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U
NIVERSIDADE
F
EDERAL DE
S
ÃO
C
ARLOS
C
ENTRO DE
C
IÊNCIAS
E
XATAS E DE
T
ECNOLOGIA
D
EPARTAMENTO DE
Q
UÍMICA
P
ROGRAMA DE
P
ÓS
-G
RADUAÇÃO EM
Q
UÍMICA
“D
ESENVOLVIMENTO DE
M
ÉTODOS
C
ROMATOGRÁFICOS PARA O
C
ONTROLE DE
Q
UALIDADE E PARA A
A
NÁLISE DE
R
ESÍDUOS EM
L
EITE
B
OVINO DE MEDICAMENTOS
V
ETERINÁRIOS
“
A
NGELA
C
AVALLINI
D
E
P
IETRO
*
Tese apresentada ao Programa de
Pós-
Graduação em Química como
parte dos requisitos para a obtenção
do título de D
OUTOR EM
C
IÊNCIAS
,
área de concentração: Q
UÍMICA
.
Orientadora: Profa. Dra. Quezia Bezerra Cass
Co-orientador: Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho
*Bolsista FAPESP
São Carlos – S.P.
2008
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Milhares de livros grátis para download.
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
D419dm
De Pietro, Angela Cavallini.
Desenvolvimento de métodos cromatográficos para o
controle de qualidade e para a análise de resíduos em leite
bovino de medicamentos veterinários / Angela Cavallini De
Pietro. -- São Carlos : UFSCar, 2009.
245 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,
2008.
1. Métodos cromatogáficos. 2. Controle de qualidade. 3.
Análise de resíduos. I. Título.
CDD: 543.089 (20
a
)
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.UNIVERSIDADEFEDERAL DE SÃO CARLOS
Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia
Departamento de Química
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Curso de Doutorado
Assinaturas dos membros da banca examinadora que avaliaram e
aprovaram a defesa de tese de doutorado da candidata Angela CavalUni De
Pietro realizado em 28 de março de 2008:
"-./1 ~
ezeITa Cass
avares
f--<t~
Prafa.
c~ ~(fÍ f\ ':)
Prof. Df.
.
Dedico esta tese....
... aos meus maravilhosos pais, José
Carlos e Solemar, que compartilharam
meus objetivos e sempre os alimentaram,
incentivando-me a prosseguir, independente
dos obstáculos.
... as minhas queridas irmãs, Giovana
e Angélica e a minha admirável avó,
Yolanda, pelo amor, incentivo e apoio em
todos os momentos.
... vocês que sempre souberam
compreender minha ausência durante essa
jornada, dedico esse trabalho com amor,
alegria e gratidão.
....................
Mais que o conhecimento científico, o meu curso de
doutorado me proporcionou um crescimento pessoal incrível. Convivi e
conheci muitas pessoas, algumas simplesmente iluminadas e
inesquecíveis que com certeza deixaram sua marquinha na minha vida.
Em tudo, só tenho a agradecer esses 5 anos da minha vida, foi uma fase
fundamental para o meu amadurecimento profissional e principalmente
pessoal.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Profa. Dra. Quezia Bezerra Cass pela
orientação, paciência e pela oportunidade de trabalhar em seu grupo de
pesquisa.
Ao Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho pela co-orientação, e
principalmente pela paciência durante o meu processo de aprendizagem
sobre espectrometria de massas.
A todo corpo técnico e administrativo do Departamento de
Química da Universidade Federal de São Carlos-UFSCar.
Aos todos os professores do Departamento de Química da
UFSCar, em especial aos professores, Prof. Dr. Alzir Azevedo Batista,
Prof. Dr. João Batista Fernandes e Prof. Dr. Orlando Fatibello Filho,
pelo empréstimo de materiais e equipamentos.
Ao querido Sr. Antonio P. Loureiro, onde quer que o Sr
esteja, o meu muito obrigada por todo seu carinho, infinita paciência,
ensinamentos e ajuda dentro e fora do laboratório.
Aos meus amigos e colegas adquiridos no grupo de Síntese
Orgânica e CLAE: Airton Vicente Pereira, Bianca Rebelo Lopes (Bibi),
Cecília Sumie Fuzita Watanabe, Profa. Dra. Carmen Lúcia Cardoso
(Carmensita), Fabiana Batigalhia, Fernando Campos Costa Rodrigues
de Paula (Fezinho Lindo!), Fernando Gonçalves de Almeida (Fer 24),
Flávio Luis Beltrame (Flavonóide), Juliana Barrero (Ju), Kátia
Roberta Anacleto Belaz (Rozinha), Kenia Lourenço Vanzolini, Lúcia
Regina Rocha Martins, Marcela Cristina Moraes, Maria da Paz
Nascimento Moreno (Da Paz), Maria Luiza Cruzera Montanari (Malu),
Mariana Coimbra (Má), Milena (Baiana), Mirian Cristina Couvre,
Profa Dra. Neila Maria Cassiano,
Patrícia Polachini (Pati), Profa.
Dra. Regina Vincenzi de Oliveira (Re), Ricardo Ferreira Gomes,
Thiago Campos Lourenço (Seu Jorge), Túlio Ferreira Galatti (Tutu),
Profa. Dra. Vanessa Migliorinni Urban (Van) e Virgínia Verônica de
Lima (Vir). Agradeço a todos pela amizade, apoio, incentivo, colaboração
e momentos descontraídos durante todos esses anos de convívio.
Ao Alexandre Augusto Cruz (Lele), por sua amizade,
carinho, conselhos, ensinamentos e principalmente pela infinita
disposição e paciência em nos ajudar com os equipamentos. Lê, muito
obrigada pelas horas extras no laboratório para nos socorrer.
Aos meus amigos Mariana, Roberta e Fer 24 pela imensa
disposição em me ajudar no desenvolvimento deste trabalho. Muito
obrigada também pela companhia, paciência, incentivo, amizade e
momentos descontraídos.
Aos meus queridos amigos Profa Dra. Vanessa Urban, Joel
Alvim Jr, Jalusa A. de Leo, Simone Simote, Andréa P. de Oliveira
por todos os momentos de amizade, apoio e alegria que foram muito
importantes para conseguir continuar seguindo em frente. A Tatiane e
em especial a Viviane Albarici pelo carinhoso acolhimento na minha
reta final, pelo carinho, pelo grande apoio, pela amizade, paciência e
pelos momentos de descontração.
A Profa. Dra Regina Vincenzi Oliveira pela grande amizade
e carinho sincero e principalmente pelos ensinamentos e orientação,
conquistados logo no meu estágio de iniciação científica com quem eu
tive a grande sorte e o imenso prazer de conviver e aprender
cromatografia. Re, o meu eterno agradecimento, muito obrigada pela
força!
Ao Fernando Campos Costa Rodrigues de Paula (Fe) que
com sua inteligência e enorme vontade de aprender sempre me
incentivou e ensinou muitas coisas; obrigada pela amizade, carinho,
companheirismo e principalmente paciência. Obrigada por tornar meus
momentos de dificuldades em momentos menos difíceis, obrigada por
me fazer rir..... obrigada por me mostrar o quanto sou capaz......obrigada
pelos conselhos...obrigada pelo seu amor!
A minha família simplesmente espetacular, em especial aos
meus maravilhosos pais, José Carlos De Pietro e Solemar Cavallini De
Pietro por toda dedicação, pelo imenso carinho, pelo apoio, obrigada por
acreditarem mim e principalmente obrigada pelo amor incondicional o
qual me dá forças para acreditar e enfrentar todos os obstáculos da
minha vida. As minhas irmãs Giovana e Angélica Cavallini De Pietro que
de uma forma ou de outra sempre torceram e torcem por mim. Muito
obrigada pelo amor e carinho. As minhas queridas avós Yolanda Pires
Cavallini e Lídia De Pietro pela imensa torcida, apoio, carinho, amor e
conselhos valiosos!
A FAPESP, pelo auxílio financeiro.
Enfim, a todos que, de alguma forma, colaboraram para a
realização deste trabalho, o meu muito obrigada!!
VII
L
ISTA DE
S
ÍMBOLOS E
A
BREVIATURAS
HFBA
PFPA
TFA
LC-MS
ABZ
ABZ-SO
ABZ-SO
2
ABZ-SO
2
-NH
2
BSA
HSA
ADS
r
CV%
λ
CBB
CLAE
LC-LC-MS-
MS
d.i.
HTBA
ESI
MFP
MMP
IRSP
SHP
RAM-BSA
Fenil-BSA
C
18
-BSA
C
8
-BSA
SPS
Ácido heptafluorbutírico
Ácido pentafluorpropiônico
Ácido trifluoracético
Acoplamento das técnicas de cromatografia líquida e
espectrometria de massas
Albendazol
Albendazol-2-Amino-Sulfona
Albendazol-Sulfona
Albendazol-Sulfóxido
Albumina Sérica Bovina (Bovine Serum Albumin)
Albumina Sérica Humana (Human Serum Albumin)
Alquil-Diol-Sílica (Alkyl-Diol-Silica)
Coeficiente de Correlação
Coeficiente de Variação
Comprimento de onda
Corante Coomassie Brilliant Blue
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cromatografia líquida multidimensional acoplada a
espectrometria de massas “tandem”
Diâmetro Interno
Dihidrogênio Fosfato de Tetrabutilamônio
Electrospray
Fase de Função Mista (Mixed-Function Phase)
Fase de Modo Misto (Mixed-Mode Phase)
Fase de Superfície Interna Reversa (Internal Surface Reversed-
Phase)
Fase Hidrofóbica Blindada (Shielded Hydrophobic Phase)
Fase RAM BSA-Imobilizada
Fase RAM tipo fenil-Sílica BSA-Imobilizada
Fase RAM tipo octadecil-Sílica BSA-Imobilizada
Fase RAM tipo octil-Sílica BSA-Imobilizada
Fase Semipermeável (Semi-Permeable Surface)
VIII
RAM
k
FDA
API
APCI
LD
LQ
C
18
C
8
pI
RID
UV
UV-Vis
Fases de Acesso Restrito (Restricted-Access Media)
Fator de Retenção
Food and Drug Administration
Ionização a pressão atmosférica
Ionização química a pressão atmosférica
Limite de Detecção
Limite de Quantificação
Octadecil-Sílica
Octil-Sílica
Ponto Isoelétrico
Refractive Index Detector
Ultravioleta
Ultravioleta-Visível
IX
L
ISTA DE
T
ABELAS
:
I
NTRODUÇÃO
Tabela 1.1: Classe de medicamentos veterinários/contaminantes autorizados para
tratamentos terapêuticos e substâncias não autorizadas, com efeito anabolizante,
rigorosamente controladas pela União Européia......................................................3
Tabela 1.2: Alterações na composição do leite causadas pela mastite.....................6
Tabela 1.3: Organismos que produzem aminoglicosídeos específicos....................8
Tabela 1.4: Características físicas e químicas dos antibióticos aminoglicosídeos..13
Tabela 1.5: Resultado da produção leiteira por animal, de 835 fêmeas tratadas com
anti-helmíntico e 835 fêmeas controle tratadas com placebo, durante 220 dias de
estudo....................................................................................................................23
Tabela 1.6: Leite - Produção mundial e dos principais países produtores. ...........31
Tabela 1.7: Leite - Produção destinada à industrialização - Brasil e principais
estados (milhões de litros).....................................................................................32
R
ESULTADOS E
D
ISCUSSÃO
Tabela 4.8: Propriedades físico-químicas das fases estacionárias utilizadas para a
preparação das colunas RAM................................................................................77
Tabela 4.9: Fases móveis avaliadas para a extração dos antibióticos
aminoglicosídeos da coluna RAM-BSA fenil........................................................97
Tabela 4.10: Fases móveis avaliadas utilizando as colunas RAM-BSA C
18
e fenil
para os antibióticos aminoglicosídeos e detecção por ELSD. ..............................102
Tabela 4.11: Valores otimizados do método LC-ELSD para a análise do
antibiótico estreptomicina. ..................................................................................134
Tabela 4.12: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise da
estreptomicina.....................................................................................................136
X
Tabela 4.13: Precisão e exatidão obtidas para a estreptomicina no teste cego (n=3).
............................................................................................................................137
Tabela 4.14: Exatidão, precisão e concentração experimental obtida na análise em
triplicata da estreptomicina em medicamentos veterinários de acordo com o método
desenvolvido.......................................................................................................138
Tabela 4.15: Valores otimizados do método LC-ELSD para a análise dos
antibióticos gentamicina e canamicina. ...............................................................143
Tabela 4.16: Concentrações dos componentes da gentamicina...........................144
Tabela 4.17: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise dos
componentes da gentamicina...............................................................................147
Tabela 4.18: Precisão e exatidão obtidas para a neomicina no teste cego (n=3)..148
Tabela 4.19: Limites de Quantificação para os componentes da gentamicina.....148
Tabela 4.20: Limites de Detecção para os componentes da gentamicina............149
Tabela 4.21: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise da
canamicina..........................................................................................................151
Tabela 4.22: Precisão e exatidão obtidas para a estreptomicina no teste cego (n=3).
............................................................................................................................151
Tabela 4.23: Valores de coeficiente linear e angular obtidos para os dois métodos
utilizados.............................................................................................................153
Tabela 4.24: Valores de concentração obtidos para os controles de qualidade dos
métodos...............................................................................................................154
Tabela 4.25: Exatidão, precisão e concentração experimental obtida na análise em
triplicata da gentamicina em medicamentos veterinários de acordo com o método
desenvolvido.......................................................................................................156
Tabela 4.26: Valores otimizados do método LC-ELSD para a análise do
antibiótico neomicina..........................................................................................162
Tabela 4.27: Concentrações dos epímeros da neomicina....................................164
XI
Tabela 4.28: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise das
neomicinas C e B. ...............................................................................................165
Tabela 4.29: Precisão e exatidão obtidas para a neomicina no teste cego (n=3)..166
Tabela 4.30: Limites de Quantificação para os componentes da neomicina........166
Tabela 4.31: Exatidão, precisão e concentração experimental obtida na análise em
duplicata da neomicina em medicamentos veterinários de acordo com o método
desenvolvido.......................................................................................................167
Tabela 4.32: Condições otimizadas no espectrômetro de massas (analisador tipo
ion-trap) para a análise do cefacetril....................................................................172
Tabela 4.33: Condições otimizadas no espectrômetro de massas (analisador tipo
ion-trap) para a análise do cefacetril....................................................................179
Tabela 4.34: Coeficientes de variação calculados para amostras em solventes e em
leite analisadas em triplicata................................................................................180
Tabela 4.35: Valores de “target” e “max accum. time” avaliados para a
cefalexina...............................................................................................................188
Tabela 4.36: Condições cromatográficas utilizadas, no sistema multidimensional,
para a exclusão das macromoléculas e eluição dos analitos na coluna RAM-C
8
-
BSA (5,0 x 0,46 cm d.i.) e para a análise dos metabólitos do albendazol na coluna
quiral tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose (15,0 x 0,46 cm d.i.). ..............194
Tabela 4.37: Transições selecionada para monitoramento nos experimentos de
MRM. .................................................................................................................198
Tabela 4.38: Condições de ionização otimizadas para a análise do ABZ-SO
2
-NH
2
–
0 à 10,1 minutos..................................................................................................199
Tabela 4.39: Condições de ionização otimizadas para a análise do (±)-ABZ-SO –
10,1 à 15,0 minutos.............................................................................................200
Tabela 4.40: Condições de ionização otimizadas para a análise do ABZ-SO
2
– 15,0
à 20,0 minutos.....................................................................................................201
XII
Tabela 4.41: Precisão (CV%) dos valores da curva de calibração para a análise de
ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
(n=3) em leite
bovino.....................................................................................................................206
Tabela 4.42: Transições selecionadas para monitoramento nos experimentos de
MRM. .................................................................................................................208
Tabela 4.43: Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdias, para a análise de
ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
(n=5) em leite
bovino.....................................................................................................................212
Tabela 4.44: Precisão e exatidão obtidas no teste cego de ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-
ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
em amostras de leite bovino (n=3). ...........213
Tabela 4.45: Eficiência de extração obtida para as amostras controle de qualidade
do ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
(n=5) ................214
Tabela 4.46: ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
em
amostras de leite bovino (n=3). ...........................................................................214
Tabela 4.47: Resultados do estudo de estabilidade a ciclos de degelo para o ABZ-
SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
em amostras de leite bovino
(n=3)...................................................................................................................216
Tabela 4.48: Resultados da estabilidade de longa duração das amostras de leite,
fortificadas com ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
,
armazenadas a -20ºC...........................................................................................218
XIII
L
ISTA DE
F
IGURAS
:
I
NTRODUÇÃO
Figura 1.1: Estrutura química característica dos antibióticos aminoglicosídeos......9
Figura 1.2: Estrutura química dos antibióticos aminoglicosídeos (Continua).......10
Figura 1.3 – Núcleo das cefalosporinas (A) e das penicilinas (B).........................17
Figura 1.4: Precursores das penicilinas e cefalosporinas.
41
...................................17
Figura 1.5: Estrutura química da cefalosporina C.
41
.............................................18
Figura 1.6: Estrutura química de alguns antibióticos cefalosporínicos. ................19
Figura 1.7: Sítios de ionização do núcleo cefano..................................................19
Figura 1.8: Principais anti-helmínticos utilizados na medicina veterinária.
1
........24
Figura 1.9: Ionização do núcleo imidazólico sobre condições ácidas (A) e básicas
(B).........................................................................................................................25
Figura 1.10: Metabólitos majoritários do albendazol............................................27
Figura 1.11: Classificação das fases RAM.
106
.....................................................37
Figura 1.12: Representação esquemática das fases de acesso restrito bimodal.
115
38
Figura 1.13: Representação esquemática das fases de acesso restrito unimodal.
115
..............................................................................................................................38
Figura 1.14: Mecanismo de funcionamento da técnica ESI.
132
............................43
Figura 1.15: Representação esquemática de uma interface do tipo APCI no sistema
MS........................................................................................................................45
Figura 1.16: Variação no número de publicações com o uso do ELSD.
30
............47
Figura 1.17: Princípio do detector de espalhamento de luz. Adaptado
30
..............48
Figura 4.18: Fases hidrofóbicas imobilizadas com proteína; C
18
: octadecilsílca;
NH
2
: aminopropilsílica; BSA: albumina sérica bovina..........................................75
Figura 4.19: Esquema representativo das etapas envolvidas na preparação das
colunas RAM-BSA.
106
..........................................................................................76
XIV
Figura 4.20: Reações envolvidas na estabilização da BSA imobilizada em fases
hidrofóbicas.
106
.....................................................................................................78
Figura 4.21: Uma das estruturas de ressonância do corante Coomassie Brilliant
Blue (CBBG-250).................................................................................................79
Figura 4.22: Procedimento realizado para avaliar a eficiência de exclusão das
proteínas do leite bovino pelas colunas RAM-BSA. Adaptado da referência 106..80
Figura 4.23: Espectro do corante “Coomassie Brilliant Blue”..............................81
Figura 4.24: Espectros obtidos: Azul (a) - amostra padrão; Vermelho (b) - corante-
proteína da primeira fração (2 min) de leite eluído da coluna extratora C
18
; Azul (c)
- reagente; Amarelo (d) - corante-proteína da segunda fração (4 min) de leite eluído
da coluna extratora C
18
..........................................................................................82
Figura 4.25: Porcentagem de proteínas excluídas pelas colunas RAM-BSA C
18
e
amino....................................................................................................................83
Figura 4.26: Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando as colunas
RAM-BSA Amino e C
18
. Condições Cromatográficas: Fase Móvel: H
2
O; vazão:
1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de injeção: 200 µL. ............................................84
Figura 4.27: Perfil de exclusão das macromoléculas das amostras de leite
utilizando as colunas RAM-BSA Amino e C
18
. Condições Cromatográficas: Fase
Móvel: NH
4
Ac (0,01M, pH = 6,5); vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de
injeção: 200 µL.....................................................................................................87
Figura 4.28: Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando a coluna
amino-BSA para as soluções de acetato de amônio e fosfato de potássio (0,01M,
pH=6,5). Condições cromatogáficas: vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de
injeção: 200 µL.....................................................................................................88
Figura 4.29: Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando a coluna C
18
-
BSA para as soluções de acetato de amônio e fosfato de potássio (0,01M, pH=6,5).
XV
Condições cromatogáficas: Vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de injeção:
200 µL. .................................................................................................................89
Figura 4.30 - Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando a coluna fenil
BSA para as soluções acetato e fosfato (0,01M, pH=6,5) e para água. Condições
cromatogáficas: Vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de injeção: 200 µL.......90
Figura 4.31 – Análise da amostra de neomicina (50 µg/mL) em solução aquosa
utilizando a coluna BSA-C
18
. Condições Cromatográficas: Fase Móvel: NH
4
Ac
(0,01M, pH = 6,5) / CH
3
CN (98:02); vazão: 1,0 mL/min; volume de injeção: 100
µL; Detecção: RID................................................................................................93
Figura 4.32 - Cromatograma de análise da gentamicina (100 µg/mL) utilizando a
coluna RAM-BSA C
18
. Condições cromatográficas: FM: NH
4
Ac (0,01M,
pH=6,5)/CH
3
CN (90:10); Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção: 100 µL;
Detecção: RID.......................................................................................................95
Figura 4.33 - Cromatogramas de análise dos antibióticos aminoglicosídeos (2
mg/mL) utilizando a coluna C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.). Condições
cromatográficas: FM: TFA (0,1M, pH=1,2); Vazão: 1,0 mL/min; Volume de
injeção: 50 µL, Detecção: RID..............................................................................99
Figura 4.34 - Cromatogramas de análise da gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
Hypersil (15 x 0.46 cm d.i.). Condições cromatográficas: FM: A-TFA
(48,5 mM, pH=1,5)/MEOH (99:01), B- TFA (48,5 mM, pH=1,5)/MEOH (97:03),
Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção: 50 µL, Detecção: RID. ........................100
Figura 4.35 - Cromatograma de análise da gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.). Condições cromatográficas: FM: TFA
(48,5 mM, pH=1,5)/MEOH (97:03), Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção: 50
µ
µµ
µL Condições do detector de espalhamento de luz: Vazão do gás: 1,6 L/min;
Temperatura: 70°C..............................................................................................101
XVI
Figura 4.36 – Cromatogramas de análise da Neomicina e Estreptomicina (1
mg/mL) utilizando a coluna C
18
-BSA (Hypersil 10x0,41 cm d.i). Condições
Cromatográficas: FM: TFA (0,005, 0,01, 0,05 e 0,1M), Vazão: 1,0 mL/min,
Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC,
Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off. ................105
Figura 4.37 – Cromatogramas de análise da Gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
-BSA (Hypersil 10x0,41 cm d.i). Condições Cromatográficas: FM: TFA
(0,005, 0,01, 0,05 e 0,1M), Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL.
Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC, Vazão do Gás (ar
comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off..............................................105
Figura 4.38 – Cromatogramas de análise das amostras de estreptomicina,
gentamicina e neomicina (1,0 mg/mL) utilizando a coluna C
18
-ADS (2,5 x 0,40 cm
d.i.; 25 µm, 60 Å). Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,005 e 0,1 M), Vazão:
1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do
Tubo: 103,4 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,1 L/min, Ganho: 1 e Impactor:
off. ......................................................................................................................108
Figura 4.39 – Cromatogramas de análise das amostras de neomicina, gentamicina,
estreptomicina e do sulfato de amônio (1,0 mg/mL) utilizando a coluna C
18
-ADS
(2,5 x 0,40 cm d.i.; 25 µm, 60 Å). Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,1M),
Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura
do Tubo: 103,4 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,1 L/min, Ganho: 1 e
Impactor: off.......................................................................................................110
Figura 4.40: Interações entre o soluto catiônico A
+
e a fase estacionária de sílica de
acordo com os mecanismos: (A) formação do par iônico na fase móvel e (B) troca
iônica dinâmica na fase estacionária, na presença do aditivo X
-
C
+
na fase móvel.
............................................................................................................................112
XVII
Figura 4.41: Mecanismo de retenção para a gentamicina usando ácidos fluorinados
como agente de pareamento iônico......................................................................114
Figura 4.42: Influência da concentração de TFA no fator de retenção (k) dos
antibióticos neomicina e estreptomicina..............................................................116
Figura 4.43: Influência da concentração de TFA no fator de retenção (k) do
antibiótico gentamicina. ......................................................................................117
Figura 4.44: Cromatogramas de análise da Gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições Cromatográficas: FM: TFA
(0,005, 0,01, 0,05, 0,08 e 0,1M), Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL.
Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC, Vazão do Gás (ar
comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off..............................................117
Figura 4.45 – Cromatograma de análise da Gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições Cromatográficas: FM: TFA
0,05M, Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD:
Temperatura do Tubo: 115 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1
e Impactor: off.....................................................................................................118
Figura 4.46 – Cromatogramas de análise das amostras de gentamicina, neomicina e
estreptomicina (1 mg/mL) utilizando a coluna Fenil
(Hypersil 15x0,41 cm d.i).
Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,005, 0,01 M), Vazão: 1,0 mL/min,
Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC,
Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off. ................120
Figura 4.47 – Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina utilizando as Colunas Fenil e C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i).
Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,005, 0,01 M), Vazão: 1,0 mL/min,
Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC ,
Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off. ................121
XVIII
Figura 4.48 – Influência da concentração de HFBA no fator de retenção (k) dos
antibióticos neomicina, gentamicina e estreptomicina.........................................123
Figura 4.49 – Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina, utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/HFBA (0,01, 0,05, 0,08 e 0,1M) (60:40), Vazão: 1,0
mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo:
94,3 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 2,5 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off....124
Figura 4.50 – Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina utilizando a coluna Fenil (Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/HFBA (0,01, 0,05, 0,08 e 0,1M) (60:40), Vazão: 1,0
mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo:
94,3 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 2,5 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off....125
Figura 4.51 – Influência da concentração de PFPA no fator de retenção (k) dos
antibióticos estreptomicina, gentamicina e neomicina.........................................128
Figura 4.52 – Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina, utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,46 cm d.i.). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/PFPA (0,01 e 0,1M) (1:1), Vazão: 1,0 mL/min;
Volume de injeção 15 µL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 87,5 ºC,
Vazão do gás (ar comprimido): 2,6 L/min, Ganho: 1 e Impactro: off. .................129
Figura 4.53 – Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina utilizando a coluna Fenil (Hypersil 15 x 0,46 cm d.i.). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/PFPA (0,01 e 0,1M) (1:1), Vazão: 1,0 mL/min;
Volume de injeção 15 µL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 87,5 ºC,
Vazão do gás (ar comprimido): 2,6 L/min, Ganho: 1 e Impactro: off. .................130
Figura 4.54: Estrutura química da estreptomicina. .............................................132
Figura 4.55 – Cromatogramas de análise de uma amostra de estreptomicina (500
µg/mL) utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm).
XIX
Condições cromatográficas: FM: A) TFA 0,05M e B) TFA (0,05M)/MeOH (99:01
v/v); Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção 15 µL. ..........................................133
Figura 4.56: Cromatograma típico obtido da análise da estreptomicina na
concentração de 0,35 mg/mL durante a validação do método..............................135
Figura 4.57: Curva de Calibração obtida para a estreptomicina..........................136
Figura 4.58 – Estrutura química dos componentes da gentamicina.....................139
Figura 4.59: Cromatogramas de análise da gentamicina (50 µ
µµ
µg/mL) utilizando a
coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µ
µµ
µm). Condições
cromatográficas: A: TFA (0,05M)/CH
3
CN (95:05), B: TFA (0,05M)/CH
3
CN
(96:04) e C: TFA (0,05M)/CH
3
CN (97:03). Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção
15 µL. Condições do ELSD: Temperatuta do tubo: 113,6 ºC, Vazão do Gás (ar
comprimido): 3,1 L/min, Ganho: 1 e Impactro: off..............................................142
Figura 4.60 – Curvas de calibração obtida para os componentes da gentamicina.
............................................................................................................................145
Figura 4.61: Curva de calibração obtida para a canamicina................................150
Figura 4.62: Estrutura química da neomicina.....................................................157
Figura 4.63: Cromatograma de análise da neomicina utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm). Condições cromatográficas: TFA
(0,05M). Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção 15 µL. Condições do ELSD:
Temperatuta do tubo: 107,0 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,1 L/min, Ganho:
1 e Impactro: off..................................................................................................158
Figura 4.64: Espectro de massa da amostra de neomicina..................................159
Figura 4.65: Cromatograma de análise da neomicina utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm). Condições cromatográficas: TFA
(0,05M). Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção 15 µL. Condições do MS: Modo
de análise: SIM; Analisador: Ion-trap..................................................................160
Figura 4.66: Experimento de LC-MS de íons fragmentos. .................................161
XX
Figura 4.67: Cromatograma típico obtido da análise da neomicina na concentração
de 0,35 mg/mL total, durante a validação do método. .........................................163
Figura 4.68: Curvas de Calibração obtidas para as neomicinas C e B. ...............164
Figura 4.69: Estrutura química do Cefacetril......................................................169
Figura 4.70: Cromatograma comparativo do cefacetril (50 µg/mL) utilizando a
coluna C
8
– BSA (5 x 0,46 cm d.i) (120Å, 10µm). FM: NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5) e
KH
2
PO
4
(0,01M, pH 7,5), Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 50 uL, λ = 270
nm.......................................................................................................................170
Figura 4.71: Espectro de massas do cefacetril na fase móvel NH
4
Ac (0,01M, pH
7,5)/CH
3
CN (95:05)............................................................................................171
Figura 4.72: Espectros de íons fragmentos dos íons m/z 357,2 e 362,2 na fase
móvel NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5)/CH
3
CN (95:05). Amplitude de fragmentação: A:
0,20 e B: 0,25......................................................................................................174
Figura 4.73: Proposta de fragmentação do aduto de sódio do cefacetril de acordo
com o espectro de íons fragmentos obtidos. ........................................................175
Figura 4.74: Proposta de fragmentação do aduto de amônio do cefacetril de acordo
com o espectro de íons fragmentos obtidos. ........................................................176
Figura 4.75: Cromatogramas de análise do cefacetril (500 µg/mL) utilizando a
coluna RAM-BSA C
8
(5 x 0,46 cm d.i.) (120Å, 10 µm). A: Full scan e B: MRM
das transições m/z 362 → m/z 177 e m/z 362 → m/z 258. FM: NH
4
Ac (0,01M, pH
7,5) até 7 minutos e NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5)/CH
3
CN (95:05). Condições para o
MRM: Inter Channel Delay: 0,03 secs; Span: 1 m/z; Dwell Time 0,08 secs........177
Figura 4.76: Cromatogramas de MRM de análise do cefacetril (40 ng/mL)
utilizando a coluna RAM-BSA C
8
(5 x 0,46 cm d.i.) (120Å, 10 µm). Transição m/z
357,2 m/z 280,2 A: Solvente e B: Leite. FM: NH
4
Ac (0,01M, pH= 7,5) até 7
minutos; NH
4
Ac (0,01M, pH= 7,5)/CH
3
CN (95:05 v/v) até 12 minutos. Amplitude
de fragmentação: 0,20.........................................................................................178
XXI
Figura 4.77: Sistema de infusão pós sistema cromatográfico da solução de NH
4
Ac
0,05M..................................................................................................................180
Figura 4.78 – Cromatogramas de MRM de análise do cefacetril (50 ng/mL)
utilizando a coluna RAM-BSA C
8
(5 x 0,46 cm d.i.) (120Å, 10 µm) – A: em
solvente e B: em leite. Transição m/z 357,2 m/z 280,2. FM: NH
4
Ac (0,01M,
pH= 7,5) até 7 minutos; NH
4
Ac (0,01M, pH= 7,5)/CH
3
CN (93:07 v/v) até 12
minutos. Amplitude de fragmentação: 0,20.........................................................181
Figura 4.79: Estrutura química da cefalexina.....................................................182
Figura 4.80 – Cromatograma do íon extraído m/z 348, para comparação da
corrente iônica gerada para a cefalexina com a utilização de diferentes
modificadores orgânicos. ....................................................................................183
Figura 4.81: Espectro de massa e de íons fragmentos gerados para a cefalexina.184
Figura 4.82: Representação esquemática do sistema de cromatografia
multidimensional utilizado.
115
............................................................................185
Figura 4.83 – Cromatograma de análise de uma amostra de cefalexina 100 ng/mL
em solvente.........................................................................................................187
Figura 4.84 – Cromatogramas de análise da cefalexina preparada em solvente e em
leite com uso do agente de pareamento iônico HTBA, monitorados com os
detectores de UV e MS........................................................................................189
Figura 4.85 – Cromatogramas de análise da cefalexina (100 µg/mL) em leite
utilizando a coluna C
18
– BSA (5 x 0,46 cm d.i) (120Å, 10µm) e C
18
-Hypersil (5 ×
0,46 cm d.i.) (120Å, 10µm), com detecção por MS. Condições cromatográficas:
Linha (A): NH
4
Ac 0,01 mol/L (pH 7,5) – 5 minutos para exclusão protéica; Linha
(B): NH
4
Ac 0,01 mol/L (pH 7,5): CH
3
CN (90:10 v/v) para transferência e análise
da cefalexina na coluna analítica; e Linha (C): NH
4
Ac 0,01 mol/L (pH 7,5):
CH
3
CN (50:50 v/v) para limpeza da coluna RAM-BSA......................................191
XXII
Figura 4.86: Espectros de massa e de íons fragmentos dos metabólitos ABZ-SO
2
-
NH
2
, ABZ-SO
2
e (±)-ABZ-SO............................................................................195
Figura 4.87: Cromatograma de análise dos metabólitos (1) ABZ-SO
2
-NH
2
(9,0
ng/mL); (2) R-(+)-ABZ-SO (27 ng/mL); (3) S-(-)-ABZ-SO (27 ng/mL) e (4) ABZ-
SO
2
.ABZ-SO
2
-NH
2
(27 ng/mL) em leite bovino utilizando as colunas RAM-C
8
-
BSA (5,0 x 0,46 cm d.i.) e tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose (15,0 x 0,46
cm d.i.), com detecção por MS. Bomba 1 (A) água 100%; (B) água:CH
3
CN (60:40)
e (C): CH
3
CN /água/ISO (75:15:10); vazão de 1,0 mL/min. Bomba 2 (D): água:
CH
3
CN (60:40); vazão de 0,8 mL/mim; volume de injeção: 100 µL. ..................202
Figura 4.88: Representação esquemática do sistema utilizado para o estudo de
efeito de matriz. ..................................................................................................204
Figura 4.89: Cromatogramas representativos do estudo de efeito de matriz. (----) –
leite integral; (----) – leite desnatado; (----) – água e (----) – efeito da válvula de
acoplamento........................................................................................................205
Figura 4.90: Curvas analíticas para o ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-
SO e ABZ-SO
2
....................................................................................................210
XXIII
R
ESUMO
“Desenvolvimento de Métodos Cromatográficos para o Controle de Qualidade e
para a Análise de Resíduos em Leite Bovino de medicamentos Veterinários”.
Este trabalho apresenta o desenvolvimento e avaliação de colunas
RAM-BSA na exclusão de proteínas do leite bovino e da capacidade de retenção
dessas colunas para os antibióticos aminoglicosídeos (estreptomicina, neomicina e
gentamicina). O perfil cromatográfico da exclusão das proteínas foi avaliado
utilizando água, solução fosfato de potássio dibásico e solução acetato de amônio
como fase móvel. A capacidade de retenção das colunas RAM-BSA para os
antibióticos aminoglicosídeos foi avaliada utilizando cromatografia no modo
reverso de eluição, com o uso de soluções tamponadas, e cromatografia de
pareamento iônico. Foi verificado, com todas as fases móveis avaliadas, uma
grande variação nos tempos de retenção dos analitos. Uma coluna RAM-ADS foi
também utilizada e, da mesma forma que as colunas RAM-BSA nenhum tempo de
retenção adequado foi obtido. Durante o estudo de retenção nas colunas RAM-BSA
foi também realizada, uma avaliação do fator de retenção (k) dos antibióticos
aminoglicosídeos utilizando cromatografia de pareamento iônico (TFA, HFBA e
PFPA como agentes de pareamento iônico) nas colunas fenil e C
18
(Hyperil 15 x
0,46 cm d.i.) e ELSD como detector. Esse estudo proporcionou o desenvolvimento
de métodos analíticos para o controle de qualidade de medicamentos veterinários.
Foram desenvolvidos métodos de análise para os três antibióticos avaliados e os
métodos apresentaram linearidade, sensibilidade, seletividade, exatidão e precisão
adequadas, de modo que foram aplicados com sucesso na análise de medicamentos
veterinários comerciais.
Este trabalho também apresenta um estudo para o desenvolvimento de
um método por injeção direta utilizando colunas RAM-BSA para análise de
XXIV
antibióticos cefalosporínicos em leite bovino com detecção por espectrometria de
massa. As propriedades físico-químicas destes compostos exigiram a utilização de
soluções tamponadas e agentes de pareamento iônico, os quais dificultaram o
acoplamento com o MS influenciando diretamente na ionização destes compostos,
impedindo o desenvolvimento do método.
O desenvolvimento e validação de um método, sensível e
enantiosseletivo por CLAE-multidimensional para a determinação dos metabólitos
do albendazol (albendazol-sulfóxido, albendazol-sulfona e albendazol-2-amino-
sulfona) em leite bovino por detecção por MS também foi realizado. Uma coluna
RAM-BSA C
8
(5,0 x 0,46 cm d.i.) foi acoplada em uma coluna quiral tris(3,5-
dimetilfenilcarbamato) de amilose em sílica APS-Nucleosil (15,0 x 0,46 cm d.i.) e
o método validado mostrou linearidade, precisão, exatidão e sensibilidade adequada
para ser utilizado em estudos de resíduos em alimentos e/ou farmacocinéticos
destes compostos. Ainda, durante este trabalho foi realizado um estudo do efeito de
matriz para verificar a influência desta na validação do método por LC-MS.
XXV
A
BSTRACT
“Development of chromatographic methods for quality control and residual limits
analysis of veterinary pharmaceutical formulations in bovine milk”.
This work reports the investigation of a series of bovine serum
albumin (BSA) restricted access media columns (RAM) for on-line milk samples
deproteinization using water, phosphate and acetate buffer as mobile phase. The
retention factor (k) of aminoglycosides antibiotics (streptomycin, neomycin and
gentamycin) on the RAM columns was evaluated using buffers and ion pair
chromatography. The results showed a wide variation on aminoglicosides
antibiotics retentions time; a RAM-ADS column was also investigated and the
same results was observed.
During the RAM columns studies, an investigation of two analytical
columns, C
18
and phenyl (Hyperil 15 x 0,46 cm i.d.), were performed using ion pair
chromatography. Perfluorinated acids (TFA, HFBA and PFPA) were evaluated as
moblile phase and the detection was accomplished by an evaporative light
scattering detector (ELSD). This study allowed the development of analytical
methods for quality control of gentamycin, neomycin and streptomycin in
veterinary pharmaceutical formulations. The developed methods showed good
selectivity, sensibility, accuracy and precision for all compounds allowing it to be
successfully used to commercials phormulation.
This works also presents a study for on line determination of
cephalosporinic antibiotics in bovine milk by multidimentional chromatography
using RAM-BSA column for sample clean-up. The chromatographic conditions
optimzed for these compounds were not adequate for the MS/MS quantification
due to suppression and/or enhancement of compound’s ionization.
XXVI
Still a sensitive and enantioselective multidimensional high
performance liquid chromatography (HPLC) method for determination of
albendazole metabolites: albendazole sulphoxide, albendazole sulphone and
albendazole 2-aminesulphone in bovine milk was development and validated at this
work. The compounds, (±)-albendazole sulphoxide, albendazole sulphone and 2-
aminesulphone were extracted from bovine milk using a octyl restricted access
media bovine serum albumin column (C
8
-RAM-BSA) (5.0 x 0.46 cm i.d.) and
analyzed on a chiral column containing amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)
coated onto APS-Nucleosil support, as stationary phase (15.0 x 0.46 cm i.d.). The
validated method showed linearity, precision, accuracy and adequate sensitivity,
allowing it to be appropriate for pharmacokinetics studies and residual limits
control. A matrix effect study was conducted to investigated its influence on the
LC-MS method development.
S
UMÁRIO
1
–
I
NTRODUÇÃO
......................................................................................................1
1.1
–
M
EDICAMENTOS VETERINÁRIOS E A
P
ECUÁRIA MODERNA
1
1.1.1
–
A
NTIBIÓTICOS
3
1.1.1.1 – A
MINOGLICOSÍDEOS
........................................................................6
1.1.1.1.1 – H
ISTÓRIA
,
ORIGEM E ATIVIDADE BACTERICIDA
6
1.1.1.1.2
–
C
LASSIFICAÇÃO
,
E
STRUTURA E
C
ARACTERÍSTICA
Q
UÍMICA
8
1.1.1.1.3 – M
ÉTODOS
E
MPREGADOS NA
D
ETERMINAÇÃO DE
A
NTIBIÓTICOS
A
MINOGLICOSÍDEOS
12
1.1.1.2 – A
NTIBIÓTICOS Β
-
LACTÂMICOS
.......................................................16
1.1.1.2.1 – C
LASSIFICAÇÃO
,
ESTRUTURA E CARACTERÍSTICA QUÍMICA
16
1.1.1.2.2 – A
PRESENTAÇÃO DOS
M
ÉTODOS
E
MPREGADOS NA
D
ETERMINAÇÃO DE
A
NTIBIÓTICOS CEFALOSPORÍNICOS
20
1.1.2 - A
NTI
-
HELMÍNTICOS
21
1.1.2.1
–
ANTI
-
HELMINTICOS BENZIMIDAZÓLICOS
..........................................24
1.1.2.2
–
M
ÉTODOS EMPREGADOS NA DETERMINAÇAO DE ALBENDAZOL E SEUS
METABÓLITOS
..............................................................................................28
1.2
–
L
EITE BOVINO
:
COMPOSIÇÃO
,
IMPORTANCIA ECONOMICA E NUTRICIONAL
30
1.3 – P
RÉ
-T
RATAMENTO DE
A
MOSTRAS
B
IOLÓGICAS
33
1.3.1 – F
ASES DE
A
CESSO
R
ESTRITO
(RAM) 35
1.4
–
E
SPECTROMETRIA DE MASSAS E
E
SPALHAMENTO DE LUZ COMO DETECTORES
NA
A
NÁLISE DE
F
ÁRMACOS E
M
ETABÓLITOS POR
CLAE 41
1.4.1 – LC-MS/MS 41
1.4.2 – LC - ELSD 46
2
–
O
BJETIVOS
.......................................................................................................49
3
–
P
ARTE
E
XPERIMENTAL
......................................................................................51
3.1
–
G
ENERALIDADES
51
3.2
–
P
REPARO DAS COLUNAS
RAM-BSA 54
3.2.1
–
S
ÍLICAS
U
TILIZADAS
54
3.2.2
–
E
MPACOTAMENTO DAS COLUNAS
54
3.2.3
-
I
MOBILIZAÇÃO DAS
F
ASES
H
IDROFÓBICAS COM
BSA 54
3.3
–
A
VALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE EXCLUSÃO DAS PROTEÍNAS DO LEITE BOVINO
PELAS COLUNAS
RAM-BSA
–
M
ÉTODO DE
B
RADFORD
142
55
3.3.1
–
P
REPARO DO REAGENTE DE
B
RADFORD
55
3.3.2
–
P
REPARO DAS AMOSTRAS
55
3.3.3
–
D
ETERMINAÇÃO DAS
P
ROTEÍNAS
T
OTAIS
56
3.4
-
A
VALIAÇÃO DO PODER DE RETENÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS PELAS COLUNAS
RAM-BSA,
ADS,
FENIL E
C
18
57
3.4.1
–
P
REPARO DAS SOLUÇÕES DE FOSFATO DE POTÁSSIO DIBÁSICO E ACETATO
DE AMÔNIO
(0,01M);
DOS ÁCIDOS TRIFLUORACÉTICO
,
HEPTAFLUORBUTÍRICO E
PENTAFLUORPROPIÔNICO
(0,005;
0,01;
0,025;
0,05;
0,075;
0,08
E
0,1M)
E DA
SOLUÇÃO DE TETRABUTILAMÔNIO
2
M
M 57
3.4.1.1
–
S
OLUÇÃO ACETATO DE AMÔNIO
(0,01M)........................................57
3.4.1.2
–
S
OLUÇÃO DE FOSFATO DE POTÁSSIO DIBÁSICO
(0,01M)...................57
3.4.1.3
–
S
OLUÇÃO DE TETRABUTILAMÔNIO
(2
M
M)......................................58
3.4.1.4
–
S
OLUÇÃO DE
TFA
(0,005;
0,01;
0,05;
0,08
E
0,1M)........................58
3.4.1.5
–
S
OLUÇÃO DE
HFBA
(0,005;
0,01;
0,05;
0,08
E
0,1M).....................58
3.4.1.6
–
S
OLUÇÃO DE
PFPA
(0,01;
0,025;
0,05;
0,075
E
0,1M)....................59
3.4.2
–
S
OLUÇÕES
P
ADRÃO
59
3.4.2.1
–
A
MINOGLICOSÍDEOS
.......................................................................59
3.4.2.2
–
C
EFACETRIL
...................................................................................60
3.5
–
M
ÉTODOS ANALÍTICOS E BIOANALÍTICO
60
3.5.1
–
E
MPACOTAMENTO DAS FASES ESTACIONÁRIAS
60
3.5.1.1
–
COLUNAS AQUIRAIS
(C
18
e fenil).....................................................60
3.5.1.2
–
C
OLUNA QUIRAL
............................................................................60
3.5.2
–
M
ÉTODOS
A
NALÍTICOS
61
3.5.2.1
–
P
REPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO
...................................................61
3.5.2.1.1
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO ANTIBIÓTICO
ESTREPTOMICINA
61
3.5.2.1.2
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO ANTIBIÓTICO
NEOMICINA
62
3.5.2.1.3
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO ANTIBIÓTICO
GENTAMICINA
62
3.5.2.1.4
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO ANTIBIÓTICO
C
ANAMICINA
63
3.5.2.2
–
P
REPARO DAS AMOSTRAS DE CALIBRAÇÃO E CONTROLE DE
QUALIDADE
..................................................................................................64
3.5.2.2.1
–
M
ÉTODOS ESTREPTOMICINA
,
NEOMICINA
,
GENTAMICINA E
CANAMICINA
64
3.5.2.3
–
O
BTENÇÃO DAS CURVAS ANALÍTICAS
.............................................64
3.5.2.4
–
P
ARÂMETROS ANALÍTICOS AVALIADOS
...........................................65
3.5.2.4.1
–
L
INEARIDADE
65
3.5.2.4.2
–
P
RECISÃO E
E
XATIDÃO
65
3.5.2.4.3
–
L
IMITES DE
Q
UANTIFICAÇÃO
(LQ)
E
D
ETECÇÃO
(LD) 66
3.5.3 – M
ÉTODO
B
IOANALÍTICO
66
3.5.3.1
-
P
REPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO DO
ABZ-SO
2
-NH
2,
ABZ-SO
2
E
(±)-
ABZ-SO......................................................................................................66
3.5.3.2
-
P
REPARO DAS AMOSTRAS DE CALIBRAÇÃO E CONTROLE DE
QUALIDADE
..................................................................................................67
3.5.3.3
–
O
BTENÇÃO DAS CURVAS ANALÍTICAS
.............................................68
3.5.3.4
-
P
ARÂMETROS ANALÍTICOS PARA VALIDAÇÃO DE FÁRMACOS EM MATRIZES
BIOLÓGICAS
69
3.5.3.4.1
-
S
ELETIVIDADE
69
3.5.3.4.2
-
E
FICIÊNCIA DE EXTRAÇÃO
(
RECUPERAÇÃO
)
E TRANSFERÊNCIA DOS
ANALITOS
70
3.5.3.4.3
-
P
RECISÃO E EXATIDÃO
70
3.5.3.4.4
-
L
IMITE DA QUANTIFICAÇÃO
(LQ)
E DETECÇÃO
(LD) 70
3.5.3.4.5
–
E
STUDOS DE ESTABILIDADE
71
3.5.3.4.5.2
-
E
STABILIDADES APÓS CICLOS DE CONGELAMENTO E DEGELO
.............................................................................................................71
3.5.3.4.5.3
-
E
STABILIDADE DE LONGA DURAÇÃO
...................................72
3.5.3.4.5.4
-
E
STABILIDADE DE CURTA DURAÇÃO
...................................72
3.5.3.4.5.5
-
E
STABILIDADES DAS AMOSTRAS DURANTE A PERMANÊNCIA
NO AUTO
-
INJETOR
..................................................................................72
3.6 –
ESTUDO DO EFEITO DA MATRIZ
72
4
–
R
ESULTADOS E
D
ISCUSSÕES
..............................................................................74
4.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E
A
VALIAÇÃO DE
C
OLUNAS
RAM-BSA 74
4.1.1 - P
REPARO DAS
C
OLUNAS DE
F
ASE
H
IDROFÓBICA
I
MOBILIZADAS COM
P
ROTEÍNA
74
4.1.2
–
A
VALIAÇÃO DO
P
ODER DE
E
XCLUSÃO DAS
P
ROTEÍNAS DO
L
EITE PELAS
C
OLUNAS
RAM-BSA 78
4.1.3
–
A
VALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE RETENÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS PELAS COLUNAS
RAM-BSA 91
4.1.4
–
A
VALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE RETENÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO A COLUNA DE FASE DE ACESSO RESTRITO
ADS
E
TFA
COMO AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO COM DETECÇAO POR
ELSD 107
4.2
–
A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO
(
K
)
PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE PAREAMENTO IÔNICO E
DETECÇÃO POR
ELSD 110
4.2.1
–
A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO O AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO
TFA
NAS
COLUNAS
C
18
E FENIL
115
4.2.2 - A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO O AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO
HFBA
NAS
COLUNAS
C
18
E FENIL
122
4.2.3
-
A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO O AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO
PFPA
NAS
COLUNAS
C
18
E FENIL
126
4.3
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA O
CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS
131
4.3.1. - Q
UANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO ESTREPTOMICINA EM MEDICAMENTOS
VETERINÁRIOS
132
4.3.1.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
............................133
4.3.1.2
–
A
PLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA ANÁLISE DE
ESTREPTOMICINA
........................................................................................137
4.3.2
-
Q
UANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO GENTAMICINA EM MEDICAMENTOS
VETERINÁRIOS
138
4.3.2.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS
.........................140
4.3.2.1.1
-
P
ADRONIZAÇÃO EXTERNA UTILIZANDO A GENTAMICINA
143
4.3.2.1.2
–
P
ADRONIZAÇÃO EXTERNA UTILIZANDO A CANAMICINA COMO
PADRÃO SECUNDÁRIO
149
4.3.2.1.3
–
C
OMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO
DESENVOLVIDOS PARA A GENTAMICINA
152
4.3.2.1.4
-
A
PLICAÇÃO DO
M
ÉTODO
D
ESENVOLVIDO PARA A
A
NÁLISE DE
G
ENTAMICINA
155
4.3.3
–
Q
UANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO NEOMICINA EM MEDICAMENTOS
VETERINÁRIOS
156
4.3.3.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
............................157
4.3.3.2
–
A
PLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA A ANÁLISE DE
N
EOMICINA
................................................................................................166
4.4
–
D
ESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO POR
CLAE-
MULTIDIMENSIONAL PARA
ANÁLISE DE CEFACETRIL EM LEITE BOVINO UTILIZANDO O
MS
COMO DETECTOR
168
4.5
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ENANTIOSSELETIVO POR
INJEÇÃO DIRETA DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO DOS METABÓLITOS DO
ALBENDAZOL POR
LC-MS-MS 192
4.5.1
–
D
ESENVOLVIMENTO
192
4.5.2
–
VALIDAÇÃO
208
5 - C
ONCLUSÕES
..................................................................................................219
5.1 – D
ESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE COLUNAS
RAM-BSA 219
5.2 – A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE PAREAMENTO IÔNICO E
DETECÇÃO POR
ELSD 220
5.3
-
D
ESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO POR
CLAE-
MULTIDIMENSIONAL PARA
ANÁLISE DE ANTIBIÓTICOS CEFALOSPORÍNICOS EM LEITE BOVINO UTILIZANDO
MS
COMO DETECTOR
221
5.4
–
D
ESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE UM MÉTODO ENANTIOSSELETIVO POR
INJEÇÃO DIRETA DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO DOS METABÓLITOS DO
ALBENDAZOL POR
LC-MS-MS
EM LEITE BOVINO
222
6
–
R
EFERÊNCIAS
B
IBLIOGRÁFICAS
.......................................................................223
INTRODUÇÃO
“Todo mundo tem dentro de si um fragmento de boas notícias.
A boa notícia é que você não sabe quão extraordinário você pode ser!
O quanto você pode amar! O que você pode executar!
E qual é o seu potencial!”.
A
NNE
F
RANK
Introdução
1
1
–
I
NTRODUÇÃO
1.1
–
M
EDICAMENTOS VETERINÁRIOS E A
P
ECUÁRIA MODERNA
Na prática da pecuária moderna, os medicamentos veterinários têm
sido amplamente utilizados e administrados como aditivos em água ou nos
alimentos dos animais destinados ao consumo humano, com intuito de prevenir o
aparecimento de doenças. Além disso, agentes promotores do crescimento como os
hormônios e determinados medicamentos veterinários são aplicados para estimular
o crescimento dos animais, o que é considerado uma prática excessiva no uso
desses medicamentos.
1
É evidente que há benefícios importantes para os pecuaristas quando
do uso ilegal dessas substâncias; geralmente, o uso desses medicamentos melhora a
absorção e a conversão dos alimentos levando a um ganho em proteínas e sais
minerais estimulando o crescimento dos animais. No entanto, essas substâncias
podem permanecer nos alimentos derivados dos animais tratados, levando a
resíduos destes nos alimentos.
A presença destes medicamentos veterinários como resíduos exerce
alguns efeitos diminuindo a qualidade dos alimentos. Por exemplo, o uso de
agentes promotores de crescimento leva a um aumento na velocidade de lipólise
gerando uma decomposição química de triacilglicerois, e conseqüente diminuição
de gordura com efetiva perda no sabor do alimento. Uma notável retenção de água
também é verificada com o uso dessas substâncias, onde o resultado é uma carne
dura e pouco suculenta.
2
Além de prejuízos significantes para indústria de processamentos entre
outras, devido à baixa qualidade dos produtos, a presença desses resíduos em
alimentos podem causar sérios problemas à saúde humana.
Introdução
2
Muitos desses compostos podem exercer efeitos genotóxicos,
imunotóxicos, carcinogênico ou endócrino
2
. Deste modo, há um interesse evidente
em organizações oficiais e indústrias alimentícias em controlar, com certo grau de
segurança, a presença dessas substâncias nos alimentos de origem animal, uma vez
que o uso indiscriminado desses medicamentos tem causado sérios problemas
relacionados à saúde pública.
O FDA (Food and Drug Administration), nos Estados Unidos, e as
Diretrizes da União Européia exigem severo controle no uso destes medicamentos
envolvendo a produção de alimentos.
3,4
De acordo com essas diretrizes, as
substâncias são classificadas em dois grupos, um grupo A que compreende
substâncias proibidas, e um grupo B que compreende outros medicamentos
veterinários autorizados, mas que possuem limites estabelecidos (Tabela 1.1).
Para os antibióticos da classe das β-lactamas, por exemplo, a
tolerância destes resíduos permitidos em leite pelo FDA é de 5 ng/mL para a
penicilina G, 10 ng/mL para a amoxicilina, ampicilina e cloxacilina e 20 ng/mL
para a cefapirina.
3
No que se refere aos anti-helmínticos, para o tiabendazol (TBZ), o
benzinidazol mais antigo utilizado, a tolerância permitida em leite de acordo com
as normas da Comunidade Européia (EC) é de 100 µg/Kg para a soma TBZ e o
metabólito 5-hidroxi-tiabendazol (5-OH-TBZ).
1
No Brasil, o Plano Nacional de Controle de Resíduos em Produtos de
Origem Animal (PNCR) estabelece que o limite máximo de resíduos (LMR´s) é
competência do Ministério da Saúde e da Agricultura e no caso de não estarem
estabelecidos por este ministério, utiliza-se os internacionalizados no Mercosul, os
recomendados pela Codex Alimentarius, os constantes nas Diretrizes da União
Européia e os utilizados pelo FDA/USA e Japão.
4
Introdução
3
Os antibióticos, na sua maioria, atuam como promotores do
crescimento e têm sido utilizados de forma abusiva levando principalmente ao
desenvolvimento de resistência microbiana no homem. Os anti-helmínticos,
embora sejam usados para o seu propósito, no tratamento de infecções parasitárias,
também tem causado sérios problemas, devido à falta de respeito por parte dos
pecuaristas com relação aos prazos de eliminação e a posologia aplicada ao animal.
Tabela 1.1: Classe de medicamentos veterinários/contaminantes autorizados para
tratamentos terapêuticos e substâncias não autorizadas, com efeito anabolizante,
rigorosamente controladas pela União Européia.
1, 2
Grupo A: classe de substâncias
proibidas, com efeito anabólico
Grupo B: classe de substâncias autorizadas,
mas com limites residuais estabelecidos
1- Estilbenos
2- Agentes antitiróideos
3- Esteróides
4- Lactonas do ácido resorcílico
incluindo zeranol
5- Beta-antagonistas
6- Nitrofuranos
1- Bactericidas
2- Anti-helmínticos
3- Carbamatos e piretróides
4- Sedativos
5- Anti-inflamatórios não esteróides
6- Organoclorados e organofosforados
7- Micotoxinas
1.1.1
–
A
NTIBIÓTICOS
O
termo antibiótico é utilizado para uma grande diversidade de
compostos, naturais ou semi-sintéticos, que possuem a capacidade de inibir os
processos biológicos vitais de microorganismos. É na síntese da parede celular, um
dos estágios mais importantes para a sobrevivência das bactérias, que os
antibióticos atuam.
6
Introdução
4
O conceito e prática dos antibióticos tiveram sua origem na antiga
medicina chinesa. Em 1877, o potencial clínico dos produtos com microorganismos
como agentes terapêuticos foi reconhecido por Pasteur e Joubert, mas somente em
1930-1940 foi descoberta a sulfanilamida por Domagk e a penicilina por Fleming
tornando possível o aprimoramento da quimioterapia de infecções.
6
O uso dos antibióticos na pecuária começou em 1950 com o uso da
oxitetraciclina e clortetraciclina como complemento alimentar. Hoje em dia estas e
outras classes de antibióticos são comumente usadas na prevenção e tratamento de
doenças, ou como agentes que promovem o crescimento desses animais
7
. Os
antibióticos podem ser administrados oralmente, por adição nos alimentos, ou
diretamente por via intramamária ou intramuscular.
Dentre os antibióticos mais utilizados na medicina veterinária, pode-se
destacar os aminoglicosídeos, β-lactamas, tertraciclinas, macrolídeos, peptídeos,
quinolonas, cloranfenicol, o verde de malaquita e os quimioterápicos sulfonamidas
(e trimetoprima).
O uso de antibióticos não autorizados, a falta de respeito aos prazos de
eliminação dos mesmos antes da comercialização de alimentos provenientes de
animais medicados, o abuso na administração e a não utilização dos medicamentos
de acordo com as recomendações prescritas, podem resultar em resíduos dos
mesmos em alimentos de origem animal.
A grande problemática com respeito à presença dos resíduos de
antibióticos em produtos destinados ao consumo está relacionada à saúde pública,
onde indivíduos sensíveis podem sofrer reações alérgicas, assim como o
desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos comuns, e também à
prejuízos de ordem econômica, onde esses resíduos podem interferir na produção e
desenvolvimento de outros produtos, como por exemplo, em culturas de
lactobacilos utilizados na produção de queijo e produtos originários do leite
Introdução
5
indicando que o produto consumido é originado de um animal com sérios
problemas infecciosos.
8
O problema da presença de antibióticos no leite tende a piorar devido
ao desenvolvimento de um hormônio denominado somatomamotrofina, produzido
por engenharia genética através de técnicas de DNA recombinante, que estimula as
mamas das vacas a produzir mais leite. Por outro lado esse hormônio também
aumenta a incidência de mastite o que, por sua vez, implica em maior uso de
antibióticos para sanar o problema.
8
A mastite bovina, caracterizada por um processo inflamatório no úbere
das vacas por bactérias e/ou fungos, é hoje um dos problemas mais sérios
encontrados na pecuária leiteira, reduzindo a produção e chegando em muitos casos
à perda efetiva da mesma. Além disso, a doença leva a uma modificação na
composição físico-química do leite, diminuindo os níveis de gordura e proteína,
além de ocasionar alterações de consistência e coloração (Tabela 1. 2).
A mastite é considerada a principal doença que afeta os rebanhos
leiteiros no mundo, e aquela que proporciona as maiores perdas econômicas na
produção de leite. Em países como a Dinamarca, é a causa de 30 a 40% das
intervenções veterinárias; nos EUA, estima-se que haja um prejuízo de cerca de
US$ 1,8 bilhões/ano em função da ocorrência de mastite. Já no Brasil, pode-se
deduzir que, em função da alta prevalência de mastite nos rebanhos, possa ocorrer
perda de produção entre 12 e 15%, o que significa um total de 2,8 bilhões de
litros/ano em relação à produção anual de 21 bilhões de litros.
10, 11
Além dos prejuízos na produção primária, a mastite também é um
problema para as indústrias de laticínios. A utilização de leite de baixa qualidade
tem implicações tecnológicas relevantes como, por exemplo, o baixo rendimento na
fabricação dos derivados, a diminuição do prazo de validade dos produtos e
também alterações nas características originais do leite e dos derivados.
9, 10
Introdução
6
As principais classes de antibióticos usadas na pecuária para o
tratamento da mastite pertencem às β-lactamas, tetraciclinas, aminoglicosídeos,
ionofóreos e macrolídeos.
7, 11
Tabela 1.2: Alterações na composição do leite causadas pela mastite.
11
Componente Leite Normal
(%)
Leite Mastítico
(%)
Gordura
Lactose
Proteína total
Caseína total
Proteína do soro
Albumina sérica
Lactoferrina
Imunoglobulinas
Sódio
Cloreto
Potássio
Cálcio
3,5
4,9
3,61
2,8
0,8
0,02
0,02
0,1
0,057
0,091
0,173
0,12
3,2
4,4
3,56
2,3
1,3
0,07
0,1
0,6
0,105
0,147
0,157
0,04
1.1.1.1 – A
MINOGLICOSÍDEOS
1.1.1.1.1 – H
ISTÓRIA
,
ORIGEM E ATIVIDADE BACTERICIDA
Nos anos de 1930 e 1940, a descoberta da penicilina estimulou a
pesquisa e o desenvolvimento de outros agentes antimicrobianos. Em 1943, Schatz
e colaboradores descobriram e isolaram um grupo particular de fungo,
Introdução
7
Streptomyces griseus, que produzia estreptomicina, um potente agente
antimicrobiano ativo contra vários microorganismos aeróbicos gram-positivos e
gram-negativos.
A partir da estreptomicina, o primeiro antibiótico aminoglicosídeos
isolado, vários outros estudos levaram ao desenvolvimento de novos agentes
antimicrobianos como, por exemplo, a neomicina a partir da Streptomyces fradiae,
canamicina a partir da Streptomyces Kanamyceticus e da gentamicina a partir do
Micronospora purpurea.
6,12
A Tabela 1.3 apresenta os microorganismos
responsáveis pela produção de importantes antibióticos aminoglicosídeos, assim
como os cientistas responsáveis por tais descobertas.
Os aminoglicosídeos são agentes antimicrobianos usados
freqüentemente no tratamento de doenças em seres humanos e animais, causados
por bactérias aeróbicas gram-positivas e gram-negativas, não sendo ativos contra
bactérias anaeróbicas devido ao bloqueio de sua ação sobre essas condições.
13
A atividade antimicrobiana dos aminoglicosídeos é baseada na
habilidade dos mesmos em inibir a síntese de proteína dos microorganismos,
resultando em uma rápida concentração dependente da ação bactericida; vale
ressaltar que os outros agentes antimicrobianos que afetam a síntese de proteína são
apenas bacteriostáticos.
6
Na medicina veterinária os aminoglicosídeos são amplamente
utilizados no tratamento de infecções por bactérias, como por exemplo, enterites e
mastites, sendo também adicionados à comida para a prevenção de doenças e para
promover o crescimento dos animais. Os mais comumente utilizados são a
gentamicina, neomicina, dihidroestreptomicina e estreptomicina. Há uma grande
preocupação com os resíduos desses antibióticos em alimentos devido a sua
toxicidade, uma vez que todos os membros desse grupo são nefro e ototóxicos.
6, 12-
15
Introdução
8
Tabela 1.3: Organismos que produzem aminoglicosídeos específicos
12
Aminoglicosídeo Organismo Descoberto por, ano
Streptomicina S. griseus Waksman e Schatz,
1944
Neomicina S. fradiae e S. albogriseolus Umezawa e
Waksman, 1949
Canamicina Streptomyces kanamyceticus Umezawa, 1957
Dihidroestreptomicina
S. griseus e S. humidus Takeda Chemicals,
1957
Paromomicina S. rimosus Parke Davis, 1959
Gentamicina Micromonospora purpurea e
M.echinospora
Schering Plough,
1963
Trobamicina S. tenebrarius Eli Lilly, 1967
Sisomicina M. inoyoensis Schering Plough,
1970
1.1.1.1.2
–
C
LASSIFICAÇÃO
,
E
STRUTURA E
C
ARACTERÍSTICA
Q
UÍMICA
Os antibióticos aminoglicosídeos são caracterizados pela presença de
um anel aminociclitol (um hidroxiciclohexano amino substituído) ligado a dois ou
mais aminoaçúcares por ligações glicosídicas. Estes, de acordo com a substituição
do anel aminociclitol, são divididos em dois grupos: estreptamina e 2-
deoxiestreptamina (Figura 1.1).
Introdução
9
HO
OH
NH
2
H
2
N
HO
2-deoxiestreptamina
HO
OH
NH
2
OH
H
2
N
HO
Estreptamina
Figura 1.1: Estrutura química característica dos antibióticos aminoglicosídeos.
O grupo 2-deoxiestreptamina é o maior e é dividido em dois
subgrupos de acordo com o número e posição dos substituintes no anel
aminociclitol; destes, os grupos mais conhecidos são os que possuem os
substituintes em posições adjacentes (posições 4 e 5) envolvendo os antibióticos
neomicina e paronomicina, e os que não possuem os substituintes em posições
adjacentes (posições 4 e 6) envolvendo os antibióticos gentamicina e canamicina. O
grupo estreptamina envolve os antibióticos estreptomicina e
dihidroestreptomicina.
12
A Figura 1.2 apresenta as estruturas químicas dos
antibióticos aminoglicosídeos citados.
Introdução
10
O
HO
NH
2
OH
O
H
NH
2
H
2
N
HO
O
O
R
1
O
R
2
HO
HO
Canamicina
A. R
1
= OH e R
2
= NH
2
B. R
1
= R
2
= NH
2
C. R
1
= NH
2
e R
2
= OH
NH
2
H
2
N
O
OH
O
NH
2
O
O
H
HO
HO
O
OH
HOCH
2
O
O
NH
2
OH
OH
H
2
NCH
2
Paromomicina
Figura 1.2: Estrutura química dos antibióticos aminoglicosídeos (Continua).
O
O
NH
2
HO
R
1
OH
O
HOCH
2
OH
NH
2
H
2
N
O
OH
R
2
O
NH
2
O
NH
2
HO
HO
Neomicina
B. R
1
= H; R
2
= CH
2
NH
2
C. R
1
= CH
2
NH
2;
R
2
= H
O
NHR
1
R
2
R
3
NH
2
O
NH
2
H
2
N
HO
O
O
HO
NH
H
3
C
CH
3
OH
Gentamicina
C
1
. R
1
= R
2
= CH
3
e R
3
= H
C
1a.
R
1
=
R
2
= R
3
= H
C
2
. R
1
= R
3
= H e R
2
= CH
3
C
2a
. R
1
= R
2
= H e R
3
= CH
3
Introdução
11
OH
HN
O
HO
NH
OH
H
2
N
NH
H
2
N
NH
O
O
OH
H
3
C
O
NH
CH
3
HO
HO
H
O
Estreptomicina
CHO
OH
HN
O
HO
NH
OH
H
2
N
NH
H
2
N
NH
O
O
OH
H
3
C
O
NH
CH
3
HO
HO
H
O
Dihidroestreptomicina
CH
2
OH
Figura 1.2: Estrutura química dos antibióticos aminoglicosídeos (Conclusão).
Os aminoglicosídeos exibem todas as propriedades físico-químicas
que dificultam o desenvolvimento de métodos confirmatórios apropriados; são
compostos básicos, hidrofílicos e polares, tornando difícil a extração a partir de
matrizes complexas; são termicamente lábeis tornando análises por GC
praticamente impossíveis e não possuem grupos cromóforos dificultando a análise
por LC-UV. São solúveis em água, parcialmente solúveis em metanol e
praticamente insolúveis em solventes orgânicos hidrofóbicos.
11, 12
Em soluções aquosas, os aminoglicosídeos encontram-se protonados
devido à presença de grupos amino, os quais variam de quatro na canamicina a seis
na neomicina e cujos valores de pKa encontram entre 7 e 8,8. As características
físicas e químicas dos aminoglicosídeos com atividades terapêuticas são
apresentadas na Tabela 1.4.
12
Dentro do grupo dos aminoglicosídeos, foram selecionados para
estudo os seguintes antibióticos: Estreptomicina, Neomicina e Gentamicina, sendo
este último uma mistura de antibióticos aminoglicosídeos semelhantes, cujos
componentes principais são gentamicina C
1
, gentamicina C
1a
, gentamicina C
2
e
gentamicina C
2a
.
16
Além das dificuldades discutidas anteriormente, a pequena
Introdução
12
diferença dos substituíntes nesses componentes principais contribui para tornar sua
análise ainda mais complicada.
A Estreptomicina, Neomicina e Gentamicina são princípios ativos dos
medicamentos de uso veterinário: Leocillin®, Newmast® e Mastifin
respectivamente. Estes medicamentos são amplamente utilizados na medicina
veterinária principalmente no tratamento da mastite bovina.
1.1.1.1.3 – M
ÉTODOS
E
MPREGADOS NA
D
ETERMINAÇÃO DE
A
NTIBIÓTICOS
A
MINOGLICOSÍDEOS
Historicamente, os ensaios microbiológicos, radioenzimáticos (REA) e
radioimunológicos (RIA) têm sido utilizados na determinação de resíduos de
antibióticos aminoglicosídeos no leite, embora seja reconhecida a falta de
performance quantitativa ou qualitativa desses métodos.
O ensaio microbiológico baseia-se na difusão em agar da substância e
da concentração dependente do crescimento da inibição (zona de inibição) do
organismo analisado, o qual é inoculado no agar. Este ensaio requer de 12 a 48
horas de incubação, após a qual a inibição da bactéria em crescimento é medida.
Vários fatores influenciam na precisão e exatidão do método, entre
eles a temperatura de incubação, pH do agar e concentração de íons, profundidade
do agar no prato, teste de tensão, tempo de incubação e a presença de outros
antibióticos na amostra podem afetar o ensaio, além da necessidade do uso de
diferentes pHs no agar para diferentes aminoglicosídeos.
Apesar de os métodos microbiológicos serem versáteis, simples e
relativamente baratos, eles são sujeitos a interferências causadas por inibidores não
específicos ou outros fármacos antimicrobianos. Além disso, a repetibilidade e
Introdução
13
reprodutibilidade dos resultados são geralmente baixas, de acordo com a matriz
avaliada.
12,13, 17
Tabela 1.4: Características físicas e químicas dos antibióticos aminoglicosídeos
12
Aminoglicosídeo Fórmula
Molecular
Massa
Molar
(g/mol)
Ponto de
Ebulição
(ºC)
Rotação
Ótica [α
αα
α]
D
Amicacina C
22
H
43
N
7
O
13
585,6 203-204 +99°
Dihidroestreptomicina
C
21
H
41
N
7
O
12
583,6 - Levógiro
Dibecacina C
18
H
37
N
5
O
8
451,5 - +132°
Gentamicina C
1
C
21
H
43
N
5
O
7
477,6 94-100 +158°
Gentamicina C
2
C
20
H
41
N
5
O
7
463,6 107-124 +160°
Gentamicina C
1a
C
19
H
39
N
5
O
7
449,5 - +165,8°
Canamicina A C
18
H
36
N
4
O
11
485,2 - +146°
Canamicina B C
18
H
37
N
5
O
10
483,6 178-182 +114°
Canamicina C C
18
H
36
N
4
O
11
484,6 - +126°
Neomicina C
23
H
46
N
6
O
13
614,6 - +80°
Netilmicina C
21
H
41
N
5
O
7
475,6 - +164°
Sisomicina C
19
H
37
N
5
O
7
447,5 198-201 +189°
Estreptomicina C
21
H
39
N
7
O
12
581,6 - Levógiro
Tobramicina C
18
H
37
N
5
O
9
467,5 - +128°
O ensaio radioimunológico é um aperfeiçoamento do microbiológico,
sendo mais sensível e específico, no entanto, a presença de outros antibióticos
aminoglicosídeos pode causar interferências. Este tipo de análise requer
complicados parâmetros de otimização, assim como especialização do analista, pois
a seleção e preparação dos anticorpos específicos disponíveis são difíceis; além
Introdução
14
disso, a manipulação de materiais radioativos, o lixo radioativo produzido e o alto
custo são fatores que tornam o método pouco atrativo.
12,13,17
O método radioenzimático oferece vantagens similares as do
radioimunológico, entretanto a instabilidade das enzimas e a presença de outros
antibióticos na amostra pode causar resultados falsos, ocasionando a destruição
desnecessária de lotes de leite.
12,13,17
Poucos métodos por cromatografia gasosa têm sido desenvolvidos
para a análise dos aminoglicosídeos, uma vez que esses compostos não são voláteis
o suficiente ou são termicamente instáveis, sendo necessárias etapas de derivação
para posterior análise.
11,13
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), devido a sua
sensibilidade e seletividade, tem sido a técnica analítica mais empregada na análise
de antibióticos aminoglicosídeos; no entanto, vários métodos desenvolvidos
apresentam problemas de robustez e reprodutibilidade. Além disso, a baixa
solubilidade em solventes orgânicos dificulta a extração e concentração dos
analitos a partir da matriz biológica, envolvendo etapas de pré-tratamento
laboriosas.
13
A maioria dos métodos de pré-tratamento e extração dos antibióticos
aminoglicosídeos a partir de matrizes complexas, faz uso de cromatografia de troca
iônica em pH alto ou baixo, ou pareamento iônico, em solução aquosa ou
metanólica. De um modo geral, a extração em fase sólida (SPE) utilizando
cartuchos de troca catiônica é a técnica mais empregada.
Para as análises envolvendo leite, por exemplo, é realizado uma
extração líquido-líquido para a retirada de gordura, em seguida as proteínas são
precipitadas com ácidos, como por exemplo, o tricloroacético (TCA) para posterior
extração em fase sólida utilizando cartuchos de troca iônica, geralmente WCX-SPE
(weak cation exchange-solid phase extraction).
18-24
Introdução
15
Do mesmo modo, devido ao caráter polar destes compostos, as
análises por cromatografia no modo reverso de eluição são dificultadas. Os
métodos utilizados para minimizar estes problemas são:
a) uso de cromatografia de troca iônica (colunas SCX (strong cation
exchange) ou WCX (weak cation exchange));
b) cromatografia de pareamento iônico utilizando colunas C
18
na
presença de alquilsulfonatos como agentes de pareamento iônico, ou em
combinação com detectores como o espalhamento de luz (ELSD) e o espectrômetro
de massas (MS) utilizando como fase móvel agentes de pareamento voláteis como
ácido pentafluorpropiônico (PFPA) e ácido heptafluorbutírico (HFBA); ou ainda
c) métodos de derivação para a obtenção de compostos menos polares
podendo ser separados e analisados por cromatografia no modo reverso.
19,20,25,26
A derivação desses compostos também auxilia no desenvolvimento de
métodos com a utilização de detectores como o ultravioleta e/ou fluorescência, uma
vez que os aminoglicosídeos não possuem grupos cromóforos. Deste modo, os
métodos desenvolvidos utilizando esses detectores obrigatoriamente fazem uso de
pré/pós-coluna de derivação. Os problemas relacionados a esses métodos são
tempos de análise extensos, baixa sensibilidade, e às vezes, falta de
reprodutibilidade pode ser verificada devido à ocorrência de reações incompletas.
Detectores como o espectrômetro de massas e o espalhamento de luz
têm se destacado na análise dessa classe de compostos. Uma das grandes vantagens
da utilização do espectrômetro de massas como detector nas análises
cromatográficas de resíduos de antibióticos em matrizes biológicas é, além da alta
sensibilidade e da possibilidade de identificação, a não necessidade de derivação da
amostra.
Introdução
16
A maioria dos métodos descritos utilizando LC-MS para este tipo de
análise faz uso das interfaces ESI (electrospray) e APCI (ionização química a
pressão atmosférica), por serem técnicas de ionização mais brandas.
11, 12, 15, 27, 28
O detector de espalhamento de luz (ELSD) é um detector bastante
utilizado para quantificação de ácidos graxos e análise de pureza; tem como
princípio a nebulização da fase móvel com um gás inerte e evaporação do solvente
para produzir pequenas partículas que serão detectadas em uma cela de
espalhamento de luz. A intensidade da luz espalhada depende do tamanho das
partículas formadas durante o processo de nebulização.
29, 30
É um detector com
menor sensibilidade, mais simples e barato quando comparado ao espectrômetro de
massas, e tem sido bastante utilizado na análise de formulações de antibióticos
aminoglicosídeos.
31-38
1.1.1.2 – A
NTIBIÓTICOS Β
-
LACTÂMICOS
Assim como os aminoglicosídeos, a classe de antibióticos pertencentes
às β-lactamas, que incluem as penicilinas e cefalosporinas, está dentre as mais
amplamente utilizadas na medicina veterinária, em especial no tratamento da
mastite bovina.
1
1.1.1.2.1 – C
LASSIFICAÇÃO
,
ESTRUTURA E CARACTERÍSTICA QUÍMICA
Os antibióticos β-lactâmicos consistem basicamente de duas classes de
compostos termolábeis que compreendem as penicilinas e cefalosporinas. Ambas
as classes contém uma cadeia lateral volumosa ligada ao ácido nucléico 7-
aminocefalosporínico (anel diidrotiazina (I) de 6 membros nas cefalosporinas (A)),
Introdução
17
e ao ácido 6-aminopenicilínico (anel tiazolidina (II) de 5 membros nas penicilinas
(B)) respectivamente, como apresentado na Figura 1.3.
1, 39,40
Figura 1.3 – Núcleo das cefalosporinas (A) e das penicilinas (B).
Um estudo mais detalhado, realizado com os antibióticos
cefalosporínicos revela que esses podem ser derivados a partir do mesmo precursor
das penicilinas, a cisteína e a valina (Figura 1.4).
41
Figura 1.4 – Precursores das penicilinas e cefalosporinas.
41
Os antibióticos cefalosporínicos são divididos em quatro gerações de
acordo com a extensão da sua atividade antibacteriana e assumem hoje um papel
importante na medicina veterinária devido ao amplo espectro antibacteriano que
possuem contra bactérias Gram-positivas e negativas
42
. Apresentam vantagens
clínicas de serem antibióticos de baixo risco alérgico, não tóxicos, o que garantem
(A)
1
2
3
4
56
7
1
2
3
4
5
6
N
S
N
R
2
O
R
1
H
O
O
N
S
H
R
1
O
N
I
II
COO
H
COOH
(B)
CIS
VAL
CIS
VAL
Introdução
18
uma ampla utilização desta classe de fármacos no tratamento da mastite bovina.
39,
40, 42,43
As cefalosporinas naturais exibem pouca atividade antibacteriana; no
entanto, modificações estruturais da cefalosporina C (Figura 1.5), a única
encontrada na natureza, pela adição de diferentes cadeias laterais gerou toda a
classe de antibióticos das cefalosporinas (Figura 1.6).
As modificações realizadas na posição 7 do anel β-lactâmico
(acilamida) estão associadas a uma alteração na atividade antibacteriana, enquanto
que as substituições na posição 3 do anel diidrotiazínico (3-acetoximetila)
encontram-se associadas a mudanças no metabolismo e nas propriedades
farmacocinéticas destes fármacos.
42
Essas modificações no entanto, são realizadas
de modo a preservar os sítios ativos da molécula, onde o anel β-lactâmico, o
sistema bicíclico, a estereoquímica dos grupos ligados aos anéis e a presença de um
ácido carboxílico livre na posição 4 são essenciais.
41, 43, 44
Figura 1.5 – Estrutura química da cefalosporina C.
41
S
OAc
HH
NNH
2
O
H
CO
2
H
CO
2
H
N
O
Introdução
19
Figura 1.6 – Estrutura química de alguns antibióticos cefalosporínicos.
Em geral, os antibióticos cefalosporínicos são hidrofílicos e possuem
no mínimo dois sítios propícios para ionização, sendo um de caráter ácido (ácido
carboxílico; pKa
1
= 1,5 – 3,1) e outro de caráter básico (amina; pKa
2
= 6,8 – 7,4)
(Figura 1.7).
Figura 1.7 – Sítios de ionização do núcleo cefano.
Essas características conferem a estes compostos propriedades
químicas que dificultam sua extração e análise a partir de matrizes complexas, uma
S
N
H
H
O
N
H
O
O
CH
3
O
COONa
N C
H
S
N
S
COOH
H
H
O
N
H
O
OH
N
O
N
N
O
O
H
3
C
N
N
N
N
CH
3
S
N
COOH
H
H
O
N
H
O
CH
3
NH
2
Cefacetril
Cefalexin
a
Cefoperazone
7
1
2
3
4
5
6
N
S
N
R
2
O
R
1
H
O
COOH
pKa
2
= 6,8 – 7,4
pKa
1
= 1,5 – 3,1
Introdução
20
vez que pequenas variações no meio alteram completamente o comportamento
desses compostos.
1.1.1.2.2 – A
PRESENTAÇÃO DOS
M
ÉTODOS
E
MPREGADOS NA
D
ETERMINAÇÃO DE
A
NTIBIÓTICOS CEFALOSPORÍNICOS
Assim como para os aminoglicosídeos, ensaios imunológicos e
microbiológicos têm sido amplamente utilizados para a determinação de resíduos
de antibióticos cefalosporínicos em leite. Do mesmo modo, é constante a busca por
métodos de analise simples, seletivos, sensíveis e seguros e a cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE) tem se destacado, principalmente quando acoplada a
técnicas de detecção mais sensíveis como espectrometria de massas.
O uso da CLAE permite, além do desenvolvimento clássico de
métodos analíticos, o desenvolvimento de métodos sensíveis, precisos e seletivos,
adequados para aplicação em estudos relacionados à farmacocinética e
farmacodinâmica de fármacos e em testes comprobatórios da ausência de resíduos
de antibióticos em alimentos.
6, 45
Deste modo, foram desenvolvidos vários métodos, tanto para a análise
e quantificação de cefalosporinas em fluidos biológicos
6, 11, 27, 45, 46-52
quanto para a
análise e quantificação desses antibióticos em formulações farmacêuticas
53-55
.
JOHNSON e colaboradores
47
desenvolveram um método para análise
de cefradina em plasma humano utilizando cromatografina no modo reverso de
eluição (150 × 4,6 mm d.i.; 5 µm), detecção por UV-VIS e precipitação das
proteínas utilizando ácido perclorico 4% (v/v).
NISHINO e colaboradores
48
apresentaram um método de análise de
cefmatilena e sete metabólitos em plasma e urina humana e animal; neste trabalho
os autores utilizaram duas pré-colunas de troca iônica, sendo a primeira de troca
Introdução
21
aniônica e a segunda de troca catiônica seguida da coluna analítica C
18
. O pré-
tratamento das amostras envolveu um sistema de ultrafiltração, precipitação e
diluição das amostras antes da injeção no sistema cromatográfico. Da mesma
forma, MOATS
50
desenvolveu um método multiresíduo em leite bovino e tecidos
utilizando como pré-tratamento da amostra precipitação das proteínas seguida de
diluição para posterior análise utilizando o modo reverso de eluição com detecção
por UV.
Em uma abordagem geral, cromatografia no modo reverso (C
18
e C
8
);
fases móveis constituídas por solução tampão com diferentes valores de pH;
cromatografia de pareamento iônico e troca iônica e o uso de detecção no
ultravioleta são encontrados na maioria desses trabalhos.
Na etapa de pré-tratamento da matriz biológica, os métodos utilizados
envolvem a precipitação das proteínas, seguida ou não por uma extração líquido-
líquido ou então a extração em fase sólida. A ultrafiltração com membranas
também tem sido utilizada.
Em nosso grupo de pesquisa, a injeção direta de amostras tem sido
aplicada com sucesso na análise desses compostos em leite bovino, oferecendo
várias vantagens em relação aos métodos convencionais, tais como, economia de
tempo, menor manuseio das amostras biológicas e volume reduzido de lixo
químico gerado.
56, 57
1.1.2 - A
NTI
-
HELMÍNTICOS
Assim como os antibióticos, os anti-helmínticos têm sido amplamente
utilizados na medicina veterinária na prevenção e no tratamento de vermes e
nematóides gastrointestinais. Estudos veterinários mostraram que o gado pode
desenvolver imunidade a parasitas no primeiro ou segundo período de pastagem;
Introdução
22
no entanto, animais adultos podem ainda serem infectados com diferentes vermes.
Estas infecções são normalmente sub-clínicas, mas no caso de vacas leiteiras, têm
sido associadas com a diminuição da produção de leite. Além disso, estudos
demonstraram que o tratamento de animais infectados influencia significantemente
na produção de leite.
58
O termo anti-helmíntico aplica-se a substâncias que atuam localmente
para expulsar os vermes do trato gastrintestinal ou sistemicamente, para erradicar
espécies e formas de helmintos em desenvolvimento, que invadem órgãos ou
tecidos. Podem atuar produzindo paralisia no verme ou lesionando sua cutícula,
resultando em digestão parcial ou rejeição do verme por mecanismos
imunológicos; podem também atuar no metabolismo do verme, esgotando suas
reservas energéticas.
59, 60
A administração racional de anti-helmínticos tem trazido benefícios à
pecuária, tanto para gado de corte quanto para a pecuária leiteira. De acordo com
dados do Conselho Regional de Medicina Veterinária do Estado do Paraná, o ganho
de peso vivo foi superior em 40 kg nas novilhas tratadas com anti-helmíntico,
quando comparadas com aquelas não tratadas.
61
Da mesma forma, foi também verificado o aumento na quantidade
produzida de leite, durante 220 dias de estudos, onde vacas tratadas com anti-
helmíntico produziram 63 litros de leite a mais que os animais do grupo controle. A
produção de proteínas e gorduras no leite foi também superior nos animais tratados,
sendo de 2,8 kg em relação à produção do grupo controle (Tabela 1.5).
62, 63
Introdução
23
Tabela 1.5: Resultado da produção leiteira por animal, de 835 fêmeas tratadas com
anti-helmíntico e 835 fêmeas controle tratadas com placebo, durante 220 dias de
estudo
62
Variáveis Controle
sem Tratamento
Tratado com
Anti-Helmíntico
Leite (L)
4966 5029
Gordura (kg)
200,4 203,2
Proteína (kg)
164,3 167,1
De acordo com esses dados, a produção leiteira diária é
consideravelmente beneficiada com o uso de anti-helmínticos no tratamento de
vermes. No entanto, é importante lembrar que o prazo de eliminação desses
compostos deve ser respeitado para evitar problemas com relação a resíduos dos
mesmos em alimentos.
A principal toxicidade relacionada a estes compostos envolvem efeitos
teratogênicos e alguns estudos revelam que os metabólitos apresentam toxicidade
superior aos compostos de origem.
64
As principais classes de anti-helmínticos utilizadas na pecuária
pertencem às avermectinas, aos benzimidazóis, imidazotiazóis e salicilanilídeos
(Figura 1.8).
1
Dentre estes, os benzimidazóis são os mais amplamente utilizados na
medicina veterinária, devido ao amplo espectro anti-helmintico.
Introdução
24
Figura 1.8:
Principais anti-helmínticos utilizados na medicina veterinária.
1
1.1.2.1
–
ANTI
-
HELMINTICOS BENZIMIDAZÓLICOS
O tiabendazol foi o primeiro anti-helmintico benzimidazólico a ser
comercializado a mais de 40 anos. Desde a sua descoberta, vários anti-helmínticos
da classe dos benzimidazóis têm se tornado disponível para o tratamento de uma
gama de helmintoses. O amplo espectro de atividade desses medicamentos, o baixo
custo, a alta eficácia e a facilidade da sua administração tornaram os
benzimidazólicos amplamente utilizados no tratamento, em larga escala, de
infecções parasitárias na medicina veterinária.
1, 64
Levamizol
Fembendazol
Tiabendazol
Albendazol
Ivermectina
Levamizol
Fembendazol
Tiabendazol
Albendazol
Ivermectina
Introdução
25
Diferentes modos de ação têm sido propostos para os medicamentos
benzimidazólicos,
mas provavelmente a sua principal ação é inibir a polimerização
dos microtúbulos, unindo-se à β-tubulina.
63
. O albendazol (ABZ), por exemplo, é
um pró-fármaco, cujo metabólito é responsável por bloquear a recepção de glicose
em parasitas susceptíveis nos estágios de larva e adultos, diminuindo as reservas de
glicogênio e consequentemente diminuindo a formação de adenosina tri-fosfato
(ATP).
64
A classe dos benzimidazóis possuem basicamente em sua estrutura um
anel imidazólico contendo um átomo de nitrogênio ácido e um básico que, sob
condições ideais pode estar protonado (pKa ∼ 5-6) ou desprotonado (pKa ∼ 12),
respectivamente (Figura 1.9).
Figura 1.9 – Ionização do núcleo imidazólico sobre condições ácidas (A) e básicas
(B).
O albendazol (ABZ) é dentre os benzimidazois, o anti-helmíntico mais
rotineiramente utilizado na medicina veterinária devido ao amplo espectro de
N
N
H
N
N
H
H
H
N
N
H
H
3
O
+
+
Átomo de nitrogênio básico (pKa ~5-6)
+
N
N
N
N
-
-
N
N
H
OH
-
Átomo de nitrogênio ácido (pKa ~12)
A
B
Introdução
26
atividade que este possui frente a diferentes classes e estágios de parasitas. É
relativamente insolúvel em água e na maior parte dos solventes orgânicos,
propriedade esta que influencia sua absorção e comportamento no organismo.
64
De acordo com DAYAN
65
, a absorção oral de ABZ em camundongos
e ratos é aproximadamente de 20-30% e em gado alcança valores de 50%,
comparado com aproximadamente 1-5% em humanos. A absorção em humanos é
intensificada pela presença de alimentos gordurosos, podendo ser aumentada em
até cinco vezes.
59
O albendazol é um pró-fármaco bastante interessante, uma vez que
durante sua metabolização requer ativação no fígado pelo citocromo P450
(CYP450), tanto em animais como em humanos.
65
Essa metabolização, após
administração oral, é bastante rápida, não sendo o ABZ detectado em plasma de
carneiros, de gado e de humanos.
66
A farmacocinética do albendazol foi analisada em diferentes espécies
animais, onde estudos envolvendo carneiros
66
, bezerros
67
e humanos
68, 69
demonstraram que este é rapidamente e extensivamente metabolizado para a forma
albendazol-sulfóxido (ABZ-SO), albendazol-sulfona (ABZ-SO
2
) e albendazol-2-
amino-sulfona (ABZ-SO
2
-NH
2
) (Figura 1.10).
O albendazol-sulfóxido apresenta um centro assimétrico no átomo de
enxofre, apresentando-se na forma dos enantiômeros R-(+)-ABZ-SO e o S-(-)-
ABZSO.
69
Introdução
27
Figura 1.10: Metabólitos majoritários do albendazol.
O albendazol-sulfóxido, metabólito ativo, é considerado direta ou
indiretamente responsável pela eficácia e toxicidade do albendazol, sendo oxidado
e convertido em albendazol-sulfona. O grupo carbamato também é rapidamente
removido por hidrólise, levando a formação do albendazol-2-amino-sulfona. Este
último é o metabólito minoritário e, assim como o albendazol-sulfona, não
apresenta atividade farmacológica.
65
Diferenças no metabolismo deste fármaco têm sido observadas de
acordo com o animal estudado.
68, 70
Em estudo realizado por CRISTOFOL e
colaboradores
71
, bezerros tratados com (±)-ABZ-SO, apresentaram metabolismos
diferentes, onde o S-(-)-ABZ-SO é metabolizado significativamente mais rápido
que o seu enantiômero, o R-(+)-ABZ-SO, sendo o (+)-enantiômero detectado em
plasma de 2,5 minutos a 32 horas após a administração, enquanto que o (-)-
enantiômero foi encontrado de 2,5 minutos a 16 horas.
S
N
N
N
O
O
H
H
Albendazol (ABZ)
S
N
N
N
O
O
H
O
H
Albendazol – Sulfóxido (ABZ-SO)
O
S
N
N
N
O
O
H
O
H
Albendazol – Sulfona (ABZ-SO
2
)
O
S
N
N
N
O
H
2
H
Albendazol-2-Amino- Sulfona
(ABZ-SO
2
-NH
2
)
Introdução
28
Tendo em vista que o albendazol é um pró-fármaco e apresenta baixa
solubilidade em água (0,61 µg/mL), algumas empresas veterinárias têm
comercializado a mistura racêmica do albendazol-sulfóxido, uma vez que este
composto é mais solúvel (62 µg/mL) do que o ABZ, devido a presença do átomo de
oxigênio.
72
Uma vez que esses enantiômeros podem apresentar propriedades
farmacológicas diferentes entre si quando administrados em bovinos, torna-se
importante a existência de métodos analíticos enantiosseletivos para a quantificação
simultânea dos metabólitos do albendazol, em fluidos biológicos. Análises desse
tipo podem fornecer informações importantes sobre o metabolismo e
farmacocinética do fármaco, contribuindo tanto para o controle parasitário em
animais quanto para o estudo toxicológico e de resíduos dessas substâncias em
alimentos.
1.1.2.2
–
M
ÉTODOS EMPREGADOS NA DETERMINAÇAO DE
ALBENDAZOL E SEUS METABÓLITOS
Ensaios imunológicos e microbiológicos têm sido utilizados para a
determinação de albendazol e seus metabólitos. No entanto, os métodos
cromatográficos são os que têm prevalecido e a cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) tem se destacado, principalmente quando acoplada a técnicas
mais sensíveis como espectrometria de massas, uma vez que a metabolização desde
fármaco é rápida e os níveis de resíduos são baixos.
De uma maneira geral, os métodos fazem uso de cromatografia no
modo reverso de eluição, utilizando colunas C
8
, C
18
e fenil e utilizando sistemas de
fase móvel baseada na supressão iônica, com o uso de solução tampão com
Introdução
29
diferentes valores de pH. Poucos métodos utilizam cromatografia quiral,
principalmente na análise de leite bovino.
O uso de detecção no ultravioleta e fluorescência são encontrados na
maioria dos trabalhos
64, 66, 68-70, 73-75
; a detecção por espectrometria de massas tem
sido mais utilizada para a determinação de resíduos de benzimidazois em matrizes
biológicas com a vantagem de oferecer uma análise quantitativa-confirmatória.
76, 77
A maioria dos métodos reportados faz uso de instrumentos com analisadores do
tipo quadrupolo e um número limitado de estudos utilizando o analisador ion-trap.
64, 78
O pré-tratamento das amostras, de uma maneira geral, envolve etapas
de extração em fase sólida ou a extração liquido-líquido utilizando soluções
aquosas a um pH alto. Entretanto a polaridade e o pKa podem diferir entre os
benzimidazóis e metabólitos não apenas dificultando o desenvolvimento de
métodos multi-resíduos, mas também o desenvolvimento de métodos de
benzimidazois específicos e seus metabólitos.
Em métodos desenvolvidos para análise de albendazol em leite
58, 74, 79
,
a precipitação de proteínas, seguida da extração líquido-líquido e SPE são as
técnicas mais utilizadas; cabe ressaltar que nenhum deles faz uso de extração on-
line utilizando colunas de acesso restrito para uma análise quiral dos enantiômeros
R-(+)-ABZ-SO e S-(-)-ABZ-SO.
Vale destacar também que a separação de enantiômeros de sulfóxidos
quirais vem sendo bastante estudada em nosso grupo de pesquisa, onde a utilização
de colunas de polissacarídeo tem se destacado na resolução de uma série de
sulfóxidos quirais.
80-85
Essas fases, apesar de terem sido originalmente
desenvolvidas para serem usadas no modo normal, também possuem poder de
resolução no modo reverso de eluição
80
, apresentando grande versatilidade e
aplicabilidade, com alto poder de discriminação quiral e reprodutibilidade.
Introdução
30
1.2
–
L
EITE BOVINO
:
COMPOSIÇÃO
,
IMPORTANCIA ECONOMICA E
NUTRICIONAL
O leite pode ser definido como uma emulsão de cor branca,
ligeiramente amarelada, de odor suave e gosto adocicado. É secretado pelas
glândulas mamarias, sendo um alimento indispensável aos primeiros meses de vida
dos mamíferos.
A composição do leite de vaca varia de acordo com a espécie, a raça, a
individualidade, a alimentação, o tempo de gestação e outros fatores. Em volume, a
água constitui o principal componente do leite, cerca de 87,5%, influindo
sensivelmente na densidade do leite, a qual é ligeiramente superior a da água, entre
1,028 e 1,033 g/mL; o restante, 12,5% de matéria seca total, compreende gordura
(3,6%), lactose (4,5%), proteína (3%) e sais (0,7%). O valor energético é de 68
calorias. É ligeiramente ácido no estado natural com pH em torno de 6,50 – 6,65.
85
Com relação ao aspecto nutricional, o leite é um importante alimento,
sendo considerado como uma inesgotável fonte de nutrientes essenciais tanto para o
crescimento de jovens e crianças, como para manutenção de uma vida saudável de
adultos e idosos. Além do que, o valor nutritivo do produto tem sido potencializado
através do seu enriquecimento com vitaminas, minerais, ômegas
a
e ausência de
lactose.
86
Com relação a produção de leite, a FAO (Food and Agricultural
Organization) divulgou em junho de 2007, a produção de leite mundial referente ao
ano de 2006 e uma projeção para 2007, e embora ainda não tenha publicado novos
dados, este último estimou a produção mundial em 2006 de 656,8 bilhões de quilos
de leite (2,3% acima da de 2005) e projetou a de 2007 em 674,6 bilhões de quilos
(Tabela 1.6).
a
Ômegas são ácidos graxos considerados essenciais para manutenção de uma vida saudável.
Introdução
31
Este crescimento deve-se principalmente à contribuição isolada de
países como Brasil, Argentina, China e Nova Zelândia. A tendência, de acordo com
esses dados, é que este panorama continue a repetir nos próximos anos, com o
crescimento se concentrando ainda mais em alguns poucos países, dentre os quais o
Brasil deve continuar ocupando papel de destaque.
87
Tabela 1.6: Leite - Produção mundial e dos principais países produtores.
87
(bilhões de quilos)
Países 2005 2006 2007
União Européia 146,9 145,5 154,5
Índia (1) 95,1 98,4 101,4
EUA 80,3 82,5 83,5
China 32,3 38,4 45,3
Federação Russa 31,1 31,2 31,4
Paquistão 29,7 30,6 31,8
Brasil 24,7 25,5 26,3
Nova Zelândia (2) 14,5 14,9 15,1
Ucrânia 13,7 13,3 13,4
Argentina 10,1 10,8 11,7
Outros países 163,9 165,7 160,2
Mundo 642,3 656,8 674,6
Fonte: FAO (Perspectivas Alimentarias - Junho/07).
(1) Campanha começa em abril do ano indicado.
(2) Campanha termina em maio do ano indicado.
Para o Brasil, o último dado oficial disponível é relativo ao ano de
2006. Segundo o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), a produção
de 2006 alcançou 25,398 bilhões de litros, 3,2% acima da produção brasileira de
2005, de 24,621 bilhões de litros. É uma taxa de crescimento superior à mundial,
que, segundo os números de junho da FAO, teria aumentado 2,3% de 2005 para
2006.
87
Para 2007, embora ainda não existam estimativas sobre a produção
nacional total, levando em consideração o crescimento do primeiro semestre na
Introdução
32
quantidade de leite recebida por algumas indústrias inspecionadas, espera-se um
crescimento mais expressivo do que o verificado em 2006 (Tabela 1.7).
Tabela 1.7:
Leite - Produção destinada à industrialização -
Brasil e principais
estados (milhões de litros).
87
Primeiro semestre
Estado 2005 2006
2005 2006 2007¹
Minas Gerais 4.700,9 4.694,9 2.271,9 2.326,4 2.359,4
Rio Grande do Sul 1.979,5 2.252,5 875,2 995,9 1.151,3
Goiás 2.036,9 2.166,6 1.005,2 1.070,9 1.092,9
São Paulo 2.299,9 2.113,7 1.148,6 1.048,6 1.038,5
Paraná 1.375,7 1.409,6 657,4 663,7 685,2
Santa Catarina 817,1 976,5 367,7 451,8 487,7
Rondônia 568,9 580,3 286,5 295,1 319,4
Rio de Janeiro 421,4 417,1 196,4 200,3 198,6
Mato Grosso 319,9 333,9 166,7 165,6 205,5
Bahia 325,3 284,2 156,1 171,4 136,9
Outros 1.439,0 1.440,5 719,6 712,3 801,9
Brasil 16.284,3 16.669,7 7.851,4 8.101,9 8.477,3
Fonte: IBGE - Pesquisa Trimestral do Leite.
(1) Dados preliminares.
De acordo com os índices apresentados, pode-se avaliar a importância
da produção leiteira no cenário da produção agropecuária e seguramente afirmar
que o aumento expressivo obtido na produtividade de leite é o resultado da adoção
de novas técnicas, que propiciam melhora significativa na qualidade e na
produtividade, além de grandes esforços realizados com pesquisas genéticas de
Introdução
33
animais produtores; melhores condições adotadas de instalação para o rebanho e a
qualidade na nutrição e na saúde dos animais.
88, 89
Vale destacar que esses cuidados são resultados diretos da grande
atenção que tem sido dada às questões relacionadas à qualidade e à segurança
alimentar, onde o desenvolvimento de métodos de análise mais sensíveis e seletivos
para o controle de qualidade desses alimentos têm contribuído significantemente
para que o país possa continuar despontando neste setor produtivo e enfrentando os
desafios provocados pela competitividade no mercado internacional.
88, 89
1.3 – P
RÉ
-T
RATAMENTO DE
A
MOSTRAS
B
IOLÓGICAS
Um dos primeiros e mais difíceis passos necessários para a análise de
fármacos em fluidos biológicos é a extração e limpeza (clean-up) do fármaco a
partir da matriz biológica, sendo este um pré-requisito para todos os procedimentos
analíticos. De um modo geral, a etapa de preparação da amostra é a que requer mais
tempo e a que leva ao maior número de erros e, em conseqüência, deve fazer parte
do método como um todo quando da validação do mesmo.
90
Fluidos biológicos não devem ser injetados diretamente nas colunas
analíticas comuns de CLAE uma vez que as proteínas presentes nas matrizes
biológicas causam o entupimento e perda de eficiência das mesmas, devido a
adsorção acumulativa no suporte. Para evitar a rápida deteriorização da coluna
analítica, é necessário realizar um pré-tratamento da amostra antes da sua injeção
no sistema cromatográfico; este pré-tratamento visa obter os analitos livre da
presença de proteínas e da interferência dos compostos endógenos presentes na
matriz biológica.
90, 91
Introdução
34
O pré-tratamento adequado a ser feito depende da matriz com a qual se
está trabalhando, bem como a que se aplica o método. Um dos procedimentos
usuais de preparação das amostras biológicas é a limpeza da matriz biológica
através da precipitação dos interferentes com um solvente apropriado e envolve as
seguintes etapas:
90, 92
precipitação e centrifugação das proteínas; extração dos
analitos a partir do sobrenadante, utilizando solventes orgânicos; evaporação do
solvente de extração; reconstituição dos analitos na fase móvel e, finalmente,
injeção no sistema cromatográfico. Em muitos casos, entretanto, após a
precipitação e centrifugação das proteínas, o sobrenadante é injetado no sistema
cromatográfico.
Outros dois métodos amplamente utilizados são as extrações líquido-
líquido ou extrações em fase sólida.
92, 93
No primeiro caso, a extração dos analitos
é realizada pela partição da amostra entre dois líquidos imiscíveis, sendo
normalmente um aquoso e outro orgânico. A extração em fase sólida emprega
cartuchos empacotados com sílicas derivadas ou não e baseia-se na retenção
seletiva dos analitos de interesse presentes na matriz biológica.
As extrações líquido-líquido ou em fase sólida tornam-se muito
interessante quando além da extração se faz necessário a concentração dos solutos.
Por outro lado, tais métodos podem apresentar vários problemas como, por
exemplo, falta de reprodutibilidade dos resultados, requerem um grande consumo
de tempo, são de difícil automação e necessitam de grandes quantidades de
solventes que muitas vezes são tóxicos.
93
A etapa de preparação das amostras pode ser muitas vezes, um fator
limitante no tempo total da análise. Deste modo, numerosos esforços têm sido
realizados com o intuito de diminuir o tempo gasto com o pré-tratamento das
amostras biológicas e minimizar as perdas do analito que muitas vezes estão
presentes como traços.
Introdução
35
Visando simplificar, economizar tempo e diminuir o manuseio de
amostras, novos métodos de pré-tratamento, envolvendo a injeção direta de
amostras biológicas no sistema de CLAE, estão sendo extensamente
investigados.
94-96
Dentre esses métodos, o uso de colunas contendo fases de acesso
restrito (RAM), ou seja, fases que permitem injeções diretas e repetitivas de
biofluídos não tratados no sistema de CLAE
91, 97-100
têm se destacado.
Esses métodos são bastante vantajosos em pesquisa e análises clínicas,
toxicológicas e farmacêuticas, devido a sua capacidade de reduzir o tempo e a mão-
de-obra empregados no procedimento analítico.
1.3.1 – F
ASES DE
A
CESSO
R
ESTRITO
(RAM)
O termo “fase de acesso restrito”, introduzido por DESILETS e
colaboradores
99
, em 1991, expressa a acessibilidade limitada de macromoléculas
aos sítios de adsorção interno do suporte poroso devido a sua elevada massa
molecular.
O princípio fundamental das fases de acesso restrito é a presença de
uma superfície hidrofílica, responsável pela exclusão não adsortiva de
macromoléculas (proteínas, ácidos nucléicos) no volume morto da coluna sem
acumulação destrutiva, e de sítios hidrofóbicos onde as pequenas moléculas
(fármacos e seus metabólitos) se ligam sendo retidas e separadas.
101, 102
Essas
colunas, portanto, combinam os princípios da cromatografia de exclusão e de fase
reversa ou de troca iônica, para produzir uma Cromatografia de Superfície
Discriminante.
100-104
Inicialmente, as fases RAM foram classificadas de acordo com o
mecanismo de exclusão de macromoléculas. Esse mecanismo fundamenta-se em
Introdução
36
uma barreira de difusão física, baseada no tamanho do poro da sílica utilizada, para
evitar o acesso das macromoléculas ao interior dos poros, e/ou uma barreira de
difusão química criada por uma rede de polímeros sintéticos/naturais ou proteínas,
ligados covalentemente ou simplesmente adsorvidos a superfície do suporte, para
evitar a difusão das proteínas.
105
BOSS e RUDOLPHI
101
ampliaram essa classificação, considerando o
tipo de grupo ligado na superfície interna e externa das partículas, subdividindo a
classificação em quatro grupos como: fases de superfície bimodal e unimodal,
ambas com barreiras de difusão química e física (Figura 1.11).
As fases de superfície bimodal são caracterizadas pela presença de
uma região externa hidrofílica e outra interna hidrofóbica. Aqui estão agrupadas
entre outras, as fases reversas imobilizadas com proteínas, as fases ISRP (internal-
surface reversed-phase), ADS (alkyl-diol sílica) e SPS (semi-permeable surface)
91,
99, 102-104, 107-114
(Figura 1.12).
As fases de superfície unimodal apresentam ambas superfícies da
sílica, externa e interna, com caráteres hidrofílicos e hidrofóbicos. Neste grupo
estão incluídas as fases MMP/MFP (mixed-function phase) e SHP (shielded
hydrophobic phase)
101-117
(Figura 1.13).
Introdução
37
Figura 1.11: Classificação das fases RAM.
106
Introdução
38
Figura 1.12: Representação esquemática das fases de acesso restrito bimodal.
115
Figura 1.13: Representação esquemática das fases de acesso restrito unimodal.
115
Introdução
39
Dos diferentes tipos de suportes existentes, a coluna de fase de acesso
restrito imobilizada com proteína tem sido utilizada com sucesso em nosso grupo
de pesquisa para os mais variados tipos de amostras.
56, 57, 118-123
A superfície
externa desta fase é hidrofílica, permitindo a exclusão de proteínas e os poros são
hidrofóbicos o suficiente para reter os fármacos e seus metabólitos.
Essas fases foram primeiramente desenvolvidas por YOSHIDA e
colaboradores
104
, em 1984, realizando simplesmente a saturação de sílica alquílicas
(C
18
), com proteínas desnaturadas.
Mais recentemente, nesta mesma classe, MENEZES e colaboradores
107-109
desenvolveram as fases de albumina sérica bovina ou humana imobilizadas
em suportes de sílica (C
8
e C
18
) e estabilizadas através de ligações cruzadas com
glutaraldeído. Também nesta classe, vale destacar as fases de aminopropil-sílica
conjugada com avidina.
110,111
As colunas RAM possuem uma ampla gama de aplicação dentro das
análises de fármacos e metabólitos em diversos tipos de matrizes biológicas,
enquanto são também muito versáteis quanto à sua utilização, podendo ser
aplicadas no modo simples ou no modo multidimensional de análise.
100, 124, 125
No modo simples, as amostras não tratadas são diretamente injetadas
no sistema cromatográfico, os interferentes são excluídos e os analitos permanecem
retidos com posterior extração por eluição gradiente.
100, 117, 124-126
Desta forma, a
coluna de acesso restrito funciona simultaneamente como coluna de exclusão e
analítica.
MENEZES e FÉLIX
107
descreveram uma metodologia para a análise
de pesticidas em leite utilizando as colunas RAM no modo simples de análise e;
recentemente, FELIX e CAMPÈSE
127
desenvolveram uma nova coluna RAM-
BSA quiral para análise dos fármacos oxazepam, lorazepam, temazepan,
lormetazepan, em plasma humano. A superfície interna da nova fase RAM é
Introdução
40
composta do seletor quiral de β-ciclodextrina e a superfície externa com BSA.
Neste trabalho, foram obtidos excelentes resultados para a exclusão protéica e para
a enantiosseletividade dos fármacos. A extensão para outros seletores quirais está
sendo realizada, como α e γ-ciclodextrinas e antibióticos.
Na maioria dos métodos, as colunas de acesso restrito são utilizadas no
modo multidimensional de análise como colunas extratoras acopladas a colunas
analíticas aquirais
56, 57, 94, 102, 106, 108, 120, 121, 123
ou quirais
118, 119, 122
. As análises são
então realizadas por um sistema de troca de colunas, onde a fração contendo o
analito é transferida de uma coluna para outra através de uma válvula seletora.
Nestes casos de acoplamento de colunas, com diferentes funções em um sistema
cromatográfico, a cromatografia é denominada multidimensional.
92
Essa técnica é
útil em análise de amostras com muitos constituintes, e pode ser utilizada para
fracionar componentes ou possibilitar a determinação de um ou mais componentes
específicos em misturas complexas.
Em geral, o uso de colunas RAM oferece várias vantagens em relação
aos métodos de pré-tratamento off-line, entre elas a eliminação de várias etapas no
pré-tratamento (precipitação de proteínas, centrifugação, evaporação do solvente,
filtração), diminuindo erros de manipulação e perdas do analito; é totalmente
compatível com sistemas automatizados, evitando manuseio de amostras perigosas
ou infecciosas e aumenta significativamente o número de análises por tempo.
120, 126,
127
SOUVERAIN e colaboradores
124
, MULLET
125
e CASSIANO e
colaboradores
105
, em recentes revisões, descreveram métodos para a análise de
fármacos em diversos tipos de fluidos biológicos, usando colunas de acesso restrito
como colunas extratoras. De acordo com estes trabalhos é possível avaliar a grande
aplicação do uso das colunas de fases de acesso restrito para a análise e
quantificação de fármacos, por injeção direta, em diferentes matrizes complexas.
Introdução
41
Foram relatados mais de 140 trabalhos na análise de fármacos em diversas matrizes
biológicas, sendo estas: plasma, soro, lágrima, cultura de células, urina, bile,
tecidos, secreção pulmonar, saliva, microdiálise e leite bovino.
No entanto, o desenvolvimento e a aplicação de métodos utilizando
colunas de acesso restrito para a análise de compostos em leite é ainda muito
restrito.
105, 107-109, 115, 123
Deste modo, dentro deste contexto, o presente trabalho tem também
por objetivo o desenvolvimento de métodos analíticos para a quantificação de
fármacos no leite, por injeção direta de amostras em colunas RAM e emprego da
cromatografia multidimensional, por acoplamento aquiral-aquiral e aquiral-quiral.
1.4
–
E
SPECTROMETRIA DE MASSAS E
E
SPALHAMENTO DE LUZ COMO
DETECTORES NA
A
NÁLISE DE
F
ÁRMACOS E
M
ETABÓLITOS POR
CLAE
1.4.1 – LC-MS/MS
A espectrometria de massas tem sido uma importante ferramenta no
estudo do metabolismo e biodisponibilidade de fármacos, assim como seus
produtos de biotransformação em organismos vivos.
Grande parte desses estudos eram tradicionalmente realizados por GC-
MS, e na maioria dos casos havia a necessidade de preparo da amostra ou derivação
do fármaco, a fim de torná-lo adequado para a análise em fase gasosa. Entretanto, o
uso de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas tem crescido em
importância com o desenvolvimento e aperfeiçoamento de interfaces, que permitem
o acoplamento das técnicas sem perda de eficiência e sensibilidade.
128
O advento da ionização em fase líquida, como por exemplo,
electrospray, tornou possível a aplicação de métodos LC-MS a moléculas de alta
Introdução
42
polaridade. Deste modo, as técnicas de LC-MS têm sido aplicadas a uma ampla
gama de produtos farmacêuticos
11, 12-15, 27, 129
, como anticancerígenos, anti-
helmínticos, antibióticos, ansiolíticos, analgésicos, antiepiléticos, antagonistas de
receptores, antioxidantes e β-bloqueadores; assim como compostos de grande
massa molar que incluem peptídeos naturais e proteínas terapêuticas obtidas pela
tecnologia de DNA recombinante.
128, 129
As interfaces que utilizam técnicas de ionização a pressão atmosférica
(API) são as que atualmente encontram as maiores aplicações; a maioria dos
trabalhos descritos na literatura
128-130
utilizam ESI (electrospray) e APCI
(ionização química a pressão atmosférica) na análise dos compostos de interesse
por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.
A seleção da interface apropriada para um dado analito é feita
considerando-se que o ESI transfere íons da solução para a fase gasosa, enquanto
que na APCI, a ionização ocorre em fase gasosa. Como regra geral, analitos que já
estão ionizados em solução são melhores analisados por ESI, enquanto que, para
analitos não-iônicos, a melhor escolha usualmente recai sobre a interface APCI.
De uma maneira geral, a ionização por electrospray pode ser dividida
em três etapas: nebulização da solução da amostra em partículas eletricamente
carregadas, liberação dos íons das gotículas, e transporte dos íons da região da
fonte de ionização a pressão atmosférica para o vácuo e o analisador de massas do
espectrômetro.
A solução da amostra é introduzida através de um tubo capilar
submetido a um forte campo elétrico onde é criado um fino jato de gotículas
altamente carregadas. O campo elétrico é gerado pela aplicação de uma voltagem
diretamente ao capilar de entrada da solução, contra um eletrodo localizado a
alguns milímetros da ponta do capilar; a voltagem aplicada fornece um gradiente
Introdução
43
eletromagnético necessário para produzir a separação de cargas na superfície do
líquido.
129-132
Nessas condições, o líquido emergente assume um formato cônico;
uma névoa de gotículas carregadas é ejetada da ponta do cone e atraída
eletrostaticamente para o orifício da entrada do espectrômetro. Cada gotícula é
carregada com várias unidades de carga, e enquanto elas decrescem de tamanho
com a evaporação do solvente, a densidade de campo elétrico em sua superfície
aumenta. A repulsão mútua entre as cargas na superfície torna-se tão grande que
excede a força de tensão superficial, fazendo com que a gotícula se desintegre em
várias outras de tamanho menor, que sofrerão o mesmo processo, até que restem
apenas os íons da amostra, que serão levados ao analisador
131
(Figura 1.14).
Figura 1.14 – Mecanismo de funcionamento da técnica ESI.
132
A intensidade do íon depende da sua estrutura e é afetado pela
composição do solvente e presença de aditivos; já a abundância do íon em um
intervalo de m/z é mais afetado pela eficiência do transporte, separação e detecção
do íon. No entanto, para que não haja interferências na abundância e intensidade
dos íons, a formação de um “spray” estável em ESI é fundamental. Variáveis como,
voltagem aplicada, condutividade e tensão superficial do líquido devem ser
cuidadosamente avaliadas.
131, 132
Introdução
44
Solutos de polaridade, volatilidade e massa molar moderada e não
termolábeis podem ser determinados com grande sensibilidade com o uso da
ionização química a pressão atmosférica (APCI). Nesta interface, a fase móvel
vinda do sistema de HPLC é transformada em “spray” e rapidamente evaporada
através de um fluxo de nitrogênio e do aquecimento do nebulizador a altas
temperaturas (100-500 °C). Embora essas temperaturas possam degradar os
analitos, a alta vazão da fase móvel e o fluxo coaxial de nitrogênio evitam a quebra
das moléculas.
132
Nesse modo de ionização, a amostra é ionizada devido à colisão com
íons reagentes gerados a partir da fase móvel e uma descarga elétrica provocada na
ponta de um filamento de aço, denominado corona, posicionado próximo à entrada
da região de alto vácuo do equipamento (Figura 1.15). Esses íons são normalmente
ricos em elétrons e a colisão do analito ocorre sem transferência de energia
excessiva aos íons quase-molecular formados resultando em um menor grau de
fragmentação.
131, 132
A ionização das moléculas da amostra se dá na câmara de ionização
por colisão com um excesso de íons reagentes, a uma pressão relativamente alta
(10
-3
– 10
-2
atm). Os íons reagentes são geralmente positivamente carregados, e são
gerados ou de um gás puro ou de uma mistura de gases.
Introdução
45
Figura 1.15 - Representação esquemática de uma interface do tipo APCI no
sistema MS.
É importante ter em mente que na ionização via APCI, as reações
químicas ocorrem em fase gasosa. O processo começa com a formação de íons N
2
+
e O
2
-
por meio de descargas contínuas da corona; estes íons então reagem com o
solvente e com moléculas do analito. Devido ao tempo relativamente longo de
permanência na fonte de APCI, os íons detectados são resultantes de processos de
equilíbrio em fase gasosa.
A utilização do espectrometro de massas como detector em
cromatografia surgiu como a solução de vários problemas principalmente
relacionados a presença de interferentes na amostra, uma vez que a técnica oferece
alta sensibilidade e seletividade, principalmente com o uso do artifício de
monitoramento de reações múltiplas (MRM) na análise dos íons. No entanto, essa
idéia vem sendo fortemente questionada.
133
Embora a técnica de MRM ofereça a vantagem de monitoramento de
fragmentos específicos de um único íon (alta seletividade), o processo de formação
do íon, tanto em ESI quanto em APCI, pode sofrer interferências resultantes do
meio em que se encontra. Compostos endógenos podem co-eluir com o composto
de interesse quando o pré-tratamento da amostra é mínimo, combinado com um
Introdução
46
baixo tempo de análise cromatográfica. Esses compostos, embora sejam invisíveis
ao detector no modo MRM de análise, podem afetar significantemente a eficiência
e reprodutibilidade do processo de ionização que acontece na interface LC-MS.
Como resultado disso, o chamado efeito de matriz pode causar uma supressão ou
até mesmo um aumento da ionização levando principalmente a problemas de
precisão e exatidão dos métodos.
134
Uma vez que o efeito de matriz pode levar a erros analíticos
significantes, guias de validação estabelecidos pelas diretrizes da União Européia e
o FDA determinam que no caso de procedimentos baseados em LC-MS e LC-
MS/MS, o efeito de matriz deve ser investigado para garantir precisão, seletividade
e sensibilidade do método. No entanto, nenhum órgão é claro quanto ao
procedimento que deve ser realizado para tal verificação.
133-135
Deste modo, na análise de matrizes biológicas complexas,
independente do detector a ser utilizado, é fundamental que a etapa de pré-
tratamento seja realizada de forma a remover o maior número de interferentes
presentes na amostra e a análise cromatográfica seja seletiva, para o sucesso do
método.
133-136
1.4.2 – LC - ELSD
O detector de espalhamento de luz (ELSD-evaporative light scattering
detector) foi desenvolvido em 1966 como uma alternativa aos detectores
cromatográficos disponíveis na época, como UV-vis e índice de refração (RID).
Apesar do alto potencial, o novo detector só começou a ser efetivamente utilizado
no final dos anos 70 e atualmente têm sido extensivamente utilizado no
desenvolvimento de métodos qualitativos e quantitativos de uma série de classe de
compostos, especialmente aqueles que não apresentam grupos cromóforos.
137
Introdução
47
A Figura 1.16, mostra o resultado de um estudo realizado por
LUCENA e colaboradores
30
, onde a crescente aplicação do ELSD em
procedimentos analíticos pode ser verificada pelo aumento significativo do número
de trabalhos publicados nos anos de 1978 a 2006.
Figura 1.16 – Variação no número de publicações com o uso do ELSD.
30
Esse crescente número de trabalhos publicados se deve a aplicações
diferentes das usuais dos detectores cromatográficos, uma vez que a resposta
apresentada pelo ELSD permite, por exemplo, a determinação de respostas
características para uma classe de compostos.
30, 138-140
O detector de espalhamento de luz tem como princípio a nebulização
da fase móvel com um gás inerte e evaporação do solvente para produzir pequenas
partículas que serão detectadas em uma cela de espalhamento de luz. A intensidade
da luz espalhada depende do tamanho das partículas formadas durante o processo
de nebulização.
29, 30, 137, 140
De uma maneira geral, o ELSD opera de acordo com três etapas bem
definidas: nebulização (1), evaporação (2) e detecção (3) (Figura 1.17).
Introdução
48
Figura 1.17 – Princípio do detector de espalhamento de luz. Adaptado
30
Na etapa de nebulização, a fase móvel vinda do sistema
cromatográfico é volatilizada em um tubo aquecido com o auxílio de um fluxo de
gás constante (nitrogênio ou ar comprimido), para a obtenção de um aerossol com
pequenas gotículas. O aerossol é direcionado para a câmara de evaporação onde o
solvente/fase móvel é evaporado para formar as partículas do analito de interesse.
Essas partículas passam por uma cela óptica onde é incidido um feixe de luz, e
provocam um desvio/espalhamento dessa luz o qual é medido por um tubo
fotomultiplicador. A medida da luz é proporcional à quantidade de amostra na cela
e não depende de um grupo funcional específico ou cromóforos.
29, 30, 137, 139, 140
O espalhamento de luz é um processo complexo que envolve
diferentes mecanismos; a interação da luz com as partículas vai depender do seu
(1)
(2)
(3)
Introdução
49
tamanho, forma e propriedades superficiais. Quando a luz atinge a partícula, uma
oscilação dos elétrons ocorre produzindo radiação. Se a partícula é perfeitamente
homogênea, toda radiação emitida terá um efeito destrutivo dessa energia;
entretanto, se a partícula não é homogênea, essa radiação é espalhada em outras
direções.
29, 30, 139, 140
O fenômeno de espalhamento de luz é geralmente descrito por quatro
mecanismos denominados: espalhamento Rayleigh, espalhamento Mie, difração e
reflexão. A importância relacionada a cada mecanismo é principalmente governada
pelo tamanho das partículas ou mais propriamente pela proporção dos tamanhos
das partículas ao comprimento de onda da luz emitida.
29, 30
Devido às interações envolvidas, a relação entre a concentração do
analito e o sinal produzido pelo ELSD não obedece a Lei de Beer, mas sim uma
equação exponencial, I = km
b
, onde I é a intensidade da luz, m a massa da partícula
espalhada, k e b são constantes determinadas principalmente pela natureza da fase
móvel e parâmetros do detector. Para facilitar o uso deste detector, a equação torna-
se linear na forma logarítmica: log I = log k + b × log m.
29, 30, 139
Várias são as aplicações cromatográficas, incluindo a determinação de
resinas, polímeros, polietilenoglicóis, carboidratos, lipídeos, triglicerídeos,
fosfolipídeos, esteróides, adoçantes, aditivos de petróleo, agentes surfactantes, entre
outras com o uso do espalhamento de luz como detector.
29, 35-38, 141
Em análises
farmacêuticas esse detector também tem sido bastante utilizado principalmente em
sistemas de triagem de substâncias, onde as amostras positivas são confirmadas por
detectores mais seletivos e sensíveis como espectrometria de massas. São métodos
qualitativos rápidos desenvolvidos para análise de grande quantidade de amostras
com o intuito de reduzir o uso de técnicas analíticas sofisticadas e de alto custo.
30
OBJETIVOS
“Não basta dar os passos que nos devem levar um dia aos objetivos,
cada passo deve ser ele próprio um objetivo em si,
que ao mesmo tempo nos leva para adiante”.
V
ON
G
OETHE
Objetivos
50
2
–
O
BJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram:
1 – O preparo de colunas de acesso restrito (RAM), de albumina sérica
bovina, imobilizadas nos diferentes suportes: octadecil e amino;
2 – A avaliação da eficiência das colunas RAM-BSA preparadas para a
exclusão das proteínas do leite bovino;
3 – O desenvolvimento de métodos para a quantificação de
antibióticos aminoglicosídeos em medicamentos veterinários, que possam ser
utilizados como uma ferramenta no controle de qualidade desses medicamentos;
4 – O desenvolvimento de métodos por CLAE multidimensional
aquiral-aquiral para a análise de antibióticos cefalosporínicos e aquiral-quiral para a
análise de anti-helmínticos benzimidazólicos no leite, que possam ser utilizados na
investigação de níveis máximos de resíduos permitidos em leite de consumo
humano, assim como, para serem utilizados em estudos de monitoramento de
eliminação destes fármacos no leite bovino.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
“O conhecimento é um tesouro, mas a prática é a chave para obtê-lo.”
T
HOMAS
F
ULLER
Parte Experimental
51
3
–
P
ARTE
E
XPERIMENTAL
3.1
–
G
ENERALIDADES
As colunas cromatográficas utilizadas foram empacotadas no DQ –
UFSCar, utilizando-se uma empacotadora SHANDON e as análises
cromatográficas foram realizadas nos seguintes equipamentos:
1- Cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU uma bomba
LC 10ATvp, com uma válvula seletora de solvente FCV – 10ALvp, um detector de
ultravioleta de comprimento de onda variável SPD – 10Avp, um detector de índice
de refração RID 10A e um alto injetor SIL 10AF. O equipamento está acoplado a
uma interface SCL 10Avp e os cromatogramas são registrados através de um
“software” CLASS-VP.
2- Cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU duas bombas
LC 10AD, um detector de ultravioleta de comprimento de onda variável SPD –
10Avp, um detector de espalhamento de luz da marca Alltech e modelo 2000ES e
um alto injetor SIL 10AF. O equipamento está acoplado a uma interface CBM 10A
e os cromatogramas são registrados através de um “software” CLASS LC10.
3- Cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU duas bombas
LC 10AD, um alto injetor SIL 10A, um detector de ultravioleta de comprimento de
onda variável SPD – 10A, um detector de arranjo de fotodiodos modelo SPDM
10Avp, interface CBM 10A acoplados a um espectrômetro de massas triplo-
quadrupolo, QuattroLC – Micromass. Os cromatogramas são registrados através de
um “software” CLASS LC10 e MassLynxs.
4- Cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU com duas
bombas LC 20AD, com uma válvula seletora de solvente FCV – 20AL, um
degaseificador de membrana SHIMADZU DGU-20A5, um detector de ultravioleta
Parte Experimental
52
de comprimento de onda variável SPD – 20A, e um alto injetor SIL 20A. O
equipamento está acoplado a uma interface CBM 20A e os cromatogramas são
registrados através de um “software” CLASS-VP. O equipamento está acoplado a
um espectrômetro de massas ESQUIRE 6000 e os cromatogramas e espectros de
massa são registrados e processados em um “software” Brucker Daltonics.
As medidas de absorção molecular na região do UV-visível para
análise de exclusão de proteínas foram realizadas em um espectrofotômetro HP
8452A, utilizando-se uma cela de vidro de 10 mm de caminho óptico.
A água deionizada utilizada no preparo das soluções tampão para a
composição das fases móveis foi obtida em um sistema MILLI-Q (MILLIPORE).
As medidas de pH foram feitas utilizando um pH-metro,
QUALXTRON, modelo 8010, com precisão de ± 0,01pH, calibrado com soluções
tampão pH 4,0 e 7,0 (CHEMIS).
A pesagem dos reagentes foi feita em uma balança analítica AND,
modelo HR200, com precisão de 0,0001 g. Utilizou-se também uma balança semi-
analítica MARTE com precisão de 0,001 g.
Os antibióticos aminoglicosídeos foram gentilmente doados pela
empresa veterinária Ouro Fino Produtos Veterinários Ltda (estreptomicina –
064K0564 – Sigma; neomicina – 3007040548 – Jebssen; gentamicina –
2010602050 – Sigma; canamicina – 104K0663- Sigma), os metabólitos
Albendazol-Sulfóxido e Albendazol-Sulfona, foram preparados e gentilmente
cedidos pela aluna Kátia Roberta Anacleto Belaz
122
e o albendazol-2-amino-
sulfona 98% foi adquirido da LAN AESER.
O leite bovino utilizado para análise foi adquirido no comércio de São
Carlos.
As micropipetas utilizadas no preparo das amostras foram da marca
GILSON. A centrifugação do leite bovino foi realizada em uma centrífuga JOUAN
Parte Experimental
53
B4i/BR4 i termostatizada e a homogeneização das amostras foi realizada em um
agitador de tubos IKA.
Os solventes graus HPLC utilizados nas análises cromatográficas
foram adquiridos da MALLINCKRODT, J. T. BAKER ou TEDIA. Todos foram
filtrados a vácuo em um sistema MILLIPORE, utilizando-se membranas de nylon
PHENOMENEX de 0,45 µm, e posteriormente degaseificados em um ultra-som
COLE-PALMER 8852 antes de serem utilizados. Os eluentes usados foram sempre
medidos na relação volume/volume.
Os demais reagentes químicos utilizados foram obtidos de diferentes
fontes:
• ácido trifluoracético (TFA), pentafluorpropiônico (PFPA) e
heptafluorbutírico (HFBA) da ALDRICH;
• acetato de amônio da MERCK;
• fosfato de potássio monobásico da CINÉTICA QUÍMICA;
• dihidrogênio fosfato de tetrabutilamônio da SIGMA;
• glutaraldeído 25% da ACROS;
• boroidreto de sódio da MERCK;
• albumina sérica bovina (fraction V powder minimun 98%) da
SIGMA;
• corante Coomassie Brilliant Blue da MALLINCKRODT;
• ácido fosfórico (85% P. A.) da J. T. BAKER;
Parte Experimental
54
3.2
–
P
REPARO DAS COLUNAS
RAM-BSA
3.2.1
–
S
ÍLICAS
U
TILIZADAS
As sílicas utilizadas no empacotamento das colunas foram: octilsílica
(C
8
) LUNA (100Å, 10µm); octadecilsílica (C
18
) LUNA (120Å, 10µm); fenil-sílica
LUNA (120Å, 5µm) e aminopropil-sílica LUNA (100Å, 10µm).
3.2.2
–
E
MPACOTAMENTO DAS COLUNAS
A sílica de fase hidrofóbica (1,0 g) foi suspensa em 30 mL de metanol,
homogeneizada no ultra-som durante 2 minutos e empacotada em uma coluna de
aço inoxidável (5 x 0,46 cm D.I.) sob pressão de 7500 psi, utilizando-se metanol
como solvente. As colunas foram condicionadas em metanol durante
aproximadamente 4 horas a uma vazão de 1,0 mL/min.
3.2.3
-
I
MOBILIZAÇÃO DAS
F
ASES
H
IDROFÓBICAS COM
BSA
As colunas de fase de acesso restrito (RAM) foram preparadas de
acordo com o procedimento estabelecido no Laboratório de Síntese Orgânica e
CLAE do Departamento de Química da UFSCar, baseado no protocolo de
MENEZES e FELIX.
107
Após o empacotamento e condicionamento das colunas, estas foram
eluídas, a uma vazão de 1,0 mL/min, com solução tampão de KH
2
PO
4
0,05 mol/L
(pH=6,0) durante 20 minutos, solução de albumina 1,0 mg/mL preparada em
tampão KH
2
PO
4
0,05 mol/L (pH=6,0) durante 30 minutos, água durante 20 minutos
e, em seguida, eluiu-se duas frações de 5 mL de glutaraldeído a 25% (v/v). Após
Parte Experimental
55
um repouso de 12 horas, uma solução de boroidreto de sódio 1,0 mg/mL foi eluída
pela coluna até a obtenção de um eluente com valor de pH 10. Após mais duas
horas em repouso, a fase estacionária foi, então, lavada com água Milli-Q durante
30 minutos e armazenadas na geladeira, numa temperatura entre 0-4 ºC.
A coluna de fase de acesso restrito alquil-diol sílica (ADS) também
avaliada neste trabalho para os antibióticos aminoglicosídeos, foi adquirida
comercialmente (RP C
18
ADS (2,5 x 0,40 cm d.i.; 25 µm, 60 Å, Merck).
3.3
–
A
VALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE EXCLUSÃO DAS PROTEÍNAS DO
LEITE BOVINO PELAS COLUNAS
RAM-BSA
–
M
ÉTODO DE
B
RADFORD
142
3.3.1
–
P
REPARO DO REAGENTE DE
B
RADFORD
A solução do corante azul brilhante, “Coomassie Brilliant Blue”, foi
preparada na concentração 100 mg/mL, segundo o procedimento descrito por
Bradford
144
. Em um béquer dissolveu-se 50,0 mg do corante azul brilhante em 25
mL de etanol e a seguir acrescentou-se 50,0 mL de ácido fosfórico. Transferiu-se a
solução para um balão volumétrico de 500 mL e completou-se o volume com água
Milli-Q. A solução do corante foi estocada em um frasco de vidro âmbar.
3.3.2
–
P
REPARO DAS AMOSTRAS
Após o condicionamento da coluna RAM com água a 1,0 mL/min
durante 30 minutos, injetou-se 50 µL de leite integral, eluiu-se com água e coletou-
se a primeira e a segunda fração de 2,00 mL em dois balões volumétricos. Em
seguida, a coluna foi eluída com acetonitrila-isopropanol (90:10 v/v) por 10
Parte Experimental
56
minutos a 1,0 mL/min, para a limpeza de lipídeos, e condicionada com água por 30
minutos.
Este procedimento foi repetido para volumes de injeção de 100 µL e
200 µL, em triplicata, em todas as concentrações. As frações coletadas foram
transferidas para frascos de vidro âmbar e guardadas na geladeira para posterior
análise.
As soluções de referência foram preparadas adicionando-se volumes
de 50, 100 e 200 µL de leite bovino integral em um balão volumétrico de 2,00 mL
e completando-se o volume com água. As soluções de referência não foram eluídas
pelas colunas RAM-BSA e foram também armazenadas em frascos de vidro âmbar
e guardadas na geladeira para posterior análise. Essas soluções representaram 100%
das proteínas presentes no leite bovino.
3.3.3
–
D
ETERMINAÇÃO DAS
P
ROTEÍNAS
T
OTAIS
Pipetou-se 250 µL das amostras eluídas das colunas RAM-BSA,
adicionou-se 5,00 mL da solução do corante azul brilhante e, com constante
agitação, deixou reagir por três minutos. Em seguida, transferiu-se uma alíquota
para uma cubeta de vidro e registrou-se o espectro na região de 190 a 820 nm. As
absorbâncias foram medidas no comprimento de onda 595 nm, relativo à máxima
absorção do complexo proteína-corante. O mesmo procedimento foi repetido para
todas as frações coletadas, bem como para as soluções de referência.
A eficiência de extração foi calculada comparando-se as absorbâncias
das amostras coletadas e as absorbâncias das soluções de referência, que fornecem
a quantidade total de proteínas presentes no leite (100%).
Parte Experimental
57
3.4
-
A
VALIAÇÃO DO PODER DE RETENÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS PELAS
COLUNAS
RAM-BSA,
ADS,
FENIL E
C
18
3.4.1
–
P
REPARO DAS SOLUÇÕES DE FOSFATO DE POTÁSSIO DIBÁSICO
E ACETATO DE AMÔNIO
(0,01M);
DOS ÁCIDOS TRIFLUORACÉTICO
,
HEPTAFLUORBUTÍRICO E PENTAFLUORPROPIÔNICO
(0,005;
0,01;
0,025;
0,05;
0,075;
0,08
E
0,1M)
E DA SOLUÇÃO DE TETRABUTILAMÔNIO
2
M
M
3.4.1.1
–
S
OLUÇÃO ACETATO DE AMÔNIO
(0,01M)
Para minimizar erros analíticos por se tratar de um sal higroscópico,
foi preparada uma solução concentrada de 1,0 M, onde em uma balança semi-
analítica, pesou-se 7,708g do sal e transferiu-o para um balão volumétrico de 100
mL completando o volume com água deionizada (MILLI-Q). Em seguida,
utilizando-se um pipeta volumétrica uma alíquota de 10 mL foi transferida para um
balão de 1000 mL para a obtenção de uma solução 0,01M do sal.
O pH da solução tampão foi então ajustado para 7,5 com a adição de
uma solução de ácido acético (3,0 mol/L).
3.4.1.2
–
S
OLUÇÃO DE FOSFATO DE POTÁSSIO DIBÁSICO
(0,01M)
A solução fosfato de potássio dibásico foi preparada pesando-se 1,361
g do sal e solubilizando-o em um volume total de 1000 mL de água. O pH da
solução foi então ajustado para 7,5 com a adição de uma solução de ácido
clorídrico (1,0 mol/L).
Parte Experimental
58
3.4.1.3
–
S
OLUÇÃO DE TETRABUTILAMÔNIO
(2
M
M)
A solução de TBA foi preparada pesando-se 6,79 mg do sal em
uma balança semi analítica e solubilizando-o em um volume total de 10,0 mL de
solução fosfato de potássio (0,01M, pH 7,5).
3.4.1.4
–
S
OLUÇÃO DE
TFA
(0,005;
0,01;
0,05;
0,08
E
0,1M)
A solução de TFA 0,1M foi preparada utilizando-se uma pipeta
graduada, onde uma alíquota de 14,9 mL do ácido foi diluída em água deionizada
para um volume final de 1,0 L de solução. A partir desta solução, diluições
consecutivas foram realizadas para a obtenção das demais concentrações.
Para obtenção da solução 0,08 mol/L, foram aliquotados 200 mL e
diluídos em água deionizada para um volume final de 250 mL. Do mesmo modo, a
solução 0,05 mol/L foi obtida diluindo-se uma alíquota de 500 mL da solução 0,1
mol/L em água deionizada para um volume final de 1,0 L.
A partir desta solução (0,05 mol/L), foram aliquotados 200 mL e
diluídos em água deionizada para um volume final de 1,0 L, para a obtenção da
solução 0,01 mol/L. Para a obtenção da solução 0,005 mol/L, 250 mL da solução
0,01 mol/L foram aliquotados e dissolvidos em água deionizada para um volume
final de 500 mL.
3.4.1.5
–
S
OLUÇÃO DE
HFBA
(0,005;
0,01;
0,05;
0,08
E
0,1M)
A solução de HFBA 0,1M foi preparada utilizando-se uma pipeta
graduada, onde uma alíquota de 13,0 mL
do ácido foi diluída em água deionizada
para um volume final de 1,0 L de solução.
Parte Experimental
59
A partir desta solução, as mesmas diluições realizadas para as soluções
de TFA (item 3.4.1.4) foram utilizadas para o preparo das soluções de HFBA.
3.4.1.6
–
S
OLUÇÃO DE
PFPA
(0,01;
0,025;
0,05;
0,075
E
0,1M)
A solução de PFPA 0,1M foi preparada utilizando-se uma pipeta
graduada, onde uma alíquota de 10,4 mL
do ácido foi diluída em água deionizada
para um volume final de 1,0 L de solução.
A partir desta solução, uma alíquota de 37,5 mL foi diluída em água
deionizada para um volume final de 500 mL, para a obtenção da solução 0,075
mol/L. A solução 0,05 mol/L foi obtida a partir da solução 0,075 mol/L, onde uma
alíquota de 200 mL foi diluída em um volume final de 300 mL de água deionizada.
Do mesmo modo, a partir da solução 0,05 mol/L, 100 mL foram aliquotados e
diluídos em 200 mL de água deionizada para a obtenção da solução 0,025 mol/L. A
solução 0,01 mol/L foi obtida aliquotando-se 80,0 mL da solução 0,025 mol/L e
diluindo em água deionizada para um volume final de 200 mL.
3.4.2
–
S
OLUÇÕES
P
ADRÃO
3.4.2.1
–
A
MINOGLICOSÍDEOS
As soluções dos antibióticos aminoglicosídeos 100 µg/mL, foram
preparadas dissolvendo 0,5 mg dos mesmos em água em um balão volumétrico de
5 mL.
As demais soluções de diferentes concentrações avaliadas, foram
preparadas por diluições realizadas a partir de uma solução de 1,0 mg/mL,
preparada dissolvendo-se 2,0 mg em água em um balão volumétrico de 2,0 mL.
Parte Experimental
60
3.4.2.2
–
C
EFACETRIL
A solução do cefacetril de 500 µg/mL foi preparada a partir de uma
solução 1,00 µg/mL, onde o volume de 100 µL foi dissolvido em água em um
balão volumétrico de 2,00 mL; a solução de concentração 100 ng/mL foi preparada
dissolvendo-se 10,0 µL da solução 500 µg/mL em água em um balão volumétrico
de 5,00 mL. As demais soluções utilizadas foram preparadas a partir da solução de
500 µg/mL.
3.5
–
M
ÉTODOS ANALÍTICOS E BIOANALÍTICO
3.5.1
–
E
MPACOTAMENTO DAS FASES ESTACIONÁRIAS
3.5.1.1
–
COLUNAS AQUIRAIS
(C
18
e fenil)
As sílicas C
18
e fenil (2,3 g), foram suspensas em 50 mL de metanol,
homogeneizadas no ultra-som durante 2 minutos e empacotadas em uma coluna de
aço inoxidável (15 x 0,46 cm d.i.) sob pressão de 7500 psi, utilizando-se metanol
como solvente. As colunas foram condicionadas em metanol durante
aproximadamente 12 horas a uma vazão de 1,0 mL/min.
3.5.1.2
–
C
OLUNA QUIRAL
A fase estacionária quiral (tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose,
adsorvida em APS Nucleosil (500Å, 7µm, 20% g/g) foi preparada no grupo pela
aluna Kátia Roberta Anacleto Belaz de acordo com um procedimento já
estabelecido no grupo
122
e gentilmente cedida para este estudo. A fase estacionária
Parte Experimental
61
(2,3 g) foi então suspensa em 50,0 mL de hexano:isopropanol (50:50 v/v),
homogeneizada no ultra-som durante dois minutos e empacotada em coluna de aço
inoxidável (15,0 x 0,46 mm d.i.) sob pressão de 7500 psi, utilizando-se
hexano:isopropanol (90:10 v/v) como solvente.
A coluna foi condicionada em hexano:isopropanol (90:10 v/v) durante
12 horas, utilizando-se uma vazão de 0,8 mL/min. Após este período a coluna foi
então convertida para o modo reverso de eluição, onde foi eluída durante 1 hora
com isopropanol, seguida de uma mistura de acetonitrila:água (50:50) também
durante aproximadamente 1 hora. Após este período a coluna foi armazenada em
isopropanol para posterior uso.
3.5.2
–
M
ÉTODOS
A
NALÍTICOS
3.5.2.1
–
P
REPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO
3.5.2.1.1
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO
ANTIBIÓTICO ESTREPTOMICINA
De acordo com a porcentagem especificada no padrão utilizado para a
validação do método, uma massa de 133,3 mg do padrão sulfato de estreptomicina
foi precisamente pesada, dissolvida em uma solução de TFA 0,05M e transferida
para um balão volumétrico de 10 mL. A solução estoque preparada apresentou uma
concentração de 10,0 mg/mL de estreptomicina.
As soluções padrão e as soluções padrão de controle de qualidade
foram obtidas, por diluição da solução estoque nas seguintes concentrações:
Soluções padrão de calibração: 0,500; 1,00; 1,75; 2,50; 3,00; 3,75;
4,50 e 5,00 mg/mL
Parte Experimental
62
Soluções padrão de controle de qualidade: 0,60; 2,0 e 4,0 mg/mL.
3.5.2.1.2
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO
ANTIBIÓTICO NEOMICINA
De acordo com a porcentagem especificada no padrão utilizado para a
validação do método, uma massa de 154,8 mg do padrão sulfato de neomicina foi
precisamente pesada, dissolvida em uma solução de TFA 0,050 M e transferida
para um balão volumétrico de 10,0 mL. A solução estoque preparada apresentou
uma concentração de 10,0 mg/mL de neomicina total.
As soluções padrões e as soluções padrão de controle de qualidade
foram obtidas, por diluição da solução estoque nas seguintes concentrações:
Soluções padrão de calibração (concentração de neomicina total):
0,500; 1,00; 1,75; 2,50; 3,00; 3,75; 4,50 e 5,00 mg/mL
Soluções padrão de controle de qualidade (concentração de neomicina
total): 0,60; 2,0 e 4,0 mg/mL
3.5.2.1.3
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO
ANTIBIÓTICO GENTAMICINA
De acordo com a porcentagem especificada no padrão utilizado para a
validação do método, uma massa de 160,5 mg do padrão sulfato de gentamicina foi
precisamente pesada, dissolvida em uma solução de TFA 0,050 M e transferida
para um balão volumétrico de 10,0 mL. A solução estoque preparada apresentou
uma concentração de 10,0 mg/mL de gentamicina total.
As soluções padrões e as soluções padrões de controle de qualidade
foram obtidas, por diluição da solução estoque nas seguintes concentrações:
Parte Experimental
63
Soluções padrão de calibração (concentração de gentamicina total):
0,500; 1,00; 1,75; 2,50; 3,00; 3,75; 4,50 e 5,00 mg/mL
Soluções padrão de controle de qualidade (concentração de
gentamicina total): 0,60; 2,0 e 4,0 mg/mL
3.5.2.1.4
–
D
ESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE ANÁLISE DO
ANTIBIÓTICO
C
ANAMICINA
Uma massa de 20,0 mg do padrão de canamicina foi precisamente
pesada, dissolvida em uma solução de TFA 0,050 M e transferida para um balão
volumétrico de 10,0 mL. A solução estoque preparada apresentou uma
concentração de 2,00 mg/mL.
As soluções padrões e as soluções padrões de controle de qualidade
foram obtidas, por diluição da solução estoque nas seguintes concentrações:
Soluções padrão de calibração: 0,1; 0,2; 0,35; 0,50; 0,60; 0,75; 0,90 e
1,0 mg/mL
Soluções padrão de controle de qualidade: 0,12; 0,40 e 0,80 mg/mL
Os valores de concentração das soluções padrão controle de qualidade
de todos os métodos foram calculados como segue:
1- O controle de qualidade de concentração mais baixa em torno de
110-120%, em relação a menor concentração da curva de calibração.
2- O controle de qualidade de concentração média em torno de 40-
60%, em relação a maior concentração da curva de calibração.
3- O controle de qualidade de concentração alta, em torno de 75-
95%, em relação a maior concentração da curva de calibração.
Parte Experimental
64
3.5.2.2
–
P
REPARO DAS AMOSTRAS DE CALIBRAÇÃO E CONTROLE DE
QUALIDADE
3.5.2.2.1
–
M
ÉTODOS ESTREPTOMICINA
,
NEOMICINA
,
GENTAMICINA E
CANAMICINA
Alíquotas de 200 µL da solução padrão apropriada foram pipetadas em
tubos de ensaio e o volume ajustado para 1000 µL com uma solução de TFA 0,050
M. As amostras foram então homogeneizadas em vórtex por 10 s e em seguida,
alíquotas de 350 µL foram transferidas para os vials do autoinjetor, tendo sido
injetado um volume de 15 µL no sistema cromatográfico.
3.5.2.3
–
O
BTENÇÃO DAS CURVAS ANALÍTICAS
A partir da solução estoque, as soluções padrão de calibração foram
preparadas em triplicata, nas seguintes concentrações:
a-) estreptomicina: 0,10; 0,20; 0,35; 0,50; 0,60; 0,75; 0,90 e 1,0
mg/mL.
b-) neomicina total: 0,10; 0,20; 0,35; 0,50; 0,60; 0,75; 0,90 e 1,0
mg/mL.
c-) gentamicina total: 0,10; 0,20; 0,35; 0,50; 0,60; 0,75; 0,90 e 1,0
mg/mL.
d-) canamicina: 0,02; 0,04; 0,07; 0,10; 0,12; 0,15; 0,18 e 0,20 mg/mL
As curvas de calibração foram obtidas, através de regressão linear,
considerando as áreas das bandas cromatográficas relativas às concentrações dos
antibióticos, ambos em escala logarítmica. A linearidade foi verificada através do
valor do coeficiente de correlação.
Parte Experimental
65
As condições cromatográficas utilizadas para obtenção das curvas
analíticas foram:
a)- coluna: C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.; 120 Å, 10 µm);
b)- fase móvel: TFA (0,05M)/ MeOH (99:01 v/v) para a
estreptomicina; TFA (0,05M) 100% para a neomicina e TFA (0,05M)/ CH
3
CN
(97:03 v/v) para a canamicina e gentamicina;
As condições utilizadas no detector de espalhamento de luz foram:
c)- vazão: 1,0 mL/min;
d)- temperatura do tubo: 115
ºC para a estreptomicina; 107 ºC para a
neomicina e 113,6 ºC para a gentamicina e canamicina;
e)- vazão do gás: 3,2 L/min para a estreptomicina; 3,1 L/min para a
gentamicina, canamicina, neomicina;
Para todos os métodos foi utilizado um ganho de 1.
3.5.2.4
–
P
ARÂMETROS ANALÍTICOS AVALIADOS
3.5.2.4.1
–
L
INEARIDADE
A linearidade foi avaliada de acordo com o coeficiente de correlação
(r) obtido pelo cálculo de regressão linear a partir das curvas de calibração,
construídas em escala logarítmica.
3.5.2.4.2
–
P
RECISÃO E
E
XATIDÃO
A precisão intradia e interdia e a exatidão foram avaliadas em três dias
não consecutivos, utilizando-se as amostras controle de qualidade do método, as
Parte Experimental
66
quais foram preparadas em replicata (n=5) como descrito no item 3.5.2.2, A
precisão do método foi expressa pelo coeficiente de variação (CV%) das replicatas.
A exatidão foi calculada através da razão da média das concentrações encontradas e
o valor médio das concentrações nominais, e foi expressa em porcentagem.
A exatidão do método foi também avaliada através do teste cego, onde
foram preparadas, em triplicata, e analisadas, amostras de concentrações
desconhecidas ao analista.
3.5.2.4.3
–
L
IMITES DE
Q
UANTIFICAÇÃO
(LQ)
E
D
ETECÇÃO
(LD)
O LQ foi estabelecido como a menor concentração, cuja precisão,
expressa pelo coeficiente de variação (CV), não excedeu o valor de 2 % (n = 5) e a
exatidão (%) apresentou desvios não superiores a 5 % do valor nominal da
concentração.
O LD foi estabelecido como a menor concentração que apresentou um
sinal três vezes maior que o ruído do detector.
3.5.3 – M
ÉTODO
B
IOANALÍTICO
3.5.3.1
-
P
REPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO DO
ABZ-SO
2
-NH
2,
ABZ-
SO
2
E
(±)-ABZ-SO
Foram preparadas, individualmente, três soluções estoque em
CH
3
CN :
H
2
O
(50:50) na concentração de 1,0 mg/mL para o ABZ-SO
2
-NH
2
, para ABZ-SO
2
e
para o (±)-ABZ-SO, através da dissolução de 2,0 mg de cada composto em um
balão volumétrico de 2,0 mL.
Parte Experimental
67
A partir destas soluções, foram obtidas, por diluição, uma solução
estoque com os antibióticos combinados nas concentrações: 10 µg/mL de ABZ-
SO
2
-NH
2
, 60 µg/mL de (±)-ABZ-SO e 30 µg/ml de ABZ-SO
2
.
As soluções padrão de calibração e as soluções padrão de controle de
qualidade foram obtidas por diluição da solução estoque com os antibióticos
combinados, nas seguintes concentrações:
Soluções padrão de calibração: 0,160; 0,180; 0,200; 0,240; 0,280;
0,320; 0,360 e 0,400 µg/mL para o ABZ-SO
2
-NH
2
; 0,480; 0,540; 0,600; 0,720;
0,840; 0,960; 1,08 e 1,20 µg/mL para cada enatiômero do (±)-ABZ-SO e também
para o ABZ-SO
2
.
Soluções padrão de controle de qualidade: 0,184; 0,260 e 0,380 µg/mL
para o ABZ-SO
2
-NH
2
; 0,552; 0,780 e 1,14 µg/mL para a cada enatiômero do (±)-
ABZ-SO e também para o ABZ-SO
2
.
Os valores de concentração dos controles de qualidade do método
foram calculados da seguinte forma:
1- O controle de qualidade de concentração mais baixa em torno de
110-120%, em relação a menor concentração da curva de calibração.
2- O controle de qualidade de concentração média em torno de 40-
60%, em relação a maior concentração da curva de calibração.
3- O controle de qualidade de concentração alta, em torno de 75-95%,
em relação a maior concentração da curva de calibração.
3.5.3.2
-
P
REPARO DAS AMOSTRAS DE CALIBRAÇÃO E CONTROLE DE
QUALIDADE
As amostras foram preparadas pipetando-se 50 µL da solução padrão
apropriada, em uma série de tubos de ensaio. Foi adicionado a cada tubo, um
Parte Experimental
68
volume de 950 µL de leite A desnatado, previamente centrifugado, ou CH
3
CN :
H
2
O (50:50) (para avaliar a eficiência da extração das colunas RAM-BSA). As
soluções foram homogenizadas por agitação em vórtex por 15 segundos. Alíquotas
de 350 µL foram transferidas para os vials do autoinjetor e um volume de 100 µL
foi injetado no sistema multidimensional de CLAE.
3.5.3.3
–
O
BTENÇÃO DAS CURVAS ANALÍTICAS
As amostras de calibração foram preparadas em triplicata nas seguintes
concentrações: 8,00; 9,00; 10,0; 12,0; 14,0; 16,0; 18,0 e 20,0 ng/mL para o ABZ-
SO
2
-NH
2
; 24,0; 27,0; 30,0; 36,0; 42,0; 48,0; 54,0 e 60,0 ng/mL para cada
enantiômero do (±)-ABZ-SO e também para o ABZ-SO
2
.
A equação da regressão linear e o coeficiente de correlação (r) foram
calculados pelo método dos mínimos quadrados, considerando a área da banda
cromatográfica referente a cada concentração dos antibióticos.
Foram utilizadas as seguintes condições cromatográficas para obtenção
das curvas analíticas:
Bomba 1:
0,00-5,00 min: fase móvel: 100% H
2
O (exclusão das proteínas pela
coluna RAM-C
8
-BSA (5,0 x 0,46 cm d.i.)); vazão de 1,0 mL/min
5,01-6,30 min: fase móvel: H
2
O:CH
3
CN (60:40 v/v) (extração dos
compostos da coluna RAM-C
8
-BSA); vazão de 1,0 mL/min
6,30-7,30 min: fase móvel: H
2
O:CH
3
CN (60:40 v/v) (transferência dos
compostos da coluna RAM-C
8
-BSA para a coluna analítica); vazão de 1,0 mL/min
7,40-12,4 min: fase móvel: CH
3
CN:H
2
O:ISO (75:15:10 v/v/v)
(limpeza da coluna RAM-C
8
-BSA); vazão de 1,0 mL/min
Parte Experimental
69
12,4-21,0 min: fase móvel: H
2
O (condicionameto da coluna RAM-C
8
-
BSA); vazão de 1,0 mL/min
Bomba 2: vazão de 0,8 mL/min;
0,00-6,30 min: fase móvel: H
2
O : CH
3
CN (50:50 v/v)
(condicionamento da coluna analítica tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose
(15 x 0,46 cm d.i.));
6,30-7,30 min: fase móvel: H
2
O : CH
3
CN (60:40 v/v) (transferência
dos compostos da coluna extratora para a coluna analítica);
7,30-21,0 min: fase móvel: H
2
O: CH
3
CN (60:40 v/v) (análise do ABZ-
SO
2
-NH
2
, ABZ-SO
2
e (±)-ABZ-SO), detecção por LC-MS/MS, analisador do tipo
íon-trap.
3.5.3.4
-
P
ARÂMETROS ANALÍTICOS PARA VALIDAÇÃO DE FÁRMACOS
EM MATRIZES BIOLÓGICAS
3.5.3.4.1
-
S
ELETIVIDADE
Embora análises por espectrometria de massas em tandem (MS/MS)
sejam consideradas capazes de gerar respostas seletivas, a seletividade do método
foi avaliada pelo monitoramento de transições específicas de cada molécula
protonada, sendo elas: ABZ-SO
2
-NH
2
(240 198); (±)-ABZ-SO (282 240) e
ABZ-SO
2
(298266) e também através do estudo de efeito de matriz realizado.
Parte Experimental
70
3.5.3.4.2
-
E
FICIÊNCIA DE EXTRAÇÃO
(
RECUPERAÇÃO
)
E
TRANSFERÊNCIA DOS ANALITOS
A eficiência de extração dos analitos da matriz biológica foi avaliada
utilizando-se as soluções de controle de qualidade, em replicatas (n=5).
Calculou-se o percentual de eficiência da extração das colunas RAM,
por comparação dos resultados obtidos para as amostras controle, preparadas em
leite bovino, com os obtidos com as amostras preparadas na fase móvel:
H
2
O:CH
3
CN (50:50 v/v) (n=5).
3.5.3.4.3
-
P
RECISÃO E EXATIDÃO
A precisão (intra e interdias) e a exatidão foram avaliadas em três dias
não consecutivos, utilizando-se as amostras controle de qualidade do método,
preparadas em quintuplicata. A precisão do método foi expressa pelo coeficiente de
variação (CV%) das replicatas. A exatidão foi calculada através da razão da média
das concentrações encontradas e o valor médio das concentrações nominais, e foi
expressa em porcentagem.
A exatidão do método foi também avaliada através do teste cego, onde
foram preparadas, em triplicata, e analisadas, duas soluções de concentração
desconhecida ao analista.
3.5.3.4.4
-
L
IMITE DA QUANTIFICAÇÃO
(LQ)
E DETECÇÃO
(LD)
O LQ foi estabelecido como a menor concentração, cuja precisão,
expressa pelo coeficiente de variação (CV), não excedeu o valor de 20 % (n = 5) e
Parte Experimental
71
a exatidão (%) apresentou desvios não superiores a 20 % do valor nominal da
concentração.
O LD foi estabelecido como a menor concentração que apresentou um
sinal três vezes maior que o ruído do detector.
3.5.3.4.5
–
E
STUDOS DE ESTABILIDADE
A estabilidade das amostras foi verificada através da determinação das
concentrações das amostras controle de qualidade, preparadas em triplicata,
analisadas por interpolação com a curva de calibração. A precisão e exatidão
obtidas nestas análises determinaram a estabilidade das amostras, onde foram
consideradas estáveis as amostras que apresentaram variabilidade de até 15%,
conforme critério de aceitação do método.
3.5.3.4.5.1 – E
STUDO DE ESTABILIDADE DA SOLUÇÃO PADRÃO
A estabilidade das amostras em solução foi avaliada por um período de
10 dias à temperatura ambiente. As amostras foram preparadas em uma mistura de
água e acetonitrila na proporção de 1:1.
3.5.3.4.5.2
-
E
STABILIDADES APÓS CICLOS DE CONGELAMENTO E
DEGELO
As amostras de leite fortificadas com os metabólitos do albendazol,
recém preparadas, foram analisadas, e posteriormente congeladas a -20°C. Após
um período de 24 horas, as amostras foram degeladas à temperatura ambiente e
Parte Experimental
72
novamente analisadas. Este procedimento foi realizado mais duas vezes, sempre em
intervalos de 24 horas para cada ciclo.
3.5.3.4.5.3
-
E
STABILIDADE DE LONGA DURAÇÃO
As amostras de leite fortificadas com os metabólitos do albendazol,
recém preparadas, foram analisadas, e posteriormente congeladas a -20°C. Após
um período de 3, 5 e 7 dias, as amostras foram degeladas à temperatura ambiente e
novamente analisadas. Os degelos foram realizados uma única vez.
3.5.3.4.5.4
-
E
STABILIDADE DE CURTA DURAÇÃO
As amostras foram preparadas, analisadas recém-preparadas e após
mantidas à temperatura ambiente por 6 horas. O período de 6 horas foi baseado no
tempo excedente de duração do preparo das amostras para as injeções no estudo de
interesse.
3.5.3.4.5.5
-
E
STABILIDADES DAS AMOSTRAS DURANTE A
PERMANÊNCIA NO AUTO
-
INJETOR
As amostras foram preparadas e analisadas após serem mantidas no
auto-injetor por 10 horas. O período de 10 horas foi baseado no tempo excedente de
duração das análises para a obtenção da curva analítica.
3.6 –
ESTUDO DO EFEITO DA MATRIZ
Uma bomba seringa Havard Apparatus (Holliston, MA, EUA) foi
usada para os experimentos de infusão contínua. Para avaliar o efeito da matriz
Parte Experimental
73
sobre a ionização do composto de interesse, uma junção em “T” foi colocada entre
o sistema de LC e a fonte de MS.
Soluções contendo separadamente os compostos de interesse na
concentração de 500 ng/mL foram infundidas a uma vazão de 10 µL/min. As
amostras brancos das matrizes avaliadas e outras soluções testes isentas dos
analitos, foram injetadas no sistema cromatográfico e a resposta foi monitorada
continuamente para produzir um perfil do efeito de matriz.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
“A mente que se abre a uma nova janela,
jamais volta ao seu tamanho original”
A
LBERT
E
INSTEIN
Resultados e Discussão
74
4
–
R
ESULTADOS E
D
ISCUSSÕES
4.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E
A
VALIAÇÃO DE
C
OLUNAS
RAM-BSA
4.1.1 - P
REPARO DAS
C
OLUNAS DE
F
ASE
H
IDROFÓBICA
I
MOBILIZADAS COM
P
ROTEÍNA
O desenvolvimento de métodos para a análise de fármacos e
metabólitos em fluidos biológicos tradicionalmente inclui etapas de tratamento
preliminar da amostra, como por exemplo, precipitação de proteínas, extração
líquido-líquido, extração em fase sólida, etc. Em muitos casos tais procedimentos
são os responsáveis por grande parte do tempo empregado em um método analítico
e, além disso, o grande manuseio da amostra, assim como dificuldades na
reprodutibilidade e possíveis decomposições das amostras podem ocasionar baixos
níveis de recuperação dos analitos que se encontram em baixas concentrações.
O uso de injeção direta de amostras biológicas tem oferecido várias
vantagens em relação aos métodos de pré-tratamento convencionais, tais como,
economia de tempo, menor manuseio das amostras biológicas e volume reduzido
de lixo químico gerado. Dentro desse contexto, as fases de acesso restrito foram
desenvolvidas especialmente para análise de compostos de massa molar baixa em
matrizes complexas, uma vez que esses materiais permitem a injeção direta de
amostras não tratadas de fluidos biológicos sem o comprometimento do sistema
cromatográfico.
Dentre as fases de acesso restrito disponíveis, as fases hidrofóbicas
imobilizadas com albumina sérica bovina (BSA) e estabilizadas através de ligações
cruzadas com glutaraldeído têm sido utilizadas em nosso grupo de pesquisa com
Resultados e Discussão
75
sucesso para as mais variadas matrizes biológicas, como por exemplo, plasma
humano e bovino, leite e ovos de galinha poedeira.
56, 57, 118-123
Deste modo, levando em consideração a experiência obtida no grupo,
à fácil disponibilidade comercial da albumina sérica bovina, ao fácil preparo da
fase, seu baixo custo e principalmente, às suas propriedades físico-químicas, a fase
de acesso restrito de albumina sérica bovina foi selecionada para o
desenvolvimento deste trabalho.
Nas fases reversas imobilizadas com proteínas, a superfície externa do
suporte cromatográfico é saturada com proteínas, tornando-se hidrofílica e
favorecendo assim a exclusão de macromoléculas como, por exemplo, proteínas,
enquanto que a superfície interna do suporte mantém as características hidrofóbicas
de modo reverso, onde os analitos de interesse são retidos. Nessas fases apenas a
superfície externa do suporte é recoberta, uma vez que os pequenos poros da sílica
não permitem o acesso das proteínas à superfície interna.
105
As fases hidrofóbicas selecionadas (Figura 4.18) foram previamente
empacotadas conforme protocolo do Laboratório de Síntese Orgânica e CLAE do
DQ-UFSCar e as colunas extratoras do tipo RAM-BSA foram posteriormente
preparadas com base no protocolo descrito por MENEZES e FÉLIX
107
,
representado esquematicamente na Figura 4.19.
Figura 4.18 – Fases hidrofóbicas imobilizadas com proteína; C
18
: octadecilsílca;
NH
2
: aminopropilsílica; BSA: albumina sérica bovina.
Coluna
BSA – C
18
BSA – NH
2
Estrutura Química da
Cadeia Hidrofóbica (FH)
(CH
2
)
17
CH
3
(CH
2
)
3
NH
2
Resultados e Discussão
76
a
) Primeira Etapa
b
)
Segunda
Etapa
c
)
Terceira
Etapa
Figura 4.19 – Esquema representativo das etapas envolvidas na preparação das
colunas RAM-BSA.
106
A Figura 4.19 apresenta um esquema das etapas realizadas no preparo
das colunas RAM-BSA utilizadas neste trabalho. Na primeira etapa, inicialmente a
coluna foi condicionada com tampão KH
2
PO
4
(0,05 M; pH 6,0), e então albumina
sérica bovina (BSA) foi imobilizada in situ na fase hidrofóbica (Tabela 4.8) através
de cromatografia frontal. Após a imobilização da BSA, para promover as ligações
intercruzadas entre as proteínas, em uma segunda etapa, a fase foi tratada com uma
solução de glutaraldeído (25% v/v).
106, 107
Para evitar possível hidrólise da dupla ligação da base de Schiff
formada e evitar que os grupos aldeídos residuais reajam posteriormente com
compostos analisados nas colunas, esse grupos foram em seguida, reduzidos com
Resultados e Discussão
77
uma solução 1 mg/mL de borohidreto de sódio (terceira etapa da Figura 4.19). A
Figura 4.20 apresenta as reações envolvidas nas etapas do processo de
imobilização e estabilização da BSA.
A reação de intercruzamento da proteína com o glutaraldeído, seguida
de redução com borohidreto de sódio, confere maior estabilidade e durabilidade às
colunas assim preparadas, uma vez que o intercruzamento evita a perda das
proteínas, que pode acontecer quando esta está apenas adorvida na superfície do
suporte.
Tabela 4.8: Propriedades físico-químicas das fases estacionárias utilizadas para a
preparação das colunas RAM
a
Sílica
(Tipo)
Fabricante
Tamanho
de
Partícula
Tamanho
de Poro
Å
C
18
Luna 10 120
NH
2
Luna 10 100
a
Dados fornecidos pelo fabricante.
Resultados e Discussão
78
NH
2
BSA
BSA N C (CH
2
)
3
H
C
O
H
BSA
BSA
BSA
BSA NH
2
BSA
BSA N C (CH
2
)
3
H
C
H
N
BSA
BSA adsorvida
na fase hidrofóbica
1) Intercruzamento da BSA 2) Redução das bases de Schiff e de
com glutaraldeído 25% grupos aldeído residuais com NaBH
4
C
O
H
NaBH
4
H
2
O
CH
2
OH
a)
b)
C N
H
NaBH
4
H
2
O
NHCH
2
(CH
2
)
3
C C
O
H
O
H
Figura 4.20 – Reações envolvidas na estabilização da BSA imobilizada em fases
hidrofóbicas.
106
4.1.2
–
A
VALIAÇÃO DO
P
ODER DE
E
XCLUSÃO DAS
P
ROTEÍNAS DO
L
EITE PELAS
C
OLUNAS
RAM-BSA
Vários métodos são empregados na determinação da concentração de
proteínas totais em fluidos biológicos, entretanto, os mais utilizados são os métodos
espectrofotométricos no ultravioleta visível.
143
Baseado no trabalho de TANAKA e colaboradores
111
, e
principalmente em trabalhos realizados no grupo para plasma humano
105, 118-120
,
plasma bovino
122
,
leite bovino
56, 57, 123
e ovos de galinha
121
, o método de
BRADFORD
142
(ou Coomassie Brilhant Blue-CBBG-250) foi escolhido para
avaliar a performance de exclusão protéica pelas colunas RAM-BSA.
Resultados e Discussão
79
Esse método baseia-se nas interações de Van der Waals e hidrofóbicas
entre corante CBBG-250 (Figura 4.21) e as proteínas de alta massa molar, que
contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas
144
, provocando um
deslocamento na absorção de 465 para 595 nm, o qual é monitorado
espectrofotometricamente. O método de BRADFORD é muito utilizado para a
determinação de proteínas devido à sua alta sensibilidade, rapidez, baixo custo e
especificidade para proteínas.
143
A Figura 4.21 mostra uma das estruturas de ressonância do corante
CBBG-250.
144
N
SO
3
-
Na
+
N
Et
C
M
e
NH
OEt
Et
-
O
3
S
M
e
Figura 4.21 – Uma das estruturas de ressonância do corante Coomassie Brilliant
Blue (CBBG-250).
A Figura 4.22 ilustra o procedimento realizado para as medidas de
exclusão das proteínas do leite bovino pelas colunas RAM-BSA, descrito no Item
3.3 da parte experimental.
Resultados e Discussão
80
Figura 4.22 - Procedimento realizado para avaliar a eficiência de exclusão das
proteínas do leite bovino pelas colunas RAM-BSA. Adaptado da referência 106.
A avaliação da eficiência de exclusão das proteínas do leite pelas
colunas RAM, foi analisada através da recuperação das proteínas. Esta recuperação
foi calculada através das absorbâncias (em 595 nm) do complexo corante-proteína
das soluções padrão de leite, que fornecem a quantidade total de proteína uma vez
que elas não são injetadas na coluna, comparadas com as absorbâncias das frações
de leite eluídas pelas colunas RAM-BSA, conforme procedimento descrito na parte
experimental (Item 3.3).
A maioria dos estudos realizados em nosso grupo de pesquisa faz uso
das colunas RAM-BSA com 10 cm de comprimento
56, 57, 105, 118-123
. LIMA
106
realizou um estudo para verificar a influência do tamanho da coluna RAM-BSA na
capacidade de exclusão das proteínas para amostras de plasma humano. De acordo
com esse estudo, foi verificado que o tamanho da coluna não apresentou diferenças
Resultados e Discussão
81
significativas na eficiência da exclusão das proteínas. Tanto a coluna de 4 cm
avaliada, quanto a coluna de 10 cm apresentaram uma eficiência de exclusão das
proteínas de plasma humano em torno de 99%. Deste modo, no intuito de avaliar
diferenças com relação ao tamanho dessas colunas na exclusão das proteínas do
leite, foram preparadas colunas de 5 cm de comprimento para este estudo.
Os resultados obtidos mostraram que tanto a eficiência quanto o tempo
de exclusão para as colunas de 5 cm foram muito similares aos da coluna de 10 cm
para as proteínas do leite bovino.
56, 57
A vantagem da utilização das colunas de 5
cm para o desenvolvimento de métodos de análises por injeção direta de amostras é
o ganho de tempo durante as análises.
Na Figura 4.23 é apresentado o espectro de absorção do corante na
região de 350-820 nm. Conforme pode ser observado, há bandas bem definidas
com máximos de absorção em 460 e 640 nm correspondentes às formas catiônica e
neutra do corante, respectivamente.
144
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
350 450 550 650 750 850
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 4.23 – Espectro do corante “Coomassie Brilliant Blue”.
Resultados e Discussão
82
A Figura 4.24 apresenta os espectros de absorbância correspondente
às frações coletadas das colunas RAM-BSA C
18
reagidas com o corante (BBG-
250), da amostra padrão e do corante (BBG-250) para o volume de injeção de 100
µL.
0
0,5
1
1,5
2
350 450 550 650 750 850
Comprimento de ona (nm)
Absorbância
Figura 4.24 – Espectros obtidos: Azul (a) - amostra padrão; Vermelho (b) -
corante-proteína da primeira fração (2 min) de leite eluído da coluna extratora C
18
;
Azul (c) - reagente; Amarelo (d) - corante-proteína da segunda fração (4 min) de
leite eluído da coluna extratora C
18
.
Os resultados obtidos para as duas colunas RAM-BSA (Figura 4.25),
apresentam excelente poder de exclusão para proteínas do leite, com uma
performance de exclusão em média de 91%. De acordo com esses resultados, pode-
se inferir que 10% das proteínas que não foram excluídas podem estar ficando
adsorvidas nas fases estacionárias ou ainda nos fritz das colunas cromatográficas,
conforme já reportado por YU et al.
98
De acordo com estes autores, após um determinado número de
injeções de fluidos biológicos, há a necessidade da limpeza dos frits ou até mesmo
a sua substituição, para eliminar problemas de elevação da pressão do sistema
cromatográfico, perdas da precisão dos tempos de retenção e da simetria das bandas
Resultados e Discussão
83
cromatográficas dos analitos de interesse. Segundo os autores, a adsorção
acumulativa de proteínas e/ou gorduras nos frits leva ao surgimento de um volume
morto, após um determinado volume de injeção na coluna.
Figura 4.25 – Porcentagem de proteínas excluídas pelas colunas RAM-BSA C
18
e
amino.
Embora as linhas de base dos espectros apresentados na Figura 4.23
não estejam corrigidas, é importante destacar que, o espectro correspondente à
amostra corante-proteína da segunda fração eluída do leite (2-4 min), é muito
similar ao próprio espectro do corante. Isto sugere baixa concentração de proteína
nesta fração que foi coletada após 2 minutos de eluição, sendo este resultado
observado independente do volume de injeção do leite.
Entretanto, observando-se o cromatograma de exclusão para ambas as
colunas, é possível observar, até 4 minutos de análise, eluição de macromoléculas.
A Figura 4.26 mostra os perfis de exclusão apresentados pelas colunas RAM-BSA
C
18
e amino para as amostras de leite utilizando água como fase móvel, com vazão
70
75
80
85
90
95
100
% de exclusão
BSA - C
18
BSA - NH
2
Fases RAM
Exclusão das proteínas do leite
50 µL
100 µL
200 µL
70
75
80
85
90
95
100
% de exclusão
BSA - C
18
BSA - NH
2
Fases RAM
Exclusão das proteínas do leite
50 µL
100 µL
200 µL
Resultados e Discussão
84
de 1,0 mL/min e λ = 280nm (absorbância dos aminoácidos tirosina, triptofano e
fenilalanina das proteínas) para o volume de injeção de 200 µL.
Figura 4.26
–
Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando as colunas
RAM-BSA Amino e C
18
. Condições Cromatográficas: Fase Móvel: H
2
O; vazão:
1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de injeção: 200 µL.
É importante destacar que, embora a avaliação do perfil
cromatográfico de exclusão tenha sido realizado utilizando um comprimento de
onda de máxima absorção dos principais aminoácidos das proteínas, os resultados
obtidos não podem ser inferidos apenas às proteínas do leite, uma vez que outras
substâncias presentes no meio com absorbâncias em 280 nm podem contribuir com
a resposta obtida pelo detector. Deste modo, o uso da expressão exclusão de
macromoléculas foi preferida à exclusão de proteínas do leite.
Nesta avaliação de exclusão foi escolhida água sem quaisquer aditivos
para ser utilizada como fase móvel, uma vez que há trabalhos no grupo que
empregam com sucesso essas condições cromatográficas na análise de fármacos em
plasma humano por injeção direta de amostras, utilizando-se uma coluna BSA-C
8
como coluna extratora.
118-119
Embora a Figura 4.26 apresente cromatogramas onde
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
0
50
100
150
200
250
300
350
Absorbância
Tempo (min)
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Absorbância
Tempo (min)
Coluna RAM-BSA NH
2
Coluna RAM-BSA C
18
Resultados e Discussão
85
é possível detectar a eluição de compostos até 4 minutos, pode-se afirmar que as
colunas RAM-BSA são extremamente satisfatórias no que diz respeito a sua
utilização como colunas extratoras no desenvolvimento de métodos analíticos em
CLAE por injeção direta de amostras biológicas, uma vez que apenas água em
vazão de 1,0 mL/min, durante 4 minutos, foi suficiente para uma exclusão de 90%
das proteínas do leite, de acordo com as medidas realizadas pelo método de
Bradford.
142
Para essas fases imobilizadas com BSA desnaturada, a boa exclusão
de proteínas indica que a BSA é hidrofílica o suficiente para excluir proteínas
nestas condições cromatográficas, ou seja, a BSA permanece negativamente
carregada por possuir um ponto isoelétrico de 4,8 e, através de interações
repulsivas, exclui as proteínas do leite. Aqui é importante salientar que no leite as
proteínas mais abundantes são k-caseína, α
S2
-caseína, α
S1
-caseína, β-caseína, α-
lactalbumina, β-lactoglobina B e A e que essas proteínas apresentam um ponto
isoelétrico de 4,6 a 20 ºC
145
e, portanto também se encontram negativamente
carregadas quando se usa água como fase móvel.
No desenvolvimento dos métodos de análises por injeção direta, a
composição da fase móvel deve ser mantida considerando o pH e força iônica
apropriados de maneira a prevenir a precipitação de proteínas
146
. A superfície de
contato entre proteína e água constitui uma interface onde há, naturalmente, uma
tensão superficial, conseqüentemente as proteínas adquirem uma forma globular
para minimizar esta energia superficial, ou seja, a proteína se encontra em um
estágio chamado de nativo.
A presença de aditivos, como por exemplo, sais inorgânicos em uma
determinada concentração, aumentam a tensão superficial, obrigando a proteína a
permanecer no seu estado nativo. Nesta situação o aditivo se encontra excluído da
camada superficial em torno da proteína, devido à repulsão entre as proteínas no
Resultados e Discussão
86
estado nativo e os sais presentes, e a proteína se encontra bem mais solúvel por
estar rodeada majoritariamente pelas moléculas de água.
Quando a concentração de sal é aumentada, a tensão superficial
também aumenta e as proteínas se agregam para reduzir sua área superficial
acessível ao solvente (água + sal), resultando em uma precipitação induzida por sal
(efeito “salting-out”).
147
A primeira etapa deste efeito, ou seja, quando a proteína se encontra
mais solúvel, com pequenas percentagens de sal e circundada por água, é algumas
vezes, essencial para exclusão de proteínas por colunas hidrofóbicas imobilizadas
com proteínas.
111
Deste modo, para verificar a influência da presenca de sais na
fase móvel para a exclusão das proteínas, foi avaliado também o perfil de exclusão
utilizando solução acetato de amônio e fosfato de potássio dibásico ambos 0,01M e
com pH ajustado para 6,5, onde não influenciaria na precipitaçao de proteínas e
também não seria prejudicial ao suporte cromatográfico.
Para a coluna RAM-BSA com suporte C
18
uma discreta melhora pode
ser observada com o alcance mais rápido da linha de base até 5 minutos de análise
utilizando-se a solução de acetato de amônio. Já para a coluna RAM-BSA no
suporte aminopropil uma alteração significativa no perfil de exclusão das
macromoléculas pode ser observado. Este comportamento provavelmente se deve a
interações promovidas pela solução de acetato de amônio, entre os grupos amino do
suporte e as proteínas a serem excluídas. A Figura 4.27 apresenta os perfis de
exclusão observados.
Resultados e Discussão
87
Figura 4.27 - Perfil de exclusão das macromoléculas das amostras de leite
utilizando as colunas RAM-BSA Amino e C
18
. Condições Cromatográficas: Fase
Móvel: NH
4
Ac (0,01M, pH = 6,5); vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de
injeção: 200 µL.
Os resultados apresentados pela coluna RAM-BSA-NH
2
utilizando
solução fosfato de potássio também não foram satisfatórios, uma vez que uma
baixa eficiência de exclusão das macromoléculas foi observada. Os cromatogramas
comparativos são apresentados na Figura 4.28 e a presença tanto de um sal
orgânico quanto a de um sal inorgânico mostram exclusão de macromoléculas em
períodos de até 8 minutos.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Absorbância
Tempo (min)
Coluna RAM-BSA NH
2
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
0
50
100
150
200
250
300
350
Absorbância
Tempo (min)
Coluna RAM-BSA C
18
Resultados e Discussão
88
Figura 4.28 - Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando a coluna
amino-BSA para as soluções de acetato de amônio e fosfato de potássio (0,01M,
pH=6,5). Condições cromatogáficas: vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de
injeção: 200 µL.
Com a coluna C
18
RAM-BSA, embora o perfil de exclusão tenha sido
melhor utilizando a solução de fosfato de potássio como fase móvel, o uso da
solução de acetato de amônio também levou a um bom perfil de exclusão das
macromoléculas. Essa última fase móvel tem a vantagem de ser um sal orgânico
podendo ser utilizado no espectrômetro de massas. A Figura 4.29 mostra o
cromatograma comparativo da coluna C
18
RAM-BSA para as duas fases móveis
avaliadas.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0
0
100
200
300
400
KH
2
PO
4
NH
4
Ac
Absorbância (mAbs)
Tempo (min)
Resultados e Discussão
89
Figura 4.29 - Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando a coluna C
18
-
BSA para as soluções de acetato de amônio e fosfato de potássio (0,01M, pH=6,5).
Condições cromatogáficas: Vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de injeção:
200 µL.
Para avaliar se o baixo desempenho de exclusão apresentado pela
coluna RAM-BSA-NH
2
era devido ao uso de soluções de sais orgânicos ou
inorgânicos como fases móveis, foi também avaliada uma coluna RAM-BSA em
um suporte fenil. Essa coluna vem sendo utilizada com sucesso em nosso grupo de
pesquisa para a análise de compostos hidrofílicos em matrizes como plasma e leite.
115, 148
A coluna RAM-BSA fenil não apresentou um bom perfil de exclusão
quando do uso de solução fosfato de potássio como fase móvel. Já, o perfil de
exclusão obtido utilizando solução acetato de amônio foi semelhante ao perfil com
a utilização de água, com eficiente eliminação das macromoléculas das amostras de
leite em 5 minutos de análise. A Figura 4.30 apresenta os perfis de exclusão
obtidos para as fases móveis avaliadas.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0
0
50
100
150
200
250
300
350
KH
2
PO
4
NH
4
Ac
Absorbância (mAbs)
Tempo (min)
Resultados e Discussão
90
Figura 4.30 - Perfil de exclusão para as amostras de leite utilizando a coluna fenil
BSA para as soluções acetato e fosfato (0,01M, pH=6,5) e para água. Condições
cromatogáficas: Vazão: 1,0 mL/min; λ: 280 nm; volume de injeção: 200 µL.
As colunas RAM-BSA preparadas mostraram excelente desempenho
na exclusão das macromoléculas do leite, utilizando água como fase móvel.
Entretanto, de acordo com os resultados obtidos, é possível inferir que a utilização
de sais orgânicos ou inorgânicos altera completamente o perfil de exclusão pela
coluna RAM-BSA-amino. Deste modo, a aplicação ideal para esta coluna na
análise de leite seria para compostos onde a utilização de fases móveis aquosas
fosse possível.
De acordo com esse estudo, as colunas RAM-BSA C
18
e fenil
apresentaram performance adequada de exclusão para solução acetato de amônio.
Já para a solução fosfato de potássio, a coluna RAM-BSA fenil teve o perfil de
exclusão das macromoléculas bastante prejudicado.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
NH
4
Ac
KH
2
PO
4
Água
Absorbância (mAbs)
Tempo (min)
Resultados e Discussão
91
4.1.3
–
A
VALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE RETENÇÃO DOS
ANTIBIÓTICOS AMINOGLICOSÍDEOS PELAS COLUNAS
RAM-BSA
Dentre os compostos citados como objeto de estudo deste trabalho, os
cefalosporínicos e o anti-helmíntico albendazol e seus metabólitos já foram
amplamente estudados com relação a retenção em colunas RAM-BSA.
57, 115, 122
A
retenção dos antibióticos aminoglicosídeos no entanto, não haviam sido estudados
em colunas RAM-BSA sendo então selecionados para este estudo.
Por se tratar de cromatografia líquida no modo reverso de eluição
deve-se ter em mente que quanto maior a hidrofobicidade de um composto, maior
será o seu tempo de retenção. Deste modo, quando um composto ácido ou básico se
ioniza, ele se torna mais hidrofílico e, conseqüentemente, seu tempo de retenção é
reduzido; assim, quando o pH da fase móvel aumenta, a retenção de um analito
ácido diminui e para um analito básico aumenta. Para compostos neutros não
ocorre variação do tempo de retenção em função do pH da fase móvel.
92
Neste trabalho, para a caracterização da retenção dos antibióticos
aminoglicosídeos pelas fases RAM, um estudo dos tempos de retenção dos
antibióticos em diferentes pHs não é justificado, uma vez que na faixa de trabalho
de pH permitido para as colunas com suporte de sílica (pH 3 - 8), os três
aminoglicosídeos encontram-se ionizados.
Apesar da excelente exclusão das macromoléculas para as amostras de
leite, usando água como fase móvel pelas colunas RAM-BSA, optou-se pela
utilização de um tampão orgânico volátil, uma vez que em água haveria uma
ionização não controlada dos antibióticos levando a alterações dos tempos de
retenção, e também, por se tratar de uma solução sem restrições para o uso em
detectores como espectrômetro de massas.
Resultados e Discussão
92
Deste modo, de acordo com os resultados obtidos, a coluna RAM-
BSA C
18
e a solução de acetato de amônio (0,01M, pH=6,5 ajustado com HCl
0.1M) foram selecionados para o estudo.
Para esse estudo foi utilizado o detector de índice de refração (RID),
uma vez que não havia a necessidade da utilização do espectrômetro de massas,
minimizando custos operacionais e tempo de utilização do espectrômetro.
Soluções (50 µg/mL) dos antibióticos neomicina, gentamicina e
estreptomicina foram injetadas no sistema cromatográfico separadamente e para
cada injeção uma análise de água foi realizada para verificar a deflexão causada
pelo índice de refração do solvente de preparo da amostra.
De acordo com os resultados obtidos, para os três antibióticos
avaliados, nenhuma banda cromatográfica foi verificada, com exceção da deflexão
referente ao índice de refração da água de preparo da amostra.
Acreditando ter usado uma fase móvel muito fraca, a força foi
aumentada adicionando-se 2% (v/v) de acetonitrila. A Figura 4.31 apresenta o
cromatograma obtido onde uma banda bastante intensa pode ser observada antes de
dois minutos de análise, sugerindo que a fase móvel utilizada era muito forte para
os compostos analisados.
Resultados e Discussão
93
Figura 4.31 – Análise da amostra de neomicina (50 µg/mL) em solução aquosa
utilizando a coluna BSA-C
18
. Condições Cromatográficas: Fase Móvel: NH
4
Ac
(0,01M, pH = 6,5) / CH
3
CN (98:02); vazão: 1,0 mL/min; volume de injeção: 100
µL; Detecção: RID
Tendo aceitado ser esta banda cromatográfica os aminoglicosídeos
eluindo no tempo morto da coluna, a formação de um par iônico durante o preparo
das amostras foi considerado. A adição de contra-íons à amostra para a formação
do par iônico é uma técnica que vem sendo usada com sucesso pelo nosso grupo,
para o desenvolvimento de métodos para compostos hidrofílicos.
115, 148
Foram avaliados o uso de ácido acético (1M) e ácido trifluoracético
(0,11 M) de modo que, durante o preparo da amostra, estes eram adicionados em
excesso para garantir a formação do par iônico de toda amostra.
A adição dos ácidos foi avaliada primeiramente utilizando 100% da
solução de acetato de amônio (0,01M, pH=6,5 – ajustado com HCl 0,1M) como
fase móvel, para a coluna C
18
RAM-BSA. O perfil cromatográfico obtido foi
exatamente o mesmo para os 3 antibióticos em estudo com os dois ácidos usados,
onde as bandas cromatográficas observadas eram referentes aos contra-íons
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
RIU
Tempo (min)
Resultados e Discussão
94
utilizados no preparo da amostra, sendo confirmado pela injeção de soluções dos
contra-íons nas mesmas condições de análise.
Nenhuma outra banda cromatográfica foi observada, indicando a não
eluição ou a não detecção dos analitos de interesse.
A fase móvel contendo 2% de acetonitrila, anteriormente considerada
forte para os antibióticos avaliados, foi re-analisada utilizando-se o ácido
CH
3
COOH (1M) na amostra. De acordo com o cromatograma obtido, a banda
cromatográfica observada no tempo morto da coluna era referente a solução do
contra-íon utilizado no preparo da amostra, indicando uma possível não eluição dos
antibióticos em estudo.
Uma fase móvel mais forte contendo 10% de acetonitrila foi avaliada
sem o uso dos ácidos na amostra e, assim como para 2% de acetonitrila, uma banda
cromatográfica intensa referente à água utilizada no preparo da amostra foi
observada (Figura 4.32), indicando uma possível retenção dos antibióticos, ou
simplesmente a não detecção pelo detector utilizado.
Resultados e Discussão
95
Figura 4.32 - Cromatograma de análise da gentamicina (100 µg/mL) utilizando a
coluna RAM-BSA C
18
. Condições cromatográficas: FM: NH
4
Ac (0,01M,
pH=6,5)/CH
3
CN (90:10); Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção: 100 µL;
Detecção: RID.
A coluna RAM-BSA-C
18
foi então substituída pela coluna RAM-BSA-
fenil a qual também foi avaliada com a fase móvel (NH
4
Ac/CH
3
CN) (98:02) a fim
de verificar a influência da fase estacionária na retenção dos compostos.
Do mesmo modo, a banda cromatográfica observada era referente à
água utilizada no preparo da amostra.
Uma alteração do modificador orgânico e conseqüentemente da força
da fase móvel utilizada, foi também avaliada com a substituição de acetonitrila por
metanol, o qual segundo SNYDER e KIRKLAND
92
tornaria a fase mais fraca.
De acordo com os cromatogramas obtidos, nenhuma alteração foi
verificada, sendo a única banda cromatográfica observada referente a água do
preparo da amostra.
Assumindo possíveis problemas com o detector e também
considerando que a não detecção dos compostos poderia ser causada pela baixa
concentração utilizada para as amostras, uma substância de perfil cromatográfico
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
0
10
20
30
40
50
60
70
Amostra: Gentamicina
RIU
Tempo (min)
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
0
10
20
30
40
50
60
Amostra: branco Água
RIU
Tempo (min)
Resultados e Discussão
96
conhecido, o antibiótico cefalosporínico cefacetril, com boa absorbância no UV foi
avaliado para comparação em um estudo de concentração.
Foi verificado que o detector apresentava boa resposta para o cefacetril
e também foi verificado que a concentração de 100 µg/mL utilizada no estudo para
os antibióticos aminoglicosídeos era muito baixa podendo ser esta a razão para a
não detecção dos compostos. No entanto, para os aminoglicosídeos avaliados
nenhuma alteração da resposta do detector foi observada para diferentes
concentrações analisadas (100, 1000 e 2000 µg/mL).
Para avaliar também a influência da albumina sérica bovina na
retenção dos antibióticos, a coluna extratora foi substituída por uma coluna
analítica fenil Hypersil (15 x 0,46 cm d.i). Para isto, dois percentuais de acetonitrila
em solução de acetato de amônio foram avaliados. Injeções de 100 µL de amostras
de 2 mg/mL foram realizadas. Os cromatogramas obtidos foram semelhantes para
os três antibióticos avaliados, e apenas uma deflexão referente a água no tempo
morto da coluna foi observada.
Considerando que a concentração utilizada para as análises foi
suficiente para boa detecção por índice de refração e que o detector não apresentava
problemas, foi assumido que fortes interações entre os antibióticos e as fases
estacionárias usadas estavam ocorrendo, de modo que não houve eluição dos
compostos com as fases móveis avaliadas. Portanto, outras fases móveis mais
fortes foram avaliadas para a coluna fenil-BSA. A Tabela 4.9 apresenta as fases
móveis avaliadas.
Apesar da variação da força da fase móvel nenhuma banda
cromatográfica foi observada, indicando mais uma vez a alta retenção dos
antibióticos pela coluna.
Resultados e Discussão
97
Tabela 4.9 – Fases móveis avaliadas para a extração dos antibióticos
aminoglicosídeos da coluna RAM-BSA fenil.
Composição % (v/v)
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
CN 90:10
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
CN 85:15
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
OH 80:20
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
CN 25:75
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
OH 20:80
Novamente o uso de agentes de pareamento iônico foi considerado
utilizando como fase móvel uma solução de ácido trifluoracético (TFA) (0,01M). A
coluna C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.) foi utilizada, de modo a tentar reproduzir as
condições utilizadas com sucesso por INCHAUSPÉ e colaboradores
33
na
separação de uma série de antibióticos aminoglicosídeos.
A Figura 4.33 mostra os cromatogramas obtidos para os 3
aminoglicosídeos em estudo. Para a estreptomicina e neomicina, foi possível
observar bandas cromatográficas diferentes do observado para a água; já para a
gentamicina várias bandas podem ser observadas, indicando a separação entre os
componentes da gentamicina.
Uma eficiente separação para os constituintes da gentamicina foi
obtida por CLAROT e colaboradores
34
com a utilização de uma fase móvel de
TFA 48,5 mM e metanol (97:03) empregando o detector de espalhamento de luz
(ELSD). Com base neste estudo, foram avaliadas as fases móveis TFA
(48,5mM)/CH
3
OH nas proporções 97:03 e 99:01.
Com exceção da estreptomicina os outros dois antibióticos
apresentaram bandas distintas do índice de refração observado para a água. A
Figura 4.34 mostra os cromatogramas obtidos para a gentamicina nas duas
Resultados e Discussão
98
proporções da fase móvel, onde é possível observar que, com o aumento da
porcentagem do modificador orgânico a retenção dos antibióticos diminuiu.
Uma vez que foi possível a separação dos componentes do antibiótico
gentamicina utilizando-se a coluna C
18
analítica e TFA (48,5 mM, pH=1,5)/MEOH
(99:01) como fase móvel, a mesma fase móvel foi avaliada para a coluna C
18
RAM-
BSA. Os cromatogramas obtidos foram semelhantes para os três antibióticos
avaliados, onde a banda cromatográfica observada era referente ao índice de
refração da água, solvente de preparo da amostra.
Resultados e Discussão
99
Figura 4.33 - Cromatogramas de análise dos antibióticos aminoglicosídeos (2
mg/mL) utilizando a coluna C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.). Condições
cromatográficas: FM: TFA (0,1M, pH=1,2); Vazão: 1,0 mL/min; Volume de
injeção: 50 µL, Detecção: RID.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
0,0
0,5
1,0
Amostra: Gentamicina
RIU
Tempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
1
2
3
4
Amostra: Estreptomicina
RIU
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Amostra: branco Água
RIU
Tempo (min)
0 5 10 15 20 25 30
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Amostra: Neomicina
RIU
Tempo (min)
Resultados e Discussão
100
Figura 4.34 - Cromatogramas de análise da gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
Hypersil (15 x 0.46 cm d.i.). Condições cromatográficas: FM: A-TFA
(48,5 mM, pH=1,5)/MEOH (99:01), B- TFA (48,5 mM, pH=1,5)/MEOH (97:03),
Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção: 50 µL, Detecção: RID.
A utilização do índice de refração como detector para os antibióticos
em estudo não foi satisfatória, uma vez que os cromatogramas obtidos ofereceram
dúvidas com relação à existência ou não de bandas cromatográficas, devido à sua
baixa sensibilidade para os analitos e alta instabilidade. O detector de espalhamento
de luz, não seletivo, universal como o índice de refração, foi então utilizado para
dar continuidade às avaliações de retenção dos antibióticos aminoglicosídeos nas
colunas RAM-BSA.
Um primeiro teste foi realizado repetindo as condições experimentais
descritas por CLAROT
34
de modo a verificar se as condições otimizadas para o
detector estavam boas para a análise dos antibióticos. A Figura 4.35 mostra o
cromatograma obtido, onde é possível identificar de acordo com o artigo a
gentamicina C
1a
, C
2
, C
2a
e C
1
.
0 10 20 30 40
0,0
0,5
1,0
Amostra: Gentamicina
RIU
Tempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Amostra: Gentamicina
RIU
Tempo (min)
A B
Resultados e Discussão
101
Figura 4.35 - Cromatograma de análise da gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.). Condições cromatográficas: FM: TFA
(48,5 mM, pH=1,5)/MEOH (97:03), Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção: 50
µL Condições do detector de espalhamento de luz: Vazão do gás: 1,6 L/min;
Temperatura: 70°C
Confirmada a boa peformance do detector, as mesmas condições
foram aplicadas utilizando a coluna RAM-BSA-C
18
para os 3 antibióticos em
estudo. Assim como os resultados anteriores, os cromatogramas obtidos
apresentaram bandas cromatográficas eluindo no tempo morto da coluna.
Várias proporções de fase móvel foram novamente avaliadas (Tabela
4.10), e de acordo com os resultados obtidos, as colunas RAM-BSA apresentaram
uma alta retenção dos analitos de interesse com a utilização de solução acetato de
amônio (0,01M, pH=6,5) independente da porcentagem de modificador orgânico
utilizado e uma baixa retenção com a utilização de ácido trifluoacetico (TFA) 48,5
mM.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
5
10
15
20
25
30
35
Amostra: Gentamicina
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
102
Tabela 4.10 - Fases móveis avaliadas utilizando as colunas RAM-BSA C
18
e fenil
para os antibióticos aminoglicosídeos e detecção por ELSD.
Composição
% (v/v)
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5) 100
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/TFA (48,5 mM) 99:01
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/TFA (48,5 mM) 97:03
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
OH/TFA (48,5 mM)
95:04:01
TFA (48,5 mM)CH
3
OH 99:01
TFA (48,5 mM)CH
3
OH 97:03
Foi considerado então, o uso de duas fases móveis; uma primeira para
excluir com eficiência as macromoléculas e reter os aminoglicosídeos de interesse e
uma segunda fase móvel para extrair-los da coluna RAM-BSA para posterior
análise.
Apesar dos bons resultados obtidos para a exclusão das
macromoléculas do leite pelas colunas RAM-BSA utilizando a solução acetato de
amônio como fase móvel, a fase móvel NH
4
Ac/CH
3
OH (97:03), que embora não
tenha sido avaliada quanto ao poder de exclusão das proteínas, foi selecionada
como fase de exclusão com base nos estudos realizados por YU e
WESTERLUND
98
.
Segundo os autores a presença de pequenas quantidades de
modificador orgânico na fase móvel auxiliou a exclusão protéica, além de
proporcionar um aumento na recuperação dos compostos, redução da adsorção de
lipídeos e compostos endógenos sob a superfície do suporte e estreitamento da
banda cromatográfica dos analitos de interesse.
Resultados e Discussão
103
Deste modo, a fase móvel NH
4
Ac/ CH
3
OH (97:03) foi utilizada para a
exclusão das macromoléculas do leite e diferentes proporções de TFA foram
avaliadas como fases de extração dos antibióticos.
As fase móveis testadas foram:
Linha A: NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/ CH
3
OH (97:03)
Linha B:
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/ CH
3
OH /TFA (48,5mM) (95:03:02)
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/TFA (48,5mM) (96:04)
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/TFA (48,5mM) (97:03)
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/TFA (48,5mM) (90:10)
TFA (0,01 M)/ CH
3
OH (97:03)
TFA (0,005 M)/ CH
3
OH (95:05)
Foi também realizada a mudança do modificador orgânico de metanol
para acetonitrila na fase de exclusão e nenhuma alteração significativa foi
observada; todos os resultados apresentaram bandas cromatográficas eluindo no
tempo morto da coluna.
Devido à alta hidrofilicidade e polaridade dos analitos avaliados, o
tamanho da coluna BSA utilizada (5 cm) poderia estar sendo um fator limitante
para a eficiente retenção dos antibióticos aminoglicosídeos avaliados. Deste modo,
uma coluna C
18
– BSA de 10 cm de comprimento foi selecionada para dar
continuidade ao estudo.
A concentração de TFA foi alterada para 0,02M para garantir eficiente
formação de par iônico na amostra e várias proporções de fase móvel utilizando
TFA 0,02M, NH
4
Ac 0,01M, CH
3
CN e CH
3
OH foram avaliadas. Apesar das
variações de força da fase móvel, os tempos de retenção obtidos para os três
aminoglicosídeos estudados foram menores que 5 minutos de análise.
Resultados e Discussão
104
Uma vez que nenhuma fase móvel avaliada foi adequada para as
análises dos aminoglicosídeos utilizando as colunas RAM-BSA e baseando-se no
estudo realizado por INCHAUSPÉ e colaboradores
33
, uma avaliação do fator de
retenção (k) para os antibióticos estudados utilizando a coluna RAM-BSA C
18
para
diferentes concentrações de TFA foi realizado.
Foram avaliadas as concentrações 0,005, 0,01, 0,05 e 0,1M de TFA, as
quais apresentaram um valor de pH entre 2,6 e 1,3, que embora seja um fator
limitante nas análises, uma vez que a sílica utilizada no preparo das colunas BSA
suportam uma faixa de pH entre 2 e 8, poderia apresentar eficiente extração dos
antibióticos estudados. Uma comparação com a coluna analítica C
18
(Hypersil, 10
µm, 120 Å, 15 x 0,46 cm d.i.) foi também realizada para verificar a influência da
albumina na retenção dos antibióticos em diferentes concentrações de TFA.
As soluções padrões foram preparadas em solução de TFA 0,05M, na
concentração de 1,0 mg/mL para que não houvessem dúvidas com relação à
resposta do detector de espalhamento de luz utilizado.
Os parâmetros do detector foram otimizados para a fase aquosa de
100% de TFA, onde a temperatura do tubo foi de 115 ºC, a vazão de gás (ar
comprimido) 3,2 L/min, o ganho 1 e impactor off, de modo que uma eficiente
resposta fosse obtida.
Mudanças de retenção foram poucos significantes para as amostras de
neomicina e estreptomicina quando a coluna RAM-BSA C
18
foi avaliada usando
TFA como fase móvel em diferentes concentrações. Entretanto, para as amostras de
gentamicina foi notado alterações de retenção nas concentrações mais altas de
TFA. As Figuras 4.36 e 4.37 mostram os cromatogramas obtidos.
Resultados e Discussão
105
Figura 4.36 – Cromatogramas de análise da Neomicina e Estreptomicina (1
mg/mL) utilizando a coluna C
18
-BSA (Hypersil 10x0,41 cm d.i). Condições
Cromatográficas: FM: TFA (0,005, 0,01, 0,05 e 0,1M), Vazão: 1,0 mL/min,
Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC,
Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
Figura 4.37 – Cromatogramas de análise da Gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
-BSA (Hypersil 10x0,41 cm d.i). Condições Cromatográficas: FM: TFA
(0,005, 0,01, 0,05 e 0,1M), Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL.
Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC, Vazão do Gás (ar
comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
0 1 2 3 4 5 6 7
8
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Neomicina
0,005M
0,01M
0,05M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Estreptomicina
0,005M
0,01M
0,05M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
0
200
400
600
800
1000
1200
Gentamicina
0,005M
0,01M
mV
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
25
50
75
100
125
150
Gentamicina
0,05M
0,1M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
106
Pode-se observar, apesar do ruído da linha de base, um início de
separação dos componentes da gentamicina com a variação da concentração de
TFA de 0,05 M para a 0,1 M. De acordo com essa separação, é possível inferir que
um aumento da concentração do agente pareante leve a maiores tempos de retenção
e separações entre os componentes da gentamicina.
No entanto, concentrações maiores resultarão em valores de pH
menores que 1,0 tornando inviável sua aplicação, uma vez que o suporte de sílica
utilizado para a coluna RAM-BSA não suporta tais valores de pH. Este pH também
poderia ser prejudicial à exclusão das macromoléculas do leite, uma vez que de
acordo com um estudo já realizado no grupo a exclusão de proteínas do leite é
prejudicada em valores baixos de pH.
115
Para a coluna analítica C
18
, os resultados obtidos para os antibióticos
neomicina e estreptomicina mostraram alterações pouco significativas nos fatores
de retenção de acordo com o aumento da concentração de TFA. Os cromatogramas
apresentaram bandas cromatográficas com tempos de retenção menores que cinco
minutos de análise. No entanto, os resultados obtidos para a gentamicina
confirmaram a seletividade do ácido trifluoracético, uma vez que os fatores de
retenção aumentaram de acordo com o aumento da concentração do ácido.
Foi possível observar em todas as concentrações avaliadas, quatro
bandas cromatográficas referentes às gentamicinas C
1a
, C
2
, C
2a
e C
1
. A separação
entre elas aumentou, de acordo com o acréscimo da concentração de TFA. Deste
modo, com o intuito de obter condições cromatográficas eficientes para o controle
de qualidade de medicamentos veterinários, foi também realizado um estudo mais
detalhado envolvendo outros agentes de pareamento iônico (Item 4.2).
De acordo com os resultados obtidos para o estudo de avaliação da
capacidade de retenção dos antibióticos aminoglicosídeos pelas colunas RAM-
BSA, pode-se concluir que a utilização destas colunas é problemática uma vez que
Resultados e Discussão
107
o comportamento apresentado por estes antibióticos nessas colunas é diferente e
imprevisível. Isso pôde ser percebido pelas análises realizadas, onde as várias fases
móveis com diferentes forças e composições avaliadas apresentaram retenções
muito altas e outras vezes retenções muito baixas, comprometendo assim o
desenvolvimento de métodos para análise direta destes compostos.
Uma vez que a análise dos antibióticos aminoglicosídeos utilizando as
colunas RAM-BSA não apresentou resultados satisfatórios, foi também avaliada
uma coluna RAM RP C
18
ADS (2,5 x 0,40 cm d.i.; 25 µm, 60 Å, Merck) para
verificar a influência do recobrimento da coluna RAM na retenção destes
antibióticos.
4.1.4
–
A
VALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE RETENÇÃO DOS
ANTIBIÓTICOS AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO A COLUNA DE FASE DE ACESSO
RESTRITO
ADS
E
TFA
COMO AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO COM DETECÇAO
POR
ELSD
As fases chamadas ADS (Alkyl-Diol Silica) apresentam uma
superfície externa com características hidrofílicas contendo grupos diol e superfície
interna com características hidrofóbicas devido à presença de grupos alquílicos
(butil, octil ou octadecil) ligados à sílica.
As condições cromatográficas utilizando diferentes concentrações de
TFA como fase móvel, avaliadas para as colunas RAM-BSA, foram utilizadas para
a coluna ADS e os resultados obtidos foram semelhantes para os três antibióticos
em estudo, onde foi observada uma intensa banda cromatográfica com menos de
um minuto de análise (Figura 4.38).
Resultados e Discussão
108
Figura 4.38 –
Cromatogramas de análise das amostras de estreptomicina,
gentamicina e neomicina (1,0 mg/mL) utilizando a coluna C
18
-ADS (2,5 x 0,40 cm
d.i.; 25 µm, 60 Å). Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,005 e 0,1 M), Vazão:
1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do
Tubo: 103,4 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,1 L/min, Ganho: 1 e Impactor:
off.
Foi feita então, variação na força da fase móvel por adição de metanol,
em diferentes proporções:
- TFA (0,005M)/MeOH (97:03)
- TFA (0,01M)/MeOH (90:10)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Estreptomicina
0,005M TFA
0,05M TFA
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Gentamicina
0,005M TFA
0,1M TFA
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Neomicina
0,005M TFA
0,1M TFA
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
109
- TFA (0,05M)/MeOH (70:30)
- TFA (0,1M)/MeOH (85:15)
Embora uma considerável alteração na força da fase móvel tenha sido
realizada nenhuma outra banda cromatográfica foi observada.
Uma vez que os padrões utilizados para as análises são descritos como
sais de sulfato dos respectivos antibióticos, uma solução de sulfato de amônio foi
preparada e analisada para verificar se as bandas cromatográficas observadas eram
referentes aos compostos de interesse ou ao contra-íon sulfato.
A Figura 4.39 mostra os resultados obtidos, onde pode-se verificar
que o sulfato resulta em uma intensa banda cromatográfica com menos de um
minuto de análise. No entanto, a sobreposição dos cromatogramas das amostras e
do sulfato mostra que as bandas cromatográficas apresentadas pelos antibióticos
são mais largas e com a presença de um “ombro” indicando co-eluição com o
sulfato.
Deste modo, assim como para as colunas recobertas com albumina
sérica bovina, a coluna C
18
ADS apresentou baixa retenção para os três
aminoglicosídeos avaliados, tornando inviável a utilização da mesma para essas
análises.
Uma vez que nenhuma das condições cromatográficas avaliadas foi
eficiente, para a retenção adequada dos antibióticos aminoglicosídeos (gentamicina,
neomicina e estreptomicina) não foi possível o desenvolvimento de um método
direto de análise utilizando as colunas de fase de acesso restrito C
18
– BSA e – ADS
.
Resultados e Discussão
110
Figura 4.39 – Cromatogramas de análise das amostras de neomicina, gentamicina,
estreptomicina e do sulfato de amônio (1,0 mg/mL) utilizando a coluna C
18
-ADS
(2,5 x 0,40 cm d.i.; 25 µm, 60 Å). Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,1M),
Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura
do Tubo: 103,4 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,1 L/min, Ganho: 1 e
Impactor: off.
4.2
–
A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO
(
K
)
PARA OS
ANTIBIÓTICOS AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE
PAREAMENTO IÔNICO E DETECÇÃO POR
ELSD
As cromatografias de par iônico e no modo reverso possuem várias
propriedades em comum, as fases estacionárias e móveis são as mesmas diferindo
principalmente na adição do contra-íon na fase móvel para a cromatografia de
pareamento iônico.
Neste tipo de cromatografia, o pH da fase móvel é ajustado de modo
que os compostos de interesse estejam na sua forma ionizada sendo a retenção
controlada pela adição de um contra-íon de carga oposta na fase móvel. Deste
0,0 0,5 1,0 1,5
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
sulfato de amonio
neomicina
gentamicina
estreptomicina
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
111
modo, a retenção nesta cromatografia é dependente da concentração e da
hidrofobicidade (cadeia alquilica) dos agentes de pareamento iônico, uma vez que o
agente pareante se encontra em um equilíbrio dinâmico entre a fase móvel e a fase
estacionária hidrofóbica da coluna.
149
Apesar dos mecanismos de retenção para cromatografia de pareamento
iônico não serem completamente compreendidos, duas teorias são propostas:
92, 149-
152
formação do par iônico e troca iônica dinâmica.
No primeiro modelo, o analito e o contra-íon formam o par iônico na
fase móvel e a separação ocorre pela distribuição do par entre as fases estacionária
e móvel (Figura 4.40A). A retenção pode ser controlada variando a concentração
do modificador orgânico na fase móvel, como no modo reverso clássico.
O segundo modelo assume que a porção hidrofóbica do contra-íon
adsorve na fase estacionária e o par iônico é feito por uma interação dinâmica do
soluto com a monocamada do contra-íon adsorvido (Figura 4.40B). Os solventes
da fase móvel podem ser usados para impedir a interação do contra-íon com a fase
estacionária, alterando deste modo à capacidade da coluna em adsorver o contra-
íon.
Ambos os mecanismos de retenção propostos são possíveis e a
expressão matemática para a relação fator de retenção k e concentração do contra-
íon é a mesma nos dois modelos.
O mecanismo de retenção dos analitos pode ser continuamente
alternado de modo reverso à troca iônica (par iônico) de acordo com a quantidade
de contra-íon adsorvido na fase estacionária; e isto é afetado variando a
concentração do contra-íon na fase móvel.
92
Para ambos modelos de mecanismo de retenção, o aumento da
concentração do agente de pareamento iônico leva a um aumento do k (fator de
retenção).
Resultados e Discussão
112
Do mesmo modo, a adsorção dos agentes de pareamento iônico na fase
estacionária aumenta até um valor onde ocorre o saturamento da coluna
cromatográfica de modo que a adsorção tende a diminuir mesmo com o aumento da
concentração do contra-íon. Uma vez que o mecanismo envolvido é o de troca
iônica, o aumento da concentração do agente de pareamento conseqüentemente
leva a um aumento na concentração do respectivo contra-íon no meio, o qual
compete com a formação do par iônico na superfície da coluna cromatográfica
influenciando o mecanismo de retenção.
92, 149, 150
Figura 4.40 – Interações entre o soluto catiônico A
+
e a fase estacionária de sílica
de acordo com os mecanismos: (A) formação do par iônico na fase móvel e (B)
troca iônica dinâmica na fase estacionária, na presença do aditivo X
-
C
+
na fase
móvel.
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
C
+
X
-
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
C
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
C
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
A
+
X
-
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
A
+
A
+
X
-
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
X
-
X
-
C
+
C
+
X
-
X
-
C
+
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
C
+
X
-
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
C
+
X
-
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
C
+
X
-
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
C
+
X
-
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
C
+
X
-
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
X
-
X
-
A
+
A
+
A
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
Fase Estacionária
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
SiO
-
C
+
SiO
-
C
+
SiO
-
A
+
SiO
-
A
+
A
+
A
+
X
-
A
+
A
+
X
-
A
+
X
-
X
-
X
-
C
+
C
+
X
-
X
-
C
+
C
+
X
-
X
-
C
+
C
+
A
B
Resultados e Discussão
113
De acordo com a natureza do agente de pareamento iônico,
concentrações diferentes resultam em um mesmo k para um determinado analito;
uma vez que agentes hidrofóbicos saturam a fase estacionária, em cromatografia de
fase reversa, em uma concentração menor do que os agentes mais hidrofílicos.
92
Deste modo, a concentração do agente de pareamento iônico é de fundamental
importância para uma eficiente separação cromatográfica.
A cromatografia de pareamento iônico é o método cromatográfico
mais utilizado na análise de aminoglicosídeos, devido às características polar,
iônica e básica apresentada por estes compostos. Os contra-íons mais utilizados são
carregados negativamente como, por exemplo, pentano, hexano e heptano
sulfonatos. Entretanto, alquilsulfonatos não podem ser usados em aplicações de
LC-MS devido as suas características não-voláteis podendo ser substituídos por
ácidos carboxílicos perfluorados voláteis
14
, os quais têm sido utilizados com
sucesso nas análises de cromatografia preparativa.
33
As aplicabilidades dos diferentes contra-íons perfluorados, para a
análise de aminoglicosídeos, têm sido comparadas e o mecanismo de separação
também tem sido investigado. INCHAUSPÉ e SAMAIN
33
analisaram os
antibióticos aminoglicosídeos usando como eluentes os agentes de pareamento
iônico, ácido pentafluorpropiônico (PFPA), ácido heptafluorbutírico (HFBA) e
TFA. Apesar das pequenas cadeias carbônicas, os ácidos PFPA e HFBA podem ser
utilizados com eficiência como contra-íons para os antibióticos neomicina e
estreptomicina; entretanto, para a gentamicina foi obtida uma baixa separação
cromatográfica. O TFA, por outro lado, mostrou-se especialmente seletivo para a
gentamicina, com adequada resolução cromatográfica entre os constituintes da
gentamicina.
33, 153
A habilidade do TFA, para a retenção seletiva da gentamicina, pode
ser explicada pela pequena distância do grupo metil (na posição α em relação ao
Resultados e Discussão
114
grupo amina) com a fase estacionária, o que permite a interação simultânea do
grupo amino com o contra-íon, e do grupo metil com a fase hidrofóbica da coluna
(Figura 4.41).
33
Figura 4.41 – Mecanismo de retenção para a gentamicina usando ácidos
fluorinados como agente de pareamento iônico.
Baseado nos resultados obtidos com a avaliação da capacidade de
retenção dos antibióticos amionoglicosídeos utilizando as colunas RAM-BSA, foi
realizado um estudo do fator de retenção destes compostos utilizando
concentrações diferentes de três agentes de pareamento perfluorados (TFA, PFPA e
HFBA) e duas colunas analíticas (C
18
e fenil Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.)). O
conhecimento do comportamento cromatográfico destes compostos na
cromatografia de pareamento iônico é essencial para o desenvolvimento de novos
métodos de análise.
CF
3
COO
-
NH
3
+
CH
CH
3
O
NH
2
O
Interação Hidrofóbica
Fase Estacionária
Contra-íon TFA
NH
3
+
CH
CH
3
O
NH
2
O
Nenhuma interação
Contra-íon HFBA
CF
3
Fase Estacionária
CF
2
2
FC
COO
-
Resultados e Discussão
115
4.2.1
–
A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO O AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO
TFA
NAS
COLUNAS
C
18
E FENIL
Para o estudo do fator de retenção utilizando como agente de
pareamento iônico o ácido TFA, foram avaliadas as concentrações 0,005; 0,01;
0,05 e 0,1 M. As soluções padrões foram preparadas em TFA 0,05M na
concentração de 1,0 mg/mL.
Os parâmetros do detector foram otimizados para a fase aquosa de
100% de TFA, onde a temperatura do tubo foi de 115 ºC, a vazão de gás (ar
comprimido) 3,2 L/min, o ganho 1 e impactor off, de modo que uma eficiente
resposta fosse obtida.
De acordo com os resultados obtidos, os antibióticos neomicina e
estreptomicina apresentaram fatores de retenção baixos utilizando a coluna
analítica C
18
, mostrando a baixa afinidade dos pares iônicos formados pela fase
estacionária. Nenhuma alteração significativa nos fatores de retenção foi verificada
para ambos compostos com o aumento da concentração do ácido. A Figura 4.42
apresenta os resultados obtidos.
Os resultados obtidos para a gentamicina confirmaram a seletividade
do ácido trifluoracético, uma vez que os fatores de retenção aumentaram de acordo
com o aumento da concentração do ácido.
Aqui também foi possível observar, em todas as concentrações
avaliadas, as quatro bandas cromatográficas referentes as gentamicinas C
1a
, C
2
, C
2a
e C
1
e a seletividade entre elas foi aumentada de acordo com o acréscimo na
concentração de TFA. A Figura 4.43 mostra o aumento do k de acordo com as
concentrações avaliadas para as quatro gentamicinas observadas e a Figura 4.44
Resultados e Discussão
116
apresenta os cromatogramas obtidos, onde pode-se observar separação entre as
gentamicinas a partir da concentração 0,05M.
Figura 4.42 - Influência da concentração de TFA no fator de retenção (k) dos
antibióticos neomicina e estreptomicina.
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Fator de Retenção (k)
Concentração de TFA (mol/L)
Neomicina
Estreptomicina
Resultados e Discussão
117
Figura 4.43 – Influência da concentração de TFA no fator de retenção (k) do
antibiótico gentamicina.
Figura 4.44 – Cromatogramas de análise da Gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições Cromatográficas: FM: TFA
(0,005, 0,01, 0,05, 0,08 e 0,1M), Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL.
Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC, Vazão do Gás (ar
comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
0
5
10
15
20
25
Fator de retenção - (k)
Concentração de TFA (mol/L)
Gentamicina C1a
Gentamicina C2
Gentamicina C2a
Gentamicina C1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Gentamicina
0,005M
0,01M
mV
Tempo (min)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Gentamicina
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
118
Excelente resolução foi obtida entre todas as bandas cromatográficas
de gentamicina, quando TFA foi usado na concentração de 0,05 M (Figura 4.45).
Deste modo, essa concentração pode ser utilizada quando da otimização de
condições de separação em menor tempo de análise.
Para verificar a influência da fase estacionária na retenção dos
compostos analisados, a coluna fenil foi então avaliada nas mesmas condições da
coluna C
18
. Em cromatografia no modo reverso, as interações predominantes na
coluna fenil, assim como na C
18
, são interações hidrofóbicas. No entanto,
interações do tipo π-π, predominantes nesta coluna no modo normal de eluição,
podem também ocorrer.
Figura 4.45 –
Cromatograma de análise da Gentamicina (1 mg/mL) utilizando a
coluna C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições Cromatográficas: FM: TFA
0,05M, Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD:
Temperatura do Tubo: 115 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1
e Impactor: off.
De acordo com os resultados obtidos, uma diminuição nos fatores de
retenção para os três antibióticos aminoglicosídeos avaliados foi verificado com o
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
mV
Tempo (min)
C
1
a
C
2
C
2a
C
1
Resultados e Discussão
119
aumento da concentração de 0,005M para 0,01M de TFA. A partir desta
concentração, nenhuma alteração significante nos fatores de retenção foi verificada
assim como nenhuma resolução para as gentamicinas foi observado. A Figura 4.46
mostra os cromatogramas obtidos para os três antibióticos nas concentrações 0,005
e 0,01M.
Esses resultados mostram que somente um dos mecanismos propostos
para a cromatografia de par iônico deve estar ocorrendo, ou seja, a formação do par
iônico na fase móvel, e não troca iônica dinâmica pela adsorção do contra-íon na
fase estacionária, uma vez que neste último caso, um aumento no tempo de
retenção seria esperado.
A comparação entre as colunas fenil e C
18
para as concentrações 0,005
e 0,01M (Figura 4.47) mostra a grande diferença obtida para a concentração
0,005M e a semelhança entre as bandas cromatográficas na concentração 0,01M,
indicando que o mecanismo de retenção é diferente para as duas colunas.
Na coluna C
18
provavelmente o mecanismo é o da troca iônica
dinâmica pela adsorção do contra-íon na fase estacionária, onde o aumento da
concentração do agente de pareamento iônico leva a uma maior adsorção do
mesmo na fase estacionária aumentando o número de sítios disponíveis para a troca
iônica favorecendo assim a retenção dos compostos avaliados. Já para a coluna
fenil, o mecanismo predominante é o da formação do par iônico na fase móvel onde
a retenção dos compostos se dá por hidrofobia, a qual diminui com o aumento da
concentração do ácido.
Resultados e Discussão
120
Figura 4.46 –
Cromatogramas de análise das amostras de gentamicina, neomicina e
estreptomicina (1 mg/mL) utilizando a coluna Fenil
(Hypersil 15x0,41 cm d.i).
Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,005, 0,01 M), Vazão: 1,0 mL/min,
Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC,
Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
Estreptomicina
0,01M
0,005M
mV
Tempo (min)
0 5 10 15 20 25
0
100
200
300
400
500
Gentamicina
0,01M
0,005M
mV
Tempo (min)
0 5 10 15 20 25
0
100
200
300
400
500
Gentamicina
0,01M
0,005M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
121
Figura 4.47 –
Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina utilizando as Colunas Fenil e C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i).
Condições Cromatográficas: FM: TFA (0,005, 0,01 M), Vazão: 1,0 mL/min,
Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 115 ºC ,
Vazão do Gás (ar comprimido): 3,2 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
200
400
600
800
1000
TFA 0,005M
Estreptomicina
Coluna Fenil
Coluna C
18
mV
Tempo (min)
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
0
100
200
300
400
500
TFA 0,005M
Neomicina
Coluna Fenil
Coluna C
18
mV
Tempo (min)
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
0
25
50
75
100
125
150
175
200
TFA 0,005M
Gentamicina
Coluna Fenil
Coluna C
18
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
TFA 0,01M
Estreptomicina
Coluna Fenil
Coluna C
18
mV
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14
0
50
100
150
200
250
300
350
400
TFA 0,01M
Gentamicina
Coluna Fenil
Coluna C
18
mV
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14
0
100
200
300
400
500
600
TFA 0,01M
Neomicina
Coluna Fenil
Coluna C
18
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
122
4.2.2 - A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO O AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO
HFBA
NAS
COLUNAS
C
18
E FENIL
O ácido HFBA foi avaliado nas mesmas concentrações do TFA, no
entanto nenhuma banda cromatográfica foi observada indicando a não eluição dos
antibióticos. Deste modo, para aumentar a força da fase móvel, foi utilizado
metanol como modificador orgânico na proporção CH
3
OH/HFBA (60:40)
mantendo as concentrações do ácido anteriormente avaliadas.
As condições do detector de espalhamento de luz foram novamente
otimizadas de acordo com a porcentagem de CH
3
OH adicionada na fase móvel para
eficiente nebulização, evaporação e detecção dos antibióticos avaliados. As
condições otimizadas foram mais brandas, uma vez que a porcentagem de fase
aquosa na fase móvel é menor facilitando o processo de nebulização e evaporação.
A temperatura do tubo foi 94,3 ºC, a vazão do gás (ar comprimido) 2,5 L/min, o
ganho 1 e o impactor: off.
Os resultados obtidos utilizando a concentração de 0,005M foram
descartados para evitar erros nos cálculos dos fatores de retenção, uma vez que os
cromatogramas obtidos apresentaram dúvidas com relação à observação das bandas
cromatográficas. Para as outras concentrações foi possível a observação de bandas
cromatográficas intensas para os três aminoglicosídeos avaliados e uma separação
parcial dos componentes da gentamicina foi obtida.
Pouca alteração nos fatores de retenção foi observada com o aumento da
concentração do ácido e um leve decréscimo a partir da concentração 0,05 M pode
ser observado na Figura 4.48. Este decréscimo pode ser justificado pela alta
concentração do ácido utilizada levando a uma saturação da superfície da coluna
cromatográfica diminuindo sua eficiência, além de uma possível competição do
Resultados e Discussão
123
contra-íon do agente de pareamento pela formação do par iônico na superfície da
coluna cromatográfica influenciando o mecanismo de retenção. A Figura 4.49
mostra os cromatogramas obtidos.
Figura 4.48 – Influência da concentração de HFBA no fator de retenção (k) dos
antibióticos neomicina, gentamicina e estreptomicina.
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Fator de Retenção (k)
Concentração de HFBA (M)
Neomicina
Gentamicina
Estreptomicina
Resultados e Discussão
124
Figura 4.49 –
Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina, utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/HFBA (0,01, 0,05, 0,08 e 0,1M) (60:40), Vazão: 1,0
mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo:
94,3 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 2,5 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
As mesmas condições de análise foram também aplicadas para a
coluna fenil, e os resultados obtidos foram semelhantes. Nenhuma diferença
significante no tempo de retenção foi observada com o aumento das concentrações
(Figura 4.50). Para a gentamicina, diferentemente do observado para o TFA,
nenhuma separação parcial foi obida.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Gentamicina
HFBA
0,01M
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 4 8 12 16 20 24 28
0
50
100
150
200
250
300
Neomicina
HFBA
0,01M
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Estreptomicina
HFBA
0,01M
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
125
Assim como o TFA, o HFBA apresentou os mesmos mecanismos de
formação do par iônico nas duas colunas cromatográficas, o mecanismo de
formação do par iônico na fase móvel e retenção por hidrofobia para a coluna fenil
e, o mecanismo de formação do par iônico na fase estacionária com retenção por
troca iônica para a coluna C
18
.
Figura 4.50 –
Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina utilizando a coluna Fenil (Hypersil 15x0,41 cm d.i). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/HFBA (0,01, 0,05, 0,08 e 0,1M) (60:40), Vazão: 1,0
mL/min, Volume de Injeção: 15 uL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo:
94,3 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 2,5 L/min, Ganho: 1 e Impactor: off.
0 3 6 9 12
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Estreptomicina
HFBA
0,01M
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Neomicina
HFBA
0,01M
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Gentamicina
HFBA
0,01M
0,05M
0,08M
0,1M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
126
4.2.3
-
A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO O AGENTE DE PAREAMENTO IÔNICO
PFPA
NAS
COLUNAS
C
18
E FENIL
O ácido PFPA foi também avaliado como agente de pareamento
iônico. As concentrações avaliadas foram 0,01; 0,025; 0,05; 0,075 e 0,1M.
Assim como no uso de HFBA, os antibióticos avaliados não eluiram
com uma fase móvel de 100% de PFPA em todas as concentrações estudadas.
Deste modo, para tornar a fase móvel mais forte foi utilizada a mistura 50:50
CH
3
OH/PFPA nas concentrações do ácido avaliadas.
As condições do detector de espalhamento de luz foram otimizadas de
acordo com a porcentagem de metanol na fase móvel para eficiente nebulização,
evaporação e detecção dos antibióticos avaliados. A temperatura do tubo foi
otimizada em 87,5 ºC, a vazão do gás (ar comprimido) 2,6 L/min, o ganho 1 e o
impactor: off.
Para o antibiótico estreptomicina, na coluna C
18
, o fator de retenção
diminuiu com o aumento da concentração do ácido. Para a gentamicina e
neomicina essa diminuição também foi observada até a concentração 0,05M e a
partir desta um leve aumento pode ser verificado; assim como uma separação
parcial dos componentes da gentamicina.
Na retenção por cromatografia de pareamento iônico a concentração
do agente de pareamento iônico pode levar a mudanças de mecanismo de retenção
de modo reverso para troca-iônica. Considerando o mecanismo de troca-iônica dois
fatores são importantes: 1) a saturação da fase estacionária - que depende da
relação de concentração do agente de pareamento iônico na fase móvel pela
concentração na fase estacionária e 2) a competição entre o contra-íon do agente de
pareamento iônico e o analito, pelo agente pareante adsorvido na fase estacionária.
Resultados e Discussão
127
Fazendo estas considerações, pode-se inferir que a diminuição na
retenção da estreptomicina com o aumento da concentração do agente de
pareamento iônico pode ter ocorrido pelo mecanismo de troca iônica com a
competição do contra-íon do agente pareante.
Para a neomicina e gentamicina o alto fator de retenção observado
indica que o mecanismo inicial é de retenção no modo reverso; e o decréscimo
observado até a concentração 0,05M pode ser explicado devido a uma transição
entre os mecanismos de modo reverso e troca-iônica; uma vez que após este
decréscimo nenhuma alteração significante no valor do fator de retenção foi
observada.
Dentre os três compostos avaliados, a formação do par iônico foi mais
eficiente para a neomicina, a qual apresentou maior valor de fator de retenção (k)
em todas as concentrações avaliadas do PFPA usado na fase móvel.
A Figura 4.51 mostra a relação encontrada entre a concentração do
agente de pareamento iônico PFPA e o fator de retenção dos compostos e a Figura
4.52 mostra os cromatogramas obtidos para este estudo.
A coluna fenil apresenta uma fase estacionária com maior polaridade
do que a coluna C
18
, assim, uma saturação desta fase com uma menor concentração
do agente de pareamento iônico pode ocorrer. Isto pode ser observado de acordo
com os resultados obtidos onde as retenções foram menores do que as obtidas para
a coluna C
18
.
Foi verificada uma diminuição dos fatores de retenção dos antibióticos
aminoglicosídeos com o aumento da concentração do acido PFPA; pode-se inferir
que o mecanismo predominante neste caso é o de troca iônica com uma competição
do contra-íon do agente de pareamento com os antibióticos aminoglicosídeos
devido a alta concentração de PFPA no meio. A Figura 4.53 mostra os
cromatogramas obtidos.
Resultados e Discussão
128
Figura 4.51 – Influência da concentração de PFPA no fator de retenção (k) dos
antibióticos estreptomicina, gentamicina e neomicina.
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Fator de Retenção (k)
Concentração de PFPA (M)
Neomicina
Gentamicina
Estreptomicina
Resultados e Discussão
129
Figura 4.52 – Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina, utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,46 cm d.i.). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/PFPA (0,01 e 0,1M) (1:1), Vazão: 1,0 mL/min;
Volume de injeção 15 µL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 87,5 ºC,
Vazão do gás (ar comprimido): 2,6 L/min, Ganho: 1 e Impactro: off.
0 2 4 6 8 10 12 14
0
20
40
60
80
100
Estreptomicina
PFPA
0,01M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Gentamicina
PFPA
0,01M
0,1M
mV
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Neomicina
PFPA
0,01M
0,1M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
130
Figura 4.53
–
Cromatogramas das amostras de neomicina, gentamicina e
estreptomicina utilizando a coluna Fenil (Hypersil 15 x 0,46 cm d.i.). Condições
Cromatográficas: FM: MEOH/PFPA (0,01 e 0,1M) (1:1), Vazão: 1,0 mL/min;
Volume de injeção 15 µL. Condições do ELSD: Temperatura do Tubo: 87,5 ºC,
Vazão do gás (ar comprimido): 2,6 L/min, Ganho: 1 e Impactro: off.
De acordo com esse estudo, foi possível verificar o comportamento
cromatográfico dos antibióticos aminoglicosídeos gentamicina, estreptomicina e
neomicina em cromatografia de pareamento iônico utilizando os ácidos TFA, PFPA
e HTBA nas colunas C
18
e fenil.
Este estudo é de fundamental importância para o desenvolvimento de
métodos de análise direta dos mesmos, uma vez que a maioria dos métodos
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
80
0,01M
0,1M
PFPA
Estreptomicina
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6
0
50
100
150
200
250
300
350
0,01M
0,1M
PFPA
Gentamicina
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
PFPA
Neomicina
0,01M
0,1M
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
131
descritos faz uso de derivação pós-coluna para detecção por ultravioleta e/ou
fluorescência.
154
Baseado neste estudo, condições cromatográficas para o
desenvolvimento de métodos de análise de controle de qualidade para
medicamentos veterinários contendo estes antibióticos, foram também
investigados.
4.3
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
PARA O CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS
Os antibióticos aminoglicosídeos são amplamente utilizados na
medicina veterinária no tratamento de mastites e outras doenças relacionadas,
apresentam alta toxicidade, de modo que deve ser realizado um controle adequado
destes compostos como ativos em medicamentos.
Uma vez que os aminoglicosídeos não apresentam grupos cromóforos,
a maioria dos métodos analíticos utilizados faz uso de derivação da amostra com
detecção por fluorescência.
154
Entretanto, técnicas de derivação apresentam várias
desvantagens, influenciadas por parâmetros experimentais como reação de
derivação incompleta, interferência dos reagentes, longo tempo de preparo da
amostra, entre outros.
Uma alternativa aos métodos de derivação é a detecção direta dos
aminoglicosídeos utilizando detectores universais como espectrometria de massas
(EM), índice de refração (IR) e o detector de espalhamento de luz (ELSD).
Dentre esses detectores o ELSD tem se destacado como um detector
simples, sensível e eficiente para este tipo de análise. Ao contrário do IR, não é um
detector sensível a alterações de temperatura podendo também ser usado em
eluições gradiente sem mudanças significativas na linha de base. Com relação ao
Resultados e Discussão
132
EM, o ELSD, embora menos sensível, destaca-se por ser uma técnica mais simples
e relativamente barata.
Levando em consideração os resultados obtidos nos estudos descritos
no item 4.2 e a necessidade de métodos de análise simples e diretos, foram
selecionados a coluna analítica C
18
e o ácido TFA na concentração de 0,05M para o
desenvolvimento de métodos analíticos de controle de qualidade de medicamentos
veterinários com detecção por ELSD.
4.3.1. - Q
UANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO ESTREPTOMICINA EM
MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS
A estreptomicina (Figura 4.54) é um importante antibiótico
pertencente ao grupo dos aminoglicosídeos. É produzido pelo fungo streptomyces
griseus e é particularmente ativo contra bactérias aeróbicas gram-negativas.
155
Este antibiótico é bastante utilizado na apicultura
156
para proteger as
abelhas contra uma série de doenças e especialmente como medicamento
veterinário no tratamento da mastite e outras doenças relacionadas.
Figura 4.54 – Estrutura química da estreptomicina.
OH
HN
O
HO
NH
OH
H
2
N
NH
H
2
N
NH
O
O
OH
H
3
C
O
NH
CH
3
HO
HO
H
O
CHO
Resultados e Discussão
133
4.3.1.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
Embora, de acordo com o estudo realizado, boa seletividade tenha sido
obtida com a utilização da fase móvel 100% TFA 0,05M (Figura 4.55A), visando
proporcionar uma proteção para a coluna utilizada, pequenas porcentagens de
metanol foram adicionadas na fase móvel. As condições avaliadas foram: TFA
(0,05M)/MeOH (99:01 v/v) e (97:03 v/v).
De acordo com os cromatogramas obtidos pôde-se verificar que a
presença do metanol leva a bandas cromatográficas mais finas e, como esperado,
com menores tempos de retenção.
Dentre as fases móveis avaliadas, a que faz uso de 1% de metanol foi
selecionada por apresentar um cromatograma com tempo de análise adequado e
melhor simetria de banda. A Figura 4.55B mostra o cromatograma com a condição
selecionada para análise.
Figura 4.55 –
Cromatogramas de análise de uma amostra de estreptomicina (500
µg/mL) utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm).
Condições cromatográficas: FM: A) TFA 0,05M e B) TFA (0,05M)/MeOH (99:01
v/v); Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção 15 µL.
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
120
140
Sulfato
Estreptomicina
mV
Tempo (min)
0 1 2 3 4 5 6
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Sulfato
Estreptomicina
mV
Tempo (min)
A
B
Resultados e Discussão
134
Com as condições cromatográficas estabelecidas, o método
desenvolvido foi validado. As figuras de mérito avaliadas foram linearidade,
precisão, inter e intradia, exatidão e limites de quantificação e detecção.
As analises foram realizadas utilizando-se a condição cromatográfica e
parâmetros do detector descritos na Tabela 4.11, e a Figura 4.56 apresenta o
cromatograma obtido durante a validação do método.
Tabela 4.11: Valores otimizados do método LC-ELSD para a análise do
antibiótico estreptomicina.
Coluna
C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.) (120 Å, 10 µm)
Fase Móvel
TFA (0,05M)/ CH
3
OH (99:01 v/v)
Vazão
1,0 mL/min
Tempo de Análise
5 minutos
Temperatura do Tubo
115 ºC
Vazão do Gás (ar comprimido)
3,2 L/min
Ganho
1
Impactor
off
De acordo com os princípios de funcionamento e resposta de detector,
para facilitar sua utilização para a quantificação, as curvas de calibração são
geralmente plotadas em uma escala logarítmica resultando em uma resposta linear.
Deste modo, utilizando as condições descritas (Tabela 4.11) e levando
em consideração a pureza do padrão secundário certificado utilizado (75,1% de
estreptomicina), a curva de calibração para a estreptomicina (Figura 4. 57) foi
obtida em função das áreas das bandas cromatográficas relativas as seguintes
concentrações de estreptomicina: 0,10; 0,20; 0,35; 0,50; 0,60; 0,75; 0,90 e 1,0
mg/mL de acordo com a curva de calibração logarítmica log A = blog C
mg/mL
+ log
Resultados e Discussão
135
α. As amostras foram preparadas, em triplicata, em TFA 0,05M, para cada
concentração, injetadas (15µL) e a curva mostrou-se linear na faixa de
concentração utilizada. O desvio padrão da regressão linear foi de 0,001 para
ambos os coeficientes de correlação linear e angular da curva.
Figura 4.56 – Cromatograma típico obtido da análise da estreptomicina na
concentração de 0,35 mg/mL durante a validação do método.
A precisão expressa pelo coeficiente de variação (CV%) das triplicatas
foi inferior a 2% e a exatidão apresentou um desvio menor que 5% do valor
nominal de concentração em todas as concentrações da curva incluindo para o LQ.
A precisão e exatidão, intra e interdias do método, foi determinada
analisando-se as quintuplicatas dos três controles de qualidade (0,12; 0,40 e 0,80
mg/mL), em um mesmo dia e em dias não consecutivos. A precisão foi expressa
pelo coeficiente de variação (CV%) e a exatidão foi avaliada através da
interpolação dos resultados na curva de calibração e expressa como percentagem de
desvio entre as quantidades adicionadas e as quantificadas nas três concentrações
examinadas. Os resultados estão mostrados na Tabela 4.12.
0 1 2 3 4 5
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
mV
Tempo (min)
Estreptomicina
Sulfato
Resultados e Discussão
136
Figura 4.57 – Curva de Calibração obtida para a estreptomicina.
A precisão apresentou para as quintuplicatas das amostras, CV de
0,380 a 1,86%, e a exatidão apresentou valores de 94,6 a 105% da concentração
nominal. Todos os valores estão de acordo com os critérios de aceitação do método
com variabilidades menores ou iguais a 2 e 5%, respectivamente.
157
A exatidão do método foi também avaliada pela análise de duas
amostras de concentrações desconhecidas ao analista e chamado de teste cego. Os
resultados estão apresentados na Tabela 4.13.
Tabela 4.12: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise da
estreptomicina.
Concentração
a
(mg/mL)
1º dia (n=5) 2º dia (n=5) 3 º dia (n=5) 3 dias (média)
(n=15)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
0.12 101 1.05 95.5 1.76 94.6 0.380
96.9 1.06
0.40 105 1.75 102 1.90 97.1 1.86 101 1.84
0.80 98.4 1.65 98.7 0.870
97.1 0.940
98.1 1.15
a
Concentração teórica
-1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0
5.6
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
log Area
log Conc
Estreptomicina
y = 7,10262 (± 0,001) x +
1,43236 (± 0,001)
r = 0,999
Resultados e Discussão
137
Tabela 4.13: Precisão e exatidão obtidas para a estreptomicina no teste cego (n=3).
Concentração
adicionada
(mg/mL)
CV
(%)
Exatidão
(%)
Amostra 1 0,195 1,02
98,1
Amostra 2 0,650 2,00
96,2
O critério de aceitação para o limite de quantificação foi que a
precisão e a exatidão das triplicatas não ultrapassassem o valor de 2 e 5% de
variabilidade respectivamente
157
, enquanto que o limite de detecção foi calculado
obtendo-se um sinal três vezes maior que o ruído do detector. Os valores obtidos
foram de 0,0175 mg/mL e de 0,0091 mg/mL para os limites de quantificação e
detecção, respectivamente.
4.3.1.2
–
A
PLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA ANÁLISE DE
ESTREPTOMICINA
O método foi aplicado e dois diferentes medicamentos veterinários
(Estreptomax - Ouro Fino e estreptomicina – Fort Dodge) foram avaliados em
triplicata. Para a análise, o conteúdo de dois frascos foi pesado e misturado e
considerando o valor do rótulo, três amostras em uma mesma concentração foram
preparadas para análise.
A precisão e exatidão obtidas não ultrapassaram os valores de 2 e 5%
aceitos. Os resultados encontrados estão descritos na Tabela 4.14.
Os valores encontrados para os medicamentos analisados (5,5 g para a
amostra 1 e 5,3 g para a amostra 2) estavam em conformidade com os rótulos (5,0 g
de estreptomicina).
Resultados e Discussão
138
É importante destacar que a seletividade para a estreptomicina no
produto acabado não foi avaliada. Esta avaliação poderia ser realizada pela análise
de um placebo, fornecido pelas empresas veterinárias, ou então pela construção de
uma curva de calibração utilizando o método de adição de padrão. No entanto,
nenhum desses procedimentos foi realizado.
Tabela 4.14: Exatidão, precisão e concentração experimental obtida na análise em
triplicata da estreptomicina em medicamentos veterinários de acordo com o método
desenvolvido.
Amostra 1
Amostra 2
Concentração Teórica (mg/mL) 0,60
0,60
Concentração Encontrada (mg/mL)
0,64 0,66
CV (%)
0.50
0.71
Exatidão (%)
106
111
4.3.2
-
Q
UANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO GENTAMICINA EM
MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS
A gentamicina (sulfato), antibiótico produzido pelo fungo
Micromonospora purpúrea e efetivo contra um amplo espectro de bactérias gram-
positivas e gram-negativas, consiste principalmente de quatro substâncias análogas
designadas como C
1
,
C
1a
, C
2
e C
2a
(Figura 4.58).
31
O método oficial para a determinação de gentamicina em formulações
farmacêuticas, segundo a farmacopéia americana
159
, é um método microbiológico,
o qual demanda um longo tempo de análise. Além disso, a falta de material de
referência padrão dos constituintes da gentamicina dificulta a quantificação direta
de cada componente, de modo que a análise cromatográfica é limitada à
Resultados e Discussão
139
determinação da fração relativa, a qual é influenciada pelas diferentes
absortividades de cada componente (fator de resposta).
Aproveitando a vantagem do ELSD de apresentar fatores de resposta
semelhantes para moléculas com massa molecular e com fórmulas estruturais
semelhantes e levando em consideração a falta de padrões para cada componente
da gentamicina, MEGOULAS e KOUPPARIS
31
apresentaram um estudo
envolvendo o desenvolvimento e validação de um método de análise dos
componentes do sulfato de gentamicina em formulações farmacêuticas por LC-
ELSD, utilizando os valores de coeficiente linear e angular de uma equação de reta
obtida a partir de uma curva de calibração construída para um composto
semelhante a gentamicina, denominado canamicina.
Figura 4.58 – Estrutura química dos componentes da gentamicina.
Segundo o estudo, levando em consideração a resposta do detector de
espalhamento de luz (ELSD), o coeficiente linear e angular das curvas de
calibração logarítmica dos componentes da gentamicina e da canamicina devem ser
O
NHR
1
R
2
R
3
NH
2
O
NH
2
H
2
N
HO
O
O
HO
NH
H
3
C
CH
3
OH
Gentamicina
C
1
. R
1
= R
2
= CH
3
e R
3
= H
C
1a.
R
1
=
R
2
= R
3
= H
C
2
. R
1
= R
3
= H e R
2
= CH
3
C
2a
. R
1
= R
2
= H e R
3
= CH
3
Resultados e Discussão
140
estatisticamente iguais. No entanto, para a quantificação dos componentes da
gentamicina deve ser introduzido um fator de correção das proporções de cada
componente (x).
De acordo com esses parâmetros foram construídas as regressões
lineares dos componentes da gentamicina e realizadas as quantificações de cada
composto em quatro formulações comerciais.
31
Deste modo, a canamicina foi
utilizada como padrão externo secundário para a quantificação das substâncias que
compõem o antibiótico gentamicina.
Baseando-se no estudo realizado, foram desenvolvidos dois métodos
de análise; um utilizando a gentamicina como padrão externo levando em
consideração a pureza do padrão e as proporções das respectivas áreas de cada
componente da mistura e o outro baseado no método de MEGOULAS e
KOUPPARIS
31
com a utilização da canamicina como padrão externo secundário.
Isso foi feito para avaliar a necessidade de uso de um padrão diferente da
gentamicina.
4.3.2.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS
A alta seletividade apresentada pela gentamicina utilizando o ácido
TFA e a analítica coluna C
18
permitiu um estudo de otimização das condições
cromatográficas mantendo a alta resolução obtida em um menor tempo de análise.
Foram avaliadas nesse estudo as seguintes fases móveis:
- TFA (0,05M)/CH
3
CN (95:05) (v/v)
- TFA (0,05M)/CH
3
CN (96:04) (v/v)
- TFA (0,05M)/CH
3
CN (97:03) (v/v)
Resultados e Discussão
141
A Figura 4.59 mostra os cromatogramas obtidos e dentre as fases
móveis avaliadas, a que faz uso de 3% de acetonitrila foi selecionada por apresentar
um cromatograma com excelente resolução e tempo de análise adequado.
Foi feita a análise da solução padrão de canamicina, nas mesmas
condições selecionadas para separação da gentamicina. Nessas condições, foi
possível analisar a canamicina e os 4 componentes da gentamicina com alta
seletividade e resolução para todos os componentes da amostra.
São apresentados na Tabela 4.15 as condições cromatográficas e os
parâmetros do detector otimizados para a análise dos antibióticos gentamicina e
canamicina
Considerando as respectivas polaridades dos componentes da
gentamicina, a ordem de eluição designada para a condição cromatográfica
utilizada foi C
1a
, C
2
, C
2a
e C
1
. Esta ordem de eluição também está de acordo com a
ordem de eluição proposta por MEGOULAS
31
no trabalho acima citado.
Com as condições cromatográficas estabelecidas, os métodos
desenvolvidos envolvendo a análise simultânea da canamicina e da gentamicina
foram validados, e as figuras de mérito analíticas avaliadas foram linearidade,
precisão inter e intradia, exatidão e limites de quantificação e detecção.
Resultados e Discussão
142
Figura 4.59 – Cromatogramas de análise da gentamicina (50 µg/mL) utilizando a
coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm). Condições
cromatográficas: A: TFA (0,05M)/CH
3
CN (95:05), B: TFA (0,05M)/CH
3
CN
(96:04) e C: TFA (0,05M)/CH
3
CN (97:03). Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção
15 µL. Condições do ELSD: Temperatuta do tubo: 113,6 ºC, Vazão do Gás (ar
comprimido): 3,1 L/min, Ganho: 1 e Impactro: off.
0 1 2 3 4 5 6 7
0
50
100
150
200
250
mV
Tempo (min)
Kanamicina
Gentamicinas
A
0 2 4 6 8 10 12
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
mV
Tempo (min)
Kanamicina
Gentamicinas
B
0 2 4 6 8
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mV
Tempo (min)
Kanamicina
Gentamicinas
C
Canamicina Canamicina
Canamicina
Resultados e Discussão
143
Tabela 4.15: Valores otimizados do método LC-ELSD para a análise dos
antibióticos gentamicina e canamicina.
Coluna
C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.) (120 Å, 10 µm)
Fase Móvel
TFA (0,05M)/ CH
3
CN (97:03 v/v)
Vazão
1,0 mL/min
Tempo de Análise
5 minutos
Temperatura do Tubo
113,6 ºC
Vazão do Gás (ar comprimido)
3,1 L/min
Ganho
1
Impactor
off
4.3.2.1.1
-
P
ADRONIZAÇÃO EXTERNA UTILIZANDO A GENTAMICINA
Utilizando as condições descritas (Tabela 4.15) e levando em
consideração a pureza do padrão secundário utilizado (62,3% para a mistura de
gentamicina), as curvas de calibração para os componentes da gentamicina (Figura
4.60 A-D) foram obtidas em função das proporções das áreas das bandas
cromatográficas relativas às seguintes concentrações de gentamicina total: 0,100;
0,200; 0,350; 0,500; 0,600; 0,750; 0,900 e 1,00 mg/mL de acordo com a curva de
calibração logarítmica log A = b log C
mg/mL
+ log α. As soluções de calibração
foram preparadas e analisadas (20µL) em triplicata em TFA 0,050M, para cada
concentração. As curvas analíticas mostraram-se linear nas faixas de concentração
utilizadas (Tabela 4.16). O desvio padrão da regressão linear para o coeficiente
angular foi de 0,007; 0,010; 0,012; 0,008 para as gentamicinas C
1a
, C
2
, C
2a
e C
1
,
respectivamente. Para o coeficiente de correlação linear os valores obtidos foram
de 0,010; 0,009; 0,011; 0,008 para as gentamicinas C
1a
, C
2
, C
2a
e C
1
,
respectivamente.
Resultados e Discussão
144
É importante destacar que os valores obtidos para os coeficientes
linear e angular de todas as equações de reta são bastante semelhantes entre si,
ratificando que compostos semelhantes apresentam respostas similares pelo
detector de ELSD. Deste modo, pode-se inferir que a validação utilizando a própria
gentamicina como padrão externo é confiável, uma vez que os compostos são
extremamente semelhantes entre si.
Tabela 4.16: Concentrações dos componentes da gentamicina.
Gentamicina Concentrações (mg/mL)
C
1a
0,016; 0,032; 0,059; 0,082; 0,102; 0,126; 0,150 e 0,168
C
2
0,037; 0,076; 0,133; 0,196; 0,226; 0,284; 0,341e 0,374
C
2a
0,016; 0,031; 0,054; 0,077; 0,096; 0,119; 0,142 e 0,165
C
1
0,030; 0,061; 0,104; 0,144; 0,175; 0,221; 0,267 e 0,293
Resultados e Discussão
145
Figura 4.60
–
Curvas de calibração obtida para os componentes da gentamicina.
As precisões, expressas pelo coeficiente de variação (CV%) das
triplicatas, foram inferiores a 2% e as exatidões apresentaram um desvio menor que
5% do valor nominal de concentração em todas as concentrações para as quatro
curvas obtidas, incluindo para os LQs.
As precisões e exatidões, intra e interdias dos métodos, foram
determinadas analisando-se quintuplicatas dos três controles de qualidade (0,120;
0,400 e 0,800 mg/mL de gentamicina total), em um mesmo dia e em dias não
consecutivos, respectivamente. A precisão foi expressa pelo coeficiente de variação
-1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
Gentamicina C
2a
log Area
log Concentração
-1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
Gentamicina C
1a
log Area
log Concentração
-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
Gentamicina C
2
log Area
log Concentração
-1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
Gentamicina C
1
log Area
log Concentração
y = 1,3688 (± 0,007) x +
7,5249 (± 0,010)
r = 0,9998
y = 1,385 (± 0,010) x +
7,4033 (± 0,009)
r = 0,9999
y = 1,3849 (± 0,012) x +
7,5488 (± 0,011)
r = 0,9998
y = 1,3901 (± 0,008) x +
7,4498 (± 0,008)
r = 0,9997
Resultados e Discussão
146
(CV%) e a exatidão foi avaliada através da interpolação dos resultados na curva de
calibração e expressa como percentagem de desvio entre as quantidades
adicionadas e as quantificadas nas três concentrações examinadas. Os resultados
estão mostrados na Tabela 4.17.
A precisão apresentou para as replicatas das amostras CV de 0,52 a
2%, enquanto a exatidão valores de 92,6 a 115 das concentrações nominais. Todos
os valores estão de acordo com os critérios de aceitação do método com
variabilidade menores ou iguais a 2 e 15% respectivamente.
Foi também avaliada a exatidão do método pela análise de duas
amostras de concentrações desconhecidas ao analista e chamado de teste cego. Os
resultados estão apresentados na Tabela 4.18.
O critério de aceitação para o limite de quantificação foi que a
precisão e a exatidão de três amostras não ultrapassassem o valor de 2 e 15% de
variabilidade respectivamente
157
, enquanto que o limite de detecção foi calculado
considerando um sinal três vezes maior que o ruído do detector. Os valores obtidos
para o limite de quantificação estão apresentados na Tabela 4.19 e para o limite
detecção na Tabela 4.20.
Resultados e Discussão
147
Tabela 4.17: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise dos
componentes da gentamicina.
C T
a
(mg/mL)
C P
a
(mg/mL)
1º dia (n=5) 2º dia (n=5)
3 º dia
(n=5)
3 dias (média)
(n=15)
Ex
(%)
CV
(%)
Ex
(%)
CV
(%)
Ex
(%)
CV
(%)
Ex
(%)
CV
(%)
0.120
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,019
0,044
0,019
0,036
107
107
104
97,8
0,520
1,77
0,670
1,23
115
114
115
114
1.98
0,810
1,81
1,56
98,2
98,9
93,7
114
1,96
1,90
1,98
2,00
110
110
107
108
1.49
1,49
1,49
1,60
0.400
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,067
0,150
0,066
0,117
101
104
97,4
100
2,00
1,25
1,78
0,52
107
110
106
108
1,21
1,43
1,61
2,00
99,0
102
92,6
108
1,73
1,47
2,00
2,00
102
105
98,7
105
1.65
1,38
1,80
1,51
0.800
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,134
0,299
0,132
0,234
96,8
99,9
95,7
99,3
1.96
1,49
0,95
1,71
102
104
103
107
1,74
1,85
2,00
2,00
98,7
101
94,6
107
1,69
1,89
1,32
1,67
99,3
101
97,8
104
1,80
1,74
1,42
1,79
Concentração teórica
CT
a
– Concentração teórica total de gentamicina
CP
a
– Concentração teórica proporcional de gentamicina
Ex - Exatidão
Resultados e Discussão
148
Tabela 4.18: Precisão e exatidão obtidas para a neomicina no teste cego (n=3).
Gentamicinas
Concentração
adicionada
(mg/mL)
CV
(%)
Exatidão
(%)
Amostra 1
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,205
a
0,046
0,055
0,045
0,059
0,790
2,00
1,69
2,00
91,8
92,0
89,9
98,1
Amostra 2
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,343
a
0,077
0,096
0,076
0,094
0,72
1,04
2,00
2,00
95,7
96,2
94,5
93,9
a
Concentração total de gentamicina
Tabela 4.19: Limites de Quantificação para os componentes da gentamicina.
Gentamicinas LQ (mg/mL)
C
1a
0,012
C
2
0,028
C
2a
0,012
C
1
0,022
Resultados e Discussão
149
Tabela 4.20: Limites de Detecção para os componentes da gentamicina.
Gentamicinas LD (mg/mL)
1 0,009
2 0,013
3 0,009
4 0,015
4.3.2.1.2
–
P
ADRONIZAÇÃO EXTERNA UTILIZANDO A CANAMICINA
COMO PADRÃO SECUNDÁRIO
Embora os valores necessários para o desenvolvimento do método da
gentamicina, utilizando a canamicina como padrão externo secundário, dependesse
apenas dos coeficientes linear e angular da reta da canamicina, a análise de precisão
e exatidão intra e inter dia foram também avaliadas.
Utilizando as condições descritas (Tabela 4.15), a curva de calibração
para a canamicina (Figura 4.61) foi obtida em função das áreas das bandas
cromatográficas relativas às seguintes concentrações de canamicina: 0,020; 0,040;
0,070; 0,100; 0,120; 0,150; 0,180 e 0,200 mg/mL de acordo com a curva de
calibração logarítmica log A = b log C
mg/mL
+ log α, sendo que para isso as
amostras foram preparadas em triplicata em TFA 0,050M, para cada concentração,
injetadas (20µL) e a curva mostrou-se linear na faixa de concentração utilizada. O
desvio padrão da regressão linear para o coeficiente angular foi de 0,006 e para o
coeficiente de correlação linear o valor obtido foi de 0,007.
Resultados e Discussão
150
Figura 4.61 – Curva de calibração obtida para a canamicina.
A precisão expressa pelo coeficiente de variação (CV%) das triplicatas
foi inferior a 2% e a exatidão apresentou um desvio menor que 5% do valor
nominal de concentração em todas as concentrações da curva incluindo para o LQ.
A precisão e exatidão, intra e interdias do método, foi determinada
analisando-se cinco replicatas dos três controles de qualidade (0,024; 0,080 e 0,160
mg/mL), em um mesmo dia e em dias não consecutivos, respectivamente. A
precisão foi expressa pelo coeficiente de variação (CV%) e a exatidão foi avaliada
através da interpolação dos resultados na curva de calibração e expressa como
percentagem de desvio entre as quantidades adicionadas e as quantificadas, nas três
concentrações examinadas. Os resultados estão mostrados na Tabela 4.21.
-1.8 -1.6 -1.4 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
Kanamicina
log Area
log Conc
Canamicina
y = 1,34 (± 0,006) x +
6,424 (± 0,007)
r = 0,9993
Resultados e Discussão
151
Tabela 4.21: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise da
canamicina.
Concentração
a
(mg/mL)
1º dia (n=5) 2º dia (n=5) 3 º dia (n=5) 3 dias (média)
(n=15)
Exatidão
(%)
CV (%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
0,024 96,0 1,74 114 1,20
87,0 1,42
99,1 1,45
0,080 97,6 0,42 110 0,44
91,5 0,86
99,7 0,57
0,160 98,5 1,81 112 1,33
98,2 1,51
103 1,55
a
Concentração teórica
A precisão apresentou para as replicatas das amostras CV de 0,420 a
1,81%, enquanto a exatidão valores de 87,0 a 112% da concentração nominal.
Todos os valores estão de acordo com os critérios de aceitação do método.
157
A exatidão do método avaliada pelo teste cego, duas amostras de
concentrações desconhecidas ao analista, também foi satisfatória e os valores são
apresentados na Tabela 4.22.
Tabela 4.22: Precisão e exatidão obtidas para a canamicina no teste cego (n=3).
Amostra 1 Amostra 2
Concentração adicionada (mg/mL)
0,095 0,120
CV (%) 0,92 2,00
Exatidão (%) 97,4 87,9
Os valores obtidos para os limites de detecção e quantificação foram
0,008 e 0,015 mg/mL, respectivamente.
Resultados e Discussão
152
4.3.2.1.3
–
C
OMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO
DESENVOLVIDOS PARA A GENTAMICINA
De acordo com o método descrito por MEGOULAS e KOUPPARIS
31
,
os coeficientes a e b das curvas de calibração logarítmica dos componentes da
gentamicina e da canamicina devem ser estatisticamente iguais.
log A = b log m + log a
No entanto para a quantificação dos componentes da gentamicina deve
ser introduzido um fator de correção relativo às proporções de cada um dos
componentes (x) de modo que:
log A = b log (x m) + log a
log A = b log m + (log a + b log x)
Onde: x é a proporção individual dos componentes da gentamicina
total, m é a concentração de gentamicina total e A é a área da banda cromatográfica
medida.
Deste modo, fazendo-se as substituições na equação obtida para a
curva analítica da canamicina tem-se:
log x = (log A – 1,34 – 6,424 log m)/ 6,424
Assim, foram calculados através da equação acima os valores de
concentração de cada gentamicina e as respectivas curvas de calibração.
Comparando os valores de coeficientes linear e angular das equações
das curvas de calibração obtidas através da canamicina e da própia gentamicina
com padrão externo é possível observar semelhanças significativas entre elas. A
Tabela 4.23 apresenta os valores obtidos.
Resultados e Discussão
153
Tabela 4.23: Valores de coeficiente linear e angular obtidos para os dois métodos
utilizados.
Gentamicina
Coeficiente Linear
Coeficiente Angular
MC* MG* MC* MG*
C
1a
1,1503 1,3688 7,3259 7,5249
C
2
1,1413 1,3850 6,9884 7,4033
C
2a
1.1408 1,3849 7,2984 7,5488
C
1
1,1319 1,3901 7,2346 7,4498
*MC – método de padronização externa utilizando a canamicina como padrão
secundário.
*MG – método de padronização externa utilizando a gentamicina.
Cabe lembrar que é através dos coeficientes linear e angular da reta
que a correlação resposta do detector e concentração do analito é realizada. Deste
modo, esses resultados indicam uma grande semelhança entre os métodos, de modo
que uma calibração utilizando a própria gentamicina como padrão externo, desde
que se tenha uma separação cromatográfica entre elas, apresenta valores tão exatos
e precisos quanto os obtidos utilizando métodos de padronização externa.
Para confirmar os resultados obtidos, uma comparação entre os
controles de qualidade dos métodos foi realizado. A Tabela 4.24 apresenta os
resultados obtidos.
Resultados e Discussão
154
Tabela 4.24: Valores de concentração obtidos para os controles de qualidade dos
métodos.
Gentamicina
QC 1 (mg/mL) QC 2 (mg/mL) QC 3 (mg/mL)
MC*
MG*
∆
∆∆
∆ (%)
MC*
MG*
∆
∆∆
∆ (%)
MC*
MG*
∆
∆∆
∆ (%)
C
1a
0,013
0,021
0,8
0,058
0,068
0,9
0,133
0,130
0,3
C
2
0,054
0,048
0,6
0,237
0,156
8,1
0,537
0,299
23,8
C
2a
0,013
0,020
0,7
0,057
0,064
0,7
0,133
0,125
0,8
C
1
0,026
0,035
1,0
0,112
0,117
0,5
0,259
0,233
2,7
*MC – método de padronização externa utilizando a canamicina como padrão
secundário.
*MG – método de padronização externa utilizando a gentamicina.
De acordo com a maioria dos resultados obtidos, a diferença entre os
valores apresentados é mínima (abaixo de 1%). Deste modo pode-se concluir que
ambos os métodos desenvolvidos apresentam valores semelhantes podendo ser
utilizados com segurança na quantificação dos componentes da gentamicina.
É importante destacar que o método proposto utilizando a gentamicina
como padrão externo envolve compostos produzidos pelo mesmo fungo com
estruturas e propriedades bastante semelhantes; cabe lembrar que essas
propriedades são as responsáveis pela resposta apresentada pelo detector de ELSD.
Ao contrário, a canamicina embora seja estruturalmente semelhante à gentamicina
pode gerar uma resposta um pouco diferente, essa diferença quando aplicada a
concentrações baixas pode implicar em um erro de medida maior.
Resultados e Discussão
155
4.3.2.1.4
-
A
PLICAÇÃO DO
M
ÉTODO
D
ESENVOLVIDO PARA A
A
NÁLISE
DE
G
ENTAMICINA
O método utilizando a gentamicina como padrão externo foi aplicado
para análise de um medicamento veterinário (Gentrin - OuroFino), o qual foi
avaliado em triplicata.
Considerando o valor do rótulo, duas amostras em diferentes
concentrações (0,300 e 0,510 mg/mL) foram preparadas para análise. A precisão e
exatidão obtidas não ultrapassaram os valores de 2 e 5% aceitos. Os resultados
encontrados estão descritos na Tabela 4.25.
O resultado encontrado para o medicamento analisado (336 mg/mL)
apresentou valores 2% acima da porcentagem aceita para o controle de qualidade
de medicamentos veterinários, uma vez que as especificações do rótulo são de 300
mg de gentamicina total. Essa análise foi refeita e valores semelhantes foram
novamente obtidos. Assim como para o método da estreptomicina, é importante
destacar que a seletividade para a gentamicina no produto acabado não foi avaliada.
De acordo com o método desenvolvido é possível, além do controle de
qualidade de gentamicina total, a determinação das concentrações de cada
componente da gentamicina no medicamento avaliado.
Resultados e Discussão
156
Tabela 4.25: Exatidão, precisão e concentração experimental obtida na análise em
triplicata da gentamicina em medicamentos veterinários de acordo com o método
desenvolvido.
Concentrações
teóricas de
gentamicina total
(mg/mL)
Concentração
encontrada de
gentamicina total
(mg/mL)
Concentração
teórica das
gentamicinas
(mg/mL)
Concentração
encontrada das
gentamicinas
(mg/mL)
CV
(%)
a
0,300
0,348
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,070
0,071
0,068
0,091
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,075
0,096
0,073
0,104
0,50
1,44
1,62
1,15
0,510
0,551
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,112
0,121
0,118
0,159
C
1a
C
2
C
2a
C
1
0,113
0,153
0,116
0,169
1,73
1,34
1,36
0,48
a
n = 3
4.3.3
–
Q
UANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO NEOMICINA EM
MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS
A neomicina (sulfato) também é um antibiótico da classe dos
aminoglicosídeos efetivo contra um amplo espectro de bactérias gram-positivas e
gram-negativas. Essa substância é composta por dois estereoisômeros majoritários
denominados neomicina B (produto majoritário) e neomicina C (Figura 4.62).
158
Resultados e Discussão
157
Figura 4.62 – Estrutura química da neomicina.
Uma vez que a neomicina B e C são diastereoisômeros e levando em
consideração o estudo realizado para a gentamicina, a resposta do ELSD é
exatamente a mesma para as duas moléculas. Deste modo, um método simples,
direto e sensível para a quantificação das neomicinas B e C foi desenvolvido
utilizando um detector de espalhamento de luz (ELSD), levando em consideração a
pureza do padrão utilizado e as proporções das respectivas áreas e concentrações de
cada componente.
4.3.3.1
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
Embora boa seletividade entre os diastereoisômeros tenha sido obtida
utilizando a fase móvel de 100% TFA 0,05M, visando ainda proporcionar uma
proteção para a coluna utilizada, uma pequena porcentagem de metanol foi
adicionada na fase móvel. A condição avaliada foi: TFA (0,05M)/CH
3
OH (99:01
v/v) e de acordo com os resultados obtidos, uma perda na resolução dos
diastereoisômeros foi observada.
O
O
NH
2
HO
R
1
OH
O
HOCH
2
OH
NH
2
H
2
N
O
OH
R
2
O
NH
2
O
NH
2
HO
HO
Neomicina
B. R
1
= H; R
2
= CH
2
NH
2
C. R
1
= CH
2
NH
2;
R
2
= H
Resultados e Discussão
158
Considerando que no método desenvolvido para a quantificação da
estreptomicina foi utilizada uma porcentagem alta de solução de TFA (0,05M) sem
danos consideráveis a coluna cromatográfica, a condição selecionada para o
desenvolvimento do método foi 100% de TFA (0,05M). A Figura 4.63 mostra o
cromatograma obtido utilizando a condição selecionada para análise.
Figura 4.63 – Cromatograma de análise da neomicina utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm). Condições cromatográficas: TFA
(0,05M). Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção 15 µL. Condições do ELSD:
Temperatuta do tubo: 107,0 ºC, Vazão do Gás (ar comprimido): 3,1 L/min, Ganho:
1 e Impactro: off.
A identificação das bandas cromatográficas, como dos epímeros da
neomicina, foram feitas através de experimentos utilizando o LC-MS/MS.
As condições ideais de ionização foram obtidas realizando-se inserção
direta da amostra (500 µg/mL de neomicina) no espectrômetro de massa. A Figura
4.64 mostra o espectro de massa obtido.
0 1 2 3 4 5 6 7
0
50
100
150
200
250
300
Neomicina C
Neomicina B
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
159
Figura 4.64 – Espectro de massa da amostra de neomicina.
Experimentos de LC-MS/MS foram então realizados e a Figura 4.65
mostra o cromatograma obtido para uma análise utilizando o experimento de SIM
para a amostra. Foram observadas duas bandas cromatográficas com intensidades
diferentes., assim como observado anteriormente utilizando o LC-ELSD.
Um experimento de scan foi também realizado e o espectro de íons
fragmentos obtidos foram exatamente o mesmo indicando que as duas bandas
cromatográficas possuem a mesma estrutura e conseqüentemente a mesma
fragmentação. A Figura 4.66 mostra os espectros obtidos de íons fragmentos.
186.2
242.3
455.2
615.3
637.3
+MS, 0.8-1.4min #(50-93)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
[
M+H]
+
Resultados e Discussão
160
Figura 4.65 – Cromatograma de análise da neomicina utilizando a coluna C
18
(Hypersil 15 x 0,41 cm d.i.) (120 Å, 10 µm). Condições cromatográficas: TFA
(0,05M). Vazão: 1,0 mL/min; Volume de injeção 15 µL. Condições do MS: Modo
de análise: SIM; Analisador: Ion-trap.
0 2 4 6 8 10 12 Time [min]
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
9
x10
Intens.
Resultados e Discussão
161
Figura 4.66 – Experimento de LC-MS de íons fragmentos.
Confirmada a separação cromatográfica dos diasteroisômeros, foi
realizada a validação do método desenvolvido com a utilização de ELSD como
detector.
Uma vez que a resposta do detector é proporcional a quantidade de
amostra presente na cela
29
e a proporção de neomicina B é maior do que a
20 3.1
2 57 .1
293 .1
323.2
419 .2
4 55.2
616.3
+MS2(6 15 .0), 11.4-11.7min #(3 40 -34 8)
0
20 00
40 00
60 00
80 00
Inte ns.
100 20 0 300 400 500 600 m/z
203.1
257.1
293.1
323.2
419.2
455.2
528.5
616.3
+MS2(615.0), 12.0-12.5min #(355-365)
0
2000
4000
6000
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
20 3.1
2 57 .1
293 .1
323.2
419 .2
4 55.2
616.3
+MS2(6 15 .0), 11.4-11.7min #(3 40 -34 8)
0
20 00
40 00
60 00
80 00
Inte ns.
100 20 0 300 400 500 600 m/z
203.1
257.1
293.1
323.2
419.2
455.2
528.5
616.3
+MS2(615.0), 12.0-12.5min #(355-365)
0
2000
4000
6000
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
20 3.1
2 57 .1
293 .1
323.2
419 .2
4 55.2
616.3
+MS2(6 15 .0), 11.4-11.7min #(3 40 -34 8)
0
20 00
40 00
60 00
80 00
Inte ns.
100 20 0 300 400 500 600 m/z
203.1
257.1
293.1
323.2
419.2
455.2
528.5
616.3
+MS2(615.0), 12.0-12.5min #(355-365)
0
2000
4000
6000
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
Neomicina C
Neomicina B
Resultados e Discussão
162
neomicina C
158
, a ordem de eluição determinada foi neomicina C (minoritária)
como a banda de menor retenção e neomicina B (majoritária) com a de maior
retenção.
Com as condições cromatográficas estabelecidas, o método
desenvolvido foi validado, consistindo da avaliação das figuras de mérito
linearidade, precisão inter e intradia, exatidão e limites de quantificação e detecção.
A análise do antibiótico neomicina foi realizada utilizando-se a
condição cromatográfica e parâmetros do detector descritos na Tabela 4.26, e a
Figura 4.67 apresenta o cromatograma obtido durante a validação do método.
Tabela 4.26: Valores otimizados do método LC-ELSD para a análise do antibiótico
neomicina.
Coluna
C
18
Hypersil (15 x 0,46 cm d.i.) (120 Å, 10 µm)
Fase Móvel
TFA (0,05M)
Vazão
1,0 mL/min
Tempo de Análise
5 minutos
Temperatura do Tubo
107 ºC
Vazão do Gás (ar comprimido)
3,1 L/min
Ganho
1
Impactor
Off
Resultados e Discussão
163
Figura 4.67 –
Cromatograma típico obtido da análise da neomicina na
concentração de 0,35 mg/mL total, durante a validação do método.
Deste modo, levando em consideração o percentual de neomicina
(64,6% de neomicina) especificado no padrão utilizado, as curvas de calibração
para os epímeros da neomicina (Figura 4.68) foram obtidas em função das
proporções das áreas das bandas cromatográficas relativas as seguintes
concentrações de neomicina total: 0,100; 0,200; 0,350; 0,500; 0,600; 0,750; 0,900 e
1,00 mg/mL de acordo com a curva de calibração logarítmica log A = b log C
mg/mL
+ log α, sendo que para isso as amostras foram preparadas para cada concentração
em triplicata em TFA 0,050M, e injetadas (15µL). As curvas mostraram-se linear
nas faixas de concentração utilizadas (Tabela 4.27). O desvio padrão da regressão
linear para o coeficiente angular foi de 0,030 e 0,011 para a Neomicina C e B,
respectivamente. Para o coeficiente de correlação linear os valores obtidos foram
de 0,038 e 0,003 para a Neomicina C e B, respectivamente.
0 1 2 3 4 5 6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Neomicina B
Neomicina C
mV
Tempo (min)
Resultados e Discussão
164
Tabela 4.27: Concentrações dos epímeros da neomicina.
Neomicina Concentrações (mg/mL)
C 0,006; 0,013; 0,023; 0,047; 0,061; 0,078 e 0,087
B 0,094; 0,187; 0,327; 0,553; 0,689; 0,822 e 0,913
Figura 4.68 – Curvas de Calibração obtidas para as neomicinas C e B.
As precisões, expressas pelo coeficiente de variação (CV%) das
triplicatas, foram inferiores a 2% e as exatidões apresentaram um desvio menor que
15% do valor nominal de concentração em todas as concentrações para as duas
curvas obtidas, exceto para os LQs, onde os desvios encontrados foram de 16%.
As precisões e exatidões, intra e interdias dos métodos, foram
determinadas analisando-se cinco replicatas dos três controles de qualidade (0,120;
0,400 e 0,800 mg/mL de neomicina total), em um mesmo dia e em dias não
consecutivos, respectivamente. A precisão foi expressa pelo coeficiente de variação
(CV%) e a exatidão foi avaliada através da interpolação dos resultados na curva de
calibração e expressa como percentagem de desvio entre as quantidades
-1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0
5.6
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
Neomicina B
log Area
log Conc
-2.4 -2.2 -2.0 -1.8 -1.6 -1.4 -1.2 -1.0
4.4
4.6
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
Neomicina C
log Area
log Conc
y = 7,48109 (± 0,038) x +
1,31375 (± 0,038)
r = 0,99913
y = 7,16771 (± 0,
003) x +
1,40038 (± 0,011)
r = 0,99921
Resultados e Discussão
165
adicionadas e as quantificadas, nas três concentrações examinadas. Os resultados
estão mostrados na Tabela 4.28.
Tabela 4.28: Exatidão (%) e precisão (%) intradia e interdia para a análise das
neomicinas C e B.
C T
a
(mg/mL)
C P
a
(mg/mL)
1º dia (n=5) 2º dia (n=5)
3 º dia (n=5)
3 dias (média)
(n=15)
Ex
(%)
CV
(%)
Ex
(%)
CV
(%)
Ex
(%)
CV
(%)
Ex
(%)
CV
(%)
0.120 C
B
0,007
0,113
100
98,8
1,07
1,54
106
101
0,66
1,54
108
101
2,00
1,90
105
100
1,25
1,66
0.400 C
B
0,035
0,365
85,7
108
1,95
1,55
88,8
108
0,12
1,37
88,4
107
1,62
1,98
87,6
108
1,23
1,63
0.800 C
B
0,070
0,730
96,7
101
2,00
0,60
97,5
101
1,97
0,82
100
101
1,35
1,26
101
101
1,77
0,89
a
Concentração teórica
CT – Concentração total de neomicina
CP – Concentração proporcional de neomicina
Ex - Exatidão
A precisão apresentou para as replicatas das amostras CV de 0,60 a
2,00%, enquanto a exatidão valores de 85,7 a 108% das concentrações nominais.
Todos os valores estão de acordo com os critérios de aceitação propostos pela
ANVISA.
157
A exatidão do método foi também avaliada pela análise de duas
amostras de concentrações desconhecidas ao analista e chamado de teste cego. Os
resultados estão apresentados na Tabela 4.29.
Os valores obtidos para o limite de quantificação estão apresentados
na Tabela 4.30. Os limites de detecção encontrados foram 25,0 µg/mL para a
neomicina C e 7,0 µg/mL para a neomicina B.
Resultados e Discussão
166
Tabela 4.29: Precisão e exatidão obtidas para a neomicina no teste cego (n=3).
Neomicinas
Concentração adicionada (mg/mL)
CV (%)
Exatidão (%)
Amostra 1
C
B
0,300
a
0,020
0,280
0,59
1,92
95,1
95,2
Amostra 2
C
B
0,950
a
0,084
0,866
1,90
1,99
93,5
94,0
a
Concentração total de neomicina
Tabela 4.30: Limites de Quantificação para os componentes da neomicina.
Neomicina LQ (mg/mL)
C 0,003
B 0,027
4.3.3.2
–
A
PLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA A ANÁLISE DE
N
EOMICINA
O método foi aplicado na análise, em triplicata, de dois diferentes
medicamentos veterinários (Flumast® - Fort Dodge - e Ememats Plus® - Merial).
Considerando o valor do rótulo, os dois medicamentos foram preparados na
concentração de 0,70 mg/mL de neomicina total para análise.
Embora a seletividade para a neomicina também não tenha sido
avaliada no produto acabado, a precisão obtida não ultrapassou o valor de 2 %
aceito. Os resultados encontrados estão descritos na Tabela 4.31.
Resultados e Discussão
167
Os valores encontrados para os medicamentos analisados (21,1 mg/mL
- Flumast® - e 18,7 mg/mL – Ememast Plus®) estavam em conformidade com as
especificações dos rótulos (20 mg/mL de neomicina total).
Com esse método foi possível a determinação das concentrações de
neomicina total e dos epímeros no medicamento avaliado utilizando como padrão
externo a própria neomicina.
Tabela 4.31: Exatidão, precisão e concentração experimental obtida na análise em
duplicata da neomicina em medicamentos veterinários de acordo com o método
desenvolvido.
Flumast® Ememast Plus®)
Concentração
teórica de neomicina (mg/mL)
NeomicinaTotal
C
B
0,700
0,024
0,676
NeomicinaTotal
C
B
0,700
0,051
0,649
Concentração encontrada de
neomicina (mg/mL)
NeomicinaTotal
C
B
0,738
0,028
0,710
NeomicinaTotal
C
B
0,655
0,049
0,606
Variação (%)
a
C
B
0,11
1,16
C
B
1,26
1,59
a
n = 2
Todos os métodos desenvolvidos para a quantificação dos antibióticos
aminoglicosídeos em medicamentos veterinários são rápidos (estreptomicina – 5
minutos; neomicina e gentamicina – 8 minutos de análise), diretos (não necessitam
de derivação), de baixo custo; apresentaram linearidade, precisão, exatidão e
sensibilidade adequada e foram aplicados com sucesso na análise de medicamentos
veterinários comercialmente disponíveis.
Resultados e Discussão
168
Considerando que os padrões utilizados, mesmo os primários, são sais
de sulfato, a farmacopéia exige a quantificação deste íon. MEGOULAS e
KOUPPARIS
32, 35
desenvolverem métodos cromatográficos para a quantificação
do sulfato nos padrões utilizados para o desenvolvimento dos métodos de análises
da gentamicina e neomicina e os resultados obtidos foram comparados com o
método descrito pela farmacopéia e foram semelhantes entre si. Uma vez que um
método cromatográfico para a quantificação de sulfato foi desenvolvido por
MEGOULAS e KOUPPARIS
32, 35
, nos métodos desenvolvidos para a
estreptomicina, neomicina e gentamicina não foram realizadas quantificação do
sulfato, sendo considerado o valor apresentado nos certificados dos padrões
utilizados.
4.4
–
D
ESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO POR
CLAE-
MULTIDIMENSIONAL PARA ANÁLISE DE CEFACETRIL EM LEITE BOVINO
UTILIZANDO O
MS
COMO DETECTOR
Assim como os aminoglicosídeos, a classe de antibióticos pertencentes
às β-lactamas, que incluem as penicilinas e cefalosporinas, está entre as mais
amplamente utilizadas na medicina veterinária para o tratamento da mastite bovina.
Os ensaios imunológicos e microbiológicos têm sido amplamente utilizados para a
determinação de resíduos desses antibióticos em leite, o que torna necessário o
desenvolvimento de métodos rápidos, seletivos e sensíveis que possam ser usados
rotineiramente.
Em nosso grupo de pesquisa, foi realizado um estudo envolvendo
alguns compostos da classe das cefalosporinas para o desenvolvimento de métodos
utilizando colunas RAM-BSA na análise de leite bovino
56, 57, 115
. Para dar
continuidade a este estudo, o composto cefacetril (Figura 4.69) foi selecionado e a
Resultados e Discussão
169
otimização das condições cromatográficas para análise desse composto, por injeção
direta de amostra, foi avaliado.
Figura 4.69 – Estrutura química do Cefacetril.
De acordo com os resultados apresentados por OLIVEIRA
115
, a
presença de um interferente no tempo de eluição do cefacetril, não permitiu o
desenvolvimento de um método de análise por LC-UV multidimensional. Uma vez
que não foi obtida a seletividade cromatográfica, o uso do espectrômetro de
massas, como detector, foi considerado para dar continuidade ao estudo.
O espectrômetro de massas é um detector bastante sensível e seletivo,
podendo ser operado em vários modos de análise fornecendo muitas informações
sobre a amostra. Análises onde a co-eluição ocorre são possíveis, desde que a
intensidade da banda cromatográfica obtida não seja afetada por outro analito.
163 -
167
Deste modo, para dar continuidade ao método proposto foram
realizadas análises utilizando solução acetato de amônio (0,01M, pH 7,5) para
verificar alterações na retenção do analito na coluna RAM-BSA, já que a utilização
da solução de fosfato não é possível no espectrômetro de massa devido à
volatilidade. Esta análise foi realizada no detector de UV para uma comparação
S
N
H
H
O
N
H
O
O
CH
3
O
COONa
N C
Resultados e Discussão
170
com os resultados já obtidos por OLIVEIRA
115
utilizando solução fosfato de
potássio.
A Figura 4.70 mostra uma comparação entre fases móveis com as
diferentes soluções avaliadas, onde nenhuma alteração significativa foi observada.
Figura 4.70 – Cromatograma comparativo do cefacetril (50 µg/mL) utilizando a
coluna C
8
– BSA (5 x 0,46 cm d.i) (120Å, 10µm). FM: NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5) e
KH
2
PO
4
(0,01M, pH 7,5), Vazão: 1,0 mL/min, Volume de Injeção: 50 uL, λ = 270
nm.
Uma vez que as condições cromatográficas encontradas não tiveram
que ser otimizadas, foi realizada a investigação dos parâmetros do espectrômetro de
massas para melhor ionização do cefacetril. Essa investigação foi realizada
utilizando ionização por ESI no modo positivo de análise, uma vez que o cefacetril
apresenta em sua estrutura vários sítios para ionização no modo positivo.
As análises foram realizadas com uma solução de cefacetril (200
µg/mL) em acetato de amônio (0,01M, pH 7,5)/CH
3
CN (95:05). O solvente usado
foi o mesmo da fase móvel de eluição da análise cromatográfica.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
10
20
30
40
50
60
70
NH
4
Ac (0,01M, ph 7,5)
KH
2
PO
4
(0,01M, pH 7,5)
mABS
Tempo (min)
Resultados e Discussão
171
A Figura 4.71 mostra o espectro de massas obtido com o ajuste dos
parâmetros de ionização, onde adutos de sódio e amônio foram obtidos como íons
mais estáveis no espectro.
Figura 4.71 – Espectro de massas do cefacetril na fase móvel NH
4
Ac (0,01M, pH
7,5)/CH
3
CN (95:05).
As condições de ionização otimizadas para as análises estão
apresentadas na Tabela 4.32.
357.2
362.2
+MS, 2.6min #194
0
1
2
3
4
6
x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
N
O
S
COOH
O
O
N
N
O
M
[M+NH
4
]
+
[M+N
a
]
+
Resultados e Discussão
172
Tabela 4.32: Condições otimizadas no espectrômetro de massas (analisador tipo
ion-trap) para a análise do cefacetril.
Tune Source (ESI+) Set
Capillary Current Control Off
Trap Drive 45,00
Skimmer 40V
Lens 1 -11V
Octapole RF amplitude 200,00Vpp
Partition 4,3V
Lens 2 -45,0V
Capillary exit 33,2V
Oct 1 D.C 7,0V
Oct 2 D.C 1,70V
HV end plate offset -500V
Current end plate 1140,000nA
HV capillary 4000V
Current capillary 42,725nA
Dry temp 350ºC
Dry gás 7,0L/min
Nebuliser 54,0psi
Trap
Charge control On
Accumulation time
5571 µs
ICC target 95000
Max accumulation time
200000 µs
Averages 7 spectra
Vacuum System
Vacuum high 1,07 e
-
0,05 mbar
Vacuum fore 3,25 e
+
000 mbar
Resultados e Discussão
173
Para o desenvolvimento de métodos analíticos em cromatografia
líquida utilizando-se o espectrômetro de massas como detector, é recomendável o
monitoramento de no mínimo dois fragmentos característicos da amostra avaliada,
garantindo alta seletividade
160-162
.
Deste modo, para a seleção dos fragmentos a serem monitorados um
experimento de íons fragmentos foi realizado para os dois picos característicos do
espectro obtido. A amplitude de fragmentação foi selecionada de modo que uma
pequena porcentagem dos íons monitorados para fragmentação (m/z 357,2 e 362,2)
fosse observada no espectro. A Figura 4.72 mostra os espectros obtidos e uma
proposta de fragmentação é apresentada nas Figura 4.73 e 4.74 para os adutos de
sódio e amônio, respectivamente.
As transições selecionadas para o monitoramento no experimento de
MRM foram m/z 357,2 m/z 280,2 e m/z 362,2 m/z 178,1, transições estas,
correspondendo aos íons mais estáveis dos espectros.
Resultados e Discussão
174
Figura 4.72 – Espectros de íons fragmentos dos íons m/z 357,2 e 362,2 na fase
móvel NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5)/CH
3
CN (95:05). Amplitude de fragmentação: A:
0,20 e B: 0,25
156.2
280.2
357.2
+MS2(357.2), 0.6-1.9min #(24-74)
0
1
2
3
6
x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
178.1
230.2
258.2
276.2
302.2
362.2
+MS2(362.2), 0.9-2.3min #(33-86)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
6
x10
Intens.
100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
A
B
Resultados e Discussão
175
Figura 4.73 – Proposta de fragmentação do aduto de sódio do cefacetril de acordo
com o espectro de íons fragmentos obtidos.
N C
CH
2
C
O
N
H
N
O
S
C
O O
CH
2
O
C
O
CH
3
H
Na
-CH
3
COOH
m/z 362.2
Na
N
O
S
C
O O
CH
2
N C
CH
2
C
O
N
H
N C
CH
2
C
O
N
H
N
O
S
C
O O
CH
2
m/z 302.2
Na
N
O
S
C
O O
CH
2
H
Na
C
N
H
O
CH
CN
-CO
2
C
N
H
O
CH
CN
Na
N
O
S
CH
2
m/z 258.2
N
S
CH
2
O
Na
C
N
H
O
CH
CN
-CO
Na
N
S
CH
2
CH
C
N
H
O
CH
CN
m/z 230.2
N
S
C
O O
CH
2
Na
Na
N
S
C
O O
CH
2
m/z 178.2
m/z 302.2
N
O
S
C
O O
CH
2
N C
CH
2
C
O
N
H
N C CH
2
C
O
NH CH C O
Na
S
Resultados e Discussão
176
Figura 4.74 – Proposta de fragmentação do aduto de amônio do cefacetril de
acordo com o espectro de íons fragmentos obtidos.
Otimizadas as condições do espectrômetro de massas para eficiente
ionização do cefacetril, foi realizado o acoplamento do LC ao MS. Uma análise no
modo “full scan” foi realizada e de acordo com os resultados obtidos uma banda
cromatográfica bastante larga foi obtida em aproximadamente 13 minutos. Uma
otimização da condição cromatográfica foi realizada, onde os cromatogramas
obtidos (Figura 4.75) apresentaram simetria de banda cromatográfica e tempo de
N
O
S
C
O O
CH
2
O
C
O
CH
3
NH
4
H
N C
CH
2
C
O
N
H
- CH
3
COONH
4
N
O
S
C
O O
CH
2
H
N C
CH
2
C
O
N
H
N C
CH
2
C
O
N
H
N
O
S
C
O O
CH
2
H
N C CH
2
C
O
NH CH C O
N C
CH
2
C
O
N
H
N
O
S
C
O O
CH
2
H
m/z 280.2
N
S
C
O O
CH
2
H
N
S
C
O O
CH
2
H
m/z 156.2
Resultados e Discussão
177
análise adequado. É importante destacar que essa análise foi realizada em um
equipamento do tipo triplo-quadrupolo, uma vez que o equipamento Íon-trap ainda
não havia sido adquiro pelo nosso grupo de pesquisa.
Figura 4.75 – Cromatogramas de análise do cefacetril (500 µg/mL) utilizando a
coluna RAM-BSA C
8
(5 x 0,46 cm d.i.) (120Å, 10 µm). A: Full scan e B: MRM
das transições m/z 362 → m/z 177 e m/z 362 → m/z 258. FM: NH
4
Ac (0,01M, pH
7,5) até 7 minutos e NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5)/CH
3
CN (95:05). Condições para o
MRM: Inter Channel Delay: 0,03 secs; Span: 1 m/z; Dwell Time 0,08 secs.
Utilizando o equipamento com analisador do tipo Ion-trap, uma
solução 10 ng/mL de cefacetril foi preparada na fase móvel utilizada e na matriz e
foram injetados 50 µL das amostras em triplicata para verificar a precisão (expressa
pelo coeficiente de variação (CV) das triplicatas) da ionização da amostra. Os
resultados obtidos apresentaram valores de CV acima de 20%, superior ao
permitido pela ANVISA (15%)
157
para fluidos biológicos.
Uma solução mais concentrada de 40 ng/mL foi então avaliada.
Nessas análises foram realizados o monitoramento de duas transições do íon de m/z
362,2, uma vez que os parâmetros de ionização foram otimizados para obtê-lo
como pico base no espectro.
As transições monitoradas foram m/z 362,2 m/z 178,1, m/z 362,2
m/z 302,2 e m/z 357,2 m/z 280,2. Os resultados obtidos indicaram problemas
Resultados e Discussão
178
na ionização da amostra, de modo que em algumas análises não foram observadas
bandas cromatográficas, e novamente o valor do CV foi maior do que o aceitável.
Deste modo então, novas condições de ionização foram determinadas
para que o pico base no espectro da amostra fosse o [M+NH
4
]
+
e não mais
[M+Na]
+
. A Tabela 4.33 mostra os novos valores de ionização otimizados.
Uma solução 40 ng/mL foi novamente preparada em solvente (NH
4
Ac
(0,01M, pH=7,5)/ CH
3
CN (95:05)) e na matriz e analisadas em triplicata. A Figura
4.76 mostra os cromatogramas obtidos e a Tabela 4.34 os coeficientes de variação
calculados.
Figura 4.76 –
Cromatogramas de MRM de análise do cefacetril (40 ng/mL)
utilizando a coluna RAM-BSA C
8
(5 x 0,46 cm d.i.) (120Å, 10 µm). Transição m/z
357,2 m/z 280,2 A: Solvente e B: Leite. FM: NH
4
Ac (0,01M, pH= 7,5) até 7
minutos; NH
4
Ac (0,01M, pH= 7,5)/CH
3
CN (95:05 v/v) até 12 minutos. Amplitude
de fragmentação: 0,20.
2
0 2 4 6 8 10 12 Time [min]
0
200
400
600
Intens.
A
1
0 2 4 6 8 10 Time [min]
0
100
200
300
400
500
Intens.
B
Resultados e Discussão
179
Tabela 4.33: Condições otimizadas no espectrômetro de massas (analisador tipo
ion-trap) para a análise do cefacetril.
Tune Source (ESI+) Set
Capillary Current Control Off
Trap Drive 49,5
Skimmer 48V
Lens 1 -5V
Octapole RF amplitude 200,00Vpp
Partition 9,4V
Lens 2 -60,0V
Capillary exit 27,8V
Oct 1 D.C 12,0V
Oct 2 D.C 6,70V
HV end plate offset -500V
Current end plate 1035,000nA
HV capillary 4000V
Current capillary 23,193nA
Dry temp 250ºC
Dry gás 11,0L/min
Nebuliser 17,0psi
Trap
Charge control On
Accumulation time
45341 µs
ICC target 10000
Max accumulation time
200000 µs
Averages 7 spectra
Vacuum System
Vacuum high 1,04 e
-
0,05 mbar
Vacuum fore 3,34 e
+
000 mbar
Resultados e Discussão
180
Tabela 4.34: Coeficientes de variação calculados para amostras em solventes e em
leite analisadas em triplicata.
Cefacetril (40 ng/mL) CV %
Solvente 33,2
Leite 2,60
De acordo com os resultados obtidos, o CV para as amostras em
solventes está com um valor muito alto. Isso não era o esperado, uma vez que as
injeções foram realizadas da mesma amostra, indicando problemas relacionados à
ionização da amostra.
Foi preparada uma solução mais concentrada de 125 ng/mL, a qual é o
limite máximo de resíduo permitido (LMR) para o cefacetril.
4
Os cromatogramas
obtidos apresentaram bandas cromatográficas satisfatórias, mas, no entanto, apesar
de uma melhora no valor obtido para as amostras preparadas em solvente, os
coeficientes de variação novamente foram altos para análises realizadas da mesma
amostra.
Considerando que a concentração de acetato de amônio no meio não
estava sendo suficiente para garantir a eficiente ionização da amostra, uma solução
0,05M de NH
4
Ac foi infundida após o sistema cromatográfico, com o auxílio de
uma bomba seringa. A Figura 4.77 apresenta um esquema do sistema utilizado.
Figura 4.77 – Sistema de infusão pós sistema cromatográfico da solução de NH
4
Ac
0,05M.
LC
MS
NH
4
Ac
0,05M
Resultados e Discussão
181
De acordo com os resultados obtidos, os CV das replicatas das
amostras analisadas continuou com valores altos, indicando que os problemas nas
condições de ionização se mantinham. A Figura 4.78 mostra os cromatogramas
obtidos para o cefacetril no espectrômetro de massa.
Os valores do coeficiente de variação medidos foram em torno de 10%
para as amostras preparadas em solvente e para as amostras preparadas na matriz.
Novamente foi realizada a infusão direta da amostra do cefacetril para
verificação das condições de ionização utilizada e de acordo com os resultados
obtidos as condições de ionização não foram reprodutíveis.
A inserção direta da amostra foi realizada em dias diferentes e foi
verificada falta de reprodutibilidade da ionização do cefacetril mesmo com a
infusão direta da amostra.
Figura 4.78 – Cromatogramas de MRM de análise do cefacetril (50 ng/mL)
utilizando a coluna RAM-BSA C
8
(5 x 0,46 cm d.i.) (120Å, 10 µm) – A: em
solvente e B: em leite. Transição m/z 357,2 m/z 280,2. FM: NH
4
Ac (0,01M,
pH= 7,5) até 7 minutos; NH
4
Ac (0,01M, pH= 7,5)/CH
3
CN (93:07 v/v) até 12
minutos. Amplitude de fragmentação: 0,20.
A B
Resultados e Discussão
182
Para verificar se o problema era especificamente da molécula avaliada,
uma vez que vários estudos de condições de ionização foram realizados e nenhuma
condição otimizada foi eficiente para a formação de um íon estável do cefacetril;
foi selecionado outro antibiótico da classe dos cefalosporínicos também bastante
utilizado na medicina veterinária para o tratamento da mastite bovina para ser
avaliado no desenvolvimento de um método por LC-MS multidimensional.
A Figura 4.79 mostra a estrutura da cefalexina, uma molécula
altamente hidrofílica, pouco solúvel em solventes orgânicos, como éter etílico,
álcoois e clorofórmio.
159
Esse composto foi avaliado com sucesso em nosso grupo
de pesquisa com injeção direta de amostras de leite por LC-UV
multidimensional
57,115
Figura 4.79 – Estrutura química da cefalexina.
Primeiramente, para verificar a estabilidade do sinal gerado pelo MS,
por inserção direta da amostra, foi realizado um estudo da intensidade da corrente
iônica gerada para a cefalexina em solução NH
4
Ac 0,01M (pH=6,5), com a adição
dos modificadores orgânicos CH
3
CN e CH
3
OH em proporções que representassem
a mesma força de fase móvel a ser avaliada.
As fases móveis avaliadas foram NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
CN
(90:10) e NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
OH (87:13) nas fontes de ESI e APCI. De
acordo com os resultados obtidos, os espectros de massa gerados na fonte de ESI
foram melhores do que os espectros gerados utilizando a fonte de APCI, de modo
S
N
COOH
H
H
O
N
H
O
CH
3
NH
2
Resultados e Discussão
183
que a comparação da corrente iônica gerada utilizando os dois modificadores
orgânicos diferentes foi realizada somente na fonte de ESI (Figura 4.80).
Figura 4.80 – Cromatograma do íon extraído m/z 348, para comparação da
corrente iônica gerada para a cefalexina com a utilização de diferentes
modificadores orgânicos.
Nas análises da cefalexina não foram observadas diferenças
significantes na intensidade da corrente iônica gerada utilizando diferentes
modificadores orgânicos. Do mesmo modo, a estabilidade do sinal observado foi
adequada para a realização de experimentos de LC-MS utilizando as fases móveis
avaliadas.
A Figura 4.81 apresenta os espectros de massas obtidos para a
molécula de cefalexina.
CH
3
CN
CH
3
OH
Resultados e Discussão
184
Figura 4.81 – Espectro de massa e de íons fragmentos gerados para a cefalexina.
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
CN (90:10)
NH
4
Ac (0,01M, pH=6,5)/CH
3
CN (90:10)
S
N
COOH
H
H
O
N
H
O
CH
3
NH
2
M
[M+H]
+
Resultados e Discussão
185
Foram preparadas soluções de cefalexina (100 ng/mL) em água para
quantificação por LC/LC-MS/MS. As condições usadas foram as mesmas do
trabalho já desenvolvido no grupo.
115
Para a realização das análises foi utilizado um sistema cromatográfico
multidimensional, através de uma válvula de seis caminhos, conforme mostrado na
Figura 4.82.
Figura 4.82 - Representação esquemática do sistema de cromatografia
multidimensional utilizado.
115
Resultados e Discussão
186
O sistema assim constituído apresenta algumas características
importantes:
(a) A válvula FCV-10AL ligada à bomba (1) permite a eluição de
diferentes fases móveis na coluna extratora;
(b) O sistema na posição 1 permite a remoção das macromoléculas
do leite e retenção do antibiótico na coluna RAM-BSA. Na posição 2 permite a
transferência somente do antibiótico para a coluna analítica e, após a transferência,
várias modificações podem ser realizadas para se obter a seletividade desejada.
(c) As colunas podem ser eluídas e condicionadas separadamente.
Desta forma, durante a remoção das macromoléculas do leite e extração dos
analitos pela coluna extratora usando as fases móveis da bomba (1), a coluna
analítica é condicionada pela fase móvel eluída da bomba (2). Por outro lado,
durante a análise do antibiótico na coluna analítica, a coluna extratora está sendo
limpa e condicionada para a próxima injeção.
As condições cromatográficas avaliadas foram: fase móvel NH
4
Ac
(0,01 M, pH 6,5) / CH
3
CN (95:05) durante 5 minutos para a exclusão protéica e de
interferentes e NH
4
Ac (0,01 M, pH 6,5) / CH
3
CN (90:10) para transferência da
banda cromatográfica da coluna extratora RAM-BSA C
8
para a coluna anlítica C
18
-
Hypersil. A mesma fase móvel utilizada para a transferência do analito, foi
utilizada para sua análise na coluna analítica.
A Figura 4.83 mostra os cromatogramas obtidos e de acordo com os
resultados, um novo problema de precisão foi verificado entre as análises
realizadas.
Resultados e Discussão
187
Figura 4.83 – Cromatograma de análise de uma amostra de cefalexina 100 ng/mL
em solvente.
De acordo com os cromatogramas pode-se verificar um aumento das
áreas obtidas na seqüência da primeira para a última injeção realizada. Assim, foi
desenvolvido um estudo detalhado dos parâmetros “target“ e “max accumulation
time”, uma vez que esses parâmetros são os responsáveis pela quantidade de íons
aprisionados no trap e o tempo de aprisionamento dos mesmos.
De acordo com esses parâmetros, se os valores realmente não
estiverem bem estabelecidos a quantidade de íons aprisionados e o tempo que esses
permanecem no trap poderiam causar o efeito observado nas análises, de aumento
da área da banda de acordo com as injeções.
Foram avaliados 6 conjuntos de valores e estes estão listados na
Tabela 4.35.
Resultados e Discussão
188
Tabela 4.35:
Valores de “target” e “max accum. time” avaliados para a cefalexina.
target max. accum. time
20000 200
2000 70
2000 20
2000 5
2000 10
15000 10
1000 5
Foram realizadas análises em triplicata para cada conjunto de
parâmetro e as áreas medidas foram avaliadas. O conjunto de valores de “target”
1000 e “max accum time” 5 foi o que apresentou melhores resultados, embora o
coeficiente de variação entre as análises ainda tenha sido fora dos valores aceitos
pela ANVISA
157
(15%).
Em se tratando de um composto facilmente ionizável, seria de se
esperar que isso facilitasse a detecção por MS, no entanto, essa propriedade, pode
acarretar em falta de precisão de retenção cromatográfica. Isso foi observado,
quando da quantificação da cefalexina usando o UV como detector. Portanto, o uso
do agente de pareamento catiônico dihidrogênio fosfato de tetrabutilamônio
(HTBA) foi também considerado.
Baseado em trabalho desenvolvido no grupo para a análise de
amoxicilina em plasma humano
148
, o HTBA foi adicionado na amostra e não na
fase móvel como comumente é utilizado.
A concentração de HTBA avaliada foi de 2,0 mM, correspondente a
proporção de ordem de 10
6
moléculas do agente de pareamento iônico em relação
Resultados e Discussão
189
ao número de moléculas de cefalexina presentes na concentração avaliada (20
ng/mL).
Essa avaliação do controle da ionização da amostra foi monitorada
pela resposta dos detectores de UV e MS. A Figura 4.84 mostra os resultados
obtidos pelos dois detectores para as amostras avaliadas.
Figura 4.84 – Cromatogramas de análise da cefalexina preparada em solvente e em
leite com uso do agente de pareamento iônico HTBA, monitorados com os
detectores de UV e MS.
De acordo com os resultados obtidos é possível verificar que ainda há
uma diferença de intensidade entre as bandas cromatográficas obtidas com o MS.
5 6 7 8 9 10 11 12 13
-30
-15
0
15
30
45
60
75
90
Cefalexina preparada em solvente
mAbs
Tempo (min)
Cefal
exina preparada em solvente
Tempo (min)
Cefalexina preparada em leite
5 6 7 8 9 10 11 12
-5
0
5
10
15
20
25
Cefalexina preparada em leite
mAbs
Tempo (min)
Resultados e Discussão
190
Esse comportamento mais uma vez pode ser atribuído a falta de um melhor
controle da ionização da molécula.
Uma vez que a fase móvel utilizada faz uso de um meio tamponado
(NH
4
Ac 0,01M, pH 6,5), e também foi realizada a adição de um agente de
pareamento iônico (HTBA) na amostra, um último parâmetro que poderia auxiliar
no controle da ionização da cefalexina seria o controle da temperatura utilizada na
coluna cromatográfica.
Deste modo foi avaliada a temperatura de 35 °C para ambas as colunas
cromatográficas utilizadas (RAM-BSA C
8
e analítica C
18
). Os resultados obtidos
não mostraram uma melhora significativa na repetibilidade dos tempos de retenção,
no entanto, o uso da temperatura de 35 °C foi mantido.
Outro fator levado em consideração foi o volume morto causado pela
válvula de 6 caminhos empregada no acoplamento das duas colunas
cromatográficas utilizadas. A fase móvel avaliada para a extração da cefalexina da
coluna extratora após a exclusão protéica (NH
4
Ac (0,01M, pH 7,5)/CH
3
CN
(90:10)), proporcionava a extração do composto logo após o acoplamento das duas
colunas, de modo que o tempo de retenção poderia causar alterações.
Foi realizada então alterações na força da fase móvel, de modo que a
porcentagem de acetonitrila (5%) utilizada na fase móvel de exclusão proteína foi
removida, aumentando a retenção da cefalexina.
Os resultados obtidos mostraram que o hifenamento LC/LC-MS/MS
continuou a apresentar problemas de precisão, uma vez que as áreas das bandas
cromatográficas obtidas apresentaram uma dispersão muito grande de valores
(Figura 4.85).
É importante ressaltar que o desenvolvimento de um método
cromatográfico com detecção por MS para essa classe de antibióticos exige o uso
de artifícios para controlar a ionização do analito em solução
56
e ao mesmo tempo
Resultados e Discussão
191
uma eficiente ionização é necessária para que a detecção por MS seja alcançada
com sucesso.
Deste modo, assim como para o cefacetril, não foi possível o
desenvolvimento de um método por injeção direta de amostra para análise de
cefalexina em leite bovino com detecção por MS.
Figura 4.85 – Cromatogramas de análise da cefalexina (100 µg/mL) em leite
utilizando a coluna C
18
– BSA (5 x 0,46 cm d.i) (120Å, 10µm) e C
18
-Hypersil (5 ×
0,46 cm d.i.) (120Å, 10µm), com detecção por MS. Condições cromatográficas:
Linha (A): NH
4
Ac 0,01 mol/L (pH 7,5) – 5 minutos para exclusão protéica; Linha
(B): NH
4
Ac 0,01 mol/L (pH 7,5): CH
3
CN (90:10 v/v) para transferência e análise
da cefalexina na coluna analítica; e Linha (C): NH
4
Ac 0,01 mol/L (pH 7,5):
CH
3
CN (50:50 v/v) para limpeza da coluna RAM-BSA.
Resultados e Discussão
192
4.5
–
D
ESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO
ENANTIOSSELETIVO POR INJEÇÃO DIRETA DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO DOS
METABÓLITOS DO ALBENDAZOL POR
LC-MS-MS
4.5.1
–
D
ESENVOLVIMENTO
Considerando os problemas verificados nos estudos dos antibióticos
cefalosporínicos e também levando em consideração as condições utilizadas para
análise dos metabólitos do albenzadol em plasma bovino
122
, foi feita uma
otimização das condições cromatográficas para obtenção de uma eficiente exclusão
das proteínas do leite, extração dos metabólitos e enantioresolução para o
albendazol sulfóxido, sem o uso de soluções tamponadas.
Foi usada solução fosfato de potássio dibásico como fase móvel, para
exclusão das proteínas do plasma bovino, no trabalho desenvolvido por BELAZ
122
.
Sabendo, que água pode ser usada de modo eficiente para exclusão de proteínas do
leite, foram avaliadas misturas de água e acetonitrila como fase móvel. De acordo
com os resultados obtidos, não foi observada nenhuma diferença significativa para
a exclusão das macromoléculas e extração dos metabólitos. Nenhuma perda de
resolução entre os metabólitos foi observada, de modo que o desenvolvimento de
um método em leite sem o uso de solução tampão foi realizado. A Tabela 4.36
apresenta as condições cromatográficas otimizadas. O mesmo sistema
multidimensional apresentado na Figura 4.82 foi utilizado nesse estudo, com o
emprego de uma coluna quiral como coluna analítica.
Para otimização das condições de ionização no MS, os compostos
foram preparados e analisados separadamente na concentração de 500 ng/mL na
fase móvel utilizada na coluna quiral (água/CH
3
CN, 50:50).
Resultados e Discussão
193
A Figura 4.86 mostra os espectros de massa obtidos com o ajuste dos
parâmetros de ionização, assim como os espectros de íons fragmentos obtidos com
amplitude de fragmentação de 0,35 para todos os íons. As transições selecionadas
para monitoramento de cada composto estão listadas na Tabela 4.37 e as Tabelas
4.38; 4.39 e 4.40 apresentam os parâmetros de ionização otimizados para cada
composto.
Resultados e Discussão
194
Tabela 4.36:
Condições cromatográficas utilizadas, no sistema multidimensional,
para a exclusão das macromoléculas e eluição dos analitos na coluna RAM-C
8
-
BSA (5,0 x 0,46 cm d.i.) e para a análise dos metabólitos do albendazol na coluna
quiral tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose (15,0 x 0,46 cm d.i.).
Tempo (min) Evento
BOMBA 1
0,00 - 5,00
FM: 100% água [exclusão das proteínas pela coluna RAM-C
8
-
BSA (5,0 x 0,46 cm d.i.)]; vazão de 1,0 mL/min
5,01–7,30 FM: água:CH
3
CN (60:40) (extração dos compostos da coluna
RAM-C
8
-BSA); vazão de 1,0 mL/min
6,30–7,30 FM: água: CH
3
CN (60:40) [transferência dos compostos da
coluna RAM-C
8
-BSA para a coluna analítica]; vazão de 1,0
mL/min
7,31–12,30 FM: CH
3
CN:água:ISO (75:15:10) (limpeza da coluna RAM-C
8
-
BSA); vazão de 1,0 mL/min
12,31-20,00 FM: 100% água (condicionamento da coluna RAM-C
8
-BSA);
vazão de 1,0 mL/min
BOMBA 2
0,00–6,30 FM: água:CH
3
CN (50:50) [condicionamento da coluna analítica
tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose (15 x 0,46 cm d.i.)];
vazão de 0,8 mL/min
6,30–7,30 FM: água:CH
3
CN (50:50) (transferência dos compostos da
coluna extratora para a coluna analítica); vazão de 0,8 mL/min
7,30–20,00 FM: água:CH
3
CN (50:50) (análise do ABZ-SO
2
-NH
2
, ABZ-SO
2
e (±)-ABZ-SO)
Resultados e Discussão
195
Figura 4.86 – Espectros de massa e de íons fragmentos dos metabólitos ABZ-SO
2
-
NH
2
, ABZ-SO
2
e (±)-ABZ-SO.
198.0
240.0
346.1
+MS, 0.1-0.2min #(5-19)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
7
x10
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z
133.0
197.9
240.0
+MS2(240.0), 0.3-0.4min #(11-15)
0
1
2
3
6
x10
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z
Scan
ABZ-SO
2
-NH
2
Íons-fragmentos
ABZ-SO
2
-NH
2
Resultados e Discussão
196
Figura 4.88 – Continuação.
266.0
266.0
298.1
+MS, 0.3-0.4min #(27-30)
0
1
2
3
4
7
x10
Intens.
50 100 150 200 250 300 m/z
224.0 256.0
298.1
+MS2(298.0), 0.2-0.6min #(6-21)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5
x10
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z
Íons-fragmentos
ABZ-SO
2
Scan
ABZ-SO
2
Resultados e Discussão
197
Figura 4.88 – Continuação.
191.0
222.0
240.0
+MS2(282.0), 0.1-0.5min #(6-19)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
6
x10
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z
240.1
282.1
304.0
320.0
+MS, 0.4min #(33)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
6
x10
Intens.
50 100 150 200 250 300 m/z
Íons-fragmentos
(±)-ABZ-SO
Scan
(±)-ABZ-SO
Resultados e Discussão
198
Tabela 4.37 – Transições selecionada para monitoramento nos experimentos de
MRM.
Composto Transições monitoradas
ABZ-SO
2
-NH
2
[M+H]
+
= 240
240 198
240 133
ABZ-SO
2
[M+H]
+
= 298
298 256
298 266
(±)-ABZ-SO
[M+H]
+
= 282
282 222
282 240
Resultados e Discussão
199
Tabela 4.38: Condições de ionização otimizadas para a análise do ABZ-SO
2
-NH
2
–
0 à 10,1 minutos.
Tune Source (ESI+) Set
Capillary Current Control Off
Trap Drive 40.9
Skimmer 40V
Lens 1 -5 V
Octapole RF amplitude 140,3 Vpp
Partition 6,8V
Lens 2 -60,0V
Capillary exit 109,0V
Oct 1 D.C 12,0V
Oct 2 D.C 1,70V
HV end plate offset -500V
Current end plate 217,500nA
HV capillary 4000V
Dry temp 325 ºC
Dry gás 8,0L/min
Nebuliser 20,0psi
Trap
Charge control On
Accumulation time
50000 µs
ICC target 70000
Max accumulation time
50000 µs
Averages 7 spectra
Vacuum System
Vacuum high 1,07 e
-
0,05 mbar
Vacuum fore 3,25 e
+
000 mbar
Resultados e Discussão
200
Tabela 4.39: Condições de ionização otimizadas para a análise do (±)-ABZ-SO –
10,1 à 15,0 minutos.
Tune Source (ESI+) Set
Capillary Current Control Off
Trap Drive 44,00
Skimmer 40V
Lens 1 -5V
Octapole RF amplitude 149,2 Vpp
Partition 4,3V
Lens 2 -60,0V
Capillary exit 112,2V
Oct 1 D.C 12,0V
Oct 2 D.C 1,70V
HV end plate offset -500V
HV capillary 4000V
Dry temp 325ºC
Dry gás 8,0L/min
Nebuliser 20,0psi
Trap
Charge control On
Accumulation time
50000 µs
ICC target 70000
Max accumulation time
50000 µs
Averages 7 spectra
Vacuum System
Vacuum high 1,07 e
-
0,05 mbar
Vacuum fore 3,25 e
+
000 mbar
Resultados e Discussão
201
Tabela 4.40: Condições de ionização otimizadas para a análise do ABZ-SO
2
– 15,0
à 20,0 minutos.
Tune Source (ESI+) Set
Capillary Current Control Off
Trap Drive 45,20
Skimmer 40V
Lens 1 -5 V
Octapole RF amplitude 152,4 Vpp
Partition 4,3V
Lens 2 -5,0V
Capillary exit 113,3V
Oct 1 D.C 12,0V
Oct 2 D.C 1,70V
HV end plate offset -500V
HV capillary 4000V
Dry temp 325ºC
Dry gás 8,0L/min
Nebuliser 20,0psi
Trap
Charge control On
Accumulation time
50000 µs
ICC target 70000
Max accumulation time
50000 µs
Averages 7 spectra
Vacuum System
Vacuum high 1,07 e
-
0,05 mbar
Vacuum fore 3,25 e
+
000 mbar
Resultados e Discussão
202
As condições de quantificação pelo espectrômetro de massa precisou
ser dividido em 3 segmentos referentes ao máximo de ionização de cada composto
levando em consideração a separação cromatográfica entre eles. A Figura 4.87
apresenta o cromatograma obtido para uma solução contendo os quatro compostos
avaliados. Foi também avaliado parâmetros de ionização intermediários para as três
classes de compostos mas problemas com relação a precisão do método foi
observado.
Figura 4.87 – Cromatograma de análise dos metabólitos (1) ABZ-SO
2
-NH
2
(9,0
ng/mL); (2) R-(+)-ABZ-SO (27 ng/mL); (3) S-(-)-ABZ-SO (27 ng/mL) e (4) ABZ-
SO
2
.ABZ-SO
2
-NH
2
(27 ng/mL) em leite bovino utilizando as colunas RAM-C
8
-
BSA (5,0 x 0,46 cm d.i.) e tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de amilose (15,0 x 0,46
cm d.i.), com detecção por MS. Bomba 1 (A) água 100%; (B) água:CH
3
CN (60:40)
e (C): CH
3
CN /água/ISO (75:15:10); vazão de 1,0 mL/min. Bomba 2 (D): água:
CH
3
CN (60:40); vazão de 0,8 mL/mim; volume de injeção: 100 µL.
1
2
3
4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Time [min]
0
2
4
6
8
4
x10
Intens.
1 2 3
Resultados e Discussão
203
Estabelecidas as condições cromatográficas, foi realizado um estudo
do efeito de matriz para garantir a eficiência do método.
FU e colaboradores
134
destacaram, em um estudo envolvendo a
determinação de indinavir em urina humana por LC-MS/MS, o efeito da matriz na
ionização e conseqüentemente na sensibilidade e precisão das análises. De acordo
com o trabalho, com um melhor tratamento da amostra uma diminuição acentuada
do coeficiente de variação (precisão medida pelas áreas dos picos) foi obtida.
Poucos são os trabalhos em fluidos biológicos por LC-MS que
discutem e apresentam estudos envolvendo o efeito da matriz principalmente
utilizando injeção direta de amostras biológicas, uma vez que os órgãos reguladores
(FDA nos EUA e a união européia, por exemplo), embora recomendem, não
possuem nenhuma exigência com relação a este tipo de estudo. ROGATSKY e
STEIN
163
, recentemente apresentaram uma discussão sobre a necessidade e a
importância desse tipo de estudo no desenvolvimento de métodos analíticos e
bioanalíticos.
De acordo com os protocolos de validação dos órgãos reguladores, o
espectrômetro de massa é considerado um outro tipo de detector passivo; os efeitos
da matriz não são considerados para a maioria das validações se não há influencia
na reprodutibilidade e linearidade do método.
163
Os efeitos da matriz podem fortemente suprimir a eficiência da
ionização da amostra, levar a um aumento do ruído da linha de base, entre outros
efeitos negativos, diminuindo a sensibilidade do método de modo que, um estudo
do efeito causado pela matriz torna-se importante como variável no controle de
qualidade da otimização do método.
Os estudos envolvendo os efeitos da matriz destacam que as condições
cromatográficas e/ou pré-tratamento da amostra são diretamente responsáveis pela
eficiência da ionização da amostra.
133-136; 163-165
Resultados e Discussão
204
Deste modo, utilizando o esquema representado na Figura 4.88 e as
condições cromatográficas descritas na Tabela 4.36, as soluções dos metabólitos
(100 ng/mL cada) foram infundidas separadamente com o auxílio da bomba seringa
e as respostas foram medidas contra injeções realizadas no sistema cromatográfico
de amostras de leite desnatado e integral e água.
Figura 4.88 – Representação esquemática do sistema utilizado para o estudo de
efeito de matriz.
A Figura 4.89 apresenta os resultados obtidos. É possível verificar
uma deflexão na linha de base entre 8 e 10 minutos de análise referente à virada da
válvula para o acoplamento das colunas. Nenhuma outra alteração significativa no
cromatograma é observado para os três compostos avaliados, de modo que pode-se
inferir que não há um efeito expressivo da matriz que poderia atrapalhar a
validação do método.
Bomba
Seringa
MSMS
Bomba
Seringa
MSMS
Resultados e Discussão
205
Figura 4.89 – Cromatogramas representativos do estudo de efeito de matriz. (----)
– leite integral; (----) – leite desnatado; (----) – água e (----) – efeito da válvula de
acoplamento.
Com as condições cromatográficas estabelecidas para a quantificação
simultânea dos metabólitos do albendazol, ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-
ABZ-SO e ABZ-SO
2
, foi construída uma curva de calibração para cada metabólito
levando em consideração as transições apresentadas na Tabela 4.37.
No entanto, os valores de CV obtidos (Tabela 4.41) foram bastante
discrepantes, principalmente para as amostras controle de qualidade variando de
6,66 a 36,1% para o ABZ-SO
2
-NH
2
;
de 13,7 a 92,7% para o R-(+)-ABZ-SO; de
6,57 a 92, 7% para o S-(-)-ABZ-SO e de 3,55 a 33,4% para o ABZ-SO
2
. Estes
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
1
2
3
4
5
6
4
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
1
2
3
4
5
6
4
x10
Intens.
0 2 4 6 8 10 12 14 Time [min]
1
2
3
4
5
6
4
x10
Intens.
m/z 240.0198.0
ABZ-SO
2
-NH
2
ABZ-SO
2
m/z 298.0266.0
(±)-ABZ-SO
m/z 282.0240.0
Resultados e Discussão
206
valores encontram-se completamente fora dos limites estabelecidos pela
ANVISA
157
para precisão de métodos bioanalíticos.
Tabela 4.41: Precisão (CV%) dos valores da curva de calibração para a análise de
ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
(n=3) em leite bovino.
Concentração
(ng/mL)
1º dia (n=5) 2º dia (n=5) 3º dia (n=5) 3 dias (média)
(n=15)
CV (%) CV (%) CV (%) CV (%)
ABZ-SO
2
-NH
2
9,20 14,3 11,5 36,1 20,6
13,0 10,4 12,9 31,7 18,3
19,0 6,66 7,30 32,2 15,4
R-(+)-ABZ-SO
27,2 27,3 69,5 92,7 63,2
39,0 18,8 50,0 56,4 41,7
57,0 13,7 86,5 28,1 42,8
S-(-)-ABZ-SO
27,2 14,7 12,5 92,7 40,0
39,0 68,5 83,1 41,3 64,3
57,0 6,57 49,6 27,9 84,1
ABZ-SO
2
27,2 6,85 11,2 20,9 13,0
39,0 8,76 15,3 33,4 19,1
57,0 3,55 6,91 27,9 12,8
Considerando problemas na ionização das moléculas, foram realizados
vários testes e modificações nos parâmetros do espectrômetro de massa. Mesmo
Resultados e Discussão
207
assim, continuaram altos os coeficientes de variação para as replicatas das amostras
controle. Foi verificado, no entanto, que os resultados apresentavam uma melhora
significativa quando o espectrômetro de massa era programado para monitorar
somente uma transição de cada íon.
Esse problema pode ser explicado pelo princípio de funcionamento do
íon-trap. Existem dois tipos de sistemas MS-MS: “tandem no espaço” e “tandem no
tempo”. Os instrumentos que operam em “tandem no espaço” apresentam dois
analisadores de massas independentes, em localizações diferentes no instrumento.
Exemplos deste tipo de equipamento incluem sistemas de triplo quadrupolo (QqQ)
e sistemas compostos por um quadrupolo e um analisador de tempo de vôo
(QqTof). O modo mais comum de operação em sistemas em “tandem no espaço” é
a varredura de íons, na qual um íon precursor é selecionado no primeiro
quadrupolo. O íon precursor é então sujeito a reações em uma cela de colisão
(segundo quadrupolo), e o espectro de massas dos íons fragmentos resultante é
obtido a partir do último estágio (terceiro quadrupolo) do espectrômetro de
massas.
166
Os instrumentos que operam em “tandem no tempo” são, em geral,
espectrômetros de massas do tipo “ion-trap” e espectrômetros de transformadas de
Fourier (FT-ICR). Os vários estágios do espectrômetro de massas são realizados
em um mesmo volume físico, mas em tempos diferentes durante o experimento.
166
Deste modo, a quantidade de íons a serem aprisionados, fragmentados e analisados
deve estar saturando a resposta do equipamento.
Por este motivo, a validação do método foi realizada monitorando
apenas uma transição de cada íon dos metabólitos. A Tabela 4.42 apresenta os íons
selecionados para o monitoramento.
Resultados e Discussão
208
Tabela 4.42: Transições selecionadas para monitoramento nos experimentos de
MRM.
Composto Transições monitoradas
ABZ-SO
2
-NH
2
[M+H]
+
= 240
240 198
ABZ-SO
2
[M+H]
+
= 298
298 266
(±)-ABZ-SO
[M+H]
+
= 282
282 240
4.5.2
–
VALIDAÇÃO
Com as condições cromatográficas e de ionização estabelecidas para a
quantificação simultânea dos metabólitos do albendazol, ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-
ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
, em amostras de leite bovino, o método
analítico foi validado consistindo de avaliações de precisão inter e intradia,
exatidão, eficiência de extração, lineridade, seletividade, limites de quantificação e
detecção e estudos relacionados à estabilidade.
A análise dos metabólitos foi realizada, utilizando-se as condições
cromatográficas descritas na Tabela 4.36 e as condições de ionização descritas nas
Tabelas 4.38, 4.39 e 4.40.
Análises por espectrometria de massas em tandem (MS/MS)
geralmente são consideradas capazes de gerar respostas seletivas. No entanto, em
situações mais complexas, a observação de múltiplas transições de MRM pode
aumentar ainda mais a seletividade. Neste método, foi monitorada somente uma
transição específica de cada íon, no entanto, além do monitoramento desses íons, a
seletividade do método foi também avaliada pelo estudo de efeito de matriz.
Resultados e Discussão
209
Os cromatogramas do estudo de efeito de matriz são apresentados na
Figura 4.89 onde pode-se verificar que não há interferências significativas para os
compostos, mostrando que o método é seletivo para as quatro bandas
cromatográficas.
Para a construção das curvas de calibração, os intervalos de
concentração utilizados foram estipulados, baseados no limite máximo residual
(LMRs) dos metabólitos do albendazol em leite.
As curvas de calibração para o ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-
ABZ-SO e ABZ-SO
2
foram obtidas em função das áreas das bandas
cromatográficas, relativas às seguintes concentrações: 8,00; 9,00; 10,0; 12,0; 14,0;
16,0; 18,0 e 20,0 ng/mL para o ABZ-SO
2
-NH
2
; 27,0; 30,0; 36,0; 42,0; 48,0; 54,0 e
60,0 ng/mL para o ABZ-SO
2
e para cada um dos enantiômeros do (±)-ABZ-SO. As
amostras foram preparadas em leite bovino, em triplicata, e foram injetados 100
µL.
Os modelos matemáticos para curvas de calibração podem ser tanto
lineares quanto não-lineares nos seus parâmetros. A escolha entre esses dois grupos
de modelos dependerá do tipo de método e/ou da faixa de concentração de
interesse. Como regra geral, deve ser selecionado o modelo que melhor representa
a relação sinal/concentração dos analitos avaliados.
167
Neste caso, as curvas analíticas foram obtidas através de um modelo
de regressão ponderada (1/X) quadrática não linear apresentados na Figura 4.90.
Resultados e Discussão
210
Figura 4.90 – Curvas analíticas para o ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-
SO e ABZ-SO
2
.
Os coeficientes de correlação linear (r) obtidos das curvas de
calibração foram acima de 0,98; a precisão das triplicatas foi inferior a 15% e a
exatidão apresentou um desvio menor que 15 % do valor nominal de concentração
em todas as concentrações da curva, exceto para o limite de quantificação, onde o
Amino
0 5 10 15 20
0.0
5000000.0
1.0
×
××
×
10
07
1.5
×
××
×
10
07
Concentração (ng/mL)
Area
Enantiômero 1
0 20 40 60 80
0
5000000
10000000
15000000
20000000
Concentração (ng/mL)
Area
y = -19990 x
2
+ 1,216e10
6
x – 3,796e10
6
r = 0.99
y = -8946 x
2
+ 1,095e10
6
x – 1,64e10
7
r = 0.99
y = 44,63 x
2
+ 283268 x – 525300
r = 0.99
Enantiômero 2
0 20 40 60 80
0
5000000
10000000
15000000
20000000
Concentração (ng/mL)
Area
Sulfona
0 20 40 60 80
0.0
2000000.0
4000000.0
6000000.0
8000000.0
Concentração (ng/mL)
Area
y = 3529 x
2
+ 432044 x – 7,637e10
6
r = 0.99
Resultados e Discussão
211
desvio encontrado foi de 20%. Todos os valores obtidos estão dentro dos critérios
de aceitação de métodos em fluidos biológicos especificados pela ANVISA.
157
A precisão e a exatidão intradia e interdias do método foram avaliadas
analisando-se cinco replicatas dos três controles de qualidade (9,20; 13,0 e 19,0
ng/mL para o ABZ-SO
2
-NH
2
; 27,2; 39,0 e 57,0 µg/mL para cada enatiômero do
(±)-ABZ-SO e também para o ABZ-SO
2
), em um mesmo dia e em dias não
consecutivos. A precisão foi expressa pelo coeficiente de variação (CV%) e a
exatidão foi calculada através da interpolação dos resultados na equação obtida da
curva de calibração e expressa como porcentagem de desvio entre as quantidades
adicionadas e as quantificadas, nas três concentrações avaliadas. Os resultados são
apresentados na Tabela 4.43.
A precisão apresentou para as replicatas das amostras coeficientes de
variação entre 1,50 e 15,0 considerando-se os resultados obtidos para todos os
compostos, enquanto que os valores de exatidão variaram entre 84,9 e 113% das
concentrações nominais. Todos os valores estão dentro dos critérios de aceitação.
157
A precisão e exatidão do método foram também avaliadas pelas
análises de duas amostras, de concentrações desconhecidas ao analista, e chamado
de teste cego. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4.44, e todos
estão de acordo com os critérios de aceitação para o método.
Resultados e Discussão
212
Tabela 4.43: Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdias, para a análise de
ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
(n=5) em leite bovino.
Concentração
(ng/mL)
1º dia (n=5) 2º dia (n=5) 3º dia (n=5) 3 dias (média)
(n=15)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
ABZ-SO
2
-NH
2
9,20 86,6 9,24
84,9 4,64
85,9 5,58
85,8 6,49
13,0 85,8 11,1
85,4 12,1
87,4 7,49
86,7 10,2
19,0 85,4 1,51
84,9 1,68
85,7 1,50
104 1,56
R-(+)-ABZ-SO
27,2 105 12,3
106 14,8
105 14,6
105 13,9
39,0 94,1 15,0
91,6 5,34
99,6 10,6
95,1 10,3
57,0 85,3 7,24
87,3 4,79
86,5 3,78
86,4 5,27
S-(-)-ABZ-SO
27,2 102 5,47
99,0 4,90
92,0 3,69
97,7 4,69
39,0 105 5,87
97,1 5,69
93,7 7,62
98,6 6,39
57,0 96,9 1,74
97,6 6,41
96,2 9,77
96,9 5,97
ABZ-SO
2
27,2 113 14,1
113 14,9
108 10,5
111 13,2
39,0 95,0 10,9
91,8 14,3
87,4 14,1
91,4 13,1
57,0 85,8 7,57
85,7 6,77
88,7 8,36
86,7 7,57
Resultados e Discussão
213
Tabela 4.44: Precisão e exatidão obtidas no teste cego de ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-
ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
em amostras de leite bovino (n=3).
Analito
Concentração
(ng/mL)
Precisão (CV)
(%)
Exatidão
(%)
ABZ-SO
2
-NH
2
Amostra 1 9,60 10,1 98,2
Amostra 2 16,8 6,66 109
R-(+)-ABZ-SO
Amostra 1 28,8 9,28 89,4
Amostra 2 50,4 11,8 86,6
S-(-)-ABZ-SO
Amostra 1 28,8 1,02 85,0
Amostra 2 50,4 9,04 87,3
ABZ-SO
2
Amostra 1 28,8 5,65 87,8
Amostra 2 50,4 13,4 86,7
Os percentuais de eficiência de extração para os quatro analitos, em
cada concentração, foram calculados pela razão entre o valor médio das áreas
encontradas nas amostras preparadas em leite bovino (n=5) com os resultados das
amostras (n=5) preparadas no solvente água:CH
3
CN (40:60). Os resultados estão
apresentados na Tabela 4.45.
Os valores obtidos mostraram que a coluna extratora (RAM-C
8
-BSA)
é eficiente para a extração dos analitos do leite bovino e na transferência destes
para a coluna analítica.
Resultados e Discussão
214
Tabela 4.45: Eficiência de extração obtida para as amostras controle de qualidade
do ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
(n=5)
Analito
(ng/mL)
Recuperação
(%)
Analito
(ng/mL)
Recuperação
(%)
ABZ-SO
2
-NH
2
R-(+)-ABZ-SO
9,20 92,8 27,2 81,0
13,0 109 39,0 72,2
19,0 112 57,0 77,9
ABZ-SO
2
S-(-)-ABZ-SO
27,2 71,8 27,2 70,1
39,0 75,9 39,0 110
57,0 77,6 57,0 73,5
O critério de aceitação para o limite de quantificação foi que a
precisão e a exatidão de três amostras extraídas não ultrapassassem o valor de 20 %
de variabilidade, enquanto que o limite de detecção foi calculado, obtendo-se um
sinal três vezes maior que o ruído do detector. Os valores obtidos para os limites de
quantificação e de detecção estão apresentados na Tabela 4.46.
Tabela 4.46: ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
em
amostras de leite bovino (n=3).
Analito Limite de Quantificação
(ng/mL)
Limite de Detecção
(ng/mL)
ABZ-SO
2
-NH
2
6,00 0,30
R-(+)-ABZ-SO
24,0 0,55
S-(-)-ABZ-SO
24,0 0,50
ABZ-SO
2
24,0 0,30
Resultados e Discussão
215
Para a realização dos testes de estabilidade, foram utilizadas amostras
preparadas nas concentrações dos controles de qualidade e os fármacos foram
considerados estáveis na matriz biológica e em solução, quando foram observadas
variações inferiores a 15 % com relação às concentrações iniciais.
A estabilidade das amostras em solução (água:CH
3
CN – 50:50) foi
avaliada por um período de 10 dias e de acordo com os resultados obtidos todos os
metabólitos apresentaram-se estáveis no período avaliado.
Para a avaliação da estabilidade das amostras após ciclos de
congelamento e degelo, as amostras foram preparadas nas concentrações dos
controles de qualidade do método, foram analisadas imediatamente (tempo zero) e
depois de congeladas a -20ºC. Nos tempos especificados (24, 48 e 72 horas) as
amostras foram degeladas, a temperatura ambiente, e analisadas. A Tabela 4.47
apresenta os valores de precisão e exatidão das replicatas (n=3) após os três ciclos
de degelo.
Através dos dados obtidos pode-se verificar que todos os metabólitos
mantiveram-se estáveis após os ciclos de congelamento e degelo. É importante
destacar que, embora os valores obtidos no terceiro ciclo estejam dentro dos limites
estabelecidos, os valores obtidos para o ABZ-SO
2
-NH
2
e o ABZ-SO
2
indicam que
esses compostos não suportariam mais um ciclo de degelo.
Resultados e Discussão
216
Tabela 4.47: Resultados do estudo de estabilidade a ciclos de degelo para o ABZ-
SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
em amostras de leite bovino
(n=3).
Analito Tempo Zero 1º Ciclo 2º Ciclo 3º Ciclo
(ng/mL) CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
ABZ-SO
2
-NH
2
9,20 9,24
86,6 6,60
104 3,27
111 4,64
112
13,0 11,1
85,8 3,53
90,3 2,90
95,1 2,25
88,5
19,0 1,51
85,4 4,32
88,4 4,80
113 2,15
86,5
R-(+)-ABZ-SO
27,2 12,3
105 6,50
112 2,54
95,7 9,29
114
39,0 15,0
94,1 3,42
93,2 3,92
99,5 2,84
106
57,0 7,24
85,3 3,39
89,3 1,03
98,7 2,11
102
S-(-)-ABZ-SO
27,2 5,47
102 6,62
109 6,57
112 4,25
89,3
39,0 5,87
105 4,37
94,8 4,19
96,2 5,24
95,8
57,0 1,74
96,9 4,07
97,5 3,17
98,6 3,10
96,7
ABZ-SO
2
27,2 14,1
113 5,21
96,8 2,30
93,0 1,63
87,0
39,0 10,9
95,0 3,50
99,3 5,76
102 5,48
85,3
57,0 7,57
85,8 5,84
93,0 2,03
107 8,57
84,9
Para a avaliação da estabilidade de curta duração, as amostras
preparadas nas concentrações dos controles de qualidade foram analisadas
imediatamente e depois de deixadas em repouso a temperatura ambiente na
bancada por seis horas.
Resultados e Discussão
217
A estabilidade das amostras, durante a permanência no auto-injetor, foi
avaliada durante um período de 10 h, que foi o tempo necessário para a realização
da curva de calibração.
Todas as amostras permaneceram estáveis durante os períodos,
avaliados, com coeficientes de variação inferiores a 15 % e exatidão dentro dos
limites de aceitação do método.
157
O estudo da estabilidade de longa duração tem como objetivo
estabelecer o tempo máximo em que amostras podem permanecer armazenadas,
após a coleta, antes de serem analisadas. Para este estudo, as amostras nas
concentrações controle foram analisadas imediatamente após a preparação (tempo
zero) e armazenadas a -20 °C. As amostras armazenadas foram degeladas uma
única vez e analisadas nos seguintes tempos: 3, 5 e 7 dias. Todos os resultados
obtidos foram calculados por interpolação na curva de calibração e comparados
com os obtidos das amostras analisadas no tempo zero, para obter o valor de
exatidão.
A Tabela 4.48 mostra os valores de precisão e exatidão para as
avaliações de estabilidade de longa duração.
As amostras apresentaram estabilidade de 5 dias para o ABZ-SO
2
-NH
2
e para os
(±)-ABZ-SO; para o ABZ-SO
2
a estabilidade apresentada foi de 3 dias.
Após esses períodos os valores de exatidão obtidos foram maiores do que 15% de
variação.
Resultados e Discussão
218
Tabela 4.48: Resultados da estabilidade de longa duração das amostras de leite,
fortificadas com ABZ-SO
2
-NH
2
, R-(+)-ABZ-SO, S-(-)-ABZ-SO e ABZ-SO
2
,
armazenadas a -20ºC.
Analito Tempo Zero 3 dias 5 dias 7 dias
(ng/mL) CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
CV
(%)
Exatidão
(%)
ABZ-SO
2
-NH
2
9,20 86,6
9,24 4,77
101 5,73
86,8 5,90
60,0
13,0 85,8
11,1 5,87
90,2 9,76
89,8 5,45
48,8
19,0 85,4
1,51 4,79
89,5 6,97
90,7 6,70
66,5
R-(+)-ABZ-SO
27,2 105 12,3 6,98
89,9 3,54
89,8 4,33
45,3
39,0 94,1
15,0 3,12
101 4,98
87,3 2,21
47,8
57,0 85,3
7,24 2,20
97,8 5,11
104 1,03
50,9
S-(-)-ABZ-SO
27,2 102 5,47 5,78
104 3,44
93,1 8,99
29,7
39,0 105 5,87 6,42
108 6,31
86,9 5,82
40,0
57,0 96,9
1,74 2,04
98,8 5,72
86,2 5,72
56,6
ABZ-SO
2
27,2 113 14,1 4,12
91,2 3,21
47,0 14,9
24,0
39,0 95,0
10,9 2,79
84,9 5,98
36.9 12,0
12,9
57,0 85,8
7,57 3,33
85,5 5,63
45,0 3,20
35,0
CONCLUSÕES
“Ter problemas na vida é inevitável, ser
derrotado por eles é opcional.”
R
OGER
C
RAWFORD
Conclusões
219
5 - C
ONCLUSÕES
5.1 – D
ESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE COLUNAS
RAM-BSA
As colunas RAM-BSA são de fácil preparo e bastante eficientes na
exclusão de proteínas do leite utilizando água como fase móvel. O estudo de
exclusão protéica realizado para as colunas RAM-BSA nos suportes C
18
, fenil e
amino, indicou que a presença de sais na fase móvel altera o perfil de exclusão das
proteínas, quando comparado com água. A coluna amino foi a que apresentou pior
perfil de exclusão frente às soluções testadas com um tempo de aproximadamente 8
minutos para eficiente exclusão das proteínas. Sua utilização seria mais indicada
para compostos não ionizáveis, onde a utilização de água como fase móvel de
exclusão pudesse ser feita. As colunas RAM-BSA C
18
e fenil apresentaram perfis
de exclusão semelhante, com eficiente exclusão das proteínas até 5 minutos de
análise.
O detector de índice de refração utilizado no ínício do estudo de
retenção dos antibióticos aminoglicosídeos, embora já tenha sido usado pra análise
de aminoglicosídeos,
33
não apresentou boas respostas, nas condições avaliadas,
oferecendo dúvidas com relação aos cromatogramas obtidos. Já, o detector de
espalhamento de luz (ELSD) mostrou-se eficiente podendo ser utilizado com
confiança em análises para estes antibióticos.
Conclusões
220
5.2 – A
VALIAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO PARA OS ANTIBIÓTICOS
AMINOGLICOSÍDEOS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE PAREAMENTO IÔNICO E
DETECÇÃO POR
ELSD
A utilização das colunas RAM-BSA e RAM-ADS em métodos para
análises de antibióticos aminoglicosídeos é problemática, uma vez que o
comportamento apresentado por estes antibióticos, nessas colunas, é imprevisível.
Isto pôde ser constatado nas análises realizadas, onde não foi possível a obtenção
de uma fase móvel para eficiente exclusão das proteínas e posterior extração dos
antibióticos analisados.
Os estudos envolvendo TFA mostraram que uma possível retenção da
gentamicina pode ser obtida em concentrações acima de 0,1M. No entanto, essas
concentrações resultariam em valores muito baixos de pH podendo prejudicar além
da coluna cromatográfica a exclusão das proteínas do leite.
O estudo de fator de retenção realizado com as colunas analíticas
mostrou uma alta seletividade para a gentamicina com o uso do ácido
trifluoracético como agente de pareamento iônico e a coluna C
18
, onde a separação
dos componentes das gentamicinas foi obtida somente variando a concentração do
ácido utilizado. Do mesmo modo foi possível obter também uma separação entre os
epímeros da neomicina. Foi também verificado um maior controle dos fatores de
retenção com o aumento da concentração dos agentes de pareamento iônico.
Baseado nesses resultados foi desenvolvido e validado três métodos
para a análise de controle de qualidade dos três antibióticos aminoglicosídeos:
estreptomicina, neomicina e gentamicina em medicamentos veterinários usando o
ELSD como detector.
Conclusões
221
Todos os métodos desenvolvidos mostraram-se práticos, lineares,
precisos, exatos e seletivos e foram aplicados com sucesso para medicamentos
veterinários comercialmente disponíveis.
O método de quantificação dos componentes da gentamicina proposto
apresentou fatores de resposta semelhantes a um método já publicado por
quantificação com padronização externa secundária
31
mostrando-se eficiente e
confiável, podendo ser utilizado com segurança na quantificação desses compostos
em medicamentos.
5.3
-
D
ESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO POR
CLAE-
MULTIDIMENSIONAL PARA ANÁLISE DE ANTIBIÓTICOS CEFALOSPORÍNICOS EM
LEITE BOVINO UTILIZANDO
MS
COMO DETECTOR
No desenvolvimento de métodos para análise dos antibióticos
cefacetril e cefalexina por LC-MS-MS, foi verificado vários problemas com relação
a ionização das moléculas utilizando soluções tamponadas e agentes de pareamento
iônico como fases móveis cromatográficas. Essas fases móveis são de fundamental
importância para o método multidimensional proposto, uma vez que para ambos
antibióticos, um severo controle da ionização deve ser realizado.
O uso dessas condições cromatográficas dificultou o desenvolvimento
do método, uma vez que de acordo com os resultados obtidos, uma falta de
reprodutibilidade entre as replicatas de análises foi verificada. Uma série de
alterações foram avaliadas para um melhor controle na ionização da amostra, mas
nenhum resultado positivo foi observado.
Deste modo, não foi possível o desenvolvimento de um método por
injeção direta de amostra para análise dos antibióticos cefalosporínicos cefacetril e
cefalexina em leite bovino por detecção com MS.
Conclusões
222
5.4
–
D
ESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE UM MÉTODO
ENANTIOSSELETIVO POR INJEÇÃO DIRETA DE AMOSTRA PARA DETERMINAÇÃO DOS
METABÓLITOS DO ALBENDAZOL POR
LC-MS-MS
EM LEITE BOVINO
A cromatografia multidimensional foi empregada com sucesso para a
análise simultânea do (+) e (-)- albendazol-sulfóxido, do albendazol-sulfona e para
o albendazol-amino-sulfona, em leite bovino, com injeção direta de amostras. Este
tipo de análise permitiu o desenvolvimento de um método prático, linear, exato,
preciso, seletivo e sensível podendo ser utilizado para estudos farmacocinéticos
enantiosseletivos e para estudos de análise de resíduos dos mesmos.
Foi importante também nesse tipo de desenvolvimento, o estudo de
efeito de matriz realizado. De acordo com esse estudo foi possível verificar que a
coluna RAM-BSA utilizada para excluir os interferentes e extrair os analitos de
interesse foi eficiente. Nenhuma alteração significante na ionização da amostra
causada pela matriz avaliada foi observada.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
"Se você não aprende a rir das dificuldades, você
não terá nada para rir quando estiver velho.”
E
DGAR
W
ATSON
H
OWE
Referências Bibliográficas
223
6
–
R
EFERÊNCIAS
B
IBLIOGRÁFICAS
1- STOLKER, A. A. M; BRINKMAN, U. A. Th. “Analytical
strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in
food-producing animals—a review”. Journal of Chromatography A, 1067: 15-53,
2005.
2- TOLDRÁ, F.; REIG, M. “Method for rapid detection of chemical
and veterinary drug residues in animal foods”. Trends in Food Science &
Technology, 17: 482-489, 2006.
3- FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. Guidance for
Industry. Evaluating the Safety of Antimicrobial New Animal Drugs with
Regard to Their Microbiological Effects on Bacteria of Human Health
Concern. U.S. Department of Health and Human Services, Center for Veterinary
Medicine, 2003, 36 p. Disponível em: <http://www.fda.gov/cvm/guidance>.
Acesso em: 10 Dez. 2003.
4- OFFICIAL JOURNAL OF EUROPEAN COMMUNITIES.
Council Regulation (EEC) n° 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community
procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medical
products in foodstuffs of animal origin (OJ n° L 224, 18.8.1990), Annex I., 2002,
29 p. Disponível em: <http://cemu10.fmv.ulg.ac.be/ostc/902377/902377reg.html>.
Acesso em: 10 Dez. 2003.
5- MINISTÉRIO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO.
Secretária de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa Nº 42, de 20 de Dezembro
de 1999.
6- MARZO, A.; DAL BO. L. “Chromatography as an analytical tool
for selected antibiotic classes: a reappraisal addressed to pharmacokinetic
applications”. Journal of Chromatography A, 812: 17-34, 1998.
Referências Bibliográficas
224
7- FEDENIUK, R. W.; SHAND, P. J. “Theory and methodology of
antibiotic extraction from biomatrices”. Journal of Chromatography A, 812: 3-15,
1998.
8- SCHENCK, F. J.; CALLERY, P. S. “Chromatographic methods of
analysis of antibiotics in milk”. Journal of Chromatography A, 812: 99-109, 1998.
9- MARQUES
,
M
.
C
.;
OLIVEIRA
,
C
.
A
.
F
. “
Avaliação das
Características Físico-Químicas do Queijo Minas
Produzido com Leite Contendo
Diferentes Níveis de Células
Somáticas”. Subprojeto de pesquisa – bolsa de
iniciação científica – Relatório Final“. Universidade de São Paulo, Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos, p. 3-6, 2004.
10- ARASHIRO, E. K. N.; TEODORO, V. A. M.; MIGUEL, E. M.
“Mastite Bovina: Importância Econômica e Tecnológica“. Disponível
<http://www.cienciadoleite.com.br/mastitebovinaimportancia.htm>. Acesso em: 10
de dezembro de 2007.
11- KENNEDY, D. G.; McCRACKEN, R. J.; CANNAVAN, A.;
HEWITT, S. A. “Use of liquid chromatograpy-mass spectrometry in the analysis of
residues of antibiotics in meat and milk”. Journal of Chromatography A, 812: 77-
98, 1998.
12-
ISOHERRANEN, N.; SOBACK, S. “Chromatographic Methods
for Analysis of Aminglycoside Antibiotics”. Journal of AOAC International, 82:
1017-1045, 1999.
13- STEAD, D. A. “Current methodologies for the analysis of
aminoglycosides”. Journal of Chromatography B, 747: 69-93, 2000.
14- McLAUGHLIN, L. G.; HENION, J. D. “Determination of
aminoglycosides antibiotics by reversed-phase ion-pair high-performance liquid
chromatography coupled with pulsed amperometry and ion spray mass
spectrometry”. Journal of Chromatography, 591: 195-206, 1992.
Referências Bibliográficas
225
15- CHERLET, M.; De BAERE, S.; De BACKER, P. “Determination
of gentamycin in swine and calf tissues by high-performance liquid
chromatography combined with electrospray ionization mass spectrometry”.
Journal of Mass Spectrometry, 35: 1342-1350, 2000.
16-
GETEK, T. A.; VESTAL, M. L.; ALEXANDER, T. G. “Analysis
of gentamicin sulfate by hight-performance liquid chromatography combined with
thermospray mass spectrometry”. Journal of Chromatography, 554: 191-203,
1991.
17- STOLKER, A. A. M.; BRINKMAN, U. A. Th. “Analytical
strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in
food-producing animals – a review”. Journal of Chromatography A, 1067: 15-53,
2005.
18- HORNISH, R. E.; WIEST, J. R. “Quantitation of spectinomycin
residues in bovine tissues by ionexchangehigh-performance liquid chromatography
with post-column derivatization and confirmation by reversed-phase high-
performance liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization
tandem mass spectrometry ”. Journal of Chromatography A, 812: 123-133, 1998.
19- CARSON, M. C.; HELLER, D. N. “Confirmation of
spectinomycin in milk using ion-pair solid-phase extraction and liquid
chromatography–electrospray ion trap mass spectrometry”. Journal of
Chromatography B, 718: 95-102, 1998.
20- EDDER, P.; CAMINOLI, A.; CORVI, C. “Determination of
streptomycin residues in food by solid-phase extraction and liquid chromatography
with post-column derivatization and fluorometric detection”. Journal of
Chromatography A, 830: 345-351, 1999.
Referências Bibliográficas
226
21- STEAD, D. A.; RICHARDS, R. M. E. “Sensitive fluorimetric
determination of gentamicin sulfate in biological matrices using solid-phase
extraction, pre-column derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate and
reversed phase high-performance liquid chromatography”. Journal of
Chromatography B, 675: 295-302, 1996.
22- STEAD, D. A.; RICHARDS, R. M. E. “Sensitive high-
performance liquid chromatography assay for aminoglycosides in biological
matrices enables the direct estimation of bacterial drug uptake”. Journal of
Chromatography B, 693: 415-421, 1997.
23- FENNELL, M. A.; UBOTH, C. E.; SWEENEY, R. W.; SOMA, L.
R. “Gentamicin in Tissue and Whole Milk: An Improved Method for Extraction
and Cleanup of Samples for Quantitation on HPLC”. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 43: 1849-1852, 1995.
24- HAAGSMA, N.; SCHERPENISSE, P.; SIMMONDS, R. J.;
WOODS, S. A.; REES, S. A. “High-performance liquid chromatographic
determination of spectinomycin in swine, calf and chicken plasma using post-
column derivatization”. Journal of Chromatography B, 672: 165-171, 1995.
25- KIJAK, P. J.; JACKSON, J.; SHAIKH, B. “Determination of
gentamicin in bovine milk using liquid chromatography with post-column
derivatization and fluorescence detection”. Journal of Chromatography B, 691:
377, 1997.
26- POSYNIAK, A.; ZMUDZKI, J.; NIEDZIELSKA, J. “Sample
preparation for residue determination of gentamicin and neomycin by liquid
chromatography”. Journal of Chromatography A, 914: 59-66, 2001.
27- NIESSEN, W. M. A. “Analysis of antibiotics by liquid
chromatography-mass spectrometry”. Journal of Chromatography A, 812: 53-75,
1998.
Referências Bibliográficas
227
28- ZHOU, S.; HAMBURGER, M. “Application of liquid
chromatography-atmospheric pressure ionization mass spectrometry in natural
product analysis. Evaluation and optimization of electrospray and heated nebulizer
interfaces”. Journal of Chromatography A, 755: 189-204, 1996.
29-
KOHLER, M.; HAERDI, W.; CHRISTEN, P.; VEUTHEY, J.L.
“The evaporative light scattering detector: some applications in pharmaceutical
analysis”. Trends in Analytical Chemistry, 16 (8): 475-484, 1997.
30- LUCENA, R.; CÁRDENAS, S.; VALCÁRCEL, M. “Evaporative
light scattering detector: trend in its analytical uses”. Anal. Bioanal. Chem., 388:
1663-1672, 2007.
31- MEGOULAS, N. C.; KOUPPARIS, M. A. “Development and
validation of a novel LC/ELSD method for the quantitation of gentamicin sulfate
components in pharmaceutical”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 36: 73-79, 2004.
32- MEGOULAS, N. C.; KOUPPARIS, M. A. “Enhancement of
evaporative light scattering detection in high-performance liquid chromatographic
determination of neomycin based on highly volatile mobile phase, high-molecular-
mass ion-pairing reagents and controlled peak shape”. Journal of Chromatography
A, 1057: 125-131, 2004.
33- INCHAUSPÉ, G.; SAMAIN, D. “Use of perfluorinated carboxylic
acids in the separation of aminoglycoside antibiotics by ion-pair reversed-phase
high-performance liquid chromatography”. Journal of Chromatography, 303: 277-
282, 1984.
34- CLAROT, I.; CHAIMBAULT, P.; HASDENTEUFEL, F.;
NETTER, P.; NICOLAS, A. “Determination of gentamicin sulfate and related
compounds by high-performance liquid chromatography with evaporative light
scattering detection”. Journal of Chromatography A, 1031: 281-287, 2004.
Referências Bibliográficas
228
35- MEGOULAS, N. C.; KOUPPARIS, M. A. “Direct determination
of kanamycin in raw materials, veterinary formulation and culture media using a
novel liquid chromatography – evaporative light scattering method”. Analytica
Chimica Acta, 547: 64-72, 2005.
36- SARRI, A. K.; MEGOULAS, N. C.; KOUPPARIS, M. A.
“Development of a novel liquid chromatography – evaporative light scattering
detection method for bacitracins and applications to quality control of
pharmaceuticals”. Analytica Chimica Acta, 573-574: 250-257, 2006.
37- MEGOULAS, N. C.; KOUPPARIS, M. A. “Development and
validation of a novel HPLC/ELSD method for the direct determination of
tobramycin in pharmaceuticals, plasma and urine”. Anal. Bioanal. Chem., 382:
290-296, 2005.
38- GALANAKIS, E. G.; MEGOULAS, N. C.; SOLICH, P.;
KOUPPARIS, M. A. “Development and validation of a novel LC non-
derivatization method for the determination of amikacin in pharmaceuticals based
on evaporative light scattering detection”. Anal. Bioanal. Chem., 40: 1114-1120,
2006.
39- SILVA, P. “Antibióticos beta-lactâmicos”. IN: Farmacologia.
SILVA, P. (Ed.). 6ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2002, p. 1001-1021.
40- ROCHA, H. “Cefalosporinas”. IN: Farmacologia. SILVA, P.
(Ed.). 6ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2002, p. 1032-1039.
41- PATRICK, G. L. “Antibacterial Agents”. IN: Medicinal
Chemistry. PATRICK, G. L. (Ed.). 2
nd
ed., New York: Oxford University Press,
2001, p. 373-419.
42- PETRI, W. A. JR. “Antimicrobial agents: penicillins,
cephalosporins, and other β-lactam antibiotics”. IN: The Pharmacological Basis of
Referências Bibliográficas
229
Therapeutics. HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E.; GILMAN, A. G. (Eds.). 10
th
ed., Nova Iorque, McGraw-Hill, 2001, p. 1206-1218.
43- KOROLKOVAS, A.; BURCKHALTER, J. H. “Antibióticos”. IN:
Química Farmacêutica. KOROLKOVAS, A. & BURCKHALTER, J. H. (Eds.). 1ª
ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1988, p. 575-610.
44- SOUZA, J. C. de. Antibióticos Anti-bacterianos. SOUZA, J. C.
de.(Ed.). 1ª ed., Porto, Publicações Farmácia Portuguesa, 2001, p.1-325.
45- PÉHOURCQ, F.; JARRY, C. “Determination of third-generation
cephalosporin by high-performance liquid chromatography in connection with
pharmacokinetic studies”. Journal of Chromatography. A, 812: 159-178, 1998.
46- BAFELTOWSKA, J. J.; BUSZMAN, E.; MANDAT, K.;
HAWRANEK, J. “Determination of cefotaxime and desacetylcefotaxime in
cerebrospinal fluid by solid-phase extraction and high-performance liquid
chromatography”. Journal of Chromatography. A, 976: 249-254, 2002.
47- JOHNSON, V. M.; ALLANSON, J. P.; CAUSON, R. C.
“Determination of the cephalosporin antibiotic cephradine in human plasma by
high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection”. Journal of
Chromatography. B, 740: 71-80, 2000.
48- NISHINO, H.; FUJITOMO, H.; UMEDA, T. “Determination of a
new oral cephalosporin, cefmatilen hydrochloride hydrate, and its seven
metabolites in human and animal plasma and urine by coupled systems of ion-
exchange and reversed high-performance liquid chromatography”. Journal
of.Chromatography. B, 749: 101-110, 2000.
49- BOMPADRE, S.; FERRANTE, L.; LEONE, L. “On-line solid-
phase extraction of cephalosporins”. Journal of Chromatography. A, 812: 191-196,
1998.
Referências Bibliográficas
230
50- MOATS, W. A.; ROMANOWSKI, R. D. “Multiresidue
determination of β-lactam antibiotics in milk and tissues with the aid of high-
performance liquid chromatographic fractionation for clean up” Journal of
Chromatography.A, 812: 237-247, 1998.
51- MOATS, W. A.; BUCKLEY, S. A. “Determination of free
metabolites of ceftiofur in animal tissues with an automated liquid chromatographic
cleanup”. Journal of AOAC International, 81(4): 709-713, 1998.
52- BREILH, D.; LAVALLEE, C.; FRATTA, A.; DUCINT, D.;
CONY-MAKHOUL, P.; SAUX, M. C. “Determination of cefepime and cefpirome
in human serum by high-performance liquid chromatography using an
ultrafiltration for antibiotics serum extraction”. Journal of Chromatography. B,
734: 121-127, 1999.
53- JOSHI, S. “HPLC separation of antibiotics present in formulated
and unformulated samples”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
28: 795-809, 2002.
54- MORSCH, L. M.; BITTENCOURT, C. F.; SOUZA, M. J.;
MILANO, J. “LC method for the analysis of cefetamet pivoxil hydrochloride in
drug substance and powder for oral suspension”. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 30: 643-649, 2002.
55- HSU, M.; LIN, Y.; CHUNG, H. “High-performance liquid
chromatographic method for potency determination of cephalexin in commercial
preparations and for stability studies”. Journal of Chromatography A, 692: 67-72,
1995.
56- CASS. Q. B., OLIVEIRA, R. V. “Evaluation of Liquid
Chromatographic Behavior of Cephalosporinics Antibiotics Using Restricted
Access Medium Columns for On-line Sample Cleanun of Bovine Milk” Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 54: 1180-1187, 2005.
Referências Bibliográficas
231
57- OLIVEIRA, R. V., DE PIETRO, A. C., CASS, Q. B.
“Quantification of cephalexin as residue levels in bovine milk by high-performance
liquid chromatography with on-line sample cleanup” Talanta, 71 (3): 1233-1238,
2007.
58- MORENO, L.; IMPERIALE, F.; MONTTIER, L.; ALVAREZ, L.;
LANUSSE, C. “Comparison of milk residue profiles after oral and subcutaneous
administration of benzimidazole anthelmintics to dairy cows“.
Analytica Chimica
Acta, 536: 91–99, 2005.
59- LOUKAS, A. & HOTEZ P. J. “Quimioterapia das Infecções por
Helmintos”. IN: As Bases Farmacológicas da Terapêutica. Rio de Janeiro,
Guanabara Koogan, 2001, p. 963-981.
60- RANG, H. P.; DALE, M. M. & RITTER, J. M. “Fármacos Anti-
Helmínticos”. IN: Farmacologia, 4º ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2001,
p. 622-626.
61- Conselho Regional de Medicina Veterinária. “Verminoses dos
Bovinos”. Disponível em: http://crmv-
pr.com.br/index2.php?option=com_content&task=view&id=112&Ite. Acesso em
11/06/2007.
62- MALACCO, M. A. F. “Controle Parasitário da Fêmea Bovina”.
Disponível em
http://br.merial.com/rage/artigos_tecnicos/Cont_par_fem_bovina.pdf Acesso em
11/06/2007.
63- MORENO, L.; ECHEVARRIA, F.; MUÑOZ, ALVAREZ, L.;
BRUNI, S. S.; LANUSSE, C. “Dose-Dependent Activity of Albendazole Against
Benzimidazole-Resistant Nematodes in Sheep: Relationship between
Pharmacokinetics and Efficacy”. Expermimental Parasitology, 106: 150-157, 2004.
Referências Bibliográficas
232
64- DANAHER, M.; RUYCK, H.D.; CROOKS, S. R. H.; DOWLING,
G.; O’KEEFFE, M. “Review of methodology for the determination of
benzimidazole residues in biological matrices”.
Journal of Chromatography B,
845: 1-37, 2007.
65- DAYAN, A. D. “Albendazole, Mebendazole and Praziquantel.
Review of Non-Clinical Toxicity and Pharmacokinetics”. Acta Tropica 86: 141-
159, 2003.
66- BATZIAS, C. G.; DELIS, G. A. “Reversed- Phase Liquid
Chromatografic Method with Fluorescence Detection for the Simultaneous
Determination of Albendazole Sulfoxide, Albendazole –Sulphone e Albendazole-2-
Amino Sulphone in Sheep Plasma”. Journal of Chromatography B, 805: 267-274,
2004.
67- FORMENTINI, E. A.; MESTORINO, O. N.; MARIÑO E. L.;
ERRECALDE, J. O. “Pharmacokinetics of Ricobendazole in Calves”. Journal of
Veterinary Pharmacology Therapeutics, 24: 199-202, 2001
68- LANCHOTE, V. L.; MARQUES, M. P. C.; TAKAYANAGUI, O.
M.; CARVALHO, R. PAIAS, F. O.; BONATO, P. S. “Simultaneous Determination
of Albendazole Sulfoxide Enantiomers and Albendazole Sulfone in Plasma”.
Journal of Chromatography B, 709: 273-279,1998.
69- KITZMAN, D.; CHENG, K. J.; FLECKENSTEIN, L. “HPLC
Assay for Albendazole and Metabolites in Human Plasma for Clinical
Pharmacokinetic Studies”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
30: 801-813, 2002.
70- GARCIA, J. J.; FÉRNANDEZ, F. B.; TORRADO, J. J.
Quantitative “Determination of Albendazole and its Main Metabolites in Plasma”.
Journal of Chromatography B, 723: 265-271, 1999.
Referências Bibliográficas
233
71- CRISTOFOL, C.; VIRKEL, G.; ALVAREZ, L.; SÁNCHEZ, S.;
ARBOIX, M.; LANUSSE, C. “Albendazole Sulphoxide Enantiomeric Ratios in
Plasma and Target Tissues after Intravenous Administration of Ricobendazole to
Cattle”. Journal of Veterinary Pharmacological Therapapeutics, 24: 117-124,
2001.
72- WU, Z.; MEDLICOTT, N. J.; RAZZAK, M.; TUCKER, I. G.
“Development and Optimization of Rapid HPLC Method for Analysis of
Ricobendazole and Albendazole Sulfone in Sheep Plasma”. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 39: 225-232, 2005.
73- PAIAS, F. O.; LANCHOTE, V. L.;TAKAYANAGUI, M. O.;
BONATO, P. S. “Enantiosselective analysis of Albendazole Sulfoxide in Plasma
Using the Chiral Stationary Phase”. Chirality, 9: 722-726, 1997.
74- FLETOURIS, D. J.; BOTSOGLOU, N. A.; PSOMAS, I. E.;
MANTIS, A. I. “Determination of the Marker Residue of Albendazole in Milk
Using Ion-Pair Liquid Chromatography and Fluorescence Detection”. Analytica
Chimica Acta, 345: 111-119, 1997.
75- SOLANA, H. D.; RODRIGUEZ, J. A.; LANUSSE, C. E.
“Comparative Metabolism of Albendazole and Albendazole Sulphoxide by
Different Helminth Parasites.” Parasitolological Research, 87: 275-280, 2001.
76- BONATO, P. S.; LANCHOTE, V. L.; TAKAYANAGUI, O. M.
“Simultaneous liquid chromatography–tandem mass spectrometric determination of
albendazole sulfoxide and albendazole sulfone in plasma”.
Journal of
Chromatography B, 783: 237–245, 2003.
77- DE RUYCK, H.; DAESELEIRE, E.; DE RIDDER, H.; VAN
RENTERGHEM, R. “Development and validation of a liquid chromatographic–
electrospray tandem mass spectrometric multiresidue method for anthelmintics in
milk”. Journal of Chromatography A, 976: 181-194, 2002.
Referências Bibliográficas
234
78- ZROSTLIKOVA, J.; HAJSLOVA, J.; POUSTKA, J.; BEGANY,
P. “Alternative calibration approaches to compensate the effect of co-extracted
matrix components in liquid chromatography– electrospray ionisation tandem mass
spectrometry analysis of pesticide residues in plant materials”. Journal of
Chromatography A, 973:
13-26, 2002.
79- CHU, P.S.; WANG, R.Y.; BRANDT, T.A.; WEERASINGHE,
C.A. “Determination of albendazole-2-aminosulfone in bovine milk using high-
performance liquid chromatography with fluorometric detection”. Journal of
Chromatography, 620: 129-135, 1993.
80-
CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G.; CASSIANO, N. M. “The Use of
a Polysaccharide Based Column on Multimodal Elution”. Journal of Liquid
Chromatography & Related Techonologies, 23 (13): 1029-1038, 2000.
81- MONTANARI, C. A.; CASS, Q. B.; TIRITAN, M. E.; SOUZA,
A. L. S. “A QSERR Study on Enantioselective Separation of Enantiomeric
Sulphoxides”. Analytica Chimica Acta, 419: 93-100, 2000.
82- CASS, Q. B.; BATIGALHIA, F. “Enantiomeric Resolution of a
Series of Chiral Sulfoxides by High-Performance Liquid Chromatography on
Polysaccharide-Based Columns with Multimodal Elution”. Journal of
Chromatography A, 987, 445-452, 2003.
83- CASS, Q. B.; TIRITAN, M. E.; BASSI, A. L.; CALAFATTI, S.
A; DEGANI, A. L. G. “Discriminação Quiral por CLAE em Carbamatos de
Polissacarídeos: Desenvolvimento, Aplicações e Perspectivas”. Química Nova, 20
(1): 49-57, 1997.
84- TIRITAN, M. E. “Resolução Enantiomérica de Sulfóxidos Quirais
por CLAE, em carbamatos de Polissacarídeos”. São Carlos, Programa de Pós-
Graduação em Química- UFSCar, 1996. Tese de Doutorado, 135 p.
Referências Bibliográficas
235
85- GUIMARÃES, P. “Composição do Leite”. Disponível em:
<http://www.cienciadoleite.com.br/composicaoleite.htm>. Acesso: 20 Dez. 2007.
86-
Leite - Considerações gerais. Disponível em <
http://www.cienciadoleite.com.br/leiteconsideracoes.htm>. Acesso em: 20 Dez.
2007.
87- MARCONDES, T. “Leite - Expressivo crescimento da produção
de Santa Catarina - 19/12/07”. Disponível em <http://cepa.epagri.sc.gov.br/>.
Acesso: 27 Dez. 2007.
88- VILELA, D. “Leite: sua importância econômica, social e
nutricional”. Disponível em: <http://www.pardo-suiço.com.br/artigoleite.htm>.
Acesso: 08 Jan. 2004.
89- COSTA, E. O. da. “Qualidade do leite: contagem de células
somáticas e resíduo de antimicrobianos”. Disponível em:
<http://www.nucleovet.com.br/02.doc>. Acesso: 08 Jan. 2004.
90- STEVENSON, D. “Sample preparation. In: High Performance
Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice”, Wainer, I.W. and
Lough, W.J., ed., Blackie Academic & Professional, Glasgow, p. 168-185, 1995.
91- HAGESTAM, H.; PINKERTON, T. C.; “Internal surface
reversed-phase silica supports for liquid chromatography”. Analytical Chemical.,
57: 1757-1763, 1985.
92- SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. “Practical
HPLC Method Development”, 2
nd
edition, John Wiley and Sons, New York, p.
100-173, 1997.
93- QUEIROZ, S. C. N.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.
“Métodos de extração e/ou concentração de compostos encontrados em fluídos
biológicos para posterior determinação cromatográfica”. Quimica. Nova, 24 (1):
68-76, 2001.
Referências Bibliográficas
236
94- BOVANOVÁ, L.; BRANDSTETEROVÁ, E. “Direct analysis of
food samples by high-performance liquid chromatography”. Journal of
Chromatography, 880: 149-168, 2000.
95- ANDERSON, J. A. “High performance liquid chromatography
(direct injection techniques)”. Clinical Chemistry, 65: 434-443, 1993.
96- CAVALERI, M.; POLLINI, W.; COLOMBO, L. “Determination
of ramoplanin in humam urine by high-performance liquid chromatography with
automated column switching”. Journal of Chromatgraphy., 846: 185-192, 1999.
97- OERTEL, R.; RICHTER, K.; GRAMATTÉ, T.; KIRCH, W.
“Determination of drugs in biological fluids by high-performance liquid
chromatography with on-line sample processing”. Journal of Chromatgraphy, 797:
203-209, 1998.
98- YU, Z.; WESTERLUND, D.; BOOS, K.S. “Evaluation of liquid
chromatographic behavior of restricted-access media pre-columns in the course of
direct injection of large volumes of plasma samples in column-switching systems”.
Journal of Chromatgraphy, 704: 53-62, 1997.
99- DESILETS, C.P.; ROUNDS. M.A.; REGNIER, F.E.
“Semipermeable-surface reversed-phase media for high-performance liquid
chromatography”. Journal of Chromatgraphy, 544: 25-39, 1991.
100- BOOS, K.-S.; RUDOLPHI, A. “The use of restricted-access
media in hplc, part II –Applications”. LC-GC, 15 (9): 816-823, 1997.
101- BOOS, K.-S.; RUDOLPHI, A. “The use of restricted-access
media in hplc, part I – classification and review”. LC-GC, 15 (7): 602-11, 1997.
102- PINKERTON, T.C. “High-performance liquid chromatography
packing materials for the analysis of small molecules in biological matrices by
direct injection”. Journal of Chromatgraphy, 544: 13-23, 1991.
Referências Bibliográficas
237
103- HAGINAKA, J. “Drug determination in serum by liquid
chromatography with restricted access stationary phases”. Trends in Analytical
Chemical, 10: 17-22, 1991.
104- YOSHIDA, H.; MORITA, I.; TAMAI, G.; MASUJIMA, T.;
TSURU, T.; TAKAI, N.; IMAI, H. “Some Characteristics of a Protein-Coated ODS
Column and its Use for the Determination of Drugs by the Direct Injection
Analysis of Plasma Samples”. Chromatographia, 19: 466-472, 1984.
105- CASSIANO, N. M.; LIMA, V.V; OLIVEIRA, R.V; DE
PIETRO, A.C.; CASS, Q.B. “Development of restriced-access media suports and
their application to the direc analysis of biological fluid samples via high-
performance liquid chromatography”. Anal. Bioanal. Chem., 384: 1462-1469,
2006.
106- LIMA V. V. Colunas de Acesso Restrito e Biorreatores de
Enzimas GAPDH: Desenvolvimento e Aplicação em Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência. São Carlos, Programa de Pós-Graduação em Química-UFSCar,
2004. Tese de Doutorado, 5, 173 p.
107- MENEZES, M.L. and FELIX, G. “Analysis of Organochlorine
Pesticides in Plain Milk Using Direct Injection on na ISRP Column with Column
Switching”. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (19): 3221-3228, 1996.
108- MENEZES, M.L.; FELIX, G. “On-Line Extration and Separation
of Bendiocarb, Methomyl, Methylparathion and Pentachlorophenol Pesticides from
Raw Milk”. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 21 (18): 2863-2871, 1998.
109- MENEZES, M.L.; FELIX, G. and DEMARCHI, A.C.C.O. “On-
Line Extration and Determination of Carbofuran in Raw Milk by Direct HPLC
Injection on na ISRP Column”. Chromatographia, 47 (1/2): 81-83, 1998.
110- ODA, Y.; ASAKAWA, N.; ABE, S.; YOSHIDA, Y. and SATO,
T. “Avidin Protein-Conjugated Column for Direct Injection Analysis of Drug
Referências Bibliográficas
238
Enantiomers in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography”. J.
Chromatogr. 572: 133-141, 1991.
111- TANAKA, H.; TAKAHASHI, K. and OHIRA, M.
“Characterization of Avidin-Bonded Column for Direct Injection in Reversed-
Phase High-Performance Liquid Chromatography”. J. Chromatogr. A, 869: 151-
157, 2000.
112- BOOS, K. S.; RUDOLPHI, A.; VIELHAUER, S.; WALFORT,
A.; LUBDA, D.; EISENBEIN, F. “Alkyl-diol silica (ADS): restricted access
precolumn packings for direct injection and coupled-column chromatography of
biofluids”. Fresenius J. Anal. Chem., 352: 684-690, 1995.
113- PERRY, J.A.; INVERGO, B.; WAGNER, H.; SZCZERBA, T.J.
and RATEIKE, J.D. “An Improved Internal-Surface Reversed-Phase”. J. Liq.
Chromatogr., 15: 3343-3352, 1992.
114- GLUNZ, I.J.; PERRY, J.A.; INVERGO, B.; WAGNER, H.;
SZCZERBA, T.J.; Rateike, J.D. and Glunz, P.W. “The Semipermeable Surface, A
New Restricted Access Medium”. J. Liq. Chromatogr., 15: 1361-1379, 1992.
115- OLIVEIRA, R. V. Métodos para a Análise de Antibióticos
Cefalosporínicos em Leite Bovino, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Multidimensional, com Injeção Direta de Amostras. São Carlos, Programa de Pós-
Graduação em Química-UFSCar, 2004. Tese de Doutorado, 35, 38 p.
116-
GISCH, D.J.; HUNTER, B.T. and FEIBUSH, B. “Shielded
Hydrophobic Phase: A New Concept for Direct Injection Analysis of Biological
Fluids by High-Performance Liquid Chromatography”. J. Chromatogr., 433: 264-
268, 1988.
117- FRIED, K. and WAINER, I.W. “Column-Switching Techniques
in the Biomedical Analysis of Stereoisomeric Drugs: Why, How and When”. J.
Chromatogr. B, 689: 91-104, 1997.
Referências Bibliográficas
239
118- CASSIANO, N. M.; CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G.;
WAINER, I. W. “Determination of the plasma levels of metyrapone and its
enantiomeric metyrapol metabolites by direct plasma injection and
multidimensional achiral-chiral chromatography”. Chirality, 14: 731-735, 2002.
119- CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G.; CASSIANO, N. M.;
PEDRAZOLLI Jr, J. “Enantiomeric determination of pantoprazole in human
plasma by multidimensional high-performance liquid chromatography”. Journal of
Chromatogr. B, 766: 153-160, 2002.
120- LIMA, V. V.; CASSIANO, N. M. & CASS, Q. B
“Desenvolvimento de Colunas Cromatográficas de Meios de Acesso Restrito
Proteína-Imobilizada e suas Avaliações para Análise de Fármacos com Injeção
Direta de Plasma Humano” Química Nova 29 (1): 72-78, 2006.
121- De PAULA, F.C.C.R.; De PIETRO, A.C.; CASS, Q.B.
“Simultaneous quantification of sulfamethoxazole and trimethoprim in whole egg
samples by column-switching high-performance liquid chromatography using
restricted access media column for on-line sample clean-up”. Journal of
Chromatography A, in press-DOI10.1016/j.chroma.2007.08.046, 2007.
122- BELAZ, K.R.A. Quantificação dos Metabólitos do Albendazol
em Plasma Bovino por Cromatografia Líquida Quiral de Alta Eficiência, com
Injeção Direta de Amostra.São Carlos, Programa de Pós-Graduação em Química-
UFSCar, 2007. Dissertação de Mestrado, 99 p.
123- PEREIRA, A. V., CASS, Q. B. “High-performance liquid
chromatograpfy method for the simultaneous determination of sulfamethozaxole
and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean up column” Journal of
Chromatography B, 826, 139-146, 2005.
124- SOUVERAIN, S., RUDAZ, S., VEUTHEY, J. L. “Restricted
Acess Materials and Large Particle Supoorts for On-Line Sample Preparation: an
Referências Bibliográficas
240
Attractive Approach for Biological Fluids Analysis” Journal of Chromatography
B, 801: 141-156, 2004.
125- MULLETT, W. M. “Determination of Drugs in Biological Fluids
by Direct Injection of Sample for Liquid-Chromatographic Analysis” Journal of
Biochemical and Biophysical Methods, 70: 263-273, 2007.
126- ANDERSON, D.J. “High-Performance Liquid Chromatography
in Clinical Analysis”. Anal. Chem., 71: 314R-327R, 1999.
127- FELIX, G.; CAMPÈSE, D. “Determination by HPLC of the
Chiral Conversion of Drugs in Biologic Fluids on New RAM-CHIRAL Columns”
30
th
Internacional Symposium & Exhibit on High Peformance Liquid Phase
Separations and Related Techiniques. San Francisco-CA-USA, 2006, p. 170.
128- GELPI, E. “Biomedical and biochemical applications of liquid
chromatography-mass spectrometry”. Journal of Chromatography A, 703: 59-80,
1995.
129- MAURER, H. H. “Liquid chromatography-mass spectrometry in
forensic and clinical toxicology”. Journal of Chromatography B, 713: 3-25, 1998.
130- NIESSEN, W. M. A. “State-of-the-art in liquid chromatography-
mass spectrometry”. Journal of Chromatography, 858: 179-197, 1999.
131- BRUINS, A. P. “Mechanistic aspects of electrospray ionization”.
Journal of Chromatography A, 794: 345-357, 1998.
132- TITATO, G. M. Desenvolvimento de Metodologia para a
Determinação de Pesticidas Selecionados em um Sistema de Cromatografia em
Fase Líquida Acoplado a Espectrometria de Massas (HPLC-MS): Comparação
entre ESI e APCI. São Carlos, Programa de Pós-Graduação em Química -
Universidade de São Paulo – Instituto de Química de São Carlos, 2004. Tese de
Doutorado em Ciências: Química Analítica, 47 p.
Referências Bibliográficas
241
133- MATUSZEWSKI, B. K. “Standard line slopes as a measure of a
relative matrix effect in quantitative HPLC–MS bioanalysis”. Journal of
Chromatography B, 830: 293-300, 2006.
134- FU, I.; WOOLF, E.J.; MATUSZEWSKI, B.K. “Effect of the
sample matrix on the determination of indinavir in human urine by HPLC with
turbo ion spray tandem mass spectrometric detection”. Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis, 18: 347–357, 1998.
135- LITTLE, J. L.; WEMPE, M.F.; BUCHANAN, C.M. “Liquid
chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry method development for
drug metabolism studies: Examining lipid matrix ionization effects in plasma”.
Journal of Chromatography B, 833: 219–230, 2006.
136- GEORGI, K.; BOOS, K. S. “Control of Matrix Effects in
Bioanalytical MS/MS using On-line Multidimensional Solid-Phase Extraction”.
LC-GC Eur., 17 (11a): 21-24, 2004.
137-
LANE, S.; BOUGHTFLOWER, B.; MUTTON, I.; PATERSON,
C.; FARRANT, D.; TAYLOR, N.; BLAXILL, Z.; CARMODY, C.; BORMAN, P.
“Toward Single-Calibrant Quantification in HPLC. A Comparison of Three
Detection Strategies: Evaporative Light Scattering, Chemiluminescent Nitrogen,
and Proton NMR”. Analytical Chemistry., 77: 4354-4365, 2005.
138- FRIES, H.E.; EVANS, C.A.; WARD, K.W. “Evaluation of
evaporative light scattering detection for metabolite quantification without
authentic analytical standards or radiolabel”. Journal of Chromatography B, 819:
339–344, 2005.
139- HERON, S.; MALOUMBI, M.G.; DREUX, M.; VERETTE, E.;
TCHAPLA, A. “Method development for a quantitative analysis performed without
any standard using na evaporative-scattering detector”. Journal of Chromatography
A, 1161: 152–156, 2007.
Referências Bibliográficas
242
140- HSY, B.H.; ORTON, E.; TANG, S.Y.; CARLTON, R.A.
“Application of evaporative light scattering detection to the characterization of
combinatorial and parallel synthesis libraries for pharmaceutical drug discovery”.
Journal of Chromatography B, 725: 103–112, 1999.
141- PORTER, R.S.; CHEN, T.K. “Chromatographic analysis of
mupirocin in polyethylene glycols 400 and 3350 using dual ultraviolet and
evaporative light scattering detection”. Journal of Chromatography A, 732: 399–
402, 1996.
142- BRADFORF, M.M. “A rapid and sensitive method for the
quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-
dye binding”. Anal. Biochem., 72: 248-254, 1976.
143- ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. “Determinação
de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos
existentes”. Quimica. Nova, 21 (6): 787-793, 1998.
144- COMPTON, S. J. & JONES, C. G. “Mechanism of dye response
and interference in the Bradford protein assay”. Anal. Biochem., 151: 369-374,
1985.
145- BORDIN, G.; RAPOSO, C, . F.; CALLE, B.; RODRIGUEZ, A.
R. “Identification and quantification of major bovine milk proteins by liquid
chromatography”. Journal of Chromatography, 928: 63-76, 2001.
146- SCHMDIT Jr., D. E.; GIESE, R. W.; CONRON, D.; KARGER,
B. L. “High performance liquid chromatography of proteins on a diol-bonded silica
gel stationary phase”. Anal. Chem., 52: 177-82, 1980.
147- DANSON, M. J.; HOUGH, D. W. “The structural basis of
protein halophilicity”. Comp. Biochem. Physiol., 117A: 307-12, 1997.
148- CASS, Q. B.; GOMES, R. F.; CALAFATTI, S. A.;
PEDRAZOLLI, J. “Determination of amoxycillin in human plasma by direct
Referências Bibliográficas
243
injection and coupled-column-high-performance liquid chromatography”. Journal
of Chromatography A., 978: 235-241, 2003.
149- LOUGH, W. J.; WAINER, I. W. “High Performance Liquid
Chromatography, Fundamental Principles and Practice”, 1
st
edition, Blackie
Academic & Professional, Glasgow, p. 52-75, 1995.
150- DIONEX. “Methods Development Using Ion-Pair
Chromatography with Suppressed Conductivity Detection”, Technical Note 12.
151- FRITZ, J. S. “Factors affecting selectivity in ion
chromatography”. Journal of Chromatography A, 1085: 8-17, 2005.
152- DAI, J.; CARR, P. W. “Role of ion pairing in anionic additive
effects on the separation of cationic drugs in reversed-phase liquid
chromatography”. Journal of Chromatography A, 1072: 169-184, 2005.
153- MIGUEL, I.; SAMAIN, D. “ Use of mixed perfluorinated ion-
pairing agents as solvents in ion-pair high-performance liquid chromatography for
the preparative purification of aminoglycoside antibiotics”. Journal of
Chromatography, 407: 109-119, 1987.
154- BRUIJNSVOORT, M. V.; OTTINK, S. J. M.; JONKER, K. M.;
BOER, E. “Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in milk and
honey by liquid chromatography with tandem mass spectrometry”. Journal of
chromatography A, 1058: 137-142, 2004.
155- ADAMS, E.; RAFIEE, M.; ROETS, E.; HOOGMARTENS, J.
“Liquid chromatographic analysis of streptomycin sulfate”. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 24: 219-226, 2000.
156- KAUFMANN, A.; BUTCHER, P.; KÖLBENER, P. “Trace level
quantification of streptomycin in honey in liquid chromatigraphy/tandem mass
spectrometry”. Rapid Communication in Mass Spectrometry, 17: 2575-2577, 2003.
Referências Bibliográficas
244
157- Anvisa. Resolução – RE nº 899 de maio de 2003. Guia para
validação de métodos analíticos e bioanalíticos.
158- CLAROT, I.; REGAZZETI, A.; AUZEIL, N.; LAADANI, F.;
CITTON, M.; NETTER, P.; NICOLAS, A. “Analysis of neomycin sulfate and
framycetin sulfate by high-performance liquid chromatography using evaporative
light scattering detection”. Journal of Chromatography A, 1087: 236-244, 2005.
159- The United States Pharmacopoeia and The National Formulary,
USP 23, NF 18, p. 702, 1995.
160- OERTEL, R.; NEUMEISTER, V.; KIRCH, W. “Hydrophilic
interaction chromatography combined with tandem-mass spectrometry to determine
six aminoglycosides in serum”. Journal of Chromatography A, 1058: 197-201,
2004.
161- OERTEL, R.; RENNER, U.; KIRCH, W. “Determination of
neomycin by LC-tandem mass spectrometry using hydrophilic interaction
chromatography”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35: 633-
638, 2004.
162- LOFFLER, D.; TERNES, T. A. “Analytical method for the
determination of aminoglycoside gentamicin in hospital wastewater via liquid
chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry”. Journal of
Chromatography A, 1000: 583-588, 2003.
163- ROGATSKY, E.; STEIN, D. “Evaluation of Matrix Effect and
Chromatography Efficiency: New Parameters for Validation of Method
Development”. J Am Soc Mass Spectrom, 16: 1757-1759, 2005.
164- LARGER, P. J.; BREDA, M.; FRAIER, D.; HUGHES, H.;
JAMES, C. A. “Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass
spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery
Referências Bibliográficas
245
bioanalysis”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 39: 206-216,
2005.
165- KOSTER, E.; RINGELING, P.; OOMS, B. “Denaturing Solid-
Phase Extraction for Reduced Protein Interference in Bioanalytical SPE-LC-MS”.
LC-GC Europe – the applicationsbook, Setembro de 2002.
166- HAGER, J. W., “Recent trends in mass spectrometer
development”. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378: 845-850, 2004.
167- ROZET, E.; CECCATO, A.; HUBERT, C.; ZIEMONS, E.;
OPREAN, R.; RUDAZ, S.; BOULANGER, B.; HUBERT, P. “Analysis of recent
pharmaceutical regulatory documents on analytical method validation”. Journal of
Chromatography A, 1158: 111-125, 2007.
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