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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro de Tecnologia e Ciências
Instituto de Química
Michelle Reis da Silva
Estudo da enzima Horseradish peroxidase (HRP) no descoramento
dos corantes têxteis Azul Drimaren X-3LR, Azul Drimaren X-BLN,
Rubinol Drimaren X-3LR e Azul Drimaren CL-R
Rio de Janeiro
2008
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Michelle Reis da Silva
Estudo da enzima Horseradish peroxidase (HRP) no descoramento dos
corantes têxteis Azul Drimaren X-3LR, Azul Drimaren X-BLN, Rubinol Drimaren
X-3LR e Azul Drimaren CL-R
Dissertação apresentada como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Ciências, ao Programa de Pós
Graduação em Química, da Universidade
do Estado do Rio de Janeiro. Área de
concentração: Química Ambiental
Orientador: Prof. Dr. Carlos Russo
Co-orientador: Dr
a
. Viridiana Santana Ferreira-Leitão
Rio de Janeiro
2008
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CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/CTC/Q
S586 Silva, Michelle Reis da
Estudo da enzima horseradish peroxidase (HRP) no descoramento
dos corantes têxteis Azul Drimaren X-3LR, Azul Drimaren X-BLN,
Rubinol Drimaren X-3LR e Azul Drimaren CL- R. / Michelle Reis da
Silva . – 2008.
106 f.
Orientador: Carlos Russo.
Orientador: Viridiana Santana Ferreira-Leitão
Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, Instituto de Química.
1. Corantes sintéticos – Teses. 2. Descoloração – Teses. 3.
Toxicidade - Teses. I. Russo, Carlos. II. Ferreira-Leitão, Viridiana
Santana. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de
Química. VI. Título.
CDU 667.28
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial
desta dissertação.
____________________________________ _____________________
Assinatura Data
Michelle Reis da Silva
Estudo da enzima Horseradish peroxidase (HRP) no descoramento
dos corantes têxteis Azul Drimaren X-3LR, Azul Drimaren X-BLN,
Rubinol Drimaren X-3LR e Azul Drimaren CL-R
Dissertação apresentada como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Ciências, ao Programa de Pós
Graduação em Química, da Universidade
do Estado do Rio de Janeiro. Área de
concentração: Química Ambiental.
Aprovado em ___________________________________
Banca examinadora:
___________________________________
Prof. Dr. Carlos Russo (orientador)
Instituto de Química / UERJ
___________________________________
Dr
a
. Viridiana Santana Ferreira-Leitão (co-orientador)
Instituto Nacional de Tecnologia - MCT
___________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Manuela da Silva
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)
___________________________________
Prof. Dr. Fábio Merçon
Instituto de Química / UERJ
Rio de Janeiro
2008
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por sua presença em todos os momentos da
minha vida, por toda força e amor;
Aos meus pais pelo amor, dedicação e renúncias que possibilitaram o início
de tudo;
Ao meu namorado Christiano, por seu amor e maior compreensão neste
momento de ansiedade e desestabilidade;
À minha co-orientadora, Dr
a
Viridiana Ferreira-Leitão, por sua dedicação,
amizade, incentivo e inestimável contribuição na minha formação profissional;
Ao meu orientador, Professor Dr. Carlos Russo, pelo apoio, ensinamentos e
orientação;
À amiga Débora França, por sua amizade, atenção e valiosos ensinamentos
que contribuíram muito na realização desse trabalho;
À amiga Lívian Ribeiro, por seu carinho e valiosa contribuição na realização
dos testes toxicológicos com Artemia salina;
Aos meus queridos companheiros de trabalho da Divisão de Catálise e
Processos Químicos – LACAT 3
0
andar – pelo incentivo, compreensão e
colaboração na realização deste trabalho;
Às queridas amigas e companheiras de trabalho: Lúcia Helena, Manoela
Ruchiga e Patrícia Maia, pela contribuição nas análises toxicológicas e por todo o
carinho dedicado;
Ao amigo Ricardo Sposina, por sua amizade e contribuição no início deste
trabalho;
Ao amigo Cristiano Ribeiro, pelos conhecimentos e contribuição no início
deste trabalho;
À amiga Natália Quinete por sua amizade e incentivo na realização deste
trabalho;
À professora Dr
a
Elita Scio e seus alunos do laboratório de pesquisa de
produtos naturais da Universidade Federal de Juiz de Fora, por ceder espaço,
material e conhecimentos para a realização das análises toxicológicas com Artemias
salina;
À Danielly Paiva do laboratório de Avaliação e Promoção da Saúde Ambiental
(LAPSA) do departamento de Biologia/ FIOCRUZ, na realização das análises
toxicológicas com Daphnia pulex;
À Ludmila Bergsten, por sua ajuda nas fotos dos experimentos e por sua
amizade e incentivo na realização desse trabalho;
À Empresa Maria Cândida, pela doação dos corantes;
À Empresa Toyobo do Brasil pelo fornecimento da enzima utilizada neste
trabalho;
Ao INT, pela oportunidade e permissão da divulgação dos dados do projeto;
Ao CNPq, pelo apoio financeiro e incentivo à pesquisa;
Aos professores do curso de Mestrado em Química do Instituto de Química da
UERJ por seus ensinamentos ministrados;
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Muito obrigada!
RESUMO
SILVA, Michelle Reis da. Estudo da enzima Horseradish peroxidase (HRP) no
descoramento dos corantes têxteis Azul Drimaren X-3LR, Azul Drimaren X-BLN,
Rubinol Drimaren X-3LR e Azul Drimaren CL-R. 2008. 106f.
Dissertação (Mestrado em Ciências), Instituto de Química, Universidade do Estado
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
O presente trabalho avaliou o potencial da enzima HRP no descoramento dos
corantes têxteis: Azul Drimaren X-3LR (DMBLR), Azul Drimaren X-BLN (DMBBLN),
Rubinol Drimaren X-3LR (DMR) e Azul Drimaren CL-R (RBBR). Parâmetros como
concentração do corante, temperatura, concentração de peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e tempo de reação foram otimizados. Os ensaios de descoramento dos
corantes foram realizados a partir desses resultados. As melhores condições
reacionais determinadas para os corantes estudados foram: concentração do
corante = 120 mg L
-1
, temperatura = 35ºC, concentração de H
2
O
2
= 0,55 mM e
tempo de reação = 1 hora. Os percentuais de descoramento dos corantes DMBLR,
DMBBLN, DMR e RBBR, após o tratamento enzimático foi de 99, 77, 94 e 97%,
respectivamente. O tempo reacional de 5 minutos foi suficiente para os corantes
DMBLR e RBBR apresentarem elevada porcentagem de descoramento, 96% para
ambos. Já os corantes DMBBLN e DMR só apresentaram elevado grau de
descoramento após 1 hora de reação, sendo o corante DMBBLN o mais
recalcitrante, apresentando uma melhora de 10% na porcentagem de descoramento,
após 24 horas de reação. Além do grau de descoramento, também foi avaliada a
toxicidade dos corantes antes e após o tratamento enzimático utilizando Daphnia
pulex e Artemia salina como bioindicadores de toxicidade. Resultados toxicológicos
utilizando Daphnia pulex não foram conclusivos, indicando que esse bioindicador
não foi adequado para avaliar a toxicidade dos corantes estudados no meio
reacional utilizado. Com o uso da Artemia salina na avaliação toxicológica foi
observado uma redução da toxicidade para os corantes DMBLR, DMR e RBBR após
tratamento enzimático, e um aumento da toxicidade não significativo para o corante
DMBBLN. Os resultados obtidos no trabalho ressaltam a eficiência da enzima HRP
no descoramento dos corantes têxteis estudados, sem a geração de produtos
tóxicos e prejudiciais ao meio ambiente.
Palavras-chave: Descoramento. Horseradish peroxidase. Corantes têxteis.
Toxicidade. Artemia salina.
ABSTRACT
The aim of the present study was to evaluate the potential of the Horseradish
peroxidase (HRP) enzyme in the decolorization of textile dyes Drimaren Blue X-3LR
(DMBLR), Drimaren Blue X-BLN (DMBBLN), Drimaren Rubinol X-3LR (DMR) and
Drimaren Blue CL-R (RBBR). Parameters such as concentration of the dye,
temperature, concentration of hydrogen peroxide (H
2
O
2
) and reaction time were
optimized. The optimum reaction conditions determined for the studied dyes were:
concentration of the dye = 120 mg L
-1
, temperature = 35 ° C, concentration of H
2
O
2
=
0.55 mM and reaction time = 1 h. The decolorization percentage of dyes DMBLR,
DMBBLN, DMR and RBBR after enzymatic treatment was 99, 77, 94 and 97%,
respectively. The reaction time of only 5 minutes presented high decolorization
percentage for both dyes DMBLR and RBBR, about 96 %. However dyes DMBBLN
and DMR showed high decolorization degree in 1 h of reaction and the dye
DMBBLN, being the most recalcitrant, exhibited an improvement of 10% in the
decolorization percentage after 24 h of reaction. Besides the decolorization degree,
the toxicity of the studied dyes was also evaluated before and after enzymatic
treatment using Daphnia pulex and Artemia salina as bioindicators. The toxicological
results using Daphnia pulex were not conclusive, indicating that it was not an
appropriate bioindicator to evaluate the toxicity of the tested dyes. Meanwhile when
using Artemia salina for toxicological evaluation it was observed a reduction of
toxicity for dyes DMBLR, DMR and RBBR after enzymatic treatment, and a not
significant increase in toxicity for the dye DMBBLN. In conclusion, the obtained
results emphasize the efficiency of the HRP enzyme in the decolorization of the
studied textile dyes, without the generation of toxic and harmful products to the
environment.
Keywords: Decolorization. Horseradish peroxidase. Textile dyes. Toxicity. Artemia
salina.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Interação de corantes reativos do tipo vinil sulfonato com a fibra têxtil
(KUNZ et al., 2002).....................................................................................................23
Figura 2 - Representação esquemática das etapas desenvolvidas no procedimento
experimental...............................................................................................................62
Figura 3 - Estruturas químicas dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR
(OZSOY; UNYAYAR; MAZMANCI, 2005; HIHARA; OKADA; MORITA, 2000)..........65
Figura 4 – Influência da concentração do corante nas reações de
descoramento.............................................................................................................66
Figura 5 - Influência da temperatura no descoramento dos corantes
têxteis.........................................................................................................................68
Figura 6 – Influência da concentração de H
2
O
2
no descoramento dos corantes
têxteis.........................................................................................................................71
Figura 7 - Ciclo catalítico das hemeperoxidases (ODIER; ARTAUD, 1992; OLLIKKA
et al., 1998).................................................................................................................74
Figura 8 – Influência do tempo de reação no descoramento dos corantes
têxteis.........................................................................................................................75
Figura 9 – Espectros de absorção molecular no visível dos corantes: DMBLR,
DMBBLN, DMR e RBBR, antes e após o tratamento enzimático..............................79
Figura 10 - Tubos de ensaio contendo os corantes: DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR, antes (1) e após (2) o tratamento enzimático.................................................80
Figura 11 - Espectro de absorção molecular no visível da mistura dos corantes antes
e após o tratamento enzimático.................................................................................82
Figura 12 - Tubos de ensaio contendo a mistura dos corantes: DMBLR, DMBBLN,
DMR e RBBR, antes (1) e após (2) o tratamento enzimático.....................................82
Figura 13 - Percentual de mortalidade de Artemia salina em função da concentração
dos corantes DMBLR, DMR, RBBR, DMBBLN e dos seus respectivos produtos após
o tratamento enzimático com HRP.............................................................................85
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais empresas produtoras de corantes e pigmentos no Brasil
(GUARATINI; ZANONI, 2000)....................................................................................20
Tabela 2 – Histórico dos corantes reativos (SALEM, 2000 apud TWARDOKUS,
2004)..........................................................................................................................25
Tabela 3 – Emprego dos principais tipos de corantes têxteis no Brasil (GUARATINI;
ZANONI, 2000)...........................................................................................................27
Tabela 4 – Vantagens e desvantagens de alguns métodos empregados na remoção
de corantes de efluentes industriais (ROBINSON et al., 2001; FERREIRA-LEITÃO,
et al., 2006).................................................................................................................38
Tabela 5 – Principais problemas ambientais com os seus respectivos poluentes
gerados e as possibilidades de tratamento enzimático (AITKEN, 1993; KARAM;
NICELL, 1997)............................................................................................................44
Tabela 6 – Características principais de algumas peroxidases (FERREIRA-LEITÃO,
2003)..........................................................................................................................47
Tabela 7 – Composição do meio reacional utilizado na determinação da atividade
enzimática..................................................................................................................57
Tabela 8 – Composição do meio reacional inicial......................................................58
Tabela 9 - Comprimento de onda dos corantes têxteis.............................................63
Tabela 10 - Percentuais de remoção de cor dos corantes têxteis.............................64
Tabela 11 – Comparação dos tratamentos enzimáticos utilizados no descoramento
do corante RBBR........................................................................................................77
Tabela 12 – Condições de descoramento otimizadas para cada corante
estudado.....................................................................................................................81
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABS – Absorbância
4-AAP - 4- aminoantipirina
COT - Carbono Orgânico Total
DBO - Demanda Bioquímica de Oxigênio
2,4-DCP -2,4– diclorofenol
DMBBLN - Azul Drimaren X-BLN
DMBLR - Azul Drimaren X-3LR
DMR - Rubinol Drimaren X-3LR
DQO - Demanda Química de Oxigênio
E
EE
E
- Coeficiente de extinção molar
Ferro-PPIX - Ferro-protoporfirina IX
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
HPA’s - Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
HRP - Horseradish peroxidase
ICI - Imperial Chemical Industries
INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
NBR – Norma Brasileira
OD - Oxigênio Dissolvido
PCB’s - Policloreto de bifenila
POAs - Processos Oxidativos Avançados
RBBR - Azul Drimaren CL-R
UV - Ultravioleta
VIS - Visível
λmax – Comprimento de onda máximo
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO...........................................................................................................15
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................19
1.1 Corantes.........................................................................................................19
1.1.1 Classificação dos corantes..............................................................................21
1.1.2 Os corantes na indústria têxtil..........................................................................26
1.1.2.1 O consumo de água na indústria têxtil...........................................................29
1.1.2.2 O processo de tingimento na indústria têxtil...................................................30
1.2 Métodos de tratamento de efluentes e corantes têxteis............................32
1.3 Enzimas como catalisadores no tratamento de efluentes.........................40
1.3.1 Peroxidases.....................................................................................................45
1.3.2 Aplicações de enzimas no tratamento de corantes e efluentes têxteis...........48
1.4 Toxicidade dos corantes...............................................................................50
2 OBJETIVO GERAL.........................................................................................55
2.1 Objetivos específicos....................................................................................55
3 METODOLOGIA..............................................................................................56
3.1 Preparo das soluções dos corantes e da enzima HRP..............................56
3.2 Determinação da atividade enzimática........................................................56
3.3 Determinação do comprimento de onda máximo dos corantes...............57
3.4 Oxidação enzimática dos corantes mediadas pela HRP............................58
3.5 Descoramento da mistura dos corantes selecionados..............................59
3.6 Ensaios toxicológicos...................................................................................60
3.6.1 Teste de toxicidade aguda com Daphnia pulex...............................................60
3.6.2 Teste de toxicidade aguda com Artemia salina...............................................61
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................63
4.1 Determinação do comprimento de onda máximo dos corantes...............63
4.2 Determinação da atividade enzimática........................................................64
4.3 Descoramento dos corantes.........................................................................64
4.4 Parâmetros avaliados no descoramento dos corantes.............................66
4.4.1 Concentração dos corantes.............................................................................66
4.4.2 Temperatura....................................................................................................68
4.4.3 Concentração de H
2
O
2
......................................................................................70
4.4.4 Tempo de reação.............................................................................................74
4.5 Espectros de absorção molecular dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR
e RBBR antes e após as reações catalisadas pela HRP.......................................78
4.6 Descoramento da mistura dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR.........................................................................................................................81
4.7 Ensaios toxicológicos...................................................................................83
4.7.1 Teste de toxicidade aguda com Daphnia pulex ..............................................83
4.7.2 Teste de toxicidade aguda com Artemia salina...............................................85
5 CONCLUSÃO..................................................................................................89
6 TRABALHOS FUTUROS................................................................................90
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................91
15
INTRODUÇÃO
O aumento da industrialização e o crescimento populacional nos últimos anos
têm contribuído fortemente para a intensificação e geração de novos problemas
ambientais. Rejeitos tóxicos provenientes dessa industrialização vêm se tornando
cada vez mais complexos e em maior quantidade, devido ao aumento da demanda
por produtos industrializados diversos (KUNZ et al., 2002).
O problema da poluição ambiental tem caráter mundial. Teve início na
revolução industrial, intensificou-se com a explosão populacional humana e
perpassa pelo desenvolvimento sócio-econômico-cultural do século. Em muitas
regiões brasileiras que abrigam pólos industriais e densa população, o meio
ambiente vem sofrendo uma degradação efetiva causada pelos esgotos domésticos
e industriais, principalmente no que se refere ao ecossistema aquático (BALAN,
1999).
A contaminação de águas naturais tem sido apontada como um dos maiores
problemas da sociedade moderna. A economia de água em processos produtivos
vem ganhando especial atenção devido ao valor agregado que tem sido atribuído a
este bem. Princípios como consumidor pagador e poluidor pagador, recentemente
incorporado em nossa legislação tem chamado atenção ao consumo mais
consciente de água (KUNZ et al., 2002).
Dentro deste contexto, o setor têxtil apresenta especial destaque por utilizar
grandes quantidades de água e por gerar grandes volumes de efluentes, os quais
apresentam composição extremamente heterogênea. Além dos produtos auxiliares
presentes no processo de tingimento, estes efluentes apresentam coloração intensa
porque aproximadamente 20% da produção total de corantes são perdidos para o
meio ambiente durante a etapa de lavagem das fibras (KUNZ et al., 2002).
A cor forte é a característica mais observada no efluente têxtil. O problema
da cor está associado aos corantes, especialmente aos corantes solúveis em água
que são adsorvidos em quantidade mínima e, portanto, saem nos efluentes das
estações de tratamento. Em geral, a concentração do corante é menor do que a de
muitos outros produtos químicos encontrados nos efluentes, mas sua cor é visível
até concentrações muito baixas. (HASSEMER; SENS, 2002).
Considerando-se ainda que mais de 50% da produção mundial de corantes
orgânicos sejam destinadas as indústrias têxteis, significa que se o tratamento não
16
for adequado pode alterar o ecossistema, diminuindo a transparência da água e a
penetração da radiação solar e, conseqüentemente, a atividade fotossintética e a
solubilidade dos gases (CLAUSEN; TAKASHIMA, 2007).
Os corantes sintéticos vêm sendo utilizados progressivamente nas indústrias
de papel, têxtil, cosméticos, farmacêutica e alimentícia, devido à facilidade do seu
uso, estabilidade e variedade de cores quando comparado aos corantes naturais
(MAZMANCI; UNYAYAR, 2005).
Aproximadamente 10.000 corantes e pigmentos diferentes são produzidos
anualmente em todo o mundo, e utilizado extensivamente nas indústrias de corantes
e impressão. Alguns desses corantes são considerados recalcitrantes e tóxicos,
sendo resistentes a biodegradação bacteriana e, portanto, dificilmente degradados
no tratamento convencional de efluentes. Desta forma, o tratamento destes
efluentes é uma etapa de fundamental importância na área ambiental (LIU; WANG;
JI, 2006).
Atualmente a oxidação química, a osmose reversa e a adsorção, entre outros
métodos são empregados no tratamento destes efluentes. Contudo, estes métodos
apresentam como limitações o elevado custo, problemas de regeneração e a
formação de poluentes secundários (LIU; WANG; JI, 2006).
Recentemente pesquisas têm sido direcionadas ao estudo de tecnologias
mais promissoras no tratamento de efluentes industriais. Nesse contexto, a
utilização de processos biológicos baseados na utilização de fungos e bactérias, ou
diretamente na utilização de enzimas, tem surgido como uma das alternativas de
grande potencial (FORGIARINI, 2006).
As enzimas são catalisadores biológicos, ou seja, proteínas com atividade
catalítica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. Sua função é
viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar
novos compostos. A singularidade desses compostos decorre do elevado grau de
especificidade ao substrato em condições moderadas, sob as quais atuam
(FORGIARINI, 2006).
Neste contexto, as enzimas peroxidases se destacam por apresentarem um
enorme potencial de aplicação em síntese orgânica e biocatálise ambiental, pois as
condições de reação oferecidas determinam a sua forma de atuação; assim estas
enzimas podem ser extremamente seletivas e específicas ou catalisar reações de
degradação de forma extensiva (FORGIARINI, 2006).
17
Devido ao seu potencial redox e sua capacidade de atuação em meios
aquosos e orgânicos, as peroxidases são aplicadas, por exemplo, na degradação de
xenobióticos e compostos tóxicos, como organoclorados, corantes sintéticos,
pesticidas e efluentes do processo de petróleo (LIU; WANG; JI, 2006).
Muitas peroxidases como a lignina peroxidase, manganês peroxidase,
soybean peroxidase, horseradish peroxidase (HRP), lacase, entre outras, são
aplicadas para descolorir e degradar corantes e efluentes têxteis (LIU; WANG; JI,
2006).
Dentre as novas aplicações das peroxidases podemos destacar o tratamento
de efluentes contendo compostos fenólicos e na síntese de vários compostos
químicos aromáticos. A HRP é conhecida por sua eficiência na remoção de um
amplo espectro de compostos aromáticos (fenol, bifenóis, anilinas) na presença de
peróxido de hidrogênio e na degradação ou precipitação de importantes corantes
industriais (SHAFFIQU et al., 2002).
Muitos tratamentos podem ser eficientes no descoramento dos corantes
têxteis, mas é necessário avaliar se está havendo a formação de produtos tóxicos
durante o processo, pois se esses corantes não forem corretamente tratados, podem
causar sérios problemas de contaminação ambiental (SOUZA; FORGIARINI;
SOUZA, 2007).
Para avaliar a eficiência dos processos de degradação de poluentes, o uso de
bioindicadores na análise da toxicidade é uma valiosa técnica empregada, como
indicativo de toxicidade.
Este trabalho tem como objetivo estudar a aplicação da enzima HRP no
descoramento dos corantes têxteis: Azul Drimaren X-3LR (DMBLR), Azul Drimaren
X-BLN (DMBBLN), Rubinol Drimaren X-3LR (DMR) e Azul Drimaren CL-R (RBBR,
Azul Reativo 19, Remazol Brilhant Blue R). As reações de descoramento foram
otimizadas quanto a concentração dos corantes, temperatura, tempo de reação e
concentração de peróxido de hidrogênio, avaliando os níveis de descoramento de
cada corante, como também a toxicidade dos corantes antes e após o tratamento
enzimático.
Os assuntos correlatos ao tema desta dissertação estão apresentados no
capítulo Revisão bibliográfica. No capítulo Materiais e Métodos, as metodologias
empregadas no desenvolvimento do trabalho estão apresentadas. Os resultados e
discussões sobre a aplicação da enzima HRP no tratamento dos corantes
18
estudados, como também a avaliação toxicológica estão descritas no capítulo
Resultados e Discussões, seguido das conclusões.
19
1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1- Corantes
A origem dos corantes têxteis é incerta, mas há indícios de seu uso pelo
homem desde os primórdios das civilizações. No Egito, muitos dos tecidos
encontrados em múmias eram coloridos. No Brasil, desde seu descobrimento, sua
história tem estado relacionada à produção de corantes. A começar pelo seu nome,
uma vez que este é proveniente da madeira “Pau Brasil”, da qual era extraído um
pigmento capaz de tingir tecidos com cores fortes, como vermelho, rosa ou marrom
(DALLAGO; SMANIOTTO; OLIVEIRA, 2005).
Segundo Guaratini e Zanoni (2000), até a metade do século XIX, todos os
corantes eram derivados de folhas, ramos, raízes, frutos ou flores de várias plantas
e substâncias extraídas de animais. Mesmo tendo sua origem na Europa desde o
século XVI, a indústria de corantes têxteis teve seu primeiro corante sintético
produzido apenas em 1856 na Inglaterra por Perkin, que de forma não intencional,
sintetizou a malveína - o primeiro corante sintético já produzido
.
Atualmente a indústria de corantes dos Estados Unidos é a maior fonte
exportadora destes produtos, colocando no mercado aproximadamente 2.000 tipos
diferentes de corantes sintéticos (TWARDOKUS, 2004).
A importância dos corantes para a civilização humana é evidente e bem
documentada. Os corantes sintéticos são extensivamente utilizados na indústria
têxtil, gráfica e de aditivos em derivados de petróleo (KUNZ et al., 2002).
Uma variedade de mais de 10.000 estruturas são utilizadas industrialmente
como corantes ou pigmentos e mais de 700.000 toneladas de corantes são
produzidas anualmente em todo o mundo, sendo utilizados no Brasil cerca de
27.000 toneladas por ano (KUNZ et al., 2002).
A produção industrial de corantes sintéticos no Brasil foi introduzida logo após
a Primeira Guerra Mundial e supre 60% da sua demanda doméstica. A tabela 1
ilustra as principais empresas produtoras de corantes e pigmentos no Brasil. Com
pequenas exceções, estas indústrias localizam-se basicamente no eixo Rio – São
Paulo e a maioria são dependentes de produtos intermediários importados tais
como: derivados de benzeno, naftaleno, e tolueno (GUARATINI; ZANONI, 2000).
20
Tabela 1- Principais empresas produtoras de corantes e pigmentos no Brasil
(GUARATINI; ZANONI, 2000).
Empresa
Localização
Tipo de Produto
BANN
SP Corantes à cuba.
BASF
SP
Corantes ácidos, corantes básicos,
corantes diretos, corantes dispersos,
corantes reativos, corantes á cuba,
corantes solventes, corantes pré-
metalizados, pigmentos orgânicos.
BAYER
RJ
Corantes ácidos, corantes diretos,
corantes pré-metalizados.
BRANCOTEX
SP
Corantes ácidos.
CHIMICAL
SP
Corantes ácidos, corantes básicos,
corantes diretos, corantes pré-
metalizados.
CIBA Especialidades
Químicas
RJ
Corantes ácidos, corantes básicos,
corantes diretos, corantes dispersos,
corantes reativos, corantes pré-
metalizados.
CLARIANT
SP, RJ
Corantes ácidos, corantes básicos,
corantes diretos, corantes dispersos,
corantes mordentes, corantes reativos,
corantes sulfurosos, corantes à cuba,
corantes pré-metalizados.
DYSTAR
SP
Corantes ácidos, corantes azóicos,
corantes dispersos, corantes reativos.
ENIA
SP
Corantes ácidos, corantes azóicos,
corantes diretos, corantes dispersos,
corantes reativos, corantes sulfurosos,
corantes à cuba, corantes solventes,
corantes pré-metalizados.
HOESCHT
(CLARIANT)
SP
Corantes ácidos, corantes solventes,
corantes pré-metalizados.
21
1.1.1 – Classificação dos corantes
A molécula do corante pode ser dividida em duas partes principais: o grupo
cromóforo que confere a cor, e a estrutura responsável pela fixação do corante à
fibra (KUNZ et al., 2002).
Os corantes podem ser classificados de acordo com sua estrutura química ou
com o método pelo qual ele é fixado à fibra têxtil. Sendo assim, quanto à estrutura
química os corantes podem ser classificados como: nitrofenol, nitrosofenol, azo,
trifenilmetano, antraquinona, ftalocianina, vinilsulfônico, pirimidina e triazina
(TWARDOKUS, 2004). Na indústria têxtil a classificação mais adotada é quanto ao
modo de fixação. Os principais grupos de corantes classificados pelo modo de
fixação são apresentados a seguir:
Corantes diretos ou substantivos: São corantes solúveis em água. Tingem
diretamente as fibras de celulose (algodão, viscose, etc), através das interações de
van der Waals. O banho aquoso deve ser acrescido de um eletrólito para aumentar a
afinidade pela fibra e a grande vantagem desta classe de corantes é o alto grau de
exaustão durante a aplicação e conseqüente diminuição do conteúdo de corante nas
águas de rejeito (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes azóicos: São compostos coloridos insolúveis em água, que são realmente
sintetizados sobre a fibra durante o processo de tingimento. Nesse processo a fibra
é impregnada com um composto solúvel em água, conhecido como agente de
acoplamento, que apresenta alta afinidade por celulose. A adição de um sal de
diazônio provoca uma reação com o agente de acoplamento já fixado na fibra e
produz um corante insolúvel em água. O fato de usar um sistema de produção do
corante diretamente sobre a fibra, através da combinação de um corante precursor
sem grupos sulfônicos e a formação de um composto solúvel, permite um método de
tingimento de fibras celulósicas com alto padrão de fixação e alta resistência à luz e
umidade (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes ácidos: O termo ácido corresponde a um grupo de corantes aniônicos,
portadores de um a três grupos sulfônicos. São solúveis em água, têm aplicação em
fibras protéicas e em fibras de poliamida sintética. Esses corantes caracterizam-se
22
por substâncias com estrutura química baseada em composto azo, antraquinona,
triarilmetano, azina, xanteno, quetonimina, nitro e nitroso, que fornecem uma ampla
faixa de coloração e grau de fixação (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes à cuba: São também chamados de corantes a tina e de redução, e são
insolúveis em água. Através de redução com hidrossulfito de sódio em meio
alcalino, transformam-se em leuco derivados solúveis e tingem as matérias têxteis
celulósicas. Como a produção química de hidrossulfito de sódio pode causar
problemas ecológicos, o custo operacional dessa classe de corante tem sido
bastante alto (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes de enxofre: É uma classe de corantes que após aplicação se caracteriza
por compostos macromoleculares com pontes de polissulfetos, os quais são
altamente insolúveis em água. Em princípio são aplicados após pré-redução em
banho de ditionito de sódio, que lhes confere a forma solúvel; são reoxidados
subseqüentemente sobre a fibra pelo contato com ar. Este composto tem sido
utilizado principalmente no tingimento de fibras celulósicas, conferindo cores pretas,
verde oliva, azul marinho, marrom, apresentando boa fixação. Entretanto, estes
corantes usualmente apresentam resíduos tóxicos (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes dispersos: Constituem uma classe de corantes insolúveis em água
aplicados em fibras de celulose e em outras fibras hidrofóbicas através de
suspensão. Durante o processo de tingimento, o corante sofre hidrólise e a forma
originalmente insolúvel é lentamente precipitada na forma dispersa sobre o substrato
têxtil. Para sua aplicação são necessários agentes dispersantes. Esta classe de
corantes tem sido utilizada principalmente para o tingimento de fibras sintéticas, tais
como: acetato de celulose, nylon, poliéster, poliacrilonitrila (GUARATINI; ZANONI,
2000).
Corantes pré-metalizados: São úteis principalmente para o tingimento de fibras
protéicas e poliamida. São caracterizados pela presença de um grupo hidroxila na
posição orto em relação ao cromóforo azo, permitindo a formação de complexos
com íons metálicos. Nesse tipo de tingimento explora-se a capacidade de interação
entre o metal e os grupamentos funcionais portadores de pares de elétrons livres,
23
como aqueles presentes nas fibras protéicas. A desvantagem ecológica deste tipo
de corante está associada ao alto conteúdo de metais presentes nas águas de
rejeito (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes branqueadores: As fibras têxteis no estado bruto por serem compostas
primariamente de materiais orgânicos, apresentam como característica uma
aparência amarelada por absorver a luz principalmente na faixa de baixo
comprimento de onda. A diminuição dessa tonalidade tem sido efetuada na indústria
ou lavanderia pela oxidação da fibra com alvejantes químicos ou utilizando-se os
corantes brancos também chamados branqueadores ópticos ou mesmo
branqueadores fluorescentes (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Corantes reativos: Os corantes deste grupo possuem como característica a alta
solubilidade em água e o estabelecimento de uma ligação covalente entre o corante
e a fibra. Esta ligação confere maior estabilidade na cor do tecido tingido, quando
comparada a outros tipos de corantes em que o processo de tingimento se opera
através de ligações de menor intensidade. A montagem se efetua pela adição de
um eletrólito. A interação de corantes reativos com a fibra é ilustrada na figura 1.
SO
2
CH
2
CH
2
O
SO
2
CH
2
CH
2
OH
SO
2
CH
CH
2
SO
2
CH
2
CH
2
OSO
3
Na
sítio cromóforo
celulose
sítio cromóforo
celulose
sítio cromóforo
OH
-
,
H
2
O
pH = 9 - 12
temp.= 30 - 70 ºC
sítio cromóforo
Figura 1: Interação de corantes reativos do tipo vinil sulfonato com a fibra têxtil
(KUNZ et al., 2002).
24
Segundo Salem (2000) apud Twardokus (2004) inicialmente, antes do
surgimento dos corantes reativos, as fibras celulósicas eram tingidas seguindo
princípios como: - o corante era adsorvido pela fibra, realizando ligações por pontes
de hidrogênio, como por exemplo, os corantes diretos; - por adsorção com
mecanismos semelhantes a dos corantes diretos seguida da insolubilização do
corante por oxidação (corantes enxofre e à tina) e na construção de corantes
insolúveis na fibra (corantes azóicos).
Os primeiros corantes reativos foram lançados no mercado somente em 1956
pela Imperial Chemical Industrieis (ICI), sendo estes obtidos a partir do Cloreto
Cianúrico. Os grupos reativos eram os diclorotriazina e monoclorotriazina. A partir
desta descoberta, ocorreu um grande desenvolvimento científico e tecnológico e
foram criados inúmeros grupos químicos reativos que possibilitavam ligações mais
ou menos estáveis com a celulose. Com o surgimento dos corantes reativos
estabeleceu-se um quarto princípio para o tingimento de fibras celulósicas (SALEM,
2000 apud TWARDOKUS, 2004).
A tabela 2 apresenta o histórico dos corantes reativos, com seus grupos
reativos, fabricantes e nomes comerciais.
25
Tabela 2: Histórico dos corantes reativos (SALEM, 2000 apud TWARDOKUS, 2004).
Ano
Grupo Reativo
Fabricante
Nome Comercial
1956
Dicloro triazina
ICI
Procion
1957
Monocloro triazina
Ciba
Cibacron E/P
1957
Vinilsulfônico
Hoechst
Remazol
1960
Tricloro pirimidina
Sandoz / Geigy
Drimaren R/K
Cibacron T-E
1961
Dicloro quinoxalina
Bayer
Levafix E
1971/72
Diflúor cloro pirimidina
Sandoz / Bayer
Drimaren R/K
Levafix E-A
1978
Monoflúor triazina
CiGy / Bayer
Cibacron F/
Levafix E-N
1980
Heterofuncional:
Monoclorotriazina/Vinilsulfô-
nico
Sumitomo
Sumifix supra
1981
Flúor cloro metil Pirimidina
Bayer
Levafix P-N
Anos 90
Heterofuncional:
Flúor-triazina/Vinilsulfônico
CiGy
Cibacron C
1997
Heterofuncional
Clariant
Drimaren CL
26
1.1.2 – Os Corantes na Indústria Têxtil
A indústria têxtil tem papel de grande importância na maioria dos países,
sendo um dos segmentos industriais de maior tradição. Dentre todos os segmentos,
ela é responsável por grande parte da economia dos países desenvolvidos, sendo o
carro-chefe nos países emergentes (GUARATINI; ZANONI, 2000).
No Brasil, a importação de corantes tem mostrado um aumento anual em
torno de 40%. Com uma grande demanda interna por corantes ácidos (cerca de 8%
da demanda mundial) e corantes reativos (4% do consumo mundial) resultantes da
grande produção de couros e algodão no país (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Devido às características climáticas, o Brasil tem sua indústria têxtil
predominantemente baseada em algodão (70%). Os outros corantes representam
um consumo per capita de aproximadamente 110 g/ano (GUARATINI; ZANONI,
2000).
O consumo de fibra têxtil no Brasil é estimado em 7,0 kg por ano por
habitante, sendo ligeiramente maior do que a média mundial. Cerca de 75% das
indústrias têxteis estão localizadas na região sul (Santa Catarina), sudeste (São
Paulo e Minas Gerais) e nordeste (Pernambuco, Bahia e Ceará) (GUARATINI;
ZANONI, 2000). A tabela 3 apresenta o emprego dos principais tipos de corantes
têxteis no Brasil.
27
Tabela 3 - Emprego dos principais tipos de corantes têxteis no Brasil (GUARATINI;
ZANONI, 2000).
Tipos de Corantes
Principais Destinos
Ácidos
Couro, fibras sintéticas (nylon e elastoméricas),
fibras naturais de lã e papel.
Azóicos
Fibras naturais de algodão e fibras sintéticas de
poliéster.
Básicos
Papel e fibras sintéticas acrílicas.
Diretos
Fibras naturais de algodão, fibras artificiais de
viscose, couro e papel.
Dispersos
Fibras sintéticas (poliéster, nylon) e fibras
artificiais de acetato e viscose.
Reativos
Fibras naturais de algodão e lã e fibras artificiais
de viscose, couro e papel.
Sulfurosos
Fibras naturais de algodão.
À Cuba
Fibras naturais de algodão.
Pré-metalizados
Tintas, plásticos, couro e papel.
Seguindo uma tendência mundial, a indústria de corantes no Brasil,
responsável por pelo menos 5.000 empregos e alto rendimento financeiro, tem
dedicado grande esforço para atender às regras de proteção ambiental. Embora a
aplicação destes corantes no processo de tingimento constitua efetivamente um
28
grande problema, a maior porcentagem das indústrias têxteis são pequenas
empresas, dificultando a fiscalização (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Na China, a indústria têxtil é tradicionalmente considerada como um pilar que
tem de fato contribuído de forma indispensável para o crescimento da economia
nacional desde a reforma e abertura política em 1978 (CHEN et al., 2007).
Em virtude do grande volume de produção, também é significativo o volume
de resíduos (sólidos, líquidos e gasosos) que são gerados pelas indústrias têxteis.
As operações de limpeza, tingimento e acabamento são responsáveis pela geração
de uma grande quantidade de efluentes que contém uma enorme variedade de
produtos químicos, que podem causar uma série de problemas quando estes são
descartados sem que os cuidados necessários sejam tomados. O reciclo mesmo
parcial, de insumos e matérias–primas é uma forma bastante significativa de reduzir
o problema da poluição ambiental (CHEN et al., 2007).
A indústria têxtil, especialmente o setor de beneficiamento, é responsável pela
poluição, principalmente dos corpos de água, das regiões em que atua. Maiores
exigências impostas pela legislação e cobranças sociais vêm criando a necessidade
premente de mudar este quadro. Atualmente, as indústrias utilizam sistemas de
gestão ambiental para aumentar a sua produtividade, seja na eficiência das
máquinas, na redução dos custos ou agregando alguma característica ao produto
final que possa valorizá-lo no mercado, gerando a menor quantidade de resíduos
possíveis (CHEN et al., 2007).
Nossas vidas são progressivamente modificadas pela ampla aplicação de
novas tecnologias que oferecem à indústria têxtil a possibilidade de reduzir custos,
proteger o meio ambiente, visando à saúde e a segurança, melhorando assim a
qualidade e a funcionalidade do processo (CHEN et al., 2007).
Adicionalmente várias regras rigorosas e regulamentações referentes às
descargas dos efluentes têm sido estabelecidas e implementadas, e assim abrindo
boas oportunidades para a biotecnologia substituir o processo têxtil
tradicional/convencional (CHEN et al., 2007).
Em 2001, a China teve a introdução de algumas técnicas de produção mais
limpa, incluindo a biostonewashing de jeans com uso de celulases e desizing dos
tecidos de coton com amilases, em empreendimentos em todo o país. Essas
técnicas foram inseridas na política de prevenção e controle da poluição do efluente
têxtil, bem como do plano geral de desenvolvimento da indústria têxtil da China.
29
Neste contexto, 28 pesquisas prioritárias estão no guia de ciência e tecnologia
número 11 (2006-2010) criado pelo programa de desenvolvimento da indústria têxtil
da China, e entre eles, a biotecnologia ambiental e o uso do tratamento enzimático
de efluentes (CHEN et al., 2007).
1.1.2.1 - O consumo de água na indústria têxtil
No que se refere ao consumo industrial de água, o setor têxtil responde por
aproximadamente 15% deste consumo. O potencial contaminante da indústria têxtil,
em sua totalidade, é considerado médio, sendo as etapas de tinturaria e o
acabamento as mais poluidoras do processo produtivo têxtil, quando comparadas
com a fiação e a tecelagem (TOLEDO, 2004 apud TWARDOKUS, 2004).
A água é usada na indústria têxtil como meio de transporte para os produtos
químicos que entram no processo, bem como para a remoção do excesso daqueles
produtos considerados indesejáveis para o substrato têxtil. A maior parte da carga
contaminante dos efluentes aquosos contém impurezas inerentes à matéria-prima,
tais como os produtos adicionados para facilitar os processos de fiação e tecelagem,
produtos químicos auxiliares e corantes eliminados durante as diferentes etapas do
acabamento (TOLEDO, 2004 apud TWARDOKUS, 2004).
Para Corrêa e Furlan (2003), o desafio é reduzir o consumo de água sem
afetar a otimização do processo, isto é, buscar a redução da captação sem afetar a
rentabilidade do negócio. Eles ainda salientam que certamente este tema ganhará
destaque crescente, pois, em maior ou menor medida, a escassez de água tende a
ser um problema universal em futuro não tão distante.
Os problemas ambientais relacionados com a indústria têxtil são numerosos e
bem documentados. Além dos problemas associados ao elevado volume de
resíduos e à sua elevada carga orgânica, surgem os inconvenientes relacionados
com a liberação de corantes não fixados e não-degradados nos processos
convencionais de tratamento. A presença desses corantes representa um elevado
potencial de impacto ambiental, não apenas em função da toxicidade associada,
mas também em relação à interferência em processos fotossintéticos (PERALTA-
ZAMORA et al., 2003).
30
O consumo de água nos processos da indústria têxtil é dependente do tipo de
material ou produto final. Grandes volumes de água são requeridos para o
processamento úmido, de modo que a indústria têxtil gera grandes volumes de
efluentes contendo quantidades variadas de contaminantes, dentre os quais se
destacam os corantes (CAMMAROTA; COELHO, 2001).
A água na indústria têxtil já está sendo avaliada como um componente a mais
nas planilhas de custos das empresas e não apenas como um veículo no processo
de tingimento de custo irrisório. A possibilidade de reutilizar os banhos de descarte
diretamente ou indiretamente, após o mínimo de tratamento possível, já é analisada
como uma forma de reduzir significativamente os custos do processo.
Outra forma de redução dos custos na indústria têxtil tem sido o uso de
enzimas em algumas etapas de beneficiamento do algodão. A catalase, por
exemplo, é uma enzima utilizada na etapa de remoção do peróxido de hidrogênio
que é adicionado na etapa de branqueamento da fibra antes do tingimento. Essa
remoção é necessária para eliminar os resíduos de peróxido prejudiciais ao
tingimento. A substituição do tratamento químico de remoção do peróxido pelo
tratamento enzimático possibilita uma considerável redução de tempo, energia e
água, evitando ou diminuindo os prolongados e repetitivos banhos presentes no
processo químico convencional (COSTA et al., 2001).
1.1.2.2 - O processo de tingimento na indústria têxtil
O tingimento de tecidos é uma arte que começou há milhares de anos e a
disponibilidade comercial de corantes é enorme. A tecnologia moderna utilizada no
tingimento consiste de várias etapas que são escolhidas de acordo com a natureza
da fibra têxtil, características estruturais, classificação e disponibilidade do corante
para aplicação, propriedades de fixação compatíveis com o destino do material a ser
tingido, considerações econômicas, etc (GUARATINI; ZANONI, 2000).
O processo de tingimento é um dos fatores fundamentais no sucesso
comercial dos produtos têxteis. Além da padronização e beleza da cor, o
consumidor normalmente exige algumas características básicas do produto, tais
como elevado grau de fixação em relação à luz, lavagem e transpiração, tanto
31
inicialmente, quanto após o uso prolongado. Para garantir essas propriedades, as
substâncias que conferem coloração à fibra devem apresentar alta afinidade,
uniformidade na coloração, resistência a agentes desencadeadores do
desbotamento e ainda apresentar-se viável economicamente (GUARATINI; ZANONI,
2000).
A fixação do corante à fibra é feita através de reações químicas que vão da
simples insolubilização do corante aos derivados gerados, e ocorre, usualmente, em
diferentes etapas durante a fase de montagem e fixação. Entretanto, todo processo
de tingimento envolve como operação final uma etapa de lavagem em banhos
correntes para a retirada do excesso de corante original ou corante hidrolisado não
fixado à fibra nas etapas precedentes (GUARATINI; ZANONI, 2000).
De acordo com Guaratini e Zanoni (2000), a forma de fixação da molécula do
corante as fibras têxteis, geralmente é feita em solução aquosa e pode envolver
basicamente quatro tipos de interações: ligações iônicas, de hidrogênio, de Van de
Waals e covalentes.
Interações Iônicas: Os tingimentos são baseados em interações mútuas entre o
centro positivo dos grupos amino e carboxilatos presentes na fibra e a carga iônica
da molécula do corante ou vice-versa. Exemplos característicos deste tipo de
interação são encontrados na tintura de lã, seda e poliamida (TWARDOKUS, 2004).
Interações de Van der Waals: Os tingimentos são baseados na interação
proveniente da aproximação máxima entre orbitais do corante e da molécula da
fibra, de tal modo que as moléculas de corante são “ancoradas” firmemente sobre a
fibra por um processo de afinidade, sem formar uma ligação propriamente dita. Esta
atração é especialmente efetiva quando a molécula do corante é linear/longa e/ou
achatada e pode assim se aproximar o máximo possível da molécula da fibra.
Exemplos característicos deste tipo de interação são encontrados na tinturaria de lã
e poliéster com corantes com alta afinidade por celulose (TWARDOKUS, 2004).
Interações de Hidrogênio: Os tingimentos são provenientes da ligação entre
átomos de hidrogênio covalentemente ligados no corante e o par de elétrons livres
de átomos doadores em centros presentes na fibra. Exemplos característicos deste
32
tipo de interação são encontrados na tintura de lã, seda e fibras sintéticas como
acetato de celulose (TWARDOKUS, 2004).
Interações Covalentes: Os tingimentos são provenientes da formação de uma
ligação covalente entre a molécula do corante contendo grupo reativo (grupo
eletrofílico) e resíduos nucleofílicos da fibra. Exemplos característicos deste tipo de
interação são tinturas de fibra de algodão (GUARATINI; ZANONI, 2000).
1.2 – Métodos de tratamento de efluentes e corantes têxteis
Tradicionalmente, o tratamento de efluentes é avaliado através da diminuição
de parâmetros inespecíficos, tais como demanda bioquímica de oxigênio (DBO),
demanda química de oxigênio (DQO) ou carbono orgânico total (COT). A atenção
para a remoção de poluentes específicos, substâncias tóxicas ou recalcitrantes, e a
efetividade do tratamento, também tem sido avaliada (AITKEN, 1993).
A formação de compostos tóxicos ou ainda a transferência de fase do
poluente não é avaliada, como é o caso de alguns compostos orgânicos presentes
em efluentes aquosos poderem ser evaporados e transferidos para a atmosfera, ou
seja, tratamentos que apenas transfere(m) o(s) poluente(s) de fase (CLAUSEN;
TAKASHIMA, 2007).
Os tratamentos de efluentes vigentes possuem limitações associadas à
remoção de compostos químicos específicos. Assim, as culturas mistas presentes
nos lodos ativados utilizados nos processos biológicos tradicionais, por exemplo, são
bastante efetivas na redução da carga orgânica, tanto nos efluentes domésticos
quanto nos efluentes industriais, entretanto, não são capazes de remover alguns
poluentes tóxicos e/ou coloridos, não sendo suficientes para atingir os padrões de
descarte (AITKEN, 1993).
Neste contexto, os corantes têxteis apresentam-se em destaque, pois devido
a sua própria natureza, a sua detecção pode ser feita a olho nu. Este
comportamento apresenta vantagens e desvantagens, pois uma pequena
quantidade lançada em efluentes aquáticos pode causar uma acentuada mudança
de coloração dos corpos receptores, mas pode também ser facilmente detectada
33
pelo público e autoridades relacionadas ao controle ambiental (GUARATINI;
ZANONI, 2000).
Deste modo, métodos para remoção da cor das águas de rejeito têm recebido
uma enorme atenção nos últimos anos. De um modo geral, a efetividade da
remoção da cor pode ser avaliada por um padrão espectrofotométrico permitido,
definido na literatura, o qual pode ser usado para controlar a diluição do corante nas
águas dos rios. Assim, através da comparação direta entre absorbância da amostra
de um efluente e o padrão de qualidade requerido para coloração em rios, é possível
avaliar o grau de contaminação (GUARATINI; ZANONI, 2000).
A resolução CONAMA 357, de 17 de março de 2005, estabelece as condições
e padrões de lançamento de efluentes. No que diz respeito aos corantes, a
resolução estabelece que corantes provenientes de fontes antrópicas devam estar
virtualmente ausentes, ou seja, não perceptível pela visão, olfato ou paladar.
Entretanto, a níveis não detectáveis a olho nu (virtualmente ausentes), o problema
pode ser mais sério, envolvendo acumulação, bio-disponibilidade, e etc, colocando
em risco o equilíbrio aquático, bem como a saúde e bem-estar humano, com a
deterioração da qualidade das águas (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Os corantes são tão variados em suas estruturas que nenhum esquema
simples e com ampla atuação pode ser desenvolvido para o tratamento de águas
residuárias. Alguns poderão sofrer biodegradação e os metabólitos formados
poderão ser ainda mais tóxicos do que aqueles que lhe deram origem. Se um
tratamento tem que ser considerado, então este tratamento pode incluir processos
físicos, químicos, físico-químicos e/ou biológicos (RODRIGUES, 2003).
Um dos maiores problemas em águas residuárias é a recalcitrância de certas
substâncias. O processo de tratamento pode ser dividido em quatro grupos:
processos de separação (concentração de compostos orgânicos sem alteração
química), processos de degradação (processos oxidativos que tem a intenção de
mineralizar os compostos orgânicos para a forma de CO
2
e água), processos que
modificam quimicamente os constituintes do efluente, mas não levam a
mineralização (processos de redução, como por exemplo, a desalogenação), e a
preparação do efluente pela adição de certos compostos químicos para tratamento
subseqüente por degradação ou separação, quebra de emulsões, floculação,
precipitação ou ajuste de pH (RODRIGUES, 2003).
34
Em geral, na indústria têxtil, os processos de tratamento estão
fundamentados na operação de sistemas físico-químicos de precipitação-
coagulação, seguidos de tratamento biológico via processo de lodos ativados. O
sistema apresenta uma eficiência relativamente alta, permitindo a remoção de
aproximadamente 80% da carga de corantes. Infelizmente, o problema relacionado
com o acúmulo de lodo torna-se crítico, uma vez que o teor de corantes absorvido é
bastante elevado, impedindo qualquer possibilidade de reaproveitamento (KUNZ et
al., 2002).
Embora os processos de lodo ativado ou lagoas aeradas consigam reduzir a
demanda de oxigênio do efluente da indústria têxtil, eles se mostram ineficientes
para o descoramento desse efluente, devido provavelmente ao baixo conteúdo de
nutrientes (nitrogênio e fósforo) nestas águas, e à toxicidade causada pela presença
de compostos fenólicos (RODRIGUES, 2003).
Devido ao fato dos padrões de preservação ambiental internacionais serem
cada vez mais exigentes, algumas alternativas são utilizadas no tratamento de
efluentes e corantes têxteis. Dentre os processos físicos mais utilizados no
tratamento de efluentes e corantes têxteis, a adsorção com carvão ativado ainda
vem sendo intensamente estudada. O estudo de alguns agentes alternativos
utilizando-se de biomassa como adsorvente também tem despertado atenção
recentemente. Alguns trabalhos vêm sendo publicados nos últimos anos utilizando
carvão ativado de coco, bambu, casca de eucalipto e quitosana como materiais
adsorventes (KUNZ et al., 2002; GOSH; BHATTACHARYYA, 2002; KANNAN;
SUNDARAM, 2000; FERREIRA-LEITÃO et al., 2007).
Neste sentido, existe um crescente interesse pela busca de materiais
alternativos de baixo custo que possam ser utilizados em substituição ao carvão
ativado, como adsorventes para a remoção de corantes têxteis (DALLAGO et al.,
2005).
Jain e Sikarwar (2008) estudaram o uso de alguns materiais como casca de
laranja, casca de banana, palha de arroz, argila betoníticas, pó de bambu, casca de
coco, serragem de madeira e outros, como materiais adsorventes na remoção de
vários corantes em efluentes. Estes materiais em geral, ofereceram um método
lento, não-econômico, mas efetivo para volumes de pequena escala.
Os processos utilizando membranas no tratamento de efluentes corados
também vêm sendo descritos. Esses processos incluem várias técnicas, nas quais a
35
pressão é utilizada para passar o efluente sobre uma membrana semipermeável.
Essa membrana permite que a água atravesse, mas impede a passagem das
substâncias solúveis que estão contidas no efluente. Desta forma, substâncias de
distintos pesos moleculares, como por exemplo, alguns corantes são removidos da
água (SANIN, 1997).
O uso de membranas especiais (nanofiltração e osmose reversa) também
vem sendo descrito na literatura. Estes métodos vêm propiciando uma boa remoção
da cor. Em ambas as técnicas, a metodologia consiste na separação efetiva de
moléculas de corantes com dimensão suficientemente grande para serem separadas
do efluente. A técnica permite o tratamento de grandes volumes, de modo rápido e
satisfatório, apesar de apresentar um elevado custo e dificuldades na limpeza das
membranas (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Em um estudo realizado por Cela et al., (2006), o uso de membranas
cerâmicas de Al
2
O
3
são sugeridas como método de tratamento terciário de efluentes
têxteis industriais por apresentarem uma elevada eficiência na filtração, removendo
uma alta porcentagem de corantes, entre outros parâmetros analisados.
As técnicas de tratamento fundamentadas em processos de coagulação,
seguidos de separação por flotação ou sedimentação, apresentam uma elevada
eficiência na remoção de material particulado. No entanto, a remoção de cor e
compostos orgânicos dissolvidos mostra-se deficiente (FORGIARINI, 2006). Para
melhorar a eficiência normalmente utiliza-se um excesso de polieletrólito (sulfato de
alumínio, amônia, etc.), que por sua vez irá acrescentar um resíduo potencial no
efluente (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Joo et al., (2007) em um estudo sobre a descoloração de corantes reativos
observou que o uso de coagulantes inorgânicos combinados a polímeros sintéticos,
melhorou a eficiência na remoção da cor de um efluente têxtil sintético. Não sendo
observada a mesma eficiência em um efluente real.
Os processos físico-químicos, como coagulação/floculação, adsorção com
carvão ativado e membranas têm sido desenvolvidos para remover a cor em
efluentes têxteis, entretanto, essas tecnologias somente transferem o corante de
fase, não resolvendo essencialmente o problema (ARAÚJO; YOKOYAMA, 2006).
A utilização de Processos Oxidativos Avançados (POAs) tem se tornado uma
alternativa para reduzir a cor dos efluentes têxteis, que geralmente está relacionada
à presença de substâncias recalcitrantes (ARAÚJO; YOKOYAMA, 2006).
36
Os POAs são tecnologias que geralmente utilizam um forte agente oxidante
como, por exemplo, O
3
e H
2
O
2
e/ou catalisadores (Fe, Mn, TiO
2
) na presença ou não
de fonte de irradiação, para gerar radicais livres OH
.
, altamente reativos, capazes de
mineralizar substâncias orgânicas refratárias, presentes nos efluentes industriais
(ARAÚJO; YOKOYAMA, 2006).
Um estudo realizado por Araújo e Yokoyama (2006) mostrou que o uso
combinado de peróxido de hidrogênio e radiação ultravioleta foi efetivo na remoção
de cor em soluções de corantes reativos. O método é baseado na remoção da cor
do efluente através da clivagem das moléculas do corante em processo catalítico ou
radiação ultravioleta. Tais técnicas podem ser usadas em grandes volumes de
efluente, sendo razoavelmente rápidas, porém apresentam um alto custo
(GUARATINI; ZANONI, 2000).
A ozonização é empregada principalmente para quebrar as moléculas de
corantes, e depois para descoloração. O pré-tratamento com ozônio é um método
promissor de oxidação dos corantes transformando-os em degradáveis. Embora
muitos trabalhos tenham sido feitos com a oxidação pelo ozônio, bem pouco se sabe
sobre a cinética da ozonização e seus produtos de reação com os corantes
(HASSEMER; SENS, 2002).
Entre os processos oxidativos avançados, o reagente de Fenton apresenta-se
como um dos métodos utilizados com sucesso na remoção de cor. O reagente de
Fenton é aplicado para corantes têxteis, aditivos e efluentes industriais. A química
do reagente de Fenton se dá em meio ácido, na presença de peróxido de hidrogênio
e excesso de íons ferro. O radical hidroxila ataca o(s) composto(s) orgânicos,
decompondo-se quimicamente. Íons férricos formados durante a reação redox são
coagulados, e as moléculas de corante e outros materiais em suspensão, também
são precipitados (MERIÇ et al., 2005).
Além dos estudos realizados com o reagente de Fenton, outros trabalhos
utilizando o reagente de Fenton na presença de radiação ultravioleta, processo
conhecido como reação Foto-Fenton, tem sido estudado, demonstrando resultados
promissores (ASHARAF et al., 2006).
Um dos limitantes ao uso do reagente de Fenton é a produção de lodo com a
presença de ferro, havendo a necessidade de uma disposição adequada,
adicionando mais um custo ao processo (DUTTA et al., 2001).
37
O uso de processos de eletrólise dos corantes também vem sendo
empregado como medida alternativa. Neste sistema a degradação da molécula é
realizada eletroquimicamente através de potencial ou corrente controlada, ou
através de reagentes secundários gerados eletroliticamente. O alto consumo de
energia empregada, além da produção de reações paralelas, tais como cloro,
radicais hidroxila e outras reações indesejáveis, têm diminuído a potencialidade do
método. Entretanto, alguns autores têm demonstrado que o método de degradação
destes produtos via oxidação química ou eletroquímica, poderiam ser mais bem
aproveitados através de investimento em novos estudos visando a geração de
produtos com características menos tóxicas e diminuição no custo (GUARATINI;
ZANONI, 2000).
Catanho, Malpass e Motheo (2006) avaliaram os tratamentos eletroquímicos e
fotoeletroquímicos na degradação dos corantes têxteis Remazol Black B, Remazol
Brilhant Orange 3R e Remazol Golden Yellow RNL, observando que o método
fotoeletroquímico apresentou maior eficiência que o eletroquímico, apresentando
uma descoloração total em aproximadamente 90 minutos. Já o tratamento
puramente eletroquímico não se mostrou eficaz na descoloração dos corantes
estudados.
O método de degradação baseado em reações fotoquímicas tem se mostrado
importante como etapa primária na degradação de alguns corantes, uma vez que os
corantes sintéticos apresentam a princípio alta estabilidade quando submetidos à luz
visível ou ultravioleta. O uso de radiação eletromagnética para produzir
intermediários mais reativos capazes de promover degradação subseqüente mais
rápida ou mais eficiente, tem sido empregado para melhorar sua aplicação como
método de tratamento (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Clausen e Takashima (2007) estudaram a fotocatálise mediada por TiO
2
no
tratamento de corantes têxteis, alcançando 98% de descoloração dos corantes
têxteis estudados, em um período de 6 horas de irradiação.
A tabela 4 apresenta as vantagens e desvantagens de alguns métodos
empregados na remoção de corantes de efluentes industriais (ROBINSON et al.,
2001; FERREIRA-LEITÃO, et al., 2007).
38
Tabela 4: Vantagens e desvantagens de alguns métodos empregados na remoção
de corantes de efluentes industriais (ROBINSON et al., 2001; FERREIRA-LEITÃO,
et al., 2007).
Métodos
Vantagens
Desvantagens
Reagente de Fenton
Descoramento efetivo de
corantes solúveis e
insolúveis
Geração de lodo
Ozonização
Aplicado no estado gasoso:
sem alteração do volume
Vida média curta
(20min.)
Fotoquímica
Não produz lodo
Formação de
subprodutos
NaOCl
Inicia e acelera a clivagem
de ligações azo
Libera aminas
aromáticas
Destruição
Eletroquímica
Gera compostos não
perigosos
Custo elevado de
eletricidade
Carvão Ativado
Remoção de grande
variedade de compostos
Custo elevado
Sílica Gel
Efetivo para remoção de
corantes básicos
Reações paralelas
impedem a utilização
industrial
Filtração por Membrana
Remove todo tipo de
corante
Produção de lodo
concentrado
Troca Iônica
Pode ser regenerado e
com isso não há perda do
adsorvente
Não é efetivo para todo
tipo de corante
Irradiação
Efetiva na escala de
laboratório
Requer altas
concentrações de O
2
Coagulação
Eletrocinética
Economicamente viável
Grande produção de lodo
Biocatálise
Destruição do
contaminante
Alto custo do
biocatalisador
39
Com o desenvolvimento da biotecnologia, diversas alternativas que viabilizam
o tratamento biológico de efluentes industriais vem sendo cada vez mais estudadas.
Neste contexto, muitos processos biológicos estão sendo utilizados no tratamento de
resíduos industriais, entre eles, resíduos da indústria têxtil. Nos últimos anos,
inúmeras culturas microbianas estão sendo testadas e muitas estão sendo aplicadas
na descoloração de corantes têxteis (BANAT et al., 1996).
A busca contínua por microrganismos versáteis, capazes de degradar de
forma eficiente um grande número de poluentes a um baixo custo operacional tem
motivado muitos pesquisadores envolvidos em estudos de biodegradação de
efluentes (KUNZ et al., 2002).
Um grande número de microrganismos foram testados por Forgacs et al.,
(2004), na descoloração e mineralização de vários corantes sintéticos presentes em
um efluente. A maioria destes compostos apresentou-se quimicamente estável e
resistente ao ataque microbiano.
Chen et al., (2003) estudaram a descoloração de corantes têxteis por
bactérias isoladas e verificaram que a eficiência do processo depende da adaptação
do microrganismo selecionado. Banat et al., (1996), em seu estudo de descoloração
de corantes, já haviam observado que muitas bactérias foram capazes de descolorir
corantes têxteis, mas verificaram problemas relacionados ao isolamento desses
microrganismos, período de adaptação desses ao meio contendo o poluente e a
capacidade de descolorir vários corantes.
Walker e Wetherley (2000), analisando o emprego de bactérias aeróbias, tais
como Bacillus gordonae, Bacillus benzeovorans e Pseudomonas putida, obtiveram
bons resultados na descoloração do corante ácido antraquinona Tectilon Blue,
utilizado no tingimento de carpetes. A descoloração foi de 19% devido à biosorção,
mas os cálculos mostraram que os Bacillus, além de promoverem a biosorção,
também degradam o corante mais rápido do que a bactéria Pseudomonas.
Chen et al., (2003) isolaram 6 linhagens de bactérias de amostras de lodo
capazes de degradar corantes têxteis, sendo identificada e selecionada Aeromonas
hydrophila, que exibiu a capacidade de remoção de cor de vários corantes.
Um estudo realizado por Swamy e Ramsay (1999) mostrou que a degradação
de corantes azóicos por bactérias anaeróbias geralmente diminui a cor, mas geram
aminas aromáticas, as quais são geralmente mais tóxicas que o corante inicial.
40
As leveduras também estão sendo aplicadas com sucesso no tratamento de
efluentes industriais. No estudo sobre a atuação do sistema ligninolítico de
leveduras isoladas no descoramento do corante preto reativo 5, Qingxiang et al.,
(2008) ressaltou que embora diversas leveduras apresentam-se capazes de remover
corantes através do mecanismo de biosorção, informações sobre a descoloração de
corantes por leveduras através do seu sistema ligninolítico ainda são escassas.
A capacidade de descoloração de corantes têxteis por leveduras foi
observada em um estudo realizado por Nascimento (2008) que ressaltou a eficiência
da descoloração e detoxificação desses corantes.
Comparada com as bactérias, as leveduras exibem características atraentes,
pois mesmo que o seu crescimento não seja tão rápido como o das bactérias, as
leveduras podem crescer mais rápido que a maioria dos fungos filamentosos e,
como eles, apresentam a capacidade de resistir à ambientes desfavoráveis (PAJOT
et al., 2007).
Neste contexto, é importante salientar o emprego diretamente de enzimas nos
processos biológicos como uma alternativa de grande potencial no tratamento de
efluentes. Os processos biotecnológicos empregando enzimas no tratamento de
corantes e efluentes têxteis serão abordados no item 1.3.
1.3 – Enzimas como catalisadores no tratamento de efluentes
As enzimas são substâncias naturais envolvidas em todos os processos
bioquímicos que ocorrem nas células vivas. São macromoléculas
predominantemente protéicas, imprescindíveis a qualquer ser vivo, pois aceleram as
reações químicas que mantém e regulam os processos vitais (SAID; PIETRO, 2004).
As enzimas são capazes de decompor moléculas complexas em unidades
menores, catalisar alterações estruturais dentro de uma molécula, como por
exemplo, isomerização da glicose em frutose, assim como também podem ajudar a
construir moléculas específicas de material celular (SAID; PIETRO, 2004).
Caracterizam-se pela alta especificidade e eficiência, e se fazem necessárias
em baixas concentrações. Em muitos processos as enzimas podem substituir
substâncias químicas sintéticas e contribuir para processos de produção ou gerar
41
benefícios para o meio ambiente, por meio da biodegradabilidade e pelo menor
consumo de energia. Como pode ser observado no estudo feito por Pricelius et al.,
(2007) que estudou o uso de enzimas na substituição ao método drástico tradicional
do uso de peróxido de hidrogênio na descolorização dos cabelos tingidos,
apresentando um ótimo resultado.
Muito da história da bioquímica refere-se à pesquisa em enzimas. Em 1926,
James Sumner isolou e cristalizou a primeira enzima, a urease, que catalisa a
hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono. As enzimas desempenham a
função de catalisar as reações nos organismos. Com exceção de alguns RNAs
(ribozimas) que são catalisadores durante seu próprio processamento, todas as
enzimas são proteínas, as quais aumentam sensivelmente a velocidade de uma
reação quando comparada a uma reação não catalisada (DALLA-VECCHIA et al.,
2004).
As enzimas apresentam várias propriedades que as tornam atrativas como
catalisadores para biotransformações. São catalisadores versáteis, existindo um
processo enzimático equivalente para cada tipo de reação orgânica (DALLA-
VECCHIA et al., 2004).
A aplicação de biocatalisadores na indústria é objeto de muitas investigações,
devido à alta atividade catalítica em comparação com os catalisadores
convencionais, e ao fato de atuarem com alta eficiência em condições reacionais
bastante suaves (DALLA-VECCHIA et al., 2004).
Os biocatalisadores industriais são utilizados em larga escala nas indústrias
de detergentes (proteases alcalinas), indústria têxtil (amilases e celulases), indústria
do amido (α-amilase, glicoamilase e glicose isomerase) e de laticínios (renina).
Outras aplicações relevantes ocorrem em panificação, cervejaria, produção de sucos
de frutas, ração animal, aromatizantes, processamento de óleos e gorduras,
hidrólise de proteínas, indústria de papel e celulose, processamento de couro,
metodologia analítica, indústria farmacêutica, química fina e tratamento de efluentes.
O mercado mundial de biocatalisadores é dominado pelos países
desenvolvidos. Assim, a Europa e a América do Norte detêm mais de 66% deste
mercado, ficando aproximadamente 30% para o restante do mundo (DALLA-
VECCHIA et al., 2004).
42
O Brasil apesar da sua biodiversidade e enorme disponibilidade de
biomateriais, tendo então uma vocação para o desenvolvimento da biotecnologia,
possui apenas 2% no mercado mundial de enzimas (BON; PEREIRA, 2000).
A produção e o uso de biocatalisadores industriais é uma área em expansão
pela grande diversidade natural de biocatalisadores e também porque métodos
moleculares vêm sendo utilizados com objetivo de aumentar a produção das
enzimas e a sua estabilidade, diminuindo o seu preço de mercado.
A produção de enzimas pode ser aumentada pela transferência das
informações genéticas para um microrganismo hospedeiro conhecido, por meio de
técnicas de DNA recombinante. Esses microrganismos geneticamente modificados
podem então ser cultivados sob as melhores condições (SAID; PIETRO, 2004).
A utilização de enzimas como catalisadores trazem vantagens imediatas aos
processos que as utilizam, como por exemplo: sua especificidade minimiza a
formação de subprodutos e as condições mais brandas de reação resultam num
menor consumo energético (temperaturas entre 25 e 40ºC, pressão atmosférica e
pH em torno da neutralidade (ROZELL, 1999).
Muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas nas duas últimas décadas com o
objetivo de investigar novas possibilidades de aplicações de enzimas em catálise
ambiental pelos motivos abaixo relacionados:
- A taxa de introdução de xenobióticos e recalcitrantes orgânicos no meio
ambiente é muito elevada. Conseqüentemente é cada vez mais difícil atender os
padrões de remoção destes contaminantes utilizando os métodos químicos e
biológicos tradicionais;
- Existe consenso de que as enzimas podem ser usadas para atingir
poluentes-alvos;
- Avanços biotecnológicos relacionados, por exemplo, ao melhoramento
genético de microrganismos produtores, têm permitido uma sensível diminuição do
custo de produção de enzimas.
Adicionalmente, os efluentes de processos industriais catalisados por
enzimas apresentam menor impacto ao meio ambiente. O desenvolvimento deste
tipo de tecnologia é uma tendência mundial e vem crescendo bastante em países
desenvolvidos, gerando inúmeras patentes e aplicações industriais rentáveis
(FERREIRA-LEITÃO, 2003).
43
O uso de enzimas no tratamento de efluentes foi primeiramente proposto na
década de 30. Entretanto, o conceito da utilização de enzimas para a destruição de
poluentes-alvo não foi desenvolvida até a década de 70. Um aspecto importante do
uso de enzimas na degradação de poluentes consiste na sua seletividade e
eficiência (AITKEN, 1993).
Na tabela 5 estão apresentados alguns problemas ambientais com os seus
respectivos poluentes gerados e as enzimas aplicáveis na solução destes problemas
(AITKEN, 1993; KARAM; NICELL, 1997).
44
Tabela 5: Principais problemas ambientais com os seus respectivos poluentes
gerados e as possibilidades de tratamento enzimático (AITKEN, 1993; KARAM;
NICELL, 1997).
Principais Problemas
Ambientais
Fontes Poluídoras
Enzimas Aplicáveis
Anilinas, fenóis,
corantes, PCBs*,
PAHs**
Indústria química em
geral: petróleo, plástico,
têxtil, corantes.
Peroxidases
Tirosinase
Lacase
Resíduos de papel e
celulose
Indústria de papel e
celulose.
Peroxidases
Lacase
Celulases
Pesticidas Atividade agrícola em
geral.
Paration hidrolase ou
fosfotriesterase
Peroxidases
Cianeto Indústria química e
farmacêutica, produção
de intermediários
químicos, fibras
sintéticas, borracha.
Cianidase
Cianeto hidratase
Resíduos da indústria
de alimentos
Laticínios,
processamento de
carnes, extratos
vegetais e
processamento de
grãos.
Prosteases
Amilases
Pectinesterase
Lactase
Quitinase
Pectinase
Lipase
Resíduos sólidos e lodo Indústrias que
descartam material
celulósico e ligno-
celulósico.
Ligninases
Lipase
Lisozima
Celulase
Metais pesados Atividade industrial e de
mineração.
Fosfatase
*PCB’s - Policloreto de bifenila; **HPA’s - Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.
45
1.3.1- Peroxidases
As peroxidases são enzimas amplamente distribuídas na natureza e são
produzidas principalmente por um grande número de microrganismos e fontes
vegetais, sendo também encontradas em tecidos animais. Elas estão entre as
primeiras enzimas descobertas com referências desde o século 19, apresentando
atividade em sistemas biológicos (SAID; PIETRO, 2004).
Essas enzimas catalisam a oxidação do substrato utilizando o peróxido de
hidrogênio como molécula aceptora. A reação consiste na transferência de
hidrogênio ou elétrons de um doador para água (SAID; PIETRO, 2004).
As peroxidases são enzimas oxidativas dependentes de peróxido que
catalisam a oxidação de uma ampla variedade de compostos orgânicos e
inorgânicos, como por exemplo, a degradação de xenobióticos e compostos tóxicos,
como organoclorados, corantes sintéticos, pesticidas, herbicidas e efluentes do
processamento de petróleo (FERREIRA-LEITÃO et al., 2003).
A peroxidase de raiz forte ou a HRP é a peroxidase vegetal mais conhecida e
melhor caracterizada até o momento. A HRP também é uma glicoproteína com
ferro-protoporfirina IX, como radical prostético, sendo seu peso molecular em torno
de 40.000 (DUNFORD, 1999).
O estudo da HRP precedeu o de todas as outras peroxidases, por isso ela
pode ser considerada a “peroxidase-mãe”. Em 1995 Hugo Theorell ganhou o prêmio
Nobel de medicina devido aos seus estudos com enzimas redox, no caso a HRP
(DUNFORD, 1999).
São conhecidas pelo menos sete isoformas da HRP, com capacidade
catalítica muito semelhante (SHANNON et al., 1996). Na natureza, uma das funções
conhecidas da HRP é catalisar a oxidação do indol-3-acetato, que regula o nível dos
hormônios de crescimento dos vegetais, as auxinas (DUNFORD, 1999).
A HRP catalisa a oxidação de vários substratos na presença de peróxido de
hidrogênio que induz a formação de um composto intermediário I via dois elétrons
oxidados. Esse composto intermediário I pode ser reduzido por um substrato
oxidado para o composto II. Este intermediário II reage com outra molécula de
substrato para voltar ao estado inicial da enzima (forma nativa) (DELLAMATRICE;
MONTEIRO, 2006).
46
Já foram descritas na literatura muitas reações catalisadas pela HRP:
adições, halogenações, desmetilações, hidroxilações e polimerização de compostos
fenólicos (FERREIRA-LEITÃO, 2003).
Algumas das novas aplicações das peroxidases incluem o tratamento de
efluentes contendo compostos fenólicos e a síntese de várias substâncias químicas
aromáticas. A HRP tem sido estudada devido a sua habilidade para descolorir polpa
contendo lignina e o efluente da indústria de papel e corantes têxteis, mostrando-se
capaz de mineralizar um amplo número de corantes azo sulfonados e não
sulfonados (SHAFFIQU et al., 2002).
Recentemente a HRP também se mostrou capaz de oxidar o Bisfenol A com
elevada taxa de transformação em pH neutro. Além disso, quando a HRP foi
utilizada no tratamento do Bisfenol A em fase aquosa, a atividade estrogênica desse
composto foi eliminada, sendo essa uma característica de grande preocupação
associada a essa substância que é considerada um disruptor endócrino (HONG-
MEI; NICELL, 2008).
Na tabela 6 são apresentadas algumas peroxidases e suas principais
características, com destaque para a HRP utilizada no presente trabalho
(FERREIRA-LEITÃO, 2003).
47
Tabela 6: Características principais de algumas peroxidases (FERREIRA-LEITÃO,
2003).
Peroxidase Fonte Peso
molecular
(kDa)
Grupo
prostético
Doador
natural de
elétrons
Função
Peroxidase de
raiz forte (HRP)
Raiz forte 40-42 Ferro-PPIX
Indol-3-
acetato
Controle do
hormônio
indol-3-
acetato
Peroxidase de
raiz japonesa
Raiz japonesa 41-55 Ferro-PPIX
Indol-3-
acetato
Controle do
hormônio
indol-3-
acetato
Peroxidase de
nabo
Nabo 38-51 Ferro-PPIX
Indol-3-
acetato
Controle do
hormônio
indol-3-
acetato
Cloro-peroxidase Caldaromyces
fumago
42 Ferro-PPIX
Cloreto Produção do
antibiótico
caldaromicina
Bromo
peroxidase
Ascophylum
nodorum
90 Vanádio Brometo Bromação de
compostos
orgânicos
Glutatião
peroxidase
Células de
mamíferos
90 Selênio Glutatião
reduzido
Prevenção de
peroxidação
de lipídeos
Citicromo C
peroxidase
Levedura e
Pseudomonas
aeruginosa
34
43-44
Ferro-PPIX
Heme C
Ferro-cit C
Ferro-cit C
Aceptor de
elétrons na
cadeia
respiratória
Mieloperoxidase Granulócitos e
monócitos
144 Ferriclorina
Cloreto Bactericida
Eosinofilo
peroxidase
Granulócitos 72 Ferro-PPIX
Brometo,
iodeto
Bactericida
Lactoperoxidase Leite, saliva,
lágrima
77-78 Ferro-PPIX
Tiocianato,
iodeto
Bactericida
Tireóide
peroxidase
Glândula
tireóide
70 Ferro-PPIX
Iodeto Iodação da
tiroglobulina
Lignina
peroxidase
Fungos da
podridão
branca,
Streptomyces
sp.
40-45 Ferro-PPIX
Álcool
veratrílico
Degradação
da lignina
Ferro-PPIX = Ferro-protoporfirina IX
48
1.3.2 - Aplicações de enzimas no tratamento de corantes e efluentes têxteis
Diversas enzimas de diferentes fontes vegetais e microbianas têm sido
estudadas objetivando a aplicação em efluentes industriais. Algumas enzimas
podem agir em compostos recalcitrantes específicos promovendo a precipitação
destas substâncias ou a sua transformação em compostos mais facilmente
degradáveis pelos processos convencionais (DURÁN; ESPOSITO, 2000).
Processos enzimáticos apresentam diversas vantagens quando comparadas
ao tratamento biológico convencional, físico e químico, como por exemplo, a
remoção seletiva de poluentes particulares, aplicação em compostos xenobióticos
recalcitrantes, elevada razão de reação, operação em diversas faixas de pH e
salinidade, redução no volume do lodo, e simplicidade de controle do processo
(IKEHATA et al., 2004).
Entre os processos enzimáticos estudados para o tratamento de efluentes, o
tratamento de fenóis e aminas aromáticas catalisado por fenol oxidases e
peroxidases, é provavelmente um dos mais conhecidos processos enzimáticos
estudados. Peroxidases produzidas por plantas como a horseradish peroxidase e a
soybean peroxidase, por fungos como, por exemplo, tirosinases e lacases têm sido
estudados para esses processos (IKEHATA et al., 2004).
Um estudo do uso da enzima lignina peroxidase na degradação do corante
azul de metileno demonstrou a elevada eficiência dessa enzima como biocatalisador
na degradação desse corante. Além disso, resultados prévios indicam a não
formação de produtos de degradação tóxicos ou indesejáveis (FERREIRA-LEITÃO
et al., 2007).
Palmieri et al., (2005) investigaram a descoloração do corante Remazol
Brilhant Blue R (RBBR), por fungos basidiomicetos Pleorotus ostreatus. Neste
trabalho os autores mostraram a eficiência de enzimas na descoloração desse
corante de freqüente uso industrial.
Estudos cinéticos da degradação do corante Azul Brilhante Drimaren, pelo
uso da Lipozyme RM IM, imobilizada em resina iônica, de procedência da
Novozymes Latim América Ltda, demonstraram que a degradação ocorre, sendo
favorecida pelo aumento da temperatura e concentração do biocatalisador
(BATTISTI; JESUS, 2006).
49
Lima et al., (2006) selecionaram microrganismos capazes de promover a
biodegradação de diferentes corantes têxteis reativos e ácidos, obtendo resultados
promissores em termos de impacto ambiental.
Alguns pesquisadores têm aumentado o interesse no versátil fungo de
decomposição branca Phanerochaete chrysosporium. O sistema ligninolítico deste
fungo tem a capacidade de mineralizar, além da lignina, pelo menos parcialmente e
em alguns casos completamente, uma variedade de poluentes resistentes a
degradação (KUNZ et al., 2002).
O sistema ligninolítico deste fungo é representado principalmente pelas
enzimas lignina e manganês peroxidase, as quais são produzidas em meios
contendo fontes limitadas de carbono e nitrogênio. Estas enzimas têm a capacidade
de despolimerizar a lignina e uma grande variedade de outros compostos (KUNZ et
al., 2002).
Spadaro, Gold e Renganathan (1992) demonstraram que P. chrysosporium foi
capaz de mineralizar alguns azocorantes, sendo a capacidade de descoloração
diretamente relacionada com a natureza dos grupos substituintes dos anéis
aromáticos. A capacidade de descoloração deste fungo foi estudada frente a uma
amostra de efluente têxtil simulada em laboratório, sendo observada a descoloração
total deste efluente sintético após sete dias de tratamento (KUNZ et al., 2002).
Couto et al., (2000) também observaram uma excelente eficiência no
tratamento de uma amostra contendo o corante poli-R-478, alcançando
descolorações superiores a 95% após o tratamento com o fungo P. chrysosporium.
A partir desses e de outros estudos realizados sobre o potencial de enzimas no
tratamento de corantes, pode-se observar a eficiência de complexos enzimáticos
como forma de tratamento de corantes.
O estudo do reaproveitamento de resíduos como fonte de enzimas para
aplicação em processos de biorremediação têm sido bastante divulgada como forma
de redução dos custos do tratamento enzimático apresentando um elevado potencial
de degradação de compostos xenobióticos (MACHADO; MATHEUS, 2006).
Machado e Matheus (2006) ressaltam o elevado potencial de aplicação de
extratos enzimáticos de Pleurotus ostreatus e extratos do resíduo da produção de
cogumelo “shimeji” na degradação do corante azul brilhante remazol (RBBR).
Tauber, Gübitz e Rehorek (2008), no estudo sobre a degradação de
azocorantes por processos oxidativos ressaltam a importância da combinação de
50
outros tratamentos, como por exemplo, a degradação enzimática e o tratamento com
ultrasom, com o objetivo de aumentar/potencializar a degradação dos corantes e
evitar a formação de produtos de degradação tóxicos.
A combinação simultânea do tratamento com lacase e ultrasom demonstrou
um efeito sinérgico na degradação dos corantes (CI Direct Blue 71 e CI Reactive
Orange 107). O corante CI Reactive Orange 107 apresentou resistência ao
tratamento enzimático, mas foi completamente degradado pelo método de
combinação simultânea desses tratamentos (TAUBER; GÜBITZ; REHOREK, 2008).
Cada vez mais é observada a necessidade do desenvolvimento de
tratamentos e tecnologias mais adequadas para remover cor e reduzir a toxicidade
desses efluentes. As condições e padrões para o lançamento de efluentes estão
dispostos na Resolução nº 357, de março de 2005 do Conselho Nacional do Meio
Ambiente (CONAMA), a qual estabelece que o efluente não poderá apresentar
potencial para causar efeitos tóxicos aos organismos aquáticos no corpo receptor,
de acordo com os critérios de toxicidade estabelecidos a partir de ensaio
ecotoxicológico padronizado ou outro método cientificamente reconhecido pelo
órgão ambiental competente.
É importante salientar que a adequação de técnicas combinadas utilizando a
biocatálise e tratamentos químicos ou físicos, poderá ser uma interessante e
promissora alternativa na remoção de corantes têxteis.
No item 1.4, a toxicidade dos corantes e dos compostos intermediários é
abordada, principalmente devido ao fato de muitos corantes serem fabricados a
partir de substâncias cancerígenas conhecidas, como por exemplo, a benzidina, o
naftaleno e outros compostos aromáticos (ANJANEYULU; CHARY; RAJ, 2005).
1.4- Toxicidade dos corantes
A toxicologia envolve o estudo qualitativo e quantitativo dos efeitos adversos
de substâncias químicas ou outros materiais antropogênicos sobre organismos
expostos. Os testes de toxicidade consistem em se expor organismos
representativos durante um período determinado a várias concentrações de uma ou
mais substâncias e avaliar os efeitos causados (DELLAMATRICE, 2005).
51
Os efeitos deletérios podem ser de dois tipos, agudo e crônico. O efeito
agudo é definido como uma resposta severa e rápida a um estímulo, a qual se
manifesta num intervalo curto variando de 0 a 96 horas. Para se avaliar efeitos
agudos utiliza-se em geral o parâmetro CL
50
, que é a concentração do agente tóxico
que causa letalidade ou outro efeito em 50% dos organismos em teste
(DELLAMATRICE, 2005).
Os efeitos tóxicos vão desde a mortalidade até efeitos chamados sub-letais,
tais como mudanças no crescimento, no desenvolvimento, na reprodução, no
comportamento etc (DELLAMATRICE, 2005).
Os riscos toxicológicos de corantes sintéticos à saúde humana estão
intrinsecamente relacionados ao modo e tempo de exposição, isto é, ingestão oral,
sensibilização das vias respiratórias (GUARATINI; ZANONI, 2000).
A análise do grau de toxicidade oral de corantes, medido através de 50% da
dose letal (DL
50
) tem demonstrado que apenas um número reduzido de corantes
pode apresentar toxicidade aguda (DL
50
< 5g/Kg) e são encontrados particularmente
nos corantes bis-azo e catiônicos. Estudos biocinéticos têm mostrado evidências de
que azocorantes solúveis em água, se oralmente administrados são metabolizados
na microflora intestinal e excretados mais rapidamente do que os compostos menos
solúveis (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Por outro lado, os corantes insolúveis em água poderiam ser biodegradados
no fígado, formando conjugados solúveis em água que seriam então transportados
para o intestino e sujeitos a reduções por bactérias da flora normal. Assim, existe
grande possibilidade dos corantes e de seus metabólitos não apresentarem
potencial de bioacumulação. Entretanto, os riscos crônicos destes tipos de corantes
e intermediários levam em consideração suas propriedades carcinogênicas e
mutagênicas (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Nesta classe de corantes, o grupo que tem atraído maior atenção tem sido os
corantes contendo a função azo-aromático como cromóforo, os quais constituem o
maior grupo de corantes orgânicos produzidos mundialmente. A biotranformação
destes corantes pode ser responsável pela formação de aminas, benzidinas e outros
intermediários com potencialidade carcinogênica (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Destes, pelo menos 3.000 azocorantes comerciais foram catalogados como
cancerígenos e não têm sido mais produzidos por fabricantes responsáveis.
Entretanto, a literatura especializada mostra que devido a problemas econômicos,
52
países menos desenvolvidos como Brasil, México, Índia e Argentina, não cessaram
completamente a produção de alguns corantes à base de benzidinas, como por
exemplo, o corante Congo Red 14, de grande potencialidade econômica
(GUARATINI; ZANONI, 2000).
Os testes de toxicidade ou bioensaios podem conter desde o princípio mais
básico das curvas “dose-resposta” e observação de modificações comportamentais,
fisiológicas e letalidade, até enfoques mais sofisticados como alterações
bioquímicas, genéticas ou teratogênicas (ZAMBONI, 2000).
Os efeitos passíveis de serem observados são numerosos e dependem das
características de cada método empregado, da biologia da espécie-teste, do tipo de
composto avaliado e do objetivo da cada estudo. Os bioensaios podem ainda ser
realizados com água, sedimentos, efluentes, produtos químicos puros e com
indivíduos, populações ou comunidades de animais, vegetais como um todo,
buscando sempre as respostas mais rápidas, precisas, de fácil interpretação e que
sejam correlacionáveis com outros meios da avaliação ambiental (VIEIRA, 2004).
A maior parte das substâncias químicas alcança direta ou indiretamente o
ecossistema marinho, especialmente porque muitos dos grandes centros urbanos
estão localizados no litoral. Com a água do mar cobrindo mais 70% da superfície da
Terra, e com a vasta diversidade de plantas e animais encontrados em estuários e
mar aberto, a avaliação toxicológica dos efeitos dessas substâncias em organismos
marinhos e estuarinos é essencial para a manutenção da biodiversidade e da própria
espécie humana (VIEIRA, 2004).
Apesar da importância e extensão do ambiente costeiro, a preocupação com
a proteção do ecossistema marinho é recente no Brasil. São ainda restritas as
espécies marinhas para as quais as normas são padronizadas. Os organismos mais
utilizados são os microcrustáceos Artemia sp. (Norma Técnica L5.021, CETESB,
1987), Daphnia (COOMAN et al., 2003; SHINY et al., 2005; HAN et al., 2006),
Mysidopsis juniae (Norma Técnica L5.251, CETESB, 1992a) e os embriões do
equinodermo Lythechinus variegatus (Norma Técnica L5.250, CETESB, 1992b). No
entanto, outras espécies vêm sendo testadas, tais como embriões da ostra
Crassostrea rhizophorae (NASCIMENTO, 2002) e do mexilhão Perna perna
(ZAMBONI, 2000), o misidáceo Mysidium gracile (BADARÓ-PEDROSO et al., 2002),
os copépodos Acartia lilljeborgi e Temora stylifera (NIPPER, 2002), o anfípodo
53
Tiburonella viscana (MELO; ABESSA, 2002), e o tanaidáceo Kalliapseudes shubartii
(ZAMBONI; COSTA, 2002).
As fontes de toxicidade aquática dos efluentes têxteis podem ser difíceis de
serem identificadas devido à falta de informações referentes à exata composição ou
da toxicidade de muitos corantes e auxiliares químicos conhecidos como
contribuintes para a toxicidade aquática dos efluentes têxteis. Dentre alguns
agentes pode-se citar: sais, tensoativos, metais, substâncias orgânicas tóxicas,
biocidas e ânions tóxicos. (ABRAHÃO; SILVA, 2002).
Os efeitos dos azocorantes no organismo humano está sendo estudado há
muito tempo. De todas as classes de compostos orgânicos, essa substância foi a
mais pesquisada (BROWN; DEVITO, 1993). Muitos dos compostos corantes não
apresentam caráter tóxico, mas sua biotransformação é responsável pela formação
de compostos com potencialidade carcinogênica e mutagênica (GONÇALVES et al.,
1999; VANDEVIVERE et al., 1998).
Segundo Ledakowicz e Gonera (1998), o efluente têxtil pode ocasionar
redução de aproximadamente 50% no crescimento microbiano dos lodos ativados,
reduzindo conseqüentemente a degradação dos demais compostos presentes.
Apesar dos corantes não apresentarem toxicidade aguda elevada, a
associação desses compostos aos agentes redutores e fixadores, durante o
processo de tingimento, faz com que o efluente bruto apresente toxicidade
significativa frente aos organismos teste (FORGIARINI, 2006).
A princípio qualquer espécie aquática pode ser utilizada em testes de
toxicidade. Entretanto, as espécies utilizadas nesses testes devem apresentar
características como: seletividade constante e elevada aos contaminantes, elevadas
disponibilidade e abundância, uniformidade e estabilidade genética nas populações,
representatividade de seu nível trófico, significado ambiental em relação à área de
estudo, ampla distribuição e importância comercial e, facilidade de cultivo e de
adaptação às condições de laboratório (Costa et al., 2008).
Dentre os organismos teste do ensaio de toxicidade aguda, pode-se citar os
crustáceos de água doce da ordem Cladocera e do gênero Daphnia, os quais são
vulgarmente conhecidos como pulgas d’água, são bastante utilizados em testes de
toxicidade. A Daphnia spp. é um microcrustáceo facilmente encontrado em lagos,
represas e lagoas de águas continentais. Este microcrustáceo mede cerca de 0,5 a
5,0 mm de comprimento (ABRAHÃO; SILVA, 2002).
54
A Daphnia é um organismo filtrador, alimenta-se de algas, bactérias e detritos
orgânicos presentes na água. Seu sistema enzimático é complexo, permitindo,
portanto a assimilação e a digestão da matéria orgânica sob diferentes formas. A
média do ciclo de vida da Daphnia magna é de 40 dias a 20ºC. No que diz respeito
ao teor de oxigênio dissolvido na água, a Daphnia é pouco exigente em comparação
a outros organismos aquáticos, pois pode viver em meio contendo concentrações
mínimas de 15 a 25% de saturação (FORGIARINI, 2006), mas apresenta
sensibilidade a vários contaminantes do ambiente aquático (Costa et al., 2008).
Outro organismo amplamente utilizado para avaliar a toxicidade de efluentes
é a Artemia salina (Crustácea, Anostraca) que é um microcrustáceo de água
salgada, o qual é utilizado como alimento vivo para peixes, sendo seus cistos
encontrados facilmente em lojas de aquaristas. O ciclo de vida da Artemia se inicia
pela eclosão de cistos dormentes, os quais são embriões encapsulados
metabolicamente inativos. Esses cistos podem permanecer no estado dormente por
muitos anos, desde que mantidos em lugar sem umidade. Quando esses cistos
entram em contato com água salgada, eles se tornam hidratados e reassumem o
seu desenvolvimento (ABRAHÃO; SILVA, 2002).
O crescimento da Artemia envolve uma série de mudas, passando por
estágios do ovo até a maturidade sexual que é atingida em duas semanas e podem
produzir cerca de 200 náuplios a cada cinco dias. O ciclo de vida da Artemia se
fecha em 21 dias. A Artemia salina tem sido empregada para muitos testes de
toxicidade nos últimos anos, sendo usada na avaliação de uma grande variedade de
compostos (ABRAHÃO; SILVA, 2002).
A letalidade de organismos simples tem sido utilizada para um rápido e
relativamente simples monitoramento da resposta biológica, onde existe apenas um
parâmetro envolvido: morte ou vida (BAE; FREEMAN, 2007).
Os resultados de toxicidade a partir dos bioindicadores são suficientes para
indicar potenciais danos ao ecossistema receptor, enfatizando cada vez mais, a
necessidade do tratamento dos efluentes associado aos estudos toxicológicos dos
compostos gerados (BAE; FREEMAN, 2007).
55
2- OBJETIVO GERAL
Este trabalho tem como principal objetivo estudar o descoramento de
corantes têxteis, mediados pela enzima HRP.
2.1- Objetivos Específicos
1. Seleção de corantes têxteis descorados pela HRP;
2. Otimização das reações de descoramento dos corantes têxteis DMBLR, DMBBLN,
DMR e RBBR quanto à concentração do corante, temperatura, concentração de
peróxido de hidrogênio e tempo de reação;
3. Avaliação dos níveis de descoramento;
4. Avaliação toxicológica utilizando Daphnia pulex e Artemia salina como
indicadores.
56
3- METODOLOGIA
3.1 - Preparo das soluções dos corantes e da enzima HRP
Os corantes têxteis foram cedidos pela empresa Maria Cândida, localizada
em Paracambi no estado do Rio de Janeiro. Foram preparadas soluções na
concentração de 2160 ppm para os dezoito corantes têxteis: Vermelho Drimaren X –
6BN (C. I. Reactive Red 243); Vermelho Drimaren CL – 5B (C. I. Reactive Red 195);
Vermelho Remazol R.G.B GRAN; Preto Remazol B – 133% (C.I. Reactive Black 5);
Preto Drimaren S – BR; Azul Drimaren X – 3LR (C. I. Reactive Blue 52) ; Azul
Marinho Drimaren X – GN (C.I. Reactive Blue 214); Vermelho Drimaren A4G; Azul
Drimaren X – BLN (C. I. Reactive Blue 198); Turquesa Drimaren X –B (C. I. Reactive
Blue 41); Rubinol Drimaren X – 3LR (C. I. Reactive Red 55); Preto Drimaren CL – S;
Azul Drimaren CL – R (C.I. Reactive Blue 19); Vermelho Drimaren CL – 5B CONC.;
Amarelo Remazol RNL (C. I. Reactive Orange 107); Amarelo Drimaren X – 4RN;
Amarelo Drimaren X – 8GN; Amarelo Drimaren CL – 2R. Os corantes foram
solubilizados em água destilada à temperatura ambiente (25ºC). Estas soluções
foram mantidas sob refrigeração à aproximadamente 4ºC.
Preparou-se uma solução de HRP na concentração de 70 µg/mL, a partir da
enzima cedida pela empresa Toyobo do Brasil LTDA. É importante ressaltar que
durante todo o estudo, esta solução foi mantida sob refrigeração.
3.2 - Determinação da atividade enzimática
A atividade enzimática foi determinada através da reação de oxidação do 2,4–
diclorofenol (2,4-DCP) na presença de 4–aminoantipirina (4-AAP) que resulta na
formação do composto corado antipirilquinonimina. As reações foram realizadas em
condições de velocidade inicial e acompanhadas a 510 nm por 90 segundos. A
concentração do produto antipirilquinonimina foi calculada através do seu coeficiente
de extinção molar a 510 nm
E
= 18.500 M
-1
cm
-1
. Uma unidade de atividade
enzimática corresponde à formação de 1µmol/min do produto. A concentração da
57
enzima foi expressa em U/mL. A composição do meio reacional está descrita na
tabela 7.
Tabela 7: Composição do meio reacional utilizado na determinação da atividade
enzimática.
Reagente
Concentração
Volume (µL)
2,4- DCP
15 mM
400
4-AAP
1,6 mM
200
Tampão fosfato de sódio (pH 7,0)
0,1 M
800
HRP
1 µg/mL
400
H
2
O
2
10 mM
200
2,4 –DCP: 2,4 – Diclorofenol; 4-AAP: 4- Aminoantipirina; HRP: Horseradish peroxidase
3.3 - Determinação do comprimento de onda máximo dos corantes
A determinação do comprimento de onda máximo de cada corante foi
realizada na concentração de 30 mg L
-1
.
Os espectros de absorção molecular UV-Vis foram obtidos em
Espectrofotômetro HACH DR/4000. Foram realizadas varreduras de 300 a 700 nm a
fim de se obter o comprimento de onda máximo de cada molécula, visando o
acompanhamento das reações de degradação dos corantes.
58
3.4 - Oxidação enzimática dos corantes mediadas pela HRP
Para a seleção dos corantes com melhor porcentagem de descoramento, foi
realizado um ensaio utilizando os dezoito corantes têxteis cedidos: Vermelho
Drimaren X – 6BN; Vermelho Drimaren CL – 5B; Vermelho Remazol R.G.B GRAN;
Preto Remazol B – 133%; Preto Drimaren S – BR; Azul Drimaren X – 3LR ; Azul
Marinho Drimaren X – GN; Vermelho Drimaren A4G; Azul Drimaren X – BLN;
Turquesa Drimaren X –B; Rubinol X – 3LR; Preto Drimaren CL – S; Azul Drimaren
CL – R; Vermelho Drimaren CL – 5B CONC.; Amarelo Remazol RNL; Amarelo
Drimaren X – 4RN; Amarelo Drimaren X – 8GN; Amarelo Drimaren CL – 2R. O
percentual de descoramento foi calculado de acordo com a equação:
O ∆ABS (Abs
inicial
– Abs
final
) expressa a redução da coloração de cada
corante. Sendo assim, quanto maior o ∆Abs, maior a descoloração do corante pela
enzima HRP no meio reacional adotado.
As condições do meio reacional inicial estão descritas na tabela 8.
Tabela 8: Composição do meio reacional inicial.
Reagentes Concentração Volume (µL)
Corante
270 mg L
-1
200
HRP
70 µg/mL
200
H
2
O
2
10 mM
200
Tampão fosfato de sódio
(pH=6,0)
0,2 M
1200
Abs
inicial
–
Abs
final * 100
Abs
inicial
59
É importante ressaltar que para todos os dezoito corantes estudados, foi
realizado também um ensaio controle. Nos ensaios controle foram empregados
todos os reagentes anteriormente mencionados (tabela 8), com exceção para o H
2
O
2
que foi substituído por água destilada.
Todos os ensaios foram realizados em triplicata, em tubo de ensaio à
temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC), no período de 30 minutos com
agitação manual de 10 em 10 minutos.
Após seleção dos corantes que apresentaram melhor porcentagem de
descoramento nas condições do ensaio preliminar (tabela 8), parâmetros como:
concentração do corante, temperatura, concentração de peróxido de hidrogênio e
tempo de reação foram estudados separadamente. Os estudos desses parâmetros
foram realizados em triplicata nas seguintes condições: concentração do corante (30
– 480 mg L
-1
); HRP (3,5 U mL
-1
); tampão fosfato de sódio pH=6,0 (0,083 M);
concentração de peróxido de hidrogênio (0 – 4,44 mM); temperatura (20 – 45ºC) e
tempo de reação (5 min., 1 e 24 h).
3.5 - Descoramento da mistura dos corantes selecionados
Uma solução 120 mg L
-1
foi preparada a partir da mistura dos corantes
selecionados. A eficiência do descoramento da mistura de corantes foi avaliada em
condições otimizadas.
60
3.6 - Ensaios toxicológicos
3.6.1 - Teste de toxicidade aguda com Daphnia pulex
As Daphnias spp. são microcrustáceos planctônicos que atuam como
consumidores primários na cadeia alimentar aquática, e se alimentam através de
filtração da matéria orgânica suspensa. Dentre os microcrustáceos as Daphnias são
conhecidas como pulgas d’água (TORRALBA, 2008).
Neste estudo foi utilizada para o desenvolvimento das Daphnias a água
Minalba® e para alimentá-las a alga Scenedesmus subspicatus. As culturas foram
mantidas em temperatura controlada a 24ºC ±2 por 24h. O cultivo destes
organismos é dependente da água e do alimento utilizado (TORRALBA, 2008).
Os ensaios de toxicidade aguda com Daphnia pulex foram realizados
seguindo as normas NBR 12713 (ABNT, 2004). Foram utilizados 20 neonatos com
24 horas de nascimento, divididos em duas réplicas de 10 indivíduos por
concentração-teste. O tempo de exposição foi de 24 horas sob temperatura
constante de 24ºC ao abrigo de luz. O método utilizado foi o estático, ou seja, não
houve troca do meio de exposição durante as 24 horas de teste.
Ao final da exposição foram medidos o pH, o oxigênio dissolvido (O.D.) e
estimado o fator de toxicidade. O fator de toxicidade corresponde à menor diluição
da amostra em que não ocorre imobilidade ou mortalidade em mais de 10% dos
organismos.
Os ensaios foram realizados em triplicata, e os resultados foram expressos
com o percentual de mortalidade dos organismos após 24h de exposição
.
Este teste foi realizado pelo Laboratório de Avaliação e Promoção da Saúde
Ambiental (LAPSA) do departamento de Biologia/ FIOCRUZ.
61
3.6.2 - Teste de toxicidade aguda com Artemia salina
A presença de constituintes citotóxicos nos meios reacionais estudados foi
avaliada utilizando a metodologia proposta por MEYER et al., (1982) e modificada
por NETO (2003). Larvas de Artemia salina (náuplios), obtidas a partir de ovos
utilizados como ração para peixes ornamentais, foram colocadas para eclodir em um
becher contendo água do mar artificial, mantida em aeração durante 48 horas.
Os meios reacionais antes e após tratamento foram testados nas
concentrações de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100% (V/V). Amostras da
solução da enzima HRP e da solução tampão fosfato de sódio 0,2 M e 0,002 M,
também foram testadas nestas concentrações. Os testes foram realizados em tubos
de ensaio contendo 10 náuplios, preenchidos com um volume total de 2 mL de
amostra.
Após 24 horas foram contados os indivíduos mortos nas diferentes
concentrações. Timol e a água do mar artificial foram usados como controle positivo
e negativo, respectivamente. Os testes foram realizados em triplicata.
Na figura 2 temos uma representação esquemática das etapas desenvolvidas
no procedimento experimental deste trabalho.
62
Figura 2: Representação esquemática das etapas desenvolvidas no procedimento
experimental.
18 Corantes
λmáx
(II) Ensaio preliminar de descoramento dos dezoito corantes
+
Abs
inicial –
Abs final * 100
Abs inicial
(III) Otimização das condições reacionais
+
18 Corantes
Corantes selecionados
HRP
HRP
[c
orante]
, temperatura, [H
2
O
2
] e
tempo de reação
Condições otimizadas de reação
Avaliação
toxicológica
(I) Determinação do λmáx. dos dezoito corantes inicialmente avaliados
Corantes
selecionados
63
4- RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 – Determinação do comprimento de onda máximo dos corantes
Para o acompanhamento das reações, foram determinados os comprimentos
de onda máximo dos dezoito corantes cedidos. Os valores dos comprimentos de
onda estão apresentados na tabela 9.
Tabela 9: Comprimento de onda dos corantes têxteis.
Nome do corante
λ
máx
.(nm)
Vermelho Drimaren X – 6BN 544 / 518
Vermelho Drimaren CL - 5B 542 / 520
Vermelho Remazol R.G.B GRAN 518
Preto Remazol B – 133% 602
Preto Drimaren S – BR 602
Azul Drimaren X – 3LR 616
Azul marinho Drimaren X - GN 608
Vermelho Drimaren A4G 534 / 514
Azul Drimaren X - BLN 626
Turquesa Drimaren X - B 666 / 620
Rubinol Drimaren X - 3LR 530
Preto Drimaren CL - S 602
Azul Drimaren CL - R 602
Vermelho Drimaren CL - 5B conc. 542 / 518
Amarelo Remazol RNL 410
Amarelo Drimaren X - 4RN 412
Amarelo Drimaren X - 8GN 420
Amarelo Drimaren CL - 2R 414
64
4.2- Determinação da atividade enzimática
A atividade enzimática foi determinada previamente aos ensaios de
descoramento. Nos meios reacionais utilizados, a atividade enzimática da HRP foi
mantida em torno de 3,5 U mL
-1
.
4.3- Descoramento dos corantes
A tabela 10 apresenta os valores do percentual de remoção de cor dos
dezoito corantes estudados, onde os quatro corantes que apresentaram os valores
mais significativos de remoção aparecem em destaque.
Tabela 10: Percentuais de remoção de cor dos corantes têxteis.
NOME DO CORANTE λmáx.(nm) Remoção de cor (%)
1 - VERMELHO DRIMAREN X – 6BN 544 / 518 20/18
2 - VERMELHO DRIMAREN CL – 5B 542 / 520 <1/<1
3 - VERMELHO REMAZOL R.G.B GRAN 518 <1
4 - PRETO REMAZOL B – 133% 602 9
5 - PRETO DRIMAREN S – BR 602 2
6 - AZUL DRIMAREN X – 3LR 616 99
7 - AZUL MARINHO DRIMAREN X – GN 608 12
8 - VERMELHO DRIMAREN A4G 534 / 514 <1/<1
9 - AZUL DRIMAREN X – BLN 626 68
10 - TURQUESA DRIMAREN X –B 666 / 620 20/7
11 – RUBINOL DRIMAREN X – 3LR 530 53
12 - PRETO DRIMAREN CL – S 602 3
13 - AZUL DRIMAREN CL – R 602 96
14 - VERMELHO DRIMAREN CL – 5B CONC. 542 / 518 <1/<1
15 - AMARELO REMAZOL RNL 410 2
16 - AMARELO DRIMAREN X – 4RN 412 <1
17 - AMARELO DRIMAREN X – 8GN 420 <1
18 - AMARELO DRIMAREN CL – 2R 414 <1
65
A partir dos resultados apresentados na tabela 10 foi possível observar que
os corantes: Azul Drimaren X – 3LR (99%); Azul Drimaren X – BLN (68%); Rubinol
Drimaren X – 3LR (53%) e Azul Drimaren CL – R (96%), apresentaram um
descoramento mais significativo frente à HRP. Sendo assim, esses quatro corantes
foram selecionados para estudos subseqüentes.
As estruturas químicas dos corantes selecionados estão apresentadas na
figura 3.
NOME ESTRUTURA QUÍMICA
Azul Drimaren X – 3LR
Reactive Blue 52
(DMBLR)
O
S
O
N
N
O
S
N
N
N
N
Cl
N
Cu
O
H
H
O
O
O
H
H
H
O
Azul Drimaren X – BLN
Reactive Blue 198
(DMBBLN)
N
N
N
Cl
NH
SO
3
Na
SO
3
Na
NHC
2
H
4
NH
N
O
SO
3
Na
O
N
Cl
Cl
SO
3
Na
NHC
2
H
4
NH
N
N
N
Cl
NH
NaO
3
S
SO
3
Na
Rubinol Drimaren X -3LR
Reactive Red 55
(DMR)
N N
X
X
Cl
N
H
Dye
X=Cl, or F
Azul Drimaren CL – R
Reactive Blue 19
(RBBR)
O
O
N
H H
N
H
S
O
O
O
Na
S
O
O
H
H H
H
O S
O
O
O
Na
Figura 3: Estruturas químicas dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR (OZSOY;
UNYAYAR; MAZMANCI, 2005; HIHARA; OKADA; MORITA, 2000).
66
4.4- Parâmetros avaliados no descoramento dos corantes
4.4.1- Concentração dos corantes
Visando avaliar a influência da concentração de corante no percentual de
descoramento, foram realizados ensaios em cinco diferentes concentrações. As
concentrações estudadas para cada corante foram de 30, 60, 120, 240 e 480 mg L
-1
.
O meio reacional descrito na tabela 9 foi usado como modelo, sendo mantida a
proporcionalidade entre os reagentes. Os resultados dessa comparação podem ser
observados na figura 4.
0
20
40
60
80
100
30 60 120 240 480
Concentração do corante (mg L
-1
)
% Descoramento
DMBLR
DMBBLN
DMR
RBBR
Figura 4 – Influência da concentração do corante nas reações de descoramento.
Em todos os meios reacionais a atividade enzimática foi mantida próximo de
3,5 U mL
-1
. As reações foram realizadas em 1 hora e em todos os casos manteve-
se a proporcionalidade entre a concentração de corante e peróxido de hidrogênio,
mantendo as relações a seguir:
30 mg L
-1
de corante e 1,1 mM de H
2
O
2
; 60 mg L
-1
de corante e 2,2 mM de H
2
O
2
;
120 mg L
-1
de corante e 4,4 mM de H
2
O
2
; 240 mg L
-1
de corante e 8,8 mM de H
2
O
2
.e
480 mg L
-1
de corante e 15,5 mM de H
2
O
2
.
67
A partir dos resultados apresentados na figura 4, é possível observar que os
corantes DMBLR e RBBR apresentaram uma elevada porcentagem de
descoramento em todas as concentrações estudadas, sendo que o corante DMBLR
foi o corante que apresentou as maiores porcentagens de descoramento. Ambos os
corantes mantiveram seu percentual de descoramento durante o estudo.
O corante DMBBLN apresentou uma pequena redução na porcentagem de
descoramento, com o aumento da concentração de 30 para 480 mg L
-1
. Já o
corante DMR apresentou a maior variação e redução da porcentagem de
descoramento com o aumento da concentração.
A significativa redução na porcentagem de descoramento do corante DMR
pode estar diretamente relacionada com as suas características estruturais e com as
elevadas concentrações de peróxido de hidrogênio adicionadas ao meio reacional,
devido o aumento da concentração do corante. Por esse motivo foi realizado um
estudo sobre a influência da concentração de peróxido de hidrogênio no
descoramento dos corantes estudados. Esses resultados estão apresentados no
item 4.4.3.
No estudo realizado por Ünyayar et al., (2005) foram avaliados os efeitos da
concentração do corante DMBLR na eficiência do percentual de descoramento após
tratamento enzimático, sendo alcançado 78% de descoramento do corante na
concentração de 60 mg L
-1
.
Özsoy, Ünyayar e Mazmanci (2005) também estudaram os efeitos da
concentração dos corantes DMBLR e RBBR no percentual de descoramento após
tratamento enzimático, observando 92 e 90% de descoramento, respectivamente
para ambos na concentração de 100 mg L
-1
.
No presente trabalho os efeitos da concentração dos corantes DMBLR e
RBBR na eficiência do percentual de descoramento após tratamento com a enzima
HRP, também foram avaliados, sendo observada uma maior eficiência no percentual
de descoramento para ambos os corantes, 99 e 97%, respectivamente, em uma
concentração mais elevada (120 mg L
-1
).
68
4.4.2- Temperatura
Visando avaliar a influência da temperatura no percentual de descoramento
dos corantes têxteis, foram realizados ensaios em cinco temperaturas diferentes (20,
25, 35, 40 e 45ºC). A faixa de temperatura foi escolhida, visando contemplar
temperaturas próximas e/ou semelhantes às de outros estudos na literatura
(ÜNYAYAR et al., 2005; FERREIRA-LEITÃO et al., 2007; LIU et al., 2006; MASUDA;
SAKURAI; SAKAKIBARA, 2001; SAKUYAMA, 2003; HONG-MEI; NICELL, 2008).
Os resultados da influência da temperatura no descoramento dos corantes
têxteis estudados estão apresentados na figura 5.
0
20
40
60
80
100
120
20 25 35 40 45
Temperatura (ºC)
% Descoramento
DMBLR
DMBBLN
DMR
RBBR
Figura 5: Influência da temperatura no descoramento dos corantes têxteis.
Condições reacionais: Atividade enzimática = 3,5 U mL
-1
, concentração dos corantes
= 120 mg L
-1
, concentração de H
2
O
2
= 0,55 mM com o tempo de reação de 1 hora.
Os corantes DMBLR e RBBR não apresentaram uma variação significativa no
percentual de descoramento, ou seja, a porcentagem de descoramento não foi
comprometida com o aumento da temperatura de 20 para 45ºC. Já o corante
DMBBLN é diretamente influenciado pela variação de temperatura. Nos ensaios
com as temperaturas testadas superiores e inferiores a 35ºC, a porcentagem de
remoção do corante DMBBLN foi reduzida em 15% (45ºC) e 30% (20ºC).
69
A porcentagem de descoramento do corante DMR também foi influenciada
pela variação de temperatura, podendo se observar que nas temperaturas
superiores à 35ºC, a remoção do corante foi afetada em até 10% (45ºC).
Ünyayar et al., (2005) estudaram o descoramento do corante DMBLR pela
enzima lacase, obtida do fungo Funalia trogii, e como no presente trabalho, também
observaram que o aumento da temperatura não prejudicou a atividade enzimática,
sendo a porcentagem de descoramento do corante mantida.
Um estudo do descoramento do corante Azul de metileno pela enzima lignina
peroxidase, também demonstrou comportamento semelhante na variação da
temperatura de 30 a 60ºC, onde não foi observada variação no percentual de
descoramento do corante na temperatura de 30ºC como também em temperaturas
mais altas, como por exemplo, 37, 45 e 60ºC (FERREIRA-LEITÃO et al., 2007).
O estudo do efeito da temperatura no descoramento dos corantes bromofenol
e metilorange pela enzima HRP, foi observado num intervalo de 30 a 80ºC, sendo
mantidas as mesmas condições reacionais. A redução da eficiência do
descoramento foi de 50% a partir de 40ºC para o corante Metilorange e de 40% a
partir de 50ºC para o corante Bromofenol blue (LIU et al., 2006).
Masuda, Sakurai e Sakakibara (2001) estudaram o efeito da temperatura de 0
a 70ºC na remoção de fenol pela peroxidase de Coprinus cinereus (CIP), sendo
observado melhor eficiência na remoção do fenol em temperaturas inferiores a 70ºC.
Os autores relacionam o efeito da diminuição da temperatura com a baixa
concentração de radicais livres formados, diminuindo desta forma a possibilidade de
inativação da enzima e acoplamento dos radicais livres.
Em um estudo feito por Sakuyama et al., (2003) a HRP foi utilizada na
degradação oxidativa de alquilfenóis. Nesse estudo observou-se que a degradação
do Bisfenol A pela enzima HRP foi reduzida com o aumento da temperatura,
podendo ser explicada pela inativação térmica da HRP. O mesmo foi observado no
presente trabalho para os corantes DMBBLN e DMR que tiveram seu percentual de
descoramento reduzido na temperatura de 45 ºC.
Segundo Hong-Mei e Nicell (2008), apesar da susceptibilidade de muitas
enzimas a inativação em elevadas temperaturas, em seu estudo da
biotransformação do Bisfenol A pela enzima HRP, foi observado que a degradação
do Bisfenol A foi levemente aumentada com a elevação da temperatura de 20 para
40ºC. Um comportamento similar foi observado no presente trabalho, onde o
70
percentual de descoramento do corante DMBBLN foi aumentado com a elevação da
temperatura de 20 para 35ºC.
Mesmo sendo conhecido que a HRP sofre significante desativação térmica
em elevadas temperaturas, o que tenderia reduzir a velocidade de oxidação do
substrato em elevadas temperaturas. O aumento da porcentagem de
degradação/oxidação do Bisfenol A em temperaturas mais elevadas pode ser
explicado pelo fato de que alguns fenômenos que tendem em aumentar a velocidade
de reação são dominantes em relação aos efeitos da inativação térmica nas
condições as quais o experimento foi desenvolvido (HONG-MEI; NICELL, 2008).
A recalcitrância de cada corante estudado está diretamente relacionada com
a sua estrutura molecular. Essa recalcitrância interfere na atividade da enzima, o
que implica na taxa de reação, ou seja, na eficiência do descoramento dos corantes.
Desta forma, o efeito da temperatura no descoramento dos corantes
estudados neste trabalho, como também nos trabalhos anteriormente citados, pode
estar diretamente relacionado com a recalcitrância de cada corante, como também
com as condições nas quais o experimento foi desenvolvido, sendo observadas
reduções de até 30% no percentual de descoramento do corante DMBBLN e 10%
para o corante DMR no presente trabalho.
4.4.3- Concentração de H
2
O
2
Como as peroxidases são dependentes de peróxido de hidrogênio, o efeito da
concentração de peróxido de hidrogênio adicionada ao meio reacional foi avaliado
no descoramento dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR pela enzima HRP.
As concentrações estudadas foram 0; 0,11; 0,28; 0,55; 1,11; 2,22 e 4,44 mM.
A figura 6 apresenta os resultados desse estudo, e confirma a dependência
de peróxido de hidrogênio pela HRP, demonstrando também que o excesso de
peróxido de hidrogênio no meio reacional pode inibir a atividade enzimática, assim
como uma quantidade muito baixa deste reagente pode limitar a eficiência da
reação.
71
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
DMBLR DMBBLN DMR RBBR
Corantes
Cor remanescente (%)
0 mM
0,11 mM
0,28 mM
0,55 mM
1,11 mM
2,22 mM
4,44 mM
Figura 6: Influência da concentração de H
2
O
2
no descoramento dos corantes têxteis.
Condições reacionais: Atividade enzimática = 3,5 U mL
-1
, concentração dos corantes
= 120 mg L
-1
, temperatura = 35 ºC com o tempo de reação de 1 hora.
Os resultados apresentados na figura 6 mostram que o descoramento dos
corantes DMBLR e RBBR foi pouco afetado pela variação da concentração de
peróxido de hidrogênio no meio reacional, sendo a concentração de 0,11 mM a
única concentração estudada que reduziu a eficiência do descoramento desses
corantes, que nesta concentração apresentaram percentuais de cor remanescente
de 26 e 11%, ou seja, 74 e 89% de descoramento, respectivamente.
O descoramento do corante DMBBLN também foi afetado quando no meio
reacional a concentração de peróxido de hidrogênio foi de 0,11 mM, apresentando
um percentual de cor remanescente de 35% (65% de descoramento). A variação da
concentração de peróxido de hidrogênio não alterou de forma significativa o grau de
descoramento desse corante, que se manteve na faixa de 76% em todas as
concentrações de peróxido de hidrogênio superiores a 0,11 mM.
Estudando o efeito da concentração de peróxido de hidrogênio no
descoramento do corante DMR foi observada uma elevada porcentagem de
descoramento, ou seja, apenas 6% de cor remanescente quando no meio reacional
a concentração de peróxido de hidrogênio foi de 0,55 e 1,11 mM. Com a redução e
o aumento da concentração de peróxido de hidrogênio foi observado diminuição do
grau de descoramento do corante, atingindo percentuais de cor remanescente de 11
72
e 46% nas concentrações de 2,22 e 4,44 mM de peróxido de hidrogênio
,
respectivamente
.
A concentração de 0,55 mM de peróxido de hidrogênio foi a mais apropriada
para a atuação da HRP, apresentando elevados percentuais de descoramento para
os quatro corantes estudados, sendo essa concentração adotada nos ensaios
subseqüentes na otimização dos próximos parâmetros avaliados neste trabalho.
Ferreira-Leitão et al., (2003) observou uma inativação da enzima HRP, devido
ao excesso de peróxido de hidrogênio
no meio reacional, na oxidação do corante
Azul de metileno pela enzima HRP. O mesmo comportamento foi observado no
presente trabalho, principalmente no descoramento do corante DMR pela enzima.
Em ambos os trabalhos foi observado que uma maior porcentagem de oxidação do
substrato (corante) ocorreu com o aumento da concentração de peróxido de
hidrogênio, mas até uma concentração limite, onde o aumento começa a ser
limitante na oxidação do corante estudado, formando possivelmente um
intermediário inativo no ciclo catalítico, impedindo a oxidação do substrato.
Mohan et al., (2005) em seu estudo da degradação do corante Preto Ácido 10
BX pela enzima HRP, relacionou a porcentagem de corante removido, a atividade da
enzima e a concentração de peróxido de hidrogênio adicionada. Neste estudo foi
possível concluir que a porcentagem de remoção do corante e a atividade da enzima
são influenciadas pela variação da concentração de peróxido de hidrogênio no meio
reacional, onde uma concentração ótima de peróxido de hidrogênio é alcançada e
um leve aumento dessa concentração, pode reduzir significativamente a atividade da
enzima e conseqüentemente, a porcentagem de corante removido.
Ferreira-Leitão et al., (2007) observou a inativação da enzima lignina
peroxidase e conseqüente redução na porcentagem de cor removida do corante
Azul de metileno, devido ao excesso da concentração de peróxido de hidrogênio no
meio reacional. Nesse trabalho, os autores chamam atenção para a forma de
adição do peróxido de hidrogênio no meio, ou seja, adições simples ou em pulso
(gradativa) da mesma concentração de peróxido de hidrogênio. Confirmando, como
já observado em outros estudos, que a adições gradativas do peróxido de hidrogênio
no meio reacional possibilitam a adição de maiores concentrações de peróxido de
hidrogênio, sem afetar a atividade enzimática.
No presente trabalho, a relação molar corante: peróxido de hidrogênio que
apresentou os melhores resultados de descoramento foram DMBLR:H
2
O
2
1:3,
73
DMBBLN:H
2
O
2
1:7 e RBBR:H
2
O
2
1:3 (RBBR). Para o corante DMR não foi possível
calcular a relação molar, devido à indefinição de sua estrutura molecular.
A adição gradativa de peróxido de hidrogênio
é bastante utilizada quando
altas concentrações de peróxido de hidrogênio
são exigidas para a degradação de
maiores concentrações do substrato ou quando uma maior razão estequiométrica
substrato:peróxido de hidrogênio é necessária para degradar o substrato
(FERREIRA-LEITÃO et al., 2007).
Souza et al., (2007) também observou inibição da atividade da enzima em
concentrações de peróxido de hidrogênio
acima de 2x10
-3
mmol L
-1
, na descoloração
do corante têxtil Azul Turquesa Remazol G 133% pela enzima HRP nas condições
estudadas.
Hoshino et al., (2002) em seu estudo sobre a estabilidade térmica e a
tolerância ao peróxido de hidrogênio pela enzima manganês peroxidase (MnP) de
Lenzites betulinus, também observou perda significativa de atividade da enzima com
o aumento da concentração de peróxido de hidrogênio no meio reacional.
A influência da concentração de peróxido de hidrogênio na atividade da HRP
também pode ser observada para outros substratos. Hong-Mei e Nicell (2007) no
estudo da biotransformação do Bisfenol A pela HRP observaram que o excesso de
peróxido de hidrogênio inibiu profundamente a atividade da HRP, prejudicando a
biotransformação do Bifenol A.
A susceptibilidade da enzima HRP à inativação pelo excesso de peróxido de
hidrogênio pode estar relacionada com a produção de formas cataliticamente
inativas chamadas verdohaemoprotein (P-670) e compostos III (figura 7). A
inativação pode ser também causada devido à interação de enzimas com radicais
livres produzidos durante a reação catalítica e produtos poliméricos oriundos da
junção subseqüente desses radicais livres (HONG-MEI; NICELL, 2008).
A figura 7 apresenta o ciclo catalítico da HRP demonstrando o efeito do
peróxido de hidrogênio na ativação e inativação desta enzima.
74
Figura 7 - Ciclo catalítico das hemeperoxidases (ODIER; ARTAUD, 1992; OLLIKKA
et al., 1998).
4.4.4- Tempo de reação
Após otimização dos parâmetros concentração do corante, temperatura e
concentração de peróxido de hidrogênio, o efeito do tempo de reação no
descoramento dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR foi estudado.
Nos ensaios de descoramento foi visualmente observada uma perda imediata
de cor dos corantes DMBLR e RBBR. Já nos ensaios com os corantes DMBBLN e
DMR a perda de cor não ocorreu imediatamente.
Visando avaliar a influência do tempo de reação no percentual de
descoramento dos corantes têxteis, foram realizados ensaios em três diferentes
tempos de reação (5 minutos, 1 e 24 horas). Os resultados dessa comparação
podem ser observados na figura 8.
ENZIMA NATIVA
H
2
O
2
H
2
O
COMPOSTO I
Fe IV
O
[P
+
]
AH
A
.
Fe III
AH
A
.
COMPOSTO II
Fe IV
O
excesso
H
2
O
2
COMPOSTO III
COMPOSTO III
*
ENZIMA
-
H
2
O
2
COMPLEXO
INATIVAÇÃO IRREVERSÍVEL
AH/A
.
75
0
20
40
60
80
100
DMBLR DMBBLN DMR RBBR
Corantes
% Cor remanescente
T inicial
5 minutos
1 hora
24 horas
Figura 8: Influência do tempo de reação no descoramento dos corantes têxteis.
Condições reacionais: Atividade enzimática = 3,5 U mL
-1
, concentração dos corantes
= 120 mg L
-1
, temperatura = 35 ºC e concentração de H
2
O
2
= 0,55 mM.
A partir dos resultados apresentados na figura 8, observou-se que no intervalo
de 5 minutos o descoramento dos corantes DMBLR e RBBR foi bastante eficiente,
alcançando o percentual de 96% para ambos, mas o intervalo de 5 minutos não foi
suficiente para os corantes DMBBLN e DMR que apresentaram respectivamente, 63
e 65% de descoramento.
Em 1 hora de reação, o percentual de descoramento dos corantes estudados
foi mais efetivo. Os corantes DMBLR e RBBR mantiveram seu elevado percentual
de descoramento, 99 e 97% respectivamente. E os corantes DMBBLN e DMR
apresentaram um aumento significativo no percentual de descoramento, alcançando
77 e 94%, respectivamente.
A necessidade de um tempo de reação ainda maior foi observada para o
corante DMBBLN que apresentou um aumento de aproximadamente 10% no
percentual de descoramento, após 24 horas de reação. Os corantes DMBLR, DMR
e RBBR não apresentaram melhora significativa no descoramento com o aumento
do tempo de reação, mantendo os percentuais de descoramento na faixa de 99, 93 e
96% respectivamente.
A necessidade de um intervalo de tempo maior para que o corante DMBBLN
alcance uma porcentagem de descoramento significativa, pode estar associada as
76
suas características estruturais. Segundo HIHARA et al., 2000, o corante DMBBLN
é um corante reativo trifenodioxazina (TPDO). Esses corantes apresentam elevada
substantividade (não perdem cor facilmente e possui elevada fixação) e alta
estabilidade.
Claus et al., (2002) em seu estudo sobre descoloração de corantes sintéticos
por enzimas, também discute a resistência a descoloração de alguns corantes, e
atribui essa resistência às suas estruturas moleculares e não à concentração da
enzima, já que essa determina a velocidade da reação, mas não o nível de
descoramento do corante.
Özsoy et al., (2005) estudou o tempo de descoramento ideal para os corantes
DMBLR e Remazol Brilhant Blue R (RBBR), ou seja, os mesmos corantes estudados
no presente trabalho. Através do sistema enzimático do fungo Funalia trogii, os
autores alcançaram uma porcentagem de descoramento de 92 e 90%, em 8 e 10
horas, respectivamente para os corantes DMBLR e RBBR, estando ambos na
concentração de 100 mg L
-1
.
No presente trabalho os mesmos corantes estudados por Özsoy et al., (2005)
(DMBLR e RBBR) foram estudados em uma concentração maior (120 mg L
-1
) sendo
alcançada uma porcentagem de descoramento mais elevada, 99 e 97%,
respectivamente em apenas uma hora de reação.
A capacidade de biodegradação de corantes sintéticos, como por exemplo, o
corante RBBR, pelo fungo Irpex lacteus, foi avaliada por Novotny et al., (2004). Os
níveis de descoramento alcançados variaram de 60 a 100%, após duas semanas de
tratamento. No presente trabalho o descoramento do corante RBBR também foi
estudado, sendo alcançados 97% de descoramento em 1 hora de reação e 96% em
apenas 5 minutos.
O tempo necessário para o descoramento do corante RBBR também foi
estudado por Baldrian e Snajdr (2006). Neste trabalho foi estudado o descoramento
de corantes sintéticos por enzimas ligninolíticas presentes em fungos
basiodiomicetos de baixa decomposição. Nesse estudo o corante RBBR apresentou
grau de descoramento de 80 a 98% em um período de 28 dias de incubação.
O corante RBBR tem sido amplamente utilizado como um composto modelo
nos estudos de degradação, e também como matéria-prima na produção de
corantes poliméricos (MACHADO; MATHEUS, 2006). O RBBR, um derivado
77
antraquinona, representa uma importante classe de organopoluentes
freqüentemente tóxicos e recalcitrantes (PALMIERI et al., 2005).
Na tabela 11 é apresentada a comparação de alguns estudos de
biodegradação do corante RBBR, mostrando as condições reacionais de cada
estudo, com destaque à elevada porcentagem de descoramento e condições
reacionais favoráveis, alcançadas no presente trabalho.
Tabela 11: Comparação dos tratamentos enzimáticos utilizados no descoramento do
corante RBBR.
Tratamentos
enzimáticos
RBBR
(mg L
-1
)
T
(ºC)
Tempo
reacional
(min.)
Descoramento
(%)
Referência
MnP e lacase
150
28
8640
100
(NOVOTNÝ et
al, 2004)
Lacase
lacase + HBT
50
60
1200
120
90
92
(MURUGESAN
et al, 2007)
Enzimas
ligninolíticas
100
25
40320
80-98
(BALDRIAN;
SNAJDR, 2006)
Complexo
enzimático
(Funalia trogii)
100
30
600
90
(ÖZSOY;
ÜNYAYAR;
MAZMANCI,
2005)
Peroxidase
(HRP)
120
35
60
5
97
96
Neste trabalho
78
Liu, Wang e Ji (2006) em seu estudo de descoloração de corantes pela
enzima HRP, observou que 5 minutos foram suficientes para degradar os corantes
Azul de bromofenol e Metilorange, que apresentaram 98% e 75% de descoramento,
respectivamente.
Souza et al., (2007), também observou que 5 minutos de reação com a
enzima HRP foi suficiente para alcançar 94% de descoramento para o corante
Lanaset Blue 2R e 59% para o corante Turquoise Blue G 133% em 45 minutos de
reação.
A relação entre a biodegradabilidade e a estrutura molecular dos corantes
depende do tipo, quantidade, posição dos grupos substituintes no anel aromático, e
o peso molecular dos corantes. No caso dos corantes azo sulfonados, a posição e o
número de grupos SO
3
H, entre outros, afeta a velocidade de degradação da
molécula do corante (SHAFFIQU et al., 2002).
4.5- Espectros de absorção molecular dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR antes e após as reações catalisadas pela HRP
Com o objetivo de acompanhar a remoção dos corantes reativos estudados
foram obtidos espectros de absorção molecular no visível, considerando os picos de
absorbância na faixa de 400 a 700 nm.
Os espectros de absorção molecular dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR, antes e após o tratamento enzimático estão apresentados na figura 9.
79
Figura 9: Espectros de absorção molecular no visível dos corantes: DMBLR, DMBBLN,
DMR e RBBR, antes e após tratamento enzimático. Condições reacionais: Atividade
enzimática = 3,5 U mL
-1
, concentração dos corantes = 120 mg L
-1
, temperatura = 35 ºC,
concentração de peróxido de hidrogênio = 0,55 mM e tempo de reação = 1 hora.
A figura 9 apresenta o eficiente resultado na remoção dos corantes DMBLR,
DMBBLN, DMR e RBBR, após o tratamento com a HRP, sendo observada
significativa redução na absorção dos corantes.
A elevada eficiência do descoramento dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR
e RBBR também pode ser observada na ilustração da figura 10.
DMBLR
0
0,5
1
1,5
2
2,5
400 500 600 700
Comprimento de onda (nm)
ABS
DMBBLN
0
0,5
1
1,5
2
2,5
400 500 600 700
Comprimento de onda (nm)
ABS
DMR
0
0,5
1
1,5
2
2,5
400 500 600 700
Comprimento de onda (nm)
ABS
RBBR
0
0,5
1
1,5
2
2,5
400 500 600 700
Comprimento de onda (nm)
ABS
ABS antes do tratamento enzimático ABS após tratamento enzimático
80
Figura 10: Tubos de ensaio contendo os corantes: DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR, antes (1) e após (2) o tratamento enzimático. Condições reacionais:
Atividade enzimática = 3,5 U mL
-1
, concentração dos corantes = 120 mg L
-1
,
temperatura = 35 ºC, concentração de H
2
O
2
= 0,55 mM e tempo de reação = 1 hora.
A figura 10 ilustra a remoção da cor dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR após o tratamento enzimático empregado, fazendo uma comparação entre os
tubos de ensaio contendo os corantes antes e após o tratamento, corroborando os
dados quantitativos apresentados na tabela 12.
RBBR
1
DMBLR DMBBLN
DMR
1 2
2
2
2
1
1
81
Tabela 12: Condições de descoramento otimizadas para cada corante estudado.
Corantes [Corantes] T
(ºC)
[H
2
O
2
]
(mM)
Tempo
de
reação
Descoramento
(%)
[Corante]:[H
2
O
2
]
DMBLR
120 mg L
-1
35 0,55 1 hora 99 1:3
DMBBLN
120 mg L
-1
35 0,55 1 hora 77 1:7
DMR
120 mg L
-1
35 0,55 1 hora 94 Não
determinado
RBBR
120 mg L
-1
35 0,55 1 hora 97 1:3
A tabela 12 apresenta as melhores condições reacionais de descoramento
dos corantes e o percentual de descoramento alcançado para cada corante após os
estudos dos parâmetros: Temperatura, concentração do corante, concentração de
peróxido de hidrogênio e tempo de reação, avaliados neste trabalho.
4.6- Descoramento da mistura dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR
Após otimização dos parâmetros concentração do corante, temperatura,
concentração de peróxido de hidrogênio e tempo de reação; o tratamento enzimático
da solução contendo uma mistura dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR foi
realizado em 1 hora.
Os espectros de absorção da mistura dos corantes na região do visível, antes
e após o tratamento estão apresentados na figura 11, mostrando uma redução
significativa da absorção nesta região após tratamento. Já a figura 12 apresenta o
meio reacional antes e após o tratamento.
82
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
400 450 500 550 600 650 700
Comprimento de onda (nm)
ABS
ABS controle
ABS reação
Figura 11 - Espectro de absorção molecular no visível da mistura dos corantes antes
e após o tratamento enzimático. Condições reacionais: Atividade enzimática = 3,5 U
mL
-1
, concentração da mistura dos corantes = 120 mg L
-1
, temperatura = 35 ºC,
concentração de peróxido de hidrogênio = 0,55 mM e tempo de reação = 1 hora.
Figura 12 - Tubos de ensaio contendo a mistura dos corantes: DMBLR, DMBBLN,
DMR e RBBR, antes (1) e após (2) o tratamento enzimático.
DMBBLN
DMBLR
DMR
RBBR
2
1
83
O resultado apresentado na figura 12 demonstra que o descoramento dos
corantes têxteis DMBLR, DMBBLN, DMR e RBBR mediados pela HRP, não ocorre
somente de forma isolada, mas também na forma mais encontrada no meio
ambiente, ou seja, misturados.
Claus et al., (2002) em seu estudo sobre a descoloração de corantes
sintéticos por enzimas lacases presentes em fungos, também observou uma
significativa redução da absorbância da solução formada pela mistura de oito
corantes sintéticos, após tratamento enzimático. É importante ressaltar que o
corante RBBR também estava presente na mistura estudada.
O descoramento dos banhos artificiais de corantes têxteis por enzimas,
também foi estudado por Mohorcic et al., (2005) que observou a capacidade de
enzimas isoladas do fungo Bjerkandera adusta de descolorir banhos de corantes azo
e antraquinonas, incluindo o corante RBBR, satisfazendo assim, padrões ecológicos.
4.7 – Ensaios toxicológicos
4.7.1 - Teste de toxicidade aguda com Daphnia pulex
A avaliação toxicológica foi realizada utilizando Daphnia pulex e Artemia
salina como bioindicadores. Os resultados obtidos utilizando o microcrustáceo
Daphnia pulex não foram conclusivos, pois o microcrustáceo se mostrou sensível,
até mesmo a solução tampão utilizada no meio reacional. Desta forma não foi
possível avaliar se a toxicidade dos corantes aumentou ou não, após o tratamento
enzimático.
Esses resultados indicam que o microcrustáceo Daphnia pulex talvez não seja
um bioindicador adequado para avaliar a toxicidade dos corantes estudados no meio
reacional utilizado, pois o meio reacional apresentava volumes consideráveis de
solução tampão fosfato de sódio 0,2 M pH 6,0 resultando em um meio salino, o que
possivelmente foi um fator crítico, já que a Daphnia é uma espécie de água doce.
Baptista et al., (2002) utilizaram Daphnia magna, Poecilia reticulata e Vibrio
fischeri para avaliar a toxicidade de efluentes têxteis. Finkler (2002) estudou os
efeitos tóxicos de lixiviados provenientes de aterros sanitários sobre as Daphnias.
84
Frello (1998) usou o mesmo organismo para avaliar a toxicidade aguda do
agrotóxico Carbofuran, e Laitano e Matias (2006) estudaram a eficiência de um
reator anaeróbico na remoção da toxicidade de lixiviados sobre o microcrustáceo.
Lanzer et al., (2007) estudou a toxicidade do corante RBBR utilizando o
microcrustáceo Daphnia magna e observou que o corante não teve efeito na taxa de
eclosão, desenvolvimento e mortalidade dos embriões, quando expostos a
concentração de 10 e 25 mg L
-1
do corante, mas a reprodução da Daphnia magna foi
bastante prejudicada.
Bae e Freeman (2007) utilizaram o bioindicador Daphnia magna para avaliar a
toxicidade de corantes têxteis no meio aquático. Observou-se que o corante
metalizado Azul Direto 218 apresentou uma maior toxicidade que os outros 12
corantes não-metalizados estudados.
Nascimento (2008) utilizou o microcrustáceo Daphnia pulex para avaliar a
detoxificação dos corantes Azul Reativo 214, Vermelho Reativo 141 e Vermelho
Reativo 198 por fungos isolados de sedimentos do Parque Nacional da Serra da
Capivara (PI), e contrário ao que foi observado no presente trabalho, o
microcrustáceo mostrou-se um bioindicador eficiente na avaliação da detoxificação
dos corantes após o tratamento.
No estudo realizado por Torralba (2008) também foi observada a eficiência do
bioindicador Daphnia pulex que contribuiu na avaliação da detoxificação dos
corantes Azul Reativo 21, Azul Reativo 214, Vermelho Reativo 198 e da mistura
desses três corantes por fungos da coleção de microrganismos de referência do
INCQS e de fungos isolados de sedimentos de igarapés em Manaus (AM).
Embora alguns autores relatem experiências bem sucedidas utilizando o
bioindicador Daphnia pulex, neste trabalho não foi observada a eficiência do
bioindicador, devido possivelmente a característica salina do meio reacional em que
o teste foi realizado, conforme mencionado anteriormente.
85
4.7.2 - Teste de toxicidade aguda com Artemia salina
O uso do microcrustáceo Artemia salina é interessante quando se pretende
avaliar a toxicidade de efluentes que apresentam alta salinidade e, portanto, alta
condutividade, uma vez que esse parâmetro é um fator crítico para espécies de
água doce (COSTA et al., 2008).
O objetivo do teste de toxicidade utilizando o bioindicador Artemia salina foi
avaliar se o tratamento enzimático realizado no presente trabalho, além de
apresentar elevados percentuais de descoramento para os corantes DMBLR,
DMBBLN, DMR e RBBR, também permite uma redução da toxicidade dos corantes
ou não forma intermediários ainda mais tóxicos.
Os resultados do teste de toxicidade dos quatro corantes antes e após o
tratamento enzimático estão apresentados na figura 13.
Figura 13: Percentual de mortalidade de Artemia salina em função da concentração
dos corantes DMBLR, DMR, RBBR, DMBBLN e dos seus respectivos produtos após
o tratamento enzimático com HRP.
Mortalidade antes do tratamento enzimático; Mortalidade após
tratamento enzimático.
86
Os resultados apresentados na figura 13 demonstram que antes do
tratamento enzimático, os quatro corantes não apresentaram toxicidade para o
bioindicador até uma concentração de 60% do meio reacional no meio teste (v/v),
não sendo observada mortalidade do bioindicador Artemia salina. Quando a
concentração do meio reacional no meio teste é maior que 60%, o percentual de
mortalidade de Artemia começa a aumentar.
A partir da concentração de 80% do meio reacional no meio teste foi
observado um aumento significativo do percentual de mortalidade das Artemias,
indicando aumento da toxicidade para o microcrustáceo.
Após o tratamento enzimático a redução da toxicidade dos corantes DMBLR,
DMR e RBBR foram observadas através da redução do percentual de mortalidade
das Artemias. Apenas o corante DMBBLN apresentou um pequeno aumento da
toxicidade após o tratamento enzimático, quando concentrações superiores a 80%
da solução do corante tratada estavam presentes no meio.
O uso do microcrustáceo Artemia salina como bioindicador de toxicidade dos
corantes estudados foi bastante adequado, permitindo observar a relação entre o
aumento da concentração do corante em solução com o aumento da toxicidade
apresentada para este organismo.
Nos primeiros ensaios foi observada a toxicidade da solução tampão fosfato
de sódio 0,2 M (pH 6,0). Essa solução foi então 100 vezes diluída, não observando
mais a toxicidade e não havendo interferência no grau de descoramento dos
corantes.
Dellamatrice (2005) observaram inibição do crescimento de bactérias por
vários corantes, sendo que os mais hidrofóbicos foram os mais tóxicos. Os autores
relacionaram a inibição, a ligação dos corantes aos componentes também
hidrofóbicos presentes nas células das bactérias, inibindo assim, a atividade
enzimática e outras funções das bactérias. Indicando mais uma vez que os corantes
podem ser tóxicos também a população microbiana presentes nos tratamento
microbiológicos, dificultando ainda mais o tratamento destes resíduos.
Gottlieb et al., (2003) em seu estudo sobre a toxicidade de corantes azo
reativos, verificou um aumento da toxicidade quando houve a descoloração em
condições anaeróbias, utilizando a bactéria bioluminescente Vibrio fisheri como
bioindicador. O mesmo efeito não foi observado quando foi utilizado biorreator
aeróbio.
87
Palmieri, Cennamo e Sannia (2005) estudaram o tratamento enzimático do
corante RBBR com lacase, obtendo um elevado percentual de descoramento e uma
elevada redução da toxicidade após o tratamento, sendo observada pela inibição no
crescimento da bactéria B. cereus na presença do corante antes do tratamento. A
redução da toxicidade do corante alcançada foi de 95% após o tratamento
enzimático.
A toxicidade aguda do corante Turquesa Remazol 133%, Azul Lanaset 2R e
de um efluente têxtil, antes e após o tratamento enzimático com a enzima HRP, foi
avaliada por Forgiarini (2006). No seu estudo foi observado que o corante Turquesa
Remazol 133% sem tratamento apresentou baixa toxicidade (CL
50
=87,5%), mas
após o tratamento enzimático, a toxicidade foi mais elevada (CL
50
= 60,70%),
causando expressiva mortalidade dos microcrustáceos (Artemia salina). O mesmo
ocorreu com o corante Azul Lanaset 2R, que antes do tratamento apresentava CL
50
=
95, 86% e após o tratamento enzimático apresentou CL
50
= 60,71%.
Forgiarini (2006) também observou que os testes de toxicidade aguda para o
efluente têxtil apresentou resultados diferentes dos anteriores, ou seja, os
bioindicadores Artemia salina e Daphnia magna, e a inibição do crescimento da raiz
de cebola (Allium cepa), mostraram que houve uma redução da toxicidade do
efluente têxtil após o tratamento com a enzima HRP. É importante ressaltar que
cada bioindicador utilizado respondeu de forma diferente quando em contato com o
efluente estudado.
Conforme mencionado anteriormente, no presente trabalho a avaliação
toxicológica do tratamento enzimático utilizando o bioindicador Daphnia pulex não foi
conclusivo. O uso do bioindicador Artemia salina indicou que o tratamento
enzimático dos corantes DMBLR, DMR e RBBR formaram produtos de degradação
com toxicidade menor que a dos corantes antes do tratamento. Uma toxicidade um
pouco maior foi observada para o(s) produto(s) de degradação do corante DMBBLN
(figura 13).
Segundo Dellamatrice (2005) o uso de mais de um bioindicador é sugerido,
sendo preferencialmente, organismos pertencentes a diferentes níveis tróficos do
ambiente, sendo eles produtores primários, representados por algas ou plantas
superiores, consumidores secundários, tais como microcrustáceos, e consumidores
terciários, representados por peixes, visando desta forma, uma avaliação mais
88
completa do comportamento de organismos em diferentes níveis tróficos, frente ao
produto a ser analisado.
89
5- CONCLUSÃO
No presente trabalho os corantes têxteis estudados (DMBLR, DMBBLN, DMR
e RBBR) apresentaram um elevado grau de descoramento nas condições reacionais
otimizadas, 99, 77, 94 e 97%, respectivamente.
Parâmetros como temperatura, concentração de peróxido de hidrogênio e
tempo de reação influenciaram o grau de descoramento dos corantes estudados.
Os corantes DMBBLN e DMR se mostraram mais recalcitrantes para enzima do que
os demais. Esse fato deve-se às diferenças estruturais de cada corante, refletindo
diretamente na velocidade de descoramento de cada um.
A partir da avaliação toxicológica utilizando o microcrustáceo Artemia salina, a
toxicidade da solução tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 6,0) presente no meio
reacional foi identificada. Passou a se utilizar uma solução tampão 100 vezes
diluída, onde o grau de descoramento dos corantes não foi prejudicado.
A análise toxicológica utilizando o bioindicador Artemia salina indicou que
após o tratamento com a HRP, os corantes DMBLR, DMR e RBBR apresentaram
produtos de degradação menos tóxicos que os corantes originais, e um aumento de
toxicidade não significativo foi observado após o tratamento do corante DMBBLN.
A enzima HRP é produzida em território nacional pela TOYOBO do Brasil,
tornando os bioprocessos catalisados pela HRP independentes de importação,
oscilações político-econômicas e restrições de disponibilidade, reduzindo assim, o
custo da enzima no tratamento dos corantes.
Com o desenvolvimento da biotecnologia, enzimas estão sendo utilizadas em
processos onde não havia expectativa do seu uso na década passada. A aplicação
de enzimas como eficientes catalisadores trabalhando em suaves condições, resulta
em uma significante economia de fontes limitadas como energia e água,
beneficiando não só a indústria que faz o seu uso, como também o meio ambiente.
A aplicação da enzima HRP neste trabalho ressalta a eficiência dessa
peroxidase como catalisador na remoção da cor dos corantes têxteis DMBLR,
DMBBLN, DMR e RBBR. Adicionalmente verificou-se que não houve a formação de
produtos tóxicos na oxidação dos corantes.
90
6 – TRABALHOS FUTUROS
1- Estudos cinéticos do descoramento dos corantes DMBLR, DMBBLN, DMR e
RBBR pela HRP;
2- Análises dos produtos obtidos após o descoramento dos corantes, utilizando a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e confirmação dos dados por
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (CL-EM).
3- Avaliação toxicológica utilizando outros bioindicadores, sendo esses pertencentes
a diferentes níveis tróficos do ambiente, como por exemplo, algas ou plantas
superiores, outros microcrustáceos e peixes;
4- Estudos de descoramento e avaliação toxicológica de um efluente têxtil, utilizando
os parâmetros já otimizados no presente estudo.
91
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