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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Estudo Fitoquímico e Biológico de
Duguetia riparia (Annonaceae)
Livia Melo Arruda Cunha
Manaus
2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Livia Melo Arruda Cunha
Estudo Fitoquímico e Biológico de
Duguetia riparia (Annonaceae)
Orientadora: Dra. Ana Lúcia Queiroz de Assis Galotta
Manaus
2009
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química da Universidade
Federal do Amazonas como requisito para
obtenção de Grau de Mestre em Química
(área de Concentração Produtos Naturais).
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C972t Cunha, Livia Melo Arruda
Estudo fitoquímico e biológico de Duguetia riparia (Annonaceae) / Livia
Melo Arruda Cunha. ___ 2009.
156f. : il. ; 27 cm.
Dissertação de Mestrado (Programa de Pós-Graduação em Química, área
de concentração Produtos Naturais da Universidade Federal do Amazonas).
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Queiroz de Assis Galotta.
1. Annonaceae - estudo. 2. Duguetia riparia. 3. Liriodenina.
4. Lisicamina. 5. Oxoputerina. 6. Asimilobina.
I. Título.
CDU: 633.88 (811)
Ficha catalográfica confeccionada por Guilhermina de Melo Terra – CRB 396/11
À PROFESSORA ANA LÚCIA QUEIROZ DE ASSIS GALOTTA
Pela orientação realizada
Agradeço.
A EBERTE FRANCISCO DA SILVA CUNHA,
Pelo apóio incondicional, incentivo, paciência e compreensão
Agradeço.
A Deus e minha Mãe pela vida,
À Professora Maria Lúcia Belém Pinheiro pela ajuda e incentivo,
Ao Professor Afonso Leão Duarte pelo apóio em todas as horas,
Agradeço.
A Emanuel Costa pela ajuda incondicional no estudo fitoquímico,
À Dra. Leonor Laura Pinto Leon pela análise leishmanicida,
Ao Dr. Wanderli Pedro Tadei pela análise larvicida,
Agradeço.
À Dominique Moura e Júnior Ribeiro pela ajuda incondicional,
À Equipe do Laboratório B08 por tomar nossos dias mais amenos,
Agradeço.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 11
LISTA DE TABELAS 14
LISTA DE ESQUEMAS 17
LISTA DE QUADROS 19
INTRODUÇÃO 20
CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 25
1. 1 – A FAMÍLIA ANNONACEAE
26
1. 1. 1 – Distribuição geográfica
26
1. 1. 2 – Aspectos botânicos
27
1. 1. 3 – Utilização
28
1. 1. 4 – Principais constituintes
29
1. 1. 5 – Substâncias isoladas e bioatividades
32
1. 2 – O GÊNERO DUGUETIA
36
1. 2. 1 – Substâncias isoladas e bioatividades
36
1. 3 – A ESPÉCIE DUGUETIA RIPARIA
42
1. 3. 1 – Distribuição geográfica
42
1. 3. 2 – Aspectos botânicos
43
CAPÍTULO II
PARTE EXPERIMENTAL – FITOQUÍMICA 44
2. 1 – MATERIAIS, MÉTODOS E EQUIPAMENTOS
45
2. 1. 1 – Métodos cromatográficos
45
2. 1. 1. 1 – Cromatografia em camada delgada
45
2. 1. 1. 2 – Cromatografia em coluna
45
2. 1. 1. 3 – Cromatografia em camada delgada preparativa
46
2. 1. 2 – Reagentes para revelação cromatográfica
46
2. 1. 3 – Equipamento utilizado na identificação espectroscópica
47
2. 2 – COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
47
2. 3 – PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
48
2. 4 – TESTES DE PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
49
2. 4. 1 – Fenóis e taninos
49
2. 4. 2 – Antocianinas, antocianidinas e flavonóides
50
2. 4. 3 – Leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas
50
2. 4. 4 – Flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas
51
2. 4. 5 – Esteróides e triterpenóides
51
2. 4. 6 – Alcalóides
52
2. 5 – FRACIONAMENTO E PURIFICAÇÃO DOS EXTRATOS
52
2. 5. 1 – Fracionamento e purificação do extrato hexânico
52
2. 5. 2 – Fracionamento e purificação do extrato metanólico
55
2. 5. 3 – Fracionamento e purificação do extrato metanólico aquoso 80%
66
CAPÍTULO III
PARTE EXPERIMENTAL – TESTES 76
3. 1 – TOXICIDADE FRENTE À ARTEMIA SALINA LEACH
77
3. 1. 1 – Procedimento
78
3. 2 – ATIVIDADE LEISHMANICIDA
79
3. 2. 1 – Procedimento
85
3. 3 – ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO MOSQUITO AEDES
AEGYPTI
88
3. 3. 1 – Procedimento
89
3. 4 – CAPACIDADE CAPTURADORA DE RADICAIS LIVRES
90
3. 4. 1 – Método qualitativo
92
3. 4. 2 – Método quantitativo
92
3. 5 – DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS
93
3. 5. 1 – Procedimento
94
CAPÍTULO IV
RESULTADOS E DISCUSSÃO 96
4. 1 – FITOQUÍMICA
97
4. 1. 1 – Prospecção fitoquímica dos extratos brutos
97
4. 1. 2 – Identificação dos constituintes químicos de Duguetia riparia
98
4. 1. 2. 1 – Fração RMG
8
98
4. 1. 2. 2 – Fração RMG
9
103
4. 1. 2. 2. 1 – Identificação do alcalóide oxoputerina
104
4. 1. 2. 2. 2 – Identificação do alcalóide lisicamina
111
4. 1. 2. 3 – Fração RMG
13
118
4. 2 – TESTES
133
4. 2. 1 – Toxicidade frente à Artemia salina Leach
133
4. 2. 2 – Atividade leishmanicida
134
4. 2. 3 – Atividade larvicida frente ao mosquito Aedes aegypti
137
4. 2. 4 – Capacidade capturadora de radicais livres
138
4. 2. 4. 1 – Método qualitativo
138
4. 2. 4. 2 – Método quantitativo
139
4. 2. 5 – Determinação de fenólicos totais
140
CONSIDERAÇÕES FINAIS 143
REFERÊNCIAS 145
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Distribuição geográfica da família Annonaceae
26
Figura 02: Algumas espécies da família Annonaceae
27
Figura 03: Estrutura de uma acetogenina (Uvaricina)
30
Figura 04: Alcalóides tipo isoquinolínico encontrados na família
Annonaceae
31
Figura 05: Alcalóides isolados de espécies do gênero Annona
32
Figura 06: Dois dos alcalóides isolados da espécie Annona montana
32
Figura 07: Alcalóides isolados da espécie Annona purpúrea
33
Figura 08: Três dos alcalóides isolados da espécie Annona salzmanii
34
Figura 09: Acetogeninas isoladas da espécie Annona muricata
35
Figura 10: Acetogeninas isoladas da espécie Annona cherimólia
35
Figura 11: Alcalóides isolados da espécie Duguetia spixiana
37
Figura 12: Substância bioativa isolada de Duguetia panamensis
38
Figura 13: Alcalóides isolados da espécie Duguetia hadrantha
39
Figura 14: Alcalóides isolados da espécie Duguetia trunciflora
39
Figura 15: Alcalóides isolados da espécie Duguetia vallicola
40
Figura 16: Alcalóides isolados da espécie Duguetia furfuraceae
41
Figura 17: Alcalóides isolados da espécie Duguetia gardneriana
41
Figura 18: Duguetia riparia 43
Figura 19: Preparação dos extratos
48
Figura 20: Teste de toxicidade frente à Artemia salina
79
Figura 21: Formas de vida do parasita do gênero Leishmania
82
Figura 22: Ciclo de vida do parasita Leishmania spp
83
Figura 23: Ajuste da concentração parasitária a ser utilizada no teste in
vitro da atividade leishmanicida
87
Figura 24: Placa de microtitulação de 96 poços utilizada no teste in vitro
da atividade leishmanicida
88
Figura 25: Estrutura química do 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)
92
Figura 26: Expansão entre
δ
H
8,75 e 6,25 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
8
99
Figura 27: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,50 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
8
99
Figura 28: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,60 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
8
101
Figura 29: Mapa de contornos COSY (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
8
103
Figura 30: Estrutura do alcalóide liriodenina
104
Figura 31: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,80 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
9
105
Figura 32: Expansão entre
δ
H
7,75 e 7,40 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
9
106
Figura 33: Expansão entre
δ
H
6,52 e 4,05 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
9
107
Figura 34: Mapa de contornos COSY (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
109
Figura 35: Espectro de TOCSY-Seletivo (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
110
Figura 36: Estrutura do alcalóide lisicamina
111
Figura 37: Expansão entre
δ
H
9,20 e 8,50 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
9
112
Figura 38: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,80 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
9
113
Figura 39: Expansão entre
δ
H
7,75 e 4,05 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
9
114
Figura 40: Mapa de contornos COSY (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
116
Figura 41: Espectro de TOCSY-Seletivo (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
117
Figura 42: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
118
Figura 43: Expansão entre
δ
H
8,33 e 6,67 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
13
119
Figura 44: Expansão entre
δ
H
3,75 e 2,70 do espectro de RMN de
1
H (400
MHz, CD
3
OD) de RMG
13
120
Figura 45: Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
122
Figura 46: Expansão entre
δ
C
150 e 30 do espectro de RMN de
13
C (100
MHz, CD
3
OD) de RMG
13
123
Figura 47: Mapa de contornos HSQC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
125
Figura 48: Expansão entre
δ
H
8,40 e 7,10 do mapa de contornos HSQC
(
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
126
Figura 49: Expansão entre
δ
H
6,65 e 2,50 do mapa de contornos HSQC
(
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
127
Figura 50: Mapa de contornos HMBC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
129
Figura 51: Expansão entre
δ
H
8,36 e 7,20 do mapa de contornos HMBC
(
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
130
Figura 52: Expansão entre
δ
H
6,65 e 6,60 do mapa de contornos HMBC
(
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
131
Figura 53: Expansão entre
δ
H
6,65 e 3,52 do mapa de contornos HMBC
(
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
132
Figura 54: Expansão entre
δ
H
2,85 e 2,65 do mapa de contornos HMBC
(
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
133
Figura 55: Curvas de inibição dos extratos brutos dos galhos finos de
Duguetia riparia testados frente às formas promastigotas de Leishmania
amazonensis 135
Figura 56: Curvas de inibição das frações dos galhos finos de Duguetia
riparia testadas frente às formas promastigotas de Leishmania amazonensis
136
Figura 57: Cromatoplacas das amostras testadas logo após contato com
DPPH, indicando a presença de compostos antioxidantes
138
Figura 58: Curva de calibração utilizada no teste de determinação de
fenólicos totais
141
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Uso popular e atividades farmacológicas comprovadas de
espécies de Annonaceae
29
Tabela 02: Alcalóides isolados de algumas espécies de Annonaceae
36
Tabela 03: Alcalóides isolados de algumas espécies do gênero Duguetia
42
Tabela 04: Classificação taxonômica da espécie Duguetia riparia St. Hil.
42
Tabela 05: Rendimento das frações oriundas da fração hidrometanólica
dos galhos de Duguetia riparia
53
Tabela 06: Rendimento dos subgrupos obtidos da fração hidrometanólica
dos galhos de Duguetia riparia
54
Tabela 07: Rendimento das frações obtidas do fracionamento do subgrupo
6 originado da fração hidrometanólica dos galhos de Duguetia riparia
55
Tabela 08: Rendimento dos subgrupos obtidos da cromatografia em coluna
da fração F
1
57
Tabela 09: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 2 proveniente do
fracionamento da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
58
Tabela 10: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 9 proveniente da
fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
59
Tabela 11: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 25 proveniente do
fracionamento da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
59
Tabela 12: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 13 proveniente da
fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
60
Tabela 13: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 4 proveniente da
fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
61
Tabela 14: Rendimento dos subgrupos obtidos da cromatografia em coluna
da fração F
3
62
Tabela 15: Rendimento das frações originadas do subgrupo 2 oriundo da
fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
63
Tabela 16: Rendimento das frações originadas do subgrupo 3 oriunda da
fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
63
Tabela 17: Frações obtidas após cromatografia em coluna da fração
metanólica solúvel
65
Tabela 18: Grupos provenientes do fracionamento do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia
68
Tabela 19: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 3 proveniente do
fracionamento do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia 68
Tabela 20: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 4 proveniente do
fracionamento do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia 70
Tabela 21: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 5 proveniente do
fracionamento do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia 70
Tabela 22: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 6 proveniente do
fracionamento do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia 71
Tabela 23: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 7 proveniente do
fracionamento do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia 71
Tabela 24: Frações obtidas após cromatografia em coluna da fração
metanóica solúvel
73
Tabela 25: Frações obtidas após cromatografia em coluna das frações 1, 2,
3, 6 e 7
74
Tabela 26: Resultado da prospecção fitoquímica realizada nos extratos
brutos da espécie Duguetia riparia
97
Tabela 27: Comparação dos deslocamentos químicos (δ
H
), multiplicidades
e constante de acoplamento (J) dos sinais dos hidrogênios de RMG
8
com
aqueles do alcalóide liriodenina
102
Tabela 28: Comparação dos deslocamentos químicos (δ
H
), multiplicidades
e constante de acoplamento (J) dos sinais dos hidrogênios de RMG
9
com
aqueles do alcalóide oxoputerina
108
Tabela 29: Comparação dos deslocamentos químicos (δ
H
), multiplicidades
e constante de acoplamento (J) dos sinais dos hidrogênios de RMG
9
com
aqueles do alcalóide lisicamina
115
Tabela 30: Comparação dos deslocamentos químicos (δ
H
), multiplicidades
e constante de acoplamento (J) dos sinais dos hidrogênios de RMG
13
com
aqueles do alcalóide asimilobina
121
Tabela 31: Dados comparativos dos deslocamentos químicos (δ
C
) dos
espectros de RMN
13
C da fração RMG
13
com os do alcalóide asimilobina
124
Tabela 32: Resultado da toxicidade frente à Artemia salina dos extratos e
frações de Duguetia riparia
134
Tabela 33: Resultado da DL
50
das amostras testadas frente às formas
promastigotas de Leishmania amazonensis
136
Tabela 34: Percentagem média de mortalidade das larvas de Aedes aegypti
frente aos extratos e frações testados
138
Tabela 35: Valores relativos às médias do percentual de redução de DPPH
dos extratos e frações estudados, em três distintas concentrações
139
Tabela 36: Concentração efetiva necessária para descolorir 50% da
solução de DPPH (CE
50
)
140
Tabela 37: Concentração de fenólicos totais presentes nas amostras
testadas
141
Tabela 38: Conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante (CE
50
)
das amostras testadas
142
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 01: Fluxograma de obtenção dos extratos dos galhos de Duguetia
riparia 49
Esquema 02: Fluxograma de obtenção da fração hidrometanólica do
extrato hexânico dos galhos de Duguetia riparia
53
Esquema 03: Obtenção da fração RHG
1
53
Esquema 04: Subgrupos obtidos da fração hidrometanólica dos galhos de
Duguetia riparia
54
Esquema 05: Frações obtidas do fracionamento do subgrupo 6 originado
da fração hidrometanólica dos galhos finos de Duguetia riparia
54
Esquema 06: Marcha completa da obtenção da fração RHG
1
55
Esquema 07: Fluxograma de obtenção da fração diclorometano alcaloídica
do extrato metanólico dos galhos de Duguetia riparia
56
Esquema 08: Subgrupos de frações originados da cromatografia em coluna
da fração F
1
56
Esquema 09: Fracionamento do subgrupo 2 oriundo da fração alcaloídica
dos galhos de Duguetia riparia
57
Esquema 10: Obtenção das frações RMG
1
e RMG
2
59
Esquema 11: Obtenção da fração RMG
3
60
Esquema 12: Fracionamento do subgrupo 13 oriundo da fração alcaloídica
dos galhos de Duguetia riparia
61
Esquema 13: Fracionamento do subgrupo 4 oriundo da fração alcaloídica
dos galhos de Duguetia riparia
61
Esquema 14: Subgrupos de frações originados da cromatografia em coluna
da fração F
3
62
Esquema 15: Frações oriundas do subgrupo 2 originado da fração
alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
62
Esquema 16: Frações oriundas do subgrupo 3 originado da fração
alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia
63
Esquema 17: Obtenção da fração metanólica solúvel dos galhos de
Duguetia riparia 64
Esquema 18: Fracionamento cromatográfico em sílica gel impregnada com
ácido oxálico a 12,1% da fração metanólica solúvel
64
Esquema 19: Marcha completa da obtenção das frações RMG
1
, RMG
2
e
RMG
3
66
Esquema 20: Fluxograma da partição do extrato metanólico aquoso 80%
dos galhos de Duguetia riparia
67
Esquema 21: Fracionamento em coluna de sílica gel do extrato metanólico
solúvel
67
Esquema 22: Fracionamento do subgrupo 3 oriundo do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia
69
Esquema 23: Fracionamento do subgrupo 4 oriundo do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia
69
Esquema 24: Fracionamento do subgrupo 5 oriundo do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia
70
Esquema 25: Obtenção da fração RMG
7
71
Esquema 26: Obtenção da fração metanólica solúvel do extrato metanólico
aquoso 80%
72
Esquema 27: Fracionamento cromatográfico em sílica gel impregnada com
ácido oxálico a 12,1% da fração metanólica solúvel
72
Esquema 28: Fracionamento cromatográfico em sílica C18 das frações 1,
2, 3, 6 e 7
74
Esquema 29: Obtenção das frações RMG
4
, RMG
5
, RMG
6
e RMG
7
75
Esquema 30: Obtenção das frações RMG
8
, RMG
9
, RMG
10
, RMG
11
,
RMG
12
, RMG
13
, RMG
14
e RMG
15
75
LISTA DE QUADROS
Quadro 01: Descrição das possíveis características observadas no teste de
fenóis e taninos
50
Quadro 02: Colorações indicativas da presença de antocianinas, antocianidinas
e flavonóides
50
Quadro 03: Colorações indicativas da presença de leucoantocianidinas,
catequinas e flavanonas
51
Quadro 04: Colorações indicativas da presença de esteróides e triterpenóides
51
20
INTRODUÇÃO
Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
Galhos
Folhas
Frutos
21
O uso de plantas para fins terapêuticos vem se perpetuando na história da civilização
humana, em grande parte, por meio da tradição oral, contribuindo na cura e prevenção de
muitas enfermidades. A própria Bíblia documenta e registra a utilização de raízes, cipós,
folhas, sementes e frutos para a cura de doenças e ferimentos. Outro registro é o papiro da
época da dinastia XVIII, encontrado e publicado por Georg Ebers. Este papiro, conhecido
como papiro de Ebers, enumera cerca de 100 doenças e descreve um grande número de
substâncias de natureza animal e vegetal utilizadas para combatê-las (VILELA apud PINTO
et al., 2002).
A consolidação do emprego de plantas para cura e prevenção de doenças se deu a partir
do século XVIII, quando as primeiras substâncias puras do reino vegetal foram isoladas. Os
compostos mais facilmente isolados nesta época foram os ácidos orgânicos e alcalóides
(PINTO et al., 2002).
Os alcalóides, que representam cerca de 20% das substâncias naturais descritas,
constituem-se em um vasto grupo de metabólitos com grande diversidade estrutural. Esse
grupo químico tem apresentado um grande impacto, através dos tempos, na economia,
medicina e em outros setores sociais e políticos. O uso de extratos vegetais contendo
alcalóides como medicamentos, venenos e em porções mágicas, pode ser traçado desde os
primórdios da civilização. Como exemplo desses usos, podemos citar o emprego de certas
plantas contendo alcalóides em execuções na Grécia antiga, como no caso do filósofo
Sócrates, executado pela ingestão de uma bebida preparada à base de cicuta contendo o
alcalóide coniina. Durante o Império Romano, a esposa do Imperador Augusto, eliminava
seus inimigos e adversários políticos assassinando-os em banquetes com o uso secreto de
beladona, fonte do alcalóide atropina, adicionada aos alimentos (HENRIQUES et al., 1999).
Atualmente, a função natural de muitos metabólitos secundários tem sido reavaliada,
reconhecendo-se que estes são, de fato, essenciais para e existência dos vegetais. Tem sido
22
observado que muitas plantas que produzem alcalóides são evitadas por animais ou insetos em
sua dieta, isto certamente devido à sua toxicidade ou ao fato de a maioria dos alcalóides terem
gosto amargo. Porém não se pode afirmar que as plantas produzam tais substâncias apenas
para sua proteção, pois se esse fosse o caso, plantas que não produzissem alcalóides teriam
sido extintas, causando uma predominância daquelas produtoras desses compostos. Outras
hipóteses têm sido levantadas, como, por exemplo, de que os alcalóides seriam produtos de
detoxificação de substâncias nocivas geradas pelo metabolismo primário vegetal. Contudo,
essa hipótese não é compatível com a complexidade metabólica envolvida na biossíntese
dessas substâncias. Outras hipóteses sugerem que tais substâncias funcionariam como uma
forma de reserva de nitrogênio, embora existam poucas evidências nesse sentido. Também foi
sugerido que os alcalóides poderiam atuar como hormônios reguladores de crescimento,
muito provavelmente inibidores de germinação, devido ao seu poder quelante e/ou citotóxico.
Essas substâncias poderiam, também, auxiliar na manutenção do equilíbrio iônico devido ao
seu caráter alcalino. Assim como outros metabólitos secundários, os alcalóides também
possuem um comprovado papel na defesa contra a invasão de microrganismos e vírus. Outra
possível função dessas substâncias seria a proteção contra a irradiação UV, devido ao fato de,
em sua maior parte, serem compostos com núcleos aromáticos altamente absorventes dessa
radiação (HENRIQUES et al., 1999).
Apesar da história da humanidade confundir-se com a história do uso de plantas no
combate a certas enfermidades, o potencial de plantas superiores como fonte de novos
fármacos ainda não foi bem explorado. Estima-se a existência de mais de dois milhões de
espécies de plantas no planeta, dentre essas a flora brasileira é estimada em aproximadamente
500.000 espécies nativas, das quais 55.000 catalogadas, e somente uma pequena fração desse
imenso acervo foi explorado fitoquimicamente e ainda uma menor parte teve esse estudo
monitorado por testes biológicos (GOTTIELIEB; MORS, 1980; SIMÕES, 2001).
23
Em meio à diversidade Amazônica, a família Annonaceae destaca-se por apresentar
importância econômica considerável e por ser empregada na medicina tradicional (LEBOEUF
et al., 1982). Entre os metabólitos secundários isolados de espécies de Annonaceae podem-se
destacar os flavonóides com propriedades antimicrobiana e antitumoral; diterpenos, com
atividades antitumoral, antibacteriana e antifúngica; acetogeninas com atividades antitumoral,
antibacteriana, antiparasitária e inseticida e os alcalóides benzilisoquinolínicos, com
propriedades antiparasitária, antitumoral, inseticida e antibacteriana (ALALI et al., 1999;
LEBOEUF et al., 1982).
Vale destacar que, apesar do grande número de metabólitos secundários isolados de
espécies de Annonaceae apresentarem atividades biológicas comprovadas, muitos, inclusive,
bioativos contra parasitas causadores da malária, doença de chagas e leishmanioses, o número
de espécies investigadas dessa família ainda é muito reduzido. Dentre as 2500 espécies
distribuídas em 135 gêneros, apenas 150 espécies em 41 gêneros foram estudadas até o
momento (CASTEDO et al., 1991; CRONQUIST, 1981; HUTCHINSON, 1964; JOLY, 1993;
LOBÃO et al., 2005; RIBEIRO et al., 1999; SANTOS, 1995).
Por essa razão objetivou-se com esse trabalho realizar o estudo fitoquímico e biológico
dos galhos finos da espécie Duguetia riparia St. Hil. (Annonaceae) e assim contribuir na
consolidação das pesquisas de plantas amazônicas como fonte de novos fármacos.
Para isso foram estabelecidas as seguintes ações:
a) Determinar as estruturas químicas dos metabólitos isolados dos galhos finos da
espécie Duguetia riparia, através de métodos cromatográficos e espectrométricos
(RMN de
1
H e
13
C, COSY
1
H -
1
H, TOCSY-Seletivo e técnicas correlatas);
b) Avaliar a capacidade capturadora de radicais livres dos extratos e frações obtidos
dos galhos finos de Duguetia riparia, utilizando o 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
(DPPH);
24
c) Determinar a concentração de compostos fenólicos presentes nos extratos e frações
dos galhos finos de Duguetia riparia;
d) Testar a toxicidade dos extratos e frações obtidos dos galhos finos de Duguetia
riparia, frente ao estágio larval de Artemia salina Leach (TAS);
e) Testar os extratos e frações dos galhos finos de Duguetia riparia contra cepas de
Leishmania amazonensis e
f) Testar os extratos e frações dos galhos finos de Duguetia riparia, frente a larvas do
mosquito Aedes aegypti.
25
CAPÍTULO I:
Revisão Bibliográfica
Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
Galhos
Folhas
Frutos
26
1. 1 – A FAMÍLIA ANNONACEAE
1. 1. 1 – Distribuição geográfica
A ordem Magnoliales, uma das mais primitivas das angiospermas, é constituída de
quase 3000 espécies pertencentes a 10 famílias, algumas com amplo número de espécies no
Brasil como Magnoliaceae, Myristicaceae, Lauraceae e Annonaceae (CRONQUIST, 1981).
Dentre estas, a família Annonaceae, descrita por Antoine Laurent de Jussieu, por
apresentar uma combinação de caracteres marcantes, é uma das mais uniformes tanto do
ponto de vista anatômico como estrutural. É constituída por aproximadamente 135 gêneros e
2500 espécies distribuídas principalmente pelas regiões tropicais e subtropicais do globo
terrestre (Figura 01), ocorrendo como árvores aromáticas, arvoretas ou lianas (CRONQUIST,
1981; HUTCHINSON, 1964; JOLY, 1993; LOBÃO et al., 2005; RIBEIRO et al., 1999;
SANTOS, 1995).
Dos gêneros que compõem esta família, 34 podem ser encontrados na América do Sul,
onde predominam os gêneros Annona Linne, Guatteria Ruiz et Pavon, Rollinia St. Hil.,
Xylopia Linne e Duguetia St. Hil. Dos 34 gêneros que ocorrem na América do Sul, 29 podem
ser encontrados no Brasil, incluindo Duguetia com 50 das 70 espécies catalogadas (RIBEIRO
et al., 1999; SANTOS, 1995).
Figura 01: Distribuição geográfica da família Annonaceae.
FONTE: HEYWOOD, 1978.
27
1. 1. 2 – Aspectos botânicos
No que tange à descrição botânica, destaca-se que as espécies dessa família são
constituídas em sua maioria por plantas lenhosas (árvores ou arbustos), apresentando folhas
inteiras, de disposição alternada dística, sem estípulas. As flores são isoladas ou reunidas em
inflorescências, grandes ou de tamanho pequeno, hemicíclicas, hermafroditas, diclamídeas,
com perianto diferenciado em cálice e corola, em geral trímeras com três sépalas e três pétalas
carnosas. Estames muito numerosos, dispostos, geralmente, espiraladas, livres entre si,
apocárpicos, com um a muitos óvulos (JOLY, 1993). O fruto geralmente é apocárpio
baciforme, porém frutos sincárpios podem ser encontrados em gêneros como Annona, Fusae,
Rollinia e Duguetia. As sementes, caracteristicamente, apresentam endosperma com período
de germinação curto (Figura 02) (JOLY, 1993; RIBEIRO et al., 1999).
Figura 02: Algumas espécies da família Annonaceae: Cananga odorata (1), Asimina triloba (2), Annona cacans
(3), Annona squamosa (4) e Goniothalamus tavoyensis (5).
FONTE: (Foto 1): http://www.da-academy.org. (Foto 2): http://www.dendronetcetera.blogspot.com. (Foto 3):
http://www.sindareia.com.br. (Foto 4): http://www.tropicalfruitnursery.com. (Foto 5) http://www.gibbonproject.org.
Acessado em 03 de março de 2008.
1 4 5
2 3
28
1. 1. 3 – Utilização
O principal valor econômico da família Annonaceae é o fornecimento de frutos
comestíveis, tais como: graviola (Annona muricata), pinha, fruta-do-conde ou ata (Annona
squamosa), biribá (Rollinia mucosa), pindaíba (Duguetia lanceolata), cherimólia (Annona
cherimólia) e araticum (nome de muitas espécies nativas do Brasil) (HUTCHINSON, 1964;
LEBOEUF et al., 1982; PAULINO NETO; OLIVEIRA, 2006).
Porém, algumas espécies, como Bocageopsis spp, Fusae longifólia, Guatteria
megalophylla, Guatteria stipitata e Oxandra polyantha, são de grande importância em
madeireiras (MURILO; RESTREPO, 2000; SÁNCHEZ, 1997). Desta forma, a madeira de
Duguetia sessilis é utilizada, geralmente, como suporte de telhados de casas, enquanto que a
espécie Xylopia sericea fornece madeira para mastros de pequenas embarcações (LOBÃO et
al., 2005).
Na alimentação, os frutos e sementes de diversas espécies de Xylopia são aproveitados
como condimentos. Assim, as sementes da X. sericea podem substituir a pimenta do reino ou
a pimenta da índia, enquanto os frutos, ainda não maduros, da X. aromática, podem ser
substitutos da pimenta malagueta (GEMTCHÚJNICOV, 1976; HOEHNE et al., 1941;
LOBÃO et al., 2005).
Outras espécies são utilizadas como plantas ornamentais (Xylopia brasiliensis e
Cananga odorata) e na obtenção de perfumes, óleos comestíveis, sabões, álcool e papel
(HOEHNE et al., 1941; HUTCHINSON, 1964; LEBOEUF et al., 1982).
Essa família também se destaca pelo amplo número de utilidades na medicina popular
(Tabela 01). Assim, as sementes reduzidas a pó de Rollinia mucosa são usadas contra
enterocolite, enquanto que seu fruto (biribá) é tido como analéptico e antiescorbútico e os
29
frutos ainda verdes de Xylopia aromática são utilizados como vermífugo e tônico para o
estômago e intestino (PRANCE, 1975).
Espécie Uso popular Atividade
comprovada
Referência
Annona spp. Antiparasitário,
antitumoral, inseticida,
antiviral, antimicrobiano
e antifúngico
Antitumoral,
Leishmanicida
Antimalárica
LEBOEUF et al., 1982
SAHPAZ et al., 1994*
Artabotrys hexapetalus Antimalárico Antimalárica
Antitumoral
WONG & BROW, 2002*
LI et al., 1997*
Enantia chlorantha Tuberculose, infecções
hepáticas e úlceras
Anti-HIV WAFO et al., 1999*
Enantia polycarpa Anti-séptico - IRVINE, 1961*
Goniothalamus velutinus Analgésico, intoxicação
alimentar e repelente
- OMAR et al., 1992
Guatteria amplifolia Antiparasitário Antimalárica PAREDES et al., 2001*
Guatteria boliviana Antitérmico e vermífugo Antiparasitária MAHIOU et al., 2000
Guatteria foliosa Antiparasitário e
inseticida
Antiparasitária
Antiviral
PAREDES et al., 2001*
Miliusa balansae Gastropatia e
glomerulonefropatia
- KAMPERDICK et al., 2002
Miliusa tomentosa - Analgésica
Antibacteriana
JUMANA et al., 2000*
LEBOEUF et al., 1982
Mnodora myristica Inseticida e analgésico - IRVINE, 1961*
Monodora tenuifolia Antitumoral - IRVINE, 1961*
Pachypodanthium staudtii Inseticida - IRVINE, 1961*
Polyalthia nemoralis - Hepatite
Antimalárica
LEBOEUF et al., 1982
Popowia diclina Edema - IRVINE, 1961*
Rollinia mucosa Antitumoral, enterocolite
e antiescorbútica
Antitumoral,
Antimicrobiana
Antifúngica
KUO et al., 2001*
SHI et al., 1997
Uvária dependens Antiparasitário Antimalárica NKUNYA et al., 1993*
Uvária klaineana Antiparasitário Leishmanicida AKENDENGUE et al., 1999
Xylopia quitashi Edema - IRINE, 1961*
Xylopia vielana Reumatismo, analgésico
e antimalárico
- KAMPERDICK et al., 2002
Xylopia frutescens Diurético e reumatismo - TAKAHASHI et al., 1995*
Tabela 01: Uso popular e atividades farmacológicas comprovadas de espécies de Annonaceae.
(*) apud COSTA, 2004.
1. 1. 4 – Principais constituintes
Segundo Leboeuf et al. (1982), os alcalóides, compostos nitrogenados em sua maioria
farmacologicamente ativos, são os principais constituintes químicos das espécies pertencentes
à família Annonaceae. Além dos alcalóides, também estão presentes: carboidratos, lipídeos,
aminoácidos, proteínas, polifenóis, diterpenos, triterpenos, lactonas, flavonóides e esteróides
30
(CAVÉ et al., 1987; COSTA, 2004). Nos últimos anos, a descoberta de acetogeninas de
Annonaceae tem atraído grande interesse dos pesquisadores devido ao elevado número de
atividades biológicas atribuídas a essa classe de substâncias (CHANG et al., 1998). Dentre as
bioatividades relatadas, destacam-se as atividades antitumoral, antimalárica, antimicrobiana,
antiprotozoária, pesticida, vermicida, abortiva, imunossupressora e inibidora do apetite
(ALALI et al., 1999; NASCIMENTO et al., 2003).
As acetogeninas de Annonaceae são compostos de origem policetídica que contêm uma
cadeia com 35 a 37 átomos de carbono. São usualmente caracterizadas por uma longa cadeia
alifática ligando um grupo metil terminal a um anel
δ
-lactona α,β-insaturado, e pela presença
de um a três anéis tetrahidrofurânicos (THF) ao longo da cadeia. Podem possuir ainda
hidroxilas, acetoxilas, cetonas, epóxidos e/ou ligações duplas (ALALI et al., 1999;
RUPPRECHT et al., 1990) (Figura 03).
Figura 03: Estrutura de uma acetogenina (Uvaricina).
Os alcalóides mais comumente encontrados nesta família são do tipo isoquinolínico,
tais como os isoquinolínicos simples (7), bisbenzilisoquinolínicos (8),
benziltetraisoquinolínicos (9), bisbenziltetraisoquinolínicos (10), protoberberínicos,
OH
O
O
CH
3
O
O
CH
3
OCH
3
O
6
31
tetrahidroprotoberberínicos (11) e aporfinóides, incluindo os alcalóides com núcleo aporfínico
verdadeiro e alcalóides com núcleo modificado (12) (Figura 04) (CAVÉ et al., 1987).
Figura 04: Alcalóides tipo isoquinolínico encontrados na família Annonaceae: isoquinolínicos simples (7),
bisbenzilisoquinolínicos (8), benziltetraisoquinolínicos (9), bisbenziltetraisoquinolínicos (10),
tetrahidroprotoberberínicos (Spiduxina) (11) e aporfinóide com núcleo modificado (12).
N
CH
3
H
R
1
O
R
2
O
OH
H
3
CO
NH
OCH
3
OR
1
OH
H
NH
H
3
CO
R
2
O
O
H
N
OCH
3
OHC
OH
H
3
CO
H
3
CO
N
R
1
H
OR
2
R
2
O
H
3
CO
N
CH
3
OMe
OR
1
OR
3
N
CH
3
R
2
O
O
O
N
7
8
9 10
11 12
32
1. 1. 5 – Substâncias isoladas e bioatividades
Dentre os alcalóides isoquinolínicos, destacam-se os compostos liriodenina, um
alcalóide do tipo oxoaporfínico (13) e anonaína, tipo aporfínico (14), os mais encontrados nas
espécies do gênero Annona (Figura 05), sendo ainda considerados marcadores
quimiotaxonômicos desta família (ACHENBACH; HEMRICH, 1991; COSTA, 2004).
Figura 05: Alcalóides isolados de espécies do gênero Annona: Liriodenina, alcalóide oxoaporfínico (13) e
Anonaína, alcalóide aporfínico (14).
Pesquisas com o extrato metanólico das folhas de Annona montana revelaram
significante citotoxicidade in vitro contra diferentes tipos de tumores. O fracionamento
biomonitorado deste extrato levou à identificação dos alcalóides liriodenina (13) (Figura 05),
annoretina (15) e argentinina (16) como compostos ativos (Figura 06) (WU et al., 1993).
Figura 06: Dois dos alcalóides isolados da espécie Annona montana: Annoretina (15) e Argentinina (16).
N
O
O
O
NH
O
O
13 14
15 16
OH
CH
3
O
N
CH
3
OH
CH
3
O
N
CH
3
CH
3
33
Segundo Chang et al. (1998), o extrato metanólico das folhas de Annona purpurea
apresentou efeito inibitório de agregação plaquetária induzido por vários agentes de
agregação, cujo fracionamento mostrou a presença de alcalóides como substâncias bioativas.
A elucidação estrutural levou à identificação dos alcalóides 7-hidróxi-desidrothalicsimidina
(17), thalicsimidina (18), norpurpureína (19), lirinidina (20) e N-metilasimilobina (21), aos
quais foi atribuída a atividade biológica (Figura 07).
Figura 07: Alcalóides isolados da espécie Annona purpúrea: 7-hidróxi-desidrothalicsimidina (17),
Thalicsimidina (18), Norpurpureína (19), Lirinidina (20) e N-metilasimilobina (21).
Da casca do tronco de Annona salzmanii, foram isolados quatro alcalóides: anonaína
(14) (Figura 05), reticulina (22), laurelliptina (23) e isoboldina (24) (Figura 08). Estes foram
submetidos a testes antimicrobianos e somente a anonaína apresentou atividade
antibacteriana, enquanto que todos os quatro alcalóides demonstraram atividade antifúngica
(PAULO et al., 1992).
17 18
CH
3
O
CH
3
O
N
CH
3
OCH
3
CH
3
O
OCH
3
OH
CH
3
O
CH
3
O
N
CH
3
OCH
3
CH
3
O
OCH
3
CH
3
O
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3
O
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OCH
3
CH
3
O
OCH
3
CH
3
O
HO
N
CH
3
HO
CH
3
O
N
CH
3
19 20 21
34
Figura 08: Três dos alcalóides isolados da espécie Annona salzmanii: Reticulina (22), Laurelliptina (23) e
Isoboldina (24).
A uvaricina (6) (Figura 03), primeira acetogenina de Annonaceae, foi isolada do
extrato etanólico de Uvaria accuminata em 1982 e apresentou significante atividade
antitumoral in vivo contra células leucêmicas de ratos (JOLAD et al., 1982; RUPPRECHT et
al., 1990).
No trabalho de Bories et al. (1991), a atividade antiparasitária foi atribuída as
acetogeninas isoladas de Annona muricata e Annona cherimolia. Da espécie A. muricata
foram obtidas cinco acetogeninas do tipo mono-tetrahidrofurânicas
δ
-lactonas: annonacina
(25), annonacinona (26), murisolina (27), corossolina (28) e corossolona (29) (Figura 09) e da
espécie A. cherimolia foram isoladas duas acetogeninas bis-tetrahidrofurânicas
δ
-lactonas:
cherimolina (30) e desidrocherimolina (31) (Figura 10).
CH
3
O
HO
N
CH
3
CH
3
O
OH
22 23 24
CH
3
O
HO
NH
OH
CH
3
O
NNH
O
35
Figura 09: Acetogeninas isoladas da espécie Annona muricata: Annonacina (25), Annocinona (26), Murisolina
(27), Corossolina (28) e Corossolona (29).
Figura 10: Acetogeninas isoladas da espécie Annona cherimólia: Cherimolina (30) e Desidrocherimolina (31).
25
29
O
H
3
C
O
OH
(
CH
2
)
5
OH
(CH
2
)
4
OH
O
(
CH
2
)
11
O H
C
H
3
O
H
3
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O
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2
)
5
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4
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O
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2
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11
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3
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O
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5
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2
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4
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2
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11
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C H
3
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H
3
C
O
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2
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5
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2
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4
O
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CH
2
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11
OH
CH
3
OH
O
H
3
C
O
OH
(CH
2
)
5
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2
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4
O
(
C H
2
)
11
OH
CH
3
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28
26
27
31
O
O
O
O
(CH
2
)
13
OH
OH
CH
3
H
3
C
OH
OH
30
O
O
O
O
(CH
2
)
13
OH
OH
CH
3
H
3
C
OH
OH
36
Além destes trabalhos, muitos outros foram realizados com o objetivo de identificar o
maior número possível de fitoconstituintes, sobretudo alcalóides, presentes em várias espécies
de Annonaceae. Alguns deles encontram-se de maneira resumida na tabela 02.
Espécie Alcalóides isolados Referência
Unonopsis lindimani Liriodenina e lisicamina SILVA et al., 2007
Rollinia pittieri O-metilmoschatolina, liriodenina, anonaina e
nornuciferina
TORRES et al., 2007
Annona dioica 1-aza-4-metilantraquinona, lasiodiplodina,
liriodenina, geovanina e 1,2-metilenodioxi-6α,7-
desidroaporfina-4(S)-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)-
3,4-diidro-2(1H)-piridinona
SANTOS et al., 2003
Hornschuchia obliqua Roemerina, guadiscina, liriodenina e cleistopholina FECHINE et al., 2002
Annona glabra Annobraina, liriodenina, lisicamina, nornuciferina,
anonaina, N-formilanonaina, asimilobina,
nordomesticina, stepharina, kikemonina,
deidrocoridalmina e 1-aza-4-metil-2-oxo-1,2-diidro-
9,10-antracenediona
CHANG et al., 2000
Guatteria calva Oxostephanina, oxoxylopina e oxoputerina RODRÍGUEZ et al., 1999
Unonopsis lindimani Unonopsina, liriodenina e lisicamina SIQUEIRA et al., 1998
Tabela 02: Alcalóides isolados de algumas espécies de Annonaceae.
1. 2 – O GÊNERO DUGUETIA
1. 2. 1 – Substâncias isoladas e bioatividades
O gênero Duguetia está representado, até o momento, por 70 espécies, mas não está
entre os mais estudados fitoquimicamente. O estudo fitoquímico tem se concentrado nos
gêneros Annona (120 espécies catalogadas), Goniothalamus (115 espécies catalogadas),
Monodora (20 espécies catalogadas), Rollinia (65 espécies catalogadas), Uvaria (150 espécies
catalogadas) e Xylopia (100-150 espécies catalogadas). Porém, apesar da escassez de
trabalhos realizados com o gênero Duguetia, diversos compostos, principalmente alcalóides,
já foram isolados de algumas espécies deste gênero (CAVÉ et al.; LEBOEUF et al. apud
SIQUEIRA et al., 2001).
Debourges et al. (1987) isolaram da Annonaceae Colombiana Duguetia spixiana, 18
alcalóides, sendo 9 deles inéditos: um benziltetrahidroisoquinolínico: N-oxicodamina (32);
37
um tetraidroprotoberberino: spiduxina (33); três fenantrenos: aterosperminina, N-
oxiaterosperminina e metoxiaterosperminina; um aporfínico stricto: N-metilasimilobina; um
oxoaporfínico: lanuginosina; dez hidroxi-7-aporfínicos: noroliveridina (34), oliveridina (35),
N-oxioliveridina (36), norpaciconfina (37), paciconfina (38), N-oxipaciconfina (39),
spixianina (40), N-oxispixianina (41), duguexina (42) e N-oxiduguexina (43) e um metil-7-
aporfínico: duguespixina (44) (Figura 11).
Figura 11: Alcalóides isolados da espécie Duguetia spixiana: N-oxicodamina (32), Spiduxina (33),
Noroliveridina (34), Oliveridina (35), N-oxioliveridina (36), Norpaciconfina (37), Paciconfina (38), N-
oxipaciconfina (39), Spixianina (40), N-oxispixianina (41), Duguexina (42), N-oxiduguexina (43) e
Duguespixina (44).
NOTA: Alcalóides inéditos: 32, 33, 37, 39, 40, 41, 42, 43 e 44.
Em 1988, Wang et al. isolaram da Duguetia panamensis a substância ativa 2,4,5-
trimetoxilestireno (45) (Figura 12), através do estudo fitoquímico biomonitorado utilizando o
18 R
1
=H, R
2
=CHO, R
3
=Me
18a R
1
=H, R
2
= Me, R
3
= CHO
14 R=OMe
15 N-Oxi de 14
16 R=H
17 N-Oxi de 16
37 R
1
=R
2
=H
38 R
1
= Me, R
2
=H
39 N-Oxi de 38
34 R=H
35 R=Me
36 N-Oxi de 35
32 33
N
OCH
3
OHC
OH
H
3
CO
H
3
CO
N
R
O
O
H
OH
N
CH
3
O
O
H
OH
R
HO
N
R
2
R
3
R
1
O
H
3
CO
N
R
1
H
OR
2
R
2
O
H
3
CO
N
+
CH
3
O
H
3
CO
HO
H
3
CO
H
3
CO
40 R=OMe
41 N-Oxi de 40
42 R=H
43 N-Oxi de 42
44 R
1
=H, R
2
=CHO, R
3
=Me
38
microcrustáceo Artemia salina. No mesmo trabalho verificaram uma correlação positiva entre
a baixa toxicidade ao microscrustáceo utilizado no teste e a baixa atividade antitumoral.
Figura 12: Substância bioativa isolada de Duguetia panamensis: 2,4,5-trimetoxilestireno.
Muhammad et al. (2001), isolaram dois novos alcalóides do tipo 4,5-dioxo-1-
azaaporfinóides de Duguetia hadrantha, denominados de hadrantina A (46) e hadrantina B
(47). Além destes dois alcalóides inéditos, os autores também isolaram três outros alcalóides
conhecidos: imbilina-1 (48), sampangina (49) e 3-metoxisampangina (50). O referido estudo
também se destaca por ser o primeiro trabalho onde se isolou os alcalóides 49 e 50, bem como
um alcalóide do tipo imbilina em uma espécie do gênero Duguetia (Figura 13). Os compostos
46, 49 e 50 apresentaram positividade contra o Plasmodium falciparum, os compostos 47 e 49
foram tóxicos sobre células cancerígenas humanas e o composto 49 foi capaz de inibir a
agregação de células.
H
3
CO
OCH
3
OCH
3
45
39
Figura 13: Alcalóides isolados da espécie Duguetia hadrantha: Hadrantina A (46), Hadrantina B (47), Imbilina-
1 (48), Sampangina (49) e 3-metoxisampangina (50).
NOTA: Alcalóides inéditos: 46 e 47.
No ano de 2002, Fechine et al. isolaram e identificaram seis alcalóides das folhas e
galhos finos de Duguetia trunciflora, sendo um do tipo benzilisoquinolínico: reticulina (51);
quatro tetraidroprotoberberínicos: tetraidropalmatina (52), tetraidrojathrorrizina (53),
discretamina (54) e thaicanina (55) e um do tipo berberínico: jathrorrizina (56) (Figura 14).
Figura 14: Alcalóides isolados da espécie Duguetia trunciflora: Reticulina (51), Tetraidropalmatina (52),
Tetraidrojathrorrizina (53), Discretamina (54), Thaicanina (55) e Jathrorrizina (56).
Em 2004, Pérez et al. isolaram um novo alcalóide aporfinóide da espécie Duguetia
vallicola, a duguevallina (57). Ainda no mesmo trabalho, isolaram quatro outros alcalóides
49 R=H
50
R=OMe
NN
R
1
OMe
O
O
R
2
NN
O
R
46 R
1
=Me, R
2
=OMe
47
R
1
=H, R
2
=H
48
R
1
=Me, R
2
=H
56
52
R
1
=Me, R
2
=H, R
3
=Me
53
R
1
=R
2
=H, R
3
=Me
54
R
1
=R
2
=R
3
=H
55 R
1
=R
3
=Me
,
R
2
=OH
51
NMe
HO
MeO
MeO
HO
N
R
2
R
1
O
MeO
OMe
OR
3
N
+
HO
MeO
OMe
OMe
40
conhecidos: cleistofolina (58), O-metilmoscatolina (59), oliverolina (60) e oliveridina (61)
(Figura 15). Além do isolamento dos referidos alcalóides, os autores verificaram que dois
deles, cleistofolina e oliverolina, apresentaram resultado positivo ao teste de atividade
antimalária contra o Plasmodium falciparum.
Figura 15: Alcalóides isolados da espécie Duguetia vallicola: Duguevallina (57), Cleistofolina (58), O-
metilmoscatolina (59), Oliverolina (60) e Oliveridina (61).
Trabalhando com a espécie Duguetia furfuraceae, Carollo et al. (2006) isolaram dois
novos alcalóides aporfínicos: N-nitrosoanonaina (62) e N-nitrosoxilopina (63) (Figura 16).
58
57
N
O
O
O
OCH
3
H
3
CO
OCH
3
N
O
O
59 60 61
N
O
OCH
3
H
3
CO
H
3
CO
N
O
O
H
CH
3
H
OH
N
O
O
H
CH
3
H
OH
OCH
3
41
Figura 16: Alcalóides isolados da espécie Duguetia furfuraceae: N-nitrosoanonaina (62) e N-nitrosoxilopina
(63).
Almeida et al. (2005), trabalhando com o extrato etanólico bruto das cascas do caule
da espécie Duguetia gardneriana, conseguiram isolar e identificar os seguintes alcalóides:
tetraidrojathrorrizina (64) e tetraidropalmatina (65) (Figura 17).
Figura 17: Alcalóides isolados da espécie Duguetia gardneriana: Tetraidrojathrorrizina (64) e
Tetraidropalmatina (65).
A tabela 03 descreve, resumidamente, cinco outros trabalhos onde seus autores
conseguiram o isolamento e identificação de alcalóides de algumas espécies do gênero
Duguetia.
N
HO
MeO
OMe
OMe
N
MeO
MeO
OMe
OMe
64 65
N
O
O
H
R
N
O
62 R=H
63
R=OCH
3
42
Espécie Alcalóides isolados Referência
Duguetia furfuracea Liriodenina e lanuginosina SILVA et al., 2007
Duguetia glabriúscula Lanuginosina, oxobuxifolina e O-metilmoscatolina SILVA et al., 2007
Duguetia flagellaris Nornuciferina, isopilina, O-metilisopilina, calicinina,
duguevanina, pachipodantina, oliverolina, oliverolina
β-N-oxide, oliveridina e duguetina
FECHINE et al., 2002
Duguetia pycnastera O-metilmoschatolina, lisicamina, liriodenina e
oxoputerina
SILVEIRA, 1994
Duguetia obovata Isolaram 18 alcalóides sendo 8 inéditos nesta espécie:
N-formilxilopina, N-metilbuxifolina, N-
formilbuxifolina, oxobuxifolina, N-metil-calicinina,
duguevanina, N-formilduguevanina e N-
metilduguevanina
ROBLOT et al., 1983
Tabela 03: Alcalóides isolados de algumas espécies do gênero Duguetia.
1. 3 – A ESPÉCIE DUGUETIA RIPARIA
1. 3. 1 – Distribuição geográfica
A espécie Duguetia riparia St. Hil., cuja classificação taxonômica encontra-se na
tabela 04, é popularmente conhecida como “araticum da mata”, “envira”, “envira-preta”,
“envira-tai” e “makahy-myra”. Encontra-se distribuída na Amazônia Colombiana, Suriname,
Guiana Francesa, Bolívia e Brasil, ocorrendo em florestas não inundadas, periodicamente
inundadas ou em savanas, frequentemente ao longo dos rios com produção de frutos durante
praticamente todo o ano (MASS et al., 2003).
REINO
Vegetal
DIVISÃO
Magnoliophyta
CLASSE
Magnoliopsida
SUBCLASSE
Magnolidae
ORDEM
Magnoliales
FAMÍLIA
Annonaceae
SUBFAMÍLIA
Annonoideae
TRIBO
Uvarieae
GÊNERO
Duguetia
ESPÉCIE
Riparia
Tabela 04: Classificação taxonômica da espécie Duguetia riparia St. Hil.
FONTE: FRIES, 1959.
43
1. 3. 2 – Aspectos botânicos
Os indivíduos desta espécie são arbustos ou árvores variando de 3 a 10 metros de
comprimento e de 2,5 a 15 cm de diâmetro; ramos, quando novos, cobertos por pêlos
estrelados; folhas com nervura central impressa na face superior de onde saem veias
secundárias; inflorescências infra e supra-axilares frequentemente opostas às folhas e
raramente terminal com 1 a 4 flores; pétalas de 12 a 34 mm de comprimento e de 10 a 19 mm
de largura, obovada ou elíptico obovada e coloração amarelo vivo. Os frutos, que medem em
torno de 2 a 6 cm de comprimento e de 2 a 4 cm de diâmetro, apresentam formato que variam
de ovóide a elopsóide e coloração marron vivo; suas sementes, com coloração que varia de
creme a marron pálido e formato obovóide, chegam a medir de 7 a 13 mm de comprimento e
de 4 a 8 mm de diâmetro (Figura 18) (MASS et al., 2003).
Figura 18: Duguetia riparia: Excicata com folhas e frutos (66), folhas frescas (67), arbusto (68), galhos secos
(69), frutos frescos (70) e folhas secas (71).
FONTE: (Foto 66): http://www.bio.uu.nl (Acessado em 03 de março de 2008). (Fotos 67 a 71): Livia Cunha e Socorro
Teodora.
67 68
66 69 70 71
44
CAPÍTULO II:
Parte Experimental - Fitoquímica
Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
Galhos
Folhas
Frutos
45
2. 1 – MATERIAIS, MÉTODOS E EQUIPAMENTOS
2. 1. 1 – Métodos cromatográficos
Para a separação e purificação dos fitoconstituintes existentes no material botânico
estudado foram utilizados três métodos cromatográficos: cromatografia em camada delgada,
cromatografia em coluna e cromatografia em camada delgada preparativa.
2. 1. 1. 1 – Cromatografia em camada delgada (CCD)
As análises em CCD foram realizadas em cromatofolhas de sílica gel da Merck e
cromatofolhas de sílica C18 da Sorbent, ambas com indicador de fluorescência F
254
com
suporte de alumínio. A revelação dos cromatogramas em camada fina foi feita por exposição à
luz ultravioleta de 254 e 365 nm, vapores de iodo (revelador universal) e/ou mediante
borrifação de soluções reveladoras.
2. 1. 1. 2 – Cromatografia em coluna (CC)
Os fracionamentos cromatográficos foram realizados em coluna de vidro, utilizando
como fase estacionária quatro tipos de suporte: Sílica Gel 60 0,040-0,063 mm (70-230 mesh
ASTM) da Merck, Sílica Gel 60 0,040-0,063 mm (70-230 mesh ASTM) da Merck,
impregnada com ácido oxálico a 12,1% (SILVA et al., 2007, adaptado), sílica C18 da Aldrich
e Sephadex LH-20 da Sigma-Aldrich. O comprimento e o diâmetro das colunas utilizadas
variaram de acordo com as quantidades de amostra a serem cromatografadas.
46
2. 1. 1. 3 – Cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP)
As análises em escala preparativa foram desenvolvidas em cromatoplacas de tamanho
20 x 20 e 10 x 10 cm e espessura de 1,0 mm. As placas foram preparadas usando 20 g de
Sílica Gel 60 GF
254
da Merck e 50 mL de água destilada. Após a evaporação da água à
temperatura ambiente, as placas foram ativadas em estufa a 100 ºC. As faixas foram reveladas
com luz UV (254 e 365 nm) e a recuperação das amostras foram realizadas com solventes
específicos previamente testados.
2. 1. 2 – Reagentes para revelação cromatográfica
a) Sulfato cérico/ácido sulfúrico (MATTOS, 1998). Solução de 1% de sulfato cérico
IV em ácido sulfúrico a 10%. As cromatoplacas foram borrifadas e aquecidas a 100ºC por
alguns minutos (revelador universal).
b) Vanilina sulfúrica (MATTOS, 1998). Solução (A): 5-10% de ácido sulfúrico em
etanol. Solução (B): solução a 1% de vanilina em etanol. As cromatoplacas foram borrifadas
com uma mistura da solução A e B na proporção 1:1 e aquecida a 100ºC por alguns minutos
(revelador universal).
c) NP/PEG (WAGNER et al., 1996). Duas soluções foram preparadas: (A) 0,5g de NP
(difenilboroximetilamina), dissolvido em 10 mL de etanol, e (B) 1g de PEG (polietilenoglicol
400), dissolvido em 10 mL de etanol. Inicialmente, as cromatoplacas foram borrifadas com a
solução A e após a secagem, com a solução B, e em seguida visualizadas em lâmpada UV a
365 nm.
d) Reagente de Dragendorff modificado por Munier (MUNIER apud MERCK,
1971). Solução (A): 1,7 g de nitrato de bismuto III e 20 g de ácido tartárico dissolvidos em 80
47
mL de água destilada. Solução (B): 16 g de iodeto de potássio dissolvidos em 40 mL de água
destilada. A mistura de partes iguais (1:1) destas soluções constituiu a solução estoque. Para
borrifamento das placas, 5 mL da solução estoque foram adicionados a 10 g de ácido tartárico,
dissolvidos em 50 mL de água destilada (revelador de alcalóides e peptídeos, cicloexilaminas,
polietilenoglicóis e derivados, compostos de óxido polietileno, lactamas, lipídeos e esteróides
α,β-insaturados e anti-histamínicos).
e) Reagente de Keddy. Solução (A): 1,5 g de ácido 3,5-dinitrobenzóico em 50 mL de
metanol. Solução (B): KOH aquoso 2N. As placas foram pulverizadas com a solução A,
seguida imediatamente da solução B (revelador de lactonas α,β-insaturadas de 5 membros).
2. 1. 3 – Equipamento utilizado na identificação espectroscópica
Os espectros de RMN de
1
H e
13
C, COSY
1
H -
1
H, TOCSY-Seletivo e técnicas
correlatas, obtidos no Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná, foram
registrados em espectrômetro Bruker AVANCE 400 de 9,4 Tesla. As amostras foram
solubilizadas em CD
3
OD e os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por
milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). As multiplicidades dos sinais
foram indicadas segundo a convenção: s (simpleto), d (dupleto), dd (dupleto duplo), ddd
(duplo dupleto duplo), t (tripleto) e m (multipleto).
2. 2 – COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
O material botânico, galhos finos de Duguetia riparia St. Hil., foi coletado no Mini
Campus da Universidade Federal do Amazonas às 07:00 horas da manhã do dia 24 de julho
de 2006. Após a identificação da amostra botânica pelo Prof. Dr. Antônio Carlos Weber, uma
48
exsicata da mesma foi depositada no Herbário do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Amazonas (ICB/UFAM).
2. 3 – PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
Os galhos finos de Duguetia riparia foram secos em estufa de ar circulante à
temperatura de 45 a 50
o
C, triturados em moinho de quatro facas e submetidos à maceração em
Mariotte. Após as macerações realizadas com hexano, metanol e solução aquosa de metanol
80%, foram obtidos, respectivamente, os extratos hexânico (EH), metanólico (EM) e
metanólico aquoso 80% (EMA80%). Os extratos hexânico e metanólico foram concentrados
em evaporador rotativo sob pressão reduzida a uma temperatura de 50°C, e em seguida
armazenados em dessecador. O extrato metanólico aquoso 80%, por sua vez, foi submetido,
após completa eliminação do solvente orgânico em evaporador rotativo, aos processos de
congelamento e liofilização (Figura 19, Esquema 1).
Figura 19: Preparação dos extratos: Estufa de ar circulante (72), moinho de quatro facas (73), galhos moídos em
maceração (74) e evaporador rotativo sob pressão reduzida (75).
72
73
74
75
49
Esquema 01: Fluxograma de obtenção dos extratos dos galhos de Duguetia riparia.
2. 4 – TESTES DE PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA
Os extratos hexânico, metanólico e metanólico aquoso 80% do material botânico
foram submetidos a testes de prospecção fitoquímica descritos por Mattos (1998) para a
determinação da presença das seguintes classes de compostos: fenóis, taninos, antocianinas,
antocianidinas, leucoantocianidinas, catequinas, flavanonas, flavonóis, flavanonas,
flavanonóis, xantonas, esteróides, triterpenóides e alcalóides.
2. 4. 1 – Fenóis e taninos
Foram transferidos 3 mL dos extratos dissolvidos a três tubos de ensaio e em seguida,
foram adicionadas em cada um deles 3 gotas de uma solução alcoólica de FeCl
3
. Após
agitação dos mesmos, a mudança de coloração e/ou formação de precipitado foram
comparados com o teste em branco (tubo contendo apenas água e a solução alcoólica de
FeCl
3
) e com as cores descritas no quadro 1.
Duguetia riparia (galhos finos)
m = 678,0 g
EH
m = 2,4 g (0,3%)
Torta
EM
m = 51,9 g (7,6%)
Torta
EMA 80%
m = 10,8 g (1,6%)
Torta
(desprezada)
50
Características Observadas Classes de Compostos Prováveis
Coloração variável entre o azul e o vermelho e o
teste em branco negativo
Indicativo de fenóis
Precipitado escuro de tonalidade azul Indicativo de taninos pirogálicos
(taninos hidrolisáveis)
Precipitado escuro de tonalidade verde Indicativo de taninos flobafênicos
(taninos condensados ou catéquicos)
Quadro 01: Descrição das possíveis características observadas no teste de fenóis e taninos.
2. 4. 2 – Antocianinas, antocianidinas e flavonóides
Foram transferidos 3 mL de cada extrato dissolvido a três tubos de ensaio. Os extratos
presentes nos primeiros tubos tiveram o pH corrigido a 3, os presentes nos segundos tubos
tiveram o pH elevado a 8,5 e os presentes nos terceiros tubos elevado a 11. A mudança de
coloração ocorrida nos tubos citados foi comparada com a descrição do quadro 2.
Constituintes
Cor em Meio
Ácido (3) Alcalino (8,5) Alacalino (11)
Antocianinas e antocianidinas Vermelho Lilás Azul-púrpura
Flavonas, flavonóis e xantonas _ _ Amarelo
Chalconas e auronas Vermelho _ Vermelho-púrpura
Flavononóis _ _ Vermelho-laranja
Quadro 02: Colorações indicativas da presença de antocianinas, antocianidinas e flavonóides.
2. 4. 3 – Leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas
Em dois outros tubos de ensaio foram transferidos 4 mL de cada extrato dissolvido.
Nos primeiros tubos foram adicionadas gotas de HCl até pH 1 a 3 e nos segundos gotas de
NaOH até pH 11. Após aquecimento dos mesmos durante 2 a 3 minutos, as mudanças
ocorridas foram comparadas com o quadro 3.
51
Constituintes
Cor em Meio
Ácido Alcalino
Leucoantocianidinas
Vermelha _
Catequinas (taninos catéquicos)
Pardo-vermelha _
Flavanonas
_ Vermelho-laranja
Quadro 03: Colorações indicativas da presença de leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas.
2. 4. 4 – Flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas
Em tubos de ensaio contendo 4 mL de cada extrato dissolvido foram adicionados
alguns centigramas de magnésio granulado (podendo também ser utilizado magnésio em fita)
e 0,5 mL de HCl concentrado. Após término da reação, o aparecimento ou intensificação da
cor vermelha indicou a presença de flavonóis, flavanonas, flavanonóis e/ou xantonas, livres
ou em forma de heterosídios.
2. 4. 5 – Esteróides e triterpenóides
Cada extrato bruto foi dissolvido em 1 a 2 mL de clorofórmio. Em seguida cada
solução foi filtrada para um tubo de ensaio seco com auxílio de um funil contendo algodão e
alguns decigramas de Na
2
SO
4
anidro. A esses novos tudos foram adicionados 1 mL de
anidrido acético e 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado tendo o cuidado de se agitar
suavemente os tubos entre as duas operações e depois da adição do ácido. Em seguida as
colorações formadas foram comparadas com a descrição do quadro 4.
Características Observadas Classes de Compostos Prováveis
Coloração azul evanescente seguida de
verde permanente
Indicativo da presença de esteróides livres
Coloração parda até vermelha Indicativo de triterpenóides pentacíclicos livres
Quadro 04: Colorações indicativas da presença de esteróides e triterpenóides.
52
2. 4. 6 – Alcalóides
O pH dos extratos foram corrigidos para 11 utilizando NH
4
OH. Em seguida, cada
solução obtida foi submetida a uma extração líquido-líquido utilizando três porções
sucessivas de 30, 20 e 10 mL de uma mistura éter-clorofórmio 3:1. As fases éter-clorofórmio
obtidas foram tratadas com Na
2
SO
4
anidro para eliminação de água e misturadas com 3
pequenas porções sucessivas de HCl diluído para extração das bases orgânicas existentes. As
soluções aquosas ácidas obtidas foram distribuídas em 3 tubos de ensaio, e a cada tubo foram
adicionadas, respectivamente, 3 gotas dos reagentes de precipitação de alcalóides: Hager,
Mayer e Dragendorff. A presença de alcalóides foi caracterizada pela formação de um
precipitado floculoso e pesado em pelo menos 2 tubos dos 3 utilizados.
2. 5 – FRACIONAMENTO E PURIFICAÇÃO DOS EXTRATOS
2. 5. 1 – Fracionamento e purificação do extrato hexânico (EH)
O extrato hexânico foi submetido à partição líquido-líquido com hexano/metanol
aquoso (10%) na proporção de 1:1 para obtenção da fração hidrometanólica. A referida fração
foi concentrada em evaporador rotativo sob pressão reduzida a temperatura de 50°C,
congelada, liofilizada e pesquisada quanto à presença de acetogeninas de Annonaceae com
auxílio do reagente de Keddy (Esquema 2). À semelhança do extrato hexânico e antes de ser
cromatografada, a fração hidrometanólica foi submetida a testes, in vitro, de toxicidade frente
à Artemia salina, atividade leishmanicida, atividade larvicida, atividade antioxidante e
capacidade capturadora de radicais livres e determinação do teor de compostos fenólicos
totais.
53
Esquema 02: Fluxograma de obtenção da fração hidrometanólica do extrato hexânico dos galhos de Duguetia
riparia.
Parte da fração hidrometanólica (74,0 mg) foi submetida à cromatografia de camada
delgada preparativa de sílica (CCDPs), utilizando-se como eluente a solução hexano/acetato
de etila 8:2 e revelação sob luz UV de 254 e 365 nm. Foram obtidas duas frações (Esquema
03, Tabela 05), das quais apenas a fração 2, codificada como RHG
1
, mostrou grau de pureza
satisfatório, quando analisada em camada delgada de sílica revelada em lâmpada UV, vapores
de iodo e vanilina.
Esquema 03: Obtenção da fração RHG
1
.
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 11,3 15,3
2 2,5 3,4
Tabela 05: Rendimento das frações oriundas da fração hidrometanólica dos galhos de Duguetia riparia.
EH
m = 1,96 g
Fração hexânica
m = 975,6 mg (49,6 %)
Fração hidrometanólica
Fração hidrometanólica seca
m = 310,9 mg (15,8 %)
hexano/metanol aquoso 10% 1:1
Con
g
elamento e liofilização
Fração hidrometanólica
m = 74,0 mg
F
1
F
2
CCDPs
RHG
1
m = 2,5 m
g
(
3,4%
)
CCDs
54
50,0 mg da fração hidrometanólica também foram cromatografadas em coluna de gel
Sephadex LH-20 em metanol. Foram recolhidas 27 frações que após análise em CCD de sílica
foram reunidas em 13 subgrupos de frações (Esquema 04, Tabela 06).
Esquema 04: Subgrupos obtidos da fração hidrometanólica dos galhos de Duguetia riparia.
Subgrupos Frações Peso
(mg)
Rendimento
(%)
Subgrupos Frações Peso
(mg)
Rendimento
(%)
1 1 <1 0,0 8 22 <1 0,0
2 2 1,0 2,0 9 23 <1 0,0
3 3 1,4 2,8 10 24 <1 0,0
4 4 2,3 4,6 11 25 <1 0,0
5 5 2,9 5,8 12 26 <1 0,0
6 6-20 5,0 10,0 13 27 <1 0,0
7 21 <1 0,0
Tabela 06: Rendimento dos subgrupos obtidos da fração hidrometanólica dos galhos de Duguetia riparia.
O subgrupo 6 (5,0 mg) foi submetido à CCDPs (hexano/acetato de etila 8:2, revelação
sob luz UV de 254 e 365 nm). As três frações obtidas (Esquema 05, Tabela 07) não
apresentaram grau de pureza satisfatório. Os demais subgrupos não foram trabalhados devido
o baixo rendimento apresentado.
Esquema 05: Frações obtidas do fracionamento do subgrupo 6 originado da fração hidrometanólica dos galhos
finos de Duguetia riparia.
SG
6
m = 5,0 mg
F
1
F
2
F
3
CCDP
Fração hidrometanólica
m = 50,0 mg
27 Frações
Se
p
hadex LH-20/Metanol
13 subgrupos de frações
CCDs
55
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,1 22,0
2 <1 0,0
3 1,0 20,0
Tabela 07: Rendimento das frações obtidas do fracionamento do subgrupo 6 originado da fração
hidrometanólica dos galhos de Duguetia riparia.
O esquema 06 mostra, de maneira resumida, os passos que o extrato hexânico foi
submetido para obtenção da primeira fração separada para o estudo fitoquímico, fração RHG
1
.
Esquema 06: Marcha completa da obtenção da fração RHG
1
.
(
1
) 74,0 mg, hexano/acetato de etila 8:2, revelação UV.
2. 5. 2 – Fracionamento e purificação do extrato metanólico (EM)
O extrato metanólico dos galhos de Duguetia riparia foi tratado com solução de ácido
clorídrico a 3% v/v, durante 30 minutos, sob agitação constante. O precipitado formado foi
separado da fração aquosa ácida através de filtração à pressão reduzida e esta, por sua vez,
basificada até pH 10 com NH
4
OH concentrado, e em seguida, extraída com diclorometano
(CH
2
Cl
2
). Desta extração duas novas frações foram obtidas: a fração aquosa básica,
desprezada, e a fração diclorometano alcaloídica, que à semelhança do extrato metanólico e
fração hidrometanólica, foi submetida aos testes, in vitro, de toxicidade frente à Artemia
EH
m = 1,96 g
Fração hidrometanólica
Fração hidrometanólica seca
m =310,9 mg (15,8%)
RHG
1
m = 2,5 mg (3,4%)
Fração hexânica
m = 975,6 mg (49,6%)
Hexano/Metanol aquoso 10% 1:1
Congelamento e liofilização
CCDPs
1
56
salina, atividade leishmanicida, atividade larvicida, atividade antioxidante e capacidade
capturadora de radicais livres e determinação do teor de compostos fenólicos totais (Esquema
07).
Esquema 07: Fluxograma de obtenção da fração diclorometano alcaloídica do extrato metanólico dos galhos de
Duguetia riparia.
NOTA: Metodologia descrita por Chang et al. (1998).
Parte da fração alcaloídica (157,0 mg) foi submetida à CCDPs (butanol/água 5,1:0,4,
revelação sob luz UV de 254 e 365 nm). Foram obtidas três frações: F
1
(105,0 mg), F
2
(4,0
mg) e F
3
(31,0 mg). A fração F
1
foi submetida à CC de Sephadex LH-20 em metanol e foram
recolhidas 11 frações. Após análise comparativa por CCD de sílica, as frações semelhantes
foram reunidas em três subgrupos de frações (Esquema 08, Tabela 08).
Esquema 08: Subgrupos de frações originados da cromatografia em coluna da fração F
1
.
Fração alcaloídica
m = 157,0 mg
F
1
F
2
F
3
11 Frações
SG
1
1
SG
2
2-7
SG
3
8-11
CCDPs
Se
p
hadex LH-20/Metanol
CCDs
EM
m = 44,87 g
Fração insolúvel
Fração aquosa ácida
Fração CH
2
Cl
2
alcaloídica
m = 485,5 mg (1,1%)
HCl 3% v/v
Fração aquosa básica
(desprezada)
N
H
4
OH/CH
2
Cl
2
57
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1 <1 0,0
2 2-7 80,0 76,2
3 8-11 1,5 1,4
Tabela 08: Rendimento dos subgrupos obtidos da cromatografia em coluna da fração F
1
.
O subgrupo 2 (80,0 mg) foi cromatografado em coluna de sílica empacotada com a
solução hexano/acetato de etila 1:1. Foram utilizados os seguintes sistemas de solventes:
hexano/acetato de etila 1:1, acetato de etila, acetato de etila/metanol em polaridades
crescentes (9:1, 8:2, 7:3, 6:4 e 1:1) e metanol. Após análise em CCD de sílica das 49 frações
recolhidas, 31 subgrupos foram obtidos (Esquema 09, Tabela 09).
Esquema 09: Fracionamento do subgrupo 2 oriundo da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia.
SG
2
m = 80,0 mg
49 Frações
CC de Sílica
31 subgrupos de frações
CCDs
58
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento
(%)
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento
(%)
1 1 <1 0,0 17 29 <1 0,0
2 2 <1 0,0 18 30 <1 0,0
3 3 <1 0,0 19 31 <1 0,0
4 4 <1 0,0 20 32 <1 0,0
5 5 <1 0,0 21 33 1,0 1,2
6 6 <1 0,0 22 34 <1 0,0
7 7 <1 0,0 23 35 <1 0,0
8 8 <1 0,0 24 36 <1 0,0
9 9-12 6,0 7,5 25 37-43 8,0 10,0
10 13 <1 0,0 26 44 <1 0,0
11 14 <1 0,0 27 45 <1 0,0
12 15 <1 0,0 28 46 16,3 20,4
13 16-25 17,0 21,2 29 47 2,0 2,5
14 26 <1 0,0 30 48 <1 0,0
15 27 <1 0,0 31 49 <1 0,0
16 28 <1 0,0
Tabela 09: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 2 proveniente do fracionamento da fração alcaloídica
dos galhos de Duguetia riparia.
Dos 31 subgrupos de frações, apenas os subgrupos de frações 9, 13 e 25 foram
trabalhados. Os subgrupos 9 (6,0 mg) e 25 (8,0 mg), após CCDPs (clorofórmio/metanol
9,5:0,5, para o subgrupo 9 e clorofórmio/metanol 7:3, para o subgrupo 25, revelação sob luz
UV de 254 e 365 nm), originaram, respectivamente, seis e duas frações (Tabelas 10 e 11).
59
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,3 21,7
2 <1 0,0
3 <1 0,0
4 <1 0,0
5 1,0 16,7
6 1,0 16,7
Tabela 10: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 9 proveniente da fração alcaloídica dos galhos de
Duguetia riparia.
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,2 15,0
2 1,0 12,5
Tabela 11: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 25 proveniente do fracionamento da fração alcaloídica
dos galhos de Duguetia riparia.
As frações 5 e 6 do subgrupo 9 e a fração 2 do subgrupo 25, após CCD de sílica,
apresentaram grau de pureza satisfatório sob luz UV de 254 e 365 nm, vapores de iodo e
reagente de Dragendorff. Após completa evaporação do solvente, as referidas frações foram
codificadas, respectivamente, como RMG
1
, RMG
2
e RMG
3
e armazenadas para o estudo
fitoquímico (Esquemas 10 e 11).
Esquema 10: Obtenção das frações RMG
1
e RMG
2
.
SG
9
m = 6,0 mg
F
1
F
2
F
3
F
4
F
5
F
6
CCDPs
RMG
2
m = 1,0 m
g
(
16,7%
)
RMG
1
m = 1,0 mg (16,7%)
CCDs
60
Esquema 11: Obtenção da fração RMG
3
.
O subgrupo 13 (17,0 mg), por sua vez, foi fracionado em coluna de sílica gel
empacotada com diclorometano/metanol 8:2 e eluída no mesmo sistema solvente em
polaridades crescentes (8:2, 7:3, 6,5:3,5, 6,4:3,6 e 6:4). Foram coletadas 22 frações, reunidas
em 17 subgrupos, mediante análise comparativa por CCD de sílica (Tabela 12, Esquema 12).
Subgrupos Frações Peso
(mg)
Rendimento
(%)
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento
(%)
1 1 1 5,9 10 15 <1 0,0
2 2 <1 0,0 11 16 <1 0,0
3 3 2,3 13,5 12 17 <1 0,0
4 4-9 8,0 47,0 13 18 <1 0,0
5 10 <1 0,0 14 19 <1 0,0
6 11 <1 0,0 15 20 <1 0,0
7 12 <1 0,0 16 21 <1 0,0
8 13 <1 0,0 17 22 <1 0,0
9 14 1,5 8,8
Tabela 12: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 13 proveniente da fração alcaloídica dos galhos de
Duguetia riparia.
SG
25
m = 8,0 mg
F
1
F
2
CCDPs
RMG
3
m = 1,0 mg (12,5%)
CCDs
61
Esquema 12: Fracionamento do subgrupo 13 oriundo da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia.
Apenas o subgrupo 4 (8,0 mg) foi cromatografado em CCDPs
(diclorometano/acetona/ácido fórmico 8:16,5:8,5, revelação UV). Foram obtidas duas frações
(Esquema 13, Tabela 13) que devido à grande quantidade de impurezas não foram
trabalhadas.
Esquema 13: Fracionamento do subgrupo 4 oriundo da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia.
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 4,0 50,0
2 1,5 18,7
Tabela 13: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 4 proveniente da fração alcaloídica dos galhos de
Duguetia riparia.
A fração F
3
, à semelhança da fração F
1
, também foi incorporada em coluna de
Sephadex LH-20 em metanol originando 14 frações das quais deu origem a quatro subgrupos
de frações (Esquema 14, Tabela 14).
SG
13
m = 17,0 mg
22 Frações
CC de Sílica
17 subgrupos de frações
CCDs
SG
4
m = 8,0 mg
F
1
F
2
CCDPs
62
Esquema 14: Subgrupos de frações originados da cromatografia em coluna da fração F
3
.
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1-5 2,6 8,4
2 6-8 11,0 35,5
3 9 15,0 48,4
4 10-14 <1 0,0
Tabela 14: Rendimento dos subgrupos obtidos da cromatografia em coluna da fração F
3
.
Os subgrupos 2 (11,0 mg) e 3 (15,0 mg) foram submetidos a CCDP de sílica gel
(clorofórmio/metanol 9,5:0,5, revelação UV) originando três frações cada (Esquema 15,
Tabela 15, Esquema 16, Tabela 16). Essas frações, por apresentarem baixo rendimento não
foram trabalhadas.
Esquema 15: Frações oriundas do subgrupo 2 originado da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia.
Fração alcaloídica
m = 157,0 mg
F
1
F
2
F
3
CCDPs
14 Frações
Se
p
hadex LH-20/Metanol
SG
1
1-5
SG
2
6-8
SG
3
9
SG
4
10-14
CCDs
SG
2
m = 11,0 mg
F
1
F
2
F
3
CCDP
63
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 3,7 33,6
2 1,5 13,6
3 3,5 31,8
Tabela 15: Rendimento das frações originadas do subgrupo 2 oriundo da fração alcaloídica dos galhos de
Duguetia riparia.
Esquema 16: Frações oriundas do subgrupo 3 originado da fração alcaloídica dos galhos de Duguetia riparia.
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,9 12,7
2 4,7 31,3
3 3,1 20,7
Tabela 16: Rendimento das frações originadas do subgrupo 3 oriundo da fração alcaloídica dos galhos de
Duguetia riparia.
Além do fracionamento descrito anteriormente, o extrato metanólico dos galhos finos
de Duguetia riparia (6,10 g) foi submetido a uma nova partição. Inicialmente foi solubilizado
com quantidades suficientes de metanol e transferido a um balão de separação com auxílio de
uma solução metanol/água 9:1. Em seguida, a solução remanescente foi submetida a
sucessivas extrações com hexano, originando as frações hexânica, concentrada e guardada sob
refrigeração, e a fração metanólica. A fração metanólica, por sua vez, antes de ser concentrada
em evaporador rotatório, foi submetida à filtração sob pressão reduzida para separação do
precipitado formado durante a etapa de extração (Esquema 17).
SG
3
m = 15,0 mg
F
1
F
2
F
3
CCDPs
64
Esquema 17: Obtenção da fração metanólica solúvel dos galhos de Duguetia riparia.
Parte da fração metanólica solúvel obtida (2,50 g) foi cromatografada em coluna de
sílica gel impregnada com ácido oxálico a 12,1% (SILVA et al., 2007, adaptado) com auxílio
dos seguintes sistemas de solvente: hexano, hexano/acetato em polaridade crescente (9:1, 8:2,
7:3, 6:4 e 1:1), acetato, acetato/metanol em polaridade crescente (9:1, 8:2, 7:3, 6:4 e 1:1) e
metanol. Foram coletadas 29 frações, reunidas em 20 subgrupos, mediante análise
comparativa por CCD de sílica (Esquema 18, Tabela 17).
Esquema 18: Fracionamento cromatográfico em sílica gel impregnada com ácido oxálico a 12,1% da fração
metanólica solúvel.
EM
m = 6,10 g
Fração hexânica
m = 92,1 mg (1,5%)
Fração metanólica
Fração metanólica solúvel
m = 3,94 g (64,6%)
MeOH/Á
g
ua 9:1 e hexano
Fração metanólica insolúvel
m = 1,43 g (23,4%)
Fração metanólica solúvel
m = 2,50 g
29 Frações
CC de Sílica (ácido oxálico 12,1%)
20 subgrupos de frações
CCDs
65
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1-5 29,6 1,2
2 6 3,5 0,1
3 7 9,0 0,4
4 8 8,0 0,3
5 9 4,8 0,2
6 10 4,6 0,2
7 11 5,8 0,2
8 12 6,9 0,3
9 13-17 32,0 1,3
10 18 7,7 0,3
11 19 4,3 0,2
12 20 5,0 0,2
13 21 7,4 0,3
14 22 3,4 0,1
15 23 10,0 0,4
16 24 14,5 0,6
17 25 9,6 0,4
18 26 11,6 0,5
19 27-28 23,0 1,0
20 29 16,0 0,6
Tabela 17: Frações obtidas após cromatografia em coluna da fração metanólica solúvel.
Os 20 subgrupos descritos na tabela 17, por terem sido fracionados em coluna de sílica
gel impregnada com ácido oxálico, apresentaram como artefato a formação de oxalato. Com
objetivo de eliminar o artefato indesejado, os 20 subgrupos foram submetidos a uma partição
utilizando uma solução aquosa de acetato de etila, neutralização do sistema com Na
2
CO
3
a
10% e congelamento.
Em seguida, as porções não congeladas de cada subgrupo foram recolhidas,
concentradas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, a uma temperatura de 50º C e
analisadas em cromatoplacas de sílica C18 com auxílio da lâmpada de UV, vapores de iodo,
reagente de Dragendorff e vanilina sulfúrica.
66
A grande quantidade de impurezas encontradas nos subgrupos em questão contribuiu
para o insusesso do isolamento e elucidação estrutural dos possíveis constituintes presentes
nas misturas obtidas.
O esquema 19 mostra, de maneira resumida, os passos que o extrato metanólico foi
submetido para obtenção das frações RMG
1
, RMG
2
e RMG
3
, separadas para o estudo
fitoquímico.
Esquema 19: Marcha completa da obtenção das frações RMG
1
, RMG
2
e RMG
3
.
(
1
) Butanol/água 5,1:0,4, revelação UV. (
2
) 6,0 mg, clorofórmio/MeOH 9,5:0,5, revelação UV e (
3
) 8,0 mg,
clorofórmio/MeOH 7:3, revelação UV.
2. 5. 3 – Fracionamento e purificação do extrato metanólico aquoso 80% (EMA 80%)
O extrato metanólico aquoso 80% foi solubilizado em quantidades suficientes de
metanol e agitado constantemente por cerca de 30 minutos. Em seguida, o precipitado
formado foi separado da fração líquida através de filtração a pressão reduzida e o filtrado
concentrado em evaporador rotativo a uma temperatura de 50°C, originando o extrato
metanólico solúvel (EMS) (Esquema 20).
EM
m = 44,87 g
Fração insolúvel Fração aquosa ácida
Fração CH
2
Cl
2
alcaloídica
m = 485,5 mg (1,1%)
Fração aquosa
(desprezada)
Subgrupo 9 Subgrupo 25
RMG
1
m = 1 mg (16,7%)
RMG
3
m = 1 mg (12,5%)
RMG
2
m = 1 mg (16,7%)
HCl 3% v/v
NH
4
OH/CH
2
Cl
2
CCDPs
1
, CC Sephadex e CC Sílica
CCDPs
2
CCDPs
3
67
Esquema 20: Fluxograma da partição do extrato metanólico aquoso 80% dos galhos de Duguetia riparia.
O EMS (258,0 mg) foi submetido ao fracionamento em coluna de sílica gel
empacotada com sistema solvente hexano/acetato de etila 1:1. A coluna foi eluída utilizando
hexano/acetato de etila 1:1, acetato de etila, acetato de etila/metanol em polaridades
crescentes (9:1, 8:2, 7:3, 6:4 e 1:1) e metanol. Foram recolhidas 20 frações que, após análise
comparativa por CCD de sílica, foram reunidas em dez subgrupos de frações (Esquema 21,
Tabela 18).
Esquema 21: Fracionamento em coluna de sílica gel do extrato metanólico solúvel.
EMA 80%
m = 8,67 g
Fração insolúvel
(desprezada)
EMS
m = 2,58 g (29,7%)
Metanol
EMS
m = 258,0 mg
20 Frações
SG
1
1-2
CC de Sílica
SG
2
3-4
SG
3
5
SG
4
6
SG
5
7
SG
6
8
SG
7
9
SG
8
10-12
SG
9
13-16
SG
10
17-20
CCDs
68
Subgrupos Frações Peso
(mg)
Rendimento
(%)
Subgrupos Frações Peso
(mg)
Rendimento
(%)
1 1-2 <1 0,0 6 8 10,0 3,9
2 3-4 <1 0,0 7 9 6,0 2,3
3 5 18,0 7,0 8 10-12 19,7 7,6
4 6 15,0 5,8 9 13-16 33,8 13,1
5 7 16,4 6,3 10 17-20 20,0 7,7
Tabela 18: Grupos provenientes do fracionamento do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia.
Os subgrupos 3, 4, 5, 6 e 7 mediante análise em cromatografia de camada delgada de
sílica apresentaram resultado positivo frente ao reagente de Dragendorff e foram
posteriormente cromatografados.
O subgrupo 3 (18,0 mg) foi submetido a CCDP de sílica tendo como sistema eluente
clorofórmio/metanol 9,5:0,5 e revelação em UV. As seis frações obtidas foram recuperadas
com metanol, filtradas em filtro poroso, concentradas a 50
o
C em evaporador rotativo a
pressão reduzida e secas em dessecador com sílica. Após cálculo de rendimento (Tabela 19),
as frações foram submetidas à CCD de sílica (clorofórmio/metanol 9,5:0,5) e reveladas com
lâmpada UV, vapores de iodo e reagente de Dragendorff. Destas frações, apenas a fração 4
apresentou grau de pureza satisfatório e foi codificada como RMG
4
(Esquema 22).
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 2,6 14,4
2 1,5 8,3
3 1,1 6,1
4 2,0 11,1
5 1,4 7,8
6 1,5 8,3
Tabela 19: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 3 proveniente do fracionamento do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia.
69
Esquema 22: Fracionamento do subgrupo 3 oriundo do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia.
À semelhança do subgrupo 3, os demais subgrupos trabalhados, subgrupo 4 (15,0 mg),
subgrupo 5 (16,4 mg), subgrupo 6 (10,0 mg) e subgrupo 7 (6,0 mg), também foram
cromatografados em CCDP de sílica (clorofórmio/metanol 9,5:0,5, revelação UV). Dos
subgrupos 4 e 5 foram obtidas, respectivamente, seis e cinco frações (Esquemas 23 e 24), cuja
porcentagem de rendimento e pesos obtidos estão distribuídos nas tabelas 20 e 21.
Após análise comparativa por CCD de sílica gel (clorofórmio/metanol 9,5:0,5)
verificou-se grau de pureza satisfatório e revelação positiva frente ao reagente de Dragendorff
da fração 6 do subgrupo 4 (fração codificada como RMG
5
) e da fração 4 do subgrupo 5
(fração codificada como RMG
6
).
Esquema 23: Fracionamento do subgrupo 4 oriundo do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia.
SG
3
m = 18,0 mg
F
1
F
2
F
3
F
4
F
5
F
6
CCDPs
RMG
4
m = 2,0 mg (11,1%)
CCDs
SG
4
m = 15,0 mg
F
1
F
2
F
3
F
4
F
5
F
6
CCDPs
RMG
5
m = 1,0 mg (6,7%)
CCDs
70
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,7 11,3
2 1,3 8,7
3 2,1 14,0
4 3,5 23,3
5 2,5 16,7
6 1,0 6,7
Tabela 20: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 4 proveniente do fracionamento do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia.
Esquema 24: Fracionamento do subgrupo 5 oriundo do extrato metanólico solúvel dos galhos de Duguetia
riparia.
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,8 11,0
2 1,9 11,6
3 1,7 10,4
4 4,0 24,4
5 1,7 10,4
Tabela 21: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 5 proveniente do fracionamento do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia.
Os subgrupos 6 e 7, após CCDP de sílica gel, realizada sob as mesmas condições
usadas nos subgrupos 3, 4 e 5, originaram, respectivamente, quatro e três frações (Tabelas 22
e 23). A fração 4 do subgrupo 6 e a fração 3 do subgrupo 7, após análise em CCD de sílica
gel, apresentaram mesmo valor de Rf e portanto reunidas e codificadas como RMG
7
(Esquema 25).
SG
5
m = 16,4 mg
F
1
F
2
F
3
F
4
F
5
CCDPs
RMG
6
m = 4,0 mg (24,4%)
CCDs
71
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,4 14,0
2 1,6 16,0
3 2,5 25,0
4 1,0 10,0
Tabela 22: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 6 proveniente do fracionamento do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia.
Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1,1 18,3
2 1,0 16,7
3 2,0 33,3
Tabela 23: Rendimento das frações obtidas do subgrupo 7 proveniente do fracionamento do extrato metanólico
solúvel dos galhos de Duguetia riparia.
Esquema 25: Obtenção da fração RMG
7
.
O extrato metanólico aquoso 80% (EMA 80%), a semelhança do extrato metanólico
(EM), também foi submetido a uma nova partição. Inicialmente foi solubilizado com
quantidades suficientes de metanol e transferido a um balão de separação com auxílio de uma
solução metanol/água 9:1. Em seguida, a solução remanescente foi submetida a sucessivas
extrações com hexano, originando as frações hexânica, concentrada e guardada sob
refrigeração, e a fração metanólica. A fração metanólica, por sua vez, antes de ser concentrada
SG
6
m = 10,0 mg
F
1
F
2
F
3
F
4
CCDPs
SG
7
m = 6,0 mg
F
1
F
2
F
3
CCDPs
CCDs
RMG
7
m = 3
,
0 m
g
(
18
,
7%
)
72
em evaporador rotatório, foi submetida à filtração sob pressão reduzida para separação do
precipitado formado durante a etapa de extração (Esquema 26).
Esquema 26: Obtenção da fração metanólica solúvel do extrato metanólico aquoso 80%.
A fração metanólica solúvel obtida (965,9 mg) foi cromatografada em coluna de sílica
gel impregnada com ácido oxálico a 12,1% (SILVA et al., 2007, adaptado) com auxílio dos
seguintes sistemas de solvente: hexano, hexano/acetato em polaridade crescente (9:1, 8:2, 7:3,
6:4 e 1:1), acetato, acetato/metanol em polaridade crescente (9:1, 8:2, 7:3, 6:4 e 1:1) e
metanol. Foram coletadas 53 frações, reunidas em 7 subgrupos, mediante análise comparativa
por CCD de sílica (Esquema 27, Tabela 24).
Esquema 27: Fracionamento cromatográfico em sílica gel impregnada com ácido oxálico a 12,1% da fração
metanólica solúvel.
EMA80%
m = 1,78 g
Fração hexânica
m = 39,6 mg (2,2%)
Fração metanólica
Fração metanólica solúvel
m = 965,9 mg (54,3%)
MeOH/Á
g
ua 9:1 e hexano
Fração metanólica insolúvel
m = 192,7 mg (10,8%)
Fração metanólica solúvel
m = 965,9 mg
53 Frações
CC de Sílica (ácido oxálico 12,1%)
7 subgrupos de frações
CCDs
73
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1-26 5,7 0,6
2 27-28 1,2 0,1
3 29 1,5 0,1
4 30 1,8 0,2
5 31 1,5 0,1
6 32-46 10,2 1,0
7 47-53 5,0 0,5
Tabela 24: Frações obtidas após cromatografia em coluna da fração metanólica solúvel.
Para eliminação do oxalato formado durante o processo de fracionamento em coluna,
todos os subgrupos de frações foram submetidos a um tratamento prévio às análises
detalhadas de seu grau de pureza em cromatoplacas de sílica C18.
O citado tratamento consistiu em uma partição utilizando uma solução aquosa de
acetato de etila, neutralização do sistema com Na
2
CO
3
a 10% e recolhimento da fração
superior do tubo após congelamento.
As frações recolhidas foram concentradas em evaporador rotativo sob pressão
reduzida, a uma temperatura de 50º C e em seguida, analisadas em cromatoplacas de sílica
C18 com auxílio da lâmpada de UV, vapores de iodo, reagente de Dragendorff e vanilina
sulfúrica.
Com exceção das frações 4 e 5, codificadas como RMG
8
e RMG
9
, respectivamente,
todas as demais apresentaram grande quantidade de impureza nas revelações das
cromatofolhas. Então foram reunidas e cromatografadas em coluna de sílica C18 com auxílio
de metanol. Foram coletadas 42 frações, reunidas em 6 subgrupos, mediante análise
comparativa por CCD de sílica (Esquema 28, Tabela 25).
74
Esquema 28: Fracionamento cromatográfico em sílica C18 das frações 1, 2, 3, 6 e 7.
Subgrupos Frações Peso (mg) Rendimento (%)
1 1-9 2,0 8,5
2 10-20 2,5 10,6
3 21-34 3,4 14,4
4 35-40 2,6 11,0
5 41 1,7 7,2
6 42 1,0 4,2
Tabela 25: Frações obtidas após cromatografia em coluna das frações 1, 2, 3, 6 e 7.
Os subgrupos de frações obtidos deste último fracionamento foram codificados,
respectivamente, como RMG
10
, RMG
11
, RMG
12
, RMG
13
, RMG
14
e RMG
15
e em seguida,
armazenados para estudo fitoquímico.
Os esquemas 29 e 30 descrevem, sucintamente, as marchas que o extrato metanólico
aquoso 80% foi submetido para obtenção das frações RMG
4
, RMG
5
, RMG
6
, RMG
7
, RMG
8
,
RMG
9
, RMG
10
, RMG
11
, RMG
12
, RMG
13
, RMG
14
e RMG
15
.
Frações 1, 2, 3, 6 e 7
m = 23,6 mg
42 Frações
CC de Sílica C18
6 subgrupos de frações
CCDs
75
Esquema 29: Obtenção das frações RMG
4
, RMG
5
, RMG
6
e RMG
7
.
(
1
) 18,0 mg, clorofórmio/MeOH 9,5:0,5, revelação UV. (
2
) 15,0 mg, clorofórmio/MeOH 9,5:0,5, revelação UV. (
3
) 16,4 mg,
clorofórmio/MeOH 9,5:0,5, revelação UV e (
4
) 16,0 mg, clorofórmio/MeOH 9,5:0,5, revelação UV.
Esquema 30: Obtenção das frações RMG
8
, RMG
9
, RMG
10
, RMG
11
, RMG
12
, RMG
13
, RMG
14
e RMG
15
.
CCDPs
1
Fração insolúvel
(desprezada)
EMS
m = 2,58 g (29,7%)
Subgrupo 3
Subgrupo 4 Subgrupo 5
Subgrupos 6 e 7
RMG
4
m = 2,0 mg (11,1%)
RMG
5
m = 1,0 mg (6,7%)
RMG
6
m = 4,0 mg (24,4%)
RMG
7
m = 3,0 mg (18,7%)
EMA 80%
m = 8,67 g
MeOH
CC Sílica
CCDPs
4
CCDPs
3
CCDPs
2
RMG
10,
RMG
11,
RMG
12,
RMG
13,
RMG
14
e RMG
15
Fração hexânica
m = 39,6 mg (2,2%)
Fração metanólica solúvel
m = 965,9 mg (54,3%)
Subgrupo 4 Subgrupo 5
Subgrupos
1, 2, 3, 6 e 7
RMG
8
m = 1,8 mg (0,2%)
RMG
9
m = 1,5 mg (0,1%)
EMA 80%
m = 1,78 g
MeOH/Água 9:1 e hexano
CC de Sílica (ácido oxálico 12,1%)
CC de Sílica C18
76
CAPÍTULO III:
Parte Experimental – Testes
Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
Galhos
Folhas
Frutos
77
3. 1 – TOXICIDADE FRENTE À Artemia salina LEACH (TAS)
Os testes de toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina foram realizados no
Laboratório de Fitoquímica do Departamento de Química da Universidade Federal do
Amazonas, sob a orientação da professora Dra. Ana Lúcia Queiroz de Assis Galotta.
Esses microcrustáceos são bastante utilizados em testes de bioensaios porque
apresentam grande sensibilidade ao meio que se encontram. Possuem coloração rosa a
vermelho-claro, comprimento entre 8 a 10 mm, ciclo de reprodução rápido e podem viver em
soluções salinas artificiais, além de lagos de água salgada (VINATEA, 1994).
O teste de toxicidade frente ao estágio larval da A. salina vem sendo cada vez mais
utilizado como indicador da bioatividade de extratos e produtos obtidos em estudos
fitoquímicos, visto que se trata de um ensaio simples, barato e não exige medidas assépticas
para o seu desenvolvimento (VINATEA, 1994).
Este ensaio determina a potência de uma substância através da medida da resposta
biológica, expressa pela morte dos metanáuplios de A. salina. Com este teste, selecionam-se
produtos naturais com habilidade de destruir ou inibir o crescimento de culturas de células
tumorais, destruir ou inibir o desenvolvimento de insetos e ainda exercer uma larga faixa de
efeitos farmacológicos (MEYER et.al., 1982).
A consolidação da técnica e sua utilização sistemática, como meio de se obter
substâncias ativas de extratos vegetais, se deram a partir da década de 80, quando McLaughin
e colaboradores iniciaram uma triagem sistemática em extratos de diferentes espécies de
famílias vegetais à procura de substâncias com atividades pesticida e antitumoral
(McLAUGHLIN et al., 1993; McLAUGHLIN, 1991).
A partir desta data, diversos outros estudos foram realizados utilizando o TAS como
biomonitoramento de bioatividades. Muitos destes sugerem que, para se dar continuidade ao
78
estudo das atividades biológicas, estes extratos devem apresentar uma DL
50
< 1000 µg/mL
(FERRIGNI et al., 1984; MEYER et al., 1982). Mais recentemente Dolabela (1997),
demonstrou que substâncias com uma DL
50
entre 80 e 250 µg/mL no bioensaio frente à A.
salina podem apresentar atividade anti-Tripanossoma cruzi, e substâncias com toxicidade de
DL
50
< 145 µg/mL podem apresentar atividade antitumoral.
3. 1. 1 – Procedimento (DOLABELA, 1997)
Em um aquário de vidro, contendo aproximadamente 100 mL de solução salina (38 g
de sal marinho sintético dissolvidos em 1 L de água destilada), foram adicionados cerca de 10
mg de ovos de Artemia salina e deixados sob iluminação artificial a 28ºC. Após 24 horas
foram transferidos os náuplios do microcrustáceo (primeiros estágios larval) para outro
aquário contendo 100 mL de solução salina limpa. Este segundo aquário, à semelhança do
primeiro, também foi mantido em incubação por mais 24 horas, sob iluminação artificial a
28ºC, para obtenção de uma cultura pura do estágio larval de metanáuplios (Figura 20).
Em seguida, foram preparadas, em triplicata, soluções de lapachol, cuja DL
50
sobre
Artemia salina é de 70 µg/mL (61 < DL
50
< 81) e das amostras-teste (extratos e frações) em
cinco concentrações diferentes, expressas em µg/mL, utilizando-se o dimetilsulfóxido
(DMSO), além de uma solução controle, utilizando-se apenas a solução salina com DMSO a
1%. Essas soluções foram adicionadas em tubos contendo 5 mL de solução salina com
aproximadamente 10 a 15 larvas de A. salina em estágio de metanáuplios (Figura 20).
Após 24 horas de incubação em local fresco, foi realizada a contagem do número de
microcrustáceos mortos (indivíduos imóveis e/ou depositados no fundo do tubo) e vivos
(Figura 20). Com os valores dos números de microcrustáceos vivos e mortos em cada
79
concentração testada, determinou-se a DL
50
(com intervalo de confiança de 95%) através do
método probitos de análise (FINNEY, 1974).
Figura 20: Teste de toxicidade frente à Artemia salina: Obtenção do primeiro estágio larval do microcrustáceo
(náuplios) (76), transferência dos náuplios para aquário limpo para obtenção do estágio larval de metanáuplios
(77), adição das amostras em 5 concentrações diferentes (78) e contagem, após 24 horas, dos microcrustáceos
vivos e mortos (79).
3. 2 – ATIVIDADE LEISHMANICIDA
A atividade leishmanicida foi realizada no Laboratório de Bioquímica de
Tripanosomatídeos, do Departamento de Imunologia da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-
RJ), sob a orientação da Dra. Leonor Laura Pinto Leon.
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as leishmanioses apresentam-se
como a segunda doença causada por protozoários de maior importância em saúde pública,
superada apenas pela malária (RATH et al., 2003). São consideradas doenças endêmicas em
16 países desenvolvidos e 72 países em desenvolvimento, totalizando uma incidência anual de
600.000 e uma prevalência de 12 milhões de casos (CAMARGO; BARCINSKI, 2003;
MARCONDES, 2001).
A rigor, as leishmanioses são zoonoses, isto é, doenças infecciosas propagadas entre
animais das quais o homem não é um elo obrigatório, mas eventual. Dessa forma, as
leishmanioses têm um ciclo natural que não depende do homem. Porém, quando o homem
76
77
78
79
80
entra em contato com os vetores da doença pode adquirir-la (CAMARGO; BARCINSKI,
2003). Por isto, a doença é particularmente freqüente entre trabalhadores e habitantes das
florestas e mesmo entre visitantes esporádicos das mesmas, como pescadores, turistas e
soldados. É muito freqüente, ainda, em agentes de desmatamento e madeireiros visto que,
derrubada a floresta, os mosquitos vetores das várias espécies de Leishmania, privados dos
animais silvestres, que se afastam das florestas desmatadas, vêm alimentar-se no homem
(CAMARGO; BARCINSKI, 2003).
As leishmanioses são classificadas em três formas principais: a forma visceral ou
calazar, causada principalmente pelo protozoário Leishmania donovani, mas também pelos L.
infantum e L. chagasi, e é caracterizada por febre irregular, perda de peso,
hepatoesplenomegalia e anemia, com aproximadamente 100% de taxa de mortalidade em
indivíduos não tratados; a forma mucocutânea, geralmente causada por L. braziliensis,
compreendendo lesões que destroem parcial ou totalmente a mucosa nasal e oral, gerando
deformidades e a forma cutânea, causada geralmente por L. mexicana, L. tropica e L. major,
sendo caracterizada por lesões ulcerativas em áreas expostas, como braços e pernas
(CAMARGO; BARCINSKI, 2003; GRIMALDI; TESH, 1993; LAINSON; SHAW, 1987).
Na realidade, as formas mucocutânea e cutânea, por afetarem principalmente a
estrutura da pele, da face e das mucosas superiores e não atingirem os órgãos internos, como
acontece com a forma visceral, são consideradas variedades da leishmaniose tegumentar. Essa
por sua vez, por se tratar de uma doença autóctone do continente americano, é conhecida pelo
nome de Leishmaniose Tegumentar Americana (ALTAMIRANO-ENCISO et al., 2003), que
de acordo com a OMS, encontra-se entre as oito doenças infecto-parasitárias listadas como de
maior prevalência no mundo (PEREIRA; FONSECA, 1994).
Os parasitas causadores das leishmanioses foram agrupados em dois subgêneros,
Viannia e Leishmania, baseados em caracteres biológicos, bioquímicos e imunológicos
81
associados aos critérios clássicos de morfologia, desenvolvimento biológico nos hospedeiros
e em meio de cultura e distribuição geográfica (LAINSON; SHAW, 1987; LAINSON et al.,
1981).
As espécies Leishmania (Viannia) braziliensis; L. (V.) guyanensis; L. (V.) shawi; L.
(V.) naiffi; L. (V.) lindenbergi; L. (Leishmania) amazonensis e L. (L.) chagasi são
responsáveis pelos casos de leishmaniose notificados no Brasil (MIRANDA et al., 2002).
Segundo Grimaldi e Tesh (1993), as espécies envolvidas nos casos notificados na região
Amazônica são Leishmania (V.) guyanensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi,
L. (V.) shawi, L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L.(V.) lindenbergi.
Os reservatórios naturais para as várias espécies de leishmanias têm sido identificados
como sendo animais domésticos e silvestres, enquanto que os mosquitos vetores da doença
são flebotomíneos fêmeas pertencentes aos gêneros Phlebotomus, vetores das leishmanioses
no Velho Mundo, e Lutzomyia, envolvidos no ciclo de transmissão desses parasitas no Novo
Mundo (CHAN-BACAB; PEÑA-RODRÍGUEZ, 2001).
Esses mosquitos, de aproximadamente 0,5 cm de comprimento, pernas longas e
delgadas e corpo densamente piloso, são facilmente identificados por voarem aos saltos e
manter as asas eretas mesmo em repouso. Por essa razão, dependendo da região do Brasil,
recebem vários apelidos, tais como mosquito palha, asa dura, asa branca, tatuquira, birigui,
cangalha, cangalhinha, ligeirinho, péla-égua, arrupiado e arrepiado (CAMARGO;
BARCINSKI, 2003).
Os parasitas do gênero Leishmania apresentam dois diferentes estágios em seu ciclo de
vida: uma forma móvel, possuidora de um flagelo anterior e que se aloja no lúmen do trato
digestivo do mosquito vetor, denominada promastigota, e uma forma conhecida como
amastigota (Figura 21), caracterizada por não apresentar flagelo e infectar células do sistema
82
fagocítico mononuclear do homem, principalmente macrófagos (BATES, 1994; RATH et al.,
2003; SOARES-BEZERRA et al., 2004).
Figura 21: Formas de vida do parasita do gênero Leishmania: Forma promastigota (80) e forma amastigota (81).
FONTE: Sinclair Stammers/TDR/OMS.
Segundo Camargo e Barcinski (2003) e Soares-Bezerra et al. (2004), a transmissão da
leishmaniose para o homem ocorre quando os mosquitos vetores sugam o sangue de um
hospedeiro vertebrado infectado ou de um hospedeiro reservatório e ingerem macrófagos
parasitados por leishmanias em sua forma amastigota ou, ainda, amastigotas livres, presentes
no sangue ou nos tecidos dos mesmos. As formas amastigotas, ao atingirem o intestino médio
do inseto, se diferenciam em promastigotas. Estas formas flageladas, após rápida
multiplicação, se convertem nos promastigotas infectantes e migratórios que do intestino
anterior do inseto são regurgitadas ou introduzidas na pele do próximo hospedeiro no
momento que o vetor se alimentar novamente de sangue (Figura 22).
80 81
83
Figura 22: Ciclo de vida do parasita Leishmania spp.
FONTE: www.dpd.cdc.gov/dpdx.
Os fármacos de primeira escolha para o tratamento de todas as formas de leishmanioses
têm sido até hoje os antimoniais pentavalentes (Sb
5+
), introduzidos há cerca de 50 anos
(AKENDENGUE et al., 1999; SOARES-BEZERRA et al., 2004). Foram usados pela
primeira vez por Gaspar Vianna, médico brasileiro, em 1912, na sua forma trivalente (Sb
3+
), o
chamado tártaro emético, obtendo algum sucesso, visto que naquela época 90% dos casos
evoluíam para o óbito por não haver tratamento (LAINSON apud SOARES-BEZERRA et al.,
2004). No entanto, esta formulação era de difícil administração e ocasionava tosse, dor no
peito e depressão. Somente em 1937, que o estibogliconato de sódio, um medicamento
derivado do ácido estibônico, onde o antimônio encontra-se na forma pentavalente, começou
a ser empregado no tratamento das leishmanioses (SOARES-BEZERRA et al., 2004).
Multiplicação de
promastigotas.
Mosquito se alimenta de sangue:
estágio de injeção de
promastigotas dentro da pele.
Promastigotas são fagocitados
pelos macrófagos.
Promastigotas são transformados
em amastigotas dentro dos
macrófagos.
Multiplicação de
amastigotas em
células de vários
tecidos.
Mosquito se alimenta de sangue e
Ingere macrófagos infectados
com amastigotas.
Ingestão de células
parasitadas.
Transformação de amastigotas em
promastigotas.
Estágios no Mosquito Estágios em Humanos
Estágio infectivo
Estágio diagnosticável
84
Além do estibogliconato de sódio, outro antimonial pentavalente, o antimoniato de N-
metilglucamina, também é utilizado no combate a essa doença (BERMAN apud SOARES-
BEZERRA et al., 2004; CHAN-BACAB; PEÑA-RODRÍGUEZ, 2001; CROFT; COOMBS,
2003). Entretanto, ambos, além de caros e apresentarem a necessidade de um tratamento
prolongado, possuem severos efeitos colaterais, que incluem problemas gastrointestinais,
cardiotoxicidade e, em alguns casos, insuficiência renal e hepática (BARATA et al., 2000).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) preconiza como tratamento para a
leishmaniose visceral 20 mg de Sb/kg/dia, por via intramuscular ou intravenosa, por, no
mínimo, 20 dias e até duas semanas após a cura parasitológica, com dose diária máxima de
850 mg de antimônio. Para a leishmaniose cutânea, a recomendação é de 10 a 20 mg
Sb/kg/dia, até que a lesão se cure. Para a leishmaniose mucocutânea, é recomendada a
administração de 20 mg de Sb/kg/dia durante 30 dias (TRACY; WEBESTER JÚNIOR apud
SOARES-BEZERRA et al., 2004).
Outras drogas alternativas como a pentamidina e a anfotericina-B, desenvolvidas
inicialmente para combater outras doenças, embora bastante tóxicas, também são empregadas
contra as diferentes formas de leishmaniose (BASSELIN et al., 1996; CHAN-BACAB;
PEÑA-RODRÍGUEZ, 2001).
A pentamidina foi descrita no final da década de 50 para o tratamento da pneumonia,
vindo a ser usada nos casos de leishmaniose visceral resistente aos antimoniais e no
tratamento de algumas leishmanioses difuso-cutânea e mucocutânea, causadas por
Leishmania aethiopica, apresentando bons resultados em pacientes imunodeprimidos
(BASSELIN et al., 1996). Para uma efetiva ação da pentaminida contra os parasitas
causadores das leishmanioses, a OMS recomenda uma dose de 4 mg/kg, aplicados por via
endovenosa três vezes por semana
(SOARES-BEZERRA et al., 2004). Segundo Berman apud
Soares-Bezerra et al. (2004), já se observou que após a administração de 15 injeções
85
(correspondente a 5 semanas de tratamento), 77% dos pacientes com leishmaniose visceral
evoluíram para cura e após a administração de 27 injeções (correspondente a 9 semanas de
tratamento) o percentual de cura foi de 94%.
A anfotericina B é um potente agente antiparasitário e antifúngico com grande faixa de
atividade contra organismos que apresentam ergosterol como principal constituinte de suas
membranas plasmáticas ao invés do colesterol das membranas de células animais, visto que o
mecanismo de ação desta droga resulta de sua ligação ao ergosterol, com conseqüente
alteração de permeabilidade de membrana e do equilíbrio osmótico do parasita (SAHA et al.,
1986; OLLIARO; BRYCESON, 1993; URBINA, 1997). É utilizada no tratamento da
leishmaniose mucocutânea na América do Sul e em casos de leishmaniose visceral refratários
ao tratamento com antimoniais (BERMAN, 1998). Atualmente é o agente terapêutico mais
promissor na cura de leishmaniose visceral e também nos casos resistentes ao tratamento com
pentamidina (CROFT et al., 1991).
Recentemente a Hexadecilfosfocolina, também conhecida pelo nome de miltefosina,
uma alquilfosfocolina desenvolvida originalmente para o tratamento do câncer (UNGER et al.
apud SOARES-BEZERRA et al., 2004), vem sendo apontada como a melhor alternativa no
tratamento da leishmaniose visceral, uma vez que o fármaco pode ser administrado por via
oral, ao contrário de outros (SUNDAR et al.; JHA et al. apud SOARES-BEZERRA et al.,
2004). Entretanto, a maior limitação na utilização de miltefosina é a teratogenicidade e isso
exclui seu uso em mulheres grávidas (CROFT; COOMBS, 2003).
3. 2. 1 – Procedimento
Antes do teste propriamente dito, deve-se realizar o ajuste da concentração parasitária
para 4,0 x 10
6
parasitas/mL. Para realizar esse ajuste, 1 mL de meio de cultura rico das formas
86
promastigotas foi transferido a um frasco contendo 15 mL de meio Schneider suplementado
com 20% de soro fetal bovino (SFB) e 2% de urina humana esterilizada, que, em seguida, foi
incubado em estufa por 72 horas a uma temperatura de 26ºC.
Após o período de incubação, os parasitas foram transferidos para um tubo de
centrífuga de 50 mL e centrifugados por 15 minutos a 4000 rpm a temperatura de 4 ºC. Desta
centrifugação se obteve uma fase sólida, contendo os promastigotas (denominada de pellet) e
o sobrenadante. A fase líquida foi transferida para outro tubo de centrífuga (Tubo B) e o pellet
deixado no tubo de origem (Tubo A).
Ao tubo contendo os parasitas (Tubo A) foi adicionado 1 mL do sobrenadante
(ressuspensão). Dessa mistura, foram realizadas as diluições necessárias para a obtenção da
melhor forma de contagem. Após a verificação da melhor diluição os parasitas foram
contados em câmara de Neubauer. Concluída a contagem, se realizou os cálculos para
obtenção da concentração parasitária desejada (Tubo C) levando em consideração a diluição
realizada (Figura 23).
87
Figura 23: Ajuste da concentração parasitária a ser utilizada no teste in vitro da atividade leishmanicida.
FONTE: COSTA, 2004.
Para a montagem da placa de microtitulação de 96 poços (Figura 24), foram colocados
200 µL do sobrenadante (Tubo B) nos primeiros poços de cada fileira da placa e 100 µL nos
demais poços, incluindo os poços controles (poços da linha H da placa). Nos primeiros poços
foi retirado um volume de 6,4 µL do sobrenadante, sendo substituído o mesmo volume pelas
amostras dissolvidas em DMSO (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA). O primeiro
poço da primeira fileira foi homogeneizado e, em seguida, foram retirados 100 µL da
suspensão, transferindo-se às próximas fileiras, em sucessivas diluições, até a última, da qual
15 mL do Meio Schneider
com os parasitas
(72 horas de incubação)
Tubo de centrífuga
Transferência para um
tubo de centrífuga
Após
centrifu
g
a
ç
ão
Tubo A
Tubo B
Concentração ajustada
p
ara 4x10
6
p
arasitas/mL
Contagem dos parasitas em
câmara de Neubauer
Ajuste de
concentra
ç
ão
Tubo C
88
o volume de 100 µL foi descartado. Um inóculo de 100 µL do parasita foi misturado ao
sobrenadante e adicionado a todos os poços da placa.
Após 24 horas de incubação a 26ºC, os valores das DLs
50/24 horas
foram determinadas
pela contagem dos parasitas em câmara de Neubauer e comparados numericamente com os
controles: DMSO contendo os parasitas sem as drogas (A) e os parasitas sozinhos (B). Todos
os experimentos foram realizados em triplicata, usando a Pentamidina como droga de
referência.
Figura 24: Placa de microtitulação de 96 poços utilizada no teste in vitro da atividade leishmanicida.
NOTA: Cada placa foi utilizada para analisar duas amostras em triplicata e em concentrações distintas. A amostra 1 foi
colocada nos poços das linhas A, B e C, a amostra 2 foi distribuída nos poços das linhas E, F e G e os controles nos poços da
linha H.
FONTE: COSTA, 2004.
3. 3 – ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO MOSQUITO Aedes aegypti
O teste de atividade larvicida frente ao mosquito Aedes aegypti foi realizado no
Laboratório de Malária e Dengue do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA),
sob a orientação do Dr. Wanderli Pedro Tadei.
89
A dengue é uma doença infecciosa, de origem viral, transmitida para o homem por
meio da picada de fêmeas de mosquitos contaminados pertencentes ao gênero Aedes. O
principal vetor é o inseto Aedes aegypti, também vetor da febre amarela urbana, embora
outras espécies como Aedes albopictus e Aedes polynesiensis possam estar envolvidos na
transmissão (GUZMÁN; KOURI, 2001).
A infecção pelo vírus pode ser assintomática ou levar a uma febre clássica ou
hemorrágica. Os sinais e sintomas clínicos variam de acordo com a idade da pessoa infectada.
Recém-nascidos e crianças jovens normalmente desenvolvem apenas uma enfermidade febril
não específica, com manchas vermelhas difíceis de distinguir de outras viroses. Os casos mais
graves geralmente ocorrem em crianças mais velhas e adultos. Esses casos são caracterizados
por um rápido aumento na temperatura corporal que dura por volta de 5 a 6 dias. Durante o
período febril, o paciente pode apresentar dores no corpo, sensação de cansaço, falta de
apetite, náuseas, vômitos, manchas vermelhas na pele, cefaléia, mialgias e artralgia. Às vezes
pode ocorrer petéquias, epistaxe e sanguamento gengival, metrorragia, além de outras
manifestações hemorrágicas (GUZMÁN; KOURI, 2001; LIGON, 2005).
Tanto o mosquito macho quanto o mosquito fêmea do Aedes aegypti alimentam-se de
néctar ou seiva vegetal, porém a fêmea, após o acasalamento, necessita de sangue para a
maturação dos ovos. Os ovos então são depositados em recipientes naturais ou artificiais,
preferencialmente contendo água limpa. As larvas, em todos os 4 ínstars, possuem grande
mobilidade e alimentam-se de detritos orgânicos, fungos, bactérias e protozoários existentes
na água que se encontram (ROZENDAAL apud COÊLHO, 2006).
3. 3. 1 – Procedimento (MONTENEGRO et al., 2006)
Larvas de mosquitos Aedes aegypti, obtidas a partir de ovos cedidos pelo Laboratório
de Malária e Dengue do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, foram criadas e
90
mantidas no Insetário do mesmo Instituto, a uma temperatura média de 27
o
C e umidade
relativa do ar de 80%, com fotoperíodo de cerca de 12 horas. Os experimentos foram
realizados em triplicata, na concentração de 300 ppm, com os extratos hexânico, metanólico e
metanólico solúvel e com as frações alcaloídica e hidrometanólica.
Grupos contendo 20 larvas no 3
o
instar foram colocados em contato com os extratos e
frações dissolvidos em DMSO. A mortalidade foi determinada após exposição das larvas
durante 24, 48 e 72 horas. O nível de atividade dos extratos e frações testados foi estabelecido
com base no percentual médio de mortalidade das larvas: mortalidade > 75% resultado
promissor, mortalidade > 50 e < 75% resultado parcialmente promissor, mortalidade > 25 e <
50% resultado fracamente promissor e mortalidade < 25% inativo.
3. 4 – CAPACIDADE CAPTURADORA DE RADICAIS LIVRES
A atividade antioxidante e capacidade capturadora de radicais livres foram realizadas
no Laboratório de Fitoquímica do Departamento de Química da Universidade Federal do
Amazonas, sob a orientação da professora Dra. Ana Lúcia Queiroz de Assis Galotta.
De forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em
concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou
inibem a oxidação do mesmo (GALOTTA, 2005; SOUSA et al., 2007). Em bioquímica e
medicina, antioxidantes são enzimas ou outras moléculas orgânicas, como vitamina A ou β-
caroteno, capazes de estabilizar ou desativar os radicais livres antes que os mesmos ataquem
os alvos biológicos das células (SOUSA et al., 2007). Na indústria química, antioxidantes são
substâncias que retardam a autoxidação de produtos químicos, como borrachas e plásticos. A
autoxidação é causada, em princípio, por reações radicalares em cadeia entre oxigênio e os
substratos. Os antioxidantes efetivos são substâncias que interrompem essas reações em
91
cadeia devido à capacidade que apresentam em capturar os radicais livres formados (HUANG
apud GALOTTA, 2005).
Triagens clínicas e estudos epidemiológicos têm estabelecido uma correlação inversa
entre a utilização de frutas e vegetais e a ocorrência de doenças cardiovasculares, inflamações,
câncer e desordens relacionadas com a idade. Acredita-se que os antioxidantes absorvidos
desses alimentos, incluindo substâncias polifenólicas, tocoferóis (vitaminas E), ácido
ascórbico (vitamina C), selênio e carotenóides, são os responsáveis pela prevenção dessas
doenças relacionadas com o estresse oxidativo (SOUSA et al., 2007). Por essa razão o
conhecimento da capacidade antioxidante dos constituintes dos alimentos vem tornando-se
um tópico de progressivo interesse nos últimos anos (HUANG apud GALOTTA, 2005).
Além dos alimentos, muitas plantas têm sido estudadas com a finalidade de se detectar
e isolar antioxidantes naturais (GALOTTA, 2005). Vários métodos são utilizados para
determinar a atividade antioxidante em extratos e substâncias isoladas; um dos mais usados
consiste em avaliar a atividade seqüestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
(DPPH), de coloração púrpura que absorve a 515 nm (SOUSA et al., 2007).
Por ação de um antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar (R
•
), o DPPH (82) (Figura
25) é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com conseqüente
desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da
absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade
antioxidante ou seqüestradora de radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH remanescente
no meio reacional (SOUSA et al., 2007).
A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH
consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para
decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente
(CE
50
), também chamada de concentração inibitória (CI
50
). Quanto maior o consumo de
92
DPPH por uma amostra, menor será a sua CE
50
e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA
et al., 2007).
Figura 25: Estrutura química do 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).
3. 4. 1 – Método Qualitativo (CHOI et al., 2002; MONTENEGRO et al., 2006)
Os extratos e as frações testadas foram submetidos à CCD (utilizando-se os eluentes
apropriados para cada caso) e, depois de secas, foram submersas, durante 10 segundos, em
solução metanólica do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) a 0,4 mM. Após secagem
das mesmas a temperatura ambiente, o aparecimento de manchas esbranquiçadas sob fundo
violeta sugeriu a presença de substâncias antioxidantes no material testado.
3. 4. 2 – Método Quantitativo (BURDA; OLESZEK apud GALOTTA, 2005)
As amostras (5,0 mg) foram solubilizadas em balão volumétrico de 50 mL com
metanol, grau espectrofotométrico (Sigma) e a partir dessas soluções foram feitas diluições,
obtendo-se, no final, concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL.
Alíquotas de 750 µL de cada diluição foram colocadas em cubetas de plástico
contendo 1,5 mL de solução de DPPH (0,002%p/v) em metanol. Os experimentos foram
realizados em triplicata e após 30 minutos as absorbâncias foram medidas em λ = 517 nm.
N
N
NO
2
O
2
N
O
2
N
82
93
A absorbância desta solução de DPPH foi também medida no mesmo tempo (30
minutos), tendo sido preparada no tempo zero do experimento, ficando, durante os 30
minutos, protegida da incidência direta de luz.
O metanol puro foi utilizado para a correção da linha base no espectrofotômetro.
O percentual de inibição do DPPH (ou a % da atividade antioxidante) foi calculado
pela seguinte fórmula:
% de inibição do DPPH=1–A
a
/A
b
x 100
Onde A
a
= absorbância da amostra e A
b
= absorbância da solução de DPPH.
O cálculo da CE
50
(concentração efetiva para descolorir 50% da solução de DPPH) foi
realizado utilizando-se o método probitos de análise (FINNEY, 1974).
3. 5 – DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS TOTAIS
Entende-se por compostos fenólicos de plantas o conjunto de substâncias de diversas
categorias capazes de neutralizar ou seqüestrar radicais livres e quelar metais de transição,
agindo tanto na inibição como na propagação do processo oxidativo (SOUSA et al., 2007).
Entre as substâncias mais comumente classificadas como compostos fenólicos
destacam-se os fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ácidos benzóico e cinâmico),
cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas.
Visto que muitos estudos têm demonstrado a possibilidade dos antioxidantes utilizados
nas indústrias alimentícias, tais como butil-hidroxi-anisol (BHA), butil-hidroxi-tolueno
(BHT), terc-butil-hidroxi-quinona (TBHQ), tri-hidroxi-butil-fenona (THBP) e galato de
propila (GP), apresentarem alguns efeitos tóxicos, as pesquisas têm-se voltado no sentido de
encontrar produtos naturais com atividade antioxidante, os quais permitirão substituir os
sintéticos ou fazer uma associação entre eles (SOUSA et al., 2007).
94
A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio de uma
variedade de técnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu figura entre as mais
extensivamente utilizadas. O reagente consiste de uma mistura dos ácidos fosfomolibídico e
fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6
+
porém, em presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os
chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação dos
metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a determinação da concentração das
substâncias redutoras, que não necessariamente precisam ter natureza fenólica (SOUSA et al.,
2007).
3. 5. 1 – Procedimento
Os extratos e frações testados (0,01 g) foram dissolvidos em metanol, transferidos
quantitativamente para balões volumétricos de 10 mL e tiveram seus volumes completados
com o mesmo solvente.
Uma alíquota de 0,2 mL de cada solução amostra foi transferida para um frasco âmbar
e colocada em contato com 1,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu por 5 minutos. Passado
este tempo, neutralizou-se as misturas com uma alíquota da solução de NaHCO
3
a 6%.
Após 1 hora e meia da adição da solução de NaHCO
3
a 6%, as absorbâncias das
amostras foram medidas a 725 nm utilizando-se cubetas de vidro, tendo como branco o
metanol e todos os reagentes, menos os extratos e frações amostras.
O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação da absorbância das amostras
contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido gálico (0,5 a 0,03125
µg/mL) e expressos como mg de EAG (equivalentes de ácido gálico) por g de amostra. A
equação da curva de calibração do ácido gálico foi Y = 5,007x – 0,0025, onde Y é a
95
concentração do ácido gálico, x é a absorbância a 725 nm e o coeficiente de correlação R =
0,9994.
96
CAPÍTULO IV:
Resultados e Discussão
Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
Folhas
Galhos
Frutos
97
4. 1 – FITOQUÍMICA
4. 1. 1 – Prospecção fitoquímica dos extratos brutos
Os extratos brutos hexânico, metanólico e metanólico aquoso 80% obtidos dos galhos
finos da espécie Duguetia riparia, foram submetidos aos ensaios de prospecção fitoquímica
descrito por Mattos (1998) e os resultados das análises foram dispostos na tabela 26.
Os ensaios realizados com o extrato hexânico, evidenciaram teste positivo apenas para
esteróides livres, enquanto os testes realizados com o extrato metanólico e metanólico aquoso
80%, apresentaram resultados positivo para compostos fenólicos, triterpenóides, esteróides
livres e alcalóides.
Os testes realizados para detecção de acetogeninas de Annonaceae, classe de
substâncias exclusiva, até o momento, desta família, apresentaram resultados negativos para
os extratos trabalhados.
Classe de substâncias EH EM EMA80%
Fenóis e taninos - - -
Antocianinas e antocianidinas - - -
Flavonas, flavonóis e xantonas - + +
Chalconas e auronas - - -
Flavanonóis - + -
Leucoantocianidinas - - -
Catequinas - - -
Flavanonas - + -
Triterpenóides - + +
Esteróides livres + + +
Alcalóides - + +
Tabela 26: Resultado da prospecção fitoquímica realizada nos extratos brutos da espécie Duguetia riparia.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMA80%: extrato metanólico aquoso 80% dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
98
4. 1. 2 – Identificação dos constituintes químicos de Duguetia riparia
Das 15 frações separadas para a análise fitoquímica, apenas as frações RMG
8
, RMG
9
e
RMG
13
foram trabalhadas e tiveram seus espectros de RMN de
1
H e
13
C e técnicas correlatas
obtidos.
Após análise dos respectivos espectros, se verificou a presença dos alcalóides
liriodenina, na fração RMG
8
; liriodenina, oxoputerina e lisicamina, na fração RMG
9
e
asimilobina, na fração RMG
13
.
4. 1. 2. 1 – Fração RMG
8
A fração RMG
8
, sólido amarelo amorfo solúvel em metanol, apresentou resultado
positivo frente ao reagente de Dragendorff.
O espectro de RMN de
1
H apresentou sinais múltiplos na região entre
δ
H
8,75 e 6,45
típicos de hidrogênios aromáticos e metilênicos (Figura 26). Os grupos de sinais mais
intensos, observados na região entre
δ
H
8,75 e 7,39, foram atribuídos a sete hidrogênios de
natureza aromática, característicos de anel piridínico (anel B) e anel benzênico (anel D)
dissubstituídos próprios de núcleo aporfínico (Figura 27).
99
Figura 26: Expansão entre
δ
H
8,75 e 6,25 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
8
.
Figura 27: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,50 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
8
.
pp
m
(
f1
)
6.256.506.757.007.257.507.758.008.258.508.75
8.7571
8.7374
8.4759
8.4746
8.4735
8.4575
8.4537
8.0066
8.0037
7.9965
7.8601
7.8566
7.8416
7.8390
7.8214
7.8197
7.8177
7.7620
7.7603
7.7419
7.6451
7.6429
7.6249
7.6072
7.3923
6.4558
1.00
1.87
2.22
1.27
1.15
1.50
2.07
1.13
N
O
HH
H
H
H
H
H
O
O
H
H
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11 a
1
2
B
A
C
D
2
1
pp
m
(
f1
)
7.507.758.008.2
5
8.508.75
8.7571
8.7374
8.4759
8.4746
8.4735
8.4575
8.4537
8.0066
8.0037
7.9965
7.8601
7.8566
7.8416
7.8390
7.8214
7.8197
7.8177
7.7620
7.7603
7.7419
7.6451
7.6429
7.6249
7.6072
7.3923
1.00
2.22
1.27
1.15
1.50
2.07
1.13
N
O
HH
H
H
H
H
H
O
O
H
H
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11 a
1
2
B
A
C
D
2
1
100
O sinal em
δ
H
8,00 (1H, d, J = 5,2 Hz) e em
δ
H
8,73 (1H, d, J = 5,2 Hz) foram
atribuídos aos hidrogênios H4 e H5,
α
e
β
respectivamente do anel B piridínico (Figura 28).
Os sinais em
δ
H
8,46 (1H, dd, J = 7,8; 1,4 Hz); em
δ
H
7,62 (1H, ddd, J = 7,8; 7,4 Hz);
em
δ
H
7,84 (1H, ddd, J = 8,4; 7,4 Hz) e 8,75 (1H, d, J = 8,4 Hz) corresponderam,
respectivamente, aos hidrogênios H8, H9, H10 e H11 do anel benzênico (D) dissubstituído
(Figura 28).
Adicionalmente, o simpleto em
δ
H
6,45 (2H) sugeriu a presença de um grupo
metilenodioxi, além do sinal em
δ
H
7,39 (1H, s) característico do anel A, pentassubstituído do
núcleo aporfínico (Figura 28).
101
\
Figura 28: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,60 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
8
.
pp
m
(
f1
)
8.4508.5008.5508.6008.6508.7008.750
8.7571
8.7374
8.4759
8.4746
8.4735
8.4575
8.4537
2.22
1.27
pp
m
(
f1
)
7.607.707.807.908.00
8.0066
8.0037
7.9965
7.8601
7.8566
7.8416
7.8390
7.8214
7.8197
7.8177
7.7620
7.7603
7.7419
7.6451
7.6429
7.6249
7.6197
7.6072
7.6048
1.15
1.50
2.07
1.13
A
B
C
D
N
O
HH
H
H
H
H
H
O
O
H
H
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
δ
= 6,45 (s)
δ
= 7,39 (s)
δ
= 8,00 (d)
J = 5,2 Hz
δ
= 8,73 (d)
J = 5,2 Hz
δ
= 8,46 (dd)
J = 7,8; 1,4 Hz
δ
= 7,62 (ddd)
J = 7,8; 7,4; 1,1 Hz
δ
= 7,84 (ddd)
J = 8,4; 7,4; 1,1 Hz
δ
= 8,75 (d)
J = 8,4 Hz
H11
H8
H4
H10
H9
8,75
8,46
8,00
7,84
7,62
102
A análise comparativa dos dados de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
8
com
os sinais registrados por Torres et al. (2007) a 400 e 200 MHz e CDCl
3
, confirmaram a
presença do alcalóide liriodenina na fração RMG
8
(Tabela 27).
Posição do hidrogênio
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade)
Torres et al. (2007)
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
RMG
8
Metilenodioxi
6,36 (2H, s)
6,45 (2H, s)
3 7,17 (1H, s)
7,39 (1H, s)
4 7,76 (1H, d)
8,00 (1H, d, 5,2)
5 8,88 (1H, d)
8,73 (1H, d, 5,2)
8 8,58 (1H, dd)
8,46(1H, dd, 7,8; 1,4)
9 7,57 (1H, ddd)
7,62 (1H, ddd, 7,8; 7,4; 1,1)
10 7,73 (1H, ddd)
7,84 (1H, ddd, 8,4; 7,4; 1,1)
11 8,63 (1H, d)
8,75 (1H, d, 8,4)
Tabela 27: Comparação dos deslocamentos químicos (
δ
H
), multiplicidades e constantes de acoplamento (J) dos
sinais dos hidrogênios de RMG
8
com aqueles do alcalóide liriodenina.
A análise do mapa de contornos COSY, evidenciou a existência de um sinal do H10
em
δ
H
7,84 (ddd, J = 8,4; 7,4 Hz) acoplando com H11 em
δ
H
8,75 (d, J = 8,4 Hz) e o H9 em
δ
H
7,62 (ddd, J = 7,8; 7,4 Hz) acoplando com o H8 em
δ
H
8,46 (dd, J = 7,8; 1,4 Hz) e com o
H10 em
δ
H
7,84 (ddd, J = 8,4; 7,4 Hz) (Figura 29), confirmando a presença do alcalóide
liriodenina na fração RMG
8
.
103
Figura 29: Mapa de contornos COSY (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
8
. Expansão da região entre
δ
H
8,80 e 7,60.
4. 1. 2. 2 – Fração RMG
9
A fração RMG
9
, sólido amarelo em forma de agulha, apresentou várias manchas
quando aplicada em cromatofolhas de sílica C18 e revelada com reagente de Dragendorff para
alcalóides.
A análise do espectro de RMN
1
H da fração RMG
9
, além de evidenciar vários sinais
que não puderam ser atribuídos a uma substância específica, revelou a presença de sinais
referentes aos alcalóides liriodenina, oxoputerina e lisicamina.
δ
= 7,39 (s)
δ
= 8,00 (d)
J = 5,2 Hz
δ
= 8,46 (dd)
J = 7,8; 1,4 Hz
δ
= 7,84 (ddd)
J = 8,4; 7,4; 1,1 Hz
δ
= 8,75 (d)
J = 8,4 Hz
2
1
pp
m
(
f2
)
8.008.50
7.50
8.00
8.50
ppm
(
f1
)
H
9
/ H
8
H
9
/ H
10
H
10
/ H
11
A
B
C
D
N
O
HH
H
H
H
H
H
O
O
H
H
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
δ
= 6,45 (s)
δ
= 7,39 (s)
δ
= 8,00 (d)
J = 5,2 Hz
δ
= 8,73 (d)
J = 5,2 Hz
δ
= 8,46 (dd)
J = 7,8; 1,4 Hz
δ
= 7,62 (ddd)
J = 7,8; 7,4; 1,1 Hz
δ
= 7,84 (ddd)
J = 8,4; 7,4; 1,1 Hz
δ
= 8,75 (d)
J = 8,4 Hz
104
Visto que os sinais característicos do alcalóide liriodenina haviam sido discutidos no
item anterior, esta secção se ocupou em discutir apenas os sinais atribuídos aos dois últimos
alcalóides: oxoputerina e lisicamina.
4. 1. 2. 2. 1 – Identificação do alcalóide oxoputerina
A fração RMG
9
evidenciou oito sinais entre
δ
H
8,68 a 4,06 com integração para onze
hidrogênios. A presença de um grupo metilenodioxi, verificada através do sinal
δ
H
6,34 com
integração para dois hidrogênios, e de um hidrogênio aromático em
δ
H
7,34 (1H, s),
evidenciou a existência de um anel pentassubstituído, semelhante ao apresentado pela
liriodenina. Os sinais em
δ
H
7,96 e
δ
H
8,68, com integração para dois hidrogênios, indicaram a
presença de hidrogênios
α
e
β
do anel piridínico (anel B) em H4 e H5, respectivamente. Os
sinais correspondentes aos três hidrogênios aromáticos em
δ
H
7,50 (1H, dd, J = 8,3 e 1,2 Hz),
δ
H
7,62 (1H, dd, J = 8,3 e 7,5 Hz) e
δ
H
8,03 (1H, dd, J = 7,9 e 1,2 Hz) e ao sinal em
δ
H
4,06,
atribuído ao grupo metoxila com integração para três hidrogênios, indicaram a presença do
benzeno trissubstituído. Estes dados sugeriram a presença de um derivado da liriodenina
substituído com um grupo metoxila em C11 (Figuras 30, 31, 32 e 33).
Figura 30: Estrutura do alcalóide liriodenina.
2
1
83
N
O
HH
H
H
H
H
H
O
O
H
H
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
B
A
C
D
105
Figura 31: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,80 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
.
pp
m
(
f1
)
8.4508.5008.5508.6008.6508.7008.750
8.7758
8.7632
8.7613
8.7555
8.7509
8.7495
8.7434
8.7375
8.7367
8.7304
8.7294
8.7259
8.6887
8.6745
8.5437
8.4938
8.4890
8.4711
8.4687
8.4516
8.4486
pp
m
(
f1
)
7.8007.8507.9007.9508.0008.050
8.0703
8.0691
8.0568
8.0457
8.0426
8.0263
8.0232
8.0177
7.9990
7.9859
7.9639
7.9503
7.8552
7.8516
7.8494
7.8371
7.8349
7.8336
7.8316
7.8168
7.8131
8
,
03
8
,
68
7
,
96
δ
= 8,68 (d)
δ
= 8,03 (dd)
J = 7,9; 1,2 Hz
N
O
HH
H
H
H
H
H
3
CO
O
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
1a
11a
7a
8
9
10
11
3a
3b
6a
B
A
C
D
2
1
δ
= 7,62 (dd)
J = 8,3; 7,5 Hz
δ
= 7,50 (dd)
J = 8,3; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 6,34 (s)
δ
= 7,34 (s)
δ
= 7,96
(
d
)
H5
H8
H4
2
1
106
Figura 32: Expansão entre
δ
H
7,75 e 7,40 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
.
pp
m
(
f1
)
7.407.507.607.707.807.908.008.10
8.0703
8.0691
8.0568
8.0457
8.0426
8.0263
8.0232
8.0177
7.9990
7.9859
7.9639
7.9503
7.8552
7.8516
7.8494
7.8371
7.8349
7.8336
7.8316
7.8168
7.8131
7.7621
7.7425
7.7411
7.6406
7.6383
7.6360
7.6271
7.6254
7.6208
7.6185
7.6028
7.6004
7.5963
7.5796
7.5074
7.5048
7.4868
7.4843
7.3860
7.3430
pp
m
(
f1
)
7.6007.6507.7007.750
7.7621
7.7425
7.7411
7.6406
7.6383
7.6360
7.6271
7.6254
7.6208
7.6185
7.6028
7.6004
7.5963
7.5796
7,62
δ
= 8,68 (d)
δ
= 8,03 (dd)
J = 7,9; 1,2 Hz
N
O
HH
H
H
H
H
H
3
CO
O
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
1a
11a
7a
8
9
10
11
3a
3b
6a
B
A
C
D
2
1
δ
= 7,62 (dd)
J = 8,3; 7,5 Hz
δ
= 7,50 (dd)
J = 8,3; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 6,34 (s)
δ
= 7,34 (s)
δ
= 7,96
(
d
)
7,50
H9
H10
H3
2
1
107
Figura 33: Expansão entre
δ
H
6,52 e 4,05 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
.
2
1
δ
= 8,68 (d)
δ
= 8,03 (dd)
J = 7,9; 1,2 Hz
N
O
HH
H
H
H
H
H
3
CO
O
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
1a
11a
7a
8
9
10
11
3a
3b
6a
B
A
C
D
2
1
δ
= 7,62 (dd)
J = 8,3; 7,5 Hz
δ
= 7,50 (dd)
J = 8,3; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 6,34 (s)
δ
= 7,34 (s)
δ
= 7,96
(
d
)
pp
m
(
f1
)
6.3256.3506.3756.4006.4256.4506.4756.5006.525
6.5137
6.4528
6.4107
6.3375
pp
m
(
f1
)
4.0504.0754.1004.1254.150
4.1277
4.0606
4.0578
Metilenodioxi
Metoxila
2
1
108
A análise comparativa dos dados de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
com
os sinais registrados por Rabelo (2008) a 400 MHz, confirmaram a presença do alcalóide
oxoputerina na fração RMG
9
(Tabela 28).
Posição do hidrogênio
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
Rabelo (2008)
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
RMG
9
Metilenodioxi
6,26 (2H, s)
6,34 (2H, s)
3 7,15 (1H, s)
7,34 (1H, s)
4 7,73 (1H, d)
7,96 (1H, d)
5 8,83 (1H, d)
8,68 (1H, d)
8 8,17 (1H, dd, 7,8; 1,1)
8,03(1H, dd, 7,9; 1,2)
9 7,55 (1H, ddd, 8,2; 7,8)
7,62 (1H, dd, 8,3; 7,5)
10 7,30 (1H, dd, 8,2; 1,1)
7,50 (1H, dd, 8,3; 1,2)
Metoxila 4,02 (1H, s)
4,06 (1H, s)
Tabela 28: Comparação dos deslocamentos químicos (
δ
H
), multiplicidades e constantes de acoplamento (J) dos
sinais dos hidrogênios de RMG
9
com aqueles do alcalóide oxoputerina.
A análise do mapa de contornos COSY, confirmou a presença do alcalóide
oxoputerina na fração através da correlação entre os sinais do H9 em
δ
H
7,62 (dd, J = 8,3; 7,5
Hz) acoplando com H10 em
δ
H
7,50 (dd, J = 8,3; 1,2 Hz) e com o H8 em
δ
H
8,03 (dd, J = 7,9;
1,2 Hz) (Figura 34).
109
Figura 34: Mapa de contornos COSY (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
. Expansão da região entre
δ
H
9,00 e 7,50.
Visto que os alcalóides oxoputerina e lisicamina encontravam-se misturados e impuros
na fração RMG
9
, foi necessária a realização do experimento de TOCSY-Seletivo para
confirmar a presença dos mesmos na referida fração.
Esse experimento consiste em irradiar o sinal de um hidrogênio pertencente a
determinado sistema para que ocorra a identificação, através de sinais, dos hidrogênios
pertencentes ao mesmo sistema e, portanto pertencentes a uma mesma substância.
No caso da oxoputerina, irradiando o sinal do H10 em δ
H
7,50 foi possível determinar
os três hidrogênios pertencentes ao anel D do sistema oxoaporfínico, os hidrogênios 8 (δ
H
δ
= 8,68 (d)
δ
= 8,03 (dd)
J = 7,9; 1,2 Hz
N
O
HH
H
H
H
H
H
3
CO
O
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
1a
11a
7a
8
9
10
11
3a
3b
6a
B
A
C
D
2
1
δ
= 7,62 (dd)
J = 8,3; 7,5 Hz
δ
= 7,50 (dd)
J = 8,3; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 6,34 (s)
δ
= 7,34 (s)
δ
= 7,96
(
d
)
pp
m
(
f2
)
7.508.008.509.00
7.00
7.50
8.00
8.50
9.00
ppm (f1
)
H
8
/ H
9
H
9
/ H
10
2
1
110
8,03), 9 (δ
H
7,62) e 10 (δ
H
7,50), já que existe uma substituição nesse anel em C11 (um grupo
metoxila em δ
H
4,06) (Figura 35).
Figura 35: Espectro de TOCSY-Seletivo (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
. Expansão da região entre
δ
H
9,00 e
7,40.
pp
m
(
f1
)
0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0
8.041
8.035
8.033
8.025
7.636
7.616
7.595
7.525
7.521
7.518
7.511
7.508
7.503
7.499
7.497
7.496
7.494
7.488
7.486
7.482
7.479
pp
m
(
f1
)
7.407.507.607.707.807.908.00
8.041
8.035
8.033
8.025
7.636
7.616
7.595
7.525
7.521
7.518
7.511
7.508
7.503
7.499
7.497
7.496
7.494
7.488
7.486
7.482
7.479
δ
= 8,68 (d)
δ
= 8,03 (dd)
J = 7,9; 1,2 Hz
N
O
HH
H
H
H
H
H
3
CO
O
O
H
H
1
2
3
4
5
6
7
1a
11a
7a
8
9
10
11
3a
3b
6a
B
A
C
D
2
1
δ
= 7,62 (dd)
J = 8,3; 7,5 Hz
δ
= 7,50 (dd)
J = 8,3; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 6,34 (s)
δ
= 7,34 (s)
δ
= 7,96
(
d
)
H8
H9
H10
2
1
111
4. 1. 2. 2. 2 – Identificação do alcalóide lisicamina
Além dos sinais característicos do alcalóide oxoputerina, a fração RMG
9
evidenciou
mais nove sinais indicativos da presença do alcalóide lisicamina.
Esses sinais foram identificados entre
δ
H
9,25 a 4,06 com integração para treze
hidrogênios. A presença de dois grupos metoxilas, verificados através dos sinais
δ
H
4,06 e
δ
H
4,13, com integração para seis hidrogênios, e do sinal de um hidrogênio aromático em
δ
H
7,
58 (1H, s), evidenciou a existência de um anel pentassubstituído. Os sinais em
δ
H
8,06 e
δ
H
8,77, com integração para dois hidrogênios, indicaram a presença de hidrogênios
α
e
β
do
anel piridínico (anel B) em H4 e H5, respectivamente. Os sinais correspondentes aos quatro
hidrogênios aromáticos em
δ
H
7,63 (1H, ddd, J = 7,7; 7,5 e 1,2 Hz),
δ
H
7,83 (1H, ddd, J = 8,5;
7,5 e 1,8 Hz),
δ
H
8,49 (1H, dd, J = 7,7 e 1,8 Hz) e
δ
H
9,25 (1H, dd, J = 8,5 e 1,2 Hz),
indicaram a presença do benzeno trissubstituído. Estes dados sugeriram a presença do
alcalóide lisicamina na mistura RMG
9
(Figuras 36, 37, 38 e 39).
Figura 36: Estrutura do alcalóide lisicamina.
84
δ
= 7,83 (ddd)
J
= 8,5; 1,8 Hz
δ
= 9,25 (dd)
J
= 8,5; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 4,13 (s)
δ
= 8
,
77
(
d
)
δ
= 8,06 (d)
δ
= 8,49 (dd)
J
= 7,7; 1,8 Hz
δ
= 7,58 (s)
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
N
O
HH
H
H
H
H
H
H
3
CO
H
3
CO
δ
= 7,63 (ddd)
J
= 7,7; 1,2 Hz
A
B
C
D
112
Figura 37: Expansão entre
δ
H
9,20 e 8,50 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
.
9,25
pp
m
(
f1
)
8.508.6 08.708.808.909.009.109.20
9.2670
9.2642
9.2468
9.2457
9.2445
9.2428
8.7758
8.7632
8.7613
8.7555
8.7509
8.7495
8.7434
8.7375
8.7367
8.7304
8.7294
8.7259
8.6887
8.6745
8.5437
8.4938
8.4890
8.4711
8.4687
8.4516
8.4486
δ
= 7,83 (ddd)
J
= 8,5; 1,8 Hz
δ
= 9,25 (dd)
J
= 8,5; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 4,13 (s)
δ
= 8
,
77
(
d
)
δ
= 8,06 (d)
δ
= 8,49 (dd)
J
= 7,7; 1,8 Hz
δ
= 7,58 (s)
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
N
O
HH
H
H
H
H
H
H
3
CO
H
3
CO
δ
= 7,63 (ddd)
J
= 7,7; 1,2 Hz
A
B
C
H11
D
113
Figura 38: Expansão entre
δ
H
8,75 e 7,80 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
.
A
B
C
D
pp
m
(
f1
)
8.4508.5008.5508.6008.6508.7008.750
8.7758
8.7632
8.7613
8.7555
8.7509
8.7495
8.7434
8.7375
8.7367
8.7304
8.7294
8.7259
8.6887
8.6745
8.5437
8.4938
8.4890
8.4711
8.4687
8.4516
8.4486
8,49
8
,
77
pp
m
(
f1
)
7.8007.8507.9007.9508.0008.050
8.0703
8.0691
8.0568
8.0457
8.0426
8.0263
8.0232
8.0177
7.9990
7.9859
7.9639
7.9503
7.8552
7.8516
7.8494
7.8371
7.8349
7.8336
7.8316
7.8168
7.8131
8
,
06
7,83
δ
= 7,83 (ddd)
J
= 8,5; 1,8 Hz
δ
= 9,25 (dd)
J
= 8,5; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 4,13 (s)
δ
= 8
,
77
(
d
)
δ
= 8,06 (d)
δ
= 8,49 (dd)
J
= 7,7; 1,8 Hz
δ
= 7,58 (s)
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
N
O
HH
H
H
H
H
H
H
3
CO
H
3
CO
δ
= 7,63 (ddd)
J
= 7,7; 1,2 Hz
A
B
C
D
H5
H8
H4
H10
114
Figura 39: Expansão entre
δ
H
7,75 e 4,05 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
.
A
B
C
D
pp
m
(
f1
)
7.6007.6507.7007.750
7.7621
7.7425
7.7411
7.6406
7.6383
7.6360
7.6271
7.6254
7.6208
7.6185
7.6028
7.6004
7.5963
7.5796
7,63
pp
m
(
f1
)
4.0504.0754.1004.1254.150
4.1277
4.0606
4.0578
δ
= 7,83 (ddd)
J
= 8,5; 1,8 Hz
δ
= 9,25 (dd)
J
= 8,5; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 4,13 (s)
δ
= 8
,
77
(
d
)
δ
= 8,06 (d)
δ
= 8,49 (dd)
J
= 7,7; 1,8 Hz
δ
= 7,58 (s)
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
N
O
HH
H
H
H
H
H
H
3
CO
H
3
CO
δ
= 7,63 (ddd)
J
= 7,7; 1,2 Hz
A
B
C
D
H9
H3
Metoxila Metoxila
115
A análise comparativa dos dados de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
com
os sinais registrados por Chang et al. (2000) em CDCl
3
, confirmaram a presença do alcalóide
lisicamina na fração RMG
9
(Tabela 29).
Posição do hidrogênio
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
Chang et al. (2000)
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
RMG
9
Metoxila
4,03 (3H, s)
4,06 (3H, s)
Metoxila
4,11 (3H, s)
4,13 (3H, s)
3 7,24 (1H, s)
7,58 (1H, s)
4 7,82 (1H, d)
8,06 (1H, d)
5 8,93 (1H, d)
8,77 (1H, d)
8 8,59 (1H, dd, 8,0; 1,4)
8,49 (1H, dd, 7,7; 1,8)
9 7,58 (1H, ddd, 8,0; 1,1) 7,63 (1H, ddd, 7,7; 1,2)
10 7,78 (1H, ddd, 8,0; 1,4)
7,83 (1H, ddd, 8,5; 1,8)
11 9,19 (1H, dd, 8,0; 1,1)
9,25 (1H, dd, 8,5; 1,2)
Tabela 29: Comparação dos deslocamentos químicos (
δ
H
), multiplicidades e constantes de acoplamento (J) dos
sinais dos hidrogênios de RMG
9
com aqueles do alcalóide lisicamina.
A análise do mapa de contornos COSY, evidenciou a existência do sinal do H11 em
δ
H
9,25 (dd, J = 8,5; 1,2 Hz) acoplando com H10 em
δ
H
7,83 (ddd, J = 8,5; 1,8 Hz) e de um
sinal do H9 em
δ
H
7,63 (ddd, J = 7,7; 1,2 Hz) acoplando com o H10 em
δ
H
7,83 (ddd, J = 8,5;
1,8 Hz) e com o H8 em
δ
H
8,49 (dd, J = 7,7; 1,8 Hz) (Figura 40), confirmando a presença do
alcalóide lisicamina.
116
Figura 40: Mapa de contornos COSY (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
. Expansão da região entre
δ
H
9,30 e 7,50.
Com a análise do espectro de TOCSY-Seletivo (400 MHz, CD
3
OD), através da
marcação do sinal do H11 em δ
H
9,25, foi possível determinar os quatro hidrogênios
pertencentes ao anel D do sistema oxoaporfínico: H8 (δ
H
8,49), H9 (δ
H
7,63), H10 (δ
H
7,83) e
H11 (δ
H
9,25) (Figura 41).
A
B
C
D
pp
m
(
f2
)
7.508.008.509.00
7.00
7.50
8.00
8.50
9.00
ppm (f1
)
H
11
/ H
10
H
8
/ H
9
H
10
/ H
9
δ
= 7,83 (ddd)
J
= 8,5; 1,8 Hz
δ
= 9,25 (dd)
J
= 8,5; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 4,13 (s)
δ
= 8
,
77
(
d
)
δ
= 8,06 (d)
δ
= 8,49 (dd)
J
= 7,7; 1,8 Hz
δ
= 7,58 (s)
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
N
O
HH
H
H
H
H
H
H
3
CO
H
3
CO
δ
= 7,63 (ddd)
J
= 7,7; 1,2 Hz
A
B
C
D
117
Figura 41: Espectro de TOCSY-Seletivo (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
9
. Expansão da região entre
δ
H
9,00 e
7,50.
A
B
C
D
pp
m
(
f1
)
0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0
9
.
250
9.242
9.170
8.489
8.484
8.481
8.479
8.472
7.868
7.863
7.849
7.847
7.845
7.842
7.828
7.823
7.818
7.648
7.645
7.631
7.610
7.607
pp
m
(
f1
)
7.508.008.509.009.50
9.265
9.250
9.242
9.170
8.489
8.484
8.481
8.479
8.472
7.868
7.863
7.849
7.847
7.845
7.842
7.828
7.823
7.818
7.648
7.645
7.631
7.610
7.607
δ
= 7,83 (ddd)
J
= 8,5; 1,8 Hz
δ
= 9,25 (dd)
J
= 8,5; 1,2 Hz
δ
= 4,06 (s)
δ
= 4,13 (s)
δ
= 8
,
77
(
d
)
δ
= 8,06 (d)
δ
= 8,49 (dd)
J
= 7,7; 1,8 Hz
δ
= 7,58 (s)
2
1
3
4
5
6
3a
3b
6a
7
7a
8
9
10
11
1a
11a
N
O
HH
H
H
H
H
H
H
3
CO
H
3
CO
δ
= 7,63 (ddd)
J
= 7,7; 1,2 Hz
A
B
C
D
H11
H8
H9
H10
H11
H8
H10
H9
118
4. 1. 2. 3 – Fração RMG
13
A fração RMG
13
, sólido amarelo amorfo solúvel em metanol, apresentou resultado
positivo frente ao reagente de Dragendorff.
O espectro de RMN de
1
H apresentou sinais múltiplos na região entre
δ
H
8,32 e 2,66
típicos de hidrogênios aromáticos, não aromáticos e de um grupo metoxila (Figura 42). Os
sinais correspondentes aos quatro hidrogênios aromáticos em
δ
H
7,21 (1H, m),
δ
H
7,26 (2H,
m) e
δ
H
8,32 (1H, d), indicaram a presença de um anel benzênico trissubstituído (Figura 43).
A presença do sinal de um hidrogênio aromático em
δ
H
6,63 (1H, s) (Figura 43) e de
um grupo metoxila, verificado através do sinal
δ
H
3,55, com integração para três hidrogênios,
evidenciou a existência de um anel pentassubstituído (Figura 44). O sinal
δ
H
3,71 (1H, dd),
δ
H
3,30 (1H, m) e os sinais em
δ
H
2,66 e
δ
H
2,97, com integração para cinco hidrogênios,
sugeriram a presença dos anéis B e C na estrutura do alcalóide isolado (Figura 44).
Figura 42: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f1
)
0.05.010.0
8.3294
8.3094
7.2952
7.2931
7.2909
7.2887
7.2754
7.2731
7.2712
7.2524
7.2260
7.2225
7.2078
7.2025
7.1895
7.1862
6.6269
4.8810
3.7379
3.7269
3.7033
3.6921
3.5525
3.3136
3.3095
3.3054
3.3013
3.2972
2.9611
2.9566
2.9495
2.9405
2.9340
2.8631
2.8518
2.8288
2.8175
2.7178
2.6831
2.6482
2.1516
3.00
1.13
1.22
2.43
1.34
2.37
1.68
3.62
1.89
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
2
1
119
Figura 43: Expansão entre
δ
H
8,33 e 6,67 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f1
)
6.676.837.007.177.337.507.677.838.008.178.33
8.3294
8.3094
7.2952
7.2931
7.2909
7.2887
7.2754
7.2731
7.2712
7.2524
7.2260
7.2225
7.2078
7.2025
7.1895
7.1862
6.6269
1.13
1.29
2.43
1.34
pp
m
(
f1
)
6.676.837.007.177.337.507.677.838.008.178.33
8.3294
8.3094
7.2952
7.2931
7.2909
7.2887
7.2754
7.2731
7.2712
7.2524
7.2260
7.2225
7.2078
7.2025
7.1895
7.1862
6.6269
1.13
1.29
2.43
1.34
δ
= 3,55 (s)
δ
= 8,32 (d)
J = 7,9 Hz
δ
= 2
,
94
(
m
)
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
δ
= 2,97
(
m
)
δ
= 2,66 (m)
δ
= 3,30 (m)
δ
= 2
,
84
(
m
)
δ
= 2
,
68
(
m
)
δ
= 7,26 (m)
δ
= 7
,
21
(
m
)
δ
= 7
,
26
(
m
)
B
A
C
D
δ
= 6,63 (s)
δ
= 3,71 (dd)
J = 13,8; 4,4 Hz
H11
H8, H9 e H10
H3
pp
m
(
f1
)
7.2007.2507.300
7.2952
7.2931
7.2909
7.2887
7.2754
7.2731
7.2712
7.2524
7.2260
7.2225
7.2078
7.2025
7.1895
7.1862
2.43
1.34
pp
m
(
f1
)
8.3008.3108.3208.3308.340
8.3294
8.3094
1.13
8,32
120
Figura 44: Expansão entre
δ
H
3,75 e 2,70 do espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f1
)
3.5503.6003.6503.7003.750
3.7379
3.7269
3.7033
3.6921
3.5525
3.00
1.89
pp
m
(
f1
)
2.702.802.903.003.103.203.30
3.3289
3.3248
3.3205
3.3136
3.3095
3.3054
3.3013
3.2972
2.9872
2.9746
2.9611
2.9566
2.9495
2.9405
2.9340
2.8631
2.8518
2.8288
2.8175
2.7178
2.6831
2.6482
2.37
1.68
3.62
B
A
C
D
δ
= 3,55 (s)
δ
= 6,63 (s)
δ
= 8,32 (d)
J = 7,9 Hz
δ
= 3,71 (dd)
J = 13,8; 4,4 Hz
δ
= 2
,
94
(
m
)
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
δ
= 2,97
(
m
)
δ
= 2,66 (m)
δ
= 3,30 (m)
δ
= 2
,
84
(
m
)
δ
= 2
,
68
(
m
)
δ
= 7,26 (m)
δ
= 7
,
21
(
m
)
δ
= 7
,
26
(
m
)
Metoxila
H5ax
H4, H5eq e H7
pp
m
(
f1
)
3.7003.750
3.7379
3.7269
3.7033
3.6921
1.89
3,71
H6a
121
A análise comparativa dos dados de RMN de
1
H (400 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
com
os sinais registrados por Fischer et al. (1999) a 300 MHz e CDCl
3
, confirmaram a presença do
alcalóide asimilobina na fração RMG
13
(Tabela 30).
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
Fischer et al. (1999)
RMN de
1
H (
δ
H
)
(multiplicidade, J em Hz)
RMG
13
δ
H
2,46 – 2,78 (5H, m)
δ
H
2,66 – 2,97 (5H, m)
δ
H
3,19 – 3,21 (1H, m)
δ
H
3,30 (1H, m)
δ
H
3,38 (3H, s, OMe)
δ
H
3,55 (3H, s, OMe)
δ
H
3,62 – 3,68 (1H, dd, 13,2; 4,8)
δ
H
3,71 (1H, dd, 13,8; 4,4)
δ
H
6,50 (1H, s)
δ
H
6,63 (1H, s)
δ
H
7,01 – 7,12 (3H, m)
δ
H
7,21 – 7,26 (3H, m)
δ
H
8,06 – 8,08 (1H, d, 6,0)
δ
H
8,32 (1H, d, 7,9)
Tabela 30: Comparação dos deslocamentos químicos (
δ
H
), multiplicidades e constantes de acoplamento (J) dos
sinais dos hidrogênios de RMG
13
com aqueles do alcalóide asimilobina.
A análise conjunta do espectro de RMN de
13
C (Figura 45) e respectivas seções
expandidas (Figura 46) da fração RMG
13
evidenciaram a presença de um grupo de carbono de
maior intensidade. Neste grupo, foi possível identificar a presença de seis carbonos não
hidrogenados, com sinais em
δ
C
145,3 (C1);
δ
C
150,9 (C2);
δ
C
137,2 (C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
127,3 (C11b) e
δ
C
128,1 (C11c); de seis carbonos metínicos, com sinais em
δ
C
116,7 (C3);
δ
C
54,8 (C6a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9);
δ
C
128,1 (C10) e
δ
C
129,0 (C11); de três carbonos
metilênicos, com sinais em
δ
C
29,1 (C4);
δ
C
43,9 (C5) e
δ
C
37,8 (C7) e um sinal em
δ
C
60,5
indicativo da presença de um grupo metoxila.
122
Figura 45: Espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
pp
m
(
f1
)
050100150200
150.88
145.28
137.17
133.55
131.47
130.40
128.96
128.91
128.56
128.11
127.35
125.44
116.66
116.61
115.98
112.81
110.10
60.46
54.80
49.68
49.47
49.26
49.04
48.83
48.62
48.40
43.88
37.82
30.71
29.07
1
2
123
Figura 46: Expansão entre
δ
C
150 e 30 do espectro de RMN de
13
C (100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f1
)
110120130140150
150.88
145.28
137.17
133.55
131.47
130.40
128.96
128.91
128.56
128.11
127.35
125.44
116.66
116.61
115.98
112.81
110.10
pp
m
(
f1
)
30.035.040.045.050.055.060.0
60.46
54.80
49.68
49.47
49.26
49.04
48.83
48.62
48.40
43.88
37.82
30.71
29.07
C8
C9
C11c e C10
C11b
C11
C3
OCH
3
C6a
C5
C7
C4
C2
C1
C7a
C11a
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
δ
= 128,6
δ
= 145,3
δ
= 43,9
δ
= 29,1
δ
= 129,0
δ
= 116,7
δ
= 150,9
δ
= 60,5
δ
= 128
,
1
δ
= 54
,
8
δ
= 137,2
δ
= 128
,
9
δ
= 37
,
8
B
A
C
D
124
A análise comparativa dos dados de RMN de
13
C (100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
com
os sinais registrados por Fischer et al. (1999) a 75,5 MHz e CDCl
3
, confirmaram a presença
do alcalóide asimilobina na fração RMG
13
(Tabela 31).
Posição e tipo de carbono Fischer et al. (1999)
(
δ
C
)
RMG
13
(
δ
C
)
1 (C) 142,5
145,3
2 (C) 148,0
150,9
3 (CH) 114,2
116,7
4 (CH
2
) 28,3
29,1
5 (CH
2
) 42,7
43,9
6a (CH) 53,1
54,8
7 (CH
2
) 36,8
37,8
7a (C) 135,6
137,2
8 (CH) 127,6
128,9
9 (CH) 127,2
128,6
10 (CH) 126,9
128,1
11 (CH) 126,8
129,0
11a (C) 131,5
133,5
11b (C) 125,0
127,3
11c (C) 127,8
128,1
OCH
3
60,0
60,5
Tabela 31: Dados comparativos dos deslocamentos químicos (
δ
C
) dos espectros de RMN
13
C da fração RMG
13
com os do alcalóide asimilobina.
A análise do mapa de contornos HSQC (Figura 47) e seções expandidas (Figuras 48 e
49), possibilitou associar os sinais dos carbonos metínicos com aqueles dos hidrogênios
correspondentes em
δ
C
129,0 (C11)/
δ
H
8,32 (H11, d);
δ
C
128,9 (C8)/
δ
H
7,26 (H8, m);
δ
C
128,6
(C9)/
δ
H
7,21 (H9, m);
δ
C
128,1 (C10)/
δ
H
7,26 (H10, m);
δ
C
116,7 (C3)/
δ
H
6,63 (H3, s) e
δ
C
54,8 (C6a)/
δ
H
3,71 (H6a, dd); os sinais dos carbonos metilênicos com os hidrogênios
125
diastereotópicos em
δ
C
43,9 (C5)/
δ
Hax
3,30 (H5, m) e
δ
Heq
2,94 (H5, m);
δ
C
37,8 (C7)/
δ
Hax
2,84
(H7, m) e
δ
Heq
2,68 (H7, m) e
δ
C
29,1 (C4)/
δ
Hax
2,97 (H4, m) e
δ
Heq
2,66 (H4, m) e o sinal do
grupo OCH
3
em
δ
C
60,5/
δ
H
3,55 (s).
Figura 47: Mapa de contornos HSQC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f2
)
0.01.02.03.04.05.06.07.08.0
0
50
100
150
200
ppm (f1
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
1
2
126
Figura 48: Expansão entre
δ
H
8,40 e 7,10 do mapa de contornos HSQC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f2
)
8.2508.3008.3508.400
127.0
128.0
129.0
130.0
131.0
ppm (f1
pp
m
(
f2
)
7.1007.1507.2007.2507.3007.3507.4007.450
126.0
127.0
128.0
129.0
130.0
131.0
132.0
133.0
ppm (f1
δ
C
129,0 (C11)/
δ
H
8,32 (H11, d)
δ
C
128,9 (C8)/
δ
H
7,26 (H8, m)
δ
C
128,6 (C9)/
δ
H
7,21 (H9, m)
δ
C
128,1 (C10)/
δ
H
7,26 (H10, m)
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
2
1
127
Figura 49: Expansão entre
δ
H
6,65 e 2,50 do mapa de contornos HSQC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f2
)
6.6006.650
115.0
116.0
117.0
118.0
119.0
ppm (f1
pp
m
(
f2
)
2.503.003.50
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
ppm (f1
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
δ
C
116,7 (C3)/
δ
H
6,63 (H3, s)
Grupo OCH
3
em
δ
C
60,5/
δ
H
3,55 (s)
δ
C
54,8 (C6a)/
δ
H
3,71 (H6a, dd)
δ
C
43,9 (C5)/
δ
Hax
3,30 (H5, m) e
δ
Heq
2,94 (H5, m)
δ
C
37,8 (C7)/
δ
Hax
2,84 (H7, m) e
δ
Heq
2,68 (H7, m)
δ
C
29,1 (C4)/
δ
Hax
2,97 (H4, m) e
δ
Heq
2,66 (H4, m)
2
1
128
Através da análise do mapa de contornos HMBC (Figura 50) e seções expandidas
(Figuras 51, 52, 53 e 54), foi possível verificar a existência das seguintes correlações:
O sinal de hidrogênio em
δ
H
8,32 (H11, d) com os sinais de carbono em
δ
C
137,2
(C7a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9);
δ
C
128,1 (C10) e
δ
C
127,3 (C11b) (Figura 51);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
7,26 (H8 e H10, m) com os sinais de carbono em
δ
C
137,2
(C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
129,0 (C11);
δ
C
128,6 (C9) e
δ
C
128,1 (C10) (Figura 51);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
7,21 (H9, m) com os sinais de carbono em
δ
C
137,2
(C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
129,0 (C11) e
δ
C
128,1 (C10) (Figura 51);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
6,63 (H3, s) com os sinais de carbono em
δ
C
150,9 (C2) e
δ
C
145,3 (C1) (Figura 52);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
6,63 (H3, s) com o sinal de carbono em
δ
C
128,1 (C11c)
(Figura 52);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
6,63 (H3, s) com o sinal de carbono em
δ
C
29,1 (C4)
(Figura 53);
O sinal de hidrogênio do grupo OCH
3
em
δ
H
3,55 (s) com o sinal de carbono em
δ
C
145,3 (C1) (Figura 53);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
2,84 (H7ax, m) com os sinais de carbono em
δ
C
137,2
(C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9) e
δ
C
128,1 (C11c) (Figura 54);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
2,68 (H7eq, m) com os sinais de carbono em
δ
C
137,2
(C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9) e
δ
C
128,1 (C11c) (Figura 54);
O sinal de hidrogênio em
δ
H
2,66 (H4eq, m) com o sinal de carbono em
δ
C
130,4 (C3a)
(Figura 54).
129
Figura 50: Mapa de contornos HMBC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz, CD
3
OD) de RMG
13
.
pp
m
(
f2
)
0.01.02.03.04.05.06.07.08.0
0
50
100
150
200
ppm (f1
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
2
1
130
Figura 51: Expansão entre
δ
H
8,36 e 7,20 do mapa de contornos HMBC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
.
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
pp
m
(
f2
)
8.2808.2908.3008.3108.3208.3308.3408.3508.360
130.0
135.0
ppm
(
f1
pp
m
(
f2
)
7.2007.2507.300
130.0
135.0
ppm (f1
δ
H
8,32 (H11, d)/
δ
C
137,2 (C7a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9);
δ
C
128,1 (C10) e
δ
C
127,3 (C11b)
δ
H
7,26 (H8 e H10, m)/
δ
C
137,2 (C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
129,0 (C11);
δ
C
128,6 (C9)
e
δ
C
128,1 (C10)
δ
H
7,21 (H9, m)/
δ
C
137,2 (C7a);
δ
C
133,5
(C11a);
δ
C
129,0 (C11) e
δ
C
128,1 (C10)
2
1
131
Figura 52: Expansão entre
δ
H
6,65 e 6,60 do mapa de contornos HMBC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
.
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
pp
m
(
f2
)
6.6006.6106.6206.6306.6406.650
145.0
146.0
147.0
148.0
149.0
150.0
151.0
ppm (f1
)
pp
m
(
f2
)
6.60506.61006.61506.62006.62506.63006.63506.6400
127.0
0
127.5
0
128.0
0
128.5
0
129.0
0
ppm (f1
)
δ
H
6,63 (H3, s)/
δ
C
150,9 (C2) e
δ
C
145,3 (C1)
δ
H
6,63 (H3, s)/
δ
C
128,1 (C11c)
2
1
132
Figura 53: Expansão entre
δ
H
6,65 e 3,52 do mapa de contornos HMBC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
.
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
pp
m
(
f2
)
6.6006.6106.6206.6306.6406.650
28.00
28.50
29.00
29.50
30.00
ppm (f1
)
pp
m
(
f2
)
3.5203.5303.5403.5503.5603.5703.580
143.5
0
144.0
0
144.5
0
145.0
0
145.5
0
146.0
0
146.5
0
147.0
0
ppm (f1
δ
H
6,63 (H3, s)/
δ
C
29,1 (C4)
Grupo OCH
3
em
δ
H
3,55 (s)/
δ
C
145,3 (C1)
2
1
133
Figura 54: Expansão entre
δ
H
2,85 e 2,65 do mapa de contornos HMBC (
1
H a 400 MHz,
13
C a 100 MHz,
CD
3
OD) de RMG
13
.
4. 2 – TESTES
4. 2. 1 – Toxicidade frente à Artemia salina Leach (TAS)
Os extratos brutos e frações obtidas dos galhos finos da espécie Duguetia riparia
foram testados, primeiramente, na concentração de 500 µg/mL, e se verificou que todas as
N
H
H
H
H
HH
H
H
3
CO
HO
H
H
H
H
H
H
2
1
3
4
6
3a
3b
7
7a
10
11
1a
11a
5
6a
8
9
A
B
C
D
pp
m
(
f2
)
2.6502.7002.7502.8002.850
130.0
135.0
ppm (f1
)
δ
H
2,84 (H7ax, m)/
δ
C
137,2 (C7a);
δ
C
133,5
(C11a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9) e
δ
C
128,1
(C11c)
δ
H
2,68 (H7eq, m)/
δ
C
137,2 (C7a);
δ
C
133,5 (C11a);
δ
C
128,9 (C8);
δ
C
128,6 (C9) e
δ
C
128,1 (C11c)
δ
H
2,66 (H4eq, m)/
δ
C
130,4 (C3a)
2
1
134
amostras apresentaram inibição maior que 50%. Por essa razão, novos ensaios foram
realizados utilizando-se cinco concentrações diferentes e inferiores a 500 µg/mL.
Os resultados obtidos foram analisados através do programa estatístico probitos de
análises para a determinação da DL
50
(Tabela 32).
Extratos e frações
DL
50
(µg/mL) Intervalo de confiança 95% (µg/mL)
EH 4,90 3,03< DL
50
< 7,95
EM 277,36 214,27< DL
50
< 359,04
EMS 358,32 199,10< DL
50
< 644,86
FA 253,29 196,08< DL
50
< 327,20
FHM 336,14 285,30< DL
50
< 396,04
Tabela 32: Resultado da toxicidade frente à Artemia salina dos extratos e frações de Duguetia riparia.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
O resultado mais promissor, entre os extratos testados foi o obtido com o extrato hexânico
(EH), que apresentou DL
50
= 4,9 µg/mL. Segundo Dolabela (1997), este resultado é indicativo
da existência de uma correlação positiva com atividade antitumoral.
Os demais extratos (EM e EMS) e as duas frações testadas (FA e FHM), apesar de
apresentarem DL
50
maiores que 200 µg/mL, são considerados, por Ferrigni et al. (1984) e
Meyer et al. (1982), substratos capazes de conterem compostos com atividade biológica, pois
os valores obtidos da DL
50
foram menores que 1000 µg/mL.
4. 2. 2 – Atividade leishmanicida
Tanto os extratos (hexânico, metanólico e metanólico solúvel) quanto às frações
(hidrometanólica e alcaloídica) obtidas dos galhos finos de Duguetia riparia foram testadas
135
frente às cepas de Leishmania amazonensis nas concentrações de 40, 80, 160 e 320 µ/mL,
utilizando-se a pentamidina como substância padrão (DL
50
= 12 µg/mL).
Analisando-se os gráficos das porcentagens de inibição de cada amostra testada frente
às formas promastigotas de Leishmania amazonensis, notou-se a existência de correlação
positiva entre essa grandeza e as concentrações analisadas (Figuras 55 e 56).
Figura 55: Curvas de inibição dos extratos brutos dos galhos finos de Duguetia riparia testados frente às formas
promastigotas de Leishmania amazonensis: extrato hexânico (85), extrato metanólico (86) e extrato metanólico
solúvel (87).
85
86
87
136
1
Figura 56: Curvas de inibição das frações dos galhos finos de Duguetia riparia testadas frente às formas
promastigotas de Leishmania amazonensis: fração alcaloídica (88) e fração hidrometanólica (89).
Atribuindo-se o valor 50 aos y das equações da reta obtidas nos gráficos de
percentagem de inibição, obtiveram-se as DL
50
de cada amostra testada (Tabela 33).
Amostra DL
50
(µg/mL)
EH 46,4
EM 75,9
EMS 55,5
FA 61,0
FHM 285,0
Tabela 33: Resultado da DL
50
das amostras testadas frente às formas promastigotas de Leishmania amazonensis.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
88
89
137
Através dos valores das DL
50
, notou-se, com exceção da fração hidrometanólica, que
apresentou DL
50
de 285 µg/mL, que as amostras testadas apresentaram resultado inibitório
significativo frente às formas promastigotas de Leishmania amazonensis, sendo o extrato
hexânico o resultado mais promissor.
Comparando-se os valores das DL
50
do extrato metanólico solúvel (55,5 µg/mL) e da
fração alcaloídica (61,0 µg/mL), com a DL
50
do extrato metanólico (75,9 µg/mL), se verificou
aumento do potencial inibitório das duas primeiras amostras com relação à última, sugerindo
que os fitoconstituintes, presentes no extrato bruto, responsáveis pela atividade leishmanicida,
permaneceram com suas estruturas intactas após os processos de partição que foram
submetidos, visto que as duas primeiras amostras foram originadas deste último.
Com relação à fração hidrometanólica, obtida da partição do extrato hexânico, se
verificou um aumento da DL
50
, indicando a possível ausência ou diminuição da concentração
dos constituintes bioativos presentes no extrato original ou sugerindo possível efeito sinérgico
entre os mesmos.
4. 2. 3 – Atividade larvicida frente ao mosquito Aedes aegypti
Geralmente, os métodos descritos na literatura para avaliar a atividade larvicida de
determinada amostra consiste em testá-la frente às larvas escolhidas em, pelo menos, cinco
concentrações diferentes para obtenção da DL
50
. Muitos autores realizam testes preliminares
fixando uma concentração máxima tolerada para a escolha das concentrações a serem trabalhadas.
Neste trabalho, como descrito anteriormente, os extratos e frações da espécie em estudo
foram preparadas, inicialmente, na concentração de 300 ppm e deixadas em contato com larvas de
3
o
instar do mosquito Aedes aegypti durante 24, 48 e 72 horas. Através desta metodologia
observou-se que as amostras analisadas apresentaram inatividade frente a larvas do mosquito
escolhido para o ensaio (Tabela 34).
138
% Média de Mortalidade das Larvas de Aedes aegypti (300 ppm)
Tempo de Exposição
EH EM EMS FA FHM
24 horas 0,0 6,67 0,0 0,0 13,3
48 horas 0,0 20,0 13,3 6,67 20,0
72 horas 13,3 13,3 0,0 6,67 13,3
Tabela 34: Percentagem média de mortalidade das larvas de Aedes aegypti frente aos extratos e frações testados.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
4. 2. 4 – Capacidade capturadora de radicais livres
4. 2. 4. 1 – Método qualitativo
A avaliação preliminar qualitativa dos extratos hexânico, metanólico e metanólico
solúvel, e das frações alcaloídica e hidrometanólica por CCD em gel de sílica, revelada com
solução metanólica a 0,4 mM do radical DPPH, sugeriu a presença de substâncias com
atividade antioxidante, evidenciadas nas cromatoplacas pela presença de manchas
esbranquiçadas sob fundo púrpuro, resultantes da redução do radical DPPH (Figura 57).
Figura 57: Cromatoplacas das amostras testadas logo após contato com DPPH, indicando a presença de
compostos antioxidantes: Extrato hexânico (90), extrato metanólico (91), extrato metanólico solúvel (92), fração
alcaloídica (93) e fração hidrometanólica (94).
90 91 92 93 94
139
4. 2. 4. 2 – Método quantitativo (espectrofotométrico)
Visto que os testes preliminares (método qualitativo) apresentaram resultados
satisfatórios, os extratos e frações em estudo foram avaliados quanto à atividade capturadora
de radicais livres e as médias dos valores percentuais de redução de DPPH para cada amostra,
nas três concentrações testadas, foram descritas na tabela 35.
Amostra
1 µg/mL 10 µg/mL 100 µg/mL
EH 38,2 41,8 79,2
EM 42,6 90,5 94,5
EMS 34,1 50,5 94,9
FA 47,6 77,3 91,2
FHM 37,4 38,4 42,6
Tabela 35: Valores relativos às médias do percentual de redução de DPPH dos extratos e frações estudados, em
três distintas concentrações.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
Analisando a percentagem de inibição, por ordem crescente de concentração, se
observou a existência de correlação positiva entre ambos, ou seja, à medida que se aumenta a
concentração das amostras testadas, também ocorre aumento da percentagem de inibição do
DPPH.
Observou-se também que na concentração de 1 µg/mL, nenhuma das amostras
apresentaram percentual de inibição maior que 50%. Na concentração de 10 µg/mL, apenas o
extrato metanólico e a fração alcaloídica apresentaram uma inibição significativa e superior a
50%. Já na concentração de 100 µg/mL, apenas a fração hidrometanólica apresentou inibição
inferior a 50%.
Em linhas gerais, pode-se afirmar que a fração alcaloídica e o extrato metanólico
foram as amostras que apresentaram melhor resultado de inibição ao DPPH, fato este que
refletiu no valor da CE
50
encontrado após tratamento estatístico utlizando-se o programa
140
probitos de análise, 1,15 µg/mL para a fração alcaloídica e 1,22 µg/mL para o extrato
metanólico (Tabela 36).
Com relação às demais amostras analisadas, observou-se que o extrato metanólico
solúvel apresentou melhor resultado de CE
50
(4,31 µg/mL) quando comparado ao extrato
hexânico (6,99 µg/mL) e à fração hidrometanólica, que por apresentar valores baixos de
inibição ao DPPH não gerou dados homogêneos para o cálculo de sua CE
50
pelo programa
estatístico empregado.
Extratos e frações testadas
CE
50
(µg/mL)
EH 6,99
EM 1,22
EMS 4,31
FA 1,15
FHM *
Tabela 36: Concentração efetiva necessárias para descolorir 50% da solução de DPPH (CE
50
).
(*) Amostra que não gerou dados homogêneos para o cálculo da CE
50
.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
4. 2. 5 – Determinação de fenólicos totais
Os resultados encontrados no ensaio de determinação de fenólicos totais pelo método
Folin-Ciocalteu, expresso como equivalentes de ácido gálico (EAG) por grama dos extratos
brutos testados e por grama das frações analisadas, foram apresentados na tabela 37. Os
cálculos para a obtenção da concentração de fenólicos totais nas amostras testadas foram
realizados através da equação da reta y = 5,007x – 0,0025 originada da curva de calibração
construída com soluções padrões de ácido gálico (0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 e 0,03125 µg/mL)
(Figura 58).
141
Extratos e frações testadas Fenólicos totais (mg EAG/g)
EH 46,63
EM 249,75
EMS 52,03
FA 79,72
FHM 11,98
Tabela 37: Concentração de fenólicos totais presentes nas amostras testadas.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
Figura 58: Curva de calibração utilizada no teste de determinação de fenólicos totais.
Pelos valores apresentados na tabela 37, podemos notar que, com exceção da fração
hidrometanólica (FHM), todas as amostras apresentaram uma concentração de fenólicos totais
significativa. Dentre essas, verificamos que o menor teor foi registrado no extrato hexânico
(46,63 mg EAG/g) e o maior teor, no extrato metanólico (249,75 mg EAG/g).
Observou-se correlação negativa entre a concentração de fenólicos totais e a CE
50
do
extrato hexânico, extrato metanólico solúvel e fração alcaloídica, sugerindo que,
provavelmente, a atividade antioxidante das referidas amostras está diretamente ligada à
presença de compostos fenólicos totais. Já o extrato metanólico não segue o mesmo
comportamento descrito nas amostras anteriores, o que leva a acreditar que a ação
95
142
seqüestradora de radicais livres desta amostra está, de certa maneira, ligada à existência de
determinado constituinte químico (Tabela 38).
Extratos e frações testadas
CE
50
(µg/mL)
Fenólicos totais (mg EAG/g)
EH 6,99 46,63
EM 1,22 249,75
EMS 4,31 52,03
FA 1,15 79,72
FHM * 11,98
Tabela 38: Conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante (CE
50
) das amostras testadas.
(*) Amostra que não gerou dados homogêneos para o cálculo da CE
50
.
Nota: EH: extrato hexânico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EM: extrato metanólico dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
EMS: extrato metanólico solúvel dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FA: fração alcaloídica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
FHM: fração hidrometanólica dos galhos finos da espécie Duguetia riparia.
143
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
Galhos
Folhas
Frutos
144
Após o término do trabalho realizado com os galhos finos da espécie Duguetia
riparia, espécie essa estudada pela primeira vez, foi possível concluir que a metodologia
empregada no estudo fitoquímico se mostrou adequada, já que resultou no isolamento e
identificação dos alcalóides liriodenina (marcador quimiotaxonômico da família
Annonaceae), oxoputerina, lisicamina e asimilobina e que os demais ensaios realizados
evidenciaram ser a espécie estudada uma matéria-prima promissora na obtenção de novos
fitoterápicos, haja vista que o extrato hexânico apresentou, pelo teste de toxicidade frente a
Artemia salina, DL
50
compatível com uma possível atividade antitumoral (DL
50
= 4,9 µg/mL);
resultado inibitório significativo frente às formas promastigotas de Leishmania amazonensis
(DL
50
= 46,4 µg/mL) e boa atividade antioxidante (CE
50
= 6,99 µg/mL).
Também foi possível observar que os extratos metanólico e metanólico solúvel, bem
como a fração alcaloídica apresentaram, além da atividade inibitória frente às formas
promastigotas de Leishmania amazonensis, resultados significativos quanto à capacidade
capturadora de radicais livres (atividade antioxidante), destacando-se entre eles a fração
alcaloídica, com CE
50
igual a 1,15 µg/mL e o extrato metanólico, com CE
50
igual a 1,22
µg/mL.
145
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Duguetia riparia
Fonte: Livia Cunha /Socorro Teodora
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Folhas
Frutos
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