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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento de Estratégias para a Determinação
Espectrofotométrica Sequencial em Fluxo de Co (II) e Mn (II)
Juliana Aparecida Ferreira*
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de MESTRE
EM QUÍMICA, área de concentração: QUÍMICA
ANALÍTICA.
Orientador: Dr. Edenir Rodrigues Pereira Filho
*bolsista CAPES
São Carlos – SP
Julho de 2009
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http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
F383de
Ferreira, Juliana Aparecida.
Desenvolvimento de estratégias para a determinação
espectrofotométrica sequencial em fluxo de Co (II) e Mn (II) /
Juliana Aparecida Ferreira. -- São Carlos : UFSCar, 2009.
83 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2009.
1. Métodos óticos. 2. Determinação de metais. 3. Análise
por injeção de fluxo. 4. Espectrofotometria. 5. Cobalto. 6.
Manganês. I. Título.
CDD: 543.085 (20
a
)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO
CARLOS
Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia
Departamento
de
Quimica
PROGRAMA
DE
PÓs-GRADUAÇÃO
EM
QU~MIGA
Curso de Mestrado
Assinaturas dos membros da banca examinadora que avaliaram e aprovaram
a
defesa
de dissertação de mestrado
da
candzdüta
Juliana Aparecida
Ferreira,
realizada em
24
de
julho
de
2009:
,A
k&f
&&-r+
f,&o
Prof Dr. Edenir ~odhgues Pereira Filho
~rof.
Dr.
Ronaldo Censi
Faria
Dedico este trabalho aos meus queridos pais
Aparecida e Valdir,
por toda a luta, dedicação, apoio e amor.
Ao meu amor Vagner,
Pelo constante incentivo, companheirismo e amor.
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida, e pela vida uma segunda vez.
Aos meus pais pela sólida estrutura familiar, dedicação, sacrifícios, apoio
e amor incondicional.
Ao Prof. Dr. Edenir Rodrigues Pereira Filho pela excelente receptividade,
orientação, apoio e amizade. Pelas valiosas sugestões e por ter contribuído para meu
crescimento profissional e pessoal durante esses dois anos de convivência e trabalho.
Ao Prof. Dr. Joaquim de Araújo Nóbrega e à Prof. Dra. Ana Rita pelas
importantes sugestões no trabalho.
Ao Prof. Dr. Ronaldo Censi Faria, pela orientação no trabalho de iniciação
científica, amizade e gentileza ao permitir que parte desse trabalho fosse realizado nas
dependências do seu laboratório de pesquisa.
Ao Vagner, pela agradável companhia, eterna preocupação com meu bem
estar, incentivo contínuo, risadas, e amor demonstrado na nossa convivência diária.
A todos os companheiros de trabalho e amigos do Grupo de Análise
Instrumental Aplicada (GAIA): Amália, Bia, Caio, Carlinha, Catarinie, Daniela, Edivaldo,
Eveline, Fernanda, Kelber, Larissa, Luana, Mário, Marcelo, Paulinha, Poliana, Renata,
Rodolfo, Rodrigo, Silmara, Sílvia, Tiago e Wladiana pela convivência agradável,
sugestões, apoio e conhecimentos compartilhados. Aos ex-gaia: Adriana, Andrea, Guto,
Marquinho, Silvéria e Simone, pela amizade, caronas, conversas, risadas e
conhecimentos trocados.
Em especial ao Marcelo e ao Kelber pela ajuda nas análises no FS-FAAS.
Aos colegas do LABIE pela companhia nas horas e horas de trabalho,
pelas conversas e momentos agradáveis.
Às eternas e queridas amigas da graduação Maiara, Luciana e Renata por
todos os momentos compartilhados, sejam eles de alegria, tristeza ou de aprendizado.
A todos os familiares e amigos que sempre acreditaram e torceram por
mim.
A todos os professores do Departamento de Química da Universidade
Federal de São Carlos que contribuíram para minha formação profissional.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela bolsa concedida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de
São Carlos pela oportunidade.
Aos funcionários do Departamento de Química, em especial às secretárias
da Pós-Graduação: Ariane, Cristina, Luciani e Caroline pela gentileza no atendimento e
colaboração, e à técnica Doraí pela gentileza de ceder um equipamento para realização
de parte do trabalho.
A todos aqueles que não foram nomeados, mas que contribuíram direta ou
indiretamente para a realização deste trabalho.
v
LISTA DE ABREVIATURAS
AAS
Espectrometria de absorção atômica
DNA
Ácido desoxirribonucléico
ETAAS
Espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica
FA
Análise em fluxo
FAAS
Espectrometria de absorção atômica com chama
FIA
Análise por injeção em fluxo
FS-FAAS
Espectrometria de absorção atômica com chama - modo
sequencial rápido
GFAAS
Espectrometria de absorção atômica com forno de grafite
IUPAC
União Internacional de Química Pura e Aplicada
LOD
Limite de detecção
LOQ
Limite de quantificação
PLS
Método dos mínimos quadrados parciais
RSD
Desvio padrão relativo
PRESS
Soma dos quadrados dos erros de previsão
SAM
Método de adições de padrão
SEV
Soma dos quadrados dos erros de validação
SRM
Material de referência certificada
UV-Vis
Espectrofotometria de absorção molecular na região do
ultravioleta-visível
vi
LISTA DE TABELAS
TABELA 4.4.1 - Amostras e suas respectivas descrições..............................................23
TABELA 4.6.1 - Planejamento fatorial 2
9-5
efetuado no estudo preliminar na triagem de
variáveis do sistema........................................................................................................24
TABELA 4.6.2 - Planejamento fatorial 2
3
efetuado na triagem de variáveis do
sistema............................................................................................................................25
TABELA 4.6.3 - Níveis das variáveis do planejamento fatorial empregado na triagem
das variáveis do sistema em fluxo...................................................................................25
TABELA 4.6.4 - Concentrações das soluções-padrão utilizadas na curva
analítica...........................................................................................................................25
TABELA 4.6.2.1 - Planejamento composto central
efetuado para a otimização das
variáveis do sistema........................................................................................................28
TABELA 4.6.2.2 - Níveis das variáveis do planejamento composto central empregado
na otimização das variáveis do sistema em fluxo...........................................................29
TABELA 4.6.2.3 - Concentrações das soluções-padrão utilizadas na curva
analítica...........................................................................................................................29
TABELA 4.8.1.1 – Planejamento fatorial fracionário 2
7-2
efetuado na triagem dos
possíveis interferentes no sinal do Co.............................................................................31
TABELA 4.8.1.2 - Níveis das variáveis do planejamento 2
7-2
empregado na triagem de
possíeveis interferentes no sinal do Co...........................................................................31
TABELA 4.8.1.3 – Planejamento fatorial fracionário 2
7-2
efetuado na triagem dos
possíveis interferentes no sinal do Mn............................................................................32
TABELA 4.8.1.4 - Níveis das variáveis do planejamento 2
7-2
empregado na triagem de
possíeveis interferentes no sinal do Mn..........................................................................32
TABELA 4.8.2.1 - Planejamento composto central
efetuado para a modelagem dos
interferentes no sinal do Co............................................................................................33
TABELA 4.8.2.2 - Níveis das variáveis do planejamento composto central efetuado para
a modelagem dos interferentes no sinal do Co...............................................................33
TABELA 4.8.2.3 - Planejamento composto central
efetuado para a modelagem dos
interferentes no sinal do Mn............................................................................................34
vii
TABELA 4.8.2.4 - Níveis das variáveis do planejamento composto central efetuado para
a modelagem dos interferentes no sinal do Mn...............................................................35
TABELA 5.3.1.1 - Resumo dos resultados obtidos na análise dos efeitos do
planejamento fatorial 2
3
realizado na triagem das variáveis...........................................50
TABELA 5.5.1.1 - Valores de efeitos significativos, da variância e de erro, experimental
e do efeito, para o planejamento fatorial 2
3
em quadruplicata, realizado no estudo de
concomitantes para o analito Co.....................................................................................59
TABELA 5.5.1.2 - Valores de efeitos significativos, da variância e de erro, experimental
e do efeito, para o planejamento fatorial 2
4
em duplicata, realizado no estudo de
concomitantes para o analito Mn.....................................................................................61
TABELA 5.6.1 - Teores médios de Co e Mn e desvios-padrão (n=3) nas amostras de
medicamentos B e D obtidos por FS-AAS......................................................................66
TABELA 5.6.2 - Teores médios e desvios-padrão (n=3) de Co no medicamento B e de
Mn no D obtidos pelo método desenvolvido....................................................................70
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 3.1.1 - Configuração geral de um sistema em fluxo. C: solução transportadora;
B: bomba peristáltica; I: Injetor; S: amostra; B
1
: reator; D: detector; e W: descarte. Esta
figura foi adaptada da referência [9]..................................................................................7
FIGURA 3.2.1 - Representação da formação de gradiente de pH em FA. Os
seguimentos pH
1
e pH
2
representam soluções com diferentes valores de
pH......................................................................................................................................9
FIGURA 3.3.2.1 - Reação de oxidação do Tiron catalisada por íons metálicos (M) de
valência 2+ [46]...............................................................................................................16
FIGURA 4.6.1 - Representação esquemática do sistema em fluxo empregado, onde R
1
:
Tiron; R
2
: H
2
O
2
; R
3
: NaOH; C: solução transportadora (HNO
3
0,01 mol L
-1
+ etanol 10%
v/v); P: bomba peristáltica; I: Injetor; S: amostra; B: 2,2-bipiridina; C
1
e C
2
: reatores de
100 e 150 cm respectivamente; l: espectrofotômetro ( = 426 nm); e W: descarte. Em
(A): posição de amostragem; em (B): posição de injeção da amostra............................27
FIGURA 5.1.1 - Espectro de absorção do Tiron oxidado em meio básico pela catálise de
Co (a – linha tracejada), e pela catálise de Mn ativada por 2,2-bipiridina (b – linha
sólida)..............................................................................................................................41
FIGURA 5.2.1 - Representação esquemática da sequencia das alças de amostragem
que passa pelo detector, onde C é a solução carregadora, L
1
e L
3
são as alças de
amostragem contendo a amostra ou branco ou soluções padrões, e L
2
é a alça do
reagente 2,2-bipiridina. Em (A) está representada a sequencia teórica (sem o efeito de
dispersão) e em (B) a simulação da situação real de acordo com o efeito de dispersão
no sistema em fluxo.........................................................................................................43
FIGURA 5.2.2 - Sinal transiente obtido na determinação sequencial de Co e Mn, através
da injeção de soluções-padrão 21 e 360 µg L
-1
dos analitos, respectivamente, no
sistema em fluxo desenvolvido........................................................................................44
FIGURA 5.3.1.1 -Fiagrama obtido no experimento 7 do planejamento fatorial realizado
na triagem das variáveis do sistema...............................................................................47
FIGURA 5.3.1.2 - Curva analítica obtida no experimento 7 do planejamento fatorial
realizado na triagem das variáveis, para Co (a) e Mn (b)...............................................48
ix
FIGURA 5.3.1.3 - Gráficos de probabilidade. Em (a) e (b) os gráficos referem-se,
respectivamente, às respostas absorbância da solução “3” e coeficiente angular (a) da
curva analítica para o analito Co. Em (c) e (d) os gráficos referem-se, respectivamente,
às respostas absorbância da solução 3 e coeficiente angular (a) da curva analítica para
o analito Mn. ...................................................................................................................49
FIGURA 5.3.2.1 - (a) Superfície quadrática descrita pela Equação 5.1. (b) Suas curvas
de nível............................................................................................................................52
FIGURA 5.4.1 – Estudo do perfil catalítico do Co na reação de oxidação de Tiron por
H
2
O
2
em meio básico. A linha contínua representa o sinal obtido em fluxo e a linha
tracejada refere-se ao sinal obtido com a interrupção do fluxo no máximo do sinal
analítico do Co.................................................................................................................53
FIGURA 5.4.2 – Estudo do perfil catalítico do Mn na reação de oxidação de Tiron por
H
2
O
2
em meio básico. A linha contínua representa o sinal obtido em fluxo e a linha
tracejada refere-se ao sinal obtido com a interrupção do fluxo no máximo do sinal
analítico do Mn................................................................................................................54
FIGURA 5.4.3 – Estudo comparativo do comprimento do reator C
2
com base no perfil
catalítico do Co e Mn na reação de oxidação do Tiron por H
2
O
2
em meio básico..........55
FIGURA 5.4.4 – Representação esquemática do sistema em fluxo otimizado, onde P é
a bomba peristáltica, I: injetor; S: amostra; B: 2,2-bipiridina; C
1
e C
2
: reatores; l:
espectrofotômetro ( = 426 nm); e W: descarte...............................................................56
FIGURA 5.5.1.1 - Gráficos de probabilidade para o resultado obtido no planejamento
experimental do estudo de interferentes na reação de oxidação do Tiron catalisada por
Co. Em (a) o gráfico refere-se, ao resultado obtido para o planejamento fatorial
fracionário2
7-2
, e em (b), ao planejamento 2
3
resultante da exclusão de 4 variáveis do
planejamento anterior......................................................................................................58
FIGURA 5.5.1.2 - Gráficos de probabilidade para o resultado obtido no planejamento
experimental do estudo de interferentes na reação de oxidação do Tiron catalisada por
Mn. Em (a) o gráfico refere-se, ao resultado obtido para o planejamento fatorial
fracionário2
7-2
, e em (b), ao planejamento 2
4
resultante da exclusão de 3 variáveis do
planejamento anterior......................................................................................................60
FIGURA 5.5.2.1 – (a) Superfície quadrática descrita pela Equação 5.5.2.1. (b) Suas
curvas de nível................................................................................................................62
x
FIGURA 5.5.2.2 - Porcentagem de interferência versus concentração normalizada de
Co, segundo a Equação 5.5.2.2......................................................................................63
FIGURA 5.6.1 - Fiagrama obtido na análise das amostras de medicamentos B e D,
utilizando-se curvas analíticas individuais (proposta 1)
.........................................................................................................................................68
FIGURA 5.6.2 - Fiagrama obtido na análise das amostras de medicamentos B e D
(proposta 2).....................................................................................................................69
xi
RESUMO
DESENVOLVIMENTO DE ESTRATÉGIAS PARA A DETERMINAÇÃO
ESPECTROFOTOMÉTRICA SEQUENCIAL EM FLUXO DE Co E Mn
Neste trabalho desenvolveu-se um método cinético-espectrofotométrico
visando a determinação sequencial de Co e Mn em amostras farmacêuticas. O método
foi baseado no efeito catalítico dos analitos na reação de oxidação do Tiron (3,5
dihidroxi-1,3-ácido benzenossulfônico-sal dissódico monohidratado
[(HO)
2
C
6
H
2
(SO
3
Na)
2
.H
2
O]) pelo H
2
O
2
em meio básico. No caso do Mn foi empregado o
reagente ativador 2,2-bipiridina para a efetiva catálise. O sistema FIA foi elaborado com
base nas propriedades catalíticas de cada analito na reação indicadora. Foram
realizados dois planejamentos fatoriais, inicialmente um fracionário 2
9-5
e depois um 2
3
,
para triagem das variáveis, seguido de um 2
2
+ ponto central + estrela para a devida
otimização das mesmas no sistema em fluxo. Planejamentos fatoriais fracionários 2
7-2
foram realizados para o estudo de possíveis interferentes para Co e Mn; e
posteriormente, a porcentagem de interferência foi descrita através de modelos
matemáticos construídos a partir de planejamentos do tipo fatorial + ponto central +
estrela. As amostras farmacêuticas foram digeridas com HNO
3
concentrado em bloco
digestor. Para avaliar a exatidão do método desenvolvido, as amostras (n=3) foram
analisadas por FS-FAAS e a partir das concentrações obtidas, estas foram diluídas para
posterior análise no método desenvolvido. Os limites de detecção e quantificação para
FS-FAAS foram 3,9 e 13,2 µg L
-1
para Co, 110,0 e 366,0 µg L
-1
para Mn,
respectivamente. No caso do método desenvolvido, os limites de detecção e
quantificação foram 0,055 e 0,18 µg L
-1
para Co, 9,76 e 32,5 µg L
-1
para Mn,
respectivamente. A comparação entre os dois métodos foi realizada através do teste-t
pareado. No caso do Co, ao nível de confiança 99% os valores não diferiram
estatisticamente. Já para o Mn os valores de concentração obtidos também foram
concordantes entre si, apesar deste fato não poder ser comprovado estatisticamente
devido à diferença de desvios-padrão dos dois métodos. A repetibilidade foi de 3,2%
para Co e 8,0% para Mn. A frequência de amostragem foi de 25 amostras h
-1
.
xii
ABSTRACT
DEVELOPMENT OF FLOW ANALYSIS SPECTROPHOTOMETRIC STRATEGIES FOR
SEQUENTIAL DETERMINATION OF Co AND Mn
In this study a kinetic-spectrophotometric method was developed for
sequential determination of Co and Mn in pharmaceutical samples. The method was
based on the catalytic effect of the analytes in the oxidation reaction of Tiron by H
2
O
2
in
basic medium. In the case of Mn it was employed the activator reagent 2,2-bipyridine to
effective catalysis. The FIA system was projected taking into account the catalytic
properties of each analyte in the indicator reaction. Two factorial designs were applied,
initially, a fractionary factorial design 2
9-5
followed by a complete factorial design 2
3
to
select the important variables, and then a factorial design 2
2
+ central point + star for
optimizing of FIA system. Fractionary factorial designs 2
7-2
were applied in the study of
possible interferents for Co and Mn. The main interferents were mathematically
described using factorial + central point + star designs. The pharmaceutical samples
were digested by concentrated HNO
3
in digestor block. To evaluate the accuracy of the
developed method, samples (n=3) were analyzed by FS-FAAS and based on the
determination concentrations, these were diluted to posterior analysis aplyingby the
developed method. Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) for FS-FAAS
were 3.9 and 13.2 µg L
-1
for Co; 110.0 and 366.0 µg L
-1
for Mn, respectively.
To
developed method the LOD and LOQ were
0.055 and 0.18 µg L
-1
for Co, 9.76 and 32.5
µg L
-1
for Mn, respectively. Comparison between the two methods was evaluated by
paired t-test. At 99% confidence level, the values did not differ statistically for Co.
However, for Mn, the concentration values agreed but this data cannot be statistically
confirmed due to differences of standard deviations of the two methods. The
repeatability was 3.2% for Co and 8.0% for Mn. The sampling frequency was 25
samples h
-1
.
xiii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 2
2 OBJETIVO ................................................................................................................ 4
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 6
3.1 ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO E SUA UTILIZAÇÃO NO ESTUDO DE ASPECTOS CINÉTICOS
6
3.2 ANÁLISE MULTICOMPONENTE SIMULTÂNEA OU SEQUENCIAL POR ESPECTROFOTOMETRIA
DE ABSORÇÃO MOLECULAR UV-VIS ................................................................................... 7
3.3 MÉTODOS CINÉTICO-ESPECTROFOTOMÉTRICOS ........................................................ 10
3.3.1 Reação indicadora ......................................................................................... 15
3.4 CO E MN ............................................................................................................... 18
4 PARTE EXPERIMENTAL ....................................................................................... 21
4.1 MATERIAL E EQUIPAMENTOS.................................................................................... 21
4.2 REAGENTES........................................................................................................... 21
4.3 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS ............................................................................... 22
4.4 AMOSTRAS ............................................................................................................ 22
4.5 DETERMINAÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA ÓTIMO PARA AS DETERMINAÇÕES
ESPECTROFOTOMÉTRICAS .............................................................................................. 23
4.6 TRIAGEM DE VARIÁVEIS E OTIMIZAÇÃO DO SISTEMA FIA ............................................ 24
4.6.1 Triagem das Variáveis .................................................................................... 24
4.6.2 Otimização do sistema FIA............................................................................. 28
4.7 ESTUDO DO PERFIL CATALÍTICO DOS ANALITOS ......................................................... 29
4.8 AVALIAÇÃO DE INTERFERENTES ............................................................................... 30
xiv
4.8.1 Triagem de interferentes ................................................................................ 30
4.8.2 Modelagem de superfície para os interferentes ............................................. 32
4.9 PREPARO DAS AMOSTRAS ....................................................................................... 35
4.9.1 Extração com ácido diluído ............................................................................ 35
4.9.2 Digestão em bloco digestor ............................................................................ 35
4.10 DETERMINAÇÃO DE CO E MN ............................................................................... 37
4.10.1 Nas amostras de alimentos .......................................................................... 37
4.10.2 Nas amostras de ligas metálicas e no medicamento C ................................ 37
4.10.3 Nas amostras de medicamentos B e D ........................................................ 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 41
5.1 DETERMINAÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA ÓTIMO PARA AS DETERMINAÇÕES
ESPECTROFOTOMÉTRICAS .............................................................................................. 41
5.2 ELABORAÇÃO DO SISTEMA FIA ................................................................................ 42
5.3 TRIAGEM DE VARIÁVEIS E OTIMIZAÇÃO DO SISTEMA FIA ............................................ 44
5.3.1 Triagem das Variáveis .................................................................................... 44
5.3.2 Otimização do sistema FIA............................................................................. 51
5.4 ESTUDO DO PERFIL CATALÍTICO DOS ANALITOS ......................................................... 53
5.5 AVALIAÇÃO DOS INTERFERENTES ............................................................................. 57
5.5.1 Triagem de interferentes ................................................................................ 57
5.5.2 Modelagem de superfície para os interferentes ............................................. 61
5.6 DETERMINAÇÃO DE CO E MN .................................................................................. 64
6 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 75
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 78
Capítulo 1
INTRODUÇÃO
Introdução 2
1 Introdução
Os métodos espectrofotométricos apresentam uma boa sensibilidade para
a determinação de diversos elementos e compostos [1]. A combinação destes métodos
com a análise em fluxo FA (do inglês, Flow Analysis) [2] representa uma alternativa
simples e atrativa em química analítica. Os sistemas em fluxo configuram-se pela sua
simplicidade, onde é requerido apenas um sistema para propulsão (tipicamente uma
bomba peristáltica), um injetor comutador para introdução de brancos, padrões e
amostras e um detector [3].
As figuras de mérito (por exemplo, limites de detecção e quantificação)
com a utilização de FA e espectrofotometria são tão vantajosas quanto aquelas obtidas
por técnicas instrumentais mais sofisticadas, tais como, FAAS (do inglês, Flame Atomic
Absorption Spectrometry) e GFAAS (do inglês, Graphite Furnace AAS) [4]. Entretanto, a
combinação FA e espectrofotometria é utilizada para determinações monoelementares
com a identificação de muitas aplicações na literatura científica [5 - 7]. Diante deste
contexto a aplicação da FA e espectrofotometria para a determinação sequencial de
elementos pode representar um ganho substancial em frequência analítica e
sensibilidade [8]. Este procedimento pode aproveitar o aspecto de que alguns
reagentes apresentam uma baixa seletividade em reações espectrofotométricas. Além
das vantagens descritas, os sistemas em fluxo acoplados a espectrofotômetros podem
ser de grande valia em estudos de especiação.
Assim, este trabalho trata da proposição de estratégias para a
determinação cinético-espectrofotométrica sequencial, em comprimento de onda fixo,
de Co e Mn, através de um método catalítico, no qual esses metais catalisam a reação
entre o Tiron e o H
2
O
2
em meio básico.
Capítulo 2
OBJETIVO
Objetivo 4
2 Objetivo
O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento e aplicação de um método
analítico em fluxo para a determinação cinético-espectrofotométrica sequencial de Co e
Mn, em amostras farmacêuticas, empregando a reação de oxidação do Tiron pelo H
2
O
2
em meio básico.
Capítulo 3
REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA
Revisão Bibliográfica 6
3 Revisão Bibliográfica
3.1 Análise por injeção em fluxo e sua utilização no estudo de
aspectos cinéticos
Uma análise química ideal seria aquela na qual o método utilizado fosse
multicomponente, simples, rápido, com baixo custo, sensível, com um reduzido
consumo de reagentes e consequente minimização de resíduos. Embora, nem sempre
seja possível aliar todas as características descritas anteriormente em um só método
analítico, grande parte destas pode ser conseguida quando utiliza-se a FA acoplada a
outras técnicas instrumentais.
Além da implantação de um sistema em fluxo exigir baixo investimento
financeiro e a técnica possuir instrumentação simples, o seu uso permite um reduzido
consumo de reagentes, alta frequência de amostragem, menor manuseio da amostra,
possibilidade do uso de diferentes tipos de detectores, alta reprodutibilidade e boa
precisão das análises [3, 9-10]. A utilização de técnicas acopladas à FA tem diversas
aplicações em análise química quantitativa devido à sua grande versatilidade [3].
Análise em fluxo é um termo geral para todas as análises que se baseiam
na introdução e processamento de amostras em um meio fluido. Já a análise por
injeção em fluxo FIA (do inglês, Flow Injection Analysis) é um tipo de FA que segundo a
classificação da International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), é uma
análise com amostragem intermitente, por meio de injeção da amostra em um fluxo
não-segmentado [11]. A técnica de FIA é baseada na injeção de uma amostra líquida
em um fluxo carregador contínuo, que é constituído por um fluido adequado a cada
sistema. A amostra injetada forma uma zona dispersa que passará por uma célula em
fluxo onde um detector medirá continuamente o parâmetro físico ou químico desejado.
Geralmente, a propulsão dos líquidos é realizada através de uma bomba peristáltica em
tubos de polietileno com diâmetro reduzido [9].
A Figura 3.1.1 mostra um exemplo geral de um sistema FIA, composto por
uma bomba (B) para propulsão do carregador, um injetor (I) e um sistema de detecção
(D).
Revisão Bibliográfica 7
C B
I
S
B
1
D
W
W
FIGURA 3.1.1 - Configuração geral de um sistema em fluxo. C: solução transportadora;
B: bomba peristáltica; I: Injetor; S: amostra; B
1
: reator; D: detector; e W: descarte. Esta
figura foi adaptada da referência [9].
Sistemas em fluxo são muito utilizados para estudos cinéticos, pois o
processo de mistura e o tempo de reação são facilmente controlados pela temperatura,
vazões e volume de amostra; nestes sistemas, amostras e reagentes são misturados
numa taxa governada pela dinâmica de transferência radial de massa e dispersão axial.
Além disso, sistemas FIA associam dinamicamente processos físicos aos químicos,
sendo que esses processos estão em evolução quando as medidas estão sendo
realizadas. Portanto, a análise por injeção em fluxo traduz processos cinéticos em
forma de sinais [9].
Para o estudo da cinética de algumas reações realizadas em sistemas em
fluxo, pode ser necessária a interrupção do fluxo (stopped-flow) para que o tempo de
residência da amostra seja maior, ou seja, pode ser requerido um tempo maior para que
a reação ocorra [12].
O stopped-flow aumenta a sensibilidade do método, como descrito em
alguns trabalhos na literatura [13-17], além de diminuir a dispersão no sistema e
conduzir a um menor consumo de reagentes [9, 17].
3.2 Análise multicomponente simultânea ou sequencial por
espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis
A espectrofotometria de absorção molecular na região do ultravioleta-
visível (UV-vis) é uma das técnicas analíticas mais amplamente utilizadas por ser
robusta, versátil, possuir instrumentação simples e de baixo custo, além de ter a
Revisão Bibliográfica 8
vantagem de instrumentos que operam em batelada serem facilmente transformados
em instrumentos de operação em fluxo [3,18].
Em um espectrofotômetro de feixe simples, a radiação proveniente de
uma fonte passa pelo monocromador, sendo, então, separada em pequenos intervalos
de comprimento de onda; em seguida passa pela amostra e segue para o detector,
onde a intensidade incidente é medida e comparada com a energia radiante que chega
no detector quando a referência (um branco, um solvente, ou ainda um reagente) está
na célula [19].
A análise multicomponente por espectrofotometria UV-Vis através de
reagentes cromogênicos é geralmente realizada por meio de reagentes seletivos, ou
seja, específicos para um determinado componente; ou ainda separando-se os
componentes de interesse na amostra dos possíveis interferentes. No entanto, nem
sempre é possível a utilização de um reagente seletivo para cada componente de
interesse, pois além dos processos de separação serem, normalmente, muito
laboriosos, estes consomem um tempo relativamente longo no processo analítico. Por
isso, as análises multicomponentes por espectrofotometria UV-Vis limitam-se a dois ou
poucos componentes em uma mesma mistura, utilizando para isto, bandas isoladas de
absorção características [20]. Portanto, a grande maioria dos trabalhos na literatura que
relatam determinações simultâneas de metais com detecção espectrofotométrica
utilizam a técnica de espectrofotometria por varredura espectral para a determinação
desses componentes, [9, 21-22] sendo que dentro dessa gama de trabalhos, grande
parte faz uso da quimiometria (área da química que utiliza métodos matemáticos e
estatísticos para a resolução de problemas químicos) [23] para o tratamento de dados,
que geralmente são extensos e complexos, neste caso.
Por exemplo, GAO e REN [24] realizaram a determinação simultânea de
Mn (II), Zn (II) e Co (II) em misturas sintéticas utilizando-se o 2-(5-bromo-2-piridilazo)-5-
dietilaminofenol (5-Br-PADAP) e brometo de cetil-piridínio (CPB) como reagentes.
Espectros dos complexos formados foram adquiridos e registrados. Devido à
sobreposição de bandas nos espectros, os autores utilizaram ferramentas
quimiométricas no processamento e tratamento dos dados. Modelos de calibração
foram construídos utilizando-se as ferramentas Partial Least-Squares (PLS) e Kernel
Partial Least-Squares (KPLS) e para ambas os resultados foram satisfatórios.
Revisão Bibliográfica 9
Para a análise multicomponente simultânea ou sequencial utilizando-se
espectrofotometria UV-Vis em comprimento de onda fixo é necessário o uso de
estratégias que possibilitem alcançar esse objetivo, tais como o uso de reagentes e
valores de pH seletivos para determinada espécie de interesse.
A complexação de íons metálicos com muitos reagentes cromogênicos,
especialmente aqueles que podem ser protonados, depende não só da natureza e
concentração do ligante de interesse, como também do pH do meio reacional [25]. A
dependência do pH do meio reacional para a efetividade da complexação de íons
metálicos conduz a uma alternativa para a determinação simultânea de metais através
da construção de um gradiente de pH. Utilizando-se o mesmo agente complexante é
possível determinar diferentes metais devido à formação de regiões de diferentes
valores de pH.
O princípio da injeção em fluxo fornece meios simples de produzir o
gradiente de pH. Se o sistema não for segmentado por ar, gradientes de pH são
formados na interface carregador/amostra quando soluções básicas são injetadas em
um carregador ácido, ou vice-versa [25], como representado na Figura 3.2.1.
Amostra CarregadorCarregador pH
1
pH
2
Fluxo
Amostra CarregadorCarregador pH
1
pH
2
Amostra CarregadorCarregador pH
1
pH
2
FluxoFluxo
Figura 3.2.1 - Representação da formação de gradiente de pH em FA. Os segmentos
pH
1
e pH
2
representam soluções com diferentes valores de pH.
Trabalhos na literatura relatam o emprego do gradiente de pH na
determinação simultânea de metais com detecção espectrofotométrica.
Em 1981, BETTERIDGE e FIELDS [25] realizaram a determinação
simultânea de Co (II) e Mn (II), Cu (II) e Ni (II) na presença de agente mascarante para
Co (II) em misturas binárias, na faixa de concentração em mg L
-1
. O reagente não
seletivo 4-(P-piridilazo)resorcinol (PAR) foi utilizado no método desenvolvido, no qual
cada íon tem um valor de pH crítico na complexação com o reagente PAR. Um sistema
de análise por injeção em fluxo foi desenvolvido para a geração do gradiente de pH.
Foram obtidas curvas de pH em função da absorbância para as espécies estudadas.
Revisão Bibliográfica 10
LIU et al. [26], aplicaram a técnica de gradiente de pH para a
determinação de Cu (II) e Zn (II) em amostras de cabelo de crianças utilizando um
sistema em fluxo, o reagente cromogênico Zincon e um único espectrofotômetro. Os
dois íons formam complexos azuis com Zincon. Então, foi escolhido um comprimento de
onda no qual as absorbâncias para os dois complexos fossem equivalentes, sendo este
o de 606 nm. Zincon reage com Cu (II) na faixa de pH 5-9,5 e Zn (II) em pH 8-9,5. No
sistema elaborado, uma única injeção produziu dois picos, no qual o primeiro refere-se
à soma dos dois metais e a altura do segundo pico equivale à concentração de Cu
apenas. Portanto, por uma simples subtração do sinal do Cu, daquele equivalente a
soma dos dois, tem-se a absorbância referente ao Zn. A faixa linear para Zn (II) foi de
0,4 – 12 µg mL
-1
e o limite de detecção foi 0,12 µg mL
-1
; já para Cu (II) foi de 0,1 – 3,0
µg mL
-1
e o limite de detecção foi de 0,02 µg mL
-1
.
No trabalho publicado por Zhao et al. [27], foi efetuada a determinação
simultânea de Fe (III) e Zn (II) em amostras de cabelo humano através do gradiente de
pH estabelecido no sistema em fluxo. Os autores utilizaram o 5-Br-PADAP como
reagente cromogênico. Em solução com pH igual a 3, apenas o complexo de Fe é
formado, enquanto que em valor de pH igual a 7,5 tem-se a formação de ambos
complexos; deste modo a absorbância do pico em valor de pH igual a 3 está
relacionada à concentração de Fe e a absorbância do sinal em valor de pH igual a 7,5
relaciona-se à soma da concentração de Fe e Zn; o que permitiu quantificá-los através
da subtração do sinal que corresponde ao complexo de Fe daquele que corresponde à
soma dos dois.
3.3 Métodos cinético-espectrofotométricos
De acordo com GERVASIO et al. [28], “com o advento das análises em
fluxo, métodos catalíticos vivenciaram uma rápida prosperidade visto que o tempo
preciso é inerente a esse tipo de método”.
A necessidade de baixos limites de detecção (LD) nas análises levou ao
estudo e aperfeiçoamento dos métodos catalíticos devido a sua grande sensibilidade
[29-30].
Revisão Bibliográfica 11
Através de uma reação catalítica é possível quantificar o catalisador em
nível de traços e até ultra-traços com o aumento da taxa de reação [31]. Por serem
muito sensíveis, esses métodos têm sido aplicados para determinação de íons
metálicos; no entanto, há o inconveniente problema de espécies com propriedades
químicas semelhantes possuírem efeitos catalíticos similares. Então, apesar dos
métodos catalíticos apresentarem alta sensibilidade, geralmente são pobres em
seletividade. Todavia, esse problema pode ser solucionado com o controle do pH do
meio reacional [25] e utilização de ativadores químicos [31], pois a atividade catalítica
das espécies depende desses fatores [21].
O primeiro trabalho envolvendo determinação de espécies com base no
seu efeito catalítico data de 1876, onde GUYARD [32], citado por MÜLLER [33],
descreveu a determinação de V através de seu efeito catalítico na reação de oxidação
da anilina por clorato de potássio. Desde então, diversos trabalhos envolvendo métodos
cinético-espectrofotométricos na determinação de íons metálicos vêm sendo
publicados. Vale ressaltar que esse tipo de método é empregado, não só para
determinação de espécies metálicas, mas também para determinação de compostos
orgânicos,
como no trabalho de SAURINA e HERNÁNDEZ-CASSOU [16], no qual foi
desenvolvido um sistema para a determinação espectrofotométrica sequencial de
anilina e ciclohexilamina via stopped-flow; e também ânions inorgânicos, como no caso
dos trabalhos de ENSAFI e KAZEMZADEH [34], e de ZHI-QI et al. [35] nos quais foram
realizadas determinações de nitrito e nitrato utilizando as propriedades catalíticas
desses ânions em determinadas reações, além do trabalho de URAISIN et al. [36], onde
os autores desenvolveram um sistema em fluxo com detecção espectrofotométrica para
a determinação de quantidades- traço de brometo em água do mar.
Em 1991, YAMANE e ISHIMIZU [37] propuseram um método cinético
utilizando “stopped-flow” para a determinação simultânea de Co (II) e Ni (II) em misturas
na faixa de concentração de sub-ppm. Neste método, Co e Ni tem efeito cinético
diferencial na reação de substituição de ligante nos complexos metálicos de 2-(5-
bromo-2-piridilazo)-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)anilina (PSAA) quando estes
encontram-se com ácido nitrilotriacético no sistema em fluxo, a taxa de reação do
complexo Ni-PSAA é cerca de 100 vezes maior que a do Co-PSAA. A mudança na
absorbância devido à substituição do ligante foi monitorada em 580 nm em função do
Revisão Bibliográfica 12
tempo. O método apresentou uma frequência de amostragem de 20 h
-1
e foi aplicado
somente às misturas sintéticas contendo Co e Ni nas proporções de 1:12 até 10:1.
WANG e HE [38] propuseram um método cinético-espectrofotométrico
para a determinação de Hg (II) e Ag (I) baseado no efeito catalítico dos metais na taxa
de reação de substituição do ligante entre hexacianoferrato (II), [Fe(CN)
6
]
4-
e α,α’-
bipiridina, em meio ácido a 90°C. A reação foi monitorada espectrofotometricamente a
536 nm via “stopped-flow” após 100 e 200 s da injeção da amostra. Foi realizado o
estudo da influência de íons concomitantes e constatado que Fe (III), Co (II) e Zn (II)
apresentaram pequena interferência. As curvas analíticas foram lineares entre 0-75 ng
mL
-1
para Hg (II) e entre 0-64 ng mL
-1
para Ag (I) segundo os autores. No entanto esta
designação é errônea, pois levando-se em conta que os limites de detecção foram 0,5
ng mL
-1
para Hg (II) e 1,0 ng mL
-1
para Ag (I), não se pode afirmar que a curva analítica
começa em zero. O método desenvolvido foi aplicado na determinação de Hg (II) e Ag
(I) em água de abastecimento, águas residuais e misturas sintéticas; e validado por
comparação com valores obtidos por espectrometria de absorção atômica AAS.
YE et al. [39] determinaram espectrofotometricamente Fe (III), Ag (I) e Mn
(II) utilizando um sistema de análise em fluxo. O método aplicado teve como base o
efeito catalítico diferencial desses íons metálicos na oxidação de Rodamina B (RB) pelo
periodato de potássio na presença do reagente ativador 1,10-fenantrolina. Os três íons
metálicos foram determinados simultaneamente devido ao comportamento cinético
diferencial dos analitos frente à reação utilizada. As análises foram desenvolvidas via
stopped-flow e realizadas através do registro da diminuição da absorbância em 555 nm.
Os autores utilizaram o filtro Kalman para o processamento dos dados cinéticos. O
método foi aplicado a amostras certificadas de ligas metálicas, e os valores encontrados
foram concordantes com os valores certificados.
TAVALLALI e MASSOUMI [40] fizeram a determinação simultânea de V
(V) e Fe (III) sem prévia separação dos analitos empregando um método baseado no
efeito catalítico dos metais na reação de oxidação do indigo carmine por bromato. Essa
reação tem um período de indução, onde a absorbância diminui em =612nm devido à
descoloração da substância indigo carmine. A taxa de descoloração é dependente da
concentração de V e independente da de Fe, já a duração do período de indução é
proporcional à concentração de Fe e independente da de V. O método foi aplicado em
Revisão Bibliográfica 13
amostras de vicalloy e petróleo não refinado além de diversas misturas de soluções-
padrão. Os resultados obtidos foram comparados com dados de AAS, com satisfatória
concordância entre os mesmos.
Em 1998, FUJIMOTO et al.
[31] relataram o desenvolvimento de um
método cinético-espectrofotométrico para determinação de Co (II) em concentrações na
faixa de sub-nanogramas baseado no efeito catalítico deste íon na reação de
acoplamento oxidativo de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona com N-etil-N-(2-hidroxi-
3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (DAOS) na presença de peróxido de hidrogênio e
Tiron, sendo este último o reagente ativador para a catálise de Co (II). As
determinações foram realizadas a 525 nm. O método foi otimizado manualmente e
depois adaptado ao sistema em fluxo. O limite de detecção foi de 5 pg mL
-1
(sinal/ruído,
s/n=3) e a frequência de amostragem de 30 h
-1
. A exatidão do método foi avaliada
através da determinação de Co em amostra de pimenteira como material de referência.
Em 2004, SU et al. [17] determinaram Mn (II) em águas naturais,
empregando um método espectrofotométrico baseado no efeito catalítico desse íon na
reação redox entre periodato de sódio e 4,4-bis(dimetilamino)-difenilmetano através de
um sistema de análise por injeção em fluxo. Um intermediário instável de coloração azul
foi monitorado a 602 nm. O “stopped-flow” foi empregado para melhorar a sensibilidade
do método. O limite de detecção foi de 0,073 µg L
-1
com uma frequência de
amostragem de 60 h
-1
. O RSD para a determinação de 10 µg L
-1
de Mn foi 0,5% (n=11).
A exatidão do método foi realizada através da análise do material de referência
certificado (SLEW-2) e o mesmo foi aplicado em amostras de águas naturais.
Em 2006, TESHIMA et al. [41] propuseram um método para determinação
espectrofotométrica simultânea de Cu (II), Fe (II) e Zn (II) em soro sanguíneo de
animais. Para isso, utilizaram um espectrofotômetro de duplo feixe e uma célula em
fluxo multicompartimentada, a qual permitiu a determinação dos três metais com uma
única injeção. Os metais foram complexados com 2-(5-nitro-2-piridilazo)-5-[N-propil-N-
(3-sulfopropil)amino]fenol (nitro-PAPS), onde em pH 3,8 na presença de pirofosfato
como agente mascarante para Fe, apenas o complexo de Cu é formado, os complexos
de Cu e Fe (II) foram formados na presença do agente redutor ácido ascórbico no
mesmo pH e finalmente os três complexos são formados com o nitro-PAPS em pH=8,6.
O sistema desenvolvido propiciou uma determinação seletiva e sensível para cada
Revisão Bibliográfica 14
metal determinado. O estudo de íons concomitantes mostrou que para a maioria dos
cátions e ânions analisados não houve interferência significativa nos níveis de 2 a 2000
mg L
-1
na determinação de 0,2 mg L
-1
de Cu, Fe e Zn; no entanto para V (V), Co (II) e Ni
(II) essas concentrações foram menores. Os limites de detecção calculados foram 3,9
µg L
-1
; 4,1 µg L
-1
e 4,0 µg L
-1
para Cu, Fe e Zn, respectivamente. O método apresentou-
se linear de 0,01-1,0 mg L
-1
para os três metais. A frequência de amostragem foi de 20
amostras h
-1
.
Em 2006, GERVASIO et al. [28] determinaram, simultaneamente, Mo (VI)
e W (VI) em ligas de aço utilizando um procedimento em fluxo com detecção
espectrofotométrica. O método empregado teve como base o efeito catalítico desses
íons na reação de oxidação do iodeto por peróxido de hidrogênio em meio ácido. A
amostra foi duplamente injetada, formando duas regiões, onde em uma delas foi
adicionado citrato como supressor da atividade catalítica do W (VI), gerando uma
discriminação cinética entre os analitos em questão. Os autores empregaram uma
minicoluna de resina catiônica (AG50W-X8) como estratégia para eliminar espécies
potencialmente interferentes. O sistema permitiu a análise de 70 amostras h
-1
. O
método foi validado por comparação com a técnica de espectrometria de emissão
óptica com plasma acoplado indutivamente ICP OES (do inglês, Inductively Coupled
Plasma Optical Emission Spectrometry).
Em 2007, SPHIGUN [42] et al. desenvolveram um método
espectrofotométrico para a análise de misturas binárias de Cu (II) e Zn (II) baseado na
separação cinética dos analitos no sistema em fluxo proposto. O método utilizou dois
princípios de FIA: monitorar a reação indicadora via stopped-flow e adquirir sinais
individuais através de duas zonas reacionais que chegam ao detector em tempos
diferentes. Nele, as medidas foram baseadas no diferente comportamento cinético na
reação de troca do ligante que ocorre entre complexos desses metais com o mesmo
reagente cromogênico (4-(2-piridilazo)-resorcinol ou zincon e ácidos
aminopolicarboxílicos). A razão dos metais estudados na mistura não foi maior do que
1:5, e as determinações tiveram erro relativo menores que 5% e boa precisão (RSD- do
inglês, Relative Standard Deviation < 10%, n= 6, P= 0.95), além de alta frequência de
amostragem (90 h
–1
). O método foi aplicado na determinação de Cu e Zn em amostras
de vitaminas e complexos minerais.
Revisão Bibliográfica 15
NI et al. [43] descreveram a determinação simultânea de Fe (III) e Al (III)
por um método espectrofotométrico baseada na cinética diferencial dos analitos com o
reagente Chrome Azurol S (CAS) em solução-tampão etilenodiamina/ácido clorídrico
(pH 6,3) a 25°C. Os resultados foram interpretados com o auxílio da quimiometria
devido à sobreposição de bandas nos espectros. Os autores estudaram o espectro do
complexo formado entre 540-750 nm, e curvas cinéticas foram adquiridas para a reação
de complexação entre 15 e 285 segundos no comprimento de onda de absorção
máxima. Modelos de calibração foram construídos com um conjunto de misturas
sintéticas com diferentes concentrações dos analitos, e estes foram baseados nos
dados cinéticos e espectrais obtidos. Fez-se a comparação entre modelos construídos a
partir de diferentes ferramentas quimiométricas como N-way Partial Least Squares
(NPLS), Parallel Factor Analysis (PARAFAC), Back Propagation artificial Neural
Network (BP-ANN), Single Radial Basis Function-artificial Neural Network (SRBF-ANN),
and Principal Component Neural Network (PC-RBF-ANN), no entanto, estes não
apresentaram diferença significativa. O método foi aplicado na determinação de Fe e Al
em chá, arroz e macarrão.
3.3.1 Reação indicadora
A reação catalisada pelo analito é denominada reação indicadora e esta é
sempre termodinamicamente favorável, o catalisador apenas facilita a conversão dos
reagentes em produtos. Segundo MÜLLER [33] há mais de 300 reações indicadoras
documentadas para a determinação de mais de 50 elementos e compostos.
O Co (II) e o Mn (II) exercem atividade catalítica em inúmeras reações e
estas vêm sendo utilizadas como ferramenta analítica para a determinação dos
respectivos metais [17, 31, 44]. Para a determinação de Co, diversos reagentes são
utilizados, como catecol, quinizarina, ácido cromotrópico e seus derivados, galocianina
e pirocatecol violeta [29]. Já o Mn tem atividade catalítica nas seguintes reações redox:
dioxima succinamida e oxigênio dissolvido, N,N-dimetil-p-fenilenodiamina, m-
fenilenodiamina e peróxido de hidrogênio, difenilcarbazona e oxigênio dissolvido, entre
outras [17].
Revisão Bibliográfica 16
Neste trabalho de mestrado, a reação indicadora escolhida para o
desenvolvimento do método analítico é a reação de oxidação do Tiron, a qual é
altamente sensível e pode ser utilizada para a determinação de quantidades traço
desses metais [14]. Esta reação foi proposta por BOGNÁR [45] em 1961, no qual o
autor monitorou a reação a 440 nm para a determinação de Co.
A oxidação do Tiron por um agente oxidante em meio básico é catalisada
por íons metálicos divalentes e produz um composto instável de coloração amarela,
conforme a reação demonstrada na Figura 3.3.1.1.
+ H
2
O
2
M (II)
+ 2 H
2
O
Produtos
2
O
SO
3
--
O
3
S
O
-
2
SO
3
--
O
3
S
OH
O
-
Tiron
Figura 3.3.1.1 - Reação de oxidação do Tiron catalisada por íons metálicos (M) de
valência 2+ [46].
Muitos trabalhos na literatura relataram o emprego dessa reação na
determinação de espécies metálicas.
OTTO et al. [47] estudaram o radical de Tiron como substância indicadora
em determinações catalíticas de quantidades traço de metais. Neste trabalho, os
autores propuseram um mecanismo reacional para a reação de oxidação, onde
comprovaram que a substância indicadora é o radical semiquinona do Tiron, e não a o-
quinona como relatado anteriormente na literatura.
Em 1983, OTTO et al. [14] otimizaram um sistema para determinação de
traços de Co (II) e Mn (II) pela catálise da oxidação do Tiron. O limite de detecção para
Co foi de 0,05 ng mL
-1
, e para Mn, na presença de 2,2-bipiridina como ativador, foi de
0,2 ng mL
-1
.
Ainda em 1983, OTTO e WERNER [46] realizaram estudos mecanísticos
para a modelagem da reação indicadora Tiron-peróxido de hidrogênio catalisada por
íons metálicos.
Revisão Bibliográfica 17
Em 1987, ISSHIKI e NAKAYAMA [29] determinaram Co (II) em água e
água do mar, em quantidade ultra-traço, pela catálise da oxidação de Tiron por peróxido
de hidrogênio em meio básico. Os autores adaptaram o método proposto por BOGNÁR
[45] a um sistema em fluxo. No sistema proposto, as concentrações de Tiron e peróxido
de hidrogênio utilizadas foram 0,01 e 0,005 mol L
-1
, respectivamente. O pH foi
determinado pelo uso de tampão carbonato. A frequência de amostragem foi de cerca
de 40 h
-1
.
ARRUDA et al. [48] realizaram a determinação catalítica de Co (II) em
fígado bovino empregando a reação de oxidação do Tiron e um sistema em fluxo. No
sistema utilizado os reagentes foram previamente misturados no sistema em fluxo e, em
seguida, com a amostra. A curva analítica mostrou-se linear entre 0,00 e 2,00 µg L
-1
; o
limite de detecção foi de 2 ng L
-1
de Co e a frequência de amostragem foi de 40 h
-1
. A
exatidão do método foi comprovada por GFAAS.
NOGUEIRA et al. [49] utilizaram um sistema em fluxo com detecção
espectrofotométrica, onde a reação de oxidação de Tiron por peróxido de hidrogênio foi
empregada para determinação de Co (II) em fezes de bovinos e equinos. Neste
trabalho, os autores extraíram o Co da amostra de interesse utilizando-se ácido
clorídrico como solução extratora. O procedimento de extração apresentou-se como
uma boa alternativa à digestão nitro-perclórica devido a este ser bem mais rápido que a
digestão. Os resultados obtidos indicaram que o método foi exato, preciso (RSD<1%) e
rápido (± 65 determinações h
-1
). O limite de detecção foi 0,2 µg L
-1
(n=3). Por todas as
vantagens descritas, o método pôde ser usado em análises de rotina de Co em fezes
animais.
Em 1999, PEREIRA-FILHO e ARRUDA [50] desenvolveram um
mecanismo de digestão de amostras de alimentos “online” utilizando radiação
microondas e empregaram a reação de oxidação de Tiron por peróxido de hidrogênio
para a determinação de Co (II) em amostras digeridas. As concentrações de Tiron e
peróxido de hidrogênio utilizadas foram 1,8 x 10
-3
e 3,0 x 10
-4
mol L
-1
, respectivamente.
O método proposto utilizou um sistema monossegmentado e apresentou-se linear de 10
a 200 ng L
-1
de Co, com limite de detecção de 1,7 ng L
-1
. A exatidão do método foi
confirmada pelo uso de amostras certificadas, além da comparação com ETAAS (do
inglês, Eletrothermal AAS).
Revisão Bibliográfica 18
Por fim, em 2002, PEREIRA-FILHO et al. [51] desenvolveram um sistema
em fluxo monossegmentado utilizando a reação de oxidação de Tiron por peróxido de
hidrogênio em meio básico (pH=13), catalisada por Co (II), para a determinação
residual de peróxido de hidrogênio em águas de lavagem de garrafas plásticas. O
método mostrou-se extremamente sensível, com limite de detecção de 19 µg L
-1
. O
sistema desenvolvido possibilitou cerca de 100 determinações por hora, utilizando
apenas 0,53 µg de Tiron por determinação.
Todos os trabalhos apresentados nesta parte efetuaram a determinação
de Co e/ou Mn de forma monoelementar.
3.4 Co e Mn
Os metais de interesse neste trabalho são o Co (II) e o Mn (II) devido à
importância bioquímica desses no corpo humano.
O Co é absorvido pelo corpo humano como cobalto inorgânico ou como
Co presente na vitamina B
12
. Este metal é imprescindível na síntese da vitamina B
12
, a
qual pode ser descrita como um grupo de corrinóides que contêm Co, conhecidos como
cobalamina [53]. Esta vitamina é indispensável ao organismo humano, pois participa na
síntese de DNA (DeoxyriboNucleic Acid), metabolismo do propionato além de prevenir e
controlar a anemia perniciosa [48]. Como já implícito anteriormente, além da deficiência
de vitamina B
12
ser a causadora da anemia perniciosa, esta pode causar lesões
neurológicas, fadiga crônica, falta de resistência física, perda de sensibilidade e até
depressão mental [54]. Já a ingestão em excesso de Co por um longo período de
tempo pode causar doenças do coração [48]. Alimentos de origem animal, tais como
fígado, ovos, leite e seus derivados são boas fontes de Co [55].
Em bovinos sob condição de pastagem, a deficiência de Co é um
problema grave e ocorre com freqüência, pois provoca a falta de apetite, perda de peso,
pêlos arrepiados, anemia megaloblástica e até mesmo a morte em casos extremos [56].
Portanto, devido aos diversos problemas relacionados à deficiência de Co
em humanos e animais, torna-se importante a determinação desse metal em produtos
alimentícios, tecidos animais e fármacos que o contenha. Como a composição dos
Revisão Bibliográfica 19
tecidos do corpo reflete a alimentação de um animal, comumente utiliza-se o fígado
para avaliar a concentração de Co [57].
O Mn, bem como o Co, é um metal importante em processos bioquímicos,
pois é um constituinte das enzimas superóxido dismutase mitocondrial (SOD,
SuperOxide Dismutase) que é responsável pela correta metabolização dos radicais
livres nas mitocôndrias. O aumento de radicais livres está associado à deficiência de
SOD. Além disso, o Mn é importante na síntese do colesterol e de dopamina, a qual é
um importante neurotransmissor. Diversos sintomas estão associados à deficiência de
Mn, sendo os mais importantes, a perda de peso, falta de resistência física,
metabolismo dos ossos e das cartilagens prejudicado, alterações da tolerância à glicose
e da síntese de insulina além da redução da fertilidade. A deficiência de Mn parece
aumentar a suscetibilidade do organismo às crises convulsivas. Baixa concentração de
Mn causa importante diminuição das taxas de colesterol no sangue podendo provocar
quadros depressivos. Em gestantes, as malformações fetais foram associadas à
deficiência desse metal [54].
Em bovinos o Mn também é importante para o bom funcionamento dos
processos reprodutivos, manutenção da estrutura óssea e adequado funcionamento do
sistema nervoso central. No entanto, a deficiência de Mn é pouco comum em bovinos
sob pastagem. Mas se a deficiência ocorrer, anomalias no esqueleto de animais jovens
e recém nascidos podem ser detectadas além do mau funcionamento do sistema
reprodutor, acarretando cios tardios e consequente diminuição na taxa de concepção
[56].
Capítulo 4
PARTE EXPERIMENTAL
Parte Experimental 21
4 Parte experimental
4.1 Material e equipamentos
Neste trabalho foram utilizados os seguintes materiais e equipamentos:
Balança analítica, marca Bel engineering, modelo Mark 210A;
Bomba peristáltica com 8 canais e velocidade variável, marca Ismatec, modelo IPC;
Bloco digestor, marca Solab;
Centrífuga, marca Labnet, modelo z 200 A;
Computador para aquisição de dados;
Cubeta, de caminho ótico de 1 cm e volume igual a 4 mL;
Desionizador de água, marca Millipore Milli-Q
®
plus;
Espectrofotômetro, marca Femto, modelo 600 Plus, equipado com célula de fluxo de
20 mm de caminho ótico e 400 µL de capacidade;
Espectrofotômetro, marca Hitachi, modelo U-2001
Espectrômetro de absorção atômica, marca Varian, modelo AA240FS;
Estufa, marca Qualxtron;
Injetor comutador confeccionado em acrílico;
Mesa agitadora, marca Thermolyne Maxi-mix III™, modelo 65800;
Tubos de Tygon de diversos diâmetros e tubos de polietileno com diâmetro
interno;igual a 0,75 mm para a configuração do sistema em fluxo;
Vidraria e outros materiais, comuns a um laboratório analítico.
4.2 Reagentes
Todos os reagentes utilizados são de grau analítico.
2,2-Bipiridina (J. T. Baker);
Ácido clorídrico concentrado, HCl (Merck);
Ácido nítrico concentrado, HNO
3
(Merck);
Etanol P.A., C
2
H
5
OH (Merck);
Dimetilglioxima, DMG (Merck);
Hidróxido de amônio concentrado, NH
4
OH (Merck);
Hidróxido de sódio, NaOH (Merck);
Parte Experimental 22
Peróxido de hidrogênio 30% v/v, H
2
O
2
(Merck);
Soluções padrão de Co
2+
, Mn
2+
, Ca
2+
, Cu
2+
, Fe
2+
, Mg
2+
, Ni
2+
, e Zn
2+
; todas com
concentração igual a 1000 mg/L (Merck);
Tiron [3,5 dihidroxi-1,3-ácido benzenossulfônico-sal dissódico monohidratado]
[(HO)
2
C
6
H
2
(SO
3
Na)
2
.H
2
O] (Aldrich);
Todas as soluções foram preparadas com H
2
O destilada/desionizada e as
soluções de Tiron, H
2
O
2
e NaOH foram preparadas diariamente e acondicionadas em
frascos de polietileno previamente descontaminados.
4.3 Programas Computacionais
WindMill versão 6.0 para aquisição dos sinais transientes;
Surfer versão 5.0 para visualização das superfícies de resposta e gráficos de
contorno;
Microsoft Office Excel 2007 para o tratamento de dados e cálculos.
4.4 Amostras
As amostras empregadas na realização deste trabalho estão relacionadas
na Tabela 4.4.1
Parte Experimental 23
Tabela 4.4.1 – Amostras e suas respectivas descrições
Amostra
Nome
Descrição
1
Ostra
Tecido de ostra
2
Arroz com
legumes*
Merenda escolar
3
Fegatelli*
Merenda escolar (preparado a partir de fígado de aves)
4
Fígado bovino
NIST (National Institute of Standards & Technology)
Standard Reference Material (SRM) 1577a
5
Tecido de ostra
NIST 1566b
6
Medicamento A
Complexo multivitamínico indicado na reposição de
vitaminas e sais minerais (sólido)
7
Medicamento B
Medicamento indicado no tratamento de anemia perniciosa
(sólido)
8
Ni 200
Liga metálica de Ni
9
Aço 420
Liga metálica
10
Aço
Liga metálica (prego)
11
Medicamento C
Medicamento indicado para a normalização do
metabolismo (associação de aminoácidos e
hidroxicobalamina) (sólido)
12
Medicamento D
Medicamento de uso veterinário para reposição de
vitamina B
12
com administração por via oral (líquido)
*amostras liofilizadas e cedidas gentilmente pela professora Dra. Semíramis M. A.
Domene da Faculdade de Nutrição da PUC-Campinas (Campinas – SP).
4.5 Determinação do comprimento de onda para as determinações
espectrofotométricas
Para estabelecer o comprimento de onda ótimo do método desenvolvido,
fez-se a varredura espectral dos produtos formados na reação de oxidação do Tiron,
resultantes da catálise por Co e por Mn, separadamente. Nestes experimentos, foi
colocado em uma cubeta de caminho ótico de 1 cm, 1 mL de cada uma das seguintes
soluções: Tiron 0,43x10
-3
mol L
-1
; NaOH 0,1 mol L
-1
; H
2
O
2
25x10
-3
mol L
-1
e solução
Parte Experimental 24
padrão de Co 20 µg L
-1
ou Mn 500 µg L
-1
; além disso, na catálise por Mn foi utilizado 1
mL de solução de 2,2-bipiridina como reagente ativador. Em ambos experimentos foram
colocados todas as soluções de reagentes na cubeta e em seguida realizou-se a adição
do catalisador. Após dois minutos desta adição foram realizadas as medidas.
A análise foi realizada em um espectrofotômetro Hitachi, modelo U-2001,
e a varredura espectral foi efetuada no intervalo de comprimento de onda de 270 nm a
1100 nm.
4.6 Triagem de Variáveis e Otimização do sistema FIA
4.6.1 Triagem das Variáveis
No processo de desenvolvimento do método, inicialmente foi efetuado um
estudo preliminar para a triagem das variáveis do sistema. Para isso foi realizado um
planejamento fatorial fracionário 2
9-5
, no qual as variáveis e seus respectivos níveis
estudados encontram-se descritos na Tabela 4.6.1:
TABELA 4.6.1 - Planejamento fatorial 2
9-5
efetuado no estudo preliminar da triagem de
variáveis do sistema
Nível
Variável
NaOH
Tiron
H
2
O
2
Bipy
L
1
L
2
L
3
Vazão*
Posição
das
alças
(mol L
-1
)
(10
-3
mol L
-1
)
(µL)
(mL min
-1
)
-1
0,1
0,5
0,5
0,5
45
90
120
0,8
L
1
/L
3
1
1,0
5,0
5,0
5,0
85
180
250
1,6
L
3
/L
1
*Para a vazão 0,8 mL min
-1
dos reagentes a da solução carregadora foi 3,0 mL min
-1
, e para a
de 1,6 mL min
-1
foi de 6,0 mL min
-1
.
Parte Experimental 25
Após a triagem das variáveis, foi realizado um planejamento fatorial 2
3
,
onde as variáveis estudadas e seus respectivos níveis encontram-se na Tabela 4.6.2 e
4.6.3.
TABELA 4.6.2 - Planejamento fatorial 2
3
efetuado na triagem de variáveis do sistema
Experimento
Tiron
H
2
O
2
NaOH
1
-1
-1
-1
2
1
-1
-1
3
-1
1
-1
4
1
1
-1
5
-1
-1
1
6
1
-1
1
7
-1
1
1
8
1
1
1
TABELA 4.6.3 - Níveis das variáveis do planejamento fatorial empregado na triagem
das variáveis do sistema em fluxo.
Nível
Tiron(10
-3
mol L
-1
)
H
2
O
2
(10
-3
mol L
-1
)
NaOH (mol L
-1
)
-1
0,5
5,0
0,1
1
2,0
20
0,4
Cada experimento realizado constituiu uma curva analítica, a qual foi
construída a partir das seguintes soluções-padrão contendo Co e Mn (Tabela 4.6.4).
TABELA 4.6.4 – Concentrações das soluções-padrão utilizadas na curva analítica
Solução-padrão
[Co] µg L
-1
[Mn] µg L
-1
1
7
120
2
14
240
3
21
360
4
28
480
5
35
600
Parte Experimental 26
A resposta para cada experimento foi o coeficiente angular da curva
analítica ou a absorbância da solução-padrão “3”.
As determinações espectrofotométricas foram efetuadas em um sistema
em fluxo, conforme esquematizado na Figura 4.6.1.
Parte Experimental 27
FIGURA 4.6.1 - Representação esquemática do sistema em fluxo empregado, onde R
1
:
Tiron; R
2
: H
2
O
2
; R
3
: NaOH; C: solução transportadora (HNO
3
0,01 mol L
-1
+ etanol 10%
v/v); P: bomba peristáltica; I: Injetor; S: amostra; B: 2,2-bipiridina; C
1
e C
2
: reatores de
100 e 150 cm respectivamente; : espectrofotômetro; e W: descarte. Em (A): posição de
amostragem; em (B): posição de injeção da amostra.
Parte Experimental 28
4.6.2 Otimização do sistema FIA
Após a triagem de variáveis do sistema, partiu-se para o processo de
otimização das variáveis realmente significativas.
Neste caso, foi realizado um planejamento 2
2
+ ponto central + estrela, no
qual as variáveis estudadas foram as concentrações da solução de Tiron e de NaOH,
conforme descrito na Tabela 4.6.2.1. A concentração das soluções de H
2
O
2
e 2,2-
bipiridina utilizadas neste estudo foram fixadas em 25 x 10
-3
e 5,0 x 10
-3
mol L
-1
,
respectivamente.
TABELA 4.6.2.1 - Planejamento composto central
efetuado para a otimização das
variáveis do sistema
Experimento
Tiron
NaOH
1
-1
-1
2
1
-1
3
-1
1
4
1
1
5
0
0
6
0
0
7
0
0
8
-1,41
0
9
1,41
0
10
0
-1,41
11
0
1,41
Parte Experimental 29
TABELA 4.6.2.2 - Níveis das variáveis do planejamento composto central empregado
na otimização das variáveis do sistema em fluxo.
Nível
Tiron (10
-3
mol L
-1
)
NaOH (mol L
-1
)
-1,41
2,0
0,40
-1
2,4
0,49
0
3,5
0,70
1
4,5
0,91
1,41
5,0
1,0
Cada experimento realizado constituiu uma curva analítica, a qual foi
construída a partir das seguintes soluções-padrão contendo Co e Mn (Tabela 4.6.2.3).
TABELA 4.6.2.3 – Concentrações das soluções-padrão utilizadas na curva analítica
Solução-padrão
[Co] µg L
-1
[Mn] µg L
-1
1
5
150
2
10
300
3
15
450
4
20
600
A resposta para cada experimento foi o coeficiente angular da curva
analítica obtida. Os experimentos foram realizados utilizando-se o mesmo sistema em
fluxo da Figura 4.6.1.
4.7 Estudo do perfil catalítico dos analitos
No estudo do perfil cinético dos analitos foram utilizadas as seguintes
soluções: Tiron 5x10
-3
mol L
-1
; H
2
O
2
25x10
-3
mol L
-1
; NaOH 1,0 mol L
-1
; 2,2-bipiridina
5x10
-3
mol L
-1
e solução carregadora HNO
3
0,01 mol L
-1
em etanol 10% v/v. A solução
analítica empregada no experimento foi preparada utilizando-se diluições sucessivas de
soluções-padrão 1000 mg L
-1
de Co e Mn, sendo que a concentração destes íons na
solução foram, respectivamente, 10 e 500 µg L
-1
.
Parte Experimental 30
Neste experimento, foi utilizado o sistema em fluxo com a mesma
configuração daquela representada na figura 4.6.1.1, exceto em relação ao
comprimento do reator C
2
, que neste caso foi de 18 cm (o menor comprimento
possível).
A primeira etapa do experimento foi o registro da absorbância da solução
analítica sem interrupção do fluxo, para a verificação dos valores máximos obtidos na
catálise por Co e Mn, respectivamente. No estudo do perfil catalítico do Co, quando a
absorbância chegou ao seu primeiro máximo a bomba peristáltica foi desligada e,
consequentemente, o fluxo interrompido; sendo que este foi religado novamente,
apenas quando cessou-se o aumento no sinal analítico. O mesmo procedimento foi
realizado para o estudo catalítico do Mn, no entanto o “stopped-flow” foi executado no
segundo valor de máximo da absorbância anteriormente registrada.
Em seguida, foram registradas as absorbâncias da solução-padrão
variando-se o comprimento do reator C
2
. Foram utilizados reatores de 150 e 300 cm.
4.8 Avaliação de interferentes
4.8.1 Triagem de interferentes
A investigação de possíveis interferentes no método desenvolvido foi feita
com base na concentração de íons metálicos de valência 2+ presentes nas amostras
certificadas utilizadas neste trabalho.
Foram tomados como possíveis interferentes os íons Ca
2+
, Cu
2+
, Co
2+
(no
caso do Mn), Fe
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
(no caso do Co), Ni
2+
e Zn
2+
. Os níveis de concentração
empregados neste estudo foram baseados em valores de concentração encontrados
em amostras de referência de alimentos.
Primeiramente foi efetuado um planejamento fatorial fracionário 2
7-2
onde
as variáveis foram os íons metálicos, como descrito nas Tabelas 4.8.1.1 a 4.8.1.4.
Parte Experimental 31
TABELA 4.8.1.1 – Planejamento fatorial fracionário 2
7-2
efetuado na triagem dos
possíveis interferentes no sinal do Co
Experimento
1
2
3
4
5
6 (1234)
7 (12345)
Ca
Cu
Fe
Mg
Mn
Ni
Zn
1
-1
-1
-1
-1
-1
1
-1
2
1
-1
-1
-1
-1
-1
1
3
-1
1
-1
-1
-1
-1
1
4
1
1
-1
-1
-1
1
-1
.
.
.
30
1
-1
1
1
1
-1
-1
31
-1
1
1
1
1
-1
-1
32
1
1
1
1
1
1
1
TABELA 4.8.1.2 - Níveis das variáveis do planejamento 2
7-2
empregado na triagem de
possíveis interferentes no sinal do Co
Nível
Ca
Cu
Fe
Mg
Mn
Ni
Zn
(mg L
-1
)
-1
2,5
0,05
0,005
12,5
0,2
0,025
0,25
1
850
3,5
4
160
5,5
0,05
19,5
Parte Experimental 32
TABELA 4.8.1.3 – Planejamento fatorial fracionário 2
7-2
efetuado na triagem dos
possíveis interferentes no sinal do Mn
Experimento
1
2
3
4
5
6 (1234)
7 (12345)
Ca
Co
Cu
Fe
Mg
Ni
Zn
1
-1
-1
-1
-1
-1
1
-1
2
1
-1
-1
-1
-1
-1
1
3
-1
1
-1
-1
-1
-1
1
4
1
1
-1
-1
-1
1
-1
.
.
.
30
1
-1
1
1
1
-1
-1
31
-1
1
1
1
1
-1
-1
32
1
1
1
1
1
1
1
TABELA 4.8.1.4 - Níveis das variáveis do planejamento 2
7-2
empregado na triagem de
possíeveis interferentes no sinal do Mn
Nível
Ca
Co
Cu
Fe
Mg
Ni
Zn
(mg L
-1
)
-1
2,5
0,05
0,5
0,5
15
0,05
0,5
1
150
0,5
10
10
60
0,5
40
4.8.2 Modelagem de superfície para os interferentes
Após obtenção das variáveis estatisticamente significativas, realizou-se
um planejamento 2
3
+ ponto central + estrela, no estudo de interferentes para Co
(Tabelas 4.8.2.1 e 4.8.2.2) e um planejamento 2
4
+ ponto central + estrela, para os
interferentes no sinal do Mn (Tabelas 4.8.2.3 e 4.8.2.4). As concentrações dos
interferentes foram estipuladas em escala logarítmica para englobar uma ampla faixa de
concentração.
Parte Experimental 33
TABELA 4.8.2.1 - Planejamento composto central
efetuado para a modelagem dos
interferentes no sinal do Co
Experimento
Ca
Mg
Mn
1
-1
-1
-1
2
1
-1
-1
3
-1
1
-1
4
1
1
-1
5
-1
-1
1
6
1
-1
1
7
-1
1
1
8
1
1
1
9
0
0
0
10
-1,68
0
0
11
1,68
0
0
12
0
-1,68
0
13
0
1,68
0
14
0
0
-1,68
15
0
0
1,68
TABELA 4.8.2.2 - Níveis das variáveis do planejamento composto central efetuado para
a modelagem dos interferentes no sinal do Co
Nível
Ca
Mg
Mn
(µg L
-1
)
-1,68
5
5
5
-1
100
70
30
0
2090
890
170
1
42600
12000
950
1,68
850000
160000
5500
Parte Experimental 34
TABELA 4.8.2.3 - Planejamento composto central
efetuado para a modelagem dos
interferentes no sinal do Mn
Experimento
Ca
Co
Fe
Mg
1
-1
-1
-1
-1
2
1
-1
-1
-1
3
-1
1
-1
-1
4
1
1
-1
-1
5
-1
-1
1
-1
6
1
-1
1
-1
7
-1
1
1
-1
8
1
1
1
-1
9
-1
-1
-1
1
10
1
-1
-1
1
11
-1
1
-1
1
12
1
1
-1
1
13
-1
-1
1
1
14
1
-1
1
1
15
-1
1
1
1
16
1
1
1
1
17
0
0
0
0
18
-2
0
0
0
19
2
0
0
0
20
0
-2
0
0
21
0
2
0
0
22
0
0
-2
0
23
0
0
2
0
24
0
0
0
-2
25
0
0
0
2
Parte Experimental 35
TABELA 4.8.2.4 - Níveis das variáveis do planejamento composto central efetuado para
a modelagem dos interferentes no sinal do Mn
Nível
Ca
Co
Fe
Mg
(µg L
-1
)
-2
500
5
500
500
-1
2100
15
1050
1650
0
8700
50
2250
5600
1
36200
150
4700
18800
2
150000
500
10000
60000
4.9 Preparo das amostras
4.9.1 Extração com ácido diluído
Para a extração dos analitos de interesse nas amostras estudadas (ostra,
arroz com legumes, Fegatelli, amostra certificada de fígado bovino e medicamento A)
foi realizada uma extração com ácido diluído, conforme proposto por DONATI et al. [52].
Inicialmente foram pesadas 0,250 g de amostra e esta massa foi
transferida a um tubo de ensaio de volume 15 mL, onde foram adicionados 10 mL de
HCl 1,0 mol L
-1
. Em seguida, aqueceram-se os tubos a 65 °C durante 15 min em uma
estufa. Após o aquecimento, fez-se a agitação dos tubos em mesa agitadora por 30
min e posterior centrifugação a 3500 rpm por 10 min. Então, foram transferidos 9 mL
para um outro tubo e 600 µL de NH
4
OH concentrado foram adicionados para ajuste de
pH. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
4.9.2 Digestão em bloco digestor
(a) Amostras de alimentos e medicamento B
Para a digestão das amostras foram pesados 0,100 g do medicamento B
e 0,200 g das amostras certificadas de fígado bovino e de tecido de ostra.
Parte Experimental 36
Essas massas foram transferidas a tubos de digestão e a estes foram
adicionados 3,0 mL de HNO
3
concentrado. Em seguida, os tubos foram aquecidos a
100 °C e mantidos nesta temperatura por 60 min. Após resfriamento, foram adicionados
2 mL de H
2
O
2
30% v/v e então, os tubos foram aquecidos vagarosamente até 180 °C,
permanecendo nesta temperatura até obtenção de cerca de 0,5 mL do digerido. Após
resfriamento, o digerido da amostra de medicamento B foi quantitativamente transferido
a um frasco volumétrico e o volume completado para 50 mL; em seguida a amostra foi
diluída pipetando-se 200 µL desta e o volume completado para 5 mL com água
deionizada. As amostras certificadas também foram transferidas quantitativamente para
frascos volumétricos e o volume completado para 10 mL. Todas as digestões foram
realizadas em triplicata
(b) Amostras de ligas metálicas e medicamento C
Para a digestão das amostras foram pesados 0,250 g de cada liga
metálica e 0,180 g do medicamento C.
As massas foram transferidas a tubos de digestão e às ligas Ni 200 e aço
(prego) foram adicionados 10 mL de HNO
3
50% (v/v); já ao aço 420 foram adicionados
4,0 mL de água régia (HCl:HNO
3
na proporção 3:1). Em seguida, os tubos foram
aquecidos a 100 °C, durante 80 minutos. Após resfriamento, os digeridos foram
quantitativamente transferidos a frascos volumétricos e o volume completado para: 25
mL no caso das amostras Ni 200 e medicamento C, 200 mL para a amostra de aço 420
e 50 mL para a amostra de aço (prego), com água deionizada. Todas as digestões
foram realizadas em triplicata.
Primeiramente, as amostras foram analisadas utilizando-se FS-FAAS para
obter as concentrações de referência de Co e Mn, no entanto, para isto a amostra de
medicamento foi diluída tomando-se uma alíquota de 10 mL e o volume foi completado
para 25 mL com solução de HNO
3
0,01 mol L
-1
. Já para a análise no sistema FIA
desenvolvido, as amostras foram novamente diluídas. As alíquotas tomadas para as
amostras de Ni 200, aço 420, aço (prego) e medicamento C foram respectivamente 35,
400, 250 e 150 µL das soluções já diluídas, e o volume foi completado para 15 mL com
solução de HNO
3
0,01 mol L
-1
.
Parte Experimental 37
(c) Amostras de medicamentos B e D
Para a digestão das amostras foram pipetados 2,5 mL do medicamento D
e pesado 0,050 g do medicamento B.
Os volumes pipetados e a massa pesada foram transferidos a tubos de
digestão. À amostra líquida foi adicionado 1,0 mL de HNO
3
concentrado e ao
medicamento B sólido foram adicionados 3 mL deste mesmo ácido. Os tubos foram
aquecidos a 120 °C por 30 minutos, a 150 °C por mais 30 minutos, e em seguida, a
temperatura foi elevada a 180 °C para a eliminação do excesso de ácido. As digestões
foram realizadas em triplicata. Após resfriamento, os digeridos foram quantitativamente
transferidos a frascos volumétricos e o volume completado para 14 mL no caso da
amostra sintética e de medicamento D, e 50 mL no caso da amostra de medicamento B.
Inicialmente, as amostras foram analisadas utilizando-se FS-FAAS e em
seguida foram diluídas para posterior análise utilizando-se o sistema FIA desenvolvido.
As alíquotas tomadas foram 840 µL para o medicamento D e 100 µL para o
medicamento B. O volume final foi completado para 15 mL com solução de HNO
3
0,01
mol L
-1
.
4.10 Determinação de Co e Mn
4.10.1 Amostras de alimentos
As determinações foram realizadas espectrofotometricamente utilizando-
se o sistema em fluxo da Figura 4.6.1, o qual foi completamente otimizado.
A curva analítica foi preparada com os dois padrões juntos e em meio de
HNO
3
0,01 mol L
-1
. As concentrações de Co e Mn nas soluções analíticas de calibração
foram
2,5; 5; 10; 20 e 30 µg L
-1
para Co e 50; 100; 200; 400 e 600 µg L
-1
para Mn.
4.10.2 Amostras de ligas metálicas e no medicamento C
Inicialmente as amostras foram analisadas por FS-FAAS. A curva
analítica foi preparada com os dois padrões juntos e em meio de HNO
3
0,01 mol L
-1
. As
concentrações de Co e Mn nas soluções analíticas de calibração foram
0,25; 1,0; 2,0;
Parte Experimental 38
4,0 e 6,0 mg L
-1
para Co e 0,50; 2,5; 5,0; 10; e 20 mg L
-1
para Mn. Os comprimentos de
onda utilizados nas análises foram 240,7 nm para Co e 403,1 nm para Mn.
Em seguida, após diluição das amostras de acordo com a faixa de
concentração dos analitos obtida por FS-FAAS, fez-se a determinação
espectrofotométrica de Co e Mn utilizando-se o sistema em fluxo da Figura 4.6.1.
Para a quantificação de Co e Mn na amostra Ni 200 também adotou-se o
método de calibração por adições de padrão (SAM). Nesse método quantidades
conhecidas do analito são adicionadas à amostra, obtendo assim uma curva analítica
na qual o meio é a própria amostra e a concentração do analito é obtida a partir da
extrapolação da curva analítica. O método das adições de padrão é recomendado em
casos nos quais a amostra é complexa e, consequentemente, a probabilidade de
ocorrência de efeitos de matriz é alta [19]. Neste estudo, foram tomadas 4 alíquotas de
5 mL da solução resultante da digestão da liga Ni 200 e a cada alíquota foram
adicionadas concentrações crescentes de Co (2, 4 e 6 µg L
-1
) e de Mn (50, 100 e 150
µg L
-1
), sendo que estes não foram adicionados na primeira alíquota (adição zero).
Após a adição dos analitos o volume foi completado para 7 mL com solução de HNO
3
0,01 mol L
-1
.
Outra alternativa testada para a quantificação de Co e Mn na amostra de
Ni 200 foi a compatibilização de matriz, devido a amostra ser constituída
majoritariamente por Ni metálico (99,70%). Neste experimento foi adicionada solução
padrão de Ni às soluções da curva analítica para que a concentração final de Ni fosse
37 mg L
-1
. As concentrações de Co e Mn nas soluções da curva analítica foram 6; 7; 8;
9 e 10 µg L
-1
e 40; 80; 120; 160 e 200 µg L
-1
, respectivamente.
Ainda na tentativa de eliminar a interferência causada pela alta
concentração de Ni na amostra da liga metálica Ni 200 tentou-se precipitar o Ni
utilizando-se um reagente específico: a dimetilglioxima (DMG). Para isto, tomou-se uma
alíquota de 50 µL da solução resultante da digestão da liga Ni 200 e o volume foi
completado para 10 mL. Aqueceu-se a amostra a 70-80 °C e em seguida adicionaram-
se 850 µL de solução de DMG 1%. Em seguida, gotejou-se solução de NH
4
OH 6 mol L
-1
até a precipitação e aqueceu-se a solução novamente por mais 20 minutos. Após
resfriamento, fez-se a centrifugação e separou-se 9 mL do sobrenadante. A este
volume foram adicionados mais 100 µL de DMG 1% para confirmar que todo Ni havia
Parte Experimental 39
precipitado. Então, foram adicionados 300 µL de HNO
3
concentrado para ajuste de pH
e por fim o volume foi completado para 15 mL com solução de HNO
3
0,01 mol L
-1
. A
amostra foi analisada espectrofotometricamente no sistema FIA desenvolvido.
4.10.3 Amostras de medicamentos B e D
Primeiramente as amostras foram analisadas por FS-FAAS. A curva
analítica foi preparada com os dois padrões juntos e em meio de HNO
3
0,01 mol L
-1
. As
concentrações de Co e Mn nas soluções analíticas de calibração foram
30; 60; 120;
240; 480 e 960 µg L
-1
para Co e 10; 20; 30; e 40 mg L
-1
para Mn. Os comprimentos de
onda utilizados para Co e Mn foram, respectivamente, 240,7 e 403,1 nm.
Em seguida, após diluição das amostras de acordo com a faixa de
concentração dos analitos obtida por FS-FAAS, fez-se a determinação
espectrofotométrica de Co e Mn utilizando-se o sistema em fluxo da Figura 4.6.1. Foram
utilizados dois tipos de curva analítica: uma contendo os dois padrões (Co: 1; 3; 5; 7 e 9
µg L
-1
e Mn: 333; 1000; 1667; 2333; 3000 µg L
-1
) e outra na qual os padrões de Co (1;
3; 5; 7 e 9 µg L
-1
) ou Mn (300; 600; 900; 1200 e 1500 µg L
-1
) estavam presentes
individualmente. Além disso, as curvas também foram obtidas de maneiras diferentes:
individualmente e no modo sequencial.
Na tentativa de quantificar Co e Mn na amostra de medicamento D
também foi utilizado o método de calibração por adições de padrão. No entanto, neste
caso foram realizados experimentos onde as adições de Co e Mn foram efetuadas
separadamente. Para a determinação de Co foram tomadas 5 alíquotas de 560 µL da
amostra digerida e a estas, com exceção da primeira, foram adicionadas concentrações
crescentes de Co (7, 14, 21 e 28 µg L
-1
). Para a determinação de Mn, também foram
tomadas 5 alíquotas de 560 µL da amostra digerida e a estas, com exceção da
primeira, foram adicionadas concentrações crescentes de Mn (300, 600, 900 e 1200 µg
L
-1
).
Capítulo 5
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
Resultados e Discussão 41
5 Resultados e discussão
5.1 Determinação do comprimento de onda ótimo para as
determinações espectrofotométricas
Na literatura, a maioria dos trabalhos que apresentam determinações
espectrofotométricas simultâneas ou sequenciais utilizam espectrofotômetros que
operam no modo de varredura espectral.
Para estabelecer o comprimento de onda para as análises realizou-se
uma varredura espectral para o produto formado na reação de oxidação do Tiron pelo
H
2
O
2
em meio básico, tanto na catálise por Co, quanto na catálise por Mn ativada por
2,2-bipiridina. O espectro de varredura obtido em ambos casos estão apresentados na
Figura 5.1.1 Analisando-se os espectros obtidos é possível verificar que o produto
formado tem sua absorção máxima em = 426 nm; desta maneira, a determinação
espectrofotométrica sequencial de Co e Mn foi realizada neste comprimento de onda.
400 600 800 1000
(nm)
Abs
(a)
(b)
FIGURA 5.1.1 - Espectro de absorção do Tiron oxidado em meio básico pela catálise de
Co (a – linha tracejada), e pela catálise de Mn ativada por 2,2-bipiridina (b – linha
sólida).
Resultados e Discussão 42
5.2 Elaboração do sistema FIA
Com base no trabalho de OTTO e WERNER [46], inicialmente, foram
realizados alguns experimentos preliminares nos quais elaborou-se um sistema em
fluxo visando a formação de um gradiente de pH, pois de acordo com este trabalho, a
catálise por Co da reação de oxidação do Tiron por H
2
O
2
, tem sua taxa máxima em
valores de pH maiores que 12 e a catálise por Mn em pH por volta de 9,8. Foram
avaliadas diversas configurações para o sistema em fluxo, assim como soluções de
NaOH em diferentes concentrações e soluções-tampão carbonato de sódio e de ácido
bórico-cloreto de potássio para estabelecer o gradiente de pH. No entanto, não foi
obtido sinal analítico quando se utilizou o Mn como catalisador da reação. De acordo
com este fato, a estratégia da utilização de gradientes de pH no sistema em fluxo foi
descartada e partiu-se, então, para a utilização de um reagente ativador no caso da
catálise por Mn, pois de acordo com o trabalho de OTTO et al.
[14], esta catálise é
ativada por 1,10-fenantrolina e por 2,2-bipiridina. Foram testados os dois reagentes
ativadores citados, no entanto somente com o ativador 2,2-bipiridina foi obtido um sinal
analítico para o Mn.
Em vista dos resultados obtidos nos experimentos preliminares o sistema
em fluxo foi desenvolvido com o objetivo de obter-se o sinal analítico do Co e do Mn
sequencialmente e com separação física entre os mesmos. Deste modo, o sistema em
fluxo foi proposto de modo que o injetor comutador possuísse três alças de
amostragem, onde duas dessas alças (L
1
e L
3
)
são utilizadas para amostra, e uma alça
(L
2
) para o reagente ativador 2,2-bipiridina. Neste sistema L
1
tem menor volume que L
3,
já que em L
1
será obtido o sinal para o Co e a reação é mais sensível para este analito
do que para o Mn. A posição das alças no sistema FIA foi elaborada com base no perfil
catalítico dos analitos. Primeiramente passa pelo detector o volume da alça de
amostragem L
1
, na qual será obtido o sinal analítico referente ao Co, pois a taxa de
catálise é maior no caso deste catalisador. Na sequencia do sistema em fluxo foi
inserida a alça para a 2,2-bipiridina (L
2
), mas entre L
1
e L
2
há um reator, que foi
otimizado para que não houvesse sobreposição dos sinais analíticos do Co e do Mn;
este reator possui 200 cm de comprimento e o mesmo separa as duas alças através do
volume de solução carregadora presente dentro do mesmo. Na sequencia está L
3
,
que
Resultados e Discussão 43
encontra-se separada de L
2
por um pequeno volume de solução carregadora, que está
presente dentro de um reator de 5 cm de comprimento; essas duas alças foram
separadas pelo menor volume possível pois os volumes de L
2
e L
3
devem misturar-se
pelo efeito de dispersão no sistema em fluxo, havendo assim a ativação da catálise por
Mn através do contato com a 2,2-bipiridina. Então, através do sistema em fluxo
desenvolvido tem-se a seguinte sequencia sendo transportada ao detector, como
mostra a Figura 5.2.1.
FIGURA 5.2.1 - Representação esquemática da sequencia das alças de amostragem
que passa pelo detector, onde C é a solução carregadora, L
1
e L
3
são as alças de
amostragem contendo a amostra ou branco ou soluções, e L
2
é a alça do reagente 2,2-
bipiridina. Em (A) está representada a sequencia teórica (sem o efeito de dispersão) e
em (B) a simulação da situação real de acordo com o efeito de dispersão no sistema em
fluxo.
De acordo com o sistema em fluxo desenvolvido para a determinação
sequencial de Co e Mn o sinal analítico obtido tem o perfil ilustrado na Figura 5.2.2.
Resultados e Discussão 44
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
Mn
Co
Absorbância
Tempo (s)
FIGURA 5.2.2 - Sinal transiente obtido na determinação sequencial de Co e Mn, através
da injeção de soluções-padrão 21 e 360 µg L
-1
dos analitos, respectivamente, no
sistema em fluxo desenvolvido.
5.3 Triagem de Variáveis e Otimização do sistema FIA
5.3.1 Triagem das Variáveis
Ao desenvolver-se um método analítico que utiliza sistemas em fluxo,
deve-se considerar que os mesmos possuem diversas variáveis a serem avaliadas e
otimizadas, tais como a concentração e vazão dos reagentes, vazão da solução
carregadora, volume de amostragem, tamanho dos reatores, entre outras.
Embora o método univariado seja mais conhecido e amplamente utilizado
para avaliar e otimizar as variáveis de um sistema, este não é adequado e prático,
principalmente quando se trata de um sistema complexo, ou seja, com diversas
variáveis, pois quando se faz este tipo de estudo, apenas um parâmetro do sistema é
variado enquanto os outros permanecem inalterados, o que leva à realização de um
grande número de experimentos, além destes não considerarem o efeito de interação
entre as variáveis avaliadas. Além disso, não é possível efetuar previsões em condições
Resultados e Discussão 45
não testadas. Portanto, torna-se mais conveniente, prático e efetivo o emprego de
planejamentos fatoriais no estudo de sistemas com muitas variáveis. Para triar variáveis
em um sistema complexo utilizam-se planejamentos fatoriais fracionários, onde apenas
uma parte da totalidade dos experimentos é realizada; ou seja, com um número
relativamente reduzido de experimentos obtêm-se as variáveis realmente significativas
na resposta do sistema.
Diversas variáveis estão englobadas na construção do método analítico
proposto, no entanto, nem todas estas variáveis podem ser significativamente
importantes na obtenção do sinal analítico. Deste modo, após a identificação das
variáveis a serem estudadas foi necessário efetuar-se a triagem das mesmas. Em um
estudo inicial do sistema foi realizado um planejamento fatorial fracionário 2
9-5
,
totalizando 16 experimentos (veja detalhes na Tabela 4.6.1), os quais foram realizados
de forma aleatória. As nove variáveis estudadas foram as seguintes: concentração das
soluções de NaOH, Tiron, H
2
O
2
, e 2,2-bipiridina, volume das alças de amostragem (L
1
e
L
3
) e da alça de 2,2-bipiridina (L
2
), além da vazão e a posição das alças de
amostragem no sistema FIA.
A partir dos resultados obtidos em cada experimento construiu-se um
modelo de calibração multivariada para Co e Mn utilizando-se a ferramenta
quimiométrica PLS (Partial Least Squares). Um modelo de calibração multivariada deve
ser avaliado através de seus parâmetros, tais como o PRESS (Prediction Errors Sum of
Squares) que é a soma dos quadrados dos erros de previsão, o SEV (Standard Errors
of Validation) que representa a soma dos quadrados dos erros de validação e o r
(coeficiente de regressão linear), dentre outros.
Através de uma análise comparativa dos parâmetros dos modelos
construídos, observou-se que as variáveis de maior influência nestes foram as
concentrações de Tiron, NaOH, H
2
O
2
e 2,2-bipiridina. Devido às variáveis restantes
(vazão, além da posição e volume das alças de amostragem e de 2,2-bipiridina) não
serem significativas nas respostas, estas foram desconsideradas no processo de
otimização.
No entanto, no decorrer do trabalho notou-se que não havia boa
repetibilidade para o sinal referente ao Co em injeções consecutivas do mesmo volume
e concentração de solução-padrão. Através de um experimento no qual a solução de
Resultados e Discussão 46
2,2-bipiridina foi substituída por solução carregadora, confirmou-se que resíduos do
reagente ativador estavam permanecendo no sistema, pois quando o carregador estava
presente obteve-se boa repetibilidade para os sinais, o que levou à conclusão de que
resíduos de 2,2-bipiridina afetavam o sinal analítico do Co.
Com o intuito de eliminar a bipiridina residual do sistema foram realizados
experimentos com as seguintes estratégias: redução da concentração e volume da
solução de bipiridina, adição de várias concentrações de surfactante Triton X-100 à
solução carregadora e também à solução de bipiridina para auxiliar na limpeza do
sistema, aumento da vazão do carregador para que o reagente ativador fosse eliminado
de forma mais rápida do sistema em fluxo, adição de etanol ao carregador para que
este dissolvesse possíveis partículas sólidas do reagente, já que a bipiridina é uma
molécula orgânica ligeiramente solúvel em água, além de um tempo maior entre as
injeções. As alternativas que resolveram o problema encontrado foram a utilização de
soluções com reduzida concentração do reagente bipiridina, a adição de etanol à
solução carregadora e um tempo maior e fixo (150 s) entre as injeções no sistema em
fluxo.
Portanto, mesmo a concentração de 2,2-bipiridina ter se mostrado uma
variável significativa para otimização no planejamento anterior, esta foi fixada a uma
concentração que não interferisse drasticamente na repetibilidade do sinal analítico do
Co.
Diante deste fato, as variáveis foram triadas novamente, e para isto foi
realizado um novo planejamento fatorial 2
3
, totalizando oito experimentos, onde as
variáveis avaliadas desta vez foram a concentração das soluções de Tiron, H
2
O
2
e
NaOH (ver detalhes na Tabelas 4.6.2 e 4.6.3), já que as outras seis variáveis
analisadas anteriormente não foram significativas estatisticamente. Incluindo-se a
variável NaOH, estamos estudando, na verdade, o pH ótimo para a determinação
sequencial de Co e Mn.
Neste planejamento, cada experimento realizado corresponde a uma
curva analítica onde as respostas analisadas foram os coeficientes angular (a), linear
(b) e de correlação (r) dessa curva ou a absorbância da “solução 3” (descrita na Tabela
4.6.4). No entanto, as respostas com magnitudes diferentes entre si em um mesmo
experimento foram apenas o coeficiente angular e a absorbância da solução 3, sendo
Resultados e Discussão 47
estas as respostas que foram utilizadas na análise dos efeitos do planejamento fatorial
executado. As respostas utilizadas foram normalizadas para uma análise mais efetiva
dos dados.
A Figura 5.3.1.1 ilustra a curva analítica obtida para o experimento 7 do
planejamento fatorial realizado.
0 500 1000 1500 2000 2500
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
Absorbância
Tempo (s)
460 480 500 520
0,000
0,020
0,040
0,060
Absorbância
Tempo (s)
Co
Mn
FIGURA 5.3.1.1 - Fiagrama obtido no experimento 7 do planejamento fatorial realizado
na triagem das variáveis do sistema.
Analisando-se a Figura 5.3.1.1, observa-se um duplo sinal para cada
injeção realizada, sendo o primeiro sinal transiente referente ao sinal do Co e o
segundo sinal referente ao Mn. Os três primeiros sinais duplos referem-se à triplicata do
branco analítico e os demais sinais em triplicata correspondem aos cinco pontos da
curva analítica. A curva analítica para Co abrangeu concentrações de 7 à 35 µg L
-1
e a
Resultados e Discussão 48
do Mn, de 120 à 600 µg L
-1
(ver detalhes na Tabela 4.6.4), e estas encontram-se
representadas na Figura 5.3.1.2 (a) e 5.3.1.2 (b), respectivamente.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
Absorbância
[Co] g L
-1
(a)
0 120 240 360 480 600
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
Absorbância
[Mn] g L
-1
(b)
FIGURA 5.3.1.2 - Curva analítica obtida no experimento 7 do planejamento fatorial
realizado na triagem das variáveis, para Co (a) e Mn (b).
Para cada um dos oito experimentos realizados, obtiveram-se duas (uma
para o Co e outra para o Mn) curvas analíticas semelhantes àquelas ilustradas na
Figura 5.3.1.2.
Finalizados os experimentos, foram calculados todos os efeitos para a
construção do gráfico de probabilidade para cada resposta analisada.
Os gráficos de probabilidade obtidos para as respostas coeficiente angular
da curva analítica e absorbância da solução “3” de cada analito estão apresentados na
Figura 5.3.1.3.
Resultados e Discussão 49
-10 0 10 20 30 40 50 60 70
1
10
40
70
95
99,5
99,999
2 (H2O2)
23
123
12
13
1 (Tiron)
3 (NaOH)
(H
2
O
2
)
Probabilidade (%)
Efeito
(a)
0 10 20 30 40 50 60
1
10
40
70
95
99,5
99,999
2 (H2O2)
23
12
123
13
1 (Tiron)
3 (NaOH)
(H
2
O
2
)
Probabilidade (%)
Efeito
(b)
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
1
10
40
70
95
99,5
99,999
23
123
12
1 (Tiron)
2 (H2O2)
13
3 (NaOH)
(H
2
O
2
)
Probabilidade (%)
Efeito
(c)
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
1
10
40
70
95
99,5
99,999
123
23
12
2 (H2O2)
1 (Tiron)
13
3 (NaOH)
(H
2
O
2
)
Probabilidade (%)
Efeito
(d)
FIGURA 5.3.1.3 - Gráficos de probabilidade. Em (a) e (b) os gráficos referem-se,
respectivamente, às respostas absorbância da solução “3” e coeficiente angular, a, da
curva analíticao para o analito Co. Em (c) e (d) os gráficos referem-se, respectivamente,
às respostas absorbância da solução 3 e coeficiente angular (a) da curva analítica para
o analito Mn.
Analisando-se o gráfico (a) da Figura 5.3.1.3, observa-se que as variáveis
Tiron (1), NaOH (3) e a sua interação (13) são estatisticamente significativas e que
essas duas variáveis têm efeito positivo sobre a absorbância da solução-padrão de Co,
ou seja, se aumentarmos a concentração dessas soluções a absorbância tende a
aumentar. Já a variável H
2
O
2
e as interações (12) (23) e (123) das variáveis encontram-
se na região de até 10% de influência no sinal analítico e, portanto, não são
estatisticamente significativas neste caso. Já no gráfico (b) da mesma figura, tem-se o
Resultados e Discussão 50
mesmo comportamento para as variáveis Tiron, NaOH e H
2
O
2
quando a resposta
utilizada é o coeficiente angular da curva analítica. Vale ressaltar que quanto maior o
coeficiente angular maior sensibilidade o método terá. Então, no caso do analito Co,
tem-se que, se aumentarmos a concentração das soluções de Tiron e de NaOH
aumentaremos a absorbância e o coeficiente angular da curva analítica, resultando
assim num método mais sensível.
Nos gráficos (c) e (d) da figura 5.3.1.3, observa-se que as três variáveis
tem efeito positivo tanto na absorbância da solução-padrão de Mn quanto no coeficiente
angular da curva analítica para este mesmo analito, o que leva a conclusão de que se
aumentarmos a concentração dessas soluções tenderemos a aumentar a absorbância
e também o coeficiente angular.
Os resultados para Mn indicam que a concentração das três soluções
deve ser aumentada, no entanto para Co, a variável H
2
O
2
não tem valor significativo,
então, optou-se por fazer um ligeiro aumento na concentração desta solução, fixando
um valor e não otimizar esta variável, visto que ela tem valor significativo apenas para
um dos analitos em questão e o método desenvolvido visou a determinação sequencial
destes. O resumo dos resultados obtidos encontra-se na Tabela 5.3.1.1.
TABELA 5.3.1.1 - Resumo dos resultados obtidos na análise dos efeitos do
planejamento fatorial 2
3
realizado na triagem das variáveis
Variável
Analito
Resposta
Conclusão/sugestão
Absorbância
Coeficiente
angular
Tiron
Co
aumentar
aumentar
aumentar
Mn
aumentar
aumentar
H
2
O
2
Co
indiferente
indiferente
aumentar, no entanto, fixar
num valor um pouco acima do
que o nível mais alto utilizado
no planejamento
Mn
aumentar
aumentar
NaOH
Co
aumentar
aumentar
aumentar
Mn
aumentar
aumentar
Resultados e Discussão 51
5.3.2 Otimização do sistema FIA
Após a triagem das variáveis, partiu-se para o processo de otimização das
variáveis realmente significativas para ambos analitos (Co e Mn), que foram a
concentração das soluções de Tiron e NaOH.
Com o intuito de se obter uma região ótima de trabalho, realizou-se a
modelagem de superfície para as duas variáveis estudadas. Um planejamento 2
2
+
ponto central + estrela (veja detalhes na Tabela 4.6.2.1) foi construído e executado.
Para o analito Co, não se obteve um modelo matemático, ou seja, os
coeficientes não foram significativos estatisticamente. Isso mostra que o intervalo de
concentrações estudado para as variáveis já apresentava os melhores resultados.
Já para o Mn, o modelo que descreve a inclinação da curva analítica em
função das variáveis concentração de Tiron e de NaOH é dado pela equação 5.3.2.1.
2
1,1 0,89 0,89 1,45
(NaOH)3,5 - (NaOH)12,6 (Tiron)5,9 86,6 a
(equação 5.3.2.1)
A superfície de resposta e as curvas de nível, geradas por esta equação
podem ser visualizadas, respectivamente na Figura 5.3.2.1 (a) e (b).
Resultados e Discussão 52
(a)
-1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00
Tiron
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
NaOH
(b)
FIGURA 5.3.2.1 - (a) Superfície quadrática descrita pela equação 5.3.2.1. (b) Suas
curvas de nível.
Analisando-se a Figura 5.3.2.1, pode-se afirmar que a inclinação da curva
analítica para o Mn tende a aumentar quando se utilizam concentrações elevadas de
Tiron e de NaOH. Portanto, optou-se por utilizar a concentração empregada no nível
mais alto para as duas variáveis estudadas.
Resultados e Discussão 53
5.4 Estudo do perfil catalítico dos analitos
Finalizando o processo de otimização das variáveis do sistema FIA, fez-se
o estudo do perfil catalítico do Co e Mn para que o reator C
2
fosse otimizado de acordo
com o tempo de reação para cada analito.
Primeiramente, obteve-se um sinal transiente sem interrupção do fluxo
utilizando-se um reator C
2
com o menor comprimento possível (no caso, 18 cm). Na
injeção seguinte, fez-se a interrupção do fluxo exatamente quando o sinal analítico
chegou ao máximo estabelecido no sinal em fluxo, e então esperou-se até que a reação
se efetivasse quase que na sua totalidade para que o fluxo fosse religado novamente.
O resultado obtido pode ser observado nas figuras 5.4.1 e 5.4.2, para Co e Mn,
respectivamente.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Reativação do fluxo
Interrupção do fluxo
Em fluxo
"Stopped-flow"
Absorbância
Tempo (s)
FIGURA 5.4.1 – Estudo do perfil catalítico do Co na reação de oxidação de Tiron por
H
2
O
2
em meio básico. A linha contínua representa o sinal obtido em fluxo e a linha
tracejada refere-se ao sinal obtido com a interrupção do fluxo no máximo do sinal
analítico do Co.
Resultados e Discussão 54
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
Interrupção do fluxo
Reativação do fluxo
Em Fluxo
"Stopped-flow"
Absorbância
Tempo (s)
FIGURA 5.4.2 – Estudo do perfil catalítico do Mn na reação de oxidação de Tiron por
H
2
O
2
em meio básico. A linha contínua representa o sinal obtido em fluxo e a linha
tracejada refere-se ao sinal obtido com a interrupção do fluxo no máximo do sinal
analítico do Mn.
Analisando-se a Figura 5.4.1, pode-se observar que após a interrupção do
fluxo, o sinal analítico aumenta rapidamente até por volta de 70 s e depois permanece
estável, o que indica que a reação se processou por completo. Então, quando o fluxo é
ligado novamente ocorre o processo de lavagem da tubulação do sistema e o sinal
retorna à linha de base.
O mesmo comportamento para o sinal do Mn pode ser observado na
Figura 5.4.2, mas neste caso, a taxa com que o sinal analítico aumenta após a
interrupção do fluxo é bem menor quando comparado ao do Co, o que indica que a
catálise se processa mais lentamente quando esta é realizada pelo Mn com ativação
por 2,2-bipiridina. Este fato justifica a configuração do sistema FIA proposta, a qual
proporciona a aquisição do sinal do Mn após o sinal do Co, ou seja, obtendo-se o sinal
do Mn após o do Co, tem-se um tempo maior para que a catálise ocorra.
Resultados e Discussão 55
Diante do fato de que a reação catalisada por ambos analitos leva um
certo tempo para ocorrer por completo, e que os sistemas em fluxo caracterizam-se por
análises rápidas, optou-se por utilizar um reator que proporcionasse uma análise
relativamente rápida, com um ganho no sinal analítico, embora esse não fosse o
máximo possível. Para isso foram testados dois comprimentos de reatores, 150 e 300
cm. Além dos fatos já mencionados, pode-se inferir que reatores ainda maiores neste
estudo não foram utilizados para evitar grande dispersão da amostra no sistema em
fluxo e redução da frequência analítica.
O resultado para os experimentos onde foram avaliados os diferentes
comprimentos de C
2
, pode ser observado na figura 5.4.3. O tempo zero é o momento
no qual a amostra foi injetada no sistema.
0 20 40 60 80 100 120
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
23 s
14 s
27 s
65 s
82 s
42 s
Absorbância
Tempo (s)
Reator 150 cm
Reator 300 cm
FIGURA 5.4.3 – Estudo comparativo do comprimento do reator C
2
com base no perfil
catalítico do Co e Mn na reação de oxidação do Tiron por H
2
O
2
em meio básico.
A partir da análise da figura 5.4.3, pode-se observar que quando o reator
de 150 cm foi utilizado, o sinal referente ao Co tem início após 14 s da injeção da
amostra e alcança seu máximo após 27 s da mesma. Já para o reator de 300 cm, o
Resultados e Discussão 56
sinal tem início após 23 s da injeção e alcança seu máximo após 42 s da mesma. Nota-
se que o sinal obtido com o reator de maior comprimento é mais largo que o outro sinal,
este fato ocorre devido à maior dispersão da amostra no sistema em fluxo quando
comparada àquela resultante da utilização do reator menor, devido ao maior espaço
percorrido pela amostra no sistema em fluxo. Em relação à absorbância alcançada, há
um aumento relativo de 63,4% quando o reator de 300 cm é utilizado apesar de haver
uma maior diluição com o emprego de um reator maior.
Ainda na mesma figura, pode-se observar que o sinal do Mn alcançou seu
máximo após 65 s da injeção quando se utilizou o reator de 150 cm, e após 82 s, para o
reator de 300 cm. A mesma explicação a respeito da largura dos sinais pode ser dada
com relação aos sinais referentes ao Mn. Já com relação à absorbância atingida nos
dois sinais pode-se afirmar que houve um aumento relativo de 62,8% quando o reator
de 300 cm é utilizado.
Após os processos de otimização realizados, o sistema em fluxo
desenvolvido pode ser descrito de acordo com a representação esquemática da Figura
5.4.4.
Vazão
0,8 mL min
-1
Tiron
5,0x10
-3
mol L
-1
H
2
O
2
25x10
-3
mol L
-1
NaOH
1 mol L
-1
HNO
3
0,01 mol L
-1
+
etanol 10% V/V
100 cm
300 cm
Vazão
3,0 mL min
-1
135µL
90µL
110µL
200 cm
5 cm
426 nm
FIGURA 5.4.4 – Representação esquemática do sistema em fluxo otimizado, onde P é
a bomba peristáltica, I: injetor; S: amostra; B: 2,2-bipiridina; C
1
e C
2
: reatores; :
espectrofotômetro ( = 426 nm); e W: descarte.
Resultados e Discussão 57
5.5 Avaliação dos interferentes
5.5.1 Triagem de interferentes
Para a avaliação de concomitantes que pudessem interferir no método
desenvolvido, avaliaram-se íons metálicos de valência 2+, pois de acordo com OTTO e
WERNER [46], esta reação é catalisada por alguns desses íons. Os cátions avaliados
foram Ca
2+
, Cu
2+
, Co
2+
(no caso do Mn), Fe
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
(no caso do Co), Ni
2+
e Zn
2+
.
(veja mais detalhes no item 4.8.1).
Inicialmente foi realizado um planejamento fatorial fracionário 2
7-2
para
cada um dos analitos (Co e Mn), com o objetivo de triar os concomitantes que fossem
realmente interferentes no método desenvolvido. Portanto, foram avaliadas sete
variáveis em dois níveis, sendo cada variável um íon metálico; totalizando 32
experimentos; onde cada um dos experimentos correspondeu a uma solução contendo
todos os íons avaliados em diferentes concentrações (veja as Tabelas 4.8.1.1 à
4.8.1.4.) mais o analito (Co ou Mn). As concentrações dos íons avaliadas neste estudo
tiveram como base os valores certificados presentes em algumas amostras de
alimentos. A resposta para cada experimento foi a porcentagem de interferência em
relação a uma solução contendo somente o analito de interesse (Co ou Mn,
dependendo do planejamento) na mesma concentração daquela presente na solução
contendo os concomitantes.
Finalizados os experimentos, foram calculados todos os contrastes para a
construção do gráfico de probabilidade para cada planejamento efetuado.
O gráfico de probabilidade obtido para a resposta porcentagem de
interferência em relação a uma solução-padrão de Co está apresentado na Figura
5.5.1.1.
Resultados e Discussão 58
-300 -200 -100 0 100 200
1
10
40
70
95
99,5
99,999
1(Ca)
4(Mg)
15
45
47
27
17
12
35
26
37
24
23
6(Ni)
57
25
3(Fe)
125
46
123
13
16
36
124
7(Zn)
56
34
2(Cu)
5(Mn)
67
14
Probabilidade (%)
Contraste
(a)
-300 -200 -100 0 100 200
1
10
40
70
95
99,5
99,999
1(Ca)
2(Mg)
13
23
123
3(Mn)
12
Probabilidade (%)
Efeito
(b)
FIGURA 5.5.1.1 - Gráficos de probabilidade para o resultado obtido no planejamento
experimental do estudo de interferentes na reação de oxidação do Tiron catalisada por
Co. Em (a) o gráfico refere-se, ao resultado obtido para o planejamento fatorial
fracionário 2
7-2
, e em (b), ao planejamento 2
3
resultante da exclusão de 4 variáveis do
planejamento anterior.
Para a exclusão de íons metálicos não interferentes tomou-se como
padrão o limite aceitável de 15% de interferência, ou seja, variáveis que apresentaram
contrastes menores ou igual a 15% foram consideradas não significativas em ambos
planejamentos.
Então, analisando-se o gráfico (a) da Figura 5.5.1.1, observa-se que as
variáveis realmente significativas, ou seja, os íons que interferiram na catálise da
reação de oxidação do Tiron pelo Co, neste estudo, foram Ca
2+
e Mg
2+
, apresentando
grande interferência negativa, e Mn
2+
, apresentando interferência positiva. Portanto,
podem ser eliminadas quatro das sete variáveis estudadas (Cu, Fe, Ni e Zn). Essa
eliminação das variáveis faz com que o planejamento se torne um fatorial completo 2
3
com quadruplicatas para cada experimento. Como o planejamento tornou-se um fatorial
completo, são calculados efeitos e não mais contrastes para a construção do gráfico de
probabilidade, e este pode ser observado na Figura 5.5.1.1 (b).
Agora, com replicatas para cada experimento, foi possível calcular a
variância e o erro experimental além da variância e erro do efeito. Esses valores
encontram-se descritos na Tabela 5.5.1.1. Todos os efeitos foram significativos ao nível
Resultados e Discussão 59
de 95% de confiança, ou seja maiores que t
crítico
(24, 95%) = 19,41. O valor de t
crítico
é
calculado através da multiplicação do valor de t (24, 95%) pelo valor do erro do efeito.
TABELA 5.5.1.1 - Valores de efeitos significativos, da variância e de erro, experimental
e do efeito, para o planejamento fatorial 2
3
em quadruplicata realizado no estudo de
concomitantes para o analito Co.
Efeito
Valor
Experimental
do efeito
1 (Ca)
-242
2 (Mg)
-195
13
-112
23
-97
123
89
3 (Mn)
135
12
204
Variância
Erro
707
88,4
27
9,40
Já o gráfico de probabilidade obtido para a resposta porcentagem de
interferência em relação a uma solução-padrão de Mn encontra-se na Figura 5.5.1.2.
Resultados e Discussão 60
FIGURA 5.5.1.2 - Gráficos de probabilidade para o resultado obtido no planejamento
experimental do estudo de interferentes na reação de oxidação do Tiron catalisada por
Mn. Em (a) o gráfico refere-se, ao resultado obtido para o planejamento fatorial
fracionário 2
7-2
, e em (b), ao planejamento 2
4
resultante da exclusão de 3 variáveis do
planejamento anterior.
Analisando-se o gráfico (a) da Figura 5.5.1.2, observa-se que as variáveis
realmente significativas foram Ca
2+
e Mg
2+
, também apresentando grande interferência
negativa assim como na catálise por Co; e Fe
2+
e Co
2+
, apresentando interferência
positiva. Portanto, neste caso, podem ser eliminadas três das sete variáveis estudadas
(Cu, Ni e Zn). Essa eliminação das variáveis faz com que o planejamento se torne um
fatorial completo 2
4
com duplicatas para cada experimento. Como já discutido
anteriormente, o planejamento tornou-se um fatorial completo e, portanto, são
calculados efeitos e não mais contrastes para a construção do gráfico de probabilidade,
sendo que este pode ser observado na Figura 5.5.1.2 (b).
Assim como no planejamento anterior, foi possível calcular a variância e o
erro experimental além da variância e erro do efeito através das replicatas para cada
experimento. Esses valores encontram-se descritos na Tabela 5.5.1.2. Os efeitos não
significativos ao nível de 95% de confiança encontram-se sublinhados pela linha
vermelha na Figura 5.5.1.2 (b). Os efeitos significativos foram aqueles cujo valor foi
maior que t
crítico
(16, 95%) = 19,10.
-200 -100 0 100 200 300 400 500 600
1
10
40
70
95
99,5
99,999
1(Ca)
5(Mg)
67
45
12
25
7(Zn)
56
14
27
3(Cu)
37
46
123
23
13
36
124
47
24
26
16
34
6(Ni)
57
17
35
125
15
4(Fe)
2(Co)
Probabilidade (%)
Contraste
(a)
-200 -100 0 100 200 300 400 500 600
1
10
40
70
95
99,5
99,999
1(Ca)
4(Mg)
34
12
24
13
1234
134
123
23
234
124
14
3(Fe)
2(Co)
Probabilidade (%)
Efeito
(b)
Resultados e Discussão 61
TABELA 5.5.1.2 - Valores de efeitos significativos, da variância e de erro, experimental
e do efeito, para o planejamento fatorial 2
4
em duplicata, realizado no estudo de
concomitantes para o analito Mn
Efeito
Valor
Experimental
do efeito
1 (Ca)
-157
4 (Mg)
-149
34
-77
12
-69
24
-26
124
21
14
39
3 (Fe)
137
2 (Co)
492
Variância
Erro
649
81,1
25,5
9,00
5.5.2 Modelagem de superfície para os interferentes
A modelagem dos interferentes foi realizada tanto para Co como para Mn.
O intuito de modelar a porcentagem de interferência nos sinais dos
analitos foi estabelecer uma condição ótima de trabalho, ou seja, obter uma região onde
a determinação de Co e Mn fosse realizada de modo que nenhuma ou pequena
interferência pudesse estar presente.
No caso do Co, três concomitantes foram interferentes no método
desenvolvido nas condições avaliadas, portanto, o planejamento realizado foi um 2
3
+
ponto central + estrela. Para o Mn, o planejamento efetuado foi um 2
4
+ ponto central +
estrela já que quatro dos sete concomitantes avaliados foram interferentes no método.
(veja detalhes nas Tabelas 4.8.2.1 a 4.8.2.4).
O modelo matemático que descreve a porcentagem de interferência
desses concomitantes no sinal do Co é dado pela equação 5.5.2.1.
Resultados e Discussão 62
2
29,1 29,1 29,1
(Mn)76,0 (Mn)126,6 (Ca)83,6- ciainterferên de %
(equação 5.5.2.1)
Na equação 5.5.2.1, o coeficiente negativo para Ca representa a interferência
negativa desse concomitante, assim como o coeficiente positivo para Mn, representa
sua interferência positiva no sinal. A superfície de resposta e as curvas de nível,
geradas por esta equação podem ser visualizadas, respectivamente na Figura 5.5.2.1
(a) e (b).
(a)
-1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50
Ca
-1.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
1.50
Mn
(b)
FIGURA 5.5.2.1 – (a) Superfície quadrática descrita pela Equação 5.5.2.1. (b) Suas
curvas de nível.
Resultados e Discussão 63
Então, analisando-se a Figura 5.5.2.1 pode-se dizer que há, teoricamente,
uma região de trabalho livre de interferências, no caso do Co.
Para Mn, a equação que descreve a porcentagem de interferência é dada
pela Equação 5.5.2.2:
2
14,4
14,9 32,7
(Co)72,7 (Co)161 128 ciainterferên de %
(equação 5.5.2.2)
A Figura 5.5.2.2 ilustra a % de interferência versus concentração
normalizada de Co, segundo a Equação 5.5.2.2.
-2 -1 0 1 2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
% de Interferência
[Co] normalizada
FIGURA 5.5.2.2 - Porcentagem de interferência versus concentração normalizada de
Co, segundo a Equação 5.5.2.2.
Já no caso do Mn, pode-se observar na Figura 5.5.2.2 que há uma região
de trabalho que apresenta um mínimo de interferência. Essa região está localizada
onde a relação Co
2+
/Mn
2+
é de 0,03.
Resultados e Discussão 64
5.6 Determinação de Co e Mn
Após o desenvolvimento e otimização do método proposto, o mesmo foi
empregado inicialmente na determinação de Co e Mn em amostras de alimentos e nos
medicamentos A e B.
Como preparo de amostras, foi avaliado um processo de extração com
ácido diluído para amostras de tecido de ostra, arroz com legumes, Fegatelli, complexo
multivitamínico e amostras certificadas de tecido de ostra e fígado bovino; além da
extração, avaliou-se a digestão em bloco digestor para as amostras certificadas de
tecido de ostra e fígado bovino e para a amostra do medicamento B.
No entanto, não se obteve êxito nas análises realizadas. Provavelmente, o
insucesso está ligado a alguns problemas que surgiram no processo analítico, como por
exemplo, a coloração final das soluções das amostras. A coloração amarelada que as
soluções das amostras apresentaram interferiu no resultado obtido, pois estas
apresentaram altos valores de absorbância no comprimento de onda utilizado nas
análises (426 nm), o que representa uma limitação da técnica utilizada. Outro fator
limitante é que essa coloração resultante não pôde ser eliminada através do uso de
H
2
O
2
visto que este é um reagente utilizado na reação indicadora, e qualquer resíduo
desse reagente influenciaria na mesma. Além desse empecilho, os digeridos das
amostras não puderam ser muito diluídas devido à faixa de concentração em que os
analitos estavam presentes nas mesmas.
Outro fator que pode ter contribuído para o insucesso das análises é a
possível presença de interferentes, pois amostras biológicas são extremamente
complexas e ricas em Ca e Mg (os dois principais interferentes para Co e Mn).
Diante das limitações citadas partiu-se para a análise de amostras de ligas
metálicas, pois nas amostras deste tipo as concentrações de Co e Mn são maiores que
nas amostras de alimentos, o que implica uma diluição maior para que as amostras
pudessem ser analisadas espectrofotometricamente no sistema FIA desenvolvido e,
consequentemente, o problema de coloração fosse eliminado. Além disso, as amostras
não contém Ca e Mg que são interferentes no método desenvolvido.
Como esperado, após a diluição dos digeridos das ligas metálicas não se
observou coloração nas soluções a serem analisadas.
Resultados e Discussão 65
No entanto, durante as análises das amostras de aço foi visível a
formação de um produto de coloração vermelha, o que evidencia uma provável
interferência do Fe
2+
, pois este íon forma um complexo de mesma coloração com a 2,2-
bipiridina. No estudo da avaliação de interferentes o Fe não se apresentou como
potencial interferente pois os níveis de concentração estudados foram baseados
naqueles presentes nas amostras de alimentos e a amostra de aço é constituída em
sua maioria por Fe o que resulta numa concentração extremamente alta e interferente
no sistema, tornando inviável a análise de amostras deste tipo.
Já na análise da liga de Ni não se observou formação de produto com
coloração diferente do produto de oxidação do Tiron, mas as concentrações
encontradas ficaram extremamente acima daquelas obtidos por FS-FAAS. Este
resultado pode ser explicado pela interferência positiva do Ni, pois assim como no caso
do Fe, os níveis de concentração de Ni estudados na avaliação dos interferentes foi
muito inferior àquela presente na amostra da liga de Ni. Na tentativa de eliminar esta
interferência, realizou-se a precipitação do Ni com o reagente específico DMG. No
entanto, na análise da solução resultante após a precipitação do Ni
2+
não foi possível
quantificar os íons Co e Mn, pois estes podem ter ficado adsorvidos no precipitado já
que os mesmos encontravam-se em quantidade muito inferior quando comparados ao
Ni.
Outra estratégia testada para quantificar Co e Mn na amostra Ni 200 foi o
método de compatibilização de matriz, o qual é utilizado apenas quando se conhece a
composição total da amostra. Considerando-se que a interferência estaria sendo
causada pela alta concentração de Ni devido a este ser o componente majoritário da
liga, este íon foi adicionado às soluções da curva analítica na mesma concentração da
amostra. No entanto, não se obteve sucesso na quantificação dos analitos de interesse,
possivelmente pela presença de alguns outros constituintes da amostra, tais como Cu,
Cr e Si que não foram adicionados às soluções da curva analítica.
Devido aos fatos ocorridos com as amostras analisadas até esta etapa,
foram avaliadas mais duas amostras (7 e 12, ver detalhes na Tabela 4.4.1) na tentativa
de quantificar Co e Mn.
Inicialmente as amostras foram analisadas por FS-FAAS e os limites de
detecção (LOD) (n = 10) e quantificação (LOQ) (n = 10) calculados foram
Resultados e Discussão 66
respectivamente 3,9 e 13,2 µg L
-1
para Co e 110 e 366 µg L
-1
para Mn. Os teores
médios de Co e Mn nas amostras analisadas encontram-se na Tabela 5.6.1.
TABELA 5.6.1 - Teores médios de Co e Mn e desvios-padrão (n=3) nas amostras de
medicamentos B e D obtidos por FS-FAAS.
Amostra
Co
Mn
Medicamento B
358* ± 7
Medicamento D
0,37** ± 0,01
104** ± 1
*mg Kg
-1
**mg L
-1
A partir dos resultados obtidos por FS-FAAS fez-se a diluição das
amostras (conforme descrito no item 4.10.3) para que estas fossem analisadas
utilizando-se o método desenvolvido.
Inicialmente construiu-se uma curva utilizando os dois analitos
simultaneamente, e os teores médios de Co e Mn encontrados nas amostras de
medicamentos B e D não foram concordantes com aqueles encontrados utilizando-se a
técnica FS-FAAS.
Então, empregou-se o método da adição de padrão para Co e Mn
separadamente na amostra do medicamento D (ver mais detalhes no item 4.10.3). O
teor de Co encontrado através deste método (2,78 mg L
-1
) foi muito diferente daquele
obtido por FS-AAS (0,37 mg L
-1
) , no entanto, o teor de Mn (90,1 mg L
-1
) foi próximo ao
valor obtido por FS-AAS (104 mg L
-1
).
Visto que nos estudos de interferentes o Co apresentou-se como
interferente do Mn e vice-versa, propôs-se o emprego de curvas analíticas elaboradas
com os padrões de Co e Mn individualmente na determinação destes analitos nas
amostras dos medicamentos B e D. As curvas foram construídas separadamente
(proposta 1: alças L
1
e L
3
sendo preenchidas pela mesma solução-padrão, ou Co ou
Mn) e também de modo sequencial (proposta 2: a solução de Co preenchendo a alça
de amostragem L
1
e a solução de Mn preenchendo L
3
).
Resultados e Discussão 67
A Figura 5.6.1 ilustra os sinais analíticos obtidos na determinação de Co e
Mn nas amostras de medicamentos B e D pela proposta 1 e a Figura 5.6.2 a
determinação realizada através da proposta 2 nas mesmas amostras.
Resultados e Discussão 68
0 2000 4000 6000 8000 10000
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
Absorbância
Tempo (s)
1
3
5
7
9 µg L
-1
Co
Branco
Branco
Branco
Branco
Mn
300
600
900
1200
1500 µg L
-1
Med. B
Med. D
Sinal do Mn
FIGURA 5.6.1 - Fiagrama obtido na análise das amostras de medicamentos B e D, utilizando-se curvas analíticas individuais
(proposta 1).
Resultados e Discussão 69
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
Absorbância
Tempo (s)
Branco
Branco
Branco
Medicamento B
Medicamento D
1
300
3
600
5
900
7
1200
Co 9 µg L
-1
Mn 1500 µg L
-1
Sinal
do
Mn
Sinal do Co
740 760 780 800 820 840
0,000
0,050
Absorbância
Tempo (s)
Co
Mn
FIGURA 5.6.2 – Fiagrama obtido na análise das amostras de medicamentos B e D (proposta 2).
Resultados e Discussão 70
Na Figura 5.6.1, pode-se observar que os brancos analíticos
apresentaram pequenos valores de absorbância. Isso se deve, provavelmente, à
diferença no índice de refração da solução quando comparada à solução carregadora.
Então, para a correta quantificação dos analitos, o valor da absorbância referente ao
branco foi subtraído dos valores de absorbância encontrados para os sinais transientes
referentes ao Co e ao Mn. Os limites de detecção (LOD) (n = 10) e de quantificação
(LOQ) (n = 10) calculados foram respectivamente 0,083 e 0,28 µg L
-1
para Co e 7,18 e
23,9 µg L
-1
para Mn.
A mesma observação da Figura 5.6.1 quanto ao branco analítico pode ser
feita para a Figura 5.6.2. Neste caso, os LOD (n = 10) e LOQ (n = 10) calculados foram
respectivamente 0,055 e 0,18 µg L
-1
para Co e 9,76 e 32,5 µg L
-1
para Mn.
Os teores médios de Co e Mn obtidos através das propostas 1 e 2
encontram-se na Tabela 5.6.2.
TABELA 5.6.2. Teores médios e desvios-padrão (n=3) de Co no medicamento B e de
Mn no D obtidos pelo método desenvolvido.
Amostra
[Co] ± SD
[Mn] ± SD
Proposta 1
Proposta 2
Proposta 1
Proposta 2
Medicamento B
349* ± 17
336* ± 11
Medicamento D
106** ± 9
105** ± 9
*mg kg
-1
**mg L
-1
O medicamento D contém os dois analitos, mas o teor médio para Co foi
discordante do obtido por FS-FAAS provavelmente devido à interferência do Mn e
outros possíveis interferentes que estivessem presentes na amostra. Já para Mn, o
valor encontrado foi concordante com aquele obtido por FS-FAAS.
No caso do medicamento B, o teor médio obtido foi concordante com
aquele obtido por FS-FAAS, pois esta contém apenas Co, ficando livre de possíveis
interferências químicas.
Resultados e Discussão 71
Então, fica evidente através da análise da Figura 5.6.1 que o Co não
interfere de modo significativo no sinal do Mn, visto que na curva analítica do Co não há
o segundo sinal que seria referente à alça de amostragem utilizada na determinação de
Mn, isto se deve ao bloqueio da catálise do Co pela 2,2-bipiridina. Mas a mesma
afirmação não pode ser feita para o Mn, pois pode ser observado na curva analítica
deste analito que mesmo que a solução analítica não contenha Co, é gerado um sinal
transiente referente à alça de amostragem onde seria determinado o Co, o que indica a
interferência desse analito no sinal do mesmo.
A exatidão do método, portanto, foi avaliada através da comparação dos
dois métodos de análise: o método desenvolvido e o método de FS-FAAS. Quando o
objetivo é comparar dois métodos, aplica-se o teste-t pareado. Se este teste é aplicado
para amostras iguais, efetua-se inicialmente o teste F para avaliar se os desvios
padrões dos dois métodos são comparáveis e, caso sejam, parte-se para o teste-t
propriamente dito [58].
Primeiramente foram realizados testes F para a amostra de medicamento
D analisada pelas duas propostas. O teste F foi realizado empregando-se a equação
5.6.1. Se o valor de F calculado for menor do que 1, deve-se inverter os fatores para
que esse valor seja sempre maior do que 1.
2
2
2
2
i
1
2
1
1
i
gl)xx(
gl)x(x
F
(equação 5.6.1)
gl= graus de liberdade
Proposta 1: F
calculado
= 103,7
Proposta 2: F
calculado
= 96,2
F
tabelado(2,2,95%)
= 19
Como em ambas propostas o valor de F
calculado
é maior que o F
tabelado
,
significa que os métodos empregados (FS-FAAS e proposto) não possuem desvios
padrão comparáveis, portanto, não se pode realizar o teste-t pareado nestes casos.
Embora não possamos expressar estatisticamente que os teores de Mn na amostra 12
não diferem ao nível de confiança 95%, pode-se observar que a faixa de concentração
Resultados e Discussão 72
obtida pelos métodos proposto 1 (97-115 mg L
-1
), proposto 2 (96-114 mg L
-1
) e FS-
FAAS (103-105 mg L
-1
) são extremamente próximas e que portanto, os valores são
concordantes entre si.
Da mesma maneira que para a amostra do medicamento D, inicialmente
foi realizado o teste F para a amostra do medicamento B com o objetivo de avaliar se os
desvios padrão obtidos nos dois métodos são comparáveis.
O teste F foi calculado utilizando-se a equação 5.6.1.
Proposta 1: F
calculado
= 5,93
Proposta 2: F
calculado
= 2,37
F
tabelado(2,2,95%)
= 19
Como o valor de F
calculado
é menor que o F
tabelado
para as propostas 1 e 2
então, pode-se dizer que os métodos (proposto 1 e FS-FAAS; proposto 2 e FS-FAAS)
possuem desvios padrão comparáveis e os dados podem ser combinados para obter-se
um desvio padrão geral (equação 5.6.2).
2NN
)x(x)x(x
SD
21
2
2
2
i
2
1
1
i
(equação 5.6.2)
N= número de réplicas
O desvio padrão geral calculado foi de 13,2 para a proposta 1 e FS-FAAS;
e de 9,17 para a proposta 2 e FS-FAAS. Estes valores foram utilizados na determinação
de t segundo a equação 5.6.3.
±
)N(N
)N(N
SD
)xx(
21
2121
t
(equação 5.6.3)
Proposta 1: t
calculado
= 0,86
Proposta 2: t
calculado
= 3,00
t
tabelado(4, 95%)
= 2,776
t
tabelado(4, 99%)
= 4,604
Resultados e Discussão 73
Para a proposta 1 o valor de t
calculado
foi igual a 0,86 e o valor de t
tabelado
(4,95%)
é de 2,776. Como o valor de t
calculado
< t
tabelado
, pode-se afirmar que os teores de
Co obtidos pelo método proposto 1 e por FS-FAAS não diferem estatisticamente ao
nível de confiança 95%. Já para a proposta 2, o valor de t
calculado
foi igual a 3,00 e o
valor de t
tabelado (4,99%)
é de 4,604. Como o valor de t
calculado
< t
tabelado
, pode-se afirmar que
os teores de Co obtidos pelo método proposto 2 e por FS-FAAS não diferem
estatisticamente ao nível de confiança 99%.
Capítulo 6
CONCLUSÕES
Conclusões 75
6 Conclusões
A partir da cinética diferencial dos analitos na reação indicadora foi
possível o desenvolvimento de um sistema FIA com detecção espectrofotométrica para
determinação sequencial de Co e Mn. Neste sistema, a determinação sequencial foi
realizada em comprimento de onda fixo, pois os produtos resultantes da catálise tem
absorbância máxima na mesma região de comprimento de onda.
As concentrações ótimas dos reagentes encontradas após a execução
dos planejamentos experimentais foram: Tiron = 5,0x10
-3
mol L
-1
; H
2
O
2
= 25x10
-3
mol L
-1
e NaOH = 1,0 mol L
-1
.
O reator de C
2
de 300 cm aumentou a sensibilidade analítica para ambos
analitos quando comparado ao reator de 150 cm.
A utilização de planejamentos fatoriais no estudo de interferentes permitiu
uma rápida e ampla avaliação de possíveis interferentes além de possibilitar a
avaliação de possíveis interações entre os concomitantes presentes nas soluções de
estudo. Os interferentes estatisticamente significativos para o Co foram o Ca e o Mn. Já
para Mn, o Co foi o único interferente estatisticamente significativo de acordo com as
razões concomitante/analito estudadas. No entanto, apesar de estatisticamente não
serem significativos, Ca e Mg também são interferentes; apresentando altos valores de
interferência negativa.
O método desenvolvido não pode ser aplicado a amostras de alimentos e
ligas metálicas devido a problemas de interferência; sendo que estes não puderam ser
eliminados com a utilização do método de adições de padrão a algumas dessas
amostras.
A exatidão do método foi avaliada por comparação com a técnica de FS-
FAAS.
Para o método desenvolvido, os LOD e LOQ calculados foram,
respectivamente 0,055 e 0,18 µg L
-1
para Co, 9,76 e 32,5 µg L
-1
para Mn; e a frequência
de amostragem foi de 25 amostras h
-1
.
Resultados e Discussão 76
Dentro das limitações do método e problemas surgidos, o método
mostrou-se com boa repetibilidade, rápido e com baixo custo para determinações de Co
e Mn em amostras farmacêuticas.
Capítulo 7
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas 78
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