( PDF ) Alterações cognitivas na esclerose múltipla e sua associação com o gene APOE4: estudo caso - controle em pacientes de um centro de ceferência no Rio de Janeiro

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM NEUROLOGIA

MESTRADO EM NEUROLOGIA

SONIA BATISTA SARAIVA

ALTERAÇÕES COGNITIVAS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA E SUA ASSOCIAÇÃO

COM O GENE APOE4: ESTUDO CASO-CONTROLE EM PACIENTES

DE UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO RIO DE JANEIRO

RIO DE JANEIRO

2009

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SONIA BATISTA SARAIVA

ALTERAÇÕES COGNITIVAS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA E SUA ASSOCIAÇÃO

COM O GENE APOE4: ESTUDO CASO-CONTROLE EM PACIENTES

DE UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO RIO DE JANEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Neurologia do Centro

de Ciências Biológicas e da Saúde da

Universidade Federal do Estado do Rio de

Janeiro, como requisito parcial para a

obtenção do título de Mestre em

Neurologia, área de concentração

Neurociências.

Orientadora: Profa. Dra. Regina Maria

Papais Alvarenga

RIO DE JANEIRO

2009

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616.8 Saraiva, Sonia Batista,

S243a Alterações cognitivas na esclerose múltipla e sua

associação com o gene Apoe4: estudo caso-controle em

pacientes de um Centro de Referência no Rio de Janeiro. /

Sonia Batista Saraiva - Rio de Janeiro, 2009.

62 f.

Orientadora: Profª. Drª. Regina Maria Papais Alvarenga.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Estado do

Rio de Janeiro, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde,

Mestrado em Neurologia, 2009.

1. esclerose múltipla. 2. APOE. 3. alterações cognitivas. I.

Alvarenga, Regina Maria Papais. II. Universidade Federal do

Estado do Rio de Janeiro. III. Título.

SONIA BATISTA SARAIVA

ALTERAÇÕES COGNITIVAS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA E SUA ASSOCIAÇÃO

COM O GENE APOE4: ESTUDO CASO-CONTROLE EM PACIENTES

DE UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO RIO DE JANEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Neurologia do Centro

de Ciências Biológicas e da Saúde da

Universidade Federal do Estado do Rio de

Janeiro, como requisito parcial para a

obtenção do título de Mestre em

Neurologia, área de concentração

Neurociências.

Aprovado em: ___/___/___.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________

Profª. Drª. Regina Maria Papais Alvarenga

Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

______________________________________________

Prof. Dr. Helcio Alvarenga

Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

______________________________________________

Profª. Drª. Vilma Duarte Câmara

Universidade Federal Fluminense

Universidade Gama Filho

AGRADECIMENTOS

Os resultados alcançados na trajetória de nossas vidas estarão sempre

associados à contribuição de muitas pessoas. São por suas ações, de forma direta

ou indireta, que conseguimos vencer obstáculos e crescer de forma integral. Rendo

os seguintes agradecimentos:

A Deus, por ter me dado o dom de persistência, perseverança, pois esta é

mais uma etapa que venço orientada por sua vontade;

A meus pais, Salvador e Afra, pelo presente da vida e pela partilha de todos

estes momentos. Sempre vibrando com minhas vitórias e tornando mais amenos os

obstáculos;

A meus filhos Pedro, Flávia e Thaís, razão do meu viver, estímulo para que

me torne cada vez mais uma pessoa melhor. Participar de suas vidas e do seu

crescimento está sendo um privilégio, a felicidade de estar junto de vocês, me faz

crer que são presentes de Deus;

A meu marido, Paulo, pelos ensinamentos e pela sua forma de Ser, ao

considerar o próximo como a si mesmo. Sempre esteve ao meu lado em todos os

momentos me incentivando com seu carinho e felicidade contagiante;

A meus irmãos Alexandre, Sandra, Flávio e Marcus companheiros dos

melhores momentos de minha infância e hoje amigos de todas as horas;

A Escola de Saúde do Hospital Naval Marcilio Dias, onde fui aluna durante

dois anos em destaque para a realização desse trabalho;

Ao Prof. Dr. Hélcio Alvarenga, valendo-se do seu profundo conhecimento,

ajudou-me a crescer como neurologista, permitindo que me espelhasse em seu

exemplo. Sou grata por realmente ter me ensinado a arte neurológica. Obrigado

Mestre;

À Profª. Drª. Regina Alvarenga, por ter me recebido em seu curso de

mestrado, depositado sua confiança em mim, ter acreditado no meu potencial,

permitindo que eu explorasse e expandisse meus horizontes. Muito obrigado;

A todos os docentes da UNIRIO que conseguem ver alem das fronteiras com

grande senso, sabedoria e servem de bússola para tantos alunos. Agradeço todas

as aulas recebidas, pois serviram para que eu pudesse acumular conhecimentos e

realizar este trabalho;

Aos médicos do Hospital da Lagoa em especial a Drª. Claudia Vasconcelos,

Drª Claudia Miranda, Dr. Gutemberg e Drª. Solange por ter facilitado o acesso dos

pacientes incluídos neste estudo. Agradeço ainda aqueles que por um excesso de

zelo com seus pacientes, me deixaram distantes deles, mas sempre me trataram

cordialmente;

A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)

em nome de seu diretor cientifico Prof. Dr. Jerson Lima pelo auxílio financeiro a

pesquisa, sem o qual este projeto não se realizaria;

Às psicólogas Renata e Dora pelas avaliações neuropsicológicas deste

trabalho, pelas discussões científicas e pela agradável convivência profissional. Foi

um privilégio está ao lado de vocês acompanhando efetivamente todas as

avaliações neuropsicológicas;

Aos pacientes com Esclerose Múltipla, seus familiares e aos controles que

com espírito humanitário e boa vontade compareceram ao ambulatório para

avaliação e coleta de sangue, permitindo a realização do estudo;

Aos secretários Luiz Eduardo e Heleine pela amizade e apoio nesta trajetória.

Muito obrigado;

As bibliotecárias Mara e Janaina da Maternidade Escola da UFRJ. Agradeço

pela prontidão com que me enviava os artigos que necessitei para realizar este

trabalho;

Ao Laboratório Genomic pela análise genética das amostras de sangue;

Aos membros da Banca examinadora por terem aceitado o convite de

participação, pela prontidão na leitura, análise do trabalho e pelas valiosas

sugestões para o aprimoramento do mesmo;

Enfim, agradeço a todos àqueles que participaram, favorável ou

contrariamente, no processo desse Mestrado. Certamente, tiveram grande

importância na execução desta pesquisa.

“Ao longo da história da humanidade (e

dos animais também) aqueles que foram

mais eficazes em aprender a colaborar e a

improvisar foram os que prevaleceram”.

(Charles Darwin)

RESUMO

Introdução: Avaliações neuropsicológicas vêm identificando alta prevalência de

alterações cognitivas (40 a 60%) na Esclerose Múltipla (EM). Apesar do genótipo

APOE4 ser considerado fator de risco genético para a doença de Alzheimer (DA),

resultados de estudos sobre seu papel na cognição em pacientes com EM são

contraditórios e não há dados na população brasileira. Objetivos: Analisar os efeitos

do polimorfismo do gene APOE na cognição de pacientes brasileiros com EM.

Metodologia: 60 pacientes e 30 controles do Rio de Janeiro foram incluídos no

estudo e submetidos à avaliação neuropsicológica por bateria breve composta dos

seguintes testes: Rey Auditory Verbal Learning Test (RAVLT); Symbol Digit

Modalities Test - (SDMT); Controlled Oral Word Association (COWAT); Inventário de

Ansiedade Beck (BAI) e Inventário de Depressão de Beck (BDI). De acordo com o

resultado dos testes neuropsicológicos os pacientes foram divididos em dois grupos:

EM com exame neuropsicológico normal e EM com alterações cognitivas. Amostras

de sangue de pacientes e controles foram coletadas e submetidas à análise do DNA

genomico amplificado pela técnica de PCR (polimerase chain reaction) e

genotipagem do alelo da APOE 4 pelo método de Donohoe. A freqüência da APOE

4 foi comparada entre pacientes e controles e entre pacientes com EM com ou sem

alteração cognitiva. Resultado: A freqüência da APOE ε4 foi maior no grupo de

pacientes com comprometimento cognitivo. (OR 3,76 IC 95% 1,04 - 13,65).

Conclusão: Apoiando estudos prévios realizados em populações caucasianas

comprovou-se associação do alelo APOE ε4 em pacientes do Rio de Janeiro com

alterações cognitivas.

Palavras-chave: Esclerose Múltipla, APOE, Alterações Cognitivas.

ABSTRACT

Background: neuropsychological evaluations may detect high prevalence of cognitive

impairment (40 60%) in Multiple Sclerosis(MS) Although genotype APOE4 can be

considered a genetic risk factor for the Alzheimer Disease (AD), its roll in the

cognition of patients with MS is contradictory and it is unknown in the Brazilian

population. Objectives: The aim of this study was to analyze the effect of APOE

polymorphism in the cognition of Brazilian patients with MS. Methodology: 60 patients

and 30 controls in Rio de Janeiro had been studied, including a neuropsychological

evaluation for brief composed battery of the following tests: Rey Verbal Auditory

Learning Test (RAVLT); Symbol Digit Modalities Test (SDMT); Controlled Oral Word

Association (COWAT); Beck Anxiety Inventory (BAI) and Beck Depression Inventory

(BDI). In accordance with the results of the neuropsychological evaluations, the

patients had been divided in two groups: ME with normal neuropsychological

evaluations and ME with cognitive impairment. Blood samples of the individuals in

this study had been collected and submitted to genomic DNA analysis, that has

amplified by the technique of PCR (polymerase chain reaction) and APOE

genotyping for the method of Donohoe. The frequency of APOE 4 was compared

between patients and controls and patients with ME with or without cognitive

impairment. Result: The frequency of the APOE ε4 was higher in the group of

patients with cognitive impairment. (OR 3, 76 IC 95% 1, 04 - 13, 65). Conclusion:

Supporting findings in previous studies, considering the Caucasian population, there

is a valid association of allele APOE ε4 and cognitive impairment in the studied

population in Rio de Janeiro.

Key-words: Multiple Sclerosis, APOE, Cognitive Impairment.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Quadro 1 Critérios Diagnósticos para EMPP (THOMPSON et al., 2000) ......... 19

Quadro 2 Critérios de RM do crânio. (BARKHOF et al., 1997; TINTORÉ et al.,

2000) …………………………………………………………………….... 20

Quadro 3 Critérios de McDonald e outros (2001) ............................................. 20

Quadro 4 Critério diagnóstico de McDonald e outros (2001) para EM revisado

por Polman e outros (2005) ............................................................... 21

Quadro 5 Testes neuropsicológicos aplicados e funções cognitivas

avaliadas ........................................................................................... 35

Quadro 6 Primers (DONOHOE et al., 1999) e outros componentes utilizados

na PCR .............................................................................................. 36

Quadro 7 Reação de PCR duas reações [A e B] para cada amostra ............... 37

Quadro 8 Processo de desnaturação ............................................................... 38

Quadro 9 Detecção dos polimorfismos APOE em gel agarose ........................ 38

Figura 1 Esquema do DNA amplificado .......................................................... 38

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Características demográficas da amostra (n=90) .............................. 40

Tabela 2 Distribuição e freqüência do alelo e genótipo APOE ........................ 42

Tabela 3 Variáveis clinicas da EM e alteração cognitiva entre pacientes de

acordo com o estado APOE4 ............................................................ 42

Tabela 4 Freqüência dos testes alterados de acordo com a presença do

alelo ε4 .............................................................................................. 43

Tabela 5 Comparação dos grupos entre o resultado dos testes e a presença

dos alelos ε4 ...................................................................................... 43

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AC Alterações Cognitivas

APOE Gene da apolipoproteína E

Apo E Apolipoproteína E

APOE4 Alelo 4 do gene APOE

BECRT

Enchanced Cued Recall Test-Buschke

BOC Bandas Oligoclonais

BRB-N

Brief Repeatable Battery of Neuropsychological Test

CBTT

Corsi Block Tapping Task

CCSS

Cognitive Composite Standard Score

Copping of Drawings

CDL

Copping Drawing With Landmarks Test

CLTR

Consistent Long Term Retrievel

CVLT

California Verbal Learning Test

COWAT Controled Oral Word Association Test

DA Doença de Alzheimer

DSMT

Digit Symbol Modalities Tests

EM Esclerose Múltipla

EMB Esclerose Múltipla Benigna

EMCD Esclerose Múltipla Clinicamente Definida

EMCP Esclerose Múltipla Clinicamente Provável

EMDLA Esclerose Múltipla Definida laboratorialmente Apoiada

EMPLA Esclerose Múltipla Provável laboratorialmente Apoiada

EMPP Esclerose Múltipla Progressiva Primária

EMPS Esclerose Múltipla Progressiva Secundária

EMPSU Esclerose Múltipla Progressiva Surto

EMRR Esclerose Múltipla Remitente Recorrente

HDL Lipoproteínas de densidade alta

HDS

Hamilton Psychiatric Rating Scale for Depression

HLA Antígeno de Histocompatibilidade Leucocitária

IBGE Instituto Brasileiro Geografia e Estatística

IDL Lipoproteínas de densidade intermediária

Ig G Imunoglobulinas G

LCR Líquido Cefalorraquiano

LDL Lipoproteínas de densidade baixa

LTS

Long Term Storage

MDB

Mental Deterioration Battery

MMSE

Mini Mental Station Examination

NSBMS

Neuropsychological Screening Battery for MS

PASAT

Paced Auditory Serial Addition Test

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

PE Potenciais Evocados

PEV Potencial Evocado Visual

PM’47

Raven’s 47 Progressive Colored Matrices test

Raven

Raven progressive matrices test

RAVLT

Rey Auditory Verbal Learning Test

RM Ressonância Magnética

SDMT

Digit Symbol Modalities Test

SNC Sistema Nervoso Central

SPART

10/36 Spatial Recall Test

SRT

Seletive Remind Test

TOL

Tower of London

VIM

Visual Immediate Memory

VLDL Lipoproteínas de densidades muito baixa

VPI Velocidade de Processamento da Informação

WLG

Word List Generation Test

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 15

2.1 DEFINIÇÃO E DADOS EPIDEMIOLOGICOS ........................................ 15

2.2 ETIOLOGIA E PATOGÊNESE ................................................................ 15

2.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS ............................................................. 17

2.4 CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS ................................................................ 18

2.5 COGNIÇÃO NA ESCLEROSE MULTIPLA ............................................. 21

2.6 APOLIPOPROTEÍNA E ........................................................................... 24

2.7 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA PROGRESSÃO E

GRAVIDADE DA ESCLEROSE MÚLTIPLA........................................... 25

2.8 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA COGNIÇÃO DA

ESCLEROSE MULTIPLA ........................................................................ 25

2.9 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE EM OUTRAS DOENÇAS

NEUROLÓGICAS ................................................................................... 29

3 OBJETIVOS ............................................................................................ 30

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 30

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 30

4 METODOLOGIA DA PESQUISA ........................................................... 31

4.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA .............................................. 31

4.2 DESENHO DO ESTUDO ........................................................................ 31

4.3 SUJEITOS E MÉTODOS ........................................................................ 31

4.3.1 Critérios de inclusão ............................................................................. 32

4.3.2 Critérios de exclusão ............................................................................ 32

4.4 PROCEDIMENTOS ................................................................................ 33

4.4.1 Testes neuropsicológicos utilizados na amostra .............................. 34

4.4.2 Teste genético analisado na amostra ................................................. 36

4.5 ANÁLISE ESTATÍSCA ............................................................................ 39

5 RESULTADOS........................................................................................ 40

5.1 DADOS DEMOGRÁFICOS E CLÍNICOS ............................................... 40

5.2 GENOTIPAGEM ..................................................................................... 41

6 DISCUSSÃO............................................................................................ 45

7 CONCLUSÃO.......................................................................................... 49

REFERÊNCIAS ...................................................................................... 50

APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .......... 59

ANEXO A - Aprovação do CEP-HUGG ................................................ 61

ANEXO B - Protocolo de Solicitação para Envio de Marcadores

Genéticos ............................................................................................... 62

1 INTRODUÇÃO

A Esclerose múltipla (EM) é a mais freqüente doença inflamatória

desmielinizante idiopática do sistema nervoso central (SNC). Apesar do grande

número de estudos descrevendo as etapas fisiopatológicas de ativação do sistema

imune que resultam na agressão aos oligodendrócitos, muitas questões ainda

necessitam ser esclarecidas em especial quanto à influência de fatores genéticos e

ambientais em sua gênese, curso clínico e prognóstico. Isto se deve possivelmente

às características heterogêneas da doença (THOMPSON et al., 2000).

Clinicamente apresenta-se como uma doença crônica destacando-se três

principais formas: Esclerose Múltipla Remitente Recorrente (EMRR), Esclerose

Múltipla Progressiva Primária (EMPP) e Esclerose Múltipla Progressiva Secundária

(EMPS) (LUBLIN; REINGOLD, 1996). Compromete o SNC agindo na mielina

normalmente constituída, determinando sinais e sintomas motores, sensitivos,

cerebelares, esfincterianos, visuais e de tronco cerebral, além dos sintomas

cognitivos e afetivos (KURTZKE, 1983).

As investigações cognitivas na EM apontam alta prevalência de alterações

cognitivas, que afetam a qualidade de vida desses pacientes (RAO et al., 1991). O

perfil cognitivo na EM, é comparável ao da demência subcortical, entretanto menos

que 10% evoluem para demência subcortical (RAO, 1996).

A prevalência da EM está atribuída as influências ambientais e genéticas. Os

fatores genéticos atuam na susceptibilidade e modulam o curso da doença

(DENNEY et al., 2004). Neste contexto destaca-se a associação do gene APOE4 as

alterações cognitivas em pacientes com EM que foi sugerida em alguns estudos

especialmente nos casos de grave comprometimento cognitivo (SAVETTIERI et al.,

2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMENTER et al., 2007; SHI et al., 2008).

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 DEFINIÇÃO E DADOS EPIDEMIOLÓGICOS

A EM é uma doença neurodegenerativa do SNC que acomete adultos jovens

evoluindo comumente para graus variados de incapacidade neurológica crônica cuja

etiologia ainda permanece desconhecida. Foi descrita em 1868 por Charcot do ponto

de vista clinico e patológico como doença, da substância branca do SNC, afetando a

bainha de mielina e preservando o axônio (CHARCOT, 1868).

Apresenta uma distribuição geográfica bem determinada com predomínio

maior em países de latitude norte, podendo acometer os diferentes grupos raciais

com uma preponderância maior em brancos. No Rio de Janeiro, região de clima

tropical e população miscigenada a prevalência de EM foi estimada em 5/100.000

habitantes (PAPAIS-ALVARENGA et al., 2000). Entre oitenta e oito pacientes

atendidos no Hospital da Lagoa no período de 1990 a 1994 foi encontrada uma

freqüência de 30 % de afro-brasileiros (PAPAIS-ALVARENGA; ALVARENGA, 1995),

resultado do projeto Atlântico Sul, primeira pesquisa multicêntrica brasileira sobre o

perfil clinico da EM. Estes dados foram confirmados com exceção da região Sul.

Observou-se maior freqüência da doença no sexo feminino como descrito em séries

internacionais.

2.2 ETIOLOGIA E PATOGÊNESE

A EM tem uma etiologia possivelmente autoimune, e sua susceptibilidade é

determinada por fatores genéticos e influências ambientais (DYMENT et al., 2005).

A interação desses dois fatores determina uma variabilidade na apresentação da

sintomatologia, da gravidade e da progressão da doença (KANTARCI; DE

ANDRADE; WEINSKENKER, 2002).

A evidência que os fatores genéticos atuam como componentes chaves na

patogênese da EM foi fortalecida por estas três observações a seguir:

9 Aumento do risco de casos dentro da mesma família (COMPSTOM,1999).

9 Taxa de concordância maior em gêmeos monozigóticos em relação aos

dizigóticos (SPIELMAN; NATHANSON, 1982; EBERS; SADOVNICK, 1994).

9 Identificação de grupos resistentes a EM nas diferentes áreas de alto risco

(KALMAN; LUBLIN, 1999).

É provável que a susceptibilidade à EM esteja sobre a influência de vários

genes (SADOVINICK, 1994).

Pesquisas na área de genética mostraram a associação da susceptibilidade

para a EM com a região do Antígeno de Histocompatibilidade Leucocitária (HLA)

classe II do cromossoma 6q21. 1-21.3 (COMPSTON,1999). A grande maioria dessas

pesquisas foi realizada em caucasianos do norte da Europa evidenciando

associação com HLA classe II haplótipo DR2 e os alelos, DQA1*0102, DQB1*0602,

DRB1*1501, DRB5*0101 (FOGDELL et al., 1995). Apesar de expressarem

geneticamente a mesma região de susceptibilidade, ocorre uma marcada diferença

da expressão clinica entre os pacientes com EM (DYMENT, 2005). No Brasil com

uma amostra afro-descendente, Caballero e outros (1999) encontraram uma

associação com o alelo HLA-DQB1*0602 e em brancos foi encontrada a clássica

associação com o haplótipo DR2 (ALVES-LEON et al., 2007).

A influência genética na expressão clinica da doença, também, já foi descrita

por alguns autores. Estudos com gemelares mostraram que o grau de incapacidade

motora era similar em gêmeos pares (BRASSAT et al., 1999; CHATAWAY et al.,

2001). Entretanto, Hensiek e outros (2007) não reproduziram este achado.

Runmarker e Andersen (1993) associaram a idade de inicio da doença à gravidade

da doença.

Ramagopalan e outros (2008) fizeram uma revisão de vários estudos que

descreveram a associação dos genes implicados com o curso clínico da EM.

Observou que os resultados dos estudos são variáveis e conflitantes. Estudos em

gêmeos sugerem que influências genéticas estão associadas à incapacidade motora

durante o curso da doença.

2.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

Os sintomas iniciais ocorrem entre vinte e quarenta anos de idade.

Raramente a doença incide abaixo dos quinze anos e acima dos cinqüenta anos,

mas algumas exceções são relatadas (LYNCH; PARMENTER; DENNEY, 2005).

As manifestações iniciais da EM dependem da localização e da extensão das

lesões, podendo manifestar-se por síndromes medulares, de tronco cerebral, neurite

óptica, motoras, sensitivas, cerebelares, esfincterianas e mentais (KURTZE, 1983).

Identificam-se dois cursos clínicos bem distintos, um de caráter recorrente

(85% dos casos) e outro progressivo (15% dos casos). Apresentam seis formas

clinicas que se distinguem entre si, segundo a classificação de Lublin e Reingold

(1996):

9 Esclerose Múltipla Remitente Recorrente (EMRR): é a forma mais freqüente.

Caracteriza-se pela presença de surtos. Aparecimento de sintomas com

duração maior que vinte e quatro horas, e recuperação parcial ou completa

posteriormente. No período entre os surtos, não existe progressão da doença.

9 Esclerose Múltipla Progressiva Primária (EMPP): existe progressão dos

sintomas desde o inicio do quadro, não havendo uma confirmação de surto

clinico.

9 Esclerose Múltipla Progressiva Secundária (EMPS): inicialmente apresenta

curso de surto remitente recorrente seguido de progressão com ou sem surtos

ocasionais e recuperações mínimas.

9 Esclerose Múltipla Progressiva-Surto (EMPSU): progressiva desde o início,

com claros surtos agudos, com ou sem recuperação total, períodos entre

surtos caracterizados por contínua progressão.

9 Esclerose Múltipla Benigna (EMB): permanece inteiramente funcional em

todos os sistemas neurológicos, mesmo depois de quinze anos de doença.

9 Esclerose Múltipla Maligna (EMM): curso breve e progressivo determinando

expressiva incapacidade em múltiplos sistemas neurológicos ou êxito letal em

curto espaço de tempo após o início da doença.

2.4 CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

O diagnóstico da EM baseia-se em critérios clínicos e exames

complementares como: o exame do Líquido Cefalorraquidiano (LCR), os exames de

neuroimagem com ênfase para a Ressonância Magnética (RM) e os Potenciais

Evocados Visuais (PEV), Auditivos e Somatossensitivos, devendo ser excluídos

outras doenças de natureza inflamatória ou infecciosa.

Diferentes critérios diagnósticos como os de Schumacker e outros (1965);

Poser e outros (1983); Thompson e outros (2000); McDonald e outros (2001) foram

propostos, baseado nas características clínicas da doença e apoiando-se nos

resultados de exames complementares.

Desses critérios o mais utilizado nas últimas duas décadas foi o de Poser e

outros (1983) que define como surto o aparecimento de um ou mais sintomas de

alterações neurológicas com duração superior a vinte e quatro horas, com ou sem

confirmação objetiva. A análise do LCR com a finalidade de se observar a síntese

intratecal de Imunoglobulinas G (Ig G) e bandas oligoclonais (BOC), foi aceita como

apoio laboratorial para critério diagnóstico. Os resultados de exames

complementares como os Potenciais Evocados (PE) e RM foram considerados

evidencias paraclinicas.

Como os critérios definidos por Poser e outros (1983), não se apropriavam às

características evolutivas da EMPP, Thompson e outros (2000) definiram critérios

mais específicos para essa forma da doença. Sintomas com tempo de duração

mínima de doze meses, sem a presença de surtos. Os resultados dos exames

complementares (LCR, RM e PE) foram empregados como evidências de apoio ao

diagnóstico. Imprescindível a evidência de síntese intratecal de IgG, com presença

de BOC ou aumento do índice de IgG na relação sangue/LCR. As evidências da

neuroimagem foram determinadas pela RM do crânio, de medula espinhal ou

ambas. Quando a RM de crânio for a única a ser avaliada faz-se necessário a

presença de no mínimo nove lesões em T2 para que se possa apoiar o diagnóstico

(BARKHOF et al., 1997). Na RM de medula são necessárias apenas duas lesões em

níveis diferentes, para serem consideradas como apoio ao diagnóstico. Considera-

se também como diagnóstico a avaliação dos PE. O mais utilizado é o Potencial

Evocado Visual (PEV) que apresentando um alargamento da onda P100, passa a

ser considerado evidência para o diagnóstico da EM (NOSEWORTHY, 2000).

A partir dos critérios clínicos e laboratoriais descritos, foram formuladas três

categorias de EMPP: Definida, Provável e Possível (Quadro 1).

EMPP definida

Progressão clínica por no mínimo um ano Evidência de LCR positivo

Evidência de RM positiva ou RM duvidosa e PEV prolongado

EMPP provável

Progressão clínica por no mínimo um ano e Evidência de LCR positivo e

Evidência de RM duvidosa ou PEV prolongado ou Progressão clínica por no

mínimo um ano e Evidência de RM positiva ou evidência de RM duvidosa e

PEV prolongado (LCR não investigado ou negativo)

EMPP possível

Progressão clínica por no mínimo um ano Evidência de RM duvidosa ou

PEV prolongado

Quadro 1: Critérios Diagnósticos para EMPP (THOMPSON et al., 2000)

EMPP - Esclerose múltipla progressiva primária; LCR - Líquido.

Cefalorraquiano; RM - Ressonância Magnética; PEV - Potencial Evocado

Visual.

McDonald e outros (2001) realizaram um painel para revisão dos critérios de

Poser. Novos critérios diagnósticos foram apresentados para a forma EMRR dando

um maior valor ao papel da RM como evidência da disseminação das lesões no

tempo e espaço, incorporando os critérios radiológicos de (BARKHOF et al., 1997) e

(TINTORÉ et al., 2000) (Quadro 2). Os critérios acima descritos para a forma EMPP

foram incluídos (THOMPSON et al., 2000).

Quadro 2: Critérios de RM do crânio. (BARKHOF et al., 1997; TINTORÉ et al., 2000)

1. Uma lesão realçada pelo gadolínio ou nove lesões hiperintensas em T2 se não houver

lesão realçada pelo contraste

2. No mínimo uma lesão infratentorial

3. No mínimo uma lesão justacortical (envolvimento de fibras em “u” subcorticais)

4. No mínimo três lesões periventriculares

Nota: Uma lesão da medula espinhal pode ser substituída por uma lesão cerebral

De acordo com McDonald e outros (2001), as informações colhidas na história

são consideradas dados de suspeita para EM, e somente a confirmação objetiva dos

sinais neurológicos serão considerados surtos que são separados entre si por um

intervalo mínimo de trinta dias.

Surtos

Requisitos adicionais para o diagnóstico

Dois ou mais surtos; evidência clínica

objetiva de 2 lesões ou mais lesões.

Nenhum teste adicional é requerido.

Dois ou mais ataques; evidência clínica

objetiva de 1 lesão.

Disseminação no espaço, demonstrada pela

RNM.

Ou duas ou mais lesões detectadas pela RM

compatível com EM mais LCR positivo.

Ou aguardar um surto clínico adicional

comprometendo um local diferente.

Um surto; evidência clínica objetiva de 2

ou mais lesões

Disseminação no tempo, demonstrada por RM.

Ou segundo surto clínico.

Um surto; evidência clínica de 1 lesão

(apresentação monossintomática).

Duas lesões ou mais detectadas pela RM

compatíveis com EM, mais o LCR positivo e

disseminação no tempo demonstrado pela RM.

Ou segundo surto clínico.

Quadro 3: Critérios de McDonald e outros (2001)

A análise da RM, do LCR e dos PE podem auxiliar no diagnóstico, sobretudo

quando não existirem evidências clinicas suficientes para o diagnóstico da doença.

Destes exames a RM é considerada a mais sensível e específica na identificação de

lesões inflamatórias da substância branca. Positiva em 95% dos pacientes com EM

(PATY; MCFARLAND, 1998).

A presença de BOC ou aumento da produção de IgG podem ser observados

em 95% dos casos de EM (MCDONALD; RON, 1999).

Para demonstrar a disseminação no tempo McDonald e outros (2001)

adotaram como critério, a realização seriada de exame de RM com um intervalo

mínimo de três meses. Caso no primeiro exame de RM de encéfalo exista uma lesão

captante de contraste, que não corresponda à alteração clinica inicial, confirma-se a

evidência de disseminação no tempo. Se não houver lesão captante no primeiro

exame de RM está indicado à realização de outro exame de imagem em um

intervalo de tempo de três meses.

Os critérios de 2001 foram revisados por Polman e outros (2005) como

podem ser observados no quadro abaixo.

Requisito Central para o diagnóstico

Progressão Neurológica Insidiosa sugestiva de EM acrescido de 1 ano de progressão da

doença determinada retrospectivamente ou prospectivamente.

Requisito Adicional para o diagnóstico

1. RNM de crânio positiva (9 lesões em T2) e LCR positivo.

2. RNM de crânio positiva (no mínimo 4 lesões em T2 com PEV positivo) e LCR positivo.

3. RNM da medula espinhal positiva (2 lesões focais em T2) e LCR positivo.

4. RNM de crânio positiva (9 lesões ou no mínimo 4 em T2 com PEV positivo) e RNM da

medula espinhal positiva (2 lesões focais em T2).

Quadro 4: Critério diagnóstico de McDonald e outros (2001) para EM revisado por Polman e

outros (2005)

Fonte: Polman e outros (2005).

2.5 COGNIÇÃO NA ESCLEROSE MÚLTIPLA

A presença de alterações cognitivas na EM já havia sido descritas por

Charcot, desde o final do século XIX, mas foi somente no final do século XX, com a

implementação de avaliações neuropsicológicas mais sensíveis, que essas

alterações foram mais observadas e melhor analisadas.

Um dos trabalhos de maior relevância no estudo da cognição na EM foi o de

Rao e outros (1991) onde eles observaram uma taxa de freqüência das alterações

cognitivas de 43% no grupo de pacientes. Essas alterações apresentavam um

caráter de declínio cognitivo heterogêneo nas funções de atenção, memória,

velocidade de processamento da informação, função executiva e percepção visuo

espacial. Neste trabalho ele observou os quatro testes que eram mais sensíveis em

identificar as alterações e propôs a formação de uma bateria breve, na tentativa de

diminuir o tempo de aplicação da bateria, tornando mais viável o estudo da cognição

em pacientes com EM principalmente naqueles com fadiga. O estudo de Rao e

outros (1991) evidenciou uma sensibilidade de 71% e uma especificidade de 94%

em apontar as alterações cognitivas no grupo estudado.

Os estudos de Paes (2007) e Negreiros e outros (2008), utilizaram uma

bateria neuropsicológica extensa nas formas EMPP e EMRR respectivamente na

população do Rio de Janeiro. No estudo de Paes (2007), os testes mais sensíveis

foram o Rey Auditory Verbal Learning Test (RAVLT) na evocação após a leitura da

lista de interferência, a fluência verbal na fonêmica da letra “A” e o Teste de Memória

Codificada e auxiliada, o Enchanced Cued Recall Test - Buschke (BECRT).

Negreiros e outros (2008), utilizando bateria semelhante à utilizada por Paes (2007)

encontraram sensibilidade para os mesmos testes. No entanto, houve uma

sensibilidade maior na fonêmica da letra “S”, frutas na fluência semântica, evocação

tardia, reconhecimento e evocação não imediata.

O estudo conduzido por Negreiros e outros (2008) indicaram que uma bateria

breve composta pelo Controled Oral Word Association Test (COWAT) que avalia a

fluência verbal semântica na letra “S” e frutas, o BECRT e o RAVLT apresentavam

uma alta especificidade (73,6%) e sensibilidade (100%) em detectar as alterações

cognitivas em brasileiros com EMRR.

As fibras de substancia branca responsáveis pela conexão do córtex pré-

frontal com as áreas corticais de associação podem ser acometidas na EM

promovendo as alterações na cognição. (RAO, 1996; DE CASTRO et al., 2002).

Estima-se que 40% a 45% dos pacientes com EM apresentem alterações

cognitivas e quando se analisa pacientes de centros de referência para EM estes

valores passam a oscilar em torno de 50 a 65% (RAO et al., 1991, 1995; PAES,

2007; NEGREIROS et al., 2008).

Amato e outros (2001) acompanharam a evolução de pacientes com EM e

verificaram que após dez anos de doença a freqüência dos distúrbios cognitivos

aumentava de 24% para 66%.

A prevalência das alterações cognitivas na EM variam dependendo do

instrumento neuropsicológico aplicado, da função cognitiva avaliada e do curso

clinico da doença. Podem desenvolver-se em qualquer momento durante o curso da

doença, na presença ou não de alterações motoras, interferindo na qualidade de

vida destes pacientes (KOUTSIS et al., 2007). Os déficits cognitivos não apresentam

um caráter uniforme, existindo diferenças individuais significativas. Os sintomas

físicos da EM não estão correlacionados com as alterações cognitivas. ( WISHART;

SHARPE, 1997; PAES, 2007). Os domínios cognitivos mais comumente afetados

nos pacientes com EM são: memória, atenção, VPI e funções executivas (RAO,

2004).

O comprometimento na função da memória é a alteração cognitiva mais

comumente observada (THORNTON; RAZ, 1997). Contudo, esta função não é

afetada igualmente pela doença (BRASSINGTON; MARSH, 1998). Segundo Rao

(2004) a memória episódica e a memória de trabalho estão acometidas, enquanto a

memória semântica, a memória implícita e a memória a curto prazo parecem estar

preservadas.

No estudo conduzido por Benedict, Carone e Bakshi (2004) foi observado que

pacientes com EM apresentavam freqüentemente alteração na função da VPI

associada à depressão, e em menor grau a euforia.

Apesar das alterações cognitivas não serem usualmente marcantes, sua

presença pode ser incapacitante em algum grau, determinando um impacto em

muitos aspectos na qualidade de vida dos pacientes, independente do grau de

incapacidade física e da duração da doença (BOBHOLZ; RAO, 2003). Uma pequena

percentagem dos pacientes, cerca de 10%, apresentam alterações cognitivas de

grave intensidade; demência subcortical de curso insidioso (RAO, 1996).

A intensidade das alterações cognitivas varia significativamente,

possivelmente devido a diferenças peculiares destes pacientes, quanto às variáveis

como curso e duração da doença, número de lesões, regiões do SNC envolvidas e o

nível da incapacidade funcional. (DELOIRE et al., 2005; CALABRESE, 2006).

Podem surgir em qualquer estágio e em todas as formas clínicas da doença, sendo

mais freqüente na EMPS quando comparados a EMRR, com tendência a ser menos

freqüente na EMPP (AMATO; ZIPOLI; PORTACCIO, 2006; PAES, 2007). O estudo

cognitivo conduzido por Paes (2007) em pacientes com EMPP demonstrou uma taxa

de freqüência de 50% de alterações cognitivas que não foram proporcionais ao grau

de comprometimento motor avaliado pelo EDSS.

2.6 APOLIPOPROTEÍNA E

Os lipídeos são apolares e insolúveis em água, portanto para circularem no

plasma, precisam estar ligados as apolipoproteinas, que juntos são designados de

lipoproteínas. Estas lipoproteínas são qualificadas de acordo com a relação

lipídeo/proteína, em: quilomícrons, lipoproteínas de densidades muito baixa (VLDL),

lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), lipoproteínas de densidade baixa

(LDL) e lipoproteínas de densidade alta (HDL). A apolipoproteina E (Apo E) é parte

integrante das lipoproteínas HDL, VLDL e dos quilomícrons. Foi identificada no inicio

da década de 1970 (SHORE; SHORE, 1973). A partir de sua identificação foi

bastante estudada, especialmente devido as suas funções na regulação do

metabolismo dos lipídeos e no transporte do colesterol e fosfolipídios para os

tecidos, através da alta afinidade para o receptor LDL (MAHLEY, 1988).

Exerce também uma importante função no transporte dos lipídeos, para o

interior do SNC. No sistema nervoso periférico coordena a mobilização e

redistribuição de colesterol exercendo um papel essencial na manutenção e no

reparo de neurônios (MAHLEY, 1988).

A principal fonte desta proteína é o fígado, seguido pelo cérebro. Os

astrócitos são os responsáveis pela produção de cerca de 1/3 da detectada pelo

fígado. A síntese também ocorre nos macrófagos e na musculatura lisa, em uma

quantidade bem menor do que nas células hepáticas e astrócitos (MAHLEY, 1988).

A ApoE é uma glicoproteína plasmática polimórfica que contém 299

aminoácidos. É codificada pelo gene APOE situado no braço longo do cromossoma

19 (19q13.2), cuja estrutura revela a presença de quatro exons e três íntrons

(MAHLEY, 1988). As mutações de ponta no exon quatro originam três alelos (ε2, ε3,

ε4) com freqüências polimórficas que codificam três formas distintas de proteínas,

pela alternância de cisteína e arginina nas posições 112 e 158. Determina a

expressão de seis genótipos: três genótipos homozigotos (E2/E2, E3/E3 e E4/E4) e

três genótipos heterozigotos. (E2/E3, E2/E4 e E3/E4). A ApoE 2 apresenta cisteína

nas posições 112 e 158, ApoE 3 possui a cisteína na posição 112 e a arginina na

posição 158, ApoE 4 possui arginina nas posições 112 e 158 (WEISGRABER;

RALL; MAHLEY, 1981). O polimorfismo do gene APOE modifica a proteína tanto na

sua estrutura quanto na sua função, bem como em suas implicações patológicas.

A freqüência de cada isoforma da apoE modifica com a raça, etnia e região

geográfica. Em geral o alelo ε3 é o mais freqüente na população geral (78%).

Seguido do alelo ε4 com uma freqüência de 15% enquanto que o alelo ε2 é o menos

prevalente (7%) (BALES et al., 2002).

2.7 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA PROGRESSÃO E GRAVIDADE

DA ESCLEROSE MÚLTIPLA

O número de publicações sobre estudos relacionando o polimorfismo do gene

APOE com as alterações cognitivas na EM é inferior quando comparados aos

estudos do alelo APOE ε4 como fator genético afetando a susceptibilidade,

severidade e progressão dos sintomas físicos da EM.

Estudos como os de Pirttilä e outros (2000) e Savettieri e outros (2003) não

evidenciaram associação do gene APOE ao curso da doença. A gravidade da

doença também não foi associada aos efeitos do alelo APOE ε4 (WEATHERBY et

al., 2000; SEDANO et al., 2006; KOUTSIS et al., 2007; GUERRERO et al., 2008).

Entretanto, Chapman e outros (2001) e Fazekas e outros (2001), observaram que o

alelo APOE4 aumenta a taxa de progressão da EM.

2.8 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA COGNIÇÃO DA ESCLEROSE

MÚLTIPLA

O impacto do polimorfismo do gene APOE na cognição das doenças

neurodegenerativas como a Doença de Alzheimer (DA), já está bem constituído

(CORDER et al., 1993). Entretanto na EM às influências do polimorfismo APOE

ainda não estão totalmente esclarecidos. Apenas cinco estudos (OLIVERI et al.,

1999; SAVETTIERI et al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMENTER et al., 2007;

SHI et al., 2008) avaliaram os efeito do alelo APOE ε4 na cognição de pacientes

com EM. Nestes estudos, a diferença na metodologia utilizada para a avaliação

neuropsicológica e os distintos critérios de inclusão empregados, bem como o

conceito que a magnitude das influências determinadas pelo polimorfismo APOE

difere de acordo com a população estudada, determinaram possivelmente

resultados diferentes, mas apontaram para uma associação do alelo ε4 com as

alterações das funções cognitivas observadas em quatro trabalhos (SAVETTIERI et

al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMENTER et al., 2007; SHI et al., 2008).

Oliveri e outros (1999) utilizaram uma amostra de oitenta e nove pacientes

com EMRR e EMPS e cento e sete controles, e submete-os a uma bateria de testes

neuropsicológicos, incluindo o Mini Mental Station Examination (MMSE), RAVLT,

Visual Immediate Memory (VIM), Corsi Block Tapping Task (CBTT), teste da

Fluência Verbal e o Raven progressive matrices test (Raven). Avaliaram também

índices de depressão com a Hamilton Psychiatric Rating Scale for Depression

(HDS). Analisaram as funções de memória, e o raciocínio abstrato e conceitual,

encontrando uma freqüência de alterações cognitivas em 66% dos pacientes. Os

testes mais sensíveis em detectar as alterações foram o RAVLT (52,5%) e o teste da

Fluência Verbal (52,5%). Toda a amostra foi submetida à coleta de sangue para a

avaliação do polimorfismo do gene APOE e do genótipo AA - 491 A/T da região

reguladora do polimorfismo APOE. Não encontraram significância estatística entre

as alterações cognitivas e o alelo ε4. Entretanto, verificaram que os homozigotos

(AA -491A/T) da região reguladora do polimorfismo APOE eram mais freqüentes no

grupo de pacientes comprometidos quando comparados aos não comprometidos e

que os efeitos na cognição eram independentes do polimorfismo APOE, sobretudo

nas funções de memória.

Parmenter e outros (2007) analisaram duzentos e sessenta e três pacientes

com EM e submeteram a amostra a uma avaliação neuropsicológica com os

seguintes testes: Tower of London (TOL), Califórnia Verbal Learning Test (CVLT-II) e

uma bateria para rastreamento de pacientes com EM, a Neuropsychological

Screening Battery for MS (NSBMS) constituída por três testes: Paced Auditory Serial

Addition Task (PASAT), Spatial Recall Task (SRT), and Controlled Oral Word

Association Task (COWAT). Com um ponto de corte representado por um desvio

padrão abaixo da média no Cognitive Composite Standard Score (CCSS). A

avaliação neuropsicológica revelou uma freqüência de 40% de alterações cognitivas.

Entretanto quando foi adotado um ponte de corte mais rigoroso, as freqüências das

alterações cognitivas da amostra diminuíram para 11%. Uma maior freqüência dos

pacientes com o alelo ε4 foi observada no grupo comprometido, somente quando foi

aplicado um ponte de corte mais rigoroso para os testes. Esse ponto de corte

consistia em alteração de pelo menos um desvio padrão abaixo da média em duas

ou mais medidas do CVLT-II, no PASAT e em dois ou mais testes da bateria

NSBMS.

Parmenter e outros (2007) encontraram uma associação entre o alelo ε4 e os

pacientes com grave comprometimento cognitivo. Fazendo uma re-análise dos

dados do estudo de Oliveri e outros (1999) com o mesmo ponto de corte que

utilizaram em seu estudo, encontraram a mesma associação. Entretanto ao utilizar

os pontos de corte do estudo de Oliveri e outros (1999) em sua amostra, não mais

acharam essa associação. Na análise das duas regiões promotoras do polimorfismo

APOE (_219 G/T e _491 A/T) encontraram resultados diferentes aos de Oliveri e

outros (1999) em relação ao genótipo AA -491 e o comprometimento cognitivo,

descrevendo uma falta de associação entre essas variáveis no grupo representado

pelo sexo feminino.

No estudo conduzido por Savettieri e outros (2003) foram incluídos

quinhentos e três pacientes com EM, que após avaliação com a Mental Deterioration

Battery, (MDB) apontaram uma freqüência de 55% para pacientes comprometidos.

Esta bateria foi composta por testes que avaliaram a memória através do Immediate

and Delayed Recall of Rey’s 15 words (Rey’s 15 words IR and DR) e do VIM. O

raciocínio abstrato e conceitual foi avaliado utilizando o Raven’s 47 Progressive

Colored Matrices (PM’47) test. As habilidades visuoespaciais foram analisadas

através do Freehand Copying of Drawings (CD) e do Copying Drawings with

Landmarks tests (CDL).

A análise da distribuição do alelo ε4 na amostra não revelou diferença

estatisticamente significativa entre os grupos, comprometidos e os não

comprometidos. A freqüência aumentada do sexo masculino no grupo com

comprometimento cognitivo levou Savettieri e outros (2004) a analisarem

separadamente cada gênero. A amostra masculina com alteração cognitiva foi

distribuída em dois grupos que se diferenciava pela intensidade das alterações em

leve e grave. Esta análise apontou diferenças entre os grupos nas variáveis: idade

do paciente, tempo de duração da doença, escolaridade, EDSS, presença do alelo

ε4. O grupo com grave comprometimento cognitivo apresentou idade mais elevada,

pontuação elevada no EDSS, tempo maior de duração da doença, baixo nível de

escolaridade e maior freqüência do alelo ε4. No grupo feminino o comprometimento

cognitivo surgiu independente de qualquer variável.

Koutsis e outros (2007) analisaram cento e vinte e cinco pacientes com EM

independente da forma clinica e quarenta e três controles. Utilizaram como

instrumento de avaliação neuropsicológica uma bateria breve (BRB-N) composta por

testes que avaliam o aprendizado verbal através do Long-Term Storage (LTS),

Consistent Long-Term Retrieval (CLTR) e SRT. A evocação tardia foi analisada pelo

Total Delayed Score (STRD) do SRT. O Aprendizado visuo espacial foi verificado

pela soma dos três índices imediatos (SPARTT) do 10/36 Spatial Recall Test

(SPART). A evocação tardia visuo espacial investigada pelo Delayed recall Trial

(SPARTD) do SPART. A atenção sustentada, o cálculo mental, e a VPI foram

avaliadas em três segundos e dois segundos no PASAT (PASAT3, PASAT2). A

exploração visual complexa e a VPI foram avaliadas pelo SDMT. A fluência verbal

semântica foi avaliada pela lista de palavras (WLG), usando a categoria frutas e

vegetais. O inventário de depressão de Beck foi aplicado em toda a amostra. A taxa

de freqüência das alterações cognitivas foi de 51%.

Koutsis e outros (2007) agruparam os pacientes classificando-os em alelo ε4+

(pacientes com pelo menos um alelo ε4) e alelo o ε4- (pacientes que não

apresentavam alelo ε4). Procederam com análise dos grupos comparando-os nas

variáveis: sexo, idade, escolaridade, idade de inicio e duração da doença, curso

clinico, EDSS, pontuação do inventário de Beck. Não encontraram diferenças entre

os grupos. Entretanto, ao analisar o aprendizado verbal encontraram uma diferença

significativa com um risco relativo aumentando em 6 vezes a probabilidade de

desenvolver alterações cognitivas no grupo alelo ε4+.

Não foram observadas uma influência significativa do alelo ε4 no risco relativo

em outros domínios cognitivos embora uma tendência para a fluência verbal

semântica pode ser registrada.

Shi e outros (2008) analisaram cento e noventa e sete pacientes com EM,

cento e cinqüenta do gênero feminino e quarenta e sete do gênero masculino

agrupando-os, assim como Koutsis e outros (2007), em dois grupos de acordo com

a presença do alelo ε4: alelo ε4+ e alelo ε4-. Aplicaram a bateria breve BRB- N,

composta por 4 testes: SRT, PASAT2, 7/24 Spatial Recall Test, WLG e observaram

qual era a freqüência da alteração dos testes comparando os grupos. Analisaram

sete variáveis entre os grupos. O sexo, a etnia, a escolaridade, a idade de inicio da

doença e o EDSS não eram diferentes entre os grupos. Somente a variável idade

entre os grupos era diferente. Havia também, uma diferença no desempenho do

SRT entre os grupos. A disfunção da memória e do aprendizado foi mais freqüente

no grupo ε4+. Com SRT associado ao PASAT e ao 7/24 Spatial Recall Test essa

diferença continuava sendo observada. Entretanto quando associado ao WLG, não

observaram diferenças entre os grupos. Achado similar foi encontrado quando se

aplicava o PASAT, o 7/24 Spatial Recall Test e o WLG isoladamente.

2.9 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE EM OUTRAS DOENÇAS

NEUROLÓGICAS

O efeito do Alelo APOE ε4 na DA , já está completamente estabelecido

(STRITTMATTER et al., 1993). Sua associação com um pior desempenho em testes

cognitivos em idosos também foi relatado (BONDI et al., 1995). Crawford e outros

(2002) observaram uma associação do alelo APOE ε4 e alteração da função do

aprendizado verbal, naqueles pacientes com história de Traumatismo Craniano,

enquanto a Epilepsia do Lobo Temporal foi associada ao alelo APOE ε4 por

Gambardela e outros (2005).

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Estimar a associação entre o genótipo APOE 4 e as alterações cognitivas de

pacientes com Esclerose Múltipla atendidos em um Centro de Referência de

Doenças Desmielinizantes.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estabelecer as freqüências alélicas do gene APOE na população estudada.

Estimar a freqüência das alterações nos testes neuropsicológicos do grupo

comprometido.

Avaliar o tempo de execução dos testes em pacientes e controles.

4 METODOLOGIA DA PESQUISA

4.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA

Conforme decisão do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário

Gaffrée e Guinle, em reunião realizada em 11 de outubro de 2007, o projeto foi

analisado e APROVADO, de acordo com a Resolução CNS nº 196/96 (ANEXO A).

4.2 DESENHO DO ESTUDO

Estudo de caso controle.

4.3 SUJEITOS E MÉTODOS

No período de outubro de 2007 a julho de 2008 foram avaliados pela

pesquisadora através do exame neurológico e análise de prontuário cem pacientes

pertencentes ao ambulatório do Centro de Referência de Doença Desmielinizante do

Hospital da Lagoa (Profª. Drª. Regina Maria Papais Alvarenga). O diagnóstico de EM

foi estabelecido pelos critérios de McDonald e outros (2001) e pelos critérios de

Thompson e outros (2000) para as formas progressivas. Desses cem pacientes,

sessenta pacientes preencheram os critérios de inclusão e exclusão e fizeram parte

deste estudo.

Dois estudos brasileiros, realizados no Rio de Janeiro em pacientes com

EMPP (PAES, 2007) e EMRR (NEGREIROS et al., 2008) contribuíram de forma

efetiva na escolha dos instrumentos utilizados na formação de uma bateria breve. A

bateria utilizada neste estudo foi desenvolvida por psicólogas vinculadas ao

programa de pós-graduação da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

(UNIRIO), para ser aplicada em curto intervalo de tempo e composta por testes que

já se mostraram sensíveis em identificar as alterações cognitivas comumente

afetadas na EM.

De acordo com os resultados da avaliação neuropsicológica esses sessenta

pacientes foram distribuídos em dois grupos distintos. No grupo A (EM/AC) foram

alocados trinta pacientes classificados pelos testes neuropsicológicos como

comprometidos e o grupo B (EM) foi formado por trinta pacientes que apresentaram

resultado normal no desempenho cognitivo. No grupo C (controle) foram alocados

indivíduos saudáveis com resultado normal no desempenho dos testes.

A categorização racial da amostra foi estudada, de acordo com a classificação

racial do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) que é aceita como

oficial desde 1991. A coleta de dados foi baseada na auto declaração da cor de pele

dos sujeitos sendo fornecidos cinco itens (branco, preto, pardo, amarelo e indígena)

a cada paciente ou controle. Estes escolhiam o item que mais lhe eram apropriados.

Posteriormente foram alocados dentro de dois grupos raciais: branco e afro-

brasileiros. No grupo racial afro-brasileiro foram alocados os que se declararam

como tendo a cor da pele parda ou preta (Tabela1).

4.3.1 Critérios de inclusão

Para compor o grupo A (EM/AC) e grupo B (EM) foram incluídos pacientes

com idade entre dezoito e cinqüenta e oito anos sem distinção de gênero,

escolaridade ou demais características sócio-demograficas. Com diagnóstico de EM

baseados nos critérios de MC Donald e outros (2001) para a forma EMRR e critérios

de Thompson e outros (2000) para as formas progressivas. Para compor o grupo C

foram incluídos indivíduos que apresentassem características sócio-demográficas

semelhantes aos grupos A (EM/AC) e B (EM).

4.3.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos os pacientes que apresentassem história pregressa de

Traumatismo Cranioencefálico (TCE), usuário de drogas licitas e ilícitas, os que

apresentassem déficits visuais importantes, aqueles que concluíram a avaliação

neuropsicológica em um intervalo inferior a trinta dias do aparecimento dos surtos ou

do uso de corticóides, os que apresentassem pontuação igual ou superior a 8 na

Expanded Disability Status Scale (EDSS) e aqueles com histórico de doenças

neurológicas ou psiquiátricas ou que estivessem em tratamento de alguma outra

doença orgânica, para que não houvesse interferência desses fatores no

desempenho dos testes neuropsicológicos.

Foram excluídos do grupo C (controles), os sujeitos com histórico de doenças

neurológicas ou psiquiátricas ou que estivessem em vigência de tratamento de

alguma outra doença orgânica.

4.4 PROCEDIMENTOS

Todos os pacientes da amostra foram submetidos às seguintes etapas de

avaliação, após: assinarem um termo de consentimento livre e esclarecido para a

participação na pesquisa (APÊNDICE A).

9 Anamnese para verificação da pertinência aos critérios de inclusão e

exclusão da pesquisa e coleta dos dados sócio-demográficos.

9 Consulta ao prontuário para verificação das informações relativa à história

clinica da doença. (data do diagnóstico, tempo de duração da doença, forma

clinica, uso de corticóides, presença de antecedentes psiquiátricos, etc).

9 Exame neurológico completo, incluindo a aplicação da escala Expandida do

Estado de incapacidade - Expanded Disability Status Scale (EDSS). Baseia-

se na pontuação de elementos mensuráveis relacionados ao desempenho

das funções visual, piramidal, sensorial, cerebelar, controle esfincteriano,

cerebral, tronco encefálico e na capacidade de locomoção. O EDSS é uma

escala funcional com pontuação variando de 0 a 10, onde 0 é classificado

como normal e 10 é a morte devido a EM.

9 Aplicação dos Inventários de Beck para Ansiedade e Depressão (CUNHA,

2001) - validado para população brasileira. Questionários contendo vinte e um

itens cada um que podem ser aplicados de forma oral ou auto administrados.

O paciente deverá escolher a alternativa que descreve a melhor maneira com

que tem se sentido na última semana incluindo o dia da administração do

questionário, na tentativa de medir o perfil mais constante do avaliado.

Realizado no dia da avaliação neuropsicológica.

9 Aplicação da bateria breve pela equipe de psicólogos com treinamento

específico para a metodologia. Essas avaliações foram acompanhadas pela

pesquisadora e seus resultados foram decisivos na formação dos grupos: A

(EM/AC) e B (EM). Foi desenvolvida por psicólogas vinculadas Ao programa

de pós-graduação da UNIRIO, a partir dos resultados dos estudos de Paes

(2007) e Negreiros e outros (2008).

9 Esta bateria incluiu a avaliação das seguintes funções: memória verbal a

curto e longo prazo (RAVLT), habilidades lingüísticas (teste da Fluência

Verbal) e concentração e VPI (Digit Symbol Oral) (Quadro 5). Servindo no

presente estudo, como instrumento de rastreamento, separando os pacientes

de acordo com a classificação nos testes, em comprometidos e não

comprometidos. O critério de comprometimento dos testes cognitivos baseou-

se no desempenho do grupo controle. O déficit cognitivo foi classificado em

leve, moderado e grave de acordo com o número de testes alterados.

Alteração em dois testes indicava comprometimento leve. Em três testes

classificado como moderado e em quatro ou mais testes apontava para um

grave comprometimento cognitivo. Ao final da bateria, os pacientes foram

classificados como: normais ou comprometidos.

9 Realizada coleta de sangue periférico de pacientes e controles, na sala da

neurologia do HUGG ou na residência dos participantes por uma enfermeira

de nível técnico e pela autora respectivamente. Foi determinado o genótipo

APOE nos três grupos, através da coleta de 3 ml de sangue periférico em

tubo de coleta a vácuo com anticoagulante EDTA e enviado, via sedex em

recipiente de isopor a temperatura ambiente no mesmo dia da coleta, ao

laboratório Genomic Engenharia Molecular Ltda., situado em São Paulo. Para

cada amostra de sangue era preenchido pela autora um protocolo de

solicitação para exames de marcadores genéticos (ANEXO B).

4.4.1 Testes Neuropsicológicos utilizados na amostra

9 Rey Auditory Verbal Learning Test (RAVLT): elaborado por Rey (1964);

Lezak (1995) Spreen e Strauss (1998). Foi selecionado para avaliar a função

de memória, que é uma das funções mais avaliadas no estudo da cognição

em pacientes com EM. Avalia a memória de curto e longo prazo, afere a

capacidade de retenção do material apresentado e a curva de aprendizagem.

Consiste na análise da memória verbal através de um teste de aprendizagem

de lista de quinze palavras que não estão relacionadas entre si, apresentadas

aos participantes oralmente, com evocação a cada leitura independente da

ordem apresentada. Após quinze minutos realiza-se a etapa de evocação

tardia e reconhecimento.

9 Digit Symbol Modalities Test (Versão Oral - SMITH, 1982): mede a atenção, a

VPI e concentração. Baseado no equivalente gráfico da Bateria Wais III. A

forma oral permite eliminar o aspecto motor com um estimulo audiovisual e

uma resposta oral. Consiste em identificar os números de um a nove que

estão associados a desenhos geométricos. A pontuação é determinada pelo

número e itens completados dentro de um tempo limite de cento e vinte

segundos.

9 Fluência Verbal: Controlled Oral Word Association Test - COWAT (BENTON,

1976): Fluência Verbal: Controlled Oral Word Association Test - COWAT

(SPREEN; STRAUSS, 1998): Fluência semântica: animais e frutas e Fluência

fonêmica: palavras com as letras “F”, “A” e “S” dentro de um tempo

previamente estabelecido de um minuto para cada. Trata-se de um teste de

associação verbal oral controlada que é uma medida de Output verbal e

função executiva.

Quadro 5: Testes neuropsicológicos aplicados e funções cognitivas avaliadas

TESTES NEUROPSICOLÓGICOS FUNÇÕES COGNITIVAS

1. Digit Symbol Modalities Oral

2.Controlled Oral Word Association Test

(COWAT)

Semântica: Animais e Frutas

Fonêmica: F-A-S

3. Rey Auditory Verbal Learning Test

(RAVLT)

4.Inventário Beck de Ansiedade (BAI) e

Depressão (BDI)

Atenção/Concentração/VPI

Fluência Verbal

Memória

Transtorno do Humor

4.4.2 Teste genético analisado na amostra

O DNA genomico foi extraído de três ml de sangue periférico fresco. Para

extração do DNA genômico utilizou-se o kit comercial Puregene da Gentra Systems.

Os segmentos polimórficos (primers) do gene para apo E foram amplificados pela

técnica de Reação em Cadeia Polimerase (PCR) e de eletroforese em gel de

agarose segundo método de Donohoe e outros (1999), que utiliza duas reações de

PCR.

A primeira etapa consistiu na extração do DNA genomico. As amostras

isoladas do DNA foram medidas pela espectrofotometria ultravioleta em 260

nanômetro e diluídas com água destilada a uma concentração final de 30 µL

(microlitros). No quadro 8 observamos os componentes utilizados na PCR.

- MEL_APOE-R (concentração 200 μM)

- MEL_APOE_C158-F (concentração 200 μM)

- MEL_APOE_C112-F (concentração 200 μM)

- MEL_APOE_R158-F (concentração 200 μM)

- MEL_APOE_R112-F (concentração 200 μM)

- DMSO 50%

- 10 x Taq Buffer Invitrogen

- 10 x dNTPs (2mM)

- MgCl

(50 mM)

- Enzima Taq Invitrogen (5U/μl)

Nota: pares de primers diluídos para a concentração de 5 μM em água

Quadro 6: Primers (DONOHOE et al., 1999) e outros componentes utilizados na PCR

μM = micrômetro.

Na segunda etapa, pelo método de Donohoe e outros (1999) existem duas

reações de PCR para cada amostra. Cada reação tem como volume final 30 μl

(Quadro 7).

Quadro 7: Reação de PCR duas reações [A e B] para cada amostra

Mistura Master 1 x

Primer R 2,0 μl

DMSO 50% 3,0 μl

10 x Taq Buffer 3,0 μl

10 x dNTPs 3,0 μl

MgCl

1,5 μl

Enzima Taq 0,5 μl

Água 7,5 μl

Volume 20,5 μl

Mistura Master A 1 x

Primer C158-F 2,0 μl

Primer C112-F 1,5 μl

DNA (*) x μl

Água (*) y μl

Volume 9,5 μl

Volume final 30 μ

Mistura Master B 1 x

Primer R158-F 2,0 μl

Primer R112-F 1,5 μl

DNA (*) x μl

Água (*) y μl

Volume 9,5 μl

Volume final 30 μl

*a massa de DNA necessária é 60 ng e a soma dos volumes de DNA e água fica em 6 μl.

Após as reações A e B ocorre à terceira etapa pelo processo de desnaturação

(Quadro 8). Segue-se a quarta etapa que consiste na detecção dos polimorfismos

em gel agarose (Quadro 9). Na figura 1 observa-se um esquema mostrando o DNA

amplificado.

5º C 3 minutos

96º C 45 segundos

66º C 45 segundos 35 x

72º C 45 segundos

72º C 5 minutos

10º C Indeterminado

Quadro 8: Processo de desnaturação

- Gel de agarose 2%, Tampão 1 x TBE com brometo de etídio

- Misturar e aplicar 2 μl de tampão sacarose e 12 μl de amostra

- Aplicar 2 μl de padrão de peso molecular 50 pb diluído (**)

- Eletroforese na cuba horizontal

- 1 hora a 100 V

- Fotografar o gel no transiluminador Ultra Violeta

Quadro 9: Detecção dos polimorfismos em gel agarose

** Diluição do padrão de peso molecular: - 2 μl de sacarose, 1 μg de padrão,

completar o volume para 12 μl com TE.

Figura 1: Esquema do DNA amplificado

Fonte: Laboratório Genomic.

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas foram realizadas com o aplicativo Statistical Package

for Social Sciences - SPSS versão 14.0 para Windows (Chicago, IL, USA). Foi

estabelecido como nível de significância para todos os testes um p-valor menor que

0,05.

As variáveis categóricas foram apresentadas como freqüências absolutas e

porcentagens e suas associações analisadas pelo teste qui-quadrado de Pearson ou

teste exato de Fischer quando apropriado. As variáveis contínuas foram

representadas por suas médias e desvios-padrão e as significâncias estatísticas das

suas diferenças foram aferidas pelo teste t de Student ou, quando analisadas para

os três grupos, por análise de variância (ANOVA). As Razões de Chances (OR) e os

respectivos Intervalos de Confiança de 95% (IC 95%) foram estimados por análises

univariadas de associação.

5 RESULTADOS

Sessenta pacientes com EM e trinta indivíduos saudáveis pareados pela

média da idade, sexo e anos de escolaridade concordaram em participar deste

estudo e concluíram as etapas de avaliação neuropsicológica e coleta de sangue

para o teste genético.

5.1 DADOS DEMOGRÁFICOS E CLÍNICOS

Os dados sócios demográficos estão dispostos na tabela 1. A amostra deste

estudo não apresentou diferenças entre os grupos, em sua composição nas

variáveis: sexo, idade, raça e escolaridade.

Tabela 1: Características demográficas da amostra (n=90)

Total

Grupo A

(EM/AC)

Grupo B

(EM)

Grupo C

(Controle)

p valor

Sexo masculino, n (%) 29 (33,2) 10 (33,3) 8 (26,7) 11 (36,7) 0, 700

Idade em anos, média (± DP) 36,4 (9,8) 39,2 (9,5)

35,8

(10,1)

34,1 (9,3) 0, 114

Escolaridade em anos, média (± DP) 13 (3,2) 11,9 (3,1) 13,5 (3,5) 13,6 (2,6) 0, 065

Raça, n (%)

Branca 67 (74,4) 22 (73,3) 24 (80) 21 (70) 0, 664

Afro-brasileira 23 (25,6) 8 (26,7) 6 (20) 9 (30)

Idade de início, média (± DP) 29,6 (9,7) 31,3 (9,9) 27,9 (9,2) - 0, 172

Duração em anos, média (± DP) 7,8 (5,0) 8,0 (4,6) 7,6 (5,3) -

Curso clínico, n (%)

EMRR 45 (75) 20 (66,7) 25 (83,3) - 0, 329

EMPP 12 (20) 8 (26,7) 4 (13,3) -

EMPS 3 (5) 2 (6,7) 1 (3,3) -

Escore EDSS, média (± DP) 2,5 (2,3) 3,5 (2,2) 1,4 (1,8) - <0, 001

Qui-quadrado de Pearson,

Anova,

Teste t de Student.

Os resultados indicam uma freqüência maior da EM no sexo feminino com

predomínio da raça branca.

Em relação ao numero de anos de escolaridade, não houve diferença

significativa entre os grupos, prevaleceram aqueles com escolaridade de nível médio

(11,9 a 13,6 anos).

A idade mínima e máxima da amostra foi de dezoito e cinqüenta e oito anos

respectivamente. Os testes estatísticos aplicados demonstraram não haver diferença

na idade entre os grupos (p = 0, 114).

Do total da amostra de sessenta pacientes a média da idade do inicio da

doença foi de 29,5 (DP ± 9,6) e a média da pontuação do EDSS foi de 2,5 (DP ± 2,3)

após média de duração da doença de 7,8 anos (DP ± 5,0). Não houve diferença

estatística entre os grupos A e B nas variáveis: idade de inicio da doença e tempo de

duração da doença. Entretanto a análise com o teste T de Student mostrou diferença

estatisticamente significativa para a variável EDSS entre os grupos A e B (p<0, 001),

com uma média maior de pontuação no EDSS para o grupo de pacientes com

alterações cognitivas (grupo A).

Quanto à forma clinica da doença observa-se freqüência maior para a forma

EMRR (75%), seguida das formas EMPP (20%) e EMPS (5%). Não foi observada

diferença estatística entre os grupos de pacientes com e sem alterações cognitivas.

5.2 GENOTIPAGEM

A distribuição do genótipo APOE e da freqüência dos alelos pode ser

observada em cada grupo e no total dos grupos na tabela 2. Não foi observada

diferença estatística entre os grupos.

Tabela 2: Distribuição e freqüência do alelo e genótipo APOE

Total

(EM/AC)

(EM)

(Controle)

p valor

Alelos - nº (%)

ε2 9(5) 3(5) 3(5) 3(5) 0, 4252

ε3 149(82,8) 46(76,7) 53(88,3) 50(83,3)

ε4 22(12,2) 11(18,3) 4(6,7) 7(11,7)

Genótipo - nº (%)

ε2/ ε2 0, 264

ε2/ ε3 7(7,8) 1(3,3) 3(10) 3(10)

ε2/ ε4 2(2,2) 2(6,7) 0(0) 0(0)

ε3/ ε3 61(67,8) 18(60) 23(76,7) 20(66,7)

ε3/ ε4 20(22,2) 9(30) 4(13,3) 7(23,3)

ε4/ ε4 - - - -

EM - Esclerose Múltipla, AC - Alteração Cognitiva.

Quando as variáveis: idade de inicio da doença e pontuação do EDSS foram

comparadas com os grupos ε4+ (portadores do alelo ε4) e ε4- (não portadores do

alelo ε4) não se observou diferença entre os grupos (Tabela 3).

Tabela 3: Variáveis clinicas da EM e alteração cognitiva entre pacientes de acordo com o

estado APOE4

ε4 + ε4 - p valor

Idade no início da doença - média (± DP) 29,27 (9,9) 29,69(± 9,7) 0,885*

EDSS - média (± DP) 3,0 (2,1) 2,3 (± 2,3) 0,263*

Comprometimento cognitivo - nº (%)

Normal 3 (20) 27 (60) 0,007**

Comprometidos 12(80) 18 (40)

* Teste t de Student, ** Teste qui-quadrado de Pearson.

Na tabela 4 foram comparados os três testes cognitivos (RAVLT, Digit Symbol

e COWAT) entre os pacientes ε4+ e ε4-, não houve diferença estatística, todos p’ >

0,3. Entretanto, quando o resultado final da bateria foi comparado entre pacientes

ε4+ e ε4-, foi observada uma diferença estatística entre os grupos A (EM/AC) e B

(EM) com p< 0, 007 (Tabela 3).

Tabela 4: Freqüência dos testes alterados de acordo com a presença do alelo ε4

Testes - nº (%) Grupo todo ε4 + ε4 - p valor

RAVLT 29 (96,7) 10 (90,9) 19 (100) 0, 367

SDMT 28 (93,3) 11 (100) 17 (89,5) 0, 520

COWAT 16 (53,3) 5 (45,5) 11 (57,9) 0, 707

O RAVLT foi o teste cognitivo que se mostrou mais alterado com uma

freqüência de 96,7%, seguido pelo Digit Symbol cuja freqüência foi calculada em

93,3%. O COWAT apresentou uma freqüência de alteração de 53,3%.

Na tabela 5 foi analisada a comparação dos grupos, entre os resultados dos

testes e a presença dos alelos APOE ε4. Se compararmos o grupo A com B,

observamos uma diferença estatisticamente significativa (p-valor 0.037 OR3, 37

(0.90-16.80). Se compararmos o grupo A com C ou B com C não observamos

diferença significativa entre esses grupos (p’> 0. 2).

Tabela 5: Comparação dos grupos entre o resultado dos testes e a presença dos alelos ε4

Grupos em relação à ε 4+ OR (IC 95%) p valor

Grupo A (EM/AC) x Grupo B (EM) 3,763 (1,04 – 13,65) 0,037

Grupo A x Grupo C 1,902 (0,61 – 5,86) 0,260

Grupo B x Grupo C 0,505 (0,13 – 1,95) 0,317

Grupo A+B x Grupo C 1,095 (0,39 – 3,06) 0,862

Grupo A - Esclerose Múltipla + pacientes com alterações cognitivas, Grupo B - Pacientes

com Esclerose Múltipla sem alterações cognitivas, Grupo C - Controles.

Foi verificada uma correlação entre o tempo de duração da doença e o EDSS

para toda a amostra de pacientes (p=0,023). Ao estratificar por grupos, observa-se

que esta associação não é significativa no grupo A (p=0,301), mas é significativa

para o grupo B (p=0.049).

O transtorno do humor não interferiu nos resultados dos testes RAVLT

(p=0.757), DSTM (p=0.528) e COWAT (p=174).

A aplicação dos testes foi realizada em um tempo médio de 36,2 minutos para

os pacientes comprometidos, apresentando uma diferença estatística em relação ao

pacientes com cognição normal e grupo controle (p’<0, 004).

6 DISCUSSÃO

As baterias breves têm sido utilizadas como ferramenta de rastreamento em

vários estudos de cognição na EM com o objetivo de identificar, quantificar as

alterações cognitivas nas diferentes formas da EM e de buscar a redução do tempo

de sua aplicação. A existência de uma ampla variabilidade na composição das

baterias breves quanto ao tipo e número de testes utilizados para avaliar uma

mesma função cognitiva, tornou-se uma variável de limitação para comparação entre

os diversos estudos.

No presente estudo os testes neuropsicológicos foram sensíveis em identificar

alterações cognitivas independente do estado APOE. A bateria breve funcionou

como um instrumento de rastreamento útil na identificação das alterações cognitivas

nas várias formas da doença em um tempo reduzido.

A freqüência das alterações cognitivas varia de 45 a 65% (RAO et al., 1991;

BOBHOLZ; RAO, 2003),dado confirmado no presente estudo. Foi observada uma

taxa de freqüência de 50% de alteração cognitiva através da bateria breve nos

pacientes com EM, enquanto os controles foram considerados normais. Esses

dados foram concordantes com os de pesquisas anteriores que utilizaram baterias

neuropsicológicas extensas em pacientes com EM. (RAO et al., 1991; RAO, 1995;

PAES, 2007; NEGREIROS et al., 2008).

As freqüências genéticas relacionadas ao polimorfismo do gene APOE, são

variáveis em algumas populações, com destaque a freqüência do alelo ε4. Lucotte,

Loirat e Hazout (1997); Siest e outros (1995) observaram um gradiente norte sul na

freqüência do alelo ε4 ao comparar diferentes populações da Europa. A freqüência

do alelo e ε4 é maior ao norte do continente europeu.

Com relação às freqüências e distribuição dos alelos e do genótipo APOE

neste estudo não foi encontrado diferenças entre os pacientes e a população

normal, dado concordante com os resultados encontrados por Pinholt e outros

(2005) e Shi e outros (2008). A idade de inicio da doença, não foi afetada pela

presença do alelo ε4 em conformidade com outros estudos (PINHOLT et al., 2005;

SHI et al., 2008). Para Shi e outros (2008) este dado indica que APOE4 é mais um

fator de susceptibilidade para o desenvolvimento das alterações cognitivas do que

para os sintomas iniciais motores e sensitivos da EM.

Neste trabalho, foi encontrada uma associação do genótipo APOE4 ao grupo

de pacientes com alterações cognitivas. A probabilidade de desenvolver alterações

cognitivas aumentou em três vezes quando comparados aqueles sem o alelo ε4.

Outros quatros trabalhos também encontraram esta mesma associação

(SAVETTIERI et al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMANTER et al., 2007; SHI et

al., 2008). Não houve diferença estatística, quando o grupo de pacientes

comprometidos foi comparado ao grupo de controles saudáveis.

Koutsis e outros (2007) avaliando funções especificas da cognição

encontraram uma associação APOE4 na função do aprendizado verbal (OR 6.74, IC

95% 2.03 - 22.36, p =0.002) como um fator de predição associado ao alelo apoe4,

em virtude de não ter encontrado a mesma associação com outras funções

cognitivas. O autor comparou seus resultados com os estudos em populações

italianas de Oliveri e outros (1999) e Savettieri e outros (2004) que não apontaram

para esse dado, atribuindo essa diferença a metodologia distinta utilizada para

avaliação do aprendizado verbal. Klages, Fisk e Rockwood (2003) concluíram que o

SRT seria uma ferramenta mais sensível para avaliação dos efeitos do alelo e4 na

memória comparados ao RAVLT que foi utilizado nos estudos italianos. A diferença

nos critérios de inclusão e o efeito variável de alelo ε4 do gene APOE em diferentes

populações também foram discutidas por Koutsis e outros (2007) como explicação

para seus achados.

No presente estudo o RAVLT fez parte dos instrumentos da bateria

neuropsicológica para avaliação da memória e foi sensível em detectar as alterações

cognitivas independente do estado APOE (tabela 4). Com a ausência de

homozigotos na amostra, não foi possível apontar as influências de dois alelos ε4 na

cognição de pacientes com EM na amostra deste estudo. Entretanto, Koutsis e

outros (2007) com apenas homozigotos na amostra refere que seus resultados

refletem um efeito real do alelo e4 na cognição de pacientes com EM apoiado nos

resultados de um estudo de meta analise concretizado por Small e outros (2004),

que abordaram o efeito do alelo APOE ε4 na cognição de indivíduos normais.

Concluíram que havia uma associação entre alterações da memória episódica

apenas em homozigotos para o alelo ε4.

Savettieri e outros (2004) observaram que as alterações cognitivas eram mais

freqüentes na amostra representada por homens e estavam associadas às variáveis

clínicas como duração, curso da doença, EDSS e com a variável genética APOE4.

Nas mulheres a associação com as variáveis clinica e genética não ocorriam.

Diferentes achados foram encontrados no presente estudo. A amostra de pacientes

comprometidos foi maior em uma proporção 2:1 para o sexo feminino. Não houve

associação com duração e curso da doença, no entanto foi concordante em relação

ao EDSS e a variável genética estudada. Dos cinco estudos publicados relacionando

a relação dos efeitos da APOE4 sobre a cognição na EM, somente Savettieri e

outros (2004) encontraram uma maior prevalência no sexo masculino. Parmenter e

outros (2007) reproduziram o achado de Savettieri e outros (2004), quanto à maior

gravidade da doença no grupo onde prevaleceu a presença do alelo ε4.

Relacionaram a gravidade da alteração cognitiva à elevada pontuação do EDSS.

Achado relatado previamente por Rao e outros (1991).

No estudo de Oliveri e outros (1999) não foi encontrado associação do

comprometimento cognitivo ao genótipo APOE4. Encontraram uma associação das

alterações cognitivas, com a região reguladora do polimorfismo APOE (-491 A/T).

Sua metodologia diferiu em relação aos outros estudos principalmente no nível de

corte que adotou para cada teste neuropsicológico. Talvez esta seja a razão dos

resultados não concordantes com o presente estudo e com os outros quatro estudos

(SAVETTIERI et al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMANTER et al., 2007; SHI et

al., 2008).

Ressalto que o trabalho de Oliveri e outros (1999) foi o pioneiro relacionando

o gene APOE com o estudo da cognição na EM, em pacientes italianos. Parmenter e

outros (2007) conseguiram reproduzir a associação do gene APOE4 com distúrbio

cognitivo fazendo uma re-analise do trabalho de Oliveri com os mesmos pontos de

corte que utilizou em sua amostra para avaliação neuropsicológica. Contudo

utilizando os pontos de corte rigorosos de Oliveri e outros em sua amostra

encontraram resultados não favoráveis a associação previamente apontada.

Os poucos trabalhos publicados, a existência de distintos critérios de inclusão

e a ampla variabilidade de testes e pontos de corte utilizados na composição das

baterias, determinaram uma limitação para a comparação deste estudo com os

previamente publicados. Mas que não foram suficientes para comprometer o

resultado final de reproduzir na população brasileira, mesmo com uma amostra

menor, os achados anteriormente descritos pelos outros autores.

Trata-se de um trabalho inédito no Brasil, que estudou a influência de um fator

genético na cognição de pacientes com EM, na cidade do Rio de Janeiro, cujos

resultados contribuem para estimular novas pesquisas nessa área. Abrindo

perspectivas para abordagens terapêuticas precoces e diferenciadas na área da

cognição nas diferentes formas da doença.

Pesquisas futuras correlacionando o gene APOE ε4 a outras variáveis

clinicas da doença e as alterações de RM em pacientes brasileiros é sugerido.

7 CONCLUSÃO

9 A freqüência e a distribuição dos alelos e do genótipo APOE são variáveis entre

as populações.

9 A freqüência e a distribuição dos alelos e do genótipo APOE foram similares

entre pacientes e controles neste estudo.

9 A bateria breve adotada neste estudo como instrumento de rastreamento

cognitivo foi eficaz em identificar pacientes com alterações cognitivas em um curto

intervalo de tempo independente da presença do alelo APOE4.

9 As freqüências de alterações nos testes neuropsicológicos revelaram para a

amostra de pacientes com alterações cognitivas, percentuais de 96,7% para o

RAVLT, 93,3% para SDMT e 53,3% para o COWAT independente do estado APOE.

9 A freqüência de alterações cognitivas neste estudo foi de 50% para amostra de

pacientes.

9 Neste trabalho, foi encontrada uma associação do alelo APOE4 ao grupo de

pacientes com alterações cognitivas quando comparados aqueles pacientes com

cognição normal. A probabilidade de desenvolver declínio cognitivo foi três vezes

maior para aquelas com a presença do alelo APOE4 quando comparados ao grupo

sem o alelo o alelo APOE4.

9 Estudos que relacionam os efeitos do genótipo APOE com a cognição em

paciente com EM são insuficientes e apresentam critérios de inclusão e metodologia

distintas, dificultando a comparação com a amostra brasileira. Entretanto não foram

suficientes, para comprometer o resultado final de reproduzir, mesmo com uma

amostra menor, os achados descritos previamente pelos outros autores.

9 O presente trabalho é um precursor no Brasil e o sexto na literatura mundial.

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

APÊNDICE A - Consentimento Livre e Esclarecido

UNIRIO - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

ESCOLA DE MEDICINA E CIRURGIA

NEUROLOGIA

CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Participação em dissertação de Mestrado

Eu, abaixo assinado, concordo em participar do estudo sobre Prejuízo

cognitivo em pacientes com Esclerose Múltipla e sua associação com o gene APOE4:

Estudo caso-controle em pacientes do Centro de Referência do Hospital da Lagoa, no

Rio de Janeiro.

Os procedimentos planejados foram a mim explicados pela médica pesquisadora,

Drª. Sonia Batista Saraiva e são os seguintes:

 Serei submetido (a) a exame Clínico e Neurológico.

 Serei avaliado (a) por bateria de testes neuropsicológicos com a equipe de

psicólogas.

 Será realizada coleta de amostra do meu sangue para análises laboratoriais em

data previamente marcada pela médica pesquisadora.

 Não terei gastos com os exames.

 Estou ciente que a pesquisa científica não tem fins lucrativos e, portanto não

serei remunerado (a).

 Ao participar desta pesquisa não terei nenhum benefício direto, estou ciente que

este estudo trará informações importantes, de forma que o conhecimento que será

construído a partir desta pesquisa possa colaborar para o desenvolvimento e avanços



terapêuticos apropriados e individualizados em pacientes com esclerose múltipla,

onde a pesquisadora compromete-se a divulgar os resultados obtidos.

 Autorizo a veiculação dos dados coletados no meu estudo em todos os tipos de

trabalhos científicos, sejam em aulas, encontros, simpósios, jornadas, congressos,

publicações, revistas e livros.

 Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem

que isso leve a qualquer penalidade ou interrupção do meu

acompanhamento/assistência/tratamento.

A médica pesquisadora explicou-me que o Estudo será realizado em um grupo

de pacientes e controles. Decidimos conjuntamente que a minha inclusão no Estudo

tem caráter voluntário, não obrigatório, não remunerado, e estarei participando como

paciente ou como controle.

Certifico que este formulário foi me explicado e que o li ou que o mesmo foi lido

para mim e que entendi o seu conteúdo.

Data: ____/____/______Hora: __________

Nº. de registro: ______________________

Paciente ou responsável: ______________________________________________________

Nome: ____________________________________________________ RG: _____________

Testemunha:________________________________________________________________

Nome: ____________________________________________________ RG: _____________

ANEXO A - Aprovação do CEP-HUGG

ANEXO B - Protocolo de Solicitação para Exames Marcadores Genéticos

Código de acesso junto a Genomic:

Nome do Laboratório Requisitante:

Médico Responsável:

Nome completo do paciente:

Data de nascimento: __/__/__

Nome do Exame solicitado:

Médico solicitante:

Data da coleta:

Data de envio das amostras:

Realizou transplante de medula? ( ) Sim ( ) Não

Realizou transfusão de sangue nos últimos três meses? ( ) Sim ( ) Não

Envio de Laudo:

( ) correio ( ) fax __________________ ( ) e-mail nosso cadastro

( ) outro e-mail ____________________________________________

Declaro ter ciência das recomendações de coleta, processamento e envio das

amostras, conforme link de manual de coleta disponível na Área Restrita do site da

Genomic.

________________________________

Nome do responsável

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