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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
YOHANA DE OLIVEIRA
MICROPROPAGAÇÃO DE Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel
CURITIBA
2009
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YOHANA DE OLIVEIRA
MICROPROPAGAÇÃO DE Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, Área de Concentração
em Produção Vegetal, Departamento de Fitotecnia e
Fitossanitarismo, Setor de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Paraná, como parte das
exigências para a obtenção do título do Mestre em
Ciências.
Orientadora: Profª. Drª. Marguerite G. G. Quoirin
Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi
CURITIBA
2009
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A Deus, na pessoa do Senhor Jesus Cristo, meu Salvador, ofereço.
Aos meus pais, Uéder e Marinez, exemplos de caráter e honestidade, por toda força
e amor, dedico.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela benção da vida e por permitir que as pessoas abaixo citadas
façam parte dela.
Aos meus pais, Uéder Florindo de Oliveira e Marinez Florindo de Oliveira, por
me conduzirem sempre com motivação, força, responsabilidade e amor
incondicional.
À Universidade Federal do Paraná e ao Curso de Pós-Graduação em
Agronomia-Produção Vegetal, pela oportunidade de realizar o mestrado.
À Professora Marguerite Quoirin pela orientação, incentivo, confiança,
paciência e ensinamentos.
Ao Professor Luiz Antonio Biasi, pela co-orientação, ensinamentos e amizade.
A Profª Francine Lorena Cuquel, pelos ensinamentos, apoio e amizade.
A Empresa Herbia (Joinville-SC) e ao Professor Cícero Deschamps, pelo
fornecimento do material vegetal inicial.
A banca de pré-defesa, composta pela Profª Luciana Lopes F. Ribas, Profª
Marguerite Quoirin e Prof. Luiz A. Biasi, pelas correções e críticas construtivas.
A banca de defesa, composta pela Profª Marguerite Quoirin, Prof. Luiz A.
Biasi e Pesquisadora Regina C. Quisen, pelas dicas valiosas.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado.
À Drª Regina Caetano Quisen, grande amiga-irmã “fortona”, que despertou
em mim a paixão pela pesquisa, e formou a base do conhecimento para que este
trabalho fosse realizado.
Às minhas para sempre irmãs “fortonas”, Sandra, Justina, Giovana e
Fernanda pela amizade, companheirismo e força.
Ao meu novo e grande amigo André, pelas dicas estatísticas, amizade e
momentos de descontração. Aos estagiários: Emílio, Ivan e Pedro, pela dedicação e
auxílio na manutenção dos experimentos. As amigas de Pós-Graduação Sibele,
Mariane, Paola e Melicia pelo carinho constante e momentos alegres.
Aos meus irmãos, Uéder Júnior e Mylana, por todo amor e a todos os meus
familiares, pela torcida e energia positiva.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho,
todo o meu amor e gratidão.
Eu Sou a videira, e o Pai é o lavrador
(João 15:1)
“Jesus é a Videira verdadeira. Eu sou um ramo. Meu Pai é o agricultor. Ele é meu
Zelador, meu Protetor, meu Escudo, meu Sustentador, meu Treinador, meu
Educador. Darei muitos frutos!”
Keinneth E. Hagin
RESUMO
Melaleuca alternifolia vem sendo cultivada de forma crescente no Brasil e tem como
produto principal o óleo essencial, cujo consumo ocorre principalmente pelas
indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de limpeza. Embora o cultivo de
Melaleuca seja economicamente lucrativo, pouco se tem relatado sobre a
propagação desta espécie. Diante disto, esse trabalho teve como objetivo
estabelecer um protocolo de micropropagação para a produção de clones de M.
alternifolia, visando propagar genótipos superiores na produção de óleo essencial,
em larga escala, além de servir como base para estudos relacionados ao
melhoramento genético. Para tanto, o trabalho foi dividido em três etapas, sendo a
primeira relacionada ao estudo de alguns fatores que interferem no estabelecimento
in vitro de segmentos nodais, ou seja, a concentração (0,25; 0,50 e 1,0%) de NaOCl,
o tempo de imersão (10 e 20 min) na solução germicida, e a utilização de fungicida
tiofanato-metílico (2 g L
-1
) na maior concentração e tempo. Além disto, foi estudada a
influência da presença ou não de ágar (6 g L
-1
) e do carvão ativado (2 g L
-1
) nos
meios de cultura MS e WPM, durante o cultivo inicial. A segunda etapa foi orientada
para o estudo da influência do meio mineral (MS e WPM), da presença do ágar e de
diferentes concentrações da citocinina BAP (0; 0,55; 1,11; 2,22; 3,33; e 4,44 µM) na
proliferação de gemas adventícias. Já a terceira etapa foi voltada para o estudo da
ação de diferentes tipos de auxinas (ANA, AIA, AIB) aplicadas em duas
concentrações (0,53 e 2,64 µM), bem como a influência de diferentes concentrações
de sacarose (0, 15, 30 e 45 g L
-1
) e tipos de meio de cultura (MS, MS/2, MS com
carvão ativado, MS/2 com carvão ativado) durante o enraizamento in vitro da
espécie, além de ser realizado o estudo da sobrevivência das mudas enraizadas em
cada meio de cultura, após a aclimatização. Pôde-se concluir que o tratamento com
fungicida e 1,0% de NaOCl por 20 min favorece o estabelecimento de 80% dos
explantes, não havendo diferença entre os dois meios de cultura testados (MS e
WPM). Na etapa de estabelecimento in vitro, os explantes cultivados em meio semi-
sólido, MS ou WPM, sem BAP, apresentam o maior número médio de brotações por
explante (1,83). Os explantes respondem de forma diferente quanto à concentração
de BAP no meio WPM e MS, líquido e semi-sólido, sendo que o meio de cultura MS
líquido, com 1,11 µM de BAP, proporciona o maior número médio de brotações por
explante (11,8). Para o enraizamento de Melaleuca alternifolia, é dispensável o
suprimento de auxinas no meio de cultura, sendo a sacarose necessária, pois
influencia de forma positiva a formação de raízes. Além disso, o meio de cultura MS
permite 100% de enraizamento e de sobrevivência durante a aclimatização das
mudas.
Palavras-chave: Óleo essencial. Planta medicinal. “Tea tree”.
ABSTRACT
Melaleuca alternifolia has been cultivated in extensive areas in Brazil. Its main
product is the essential oil useful in cosmetic and pharmaceutical industries. Though
it’s economic importance, there is little knowledge about its in vitro propagation. The
aim of this study was to establish a protocol of micropropagation of M. alternifolia for
the clonal propagation of elite genotypes with superior oil yield. This study was
divided in three stages: (1) In vitro establishment of nodal segments. Disinfection was
carried out with 0.25; 0.50 and 1.0% of NaOCl and the time of exposition was 10 and
20 min. Different culture media were tested (MS and WPM) with or without agar (6 g
L
-1
) and activated charcoal (0.2%), beyond the use of fungicide Cercobin
®
(0.2%) in
the highest concentration of NaOCl. (2) For in vitro multiplication, MS and WPM
media were tested, solid and liquid, supplemented with BAP at 0, 0.55, 1.11, 2.22,
3.33 and 4.44 µM. (3) In vitro rooting was promoted by different auxins (NAA, IAA
and IBA) all at 0.53 and 2.64 µM. Several sucrose concentrations were also tested:
0, 15, 30 and 45 g L
-1
. Four culture media were used: MS, MS/2, MS+AC and
MS/2+AC. Rooted plantlets from different culture media were acclimatized and the
survival percentage was evaluated. In conclusion, the best result of disinfestation
was obtained with fungicide and 1.0% of NaOCl for 20 min, which promoted the
establishment of 80% of the explants. During establishment in vitro, there was no
statistical difference between the results with the use of MS and WPM BAP-free
media; nevertheless the semi-solid media promoted higher shoot number per explant
(1.83). The explants response to BAP concentrations was different in MS or WPM
media, semi-solid or liquid. On liquid MS medium supplemented with 1.11 µM BAP,
the highest mean shoot number was reached (11.8). Auxins are not necessary for in
vitro rooting of M. alternifolia. Plantlets rooted in the absence of auxin presented the
highest survival rate during acclimatization in the greenhouse.
Key words: Essential Oil. Medicinal plant. Tea tree.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - ASPECTO DAS FOLHAS DE Melaleuca alternifolia .................... 16
FIGURA 2- A. PLANTAS MATRIZES DOADORAS DOS EXPLANTES,
EM CASA-DE- VEGETAÇÃO. B. SEGMENTOS NODAIS
UTILIZADOS COMO EXPLANTE. C. SEGMENTOS NODAIS
DE M. alternifolia APÓS 30 DIAS DE CULTIVO IN VITRO:
SEM CONTAMINAÇÃO, COM CONTAMINAÇÃO FÚNGICA
E APRESENTANDO CONTAMINAÇÃO BACTERIANA,
DA ESQUERDA PARA A DIREITA, RESPECTIVAMENTE.
BARRA: 1 CM. .............................................................................. 37
FIGURA 3 - ASPECTO DAS BROTAÇÕES DE M. alternifolia MANTIDAS
POR 30 DIAS EM MEIO DE CULTURA WPM:
A. SEMI-SÓLIDO COM 0,55 µM DE BAP.
B. LÍQUIDO COM 0,55 µM DE BAP. C. LÍQUIDO COM 1,11 µM
DE BAP. D. LÍQUIDO COM 2,22 µM DE BAP.
E. ASPECTO DAS BROTAÇÕES DE M. alternifolia
AOS 30 DIAS DE CULTIVO IN VITRO EM MEIO
DE CULTURA MS LÍQUIDO CONTENDO 0,55 µM DE BAP.
F. ASPECTO DE TUFO COM BROTAÇÕES ALONGADAS,
AOS 30 DIAS DE CULTIVO IN VITRO,
MANTIDO EM MEIO DE CULTURA MS LÍQUIDO
COM 1,11 µM DE BAP. BARRA: 1 CM. ....................................... 52
FIGURA 4 - FIGURA 4 - EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
SACAROSE NA PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO DE M.
alternifolia (A); NÚMERO MÉDIO DE RAÍZES (B);
COMPRIMENTO MÉDIO DE RAÍZES (C); ALTURA DA PARTE
AÉREA (D) E MASSA FRESCA TOTAL (E).................................. 66
FIGURA 5 - A. ASPECTO DAS PLANTAS ENRAIZADAS DE M. alternifolia
EM DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS
NO MEIO DE CULTURA MS. B. ASPECTO DAS PLANTAS
ENRAIZADAS DE M. alternifolia EM MEIO DE CULTURA MS
COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
C. ASPECTO DAS PLANTAS ENRAIZADAS DE M. alternifolia
EM DIFERENTES VARIAÇÕES DO MEIO MS. D. ASPECTO
DAS MUDAS DE M. alternifolia APÓS 30 DIAS DE
ACLIMATIZAÇÃO. BARRA: 1 CM................................................. 74
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - EFEITO DA CONCENTRAÇÃO E TEMPO DE IMERSÃO
EM HIPOCLORITO DE SÓDIO NA DESINFESTAÇÃO
DE SEGMENTOS NODAIS DE Melaleuca alternifolia, AOS 30
DIAS DE CULTIVO IN VITRO ...................................................... 31
TABELA 2 - EFEITO DO ÁGAR E DO CARVÃO ATIVADO NOS MEIOS MS
E WPM NO NÚMERO E BROTAÇÕES EM SEGMENTOS
NODAIS DE M. ALTERNIFOLIA, AOS 20 DIAS DE CULTIVO .... 34
TABELA 3 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE E
PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO NA MULTIPLICAÇÃO
DE M. alternifolia, AOS 30 E 60 DIAS DE CULTIVO EM
MEIO DE CULTURA WPM (médias entre os dois subcultivos).... 45
TABELA 4 - MASSA FRESCA E MASSA SECA DE M. alternifolia, AOS
30 E 60 DIAS DE CULTIVO EM MEIO DE CULTURA WPM
(médias entre os dois subcultivos) ............................................... 47
TABELA 5 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS E PORCENTAGEM DE
OXIDAÇÃO NA MULTIPLICAÇÃO DE M. alternifolia, AOS 30 E
60 DIAS DE CULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS
(médias entre os dois subcultivos) ............................................... 48
TABELA 6 - MASSA FRESCA E MASSA SECA DE M. alternifolia, AOS
30 E 60 DIAS DE CULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS
(médias entre os dois subcultivos) ............................................... 51
TABELA 7 - PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO E MASSA
FRESCA DE MICROESTACAS ENRAIZADAS EM MEIO DE
CULTURA MS CONTENDO DIFERENTES
TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINA ................................. 62
TABELA 8 - NÚMERO E COMPRIMENTO MÉDIO DE RAÍZES E
ALTURA DA PARTE AÉREA DE MICROESTACAS
ENRAIZADAS EM MEIO MS CONTENDO DIFERENTES
TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINA ................................. 63
TABELA 9 - EFEITO DE DIFERENTES VARIAÇÕES DO MEIO
MS NO ENRAIZAMENTO IN VITRO DE M. alternifolia................ 69
TABELA 10 - SOBREVIVÊNCIA DAS PLANTAS DE M. alternifolia,
ENRAIZADAS EM MEIOS DE CULTURA CONTENDO
DIFERENTES TIPOS DE CONCENTRAÇÕES DE AUXINA,
AOS 30 E 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO..................................... 71
TABELA 11 - SOBREVIVÊNCIA DAS PLANTAS DE M. alternifolia,
ENRAIZADAS EM MEIO DE CULTURA MS COM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE,
AOS 30 E 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO..................................... 71
TABELA 12 – SOBREVIVÊNCIA DAS PLANTAS DE M. alternifolia,
ENRAIZADAS EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA,
AOS 30 E 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO..................................... 72
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIA Ácido indolacético
AIB Ácido indol-3-butírico
ANA Ácido α-naftalenoacético
BAP 6-benzilaminopurina
CA Carvão ativado
CIN Cinetina
CV Coeficiente de variação
MS Meio de cultura de MURASHIGE e SKOOG (1962)
MS/2 Meio MS com a concentração dos sais reduzida à metade
PA Parte aérea
WPM Meio de cultura Woody Plant Medium de LLOYD e Mc COWN (1980)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL................................................................................. 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 15
2.1 O GÊNERO Melaleuca............................................................................... 15
2.2 Melaleuca alternifolia.................................................................................. 16
2.3 ÓLEO ESSENCIAL .................................................................................... 17
2.4 PROPAGAÇÃO VEGETATIVA ................................................................. 18
2.5 MICROPROPAGAÇÃO.............................................................................. 20
REFERÊNCIAS................................................................................................ 22
3 ESTABELECIMENTO IN VITRO DE Melaleuca alternifolia ....................... 25
3.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 27
3.2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 28
3.2.1 Material vegetal ...................................................................................... 28
3.2.2 Condições de cultura in vitro ................................................................... 29
3.2.3 Concentração e tempo de imersão em hipoclorito de sódio na
assepsia de segmentos nodais de M. alternifolia .................................... 29
3.2.4 Influência de diferentes meios de cultura no estabelecimento in vitro
de M. alternifolia ..................................................................................... 30
3.2.5 Análise estatística ................................................................................... 30
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 31
3.3.1 Concentração e tempo de imersão em hipoclorito de sódio na
assepsia de segmentos nodais de M. alternifolia .................................... 31
3.3.2 Influência de diferentes meios de cultura no estabelecimento in vitro
de M. alternifolia .............................................................................................. 34
3.4 CONCLUSÕES .......................................................................................... 36
REFERÊNCIAS................................................................................................ 38
4 MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE Melaleuca alternifolia ............................. 40
4.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 42
4.2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 43
4.2.1 Material vegetal ...................................................................................... 43
4.2.2 Condições de cultura in vitro ................................................................... 43
4.2.3 Efeito da utilização do ágar e concentrações de BAP em diferentes
meios de cultura...................................................................................... 44
4.2.4 Delineamento experimental e análise estatística .................................... 44
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 45
4.3.1 Experimento 1: Meio de cultura WPM ..................................................... 45
4.3.2 Experimento 2: Meio de cultura MS ........................................................ 47
4.4 CONCLUSÕES .......................................................................................... 51
REFERÊNCIAS................................................................................................ 53
5 ENRAIZAMENTO E ACLIMATIZAÇÃO DE Melaleuca alternifolia ............ 55
5.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 57
5.2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 58
5.2.1 Material vegetal ....................................................................................... 58
5.2.2 Condições de cultura .............................................................................. 58
5.2.2.1 In vitro................................................................................................... 58
5.2.2.2 Ex vitro ................................................................................................. 59
5.2.3 Variáveis analisadas................................................................................ 59
5.2.4 Efeito do ANA, AIA e AIB no enraizamento in vitro de
M. alternifolia ........................................................................................... 59
5.2.5 Delineamento experimental e análise estatística ................................... 60
5.2.6 Efeito de diferentes concentrações de sacarose no enraizamento
in vitro de M. alternifolia........................................................................... 60
5.2.7 Delineamento experimental e análise estatística .................................... 60
5.2.8 Efeito de diferentes meios de cultura no enraizamento in vitro de
M. alternifolia ........................................................................................... 61
5.2.9 Delineamento experimental e análise estatística .................................... 61
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 61
5.3.1 Efeito do ANA, AIA e AIB no enraizamento in vitro de
M. alternifolia .......................................................................................... 61
5.3.2 Efeito de diferentes concentrações de sacarose
no enraizamento in vitro de M. alternifolia............................................... 65
5.3.3 Efeito de diferentes meios de cultura no enraizamento
in vitro de M. alternifolia........................................................................... 69
5.3.4 Efeito dos meios de cultura utilizados no enraizamento sobre a
sobrevivência das plantas ....................................................................... 71
5.4 CONCLUSÕES .......................................................................................... 73
REFERÊNCIAS................................................................................................ 75
6 CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................. 79
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 79
ANEXOS .......................................................................................................... 81
14
1 INTRODUÇÃO GERAL
Os principais gêneros pertencentes à família Myrtaceae são: Eucalyptus;
Melaleuca; Eugenea (exemplo: oliveira) e Psidium (exemplo: goiabeira). São
cultivados no Brasil para várias finalidades, principalmente por apresentarem frutos
comestíveis, serem fonte de madeira e lenha, conterem óleos essenciais e, pela
aparência de algumas espécies, são utilizados como ornamentais (SIANI et al.,
2000).
A Melaleuca alternifolia Cheel é conhecida na Austrália como “tea tree”
(árvore de chá), sendo nativa da região de New South Wales onde cresce em
regiões pantanosas ou próximas a rios (RIEDL, 1997). Tem como produto principal o
óleo essencial, sendo os principais consumidores a América do Norte e Europa,
principalmente indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de limpeza, devido as suas
propriedades farmacológicas. No Brasil o seu cultivo é crescente, sendo a espécie
conhecida somente por Melaleuca.
Um dos inconvenientes na produção de óleos essenciais é a variabilidade na
sua composição quando é oriundo de plantas produzidas pela via sexuada, pois a
produção de metabólitos secundários está diretamente relacionada com o genótipo
da planta. Logo, um método de clonagem de plantas que apresentem características
superiores em termos de produção e composição do óleo essencial, mostra-se como
uma ferramenta interessante na otimização deste processo.
Trabalhos de domesticação de plantas medicinais são escassos ou
inexistentes para a maioria das espécies, sendo necessário o desenvolvimento de
estudos relacionados à adaptação destas plantas às condições de cultivo,
principalmente em virtude do aumento da demanda por parte das indústrias
farmacêutica e cosmética (COSTA et al., 2007a). Embora o cultivo de Melaleuca
seja economicamente lucrativo, pouco se tem relatado sobre a propagação desta
espécie.
A propagação vegetativa é uma importante ferramenta no melhoramento de
espécies lenhosas e herbáceas e vem sendo amplamente utilizada, visando
melhorar e manter variedades de importância econômica e medicinal (EHLERT et
al., 2004). A micropropagação pode ser uma ferramenta vantajosa na obtenção
destes clones em larga escala, permitindo rapidez, uniformidade e bom estado
15
fitossanitário, além de servir como suporte para programas de melhoramento
genético.
Diante do exposto, este trabalho tem como objetivo estabelecer um protocolo
de micropropagação para M. alternifolia, visando a propagação de genótipos
superiores em larga escala.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O GÊNERO Melaleuca
A família Myrtaceae divide-se em duas subfamílias: Myrtoidea, de ampla
ocorrência na América tropical, e Leptospermoideae, que ocorre principalmente na
Austrália, Malásia e Polinésia. O gênero Melaleuca, pertence a esta última, incluindo
aproximadamente 100 espécies nativas da Austrália e Ilhas do Oceano Índico
(CRONQUIST, 1981).
Este gênero possui introdução recente no país, mostrando-se tolerante a
variações climáticas e de solo, podendo ser cultivado em todo o território brasileiro
(LORENZI, 2003). Poucas informações são encontradas com relação à taxonomia
de Melaleuca alternifolia. Entretanto, as espécies Melaleuca armillaris, Melaleuca
leucadendron e Melaleuca linariifolia já foram descritas por Lorenzi et al. (2003).
De uma forma geral, as árvores deste gênero são perenifólias, podendo
apresentar de 5 a 15 m de altura, e possuem características ornamentais, tanto pelo
aspecto da copa quanto do tronco. Suas folhas são simples, opostas, variando de
1,5 a 5,0 cm de comprimento, dependendo da espécie.
As inflorescências são axilares, em espigas cilíndricas, com grande número
de estames e com coloração variando de branca a amarelada. Seus frutos são
agrupados em cápsulas globosas, com numerosas sementes diminutas (LORENZI et
al., 2003). Em Melaleuca quinquenervia, após a floração, de 30 a 70 cápsulas são
produzidas por ramo, contendo cada cápsula, em média, 264 sementes
(ALEXANDER e HOFSTETTER, 1975; MESKIMEN, 1962). O comprimento médio e
o diâmetro das sementes são de 1,20 mm e 0,26 mm, respectivamente
(RAYACHHETRY et al., 1998), havendo em média, em cada grama, 30.000
sementes de vários tamanhos, forma e peso (MESKIMEN, 1962; WOODALL, 1982).
16
M. armillaris mostra-se aparentemente tolerante a geadas, podendo ser
cultivada no sul, além de apresentar um ótimo desenvolvimento e rápido crescimento
no Sudeste (LORENZI et al., 2003). M. leucadendron é também utilizada para
constituição de quebra-ventos, sendo feito menção à existência de óleo essencial
em suas folhas. Entretanto, em relação às propriedades farmacológicas do óleo
essencial, os trabalhos se restringem ao extraído de M. alternifolia, espécie alvo
deste trabalho.
2.2 Melaleuca alternifolia
A espécie M. alternifolia Cheel (FIGURA 1) apresenta-se como uma árvore
pequena de até 5 m, conhecida internacionalmente como “tea tree”. Possui casca
fina, semelhante a folha de papel, folhas afiladas de aproximadamente 2,0 cm de
comprimento e floresce no verão. É nativa da costa subtropical nordeste da
Austrália, região de New South Wales, crescendo em regiões pantanosas ou
próximas a rios (SILVA et al., 2002).
Esta espécie possui grande potencial ornamental, pelas características
descritas acima. Entretanto, seu cultivo vem sendo recentemente realizado no Brasil
pela grande demanda por seu óleo essencial, e existem poucos estudos
relacionados à sua propagação.
FIGURA 1 - ASPECTO DAS FOLHAS DE Melaleuca alternifolia.
17
2.3 ÓLEO ESSENCIAL
No Brasil, o cultivo de M. alternifolia voltado para a extração do óleo essencial
é recente. Entretanto, esta atividade apresenta grande potencial, tendo em vista a
grande aplicabilidade, já descrita, que o seu óleo essencial possui.
O óleo essencial das plantas de M. alternifolia, cultivadas na Austrália,
caracteriza-se pela mistura aproximada de 97 compostos, a maioria já identificados.
Os principais constituintes são os compostos terpinen-4-ol, 1,8-cineol, α-terpineno, γ-
terpineno, α-pineno, β-pineno, α-terpineol, p-cimeno e álcoois sesquiterpênicos, que
representam cerca de 90% do óleo (BROPHY et al., 1989; MURTAGH e SMITH,
1996). Em M. alternifolia o rendimento da extração é de aproximadamente 1 a 2% da
massa fresca da planta utilizada (CARSON e RILEY, 1993).
O Comitê Australiano de Padronização estabeleceu que o óleo deve conter
quantidades de cineol abaixo de 15% e de terpinen-4-ol acima de 30% para que
tenha eficácia mínima como anti-séptico (SIMÕES et al., 2002). Estudos sobre o
teor, a composição química e atividade antimicrobiana do óleo essencial de M.
alternifolia cultivada no Brasil, indicam que o óleo possui as mesmas características
qualitativas e quantitativas do óleo australiano (SILVA, 2001).
Este óleo essencial possui comprovada ação antimicrobiana contra bactérias
e bolores alteradores e/ou patogênicos, alguns vírus, microrganismos resistentes a
antibióticos além de forte atividade repelente contra mosquitos, pulgas, piolhos entre
outros. Devido às suas propriedades farmacológicas é utilizado em formulações
farmacêuticas de vários produtos como shampoos, sabonetes, cremes dentais, anti-
séptico bucal, repelente de insetos, produtos veterinários, germicidas de
condicionadores de ar, dentre outros (SILVA et al., 2002). Estudos in vitro
evidenciaram o seu potencial antifúngico e antibacteriano contra vários
microorganismos. Testes com C. albicans, Trichophyton rubrum, T.mentagrophytes,
T. tonsurans, Aspergillus niger, Penicillium sp, Epidermophyton floccosum e
Microsporum gypsum revelaram uma atividade antimicrobiana significante contra
esses microorganismos, sugerindo que o óleo pode ser útil no tratamento de
infecções fúngicas da pele (CONCHA et al., 1998).
A Austrália é o principal fornecedor mundial do óleo essencial de Melaleuca
(aproximadamente 400 t/ano). A China também produz o óleo, porém em escala
não-significativa frente ao mercado mundial. No Brasil, as indústrias farmacêuticas e
18
casas de produtos naturais agregam valores ao óleo essencial de Melaleuca e até
2002 todo o óleo consumido era importado. O preço desse óleo encontra-se, hoje,
num patamar econômico mundial elevado, resultado do monopólio produtivo
australiano (CASTRO et al., 2005). Descoberto em 1920 por Penfold e Grant, o óleo
é obtido por hidrodestilação ou destilação por arraste a vapor das folhas de M.
alternifolia, que hoje é cultivada na Austrália em escala industrial para atender às
demandas crescentes do mercado (RIEDL, 1997).
M. leucadendron apresenta também menção quanto ao óleo essencial
encontrado em suas folhas, também chamado de óleo-de-cajeput, obtido por
destilação (LORENZI et al., 2003), embora M. alternifolia seja o foco dos estudos
nesta área.
2.4 PROPAGAÇÃO VEGETATIVA
Quanto à propagação deste gênero, poucos relatos existem na literatura.
Lorenzi et al. (2003) indicam que a propagação das espécies M. armillaris, M.
leucadendron e M. linariifolia é exclusivamente feita pela via sexuada, ou seja, por
sementes.
Hartman (1999) demonstrou com os seus experimentos que o processo de
germinação da Melaleuca representa seu ponto fraco e possui grande potencial para
estudo. Embora apresente baixos índices de germinação, o fato de cada árvore
produzir milhões de sementes possibilita o seu estabelecimento. Nesse mesmo
sentido, Woodall (1978) diz que as sementes de Melaleuca quinquenervia
apresentam baixa adaptação para sobrevivência, mas devido ao grande número de
sementes que são produzidas, as chances das plantas se estabelecerem são altas.
Um estudo realizado no sul da Flórida mostrou que 15% das sementes de M.
quinquenervia que foram encontradas continham embriões (RAYACHHETRY et al.,
1998) e, dessas sementes, 62% eram viáveis, e das sementes viáveis, 73%
germinaram em casa-de-vegetação após 10 dias. Rayachhetry et al. (1998)
indicaram que 27% das sementes restantes que não germinaram após este período
poderiam apresentar dormência.
Além desses estudos, Bodle e Van (1999) afirmam que a viabilidade de
germinação das sementes reduziu cerca de 50% após oito meses de permanência
19
no solo. Já Meskimen (1962) menciona que as sementes de M. quinquenervia
podem sobreviver submersas na água por 6 meses e até serem viáveis e
germinarem, entretanto, após um ano as sementes submersas perdem a sua
viabilidade.
Entretanto, o rendimento da extração do óleo de um campo formado por
árvores reproduzidas por sementes pode ser reduzido, pois este tipo de propagação
pode gerar variabilidade considerável entre as plantas. Diante deste cenário,
técnicas de clonagem são ferramentas importantes e decisivas para o sucesso da
exploração da cultura em escala comercial. Além disto, a propagação vegetativa é
uma importante ferramenta no melhoramento de espécies lenhosas e herbáceas e
vem sendo amplamente utilizada, visando a melhorar e manter variedades de
importância econômica e medicinal (EHLERT et al., 2004).
Embora Castro et al. (2005) tenham comprovado a rentabilidade do cultivo de
Melaleuca, por meio de levantamento dos custos e receitas do cultivo da planta e
extração do óleo essencial, informações sobre a propagação vegetativa desta
espécie ainda são escassos. Estes estudos são de grande importância para o
estabelecimento de campos de produção e exploração da cultura em larga escala.
Em Joinville - Santa Catarina, M. alternifolia é cultivada para extração de óleo
essencial, sendo que as plantas matrizes foram estabelecidas a campo a partir de
sementes australianas. Com isto, percebe-se uma grande variabilidade na
composição do óleo e conseqüentemente, no rendimento da extração. Isso confirma
a observação feita por List et al. (1996), quando comenta que as plantações de M.
alternifolia são normalmente estabelecidas por meio de sementes coletadas de
plantas que possuem alto rendimento, entretanto, há uma variabilidade significante
no rendimento e na qualidade do óleo essencial extraído dessas populações de
plantas.
No entanto, a propagação clonal de um genótipo selecionado da M.
alternifolia, oferece potencial para a obtenção de um grande número de indivíduos
que produzam óleo essencial de excelente qualidade (LIST et al., 1996).
Em relação à propagação vegetativa de M. alternifolia, Costa et al. (2007b)
testaram diferentes concentrações de AIB (0, 500, 1000 e 1500 mg L
-1
) para o
enraizamento das estacas (6 cm de comprimento). O melhor resultado quanto a
porcentagem de estacas enraizadas (82,5%) foi encontrado com a aplicação de
1500 mg L
-1
de AIB em solução na base das estacas e 17,5% das estacas restante
20
não enraizaram mas sobreviveram. Já Oliveira et al. (2008) trataram estacas de
melaleuca de diferentes tamanhos com a mesma concentração de AIB (1500 mg L
-1
)
e encontraram maior taxa de enraizamento (41,25%) em estacas com 10 cm de
comprimento, sendo que este tipo de estaca apresentou 45% de sobrevivência.
Estes resultados contrastantes nos levam a crer que esta espécie se comporta de
forma distinta quanto ao enraizamento em virtude das características da estaca, da
época do ano e do genótipo.
Diante deste cenário e visando a produção massal de clones superiores de M.
alternifolia, faz-se necessário uma metodologia eficiente de propagação vegetativa,
como a micropropagação, que alie alto índice de enraizamento e sobrevivência,
independentemente da época do ano.
2.5 MICROPROPAGAÇÃO
A micropropagação ou propagação in vitro possui esta denominação devido
ao tamanho dos propágulos utilizados (TORRES et al., 1998), englobando vários
protocolos de regeneração a partir de tecidos vegetais, incluindo como explantes:
folhas, gemas apicais ou axilares, segmentos nodais, dentre outros. Como forma de
propagação vegetativa, baseada em técnicas de cultura de tecidos in vitro, a
micropropagação torna-se uma alternativa para a regeneração de plantas que
apresentam dificuldades de reprodução natural, e também onde os métodos
convencionais de propagação vegetativa não se tornam viáveis (THORPE et al.,
1991).
A técnica de micropropagação teve um forte impacto sobre a produção de
plantas em larga escala e centenas de protocolos foram estabelecidos visando à
produção comercial de mudas, como também à preservação de espécies vegetais
ameaçadas de extinção (SOUZA e PEREIRA, 2007). Isto ocorreu devido ao fato
desta técnica estar embutida nos programas de melhoramento que, na maioria das
vezes, objetivam a manutenção ou a maximização do valor genético do clone a ser
propagado, permitindo acelerar os métodos convencionais de propagação vegetativa
(XAVIER e COMÉRIO, 1997; JOSHI et al., 2003).
De acordo com o tipo de explante inicial e sua subseqüente manipulação, a
micropropagação pode ser conduzida de três maneiras: multiplicação por meio de
21
proliferação de gemas axilares, por indução de gemas adventícias (via
organogênese direta ou indireta) ou via embriogênese somática (TORRES et al.,
1998).
A possibilidade de propagação massal de clones em um curto espaço de
tempo, maior controle nutricional, ambiental e fitopatológico, transporte do material
clonal por grandes distâncias sem danos, armazenamento por longos períodos e a
retenção do vigor híbrido (GEORGE, 1993; BISHT et al., 1999) apresentam-se como
as principais vantagens da micropropagação, que é uma técnica muito difundida.
Para M. alternifolia, existem poucos trabalhos relacionados a esta técnica. List
et al. (1996) afirma que a propagação clonal de M. alternifolia por meio da cultura de
tecidos oferece grande potencial para o estabelecimento de campos de produção a
partir de indivíduos “elite” com alta produção de óleo essencial. A proliferação de
gemas a partir de segmentos nodais de M. alternifolia cultivados em meio MS
(MURASHIGE e SKOOG, 1962) com a adição de 4,5 µM de BAP (6-
benzilaminopurina) e 20 g L
-1
de sacarose, subcultivado por 12 semanas, foi
recomendada por List et al. (1996) para a multiplicação das brotações.
Entretanto, cada espécie vegetal, ou mesmo diferentes variedades e
genótipos dentro de uma espécie, possuem diferentes exigências nutricionais e
hormonais para a sua multiplicação in vitro, sendo vários os fatores que podem
influenciar a otimização de protocolos pré-estabelecidos.
22
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27p.
25
3 ESTABELECIMENTO IN VITRO DE Melaleuca alternifolia
RESUMO
As espécies lenhosas apresentam dificuldades para o estabelecimento in vitro,
principalmente quando é utilizado material vegetal proveniente de plantas adultas.
Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de agentes germicidas e meios de
cultura no estabelecimento in vitro de explantes de M. alternifolia. Foram testadas
concentrações de hipoclorito de sódio (0,25; 0,50; 1,0%) e tempos de imersão (10 e
20 min) e um tratamento com tiofanato-metílico (2 g L
-1
) antes da imersão em
hipoclorito de sódio 1% por 20 min. Também foram testados os meios de cultura MS
e WPM nas formas semi-sólida (6 g L
-1
de ágar), líquida e semi-sólida com carvão
ativado (2 g L
-1
). Para ambos os ensaios, foram utilizados segmentos nodais
retirados de plantas matrizes, mantidas em casa-de-vegetação, com
aproximadamente 1 cm de comprimento. No ensaio de assepsia, o melhor
tratamento foi o com fungicida e 1,0% de NaOCl, que favoreceu a eliminação total de
bactérias e a diminuição significativa da proliferação de fungos, permitindo o
estabelecimento de 80% dos explantes. Não houve diferença significativa entre os
dois meios de cultura testados (MS e WPM) com relação à quantidade de brotos
formados por explante. Independentemente do meio de cultura utilizado (MS ou
WPM), observou-se o maior número médio de brotações por explante (1,83) no meio
semi-sólido sem carvão ativado, seguido do meio semi-sólido com carvão ativado
(1,45) e do meio líquido (1,01).
Palavras-chave: Cultura de tecidos. Micropropagação. Planta aromática. Planta
medicinal.
26
IN VITRO ESTABLISHMENT OF Melaleuca alternifolia
ABSTRACT
Woody species are difficult to establish in vitro, especially when explants from adult
plants are used. The first aim of this work was to determine the best concentration of
sodium hypochlorite (0.25; 0.50 or 1.0%) and optimum time of exposition (10 and 20
min), aiming at the disinfestation of the explants of Melaleuca alternifolia introduced
in vitro. Fungicide was used before the immersion in ethanol and NaOCl 1.0% for 20
min. The second objective was to evaluate the influence of MS and WPM media and
their variations, semi-solid (6 agar g L
-1
), liquid and with activated charcoal (0.2%), in
the formation of axillary shoots during establishment. For both experiments, 1 cm
stem segments were removed from plants from greenhouse. In the experiment of
disinfestation, the best treatment was with fungicide followed by 1.0% sodium
hypochlorite. This treatment resulted in the elimination of bacteria and the reduction
of fungus proliferation. The establishment reached 80% of the explants. There was
no significant difference between the results of the two media (MS and WPM) with
regard to the amount of shoots per explant. Independently of the culture medium (MS
or WPM), the highest average number of shoots per explant was observed (1,83) in
the semi-solid medium without activated charcoal, followed by the solid medium with
activated charcoal (1,45) and the liquid medium (1,01).
Key-words: Aromatic plant. Medicinal plant. Micropropagation. Tissue culture.
27
3.1 INTRODUÇÃO
A propagação clonal de um genótipo selecionado de Melaleuca alternifolia,
oferece potencial para a obtenção de um grande número de indivíduos que
produzam óleo essencial de excelente qualidade (LIST et al., 1996). Nesse sentido a
micropropagação pode viabilizar esse objetivo.
As espécies lenhosas apresentam dificuldades para o estabelecimento in
vitro, principalmente quando é utilizado material vegetal proveniente de plantas
adultas, pois podem apresentar infestação interna ou externa por microorganismos,
que são de difícil controle (SKIRVIN, 1981; BONGA, 1982). A micropropagação só
pode ocorrer se o processo de desinfestação obtiver sucesso (ALMEIDA et al.,
2008).
A escolha do explante apropriado constitui o primeiro passo para o
estabelecimento in vitro (MROGINSKI e ROCA, 1991). Teoricamente, qualquer
tecido pode ser escolhido como explante, devido à totipotência que as células
vegetais possuem, ou seja, a capacidade de possuírem toda a informação genética
necessária para o desenvolvimento de uma planta completa (TAIZ e ZEIGER, 2004).
Entretanto, isso não se verifica com as plantas lenhosas, cujos tecidos
especializados apresentam dificuldade em expressar a totipotência. Por isso, os
explantes normalmente utilizados para iniciar o processo são os ápices
meristemáticos e os segmentos nodais, também chamados de microestacas. Estes
materiais são portadores de meristemas primários apicais ou axilares, que
continuam o seu crescimento e diferenciação de novas brotações com grande
estabilidade genética, sendo preferidos na micropropagação.
Fatores como a sanidade da planta matriz, o tamanho dos explantes, a
concentração do agente desinfestante, a assepsia dos instrumentos e do tempo de
exposição ao tratamento, também influenciam a obtenção de explantes livres de
contaminação (CARNEIRO et al., 1999).
Contudo, vários fatores interferem no sucesso do estabelecimento de um
protocolo, dentre eles, o meio de cultura. Os meios nutritivos fornecem às plantas
substâncias essenciais para o seu crescimento e controlam, em grande parte, o
padrão de desenvolvimento in vitro. O meio de cultura mais utilizado neste processo
é o meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962). Formulações especiais, como o meio
WPM – “Woody Plant Medium” (LLOYD e McCOWN, 1980), surgem como
28
alternativas ao meio MS, atendendo melhor, em alguns casos, as exigências de
espécies lenhosas (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Nesta mesma
perspectiva, o carvão ativado tem sido utilizado com mais freqüência para melhorar
ou regular o crescimento de plantas in vitro (GEORGE, 1996).
Este trabalho teve como objetivo geral o estabelecimento in vitro de M.
alternifolia e como objetivos específicos, avaliar diferentes concentrações e tempos
de exposição à solução de hipoclorito de sódio, bem como a influência de diferentes
meios de cultura e do carvão ativado no cultivo inicial de segmentos nodais.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Micropropagação de
Plantas, do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, do Setor de Ciências
Agrárias, da Universidade Federal do Paraná, Curitiba - Paraná.
3.2.1 Material vegetal
As plantas matrizes foram mantidas em vasos com capacidade de 15 L,
contendo uma mistura de solo e substrato Plantmax HT
®
(1:1), dentro de uma casa-
de-vegetação (FIGURA 2A). O material vegetal teve origem da estaquia de plantas
de M. alternifolia cultivadas a campo em Joinville (SC) com aproximadamente 2 anos
de idade.
De acordo com a necessidade, as plantas matrizes foram irrigadas e
receberam podas visando a obtenção de brotações rejuvenescidas, que foram
utilizadas como fonte de explantes. A primeira poda aconteceu aproximadamente 45
dias antes da instalação do primeiro ensaio de assepsia visando o estabelecimento
in vitro, e outras podas foram realizadas até o final dos experimentos em intervalos
de 60 dias.
29
3.2.2 Condições de cultura in vitro
Todas as culturas foram mantidas em sala climatizada, equipada com
lâmpadas fluorescentes do tipo “luz do dia”, com irradiância de 20 µmol m
-2
s
-1
,
fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25 ± 2º C.
3.2.3 Concentração e tempo de imersão em hipoclorito de sódio na assepsia de
segmentos nodais de M. alternifolia
As brotações (FIGURA 2B) foram lavadas com detergente neutro e
expostas à água corrente por 30 min. Em câmara de fluxo laminar, foram imersas
em etanol (70% v/v) por 30 segundos, seguido da imersão em solução de hipoclorito
de sódio (NaOCl), em diferentes concentrações finais (0,25; 0,5 e 1,0%) e tempos de
imersão (10 e 20 min), mais Tween 20
®
(0,05% v/v). Também foi aplicado um
tratamento com tiofanato-metílico
(1,4 g L
-1
) antes da imersão em etanol e na maior
concentração de hipoclorito, durante 40 minutos. Após o contato com o agente
germicida, procedeu-se quatro lavagens em água deionizada esterilizada, sendo as
brotações seccionadas em segmentos nodais com aproximadamente 1,0 cm de
comprimento, sem ápice e folhas (FIGURA 2B).
Os segmentos nodais foram inoculados em tubos de ensaio, contendo 10
mL de meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962). A cultura de segmentos
permaneceu no escuro em sala de crescimento por 7 dias, sendo então transferida
para luz.
Após 30 dias de cultivo in vitro foram avaliadas as porcentagens de
explantes contaminados por fungos ou bactérias, e calculada a porcentagem de
sobrevivência. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com
cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída por 10 tubos de
ensaio contendo um segmento nodal.
30
3.2.4 Influência de diferentes meios de cultura no estabelecimento in vitro de M.
alternifolia
Neste experimento, segmentos nodais com aproximadamente 1 cm de
comprimento foram estabelecidos in vitro pelo melhor tratamento de desinfestação
verificado no ensaio anterior. Foram retirados os ápices dos segmentos, que
continham aproximadamente 4 gemas axilares, sendo então inoculados em
diferentes meios de cultura, permanecendo em sala de crescimento, nas condições
descritas no item 3.2.2.
Os tratamentos foram constituídos pelos seguintes meios de cultura: (T1)
MS com 6 g L
-1
de ágar (Vetec
®
), (T2) MS sem ágar (líquido), (T3) MS com 2 g L
-1
de
carvão ativado (CA) e 6 g L
-1
de ágar, (T4) meio mineral WPM com 6 g L
-1
de ágar,
(T5) WPM sem ágar (líquido) e sem agitação, (T6) WPM com 2 g L
-1
(CA) e 6 g L
-1
de ágar. Em todos os meios foram acrescentadas as vitaminas e compostos
orgânicos do meio MS (ANEXO 1) e 30 g L
-1
de sacarose. O pH foi ajustado em 5,8
antes da autoclavagem a 120ºC por 20 min.
Segmentos nodais foram inoculados em tubos de ensaio, contendo 10 mL
de meio de cultura, permanecendo em sala de crescimento por 20 dias. Após este
período de cultivo in vitro, foi avaliado o número de brotações por explante. O
delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, num esquema fatorial 2x3
(MS e WPM x semi-sólido; líquido; semi-sólido com carvão ativado), com cinco
repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída por 10 tubos de ensaio
contendo um segmento nodal.
3.2.5 Análise estatística
Realizou-se o teste de Bartlett para se verificar a homogeneidade entre os
dados, sendo então os oriundos de porcentagem transformados para
arcoseno 100/x e os de contagem para 1+x . As médias foram submetidas à
análise de variância e ao teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro.
Utilizou-se para o processamento dos dados, o programa computacional SOC
(Embrapa, 1990).
31
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1 Concentração e tempo de imersão em hipoclorito de sódio na assepsia de
segmentos nodais de M. alternifolia
Aos 7 dias da inoculação observou-se contaminação, sendo que a presença
de contaminação bacteriana precedeu a fúngica em todos os tratamentos. Não foi
observada oxidação nos segmentos desinfestados (FIGURA 2C). List et al. (1996),
ao isolarem segmentos nodais de M. alternifolia, não comentaram a presença ou não
de oxidação.
Em todas as variáveis analisadas, ocorreu diferença estatística significativa
entre os tratamentos aplicados (ANEXOS 3 a 5). Os tratamentos com menores
concentrações de hipoclorito de sódio (0,25%) não permitiram eliminar as
contaminações, impossibilitando o estabelecimento in vitro dos explantes (TABELA
1).
TABELA 1 - EFEITO DA CONCENTRAÇÃO E TEMPO DE IMERSÃO EM HIPOCLORITO DE SÓDIO
NA DESINFESTAÇÃO DE SEGMENTOS NODAIS DE Melaleuca alternifolia, AOS 30
DIAS DE CULTIVO IN VITRO.
Concentração de NaOCl e
tempo de imersão
Contaminação
bacteriana (%)
Contaminação
fúngica (%)
Sobrevivência
(%)
0,25% por 10 min 72 a * 28 ab 0 d
0,25% por 20 min 64 a 36 a 0 d
0,5% por 10 min 46 b 40 a 14 c
0,5% por 20 min 50 b 40 a 10 c
1,0% por 10 min 30 c 40 a 30 b
1,0% por 20 min 20 c 40 a 40 b
Tiofanato-metílico + 1,0%
NaOCl por 20 min
0 d 20 b 80 a
Média geral 43,1 32 24,9
CV(%) 13,9 17,6 31,8
* Médias seguidas com letra idêntica nas colunas não diferem entre si pelo teste de Duncan ao nível
de 5% de probabilidade de erro.
32
Observou-se que à medida que se elevou a concentração de hipoclorito de
sódio, a contaminação bacteriana decresceu até anular-se completamente no
tratamento que utilizou tiofanato-metílico e 1,0% de NaOCl por 20 min, embora a
contaminação fúngica ainda tenha persistido, em menor grau. Percebeu-se que este
tratamento eliminou totalmente bactérias e reduziu significativamente a proliferação
de fungos.
Embora a contaminação por fungos tenha ocorrido em todos os tratamentos,
a utilização do fungicida auxiliou de forma significativa no controle deste tipo de
contaminação, possibilitando a melhor taxa de sobrevivência (80%).
No tratamento com 0,25% de NaOCl e 10 min de imersão, observou-se taxa
de contaminação por fungos semelhante ao melhor tratamento. Isto provavelmente
se deve ao fato da contaminação bacteriana ter levado à necrose os explantes de
forma mais rápida, visto que era este tipo de contaminação que ocorria inicialmente.
A contaminação fúngica atingiu valores de até 40 % no presente estudo.
Semelhantemente, no estabelecimento in vitro de segmentos nodais do hibrido
Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii, Brondani (2008) constatou que a
porcentagem de contaminação fúngica, independente do clone avaliado, foi de
41,33%, sendo responsável pela maior perda de material durante a fase de
estabelecimento.
Plantas mantidas em viveiro protegido ou casa-de-vegetação apresentam-se
também como fontes potenciais de microorganismos, que podem tornar-se limitantes
para os procedimentos de cultivo in vitro (MEDEIROS, 1999), o que foi observado
neste estudo.
List et al. (1996) ao estabelecerem um protocolo de micropropagação para
melaleuca, utilizaram para a desinfestação de segmentos nodais, hipoclorito de
sódio a 1% por 20 min. Os autores não relataram a porcentagem de sobrevivência
que obtiveram com este método de assepsia, que foi o segundo melhor tratamento
encontrado no presente trabalho.
Brondani (2008) utilizou segmentos nodais de Eucalyptus benthamii x
Eucalyptus dunnii com tamanho médio de 1,5 cm. Estes foram imersos em solução a
70% de etanol (v/v) por 15 s e submetidos a soluções de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0% (v/v) de
NaOCl acrescidas de Tween 20
®
(0,05% v/v) durante 10 minutos. A porcentagem de
estabelecimento alcançou valores médios acima de 45%, tanto na menor quanto na
33
maior concentração de NaOCl utilizada. Diferentemente do presente estudo, a
contaminação bacteriana resultou em pouco efeito na fase de estabelecimento.
Em Eucalyptus dunnii, Almeida et al. (2008) verificaram que o processo de
desinfestação de segmentos nodais apresentou melhores resultados nas
concentrações de 1,5% e 2,0% de NaOCl, onde obtiveram maiores porcentagens de
explantes estabelecidos, aproximadamente 40%. A concentração de 1,0% de NaOCl
proporcionou uma porcentagem de desinfestação de 10%, indicando que os
resultados encontrados no presente estudo são satisfatórios, considerando a
dificuldade de desinfestar explantes de espécies lenhosas.
Já para a desinfestação de segmentos nodais de mirtilo, Erig e Schuch
(2005) utilizaram hipoclorito de sódio na concentração de 2 - 2,5% de cloro ativo
(água sanitária comercial) durante 5 minutos, e obtiveram valores de desinfestação
satisfatórios, sendo que a contaminação fúngica e bacteriana ocorreu em 0,96% e
7,26% dos explantes, respectivamente. Neste caso, as mudas doadoras de
explantes, mantidas em vasos na casa-de-vegetação, foram pulverizadas
semanalmente até 45 dias antes da coleta das brotações, com o antibiótico
Agrimicina
®
(oxitetraciclina e sulfato estreptomicina) e os fungicidas Cercobin
®
(tiofanato-metílico) e Kumulus
®
(enxofre), nas doses de 2,4 g L
-1
, 0,7 g L
-1
e 3,0 g L
-1
respectivamente. Isto demonstra a influência dos tratamentos sanitários na planta
matriz sobre o comportamento in vitro dos explantes.
Grattapaglia e Machado (1998) ressaltaram que o estado fisiológico da
planta de onde são retirados os explantes apresenta grande influência no posterior
comportamento das culturas. No presente estudo, não foram realizadas
pulverizações sobre a planta matriz, em casa-de-vegetação, ocorrendo somente um
tratamento de aplicação de fungicida nos explantes antes do contato com o agente
desinfestante, cuja taxa de estabelecimento foi a melhor encontrada.
Em termos gerais, o estabelecimento da espécie foi satisfatório, não
havendo ocorrência de oxidação, podendo ainda ser otimizado por aplicação de
fungicida na planta matriz.
34
3.3.2 Influência de diferentes meios de cultura no estabelecimento in vitro de M.
alternifolia
No presente trabalho, não houve diferença significativa entre o meio MS e
WPM, nem interação entre as suas variações (com carvão ativado, com e sem ágar)
com relação à quantidade de brotos formados por explante após 30 dias de cultivo in
vitro. Ambos os meios produziram em média 1,4 brotos por explante (ANEXO 6).
Analisando o efeito da adição de carvão ativado e ágar, independentemente
do meio de cultura, observou-se diferença estatística entre os resultados, sendo que
o meio semi-sólido proporcionou o maior número médio de brotações por explante,
seguido do meio com carvão ativado e o meio líquido (TABELA 2).
TABELA 2- EFEITO DO ÁGAR E DO CARVÃO ATIVADO NOS MEIOS MS E WPM NO NÚMERO E
BROTAÇÕES EM SEGMENTOS NODAIS DE M. ALTERNIFOLIA, AOS 20 DIAS DE
CULTIVO.
Característica do meio de cultura
(MS e WPM)
Número médio de brotos por explante
Semi-sólido sem CA 1,83 a
Semi-sólido com CA 1,45 b
Líquido 1,01 c
CV (%) 4,2
* Médias seguidas com letras idênticas nas colunas não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de probabilidade de erro.
Devido ao custo que o ágar representa na elaboração do meio de cultura,
são interessantes estudos que visem identificar a influência deste componente nas
fases da micropropagação. Segundo Grattapaglia e Machado (1990) o ágar pode,
conforme o teor de impurezas, modificar a composição química do meio de cultura,
além de influenciar o potencial mátrico, alterando a disponibilidade de água,
nutrientes e reguladores vegetais no meio de cultura. Entretanto, de acordo com os
resultados obtidos, esse componente parece não ter influenciado o cultivo inicial de
M. alternifolia, onde o meio com a presença de ágar mostrou-se superior ao meio
líquido para o desenvolvimento de brotações.
Além disto, para algumas espécies lenhosas, o meio de cultura MS não se
mostrou eficiente e composições mais diluídas em macronutrientes têm sido
utilizadas com sucesso (HARRY e THORPE, 1994). Contudo, o meio de cultura
35
WPM não mostrou superioridade em relação ao MS no estabelecimento in vitro de
Melaleuca.
Rocha et al. (2005), ao testarem a influência do ágar no estabelecimento in
vitro de segmentos nodais de pêssego (com 1,0 cm de comprimento), verificaram
que o meio MS, com 3,33 µM de BAP + 0,13 µM de GA
3
+ 2,85 µM de AIB, semi-
sólido (6,5 g L
-1
de ágar) foi significativamente superior ao meio líquido com relação
a porcentagem de estabelecimento, que foi de 99,6 e 50,2% respectivamente.
Constatou-se que o comprimento e o número médio das folhas foram superiores
também no meio de cultura com a presença do ágar.
Neste mesmo sentido, Erig e Schuch (2005) ao testarem o estado físico do
meio de cultura WPM no estabelecimento in vitro de mirtilo, verificaram que o meio
semi-sólido (6 g L
-1
), proporcionou de forma significativa a maior taxa de
estabelecimento (79,23%) comparada ao meio de cultura líquido (0,74%),
demonstrando que a presença do ágar influencia de forma expressiva esta fase
inicial da micropropagação.
No estabelecimento in vitro, o cultivo inicial em meio líquido de M. alternifolia
mostrou-se viável, não sendo observada a ocorrência de hiperhidricidade. Entretanto
o número de brotações por explante foi inferior ao dos meios semi-sólidos.
Outro fator que pode estar relacionado ao desenvolvimento inferior que o
meio liquido proporcionou, é a menor aeração que ocorreu nessa condição.
Geralmente os frascos de cultura com meio líquido são submetidos à agitação, o que
não ocorreu no presente estudo. Os explantes ficaram em parte submersos no meio
de cultura dentro dos tubos de ensaio. Essa observação confirma a de MURASHIGE
(1974) que afirma que os explantes afundam quando em meio líquido estacionário
prejudicando a troca gasosa.
Os segmentos que permaneceram em meio com carvão ativado
apresentaram números de brotações intermediários aos do meio semi-sólido sem
carvão e líquido. A adsorção de compostos fenólicos liberados pelo explante é uma
das propriedades que o carvão ativado possui e que pode ser útil na
micropropagação. No presente estudo, a liberação destes compostos não foi
expressiva, ocorrendo somente ao redor da base dos explantes, não
comprometendo o seu desenvolvimento.
O menor desenvolvimento das brotações observada no meio semi-sólido
com carvão em relação ao sem carvão ativado pode ser devido ao fato desta
36
substância também adsorver nutrientes do meio de cultura, desequilibrando a faixa
ideal da concentração destes nutrientes. O carvão ativado é comumento usado em
meios de cultura. Adicionado ao meio de cultura pode promover ou inibir o
crescimento in vitro dependendo da espécie e tecido usado. Os efeitos do carvão
ativado podem ser atribuídos ao estabelecimento de um ambiente escuro, adsorção
de substâncias inibidoras e/ou indesejáveis, adsorção de reguladores vegetais e
outros compostos orgânicos (PAN e STADEN, 1998).
M. alternifolia demonstrou melhor desenvolvimento em meio semi-sólido sem
carvão, possivelmente devido ao fato da espécie necessitar de menor concentração
de nutrientes nesta fase inicial, já que Caldas et al. (1990) observou a existência de
um excesso nas concentrações de macro e microelementos no meio de cultura
líquido. Além disto, para M. alternifolia a oxigenação parece ser um fator importante
para a espécie nesta fase inicial do cultivo in vitro.
Considerando que um dos objetivos desta fase inicial é a produção de
material vegetal para que a fase de multiplicação seja viável e eficiente, se faz
necessário a escolha do meio de cultura que possibilite maior número de brotos, o
que ocorreu com o meio de cultura semi-sólido.
3.4 CONCLUSÕES
De acordo com as condições em que o presente trabalho foi realizado, pode-
se concluir que:
- O estabelecimento in vitro de Melaleuca alternifolia é possível e pode ser
realizado pela imersão de segmentos nodais em fungicida tiofanato-metílico 2 g L
-1
por 40 min, etanol 70% por 30 segundos e NaOCl 1% por 20 min.
- O cultivo inicial pode ser realizado em meio de cultura MS ou WPM
solidificado com 6 g L
-1
de ágar.
37
FIGURA 2- A.PLANTAS MATRIZES DOADORAS DOS EXPLANTES, EM CASA-DE- VEGETAÇÃO.
B.SEGMENTOS NODAIS UTILIZADOS COMO EXPLANTE. C. SEGMENTOS NODAIS
DE M. alternifolia APÓS 30 DIAS DE CULTIVO IN VITRO: SEM CONTAMINAÇÃO, COM
CONTAMINAÇÃO FÚNGICA E APRESENTANDO CONTAMINAÇÃO BACTERIANA, DA
ESQUERDA PARA A DIREITA, RESPECTIVAMENTE. BARRA: 1 CM.
C
B A
38
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TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. Porto Alegre, Artmed, 2004. 719p.
40
4. MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE Melaleuca alternifolia
RESUMO
A disponibilidade de trabalhos referentes à micropropagação de M. alternifolia é
bastante restrita na literatura, fazendo-se necessário o estudo de vários fatores que
podem interferir durante o processo. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo
comparar dois meios de cultura (MS e WPM) com e sem ágar, bem como diferentes
concentrações de BAP durante a fase de multiplicação de gemas. Para tanto,
explantes constituídos de brotações retiradas de segmentos nodais de M. alternifolia
foram inoculados nos meios de cultura MS e WPM, com diferentes concentrações de
BAP (0; 0,55; 1,11; 2,22; 3,33; e 4,44 µM) com e sem ágar (6 g L
-1
) e mantidos em
sala de crescimento por 60 dias. Após 30 e 60 dias, foram avaliados o número de
brotos por explante, a massa fresca e seca (g), a porcentagem de oxidação, além de
ser observada a hiperhidricidade. Durante a etapa de multiplicação in vitro de M.
alternifolia, os explantes respondem de forma diferenciada quanto à presença de
ágar e concentrações de BAP nos meios WPM e MS. Os meios de cultura líquidos
favoreceram a ocorrência de oxidação nos explantes, sendo crescente à medida que
se aumentou a concentração de BAP. O meio de cultura MS líquido contendo 1,11
µM de BAP proporcionaram o maior número médio de brotações por explante (11,8).
Palavras-chave: Ágar. BAP. Meio de cultura. Micropropagação.
41
IN VITRO MULTIPLICATION OF Melaleuca alternifolia
ABSTRACT
The number of studies about M. alternifolia micropropagation reflects the scarcity of
publications in this area and a series of factors which interfere in the process need to
be studied. The purpose of this study was to compare two culture media (MS and
WPM) with or without agar, as well as different BAP concentrations during the shoot
multiplication. Shoots (30-day old) were removed from nodal segments of M.
alternifolia inoculated on MS and WPM culture media supplemented with BAP (0;
0.55; 1.11; 2.22; 3.33 and 4.44 µM), with or without agar (6g L
-1
) and kept in a
growth room for 60 days. After 30 and 60 days, the shoot number per explant, fresh
and dry mass (g), oxidation percentage, and hyperhydricity were evaluated. During in
vitro multiplication of M. alternifolia the explants responses to agar presence and
BAP concentrations on media WPM and MS were different. Liquid culture media (MS
or WPM) favored the occurrence of oxidation of the explants and high concentrations
of BAP promoted highest oxidation rate. The highest shoot number per explant (11.8)
was reached with 1.11 µM BAP in liquid MS medium.
Key-words: Agar. BAP. Culture media. Micropropagation.
42
4.1 INTRODUÇÃO
A disponibilidade de trabalhos referentes à micropropagação de M.
alternifolia é bastante restrita na literatura, sendo interessante e de grande valia o
estudo de vários fatores que podem interferir durante todo este processo. Na
micropropagação, a fase de multiplicação requer estudos relacionados à escolha do
meio de cultura e regulador vegetal (tipo e concentração) mais favorável ao
desenvolvimento de brotações múltiplas.
A escolha adequada do meio de cultura é um fator relevante para a
micropropagação, devido ao importante papel dos componentes minerais no
processo de regeneração dos explantes (RAMAGE e WILLIAMS, 2002). Além dos
sais minerais, os nutrientes essenciais do meio de cultura incluem uma fonte de
carbono e energia, vitaminas e reguladores de crescimento (GAMBORG e SHYLUK,
1981).
O meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) foi utilizado por List et
al. (1996) em todo o processo de micropropagação de M. alternifolia. Entretanto,
formulações especiais, como o meio WPM – “Woody Plant Médium” (LLOYD e
McCOWN, 1980), surgem como alternativas ao meio MS, atendendo melhor, em
alguns casos, as exigências de espécies lenhosas (GRATTAPAGLIA e MACHADO,
1998; VENGADESAN et al., 2002).
List et al. (1996) estudaram o efeito das citocininas benzilaminopurina (BAP)
e cinetina (CIN) e da combinação de ambas em meio MS, visando à indução da
proliferação de gemas axilares em segmentos nodais de M. alternifolia. O melhor
resultado obtido foi com 4,5 µM de BAP, sendo superior ao encontrado com a
cinetina e esta combinada à BAP. Nestas condições, foi possível produzir em média,
ao final de 9 semanas de cultivo, 5,57 brotações por segmento nodal.
Atualmente, estudos referentes à não utilização do ágar durante a
micropropagação vêm sendo realizados, visando à diminuição do custo do meio de
cultura. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo comparar dois meios de
cultura (MS e WPM) e a presença do ágar, bem como diferentes concentrações de
BAP durante a fase de multiplicação de gemas.
43
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Micropropagação de
Plantas do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, do Setor de Ciências
Agrárias, da Universidade Federal do Paraná, Curitiba-Paraná.
4.2.1 Material vegetal
Os explantes utilizados nos experimentos de multiplicação foram brotações
axilares retiradas de segmentos nodais de M. alternifolia recém estabelecidos in
vitro, oriundos de plantas matrizes mantidas em casa-de-vegetação.
Para o estabelecimento in vitro dos segmentos nodais, brotações foram
seccionadas, tendo seus ápices e folhas retirados. Após a desinfestação com etanol
70% (v/v) e 1,0 % de NaOCl, e tratamento com tiofanato-metílico (2 g L
-1
) por 40
min, o material vegetal foi seccionado em segmentos de aproximadamente 1 cm de
comprimento (contendo em média 2 nós com 4 gemas), sendo então inoculados em
meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) semi-sólido, geleificado com 6 g L
-1
de
ágar (Vetec
®
).
Após 20 dias de cultivo, as brotações axilares de cada segmento (com cerca
de 0,5 cm de altura e 17 mg de massa fresca) apresentando em média 3 folhas,
foram inoculadas em frascos de cultivo com aproximadamente 20 mL dos meios de
cultura líquido (onde os explantes ficaram soltos na solução nutritiva) e semi-sólido,
que constituíram os tratamentos do presente experimento.
4.2.2 Condições de cultura in vitro
As culturas foram realizadas em frascos de vidro de 6 cm de diâmetro e 9 cm
de altura, vedados com tampa de polipropileno rígido, sendo mantidas em sala
climatizada, equipada com lâmpadas fluorescentes do tipo “luz do dia”, irradiância de
20 µmol m
-2
s
-1
, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 25 ± 2º C.
44
4.2.3 Efeito da utilização do ágar e concentrações de BAP em diferentes meios de
cultura
Brotações originadas de segmentos nodais de M. alternifolia, com 20 dias de
cultivo em meio de cultura inicial, MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) semi-sólido,
foram inoculadas nos meios de cultura MS e WPM (LLOYD e McCOWN, 1980),
adicionados das vitaminas e compostos orgânicos do meio MS (ANEXO 1) e de
várias concentrações de BAP (0; 0,55; 1,11; 2,22; 3,33 e 4,44 µM), suplementados
ou não com ágar (Vetec
®
) (6 gL
-1
).
Os explantes foram inoculados em frascos de cultivo e mantidos em sala de
crescimento por 60 dias. Foram realizados subcultivos aos 30 e 60 dias, totalizando
2 subcultivos, onde a brotação foi isolada e transferida para o mesmo meio de
cultura. A cada subcultivo foram avaliadas as variáveis número de brotos novos por
explante, massa fresca e seca (g), porcentagem de oxidação, além de ser observada
a hiperhidricidade. Durante a contagem do número de brotos por explante, não foi
considerada a brotação inicial, sendo somente as novas brotações formadas
contabilizadas.
Para a determinação da massa seca, amostras (10 tufos por tratamento)
foram retiradas, pesadas, e permaneceram em estufa por 48h à 80ºC. Após este
período procedeu-se nova pesagem do material vegetal.
4.2.4 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, num arranjo tri
fatorial 2x2x6, considerando dois subcultivos (30 e 60 dias), o estado físico do meio
(semi-sólido e líquido) e seis concentrações de BAP (0; 0,55; 1,11; 2,22; 3,33 e 4,44
µM) para os meios de cultura MS e WPM. Cada tratamento apresentou cinco
repetições de cinco explantes cada. Os dados foram submetidos ao teste de Bartlett
para verificar a homogeneidade, sendo então os oriundos de porcentagem
transformados para arcoseno 100/x e os de contagem para 1+x . As médias
foram submetidas à análise de variância e ao teste de Duncan ao nível de 5% de
45
probabilidade de erro. Utilizou-se para o processamento dos dados, o programa
computacional SOC (Embrapa, 1990).
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 Experimento 1: Meio de cultura WPM
Com relação à variável número de brotos novos por explante, a interação
entre os fatores consistência do meio de cultura WPM e concentrações de BAP foi
significativa (ANEXO 7). Não houve diferenças significativas entre os dois
subcultivos em relação ao número médio de brotos, sendo apresentada neste caso a
média da variável para as duas subculturas (TABELA 3).
TABELA 3 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE E PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO
NA MULTIPLICAÇÃO DE M. alternifolia, AOS 30 E 60 DIAS DE CULTIVO EM MEIO DE
CULTURA WPM (médias entre os dois subcultivos).
Número de brotos Oxidação (%)
BAP (µM)
Semi-sólido Líquido Semi-sólido Líquido
0,00
0,55
1,11
2,22
3,33
4,44
0,0 eA
5,5 aA
4,5 bA
3,6 cA
3,4 cA
2,7 dA
0,0 dA
4,7 aB
1,0 bcB
1,2 bB
1,0 bcB
0,9 cB
0,0 cB
5,5 cB
4,5 cB
16,0 bB
31,5 aB
40,0 aB
52,5 deA
44,5 eA
70,5 bA
60,5 cdA
64,5 bcA
82,5 aA
CV(%) 33,0 50,9
Médias seguidas por letras minúsculas idênticas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro.
A concentração de 0,55 µM foi superior estatisticamente as demais,
proporcionando o maior número de novas brotações por explante, tanto no meio
semi-sólido (5,5), quanto no meio líquido (4,7). O meio semi-sólido apresentou-se
superior ao meio líquido em todas as concentrações testadas, salvo a testemunha
que não apresentou novas brotações em ambas as consistências.
O melhor desempenho do meio semi-sólido pode estar relacionado ao fato
dos explantes neste tipo de meio possuírem maior aeração que os mantidos em
meio líquido, que não sofreu agitação durante todo o período de cultivo. Murashige
(1974) afirma que os explantes que ficam submersos quando submetidos ao cultivo
46
em meio líquido estacionário, são prejudicados quanto à troca gasosa. A absorção
de nutrientes e de reguladores vegetais pode ter sido influenciada por essa falta de
aeração.
Além do exposto, a superioridade do meio sólido sobre o meio líquido pode
ser devida ao potencial osmótico menos negativo do meio líquido, em relação ao
meio sólido, ocasionando maior perda de água da célula para o meio de cultura e
causando estresse osmótico na célula (George, 1993) ou estresse hídrico.
Observou-se que o número de brotações se reduziu significativamente à
medida que a concentração de BAP aumentou, em ambas as consistências do meio
de cultura. Em todos os tratamentos, as brotações cultivadas em meio de cultura
WPM semi-sólido ou líquido apresentaram brotações reduzidas, com folhas
pequenas, e aparência clorótica e oxidada (FIGURA 3 A à D).
Em cinamomo (Melia azedarach L.), Cabel (2006) também encontrou
sintomas de clorose foliar durante a fase de multiplicação dos explantes submetidos
ao cultivo em meio de cultura WPM semi-sólido (6 g L
-1
de ágar). As brotações
formadas apresentavam-se pouco vigorosas e com crescimento lento, conforme o
observado em M. alternifolia. De forma semelhante, em canjarana, Rocha et al.
(2007) também verificaram a ocorrência de clorose foliar em brotações mantidas em
meio de cultura WPM, a partir do 3º subcultivo.
Além disto, a análise estatística mostrou que a oxidação diferiu
estatisticamente em função da consistência do meio WPM, sendo a interação entre
consistência e concentrações de BAP significativa (ANEXO 10). Verificou-se, de uma
maneira geral, a presença de oxidação ao redor das folhas de todas as brotações
mantidas no meio WPM, sendo que na sua fase líquida, em todas as concentrações
de BAP testadas, ela foi superior do que na fase semi-sólida. No meio de cultura
líquido suplementado com 4,44 µM de BAP, a incidência desse fenômeno foi a maior
encontrada nesse experimento (82,5%) (TABELA 3).
Na produção de massa fresca houve diferença significativa em relação às
concentrações de BAP e interação entre o tipo de meio e as concentrações de BAP
(ANEXO 8). De maneira geral, as menores concentrações (0,55 e 1,11 µM)
produziram um maior valor de massa fresca e seca que as demais (TABELA 4),
provavelmente em virtude de ter ocorrido maior produção de brotos nessas
condições.
47
Em relação à consistência do meio de cultura, os valores de massa fresca
nas menores concentrações de BAP foram superiores no meio líquido,
possivelmente pela maior absorção de água que esta condição favorece, refletindo
na massa do explante.
TABELA 4 – MASSA FRESCA E MASSA SECA DE M. alternifolia, AOS 30 E 60 DIAS DE CULTIVO
EM MEIO DE CULTURA WPM (médias entre os dois subcultivos).
Massa fresca (mg) Massa seca (mg)
BAP (µM)
Semi-sólido Líquido Semi-sólido Líquido
0,00
0,55
1,11
2,22
3,33
4,44
39 aB
37 aB
38 aA
20 bA
20 bA
17 bA
64 aA
53 bA
26 cB
15 dA
16 dA
10 dA
7,5 aA
7,3 aA
7,5 aA
4,1 bA
4,3 bA
3,3 bA
7,5 aA
2,1 bB
0,5 cB
1,0 bcB
0,6 cB
0,4 cB
CV(%) 51,7 58,9
Médias seguidas por letras minúsculas idênticas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro.
A variável massa seca apresentou médias superiores, independente da
concentração de BAP utilizada, no meio de cultura semi-sólido (TABELA 4 e ANEXO
9). Esse dado comprova a hipótese que grande parte da massa fresca encontrada
nos explantes cultivados em meio líquido é decorrente da quantidade de água
absorvida pelo explante, não sendo necessariamente pelo aumento de sua
biomassa.
4.3.2 Experimento 2: Meio de cultura MS
Houve diferença estatística significativa para o número médio de brotos por
explante no meio de cultura MS em função das concentrações de BAP e a interação
entre elas e o tipo de meio (ANEXO 11). Semelhantemente ao meio de cultura WPM,
houve uma tendência de diminuição do surgimento das brotações à medida que a
concentração de BAP aumentava (TABELAS 3 e 5), exceto para a concentração de
1,11 µM que proporcionou, no meio líquido, a maior média de brotos encontrada
neste estudo (11,82). Fantini Junior e Graça (1990) e Dibax (2007) também
observaram decréscimos da taxa de multiplicação de Eucalyptus saligna à medida
que a concentração de BAP aumentou.
48
TABELA 5 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS E PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO NA
MULTIPLICAÇÃO DE M. alternifolia, AOS 30 E 60 DIAS DE CULTIVO EM MEIO DE
CULTURA MS (médias entre os dois subcultivos).
Número de brotos Oxidação (%)
BAP (µM)
Semi-sólido Líquido Semi-sólido Líquido
0,00
0,55
1,11
2,22
3,33
4,44
0,0 eA
5,6 aA
5,4 aB
4,7 bB
4,0 cA
3,3 dA
0,0 dA
3,2 cB
11,8 aA
5,1 bA
3,2 cB
1,0 dB
0 bA
0 bA
0 bA
4 bA
4 bB
12 aB
5,2 cA
4,8 cA
6,0 cA
4,0 cA
65 bA
100 aA
CV(%) 26,4 79,5
Médias seguidas por letras minúsculas idênticas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro.
As concentrações de 0,55 e 1,1 µM de BAP proporcionaram maior número de
brotos (5,6 e 5,4, respectivamente) no meio de cultura MS semi-sólido. Entretanto, a
concentração de 1,11 µM de BAP foi a que apresentou melhor resultado no meio
líquido, sendo superior ao meio semi-sólido, favorecendo a produção de 11,8
brotações por explante.
No presente estudo, o vigor das brotações originadas no meio de cultura MS
foi superior (FIGURA 3E) ao das brotações cultivadas em meio WPM, independente
da concentração de BAP utilizada, mostrando que há diferenças na resposta dos
explantes de acordo com o meio de cultura. Em canjarana (Cabralea canjerana),
Rocha et al. (2007), ao testarem os dois meios de cultura, verificaram que o meio
WPM proporcionou o menor número de brotos por explante (dados não
apresentados pelos autores) e a maior taxa de multiplicação quando adicionado de
2,25 µM de BAP (1,77 no 2º subcultivo). Já no caso de Acacia (VENGADESAN et
al., 2002) e Anacardium occidentale (MNENEY e MANTELL, 2002), o meio de
cultura MS apresentou melhores resultados que o WPM para indução de brotos.
A ausência de ágar no meio MS proporcionou brotações vigorosas e com
características físicas favoráveis para a manipulação, quando comparado ao meio
WPM líquido (FIGURA 5B e FIGURA 6). Além disto, o meio líquido favoreceu, em
certas concentrações de BAP, o surgimento de brotações mais alongadas (FIGURA
3F) e individualizadas dentro dos tufos. Este aspecto deve ser levado em conta visto
que o mesmo facilita a manipulação e posterior isolamento dos explantes para a fase
de enraizamento. Diante deste fato observado, não houve fase de alongamento para
Melaleuca no presente trabalho.
49
List et al. (1996) testaram diferentes concentrações de BAP (0,0045; 0,045;
0,45 e 4,5 µM) no meio de cultura MS semi-sólido (8 g L
-1
de ágar), na fase da
multiplicação de explantes constituídos por segmentos nodais de M. alternifolia. O
melhor resultado encontrado foi com 4,5 µM de BAP, que induziu a formação de 5,5
brotações em média por segmento, ao final de 9 semanas de cultivo in vitro. Já no
presente experimento, ao final de 8 semanas de cultivo em condições similares,
cada explante, constituído por uma brotações isolada, produziu em média 3,3
brotações. Entretanto, a utilização de 1,11 µM de BAP em meio líquido, foi superior
ao meio semi-sólido e aos resultados encontrados por List et al. (1996), favorecendo
a produção de 11,8 brotações por explante.
O meio líquido pode ter favorecido a absorção de nutrientes e
conseqüentemente, facilitado a absorção de BAP, pois de acordo com a observação
feita por Costa e Zaffari (2005), o meio líquido permite maior velocidade de difusão e
absorção mais eficiente de nutrientes.
Domingues et al. (1995) estudaram também a influência do estado físico do
meio de cultura MS durante a multiplicação de ápices caulinares de bananeira cv.
maçã. Foram testados o meio líquido com agitação (65 rpm), sem agitação e o meio
semi-sólido (6,5 g L
-1
). Os explantes cultivados em meio com agitação e semi-sólido
foram os que apresentaram maiores médias em relação ao número de brotos por
explante (1,56 e 1,20, respectivamente) quando comparadas com o meio líquido
sem agitação (0,49 brotos). Os autores mencionam que a falta de aeração que
ocorre no meio líquido sem agitação pode ter provocado essa redução na
capacidade de brotação dos explantes, o que foi verificado também em algumas
concentrações de BAP utilizadas, no mesmo meio de cultura líquido durante a
multiplicação de M. alternifolia.
Contudo, a concentração de 1,1 µM de BAP, a formulação salina do meio de
cultura MS e a ausência de ágar, mesmo em meio de cultura desprovido de
agitação, mostraram-se favoráveis a indução de brotações múltiplas em M.
alternifolia.
Os comportamentos distintos observados, no presente trabalho, entre os
dois meios de cultura testados (MS e WPM) podem estar relacionados também às
peculiaridades existentes entre eles. Sabe-se que o meio WPM possui apenas 45%
da força iônica total do meio MS (NUNES et al., 2002). O meio MS contém 94,21 mM
de sais e o WPM 41,06 mM, além de concentrações menores de nitrato (MS 39,4
50
mM; WPM 9,71 mM) e amônio (MS 20,61 mM; WPM 4,94 mM. (ANEXO 2). Com
isso, o meio WPM possui uma baixa concentração de nitrogênio total (14,71 mM)
comparado ao MS (60,01 mM). Schottz (2003) verificou o efeito de diferentes
soluções minerais sobre a clorose durante o cultivo de tecidos in vitro de mogno e
verificou que o WPM provocou os maiores índices, juntamente com o meio B5, que
possui menores concentrações de nitrogênio. O mesmo efeito foi verificado nos
explantes de M. alternifolia mantidos em meio WPM.
O meio básico WPM (Woody Plant Medium) foi desenvolvido para cultura de
brotações de plantas lenhosas e apresenta ¼ das concentrações de NO3
-
e NH4
+
do
meio MS, além de possuir menos potássio e um alto nível de íons sulfato.
Entretanto, para cada tipo de espécie, cultivar e explante, o meio mais adequado e
eficiente é variável. Para determinar qual o melhor meio de cultura deve-se realizar
diversos ensaios (BRUM, 2001). Além disto, o meio de cultura WPM em relação ao
MS possui uma concentração reduzida de cloro, manganês, além de não conter
cobalto e iodo. Possivelmente, esses elementos são importantes para o
desenvolvimento de M. alternifolia.
Entretanto, na multiplicação in vitro de algumas espécies lenhosas, o meio
WPM tem mostrado resultados interessantes. Em caixeta (Didymopanax morototoni),
Mantovani et al. (1999) obtiveram os melhores resultados de multiplicação de
brotações com o meio WPM quando comparado ao meio MS. Neste caso, o meio
WPM, na presença ou ausência de citocinina, proporcionou maior porcentagem de
explantes com novas brotações (36,7%) em relação ao meio MS (18,3%). Da
mesma forma, a porcentagem de brotações com folhas maiores que 10 mm de
comprimento, foi maior no meio WPM (50,0%) do que no meio MS (18,2%). O autor
sugere que há uma inter-relação entre os sais inorgânicos e os reguladores vegetais,
que pode resultar em diferentes respostas quanto à capacidade de multiplicação.
O meio líquido favoreceu a ocorrência de oxidação nos explantes nos dois
meios testados (MS e WPM). No meio MS líquido esse fenômeno ocorreu em
grande parte dos explantes, diferentemente do mesmo meio na fase semi-sólida.
Verificou-se que a oxidação foi crescente à medida que a concentração de BAP
aumentava em ambos os casos, como mostram as TABELA 3 e 5.
Em relação à massa fresca e seca, o meio MS líquido adicionado de 1,1 µM
de BAP apresentou as maiores médias, 418 mg e 167 mg, respectivamente
(TABELA 6). Elas foram superiores estatisticamente às médias encontradas no meio
51
semi-sólido, para a mesma concentração. Possivelmente esse resultado seja em
virtude da alta produção de brotações verificada nessa condição.
TABELA 6 – MASSA FRESCA E MASSA SECA DE M. alternifolia, AOS 30 E 60 DIAS DE CULTIVO
EM MEIO DE CULTURA MS (médias entre os dois subcultivos).
Massa fresca (mg) Massa seca (mg)
BAP (µM)
Semi-sólido Líquido Semi-sólido Líquido
0,00
0,55
1,11
2,22
3,33
4,44
80 cA
146 aA
128 abB
80 cB
89 bcB
82 cA
39,0 cB
155 bA
418 aA
305 aA
198 bA
17,0 cB
22 bA
29 abB
44 aB
15 bB
16 bA
7,0 bA
6,0 eA
106 cA
167 aA
125 bA
28 dA
5,0 fA
CV(%) 52,6 76,3
Médias seguidas por letras minúsculas idênticas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro.
Correia et al. (1995) testaram meio de cultura JADS líquido e sólido na fase
de multiplicação de clones de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla durante 42
dias de cultura e encontraram as maiores produções de massa fresca e seca no
meio semi-sólido. Os autores relataram a ocorrência de hiperhidricidade nos
explantes mantidos em meio liquido, o que pode explicar a ocorrência de maior
produção de massa seca nos explantes mantidos em meio semi-sólido. Este
fenômeno não foi observado nos explantes de M. alternifolia mantidos em meio
líquido.
4.4 CONCLUSÕES
De acordo com as condições em que o presente trabalho foi realizado, pode-
se concluir que:
- Concentrações elevadas de BAP inibem a formação de novas brotações
em M. alternifolia.
- Os meios de culturas MS e WPM líquidos favorecem a ocorrência de
oxidação nos explantes.
- O meio de cultura WPM favorece a ocorrência de clorose nos explantes de
M. alternifolia.
- O meio de cultura MS líquido contendo 1,11 µM de BAP, possibilita a
formação de maior número médio de brotações (11,8) por explante.
52
FIGURA 3- ASPECTO DAS BROTAÇÕES DE M. alternifolia MANTIDAS POR 30 DIAS EM MEIO
DE CULTURA WPM: A. SEMI-SÓLIDO COM 0,55 µM DE BAP. B. LÍQUIDO COM 0,55
µM DE BAP. C. LÍQUIDO COM 1,11 µM DE BAP. D. LÍQUIDO COM 2,22 µM DE BAP.
E. ASPECTO DAS BROTAÇÕES DE M. alternifolia AOS 30 DIAS DE CULTIVO IN
VITRO
EM MEIO DE CULTURA MS LÍQUIDO CONTENDO 0,55 µM DE BAP. F.
ASPECTO DE TUFO COM BROTAÇÕES ALONGADAS, AOS 30 DIAS DE CULTIVO
IN VITRO, MANTIDO EM MEIO DE CULTURA MS LÍQUIDO COM 1,11 µM DE BAP.
BARRA: 1 CM.
A
E F
B C D
53
REFERÊNCIAS
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55
5. ENRAIZAMENTO E ACLIMATIZAÇÃO DE Melaleuca alternifolia
RESUMO
O estudo de fatores como tipo de auxina, concentração de sacarose e composição
do meio de cultura é importante durante a fase de enraizamento das brotações e
pode refletir no comportamento das plantas após a transferência das mesmas para a
casa-de-vegetação. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi o de avaliar a
influência de diferentes concentrações de ANA, AIA e AIB, sacarose e meios de
cultura no enraizamento in vitro de Melaleuca alternifolia. Brotações mantidas em
meio de multiplicação (MS líquido com 1,11 µM
de BAP) foram utilizadas como
explantes. Microestacas, destacadas de tufos em multiplicação, com
aproximadamente 1 cm de comprimento, foram inoculadas em meio de cultura MS,
onde foram variadas o tipo de auxina (ANA, AIA ou AIB) e as suas concentrações
(0,53 e 2,64 µM). Foram testadas três concentrações de sacarose (15, 30 e 45 g L
-1
).
Estudou-se também o efeito da adição do carvão ativado nos meios MS e MS/2
sobre o enraizamento in vitro. Posteriormente, foi avaliada a influência do meio de
cultura utilizado no enraizamento sobre a sobrevivência das plantas após 30 e 60
dias de aclimatização. Pode-se concluir que para o enraizamento de M. alternifolia é
dispensável o suprimento de auxinas no meio de cultura, que a sacarose influencia
de forma positiva o enraizamento, obtendo-se o maior percentual (100%) com 30 g
L
-1
, e que o meio de cultura MS permite maior taxa de enraizamento (100%) e
sobrevivência após a aclimatização das mudas.
Palavras-chave: Auxinas. Carvão ativado. Micropropagação. Sacarose.
56
IN VITRO ROOTING AND ACCLIMATIZATION OF Melaleuca alternifolia
ABSTRACT
Studying some factors like type of auxins, sucrose concentration and culture medium
composition are important for in vitro rooting and may affect the survival percentage
in a greenhouse. Therefore, the third aim of this work was to evaluate the influence of
different concentrations of NAA, IAA and IBA, sucrose and culture media on the in
vitro rooting of Melaleuca alternifolia. Shoots of M. alternifolia propagated on liquid
MS with 1,11 µM BAP were used as explant source. The microcuttings, detached of
shoot clumps, with approximately 1 cm of length, were cultured in MS medium
supplemented with 3 types (NAA, IAA or IBA) and concentrations (0.53 and 2.64
µM) of auxin and 3 concentrations of sucrose (15, 30 and 45 g L
-1
). The addition of
activated charcoal into MS and MS/2 medium was also studied during in vitro rooting.
The influence of the rooting medium on survival of plants in the greenhouse was
evaluated after 30 and 60 days. In conclusion, rooting of M. alternifolia does not need
auxin. However, 30 g L
-1
sucrose added into the MS medium allows higher rooting
rate (100%) and ex vitro survival during acclimatization.
Key-words:
Activated charcoal. Auxins. Micropropagation. Sucrose.
57
5.1 INTRODUÇÃO
O estudo dos fatores que interferem no enraizamento e aclimatização de
mudas micropropagadas é decisivo para que a técnica de micropropagação torne-se
economicamente viável. A manipulação correta destas últimas fases é decisiva para
que se alcance um bom índice de sobrevivência ao final de todo o processo.
O estudo de fatores como tipo de auxina, concentração de sacarose e
composição do meio de cultura são importantes durante a fase de enraizamento das
brotações e podem refletir no comportamento das plantas após a transferência das
mesmas para a casa-de-vegetação.
Embora existam espécies que formam raízes adventícias apenas com os
níveis endógenos de auxina, geralmente é necessário adicionar auxina exógena
para estimular a rizogênese (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1990). Estes
reguladores podem ser utilizados isoladamente ou em combinação, no meio de
enraizamento, sendo que o ácido indolacético (AIA), ácido indolilbutírico (AIB) e
ácido α-naftalenoacético (ANA) são os mais empregados. As concentrações mais
freqüentes estão na faixa de 0,5 a 5,0 µM (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).
Além disto, os tratamentos in vitro também podem refletir na capacidade das
plantas suportarem as mudanças bruscas de ambiente que a passagem para a
casa-de-vegetação ocasiona. Dentre estes, a necessidade de sacarose no período
final do cultivo é bastante discutida por vários autores. Conforme Kozai (1991), na
presença de açúcar, as plantas não desenvolvem capacidade fotoautótrofica,
podendo levar a um crescimento reduzido e conseqüente morte das mudas durante
a fase de aclimatização.
Diluições do meio MS, bem como o uso de carvão ativado no meio de
cultura, são práticas que vem sendo utilizadas em várias espécies durante o
enraizamento in vitro. Em muitos casos, a resposta quanto ao enraizamento não
difere em relação aos tratamentos que utilizam auxinas, como observado por Dibax
(2007) em Eucalyptus saligna.
Diante da importância em se estabelecer um protocolo de enraizamento e
aclimatização que permita a obtenção de altos níveis de sobrevivência, o objetivo
deste trabalho foi o de avaliar a influência de diferentes concentrações de ANA, AIA
e AIB, sacarose e meios de cultura no enraizamento in vitro de Melaleuca alternifolia.
58
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Micropropagação de
Plantas do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, do Setor de Ciências
Agrárias, da Universidade Federal do Paraná, Curitiba-Paraná.
A aclimatização das mudas enraizadas deu-se em casa-de-vegetação
climatizada (PAD & FAN), coberta com plástico de polietileno anti-UV, situada no
mesmo Setor.
5.2.1 Material vegetal
Brotações de M. alternifolia, mantidas em meio de multiplicação (MS líquido
com 1,11 µM
de BAP) foram utilizadas como explantes. Esses foram constituídos de
microestacas destacadas dos tufos com aproximadamente 1 cm de comprimento e
inoculados em frascos de cultivo contendo 30 mL de meio de cultura, conforme os
experimentos.
5.2.2 Condições de cultura
5.2.2.1 In vitro
As culturas foram realizadas em frascos de vidro de 6 cm de diâmetro e 9
cm de altura, vedados com tampa de polipropileno rígido, mantidos em sala
climatizada por 30 dias, equipada com lâmpadas fluorescentes do tipo “luz do dia”,
irradiância de 20 µmol m
-2
s
-1
, fotoperíodo de 16 h e temperatura de 25 ± 2º C.
59
5.2.2.2 Ex vitro
Após o cultivo in vitro, as plantas que apresentaram raízes foram
transferidas para casa-de-vegetação, aclimatizadas em tubetes de prolipropileno
(capacidade de 53 cm
3
) com substrato Plantmax HT
®
e mantidas sob nebulização
intermitente (das 8:00 às 17:00 h irrigação de 15 s a cada 15 min; das 17:00 às
23:00 h irrigação de 15 s a cada 1 hora e das 23:00 às 8:00 h irrigação de 15 s a
cada 3 h) por 30 dias, sendo então transferidas para bancada e irrigadas
manualmente conforme a necessidade.
5.2.3 Variáveis analisadas
Em todos os experimentos, após 30 dias da inoculação nos diferentes meios
de cultura, foram analisadas em laboratório as variáveis porcentagem de explantes
enraizados, número médio de raízes por explante, comprimento médio de raízes,
altura da parte aérea (cm) e massa fresca total (g).
Aos 30 e 60 dias da transferência para o substrato, foi avaliada a
porcentagem de sobrevivência das plantas.
5.2.4 Efeito do ANA, AIA e AIB no enraizamento in vitro de M. alternifolia
Microestacas de M. alternifolia com aproximadamente 1 cm de comprimento
foram inoculadas em meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) semi-
sólido (6 gL-1), suplementado com vitaminas e compostos orgânicos do meio MS e
30 g L
-1
de sacarose, onde foram variados o tipo de auxina (ANA, AIA ou AIB) e as
suas concentrações (0,53 e 2,64 µM).
Todos os reguladores vegetais foram adicionados ao meio de cultura antes
da esterilização do mesmo, que ocorreu em autoclave a 1 atm e 121 ºC, durante 20
minutos.
60
5.2.5 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, num arranjo
bifatorial 3x3, considerando duas concentrações (0,53 e 2,64 µM) e um controle sem
auxina, e três tipos de auxinas (ANA, AIA e AIB). Cada tratamento foi constituído de
cinco repetições de cinco explantes cada, sendo os resultados apresentados, a
média de três experimentos.
Os dados oriundos de porcentagem foram transformados para
arcoseno 100/x e os de contagem para 1+x , submetidos à análise de variância e
ao teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Para o processamento
dos dados, utilizou-se o programa computacional SOC (Embrapa, 1990).
5.2.6 Efeito de diferentes concentrações de sacarose no enraizamento in vitro de M.
alternifolia
Microestacas de M. alternifolia com aproximadamente 1 cm de comprimento
foram inoculadas em meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) semi-
sólido, suplementado com 6 g L
-1
de ágar (Vetec
®
) com diferentes concentrações de
sacarose (15, 30 e 45 g L
-1
).
5.2.7 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, sendo que os
tratamentos foram constituídos por três concentrações de sacarose (15; 30; e 45 g L
-
1
). Cada tratamento apresentou cinco repetições de cinco explantes cada, sendo os
resultados apresentados, a média de três experimentos.
Os dados oriundos de porcentagem foram transformados para
arcoseno 100/x e os de contagem para 1+x , submetidos à análise de variância e
ao teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Utilizou-se para o
processamento dos dados, o programa computacional SOC (Embrapa, 1990).
61
5.2.8 Efeito de diferentes meios de cultura no enraizamento in vitro de M. alternifolia
Microestacas de M. alternifolia com aproximadamente 1 cm de comprimento
foram inoculadas em meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) semi-
sólido (6 gL
-1
de ágar). Os tratamentos consistiram do meio de cultura MS com a
concentração de sais normal ou reduzida à metade (MS/2), com ou sem carvão
ativado (2 g L
-1
).
5.2.9 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com quatro
tratamentos, onde cada tratamento apresentou cinco repetições de cinco explantes
cada, sendo os resultados apresentados, a média de três experimentos.
Os dados oriundos de porcentagem foram transformados para
arcoseno 100/x e os de contagem para 1+x , submetidos à análise de variância e
ao teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Utilizou-se para o
processamento dos dados, o programa computacional SOC (Embrapa, 1990).
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.3.1 Efeito do ANA, AIA e AIB no enraizamento in vitro de M. alternifolia
De forma geral, a iniciação do enraizamento foi verificada após o 8º dia da
inoculação das microestacas nos meios de enraizamento, sendo que no tratamento
controle (sem adição de auxina), as raízes apresentavam-se mais finas, maleáveis, e
em menor número (2,3) (FIGURA 5A).
Em relação às variáveis porcentagem de enraizamento e massa fresca total,
verificou-se que a interação entre os fatores tipo de auxina e concentrações testadas
não foi significativa (ANEXOS 15 e 16). Porém, houve diferença significativa entre as
concentrações, onde a ausência de auxina e a menor concentração testada (0,53
62
µM) possibilitaram maior porcentagem de enraizamento em relação à concentração
de 2,64 µM. Já a maior concentração proporcionou, por outro lado, incremento em
massa fresca significativo (TABELA 7), provavelmente pelo fato dessa condição ter
favorecido a variável número médio de raízes.
TABELA 7 - PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO E MASSA FRESCA DE MICROESTACAS
ENRAIZADAS EM MEIO DE CULTURA MS CONTENDO DIFERENTES TIPOS E
CONCENTRAÇÕES DE AUXINA.
Auxinas (µM) Enraizamento (%) Massa fresca (g)
0,00
0,53
2,64
100 a
96,0 a
90,6 b
0,15 c
0,22 b
0,27 a
CV(%) 13,63 11,29
* Médias seguidas com letras idênticas nas colunas não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de probabilidade de erro.
De forma semelhante, em amoreira-preta cv Brazos, Augusto (2001) verificou
que na ausência de auxina no meio de cultura, o enraizamento foi de 100%.
Entretanto, em muitos casos as auxinas aumentam o porcentual de enraizamento in
vitro, como foi verificado por Randmann (2002) no porta-enxerto de macieira M-9.
Já Dibax (2007) não encontrou diferenças significativas entre os resultados
quando utilizou a auxina ANA (0; 1,35; 2,70 e 5,4
µM)
durante o enraizamento de E.
saligna. As porcentagens de microestacas enraizadas variaram entre 59,75 e
76,25%, sendo que o controle, constituído pelo meio MS/2 sem ANA, apresentou
73,75%. Valores semelhantes foram encontrados no enraizamento de microestacas
de E. botryoides, E. camaldulensis, E. deglupta e E. grandis por Ito et al. (1996),
quando foram utilizadas concentrações inferiores às testadas por Dibax (2007),
sugerindo que para estes casos, as concentrações endógenas de auxinas são
suficientes para a promoção do enraizamento, como o verificado em M. alternifolia.
As variáveis número médio de raízes, comprimento médio e altura da parte
aérea, por outro lado, apresentaram interação significativa entre os tipos e as
concentrações de auxina utilizadas (ANEXOS 17 à 19).
Na variável número de raízes, analisando o efeito das concentrações em cada
tipo de auxina testadas, a concentração de 2,64 µM foi superior estatisticamente a
0,53 µM nos três tipos de auxinas. Analisando o efeito do tipo da auxina nas
concentrações testadas, na concentração de 0,53 µM o ANA mostrou-se superior
em relação ao AIA e AIB para esta variável. Contrariamente, na concentração de
2,64 µM o ANA mostrou-se inferior as outras duas auxinas (TABELA 8).
63
TABELA 8 – NÚMERO E COMPRIMENTO MÉDIO DE RAÍZES E ALTURA DA PARTE AÉREA DE
MICROESTACAS ENRAIZADAS EM MEIO MS CONTENDO DIFERENTES TIPOS E
CONCENTRAÇÕES DE AUXINA.
Número de raízes
Auxinas
Concentração (µM) ANA AIA AIB
0,00
0,53
2,64
2,3 cA
7,5 bA
8,0 aB
2,3 cA
4,9 bB
10,1aA
2,3 cA
4,5 bC
10,2 aA
CV(%) 6,93
Comprimento das raízes (cm)
Auxinas
Concentração (µM) ANA AIA AIB
0,00
0,53
2,64
1,7 bA
2,1 aB
1,3 cB
1,7 bA
2,6 aA
1,7 bA
1,7 bA
2,4 aA
1,6 bA
CV(%) 7,67
Altura da PA (cm)
Auxinas
Concentração (µM) ANA AIA AIB
0,00
0,53
2,64
2,3 aB
3,1 aB
2,7 bB
2,3 bA
3,6 aA
3,5 aA
2,3 cA
3,3 bAB
3,7 aA
CV(%) 10,38
Médias seguidas por letras minúsculas idênticas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
entre si pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro.
No presente experimento, pôde-se perceber também que a ausência da
auxina, embora tenha favorecido o enraizamento, proporcionou menor produção de
raízes por explante. Diferentemente, Radmann et al. (2003) ao estudarem a
influência do AIB (0,5 e 10 µM) no enraizamento de amoreira-preta em meio MS,
verificaram que o maior número de raízes por explante (5,5) ocorreu no tratamento
sem auxina.
Observou-se que as raízes formadas em meio de cultura contendo auxina
apresentavam-se mais grossas que as formadas na ausência do regulador vegetal,
sendo naquela situação também observada a formação de calos na base das raízes.
Alguns autores ressaltam que a formação de raízes grossas e/ou calos é indesejável
durante esta etapa, visto que podem interferir na funcionabilidade do sistema
radicial, comprometendo assim a aclimatização das plantas e o completo
desenvolvimento dos protocolos de micropropagação (GRATTAPAGLIA e
MACHADO, 1998; COMPTON et al., 2001).
64
Com relação ao comprimento das raízes, verificando o efeito das
concentrações em cada tipo de auxina, a concentração de 0,53 foi superior
estatisticamente em todos os três tipos para esta variável. Já analisando o efeito do
tipo do regulador vegetal em cada concentração, tem-se que na concentração de
0,53 µM, AIA e AIB foram superiores ao ANA e na concentração de 2,64 µM ocorreu
o mesmo efeito (TABELA 8). Já Melo et al. (2001) verificou que o ANA foi superior
ao AIB quanto ao comprimento das raízes (5,6 e 0,79 cm, respectivamente) de
guarirobeira, mostrando que o efeito da auxina é muito variável entre as espécies.
Com relação à altura da parte aérea, analisando o efeito das concentrações
dentro de cada tipo de auxina testada, para o ANA a melhor concentração foi 0,53
µM, para o AIA as duas concentrações tiveram o mesmo efeito e para AIB 2,64 µM
foi superior. Verificando o efeito do tipo de auxina em cada concentração, em 0,53
µM o AIA foi superior ao ANA não diferindo da testemunha, e em 2,64 µM, AIA e AIB
tiveram o mesmo comportamento, sendo superiores ao ANA (TABELA 8). O maior
valor encontrado para esta variável foi com a utilização de 2,64 µM de AIB (3,7 cm).
De forma geral produziu-se plantas entre 2,3 e 3,7 cm de comprimento.
A suplementação de auxinas ao meio de enraizamento é usual, entretanto, há
espécies que enraízam com facilidade e não necessitam da presença destes
reguladores, o que pode ser explicado pelo elevado nível endógeno desses
reguladores vegetais (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; PINTO e LAMEIRA,
2001).
List et al. (1996) ao testarem duas concentrações de AIA (0,1 e 1,0 µM) no
enraizamento de M. alternifolia em meio MS semi-sólido, encontraram valores
crescentes para ambas as concentrações quanto ao incremento no número de
raízes no decorrer de 8 semanas, relatando a ocorrência de 80% de enraizamento
ao final deste período, em ambas as concentrações.
Já no presente trabalho, a ausência de auxina possibilitou resultados
satisfatórios em relação ao enraizamento in vitro em todas as variáveis analisadas,
sendo superiores aos encontrados por List et al. (1996) Esta condição permitiu a
maior porcentagem de enraizamento (100%), demonstrando que a espécie
provavelmente possui níveis endógenos de auxina satisfatórios e suficientes para
que ocorra o enraizamento.
65
5.3.2 Efeito de diferentes concentrações de sacarose no enraizamento in vitro de
Melaleuca alternifolia
A análise de variância mostrou que houve significância para todas as
variáveis analisadas, sendo que houve uma tendência de aumento nas variáveis à
medida que ocorria o acréscimo na concentração de sacarose, até 30 g L
-1
(ANEXOS 20 a 24 e FIGURA 4).
A iniciação radicial visualmente aconteceu a partir do 12º dia da inoculação
em praticamente todos os tratamentos, exceto no tratamento testemunha, com
ausência de sacarose, sugerindo que a presença de carboidrato influencia na
velocidade de enraizamento de M. alternifolia. Este fato vai ao encontro da afirmativa
que além dos nutrientes, os carboidratos também têm efeito sobre a formação de
raízes adventícias (ASSIS e TEIXEIRA, 1998; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998;
PASQUAL, 2001; ALOUFA, 2003).
Analisando a porcentagem de enraizamento, verificou-se um efeito quadrático
positivo, onde a máxima eficiência estimada é de 30,8 g L
-1
. Segundo George
(1996), para a formação de raízes in vitro há necessidade de energia e carboidratos,
sendo estes fornecidos pela fotossíntese (em condições autotróficas) ou oriundos de
uma fonte exógena de açúcar (em sistema heterotrófico ou mixotrófico).
Na ausência de sacarose ocorreu enraizamento, em taxa baixa, sugerindo
que as reservas de carboidratos contidas nos tecidos, devido ao cultivo em meio
anterior contendo sacarose, possivelmente foram utilizadas como fonte de energia
para promover a formação de raízes.
A concentração de sacarose não deve ser superior a 30 g L
-1
, pois acima
desta concentração existe uma tendência de redução em todas as variáveis
analisadas (FIGURA 4).
Em marmeleiro, Erig et al. (2004) verificaram que a ausência de sacarose
ocasionou as menores porcentagens de enraizamento. Resultados semelhantes
foram obtidos por Lane (1978), onde concentrações de sacarose inferiores a 20 g.L
-1
e superiores a 50 g.L
-1
no meio de cultura, prejudicaram o enraizamento de macieira.
Da mesma forma, De Paoli et al. (2002) também observaram que brotos de
Cydomalus (Malus communis x Cydonia oblonga) enraizaram com dificuldade em
meio de cultura sem sacarose.
66
y = -0,093x
2
+ 5,72x + 17,8
(R
2
= 0,98)
0
20
40
60
80
100
120
0 15 30 45
Sacarose (g.L
-1
)
Enraizamento (%)
A
y = -0,00193x
2
+ 0,147x + 0,109
R
2
= 0,93
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 15 30 45
Sacarose (g.L
-1
)
Número médio de raízes
B
y = -0,0018x
2
+ 0,122x + 0,16
R
2
= 0,92
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 15 30 45
Sacarose (g.L
-1
)
Comprimento médio das raízes (cm)
C
D
y = -0,00109x
2
+ 0,078x + 1,34
R
2
= 0,86
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 15 30 45
Sacarose (g.L
-1
)
Altura da parte aérea (cm)
y = -0,000088x
2
+ 0,0053x + 0,091
R
2
= 0,92
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0 15 30 45
Sacarose (g.L
-1
)
Massa fresca total (g)
E
FIGURA 4 - EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE NA PORCENTAGEM
DE ENRAIZAMENTO DE M. alternifolia (A); NÚMERO MÉDIO DE RAÍZES (B);
COMPRIMENTO MÉDIO DE RAÍZES (C); ALTURA DA PARTE AÉREA (D) E MASSA
FRESCA TOTAL (E).
Nos estudos realizados por Leite et al. (2000) com porta-enxerto de pereira,
maior porcentagem de enraizamento foi obtida com 20 g L
-1
de sacarose. Isutsa
(2004) não obteve diferença quanto à porcentagem de enraizamento in vitro de
67
Passiflora edulis, quando utilizou 20 ou 30 g L
-1
de sacarose, já que em ambas
concentrações houve 100% de enraizamento.
Estes resultados mostram que existe variação na resposta rizogênica entre as
espécies em relação à concentração de carboidratos existente no meio de cultura.
No entanto, a relação exata entre auxinas, carboidratos e enraizamento é bastante
complexa e o seu completo entendimento ainda é desconhecido e exige estudos
mais elaborados (VEIERSKOV, 1988; ALOUFA, 2003).
As médias relativas às variáveis número, comprimento, altura da parte aérea
e massa fresca foram superiores à medida que se aumentou o suprimento de
sacarose no meio de cultura. É evidente a diferença no comprimento da parte aérea
das plantas mantidas em meio de cultura com a suplementação de carboidrato
(FIGURA 5B).
Observou-se a ocorrência de coloração escura (FIGURA 5B) nos explantes
mantidos em meio de cultura contendo maior concentração de sacarose, uma maior
sensibilidade a desidratação, além da produção de folhas mais estreitas.
Provavelmente a alta concentração de sacarose interferiu em algum processo
relativo à produção de clorofila em Melaleuca. Entretanto, para confirmar tal
hipótese, se faz necessário a realização de testes relativos à quantificação dos
teores de clorofilas nas folhas submetidas ao cultivo em meio de cultura com
distintas concentrações de sacarose.
De uma maneira geral, os explantes que foram cultivados na ausência de
sacarose não se desenvolveram em altura e não formaram raízes, sendo que as
plantas dos demais tratamentos apresentaram coloração semelhante. A sacarose
influenciou de forma positiva o enraizamento de M. alternifolia, mostrando-se
necessária nessa fase do cultivo in vitro. O observado concorda com vários autores
que mencionam como sendo indispensável o fornecimento de sacarose no processo
de enraizamento in vitro (BOSA et al., 2003; CALVETE et al., 2002; LEITE et al.,
2000; SEON et al., 1999).
Já Santana et al. (2008) indicam que a presença de sacarose no meio foi
dispensável na fase de enraizamento de Annona glabra, relatando que o estímulo do
comportamento fotoautotrófico foi obtido com sucesso durante a fase de
enraizamento in vitro da espécie. Entretanto, esse comportamento foi verificado
pelos autores nos explantes mantidos em tubos de ensaio vedados com algodão e
68
com tampa plástica sem película de PVC, que ocasionou assim maior aeração
dentro do recipiente de cultivo.
Nesse sentido, Kozai et al. (2004), afirmam que a baixa concentração de CO
2
nos frascos durante a maior parte do fotoperiodo é devida em parte ao baixo índice
de ventilação dos frascos hermeticamente fechados e a uma quantidade de CO
2
limitada nos pequenos frascos de cultivo. A baixa concentração de CO
2
inibe a
atividade fotossintética nas plantas in vitro forçando as plantas a desenvolverem um
crescimento heterotrófico ou fotomixotrófico pela absorção de sacarose do meio de
cultura como sua principal fonte de carbono. Já Capellades et al. (1991) e Hdider e
Desjardins (1994) sugerem ainda que in vitro não há atividade fotossintética em
presença de altas concentrações de sacarose, devido ao acúmulo de amido ou à
inibição da enzima Rubisco. Reduções nas taxas fotossintéticas em decorrência do
acúmulo de amido nas folhas de cafeeiro foram demonstradas por Da Matta et al.
(1997).
Em mamoeiro, Schmildt et al. (2007), perceberam que na ausência de
sacarose as folhas apresentaram-se aclorofiladas. Segundo Grattapaglia e Machado
(1998), adições de sacarose no meio de cultivo em concentrações menores de 20 g
L
-1
podem causar clorose generalizada da cultura, o que não foi observado em M.
alternifolia. Em contraposição, a adição de sacarose no meio de cultivo em
concentrações acima de 40 g L
-1
podem causar um excessivo decréscimo do
potencial hídrico do meio, podendo ocasionar desidratação dos tecidos e levar à
deterioração das culturas.
No presente trabalho o número de raízes foi favorecido pela presença de
sacarose, havendo uma tendência de estabilização na maior concentração (45 g L
-1
).
Já Schmildt et al. (2007) relataram que em mamoeiro, o número médio de raízes
formadas nos segmentos nodais foi muito próximo nos níveis 15, 30 e 0 g L
-1
de
sacarose, com valores de 3,35; 2,87 e de 2,75 raízes por ramo, respectivamente. As
concentrações de sacarose de 45 e 60 g L
-1
promoveram menores emissões de
raízes formando, respectivamente, 1,80 e 2,01 raízes por microestaca.
Em Melaleuca, o enraizamento, o comprimento médio e a massa fresca total
também foram crescentes, respondendo de forma positiva até a maior concentração
testada. Pelos gráficos percebe-se que há uma tendência de decréscimo destas
variáveis em concentrações superiores a esta, apresentando provavelmente nestes
casos, um efeito inibitório ao enraizamento (FIGURA 4).
69
Entretanto, segundo Souza e Pereira (2007), os carboidratos em si não
aumentam a resposta ao enraizamento, e sim são fontes de energia e de carbono
para a síntese de substâncias essenciais para a formação de raízes. Nessa mesma
perspectiva, Assis e Teixeira (1998) comentam que, durante a etapa de
enraizamento, quantidades ótimas de carboidratos devem ser consideradas, visto
que a sua influência sobre a formação das raízes in vitro, está relacionada ao
requerimento de energia durante o processo de iniciação radicular. Além disto, no
meio de cultura também exercem a função de agente osmótico.
5.3.3 Efeito de diferentes meios de cultura no enraizamento in vitro de Melaleuca
alternifolia
Por meio da análise de variância (Anexos 25 a 29), constatou-se que houve
diferenças estatísticas entre os resultados obtidos nos meios de cultura testados
para todas as variáveis analisadas. Verificou-se que o meio MS apresentou
porcentagem de enraizamento de 100%, superior aos demais meios (TABELA 9).
TABELA 9 – EFEITO DE DIFERENTES VARIAÇÕES DO MEIO MS NO ENRAIZAMENTO IN VITRO
DE Melaleuca alternifolia.
Meio
Enraizamento
(%)
Nº médio
raízes
Comprimento
médio raízes
(cm)
Altura
parte aérea
(cm)
Massa
fresca
total (g)
MS/2
MS
MS/2+CA
MS+CA
64 b
100 a
28 c
36 c
2,72 a
3,00 a
1,36 b
1,18 b
3,34 a
2,20 c
3,32 a
2,78 b
2,06 c
3,27 a
2,60 b
3,42 a
0,137 c
0,189 a
0,148 c
0,165 b
Média Geral
57 2,06 2,91 2,83 0,160
CV(%) 15,0 9,0 7,7 10,9 5,3
Médias seguidas com letras idênticas na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de probabilidade de erro.
A influência da composição dos meios de cultura no processo de
enraizamento adventício in vitro, está relacionada à concentração de sais minerais
empregados no preparo do mesmo e na presença de reguladores vegetais. De
modo geral, o uso de meios menos concentrados tem permitido melhores resultados
no enraizamento de plantas in vitro (McCOWN, 1988; GRATTAPAGLIA e
MACHADO, 1998; PINTO e LAMEIRA, 2001; PASQUAL, 2001; ALOUFA, 2003;
SOUZA et al., 2004; LIMA, 2004). A alta concentração de sais, que compõem o meio
70
básico MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), mesmo em presença de auxinas, pode
inibir o enraizamento in vitro (McCOWN, 1988). Diluições para ½, e até ¼ de sais,
têm possibilitado melhores resultados para muitas espécies de plantas. No presente
trabalho, a redução da concentração de sais do meio MS prejudicou o enraizamento
da espécie, cujo valor foi estatisticamente inferior (64%) ao mesmo meio completo
(100%) (TABELA 9).
De acordo com Grattapaglia e Machado (1998), os efeitos benéficos da
adição do carvão ativado ao meio de cultura estão relacionados a aspectos físicos,
já que o carvão ativado simula uma condição de escuro, situação mais favorável ao
desenvolvimento de raízes adventícias, além de adsorver substâncias prejudiciais ao
enraizamento, como os compostos fenólicos.
Estudos de multiplicação e enraizamento in vitro de Acacia mearnsii
realizados em meio MS suplementado com carvão ativado, mostraram a eficiência
desse elemento no enraizamento, no desenvolvimento normal da parte aérea e na
prevenção de clorose nas folhas (QUOIRIN et al., 2001). Efeito positivo no
enraizamento de Ensete ventricosum e Argania spinosa foi também relatado por
Negash et al. (2000) e Bousselmane et al. (2001), respectivamente.
Contudo, a presença do carvão ativado não foi benéfica ao enraizamento de
Melaleuca, diminuindo consideravelmente as porcentagens de enraizamento quando
adicionado ao meio MS completo e MS/2, onde as porcentagens foram as mais
baixas encontradas, 36 e 28% respectivamente. Segundo a literatura, esta
substância pode também adsorver auxinas e nutrientes do meio de cultura,
necessários ao enraizamento e desenvolvimento normal da parte aérea (McCOWN,
1988; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998; PASQUAL, 2001; PINTO e LAMEIRA,
2001; ALOUFA, 2003). Possivelmente, a concentração utilizada de carvão ativado
não foi adequada, fazendo-se necessário o estudo de menores concentrações, já
que Grattapaglia e Machado (1998) mencionam que as concentrações de carvão
adicionadas ao meio de enraizamento podem variar de 0,1 a 2%, e no presente
estudo, foi utilizada a concentração máxima limite.
Resultados negativos quanto ao enraizamento em meio contendo carvão
ativado foram obtidos também para a espécie Ananas porteanus, conhecida como
abacaxi ornamental. Os resultados mostraram que ocorreu uma redução no tempo
de indução, número de raízes e porcentagem de enraizamento (BORGES et al.,
2001).
71
O carvão ativado também reduziu significativamente o número de raízes
emitidas por explante, em relação aos mesmos meios sem a sua suplementação,
provavelmente pelo fato de ter adsorvido nutrientes essenciais ao enraizamento.
Contudo, aparentemente as plantas enraizadas nos tratamentos testados no
presente experimento apresentavam alto vigor (FIGURA 5C ).
5.3.4 Efeito dos meios de cultura utilizados no enraizamento sobre a sobrevivência
das plantas
Analisando a sobrevivência das plantas advindas dos meios de cultura
estudados neste trabalho, tem-se que o meio MS adicionado de 30 g L
-1
de sacarose
proporcionou ao final de 30 e 60 dias da transferência para casa-de-vegetação, uma
taxa de 100% de sobrevivência, tornando o protocolo economicamente viável. Esse
valor foi superior estatisticamente aos dos demais meios (TABELA 11).
TABELA 10 – SOBREVIVÊNCIA DAS PLANTAS DE M. alternifolia, ENRAIZADAS EM MEIOS DE
CULTURA CONTENDO DIFERENTES TIPOS DE CONCENTRAÇÕES DE AUXINA,
AOS 30 E 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO.
Data Tratamentos 30 dias 60 dias
05/02/08
MS
MS + 0,53 µM AIA
MS + 2,64 µM AIA
MS + 0,53 µM ANA
MS + 2,64 µM ANA
MS + 0,53 µM AIB
MS + 2,64 µM AIB
80 a
28 c
16 d
28 c
20 cd
44 b
28 c
74 a
24 cd
16 d
28 c
20 cd
40 b
22 cd
CV(%) 20,94 20,69
Médias seguidas com letras idênticas na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de probabilidade de erro.
TABELA 11 - SOBREVIVÊNCIA DAS PLANTAS DE M. alternifolia, ENRAIZADAS EM MEIO DE
CULTURA MS COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE, AOS 30 E
60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO.
Data Tratamentos 30 dias 60 dias
07/02/08
MS (0 g L
-1
sacarose)
MS (15 g L
-1
sacarose)
MS (30 g L
-1
sacarose)
MS (45 g L
-1
sacarose)
44 c
80 b
100 a
49 c
44 c
76 b
100 a
36 d
CV(%) 6,31 9,42
Médias seguidas com letras idênticas na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de probabilidade de erro.
72
TABELA 12 – SOBREVIVÊNCIA DAS PLANTAS DE M. alternifolia, ENRAIZADAS EM DIFERENTES
MEIOS DE CULTURA, AOS 30 E 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO.
Data Tratamentos 30 dias 60 dias
10/02/08
MS
MS/2
MS + 0,2 % CA
MS/2 + 0,2 % CA
94 a
88 a
68 b
64 b
94 a
80 b
64 c
60 c
CV(%) 14,2 12,28
Médias seguidas com letras idênticas na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan ao
nível de 5% de probabilidade de erro.
Na aclimatização, as plantas que foram enraizadas em meio contendo
auxinas tiveram as menores taxas de sobrevivência (TABELA 10). Possivelmente as
raízes que foram produzidas in vitro sob estas condições não eram funcionais. Além
disto, para Bhojwani e Razdan (1983), a diferenciação em tecidos vasculares é
afetada pela presença de auxinas e sacarose e o efeito da auxina na diferenciação
de tecidos vasculares está relacionado com a presença de sacarose. As raízes
produzidas em meio de cultura contendo auxina, como já mencionado,
apresentavam-se quebradiças, fato que foi observado em algumas plantas no
momento da transferência.
Outro aspecto que pode ter influenciado a baixa taxa de sobrevivência
destas plantas foi o tempo de permanência do explante em contato com a auxina (30
dias). A importância da relação entre concentração de auxina e tempo de
permanência foi demonstrada no trabalho realizado por Radmann et al. (2002). Eles
avaliaram a capacidade de enraizamento in vitro de diferentes porta-enxertos de
macieira e concluíram que as estacas que permaneceram por 10 dias na presença
de ANA, apresentaram maior porcentagem de enraizamento do que aquelas que
permaneceram por períodos mais prolongados.
As plantas enraizadas na ausência de sacarose apresentaram uma
sobrevivência de 44% ao final de 60 dias da aclimatização (TABELA 11), enquanto
as enraizadas em meio contendo 15 e 30 g L
-1
de sacarose, tiveram 76 e 100%,
respectivamente. Isto comprova a importância da sacarose no acúmulo de energia
que é utilizada durante este processo de aclimatização de Melaleuca até a emissão
de novas raízes. Já na concentração de 45 g L
-1
de sacarose a taxa de
sobrevivência das mudas decresceu para 36%, semelhante as enraizadas em meio
sem a presença de sacarose, diferentemente do encontrado por Calvete (1998), que
73
ao enraizar mudas de morangueiro nesta mesma concentração, encontrou a melhor
taxa de sobrevivência .
O meio MS/2 merece destaque por ter proporcionado a segunda maior taxa
de sobrevivência das mudas (80%) após 60 dias de aclimatização (TABELA 12).
Mesmo valor (80%) foi encontrado por Dibax (2007) ao aclimatizar mudas de
Eucalyptus saligna enraizadas neste meio de cultura de mesma formulação ao
utilizado no presente trabalho. Já quando o MS/2 foi suplementado com 2 g L
-1
de
carvão ativado, proporcionou 64% de sobrevivência. Entretanto, Quisen (2007) ao
utilizar este meio com a mesma concentração de carvão ativado no enraizamento de
Eucalyptus camaldulensis, encontrou ao final de 20 dias da aclimatização uma taxa
de 87% de sobrevivência.
As plantas enraizadas em meio MS nos três experimentos realizados
apresentaram as maiores taxas de sobrevivência (74%, 100% e 94%) quando
comparadas com os demais tratamentos dentro de cada experimento. Essa
diferença pode estar relacionada às condições climáticas nos dias que ocorreram os
transplantes.
No presente trabalho, tanto em termos de enraizamento como de
aclimatização, o meio de cultura MS completo possibilitou maior porcentagem de
enraizamento, possibilitando condições para M. alternifolia alcançar uma ótima taxa
de aclimatização. As mudas apresentaram desenvolvimento satisfatório em casa-de-
vegetação, após 60 dias de aclimatização (FIGURA 5D).
5.4 CONCLUSÕES
De acordo com as condições em que o presente trabalho foi realizado, pode-
se concluir que:
- Para o enraizamento de M. alternifolia, é dispensável o suprimento de
auxinas no meio de cultura.
- A sacarose influencia de forma positiva o enraizamento e a aclimatização,
obtendo-se o maior percentual em ambas as fases com 30 g L
-1
, sendo necessária
ao cultivo in vitro da espécie.
- O meio de cultura MS é o que permite maior taxa de enraizamento e
sobrevivência após a aclimatização das mudas.
74
FIGURA 5- A. ASPECTO DAS PLANTAS ENRAIZADAS DE M. alternifolia EM DIFERENTES TIPOS
E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS NO MEIO DE CULTURA MS. B. ASPECTO DAS
PLANTAS ENRAIZADAS DE M. alternifolia EM MEIO DE CULTURA MS COM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE. C. ASPECTO DAS PLANTAS
ENRAIZADAS DE M. alternifolia EM DIFERENTES VARIAÇÕES DO MEIO MS. D.
ASPECTO DAS MUDAS DE M. alternifolia APÓS 30 DIAS DE ACLIMATIZAÇÃO.
BARRA: 1 CM.
B
A
C
D
A
NA
0 g L
-
1
45 g L
-
1
30 g L
-
1
15 g L
-
1
A
IB
A
IA
A
NA
A
IB
A
IA
0,53µM
0,53µM
0,53µM
2,64µM
2,64µM
2,64µM
0 µM
MS MS/2 MS/2+CA MS+CA
75
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79
6 CONCLUSÕES GERAIS
O estabelecimento in vitro de Melaleuca alternifolia é possível mediante o
isolamento de segmentos nodais. A utilização de fungicida durante a assepsia e a
inoculação em meio de cultura MS, permite maior produção de brotações por
segmento nodal inoculado do que o meio WPM.
A multiplicação pode ser realizada em meio de cultura MS líquido,
suplementado com 1,11 µM BAP que favorece maior produção de brotações
múltiplas alongadas, não havendo necessidade de fase de alongamento.
Para o enraizamento e aclimatização, sugere-se o meio MS com 30 g L
-1
de
sacarose, isento de reguladores vegetais e carvão ativado, para que ocorra
sobrevivência satisfatória (100%) após a aclimatização das mudas em substrato
Plantmax HT
®
.
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A micropropagação de M. alternifolia utilizando o protocolo estabelecido no
presente trabalho utilizando meio de cultura MS com 1,11 M BAP, permitiu produzir
ao final de 60 dias, 11,8 brotos por nó, sendo superior ao protocolo elaborado por
List et al. (1996) que ao final de 20 semanas, produziu 7 plantas por nó cultivado.
Contudo, testes envolvendo a aplicação de fungicida nas plantas matrizes em
casa-de-vegetação, agitação dos frascos quando realizado cultivo em meio líquido e
concentrações menores de carvão ativado durante as fases de estabelecimento in
vitro e enraizamento, são sugeridas. Além disto, no cultivo inicial sugere-se o
isolamento em meio de cultura suplementado com BAP.
Visando a produção comercial em larga escala, e tendo em vista o bom
desempenho das brotações submetidas à multiplicação em meio de cultura líquido,
sugere-se estudos envolvendo a utilização de biorreatores na micropropagação da
espécie.
Para a fase de enraizamento, em virtude do nível endógeno de auxina na
espécie, recomenda-se testes envolvendo o enraizamento ex vitro, o que diminuiria
80
assim o período de cultivo in vitro e uso de mão de obra, e conseqüentemente, o
custo.
A análise do conteúdo de clorofila nas plantas submetidas ao cultivo em
diferentes concentrações de sacarose durante o enraizamento seria interessante,
bem como o estudo da influência do tipo de vedação do frasco de cultivo.
81
ANEXOS
82
ANEXO 1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS MEIOS DE CULTURA MS E WPM:
MS WPM
Macronutrientes mgL
-1
µM mgL
-1
µM
NH
4
NO
3
1650 20612,12 400 5000,00
KNO
3
1900 18791,41 - -
K
2
SO
4
- - 990 5680,40
KH
2
PO
4
170 1249,17 170 1249,70
Ca(NO
3
)2.4H
2
O - - 556 2354,40
CaCl
2
.2H
2
O 440 2992,59 96 652,93
MgSO
4
.7H
2
O 370 1501,01 370 1501,10
Micronutrientes
Fe
2
SO
4
.7H
2
O 27,80 100,00 27,80 100,00
Na
2
EDTA 37,30 100,20 37,30 100,20
H
3
BO
3
6,20 100,26 6,20 100,26
MnSO
4
.4H
2
O 22,30 100,00 22,30 100,00
ZnSO
4
.7H
2
O 8,60 29,91 8,60 29,91
KI 0,83 5,00 - -
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 1,03 0,25 1,03
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,10 - -
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 0,10 0,25 1,00
Substâncias orgânicas do meio MS mgL
-1
Tiamina.HCl
Piridoxina.HCl
Ácido Nicotínico
Glicina
Mio-inositol
Sacarose
0,1
0,5
0,5
2
100
30000
83
ANEXO 2 – COMPOSIÇÃO IÔNICA DOS MEIOS MS E WPM.
ANEXO 3 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
CONTAMINAÇÃO BACTERIANA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Desinfestação 6 11581.04319924 1930.17386654 72.83 *
Resíduo 28 741.99512228 26.49982580
Total 34 12323.03832152
Média: 36.9
CV (%): 13,9
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 4 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
CONTAMINAÇÃO FÚNGICA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Desinfestação 6 760.256156 126.709359 3.1498 *
Resíduo 28 1126.390309 40.22822535
Total 34 1886.64646595
Média: 35,8
CV (%): 17,6
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
MS WPM
Macroelementos (mM)
NH
+
4
NO
-
3
K
+
Ca
+2
Mg
+2
SO
=
4
PO
=
4
PO
3
=
20,61
39,40
20,04
2,99
1,50
1,73
1,25
0,1
5,00
9,71
12,61
3,01
1,50
7,41
1,25
0,1
Microelementos (µM)
Mn
+2
Zn
+2
Na
+2
Fe
+2
Cl
-
Co
+2
Cu
+2
MoO
=
4
B
+3
100
29,91
202,40
100
6000
0,105
0,100
1,03
100
2,1
30
202,50
100
1306
-----
0,100
1,03
100
Total de íons (mM) 94,213 41,063
NH
4
+ NO
3
NH
4
/NO
3
60
0,52
14,58
0,51
84
ANEXO 5 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Sobrevivência 6 15733.61417 2622.269029 44.0243 *
Resíduo 28 1667.7951083 59.564111
Total 34 17401.409282
Média: 24,2
CV (%): 31,8
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 6 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL NÚMERO MÉDIO DE
BROTAÇÕES POR EXPLANTE NO CULTIVO INICIAL.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Tipo de meio 1 0,00132 0,00132 0,358 ns
Característica do meio 2 3,32792 1,66396 452,404*
Tipo x Variação 2 0,0072 0,0036 0,978 ns
Resíduo 24 0,08827 0,00368
Total 29 3,42471
Média: 1,4
CV (%): 4,2
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 9.0525433 9.0525433 35.114*
BAP 5 21.491439 4.2982879 16.672*
Subcultivos 1 0.0034141 0.0034141 0.013 ns
Consist x BAP 5 8.85798703 1.771597 6.871*
Consist x Subcultivos 1 0.00008290 0.000082 0.0003 ns
BAP x Subcultivos 5 0.00414320 0.000828 0.0032 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 0.00627889 0.001255 0.0049 ns
Resíduo 96 24.7492375 0.257804
Total 119 64.1651270
Média: 1.53
CV (%): 33,06
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
85
ANEXO 8 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA FRESCA NO CULTIVO
EM MEIO DE CULTURA WPM.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 0.00011571 0.00011571 0.4878 ns
BAP 5 0.02292950 0.00458590 19.3326 *
Subcultivos 1 0.00011718 0.00011718 0.4940 ns
Consist x BAP 5 0.00754566 0.00150913 6.3620 *
Consist x Subcultivos 1 0.00005256 0.00005256 0.2216 ns
BAP x Subcultivos 5 0.00086829 0.00017366 0.7321 ns
Cons. x BAP x Subc 5 0.0002701 0.00005402 0.2277 ns
Resíduo 96 0.02277225 0.00023721
Total 119 0.05467126
Média: 0,029
CV (%): 51,74
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 9 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA SECA NO CULTIVO EM
MEIO DE CULTURA WPM.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 0.00023964 0.00023964 37.52 *
BAP 5 0.00085540 0.00017108 26.79 *
Subcultivos 1 0.00000082 0.00000082 0.12 ns
Consist x BAP 5 0.00040186 0.00008037 12.58 *
Consist x Subcultivos 1 0.00000022 0.00000022 0.035 ns
BAP x Subcultivos 5 0.00000781 0.00000156 0.244 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 0.00000035 0.00000007 0.010 ns
Resíduo 96 0.00061304 0.00000639
Total 119 0.00211914
Média: 0,004
CV (%): 58,9
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 10 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO
NO CULTIVO EM MEIO DE CULTURA WPM.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 44303.099556 44303.09955 133.565 *
BAP 5 2533.296913 506.659382 1.5275 ns
Subcultivos 1 8.69117563 8.69117563 0.0262 ns
Consist x BAP 5 14037.5295 2807.50590 8.4641 *
Consist x Subcultivos 1 31.5380490 31.5380490 0.0951 ns
BAP x Subcultivos 5 18.85229891 3.77045978 0.0114 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 329.387627 65.87752551 0.1986 ns
Resíduo 96 31842.90119 331.6968874
Total 119 93105.296318
Média: 35,78
CV (%): 50,9
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
86
ANEXO 11 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL NÚMERO MÉDIO DE BROTOS
POR EXPLANTE NO CULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 0.03993053 0.039930 0.1584 ns
BAP 5 47.85130977 9.5702619 37.9562 *
Subcultivos 1 0.00032674 0.00032674 0.0013 ns
Consist x BAP 5 17.02210491 3.40442098 13.5021 *
Consist x Subcultivos 1 0.00285764 0.00285764 0.0113 ns
BAP x Subcultivos 5 0.01027815 0.00205563 0.0082 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 0.00410108 0.00082022 0.0033 ns
Resíduo 96 24.20541915 0.25213978
Total 119 89.13632796
Média: 1,89
CV (%): 26,48
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 12 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA FRESCA NO CULTIVO
EM MEIO DE CULTURA MS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 0.24399642 0.24399642 41.059 *
BAP 5 0.65048602 0.13009720 21.892 *
Subcultivos 1 0.0006314 0.00063140 0.106 ns
Consist x BAP 5 0.57565950 0.11513190 19.374 *
Consist x Subcultivos 1 0.00021136 0.00021136 0.035 ns
BAP x Subcultivos 5 0.00160911 0.00032182 0.054 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 0.00084390 0.00016878 0.028 ns
Resíduo 96 0.57047825 0.00594248
Total 119 2.04391595
Média: 0,146
CV (%): 52,67
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 13 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA SECA NO CULTIVO EM
MEIO DE CULTURA MS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 0.09326247 0.09326247 58.010 *
BAP 5 0.12361455 0.02472291 15.378 *
Subcultivos 1 0.00047620 0.00047620 0.296 ns
Consist x BAP 5 0.11739931 0.02347986 14.604 *
Consist x Subcultivos 1 0.00000349 0.00000349 0.002 ns
BAP x Subcultivos 5 0.00039701 0.00007940 0.049 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 0.00157400 0.00031480 0.195 ns
Resíduo 96 0.15433768 0.00160768
Total 119 0.49106472
Média: 0,052
CV (%): 76,32
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
87
ANEXO 14 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO
NO CULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Consistência do meio 1 19637.377600 19637.377600 107.0344 *
BAP 5 38739.32559 7747.865118 42.2301 *
Subcultivos 1 37.211282 37.21128232 0.2028 ns
Consist x BAP 5 23066.5850 4613.31700 25.1451 *
Consist x Subcultivos 1 5.43167980 5.43167980 0.0296 ns
BAP x Subcultivos 5 26.88463097 5.37692619 0.0293 ns
Cons. x BAP x Subc. 5 27.08173865 5.41634773 0.0295 ns
Resíduo 96 17612.92495 183.4679682
Total 119 99152.8225
Média: 17,02
CV (%): 79,57
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 15 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
ENRAIZAMENTO EM DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Concentrações 2 988,56714 494,28357 3,7333*
Auxinas 2 7,13064 3,56532 0,02693 ns
Concentração x auxina 4 14,26128 3,56532 0,02693 ns
Resíduo 36 4766,34571 132,39849
Total 44 5776,30477
Média: 84,40
CV (%):13,63
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 16 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA FRESCA TOTAL EM
DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Concentrações 2 0,10882 0,05441 93,2781 *
Auxinas 2 0,00282 0,00141 2,42095 ns
Concentração x auxina 4 0,00456 0,00114 1,95524 ns
Resíduo 36 0,021 0,00058
Total 44 0,1372
Média: 0,2138
CV (%): 11,29
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
88
ANEXO 16 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL NÚMERO MÉDIO DE RAÍZES
EM DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Concentrações 2 15,82832 7,91416 278,305 *
Auxinas 2 0,03998 0,01999 0,7029 ns
Concentração x auxina 4 1,39304 0,34826 12,246 *
Resíduo 36 1,02373 0,02844
Total 44 18,28508
Média: 2,43
CV (%): 6,93
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 17 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL COMPRIMENTO MÉDIO DE
RAÍZES EM DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Concentrações 2 5,43772 2,71886 125,679 *
Auxinas 2 0,74183 0,37092 17,145 *
Concentração x auxina 4 0,38468 0,09617 4,445 *
Resíduo 36 0,7788 0,02163
Total 44 7,343
Média: 1,91
CV (%): 7,67
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 18 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL ALTURA DA PARTE AÉREA EM
DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINAS.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Concentrações 2 9,24162 4,62081 46,997 *
Auxinas 2 1,67842 0,83921 8,535 *
Concentração x auxina 4 1,87364 0,46841 4,764 *
Resíduo 36 3,5395 0,09832
Total 44 16,3332
Média: 3,02
CV (%): 10,38
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 20 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PORCENTAGEM DE ENRAIZAMENTO EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Sacarose 3 13514.94137589 4504.98045863 31.918 *
Resíduo 16 2258.24622143 141.14038884
Total 19 15773.18759732
Média: 64.8
CV (%): 18.3
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
89
ANEXO 21 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DO NÚMERO MÉDIO DE RAÍZES EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Sacarose 3 4.76165622 1.58721874 44.45 *
Resíduo 16 0.57132753 0.03570797
Total 19 5.33298375
Média: 1.47
CV (%): 12.83
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 22 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DO COMPRIMENTO MÉDIO DE RAÍZES (CM)
EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Sacarose 3 13.46000000 4.48666667 84.22*
Resíduo 16 0.85232000 0.05327000
Total 19 14.31232000
Media: 1.46
CV (%): 15.72
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 23 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA ALTURA DA PARTE AÉREA (CM) EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Sacarose 3 7.45046000 2.48348667 51.8581*
Resíduo 16 0.76624000 0.04789000
Total 19 8.21670000
Média: 2.26
CV (%): 9.66
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 24 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA FRESCA TOTAL (G) EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Sacarose 3 0.02069556 0.00689852 21.6712 *
Resíduo 16 0.00509323 0.00031833
Total 19 0.02578879
Média: 0.14
CV (%): 12.42
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
90
ANEXO 25 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
ENRAIZAMENTO EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de cultura 3 10541.99577848 3513.99859283 55.5073 *
Resíduo 16 1012.91081289 63.30692581
Total 19 11554.90659137
Média: 55,7
CV (%): 15,07
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 26 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL NÚMERO MÉDIO DE RAÍZES
EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de cultura 3 1.30778684 0.43592895 21.5490 *
Resíduo 16 0.32367472 0.02022967
Total 19 1.63146156
Média: 1,57
CV (%): 9,02
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 27 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL COMPRIMENTO MÉDIO DE
RAÍZES EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de cultura 3 4.37000000 1.45666667 28.8449 *
Resíduo 16 0.80800000 0.05050000
Total 19 5.17800000
Média: 2,91
CV (%): 7,72
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 28 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL ALTURA DA PARTE AÉREA EM
DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de cultura 3 5.94504000 1.98168000 20.7007 *
Resíduo 16 1.53168000 0.09573000
Total 19 7.47672000
Média: 2,83
CV (%): 10,90
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
91
ANEXO 29 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL MASSA FRESCA TOTAL EM
DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de cultura 3 0.00756560 0.00252187 34.5680*
Resíduo 16 0.00116726 0.00007295
Total 19 0.00873286
Média: 0,16
CV (%): 5,32
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 30 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA APÓS 30 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS ENRAIZADAS IN VITRO EM
MEIO DE CULTURA COM DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de culturas 6 11536.6953 1922.7825 30,8*
Resíduo 28 1747.1228 62.3972
Total 34 13283.8182
Média: 37,7
CV (%): 20,9
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 31 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA APÓS 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS ENRAIZADAS IN VITRO EM
MEIO DE CULTURA COM DIFERENTES TIPOS E CONCENTRAÇÕES DE AUXINA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de culturas 6 10964.4927 1827.4154 32.2 *
Resíduo 28 1587.0777 56.6
Total 34 12551.5704
Média: 36,3
CV (%): 20,6
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 32 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA APÓS 30 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS ENRAIZADAS IN VITRO EM
MEIO DE CULTURA COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de culturas 3 9695.6760 3231.8920 228.32*
Resíduo 16 226.4811 14.1550
Total 19 9922.1571
Média: 59,5
CV (%): 6,3
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
92
ANEXO 33 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA APÓS 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS ENRAIZADAS IN VITRO EM
MEIO DE CULTURA COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de culturas 3 10144.1417 3381.3805 111.969 *
Resíduo 16 483.1842 30.1990
Total 19 10627.3259
Média: 58,2
CV (%): 9,4
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 34 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA APÓS 30 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS ENRAIZADAS IN VITRO EM
DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de culturas 3 4002.9698 1334.3298 14.746*
Resíduo 16 1447.7212 90.4825
Total 19 5450.7108
Média: 67,7
CV (%): 14,02
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ANEXO 35 RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA VARIÁVEL PORCENTAGEM DE
SOBREVIVÊNCIA APÓS 60 DIAS DA ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS ENRAIZADAS IN VITRO EM
DIFERENTES MEIOS DE CULTURA.
Fonte de variação GL Soma de quadrados Quadrado médio F
Meios de culturas 3 4275.6725 1425.2241 23.0525*
Resíduo 16 989.2002 61.8
Total 19 5264.8
Média: 63,9
CV (%): 12,2
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
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