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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO – OESTE – UNICENTRO-PR
AVALIAÇÃO DA CORRELAÇÃO DE ÍONS METÁLICOS E
COMPOSTOS FENÓLICOS EM PLANTAS MEDICINAIS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
GISELI DUCAT
GUARAPUAVA – PR
2009
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GISELI DUCAT
AVALIAÇÃO DA CORRELAÇÃO DE ÍONS METÁLICOS E COMPOSTOS
FENÓLICOS EM PLANTAS MEDICINAIS
Profª Drª Sueli Pércio Quináia
Orientadora
Profª Drª Yohandra Reyes Torres
Coorientadora
GUARAPUAVA – PR
2009
Dissertação apresentada à Universi
dade
Estadual do Centro-
Oeste, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação
em Química Aplicada, área de concentração
em Metodologias
Analíticas e Aplicações,
para obtenção do título de Mestre.
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GISELI DUCAT
AVALIAÇÃO DA CORRELAÇÃO DE ÍONS METÁLICOS E COMPOSTOS
FENÓLICOS EM PLANTAS MEDICINAIS
Aprovada em 31 de agosto de 2009
Prof. Dr. Membro da Banca: Gilberto Abate
Prof. Dr. Membro da Banca: Ricardo Celeste
Profª Drª Sueli Pércio Quináia
Orientadora
GUARAPUAVA – PR
2009
Dissertação apresentada à Universi
dade
Estadual do Centro-
Oeste, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação
em Química Aplicada, área de concentração
em Metodologias Analíticas e Ap
licações,
para obtenção do título de Mestre.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à Deus por ter me dado força, coragem, e pelas pessoas maravilhosas que
colocou em minha vida.
A minha família pelo incentivo.
A minha orientadora pela dedicação, paciência, carinho e conhecimentos transmitidos para a
efetivação deste trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação da UNICENTRO e seus professores pelos ensinamentos.
A UNICENTRO pelas instalações para realização do trabalho.
Aos amigos pelo apoio, em especial a Sirlene Adriana Kleinübing pelo carinho, ajuda e
dedicação.
Aos colegas de laboratório pela ajuda e atenção: Daiane Finger, Daniele Stock, Tais H. Justo,
Loyse Tussolini.
À professora Herta Stutz Dalla Santa pelo carinho, atenção, disponibilidade do laboratório de
microbiologia do Departamento de Engenharia de Alimentos e auxílio para a realização dos
testes antimicrobianos.
Às professoras Yohandra Reys Torres e Ísis K. Caetano pelo apoio e materiais.
À CERCCOPA, pelas amostras doadas.
Ao Sr. Télcio Silveira pelo histórico da CERCCOPA.
SUMÁRIO
Lista de Símbolos e Abreviaturas …........................................................................................i
Resumo......................................................................................................................................iii
Abstract.....................................................................................................................................iv
1. Introdução..............................................................................................................................1
2. Objetivos ...............................................................................................................................3
3. Referencial Teórico ..............................................................................................................4
3.1. Cultivo de plantas medicinais .............................................................................................4
3.1.1. Calêndula (Calendula officinalis L.).................................................................................6
3.1.2. Capim – limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf) …………………………………….8
3.1.3. Espinheira – santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek )...............................................9
3.2. Essencialidade dos minerais...............................................................................................10
3.2.1. Função dos minerais no organismo humano...................................................................12
3.2.2. Íons metálicos não essenciais.........................................................................................17
3.2.3. Função dos minerais nas plantas....................................................................................21
3.2.3.1. Macronutrientes...........................................................................................................21
3.2.3.2. Micronutrientes............................................................................................................23
3.3. A toxicidade das plantas medicinais..................................................................................26
3.4.Compostos fenólicos em plantas medicinais......................................................................27
3.5. Atividades biológicas nas plantas......................................................................................30
3.6. Métodos de análise quantitativa de íons metálicos e compostos fenólicos em plantas
medicinais.................................................................................................................................32
4. Materiais e Métodos ...........................................................................................................34
4.1.Instrumental .......................................................................................................................34
4.2. Amostras e reagentes.........................................................................................................35
4.3. Testes antimicrobianos .....................................................................................................36
4.4. Parte experimental............................................................................................................. 36
4.4.1. Obtenção dos extratos etanólicos ...................................................................................36
4.4.2. Determinação do teor de íons metálicos extraídos nas infusões aquosas ......................37
4.4.3. Determinação do teor total de íons metálicos nas plantas medicinais ...........................37
4.4.4. Determinação do teor de íons metálicos extraídos nos extratos etanólicos....................37
4.4.5. Quantificação de fenóis totais pelo método Folin – Ciocalteu ......................................38
4.4.6. Quantificação de flavonóides por complexação com cloreto de alumínio ....................39
4.4.7. Avaliação da atividade antimicrobiana...........................................................................40
4.4.7.1. Teste de difusão em ágar..............................................................................................40
4.4.7.2. Teste da concentração inibitória mínima– CIM...........................................................40
4.4.7.3. Teste de concentração bactericida mínima –CBM......................................................41
4.4.8. Análises das correlações entre os parâmetros avaliados.................................................42
5. Resultados e Discussão.. .....................................................................................................43
5.1. Determinação de íons metálicos na água de infusão e nas plantas medicinais .................43
5.2. Determinação do teor de íons metálicos essenciais e não essenciais nos EEP70% e
EEP95% ...................................................................................................................................50
5.3. Determinação de ácidos fenólicos nos EEP70% e EEP95% e nas águas de infusão das
plantas medicinais ....................................................................................................................53
5.4. Determinação quantitativa de flavonóides nos EEP70% e EEP95% e nas águas de
infusão. .....................................................................................................................................58
5.5. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos e das águas de infusão ........................59
5.6. Estudo quimiométrico........................................................................................................63
6. Conclusões ...........................................................................................................................78
7. Trabalhos Futuros ..............................................................................................................79
8. Referências Bibliográficas..................................................................................................80
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
OMS – Organização Mundial de Saúde
WHO – World Health Organization
UV – vis – ultravioleta visível
CERCCOPA – Central Regional de Comercialização do Centro Oeste do Paraná
RURECO – Fundação para o desenvolvimento econômico e rural do Centro – Oeste do
Paraná.
EUA – Estados Unidos da América
FDA – Food and Drug Administration
EMEA – European Medicines Agency
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
RDA – Recommended Dietary Allowance/Recomendações nutricionais diárias
FAAS – espectrometria de absorção atômica com chama
ICP – OES – espectrometria de emissão óptica com acoplamento de plasma induzido
ICP – MS – espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado
ATP – trifosfato de adenosina
AMPc – monofosfasto de adenosina cíclico
DNA – ácido desoxirribonucléico
RNA – ácido ribonucléico
ESADDI – estimated safe and adequate daily dieteary intake (ingestão dietética diária
considerada segura e adequada)
LD – limite de detecção
EEP70 – extrato etanólico de plantas 70%
EEP95 – extrato etanólico de plantas 95%
ATCC – American Type Culture Collection
TSB – tripticase soy broth
TSA – ágar tripticase de soja
NCCLS/CLSI - National Committee for Clinical Laboratory Standards
CIM – concentração inibitória mínima
CBM – concentração bactericida mínima
ACP – análise dos componentes principais
CA – calêndula
CL – capim limão
ES – espinheira santa
CL70% - extrato etanólico 70% de capim-limão
CL 95% - extrato etanólico 95% de capim-limão
CA 70% - extrato etanólico 70% de calêndula
CA 95% - extrato etanólico 95% de calêndula
ES 70% - extrato etanólico 70% de espinheira-santa
ES 95% - extrato etanólico 95% de espinheira-santa
ESINF – espinheira santa em infusão aquosa
CLINF – capim limão em infusão aquosa
CAINF – calêndula em infusão aquosa
ESFL – espinheira santa na folha calcinada
CLFL – capim limão na folha calcinada
CAFL – calêndula na folha calcinada
RESUMO
Giseli Ducat. Plantas Medicinais, Metais, Fenólicos, Flavonóides, Atividade Antimicrobiana.
A utilização de plantas para fins medicinais tem se tornado um recurso terapêutico alternativo
de grande aceitação pela população mundial e vem se desenvolvendo juntamente com a
comunidade médica, desde que sejam empregadas plantas cujas atividades biológicas tenham
sido comprovadas cientificamente, confirmando sua eficácia e segurança (CECHINEL &
YUNES,1998; KINGHORN,2001). Além disso, a importância das plantas deve-se por sua
contribuição como fonte natural de fármacos. Esta pesquisa teve como objetivos determinar o
teor de metais essenciais e não essenciais ao organismo humano em infusões aquosas, em
amostras calcinadas e em extratos etanólicos 70% e 95% v/v obtidos a partir de plantas
medicinais, através da técnica de espectrometria de absorção atômica em chama, avaliar o teor
de fenóis totais e flavonóides nas infusões aquosas e nos extratos etanólicos, através da
espectrofotometria UV-vis nos comprimentos de onda 760 e 425 nm, respectivamente e ainda
verificar a ação antimicrobiana dos extratos etanólicos e infusões aquosas, através da técnica
de difusão em ágar. As plantas avaliadas foram a calêndula (Calendula officinalis L.), o
capim-limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf) e a espinheira-santa (Maytenus ilicifolia
Mart. ex Reissek ) cultivadas e comercializadas pela população na região de Guarapuava -
PR. Os resultados obtidos mostraram que a extração dos metais nas infusões variou entre 6,2
a 68,2% do total encontrado em cada planta; os metais tóxicos foram encontrados apenas nas
amostras calcinadas. O extrato etanólico 70% do capim- limão apresentou o maior teor de
fenóis e flavonóides. Os extratos de espinheira- santa 70% e 95%, capim limão 70% e 95% e
calêndula 95% apresentaram atividade antimicrobiana importante frente à Klebsiella sp.
Palavras – chaves: plantas medicinais, metais, fenólicos, flavonóides, ação antimicrobiana.
ABSTRACT
Giseli Ducat. Medicinal Plants, Metals, Phenolics, Flavonoids, Antimicrobial Activity
The use of medicinal plants has become an alternative therapy of great acceptance by the
population and the medical community. Physicians prescribe medicinal plants and
phytotherapics whose biological activities, effectiveness and safety have been scientifically
investigated and proved (CECHINEL & YUNES,1998; KINGHORN,2001). Plants are also
resources of active principles used as models in the synthesis of modified compounds with
improved activity and lesser toxic effects. This research aimed to determine by flame atomic
absorption spectrometry the concentration of essential and no essential metals in aqueous
infusions, in roasted plant samples and in 70% and 95% v/v ethanolic extracts. The quantity
of total phenols and flavonoids in the aqueous infusions and in the ethanolic extracts were
further determined through UV-vis spectrometry at 760 and 425 nm, respectively.
Additionally, the antimicrobial activity of the ethanolic extracts and aqueous infusions was
assayed by the diffusion technique in agar. The appraised plants were the marigold
(Calendula officinalis L.), the grass lemon (Cymbopogon citratus (DC) Stapf) and the
“espinheira-santa” (Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reissek) cultivated and marketed in
Guarapuava – PR region. The obtained results showed that metals extraction in the infusions
varied among 6,2 to 68,2% of the total amount found in each plant; the poisonous metals were
just found in the roasted samples. The 70% ethanolic extract of grass lemon presented the
largest amount of total phenols and flavonoids. The 70% and 95% espinheira santa and grass
lemon extracts and 95% marigold extracts showed important antimicrobial activity against
Klebsiella sp.
Keywords: medicinal plants, metals, phenolics, flavonoids, antimicrobial activity
1. INTRODUÇÃO
Os vegetais de modo geral fazem parte da vida do homem desde quando ele começou
a usá – los como fonte de alimentos, de materiais para o vestuário, habitação, utilidades
domésticas, na produção dos meios de transporte, e na cura e prevenção de doenças através do
uso de plantas medicinais. Sua importância, medida pela intensidade de seu uso transcende os
diversos estágios de desenvolvimento da sociedade. Atualmente representam uma das
alternativas entre as diversas fontes de insumos necessários à existência da sociedade, tendo
como principal vantagem o fato de ser uma fonte renovável e, em grande parte, controlável
pelo homem (LORENZI & MATOS,2002).
Em todo o mundo tem sido realizadas pesquisas sobre as virtudes das plantas
medicinais, seja para fins alimentícios, cosméticos ou medicinais (VOLPATO et al,2001; LU
& FOO, 2001; KUMAR et al,2005; LOZAK et al, 2002). A Organização Mundial da Saúde
(OMS) estima que 80% da população mundial utiliza as plantas medicinais como principal
recurso no atendimento básico de saúde. A utilização de plantas medicinais, prática
tradicional ainda existente entre os povos de todo o mundo, tem recebido incentivos da
própria Organização Mundial de Saúde (WHO, 2002).
Em consequência do aumento na demanda por produtos a base de plantas medicinais,
que ocorreu devido o aumento significativo do interesse do público brasileiro pelas "terapias
naturais", faz-se necessário investigar como esses produtos estão sendo ofertados ao
consumidor, de acordo com a legislação específica e critérios estabelecidos cientificamente
(MELO et al 2007).
Muitos compostos estão presentes nas plantas medicinais, entre eles, compostos
fenólicos, originados do metabolismo secundário que possuem propriedades antioxidantes,
onde diversos extratos de plantas vêm sendo estudados, como a sálvia (LU & FOO, 2001),
coentro (MELO et al 2003), alecrim (RAMALHO, 2005), etc. Além das propriedades
antioxidantes, muitos óleos essenciais e extratos tem sido estudados pela sua atividade
antimicrobiana, como o capim-limão(SCHUCK et al, 2001; ONAWUNMI et al, 1984),
carqueja (AVANCINI et al, 2000), calêndula (VOLPATO et al,2001), entre outros
(GONÇALVES et al, 2006).
Existem também diversas pesquisas sobre o teor de minerais presentes em plantas
medicinais, visto que estes são imprescindíveis para a nutrição humana (FERNANDEZ et al,
2002; ALMEIDA et al 2002; RASHED, 1995).
Na região de Guarapuava-PR, a produção de plantas medicinais cresceu
consideravelmente e contou com a criação da cooperativa CERCCOPA que possui estruturas
de armazenamento, beneficiamento de mel, cera de abelhas e plantas medicinais, a qual
comercializa no atacado e varejo, no Paraná e em diversos estados do Brasil. Comercializa
ainda outros produtos como material apícola, própolis, etc. Hoje a CERCCOPA atinge
diretamente aproximadamente 350 famílias com a cadeia produtiva de mel e plantas
medicinais, com atuação em 09 municípios da região (Pinhão, Turvo, Pitanga, Santa Maria do
Oeste, Boa Ventura de São Roque, Nova Tebas, Cantagalo, Virmond e Laranjeiras do Sul).
Nos últimos 10 anos, o processo organizativo na região cresceu e foi se especializando por
cadeia produtiva. Surgiram as cooperativas de crédito e mais recentemente as cooperativas da
cadeia do leite. A produção de plantas medicinais para esta região tem importância sócio-
econômica, além do agro-negócio e da agroecologia.
Este trabalho destaca três plantas medicinais cultivadas e utilizadas pela população de
Guarapuava – PR: calêndula (Calendula officinalis L.), espinheira-santa (Maytenus ilicifolia
Mart. ex Reissek) e capim – limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf). O objetivo principal
foi caracterizar parcialmente estas plantas através da quantificação de íons metálicos
essenciais e não essenciais para o organismo humano na água de infusão, em amostras
calcinadas e em extratos etanólicos, pela técnica de espectrometria de absorção atômica em
chama, visto que íons metálicos são imprescendíveis para o organismo humano. Também foi
determinado o teor de fenólicos totais e flavonóides por espectrofotometria Uv-vis, pois estas
substâncias são consideradas antioxidantes. Como a população tem o hábito de consumir chás
para diversas moléstias, neste trabalho também foi avaliada a atividade antimicrobiana da
água de infusão e dos extratos etanólicos frente a alguns micro-organismos. Ao término do
estudo aplicou-se uma ferramenta estatística aos dados obtidos a fim de avaliar uma possível
correlação entre os íons metálicos, os compostos orgânicos e a ação antimicrobiana das
infusões e extratos alcoólicos.
2. OBJETIVOS
Geral:
- Caracterizar parcialmente as seguintes plantas medicinais: calêndula (Calendula
officinalis L.), capim-limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf), espinheira-santa
(Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek) cultivadas na região de Guarapuava-PR pela
determinação de compostos orgânicos e inorgânicos presentes nas mesmas.
Específicos:
- Quantificar os íons metálicos essenciais e não essenciais para o organismo humano na
água de infusão das plantas calêndula, espinheira-santa e capim-limão;
- Quantificar os íons metálicos totais essenciais e não essenciais nas plantas após o
processo de calcinação (digestão via seca);
- Quantificar os íons metálicos essenciais e não essenciais para o organismo humano nos
extratos etanólicos;
- Quantificar os ácidos fenólicos e flavonóides presentes nos extratos etanólicos e na água
de infusão das plantas;
- Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos e na água de infusão das
plantas.
- Aplicar ferramentas estatísticas aos resultados obtidos a fim de conhecer possíveis
correlações entre os íons metálicos e os compostos fenólicos existentes nas plantas.
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Cultivo de plantas medicinais
Desde a antiguidade, os homens buscam na natureza recursos para melhorar suas
próprias condições de vida e aumentar suas chances de sobrevivência. O uso de plantas como
alimento sempre existiu e a este se incorporou a busca de matéria prima para a confecção de
roupas e ferramentas, além de combustível para o fogo (LORENZI & MATOS, 2002).
Atualmente o uso de plantas com propriedades farmacêuticas tem aumentado
significativamente. Além disso, as plantas medicinais desempenham um papel importante na
saúde publica, especialmente em países em desenvolvimento.
No Brasil, o uso de extratos vegetais para o tratamento de algumas doenças é um
hábito totalmente difundido. Esse hábito pode ser explicado, pelo menos em parte, pela crença
que plantas com efeitos terapêuticos não causam efeitos tóxicos no organismo (BOSSOLANI,
2000). A flora brasileira é estimada em aproximadamente entre 40.000 a 60.000 espécies
vegetais. O Brasil também é conhecido por possuir uma medicina tradicional muito rica, que
pode ser explicado considerando sua população multiracial, ou seja, o resultado de uma
miscigenação cultural.
(
FARNSWORTH & SOEJARTO
,
1991; ENGELKE, 2004
).
Diversas investigações têm provado que as plantas medicinais contêm diversas classes
de compostos como polifenóis, alcalóides, taninos, carotenóides, terpenóides, etc., (ARABBI
et al, 2004; ARAÚJO 2007; HAMBURGER et al, 2003; LEITE et al, 2001; NOSSACK et al,
2000). Entre essas classes estão os flavonóides e os ácidos fenólicos, que são conhecidos por
exibir várias propriedades farmacológicas como vasoprotetoras, anticarcinogênicas, antivirais,
anti-inflamatórias, bem como antialérgico, algumas dessas propriedades tem sido relacionadas
à ação desses compostos como antioxidantes (CARBAJAL et al, 1989; HAMBURGER et al,
2003; HOLETZ et al, 2002; PUATANACHOKCHAI et al, 2002; RUNNIE et al, 2004;
SARTORI et al,2003).
No início da década de 80, os pequenos agricultores da região Centro Oeste do Paraná,
principalmente os que viviam sob o regime de economia familiar, buscaram entre as várias
formas produzir e resistir na terra à formação de associações, de caráter econômico. Com
objetivos diversos (produção, compra de equipamentos coletivos, prestação de serviços,
assistência técnica e comercialização), de forma articulada, os pequenos produtores foram se
organizando em grupos informais, associações comunitárias, municipais, centrais, etc.
Este processo organizativo se constituiu num importante instrumento na busca de
alternativas de produção, tendo como base a agroecologia, o desenvolvimento sustentável e a
organização de cadeias produtivas, como a do mel, plantas medicinais, leite, criação de fundos
de crédito rotativo, etc. Buscaram-se com isso, a melhoria da renda das famílias envolvidas e
sua fixação na terra, num período que o modelo de desenvolvimento agrícola, vinha excluindo
do campo, milhares de pequenos agricultores todo ano.
Como resultados deste processo foram constituídos neste período, mais de 80
associações comunitárias que deram origem a cinco associações com abrangência municipal.
Este trabalho associativo, articulado com o movimento sindical, dos trabalhadores rurais,
assessorado pela fundação RURECO, iniciou o debate que deu origem a fundação da Central
Regional de Comercialização do Centro Oeste do Paraná – CERCCOPA (Figura1).
Figura 1. Foto externa da CERCCOPA (Guarapuava – PR)
A CERCCOPA nasceu da necessidade dos agricultores familiares que participavam
deste processo organizativo, de se ter na região, uma entidade que pudesse articular, orientar,
defender e propor políticas de desenvolvimento local, a partir das necessidades e ações
realizadas nas comunidades juntos a estas famílias. As plantas medicinais cultivadas pelos
agricultores e comercializadas pela CERCCOPA, incluem: alcachofra (Cynara scolymus L.),
alecrim (Rosmarinus officinalis L.), arnica (Solidago microglossa), calêndula (Calendula
officinalis L.), camomila (Matricaria chamomilla L.), capim-limão (Cymbopogon citratus
(DC) Stapf.), carqueja (Baccharis genistelloides), cavalinha (Equisetum sp.), chapéu-de-couro
(Echinodorus macrophyllus), erva-de-são-joão (Hypericum perforatum L.), espinheira-santa
(Maytenus illicifolia), funcho (Foeniculum vulgare), guaçatonga (Casearia sylvestris Sw.),
guaco (Mikania glomerata Spreng.),ginkgo (Gingko biloba L.), hortelã (Mentha piperita L.),
macela (Achyrocline satureoides DC), manjerona (Origanum majorana), maracujá
(Passiflora edulis), melissa (Melissa officinalis L.), pata-de-vaca (Bauhinia forficata), poejo
(Menta pulegium), sálvia (Salvia officinalis), sete-sangrias (Cuphea carthaginensis),
tanchagem (Plantago australis). A seguir encontra-se a descrição de três plantas selecionadas
como objeto de estudo deste trabalho.
3.1.1 Calêndula (Calendula officinalis L.)
A calêndula pertence à família Asteracea Compositae, a mesma família da margarida,
nativa das Ilhas Canárias e região Mediterrânea. É uma planta herbácea anual, ereta,
ramificada de 30 – 60 cm de altura, suas folhas são simples, sésseis, de 6 – 12 cm de
comprimento, suas flores são amarelas ou alaranjadas (Figura 2), dispostas em capítulos
terminais grandes, multiplica-se por semente (LORENZI & MOREIRA, 2001). É cultivada
em toda zona temperada do mundo, é muito cultivada no Brasil para fins ornamentais,
havendo variedades especialmente desenvolvidas para jardins. Vegeta em vários tipos de
solos, desde que ricos em matéria orgânica. A espécie se adapta bem aos solos férteis e
úmidos, com iluminação plena (LORENZI & MATOS, 2002).
É amplamente utilizada em todo o mundo na medicina tradicional desde a Idade
Média, havendo inclusive hoje variedades mais apropriadas para este fim. Seus principais
constituintes são óleos essenciais ricos em carotenóides: caroteno, calendulina e licopina,
flavocromo, mutacromo, aurocromo, favoxantina, crisantemazantina e xantofila, além de
flavonóides, corantes (TESKE & TRENTINI, 2001, GAZIM et al 2007), monoésteres de
faradiol (HAMBURGER et al, 2003).
Seu óleo essencial estimula a granulocitose e fagocitose
auxiliando no combate às infecções. Pela sua ação cicatrizante diminui a gastrite e a úlcera
gástrica. Testes clínicos comprovaram sua ação antitumoral. O óleo de calêndula é indicado
em casos de fissura de mamilo devido à amamentação, não sendo prejudicial ao lactante
(TESKE & TRENTINI, 2001).
A calêndula é uma planta medicinal muito popular na Europa e nos EUA, já foi
monografada em várias farmacopéias nacionais, e em 1999 no suplemento European
Pharmacopeia (EUROPEAN PHARMACOPOEIA SUPPLEMENT, 1999).
A parte da planta usada para propósitos farmacêuticos e cosméticos é a flor seca,
que contêm saponinas, álcoois triterpenos e ésteres ácidos, carotenóides, flavonóides,
cumarinas, taninos, (HAMBURGER et al, 2003; GAZIM et al, 2007). Foram atribuídas
propriedades anti-inflamatórias das flores de calêndula com a ajuda de testes farmacológicos
in vivo (SARTORI et al, 2003) atividade antimicrobiana (HSIEH et al, 2001), antiedematosa
(HAMBURGER et al, 2003).
A calêndula tem sido utilizada normalmente como chás e pomadas. As infusões
geralmente são feitas com 1 a 2 g da planta in natura em 150 mL de água fervente e ingeridas
três vezes ao dia como antiespasmódico (JELLIN et al., 2003); como pomada é usada como
anti-inflamatório, para queimaduras, contusões e erupções cutâneas (LUENG & FOSTER,
1996; BLUMENTHAL et al, 2000).
As folhas secas também são usadas como um tempero sendo seu uso considerado
seguro, pela FDA (FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2007). A calêndula tem sido
usada tradicionalmente na medicina pela European Medicines Agency (EMEA, 2008, a, b). A
calêndula também é usada na perfumaria, na composição de perfumes, o aroma de suas flores
está associado à presença dos sesquiterpenos na fração volátil, dentre esses está o d-candineno
que confere notas verdes, refrescantes e doces; e responsável pelas notas amadeiradas está o
a-cadinol (REZNICEK & ZITTERL-EGLSEER, 2003).
(a) www.greenspiralherbs.com/Pictures.htm
(b)
http://commons.wikimédia.org/wiki/File:CalendulaOfficinalis.jpg
Figura 2. Flor da calêndula (a) e plantação de calêndulas (b)
3.1.2 Capim – limão (Cymbopogon citratus (DC) Stapf)
O capim-limão pertence à família Poaceae, é uma erva perene, cespitosa quase acaule,
com folhas longas, estreitas e aromáticas (Figura 3) e, quando recentemente amassadas tem
forte odor de limão, flores raras e estéreis, de origem asiática, encontrada em cultivo
principalmente na América do Sul, África, Índia, Austrália e nos Estados Unidos. É conhecida
por diversos nomes populares, tais como capim-limão, capim-cidreira e capim-cidrão no
Brasil, belgata e chá-do-gabão em Portugal, citronelle na França, lemon-grass nos países de
língua inglesa e surwai na Índia (CORRÊA, 1984; SANGUINETTI, 1989; LORENZI &
MATOS, 2002).
É consumido como uma bebida aromática e usado na culinária tradicional pelo seu
sabor de limão, mas também é empregado na medicina popular. Infusões ou decocções de
folhas secas têm sido utilizadas para dores no estômago, antiespamódico, calmante, e agente
anti-hipertensivo (BORRELLI & IZZO, 2000; GUPTA, 1995). Em muitos países é usado
para tratar estados febris e como um relaxante. Ajuda em estados emocionais alterados e é um
agente antidepressivo (GUPTA, 1995).
Possui emprego medicinal, para o qual podem ser utilizadas as folhas frescas ou
dessecadas e o óleo extraído delas (BENNETT & PRANCE, 2000; SOUZA et al, 1991). O
principal constituinte do óleo essencial é o citral (47 a 85%), formado por uma mistura dos
isômeros geranial e neral (BRUNETON, 1991; EVANS, 1996; PINO & ROSADO, 2002;
SIDIBE et al, 2001). Em quantidades menores já foram identificados outros componentes,
como canfeno, citronelal, citronelol, farnesol, geraniol, limoneno, linalol, mentol, mirceno,
nerol, a-pineno, b-pineno e terpineol (TESKE & TRENTINI, 2001;
SOUZA et al, 1991).
Entre os constituintes fixos encontram-se flavonóides (DEMATOUSCHEK &
SATHLBISKUP, 1991), saponinas e alcalóides (SOUZA et al, 1991; D’MELLO
et al, 1991).
Estudos com extratos de folhas e óleo essencial do C. citratus demonstraram efeito
anti-inflamatório, hipotensivo, vasorelaxante, e atividade diurética (CARBAJAL et al, 1989;
RUNNI et al, 2004), atividade antioxidante, (CAPIRO et al, 2001; MELO et al, 2001),
propriedades quimiopreventivas (PUATANACHOKCHAI et al., 2002), atividade
antimicrobiana frente a cepas isoladas de infecção urinária (PEREIRA et al 2004) e atividade
antimicrobiana, (DUKE, 1997; FIORI et al., 2000).
http://shaman-australis.com.au/shop/images/Cymbopogon_citratus.jpg
Figura 3. Arbusto de capim-limão
3.1.3 Espinheira – santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek)
Várias plantas são conhecidas no Brasil com o nome popular “espinheira-santa”,
dentre elas a Maytenus ilicifolia da família Celastracea, nativa de muitas partes da América do
Sul, incluindo partes do Brasil (HARTWELL, 1968; LIMA et al, 1969; LIMA, 1971), é uma
árvore de pequeno porte ou arbusto grande, crescendo até o máximo de 5 m de altura, dotada
de copa redonda e densa, nativa de regiões de altitude do sul do Brasil. Folhas coriáceas e
brilhantes, com margens providas de espinhos pouco rígidos. Flores pequenas de cor
amarelada. Os frutos são cápsulas oblongas, deiscentes, de cor vermelha contendo 1a 2
sementes de cor preta (Figura 4) (LORENZI, 2002).
Estudos demonstraram a atividade antiúlcera gástrica em ratos e seres humanos,
utilizando os extratos aquosos das folhas (CARLINI, 1988; SOUZA-FORMIGONE et al,
1991; GONZALEZ et al, 2001; QUEIROGA et al, 2000). O estudo fitoquímico indicou a
presença de flavonóides (LEITE et al, 2001), há também relatos sobre outras substâncias
polifenólicas (possivelmente taninos) nos extratos aquosos (CARLINI, 1988). A friedelina e o
fridelan-3-ol são os triterpenos majoritários nas folhas de Maytenus ilicifolia, sendo proposto
um método para sua quantificação (NOSSACK et al, 2000), visando o estabelecimento de
critérios gerais de qualidade para os medicamentos fitoterápicos contendo espinheira-santa
(VILEGAS et al, 1994; VILEGAS & LANÇA, 1997).
O Governo brasileiro através da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária);
aprovou o uso e a comercialização de fitoterápicos da Maytenus ilicifolia pelo seu conteúdo
conhecido de taninos, sendo que os mesmos são conhecidos por suas propriedades
cicatrizantes (SOUZA et al, 2008).
(a) www.infobibos.com/.../2006_3/Espinheira/Fig1.jpg (b) http://cerradobrasileiro1ano.blogspot.com.jpg
Figura 4. Folhas (a) e frutos (b) da espinheira – santa
3.2 Essencialidade dos minerais
Os elementos minerais possuem papéis essenciais, tanto como íons dissolvidos em
líquidos orgânicos como constituintes de compostos essenciais, eles estão distribuídos na
natureza e exercem papéis fundamentais no organismo humano. O equilíbrio de íons minerais
nos líquidos corpóreos regula a atividade de muitas enzimas, mantém o balanço ácido – base e
a pressão osmótica facilitando a transferência de compostos essenciais e mantém a
irritabilidade nervosa e muscular (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
Os elementos traços, também chamados oligoelementos, juntamente com outros
nutrientes essenciais são necessários para o crescimento, funcionamento fisiológico normal e
manutenção da vida; eles devem ser consumidos através dos alimentos. A classificação exata
de elementos traços e macrominerais não é clara, mas consideram-se elementos traços aqueles
que são requeridos em quantidades menores que 100mg/dia, enquanto alguns deles são de
vital importância para a vida, outros ainda têm seu papel biológico indefinido e outros podem
causar sérios danos à saúde. Recomendações diárias fixas têm sido estabelecidas para alguns
elementos traços, pois sua deficiência pode causar prejuízo à saúde. Para decidir se um
elemento é um micronutriente essencial, vários critérios são estabelecidos, como a presença
do elemento em um tecido saudável, se aparece no feto ou recém-nascido, se o corpo mantém
controle homeostático na sua captação, circulação sanguínea, tecido e excreção
(LESNIEWICZ et al, 2006,).
Juntos, os minerais representam de 4 a 5% do peso corpóreo, aproximadamente
metade deste peso é Ca, e outro quarto é P. Os outros cinco macrominerais (Mg, Na, Cl, K e
S) e os 14 microminerais (Fe, Zn, Cu, I, Mn, F, Mo, Co, Se, Cr, Sn, Ni, V e Si) constituem os
25% restantes (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
Elementos traços possuem características preventivas e curativas no combate às
doenças, por isso é muito importante conhecer o nível de macro e micronutrientes nas plantas
medicinais e em medicamentos fitoterápicos estimando seus teores para fazerem parte da
dieta humana, e também para verificar se estão em um nível adequado, pois alguns minerais
em níveis elevados podem se tornar tóxicos.
Vários estudos ao longo da última década foram realizados para determinar a
quantidade de macro, micronutrientes e íons de íons metálicos pesados em plantas, tanto
medicinais quanto aromáticas (AJASA et al, 2004; CHIZZOLA et al, 2003; GARCIA et al,
2000; KUMAR, et al, 2005; LOPEZ et al, 2000, RAZIC et al, 2003).
Yemane et al analisaram o teor de íons metálicos (K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, Na, Cd
e Pb) em cinco amostras de chá de Camellia assamica, por espectrometria de absorção
atômica em chama, entre os macronutrientes estudados o K foi o elemento mais abundante
nos chás (17,7–24,8 mg/g), os íons metálicos tóxicos Pb e Cd estavam abaixo do limite de
detecção do método utilizado (YEMANE et al, 2008).
Caldas e Machado determinaram o teor total de Cd, Hg e Pb em amostras de ginkgo-
biloba (Ginkgo biloba), espinheira-santa (Maytenus illicifolia), cáscara-sagrada (Rhamus
purshiana), berinjela (Solanum melongena), castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum),
ginseng (Pffafia glomerata), centelha-asiática (Hydrocotyle asiatica), guaraná (Paullinia
cupana), alcachofra (Cynara scolymus), clorela (Chlorella pyrenoidosa), no total foram 130
amostras, utilizando espectrometria de absorção atômica, o Hg foi o elemento que foi
determinado no maior número de amostras (38% das amostras), seguido do Pb (23%) e Cd
(13%) (CALDAS & MACHADO, 2004).
Basgel & Edermoglu, determinaram 14 elementos nas águas de infusão de sete plantas
diferentes consumidas na Turquia, pelas técnicas FAAS e ICP-OES, o conteúdo de Ca variou
entre 17,74 e 965 mg/kg; Mg 610 – 2078 mg/kg, Fe 4,90 – 107,4 mg/kg, Al 1,60 – 19,7
mg/kg, Mn 4,30 – 49,1 mg/kg, Zn 3,9 – 18,0 mg/kg, cobre 2,45 – 8,1 mg/kg, não foram
detectados os teores de Co, Cr, Pb e Cd nas infusões (BASGEL & EDERMOGLU, 2006).
3.2.1 Função dos minerais no organismo humano
Os minerais essenciais ao organismo humano podem ser classificados como
macrominerais, microminerais e elementos traços. Os macrominerais (Ca, P, Mg, S, Na, Cl e
K), são os elementos que devem ser consumidos diariamente em concentrações acima de 100
mg, os microminerais (Fe, Zn, Cu e Mn) em torno de 1 a 50 mg/dia e os elementos traços (I,
Cr, Sb, Co, Se, Al, Si, Sr e Sn) abaixo de 1 mg/dia. A seguir encontram-se relacionados à
importância de alguns elementos na nutrição humana (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
Cálcio
O Ca no organismo é o mineral mais abundante, constituindo de 1,5 a 2% do peso
corpóreo e 39% dos minerais corpóreos totais; 99% do Ca encontram-se nos ossos e dentes. O
1% restante está no sangue e líquidos extracelulares e dentro das células dos tecidos moles
regulando muitas funções metabólicas importantes (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
A principal função do Ca está na construção e manutenção dos ossos e dentes, além de
ter uma série de papéis metabólicos, afeta a função de transporte das membranas celulares,
possivelmente agindo como um estabilizador de membrana influencia ainda na transmissão de
íons através da membrana de organelas celulares, na liberação de neurotransmissores nas
articulações sinápticas, na função dos hormônios protéicos e na liberação ou ativação de
enzimas intracelulares e extracelulares, é necessário para a coagulação sanguínea. O Ca é
necessário na transmissão nervosa e regulação da batida cardíaca. O equilíbrio apropriado dos
íons Ca, Na, K e Mg mantém o tônus muscular e controlam a irritabilidade. O Ca também
previne a osteoporose sendo também um tranquilizante natural (MAHAN & ESCOTT-
STUMP, 1998; COSTA, 2002).
A recomendação nutricional diária (RDA) para adultos está baseada nas estimativas de
perda obrigatória (200 a 250 mg/dia) e na taxa de absorção de 30 a 40%, ou seja, de 800 a
1200 mg/dia (FOOD AND NUTRITION BOARD, 1989).
Magnésio
O Mg é o segundo maior em quantidade de cátion dentro dos líquidos celulares. No
organismo humano adulto está presente em aproximadamente 20 a 28g, dos quais
aproximadamente 60% se encontram nos ossos, 26% nos músculos e o restante nos tecidos
moles corpóreos (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
A principal função do Mg pode ser a de estabilizar as membranas das células em todo
o organismo regulando o transporte ativo de outros minerais (Na, Ca, K), estabiliza também a
estrutura da ATP (trifosfato de adenosina) nas reações enzimáticas dependentes da mesma. O
Mg é um cofator para mais de 300 enzimas envolvidas no metabolismo de componentes
alimentares e na síntese de muitos produtos. Entre as reações que exigem Mg estão a síntese
dos ácidos graxos e proteínas, a fosforilação da glicose e seus derivados na via glicolítica e as
reações da transcetolase. O Mg é importante na formação do monofosfato de adenosina
cíclico (AMPc), que foi o “segundo mensageiro” a ser identificado. O AMPc recebe a
mensagem de fora das células ou por hormônios ou por estímulos. O Mg desempenha também
um papel na transmissão e atividade neuromuscular, trabalhando em conjunto ou contra os
efeitos do Ca (COSTA, 2002; MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
As ingestões médias diárias variaram de 187 mg para mulheres de 60 a 65 anos de
idade até 194 mg para mulheres de 14 a 16 anos de idade (PENNINGTON & WILSON,
1990). Para os homens a variação média de ingestão foi de 250 mg para o grupo mais velho e
de 297 mg para o grupo mais jovem.
Sódio, cloreto e potássio
Estes três constituintes dietéticos indispensáveis estão intimamente relacionados no
organismo. O Na constitui 2%, o K 5% e o Cl
-
3% do conteúdo total de minerais no
organismo. Estão distribuídos por todos os líquidos e tecidos orgânicos, mas o Na e o Cl são
elementos primariamente extracelulares, enquanto o K é um elemento principalmente
intracelular. O Na, o K e o Cl
-
estão envolvidos na manutenção das seguintes funções
fisiológicas importantes do organismo: balanço e distribuição de água e nutrientes nas células,
equilíbrio ácido-base e osmótico, contrações musculares normal. O sistema “bomba”
Na/K/ATPase é importante na regulação do volume, manutenção do potencial de membrana,
transporte de glicose e de alguns aminoácidos incluindo a alanina, prolina, tirosina e
triptofano (COSTA, 2002; MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
As necessidades mínimas estimadas para estes eletrólitos estão incluídas nas RDAs de
1989, uma vez que os dados ainda não estão disponíveis para sustentar recomendações
específicas. A ingestão média de Na por indivíduos com 20 anos de idade e mais velhos
variou de 2172 mg para as mulheres a partir de 80 anos até 4126 mg para homens de 20 a 29
anos de idade. A ingestão de K está entre 1800 a 2600mg/dia (COSTA, 2002; MAHAN &
ESCOTT-STUMP, 1998).
Ferro
O Fe foi reconhecido pela primeira vez como um nutriente essencial para animais em
1860. No organismo humano existem de 3 a 5g de Fe, aproximadamente 2g como
hemoglobina e 8 mg como enzimas, ambas as formas são muito importantes, o restante do
ferro está distribruído pelo organismo (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998).
Este íon desempenha muitas funções que resultam de suas propriedades físicas e
químicas, principalmente sua habilidade de participar das reações de oxidação e redução, é
essencial para o organismo. Quimicamente, o Fe é um elemento altamente reativo que pode
interagir com o oxigênio para formar intermediários capazes de danificar membranas
celulares ou degradar o DNA. O Fe precisa estar firmemente ligado às proteínas para prevenir
efeitos destrutivos (COSTA, 2002; MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998; LOZOFF, 1990).
O Fe tem um papel no transporte respiratório de oxigênio e dióxido de carbono é uma
parte ativa das enzimas envolvidas no processo de respiração celular. O Fe também parece
estar envolvido na função imunológica e no desempenho cognitivo. Apesar destas relações
não estarem claramente identificadas, reforçam o imperativo de prevenir a anemia por
deficiência de Fe na população mundial (COSTA, 2002; MAHAN & ESCOTT-STUMP,
1998).
É muito importante para a função cerebral normal em todas as idades (BEARD et al,
1993), estando envolvido na função e síntese dos neurotransmissores e possivelmente mielina.
Ocorrem mudanças no metabolismo de Fe em certos estados de doença, tais como o
mal de Alzheimer. A distribuição de Fe no cérebro muda durante o envelhecimento normal
(JOHNSON et al 1994).
O “Food and Nutrition Board” recomenda uma ingestão diária de 10 mg Fe para
homens e mulheres na pós-menopausa. Para mulheres e meninas é necessário uma ingestão de
15 mg/dia para repor as perdas ocasionadas pela menstruação e fornecer estoques de Fe
suficientes para sustentar uma gravidez. Já para os meninos é uma RDA de 12 mg/dia (OMS,
1998).
Zinco
O Zn encontra-se distribuído por todo o reino vegetal e animal perdendo para o Fe em
abundância. Sua concentração pode varia de 2 a 3 g no organismo de um adulto, sendo que as
maiores concentrações estão no fígado, pâncreas, rim, ossos e músculos voluntários, está
presente em todos os tecidos e líquidos do organismo (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998;
OMS, 1998).
Este íon participa da síntese ou a degradação de metabólitos maiores, tais como
carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos, da síntese de conversão por hidrólise do
colágeno, da síntese do DNA e de fibroblastos. Mais de 200 enzimas de Zn foram isoladas de
várias espécies. O Zn também está envolvido na estabilização de estruturas de proteínas e
ácidos nucléicos e na integridade de organelas subcelulares, assim como nos processos de
transporte, função imunológica e expressão da informação genética (COSTA, 2002; MAHAN
& ESCOTT-STUMP, 1998, PRASAD, 1998).
A RDA de 1989 estabeleceu 15 mg/dia como a ingestão apropriada para adolescentes
e adultos. Devido ao peso corpóreo menor das adolescentes e mulheres adultas, sua RDA é de
12 mg/dia. A exigência para pré-adolescentes é estimada em 6 mg/dia, mas devido a uma
perda dérmica maior e mais variação, a RDA tem sido estabelecida em 10 mg. A RDA para
bebês é de 5 mg/dia durante o primeiro ano de vida (OMS, 1998).
Cobre
O Cu é um antioxidante que regenera a citocromo-oxidase é reconhecido também
como um constituinte normal do sangue desde 1875. As concentrações de Cu são maiores no
fígado, cérebro, coração e rim. O músculo tem uma concentração mais baixa, mas devido a
sua grande massa, contém aproximadamente 40% de todo o Cu no organismo.
Aproximadamente 90% do Cu no plasma são incorporado na ceruloplasmina, o resto é ligado
e à albumina, transcupreína e aminoácidos (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998, OMS,
1998).
O Cu é um componente de muitas enzimas sendo necessário para a produção do ácido
ribonucléico (RNA), e tem papéis bem documentados na oxidação do Fe antes dele ser
transportado no plasma e na ligação cruzada do colágeno necessária para a sua força de
tensão, atua também na produção de energia mitocondrial, é essencial para a formação da
mielina nas fibras nervosas (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998; COSTA, 2002).
Apesar de dados suficientes não estarem disponíveis para estabelecer uma RDA, a
revisão de 1989 recomenda como “ingestão dietética diária considerada segura e adequada”
(ESADDI) para o Cu de 1,5 a 3 mg/dia para adolescentes e adultos. A ESADDI para crianças
é de 0,7 a 2 mg/dia (OMS, 1998).
Crômio
Em 1945, os dados sugeriram pela primeira vez um papel biológico para o Cr, mas
este não era geralmente aceito como um nutriente essencial até 1977.
Assim como outros minerais, as formas orgânicas e inorgânicas do Cr são absorvidas
diferentemente. O Cr orgânico é prontamente absorvido, mas sai rapidamente do sangue.
Menos de 2% do Cr trivalente consumido é absorvido, sendo esse o essencial ao organismo
humano. A absorção do Cr é aumentada pelo oxalato e é maior em animais com deficiência de
Fe do que em animais com estados de Fe adequados. A quantidade de Cr que é absorvida
permanece constante com uma ingestão da dieta acima de 40 µg, ponto no qual a excreção
urinária aumenta proporcionalmente a ingestão (ANDERSON, 1986). O Cr atua aumentando
a efetividade da insulina facilitando a entrada de glicose no interior da célula.
A deficiência de Cr (III) pode causar sérios danos ao organismo. A deficiência afeta o
fator de tolerância à glicose, aumenta a concentração de insulina no corpo, eleva a
concentração de colesterol e triglicerídeos no sangue, diminui a fertilidade e a longevidade,
aumenta a incidência de placas na aorta e ainda causa desordem cerebral (ANDERSON,
1988).
A ESADDI para o Cr (III) é de 50 a 200 µg/dia para pessoas de 7 anos de idade e mais
velhas.
Manganês
Até 1972, quando o primeiro relato de deficiência em humanos apareceu, duvidava-se
que tal deficiência pudesse ocorrer em humanos. O Mn tem a função de atuar na diabetes,
aumentando a produção da insulina; atua no pâncreas, é necessário na ativação enzimática
estando associado à formação dos tecidos conjuntivo e ósseo, crescimento e reprodução e
metabolismo de carboidratos e lipídeos (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 1998; COSTA,
2002).
Em 1989 foi estabelecida uma ESADDI para o Mn para adultos e crianças de 11 anos
de idade ou mais na faixa de 2 a 5 mg/dia. Para crianças, de 1 a 3 mg/dia são sugeridas
dependendo da idade (OMS, 1998).
3.2.2 Íons metálicos não essenciais
Os íons metálicos se movimentam mais largamente nos sistemas biológicos do que na
crosta terrestre de onde são originados. Os mais abundantes na natureza são aqueles que
apresentam numero atômico menor que 40 e com exceção do Sn e Ba, todos os demais,
quando encontrados nos seres vivos, são em quantidade traços (WOOD, 1976).
Dos 92 elementos naturais encontrados na natureza 22 são essenciais para os seres
humanos e recebem o nome de micronutrientes (CONCON, 1988).
A maior parte dos íons metálicos encontrados no organismo humano apresentando ou
não essencialidade, possuem alta reatividade química e atividade biológica, especialmente na
forma de radicais, íons ou complexos orgânicos. Assim, podem ser de alto risco, dependendo
da quantidade ingerida e das outras condições associadas à exposição (MIDIO & MARTINS,
2000).
Metal tóxico é considerado como aquele pertencente a um grupo de elementos que não
possui propriedades benéficas e muito menos essenciais para o organismo vivo, podendo
produzir efeitos maléficos, mesmo em quantidades traços para as funções metabólicas
normais (PARMIGIANI & MIDIO, 1995). Entretanto os minerais essenciais tornam-se
nocivos ao organismo quando ingeridos através de alimentos em quantidades muito acima das
nutricionalmente desejáveis, ou se ocorrer exposição por outro meio que não a oral (MIDIO
& MARTINS, 2000).
A maioria dos íons essenciais e não essenciais no organismo humano, provém da
dieta, porém nem todo metal ingerido é retido no organismo, podendo ser eliminado pelas
fezes, urina, suor, etc.(REILLY, 1980).
Na dieta, quando um íon metálico ou seus compostos estão presentes, as quantidades
que serão absorvidas e retidas pelo animal dependem das características físico-químicas da
substância, da composição dos alimentos, do estado nutricional e de fatores genéticos do
organismo exposto (MIDIO & MARTINS, 2000).
A concentração dos íons metálicos em alimentos, independentemente de sua origem,
fica em função das condições ambientais do local ou região onde este alimento foi produzido,
e também das técnicas usadas no seu processamento e das condições de armazenamento,
sendo que em um mesmo tipo de alimento podem existir variações consideráveis nos níveis
de íons metálicos. (MIDIO & MARTINS, 2000; PARMIGIANI & MIDIO, 1995).
Chumbo
Devido suas características físicas como ductilidade, maleabilidade e baixo ponto de
fusão, o Pb vem sendo utilizado a milhares de anos. Produtos provenientes de fundição e
cosméticos a base de Pb tem sido usados desde a antiguidade. Atualmente, seu principal uso é
na produção de baterias e alguns tipos de soldas, formando ligas com outros íons metálicos.
Até pouco tempo seus sais eram usados na produção de pigmentos para tintas (KENDLER,
1993).
O Pb, tanto em sua forma elementar, como em compostos inorgânicos ou orgânicos
apresentam riscos de intoxicação aos organismos expostos. Compostos como o chumbo
tetraetila, por exemplo, ainda são usados em alguns países como aditivo da gasolina sendo
centenas de vezes mais tóxicos que os compostos inorgânicos (MIDIO & MARTINS, 2000).
Intoxicações graves por Pb causam efeitos decorrentes da sua ação no sistema nervoso
central (SNC) e no sistema renal. Porém, este tipo de intoxicação tornou-se praticamente
incomum graças às várias regulamentações impostas para a obtenção do Pb e seus compostos,
bem como seu emprego industrial. As possíveis intoxicações provocadas pelo Pb na
população humana atualmente, ocorrem pela exposição ocupacional (MIDIO & MARTINS,
2000).
As exposições consideradas não ocupacionais são aquelas que se restringem à dieta e
representa a principal fonte de absorção diária de compostos inorgânicos para a população,
apesar de serem poucos os casos relatos de intoxicações através desse tipo de exposição,
sendo que compostos orgânicos de Pb não estão presentes em alimentos (MIDIO &
MARTINS, 2000)
O Pb estando presente no solo, apesar de pouco disponível em função de sua baixa
hidrossolubilidade, pode ser transferido para os vegetais, sendo que raízes contêm maiores
quantidades do que caules e folhas. Já os frutos e sementes apresentam, via de regra, as
menores concentrações. A absorção do Pb pelos vegetais pode ser incrementada com o
aumento da acidez do solo e diminuição da quantidade de húmus (PARMIGIANI & MIDIO,
1995).
Na atmosfera, o Pb se apresenta em sua forma particulada, podendo aderir-se
firmemente aos vegetais folhosos cultivados em regiões muito próximas a centros urbanos,
especialmente rodovias, elevando substancialmente as concentrações nos mesmos. (WHO,
1995; BURGUERA & BURGUERA, 1988).
No organismo humano, a distribuição inicial do Pb dependerá da velocidade de sua
liberação do sangue para os vários outros órgãos. Evidências sugerem que essa distribuição é
semelhante, independentemente da via de entrada do metal no organismo (MIDIO &
MARTINS, 2000).
Quando presente na corrente circulatória, o Pb poderá ser distribuído de muitas
maneiras, uma parte poderá ser excretada pela urina e, em menor quantidade, secretado na
bile, no suor, ou pode ser armazenado em pelos unhas e dentes, não voltando à circulação. A
quantidade que ficará disponível no organismo poderá ser retida em três locais diferentes, no
tecido ósseo; nos rins, no sistema nervoso central, no fígado; e no próprio sangue circulante
(MIDIO & MARTINS, 2000).
O Pb pode acumular-se nos ossos como fosfato insolúvel ficando 90% ou mais do total
disponível no organismo, sendo que sua vida média nesse tecido ultrapassa os 20 anos. O Pb
segue o movimento do Ca no organismo, e a exemplo deste, pode ser liberado dos ossos para
a corrente sanguínea, podendo, também, ser mobilizado durante a gravidez e amamentação.
(WHO, 1995; MIDIO & MARTINS, 2000).
Cádmio
O Cd é um elemento que não possui função fisiológica estabelecida, é encontrado
somente no estado de valência 2, foi descoberto em 1817, possui alta resistência a corrosão e
tem aplicações na galvanoplastia, em plásticos e pigmentos de tintas (MIDIO & MARTINS,
2000).
É armazenado nos rins, fígado, ossos e dentes, sua meia vida no organismo é de um a
três anos, o que o torna tóxico, produzindo diminuição do crescimento e reprodução,
hipertensão e disfunção renal e pulmonar. A exposição crônica ao Cd pode causar
nefrotoxicidade em seres humanos, principalmente devido a anormalidades tubulares de
reabsorção (NORDBERG, 1999). A ingestão diária de Cd em diferentes países europeus e nos
Estados Unidos é estimada entre 10 a 40 µg/dia (GOYER, 1996).
Alumínio
O Al é um dos elementos mais abundantes da crosta terrestre, sendo responsável por
8% do total, é um metal muito versátil com uma ampla variedade de usos, como por exemplo,
em cosméticos, pigmentos de tintas, abrasivos, aditivos alimentares, antiácidos, materiais de
embalagem e construção; para o Al não existe evidência confirmada que possui alguma
função essencial em animais ou seres humanos (OMS, 1998).
Com relação à saúde, seu potencial de toxicidade aumenta se a exposição for
excessiva, principalmente no uso de água com Al em pacientes com falha renal submetidos à
diálise crônica, onde foi evidenciado que o excesso de Al afeta o esqueleto pela formação
óssea marcadamente reduzida, resultando em osteomalacia, outra manifestação patológica
adicional da toxicidade do Al é uma anemia hipocrômica microcítica não associada à
deficiência de Fe, esses problemas tem praticamente desaparecido desde que o uso de água
deionizada livre de Al para diálise foi usada (ALFREY et al, 1980; OMS, 1998).
Vários trabalhos encontrados em literatura específica sugerem que o Al intervém em
diversos processos neurofisiológicos responsáveis pela degeneração característica da doença
de Alzheimer (DA). Apesar da polêmica existente, a evidência científica demonstra, ao longo
dos últimos anos, que o Al se associa com o desenvolvimento da DA (FERREIRA et al, 2008;
CAMPBELL, 2002).
Tem sido sugerido uma ingestão semanal tolerável de Al de aproximadamente 7
mg/kg de peso corpóreo. Em geral, não existe risco conhecido para pessoas saudáveis de
ingestões de dieta típicas de Al. Os riscos surgem apenas do consumo exagerado de antiácidos
por longo períodos de tempo e são aumentados nas pessoas com a função renal prejudicada
(OMS, 1998).
3.2.3 Função dos minerais nas plantas
Os nutrientes nas plantas são divididos em dois grupos dependendo da quantidade
requerida de cada elemento, os macronutrientes (N, P, S, Ca, Mg, K), que constituem o maior
peso da planta e os micronutrientes (Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, B, Cl, Co, Si, Na) responsáveis por
diversas funções nas plantas.
3.2.3.1 Macronutrientes
Nitrogênio
O N estimula a formação e o desenvolvimento das plantas e é componente das
proteínas e aminoácidos, além de ser um importante ligante de íons metálicos, dependendo da
espécie, do estágio de desenvolvimento e do órgão, a quantidade de N para o crescimento
varia de 2 a 5% do peso da planta. A absorção de N ocorre de diferentes formas: N
2(g)
,
através das bactérias fixadoras, na forma mineral e como uréia, a forma predominante que as
planta absorvem, em condições naturais é a do nitrato devido o processo de nitrificação no
solo. O N é um elemento de alta mobilidade na planta, na forma orgânica (FERRI, 2007;
KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Fósforo
O P tem o papel de acelerar a formação das raízes, aumentar a frutificação, apressar a
maturação dos frutos; ajudar na fixação simbiótica do N e aumentar o teor de carboidratos,
óleos, gorduras e proteínas. O P é um elemento móvel na planta, e a forma de fixação depende
da faixa de pH do solo, na faixa entre 2 e 7, predomina a forma H
2
PO
4
-
; na faixa de 7 a 12
predomina a forma HPO
4
2-
. A presença de Mg favorece a absorção de P. O P faz parte da
molécula ATP (trifosfato de adenosina), produzido nas fosforilações oxidativas e
fotossintéticas que participa de reações de sínteses e desdobramento de carboidratos, síntese
de proteínas, da absorção salina. O P se redistribui facilmente na planta, principalmente
quando está em falta (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS &
SALISBURY; 1991).
Enxofre
O S é responsável pelo aumento na frutificação e vegetação, além de aumentar o teor
de óleos, gorduras e proteínas e ajudar na fixação simbiótica do N. O S é absorvido pelas
raízes, em condições aeróbicas, predominantemente na forma de sulfato SO
4
2-
, as folhas além
do sulfato absorvem também o gás SO
2
existente no ar, e S orgânico de aminoácidos. O S é
constituinte dos aminoácidos cisteína e metionina e consequentemente de proteínas (FERRI,
2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Cálcio
O Ca nas plantas é um ativador de diversas enzimas além da regulação da
permeabilidade da membrana citoplasmática, neutralização de ácidos tóxicos,
desenvolvimento e funcionamento das raízes; da germinação, de aumentar a resistência a
pragas e doenças; auxiliar na fixação simbiótica do N. No solo, o Ca é absorvido na forma de
cátion Ca
2+
, nas extremidades das radicelas; possui baixa mobilidade tanto no solo como na
planta, é praticamente imóvel no floema. A presença de cátions como K
+
, Mg
2+
e NH
4
+
,
diminuem a absorção de Ca (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997;
ROSS & SALISBURY; 1991).
Magnésio
O papel mais conhecido do Mg nas plantas é sua presença na clorofila, sendo o átomo
central, e é ativador de quase todas as enzimas fosforilativas, é essencial para a absorção de P.
A absorção do Mg da solução do solo é feita na forma de Mg
2+
, é um cátion bastante móvel;
sua absorção é reduzida na presença de altas concentrações de Ca
2+
, NH
4
+
e K
+
, pois esses
cátions concorrem pelo mesmo sítio ativo de absorção (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004;
MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Potássio
O K possui muitas funções nas plantas, ativa muitas enzimas, regula a abertura e o
fechamento dos estômatos, estimula a vegetação, aumenta a utilização de água, aumenta a
resistência as secas, geadas, pragas e moléstias, promove o armazenamento de açúcar e
amido, ajuda na fixação simbiótica do N, aumenta o teor de carboidratos, óleos, gorduras e
proteínas. A absorção do K é altamente seletiva e está interligada a atividade metabólica,
aparece na forma K
+
sendo esta a forma mais absorvida pelas raízes dos vegetais, possui baixa
afinidade por ligantes orgânicos. Baixas concentrações de Ca contribuem para sua absorção
(FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY;
1991).
3.2.3.2. Micronutrientes
Ferro
O Fe se apresenta no solo nas formas Fe
2+
, Fe
3+
ou complexado, exercendo várias
funções importantes nas plantas devido sua alta capacidade redox, como na respiração,
fotossíntese, reações de várias enzimas que operam na assimilação e na fixação do N
2
. O Fe
possui pouca mobilidade na planta. Concentrações altas de Mn, Cu ou Zn podem inibir
competitivamente a absorção de Fe (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al;
1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Cobre
O Cu se apresenta no solo na forma de Cu
2+
ligando-se com facilidade aos ácidos
húmicos e fúlvicos, e como quelatos solúveis mais de 98% está complexado com compostos
orgânicos como aminoácidos e compostos fenólicos. Acumula-se nas raízes e sua mobilidade
é restrita, dependendo do teor no tecido. As principais funções do Cu são a participação na
síntese de enzimas, participação indireta da fixação simbiótica do N, aumento na resistência a
doenças, ativador de enzimas de óxido-redução que oxidam fenóis e que participam do
transporte eletrônico terminal e da fotossíntese. O Zn compete com o Cu pelos mesmos sítios
do carregador no processo de absorção (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et
al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Manganês
No solo as principais formas do Mn são Mn
2+
e Mn
3+
, estando em grande parte 90%
complexado a compostos orgânicos. O Mn possui papéis importantes na planta, na
fotossíntese, na redução do nitrato, na defesa contra doenças, a dismutase de peróxido
depende do Mn e protege a célula do efeito dos radicais livres. O Mn possui baixa
mobilidade, e é absorvido pelo sistema radicular na forma divalente Mn
2+
(FERRI, 2007;
KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Zinco
O Zn está presente na forma Zn
2+
, não fazendo parte das reações de oxiredução. Um
pH em torno de 6 favorece a absorção e diminui em um pH próximo de 3, o Fe, o Cu e o P
inibem sua absorção. A absorção ocorre pelas raízes. O Zn é um elemento pouco móvel nas
plantas, os quelados que forma com ácidos orgânicos são pouco estáveis. O Zn é importante
na atividade de várias enzimas, além de possuir função no metabolismo do DNA e RNA, na
divisão celular e na síntese de proteínas (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et
al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Molibdênio
É o micronutriente menos abundante no solo, a absorção do Mo se apresenta na forma
de molibdato (MoO
4
2-
) quando o pH é igual ou maior que 5 e como HMoO
4
-
em pH menor, é
pouco requerido pelas plantas e é um dos micronutrientes menos abundante no solo. A
absorção é aumentada em presença de Fe
2+
e reduzida na presença de Cl
-
, Cu
2+
, Mn
2+
e Zn
2+
.
As funções do Mo são fixação do N através da enzima nitrogenase, aumento nas proteínas,
ácidos nucléicos e ácido ascórbico (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al;
1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Boro
O B é absorvido pelas plantas na forma H
3
BO
3
(ácido bórico) estando relacionado ao
pH e a concentração externa do elemento, sendo um elemento praticamente imóvel no floema,
assim como o Ca. O B desempenha muitas funções, síntese e estrutura da parede celular para
divisão e aumento no tamanho das células, transporte de carboidratos das folhas para outros
órgãos, metabolismo do RNA, respiração, metabolismo fenólico, funcionamento das
membranas celulares (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS &
SALISBURY; 1991).
Cloro
O Cl está presente no solo na forma de anion Cl
-
, é absorvido via radicular e foliar, é
um íon de grande mobilidade, não entra na constituição de nenhum composto orgânico. Com
relação às funções, o Cl
-
atua como cofator em uma enzima que contém Mn que catalisa a
fotólise de água com a liberação de O
2(g)
, ativação de várias enzimas, mantém o balanço de
cargas elétricas, regulação estomática, reduz o efeito de várias doenças (FERRI, 2007;
KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Cobalto
Nas plantas o Co é absorvido na forma de Co
2+
, quando absorvido via foliar é
praticamente imóvel, a maior concentração se encontra nas raízes depois nas folhas. Quando o
Co está em excesso, diminui a absorção de Fe e Mn. É um elemento essencial para a fixação
de N
2
por bactérias de vida livre, faz parte da constituição da vitamina B
12
, intervém no
metabolismo dos carboidratos e proteínas, ajuda no crescimento das raízes (FERRI, 2007;
KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
Silício
Em plantas o Si é absorvido como ácido monossilícico, H
4
SiO
4
, não dissociado. Como
funções, diminui a toxidez do Fe e Mn, aumenta a absorção de P, aumenta a resistência a
praga e doenças, sua essencialidade foi demonstrada para um número reduzido de plantas
(FERRI, 2007; KERBAUY, 2004; MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY;
1991).
Sódio
Absorvido ativamente na forma de íon Na
+
, dependendo de algumas espécies de planta
pode substituir o K em algumas funções não específicas, o Na acumula-se principalmente nas
raízes, depois caule e folhas, sua mobilidade é alta (FERRI, 2007; KERBAUY, 2004;
MALAVOLTA et al; 1997; ROSS & SALISBURY; 1991).
3.3 A toxicidade das plantas medicinais
O uso de plantas medicinais em terapias, ou como suplemento dietético tem se tornado
comum ao longo da história, mas nas últimas décadas houve um aumento significativo
(WOODS, 1999; KHAN et al, 2001; WHO, 2002). Muitas vezes por serem considerados
como medicamentos naturais, e, portanto inofensivos, a grande maioria não possui
licenciamento e não precisam provar sua eficácia, segurança ou qualidade. Porém a segurança
no uso apropriado destas plantas tem sido questionada através de trabalhos sobre doenças e
fatalidades envolvendo o uso dessas terapias (STEWART et al, 1999; ERNST, 2002).
Envenenamentos associados com a presença de íons metálicos tóxicos em plantas medicinais
foram reportados na Ásia, Europa e Estados Unidos (CALDAS & MACHADO, 2004;
OLUJOHUNGBE et al, 1994; DUNBABIN et al, 1992; KAKOSY et al, 1996;
MARKOWITZ et al, 1994)
As plantas podem conter íons metálicos pesados provenientes do solo, água ou ar
(MCLAUGHLIN, 1999). Altos níveis de íons metálicos tóxicos podem ocorrer em
medicamentos quando as plantas são usadas como princípios ativos, como no caso de Hg e Pb
em alguns medicamentos chineses, mexicanos e indianos (LEVITT, 1984; CHAN et al.,
1993), ou quando as plantas são cultivadas em áreas poluídas, como perto de estradas, ou
locais de mineração e fundição (PIP, 1991). Além disso, os elevados níveis podem ser
encontrados quando se usam aditivos agrícolas como adubos orgânicos ou pesticidas
contendo Cd, Pb ou Hg e também pela irrigação através da água contaminada (ABOU-ARAB
et al, 1999). O Pb e o Hg podem causar efeitos adversos sobre os sistemas renal e nervoso e
podem atravessar a placenta, com potenciais efeitos tóxicos sobre o feto (TONG et al., 2000;
WHO, 2003).
Além dos íons metálicos pesados as plantas podem ser contaminadas com agentes
microbianos patogênicos e toxinas químicas, através da adulteração, da colheita, do ambiente
em que são cultivadas, conservação e armazenagem desfavoráveis e errados (CHAN, 2003).
3.4 Compostos fenólicos em plantas medicinais
Quimicamente compostos fenólicos são aqueles que pertencem a uma classe na qual
são incluídas estruturas simples e complexas, tendo como característica principal possuir pelo
menos um anel aromático no qual, ao menos um hidrogênio é substituído por um grupo
hidroxila (Figura 5). Esses compostos englobam desde moléculas simples até algumas com
alto grau de polimerização e contribuem para o sabor, odor e coloração de diversos vegetais,
além de serem essenciais para o crescimento e reprodução (SIMÕES et al, 2007, SOARES,
2002).
Figura 5. Estrutura básica de um composto fenólico
Entre os compostos fenólicos que pertencem ao metabolismo secundário dos vegetais,
não fazendo parte do metabolismo básico, são encontradas estruturas variadas como: ácidos
fenólicos, derivados da cumarina, flavonóides, saponinas, taninos, alcalóides, entre outros
(NACZK & SHAHIDI, 2004).
Os ácidos fenólicos são caracterizados por terem um anel benzênico, um grupamento
carboxílico, e um ou mais grupamentos hidroxila e/ou metoxila na molécula, podendo ser
divididos como derivados do ácido benzóico, como por exemplo, o ácido gálico e ácido
siríngico, e derivados do ácido cinâmico, como por exemplo, ácido p-cumárico e o ácido
caféico (Figura 6) (SIMÕES, et al, 2007, SOARES, 2002).
Figura 6. Estruturas moleculares de compostos fenólicos. (A) Ácido Gálico, (B) Ácido
Siríngico, (C) Ácido p – cumárico, (D) Ácido caféico.
Os flavonóides são um grupo de compostos polifenólicos amplamente distribuído nas
plantas medicinais, hortaliças, sucos de frutas e em uma variedade de bebidas (chás, café,
vinhos, etc). A estrutura básica é representada por 15 átomos de carbono em seu núcleo
fundamental dispostos em uma configuração C
6
– C
3
– C
6
, constituída de duas fenilas A e B,
ligadas por uma cadeia de 3 carbonos entre elas (Figura 7). Alguns flavonóides encontrados
em plantas são: galangina, canferol, miricetina, quercetina, flavona, flavonona, entre outros
(Figura 8). Esses compostos apresentam funções importantes nas plantas, entre elas ação
antioxidante, inibidores de enzimas, proteção contra a incidência dos raios solares e contra
insetos, fungos, vírus e bactérias, atração de animais com a finalidade de polinização
(SIMÕES, et al, 2007; ANGELO & JORGE, 2007).
Figura 7. Estrutura genérica das moléculas dos flavonóides
Figura 8. Estruturas moleculares de flavonóides. (A) Quercetina, (B) Flavona, (C) Flavonona
Estudos experimentais recentes demonstram que os flavonóides possuem efeitos
benéficos para a saúde humana, incluindo propriedade de proteção cardiovascular, atividade
antineoplásica, antiúlceras, antialérgicas, antivirais e anti-inflamatórias. Esta promoção na
saúde parece estar relacionada com a atividade dos flavonóides em serem antioxidantes
naturais (SHAGHAGHI et al, 2008; HANASAKI et al, 1994).
Os radicais livres são átomos ou moléculas que possuem em sua última camada
eletrônica, um número ímpar de elétrons. O não emparelhamento de elétrons nesta última
camada confere alta reatividade a estas moléculas ou átomos (FERREIRA & MATSUBARA,
1997). Essas espécies de alta reatividade ou espécies reativas de oxigênio (EROs), como O
2
-
,
causam danos no DNA ou ainda podem oxidar proteínas e lipídios (SOUSA et al, 2007).
Substâncias antioxidantes podem ser definidas como sendo aquelas capazes de inibir
ou retardar a oxidação substratos oxidáveis, podendo ser enzimáticos ou não enzimáticos
como as vitaminas A e E e os compostos fenólicos como os flavonóides (HALLIWELL,
2001, ASOLINI et al, 2006; HANASAKI et al, 1994).
O mecanismo de ação dos compostos antioxidantes, ou seja, neutralizadores de
radicais livres, presentes nos extratos das plantas, desempenha um papel fundamental na
redução da oxidação lipídica em tecidos, vegetal e animal e quando incorporado na
alimentação humana além de conservar a qualidade do alimento também reduz o risco de
desenvolvimento de patologias, como arteriosclerose e câncer (NAMIKI, 1990;
RAMARATHNAM et al, 1995). A atividade anticarcinogênica dos compostos fenólicos já
tem sido relacionada à inibição dos cânceres de cólon, esôfago, pulmão, fígado, mama e pele.
Os compostos fenólicos que possuem este potencial são resveratrol, quercetina, ácido caféico
e flavonóis (PIMENTEL et al, 2005).
Arabbi et al estimaram a ingestão dietética de flavonóides pela população brasileira
como sendo de 60 a 106 mg/dia.
3.5 Atividades biológicas nas plantas
A grande maioria das plantas utilizadas com fins medicinais não teve suas
potencialidades terapêuticas devidamente comprovadas. Portanto faz-se necessário estudos
sobre as plantas devido o grande consumo das mesmas para diversos males da saúde, e
também devido ao aumento da resistência dos micro-organismos aos antibióticos alopáticos.
Devido à presença dos metabólitos secundários os vegetais são capazes de produzir
substâncias antibióticas, sendo utilizadas como mecanismo de defesa contra micro-
organismos, insetos e até herbívoros (GOTLIEB, 1981).
Muitos são os fatores que interferem na produção dos metabólitos secundários, como
variações sazonais, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, nutrientes,
altitude, poluição, estágio de desenvolvimento e idade, composição do solo. (GOBBO-NETO
& LOPES, 2007).
Incluem-se nos principais grupos de compostos com propriedades antimicrobianas
extraídos de extratos de plantas as flavonas, flavonóis e flavonóides, (GONÇALVES et al,
2005; SILVA et al, 2005; LEITE et al, 2001); substâncias fenólicas e polifenólicas, sendo os
fenóis simples, ácidos fenólicos e quinonas (STERN et al, 1996), taninos (SCALBERT, 1991;
ARAÚJO, 2007; LOGUERCIO et al, 2005); entre outros.
A maioria dos estudos sobre as atividades terapêuticas das plantas tem sido realizada
com seus extratos etanólicos e óleos essenciais descrevendo numerosas atividades como a
antimicrobiana (BETONI et al, 2006; INDU et al, 2006; HSIEH et al, 2001; DUARTE et al,
2004), a antioxidante (ANDRADE et al, 2007; ASOLINI et al, 2006; LU & FOO, 2001;
RAMALHO, 2005; MELO et al, 2003; SOUSA et al, 2007; RAMARATHNAM et al, 1995),
a anti-inflamatória (HAMBURGER et al, 2003; HOLETZ et al, 2002; SARTORI et al, 2003),
a antifúngica (RESENDE & RESENDE, 1999; FIORI et al, 2000) e a antiulcerogênica
(CARLINI, 1988; GONÇALVES et al, 2006; GONZALEZ et al, 2001; QUEIROGA et al,
2000; SOUZA-FORMIGONE et al, 1991).
Dentre as atividades mais estudadas das plantas medicinais, está a antimicrobiana ou
antibacteriana, onde as pesquisas focam principalmente em bactérias Gram-negativas e Gram-
- positivas, onde se utiliza testes de difusão em ágar e em disco (SANTOS et al, 2007;
SCHUCK et al, 2001; LOGUERCIO et al, 2005; MICHELIN et al, 2005; FALCÃO et al,
2006). As bactérias Gram-positivas geralmente estudadas são a Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes e as Gram-negativas podem-se citar a Pseudomonas aeruginosa e a
Klebsiella pneumoniae. Diversos estudos apresentam também a concentração inibitória
mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) de extratos ou óleos essenciais
das plantas frente a esses micro-organismos patogênicos (AVANCINI et al, 2000; ANTUNES
et al, 2006; SOUZA et al, 2000; MELO et al, 2006; DIAS et al, 2006; OSTROSKY et al,
2008; PEREIRA et al, 2005)
O Staphylococcus aureus, é uma das bactérias mais comuns na prática médica sendo a
causa comum de furunculose, mas quando invadem a corrente sanguínea causam infecções,
como osteomielite e pneumonia, essa bactéria é uma das que mais causa mortalidade entre as
infecções hospitalares (SILVA et al, 2007; BETONI et al, 2006, MOREIRA et al, 1998;
MURRAY et al, 2002).
A Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva amplamente distribuída entre
animais e no meio ambiente, e tem sido associada à toxinfecções alimentares (alimentos crus),
a infecção pode ser grave (INDU et al, 2006).
A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa oportunista, pois causa
doença em indivíduos imunocomprometidos estando associada a uma variedade de infecções
nestes indivíduos sendo um dos principais agentes isolados em casos de infecção hospitalar
em uma UTI (unidade de terapia intensiva), particularmente em pneumonia associada à
ventilação mecânica, pelo fato desta bactéria ter adquirido resistência múltipla aos
antibióticos usuais. Esse micro-organismo pode causar infecções urinárias e respiratórias,
pneumonias, meningites, endocardites e diversos outros tipos de infecção (ARRUDA, 1998;
FOCA et al., 2000; CUNICO et al, 2004)
A Klebsiella pneumoniae é uma bactéria Gram-negativa que causa pneumonia,
envolvendo a destruição necrótica dos espaços alveolares, a formação de cavidades e a
produção de escarro sanguinolento, essa bactéria pode causar ainda infecções de ferimentos e
dos tecidos moles (MURRAY et al, 2002).
Além de bactérias há registros do uso de extratos ou óleos essenciais de plantas para
fungos, na literatura são encontrados comumente testes envolvendo a levedura Candida
albicans (ANTUNES et al, 2006; FALCÃO et al, 2006), que afeta mucosas da boca, vagina,
esôfago. A candidíase disseminada geralmente se propaga na corrente sanguínea e
consequentemente, afeta muitos órgãos (MURRAY et al, 2002).
3.6 Métodos de análise quantitativa de íons metálicos e compostos fenólicos em
plantas medicinais
Muitos métodos e técnicas analíticas têm sido propostos e usados na determinação de
íons metálicos em uma grande variedade de amostras tais como águas, solos, sedimentos,
peixes, vegetais e alimentos, e também em materiais biológicos. A análise de qualquer
material encontra a dificuldade de se obter uma amostra representativa sem perdas nem
contaminação durante a amostragem, a estocagem ou a preparação no laboratório. Devido à
importância dos minerais e elementos traço para a nutrição humana, faz-se necessária a
determinação destes. Além da determinação de minerais essenciais, geralmente é realizada
também a quantificação de elementos não essenciais ao organismo, pois muitas plantas e/ou
suas misturas podem apresentar risco à saúde humana devido à presença de elementos tóxicos
como Pb, Cd, Al, Hg, Cr, (GARCIA et al, 2000; CALDAS & MACHADO, 2004; LOPEZ et
al, 2000). Para a quantificação de íons metálicos em plantas, utilizam-se diferentes técnicas:
espectrometria de absorção atômica em chama (FAAS), espectrometria de massa com plasma
indutivamente acoplado (ICP-MS), espectrometria de emissão óptica com acoplamento de
plasma induzido (ICP-OES), métodos eletrotérmicos, análise por ativação de neutrônica e a
fluorescência de raios X por reflexão total, (VASSILEVA & HOENING, 2001; KRACHLER
et al, 2002; KHAN et al, 2001; FERNADEZ et al, 2002, BASGEL & EDERMOGLU, 2006),
sendo a mais utilizada para este tipo de amostra a espectrometria de absorção atômica.
Para a determinação de compostos fenólicos em plantas, podem-se utilizar as técnicas:
espectrofotometria no UV-Vis e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e apesar da
segunda técnica ser mais precisa, a primeira também apresenta bons resultados sendo uma
técnica simples e barata (ASOLINI et al, 2006; SHAGHAGHI et al, 2008, SOUSA et al,
2007).
Geralmente quando se utiliza o método espectrofotométrico UV-vis, para
quantificação de compostos fenólicos, emprega-se o reagente de Folin-Ciocalteu, o qual é
muito presente na literatura, pois se obtém boa reprodutibilidade, (ASOLINI et al, 2006;
ARAÚJO, 2008; SHAGHAGHI et al, 2008, VERZA et al, 2007). Este método baseia – se em
uma reação de óxido-redução em meio alcalino onde o íon fenolato é oxidado enquanto o
reagente Folin (W e Mo) é reduzido deixando a solução azul (NACZK & SHAHIDI, 2004;
IKAWA et al, 2003; SOUSA et al, 2007).
Na quantificação dos flavonóides em plantas utiliza-se o método espectrofotométrico
através da complexação do alumínio (SANNOMIYA et al, 1998). Na presente técnica, o
cátion Al forma complexos estáveis com os flavonóides em metanol promovendo um desvio
batocrômico na absorção, assim determina-se a quantidade de flavonóides presente nos
extratos das plantas, evitando a interferência de outros compostos fenólicos, principalmente
dos ácidos fenólicos (JURD & GEISSAMAN, 1956; PETRY et al, 2001).
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Instrumental
As determinações de Cd, Pb, Cr, Fe, Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, Al, Na e K foram realizadas
em um espectrômetro de absorção atômica em chama - FAAS (Varian modelo AA 220),
equipado com lâmpadas de catodo oco da marca Varian. Os parâmetros instrumentais estão
apresentados na Tabela 1. Todas as medidas de absorbância foram realizadas no modo
integração de área e as amostras preparadas em triplicatas e descontados os respectivos sinais
das provas em branco. Todos os íons metálicos fez-se em modo absorção com exceção do Na
e K que utilizou-se emissão, a chama utilizada foi de ar/acetileno, exceto para Ca e Al os
quais foram determinados com chama óxido nitroso/acetileno. O limite de detecção (LD)
representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada e pode ser
calculado de três maneiras diferentes: método visual, método relação sinal-ruído, método
baseado em parâmetros da curva analítica. Neste estudo o L.D. dos íons metálicos foi
considerado igual a três vezes o desvio padrão do branco dividido pela inclinação da reta.
Para efetuar as análises, utilizaram-se curvas analíticas com padrões certificados de metais de
pureza elevada, em concentração de 1.000 mg L
-1
, fizeram-se 5 padrões para cada metal.
As determinações dos fenólicos totais e flavonóides foram realizadas em um
espectrofotômetro UV-VIS Varian Cary 50 Bio. O comprimento de onda utilizado foi 760 nm
para ácidos fenólicos e 425 nm para flavonóides.
Para as análises antimicrobianas utilizou-se uma autoclave Vertical Phoenix para a
esterilização dos materiais e uma câmara em fluxos Logen Scientific para os procedimentos
decorrentes da análise. Foram utilizados outros materiais complementares como o swab, tubo
de Duran, placas de petri e paquímetro.
Para a obtenção dos extratos das plantas, utilizou-se um agitador magnético Fisatom
Mod. 752A, e a evaporação do solvente foi realizada em evaporador rotativo com banho de
água em temperatura até 60ºC e pressão reduzida.
A calcinação das plantas foi realizada utilizando cadinhos de porcelana em mufla a
aproximadamente 500ºC, por 8 horas.
Tabela 1: Parâmetros instrumentais para determinação de íons metálicos por espectrometria
de absorção atômica em chama (FAAS)
4.2 Amostras e reagentes
As amostras das plantas calêndula e capim-limão, devidamente secas e embaladas
foram cedidas pela CERCCOPA (Central Regional de Comercialização do Centro Oeste do
Paraná), e a amostra da planta espinheira-santa foi obtida diretamente de pequenos produtores
rurais do município de Turvo-PR.
Os reagentes e solventes utilizados nas análises espectrofotométricas foram de grau
analítico. Todos os padrões utilizados para as análises dos íons metálicos por FAAS foram da
marca J.T.Baker Instra-Analysed
®
(1000 µg/mL). Todas as soluções foram preparadas com
água ultrapura, proveniente do aparelho HUMAN UP 900
®
.
Metais
Comprimento
de onda (nm)
Limite de
detecção (mg/L)
Fenda (nm)
Corrente
(mA)
Chama
Cd 228,8 0,03 0,5 4 ar/C
2
H
2
Pb 217,0 0,28 1,0 5 ar/C
2
H
2
Cr 357,9 0,05 0,2 6 ar/C
2
H
2
Fe 248,3 0,06 0,2 5 ar/C
2
H
2
Ca 239,9 0,02 0,2 10 C
2
H
2
/N
2
O
Mg 202,6 0,01 1,0 4 ar/C
2
H
2
Mn 279,5 0,09 0,2 5 ar/C
2
H
2
Cu 324,7 0,14 0,5 4 ar/C
2
H
2
Zn 213,9 0,18 1,0 5 ar/C
2
H
2
Al 309,3 0,17 0,2 10 C
2
H
2
/N
2
O
Na 330,3 0,01 0,1 - ar/C
2
H
2
K 766,5 0,03 0,1 - ar/C
2
H
2
Na determinação dos fenóis totais empregou-se uma solução estoque de 0,1 g de ácido
gálico em 100 mL de metanol, uma solução saturada de carbonato de sódio (20 g) e tartarato
de sódio (1,2 g) em 100 mL de água ultrapura e o reagente Folin- Ciocalteu®.
Para a determinação de flavonóides utilizou-se solução estoque de quercetina 0,01%
m/v em metanol e uma solução de cloreto de alumínio 5% m/v em metanol.
4.3 Testes antimicrobianos
Para os testes antimicrobianos foram utilizados os seguintes micro-organismos
patogênicos que estão armazenados no laboratório de microbiologia do Departamento de
Engenharia de Alimentos da UNICENTRO: bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus
(American Type Culture Collection) ATCC 25923, Listeria monocitogenes ATCC 19111;
bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Klebsiella pneumoniae
isolado clínico; e a levedura Candida albicans isolado clínico. Os testes foram feitos em
duplicata.
Para o meio de cultura preparou-se um caldo de tripticase de soja (TSB), onde em 1 L
de água destilada adicionaram-se 30 g de TSB e 15 g de ágar. A dissolução foi realizada com
aquecimento a temperaturas em torno de 60 a 80°C utilizando uma chapa de aquecimento da
Fisatom Mod. 752A.
4.4 Parte experimental
4.4.1 Obtenção dos extratos etanólicos
Para a obtenção dos extratos alcoólicos a partir das amostras de plantas medicinais
foram preparadas soluções etanólicas nas proporções de 70% e 95% v/v. Transferiu-se 25 g
de cada planta para béqueres de 1000 mL e adicionou-se 400 mL de etanol em cada
recipiente, respectivamente. Deixou-se em agitação magnética por 24 h, filtrou-se e fez-se a
evaporação dos solventes pelo evaporador rotativo com banho de água em temperatura até
60ºC e pressão reduzida, para obtenção dos extratos secos. Os extratos obtidos foram
denominados de acordo com a concentração da solução etanólica, EEP70 (extrato etanólico de
planta 70%) e EEP95 (extrato etanólico de planta 95%).
4.4.2 Determinação do teor de íons metálicos extraídos nas infusões aquosas
Para a determinação do teor de íons metálicos na infusão aquosa de cada planta,
pesou-se 2 g de amostra em um béquer de 50 mL, adicionou-se água fervente, até cobrir a
planta, abafou-se a infusão por cerca de 10 min., esperou-se esfriar, filtrou-se em uma bomba
à vácuo, e transferiu-se para balões de 100 mL (triplicata). A quantificação foi realizada
através de espectrometria de absorção atômica em chama utilizando curvas analíticas dos íons
metálicos em meio aquoso.
4.4.3 Determinação do teor total de íons metálicos nas plantas medicinais
Para a determinação da concentração total de íons metálicos nas plantas utilizou-se o
procedimento de digestão por via seca (calcinação). Pesou-se 1 g de cada amostra,
carbonizou-se em bico de Bunsen até completa liberação de fumos, calcinou-se em mufla
durante 8 h a 500°C. Após solubilizou-se com aproximadamente 3 mL de uma solução de
HCl 1:1 v/v, e transferiu-se para balão de 50 mL (triplicata).
Como o Pb é um metal volátil em temperaturas elevadas procurou-se otimizar o
procedimento de calcinação a fim de não perder o Pb por volatilização (este estudo foi um
experimento paralelo à determinação dos outros metais). Adicionou-se 100 µg Pb/mL em
amostras de calêndula previamente ao processo de calcinação. Após a digestão da amostra
efetuou-se o estudo de recuperação do metal através de medidas por espectrometria de
absorção atômica.
4.4.4 Determinação do teor de íons metálicos extraídos nos extratos etanólicos
Para a determinação da concentração de íons metálicos nos extratos etanólicos, pesou-
se 0,01 g de cada extrato de planta (70 e 95%), dissolveu-se em etanol 95%, avolumou-se
para balões de 10 mL (triplicata). A quantificação foi realizada através de espectrometria de
absorção atômica em chama utilizando curvas analíticas dos metais em meio etanólico.
4.4.5 Quantificação de fenóis totais pelo método Folin – Ciocalteu
Para elaboração da curva analítica foram usadas soluções de concentrações conhecidas
de ácido gálico em metanol (5 a 70 µg/mL) preparadas a partir de uma solução estoque
(1000µg/mL). Preparou-se uma solução intermediária do padrão para se chegar as
concentrações utilizadas no trabalho. Dessas soluções de referência retiraram-se alíquotas de
1 mL e misturaram-se em balão volumétrico de 5 mL com 500 µL do reagente Folin-
Ciocalteau e 500 µL de solução saturada de carbonato de sódio e tartarato de sódio. Ajustou-
se o volume do balão volumétrico com água destilada. Esperou-se 2 horas e fez-se a leitura da
absorbância no espectrofotômetro na região do visível no comprimento de onda de λ = 760
nm.
Para a determinação do teor de fenóis nos extratos das plantas preparou-se soluções
onde 10 mg de cada extrato foram dissolvidos, separadamente, em 5 mL de metanol e
transferidos para balões de 10 mL. A partir de cada solução retiraram-se alíquotas de 150 µL
e repetiu-se o mesmo procedimento descrito para as curvas de calibração. Para cada extrato as
medidas foram realizadas em triplicata.
Para a determinação do teor de fenóis nas águas de infusão, preparou-se uma infusão
com 2 g de planta em 100 mL de água, desta solução retirou-se 300 µL e repetiu-se o mesmo
procedimento descrito para as soluções padrão. O Fluxograma 1 apresenta o procedimento
utilizado na determinação de fenóis por espectrofotometria Uv-vis.
Fluxograma 1: Determinação do teor de fenóis totais nas águas de infusão e nos extratos
etanólicos.
4.4.6 Quantificação de flavonóides por complexação com cloreto de alumínio
Para elaboração da curva analítica foram usadas soluções de concentração conhecida
de quercetina em metanol (5 a 60 µg/mL) preparadas a partir de uma solução estoque
(1000µg/mL). Fez-se inicialmente um estudo de diluições até se chegar às concentrações
utilizadas no trabalho. Dessas soluções de referência retiraram-se alíquotas de 500 µL e
misturaram-se em balão volumétrico (5 mL) com 1 mL de metanol e 250 µL de solução
cloreto de alumínio 5% m/v. Esperou-se 30 min. e fez-se a leitura da absorbância no
espectrofotômetro na região do visível no comprimento de onda de λ=425 nm.
Para a determinação do teor de flavonóides nos extratos das plantas preparou-se
soluções dissolvendo 10 mg de cada extrato em 5 mL de metanol completando-se o volume
com metanol em balão volumétrico de 10 mL. A partir de cada amostra retirou-se alíquotas de
300 µL e repetiu-se o mesmo procedimento descrito para as soluções utilizadas na curva
analítica. Para cada extrato as análises foram feitas em triplicata.
Para a determinação do teor de flavonóides nas águas de infusão, preparou-se uma
infusão com 2 g de planta em 100 mL de Agua, desta solução retirou-se 300 µL e repetiu-se o
mesmo procedimento descrito para as soluções padrão (Fluxograma 2).
Fluxograma 2: Determinação do teor de flavonóides nas águas de infusão e nos extratos
etanólicos
4.4.7 Avaliação da atividade antimicrobiana
4.4.7.1 Teste de difusão em Agar
Os micro-organismos foram testados frente à água de infusão e frente aos extratos
etanólicos 95% e 70% das plantas. Os extratos obtidos em meio etanólicos 70% e 95% foram
preparados na concentração de 10% m/v com etanol 95% como solvente. A água de infusão e
os extratos foram esterelizados por filtração em membrana 0,22 µm.
Todo material utilizado para os testes antimicrobianos foi esterilizado em autoclave
por 15 min. a 120ºC. O procedimento de inoculação dos micro-organismos e de adição dos
extratos e infusões foi executado em câmara de fluxo.
Os micro-organismos foram repicados em caldo tripticase de soja (tripticase soy
broth– TSB) (Difco) e mantidos por 24 horas a 35ºC em estufa bacteriológica. Estas
suspensões microbianas foram padronizadas em solução salina estéril (0,9%) para uma
concentração de 10
6
UFC/mL (unidades formadoras de colônias), comparando-se com a
escala 0,5 de McFarland, segundo normas NCCLS/CLSI. As suspensões microbianas foram
semeadas com o auxílio de swab estéril, sobre a superfície de placas de Petri contendo 18 mL
de ágar tripticase de soja TSA (Difco).
Em seguida foram feitos orifícios de 8 mm com auxílio de tubos de Duran no meio
TSA jA inoculado com as suspensões microbianas. Com auxílio de micropipeta foram
adicionados 100 µL dos extratos concentrados e das infusões. Como controle negativo
utilizou-se água e etanol 95% e 70%, conforme o extrato ou infusão testado. As placas foram
incubadas a 37 ºC por 24 h para as bactérias e a 25 ºC por 48 h para a levedura. Os resultados
da susceptibilidade aos produtos vegetais foram expressos em termos de tamanho de diâmetro
do halo de inibição do crescimento microbiano, medido com auxílio de paquímetro.
4.4.7.2 Teste da concentração inibitória mínima– CIM
Os extratos e infusões que apresentaram resultados positivos obtidos no teste de
difusão em Agar foram testados para verificação da concentração inibitória mínima (CIM)
através do teste de diluição seriada com sistema de tubos múltiplos (RIOS et al, 1988). O teste
foi feito adicionando-se 1 mL de meio Miller Hinton (Difco) em tubos seriados, com exceção
do primeiro tubo (tubo 1), que recebeu 2 ml do meio. Em seguida retirou-se 1 ml do meio do
tubo 1 e adicionou-se 1 mL do extrato da planta previamente diluído em água destilada (1:2).
A partir do tubo 1 foi feita a diluição 1:10 para os tubos seguintes 2 e 3. O tubo 4 não recebeu
adição de extrato e foi utilizado como controle negativo. Desta forma, a concentração final de
extratos foi de 25 mg/mL; 2,5 mg/mL e de 0,25 g/mL para os tubos 1, 2 e 3, respectivamente.
Em seguida, todos os tubos receberam a adição de 1 mL de suspensão microbiana
devidamente diluídos, e foram incubados a 37 ºC para as bactérias e a 25 ºC para a levedura
por 24 h. Foi considerada CIM a menor concentração que inibiu o desenvolvimento
microbiano, ou seja, sem turvação do meio no tubo.
4.4.7.3 Teste de concentração bactericida mínima – CBM
A partir dos tubos do teste do CIM em que não foi observada turvação no meio, foi
retirada uma alíquota, devidamente diluída e plaqueada em meio TSA. A leitura foi feita após
incubação a 37ºC para as bactérias e a 25 ºC para a levedura por 24 h, sendo considerada
CBM a concentração da placa que não apresentou desenvolvimento de nenhuma colônia de
micro-organismo (Fluxograma 3).
Fluxograma 3: Determinação da atividade antimicrobiana
4.4.8 Análises das correlações entre os parâmetros avaliados
Com o objetivo de se estudar possíveis relações entre os teores dos íons metálicos e os
compostos orgânicos determinados nas plantas, aplicou-se um estudo quimiométrico aos
resultados obtidos. Para se identificar grupos de elementos com comportamento similar e o
comportamento geral dos dados, foi utilizada a análise de componentes principais (PCA),
avaliando o conjunto de dados obtidos e obtendo uma redução da dimensão dos mesmos,
conservando a maior parte das informações estatísticas úteis presentes nos dados originais. As
operações estatísticas foram realizadas através do programa Statistic versão 6.0.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Determinação de íons metálicos na água de infusão e nas plantas medicinais
A quantidade de íons metálicos essenciais e não essenciais extraídos nos chás
preparados à partir da infusão de plantas com água quente não reflete o conteúdo total de íons
metálicos presentes nas plantas medicinais, pois para alguns íons metálicos apenas uma
pequena fração, é extraída no processo de infusão. Portanto, um estudo da concentração total
de íons metálicos foi realizada através de medidas espectrométricas após a calcinação das
plantas em forno mufla. O teor de cinzas obtido após a calcinação de cada planta foi
determinado para quantificar a fração mineral presente, pela diferença de massa obtida antes e
após a calcinação. A planta capim-limão apresentou o maior teor de cinzas, seguido da
calêndula e depois da espinheira-santa. Em produtos vegetais a determinação de cinzas tem
relativamente pouco valor, pois o teor de cinzas nesses produtos oferece pouca informação
sobre sua composição, uma vez que seus componentes minerais são muito variáveis e tal
determinação fornece, em geral, apenas uma indicação da riqueza da amostra nesses
elementos (SILVA, 1990). O perfil da cinza pode ser considerado medida geral de qualidade e
frequentemente é utilizado como critério na identificação dos alimentos. A cinza contém, em
geral, Ca, Mg, Fe, P, Pb, Na e outros componentes minerais (ANGELUCCI et al, 1987). A
Tabela 2 indica a quantidade de cinzas medidas nas plantas avaliadas.
Tabela 2: Porcentagem de cinzas em plantas medicinais (T
calcinação
=500ºC, 8 h), n=3.
Planta (1,0 g) % de cinzas
Espinheira-santa 4,3 ± 0,0005
Capim-limão 9,5 ± 0,002
Calêndula 7,4 ± 0,002
O Pb é um elemento que facilmente pode ser volatilizado a 550 ºC, portanto um estudo
de adição e recuperação do analito em plantas foi realizado para verificar se a temperatura de
calcinação de 500ºC não iria interferir nas medidas deste metal. A Figura 9 apresenta o teor de
Pb adicionado e recuperado em uma amostra de calêndula antes e depois da mesma ser
calcinada a 500 ºC. Conforme pode ser verificado a recuperação do analito foi satisfatória,
isto é, o Pb não foi volatilizado durante o processo de calcinação, portanto as medidas
realizadas para este metal foram confiáveis.
Figura 9: Adição e recuperação de Pb em amostra de calêndula dopada antes da etapa de
calcinação.
A Tabela 3 apresenta os resultados dos íons metálicos essenciais (Cu, Zn, Mn, Fe, Na,
Mg, Ca, K,Cr) e não essenciais (Al, Pb, Cd) nas amostras das plantas calcinadas e nas águas
de infusões. Verificou-se que os íons metálicos Pb e Cd estão presentes na planta, mas não na
água de infusão, o que pode ser considerado satisfatório, visto que o indivíduo não irá ingerir
esses íons metálicos tóxicos em um chá. Verificou-se também que estas plantas apresentaram
quantidades significativas de minerais essenciais como Mg, Ca e K. Dos nove íons metálicos
essenciais, a infusão da planta calêndula apresentou a maior quantidade dos minerais: Cu, Zn,
Na, Ca, além de grande quantidade de K presente. Para uma melhor visualização da
concentração dos íons metálicos em cada planta, foi realizada uma distribuição espacial dos
íons metálicos estudados (Figuras 10, 11 e 12).
Tabela 3: Concentração de íons metálicos na água de infusão e nas amostras calcinadas da espinheira-santa, calêndula e capim-limão por FAAS.
Espinheira-santa Calêndula Capim-limão
Infusão (µg/g ± sd) Total (µg/g ± sd) Infusão (µg/g ± sd) Total (µg/g ± sd) Infusão (µg/g ± sd) Total (µg/g ± sd)
Cu
2,30 ± 0,01 17,75 ± 0,13 7,20 ± 0,01 12,50 ± 0,11 1,35 ± 0,01 7,02 ±0,02
Zn
5,08 ± 0,01 23,02 ± 0,12 19,14 ± 0,03 43,91 ± 0,23 5,37 ± 0,01 25,29 ± 0,03
Mn
20,88 ± 0,04 82,08 ±0,13 12,32 ± 0,02 30,95 ± 0,03 43,87 ± 0,04 109,00± 0,17
Fe
6,35 ± 0,05 12,95 ± 0,02 6,23 ± 0,01 89,55 ± 0,29 5,00 ± 0,01 80,35 ± 0,14
Na
47,87 ± 0,01 104,28 ± 0,18 428,37 ± 0,06 700,82 ± 0,16 50,59 ± 0,01 137,46 ± 0,18
Cr
ND 0,77 ± 0,01 ND 0,47 ± 0,01 ND 0,02 ± 0,01
Al
148,67 ± 0,26 372,50 ± 0,1 153,83 ± 0,39 528,67 ± 0,54 139,50 ± 0,12 548,50 ± 0,47
Mg
1.510,75 ± 0,17 5.201,00 ± 0,06 1.170,88 ± 0,05 3.102,50 ± 0,03 711,50 ± 0,02 2.277,25 ± 0,01
Ca
489,00 ± 0,01 6.455,00 ± 0,05 1.797,00 ± 0,40 6.680,00 ± 0,09 1.206,83 ± 0,06 3.851,65 ± 0,02
K
8.766,80 ± 0,62 12.846,15 ± 0,06 17.850,80 ± 0,63 28.465,00 ± 0,02 19.425,88 ± 0,54 34.451,25 ± 0,29
Pb
ND 13,17 ± 0,03 ND 9,84 ± 0,02 ND 9,17 ± 0,02
Cd
ND ND ND ND ND ND
* ND = não detectado
Figura 10: Distribuição espacial dos íons metálicos na infusão aquosa e na espinheira-santa
calcinada.
Figura 11: Distribuição espacial dos íons metálicos na infusão aquosa e na calêndula
calcinada.
Figura 12: Distribuição espacial dos íons metálicos na infusão aquosa e no capim-limão
calcinado.
Sabendo a quantidade total de íons metálicos presentes em cada planta e a quantidade
extraída através das infusões aquosas pode-se estimar a porcentagem que é administrada em
uma dieta alimentar de cada elemento estudado. A Tabela 4 e Figura 13 apresentam a
porcentagem dos íons metálicos em cada infusão aquosa. Pode-se observar pela Figura 13 que
alguns íons metálicos são melhores extraídos na infusão proveniente da calêndula (Cu, Zn,
Mg e Na). A extração de Fe foi significativa na espinheira-santa. Vale salientar que a parte da
planta calêndula utilizada para os chás são as flores e não as folhas, enquanto as outras duas,
capim-limão e espinheira-santa utilizam as folhas. O K foi o elemento com maior
porcentagem de extração, isso ocorre devido o K ser um elemento de alta concentração e
mobilidade nas plantas, pois não se liga a quelatos orgânicos. Quando em uma planta existe
muito Mg, este elemento poderá afetar a quantidade de Ca e K, o que ocorreu com a planta
espinheira-santa, pois foi a planta que apresenta menores teores de Ca e K e o maior de Mg. O
Cu é um elemento com muita afinidade com a matéria orgânica, liga-se aos ácidos húmico e
fúlvico no solo e quase 98% estão quelado à compostos orgânicos. Quando em uma planta há
mais disponibilidade de Ca e K, esses diminuem a quantidade de Mg na planta, o que pode ser
visto no capim-limão. É importante salientar que uma planta adaptada, extrai do solo muitos
nutrientes, mesmo que esses estejam em pequena concentração. O pH influencia na absorção
de cátions, pois um pH abaixo de 7 diminui a absorção de cátions, isso ocorre talvez por
competição entre estes e íon H
+
por sítios do carregador.
O deslocamento e a solubilidade do Al nas plantas podem ser bastante influenciados
pela presença de complexantes orgânicos naturais do solo como ácidos húmicos, ácido cítrico,
ácido oxálico (TAN & BINGER, 1986; MIYAZAWA et al., 1992) e, especialmente, pelos
ácidos fúlvicos (SCHNITZER, 1969), por apresentarem, em relação aos ácidos húmicos, uma
maior quantidade de grupos funcionais (por exemplo, COOH) e valores superiores da
constante de estabilidade (STEVENSON, 1982). O Al normalmente está presente em
quantidades significativas nas plantas, provenientes do solo de cultivo. Existem na literatura
inúmeros trabalhos indicando os efeitos negativos do Al, no entanto outros mostram efeitos
benéficos em algumas espécies de plantas, como por exemplo, a necessidade de uma pequena
quantidade de Al na solução do solo para estimular o desenvolvimento de algumas plantas.
Quando o Al está presente em elevadas concentrações no solo, a planta desenvolve um
mecanismo de defesa, capaz de acumular elevadas quantidades de Al em seus tecidos, como
meio de desintoxicação. Vários compostos podem complexar o Al e outros íons metálicos
como forma de desintoxicação dos mesmos na planta. Os compostos fenólicos apresentam
elevada estabilidade de formação de complexação com íons metálicos e apresentam ação
antioxidante em condições que podem provocar alterações no crescimento da planta
(HARTWIG et al, 2007). Não existe evidência confirmada de que o Al possui alguma função
essencial em animais ou seres humanos. A consideração principal com respeito ao Al e saúde
é seu potencial de toxicidade quando a exposição for excessiva. Os aspectos toxicológicos de
Al consumido oralmente são bem menos definidos. O Al interage com um número de outros
elementos, incluindo Ca, F, Fe, Mg, P e Sr e, quando ingerido em excesso, pode reduzir suas
absorções. Consideravelmente, a contribuição mais importante para a ingestão de Al vem das
medicações antiácidas que podem fornecer vários gramas do metal por dia. Estas quantidades
interferem com a absorção de outros elementos; também podem levar a uma acumulação
gradual de Al no esqueleto. As concentrações localmente aumentadas de Al ocorrem no
cérebro de pacientes com Alzheimer, mas se esse metal possui um papel que pode causar a
patogênese desta doença não foi ainda estabelecido (BECARIA et al, 2002; MOLLOY et al,
2007).
Para avaliar os efeitos tóxicos do Al, não é importante considerar apenas a
concentração total de Al solúvel em uma amostra, mas é igualmente necessário investigar a
distribuição de sua espécie, visto que a disponibilidade biológica e a toxicidade de um
elemento dependem da forma em que se encontra no alimento. A espécie livre do Al parece
ser a principal responsável pela sua toxicidade (GÜÇER et al, 2000). Por outro lado, ligantes
naturais como os compostos fenólicos presentes nas plantas contribuem diminuindo a sua
toxicidade por meio da formação de complexos estáveis (FLATEN, 2002).
Tabela 4: Teor de íons metálicos extraídos no processo de infusão das plantas medicinais em
relação ao teor total de íons metálicos contido em cada planta
Metal Espinheira-santa % Calêndula % Capim-limão %
Cu
12,9 57,6 19,2
Zn
22,0 43,5 21,2
Mn
25,4 39,8 40,2
Fe
49,0 6,9 6,2
Na
45,9 61,1 36,8
Al
39,9 29,1 25,4
Mg
29,0 37,7 31,2
Ca
7,5 26,9 31,3
K
68,2 62,7 56,3
Figura 13: Representação gráfica da porcentagem de íons metálicos extraída nas infusões
aquosas de plantas medicinais.
5.2 Determinação do teor de íons metálicos essenciais e não essenciais nos
EEP70% e EEP95%
O teor de íons metálicos essenciais e tóxicos também foi avaliado nos extratos
etanólicos a fim de verificar o teor de elementos que possivelmente podem estar complexados
aos compostos orgânicos e, portanto podem estar presentes nos extratos. Este estudo é
importante, pois é a partir dos extratos secos das plantas que são fabricados os fitoterápicos
encapsulados. Na Tabela 5, são apresentados os teores determinados de íons metálicos
presentes nos extratos etanólicos 70% e 95%. Verificou-se que o solvente 70% extraiu com
mais eficiência todos os elementos enquanto os íons metálicos Cd , Pb, Fe e Mn não foram
detectados, a eficiência ocorre devido a maior quantidade de água no referido extrato. As
Figuras 14, 15 e 16 apresentam as representações gráficas dos teores extraídos em cada
extrato etanólico.
Tabela 5: Teor de íons metálicos presentes nos extratos etanólicos
*
70% e 95% das plantas medicinais por FAAS
Espinheira-santa Calêndula Capim-limão
EEP70 (µg/g ± sd)
EEP95 (µg/g ± sd) EEP70 (µg/g ± sd) EEP95 (µg/g ± sd) EEP70 (µg/g ± sd) EEP95 (µg/g ± sd)
Cu 2,20±0,00 ND 10,79±0,01 0,177±0,00 6,15±0,02 0,60±0,003
Zn 8,14±0,01 0,876±0,01 10,04±0,01 1,03±0,00 4,39±0,02 0,854±0,00
Mn ND ND ND ND ND ND
Fe ND ND ND ND ND ND
Na 61,93±0,03 31,89±0,07 153,62±0,12 82,92±0,37 71,22±0,05 24,94±0,09
Cr ND ND ND ND ND ND
Al 306,18±0,41 122,49±0,15 363,68±0,01 169,89±0,14 420,39±0,20 90,07±0,15
Mg 1.129,15±0,52 46,09±0,06 384,00±0,04 9,62±0,01 24,80±0,01 21,87±0,02
Ca 63,70±0,08 29,61±0,02 167,27±0,13 18,87±0,07 98,90±0,19 7,15±0,06
K 9.274,46±0,12 1.907,52±0,23 9.578,94±0,32 924,35±0,08 2.801,06±0,03 913,85±0,13
Pb ND ND ND ND ND ND
Cd ND ND ND ND ND ND
*Extratos obtidos a partir de 25 g de plantas
ND = não detectado
Figura 14: Representação gráfica dos teores de íons metálicos extraídos nos extratos
etanólicos da espinheira-santa.
Figura 15: Representação gráfica dos teores de íons metálicos extraídos nos extratos
etanólicos da calêndula.
Figura 16: Representação gráfica dos teores de íons metálicos extraídos nos extratos
etanólicos do capim-limão.
5.3 Determinação de ácidos fenólicos nos EEP70% e EEP95% e nas águas de
infusão das plantas medicinais
Antes de dar início as medidas dos teores de ácidos fenólicos, fez-se um estudo da
cinética da reação entre os compostos fenólicos e o reagente Folin-Ciocalteu para a obtenção
de um melhor sinal analítico visto que a literatura não apresenta um consenso definido quanto
ao tempo de reação necessário para efetuar as medidas espectrofotométricas. O reagente
Folin-Ciocalteu é extensivamente utilizado em medidas de compostos fenólicos e consiste em
uma mistura dos ácidos fosfomolíbdico e fosfotúngstico, no qual o Mo e o W encontram-se
no estado de oxidação VI, porém, em presença de certos agentes redutores, como os
compostos fenólicos, formam-se os chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais o
estado de oxidação dos íons metálicos está entre 5 e 6 e cuja coloração, permite a
determinação da concentração das substâncias redutoras, que não necessariamente precisam
ter natureza fenólica (NACZK & SHAHIDI, 2004; IKAWA et al, 2003, SOUSA et al, 2007).
A Figura 17 mostra um estudo da sensibilidade em função do tempo de espera para
uma completa reação entre os compostos fenólicos e o meio reacional, mostrando que no
tempo de 2h a absorbância foi maior, após este período não houve incremento na
sensibilidade analítica.
Figura 17: Estudo da sensibilidade em função da velocidade de reação entre os compostos
fenólicos e o meio reacional. (760 nm)
Os comprimentos de onda utilizados para a quantificação de fenóis totais e flavonóides
foram 760 e 425 nm, respectivamente. A escolha de ambos os comprimentos de onda foi
baseada no estudo de artigos científicos que realizaram essas quantificações em extratos de
plantas (ANDRADE
et al, 2007; KUJALA et al, 2000).
Os compostos fenólicos de plantas enquadram-se em diversas categorias, como fenóis
simples, ácidos fenólicos (derivados de ácido benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides,
estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas (NACZK & SHAHIDI,
2004). Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural, os
compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos, sobretudo por inibirem a
peroxidação lipídica e a lipooxigenase in vitro (HASLAM, 1996; SOARES, 2002). A
quercetina e a galangina, as quais pertencem ao grupo dos flavonóis, absorvem fortemente no
comprimento de onda de 425 nm em soluções metanólicas de cloreto de alumínio. Já, os
complexos derivados de flavonas, como a crisina, não absorvem nesse comprimento de onda,
de 425 nm, mas sim em comprimentos inferiores, causando uma subestimativa nas amostras
ricas em flavonas. Por isso, o valor medido encontra-se aquém do real, sendo tanto mais
próximo do real quanto maior a concentração de flavonóis na amostra. Este comprimento de
onda é selecionado devido à quercetina (flavonol) ser o mais comum dos flavonóides
encontrados em fontes vegetais. Em 425 nm outras substâncias fenólicas, como ácidos
fenólicos, não absorvem em presença de cloreto de alumínio, não havendo interferências para
a quantificação de flavonóides.
As Figuras 18, 19 e 20 apresentam as curvas analíticas obtidas a partir de soluções
padrão para fenóis totais e flavonóides nos extratos etanólicos e águas de infusão das plantas.
Figura 18: Curva analítica para determinação de fenóis totais em extratos etanólicos
(λ=760nm). Dados obtidos: y= (-0,03 ± 0,003) + (0,0037 ± 0,0001) x, R=0,99865
Figura 19: Curva analítica para determinação de fenóis totais em água de infusão (λ=760nm).
Dados obtidos: y= (-0,016 ± 0,008) + (0,0073 ± 0,0002) x, R=0,99769
Figura 20: Curva analítica para determinação de flavonóides em extratos etanólicos e na água
de infusão. (λ=425nm). Dados obtidos: y= (-0,021 ± 0,001) + (0,0082 ± 0,0002) x, R=0,99833
A Tabela 6 apresenta o rendimento obtido com os extratos etanólicos. Os extratos
70% sempre apresentaram um rendimento superior em relação aos extratos 95%. Entre as
plantas, o capim-limão apresentou o menor rendimento e a calêndula apresentou os maiores
valores.
Tabela 6: Rendimento em % dos extratos etanólicos secos
Planta EEP70 (%) EEP95 (%)
Calêndula 33,19 28,26
Capim-limão 20,26 6,55
Espinheira-santa 23,21 7,96
Na Tabela 7 estão apresentados os resultados das quantidades de ácidos fenólicos
presentes nos extratos e nas águas de infusões das plantas, cujos valores mostram que o
extrato obtido em etanol 95% foi mais eficiente na extração dos compostos para a calêndula e
espinheira-santa. Já para o capim-limão, o extrato 70% apresentou-se mais eficiente. Na água
de infusão, a calêndula foi a planta que apresentou o maior teor de fenóis totais e flavonóides.
É importante saber que vários fatores podem interferir na quantidade dos ácidos fenólicos nas
plantas, como a época em que a planta foi colhida, tecidos mais novos geralmente possuem
maior quantidade de ácidos fenólicos. Menores quantidade de compostos fenólicos são
produzidas quando o solo contem muito nitrogênio (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
Tabela 7: Determinação de ácidos fenólicos nos extratos etanólicos e na água de infusão por
UV-Vis. Comprimento de onda = 760 nm. (n=3) (mg/g de extrato)
Planta Água de infusão
mg/g
% extraída na
infusão*
Extrato 70% mg/g Extrato 95% mg/g
Calêndula
Capim-limão
Espinheira-santa
9,00 ± 0,67
3,35 ± 0,36
4,36 ± 0,62
7,4
1,2
0,8
92,35 ± 0,50
285,97 ± 0,84*
230,44 ± 0,40
120,26 ± 0,90*
170,00 ± 0,50
518,28 ± 1,30*
* considerado o maior valor como 100%
5.4 Determinação de flavonóides nos EEP70% e EEP95% e nas águas de infusão
Os flavonóides são compostos polifenólicos naturais largamente distribuídos nos
vegetais, ocorrem naturalmente em frutas, plantas, flores, legumes e são uma parte integrante
da dieta humana (MIDDLETON & KANDASWAMI, 1993; RATTY & DAS, 1988;
HACKETT, 1993). Tem-se reportado na literatura muitos efeitos biológicos dos flavonóides
como: antibacteriano, antiviral, anti-inflamatório, antialérgico (HANASAKI et al, 1994;
HOPE et al, 1983), ação vasodilatadora (DUARTE et al, 1993). Na Tabela 8 são apresentados
os resultados das quantidades de flavonóides presentes nos extratos e nas águas de infusões
das plantas. Os resultados foram parecidos com os obtidos na determinação dos fenólicos,
pois a extração de flavonóides foi mais eficiente com o solvente etanólico a 95% para a
calêndula e espinheira-santa, para o capim-limão a eficiência da extração foi igual para os
dois extratos etanólicos. Um teor maior de flavonóides é encontrado nos extratos etanólicos
obtidos a partir das plantas capim-limão e espinheira-santa, no entanto, quando a extração é
realizada com água quente, nota-se a maior presença dos compostos orgânicos proveniente da
planta calêndula.
A produção de flavonóides nas plantas pode ser afetada devido a variações sazonais
(época de colheita), a idade das plantas, pois em tecidos mais novos há maior concentração de
flavonóides, por serem acumulados principalmente em tecidos superficiais, eles são muito
sensíveis a intensidade da radiação solar, pela proteção contra foto-destruição, ou seja, ao
absorver ou dissipar a energia solar dificultam a danificação dos tecidos internos pela radiação
UV-B, absorvem esta radiação sem alterar a radiação fotossinteticamente ativa; existe ainda
para os flavonóides uma correlação com a altitude, pois em maiores altitudes há maior
susceptibilidade a radiação UV, (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
Tabela 8: Determinação de flavonóides nos extratos etanólicos e na água de infusão por UV-
Vis. Comprimento de onda = 425 nm, (n=3). (mg/g de extrato)
Planta Água de infusão
mg/g
% extraída na
infusão*
Extrato 70% mg/g Extrato 95% mg/g
Calêndula
Capim-limão
Espinheira-santa
2,23 ± 0,50
0,66 ± 0,08
0,89 ± 0,73
11,7
1,5
2,2
13,55±0,55
41,54 ± 2,69*
20,60 ± 1,25
18, 95 ± 0,45*
38,20 ± 2,04
39,00 ± 1,10*
* considerado o maior valor como 100%
5.5 Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos e das águas de infusão
Para as águas de infusão das plantas os resultados foram todos negativos, ou seja, não
apresentaram atividade antimicrobiana frente aos micro-organismos testados. Segundo
Silveira et al., a utilização de plantas no tratamento de doenças é uma prática muito comum,
principalmente nos países subdesenvolvidos, devido a dificuldade de acesso imediato ao
serviço de saúde pública (SILVEIRA et al, 2007). Desta forma, o uso de chás ou infusões pela
população deve ser revisto com cuidado, dependendo do objetivo, pois muitas vezes a infusão
de calêndula é utilizada para o tratamento de candidíase. Por outro lado, é preciso salientar
que muitas vezes moléculas, como polissacarídeos de cogumelos não têm efeito positivo em
testes in vitro, entretanto, quando in vivo, estimulam o sistema imune e propiciam efeitos
benéficos. Portanto, os resultados de ausência da atividade antimicrobiana das infusões devem
ser interpretados com cuidado, e apenas indicam a necessidade de novos estudos, a fim de
esclarecer se há benefícios reais no organismo após a ingestão destes chás.
Para os extratos etanólicos 95% e 70% das três plantas estudadas, os micro-
organismos Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Listeria monocytogenes ATCC 19111 e
Candida albicans (isolado clínico), apresentaram resultados negativos, ou seja, os extratos
não apresentaram atividade frente a esses micro-organismos.
Para os micro-organismos Staphylococcus aureus ATCC 25923, e Klebsiella sp. os
resultados foram positivos e podem ser verificados na Tabela 9.
Tabela 9: Atividade antimicrobiana de extratos etanólicos de espinheira-santa (ES), calêndula
(CA) e capim-limão (CL) por difusão em ágar. (n=2)
Média dos halos de inibição (mm)
Extratos Staphylococcus aureus Klebsiella sp.
ES 70%
ES 95%
CA 70%
CA 95%
CL 70%
CL 95%
1,45 ± 0,35
NO
NO
0,73 ± 0,11
NO
NO
2,45 ± 0,64
2,70 ± 0,28
3,48 ± 1,10
5,35 ± 2,19
9,00 ± 0,42
6,10 ± 0,57
NO= não observado
Como esperado, nenhuma solução etanólica utilizada como controle negativo
apresentou atividade contra os micro-organismos testados.
De acordo com a Tabela 8, verificou-se que os extratos ES70% e CA95%
apresentaram atividade antagônica fraca frente à Staphylococcus aureus, enquanto os outros
extratos não apresentaram atividade. Todos os extratos testados apresentaram atividade frente
a Klebsiella sp. sendo que o extrato CL70% apresentou a maior atividade, com um halo de
9,00 ± 0,42 mm. Este extrato também apresentou a maior concentração de flavonóides
(41,54±2,69), o que sugere que a atividade antimicrobiana está correlacionada a presença
deste grupo de moléculas (MIDDLETON & KANDASWAMI, 1993; RATTY & DAS, 1988;
HACKETT, 1993).
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada também através da
determinação da quantidade de substância necessária para inibir o crescimento do micro-
organismo teste; cujo valor é conhecido como concentração inibitória mínima - CIM.
Os extratos que apresentaram atividade antimicrobiana foram utilizados para
determinar o CIM (concentração inibitória mínima) e o CBM (concentração bactericida
mínima). Os resultados são apresentados na Tabela 10.
Tabela 10: Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM)
dos extratos etanólicos de espinheira-santa (ES), calêndula (CA) e capim-limão (CL) frente à
Staphylococcus aureus e Klebsiella sp.
Extratos etanólicos
ES CA CL
Micro-organismos
Concentração
(mg/mL)
95% 70% 95% 70% 95% 70%
CIM - - CIM - -
25,0
CBM
CBM
2,5 CIM - - CIM - -
Staphylococcus aureus
0,25 CIM - - - - -
CIM CIM CIM CIM CIM
2,5
CBM CBM CBM
-
CBM
CBM
CIM CIM CIM - CIM CIM
Klebsiella sp.
0,25
CBM
- - - CBM
CBM
- ocorreu turvação pelo desenvolvimento microbiano e, portanto não apresenta atividade
antimicrobiana
O extrato de ES 95% apresentou ausência de turvação, ou seja, inibiu o
desenvolvimento de S. aureus nas concentrações de 25, 2,5 e 0,25 mg/mL, portanto a CIM
para este extrato é de 0,25 mg/mL. Entretanto, após o plaqueamento destas alíquotas foi
observada ausência de desenvolvimento microbiano apenas na concentração de 25 mg/mL, o
que indica que esta concentração é a CBM deste extrato frente ao S. aureus. Segundo o
estabelecido por Holetz et al., uma planta ou seu extrato é considerado com potencial
antimicrobiano quando apresenta CIM menor que 1,0 mg/mL (HOLETZ, 2002); desta forma
o extrato de ES95% pode ser considerado como tendo atividade antimicrobiana importante
frente à S. aureus.
O extrato de CA70% apresentou atividade inibitória nas concentrações de 25 e 2,5
mg/mL (CIM), entretanto a CBM ocorreu em 25 mg/mL. Este resultado sugere a presença de
moléculas inibitórias neste extrato, porém com insignificante potencial antimicrobiano versus
S. aureus.
A ação antimicrobiana dos extratos foi mais eficiente contra Klebsiella sp., pois os
resultados indicaram que a CIM é de 0,25 mg/mL para os extratos ES95%, ES70%, CA95%,
CL 95% e CL70%. E ainda, a CBM também foi determinada como sendo de 0,25 mg/mL
para os extratos de ES95%, CL95% e CL70%. A Klebsiella sp. apresentou uma
susceptibilidade muito maior do que S. aureus aos extratos testados. Estes resultados
demonstraram que os extratos de ES 95% e CL95% e CL70% portanto, poderiam ser
utilizados para combater a Klebsiella sp., pois os resultados dos testes in vitro demonstraram
ausência de ação antimicrobiana das infusões frente aos micro-organismos testados. Portanto,
os extratos ES95%, ES70%, CA95%, CL 95% e CL70% apresentam importante atividade
antimicrobiana frente à Klebsiella sp.
5.6 Estudo quimiométrico
A análise dos componentes principais foi aplicada aos dados experimentais auto-
escalonados dos teores de íons metálicos, fenóis, flavonóides, e atividades antimicrobianas
obtidos das folhas calcinadas, infusões e extratos de plantas medicinais para verificar as
possíveis semelhanças e diferenças entre as amostras e sua correlação entre as variáveis. O
auto-escalonamento foi feito para assegurar que todas as análises tivessem igual importância
para auxiliar na discriminação das amostras (Tabelas 11 e 12). O estudo quimiométrico foi
dividido em duas partes, a primeira envolveu a análise de componentes principais dos
resultados obtidos com as infusões aquosas e folhas calcinadas e a segunda análise fez-se
orientada aos resultados obtidos com os extratos etanólicos das plantas.
A Figura 21 apresenta os gráficos de escores das amostras e os pesos das variáveis da
primeira etapa do estudo. A primeira, segunda e terceira componentes principais capturaram
juntas 97,7% de variância dos dados experimentais. Em 64,20% de variância capturada pela
primeira componente principal, as amostras foram divididas em dois grandes grupos (Figura
21A). O grupo das amostras de infusões aquosas, no eixo negativo de X e o das plantas
calcinadas no eixo positivo de X. A separação ocorreu devido a grande diferença entre as
quantidades de íons metálicos e compostos orgânicos presentes nas plantas calcinadas em
relação às infusões aquosas. A Figura 21B apresenta os pesos das variáveis, podendo ser
observado que as variáveis da primeira componente principal estão todas no eixo positivo de
X, indicando que ocorre uma correlação direta entre elas.
Analisando a Figura 21B observa-se que os maiores escores da primeira componente
principal formam um grupo de amostras de folhas de capim-limão (CL), espinheira-santa (ES)
e calêndula (CA). Os pesos da primeira componente principal, que separaram o grupo das
plantas calcinadas, são os de teores de Pb, Ca, Al, flavonóides, Cu, Mg, fenóis, Zn, Cr, Fe,
Mn, K e Na (nesta ordem) que estão presentes em uma quantidade relativamente maior nas
plantas calcinadas do que nas infusões. Um dado relevante é que os íons metálicos pesados
não foram encontrados nas infusões, podendo estar fixados pelas constituintes menos solúveis
da planta.
De acordo com a segunda componente principal (18.86% de variância capturada -
Figura 21B), dentro do grande grupo das plantas calcinadas, ainda pode-se diferenciar a planta
ES das demais CL e CA, respectivamente. A ES está localizada no eixo positivo de X e Y,
portanto apresenta os maiores teores relativos das variáveis localizadas nos eixos de maiores
pesos em X e Y, isto é, teores de fenóis, Mg, Cr, Cu ,flavonóides e Pb (nesta ordem de
importância). A CA e CL calcinados contêm maiores teores relativos de Zn e Al. Os maiores
teores de Mn nas infusões foram importantes para formar um grupo de amostras de infusão de
CL e ES, diferenciando-a da amostra de infusão da CA, esta contém maiores teores de Na, Zn,
Al e quantidade intermediária de K e Fe nas infusões.
Tabela 11: Valores auto-escalonados dos teores de íons metálicos nas folhas calcinadas (cinzas) e infusões das plantas medicinais.
Amostras Calêndula folha Calêndula infusão
aquosa
Espinheira-santa
folha
Espinheira-santa
infusão aquosa
Capim-limão folha Capim-limão
infusão aquosa
Flavonóides
-0.17561 -0.70928 1.73356 -0.73154 0.61925 -0.73638
Fenóis 0.09075 -0.78216 1.13752 -0.85212 1.27013 -0.86413
Al 1.1007 -0.83277 0.29516 -0.85939 1.20299 -0.90669
Ca 1.21495 -0.60111 1.13127 -1.08757 0.16305 -0.8206
Cu 0.71992 -0.13177 1.56358 -0.91918 -0.1607 -1.07185
K 0.84907 -0.25482 -0.77532 -1.19958 1.47165 -0.09101
Mg 0.47116 -0.70541 1.74938 -0.49839 -0.03151 -0.98523
Na 1.72465 0.69403 -0.53193 -0.74532 -0.40642 -0.73503
Zn 1.63253 -0.08033 0.18797 -1.05259 0.34495 -1.03253
Cr 0.78422 -0.63341 1.68909 -0.63341 -0.57308 -0.63341
Fe 1.3991 -0.67719 -0.50973 -0.6742 1.16984 -0.70784
Mn -0.49881 -0.9905 0.85062 -0.76458 1.5611 -0.15783
Pb 0.74247 -0.88952 1.29476 -0.88952 0.63135 -0.88952
Figura 21: Análise dos componentes principais dos dados de teores de íons metálicos e
compostos fenólicos: escores (A) e pesos (B) da primeira e segunda componentes principais
para as amostras das folhas calcinadas e infusões aquosas.
ESINF (espinheira-santa em infusão aquosa); CLINF (capim-limão em infusão aquosa); CAINF (calêndula em
infusão aquosa); ESFL (espinheira-santa na folha calcinada); CLFL (capim-limão na folha calcinada); CAFL
(calêndula na folha calcinada).
A segunda e a terceira componentes principais capturaram 33,5% da variância, dos
quais 14,7% foram correspondentes a terceira componente principal. As duas componentes
separaram as amostras de acordo com o tipo de planta (Figura 22). O CL calcinado e infusão
formaram um grupo devido as maiores quantidades de Mn, flavonóides (maior quantidade
extraída da folha calcinada e menor quantidade na infusão), K (maior quantidade na folha
calcinada e infusão) e de Al (maior quantidade na folha calcinada e menor quantidade na
infusão). O grupo da ES (infusão e folha calcinada) foi isolado de acordo com os teores de
fenóis (maior quantidade total extraída e menor quantidade na infusão aquosa), Pb (maior
quantidade na folha calcinada e zero na infusão) e Mg (maiores quantidades na folha
calcinada e na infusão). A CA infusão e folha foram separadas devido aos teores de Na
(maiores quantidades na folha calcinada e na infusão), Zn (maiores quantidades na folha
calcinada e na infusão), Ca (maiores quantidades na folha calcinada e na infusão), Cu
(quantidade intermediária na folha calcinada e maior na infusão), Cr (quantidade
intermediária na folha calcinada e zero na infusão) e Fe (maior na folha calcinada e
intermediária na infusão).
Figura 22: Análise dos componentes principais dos dados de teores de íons metálicos e
compostos fenólicos: escores (A) e pesos (B) da segunda e terceira componentes principais
para as amostras das folhas calcinadas e infusões aquosas.
ESINF (espinheira-santa em infusão aquosa); CLINF (capim-limão em infusão aquosa); CAINF (calêndula em
infusão aquosa); ESFL (espinheira-santa na folha calcinada); CLFL (capim-limão na folha calcinada); CAFL
(calêndula na folha calcinada).
Na Figura 23 (A,B,C) foram plotados os pesos correspondentes a cada variável da
primeira, segunda e terceira componentes principais mostrando novamente que todas as
variáveis estão correlacionadas positivamente de acordo com a primeira componente
principal, mas que K e Na foram menos importantes na diferenciação das amostras de folha
calcinada e infusão.
Por outro lado, a segunda componente principal mostrou que fenóis, flavanóides, Cr,
Mg, Cu, Mn e Pb estão inversamente correlacionados a Al, K, Na, Zn e Fe. Estes dados estão
consistentes com o fato de que na solução do solo a presença de Ca e Mg está inversamente
correlacionada a do Al, pois é desta solução que a planta extrai minerais, portanto se houver
menos Al haverá mais Ca e Mg na folha. O Ca teve peso próximo a zero, portanto não
contribuiu para esta segunda componente principal.
Um dos mecanismos de proteção da planta contra íons metálicos nocivos é a
complexação dos mesmos com compostos fenólicos, como flavonóides, que tem a habilidade
de formar quelatos com cátions metálicos (CUYCKENS & CLAEYS,2004). Uma correlação
positiva, entre Al, fenóis e flavonóides pode ocorrer se ele estiver complexado. Essa
correlação fica mais evidente na análise quimiométrica dos extratos etanólicos. Nesta primeira
etapa do estudo quimiométrico, o Al está inversamente correlacionado a fenóis e flavonóides
(Figura 23 B), pois o Al medido foi resultante do processo de calcinação da folha, portanto
sendo o Al total presente na folha, complexado e não complexado e esta quantidade pode não
estimular a produção de fenóis e flavonóides pela planta.
Estudos adicionais serão necessários para avaliar a relação da presença de maiores
teores de Na, K, Fe e Zn (Figura 23B), que estão inversamente correlacionados aos
fenóis/flavonóides, na produção destes compostos pela planta. Já a correlação positiva destes
compostos com Cu, Pb e Cr, pode significar quais os íons metálicos que, complexados ou
não, promovem a produção de fenóis/flavonóides na folha, através do metabolismo, ou seja o
aumento da quantidade de determinado metal na folha propicia um aumento de compostos
orgânicos. Se na segunda etapa da análise (extração de íons metálicos, flavonóides e fenóis
com solventes) um aumento destes compostos orgânicos representa um aumento da extração
destes íons metálicos, seria um indicativo da possível complexação dos mesmos por
compostos orgânicos. Os teores de maior peso que compuseram a terceira (C) componente
principal foram os fenóis, flavonóides e Mn correlacionados diretamente entre si e
inversamente aos teores de Na e Zn.
Figura 23: Pesos da primeira (A), segunda (B) e terceira (C) componentes principais nas
infusões e plantas calcinadas.
Para avaliar o que foi questionado acima e outras correlações entre determinados
constituintes realizou-se a análise dos componentes principais para os seis extratos etanólicos
das folhas. Na Tabela 12 estão os dados auto-escalonados processados, da mesma forma que
na primeira análise quimiométrica. A primeira, a segunda e a terceira componentes principais
capturaram 38,0%, 26,5% e 19,4% da variância dos dados experimentais respectivamente,
juntas totalizando 83,9% da variância capturada.
A primeira e a segunda componentes principais (Figura 24A) separaram os extratos
etanólicos 95% obtidos a partir do CL, CA e ES dos demais. O extrato CL 70% diferenciou-se
por maiores teores de Al , flavonóides e atividade frente a Klebsiella sp., o extrato CA 70%
por maiores teores de Cu, Ca, Zn e quantidade intermediária (próxima ao máximo) de K, o da
ES maiores teores de Mg e melhor atividade contra S. aureus. Os extratos 95% separam
devido a teores similares de Na.
Os dados de escores e pesos da terceira componente principal são apresentados na
Figura 25. A terceira componente principal separou os extratos de acordo com o tipo de planta
formando vários grupos: grupo com escores negativos (extratos de ES); grupo próximo de
zero (CL) e grupo positivo (CA). As variáveis flavonóides (próximo do máximo ES 95%),
fenóis (máximo ES 95%) e Mg (máximo na ES 70%), separaram a ES; Al (máximo CL 70%),
Ca (próximo do máximo), atividade contra S. aureus (zero) e Zn (quantidade intermediária) o
CL; Na (quantidade intermediária), Cu (quantidade máxima) e atividade anti-Klebsiela sp.
(intermediária) a CA. Isto sugere o uso do extrato de ES como fonte de fenóis, flavonóides e
Mg, e o CL adicional de Ca e Zn. Os cuidados com o solo para diminuir a absorção de Al pela
planta devem ser maiores durante o cultivo de CL considerando os extratos etanólicos.
Tabela 12: Valores auto-escalonados dos teores de íons metálicos, fenóis e flavonóides nos extratos etanólicos 70% e 95%.
Amostras Calêndula
Extrato 70%
Capim-limão
Extrato 70%
Esp. santa
Extrato 70%
Calêndula
Extrato 95%
Capim-limão
Extrato 95%
Esp. santa
Extrato 95%
Flavonóides -1.23096 1.05231 -0.65586 -0.79046 0.77985 0.84511
Fenóis -0.92636 0.32036 -0.0372 -0.74664 -0.42637 1.81620
Al -0.50998 1988 -0.51319 -0.13111 -0.69941 -0.13432
Ca 1.33811 0.89926 -0.32919 -0.89449 -1.20632 0.19263
Cu 1.45421 1.03961 -0.34239 -0.82402 -0.41149 -0.91592
K 0.96083 -0.59772 01/01/35 -1.12629 -0.75386 0.15354
Mg 0.09027 -0.59444 1.97071 -0.62043 -0.50029 -0.34581
Na 0.37816 -0.45331 -0.89517 1.85204 -0.56616 -0.31556
Zn 1.239 0.16121 1.12846 -0.99028 -0.74156 -0.79683
S.aureus -0.59839 -0.59839 1.7897 0.60389 -0.59839 -0.59839
Klebsiella sp -0.54628 1.66016 -0.95799 0.20119 0.50098 -0.85806
Figura 24: Análise dos componentes principais dos dados de teores de íons metálicos:
escores (A) e pesos (B) da primeira e segunda componentes principais nos extratos alcoólicos.
Kleb. –
Klebsiella sp
; Staf. – S. aureus.
Figura 25: Análise dos componentes principais dos dados de teores de íons metálicos:
escores das amostras (A) e pesos das variáveis (B) nos extratos alcoólicos da primeira e
terceira componentes principais.
Kleb. –
Klebsiella sp;
Staf. – S. aureus.
A Figura 26 apresenta os pesos das variáveis avaliadas nas PCAs. Na primeira
componente principal estão diretamente correlacionados, o teor de flavonóides, atividade anti-
Klebsiela e teor de Al indicando que o mesmo pode estar complexado com os flavonóides.
Estão inversamente correlacionados aos teores de flavonóides e a atividade anti-Klebsiela
todos os demais íons metálicos e a atividade anti – S.aureus. Os pesos da segunda
componente principal indicam os teores de Al, Ca, Cu, Zn, flavonóides e atividade anti-
Klebsiela diretamente correlacionados entre si, tornando possível novamente a hipótese de
formação de complexos fenóis/flavonóides com Al e Cu e estão inversamente correlacionados
aos teores de Na e anti S.aureus.
As correlações positivas entre teores de fenóis/flavonóides nos extratos etanólicos com
determinados íons metálicos permitem outras hipóteses, além da possível complexação entre
estes íons metálicos e flavanóides/fenóis tais como: a extração dos flavonóides/fenóis em
etanol é favorecida pela presença do metal, como a de flavonóides é favorecida por Ca, K, Cu
e Zn; as correlações entre a solubilidade de determinados fenóis/flavonóides com a
solubilidade de íons metálicos, como Ca, K Cu e Zn e flavonóides; alguns íons metálicos ou
compostos organometálicos que se formam podem favorecer a atividade antimicrobiana de
fenóis/flavonóides, neste caso, Al, Cu, Ca, K Cu e Zn podem favorecer a atividade anti-
Klebsiela sp. , mas com maior intensidade os íons metálicos o Al, Ca e Cu (maiores pesos –
Fig. 26).
A Figura 26C apresenta os pesos das variáveis correlacionadas pela terceira
componente principal, mostrando que para diferenciar os extratos das plantas são importantes
os teores de flavonóides, fenóis, Mg (diretamente correlacionados) que estão inversamente
correlacionados aos teores de Na, Cu e atividade anti-Klebsiela sp.. Novamente o Al foi
correlacionado positivamente a fenóis e flavonóides para valores intermediários, mas o Mg e
K foram mais importantes para favorecer a extração destes compostos de acordo com a planta.
Figura 26: Pesos da primeira (A), segunda (B) e terceira (C) componentes principais nos
extratos etanólicos.
Kleb. –
Klebsiella sp;
Staf. – S. aureus.
O reconhecimento de padrões feito através da análise de componentes principais pode
estabelecer uma assinatura química das plantas medicinais e extratos de plantas de um
determinado local e, para atingir este objetivo, devem ser pesquisados vários locais com
diferentes tipos de plantas, de solos e clima. Como o número de plantas analisadas é pequeno,
este trabalho somente sugere direcionamentos para futuras pesquisas, dando indícios de que
existe um padrão entre os diferentes tipos de plantas medicinais em relação entre seu
conteúdo em substâncias minerais e compostos fenólicos.
6. CONCLUSÕES
Através deste estudo pode-se concluir que os chás (águas de infusão) das plantas
medicinais, são fontes importantes de minerais essenciais como Mg, K e Ca; percebe-se
também que os íons metálicos não essenciais, Pb e Cd, são fracamente extraídos nas infusões,
não causando danos ao ser humano. O Al está presente nas infusões em quantidades
significativas, mas será tóxico apenas se a pessoa sofrer de problemas renais, as quantidades
pequenas absorvidas nas dietas normais são excretadas pelos rins saudáveis, de modo que
nenhuma acumulação ocorre de forma considerável. Como foi verificada uma forte correlação
deste metal com os compostos orgânicos sugere-se que uma porcentagem significante esteja
complexado com os ácidos fenólicos deixando o mesmo menos disponível para o organismo.
Com relação aos compostos orgânicos, a calêndula foi a planta que mais apresentou
ácidos fenólicos e flavonóides na água de infusão. Os extratos etanólicos 95% v/v da
calêndula e da espinheira-santa apresentaram maiores valores de ácidos fenólicos com relação
aos extratos 70%, já no caso do capim-limão, ocorreu o contrário. Para os flavonóides, os
extratos de capim-limão 70% e 95% e de espinheira-santa 95% foram os que apresentaram
maiores teores.
O extrato de espinheira-santa 95% v/v pode ser considerado como tendo atividade
antimicrobiana importante frente a S.aureus, como mostrou o estudo de CIM. E os extratos de
espinheira-santa 70% e 95%, capim-limão 70% e 95% e calêndula 95% apresentaram
atividade antimicrobiana importante frente a Klebsiella sp. As infusões aquosas, nas
concentrações avaliadas, não apresentaram atividade antimicrobiana frente aos micro-
organismos estudados.
Nos extratos etanólicos, não verificou-se a presença dos íons metálicos, Mn, Fe, Cr, Pb
e Cd. Os demais íons metálicos foram melhor extraídos em etanol 70%.
Através da análise das componentes principais foi possível determinar algumas
correlações entre íons metálicos e o teor de fenólicos e flavonóides, entre agentes
antimicrobianos e compostos fenólicos. Sugere-se também que o Ca e o Al competem entre si
pelo mesmo sítio ativo na planta, por isso aparecem inversamente nas PCA´s.
7. TRABALHOS FUTUROS
A partir deste trabalho é possível sugerir a realização de novas pesquisas que poderão
ser desenvolvidos:
• Estudo de íons metálicos e compostos fenólicos em amostras coletadas em outras
regiões (estudo de correlações);
• Estudo de íons metálicos e compostos fenólicos em amostras coletadas em diferentes
estações do ano, com maior e menor incidência de sol;
• Avaliar a ação antimicrobiana dos extratos etanólicos frente a outros micro-
organismos.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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