binding to holo-RBP in the absence (●) or in the presence of 15 µM ZnCl
2
(▼) and
50 µM ZnCl
2
(■). Data are normalized to fraction of holo-RBP:TTR complex formed. The Kd
values (inset, error bars show ± s.d.) were calculated as described in Methods. (C) Size-
exclusion chromatography demonstrates that WT-TTR remains a tetramer upon Zn
2+
binding.
The elution profiles of WT-TTR without (black line) and in the presence of 20 µM (red line)
and 100 µM (green line) ZnCl
2
are shown. T = elution time of tetrameric TTR; M = elution
time of monomeric TTR.
83
Fig. 4. Mapping Zn
2+
binding to TTR by TROSY-NMR measurements.
The chemical-shift perturbations (CSP) in the NMR spectrum of fully
15
N-
2
H labeled WT-
TTR (100 µM) were measured at different concentrations of ZnCl
2
. CSP derived from
differences between a reference spectrum of WT-TTR in the absence of Zn
2+
and the spectra
in the presence of Zn
2+
were obtained for: (A) 100 µM ZnCl
2
; (B) 200 µM ZnCl
2
; (C) 300 µM
ZnCl
2
; (D) 400 µM ZnCl
2
; (E) 900 µM ZnCl
2
and (F) 900 µM ZnCl
2
+ 1 mM EDTA. Blue
84
bars are residues for which signal vanished during experiment; red bars are non-assigned
residues; gray bars are prolines. Images at right show where CSP occurred in WT-TTR at each
Zn
2+
concentration, marked in red in a ribbon representation of Zn
2+
:TTR (PDB ID 3GRG).
For clarity, only one out of the four monomers is marked. Zn
2+
atoms are represented as gray
spheres. CSP was calculated for each assigned main-chain amide using Equation 1. Dotted
lines are the threshold for considering a CSP significant (0.025 ppm).
SI figures, tables and legends
Table S1. Conservation and coupling among the residues in ZBS in the TTR multiple
sequence alignments (MSA).
ZBS1 ZBS2 ZBS3 ZBS4
Residue
and
Position
Conservation C10 H56 H88 H90 E92 H31 E72 D74 E62 E61
ZBS1
C10 12.9% X 87.2% 94.4% 75.0% 34.9% 36.4% 58.5% 45.5% 33.8% 40.0%
H56 14.8% 100% X 97.2% 75.0% 34.9% 45.5% 60.4% 47.0% 35.4% 45.0%
ZBS2
H88 13.7% 100% 89.7% X 75.0% 34.9% 36.4% 58.5% 45.5% 33.8% 40.0%
H90 3.0% 17.6% 15.4% 16.7% X 14.0% 27.3% 11.3% 9.1% 9.2% 15.0%
E92 16.3% 44.1% 38.5% 41.7% 75.0% X 45.5% 24.5% 25.8% 26.2% 20.0%
ZBS3
H31 4.2% 11.8% 12.8% 11.1% 37.5% 11.6% X 9.4% 7.6% 6.2% 12.5%
E72 20.2% 91.2% 82.1% 86.1% 75.0% 30.2% 45.5% X 53.0% 41.5% 42.5%
D74 11.8% 88.2% 79.5% 83.3% 75.0% 39.5% 45.5% 66.0% X 36.9% 47.5%
E62 24.7% 64.7% 59.0% 61.1% 75.0% 39.5% 36.5% 50.9% 36.4% X 27.5%
ZBS4 E61 15.2% 47.1% 46.2% 44.4% 75.0% 18.6% 45.5% 32.1% 28.8% 16.9% X
Column “Conservation” shows the percentage of conservation of each amino acid in the first
column for 262 TTR sequences in the MSA from the Protein Families database (Pfam,
http://pfam.sanger.ac.uk/) (26). Subsequent numbers show the frequency with wich the amino
acid at the top of a given column appears in the position indicated when another amino acid
appears in the position shown at the beginning of that row (e.g., 11.8% of the sequences that
have a cysteine in position 10 have a histidine in position 31, all sequences with a cysteine in
position 10 also have a histidine in position 56, and so on). Bold-italic numbers indicates
coupling among residues of same ZBS.
85
Fig. S1. MSA analysis of mammalian TTR sequences.
Multiple sequence alignments of mammalian TTR sequences showing increased conservation
of residues that form ZBS. Asterisks mark residues that form ZBS.
86
Fig. S2. Details of the loop E – α-helix – loop F region.
Close-up views of the loop E – α-helix – loop F region (residues 71–94) of subunit A of
Zn
2+
:M-TTR structures at pH 7.5, 6.5, 5.5 and 4.6 (PDB IDs 3GRG, 3GRB, 3GPS and 3DGD,
respectively). This is the same region shown in Fig. 3A. Mesh shows electron density from the
2|F
obs
-F
calc
| omit map contoured at 1σ. The electron densities displayed is limited to within 1.5
Å of the residues. Zn
2+
ions are shown as gray spheres and water molecules as red spheres.
Note the well-defined electron-density map in this region at all pH values.
87
Fig. S3. Holo-RBP:TTR interface showing interacting region with and without Zn
2+
.
(A) Zn
2+
:M-TTR (red) from PDB ID 3GRG is superimposed on Zn
2+
-free WT-TTR (green)
bound to holo-RBP (orange), showing the disrupted interface of holo-RBP recognition when
Zn
2+
is bound. Zinc-free WT-TTR (green) and holo-RBP (orange) are from PDB ID 1QAB
(56). (B) Close-up view of the interface region between holo-RBP and TTR. For orientation,
in the TTR structures Trp79 on the α-helix is blue and loops 63-67 and 92-98 of holo-RBP are
gray. Note that unwinding of the α-helix of TTR leads to a loss of complementarity and steric
exclusion of holo-RBP.
88
Fig. S4.
1
H–
15
N TROSY-HSQC spectra of the Zn
2+
-free (blue) and -bound (red) states of WT-
TTR.
WT-TTR
2
H/
15
N 100 μM in deuterated TrisHCl 25 mM, KCl 50 mM, pH 7.5 without ZnCl
2
(blue) and in presence of 400 μM ZnCl
2
(red). Note changes in position of various resonances
due to addition of Zn
2+
.
89
3GRG (pH7.5) 3GRB (pH6.5) 3GPS (pH5.5) 3DGD (pH4.6)
Data collection
Space group P2
1
P2
1
P2
1
P2
1
Cell dimensions
a, b, c (Å) 47.30, 61.92, 83.32 47.34, 62.19, 83.80 47.26, 61.61, 83.49 46.95, 60.69, 82.98
α, β, γ (°)
90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90
Resolution (Å) 24.72 - 1.90 (1.94 -
1.90 )
26.00 - 1.75 (1.79 -
1.75)
28.92 - 1.78 (1.82 -
1.78)
19.37 - 1.38 (1.42 -
1.38)
R
sym
or R
merge
0.063 (0.394) 0.063 (0.383) 0.061 (0.488) 0.056 (0.774)
I / σI 13.7 (2.7) 21.0 (4.0) 8.1 (3.0) 7.1 (1.0)
Completeness (%) 99.81 % (100 %) 99.47 % (99.16 %) 99.18 % (100 %) 97.2 % (94.7%)
Redundancy 3.7 (3.6) 7.2 (7.0) 5.2 (5.1) 7.1 (7.0)
Refinement
Resolution (Å) 1.90 1.75 1.78 1.38
No. reflections 41141 46093 43051 92475
R
work
/ R
free
19.38 / 25.4 20.6 / 25.9 20.5 / 25.3 15.9 / 20.2
No. atoms
Protein 3773 3790 3860 4200
Ligand/ion 52 52 60 87
Water 238 327 247 392
B-factors (Å
2
)
Protein 34.58 29.13 34.94 23.17
Zn
2+
ions 45.29 44.19 46.69 24.64
Water 34.58 41.97 53.32 39.70
R.m.s. deviations
Bond lengths (Å) 0.018 0.015 0.021 0.030
Bond angles (°)
1.89 1.67 1.90 2.63
Structures were determined using a single crystal at each pH. Values in parentheses are for highest-resolution
shell.
Table S2. Data collection and refinement statistics for Zn
2+
:M-TTR complexes at pH 7.5, 6.5,
5.5, 4.6.
Fim do manuscrito.
90
4.2 Caracterização dos Sítios de Ligação de Zn
2+
da TTR
No manuscrito acima apresentado descrevemos 4 sítios de ligação de Zn
2+
na
estrutura cristalográfica do M-TTR (ZBS1-4) em diversos pHs (7,5 - 4,6), bem como
mudanças estruturais na proteína provavelmente devido à ligação de tais íons. Vimos também
a hierarquia de ocupação dos sítios de ligação de Zn
2+
por RMN na WT-TTR, o passo a passo
das mudanças causadas pela ocupação dos sítios e suas implicações no reconhecimento da
holo-RBP, em solução.
Já foi descrito que a TTR apresenta supressão do sinal de fluorescência do triptofano
devido à ligação de Zn
2+
ou Cu
2+
(Wilkinson-White and Easterbrook-Smith, 2007) e, como
vimos, a ligação de Zn
2+
parece estar associada a disrupção da α-hélice, bem como
modificações nas voltas que a conectam as fitas-β E e F.
A TTR apresenta dois resíduos de Trp por monômero (posições 41 e 79),
convenientemente afastados um do outro na estrutura terciária, o que tem permitido o estudo
de seu enovelamento através do monitoramento da fluorescência intrínseca desses resíduos
(McCutchen et al., 1995; Fowler et al., 2007; Wilkinson-White and Easterbrook-Smith, 2007;
Hurshman Babbes et al., 2008).
O Trp79 encontra-se localizado na região da α-hélice e o Trp41 na volta próxima à
fita-β C. A análise de estruturas cristalográficas da WT-TTR (PDB IDS 2PAB, 1BMZ e 1F41)
(Blake et al., 1978; Peterson et al., 1998; Hörnberg et al., 2000), usando-se o servidor PISA-
EBI (Krissinel and Henrick, 2007), mostra que a área de acessibilidade ao solvente do Trp41
na WT-TTR é de cerca de 80Å
2
, consistente com um resíduo exposto. A fluorescência deste
Trp41 estaria, portanto, suprimida devido à interação com o solvente. Já o Trp79 apresenta
acessibilidade de apenas 3Ų, consistente com um resíduo protegido do solvente. Sua
exposição seria então acompanhada da supressão de fluorescência, que pode ser monitorada e
91
usada como um sensor da disrupção da região da volta E - α-hélice - volta F, em solução.
Considerando que a disrupção da estrutura nesta região pode estar associada à
ligação de cátions divalentes aos ZBS 2 e 3 que a flanqueiam, usamos a fluorescência
intrínseca do Trp para testarmos a especificidade desses dois sítios de ligação de Zn
2+
para
outros cátions divalentes, como o Mg
2+
, Ca
2+
, Mn
2+
. Para tal, realizamos uma titulação de
cloretos desses cátions divalentes sobre uma amostra de WT-TTR 3,5 μM, pH 7,5 e
monitoramos a variação da intensidade de emissão de fluorescência intrínseca dos Trp (Figura
16).
Figura 16- Especificidade dos sítios de ligação de Zn
2+
encontrados na TTR.
Efeito de supressão da fluorescência da WT-TTR 3,5 μM pela adição de sais de cloreto de Zn
2+
(□), Mg
2+
(◊),
Mn
2+
(∆) e Ca
2+
(○). A seta mostra o sinal de fluorescência após a adição de EDTA na amostra mais concentrada
da titulação de Zn
2+
.
Conforme vemos na Figura 16, a adição de concentrações crescentes de ZnCl
2
levou
a redução de ~25% da fluorescência intrínseca dos Trp. Esse mesmo efeito já foi descrito para
o Cu
2+
, cátion divalente tido como competidor pelos sítios de ligação de Zn
2+
(Wilkinson-
White and Easterbrook-Smith, 2007), não havendo, no entanto, dados estruturais sobre sua
ligação à TTR. Entretanto, os outros cátions divalentes que testamos, como o Mg
2+
, Ca
2+
,
Mn
2+
, não mostraram o mesmo efeito, sugerindo que os sítios sejam específicos à ligação de
92
Zn
2+
e Cu
2+
. A adição de EDTA sobre a amostra com a maior concentração de Zn
2+
promove o
retorno imediato dos valores de emissão de fluorescência, provavelmente devido à
restruturação da α-hélice.
Interessantemente, tentativas de obter-se cristais do M-TTR usando-se outros cátions
divalentes, como o Cu
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
e Ca
2+
, na forma de cloretos, acetatos ou sulfatos também
foram feitas, usando-se tampões de cristalização de composição semelhante ou diferente ao
que gerou os cristais do complexo Zn
2+
:M-TTR, mas todas mostraram-se infrutíferas,
levantando a hipótese de que o Zn
2+
pode estar envolvido em contatos cristalinos.
Os fatores associados à especificidade de sítios de ligação de metais em proteínas são
o raio iônico do metal, efeitos de ácido base de Pearson e a mudança na energia de
estabilização do campo ligante, sendo este último o mais importante no caso do Zn
2+
e do Cu
2+
(Hanas et al., 2005) e parecem estar relacionados a geometria do sítio de ligação.
Essa preferência por Zn
2+
e Cu
2+
pode estar associada à possível função fisiológica da
ligação de cátions divalentes na TTR. Como mostramos, a afinidade da WT-TTR pela holo-
RBP é diminuída pela ligação de Zn
2+
, uma vez que esta ligação parece promover mudanças
estruturais na região de reconhecimento entre essas duas proteínas (Figura 2). Está descrito na
literatura uma conexão entre a homeostase de Zn
2+
e de retinol, sendo desconhecida sua
origem molecular (Christian and West, 1998). A modulação da afinidade da TTR pela holo-
RBP, mediada pela ligação de Zn
2+
, como descrevemos aqui, poderia prover uma explicação
para esta conexão.
Como descrevemos, os sítios de ligação de Zn
2+
que flanqueiam a região da fita-β E -
α-hélice - fita-β F (ZBS 2 e 3) possuem cadeias laterais de histidina, ácido glutâmico e ácido
aspártico, envolvidas na coordenação do cátion divalente. O grupamento ácido carboxílico da
cadeia lateral do ácido glutâmico e do ácido aspártico possuem pKa de 4,25 e 3,65,
respectivamente, enquanto o grupamento imidazólico da histidina apresenta um pKa
93
macroscópico em torno de 6,0. A protonação/desprotonação do grupamento imidazólico das
histidinas envolvidas na ligação de Zn
2+
na TTR poderia alterar a afinidade dos sítios 2 e 3
pelo Zn
2+
, devido à mudança na carga resultante do anel pirrólico e, consequentemente,
modular o efeito de supressão na fluorescência do Trp da WT-TTR, efeito que parece estar
associado a desorganização da α-hélice.
Novamente, monitorando a variação da intensidade de emissão de fluorescência
intrínseca do Trp como um sensor da disrupção da região da volta E - α-hélice - volta F em
solução, realizamos uma titulação de ZnCl
2
sobre amostras de WT-TTR 3,5 μM em diversos
pHs, como mostrado na Figura 17.
Figura 17- Efeito do pH sobre a supressão da fluorescência do Trp pela adição de Zn
2+
na WT-TTR 3,5 μM.
As linhas cheias mostram o ajuste da equação 4, usada também para o cálculo das afinidades. O inserto mostra a
variação do K
d(app)
dos sítios ligadores de zinco, dependente de pH.
Como podemos notar na Figura 17, a variação de pH na faixa estudada afeta o efeito
de supressão de fluorescência pela adição de Zn
2+
à WT-TTR. A análise da Figura 17 mostra
que o efeito foi menos acentuado em pHs mais ácidos, para uma dada concentração do íon
metálico. O inserto da Figura 17 mostra que o K
d(app)
varia de 20 μM em pH 7,5 para 40 μM
em pH 6,5 e 80 μM em pH 5,5. Esses valores são diferentes dos já publicados (1μM em pH
94
7,4 e 5μM em pH 6,5) (Wilkinson-White and Easterbrook-Smith, 2007). Estas variações
podem estar associados a diferenças na concentração de proteína ou diferenças na técnica
experimental utilizada.
A protonação dos nitrogênios dos anéis imidazólicos causa mudança na carga
resultante das cadeias laterais das histidinas, que se tornam menos negativas, provavelmente
alterando a afinidade dos sítios que flanqueiam a região da fita-β E - α-hélice - fita-β F (ZBS
2 e 3).
O ZBS 2 é composto pela cadeia lateral da His88, His90 e Glu92 enquanto o ZBS3 é
composto pela cadeia lateral His31 e Asp74. A partir de nossos experimentos de supressão de
fluorescência, não podemos calcular a afinidade de cada sítio separadamente, sendo
impossível dizer se um ou ambos estão tendo suas afinidades reduzidas. Porém, neste caso, o
ZBS3 poderia ser o mais afetado, uma vez que as mudanças na carga da His31 deixaria como
único resíduo coordenante do íon Zn
2+
o Asp74, portanto, com reduzida estabilidade para
ocorrer em solução.
A modulação da afinidade dos sítios ligadores de Zn
2+
pela concentração de H
+
pode
estar relacionado à modulação da afinidade da TTR pela holo-RBP. O diferente balanço entre
a concentração de H
+
e Zn
2+
na superfície de diversas membranas basais poderia regular a
entrega da holo-RBP e a passagem do retinol para os seus receptores específicos, dependendo
do tecido em questão. Os resultados mostrados nesta tese, porém, não revelam demais dados
que apoiem essa proposição.
4.3 Estado Oligomérico do Complexo Zn
2+
:WT-TTR
Como descrito no manuscrito, a ligação de Zn
2+
à TTR causa diversas modificações
estruturais a esta. Esses dados, porém, não nos dão informações sobre o estado oligomérico e
95
distribuição dos tamanhos das partículas da proteína ligada com Zn
2+
em solução.
Para melhor analisarmos as diferenças entre o estado oligomérico e a distribuição dos
tamanhos das partículas da WT-TTR na ausência e na presença de Zn
2+
, em solução, bem para
corroborar nossos achados a respeito das mudanças estruturas ocorridas nesta proteína,
realizamos medidas de SAXS na ausência e na presença de concentrações crescentes de Zn
2+
em solução, como mostrado na Figura 18, Tabela 4 e Figura 19.
Figura 18- Avaliação da mudança no estado oligomérico da WT-TTR induzida por Zn
2+
.
O gráfico mostra a análise da função de distribuição de pares de distância dos dados de SAXS de amostras de
WT-TTR 36 μM na ausência (●) ou presença de 72 μM (●) e 145 μM (●) de ZnCl
2
.
Tabela 4- Sumário dos parâmetros I(q) e p(r) derivados dos dados de SAXS.
Parâmetro
a
sem Zn
2+
a
72 μM Zn
2+
a
145 μM Zn
2+ b
TTR sem metal
(1F41)
R
g
, Å:
I(q)
p(r)
26,0
25,47 ± 0,029
26,3
25,89 ± 0,016
26,5
25,69 ± 0,043
28,60
D
max
, Å 78 ± 2 78 ± 2 82 ± 2 71,44
a: Análise realizada com o programa Gnom (Svergun, 1992). b: Análise realizada com o programa Crysol
(Svergun et al., 1995). PDB ID 1F41 foi transformado em tetrâmero por operação de simetria para os cálculos.
96
Figura 19- Avaliação das mudanças na topologia da WT-TTR induzidas por Zn
2+
.
Análise das curvas de intensidade dos dados de SAXS de WT-TTR 36 μM na ausência (●) ou presença de 72 μM
(●) e 145 μM (●) de ZnCl
2
. O inserto mostra o gráfico da aproximação de Guinier.
As medidas de SAXS realizadas com amostras de WT-TTR na ausência de Zn
2+
,
como mostrado na Figura 18, onde vemos a função de distribuição de pares de distância,
revelam partículas com raio de giro (R
g
) de 26 Å, com um tamanho máximo (D
max
) de 78 Å.
Esses valores são compatíveis com os calculados para a estrutura cristalográfica da WT-TTR
na ausência de metais, que foram de 28 Å para o R
g
e de 71,44 Å para o D
max
, conforme
mostrado na Tabela 4.
A análise das curvas de espalhamento de raio-X destas mesmas amostras nos faz
notar que elas são semelhantes na faixa de baixa resolução das medidas (q < 0,15 Å
-1
),
condizente com os dados derivados da função de distribuição de pares de distância. Porém, a
faixa de alta resolução (q > 0,15 Å
-1
) mostra diferenças no perfil do sinal de espalhamento
entre a WT-TTR na ausência e na presença de Zn
2+
, como mostrado na Figura 19. Estas
diferenças são indicativas de mudanças na superfície da molécula, que podem estar associadas
às alterações estruturais causada pela ligação de Zn
2+
, aqui descritas por nós.
97
Além disso, a linearidade do gráfico da aproximação de Guinier (Guinier and
Fournet, 1955), como mostrado no inserto da Figura 19, indica que as amostras mantiveram-
se monodispersas durante as medidas. Todas as curvas do gráfico da aproximação de Guinier
possuem o mesmo coeficiente angular, i.e., a mesma inclinação, mais um indicativo da
semelhança entre os R
g
das amostras de WT-TTR na ausência e na presença de diferentes
concentrações de Zn
2+
.
Como podemos notar pelo formato da curva, a ligação de Zn
2+
na WT-TTR não
parece alterar o aspecto globular da proteína, havendo, na verdade, uma identidade próxima
entre o estado oligomérico da WT-TTR na ausência e na presença de Zn
2+
, em solução,
durante as medidas. Esses dados mostram também que os valores de R
g
e de D
max
entre as
amostras em solução e os calculados para a estrutura cristalográfica da WT-TTR são
compatíveis.
Juntamente com os resultados obtidos por CLET descritos no manuscrito, que
mostram que a ligação de íons de Zn
2+
à WT-TTR não altera o equilíbrio entre
monômeros/tetrâmeros, os dados de SAXS mostram que, em solução, não parece haver
desestabilização nas regiões das interfaces de oligomerização, e portanto não ocorre a
dissociação do tetrâmero, apesar das modificações estruturais associadas a ligação de Zn
2+
na
proteína.
As alterações estruturais que ocorrem na TTR devido a ligação de Zn
2+
parecerem
não afetar diretamente a interface que une os dímeros AB e CD (Figura 6). Esta região
também forma os canais hidrofóbicos de ligação do hormônio T4 (2 por tetrâmero) (Figura 1).
Mudanças sutis nesta interface, mesmo que não provoquem a dissociação do tetrâmero,
poderiam alterar a afinidade de ligantes a esses canais hidrofóbicos. Para testarmos essa
hipótese, avaliamos a ligação de 1,8-ANS (Figura 15), uma sonda que tem um aumento na
intensidade de emissão de fluorescência quando ligada a sítios hidrofóbicos. Essa sonda vem
98
sendo usada para se medir a afinidade de ligantes aos canais de tiroxina e, por conseguinte,
como indicador do estado oligomérico da TTR (Cheng et al., 1977; Lai et al., 1996;
Wilkinson-White and Easterbrook-Smith, 2007).
O 1,8-ANS liga-se à TTR com afinidade moderada (~10 μM) e menor do que o T4
(10 nM e 1 μM, cooperatividade negativa) (Cheng et al., 1977) e do que compostos inibidores
da agregação, como o ácido flufenâmico (30 nM e 255 nM, cooperatividade negativa) (Baures
et al., 1999). Além disso, o 1,8-ANS se liga à TTR alocando sua porção anilina no interior do
canal, posicionado o anel naftaleno entre a Lis15 e a Leu119 e ancorando o grupamento
sulfonato na Lis15' do monômero adjacente (PDB ID 3CFN) (Lima et al., 2009). Essa forma
de ligação é bastante sensível a mudanças, tanto no arcabouço, quanto nas cadeias laterais dos
canais hidrofóbicos da TTR.
Para avaliarmos a influência da ligação de Zn
2+
sobre a afinidade da TTR pelo 1,8-
ANS, realizamos isotermas de ligação incubando amostras de WT-TTR 3,0 μM e 0,3 μM com
concentrações crescentes de 1,8-ANS, na ausência e na presença de ZnCl
2
(50 μM).
Monitoramos o aumento da emissão de fluorescência da sonda em 480 nm, como mostrado na
Figura 20, aumento esse que ocorre devido a sua ligação à proteína. Os resultados das análises
destas isotermas encontram-se na Tabela 5.
99
Figura 20- Efeito do Zn
2+
sobre a afinidade da WT-TTR pelo 1,8-ANS.
Medidas de emissão de fluorescência em 480 nm de concentrações crescentes de 1,8-ANS ligado a WT-TTR 3,0
μM (símbolos fechados) e 0,3 μM (símbolos abertos), na ausência (círculos) e na presença (triângulos) de ZnCl
2
50 μM. As linhas representam os ajustes de acordo com a equação 11, usando o parâmetro de cooperatividade
“n” de Hill variável. O inserto mostra a fração de TTR ligada ao 1,8-ANS.
Tabela 5- Interação do 1,8-ANS com a WT-TTR na ausência e presença de Zn
2+
.
Amostra K
d
“n” de Hill
WT-TTR 3,0 μM 1,69 ± 0,20 1
sem Zn
2+
0,75 ± 0,29 0,84 ± 0,05
WT-TTR 3,0 μM 2,46 ± 0,14 1
+ 50 μM Zn
2+
1,66 ± 0,10 0,89 ± 0,01
WT-TTR 0,30 μM 2,44 ± 0,12 1
sem Zn
2+
2,41 ± 0,12 0,96 ± 0,04
WT-TTR 0,30 μM 3,89 ± 0,23 1
+ 50 μM Zn
2+
3,82 ± 0,26 0,97 ± 0,05
O ensaio mostra que a ligação de Zn
2+
pela TTR não causa um decréscimo
significativo na afinidade desta pelo 1,8-ANS, tanto em concentrações de WT-TTR de 3,0 μM
quanto de 0,3 μM. Esse efeito pode ser observado assumindo-se o sistema como não
100
cooperativo (“n” de Hill = 1), e como cooperativo (“n” de Hill variável), que é mais
condizente com a já conhecida cooperatividade negativa dos canais de ligação do hormônio
T4 da TTR (Neumann et al., 2001).
O mecanismo de agregação disparado pelo Zn
2+
parece diferir do disparado pela
acidificação do meio. A mudança na concentração de H
+
altera a estabilidade do tetrâmero
(Lai et al., 1996), levando a sua dissociação e subsequentes modificações estruturais nas
subunidades isoladas (Palaninathan et al., 2008), o que resulta no intermediário monomérico
amiloidogênico. Na presença de Zn
2+
, a sequência de eventos pode ser invertida, isto é,
primeiramente os monômeros ainda ligados como tetrâmeros sofrem rearranjo estrutural para,
então, dissociar e agregar. É possível ainda que a agregação na presença de Zn
2+
use como
matéria prima os tetrâmeros modificados, previamente descritos pelo nosso grupo (Ferrão-
Gonzales et al., 2003), eliminando-se a necessidade da dissociação dos tetrâmeros para a
agregação.
4.4 Estabilidade Termodinâmica do Complexo Zn
2+
:M-TTR
Como vimos, a ligação de Zn
2+
causa diversas mudanças estruturais na TTR. Tais
mudanças parecem não causar a desestabilização nas interfaces de oligomerização do
tetrâmero da TTR, porém poderiam gerar a desestabilização do monômero. Para testarmos
essa hipótese, usamos novamente o M-TTR e avaliamos sua estabilidade em pH 7,5 frente a
desnaturação por ureia, quando ligado a Zn
2+
. Para tal, tomamos o centro de massa espectral
da fluorescência intrínseca do triptofano como sensor do enovelamento da proteína, como
mostrado na Figura 21.
101
Figura 21- Efeito do Zn
2+
na desnaturação do M-TTR induzida por ureia em pH7,5.
Medidas de emissão de fluorescência varridas de 300 a 400 nm de amostras de M-TTR 3,5 μM, excitadas a 280
nm, previamente incubados em diferentes concentrações de ureia na ausência e na presença de concentrações
crescentes de ZnCl
2
. O centro de massa espectral foi calculados conforme a equação 5 para cada espectro de
cada amostra. As linhas mostram o ajuste de uma equação sigmoidal aos dados.
Como podemos ver na Figura 21, a transição entre o estado enovelado e
desenovelado do M-TTR ocorre entre 2 e 6 M de ureia, com metade da transição ocorrendo
em torno de 4 M de ureia (círculos pretos). A adição de concentrações crescentes de Zn
2+
altera o perfil das curvas de desnaturação do M-TTR induzida por ureia. Essa alteração parece
estar associada a mudança na inclinação das curvas, na região onde ocorre a transição entre o
estado enovelado e desenovelado do M-TTR (2 a 6 M de ureia). Interessantemente, a adição
de EDTA à amostra com a mais alta concentração de Zn
2+
, (ZnCl
2
600 μM) restaura o perfil da
curva de desnaturação (quadrados marrons), indicando reversibilidade do efeito.
A partir do ajuste de equação não-linear aos dados das isotermas de desnaturação
induzida por ureia mostrados na Figura 21 e usando método da extrapolação linear (Santoro
and Bolen, 1988), calculamos a variação da energia livre de Gibbs (ΔG
unf
) e do parâmetro
“m
unf
” de desenovelamento do M-TTR usando a equação 6, nas diferentes concentrações de
Zn
2+
, como mostrados na Figura 22. Os valores obtidos por esta análise estão mostrados na
Tabela 6.
102
Figura 22- Efeitos de ligação de Zn
2+
sobre o ΔG
unf
e sobre o parâmetro “m
unf
” do M-TTR.
Os valores destes parâmetros foram calculados a partir das curvas de ureia mostradas na Figura 21, usando-se o
método da extrapolação linear (Santoro and Bolen, 1988) e a equação 6. Os símbolos em vermelho mostram os
valores após a adição de EDTA à amostra com a mais alta concentração de Zn
2+
, (ZnCl
2
600 μM).
Tabela 6- Valores de ΔG
unf
, ΔΔG
unf
e do parâmetro “m
unf
” do M-TTR para concentrações crescentes de Zn
2+
.
O ΔΔGunf é a de ΔGunf, em cada concentração de Zn
2+
.
Amostra ΔG
unf
ΔΔG
unf
m
unf
Δm
unf
sem Zn
2+
2,54 0 0,860 0
Zn
2+
20 μM 2,05 0,49 0,567 0,293
Zn
2+
40 μM 1,85 0,69 0,485 0,375
Zn
2+
60 μM 1,81 0,73 0,460 0,400
Zn
2+
80 μM 1,67 0,87 0,427 0,433
Zn
2+
100 μM 1,66 0,88 0,414 0,446
Zn
2+
300 μM 1,49 1,05 0,364 0,496
Zn
2+
600 μM 1,47 1,07 0,358 0,502
Zn
2+
600 μM + EDTA 2,51 0,03 0,850 0,001
Como mostrado na Figura 22, a adição de concentrações crescentes de Zn
2+
alteram
tanto o ΔG
unf
quanto o parâmetro “m
unf
” da desnaturação do M-TTR. A diminuição do ΔG
unf
significa a diminuição da energia necessária para que ocorra a transição “M-TTR enovelado
→ M-TTR desenovelado”. Esta diminuição pode estar associada às modificações estruturais
103
causadas pela ligação de Zn
2+
no M-TTR em pH 7,5. Novamente, a adição de EDTA à
amostra com a mais alta concentração de Zn
2+
, (ZnCl
2
600 μM) restaura os valores de ΔG
unf
e
do parâmetro “m
unf
” (Figura 22, símbolos vermelhos), demonstrando novamente a
reversibilidade, não só das modificações estruturais causadas pela ligação de Zn
2+
, quanto da
desestabilização que parece ser causada por tais modificações.
Além disso, a diminuição do parâmetro “m
unf
” está associada a redução na diferença
entre a área acessível ao solvente da proteína no estado enovelado e desenovelado (ΔASA)
(Myers et al., 1995). Assumindo que os estados finais de desenovelamento tanto do M-TTR
quanto do complexo Zn
2+
:M-TTR são equivalentes, podemos entender que a variação do
ΔASA (ΔΔASA) representa a diferença de exposição de superfícies proteicas entre o M-TTR
e o M-TTR ligado a Zn
2+
, como mostrado na Figura 23.
Figura 23- Esquema da variação da área acessível ao solvente no M-TTR e no complexo Zn
2+
:M-TTR.
Calculamos o ASA das estruturas cristalográficas do M-TTR na ausência e na
presença de Zn
2+
em pH 7,5, usando o servidor PISA-EBI (Krissinel and Henrick, 2007) e
encontramos os valores de 18840 Å
2
e 19300 Å
2
, respectivamente, quantificando o ΔΔASA
como sendo de 460Å
2
.
As modificações estruturais causadas pela ligação de Zn
2+
podem diminuir a
estabilidade devido ao aumento de área de superfície exposto ao solvente. Como esse
aumento não é muito grande, propomos que a disrupção da região da α-hélice poderia expor o
104
interior do sanduíche de folhas-β, facilitando a entrada de água nessa cavidade e com isso
facilitando a hidratação de contatos hidrofóbicos estabilizadores da estrutura da proteína.
Além disso, a exposição desses contatos hidrofóbicos ao solvente pode promover a
agregação, uma vez que tais contatos poderiam agora participar de interações interproteicas,
envolvidas com a agregação e estabilização das fibras de TTR.
4.5 Caracterização do Complexo Zn
2+
:M-TTR Ligado ao Resveratrol
A ligação do hormônio T4 à TTR provoca a estabilização do tetrâmero (Miroy et al.,
1996) e, como a via de agregação mediada por acidificação da TTR prevê a dissociação das
subunidades para que haja a formação do intermediário monomérico amiloidogênico, uma
abordagem terapêutica poderia se basear no desenvolvimento de drogas que usassem a
estrutura do hormônio T4 como molde estrutural (Miroy et al., 1996). Diversos estudos
mostraram que drogas da classe NSAID funcionam como estabilizadores da estrutura
quaternária da TTR, onde alguns compostos chegam a inibir até 99% da agregação in vitro
(Baures et al., 1998, 1999). Alguns destes compostos, inclusive, encontram-se em teste clínico
de fase II/III (www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00409175?order=1).
Para o desenho destes compostos, diversas estruturas cristalográficas foram
resolvidas, para uma melhor compreensão da forma de ligação, do mecanismo de
estabilização e na tentativa de se desenhar compostos com afinidade aumentada pela TTR
(Peterson et al., 1998; Baures et al., 1998, 1999; Klabunde et al., 2000; Johnson et al., 2008a,
b, 2009), tornando assim o composto candidato a medicamento mais específico à TTR e,
consequentemente, causador de menos efeitos colaterais devido à interação com outras
proteínas.
Como mostramos na seção 4.3, a ligação de Zn
2+
e as modificações estruturais
105
associadas a esta ligação não parecem afetar os canais ligação do hormônio T4 e nem as
interfaces de oligomerização da TTR. Porém, não podemos descartar a hipótese de que a
ligação de um composto inibidor da agregação aos canais hidrofóbicos da TTR possa prevenir
ou acentuar as modificações estruturais ocorridas na proteína.
Para testarmos essa proposição e melhor compreendermos o mecanismo de ligação
destes inibidores à estrutura da TTR em seu estado amiloidogênico, incubamos cristais do
complexo Zn
2+
:M-TTR, formados em diversos pHs, com compostos como o T4, o ácido
flufenâmico, o diclofenaco e o resveratrol, todos descritos como potentes inibidores da
agregação da TTR (Klabunde et al., 2000).
Resolvemos diversas dessas estruturas, porém a única que mostrou a densidade
eletrônica nos canais hidrofóbicos compatível com a presença de um ligante foi a do
complexo Zn
2+
:M-TTR cristalizado em pH 4,6, complexada com resveratrol (trans-3,4',5-
trihidroxistilbeno) (Figura 8B) (Figura 24 e Figura 25), um composto capaz de reduzir a
formação de fibras de TTR em pH ácido em 98% (Klabunde et al., 2000).
Figura 24- Diagrama de fitas do complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6, ligado ao composto resveratrol.
A figura mostra o resveratrol (em laranja) ligado aos dois canais hidrofóbicos da TTR. Figura gerada pelo
programa Pymol (DeLano, 2008).
106
Figura 25- Canal hidrofóbico da TTR mostrando a ligação do composto resveratrol ao complexo Zn
2+
:M-TTR
em pH 4,6.
A- O composto mostra-se ligado por interações hidrofóbicas com as cadeias laterais da Leu17, Ala108, Met110,
Ser115, Ser117, Thr119 e por quatro ligações de hidrogênio possíveis, representadas por linhas tracejadas
amarelas, entre o composto e as cadeias laterais da Ser117, Thr119, Ser117' e Thr119'. A rede azul mostra a
densidade eletrônica do composto.
B- O composto mostra-se ligado a WT-TTR pH 7,5, exibindo dupla ocupância. Retirado de (Klabunde et al.,
2000).
A ligação do resveratrol à WT-TTR em pH 7,4 (Klabunde et al., 2000) na ausência de
qualquer metal, mostra o resveratrol ligado com o anel p-hidroxifenil enterrado na cavidade
do canal (Figura 25, B). A interação ligante-proteína se dá, principalmente, por contatos
apolares entre o composto e cadeias hidrofóbicas da Leu17, Ala108, Leu110, Ser117, Thr119
e Val121. Além disso, a estabilização do tetrâmero é atribuída a duas ligações de hidrogênio
que se estabelecem entre uma das hidroxilas da porção 1,3-dihidroxiestiril do resveratrol e o
Nε da Lis15, e outra entre a p-hidroxila do anel p-hidroxifenil do resveratrol, enterrado na
cavidade, e o Oγ da hidroxila da Ser117. Esta última desloca uma molécula de água que
anteriormente achava-se ligada à hidroxila da Thr119 e Ser117 (Figura 25 B).
Em nossa estrutura, encontramos o resveratrol ligado de forma diferente da
anteriormente descrita, com a porção 1,3-dihidroxiestiril enterrada na cavidade do canal.
107
Observamos contatos apolares entre o composto e as cadeias hidrofóbicas da Leu17, Ala108,
Met110, Ser115, Ser117, Thr119 nas subunidades A e C. Além disso, 4 pontes H são possíveis
nessa nova orientação do resveratrol no canal, que se estabeleceriam entre as hidroxilas da
porção dihidroxifenil enterrada na cavidade e as hidroxilas das cadeias laterais da Thr119 ou
da Ser117 (Figura 25).
A sobreposição da região da fita-β E - α-hélice - fita-β F do M-TTR ligado ao Zn
2+
na
presença e ausência de resveratrol encontra-se na Figura 26.
Figura 26- Desorganização da região da fita-β E - α-hélice - fita-β F do complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6,
ligado ao resveratrol.
A estrutura em magenta representa o M-TTR em pH 8,0, na ausência de qualquer metal e na ausência de
resveratrol (PDB ID 1GKO); a estrutura em azul representa o complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6, na ausência de
resveratrol (PDB ID 3DGD) e a estrutura em verde representa o complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6, ligado ao
resveratrol. Note que a α-hélice das estruturas azul e verde estão igualmente desfeitas. Figura gerada pelo
programa Pymol (DeLano, 2008).
Ao analisarmos a Figura 26, podemos notar a presença da α-hélice do M-TTR em pH
8,0, na ausência de metal e de resveratrol (PDB ID 1GKO), mostrado em magenta. A
sobreposição das estruturas dos complexos Zn
2+
:M-TTR com e sem resveratrol (estrutura em
verde, com resveratrol e estrutura em azul, sem resveratrol), nos revela que a ligação do
resveratrol pelo complexo Zn
2+
:M-TTR em pH 4,6, parece não ser suficiente para reverter as
modificações estruturais, principalmente as ocorridas na região da fita-β E - α-hélice - fita-β F
108
devido a ocupação dos sítios ligadores de Zn
2+
(Figura 26). A sobreposição das estruturas do
complexo Zn
2+
:M-TTR com e sem resveratrol apresenta um rmsd de apenas 0,27 Å.
Para a determinação da estrutura do complexo Zn
2+
:M-TTR, incubamos cristais pré-
formados com os ligantes. Esse detalhe experimental não nos permite saber se a TTR, ligada
previamente ao resveratrol na ausência de Zn
2+
, poderia posteriormente sofrer as mudanças
conformacionais, se for agora exposta ao íon metálico. Por outro lado, a reversão das
mudanças estruturais pode exigir uma mobilidade que a estrutura não possui dentro do
empacotamento cristalino.
A ideia de fármacos inibidores da agregação da TTR se baseia na estabilização do
tetrâmero, impedindo a formação do intermediário amiloidogênico. Além disso, um fármaco
com boas chances agir como inibidor da agregação teria de ser usado ao longo de toda a vida
do paciente. Tal fármaco não poderia ter, por exemplo, o efeito colateral da constante inibição
da ciclooxigenase, que ocorre no caso do uso de NSAIDS como inibidores da agregação de
TTR (Julius et al., 2007). O desenho de compostos que se liguem com alta afinidade à
estrutura da TTR em seu estado amiloidogênico, onde a droga deve realmente atuar, seja ele
mediado por acidificação ou ligação de Zn
2+
, pode ser uma nova opção no controle
farmacológico das amiloidoses associadas a TTR.
109
5 Conclusão
Em solução, a ligação de Zn
2+
aos ZBS 2 e 3 parece resultar em um rearranjo
estrutural na WT-TTR, em pH 7,5. Essas mudanças estruturais ocorrem em larga escala na
região da fita-β E - α-hélice - fita-β F e parecem resultar em uma diminuição da afinidade da
WT-TTR pela holo-RBP, mas não por moléculas que se ligam ao canal de ligação do
hormônio T4, como por exemplo o 1,8-ANS. Tais alterações estruturais não parecem alterar o
estado oligomérico tetramérico da TTR.
Nossos dados mostrados aqui sugerem que as modificações estruturais causadas pela
ligação de Zn
2+
à TTR ocorrem em regiões específicas da proteína, o que sugere que o Zn
2+
poderia se comportar como um modular alostérico heterotrópico da interação da TTR com a
holo-RBP, manifestando mudanças em suas funções e patologias (White and Kelly, 2001). A
maior parte da holo RBP circula ligada a TTR no plasma (Mody et al., 2008), resultando em
uma interação mutuamente benéfica, como a prevenção da perda de RBP, estabilização do
complexo retinol:RBP (Monaco, 2000), prevenção da dissociação da TTR e formação de
amiloide (White and Kelly, 2001).
Um desbalanço na homeostase de Zn
2+
poderia perturbar essas interações,
cancelando os benefícios e como consequência teria-se uma diminuição da concentração de
holo RBP circulante e amiloidogênese da TTR (Wilkinson-White and Easterbrook-Smith,
2007; Susuki et al., 2008; White and Kelly, 2001).
Em pacientes de FAP, os depósitos amiloides de TTR acumulam-se principalmente
em torno de nervos periféricos, na bainha de mielina (Sousa and Saraiva, 2003), local onde
ocorre alta concentração de Zn
2+
(cerca de 50 μM) (Riccio et al., 1995). Essa alta
concentração de Zn
2+
na bainha de mielina associada a desestabilização causada pela mutação
na TTR (McCutchen et al., 1995; Ferrão-Gonzales et al., 2003), poderia explicar o tropismo
110
das fibras amiloides de TTR por essa região específica do SNP. Além disso, o Zn
2+
sequestrado na fibra pode contribuir para sua alta estabilidade, tornando ineficazes os
mecanismos fisiológicos de remoção de agregados
Nossa hipótese poderia explicar também a formação das opacidades vítreas causadas
pelo acúmulo de fibras amiloides de TTR nos olhos, uma característica associada a ~20% das
mutações da TTR (Benson and Kincaid, 2007), uma vez que novamente o Zn
2+
é o elemento
traço mais abundante nesta região (2.4 ± 0.95 mg/L, 36 ± 14 μM) (Coutselinis et al., 1977).
A diminuição da estabilidade do M-TTR e o aumento em seu ASA podem se mostrar
fatores que contribuem para formação de fibras amiloides, devido à exposição ao solvente de
regiões da proteína que antes ficariam protegidas de fazerem contatos interproteicos, contatos
esses que podem iniciar, estruturar e estabilizar a fibra amiloide (Chiti, 2006).
Propomos uma nova abordagem terapêutica para as amiloidoses, que seria o desenho
de drogas feito a partir de estruturas proteicas em seus estados amiloidogênicos. Essa
abordagem pode permitir, em alguns casos, o desenho de compostos com alta afinidade pela
proteína fora de seu estado nativo, porém ligando-se com baixa afinidade a ela quando
corretamente enovelada. Dessa forma, o uso do fármaco não alteraria as funções normais
associadas à sua estrutura nativa, por não se ligar a ela neste estado. Sabemos, porém, que tais
estruturas nem sempre são fáceis de serem obtidas e que, nos casos de proteínas que perdem
totalmente a estrutura, pode não ser factível.
Chamamos a atenção também para o papel que íons metálicos tem representado em
um crescente número de amiloidoses, como observado para o Mal de Alzheimer (Atwood et
al., 1998), Mal de Parkinson (Uversky et al., 2001), entre outras (Davis et al., 2001; Jobling et
al., 2001; Deng et al., 2006), às quais talvez possamos incluir a FAP causada por TTR, nos
deixando tentados a especularmos se a ligação de metais seria uma outra característica das
amiloidoses. Além disso, um melhor entendimento do papel da homeostase desses íons
111
metálicos em tais doenças poderia ser usado no desenvolvimento de novas abordagens
terapêuticas.
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125
7 Anexos
7.1 Curriculum Vitae Lattes
Leonardo de Castro Palmieri
Curriculum Vitae
_________________________________________________________________________________
Dados Pessoais
Nome Leonardo de Castro Palmieri
Nome em citações bibliográficas PALMIERI, L. C.
Sexo masculino
Filiação Italo Palmieri e Amélia Rosa de Castro Palmieri
Nascimento 10/08/1980 - Rio de Janeiro/RJ - Brasil
Carteira de Identidade 124742719 IFP - RJ - 25/06/1998
CPF 08469765795
Endereço residencial RUA das Palmeiras, 61, 704
Botafogo - Rio de Janeiro
22270-070, RJ - Brasil
Telefone: 21 91888319
Endereço profissional Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica
Médica, IBqM, UFRJ
Av Bauhinia, 400 bloco B subsolo sala 34
Cidade Universitária - Rio de Janeiro
21941-590, RJ - Brasil
Telefone: 21 25626761
URL da home page: http://www.farmacia.ufrj.br/mauricio/
Endereço eletrônico
e-mail para contato : [email protected]
e-mail alternativo : [email protected]
_________________________________________________________________________________
Formação Acadêmica/Titulação
2009 Pós-Doutorado.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio De Janeiro, Brasil
Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
Áreas do conhecimento : Química de Macromoléculas
2005 - 2009 Doutorado em Química Biológica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio De Janeiro, Brasil
Título: Complexo transtirretina humana e zinco: caracterização estrutural, funcional
e termodinâmica, Ano de obtenção: 2009
Orientador: Debora Foguel
Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Palavras-chave: M-TTR, tranthyretin, amyloidosis, protein crystallography, zinc, protein nmr
Áreas do conhecimento : Química de Macromoléculas
2003 - 2005 Mestrado em Química Biológica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio De Janeiro, Brasil
Título: Estudo do enovelamento e agregação do monômero da proteína
amiloidogênica transtirretina (M-TTR), Ano de obtenção: 2005
126
Orientador: Debora Foguel
Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
Palavras-chave: amyloidosis, folding, tranthyretin, M-TTR
Áreas do conhecimento : Bioquímica,estrutura de proteínas
1999 - 2003 Graduação em Biomedicina.
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, UNIRIO, Rio De Janeiro, Brasil
Título: ESTUDO DO ENOVELAMENTO E AGREGAÇÃO DA PROTEÍNA
TRANSTIRRETINA (TTR) SELVAGEM E SEUS MUTANTES ATRAVÉS DA ALTA
PRESSÃO HIDROSTÁTICA
Orientador: Débora Foguel
_________________________________________________________________________________
Formação complementar
1999 - 1999 Curso de curta duração em Mini-Cursos da I Semana de Biomedicina.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio De Janeiro, Brasil
2000 - 2000 Curso de curta duração em Mini-Cursos da II Semana de Biomedicina.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio De Janeiro, Brasil
2005 - 2005 Curso de curta duração em Investigação de Estruturas de Proteínas por RMN.
Associação Brasileira de Tecnologia de Luz Sincrotron, ABTLuS, Campinas, Brasil
2005 - 2005 Curso de curta duração em Curso Avançado de Estrutura e Função de Proteínas.
Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio De Janeiro, Brasil
2007 - 2007 Curso de curta duração em RapiData.
Brookhaven National Laboratory, BNL*, Long Island, Estados Unidos
_________________________________________________________________________________
Áreas de atuação
1. Bioquímica
2. Proteínas
3. estrutura de proteínas
_________________________________________________________________________________
Idiomas
Inglês Compreende Bem , Fala Bem, Escreve Bem, Lê Bem
Italiano Compreende Razoavelmente , Fala Pouco
Português Compreende Bem , Fala Bem, Escreve Bem, Lê Bem
_________________________________________________________________________________
Prêmios e títulos
2009 Prêmio Melhor Pôster XXXVIII Reunião Anual SBBq, Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular
2007 Premio Melhor Poster XXXVI Reuniao Anual SBBq, Sociedade Brasileira de
Bioquimica e Biologia Molecular
127
Produção em C, T& A
_________________________________________________________________________________
Produção bibliográfica
Artigos completos publicados em periódicos
1. FOGUEL, D., Suarez, M.C., Ferrão Gonzales, A. D., PORTO, T. C. R., PALMIERI, L. C.,
EINSIEDLER, C. M., LASHUEL, H., LANSBURY, P. T., KELLY, J., SILVA, J. L.
Dissociation of amyloid fibrils of a-synuclein and transthyretin by pressure reveals their reversible
nature and the formation of water-excluded cavities. PNAS. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. , v.100, p.9831 - 9836, 2003.
Palavras-chave: amyloidosis, folding, tranthyretin
Áreas do conhecimento : estrutura de proteínas
Referências adicionais : Estados Unidos/Inglês. Meio de divulgação: Vários, Home page:
http://www.pnas.org/cgi/content/full/100/17/9831
2. Ferrão Gonzales, A. D., PALMIERI, L. C., VALLORY, M., SILVA, J. L., LASHUEL, H., KELLY, J.,
FOGUEL, D.
Hydration and Packing are Crucial to Amyloidogenesis as Revealed by Pressure Studies on
Transthyretin Variants that Either Protect or Worsen Amyloid Disease. Journal of Molecular Biology. ,
v.328, p.963 - 974, 2003.
Palavras-chave: amyloidosis, folding, tranthyretin
Áreas do conhecimento : estrutura de proteínas
Referências adicionais : Estados Unidos/Inglês. Meio de divulgação: Vários
Produção Técnica
Demais produções técnicas
1. PALMIERI, L. C., FREIRE, J. B. B., FOGUEL, D., Lima, L.M.T.R.
PDB 3GPS Crystal structure of the F87M/L110M mutant of human transthyretin at pH 5.5, 2009.
(Outra produção técnica)
Referências adicionais : Estados Unidos/Inglês. Meio de divulgação: Meio magnético
2. PALMIERI, L. C., FREIRE, J. B. B., FOGUEL, D., Lima, L.M.T.R.
PDB 3GRB Crystal structure of the F87M/L110M mutant of human transthyretin at pH 6.5, 2009.
(Outra produção técnica)
Palavras-chave: tranthyretin, M-TTR, zinc
Referências adicionais : Estados Unidos/Inglês. Meio de divulgação: Meio digital
3. PALMIERI, L. C., FREIRE, J. B. B., FOGUEL, D., Lima, L.M.T.R.
PDB 3GRG Crystal structure of the F87M/L110M mutant of human transthyretin at pH 7.5, 2009.
(Outra produção técnica)
Palavras-chave: tranthyretin, M-TTR, zinc
Referências adicionais : Estados Unidos/Inglês. Meio de divulgação: Meio digital
4. PALMIERI, L. C., FREIRE, J. B. B., FOGUEL, D., Lima, L.M.T.R.
PDB 3DGD Crystal structure of the F87M/L110M mutant of human transthyretin at pH 4.6, 2008.
(Outra produção técnica)
Palavras-chave: tranthyretin, M-TTR, zinc
Referências adicionais : Estados Unidos/Inglês. Meio de divulgação: Meio digital
Orientações e Supervisões
Orientações e Supervisões concluídas
128
Iniciação científica
1. Priscila dos Santos Ferreira. Estudos estruturais do dimero da transtirretina. 2005. Iniciação
científica (Biomedicina) - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
Referências adicionais : Brasil/Português.
Orientações e Supervisões em andamento
Iniciação científica
1. Juliana Batista dos Barros Freire. Estudos estruturais do monomero artificial da transtirretina.
2008. Iniciação científica (Farmacia) - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Referências adicionais : Brasil/Português.
Eventos
Participação em eventos
1. Speaker no(a) Cristalografia de Proteínas, disciplina Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da UFRJ, 2009. (Seminário)
Complexo Transtirretina e zinco: uma caracterização estrutural, funcional e termodinâmica.
2. Speaker no(a) Seminários da Pós-Graduação Strictu Sensu da Faculdade de Farmácia UFRJ,
2009. (Seminário)
Complexo transtirretina humana e zinco: caracterização estrutural, funcional e termodinâmica.
3. International Bunsen Discussion Meeting, 2009. (Encontro)
Zinc binding sites on human TTR: structural changes and implication for amyloidogenesis.
4. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXVII SBBq, 2008. (Congresso)
Dissociation and aggregation studies with engineered dimers of TTR.
5. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXVII SBBq, 2008. (Congresso)
Partial assignmet of the monomeric TTR by NMR.
6. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXVI Reunião da SBBq, 2007. (Congresso)
How large changes in protein structure needed to promote aggregation?.
7. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXV SBBq, 2006. (Congresso)
Structural studies of with an engineered dimer of TTR (bd-ttr) and citotoxic assay of WT-TTR and
mutantes.
8. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXIV SBBq, 2005. (Congresso)
Folding and aggregation studies of monomer of amiloidogenic protein TTR.
9. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXIV SBBq, 2005. (Congresso)
Structural studies with an engineered dimer of TTR: Does TTR aggregates as a tetramer, dimer or
monomer?.
10. Apresentação de Poster / Painel no(a) 3rd International conference on high pressure
bioscience and biotechnology, 2004. (Congresso)
Structural studies of an engineered monomer of TTR by high hydrostatic pressure and the role of
histidines on its amyloidogenic properties.
11. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXIII SBBq, 2004. (Congresso)
Structural studies of an engineered monomer of TTR by high hydrostatic pressure and the role of
histidines residues on its amyloidogenic properties.
129
12. Apresentação de Poster / Painel no(a) 1st Latin american protein society meeting, 2004.
(Encontro)
Structural studies of an engineered monomer of TTR by high hydrostatic pressure and the role of
histidines residues on its amyloidogenic properties.
13. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXII Reunião Anual da SBBq, 2003. (Congresso)
Thermodynamic stability and amiloidogenic properties of the monomers of transthyretin: implications
for senile systemic amyloidoses.
14. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXI Reunião Anual da SBBq, 2002. (Congresso)
Is there any correlation between the partially unfolded Conformation of Transthyretin and Fibril
Formation?.
Palavras-chave: tranthyretin, folding, amyloidosis
Áreas do conhecimento : Bioquímica,Proteínas,estrutura de proteínas
15. Hydration forces in protein folding and protein interactions: osmotic and hydrostatic
pressure approaches, 2002. (Encontro)
Is there any correlation between the partially unfolded conformation of TTR and fibril formation?.
16. Apresentação Oral no(a) XXXI Reunião Anual da SBBq, 2002. (Congresso)
There any correlation between partially unfolded conformation of transthyretin and fibril formation?.
17. XXX SBBq, 2001. (Congresso)
Comparing the thermodynamic stability of WT-TTR and mutants: stability x amyloidogenesis.
18. International Workshop on Spectroscopy for Biology, 2001. (Oficina)
Folding and stability studies of WT-TTR and mutants using pressure-induced denaturation:
implications for aggregation.
19. XXX SBBq, 2001. (Congresso)
Inhibition of pressure-induced denaturation and aggregation of TTR by antinflamatory drugs
(NSAIDS): A way to therapeutics?.
20. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXII Jornada de Iniciação Científica, 2000. (Outra)
Estabilidade e enovelamento da transtirretina selvagem e seus mutantes (T119M e L55P) frente a
desnaturação por pressão.
21. II Semana de Biomedicina, 2000. (Encontro)
.
22. XXIX SBBq, 2000. (Congresso)
.
23. I Semana de Biomedicina, 1999. (Encontro)
.
_________________________________________________________________________________
Totais de produção
Produção bibliográfica
Artigos completos publicado em
periódico.................................................. 2
Produção Técnica
Outra produção
técnica.................................................................... 4
Orientações
130
Orientação concluída (iniciação
científica)............................................... 1
Orientação em andamento (iniciação
científica)............................................ 1
Eventos
Participações em eventos
(congresso)...................................................... 14
Participações em eventos
(seminário)...................................................... 2
Participações em eventos
(oficina)........................................................ 1
Participações em eventos
(encontro)....................................................... 5
Participações em eventos
(outra).......................................................... 1
131
7.2 Declaração de Defesa de Tese
132
7.3 Histórico Oficial
Livros Grátis
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