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Universidade de Brasília
Faculdade de Medicina
Análise comparativa das variações
morfológicas entre dois diferentes isolados
(Pb01 e Pb18) do fungo Paracoccidioides
brasiliensis e da sua interação com o
sistema imune do hospedeiro
Cecília Lívia Falcomer Fraga
Brasília, 2008
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I
Programa de pós-graduação em Patologia Molecular
Análise comparativa das variações morfológicas
entre dois diferentes isolados (Pb01 e Pb18) do
fungo Paracoccidioides brasiliensis e da sua
interação com o sistema imune do hospedeiro
Aluna: Cecília Lívia Falcomer Fraga
Orientadora: Drª Anamélia Lorenzetti Bocca
Co-orientadora: Drª Alice Melo Ribeiro
Dissertação de mestrado desenvolvida no Laboratório de
Imunopatologia da Universidade de Brasília e apresentada
ao programa de pós-graduação em patologia molecular, da
Faculdade de Medicina, da Universidade de Brasília como
requisito parcial à obtenção do título de mestre em
patologia molecular.
Brasília, 2008
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II
Banca Examinadora
Titulares:
Profª Drª Anamélia Lorenzetti Bocca, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade de Brasília.
Prof Dr Cesar Koppe Grisolia, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade de Brasília.
Drª Larissa Fernandes Matos, Faculdade de Ceilândia,
Universidade de Brasília.
Suplente:
Drª Luciana Menezes da Silva Flannery, Fundação
Oswaldo Cruz, Unidade de Brasília.
III
Agradecimentos
A Drª Anamélia L. Bocca e Drª Alice M. Ribeiro pela oportunidade para que eu
desenvolvesse este projeto de pesquisa.
Aos alunos Ana Camila e Isaque pelo enorme auxilio no desenvolvimento dos meus
experimentos, como também, aos demais alunos do laboratório Ana Paula, Eleuza,
Laura, Márcio e Natália pela colaboração em determinados momentos do meu projeto.
A Yanna Nóbrega pelas dicas, conselhos, e super-ajuda nos experimentos das dosagens
de citocinas e da fagocitose dos macrófagos. É claro, não posso esquecer dos momentos
de lazer após duras rotinas de trabalho nos finais de semana.
A minha querida amiga e companheira de guerra Janaina Nunes, pela força e auxilio nos
momentos difíceis que passamos juntas, pela ajuda no desenvolvimento dos
experimentos em finais de semana e feriados. Muito obrigada!
A professora Maria Sueli S. Felipe pelos ensinamentos sobre biologia molecular, dentre
outros conhecimentos transmitidos nos seminários do grupo Pb, como também, nas
palestras e work-shop.
Aos alunos do Laboratório de Biologia Molecular da UnB - Adriane, Alex, Calliandra,
Hugo, Larissa, Lorena, Marcus e Túlio – que sempre foram super atenciosos e
prestativos em auxiliar-me quando solicitava.
A Simoneide Silva que me auxiliou com uma paciência, atenção e carinho nos
experimentos de ensaio de fagocitose com macrófagos. Além de auxiliar-me com dicas
super interessantes e coerentes nos momentos que estava meio perdida com os rumos do
meu projeto pesquisa.
Ao meu verdadeiro orientador André Amaral, que desde inicio do meu trabalho com
este projeto, esteve ao meu lado auxiliando-me no desenvolvimento prático dos meus
experimentos com dicas, conselhos, e claro, não posso esquecer das broncas também.
IV
Além disso, muito obrigada pelas correções sugeridas, pela preocupação com minha
saúde e pela amizade.
A Patrícia Cunha pelos ensinamentos sobre as técnicas histológicas, pelo incentivo e
carinho com o qual me auxiliou nestes difíceis momentos finais pelos quais passei.
A Rosane Mansan pela amizade, pelos momentos de lazer, pela super ajuda nesta reta
final do meu mestrado. Muito obrigada!
A profª Fabiana Pirani pelo auxilio na fotografia das lâminas da histopatologia, como
também, pela correção da minha descrição das lâminas, muito obrigada!
A professora Sônia Bao por disponibilizar os equipamentos e materiais para que eu
realizasse os procedimentos da MET, e não posso esquecer da sua aluna Shélida Braz
que me auxiliou com muita atenção e carinho nos procedimentos da MET na interação
Pb-macrófago. Muito obriga!
Ao professor Florêncio Figueiredo e a técnica Viviane do laboratório LIB pelo
processamento do material para análise histopatológica.
Ao pesquisador Alexandre Caetano da Embrapa, por disponibilizar o aparelho β-
cintilador para que eu utilizasse na leitura das minhas amostras. Muito obrigada!
Ao técnico Nelson Pellet pelo carinho, paciência, auxilio e colaboração nos
experimentos para realizar a leitura da timidina tritiada, muito obrigada!
Ao técnico Sr° Dedé pelos ensinamentos sobre como manipular e cuidar dos animais,
pelas dicas e conselhos, como também, por conseguir arrecadar animais para os meus
experimentos, muito obrigada!
Aos os órgãos financiadores do fomento para pesquisa CAPES, CNPQ e FINATEC
pelo apoio financeiro neste projeto.
V
Agradecimento mais do que especial aos meus pais e minhas irmãs que foram pessoas
fundamentais nesta etapa da minha vida, muito obrigada pelo carinho, compreensão,
apoio psicológico e financeiro que dispuseram comigo ao longo desses anos do
mestrado.
A minha super amiga Juliana Caldas que foi meu verdadeiro anjinho, sempre
auxiliando, aconselhando, escutando as minhas reclamações e fazendo-me rir no final, e
principalmente muito obrigada pela sua enorme ajuda e incentivo nesta reta final!
As minhas amadas e queridas mocras pelo carinho, preocupação, paciência, incentivo e
pelos alegres momentos de distração que tiveram comigo ao longo desses anos de
estudo. Ana por sempre me acompanhar nas longas horas de estudo na biblioteca; Beta
por disponibilizar seu tempo para auxiliar-me com os trabalhos no photoshop; La pelo
seu entusiasmo em sempre querer saber como estava indo meu projeto de pesquisa; e
não posso esquecer da minha “fia”, Marina por ter me auxiliado desde a preparação dos
slides para prova de seleção, como também, em diversos outros momentos do mestrado.
Muito obrigada!
As minhas médicas - Carmem, Rose e Patrícia - e a enfermeira Angélica pelos
carinhosos cuidados com a minha saúde, pelo incentivo para que persistisse nos meus
estudos nos momentos que eu queria desistir. Muito obrigada!
A Deus pela força para que eu conseguir ultrapassar todos obstáculos presentes ao longo
destes anos de estudo. Muito obrigada!
VI
Sumário
Índice de figuras
Índice de quadros
Índice de tabelas
Lista de abreviaturas e siglas
Resumo
Abstract
Introdução
1 - Paracoccidioides brasiliensis
1.1 - Paracocidioidomicose
1.2 - Resposta imune do hospedeiro na paracocidioidomicose
Justificativa
Objetivo Geral
Material e Métodos
1.1 Fungo
1.2 Animais experimentais
1.3 Manutenção da virulência dos isolados
1.4 Morfometria dos isolados Pb01 e Pb18
1.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão
1.6 Protocolo do Co-cultivo dos macrófagos com os isolados in vitro
1.6.1 Índice de Fagocitose
1.6.2 Dosagem Óxido Nítrico
1.6.3 MET da interação macrófago com isolados do P. brasiliensis
1.7 Preparação dos isolados para infecção via endovenosa e via
intratraqueal nos animais experimentais
1.8 Protocolo experimental da infecção sistêmica in vivo
1.8.1 Unidades formadoras de colônia do pulmão
1.8.2 Histopatologia do pulmão
1.8.3 Ensaio de proliferação celular
1.8.4 Dosagem de anticorpos (IgG1 e IgG2a) pelo método ELISA
1.9 Protocolo experimental da infecção intratraqueal in vivo
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17
18
18
19
19
VII
1.9.1 Recuperação dos isolados levedura do pulmão
1.10 Análise Estatística
Resultados
1- Comparações morfológicas entre os isolados Pb01 e Pb18 cultivados in
vitro
1.1-Análise morfométrica dos isolados
1.2 Microscopia Eletrônica Transmissão dos isolados
2- Interação dos isolados Pb01 e Pb18 com macrófagos MH-S in vitro
2.1-Capacidade de fagocitose dos macrófagos
2.2 Dosagem de Óxido Nítrico
2.3 Microscopia eletrônica transmissão da interação P.brasiliensis
com células MH-S
3- Interação dos isolados Pb01 e Pb18 com o hospedeiro in vivo
3.1 - Via de infecção endovenosa
3.1.1 - Análise histopatológica do pulmão dos animais dos dois
grupos experimentais
3.1.2 - Determinação do número de leveduras viáveis no tecido
pulmonar
3.1.3 - Capacidade linfoproliferativa dos animais com infecção
sistêmica
3.1.4 - Quantificação das imunoglobulinas
3.2 - Via de infecção intratraqueal
3.2.1-Recuperação das Unidades Formadoras de Colônia do tecido
pulmonar
3.2.2-Análise histopatológica do tecido pulmonar
3.2.3-Dosagem de NO e dos anticorpos IgG1 e IgG2a
Discussão
Conclusão
Referências Bibliográficas
Anexo 1
20
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67
VIII
Índice de Figuras:
Figura 1: Gráficos que representam à média aritmética dos valores do
diâmetro dos isolados de levedura Pb01 e Pb18.
Figura 2: Imagens em microscopia óptica ilustrando as diferenças
morfológicas entre o Pb01 e o Pb18, corados com azul de algodão.
Figura 3: Eletromicrografias de transmissão do Pb01 e Pb18 do fungo
Paracoccidioides brasiliensis.
Figura 4: Capacidade de fagocitose dos macrófagos MH-S in vitro em
relação ao Pb01 e Pb18.
Figura 5: Viabilidade das células dos isolados nos ensaios de
fagocitose.
Figura 6: NO liberado pelos macrófagos MH-S em co-cultivo.
Figura 7: Microscopia eletrônica transmissão da interação das
leveduras de P.brasiliensis com células MH-S após 72 horas.
Figura 8: Fotomicrografias mostrando a evolução da lesão
granulomatosa pulmonar ocasionada pela inoculação por via endovenosa
de 1x10
6
leveduras do isolado Pb18.
Figura 9: Fotomicrografia dos infiltrados inflamatórios induzido no
pulmão dos animais infectados via endovenosa com isolado Pb01 do
fungo P. brasiliensis.
Figura 10: Cinética da recuperação das CFU do pulmão durante o
curso da infecção sistêmica com os isolados Pb01 e Pb18.
Figura 11: Resultados dos índices de proliferação dos esplenócitos
obtidos dos animais infectados com isolados Pb01 e Pb18.
Figura 12: Cinética de recuperação das CFU/g pulmão durante o curso
da infecção intratraqueal com os isolados Pb01 e Pb18.
Figura 13: Fotomicrografia dos infiltrados inflamatórios induzido no
pulmão dos animais infectados via intratraqueal com 10
6
leveduras do
isolado Pb01.
Figura 14: NO liberado nos pulmões dos animais C57Bl/6 infectados
intratraquealmente.
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IX
Índice de Quadros:
Quadro I: Algumas manifestações clínicas da PCM que afetam órgãos
do paciente infectado com P. brasiliensis.
Quadro 2: Isolados do fungo P. brasiliensis demonstrando o grupo
genético que pertencem, como também, o local onde foi extraído do
hospedeiro e o órgão no qual foi retirado cada isolado.
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6
7
X
Índice de Tabela:
Tabela 1:
Morfometria do Pb01 e Pb18 no 4º, 5º, 6º e 7º dia de cultivo
em meio BHI líquido.
Tabela 2: Dosagem dos isotipos IgG1 e IgG2a da imunoglobulina IgG
no soro animais infectados.
Tabela 3: Dosagem dos isotipos IgG1 e IgG2a no soro animais
C57Bl/6 infectados pela via intratraqueal com 10
5
leveduras
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XI
BHI
ºC
CACO
CFU
cm
2
ConA
CPM
DNA
DO
ELISA
g
G
h
HE
IFN-γ
Ig
IL-2
L
LPS
μCi
µg
µL
µm
µM
mg
mL
mM
min.
M
nm
N
Brain Heat Infusion
Graus centígrados
Tampão cacodilato de sódio
Unidades formadoras de colônias
Centímetros quadrados
Concanavalina A
Contagem de pulsos por minuto
Ácido desoxirribonucléico
Densidade óptica
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Grama
Gravidade
Horas
Hematoxilina-Eosina
Interferon gama
Imunoglobulina
Interleucina do subtipo 2
Litros
Lipopolissacarídeo
MicroCurie
Microgramas
Microlitros
Micrometros
Micromolar
Miligramas
Mililitros
Milimolar
Minutos
Molar
Nanômetros
Normal
Lista de Abreviaturas e Si
g
las
XII
NO
PBS
PCM
pH
rRNA
SD
Th
%
RNI
RNO
Óxido nítrico
Tampão salina fosfato
Paracoccidioidomicose
Potencial de hidrogênio
Ácido ribonucléico ribossômico
Desvio padrão
Células T auxiliares
Percentagem
Espécies reativas de nitrogênio
Espécies reativas de oxigênio
XIII
Resumo
O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da micose
sistêmica paracoccidioidomicose, cuja região endêmica restringe-se a América Latina,
sendo o Brasil, a Colômbia e a Venezuela os países com alta freqüência na incidência de
casos. O desenvolvimento da doença depende diretamente da interação entre o P.
brasiliensis e o hospedeiro, aspectos como a virulência do fungo e o tipo de resposta
imune que ele induz no hospedeiro são importantes para compreender as diferenças nas
formas clínicas desta doença. Um aspecto importante a ser considerado nesta interação
são as diferenças genéticas, observadas entre os grupos filogenéticos, do gênero
Paracoccidioides. Assim, neste trabalho avaliamos as diferenças morfológicas entre
dois isolados P. brasiliensis (Pb01 e Pb18), como também, observamos a interação
destes isolados com macrófagos in vitro. Além de realizar a caracterização da resposta
imune induzida por diferentes vias de infecção em camundongos. As células do isolado
Pb01 apresentaram um menor diâmetro em relação à do Pb18 e com o formato circular
predominante tanto para células mães como para os brotamentos, enquanto Pb18 variou
sua morfologia entre a forma elíptica e circular. As leveduras Pb01 são fagocitadas mais
rápido e numa porcentagem maior que as do Pb18, as quais sobrevivem por um tempo
maior dentro dos macrófagos e induzem uma menor produção óxido nítrico. Na
infecção sistêmica, os animais inoculados com Pb01 apresentaram uma resposta
linfoproliferativa mais eficiente até 30 dias após infecção. Após este período a resposta
tornou-se similar com a do Pb18, no qual ocasiona supressão da resposta
linfoproliferativa. Neste tipo de infecção observou-se uma resposta imunológica
predominantemente Th1. Mas, na infecção pela via intratraqueal houve uma resposta
imunológica mista (Th1 e Th2) nos animais infectados, porém nas duas formas de
infecção, houve uma baixa carga fúngica recuperada do tecido pulmonar e não
apresentou a formação da resposta inflamatória granulomatosa. Os animais infectados
com o isolado Pb18, nas duas formas de infecção, houve predomínio da resposta Th2,
como também, uma quantidade crescente na carga fúngica recuperada do pulmão e uma
resposta inflamatória granulomatosa neste órgão. Portanto, o isolado Pb01 possui uma
menor patogenicidade em relação ao Pb18, como também, induz uma resposta
imunológica mais efetiva nos animais experimentais.
Palavras chaves: Paracoccididoides brasiliensis, paracoccidioidomicose experimental,
isolados Pb01 e Pb18, resposta imune celular.
XIV
Abstract
The dimorphic fungus Paracoccididoides brasiliensis is the etiologic agent of
systemic mycosis paracoccidioidomycosis, it is restrict to Latin American. It is
frequently diagnosed in Brazil, Colombia and Venezuela. The evolution of this disease
depends directly on the interaction between P.brasiliensis and host. Aspects of
fungus’s virulence and the immune type response of host that is caused by fungi are
important to understand differences on the clinical form’s disease. An important aspect
to be considerated on this interaction are genetic differences, observed between
phylonegetics groups from Paracoccidioides genus. In this work we analyzed
morphological differences of two isolate of P. brasiliensis (Pb01 and Pb18) and studied
the interaction of these isolate and macrophages in vitro. Immune response induced by
distinct ways of infection in murine was caracterizated. The isolate Pb01 cells showed
mainly a circular shape and a littlest diameter either to mother’s cells and budding
compared to Pb18 that presented an elliptical and circular shape. Yeasts Pb01 are
phagocyted fastly and in a major quantity than Pb18. Yeasts Pb18 survived for more
time inside macrophages and induced a little oxide nitric’s production. In systemic
infection, inoculated animals with Pb01 presented more efficient linfoproliferative
response until 30 days after infection. After this period, the response became similar to
Pb18, which causes suppression of linfoproliferative response. In this kind of infection
we observed an immunological response predominantly Th1. But, in infection by
intratracheally way occurred a mixed immunological response (Th1 e Th2) in infected
animals, however in two types of infection, a low fungic’s load was recovered from
lung’s tissue and did not present formation of inflammatory granulomatosa response.
Infected animals with isolate Pb18, in both ways of infection, occurred mainly response
Th2 and a crescent increase on quantity of fungal burden recovered from lungs and an
inflammatory granulomatosa in this organ. Then, the isolate Pb01 has a minor
pathogenicity in relation to Pb18 and induces an immunological response more efficient
in model animals.
Keywords: Paracoccididoides brasiliensis, experimental paracoccidioidomycosis,
isolates Pb01 and Pb18, cellular immune response
Introdução
2
Introdução
1 – Paracoccidioides brasiliensis
O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da
micose sistêmica paracoccidioidomicose (PCM). Ele é encontrado na forma de micélio
em temperaturas inferiores a 28°C, que é caracterizado por filamentos septados com
conídios terminais ou intercalares (San-Blas, 1993). Em temperaturas 37°C, ele
apresenta a forma de levedura que é caracterizada por brotamentos múltiplos formados
por evaginação da célula mãe, onde uma célula central é circundada por várias células
periféricas, conferindo um aspecto de roda de leme de navio (Lacaz et al., 1991). Essa
diferenciação morfológica é conseqüência de um conjunto de alterações bioquímicas e
fisiológicas desencadeadas pela variação da temperatura, a qual estimula uma adaptação
no padrão transcricional e/ou regulatório de genes (Nunes et al., 2005; Bastos et al.,
2007).
As condições e o local exato onde P. brasiliensis ocorre na natureza ainda não
foram totalmente elucidadas, embora, sabe-se que a sua adaptação é favorecida em solos
úmidos, com pH ácido e rico em matéria orgânica, os quais são típicos de regiões que
apresentam temperatura moderada e com curtos períodos de seca (Restrepo et al.,
1985). Estas condições estavam presentes em áreas onde P. brasiliensis já foi isolado,
como: nas plantações de café no Brasil (Silva-Vergara et al., 1998), na Argentina
(Negroni, 1966), na Venezuela (Albornoz, 1971), nas de fezes de morcegos Artibeus
literatus (Grose & Tamsitt, 1965), de pinguins Pygoscelis adeliae (Gezuele, 1989) e de
tatu Dasypus novemcinctus e Cabassous centralis (Silva-Vergara et al., 1999; Corredor
et al., 2005).
O fungo foi inicialmente caracterizado por Almeida (1930) como sendo do
gênero Paracoccidioides e da espécie brasiliensis. A sua classificação como membro do
filo Ascomycota foi realizada por Leclerc et al. (1994), após comparações filogenéticas
das seqüências de DNA da subunidade ribossomal maior (28S) entre fungos dimórficos
e dermatófitos. A partir de comparações entre seqüências parciais de rRNA de fungos
dimórficos realizadas por Guého et al. (1997), o fungo P. brasiliensis foi classificado,
juntamente com os gêneros Histoplasma, Emmonsia e Blastomyces, como pertencente à
família Onygenaceae. Análises filogenéticas das seqüências da subunidade ribossomal
menor de vários fungos reforçaram a tese de que P. brasiliensis deveria ser agrupado na
3
ordem Onygenales (Bialek et al., 2000). Assim, atualmente P. brasiliensis é descrito
como pertencente ao reino: Fungi; divisão: Ascomycota; subdivisão: Euascomycotina;
classe: Plectomyceto; subclasse: Euascomycetidae; ordem: Onygenales; família:
Onygenaceae; subfamília: Onygenaceae anamórficos; gênero: Paracoccidioides;
espécie: brasiliensis (San-Blas et al., 2002).
Além da classificação em filo, ordem, família e gênero, Matute (2006)
demonstrou que existem espécies crípticas dentro da espécie P. brasiliensis:
S1 – constituída por 38 isolados de diferentes localizações geográficas na América
Latina: Brasil, Argentina, Paraguai, Peru e Venezuela -;
PS2 - formada por 2 espécies filogenéticas, com 5 isolados brasileiros encontrados nos
estados de São Paulo e Minas Gerais e 1 isolado venezuelano da região de Caracas -;
PS3 – composta por 3 espécies filogenéticas, formada por 21 isolados colombianos - .
Sendo que PS2 e PS3 são parafiléticas e o grupo S1 é considerado como espécies
independentes.
O isolado Pb18 está incluso dentro do grupo S1, porém o isolado Pb01 não se
apresenta dentro desta classificação (Carrero et al., 2008). Assim, o isolado Pb01
apresenta um alto nível de divergência quando comparado com as 3 espécies
filogenéticas descritas por Matute (2006), corroborando com estudos prévios de Carrero
(2008) e Teixeira (2008) que definem uma nova espécie filogenética para fungo, Pb01-
like, a qual abrange Pb01, como também, outros isolados dos estados Goiás e Mato-
Grosso. Além disso, Teixeira (2008) sugere no seu trabalho que isolado Pb01 representa
uma nova espécie para o gênero Paracoccidioides, propondo a denominação de
Paracoccidioides lutzii.
1.1- Paracoccidioidomicose (PCM)
A infecção no hospedeiro humano geralmente ocorre pela inalação de
propágulos, os quais alcançam o epitélio alveolar pulmonar convertendo-se na forma de
levedura (Restrepo et al., 2001). Este processo de transformação ocorre no hospedeiro,
sendo fundamental para o sucesso no estabelecimento do foco inflamatório (Brummer et
al., 1993; Camargo et al., 2000). Porém, o desenvolvimento da doença depende
diretamente da resposta imune do hospedeiro (Mendes et al., 1971).
Inicialmente descrita por Adolpho Lutz em 1908, a PCM ocorre
predominantemente em áreas rurais, onde os indivíduos estão possivelmente mais
4
expostos ao agente etiológico, acometendo principalmente indivíduos do sexo
masculino entre 30 e 60 anos de idade e pacientes com deficiência imunológica
(Brummer et al., 1993; Coutinho et al., 2002). É uma micose sistêmica com alta
prevalência na América Latina (Franco et al., 1987) onde se estima que cerca de dez
milhões de pessoas estejam infectadas, embora somente cerca de 2% apresentam
predisposição para desenvolver a doença (McEwen et al., 1995).
Dados epidemiológicos indicam uma distribuição situada entre 20º ao norte e 35º
ao sul do Equador, estendendo-se por 14 países situados do México à Argentina
(Restrepo et al., 1985; San-Blas et al., 2002). Entretanto, a doença não ocorre em todos
os países dentro destes limites, a maior incidência da doença é observada no Brasil,
Colômbia e Venezuela (Rivitti & Aoki, 1999).
No Brasil ocorrem cerca de 80% dos casos descritos na literatura (Lacaz et al.,
1991; Brummer et al., 1993). A distribuição da doença nas regiões endêmicas mostra-se
heterogênea, ocorrendo mais casos nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, destacando-
se os estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul,
Goiás e Mato Grosso do Sul na incidência de casos (Camargo et al., 2000). Por não
requerer notificação compulsória, a real incidência da PCM na América Latina não é
conhecida, mas estima-se a ocorrência de 1 a 3 casos por 100.000 habitantes (Brummer
et al., 1993). Além disso, o longo período de latência que caracteriza a PCM dificulta
determinar com precisão o possível local onde a infecção foi adquirida, já que em
homens esta latência é por volta de 15 anos para as primeiras manifestações clínicas
aparecerem (Brummer et al., 1993).
A maioria dos indivíduos infectados desenvolve a forma assintomática, podendo
ou não progredir para a doença, que apresenta diferentes formas clínicas, as quais estão
relacionadas com fatores do hospedeiro, níveis de virulência dos isolados e condições
ambientais (San-Blas et al., 2002). Dentre os fatores do hospedeiro que facilitariam a
transição do estado de infecção para doença, seriam: a desnutrição (Franco, 1987), o
alcoolismo (Martinez & Moya, 1992) e o estado imunitário do hospedeiro (Leão &
Mendes, 1980). Tais fatores conferem à doença uma característica de micose
oportunista. Portanto, a apresentação clínica da PCM e o curso da infecção dependem
principalmente das condições de saúde do indivíduo e também, do isolado de P.
brasiliensis no qual o hospedeiro foi infectado.
Há duas formas da doença que são conhecidas e distintas entre si: a forma aguda
(ou juvenil) e a forma crônica (ou adulta) (Franco et al., 1987). A primeira desenvolve-
5
se mais rapidamente sendo mais grave que a segunda (Montenegro et al., 1986). Porém,
nos dois casos, as funções imunes mediadas por células são alteradas, e na ausência de
terapia específica, a mortalidade é alta (Lacaz et al., 1991). Um estudo realizado por
Coutinho e colaboradores avaliou o número de óbitos por PCM no Brasil durante o
período 1980 a 1995 (Coutinho et al., 2002). Os seus resultados demonstraram que a
PCM é a 8ª causa de mortalidade entre as doenças crônicas, como também, é a detentora
da maior taxa de mortalidade entre as micoses sistêmicas no país.
A forma aguda ou juvenil acomete principalmente crianças e jovens,
representando apenas 3 a 5% dos casos de PCM. É caracterizada pelo rápido curso
(semanas a meses) e pelo envolvimento do sistema reticulo endotelial -baço, fígado,
nódulos linfáticos e medula óssea- resultando na hipertrofia destes órgãos (Londero &
Melo, 1983). A função imune mediada por células é deprimida nestes pacientes,
ocasionando uma desordem linfoproliferativa. Esta é a forma mais grave da PCM e com
o pior prognóstico para pacientes (Brummer et al.,1993).
A forma crônica acomete mais de 90% dos pacientes com PCM, sendo que os
homens adultos são os mais afetados. A progressão da doença acontece de forma lenta,
podendo levar meses ou até anos para se tornar completamente estabelecida (Brummer
et al.,1993; Svidzinski et al.,1999). Em 25% dos casos ela é unifocal e os únicos órgãos
clinicamente afetados são os pulmões. Mas, em muitos casos o paciente somente irá
tratar-se quando a doença se espalhar para outros órgãos, devido a sua forma silenciosa,
ou seja, ao seu período de latência (Restrepo et al., 1976; Londero, 1986; Franco et al.,
1989). Esta disseminação gera o quadro clínico denominado forma crônica multifocal a
qual apresenta sintomas variáveis, porém com freqüentes lesões na mucosa oral e nasal,
na pele, nos nódulos linfáticos e nas glândulas adrenais e as funções da imunidade
celular são diminuídas (Tendrich et al., 1991; Brummer et al.,1993).
As manifestações clínicas da forma crônica da PCM são classificadas em duas
formas polares (Franco et al., 1994). A polar positiva que é caracterizada pela presença
de lesões generalizadas, pelo elevado título de anticorpos específicos aos antígenos de
P. brasiliensis, imunidade celular enfraquecida e presença de reação inflamatória
granulomatosa, contendo muitos fungos viáveis. Na forma polar negativa, as lesões são
localizadas, o título de anticorpos específicos ao P. brasiliensis é baixo ou ausente, a
imunidade celular é preservada e as lesões granulomatosas são compactas e com baixo
número de fungos. Ambas as formas clínicas da doença estão associadas com extensas
seqüelas nos órgãos do hospedeiro que incluem lesões ocasionadas por uma resposta
6
anormal de células do sistema imune. O quadro I representa alguns órgãos que podem
ser afetados no decurso do quadro clínico da PCM.
Quadro I: Algumas manifestações clínicas da PCM que afetam órgãos do paciente
infectado com P. brasiliensis.
Regiões afetadas Características clínicas
Mucosa Lesões ulcerativas que podem afetar qualquer estrutura
dentro da boca, nariz, laringe e orofaringe.
e, c, h
Pulmão Nódulos confluentes bilaterais com infiltração afetando,
principalmente a região central e basal do pulmão;
a, c, g
Fibrose pulmonar.
c, d, g
Pele Lesões ulcerativas que tendem a infiltrar nos tecidos
subcutâneos.
b, c
Diversos órgãos do
sistema digestivo,
vascular e nervoso.
Pode afetar baço, gânglios linfáticos, trato intestinal, tubo
digestivo, fígado, ocasionar a destruição óssea,
comprometimento do sistema nervoso central.
a, b, f, c
a: Chojniak et al., 2000; b: Brummer et al.,1993; c: Del Negro et al., 1982 d: Cock et
al., 2000; e: Sposto et al., 1994; f: Silva et al., 1999; g: Franco et al., 1993; h: Manns et
al., 1996.
Os diversos isolados do fungo P. brasiliensis são obtidos de pacientes com
PCM, como também, de animais (quadro 2). Estes isolados de P. brasiliensis exibem
variações biológicas em relação ao seu crescimento, nas suas características estruturais e
moleculares, como também, na patogenicidade e virulência (Mendes-Giannini et al.,
1990; Salem-Izacc et al., 1997; Mollinari-Madlum et al., 1999; Camargo et al., 2000).
Estas variações sugerem que a PCM pode ser causada por diferentes isolados de P.
brasiliensis (Camargo et al., 2000). Diversos autores (Franco et al., 1993; Mollinari-
Madlum et al., 1999; Camargo et al., 2000) observaram que nas infecções
experimentais induzidas por diferentes isolados de P. brasiliensis, ocorrem diferenças
na formação dos granulomas e no comprometimento dos órgãos, na resposta imune do
hospedeiro ao patógeno, devido principalmente, à virulência de cada isolado utilizado, a
qual influencia diretamente na relação P. brasiliensis - hospedeiro.
7
Quadro 2: Isolados do fungo P. brasiliensis demonstrando o grupo genético que
pertencem, como também, o local onde foi extraído do hospedeiro e o órgão no qual foi
retirado cada isolado.
Isolado
Grupo
genético
Localização Hospedeiro Origem Referência
T1F1 S1 Pratania, São
Paulo, Brasil
Dasypus
novemcinctus
Fígado
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T3B6 S1 Pratania, São
Paulo, Brasil
Dasypus
novemcinctus
Baço
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T4B17 S1 Manduri, São Paulo,
Brasil
Dasypus
novemcinctus
Baço
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T5LN1 S1 Botucatu, São
Paulo, Brasil
Dasypus
novemcinctus
Nódulo linfático
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T7F6 S1 Manduri, São Paulo,
Brasil
Dasypus
novemcinctus
Fígado
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T8LN2 S1 Botucatu, São
Paulo, Brasil
Dasypus
novemcinctus
Nódulo linfático
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T9B1 S1 Botucatu, São
Paulo, Brasil
Dasypus
novemcinctus
Baço
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T13LN2 S1 Manduri, Sao Paulo,
Brasil
Dasypus
novemcinctus
Nódulo linfático
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T15LN1 S1 Manduri, São Paulo,
Brasil
Dasypus
novemcinctus
Nódulo linfático
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
BT60 S1 Manduri, São Paulo,
Brasil
Humano Sputum
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
Pb18 S1 São Paulo, São
Paulo, Brasil
Humano Ganglionar pus
Teixeira et al., 1987
Pb339 S1 São Paulo, São
Paulo, Brasil
Humano Desconhecido Restrepo-Moreno &
Schneidau, 1967
Pb927 S1 Antártida/Uruguai
Pygoscelis
adeliae
Feces
Garcia et al., 1993
BT84 PS2 Botucatu, São
Paulo, Brasil
Humano Sputum
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
T10B1 PS2 Botucatu, São
Paulo, Brasil
Dasypus
novemcinctus
Baço
Hebeler-Barbosa et al.,
2003
Pb262 PS2 Uberlândia, Minas
Gerais, Brasil
– Ração canina
Ferreira et al., 1990
Pb02 PS2 Caracas, Venezuela Humano Desconhecido
Morais et al., 2000
Pb04 PS2 São Paulo, São
Paulo, Brasil
Humano Desconhecido
Morais et al., 2000
EPM83 PS3 Colômbia Humano Desconhecido Desconhecido
EPM77 PS3 Colômbia Desconhecido
Desconhecido Desconhecido
Pbdog Desconhecido
Curitiba, Paraná,
Brasil
Canis
familiares
Nódulo linfático
Farias et al., 2005
Pb01 Pb01-like Goiânia, Goiás,
Brasil
Humano Pulmão Maria do Rosário R. Silva
comunicação pessoal
Adaptado: Theodoro et al., 2008
Singer-Vermes e colaboradores (1994) estudaram a patogenicidade de 6
diferentes isolados (Pb44, Pb47, Pb50, Pb45, Pb56, Pb57) do fungo P. brasiliensis, os
quais foram provenientes de pacientes com PCM crônica que apresentavam diferenças
na apresentação clínica da doença - variando entre as formas brandas a graves. Os
8
autores compararam a PCM dos humanos nos quais os isolados foram obtidos, com a
virulência destes isolados, o tropismo para diferentes órgãos como também, habilidade
de induzir a resposta imune celular e humoral em animais susceptíveis B.10A. Os seus
resultados indicam que associação entre patogenicidade e virulência do fungo na doença
humana e em animais susceptíveis não são análogas.
Além do estado imunitário do hospedeiro, alguns fatores relacionados ao fungo
são importantes na indução e na manutenção do processo inflamatório granulomatoso,
como os componentes da parede celular do fungo, principalmente a α-1,3-glucana que é
um polissacarídeo presente predominantemente na forma de levedura do fungo P.
brasiliensis, e na fase de micélio o polissacarídeo é a β-1,3-glucana (San-Blas et al.,
1993). A β-1,3-glucana está presente na parede celular das células dos seres do reino
Fungi, enquanto a α-1,3-glucana ocorre com menor freqüência nos indivíduos deste
reino. Assim, Zaccarias e colaboradores (1986) que estudaram a composição da parede
celular de dois isolados Pb265 e o Pb18, observaram a não existência de diferenças em
relação à percentagem de hexoses encontradas na fração 1 (composta por β-1,3-glucana
e quitina) em ambos isolados. Porém, o isolado Pb265 que apresenta uma menor
virulência, possui uma maior percentagem de hexoses na fração 2 (que contém α-1,3-
glucana e resíduos de β-1,3-glucana). Fato este que corrobora com trabalho de San-Blas
& Nino-Vega (2008) que sugerem a existência de uma relação entre a quantidade de
α
-
glucana na parede celular das leveduras dos isolados de P. brasiliensis com a virulência
destas.
Vários autores trabalham com as leveduras do isolado Pb18 para induzir a
paracoccidioidomicose experimental em animais. Em relação ao isolado Pb01, pouco se
conhece sobre a infecção ocasionada por este, já que este isolado é muito utilizado para
estudos moleculares, como seu transcriptoma (Felipe et al., 2005). Assim, o intuito
deste trabalho foi demonstrar se a levedura do isolado Pb01 é capaz de induzir a PCM
em modelos murinos como a do isolado Pb18.
1.2 Resposta imune do hospedeiro na paracocidioidomicose
A resposta imune do hospedeiro desempenha um papel fundamental na
progressão da PCM, já que direciona a evolução da doença para uma das formas
clínicas. Assim, a forma aguda da doença, com envolvimento de vários órgãos e que
9
ocasiona a morte do paciente, é acompanhada da perda gradual de respostas imunes
celulares específicas e de número maior de títulos de anticorpos específicos. O pólo
positivo ou hiperérgico da forma crônica da doença pode apresentar algumas lesões
localizadas e que regridem com tratamento, conseguindo manter um adequado
funcionamento da resposta imune celular e níveis baixos de anticorpos específicos
(Fava-Netto, 1955; Mendes & Raphael, 1971). Este fato não é observado no pólo
negativo ou anérgico da forma crônica da doença.
O papel de proteção da resposta imune humoral na paracoccidioidomicose é
controverso. Embora possa facilitar a opsonização de fungos e mediar sua lise via
complemento em soros de pacientes com doença ativa (Nogueira et al., 1986) a
superprodução de anticorpos em pacientes com PCM, estaria refletindo uma
desregulação no balanço da resposta humoral do sistema imune, sendo relacionada com
um mau prognóstico da doença. A produção de anticorpos específicos das classes IgG,
IgM e IgA é induzida pela infecção por P.brasiliensis (Vaz et al., 1992; Blotta &
Camargo, 1993). Com a disseminação da doença, observa-se a ativação policlonal de
células B (com produção de altos níveis de anticorpos das classes IgG, IgE e IgA) e
resposta imune celular comprometida (Chequer-Bou-Habib et al., 1989). O alto nível de
anticorpos nestes casos provavelmente, deve-se à disseminação de leveduras, visto que
o sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro é incapaz de controlar a multiplicação
das leveduras no seu interior (Diniz et al., 1999).
A imunidade celular representa um dos mecanismos mais importantes de defesa
do hospedeiro contra o fungo, ocorrendo uma relação inversa entre a integridade da
resposta imune celular do paciente e a gravidade da doença (Mota et al., 1985). A
resposta imune celular é mediada principalmente por células T auxiliares do subtipo
CD4+ (Th1) que são produtoras das citocinas INFγ e IL-2.
O granuloma é um componente essencial na defesa anti-P. brasiliensis, sendo o
macrófago a sua principal célula constituinte. Vários estudos clínicos e experimentais
sugerem que macrófagos ativados pelos linfócitos T têm papel fundamental na
resistência a este fungo. Nos granulomas, as células T, que se localizam
perifericamente, formam um manto ao redor dos macrófagos agregados no centro. A
relação das células apresentadoras de antígenos com linfócitos, possivelmente pode
resultar na liberação de fatores estimuladores de célula T, como interleucina 2 (IL-2).
Estes linfócitos ativados secretam IL-2 e IFN-
γ que atraem, fixam e ativam os
10
macrófagos nos focos inflamatórios. Além disso, a diferenciação dos macrófagos em
células epitelióides nos granulomas, também é estimulada por IL-2 e IFN-γ.
A interação entre macrófago e linfócito T permite que o macrófago exerça suas
atividades microbicidas e de apresentador de antígenos. Além disto, junto com o
linfócito T eles irão produzir e secretar citocinas e outros fatores, como por exemplo,
óxido nítrico o qual aumenta a capacidade das células imunes localizadas no granuloma
de eliminar P. brasiliensis, a fim de evitar a sua disseminação pelo organismo. Como a
manutenção do granuloma é uma das características principais da imunidade celular,
este ramo do sistema imune adaptativo exerce um papel crucial na proteção contra a
infecção por P. brasliensis.
Na infecção humana como na experimental há uma relação entre o padrão de
citocinas produzidas e a resistência ao patógeno. Indivíduos resistentes apresentam um
padrão de citocinas do tipo Th1 enquanto indivíduos susceptíveis apresentam um padrão
de citocinas do tipo Th2 (Kashino et al., 2000). As diferenças no perfil de citocinas
podem ter um impacto no tipo de granuloma formado, principalmente na intensidade,
como também, na extensão de necrose central do granuloma. Apesar de não estarem
elucidados precisamente o mecanismo da formação e manutenção do granuloma, as
citocinas apresentam um importante papel neste mecanismo, já que o padrão diferente
de citocinas secretadas por linfócitos T localizados nos infiltrados inflamatórios
influencia na evolução do granuloma (Kashino et al., 2000).
Durante a formação de um granuloma típico de hipersensibilidade, um perfil de
citocinas Th1 predomina, enquanto o perfil Th2 está associado a uma reação
granulomatosa prejudicada e de reduzida resistência aos patógenos intracelulares
(Kunkel et al., 1996). Outros fatores, além das citocinas presentes, influenciam a
diferenciação de uma resposta para Th1 ou Th2. Nestes incluem-se: a dose ou
concentração do antígeno, o tipo das células apresentadoras de antígeno que interagem
com o linfócito T e o sinal co-estimulador envolvido nessa interação (Pfeiffer et al.,
1991; Bretscher, 1992; Hosken et al., 1995).
Os monócitos, assim como os macrófagos, quando não ativados permitem o
crescimento e a multiplicação intracelular de P. brasiliensis. Porém, ao serem ativados
pelo IFN-γ conseguem inibir o crescimento fúngico intracelular (Moscardi-Bacchi et al.,
1994). O sistema complemento também participa no processo de inibição do
desenvolvimento da doença. A ativação da via alternativa do sistema complemento pelo
P. brasiliensis, descrita por Calich et al. (1979) pode resultar na opsonização do fungo,
11
fato este que facilita a fagocitose das leveduras pelos macrófagos (Singer-Vermes et al.,
1993).
Justificativa
A elucidação das características de um fungo, tais como a patogenia, são
necessárias para compreender se diferenças genéticas observadas entre os grupos
filogenéticos do gênero Paracoccidioides resultam em diferenças no aspecto clínico da
PCM. Além disso, sabe-se que o desenvolvimento desta doença depende da virulência
da fase leveduriforme do fungo. O isolado Pb01 é usado como modelo para estudos de
transcriptoma do fungo P. brasiliensis, porém, pouco se conhece sobre este isolado em
relação a sua virulência e a resposta imunitária que induz em modelos experimentais
quando comparada com isolado Pb18, o qual é amplamente utilizado em pesquisas
devido ao conhecimento prévio da sua virulência e da resposta imunológica que
promove nos hospedeiros.
Objetivo Geral
O objetivo do presente trabalho foi comparar a resposta imunológica na infecção
induzida pelas leveduras dos isolados Pb01 e Pb18 do fungo Paracoccidioides
brasiliensis em modelo murino.
Objetivos específicos:
• Investigar as diferenças morfológicas entre os isolados Pb01 e Pb18;
• Observar a interação entre os macrófagos e os isolados Pb01 e Pb18;
• Caracterizar a resposta imune associada com modelos experimentais que
mimetizam a doença natural, por meio da determinação de parâmetros
imunológicos em diferentes vias de infecção.
Material e Métodos
13
Material e Métodos
1.1 Fungo
Os isolados do fungo Paracoccidioides brasilienses das linhagens Pb01 e Pb18, na
sua morfologia leveduriforme, foram obtidos da micoteca do laboratório de Biologia
Molecular do Instituto de Biologia da Universidade de Brasília (UnB) em meio Fava
Netto sólido mantidos em estufa a 37ºC, realizando-se a troca de meio a cada 15 dias.
1.2 Animais experimentais
Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com idades entre 8 a 12 semanas
da linhagem C57Bl/6 os quais apresentam uma susceptibilidade intermediária a
paracoccidioidomicose (Vaz et al., 1992). Estes animais foram cedidos pelo biotério da
Faculdade de Medicina da UnB e mantidos em condições controladas de luminosidade,
com livre acesso à água e a uma dieta padrão do alojamento de animais da Faculdade de
Medicina da Universidade de Brasília.
Os animais foram separados em 2 grupos (isolado Pb01 e isolado Pb18) com 20
indivíduos cada, para estabelecer a infecção sistêmica utilizou-se a via de infecção
endovenosa. Na infecção pulmonar usou-se a via intratraqueal para inoculação 10
5
leveduras nos animais, subdividindo-os em 2 grupos (isolado Pb01 e isolado Pb18) com
10 indivíduos cada grupo. Além disso, realizou-se a infecção pela via intratraqueal em
animais Balb/c com a inoculação de 10
6
leveduras do isolado Pb01, os quais também
apresentam uma susceptibilidade à PCM similar à apresentada pelos camundongos da
linhagem C57Bl/6 conforme descrição de Vaz e colaboradores (1992).
Os procedimentos realizados com os animais estão em acordo com as normas
estabelecidas pelo Comitê Brasileiro de Ética Animal (COBEA) e foram analisados e
aceitos pelo Comitê de Ética no Uso Animal (CEUA) da Universidade de Brasília
(anexo 1).
1.3 Manutenção da virulência dos isolados
A manutenção da virulência dos fungos foi feita como previamente descrito por
Nascimento e colaboradores (2002), com adaptações. Uma solução de 5x10
6
células/mL de leveduras foi inoculada no peritônio de camundongos da linhagem
C57Bl/6. Após 2 semanas infecção, sacrificou-se esses animais e os isolados fúngicos
deles obtidos, foram utilizados na infecção dos animais de experimentação.
14
1.4 Morfometria dos isolados Pb01 e Pb18
Utilizou-se isolados na sua morfologia de levedura que cresceram em meio Fava
Netto sólido por 7 dias, transferindo-os para crescer em meio BHI (MercK, Germany)
liquido por 4, 5, 6 e 7 dias em gabinete incubação com agitação de 1,2G a 37ºC. Após o
período de crescimento, realizou-se a centrifugação (768,5G/5minutos) retirando-se
sobrenadante e diluindo as células em 1mL PBS estéril. Usou-se uma aliquota de 10µL
da solução de células mais 10µL do corante azul de algodão (Sano et al., 1993) na
preparação das lâminas, as quais foram observadas em microscópio óptico (Zeiss) para
análise da morfometria das células de levedura, inclusive dos seus brotamentos. Mediu-
se o maior diâmetro das células, já que estas possuem um formato circular/elíptico
predominante. Para cada dia crescimento montou-se 2 lâminas de cada isolado fúngico,
realizando-se a medida do diâmetro de 30 células leveduras e destas foram escolhidas
20 brotamentos para medição do diâmetro em cada lâmina.
1.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Soluções contendo separadamente os isolados de leveduras (Pb01 e Pb18) do fungo
P. brasiliensis nas concentrações de 5x10
4
células/ml, foram cultivadas em meio BHI
líquido e coletadas no 4º dia de crescimento. Após centrifugação 768,5G por 5 minutos,
as soluções foram fixadas por 12horas a 4ºC em 2% gluteraldeido, 2% paraformaldeido
e 3% de sacarose em tampão cacodilato de sódio (CACO) 0,1M, pH 7,2. Em seguida, o
material foi submetido a duas lavagens de 10 minutos com tampão CACO. O material
foi posteriormente pós-fixado por 1 hora em tetróxido de ósmio/ferricianeto de potássio
seguido de 3 lavagens rápidas em tampão CACO e água destilada. Posteriormente, o
material foi desidratado em séries cetônicas cujas concentrações foram de 30, 50, 70 e
90% de acetona, através de imersão em cada uma das soluções durante 15 min., e mais
três vezes em acetona absoluta, por 10 minutos cada. Para a inclusão, foi adicionando
resina Spurr às amostras de forma que estas foram imersas em acetona absoluta, na
proporção (acetona: resina) de 3:1, 3:2, 1:1, 3:2 e 3:1, com intervalo de 12 horas entre
cada troca e, a seguir, em resina pura por mais 12 horas (Batista et al., 2006). O material
foi emblocado de forma que a resina foi polimerizada em estufa a 70ºC por 48 horas.
Cortes ultrafinos, realizados com lâminas de vidro e de diamante, foram observados em
microscópio eletrônico de transmissão Jeol 1011 operando a 80KV.
15
1.6 Protocolo do Co-cultivo dos macrófagos com os isolados in vitro
Utilizou-se a linhagem de macrófagos MH-S (ATCC, CRL-2019) os quais são
derivados de macrófagos alveolares de camundongos Balb/c. Estas células foram
cultivadas em placas de 24 orifícios cobertas com lamínulas na proporção de
3x10
4
células por poço em 1mL de meio RPMI1640 (Gibco, USA) suplementado com
2mM L-glutamina, 1mM piruvato de sódio, gentamicina 40mg/L e 10% soro bovino
fetal inativado. Após 48horas de cultivo em estufa a 37ºC e 5% CO
2
, recolheu-se o meio
de cultura acrescentando novo meio RPMI 1640 com menor porcentagem (4%) de soro
bovino fetal inativado.
Antes da infecção dos macrófagos, as leveduras retiradas do meio de cultura Fava
Netto sólido após 7 dias de crescimento e foram ressuspensas em meio RPMI 1640
contendo 20% soro fresco de camundongo e deixadas em estufa 37ºC a 5% CO
2
por 30
minutos para opsonização (Tavares et al., 2007). Posteriormente, realizou-se a infecção
dos macrófagos com os isolados de levedura Pb01 e Pb18 na proporção de 5
macrófagos para cada levedura (Silva et al., 2008), com finalidade determinar o índice
fagocitose para cada isolado, assim como, a produção de NO pelos macrófagos após
interação com as leveduras. Além disso, realizou-se a MET desta interação.
1.6.1 Índice de Fagocitose
Os macrófagos após serem infectados com isolados levedura foram incubados a
37ºC a 5% CO
2
durante 6, 24, 48 horas, realizando-se triplicata dos experimentos para
cada período. Ao termino do tempo co-cultivo, recolheu-se o meio de cultura RPMI, o
qual foi centrifugado 492G/3minutos separando-se sobrenadante para dosagem de NO e
as células fúngicas foram cultivadas em BHI para a contagem de CFU, representando os
fungos não aderidos aos macrófagos. Em seguida, as lamínulas foram lavadas com
500µL PBS estéril e aquecido a 37ºC com a finalidade de remover as leveduras aderidas
aos macrófagos, porém não internalizadas pelos mesmos. Realizou-se o cultivo do
sobrenadante das lavagens em meio BHI formando CFU denominado como fungos
aderidos.
Posteriormente, as lamínulas foram fixadas, reveladas e coradas com a solução
Panótico Rápido (Laborclin, Brasil) sendo que o tempo para cada passo foi de 5
segundos. Seguiu-se com as lavagens das lamínulas por 3 vezes com PBS antes de fixá-
las nas lâminas (adaptado Coelho et al., 2006). Foram analisadas as lâminas por meio de
microscopia óptica (magnitude 1000x) e quantificando em cada lamina 100 macrófagos.
16
Desta forma, a capacidade fagocitária foi expressa pela porcentagem de macrófagos
envolvidos na fagocitose das leveduras, como também, na porcentagem das leveduras
aderidas nos macrófagos contados.
1.6.2 Dosagem Óxido Nítrico (NO)
A dosagem de Óxido Nítrico (NO) foi possível para todos os períodos de co-cultivo.
Realizou-se como controle positivo na quantificação de NO, o cultivo dos macrófagos
MH-S com o estímulo LPS (Sigma, USA) 1µg/mL (Krieg, 1995). O Óxido Nítrico
(NO) decompõe-se em nitritos (NO
2
) e nitratos (NO
3
) no meio de cultura celular. A
produção de NO
2
pelos macrófagos pode ser quantificada pelo ensaio colorimétrico da
reação de Griess (Green et al, 1981).
Na dosagem adicionou-se 100µl do sobrenadante de cultura de macrófagos
cultivados em meio RPMI com isolados fúngicos por 6, 24, 48, 72 e 96 horas, com o
mesmo volume do reagente de Griess composto por: NEED 0,1% [N-(l-Naphthyl)ethyl-
enedinamine - Sigma, USA] e 1% sulfanilamida diluída em 5% ácido fosfórico
(H
3
P0
4
) (Nascimento et al., 2002). As amostras foram lidas em leitor de ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) com filtro de 540nm. Os resultados foram
expressos em µM de NO
2
comparando-se a DO (Densidade Ótica) das amostras do
experimento com a DO da curva padrão de NaNO
2
a qual possui variação de 3,125 a
200µmol (Bocca et al., 1999; Nascimento et al., 2002).
1.6.3 MET da interação macrófago com isolados do P. brasiliensis
No tempo 72 horas de interação dos macrófagos MH-S com os isolados das
leveduras (Pb01 e Pb18), os macrófagos desprendiam-se do fundo da placa de cultura o
que facilitou e possibilitou a realização da microscopia eletrônica de transmissão do co-
cultivo. Seguiu-se a mesma descrição do item 1.5 para realização deste procedimento.
1.7 Preparação dos isolados para infecção via endovenosa e via intratraqueal nos
animais experimentais
As leveduras recuperadas conforme item 1.3 foram cultivadas num volume 50mL de
meio BHI (Merck, Germany) suplementado com 1,5% (g/100mL) dextrose e
0,04mg/mL gentamicina, em gabinete incubação com agitação de 1,2G a 37ºC. Todo
procedimento foi realizado em condições estéreis. Após período 5 dias, a solução foi
centrifugada (492G/5min), as células foram lavadas 2 vezes com PBS e posteriormente
17
contadas as células com auxilio de hemocitometro. Preparou-se uma suspensão fúngica
cuja concentração era 1x10
7
leveduras/mL e a viabilidade das células foi determinada
pela utilização do corante vital Verde Janus 0,05% (Merck, Germany) (Dias et al.,
2004) resultando numa quantidade de células viáveis superior a 80%.
Na infecção sistêmica, os camundongos foram previamente anestesiados com
solução de éter etílico 70% para a inoculação de 100µL desta suspensão dos isolados
fúngicos pela via endovenosa do plexo venoso retro-orbital.
Na infecção pulmonar, os camundongos foram anestesiados com 100 a 200µL da
solução [0,1mL xilagina -cloridrato 2(2,6xilidino)5,6dihidro-4H-1,3tiazina; Rompun,
Bayer - e Ketamina 10% - cloridrato de ketamina; Agener, União Farmacêutica
Nacional - diluídas em 0,8mL PBS estéril], seguindo-se uma relação 100µL da solução
anestésica para cada 10g peso corpóreo dos animais. Após 10 minutos, realizou-se uma
pequena incisão na pele próxima da região das glândulas tireóide e as camadas de
tecidos foram separadas para expor a traquéia. Utilizando uma seringa de 1mL com
calibre da agulha 30G dispensou-se 50µL de uma solução fúngica cuja concentração era
de 1x10
5
leveduras para o isolado Pb18 e também para o isolado Pb01, e utilizou-se
uma solução com maior concentração (1x10
6
)
de leveduras
do isolado Pb01.
Posteriormente, os animais foram suturados e mantidos cobertos por maravalha durante
uma hora em ambiente aquecido (Cano et al., 1995 e Pina et al., 2006).
1.8 Protocolo experimental da infecção sistêmica in vivo
Após 15, 30 e 60 dias de infecção os animais foram sacrificados e avaliados em
relação à evolução da doença por meio da quantificação das unidades formadoras de
colônia no tecido pulmonar e análise histopatológica deste órgão. Avaliação da resposta
imunológica foi feita através ensaio de proliferação celular e dosagem de anticorpos.
1.8.1 Unidades formadoras de colônia (CFU) do pulmão
Antes do sacrifício os animais foram anestesiados com solução de éter a 70% para
retirada do sangue pela via retro-orbital e em seguida realizou-se o deslocamento
cervical. Transferidos para fluxo laminar, os animais foram fixados na posição de
decúbito dorsal em uma plataforma. Fez-se assepsia do tórax e abdômen com álcool
etílico 70% para retirada dos órgãos como: baço e pulmão.
Retirou-se um pedaço de aproximadamente 2 cm
2
da região mediana de um dos
lobos pulmonares para análise histopatológica. Os restos dos lobos foram pesados e
18
dilacerados assepticamente em 1mL de PBS estéril. O homogenato obtido, foi cultivado
em meio sólido BHI (MercK, Germany) suplementado com 4% (v/v) de soro cavalo
inativado (Gibco, USA); 5% (v/v) do filtrado do meio de cultura do isolado Pb192;
1,5% (g/100mL) de dextrose e a proporção 40mg/L do antibiótico gentamicina.
Suplementos necessários para crescimento do fungo P. brasiliensis, conforme (Singer-
Vermes et al., 1992; Cano et al., 1995). As placas de cultura foram incubadas em estufa
a 37ºC por até 15 dias quando foram contadas as CFU.
1.8.2 Histopatologia do pulmão
Os lobos pulmonares são os locais de preferencial deposição das leveduras do fungo
P. brasiliensis (Linares e Friedman, 1972; Brummer et al., 1993). Fragmentos de
aproximadamente 2 cm
2
da região mediana de um dos lobos pulmonares foram
coletados e fixados em solução de tampão fosfato com 10% de formol. Após fixação, os
fragmentos foram desidratados em solução alcoólica de 70 a 100% de acordo com as
técnicas de rotina para inclusão em parafina. Realizaram-se cortes de 5µm de espessura
os quais foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e alguns casos as lâminas
também foram coradas com corante metenamina-nitrato de prata (Grocott) para
visualização em microscópio óptico.
1.8.3 Ensaio de proliferação celular
O baço foi retirado de forma asséptica e dilacerado em meio RPMI 1640 (Gibco,
USA) suplementado com 2mM L-glutamina, 1mM piruvato de sódio, 2-mercaptoetanol,
gentamicina 40mg/L, 5% (v/v) de aminoácidos não essenciais (Sigma, USA) e soro
bovino fetal (Bocca et al., 1999). As células foram contadas com auxílio de
hematocitometro e cultivadas em placas de cultura de células com 96 orifícios de fundo
chato na proporção de 3x10
5
células em 100µL/poço. Os linfócitos em cultivo foram
estimulados por antígenos como: o mitógeno inespecífico concanavalina A (ConA)
(0,4µg/ poço, Sigma); extrato protéico da parede do fungo P. brasiliensis (antigeno-
específico) numa proporção de diluição de 100 e 500 vezes. Este experimento foi
realizado em triplicada para cada estímulo num volume final de 100µL/poço.
Após 48horas de incubação na estufa a 37ºC e a 5% CO
2
adicionou-se 0,5µCi/poço
de timidina tritiada [
3
H] TdR (Amersham, Arlington Heights) (Omarsdottir et al., 2005).
Após 16 horas, as células foram coletadas em uma membrana de filtro (Whatman,
England) e a radioatividade do filtro foi determinada por um contador de cintilação
β
19
líquida (Beckman, Packard LS Analyzer 6500), o qual expressa os resultados em
contagem de pulsos por minuto (cpm). Os resultados foram expressos na forma de
índice de proliferação que consiste na seguinte formula:
Índice proliferação = cpm linfócitos obtidos animais infectados
cpm linfócitos obtidos dos animais normais
1.8.4 Dosagem de anticorpos (IgG1 e IgG2a) pelo método ELISA
As amostras sanguíneas dos animais foram coletadas e identificadas, deixando em
repouso por 4 horas antes de serem centrifugadas 492G/3min para obtenção do soro, o
qual foi utilizado para dosagem de anticorpos IgG1 e IgG2a. Em parceria com
laboratório do profº Drº Célio Lopes Silva (USP-Ribeirão Preto-SP, Brasil) realizou-se
os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) em placas de 96 orifícios (Nunc) sensibilizadas
com 100µL do extrato protéico da parede do fungo P. brasiliensis na diluição de 1:50,
por 12horas a 4ºC. Em seguida, os orifícios foram bloqueados com tampão fosfato
acrescido de caseína a 2% durante 2 horas a 37ºC. Posteriormente, as amostras dos
soros diluídas 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000 foram incubados por 2h a 37ºC. Após este
período, a placa foi lavada com tampão lavagem (fosfato mais 0,05% Tween20) e
incubada com anticorpos específicos de camundongo para os isótopos IgG1 e IgG2a
diluídos 1:5000 pelo período de 2h a 37ºC. Seguiu-se com a lavagem das placas com
tampão de lavagem por 7 vezes, para acrescentar H
2
O
2
e a fenilenediamina
desenvolvendo-se a reação. Interrompeu-se com 20µL de H
2
SO
4
a 2N, realizando-se as
leituras em filtro de 490nm na leitora de placas de ELISA (BIORAD, modelo 2550,
CA,USA).
1.9 Protocolo experimental da infecção intratraqueal in vivo
Avaliação da evolução da doença nos animais foi feita por meio do sacrifício destes
após 15, 30 e 60 dias de infecção para quantificação das unidades formadoras de colônia
no tecido pulmonar e análise histopatológica deste órgão, realizado conforme item
1.8.2. A análise da resposta imunológica foi feita através da dosagem de anticorpos e de
óxido nítrico seguindo o mesmo protocolo descrito nos itens 1.84 e 1.6.2,
respectivamente.
20
1.9.1 Recuperação dos isolados de levedura do pulmão
A determinação do número de microorganismos viáveis no pulmão dos animais
infectados foi determinada pela contagem CFU nos períodos 15, 30 e 60 dias após
infecção. Foram sacrificados 3 animais de cada grupo por período, seguindo os mesmos
procedimentos descritos nos item 1.8.1. Removendo assepticamente o pulmão, o qual
foi pesado e dilacerado em 1mL de PBS estéril. O homogenato formado foi
centrifugado (768,5G por 5 minutos), retirando-se 100µL do sobrenadante para
dosagem de NO (descrição item 1.6.2). O pellet formado foi diluído em 500µL PBS
estéril e cultivado em placas contendo meio BHI que foram incubadas em estufa a 37ºC
por até 15 dias quando foram contadas as unidades formadoras de colônia (CFU) (Cano
et al., 1995 e Pina et al., 2006).
1.10 Análise Estatística
Foi utilizada análise da variância (ANOVA) para determinar as diferenças entre os
grupos experimentais, seguida pelo método pós-teste (Bonferroni t test). Testes e
análises foram feitos pelo programa GraphPad Prisma versão 4.0 para Windows (San
Diego, Califórnia, USA). Dados foram considerados significativos quando p<0,01.
Resultados
22
Resultados
1- Comparações morfológicas entre os isolados Pb01 e Pb18 cultivados in vitro
As diferenças morfológicas entre isolados da mesma espécie ou de espécies
diferentes são importantes para determinar a sua virulência e patogenia. Para analisar se,
para os dois isolados estudados, estas diferenças também interferem na relação entre as
leveduras e o hospedeiro, realizaram-se as análises morfológicas por microscopia óptica
e eletrônica.
1.1-Análise morfométrica dos isolados
O intervalo dos diâmetros encontrados para os isolados Pb01 e o Pb18 estão
representadas na Tabela 1. Observou-se que nos dias 4 e 5, os dois isolados
apresentaram leveduras dentro do mesmo intervalo, e após o 5º dia de cultivo o Pb18
apresentou células com diâmetros maiores. Analisando o diâmetro médio destas
leveduras, foi observado que as células do Pb01 apresentaram uma tendência de queda
do diâmetro a partir do 5º dia de crescimento (figura 1A). Em relação aos brotamentos
do Pb01, observou-se que não houve uma diminuição dos seus diâmetros de forma
linear como observado nas células mães. Para as células do Pb18, observou-se que o 6º
dia representa o período onde as leveduras (células mães) apresentaram o maior
diâmetro quando comparado com os demais dias da cinética.
Os resultados corroboram com dados da literatura, os quais dizem que o diâmetro da
célula mãe é uma grandeza inversamente proporcional ao diâmetro dos seus respectivos
brotamentos (Del Negro et al., 1982). Para o isolado de levedura Pb18, o 6º dia
apresentou um pico no aumento do diâmetro da célula mãe e um forte decréscimo nos
valores do diâmetro de seus brotamentos (figura 1 e tabela 1).
Analisando os resultados obtidos para os dois isolados, observou-se que ambos
apresentam diferenças significativas em relação ao tamanho dos seus brotamentos. Pois,
os brotamentos do Pb18 apresentam os maiores valores de diâmetro quando comparado
com os brotamentos do Pb01 (figura 1B e tabela 1).
Avaliando a morfologia das células dos isolados observou-se que o Pb01 apresenta
um formato circular predominante tanto para células como para seus brotamentos
23
(figura 2A, 2B e 3A), já o Pb18 apresenta células com formato circular e seus
brotamentos apresentam uma morfologia elíptica (figura 2C, 2D e 3D).
Tabela 1: Morfometria do Pb01 e Pb18 no 4º, 5º, 6º e 7º dia de cultivo em meio BHI
líquido.
4º dia 5º dia 6° dia 7º dia Estrutura
celular
Pb01 Pb18 Pb01 Pb18 Pb01 Pb18 Pb01 Pb18
Célula
Diametro
(µm)
10 - 25 10 - 26 10 - 22 8 - 22 9 - 20 8 - 30 8 - 16 12 - 30
Média
14,98 16,92 14,92 15,67 13,64 20 12,3 16,7
Desvio Padrão
3,2 4,03 3,05 3,5 3,2 4,5 2,4 3,8
Brotamento
Diametro
(µm)
0 - 14 0 - 27 0 - 14 0 - 24 0 - 14 0 - 30 0 - 13 0 - 30
Média
6,7 17,95 9,35 18,8 7,25 9,8 7,4 14,75
Desvio Padrão
2,72 6,16 2,62 2,91 3,0 6,65 2,78 6,87
4 5 6 7
0
5
10
15
20
25
Pb18
*
*
Pb01
A
Dias de cultivo das células
Diâmetro (
µ
m)
B
4 5 6 7
0
5
10
15
20
25
Pb01
Pb18
*
*
*
*
Dias de cultivo das células
Diâmetro (
µ
m)
Figura 1: Gráficos que representam à média aritmética dos valores do diâmetro
dos isolados de levedura Pb01 e Pb18. O gráfico (A) apresenta os valores do diâmetro
das células dos isolados, ou seja, as células mães, e o gráfico (B) representa os valores
do diâmetro dos brotamentos dos isolados de levedura. Experimentos realizados em
duplicata e com diferença estatística de p<0,05 * representa diferença estatística
significante entre os grupos Pb01 e Pb18.
24
.
Figura 2: Imagens em microscopia óptica ilustrando as diferenças morfológicas
entre o Pb01 e o Pb18, corados com azul de algodão. (A) e (B) ilustram o Pb01 no 4º
e no 5º dia de crescimento respectivamente. (C) e (D) mostram respectivamente, o Pb18
no 4º e no 5º dia de crescimento. (Barra igual à 10µm, magnitude das imagens 1000x).
1.2 Microscopia Eletrônica Transmissão (MET) dos isolados
Com intuito de verificar se haveria alguma diferença na característica ultra-
estrutural da parede celular, como espessura e constituição de microfibrilas entre as
células de levedura dos dois tipos de isolados, realizou-se a caracterização ultra-
estrutural das leveduras dos isolados Pb01 e Pb18.
Analisando as imagens da célula do Pb01 observou-se que a parede celular
apresentou espessura variando entre 0,160 a 0,423µm (média = 0,31µm e SD = 0,08
figura 3A) enquanto que a espessura da parede celular dos brotamentos variou entre
0,106 a 0,200µm (média = 0,14µm e SD = 0,03 figura 3C). Para o Pb18, as imagens
das células apresentaram uma parede celular com espessura de 0,149 a 0,237µm
(média= 0,187µm e SD = 0,032 figura 3B). A parede celular dos brotamentos do Pb18
apresentou uma espessura de 0,047 a 0,064 (média = 0,05µm e SD = 0,01 figura 3D).
Comparando-se os dois isolados, observou-se que a célula do Pb01 possui a parede
celular 1,65 vezes mais espessa que a da célula do Pb18.
10µm 10µm
10µm 10µm
25
Os isolados apresentaram também diferenças significativas com relação à presença
de microfibrilas, já que o Pb01 apresentou uma parede celular composta por
microfibrilas de forma mais densa que o Pb18 (figura 3C e 3D). Estes dados
corroboram com os resultados da morfometria, onde se observou uma disparidade no
tamanho dos brotamentos entre os isolados, como também, diferenças nas suas
morfologias.
Figura 3: Eletromicrografias de transmissão do Pb01 e Pb18 do fungo
Paracoccidioides brasiliensis. Imagens A e C representam o Pb01, em B e D observa-
se o Pb18. Imagens C e D demonstram o momento de separação entre a célula e seu
brotamento dos isolados. Abreviações: (M) mitocôndria, (N) núcleo, (L) corpos de
lipídeos, (ER) retículo endoplasmático, (CM) célula mãe, (BM) brotamento, (CW)
parede celular. As setas indicam as microfibrilas da parede celular dos isolados.
Magnitude A e C 30.000x; B 20.000x; D 15.000x.
C
A
B
D
26
2- Interação dos isolados Pb01 e Pb18 com macrófagos MH-S in vitro
2.1-Capacidade de fagocitose dos macrófagos
Considerando as diferenças morfológicas observadas entre os isolados, realizaram-
se os ensaios de fagocitose para investigar se havia alguma diferença nas etapas de
aderência, internalização e destruição das leveduras pelos macrófagos no período de 6,
24 e 48 horas de co-cultivo (figuras 4 e 5). Após 6 horas de co-cultivo, o isolado Pb01
apresentou uma maior adesão aos macrófagos quando comparado ao isolado Pb18.
Com 24 horas de co-cultivo, esta relação se inverte e o Pb18 está mais aderido aos
macrófagos do que o Pb01, porém com 48 horas os macrófagos apresentam mais células
do Pb01 aderidos na sua superfície.
Em relação ao processo de fagocitose, os macrófagos MH-S internalizaram um
número maior de leveduras do isolado Pb01 em todos os tempos analisados. O isolado
Pb01 apresentou uma maior adesão e uma menor internalização com 6 horas de co-
cultivo e esta relação foi invertida em 48 horas. Esta cinética não foi observada pelo
Pb18 que apresentou uma maior percentagem de células aderidas do que internalizada
em 6 e 24 horas de co-cultivo (figura 4).
Figura 4: Capacidade de fagocitose dos macrófagos MH-S in vitro em relação ao
Pb01 e Pb18. Macrófagos foram incubados com leveduras opsonizadas na proporção de
5:1 a 37ºC e a 5% CO
2
. Experimentos realizados em triplicata e com diferença
estatística de p<0,001 * representa diferença estatística significante entre os grupos
aderidos e fagocitados dos dois isolados; # representa a diferença entre os grupos
aderidos dos dois isolados; e & representa a diferença entre os grupos fagocitados dos
dois isolados.
27
Para confirmar os dados da aderência e fagocitose, realizou-se o cultivo dos
sobrenadantes dos co-cultivos, em duas situações distintas: cultivo dos fungos não
aderidos aos macrófagos e o cultivo dos fungos aderidos e não internalizados pelos
macrófagos (figura 5). Com 6 horas de co-cultivo os dois isolados apresentaram um
grande número de células não aderidas viáveis e um número similar de células aderidas
viáveis. O Pb18 apresentou uma quantidade maior de células viáveis não aderidas e
aderidas após 48 horas quando comparado com o Pb01, demonstrando que a
internalização mais eficiente do Pb01 diminui as leveduras viáveis do meio de cultura.
6 24 48 6 24 48
0
50
100
150
200
250
300
350
fungos não aderidos
fungos aderidos
horas de co-cultivo
Pb18
Pb01
*
*
#
#
#
CFUs
Figura 5: Viabilidade das células dos isolados nos ensaios de fagocitose. Barras
hachuradas representam os fungos não aderidos e as barras em branco os fungos
aderidos aos macrófagos. Experimentos realizados em triplicata e com diferença
estatística de p<0,001 # representa diferença estatística significante entre os grupos dos
fungos não aderidos e os grupos dos fungos aderidos de cada isolado; * representa
diferença estatística significante entre os grupos dos isolados Pb01 e Pb18 em cada
ponto de co-cultivo.
28
2.2 Dosagem de Óxido Nítrico (NO)
A produção de óxido nítrico é um mecanismo microbicida importante para a
destruição do P. brasiliensis. Sendo assim, analisou-se a produção deste importante
mediador pelos macrófagos MH-S nos tempos 6, 24, 48, 72 e 96 horas após co-cultivo
pelo método colorimétrico da reação de Griess (Green et al, 1981) (figura 6).
Observa-se que até o período de 48 horas a produção de NO pelos macrófagos
infectados com isolado Pb01 e Pb18 são similares. Após 72 horas de co-cultivo, os
macrófagos infectados com os dois isolados aumentaram a produção de NO, fenômeno
observado até o período 96 horas, porém os níveis deste mediador foram superiores para
o isolado Pb01 do que para o Pb18 (figura 6).
5 15 25
6
24
48
72
96
Pb01
Pb18
*
*
Horas de co- cultivo
*
*
#
#
µM NO
2
Figura 6: NO liberado pelos macrófagos MH-S em co-cultivo. Macrófagos foram
infectados com as leveduras do fungo P. brasiliensis após 6, 24, 48, 72 e 96 horas, o
sobrenadante do meio cultura foi coletado e quantificado as concentrações em
micromolar (µM) NO
2
pela reação de Griess. Barras pretas representam o isolado Pb18
e Barras brancas o isolado Pb01. Os resultados apresentados no gráfico foram
comparados com dados obtidos dos macrófagos estimulados com controle positivo.
Experimentos realizados em duplicata e com diferença estatística em relação ao tempo
6horas p<0,05. # representa diferença estatística significante entre os grupos Pb01 e
Pb18 no mesmo período co-cultivo; * representa diferença estatística significante de
cada grupo comparado com o seu período de 6 horas co-cultivo.
29
2.3 Microscopia eletrônica transmissão da interação P.brasiliensis com células
MH-S
A interação entre os macrófagos MH-S e o Pb01 ou Pb18 foi avaliada utilizando o
MET, após 72 horas de co-cultivo (figura 7). Observou-se que os macrófagos são
capazes de fagocitar as leveduras dos dois isolados, porém os macrófagos são mais
velozes em ingerir o isolado Pb01, uma vez que foi evidenciado um maior número de
leveduras dentro das células (figura 7D) quando comparada a mesma situação com o
isolado Pb18 (figura 7A). Em algumas situações observou-se que a internalização de 5
leveduras ou mais pelos macrófagos induz a lise célular (figuras 7C e 7D).
As imagens apresentam uma diferença na coloração dos isolados que se
encontram no interior da célula em relação aos aderidos à mesma (figura 7B) isto é
ocasionado pela alta concentração óxido nítrico no interior celular, ou seja, dentro
fagolisossomo.
3- Interação dos isolados Pb01 e Pb18 com o hospedeiro in vivo
Para analisar a capacidade de induzir uma infecção em modelo experimental
utilizamos dois modelos de infecção dos fungos, por via endovenosa e intratraqueal.
3.1 – Via de infecção endovenosa
Os animais deste grupo foram infectados com leveduras dos dois isolados e a
avaliação da evolução da doença nos camundongos foi feita através de sacrifício dos
animais após 15, 30 e 60 dias de infecção para análise histopatológica das lesões e a
quantificação da carga fúngica no tecido pulmonar. A resposta imunológica foi
analisada através do ensaio de proliferação celular de esplenócitos e dosagem de
anticorpos.
30
Figura 7: Microscopia eletrônica transmissão da interação das leveduras de
P.brasiliensis com células MH-S após 72 horas. As imagens A, B e C representam à
interação do macrófago com o Pb18 e a imagem D com o Pb01. Abreviações: ML
macrófago lisado; V-vacúolo; N-núcleo; P-isolados levedura. Magnitude A 15.000x; B
20.000x; C 5.000x; D 10.000x.
A
B
C
D
31
3.1.1 - Análise histopatológica do pulmão dos animais dos dois grupos
experimentais
A resposta inflamatória foi avaliada em cortes do pulmão, corados com HE, dos
animais sacrificados após 15, 30 e 60 dias de infecção (figura 8 e 9).
Os animais inoculados por via endovenosa com leveduras do isolado Pb18 do fungo
P.brasiliensis apresentaram resposta inflamatória progressiva no tecido pulmonar que
está diretamente relacionada à disseminação e reprodução do fungo pelo organismo dos
animais. Após 15 dias do curso de infecção (figura 8A) houve um leve
comprometimento pulmonar caracterizado por um infiltrado localizado na região
peribronquiovascular constituído de forma predominante por células mononucleares
contendo algumas leveduras no seu interior, formando o granuloma.
Aos 30 dias de infecção, o comprometimento pulmonar foi mais extenso,
caracterizado pela formação de múltiplos granulomas de diferentes tamanhos e que se
localizam de forma difusa no parênquima pulmonar (figura 8B). Apresentando várias
leveduras no interior das células gigantes e com poucas células epitelióides, porém há
necrose no centro granuloma.
O comprometimento pulmonar acentuou-se com a progressão da infecção (60 dias).
Apresentando granulomas confluentes e com predomínio de células epitelióides no seu
interior envolvendo as numerosas leveduras do P.brasiliensis (figura 8C).
A reação inflamatória no tecido pulmonar em resposta à infecção via endovenosa
com leveduras do isolado Pb01 não apresentou formação de granulomas como
observado nos animais infectados com isolado Pb18. Mas, há evidencias do processo
inflamatório, pois houve um aumento do infiltrado linfocitário na região
periobronquiovascular ao longo dos dias após infecção (figura 9). Os infiltrados
inflamatórios são compostos por pequenas células mononucleares com pouca
diferenciação morfológica e que apresentam características de núcleo arredondado e
hipercromático. Realizou-se a coloração de Grocott das lâminas (figura 9 A
1
, B
1
e C
1
)
para verificar a presença de fungos, porém os infiltrados inflamatórios não apresentaram
nem vestígios de células mortas dos fungos.
32
Figura 8: Fotomicrografias mostrando a evolução da lesão granulomatosa
pulmonar ocasionada pela inoculação por via endovenosa de 1x10
6
leveduras do
isolado Pb18. À esquerda as imagens possuem uma magnitude 100x e na direita de
200x. As fotomicrografias denominadas A, B e C representam respectivamente, animais
infectados e sacrificados com 15, 30 e 60 dias após infecção. As setas indicam as
leveduras do isolado Pb18 no interior do granuloma.
100x 200x
100x 200x
C C
B B
A
A
33
Figura 9: Fotomicrografia dos infiltrados inflamatórios induzido no pulmão dos
animais infectados via endovenosa com isolado Pb01 do fungo P. brasiliensis. À
esquerda as imagens (A, B e C) foram coradas com HE e na direita as imagens (A
1
, B
1
e
C
1
) a coloração foi a Grocott. As imagens possuem uma magnitude 200x. As
fotomicrografias denominadas A e A
1
; B e B
1
;
C e C
1
representam respectivamente,
animais infectados e sacrificados com 15, 30 e 60 dias após infecção. As setas indicam
o infiltrado linfocitário na região periobronquiovascular.
A
1
A
B B
1
C
C
1
34
3.1.2 Determinação do número de leveduras viáveis no tecido
pulmonar
O grupo inoculado com isolado Pb01 houve crescimento das unidades formadoras
de colônia somente para os pontos de 15 e 30 dias após infecção (figura 10A). Na
avaliação da recuperação das colônias do fungo P.brasiliensis dos camundongos
C57Bl/6 infectados com isolado Pb18 observa-se um aumento progressivo no número
de unidades formadoras de colônia (CFU) recuperadas do pulmão destes animais até 60
dias após infecção (figura 10B). O grupo inoculado com isolado Pb18 obteve uma
média de 160, 373 e 1115 colônias recuperadas do pulmão dos animais com um desvio
padrão ± 16, 12, 85 respectivamente após 15, 30 e 60 dias infecção. Diferindo da
resposta do isolado Pb01, na qual houve uma média 1 colônia por animal sacrificado
para pontos de 15 e 30 dias após infecção e nenhuma colônia foi recuperada com 60
dias.
Figura 10: Cinética da recuperação das CFU do pulmão durante o curso da
infecção sistêmica com os isolados Pb01 e Pb18. Os resultados foram expressos em
CFU/grama de pulmão. (A) representa o grupo Pb01 e (B) o grupo Pb18. As barras
representam a média ± desvio padrão das unidades formadoras de colônias recuperadas
dos 4 animais sacrificados por cada ponto experimental. * diferença estatística dos
pontos analisados em relação ao ponto de 15 dias após sacrifício, com p<0,001.
Pb01 A
15 30 60
0
1
2
3
4
5
Dias após infecção
CFU/gpulmão
Pb18 B
15 30 60
0
250
500
750
1000
1250
*
*
Dias após infecção
CFU g/pulmão
*
*
35
3.1.3 - Capacidade linfoproliferativa dos animais com infecção sistêmica
Os linfócitos em cultivo foram estimulados por antígenos como: Concanavalina A –
ConA (Sigma, USA), extrato protéico da parede do fungo P. brasiliensis numa
proporção diluição de 100 e de 500 vezes (Pb1:100; Pb1:500) para quantificar a
imunocompetencia celular. Estes ensaios in vitro de proliferação celular antígeno-
especifica detectam principalmente respostas celulares dos linfócitos T. A quantificação
da proliferação foi realizada através da análise da incorporação de timidina exógena
marcada com trítio na síntese do DNA das células em cultivo por meio da utilização
equipamento contador de cintilação β que faz a contagem de pulsos por minuto (cpm).
Na figura 11 observa-se o índice de proliferação dos 2 grupos experimentais (Pb01
e Pb18) com uma diferença estatística significante (p<0,001) entre os dois isolados para
15 dias após infecção. Desta forma, os animais inoculados com o Pb01 possuem uma
maior capacidade de linfoproliferar do que os com isolado Pb18 no período de até 15
dias após infecção. Porém, no decurso do tempo de infecção a capacidade
linfoproliferativa dos animais infectados com Pb01 se iguala a dos animais inoculados
com Pb18.
- + - - - + - - - + - -
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Pb01
Pb18
15
30
60
Dias após infecção
ConA
Pb 1:100
Pb 1:500
- - + - - - + - - - + -
- - - + - - - + - - - +
*
*
*
1
*
2
índice de Proliferação
*
2
Figura 11: Resultados dos índices de proliferação dos esplenócitos obtidos dos
animais infectados com isolados Pb01 e Pb18. As culturas de linfócitos cultivadas
com diferentes estímulos: RPMI; Con-A; Pb1:100 e Pb1:500. Experimentos realizados
em triplicata, * representa a diferença estatística significante entre os grupos Pb01 e
Pb18 com p<0,001; *
1
com p<0,01 e *
2
com p<0,05.
36
3.1.4 - Quantificação das imunoglobulinas
Os anticorpos constituem um importante mecanismo de defesa do hospedeiro
nas infecções por microorganismos. Biagioni e colaboradores (1984) realizaram um
estudo e verificaram a presença do isotipo IgG anti- P.brasiliensis em 98% dos casos de
humanos com PCM. Assim, decidiu-se dosar os isotipos IgG1 que é um anticorpo do
padrão da resposta Th2 e IgG2a a qual é do padrão Th1 para investigar se a resposta
imune dos animais infectados com os isolados Pb01 e Pb18 é polarizada para certo
padrão células T auxiliares (Th) de forma igual ou diferente entre os grupos
experimentais. Deste modo, analisou-se a presença de IgG1 e IgG2a (tabela 2).
Durante todo o período analisado, o isolado Pb01 induziu uma produção menor
de anticorpos do isotipo IgG1 do que o isolado Pb18. Em relação ao isotipo IgG2a o
grupo Pb01 apresentou uma maior concentração desta imunoglobulina nos tempos 15 e
30 dias após infecção quando comparado com Pb18. Com 60 dias de infecção, houve
uma inversão nos níveis da imunoglobulina analisada.
Tabela 2: Dosagem dos isotipos IgG1 e IgG2a da imunoglobulina IgG no soro animais
infectados.
IgG1 IgG2a
Dias após
infecção
Isolado Pb01 Isolado Pb18 Isolado Pb01
Isolado Pb18
15
0,003 0,045 0,022 0,007
30
0,23 0,049 0,086 0,024
60
0,024 0,44 0,061 0,082
Resultados expressos estão na diluição 10x dos soros dos animais infectados, DO =
492nm.
3.2-Via de infecção intratraqueal
Com intuito de verificar a patogenicidade do isolado Pb01, resolveu-se fazer uma
infecção localizada no pulmão, por meio da inoculação das leveduras na traquéia dos
animais, os quais foram subdivididos em 3 grupos: · infectados com 10
5
leveduras
isolado Pb18 e · do Pb01 usou-se animais da linhagem C57Bl/6, · infectados com 10
6
leveduras do Pb01 usou-se animais da linhagem Balb/c. Analisou-se a evolução da
doença nos camundongos por meio do sacrifício destes animais após 15, 30 e 60 dias de
infecção para análise histopatológica do tecido pulmonar, como também, para
quantificar a carga fúngica neste tecido. Avaliou-se a resposta imunológica através da
dosagem de anticorpos no soro dos animais e de óxido nítrico no tecido pulmonar.
37
3.2.1-Recuperação das Unidades Formadoras de Colônia do tecido pulmonar
No grupo infectado com 10
5
leveduras do isolado Pb01 não se obtive recuperação de
CFU, desta forma, comparou-se o CFU/g pulmão dos animais balb/c inoculados com
10
6
leveduras do isolado Pb01 em relação aos animais C57Black/6 inoculados com 10
5
leveduras do isolado Pb18 (figura 12). Pode-se observar que a recuperação de fungos
viáveis do tecido pulmonar dos animais infectados com isolado Pb18 é superior ao dos
inoculados com Pb01, o qual não apresentou CFU/g pulmão após 15 dias de infecção.
Enquanto o grupo Pb18 possui uma média de 36, 48 e 64 CFU por animal sacrificado
respectivamente após 15, 30 e 60 dias infecção (figura 12B), o grupo Pb01 apresenta
uma média de 9,6 e de 4,6 CFU para 30 e 60 dias após infecção (figura 12A).
Figura 12: Cinética de recuperação das CFU/g pulmão durante o curso da infecção
intratraqueal com os isolados Pb01 e Pb18. As barras representam a média ± desvio
padrão das unidades formadoras de colônias recuperadas dos 3 animais sacrificados por
cada ponto experimental. (A) representa grupo infectado com 10
6
leveduras do isolado
Pb01 e (B) representa grupo infectado com 10
5
leveduras do isolado Pb18. * diferença
estatística dos pontos analisados em relação ao período de 15 dias após sacrifício, com
p<0,01.
3.2.2-Análise histopatológica do tecido pulmonar
A paracoccidioidomicose provocada pelo isolado Pb18 tende a evoluir com decurso
do tempo de infecção. Realizou-se o estudo histopatológico do pulmão nesta forma de
infecção, e o grupo Pb18 apresentou a mesma situação descrita no item 3.1.1 e na
figura 8. Porém, o grupo Pb01 apresentou um infiltrado inflamatório pulmonar mais
denso e intenso ao longo do tempo infecção situado na região periobronquiovascular
(figura 13), mas, sem a formação de granulomas e também, sem a presença de
leveduras como demonstrado na coloração Grocott das lâminas (figura 13 A
1
, B
1
e C
1
).
A
15 30 60
0
10
20
Pb01
Dias após infecção
CFU/g pulmão
B
15 30 60
0
25
50
75
Pb18
*
*
Dias após infecção
CFU/g pulmão
38
Figura 13: Fotomicrografia dos infiltrados inflamatórios induzido no pulmão dos
animais infectados via intratraqueal com 10
6
leveduras do isolado Pb01. À
esquerda as imagens (A, B e C) estão coradas com HE e na direita as imagens (A
1
, B
1
e
C
1
) a coloração é a Grocott. As imagens possuem uma magnitude de 200x. As
fotomicrografias denominadas A e A
1
; B e B
1
; C e C
1
representam respectivamente,
animais infectados e sacrificados com 15, 30 e 60 dias após infecção. As setas indicam
o infiltrado linfocitário na região periobronquiovascular.
A A
1
B B
1
C
C
1
39
3.2.3-Dosagem de NO e dos anticorpos IgG1 e IgG2a
Em relação ao óxido nítrico (NO) observa-se na figura 14 que a produção deste
composto para os grupos experimentais da infecção intratraqueal aumenta no decurso
do tempo infecção. O grupo de animais Balb/c infectados com 10
6
leveduras do isolado
Pb01 apresentou uma produção média de 122µM NO
2
em 15 dias e de 128µM NO
2
para
30 dias infecção. Estando estes valores acima da média do grupo de animais C57Bl/6
infectados com 10
5
leveduras do isolado Pb18 para estes mesmos pontos, pois com 60
dias após infecção a média deste grupo é de 137µM NO
2
ficando um pouco acima do
grupo Pb01 10
6
leveduras a qual foi de 133µM NO
2
. Isto pode ter ocorrido devido a
menor carga fúngica pulmonar no grupo Pb01 10
6
em relação ao Pb18 10
5
, como
também, a diferença da linhagem dos animais experimentais usados nestes dois grupos.
Figura 14: NO liberado nos pulmões dos animais C57Bl/6 infectados
intratraquealmente. Barras hachuradas representam animais infectados com
10
5
leveduras do isolado Pb01; Barras pretas são os inoculados 10
5
leveduras do isolado
Pb18. Experimentos realizados em triplicata, * representa a diferença estatística em
relação ao tempo 15 dias, com p<0,05.
Analisou-se a presença das imunoglobulinas IgG1 e IgG2a nas amostras do soro dos
animais infectados intratraquealmente (tabela 3). Para os animais infectados com 10
5
leveduras do isolado Pb01 observa-se que as concentrações de IgG1 são maiores até 30
40
dias após infecção e depois decaem. Enquanto, as concentrações de IgG2a aumentam
progressivamente no período analisado. Para os animais infectados com 10
5
leveduras
do isolado Pb18, observamos uma produção similar, porém com níveis mais elevados
de IgG1.
Os animais Balb/c infectados com 10
6
leveduras do isolado Pb01 pela via
intratraqueal apresentaram um padrão de produção de isótipos misto, ou seja, elevadas
concentrações tanto de IgG1 como de IgG2a. O mesmo padrão de produção de isótipos
foi observado para animais infectados com 10
6
leveduras do isolado Pb18 pela via
endovenosa (dados não apresentados).
Tabela 3: Dosagem dos isotipos IgG1 e IgG2a no soro animais C57Bl/6 infectados pela
via intratraqueal com 10
5
leveduras
Resultados expressos estão na diluição 10x dos soros dos animais infectados,
DO = 492nm.
IgG1 IgG2a
Dias após
infecção
Pb01 10
5
Pb18 10
5
Pb01 10
5
Pb18 10
5
15
0,021 0,04 0,005 0,021
30
0,042 0,079 0,013 0,025
60
0,020 0,038 0,019 0,028
Discussão
42
Discussão
O conceito de espécies filogenéticas, o qual detecta divergência genética entre
grupos através do seqüênciamento de multi-locus representada pela concordância na
genealogia de genes, é o método mais apropriado para reconhecimento de espécies de
fungos (Theodoro et al., 2008). Matute (2006) demonstrou a existência de pelo menos 3
espécies filogenéticas no gênero Paracoccidioides (S1, PS2, PS3) já que era
classificado taxonomicamente como espécie clonal (Morais et al.,2000). Seus resultados
seguiram para tentar detectar especiação críptica por meio da concordância ou não na
genealogia de genes em relação à filogenia de seqüências genes nucleares, como foi
realizado para o fungo Neurospora.
O fungo P. brasiliensis apresenta isolados com diferentes características
fenotípicas relacionadas ao crescimento; morfologia de micélios; produção de conídios;
transição de micélio para levedura; microscopia da levedura em relação ao tamanho e a
forma desta célula com os de seus brotamentos; virulência e manifestações clínicas
(Theodoro et al., 2008). Variações na virulência e na expressão genética do P.
brasiliensis vêm sendo demonstradas entre seus isolados que se situam nos grupos
filogenéticos S1 e PS2 (Hebeler-Barbosa et al., 2003; Carvalho et al., 2005). O isolado
Pb18 está incluso dentro do grupo S1, porém o isolado Pb01 está separado dos isolados
que se agrupam nos 3 grupos filogenéticos S1, PS2, PS3, como exemplo de integrantes
destes grupos podemos citar isolados Pb339, Pb2 e DASYPUS respectivamente
(Carrero et al., 2008). Revelando uma diferença significativa entre o isolado Pb01 e os
isolados dos 3 diferentes grupos genéticos, este fato corrobora com estudo (Teixeira,
2008) o qual sugere que Pb01 representa uma nova espécie no gênero Paracoccidioides.
Além disso, Carrero et al., 2008 e Teixeira, 2008 classificaram este isolado junto com
outros isolados como uma nova espécie filogenética – Pb01-like – para o fungo P.
brasiliensis.
Estas recentes descobertas de espécies crípticas do fungo P. brasiliensis, como
também, de uma nova espécie para gênero Paracoccidioides aumenta a importância de
correlacionarem os isolados conhecidos por meio de marcadores moleculares para fins
de diagnóstico. Esta separação genética entre os grupos pode resultar no acúmulo de
algumas diferenças nas estratégias para sobrevivência no hospedeiro, como também, no
meio saprobiótico (Theodoro et al., 2008). Além disso, características micológicas
como morfologia e virulência são necessárias para compreender se as diferenças
43
genéticas e patogênicas observadas entre os isolados do gênero Paracoccidioides podem
resultar em diferenças nas formas clínicas da PCM apresentadas pelo hospedeiro.
Neste trabalho, utilizaram-se as características morfológicas dos isolados Pb01 e
Pb18 para auxiliar na compreensão da resposta imune induzida por estes isolados em
modelo murino. Fato este inovador, já que a literatura científica aborda a virulência
como principal característica fenotípica correlacionada com os aspectos imunológicos
(Franco et al., 1993; Singer-Vermes et al., 1994; Mollinari-Madlum et al., 1999;
Camargo et al., 2000). Observou-se que as células do isolado Pb01 possuem uma menor
média nos valores do diâmetro das leveduras tanto na célula mãe, como dos seus
brotamentos e com predomínio da forma circular, ao se comparar com os dados do
isolado Pb18 que tiveram uma maior média nos valores do diâmetro e a forma variando
de circular a elíptica. Em relação à espessura da parede celular as leveduras do Pb01
apresentaram-se mais espessas que as do Pb18.
Estes resultados podem explicar alguns pontos na capacidade dos macrófagos
MH-S de fagocitarem de forma mais rápida e em maior quantidade as leveduras do
Pb01 em relação ao Pb18 nos experimentos in vitro. Além disso, nos ensaios in vivo
nota-se que a relação do tamanho do inóculo utilizado na infecção dos animais
experimentais teve uma influência direta com aumento do processo inflamatório no
pulmão, visto que o isolado Pb18 gerou a formação de granulomas no tecido pulmonar
ao longo dos dias estudados. Sanchez e colaboradores (2008) estudaram as diferenças
fenotípicas ligadas a morfologia e virulência em 2 espécies do gênero Cryptococcus (C.
neoformans e C. gattii) e a influência destas características fenotípicas na
patogenicidade dos fungos. Observaram através de microscopia diferenças morfológicas
no tamanho das cápsulas entre as espécies, sendo que C. gattii possui uma cápsula
maior o que influencia na forte patogenicidade quando comparado com C. neoformans
(Torres-Rodríguez et al., 2003). Este fato corrobora com nossos resultados em relação
ao fungo P. brasiliensis, no qual isolado com maior tamanho possui uma maior
patogenicidade.
Pesquisas desenvolvidas com o fungo do gênero Cryptococcus, também
abordam a virulência de diferentes isolados deste fungo como principal característica
fenotípica correlacionada com os aspectos imunológicos desenvolvidos pelos
hospedeiros para combater a infecção. Blackstock e colaboradores (1999) observaram
uma regulação da resposta imune de forma diferencial entre um isolado virulento e
outro com baixa virulência do fungo C. neoformans.
44
Adesão do microorganismo patogênico no tecido hospedeiro é considerado
ponto crucial no processo de colonização e disseminação do parasita no organismo. Este
processo de invasão induz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos
leucócitos do hospedeiro com intuído de inibi-lo. Assim, a produção de ROS gerada
pela resposta imune na infecção pelo P. brasiliensis, ocasiona um estresse oxidativo na
célula fúngica que induz a perda da homeostasia celular (Campos et al., 2005). Portanto,
a sobrevivência de fungos patogênicos no hospedeiro depende da capacidade da célula
fúngica de evadir da resposta imune do hospedeiro.
Os macrófagos são considerados peças centrais na imunidade anti-P.
brasiliensis, pois eles podem conter a infecção fúngica. Porém, também podem ser
utilizados pelos fungos como ambiente propício para sua multiplicação e disseminação
no organismo do hospedeiro (Benarde, 2008). Observamos este fato nos experimentos
in vitro com macrófagos infectados com isolado Pb18 onde possivelmente os
macrófagos facilitaram a multiplicação deste isolado no meio intracelular e nos ensaios
in vivo eles podem ter auxiliado na disseminação do Pb18 pelo tecido pulmonar dos
animais experimentais. Mas, na relação dos macrófagos com isolado Pb01 nos ensaios
in vitro ocorreu uma redução na multiplicação das leveduras no meio intracelular e nos
experimentos in vivo a infecção dos animais ocasionada pelo isolado Pb01 foi contida.
Estes resultados estão em acordo com os dados de Soares e colaboradores (2001)
que ao utilizarem macrófagos provenientes de pessoas saudáveis quando foram
infectados com isolado virulento de P. brasiliensis (Pb18) tiveram uma limitada
atividade in vitro contra o fungo, porém, nos infectados com isolado menos virulento
(Pb265) não se observou esta limitação na atividade do macrófago. Tavares e
colaboradores (2007) estudaram o perfil transcricional do P. brasiliensis em resposta à
fagocitose por macrófagos murinos, observaram que após 6 horas de interação, o fungo
induziu nos macrófagos a transcrição de genes relacionados à atividade pró-inflamatória
e de fagocitose, e este apresentou a expressão de genes relacionados ao estresse
oxidativo e nutricional.
A análise do trascriptoma do Paracoccidioides brasiliensis revelou que este
patógeno possui diferentes vias de combate as espécies reativas de oxigênio (ROS) e de
nitrogênio (RNI) que o hospedeiro produz, como por exemplo: catalases; superóxido
dismutase; glutationa peroxidase e citocromo c peroxidase (Felipe et al., 2005). Além
disso, na interação P. brasiliensis-hospedeiro, o fungo está em vantagem, pois os genes
que codificam a produção de ROS pelas células imunes do hospedeiro promovem a
45
ativação das enzimas da via combate aos ROS no fungo. Mas, a capacidade microbicida
dos macrófagos está relacionada com a produção de RNI, dentre estas espécies, o NO é
o mais potente agente citotóxico (MacMicking et al., 1997) e participa da morte de P.
brasiliensis (Gonzalez et al., 2000).
Óxido nítrico é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase a partir do
aminoácido L-arginina. Souto e colaboradores (2000) demonstraram que há uma relação
direta entre a produção de NO pelos macrófagos e a presença das citocinas TNF-α e
IFN-γ, se a concentração destas decair ocorre uma diminuição na geração de NO. Sendo
que o TNF-α está associado com atividade fungicida dos macrófagos em relação ao P.
brasiliensis (Calvi et al., 2003). O óxido nítrico possui um papel protetor, pois atua
como molécula efetora da citotoxicidade dos macrófagos e também, pode atuar como
regulador da resposta inflamatória (Gonzalez et al., 2000). Este papel do NO foi
evidenciado nos ensaios in vitro dos macrófagos infectados com isolado Pb01, onde a
concentração de NO teve um aumento exponencial ao longo das horas de co-cultivo
ocasionando uma diminuição da viabilidade das leveduras recuperadas após interação
com os macrófagos.
Bocca e colaboradores (1998 e 1999) relataram que NO possui um papel
secundário que pode ocasionar a imunossupressão. Este fato corrobora com os dados de
Nascimento e colaboradores (2002) que relacionam a produção persistente de NO com a
susceptibilidade à infecção por P. brasiliensis. Na infecção sistêmica dos animais
inoculados com isolado Pb18, observou-se uma menor capacidade linfoproliferativa em
todos os tempos analisados em relação ao isolado Pb01. Entretanto, na infecção
intratraqueal houve uma produção e liberação contínua de NO que foi aumentando
gradativamente ao longo dos dias de infecção, podendo este fato explicar a
imunossupressão observada na outra forma de infecção.
O curso da infecção ocasionada pelo P. brasiliensis depende da virulência deste
fungo, como também, da resistência natural do hospedeiro à infecção. Teixeira e
colaboradores (1987) infectaram animais considerados resistentes à infecção pelo P.
brasiliensis (A/SN) e susceptíveis (B10.A) com isolado virulento (Pb18) e não virulento
(IVIC Pb267) e observaram um rápido estado de imunossupressão nos animais
susceptíveis infectados com Pb18 e nos inoculados com IVIC Pb267 não houve esta
rápida imunossupressão, que somente começou a surgir após 12 semanas de infecção.
Observou-se estes mesmos acontecimentos nos experimentos de capacidade
linfoproliferativa dos animais com infecção sistêmica, sendo que camundongos
46
inoculados com Pb01 apresentaram até 4 semanas após infecção uma maior capacidade
linfoproliferativa, mais posteriormente esta capacidade decaiu tornando-se similar com
a do Pb18.
Benarde (2008) observou que o déficit na resposta linfoproliferativa aos
mitógenos, como também, aos antígenos de P. brasiliensis pode ser ocasionado pela
deficiência na imunidade celular dos pacientes com PCM, pois a falta de um adequado
sinal co-estimulatório pode ocasionar anergia das células T nestes indivíduos.
Zacharias e colaboradores (1986) realizaram um estudo comparativo da
histopatologia e da imunologia em animais infectados endovenosamente com 3 tipos de
isolados de P. brasiliensis (Pb18, Pb192 e Pb265, que apresentam diferenças em relação
à virulência). Seus resultados demonstraram que o isolado Pb265 não induziu a
formação de granuloma no pulmão e nem a produção de anticorpos, além disso, a
imunidade celular foi significantemente baixa quando comparada com os outros dois
isolados. Os granulomas induzidos pelo Pb18 e também, pelo Pb192 apresentaram-se
ricos em fungos, mas com diferenças entre si nas quantidades de células mononucleares.
Porém estes isolados tiveram similaridades nas respostas imunes humoral e celular
contra P. brasiliensis. Devido a estes fatos, os autores consideraram isolado Pb265 não
virulento e os outros dois isolados virulentos (Zacharias et al., 1986).
Na análise histopatológica do pulmão tanto na infecção sistêmica como na
infecção intratraqueal nos animais inoculados com o isolado Pb18, houve uma resposta
inflamatória progressiva na formação de granulomas no tecido pulmonar com decurso
do tempo infecção. Porém, os animais inoculados com Pb01 nas duas formas de
infecção não houve a formação de granulomas, somente a presença de infiltrados
inflamatórios localizados próximos da região periobronquiovascular, os quais foram
tornando-se mais densos e intensos ao longo tempo infecção. Estes dados corroboram
com os resultados obtidos na recuperação das CFU/g pulmão nos dois tipos de infecção
para ambos isolados, sendo que o grupo Pb18 houve um aumento progressivo no
decurso da infecção sistêmica e da intratraqueal nas quantidades de colônias
recuperadas. Mas, para isolado Pb01 ocorreu uma diminuição na quantidade CFU/g
pulmão recuperada no decorrer da infecção sistêmica. Na infecção intratraqueal do
grupo Pb01 foi necessário aumentar concentração do inóculo de infecção 10 vezes em
relação ao do grupo Pb18 para conseguir recuperar as CFU/g pulmão. Após 15 dias de
infecção não se conseguiu recuperar as colônias, 30 dias foi o ponto com a maior
47
quantidade de CFU recuperada para este grupo e aos 60 dias houve um decréscimo na
quantidade de CFU recuperada do tecido pulmonar.
Uenotsuchi e colaboradores (2006) observaram que as diferenças na virulência
das linhagens do fungo Sporothrix schenckii e no estado imune do hospedeiro podem
contribuir com as diferentes formas de manifestações clínicas desta micose.
Investigaram a interação entre monócitos derivados das células dendríticas com 2 duas
linhagens (uma de origem visceral e outra cutânea) deste fungo. Observaram que a
linhagem cutânea induziu uma forte resposta Th1 com uma alta ativação dos monócitos,
enquanto a visceral induziu uma mínima ativação dos monócitos, como também, uma
fraca resposta Th1 (Uenotsuchi et al., 2006).
As células Th1 secretam citocinas que ativam os macrófagos. Além disso, a
produção de citocinas por estas células possui um papel na regulação da expressão do
tipo de imunoglobulina. A secreção de IFNγ por estas células participa na indução da
expressão do tipo IgG2a em murinos (Kun et al., 2001). Observou-se na infecção
sistêmica dos animais inoculados com isolado Pb01 uma resposta imunológica com uma
tendência a resposta de padrão Th1, e na infecção intratraqueal houve uma resposta
imunológica de padrão misto (Th1 e Th2). Mas, nos dois tipos de infecção os animais
inoculados com Pb18 houve uma tendência em relação à resposta Th2.
As diferenças morfológicas e patogênicas observadas entre isolado Pb01 e Pb18
podem ser possivelmente devido às diferenças na expressão gênica de cada isolado
estudado. Já que o isolado Pb01 apresenta 32,94Mb de comprimento da sequência
completa do genoma e o número de genes deste genoma que predizem códigos para a
síntese de proteínas é entorno de 9,132. O isolado Pb18 apresenta um menor
comprimento da sequência completa do genoma (29,95Mb), como também, uma menor
quantidade de genes (8,741) que predizem códigos para a síntese de proteínas
(http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/GenomeSt
ats.html).
Diferentes apresentações clínicas da PCM podem ser ocasionadas pela virulência
dos isolados de P. brasiliensis no qual hospedeiro foi infectado. Estudos sobre a
biologia do fungo estão começando a direcionar quais mecanismos e moléculas
existentes entre os diferentes isolados de P. brasiliensis podem estar associadas com a
virulência e a patogenicidade de cada tipo de isolado, como também, podem ajudar a
elucidar os mecanismos de susceptibilidade e de resistência apresentados pelos modelos
animais em determinados tipos infecção induzida por diferentes isolados.
48
O desenvolvimento de novas drogas antifúngicas está buscando utilizar as
pesquisas moleculares sobre a composição da parede celular dos diferentes isolados
fúngicos, com intuíto de construir drogas antifúngicas altamente específicas. Desta
forma, a utilização do método do diagnóstico molecular para investigar o tipo de isolado
fúngico que o paciente com PCM foi infectado, facilitará a prescrição do melhor e mais
específico medicamento antifúngico. Assim, o conhecimento sobre a morfologia,
patogenia e genética de cada isolado do gênero Paracoccidioides possivelmente poderá
auxiliar no diagnóstico, como também, no tratamento dos pacientes com PCM.
Portanto, uma das possíveis perspectivas que este trabalho pode deixar, é a realização de
um estudo sobre a composição da parede celular do isolado Pb01 para verificar a
presença e quantidade de α-1,3-glucana e de α-manana comparando com dados relativos
de outros isolado, pois estes componentes se relacionam com o grau de virulência e o
poder patogênico de um isolado. Além disso, utilizar uma linhagem mais susceptível a
PCM, ou seja, a linhagem B10.A como modelo experimental de PCM induzida pelo
isolado Pb01 comparando-se com a PCM induzida por um outro isolado do grupo
filogenético Pb01-like.
Conclusão
50
Conclusão
O isolado Pb01 apresenta um menor tamanho e uma parede celular mais espessa
em relação ao isolado Pb18. Estes fatores influenciaram na interação do isolado Pb01
com os macrófagos (MH-S), que fagocitaram de forma mais rápida e em maior
quantidade as leveduras Pb01, como também, induziu uma maior produção de NO pelos
macrófagos quando comparado com isolado Pb18. O isolado Pb01 induziu nos animais
experimentais utilizados neste trabalho uma resposta imunológica mais efetiva,
possivelmente devido a sua característica de ser mais imunogênico do que Pb18. Desta
maneira, o isolado Pb01 possui uma menor patogenicidade em relação ao isolado Pb18.
Estes dados sobre o isolado Pb01 corroboram com as pesquisas sobre a nova espécie
críptica a Pb01-like para espécie Paracoccidioides brasiliensis.
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Anexos
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