( PDF ) Alterações neuropatológicas induzidas pelo tratamento neonatal com ferro e pelo envelhecimento em ratos e em camundongos transgênicos e suas implicações em processos neurodegenerativos

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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

Faculdade de Biociências

Liana Lisboa Fernandez

Alterações neuropatológicas induzidas

pelo tratamento neonatal com ferro e

pelo envelhecimento em ratos e em

camundongos transgênicos e suas

implicações em processos

neurodegenerativos

Porto Alegre

2009

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Liana Lisboa Fernandez

Alterações neuropatológicas induzidas pelo tratamento

neonatal com ferro e pelo envelhecimento em ratos e em

camundongos transgênicos e suas implicações em

processos neurodegenerativos

Tese apresentada como requisito para

obtenção do título de Doutor

pelo Programa de Pós-graduação

em Biologia Celular e Molecular

da Faculdade de Biociências da Pontifícia

Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

Orientadora: Dra. Nadja Schroder

Porto Alegre

2009

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AGRADECIMENTOS

À toda equipe do Laboratório de Pós Graduação de Patologia da

UFCSPA, especialmente a Professora Dra. Marilda Fernandes Cruz responsável

pelo laboratório, as técnicas Terezinha Stein e Rosauva Meurer pela dedicação

e apoio para conseguirmos os resultados desta pesquisa, realizada no Brasil.

À colega Mônica Fernandes Rosa de Lima pelo companheirismo na hora

do cafezinho.

À colega de Pós-Graduação Clívia Miwa pelo auxílio na realização deste

trabalho.

Aos graduandos de medicina da UFCSPA Luis Henrique Fornari e Malu

Viter pela colaboração na revisão do metabolismo de ferrro para realização do

artigo de Revisão Ferro e Neurodegeneração.

À Professora Dra Arlete Hilbig, colega de sonhos e realizações,

colaboradora fundamental para avaliação das imunoistoquímicas realizadas no

Brasil e especialmente amiga de momentos muito bons e muito ruins também.

À toda equipe do Laboratório de Biologia de Desenvolvimento do Sistema

Nervoso do Pós-Graduação de Biologia Molecular e Celular da PUCRS ,

especialmente a Maria Noêmia Martins de Lima, Felipe Scalco e Gustavo

Vedana responsáveis pelo tratamento e eutanasia dos animais no Brasil.

À secretária do Pós-Graduação de Biologia Molecular e Celular da

PUCRS Catia de Oliveira Bonacina pela competência e incansável dedicação

na solução de todos os problemas administrativos durante estes quase quatro

anos, especialmente para que meu estágio no exterior com apoio da CAPES

pudesse ser realizado.

À Professora Dra Nadja Schroder, minha orientadora, pela presença

constante, pelas idéias, discussões e por ter dado uma chance a Histologia e

principalmente por ter acreditado em mim.

À colaboração dos Drs Manuel Portero-Otin, Alba Naudi, Reinald

Pamplona do Departamento de Medicina Experimental de Lerida na Espanha

pelos resultados de Espectoscopia de Massas.

À toda equipe do Laboratório de Neuropatologia do Hospital Bellvigte em

Barcelona, especialmente a Marga Carmona, mi amiga y maestra em

Imunohistoquímica, Gabriel Santpere e Gerard Muntané, mis maestros em

western blotting . A todos: Núria, Laia, Ester, Ana, Ana Martinez, Ana Janue,

Sandra, Beatrice, Marta, Salvador que me receberam e tornaram-se meus

amigos catalanes.

Ao Professor Dr. Isidro Ferrer pelo carinho, entusiasmo com que me

recebeu em seu Laboratório e pela competência dedicada a suas investigações

transformando meu estágio em Barcelona rico em descobertas e em emoções

ao desbravar o conhecimento.

A meus pais por terem sempre apoiado incondicionalmente minha

curiosidade.

Ao Glênio por ter arriscado seus empregos e ter aceitado me acompanhar

e também crescer como pessoa e profissionalmente no período que passamos

em Barcelona.

À Gabriela por ter deixado o Lucas e o verão brasileiro para descobrir que

se pode também ter prazer nas Ramblas, na Barceloneta, na Sagrada Família,

no parque Guel e especialmente no Corte Inglês.

Ao Rafael que mesmo do outro lado do mundo esteve sempre próximo

compartilhando suas descobertas num doutorado de vida.

RESUMO

O presente estudo foi planejado para investigar alterações neuropatológicas em

ratos adultos e velhos, e em camundongos trangênicos APP/PS1 submetidos à

administração de ferro suplementar num período crítico pós-natal, com o objetivo

de estudar a contribuição de fatores de risco ambientais e genéticos na

patogênese de doenças neurodegenerativas. Nenhuma diferença significativa foi

vista na abundância das proteínas β-amilóide, tau fosforilada e na α-sinucleína,

analisados por IHC no encéfalo, quando ratos tratados com ferro e sem ferro são

comparados. Aumento de astrocitose, detectada por densitometria de astrócitos

imunoreativos marcados por GFAP, foi encontrado em ratos velhos (24 meses)

tratados com ferro na substância negra e estriado e no hipocampo de ratos

adultos (3 meses) tratados com ferro quando comparados com controles

pareados por idade. Nenhuma modificação nas placas de β-amilóide foram

vistas em camundongos trangênicos APP/PS1 tratados e não tratados.

Nenhuma diferença na reação microglial foi observada quando comparados os 4

grupos: trangênicos com ferro (TgFe),transgênicos com sorbitol (TgSb), wild type

com ferro (WtFe), wild type com sorbitol (WtSb). Ainda, aumento em astrocitose,

revelado por densitometria de astrócitos reativos marcados por GFAP, e

aumento de níveis de expressão de GFAP, revelados por western blotting,

foram encontrados em camundongos tratados com ferro (tanto Tg como Wt)

quando comparados com TgSb e WtSb. Este aumento foi acompanhado por

alterações significativas na composição de ácidos graxos no cérebro de

camundongos APP/PS1 que levaram à diminuição do índice de capacidade

peroxidativa de membrana e redução do dano oxidativo protéico. Os presentes

achados claramente documentam que o excesso de ferro durante o período

neonatal impacta na composição celular e molecular de cérebros de ratos

adultos e velhos e de camundongos trangênicos APP/PS1. Estas observações

podem encorajar mais estudos focados nos efeitos de suplementações na dieta

de crianças.

ABSTRACT

The present study was aimed to investigate neuropathological changes in adult

and old rats, and in APP/PS1 transgenic mice subjected to supplementary iron

administration in a critical postnatal period in order to study the contribution of

environmental and genetic risk factors to the pathogenesis of neurodegenerative

disorders. No significant differences in abundance of proteins β-amyloid,

phosphorylated tau and α-synuclein analysed by IHC in brain were seen, when

treated and non-treated rats were compared. Increased astrocytosis, revealed by

densitometry of immnoreactive astrocytes marcked with GFAP, was found in old

(24 months) treated rats in substantia nigra and striatum and in the hippocampus

of adult (3 months) treated rats when compared to age-matching controls. No

modifications in β-amyloid burden were seen in treated and non-treated

APP/PS1 mice. No differences in microglial reactions were observed when

comparing the four groups of mice: transgenic with iron (TgFe), transgenic with

sorbitol (TgSb), wild type with iron (WtFe) and wild type with sorbitol (WtSb). Yet

increased astrocytosis, as revealed by densitometry of immnoreactive astrocytes

marcked with GFAP, and increased expression levels of GFAP, as revealed by

western blotting, were found in iron-treated mice (both Tg and Wt) when

compared with TgSb and WtSb. This was accompanied by significant changes

in brain fatty acid composition in APP/PS1 mice that lead to a lower membrane

peroxidizability index and to reduced protein oxidative damage. The present

findings clearly document that excess of iron during the neonatal period impacts

in the cellular and molecular composition of the adult and old brain rats and

APP/PS1 trangenic mice. These observations may encourage further studies

focused on the effects of dietary supplementations in children.

LISTAS DE ABREVIATURAS

AASA: Ácido aminoadípico

ACL: Comprimento de cadeia média

APOE: Apolipoproteína E

APP/PS1: Proteína Precursora do Amilóide/ Presenilina 1

APP: Proteína Precursora do Amilóide

Aβ: Peptídeo beta-amilóide

BHE: Barreira Hemato-Encefálica

BHL: Barreira Hemato-Liquórica

CEL: Carboxietillisina

CL: Corpos de Lewy

CML: Carboximetillisina

DA ou AD: Doença de Alzheimer

DAB: Tetrahidroclorito diaminobenzidina

DBI: Índice de ligação dupla

DMT-1: Transportador Divalente de Metal 1

DP ou PD: Doença de Parkinson

ENF: Emaranhados Neurofibrilares

Fe: Ferro

FEEPS: Fundação Estadual de Pesquisa e Produção em Saúde

Fr: Ferritina

GC/MC: Cromatografia a gás/ espectroscopia de massas

GFAP: Proteína Ácida fibrilar da Glia

GSA : Glutationa sulfonamida- ácido glutâmico

Hfe: Proteína de Hemocromatose Hereditária

Hs: Hemossiderina

IHC: Imunohistoquímica

IL1, IL6, IL8: Interleucinas 1,6 e 8

IREs: Elementos Reguladores do Ferro

IRPs: Proteínas Reguladoras do Ferro

MDAL: Malondialdehidolisina

MUFA: Ácidos Graxos Monoinsaturados

PBS: Solução tampão fosfato

PI: Índice de capacidade peroxidativa

PS: Placas senis

PUFA: Ácidos Graxos Polinsaturados

RL: Radicais Livres

ROS: Espécies Reativas de Oxigênio

Sb: Sorbitol

SBNeC: Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento

SFA: Ácidos Graxos Saturados

SN: Substância Negra

SNC: Sistema Nervoso Central

Tf: Transferrina

TfR: Recpeptor de Transferrina

Tg: Transgênico

UFA: Ácidos Graxos Insaturados

Wt: Wild type, selvagem

SUMÁRIO

Capítulo 1.......................................................................................... 10

1. Introdução

2. Objetivos

Capítulo 2......................................................................................... 21

Artigo científico 1: Ferro e neurodegeneração / Iron and neurodegeneration

Publicado na revista Scientia Medica, Porto Alegre, v. 17, n. 4, p. 2

Capítulo 3.......................................................................................... 41

Artigo científico 2: Neuropathological changes following iron administration in adult

and old rats (manuscrito em preparação)

Capítulo 4………………………………………………………………. 61

Artigo científico 3: Effects of increased iron intake during the neonatal period on

the brain of adult APP/PS1 transgenic mice (submetido ao Journal of Alzheimer’s

Disease)

Considerações finais……………………………………………........ 88

Conclusões………………………………………………………......... 92

Referências Bibliográficas................................................................ 95

Anexo I (Comprovante de Submissão do Artigo Científico do Capítulo

3)..................................................................................................... 103

CAPÍTULO 1:

1. INTRODUÇÃO

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. INTRODUÇÃO

Com o aumento da expectativa de vida, têm crescido o número de

indivíduos idosos e conseqüentemente a prevalência de doenças associadas ao

envelhecimento, como as doenças neurodegenerativas (ARKING, 1998).

Uma tendência atual é relacionar as enfermidades neurodegenerativas

com alterações em proteínas específicas, as quais se acumulam em regiões

específicas no SNC, conforme mostrado na Figura 1, porque são sintetizadas de

forma anômala, encontram-se em excesso, mudam sua conformação ou têm

dificuldades para serem eliminadas (PRUSINER, 2001).

FIG.1 Localização anatômica macroscópica e microscópica das alterações características das

doenças neurodegenerativas (BERTRAM, 2005).

Estes agregados protéicos estão presentes também em cérebros de

idosos normais, porém em menor quantidade do que em indivíduos com

doenças neurodegenerativas (KELLER, 2004). O entendimento da fisiologia

destas proteínas, e dos mecanismos que as levam a se acumular formando

agregados, poderão contribuir para o entendimento da fisiologia do

envelhecimento e a fisiopatologia das doenças neurodegenerativas.

Uma forma especializada de agregado protéico intracelular

frequentemente observada durante o envelhecimento normal é conhecida como

lipofuscina. A análise bioquímica revela que a lipofuscina é um complexo

dinâmico de agregação protéica intracelular composta primariamente de

proteína e lipídio com vestígios de carboidratos e metais (KELLER, 2004). Com

o tempo, este grânulo se acumula em células de vida longa sendo conhecido

como um marcador do envelhecimento celular. Sabe-se que células pós-

mitóticas como os neurônios exibem acúmulo de lipofuscina relacionado à idade

(KELLER, 2004). O grau de acúmulo de lipofuscina nas camadas e áreas

corticais representa o curso oposto da mielinização cortical: neurônios de

projeção muito mielinizados e camadas densamente mielinizadas possuem

muito poucos grânulos de lipofuscina enquanto àqueles mielinizados por último

no mesocórtex temporal são os mais ricamente pigmentados do córtex humano

(KELLER, 2004)

As alterações neuropatológicas características da Demência de Alzheimer

(DA) são: placas de amilóide extracelulares ou placas senis (PS) (Figura 2) e os

emaranhados neurofibrilares (ENF) de proteína tau hiperfosforilada. A PS

contém um pequeno e tóxico produto Aβ40 e/ou o Aβ42 resultado da clivagem

da proteína precursora do amilóide (APP) pela rota da β-secretase (BOSSY-

WETZEL, 2004; SELKOE, 2004).

A DA é a principal causa de demência e é uma patologia multifatorial

resultado da interação de fatores genéticos e ambientais (BOSSY-WETZEL,

2004; SELKOE, 2004; PRINCE, 1998; BLENNOW, 2006).

A DA familial é uma doença muito rara, de início precoce causada por

mutações na Proteína Precursora do Amilóide (APP) ou de genes da Presenilina

(PS1, PS2) ambas ligadas ao metabolismo do Aβ. Por outro lado a DA

esporádica é muito comum e sua causa desconhecida, provavelmente porque é

uma doença heterogênea causada pelo envelhecimento associado a interações

genéticas (polimorfismo gene APOE) e fatores de risco ambientais

(BERTRAM,2005; FERNANDEZ, 2005; BOLCHELT,1996).

FIG.2 Placa Senil: imunohistoquímica (IHC) para β-amilóide (FERNANDEZ, 1997).

Na Doença de Parkinson (DP) observam-se níveis elevados de

agregados de α-sinucleína, uma proteína encontrada na membrana das

vesículas do terminal pré-sináptico, com função desconhecida, formando os

Corpos de Lewy (CL) quando acumula-se na forma de inclusões citoplasmáticas,

por provável sobrecarga do sistema ubiquitina-proteossoma (MOORE, 2005).

É interessante observar que os neurônios mais finos, longos, e pouco

mielinizados são os mais suscetíveis à DA e DP. Estes neurônios vulneráveis

apresentam agregados de proteína tau ou de α-sinucleína na proximidade de

grânulos de lipofuscina (KELLER, 2004; BRAAK 2006; SCHULTZ, 2004).

O estresse oxidativo tem sido considerado um dos principais mediadores

do declínio progressivo da função celular observada no envelhecimento normal.

O aumento dos níveis de ácidos nucléicos, lipídios e proteínas oxidadas

encontrados no envelhecimento causam a inibição ou dano enzimático múltiplo,

levando a alterações na síntese de proteínas, produção de energia, dinâmica do

citoesqueleto e transdução de sinal, funções fundamentais das células

(KELLER, 2004).

A oxidação protéica também aumenta a agregabilidade de moléculas,

alterando seu formato e seu índice de degradação, diminuindo o turnover de

proteínas específicas, determinando interações entre proteínas, formando os

agregados protéicos. Estes agregados alteram o tráfego intracelular e

sobrecarregam as vias proteolíticas proteossomal e lisossomal (KELLER, 2004).

Acredita-se que o aumento dos níveis de oxidação protéica tem

importante papel na agregação da proteína tau e da α-sinucleína tanto pela ação

direta das espécies reativas de oxigênio (ROS) como indireta pela inibição da

atividade proteossômica induzida por ROS (KELLER, 2004).

O ferro é o metal mais abundante do cérebro. Ele participa dos principais

processos neuronais, incluindo síntese de neurotransmissores e mielinização

dos axônios (QUINTANA, 2006).

O ferro em sua forma ferrosa é quimicamente uma fonte irrefutável de

estresse oxidativo porque ele é capaz de catalizar a formação de radicais livres

via reação de Fenton (QUINTANA, 2006; ZECCA, 2004).

Concentrações de ferro cerebral não são estáticas; elas aumentam com a

idade e em várias doenças e diminuem quando o ferro é deficiente na dieta

(PINERO, 2000). A concentração de ferro no cérebro é muito baixa no primeiro

ano de vida e grande quantidade deste metal é necessária durante o

desenvolvimento cerebral especialmente durante a mielinogênese onde é

encontrado em altos níveis nos oligodendrócitos (FALANGOLA, 2005; ZHANG,

2005). Os oligodendrócitos são as células cerebrais que mais contêm ferro

(BARTZOKIS, 2007). A concentração de ferro adquirida até os 20 anos é

mantida para o resto da vida do indivíduo (ZECCA, 2004).

O aumento do ferro cerebral com a idade ocorre em concentrações

diferentes, em diferentes regiões do Sistema Nervoso Central (SNC). As maiores

concentrações de ferro no encéfalo humano adulto são encontradas nos núcleos

da base especificamente no globo pálido, no núcleo rubro e na substância negra

(SN) (QUINTANA, 2006; FALANGOLA, 2005; GAASCH, 2007).

Em cérebros normais, o ferro não é tóxico apesar de seus altos níveis,

provavelmente devido a mecanismos homeostáticos eficientes (FALANGOLA,

2005; CASTELLANI, 2007).

A ferritina é a principal molécula responsável pelo estoque de ferro não

tóxico no cérebro. Observa-se um aumento da H-ferritina até os 20 anos e da L-

ferritina durante o envelhecimento normal o que pode indicar um mecanismo

citoprotetor, seqüestrando o ferro livre e gerando complexos estáveis de ferro

solúvel (Fe

), protegendo as células do dano oxidativo causado pelo ferro livre

(Fe

) (ZECCA, 2004; QUINTANA, 2006; GAASCH, 2007). A Hemossiderina

armazena ferro na sua forma insolúvel (PRINCE, 1998). Um excesso de ferro

intracelular pode ser encontrado no reservatório de ferro lábil, forma muito mais

transitória (GAASCH, 2007). A ferritina é encontrada no SNC no citoplasma e

núcleos dos oligodendrócitos. Portanto a ferritina é particularmente abundante

em axônios mielinizados, aqueles pouco comprometidos pela DA. Disfunção na

ferritina (com eventual degradação à hemossiderina) poderia resultar num

aumento de íons ferrosos tóxicos, levando a uma produção de radicais livres que

induziriam tanto ao estresse oxidativo quanto o dano de mielina relacionado à

idade e ao declínio cognitivo na DA (QUINTANA, 2006).

A neuromelanina é o principal local de estoque de ferro em neurônios da

SN em indivíduos normais e é responsável por 10-20% do conteúdo total de

ferro do sistema nervoso. É um pigmento completamente ausente no primeiro

ano de vida aumentando continuamente até o fim da vida. (ZECCA, 2004).Tem

uma forte afinidade pelo ferro e outros metais apresentando provavelmente um

papel protetor contra o acúmulo de ferro intraneuronal. A síntese da

neuromelanina depende aparentemente da concentração citosólica da

dopamina, porque um produto da oxidação da dopamina é seu precursor.

(ZECCA, 2004). Portanto, a síntese da neuromelanina protege contra a

toxicidade da dopamina, prevenindo seu acúmulo citoplasmático (ZECCA, 2004;

RIEDERER, 2004).

A existência de uma relação tem sido sugerida entre disfunções nas vias

de manutenção da homeostasia do ferro, principalmente nas regiões onde seu

metabolismo é mais alto, e a patogênese de doenças neurodegenerativas

(BENKOVIC, 1993; MARTIN, 1998; QUIAN, 2001). Estudos demonstram a

elevação da concentração de ferro na SN de portadores de DP (DEXTER, 1991;

JELLINGER, 1993; FAUCHEUX, 1993; KIENZI, 1995; EBALDI, 1996;

GRFFITHS, 1999)

e ao redor das PS de pacientes com DA (LYNCH, 2000;

RIEDERER, 2004).

Sabe-se que a perda da neuromelanina da SN é um marcador

neuropatológico da DP (FASANO, 2003). Evidências histológicas demonstram

que os neurônios mais pigmentados são os primeiros a degenerarem (FASANO,

2006).

O papel do ferro, da neuromelanina e da ferritina na patogênese da DP

não são claros, porém um déficit no acúmulo de ferro pela neuromelanina e da

capacidade de estocá-lo pela ferritina pode indicar uma migração progressiva do

ferro de seus estoques para o citosol, contribuindo para neurodegeneração

(ZECCA, 2004; FASANO, 2006).

A barreira hemato-encefálica e hemato-liquórica controlam a captação de

ferro para o cérebro, através da regulação da expressão de proteínas receptoras

de transporte, como a expressão de receptor da transferrina no endotélio e

células do plexo coróide (RIEDERER, 2004). O aumento significativo do ferro no

sistema nervoso de pacientes com DP pode estar relacionado também com uma

alteração na barreira hematoencefálica (RIEDERER, 2004).

Também foi descrita que a neurodegeneração do sistema nervoso

induzida por inibidores de proteossoma pode ser prevenida por quelantes de

ferro (ZHANG, 2005).

Sabe-se que o Aβ liga-se com Cu

, Fe

e Zn

e esta ligação com metais

induz a uma alteração da conformação do Aβ tipo

-sheet, resultando num

aumento da agregabilidade (BOSSY-WETZEL, 2004).

Acredita-se que o Aβ pode mediar efeitos danosos às células ligando-se a

esses metais que geram reações de redução e oxidação, liberando radicais

livres (BOSSY-WETZEL, 2004). A análise dos dados disponíveis indica que o Aβ

possui propriedades de uma apolipoproteína ligante de metais que influencia o

transporte e metabolismo lipídico (KONTUSH, 2004). Como o fragmento Aβ tem

uma alta afinidade por ligar-se a metais iônicos, ferro e cobre livre ligar-se-iam

rapidamente no Aβ solúvel e o complexo Aβ-metal formaria agregados que

estimulariam uma resposta inflamatória da microglia levando a fagocitose destes

complexos. Portanto, as ligações dos metais com Aβ pode ser um mecanismo

de remoção dos íons metálicos do espaço extracelular e de eliminação dos

mesmos do cérebro. Isto sugere que o Aβ pode ajudar a limitar a toxicidade de

metais, auxiliando mecanismos antioxidantes cerebrais. Caso este complexo

não seja eliminado, então formaria o centro da placa, agregando com o tempo

mais Aβ (BISHOP, 2004).

O envolvimento direto do ferro na formação da placa senil também induz,

além da ativação da micróglia, a ativação de astrócitos reativos, levando à

síntese de várias citocinas (IL-1, IL-6, IL-8) que ativam os macrófagos a produzir

grande quantidade de ROS. A ativação da micróglia também libera ferro da

ferritina de uma maneira dependente de superóxido, resultando em oxidação

lipídica. (CASTELLANI, 2007).

Os emaranhados neurofibrilares são outro sítio de acúmulo de ferro

(CASTELLANI, 2007). O Fe

é essencial para induzir agregação da proteína tau

hiperfosforilada, levando à formação de emaranhados neurofibrilares

(YAMAMOTO, 2002). Além disso, o Aβ induz a desregulação de

cinases/fosfatases associadas com a hiperfosforilação da tau, constituindo uma

via crítica para neurodegeneração (EGAÑA, 2003).

Por isso diversas pesquisas

com quelantes de metais têm sido realizadas em busca de novas terapias para

DA (FINEFROCK, 2003; WHITE, 2006; HUANG, 2004).

Fredriksson (1999), e Schroder (2001), utilizando camundongos e ratos,

descreveram pela primeira vez que o tratamento sistêmico com ferro durante o

período de rápido desenvolvimento cerebral (nos humanos este período equivale

ao último trimestre da gestação até o primeiro ano de vida) produz acúmulo

seletivo de ferro nos gânglios da base, além de causar disfunções

neurocomportamentais. Ratos e camundongos tratados com ferro do 10

ao 12

dia de vida pós-natal apresentam hipoatividade motora, bem como déficits no

aprendizado e memória em duas tarefas comportamentais, o labirinto radial de

oito braços e a esquiva inibitória (FREDRIKSSON, 1999; FREDRIKSSON, 2000;

SCHRODER, 2001). Subsequentemente, diversos estudos realizados em nosso

laboratório demonstraram que o tratamento com ferro no período neonatal

também produz prejuízos em memória de reconhecimento (DE LIMA, 2004,

2005a).

Este modelo animal foi útil na demonstração do efeito neuroprotetor da

selegilina (inibidor da monoaminooxidase B), rolipram (inibidor fosfodiesterase) e

desferoxamina (quelante de ferro) com reversão dos déficits cognitivos (DE

LIMA, 2004; 2007, 2008, 2005b).

O camundongo transgênico PS1/APP é um modelo de patologia da DA,

superexpressando ambos genes mutantes APP e PS1, demonstrando

precocemente (aos 6 meses) extensa deposição de amilóide (BOLCHELT, 1996;

SCHEUNER, 1996; MC GOWAN, 1999). Este animal transgênico é usado para

compreender o desenvolvimento das alterações neuropatológicas da DA.

É evidente o impacto do conteúdo de ferro na dieta alimentar sobre o

metabolismo desse metal no sistema nervoso central. Como o período neonatal

é crítico para o estabelecimento do conteúdo de ferro cerebral nos adultos,

torna-se importante estudar os possíveis efeitos tóxicos da sobrecarga desse

metal nessa fase, suas conseqüências no envelhecimento e possíveis

associações com a fisiopatologia de doenças neurodegenerativas.

Por isso este trabalho se propõe a contribuir na elucidação do papel do

ferro como agente indutor da agregação protéica encontrada nas diversas

desordens neurodegenerativas e no próprio envelhecimento normal.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar as alterações neuropatológicas induzidas pelo tratamento neonatal

com ferro e pelo envelhecimento em ratos e em camundongos transgênicos.

2.2 Objetivos Específicos

• Avaliar a presença de proteína tau hiperfosforilada em ratos

tratados com ferro neonatal comparados com ratos controles na

fase adulta (3 meses) e no envelhecimento (24 meses) através de

IHC;

• Avaliar a presença de beta-amilóide em ratos tratados com ferro

neonatal comparados com ratos controles na fase adulta (3 meses)

e no envelhecimento (24 meses) através de IHC;

• Avaliar a presença de alfa-sinucleína em ratos tratados com ferro

neonatal comparados com ratos controles na fase adulta (3 meses)

e no envelhecimento (24 meses) através IHC;

• Avaliar a presença de GFAP em ratos tratados com ferro neonatal

comparados com ratos controles na fase adulta (3 meses) e no

envelhecimento (24 meses) através IHC;

• Avaliar a presença de β-amilóide e microglia em camundongos

transgênicos e selvagens tratados com ferro neonatal comparados

com camundongos trangênicos APP/PS1 e selvagens controles na

fase adulta (6 meses) através IHC;

• Avaliar a presença de GFAP em camundongos transgênicos

APP/PS1 e selvagens tratados com ferro neonatal comparados

com camundongos trangênicos e selvagens controles na fase

adulta (6 meses) através de IHC e WB;

• Avaliar a distribuição de lipídios e concentração de marcadores de

estresse oxidativo nos camundongos transgênicos APP/PS1

tratados com ferro comparados com os tratados com sorbitol,

através de espectroscopia de massas.

CAPÍTULO 2

ARTIGO

TÍTULO: Ferro e neurodegeneração / Iron and neurodegeneration

REVISTA: SCIENTIA MEDICA,2007;17( 4): 218-224.

Ferro e Neurodegeneração

Iron and neurodegeneration

Liana L. Fernandez

, Luis Henrique T. Fornari

, Malu Viter

, Nadja Schroder

Doutoranda

Biologia Celular e Molecular PUCRS, Prof. Assistente FFFCMPA,

Coordenadora do Ambulatório de Demências da Santa Casa de Misericórdia de

porto Alegre.

Acadêmicos Medicina FFFCMPA

Doutora, Prof. Pós-graduação Biologia Celular e Molecular PUCRS

Liana Lisboa Fernandez, Cel. Bordini, 675/204

Fone/Fax:33325983, [email protected]

RESUMO:

O ferro tem tido um papel importante na participação dos mecanismos da

neurodegeneração. Esta revisão tem por objetivo abordar aspectos do seu

metabolismo: absorção, transporte e estoque; sua participação no estresse

oxidativo; e, por fim, hipóteses de sua participação nas doenças

neurodegenerativas mais freqüentes: Demência de Alzheimer (DA) e Doença de

Parkinson (DP). Foram utilizados artigos de revisão e originais acessados pelo

Pubmed e Scopus, dos últimos sete anos, assim como livros textos. Foram

excluídos artigos que o principal enfoque era o uso de drogas e mutações

genéticas relacionadas com metais. Concluiu-se que o desequilíbrio na

homeostase do ferro, aumentando o estresse oxidativo é uma via importante em

relação à patogênese da neurodegeneração. Torna-se fundamental o

esclarecimento se estas alterações são causa ou conseqüência do processo

neurodegenerativo.

DESCRITORES: ferro, neurodegeneração, estresse oxidativo, Demência de

Alzheimer, Doença de Parkinson

ABSTRACT:

Aims: Increasing evidence has indicated that iron plays an important role in the

pathogenesis of neurodegenerative disorders. The aim of this article is to review

aspects related to iron absortion, transport and storage in the human body.

Additionally, the role of iron in oxidative stress in the central nervous system, and

its implications to prevalent neurodegenerative disorders, with special reference

to Alzheimer’s dementia and Parkinson’s disease are discussed. Data source: A

systematic review of all published

English literature was conducted on Medline, Ovid, and Scopus, from January

2000 through September 2007. Textbooks were used as well. Studies focusing

mainly on pharmacological therapies and metal-related genetic

mutations were not included. Summary of the findings: This article review the iron

metabolism like absorption, transport and storage, and its

influence in oxidative stress and in the most important neurodegenerative

disorders, Alzheimer’s dementia and Parkinson disease. Conclusions: The

reviewed literature strongly suggests that iron-induced oxidative stress is a

central pathway in the pathogenesis of neurodegenerative disorders. These data

warrant further investigation in order to clarify whether disruption in iron

homeostasis plays a causative role or is a consequence of the

neurodegenerative process.

KEYWORDS: iron/metabolism; nerve degeneration; oxidative stress; Alzheimer

disease; Parkinson disease.

Scientia Medica, Porto Alegre, v. 17, n. 4, p. 2

INTRODUÇÃO:

O ferro tem sido descrito como um elemento importante na participação

dos mecanismos da neurodegeneração. O entendimento do seu metabolismo e

das disfunções relacionadas ao estresse oxidativo é fundamental para

desvendar a patofisiologia de doenças neurodegenerativas, como DP e DA,

cada vez mais prevalentes no nosso meio devido ao aumento da expectativa de

vida.

MATERIAL e MÉTODOS:

A revisão foi feita utilizando-se livros textos, artigos de revisão e originais

retirados do Pubmed e Scopus sobre o assunto: iron, neurodegeneration

process, Alzheimer, Parkinson, nos últimos sete anos. Excluíram-se artigos que

enfocavam principalmente drogas, como quelantes de metais, e mutações

genéticas relacionadas com acúmulo de ferro. Utilizou-se livros textos com

enfoque no metabolismo do ferro e estresse oxidativo. A revisão concentrou-se

na fisiologia do metabolismo do ferro, estresse oxidativo e possíveis alterações

relacionadas às patologias neurodegenerativas: DP e DA.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

ABSORÇÃO, TRANSPORTE, ESTOQUE DO FERRO E ACESSO AO SISTEMA

NERVOSO CENTRAL (SNC)

São três as proteínas que medeiam a distribuição e o transporte de ferro:

Transferrina (Tf), Receptor de Transferrina (TfR) e Ferritina (Fr). A Tf conduz

ferro para os tecidos que possuem TfR. A maior parte dos íons férricos ligados à

Tf provém da degradação da hemoglobina de eritrócitos velhos; este processo é

realizado pelos macrófagos do sistema reticuloendotelial (baço, fígado, medula

óssea) e proporciona uma reciclagem de ferro. Pouco ferro ligado à Tf é

proveniente da alimentação (1%). Fr e hemossiderina (Hs) são exemplos de

proteínas com função de armazenamento de ferro intracelular. A Fr é composta

por uma concha protéica externa (apoferritina - a qual contém de 4000 a 5000

íons férricos) e por um núcleo hidroxifosfato de ferro; a Hs provém da digestão

lisossomal de agregados de moléculas de Fr

As proteínas reguladoras do ferro (IRPs) percebem as concentrações de

ferro intracelular e participam da manutenção da sua homeostase. Estas IRPs

(IRP1 e IRP2) ligam-se a elementos reguladores do ferro (IREs) presentes nos

mRNAs que codificam proteínas envolvidas com o metabolismo do ferro

controlando suas traduções. O TfR e a Fr são dois alvos importantes das IRPs e

são responsáveis pela captação e estoque do ferro celular respectivamente

Fig.1.

A absorção do ferro ocorre no duodeno, preferencialmente a partir

do ferro reduzido. A quantidade de ferro absorvida é regulada conforme as

necessidades do organismo através de mudanças na expressão de DMT-1

(transportador divalente de metal 1) envolvido na captação de ferro da luz

intestinal através das microvilosidades e, de ferroportina (transportador de ferro

que controla a saída de ferro da célula para o plasma portal), conforme a

concentração de ferro nos enterócitos vilosos das criptas intestinais. Tais

enterócitos possuem TfRs associados à proteína Hfe (proteína da

hemocromatose hereditária) na sua superfície basal

. A Hfe normal interage com

TfR, atenuando sua capacidade de mediar a entrega do ferro para o interior da

célula

A expressão do DMT-1 é controlada da mesma forma que o TfR. Fig1 Na

deficiência de ferro, a Tr (baixo índice de saturação) fornece pouco ferro aos

enterócitos vilosos das criptas intestinais. Aumenta a síntese de DMT-1 e a sua

conseqüente expressão nas microvilosidades intestinais. Embora não haja

evidências experimentais de que os níveis de ferroportina aumentem durante a

deficiência de ferro, supõe-se que um mecanismo análogo envolvendo IRP/IRE

ocorra e culmine no aumento da expressão de ferroportina. Os aumentos nas

concentrações de DMT-1 e ferroportina resultam num aumento da transferência

de ferro do enterócito para o sangue portal

. Fig.2

A principal causa da deficiência de ferro, caracterizada pela perda progressiva

dos estoques de Fr e Hs, é a perda crônica de sangue. O baixo padrão de

saturação da Tr está relacionado à deficiência na síntese de hemoglobina e

conseqüente anemia ferropênica (hipocrômica e microcítica)

. A deficiência de

ferro também tem sido descrita como tendo papel na patofisiologia da síndrome

das pernas inquietas

Uma das principais causas da sobrecarga de ferro é o aumento da absorção

intestinal, o que predispõe a uma deposição nociva de ferro tissular. Na

Hemocromatose Hereditária, há absorção exacerbada de ferro, em função da

mutação na proteína Hfe. As concentrações intracelulares de ferro nos

enterócitos permanecem baixas, o que determina a absorção contínua de ferro

Em relação aos tecidos (especialmente fígado, coração, glândula pituitária e

cérebro) ocorre um excesso de seqüestro de ferro. A Hemocromatose tem sido

descrita como fator de risco para DP e DA

Concentrações de ferro cerebral não são estáticas; elas aumentam com a idade

e em várias doenças e diminuem quando o ferro é deficiente na dieta

. Pinero. O

aumento do ferro cerebral com a idade ocorre em concentrações diferentes, em

diferentes regiões do SNC. As maiores concentrações de ferro no encéfalo

humano adulto são encontradas nos núcleos da base especificamente no globo

pálido, no núcleo rubro e na substância negra

5,6,7

. O ferro também está presente

na substância branca, especialmente durante o desenvolvimento cerebral, onde

é encontrado em altos níveis nos oligodendrócitos para formação de mielina

5,8

barreira hemato-encefálica (BHE) e a barreira hemato-liquórica (BHL) controlam

a captação do ferro para dentro de cérebro pela regulação da expressão de

receptores de proteínas de transporte, tais como TfR no endotélio e em células

do plexo coróide

5,9,10,11

Para manter a homeostase do ferro no SNC, o sistema

IRP/IRE regula a expressão de Fr e TfR

2,9

. O ferro ligado a Tf da circulação

sistêmica é endocitado pelas células endoteliais cerebrais na sua forma férrica

(Fe+3)

. No endossoma é convertido a sua forma ferrosa (Fe+2) na presença

do pH ácido. É transportado ao citossol através da DMT-1 aumentando sua

concentração no reservatório de Fe+2 lábil

2,7

. Daí o ferro pode ativar o sistema

IRP/IRE; ser sequestrado por chaperonas ou proteínas de estoque (Fr,

neuromelanina, Hs, metalotioninas, frataxina); ser reoxidado a Fe+3 e ser

exportado da célula via ceruloplasmina/IRG ou ferroportina; participar de

reações catalizadas por ferro gerando espécies reativas de oxigênio (ROS)

2,7,9,10

. Ferro não ligado a Tf é encontrado dentro do cérebro, no fluído

extracelular, sugerindo que neurônios e outras células do cérebro podem

potencialmente capturar ferro de uma forma livre de Tf, como por exemplo

DMT1, receptor de lactoferrina (neurônios) e ceruloplasmina

7,11

Em cérebros normais, o ferro não é tóxico apesar de seus altos níveis,

provavelmente devido a mecanismos homeostáticos eficientes

5,9

Um terço a três-quartos de todo ferro cerebral está estocado dentro das células

gliais ligado a Fr (Fe

) na sua forma solúvel, protegendo as células do dano

oxidativo causado pelo ferro livre (Fe

)

6,7

. A Hs armazena ferro na sua forma

insolúvel

. Um excesso de ferro intracelular pode ser encontrado no reservatório

de ferro lábil, forma muito mais transitória

. Os oligodendrócitos são as células

cerebrais que mais contêm ferro

. Na pars compacta da substância negra (SN)

a neuromelanina é conhecida como principal armazenador de ferro. Ela não é

detectável durante o primeiro ano de vida e aumenta a partir da segunda

década, continuamente, até os 80 anos

9,13

. Já a Fr na SN é muito baixa no

primeiro ano de vida, aumenta até os 20 anos e permanece constante até os 90

anos

. Os níveis de ferro aumentam até a quarta década de vida e permanecem

constantes até os 90 anos na SN de indivíduos normais

. No caso de uma BHE

alterada o ferro passa a ser continuamente capturado pelo cérebro levando a um

acúmulo excessivo deste metal

FERRO E ESTRESSE OXIDATIVO

O oxigênio apresenta um papel essencial em nosso organismo, porém, também,

um papel tóxico

. Durante a respiração mitocondrial, o oxigênio molecular é

reduzido em água pelas células, para a formação de energia, produzindo

concomitantemente pequenas quantidades de radicais livres

. Através de

processos enzimáticos e não-enzimáticos que ocorrem normalmente na célula, o

oxigênio aceita elétrons livres e se transforma em radicais de oxigênio altamente

reativos (ROS: H

, O

). A geração de radicais livres (RL:OH) atua fazendo

parte do mecanismo de defesa antimicrobiana humana que se destina a destruir

microorganismos invasores, células tumorais e outras células alvos de remoção.

Por outro lado, podem ser extremamente tóxicos danificando lipídios, proteínas,

DNA e RNA celulares, levando a várias formas de lesão celular. Porém, as

células possuem sistemas de defesa (proteínas quelantes de metais, enzimas

de defesa, antioxidantes) para prevenir lesões causadas por ROS. Um

desequilíbrio entre a taxa de geração e a capacidade de remoção celular de

radicais livres causa um estresse oxidativo, que pode ser causa direta de uma

patologia ou, estar associado a uma forma de perpetuar o dano celular causado

por outro processo patológico

Metais de transição, como o ferro (ou o cobre) doa ou aceita elétrons livres

durante reações intracelulares e catalisa a formação de radicais livres, como na

reação de Fenton: H

(ROS) + Fe

= Fe

+ OH (RL) + OH-. Visto que a

maior parte do ferro intracelular está na forma férrica (Fe

) ele primeiro precisa

ser reduzido para a forma ferrosa (Fe

) para participar da reação de Fenton

No estado metabólico normal, o superóxido favorece a oxidação de Fe

a Fe

No entanto, se a concentração intracelular de superóxido é elevada, a reação

favorece a redução de Fe

a Fe

perpetuando a reação de Fenton formando

mais radicais hidroxila

. FIG3

Os níveis das ROS, no entanto, são minimizados pela ligação dos íons a

proteínas de armazenamento e de transporte (p.ex., Tr, Fr, lactoferrina e

ceruloplasmina), que agem como quelantes e assim, minimizam a formação de

De todos os órgãos, o cérebro deve ser considerado o mais sensível ao estresse

oxidativo devido as seguintes características:

• Alto consumo de oxigênio (20% de todo organismo);

• Altos níveis de ferro e ascorbato (cruciais para peroxidação lipídica da

membrana, através da Reação de Fenton);

• Relativamente baixos níveis de agentes protetores antioxidantes;

• Tendência a acumular metais;

• Microglia (macrófagos do SNC) produz ROS sob ativação e é capaz de

secretar citokinas inflamatórias;

• Contém altas concentrações de neurotransmissores auto-oxidáveis

(dopamina, noradrenalina) que reagem com O2 produzindo ROS;

• Contém aminoácidos excitotóxicos (glutamato);

• Contém enzimas (monoamino oxidase, tirosina,etc) que produzem H2O2

como produtos finais de suas atividades;

• E tem alto tráfego de Ca+2 através da membrana neuronal seguindo

interferência com transporte de íons (pela ruptura de metabolismo

energético)

17,18,19

Ocorrendo um excesso ou desregulação na homeostase do ferro em áreas

cerebrais relevantes, aumenta o dano oxidativo induzido por ferro, levando a

processos neurodegenerativos com conseqüente morte neuronal

5,20,21

NEURODEGENERAÇÃO:

Uma classificação clara de neurodegeneração pode basear-se nas

principais alterações neuropatológicas: presença de componentes protéicos

anormais que se acumulam no cérebro, levando à perda neuronal, dependentes

da idade. Acúmulos de β-amilóide (Aβ) nas placas senis (PS) e de proteína tau

hiperfosforilada nos emaranhados neurofibrilares (ENF) da DA; da α-sinucleína

nos corpos de Lewy(CL) na DP; agregados da proteína huntingtina na Doença

de Huntington; corpos de Pick na demência de Pick são alguns exemplos. Um

mecanismo comum no desenvolvimento de processos neurodegenerativos é a

presença de alteração na conformação de proteínas (por oxidação protéica ou

dano oxidativo de RNA), gerando estruturas intermediárias, que formam

oligômeros solúveis (considerados os mais tóxicos) que posteriormente se

agregam formando protofibrilas e por fim fibrilas que são consideradas

marcadores de neurodegeneração. Tanto a agregação protéica como o estresse

oxidativo, presentes nestas patologias, estão associados com o envolvimento de

metais

9,22,23,24

Há uma tentativa durante o envelhecimento normal, de manter o turnover

destas proteínas anômalas, via sistemas de degradação proteolítica

proteossomal e lisossomal, levando a formação e acúmulo do pigmento

lipofuscina dentro das células de vida longa como os neurônios. A lipofuscina é

um agregado protéico, composto por proteína, lipídio, traços de carbohidratos e

também metais, oriunda da degradação lisossomal. Ainda não se sabe o papel

da lipofuscina no envelhecimento ou nas doenças relacionadas à idade, porém

parece que ela pode induzir neurotoxicidade pela geração de ROS. Além disso,

a degradação lisossomal de mitocôndrias possivelmente é uma das fontes

metabólicas de ferro dentro de uma célula danificada levando ao aumento do

estresse oxidativo. O aumento da quantidade de proteínas oxidadas ou a

diminuição de sua degradação leva a formação dos agregados relacionados

com a neurodegeneração

PAPEL DE FERRO NA DA:

Existe duas vezes mais ferro na neuropila de pacientes com DA que em

pacientes não demenciados

. A Fr aumenta com a idade e seu acúmulo é

considerado fator de risco para DA

. Sabe-se que a proteína Aβ tem sítios de

ligação com íons metais e que a interação entre Aβ e ferro é um dos fatores

responsáveis por agregação e depósito do Aβ

5,26

. Existem evidências que se

ligando com o ferro o Aβ está agindo como quelante para diminuir o dano

oxidativo de altas concentrações de ferro livre, porém o acúmulo deste complexo

parece contribuir para aumentar o estresse oxidativo apresentando

paradoxalmente um efeito neuroprotetor e neurotóxico

5,9,22,27,28

. Acredita-se que

oligômeros de Aβ solúveis sejam tóxicos e seus níveis correspondam ao grau de

neurodegeneração na DA

18,19

O envolvimento do ferro diretamente na formação da PS também induz a

ativação da microglia e astrócitos reativos levando a síntese de várias citocinas

(IL1, IL6, IL8) que ativam macrófagos a produzirem grande quantidade de ROS.

A ativação da microglia também libera ferro da ferritina de uma maneira

dependente de superóxido resultando em oxidação lipídica

Os ENF são outros sítios de acúmulo de ferro

. O Fe+3 é essencial para induzir

agregação da proteína tau hiperfosforilada levando a formação de ENF

. Além

disso, o Aβ induz a desregulação de kinases/fosfatases associadas com a

hiperfosfolilação da tau constituindo uma via crítica para neurodegeneração

Em relação a modelos animais, Schroder e cols demonstraram em ratos adultos,

que receberam excesso de Fe+2, 10-12 dias após o nascimento, déficits de

memória nos testes de campo aberto e labirinto radial, comprovando um efeito

danoso tardio do ferro em comportamentos aprendidos

PAPEL DO FERRO NA DP:

A neuromelanina da SN armazena grande quantidade de ferro que pode migrar

progressivamente para o citosol, durante a patogênese da DP, aumentando

ROS, fazendo com que os neurônios dopaminérgicos nigrais sejam

peculiarmente susceptíveis ao estresse oxidativo. Evidências histológicas têm

demonstrado que neurônios mais pigmentados são os primeiros a degenerarem

na DP

. Qualquer evento que concorra para aumentar o potencial oxidativo

destes neurônios (mobilização de Fe, aumento concentração de dopamina

intracelular, estabilização de protofibrilas protéicas: α-sinucleína) poderiam

constituir o evento inicial desencadeante da cascata de degradação oxidativa

Além de contribuir para o estresse oxidativo o ferro induz a agregação de α-

sinucleína contribuindo para formação de CL

34,35

Zhang e cols demonstraram papel neuroprotetor de um quelante de ferro num

modelo de degeneração nigral induzido por inibidor de proteossomo, diminuindo

a perda de neurônios dopaminérgicos e presença α-sinucleína de CL o que

confirma o papel importante do ferro como causa das alterações

neuropatológicas da DP

CONCLUSÃO:

O ferro é um metal fundamental para homeostase do organismo. Porém quando

em excesso, não conseguindo ser estocado pela Fr e neuromelanina, passa a

desencadear reações oxidativas aumentando o estresse oxidativo. Um

desequilíbrio entre a formação de radicais livres e das enzimas de defesa contra

seus danos, leva a oxidação de elementos fundamentais celulares para um

funcionamento normal, trazendo alteração na conformação de proteínas e

aumento de sua agregabilidade formando fibrilas e por fim, neurodegeneração.

Um modelo animal que comprove este processo é fundamental para o

entendimento da fisiopatologia das doenças neurodegenerativas (DP e DA as

mais freqüentes) e para o desenvolvimento de novas drogas.

ANEXOS

Fig 1

Fig 2

Fig.3

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CAPÍTULO 3

ARTIGO CIENTÍFICO

TÍTULO: Neuropathological changes following iron administration in adult and old

rats

REVISTA: manuscrito em preparação para submissão

Research paper

Section Editor:

Neuropathological changes in adult and old rats following early post-natal

iron administration

Liana Lisboa Fernandez

1,2

, Maria Noêmia Martins de Lima

, Felipe Scalco

Gustavo Vedana

, Clívia Miwa

Arlete Hilbig

, Nadja Schröder

Neurobiology and Developmental Biology Laboratory, Faculty of Biosciences,

Pontifical Catholic University, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil

Health Basic Science Department, Federal University of Medical Science, Porto

Alegre, RS, Brazil

*Correspondence to: Liana Lisboa Fernandez, Rua Coronel Bordini, 675, sala

204, Porto Alegre, CEP 90440-001, RS, Brasil. Tel.fax:+55 51 33325983

E-mail address: [email protected]

Abstract

The present study was aimed to investigate neuropathological changes in adult

and aged rats subjected to supplementary iron administration in a critical

postnatal period in order to study the contribution of environmental risk factors to

the pathogenesis of neurodegenerative disorders. Ten rats received iron

between 12

and 14

post-natal days; 9 rats received vehicle (sorbitol 5% in

water) in the same period. Five iron-treated and 3 sorbitol-treated rats were killed

at the age of 3 months (adults) while 5 iron-treated and 6 sorbitol-treated rats

were killed at age of 24 months (aged) and their brains processed for

immunohistochemistry. No significant differences in β-amyloid, phosphorylated

tau and α-synuclein were seen when iron-treated and non-treated rats were

compared. Increased astrocytosis, revealed by densitometry of GFAP-

immnoreactive astrocytes, was found in old (24 months) iron-treated rats in

substantia nigra and striatum and in the hippocampus of adult (3 months) iron-

treated rats when compared to age-matching controls. These findings suggest

that transient dietary iron supplementation during the neonatal period is

associated to cellular imprinting in the brain later in life.

Key words: neurodegeneration; Alzheimer’s disease; Parkinson disease; iron;

GFAP; astrocytosis.

Introduction

Iron is the most abundant transition metal in the body and in the brain. It has

versatile functions as a cofactor and biocatalyst in many vital as well as

potentially damaging reactions in the cell. Iron is an essential cofactor in

cytochrome oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, NADH

dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, succinate dehydrogenase, and

aconitase enzymes among others, all of which are enzymes involved in

production of ATP. Iron plays a crucial role in function of hemoglobin and the

cytochromes a, b, and c, and in the biosynthesis of cholesterol and lipids, which

are necessary precursors in the formation of neuronal membranes and myelin

(1,2,3)

. Because of the high oxygen utilization in the brain and high content of

myelin, and the crucial role of iron for the production of several neurotransmitters

such dopamine, norepinephrine, serotonin and GABA, there is an especially

important link between iron and brain function

(1,2,3)

. Excess of iron have been

implicated in free radical formation via the Fenton reaction

(4)

. Free radicals may

damage proteins, nucleic acids, and lipids, causing irreversible damage to cells

and inducing cell death by apoptosis or necrosis. It has been suggested that

disrupted iron homeostasis leading to iron accumulation in one or more brain

regions is associated with numerous conditions such as Alzheimer’s disease

(AD) and Parkinson’s disease (PD)

(1,2,3)

. It has been proposed that an imbalance

in the synthesis of iron-storage proteins, ferritin, hemosiderin, neuromelanin, and

the amount of free iron would increase the risk of cellular damage by oxidative

stress. In fact, these dysfunctions of iron-storing proteins would be a normal

aging event that would explain the predisposition of neurodegenerative disorders

in elderly

(5,6,7,8)

. Regions undergoing degeneration display an excess of iron

relative to ferritin levels which may indicate that iron accumulates at a faster rate

than ferritin is produced

(4)

. AD is characterized by the presence of two

neuropathological markers: senile plaques enriched with Aβ-peptide deposition

(extracellular), and neurofibrilary tangles formed by hyperphosphorylated tau

protein (intracellular)

(9,10,11,12)

. Studies have shown that iron co-localizes and

influences the aggregation of both AD markers

(13,14,15,16,17,18)

. Moreover, iron-

induced Aβ and plaque formation induces activation of microglia and reactive

astrocytes

(4)

. Interestingly, Bishop and co-workers

(19)

observed that when iron

was combined with Aβ, the neurotoxicity of this metal was substantially reduced,

suggesting that this complex may be a mechanism to remove iron from the

extracellular space and to facilitate its clearance from the brain, reducing

oxidative stress

(19,20)

α-synuclein is the main component of the abnormal protein depositions

constituting the Lewy bodies, intracytoplasmic inclusions in the cell body of

neurons, recognized as the hallmark of PD

(16,21)

. The Lewy bodies are located

mainly in dopaminergic neurons in the substantia nigra and noradrenergic

neurons in the locus coeruleus

(22)

. Elevated levels of iron in microglia,

astrocytes, oligodendrocytes and dopaminergic neurons is observed in

substantia nigra pars compacta

(16,21)

. Fasano et al

(23)

emphasized that nigral

neuromelanin stores large amounts of iron that can be released during PD

pathogenesis. The high content of dopamine, neuromelanin, and high levels of

iron make dopaminergic nigral neurons peculiarly susceptible to oxidative

stress

(23,24)

Iron has also been implicated in promotion of α-synuclein aggregation either

directly or by increasing levels of oxidative stress suggesting an important role for

it in Lewy body formation

(16,21,25)

. Zhang and coworkers

(26)

found that co-

injection of the iron chelator desferroxamine not only attenuates the lactacystin-

induced dopamine neuron loss, but also reduces the presence of ubiquitin-

positive intracellular inclusions in the substantia nigra.

In 1999, Fredriksson and collaborators observed neurobehavioral

dysfunctions and increased content of total iron in the basal ganglia in adult mice

exposed to a neonatal iron administration

(27,28)

. Subsequently, Schröder and

coworkers

(29)

observed memory impairments in the radial arm maze and in the

inhibitory avoidance task in adult rats following postnatal iron administration.

Studies by De lima et al

(30)

demonstrated that recognition memory was also

impaired by iron neonatal treatment. These effects were reversed by selegiline

(31)

and

the iron chelator desferoxamine

(32)

. It was reported that iron

supplementation in the neonatal period induces oxidative stress in substantia

nigra, but not in cerebellum and striatum of adult rats

(33)

. In another study,

oxidative stress parameters were investigated in other brain regions,

demonstrating that iron administration as early as postnatal days 5-7 and as late

as days 19-21 induces oxidative stress at least in the hippocampus, cortex and

substantia nigra

(30)

Based on these findings, the present study was designed to investigate

histopathological modifications in adult (3 months) and old (24 months) rats

subjected to transient iron administration at a critical postnatal period and to

correlate the findings with neurogeneration.

Material and methods

Animals

Pregnant Wistar rats were obtained from Fundação Estadual de Pesquisa e

Produção em Saúde (FEEPS), Porto Alegre, Brazil. After birth, each litter was

adjusted within 48 h to eight rat pups. Each pup was maintained together with its

respective mother in a plastic cage with sawdust bedding in a room at a

temperature of 22 ± 1 °C and a 12 h light: dark cyc le. At the age of 4 weeks the

pups were weaned and the males were selected and raised in groups of three–

five rats. At postnatal treatment, the animals were supplied with standardized

pellet food and tap water ad libitum. All experimental procedures were performed

in accordance with the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,

and the Brazilian Society for Neuroscience and Behaviour (SBNeC)

recommendations for animal care. The protocol for this research was approved

by the Institutional Ethics Committee of the Pontificia Universidade Catolica do

Rio Grande do Sul.

Animal treatment

The neonatal iron treatment was performed as previously described

(29,30,31,32,34)

Ten twelve-day-old rat pups received orally a single daily dose of 10.0 mg

/kg body weight in solution volume (Ferromyn®, AB Hässle,

Göteborg,Sweden) and 9 ones received vehicle (5% sorbitol in water, control

group) via a metallic gastric tube, over 3 days (post natal days 12–14). The

period of treatment was chosen based on studies that show that iron uptake by

the brain increases rapidly in the first 15 days of life, decreasing after the 15

day

of life in rats

(35,36)

Immunohistochemical analyses (IHC)

Five iron-treated, 3 sorbitol-treated 3-month-old rats, 5 iron-treated and 6

sorbitol-treated 24-month- old rats were perfused through the left cardiac

ventricle for 20 min with 4% paraformaldehyde in phosphate buffer. The brains

were rapidly removed, and immersed in the same fixative solution at room

temperature. Immediately afterwards, the brains were cut coronally and

embedded in paraffin. Serial, 5-µm-thick coronal sections were obtained with a

microtome, and used for immunohistochemistry. De-waxed sections

corresponding to striatum (sections of figure 27 to 38 from Paxinos and Watson

2005)

(37)

, hippocampus (sections of figure 54 to 66 from Paxinos and Watson

2005)

(37)

and substantia nigra (sections of figure 71 to 80 from Paxinos and

Watson 2005)

(37)

were immersed in 3% hydrogen peroxide in 100% methanol

for 15 min to inhibit endogenous peroxidase activity. Then, sections were boiled

in 10 mM citrate buffer, pH 6.0, for 30 min or treated with formic acid for 3 min,

for antigen retrieval. After rinsing in phosphate-buffered saline (PBS), the

sections were incubated with normal horse serum for 2 h and then with the

primary antibody overnight at 4°C in humid chambers . The following primary

antibodies were used: anti-Aβ (mouse, monoclonal anti-human beta-amyloid,

Dako), dilution 1:60, pretreated for 3 min with formic acid and citrate; anti-tau

(pT

205

) (rabbit, polyclonal, anti-tau INVITROGEN) 1:250, pretreated with citrate;

anti-α-synuclein (rabbit, ZYMED) 1:200, pretreated with formic acid and citrate;

anti-GFAP (mouse, monoclonal anti-human glial fibrillary acidic protein,

DAKOCYTOMATION), dilution 1:400, pretreated for 20 min with boiling citrate.

The sections were washed three times in PBS and immunostained by a MAX

Polymer Detection Kit (secondary biotinylated universal, HRP polymer conjugate,

and DAB cromogen, ZYMED) for optical detection.

Densitometry and statistical processing of data

The immunohistochemical images were captured using AxisVision AC Real 4.5

software through inverted microscope with a 10x objective coupled to an

AxioCam IC Zeiss camera. The selection section was done manually including

striatum, hippocampus or substantia nigra. To analyze the images, Image J

software was used (http://www.uhnresearch.ca/facilities/ wcif/fdownload.html).

For each image, color functions and color de-convolution, H DAB vectors: color 2

R: 0.26814753, G: 0.57031375, B: 0.77642715 were applied. The color 2 image

(brown) was inverted and the measurement was obtained as a percentage of the

DAB chromogen. Data were expressed as mean + standard error of the mean

(SEM). Comparisons between groups were performed using the independent

samples T-TEST. p values of less than 0.05 were considered statistical

significant and are indicated in the figure as * p<0.05 and ** p<0.01.

Results

No significant changes in β-amyloid, phosphorylated tau and α-synuclein

were seen in iron- and vehicle-treated rats in striatum, hippocampus and

substantia nigra of adult and aged rats. Representative pictures with respective

positive controls (human brain) are shown in Figure 1.

________________________________________________________________

INSERT Fig 1 HERE

_______________________________________________________________

Increased astrocytosis, revealed by densitometry of GFAP-immnoreactive

astrocytes, was found in hippocampus of 3-month old iron-treated rats (p<0,05)

when compared to vehicle- treated rats, as shown in Figure 2.

________________________________________________________________

INSERT Fig 2 HERE

_______________________________________________________________

Statistical analysis of densitometric immunohistochemistry for GFAP

showed an increase in GFAP levels in the substantia nigra and striatum (both

p’s< 0.05), but not in hippocampus, in aged rats that received iron in comparison

to the group treated with vehicle in the neonatal period (Figure 3).

________________________________________________________________

INSERT Fig 3 HERE

________________________________________________________________

Discussion

The present findings show that transient iron intake during neonatal period

induces a region-specific astrocytic gliosis in adult and old rats, and that this

change is not accompanied by apparent differences in Aβ-amyloid,

phosphorylated tau nor in α-synuclein. Iron administration in rats’ early life has no

role in Aβ metabolism, in contrast to the well-known interactions of Aβ and iron in

older individuals

(19,20)

. Similarly, lack of differences regarding α-synuclein and

phosphorylated tau do not give support to the concept that iron accelerates α-

synuclein aggregation and Lewy body formation

(16,21,25)

nor that it modifies tau

phosphorylation patterns

(18)

Kimoto et al

(38)

, studying glial cells in mouse hippocampus during

postnatal development, concluded that glial cells may play a role in the

maintenance and neuronal function. Their findings suggest that glial neurotrophic

factors may be important for neuronal growth and maturation of oligodendrocyte

during postnatal development. They emphasize that astrocytes perform a wide

range of adaptative functions in the mammalian nervous system, including

neurotransmitter uptake, synthesis and secretion of trophic factors, aid in the

repair and regeneration of wounds, and regulation of synaptic density

(38)

Astrocytes are the most numerous cells in the brain, dwell in both grey and white

matter and act as the main element of the homoeostatic system of the brain.

They shape the microarchitecture of the brain, form neuronal-glia-vascular units,

regulate the blood-brain barrier, control microenvironment of the central nervous

system and defend nervous system against a multitude of insults

(39)

Acute and chronic brain insults trigger a specific glial reaction, generally

known as reactive astrogliosis, represented by a complex morphofunctional

remodeling of astrocytes

(39)

. Reactive astrogliosis is a defensive brain reaction

which is aimed at isolation of the damage area from the rest of the central

nervous system (CNS) tissue, reconstruction of the blood-brain barrier and

facilitation of the remodeling of brain circuits in areas surrounding the lesioned

region

(39)

. There are two types of astrogliosis: astrocytes surrounding the lesion

undergo a robust hypertrophy and proliferation, which ultimately ends up in

complete substitution of previously existing tissue architecture with a permanent

glial scar; and damage distant astrogliosis do not distort the normal architecture

of CNS tissue but astroglial cells modify their appearance and undergo multiple

biochemical and immunological changes although permit growth of neuritis and

synaptogenesis, thus facilitating remodeling of neuronal networks. In particular,

dystrophic astrocytes may have reduced ability for glutamate uptake, thus

increasing the overall brain vulnerability to glutamate excitotoxicity. In contrast,

the reactive astroglial cells may serve another function- the function of neuronal

killers

(39)

GFAP, an intermediate filament protein, is increasingly expressed in

response to astrocytic activation

(40)

. It has been shown that GFAP expression

also increases with ageing in the human brain and that astrocytes may respond

to preclinical AD molecular pathology

(41)

. Increased astroglial responses precede

the oxidative impairments of critical cellular components in an AD animal model

(40)

. Recent studies have shown that the number of astrocytes is significantly

increased in the hippocampus in APP/PS1 mice compared with age- and gender-

matched wild-type littermates

(42)

. We also found in another study, that astrocytic

gliosis is an early event in the course of APP/PS1-related pathology and that iron

administration during the neonatal period and its late effects are independent of

the genetic substrate of the individuals, as similar astrocytic responses was

observed in APP/PS1 and wild-type littermates as well

(43)

. In the present study

we also observed an increased astrogliosis in hippocampus of adult rats that

received iron overload early in life, which might be related to iron-induced

hippocampal based memory impairments, previously described by our research

group. Moreover, in old iron-treated rats we found the same astrocytic responses

in striatum and substantia nigra.

At certain iron concentrations, the defenses of brain cells may fail, and

homeostatic mechanisms are overwhelmed. Under such conditions, differential

cellular responses in brain-associated cell types are recruited to manage cell

survival

(4,15)

. It has been demonstrated that astrocytes are more resistant to free

iron and oxidative stress toxicity than neurons and brain vascular endothelial

cells, and may even provide transient protection to other cells within the brain

(15,44)

. Initially astrocytes play a protective role vis a vis in thiamine deficiency-

induced neurodegeneration, but in later stages an increase in GFAP-positive

astrocytes is observed, an event that is indicative of astrocyte activation along

with increased neurodegeneration. It is not known whether astrocytes fail to

produce protective factors in the later stages or if neuronal cells are too impaired

to respond to these factors

(4)

The present study shows that increased iron availability to the CNS tissue

at early stages of development in rats results in significant increased GFAP-

astrocyte expression levels that are maintained later in life in different regions.

The early hippocampal response suggests increased cell vulnerability compared

with substantia nigra and striatum, perhaps due to the presence of higher levels

of iron-storage proteins in these regions (neuromelanin and ferritin). Although

these results suggest a permanent cellular defense to transient iron overload

during development, it may be questioned whether these changes are protective

or facilitators of later brain damage. Absence of increased β-amyloid,

phosphorylated tau and α-synuclein in iron-treated rats are indicators of a

scenario consistent with a successful adaptative response. On the other hand

increased astrocytic gliosis usually reflects impaired neuronal/glial homeostasis

(39,41,45)

. It is possible based in Castellani et al hypothesis that brain protein

deposit pathology is therefore a host response rather than a manifestation of

cytotoxic protein injury. The pathology would be a manifestation of cellular

adaptation, as a defense against oxidative injury

(46)

in our case caused by iron

overload early in life.

The present findings clearly document that excess of iron during the neonatal

period also impacts in the cellular composition of the adult and old brain. These

observations may encourage further studies focused on the effects of dietary

supplementations in children.

Acknowledgements

LLF was a recipient of a CAPES/ MEC PDEE fellowship and UFCSPA

assintance professor.

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Figure legends

β -amiloid

Adults

Phospho-Tau

Adults

Hippocampus Hippocampus

Positive control

α-synuclein

Adults

Iron Vehicle

Figure 1. (A) Representative histological sections of β-amyloid, phosphorylated

tau and α-synuclein immunohistochemistry of hippocampus of adult rats treated

with vehicle or iron in the neonatal period. Magnification: 10x.

Figure 2. (A) Representative histological sections of GFAP

immunohistochemistry of striatum, hippocampus and substantia nigra of adult

rats treated with vehicle or iron in the neonatal period. Magnification: 10x. (B)

Densitometric analysis of GFAP imunohitochemistry. Data were expressed as

mean + standard error of the mean (SEM). Comparisons between groups were

performed using the independent samples T-TEST. ** indicates p<0.01.

Figure 3. (A) Representative histological sections of GFAP

immunohistochemistry of striatum, hippocampus and substantia nigra of old rats

treated with vehicle or iron in the neonatal period. Magnification: 10x. (B)

Densitometric analysis of GFAP imunohitochemistry. Data were expressed as

mean + standard error of the mean (SEM). Comparisons between groups were

performed using the independent samples T-TEST. * indicates p<0.05.

CAPÍTULO 4

ARTIGO CIENTÍFICO

TÍTULO: Effects of increased iron intake during the neonatal period on the brain

of adult APP/PS1 transgenic mice

REVISTA: JOURNAL OF ALZHEIMER’S DISEASE, submetido.

Research paper

Section Editor: Sigfrido Scarpa

Effects of increased iron intake during the neonatal period on the brain of

adult APP/PS1 transgenic mice

Liana Lisboa Fernandez

1,2,3

, Marga Carmona

, Manuel Portero-Otin

, Alba

Naudi

, Reinald Pamplona

, Nadja Schröder

, Isidro Ferrer

Neurobiology and Developmental Biology Laboratory, Faculty of Biosciences,

Pontifical Catholic University, 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil

Health Basic Science Department, Federal University of Medical Science, Porto

Alegre, RS, Brazil

Institut de Neuropatologia, Servei Anatomia Patològica, IDIBELL-Hospital

Universitari de Bellvitge, Universitat de Barcelona, Carrer Feixa LLarga sn,

Hospitalet de LLobregat, CIBERNED, Spain.

Department of Experimental Medicine, University of Lleida-IRBLLEIDA, 25008

Lleida, Spain.

*Correspondence to: Liana Lisboa Fernandez, Rua Coronel Bordini, 675, sala

204, Porto Alegre, CEP 90440-001, RS, Brasil. Tel., fax: +55 51 33325983

E-mail address: [email protected]

Short title: Late effects of iron intake in APP/PS1 mice

Abstract

The present study was aimed to investigate neuropathological changes in

APP/PS1 transgenic mice (Tg), as a model of Alzheimer’s disease, subjected to

supplementary iron administration in a critical postnatal period, in order to reveal

the interaction of genetic and environmental risk factors in the pathogenesis of

the disease. Twelve Tg and 10 ten wild-type (Wt) littermates were administered

iron between the 12

and 14

post-natal days (TgFe, WtFe); 11 Tg and 15 Wt

received vehicle (sorbitol 5%) alone in the same period (TgSb, WtSb). Mice were

killed at the age of six months and processed for morphological and biochemical

studies. No modifications in β-amyloid burden were seen in iron-treated and non-

iron-treated APP/PS1 mice. No differences in microglial reactions were observed

when comparing the four groups of mice. Yet increased astrocytosis, as revealed

by densitometry of GFAP-immnoreactive astrocytes, and increased expression

levels of GFAP, as revealed by gel electrophoresis and western blotting, were

found in iron-treated mice (both Tg and Wt) when compared with TgSb and

WtSb. This was accompanied by significant changes in brain fatty acid

composition in APP/PS1 mice that lead to a lower membrane peroxidizability

index and to reduced protein oxidative damage, as revealed by reduced

percentages of the oxidative stress markers: glutamic semialdehyde, aminoadipic

semialdehyde, N

-carboxymethyl-lysine, N

-carboxyethyl-lysine, and N

malondialdehyde-lysine. These findings demonstrate that transient dietary iron

supplementation during the neonatal period is associated with cellular and

metabolic imprinting in the brain in adult life, but it does not interfere with the

apperance of amyloid plaques in APP/PS1 transgenic mice.

Key words: neurodegeneration; Alzheimer’s disease; APP/PS1 transgenic mice;

iron; GFAP; docosahexaenoic acid, docosapentaenoic acid, peroxidizability

index, protein oxidation

Introduction

The number of old people has risen with the increase of life expectancy and, as a

consequence, the prevalence of age-related diseases including

neurodegenerative disorders has increased as well [1]). Neuropathological

changes in many degenerative diseases of the nervous system are characterized

by the presence of abnormal proteins which accumulate in the brain, leading to a

selective loss of neurons in an age-dependent manner [1-3]. Alzheimer’s disease

(AD) is the leading cause of dementia in the elderly [1, 2, 4]. AD is a

multisystemic disease involving the neuronal circuits in the entorhinal and

perirhinal cortex, hippocampal complex, amygdala and neocortex, together with

the basal forebrain cholinergic system, striatum, thalamus and several nuclei of

the brain stem. The neuropathological hallmarks of AD are extracellular deposits

of β-amyloid peptides (Aβ) consisting of diffuse or neuritic plaques, and amyloid

angiopathy; and intraneuronal deposits of hyperphosphorylated tau manifested

as neurofibrillary pre-tangles and tangles, dystrophic neurites of neuritic plaques,

and neuropil threads [1-4]. Sporadic AD is a common multifactor complex

disorder resulting from the interaction of both genetic (e.g. APOE) and

environmental factors in aged individuals [4-6].

Familial AD is a very rare

autosomal dominant disease, often with early onset, caused by mutations in the

amyloid precursor protein and presenilin genes (APP, PSEN1, PSEN2) both

linked to Aβ metabolism [3-5].

Several transgenic animal models have been produced to recapitulate particular

aspects of AD. APP/PS1 transgenic mice over-express both mutant human APP

and PS1, and show early and extensive Aβ deposition in the form of plaques and

amyloid angiopathy [7-9]. APP/PS1 transgenic mice show progressive amyloid

plaque formation, dendritic spine loss, astrocytosis and behavioral deficiencies

[10-13].

Increasing evidence shows that, in spite of vital physiological functions, iron may

play a role in metal-ion-mediated oxidative damage under certain conditions,

most clearly pronounced with aging [14-20]. Accumulation of proteins related with

iron storage as ferritin and hemosiderin occurs in the hippocampus, and probably

other regions, in AD [21]. However, regions undergoing degeneration display an

excess of iron relative to ferritin levels which may indicate that iron accumulates

at a faster rate than ferritin is produced [22]. Moreover, iron-activated Aβ and

plaque formation induces activation of microglia and reactive astrocytosos [22].

Furthermore, iron co-localizes with Aβ in amyloid plaques in APP/PS1 transgenic

mice [23].

Several studies have shown that neonatal iron exposure may induce

neurobehavioral and cognitive dysfunctions in adult mice [24, 25].

Similar deficits

are observed in adult rats after postnatal iron administration [26-30]. These

effects are reversed by selegiline [30] and

the iron chelator desferoxamine [28].

In these models, iron is given orally during the period of maximal iron uptake by

the brain so that the rodent models mimic dietary iron supplementation to human

infants [28].

The present study was designed to investigate histological and biochemical

modifications in adult APP/PS1 transgenic mice subjected to transient iron

administration at a critical postnatal period. The main objective was to evaluate

the interaction of genetic and environmental factors in the pathology of the

disease.

Material and methods

Animal treatment

Twenty three 6-month-old APP/PS1 transgenic mice (Tg) from the Jackson

Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) and 25 age-matched littermate control

mice (Wt) were used. The mouse line used in this study expressed a Mo/Hu

APP695swe construct in conjunction

with the exon-9-deleted variant of human

presenilin 1 (PS1-dE9) [8]. Details of neuropathological and behavioural aspects

of these mice are reported elsewhere [11, 13].

Twelve Tg and 10 Wt were subjected to iron administration between the 12

and

the 14

postnatal days (TgFe, WtFe); 11 Tg and 15 Wt received vehicle alone

during the same period (TgSb, WtSb). The neonatal iron treatment was

performed as previously described [24-30].

Briefly, 12-day-old mouse pups

received a single oral daily dose (10.0 ml/kg solution volume) of vehicle (5%

sorbitol in water) (control group) or 10.0 mg/kg of body weight of iron carbonyl

(Sigma; iron concentration in the solution was 1.0 mg/ml) via a metallic gastric

tube for 3 days. All the process was conducted with the approval of the

Committee for Animal Care and Research of the Autonomous Government of

Catalunya.

Immunohistochemical analyses (IHC)

Three TgFe, 3 TgSb, 4 WtFe and 4 WtSb 6-month old mice were perfused

through the left cardiac ventricle for 20 min with 4% paraformaldehyde in

phosphate buffer. The brains were rapidly removed and immersed in the same

fixative solution at room temperature. Immediately afterwards, the brains were

cut sagitally and embedded in paraffin. Serial, 5-µm-thick coronal sections were

obtained with a microtome, and used for immunohistochemistry. De-waxed

sections were immersed in 3% hydrogen peroxide in 100% methanol for 15 min

to inhibit endogenous peroxidase activity. Then the sections were boiled in 10

mM citrate buffer, pH 6.0, for 30 min or treated with formic acid for 3 min, for

antigen retrieval. After rinsing in phosphate-buffered saline (PBS), the sections

were incubated with normal horse serum for 2 h and then with the primary

antibody overnight at 4°C in humid chambers. The fo llowing primary antibodies

were used: anti-Aβ (monoclonal mouse anti-human beta-amyloid, Dako,

Barcelona, Spain), dilution 1:25, pretreated for 3 min with formic acid; anti-GFAP

(monoclonal mouse anti-human glial fibrillary acidic protein,

DAKOCYTOMATION), dilution 1:250, pretreated for 20 min with boiling citrate;

and anti-lectin of Lycopersicon esculentum (L-0651, Sigma, Madrid, Spain),

dilution 1:100, with no pre-treatment.

The sections were washed three times in PBS and immunostained by a standard

avidin–biotin complex method (secondary biotinylated universal Dako and

Streptavidin HRP, Dako), washed and finally treated for 3 min with 0.01% H

and 0.05% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma) for optical

detection, except for lectin, in which the sections were treated only with

streptavidin and DAB.

Western blot (WB) analysis

Nine TgFe, 8 TgSb, 6 WtFe and 11 WtSb 6-month-old mice were killed by rapid

decapitation and all brains were separated in regions and frozen in -80

Samples of the posterior hemisphere (including the hippocampus) of all animals

were homogenized in a glass homogenizer in 600 µl of RIPA buffer (25mM Tris,

HCl pH 7.6, 150mM NaCl,1%NP-40, 1% sodium deoxyenolate, 0.1% SDS) with

phosphatase inhibitors (complex mini-protease inhibitors 1:10ml, NaV 200mM,

NaF 1M, PMSF 100mM) and centrifuged at 10,000 rpm for 5 min at 4°C. Pellet

fractions were discarded and protein concentrations of the supernatants were

determined with the BCA method with bovine serum albumin as a standard.

Samples containing 20 µg of protein were loaded onto 10% acrylamide gels.

Proteins were separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel

electrophoresis (PAGE) and electrophoretically transferred to nitrocellulose

membranes (400 mA for 90 min). Then the membranes were incubated with 5%

skimmed milk in TBS-T buffer (100 mM Tris-buffered saline, 140 mM NaCl and

0.1% Tween 20, pH 7.4) for 1 h at room temperature, and incubated in primary

antibody anti-GFAP (monoclonal mouse anti-human glial fibrillary acidic protein)

diluted 1:3,000 in TBS-T containing 3% BSA (Sigma) overnight at 4°C.

Subsequently, the membranes were incubated with the secondary antibody (anti-

rabbit) labeled with horseradish peroxidase (Dako) in a dilution of 1:1,000.

Finally, membranes were developed with the chemiluminescence ECL Western

blotting system (Amersham/Pharmacia, Barcelona, Spain) followed by apposition

of the membranes to autoradiographic films (Hyperfilm ECL, Amersham). The

monoclonal antibody to β-actin (Sigma) was used at a dilution of 1:5,000 as a

control of protein loading.

Densitometry and statistical processing of data

The immunohistochemical images were captured using AxisVision AC Real 4.5

program, an inverted microscope with a 20x objective, and an AxioCam IC Zeiss

camera. The selection was made manually including hippocampus or adjacent

temporal cortex. To analyze the image the Image J software was used

(

http://www.uhnresearch.ca/facilities/ wcif/fdownload.html). For each image, color

functions and color de-convolution, H DAB vectors: color 2 R: 0.26814753, G:

0.57031375, B: 0.77642715 were applied. The color 2 image (brown) was

inverted and the measurement was obtained as a percentage of the DAB

chromogen. Data were expressed as mean + standard error of the mean (SEM).

Comparisons between groups were performed using the independent samples T-

TEST. p values of less than 0.05 were considered statistically significant and

these are indicated in the figure as * p<0.05 and ** p<0.01.

Western blotting analysis was performed by measuring protein levels using

densitometry of all bands, measured with Total Lab v2.01 software. The results

were normalized with β-actin. Data were expressed as mean + SEM.

Comparisons among groups were performed with a one-way analysis of variance

(ANOVA) followed by Tukey post-hoc test. p values of less than 0.05 were

considered statistically significant and these are indicated in the figure as *

p<0.05 and ** p<0.01.

Mass spectrometry analysis of protein oxidative damage markers

The same animals used for gel electrophoresis and western blotting were utilized

for the study of brain lipid composition and oxidative stress markers (4 TgFe, 4

TgSb). The frontal and part of the parietal cortex were used for study.

The markers of protein oxidation--the protein carbonyls glutamic (GSA) and

aminoadipic (AASA) semialdehydes, glycoxidation (carboxyethyl-lysine CEL, and

carboxymethyl-lysine CML), and lipoxidation (malondialdehydelysine MDAL, and

CML)--were determined by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS).

The trifluoroacetic acid methyl ester derivatives of these five markers were

measured in acid hydrolyzed de-lipidated and reduced protein samples using an

isotope dilution method as previously described [31], with an HP6890 Series II

gas chromatograph (Agilent, Barcelona, Spain), an MSD5973A Series and a

7683 Series automatic injector, an HP-5MS column (30-m x 0.25-mm x 0.25-µm),

and the described temperature program [31]. Quantification was performed by

external standardization using standard curves constructed from mixtures of

deuterated and non-deuterated standards. Analyses were carried out by selected

ion-monitoring GC/MS (SIM-GC/MS). The ions used were lysine and [

]lysine,

m/z 180 and 187, respectively; 5-hydroxy-2-aminovaleric acid and [

]5-

hydroxy-2-aminovaleric acid (stable derivatives of GSA), m/z 280 and 285,

respectively; 6-hydroxy-2-aminocaproic acid and [

]6-hydroxy-2-aminocaproic

acid (stable derivatives of AASA), m/z 294 and 298, respectively; CML and

[

]CML, m/z 392 and 396, respectively; CEL and [

]CEL, m/z 379 and 383,

respectively; and MDAL and [

]MDAL, m/z 474 and 482, respectively. The

amounts of product were expressed as the µmolar ratio of GSA, AASA, CML,

CEL or MDAL/mol lysine.

Fatty acid analysis

Fatty acyl groups of brain lipids were analyzed as methyl ester derivatives by

GC/MS as previously described [31]. Separation was performed in an SP2330

capillary column (30 m x 0.25 mm x 0.20 µm) in a GC Hewlett Packard 6890

Series II gas chromatograph (Agilent). A Hewlett Packard 5973A mass

spectrometer was used as detector in the electron-impact mode. Identification of

fatty acyl methyl esters was made by comparison with authentic standards and

on the basis of mass spectra. Results are expressed as mol%. The following fatty

acyl indexes were also calculated: saturated fatty acids (SFA); unsaturated fatty

acids (UFA); monounsaturated fatty acids (MUFA); polyunsaturated fatty acids

from n-3 and n-6 series (PUFAn-3 and PUFAn-6); average chain length (ACL) =

[(Σ%Total14 x 14) + (Σ%Total16 x 16) + (Σ%Total18 x 18) + (Σ%Total20 x 20) +

(Σ%Total22 x 22)]/100]; double bond index (DBI) = [(1 x Σmol% monoenoic) + (2

x Σmol% dienoic) + (3 x Σmol% trienoic) + (4 x Σmol% tetraenoic) + (5 x Σmol%

pentaenoic) + (6 x Σmol% hexaenoic)], and peroxidizability index (PI) = [(0.025 x

Σmol% monoenoic) + (1 x Σmol% dienoic) + (2 x Σmol% trienoic) + (4 x Σmol%

tetraenoic) + (6 x Σmol% pentaenoic) + (8 x Σmol% hexaenoic)].

Statistical analyses

All values were expressed as means ± SEM. Comparisons between

experimental groups were statistically analyzed with Student’s t tests. The

minimum level of statistical significance was set at p < 0.05 in all the mass

spectrometry analyses.

Results

Immunohistochemistry

APP/PS1 mice treated neonatally either with iron or vehicle and killed at six

months presented Aβ plaques in hippocampus (Fig. 1 a1, b1) and temporal

cortex (Figure1 a2, b2). Aβ plaques were not observed in the hippocampus (Fig.1

c1, d1) and temporal cortex (Fig.1 c2, d2) in Wt mice irrespectively of neonatal

treatments. No significant differences in the number of plaques were seen in Tg

mice treated with iron when compared with Tg mice treated with vehicle alone

(data not shown).

In order to investigate the possibility of an inflammatory reaction in the tissue,

labeling of microglia cells using lectin showed no differences between both Wt

and Tg mice groups at six months of age treated with iron or sorbitol in the

neonatal period.

INSERT Fig 1 HERE

In contrast, statistical analysis of densitometric immunohistochemistry for GFAP

showed an increase in GFAP levels in the hippocampus (p< 0.05), but not in

temporal cortex, in Wt mice that received iron in comparison to the group treated

with vehicle alone in the neonatal period (Fig 2). Moreover, GFAP levels were

also significantly increased in the temporal cortex of APP/PS1 mice treated with

iron in comparison to the Tg group treated with vehicle alone (p< 0.05) (Fig. 3).

INSERT Fig 2 and Fig 3 HERE

________________________________________________________________

Western blotting

In order to confirm immunohistochemical findings, gel electrophoresis and

western blotting of total homogenates including the parietal cortex and

hippocampus was carried in Tg and Wt mice. Statistical comparison of GFAP

band optic density normalized with β-actin showed significant differences among

the different groups. Tukey post hoc test revealed that iron treatment in the

neonatal period produced an increase in GFAP expression levels in Wt mice

when compared with Wt mice treated with sorbitol alone (p< 0.01). Increased

GFAP expression was seen in Tg mice when compared with Wt independently of

neonatal iron exposure (p< 0.01) (Fig 4). Expression levels of GFAP in Tg mice

at six months treated with iron where higher, although not significantly so, when

compared with mice treated with sorbitol alone.

________________________________________________________________

INSERT Fig 4 HERE

________________________________________________________________

Fatty acid composition

Table I shows the fatty acid composition of brain lipids from both untreated and

treated APP/PS1 transgenic mice. Iron administration altered the fatty acid

composition of total brain lipids, so that the total number of double bonds (DBI)

and peroxidizability index (PI) was significantly decreased (p< 0.020 and p<

0.025, respectively). The fatty acids mainly responsible for the decrease in DBI

and PI were basically from the PUFA n-3 series. Thus, iron transiently

administered at neonatal period significantly increased, at the age of six months,

the levels of saturated fatty acids such as 16:0 (p< 0.027) and 18:0 (p= 0.05),

whilst it decreased the highly unsaturated eicosapentaenoic acid (20:5n-3) and

docosapentaenoic acids (22:5n-3). The content of the highly unsaturated

arachidonic acid (20:4n-6) and docosahexaenoic acid (22:6n-3) maintained

stable. No changes were detected for monounsaturated fatty acids and PUFA n-

6 contents. The membrane acyl composition indicated that the membranes

maintained a similar, even though slightly lower, fatty acid average chain length

(around 18 carbon atoms) in the Tg-Fe group when compared with the group

treated with sorbitol alone.

Oxidative stress markers

Concerning the steady-state level of the protein oxidative damage markers, the

concentrations of all the five different oxidative (the specific protein carbonyls

GSA and AASA), glycoxidative (CEL and CML) and lipoxidative (CML and

MDAL) markers analyzed were significantly decreased by iron treatment in the

Tg animal group (Table II). The mean magnitude of all these decreases taken

together was 23.0% in the brain of the Tg treated with iron when compared with

the group treated with sorbitol alone.

Discussion

The present findings have shown that transient iron intake during neonatal period

induces astrocytic gliosis in APP/PS1 transgenic mice and in age-matched

littermates at the age of six months, and that this change is not accompanied by

apparent differences in microglial reactions and, more particularly, in Aβ burden,

as revealed by the amount of β-amyloid plaques, in APP/PS1 transgenic mice at

least, within the range of the period studied. With minor differences, GFAP

changes are consistent with densitometry in GFAP immunostained sections and

gel electrophoresis and western blotting. Administration of iron at very early

stages of development resulting in very similar effects in APP/PS1 and age-

matched littermates points to the fact that Aβ metabolism has no role in iron

removal and later astrocytic responses in the neonatal period, in contrast to the

well-known interactions of Aβ and iron in older individuals [32]. Similarly, the lack

of differences regarding microglia does not give support to the concept that

soluble Aβ-metal complex may stimulate inflammatory responses and thereby

promote rapid phagocytosis of the peptide [33].

Acute and chronic brain insults trigger a specific glial reaction, generally known

as reactive astrogliosis, represented by a complex morphofunctional remodeling

of astrocytes [12].

GFAP expression also increases with ageing in the human

brain; astrocytes may respond to preclinical AD molecular pathology [34]. In line

with these observations in AD, recent studies have shown that the number of

astrocytes is significantly increased in the hippocampus in APP/PS1 mice

compared with age- and gender-matched wild-type littermates [10]. Exactly the

same results have been reproduced in the present study, thus indicating that

astrocytic gliosis is an early event in the course of APP/PS1-related pathology.

Additionally, and critically, iron administration during the neonatal period and later

effects are independent of the genetic substrate of the individual, as similar

astrocytic responses occur in APP/PS1 and wild-type littermates.

The brain is unique in its homeostatic management of iron in that saturation of

iron-handling proteins can occur more rapidly in the brain than in the peripheral

organs [20]. Iron accumulation and overload have been identified as a severe

toxic event affecting brain cells. At certain iron concentrations, the defenses of

brain cells may fail, and homeostatic mechanisms are overwhelmed. Under such

conditions, differential cellular responses in brain-associated cell types are

recruited to manage cell survival [20]. For instance, it has been demonstrated

that astrocytes are more resistant to free iron toxicity than neurons and brain

vascular endothelial cells, and may even provide transient protection to other

cells within the brain [20]. A similar response may also occur at less toxic doses

of iron, thus explaining astrocytic reactions in adult animals following neonatal

administration of 10.0 mg/Kg of body weight of iron carbonyl in postnatal days

12, 13 and 14.

Mechanisms leading to accompanying metabolic changes in the brain of adult

mice treated with iron in the neonatal period are difficult to follow as a single point

at the age of six months is available for study in APP/PS1 mice. Yet it can be

assumed, as a working hypothesis, that iron treatment during the neonatal period

may enhance Fenton-type reactions, leading to oxidative stress in this period.

These reactions may be followed by net flux of free radical generation leading to

protein modifications and membrane susceptibility to lipid peroxidation, as well as

qualitative and quantitative changes in cell types. Concerning protein

modifications, the percentage of change in the five measured markers of protein

oxidative damage, resulting in reduced glutamic and aminoadipic semialdehydes,

-carboxymethyl-lysine, N

-carboxyethyl-lysine and N

-malondialdehyde-lysine,

is compatible with a homeostatic response to one-time increased oxidative

damage [35]. Similarly, the changes in fatty acid composition are clearly

compatible with an adaptive response of brain to iron intake. Thus, the depletion

of 20 and 22 carbon n-3 precursors would reflect an attempt to spare the levels

of docosahexaenoic acid. The conserved docosahexaenoic levels, allowing for

the essential functions of this fatty acid in neurons, seem to confirm a successful

response. These changes in lipid composition lead to a lower lipid

peroxidizability, a fact that would also contribute to reduced protein oxidative

damage [36]. The results of fatty acid analyses and levels of protein oxidative

damage are complementary, and, taken together, reflect an adaptation to

increased oxidative damage geared to curve protein oxidative damage and lipid

peroxidizability. Whether these changes are specific to APP/PS1 transgenic mice

is not known, but in all likelihood they are not. Studies in a limited number of wild-

type littermates treated with iron or with sorbitol alone (n=2) per group) showed a

similar pattern as that observed in APP/PS1 mice (unpublished observations).

In summary, the present study shows that increased iron availability to the

nervous tissue at early stages of development in APP/PS1 mice results in

significant cellular (increased astrocytes and increased GFAP expression levels)

and metabolic (brain lipid composition, and reduced index of peroxidizability and

oxidative protein damage) responses that are maintained later in life. Although

these results suggest a permanent cellular and molecular defense to transient

iron overload during development, it may be questioned whether these changes

are protective or facilitators of later brain damage. The absence of increased

microglial responses, the lack of increased amyloid burden, together with

reduced index of lipid peroxidizability and oxidative protein damage in iron-

treated mice, are indicators of a scenario consistent with reduced vulnerability to

oxidative stress. Yet increased astrocytic gliosis usually reflects impaired

neuronal/glial homeostasis [12, 34, 37]. It is well documented that perinatal iron

deficiency is causative of brain damage persisting into adult life [38-42]. The

present findings clearly document that excess of iron during the neonatal period

also impacts in the cellular and molecular composition of the adult brain.

Furthermore, early Fe administration during development does not interfere with

the appearance of amyloid plaques in APP/PS1 transgenic mice.

Acknowledgements

LLF was a recipient of a CAPES/ MEC PDEE fellowship. Work carried out at the

Institute of Neuropathology was partially funded by grants from the Spanish

Ministry of Health, Instituto de Salud Carlos III PI080582. Work carried out at the

Department of Experimental Medicine was supported in part by R+D grants from

the Spanish Ministry of Science and Innovation (AGL2006-12433 and BFU2009-

11879/BFI), the Spanish Ministry of Health (ISCIII, Red de Envejecimiento y

Fragilidad, RD06/0013/0012 and PI081843), the Autonomous Government of

Catalonia (2009SGR735), ‘La Caixa’ Foundation, and COST B-35 Action. Alba

Naudí received a predoctoral fellowship from ‘La Caixa’ Foundation. We wish to

thank J. Visa, G. Muntané, and G. Santpere for animal treatment and care.

Thanks to T. Yohannan for editorial help.

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Table I. Fatty acyl composition (%) of total lipids in the frontal cortex of APP/PS1

transgenic mice treated with sorbitol (Tg sorbitol) or with iron (TgFe) during the

neonatal period and killed at six months of age. Values are means ± SEM from

n=4 samples. ACL: average chain length; SFA: saturated fatty acids; UFA:

unsaturated fatty acids; MUFA: monounsaturated fatty acids; PUFAn=3:

polyunsaturated n-3 fatty acids; PUFAn-6: polyunsaturated n-6 fatty acids; PI:

peroxidizability index .

Tg sorbitol Tg Fe p values

14:0

0.68±0.10 0.60±0.05 0.569

16:0

21.47±0.56 25.38±1.22 0.027

16:1n-7

0.52±0.07 0.80±0.15 0.143

18:0

19.20±0.26 21.04±0.72 0.054

18:1n-9

18.23±0.42 18.55±0.50 0.633

18:2n-6

4.31±0.26 2.97±0.23 0.008

18:3n-3

0.13±0.02 0.91±0.47 0.152

18:4n-6

0.16±0.02 0.17±0.03 0.628

20:0

0.27±0.02 0.32±0.09 0.618

20:1n-9

1.01±0.05 1.09±0.07 0.409

20:2n-6

0.33±0.02 0.26±0.08 0.438

20:3n-6

0.32±0.04 0.33±0.03 0.742

20:4n-6

7.26±0.50 7.62±0.29 0.560

20:5n-3

8.23±1.26 4.82±1.27 0.078

22:0

1.16±0.08 0.90±0.15 0.163

22:4n-6

2.43±0.45 2.04±0.04 0.423

22:5n-6

0.46±0.11 0.41±0.04 0.678

22:5n-3

2.34±0.59 0.71±0.09 0.034

24:0

0.74±0.09 0.43±0.09 0.050

22:6n-3

9.70±1.46 9.94±0.34 0.878

24:5n-3

0.49±0.08 0.30±0.05 0.103

24:6n-3

0.56±0.09 0.40±0.02 0.129

ACL

18.63±0.04 18.36±0.06 0.014

SFA

43.52±0.83 48.67±1.29 0.015

UFA

56.48±0.83 51.33±1.29 0.015

MUFA

19.76±0.31 20.45±0.56 0.330

PUFA

36.71±0.69 30.89±1.55 0.014

PUFAn-3

21.45±0.60 17.07±1.13 0.014

PUFAn-6

15.26±0.66 13.81±0.52 0.136

DBI

188.96±4.39 163.20±6.86 0.020

196.65±5.86 165.71±8.68 0.025

Table II. Markers of oxidative damage in frontal cortex in APP/PS1 mice treated

with iron (TgFe) in vehicle or with sorbitol alone (Tg) in neonatal period and killed

at the age of six months. Values are means ± SEM from n=4 samples. GSA:

Glutamic semialdehyde; AASA: aminoadipic semialdehydes; CML: N

carboxymethyl-lysine; CEL: N

-carboxyethyl-lysine; MDAL: N

-malondialdehyde-

lysine. Units: µmol/mol lysine.

Tg Sorbitol Tg Fe p (Tg vs TgFe)

GSA

6885.50±314.48 5987.27±155.05 0.034

AASA

86.88±3.63 64.59±2.92 0.001

CEL

270.17±10.40 212.93±6.80 0.002

CML

352.37±25.20 233.11±14.38 0.003

MDAL

1263.65±96.18 938.03±29.30 0.012

Figures

Fig 1. Representative histological sections of Aβ immunohistochemistry of

hippocampus (1) and temporal cortex (2) of (a) TgFe group; (b) TgSb group; (c)

WtFe group; (d) WtSb group show amyloid plaques. Magnification: 20x. No

differences among groups are observed.

Fig 2. Representative histological sections of GFAP immunohistochemistry of the

hippocampus and temporal cortex of WtFe and WtSb groups show

immunostained astrocytes. Magnification: 20x (a). Statistical analysis reveals a

significant increase in GFAP in the hippocampus of Wt animals that received iron

(* p < 0.05, independent samples t-test) (b).

Fig 3. Representative histological sections of GFAP immunohistochemistry of the

hippocampus and temporal cortex of TgFe and TgSb groups show

immunostained astrocytes. Magnification: 20x (a). A significant increase in GFAP

is observed in the temporal cortex of transgenic animals that received iron

(**p<0.01, independent samples t-test) (b).

Fig 4. Western blot analysis of GFAP in 1: WtSb (n=11); 2: WtFe (n=6); 3: TgSb

(n=8); and 4: TgFe (n=9). Increased expression levels of GFAP are seen in WtFe

group versus WtSb, and in TgSb group versus WtSb; ** p<0.001.

CAPÍTULO 5

1. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O ferro tem sido descrito como um elemento importante na participação

dos mecanismos da neurodegeneração (BOSSY-WETZEL, 2004).

Nossos achados demonstraram que administração transitória de ferro

durante o período neonatal induz a uma gliose astrocítica em camundongos

transgênicos APP/PS1 e em camundongos selvagens na idade de seis meses, e

esta alteração não é acompanhada de diferenças aparentes em reações

microgliais e especialmente na formação de placas reveladas pela quantidade

de β-Amilóide, nos camundongos transgênicos APP/PS1 ao menos no período

estudado. Alterações na GFAP foram consistentes na densitometria de GFAP

em cortes imunocorados e em gel de eletroforese por western blotting.

Encontramos também que a ingesta transitória de ferro durante o período

neonatal induz gliose astrocítica em ratos adultos (3 meses) e velhos (24

meses), em diferentes regiões. Nos ratos adultos encontramos aumento da

GFAP no hipocampo e em ratos velhos, no estriado e substancia negra. Esta

alteração não foi acompanhada de diferenças aparentes no β-amilóide, tau

fosforilada e nem em α-sinucleína.

Portanto, a administração de ferro em estágios precoces do

desenvolvimento parece não interferir no metabolismo do β-amilóide tanto em

ratos como em camundongos transgênicos APP-PS1 nem em reação microglial

(camundongos transgênicos) em contraste com interações bem-estabelecidas

do β-A e ferro em indivíduos idosos (Kontush, 2004; BISHOP, 2004). Da mesma

forma, a falta de efeito em relação a α-sinucleína e tau fosforilada em ratos não

dão suporte à hipótese que o ferro acelera a agregação de α-sinucleína na

formação de corpos de Lewy (MOLIN-HOLGADO, 2007; GAETA, 2005; SAYRE,

2005) nem na modificação dos padrões de fosforilação da tau (EGAÑA, 2003).

Mecanismos que levam a alterações metabólicas no cérebro de

camundongos adultos tratados com ferro no período neonatal são difíceis de

caracterizar somente avaliando camundongos APP-PS1 com seis meses de

idade. Porém, podemos assumir como hipótese que o ferro durante o período

neonatal pode ter aumentado reações do tipo Fenton levando a um estresse

oxidativo neste período. Estas reações podem ter sido seguidas por um fluxo de

geração de radicais livres que levaram a modificações de proteínas e membrana

suscetíveis a peroxidação lipídica, tanto quanto a alterações qualitativas e

quantitativas em tipos celulares. A despeito de modificações protéicas, a

percentagem de alterações em cinco marcadores de dano oxidativo proteico,

resultando em diminuição semialdeídos glutâmico e aminodípico, N

carboximetil-lisina, N

-carboxietil-lisina and N

-malondialdeido-lisina, é

compatível com resposta homeostática a aumento do dano oxidativo prévio

(BREUSING, 2008).

Semelhantemente, alterações na composição de ácidos graxos são

claramente compatíveis com uma resposta adaptativa do cérebro a ingesta de

ferro. Então, a depleção de precursores 22 e 24 carbonos poderia refletir uma

tentativa de poupar níveis de ácido docosahexaenóico. A conservação de níveis

de docosahexaenoico, permitindo funções essenciais de ácidos graxos nos

neurônios, parece confirmar uma resposta bem sucedida. Estas alterações na

composição lipídica levam a menor capacidade peroxidativa, fato que poderia

contribuir para um dano oxidativo proteico reduzido (PAMPLONA, 2008). Os

resultados das análises de ácidos graxos e dano oxidativo proteico são

complementares e juntos refletem uma adaptação ao aumento de dano oxidativo

gerado para reverter o rumo do dano oxidativo proteico e da capacidade

peroxidativa lipídica.

Em resumo, o presente estudo demonstra que uma disponibilidade

aumentada de ferro para o tecido nervoso em estágios precoces do

desenvolvimento de camundongos APP-PS1 e ratos resulta em resposta celular

significante (aumento de astrócitos e aumento de níveis de expressão de GFAP)

assim como resposta metabólica (composição lipídica cerebral, e redução de

índice da capacidade peroxidativa e dano oxidativo protéico em camundongos

APP-PS1) mantidos em fases mais tardias da vida.

Apesar destes resultados sugerirem defesa celular e molecular

permanente à sobrecarga de ferro durante o desenvolvimento, pode-se

questionar se estas alterações são protetoras ou facilitadoras de dano cerebral

tardio. A ausência de um aumento de resposta microglial, ausência de aumento

β-A, α-sinucleína, tau fosforilada, junto com redução do índice de capacidade

peroxidativa lipídica e dano oxidativo protéico em camundongos e ratos, são

indicadores de um cenário consistente com redução de vulnerabilidade a

estresse oxidativo. Mas o aumento de gliose astrocítica geralmente reflete dano

na homeostase neurônio/glial (RODRIGUEZ, 2009; WHARTON, 2009;

SALMIRA, 2009). Está bem documentado que uma deficiência de ferro neonatal

é causa de dano cerebral persistente no adulto (WU, 2008, GEORGIEFF, 2008;

TRAN, 2009; CARLSON, 2009; COLLARD, 2009). Os resultados deste trabalho

claramente demonstram que um excesso do ferro durante o período neonatal

também impacta na composição celular e molecular do cérebro adulto.

CAPÍTULO 6

1. CONCLUSÕES

• Nenhuma modificação no β-A, tau fosforilada e α-sinucleína foi

detectada em ratos adultos e velhos tratados e não tratados com ferro

no estriado, hipocampo e substancia negra.

• Aumento de astrocitose, revelada pela densitometria de GFAP-

astrócitos imunoreativos, foi encontrado no hipocampo de ratos

adultos tratados com ferro e no estriado e substância negra de ratos

velhos.

• Nenhuma diferença significativa no número de placas foi encontrada

nos camundongos trangênicos APP-PS1 tratados com ferro ou

somente veículo.

• Aumento de astrocitose, revelado pela densitometria de GFAP-

astrócitos reativos e por gel de eletroforese em western blotting, em

camundongos transgênicos APP/PS1 e em camundongos selvagens

com seis meses de idade foi encontrado no hipocampo e córtex

temporal dos animais tratados com ferro neonatal.

• Nenhuma diferença na reação microglial foi encontrada em

camundongos transgênicos APP-PS1 e selvagens tratados e não

tratados com ferro neonatal.

• Gliose astrocítica é um evento precoce no curso da patologia

relacionada com APP/PS1.

• A administração do ferro durante o período neonatal e seus efeitos

tardios independe do substrato genético do indivíduo, já que a

resposta astrocítica ocorre em animais transgênicos e em selvagens.

• Os resultados das análises dos ácidos graxos e dos níveis de dano

oxidativo proteico são complementares, e, juntos, refletem uma

adaptação a um aumento de dano oxidativo gerado em algum

momento.

• Em resumo, o presente estudo demonstra que um aumento na

disponibilidade de ferro para o tecido nervoso em estágios precoces

do desenvolvimento de ratos e camundongos transgênicos APP/PS1

resulta em resposta significante celular (aumento de astrócitos e

aumento dos níveis de expressão da GFAP) e metabólica

(composição lipídica, e índice reduzido de capacidade peroxidativa e

dano oxidativo protéico em camundongos) que são mantidos em fases

tardias da vida.

• Os achados presentes claramente documentam que o excesso de

ferro durante o período neonatal impacta na composição celular e

molecular do cérebro adulto.

• Estas observações podem encorajar futuros estudos focados nos

efeitos da suplementação de ferro na dieta de crianças.

CAPÍTULO 7

1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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102

ANEXO I

1. Comprovante de Submissão do Artigo Científico do Capítulo 4

103

ANEXO 1

Journal of Alzheimer's Disease

History of Manuscript 09-901

"Effects of increased iron intake during the

neonatal period on the brain of adult APP/PS1

transgenic mice"

Date

Action

2009-08-

Out For Review

2009-08-

Assigned to Editor (Smith)

2009-08-

Record Created/Needs Editor

Assigned

2009-08-

Acknowledgment Sent to

Author

2009-08-

Manuscript Accessioned

2009-08-

Manuscript Submitted

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