( PDF ) Análise de polimorfismos no gene CTLA-4 em pacientes com paracoccidioidomicose

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Universidade de Brasília – UnB

Faculdade de Medicina – FM

Pós-Graduação em Patologia Molecular

Análise de polimorfismos no gene CTLA-4 em pacientes com

paracoccidioidomicose

Viviane Furlan Lozano

Brasília-DF

Março/2008

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Viviane Furlan Lozano

Análise de polimorfismos no gene CTLA-4 em pacientes com

paracoccidioidomicose

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em

Patologia Molecular, da Faculdade de Medicina da

Universidade de Brasília, como parte dos requisitos

necessários para obtenção do Título de Mestre em Patologia

Molecular.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Sueli Soares Felipe

Brasília – DF

Março/2008

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Agradecimentos

A Deus por me dar saúde, sabedoria e persistência.

À minha família: meus pais, Valdomiro e Maria Alice; meus irmãos, Alessandro, Fábio

e Vitor; minhas tias, Angelina e Luiza, pelo amor incondicional, que mesmo de longe

nunca deixaram de me incentivar e acreditar em mim. Ao caçula, Vitor, meu

companheiro nessa difícil jornada.

À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Sueli Soares Felipe, pelos ensinamentos

transmitidos e por acreditar na minha capacidade.

À minha co-orientadora, Profa. Dra. Anamélia Lorenzetti Bocca, pelos ensinamentos,

compreensão e amizade.

À Profa. Dra. Tarcília Aparecida da Silva por toda a ajuda e incentivo durante o projeto.

Ao Prof. Dr. Rinaldo Welerson Pereira pela dedicação e ensinamentos transmitidos.

Aos Profs. Drs. Alfredo Miranda de Góes, Maria Heloisa Souza Lima Blotta e Ana

Joaquina Cohen, que gentilmente cederam amostras de pacientes para a realização do

projeto.

Ao mestre e amigo, Prof. Dr. Sérgio Paulo Severo de Souza Diniz, pelo constante

incentivo na carreira científica.

Ao querido Prof. Dr. Carlos Eduardo Tosta, pelo apoio incondicional nos momentos

mais difíceis.

Aos professores Ildinete, Lídia, Andréa, Marcelo Fernando e Élida do Laboratório de

Biologia Molecular e à professora Cynthia do Laboratório de Microbiologia pela

atenção e incentivo dedicados.

À amiga Amabel, que possibilitou o início do meu mestrado.

Às amigas Yanna, Yllana, Cleide, Sônia, Adriana, Gianni, Vanuza, Rosana e Renata

pela amizade sincera e compreensão em todos os momentos.

Às amigas, Sheila, Karla, Alciara e Dôres, sempre presentes, pessoas muito especiais.

Às queridas amigas de infância Alessandra e Juliana, pelo carinho.

Aos amigos do laboratório de Biologia Molecular da UnB – Vera, Simoneide, Hugo,

Larissa, Marcus, André, Alice, Marciano, Aldo e do laboratório de Patologia – Janayna

e Cecília, por tudo que aprendi e pelo convívio maravilhoso.

Em especial aos colegas Hugo, Simoneide e Vera, que tanto me ajudaram.

Aos amigos do laboratório Exame – Ormy, Marlene, Welker, Carmita, José Fernando,

Solange e Bruno pelo convívio diário e pelas boas risadas mesmo em meio a tanto

trabalho.

Ao Prof. Dr. Raul Yukihiro Matsuschita e à Izabel, que prontamente me ajudaram com

as análises estatísticas.

Aos novos colegas da UCB – Rodrigo, Dione e Túlio pela ajuda na fase final deste

trabalho.

À Universidade de Brasília e ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular,

que permitiram a realização deste trabalho.

Sumário

Resumo iii

Abstract iv

1. Introdução 1

1.1. Aspectos gerais da resposta imunológica 1

1.2. Estrutura do gene e expressão da proteína CTLA-4 6

1.3. O CTLA-4 e a susceptibilidade às doenças 8

1.3.1. A proteína CTLA-4 8

1.3.2. O polimorfismo no gene CTLA-4 10

1.4. A Paracoccidioidomicose (PCM) 15

1.4.1. O fungo Paracoccidioides brasiliensis e as características

gerais da PCM 15

1.4.2. Formas clínicas da PCM 17

1.4.3. Resposta imunológica da PCM 18

1.5. Análise populacional e ancestralidade 20

2. Justificativa 23

3. Objetivos 24

3.1. Objetivos específicos 24

4. Materiais e Métodos 25

4.1. Amostras de sangue 25

4.1.1. Pacientes com PCM 25

4.1.2. Controles 25

4.2. Extração de DNA 25

4.2.1. Extração por fenol-clorofórmio 26

4.3. Quantificação dos DNAs 26

4.4. Genotipagem dos SNPs -318C/T e +49ª/G 27

4.5. Análise Populacional 28

4.5.1. Marcadores Informativos de Ancestralidade (AIMs) 28

4.5.2. Amplificação das seqüências alvo 32

4.5.3. Tratamento enzimático com EXOI/SAP 32

4.5.4. Reação de Miniseqüenciamento 32

4.5.5. Tratamento enzimático com SAP 33

4.5.6. Desnaturação 33

4.5.7. Eletroforese em seqüenciador automático 33

4.6. Análises estatísticas 33

5. Resultados 35

5.1. Análise do DNA genômico das amostras de pacientes e indivíduos controle 35

5.2. Análise do produto de PCR amplificado pelo oligo 1 35

5.3. Análise do seqüenciamento das amostras amplificadas pelo oligo 1 36

5.4. Análise do SNP -318C/T 38

5.5. Análise do SNP +49A/G 40

5.6. Associação haplotípica dos SNPs -318C/T e +49A/G 42

5.7. Análise da estrutura populacional 44

5.6.1. Reação de PCR e genotipagem 44

5.6.2. Caracterização da ancestralidade 45

6. Discussão 48

7. Conclusão 54

8. Perspectivas 54

9. Referências 55

RESUMO

A proteína CTLA-4 é expressa principalmente em células T ativadas, possuindo

um papel fundamental na resposta imune, exercendo efeito regulador na ativação de

célula T através da sua ligação com as moléculas da família B7, as quais são expressas

em células apresentadoras de antígenos. Polimorfismos do gene CTLA-4 têm sido

associados a várias doenças autoimunes e, recentemente, à doenças neoplásicas e

infecciosas. A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica, causada pelo fungo

dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. As manifestações clínicas desta doença estão

associadas a vários fatores como a secreção alterada de citocinas,

hipergamaglobulinemia, e depressão da imunidade celular, sendo que a

hiporesponsividade é também atribuída a uma maior expressão de CTLA-4 em células T

de pacientes quando comparados a indivíduos controles. O presente trabalho teve por

objetivo estudar a possível associação dos SNPs -318C/T na região promotora e +49A/G

do éxon 1 do gene CTLA-4 com a PCM. Para isso, 74 pacientes com PCM e 76

indivíduos controles provenientes de regiões distintas do País tiveram suas freqüências

alélicas e genotípicas determinadas. A comparação das freqüências genotípicas e

alélicas, entre os grupos pacientes e controles, não mostrou diferenças significativas que

pudessem associar o polimorfismo dos SNPs -318 e +49 do gene CTLA-4 com a PCM.

A análise dos resultados referentes às freqüências haplotípicas obtidas mostrou que

existe um forte desequilíbrio de ligação (D’=1) entre os SNPs -318 e +49 para os dois

grupos estudados. Porém, a análise realizada não revelou diferenças significativas entre

as freqüências haplotípicas dos grupos. Outro ponto importante analisado foi o estudo da

estrutura genética (ancestralidade) dos grupos de pacientes e controles. Verificou-se que

há predomínio de ancestralidade européia sobre as ancestralidades ameríndia e africana

em ambos os grupos. Através desses resultados foi possível determinar que a população

utilizada no estudo é geneticamente homogênea, e que o resultado negativo da

associação detectado para o gene CTLA-4 e a PCM não está relacionado a

ancestralidade da amostragem. Este trabalho demonstra que não foi observada nenhuma

associação entre o polimorfismo dos SNPs -318 e +49 do gene CTLA-4 com a

resistência e/ou susceptibilidade à Paracoccidioidomicose.

iii

ABSTRACT

The CTLA-4 protein is mainly expressed in activated T cells and plays an

essential role in the immune response through its regulatory effect on T cell activation.

This activity is mediated by the binding of CTLA-4 to molecules of the B7 family that

are expressed by antigen-presenting cells. Polymorphisms of the CTLA-4 gene have

been correlated to several autoimmune pathologies and, more recently, to neoplastic and

infectious illnesses. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the

dimorphic pathogen Paracoccidoides brasiliensis. Its symptoms are associated to

various factors, including altered secretion of cytokines, hypergammaglobulinaemia and

suppression of cellular immunity. This low responsiveness is also attributed to a higher

expression of CTLA-4 in the cells of patients relative to control individuals. This work

aimed at studying possible associations of PCM and two single nucleotide

polymorphisms (SNPs) of CTLA-4, namely -318C/T in the promoter and +49A/G in

exon 1. To this end, 74 PCM patients and 76 controls from different regions of the

country had their allelic and genotypic frequencies determined. The comparison of

genotypic and allelic frequencies had not showed significant differences between patient

and control groups which could associate the CTLA-4 gene SNPs to PCM. The analysis

of results concerning haplotypic frequencies revealed a strong linkage disequilibrium

(D’=1) between SNPs -318 and +49 for the two groups. Nevertheless, the analysis did

not reveal significant differences of haplotypic frequencies between groups. Another

important focus of study was the genetic structure (ancestry) of the patient and control

groups. There was a predominance of European over Amerindian and African ancestries

in both groups. From the results it was possible to determine that the population used in

this study was genetically homogeneous, and that the absence of an association between

polymorphisms of CTLA-4 and PCM cannot be attributed to ancestral bias. This work

shows that there is no association of SNPs -318 and +49 of CTLA-4 and resistance

and/or susceptibility to paracoccidioidomycosis.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos gerais da resposta imunológica

A imunidade é definida, de forma abrangente, como uma reação a microrganismos e

macromoléculas como proteínas e polissacarídeos, independentemente das conseqüências

fisiológicas ou patológicas de tal reação. Porém, o seu equilíbrio é fundamental para garantir a

adequada proteção ao hospedeiro, controlando a resposta inflamatória e os prejuízos

imunopatológicos que possam ser provocados (Abbas & Lichtman, 2005; Butty et al., 2007).

A resposta imune é representada pela imunidade inata ou natural e pela imunidade

adaptativa ou adquirida. A imunidade inata fornece a linha de defesa inicial contra os

microrganismos. Os principais componentes da imunidade inata são: barreiras físicas e

químicas; células NK (natural killers); proteínas do sistema complemento e outras proteínas

plasmáticas; citocinas como interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e

interleucina IL-1; células fagocitárias: células dendríticas (DC), neutrófilos e

monócitos/macrófagos (Medzhitov & Janeway, 1997; Romani, 2004). O processo de

reconhecimento dos antígenos depende dos receptores de reconhecimento padrão (PRR),

presentes em grande diversidade na membrana plasmática de DCs e outros fagócitos, podendo

estar presentes no soro, fluídos de tecidos ou citoplasma celular. Os PRRs reconhecem

moléculas estruturais invariantes comuns a um grande número de patógenos conhecidas como

padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) (Janeway & Medzhitov, 2002). Os

receptores Toll-like (TLR) são os principais PRRs presentes em macrófagos e neutrófilos e

representam uma classe de proteínas transmembrana que reconhecem determinados PAMPs,

ativando vias de sinalização celulares, resultando na indução da expressão de citocinas pró-

inflamatórias e moléculas co-estimulatórias (Pasare & Medzhitov, 2004; Levitz, 2004). Os

componentes da resposta imune inata freqüentemente reagem de modos distintos a diferentes

microrganismos como os intracelulares e extracelulares e, desse modo, influenciam o tipo de

resposta imune adaptativa que se desenvolve (Abbas & Lichtman, 2005).

A imunidade adaptativa possui especificidade para distinguir um grande número de

substâncias microbianas ou não, e habilidade de memória em responder com mais intensidade

a exposições subseqüentes ao mesmo microrganismo. A imunidade adaptativa pode ser

dividida em imunidade humoral e celular. A imunidade humoral é mediada principalmente

pelos linfócitos B e os anticorpos por eles produzidos, enquanto que a imunidade celular é

mediada principalmente pelos linfócitos T e seus produtos como as citocinas (Abbas &

Lichtman, 2005). As células T CD4+ podem se diferenciar em subpopulações de células

efetoras que produzem diferentes citocinas, desempenhando funções distintas. As

subpopulações mais bem definidas são as células Th1 e Th2 (Figura 1) e seu conhecimento

tem sido bastante útil no entendimento dos mecanismos de defesa imunológica em infecções e

também no planejamento de estratégias terapêuticas (Jankovic et al., 2001; Kidd, 2003).

As reações imunes crônicas são normalmente representadas por uma das populações

Th1 ou Th2, e a proporção da subpopulação presente pode determinar a função protetora ou a

conseqüência patológica da resposta (Abbas & Lichtman, 2005). Os linfócitos Th1 e Th2

diferenciam-se a partir de uma célula T precursora denominada Th0 sob influência

principalmente, mas não unicamente, das citocinas produzidas pelas células do sistema imune

logo após a infecção (IL-12 para Th1 e IL-4 para Th2). Por exemplo, em uma resposta típica à

infecção fúngica, ocorre uma produção de IL-12 pelas DCs e macrófagos seguida pela

produção de IFN-γ por linfócitos NK em resposta à IL-12. Isso induz uma resposta mediada

por Th1, que caracteriza a imunidade celular. Por outro lado, a produção inicial de IL-4 pelas

DCs ou por leucócitos como linfócitos B, eosinófilos, basófilos ou mastócitos direciona uma

resposta do tipo Th2, a qual caracteriza a imunidade humoral (Kidd, 2003; Romani, 2004). Os

linfócitos Th1 produzem IFN-γ, TNF β e IL-12 enquanto que os linfócitos Th2 produzem as

interleucinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 entre outros (Jankovic et al., 2001; Kidd, 2003).

A IL-10 é freqëntemente classificada como uma citocina tipo Th2 em camundongo, porém no

homem tanto os linfócitos Th1 como Th2 secretam IL-10 (Katsikis et al., 1995).

Outra subpopulação de célula T auxiliar é a célula Th3, um linfócito T CD4+CD25+

imunoregulador (Treg), que secreta o TGF-β (fator transformador de crescimento beta) e

IL-10 (Letterio & Roberts, 1998). Há fortes evidências de que as Treg sejam especializadas na

atenuação das respostas imunológicas, tendo como função principal a regulação ou supressão

das respostas mediadas por linfócitos Th1 e Th2 (Cavassani et al., 2006). Além das

subpopulações efetoras da linhagem de células auxiliares T CD4+ existem ainda as células

efetoras T CD8+, e elas respondem a microrganismos que podem infectar qualquer célula

nucleada. A diferenciação das células T CD8+ virgens em linfócitos T citolíticos (CTLs)

funcionais requer a participação das células T CD4+. Os CTLs reconhecem e eliminam

células-alvo que expressam peptídios antigênicos estranhos em associação a moléculas MHC

classe I. São capazes de secretar citocinas, principalmente IFN-γ, linfotoxinas e TNF, os quais

atuam na ativação dos fagócitos e induzem a inflamação (Abbas & Lichtman, 2005).

Figura 1. Visão geral da resposta linfocitária. Os linfócitos T possuem o receptor de célula T (TCR),

que reconhece o antígeno apresentado pelas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade

(MHC) presente nas células apresentadoras de antígenos. Os linfócitos T citotóxicos (CD8+)

reconhecem os antígenos apresentados pelas moléculas do MHC-I, eliminando as células infectadas

por microrganismos intracelulares como os vírus, prevenindo sua replicação. Ainda, estes linfócitos,

quando ativados, secretam interferon-γ (IFN- γ), que juntamente com os interferons α e β produzidos

pelas células infectadas, promovem um estado de resistência à infecção viral. Os linfócitos T

auxiliares (CD4+) reconhecem os antígenos apresentados pelas moléculas do MHC-II e podem ser

divididos em duas sup-populações principais: os linfócitos Th1, que secretam IFN- γ e IL-2 os quais

ativam macrófagos e linfócitos T citotóxicos para eliminarem os micorganismos; e os linfócitos Th2,

que secretam IL-4, IL-5 e IL-6 as quais auxiliam na estimulação dos linfócitos B para que estes

produzam anticorpos protetores. Os linfócitos B reconhecem o antígeno de forma direta, ou na forma

de imunocomplexos nas células dendríticas nos centros germinativos (Delves & Roitt, 2000).

De maneira geral, os linfócitos T e B precisam de um duplo sinal para iniciar sua

proliferação e diferenciação em células efetoras, como também para regular a resposta imune

desencadeada por algum processo de ativação. No caso das células T o primeiro sinal, que

garante a especificidade da resposta imunológica subseqüente, é representado pela ligação do

complexo formado pelo peptídio-MHC ao receptor de célula T (TCR) e aos co-receptores

CD4 e CD8. O segundo sinal é gerado pela interação de moléculas co-sinalizadoras das

células apresentadoras de antígenos (APCs) - as proteínas da família B7 - com moléculas co-

sinalizadoras específicas das células T (Chen, 2004; Abbas & Lichtman, 2005). As proteínas

B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86 respectivamente) são os co-sinalizadores mais bem definidos

para as células T e são induzidos nas APCs por moléculas de microrganismos e por citocinas

produzidas durante a resposta imune inata (Parjis & Abbas, 1998). A maioria das moléculas

co-sinalizadoras presentes nas células T são componentes importantes das sinapses

imunológicas (representadas pela superfície celular formada entre a célula T e a APC). Tais

moléculas podem ser classificadas em co-estimulatórias, que amplificam a resposta mediada

pelo TCR e garantem a ocorrência de uma resposta imune celular e em co-inibitórias, que

diminuem este tipo de resposta promovendo a manutenção da homeostase imunológica. A

falta de um sinal co-estimulatório leva a uma diminuição da resposta imune e, em alguns

casos, induz à anergia (falta de resposta à estimulação antigênica) e até mesmo à morte celular

(Parjis & Abbas, 1998; Chen, 2004; Moretta & Bottino, 2004). As moléculas CD28 e

CTLA-4 (antígeno 4 de linfócito T citotóxico) são co-sinalizadores presentes nas células T e

possuem funções complementares na resposta imune (Figura 2). A interação CD28/B7

promove um sinal positivo relacionado à ativação de células T e amplifica a resposta imune

celular; em contraste, a interação CTLA-4/B7 exerce papel regulador, diminuindo a resposta

gerada (Ling et al., 2001; Butty et al., 2007). Outras moléculas têm sido descritas com

funções sinalizadoras na resposta imune como o co-estimulador induzível ICOS, o programa

de morte celular PD-1 e o atenuador de linfócitos B e T – BTLA. Porém, ambos ligam-se a

outros membros da família B7 que não B7-1 e B7-2 (Greenwald et al., 2005).

A imunidade adaptativa tem a função de defesa do hospedeiro contra infecções

microbianas, mas as respostas imunes também podem provocar lesão tecidual e doença. Os

distúrbios causados por respostas imunes são chamados de doenças causadas por

hipersensibilidade. Uma causa comum dessas doenças é a falha da auto-tolerância, a qual

assegura que os indivíduos normalmente não respondam a seus antígenos próprios. As

doenças causadas por falha na auto-tolerância são chamadas de doenças auto-imunes. As

doenças causadas por hipersensibilidade também podem resultar de respostas descontroladas

ou excessivas contra antígenos estranhos, como microrganismos e antígenos ambientais não-

infecciosos (Abbas & Lichtman, 2005).

Figura 2. Complexidade da via co-estimulatória de célula T: CD28/CD152-B7-1/B7-2. Após a

interação peptídeo-MHC/TCR (dados não mostrados), o CD28 interage com B7-2 e posteriormente

com B7-1, expressos nas células apresentadoras de antígenos (APC). Isto resulta na transdução de um

sinal co-estimulatório positivo para a célula T, culminando com a produção de citocinas, expansão

clonal, e prevenção da anergia e morte celular. As células T ativadas expressam então o CTLA-4,

homólogo ao CD28, porém sua interação com B7-1 e B7-2 promove um sinal negativo para a célula T,

resultando em inibição da produção de citocinas e da progressão do ciclo celular, finalizando a

resposta imune. O uso de agentes biológicos como anticorpos monoclonais anti-B7 ou CTLA-4Ig

resulta em anergia da célula T in vitro, e em anergia, deleção, ou indução de células T regulatórias in

vivo (Sayegh, 2004).

Estudos recentes mostram que os genes CTLA-4 e CD28 e alguns de seus

polimorfismos conferem susceptibilidade às doenças auto-imunes e infecciosas por meio da

regulação da ativação de células T. O CTLA-4, expresso principalmente em células T

ativadas, tem papel fundamental na regulação da resposta imune, ligando-se às moléculas B7

presentes nas APCs, funcionando como um regulador negativo da ativação de célula T. Dessa

forma, o papel inibitório do CTLA-4, na manutenção da homeostase das reações imunes e

inflamatórias, tornou-o um gene candidato potencial na determinação de predisposições

genéticas para doenças auto-imunes e infecciosas (Cheng et al., 2006).

1.2. Estrutura do gene e expressão da proteína CTLA-4

O gene CTLA-4 humano foi mapeado no cromossomo 2q33 em humanos por

Dariavach et al. (1988). Este gene possui 7195 kilobases (kb) (Ling et al., 1999), e apresenta

4 éxons (Figura 3), os quais codificam respectivamente o peptídeo de sinalização, o domínio

de ligação ou extracelular, o domínio transmembrana e a região citoplasmática do gene

(Harper et al., 1991; Ling et al., 1999). Está intimamente ligado ao gene CD28 (Harper et al.,

1991) e dentro do domínio extracelular o motivo de ligação às moléculas B7, centralizado nos

aminoácidos MYPPY, corresponde a uma seqüência também encontrada no domínio

extracelular do CD28 (Balzano et al., 1992). O domínio citoplasmático codifica o motivo

YVKM, no qual o estado de fosforilação da tirosina (Y) está relacionado à internalização do

CTLA-4 da membrana plasmática, com subseqüente acúmulo intracelular via endocitose

mediada pela clatrina (Ling et al., 1999).

Embora o CTLA-4 e o CD28 tenham funções opostas, esses dois receptores mostram

similaridade entre os seus genes (ambos localizados no cromossoma 2q33) e suas proteínas

em humanos e camundongos, sugerindo fortemente que ambos os genes são resultado de uma

duplicação gênica que deve ter ocorrido antes da divergência entre as espécies sendo,

entretanto, suficientemente recente para revelar a sua homologia (Harper et al., 1991; Balzano

et al., 1992; Ling et al., 1999; Kristiansen et al., 2000; Gough et al., 2005).

Dois transcritos do gene CTLA-4 são codificados, com 1,8 e 0,8 Kb respectivamente,

gerando duas isoformas conhecidas: flCTLA-4 (isoforma de comprimento total) expressa na

superfície de células T CD4+ e CD8+ ativadas e sCTLA-4 (isoforma solúvel), sendo que esta

última representa uma forma de splicing alternativo do mRNA e não possui o éxon 3, que

codifica o domínio transmembrana. O sCTLA-4 é traduzido, secretado, e está presente no

soro humano, podendo ligar-se às moléculas B7 e inibir a proliferação celular in vitro (Harper

et al., 1991; Ueda et al., 2003; Gough et al., 2005).

A proteína CTLA-4 é expressa em maior quantidade nas células T CD4+ e T CD8+

recentemente ativadas, por meio de indução transcricional ou redistribuição celular (Gough et

al., 2005; Butty et al., 2007). A proteína CD28, nos seres humanos, é expressa de forma

constitutiva em mais de 90% das células T CD4+ e em 50% das células T CD8+. A afinidade

do CTLA-4, comparada ao CD28 para seus ligantes comuns B7-1 e B7-2, é muito maior e

seus níveis de expressão na superfície celular alcançam 1/30-50 dos níveis de CD28 (Jago et

al., 2004; Gough et al., 2005). A molécula B7-1 possui dois sítios de ligação para

CD28/CTLA-4, ao contrário de B7-2 que tem estrutura monomérica. Dado que o CD28

possui apenas um sítio de ligação e menor avidez, a interação B7-1-CTLA-4 é então

favorecida, considerando-se também que B7-1 recruta e estabiliza a molécula de CTLA-4 na

sinapse imunológica, o que não ocorre na interação com o CD28 (Mao et al., 2004; Gough et

al., 2005).

O CTLA-4, em células não-ativadas, localiza-se intracelularmente em vesículas

semelhantes a lisossomos secretores. Enquanto uma quantidade significativa da proteína

CTLA-4 é transportada para a superfície celular após a estimulação pelo TCR, ela também é

rapidamente endocitada através do complexo adaptador da clatrina (AP-2) e, portanto, apenas

uma pequena porção continua presente na superfície celular sob condições controladas

(Shiratori et al., 1997; Gough et al., 2005). O domínio citoplasmático defosforilado do

CTLA-4 interage com AP-2, resultando na rápida endocitose do CTLA-4 da superfície

celular; porém, quando este domínio está fosforilado, o CTLA-4 é estabilizado na superfície

(Egen et al., 2002).

1 2 3 4

Peptídeo de

sinalização

Domínio de

Ligação

Domínio

Transmembrana

5’

3’

Região

Citoplasmática

flCTLA-4

sCTLA-4

1 3 42

5’ UTR

Promotor

3’ UTR

Figura 3. Representação esquemática das isoformas codificadas pelo CTLA-4. Em flCTLA-4

(isoforma de comprimento total) estão representados os éxons 1, 2, 3 e 4. Em sCTLA-4 (isoforma

solúvel) verifica-se a ausência do éxon 3 (adaptado de van Oosterhout et al., 2004).

Segundo Gough et al. (2005) o padrão do controle de expressão de CTLA-4 pode ser

explicado pelo fato de que a restrição do mesmo na superfície celular permite uma melhor

interação entre o CD28 e seus ligantes, favorecendo a ativação de célula T, enquanto que a

rápida alteração na expressão de CTLA-4 na sinapse imunológica, após a ativação da célula

T, permite um sistema inibitório finamente regulado. Como a função do CTLA-4 está

intimamente relacionada à sua expressão, Jago et al. (2004) determinaram a cinética de

regulação do CTLA-4 em vários subtipos de células T, incluindo as células T não-ativadas,

células T de memória, as células Treg CD4+CD25+ e as não-regulatórias. Eles observaram

que, assim como o CTLA-4 de superfície celular pode ser recrutado de estoques

intracelulares, a presença de reservatórios pré-existentes poderia ter um papel importante

determinando a capacidade para expressão na superfície. Seus resultados mostraram que as

células T não-ativadas possuem um reservatório intracelular pequeno enquanto que as células

T de memória possuem um reservatório maior de CTLA-4. Foram verificados também níveis

intracelulares significantes de CTLA-4 em células CD4+CD25+, confirmando sua ação em

células Treg. Eles verificaram ainda que, após serem estimuladas, as células Treg e as células

T de memória mantinham a expressão de CTLA-4 na superfície celular por mais tempo que as

células T não-ativadas e as células não-regulatórias. Isso sugere que a manutenção da

expressão de CTLA-4 na superfície celular pode ser mais importante que os níveis de

expressão das células não-ativadas, e que os níveis intracelulares de CTLA-4 podem estar

relacionados ao histórico de estímulos pelo qual a célula foi submetida (Jago et al., 2004).

1.3. O CTLA-4 e a susceptibilidade às doenças

1.3.1. A proteína CTLA-4

Doenças auto-imunes como diabetes tipo I (TID), o hipotireoidismo auto-imune

(AIH), a doença de Graves (GD) e a artrite reumatóide (RA) acontecem por uma falha em um

ou mais mecanismos do sistema imunológico, que estabelecem e mantêm a não-

responsividade ou tolerância ao próprio organismo. Como as doenças citadas estão

regularmente agrupadas nas mesmas famílias, é provável que elas compartilhem a mesma

base genética. De fato, o risco a essas doenças tem sido associado com a mesma região no

cromossoma 2q33, a qual contém os genes reguladores dos linfócitos T (CD28, CTLA-4 e

ICOS), que são os únicos genes funcionais dessa região (Ueda et al., 2003). A importância do

CTLA-4 nos mecanismos de homeostase do sistema imunológico é evidenciada através da

observação de que camundongos nocauteados para o gene CTLA-4 desenvolvem

espontaneamente desordens linfoproliferativas acompanhadas pela infiltração letal de muitos

órgãos por células T policlonais (Tivol et al., 1995; Chen, 2004; Abbas, 2005).

Adicionalmente, as respostas auto-imunes nesses camundongos sofrem influência do CD28,

pois a sua ausência elimina a doença linfoproliferativa anteriormente instalada. Isso confirma

que a co-estimulação por CD28 é suprimida pela sinalização de CTLA-4 (Chen, 2004;

Moretta & Bottino, 2004). Uma variante do CTLA-4 denominada liCTLA-4 não possui o

éxon 2, que codifica o domínio de ligação, sendo portanto incapaz de se ligar às moléculas

B7-1 e B7-2. A proteína liCTLA-4 é capaz de inibir a função de células T atuando sobre o

TCR. Esta forma alternativa do CTLA-4 tem uma ligação genética com diabetes tipo I em

camundongos diabéticos não-obesos (NOD), e sua expressão está aumentada em células Treg

e células de memória dos camundongos resistentes a essa doença, sugerindo que o aumento da

sinalização negativa fornecida pelo liCTLA-4 pode regular o desenvolvimento de doenças

auto-imunes mediadas por células T (Vijayakrishnan et al., 2004; Moretta & Bottino, 2004).

Além da correlação do CTLA-4 com doenças auto-imunes, alguns grupos estudaram o

papel dessa molécula em doenças infecciosas. Martins et al. (2004) estudaram os efeitos

decorrentes do bloqueio do CTLA-4 na parasitemia de camundongos infectados por

Trypanosoma cruzi e verificaram que isso aumentava a produção de IFN-γ , TNF-α e óxido

nítrico (NO), que são fatores importantes envolvidos na resistência à infecção pelo T. cruzi,

resultando em uma diminuição da parasitemia. Da mesma forma, verificou-se que o bloqueio

da molécula de CTLA-4 aumenta a resistência à infecção pela Leishmania donovani (Murphy

et al., 1998) e pelo Nippostrongylus brasiliensis (McCoy et al., 1997). No caso da infecção

causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) a expressão diferenciada de CTLA-4

pode provocar diferentes efeitos em circunstâncias especiais. É sabido que células T CD4+

ativadas estão relacionadas à multiplicação aumentada do HIV. A maior expressão de

CTLA-4 nessas células poderia refletir no controle da replicação viral durante a fase aguda da

infecção, diminuindo a ativação celular e conseqüentemente a replicação viral. Já durante a

fase crônica, o efeito da expressão aumentada de CTLA-4 poderia estar relacionado com uma

maior depleção de células T CD4+ e CD8+ através de anergia e apoptose, diminuindo ainda

mais a resposta imune contra o vírus, acelerando o curso da doença (Shao et al., 2006).

Cavassani et al. (2006) demonstraram que células Treg com expressão aumentada de CTLA-4

estavam presentes nas lesões e no sangue periférico de pacientes com paracoccidioidomicose

(PCM), sugerindo uma potencial função dessas células em regular a ação efetora das APCs e

das células T. Campanelli et al. (2003) investigaram a participação de moléculas co-

sinalizadoras na hiporesponsividade celular verificada em pacientes com PCM, avaliando a

cinética de expressão de CD28 e CTLA-4 nesses pacientes comparados a indivíduos controle.

Eles verificaram que a expressão de CD28 era muito similar em células do sangue periférico

de pacientes e controles. Em contraste, a expressão de CTLA-4 em células de pacientes com

PCM era significativamente maior que dos indivíduos controle, indicando que a expressão do

CTLA-4 poderia estar envolvida na hiporesponsividade encontrada nas células mononucleares

do sangue periférico dos pacientes com PCM.

Atualmente estão sendo estudadas aplicações terapêuticas para as moléculas co-

inibitórias. O bloqueio destas moléculas por antagonistas, como anticorpos monoclonais,

poderia levar ao aumento da resposta de células T, podendo ser aplicado na promoção da

imunidade celular contra antígenos tumorais ou infecções virais. Ao contrário, o uso de

agonistas dessas moléculas poderia suprimir a resposta imune mediada por células T e ser

aplicado no tratamento de doenças auto-imunes, rejeições de transplantes e respostas

inflamatórias. Em alguns modelos clínicos, a proteína de fusão CTLA-4-Ig tem sido testada

em uma variedade de doenças incluindo psoríase severa e artrite reumatóide, promovendo

benefícios clínicos como a diminuição da resposta imune celular sem efeitos colaterais graves,

podendo induzir uma diminuição transitória ou permanente da resposta imune em portadores

dessas doenças (Chen, 2004).

1.3.2. O polimorfismo no gene CTLA-4

Os polimorfismos correspondem a alterações na seqüência de nucleotídeos em

membros individuais da população. O tipo mais simples de polimorfismo é o SNP, onde há

uma mutação de base única, que substitui um nucleotídeo por outro. Os SNPs não

necessariamente possuem alguma relevância no desenvolvimento de doenças; eles podem ser

variantes anônimas dentro de/ou entre genes, ou podem ser funcionais, mutações causais.

Existem mais SNPs no genoma humano do que qualquer outro tipo de polimorfismo.

Aproximadamente três milhões de variantes foram relatadas e catalogadas em um banco de

dados público (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) (Cardon & Palmer, 2003).

Polimorfismos envolvendo a região promotora do CTLA-4 (-318 C/T), o éxon 1 (+49

A/G), e a região 3’UTR [microsatélite (AT)n] têm sido estudados por apresentarem ligação

com várias doenças auto-imunes e, recentemente, com algumas doenças neoplásicas e

infecciosas. O primeiro SNP, -318 C/T, mostra a substituição de uma citosina por uma timina

(Deichmann et al., 1996) e poderia influenciar os níveis de expressão gênica do CTLA-4

devido à sua localização na região promotora (Holopainem et al., 2004); o segundo, +49 A/G,

mostra a substituição de uma adenina por uma guanina, que leva à troca do aminoácido

treonina por alanina do códon 17 do peptídeo sinal (Nistico et al., 1996); e, finalmente, o

polimorfismo microsatélite (AT)n, com pelo menos 23 alelos diferentes contendo repetições

que variam de 7 a 30 AT (Polymeropoulos et al., 1991). Alguns autores identificam este

polimorfismo de diferentes formas, que podem ser baseadas nos tamanhos dos produtos de

PCR em pares de base (bp) ou de acordo com o número de repetições. A repetição (AT)n

pode afetar a estabilidade do mRNA do CTLA-4 e, conseqüentemente, o nível de expressão

deste gene (Huang et al., 2000).

Trabalhos recentes mostram a relação entre o polimorfismo na posição +49 do éxon 1

e a regulação negativa exercida sobre a ativação da célula T. Este polimorfismo afeta a

função inibitória do CTLA-4, sendo que o alelo +49G está associado a uma resposta

proliferativa celular T aumentada (Kouki et al., 2000). Segundo estes autores, algumas

hipóteses poderiam explicar a ocorrência causada pelo polimorfismo, que afeta a seqüência

líder através: a) do nível de expressão da proteína; b) transporte intracelular de CTLA-4 e, c)

ativação diminuída da via de sinalização negativa ou ainda diminuição da apoptose.

Posteriormente, Mäurer et al. (2002) avaliaram a alteração funcional envolvendo o

polimorfismo +49A/G com a ativação da célula T e localização intracelular. Eles

demonstraram padrões qualitativamente diferentes de distribuição intracelular do CTLA-4

entre indivíduos com os genótipos G/G e A/A na posição +49, além de notarem uma resposta

proliferativa aumentada em células T dos indivíduos com o genótipo G/G. Gough et al.

(2005) verificaram que maiores quantidades de mRNA de sCTLA-4 eram produzidas por

indivíduos portadores dos genótipos A/A (considerado então protetor para doenças auto-

imunes) ao contrário dos portadores de G/G, enquanto que nenhuma diferença foi observada

para a isoforma flCTLA-4. Ainda, verificaram que a razão entre o mRNA de sCTLA-4 e

flCTLA-4 era 50% menor em células T CD4+ não estimuladas de indivíduos portadores do

genótipo GG comparada aos portadores de AA. Esses resultados demonstram que os alelos

susceptíveis associados a esta região podem determinar a eficiência da produção de sCTLA-4,

com o haplótipo susceptível à doença produzindo menor quantidade do transcrito de sCTLA-4

do que o haplótipo protetor.

De acordo com Anjos et al. (2002) a associação com diabetes tipo 1 tem se limitado a

um haplótipo abrangendo o CTLA-4 mas não os genes adjacentes. O haplótipo é composto

dos três polimorfismos já citados, que estão em desequilíbrio de ligação (LD) entre si e, por

causa disto, alguns estudos funcionais seriam necessários para definir as variantes etiológicas.

Entenda-se por LD a situação na qual uma determinada combinação de alelos, chamada de

haplótipo, encontra-se numa freqüência estatisticamente diferente daquela esperada caso os

alelos estivessem associados aleatoriamente (Lewontin, 1988). Dessa forma, Anjos et al.

(2002) apresentaram um modelo onde o polimorfismo da região +49G/G provoca a alteração

do tráfego intracelular de CTLA-4 por meio de diferenças no processo de glicosilação da

proteína. Este processo compromete sua expressão na superfície celular em cerca de um terço

a menos do que a quantidade de proteína expressa pelos homozigotos +49A/A, favorecendo a

ativação celular aumentada e levando a uma maior predisposição às doenças auto-imunes.

O primeiro caso relatado sobre a associação entre polimorfismo no gene CTLA-4 e

doença auto-imune foi na doença de Graves, descrito por Yanagawa et al. (1995), envolvendo

o microsatélite (AT)n na região 3’UTR. Eles verificaram a presença de 21 alelos diferentes,

variando entre 88 e 134 bp, na população caucasiana estudada. Nas análises de associação, as

freqüências de genótipos entre pacientes e controles diferiram significativamente e tal

diferença foi atribuída à alta freqüência do alelo de 106 bp entre os pacientes com doença de

Graves. No ano seguinte, Nistico et al. (1996) relataram a associação entre o SNP +49 A/G

com o diabetes tipo 1 e a doença de Graves, onde o alelo +49G mostrou estar em

desequilíbrio de ligação com o alelo microsatélite de 106 bp. Vários outros estudos foram

realizados envolvendo o SNP +49 A/G e sua associação com diabetes tipo 1 (Anjos &

Polychronakos, 2003; Zalloua et al., 2004; Kavvoura & Ioannidis, 2005) e doença de Graves

(Badenhoop & Seidl, 2003; Furugaki et al., 2004; Yanagawa et al., 2007).

Estudos funcionais têm evidenciado que os polimorfismos das posições -318 e +49,

juntamente com os haplótipos resultantes das variantes desses loci exercem um efeito

funcional diferente na regulação negativa exercida pelo CTLA-4 na ativação celular (Yee et

al., 2003). Ligers et al. (2001) verificaram que os indivíduos com esclerose múltipla

portadores de timina (T) na posição -318 do promotor, e homozigotos para adenina (A) na

posição +49 do éxon 1, têm uma expressão significativamente aumentada tanto da proteína

CTLA-4 na superfície celular após estimulação quanto do mRNA de CTLA-4 em células não-

estimuladas. Experimentos realizados em células T por Wang et al. (2002) mostraram que o

alelo -318T estava associado a uma alta atividade promotora do gene CTLA-4, considerando

a presença do alelo como uma fator protetor para doenças auto-imunes.

Ueda et al. (2003) seqüenciaram uma região de mais de 300 Kb contendo o CD28,

CTLA-4 e ICOS e dos 108 SNPs verificados apenas esse, na posição +49 do éxon 1 do

CTLA-4 (+49A/G), mostrava alteração do aminoácido. Neste mesmo trabalho, que também

estudou a região microsatélite (AT)n na região 3’UTR, os autores sugeriram que nenhum dos

polimorfismos estudados para as regiões de CD28 e ICOS estavam associados a doença de

Graves. Porém, observou-se que a variante causal da doença estava provavelmente localizada

dentro de uma região em desequilíbrio de ligação (LD) contendo o CTLA-4 e a região 5’ de

ICOS. Cinco outros SNPs do gene CTLA-4 mostraram associação mais forte com a doença de

Graves sendo eles denominados CT60, MH30, JO30, JO31 e JO27. Dentre esses, o CT60 (A/

G) mostrou associação também com diabetes tipo 1 e hipotireoidismo auto-imune. A redução

dos níveis de mRNA de sCTLA-4 produzidos pelo haplótipo susceptível à doença (CT60

G/G) poderiam reduzir o bloqueio das moléculas B7-1 e B7-2, causando um aumento da

ativação celular através de CD28 ou ainda uma menor estimulação dessas moléculas pelo

sCTLA-4 em DCs imaturas. As correlações já publicadas entre a ativação de células T in

vitro e o genótipo de CTLA-4 poderiam ser explicadas pela variação nos níveis de sCTLA-4.

Além da verificação de que o alelo G para este SNP provoca a redução do sCTLA-4,

verificou-se também a associação deste SNP com a freqüência de células T reguladoras,

sendo que indivíduos homozigotos para o alelo A apresentavam um aumento na freqüência

dessas células, relacionando o polimorfismo de CT60 com variações nas respostas imunes

adaptativas tanto para antígenos próprios quanto para patógenos (Sowsan et al., 2005). Outro

SNP foi identificado no CTLA-4 e encontra-se na posição +1822(C/T) no íntron 1, com

relatos de associação com diabetes tipo 1 e a doença de Graves, em desequilíbrio de ligação

com o SNP +49(A/G) do éxon 1 (Holopainem et al., 2004).

Estudos subseqüentes foram realizados envolvendo os polimorfismos citados para o

gene CTLA-4, isolados ou associados, relacionando os mesmos a uma série de outras doenças

auto-imunes, incluindo a doença celíaca (Djilali-Saiah et al., 1998; van Belzen et al., 2004;

Holopainem et al., 2004), o lupus eritematoso sistêmico (Barreto et al., 2004; Lee et al.,

2005), a doença de Addison (Blomhoff et al., 2204), e o hipotireoidismo auto-imune

(Akamisu et al., 2000; Tomer et al., 2001; Zalatel et al., 2006). Com relação à psoríase, os

resultados obtidos referentes às análises dos polimorfismos em indivíduos portadores dessa

doença não mostraram associação alguma (Luszczek et al., 2006). Em recente meta-análise

Han et al. (2005) confirmaram a associação do polimorfismo +49A/G em pacientes

portadores de artrite reumatóide. Já, o mesmo tipo de estudo, realizado por Bagos et al.

(2007) descarta a participação dos SNPs +49 e -318 em pacientes com esclerose múltipla.

Todos esses dados são importantes no entendimento do papel do CTLA-4 na patogênese de

doenças auto-imunes (Mäurer et al., 2002; Chistiakov & Turakulov, 2003), e também servem

de base para o estudo dos polimorfismos desse gene e sua correlação com outras patologias

(Tabela I). Recentemente, a verificação da ocorrência de polimorfismos no gene CTLA-4 em

doenças tumorais e infecciosas mostraram que o conceito de genótipo protetor e genótipo

susceptível, ligado às doenças auto-imunes, não tem o mesmo significado quando há tentativa

de correlação com essas outras doenças. Ghaderi et al. (2004) verificaram que o genótipo

+49(AA), considerado protetor para algumas doenças auto-imunes, está correlacionado com a

progressão do câncer de mama, admitindo-se o fato de que indivíduos que possuem o

genótipo AA expressam níveis maiores da proteína CTLA-4, regulando negativamente a

resposta imune celular contra as células tumorais. A especulação sobre a perpetuação do alelo

G durante a evolução, a despeito da desvantagem da susceptibilidade relacionada à auto-

imunidade, seria relacionada a uma defesa mais efetiva contra as doenças infecciosas.

Thio et al., (2004) estudaram a hipótese de os diferentes haplótipos e SNPs do

CTLA-4 poderem explicar algumas das diferenças que ocorrem entre os indivíduos no

processo de recuperação da infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Eles sugeriram que

haplótipos contendo o alelo +49G sozinho ou com o alelo -1722C estavam associados com a

recuperação da infecção, considerando que eles podem alterar a habilidade do CTLA-4 em

regular negativamente a resposta imune. Segundo esses autores o vigor desse mecanismo

provavelmente contribui para a resolução da infecção pelo HBV. Ainda, o SNP da posição

-318C/T do sítio promotor, na maioria dos relatos, não parece estar associado com doenças

auto-imunes (Gough et al., 2005), porém alguns trabalhos sugerem que exista uma forte

ligação entre este SNP com o +49 do éxon 1 (Kristiansen et al., 2000; Liegers et al., 2001) e

ainda mostram a sua maior freqüência em mulheres com papiloma vírus humano (HPV),

sugerindo que este SNP possa estar envolvido na persistência do vírus com o possível

desenvolvimento do câncer de colo de útero (Su et al., 2007).

Variantes de DNA que alteram mecanismos fisiológicos, bioquímicos e imunológicos

envolvidos em uma doença são, por si só, fatores de risco primários naturais. A demonstração

de efeitos funcionais associados com uma variante de DNA é um passo importante na

tentativa de correlacionar tal variante com a patogênese da doença (Gough et al., 2005).

Alterações genéticas exercem impacto em algumas doenças auto-imunes, neoplásicas e

infecciosas em humanos e modelos animais. Como o CTLA-4 exerce um papel

imunomodulador importante, variações genéticas que promovam uma falha nesse mecanismo

são de total relevância no que se refere ao estudo dos mais diversos tipos de doenças. Vários

trabalhos sugerem que a região do CTLA-4 é um locus importante para as doenças auto-

imunes de uma forma geral, tendo focado nos três polimorfismos mais estudados do gene

CTLA-4: -318C/T na região do sítio promotor, +49A/G do éxon 1 e (AT)n na região 3’ UTR.

Estes três polimorfismos têm mostrado associações com algumas doenças, embora nenhum

deles tenha sido identificado como sendo a variante causal. As associações com variantes não-

causais provavelmente ocorrem em locais como a região do CTLA-4, onde há um forte

desequilíbrio de ligação (King et al., 2003). No entanto, apenas um mapeamento rigoroso do

CTLA-4 e dos genes vizinhos pode afirmar essa hipótese (Gough et al., 2005).

Tabela I. Alterações funcionais e algumas patologias associadas ao SNP +49A/G, de forma

isolada ou em associação com outros polimorfismos.

SNP +49 (alelo A)

Alterações funcionais:

* aumento de mRNA de sCTLA-4 (Gough et al., 2005)

* aumento na expressão da proteína de superfície em associação com o alelo -318T (Ligers et

al., 2001)

Patologias associadas:

* progressão do câncer de mama (Ghaderi et al., 2004)

* infecção crônica pelo vírus da hepatite B (Thio et al., 2004)

___________________________________________________________________________

SNP +49 (alelo G)

Alterações funcionais:

* diminuição da expressão na superfície celular com conseqüente proliferação celular T

aumentada (Kouki et al., 2000; Mäurer et al., 2000)

Patologias associadas:

* Diabetes mellitus tipo 1 (Harbo et al., 1999; Anjos et al., 2002; Kavvoura & Ioannidis,

2005)

* Artrite reumatóide (Han et al., 2005)

* Lupus eritematoso sistêmico (Lee et al., 2005)

* Doença de Graves, em associação com o alelo de 106bp (AT)n (Nistico et al., 1996)

1.4. A paracoccidioidomicose (PCM)

1.4.1. O fungo Paracoccidioides brasiliensis e as características gerais da PCM

A PCM é uma doença sistêmica, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides

brasiliensis, encontrada com maior prevalência na América Latina (Restrepo, 1985). O Brasil

é o centro endêmico, possuindo 80% dos casos relatados, sendo os estados de São Paulo,

Goiás, Minas Gerais e Mato Grosso os mais afetados. Acometendo principalmente a

população rural, provavelmente devido ao contato contínuo com o habitat do fungo, a PCM é

a oitava causa de mortalidade por doença crônica (entre as infecciosas e parasitárias) e a

primeira entre as micoses sistêmicas no Brasil (Coutinho et al., 2002). Estima-se que existam

cerca de 10 milhões de indivíduos infectados na América Latina e que 2% destes

desenvolvam a doença (Restrepo, 1985).

A incidência da PCM ocorre numa taxa de 78:1 em adultos do sexo masculino quando

comparados àqueles do sexo feminino (Restrepo et al., 1984). O fato desse perfil não ser

verificado em indivíduos infectados antes da puberdade e que a exposição ao fungo é

praticamente igual para ambos os sexos levou à hipótese de que os hormônios sexuais

femininos interferem na infecção do fungo (Kerr et al., 1984; Restrepo, 1984). De fato,

Restrepo et al. (1984), Salazar et al. (1988) e Sano et al. (1992) mostraram a presença de

proteínas que atuam como receptores do 17-β-estradiol no citosol das células fúngicas. Esses

estudos demonstraram, in vitro, que esse estrógeno tem a capacidade de inibir a transição do

micélio para levedura. Posteriormente, Aristizabal et al. (1998) demonstraram que fêmeas de

camundongos infectadas por via intranasal com conídios de P. brasiliensis inibiram a

transformação dessas células para levedura.

A infecção envolve primariamente os pulmões, local da lesão primária, através

da inalação de conídios ou fragmentos de micélios pelas vias aéreas superiores, que na

temperatura corpórea sofrem a transição para a forma leveduriforme e podem, ou ser

eliminadas pelo sistema imune ou persistir, produzir lesão tecidual e se espalhar pelo resto do

organismo (Restrepo, 1985; Newman et al., 1990). O contágio também pode acontecer

através de lesões na mucosa oral ou na pele provocadas por trauma. As lesões secundárias

freqüentemente aparecem nas membranas mucosas, linfonodos, pele e glândulas adrenais

(Domer et al., 1992; Brummer et al., 1993). A evolução e as conseqüências da infecção vão

depender de fatores relacionados ao fungo, como virulência e composição antigênica; e do

hospedeiro, como características genéticas, imunidade e ao meio ambiente (Restrepo, 1985;

Calich et al., 1985 e 1987). Acredita-se que os fungos causadores de micoses sistêmicas

utilizem mecanismos de patogenicidade e/ou virulência, como capacidade de adesão,

colonização, disseminação, sobrevivência em ambientes hostis e escape dos mecanismos de

resposta imune para se estabelecerem no hospedeiro e causarem doença (Franco, 1987). A

virulência fúngica é um evento complexo resultante da regulação de diversas vias de

sinalização que culminam na ativação de um conjunto de genes em diferentes estágios da

infecção, e cuja conseqüência está fortemente associada ao estabelecimento da patogênese.

Em P. brasiliensis, as adesinas envolvidas na interação do fungo com as células do

hospedeiro têm sido correlacionadas à virulência e patogenicidade, destacando-se a

glicoproteína 43 (gp43) (Gesztesi et al., 1996), uma adesina de 30 kDa (Andreotti et al.,

2005) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Barbosa et al., 2006), a gp70 (Grosso et al.,

2003), e a paracoccina (Coltri et al., 2006).

A PCM caracteriza-se como uma doença de padrão granulomatoso. O granuloma, a

lesão fundamental desta doença, é resultante de uma reação de hipersensibilidade tardia

(DTH) contra antígenos do agente infeccioso que permite a restrição do patógeno prevenindo

a sua disseminação pelo organismo (Romani, 1997). Fagócitos mononucleares, plasmócitos,

neutrófilos, eosinófilos e fibroblastos estão presentes no granuloma (de Brito & Franco,

1994), no entanto, a principal célula constituinte é o macrófago, que tem por funções a

liberação de substâncias microbicidas (óxido nítrico, radicais superóxido e peróxido de

hidrogênio), a apresentação de antígenos e o recrutamento de linfócitos T para a produção de

citocinas que variam de acordo com a susceptibilidade do hospedeiro. A atividade de

linfócitos T e a resposta granulomatosa são características das formas localizadas da infecção,

enquanto que nas formas disseminadas não se observa formação de granulomas epitelióides

(Murphy, 1998; Camargo e Franco, 2000). Ao mesmo tempo, o microrganismo pode se

beneficiar da formação do granuloma. Por se tratar de um microambiente isolado, o

granuloma apresenta um ecossistema especial para o patógeno no hospedeiro. A lesão

granulomatosa pode ser um reservatório do qual o patógeno sobrevivente emerge para reativar

a infecção após um longo período de latência, rompido por alguma falha no sistema imune

(Chan & Flynn, 2004). Silva et al. (2008), com a finalidade de compreender a complexa

interação entre as células hospedeiras e leveduras de P. brasiliensis, analisou a modulação de

genes imunoregulatórios após a infecção de macrófagos peritoniais de camundongos por este

patógeno. A análise do perfil transcricional dessas células revelou que o patógeno interage

com os macrófagos modulando genes envolvidos no processo pró-inflamatório (ex: Irak2,

Il7r, Cxcl1), proteínas relacionadas à membrana e fagocitose (ex: Clec1b, Ddr1), regulação da

transcrição de citocinas e quimiocinas (ex: Stat1), transdução de sinal (ex: Rasa3, Grb2) e

apoptose (Gzma), na tentativa de aumentar a eficiência da resposta imune tanto inata quanto

adaptativa contra o fungo.

1.4.2. Formas clínicas da PCM

Existem duas diferentes formas da PCM, a infecção (assintomática) e a doença

(sintomática), podendo esta última ser subdividida em aguda (juvenil) ou crônica (adulto). A

forma aguda apresenta evolução rápida e lesões multifocais, comumente acometendo jovens

de ambos os sexos, com deterioração do estado geral e evidente comprometimento do sistema

retículo-endotelial (linfoadenomegalia e hepatoesplenomegalia). A forma crônica é

responsável por mais de 90% dos casos de PCM, com evolução lenta e silenciosa,

acometendo principalmente adultos do sexo masculino, tendendo a ser localizada, geralmente

apresentando lesões granulomatosas pulmonares (Franco et al., 1993). Em 25% dos casos, os

pulmões são os únicos órgãos afetados (forma crônica unifocal). Os sintomas respiratórios são

inespecíficos e incluem tosse, expectoração, perda de fôlego, sendo que anorexia, febre e

perda de peso são também usualmente relatados. Entretanto, em alguns casos, o envolvimento

pulmonar unifocal é silencioso, o que leva os pacientes a procurarem cuidados médicos

somente após a disseminação do fungo (via corrente sangüínea ou sistema linfático) ter

ocasionado lesões extra-pulmonares (forma crônica multifocal). Nessa forma clínica, os

sintomas são variáveis e estão relacionados a mais de um órgão ou sistema, sendo que as

lesões frequentemente ocorrem na mucosa oral e nasal, pele, linfonodos e glândulas adrenais

(Franco et al., 1993; Shikanai-Yasuda et al., 2006).

1.4.3. Resposta imunológica da PCM

A defesa imunológica do hospedeiro mamífero contra as micoses sistêmicas é

complexa e multifatorial, dependendo de mecanismos inatos e adaptativos (Huffnagle &

Deepe, 2003; Romani, 2004). A importância de qualquer um desses mecanismos na

resistência às infecções fúngicas sistêmicas pode variar conforme o agente infeccioso, de tal

maneira que os fatores da resposta inata teriam uma maior importância na ação contra os

fungos oportunistas como C. albicans, A. fumigatus, C. neoformans do que contra fungos

patogênicos primários como C. immitis, H. capsulatum, B. dermatitidis e P. brasiliensis

(Schaffner et al., 1986; Cutler et al., 2007). Nas últimas décadas, diversos trabalhos vêm

demonstrando que a resistência aos fungos causadores de micoses sistêmicas como C.

albicans, A. fumigatus, C. neoformans, C. immitis, H. capsulatum, B. dermatitidis e P.

brasiliensis está associada a uma resposta imunológica celular efetiva, enquanto que a

susceptibilidade está associada a uma resposta predominantemente humoral (Romani, 2004,

Abbas & Lichtman, 2005). Durante uma resposta imunológica a agentes infecciosos, em

muitos casos, não há uma absoluta restrição na ativação de linfócitos Th1 ou Th2. Entretanto,

em algumas enfermidades, há uma clara dominância de uma ou outra subpopulação de

linfócitos auxiliares, e uma falha na ativação da subpopulação apropriada pode ocasionar

resultados desastrosos para o hospedeiro (Cavassani et al., 2006).

Na PCM humana e experimental ocorre uma extensa variação da resposta

imunológica, cujo grande espectro de manifestações clínicas depende principalmente do nível

de supressão da imunidade celular. Assim, formas severas de PCM são caracterizadas por

distúrbios imunológicos como alterações na razão de subpopulações de linfócitos T, DTH,

prejudicada, produção de citocinas que inibem o desenvolvimento de uma resposta imune

celular efetiva e supressão da proliferação de linfócitos T (Bocca et al., 1998; Campanelli et

al., 2003; Cavassani et al., 2006). A resposta imune celular é a principal defesa contra o P.

brasiliensis sendo que a resistência à infecção está relacionada à presença do IFN- γ e outros

tipos de citocinas Th1 como IL-2 e também IL-10, enquanto que a susceptibilidade à infecção

está relacionada ao padrão celular Th2, com a presença das interleucinas IL-4, IL-5, IL-13 e

IL-10 (Bernard et al., 2001; Bozzi et al., 2004).

Mamoni et al. (2002) observaram no soro de pacientes com a forma aguda e a forma

crônica multifocal um padrão de citocinas do tipo Th2 (IgE anti-GP-43, IgA, IgG4 e

eosinófilos aumentados) quando comparados com pacientes portadores da forma crônica

unifocal. Posteriormente Mamoni et al. (2006) ampliaram seus estudos por meio da avaliação

da expressão intracelular de IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-10, IL-12 em células mononucleares do

sangue periférico (PBMC) de pacientes com a forma aguda e forma crônica da doença, além

de indivíduos sensibilizados para o fungo (Pb infecção). Um perfil condizente com uma

resposta predominantemente Th1 foi encontrado nos indivíduos sensibilizados. Esse perfil era

caracterizado por um número elevado de linfócitos T expressando IFN-γ, TNF-α, IL-2, com

baixos níveis dessas células positivas para IL-10. Apesar de uma polarização clara Th2 não ter

sido evidenciada nos pacientes com a forma aguda neste trabalho, uma baixa produção de

citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, além de um grande número de células expressando

IL-10 foram encontradas.

Bozzi et al. (2004), estudando a resposta imune celular em pacientes com PCM não-

tratados e em diferentes períodos de tratamento, verificaram que os níveis de IFN-γ aumentam

e os de IL-4 diminuem com o tratamento. Além disso, verificaram que linfócitos CD4+ e

CD8+ no grupo de indivíduos não-tratados mostraram expressão reduzida da molécula co-

estimulatória CD28 após estimulação antigênica, e uma presença aumentada de células B

expressando B7-2 em todos os grupos, que concorda com a grande quantidade de anticorpos

específicos não-protetores encontrados nos indivíduos com PCM, além do possível papel de

B7-2 em sinalizar para a produção de IL-4 e contribuir com o fenótipo celular Th2. Este

mesmo trabalho verificou ainda a expressão celular de CTLA-4 e não encontrou diferenças

significativas da sua expressão nas diferentes fases do tratamento dos indivíduos com PCM,

apesar de constatar uma regulação nos níveis de CD4+CD28+ com o tratamento. Outros

estudos envolvendo o fungo P. brasiliensis e a PCM realizados por Cavassani et al. (2006)

verificaram que a hiporesponsividade imune celular presente na PCM está relacionada a

alguns fatores como a secreção alterada de citocinas, a apoptose de células T induzida por

Fas-FasL e também pela participação do CTLA-4. Observa-se uma maior expressão dessa

proteína em pacientes portadores de PCM do que em indivíduos controles. Além disso, a

presença de células Treg (que expressam quantidades aumentadas de CTLA-4) no sangue e

nas lesões de pacientes com a forma crônica de PCM sugere uma regulação da resposta imune

sistêmica e local nessa doença. Masteller et al. (2000) mostraram que o domínio

citoplasmático de CTLA-4 contribui na regulação do balanço Th1/Th2 da resposta imune.

Isso poderia ocorrer através da habilidade do domínio citoplasmático iniciar a transdução de

sinal ou ainda como resultado da sua habilidade em reposicionar o CTLA-4 para sítios

específicos durante a ativação da célula T. Greenwald et al. (2001), utilizando camundongos

nocauteados para CTLA-4, sugeriram um desvio da resposta imune para o perfil Th2,

indicando que CTLA-4 normalmente opõe-se ao fenótipo Th2. Campanelli et al. (2003)

verificaram que o bloqueio simultâneo de Fas e CTLA-4 resulta em aumento significativo da

proliferação celular em pacientes com PCM, apontando seu envolvimento na modulação da

resposta imune. Esses autores sugerem que um protocolo terapêutico envolvendo o bloqueio

de CTLA-4 poderia aumentar a proteção mediada por células T nesses pacientes.

A produção de citocinas está sob controle genético, e variantes alélicas de genes de

citocinas estão associadas a uma maior ou menor produção destas, o que poderia indicar

susceptibilidade ou resistência à diversas doenças, inclusive às infecciosas (Lio et al., 2002;

Cipriano et al., 2005). Dessa forma, Bozzi et al. (2006) avaliaram a freqüência dos

polimorfismos de SNPs conhecidos em duas importantes citocinas presentes no soro de

pacientes com PCM, a IL-10 (-1082 G/A) e o TNF-α (-308 G/A). Seus estudos indicaram que

a estimulação de células de pacientes com PCM portadores do fenótipo A+ (genótipo GA ou

AA) apresentaram um aumento de células produtoras de TNF-α em comparação às células

produtoras de IL-10, sugerindo que a avaliação genética dos pacientes com PCM seria uma

ferramenta válida em sua terapia. É importante ressaltar que, até o momento, não existem

dados na literatura sobre a análise de polimorfismo no gene CTLA-4 em pacientes com PCM,

objeto deste estudo.

1.5. Análise populacional e ancestralidade

Durante as últimas décadas as causas genéticas de várias doenças complexas

(multifatoriais) têm sido enfatizadas para um melhor entendimento da sua patogênese, com o

objetivo de desenvolver estratégias preventivas, ferramentas diagnósticas e tratamento

(Cardon & Palmer, 2003). Existem alguns métodos geralmente usados para a detecção de

genes que contribuem para a susceptibilidade ou resistência a doenças multifatoriais e dentre

eles encontram-se os estudos de associação (Tsuchiya et al., 2002).

Os estudos de associação envolvem a seleção de um gene candidato e o encontro de

alelos polimórficos predisponentes para a doença na população (Cardon & Palmer, 2003). Em

geral, este método considera uma variedade de informações como os mecanismos conhecidos

do início da doença e a sua patologia, resultados de estudos de ligação em humanos e modelos

animais e os fenótipos de animais nocauteados e transgênicos. Examina-se a variação

encontrada e se existe uma diferença significativa entre pacientes (casos) e indivíduos-

controle, em termos de freqüência alélica ou genotípica. Esse tipo de estudo possui um alto

poder de detecção, porém esse método pode apresentar resultados espúrios, associações

falsamente positivas ou negativas quando o background genético dos casos e controles for

diferente (Tsuchiya et al., 2002).

O conceito de variação genética levou o matemático inglês Godfrey Hardy e o médico

alemão Wilhelm Weinberg a desenvolverem o princípio matemático que é conhecido como

equilíbrio de Hardy-Weinberg, o qual indica que, sob determinadas condições, após uma

geração de acasalamentos aleatórios, as freqüências genotípicas em um único loco de gene

tornar-se-ão fixas em um valor particular no equilíbrio, sendo então a conseqüência direta da

segregação de alelos na meiose dos heterozigotos (Hartl & Clark, 1997). É sabido que as

freqüências alélicas variam amplamente dentro e entre as populações, independentemente da

doença. Essa diferença nas freqüências surgiu porque cada população tem um histórico

genético e social, e então os padrões ancestrais de migração geográfica provocam diferenças

nas freqüências alélicas entre indivíduos, que estão espalhadas por todo o genoma, incluindo

muitos genes de relevância médica. Quando casos e controles têm diferentes freqüências

alélicas atribuídas ao background populacional então o estudo apresenta uma estratificação

populacional, sendo uma das razões mais comumente citadas para resultados de associações

genéticas não-reprodutíveis (Tsuchiya et al., 2002). Baseando-se neste fato, instituições

públicas e privadas juntaram-se para fundar o Consórcio Internacional de Mapas de

Haplótipos (HapMap), que foi criado a partir do seqüenciamento do genoma humano e teve

como objetivo inicial guiar o desenho e análise de estudos de associação genética em

medicina pela organização de um banco de dados público para os polimorfismos mais comuns

no genoma humano, os SNPs, e prover informações necessárias para os estudos genéticos de

doenças complexas (Altshuler et al., 2005). Desta forma, nos estudos de associação deve-se

considerar a análise de ancestralidade na população estudada para eliminar-se a possibilidade

da associação não ser uma conseqüência do background genético de casos e controles, mas

sim do polimorfismo do gene candidato escolhido para análise.

Considerando a ocorrência de variação da estrutura genética da população de acordo

com a distribuição geográfica (Rosenberg, 2002), existe a chance de se encontrar loci com

diferenças extremas de freqüência alélica entre os grupos populacionais diversos, que podem

caracterizar a ancestralidade individual ou determinar a contribuição de cada população

parental em grupos miscigenados recentemente. Para essa finalidade, marcadores genéticos

que capturam essas informações de freqüência alélica em duas ou mais populações distintas

vêm sendo amplamente explorados pela comunidade científica e são designados marcadores

informativos de ancestralidade (AIMs) (Shriver et al., 1997). O marcador bi-alélico ideal

para distinguir uma população de outras populações, ou estimar proporções de ancestralidade

em amostras miscigenadas, seria aquele em que um alelo (X) se encontre altamente fixado

para uma população enquanto o outro alelo (x) se encontre fixado para as demais, fazendo

com que a diferença de freqüência alélica (δ) seja igual a 1,0. No entanto, tais loci são

relativamente raros (Pfaff et al., 2004). A diferença de freqüência alélica atualmente indicada

para um AIM de grande informação e correta atribuição é δ ≥ 0,60 (Hoggart et al., 2003;

Rosenberg et al., 2003).

Nos trabalhos onde a população brasileira é objeto de estudos de associação genética

ou estudos de genética populacional o risco de heterogeneidade é muito alto, mesmo com o

cuidado de se agrupar indivíduos por características físicas que possam determinar a origem

africana ou européia, por exemplo (Parra et al., 2003). Esta heterogeneidade é causada, em

sua maioria, pelo histórico de miscigenação recente e contínua, ao longo de 500 anos, entre

africanos, europeus e ameríndios. Tal fato reforça a necessidade de atentar-se aos riscos de

resultados espúrios devidos à estratificação. Assim, a utilização de marcadores SNPs

informativos de ancestralidade em metodologias otimizadas de miniseqüenciamento tornam-

se necessários para a aplicação da associação estruturada nos estudos da população brasileira.

2. JUSTIFICATIVA

Como mencionado anteriormente, as alterações na expressão do gene CTLA-4 e sua

capacidade de regulação da resposta imune em doenças infecciosas podem estar

correlacionadas com o polimorfismo existente na sua seqüência gênica. No caso da PCM, por

meio da verificação: a) da hiporesponsividade imune celular presente na PCM; b) da

expressão aumentada da molécula de CTLA-4 em pacientes com esta doença; c) do aumento

da concentração de CTLA-4 solúvel; d) do conhecimento das alterações provocadas na

resposta imune por este aumento, justifica-se a análise de polimorfismos deste gene em

pacientes com PCM.

A associação de polimorfismos no gene CTLA-4 com a ocorrência de diferentes

patologias fortalece a necessidade de um melhor entendimento do background genético do

indivíduo com PCM e sua importância no curso da infecção. Desta forma, a avaliação da

presença de polimorfismo no sítio promotor (-318C/T) e no éxon 1 (+49A/G) poderá

fortalecer a hipótese do envolvimento de diferentes haplótipos influenciando o

desenvolvimento da PCM. Adicionalmente, se forem constatadas diferenças entre os

indivíduos controle e com PCM, os dados poderão ser utilizados como referência para futuros

estudos e também para a criação de um protocolo de atendimento dos pacientes com PCM.

Neste protocolo as variações genéticas do CTLA-4 poderão ser consideradas dentro do plano

de tratamento destes pacientes, aumentando desta forma a possibilidade de tornar o tratamento

desta micose sistêmica mais eficaz.

3. OBJETIVOS

Investigar a associação do polimorfismo do gene CTLA-4 entre indivíduos com PCM

e indivíduos não-infectados, nas posições -318 do sítio promotor e +49 do éxon 1. Além disto,

para afastar a possibilidade da ocorrência do polimorfismo estar relacionada à ancestralidade

e não à ocorrência de infecção, foi também avaliada a estrutura populacional das amostras

analisadas.

3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Extração de DNA genômico de pacientes e controles a partir de amostras sangüíneas.

• Amplificação por reação de PCR das regiões -318 e +49 usando oligonucleotídeo

específico.

• Seqüenciamento dos produtos de PCR e análise dos SNPs nos eletroferogramas

gerados pelo seqüenciador automático.

• Análise da estrutura populacional visando avaliar a relação dos fenótipos estudados

com a estratificação através de reações de PCR em sistema multiplex, utilizando

oligonucleotídeos específicos e genotipagem automatizada baseada em extensão de

base única (miniseqüenciamento).

• Análise estatística dos resultados obtidos através dos testes de χ2 (Qui-Quadrado) e

OR (Odds Ratio).

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Amostras de sangue

Os indivíduos incluídos neste estudo assinaram um termo de consentimento após

terem recebido orientações sobre os objetivos da pesquisa, e também responderam a

questionamentos relevantes para este estudo. Foram colhidos aproximadamente 8 ml de

sangue de cada indivíduo, distribuídos em dois tubos, um deles contendo o anticoagulante

EDTA (ácido etileno diamino tetra-acético) e o outro tubo sem adição de anticoagulante. Este

projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da

Universidade de Brasília sob registro CEP-FM 065/2004.

4.1.1. Pacientes com PCM

O grupo de pacientes com PCM foi constituído por 74 indivíduos. Desse total, 9

amostras de sangue foram colhidas no Hospital Universitário de Brasília (HUB), 13 amostras

de sangue foram colhidas no Hospital de Doenças Tropicais de Goiânia (HDT) com o auxílio

da Dra. Ana Joaquina Cohen, 29 amostras de DNA foram cedidas pelo Dr. Alfredo Miranda

de Goes da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e 23 amostras de DNA foram

cedidas pela Dra. Maria Heloisa Souza Lima Blotta, da Universidade de Campinas

(UNICAMP). Foram incluídos no estudo pacientes do sexo masculino e feminino, com idades

variando entre 13 e 70 anos, não-relacionados (sem qualquer grau de parentesco),

diagnosticados clínica e/ou laboratorialmente com alguma das formas clínicas conhecidas de

PCM.

4.1.2. Controles

O grupo controle do estudo foi constituído de 76 amostras de voluntários saudáveis,

sem histórico de PCM e/ou quaisquer doenças auto-imunes, do Hospital Geral de Brasília

(HGeB), Exame Medicina Laboratorial, Laboratórios de Biologia Molecular e de Patologia

Molecular da Universidade de Brasília (UnB), também de ambos os sexos, não-relacionados

(sem qualquer grau de parentesco), com idades variando entre 9 e 75 anos.

4.2. Extração de DNA

O DNA das amostras de sangue foi obtido pelo método de extração por fenol-

clorofórmio (adaptado de Sambrook & Russel, 2001) ou, alternativamente, por utilização do

kit comercial GeneCatcher gDNA Blood Kits (Invitrogen™) seguindo as recomendações do

fabricante.

4.2.1. Extração por fenol-clorofórmio

Um volume de aproximadamente 4 ml de sangue foi colocado em tubo sem

anticoagulante e centrifugado a 3000 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos. Em seguida

o sobrenadante (soro) foi separado e o coágulo obtido, contendo a porção celular sangüínea,

foi utilizado para a extração do DNA. O coágulo foi transferido para um tubo Falcon (50 ml)

onde foram acrescentados 30 ml de Tampão de Lise (MgCl2 5mM; NaCl 1mM; Tris-HCl

10mM). A mistura foi agitada em vórtex, colocada em banho-maria 37ºC por 10 minutos e

posteriormente centrifugada a 4000 rpm por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado

e o sedimento novamente tratado com Tampão de Lise sob as condições descritas

anteriormente por mais duas vezes. Em um tubo a parte foram adicionados 0,006g de DL-

ditiotretiol (DTT) em 1 ml de Tampão de Extração (NaCl 100mM; Tris-HCl 1mM; EDTA

0,5mM; SDS 2%) e então 900 μl desta mistura foram adicionados ao sedimento anteriormente

obtido, juntamente com 22,5 μl de Proteinase K (10 mg/ml). A mistura foi agitada em vórtex

e incubada em banho-maria 56ºC overnight. Após esse período, o material obtido foi separado

em três tubos eppendorfs com capacidade de 1,5 ml e, a cada alíquota, 300 μl de uma solução

contendo Fenol/Clorofórmio (1:1, v:v, pH 7.9) foram adicionados. A mistura obtida foi

agitada em vórtex até que obtivesse aparência leitosa e foi centrifugada a 14.000 rpm por 3

minutos a 4ºC. Os sobrenadantes obtidos foram cuidadosamente transferidos para novos tubos

eppendorfs e então 600 μl de isopropanol (PA) foram adicionados a cada tubo, os quais foram

suavemente homogeneizados por inversão. Os tubos foram submetidos a uma temperatura de

-20ºC por 20 minutos e então centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Os

sobrenadantes foram descartados e 600 μl de álcool 70º foram adicionados aos pellets obtidos,

centrifugando-se os eppendorfs a 10.000 rpm por 5 minutos a 4ºC. Os sobrenadantes foram

novamente descartados e os pellets foram ressuspendidos com 10 μl de Tampão TE pH8.0

(EDTA 1mM; Tris-HCl 10mM) e seus volumes foram todos reunidos em um único tubo

eppendorf. Uma alíquota de 1 μl foi utilizada para corrida eletroforética em gel de agarose 1%

para a verificação da qualidade do material obtido.

4.3. Quantificação dos DNAs

Os DNAs extraídos foram quantificados no "GeneQuant™pro” (GE Healthcare) ou,

alternativamente, tiveram suas concentrações estimadas com Low DNA Mass Ladder

(GIBCO BRL) em gel de agarose 1% (p/v) corado com EtBr (0,5 μg/ml). Usou-se tampão de

corrida TBE 0,5X (EDTA 20mM; Ácido Bórico 890 mM; Trizima Base 890 mM, pH 8.0) e

voltagem de corrida 60 V/cm². Para a corrida das amostras foi usado tampão de amostra (Azul

de Bromofenol 0,1%; Glicerol 50%; Xileno Cianol 0,1%).

4.4. Genotipagem dos SNPs -318C/T e +49A/G

Para a genotipagem destes SNPs foi utilizada a técnica de PCR para a amplificação

das regiões de interesse, seguida pelo seqüenciamento automático do produto amplificado no

equipamento MegaBACE 1000 (GE Healthcare) com o kit DYEnamic™ ET Dye Terminator

Cycle Sequencing kit. Os eletroferogramas gerados foram analisados visualmente.

Tabela II. Condições utilizadas para amplificação das regiões do sítio promotor e éxon 1 do CTLA-4

com o Par 1 de oligonucleotídeos (P1F e P1R).

Reagentes Concentrações finais Volumes

FideliTaq™ 1X 25,0 μl

P1Forward 10 μM 0,10 μM 0,50 μl

P1Reverse 10 μM 0,10 μM 0,50 μl

DNA 20ng/μl 1,00 μl

H2O ___ 23,0 μl

___________________________________________________________________________

Volume total 50,0 μl

O desenho dos oligonucleotídeos (P1Forward 5’ AGGCTCAGAAGTTAGCAGCCT

3’ e P1Reverse 5’ CCCTGGAATACAGAGCCAGC 3’ - Integrated DNA Technology -

IDT) utilizados para a PCR foi baseado na seqüência com código de acesso M74363 do

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), representado na Figura 4. A referida seqüência

compreende a região do CTLA-4 onde estão localizados os SNPs -318C/T do sítio promotor e

+49A/G do éxon 1. As amostras de DNA foram amplificadas de acordo com as condições

mostradas acima na Tabela II. O programa de PCR consistiu em um primeiro passo de

desnaturação 95ºC/1 minuto; 28 ciclos de 95ºC/20 segundos, 62ºC/1 minuto, 72ºC/1 minuto e

30 segundos; e uma extensão final a 72ºC/5 minutos.

CTGCAGAGTCTCCTCTGCTGTGCTGAGGTGTGGACAATGGGAAACCATGGACGGACTGGAGTAGGCAAAT

GTCATATTCCCTGTTGCAACTGTCTGTTTGCATGTCAGCCTTCTAGAAGCCCCTTAAGGTATCAACTATG

TTTTTGTTTTGTCATCATTCAATCCTAAGTGCACAGAATTCCGGGCATATTACAGGTTCCCCATAAATGT

TTCTTTCTTTATTAAAATGTATGAAAACTCTCCAGATTTAAGGAAGGTCCTCAATGTTTCAAATTCTTTT

TGTTAGATCAGTTGGTCCTGTCTACAGCTGTCACAAATTTAAGGACTCTGGTTATATTTAATCTTCACTT

TTGAATTTTCTGCTTGAAAAATTTGTATTAGAAAAAAAAGTCTATCCTTTTATGGACGGCTCTAATCTCT

TGAATCATTTGGGTTGGCTTTTCTTTGGACCTTCTTCAACTCTGTTTTGTCTCTGTTGAGTTAAGGCTTT

TAAGAACACCTGAATTCTTTCCTTCTGCAAAACCAGAGGCAGCTTCTTTTCCGCCTATTTTCAGTTTATT

TCTTGTGATTTTAGTTTTTTTCTCTTAACCAAATGCTAAATGGATTTAGGAGAAATAAACTTATTTGTAA

AGCTGTCAAGGGACCATTAGAAGGATGGTGCTTCACAGATAGAATACAGTTTTTATTAATGATGCCTAGA

CAATCCTGCCATTACGCAAGGCTCAGAAGTTAGCAGCCTAGTAGTTTGAGATGTCAATGAAATGAATTGG

ACTGGATGGTTAAGGATGCCCAGAAGATTGAATAAAATTGGGATTTAGGAGGACCCTTGTACTCCAGGAA

ATTCTCCAAGTCTCCACTTAGTTATCCAGATCCTCAAAGTGAACATGAAGCTTCAGTTTCAAATTGAATA

CATTTTCCATCCATGGATTGGCTTGTTTTGTTCAGTTGAGTGCTTGAGGTTGTCTTTTCGACGTAACAGC

TAAACCCACGGCTTCCTTTCTCGTAAAACCAAAACAAAAAGGCTTTCTATTCAAGAGCCTTCTGTGTGTG

CACATGTGTAATACATATCTGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTGTGGGTTCAAACAC

ATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACACCGCTCCCATAAAG

CCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGACCTGGCCCTGCAC

TCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGGTGAGTGAGACTTTTGGAGCATGAAGATG

GAGGAGGTGTTTCTCCTACCTGGGTTTCATTTGTTTCAGCAGTCAAGGGCAGTCATTTATAGCAAAGCCA

GAAGTTAAAGGTAAAACTCAATCTGGCTTGGCTGGCTCTGTATTCCAGGGCCAGCAGGGAGCAGTTGGGC

GCCAGAATAAGGCAAAAGAGATAGCTCGAGAACAGAGCGCCAGGTATTTAGTAGGGGCTTCATGAATGCA

TGTGAGTTGGTTTAGTAGAGAGACACAGGCAATTTCAGACCCTTCTATGAGACTGGAAGTGATTTAAGAG

GGAAAGGATAGCCATAGTAATGAATACATTTGAGCTGGGTTTCAGGATGAGCTC

Figura 4. Seqüência representativa do código de acesso M74363 do GenBank. Em azul estão

representados os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação das regiões do sítio promotor e do

éxon 1 do CTLA-4. Em vermelho estão sinalizadas as posições dos SNPs -318 e +49, respectivamente.

4.5. Análise Populacional

4.5.1. Marcadores informativos de ancestralidade (AIMs)P

Foram utilizados neste trabalho 16 marcadores informativos de ancestralidade (AIMs)

anteriormente selecionados na literatura (Shriver et al., 2003; Smith, 2004) pelo grupo do

Prof. Dr. Rinaldo Welerson Pereira (UCB – Brasília – DF). Esses AIMs são caracterizados

por marcadores com eixo de diferença de freqüência alélica (δ) entre Europeus e Ameríndios,

Europeus e Africanos e Ameríndios e Africanos.

A Tabela III mostra as informações da posição genética, da descrição alélica, da

freqüência alélica para um dos alelos e da diferença de freqüência alélica para cada um dos 16

marcadores nas três populações parentais. A Tabela IV mostra os desenhos e os tamanhos

dos oligonucleotídeos utilizados na PCR e dos oligonucleotídeos do miniseqüenciamento

(descrito no item 4.5.4.).

Além das amostras de pacientes (43 indivíduos) e controles (70 indivíduos), dados de

genótipos de três populações alocadas no HapMap foram utilizadas nas análises: Africanos

Sub-Saarianos (120 indivíduos), Ameríndios (69 indivíduos) e Euro-Americanos (78

indivíduos).

Tabela III. Descrição dos 16 marcadores informativos de ancestralidade estudados: suas posições

gênicas, seus alelos e as freqüências do alelo 1 nas populações parentais Européia (EUR), Africana

(AFR) e Ameríndia (AMR). Descrição da diferença de freqüência alélica (δ) entre as três populações

parentais arranjadas par a par. Fonte: Lins, (2007).

___________________________________________________________________________

Alelos Freq. alelo 1

___________________________________________________________________________

loci Posição 1 2 EUR AFR AMR δAFR/ δAFR/ δAMR/

gênica EUR AMR EUR

__________________________________________________________________________________________

rs2065160 (TSC) 1q32 C T 0,078 0,512 0,850 0,434 0,336 0,770

rs1129038 15q13 C T 0,224 0,995 0,983 0,771 0,012 0,759

rs1426654 15q21 C T 0,000 0,980 0,950 0,980 0,030 0,950

rs0727563 22q13 C T 0,260 0,820 0,950 0,560 0,130 0,690

rs0734780 15q26 C T 0,070 0,710 0,854 0,640 0,144 0,787

rs4305737 6q24 A G 0,250 0,929 1,000 0,679 0,071 0,750

rs1240709 1p36.3 A G 0,794 0,036 0,103 0,758 0,067 0,691

rs3796384 3p14 C G 0,154 0,783 0,875 0,629 0,092 0,721

rs2278354 5p15.2 G T 0,120 0,704 0,839 0,584 0,135 0,719

rs3176921 CRH) 8q13 G A 0,073 0,682 0,017 0,609 0,665 0,056

rs2814778 (FYNULL) 1q23 C T 0,998 0,001 1,000 0,997 0,999 0,002

rs0803733 9q33 C T 0,880 0,015 0,411 0,865 0,396 0,469

rs285 (LPL) 8p21 G A 0,508 0,029 0,558 0,479 0,529 0,050

rs1800404 (OCA2) 15q13 G A 0,254 0,885 0,552 0,631 0,333 0,298

rs6034866 20p12 G A 0,917 0,051 0,857 0,866 0,806 0,060

rs7349 10p11.2 G A 0,939 0,016 1,000 0,923 0,984 0,061

__________________________________________________________________________________

Tabela IV. Descrição das seqüências e dos tamanhos dos oligos de PCR (F e R) e dos oligos de

miniseqüenciamento (S). Fonte: Lins, (2007).

___________________________________________________________________________

Oligos Seqüência Direção do Tamanho

Iniciador (bp)

___________________________________________________________________________

TSC-F CTGCTGTGCTAGCTGCTGAT direto 20

TSC-R GCTGTGAGGACGTCAAACCT reverso 20

TSC-S gactCCTCTCGATGAGTAAATATGGG reverso 26

rs1129038-F CAGCAGCGACGATTCA direto 20

rs1129039-R ATCACGGCCAGTCAGTCTCT reverso 20

rs1129040-S (gact)5ACAGTCTACACAGCAGCGAG reverso 40

rs1426654-F TTCAGCCCTTGGATTGTCTC direto 20

rs1426655-R AATTGCAGATCCAAGGATGG reverso 20

rs1426656-S gactGACCGCTGCCATGAAAGTTG reverso 24

rs0727563-F CACGGTATCCAGAACAAGCA direto 20

rs0727564-R ACACTGCCTCCCAATAACCA reverso 20

rs0727565-S (gact)3ACCAGGCTGTCTCAAATAAC reverso 32

rs0734780-F GATGGCACTGACCTTCCTTC direto 20

rs0734781-R AGGTTGCAGTGAGCCAAGAT reverso 20

rs0734782-S (gact)4CCCAGCAGTGGGTATCAC direto 34

rs4305737-F TGGTGAACACGTGAGGTTACA direto 21

rs4305737-R TGGAGAAACCAGTCTCACCTG reverso 21

rs4305737-S (gact)3AATTGAGGCCCCTGAAGA direto 30

rs1240709-F ATCCTATCTGGGTGGCACAG direto 20

rs1240710-R CAGCAGTCAGCTCAGTTCAGTCAGG reverso 20

rs1240711-S (gact)5ATGTGGACACGGGTGAGGGA direto 40

rs3796384-F GCCAATGTCGGAAGGATTAC direto 20

rs3796385-R GCTAGCCAATGTGCAAGACA reverso 20

rs3796386-S (gact)6CGTTCTTCTCTCCATTCAGA direto 44

CRH-F TTTGTGCCCCTTCACTATGG direto 20

CRH-R CCATATTTCTGCCTGGAAAA reverso 20

CRH-S (gact)3TGCAGAAGCAAGGCCAATAA reverso 32

FYNULL-F TCACCCTGTGCAGACAGTTC direto 20

FYNULL-R GTGGGGTAAGGCTTCCTGAT reverso 20

FYNULL-S (gact)2GACCTCATTAGTCCTTGGCTCTTA reverso 32

LPL-F CAGTGGGTTCAAGGCTCTGT direto 20

LPL-R AACAACAACAAAACCCCACA reverso 20

LPL-S (gact)4GACAACAAAACCCCACAGCT reverso 36

OCA-2-F CAGGCTTTCGTGTGTGCTAA direto 20

OCA-2-R TGAGCTGACATCCCACTGAG reverso 20

OCA-2-S (gact)2GGTGCACAGAACTCTGGC direto 26

rs6034866-F TTGTGAGTCAAGGCAAGCTG direto 20

rs6034866-R TAGCTAGGGCAGGAGGTGAA reverso 20

rs6034866-S (gact)7TGTGAGTCAAGGCAAGCTGG direto 48

rs7349-F GCAATTGGTTCTCCTGCATT direto 20

rs7349-R GAAATGAGAGTTGTATGGTTAGGC reverso 24

rs7349-S (gact)5AAATGAGAGTTGTATGGTTAGGCT reverso 44

rs0803733-F TCCCCAAGAGTTCAACCAAC direto 20

rs0803733-R AACCTTAGGCTTGAGCATGG reverso 20

rs0803733-S (gact)7ATGTCATTGTGGAGGAGATA reverso 48

__________________________________________________________________________________

4.5.2. Amplificação das seqüências alvo

Os dois painéis foram co-amplificados em uma reação de volume final igual a 12,5 μl,

contendo: 10 a 50 ng do DNA molde; 0,25 μM de cada oligonucleotídeo (Forward e Reverse)

em multiplex; dNTP 0,25 μM; MgCl2 1,5 μM; BSA (albumina sérica bovina) 0,16mg/ml; Taq

Platinum DNA Polimerase (Invitrogen) 1U; Tampão Taq Platinum (Invitrogen) 1X e H2O

Milli-Q qsp. O programa de PCR utilizado consistiu em um two-step touchdown PCR

sugerido por Lins (2007) da seguinte forma: 95ºC/3 minutos; 26 ciclos de 95ºC/30 segundos,

65ºC/35 segundos decrescendo até 52ºC (-0,5 ºC por ciclo); em seguida, 20 ciclos de 94ºC/30

segundos, 52ºC/30 segundos e uma extensão final de 72ºC/12 minutos. O método de

touchdown consiste na redução seriada das temperaturas de anelamento a cada repetição ciclo,

reduzindo a perda de anelamento por parte de alguns oligonucleotídeos que possuam

temperaturas de anelamento diferenciadas (Don et al., 1991). A verificação da presença dos

amplicons (visualização de 2 ou 3 bandas com aproximadamente 300 bp cada) foi feita

aplicando-se 3 μl do produto de PCR em gel de agarose 2% .

4.5.3. Tratamento enzimático com EXOI / SAP

Após a amplificação, os produtos de PCR foram submetidos a um tratamento

enzimático para a eliminação do excesso de oligonucleotídeos e dNTP através das enzimas

EXOI (Exonuclease I – New England BioLabs) e SAP (Fosfatase Alcalina de Camarão -

USB). A reação foi realizada nas seguintes condições: 3 μl do produto de PCR acrescidos de

EXOI 1U, SAP 0.9U e Tampão de SAP 0,5X. A mistura foi colocada em termociclador e

submetida às seguintes condições: 37ºC/90 minutos e 80ºC/20 minutos.

4.5.4. Reação de Miniseqüenciamento

Amplificações de regiões genômicas por oligonucleotídeos são mecanismos robustos e

flexíveis de discriminação alélica e requerem quantidades muito pequenas de DNA e de

oligos (Sambrook & Russel, 2001). A reação de extensão ou miniseqüenciamento é a mais

difundida para a detecção de SNPs em média escala, e baseia-se na habilidade da DNA-

polimerase em incorporar um dideoxiribonucleotídeo fosfato (ddNTP) específico

complementar à seqüência do molde de DNA (Kwok, 2001). Assim, um

dideoxiribonucleotídeo fosfato marcado com fluorescência é estendido a um iniciador não-

marcado, anelado adjacente ao sítio da mutação de interesse (Syvanen et al., 1999). A

especificidade e sensibilidade dessa detecção dependem, principalmente, da amplificação por

PCR da região do DNA que contém a variável de interesse.

A genotipagem dos SNPs foi realizada utilizando o sistema SNaPshot™ Multiplex

System (Applied Biosystems), em uma reação de volume final igual a 5 μl contendo: 1 μl de

SNaPshot™ Kit reaction mix; 1,5 μl de uma mistura de oligos S (0,1 a 0,3 μM cada); 1,25 μl

do produto de PCR purificado e H2O Milli-Q qsp. O programa de PCR consistiu de: 96ºC/2

minutos; 30 ciclos de 96ºC/20 segundos, 55ºC/20 segundos decrescendo até 40ºC (-0,5ºC por

ciclo) e extensão a 60ºC por 30 segundos; em seguida, 15 ciclos de 96ºC/15 segundos,

40ºC/20 segundos e 60ºC/30 segundos.

4.5.5. Tratamento enzimático com SAP

Os produtos do miniseqüenciamento foram submetidos a um novo tratamento

enzimático para a remoção do excesso dos ddNTPs fluorescentes. A reação foi realizada

adicionando-se 0,5U de SAP e 0,5X de Tampão de SAP ao produto do miniseqüenciamento.

Em seguida, essa mistura foi levada ao termociclador, onde foi submetida às seguintes

condições: 37ºC/60 minutos e 85ºC/15 minutos.

4.5.6. Desnaturação

Em 1 μl de produto purificado acrescentou-se 8,85 μl de formamida altamente

deionizada e 0,15 μl de Liz 120 Size Standard (Applied Biosystems). A mistura foi submetida

a 95ºC por 3 minutos e, imediatamente após, a uma temperatura de -20ºC por 3 minutos.

4.5.7. Eletroforese em seqüenciador automático

A eletroforese do material desnaturado foi realizada no seqüenciador automático de

DNA ABI 3130 xl Genetic Analyser (Applied Biosystems), em polímero ABI 3700 POP-6™.

As corridas foram analisadas com o programa GeneScan Analysis 3.7 e os eletroferogramas

foram analisados, para cada grupo de iniciadores, no programa Genotyper 3.7 (Applied

Biosystems, EUA).

4.6. Análises estatísticas

As freqüências alélicas e genotípicas de pacientes com PCM e indivíduos-controle

para os SNPs -318 e +49 foram comparadas e a significância dos desvios foi verificada

através do teste de Qui-Quadrado utilizando-se o programa “SPSS Data Editor”. Valores de

P<0,05 se encontrados, indicariam associação positiva da variante com a doença. Foi

realizado o cálculo de OR (“Odds Ratio”) e determinado o intervalo de confiança (IC 95%)

de OR através do programa “Med Calc”. O OR reflete a força da associação de um

determinado fator com o desenvolvimento de algum evento ou doença.

A estimativa dos haplótipos, suas freqüências e o desequilíbrio de ligação entre os dois

SNPs -318 e +49 foram obtidas utilizando-se o algoritmo EM (maximização das expectativas)

implementado no programa “Haploview” (Barrett et al., 2005). Ainda com este programa

buscou-se a associação entre haplótipos, pacientes e controles, a qual também é verificada

através do teste de Qui-Quadrado.

Para avaliar a existência de estruturação populacional (ancestralidade) foi usado o

programa “Structure 2.1” (Pritchard et al., 2000). Este programa modela a estrutura

populacional, miscigenação populacional e miscigenação individual utilizando inferência

Bayesiana a partir dos dados de genótipos.

5. RESULTADOS

5.1. Análise do DNA genômico das amostras de pacientes e indivíduos controle

A qualidade das amostras de DNA extraídas de pacientes com PCM e controles foi

verificada em gel de agarose 1%. O perfil eletroforético demonstrou a integridade das

amostras de DNA como observado na Figura 5. As amostras foram quantificadas e tiveram

suas concentrações ajustadas para serem utilizadas nas reações de PCR com o par 1 de

oligonucleotídeos (oligo 1).

Figura 5. Gel representativo de DNAs de pacientes e controles. O gel possui amostras representativas

de DNA extraídos de pacientes com PCM (1 a 7) e controles (8 a 14) em gel de agarose 1% corado

com brometo de etídio (1 μl DNA + 9 μl H2O + 1,3 μl tampão de amostra por poço).

5.2. Análise do produto de PCR amplificado pelo oligo 1

O produto de PCR amplificado pelo oligo 1 foi verificado através de corrida em gel de

agarose 1% com marcador de massa molecular “100 bp Leader Invitrogen™”, para que o

tamanho dos amplicons obtidos pudessem ser avaliados. As bandas mostradas no gel

apresentam tamanho de aproximadamente 700 pares de base (bp), compatível com o tamanho

esperado (731 bp) para os amplicons (Figura 6). Após a reação de amplificação pela PCR,

estas amostras foram purificadas com o kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit

(GE Healthcare)”. Após a purificação, tiveram suas concentrações estimadas em gel de

agarose 1% com marcador de massa molecular, sendo então submetidas ao seqüenciamento

automático.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 6. Gel representativo dos produtos de PCR com oligo 1. O gel mostra bandas representativas

da reação de PCR com oligo 1 mostrando tamanho compatível com 731 bp (1 μl de produto

amplificado + 9 μl H2O + 1,3 μl tampão de amostra por poço) em gel de agarose 1%. À esquerda,

marcador de massa molecular com a seta preta indicando a banda referente a 700 bp.

5.3. Seqüenciamento das amostras amplificadas com o oligo 1

As amostras amplificadas com o oligo 1 foram seqüenciadas no equipamento

MegaBACE 1000 (GE Healthcare) para que a determinação dos genótipos de cada amostra

pertencente aos grupos de pacientes e controles pudesse ser realizada. A determinação das

bases presentes nas localizações referentes aos SNPs -318C/T do sítio promotor e +49 A/G

do éxon 1 do CTLA-4 foi realizada através da análise individual dos eletroferogramas gerados

pelo seqüenciador. Pode-se verificar que a posição referente ao SNP -318C/T apresentava

uma base C (citosina) representada por um pico de cor azul ou uma base T (timina)

representada por um pico de cor vermelha. A posição referente ao SNP +49 A/G apresentava

uma base A (adenina) representada por um pico de cor verde ou uma base G (guanina)

representada por um pico de cor preta. A sobreposição de picos com cores diferentes

(referentes a bases diferentes) numa mesma localização caracteriza um genótipo

heterozigótico para o SNP em questão, enquanto que a presença de um único pico, de uma

única cor, caracteriza um genótipo homozigótico. A Figura 7 exemplifica um dos genótipos

caracterizados nas amostras estudadas, onde a posição -318 apresenta um único pico referente

à base citosina, caracterizando o genótipo CC enquanto que a posição +49 mostra a presença

de dois picos de cores distintas, representando as bases guanina e adenina respectivamente,

caracterizando o genótipo heterozigoto AG para esta amostra.

700 bp

Figura 7. Representação dos eletroferogramas gerados pelo seqüenciador automático MegaBACE

1000 (GE Healthcare). Em A o retângulo amarelo evidencia a posição correspondente ao SNP -318C/

T e em B a posição correspondente ao SNP +49A/G para uma das amostras seqüenciadas. Observar

que em A o pico de cor azul correspondente à citosina não possui sobreposição, e em B o pico de cor

preta correspondente à guanina está sobreposto por um pico de cor verde correspondente à adenina,

caracterizando o genótipo -318CC; +49AG para esta amostra.

A B

5.4. Análise do SNP -318C/T

A distribuição dos genótipos CC, CT e TT em pacientes com PCM (n=74) e controles

(n=76) relacionada à posição -318 está representada na Tabela V, assim como suas

respectivas freqüências obtidas e esperadas. A quantidade dos três genótipos mencionados em

cada grupo de indivíduos foi determinada através da análise individual dos eletroferogramas.

O genótipo CC é o mais freqüente para os dois grupos de amostras (88% em pacientes e 95%

em indivíduos-controle) na posição -318 do gene CTLA-4, seguido do genótipo CT e

ausência do genótipo TT. Observa-se que as freqüências genotípicas não diferiram

significativamente entre pacientes e controles, o que foi avaliado pelos testes de Qui-quadrado

(valores significativos são considerados quando P< 0,05) e “Odds Ratio” [segundo Rumel,

(1986) o limite inferior do intervalo de confiança atribuído ao “Odds Ratio” deve ser maior

do que “1,0” para que se possa afirmar que em dado intervalo exista associação]. Pode-se

observar também que as distribuições genotípicas encontram-se em equilíbrio de Hardy-

Weinberg (HWE), pois as freqüências obtidas para pacientes e controles não diferem

significativamente das freqüências esperadas, como verificado em “DeFinetti for Online

HWE Analysis for SNP Data” (http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl).

A partir da determinação dos genótipos foi possível verificar a distribuição dos alelos

C e T e suas respectivas freqüências nos dois grupos. Para isto, foi considerada a presença dos

2 alelos em cada individuo; sendo assim os valores de 2n considerados foram 148 e 152 para

pacientes e controles, respectivamente. Os resultados obtidos mostraram a maior freqüência

do alelo C (94% em pacientes e 97% em controles), enquanto que o alelo T apresentou uma

freqüência menor que 10% em ambos os grupos. De acordo com a análise estatística

realizada, também não foram observadas diferenças significativas entre as freqüências alélicas

para os dois grupos estudados. A representação gráfica da distribuição dos genótipos e alelos

para o SNP -318 do sítio promotor do CTLA-4 descrita na Tabela V para os grupos de

pacientes e controles pode ser observada na Figura 8.

Tabela V. Distribuição dos genótipos e alelos com suas respectivas freqüências para a posição -318

do sítio promotor do CTLA-4 em pacientes com PCM e controles. N= número de indivíduos; fo=

freqüência obtida; fe=freqüência esperada; P= P value; OR= Odds ratio; IC= Intervalo de Confiança.

Pacientes n = 74 Controles n = 76

________________ _______________

Posição -318 N fo(%) fe(%) N fo(%) fe(%) P OR IC (95%)

Genótipos

CC 65 88 (88,3) 72 95 (95,0) 0,13 0,40 [0,12 – 1,37]

CT 9 12 (11,3) 4 5 (4,9) 0,13 2,49 [0,73 – 8,48]

TT 0 0 (0,4) 0 0 (0,1) - - -

HWE (P) 0,58 0,81

Pacientes (2n = 148) Controles (2n = 152)

_________________ _________________

N fo(%) N fo(%) P OR IC (95%)

Alelos

C 139 94 148 97 0,142 0,42 [0,13 – 1,39]

T 9 6 4 3 0,142 2,40 [0,72 – 7,96]

Figura 8. Representação gráfica da distribuição dos genótipos (CC, CT, TT) e alelos (C e T) para a

posição -318 do sítio promotor do CTLA-4 nos os grupos de pacientes e controles.

5.5. Análise do SNP +49A/G

A distribuição dos genótipos AA, AG e GG de pacientes com PCM (n=74) e controles

(n=76) para a posição do SNP +49 está representada na Tabela VI, assim como suas

respectivas freqüências obtidas e esperadas. A quantidade dos genótipos mencionados e suas

respectivas freqüências para cada grupo foram determinadas da mesma forma que para o SNP

-318C/T. Os genótipos AA (pacientes = 39%; controles = 47%) e AG (pacientes = 49%;

controles = 45%) são mais freqüentes que o genótipo TT (pacientes = 12%; controles = 8%)

em ambos os grupos para esta posição gene CTLA-4. Observa-se que as freqüências

genotípicas não diferiram significativamente entre pacientes e controles, o que foi avaliado

pelos testes de Qui-quadrado e “Odds Ratio”. Pode-se observar também que as distribuições

genotípicas encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE), pois as freqüências

obtidas para pacientes e controles não diferem significativamente das freqüências esperadas,

como verificado em “DeFinetti for Online HWE Analysis for SNP

Data” (http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl).

A partir da determinação dos genótipos foi possível verificar a distribuição dos alelos

A e G e suas respectivas freqüências nos grupos de pacientes e controles. Para isto, também

foi considerada a presença dos 2 alelos em cada individuo. Os resultados obtidos mostraram a

maior freqüência do alelo A nos dois grupos (64% em pacientes e 70% em controles),

enquanto que o alelo G apresentou uma freqüência menor (36% em pacientes e 30% em

controles). De acordo com a análise estatística realizada, também não foram observadas

diferenças significativas entre as freqüências alélicas para os dois grupos estudados. A

representação gráfica da distribuição dos genótipos e alelos para o SNP +49 do éxon 1 do

CTLA-4 descrita na Tabela VI para os grupos de pacientes e controles pode ser observada na

Figura 9.

Tabela VI. Distribuição dos genótipos e alelos com suas respectivas freqüências para a posição -318

do sítio promotor do CTLA-4 em pacientes com PCM e controles. N= número de indivíduos; fo=

freqüência obtida; fe=freqüência esperada; P= P value; OR= Odds ratio; IC= Intervalo de Confiança.

Pacientes n = 74 Controles n = 76

________________ _______________

Posição +49 N fo(%) fe(%) N f(%) fe(%) P OR IC (95%)

Genótipos

AA 29 39 (40,2) 36 47 (45,6) 0,31 0,72 [0,37 – 1,37]

AG 36 49 (46,7) 34 45 (45,1) 0,47 1,27 [0,66 – 2,43]

GG 9 12 (13,1) 6 8 (9,3) 0,38 1,62 [0,54 – 4,79]

HWE (P) 0,67 0,60

Pacientes (2n = 148) Controles (2n = 152)

_________________ _________________

N fo(%) N fo(%) P OR IC (95%)

Alelos

A 94 64 106 70 0,25 0,75 [0,47 – 1,22]

G 54 36 46 30 0,25 1,32 [0,82 – 2,14]

Figura 9. Representação gráfica da distribuição dos genótipos (AA, AG, GG) e alelos (A e G) para a

posição +49 do éxon 1 do CTLA-4 nos grupos de pacientes e controles.

5.6. Associação haplotípica dos SNPs -318C/T e +49A/G

Esta análise foi realizada utilizando-se o programa “Haploview” (Barret et al., 2005),

com o qual foi possível estimar os haplótipos das amostras de pacientes e controles e suas

respectivas freqüências haplotípicas. Este software permite também visualizar padrões de

desequilíbrio de ligação (LD) entre os dois SNPs. O resultado revelou a ocorrência de três

tipos de haplótipos em ambos os grupos de amostras: CA, CG e TA. O haplótipo TG (também

esperado) não foi observado, provavelmente pela baixa freqüência do alelo T observada em

ambos os grupos. A composição dos haplótipos é dada da seguinte forma: CA é formado a

partir da herança do alelo C do SNP -318 com o alelo A do SNP +49; CG é formado a partir

da herança do alelo C do SNP -318 com o alelo G do SNP +49; TA é formado a partir da

herança do alelo T do SNP -318 com o alelo A do SNP +49.

As freqüências haplotípicas observadas foram diferentes das freqüências esperadas

(0,25 para cada um dos quatro haplótipos esperados: CA, CG, TA, TG) - Tabela VII.

Observou-se que o haplótipo CA ocorre com maior freqüência nos dois grupos (57,4% em

pacientes e 67,1% em controles), seguido pelo haplótipo CG (36,5% em pacientes e 30,3%

em controles). O haplótipo TA mostrou freqüência abaixo de 10% em ambos os grupos de

análise.

Após a estimativa dos haplótipos, o software forneceu o desvio entre as freqüências

observadas e esperadas, o qual é representado por D’. Valores positivos de D’, diferentes de

zero, indicam LD. Os dados desta análise mostram que existe um desequilíbrio de ligação

entre os os SNPs -318 e +49, com valor de D’=1 (Tabela VII). A análise estatística pelo teste

de Qui-Quadrado verificou que não existem diferenças significativas entre os grupos de

pacientes PCM e controles com relação às freqüências haplotípicas.

A representação gráfica dos haplótipos CA, CG, TA e suas respectivas freqüências

descritas na Tabela VII para pacientes e controles está mostrada na Figura 10.

Tabela VII. Caracterização dos haplótipos e suas respectivas freqüências (f) nos grupos de pacientes

PCM e controles, fornecidas pelo programa “Haploview”. P = p value.

Pacientes (n = 74) Controles (n = 76)

Haplótipos f (%) f (%) P

CA 57,4 67,1 0,08

CG 36,5 30,3 0,25

TA 6,1 2,6 0,14

Desvio entre as freqüências observadas e esperadas (D’) = 1.

Figura 10. Representação gráfica das freqüências haplotípicas observadas nos grupos de pacientes

e controles através da análise obtida pelo programa “Haploview”. O haplótipo CA ocorre em maior

freqüência nos grupos descritos, seguido pelos haplótipos CG e TA respectivamente.

5.7. Análise da estrutura populacional

5.7.1 Reação de PCR e genotipagem

A análise da estrutura populacional foi realizada para verificar o grau de

homogeneidade genética entre os dois grupos. A existência de uma não-homogeneidade entre

os grupos comparados poderia acarretar a ocorrência de resultados espúrios no estudo de

associação de polimorfismos no gene CTLA-4 com a PCM.

O sistema multiplex foi utilizado para a realização de uma tipagem rápida e eficiente

dos marcadores informativos de ancestralidade (AIMs). Foram utilizados 16 AIMs, o que

deveria gerar na reação de amplificação 16 bandas referentes aos amplicons destes

marcadores, de tamanhos que variariam entre 100-300 pb. A análise dos fragmentos

amplificados revelou a presença de bandas na região com os tamanhos esperados, que

variaram entre 100 e 300 bp, como mostrado na Figura 11. O aparecimento de todas as

bandas correspondentes a todos os marcadores utilizados não foi verificado, pois vários

produzem amplicons de tamanhos semelhantes.

Figura 11. Gel de agarose 2% representativo das amostras controle 1 a 5 amplificadas com 16

maracadores de ancestralidade (AIMs) em sistema multiplex (3 μl de amplicon + 7 μl de H2O + 1,3 μl

de tampão de amostra).

O material amplificado foi purificado para eliminação de excesso de dNTP e

submetido à reação de minisequenciamento por SNaPshot™. Um eletroferograma

representativo da genotipagem dos amplicons marcados, do total de 113 realizados (70 DNAs

do grupo controle e 43 de pacientes), utilizando 16 marcadores informativos de ancestralidade

(AIMs), amplificados pelo método de miniseqüenciamento em sistema múltiplo, está

mostrado na Figura 12.

Figura 12. Eletroferograma representativo da amplificação dos alelos dos AIMs por SNaPshot™ para

uma das amostras controle utilizadas no estudo. Os picos referentes às diferentes bases estão

representados pelas cores: azul (G), verde (A), preto (C), vermelho (T). rfu = unidade relativa de

fluorescência.

5.7.2. Caracterização da ancestralidade

Os dados obtidos a partir da genotipagem das amostras analisadas de pacientes com

PCM (43) e controles (70) foram analisados junto aos dados dos genótipos de três populações

parentais alocadas no HapMap: Africanos Sub-saarianos, Ameríndios e Euro-Americanos,

caracterizando a proporção de indivíduos na amostragem em cada população pré-definida no

programa “Structure 2.1” para os clusters europeu, ameríndio e africano (Tabela VIII). Os

resultados mostram que ambos os grupos, pacientes com PCM e controles, possuem maior

ancestralidade européia (superior a 70%), seguida das ancestralidades ameríndia e africana.

As proporções de ancestralidade européia, ameríndia e africana encontradas mostram

diferenças não-significativas entre pacientes e controles (P = 0,221), refletindo a

homogeneidade genética entre os dois grupos.

Tabela VIII. Caracterização da média da proporção dos membros de cada população

analisada para os clusters europeu (1), ameríndio (2) e africano (3).

População Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 Nº indivíduos

___________________________________________________________________________

*Africanos 0,017 0,026 0,957 120

Sub-saarianos

*Ameríndios 0,023 0,950 0,027 69

*Euro-Americanos 0,961 0,028 0,011 78

___________________________________________________________________________

*Pacientes PCM 0,717 0,148 0,135 43

*Controles 0,767 0,104 0,129 70

___________________________________________________________________________

P = 0,221

A representação gráfica das amostras de pacientes e controles de acordo com a

ancestralidade atribuída a cada grupo (mostrado na tabela VIII) é observada na Figura 13.

Figura 13. Gráfico tipo triângulo com os três vértices representando em cada um deles o valor de

100% de cada ancestralidade atribuída aos indivíduos dos dois grupos estudados (pacientes PCM e

controle). Observa-se um maior predomínio de ancestralidade européia em ambos os grupos, com

semelhança em relação às suas distribuições entre as ancestralidades ameríndia e africana.

Os três vértices do triângulo indicam a caracterização máxima em cada

ancestralidade, que vai diminuindo à medida que os pontos representativos das populações se

afastam dos vértices. As linhas internas do triângulo facilitam a caracterização aproximada da

ancestralidade para cada amostra. È possível observar que a maioria dos pacientes e controles

encontra-se em uma área do triângulo (A) onde a ancestralidade européia para estas amostras

varia entre 75% e 100% e a ancestralidade ameríndia varia entre 0% e 25%. Outro grupo de

amostras encontra-se distribuídos em uma área (B) onde a ancestralidade européia varia entre

50% e 75%, a ancestralidade ameríndia varia entre 25% e 50% e a ancestralidade africana

varia entre 25% e 50%.

Também foi realizado no programa “Structure 2.1” o cálculo do valor de Fst, o qual

mede a diferença entre uma população e outra baseado em dados de freqüência alélica.

Valores de Fst próximos a zero apontam para homogeneidade genética entre os grupos em

questão. A média e o desvio-padrão dos grupos de pacientes com PCM e controles são

apresentados na Tabela IX.

Tabela IX. Médias e respectivos desvios-padrão (SD) apresentados para os grupos de pacientes com

PCM e controles com relação aos clusters Europeu (EU), Ameríndio (AM) e Africano (AF).

Clusters Clusters

___________________________________________________________________________

Controles EU AM AF Pacientes EU AM AF

___________________________________________________________________________

Média 0,767 0,104 0,129 Média 0,717 0,148 0,135

SD 0,237 0,164 0,137 SD 0,250 0,191 0,155

Máx 0,991 0,727 0,550 Máx 0,986 0,839 0,579

Mín 0,015 0,005 0,003 Mín 0,059 0,008 0,007

___________________________________________________________________________

Fst = 0,002 P = 0,221

O resultado encontrado de Fst (0,002) confirma a observação de que os grupos

analisados neste trabalho não apresentam níveis de heterogeneidade significativos,

caracterizando a homogeneidade genética das amostras envolvidas neste estudo de associação.

Esta caracterização evita a obtenção de resultados espúrios, que poderiam estar associados à

ancestralidade das amostras caso as mesmas fossem geneticamente heterogêneas e não ao

fenótipo estudado.

6. DISCUSSÃO

O CTLA-4 é expresso principalmente em células T ativadas e tem papel fundamental

na resposta imune, exercendo efeito regulador na ativação de célula T através da sua ligação

com as moléculas da família B7 expressas em células apresentadoras de antígenos. Estudos

experimentais mostram que camundongos nocauteados para o gene CTLA-4 desenvolvem

desordens linfoproliferativas, o que confirma a importância do seu papel na manutenção da

homeostase imunológica (Tivol et al., 1995). A influência dos polimorfismos localizados na

região promotora (SNP -318C/T) e no éxon 1 (SNP +49A/G) do CTLA-4 nas respostas

imunes e susceptibilidade à doenças tem sido demonstrada em estudos de associação genética

(Nistico et al., 1996; Wang et al., 2002; Polychronakos, 2003; Zalloua et al., 2004; Kavvoura

& Ioannidis, 2005; Badenhoop & Seidl, 2003; Furugaki et al., 2004; Yanagawa et al., 2007).

Estudos recentes mostram a relação entre o polimorfismo na posição +49 do éxon 1 e

a regulação negativa exercida sobre a ativação da célula T. Este polimorfismo afeta a função

inibitória do CTLA-4, sendo que o alelo +49G está associado a uma menor expressão de

CTLA-4, com conseqüente resposta proliferativa aumentada de célula T (Kouki et al., 2000).

Algumas doenças autoimunes foram associadas a este polimorfismo, como a artrite

reumatóide (Han et al., 2005), diabetes (Nistico et al., 1996) e o hipotireoidismo autoimune

(Zalatel et al., 2006). Com relação ao SNP -318C/T, experimentos realizados em células T

por Wang et al. (2002) mostraram que o mesmo estava associado a uma alta atividade

promotora do gene CTLA-4, provocando uma maior expressão da proteína e regulando de

forma acentuada a resposta de célula T, o que seria relevante na regulação das respostas

autoimunes. Além da correlação do CTLA-4 com doenças autoimunes, alguns grupos

estudaram o papel dessa molécula em doenças infecciosas. Martins et al. (2004) verificaram

que o CTLA-4 é uma molécula importante no controle da resposta contra parasitos. A indução

da sua expressão por agentes infecciosos (principalmente na fase aguda da doença, levando a

uma forte imunossupressão) poderia ser parte de um mecanismo desenvolvido pelo parasito

visando sua evasão da ação do sistema imune.

Na PCM verifica-se uma ampla variação da resposta imunológica, dependente

principalmente do nível de supressão da imunidade celular. Lacaz et al. (1992) realizaram

estudos correlacionando o quadro histológico da forma clínica crônica da doença com a

resposta imune humoral e celular, definindo duas formas polares: o pólo positivo ou

hiperérgico e o negativo ou anérgico. Entre essas duas formas polares existe um amplo

espectro de manifestações com reatividade imunológica variável. Os indivíduos do pólo

hiperérgico, com imunidade celular preservada e anticorpos específicos geralmente não

demonstrados, apresentam lesões localizadas, poucos parasitos nas lesões e estado geral

preservado. Por outro lado os indivíduos do pólo anérgico, com imunidade celular deprimida

e altos níveis de anticorpos circulantes, apresentam lesões disseminadas ou sistêmicas, grande

quantidade de fungos nas lesões e estado geral comprometido, o que reflete na severidade

com que a doença se desenvolve. Esta polarização das formas clínicas também é observada

nos modelos experimentais e Calich et al. (1987) demonstraram que, no modelo murino, a

resistência e susceptiblidade estão associadas a um gene autossômico dominante. Campanelli

et al. (2003) e Cavassani et al. (2006) demonstraram que a hiporesponsividade imune celular

presente na PCM, além de estar relacionada a alguns fatores como a secreção alterada de

citocinas (TGF-β, IL-10, IFN-γ) e moléculas indutoras da apoptose de células T (Fas e Fas-L),

também possui relação com o CTLA-4. Pacientes portadores de PCM apresentam maior

expressão dessa proteína do que indivíduos controles. Além disso, a presença de células T

expressando quantidades aumentadas de CTLA-4 no sangue e nas lesões de pacientes com a

forma crônica de PCM sugere uma regulação da resposta imune sistêmica e local nessa

doença. O bloqueio de CTLA-4 e de Fas-L por anticorpos específicos resulta em um aumento

na produção de IFN-γ e significativa proliferação de células T (Campanelli et al., 2003).

Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de verificar a associação entre os SNPs

-318C/T e +49A/G do gene CTLA-4 e pacientes com PCM. Um total de 150 amostras de

DNA foram utilizadas, sendo que destas, 76 eram amostras de indivíduos controles, e 74 eram

amostras de pacientes com PCM, a maioria portadores da forma crônica, provenientes de três

diferentes estados do País: Goiás, Minas Gerais e São Paulo. Foram empregadas técnicas

moleculares como a PCR e o seqüenciamento automático dos seus produtos, visando

evidenciar os polimorfismos citados em cada amostra e determinar os genótipos das amostras

analisadas. A comparação destes genótipos entre os grupos de pacientes e controles não

revelou diferenças estatisticamente significativas para os dois SNPs analisados. Além da

análise genotípica, realizou-se a análise comparativa entre os dois grupos da freqüência dos

alelos C, T, A e G para cada um dos SNPs citados. Novamente não foram observadas

diferenças significativas entre as amostras de pacientes com PCM e controles. Esses

resultados mostram que não existe relação entre qualquer dos alelos ou genótipos avaliados

com a PCM. Os SNPs -318 e +49 apresentaram forte desequilíbrio de ligação (D’=1). O

desequilíbrio de ligação representa a situação onde uma determinada combinação de alelos,

chamada de haplótipo, encontra-se numa freqüência estatisticamente diferente daquela

esperada caso os alelos estivessem associados aleatoriamente e em equilíbrio (Lewontin,

1988). Tal fato nos levou a analisar a associação entre os haplótipos obtidos (CA, CG, TA)

para os dois grupos de amostras estudados e a PCM. A comparação entre as freqüências

haplotípicas para os grupos de pacientes e controles foi realizada, e também mostrou que não

existem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, evidenciando que não

existe relação entre qualquer dos haplótipos observados e a PCM.

Ainda existem poucos relatos na literatura correlacionando os polimorfismos

existentes no gene CTLA-4 com doenças neoplásicas e infecciosas. Ghaderi et al. (2004)

estudaram a correlação do SNP +49A/G com câncer de mama em 197 mulheres iranianas

diagnosticadas com o câncer e 151 controles. Foi verificado que o genótipo +49 AA,

considerado protetor para as doenças autoimunes, estava relacionado à progressão do câncer

de mama, considerando-se que indivíduos que possuem o genótipo AA expressam mais

CTLA-4, o que irá regular negativamente a resposta imune contra as células tumorais.

Estudos realizados por Thio et al. (2004) sugeriram que o alelo +49G estava associado com a

recuperação da infecção pelo vírus da hepatite B, de forma isolada ou associada com o alelo C

no SNP-1722, alterando a regulação negativa normalmente exercida pelo CTLA-4 na resposta

imune. Os grupos estudados neste trabalho foram compostos de 189 indivíduos portadores de

hepatite B crônica e 338 indivíduos que apresentaram recuperação da infecção pelo vírus

causador da hepatite B. A presença do alelo +49G foi detectada com maior freqüência no

grupo de indivíduos que apresentaram recuperação da infecção, mostrando que este alelo

estava relacionado com o vigor da resposta imune apresentada nesses pacientes. Estes dados

corroboram com o que foi descrito por Kouki et al. (2000), onde o alelo +49G está associado

a uma diminuição da expressão do CTLA-4, resultando em uma resposta imune com maior

intensidade. Recentemente, Su et al. (2007) estudaram a correlação do polimorfismo do

CTLA-4 com o câncer em 144 mulheres tailandesas com carcinoma cervical escamoso e 378

mulheres tailandesas saudáveis. Foi verificada uma maior freqüência do alelo -318T em

mulheres portadoras do papiloma vírus humano do que em mulheres saudáveis, sugerindo o

envolvimento deste SNP com a persistência do vírus, que é o principal agente causal do

câncer de colo uterino. Esses resultados corroboram o que foi descrito por Wang et al. (2002),

que mostraram a associação do alelo -318T com uma maior expressão da proteína, regulando

negativamente a resposta imune. Adicionalmente, alguns trabalhos sugerem que exista uma

forte ligação entre os SNPs -318 e o +49 do éxon 1 (Kristiansen et al., 2000; Liegers et al.,

2001), sugerindo que os haplótipos decorrentes desses SNPs possam estar associados a

algumas doenças onde não se encontra associação para tais SNPs isoladamente.

Estudos correlacionando o polimorfismo de genes de citocinas relevantes para a

eficiência da resposta imunológica foram realizados por Bozzi et al. (2006), que avaliaram a

freqüência dos polimorfismos em duas citocinas presentes no soro de pacientes com PCM

(n=54) e controles (n=31), a IL-10 (-1082 G/A) e o TNF-α (-308 G/A). Estes estudos

indicaram que a freqüência aumentada do genótipo GG para o SNP -1082 do gene da IL-10

(que auxilia no controle das respostas imunes inatas e adaptativas) em pacientes com PCM,

quando comparados com indivíduos controles, poderia ser considerada como um fator de

risco para a susceptibilidade aumentada à PCM. Porém, essa correlação não foi observada

para o TNF-α, bem como não se observou a correlação entre o polimorfismo e a produção

dessas citocinas.

Apesar de existirem alguns estudos correlacionando a proteína CTLA-4 com a PCM

(Campanelli et al., 2003; Bozzi et al., 2004; Cavassani et al., 2006), o presente trabalho é

pioneiro no que se refere à análise de associação entre polimorfismos do gene CTLA-4 com a

PCM. O poder em estudos de associação é determinado pela inter-relação entre tamanho

amostral, efeito do alelo no fenótipo em estudo, freqüência do alelo na população e em casos

onde o alelo estudado não é o alelo causal, a verificação do seu desequilíbrio de ligação com o

verdadeiro alelo causal (Zondervan & Cardon, 2004). Os estudos de associação envolvendo

polimorfismos do CTLA-4 em doenças autoimunes ou infecciosas possuem um número

amostral médio de 231 indivíduos apresentando o fenótipo em estudo, variando de 133 até

483 indivíduos (Nistico et al., 1996; Zalloua et al., 2004; Thio et al., 2004; Balbi et al., 2007;

Yanagawa et al., 2007; Sue et al., 2007). Em estudos com número amostral pequeno, a

possibilidade de se encontrar associação, uma vez que ela exista, está basicamente relacionada

ao alto efeito dos alelos, o que raramente ocorre em fenótipos não-mendelianos. Em nosso

estudo não verificamos a existência de associação entre os SNPs -318 e +49 do CTLA-4 e a

PCM com o número amostral utilizado (n=74 pacientes). Se o efeito dos alelos estudados

fosse alto, a associação entre os polimorfismos e a PCM poderia ter sido detectada mesmo

com este número amostral. É possível dizer que caso o número amostral deste trabalho fosse

aumentado em cerca de três vezes, o que aproximaria do número médio de amostras utilizadas

em outros trabalhos (n=231), se alguma associação fosse encontrada a mesma seria

provavelmente fraca. Deve-se considerar a dificuldade de obtenção de amostras de indivíduos

que apresentam a PCM, uma vez que não é uma doença de notificação compulsória.

Outro ponto importante a ser considerado neste trabalho é o estudo da estrutura

genética (ancestralidade) dos grupos de pacientes e controles, pois diferenças em freqüências

alélicas têm sido observadas em grupos étnicos distintos (Guzman et al., 2005). Quando

pacientes e controles têm diferentes freqüências alélicas atribuídas ao background genético,

significando que o estudo apresenta uma estratificação populacional, isto se torna uma das

razões mais comumente citadas para obtenção de resultados de associações genéticas espúrias

(Tsuchiya et al., 2002). Desta forma, nos estudos de associação, e principalmente naqueles

onde a população brasileira (que é altamente miscigenada) constitui as amostras envolvidas

no estudo, deve-se considerar a análise de ancestralidade para eliminar-se a possibilidade da

associação não ser uma conseqüência do background genético da amostragem, mas sim de

fato do polimorfismo do gene-candidato escolhido para análise (Parra et al., 2003). Através da

utilização de dados alocados no Consórcio Internacional de Mapas de Haplótipos (HapMap)

sobre as populações parentais de Europeus, Ameríndios e Africanos-Subsaarianos e de

Marcadores Informativos de Ancestralidade (AIMs), foi possível determinar a ancestralidade

das amostras de pacientes com PCM e controles com auxílio da técnica de

miniseqüenciamento. A grande vantagem desta técnica é a possibilidade de ser trabalhada em

um sistema múltiplo, onde diferentes sítios de mutações podem ser investigados

simultaneamente (Syvanen et al., 1999). Verificou-se que há predomínio de ancestralidade

européia em ambos os grupos de pacientes e controles (valores superiores a 70%) sobre as

ancestralidades ameríndia e africana. Através desses resultados foi possível determinar que a

população utilizada no estudo é geneticamente homogênea, e que o resultado negativo da

associação detectado para o gene CTLA-4 e a PCM não está então possivelmente relacionado

a ancestralidade da amostragem.

Os valores das freqüências genotípicas e alélicas encontradas neste trabalho são

similares aos verificados por Guzman et al., (2005). Estes autores determinaram a freqüência

de polimorfismos dos genes CD28, ICOS e CTLA-4 (SNPs -318 e +49) em três diferentes

grupos étnicos da população brasileira (brancos, mulatos e negros), utilizando 279 indivíduos

brasileiros saudáveis, provenientes da região sudoeste do país. Os resultados das freqüências

genotípicas e alélicas apresentados para o grupo étnico dos brancos (com ancestralidade

predominantemente européia) é compatível com aqueles aqui encontrados para os grupos de

pacientes e controles (que também possuem ancestralidade predominantemente européia),

reforçando os resultados deste trabalho.

Diferentemente do que foi observado em estudos de associação envolvendo

polimorfismos no gene CTLA-4 e doenças como a artrite reumatóide, diabetes, tireoidismo

autoimune, hepatite B crônica e o carcinoma de colo uterino, não foram observadas diferenças

significativas entre os grupos de pacientes com PCM e controles para os SNPs -318 e +49.

Tal fato é provavelmente decorrente de: 1) diferenças não-significativas das freqüências

genotípicas e alélicas entre os grupos de pacientes e controles; 2) diferenças não-significativas

entre as freqüências haplotípicas encontradas para os dois grupos; 3) nível do efeito dos alelos

estudados na PCM. Outros SNPs do gene CTLA-4 poderiam também ser investigados quanto

a sua associação com a PCM. O marcador microsatélite (AT)n, localizado na região 3’-UTR,

tem sido relacionado em vários trabalhos de associação entre o CTLA-4 e doenças

autoimunes, o que gera a curiosidade sobre sua possível influência em doenças infecciosas.

Além disso, não se pode descartar a possibilidade de que o aumento da expressão do CTLA-4

em pacientes com PCM não seja devido ao polimorfismo no seu gene, mas sim decorrente de

outros pontos que controlem a sua expressão como possíveis alterações em fatores de

transcrição decorrentes do contato com o fungo P. brasiliensis. O aumento da expressão de

CTLA-4 também poderia ocorrer como um mecanismo compensatório caso outras vias

envolvidas na regulação da resposta imune celular estivessem prejudicadas.

Em resumo, este trabalho demonstra que, considerando a amostragem analisada, não

foi detectada nenhuma correlação/associação entre o polimorfismo dos SNPs -318 e +49 do

gene CTLA-4 e a resistência e/ou susceptibilidade à paracoccidioidomicose. Em decorrência

da complexidade do processo inflamatório desenvolvido no curso da PCM, não se pode

excluir a possibilidade de associação entre polimorfismos em outros genes relacionados com a

resposta imune e a PCM. As citocinas produzidas no curso desta infecção determinam

diretamente as populações celulares que migram para o foco inflamatório assim como o grau

de ativação destas células recém-migradas. Em adição, a expressão do gene CTLA-4 está

relacionada a um mecanismo regulatório que ocorre na fase mais tardia da resposta imune

sendo que esta expressão também é influenciada pelas citocinas produzidas no foco

inflamatório. Considerando a importância dos diferentes mediadores produzidos no curso da

PCM é importante investigar o polimorfismo em outros genes que estão envolvidos com a

transdução de sinal nas células que interagem com o fungo, bem como outras

citocinas/proteínas importantes na ativação/regulação da resposta do hospedeiro.

7. CONCLUSÃO

Considerando que:

• a comparação das freqüências genotípicas e alélicas, entre os grupos pacientes e

controles, não mostrou diferenças significativas que pudessem associar o

polimorfismo dos SNPs -318 e +49 do gene CTLA-4 com a PCM;

• apesar de ter sido detectado um desequilíbrio de ligação entre os SNPs -318 e +49 do

gene CTLA-4, a comparação dos haplótipos não mostrou diferenças significativas

entre os grupos;

• o estudo de ancestralidade das amostras envolvidas no estudo mostrou

homogeneidade genética entre os grupos, o que reforçou a não existência de

associação dos polimorfismos estudados do gene CTLA-4 e a PCM;

Pode-se concluir que os dados deste trabalho indicam que os SNPs -318 e +49 do gene

CTL-4 não estão associados à resistência e ou susceptibilidade à PCM.

8. PERSPECTIVAS

Considerando os resultados obtidos até o momento, pode-se colocar como

perspectivas analisar a possível associação do marcador microsatélite (AT)

da região 3´-UTR

do gene CTLA-4 com a PCM bem como a possibilidade de analisar o polimorfismo de outros

genes envolvidos na resposta imune (por exemplo, o CD28).

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