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PRISCILLA SCHERLOSKI DOS SANTOS
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO
DA OSTEOPOROSE
Tese apresentada à Universidade Federal de
Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária, para obtenção do título de
“Magister Scientiae”.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2004
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1
PRISCILLA SCHERLOSKI DOS SANTOS
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO EXPERIMENTAL PARA O ESTUDO
DA OSTEOPOROSE
Tese apresentada à Universidade Federal de
Viçosa, como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, para
obtenção do título de “Magister Scientiae”.
APROVADA: 14 de maio de 2004
_____________________________ ___________________________
Prof. Ricardo Junqueira Del Carlo Prof
a
. Tânia Toledo de Oliveira
(Conselheiro) (Conselheira)
_____________________________ ___________________________
Prof. Rubens Chaves de Oliveira Prof. Cláudio César Fonseca
______________________________
Prof
a
Marlene I. Vargas Vilória
(Orientadora)
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2
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Santos, Priscilla Scherloski dos, 1974-
S237d Desenvolvimento de um modelo experimental para o
2004 estudo da osteoporose / Priscilla Scherloski dos Santos.
– Viçosa : UFV, 2004.
xvii, 83f. : il. ; 29cm.
Orientador: Marlene Isabel Vargas Vilória.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 77-83.
1. Rato - Osteoporose - Efeito de glicocorticóides. 2.
Rato - Osteoporose - Esterilização. I. Universidade Federal de
Viçosa. II.Título.
CDD 20.ed. 636.0885
3
A Deus,
Aos meus pais: Alfredo e Helena,
Ao meu irmão: Rafael,
Aos meus primos: Sérgio e Cida,
Pela confiança e pelo apoio
em todos os momentos.
Dedico este trabalho a vocês.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus por me conceder a vida, minha família e todas as pessoas
maravilhosas que fazem parte da minha história.
Aos meus amados pais por incentivar, amar, ter sempre a palavra certa
no momento certo e por serem o meu porto seguro.
Ao meu adorado irmão por ser amigo, companheiro e cúmplice.
Aos queridos primos Sérgio e Cida por abrirem as portas de sua casa e
de suas vidas para mim.
À querida professora Marlene por me receber como estudante ensinando
e orientando, mas principalmente por me receber em seu lar e sua família como
amiga e como filha.
Ao professor Ricardo por contribuir incansavelmente para conclusão
deste trabalho, pela paciência e pela confiança.
Ao professor Rubens pela gentileza de nos receber e pela dedicação para
realização deste trabalho.
A professora Maria Ignês pela gentileza de nos receber e colaborar para a
realização das análises do experimento.
Ao professor Patarroyo pela atenção, ensinamentos, colaboração e
principalmente pela amizade e pelo carinho.
A professora Andréa por estar sempre disposta a auxiliar, pelo
companheirismo e pelo carinho.
À minha querida amiga Michelle pelo estímulo, carinho, bons momentos e
a amizade que vou levar sempre comigo.
Ao Fabrício pela presença constante na minha vida como companheiro,
cúmplice e principalmente como amigo.
Ao Policarpo pela amizade, companheirismo e incansável cooperação
para realização deste trabalho.
5
Aos amigos Mário e Tati pela amizade, companheirismo e excelentes
momentos que passamos juntos.
À Gisele pela amizade, estímulo, companheirismo e pela cooperação.
Ao Sidimar pela colaboração, carinho e amizade.
Ao Ferdinan por participar da minha vida como companheiro, amigo e
irmão.
Ao Luís pela recente amizade e irmandade.
Aos amigos Richard, Ester, Rafa, Érika, Jéferson, Andréa pelos bons
momentos.
Às amigas Claudia e Irma pelo carinho e pela ajuda.
A Pati pela amizade, cumplicidade, maternidade, companheirismo e pelos
excelentes momentos que passamos juntas.
À Lisa, Sandra e Lúcia pelo companheirismo e amizade.
Às amigas Cíntia e Silvinha pela amizade e carinho.
Aos estagiários e amigos Paloma, Denise, Jair, Fabio, Leonardo, Marcel,
Humberto e Gabriela pela consideração e colaboração para a realização deste
trabalho.
Aos professores do DVT José Antônio Viana, Cláudio César Fonseca,
Pacífico Antônio Diniz Belém, Tarcizio Antônio Rego de Paula, Luiz Gonzaga
Pompermayer sempre solícitos.
Aos professores Tânia Toledo de Oliveira, Sérgio Luís Pinto da Mata,
Marcelo José Vilela, Jorge Clin.
Ao Zé de Oliveira pelo auxílio, pela amizade e por estar sempre sorrindo
mesmo quando as coisas estão difíceis.
Aos funcionários do DVT: Rosi, Adão, Cláudio, Maninha, Calzinho, Sérgio,
Ulisses, Camilo, Toninho, Etelvina, Heloísa, Divina, Sônia, Batalha, Luís
Carlos, Geraldinho e Margarete.
Aos funcionários dos departamentos de Zootecnia, Engenharia Florestal,
Bioquímica e do Centro de Ciências Biológicas: Fernando (DZO), Zé Geraldo
(DBQ), Luciano (DEF), Monteiro (DZO), Regina (CCB), Maria do Carmo (CCB).
6
BIOGRAFIA
PRISCILLA SCHERLOSKI DOS SANTOS, filha de Alfredo Juvaldo
Nunes dos Santos e Helena Scherloski dos Santos, nascida em 15 de
janeiro de 1974, na cidade de Cascavel-Paraná-Brasil.
Ingressou no curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do
Paraná, Brasil, em janeiro de 1994, concluindo sua graduação em abril do ano de
2001.
Iniciou o curso de Mestrado em Medicina Veterinária na Universidade
Federal de Viçosa em agosto de 2001.
7
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ..........................................................................
viii
LISTA DE GRÁFICO .....................................................................................
ix
LISTA DE QUADROS ...................................................................................
xi
LISTA DE TABELAS .....................................................................................
xii
RESUMO .......................................................................................................
xv
ABSTRACT ...................................................................................................
xvii
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................
1
2. OBJETIVOS .............................................................................................
4
2.1 Objetivo Geral ..........................................................................................
4
2.2 Objetivos Específicos ..............................................................................
4
3. REVISÃO DE LITERATURA .....................................................................
5
3.1 Tecido Ósseo ......................................................................................
5
3.1.1 Classificação do Tecido Ósseo segundo Estrutura e Forma............
6
3.1.2 Células do Tecido Ósseo .................................................................
7
3.2 Remodelação Óssea e BMU ...............................................................
8
3.3 Fisiologia do Metabolismo Ósseo ........................................................
10
3.4 Osteoporose ........................................................................................
15
3.4.1 Conceito e Classificação ..................................................................
15
3.4.2 Epidemiologia ...................................................................................
17
3.4.3 Fatores de Risco ..............................................................................
19
3.4.4 Fisiopatologia da Osteoporose .........................................................
21
3.4.4.1 Fatores que afetam a atividade dos osteoclastos ................
22
3.4.4.2 Fatores que afetam a atividade dos osteoblastos.................
22
8
3.4.5 Alterações plasmáticas e no tecido ósseo .......................................
23
3.4.6 Alterações biomecânicas ............. ....................................................
24
3.4.6.1 Estrutura óssea e resistência ...............................................
24
3.5 Modelos Animais .................................................................................
25
4. MATERIAL E MÉTODOS .........................................................................
29
4.1 Distribuição dos Grupos ......................................................................
29
4.2 Procedimento Cirúrgico .......................................................................
30
4.3 Administração de Glicocorticóide ........................................................
31
4.4 Coleta de Material para Análises .........................................................
31
4.4.1 Bioquímica do Plasma ......................................................................
32
Bioquímica Óssea ...........................................................................
32
4.4.3 Teste Biomecânico ...........................................................................
33
4.5 Análise Estatística ...............................................................................
34
5. RESULTADOS .........................................................................................
35
5.1 Análise Quantitativa de Cálcio, Fósforo e Proteínas Totais no
Plasma..................................................................................................
35
5.2 Análise Quantitativa de Cálcio, Fósforo e Magnésio no Osso ............
38
5.3 Ensaios Biomecânicos ........................................................................
42
5.3.1 Ensaio Mecânico de Flexão ...........................................................
42
5.3.2 Ensaio Mecânico de Compressão ....................................................
51
6. DISCUSSÃO ............................................................................................
59
7. CONCLUSÕES ........................................................................................
74
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................
77
9
LISTA DE ABREVIATURAS
BMU - Unidade Básica Multicelular
BMD - Densidade Mineral Óssea
Ca - Cálcio
Cbfa 1 - Gene codificador ativador de transcrição de
diferenciação de osteoblastos
Célula NK - Célula Natural Killer
Célula T CD4
+
-Th1, Th2 - Linfócito T CD4+ (Resposta Imune tipo: Th1 e Th2)
Célula Tc - Linfócito Tc
CO
3
- Carbonato
IFG - Interferon Gama
IGF-1, 2 - Fator de Crescimento semelhante à Insulina-1, 2
IL-1, 3, 6, 8 - Interleucina-1, 3, 6, 8
K - Potássio
Kgf - Quilograma-força
LPS - Lipopolissacarídeo
M - Macrófagos
Mg - Magnésio
M-CSF - Fator Estimulante de Colônia-Macrófagos
N - Newton
Na - Sódio
NO - Óxido Nítrico
PG - Prostaglandina
PG E
2
- Prostaglandina endoperóxido com duas ligações
insaturadas
PTH - Paratormônio
RANK-ligante - Receptor ativador do Fator Nuclear (NF- )
ROI - Oxigênio Reativo Intermediário
TGF- - Fator de Crescimento Transformante-
TNF- , - Fator de Necrose Tumoral- ,
10
LISTA DE GRÁFICOS Página
Gráfico 1.
Concentrações plasmáticas médias de fósforo nos
grupos de machos II e III..........................................................
36
Gráfico 2.
Concentrações plasmáticas médias de cálcio nos
grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII............................................
37
Gráfico 3.
Concentrações plasmáticas médias de fósforo nos grupos de
fêmeas VI, VII e VIII.................................................................
37
Gráfico 4.
Concentrações médias de proteínas plasmáticas nos
grupos de fêmeas V e VII.........................................................
38
Gráfico 5.
Concentração média de fósforo no úmero nos grupos
de machos I, II, III e IV.............................................................
39
Gráfico 6.
Concentrações médias de magnésio no úmero nos
grupos de fêmeas V e VIII........................................................
41
Gráfico 7.
Médias de força máxima até o ponto de ruptura
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I,
II e IV........................................................................................
43
Gráfico 8.
Médias de deformação máxima até o ponto de
ruptura obtidas por flexão em tíbia nos grupos de
machos I, II e IV.......................................................................
43
Gráfico 9.
Médias de força até o limite de proporcionalidade
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I,
II e IV........................................................................................
44
Gráfico 10.
Médias de deformação até o limite de
proporcionalidade obtidas por flexão em tíbia nos
grupos de machos I e IV..........................................................
45
Gráfico 11.
Comparação de médias de resiliência entre
tratamentos e períodos de coleta dos grupos I e
IV..............................................................................................
47
11
Gráfico 12.
Comparação de médias de rigidez entre
tratamentos e períodos de coleta dos grupos I,
II e IV........................................................................................
47
Gráfico 13.
Comparação das médias de força até o limite de
proporcionalidade entre períodos de coleta dos
grupos I, II, III e IV...................................................................
53
Gráfico 14.
Comparação das médias de contração até o limite de
proporcionalidade entre períodos de coleta dos grupos
I, II e III.....................................................................................
53
Gráfico 15.
Médias de compressão obtidas em vértebras L5 nos
grupos de machos I, II, III e IV.................................................
54
12
LISTA DE QUADROS Página
Quadro 1.
Fatores relacionados com a formação e reabsorção
óssea........................................................................................
15
Quadro 2.
Classificação da Osteoporose.................................................
16
Quadro 3.
Fatores de risco para Osteoporose..........................................
20
Quadro 4.
Alterações celulares relacionadas às três causas mais
comuns de perda óssea...........................................................
22
Quadro 5.
Distribuição dos grupos experimentais nas diferentes
coletas......................................................................................
30
13
LISTA DE TABELAS Página
Tabela 1.
Concentrações plasmáticas de cálcio, fósforo e proteínas totais
nos grupos de machos I, II, III e IV...................................................
35
Tabela 2.
Comparação de médias entre tratamentos de proteínas
plasmáticas dos grupos I, II, III e IV..................................................
36
Tabela 3.
Concentrações plasmáticas médias de cálcio, fósforo e
proteínas totais nos grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII....................
37
Tabela 4.
Concentrações médias de fósforo, cálcio e magnésio do úmero
nos grupos de machos I, II, III e IV...................................................
39
Tabela 5.
Comparação de médias entre tratamentos de magnésio no
úmero dos grupos I, II, III e IV..........................................................
39
Tabela 6.
Concentrações médias de fósforo, cálcio e magnésio do
úmero nos grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII..................................
40
Tabela 7.
Comparação de médias de fósforo entre tratamentos do úmero
dos grupos V, VI, VII e VIII...............................................................
40
Tabela 8.
Comparação de médias de cálcio entre tratamentos no úmero dos
grupos V, VI, VII e VIII......................................................................
40
Tabela 9.
Médias de força e deformação máximas até o ponto de ruptura
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I, II, III e
IV......................................................................................................
42
Tabela 10.
Médias de força e deformação até o limite de proporcionalidade
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I, II, III e
IV......................................................................................................
44
Tabela 11.
Médias de tenacidade, resiliência e rigidez obtidas por flexão em
tíbia nos grupos de machos I, II, III e IV..........................................
46
14
Tabela 12.
Comparação de médias de tenacidade entre tratamentos dos
grupos I, II, III e IV............................................................................
46
Tabela 13.
Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos I, II, III e IV............................................................................
46
Tabela 14.
Comparação de médias de rigidez entre tratamentos dos grupos I,
II, III e IV...........................................................................................
47
Tabela 15.
Médias de força e deformação máximas até o ponto de ruptura
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de fêmeas V, VI, VII e
VIII....................................................................................................
48
Tabela 16.
Comparação de médias de força máxima até o ponto de ruptura
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII..................................
48
Tabela 17.
Médias de força e deformação até o limite de proporcionalidade
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de fêmeas V, VI, VII e
VIII....................................................................................................
49
Tabela 18.
Comparação de médias de força até o limite de proporcionalidade
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e
VIII....................................................................................................
49
Tabela 19.
Comparação de médias de deformação até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos V, VI, VII
e VIII.................................................................................................
49
Tabela 20.
Médias de tenacidade, resiliência, e rigidez obtidas por flexão
em tíbia nos grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII................................
50
Tabela 21.
Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos V, VI, VII e VIII......................................................................
50
Tabela 22.
Comparação de médias de rigidez entre tratamentos dos grupos
V, VI, VII e VIII..................................................................................
51
Tabela 23.
Médias de força e deformação máximas até o ponto de ruptura
obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de machos I,
II, III e IV...........................................................................................
51
Tabela 24.
Comparação de médias de deformação máxima até o ponto de
ruptura entre tratamentos dos grupos I, II, III e IV............................
52
Tabela 25.
Médias de força e contração até o limite de proporcionalidade
obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de machos I,
II, III e IV...........................................................................................
52
15
Tabela 26.
Comparação de médias de contração até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos I, II, III e IV...........
53
Tabela 27.
Médias de compressão e resiliência obtidas por
compressão em vértebras L5 nos grupos de machos I, II, III e
IV......................................................................................................
54
Tabela 28.
Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos I, II, III e IV............................................................................
55
Tabela 29.
Médias de força e deformação máximas até o ponto de ruptura
obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de fêmeas
V, VI, VII e VIII..................................................................................
55
Tabela 30.
Comparação de médias de força máxima até o ponto de ruptura
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII..................................
56
Tabela 31.
Médias de força e contração até o limite de proporcionalidade
obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de fêmeas
V, VI, VII e VIII..................................................................................
56
Tabela 32.
Comparação de médias de força até o limite de proporcionalidade
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e
VIII....................................................................................................
57
Tabela 33.
Comparação de médias de contração até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e
VIII....................................................................................................
57
Tabela 34.
Médias de compressão e resiliência obtidas por
compressão em vértebras L5 nos grupos de fêmeas V, VI, VII e
VIII....................................................................................................
58
Tabela 35.
Comparação de médias de compressão entre tratamentos dos
grupos V, VI, VII e VIII......................................................................
58
Tabela 36.
Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos V, VI, VII e VIII......................................................................
58
16
RESUMO
SANTOS, Priscilla Scherloski dos, M. S., Universidade Federal de Viçosa, maio
de 2004. Desenvolvimento de um modelo experimental para o estudo da
osteoporose. Orientadora: Marlene Isabel Vargas Vilória. Conselheiros:
Ricardo Junqueira Del Carlo e Tânia Toledo de Oliveira.
A osteoporose é uma doença caracterizada por baixa massa óssea e
deterioração da microarquitetura do esqueleto, levando a uma acentuada
fragilidade óssea e a um conseqüente aumento do risco de fraturas. Atualmente
considera-se a osteoporose como um dos maiores e mais preocupantes
problemas de saúde do mundo, que atinge homens e mulheres. O modelo animal
com ratos (Rattus norvegicus) está sendo utilizado porque permite o acesso a
informações sobre a qualidade e estrutura ósseas que não seriam obtidas em
pacientes de triagem clínica, sendo portanto agentes fundamentais para se
realizar uma mensuração eficaz e segura da qualidade óssea. A proposta deste
modelo é estabelecer a osteoporose seja por meio da castração, ou da
administração de glicocorticóide, ou ainda, pela associação da castração com a
administração de glicocorticóide, tanto em machos como em fêmeas, e avaliar a
partir de que momento isto ocorre. Para realização do experimento foram
utilizados 192 ratos adultos (96 machos e 96 fêmeas). Os animais foram divididos
em oito grupos com 24 ratos em cada: grupo I – machos controle; grupo II –
machos castrados; grupo III – machos com terapia de glicocorticóide; grupo IV –
machos castrados com terapia de glicocorticóide; grupo V – fêmeas controle;
grupo VI – fêmeas castradas; grupo VII – fêmeas com terapia de glicocorticóide;
grupo VIII – fêmeas castradas com terapia de glicocorticóide. As coletas foram
realizadas em todos os grupos aos 14, 28, 42 e 56 dias após o início da
administração do glicocorticóide. Foram realizadas análise plasmática de cálcio,
fósforo e proteínas totais; análise quantitativa de cálcio, fósforo e magnésio do
úmero; teste biomecânico de flexão em tíbia e teste biomecânico de compressão
17
em vértebra lombar (L5). Associando-se os resultados obtidos, todos os grupos
experimentais apresentaram concentrações plasmáticas normais de cálcio:fósforo
(1:1 a 2:1) e concentrações ósseas de cálcio:fósforo (2:1) inferiores ao normal,
com exceção dos grupos controle. Com relação aos testes biomecânicos nos
machos, o grupo IV se apresentou com menor resistência a fratura óssea,
seguido do grupo III e do grupo II quando comparados ao grupo controle. Sendo
que nos grupos de fêmeas se constatou que o grupo VI teve uma perda óssea
mínima, indicada principalmente pelo desequilíbrio da concentração óssea de
cálcio:fósforo e pela redução da rigidez observada nos testes biomecânicos. Já os
grupos VII e VIII, apresentaram tanto concentração óssea inadequada de
cálcio:fósforo como fragilidade óssea, que foi observada nos testes de flexão e
compressão, considerando que o grupo VII apresentou menor média de rigidez e
o grupo VIII menor resistência a fratura tanto em vértebra L5 como em tíbia com
relação ao grupo controle.
18
ABSTRACT
SANTOS, Priscilla Scherloski dos, M. S., Universidade Federal de Viçosa, May
of 2004. Development of an experimental model to study osteoporosis.
Advisor: Marlene Isabel Vargas Vilória. Committee members: Ricardo
Junqueira Del Carlo and Tânia Toledo de Oliveira.
Osteoporosis is a disease characterized by low bone mass and
deterioration of the microarchitecture of the skeleton, leading to an accentuated
bone fragility and a consequent increase in the risk of fractures. Nowadays
osteoporosis is being considered one of the largest and more preoccupying health
problems in the world, which strikes men and women. An animal model with mice
(Rattus norvegicus) is being used because it allows the access to information on
the quality and bone structure that otherwise would not be obtained in patients of
clinical selection, being therefore fundamental agents to accomplish an effective
and safe measurement of the bone quality. The proposal of this model is to cause
osteoporosis through castration, glucocorticoid administration, or the association
of both, in males and females, and to evaluate that moment the disease starts. For
the accomplishment of the experiment 192 adult mice were used (96 males and 96
females). They were divided in eight groups with 24 animals in each: group I -
male control; group II - castrated males; group III - males with glucocorticoid
therapy; group IV - castrated males with glucocorticoid therapy; group V - female
control; group VI - castrated females; group VII - females with glucocorticoid
therapy; group VIII - castrated females with glicocorticóide therapy. The collections
took place to the 14, 28, 42 and 56 days after beginning of the administrating
glucocorticoid in all the groups. It was performed plasmatic analysis of calcium,
phosphorus and total proteins; quantitative analysis of calcium, phosphorus and
magnesium of the humerus; flexing biomechanic test in shinbone and
compression biomechanic test in lumbar vertebra (L5). Comparing the obtained
results, all the experimental groups presented normal plasmatic concentrations of
calcium:phosphorus (1:1 to 2:1) and bone concentrations of calcium:phosphorus
(2:1) inferior to the normal rate, except for the control groups. In regarding to the
19
biomechanic tests with males, the group IV showed smaller resistance to bone
fracture, following by the group III and the group II when compared to the control
group. In the groups of females it was verified that the group VI had a minimum
bone loss, indicated mainly by the unbalance of the concentration of
calcium:phosphorus in the bone and by the reduction of the rigidity observed in the
biomechanic tests. On the other hand, the groups VII and VIII, presented
inadequate bone concentration of calcium:phosphorus and bone fragility, which
was observed in the flexing and compression tests, considering that the group VII
presented minor rigidity average and the group VIII smaller resistance to fracture
vertebra L5 and in shinbone compared to the control group.
20
21
1- INTRODUÇÃO
As desordens músculo-esqueléticas são as causas mais comuns de dores
intensas prolongadas e incapacidade física que atingem milhares de
pessoas em todo o mundo. Sendo assim, doenças como a osteoporose têm
um impacto expressivo no indivíduo, na sociedade e nos custos sociais. E
esta tendência deve crescer de maneira significativa nas próximas décadas
com o aumento do número de idosos e com as mudanças no estilo de vida
que estão ocorrendo no mundo (WHO, 1999).
No entanto, existem modos efetivos de prevenir ou tratar estas condições
que causam incapacitação. As Nações Unidas, a Organização Mundial da Saúde,
e outras organizações nacionais e internacionais bem como profissionais da
saúde estão trabalhando globalmente com o chamado Movimento da Década de
Ossos e Articulações (2000-2010) para melhorar a qualidade de vida de pessoas
com problemas músculo-esqueléticos (WOOLF, 1999).
A osteoporose, segundo os critérios da Organização Mundial da Saúde, é
uma doença caracterizada por baixa massa óssea e deterioração da
microarquitetura do esqueleto, levando a uma acentuada fragilidade óssea
e a um conseqüente aumento do risco de fraturas. Cerca de 1/3 das
mulheres brancas acima de 65 anos são portadoras de osteoporose e há
uma estimativa prevendo que 50% das mulheres acima de 75 anos possam
sofrer alguma fratura osteoporótica. E embora os homens apresentem
osteoporose numa proporção substancialmente inferior às mulheres,
estima-se que um homem branco acima de 60 anos de idade tem 25% de
chance de sofrer uma fratura osteoporótica (WHO, 1999).
A osteoporose é uma doença que pode se desenvolver pela deficiência de
hormônios sexuais, pela senescência ou pelo uso excessivo de
glicocorticóides, considerando-se, no entanto, que esses fatores podem agir
22
de forma independente na perda óssea (MANOLAGAS, 2000). Essa
enfermidade pode ser primária ou secundária, sendo que a forma primária é
classificada em tipo I e tipo II. No tipo I ou pós-menopausa, associa-se uma
rápida perda óssea, enquanto que, no tipo II ou senil, relaciona-se à
deficiência crônica de cálcio, aumento da atividade do paratormônio e
diminuição da formação óssea. A osteoporose secundária é decorrente de
processos inflamatórios, alterações endócrinas, medicamentos como
corticosteróides, hormônios tireoidianos, anticonvulsivantes (GALI, 2001;
GENNARI et al., 2002).
Entre os fatores considerados de risco, individuais ou ambientais, para a
manifestação da osteoporose primária está a etnia, o estilo de vida
(tabagismo, alcoolismo, sedentarismo), a senescência. E ainda, menopausa
e histórico maternal de fratura como fatores ligados diretamente às
mulheres (OTT, 1998). Com relação aos fatores associados à osteoporose
secundária está a
anorexia, fibrose cística, insuficiência renal, doença hepática, depressão,
hipercalciúria, má absorção, desordens endócrinas e metabólicas
(hipogonadismo, hiperparatireoidismo, síndrome de Cushing, acidose),
doenças hereditárias do esqueleto (osteogênese imperfeita, raquitismo),
medicamentos (corticosteróides, heparina), lupus sistêmico (GENNARI et
al., 2002; OTT, 1998).
Para esclarecer a etiologia e melhorar a conduta preventiva perante a
osteoporose é necessário estabelecer um modelo animal apropriado para
validar uma terapia segura e eficaz (THOMPSON et al., 1995; THORNDIKE
et al., 1998). De forma que, no intuito de selecionar um modelo animal
adequado deve-se levar em consideração uma variedade de fatores:
modelo apropriado para deficiência de estrógeno; homogeneidade genética
do organismo; conhecimento anterior de propriedades biológicas; custo e
viabilidade; fácil manipulação experimental; considerações ecológicas;
implicações éticas e sociais (THORNDIKE & TURNER, 1998).
23
Segundo os mesmos autores, o modelo animal mais utilizado é o rato
(Rattus norvegicus) pelo fato de apresentarem baixo custo, serem animais de fácil
manuseio, não apresentarem implicações sociais e possuírem curto período de
vida facilitando o estudo dos efeitos do envelhecimento no osso.
THOMPSON et al. (1995) também recomendam utilizar ratas castradas
como modelo de osteoporose porque fornecem informações sobre a
qualidade óssea, ou seja, estrutura das trabéculas, tamanho dos cristais de
hidroxiapatita e viabilidade das células ósseas (OTT, 1998), que não podem
ser obtidas em pacientes humanos.
Este modelo animal foi selecionado por se apresentar adequado para um
estudo direto que esclareça detalhes da patogênese da osteoporose que ainda
permanecem obscuros.
24
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral
Avaliar se a esterilização (ovariectomia e orquiectomia) e a administração
de glicocorticóide em ratos adultos definem o aparecimento e progressão
da osteoporose.
2.2 – Objetivos específicos
1. Avaliar a fragilidade óssea e o risco de fratura por meio de testes
biomecânicos;
2. Avaliar a concentração plasmática de cálcio, fósforo e proteínas totais;
3. Avaliar a concentração de cálcio, fósforo e magnésio no osso.
25
3 - REVISÃO DE LITERATURA
3.1 - Tecido ósseo
O tecido ósseo é um tecido altamente especializado e dinâmico que está
em constante regeneração (OTT, 1998; COHEN & ROE, 2000;
JUNQUEIRA, et al., 2000; MANOLAGAS, 2000; WEINSTEIN &
MANOLAGAS, 2000; KALFAS, 2001; GENNARI et al., 2002). Constituído
por diversas células, matriz mineralizada e não mineralizada de tecido
conjuntivo, e espaços que incluem a medula óssea, canais vasculares,
canalículos e lacunas. Durante o desenvolvimento e crescimento, o
esqueleto é esculpido em forma e tamanho pela remoção de osso de um
local e deposição em outro diferente; este processo é chamado modelação.
Quando o esqueleto atinge a “maturidade”, a regeneração continua em
vários locais simultaneamente, onde o osso existente é substituído por osso
novo, sendo este processo chamado de remodelação (KARSENTY, 2000;
MANOLAGAS, 2000).
O tecido ósseo é composto por elementos orgânicos e inorgânicos, sendo
que aproximadamente 20% é água (KALFAS, 2001). A matriz óssea é
composta em sua parte inorgânica (65%) por cálcio e fosfato, que formam
26
uma estrutura cristalina denominada hidroxiapatita Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
, e por
outros íons como Na, K, Mg, CO
3
em diferentes proporções. A parte
orgânica (35%) é composta aproximadamente por 90% de colágeno,
mucopolissacarídeos e células, sendo responsável pela relativa flexibilidade
óssea (ROBBINS, 1994; KALFAS, 2001).
3.1.1- Classificação do tecido ósseo segundo estrutura e forma
A arquitetura da maioria dos ossos é semelhante, sendo composta de
osso do tipo trabecular (esponjoso) e do tipo compacto (cortical)
(ROSS & ROMRELL, 1993; MUNDY, 2000). O osso do tipo trabecular imaturo é
encontrado durante o desenvolvimento embrionário, a reparação de fraturas e em
algumas patologias como hiperparatireoidismo. Este tipo de tecido ósseo é
composto por feixes de colágeno arranjados aleatoriamente e espaços vasculares
formados irregularmente, revestidos por osteoblastos. O osso trabecular imaturo
é normalmente remodelado e substituído por osso cortical ou trabecular
(KALFAS, 2001).
No osso esponjoso, as trabéculas de tecido mineralizado se interconectam
formando uma rede resistente a cargas mecânicas, permanecendo os
espaços vazios entre estas, preenchidos por medula óssea
(ROSS & ROMRELL, 1993; KALFAS, 2001). Este tecido ósseo é
remodelado continuamente nas superfícies endosteais (KALFAS, 2001).
O osso cortical apresenta-se de forma compacta ao redor do componente
trabecular e contribui para a manutenção da sua integridade estrutural
(ROSS & ROMRELL, 1993; UDDO, 2002).
O tecido ósseo trabecular e o compacto apresentam-se em diferentes
proporções dependendo da forma do osso. Segundo a estrutura os ossos
são classificados em longos, curtos, planos e irregulares. Os ossos longos
como a tíbia, por exemplo, têm as extremidades denominadas de epífises e
sua extensão de diáfise, a porção que sobressai da epífise diretamente
27
contígua à diáfise é chamada metáfise. No caso dos ossos longos, a epífise
possui maior quantidade de osso trabecular e menor de cortical, enquanto
que na diáfise ocorre o contrário. Os ossos irregulares como, por exemplo,
as vértebras, têm uma forma complexa que não se ajusta às outras
classificações, sendo uma combinação dos tipos acima (ROSS &
ROMRELL, 1993).
Os ossos que constituem os esqueletos axial e apendicular são revestidos
externamente pelo periósteo e internamente nas superfícies medulares pelo
endósteo (SEEMAN, 1999; KALFAS, 2001). Esta massa é determinada
pela modelação e remodelação absoluta e relativa dessas superfícies
durante o crescimento e envelhecimento. Sua separação durante o
crescimento pela expansão periosteal e aposição endocortical aumenta a
massa mineral cortical. A espessura das trabéculas aumenta pela
modelação e remodelação que ocorre nas superfícies trabeculares
(SEEMAN, 1999).
3.1.2 Células do tecido ósseo
Os osteoclastos e os osteoblastos são células derivadas de precursores
originados na medula óssea. Os precursores dos osteoblastos são células
multipotentes de linhagem mesenquimal que também originam células
estromais, condrócitos, adipócitos e células musculares, enquanto que os
precursores dos osteoclastos são células hematopoiéticas da linhagem de
macrófago/monócito (ALBERTS et al., 1997; BAKER, 2000; MANOLAGAS,
2000; WEINSTEIN & MANOLAGAS, 2000).
Osteoclastos são células grandes, multinucleadas, móveis que, quando
ativas, repousam diretamente sobre a superfície óssea fazendo reabsorção
da matriz óssea calcificada. O tempo médio de vida de um osteoclasto é de
duas a três semanas (ROSS & ROMRELL, 1993; MANOLAGAS, 2000;
WEINSTEIN & MANOLAGAS, 2000).
28
Osteoblastos são células diferenciadas, cúbicas ou poligonais, que
produzem e secretam proteínas que constituem a matriz óssea. O produto
mais secretado por essas células é o colágeno do tipo I (ROSS &
ROMRELL, 1993; MANOLAGAS, 2000). Os osteoblastos sintetizam, entre
outras, osteocalcina e osteonectina que constituem de 40% a 50% das
proteínas não colagenosas do tecido ósseo, além de regular as
concentrações locais de cálcio e fosfato e promover a formação da
hidroxiapatita (BAKER, 2000; MANOLAGAS, 2000).
Os osteoblastos secretam osteóide, matriz orgânica não mineralizada, que
posteriormente sofre mineralização proporcionando rigidez e resistência ao
osso, sendo as únicas células ósseas que possuem receptores para o
hormônio da paratireóide (BAKER, 2000; KALFAS, 2001). A síntese da
matriz pelo osteoblasto determina o volume ósseo, mas não sua densidade.
A mineralização da matriz aumenta a densidade do osso pela eliminação da
água, mas não altera o seu volume. O osteoblasto quando ativo tem
aproximadamente doze semanas de vida (MANOLAGAS, 2000).
Os osteoblastos são relacionados diretamente com o Cbfa 1, que é um
gene que codifica um fator de transcrição cuja função é crítica tanto para
diferenciação de osteoblastos como para expressão de gene para matriz
extracelular. O Cbfa 1 é o único ativador de transcrição de diferenciação de
osteoblasto conhecido, sendo considerado um marcador molecular de
osteogênese (DUCY et al., 2000; KARSENTY, 2000).
O Cbfa 1 possui características de ativador de transcrição de diferenciação
celular, tais como: ser expresso em células destinadas a ser osteoblastos
mas que não estão diferenciadas ainda; não ser expresso em outros tipos
de células em níveis significativos; regular a expressão da maioria dos
genes expressos nos osteoblastos, em particular aqueles que codificam a
matriz extracelular; a transferência de Cbfa 1 em células não osteoblásticas
induz a expressão de genes osteoblásticos específicos (KARSENTY, 2000).
29
Os osteócitos são células ósseas maduras, as quais foram previamente
osteoblastos, que incluídos nas superfícies periostais e endosteais, passam
a ser responsáveis pela manutenção da matriz mineralizada como células
de revestimento (ROSS & ROMRELL, 1993; KALFAS, 2001). Os osteócitos
dentro da matriz são regularmente espaçados e comunicam-se uns com os
outros e com outras células na superfície óssea via múltiplas extensões de
sua membrana plasmática através dos canalículos da matriz. Estas células
ósseas detectam alterações no fluxo do fluído intersticial produzido por
forças mecânicas através dos canalículos e retificam alterações nos níveis
de hormônios, como estrógenos e glicocorticóides, os quais influenciam sua
sobrevivência. Portanto, a neutralização da atividade dos osteócitos, os
quais atuam de forma interconectada no tecido ósseo, contribuiria para o
aumento da fragilidade óssea (MANOLAGAS, 2000).
3.2 - Remodelação óssea e BMU (Unidade Básica Multicelular)
No esqueleto adulto humano saudável todos os osteoblastos e osteoclastos
pertencem a uma estrutura temporária única conhecida como unidade
básica multicelular (BMU) que realiza a remodelação óssea (OTT, 1998;
MANOLAGAS, 2000; WEINSTEIN & MANOLAGAS, 2000).
A remodelação óssea é um processo fisiológico celular observado nos
vertebrados que visa manter constante a massa óssea entre o fim da
puberdade e o tempo em que haverá redução intensa ou término da função
gonadal (HABERLAND et al., 2001; KARSENTY, 2000).
PAPATHANASOPOULOU et al. (2002) acreditam que a remodelação óssea
inclui todos os processos simultâneos pelos quais o tecido ósseo adulto
altera seu tamanho, forma e estrutura em resposta a circunstâncias
mecânicas às quais é submetido. Levando em consideração que o osso é
descrito como um tecido poroso saturado, com osteócitos e fluido
extracelular, estes pesquisadores acreditam que sob condições de
30
resistência mecânica ao fluxo do fluido através dos poros da matriz óssea,
se compele os osteócitos a regular o processo de remodelação óssea. O
processo de remodelação óssea é responsável pela completa regeneração
do esqueleto adulto humano a cada 10 anos (MANOLAGAS, 2000).
A massa óssea nos adultos é mantida localmente pelo balanço entre
reabsorção e formação óssea (HARADA & RODAN, 2003), ou seja, o
esqueleto adulto está em constante processo de remodelação
(MANOLAGAS, 2000). A BMU possui um tempo médio de vida de seis a
nove meses (MANOLAGAS, 2000; WEINSTEIN & MANOLAGAS, 2000),
durante o qual promove o recrutamento de osteoclastos, que por sua vez
atraem osteoblastos de seus respectivos progenitores na medula óssea
(MANOLAGAS, 2000). Os osteoclastos são ativos em uma BMU por duas
semanas num mesmo local da superfície óssea (OTT, 1998; BAKER,
2000), e logo após morrem por apoptose sendo rapidamente removidos por
fagocitose (WEINSTEIN & MANOLAGAS, 2000). Estas células liberam
mediadores químicos durante a reabsorção, dentre os quais interleucinas e
fatores de crescimento que atuam como quimiotáticos para os osteoblastos
(OTT, 1998; BAKER, 2000).
Segundo OTT (1998), os osteoblastos ativos secretam osteóide que
preenche lentamente a cavidade formada pela reabsorção. Quando o
osteóide atinge 6 m de espessura começa a ser mineralizado, processo
este que é regulado também pelos osteoclastos. Durante meses a cavidade
vai sendo preenchida o que deixa os cristais de hidroxiapatita mais
próximos e a densidade óssea mais elevada. A maioria dos osteoblastos
envolvidos torna-se parte das células de revestimento que participam da
liberação de cálcio dos ossos e o restante permanece no osso como
osteócito. Na conformação da BMU existe um capilar vascular central, um
suprimento nervoso, sendo associada também ao tecido conjuntivo
(MANOLAGAS, 2000).
31
Após cada dano ao tecido ósseo ou estresse mecânico desenvolvem-se
mais unidades de BMU mediadas por interleucinas e fatores de crescimento
(OTT, 1998). E no caso de um tecido ósseo normal há um intervalo de dois
a cinco anos para que haja remodelação óssea sucessiva no mesmo local
(MANOLAGAS, 2000).
3.3 - Fisiologia do metabolismo ósseo
É importante conhecer as peculiaridades do metabolismo ósseo humano
relacionadas diretamente ao sexo. Dentre elas estão o pico de massa
óssea que corresponde à quantidade máxima de massa óssea que um
indivíduo acumula desde o nascimento até a maturidade do esqueleto,
momento em que começa a perda associada ao envelhecimento (ROSEN,
2000; UDDO, 2002).
A massa óssea média para a idade (ou inadequada) pode ser considerada
uma conseqüência de acúmulo insuficiente de osso durante a vida de
adulto jovem (baixo pico de massa óssea) ou de excessiva perda óssea, ou
de ambas as condições. O pico de massa óssea é adquirido entre 20 e 30
anos de idade, regulado por forte controle genético e parece ser
influenciado por fatores hormonais e estilo de vida, como condicionamento
físico e cálcio na dieta (GENNARI et al., 2002).
No pico de massa óssea, a atividade das células formadoras de tecido
ósseo equivale à atividade das células de reabsorção e o tamanho do
esqueleto permanece inalterado e estável até o fim da década de
quarenta anos e início da década de cinqüenta (MANOLAGAS, 2000;
GENNARI et al., 2002). A mulher tem uma fase de perda rápida durante os
5 a 10 anos subseqüentes à menopausa devido à perda dos estrógenos
(MANOLAGAS, 2000; RIGGS et al.; 2002). No homem esta fase é obscura,
porque há um declínio lento na produção de esteróides sexuais
(MANOLAGAS, 2000). Logo depois da década de quarenta anos, a massa
32
óssea
começa a diminuir progressivamente em homens e mulheres (SEEMAN,
1999;
GENNARI et al., 2002).
Além da rápida perda de massa óssea após a menopausa, as mulheres
acumulam menos massa esquelética que os homens durante o
crescimento, particularmente na puberdade (SEEMAN, 1999;
MANOLAGAS, 2000). Então, os homens são mais altos que as mulheres
porque eles têm um período maior de crescimento, ao redor de dois anos
na fase da pré-puberdade, a velocidade de crescimento é maior durante a
puberdade e a duração deste impulso no crescimento é mais extenso do
que nas mulheres (SEEMAN, 1999), razão pela qual elas apresentam
ossos menores com corticais mais finas e diâmetro reduzido
(MANOLAGAS, 2000).
O controle da formação e reabsorção óssea é complexo e é regulado em
nível local e sistêmico por processos autócrinos, parácrinos e endócrinos.
Os fatores locais incluem as citocinas (autócrinas e parácrinas), fatores de
crescimento, óxido nítrico, comunicação célula-célula e sinais resultantes
da resistência mecânica sofrida pelo tecido ósseo. O controle sistêmico é
exercido pela ação das citocinas, fatores de crescimento e hormônios. A
regulação endócrina é mediada por hormônios como a calcitonina, o
paratormônio, a vitamina D e os hormônios sexuais que são importantes
reguladores da função de células ósseas e podem desencadear um
crescimento ou metabolismo ósseo anormal (ROSEN, 2000; GENNARI et
al., 2002).
Os esteróides sexuais são muito importantes para o desenvolvimento e
manutenção do tecido ósseo (GENNARI et al., 2002; HARADA &
RODAN, 2003). A preservação do esqueleto pelo estrógeno nas fêmeas é
relacionada evolutivamente com a necessidade de armazenar cálcio para o
desenvolvimento embrionário do esqueleto. Nos mamíferos adultos, tanto
33
machos quanto fêmeas, incluindo os humanos, os estrógenos inibem a
reabsorção óssea pela redução do número de osteoclastos (HARADA &
RODAN, 2003) e participam da regulação do metabolismo do cálcio no
osso cortical e esponjoso
(GENNARI et al., 2002).
O mecanismo de manutenção do esqueleto mais conhecido, envolve os
precursores da linhagem monócito/macrófago/osteoclasto, através dos
efeitos reguladores de citocinas, incluindo interleucinas 1, 6, (IL-1, IL-6),
fator de necrose tumoral- (TNF- ) e prostaglandinas (PGs) (ROSEN,
2000; HARADA & RODAN, 2003). Os estrógenos são necessários para
fechar as placas de crescimento das epífises e para fazer a manutenção da
massa óssea após a puberdade (GENNARI et al., 2002; HARADA &
RODAN, 2003).
Os andrógenos têm maior influência na regulação do metabolismo ósseo
porque devido ao seu metabolismo periférico podem atuar diretamente no
osso, via receptor de andrógenos, ou indiretamente, via receptor de
estrógenos depois de aromatizados para estrógenos (SEEMAN, 1999;
GENNARI et al., 2002).
A testosterona ou andrógeno não aromatizado, dihidrotestosterona,
estimula a formação óssea periosteal e crescimento radial no macho
determinando o tamanho do osso (SEEMAN, 1999; RIGGS et al., 2002).
Este esteróide sexual é responsável pelo fenótipo que caracteriza os
machos com um esqueleto maior, afetando o metabolismo ósseo de
diversas maneiras. A testosterona pode ser convertida pela aromatase em
estrógeno podendo inibir a reabsorção óssea e estimular a formação tanto
em machos quanto em fêmeas (HARADA & RODAN, 2003). A deficiência
de testosterona reduz o crescimento periosteal, resultando em tronco e
membros menores nos machos
(SEEMAN, 1999).
34
Entre as funções dos ossos estão a manutenção dos níveis de cálcio,
suporte mecânico para os tecidos moles, atuação como alavancas para a
ação muscular, suporte para a hematopoiese e abrigo para o encéfalo e
coluna vertebral. Deve ser lembrado que, para o cálcio ser liberado do
tecido ósseo deve haver reabsorção óssea (MANOLAGAS, 2000).
Os hormônios fundamentais na regulação do cálcio, fosfato e magnésio são
o paratormônio (PTH), a vitamina D [1,25(OH)
2
]
e a calcitonina, sendo suas
ações similares para o cálcio e magnésio (SARIS et al., 2000). Ressalta-se
que os principais mediadores da reabsorção óssea são PTH e a vitamina D
(NORDIN, 1997; HARADA & RODAN, 2003), que funcionam como potentes
estimuladores da formação de osteoclastos. A habilidade desses hormônios
para estimular o desenvolvimento de osteoclastos e para regular a
absorção e excreção de cálcio pelo intestino e rins, respectivamente, são
elementos chave para a homeostasia extracelular de cálcio (MANOLAGAS,
2000).
O PTH mantém o nível de cálcio sérico pelo aumento da reabsorção óssea
(SWENSON & REECE, 1993; ROUX et al., 1998; MANELLI & GUISTINA,
2000; HULLEY et al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002; McILWAIN, 2003),
pela reabsorção renal de cálcio e pela ativação da vitamina D com
conseqüente aumento da absorção intestinal de cálcio (ROUX et al., 1998;
COHEN & ROE, 2000; HULLEY et al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002;
McILWAIN, 2003). Além disso, também reduz a reabsorção renal de
fósforo, resultando em uma excreção elevada de fosfato, ou seja, baixa
concentração de fosfato sérico e manutenção de cálcio (SWENSON &
REECE, 1993). Relata-se também que o PTH libera magnésio do osso e
aumenta sua absorção intestinal. Assim os níveis de magnésio devem
influenciar a secreção de PTH pelo sistema de feedback , ou seja, no caso
de uma hipermagnesemia ocorre supressão da secreção de PTH causando
distúrbios na homeostasia do cálcio (SARIS et al., 2000).
Os níveis de PTH aumentam com a idade, possivelmente em
resposta
35
ao decréscimo de absorção intestinal de cálcio, devendo contribuir
também para o aumento de perda óssea relacionada com a idade
(COHEN & ROE, 2000).
A calcitonina é um dos hormônios clássicos na regulação óssea, produzido
pelas células C (parafoliculares) da tireóide (GALI, 2001), que atua inibindo
o desenvolvimento e atividade dos osteoclastos e ainda promove a
apoptose destes (MANOLAGAS, 2000) ou causa depressão da atividade
osteoclástica (SWENSON & REECE, 1993). Embora a calcitonina tenha
propriedades antireabsortivas, o seu uso terapêutico em doenças ósseas
que apresentam aumento de reabsorção ainda está sendo estudado, sendo
que
o papel deste hormônio na fisiologia humana permanece questionável
(MANOLAGAS, 2000).
O aumento em comprimento dos membros na deficiência de estrógenos é
dependente do hormônio do crescimento (SEEMAN, 1999). O hormônio do
crescimento é liberado pelo lobo anterior da glândula hipófise que através
da circulação chega ao tecido ósseo e ao fígado, onde células alvo são
estimuladas para liberar o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF).
E tanto o hormônio do crescimento quanto o IGF estão ativamente
envolvidos no desenvolvimento do esqueleto, tendo papel na reparação e
remodelação óssea no adulto (SWENSON & REECE, 1993; LIEBERMAN,
2002). Existem dois IGF identificados, IGF-1 e IGF-2, sendo que IGF-2 é o
fator de crescimento mais abundante no osso e tem-se mostrado mais
potente na reparação de fraturas em estudos realizados em humanos e
ratos (LIEBERMAN, 2002).
Quando há deficiência de hormônio do crescimento ou hipopituitarismo, o
aumento no comprimento ósseo após a ovariectomia não ocorre porque a
somatostatina é necessária para estimular a proliferação de células na
placa de crescimento. A somatostatina restaura o crescimento em resposta
à deficiência de estrógeno. Por outro lado, nos machos o crescimento dos
membros é simultaneamente dependente de testosterona e da hipófise
36
intacta, porque o hipopituitarismo é associado à falha no crescimento em
resposta a testosterona, sendo que essa falha na resposta não é reversível
pela administração de hormônio do crescimento (SEEMAN, 1999).
Além dos fatores citados existem muitos outros que agem direta e
indiretamente no metabolismo ósseo: fatores genéticos, fatores de
crescimento e citocinas, entre outros (Quadro 1).
As citocinas consideradas ativas, mais freqüentemente, como promotoras
de reabsorção são a IL-1, TNF e IL-6. Ressaltando que os efeitos destas
citocinas dependem de sua concentração, como a IL-1, por exemplo, que
estando em média e alta concentração desencadeia reabsorção, mas em
baixas concentrações induz a formação óssea. Essas situações também
são influenciadas por citocinas inibitórias, ou seja, um receptor IL-1
antagonista pode se ligar aos receptores IL-1 ou TNF, bloqueando a ligação
da citocina e sua atividade (BAKER, 2000).
Quadro 1. Fatores relacionados com a formação e reabsorção óssea.
Fator
Secretado por
Ação no osso
IL-1
M (macrófagos), exceto
linfócitos T e eritrócitos
Alta concentração: aumenta o nº de
osteoclastos por fusão do precursor; inibe a
síntese de colágeno
TNF-
M , células T e NK
Bloqueia formação óssea: inibe síntese de
colágeno, estimula reabsorção pela indução de
liberação de osteoblasto de PGE
2
e M-CSF
TNF-
(linfotoxina)
Linfócitos
Bloqueia formação óssea: inibe síntese de
colágeno; estimula reabsorção com PGE
2
:
liberação de Ca, aumenta efeito da IL-1
IL-6
Células T, fibroblastos gengivais,
osteoblastos se estimulados com
IL-1 ou TNF
Aumenta o número de osteoclastos
PGE
2
Monócitos, M , osteoblastos se
Promove fusão de osteoclasto; bloqueia
37
estimulados com IL-1, TNF,
TGF- ou
formação óssea
1,25 dihidroxi
vitamina D
3
Monócitos, M
Promove fusão de progenitores de osteoclastos,
diferenciação de osteoclastos
Oxigênio reativo
intermediário (ROI)
Neutrófilos, M , osteoclastos
Formação e ativação de osteoclastos
Óxido nítrico (NO)
M com LPS, IL-1, TNF ou IFG
Altas quantidades: estimula reabsorção e inibe
proliferação de osteoblastos
IL-8
M
Quimiotático para neutrófilos; promove secreção
de IL-1 e TNF- pelos neutrófilos
IL-3
Células T CD4+ (Th1 e Th2),
células NK e mastócitos
Promove diferenciação das células tronco da
medula óssea em linhagem de M , então CSF-
1 pode induzir osteoclastos
RANK-ligante
Células T e osteoblastos
Promove diferenciação de osteoclastos
IFG
Células Th1, células Tc, células
NK
In vivo: promove reabsorção; aumenta efeitos
na IL-1 ou inibe TNF da matriz em formação
Adaptado de: BAKER, P. J. The role of immune responses in bone loss during periodontal disease; p.1183, 2000.
3.4 - Osteoporose
3.4.1 - Conceito e classificação
A osteoporose é uma doença caracterizada por baixa massa óssea e
deterioração da microarquitetura do esqueleto, levando a acentuada
fragilidade óssea e conseqüente aumento do risco de fraturas (WHO,
1999). Esta doença pode se desenvolver quando há um desequilíbrio na
remodelação óssea em favor da reabsorção, resultando em perda
acumulativa de massa óssea e enfraquecimento do esqueleto (BONE et al.,
1997).
Em anos passados, estudos realizados com famílias e gêmeos mostraram
que essa doença possui forte componente genético que tem papel
importante na regulação da densidade mineral óssea (BMD). Enquanto em
algumas condições isoladas a osteoporose pode ser vista como padrão
hereditário Mendeliano, devido a mutações genéticas simples, na maioria
dos casos tem sido considerada doença poligênica multifatorial na qual os
determinantes genéticos são modulados por fatores hormonais, ambientais
e nutricionais (GENNARI et al., 2002).
38
Esta doença é classificada, segundo a causa determinante, em primária
e secundária, sendo que a primária é subdividida em tipo I e II
(COHEN & ROE, 2000; GALI, 2001). A primária do tipo I é caracterizada pela
perda de massa óssea, microfraturas em tecido ósseo esponjoso e fraturas em
vértebras lombares. A osteoporose primária do tipo II resulta em afinamento de
trabéculas e perda de tecido ósseo cortical e esponjoso (GENNARI et al., 2002;
RIGGS et al., 2002). E em raras circunstâncias, a osteoporose ocorre em adultos
jovens, homens e mulheres, sendo considerada sob o ponto de vista clínico como
idiopática (GENNARI et al., 2002). No Quadro 2 encontram-se os diferentes tipos
de osteoporose e as causas relacionadas.
Quadro 2. Classificação da Osteoporose.
OSTEOPOROSE
ORIGEM
PRIMÁRIA -TIPO I
(Idiopática pós-menopausa)
Período inicial após a menopausa. Associada a deficiência de
estrógenos.
PRIMÁRIA - TIPO II
(Idiopática senil)
Associada ao envelhecimento, fase em que ocorre deficiência
crônica de cálcio, aumento da atividade do PTH e diminuição
de formação óssea.
SECUNDÁRIA
Associada a processos inflamatórios; alterações endócrinas;
por uso de drogas (heparina, glicocorticóides, entre outros).
Adaptado de GALI, J. C. Osteoporose. Revista Acta Ortopédica Brasileira, volume 9, p. 53-62, 2001.
3.4.2 - Epidemiologia
A osteoporose leva ao enfraquecimento dos ossos, tornando-os
mais vulneráveis a traumas, sendo considerada uma das maiores causas de
morbidade e mortalidade na terceira idade (GILSANZ, 1998). Esta alteração
no metabolismo ósseo apresenta-se de maneira assintomática, lenta e
39
progressiva. E seu caráter silencioso leva a um diagnóstico tardio, quando
já existem riscos significativos de fraturas (GALI, 2001).
Atualmente considera-se a osteoporose como um dos maiores e
mais preocupantes problemas de saúde do mundo. Estima-se que nos EUA,
no mínimo 90% de todas as fraturas de quadril e vertebrais em mulheres
idosas de raça branca e mais de 70% destas em homens idosos de raça
branca são devidas à osteoporose. O risco de fraturas em mulheres de 50
anos é devido a 16% de fraturas de quadril, 15% de fraturas de pulso (radio)
e 32% de fraturas vertebrais. Aproximadamente, 50% das mulheres vão ter
osteoporose quando atingirem 80 anos de idade, enquanto que, um homem
de 50 anos de idade, tem 6% de risco de sofrer fratura de quadril e 16 a 25%
de sofrer alguma fratura osteoporótica durante a sua vida (GENNARI et al.,
2002).
Com o aumento da expectativa de vida observada no último século,
tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento, a incidência e
a prevalência da osteoporose e o seu custo para a sociedade
estão aumentando consideravelmente tanto para mulheres quanto para
homens (OTT, 1998; JUNQUEIRA et al., 2000; GENNARI et al., 2002). Isto,
considerando que a incidência das fraturas de quadril cresce
exponencialmente tanto em mulheres quanto em homens idosos (WANG et
al., 2001) e que os custos estimados para o tratamento destas fraturas
dobrarão durante os próximos vinte e cinco anos (GENNARI et al., 2002).
As fraturas osteoporóticas representam o aspecto clínico mais relevante da
osteoporose afetando todo o esqueleto, exceto o crânio. As fraturas mais
comuns são nas regiões do fêmur proximal, radio distal e vértebras
lombares. As fraturas de vértebras e radio têm pouca significância
econômica, mas apresentam morbidade significativa. É importante ressaltar
que as fraturas vertebrais são na maioria assintomáticas, dificultando a
avaliação clínica (GENNARI et al., 2002).
De acordo com Enriori & Enriori (2002), 55% das mulheres entre 50 e 59
anos de idade têm BMD reduzida, sendo que esse número cresce para 69
40
a 88% para as mulheres entre 60 e 70 anos. Muitos fatores são associados
a BMD: menopausa precoce; período da vida reprodutiva e paridade;
mulheres jovens com amenorréia ou distúrbios ovulatórios, entre outros.
Considerando que os ossos dos machos são maiores que os das fêmeas,
conclui-se que isto deve contribuir para a maior resistência e o menor risco
de fraturas observados nos machos (SEEMAN, 1999; GENNARI et al.,
2002). E, no entanto, segundo SEEMAN (1999), um terço das fraturas de
quadril ocorrem nos homens idosos, o que, segundo ele pode ser devido ao
aumento e severidade das quedas ou da fragilidade óssea.
Epidemiologicamente, as bases morfológicas para o aumento da fragilidade
óssea devem ser o resultado de várias quedas durante o crescimento ou
perda óssea relacionada à idade, ou ambos.
As fraturas osteoporóticas parecem ser a causa mais importante de
hospitalização, perda de independência e morte em homens e mulheres
idosos (ENRIORI & ENRIORI, 2002). Fraturas vertebrais ocorrem mais
cedo no homem e a mortalidade, depois da fratura de quadril ou das
vértebras lombares, é também mais freqüente que nas mulheres (SEEMAN,
1999; ENRIORI & ENRIORI, 2002).
No Brasil, cerca de 10 milhões de pessoas são atingidas pela osteoporose,
com a ocorrência de 80.000 casos anuais de fratura de quadril. Estima-se
que em 2025, a população incluída na faixa etária acima de 60 anos de
idade será de 34 milhões de pessoas, ou seja, aproximadamente
13,8% da população total brasileira poderá apresentar osteoporose
(LEDERMAN & CARNEIRO, 1996).
A mortalidade depois da fratura de quadril é maior no homem do que na
mulher e está relacionada à presença de co-morbidade. Estudos baseados
em várias populações sugerem que a prevalência de fratura vertebral
idade-específica é similar em homens e mulheres. Entretanto, as fraturas
nos homens durante a maturidade estão mais relacionadas a traumas do
que a fragilidade óssea. Isto se confirma porque a prevalência de fratura
41
vertebral idade-específica é menor no homem do que na mulher; o aumento
na prevalência com o avanço da idade é 30% no homem e 300% na mulher
(SEEMAN, 1999).
A prevenção e o tratamento da osteoporose é, portanto, da maior
importância para as organizações de saúde de todos os países do mundo
(GENNARI et al., 2002).
3.4.3 - Fatores de risco
Existem diferenças raciais na densidade mineral óssea e no turnover ósseo
demonstradas pelos valores maiores de BMD em diferentes locais do
esqueleto que as mulheres de raça negra tem em relação às mulheres de
raça branca com a mesma idade, peso e altura, consumo de cálcio e
atividade física similares. De modo que a diferença na massa óssea é
associada com a maior prevalência de osteoporose em mulheres brancas
do que negras. Similarmente diferentes valores de BMD têm sido
observados entre populações européias e polinésias. Essas variações na
incidência da osteoporose entre grupos raciais e étnicos devem estar
relacionadas com fatores ambientais e com diferenças hereditárias na
susceptibilidade (GENNARI et al., 2002). No Quadro 3 estão listados os
principais fatores de risco para a osteoporose.
42
Quadro 3. Fatores de risco para osteoporose:
FATORES DE
RISCO
SIGNIFICÂNCIA DOS FATORES DE RISCO
Mapa Genético
Forte componente genético no pico de massa e menos aparente na fase de
menopausa
Exercício
Formação óssea advinda de exercícios vigorosos e perda óssea por imobilização;
tecido ósseo saudável não é significantemente afetado por exercícios regulares
moderados
Idade à Menarca
Maior pico de massa óssea associado com menarca precoce não confirmada;
menarca tardia relacionada com efeito adverso no estado ósseo após a
menopausa
Idade à
Menopausa
Redução da densidade óssea na mulher após a menopausa significantemente
correlacionada com os anos em que está em menopausa e não com a idade em
que entrou na menopausa
Período em que
está na
Menopausa
Idade à menopausa e período em que está na menopausa são determinantes de
perda óssea tornando-se mais aparente com a passagem do tempo
Tipo de
Menopausa
Ovariectomia é geralmente associada como fator de risco osteoporótico, embora
não confirmado; tipo de menopausa não afeta o estado ósseo subseqüente
Período de
vida reprodutiva
Duração entre o período de menarca e menopausa com efeito mínimo na
densidade óssea subseqüente
Paridade
Gravidez não tem efeito a longo termo aparente na densidade óssea
Álcool
As observações são conflitantes do efeito na densidade óssea; beber socialmente
pode ter efeitos adversos modestos; consumidores de álcool apresentam mais de
24 horas de excreção urinária de cálcio e baixa concentração de fosfatase alcalina
plasmática quando comparados com não consumidores; álcool pode atuar como
depressor da formação óssea e aumentar o cálcio urinário
Tabagismo
Efeitos adversos marginais na densidade óssea, como por exemplo pode reduzir
a absorção de cálcio; menores efeitos do que os observados no consumo de
álcool, mas a combinação de álcool e tabagismo provavelmente é a mais
significante
Peso corporal
Relacionado a massa óssea pelo fator comum de tamanho dos ossos; relação
entre peso corporal e densidade óssea é evidente somente após a menopausa;
mais devido ao efeito de perda óssea que ao pico de densidade óssea
Consumo de Ca
Deficiência de cálcio causa osteoporose em animais e suplementação de cálcio
pode retardar a perda óssea nas mulheres após a menopausa; ainda não se
comprovou a relação entre consumo de cálcio (na dieta) e estado ósseo nas
mulheres após a menopausa
Absorção de Ca
Absorção de cálcio relacionada inversamente ao consumo de cálcio em indivíduos
normais mas não com osteoporose; declínio na absorção de cálcio com
severidade progressiva na osteoporose
Excreção urinária
de Ca
Aumento na concentração urinária cálcio/creatinina matinal (marcador de perda de
cálcio) como conseqüência da progressão da osteoporose; excreção de cálcio é
43
um dos maiores fatores de risco para compressão vertebral
Albumina
plasmática
Declínio relacionado à idade, sendo mais marcante na osteoporose primária tipo I
Sulfato dihidro-
epiandrosterona
sérica (DHAS)
Declínio relacionado à idade, sendo mais marcante na osteoporose primária tipo I
Espessura da pele
Pico de redução na osteoporose primária tipo I
Adaptado de Nordin et al. Bad habits and bad bones. In Nutritional Aspects of Osteoporosis. Challenges of Modern
Medicine, v. 7, p. 1-25, 1995
3.4.4 Fisiopatologia da osteoporose
A maior alteração patológica observada em grande parte dos casos de
osteoporose inclui o aumento de porosidade na cortical da diáfise e
afinamento das trabéculas ósseas. Essa alteração é controlada pela
remodelação óssea, sendo esta por sua vez realizada pelas BMUs. A
intensidade da perda óssea depende da relação entre formação e
reabsorção óssea, podendo ocorrer um aumento, concomitantemente, tanto
na formação quanto na reabsorção óssea, ou formação normal e
reabsorção óssea aumentada, ou reabsorção
normal e formação óssea diminuída (DEMPSTER et al., 1995; OTT, 1998;
ABE et al., 1999; HARADA & RODAN, 2003).
Os princípios da regeneração óssea fisiológica e do papel dos osteoblastos
e osteoclastos neste processo torna-se óbvio que a reposição dessas
células e o tempo decorrido para morte por apoptose são determinantes
críticos para o desenvolvimento de novas BMUs. No caso da patogênese
das várias formas de osteoporose a reposição ou não dessas células é um
problema fundamental para a remodelação que ocorre na osteoporose
(MANOLAGAS, 2000).
Segundo o mesmo autor, de acordo com a origem da perda óssea
ocorrem diferentes alterações celulares relacionadas principalmente com
osteoblastos, osteoclastos, osteócitos e em menor proporção com
adipócitos conforme
Quadro 4.
44
Quadro 4. Alterações celulares relacionadas às três causas mais comuns
de perda óssea.
OSTEOPOROSE
ALTERAÇÕES CELULARES
DEFICIÊNCIA DE ESTERÓIDES SEXUAIS
osteoblastogenese
osteoclastogenese
período de vida dos osteoclastos
período de vida dos osteoblastos
período de vida dos osteócitos
ENVELHECIMENTO
osteoblastogenese
osteoclastogenese
adipogenese
período de vida de osteócitos
EXCESSO DE GLICOCORTICÓIDES
osteoblastogenese
osteoclastogenese
adipogenese
período de vida de osteoclastos
período de vida de osteoblastos
período de vida de osteócitos
Adaptado de MANOLAGAS, S. C. Birth And Death Of Bone Cells: Basic Regulatory Mechanisms And Implications
For The Pathogenesis And Treatment Of Osteoporosis. Endocrine Reviews. v. 21, n.2,:p. 115–137, 2000.
3.4.4.1 - Fatores que afetam a atividade dos osteoclastos
A atividade dos osteoclastos pode ser aumentada pela deficiência de
estrógenos, corticosteróides (HULLEY et al., 2002; HARADA & RODAN,
2003), acidose e metabólitos de vitamina D. Já a atividade dos osteoclastos
é reduzida pela calcitonina e bifosfonatos (OTT, 1998).
3.4.4.2 - Fatores que afetam a atividade dos osteoblastos
45
Com o envelhecimento, os osteoblastos não conseguem completar os
espaços reabsorvidos, provavelmente pelo número insuficiente destes
(OTT, 1998). Estudos in vivo que foram conduzidos em ratos mostraram
que o tratamento diário com PTH aumenta o número de osteoblastos e sua
atividade, provavelmente sem estimular a proliferação de osteoblastos
(SATO et al., 2002). A atividade dos osteoblastos pode ser aumentada
também pelos fatores de crescimento como TGF- (fator de crescimento
transformante- ), e deprimida por corticosteróides, bilirrubina e intoxicações
com alumínio (OTT, 1998).
3.4.5 - Alterações plasmáticas e no tecido ósseo
A porção dos principais elementos estruturais do tecido ósseo, cálcio e
fosfato, que se encontra na parte trabecular dos ossos está em equilíbrio
dinâmico com aqueles dos fluidos corporais e outros tecidos do corpo. Nos
períodos de deficiência, o cálcio e o fosfato são mobilizados dos ossos para
manter os níveis normais no sangue e outros tecidos moles. Normalmente,
o plasma contém 9 a 11 mg/dl de cálcio para a maioria das espécies, sendo
que 45 a 50% está na forma ionizada e 40 a 45% está ligado às proteínas
plasmáticas, principalmente a albumina. Os 5% restantes estão
complexados com elementos não-ionizados, dependendo do pH do sangue.
A proporção plasmática de 1:1 ou 2:1 de cálcio e fósforo é indicada para
que ocorra uma boa absorção intestinal do cálcio, sendo que qualquer
desequilíbrio na homeostasia deste constituinte altera os níveis normais dos
hormônios calciotrópicos tendo como conseqüência direta sua mobilização
do tecido ósseo, considerando que a concentração óssea adequada destes
minerais é de 2:1 (SWENSON & REECE, 1993).
Em estudo experimental de deficiência de cálcio em vertebrados adultos,
não houve hipocalcemia significante, mas indução de reabsorção óssea
mediada por PTH. O organismo demonstra preferência na manutenção da
46
concentração de cálcio plasmático em relação a preservação da integridade
do esqueleto, presumivelmente para proteger o sistema neuromuscular e
outros processos dependentes de cálcio. Então, nos estados de deficiência
crônica de cálcio, o balanço negativo e a mobilização de cálcio do
esqueleto são continuas e desencadeiam mais cedo ou mais tarde a
condição de osteoporose, ou seja, redução da densidade óssea (NORDIN,
1996).
A matriz colagenosa é depositada pelos osteoblastos e na seqüência é
mineralizada. Se a mineralização for inibida, o indivíduo vai desenvolver
osteomalácia, que pode mimetizar a osteoporose, apresentando níveis
inadequados de cálcio ou fosfato. Sendo que o tratamento com bifosfonatos
pode induzir um aumento de mineralização resultando em um aumento da
densidade óssea, continuando o osso no entanto, poroso (OTT,1998).
3.4.6 - Alterações biomecânicas
3.4.6.1 - Estrutura óssea e resistência
O cálcio é um nutriente essencial que está envolvido na maioria dos
processos metabólicos e nos sais de fosfatos dos quais provém a rigidez
mecânica para os ossos e dentes, onde se deposita 99% do cálcio total. Os
efeitos da deficiência de cálcio e ovariectomia são aditivos. Em humanos, a
perda óssea começa na menopausa para mulheres e aproximadamente
aos 55 anos para os homens, sendo que no caso das mulheres as
alterações no metabolismo do cálcio são a causa ou o resultado da perda
óssea após a menopausa (NORDIN, 1997). Ainda com relação à
menopausa, no período inicial, ocorre um declínio exponencial de tecido
ósseo sendo que aproximadamente 20 a 30% é de osso trabecular e em
torno de 10% de osso cortical (RIGGS et al., 2002)
47
Na osteoporose secundária e primária do tipo II, nos homens, a depressão
na formação óssea é provavelmente um fator crítico. Considerando-se a
associação da má absorção de cálcio e/ou alta excreção deste na
osteoporose estabelecida, entende-se que um balanço negativo de cálcio é
no mínimo um fator contribuinte senão o fator fundamental para a maioria
das formas de osteoporose no homem (NORDIN, 1997).
A massa óssea é um dos fatores determinantes da resistência mecânica
óssea, embora justifique somente 30 a 40% da variabilidade desta
característica. Outros fatores estão envolvidos na determinação da
qualidade do tecido ósseo, sendo que dentre estes estão o grau de
mineralização, o turnover ósseo e a microarquitetura deste tecido. Por
exemplo, o volume de medula óssea tem influência inversamente
proporcional à conectividade trabecular, ou seja, quanto maior o volume
medular, menor a conectividade e conseqüentemente menor a resistência
deste tecido (CORTET & MARCHANDISE, 2001).
Em adição à porosidade, a resistência óssea é determinada pela
microestrutura trabecular. “Perfurações” de trabéculas individuais ocorrem
quando as cavidades reabsorvidas estão muito profundas, sendo este tipo
de alteração observada no caso de deficiência de estrógeno. As trabéculas
remanescentes não são bem conectadas às outras e são mecanicamente
frágeis. A restauração de microfraturas é outro aspecto de resistência
óssea que não é mensurado pela densidade óssea. As trabéculas ósseas
sofrem fraturas e são formados microcalos como aqueles vistos em
reparação de macrofraturas em ossos longos. O osso osteoporótico é mais
suscetível a esse tipo de fraturas porque as trabéculas, individualmente,
não têm conexões muito reforçadas. Esses calos que se formam após a
fratura representam um método de reparação óssea. Quando os ossos
perdem a capacidade de formar esses calos, se tornarão frágeis
(OTT, 1998).
48
3.5 - Modelos animais
A diretriz para avaliação pré-clínica e clínica de agentes usados na
prevenção ou no tratamento da osteoporose pós-menopausa proposta por
THOMPSON et al. (1995), recomenda modelos animais específicos para
avaliação dos novos agentes em potencial para terapêutica da
osteoporose. Considerando que estudos realizados reconhecem que não
há modelo
animal que imite precisamente as condições humanas de osteoporose
(THOMPSON et al., 1995; THORNDIKE & TURNER, 1998), uma condição
essencial é que os modelos animais escolhidos possam fornecer
informação sobre a qualidade e estrutura óssea que não seria obtida em
pacientes de triagem clínica. Os modelos animais de osteoporose são,
portanto, agentes imprescindíveis para se obter uma mensuração eficaz e
segura da qualidade óssea (THOMPSON et al., 1995).
O esqueleto do rato adulto tem muitas similaridades com o esqueleto
humano. Os ossos longos de ambas as espécies alongam pelo crescimento
epifiseal (ossificação endocondral) e aumentam sua seção transversal pelo
crescimento periosteal (ossificação intramembranosa secundária). Nos
ratos adultos, o crescimento radial ocorre em graus ínfimos e a ossificação
esponjosa secundária ocorre como remodelação seqüencial similar àquela
observada no tecido ósseo esponjoso em humanos (MARTIN et al., 2003).
Uma das grandes vantagens no uso de roedores para estudos genéticos
é a viabilidade dos ossos para mensuração direta de propriedades biomecânicas
incluindo resistência e fragilidade. Propriedades biomecânicas fundamentais
incluem força de fratura (mensuração de resistência), firmeza (inflexibilidade) e
trabalho para fratura (mensuração da fragilidade óssea). E os ratos, tanto
machos como fêmeas, têm sido utilizados como modelo padrão para o estudo
biomecânico do esqueleto (JÄMSÄ et al., 1998). As propriedades biomecânicas
podem ser avaliadas em vários locais incluindo diáfise, colo femoral e vértebra
(PEACOCK et al., 2002).
49
No caso da osteoporose pós-menopausa, o modelo animal mais utilizado
para estudar as conseqüências de perda óssea na estrutura e resistência
óssea ou para validar estratégias terapêuticas é o de rata ovariectomizada
(BAGI et al., 1997), existindo uma extensa literatura a respeito da fisiologia
e da biologia do esqueleto desta espécie (THOMPSON et al., 1995) e de
alterações histomorfométricas, marcadores bioquímicos, metodologia para
densitometria óssea, fragilidade óssea, entre outros (THORNDIKE &
TURNER, 1998).
WANG et al. (2001) sugerem utilizar ratos adultos intactos (não castrados)
para estudar a perda óssea relacionada com a idade no homem, porque o
homem não apresenta a perda abrupta de hormônios sexuais com o
envelhecimento, embora uma deficiência gonadal possa causar osteopenia
tanto em homens como em ratos.
Enfim, essa espécie é utilizada como modelo animal para doenças
humanas porque é fácil de obter, tem baixo custo e é apropriada para
o estudo da perda óssea devido ao curto período de vida
(WANG et al., 2001; MARTIN et al., 2003). Com relação ao uso do rato
como modelo animal para o estudo da perda óssea relacionada à idade no
homem a motivação é também devido ao extenso conhecimento que se
tem sobre os machos desta espécie (WANG et al., 2001).
Por outro lado, os ratos pertencem a uma espécie que apresenta pouca
similaridade com os humanos em relação à remodelação Haversiana, ou
seja, quando crescem em condições normais não apresentam remodelação
Haversiana secundária de osso cortical (SIETSEMA, 1995; ORTOFT &
OXLUND; 1996; MARTIN et al., 2003), mas pode se observar um aumento
na fragilidade dos ossos longos, após terapia com glicocorticóides, através
de testes biomecânicos (ORTOFT & OXLUND, 1996).
No caso de ratas ovariectomizadas e avaliadas após três meses de perda
óssea, quanto à porosidade cortical, não apresentam diferença significante
quando comparadas com as ratas inteiras ou não castradas (SIETSEMA,
50
1995). Como efeitos imediatos da ovariectomia no esqueleto das ratas, os
resultados dos estudos de THOMPSON et al. (1995), indicaram que o
modelo mimetiza a perda de tecido ósseo esponjoso que ocorre após a
menopausa. Estas observações mostraram que o turnover do tecido ósseo
esponjoso aumenta como conseqüência da ovariectomia e que este
aumento produz perda óssea. O estrógeno bloqueia o turnover e a perda
óssea. Então, esta avaliação sugere que o modelo de rata ovariectomizada
mimetiza as condições da tíbia proximal, fêmur distal e vértebra lombar na
mulher após a menopausa e é adequado para avaliação do potencial
terapêutico de agentes para a osteoporose.
Nas ratas castradas a tíbia proximal e a vértebra lombar, por exemplo,
respondem similarmente à deficiência de estrógeno como mensurado pela
perda de osso trabecular e resposta positiva ao tratamento com estrógeno.
É importante que a ovariectomia tenha sido realizada entre 6 meses
a 1 ano, porque após este período os efeitos do aumento do tamanho do
esqueleto nos ossos cortical e esponjoso começam a ficar obscuros
(THOMPSON et al.,1995). Os autores sugerem restringir os estudos de
indução de perda óssea e uso de agentes terapêuticos em modelos de
ratas por um período inferior a 6 meses após a ovariectomia (THOMPSON
et al., 1995; TANIZAWA et al., 2000).
Segundo estudo realizado por DEMPSTER et al. (1995), as ratas
apresentam um aumento no turnover ósseo após a ovariectomia que é
evidenciado pelo aumento de osteoclastos na superfície óssea (400%) e
pelo grau de formação óssea (270%). O decréscimo no volume de osso
esponjoso que ocorre na seqüência é tempo-dependente e altamente
relacionado à redução do número de lamelas trabeculares e parâmetros de
conectividade, mas não é relacionado com a espessura de placas
esponjosas remanescentes. Os resultados obtidos sugerem que a perda de
osso esponjoso devido à deficiência de estrógeno é o resultado do
decréscimo de conectividade, provavelmente
51
devido à “perfuração” das lamelas trabeculares realizada pelos
osteoclastos, seguida pela completa remoção da lamela sem um prévio
afinamento generalizado.
52
4- MATERIAL E MÉTODOS
Para realização do experimento foram utilizados 192 ratos (Rattus
norvegicus), adultos (96 machos e 96 fêmeas) oriundos do Biotério da
Universidade Federal de Viçosa (UFV). O experimento foi conduzido no
Laboratório Biofármacos/UFV em uma sala devidamente climatizada com
controle de temperatura (20 - 24°C), umidade relativa do ar (45 – 70%) e
fotoperíodo de 12 horas. Os animais permaneceram nesta sala durante
uma semana em ambientação.
4.1 - Distribuição dos Grupos
Os animais foram divididos em oito grupos, com 24 animais em cada
(Quadro 5):
53
Quadro 5. Distribuição dos grupos experimentais nas diferentes coletas.
Coleta
Animais
1ª
Coleta
(14 Dias)
2ª
Coleta
(28 Dias)
3ª
Coleta
(42 Dias)
4ª
Coleta
(56 Dias)
Total de
Animais/
Grupo
Grupo I
Machos controle
6
6
6
6
24
Grupo II
Machos castrados
6
6
6
6
24
Grupo III
Machos + glicocorticóide
6
6
6
6
24
Grupo IV
Machos castrados +
glicocorticóide
6
6
6
6
24
Grupo V
Fêmeas controle
6
6
6
6
24
Grupo VI
Fêmeas castradas
6
6
6
6
24
Grupo VII
Fêmeas + glicocorticóide
6
6
6
6
24
Grupo VIII
Fêmeas castradas +
glicocorticóide
6
6
6
6
24
Total de
Animais/Coleta
48
48
48
48
192
O experimento foi conduzido em gaiolas com seis ratos em cada. A
cama utilizada foi de maravalha estéril (autoclavada). As gaiolas foram
lavadas de 2 a 3 vezes por semana e a cama substituída. Os animais
receberam ração comercial (Labina-Purina) e água ad libitum.
54
4.2 - Procedimento cirúrgico
Uma semana após a chegada, os animais dos grupos II, IV, VI e VIII foram
submetidos à castração, a qual foi realizada sob anestesia geral com
tiletamina-zolazepam*
1
, na dose de 30 mg/kg de peso vivo, via
intramuscular.
Nas fêmeas, após a incisão retroumbilical da pele e subcutâneo, foi
incisada a linha alba, fazendo-se acesso à cavidade abdominal. Foram
realizadas duas ligaduras, uma em cada pedículo ovariano com fio de
*
1
ZOLETIL 50 – Virbac
algodão nº 10-0 e estes foram seccionados. Foram realizadas duas linhas
de sutura com fio não absorvível (nylon nº 0,25) peritônio e musculatura;
tecido subcutâneo e pele.
Nos machos, o testículo foi empurrado até a incisão cutânea escrotal e, em
seguida efetuou-se a incisão da fáscia espermática e ligamento escrotal
para exteriorizá-lo e liberá-lo de suas inserções escrotais. O cordão
espermático foi mantido intacto e as túnicas vaginais receberam dupla
ligadura. O cordão espermático foi transeccionado e retornado à região
inguinal. Realizou-se o mesmo procedimento no outro testículo. A sutura da
pele e tecido subcutâneo foi realizada com fio não absorvível (nylon nº
0,25).
Imediatamente após o ato cirúrgico, todos os animais receberam
antibiótico*
2
na dosagem de 5g/kg por via intramuscular, que foi repetida
por mais dois dias consecutivos.
4.3 - Administração de Glicocorticóide
Aos 15 dias após o procedimento cirúrgico os animais dos grupos IV e VIII
receberam uma dose de 7 mg/kg de dexametazona*
3
por semana, via
55
intramuscular, durante quatro semanas. Os animais dos grupos III e VII
também receberam o mesmo tratamento.
4.4 - Coleta de Material para Análises
As coletas foram realizadas em todos os grupos aos 14, 28, 42 e 56 dias
após o início da administração do glicocorticóide.
Após a coleta do sangue os animais foram sacrificados por inalação
com éter etílico. Em seguida realizou-se a necropsia e as tíbias esquerdas,
úmeros direitos e as vértebras lombares L5 foram coletados.
*
2
Oxitrat-La - Vallée
*
3
Azium - Schering-Plough
4.4.1 - Bioquímica do Plasma
Os animais foram sedados por inalação com éter etílico para coleta
de sangue que foi realizada com seringa de 5 ml, agulha nº 25x7, sendo o
material acondicionado em tubos de ensaio estéreis contendo heparina
sódica*
4
. Logo a seguir as amostras foram centrifugadas a 7.100 xg por 15
minutos a temperatura ambiente. O plasma foi recolhido e mantido em
geladeira a 6
0
C.
Para determinar as concentrações plasmáticas de cálcio, fósforo e
proteínas totais foi usado um analisador multiparamétrico de bioquímica*
5
,
além de kits específicos*
6
.
4.4.3 - Bioquímica Óssea
Os ossos coletados foram desengordurados*
7
utilizando-se o éter etílico
como solvente. Após a retirada da gordura, os ossos foram mantidos em
56
dessecador com sílica até o momento da análise do cálcio, fósforo e
magnésio.
Os úmeros depositados individualmente em cadinhos de porcelana foram
calcinados em mufla a uma temperatura de 600°C durante quatro horas e
conservados em dessecador por uma hora. A dissociação dos minerais dos
ossos foi obtida com ácido clorídrico 1:1 em chapa de aquecimento (banho
de areia), e essa solução foi diluída em água destilada e desionizada até
completar um volume de 100ml.
A análise quantitativa do cálcio e magnésio foi realizada em
espectrofotômetro de absorção atômica por chama*
8
e para análise do
fósforo um espectrofotômetro de calorimetria/fotometria*
9
.
*
4
Liquemine - Roche
*
5
Alizé – modelo Lisabio nº b-652
*
6
Biomerieux
*
7
aparelho Marconi – modelo MA 490
*
8
modelo GBC AVANTA
*
9
modelo U-2000
4.4.4 - Teste Biomecânico
As análises foram realizadas nas tíbias esquerdas e vértebras L5 em
laboratório climatizado (umidade: 50% 2%; temperatura: 23°C 1 °C)
com equipamento do tipo Instron*
10
, sendo que a velocidade de teste foi de
25 mm/min e capacidade da célula de carga de 100 Kgf.
Para os testes de flexão, as tíbias foram apoiadas em um suporte com
30 mm de distância entre seus dois pontos de apoio e flexionados com
aplicação de força ao centro. Neste teste foram analisadas: força máxima
no ponto de ruptura, deformação máxima no ponto de ruptura, força no
limite de proporcionalidade, deformação no limite de proporcionalidade,
57
tenacidade, resiliência e rigidez. Na Figura 1 observam-se os parâmetros
analisados de acordo com a deformação à qual o osso é submetido em
função da força aplicada.
Figura 1. Exemplo das relações de Força X Deformação produzidas nas
tíbias esquerdas e vértebras L5 nos testes de flexão e compressão.
Para um melhor entendimento dos testes biomecânicos, foram definidos
abaixo os termos utilizados para os parâmetros avaliados nestes testes.
A força até ponto de ruptura é aquela necessária para alcançar a
resistência final do osso expressa em Newton ou um de seus múltiplos. A
*
10
modelo 4204
deformação até o ponto de ruptura é a relação entre o tamanho inicial do osso e o
alongamento máximo observado neste até a falência óssea quando submetido ao
teste força aplicada.
O limite de proporcionalidade expressa a partir de que momento o osso
começa a se danificar de modo irreversível em relação à força aplicada versus
deformação.
Tenacidade é uma medida que expressa a capacidade do osso em
absorver energia sob condições de aplicação de carga até sua ruptura.
Resiliência é a capacidade do osso em absorver energia de forma elástica,
permitindo-o retornar a sua forma anterior após a retirada da carga.
DEFORMAÇÃO
F
O
R
Ç
A
LIMITE DE
PROPORCIONALIDADE
(ELASTICIDADE)
PONTO DE
RUPTURA
58
A rigidez expressa a habilidade do osso em resistir a deformações em
função das tensões aplicadas.
As vértebras lombares foram polidas com lixa nº P150 nas extremidades
cranial e caudal para se obter estabilidade quanto ao seu posicionamento
no aparelho, os processos transversos e espinhosos foram retirados para
que não oferecessem resistência no momento do teste. As propriedades
mecânicas analisadas na compressão das vértebras foram: força máxima
até o ponto de ruptura, deformação máxima até o ponto de ruptura,
compressão, força até o limite de proporcionalidade, contração até o limite
de proporcionalidade e resiliência. Sendo que a compressão é a força
exercida em kN/m sobre o diâmetro do corpo vertebral até o momento de
fratura.
4.5 - Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Sistema de
Análises Estatísticas (SAEG/UFV). As médias obtidas foram submetidas à
Análise de Variância (ANOVA) e a significância das médias pelo teste F.
Para a comparação de médias entre tratamentos e entre tratamento e
períodos de coleta usou-se o teste Newman Keuls, com probabilidade de
erro de 5%.
59
5- RESULTADOS
5.1 Análise Quantitativa de Cálcio, Fósforo e Proteínas Totais no
Plasma
A análise de variância das médias de concentração do cálcio plasmático
não foram estatisticamente significativas nos grupos I, II, III e IV para
tratamentos e períodos de coleta (Tabela 1).
Na comparação de médias de fósforo plasmático obteve-se significância
estatística para tratamentos e períodos de coleta para os grupos II e III
(Tabela 1, Gráfico 1).
Os grupos I, II, III e IV apresentaram na concentração de proteínas
plasmáticas médias significativas entre tratamentos. Sendo que o grupo II
apresentou a maior média e comportamento diferente dos outros grupos.
Os grupos IV, III e I tiveram o mesmo comportamento e médias
semelhantes para esta análise (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1. Concentrações plasmáticas de cálcio, fósforo e proteínas totais
nos grupos de machos I, II, III e IV.
CÁLCIO (mg/dL)
ns
FÓSFORO (mg/dL) *
1
PROTEÍNAS TOTAIS (g/L)*
2
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
11,88
11,24
12,49
12,38
7,71
8,13
17,80
8,28
63,50
68,73
63,90
65,38
28
12,14
11,13
11,40
11,93
7,44
19,56
17,21
9,34
68,36
68,80
68,45
66,11
42
11,51
12,40
11,96
12,90
6,77
5,52
5,90
6,07
68,16
75,58
67,80
71,90
56
12,18
12,40
12,63
12,53
6,05
4,98
5,44
6,19
68,38
71,90
69,88
69,25
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
60
ns: não significativo
a. b.
y
II
= 0.4550+0.9011x-0.01526x
2
R
2
II
= 0.4547 y
III
= 23.686-0.3455x R
2
III
= 0.8340
Gráfico 1. Concentrações plasmáticas médias de fósforo nas diferentes
coletas dos grupos de machos II (a) e III (b).
Tabela 2. Comparação de médias entre tratamentos de proteínas
plasmáticas dos grupos I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (g/L)
II
71.25
A
IV
68.16
B
III
67.50
B
I
67.10
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
As médias de concentração de cálcio plasmático obtidas dos grupos V, VI,
VII e VIII e submetidas a análise de variância foram significativas
estatisticamente entre períodos de coleta (Tabela 3, Gráfico 2).
Os grupos VI, VII e VIII apresentaram concentração de fósforo com
significância estatística na comparação de médias entre tratamentos e
períodos de coleta (Tabela 3, Gráfico 3). Os grupos V e VII tiveram
resultados estatisticamente significativos para proteínas plasmáticas
(Tabela 3,
Gráfico 4).
dias
dias
Fósforo Plasmático (mg/dL)
Fósforo Plasmático (mg/dL)
61
Tabela 3. Concentrações plasmáticas médias de cálcio, fósforo e proteínas
totais nos grupos de fêmeas V, VI, VII, VIII.
CÁLCIO (mg/dL)
ns
FÓSFORO (mg/dL)*
1
PROTEÍNAS TOTAIS (g/L)*
2
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETAS
(dias)
14
12,40
12,60
12,60
13,13
7,70
11,92
6,87
12,61
63,54
61,18
68,45
63,70
28
12,35
12,37
12,00
11,80
7,77
8,29
5,54
5,12
72,70
66,56
62,45
64,20
42
11,45
11,80
12,53
12,50
6,96
6,34
12,66
11,73
65,16
65,12
71,10
70,98
56
11,33
11,88
12,25
11,29
9,91
6,08
7,13
7,11
76,05
67,46
72,11
67,45
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
y= 12.903-0.0217x R
2
= 0.9195
Gráfico 2. Concentrações plasmáticas médias de cálcio nos grupos de
fêmeas V, VI, VII e VIII.
a. b.
dias
Cálcio Plasmático (mg/dl)
Fósforo Plasmático (mg/dL)
Fósforo Plasmático (mg/dL)
dias
dias
62
y
VI
=13.02-0.1389x R
2
VI
=0.8697 y
VII
= 0.8279+0.4314x-0.00535x
2
R
2
VII
= 0.2529
y
VIII
=11.6191-0.0706x R
2
VIII
= 0.1253
Gráfico 3. Concentrações plasmáticas médias de fósforo nos grupos de
fêmeas VI (a), VII (b) e VIII (a).
y
V
=61.8650+0.2142x R
2
V
= 0.4190
y
VII
= 63.6167+0.1403x R
2
VII
= 0.3420
Gráfico 4. Concentrações médias de proteínas plasmáticas nos grupos de
fêmeas V e VII.
5.2 Análise Quantitativa de Cálcio, Fósforo e Magnésio no Osso
Os resultados obtidos da concentração de fósforo no osso foram
significativos estatisticamente entre períodos de coleta para os grupos I, II,
III e IV (Tabela 4, Gráfico 5).
A concentração de cálcio no úmero segundo teste de análise de variância
(ANOVA) não foi estatisticamente significativa com relação aos diferentes
tratamentos e períodos de coleta nos grupos I, II, III e IV (Tabela 4).
Na comparação de médias entre tratamentos para concentração de
magnésio no osso, o grupo I apresentou a maior média e comportamento
diferente dos outros grupos. Os grupos II, III e IV obtiveram médias muito
próximas e comportamento semelhante com relação a concentração de
magnésio no úmero (Tabelas 4 e 5).
dias
Proteína Plasmática (g/L)
63
Tabela 4. Concentração média de fósforo, cálcio e magnésio do úmero nos
grupos de machos I, II, III e IV.
FÓSFORO (g/kg)
ns
CÁLCIO (g/kg)
ns
MAGNÉSIO (g/kg)*
2
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
84,0
85,6
66,0
73,1
192,9
191,8
181,6
176,2
3,9
3,4
3,2
2,8
28
94,7
88,7
83,6
90,8
196,0
182,3
179,2
180,4
3,5
3,2
3,0
3,0
42
115,9
108,0
115,4
116,8
179,9
169,0
176,5
172,1
3,4
2,9
3,0
2,9
56
136,9
129,2
114,4
123,7
197,9
187,9
161,6
192,9
3,9
3,3
2,9
3,3
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
y= 5.8901+0.1223x R
2
= 0.9795
Gráfico 5. Concentração média de fósforo no úmero nos grupos de machos
I, II, III e IV.
Tabela 5. Comparação de médias entre tratamentos de magnésio no osso
dos grupos I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (g/kg)
I
0.37
A
II
0.32
B
III
0.30
B
IV
0.30
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
dias
Fósforo (g/kg)
64
A concentração de fósforo no osso foi significativa estatisticamente na
comparação entre tratamentos, onde observou-se que o grupo VII teve
comportamento diferente dos outros grupos e a maior concentração de
fósforo no úmero. Os grupos VI, V e VIII obtiveram médias próximas e
mesmo comportamento para esta análise (Tabelas 6 e 7).
Na comparação da concentração de cálcio no osso entre tratamentos, o
grupo V apresentou a maior média e comportamento diferente dos outros
grupos. Os grupos VII, VI e VIII tiveram médias próximas e mesmo
comportamento com relação a concentração de cálcio no úmero (Tabelas 6
e 8).
A concentração de magnésio no úmero foi significativa estatisticamente
entre tratamentos e períodos de coleta para os grupos V e VIII (Tabela 6,
Gráfico 6).
Tabela 6. Concentração média de fósforo, cálcio e magnésio do úmero nos
grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII.
FÓSFORO (g/kg)*
2
CÁLCIO (g/kg )*
1
*
2
MAGNÉSIO (g/kg )*
1
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETAS
(dias)
14
70,0
75,9
85,2
86,9
184,3
163,3
185,7
185,3
3,3
3,0
3,4
3,1
28
96,0
100,6
99,7
91,2
194,5
203,3
199,6
186,9
3,4
3,7
3,4
3,9
42
130,2
130,2
135,1
126,0
175,6
177,2
181,6
167,6
3,3
3,2
3,2
3,1
56
135,6
133,5
140,2
128,8
235,8
191,2
185,1
171,5
4,0
3,2
3,4
2,9
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
Tabela 7. Comparação de médias de fósforo entre tratamentos no úmero
dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (g/kg)
VII
11.50
A
VI
10.95
B
V
10.89
B
65
VIII
10.82
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
Tabela 8. Comparação de médias de cálcio entre tratamentos no úmero dos
grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (g/kg)
VII
19.75
A
VI
18.80
B
V
18.38
B
VIII
17.78
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
a. b.
y
V
= 0.3033+0.001528x R
2
V
=0.6225 y
VIII
= 0.2428+0.00781x-0.000126x
2
R
2
VIII
= 0.6120
Gráfico 6. Concentração média magnésio no úmero nos grupos de
fêmeas V (a) e VIII (b).
dias
dias
Magnésio (g/kg)
Magnésio (g/kg)
66
5.3 Ensaios Mecânicos
5.3.1 Ensaio Mecânico de Flexão
No ensaio mecânico de flexão realizado em tíbias se observa e comparam
os valores das propriedades mecânicas dos ossos dos diferentes grupos
experimentais.
Os testes biomecânicos para se obter a força máxima até o ponto de
ruptura demonstraram que na comparação entre tratamentos e períodos de
coleta o grupo I apresentou maior resistência para que ocorresse a fratura,
ou seja, precisou se aplicar mais força para que o osso se rompesse.
Enquanto que, o grupo II apresentou-se mais frágil. E o grupo IV
apresentou média inferior a todos os outros grupos. O grupo III não
apresentou resultados significativos (Tabela 9, Gráfico 7). Nos testes de
deformação máxima até o ponto de ruptura as comparações das médias
entre tratamentos e períodos de coleta foram estatisticamente significativas
para os grupos I, II e IV (Tabela 9,
Gráfico 8).
Tabela 9. Médias da força (FMPR) e deformação (DMPR) máximas até o
ponto de ruptura obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I, II, III e
IV.
67
FMPR (N) *
1
*
2
DMPR (mm) *
1
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
59,04
59,73
52,18
54,25
0,99
0,83
1,11
0,82
28
62,93
50,62
52,93
39,83
1,26
1,52
1,30
1,48
42
75,78
58,94
58,76
46,17
1,33
1,01
1,06
0,95
56
68,69
62,60
57,39
46,31
1,37
1,23
1,45
1,00
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
a. b.
y
I
= 56.1648+0.2985x R
2
I
=0.5484 y
II
=69.707-1.019x+0.0162x
2
R
2
II
=0.6931
y
IV
=69.2037-1.4243x+0.0185x
2
R
2
IV
=0.6522
Gráfico 7. Médias de força máxima até o ponto de ruptura (FMPR) obtidas
por flexão em tíbia nos grupos de machos I (a), II e IV (b).
FMPR (N)
FMPR (N)
dias
dias
68
a. b.
y
I
=0.9377+0.00863x R
2
I
=0.8320 y
II
=0.3777+0.04784x-0.000613x
2
R
2
II
=0.3047
y
IV
=0.2971+0.0548x-0.00078x
2
R
2
IV
=0.3673
Gráfico 8. Médias de deformação máxima até o ponto de ruptura (DMPR)
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I (a), II e IV (b).
Nos testes de força até o limite de proporcionalidade, as comparações entre
tratamentos e períodos de coleta demonstraram que o grupo I necessita de
maior força aplicada para que haja algum dano ao osso. Na seqüência o
grupo II que teve média inferior ao grupo citado. Sendo que a média do
grupo IV foi inferior a dos outros grupos e o grupo III não teve resultado
significativo estatisticamente (Tabela 10, Gráfico 9). Os grupos I e IV
apresentaram médias de deformação até o limite de proporcionalidade
estatisticamente significativas entre tratamentos e períodos de coleta
(Tabela 10, Gráfico 10).
Tabela 10. Médias da força (FLP) e deformação (DLP) até o limite
de proporcionalidade obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I, II,
III e IV.
FLP (N) *
1
*
2
DLP (mm) *
1
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
42,02
47,88
38,84
45,67
0,56
0,55
0,68
0,55
28
42,07
34,13
38,34
28,32
0,65
0,78
0,64
0,84
42
52,77
42,51
41,20
31,45
0,61
0,60
0,54
0,67
56
50,21
44,97
36,16
28,87
0,79
0,67
0,68
0,46
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
DMPR (mm)
DMPR (mm)
dias
dias
69
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
a. b.
y
I
=37.9540+0.2519x R
2
I
=0.6722 y
II
=62.731-1.4501x+0.0206x
2
R
2
II
=0.6255
y
IV
=45.3981-0.3376x R
2
IV
=0.5573
Gráfico 9. Médias de força até o limite de proporcionalidade (FLP) obtidas
por flexão em tíbia nos grupos de machos I (a),II (b) e IV (a).
a. b.
y
I
=0.4980+0.00458x R
2
I
=0.6927 y
IV
=0.1647+0.0405x-0.00062x
2
R
2
IV
=0.8945
Gráfico 10. Médias de deformação até o limite de proporcionalidade (DLP)
obtidas por flexão em tíbia nos grupos de machos I (a) e IV(b).
FLP (N)
FLP (N)
dias
dias
DLP (mm)
DLP (mm)
dias
dias
4
70
Nos testes de tenacidade, as comparações entre tratamentos indicaram
que o grupo I apresentou maior habilidade em absorver energia sob
condições de aplicação de carga e trabalho realizado pelo mesmo ao ser
submetido a variações crescentes de carga até o ponto de ruptura. Os
grupos III e II, que tiveram comportamentos semelhantes, tiveram médias
inferiores ao grupo I. E o grupo IV obteve a menor média de tenacidade
(Tabelas 11 e 12).
No caso dos testes de resiliência, a comparação das médias entre
tratamentos indicou que os grupos I, II, III e IV possuem capacidades
distintas de absorver energia de forma elástica, ou de permitir que o osso
retorne a sua forma anterior após a retirada da carga aplicada. Sendo que o
grupo I obteve a maior média de resiliência seguido pelos grupos II, III e IV
respectivamente (Tabelas 11 e 13). Na comparação entre tratamentos e
períodos de coleta houve interação entre os grupos I e IV (Gráfico 11).
As comparações das médias entre tratamentos nos testes de rigidez
demonstraram que os grupos I e II, que apresentaram comportamentos
semelhantes, possuem maior habilidade em resistir a deformações em
função das tensões aplicadas. Enquanto que, o grupo III apresentou média
inferior e comportamento distinto dos grupos citados. E a menor média foi
observada no grupo IV (Tabelas 11 e 14). Com relação a comparação entre
tratamentos e períodos de coleta, os grupos I e IV apresentaram resultados
significativos estatisticamente (Gráfico 12).
Tabela 11. Médias de tenacidade, resiliência e rigidez obtidas por flexão em
tíbia nos grupos de machos I, II, III e IV.
TENACIDADE (Jx10
-3
) *
2
RESILIÊNCIA (Jx10
-3
) *
1
*
2
RIGIDEZ (10
3
N/m) *
1
*
2
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
33
29
34
27
12
13
13
12
74,69
86,55
57,07
82,03
28
49
46
46
35
13
14
12
12
64,58
48,51
68,92
34,89
42
64
34
39
25
16
12
11
10
86,49
71,08
76,27
47,55
56
56
45
50
28
20
14
12
6
63,73
73,84
53,31
62,68
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
71
Tabela 12. Comparação de médias de tenacidade entre tratamentos dos
grupos I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (Jx10
-3
)
I
50.5
A
III
42.2
B
II
38.5
B
IV
28.7
C
A, B e C: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
Tabela 13. Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (Jx10
-3
)
I
15.25
A
II
13.25
AB
III
12.00
BC
IV
10.00
C
A, B e C: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
y
I
=0.00889+0.00019x R
2
I
=0.9667
Gráfico 11. Comparação de médias de resiliência entre tratamentos e
períodos de coleta dos grupos I e IV.
Tabela 14. Comparação de médias de rigidez entre tratamentos dos grupos
I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (10
3
N/m)
dias
Resiliência (J x 10 )
-3
72
I
72.37
A
II
69.99
A
III
63.89
AB
IV
56.78
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
y
II
=124893-3754.4x+52.0478x
2
R
2
II
=0.5698
y
IV
=145983-5884.2x+7904268x
2
R
2
IV
=0.8670
Gráfico 12. Comparação de médias de rigidez entre tratamentos e períodos
de coleta dos grupos II e IV.
Os testes biomecânicos medindo força máxima até o ponto de ruptura
constataram na comparação entre tratamentos que os grupos V e VI, que
tiveram comportamentos semelhantes, apresentaram maior resistência para
que ocorresse a fratura, ou seja, precisou se aplicar mais força para que o
osso se rompesse. Enquanto que, o grupo VIII teve média inferior aos
grupos VI e V e o grupo VII a menor média de todos os grupos (Tabelas 15
e 16).
Com relação a deformação máxima até o ponto de ruptura os resultados
não foram estatisticamente significativos para os grupos V, VI, VII e VIII
(Tabela 15).
Tabela 15. Médias de força (FMPR) e deformação (DMPR) máximas até o
ponto de ruptura obtidas por flexão em tíbia nos grupos de fêmeas V, VI, VII
e VIII.
FMPR (N) *
1
*
2
DMPR (mm) *
1
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
Rigidez (10 N/m)
4
dias
73
COLETAS
(dias)
14
48,90
46,38
42,59
44,66
1,08
1,11
1,03
1,20
28
43,08
64,70
36,65
44,76
1,32
1,07
1,18
1,16
42
60,48
56,79
39,19
44,71
0,78
1,25
1,10
1,41
56
54,91
44,30
43,60
45,47
1,13
1,11
1,29
1,20
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
Tabela 16. Comparação de médias de força máxima até o ponto de ruptura
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (N)
VI
53.04
A
V
51.84
A
VIII
44.90
B
VII
40.51
C
A, B e C: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
Com relação aos testes de força até o limite de proporcionalidade, as
comparações entre tratamentos demonstraram que os grupos V e VI, que
tiveram médias semelhantes, necessitam de maior força aplicada para que
haja algum dano ao osso. Na seqüência o grupo VIII com média inferior aos
grupos citados. Sendo que o grupo VII teve a menor média em relação aos
outros grupos (Tabelas 17 e 18). O grupo VIII apresentou a maior
deformação em função da força recebida até o limite de proporcionalidade,
ou seja, sofreu maior flexão sem que houvesse dano irreversível ao osso.
Os grupos V, VI e VII apresentaram médias semelhantes de deformação
até o limite de proporcionalidade e inferiores ao grupo VIII (Tabelas 17 e
19).
Tabela 17. Médias de força (FLP) e deformação (DLP) até o limite de
proporcionalidade obtidas por flexão em tíbia nos grupos de fêmeas V, VI,
VII e VIII.
FLP (N) *
1
*
2
DLP (mm) *
1
*
2
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETAS
(dias)
14
34,80
35,69
32,06
35,29
0,61
0,67
0,63
0,82
28
32,82
45,85
26,87
33,20
0,80
0,64
0,72
0,72
74
42
44,94
32,16
27,51
35,20
0,48
0,53
0,57
0,80
56
39,53
32,79
29,44
28,01
0,63
0,69
0,67
0,56
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
Tabela 18. Comparação de médias de força até limite de proporcionalidade
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (N)
V
38.02
A
VI
36.62
A
VIII
32.93
B
VII
28.97
C
A, B e C: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
Tabela 19. Comparação de médias de deformação até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (mm)
VIII
0.73
A
VII
0.65
B
VI
0.63
B
V
0.63
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
Os testes de tenacidade, que indicam a habilidade do osso em absorver
energia sob condições de aplicação de carga e trabalho realizado pelo
mesmo ao ser submetido a variações crescentes de carga até o ponto de
ruptura, não foram estatisticamente significativos tanto nas comparações
entre tratamentos quanto nas comparações entre tratamentos e períodos
de coleta para os grupos V, VI, VII e VIII (Tabela 20).
No caso dos testes de resiliência, a comparação das médias entre
tratamentos indicou que os grupos V, VI, VII e VIII possuem capacidade
semelhante de absorver energia de forma elástica, permitindo que o osso
retorne a sua forma anterior após a retirada da carga (Tabelas 20 e 21).
As comparações das médias entre tratamentos nos testes de rigidez
demonstraram que os grupos V e VI, que apresentaram comportamentos
75
semelhantes, possuem maior habilidade em resistir a deformações em
função das tensões aplicadas. Enquanto que, os grupos VII e VIII tiveram
médias similares e inferiores aos grupos V e VI (Tabelas 20 e 22).
Tabela 20. Médias de tenacidade, resiliência e rigidez obtidas por flexão em
tíbia nos grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII.
TENACIDADE (Jx10
-3
) *
1
RESILIÊNCIA (Jx10
-3
) *
1
*
2
RIGIDEZ (10
3
N/m) *
1
*
2
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETA
(dias)
14
30
30
26
28
10
12
10
14
57,15
50,70
50,70
43,53
28
33
39
24
29
13
15
09
11
41,10
73,42
37,56
47,50
42
25
43
26
41
10
08
07
14
94,92
62,78
49,33
43,63
56
38
28
32
31
12
11
10
08
65,80
48,28
43,79
49,34
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos
ns: não significativo
Tabela 21. Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (Jx10
-3
)
VIII
11.75
A
VI
11.50
A
V
11.25
A
VII
09.00
A
A: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
Tabela 22. Comparação de médias de rigidez entre tratamentos dos grupos
V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (10
3
N/m)
V
64.74
A
VI
58.79
A
VIII
46.00
B
76
VII
45.34
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<5)
5.3.2 Ensaio Mecânico de Compressão
O ensaio mecânico de compressão realizado em vértebras L5 permite a
comparação dos valores obtidos das propriedades mecânicas com relação
à resistência dos ossos nos diferentes grupos experimentais.
Nos testes para avaliar a força máxima aplicada até o ponto de ruptura, os
resultados não foram estatisticamente significativos para os grupos I, II, III
e IV (Tabela 23).
Os testes biomecânicos medindo deformação máxima até o ponto de
ruptura constataram na comparação entre tratamentos que o grupo II
necessitou de maior compressão para que ocorresse a fratura, ou seja,
precisou se
aplicar mais força para que o osso se rompesse. Enquanto que os grupos
I, III e IV tiveram médias similares e inferiores ao grupo II (Tabelas 27 e 28).
Tabela 23. Médias de força (FMPR) e deformação (DMPR) máximas até o
ponto de ruptura obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de
machos I, II, III e IV.
FMPR (N)
ns
DMPR (mm) *
1
*
2
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
100,31
140,86
140,35
130,47
0,84
1,44
0,68
0,70
28
198,02
189,10
218,18
162,27
0,69
0,86
0,66
0,48
42
131,20
164,16
153,52
155,74
0,55
0,54
0,54
0,67
56
187,15
150,52
140,53
135,74
0,89
0,83
0,58
0,49
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta (p<0,05)
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos (p<0,05)
ns: não significativo
Tabela 24. Comparação de médias de deformação máxima até o ponto de
ruptura entre tratamentos dos grupos I, II, III e IV.
77
GRUPOS
MÉDIAS (mm)
II
0.92
A
I
0.74
B
III
0.61
B
IV
0.59
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
Com relação aos testes de força até o limite de proporcionalidade, as
comparações entre períodos de coleta das médias dos grupos I, II, III e IV
foram estatisticamente significativas (Tabela 25, Gráfico 13). Na
comparação de médias entre tratamentos referente a contração até o limite
de proporcionalidade, o grupo II apresentou a maior deformação em função
da força recebida até o limite de proporcionalidade, ou seja, sofreu maior
contração sem que houvesse dano irreversível ao osso. Os grupos I, III e
IV, apresentaram comportamentos diferentes de deformação até o limite de
proporcionalidade com médias inferiores ao grupo II respectivamente
(Tabelas 25 e 26). Com relação a comparação entre tratamentos e períodos
de coleta houve comportamento significativo entre os grupos I, II e III
(Gráfico 14).
Tabela 25. Médias de força (FLP) e contração (CLP) até o limite de
proporcionalidade obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de
machos I, II, III e IV.
FLP (N)
ns
CLP (%)*
1
*
2
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETAS
(dias)
14
63,99
102,25
111,18
80,20
2,83
6,02
3,61
2,37
28
157,20
131,57
150,69
116,23
3,34
3,65
2,55
2,31
42
85,69
115,91
124,46
98,57
2,05
2,21
2,61
2,19
56
153,33
108,02
74,80
90,56
4,11
2,36
1,51
1,86
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta (p<0,05)
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos (p<0,05)
ns: não significativo
78
y= 44.27+4.511x-0.0625x
2
R
2
= 0.480
Gráfico 13. Comparação das médias de força até o limite de
proporcionalidade (FLP) entre períodos de coleta dos grupos I, II, III e IV.
Tabela 26. Comparação de médias de contração até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (%)
II
3.56
A
I
3.08
AB
III
2.57
BC
IV
2.18
C
A, B e C: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
a. b.
y
I
=4.3734-0.1193x+0.000196x
2
R
2
I
=0.408 y
II
=6.6670-0.08867x R
2
II
=0.828
y
III
=4.1280-0.04443x R
2
III
= 0.879
Gráfico 14. Comparação das médias de contração até o limite de
proporcionalidade (CLP) entre períodos de coleta dos grupos I, II e III.
FLP (N)
dias
CLP (%)
Compressão (kN/m)
dias
dias
79
Os resultados obtidos pelo teste de compressão foram estatisticamente
significativos entre períodos de coleta segundo a análise de variância
(ANOVA) para os grupos I, II, III e IV (Tabela 27, Gráfico 15).
No caso dos testes de resiliência, a comparação das médias entre
tratamentos indicou que os grupos I e II, que apresentaram médias
similares, possuem capacidade semelhante de absorver energia de forma
elástica, permitindo que o osso retorne a sua forma anterior após a retirada
da carga. Enquanto que o grupo III apresentou média inferior aos grupos
citados. E o grupo IV obteve a menor média de resiliência (Tabelas 27 e
28).
Tabela 27. Médias de compressão e resiliência obtidas por compressão em
vértebras L5 nos grupos de machos I, II, III e IV.
COMPRESSÃO (kN/m)
ns
RESILIÊNCIA (10
-6
J) *
1
*
2
GRUPOS
I
II
III
IV
I
II
III
IV
COLETA
(dias)
14
0,66
0,92
0,92
0,85
16,9
40,0
22,8
16,6
28
1,29
1,24
1,43
1,06
23,4
26,7
16,9
13,8
42
0,86
1,07
1,00
1,02
15,7
15,5
18,3
15,4
56
1,22
0,98
0,92
0,89
32,9
15,7
11,0
13,7
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta (p<0,05)
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos (p<0,05)
ns: não significativo
y =4.373-0.119x+0.00196x
2
R
2
= 0.408
Gráfico 15. Médias de compressão obtidas em vértebras L5 nos grupos de
machos I, II, III e IV.
Compressão (kN/m)
dias
80
Tabela 28. Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos I, II, III e IV.
GRUPOS
MÉDIAS (10
-6
J)
II
24.47
A
I
22.22
A
III
17.25
AB
IV
14.87
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
Nos testes para avaliar a força máxima aplicada até o ponto de ruptura, as
comparações entre tratamentos demonstraram comportamento similar nos
grupos V, VI e VII. Sendo que o grupo VIII obteve a menor média e
comportamento distinto dos outros grupos (Tabelas 29 e 30).
Os resultados dos testes de deformação máxima até o ponto de ruptura não
apresentaram significância estatística para os grupos V, VI, VII e VIII
(Tabela 29).
Tabela 29. Médias de força (FMPR) e deformação (DMPR) máximas até o
ponto de ruptura obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de
fêmeas V, VI, VII e VIII.
FMPR (N) *
2
DMPR (mm)
ns
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETAS
(dias)
14
136,60
84,70
146,88
117,35
0,50
0,72
0,39
0,71
28
174,28
199,08
179,60
156,36
0,57
0,69
0,55
0,64
42
181,46
176,67
174,98
129,27
0,73
0,57
0,60
0,58
56
180,56
167,12
165,31
128,26
0,66
0,59
0,58
0,54
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta (p<0,05)
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos (p<0,05)
ns: não significativo
81
Tabela 30. Comparação de médias de força máxima até o ponto de ruptura
entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (N)
V
168.22
A
VII
166.69
A
VI
156.89
A
VIII
132.81
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
Com relação aos testes de força até o limite de proporcionalidade, as
comparações de médias entre tratamentos dos grupos V, VI e VII
apresentaram-se de maneira similar indicando que estes grupos resistem a
aproximadamente mesma força de compressão sem que ocorra dano ao
osso. E o grupo VIII teve um comportamento diferente apresentando a
menor média para este teste (Tabelas 31 e 32).
Na comparação de médias entre tratamentos referente a contração até o
limite de proporcionalidade, os grupos VI e V, que tiveram comportamentos
similares, apresentaram maior deformação em função da força aplicada
sobre estes, ou seja, sofreram maior contração antes que houvesse dano
irreversível ao osso. Os grupos VIII e VII apresentaram comportamentos
semelhantes de deformação até o limite de proporcionalidade e médias
inferiores aos outros grupos (Tabelas 31 e 33).
Tabela 31. Médias de força (FLP) e contração (CLP) até o limite de
proporcionalidade obtidas por compressão em vértebras L5 nos grupos de
fêmeas V, VI, VII e VIII.
FLP (N) *
2
CLP (%)*
2
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETAS
(dias)
14
115,39
67,81
125,02
65,07
3,03
3,42
2,22
2,19
28
140,70
144,74
143,19
120,57
3,33
3,22
2,41
3,18
42
146,22
151,31
127,95
76,72
2,97
3,71
2,85
1,86
56
138,89
133,97
103,90
87,99
3,15
2,73
1,93
2,33
82
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta (p<0,05)
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos (p<0,05)
ns: não significativo
Tabela 32. Comparação de médias de força até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (N)
V
135.30
A
VII
125.02
A
VI
124.46
A
VIII
87.59
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
Tabela 33. Comparação de médias de contração até o limite de
proporcionalidade entre tratamentos dos grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (%)
VI
3.27
A
V
3.12
A
VIII
2.39
B
VII
2.35
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
Os testes de compressão revelaram na comparação de médias entre
tratamentos um comportamento similar dos grupos V, VI e VII, que indica
capacidade semelhante de resistir a força aplicada sobre estes grupos. E o
grupo VIII apresentou uma média inferior aos outros grupos para este teste
(Tabelas 34 e 35).
No caso dos testes de resiliência, a comparação das médias entre
tratamentos indicou que os grupos V e VI, que apresentaram médias
similares, possuem capacidade semelhante de absorver energia de forma
elástica, permitindo que o osso retorne a sua forma anterior após a retirada
da carga. Enquanto que o grupo VII apresentou média inferior aos grupos
citados, o grupo VIII obteve a menor média (Tabelas 34 e 36).
83
Tabela 34. Médias de compressão e resiliência médias obtidas por
compressão em vértebras L5 nos grupos de fêmeas V, VI, VII e VIII.
COMPRESSÃO (kN/m) *
2
RESILIÊNCIA (10
-6
J) *
2
GRUPOS
V
VI
VII
VIII
V
VI
VII
VIII
COLETA
(dias)
14
0,89
0,55
0,96
0,77
18,2
20,5
13,3
13,8
28
1,14
1,30
1,17
1,02
21,0
20,4
14,4
21,1
42
1,19
1,16
1,15
0,84
19,7
26,0
17,1
12,3
56
1,18
1,09
1,08
0,84
22,0
17,2
12,2
16,3
*
1
: significativo a 5% de probabilidade para interação tratamentos e períodos de coleta (p<0,05)
*
2
: significativo a 5% de probabilidade para interação entre tratamentos (p<0,05)
ns: não significativo
Tabela 35. Comparação de médias de compressão entre tratamentos dos
grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (kN/m)
V
1.10
A
VII
1.09
A
VI
1.03
A
VIII
0.87
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
Tabela 36. Comparação de médias de resiliência entre tratamentos dos
grupos V, VI, VII e VIII.
GRUPOS
MÉDIAS (10
-6
J)
VI
21.02
A
V
20.22
A
VIII
15.87
AB
VII
14.25
B
A e B: Comparações a 5% de probabilidade (p<0,05)
i
6- DISCUSSÃO
O modelo animal com ratos para estudo da indução de osteoporose
pós-menopausa ou pela administração de glicocorticóides vem
adquirindo grande aceitação nos últimos anos. A proposta deste modelo
é comprovar que se consegue estabelecer a osteoporose, e a partir de
qual momento isto ocorre, tanto em machos como em fêmeas, seja por
meio da castração, ou da administração de glicocorticóides, ou ainda,
pela associação da castração com a administração de glicocorticóides.
A discussão dos resultados da análise quantitativa dos
constituintes plasmáticos (cálcio, fósforo e proteínas totais) e do tecido
ósseo (cálcio, fósforo e magnésio), e a avaliação dos testes biomecânicos
de flexão e compressão dos grupos experimentais foi dividida para
avaliação dos diferentes tratamentos entre os grupos de machos e entre
os grupos de fêmeas, pois existem diferenças significativas entre os
gêneros. Embora não se tenha obtido resultados significativos (p<0,05)
para todos os constituintes avaliados em todos os grupos, se pode
observar em um panorama geral as diferenças comportamentais destes
grupos durante o período experimental.
As concentrações de cálcio plasmático e ósseo, por exemplo, não
foram significativas estatisticamente, mas as concentrações plasmáticas
deste constituinte se mantiveram estáveis dentro dos limites esperados
para sua homeostasia nos grupos I, II, III e IV. Estes resultados são
compatíveis com estudos que afirmam que a prioridade do organismo
consiste em manter a homeostasia do cálcio, mobilizando este
constituinte principalmente dos ossos, e também aumentando sua
ii
absorção intestinal e reabsorção renal (SWENSON & REECE, 1993;
NORDIN, 1997).
O grupo II manteve adequada a proporção cálcio:fósforo
plasmática, enquanto que a proporção óssea final destes constituintes
ficou abaixo da concentração esperada (1,4:1). Este valor é indicativo de
desequilíbrio na remodelação óssea em favor da reabsorção, confirmando
estudos que constatam a perda óssea induzida pela deficiência de
estrógenos em modelos de ratos castrados, devido às suas similaridades
com a doença em humanos (DEMPSTER et al., 1995), incluindo um
aumento do turnover ósseo e uma rápida perda óssea na fase inicial da
deficiência de estrógenos (MUNDY, 2000; DEMPSTER et al., 1995;
MOKESILDE, 1995; KALU, 1991), ou ainda, segundo trabalhos de
HARADA & RODAN (2003) e HULLEY (2002) uma perda óssea devida ao
aumento na atividade dos osteoclastos que se traduz por uma elevação
na taxa de reabsorção. Pode-se inferir que este resultado é semelhante ao
que tem sido descrito em homens que foram castrados, ou seja, há uma
perda óssea rápida, similar ao que ocorre em mulheres castradas ou na
menopausa (ENRIORI & ENRIORI, 2002; RIGGS et al., 2002), que é
relacionada diretamente com o declínio nos níveis de estrógenos
(BILEZIKIAN et al., 1999).
Com relação às proteínas totais, o grupo II apresentou a maior
média entre tratamentos, possivelmente devido a redução significativa de
testosterona. Este achado é plausível levando-se em consideração que
existem trabalhos afirmando que a testosterona atua fazendo deposição
de proteínas plasmáticas nos tecidos do organismo (GUYTON & HALL,
1997), então no caso de deficiência deste hormônio espera-se um
aumento na concentração das proteínas plasmáticas. Por outro lado, este
grupo apresentou a segunda maior concentração de magnésio ósseo, o
que está de acordo com estudos que relatam que a testosterona periférica
(residual ou produzida pelas adrenais) é aromatizada em estrógeno
contribuindo para que não haja desequilíbrio muito severo na
remodelação óssea (ENRIORI & ENRIORI, 2002; SEEMAN, 1999). E
confirmando estudo sobre magnésio, se houvesse elevação considerável
nos níveis de PTH a concentração óssea desse constituinte se
iii
apresentaria reduzida (SARIS et al., 2000). Ainda corroborando com outro
trabalho sobre perda óssea logo após a castração, o qual afirma que
existe um aumento da liberação de cálcio do osso para o pool
extracelular, e que o organismo previne a hipercalcemia pela redução da
absorção intestinal, aumento da excreção renal deste, e pela supressão
parcial na secreção de PTH (RIGGS et al., 2002).
Ao se associarem as análises de concentração plasmática e óssea
dos constituintes referidos com os testes biomecânicos, se consegue
observar com mais clareza os efeitos da castração e/ou da terapia com
glicocorticóides ou de ambos nos diversos grupos experimentais. Mas
como no caso das análises quantitativas nem todos os parâmetros
biomecânicos tiveram resultados significativos.
Os resultados das análises dos testes biomecânicos de flexão em
tíbia no grupo I indicam que houve um aumento linear na resistência
óssea durante o período experimental, apresentando as maiores médias
de tenacidade, resiliência e rigidez. Enquanto que o grupo II, por sua vez,
obteve redução na resistência a fratura de acordo com a força aplicada e
aumento de deformação no decorrer do experimento, indicando menor
conteúdo mineral ósseo e conseqüentemente menor rigidez. THOMPSON
et al. (1995) constataram que o efeito imediato após a ovariectomia em
ratas é principalmente a perda de osso esponjoso na tíbia proximal.
Ainda, considerando que a resposta dos machos é igual a das fêmeas
perante a deficiência de estrógenos (SEEMAN, 1999) e levando em
consideração o trabalho de RIGGS et al. (2002) que relata uma perda
óssea logo após a castração de fêmeas em torno de 20 a 30% de osso
esponjoso e até 10% de osso cortical, sendo a perda de osso trabecular
na tíbia após a castração definida pela redução do número de trabéculas
sem a redução aparente da espessura destas (THOMPSON et al., 1995). E
devido ao fato de os ratos não apresentarem remodelação haversiana
secundária e nem sistema de remodelação bem definida do osso cortical
sob condições normais (ORTOFT & OXLUND, 1996), pode se inferir que
deve ter havido perda óssea trabecular e cortical suficiente para que
fosse observada no teste de flexão.
iv
Os testes de compressão em vértebra L5 do grupo II
demonstraram uma redução gradual na capacidade de deformação até a
ruptura do osso, o que corresponde à habilidade de absorver energia.
Este resultado indica que houve pouca perda óssea, igual ao que foi
constatado no grupo controle, confirmando mais uma vez que a
semelhança do que ocorre nas fêmeas após a ovariectomia (SEEMAN,
1999), o resultado direto da deficiência de estrógenos após a
orquiectomia é a perda óssea relacionada com a redução na espessura
das placas trabeculares e não com o número destas, como no caso da
tíbia (THOMPSON et al., 1995). Por outro lado, se deve considerar que o
diâmetro da vértebra é de importância crucial para que ocorra a fratura
(BILEZIKIAN et al., 1999). Além disso, alguns estudos admitem que
associando uma provável redução mínima na espessura das trabéculas
(THOMPSON et al., 1995) com o tamanho do corpo vertebral, que é maior
nos machos e exige naturalmente maior força aplicada para ocorrência de
fraturas (BILEZIKIAN et al., 1999), podem-se explicar os valores não
significativos no teste de compressão que foram observados no grupo II
em relação ao grupo controle.
No caso do grupo III a relação cálcio:fósforo plasmática adequada
foi atingida aos 42 dias de experimento e se manteve até os 56 dias,
enquanto que houve desequilíbrio na concentração óssea destes
constituintes a partir dos 42 dias e permaneceu até o final do experimento
(1,4:1). Considerando que no início do experimento a proporção
cálcio:fósforo plasmática estava inferior ao esperado, se deduz que
houve um desequilíbrio na remodelação óssea devido ao tratamento com
glicocorticóides e concomitantemente um aumento na secreção de PTH
para liberar cálcio dos ossos, liberando também o magnésio, condizendo
com os resultados observados, uma vez que este grupo apresentou a
menor concentração deste mineral no osso. Estes resultados estão de
acordo com estudos que relatam que os glicocorticóides agem reduzindo
a absorção intestinal de cálcio, aumentando a excreção renal deste
mineral e conseqüentemente reduzindo sua concentração sérica, que por
sua vez estimula a secreção de PTH (McILWAIN, 2003; RUBIN &
BILEZIKIAN, 2002; HULLEY et al., 2002; MANELLI & GIUSTINA, 2000;
v
ROUX et al., 1998). E ainda, como há indícios de aumento da secreção de
PTH, este deve reduzir a concentração óssea de magnésio liberando-o e
aumentando sua absorção intestinal de acordo com estudos de SARIS et
al. (2000), sendo que esta afirmação é confirmada pelos resultados
obtidos para este grupo. É importante lembrar que o provável aumento
nos níveis séricos do PTH foi por um curto período de tempo, o suficiente
para liberar minerais do tecido ósseo mas não a ponto de instalar um
quadro de hiperparatireoidismo secundário, pois não se realizou uma
terapia crônica com glicocorticóides.
Com relação às proteínas plasmáticas, o grupo III teve um
comportamento similar ao grupo controle e média um pouco superior,
condizendo com o fato de que os glicocorticóides liberam proteínas dos
tecidos no plasma (GUYTON & HALL, 1997) e tem efeito inibitório sobre
as gonadotropinas da pituitária provocando um declínio nos níveis de
testosterona (McILWAIN, 2003; HULLEY et al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN,
2002; MANELLI & GIUSTINA, 2000; ROUX et al., 1998). Assim sendo,
reduzem-se os níveis de estrógenos derivados da aromatização dos
andrógenos, alterando desta forma a deposição de proteínas em diversos
tecidos pela deficiência de testosterona (GUYTON & HALL, 1997) o que se
traduz em alteração da remodelação óssea pela deficiência de
estrógenos. Então, os resultados obtidos das concentrações de proteínas
totais plasmáticas superiores aos do grupo controle estão corroborando
com os estudos relacionados acima.
Os resultados obtidos nos testes biomecânicos de flexão do
grupo III somente foram significativos (p<0,05) na comparação de médias
entre tratamentos para tenacidade, resiliência e rigidez. As médias deste
grupo, quando comparadas às do grupo I indicaram menor habilidade em
absorver energia, ou ainda, menor capacidade de resistir ao impacto
mecânico. Os grupos II e III apresentaram o mesmo comportamento para
absorver energia. O grupo III obteve menor média de rigidez, o que
confirma os resultados obtidos na quantificação de cálcio e magnésio
para este grupo (médias inferiores ao grupo I), estando de acordo com
trabalhos que afirmam que o tratamento com glicocorticóides reduz o
grau de mineralização, aumenta a reabsorção óssea (McILWAIN, 2003;
vi
MANELLI & GIUSTINA, 2000; ORTOFT & OXLUND, 1996) e excreção do
cálcio, reduzindo sua concentração sérica e elevando os níveis de PTH.
Sendo que o PTH estimula a perda óssea trabecular e também cortical de
forma significativa, embora sem caracterizar um quadro de
hiperparatireoidismo (RUBIN & BILEZIKIAN, 2002). Este comportamento
apresentado pelo grupo III também está de acordo com estudo que afirma
que a terapia com glicocorticóides diminui a qualidade óssea com
consequente perda de resistência mecânica dos ossos longos que pode
ser constatado por testes biomecânicos (ORTOFT & OXLUND, 1996).
Já, os resultados dos testes de compressão em vértebra L5 no
grupo III permitiram observar que houve uma redução gradual na
capacidade de deformação do osso em função da força aplicada e
também uma redução na capacidade de absorver energia de acordo com
os resultados de resiliência que mostram média inferior aos grupos I e II.
Os resultados destes testes estão compatíveis com estudos que indicam
haver redução na mineralização do tecido ósseo e aumento da fragilidade
de vértebras provavelmente por apoptose de osteoblastos,
principalmente nas trabéculas e em menor proporção no osso cortical
(HULLEY et al., 2002). Outros trabalhos confirmam aumento na incidência
de fraturas vertebrais (MANELLI & GIUSTINA, 2000; ROUX et al., 1998),
que se deduz ser devido a redução da espessura das placas trabeculares
(McILWAIN, 2003) como conseqüência da terapia com glicocorticóides
(HULLEY et al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002).
O grupo IV apresentou concentrações plasmáticas de
cálcio:fósforo nos níveis normais e dentro de limites constantes durante
todo o período de experimento de acordo com o esperado, pois segundo
SWENSON & REECE (1993) nos períodos de deficiência, o cálcio e o
fósforo são rapidamente mobilizados dos ossos e disponibilizados para o
sangue e outros tecidos moles. Este grupo além da castração, recebeu
tratamento com glicocorticóides, que age inibindo a atividade das
gonadotropinas da pituitária provocando um declínio cumulativo com a
castração nos níveis de testosterona de origem gonadal e adrenal
(McILWAIN, 2003; HULLEY et al., 2002; RIGGS et al., 2002; RUBIN &
BILEZIKIAN, 2002; MANELLI & GIUSTINA, 2000; ROUX et al., 1998). Esta
vii
terapia também induz uma concentração de proteínas totais superior ao
grupo I, pelo fato desse hormônio fazer deposição destas proteínas nos
tecidos como citado anteriormente (SWENSON & REECE, 1993).
Com relação às concentrações dos constituintes ósseos do grupo
IV, embora os resultados das médias de cálcio não tenham sido
significativas, observou-se redução progressiva na proporção
cálcio:fósforo até os 42 dias de experimento, sendo que aos 56 dias
houve um aumento como provável consequência do término da ação do
glicocorticóide, e ainda assim a proporção final (1,5:1) foi inferior à
concentração normal. E este achado está de acordo com estudos que
afirmam que na primeira fase da ação dos glicocorticóides no tecido
ósseo ocorre uma perda óssea rápida pelo desequilíbrio na remodelação
óssea, havendo aumento na reabsorção e redução na formação
(McILWAIN, 2003; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002; MANELLI & GIUSTINA,
2000; ROUX et al., 1998). Confirmando este dado, o grupo IV apresentou
concentração média de magnésio similar ao grupo III e inferior ao grupo I,
como um efeito da castração e do tratamento com glicocorticóide,
indicando que é provável ter havido alteração na remodelação óssea o
que conseqüentemente levaria a um aumento na secreção de PTH devido
a uma redução do cálcio sérico (McILWAIN, 2003; RUBIN & BILEZIKIAN,
2002; MANELLI & GIUSTINA, 2000). Então, este hormônio induziria
aumento da taxa de reabsorção óssea com redução na concentração de
magnésio (SARIS et al., 2000).
Os resultados obtidos nos testes de flexão do grupo IV foram
significativos (p<0,05) para todos os parâmetros avaliados, sendo que
isto permitiu analisar com maior confiabilidade o comportamento deste
grupo. O grupo IV apresentou um aumento significativo na fragilidade do
tecido ósseo indicado pela redução na capacidade de resistir a força
aplicada. O osso submetido ao teste de flexão apresentou um período de
maior deformação em relação a força aplicada na metade do experimento
sugerindo uma redução do conteúdo mineral e, logo após, uma redução
na deformação concomitante com uma redução da força aplicada que
demonstra uma fragilidade óssea acentuada em comparação com os
grupos I, II e III. Os trabalhos relacionados com a castração e efeitos dos
viii
glicocorticóides, afirmam que a perda de osso trabecular na tíbia após a
castração é definida pela redução do número de trabéculas sem a
redução aparente da espessura destas (THOMPSON et al., 1995), e que o
tratamento com glicocorticóides reduz o grau de mineralização e aumenta
a reabsorção óssea (McILWAIN, 2003; MANELLI & GIUSTINA, 2000;
ORTOFT & OXLUND, 1996). E ainda, com relação aos estudos sobre
terapia com glicocorticóides, descreve-se um aumento na excreção renal
do cálcio com conseqüente redução sérica deste constituinte, o que leva
a um aumento nos níveis de PTH, que por sua vez, estimula a perda óssea
trabecular e também cortical de forma significativa, embora sem a
caracterização de um quadro de hiperparatireoidismo (RUBIN &
BILEZIKIAN, 2002). Os resultados obtidos nos testes biomecânicos são
confirmados por trabalho que relata que este tratamento diminui a
qualidade óssea com conseqüente perda de resistência mecânica dos
ossos longos (ORTOFT & OXLUND, 1996). Os resultados observados para
este grupo concordam com os trabalhos citados demonstrando uma
redução na qualidade óssea que se reflete em menor resistência à fratura
nos testes de flexão.
Nos testes de compressão em vértebra L5, os resultados obtidos
do grupo IV demonstraram menor habilidade de deformação do osso em
função da carga aplicada e menor capacidade em absorver energia que os
grupos I, II e III. Sendo que isto indica que ocorreu perda óssea
significativa tornando o osso mais frágil e ressaltando que, com relação
ao comportamento, os grupos III e IV agiram de forma semelhante. Os
resultados obtidos do grupo IV para estes testes estão compatíveis com
estudos que indicam haver uma redução na resistência mecânica óssea
possivelmente por apoptose de osteoblastos, principalmente nas
trabéculas e em menor proporção no osso cortical, e também um declínio
na deposição de minerais no tecido ósseo (HULLEY et al., 2002). Outros
trabalhos confirmam este achado citando um aumento na incidência de
fraturas vertebrais (MANELLI & GIUSTINA, 2000; ROUX et al., 1998) que se
deve provavelmente às placas trabeculares se apresentarem menos
espessas (McILWAIN, 2003) como conseqüência do tratamento com
glicocorticóides (HULLEY et al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002).
ix
E ainda, o efeito da deficiência de estrógenos após a orquiectomia
é descrito como a perda óssea relacionada com a redução na espessura
das placas trabeculares e não com o número destas como no caso da
tíbia (THOMPSON et al, 1995), sem deixar de considerar que o diâmetro da
vértebra é de importância crucial para que ocorra a fratura (BILEZIKIAN et
al., 1999). Então apesar do tamanho do corpo vertebral dos machos ser
maior do que o das fêmeas, ainda assim, pode se observar o efeito
cumulativo dos dois procedimentos empregados neste grupo (castração
e terapia com glicocorticóides) que apresentou uma acentuada fragilidade
óssea quando comparado com os outros grupos experimentais.
Nas análises quantitativas de constituintes plasmáticos e ósseos
nos grupos de fêmeas constatou-se comportamentos distintos dos
grupos de machos sob alguns aspectos.
A concentração média de cálcio plasmático apresentou resultados
significativos (p<0,05) entre períodos de coleta nos grupos V, VI, VII e VIII,
reduzindo-se durante o experimento, mas mantendo uma proporção
adequada de cálcio e fósforo plasmáticos. Corroborando com SWENSON
& REECE (1993) que afirmam que nos períodos de deficiência, o cálcio e o
fósforo são rapidamente mobilizados dos ossos e disponibilizados para o
sangue e outros tecidos moles.
O grupo VI obteve concentrações adequadas de cálcio:fósforo
plasmáticos durante todo o período de experimento, enquanto que as
concentrações ósseas destes constituintes reduziram-se apresentando
uma proporção abaixo do limite normal (1,4:1). A deficiência de
estrógenos se reflete em um desequilíbrio na remodelação óssea,
ocorrendo maior reabsorção do que formação (HARADA & RODAN, 2003;
ABE et al., 1999; SEEMAN, 1999; DEMPSTER et al., 1995; DEMPSTER &
LINDSAY, 1993), embora deva se considerar que nos primeiros trinta dias
após a castração possa ocorrer um aumento na formação óssea na
tentativa de reverter o quadro de perda óssea devido a reabsorção mais
acentuada (TANIZAWA et al., 2000). E apesar da concentração de
proteínas plasmáticas e do magnésio ósseo não terem apresentado
resultados significativos (p>0,05), suas médias foram inferiores as do
grupo I durante todo o experimento.
x
Ainda com relação as proteínas plasmáticas, a deficiência de
estrógenos não interfere de maneira significativa, porque ao contrário da
testosterona, estes fazem uma deposição mínima de proteínas nos
tecidos (SWENSON & REECE, 1993). Vários estudos afirmam que após a
ovariectomia existe uma fase de perda óssea rápida na qual ocorre uma
elevação na liberação de cálcio do tecido ósseo para o pool extracelular e
conseqüentemente aumentando sua concentração sérica (RIGGS et al.,
2002 MUNDY, 2000; DEMPSTER et al., 1995; MOKESILDE, 1995; KALU,
1991). Então, para manutenção da homeostasia do cálcio, a hipercalcemia
é prevenida pelo aumento da sua excreção renal, pela redução
da absorção intestinal e pela supressão parcial da secreção de PTH
(RIGGS et al., 2002).
Ainda com relação às alterações da concentração óssea de
magnésio do grupo VI durante o período experimental se pode sugerir
que nos trinta primeiros dias após a ovariectomia houve a tentativa de
equilibrar a remodelação óssea aumentando a formação além da
reabsorção (TANIZAWA et al., 2000). Então, na primeira parte do
experimento se pode deduzir que houve redução do cálcio sérico que foi
utilizado para formação óssea e como conseqüência, os níveis de PTH
devem ter se apresentado elevados até o momento que se obteve
novamente a homeostasia do cálcio. Na segunda parte do experimento,
ou seja, mais de trinta dias após a ovariectomia, a taxa de formação se
estabilizou e a taxa de reabsorção permaneceu mais elevada mantendo o
quadro de desequilíbrio na remodelação. E no que diz respeito a
concentração óssea do magnésio, na primeira parte do experimento, sua
concentração estava mais elevada, acompanhando o suposto aumento da
formação óssea e, na segunda parte, se apresentou inferior ao grupo
controle porque a taxa de reabsorção estava superior a formação óssea.
Os resultados obtidos nos testes de flexão do grupo VI mostraram
um comportamento similar com o grupo V. Então, como sugerido
anteriormente, dividindo-se o período experimental em duas partes, se
observa que o grupo VI recebeu maior carga de força aplicada para que
ocorresse fratura na primeira parte do experimento e que esta carga foi
reduzida consideravelmente na segunda parte concordando com o fato de
xi
que após trinta dias de ovariectomia a remodelação não se encontra mais
na tentativa de retornar ao equilíbrio tornando as conseqüências disto
mais evidentes. E apesar deste grupo apresentar comportamento similar
ao grupo controle em relação a comparação de média de rigidez entre
tratamentos, ao se avaliar os resultados obtidos nos diferentes períodos
de coleta, se observa uma redução crescente na rigidez a partir dos 28
dias de experimento, concordando novamente com os estudos referentes
ao desequilíbrio na remodelação óssea após a ovariectomia. E, levando
em consideração a ação da castração entre períodos de coleta, apesar de
não terem apresentado resultados significativos, se pode sugerir uma
redução no conteúdo mineral ósseo (cálcio e magnésio) e na resistência
do tecido ósseo à flexão. Mas, no caso dos resultados que foram
significativos (p<0,05) na comparação de médias entre tratamentos, o
grupo VI se comportou da mesma forma que o grupo controle.
THOMPSON et al. (1995) sugeriram que como efeito imediato após a
ovariectomia ratas perdem osso esponjoso na tíbia proximal e GOH et al.
(1995), que a fratura dos ossos longos é correlacionada diretamente com
a redução da densidade mineral óssea, o que pode indicar que não houve
redução de conteúdo mineral e perda óssea cortical significativa (p<0,05)
que pudesse ser observada no teste de flexão.
Nos testes biomecânicos de compressão em vértebra L5, os
resultados obtidos dos grupos V, VI e VII demonstraram comportamento
semelhante na capacidade de receber força aplicada, na habilidade de
absorver energia e na força de compressão (kN/m), indicando que não
houve perda óssea significativa (p<0,05) nestes grupos, pois os
resultados dos grupos tratados foram semelhantes aos resultados do
grupo controle. Mas levando em consideração as médias obtidas entre
períodos de coleta para este grupo, se observou a partir dos 28 dias de
experimento uma redução crescente da carga de força aplicada para que
ocorresse a fratura da mesma forma que foi verificada no teste de flexão.
E também obteve média final de conteúdo mineral ósseo (cálcio, fósforo e
magnésio), de resiliência e de compressão inferior ao grupo controle.
Considerando estudo de THOMPSON et al. (1995) que relata como
resultado direto da deficiência de estrógenos após a ovariectomia a perda
xii
óssea trabecular em vértebra lombar, também não se pode excluir o
trabalho que afirma que para ocorrência de fraturas vertebrais por
compressão o diâmetro do osso é de suma importância (BILEZIKIAN,
1999), e que além da microarquitetura óssea ter influência em
aproximadamente 10 a 30% da variabilidade da resistência mecânica,
também o volume de medula óssea pode interferir na conectividade
trabecular (CORTET & MARCHANDISE, 2001). Então sugere-se que houve
perda óssea mas com resultado não significativo para este grupo.
O grupo VII, com relação ao cálcio e fósforo plasmáticos,
apresentou proporção adequada durante todo o experimento. E apesar de
não atender a proporção adequada de cálcio:fósforo ósseos (1,3:1)
apresentou a maior concentração destes minerais no osso quando
comparado com os grupos V, VI e VIII. Ainda assim, apesar de não obter
resultados significativos entre períodos de coleta, a partir dos 28 dias a
proporção desses constituintes ósseos declinou até os 56 dias de
experimento, indicando a ação da terapia com glicocorticóide em
desequilibrar a remodelação óssea, causando um aumento na secreção
de PTH, que conseqüentemente liberou cálcio dos ossos para
manutenção da homeostasia deste. Estes resultados estão de acordo
com estudos que relatam que os glicocorticóides atuam alterando a
remodelação óssea e o metabolismo do cálcio, induzindo duas fases de
perda óssea: uma fase inicial, na qual ocorre uma perda rápida e
acentuada (reduz a taxa de formação e aumenta a de reabsorção), e uma
segunda fase, na qual a perda óssea é mais lenta (taxa de formação
reduzida e a taxa de reabsorção também se reduz um pouco) (RIGGS et
al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002). E ainda, confirmando alguns
trabalhos que relatam que os glicocorticóides reduzem a absorção
intestinal de cálcio, aumentando a excreção renal deste mineral, tendo
como conseqüência a redução da sua concentração sérica, que por sua
vez, estimula uma elevação nos níveis séricos de PTH (McILWAIN, 2003;
RUBIN & BILEZIKIAN, 2002; HULLEY et al., 2002; MANELLI & GIUSTINA
2000; ROUX et al., 1998).
A concentração de proteínas totais aumentou gradualmente,
indicando que a terapia com glicocorticóide diminuiu a quantidade de
xiii
proteínas na maioria dos tecidos elevando sua concentração no plasma
(GUYTON & HALLL, 1997) e provocou um efeito inibitório sobre as
gonadotropinas da pituitária provocando um declínio nos níveis de
estrógenos (McILWAIN, 2003; HULLEY et al., 2002; RUBIN & BILEZIKIAN,
2002; MANELLI & GIUSTINA, 2000; ROUX et al., 1998), o que se traduz em
alteração da remodelação óssea pela deficiência de estrógenos (HARADA
& RODAN, 2003; ABE et al., 1999; SEEMAN, 1999; DEMPSTER et al., 1995;
DEMPSTER & LINDSAY, 1993). Sugere-se que houve um aumento na
concentração de proteínas plasmáticas durante o período de experimento
devido ao tratamento com glicocorticóides.
No caso da concentração do magnésio ósseo não houve
resultados significativos, mas a concentração deste constituinte
apresentou-se acentuadamente inferior a do grupo controle. E ainda,
como há indícios de aumento da secreção de PTH, este deve reduzir a
concentração óssea de magnésio liberando-o e aumentando sua
absorção intestinal de acordo com estudos de SARIS et al. (2000),
afirmação esta confirmada pelos resultados obtidos para este grupo. É
importante lembrar que o provável aumento nos níveis séricos do PTH foi
por um curto período de tempo, o suficiente para liberar minerais do
tecido ósseo mas não a ponto de instalar um quadro de
hiperparatireoidismo secundário, pois não se realizou uma terapia crônica
com glicocorticóides.
Nos testes de flexão em tíbia o grupo VII mostrou maior fragilidade
óssea quando comparado com os grupos V, VI e VIII. Pois obteve a menor
média de resistência a força aplicada até sua ruptura, apresentou maior
deformação que os grupos V e VI e menor média de rigidez que os grupos
V, VI e VIII indicando que este grupo possui menor conteúdo mineral
ósseo. Estes resultados estão de acordo com McILWAIN (2003), MANELLI
& GIUSTINA (2000), ORTOFT & OXLUND (1996) que relatam o aumento da
reabsorção óssea após terapia com glicocorticóides, e com HULLEY et al.
(2002), ORTOFT & OXLUND (1996), GOH et al. (1995) que afirmam que este
tratamento em ratas causa redução da massa óssea cortical e da
resistência mecânica de ossos longos.
xiv
No caso dos resultados dos testes de compressão em vértebra L5
do grupo VII, como citado anteriormente, não houve diferença de
comportamento com os grupos V e VI com relação à fragilidade óssea.
Apesar da afirmação de RUBIN & BILEZIKIAN (2002) de que o local
tipicamente afetado pelo tratamento com glicocorticóide ser o osso
trabecular das vértebras, GILSANZ (1998) comenta que a resistência das
vértebras lombares é determinada também pela área total destas e que o
tamanho da vértebra é fator determinante de fraturas.
Os animais do grupo VIII, assim como os do grupo IV, foram
castrados e receberam tratamento com glicocorticóide, resultando assim
em um efeito cumulativo de perda óssea. Este grupo apresentou
homeostasia de cálcio e fósforo, mas por outro lado, mostrou
concentrações destes constituintes inferiores no tecido ósseo aos outros
grupos, com uma proporção abaixo da normal (1,3:1), provavelmente
devido a ação conjunta do glicocorticóide e da deficiência de estrógenos.
Este achado ocorre porque na deficiência de estrógenos se observa
significativa perda de conteúdo mineral, com redução da absorção
intestinal e aumento da excreção renal do cálcio (RIGGS et al., 2002;
MANELLI & GIUSTINA, 2000; MOKESILDE, 1995; KALU, 1991), e uma
alteração na remodelação óssea, ocorrendo maior reabsorção do que
formação (HARADA & RODAN, 2003; ABE et al., 1999; SEEMAN, 1999;
DEMPSTER et al., 1995; DEMPSTER & LINDSAY, 1993). E no caso do
tratamento com glicocorticóide há um efeito cumulativo na redução na
absorção intestinal de cálcio, no aumento da excreção renal deste mineral
e conseqüentemente redução da sua concentração sérica, estimulando a
secreção de PTH (McILWAIN, 2003; RUBIN & BILEZIKIAN, 2002; HULLEY
et al., 2002; MANELLI & GIUSTINA 2000; ROUX et al., 1998) e ainda, uma
potencialização da reabsorção óssea com concomitante redução na
formação (RUBIN & BILEZIKIAN, 2002).
Os resultados dos testes de flexão do grupo VIII demonstraram
perda óssea superior aos grupos V e VI, e comportamento similar ao
grupo VII para a maioria dos parâmetros. Houve aumento da fragilidade
óssea indicada por redução da resistência do osso em função da força
aplicada e redução do conteúdo mineral ósseo observada em função da
xv
maior média de deformação em relação a carga aplicada, e média de
rigidez similar ao grupo VII e inferior aos grupos V e VI. Estes resultados
confirmam estudos de McILWAIN (2003), MANELLI & GIUSTINA (2000),
ORTOFT & OXLUND (1996) que citam em seus estudos o desequilíbrio na
remodelação óssea, com aumento da reabsorção e também de HULLEY et
al. (2002), ORTOFT & OXLUND (1996), GOH et al. (1995) que descrevem a
diminuição de massa óssea cortical e redução da resistência mecânica
dos ossos longos como conseqüência da administração de
glicocorticóides em ratas. E com relação a castração, THOMPSON et al.
(1995) sugeriram que como efeito imediato após a ovariectomia, ratas
perdem osso esponjoso na tíbia e GOH et al. (1995) que a fratura dos
ossos longos é correlacionada diretamente com a redução da densidade
mineral óssea. Sugere-se que o somatório dos efeitos dos tratamentos
para este grupo tenham sido positivos para obtenção da fragilidade óssea
e redução na resistência à fratura por flexão.
Nos testes biomecânicos de compressão em vértebra L5, os
resultados do grupo VIII indicaram perda óssea, pois este grupo
necessitou de menor carga de força aplicada para sua ruptura,
apresentou menor capacidade em absorver energia sem injúria e menor
média de compressão. Estes achados concordam com os estudos de
THOMPSON et al. (1995) que descrevem a perda óssea trabecular em
vértebra lombar como resultado direto da deficiência de estrógenos após
a ovariectomia, com BILEZIKIAN (1999) que relata que para ocorrência de
fraturas vertebrais por compressão o diâmetro do osso é de suma
importância, e ainda, com CORTET & MARCHANDISE (2001) que afirmam
que a microarquitetura óssea tem influência na variabilidade da
resistência mecânica, como também o volume de medula óssea, que pode
interferir na conectividade trabecular. Do mesmo modo que nos testes de
flexão, os resultados dos testes de compressão evidenciaram uma
redução da resistência óssea como resultado da ação dos tratamentos
empregados para o grupo VIII, que se deve provavelmente ao declínio dos
níveis de mineralização e redução da espessura das placas trabeculares
com conseqüente aumento da fragilidade óssea.
xvi
xvii
6- CONCLUSÕES
Baseado nos resultados do presente estudo pode-se concluir:
1. A associação da deficiência de estrógenos e tratamento com
glicocorticóides induz alterações ósseas compatíveis com a Osteoporose,
tanto em machos como em fêmeas.
2. A rápida perda óssea observada nos ratos após a orquiectomia e a
ovariectomia é similar ao que ocorre em homens e mulheres,
submetidos a estes procedimentos cirúrgicos, ou no período inicial
da menopausa.
3. A concentração plasmática de cálcio, fósforo e proteínas totais
durante o período de observação não indicou isoladamente o
estabelecimento do quadro de osteoporose.
4. A proporção de cálcio:fósforo do tecido ósseo apresentou
desequilíbrio indicativo de Osteoporose para todos os grupos
experimentais, sendo que nos grupos de machos a partir dos 28
dias do período de observação, e a partir dos 42 dias para os
grupos de fêmeas. Esta alteração foi mais acentuada nos grupos
de fêmeas inteiras e castradas que receberam tratamento com
glicocorticóide (1,3:1) e nos grupos de machos castrados e
machos que receberam a terapia com glicocorticóide (1,4:1).
5. A concentração de magnésio ósseo foi indicativa de desequilíbrio na
remodelação óssea apresentando-se consideravelmente inferior nos
grupos experimentais em relação aos grupos controle. Sendo que os
resultados mais significativos foram observados no grupo de machos
inteiros e de fêmeas castradas que receberam terapia com glicocorticóide.
xviii
6. Os testes biomecânicos de flexão em tíbia confirmaram o declínio do
conteúdo mineral ósseo pela redução da resistência a fratura nos grupos
experimentais como esperado no quadro de Osteoporose. O grupo de
machos castrados e de fêmeas inteiras submetidos a tratamento com
glicocorticóide apresentaram maior fragilidade óssea.
7. Os testes biomecânicos de compressão em vértebras L5 demonstraram
declínio na resistência a fratura assim como os testes de flexão, sugerindo
um aumento na fragilidade óssea dos grupos experimentais devido aos
tratamentos recebidos. Os grupos de machos e fêmeas castrados
submetidos à terapia com glicocorticóide apresentaram-se os mais frágeis
com relação à resistência a fratura.
xix
Perspectivas Futuras
O modelo que associa os efeitos da castração com o uso da
sobredosagem de glicocorticóides por período pré-determinado
apresenta alterações do metabolismo ósseo como esperado, devendo se
considerar o uso de animais jovens que atingiram a maturidade sexual
pelo fato de apresentarem maior resposta em relação à remodelação
óssea (ou a deficiência de estrógenos) que animais mais idosos.
E, com relação aos constituintes plasmáticos, é interessante realizar a
dosagem complementar de albumina plasmática, pois aproximadamente
50% do cálcio plasmático se encontra ligado a esta proteína; de
magnésio plasmático, para se observar o comportamento deste mineral
paralelamente no sangue e no tecido ósseo, e ainda, de marcadores de
remodelação óssea como por exemplo, a fosfatase alcalina óssea.
É importante considerar também o uso do diagnóstico por imagem, como
a densitometria óssea, que é utilizada na rotina da medicina humana
para se avaliar a densidade mineral óssea.
A histopatologia é outra análise fundamental para se obter informações
mais precisas sobre a remodelação óssea durante o período
experimental.
Concluindo-se então, que além da metodologia utilizada, o uso de
ferramentas como a histopatologia, diagnóstico por imagem e dosagem
de marcadores de remodelação óssea são de fundamental importância
para o diagnóstico definitivo da Osteoporose.
xx
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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