( PDF ) Rotavirose em suínos: implicação dos efluentes da criação no ambiente

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INSTITUTO BIOLÓGICO

PÓS-GRADUAÇÃO

Rotaviroses em suínos:

Implicação dos efluentes da criação no ambiente

Marcelo Kenji Nishida

Dissertação apresentada ao Instituto

Biológico, da Agência Paulista de

Tecnologia dos Agronegócios, para

obtenção do título de Mestre em

Sanidade, Segurança Alimentar e

Ambiental no Agronegócio.

Área de Concentração: Sanidade

Animal, Segurança Alimentar e o

Ambiente

Orientador: Prof. Dr. Fábio Gregori

São Paulo

2009

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SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO

AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS

INSTITUTO BIOLÓGICO

Pós-Graduação

Av. Cons. Rodrigues Alves 1252

CEP 04014-002 - São Paulo – SP

[email protected].gov.br

FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome do candidato: Marcelo Kenji Nishida

Título:Rotavirose em suínos: Implicação dos efluentes da criação no ambiente

Orientador(a): Prof. Dr. Fábio Gregori

Dissertação apresentada ao Instituto

Biológico da Agência Paulista de

Tecnologia dos Agronegócios para

obtenção do título de Mestre em

Sanidade, Segurança Alimentar e

Ambiental no Agronegócio.

Área de Concentração: Sanidade

Animal, Segurança Alimentar e

Ambiental do Agronegócio

Aprovada em:

Banca Examinadora

Assinatura:____________________________________________________________

Prof. (a) Dr.(a):__________________________________________________

Instituição:____________________________________________________________

Assinatura:____________________________________________________________

Prof. (a) Dr.(a):__________________________________________________

Instituição:____________________________________________________________

Assinatura:____________________________________________________________

Prof. (a) Dr.(a):__________________________________________________

Instituição:____________________________________________________________

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DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca

Instituto Biológico

Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo

Nishida, Marcelo Kenji

Rotavirose em suínos: implicação dos efluentes da criação no ambiente /

Marcelo Kenji Nishida. – São Paulo, 2009.

Dissertação (Mestrado) Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação.

Área de concentração:.Sanidade Animal, Segurança Alimentar e o Ambiente

Linha de pesquisa: Sanidade suína.

Orientador: Fábio Gregori

Versão do título para o inglês: Rotavirosis in swine: implications of farm wastewater in

the environment.

1. Rotavirus 2. Meio ambiente 3. Suinocultura 4. Criações de baixa tecnificação 5.

Efluentes contaminados I.Gregori, Fábio II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa

de Pós-Graduação III. Título

IB/Bibl /2009/015

Agradecimentos

Dedico esta dissertação:

Para toda minha família, sem distinção;

Aos meus amigos da pós-graduação;

Aos meus amigos do colégio, no qual mesmo as interpéries do tempo não desgastou a

amizade, apenas se criou saudades;

A minha turma, 67, pelos 5 anos de vivência que apesar de breves, deixaram um legado de

irmandade para uma vida inteira;

Aos meus outros amigos no qual não citei, mas não por isso, menos importantes;

A todos os outros que me ajudaram direta e indiretamente em minha vida.

E ao meu futuro.

Meus agradecimentos vão a aqueles que tornaram este trabalho realidade e os dou para:

O meu orientador Fábio Gregori não só pela orientação, mas também os momentos de

amizade e descontração;

A Leticie, pesquisadora do laboratório pelas ajudas, conversas e os bons momentos;

Ao Professor José Antônio Jerez da USP, por seus conselhos e pela orientação dada;

A pesquisadora Josete Garcia Bersano, por me auxiliar na na etapa de colheita de amostras

clínicas;

O Instituto de Zootecnia, em particular, os doutores Fernando Castro e Fábio Budiño pela

ajuda em contatar as propriedades de Nova Odessa;

A CATI, em especial ao Engenheiro Agrônomo José De Sordi Neto por auxiliar na coleta de

amostras em Nova Odessa;

O mestre Daniel Gonçalves Bruno (Emú) do VNP-FMVZ-USP, por me auxiliar na coleta de

amostra em Descalvado;

Todos os outros que injustamente tenha esquecido citar.

“Now this is not the end. It is not even the beginning of the end, but it is, perhaps, the

end of the beginning.”

Winston Churchill

Resumo

VII

Resumo:

NISHIDA, M.K. ROTAVIROSES EM SUÍNOS: IMPLICAÇÃO DOS EFLUENTES DA

CRIAÇÃO NO AMBIENTE. São Paulo. 2009. Dissertação (Mestrado em sanidade animal,

segurança alimentar e ambiental no agronegócio) – Instituto Biológico.

Os rotavírus são um dos principais agentes virais envolvidos na ocorrência de

gastroenterites em crianças e em animais de diferentes espécies. Sua elevada resistência

ambiental aliada à via de transmissão fecal-oral, torna-o um agente propício de se propagar

pela água, principalmente nos efluentes. O objetivo deste estudo foi o de se detectar a

circulação e eliminação de rotavírus das criações de suínos de baixa tecnificação no Estado

de São Paulo, Brasil, a partir de materiais fecais de leitões com diarréia e efluentes. As

amostras foram triadas em paralelo para detecção do rotavírus através da eletroforese em

gel de poliacrilamida (PAGE) e ELISA, sendo os resultados positivos confirmados por RT-

PCR (transcrição reversa - reação em cadeia pela polimerase). Foram colhidas 69 amostras

de 16 propriedades, das quais evidenciou apenas uma amostra positiva (1/69 ou 1,45%)

pela PAGE, proveniente de material fecal. Através do ELISA observou-se 19 (19/69 ou

27,53%) amostras positivas, dentre elas 12 de material fecal e 7 de efluentes. A RT-PCR

confirmou o resultado do PAGE e ELISA positivo de todas as amostras fecais e em 3

amostras de efluentes. O presente estudo demonstrou a presença do rotavírus em 6 de 16

(37,5%) das criações pesquisadas, das quais em 3 foram encontrados o vírus tanto no

efluente quanto nos animais, cujo manejo envolviam o despejo das excretas em solo direto,

aterro e caixa de decantação com posterior destinação a agricultura. Adicionalmente foram

definidos os genotipos G e P de rotavírus nestes materiais, sendo eles o G[5], G[10], P[6] e

P[7], sendo que em uma amostra pode ser definido o G[10] P[7]. Tais resultados

evidenciaram a eliminação de rotavírus no ambiente a partir dos efluentes das criações de

suínos apesar das práticas de manejo nelas adotadas, comprovando-se a necessidade de

se assegurar tratamentos de excretas que visem a sua inocuidade, não só ambiental, mas

também microbiológica.

VIII

Palavras Chave: rotavírus, efluente, meio-ambiente, suíno

Abstract

Abstract:

NISHIDA, M.K. ROTAVIROSIS IN SWINE: IMPLICATIONS OF FARM WASTEWATER IN

THE ENVIRONMENT. São Paulo. 2009. Dissertation (Mestrado em sanidade animal,

segurança alimentar e ambiental no agronegócio) – Instituto Biológico.

The rotavirus is one of the most important viral agent of gastroenteritis in child and

animals from different species. The high environmental resistance and the fecal-oral way of

transmission make the rotavirus suitable to be transmitted by water, mainly by wastewater.

This present study seeks to detect the elimination and circulation of rotavirus in low

technified pig farms in São Paulo State, Brazil, from feces of piglets with diarrhea and

wastewater samples. These samples were submitted in a parallel screening scheme of

rotavirus detection through poliacrilamide gel electrophoresis (PAGE) and ELISA, which the

positive samples were further confirmed by RT-PCR (reverse transcription polimerase chain

reaction). From 16 properties, 69 samples were collected, which by PAGE only one sample

were positive (1/69 or 1.45%) from fecal sample and by ELISA 19 (19/69 or 27.53%)

samples were seen positive, which 12 were from fecal samples and 7 from wastewater

samples. The RT-PCR confirmed the positive PAGE and ELISA results in all fecal samples

and 3 wastewater samples. This study confirmed the rotavirus presence in 6 of 16 (37.5%)

researched farms, which in 3 of them, the virus were found both in animals and wastewater

samples. The excreta treatment found in these rotavirus positive wastewater farms were

direct soil wasting, landfill wasting and the use of stabilization pond with later use to

agriculture. Further, the G and P genotypes in these samples were definied as G[5], G[10],

P[6] e P[7], where one sample could be definied as G[10] P[7]. These results show the

rotavirus elimination from pig farm wastewater in spite of the given management, what

means the need of assuring microbiological and environmental safety in wastewater

treatments.

Keywords: rotavirus, wastewater, environment, swine

Lista de Figuras

XII

Figura 1 (NISHIDA, 2007): Aspecto de uma suinocultura tecnificada. Destaca-se a alta

densidade animal, higiene, controle nutricional e infraestrutura. ........................................... 5

Figura 2 (NISHIDA, 2007): Exemplo de uma criação de suínos com baixa (ou nenhuma)

tecnificação. Observam-se o mal estado de conservação das instalações e entulho próximo

à baia de criação. ................................................................................................................. 6

Figura 3 (IBGE, 2009): Mapa político do Estado de São Paulo. As propriedades visitadas

neste estudo encontram-se nos municípios destacados em vermelho. ................................ 18

Figura 4 (NISHIDA, 2007): Emissão de efluente de criação de suínos diretamente em corpo

d´água.. ............................................................................................................................... 28

Figura 5 (NISHIDA, 2007): Tanque de decantação de efluentes danificado, apresentando

vazamento, presente em criação de suínos. ........................................................................ 28

XIII

Lista de Tabelas

XIV

Tabela 1: Destinação e tratamento de efluentes em granjas de suínos de baixa tecnificação

amostradas no presente estudo. São Paulo – 2008............................................................. 27

Tabela 2: Resultados dos testes de PAGE e ELISA em amostras fecais e de efluentes de

granjas de criação de suínos. São Paulo – 2008. ................................................................ 29

Tabela 3: Resultados dos testes de PAGE, ELISA e RT-PCR em amostras fecais e de

efluentes de granjas de criação de suínos, de acordo com o município de colheita. São

Paulo – 2008. ...................................................................................................................... 32

Lista de Abreviaturas

XVI

apud = citado por

bp = pares de base

BNDES = Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social

°C = graus Celsius

°C / minuto = graus Celsius por minuto

CONAMA = Conselho Nacional do Meio Ambiente

DALY = ajuste de anos de vida por doença

DMSO = dimetil-sulfóxido

DNA = ácido desoxirribonucléico

DNAc = ácido desoxirribonucléico complementar

dNTP = nucleotídeos trifosfato (desoxi adenilato, desoxi guanilato, desoxi citidilato e desoxi

timidilato)

DTT = ditiotreitol

EDTA = ácido etilenoamino tetra-acético

et al. = e colaboradores

g = aceleração da gravidade terrestre (aproximadamente 9,8 m/s²)

HCl = ácido clorídrico

M = molar

mA = miliamperes

MgCl

= cloreto de magnésio

µg/mL = micrograma por mililitro

µL = microlitro

mL = mililitro

mM = milimolar

nº = número

NCDV = Nebraska calf diarrhea virus

nm = nanômetro

NSP = proteína não estrutural

partículas/mL = partículas por mililitro

PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida

PAHO = Organização Pan-Americana de Saúde

§ = parágrafo

PCR = reação em cadeia pela polimerase

pmol/µL = picomol por microlitro

p/v = peso por volume

pH = potencial hidrogeniônico

q.s.p. = quantidade suficiente para

XVII

VP = proteína viral

v/v = volume por volume

RNA = ácido ribonucléico

RT-PCR = reação em cadeia pela polimerase precedido por transcrição reversa

SDS = dodecilsulfato de sódio

TRIS = hidroximetil-aminometano

U = unidade internacional

UFP = unidade formadora de placa

WHO = Organização Mundial da Saúde

XVIII

Sumário

XIX

AGRADECIMENTOS .................................................................................... IV

RESUMO ..................................................................................................... VI

ABSTRACT.................................................................................................. IX

LISTA DE FIGURAS .................................................................................... XI

LISTA DE TABELAS................................................................................... XIII

LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................... XV

SUMÁRIO ............................................................................................... XVIII

1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................1

2. REVISÃO LITERÁRIA ................................................................................4

2.1. Suinocultura no Brasil ...............................................................................5

2.2. Efluentes ................................................................................................6

2.2.1. Aspectos legais .....................................................................................7

2.2.2. Implicações ambientais e sanitárias .........................................................9

2.2.3. Tratamento de efluentes ...................................................................... 11

2.3. Rotavírus .............................................................................................. 12

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 16

3.1. Propriedades ......................................................................................... 17

3.2. Amostras fecais e efluentes ..................................................................... 18

3.3. Detecção de rotavírus ............................................................................. 19

3.3.1. Preparo do material fecal e efluente....................................................... 19

3.3.2. Eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) ........................................... 20

3.3.2.1. Extração do RNA viral para a PAGE ..................................................... 20

3.3.2.2. Preparo do gel de poliacrilamida ......................................................... 21

3.3.2.3. Condições de corrida eletroforética ..................................................... 21

3.3.2.4. Coloração com nitrato de prata .......................................................... 22

3.3.2.5. Interpretação dos resultados .............................................................. 22

3.3.3. Reação de ELISA ................................................................................. 22

3.3.3.1. Condições de teste ........................................................................... 23

3.3.4. Reação de RT-PCR ............................................................................... 24

4. RESULTADOS ......................................................................................... 26

4.1. Criações e tratamentos de água ............................................................... 27

4.2. Amostras fecais e efluentes ..................................................................... 29

4.2.1. Confirmação dos resultados por ELISA e RT-PCR ..................................... 32

5. DISCUSSÃO ........................................................................................... 34

6. CONCLUSÃO ........................................................................................... 42

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 44

8. ANEXOS ................................................................................................. 57

1 - Introdução

A suinocultura brasileira desempenha um papel importante na agroindústria nacional.

O país foi o quarto maior exportador e criador do mundo, produzindo 2.869,9 mil toneladas

(superado apenas pelos Estados Unidos, União Européia e a China) e fornecendo 528,195

mil toneladas em 2006 (perdendo apenas nos Estados Unidos, União Européia e Canadá),

gerando apenas de exportação neste ano 1,037 bilhões de dólares (Anuário brasileiro de

aves e suínos, 2007; ABIPECS, 2006). Além da contribuição econômica, a produção de

suínos também tem repercussões sociais, pois a produção suína no país foi responsável no

ano de 2002 pelo emprego de 730 mil pessoas diretamente e 2,7 milhões indiretamente

(ROPPA, 2002 apud GONÇALVES; PALMEIRA, 2006).

As criações atualmente caracterizam-se pelo sistema intensivo e elevado grau de

tecnificação e desempenho (GONÇALVES; PALMEIRA, 2006), porém, em contraste,

convivem com propriedades de tecnificação mínima, destinadas a um mercado fragmentado

com poucas práticas voltadas à sanidade ou qualidade, mas que, por sua vez, constituem-

se como fonte de renda e subsistência a estes trabalhadores (BNDES, 1995).

Paralelamente à produção, ocorre a geração de excretas e efluentes, estes últimos

definidos pela Organização Mundial da Saúde como todo líquido com excretas animais ou

humanas, sem resíduos químicos industriais, podendo também ser chamado de esgoto,

sendo atualmente objeto de intenso debate ambiental, social, tecnológico, sanitário e

econômico (WHO, 2006).

A Lei federal brasileira número 6.938 (de 31/08/1981), dispõe sobre a Política

Nacional do Meio Ambiente, e em seu artigo 3º, inciso 3º, entende como poluição “atividades

que direta ou diretamente, prejudiquem a saúde, a segurança e o bem-estar da população,

criem condições adversas às atividades sociais e econômicas, afetem desfavoravelmente a

biota, afetem as condições estéticas ou sanitárias do meio ambiente e lancem matérias ou

energia em desacordo com os padrões ambientais estabelecidos”. Nesse sentido, as

atividades ligadas à suinocultura, conduzidas sem procedimentos zootécnicos adequados e

atendimento às exigências legais, em princípio são poluidoras (SEGANFREDO, 2000). As

fezes de suínos apresentam-se ricas em nutrientes capazes de causar sérios problemas

ambientais, como a eutrofização. Estimativas apontam que 20 milhões de hectares de terras

agriculturáveis no mundo são irrigados com efluentes brutos, tratados e/ou parcialmente

diluídos, tornando necessários mais estudos quanto aos danos e riscos que esta prática

pode trazer (HAMILTON et al., 2006).

Além disso, os efluentes constituem-se numa importante via de transmissão de

agentes patogênicos virais, parasitários e bacterianos (RZEZUTKA; COOK, 2004; JAY,

2005; HAMILTON et al., 2006; WHO, 2006; SEGANFREDO, 2007).

Dentre os agentes virais, os rotavírus participam da etiologia da diarréia em animais

neonatos de diversas espécies e constituem-se no principal agente etiológico da

gastroenterite infantil, sendo responsável por cerca de 610.000 óbitos em crianças

anualmente, sobretudo em países emergentes (PARASHAR et al., 2006, KHAMRIN et al.,

2007). O agente encontra-se bastante disseminado tanto mundialmente como no Brasil,

tendo sido descrito por diversos autores tanto em animais quanto em humanos (ALFIERI et

al., 1999; GREGORI, 2003; KHAMRIN et al., 2007; STEYER et al., 2008).

Cabe ressaltar o caráter zoonótico dos rotavírus ou mesmo sua capacidade de

infecção inter-espécies, no qual os suínos são considerados como principal reservatório

para a diversidade genética e antigênica dos rotavírus humanos (PAHO, 2001; MARTELLA

et al., 2005; COOK et al., 2004).

A principal via de transmissão dos rotavírus é indireta, pelo contágio fecal-oral

(ESTES; KAPIKIAN, 2007), onde o ambiente de criação exerce um importante papel na

propagação do agente. As partículas virais são eliminadas pelos animais durante a fase

aguda da diarréia, em torno de 10

partículas/mL de fezes (KOOPMANS; DUIZER, 2004).

É bem conhecida a elevada resistência dos rotavírus às condições ambientais.

Segundo a WHO (2006) o vírus permanece viável por 60±16 dias em esgoto comum, ou até

mesmo infectantes em temperaturas tão altas quanto 50 °C (FAUQUET et al., 2005). Ramos

et al. (2000) demonstraram que a infectividade dos rotavírus suínos pode ser mantida por

um longo período de tempo (32 meses aproximadamente) a 10 °C em fezes, tornando

preocupante a possibilidade de serem veiculados através dos efluentes não-tratados e como

conseqüência, disseminarem-se para outras criações, espécies animais ou mesmo

humanos, através de um curso d'água.

Considerando a importância das rotaviroses tanto em animais quanto em humanos, e

dada a escassez de informações quanto a possível eliminação do agente em criações de

suínos de baixo grau de tecnificação, este trabalho tem por objetivos:

a) Pesquisar a ocorrência de rotavírus a partir de amostras fecais de suínos, oriundas de

diferentes criações de baixa tecnificação localizadas em municípios no Estado de São Paulo.

b) Detectar a presença de rotavírus nos efluentes destas criações;

c) Contribuir para o entendimento de possíveis implicações ambientais das rotaviroses

suínas e sua prevenção.

2 - Revisão literária

2.1 - Suinocultura no Brasil

O mercado de carne suína é de grande importância para o Brasil e muito embora

seja o quarto maior produtor e exportador do mundo, há ainda um marcante potencial de

crescimento, sobretudo pelo fato de existirem terras passíveis de cultivo sem denegrir o

meio ambiente. A região de maior importância no país é a Sul, sendo responsável por 58,7%

da produção, porém, atualmente, a maior parte dos investimentos está direcionada para o

Centro-Oeste, contando com 14% do rebanho nacional (Anuário Brasileiro de Aves e Suínos,

2007).

Apesar dos elevados patamares de produção e sucesso obtidos, a trajetória da

suinocultura é recente no país. Com efeito, até o início do século XX, a produção era

rudimentar e destinada principalmente à subsistência, tornando-se então expressiva

décadas de 80 e 90, fruto da tecnificação do setor (GOYOS JÚNIOR, 2007; BNDES, 1995).

As criações industriais voltadas à exportação e mercado interno são caracterizadas

pela alta tecnificação (Figura 1), manejo intensivo, animais com alto valor genético e

rigoroso controle sanitário e nutricional, localizadas principalmente nas regiões Sul, Sudeste

e Centro Oeste do Brasil (GOYOS JÚNIOR, 2007).

Figura 1: Aspecto de uma suinocultura tecnificada. Destacam-se a alta densidade animal, higiene,

controle nutricional e a infraestrutura(NISHIDA, 2007).

Por outro lado, em algumas regiões coexistem suinoculturas de baixa tecnificação,

caracterizadas pelo baixo emprego de tecnologia (Figura 2) e geralmente voltadas à

subsistência, cuja participação no mercado interno é de 23% (GOYOS JÚNIOR, 2007;

BNDES, 1995).

Figura 2: Exemplo de uma criação de suínos com baixa (ou nenhuma) tecnificação. Observam-se o

mal estado de conservação das instalações e entulho próximo à baia de criação (NISHIDA,

2007).

2.2 - Efluentes

Os efluentes da suinocultura são uma mistura de água, fezes e urina, sem resíduos

químicos industriais (WHO, 2006), de composição química variável em função dos

elementos presentes na ração dos animais (PALHARES, 2007). Este último aspecto talvez

seja o grande entrave da utilização direta destes dejetos na agricultura industrial, devido à

demanda de um fertilizante homogêneo, nutricionalmente equilibrado e capaz de atender

uma escala correspondente às dimensões da plantação (SEGANFREDO et al., 2000).

2.2.1 - Aspectos legais

A Constituição Brasileira de 1988 foi a primeira da história do país a abordar

diretamente o meio ambiente (LENZA et al., 2008) tendo como influência a Declaração de

Estocolmo de 1972, reforçada ainda pela Declaração do Rio em 1992 e pelo Protocolo de

Quioto em 2002. De uma maneira geral são resguardados os seguintes princípios (PHILLIPI

JUNIOR, ALVES, 2005):

a) Ambiente ecologicamente equilibrado como direito fundamental da pessoa

humana. O meio ambiente saudável é parte integrada do direito humano não só relativo ao

bem estar, mas também da saúde e a própria existência do homem.

b) Natureza pública da proteção ambiental. Os bens ambientais são de natureza pública.

Ninguém pode utilizar o meio ambiente à sua conveniência.

c) Obrigatoriedade da intervenção estatal. O Estado não pode se omitir de proteger o

meio ambiente.

d) Prevenção e precaução. Os danos no meio ambiente são de difícil correção e

indenização, portanto, deve-se evitar ao máximo possível quaisquer danos ambientais.

e) Participação. Permite que todos os interessados possam a participar no cuidado do meio

ambiente, mesmo que indiretamente.

f) Informação e notificação ambiental. As pessoas têm direito ao acesso e notificação ao

se tratar de matérias ambientais.

g) Educação ambiental. A educação sobre as questões ambientais deve atingir a todos,

tanto jovens como adultos e os menos favorecidos, ampliando e estimulando a consciência

ambiental.

h) Poluidor pagador. O impacto ambiental deve ser levado conta pelo agente econômico,

antes de realizar qualquer alteração do meio ambiente, impondo uma contribuição pelo seu

uso.

i) Desenvolvimento sustentável. Evitar o esgotamento econômico dos bens ambientais,

devido à exploração excessiva ou poluição.

j) Ubiquidade. Todo ato, desde a legislação até a exploração, deve levar em conta a

proteção do meio ambiente, ou seja, tudo que se pretende fazer, criar ou desenvolver deve

passar preliminarmente por um crivo ambiental.

As questões envolvendo os efluentes contextualizam-se tanto nas áreas de

conhecimento da Saúde Pública quanto do Ambiente, estabelecidas na Constituição Federal

de 1988 no artigo nº 225, que declara: “Todos tem direito ao meio ambiente ecologicamente

equilibrado, bem de uso comum do povo e essencial à sadia qualidade de vida”.

Prova disto, a partir das premissas anteriores e agora dentro do escopo das

legislações infraconstitucionais, a Lei nº 8.080 de 19 de setembro de 1990, em seu artigo 3º

considera o saneamento como um fator determinante à saúde. Como definição, a Lei nº

6.938 de 31 de agosto 1981, artigo 3º, §3º, considera poluição as “atividades que direta ou

diretamente, prejudiquem a saúde, a segurança e o bem-estar da população, criem

condições adversas às atividades sociais e econômicas, afetem desfavoravelmente a biota,

afetem as condições estéticas ou sanitárias do meio ambiente e lancem matérias ou energia

em desacordo com os padrões ambientais estabelecidos.” (BRASIL, 1981).

As punições dos agravos ambientais relacionadas aos efluentes estão previstas na

Lei nº 9.605 de 12 de fevereiro de 1998 e no Decreto nº 3.179 de 21 de setembro 1999,

neste último, em seu artigo nº 41, prescreve-se multa a quem “causar poluição de qualquer

natureza em níveis tais que resultem ou possam resultar em danos à saúde humana, ou que

provoquem a mortandade de animais ou a destruição significativa à flora”, caracterizando no

§1º como causador de poluição hídrica, todo aquele causar a interrupção do suprimento

público de água de uma comunidade em função das suas atividades devido ao lançamento

de resíduos em desacordo com as leis ou regulamentação. Complementarmente, o artigo nº

45, sujeita a multa quem “disseminar doença ou praga ou espécies que possam causar

danos à agricultura, à pecuária, à fauna, à flora ou aos ecossistemas.”

Apesar do Decreto-Lei nº 2.848 de dezembro de 1940, artigo nº 21, afirmar que o

desconhecimento não é motivo de escusabilidade, existem atenuantes e agravantes para a

pena, definidos pela Lei nº 9.605, de 12 de fevereiro de 1998 (BRASIL, 1998).

No Estado de São Paulo, a Lei Estadual nº12.300 de 16 de março de 2006, artigo

nº14, §1° a 8°, proíbe que efluentes sejam:

a) Lançados céu aberto “in natura”, em redes de drenagem de águas pluviais, de esgotos,

eletricidade, telecomunicações e assemelhados;

b) Depositados inadequadamente e em locais sob regime de proteção especial ou sujeitas à

inundação;

c) Queimados a céu aberto;

d) Infiltrados no solo sem tratamento prévio e sem projeto aprovado pelo órgão de controle

ambiental estadual competente;

e) Utilizados para alimentação animal ou humana.

O artigo nº16 desta mesma Lei, exige dos responsáveis pela contaminação ou

degradação ambiental causada por estes resíduos o dever de realizar a recuperação das

áreas e pelo artigo nº48, de realizar o manejo ambientalmente adequado delas.

A Lei Estadual de São Paulo nº 9.509 de 20 de março de 1997, por sua vez,

regulamenta as penalizações impostas nos artigos 28 a 33, variando a infração desde uma

advertência, multa, embargo, até mesmo demolição ou confisco de bens, no qual a

gravidade tem como variante a reincidência, cumprimento das normas estabelecidas e os

danos causados.

Por último, os limites estabelecidos do despejo de poluentes estão na Resolução

nº 357 de 17 de março de 2005 do CONAMA, artigos 14 a 17. Ela define padrões aceitáveis

de coliformes fecais, cianobactérias, resíduos tóxicos, metais pesados e características

físico-químicas (BRASIL, 2005).

2.2.2 - Implicações ambientais e sanitárias

A intensificação dos processos produtivos animais tornaram o desprezo de efluentes

das criações animais num sério desafio ambiental, sobretudo em função do montante de

dejetos produzidos atualmente ser insuportável para a natureza, caso fossem lançados

diretamente na natureza (HOODA et al., 2000; SEGANFREDO, 2007). Apenas como

exemplos do volume de esgoto criado na suinocultura, a engorda de 10.000 animais produz

poluição equivalente a uma cidade com 18.000 habitantes (TOWNSEND; BEGON; HARPER,

2006) e nos Estados Unidos, os processos de alimentação animal geram 100 vezes mais

resíduos efluentes que os serviços de esgoto doméstico (GERBA; SMITH JUNIOR, 2005).

As fezes de suínos são ricas em material orgânico, abundante de nitrogênio e

fósforos e se lançadas num corpo d´água pode levar à ocorrência de dois eventos distintos,

porém muito relacionados; a eutrofização e a anaerobiose, descritos a seguir (HOODA et al.,

2000; TOWNSEND; BEGON; HARPER, 2006; SEGANFREDO, 2007).

A eutrofização consiste na multiplicação excessiva de algumas algas unicelulares na

água, tornando sua superfície rica em oxigênio enquanto sua porção mais profunda

apresenta-se anaeróbia devido à falta de luminosidade. Com isso, gera-se uma dinâmica

própria, resultando na morte dos fitobentos (plantas e algas do substrato aquático) e animais

pela falta de oxigenação. Porém, as algas da superfície que se proliferavam pelo excesso de

nutrientes (principalmente o fósforo), dado o esgotamento destes últimos, passam a morrer,

evoluindo o sistema para uma anaerobiose (CHORUS; BARTRAM, 1999; TOWNSEND;

BEGON; HARPER, 2006).

A anaerobiose, por sua vez, pode ocorrer diretamente sem a necessidade prévia de

eutrofização, a partir do momento quando determinadas bactérias decompõem os detritos

orgânicos lançados, aumentando demasiadamente a demanda de oxigênio, cujo resultado é

a redução do teor deste gás na água. Ela se difere da eutrofização porque tanto a superfície

como o fundo da água permanecem com teores baixos ou mesmo ausentes de oxigênio.

Este processo também é extremamente prejudicial ao ambiente, pois a falta de oxigênio

mata praticamente toda a fauna e flora do local e faz com que a água tenha um odor

pungente (TOWNSEND; BEGON; HARPER, 2006).

Além dos processos de eutrofização e anaerobiose, a presença das fezes causa

degradação paisagística e perda de potabilidade. Quando há lançamento das fezes no solo,

os impactos ambientais encontrados consistem na redução da fertilidade do solo com

acúmulo de metais pesados, multiplicação excessiva de moscas e na existência de um

lençol freático no subterrâneo, como risco de contaminação destas águas (SEGANFREDO,

2007).

No universo de problemas de saúde implicados pelos efluentes, as alterações dos

níveis nitrogênio devido o despejo de material fecal, causam efeitos tóxicos em humanos e

animais (TOWNSEND; BEGON; HARPER, 2006), como a metahemoglobinemia em

humanos, causada pela ingestão de elevadas quantidades de nitratos, cujas principais

vítimas são bebês e crianças que venham a consumir regularmente a água (WHO, 2006).

As fezes e água contaminada também são uma importante forma de contágio de

agentes causadores de doenças, entre eles parasitas, bactérias e vírus (JAY, 2005;

MEHNERT, 2003). Muitos destes contam com alta resistência ambiental, ou seja, não têm

dificuldade em permanecerem vários dias em ambiente adverso até estabelecerem uma

relação de parasitismo com um hospedeiro suscetível (WHO, 2006).

Dentre as zoonoses passíveis de se contraírem a partir do contato com excretas

suínas incluem-se a colibacilose (PELL, 1997), salmonelose, rotavirose, leptospirose (WHO,

2006) e hepatite E (KASORNDORKBUA et al., 2005).

A propósito, já foi descrito o encontro de rotavírus em verduras e água potável

(HERNÁNDEZ et al., 1997; WALTER et al., 2001; KOOPMANS; DUIZER, 2004; RZEZUTKA

et al., 2004; JAY, 2005; HAMILTON et al., 2006; VAN ZYL et al., 2006). Outros exemplos

incluem adenovírus humano (HE; JIANG, 2005), bacteriófagos (HARWOOD et al., 2005) e

enterovírus bovino (LEY; HIGGINS; FAYER, 2002). Na realidade, estima-se que cerca de

150 agentes microbianos patógenos já tenham sido relacionados à transmissão por

efluentes (GERBA; SMITH JUNIOR , 2005).

2.2.3 - Tratamento de efluentes

O tratamento dos efluentes, como visto, é obrigatório por lei e a redução de agentes

patógenos na água é uma preocupação da engenharia sanitária (LIBÂNIO, 2005). Portanto,

existe a necessidade de uma correta destinação dos efluentes gerados, que por sua vez

implica num adequado tratamento dos mesmos, fazendo-se necessários investimentos e

orientação técnica correta (SEGANFREDO, 2007). Na falta de uma escala de produção que

possa gerar recursos financeiros suficientes, os pequenos criadores por vezes encontram

grandes dificuldades quanto ao acesso de soluções para a destinação dos resíduos

(PALHARES, 2007).

Na suinocultura, a compostagem é uma alternativa para a destinação de animais

mortos e dejetos sólidos, consistindo a técnica em estocar o material em condição de

anaerobiose e então utilizá-lo como fertilizante (PEDROSO-DE-PAIVA, 1987). Outra opção

é o uso de biodigestor, no qual as excretas são colocadas com água em ambiente anaeróbio.

Este meio propicia a geração do biogás, opcionalmente utilizado com finalidades de

aquecimento, e cuja parte sólida restante, assim como a líquida, podem ser utilizadas na

agricultura, sem o odor desagradável. Por ser uma medida mitigadora do efeito estufa,

possibilita a venda de créditos de carbono, se forem atendidos os requerimentos para tanto.

O biodigestor, contudo, implica em investimento de capital maior em relação às outras

opções de tratamento de efluentes, nem sempre disponível ao produtor (PALHARES, 2007).

Entre os meios alternativos de baixo custo e não tradicionais, Brandão et al. (2007)

pesquisaram a viabilidade do uso de filtros de material orgânico, tendo sido avaliados casca

de arroz, casca de frutos do cafeeiro, bagaço de cana de açúcar, sabugo de milho,

serragem de madeira e fino de carvão vegetal, como componentes deste sistema. Dentre

eles, os autores observaram maior efetividade na retenção de matéria orgânica e minerais

utilizando-se o bagaço de cana e a serragem de madeira.

A lagoa de decantação (ou de estabilização) é um dos tratamentos mais utilizados na

suinocultura brasileira em função da sua eficiência e relativa facilidade de implementação. O

sistema compreende duas fases, sendo a primeira a decantação dos efluentes e uma

segunda etapa o tratamento da matéria orgânica, feito numa lagoa destinada a este fim com

a marcante ação de microorganismos que atuarão sobre este substrato (PERDOMO et al.,

1999). É considerado um método efetivo para eliminar bactérias, vírus e ovos de parasitas

(VARÓN; COLOMBIA; MARA, 2004).

2.3 - Rotavírus

O rotavírus pertence à família Reoviridae, gênero Rotavírus, cuja morfologia é

semelhante a uma roda radiada (do latim “rota”, significa roda) (FAUQUET et al., 2005),

acometendo animais de diferentes espécies e crianças, principalmente de até 5 anos de

idade (CARMO, 2006).

Na suinocultura, a rotavirose afeta principalmente animais de maternidade e creche

(entre 5 a 35 dias de vida), sendo altamente infecciosa, cujo principal sintoma é uma

gastroenterite de grau variável, aliado à inapetência, febre e eventualmente vômitos, com

duração entre 4 a 6 dias, podendo levar o animal à morte ou a infecção ser auto limitante.

Sua ocorrência acarreta, portanto, prejuízos ao produtor, em função da morte e refugo dos

animais, perda de uniformidade dos lotes e custos por tratamento de suporte (MORES et al.,

1987; PAHO, 2001).

A partícula viral do rotavírus mede aproximadamente 75 nm e possui um capsídeo

icosaédrico de 3 camadas protéicas não envelopadas com 60 espículas protéicas. Seu

material genético é um RNA de fita dupla, constituído de 11 segmentos e tamanho

aproximado de 18.000 pares de base. Das doze proteínas dos rotavírus, seis são estruturais,

denominadas VP (do inglês “viral protein”), sendo elas VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e VP7, e

outras seis não estruturais, NSP (no inglês “Non-structural protein”), a NSP1, NSP2, NSP3,

NSP4, NSP5 e NSP6, (ESTES; KAPIKIAN, 2007).

A camada exterior do vírus é composta pela VP7 e permeada por espículas

formadas de dímeros da VP4. A camada intermediária é constituída pela VP6, onde a VP4

está ancorada e a camada mais interna da partícula cujo componente é a molécula VP2,

que envolve as moléculas VP1, VP3 e o genoma (TANIGUCHI; URASAWA, 1995;

HOSHINO; KAPIKIAN, 2000; WARD et al., 2006).

Até o presente momento foram definidos 5 diferentes grupos de rotavírus, com base

na proteína viral VP6, sendo eles: A, B, C, D e E, admitindo-se a possibilidade de

adicionalmente mais dois: F e G. Os rotavírus do grupo A são os mais prevalentes na

maioria dos surtos em diferentes espécies animais, tanto que os demais são por vezes

denominados “rotavírus não-A”. Assim, embora existam diferenças entre os rotavírus do

grupo A, quer em amostras animais ou humanas, o diagnóstico imunológico destes vírus,

por exemplo através do teste de ELISA, é facilitado, já que todas as amostras conhecidas do

grupo A compartilham epítopos de reatividade cruzada, localizados na VP6 (FAUQUET et al.,

2005; ESTES; KAPIKIAN, 2007).

Outros epítopos, denominados antígenos de subgrupo, foram definidos

sorologicamente também com base na VP6 e têm sido usados como marcadores

epidemiológicos para os rotavírus do grupo A, dada a possibilidade de ajudar na

diferenciação das amostras (BISHOP, 1994).

Os rotavírus também podem ser classificados em sorotipos definidos pela reatividade

imunológica dos vírus frente a duas proteínas: a “VP4” e “VP7”. Assim, o sorotipo do VP7 é

denominado G, pela VP7 ser uma glicoproteína e o sorotipo do VP4 é denominado P pela

VP4 ser protease sensível (HOSHINO; KAPIKIAN, 2000).

Entretanto, a sorotipagem de amostras apresenta algumas limitações principalmente

quanto ao acesso e desenvolvimento de anticorpos específicos necessários para os testes.

Houve, portanto, um incremento a partir da década de 1990 do uso de reações de Biologia

Molecular, que independem destes reagentes, entre elas a transcrição reversa de RNA

aliada à reação em cadeia pela polimerase (PCR) (GENTSCH et al., 1992; DAS et al., 1994;

GOUVEA; SANTOS; TIMENETSKY , 1994a, b; HOSHINO; KAPIKIAN, 2000).

Existe correlação biológica entre os genótipo e sorotipo G, fato este que não ocorre

quanto aos sorotipos e genótipos P, onde não há concordância na classificação (ESTES;

KAPIKIAN, 2007), adotando-se por convenção, colocar os algarismos entre colchetes

quando se trata de um genótipo de P e ao ser um sorotipo, se escrever sem os colchetes

(HOSHINO; KAPIKIAN, 2000). As causas desta não concordância, entre outras, incluem os

mecanismos de diversidade evolutiva dos rotavírus, os quais incluem mutações pontuais,

rearranjo e a reestruturação (TANIGUCHI; URASAWA, 1995).

Até o momento presente, foram relatados 16 diferentes tipos G e 27 genótipos P,

com uma aparente predominância de certos genótipos infectando diferentes espécies

hospedeiras. Em suínos, os genótipos G3, G4, G5, G11, P[6] e P[7] são os mais

frequentemente detectados, muito embora existam relatos do encontro de amostras G1, G2-

like, G6, G8, G9, G10, P[13], P[19], P[23], P[26] e P[27] (KHAMRIN et al., 2007; MARTELLA

et al., 2007; PARRA et al., 2008; STEYER et al., 2008).

A via de transmissão do rotavírus é fecal-oral, contando com importante participação

do ambiente, água, alimentos e fômites (SAIF; ROSEN; PARWANI, 1994; COOK et al.,

2004; GRATACP-CAVALLIER et al., 2000). O vírus pode permanecer na criação ao ser

eliminado pelos animais sintomáticos como pelas porcas assintomáticas e causar surtos

quando há redução da imunidade do rebanho por estresse ambiental ou mudança de

manejo, dentre outros fatores (MORES et al., 1987).

A rotavirose tem um caráter zoonótico, amplamente revisado por Cook et al. (2004).

Segundo a Organização Pan-Americana da de Saúde, apesar do rotavírus ser um agente

espécie específico, ele pode infectar outros animais (FLORES et al., 1986 apud PAHO,

2001), mas de acordo com Estes e Kapikian (2007) a transmissão interespécies é rara.

Mesmo assim, a Organização Mundial de Saúde considera a rotavirose como uma zoonose

com possibilidade de ser transmitida pela água (WHO, 2004).

Entre relatos zoonóticos de rotaviroses no mundo, Nakagomi et al. (1992)

diagnosticaram uma amostra humana (Ro1845, sorotipo G3) de provável origem animal em

Israel; LAIRD et al. (2003), detectaram genótipos P pertencentes a rotavírus de origem suína

e canina no México; Banerjee et al. (2007) encontraram na Índia, a partir de amostras

humanas de crianças assintomáticas, um rotavírus G11P[25] no qual, os autores relatam a

possibilidade de uma interação zoonótica, ao considerarem que o genótipo G11 é mais

frequentemente encontrado em bovinos e suínos. Estes mesmos autores também

encontraram uma amostra G3P[3], cujo genótipo G3 mostrava maior identidade nucleotídica

com cepas animais, comparada às humanas.

No Brasil, Gouvea, Santos e Timenetsky (1994a) observaram a presença do sorotipo

humano G8 em amostra suína pela prova de PCR; Gabbay et al. (2008) detectaram por

PCR, rotavírus do grupo C com características suínas em fezes de crianças na cidade de

Belém, Pará; e Mascarenhas et al. (2007) encontraram rotavírus humano com seqüências

nucleotídicas de VP4 e NSP4 semelhantes às de origem suína, também na cidade de Belém,

no Estado do Pará.

Foram desenvolvidos vários testes visando o diagnóstico de rotavírus, dentre eles a

microscopia eletrônica (BISHOP et al., 1973), imunofluorescência e imunomicroscopia

eletrônica (BRIDGER; WOODE, 1975), ensaio imunoenzimático (ELLENS; DELEEUW,

1977; GREGORI et al. 2000), radioimunoensaio (CUCKOR; BERRY; BLACKLOW, 1978),

co-aglutinação com proteína A do Staphylococcus aureus (DURIGON et al., 1991),

contraimunoeletroforese (CANDEIAS; ROSENBURG; RÁCZ, 1978) e reação em cadeia pela

polimerase precedido por transcrição reversa (GOUVEA et al., 1991; TANIGUCHI et al.,

1992), "real-time" RT-PCR (SCHWARZ et al., 2002).

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) tornou-se uma importante técnica

laboratorial e epidemiológica na caracterização das amostras de vírus. Consiste em extrair o

RNA viral e observar os segmentos genômicos de acordo com a sua mobilidade

eletroforética (HERRING et al., 1982). Assim, ela permite a detecção de rotavírus de

qualquer grupo (ESTES; KAPIKIAN, 2007), dispensando o desenvolvimento de reagentes

imunológicos (HERRING et al., 1982), apesar de ter uma execução relativamente complexa,

dificultando o processamento em grande quantidade de amostras (JEREZ, 1997).

A técnica de ELISA é uma alternativa bastante sensível, específica e com maior

praticidade metodológica, mas depende diretamente da qualidade dos anticorpos

empregados e de sua disponibilidade (BEARDS et al., 1984; GREGORI et al., 2000). Apesar

do ELISA ser um método eficiente para detecção do agente, é importante que haja outras

técnicas confirmatórias da presença do vírus (MARKOWSKA et al., 1996). Atualmente, o

ELISA é empregado principalmente na detecção dos rotavírus do grupo A (PAHO, 2001).

A RT-PCR é uma técnica de alta sensibilidade e especificidade, no qual teoricamente

é possível detectar apenas uma partícula viral, mas em prática, o limiar se encontra entre

100 a 1000 partículas virais (WALTER, 2001). Outra característica da RT-PCR é a

possibilidade de se caracterizarem os genótipos virais em conjunto com a detecção

(GOUVEA et al., 1994a), desde que haja os primers adequados (GOUVEA et al., 1990).

Comparando as três técnicas anteriormente citadas mais a microscopia eletrônica,

Winiarczyk; Gradzki (2002) encontraram valores sensibilidade e especificidade respectivos

de 91,3% e 100% para PAGE, 78,3% e 100% para a microscopia eletrônica, 100% e 94,7%

para ELISA e 100% de e 98,7% para RT-PCR.

Com relação às suas características de persistência ambiental, os rotavírus

apresentam uma elevada viabilidade, estimada em 60±16 dias em esgoto comum (WHO,

2006); 7 meses no meio ambiente (ESTES; KAPIKIAN, 2007); temperaturas de 60°C, bem

como grande amplitude de pH, frente a uma diversidade desinfetantes conhecidos (RAMOS

et al., 2000).

A variação do tempo que o vírus se mantém estável está em função da temperatura

e condições ambientais, constatado por Walter (2001) ao encontrarem valores de

persistência de 14 dias no verão e 200 dias no inverno na Alemanha.

Favorece a sua persistência o elevado número de partículas virais eliminadas pelas

fontes de infecção, em torno de 10

partículas viáveis por grama de fezes (KOOPMANS;

DUZIER, 2004), enquanto a dose mínima de infecção é considerada apenas uma unidade

viral (WALTER, 2001).

A presença do rotavírus em efluente tratado já foi demonstrada em esgoto municipal

de Pequim (XE et al., 2008), em suínos nos Estados Unidos, a partir de amostras colhidas

em lagoa de decantação, biodigestor e compostagem, por Constantini et al. (2007),

mediante as técnicas de ELISA e PCR e também em águas fluviais no município de Manaus,

Amazonas, Brasil (MIAGOSTOVICH et al., 2008). Cabe ressaltar que a quantidade estimada

de partículas virais presente em efluentes geralmente é baixa, variando entre 10

a 10

partículas virais por litro, porém suficiente para infectar um hospedeiro (BATES; GODDARD;

BUTLER, 1984; DESSELBERGER, 1995 apud SCHWARZ, 2002; WHO, 2006 e WALTER,

2001).

3 - Materiais e Métodos

Neste capítulo estão descritos os materiais e metodologias utilizadas para a

realização deste trabalho.

Resumidamente, foi delineado um estudo transversal, com amostragem não-

probabilística, com o intuito de se diagnosticar a presença de rotavírus a partir de amostras

clínicas e efluentes mediante o emprego em paralelo das reações de Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida (PAGE) e ELISA. Para a confirmação dos resultados de ELISA, foi

estabelecido o emprego em série do RT-PCR das amostras positivas. Os resultados foram

tabulados e analisados a concordância entre tais provas mediante o coeficiente Kappa.

3.1 - Propriedades

Em função da ausência de definição na literatura acerca da caracterização de granja

de baixa tecnificação, adotou-se como critério o atendimento a pelo menos três dos

seguintes aspectos: rara (ou nenhuma) orientação técnica de veterinário na criação;

ausência ou pouca racionalização do espaço de criação em termos de instalações

zootécnicas e de manejo dos animais; ausência de escrituração zootécnica; uso de lavagem

como base da alimentação dos animais; ausência de restrição à entrada e saída de

tratadores ou da circulação de outras espécies animais nas áreas de criação de suínos. No

total, foram visitadas 16 propriedades localizadas nos municípios de Descalvado, Embu

Guaçú, Francisco Morato, Franco da Rocha, Ibiúna, Itapeva, Mairiporã, Nova Odessa,

Piedade e São Paulo (Figura 3), todos estes no Estado de São Paulo.

Figura 3: Mapa político do Estado de São Paulo sem escala (IBGE, 2009 disponível em

http://www.ibge.gov.br/. acesso em 05/02/2009, 11:26:12). As propriedades visitadas neste estudo

encontram-se nos municípios destacados em vermelho.

3.2 - Amostras fecais e efluentes

Foram colhidas amostras de fezes de leitões com quadro clínico de diarréia e águas

de efluentes, em criações com baixa tecnificação do Estado de São Paulo, totalizando 69

amostras, das quais 16 consistem de efluentes e 53 de fezes, sendo pelo menos uma de

cada propriedade. Foi também observado qual o sistema de tratamento de efluentes nelas

presentes.

As colheitas de amostras fecais foram feitas mediante a compressão do abdômen

dos leitões, sendo indicativos a presença de fezes liquidas e/ou pastosas nas baias,

resíduos de fezes emplastradas no corpo dos leitões e/ou eritema em região perianal. Com

relação aos efluentes, foram colhidos pós tratamento em quantidade aproximada de 300mL

a partir do local que estes eram despejados para fora da criação. As amostras fecais e de

efluentes foram mantidas sob refrigeração durante a colheita e congeladas a -20°C até o

momento do processamento.

3.3 - Detecção de rotavírus

Foi adotado um esquema diagnóstico em paralelo (THRUSFIELD, 2004), utilizando-

se as técnicas de PAGE e ELISA em todas as amostras colhidas. A confirmação dos

resultados positivos gerados, e adicionalmente a genotipagem viral, foram feitas mediante

emprego da reação de RT-PCR.

3.3.1 - Preparo do material fecal e efluente

As amostras de efluentes foram concentradas mediante osmose, utilizando-se

açúcar refinado e sacos de diálise (Sigma

D6191), com retenção de proteínas maiores que

12.000 Da, reduzindo-se o volume a aproximadamente 5 mL.

Quanto as amostras fecais, diluíram-se aproximadamente 5 gramas de cada material

em tampão TRIS-HCl 0,1 M pH 7,3, em proporção de 1:5 (p/v), utilizando-se tubos de

polipropileno contendo em seu interior algumas pérolas de vidro e identificados

individualmente. Homogeneizou-se este material em agitador de tubos tipo vórtex por 3

vezes em intervalos de 10 minutos. O material foi então centrifugado a 11.400 g durante 30

minutos.

Quanto aos efluentes, já concentrados, eles foram apenas centrifugados nas

condições anteriormente citadas e utilizado o seu sobrenadante nas etapas subseqüentes.

O controle positivo foi feito com amostra NCDV de rotavírus, gentilmente cedida pelo

Laboratório de Virologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade

de São Paulo.

3.3.2 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

Foi realizada segundo Herring et al. (1982) com algumas modificações,

particularmente nas etapas de extração de RNA viral.

3.3.2.1 - Extração do RNA viral para a PAGE

A extração do RNA viral para a prova de PAGE consistiu em transferir 400 µL da

suspensão fecal ou efluente previamente preparado (Item 3.3.1) em um tubo de

polipropileno e adicionar 40 µL de SDS, este último previamente diluído à concentração de

10% (p/v) em água ultrapura. Depois, 40 µl de acetato de sódio 1 M e 400 µl de solução

fenol (240 µL)/clorofórmio (156 µL)/álcool isoamílico (4 µL) (v/v) (Anexo 1, Item 1) foram

adicionados e posteriormente, os tubos foram agitados em vórtex por um minuto e

centrifugados a 8.000 g por 2 minutos, para então se transferir o sobrenadante para outros

tubos previamente identificados.

A próxima etapa consistiu em adicionar 800µL de etanol 75% a 4 °C em cada tubo e

agitá-los em vórtex por 1 minuto. Os tubos então foram incubados por 8 horas a – 20 °C, e

depois centrifugados 13.800 g por 10 minutos. Após esta etapa, o sobrenadante foi

desprezado, o tubo invertido sobre papel filtro e removido o excesso de etanol. A seguir, o

sedimento foi ressuspenso em 20 µL de dissociador de amostra (anexo 1, item 2) e os tubos

incubados a 56 °C por 15 minutos. Finalmente, foram adicionados 15 µL de cada amostra

nas canaletas da placa de gel de poliacrilamida (Item 3.3.2.2).

3.3.2.2 - Preparo do gel de poliacrilamida

Em posição horizontal, os espaçadores foram colocados sobre uma das placas,

sobrepondo-se a outra restante, sendo ambas presas com garras metálicas. A seguir, foi

promovido o correto ajuste das peças, no qual as extremidades das placas foram vedadas

com agarose fundida a 2% (p/v em água ultrapura). Em seguida o conjunto foi colocado em

posição vertical, apoiado sobre as garras, mantendo-se um correto nível horizontal no

espaço destinado ao gel para finalmente se adicionar o gel de corrida a 7,5% (Anexo 1, Item

7) até o nível ligeiramente inferior à extremidade do pente e se aguardou a polimerização. O

gel de empilhamento a 3,5% (Anexo 1, Item 7) foi adicionado, assim como o pente, e se

aguardou a polimerização.

Após a última polimerização, as garras da parte inferior do conjunto foram soltas,

retirando a vedação e o espaçador da base. As placas montadas foram então fixadas ao

suporte de eletroforese com o auxílio das garras, evitando a formação de bolhas. A face

com a placa de vidro recortada ficou encostada ao suporte, abaixo do nível superior do

aparato de eletroforese vertical. A seguir, os reservatórios foram preenchidos com tampão

de corrida (Anexo 1, Item 9) e o pente foi retirado em movimentos firmes e verticais.

3.3.2.3 - Condições de corrida eletroforética

Cada amostra foi colocada em sua canaleta correspondente com o auxílio de um

pipetador, numa quantidade aproximada de 15 µL (item 3.3.2.1). Depois, os “plugs” da fonte

de tensão foram conectados e a corrente regulada em 20 mA. A corrida eletroforética tinha

um tempo estimado de 2 horas, se adotando como medida geral, esperar que a linha azul

decorrente da presença de azul de bromofenol presente na solução dissociadora da amostra

percorresse toda a placa para então finalizar a eletroforese dentro de 30 minutos.

3.3.2.4 - Coloração com nitrato de prata

Após a finalização da eletroforese, as placas de suporte foram retiradas, assim como

uma das placas de vidro. O gel de empilhamento foi eliminado e se fez uma referência no

gel com um pequeno corte na margem superior esquerda. Depois, deslizou-se o gel pela

placa de vidro lavando-se a placa com água ultrapura para um recipiente plástico. O gel foi

lavado 3 vezes com água ultrapura e a solução de etanol-ácido acético (Anexo 1, Item 10)

foi adicionada, mantendo-se sob agitação por 30 minutos. Desprezou-se a solução anterior,

e o gel imerso em solução de nitrato de prata 0,011 M sob agitação por 60 minutos para

então se desprezar esta solução. Depois, o gel foi lavado 3 vezes com água ultrapura para

se remover todo o resíduo de nitrato de prata. Uma vez removida toda a água de lavagem,

adicionou-se a solução reveladora Anexo 1, Item 11), até o aparecimento nítido das bandas.

Uma vez observadas estas bandas, a solução reveladora foi removida e se adicionou ao gel

a solução de ácido acético previamente diluído em água ultrapura a 5% (v/v). Após 15

minutos, o gel então, foi lavado 3 vezes com água ultrapura e a água residual eliminada; a

solução de etanol 15% foi adicionada e examinou-se o gel com auxílio de transiluminador

com luz visível.

3.3.2.5 - Interpretação dos resultados

Consideraram-se positivas as amostras que apresentaram disposição de bandas na

migração eletroforética de padrão compatível com os grupos de rotavírus, sendo

considerado no experimento como amostra padrão positiva o NCDV.

3.3.3 - Reação de ELISA

Foi empregado um método de ELISA direto do tipo “duplo sanduíche” no qual o

antígeno é capturado em fase sólida (microplaca) por anticorpo policlonal elaborado em

carneiro, revelado através de anticorpo elaborado em coelho e um conjugado anticoelho

(com peroxidase), segundo metodologia descrita por Gregori et al. (2000).

3.3.3.1 - Condições de teste

A microplaca de ELISA (Nunc-Maxisorp

) foi sensibilizada com anticorpo de captura

em concentração de 10 µg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9,6 (Anexo 2,

Item 1), e incubada a 4 °C por 18 horas. Depois, cada cavidade da microplaca foi lavada

com 250 µL de tampão de lavagem (Anexo 2, Item 2.4), por 3 vezes consecutivas e a placa

bloqueada através da adição de 200 µL por cavidade de tampão carbonato-bicarbonato

0,05 M pH 9,6 (Anexo 2, Item 1) acrescido de leite em pó desnatado a 10% (p/v),

mantendo-se a placa a 37 °C por 1 hora.

A seguir, cada cavidade foi lavada com 250 µL de tampão de lavagem (Anexo 2, Item

2.4), por 3 vezes consecutivas. As amostras fecais tratadas (Item 3.3.1) foram adicionadas e

diluídas a 1:4 (v/v) em tampão de lavagem (Anexo 2, Item 2.4), acrescido de leite em pó

desnatado a 5% (p/v), em volume final de 100 µL por cavidade, em duplicata. A microplaca

foi vedada e incubada em estufa a 37 °C por 1 hora e finalmente, cada cavidade foi lavada

com 250 µL de tampão de lavagem (Anexo 2, Item 2.4), por 3 vezes consecutivas.

O anticorpo revelador foi diluído a 1:100 em tampão de lavagem (Anexo 2, Item 2.4),

acrescido de leite em pó desnatado a 5% (p/v), e adicionado em volume final de 100 µL por

cavidade. Depois, a microplaca foi incubada em estufa a 37 °C por 1 hora, sendo que cada

cavidade foi posteriormente lavada com 250 µL de tampão de lavagem (Anexo 2, Item 2.4)

por 3 vezes consecutivas.

Adicionou-se o conjugado (Sigma

A-61543) na diluição de 1:1.000 em tampão de

lavagem (Anexo 2, Item 2.4) acrescido de leite em pó desnatado a 5% (p/v) em volume final

de 100 µL por cavidade. A microplaca foi incubada em estufa a 37 °C por 1 hora e

posteriormente, cada cavidade foi lavada com 250 µL de tampão de lavagem (Anexo 2, Item

2.4), por 3 vezes consecutivas, para então se adicionar a solução cromógena (Anexo 2, Item

3.3) em volume de 100 μL por cavidade.

Passados 10 minutos, foi adicionada a cada cavidade 50 μL de HCl 1 N, realizada a

leitura da reação em aparelho leitor de microplacas com filtro de 492 nm, utilizando-se a

amostra NCDV de rotavírus como controle. Os valores de absorbância obtidos foram

expressos através da média aritmética da duplicata de cada diluição, considerando-se

amostra positiva aquela cujo valor da absorbância fosse maior que o ponto de corte.

3.3.4 - Reação de RT-PCR

As reações visando o diagnóstico de rotavírus, e adicionalmente a sua

caracterização genotípica, foram baseadas em RT-PCR utilizando-se primers e suas

respectivas condições de amplificação previamente descritas por Gouvea, Santos e

Timenetsky (1994a, 1994b).

Para a extração de RNA total foi utilizado o reagente TRIzol

(Invitrogen™) de

acordo com as instruções do fabricante, a partir de suspensões fecais ou efluentes

previamente clarificados por centrifugação (Item 3.3.1).

A partir do RNA extraído, procedeu-se a reação de transcrição reversa (síntese de

DNAc), na qual foram inicialmente misturados 5,6 µL da amostra de RNA extraído com

1,4 µL DMSO, desnaturado a 97 °C por 5 minutos e mantidos em gelo. Estes foram então

adicionados à solução composta por 1x First Strand Buffer (Invitrogen™), 1 mM de cada

dNTP, 10 mM DTT, 1 pmol/µL de cada primer (Con2 e Con3, para a detecção/genotipagem

P; Beg9, End9, End9UK e End9CRW8, para a detecção/genotipagem G) e 200 U M-MLV

Reverse Transcriptase (Invitrogen™) para um volume final de reação de 20 µL, mantidos a

42 °C por 1 hora.

A seguir, 5 µL do DNAc foi adicionado à solução de PCR composta por 1x PCR

Buffer (Invitrogen™), 0,2 mM de cada dNTP, 0,5 pmol/µL de cada primer (Con2 e Con3,

para a detecção/genotipagem P; Beg9, End9, End9UK, e End9CRW8, para a

detecção/genotipagem G), 1,5 mM de MgCl

, 1,25 U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen™),

água ultrapura q.s.p. 50 µL. A solução foi então submetida em termociclador, a 30 ciclos de

94 °C/ 1 minuto, 42 °C/ 2 minutos, 72 °C/ 1minuto, seguido de 72 °C/ 10 minutos para

extensão final.

A segunda amplificação ("nested-PCR"), consistiu em misturar 5 µL de DNA

amplificado na etapa anterior à solução composta por 1x PCR Buffer (Invitrogen™), 0,2 mM

de cada dNTP, 0,5 pmol/µL de cada primer (Con2, pUK, pNCDV, pGOTT, pB223 e pOSU

para a detecção/genotipagem P; sBeg9, FT5, ET10, DT6, BT11 e HT8 para

detecção/genotipagem G), 1,5 mM de MgCl

, 1,25 U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen™),

água q.s.p. 50 µL, e submetidos a 25 ciclos de 94 °C/ 1 minuto, 55 °C/ 2 minutos, 72 °C/1

minuto, seguindo-se um passo final de 72 °C/10 minutos para extensão final.

Em seguida, 10 µL dos produtos oriundos tanto da 1ª quanto da 2ª amplificação

foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% (p/v) em tampão TRIS-borato

0,045 M; EDTA 0,001 M pH 8,0, fazendo-se corar o gel em banho de água com 0,5 µg/mL

de brometo de etídio por 10 minutos. Cada uma das etapas da RT-PCR (extração,

transcrição reversa, PCR e eletroforese) foi conduzida em salas separadas, sendo utilizando

como controle positivo a amostra NCDV de rotavírus e água ultrapura como negativo.

Consideram-se positivas as amostras que, apresentaram no gel segmentos (bandas)

visíveis de tamanho correspondente àqueles descritos por GOUVEA et al. (1994a,b), em

qualquer uma das etapas de PCR (1ª ou 2ª amplificação), tendo como referência a inclusão

de 10 µL de DNA ladder 100 bp (Invitrogen™).

3.4 - Concordância

Foi calculada a concordância dos resultados gerados entre as técnicas de PAGE e

ELISA através do teste Kappa (MARTIN; MEEK; WILLBERG, 1987) a um intervalo de

NOORDHUIZEN; THRUSFIELD). Além disso, foi definida a frequência de resultados

positivos à RT-PCR concordantes com aqueles gerados pelas provas de PAGE e ELISA.

4 - Resultados

4.1 - Criações e tratamentos de água

Nas propriedades, foram encontradas diferentes formas de destinação final

dos efluentes, variando desde a presença de biodigestor e compostagem, até o lançamento

direto em curso de água, conforme a Tabela 1 e Figuras 4 e 5.

Tabela 1: Destinação e tratamento de efluentes em granjas de suínos de baixa tecnificação

amostradas no presente estudo. São Paulo – 2008.

Propriedade

Município

Tratamento

São Paulo

Efluente sem tratamento

Piedade

Caixa de decantação com destinação a agricultura

Embu-guaçu

Aterro

São Paulo

Caixa de decantação com destinação a agricultura

Francisco Morato

Caixa de decantação com destinação a agricultura

São Paulo

Caixa de decantação com destinação a agricultura

Itapeva

Caixa de decantação com destinação a agricultura

Descalvado

Biodigestor

São Paulo

Efluente sem tratamento

São Paulo

Efluente sem tratamento

Nova Odessa

Caixa de decantação com destinação a agricultura

Nova Odessa

Caixa de decantação com destinação a agricultura

Ibiúna

Solo sem tratamento

Nova Odessa

Solo sem tratamento

Franco da Rocha

Compostagem

Nova Odessa

Solo sem tratamento

Fonte: NISHIDA, 2008

Dentre as propriedades apresentadas na Tabela 1, observou-se que 7/16 (43,75%)

das criações destinavam os efluentes numa caixa de decantação para posterior uso do

material na agricultura; 3/16 (ou 18,75%) desprezava o efluente diretamente em solo; 3/16

(ou 18,75%) lançava-os sem tratamento em corpo d´água, e por último, a utilização de

aterro (1/16 ou 6,25%), compostagem (1/16 ou 6,25%) e biodigestor (1/16 ou 6,25%).

Figura 4: Emissão de efluente de criação de suínos diretamente em corpo d´água. (NISHIDA, 2007).

Figura 5: Tanque de decantação de efluentes danificado, apresentando vazamento, presente em

criação de suínos. (NISHIDA, 2007).

4.2 - Amostras fecais e efluentes

Foram colhidas 69 amostras, das quais 53 eram de origem fecal e 16 de efluentes,

cujos resultados dos testes para a presença de rotavírus mediante os testes de PAGE e

ELISA estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: Resultados dos testes de PAGE e ELISA em amostras fecais e de efluentes de

granjas de criação de suínos. São Paulo – 2008.

Identificação

Propriedade

Município

Material

PAGE

ELISA

São Paulo

fezes

NEG

POS

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

efluente

NEG

Piedade

fezes

NEG

Piedade

fezes

NEG

Piedade

fezes

NEG

Piedade

fezes

NEG

Piedade

fezes

NEG

Piedade

efluente

NEG

Embu-guaçu

fezes

POS

Embu-guaçu

fezes

NEG

POS

Embu-guaçu

fezes

NEG

Embu-guaçu

fezes

NEG

Embu-guaçu

fezes

NEG

Embu-guaçu

efluente

NEG

POS

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

efluente

NEG

POS

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Fonte: NISHIDA, 2008

Notas: Abreviaturas utilizadas:

"POS" significando resultado positivo ao teste

"NEG" significando resultado negativo ao teste

(Cont.) Tabela 2: Resultados dos testes de PAGE e ELISA em amostras fecais e de

efluentes de granjas de criação de suínos. São Paulo – 2008.

Identificação

Propriedade

Município

Material

PAGE

ELISA

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

fezes

NEG

Francisco Morato

efluente

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

efluente

NEG

Itapeva

fezes

NEG

Itapeva

fezes

NEG

POS

Itapeva

fezes

NEG

POS

Itapeva

fezes

NEG

POS

Itapeva

fezes

NEG

POS

Itapeva

efluente

NEG

POS

Descalvado

fezes

NEG

Descalvado

fezes

NEG

Descalvado

efluente

NEG

POS

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

efluente

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

fezes

NEG

São Paulo

efluente

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

Nova Odessa

fezes

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

Nova Odessa

efluente

NEG

POS

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

Nova Odessa

fezes

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

Nova Odessa

efluente

NEG

POS

Ibiúna

fezes

NEG

Ibiúna

fezes

NEG

Ibiúna

efluente

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

Fonte: NISHIDA, 2008

Notas: Abreviaturas utilizadas:

"POS" significando resultado positivo ao teste

"NEG" significando resultado negativo ao teste

(Cont.) Tabela 2: Resultados dos testes de PAGE e ELISA em amostras fecais e de

efluentes de granjas de criação de suínos. São Paulo – 2008.

Identificação

Propriedade

Município

Material

PAGE

ELISA

Nova Odessa

efluente

NEG

POS

Franco da Rocha

fezes

NEG

Franco da Rocha

fezes

NEG

Franco da Rocha

fezes

NEG

Franco da Rocha

efluente

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

Nova Odessa

efluente

NEG

Fonte: NISHIDA, 2008

Notas: Abreviaturas utilizadas:

"POS" significando resultado positivo ao teste

"NEG" significando resultado negativo ao teste

Das 53 amostras fecais testadas, 1 delas (1/53 ou 1,8%) foi positiva para a presença

de rotavírus por PAGE sendo pertencente ao sorogrupo A, enquanto que 12 (12/53 ou

22,64%) entre elas foram positivas por ELISA.

Se consideradas as 16 propriedades envolvidas no estudo, apenas uma delas

apresentou resultado positivo para rotavírus a partir de material fecal, enquanto que, por

ELISA, 6 propriedades tiveram pelo menos uma amostra fecal positiva (6/16 ou 37,5%).

Das 16 amostras de efluentes testadas, nenhuma delas apresentou-se positiva para

a presença de rotavírus mediante a prova de PAGE (0/16 ou 0%), enquanto que, por ELISA,

observaram-se 7 amostras positivas (7/16 ou 43,75%).

Se consideradas apenas as propriedades que foram simultaneamente negativas para

a presença de rotavírus em material fecal e em efluente, totalizam-se 8 propriedades (ou

50%).

Entre as 8 (ou 50%) propriedades positivas para a presença de rotavírus em material

fecal e/ou efluente, em 5 houve a detecção simultânea do agente em fezes e efluentes.

4.2.1 - Confirmação dos resultados de ELISA por RT-PCR

Um total de 19 amostras foram triadas como positivas para rotavírus, das quais 12

delas eram de origem fecal e 7 de efluente. Estas foram submetidas à tecnica de RT-PCR,

cujos resultados estão dispostos na Tabela 3.

Tabela 3: Resultados dos testes de RT-PCR, PAGE e ELISA em amostras fecais e de

efluentes de granjas de criação de suínos, de acordo com o município de colheita.

São Paulo – 2008.

Amostras

Cidade

Material

PAGE

ELISA

1ªG

2ªG

1ªP

2ªP

São Paulo-1

fezes

NEG

POS

Embu-guaçu

fezes

POS

NEG

POS

P[6]

Embu-guaçu

fezes

NEG

POS

G[10]

POS

Embu-guaçu

efluente

NEG

POS

G[10]

POS

São Paulo-2

efluente

NEG

POS

NEG

Itapeva

fezes

NEG

POS

NEG

POS

Itapeva

fezes

NEG

POS

NEG

POS

Itapeva

fezes

NEG

POS

NEG

POS

Itapeva

fezes

NEG

POS

NEG

G[5]

POS

Itapeva

efluente

NEG

POS

NEG

POS

Descalvado

efluente

NEG

POS

NEG

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

NEG

POS

P[7]

Nova Odessa

fezes

NEG

POS

NEG

G[10]

POS

P[7]

Nova Odessa

efluente

NEG

POS

NEG

Nova Odessa-2

fezes

NEG

POS

NEG

POS

P[7]

Nova Odessa-2

fezes

NEG

POS

NEG

POS

Nova Odessa-2

efluente

NEG

POS

NEG

Nova Odessa-3

fezes

NEG

POS

NEG

Nova Odessa-3

efluente

NEG

POS

NEG

Fonte: NISHIDA, 2008

Notas: Números após o nome da cidade referem-se à identificação da propriedade.

Sinais convencionais utilizados:

"POS" significando resultado positivo ao teste

"NEG" significando resultado negativo ao teste

“NT” significando resultado de não tipificado

O valor de concordância obtido através do teste Kappa, a um intervalo de confiança

de 95%, a partir dos resultados gerados entre os testes de PAGE e ELISA aplicados a todas

as amostras do estudo (n=69) foi de 0,075.

Ao se compararem os resultados positivos frente as três diferentes provas

diagnósticas para a presença de rotavírus, observou-se que das 19 amostras triadas por

ELISA, 15 delas (78,94%) também apresentaram resultado positivo à RT-PCR (Tabela 3). A

única amostra triada (Tabela 3) como positiva pela PAGE, também apresentou resultado

positivo à RT-PCR (100%).

5 - Discussão

As diarréias nas criações animais consistem num complexo desafio quanto ao seu

controle e prevenção não só pela carência diagnóstica em grande parte dos episódios

(BERN; GLASS, 1994), mas por contar com diferentes causas associadas, entre elas

nutricionais, fisiológicas, ambientais, infecciosas, entre outras, atuando simultaneamente.

Em se tratando da produção animal isto reflete em prejuízos principalmente nas fases

iniciais de vida, um período crítico na sobrevida e desenvolvimento dos animais (MORÉS;

AMARAL, 2001).

Os municípios envolvidos neste estudo representam áreas de intensa produção

suína no Estado de São Paulo, de acordo com o último censo agropecuário (IBGE, 1996). A

maioria das propriedades pesquisadas (8/16 ou 50%) era proveniente da mesorregião

Grande São Paulo, aqui incluindo os municípios de Embu-Guaçu (1/8), Francisco Morato

(1/8), Franco da Rocha (1/8) e São Paulo (5/8); houve também propriedades da mesorregião

de Campinas (4/16 ou 25%), todas estas do município de Nova Odessa (4/4); da

mesorregião Macro Metropolitana Paulista (2/16 ou 12,5%), advindas de Ibiúna (1/2) e

Piedade (1/2); da mesorregião de Araraquara (1/16 ou 6,25%), esta de Descalvado; e da

mesorregião de Itapetininga (1/16 ou 6,25%), aqui representada pelo município de Itapeva

(1/1).

Todas as propriedades amostradas eram de pequeno porte, destinadas à

subsistência e muitas vezes compartilhando o mesmo espaço de criação com outras

espécies animais. Apresentavam ciclo de produção completo, isto é, englobavam todas as

fases da criação, desde a maternidade até a terminação do animal (SOBESTIANSKY et al.,

1998).

Além destas características, elas apresentavam em comum a sua baixa tecnificação,

além de uma notável carência de higienização das instalações, manejo nutricional irregular

(uso de lavagem, ração não balanceada), mistura de animais de diferentes faixas etárias,

práticas de profilaxia, biossegurança e sanidade deficientes, mesmo naquelas que

apresentavam infra-estrutura para compostagem e biodigestão de efluentes (Tabela 1),

sendo estes dois últimos os mais eficientes na redução de contaminantes ambientais

(SEGANFREDO, 2007). Tais características são relevantes, pois são fatores capazes de

elevar a ocorrência das gastroenterites (DEWEY et al., 2003; MORÉS; AMARAL, 2001).

Aliás, quanto ao manejo de efluentes, observou-se que a maioria das criações

realizava tratamento através de caixa de decantação, com posterior uso para a agricultura

(7/16 ou 43,75%), mas também foram encontradas criações que realizavam compostagem

(1/16 ou 6,25%) ou uso de biodigestor (1/16 ou 6,25%), além das propriedades sem

tratamento de esgoto, destinando-os diretamente nas coleções de água (3/16 ou 18,75%)

(Figura 4), terra (3/16 ou 18,75%) ou mesmo em aterro (1/16 ou 6,25%).

Dentre algumas das propriedades com tratamento de efluentes se observou não

conformidades tanto na instalação como na manutenção dos mesmos. Por exemplo, em

uma propriedade havia vazamento do efluente cuja destinação acabava sendo uma coleção

de água próxima (Figura 5), em outra, a caixa de decantação estava adjacente ao rio (dado

não mostrado), quando o aconselhado é pelo menos a 45 metros de distância (PHILLIPI;

ALVES, 2005)

Face a estes resultados, parece evidente a necessidade de se proporcionar um

maior nível de acesso e orientação destes pequenos produtores quanto à destinação dos

efluentes gerados, e assim, resguardar o ambiente e a saúde (PELL, 1997) em

concordância com o que já é preconizado pela Constituição Federal Brasileira de 1988

(BRASIL, 1988), leis infra-constitucionais (PHILLIPI et al., 2005) e também pela WHO (2006).

Os riscos causados na emissão de efluentes afetam não só as coleções aquáticas,

como também o solo (WALTER, 2001; WHO, 2006), e nesse sentido, Abbaszadegan,

Stewart, Le Chevallier (1999) e Shay Fout et al. (2003) relataram o encontro de enterovírus

em lençol freático.

Considerando a elevada ocorrência de diarréias em crianças e diversas espécies

animais (STEYER et al., 2008; GABBAY et al, 2008), o estudo dos rotavírus em efluentes

torna-se relevante, não só pela possibilidade de veiculação hídrica (HUNTER; ZMIROU-

NAVIER; HARTEMANN, 2009), mas também por sua resistência às condições ambientais

(WALTER, 2001; WHO, 2006).

A aplicação das técnicas diagnósticas de ELISA e PAGE nas amostras fecais e de

efluentes evidenciaram a circulação de rotavírus em parte das criações abordadas neste

estudo (Tabela 2).

Os resultados da PAGE indicaram a presença de uma única amostra com rotavírus

(1/69 ou 1,45%), sem ter sido observado, neste caso, a presença do agente no respectivo

efluente da criação. As demais amostras (fecais e efluentes) foram negativas ao teste.

Por outro lado, a técnica de ELISA detectou o vírus tanto em efluentes quanto em

fezes de suínos de 5 propriedades, o que representa 31,25% (5/16). Além disso, em duas

propriedades detectou-se o agente somente no efluente e em outra propriedade, apenas em

material fecal.

Podem ser atribuídas algumas hipóteses quanto às discrepâncias observadas entre

o total de resultados positivos gerados pelas técnicas empregadas, uma vez que o valor

Kappa (k) obtido foi de 0,075 (Item 4.2.1), que indica uma concordância pobre.

Uma primeira explicação consistiria nas diferenças entre os limiares de detecção

destas provas. Desselberger (1995) apud Schwarz (2002) e Winiarczyk; Gradzki (2002)

indicam que a prova de PAGE apresenta um limiar de detecção superior ao teste de ELISA.

Portanto, as amostras de efluentes poderiam apresentar diluições virais tão elevadas que

mesmo apesar do processo de concentração utilizado (Item 3.3.1), este não tenha sido

suficiente para intervir no sinal da prova.

Outro aspecto diz respeito à integridade do RNA viral, submetido a condições de

elevada umidade e presença de inibidores inespecíficos. Os efluentes, em função da sua

composição e condições diversas aos quais estão submetidos podem degradar o RNA viral

(WILSON, 1997) e com isso gerar resultados negativos. Entretanto, podemos refutar

parcialmente esta hipótese, visto que a prova de RT-PCR também depende da integridade

do material genético viral, que por sua vez resultou em 3 amostras de efluentes positivas

(Tabela 3).

Quanto ao teste de ELISA, este depende da integridade das proteínas virais, em

especial a VP6 (ESTES; KAPIKIAN, 2007), mas não necessariamente ligada à viabilidade

da partícula. Por outro lado, a prova de ELISA pode gerar resultados do tipo falso-positivo,

devido ao encontro de substâncias capazes de promover a ocorrência de reações cruzadas

e ruídos (CROWTHER, 1995), partindo-se de amostras de composição tão diversa quanto

fezes e efluentes. No entanto, das 12 amostras fecais positivas por ELISA, todas elas foram

também RT-PCR positivas, indicando que a PAGE, se utilizada isoladamente para a triagem

das amostras, não seria uma abordagem apropriada, pois isso implicaria em grande perda

de sensibilidade diagnóstica.

Devido a uma maior sensibilidade e especificidade atribuída à RT-PCR

(WINIARCZYK; GRADZKI, 2002), esta prova foi utilizada para a confirmação dos resultados.

Dentro da literatura consultada, entretanto, observou-se que as metodologias para a

detecção genérica de rotavírus fazem uso de primers desenhados principalmente a partir de

sequências de amostras virais de origem humana, tal como aqueles desenvolvidos por

Iturriza-Gomara et al. (1999), Winiarczyk; Gradzki (2002) e Elschner et al. (2002).

Considerando os mecanismos de variabilidade dos rotavírus (TANIGUCHI;

URASAWA, 1995), optou-se por utilizar primers descritos por Gouvea et al. (1994a,b),

destinados à genotipagem de amostras de rotavírus do grupo A, mas que implicitamente

também fornece diagnóstico quanto à presença ou não do agente, justificando a atribuição

do estado de positivo a partir de evidenciação de banda específica na 1ª ou 2ª etapas de

amplificação visando os genes codificadores da VP4 e VP7.

Deve ser levado em conta que amostras não caracterizadas por esta técnica não

sejam necessariamente negativas. Dentre as causas podemos citar: baixa concentração

viral; o estado de conservação da partícula; a marcante presença de inibidores inespecíficos

nas amostras (WILSON, 1997, RÅDSTRÖM et al., 2002; ABBASZADEGAN; STEWART;

LeCHEVALLIER, 1999; SHAY FOUT et al., 2003; SHIEH et al., 1995); o vírus em questão

pertencer a um genótipo diferente daqueles contemplados pelos primers utilizados nas

reações (WINIARCZYK; GRADZKI, 2002); mutações pontuais no sítios de ligação dos

primers (PARRA et al., 2008); ou mesmo por um excesso de template DNAc na segunda

amplificação (SACHSE, 2002).

Com efeito, Winiarczyk; Gradzki (2002) genotiparam 96,8% de G e 87,1% de P das

amostras dos Estados Unidos, mas na Polônia, obtiveram apenas 54,5% de G e 38,6% de P.

Parra et al. (2008), ao genotiparem 30 amostras argentinas, tiveram sucesso em identificar o

genótipo de apenas 8 amostras (26,67%).

Das 19 amostras que foram submetidas a técnica de RT-PCR, 12 eram de fezes e 7

de efluentes, das quais 15 (78,95%) foram confirmadas positivas, sendo 12 amostras fecais

e 3 de efluentes.

Quanto à caracterização de rotavírus de acordo com os genótipos G, 3 delas (3/19

ou 15,78%) apresentaram o genótipo G[10] e 1 delas (1/19 ou 5,26%) o genótipo G[5]

(Tabela 3). Cabe ressaltar que uma destas 3 amostras genotipadas como G[10] era

proveniente de efluentes da criação e a outra era de origem fecal. O encontro de um mesmo

genótipo de rotavírus em amostras fecais e de efleuntes, como no caso da propriedade 03,

de Embu-Guaçu, permite argumentar de um modo seguro que há uma contaminação fecal

suína em direção aos efluentes gerados por uma dada granja.

Já para os genótipos P (Tabela 3), foi possível identificar a presença de 3 amostras

P[7] e uma P[6], muito embora outras 9 amostras (2 delas de efluentes) tenham apresentado

amplificação viral específica na 1ª amplificação por RT-PCR (Item 3.3.4, Tabela 3).

Não foram encontradas misturas entre genótipos e uma única amostra foi definida

como G[10]P[7] (Tabela 3). Estes genótipos estão em concordância com aqueles descritos

na literatura em suínos.

Com efeito, os genótipos mais frequentemente relacionados a suínos são o G3, G4 e

G5, (STEYER et al., 2008), muito embora o G10, predominantemente descrito infectando

bovinos, já tenha sido relatado (PONGSUWANNA et al. ,1996; ESTES; KAPIKIAN, 2007).

Gregori (2003) ao caracterizar amostras fecais de suínos no Estado de São Paulo

encontrou a presença de G10, além do G5, e Pongsuwanna et al. (1996) também encontrou

como mais predominante na Tailândia o G10.

Rácz et al. (2000) detectaram em amostras da Região Sul do Brasil principalmente o

G3, G4 e o G5, além do G10, um atípico G9, combinações entre G4 e G9 e entre G5 e G10;

e Alfieri et al. (1999), por sua vez, ao testarem amostras fecais diarréicas em leitões da

região Norte, Oeste e Sudoeste do Estado do Paraná, observaram a ocorrência de

infecções singulares G5, G4 e G3; infecções mistas G3+G5; G3+G4 e G5+G10.

Já em outros países, há predominância do relato dos genótipos G3, G4 e G5 em

suínos, como visto por Steyer et al. (2008), em amostras da Eslovênia, além de terem

encontrado em menor quantidade o G1, G2, G6, G10 e G11; Solarte et al. (1999)

observaram predominantemente o G5 em na Colômbia; Winiarczyk; Gradzki (2002)

detectaram a ocorrência dos genótipos G3, G4, G5, G9 e G10 em amostras fecais nos

Estados Unidos e G3, G4, G5 naquelas oriundas da Polônia; Van der Heide et al. (2005)

obtiveram em amostras da Holanda os genótipos G3 e G4; Parra et al. (2008) encontraram

os genótipos G4, G8 e G6 em amostras de 4 propriedades na Argentina. Teodoroff et al.

(2005) observaram um padrão de infecção que difere dos demais, com predominância do

rotavírus G9, além do G1, G3, G4 e G5 no Japão.

Quanto ao genótipo P, em estudos a partir de amostras suínas no Brasil, Rácz et al.

(2000) encontraram P[6,Gott], P[6,M37] e P[7]; enquanto que Alfieri et al. (1999) ao testarem

amostras da região Norte, Oeste e Sudoeste do Estado do Paraná, observaram a ocorrência

de infecções genótipos P[6] e P[7].

Steyer et al. (2008) em amostras da Eslovênia relataram maior ocorrência de P[6],

P[7] e P[13], com presença também de amostras de P[9] e P[27]; Parra et al. (2006) teve em

amostras da Argentina uma predominância de P[6], além do o encontro de uma amostra

P[1]; Pongsuwanna et al. (1996) descreveram uma grande variedade de genótipos P na

Tailândia, pertencentes ao P[1A], P[1B], P[2A], P[3A], P[3B], P[4], P[5], P[6], P[7], P[8], P[9],

e P[10]; Teodoroff et al. (2005) teve como resultado em amostras do Japão, os genótipos

P[6], P[7], P[13]+P[22] e P[23]; Van der Heide et al. (2005) em amostras da Holanda,

caracterizou o P[6] e P[7].

Se analisados conjuntamente resultados positivos das reações de RT-PCR que

apresentaram resultados positivos com o tipo de manejo de efluentes utilizados nas

propriedades, observa-se que 3 propriedades tiveram em seus efluentes a eliminação de

rotavírus. Os manejos nelas presentes eram: “caixa de decantação com destinação para a

agricultura”, “aterro” e “solo direto sem tratamento”.

Face a estes resultados, foi detectada a eliminação de rotavírus nos efluentes, o que

concorda com Constantini et al. (2007), quando estes descreveram a ocorrência da

eliminação do rotavírus em lagoa de decantação nos Estados Unidos tanto por ELISA como

via RT-PCR.

Não foi detectado rotavírus em efluentes lançados diretamente em curso d'água,

muito embora, numa das três propriedades que adotavam esta prática, observou-se a

presença de rotavírus a partir de material fecal. Devem ser consideradas neste caso, ao

menos três possibilidades. A primeira delas seria a ausência ou baixa circulação de

rotavírus nestas criações, o que explicaria a não detecção nos efluentes. A segunda seria a

alta diluição das partículas no momento da colheita, ou então o comprometimento da

viabilidade viral para os testes. Neste caso, estudos mais detalhados que envolvam um

aumento amostral e acompanhamento longitudinal, se fazem úteis para se definirem

possíveis padrões da dinâmica da eliminação do vírus nos efluentes.

Deve ser levado em conta, entretanto, que os resultados positivos aos testes de

detecção empregados, não necessariamente implicam na viabilidade e/ou infecciosidade

das partículas virais, já que estão presentes condições adversas, tal como a alta umidade,

que são capazes de inativar o rotavírus (ESTES; KAPIKIAN, 2007).

Por outro lado, Constantini et al. (2007) tiveram sucesso em inocular o rotavírus de

efluentes em animais gnotobióticos. Estes animais permaneceram assintomáticos, mas eles

eliminaram o rotavírus pelas fezes. Além disso, segundo Limsawat e Ohgaki (1997), apesar

de não ser possível mensurar a viabilidade viral por técnicas moleculares de detecção do

ácido nucléico como o RT-PCR, é provável que a partícula viral esteja competente a

infeccionar, visto a rápida degradação sofrida pelos ácidos nucléicos quando em contato

com os efluentes.

Assim, para se elucidar tal questão, uma das alternativas seria a tentativa de

isolamento destes vírus em cultivos celulares, muito embora esta técnica ainda tenha baixa

sensibilidade e alto limiar de detecção (GREEN; LEWIS, 1999).

O risco do rotavírus apresentar transmissão inter-espécies é rara (ESTES; KAPIKIAN,

2007), mas existente, podendo inclusive afetar humanos a ponto da doença ser considerada

uma zoonose (WHO, 2006; PAHO, 2001). A eliminação do rotavírus no ambiente pode

apresentar relações com a agricultura, na medida em que pode contaminar alimentos; com a

água, para o consumo humano e de animais, inclusive de outras espécies (principalmente

bovinos e aves) e a fauna silvestre; e também pelo contato de humanos ao utilizarem a água

para outros fins como banho, diversão ou higienização (WHO, 2006; WHO, 2004; VAN ZYL

et al., 2006; WALTER et al., 2001; HAMILTON et al., 2006; HERNÁNDEZ et al., 1997). Cabe

ressaltar que foi possível detectar neste estado o genótipo G[10], amplamente descrito em

bovinos (PONGSUWANNA et al. ,1996; ESTES; KAPIKIAN, 2007) tanto em fezes quanto

em efluente de criações suínas, sugerindo um possível histórico de infecção cruzada entre

as espécies animais.

Apesar do objetivo deste trabalho não contemplar a avaliação da efetividade do qual

cada método de tratamento efluente contribui na inativação do agente viral, o fato é que foi

possível detectar a presença de rotavírus neste material. Portanto, abrem-se perspectivas

para estudos cujo escopo envolva:

a) a constatação da viabilidade destas partículas detectadas;

b) avalição, em condições experimentais, dos diferentes tratamentos de efluente em

prática na suinocultura;

c) amplificação para pesquisa/detecção de outros vírus, por exemplo, Hepatite E

(KASORNDORKBUA et al., 2005) e o vírus da diarréia epidêmica suína (PEDV) (CHOI et al.,

2009);

d) o desenvolvimento de metodologias para a concentração viral;

e) a realização de inquéritos de surtos de rotavírus animais, relacionando-os com a

presença de curso hídrico unindo estas criações.

f) a detecção de rotavírus em espécies vegetais irrigadas com o material de efluente,

principalmente se estes vegetais são consumidos crus (HERNÁNDEZ et al., 1997; WALTER,

2001; KOOPMANS; DUIZER, 2004; RZEZUTKA et al., 2004; JAY, 2005; HAMILTON et al.,

2006; VAN ZYL et al., 2006; WHO, 2006).

Os resultados ora obtidos apontam também para um maior aprimoramento legal da

questão sanitária dos efluentes, por exemplo quanto à legislação vigente sobre o padrão

limite aceitável de poluição das águas (Resolução nº357 de 17 de março de 2005 do

CONAMA). Esta Resolução é bem descritiva quanto a concentração de metais pesados,

nutrientes e produtos tóxicos, mas é carente quanto as questões de agentes biológicos,

limitando-se aos limites aceitáveis de coliformes fecais e cianobactérias, sem se detalhar em

outros, como espécies virais ou protozoários.

Há também preocupações relativas aos métodos de tratamento de esgoto. Sistemas

efetivos contra vírus já foram testados, como aqueles à base de detergente SDS, cloro,

ozônio, raios ultravioleta ou microfiltração (WARD; ASHLEY, 1980; VAUGHN et al., 1987;

LIBÂNIO et al., 2005; WALTER, 2001; WHO, 2006). Entretanto, tais técnicas não são viáveis

na criação de suínos pelo vultoso investimento necessário para viabilizar sua instalação.

A realidade dos pequenos produtores de suínos está relacionada a processos de

menor escala de geração de efluentes, como lagoas de decantação, biodigestores e

compostagem, cujo investimento inicial é menor, mas ainda há necessidade de aumentar a

acessibilidade destes sistemas principalmente em termos de crédito e assistência técnica.

6 - Conclusões

As conclusões deste estudo foram:

- Foi detectada a circulação de rotavírus em criações de baixa tecnificação no Estado de

São Paulo;

- Houve a eliminação de rotavírus de criações de suínos através de seus efluentes, apesar

das práticas de tratamento adotadas;

- O lançamento de efluentes suínos pode ser um potencial meio de transmissão do

rotavírus não só a outras espécies animais, mas também a humanos, demonstrando-se a

necessidade de se assegurem tratamentos de efluentes na suinocultura que visem a sua

inocuidade, não só ambiental, mas também microbiológica.

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Anexo 1

Soluções empregadas na reação de PAGE

1 - Mistura fenol, clorofórmio e álcool isoamílico

Reagente

Quantidade

Fenol

6,0 mL

Clorofórmio

3,9 mL

Álcool Isoamílico

100 L

2 - Dissociador da amostra

Reagente

Quantidade

SDS 10%

3,0 mL

Upper TRIS 4x

1,25 mL

2-mercapto-etanol

0,5 mL

Glicerol

4,0 mL

Azul de bromofenol 0,5%

100 l

Água bidestilada

q.s.p. 10,0 mL

Nota: para preparo do padrão, preparar mistura dissociador com 3g de uréia em substituição

ao glicerol.

3 - Acrilamida / bis-acrilamida (50/1,3)

Reagente

Quantidade

Acrilamida

50,0 g

Bis-acrilamida

1,3 g

Água bidestilada

q.s.p. 100,0 mL

4 - Lower TRIS 4x (1,5M TRIS/HCl; pH 8,8)

Reagente

Quantidade

TRIS (base)

18,17 g

HCl concentrado

q.s.p. pH 8,8

Água bidestilada

q.s.p. 100,0 mL

5 - Upper TRIS 4x (0,5M TRIS/HCl;pH 6,8)

Reagente

Quantidade

TRIS (base)

6,06 g

HCl concentrado

q.s.p. pH 6,8

Água bidestilada

q.s.p. 100 mL

6 - Persulfato de amônio (20 mg/mL)

Reagente

Quantidade

Persulfato de amônio

20 mg

Água bidestilada

q.s.p. 1,0 mL

7 - Gel de poliacrilamida

Quantidade de Reagente

Gel de empilhamento (3,5%)

Gel de corrida (7,5%)

Solução mãe de

Acrilamida/Bisacrilamida*

0,35 mL

3 mL

Lower TRIS 4x

-----

5 mL

Upper TRIS 4x

1,25 mL

-----

O bidestilada

3,23 mL

11,3 mL

Persulfato de amônio

150 L

660 L

TEMED

20 L

50 L

*Solução-mãe de acrilamida/bis-acrilamida a 50/1,3, com C=2,53% (crosslinking).

8 - Solução estoque TRIS-glicina 4x

Reagente

Quantidade

TRIS (base)

12,0 g

Glicina

57,6 g

Azida sódica 10%

10, 0 mL

Água bidestilada

q.s.p. 1000 mL

9 - Tampão de corrida

Reagente

Quantidade

TRIS-glicina 4x

200 mL

Água bidestilada

800 mL

10 - Etanol-ácido acético

Reagente

Quantidade

Etanol

20 mL

Ácido acético

1 mL

Água bidestilada

q.s.p. 200 mL

11 - Solução reveladora

Reagente

Quantidade

NaOH

7,5 g

Formaldeído (40%)

1,9 mL

Água bidestilada

q.s.p.250 mL

Nota: Adicionar o formaldeído quando o volume estiver próximo do volume total.

Anexo 2

Soluções empregadas na reação de ELISA

1 - Tampão carbonato-bicarbonato 0,05M pH 9,6

Reagente

Quantidade

0,85 g

NaHCO

1,43 g

Água bidestilada

q.s.p. 500 mL

2 - Tampão de lavagem (PBS 0,01M pH 7,2 + 0,5% Tween 80 (v/v))

2.1 - Solução A (mãe) de PO4 0,2M

Reagente

Quantidade

NaH

x H

14,2 g

Água bidestilada

q.s.p. 500 mL

2.2 - Solução B (mãe) de PO4 0,2M

Reagente

Quantidade

HPO

x 7 H

26,9 g

Água bidestilada

q.s.p. 500 mL

2.3 - NaCl solução mãe a 1,5 M

Reagente

Quantidade

NaCl

43,83g

Água bidestilada

q.s.p. 500 mL

2.4 - Solução de uso - Tampão de lavagem

Reagente

Quantidade

NaCl solução mãe a 1,5 M

100 mL

Mistura das soluções A+B de

14 mL solução A

36 mL solução B

Tween 80

5 mL

Água bidestilada

q.s.p. 200 mL

3 - Solução cromógena

3.1 - Solução A (mãe) de ácido cítrico 0,033M para substrato

Reagente

Quantidade

Ácido cítrico x H

0,7 g

Água bidestilada

q.s.p. 100 mL

3.2 - Solução B (mãe) de PO

0,084M para substrato

Reagente

Quantidade

HPO

x 7 H

11,3 g

Água bidestilada

q.s.p. 500 mL

3.3 - Tampão para substrato OPD

Reagente

Quantidade

Mistura das soluções

A+B de PO

13 mL solução A

12 mL solução B

OPD

10 mg

Perhidrol

10 μL

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