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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO – DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA APLICADAS
BARBARA NEVES DOS SANTOS
ANÁLISE DE MARCADORES DE VALOR DIAGNÓSTICO PARA A
DISTINÇÃO ENTRE TRYPANOSOMA CRUZI CHAGAS, 1909 E
TRYPANOSOMA RANGELI TEJERA, 1920
Niterói, RJ
2009
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BARBARA NEVES DOS SANTOS
ANÁLISE DE MARCADORES DE VALOR DIAGNÓSTICO PARA A
DISTINÇÃO ENTRE TRYPANOSOMA CRUZI CHAGAS, 1909 E
TRYPANOSOMA RANGELI TEJERA, 1920
ORIENTADORES: Prof. Dr. OTÍLIO MACHADO PEREIRA BASTOS (IB-CCM-UFF)
Prof. Dra. MARIA AUXILIADORA DE SOUSA (IOC-FIOCRUZ)
Niterói, RJ
2009
Dissertação apresentada ao curso de
Pós-Graduação em Microbiologia e
Parasitologia Aplicadas, como
requisito parcial para obtenção do
Grau de Mestre.
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BARBARA NEVES DOS SANTOS
ANÁLISE DE MARCADORES DE VALOR DIAGNÓSTICO PARA A
DISTINÇÃO ENTRE TRYPANOSOMA CRUZI CHAGAS, 1909 E
TRYPANOSOMA RANGELI TEJERA, 1920
Aprovada em março de 2009
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Otílio Machado Pereira Bastos - Orientador
IB- CCM - UFF
Prof. Dra. Maria Auxiliadora de Sousa - Orientadora
IOC-FIOCRUZ
Prof. Dra. Ângela Hampshire C. Lopes
Depto de Microbiologia - UFRJ
Prof. Dra. Cláudia Uchoa
IB-CCM-UFF
Niterói, RJ
2009
Dissertação apresentada ao curso de
Pós-Graduação em Microbiologia e
Parasitologia Aplicadas, como
requisito parcial para obtenção do
Grau de Mestre.
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2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
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O presente trabalho faz parte de um projeto de colaboração entre o Departamento de
Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, Instituto Biomédico/UFF e a
Coleção de Tripanosomatídeos, Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ.
Apoio Financeiro: POM, IOC; PROPP, UFF.
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A gente pode
morar numa casa mais ou menos,
numa rua mais ou menos,
numa cidade mais ou menos
e até ter um governo mais ou menos.
A gente pode
dormir numa cama mais ou menos,
comer um feijão mais ou menos,
ter um transporte mais ou menos
e até ser obrigado a acreditar
mais ou menos no futuro.
A gente pode
olhar em volta e sentir que tudo está mais
ou menos.
Tudo bem.
O que a gente não pode
mesmo, nunca, de jeito nenhum
é amar mais ou menos,
é sonhar mais ou menos,
é ser amigo mais ou menos,
é namorar mais ou menos,
é ter fé mais ou menos
e acreditar mais ou menos.
Senão a gente corre o risco de se tornar
uma pessoa mais ou menos.
(Chico Xavier)
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A árvore da amizade
Existem pessoas em nossas vidas que nos deixam felizes
pelo simples fato de terem cruzado o nosso caminho.
Algumas percorrem ao nosso lado, vendo muitas luas passarem,
mas outras apenas vemos entre um passo e outro.
A todas elas chamamos de amigo. Há muitos tipos de amigos.
Talvez cada folha de uma árvore caracterize um deles.
O primeiro que nasce do broto é o amigo pai e o amigo mãe.
Mostram o que é ter vida. Depois vem o amigo irmão,
com quem dividimos o nosso espaço para que ele floresça como nós.
Passamos a conhecer toda a família, a qual respeitamos e desejamos o bem.
Mas o destino nos apresenta outros amigos,
os quais não sabíamos que iam cruzar o nosso caminho.
Muitos desses são designados amigos do peito, do coração.
São sinceros, são verdadeiros.
Sabem quando não estamos bem, sabem o que nos faz feliz.
Às vezes, um desses amigos do peito estala o nosso coração
e então é chamado de amigo namorado.
Esse dá brilho aos nossos olhos, música aos nossos lábios, pulos aos nossos pés.
Mas também há aqueles amigos por um tempo,
talvez umas férias ou mesmo um dia ou uma hora.
Esses costumam colocar muitos sorrisos na nossa face,
durante o tempo que estamos por perto.
Falando em perto, não podemos nos esquecer dos amigos distantes,
que ficam nas pontas dos galhos, mas que quando o vento sopra,
aparecem novamente entre uma folha e outra.
O tempo passa, o verão se vai, o outono se aproxima, e perdemos algumas de nossas folhas.
Algumas nascem num outro verão e outras permanecem por muitas estações.
Mas o que nos deixa mais feliz é que as que caíram continuam por perto,
continuam aumentando a nossa raiz com alegria.
Lembranças de momentos maravilhosos enquanto cruzavam o nosso caminho.
Cada pessoa que passa em nossa vida é única.
Sempre deixa um pouco de si e leva um pouco de nós.
Há os que levaram muito, mas não há os que não deixaram nada.
Esta é a maior responsabilidade de nossa vida
é a prova evidente de que duas almas não se encontram por acaso.
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DEDICATÓRIA
À Prof. Dra. Maria Auxiliadora de Sousa,
por sua valiosa contribuição na parasitologia clássica dos tripanosomatídeos,
pelo apoio e participação na minha formação acadêmica e profissional,
pela amizade.
Ao meu pai, pela força além deste plano,
por iluminar e guiar meus caminhos.
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal Fluminense pela realização do trabalho e auxílio financeiro.
A Prof. Dra. Maria Auxiliadora de Sousa, orientadora e amiga, pelo apoio, amizade, aposta e
confiança. Pelo prazer de aprender e crescer cada vez mais...
Ao Prof. Dr. Otílio Machado Pereira Bastos, pela orientação e correção. Pelo apoio na finalização
do trabalho, pelos ensinamentos acadêmicos e pessoais, pelo prazer de ser orientanda.
À Prof. Dra. Ângela Hampshire C. Lopes, pela participação na banca de defesa, pelo apoio em
momentos difíceis da Coleção, pela compreensão e parceria.
À Prof. Dra. Cláudia Uchôa, por participar da banca de defesa.
À minha querida tia Marilda, pela dedicação e apoio nesta fase tão especial e peculiar da minha.
Por sempre estar ao meu lado, orando e consolando.
À minha mãe, pela preocupação, carinho, amizade e amor.
Ao Alexandre, por sempre apoiar meu crescimento, promover um momento muito especial em
2008, por suportar dias exaustivos e ausência familiar, por ajudar na confecção de gráficos e
tabelas. Por me ajudar a despertar pro mundo...
À amiga Lu, por estar ali, sempre... Principalmente na reta final. Por apoiar, aconselhar, pelo amor
e eterna amizade. Pelas dicas e maravilhosa ajuda na confecção das pranchas e ilustrações.
À amiga Mariana, por ser a qualquer momento uma pessoa pra confiar e desabafar...
Às eternas e maravilhosas amigas da Coleção de Tripanosomatídeos, por todo apoio, sempre...
Ajuda na reta final, mesmo com minha ausência física do laboratório:
Edna, pela presteza, imenso carinho e maravilhosa amizade. Pelas colorações com Giemsa,
preparo de meios de cultura e ajuda em todos meus momentos profissionais.
Sheila, pelos ensinamentos, conselhos, amizade, carinho, preocupação e torcida fiel. Pelo
prazer de conviver bons e maus momentos, compartilhar angústias e alegrias. Pela ajuda com os
desenhos em câmara clara e curvas de crescimento. Por ser parte fundamental neste trabalho.
Tatiana, por ajudar a construir uma nova, boa e fiel amizade. Pela ajuda nos contatos com a
UFF, segurar minhas pontas com as fotografias de ultima hora e inúmeros outros pedidos.
A mais recente amiga Mariana Côrtes Boité, pela ajuda com a realização da PCR, por aconselhar no
meu novo momento profissional.
Ao Prof. Dr. Jefferson Carvalho Paes, coordenador do Curso de Pós Graduação em Microbiologia e
Parasitologia Aplicadas, pela formação acadêmica, suporte e compreensão com os problemas na
reta final do trabalho. Pelo prazer de conviver nesses dois anos de aprendizado e trabalho.
As Profs Adriana, Danuza e Patrícia, pela orientação e formação no estágio docente, dicas e apoio.
Aos meus colegas de curso, em especial Ivana e Carlos, pela convivência harmoniosa e divertida,
pelos trabalhos, estudos e expectativas de defesa.
Aos chefes e colegas do Lab. de Pesquisas em Leishmaniose, em especial Antonio Teva, pela
compreensão e liberação de parte de minhas atividades para a finalização da dissertação.
A todos que de alguma forma ajudaram e motivaram a realização deste trabalho.
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―A ciência alimenta-se da ciência e este é um fato fundamental.
As descobertas científicas e as inovações técnicas
retrocederiam e provavelmente desapareceriam,
se a comunidade científica não pudesse dispor das
informações acumuladas ao longo dos anos (...)”
(Guinchat & Menou)
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RESUMO
Neste trabalho foram analisadas culturas axênicas de 10 amostras de referencia de
Trypanosoma cruzi e 6 de Trypanosoma rangeli, todas parte do acervo da Coleção de
Tripanosomatídeos dos Instituto Oswaldo Cruz (CT-IOC). Estas amostras foram estudadas
comparativamente por técnicas parasitológicas clássicas (morfobiologia e biometria), perfil
eletroforético de isoenzimas e dos produtos de amplificação por PCR de minicírculos do
kDNA. Todas foram crescidas à 27,3 C (±0,3) em meio LIT (Liver Infusion-Tryptose)
contendo um total de 10 ou 20% de soro fetal bovino (LIT 10% ou 20% SFB). As massas
parasitárias visando análises bioquímicas e moleculares foram ampliadas em meio bifásico
contendo agar-sangue (N.N.N) e LIT 10% ou 20% SFB. Os objetivos deste trabalho foram: a)
verificar o valor destas técnicas para distinção de T. cruzi e T. rangeli ou suas variedades;
b) confirmar autenticidade das amostras da Coleção acima citada; c) resgatar
conhecimentos parasitológicos clássicos para o estudo dos tripanosomatídeos, identificando
marcadores para diagnóstico diferencial de espécies. Os principais resultados encontrados
foram: a) diferentemente de T. cruzi, todas as amostras de T. rangeli só cresceram em LIT
20% SFB e apresentaram um padrão de diferenciação mais complexo, incluindo
esferomastigotas, além de formas com cinetoplasto posterior e extremidade arredondada;
b) T. cruzi e T. rangeli apresentaram diferenças estatisticamente significantes (p ≤ 0,000)
nas dimensões dos tripomastigotas (comprimento total, flagelo incluído) e dos
cinetoplastos dos epimastigotas; (c) os sistemas enzimáticos MDH e ME foram úteis para a
distinção entre estas espécies, enquanto GPI e PGM evidenciaram uma variação
intraespecífica; (d) os primers 121/122 geraram produtos amplificados típicos de T. cruzi
(330pb) e de T. rangeli (760pb) para as todas as amostras identificadas com estas espécies;
(e) com estes mesmos primers e utilizando condições de corrida diferenciadas, todas as
cepas de T. rangeli (KP1+) não apresentaram produtos com 330pb, assim confirmando sua
pureza. Os resultados deste trabalho identificaram técnicas e parâmetros úteis para a
distinção entre T. cruzi e T. rangeli ou suas variedades, confirmação de autenticidade de
amostras da Coleção de Tripanosomatídeos, como também para análise e identificação de
novos isolados (ver artigos publicados, em anexo). Este trabalho também contribui para a
valorização do emprego de técnicas parasitológicas clássicas no estudo dos
tripanosomatídeos, sugerindo-se que sejam utilizadas como abordagens iniciais para
auxiliar na escolha de técnicas complementares e avançadas para caracterização e
identificação destes organismos.
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ABSTRACT
In this work were analyzed 10 reference stocks of Trypanosoma cruzi and 6 of
Trypanosoma rangeli, all from the Trypanosomatid Collection at Institute Oswaldo Cruz
(CT-IOC). These stocks were comparatively studied by conventional parasitological
techniques (morfobiology, biology and biometry), electrophoretic profiles of isoenzymes
and amplification of products by PCR of kDNA minicircles using the primers #121/122. All
stocks were grown at 27 ºC (± 0.3) in LIT medium (Liver Infusion-Tryptose) supplemented
with 10 or 20% fetal calf serum (LIT 10% or 20% FCS). For biochemical and molecular
analysis, parasite cells were grown in biphasic blood-agar slants (NNN) overland by LIT 10%
or 20% FCS. The aims of this study were: a) verify the usefulness of these techniques to
distinguish T. cruzi and T. rangeli and their intraspecific varietiets, b) confirm the
authenticity of the stocks from the trypanosomatid collection c) review the importance of
parasitological techiniques to analyse the trypanosomatids, identifying markers for their
differential diagnosis. The main results were: a) differently from T. cruzi, all samples of T.
rangeli only grew in LIT 20% FCS and presented a more complex differentiation pattern,
including esferomastigotas, and tadpole-like forms with posterior kinetoplast b) T. cruzi
and T.rangeli showed statistically significant differences (p < 0.000) at the size of
trypomastigotes (total length, flagellum included) and kinetoplast of epimastigotes (c) all
enzyme systems were useful for distinguishing these species, although GPI and PGM
displayed higher intraspecific variation, (d) the primers #121/122 give rise to amplified
products typical of T. cruzi (330bp) and T. rangeli (760bp) for all stocks identified as these
species, (e) these primers under different running conditions, all strains of T. rangeli (KP1
+) showed no 330bp products, thus confirming its purity. These results identified
techniques and parameters useful for distinguishing T. cruzi from T. rangeli, confirming of
the authenticity of the stocks from the Trypanosomatid Collection, species under study for
identification of new isolates (published articles). This work also contributes emphasize
the use of conventional parasitological techniques in the study of trypanosomatids,
suggesting that they should be used as the steps, aiming further choice of complementary
and advanced techniques for characterization and identification of these organims.
2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................... 2
1.1. Família Trypanosomatidae Doflein, 1901 ................................................. 2
1.2. Gênero Trypanosoma Gruby, 1843 ........................................................ 5
1.3. O Subgênero Schizotrypanum Chagas, 1909.............................................. 6
1.3.1. Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi Chagas, 1909 ............................................... 6
1.3.1.1. Características morfológicas .............................................................. 7
1.3.1.2. Ciclo evolutivo ............................................................................... 8
1.3.1.3. Epidemiologia ................................................................................ 8
1.4. O Subgênero Tejeraia Ãnez, 1982 ....................................................... 12
1.4.1. Trypanosoma (Tejeraia) rangeli Tejera, 1920 .................................................... 12
1.4.1.1. Características morfológicas ............................................................ 13
1.4.1.2. Ciclo evolutivo ............................................................................. 14
1.4.1.3. Epidemiologia .............................................................................. 15
1.4.1.4. Heterogeneidade de T. rangeli ......................................................... 17
1.5. Importância do diagnóstico diferencial de Trypanosoma cruzi e T. rangeli ..... 17
1.6. Coleção de Tripanosomatídeos - Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ ............... 18
1.7. Justificativa ................................................................................... 19
2. OBJETIVO GERAL ......................................................................... 21
2.1. Objetivos específicos ........................................................................ 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................. 23
3.1. Organismos analisados ...................................................................... 23
3.2. Curvas de crescimento em meio de cultivo axênico .................................. 24
3.3. Estudos morfológicos ao microscópio óptico (M.O) .................................... 25
3.3.1. Avaliação qualitativa de estágios evolutivos ...................................................... 25
3.3.2. Avaliação quantitativa de estágios evolutivos - padrão de diferenciação celular .......... 26
3.3.3. Biometria dos principais estágios evolutivos ...................................................... 26
3.4. Análise estatística ........................................................................... 27
3.5. Preparo de massas parasitárias para análises bioquímica e molecular ............ 28
3.6. Análise eletroforética de isoenzimas .................................................... 28
3.7. Análise dos produtos de amplificação pela reação em cadeia da polimerase dos
fragmentos do kDNA ............................................................................... 29
3.7.1. Extração do kDNA ...................................................................................... 29
3.7.2. Reação de amplificação dos produtos dos minicírculos do kDNA .............................. 31
3.8. Análise numérica computacional de caracteres estáveis ............................ 32
4. RESULTADOS ............................................................................... 34
2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
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4.1. Curvas de crescimento em meio de cultivo axênico .................................. 34
4.2. Estudos morfológicos ........................................................................ 37
4.2.1. Avaliação qualitativa dos estágios evolutivos ..................................................... 38
4.2.2. Avaliação quantitativa dos estágios evolutivos ................................................... 44
4.2.3. Biometria dos principais estágios evolutivos ...................................................... 48
4.3. Análise estatística ........................................................................... 48
4.4. Analise bioquímica ........................................................................... 51
4.5. Análise molecular ............................................................................ 54
4.6. Análise numérica computacional ......................................................... 55
5. DISCUSSÃO ................................................................................. 59
5.2. Parâmetros morfobiológicos ............................................................... 61
5.2. Parâmetros bioquímicos e moleculares .................................................. 64
5.3. Considerações finais ......................................................................... 66
6. CONCLUSÕES .............................................................................. 68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 71
8. ANEXOS ..................................................................................... 78
2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática de estágios evolutivos da família Trypanosomatidae ........... 4
Figura 2: A, B, C: Formas sanguíneas de Trypanosoma cruzi cepas Y, FL, CL de camundongos
experimentalmente infectados; D: formas de cultura da cepa CL. Originais modificados de SOUSA MA
(1999 – cópia autorizada). ............................................................................................ 7
Figura 3: Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi no vertebrado (1-4) e no vetor (5-8). ................ 11
Figura 4: Distribuição geográfica do T. cruzi nas Américas . ................................................ 11
Figura 5: A: formas sanguineas de Trypanosoma rangeli; D: ................................................ 13
Figura 6: Ciclo evolutivo do T. rangeli no hospedeiro invertebrado. ...................................... 15
Figura 7: Distribuição geográfica do Trypanosoma rangeli .................................................. 16
Figura 8: Parâmetros biométricos utilizados na morfometria de tripanosomas obtidos na Coleção de
Tripanosomatídeos, IOC, FIOCRUZ. Originais de M.A. Sousa ((2007). ..................................... 27
Figura 9: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma cruzi ................. 38
Figura 10: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma cruzi ............... 39
Figura 11: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma rangeli ............ 40
Figura 12: Cinetoplastos de epimastigotas de cepas/clones de Trypanosoma cruzi .................... 41
Figura 13: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma cruzi ............... 42
Figura 14: Estágios evolutivos representativos de cepas de Trypanosoma rangeli: ..................... 43
Figura 15: Perfis eletroforéticos de isoenzimas em gel de agarose de cepas de Trypanosoma cruzi 52
Figura 16: Perfis eletroforéticos de isoenzimas em gel de agarose de cepas de Trypanosoma cruzi 53
Figura 18: Perfis dos produtos de amplificação do minicírculos do kDNA por PCR de T. rangeli H-
14,amostras isoladas de pacientes chagásicos 535,536,546,545 e T. cruzi: Y, utilizando primers
#121/122 (SOUSA et al 2008). ..................................................................................... 55
Figura 19: Perfis dos produtos de amplificação do minicírculos do kDNA por PCR de T. cruzi: Y, CL Brener,
DM28c, T. rangeli H-14 e Macias e T. caninum (A27) (MADEIRA et al 2009.............................................55
Figura 20: Dendograma de similaridade global de amostras de T.cruzi ................................... 57
2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Principais estágios evolutivos descritos para a família Trypanosomatidae. ..................... 3
Tabela 2: Diversidade intraespecífica de Trypanosoma cruzi. .............................................. 10
Tabela 3: Diversidade intraespecífica de Trypanosoma rangeli. ........................................... 17
Tabela 4: Informações sobre amostras de Trypanosoma cruzi e T. rangeli utilizadas no presente
trabalho ............................................................................................................... 23
Tabela 5: Reagentes empregados na análise de isoenzimas de Trypanosoma cruzi e T. rangeli. .... 30
Tabela 6: Crescimento das amostras de T. cruzi em meio de cultivo axênico (LIT) .................... 35
Tabela 7: Crescimento das amostras de T. rangeli em meio de cultivo axênico (LIT 20%SFB) ........ 36
Tabela 9: Análise morfométrica de epimastigotas de cepas/clones de T. cruzi e T.rangeli. ......... 49
Tabela 10: Análise morfométrica de tripomastigotas de cepas/clones de T. cruzi e T.rangeli. ..... 50
Tabela 11: Análise estatística (T-Test) dos dados biométricos do cinetoplasto de epimastigotas
de T. cruzi e T. rangeli. ............................................................................................ 51
Tabela 12: Análise estatística (T-Test) dos dados biométricos do comprimento total de
epimastigotas de T. cruzi e T. rangeli. .............................................................. 51
Tabela 13: Análise estatística (T-Test) dos dados biométricos do comprimento total de
tripomastigotas de T. cruzi e T. rangeli. ........................................................... 51
Tabela 14: Parâmetros utilizados para codificação de caracteres para processamento
computacional. ....................................................................................................... 56
Tabela 15: Codificação de caracteres selecionados das amostras de T.cruzi e T. rangeli para
processamento computacional usando o índice de similaridade de Jaccard e algoritmo de
agrupamento de UPGMA. ........................................................................................... 56
2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
xiii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Crescimento em cultura axênica (meio LIT) de 10 cepas de Trypanosoma cruzi ........... 35
Gráfico 2: Crescimento em cultura axênica (meio LIT +20%\SFB) de 6 cepas de Trypanosoma
rangeli. Eixo das coordenadas: número de células/ml; eixo abscissas: dias de acompanhamento da
curva. .................................................................................................................. 36
Gráfico 3: padrão de diferenciação celular em cepas de Trypanosoma cruzi (DM28c, Y, CL Brener,
YuYu, Colombiana). Eixo das coordenadas:
dias de cultivo; eixo abscissas: percentual de estágios evolutivos. ........................................ 45
Gráfico 4: padrão de diferenciação celular em cepas de Trypanosoma cruzi (Trypanosoma cruzi MR,
SF21, FL, G, Peruana). Eixo das coordenadas:
dias de cultivo; eixo abscissas: percentual de estágios evolutivos. ........................................ 46
Gráfico 5: padrão de diferenciação celular em cepas de Trypanosoma cruzi (H14, San Agustin, H9,
Choachi, Macias, R1625). Eixo das coordenadas:
dias de cultivo; eixo abscissas: percentual de estágios evolutivos. ........................................ 47
2009 Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
II
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
l
microlitro
ALAT
Alanina aminotransferase
ASAT
Aspartato aminotrasnferase
ATCC
American Type Culture Collection
pb
pares de base
º C
graus Celsius
CC
comprimento do corpo
ml
mililitr
CTE
comprimento total dos epimastigotas
CTT
comprimento total dos tripomastigotas
CT-IOC
Coleção de Trinapanosomatídeos do Instituto Oswaldo Cruz
DNA
ácido desoxirribonucleico
DTT
ditiotreitol
EDTA
ácido etileno-diamino tetracético
F6P
Frutose 6-fosphato
G
gravidade
G1P
Glicose 1-fosfato
G6PDH
Glicose 6-fosphato desidrogenase
GPI
glicosilfosfatidilinositol
HCl
ácido clorídrico
ICD
Isocitrato desidrogenase
IN
indice nuclear
Kb
kilobases
kDNA
DNA do cinetoplasto
L
largura do corpo
LIT
Liver Infusion Tryptose
M.O.
microscópio óptico
mÅ
miliampére
MDH
malato desidrogenase
ME
enzima málica
mg
miligrama
MLEE
Multilocus Enzime Eltrophoresis
mM
milimolar
dNTP
Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
N.N.N.
meio Novy, Nicole, MacNeal
N
2
nitrogênio líquido
nDNA
DNA nucelar
ng
nanograma
PCR
reação m cadeia da polimerase
PGM
Fosfoglucomutase
POPs
procedimentos operacionais padrões
RAPD
Random Amplification of Polymorphic DNA
rDNA
DNA ribossomal
RFLPs
Restriction Fragment Lenght Polymorphism
RPM
rotações por minuto
SDS-PAGE
eletroforese em gel d acrilaminda contendo SDS
SFB
soro fetal bovino
SM
Simple Matching
TAE
tampão Tris-Acetato-EDTA
U
unidade
UPGMA
Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
1
1. INTRODUÇÃO
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Família Trypanosomatidae Doflein, 1901
Segundo o Comitê de Sistemática e Evolução da Sociedade de Protozoologia, a
família Trypanosomatidae encontra-se classificada na Ordem Kinetoplastida, Subfilo
Mastigophora, Classe Zoomastigophora, Filo Sarcomastigophora (LEVINE et al. 1980 apud
SOUSA 2007, REY 2006). Entretanto, uma nova nomenclatura foi elaborada e proposta pelo
comitê da Sociedade Internacional de Protozoologia em 2005, classificando os estes
organimos em Trypanosomatida, Divisão Kinetoplastea, Primeira Divisão Euglenozoa,
Supergrupo Excavata. Ainda que o comitê evite utilizar esta nomenclatura, alguns livros
texto decidiram adotá-las, justificando o fato de estarem baseadas em conhecimentos de
ultra-estrutura e filogenia molecular dos parasitas (REY 2008).
A família Trypanosomatidae reúne um importante grupo de protozoários, todos
parasitas, de interesse médico, veterinário e econômico. Estes apresentam como uma das
características principais, a presença de uma massa evidente de DNA extranuclear (kDNA)
composta por cadeias de moléculas circulares - o cinetoplasto (VICKERMAN 1990, 1994).
Esta organela encontra-se contida em uma porção da mitocôndria única que percorre todo
o corpo celular, próximo a implantação do corpo basal do flagelo. Além disso, outras
características são peculiares a estes organismos: citoesqueleto formado por microtúbulos
corticais, mudança de estágios evolutivos com alternância ou não de hospedeiros e,
enzimas da via glicolítica contidas no glicossoma (HOARE 1972, WALLACE 1966, VICKERMAN
1994, SOUSA 2007).
O cinetoplasto dos tripanosomatídeos corresponde a cerca de 20% do total de DNA da
célula e difere do DNA nuclear (nDNA) pela composição de bases e estrutura molecular
(VICKERMAN 1994). O kDNA é composto por uma rede de moléculas circulares de dois
diferentes tamanhos: 1) minicírculos (cada cerca de com 0.46 a 3.8 kb) - heterogêneos em
sua seqüência e numerosos, com cerca de 5.000 a 27.000 por célula; 2) maxicírculos
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
3
(aproximadamente 20 a 38 kb, dependendo da espécie) - os quais são homogêneos em sua
seqüência de nucleotídeos, e formam uma rede com cerca de 25 a 50 moléculas. Os
maxicírculos correspondem ao DNA mitocondrial de outros eucariontes (WALLACE 1966,
1979, VICKERMAN 1994, BRANDÃO 2000).
Os estágios evolutivos dos tripanosomatídeos são nomeados de acordo com a forma
do corpo celular, posição do cinetoplasto em relação ao núcleo e o ponto emergência do
flagelo, lateral ou terminal. Os mais conhecidos são: promastigota, paramastigota,
opistomastigota, endomastigota, coanomastigota, epimastigota, tripomastigota,
amastigota e esferomastigota (WALLACE 1979, VICKERMAN 1990, SOUSA 2000). Além disso,
observou-se também diferenças na forma coanomastigota (SOUSA 2000). Estes estágios
estão descritos na tabela 1 e representados na figura 1.
Tabela I: Principais estágios evolutivos descritos para a família Trypanosomatidae.
Estágios
evolutivos
Forma do corpo
Posição do
cinetoplasto em
relação ao núcleo
Flagelo livre
visível ao
MO
Ponto emergência
do flagelo
Promastigota
alongada
anterior
sim
Porção anterior do
corpo
Paramastigota
alongada
lateral
sim
Porção anterior do
corpo
Opistomastigota
alongada
posterior
sim
Porção anterior do
corpo
Endomastigota
alongada
anterior
sim ou não
Porção anterior do
corpo
Coanomastigota
Curtas e largas,
extremidade
anterior truncada
anterior ou lateral
sim ou não
Porção anterior do
corpo
Epimastigota
alongada
anterior
sim
Lateralmente, forma
―membrana ondulante‖
Tripomastigota
alongada
posterior
sim
Lateralmente, forma
―membrana ondulante‖
Amastigota
oval ou
arrendondada
anterior
não
Sem flagelo visível ao
MO
Esferomastigota
arrendondada
Posterior
sim
Emerge a superfície e
conserva-se aderido ao
corpo
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
4
Figura 1: Representação esquemática de estágios evolutivos da família Trypanosomatidae: (1) amastigota; (2)
transição amastigota-promastigota; (3) promastigota; (4) paramastigota; (5) opistomastigotas; (6)
endomastigota; (7) coanomastigotas; (8) metacoanomastigota (ou opistomorfa); (9) endocoanomastigota; (10)
transição amastigota-epimastigota; (11) epimastigotas; (12) tripomastigotas; (13) esferomastigota; (14)
transição esferomastigota-tripomastigota. Originais de MA SOUSA (2007 - cópia autorizada).
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
5
A classificação dos gêneros de tripanosomatídeos, por técnicas parasitológicas
clássicas, baseia-se na observação de seus estágios e o número de hospedeiros necessários
à finalização do ciclo evolutivo de cada espécie. Estes protozoários podem ter um ou dois
hospedeiros ao longo deste ciclo sendo, respectivamente, monoxênicos ou heteroxênicos.
Estes hospedeiros podem ser um vertebrado ou vegetal e/ou um inseto ou outro
invertebrado (hospedeiro único ou vetor). Os gêneros classicamente reconhecidos na
literatura são: Blastocrithidia, Crithidia, Herpetomonas, Leptomonas e Rynchoidomonas
para os monoxênicos e Phytomonas, Endotrypanum, Leishmania, Trypanosoma para os
heteroxênicos (WALLACE 1966, 1979, VICKERMAN 1976, SOUSA 2000).
1.2. Gênero Trypanosoma Gruby, 1843
No gênero Trypanosoma estão incluídos parasitos de todas as classes de vertebrados
que têm importância médica e veterinária e, entre as espécies deste gênero, Trypanosoma
cruzi e Trypanosoma rangeli destacam-se por serem as únicas capazes de infectar seres
humanos no continente americano. Hoare (1964, 1972) propôs a classificação de espécies
de Trypanosoma de mamíferos em duas seções:
Seção Stercoraria, a qual incluí os subgêneros Herpetosoma Doflein 1901,
Schizotrypanum Chagas 1909 e Megatrypanum Hoare 1964. Nesta seção, o ciclo de
desenvolvimento no inseto completa-se no intestino posterior, onde ocorrem os
metacíclicos e a transmissão ocorre por via contaminativa. Ãnez (1982) propôs o
subgênero Tejeraia para alocar uma espécie (T. rangeli) previamente classificada
nesta seção. Entretanto, esta proposta continua sendo tema de discussão.
Seção Salivaria que incluí os subgêneros Trypanozoon Lühe 1906, Duttonela
Chalmers 1928, Nannomonas Hoare 1964 e Pycnomonas Hoare 1964. Já nesta seção, o
ciclo de desenvolvimento no inseto completa-se na porção anterior do tubo digestivo
(probóscide, hipofaringe, glândulas salivares), na qual os metacíclicos estão
presentes e a transmissão é por via inoculativa. As espécies transmitidas
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
6
mecanicamente, T. evansi, ou pelo coito, T. equiperdum, estão incluídas na seção
Salivaria por não estarem relacionadas com outros membros desta seção.
1.3. O Subgênero Schizotrypanum Chagas, 1909
O Subgênero Schizotrypanum é formado por tripanosomas que possuem como
características principais: estágios tripomastigotas sanguícolas em forma de ―C‖ ou ―S‖,
cinetoplasto volumoso próximo à extremidade posterior e a reprodução intracelular no
mamífero sob a forma amastigota. Estes parasitas assemelham-se morfologicamente com a
espécie-tipo, Trypanosoma cruzi, mas diferem de modo marcante dos tripanosomas de
outros subgêneros. De um modo geral, não apresentam patogenicidade conhecida, com
exceção de T. cruzi, e são parasitas de diversos mamíferos, incluindo o homem. Os
tripanosomas deste subgênero que infectam quirópteros têm distribuição geográfica
cosmopolita (HOARE 1972, SOUSA 1999).
1.3.1. Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi Chagas, 1909
O agente etiológico da doença de Chagas ou Tripanosomíase Americana,
Trypanosoma cruzi, foi descoberto por Carlos Chagas em 1909, inicialmente em insetos
triatomíneos (Panstrongylus megistus) capturados em Minas Gerais (Brasil) e,
posteriormente, em seres humanos (HOARE 1972, SOUSA 1999). Atualmente, sabe-se que
T. cruzi encontra-se amplamente distribuído no Continente Americano, tendo sido descrito
em mais de 200 espécies e subespécies de mamíferos de diferentes ordens, como também
em mais de 70 espécies de triatomíneos (BARRETTO & RIBEIRO 1979, SHERLOCK 1997). A
doença de Chagas afeta cerca de 18 milhões de seres humanos, entretanto
aproximadamente 100 milhões de pessoas estão expostas ao risco da infecção (WHO 2009).
A infecção pelo T. cruzi em seres humanos pode ser assintomática ou manifestar-se sob
diferentes formas clínicas: cardíaca, digestiva e mista. Na chamada forma indeterminada
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
7
não há sintomas evidenciáveis, mas o paciente apresenta reações sorológicas positivas para
antígenos de T. cruzi (ANDRADE & ANDRADE 1979, BRENER 1987).
1.3.1.1. Características morfológicas
De acordo com desenvolvimento no vertebrado e no inseto transmissor (VICKERMAN
1990, SOUSA 1999), Trypanosoma cruzi apresenta os seguintes estágios (figura 2):
amastigota: forma oval ou arredondada, cinetoplasto em forma de bastão;
epimastigota: forma alongada, núcleo esférico, cinetoplasto em forma de bastão na
porção anterior junto ao núcleo;
tripomastigota: forma alongada, núcleo geralmente alongado, cinetoplasto esférico
nos estágios diferenciados. Os tripomastigotas sanguícolas apresentam-se em
formas de C ou S e com cinetoplasto volumoso, principalmente subterminal.
Figura 2: A, B, C: Formas sanguíneas de Trypanosoma cruzi cepas Y, FL, CL de camundongos
experimentalmente infectados; D: formas de cultura da cepa CL. Originais modificados de SOUSA MA (1999 –
cópia autorizada).
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
8
1.3.1.2. Ciclo evolutivo
Resumidamente, o ciclo evolutivo do T. cruzi no hospedeiro vertebrado inicia-se
quando tripomastigotas metacíclicos depositados juntamente com as fezes do triatomíneo
penetram na pele ou mucosa do vertebrado, assim atingindo a corrente circulatória e
principalmente células do sistema fagocitário mononuclear, inclusive no local da picada
(HOARE 1972, CDC 2009). No interior das células do hospedeiro, estes tripomastigotas
escapam do vacúolo fagocitário e no citoplasma transformam-se em amastigotas, que se
multiplicam por divisa binária e após transformam-se em tripomastigotas. Estas podem
penetrar em outras células do hospedeiro ou circular na corrente sanguínea e ser ingeridas
por um triatomíneo, reiniciando o ciclo. Os principais tecidos que podem ser infectados por
T. cruzi são da musculatura lisa, cardíaca e esquelética (ANDRADE 1979, HOARE 1972,
SOUSA 1994). Este ciclo assegura a continuidade da infecção no hospedeiro vertebrado,
devido à formação de novos ―ninhos‖ de parasita em outros órgãos e tecidos deste
hospedeiro. A figura 3 ilustra bem esta fase do ciclo (itens 1 a 4).
No hospedeiro invertebrado o ciclo tem início quando este ingere sangue de animais
infectados com tripomastigotas sanguíneos. Após a ingestão, estes tripomastigotas sofrem
uma série de transformações, originando principalmente epimastigotas, os quais são
encontrados desde o intestino médio até o reto. No intestino médio os epimastigotas
multiplicam-se intensamente e, após migrarem para o reto, diferenciam-se em
tripomastigotas metacíclicos, os quais são eliminados junto às fezes. (VICKERMAN 1994,
ZELÉDON, 1997), conforme ilustrado na figura 3 (itens 5 a 8).
1.3.1.3. Epidemiologia
A infecção por este tripanosoma inicialmente ocorria exclusivamente entre animais e
vetores silvestres comportando-se como uma zoonose. Entretanto, através da destruição
do ciclo natural do T. cruzi com a destruição de florestas, conseqüente rareamento dos
animais silvestres que serviam de fonte natural de alimentação aos triatomíneos e invasão
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
9
do homem na floresta, estes passaram a se alimentar em animais domésticos e humanos,
passando a doença a ser considerada uma antropozoonose (SILVEIRA & VINHÃES 1998).
Trypanosoma cruzi tem distribuição geográfica exclusiva no continente americano,
circulando desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina (Figura 4). No Brasil, as
principais espécies de triatomíneos vetores do parasita são: Triatoma infestans,
Panstrongylus megistus, Rhodnius prolixus. Os animais reservatórios do T. cruzi são
mamíferos pertencentes às seguintes ordens Marsupialia, Ciabata, Chiroptera, Carnívora,
Rodentia, Primates e Lagomorfa (BARRETO & RIBEIRO 1979, WIKIPEDIA 2009), sendo as
outras classes de vertebrados, tais como aves, anfíbios, répteis e peixes refratários ao T.
cruzi.
A variedade de espécies transmissoras e hospedeiros vertebrados, associadas a
diferentes habitats inviabilizam a erradicação deste parasita e, como o ciclo doméstico de
transmissão é responsável pela maioria dos casos humanos, o controle da doença passou a
ser feito principalmente através de medidas de combate ao vetor (SHERLOCK 1979,
SANTOS-MALLET 2000, SILVEIRA & VINHÃES 1998).
1.3.1.4. Heterogeneidade de T. cruzi
É possível que a diversidade de T cruzi, observada em cepas, clones e diferentes
isolados, decorra da grande variedade de vertebrados e insetos vetores que esta espécie
pode infectar (BARRETTO & RIBEIRO 1979, SOUSA 1999).
A heterogeneidade de T. cruzi pode ser verificada tanto pelos caracteres de
diferentes isolados analisados por parâmetros morfobiológicos, antigênicos, bioquímicos e
moleculares, quanto pela variedade de formas clínicas que podem causar em seres
humanos. Esta heterogeneidade intraespecífica foi descrita por muitos autores, o primeiro
deles sendo o próprio Carlos Chagas (1909), sendo que os estudos mais recentes
demonstram que a heterogeneidade intraespecífica de isolados de T. cruzi podem ser
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
10
referidos e/ou classificados como cepas, clones, clones principais, biodemas, zimodemas,
linhagens e grupos, conforme descrito na tabela 2.
Tabela 2: Diversidade intraespecífica de Trypanosoma cruzi.
Metodologias
Grupos
Autores
Tipos antigênicos
A, B, C
Nussenzweig 1962
Nussenzweig & Goble 1966
Clones Principais
Tinayrenc & Breniere 1988
Morfologia das
formas sanguíneas
Cepas polares Y e CL
Formas delagadas – invasão celular
Formas largas – desenvolvimento em
triatomíneos e culturas
Brener 1965, 1969
Brener & Chiari 1963
Deane 1974
Lectinas
WAG +
PNA+
Schotelius 1983
Morfologia,
parasitismo,
letalidade
Biodemas I, II, III
Andrade 1974
Andrade & Magalhães 1997
Perfis de restrição
do kDNA
Esquizodemas
Morel 1980
Isoenzimas
Zimodemas 1, 2, 3
Zimodemas A, B, C, D
Miles 1977, 1980
Murta & Romanha 1999
Tibayrenc 1986, 1988
RAPD
Steindel 1988
Tibayrenc 1993
rRNA
Genes de mini-exon
Linhagem 1 – doméstico
Linhagem 2 - sivestre
Souto 1996
Zingales 1998
DTU’s
TCI – silvestre
TCII - humanos
Souto 1996
Zingales 1998
Fernandes 1998
DTU’s
TCII a, b, c, d, e
Brisse 2000
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
11
Figura 3: Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi no vertebrado (1-4) e no vetor (5-8). Fonte: CDC (2009)
Figura 4: Distribuição geográfica do T. cruzi nas Américas . Fonte: WHO 2006.
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
12
1.4. O Subgênero Tejeraia Ãnez, 1982
Os tripanosomas do subgênero Tejeraia são principalmente parasitos de tamanho
médio, cinetoplasto pequeno, apresentando-se sob formas amastigotas, epimastigota e
tripomastigota. Não há reprodução intracelular no vertebrado e/ou no sangue dos
hospedeiros e, no vetor, a reprodução ocorre no intestino médio, hemolinfa e glândulas
salivares. Caracterizam-se pela falta de especificidade de hospedeiros vertebrados e por
não serem patogênicos a estes, mas sim ao hospedeiro invertebrado (ANEZ 1982,
D’ÁLESSANDRO, 1976). A espécie tipo deste grupo é Trypanosoma rangeli.
Ãnez (1982) propôs este subgênero visando alocar T. rangeli, classificada
anteriormente no subgênero Herpetosoma, mas que apresenta diferenças significativas dos
outros membros deste subgênero. Apesar desta proposta continuar sendo tema de
discussão, resolvemos adotá-la no presente trabalho.
1.4.1. Trypanosoma (Tejeraia) rangeli Tejera, 1920
Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 é outra espécie de tripanosoma que infecta seres
humanos em alguns países das Américas Central e do Sul, o qual foi descrito por Tejera
(1920) como parasita de Rhodnius prolixus na Venezuela, mas possivelmente descoberto
Escomel em 1919(apud HOARE 1972) como T. escomeli. Posteriormente, foi encontrado em
animais silvestres e domésticos, assim como em outras espécies de triatomíneos,
principalmente do gênero Rhodnius, sendo transmitido aos vertebrados por via inoculativa
(D’ALESSANDRO 1976, 1992).
Trypanosoma rangeli apresenta posição taxonômica discutível. Com base na
similaridade das formas sanguíneas com T. lewisi e pela crença nunca demonstrada na
transmissão deste parasito através das fezes, Hoare (1972) posicionou este parasito no
subgênero Herpetosoma, seção Stercoraria. Entretanto, este tripanosoma apresenta como
característica diferencial, a capacidade de parasitar uma variedade de animais, enquanto
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
13
os demais membros do subgênero Herpetosoma são hospedeiros restritos (D’ALESSANDRO,
1976, AÑEZ 1982). Segundo Hoare (1972), T. rangeli possui características dos membros da
seção Stercoraria, mas tornou-se adaptado ao desenvolvimento na porção anterior do
inseto, característica dos membros da Seção Salivaria. Añez (1982) sugeriu então a criação
do subgênero Tejeraia para este parasito, reconsiderando sua posição taxonômica.
1.4.1.1. Características morfológicas
O Trypanosoma rangeli apresenta basicamente os seguintes estágios evolutivos:
epimastigotas, tripomastigotas e esferomastigotas. Estes estágios, no hospedeiro
invertebrado apresentam dimensões muito variáveis e cinetoplasto pequeno, já a formas
sanguíneas de T. rangeli são tipicamente maiores que as de T. cruzi, o qual apresenta
membrana ondulante bem desenvolvida e cinetoplasto pequeno (D’ALESSANDRO 1976,
SOUSA 1999, HOARE 1972, VICKERMAN 1990) (Figura 5).
Este tripanosoma assemelha-se com T. lewisi nos estágios sanguíneos, mas infecta o
hospedeiro invertebrado através de tripomastigotas metacíclicos no interior das glândulas
salivares. Tal comportamento difere dos demais membros deste subgênero, os quais não
são capazes de invadir a hemocele (D’ALESSANDRO 1976, HOARE 1972, TOBIE 1970).
Figura 5: A: formas sanguineas de Trypanosoma rangeli; D: formas de cultura. 1 -6 epimastigotas 7-8
tripomastigotas 9-10 tripomastigotas metaciclicos Originais modificados de SOUSA MA (1999 – cópia autorizada).
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
14
1.4.1.2. Ciclo evolutivo
O ciclo evolutivo do T. rangeli no hospedeiro vertebrado ainda é pouco conhecido,
pois, como este tripanosoma apresenta baixa parasitemia nestes hospedeiros, dificultando
a identificação de seus locais de multiplicação (D’ALESSANDRO 1976, HOARE 1972).
Entretanto, apesar de suas características não patogênicas, a infecção do T. rangeli induz
uma resposta imune uma vez que provoca reações cruzadas
com T. cruzi devido a partilha antigênica de epítopos (GHULL 1985, GRISARD 2008).
Também não é aceita pela maioria dos pesquisadores a existência de um ciclo intracelular
e desconhece-se a ocorrência de multiplicação no sangue do hospedeiro vertebrado
(URDANETA MORALES & TEJERO 1986).
O T. rangeli apresenta ciclo evolutivo complexo em seu hospedeiro intermediário
(FIG.6) e apresenta-se patogênico para seu vetor. A invasão por T. rangeli na maioria dos
tecidos dos insetos produz danos que constituem as principais causas da mortalidade
(D’ALESSANDRO & SARAVIA 1999, TOBIE 1970).
O ciclo inicia-se no intestino anterior do triatomíneo, após a ingestão de formas
infectivas de T. rangeli presentes no sangue de vertebrados utilizados para alimentação.
Ao atingirem o intestino médio, os parasitas diferenciam-se em epimastigotas e
tripomastigotas de dimensões variadas e multiplicam-se. Após, estas formas podem migrar
para o reto e serem eliminadas pelas fezes ou, atravessam as células do epitélio intestinal
por uma rota intracelular, chegando assim à hemocele. Nesta fase, os parasitos
multiplicam-se na hemolinfa ou no interior de hemócitos (CUBA-CUBA 1998, TOBIE 1970),
os epimastigotas invadem as glândulas salivares do inseto, diferenciando-se em
tripomastigotas metacíclicos (metaciclogênese). Estes tripomastigotas possuem pequenas
dimensões, quando comparadas às demais formas no vetor, e são capazes de infectar por
via inoculativa o hospedeiro vertebrado durante seu repasto (D’ALESSANDRO 1976),
conforme pode ser observado na figura 6.
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
15
Figura 6: Ciclo evolutivo do T. rangeli no hospedeiro invertebrado. (A) Infecção do triatomíneo: ingestão de
tripomastigotas durante o repasto sanguíneo. (B-2) Após a ingestão, predomínio de epimastigotas e
tripomastigotas no intestino médio. (C-3) Epimastigotas atravessam o epitélio do intestino médio e migram
para a hemocele. (C-4,5) Estes estágios invadem, dividem-se ou multiplicam-se no interior dos hemócitos (D-7)
Parasitos livres na hemolinfa. (E-8) Parasitos dividem-se extracelularmente e ou invadem e multiplicam-se no
interior das glândulas salivares. (E-8) Tripomastigotas metacíclicos produzidos nas glândulas salivares são
injetados com a saliva durante o processo de alimentação. Fonte: Tobie (1970).
1.4.1.3. Epidemiologia
Trypanosoma rangeli tem uma ampla distribuição geográfica entre as Américas
Central, do Norte e Sul, sendo amplamente disseminado nas Américas, conforme ilustrado
na figura 7 (CUBA-CUBA 1998). Sua presença já foi confirmada na Argentina, Bolívia, Brasil,
Colômbia, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Guiana Francesa, Honduras, México,
Nicarágua, Panamá, Paraguai, Peru e Venezuela (AÑEZ 1982, D’ALESSANDRO 1976).
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
16
No Brasil já foram relatados casos de tripanosomas semelhantes a T. rangeli em
diversos Estados e a descoberta de T. rangeli nesta área geográfica tem importância
epidemiológica relevante, pelas infecções mistas com T. cruzi que ocorrem naturalmente
em reservatórios vertebrados, triatomíneos e homens, sendo este fator importante na
dificuldade do diagnóstico da Doença de Chagas.
Os vetores potenciais de T. rangeli estão compreendidos em 12 espécies do gênero
Rhodnius. Além disso, tem sido observada a presença deste tripanossoma, no intestino de
16 espécies dos gêneros Carvenicola, Eratyrus, Dipetalogaster, Panstrongylus e Triatoma,
mas tal parasitismo não constitui elemento conclusivo da capacidade vetorial destes
triatomíneos para T. rangeli. Ao contrário de outras espécies do subgênero Herpetosoma,
T. rangeli apresenta grande variedade de hospedeiros vertebrados, distribuídas nas
seguintes ordens: Marsupialia, Carnívora, Rodentia e Primates (D’ALESSANDRO 1976,
GUHL & VALLEJO 2003).
Figura 7: Distribuição geográfica do Trypanosoma rangeli. Fonte: Cuba-Cuba (1998)
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
17
1.4.1.4. Heterogeneidade de T. rangeli
Parâmetros biológicos, bioquímicos e moleculares têm revelado pequena
variabilidade entre as cepas isoladas de diferentes hospedeiros, procedentes de diferentes
regiões geográficas (D’ ALESSANDRO 1976, GRISARD 1999, VALLEJO 2003). Destacamos os
principais parâmetros utilizados para classificação destas espécies:
Tabela 3: Diversidade intraespecífica de Trypanosoma rangeli.
Metodologias
Autores
Lise pelo complemento
Schhotelius & Muller 1984
Marinkelle 1985
Lectinas
Schhotelius 1986
Schhotelius & Muller 1984
Produção de neuramidase
Pereira & Moss 1985
Vallejo & Marinkelle 1992
Perfis de restrição do kDNA
Morel 1980
Isoenzimas
Kreutzer & Sousa 1981
Steindel 1994
Acosta 1991
Minicírculos do kDNA
(KP1, 2, 3, 4)
(KP1+, KP1-)
Recinos 1994
Vallejo 1994, 1999, 2002, 2003
RAPD
Steindel 1994
1.5. Importância do diagnóstico diferencial de Trypanosoma cruzi e T. rangeli
Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi são espécies que infectam insetos
triatomíneos, seres humanos, animais domésticos e uma variedade de animais silvestres;
ambos com distribuição geográfica de pela América Latina. T. rangeli não é patogênico
para seres humanos, enquanto T. cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. T.
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
18
rangeli é considerado importante do ponto de vista biológico e epidemiológicos
(D’ALESSANDRO & SARAVIA 1999, GHULL & VALLEJO 2003), uma vez que provoca reações
cruzadas com T. cruzi em exames de diagnóstico, devido a partilha antigênica de epítopos
(GHULL 1985, GRISARD 2008). Desta forma, o diagnóstico diferencial entre T. cruzi e T.
rangeli torna-se muito importante.
1.6. Coleção de Tripanosomatídeos - Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
A Coleção de Tripanosomatídeos do Instituto Oswaldo Cruz foi organizada a partir de
1991 pela protozoologista Maria Auxiliadora de Sousa, inicialmente para estudar estes
organismos de forma abrangente e comparativa, diante dos diversos problemas
taxonômicos. A partir de 1993 passou a distribuir material biológico para projetos de
pesquisa e ensino, principalmente nacionais (mais de 200 apoiados). Em 1995 foi
reconhecida institucionalmente, entretanto atualmente encontra-se com suas atividades
paralisadas.
A maioria das amostras depositadas nesta Coleção procedeu de doações de
pesquisadores e professores brasileiros; as demais vieram por permuta ou compradas
diretamente da American Type Custure Collection (ATCC - Manassas, USA). No presente
estudo foram utilizadas amostras da referida Coleção, selecionadas por serem
representantes do gênero Trypanosoma que infectam seres humanos no Continente
Americano, principalmente na América Latina. Este estudo faz parte ainda de um amplo
projeto coordenado pela pesquisadora M. A. Sousa para assegurar a autenticidade do
acervo da Coleção de Tripanosomatídeos, a qual pretende manter sua prestação de
serviços tão logo se restabeleça a normalidade interna.
2009 INTRODUÇÃO Santos BN Santos-Faissal BN
19
1.7. Justificativa
O presente trabalho justifica-se pela necessidade da caracterizar cepas de referência
de Trypanosoma cruzi e T. rangeli, depositadas na ―Coleção de Tripanosomatídeos‖ do
Instituto Oswaldo Cruz (CT-IOC). Os resultados deste estudo servirão para validação dos
métodos, técnicas e procedimentos rotineiramente utilizados na referida Coleção visando a
certificação de autenticidade das amostras regularmente cedidas à comunidade científica
para pesquisa e ensino, e foram aplicados em pesquisas em andamento para definição dos
principais maracdores de valor diagnóstico.
Além dos motivos acima descritos, outro aspecto relevante deste trabalho é o resgate
do conhecimento destes organismos por técnicas parasitológicas clássicas, tanto pela
necessidade de preencher lacunas na formação dos profissionais que utilizam estes
organismos, quanto pela necessidade de implantação de uma rotina simples e de baixo
custo para caracterização de amostras.
2009 OBJETIVOS Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
20
2. OBJETIVOS
2009 OBJETIVOS Santos-Faissal BN Santos-Faissal BN
21
2. OBJETIVO GERAL
Caracterizar por abordagens biológica, morfológica, bioquímica e molecular cepas de
Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli depositados na Coleção de Tripanosomatídeos
do Instituto Oswaldo Cruz (CT-IOC), FIOCRUZ.
2.1. Objetivos específicos
Analisar a biologia e morfologia de cepas de T. cruzi e T. rangeli mantidas em cultivo
axênico;
Analisar o perfil de atividade isoenzimática destas espécies;
Comparar o resultado dos produtos de amplificação dos minicírculos do kDNA;
Confirmar a autenticidade de amostras depositadas na Coleção de Tripanosomatídeos
do Instituto Oswaldo Cruz;
Analisar as informações obtidas e identificar caracteres que podem ser úteis no
diagnóstico diferencial entre T. cruzi e T. rangeli e sugerir a aplicação destes
marcadores em atividades de rotina para a distinção de amostras isoladas ou
mantidas em culturas axênicas;
Complementar e resgatar o conhecimento parasitológico básico sobre estas espécies.
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
22
3. MATERIAIS E MÉTODOS
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
23
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Organismos analisados
No presente trabalho foram examinadas 10 amostras de Trypanosoma cruzi e 6 de
Trypanosoma rangeli, mantidas na Coleção de Tripanosomatídeos do Instituto Oswaldo
Cruz (CT-IOC), FIOCRUZ, criopreservadas em nitrogênio líquido e com número de registro
próprio (CT-IOC), conforme tabela a seguir (tabela 4).
Tabela 4: Informações sobre amostras de Trypanosoma cruzi e T. rangeli utilizadas no presente trabalho
Espécies
Cepas
CT-IOC (*)
Hospedeiro
Procedência
geográfica
Trypanosoma cruzi
Y
106
Homo sapiens
Brasil
Trypanosoma cruzi
CL-Brener
005
Triatoma infestans
Brasil
Trypanosoma cruzi
FL
249
Triatoma infestans
Brasil
Trypanosoma cruzi
MR
301
Triatoma infestans
Brasil
Trypanosoma cruzi
YuYu
300
Triatoma infestans
Brasil
Trypanosoma cruzi
Peruana
252
Homo sapiens
Peru
Trypanosoma cruzi
G
216
Didelphis
marsupialis
Brasil
Trypanosoma cruzi
DM28c
010
Didelphis
marsupialis
Venezuela
Trypanosoma cruzi
SF 21
251
Homo sapiens
Brasil
Trypanosoma cruzi
Colombiana
004
Homo sapiens
Colombia
Trypanosoma rangeli
Choachi
271
Rhodnius prolixus
Colômbia
Trypanosoma rangeli
H-9
274
Homo sapiens
Honduras
Trypanosoma rangeli
H-14
038
Homo sapiens
Honduras
Trypanosoma rangeli
Macias
273
Triatoma infestans
Venezuela
Trypanosoma rangeli
R1625
002
Homo sapiens
El Salvador
Trypanosoma rangeli
San Agustín
282
Homo sapiens
Colombia
(*) número código da Coleção de Tripanosomatídeos.
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
24
3.2. Curvas de crescimento em meio de cultivo axênico
As amostras de cada espécie foram retiradas do nitrogênio líquido (N
2
) e semeadas
com volume de aproximadamente 0,5 ml em tubos de cultura com tampa de rosca,
contendo 4 ml de ágar-sangue solidificado (N.N.N. - Novy, Nicole & McNeal) e 3 ml de meio
LIT (Liver Infusion Tryptose), este suplementado com soro fetal bovino (SFB) contendo o
volume final de 10% ou 20%. As culturas foram incubadas em estufa B.O.D (Fanem®) a
temperatura de 27
o
C (±0,3) e mantidas por repiques quinzenais. Antes do início das curvas
de crescimento, as amostras passaram por 2 repiques com intervalos de 7 dias, utilizando-
se apenas meio monofásico suplementado com 10% ou 20% de SFB, dependendo de suas
exigências previamente conhecidas.
Para o ajuste do inóculo inicial de cada curva de crescimento, alíquotas das culturas
foram diluídas (1:100) em tubos de polipropileno de 1,5 ml (Eppendorf®) contendo salina
glicosada (NaCl 0,85% com 1% glicose). Após leve homogeneização, 10 l de cada amostra
foram transferidos para uma das câmaras do hemocitômetro de Neubauer para
quantificação dos parasitas, esta realizada em duplicata. Após, o número de células
utilizado na semeadura foi ajustado para 210
6
para um volume final de 4ml de meio LIT
contido em tubo com tampa de rosca de 16x150 mm. Todas as culturas foram mantidas em
estufa incubadora nas condições acima mencionadas. O crescimento de cada amostra foi
avaliado através da média do número de parasitas/ml determinada nos seguintes dias após
a semeadura: 4
o
, 7
o
, 10
o
, 13
o
, 17
o
e 20
o
.
Com os resultados, analisou-se o comportamento de cada amostra (períodos de
crescimento e declínio) e, através da média dos valores encontrados entre o 7º e 17º dia,
formaram-se grupos baseados na intensidade de crescimento de cada amostra de T. cruzi e
T. rangeli : baixa intensidade (≤ 10 x 10
6
parasitas/ml), média intensidade (10 a 30 x 10
6
parasitas/ml) e alta intensidade (≥ 30 x 10
6
parasitas/ml).
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
25
3.3. Estudos morfológicos ao microscópio óptico (M.O)
Para os estudos morfobiológicos foram coletadas alíquotas de cada cultura nos
mesmos dias da curvas de crescimento. Assim, foram preparados esfregaços da cultura
sobre lâminas de vidro. Essas preparações foram fixadas com metanol por 10 minutos e,
após descarte do fixador e secagem, foram tratadas com HCl 5N por 15 minutos e lavadas
em fluxo delicado de água corrente. Subseqüentemente, os esfregaços foram corados por
cerca de 90 min com solução de corante Giemsa (Merck) diluído em tampão fosfato 0,02M,
pH 7,2 (3 gotas de Giemsa/ml de tampão). Após, as lâminas foram lavadas rapidamente em
água corrente para retirada do excesso de corante e colocadas para secar em posição
inclinada. Para a preservação da coloração, cada lâmina foi montada com resina sintética
Permount (Fisher) e lamínulas finas (SOUSA 2000, 2007).
As observações dos esfregaços corados foram realizadas ao microscópio óptico (M.O. -
Hund H600) com objetiva de imersão (1.000 ), visando identificação e quantificação de
estágios evolutivos, confecção de desenhos em câmara clara e fotografias.
3.3.1. Avaliação qualitativa de estágios evolutivos
Os principais estágios evolutivos encontrados em cada amostra foram analisados
previamente por parâmetros definidos na literatura (DIAS & FREITAS 1943, HOARE 1972;
SOUSA 2008). Estágios encontrados ao acaso foram desenhados, com o auxílio de câmara
clara acoplada ao M.O. (1.000 ). Nas condições de trabalho padronizadas na Coleção de
Tripanosomatídeos, os desenhos originais foram obtidos na escala de 10 m = 1,4 cm, esta
previamente definida com base em uma lâmina micrométrica (1:100 mm, na qual 1=1mm).
Ainda com base nestes parâmetros, foram também desenhados cinetoplastos do principal
estágio encontrado nas culturas de cada cepa, no caso, epimastigotas.
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
26
3.3.2. Avaliação quantitativa de estágios evolutivos - padrão de diferenciação
celular
O padrão de diferenciação celular de cada amostra foi analisado ao MO (1000 ) em
laminas coradas pelo Giemsa procedentes de culturas de 10º, 13º, 17º e 20º dias de cultivo
de cada amostra. Determinaram-se os percentuais dos diferentes estágios evolutivos após
exame de 200 células, encontradas ao acaso nas referidas lâminas.
Os seguintes estágios evolutivos foram quantificados para posterior determinação de
seus percentuais: epimastigotas, tripomastigotas com extremidade posterior afilada,
esferomastigotas e formas semelhantes a um girino (―tadepole‖ ou lâmpadas), além de
divisões.
3.3.3. Biometria dos principais estágios evolutivos
Foram tomadas medidas dos estágios de epimastigotas e tripomastigotas;
comprimento do eixo longitudinal dos cinetoplastos de epimastigotas, segundo parâmetros
descritos na literatura. Os parâmetros morfométricos selecionados para o presente
trabalho foram propostos por Dias e Freitas (1943), Hoare (1972) e Sousa (2000) foram:
comprimento do corpo (C), comprimento do flagelo livre (FL), comprimento total (CT -
comprimento do corpo + flagelo livre), largura do corpo na altura do núcleo (L), distância
entre a extremidade posterior do corpo e o meio do núcleo (PN), distância entre a
extremidade anterior e o meio do núcleo (NA), razão PN/NA, conhecida como índice
nuclear (IN) (Fig 8).
Todas as medidas foram tomas em centímetros com uma régua ou curvímetro
diretamente sobre os desenhos obtidos com auxílio da câmara clara e, após, tranformadas
em micrometros através de fator de multiplicação. Este fator é deduzido do tamanho da
barra-escala (cm), correspondente a 10 µm e que foi incluída em todas as pranchas. Após,
calculou-se a média, desvio padrão e variação por amostragem de cada parâmetro
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
27
analisado, utilizando-se planilhas em programa Excel. Os resultados considerados mais
significantes para a distinção entre T. cruzi e T. rangeli foram analisados estatisticamente.
3.4. Análise estatística
As análises estatísticas dos caracteres que apresentaram menor variação dentro de
cada espécie foram realizadas utilizando-se o teste T Student (Programa PASW Statistics-
17.0).
Figura 8: Parâmetros biométricos utilizados na morfometria de tripanosomas obtidos na Coleção de
Tripanosomatídeos, IOC, FIOCRUZ. Originais de M.A. Sousa ((2007).
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
28
3.5. Preparo de massas parasitárias para análises bioquímica e molecular
Culturas de todas as amostras selecionadas foram crescidas em condições favoráveis
para a obtenção de massa de parasitas com cerca de 10
7
a 10
8
células por amostra para as
análises bioquímica e molecular. As 16 amostras foram ampliadas em tubos de
polipropileno (Falcon ®) de 50 ml (contendo 10 ml de meio NNN e 15 ml de meio LIT 10 ou
20% FSB) e 15 ml (contendo 5 ml de meio NNN e 10 ml meio LIT 10 ou 20% SFB). Após 7 dias
de crescimento, as culturas foram transferidas para novos tubos de polipropileno e lavadas
3 vezes por centrifugação a 3.500 g por 20 min à temperatura de 4ºC, desprezando-se o
sobrenadante e ressuspendendo-se o sedimento em solução salina/EDTA (NaCl 0,85%; EDTA
0,01 M pH 8,0). Ao final deste processo, as massas parasitárias foram transferidas para
tubo de criopreservação e estocadas em nitrogênio líquido (-196ºC). Estas foram destinadas
a preparação do extrato enzimático e extração do kDNA do cinetoplasto.
3.6. Análise eletroforética de isoenzimas
A determinação do perfil isoenzimático através de eletroforese horizontal em gel de
agarose foi realizada segundo protocolo operacional da Coleção de Tripanosomatídeos (MA
SOUSA) baseado em Cupolillo et al (1994). Os seguintes loci enzimáticos foram analisados:
MDH (Malato desidrogenase - E.C. 1.1.1.37), ME (Enzima málica - E.C. 1.1.1.40), GPI
(Glicose-6-Fosfato isomerase - E.C. 5.3.1.9) e PGM (Fosfoglucomutase - E.C. 2.7.5.1). As
etapas deste processo são detalhadas a seguir.
As massas parasitárias foram retiradas do nitrogênio líquido e, após
descongelamento, adicionou-se 100µl do tampão de lise com protetor de atividade
enzimática (10 ml Tris HCL 0,05 M pH 8,0; 10 ml Triton X-100 10%; 37 mg EDTA dissódico;
15 mg Dithiothreitol (DTT); 13 mg ácido n-amino-capróico; 80 ml H
2
0 q.s.p).
Para o preparo do gel de corrida utilizou-se agarose a 1% em uma solução 1:1 (50ml
H
2
0 destilada; 50 ml de tampão) tamponada específica para cada sistema (tabela 5). Após
aquecimento, a agarose foi distribuída sobre filme de poliestireno (Gel Bond® - Amersham
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
29
Pharmacia) em suporte de vidro horizontal (124 x 258 mm); após solidificação, este gel foi
mantido a 4ºC por 24h.
Os géis foram secos com papel de filtro e a seguir as amostras foram aplicadas com
auxílio de uma fita plástica com 24 poços (Amersham Pharmacia). No primeiro e último
poço foram aplicados 5 µl de corantes (azul de bromofenol 3,4 mg/ml; xilenocianol 2,8
mg/ml) para indicar visualmente o momento de interrupção da corrida. Igual quantidade
de cada amostra foi aplicada nos demais poços em seqüência.
As corridas eletroforéticas foram realizadas em cuba horizontal refrigerada
(Multiphor, Pharmacia Biotech) de acordo com a seguinte programação: 150 V, 320 mÅ, 70
W. O tempo de interrupção de cada corrida variou de acordo com o pré-estabelecido no
protocolo padrão e a migração do corante marcador.
Para a revelação da atividade enzimática concentrações adequadas de tampões,
substratos, coenzimas, enzimas de ligação, co-fatores e corantes específicos foram
misturados com agarose (1%) e aplicados sobre o gel. Os componentes da revelação
diferiram para cada enzima testada, conforme observado na tabela 2. As bandas foram
reveladas após incubação a 37 ºC e a reação foi interrompida utilizando-se ácido acético
glacial a 5%. Após, os géis foram secos ao ar, analisados visualmente e escaneados.
3.7. Análise dos produtos de amplificação pela reação em cadeia da polimerase
dos fragmentos do kDNA
3.7.1. Extração do kDNA
Para a extração do kDNA utilizou-se o procedimento descrito por Chomezynski et al
(1997). A massa parasitária congelada foi ressuspensa em 1 ml de DNAzol. Esta suspensão
foi submetida a centrifugação por 13.250 g por 10 minutos a 4ºC. Após essa etapa, o
sobrenadante foi retirado e transferido para um novo tubo de polipropileno de 1,5 ml
(Eppendorf ®). Ao sobrenadante foram acrescentados 500 l de etanol anidro gelado
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
30
(100%) e a seguir esta suspensão foi homogeneizada e centrifugada (13.250 g, 10 min, 4ºC).
Após descarte do sobrenadante, repetiu-se essa operação com etanol a 70 % de 3.000 RPM,
2 minutos a 4ºC. Ao final descartou-se o sobrenadante e os tubos foram secos ao ar. Após
esta etapa, foram adicionados 100 l de H
2
O ultrapura (MilliQ). Vale ressaltar que todo o
procedimento foi realizado no interior de capela de segurança (própria para extração
DNA), utilizando-se materiais novos e estéreis, a fim de evitar contaminação do DNA por
qualquer agente externo.
Tabela 5: Reagentes empregados na análise de isoenzimas de Trypanosoma cruzi e T. rangeli.
Enzimas
GPI
E.C.5.3.1.9
PGM
E.C.1.4.19
MDH
E.C.1.1.1.37
ME
E.C.1.1.1.40
Tampão corrida
1
Tris-Maleico
pH 7,4
Tris-Maleico
pH 7,4
Fosfato
pH 8,0
Fosfato
pH 8,0
Tampão reação
2
Tris HCL
pH 8,0
(4 ml)
pH 7,4
(4 ml)
pH 8,0
(4 ml)
pH 7,4
(4 ml)
H
2
O
1 ml
-
-
1 ml
Substratos
3
(20 mg/ml)
F6P
(1 ml)
G1P
(2 ml)
Na Malato
(1 ml)
Na Malato
(1 ml)
Coenzimas
4
(4 mg/ml)
NADP
(1 ml)
NADP
(1 ml)
NAD
(1 ml)
NADP
(1 ml)
Ativadores
5
(4 g/20 ml)
MgCl
2
(200 µl)
MgCl
2
(200 µl)
-
MgCl
2
(200 µl)
Enzimas ligação
6
G6PDH
(2 U)
G6PDH
(2 U)
-
-
Visualização
7
MTT (3 mg/ml)
PMS ( 2mg/ml)
MTT / PMS
(2 ml /1 ml)
MTT / PMS
(2 ml /1 ml)
MTT / PMS
(2 ml /1 ml)
MTT / PMS
(2 ml /1 ml)
Agarose
(1g/100 ml)
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
1. Tris-Maleico pH 7,4 (Tris 0,1M, EDTA dissódico 0,001M, MgCl
2
0,001M, Ácido Maleico 0,43M);
2. Fosfato pH 8,0 (Na
2
HPO
4
0,5 M; NaHPO
4
0,5 M);
3. Tris-HCL 0,05 M (Trizma Pre-Set Crystals pH 7,4, pH 8,0);
4. F6P (frutose-6-fosfato), G1P (glicose-1-fosfato), Malato de sódio ( 2,7 g ácido málico/ 20 ml H
2
O - pH 7,0);
5. NAD (nicotinamida adenina dinucleotídeo), NADP (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato);
6. MgCl
2
(cloreto de magnésio);
7. G6PDH (glicose-6-fofato desidrogenase); U: unidades
8. MTT (metil tiazolil tetrasólio), PMS (Phenazine methosulphate).
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
31
3.7.2. Reação de amplificação dos produtos dos minicírculos do kDNA
A análise do tamanho de fragmentos do kDNA das amostras de T. cruzi e T. rangeli
amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR - Polimerase Chain Reaction) foi
realizada segundo protocolo descrito por Wincker et al 1994, utilizando-se o par de
oligonucleotídeos sintéticos #121 (5’- AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3’) e #122
(5’- GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3’) Estes primers foram descritos como específicos
para T. cruzi (JUNQUEIRA 1996), mas segundo podem amplificar seqüências de minicírculos
de kDNA de T. rangeli e T. caninum (SOUSA 2008, MADEIRA 2009).
Para a PCR preparou-se uma mistura com volume final de 50 μl contendo 1 ng de
kDNA como molde, 200ng de cada iniciador (#121/122), 5 mM dNTP, 50 mM MgCl
2,
, tampão
recomendado pelo fabricante (10X buffer), 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e H
2
O
ultrapura (MilliQ). A reação de amplificação foi realizada no termociclador (Mastercycler
Gradient -Eppendorf) de acordo com as seguintes condições de temperatura: 94ºC por 2
minutos e 15 segundos para a desnaturação, 55°C durante 20 segundos para o anelamento
dos iniciadores e 72°C por 20 segundos para a extensão final da fita de DNA. Foram
realizados 34 ciclos desta seqüência e um ciclo final 2 minutos a 72°C. A reação foi
finalizada a 4°C.
As corridas eletroforéticas foram realizadas em gel de agarose foi preparado um gel
de agarose 1,6 % em tampão TAE 1X (Tris-Acetato-EDTA: 50X- 242 g Tris-Base 2M, 57,1ml
ácido acétido, 100 ml EDTA 0,5 M pH 8,0, 1L H2O q.s.p.) o qual foi solidificado utilizando-
se um demarcador de poços (―pente‖) para aplicação das amostras. Após solidificação, o
gel já localizado no interior da cuba de eletroforese horizontal (Amersham) foi submerso
em tampão TAE 1X e aplicado o volume total de 18 μl de cada amostra (15 μl do DNA
amplificado e 3 μl do corante - azul de bromofenol; xilenocianol, glicerol), além do
controle negativo e marcador de 50 pb (Invitrogen®). As seguintes programações foram
utilizadas: 100 V a 120 V durante 1h. Após, os géis foram incubados com brometo de etídio
(20 ng/ml), examinados sob luz ultravioleta e fotografados (Mini BIS Pro - BioAmérica).
2009 MATERIAIS E MÉTODOS Santos-Faissal BN
32
3.8. Análise numérica computacional de caracteres estáveis
Esta análise foi realizada com base em 10 caracteres considerados estáveis (40
variantes). Estes caracteres foram codificados em uma matriz computacional, sendo a
presença de um caracter referida como 1 e a ausência deste como 0. Os demais caracteres
considerados nesta análise estão listados abaixo:
1. Perfil eletroforético da enzima MDH
2. Perfil eletroforético da enzima ME
3. Perfil eletroforético da enzima GPI
4. Perfil eletroforético da enzima PGM
5. Perfil eletroforético dos produtos de amplificação dos minicírculos do kDNA
6. Crescimento em meio LIT
7. Intensidade de crescimento
8. Dia de pico de crescimento das amostras
9. Padrão de diferenciação celular
10. Resultados da morfometria
Foram utilizados os índices de similaridade global de SM e algoritmo de agrupamento
de UPGMA (método não-ponderado de agrupamento aos pares por média aritmética) para a
obtenção de dendogramas que refletiram a similaridade global entre as amostras (SNEATH
& SOKAL 1962, 1973). Utilizou-se o programa NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and
Multivariate Analysis System - versão 2.1; Applied Bioestatistics) para a realização desta
análise e do dendograma.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
33
4. RESULTADOS
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
34
4. RESULTADOS
4.1. Curvas de crescimento em meio de cultivo axênico
Amostras de Trypanosoma cruzi e T. rangeli foram analisadas quantitativamente do
4
o
ao 20
o
dia da curva de crescimento.
As cepas de Trypanosoma cruzi apresentaram diferentes padrões de crescimento
celular (gráfico 1) . A partir da análise da média dos valores encontrados entre o 10º e 17º
dia, foi possível agrupar as amostras em 3 grupos distintos, de acordo com a intensidade de
crescimento (Tabela 6):
1. Baixa intensidade (≤ 10 x 10
6
parasitas/ml): DM28c;
2. Média intensidade (10 a 30 x 10
6
parasitas/ml): Y, CL Brener, FL, YuYu, Peruana e
21SF;
3. Alta intensidade (≥ 30 x 10
6
parasitas/ml): Colombiana, G, MR.
As amostras de T. rangeli, assim como em T. cruzi, também apresentaram diferenças
na intensidade de crescimento e, a partir da análise da média dos valores encontrados
entre o 7º e 17º dia, foi utilizado mesmo parâmetro para distinguir grupos de acordo com o
padrão de crescimento. Vale ressaltar que as curvas de T. rangeli foram realizadas com
adição de 10% de SFB, devido a exigência deste parasita ara sua manutenção em mio
monofásico.
1. Baixa intensidade (≤ 10 x 10
6
parasitas/ml): Choachi e H-14
2. Média intensidade (10 a 30 x 10
6
parasitas/ml): H-9 e Macias
3. Alta intensidade (≥ 30 x 10
6
parasitas/ml): R 1625
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
35
Intensidade de crescimento - Trypanosoma cruzi
-
10
20
30
40
50
60
70
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
n
o
céls x 10
6
/ml
dias de cultivo
Y
CL-Brener
FL
MR
YUYU
Peruana
G
DM28C
21SF
Colombiana
Gráfico 1: Crescimento em cultura axênica (meio LIT) de 10 cepas de Trypanosoma cruzi. Eixo das
coordenadas: numero de células/ml; eixo abscissas: dias de acompanhamento da curva.
Tabela 6: Crescimento das amostras de T. cruzi em meio de cultivo axênico (LIT)
Dia
Y
CL-
Brener
FL
MR
YuYu
Peruana
G
DM28c
SF 21
Colombiana
4
2,6
1,6
2,4
2,1
3,9
3,3
3,3
3,8
2,3
2,6
7
13,3
12,0
4,6
5,4
8,5
10,3
13,1
5,4
7,8
5,0
10º
20,3
18,0
11,3
20,6
21,9
31,6
32,9
8,6
18,6
16,6
13º
16,5
26,1
21,4
44,1
26,5
44,0
66,8
11,4
25,0
44,5
17º
33,5
33,0
21,3
27,0
20,3
8,3
4,9
7,8
21,3
64,0
20º
27,9
29,8
21,3
22,1
15,5
7,5
2,9
7,0
13,8
57,0
Média
7º-17º
23,4
25,7
18,0
30,6
22, 9
28,0
34,8
9,3
21,6
41,7
Valores da intensidade de crescimento expressos em 10
6
células/ml
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
36
Intensidade de crescimento - Trypanosoma rangeli
-
10
20
30
40
50
60
70
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
n
o
céls x 10
6
/ml
dias de cultivo
CHOACHI
H-9
H-14
MACIAS
R1625
San Agostin
Gráfico 2: Crescimento em cultura axênica (meio LIT +20%\SFB) de 6 cepas de Trypanosoma rangeli. Eixo das
coordenadas: número de células/ml; eixo abscissas: dias de acompanhamento da curva.
Tabela 7: Crescimento das amostras de T. rangeli em meio de cultivo axênico (LIT 20%SFB)
Dia
Choachi
H-9
H-14
Macias
R1625
San
Agostín
4
6,3
4,9
11,3
15,3
5,5
5,4
7º
22,3
27,9
18,6
26,0
17,5
14,3
10º
13,8
27,5
18,4
41,3
40,9
33,8
13º
8,3
18,8
21,0
35,3
48,0
26,0
17º
6,9
13,5
16,4
16,5
26,5
23,8
20ª
4,5
8,0
10,5
10,0
17,5
12,5
Media
7º -17º
12,9
21,9
18,7
29,8
32,9
24,4
Valores da intensidade de crescimento expressos em 10
6
células/ml
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
37
Os valores médios de crescimento alcançados em cada condição favorável ao parasita
revelaram que estes podiam ser variáveis entre as espécies, atingindo valores semelhantes.
Entretanto, nossos resultados revelam que T.cruzi cresce com mais facilidade que T.
rangeli em meio LIT puro (10% SFB).
Em T. cruzi, os valores máximos de crescimento variaram entre 11,4 céls/ml (DM28c)
e 66,8 céls/ml (G). As médias entre o 7º e 17º dia variaram entre 9,3 céls/ml (DM28c) e
41,7 (Colombiana). Vale ressaltar que a maioria das amostras apresentou pico de
crescimento no 10º dia da curva e as demais no 17º dia. A tabela 6 ilustra esses resultados.
Em T. rangeli, foram observados os valores máximos de crescimento variaram entre
21,0 céls/ml (H14) e 48,0 céls/ml (R1625). As médias entre o 7º e 17º dia variaram entre
12,9 céls/ml (Choachi) e 32,9 (R1625). Nesta espécie, as amostras apresentaram-se
heterogêneas em relação ao dia de pico de crescimento, alternando entre o 7º e 13º dia da
curva e declínio após o pico de crescimento. A tabela 7 ilustra esses resultados.
4.2. Estudos morfológicos
Em T. cruzi os seguintes estágios evolutivos foram encontrados: em epimastigotas
pequenos e largos, tripomastigotas característicos da espécie, cinetoplasto redondo e
volumoso (próximo a extremidade posterior do corpo, além de formas em divisão.
Peculiaridades encontradas: tamanho dos tripomastigotas variando e cinetoplasto globoso.
As figuras 9 e 10 reproduzem estes estágios.
Em T. rangeli foram observados em epimastigotas pequenos e largos, tripomastigotas
característicos da espécie, cinetoplasto redondo e volumoso (próximo a extremidade
posterior do corpo, além de formas em divisão. Estes dados podem ser observados na
ilustração 11.
Além dos estágios evolutivos característicos de cada espécie, foi confeccionada
prancha ilustrativa dos cinetoplastos de cada espécie.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
38
4.2.1. Avaliação qualitativa dos estágios evolutivos
Figura 9: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma cruzi: (1) Y; (2) CL Brener; (3)
FL; (4) MR; (5) YuYu em meio de cultivo axênico (LIT). Desenhos em câmara clara de lâminas coradas pelo
Giemsa tamponado.
10 m
10 m
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
39
Figura 10: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma cruzi: (6) Peruana; (7) G; (8)
DM28c; (9) SF 21; (10)Colombiana em meio de cultivo axênico (LIT). Desenhos em câmara clara de lâminas
coradas pelo Giemsa tamponado.
10 m
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
40
Figura 11: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma rangeli: (1) Choachi; (2) H-9; (3)
H-14;(4) Macias; (5) R1625; (6) San Agustin em meio de cultivo axênico (LIT). Desenhos em câmara clara de
lâminas coradas pelo Giemsa tamponado.
10 m
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
41
Figura 12: Cinetoplastos de epimastigotas de cepas/clones de Trypanosoma cruzi:(1) Y; (2) 2 CL Brener; (3) FL;
(4) MR; (5) YuYu; (6) Peruana; (7) G; (8) DM28c; (9) SF 21); Colombiana; e Trypanosoma rangeli: (11) Choachi;
(12) H-9; (13) H-14;(14) Macias; (15) R1625; (16) San Agustín em meio de cultivo axênico (LIT). Desenhos em
câmara clara de lâminas coradas pelo Giemsa tamponado.
10 m
10 m
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
42
Figura 13: Estágios evolutivos representativos de cepas/clones de Trypanosoma cruzi: (1)Y; (2)
Colombiana; (3) CL Brener; (4) MR; (5)SF 21; (6) YuYu em meio de cultivo axênico (LIT). Fotomicrografia de
esfregaços corados pelo Giemsa.
10 m
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
43
Figura 14: Estágios evolutivos representativos de cepas de Trypanosoma rangeli: (1)H-14; (2) San Agustin; (3)
Choachi;(4) H-9; (5)R1625; (6) Macias em meio de cultivo axênico (LIT). Fotomicrografia de esfregaços corados
pelo Giemsa.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
44
4.2.2. Avaliação quantitativa dos estágios evolutivos
O estudo do padrão de diferenciação celular foi realizado através da quantificação
dos principais estágios evolutivos encontrados em T. cruzi e T. rangeli, em lâminas coradas
pelo Giemsa nos 10°, 13°, 17° e 20° dias da curva de crescimento.
Os estágios evolutivos encontrados em T. cruzi foram acentuadamente mais simples
que nas cepas de T. rangeli. Em T. cruzi a diferenciação ocorreu na seguinte seqüência:
epimastigota, transição para tripomastigotas metacíclicos e tipo metacíclicos, passando
por um estágio intermediário (transição epi-tripo). Dentre as cepas de T. cruzi, as que
apresentaram taxas de metaciclogênese foram MR, SF 21, FL, YuYu e Peruana, enquanto
que Y e DM28c apenas apresentaram estágios em transição para tripomastigotas.
Em T. rangeli além da transição também ocorria de epimastigota para
tripomastigotas, também ocorriam epimastigotas e tripomastigotas com a extremidade
posterior alargada (forma de girino ou lâmpada) e esferomastigotas. A grande variabilidade
nos tripomastigotas de T. rangeli pode sugerir que algumas das formas menores
encontradas em uma das cepas (R1625) são semelhantes aos metacíclicos de T. rangeli,
entretanto a cepa H-14 foi a que apresentou menor taxa de diferenciação celular.
O padrão de diferenciação de todas analisadas de T. cruzi e T. rangeli estão
representadas nos gráficos 3 a 5, excluído o dado dos epimastigotas, os quais foram
representativos em todas as amostras analisadas, representando cerca de 70 a 95% em T.
cruzi e 35 e 80% em T. rangeli.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
45
DM28c
0,5%
1%
0,5%
2%
1%
3,5%
1%
4,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
DM28C
YuYu
2,5%
4,5%
2,0%
1,0%
0,5%
4,0%
2,0%
3,5%
2,0%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
YuYu
Y
1%
3%
4%
0,5%
1%
3%
1%
2%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
Y
Colombiana
1,0%
5,0%
1,0%
2,0%
2,0%
3,0%
2,0%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
Colombiana
CL Brener
0,5%
1,0%
1,0%
1,0%
1,5%
3,0%
3,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
CL Brener
Gráfico 3: padrão de diferenciação celular em cepas de Trypanosoma cruzi (DM28c, Y, CL Brener, YuYu, Colombiana).
Eixo das coordenadas: dias de cultivo; eixo abscissas: percentual de estágios evolutivos.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
46
Trypanosoma cruzi MR
13,0%
1,5%
11,5%
0,5%
16,0%
2,5%
63,5%
0,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
Trypanosoma cruzi MR
Tripomastigotas
ponta fina
Outros/Esfero
Divisão
G
7%
12%
6,5%
0,5%
17%
17%
0,5%
8,5%
9,5%
1%
5,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
G
SF 21
5%
3,5%
7,5%
1,5%
22,0%
1,5%
22%
2%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
SF 21
Tripomastigotas
ponta fina
Outros/Esfero
Peruana
3%
2,5%
3,5%
1,5%
0,5%
7,0%
3%
8%
10,5%
5%
3,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
Peruana
Tripomastigotas
Outros/Esferomastigotas
Divisões
FL
1,0%
1,5%
4%
8,0%
1%
3,5%
5,5%
4%
1,0%
12%
0,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
FL
Tripomastigotas
ponta fina
Outros/Esfero
Divisão
Gráfico 4: padrão de diferenciação celular em cepas de Trypanosoma cruzi MR, SF21, FL, G, Peruana.
Eixo das coordenadas: dias de cultivo; eixo abscissas: percentual de estágios evolutivos.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
47
H14
7,5%
3,0%
5,5%
2,5%
1%
6%
6%
7%
1,5%
3,5%
7%
6%
3,5%
4,5%
9%
10%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
H14
Choachi
5,5%
10%
7%
8,5%
10%
11%
11%
15%
12,5%
7,5%
10,5%
13,5%
16,5%
4%
11%
13%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
Choachi
San Agustin
3%
5,5%
10%
1%
6%
2%
9,5%
11%
5%
1%
12,5%
11%
5%
2,5%
14%
13,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
San Agustin
Tripomastigotas
Divisão
Lâmpadas
Esferos
Macias
4%
8,5%
1%
14%
7,5%
9%
6,5%
17%
9%
3,5%
5%
27,5%
11%
3%
3,5%
33,5%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
Macias
H9
3,5%
4%
8,5%
27%
4%
2,5%
17,5%
1,5%
2,5%
1%
24,5%
8%
3%
2%
17%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
H9
R1625
2%
32,5%
30,5%
1%
30,0%
36%
1%
36%
43%
11%
15%
56%
10º
13º
17º
20º
dias de cultivo
R 1625
Tripomastigotas
Divisão
Lâmpadas
Esferos
Gráfico 5: padrão de diferenciação celular em cepas de Trypanosoma rangelii (H14, San Agustin, H9, Choachi, Macias, R1625).
Eixo das coordenadas: dias de cultivo; eixo abscissas: percentual de estágios evolutivos.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
48
4.2.3. Biometria dos principais estágios evolutivos
Os dados biométricos de epimastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi e T.
rangeli estão apresentados nas tabelas 9 e 10.
Nos epimastigotas observa-se que houve grande variação nos parâmetros analisados,
dentre as cepas de cada espécie, com sobreposição de dados. Entretanto, o comprimento
do cinetoplasto demonstrou diferenças marcantes. Este parâmetro foi então selecionado
para a análise estatística.
Na maioria dos parâmetros analisados nos estágios tripomastigotas, observou-se
também grande variação e sobreposição de resultados, tanto entre as cepas , quanto entre
as espécies estudadas. Entretanto, valores de comprimento total e largura revelaram
diferenças significativas. Neste caso, foi selecionado para a análise estatística o valor do
comprimento total.
4.3. Análise estatística
Visando confirmar a diferença entre T. cruzi e T. rangeli e validar a escolha dos
caracteres biométricos do comprimento total dos tripomastigotas e cinetoplasto dos
epimastigotas, os valores das médias de cada cepa foram submetidos à análise estatística
para comparação entre espécies, utilizando-se o teste T-Student.
Os resultados obtidos na análise estatística confirmaram a diferença significativa
entre os caracteres escolhidos: p< 0,008 para o comprimento total dos tripomastigotas e,
p < 0,000 para o comprimento dos cinetoplastos. O comprimento total dos epimastigotas,
embora apresentando variação, também foram submetidos a análise estatística e como já
observado, não teve resultado estatístico significante de diferença entre as espécies.
Estes resultados estão expressos nas tabelas 11 a 13.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
49
Tabela 9: Análise morfométrica de epimastigotas de cepas/clones de T. cruzi e T.rangeli.
Espécie
Cepa
CT
IOC
C
L
CT
FL
IN
Y
106
23,8±5,9
(8,7—39,2)
2,3±0,4
(1,5—3,3)
28,4±6,0
(14,8—44,4)
4,6±1,7
(1,7—9,6)
0,8±0,3
(0,4—2,0)
Cl-Brener
005
17,6±3,5
(10,9—23,9)
2,1±0,4
(1,5—3,0)
24,1±3,5
(15,3—30,5)
6,5±2,4
(2,2—10,9)
0,8±0,3
(0,4—1,5)
FL
249
18,8±5,2
(8,3—27,8)
2,6±0,5
(1,7—3,5)
24,6±5,4
(14,0—34,0)
5,9±2,5
(2,2—13,1)
0,7±0,3
(0,3—1,9)
MR
301
20,3±4,5
(13,1—23,6)
2,2±0,4
(1,7—3,0)
26,3±3,7
(21,8—34,4)
6,0±2,3
(1,3—9,6)
0,5±0,2
(0,3—1,5)
T. cruzi
YuYu
300
25,7±5,9
(15,2—35,7)
2,5±0,5
(1,7—3,5)
33,0±6,6
(19,6—44,8)
7,3±2,8
(2,4—15,2)
1,1±0,4
(0,5—2,0)
Peruana
252
23,7±4,5
(14,6—31,8)
2,4±0,3
(1,7—3,0)
30,6±4,6
(20,9—39,6)
6,8±2,0
(3,9—13,7)
0,7±0,2
0,3—1,2
G
216
14,5±4,3
(8,7—25,7)
2,1±0,4
(1,3—2,6)
23,5±4,7
(13,1—34,0)
9,0±2,7
(4,4—15,2)
0,6±0,2
(0,2—1,0)
DM28c
010
16,0±4,1
(8,7—26,1)
2,0±0,3
(1,3—2,6)
27,1±6,0
(14,8—41,4)
11,1±3,3
(4,4—19,6)
1,0±0,6
(0,4—3,4)
SF 21
251
21,6±7,3
(10,9—38,7)
2,3±0,5
(1,3—3,5)
27,0±6,0
(16,6—41,7)
5,4±2,3
(1,7—9,4)
0,7±0,3
(0,3—1,5)
Colombiana
004
16,7±4,2
(8,7—23,1)
2,2±0,3
(1,5—3,3)
23,2±5,2
(13,1—32,2)
6,5±2,1
(3,9—9,8)
0,7±0,3
(0,3—1,2)
Choachi
271
22,7±4,1
(13,9—30,5)
1,8±0,3
(1,3—2,6)
33,4±5,0
(23,9—43,5)
10,8±3,0
(4,4—17,4)
0,3±0,1
(0,2—0,6)
H—9
274
18,9±4,7
(9,6—27,0)
1,9±0,4
(1,3—2,6)
28,2±5,5
(16,1—39,6)
9,3±2,5
(4,4—13,5)
0,5±0,4
(0,2—2,0)
H—14
038
29,4±7,7
(13,9—40,5)
1,5±0,3
(1,1—2,2)
39,5±9,2
(20,9—57,4)
10,1±3,2
(3,9—17,4)
0,8±0,3
(0,3—1,4)
T.rangeli
Macias
273
18,4±4,8
(10,4—31,3)
1,8±0,4
(0,9—2,4)
24,0±7,3
(12,1—40,0)
5,6±3,2
(0,9—12,6)
0,3±0,1
(0,1—0,6)
R1625
002
17,4±3,6
(10,9—27,0)
2,2±0,3
(1,7—3,0)
27,8±5,8
(17,4—37,9)
10,4±3,6
(4,4—17,4)
1,0±0,3
(0,5—1,8)
San
Agustín
282
20,9±5,7
(8,3—30,5)
1,8±0,3
(1,3—2,6)
28,8±6,8
(10,3—39,2)
7,9±2,3
(2,0—10,9)
0,6±0,3
(0,1—1,8)
Todas as medidas estão em µm (média, desvio padrão e variação); n=30
(C) comprimento do corpo sem flagelo livre; (L) largura do corpo;
(CT) comprimento total, flagelo livre incluído;
(FL) Flagelo livre;
(IN) índice nuclear
(CT—IOC) Numero código da Coleção de Tripanosomatideos IOC
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
50
Tabela 10: Análise morfométrica de tripomastigotas de cepas/clones de T. cruzi e T.rangeli.
Espécie
Cepa
CT
IOC
C
L
CT
FL
IN
K
Y
106
ND
ND
ND
ND
ND
1,9±0,3
(2,3—1,3)
Cl—
Brener
005
14,5±2,0
(10,9—17,4
1,0±0,2
(0,7—1,3)
19,2±2,4
(14,4—22,2)
4,5±1,3
(2,6—7,4)
1,2±0,4
(0,7—2,0)
1,8±0,3
(2,3—1,2)
FL
249
14,6±1,9
(10,0—17,4
1,1±0,2
(0,9—1,3)
20,1±2,8
(14,8—25,2)
5,5±2,1
(1,7—10,0))
1,2±0,5
(0,6—2,0)
1,8±0,4
(2,5—1,2)
MR
301
17,4±2,9
(12,6—22,6)
1,1±0,2
(0,7—1,3)
22,3±2,6
(17,0—26,1)
4,9±1,8
(1,7—8,7)
1,1±0,5
(0,5—2,4)
1,7±0,2
(2,3—1,2)
T. cruzi
YuYu
300
15,7±2,7
(10,7—20,0
1,0±0,3
(0,4—1,5)
21,8±3,0
(15,1—26,5)
6,1±1,8
(3,5—8,7)
1,1±0,3
(0,6—1,6)
1,7±0,
(2,3—1,3)
Peruana
252
16,7±2,2
(11,7—21,3
1,1±0,2
(0,7—1,5)
22,2±3,2
(14,7—27,4)
5,6±2,0
(2,6—8,7)
1,0±0,3
(0,4—2,0)
1,7±0,3
(2,3—1,2)
G
216
13,6±2,4
(9,6—17,8)
1,1±0,2
(0,7—1,7)
19,2±3,0
(14,3—26,1)
5,6±2,2
(1,5—10,9)
1,4±0,4
(0,8—2,5)
1,9±0,2
(2,3—1,5)
DM28c
010
ND
ND
ND
ND
ND
1,7±0,3
(2,3—1,2)
SF 21
251
17,1±2,1
(13,9—21,8)
1,0±0,2
(0,7—1,3)
21,1±2,4
(16,9—25,3)
4,0±1,1
(1,3—5,7)
1,1±0,2
(0,8—1,7)
1,8±0,3
(2,3—1,2)
Colombiana
004
14,3±2,9
(9,4—19,6)
1,1±0,2
(0,7—1,3)
18,4±3,1
(14,3—24,0)
4,1±1,1
(1,7—6,1)
1,3±0,5
(0,8—3,2)
1,9±0,3
(2,3—1,5)
Choachi
271
18,5±4,3
10,7—26,1
1,3±0,2
(0,7—1,1)
26,9±4,8
(17,8—33,9)
8,4±2,5
(2,8—14,4)
0,7±0,3
0,3—1,4
1,2±0,2
(1,5—0,8)
H-9
1
274
19,0±4,7
10,9—27,4
1,3±0,3
(0,9—1,7)
28,5±7,1
(14,8—39,6)
9,5±3,9
(3,9—17,4)
0,8±0,3
0,4—1,5
1,2±0,2
(1,5—0,8)
H-14
038
26,8±3,4
19,6—31,3
1,4±0,3
(0,9—2,0)
38,4±6,7
(24,0—48,3)
11,6±4,9
(4,4—18,7)
1,6±1,0
0,6—3,6
1,2±0,2
(1,5—0,8)
T.rangeli
Macias
273
22,8±4,6
10,9—32,4
1,3±0,2
(0,9—1,7)
29,4±6,3
(14,6—41,5)
6,6±3,1
(2,2—12,6)
0,5±0,2
0,2—0,9
1,0±0,2
(1,3—0,8)
R1625
2
002
14,6±3,2
11,7—19,6
1,7±0,3
(1,6—2,4)
24,1±4,9
(14,7—32,7)
9,5±3,0
(3,0—13,1)
1,1±1,1
0,3—3,9
1,2±0,2
(1,5—0,8)
San
Agustín
282
27,4±4,2
17,4—38,7
1,3—0,2
(0,7—1,5)
38,7±5,0
(27,0—52,6)
11,3±4,0
(4,4—18,3)
0,7±0,3
0,3—1,3
1,3±0,2
(1,7—0,8)
Todas as medidas estão em µm (média, desvio padrão e variação);
N=20, exceto quando a taxa de diferenciação era baixa ( n=14;
2
n=9)
(C) comprimento do corpo sem flagelo livre; (L) largura do corpo;
(CT) comprimento total, flagelo livre incluído; (FL) Flagelo livre;
(IN) índice nuclear
(CT—IOC) Código da Coleção de Tripanosomatideos IOC
(ND) não determinado: não encontrado e/ou poucos
parasitas encontrados nesse estágio.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
51
Tabela 11: Análise estatística (T-Test) dos dados biométricos do cinetoplasto de epimastigotas
de T. cruzi e T. rangeli.
T. cruzi
T. rangeli
Significância
estatística (P)
Média/SD
1,7 ± 0,08
x
1,1 ± 0,09
P < 0,000
Tabela 12: Análise estatística (T-Test) dos dados biométricos do comprimento total de epimastigotas
de T. cruzi e T. rangeli.
T. cruzi
T. rangeli
Significância
estatística (P)
Média/SD
26,7 ± 3,1
x
30,2 ± 5,4
P < 0,192
Tabela 13: Análise estatística (T-Test) dos dados biométricos do comprimento total de tripomastigotas
de T. cruzi e T. rangeli.
T. cruzi
T. rangeli
Significância
estatística (P)
Média/SD
20,5 ± 1,5
x
31,0 ± 6,1
P < 0,008
4.4. Analise bioquímica
Neste trabalho, a análise do perfil eletroforético de isoenzimas, utilizando os
sistemas ME, MDH, GPI e PGM revelou o poder discriminatório destas enzimas entre as
amostras de T. cruzi e T. rangeli, principalmente nas enzimas MDH e ME (com apenas 1 ou
2 loci enzimáticos). Entretanto, as enzimas GPI e PGM destacaram-se por evidenciarem a
heterogeneidade intraespecífica (6 perfis cada). Outras enzimas foram testadas e, apesar
de importantes na caracterização intra-específica, não obtivemos boa resolução nos géis,
seja por problemas relacionados aos reagentes ou emprego das amostras.
Como o objetivo principal do trabalho é obter caracteres de valor diagnóstico entre
T. cruzi e T. rangeli, foram escolhidos os sistemas GPI, PGM, MDH e ME para a análise
qualitativa, associando estes dados a outros de morfobiologia.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
52
Figura 15: Perfis eletroforéticos de isoenzimas em gel de agarose de cepas de Trypanosoma cruzi: (106) Y,
(005) CL Brener, (249) FL , (301) MR, (300) Peruana, (252) YuYu, (216) G, (010) DM28c, (251) SF-21, (004)
Colombiana e Trypanosoma rangeli: (002) R1625, (274) H-9, (038) H-14, (273) Macias, (271) Choachi, (282) San
Agustín. Enzimas: MDH (Malato dehidrogenase - E.C. 1.1.1.37); ME (Enzima málica - E.C. 1.1.1.40).
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
53
Figura 16: Perfis eletroforéticos de isoenzimas em gel de agarose de cepas de Trypanosoma cruzi: (106) Y,
(005) CL Brener, (249) FL , (301) MR, (300) Peruana, (252) YuYu, (216) G, (010) DM28c, (251) SF-21, (004)
Colombiana e Trypanosoma rangeli: (002) R1625, (274) H-9, (038) H-14, (273) Macias, (271) Choachi, (282) San
Agustín. Enzimas: GPI (Glicose-6-Fosfato isomerase - E.C. 5.3.1.9); PGM (Fosfoglucomutase - E.C. 2.7.5.1).
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
54
4.5. Análise molecular
As cepas de T. cruzi apresentaram uma única banda com aproximadamente 330 pb,
com exceção da cepa Y, a qual apresentou uma banda adicional abaixo de 330 pb, nem
sempre apresentada nos em outras corridas. Entre as amostras de T. rangeli observou-se
produtos amplificados típicos da região conservada kP2 desta espécie (760pb –dados não
mostrados), além de um conjunto de bandas entre 300 e 450bp. Em nossas publicações,
utilizando amostras deste trabalho, afirmamos não poder distinguir estes fragmentos dos
encontrados em T. cruzi, assim como a pureza das culturas (figuras 17 e 18). Entretanto,
utilizando diferentes condições de corrida, os fragmentos desta região em todas as
amostras de T. rangeli (KP1+), revelaram-se distintos de T. cruzi.
Figura 17: Perfis eletroforéticos dos produtos de amplificação do minicírculos do kDNA por PCR de T. cruzi:
(106) Y, (005) CL Brener, (249) FL, (301) MR, (300) Peruana, (252) YuYu, (216) G, (010) DM28c, (251) SF-21,
(004) Colombiana; T. rangeli: (002) R1625, (274) H-9, (038) H-14, (273) Macias, (271) Choachi, (282) San
Agustín. , utilizando primers #121/122. Marcador de peso molecular de 50 bp.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
55
Figura 18: Perfis dos produtos de amplificação do
minicírculos do kDNA por PCR de T. rangeli H-14,amostras
isoladas de pacientes chagásicos 535,536,546,545 e T.
cruzi: Y, utilizando primers #121/122 (SOUSA et al 2008).
Figura 19: Perfis dos produtos de amplificação do
minicírculos do kDNA por PCR de T. cruzi: Y, CL Brener,
DM28c, T. rangeli H-14 e Macias e T. caninum (A27),
utilizando primers #121/122 (MADEIRA et al 2009).
4.6. Análise numérica computacional
Com base nos resultados encontrados, foram escolhidos parâmetros para a
composição de uma matriz numérica para odificação dos catares mais estáveis de cada
espécie. Estes dados foram codificados com base nas variações encontradas (tabela 14). A
matriz numérica (tabela 15) foi submetida à análise computacional e confecção de um
dendograma, no qual foi possível visualizar o agrupamento formado pelas cepas, conforme
figura 20. Evidenciou-se a formação de 2 grupos distintos com as amostras de T. cruzi e T.
rangeli, cada qual com suas variações dentro da espécie.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
56
Tabela 14: Parâmetros utilizados para codificação de caracteres para processamento computacional.
CARACTERES
PADRÕES ANALISADOS
NUMERO DE
VARIANTES
Perfil Sistema MDH
Presença ou ausência de 2 loci
1 2
Perfil Sistema ME
Presença ou ausência de 4 loci
1 2 3 4 5
Perfil Sistema GPI
Presença ou ausência de 6 loci
1 2 3 4 5 6
Perfil Sistema PGM
Presença ou ausência de 5 loci
1 2 3 4 5 6
Perfil produtos
amplificados na PCR
Presença ou ausência de 3 bandas
1 2 3
Meio de cultivo (LIT)
LIT10%SF, 20%SFB
1, 2
Intensidade de crescimento
das amostras
≤10 x 10
6
Entre 10,1 e 29,9 x 10
6
≥ 30 x 10
6
1
2
3
Dias de pico de
crescimento
7º, 10º, 13º, 17º
1, 2,3, 4
Padrão de diferenciação
celular
Epimastigotas, Tripmastigotas
Esferomastigotas, ―tadepole‖, outros
1, 2
3, 4, 5
Dados biométricos
CT ≤ 25µm, CT ≥ 25µm
K ≤ 25µm, K ≥ 25µm
1, 2
3, 4
Tabela 15: Codificação de caracteres selecionados das amostras de T.cruzi e T. rangeli para processamento
computacional usando o índice de similaridade de Jaccard e algoritmo de agrupamento de UPGMA.
CEPAS
MDH
ME
GPI
PGM
PCR
LIT
INT.
CRESC.
PICO
CRESC.
ESTÁGIOS
BIOMETRIA
12
12345
123456
123456
123
12
123
1234
12345
1234
Y
10
10010
000010
000000
101
10
010
0001
10001
0110
Cl Brener
01
1001
000110
101000
100
10
010
0001
11001
0110
FL
01
10010
000010
101000
100
10
010
0010
11001
0110
MR
01
10001
000110
101000
100
10
010
0010
11000
0110
YuYu
01
10010
001110
101000
100
10
010
0010
11001
0110
Peruana
01
10010
001110
000100
100
10
010
0010
11001
0110
G
01
10010
001000
000100
100
10
010
0010
11001
0110
DM28c
01
10001
001000
010000
100
10
100
0010
10001
0110
SF 21
01
00001
000001
000100
100
10
010
0010
11000
0110
Colombiana
01
00001
001000
000100
100
10
001
0001
11001
0110
R1625
10
01000
100000
000010
011
01
011
0010
11110
0110
H 9
10
00100
110000
000001
011
01
011
1000
11110
0110
H 14
10
00100
100000
000010
011
01
011
0010
11110
0110
Macias
10
00100
100000
000010
011
01
011
0100
11110
0110
Choachi
10
01000
100000
000010
011
01
011
1000
11110
0100
San Agustin
10
01000
100010
000000
011
01
011
0100
11110
0110
* A numeração corresponde a: (0) ausência do caracter; (1) presença do caracter.
2009 RESULTADOS Santos-Faissal BN
57
Figura 20: Dendograma de similaridade global de amostras de T.cruzi (Y, Peruana, G, CLBrener, FL, YuYu, MR, DM28c, SF21, Colombiana) e T. rangeli (R 1625,Choachi,
San Agustín, H14, Macias, H 9) utilizando-se o índice de SM e algoritmo de agrupamento de UPGMA (Software NTSYS).
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
58
5. DISCUSSÃO
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
59
5. DISCUSSÃO
Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi são espécies que infectam insetos
triatomíneos, seres humanos, animais domésticos e uma variedade de animais silvestres;
ambos com distribuição geográfica de pela América Latina. T. rangeli não é patogênico
para seres humanos, enquanto T. cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, na qual
mais cerca de 16 milhões de pessoas estão infectadas. Mais de 2500 casos de infecções em
humanos por T. rangeli já foram relatadas (mistas ou não com T. cruzi) e este parasita é
considerado importante do ponto de vista biológico e epidemiológicos (D’ALESSANDRO &
SARAVIA 1999, GHULL & VALEJJO 2003), uma vez que provoca reações cruzadas
com T. cruzi em exames de diagnóstico devido a partilha antigênica de epítopos entre
essas espécies (GRISARD 2008, GHULL 1985). Desta forma, o diagnóstico diferencial entre
essas espécies torna-se muito importante.
Trypanosoma cruzi é uma espécie heterogênea, pela diversidade de aspectos
morfológicos, imunológicos e patogênicos que apresenta nas diferentes populações do
parasita que circulam entre hospedeiros vertebrados, invertebrados, silvestres e
domésticos, além de uma ampla distribuição geográfica. Algumas cepas de T. cruzi foram
agrupadas de acordo com comportamento com animais experimentalmente infectados,
padrões de parasitemia, padrão de crescimento, parasitismo tissular, virulência, clones
principais ANDRADE 1974, 1985, BRENER 1965, BRENER & CHIARI 1963, DEANE 1974), além
do estudo do polimorfismo genético analisado através de marcadores isoenzimáticos e
moleculares e estabelecendo uma relação entre características genéticas destas cepas com
manifestações clínicas da doença de Chagas (BRISSE 2000, FERNANDES 1998, MOREL 1980,
1986, MILES 1980, SOUTO 1996, STURM 1989, 2003, ZINGALES 1998, WINCKER 1994).
Alguns autores relatam que em T. rangeli, parâmetros biológicos, bioquímicos e
moleculares têm revelado pequena variabilidade entre as cepas isoladas de diferentes
hospedeiros, procedentes de diferentes regiões geográficas (D’ ALESSANDRO 1976, GRISARD
1999, VALLEJO 2003). Entretanto, esta espécie ciclo evolutivo complexo em seu hospedeiro
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
60
intermediário e apresenta-se patogênico para seu vetor. Desta forma, alguns autores estão
continuadamente empenhados melhor caracterizar estes organismos (D’ALESSANDRO &
SARAVIA 1999, TOBIE 1970, VALLEJO 1987, GHULL & VALLEJO 2003).
Investigações sobre a heterogeneidade de T. cruzi e T. rangeli, tanto no inseto
vetor, como nas formas de cultivo in vitro e características, que podem ser úteis no
diagnóstico diferencial entre essas espécies, são continuadamente realizadas por diversas
abordagens. Dentre as técnicas parasitológicas clássicas podemos citar a morfologia,
biometria, comportamento em animais experimentais e estudos in vitro de culturas
celulares e axênicas, assim como em como técnicas bioquímicas e moleculares, tais como
SDS-PAGE, eletroforese de isoenzimas, RAPD, estudo das lectinas; tamanho dos
minicírculos ou maxicírculos do kDNA, RNA ribossomal, genes de mini-exon, além da
análise dos fragmentos de restrição do nDNA, rDNA, kDNA (RFLPs)(GHUL 2003, SOUSA 2008,
MADEIRA 2009)
No presente trabalho foram analisadas as seguintes amostras de Trypanosoma cruzi:
Y, isolada por xenodiagnóstico de um caso agudo humano; FL, MR, isoladas a partir de
fezes de triatomíneos provenientes do Rio Grande do Sul; Colombiana, isolada de caso
agudo na Colômbia; Cl-Brener, clone da cepa CL (isolada de triatomineos), utilizada no
projeto genoma de T. cruzi; YuYu, isolada de Triatoma infestans no Brasil; Peruana,
obtida a partir de caso humano no Peru; G, isolada de reservatório silvestre (gambá) no
Brasil; DM28c, clone obtido de isolado de Didelphis marsupialis na Venezuela; SF 21,
isolada de caso agudo humano na localidade de São Felipe, Bahia, Brasil. Para T. rangeli
foram escolhidas: Choachi, isolada de caso humano em Choachi, Colômbia; H-9 e H-14,
isoladas de caso humano em Honduras; Macias, em Triatoma infestans na Venezuela;
R1625, obtida a partir de caso humano em El Salvador; San Agustín, isolado de Rhodinius
prolixus utilizado em xenodiagnóstico humano na Colômbia.
Os seguintes parâmetros foram utilizados para caracterização e avaliação de
caracteres de valor diagnóstico entre as espécies: intensidade de crescimento em meio
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
61
axênico, padrão de diferenciação celular, biometria dos principais estágios evolutivos,
análise do perfil de isoenzimas e amplificação de seqüências do kDNA.
A escolha por muitas cepas/clones justifica-se pela necessidade de extrair
informações da variedade de populações representativas de T. cruzi e T. rangeli que
possam ser úteis na escolha de marcadores de valor diagnóstico entre estas espécies. Desta
forma, na aplicação de nossos resultados na identificação e /ou caracterização de isolados
novos ou verificação de autenticidade de amostras não há necessidade da utilização de
muitas referências, apenas as mais representativas de cada espécie e também a correta
aplicação destes marcadores.
5.2. Parâmetros morfobiológicos
Como já relatado na literatura, T. cruzi apresenta fácil crescimento a temperatura
de 27°C em diversos meios de culturas convencionais, apresentando nestes, estágios
similares aos encontrados em insetos triatomíneos. Já T. rangeli, também pode ser
cultivado em meios líquidos convencionais a 27°C, porém é mais exigente que T. cruzi,
necessitando de NNN e suplementação de soro fetal bovino nos sucessivos repiques para a
manutenção de isolados de recentes de triatomíneos (SOUSA 1999). Neste estudo observou-
se que, apesar dos valores médios de crescimento alcançados variaram entre as espécies,
atingindo valores semelhantes, foi possível confirmar que T.cruzi cresce com mais
facilidade que T. rangeli em meio LIT puro (10% SFB). Sendo este caráter importante na
identificação ou seleção de amostras (SOUSA 2008).
Em T. cruzi, as médias entre o 7º e 17º dia variaram entre 9,3 céls/ml (DM28c) e 41,7
céls/ml (Colombiana). Vale ressaltar que a maioria destas amostras apresentou pico de
crescimento no 10º dia da curva e as demais no 17º dia. Em T. rangeli, foram observados os
as médias entre o 7º e 17º dia variaram entre 12,9 céls/ml (Choachi) e 32,9 céls/ml
(R1625), com pico de crescimento, alternando entre o 7º e 13º dia da curva.
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
62
Chagas (1909) em seus artigos originais sobre a descrição de T. cruzi acreditou que
a variabilidade morfológica dos tripomastigotas sanguíneos tinham significado de
dimorfismo sexual, outros autores acreditavam que as formas largas presentes no sangue
representavam estágios evolutivos adultos e eram derivadas de formas delgadas mais
jovens (BRENER 1965, BRENER & CHIARI 1963, BRUMPT 1912). A ocorrência de
tripomastigotas sangüíneos indiferenciados foi sugerida por Deane (1979), sendo estes
aparentes em células e em culturas axênicas, estágios representados talvez pelas formas
intermediárias, relatando que o padrão de crescimento de diferentes cepas de T. cruzi em
cultura pode variar de acordo com as formas predominantes no momento da semeadura.
No presente trabalho, as cepas de T. cruzi apresentaram os seguintes estágios
evolutivos: epimastigotas, transição para tripomastigotas, tripomastigotas metacíclicos,
outros estágios e divisões. Todas as amostras apresentaram epimastigotas em altos
percentuais, principalmente as cepas DM28c, Y, Cl Brener, YuYu. FL e Peruana, enquanto
demais estágios apresentaram taxas inferiores a 10%. As cepas SF21, G e MR foram as que
apresentaram maior taxa de diferenciação celular.
Relatos da literatura comprovam o alto polimorfismo em amostras de T. rangeli
isoladas de diversas regiões geográficas. Geralmente esta espécie apresenta poucos
epimastigotas pequenos e formas aflageladas, epimastigotas e tripomastigotas de tamanho
médio e longos; apresenta parasitemia baixa ou subpatente e os tripomastigotas da
circulação sanguínea podem ser distinguidos de T. cruzi principalmente por seu tamanho
ser maior, além de pequeno cinetoplasto. Nota-se ainda a presença de formas
arredondadas tipo esferomastigotas (D’ALESSANDRO 1976, SOUSA 1999, TEJERA 1920,
VALLEJO 1987)).
Neste estudo, dados apresentados corroboram com a literatura, pela constatação
do seguinte padrão de diferenciação celular: epimastigotas, tripomastigotas, células
peculiares do tipo ―tadepole ou lâmpadas‖ e esferomastigotas. O estágio epimastigota
também apresentou-se predominante em diversas amostras de T. rangeli. Os demais
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
63
estágios apresentaram variação na representatividade (gráficos 3 a 5). A cepa H-9 e Macias
destacaram-se pela alta taxa de diferenciação para esferomastigota. Já a cepa R1625
apresentou padrão de diferenciação típico da espécie, com todos os estágios igualmente
encontrados: cerca 35% de epimastigotas, 38% de células ―lâmpadas‖ e taxas elevadas
taxas de esferomastigotas (max: 56%).
Conforme observado, as diferenças nos padrões de diferenciação celular são
evidentes. Ressalta-se aqui a presença de células lâmpadas e esferomastigotas apenas em
T. rangeli, uma vez que quando observadas em T. cruzi não apresentavam significância,
desta forma, contrariando uma proposta diferente do ciclo do T. cruzi (BRACK 1968), no
qual observou-se a presença de esferomastigotas. Entretanto, outros autores já
demonstraram que a presença destas formas são insignificantes em T. cruzi, mas muito
representativas em T. rangeli (VALLEJO 1987). Sendo este caráter importante caráter na
distinção destas espécies. A diferença nos padrões de diferenciação celular entre T. cruzi e
T. rangeli, podem ser atribuídas ainda às diferenças no ciclo evoltutivo destas espécies em
seus hospedeiros vertebrados e invertebrados. Além disso, torna-se evidente que esta
metodologia pode ser utilizada como abordagem inicial no diagnóstico destas espécies,
Segundo a Hoare (1972), a média total comprimento dos tripomastigotas sangüíneos
em vários isolados de T. cruzi, de hospedeiros naturais ou experimentais, varia de 16,3 a
21,8 μm. No presente trabalho, os epimastigotas de T. cruzi apresentaram variação no
comprimento total entre 23,5µm (Colombiana) e 33,0µm (YuYu). Entretanto, no
comprimento dos tripomastigotas apresentaram medidas mínimas de 18,4µm (Colombiana)
e máxima de 22,3µm (MR), com pouca variação.
De acordo com D'Alessandro (1976) a média total comprimento de T. rangeli sangue
de vertebrados varia entre 26,4 a 33,8 μm, mas a multiplicação deste parasita em
mamíferos ao foi convincentemente demonstrada (D'ALESSANDRO-BACIGALUPO & SARAVIA
1992). Em triatomíneos, T. rangeli desenvolve no intestino apresentando pequenos
tripomastigotas com cerca de 8-13 μm de comprimento (HOARE 1972).
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
64
Na maioria dos parâmetros analisados nos estágios tripomastigotas, observou-se
também grande variação e sobreposição de resultados, tanto entre as cepas, quanto entre
as espécies estudadas. Entretanto, valores de comprimento total e largura revelaram
diferenças significativas. Outro parâmetro morfológico que pode ser utilizado na distinção
entre T. cruzi e T. rangeli é através da dimensão do cinetoplasto, conforme observado por
Vallejo (1988,1987) e Mulphordt (1975), no qual distingui-se T. cruzi, T. conorhini, T.
lewisi e T. rangeli pela ultraestrutura do cinetoplasto. Nossos dados confirmam estes
relatos, uma vez que esta organela apresentou médias de comprimento dos tripomastigotas
entre 1,0µm a 1,3µm em T. rangeli e 1,7µm e 1,9µm em T.cruzi.
Neste estudo, observou-se uma grande variação nos parâmetros, com sobreposição de
resultados. Alguns menos variáveis foram selecionados para a análise estatística, a qual
confirmou a diferença significativa entre as espécies principalmente no comprimento total
dos tripomastigotas (p<0,008) e no tamanho do cinetoplasto, com significância estatística
de p< 0,000.
5.2. Parâmetros bioquímicos e moleculares
Através da análise de eletroforese de isoenzimas é possível observar as diferentes
mobilidades de enzimas isofuncionais, as quais mostram diferenças entre os produtos
genéticos de cada amostra, assim como a homogeneidade ou heterogeneidade populacional
de espécies. Miles et al (1981) introduziram a técnica dos perfis de isoenzimas para a
caracterização de cepas de T.cruzi utilizando 10 sistemas enzimáticos e propondo 3
zimodemas principais: Z1, Z2 e Z3. Romanha et al (1979) classificaram cepas de T. cruzi
em 2 diferentes grupos e Tibayrenc (1986) apresentou resultados conflitantes, utilizando
15 sistemas e 121 isolados. Em T. rangeli, poucos estudos foram realizados para
caracterização desta espécie, uma vez que esta técnica não revela grande
heterogeneidade entre as amostras. Holguín (1987) observou em 14 sistemas, que apenas a
enzima ICD representava a variabilidade entre amostras silvestres e domiciliares na
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
65
Colômbia. Steindel (1994)observou a formação de de 2 grupos distintos em 16 amostras de
T. rangeli com cepas do Brasil, Honduras, Colômbia e Venezuela. Devido a esta baixa
variabilidade, alguns autores propõem o uso desta técnica na distinção entre T. cruzi e T.
rangeli (MILES 1983, STEINDEL 1994, SOUSA 2008).
Neste trabalho, a análise do perfil eletroforético de isoenzimas, utilizando os
sistemas ME, MDH, GPI e PGM revelou o poder discriminatório destas enzimas entre as
amostras de T. cruzi e T. rangeli, principalmente nas enzimas MDH e ME (com apenas 1 ou
2 loci enzimáticos). Entretanto, as enzimas GPI e PGM destacaram-se por evidenciarem a
heterogeneidade intraespecífica. Além disso, apesar de não existirem muitos trabalhos
sobre isoenzimas com as mesmas amostras utilizadas neste trabalho, pudemos verificar que
a cepa Peruana não é uma amostra autêntica (VIRGINIA 1983). Em contrapartida, nossos
resultados para a cepa Y demonstraram que esta apresenta perfil eletroforético
semelhante a outros trabalhos (STEINDEL 2008, DEANE 1984), confirmando a autenticidade
desta amostra.
Amplificação dos minicírculos do kDNA de cepas de T. rangeli, utilizando como
modelos os primers #S35/S36 (STURM ET AL 1989), permitem a amplificação de um
fragmento de 760 pb de uma (KP2) e fragmentos de 300 a 450 pb (KP3) (GHUL 2002). Neste
trabalho, foi utilizado o par de primers #121/122, semelhantes aos #S35/S36, descritos
como específicos para T. cruzi (JUNQUEIRA 1996), mas que podem amplificar seqüências
de minicírculos de outras espécies de tripanosomas isolados de pacientes chagásicos e de
uma nova espécie isolada de animal doméstico (ver artigos publicados em anexo).
Neste trabalho, as cepas de T. cruzi apresentaram uma única banda com
aproximadamente 330 pb, com exceção da cepa Y, a qual apresentou uma banda adicional
abaixo de 330 pb, nem sempre apresentada nos em outras corridas. Entretanto, diversos
relatos da literatura afirmam a presença desta banda (AVILA 1990), a qual precisa ser mais
estudada e identificada. Nas amostras de T. rangeli foi possível observar produtos de
amplificados típicos da região conservada kP2 (760pb) desta espécie, além de um conjunto
2009 DISCUSSÃO Santos-Faissal BN
66
de bandas entre 300 e 450bp. Em nossas publicações, afirmamos não poder distinguir esses
fragmentos de T. cruzi, e a pureza das culturas (SOUSA 2008). Entretanto, utilizando
diferentes condições de corrida eletroforética, estes fragmentos de todas as amostras de
T. rangeli utilizadas, KP1+, revelaram-se distintos de T. cruzi, confirmando a
autenticidade destas amostras.
5.3. Considerações finais
Considerando os resultados, identificou-se um conjunto de abordagens
metodológicas e parâmetros que podem utilizados no diagnóstico diferencial entre T. cruzi
e T. rangeli ou suas variedades. Como as amostras utilizadas fazem parte do acervo da
Coleção de Tripanosomatídeos do IOC, e são utilizadas em diversos projetos de pesquisa e
ensino nacionais e internacionais, o presente estudo também serviu para confirmar a
autenticidade destes organismos como T. cruzi e T. rangeli e suas cepas. Além disso, estes
dados foram utilizados na identificação de novos isolados (ver artigos publicados, em
anexo), bem como na descrição de uma nova espécie.
Este trabalho também contribui para o resgate do conhecimento parasitológico
clássico sobre T. cruzi e T. rangeli, além da valorização do emprego destas técnicas no
estudo dos tripanosomatídeos, sugerindo que estas sejam utilizadas como abordagens
iniciais para auxiliar na escolha de técnicas complementares e avançadas para
caracterização e identificação destes organismos.
2009 CONCLUSÕES Santos-Faissal BN
67
6. CONCLUSÕES
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6. CONCLUSÕES
As amostras de Trypanosoma cruzi e T. rangeli apresentaram intensidade de
crescimento em valores aproximados, diferindo apenas nos de picos de crescimento.
Entretanto, diferentemente de T. cruzi, as amostras de T. rangeli só cresceram em LIT
suplementado com 20% soro fetal bovino, sendo este dado de importância na distinção
destas espécies e fator identificador no isolamento de amostras.
Trypanosoma cruzi apresentou padrão de diferenciação celular típico da espécie:
epimastigotas, transição para tripomastigotas, tripomastigotas metacíclicos. Dentre as
cepas com maior taxa de diferenciação destacam-se SF21, G e MR.
Foram observados em T. rangeli os seguintes estágios evolutivos: epimastigotas,
tripomastigotas, esferomastigotas e formas com cinetoplasto posterior e extremidade
arredondada, denominadas ―tadepole ou lâmpadas‖. Destacamos as cepas H-9, Choachi,
Macias e R1625 com altos percentuais de diferenciação para esferomastigotas e
―tadepole”, sendo estes estágios característicos de T. rangeli e importante na distinção de
desta espécie de T. cruzi.
Através dos resultados da morfometria dos principais estágios evolutivos
encontrados, além do cinetoplasto, evidenciou-se que as dimensões do comprimento total
dos tripomastigotas (flagelo livre incluído) p ≤ 0,008 e cinetoplasto possuem valores muito
distintos, confirmados estatisticamente (p ≤ 0,000).
A análise do perfil eletroforético de isoenzimas, utilizando os sistemas ME, MDH,
GPI e PGM revelou poder discriminatório entre T. cruzi e T. rangeli, principalmente nas
enzimas MDH e ME (com apenas 1 ou 2 loci enzimáticos). Entretanto, as enzimas GPI e PGM
destacaram-se por evidenciarem a heterogeneidade intraespecífica.
A utilização do conjunto de primers #121/122 na amplificação de seqüências dos
minicírculos do kDNA revelaram bandas específicas de T. cruzi (330 pb) e T. rangeli
(~760pb) para as todas as amostras identificadas com estas espécies. Além disso, todas as
cepas de T. rangeli (KP1+) não apresentaram produtos de 330pb (SOUSA 2008, MADEIRA
2009 CONCLUSÕES Santos-Faissal BN
69
2009) na região entre 300 e 450 pb, uma vez que neste trabalho, utilizando diferentes
condições de corrida, revelaram-se distintas das amostras de T. cruzi, confirmando a
pureza e autenticidade destas amostras.
Os resultados deste trabalho identificaram técnicas e parâmetros úteis para a
distinção entre T. cruzi e T. rangeli ou suas variedades, os quais podem ser utilizados para
autenticar amostras de culturas axênicas, assim como para análise e identificação de novos
isolados (ver artigos publicados, em anexo). Confirmou-se a autenticidade das amostras da
Coleção de Tripanosomatídeos do Instituto Oswaldo Cruz, a qual ao longo de sua existência
tem apoiado diversos projetos de pesquisa e ensino de instituições nacionais e
internacionais.
Este trabalho também contribui para o resgate do conhecimento parasitológico
clássico sobre T. cruzi e T. rangeli, além da valorização do emprego destas técnicas no
estudo dos tripanosomatídeos, sugerindo que estas sejam utilizadas como abordagens
iniciais para auxiliar na escolha de técnicas complementares e avançadas para
caracterização e identificação destes organismos.
2009 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÀFICAS Santos-Faissal BN
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