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ÓXIDO NÍTRICO MODULA OS SISTEMAS PRIMÁRIOS DE
TRANSPORTE DE PRÓTONS E ENZIMAS ANTIOXIDANTES
DURANTE O ESTRESSE SALINO EM PLANTAS MUTANTES
E NÃO MUTANTES EM ÁCIDO ABSCÍSICO
MIRELLA PUPO SANTOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO –UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
AGOSTO – 2009
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O ÓXIDO NÍTRICO MODULA OS SISTEMAS PRIMÁRIOS DE
TRANSPORTE DE PRÓTONS E AS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
DURANTE O ESTRESSE SALINO EM PLANTAS MUTANTES
E NÃO MUTANTES EM ÁCIDO ABSCÍSICO
MIRELLA PUPO SANTOS
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Genética e Melhoramento
de Plantas.”
Orientador: Prof. Ricardo Enrique Bressan-Smith
Co-orientador: Prof. Arnoldo Rocha Façanha
CAMPOS DOS GOYTACAZES/ RJ
AGOSTO-2009
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O ÓXIDO NÍTRICO MODULA OS SISTEMAS PRIMÁRIOS DE
TRANSPORTE DE PRÓTONS E AS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
DURANTE O ESTRESSE SALINO EM PLANTAS MUTANTES
E NÃO MUTANTES EM ÁCIDO ABSCÍSICO
MIRELLA PUPO SANTOS
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Genética e Melhoramento
de Plantas.”
Aprovada em 7 de agosto de 2009.
Comissão Examinadora:
Prof. Alexandre Pio Viana (D.Sc., Produção Vegetal) – UENF
Prof. Lázaro (D.Sc., Ciências Biológicas) – ESALQ
Prof. Arnoldo Rocha Façanha (D.Sc., Química Biológica) – UENF
(Co-orientador)
Prof. Ricardo Bressan-Smith (D.Sc., Fisiologia Vegetal) – UENF
(Orientador)
ii
À Deus;
Aos meus pais Paulo e Virgína;
Ao meu irmão Fhilipe;
À minha Vó Laura
DEDICO
“Viver e não ter a vergonha de ser feliz..
cantar e cantar e cantar ...
a alegria de ser um eterno aprendiz.....”
iii
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ricardo E. Bressan-Smith pela orientação, pela amizade, apoio
e profissionalismo;
Ao Prof. Dr.Arnoldo Rocha Façanha pela co-orientação, pela oportunidade,
experiência científica, amizade e, acima de tudo, por acreditar na minha
capacidade;
Ao meu amigo e companheiro de trabalho Daniel Zandonadi pela amizade
e apoio estando ao meu lado em todos os momentos, auxiliando na elaboração
das hipóteses, dos experimentos e das discussões da tese;
À Profa. Dra Marla Binzel pelo fornecimento das sementes de tomateiro
mutantes em ácido abscisico;
Ao Prof. Dr. Alexandre Pio Viana pelo fornecimento das sementes de milho
UENF- 512 e pela participação na banca de defesa de tese;
Ao Prof. Dr Lázaro E. P. Peres pela participação na banca de tese e sua
enorme experiência profissional auxiliando de forma significativa;
Ao prof. Gonçalo Apolinário pela participação na banca de projeto e pelo
apoio;
Ao Prof. Dr. Messias G. Pereira pelo fornecimento das sementes de milho
UENF- 512;
Aos colegas, Silvia, Inga, Guilherme, Leonardo, Renata, Juliana, Leandro,
Viviane, Lilian, Liane, Sarah, Clara, Gleidson e Luciane, pela amizade e
iv
colaboração. Aos funcionários da UENF, em especial, ao secretário Daniel, pelo
coleguismo e competência, auxiliando muito os alunos;
Aos professores do curso de genética e melhoramento de plantas, pelos
conhecimentos transmitidos;
Aos colegas do curso, pelo companheirismo;
Aos meus pais, Paulo e Virginia, meu irmão, Fhilipe, e à minha vovó, Laura,
e a toda família, pelo amor incondicional, carinho e apoio constante, me ajudando
a suportar as dificuldades, a distância e a saudade;
À minha querida amiga Juliana Motta Oliveira que mesmo de longe está
sempre presente em minha vida. Obrigada pelo amor, carinho e amizade;
À minha querida amiga Eliomara S. S. Alves pela amizade, apoio e seus
valiosos conselhos;
A Universidade Federal Norte Fluminense pela oportunidade de realização
do curso e pela concessão da bolsa de estudos;
A todos que, de uma forma ou outra, participaram de mais esta conquista.
v
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................. vii
ABSTRACT ..............................................................................................
ix
1- INTRODUÇÃO......................................................................................
1
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................. 4
2.1 Salinidade.................................................................................. 4
2.1.1 Alterações no metabolismo das plantas pela salinidade......... 6
2.1.2 Mecanismos de tolerância ao estresse salino......................... 8
2.1.2.1 Manutenção da homeostase celular.....................................
8
2.1.2.2 Ajustamento osmótico.......................................................... 11
2.1.2.3 Redução do estresse oxidativo.............................................
13
2.1.2.4 Balanço entre a absorção e dissipação de luz:
Fluorescência da clorofila a..............................................................
14
2.2 Sinalização: ABA, Óxido Nítrico................................................. 16
2.2.1 Ácido Abscísico....................................................................... 16
2.2.2 Mutantes Hormonais................................................................
18
2.2.2.1 Tomateiro mutante (sitiens) .................................................
18
2.2.3 Óxido Nítrico............................................................................ 19
3-TRABALHOS......................................................................................... 22
A modulação de bombas de prótons e de enzimas antioxidantes em
resposta ao estresse salino é mediada por óxido
nítrico........................................................................................................
24
vi
Resumo.................................................................................................... 25
Abstract.....................................................................................................
25
Introdução................................................................................................. 26
Material e Métodos................................................................................... 28
Resultados................................................................................................ 33
Discussão................................................................................................. 36
Conclusão ................................................................................................ 44
Referências Bibliográficas ....................................................................... 44
Produção de óxido nítrico e interação com ácido abscísico na
modulação de bombas de prótons e na indução de enzimas
antioxidantes durante o estresse salino....................................................
64
Resumo.....................................................................................................
64
Abstract.....................................................................................................
65
Introdução................................................................................................. 66
Material e Métodos................................................................................... 68
Resultados................................................................................................ 80
Discussão................................................................................................. 86
Conclusão.................................................................................................
95
Referências Bibliográficas........................................................................
96
4-RESUMO E CONCLUSÕES................................................................. 123
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 125
vii
RESUMO
SANTOS, Mirella Pupo; D.Sc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; Agosto, 2009. O óxido nítrico modula os sistemas primários de transporte
de prótons e as enzimas antioxidantes durante o estresse salino em plantas
mutantes e não mutantes em ácido abscísico. Professor orientador: Ricardo
Enrique Bressan-Smith. Professor Co-Orientador: Arnoldo Rocha Façanha.
Conselheiros: Alexandre Pio Viana e Gonçalo Apolinário de Souza Filho.
O fitohormônio ácido abscísico (ABA) está relacionado à regulação de respostas
adaptativas a estresses ambientais. O óxido nítrico (ON) é relatado como
mediador de respostas hormonais, em particular mediando efeitos de hormônios e
moléculas envolvidas em estresses abióticos. No primeiro trabalho da presente
tese, objetivou-se verificar a participação do ON em vias de indução de respostas
ao estresse salino em plantas de milho. Foi possível verificar a atenuação dos
efeitos da salinidade em raiz e parte aérea pelo tratamento com o doador de ON
(SNP). O tratamento com SNP incrementou a atividade de enzimas antioxidantes
possibilitando a redução da peroxidação lipídica em raízes. Observou-se aumento
da produção de ON durante o estresse salino, sendo esta produção atribuída
principalmente a redutase do nitrato (RN) e possivelmente a enzima associada a
produção de ON (NOA1). O tratamento com o doador de ON incrementou a
atividade de P-ATPase, V-ATPase e PPase comprovando a hipótese da
participação desta molécula na modulação de bombas de prótons. No segundo
trabalho, se buscou entender a interação entre o hormônio ABA e o ON em
processos fisiológicos durante o estresse salino. Para tal, foi utilizado um
tomateiro mutante sitiens deficiente na produção de ABA. As plantas mutantes
viii
apresentaram grande susceptibilidade ao estresse salino, sendo este fator
explicado por características inerentes a este genótipo e possivelmente causada
pela redução da produção de ON nas raízes durante o estresse. A redução da
produção de ON nas raízes foi atribuída, em grande parte, à enzima RN, pelo fato
da atividade desta ser reduzida de forma considerável durante o estresse salino
nas plantas sitiens. Observou-se que o ABA é necessário na indução de enzimas
antioxidantes em plantas controle durante o estresse salino. Na via de sinalização
induzida pelo ABA possivelmente o ON atue como sinalizador após este
hormônio. ON minimizou os efeitos danosos provocados pelo tratamento salino
reduzindo a peroxidação lipídica e mantendo a integridade de membranas, sendo
estes fatores atribuídos ao aumento da atividade das enzimas antioxidantes e das
bombas de prótons. O balanço da ativação entre as bombas de H
+
associado à
síntese de ON pode compor um dos mecanismos de controle de resposta ao
estresse salino.
ix
ABSTRACT
SANTOS, Mirella Pupo; D.Sc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; August, 2009. Nitric oxide regulates primary proton transport systems and
antioxidants enzymes during salt stress in abscisic acid-mutant and non-mutant
plants. Adviser: Ricardo Enrique Bressa-Smith. Professor Co-adviser: Arnoldo
Rocha Façanha. Committe Members: Alexandre Pio Viana and Gonçalo
Apolinário de Souza Filho.
The phytohormone abscisic acid (ABA) is related to the regulation of adaptive
responses to environmental stresses. Nitric oxide (NO) is reported as a mediator
of hormonal responses particularly mediating effects of hormones and molecules
involved in abiotic stresses. In the first work of this Thesis, the aim was to
understand the role of NO in the induction of responses to salt stress in maize
plants. It was shown that the NO donor (SNP) reduced the salinity effects in root
and shoot. The SNP increased the activity of antioxidant enzymes leading to a
reduction of lipid peroxidation in roots. It was observed an increase in the NO
production during salt stress in maize roots, which was attributed to the nitrate
reductase (RN) and possibly to the NO associate enzyme 1 (NOA1). The
treatment with SNP enhanced the activity of P-ATPase, V-ATPase and PPase
confirming the hypothesis of NO role in the proton pumps modulation. The second
work aimed to understand the interaction between the hormone ABA and NO in
physiological processes during salt stress. Therefore, the mutant tomato sitiens
deficient in ABA production was used. The mutants showed a high susceptibility to
salt stress and this feature was explained by the inherent characteristics of this
genotype and possibly by the reduced production of NO in the roots during stress.
The reduced production of NO in roots was attributed in part to the enzyme NR,
which showed reduced activity during salt stress in sitiens plants. It was shown
x
that ABA is required to antioxidant enzymes’ activation in wild type plants during
salt stress, and NO possibly act as a signal downstream ABA pathway. NO
alleviated the salt stress effects, reducing lipid peroxidation and maintaining the
cell membranes integrity, characteristic possible related to both antioxidant and
proton pumps activation. The concerted regulation in pre- and post transcriptional
levels of H
+
pumps associated with NO synthesis and the induction of antioxidant
enzymes may integrate a mechanism of plant responses to salt stress.
1. INTRODUÇÃO
Os estresses abióticos são um dos fatores limitantes à produtividade. A
salinização do solo provoca alterações no metabolismo da planta, geradas por
estresse osmótico e iônico. Como conseqüência, há alterações na fotossíntese,
intensificação de processos oxidativos e inibição de diversas enzimas essenciais
ao metabolismo da planta resultando na redução da produtividade (Zhao et al.,
2007; Ghanem, et al., 2008; Debouba et al., 2007).
Durante o estresse salino a entrada de CO
2
fica limitada havendo a
redução na disponibilidade de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidada
(NADP
+
) (Lawlor, 2002). Nestas condições, o oxigênio compete com o NADP
+
como redutor podendo gerar o superóxido,O
2
-
, uma espécie reativa de oxigênio
(EROs). As EROs são responsáveis pela degradação de pigmentos
fotossintéticos, inativação de enzimas e peroxidação lipídica, resultando em
injúrias nas membranas celulares (Bartels e Sunkar, 2005; Smirnoff, 1993).
O estresse oxidativo e iônico gerado durante a salinização é amenizado
pela atuação de enzimas antioxidantes, que degradam as EROs, e por
transportadores secundários como, Na
+
/H, que promovem a exclusão e ou
alocação de íons no vacúolo. A ativação dos transpotadores secundários é
dependente da atuação de transportadores primários de prótons, como a P-
ATPases e a H
+
-PPase, responsáveis pelo equilíbrio osmótico e iônico celular. A
modulação de enzimas antioxidantes e de bombas de prótons, entre outros
2
processos tem sido relacionada à aquisição de tolerância a salinidade (Bartels e
Sunkar., 2005; Chaves et al., 2008).
As plantas sob estresse salino apresentam acúmulo de ácido abscísico
(ABA), fitormônio importante para regulação de respostas adaptativas ao
estresse. O aumento da sua produção está correlacionado, ao fechamento
estomático, acúmulo de osmorreguladores, indução da atividade de enzimas
antioxidantes e aumento da expressão de genes relacionados à tolerância ao
estresse (Bartels e Sunkar., 2005; Chaves et al., 2008).
A participação de ABA durante o estresse abiótico tem sido relacionada à
atuação de outra molécula, o óxido nítrico (ON). O ON é um gás lipofílico que se
difunde facilmente no meio intracelular e é atualmente apontado como grande
sinalizador de processos fisiológicos, atuando na modulação de sinais gerados
por hormônios, afetando os níveis de mensageiros secundários. Esta molécula
esta relacionada à indução da atividade de MAPK na via de indução de raízes
laterais por auxina (Pagnussat et al., 2004) e na participação da indução ao
fechamento estomático induzido por ABA, por sua atuação na indução de canais
de Ca
+2
e mobilização intracelular de Ca
+2
e canais de K
+
e Cl
-
(Sokolovski et al.,
2005; Sokolovski e Blatt, 2004; Garcia-Mata et al., 2003). Outros estudos trazem
ainda a participação do ON como mediador na via de indução de enzimas
antioxidantes promovida pelo ABA (Zhang et al., 2006) e na indução de bombas
de prótons em plantas promovendo a tolerância a alguns tipos de estresses
abióticos (Zhang et al., 2007; Song et al., 2006).
Existem poucos trabalhos estudando a interação entre ABA e o óxido
nítrico em vias de sinalização durante o estresse, tornando-se necessários mais
estudos para desvendar o papel do óxido nítrico em algumas vias de sinalização
mediada por ABA. Neste trabalho foi utilizada como ferramenta uma planta
mutante na produção de ABA em tomateiro para entender a participação do óxido
nítrico na via de sinalização promovida por ABA, ou seja, se esta molécula está
antes (upstream) ou após (downstream) o ABA, ou mesmo se participa de outra
rota independente de ABA na mediação de respostas ao estresse salino.
Primeiramente, procurou-se afirmar o papel do ON como modulador da
bioenergética celular durante o estresse salino e logo após foi realizado o estudo
da interação desta molécula com o ABA, procurando determinar a sua
participação em vias dependentes e não dependentes de ABA, para então
3
estabelecer qual interação existe entre o ON e este fitormônio durante o estresse
salino.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Salinidade
A salinidade e a sodicidade dos solos ocorrem em diversas regiões do
mundo, sendo um problema ainda mais grave em regiões áridas e semi-áridas.
Os solos salinos são aqueles com elevada quantidade de sais solúveis incluindo
sulfatos (SO
4
-2
), carbonatos (CO
3
-2
) e cloretos (Cl
-
). Os solos sódicos possuem
conteúdo elevado de Na
+
a ponto de restringir o crescimento vegetal (Bartels e
Sunkar, 2005).
O departamento de agricultura americano classifica os solos como salinos
quando a condutividade elétrica é igual ou maior do que 4 dS/m (USDA, 2008), o
que equivale aproximadamente a 40 mM de NaCl e pode gerar uma pressão
osmótica de cerca de 0,2 MPa (USDA, 2008).
A salinidade é um problema encontrado em 30 % dos solos irrigados no
mundo. A expansão da agricultura em áreas áridas e semi-áridas e o uso da
irrigação de forma incorreta contribuem para aumentar este problema por ser a
água o agente transportador de sais (Silveira et al., 2001; Chaves et al., 2008).
As plantas submetidas à salinização do solo modificam seu metabolismo
de tal forma que há redução do crescimento, desenvolvimento e produtividade
(Cruz et al., 2003; Willadino e Camara, 2005; Bartels e Sunkar, 2005; Wang et al.,
2008).
5
A concentração elevada de sais pode afetar as plantas de duas formas
principais: (1) provocando o estresse osmótico, afetando imediatamente o
crescimento, sendo causado pelo sal presente no ambiente externo às raízes e;
(2) induzindo o estresse iônico, o qual se desenvolve mais lentamente e é
resultado da combinação do acúmulo de íons nos ramos da planta e da sua
inabilidade de tolerar esses íons acumulados (Munns e Tester, 2008).
Para lidar com os estresses ambientais os vegetais desenvolveram
diversas estratégias, como mecanismos de adaptação e hábitos de crescimentos
específicos, tornando-as mais tolerantes ao estresse. A percepção rápida do
estresse garante respostas apropriadas alterando o metabolismo, crescimento e
desenvolvimento. As respostas ao estresse envolvem sensores de estresse, vias
de sinalização que compreendem uma rede de proteínas que interagem entre si,
fatores de transcrição, genes e finalmente metabólitos e proteínas relacionadas
ao aumento da tolerância ao estresse (Chaves et al., 2009; Bartels e Sunkar,
2005).
Plantas tolerantes a estresse desenvolveram mecanismos adaptativos
apresentando diferentes graus de tolerância os quais são determinados
fortemente pela variabilidade genética. É relatado que o programa genético para
tolerância esteja presente pelo menos em algum grau em plantas não tolerantes.
A adaptação gradual da planta ao estresse envolve a expressão apropriada de
genes responsáveis pela tolerância, levando a aquisição de tolerância a plantas
antes consideradas não tolerantes (Chaves et al., 2009; Bartels e Sunkar, 2005).
Desta forma os diferentes tipos de tolerância podem ser atribuídos a diferenças
na percepção ao estresse, na transdução de sinal e na apropriada modificação na
expressão gênica e do metabolismo (Chaves et al., 2009).
A adaptação à salinidade é sem dúvida um dos processos mais complexos
e que envolvem numerosas alterações no metabolismo e desenvolvimento das
plantas incluindo aumento transitório do fitormônio ácido abscísico (ABA),
acúmulo de solutos compatíveis e proteínas protetoras, indução da atividade e
expressão de enzimas antioxidantes, modulação de transportadores primários e
secundários e supressão das vias consumidoras de energia (Munns et al., 2006;
Chaves et al., 2008).
6
Como o estresse salino ocorre freqüentemente e pode afetar a maioria dos
ambientes, compreender a tolerância à salinidade é fundamental, sendo este um
dos tópicos de pesquisa mais importantes.
2.1.1 Alterações no metabolismo das plantas pela salinidade
A salinidade altera a fotossíntese devido à redução da assimilação de CO
2
,
mudanças da osmolaridade celular e do equlibrio iônico. O excesso de sais
diminui o potencial osmótico do solo, reduzindo a disponibilidade de água para as
plantas, acarretando no fechamento dos estômatos para minimizar a perda de
água pela transpiração. A redução da entrada de CO
2
pelo fechamento
estomático limita as reações de carboxilação, reduzindo desta forma a atividade
fotossintética (Reddy et al., 1992; Lawlor e Cornic, 2002). A redução da difusão de
CO
2
ocorre ainda no mesófilo gerado por mudanças físicas e estruturais e
alterações bioquímicas geradas pelo estresse (Lawlor e Cornic, 2002; Flexas et
al., 2004; Flexas et al., 2007). Além do estresse osmótico, o excesso de íons
modifica a dinâmica celular inativando diversas proteínas e moléculas como
transportadores de elétrons da fotossíntese (Munns et al., 2006; Chaves et al.,
2008; Reddy et al., 1992; Lawlor e Cornic, 2002). Enzimas que necessitam do K
+
como co-fator são particularmente sensíveis à alta concentração de Na
+
ou ao
aumento da taxa Na
+
/K
+
.
Concentrações de Na
+
acima de 100 mM inibem
diversas enzimas, principalmente as relacionadas à fotossíntese (Lawlor e Cornic,
2002; Chaves et al., 2008).
A redução de CO
2
limita a disponibilidade de nicotinamida adenina
nucleotídeo oxidada (NADP
+
), que constitui um aceptor de elétrons no
fotossistema I (Lawlor e Cornic, 2002). Nestas condições, o oxigênio compete
com o NADP
+
como redutor podendo gerar espécies reativas de oxigênio (EROs)
como o superóxido (O
2
-
) (Newton e McBeath, 1996; Reddy et al., 2004; Sudhir e
Murthy, 2004; Naumann et al., 2007; Chaves et al., 2008). As EROs causam entre
outros problemas a inativação de enzimas, degradação de pigmentos
fotossintéticos e peroxidação lipídica de membranas celulares (Smirnoff, 1993;
Bartels e Sunkar, 2005; Sekmen et al., 2007).
As membranas celulares são basicamente compostas por proteínas e
lipídios. Os lipídios são compostos ricos em pontes de hidrogênio e alvos de
7
reações oxidativas A peroxidação lipídica causa danos nas membranas celulares,
reduzindo a integridade destas estruturas. As reações oxidativas são
problemáticas também para enzimas, podendo levar a modificações em suas
estruturas, bem como para os ácidos nucléicos como o DNA (Smirnoff, 1993).
Os pigmentos fotossintéticos também são afetados pelas altas
concentrações de sal. Os conteúdos de clorofila e carotenóides diminuem em
plantas consideradas sensíveis a este estresse como, milho, tomate, batata e
feijão. Já em plantas tolerantes há a manutenção da concentração de clorofilas e
aumento da concentração de carotenóides (Hernandez et al., 1995; Gadallah,
1999). Plantas sob estresse prolongado desenvolvem clorose e há perda de
folhas (Hernandez et al., 1995; Gadallah, 1999, Agastian et al., 2000).
A salinidade afeta o estado nutricional vegetal por alterar o equilíbrio iônico
celular provocando a inibição da absorção de outros íons. O aumento no nível de
Na
+
e Cl
-
freqüentemente resulta em redução na concentração de K
+
, Ca
2+
, PO
4
-
,
e NO
3
-
(Cramer et al., 1991; Martinez e Lauchli, 1994; Gouia et al., 1994). O íon
nitrato (NO
3
-
) é a principal forma nitrogenada absorvida pelas plantas, sendo,
posteriormente, reduzido a amônio (NH4
4+
) por reações de redução, na qual, a
redutase do nitrato (RN) é considerada enzima chave no processo, catalisando o
primeiro passo na via (Debouba et al., 2007, Gouia et al., 1994). O estresse salino
afeta diretamente o metabolismo do nitrogênio, devido às mudanças iônicas e
osmóticas geradas, alterando a atividade da RN e de enzimas relacionadas, como
a nitrito redutase e NADH-GOGAT (Gouia et al., 1994; Abd-ElBaki et al., 2000;
Flores et al., 2000; Carillo et al., 2005; Silveira et al., 2001; Debouba et al., 2007).
As organelas celulares são alteradas em resposta ao estresse gerado pelo
excesso de sal. Há desenvolvimento de vacúolos, modificações no retículo
endoplasmático, diminuição das cristas mitocondriais, fragmentação do tonoplasto
e degradação do citoplasma (Mitsuya et al., 2000). Plantas tratadas com NaCl
apresentaram alterações das estruturas dos tilacoídes dos cloroplastos tornado-
os desorganizados (Hernandez et al., 1995). O estresse osmótico gerado leva
ainda a redução do tamanho celular e aumento da densidade de células, ou seja,
números de células por milímetro quadrado. Estes resultados foram encontrados
em tecidos como parênquima paliçádico e esponjoso (Hernandez et al., 1995;
Mitsuya et al., 2000).
8
Como resultado de tantas alterações no metabolismo e fisiologia
resultantes da salinidade ocorre a inibição de diversas características de
desenvolvimento tais como: a expansão da superfície foliar, a biomassa de folhas
e raízes (Hernandez et al., 1995; Bartels e Sunkar, 2005), a altura da planta, o
número de folhas por planta, o comprimento de raízes e a superfície de raízes por
planta e conseqüentemente a redução da produtividade (Mohammad et al., 1998;
Bartels e Sunkar, 2005).
2.1.2 Mecanismos de tolerância ao estresse salino
As plantas podem ser classificadas como halófitas ou glicófitas de acordo
com a tolerância ao estresse salino. As halófitas são plantas que toleraram
quantidades elevadas de sais (500 mM de NaCl) na rizosfera sem afetar seu
crescimento (Flowers et al., 1977; Niu et al., 1993). Já plantas que não
conseguem desenvolver-se sobre o substrato com elevado conteúdo de sais
solúveis são conhecidas como glicófitas. A vantagem das halófitas sobre as
glicófitas advém da melhor atuação de mecanismos de tolerância, que
proporcionam um manejo mais eficiente em acumular e compartimentar os
solutos (Flowers et al., 1977) ou excluí-los (Niu et al., 1993).
As plantas possuem mecanismos bioquímicos e moleculares para tolerar o
estresse salino através de produtos e processos alternativos. Entre estes
mecanismos estão: (1) a exclusão seletiva de íons e/ou compartimentalização de
íons em nível celular (vacúolos) e estrutural (folhas); (2) síntese e acúmulo de
osmólitos; (3) alterações na fotossíntese e na fluorescência da clorofila a; (4)
indução de enzimas antioxidantes e (5) síntese de hormônios e moléculas
associadas à sinalização durante o estresse (Hasegawa et al., 2000).
2.1.2.1 Manutenção da homeostase celular
As bombas de prótons de membrana plasmática e vacuolar exercem um
papel fundamental no controle do pH citoplasmático e na manutenção da
homeostase celular, bem como na expansão celular (Taiz e Zeiger, 1998; Gaxiola
et al., 2007; Gaxiola et al., 2001).
9
A homeostase celular é importante para a atividade de várias enzimas e
para a manutenção de um potencial de membrana e osmótico adequado para a
regulação do volume celular (Serrano et al., 1999). A regulação do fluxo iônico é
necessária para a manutenção de níveis baixos de íons tóxicos e para o acúmulo
dos íons essenciais ao desenvolvimento celular (Serrano e Rodriguez-Navarro,
2001; Zhu, 2003). O íon Na
+
é considerado potencialmente tóxico para as plantas,
havendo a necessidade de limitar sua entrada e/ou compartimentalizar este em
tecidos mais velhos, formando um ambiente estoque, que posteriormente será
eliminado por meio da absicisão de folhas velhas (Taiz e Zeiger 1998; Hasegawa
et al., 2000).
Em condições normais as plantas mantêm concentrações de K
+
maiores do
que de Na
+
no citosol através de transportadores antiportes K
+
/H
+
e Na
+
/H
+
condicionados a gradientes eletroquímicos dependentes de ATP (Serrano,1999;
Zhu et al., 2003; Hassidim, 1990). O K
+
é elevado em condições normais, pois é
um íon móvel, que possui função osmótica, regulando a abertura e fechamento
dos estômatos, auxiliando na ascensão capilar do NO
3
-
no xilema e atuando na
ativação enzimática (Taiz e Zeiger, 1998).
Os sistemas de transporte primários de prótons da membrana plasmática e
vacuolar são considerados importantes marcadores moleculares em estudos
sobre mudanças da membrana associadas a vários estresses ambientais
(Matsumoto et al., 1992; Gaxiola et al., 2002).
O H
+
-ATPase constitui o principal sistema de transporte primário da
membrana plasmática (H
+
-ATPase do tipo P), sendo responsável pela
energização dos sistemas secundários de transporte. No tonoplasto, encontram-
se duas diferentes bombas de prótons, uma H
+
-ATPase (tipo V) e uma H
+
-
pirofosfatase (H
+
-PPase) (Rea et al., 1992). Estas bombas são capazes de gerar
um gradiente eletroquímico de prótons no tonoplasto acidificando o vacúolo e
fornecendo energia para o transporte de íons inorgânicos, açúcares e ácidos
orgânicos (Rea e Sanders, 1987). Esse gradiente de H
+
gerado através da
membrana vacuolar pode também impulsionar a síntese de ATP e PPi, devido à
capacidade de reversibilidade dos ciclos catalíticos dessas enzimas (Façanha e
de Meis, 1998).
A exclusão de sal para o apoplasto e o acúmulo de sal no vacúolo das
plantas requer uma ação coordenada das proteínas de transporte presentes na
10
membrana plasmática e no tonoplasto (Binzel e Ratajczak, 2002). Os
transportadores secundários, como Na
+
/H
+
, são dependentes da energização das
membranas promovida por transportadores primários de H
+
(ATPases e PPases).
Esse transporte pode servir como fonte de energia para a retirada do Na
+
do
citoplasma via antiporte (Serrano e Rodriguez-Navarro, 2001).
Alguns trabalhos relataram o papel de algumas destas bombas durante o
estresse salino. Binzel e Dunlap (1995) demonstrou que o nível de RNA
mensageiro que codifica as H
+
-ATPases das membranas plasmática e vacuolar é
aumentado em resposta ao estresse salino em tomateiro. Estas enzimas foram
moduladas de forma diferenciada, onde no mesmo tecido, no mesmo tempo, os
transcritos para a H
+
-ATPase de membrana continuavam a aumentar enquanto
que para a V-ATPase começava-se a retornar para os níveis anteriores à
aplicação do sal.
A halófita Mesembryanthemum. crystallinum crescida sob elevadas
concentrações de NaCl apresentou atividade do antiporte Na
+
/H
+
associada ao
transporte de H
+
dependente da atividade de hidrólise de ATP promovida pela V-
ATPase em folhas (Barkla et al., 1995). Durante o estresse salino, osmótico, de
frio e de calor, 12 subunidades da V-ATPase tiveram o nível de seus transcritos
alterados em folhas e raízes de M. crystallinum (Kluge et al., 2003). A V-ATPase
possui uma estrutura complexa formada por várias subunidades reguladas por
diferentes genes (Sze et al.,1992; Ratajczack, 2000).
O estímulo da atividade hidrolítica e do transporte de H
+
tanto da H
+
-
ATPase de membrana quanto da de vacúolo por Na
+
são observados em caule de
algumas plantas halófitas (Ayala et al., 1996). Tsiantis et al. (1996) demonstraram
que a subunidade c da V-ATPase em raízes e folhas de M. crystallinum tem sua
expressão aumentada na presença de sal e ABA. Segundo esses autores, o
aumento da atividade da V-ATPase observada no trabalho de Barkla et al. (1995)
poderia ser explicado pela regulação da expressão da subunidade c dessa
enzima. Enquanto há o aumento do nível de transcritos da subunidade c da V-
ATPase mediado por ABA em M. crystallinum, Binzel e Dunlap (1995) observaram
que o aumento da subunidade a durante o estresse salino não parece ser
mediado por ABA em tomateiro.
A H
+
-PPase também tem um papel importante durante o estresse salino.
Gaxiola et al., (2001) relataram que a super-expressão do gene AVP1 que
11
codifica a H
+
-PPase resultou em tolerância ao estresse salino e hídrico em
plantas de Arabidopsis. A resistência foi atribuída à retenção de íons, que
manteve o equlibrio iônico celular. O gene AVP1 também tem sido relacionado
com o desenvolvimento radicular e organogênese, associado à facilitação do fluxo
de auxina e regulação da H
+
-ATPase de membrana (Li et al., 2005). Em tomateiro
(Lycopersicon esculentum) a expressão aumentada de AVP1 gerou aumento da
resistência à seca, elevando o crescimento radicular, a absorção de água, o
potencial hídrico foliar e a sobrevivência das plantas (Park et al., 2005). A
expressão em paralelo do gene AVP1 e do antiporte vacuolar Na
+
/H
+
(SsNHX1)
em arroz revelou uma tolerância à salinidade de maneira mais pronunciada do
que a expressão do antiporte isoladamente (Zhao et al., 2006).
2.1.2.2 Ajustamento osmótico
Em condições normais a célula acumula compostos de baixo peso
molecular, os osmólitos, que não interferem nas reações bioquímicas habituais
das plantas, para adequar o balanço iônico nos vacúolos (Chaves e Oliveira,
2004). Em condições de estresse, estas substâncias mantêm o balanço osmótico
sustentando a integridade de diversos elementos como membranas celulares e
enzimas (Chaves e Oliveira, 2004). Compostos nitrogenados, polióis e açúcares
são alguns exemplos de osmólitos (Chaves e Oliveira, 2004; Bartels e Sunkar,
2005).
No ajuste osmótico, os osmólitos facilitam a retenção de água no
citoplasma e permitem o seqüestro de Na
+
para o vacúolo (Bartels e Sunkar; Apse
et al, 2000). Por serem aptos em formar pontes de hidrogênio, estes compostos
protegem as estruturas celulares através da sua interação com membranas,
complexos protéicos ou enzimas evitando os danos gerados pelo estresse iônico
e osmótico (Chaves e Oliveira, 2004; Bartels e Sunkar, 2005).
O acúmulo de compostos nitrogenados em plantas é comumente
relacionado à tolerância a salinidade. Existem alguns estudos sobre o acúmulo de
aminoácidos livres e outros compostos nitrogenados sob estresse salino (Bartels
e Sunkar, 2005). O acúmulo de compostos como aminoácidos, amidas, proteínas
e poliaminas é bem relatado em algumas espécies. Os aumentos do conteúdo de
glicina-betaína e prolina também ocorrem durante condições de estresse. Estes
12
compostos atuam no ajuste osmótico, proteção de macromoléculas celulares,
estocagem de nutrientes, manutenção do pH celular, desintoxicação de células e
minimização dos efeitos das espécies reativas de oxigênio (Bartels e Sunkar,
2005).
Os polióis são alcoóis polihídricos (Clark et al., 2003), que apresentam um
número considerável de cadeias de carbono produzidas a partir da assimilação de
CO
2
, e que executam algumas funções no metabolismo da planta, tais como, a
formação de chaperonas, a osmorregulação e minimização do efeito de espécies
reativas de oxigênio (Smirnoff e Cumbes, 1989). Existem formas de polióis
acíclicas (manitol, glicerol e sorbitol) e cíclicas (pinitol e ononitol). Em geral, os
polióis se acumulam no citoplasma de algumas halófitas, evitando distúrbios
osmóticos causados pela elevada concentração de íons (Clark et al., 2003). Estes
polióis podem ainda ser úteis no estoque do carbono sob condições ambientais
adversas (Bartels e Sunkar, 2005). O manitol é um álcool polihídrico, que atua
como osmólito para minimizar o efeito da salinidade, sendo este fato comprovado
em estudos relacionando o acúmulo deste álcool com a tolerância à salinidade
(Chaves e Oliveira, 2004). O pinitol é outro álcool polihídrico, que é sintetizado a
partir de mio-inositol, tendo papel importante no ajuste osmótico intracelular entre
o vacúolo e o citoplasma, além de atuar como redutor de espécies reativas de
oxigênio. O acúmulo de pinitol tem sido registrado em plantas que habitam
regiões costeiras como, Honkenya peploides e Sesbania aculeata, quando
expostas à salinização (Chaves e Oliveira, 2004).
Dentre os vários compostos osmóticos orgânicos, os açúcares apresentam
mais de 50 % do potencial osmótico total em glicófitas submetidas à salinização.
Açúcares como glicose, frutose e sacarose atuam na osmoproteção, ajuste
osmótico e estoque de carbono (Chaves e Oliveira, 2004; Bartels e Sunkar, 2005).
Os açúcares atuam ainda como sinalizadores celulares interagindo com outras
moléculas, como hormônios, modulando o metabolismo celular durante o
estresse. O metabolismo do carbono é afetado pela concentração de açúcares. O
aumento de sacarose na folha é correlacionado à inibição da fotossíntese por
feedback, sendo este um dos fatores que explicam a redução da taxa
fotossintética durante o estresse salino (Chaves et al., 2008). A síntese de amido
tende a diminuir durante o estresse abiótico, sendo acelerado o processo de
quebra deste para liberação de sacarose para ajustamento osmótico e como fonte
13
de energia. A síntese e acúmulo de sacarose são determinados pelo balanço
entre a atividade da enzima, sacarose sintase, e da enzima invertase que
metaboliza a sacarose em frutose e glicose. Os açúcares ainda estão envolvidos
no balanço de espécies reativas de oxigênio e em respostas ao estresse oxidativo
em plantas (Couée et al, 2006). Um grande número de genes responsivos a
estresses é induzido por glicose, indicando a participação de açúcares nas
respostas a estresses ambientais (Camoni et al, 2006; Mito et al, 1996; Rolland et
al, 2006).
2.1.2.3 Redução do estresse oxidativo
Uma das conseqüências do estresse salino é o aumento na produção de
espécies reativas de oxigênio (EROs). Os danos causados pelas EROs podem
ser minimizados por duas formas: (1) por meio de enzimas de varredura de
radicais livres como superóxido desmutase (SOD), catalase (CAT), a guaiacol
peroxidase (GPX), e enzimas do ciclo ascorbato/glutationa (Asada, 1992; Chaves
e Oliveira, 2004) e; (2) um sistema não-enzimático composto por moléculas
antioxidantes, como ácido ascórbico, glutationa, carotenóides, tocoferol (Mittler,
2002) e compostos fenólicos (Sakihama et al., 2002).
A superóxido desmutase (SOD) participa de uma via crucial na defesa
antioxidativa (Scandalios, 1993), pois catalisa a dismutação de O
2
-
para H
2
O
2
. A
enzima SOD possui três isoformas: a Cu/Zn-SOD que, em geral, é inativada por
KCN e H
2
O
2
, ocorrendo geralmente no citoplasma e no cloroplasto; a Fe-SOD,
inativada por H
2
O
2
, e resistente a KCN, ocorrendo no cloroplasto; e a Mn-SOD,
resistente a H
2
O
2
e KCN, e presente nas mitocôndrias (Bowler et al., 1992; Del
Rio et al., 1998). Vários trabalhos têm relatado aumento nas concentrações de
superóxido e, conseqüentemente, da atividade SOD sobre diferentes condições
de estresse (Jiang e Zhang, 2001).
A enzima catalase (CAT) realiza a remoção de H
2
O
2
(Foyer et al., 1994).
Estas são encontradas no citoplasma, mitocôndria e peroxissomos de células
animais, vegetais e microrganismos, atuando como reguladores dos níveis de
H
2
O
2
, os quais são decompostos em H
2
O e O
2
(Williamson e Scandalios, 1992;
Guan e Scandalios, 1998).
14
As peroxidases, entre elas a ascorbato peroxidase e a guaiacol peroxidase
(GPX), são encontradas como várias isoformas em plantas e estão localizadas
em diferentes compartimentos (principalmente na parede celular e no vacúolo).
Estas decompõem H
2
O
2
por oxidação de co-substratos, tais como, compostos
fénolicos e outros metabólitos antioxidantes, como o ácido ascórbico.
As plantas, quando sujeitas a estresses ambientais têm o balanço entre a
produção de EROs e atividade de antioxidantes aumentada, resultando em
prejuízos oxidativos (Sminorff, 1993). Plantas com elevados níveis de
antioxidantes, constitutivos e induzidos, têm mostrado maior resistência ao
estresse oxidativo. De um modo geral, a atividade das enzimas antioxidativas,
como a catalase, superóxido desmutase, guaiacol peroxidase, glutationa redutase
e ascorbato peroxidase é aumentada durante o estresse salino (Williamson e
Scandalios, 1992; Guan e Scandalios, 1998).
2.1.2.4- Balanço entre absorção e dissipação de luz: A fluorescência da clorofila a
A medição da fluorescência da clorofila a é um método não-destrutivo e
muito sensível para estimar o funcionamento do fotossistema II (FS II). A
estimativa do desempenho funcional do FSII pode ser monitorada pelas
características da fluorescência, como a fluorescência inicial (F
0
), a fluorescência
máxima (F
m
), a fluorescência variável (F
v
), o redimento quântico máximo potencial
do FSII quando os centros de reação estão oxidados (F
v
/F
m
), o rendimento
quântico efetivo (Fv’/Fm’), os “quenchings” fotoquímico (qP) e não-fotoquímico
(qN e NPQ) e, finalmente, a taxa relativa de transporte de elétrons (ETR) (Krause
e Weiss, 1991). Esse método pode ser utilizado para determinar os efeitos de
diversos estresses no funcionamento do aparelho fotossintético (Krause e Weiss,
1991; van Kooten e Snel, 1900).
A fluorescência inicial (F
0
)
indica a intensidade da fluorescência com todos
os centros de reação do FSII “abertos”. Ele é obtido após deixar a folha no escuro
por um período mínimo de 30 minutos. Com o pulso de luz, ocorre o “fechamento”
do centro de reação pela redução do receptor de elétrons, plastoquinona A (Q
A
),
resultando no aumento da emissão da fluorescência, desde F
0
até um pico, a
fluorescência máxima (F
m
). O F
m
representa a completa redução de Q
A
(van
Kooten e Snell, 1990). A diferença entre F
m
e F
0
é denominada fluorescência
15
variável (F
v
). A taxa F
v
/F
m
, calculada a partir dos valores obtidos (F
v
/F
m
= F
m
-
F
0
/F
m
), é uma característica importante para avaliar o estado do aparelho
fotossintético. A razão F
v
/F
m
repersenta o rendimento quântico máximo potencial
do FSII que mede o potencial de dissipação fotoquímica de energia e é um
excelente indicador do efeito do estresse ambiental. Esse valor mostra-se
proporcional à eficiência fotoquímica máxima do FSII, bem como tem correlação
com a taxa fotossintética líquida em folhas intactas. Um baixo valor indica que os
centros de reação do FSII podem estar danificados. Os valores esperados para a
relação F
v
/F
m
, na ausência de estresse, estão entre 0,75 e 0,85 (Bolhàr-
Nordenkampf et al., 1989).
Durante circunstâncias normais ou sobre estresse o balanço entre
absorção e utilização da energia é necessário de forma a minimizar danos
causados por foto-oxidação. Uma das formas de analisar danos no aparato
fotossintético durante o estresse é analisar os “quenchings”. Os “quenchings” são
dissipadores de energia e são representados de duas formas: o quenching
fotoquímico (qP) e o não-fotoquímico que pode ser expresso com qN ou NPQ
(Krause e Weiss, 1991; van Kooten e Snel, 1900). O qP representa a energia
utilizada para processos fotoquímicos, já o qN e NPQ representam a dissipação
do excesso de luz na forma de calor, realizada pelo ciclo das xantofilas. A
dissipação do excesso de luminosidade regula e protege a fotossíntese durante
estresses ambientais, quando a absorção excede à capacidade da utilização da
luz (Bolhàr-Nordenkampf et al., 1989; Krause e Weis, 1991).
O qP é calculado a partir pela fórmula: qP= (Fm-Ft) /(Fm- Fo), onde Ft
corresponde à fluorescência quando os processos de transporte de elétrons e as
reações bioquímicas de redução do carbono acopladas estão equilibrados. Para
calcular o qN é necessário a utilização do F
0
, ou seja, leva-se em conta a
fluorescência que ocorre no FSII, conforme mostra a fórmula: qN= Fm – F
m’
/Fm –
F
0
. Já para o cálculo de NPQ não é utilizada a fluorescência inicial sendo
calculado por meio da fórmula: NPQ= Fm – F
m’
/ F
m’
. Tem sido mostrado que NPQ
é ótimo indicador da dissipação do excesso de energia luminosa, sendo um
parâmetro muito utilizado para determinação de danos causados pelo estresse
(Bolhàr-Nordenkampf et al., 1989; Krause e Weis, 1991),
O qP é igual a 1 quando todo o centro de reação está aberto, no estado
oxidado. Com a emissão de luz actínica suficientemente forte, o F
m
é atingido
16
aonde Q
A
tornar-se completamente reduzida e o qP é praticamente zero. Após a
aplicação de um novo pulso de luz suficientemente forte, o valor de F
m
não mais
retorna ao valor máximo, mesmo com a aplicação de novos pulsos, provocando,
então, a redução seqüencial do qP e um aumento no qN. O aumento de qN pode
indicar um baixo consumo de ATP e baixa disponibilidade de NADPH para o ciclo
de Calvin, resultando em um aumento na energização da membrana tilacoidal. A
análise dos “quenchings” possibilita fazer inferências sobre danos no aparato
fotossintético e na assimilação de carbono (Bolhàr-Nordenkampf et al., 1989;
Krause e Weis, 1991).
2.2- Sinalização: ABA, Óxido nítrico
2.2.1 Ácido Abscísico (ABA)
O ácido abscísico (ABA) está envolvido em vias de transdução de sinais
que regulam a expressão de muitos genes durante estádios específicos de
desenvolvimento ou em condições de estresse ambiental (Nambara et al., 1998;
Shinozaki e Yamaguchi-Schinozaki, 1997; Siddiqui et al., 1998).
O ABA participa de diversos processos fisiológicos nas plantas, incluindo
estimulação de movimentos estomáticos, acúmulo de prolina e inibição de
crescimento da parte aérea (Bartels e Sunkar, 2005). Este hormônio parece
suavizar o efeito inibitório de NaCl sobre a fotossíntese e a translocação de
assimilados (Chaves et al., 2008). É um dos responsáveis pela alteração de
genes induzidos pelo estresse salino, sendo considerado o hormônio mais
intimamente ligado aos estresses (Siddiqui et al., 1998).
Este fitormônio é um sesquiterpeno sintetizado a partir da oxidação de
zeaxantina e anteroxantina à violaxantina pela enzima zeanxantina epoxidase
(ZEP), etapa que ocorre nos plastídios. A violaxantina é convertida em 9-cis
epoxicarotenoide (9-cis noxantina) e oxidada pela dioxigenase 9-cis-
epoxicarotenoide (NCED) à xantonina. A xantoxina é convertida a aldeído
abscísico pela xantoxina oxidase que é oxidada para formação do ABA pela
enzima aldeído abscísico oxigenase (AAO) no citosol (Taylor et al., 2000; Xiong, e
Zhu, 2003). O esquema da síntese de ABA está representado na figura 1.
17
Xantonina (C
15
)
ABA- Aldeído
Acido Abscísico
(ABA)
Proteínas ligadoras –Ca
+2
Cascata fosfoproteínas
Fatores de transcrição
Ca
+2
Durante o déficit osmótico, as concentrações de ABA aumentam em raízes
e folhas em conseqüência de fatores de transcrição que induzem o aumento da
expressão de vários genes relacionados à síntese de enzimas da rota de
produção do ABA como o gene que sintetiza NCED e AAO (Thompson et al.,
2000). Durante o estresse osmótico a biossíntese de ABA é induzida pela perda
da turgescência, em raiz ou nas células guarda e o transporte é realizado pelo
xilema, da raiz para folhas, e floema, do local de síntese nas folhas para outras
regiões deste órgão (Davies e Zhang, 1991; Liang et al., 1996; Sauter et al.,
2002).
Figura 1: Rota Metabólica do ácido abscísico (esquema adaptado de Xiong e Zhu,
2003).
O ABA é um ácido fraco que se apresenta na forma não dissociada
(protonado) ABAH ou na forma inativa conjugada (ácido abscísico glicose éster)
(Sauter e Hartung 2000; Sauter et al., 2002). A forma protonada se difunde pela
membrana plasmática para o interior da célula deixando de estar disponível no
apoplasto para que ocorra o fechamento estomático, uma vez que o local de ação
do ABA localiza-se na superfície externa das células (Hartung, 1983). Durante o
Caroteno (C
40
)
Zeaxantina
Violaxantina
Neoxantina
plastídio
SRD
Estresse Osmótico
ZEP
NCED
Açúcar
AAO
NCED
AAO
ZEP
18
estresse osmótico, o pH da seiva do xilema torna-se mais alcalino favorecendo a
produção da forma dissociada do ABA que não consegue atravessar as
membranas, favorecendo, portanto a redução de sua entrada nas células e
acúmulo no apoplasto no qual mais células guarda são atigindas (Chaves et al.,
2008).
Este hormônio além de gerar respostas adaptativas ao estresse osmótico,
como a redução no fechamento estomático, é relatado como componente da via
de sinalização durante o estresse oxidativo, sendo responsável pela indução da
atividade e /ou aumento da expressão de genes que sintetizam algumas enzimas
antioxidantes (Jiang e Zhang, 2001; Jing e Zhang, 2003). Alguns autores relatam
que o ABA é responsável pelo aumento da concentração de H
2
O
2
(Guan e
Scandalios, 2000; Jing e Zhang, 2001) e O
2-
(Jing e Zhang, 2001) induzindo a
expressão de Cu, Zn- SOD (Sakamoto et al., 1995), Mn-SOD (Zhu e Scandalios,
1998; Bueno et al., 1998), CAT (Williamson e Scandalios, 1992; Guan e
Scandalios, 1998) e a atividade de SOD, CAT, guaiacol peroxidase (GPX),
ascorbato peroxidase (APX) e glutationa redutase (GR) (Anderson et al., 1994;
Bueno et al., 1998; Bellaire et al., 2000). Estudos prévios mostraram que o cálcio-
calmodolina (CaM), NADPH oxidase e H
2
O
2
são requeridos pelo ABA para induzir
o aumento da atividade de enzimas antioxidantes (Jiang e Zhang, 2001; Jiang e
Zhang , 2002; Jiang e Zhang, 2003; Hu et al., 2005; Hu et al., 2007; Zhang et al.,
2006).
2.2.2 Mutantes hormonais
As plantas mutantes são ferramentas essenciais para o estudo da
participação dos hormônios em rotas de sinalização. Estes modelos para estudos,
têm sido desenvolvidos há décadas e têm auxiliado a desvendar a ação hormonal
na regulação de processos fisiológicos.
2.2.2.1 Tomateiro mutante (sitiens)
O tomateiro sitiens consiste em uma planta mutante deficiente na produção
de ABA. Foi criado a partir de mutações pontuais produzidas por tratamento com
raios X, que afetam a síntese da enzima aldeído abscísico oxigenase (AAO). A
19
AAO catalisa a oxidação da cadeia lateral do ABA aldeído e fornece o grupo
carboxílico do ácido. A deficiência na oxidação do aldeído de ABA gera acúmulo
de 2-trans-ABA álcool ao invés de ABA (Parry et al., 1988).
As plantas mutantes na produção de ABA germinam precocemente e
possuem o desenvolvimento vegetal mais lento (Tal, 1966; Spollen et al., 2000;
Nagel et al., 1994). As folhas possuem tamanho reduzido e apresentam epinastia,
explicada pela alta concentração de etileno (Spollen et al., 2000; Sharp e
LeNoble, 2002).
O mutante sitiens possui uma quantidade maior de estômatos e estes
permanecem abertos mesmo no escuro ou após o tratamento com acetato de
fenilmercúrio, uma substância que causa em plantas normais o fechamento
estomático. Portanto, possuem alta condutância estomática e altas taxas de
transpiração por área foliar (Tal, 1966). O conteúdo relativo de água nas folhas, o
turgor celular e a condutância hidráulica são reduzidos em comparação a planta
silvestre (Tal, 1966; Nagel et al., 1994).
2.2.3 Óxido nítrico (ON)
O óxido nítrico (ON) foi descoberto por Joseph Priestley em 1772 e por dois
séculos esta substância foi considerada apenas como tóxica. Em 1980, Furchgott
e Zawadzki reportaram que uma substância seria responsável pelo relaxamento
dos músculos do endotélio, entretanto ainda não sabiam que substância promovia
tal efeito. Em 1987, Palmer e colaboradores sugeriram que esta substância seria
o ON produzido pela oxidação de L-arginina a L-citrulina. Em 1992, a Revista
Science nomeou o ON como “a molécula do ano” por sua importância biológica
(Koshland, 1992).
Robert F. Furchgott, Loius J. Ignarro e Ferid Murad receberam em 1998 o
premio Nobel em Fisiologia e Medicina pela descoberta do papel do ON como
molécula sinalizadora no sistema cardiovascular. Após as primeiras descobertas,
o ON tem sido identificado como molécula crucial em diversos processos
fisiológicos e metabólicos envolvidos com a ativação da síntese de GMPc, entre
eles, a manutenção da pressão arterial, atuando como vasodilatador, sendo
utilizado em medicamentos do controle da pressão arterial, na estimulação do
sistema imunológico, na regulação da transmissão neuronal, na expressão de
20
genes, no relaxamento muscular, nas sinalizações cerebrais que envolvem o
aprendizado e a memória, na morte celular (citotóxico) e na proteção celular
(citoprotetor) (Moncada et al., 1991; Lipton et al., 1993; Stamler, 1994).
Em seu estado puro, sob condições normais de temperatura e pressão, o
ON é um gás. Sua solubilidade é moderada em água, sendo muito mais solúvel
em solventes apolares, tais como hexano. Desta forma, quando presente em
sistemas biológicos, o ON tende a se concentrar em ambientes lipofílicos, como
membranas e domínios hidrofóbicos de proteínas. Possui um tempo de vida curto
nos sistemas biológicos que estão na ordem de 5 a 15 segundos (Lancaster,
1997). O ON é encontrado em três formas, o radical óxido nítrico (ON), o cátion
(ON
+
) e o anion (ON
-
) (Stamler et al., 1992; Wojtaszek, 2000).
O ON possui uma alta reatividade, especialmente com o oxigênio molecular
(O
2
) e o ânion superóxido (O
2
-
), podendo também complexar-se com metais de
transição, como o ferro. A reação com o O
2
-
em solução aquosa leva a formação
de peroxinitrito (ONO
2
-
), o qual, em pH neutro, é protonado rapidamente,
formando o ácido peroxinitroso (HONO
2
). Este, por sua vez, é instável e
decompõe-se espontaneamente em dióxido de nitrogênio, radical hidroxila e íons
nitrato. Embora o ON e o O
2
-
não sejam considerados oxidantes fortes, ONO
2
-
,
assim como as moléculas oriundas de sua decomposição, são oxidantes potentes
capazes de iniciar a peroxidação de lipídios, oxidando tióis ou lipídios solúveis
antioxidantes (Darley-Usmar et al., 1995).
O radical óxido nítrico (ON) vem emergindo como uma molécula
fundamental também no reino vegetal, atuando como um mensageiro biológico,
mediando os efeitos dos hormônios e de outras moléculas sinalizadoras
preliminares (Neill et al., 2003; Neill et al., 2008; Wilson et al., 2008). Foi relatado
que o ON participa da modulação de sinais de transdução em vias metabólicas de
células vegetais afetando os níveis de mensageiros secundários como o GMPc ,
ADPRc e Ca
+2
(Durner et al., 1998; Pagnussat et al., 2004).
Em animais, a óxido nítrico sintase (NOS) catalisa a formação de ON por
meio da oxidação da L-arginina em L-citrulina (Wang e Marsden, 1995).Três
classes de enzimas NOS foram identificadas em células de mamíferos, duas com
expressão constitutiva (eNOS, forma endotelial e nNOS, forma neuronal) e a
terceira a iNOS que é induzida por patógenos.
21
Nas plantas o ON é produzido por reações enzimáticas e não enzimáticas.
Uma das vias de síntese de ON nas plantas dependente da redutase do nitrato
(RN), por meio da redução de nitrito para ON usando NADPH como doador de
elétrons. Outra enzima responsável pela produção de ON, mas com pouca
relevância, é a nitrito redutase (Ni-NOR) (Desikan et al, 2002, Stöhr et al., 2001;
Rockel et al. 2002; Stöhr e Stremiau, 2006). Esta enzima é encontrada em
membrana plasmatica e utiliza o citocromo c como doador de elétrons. A AtNOS1
é uma enzima produtora de ON recentemente descoberta em Arabidopsis. Possui
seqüência de aminoácidos similar à existente no caramujo Helix pomata (Guo et
al., 2003), entretanto, não foi observado homologia entre esta proteína e as
encontradas em mamíferos. A sua atividade é dependente de NADPH e Ca
+2
semelhante a eNOS e a nNOS, não havendo regulação em nível transcricional e
sim pós-transcricional mediada pelo Ca
+2
(Guo et al., 2003). O termo NOS tem
sido substitido por NOA, já que esta enzima parece ser associada à produção de
ON e não está diretamente ligada à sua produção (Crawford et al., 2006).
O ON pode também ser produzido por reações não enzimáticas, como a
redução de nitrito no apoplasto por acidificação do pH em resposta à giberelina e
ao ABA ou, por meio de reação química na presença de carotenóides e luz
(Bethke et al., 2004; Stöhr e Ullrich, 2002).
A molécula de ON tem-se revelado capaz de influenciar vários processos
em vegetais como crescimento de raízes (Gouvêa et al., 1997; Correa-Aragunde,
et al., 2004), germinação de sementes (Beligni e Lamattina, 2000),
fotomorfogênese (Pagnussat et al., 2003), lignificação de parede celular (Ferrer e
Ros Barceló, 1999), senescência (Magalhães et al., 2000), movimento de
estômatos (Neill et al., 2002; Garcia-Mata et al., 2003), via de sinalização por
citocinas (Scherer e Holk, 2000; Tun et al., 2001), aumento da disponibilidade de
ferro (Graziano et al., 2002), acúmulo de ferritina mediado por ferro (Murgia et al.,
2002), morte celular (Pedroso et al., 2000), funcionalidade mitocondrial (Zottin et
al., 2002) e de cloroplastos (Takahashi e Yamasaki, 2002), sinalização durante
injúria (Orozco-Cárdenas e Ryan, 2002; Huang et al., 2004), defesa contra
patógenos (Noritake et al., 1996, Durner et al.,1997; Delledonne et al., 1998,
Delledonne et al., 2001, Yamamoto et al., 2003) e como sinalizador celular
durante estresse hídrico, salino e de calor (Garcia-Mata e Lamattina , 2001;
Zhang et al., 2006; Song et al., 2006).
22
O ON é relatado como mediador de respostas hormonais em particular
mediando efeitos de hormônios e moléculas envolvidas em estresses abióticos.
Recentemente, o ON foi relatado como indutor de tolerância ao déficit hídrico, por
atuar como mensageiro secundário de ABA durante o fechamento estomático, por
aumentar a síntese de proteínas LEA e induzir enzimas antioxidantes (Garcia-
Mata e Lamattina, 2001; Garcia Mata e Lamattina, 2002; Lamotte et al., 2004;
Lamote et al., 2006; Tian e Lei, 2006). Durante o fechamento estomático, foi
observado que o ON atua regulando canais de cálcio, K
+
e Cl
-
por intermédio de
GMPc e ADPRc e por nitrosilação de proteínas (Garcia-Mata e Lamattina, 2001;
Garcia-Mata e Lamattina, 2002; Lamotte et al., 2004; Lamote et al., 2006).
O papel do ON no fechamento estomático tem sido bastante discutido, e
conta com algumas respostas que direcionam a ação desse gás a algo próximo
da mimetização da ação do fitormônio ABA. O ABA pode alterar o fechamento
estomático devido ao aumento na concentração de Ca
2+
e alcalinização do
citoplasma e inibição da H
+
-ATPase, refletindo na inativação de canais de
absorção de K
+
, e ativação de canais de liberação de K
+
e ânions (Sokolovski et
al., 2005). De maneira interessante foi observado que, através de nitrosilação, o
ON bloqueia diretamente o canal de liberação de K
+
em células guarda
(Sokolovski e Blatt, 2004). Aparentemente, o fechamento estomático induzido
pelo ABA pode ser suprimido por inibidores da ação do ON, enquanto que
doadores de ON poderiam induzir o fechamento estomático mesmo na ausência
de ABA (Neill et al., 2002; Garcia-Mata e Lamattina, 2002). De fato parece que o
fechamento estomático é dependente do ON. Mas esse seria produzido via RN,
sendo dependente também de ABA e H
2
O
2
(Bright et al., 2006).
Alguns estudos sugerem que o ON participa da via de indução de enzimas
antioxidantes como SOD, CAT e APX induzida por ABA, entretanto, há estudos
que sugerem não haver indução de APX e CAT com o tratamento com ON
(Murgia et al., 2004). Zhang et al., (2007), relatam que o ABA induz a produção de
H
2
O
2
e que este é responsável pelo acréscimo de ON e indução das enzimas
antioxidantes. Entretanto, a interação e dependência de ABA para indução de
enzimas antioxidantes por ON é pouco relatada.
O ON tem sido relatado como indutor de tolerância em plantas ao estresse
induzido por NaCl e por calor (Zhang et al., 2007; Song et al., 2006). Zhao et al.,
(2004) observaram que o ON foi capaz de induzir a atividade e a expressão de
23
H
+
-ATPases do tipo P em calos de P. communis Trin., acarretando um aumento
da razão K
+
/Na
+
. Estudo semelhante foi realizado por Zhang et al., (2006), no qual
os autores sugerem que o ON aumenta a resistência ao sal pelo aumento do
transporte de H
+
, da atividade de V-ATPases, V-PPases e do antiporte Na
+
/H
+
em
folhas de milho. Recentemente, foi demonstrado que a atividade e a expressão da
P-ATPase, induzida por H
2
O
2
e mediada por NO, é uma das características
responsáveis pela resistência ao estresse salino (Zhang et al., 2007).
24
3- TRABALHOS
A MODULAÇÃO DE BOMBAS DE PRÓTONS E DE ENZIMAS
ANTIOXIDANTES EM RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO É MEDIADA POR
ÓXIDO NÍTRICO.
Mirella Pupo Santos
1
, Daniel Basílio Zandonadi
2
, Arnoldo Rocha Façanha
2
,
Ricardo Bressan-Smith
1
1
Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias (CCTA) Laboratório de Melhoramento Genético
Vegetal - LMGV, Setor de Fisiologia Vegetal.
2
UENF-, Centro de Biociências e
Biotecnologia- CBB, Laboratório de Biologia Celular e Tecidual. Av. Alberto
Lamego 2000, CEP 28013-620, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil.
Palavras-chave: óxido nítrico, bombas de prótons, estresse salino
25
Resumo
O óxido nítrico (ON) participa de vias de sinalização em plantas, sendo
considerado indutor de respostas de defesa a estresses abióticos. O presente
trabalho teve como objetivo verificar se a modulação de bombas de prótons e de
enzimas antioxidantes durante o estresse salino é mediada pelo ON. O
tratamento salino reduziu drasticamente a massa de raiz fresca em 38 %. Nas
plantas tratadas com NaCl+SNP a redução foi pequena. O número de raízes
laterais foi reduzido em cerca de 50 % pelo tratamento NaCl e aumentado em
quase 3 vezes pelo tratamento com SNP. O conteúdo de MDA aumentou com o
tratamento salino, já o tratamento salino feito em conjunto ao SNP reduziu os
níveis de peroxidação lipídica. Os tratamentos com NaCl e SNP aumentaram a
atividade das enzimas antioxidantes CAT, APX e GPX. O ON foi detectado nos
tecidos usando-se a sonda fluorescente DAF-2 DA. O tratamento salino induziu a
produção de ON em raízes sendo possível observar aumento na fluorescência da
sonda DAF-2 DA. Os tratamentos com o doador de ON, bem como o tratamento
salino, aumentaram a atividade de hidrólise e transporte de prótons da P-ATPase,
V-ATPase e V-PPase. Estes dados sugerem que o estresse salino induz à
produção de ON e que esta molécula participa da indução de enzimas
antioxidantes e modula os sistemas primários de transporte de H
+
, auxiliando na
redução dos efeitos do estresse oxidativo causados pelo estresse salino.
Abstract
Regulation of proton pumps and antioxidant enzymes in response to salt
stress is mediated by nitric oxide
Nitric oxide (NO) participates of the plant signalling pathways and can promote the
defence responses to abiotic stresses. This study aimed to determine if the
modulation of proton pumps and antioxidant enzymes during salt stress is NO-
mediated. The salt treatment reduced dramatically the root and shoot development
(38 %), however, when this treatment was done in conjunction with the NO donor
(SNP), a reduction in the salt stress effects was observed. The number of lateral
roots was diminished more than 50 % by NaCl and increased around 3-fold by
26
SNP. The MDA content was high due salt treatment, but SNP alleviate the salt
effect reducing lipid peroxidation. Both SNP and NaCl increased the activity of
antioxidant enzymes CAT, APX and GPX. NO was detected using the fluorescent
probe DAF-2DA. The salt treatment enhanced NO production in roots as
measured by DAF-2DA. Both NO donor and salt treatment has increased the
proton transport and hydrolytic activity of P-ATPase, V-ATPase and V-PPase. The
data suggest that salt stress induced the NO production, antioxidant enzymes
activity and the H
+
pumps, reducing the oxidative stress generated during the salt
stress.
Key words: nitric oxide, proton pump; salt stress
Introdução
O gás óxido nítrico (ON) tem sido relatado como molécula de múltiplas
funções biológicas em plantas (Lamotte et al., 2006; Neill et al., 2008; Wilson et
al., 2008), incluindo a modulação do crescimento e desenvolvimento em plantas
(Durner et al., 1998; Correa-Aragunde et al., 2004), estimulação de germinação
de sementes (Beligni e Lamattina, 2000), e a participação no fechamento
estomático (Guarcia-Mata e Lamattina, 2002; Neill et al., 2008).
O ON é sintetizado em plantas pela enzima redutase do nitrato (RN) por
meio da redução de nitrito para ON (Stöhr et al., 2001; Rockel e Kaiser, 2002;
Stöhr e Stremiau 2006). Uma segunda via enzimática encontrada em plantas é
dependente da enzima ON sintase (NOS1), que catalisa a formação de ON por
meio da oxidação da L-arginina em L-citrulina (Guo et al., 2003). Entretanto,
devido a alguns questionamentos a respeito da relação direta da atividade desta
com a biossíntese de ON, a enzima foi renomeada como enzima associada à
biossíntese de ON (NOA1) (Crawford et al., 2006). A produção de ON também foi
observada em reações enzimáticas realizadas pela Ni-NOR de membrana
plasmática e por reações não enzimáticas, como a redução de nitrito no apoplasto
em baixo pH na presença de um agente redutor (Stöhr e Ullrich, 2002).
Alguns trabalhos mostram a atuação do ON como mediador de repostas a
estresses bióticos (Delledonne et al., 1998; Kumar and Klessing, 2000) e abióticos
(Garcia-Mata e Lamattina, 2001; Song et al., 2006). A participação desta molécula
27
como sinalizadora durante o estresse salino tem sido recentemente estudada
(Zhao et al., 2004; Zhang et al., 2006; Zhang et al., 2007; Zhao et al., 2007) e sua
atuação está na indução de respostas que geram tolerância à planta.
A tolerância ao estresse salino está relacionada principalmente ao controle
da aquisição e da alocação de íons na planta e ao controle do estresse oxidativo
gerado, além de outros mecanismos como o ajustamento osmótico (Nakamura et
al., 1992; De Costa et al., 2007; Kozlowski e Pallardy, 2002; Bartels e Sunkar,
2005). A exclusão de íons para o apoplasto ou alocação de íons no vacúolo é
energizado por bombas de prótons capazes de criar um gradiente eletroquímico
na membrana plasmática e no tonoplasto ativando transportadores secundários
de íons, como o Na
+
/H
+
(Rea e Sanders, 1987; Wang et al., 2001; Serrano e
Rodriguez-Navarro, 2001) mantendo o equilíbrio iônico e osmótico na célula
(Binzel e Ratajczak, 2002; Gévaudant et al., 2007; Janicka-Russak e Klobus,
2007).
A salinização do solo provoca alterações no metabolismo da planta,
incluindo redução do potencial hídrico, da assimilação de CO
2
e de nutrientes,
desbalanço iônico e toxidez (Bartels e Sunkar, 2005; Debouba et al., 2007). Como
resultado do estresse, há alterações na fotossíntese, intensificação de processos
oxidativos e inibição de diversas enzimas essenciais ao metabolismo da planta
(Zhao et al., 2007; Sekmen et al., 2007; Ghanem, et al., 2008; Debouba et al.,
2007). O estresse oxidativo é minimizado por compostos e enzimas antioxidantes
que degradam as espécies reativas de oxigênio geradas regulando a
concentração destas nos tecidos das plantas (Asada, 1992; Guan e Scandalios,
2000; Jiang e Zhang, 2001).
A modulação de bombas de prótons e enzimas antioxidantes tem sido
relacionada à tolerância ao estresse salino (Kluge et al., 2003; Ayala et al., 1996;
Gaxiola et al., 2001). Muitas moléculas são sugeridas como mensageiros
secundários durante a via de sinalização durante o estresse salino, atuando como
indutoras de tolerância, entretanto, pouco se conhece da participação do ON
neste processo. O presente trabalho teve como objetivo verificar a ação do ON
como molécula moduladora de bombas de prótons e de enzimas antioxidantes,
bem como estimar a produção de ON durante o estresse salino em raízes.
28
Material e Métodos
Material Vegetal e Tratamentos
Para realizar os experimentos foram utilizadas plantas de milho Uenf (Zea
mays L., var. Uenf 506-8). As sementes foram esterilizadas utilizando hipoclorito
de sódio 1 % por 15 minutos e depois mantidas em água destilada por um período
de duas horas. Logo após, foram acondicionadas em papel de germinação e
mantidas em câmara de germinação com fotoperíodo de 14h de dia e 10h de
escuro a 25 ˚C. Após 5 dias de germinação as plântulas foram transferidas para
frascos contendo solução de Hoagland com os tratamentos ou sem (controle). As
plantas foram previamente selecionadas com padrão de tamanho de cerca de 3-4
cm de comprimento da radícula antes na realização dos experimentos.
Foram realizados experimentos no qual foram coletadas plantas com um
dia ou 7 dias submetidas aos tratamentos. Os tratamentos foram: 200 µM de SNP
(doador de óxido nítrico), 150 mM de NaCl, 200 µM de SNP + 200 µM PTIO
(sequestrador de óxido nítrico), 150 mM de NaCl + 200 µM PTIO, 300 µM de
tungstato de sódio (inibidor da redutase do nitrato) e 200 µM L-Name.
Comprimento de raiz principal e número de raízes laterais
A arquitetura radicular foi avaliada por meio de medidas do comprimento da
raiz principal e número de raízes laterais com auxilio do software Image J. Foram
contadas somente raízes laterias de tamanho superior a 0,2 cm.
Determinação da massa fresca e seca
A massa da parte aérea (folhas e caule) e raízes frescas foram obtidas pela
pesagem em balança analítica. A massa da parte aérea (folhas e caule) e raízes
secas foram obtidas após secagem do material vegetal em estufa de circulação
forçada de ar, à temperatura de 70 ºC, por 72 horas e posterior determinação em
balança analítica.
29
Fluorescência da clorofila a
A cinética da emissão da fluorescência da clorofila a foi medida na terceira
folha (contando do ápice para a base da planta) completamente expandida,
utilizando-se um fluorímetro modulado Mini-Pam (Walz, Alemanha). As variáveis
foram obtidas seguindo-se uma curva de resposta à luz, a qual tinha oito períodos
consecutivos de iluminação com intensidade crescente, resultando nos seguintes
parâmetros: eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm), o “quenching” fotoquímico
(qP) e o “quenching” não-fotoquímico (qN) e a taxa relativa de transporte de
elétrons (ETR).
Determinação da Peroxidação Lipídica
A estimativa da peroxidação de lipídios das membranas de raízes e folhas
foi feita pela medida do conteúdo de malondialdeído (MDA), de acordo com
Dhindsa et al, (1981). Foram retiradas 5 gramas de tecido fresco e maceradas em
5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 0,1 % na presença de polivinil polipirrolidona
(PVPP) na proporção de 1:1,5. O homogenato foi centrifugado a 10.000 g por dez
minutos. 1 mL do sobrenadante foi retirado e adicionado a 4 mL de uma mistura
formada por TCA 20 % e TBA 0,5 % (ácido tiobarbitúrico). O extrato foi submetido
a 95
0
C por 30 minutos, seguindo-se de rápido resfriamento em gelo. A amostra
foi lida a 535 e 600 nm. A concentração de MDA foi determinada utilizando o
coeficiente de extinção de 155 mM. cm
-1
e expressa em nmol.mg
-1
de tecido
fresco.
Determinação da atividade da redutase do nitrato
Utilizou-se do método in vivo, descrito por Jaworski (1971) para
determinação da atividade da redutase do nitrato em folhas e raízes de milho.
Para tal, foram retirados discos foliares de 0,5 cm de diâmetro ou fragmentos de
raízes e pesados para obtenção de 200 mg de tecido fresco. Os discos foliares ou
os fragmentos de raízes foram colocados em meio de incubação, composto por
tampão fosfato (pH 7,5), KNO
3
, propanol e triton e submetidos ao vácuo por 3
minutos. As amostras foram levadas para o banho-maria a 30 ºC por 40 minutos
30
com agitação constante em total obscuridade (envolto com papel alumínio). A
atividade da enzima foi estimada pela quantidade de NO
2
–
liberada na solução de
incubação, medida em espectrofotômetro, a 540 nm, e expressa em µmoles de
NO
2
–
.h
-1
. g
-1
de matéria fresca.
Atividade de enzimas antioxidantes
Preparação de extrato enzimático
Após cada tratamento, 1 grama de raízes foi macerada em nitrogênio
líquido em gral de porcelana na presença de PVPP, na proporção de 5 % (p/v)
para a concentração final de tampão a ser utilizado. Após a obtenção de um pó
fino, foi acrescentado tampão na proporção de 1:4 (p/v). O tampão de extração
era composto por 100 mM de fosfato de potássio, 1 mM de EDTA e 3 mM de DTT
com pH ajustado para 7,5. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g por 30
minutos a 4 ºC. Em seguida, o sobrenadante coletado foi distribuído em tubos,
congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -70 ºC. A determinação do
conteúdo de proteína foi realizada pelo método de Bradford (1976).
Determinação da atividade da catalase (CAT)
A atividade da CAT foi determinada de acordo com Jiang e Zhang, (2001),
com algumas modificações. O ensaios foram realizados utilizando o tampão
fosfato 50 mM com pH 7,0 e concentração final de H
2
O
2
15 mM. A reação foi
iniciada com adição de 15 µL do extrato enzimático e as leituras de absorvância
foram realizadas em espectrofotômetro, monitorando a decomposição de H
2
O
2
a
240 nm (ε = 36mM. cm
-1
) durante 1 minuto, após o início da reação. O branco foi
composto de meio de reação livre de H
2
O
2
. A atividade da CAT foi expressa em
µmol min
-1
mg
-1
de proteína.
Determinação da atividade da guaiacol peroxidase (GPX).
A atividade da GPX foi determinada por mensuração da taxa de oxidação
de guaiacol a tetraguaicol por monitoramento do acréscimo, na absorvância a 470
31
nm (ε= 26,6 mM cm
-1
), de acordo com o método usado por Zhang e Kirkham
(1994), com algumas modificações. O meio de reação foi composto de 5 mM de
guaiacol, 1,2 mM de H
2
O
2
em 50 mM tampão fosfato de sódio pH 6,0. A reação foi
iniciada com adição de 10 µL de extrato enzimático. Foi utilizado como branco o
meio de reação livre de extrato enzimático. A atividade da GPX foi expressa em
µmol min
-1
mg
-1
de proteína.
Determinação da atividade da ascorbato peroxidase (APX)
A atividade da APX foi determinada de acordo com Jiang e Zhang, (2001).
Para isso, o meio de reação foi preparado com, 0,5 mM de ácido ascórbico, 1 mM
de EDTA, 1 mM de H
2
O
2
em 50mM de tampão fosfato de potássio pH 7,0. A
reação foi iniciada com a adição de 30 µL do extrato enzimático e as leituras de
decréscimo de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro a 290 nm (ε=
2,8 mM cm
-1
), monitorando a oxidação de ascorbato, tendo, como branco, o meio
de reação livre de H
2
O
2
e extrato enzimático. A atividade da APX foi expressa em
µmol min
-1
mg
-1
de proteína.
Determinação da atividade das bombas de H
+
Preparação da fração microssomal
As frações microssomais contendo vesículas de membrana plasmática e
de tonoplasto foram isoladas do material vegetal, através de centrifugação
diferencial, essencialmente como descrito por Giannini e Briskin (1987).
Após pesado, o material vegetal (2 g) foi homogeneizado em meio
tamponado em gral de porcelana, onde o volume de tampão utilizado foi 1,5
vezes a quantidade de material fresco. A maceração foi processada no gelo. O
tampão de extração é constituído de sacarose 250 mM, glicerol 10 %, Mops-BTP
100 mM, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 2 mM, 0,4 % de PVP-40T, 0,3 % BSA e
100 mM de KCl. (pH = 8,0). O homogenato foi filtrado em membrana Miracloth
(Calbiochem). O extrato foi centrifugado a 3000 g por 10 minutos a 4
o
C para a
remoção das células não rompidas e impurezas. O sobrenadante foi centrifugado
em ultracentrífuga a 10.000 x g por 10 minutos a 2
o
C para separação das
32
mitocôndrias (precipitado). O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 100.000
g por 40 minutos a 2
o
C para obtenção da fração microssomal (membrana de
vacúolo e membrana plasmática). Após centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e o pellet foi ressuspendido em meio de ressuspensão (volume de
500µL). O meio de ressuspensão foi constituído contendo glicerol 15 %, tris-HCl
20 mM (pH 7,6), 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT e PMSF 1 mM. Este material foi
armazenado a -70 ºC em diferentes alíquotas.
Hidrólise de ATP e PPi
As atividades ATPasicas foram determinadas colorimetricamente,
consistindo na determinação de Pi liberado durante a hidrólise do ATP, segundo o
método descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com modificações propostas por
Façanha e De Meis (1998). As reações foram iniciadas com a adição da proteína
e finalizadas através da adição de 5 % (m:v) de ácido tricloroacético gelado. O
meio de reação composto foi composto de 50 mM de Tris-BTP (pH 7,0), 100 mM
de KCl, 5 mM de MgSO
4
, 0,2 mM de Na
2
MoO
4
, 0,2 mM de Na
2
VO
4
-
e 1 mM de
ATP e 30 µg de proteína por mL. A revelação do Pi hidrolisado foi realizada
mediante a adição da mistura contendo 100 partes de molibidato de amônio 2 %
em H
2
SO
4
2 % e uma parte de ácido ascórbico 1 % (proporção de 100:1). Após 5-
10 minutos, realizou-se a leitura em leitor de microplaca Modelo µQuant, Bio Tek
instruments, NC, em comprimento de onda de 750 nm.
Transporte de H
+
O gradiente de prótons foi medido monitorando a taxa de decréscimo da
fluorescência (DF) da sonda fluorescente metacromática, 9-amino-6-cloro-2-
metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de comprimento de onda de 415
nm e a emissão captada a 485 nm, utilizando-se um espectrofluorímetro (modelo
F 4500, HITACHI, Japan). O meio de reação foi composto de 10 mM Mops-BTP
(pH 7.0), 100 mM KCl, 5 mM MgSO
4
, 250 mM sacarose, 2 mM ACMA, 1 mM de
ATP ou PPi e 30 µg de proteína/ml. Após atingir o equilíbrio entre efluxo e influxo
de prótons, utilizou-se 20 µL de FCCP ou NH
4
Cl para dissipar o gradiente
33
formado. A partir dos dados obtidos foi determinada a velocidade inicial (V
0
) e a
variação da fluorescência máxima (DF
máx
).
Detecção de ON
As imagens para detecção de ON foram realizadas com a sonda 4,5-
diaminofluoreceina diacetato (DAF-2 DA) em microscópio ótico de fluorescência
(Zeiss Axioplan com câmera digital Canon A640 acoplada). As seções
transversais da região de emissão de raízes laterais de raízes de milho tratadas
por 72h (ver tratamentos no tópico material vegetal e delineamento experimental)
foram mantidas em tampão 10 mM de Hepes-BTP pH 7,5 com 10 µM da sonda
DAF-2 DA por 40 minutos. As amostras foram lavadas 3 vezes com o tampão
Hepes-BTP e analisadas em seguida no microscópio (excitação: 488 nm,
emissão: 495-575 nm). As imagens foram analisadas pelo programa ImageJ
TM
.
Cortes transversais de raízes sem adição DAF-2 DA foram utilizadas como
controle negativo. As características de obtenção de imagens pela câmera foram
mantidas idênticas durante a aquisição de todas as imagens e não sofreram
nenhum tipo de processamento ou tratamento. Pelo menos 5 amostras foram
analisadas em 4 experimentos independentes.
Delineamento experimental e análises estatísticas
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC)
com 5 repetições por tratamento, sendo o experimento realizado três vezes. O
modelo matemático pode ser descrito como: Y
ij
= µ + t
i
+ e
ij
, onde: Y
ij
= resposta
experimental medida na unidade experimental j submetida ao tratamento i; µ =
média geral; t
i
= efeito relativo ao tratamento i; e
ij
= erro aleatório. Foi realizada a
análise de variância e feito o teste Dunnet (P < 0,05).
Resultados
Na Figura 1 pode-se observar que 150 mM de NaCl reduziu
aproximadamente 50 % o crescimento do eixo principal das raízes de milho.
Quando o sal foi adicionado em conjunto com o doador de ON (tratamento
34
NaCl+SNP) este preveniu a redução do comprimento do eixo principal causada
pela salinidade. O uso de tungstato (inibidor da redutase do nitrato) ou PTIO
(seqüestrador de ON) inibiu o crescimento radicular em 50 % e 40 %,
respectivamente.
O número de raízes laterais (RLs) foi reduzido por NaCl em 60 % e
aumentado em quase 3 vezes com o tratamento com SNP. O SNP reduziu o
efeito inibitório do sal na emissão de RLs (Figura 2). O tratamento com
NaCl+SNP+PTIO também reduziu a emissão de RLs, resultado possivelmente
atribuído ao PTIO, seqüestrador de ON .
O tratamento salino reduziu a massa de raiz fresca em quase 40 %. As
plantas tratadas com NaCl e SNP tiveram uma redução de 13 % não
apresentando diferença estatística das plantas controle (Figura 3 A). Em plantas
tratadas com NaCl foi observada a redução de 46 % da massa da parte aérea
fresca (Figura 3 B). Esta característica foi 36 % maior nas plantas tratadas com o
doador de ON. Em plantas que tiveram o estresse salino combinado ao SNP não
houve modificações significativas.
O tratamento com NaCl reduziu em 34 % a massa de raíz seca (Figura 4
A). O tratamento combinado NaCl e SNP minimizou em parte a redução da massa
seca (Figura 4 A). Plantas que foram tratadas com NaCl tiveram redução de 40 %
da massa da parte aérea seca. O uso de SNP em plantas que receberam NaCl
não impediu a redução da massa da parte aérea seca (Figura 4 B).
O conteúdo de MDA em raízes aumentou em 54 % no tratamento salino,
quando este tratamento foi feito em conjunto ao SNP o aumento foi de 14 %
(Figura 5).
A atividade da enzima CAT não foi alterada significativamente por nenhum
dos tratamentos. (Figura 6A). A enzima GPX apresentou aumento de sua
atividade nos tratamentos com NaCl, SNP e NaCl+SNP de 45 %, 65 % e 79 %,
respectivamente (Figura 6B). O NaCl aumentou em 72 % a atividade da APX. O
tratamento com SNP aumentou também a atividade desta enzima, cerca de 75 %.
Já em plantas submetidas a SNP+NaCl houve duplicação da atividade desta
enzima (Figura 6C).
A taxa relativa de transporte de elétrons (ETR) entre os fotossistemas PS2
e PS1 foi reduzida drasticamente pelo tratamento com NaCl durante todos os
pontos analisados, havendo redução de 73 % no último ponto da curva de luz
35
(Figura 7A). O ON reduziu significativamente a ETR, nos três últimos pontos de
luz, havendo redução de 23 % no último ponto. O tratamento com SNP em
conjunto ao NaCl minimizou a redução gerada pelo tratamento salino, havendo
redução de 57 % no ponto de saturação luminosa (Figura 7A).
Os valores de Fv/Fm não diferiram entre os tratamentos, entretanto, os
valores Fv’/Fm’ foram menores nas plantas tratadas com sal em toda curva de luz
utilizada, exibindo valor 73 % menor no último ponto da curva, quando comparado
ao controle (Figura 7B). O tratamento com SNP manteve-se semelhante ao
controle em quase todos os pontos da curva de luz, havendo redução de 55 % ao
final da curva. O tratamento SNP+PTIO também reduziu os valores de Fv’/Fm’,
cerca de 56 % no último ponto da curva de luz. O tratamento salino em
combinação ao ON manteve os valores de Fv’/Fm’ maiores que os encontrados
em plantas tratadas somente com sal, apesar de não manter este semelhante ao
controle no último ponto da curva de luz avaliado, com redução de 41 % (Figura
7B).
Os resultados obtidos para o “quenching” fotoquímico (qP) (Figura 8A)
mostram que os tratamentos praticamente não alteraram os valores de qP, com
exceção do tratamento salino, que reduziu o qP em 7 %, não sendo esta redução
significativa. Este mesmo tratamento aumentou os níveis de NPQ em 80 %
(Figura 8B). O tratamento com SNP aumentou o NPQ em 46 %, entretanto esta
variação não foi significativa quando comparada ao controle. O tratamento com
SNP+PTIO não diferiu significativamente do controle. O tratamento salino em
conjunto ao doador de ON apresentou valores de NPQ 53 % maiores que os
encontrados no controle (Figura 8B).
O estresse imposto causou redução não significativa de 20 % da atividade
da enzima RN em raízes (Figura 9 A). O inibidor desta enzima reduziu de forma
significativa a atividade desta enzima em raízes. A atividade da RN em folhas
apresentou resultados semelhantes aos encontrados em raízes, entretanto, houve
a redução de 40 % da atividade desta enzima pelo tratamento salino. O tungstato
inibiu em 54 % a atividade de RN em folhas (figura 9 B).
O tratamento com NaCl aumentou em 90 % a atividade hidrolítica de P-
ATPase (Figura 10 A). O ON aumentou cerca de 2 vezes a atividade hidrolítica
dessa enzima. O tratamento salino combinado ao SNP induziu a atividade
hidrolítica desta enzima em quase 3 vezes. O ΔF do transporte de prótons
36
(quantidade total de H
+
transportada) de P-ATPase foi induzido 5 vezes pelo
tratamento salino e 43 % por SNP. O tratamento salino+SNP aumentou o ΔF em
6 vezes. O estresse salino e o tratamento com SNP aumentaram em 2 vezes e 90
%, respectivamente a V
0
do transporte de prótons. O tratamento de NaCl+SNP foi
2,5 vezes maior que o controle.
A atividade hidrolítica de V-ATPase aumentou 94 % com tratamento salino.
O SNP aumentou 70 % da atividade hidrolítica desta enzima. O tratamento com
NaCl+SNP aumentou em 2 vezes a atividade da V-ATPase. O ΔF do transporte
de prótons realizado por esta enzima foi 4 vezes maior no tratamento com NaCl e
70 % maior com o tratamento SNP. O tratamento com SNP e PTIO foi semelhante
ao controle. O maior valor de ΔF foi no tratamento NaCl+SNP, com incremento de
4,5 vezes. A V
0
(velocidade inicial de transporte de H
+
) com tratamento salino,
SNP e NaCl+SNP foi 3, 2 e 4 vezes maior, respectivamente.
Os tratamentos com NaCl ou SNP aumentaram a atividade hidrolítica de V-
PPase em 32 % e 59 %. O tratamento com ambos, NaCl+SNP, aumentou a
atividade em 90 %. O ΔF do transporte de prótons de PPase foi induzido pelo
tratamento salino e por SNP, 2 vezes e 65 %, respectivamente. O NaCl+SNP
aumentou o ΔF em 2,3 vezes. O estresse salino e o tratamento com SNP
aumentaram em 2 vezes e 90 %, respectivamente a V
0
do transporte de prótons.
A V
0
do tratamento foi cerca de 2 vezes superior ao controle.
Para determinação da presença de ON foi utilizada uma sonda específica
que detecta a presença deste na célula (DAF-2 DA). Pode-se observar na figura
11 que o estresse salino induziu significativamente a produção de ON nas pontas
de raízes de milho, cerca de 25 %. O tratamento com tungstato, inibidor da RN,
uma das enzimas responsáveis pela produção de ON, resultou na redução em 15
% da fluorescência. O L-Name, outro inibidor da síntese de ON, entretanto via
enzima ATNOA1, resultou na redução de 17 % da fluorescência. O seqüestrador
de ON, PTIO reduziu a fluorescência em 15 %.
Discussão
A inibição do crescimento radicular e da parte aérea durante o estresse
salino é muito bem documentada em muitas espécies incluindo o milho (Fortmeier
e Schubert, 1995; Zorb et al., 2005; Munns, 2002). O desenvolvimento adequado
37
de um sistema radicular é fundamental para a sobrevivência, especialmente em
ambientes inóspitos ao crescimento (Deak e Malamy, 2005).
Os resultados mostram que o estresse salino reduziu de forma
considerável o comprimento da raiz principal (Fig. 1), sendo isto atribuído à
modificação de fatores como turgescência das células, o balanço hormonal e de
nutrientes, fatores afetados durante o estresse salino (Spollen et al., 2000;
Ghanem et al., 2008; Fukaki e Tasaka, 2009; De Costa et al., 2007; Debouba et
al., 2007).
Houve redução da massa de raízes e parte aérea fresca e seca (Fig. 3 e 4),
conseqüência provável da redução do conteúdo de água, afetando desta forma a
turgescência celular e o crescimento. Os resultados mostram que a redução na
massa fresca e seca foi mais pronunciada na parte aérea semelhante aos dados
da literatura que sugerem que as raízes parecem suportar melhor a salinidade
que a parte aérea, fenômeno este que pode estar associado a um ajustamento
osmótico mais rápido e a uma perda de turgor mais lenta das raízes, quando
comparadas com a parte aérea. Por ocorrer mais lentamente o ajuste osmótico
nas folhas, há uma diminuição ou a parada da expansão das paredes, resultando
na inibição do crescimento mais pronunciado da parte aérea (Jia et al., 2002;
Hsiao e Xu, 2000).
O tratamento com o doador de ON minimizou os efeitos do estresse salino
em raíz e parte aérea mantendo o comprimento da raiz principal e a massa seca e
fresca próximos ao controle (Fig. 1, 2 e 3). Este efeito do ON é atribuído à
capacidade de manutenção do conteúdo relativo de água por meio de
ajustamento osmótico induzido por bombas de prótons e por indução de
sinalizadores secundários com GMPc, canais de cálcio e MAPK relacionados a
respostas ao estresse (Zhang et al., 2006; Neill et al., 2003; Durner et al., 1998,
Lamote et al., 2006).
O estresse salino afeta também o metabolismo do nitrogênio reduzindo a
captação de nitrato e assimilação de amônia (Debouba et al., 2006 a; Debouba et
al., 2007; Chandra et al., 2001). A RN é uma enzima chave na assimilação do
nitrogênio, pois participa da primeira etapa de redução do NO
-
3
a NO
-
2
. Durante o
estresse salino pode-se observar a redução da atividade desta enzima,
principalmente em folhas (Fig. 9 A e 9 B). A redução da atividade da RN pela
salinidade assim como de enzimas como a glutamina e glutamato sintase,
38
enzimas responsáveis pela conversão da amônia a glutamina e glutamato,
respectivamente, leva ao decréscimo no crescimento e desenvolvimento de raízes
e da parte aérea (Debouba et al., 2006a; Debouba et al., 2006b; Debouba et al.,
2007). O tungstato, inibidor da RN, reduziu o crescimento da raiz principal, e a
massa seca de raiz e parte aérea confirmando a relação desta enzima com o
crescimento vegetal, possivelmente em função da restrição na redução de nitrato,
ocasionando diminuição do suplemento de nitrogênio para planta (Fig. 1).
Além da redução da atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de
nitrogênio, a salinidade afeta o balanço hormonal principalmente entre ABA e
auxina resultando em alterações do desenvolvimento radicular (Binzel e Dunlap,
1995; Ghanem et al., 2008). Durante o estresse salino há aumento da produção e
acúmulo de ABA e redução de auxina nas raízes. Este fato pode ser atribuído à
atividade da enzima aldeído oxidase (AO), responsável pela produção de ABA por
meio da oxidação de ABA aldeído e pela produção de auxina em uma via
alternativa pouco relatada por meio da oxidação de 3-indol-acetaldeído (Koshiba
et al., 1996). A salinidade induz a produção de ABA, pois aumenta a atividade de
AO em raízes, entretanto parece reduzir a atividade desta na parte aérea
(Omarov et al., 1998; De Costa et al., 2007). A redução das concentrações de
auxinas em raízes durante o estresse salino também é atribuída ao decréscimo
na atividade de outras proteínas sintetizadoras e transportadoras e a redução da
condutividade hidráulica (Deak e Malamy, 2005).
A salinidade reduziu a emissão de RLs (Fig. 2), sendo este fato atribuído,
por alguns autores, ao balanço do efeito da auxina e de ABA na emissão de RLs
durante o estresse osmótico (Deak e Malamy, 2005). Os hormônios auxina e ABA
interagem na sinalização para mudanças requeridas em condições de estresse.
Altas concentrações de sal inibem os níveis de auxina nas raízes, entretanto
aumentam as concentrações de ABA (Dunlap e Binzel, 1996; Bartels e Sunkar,
2005). A repressão do desenvolvimento de RLs pelo efeito do estresse osmótico é
mediada pelo ABA, já a emissão é estimulada por auxina (Deak e Malamy, 2005).
O radical ON atua como um mensageiro biológico, mediando os efeitos dos
hormônios e de outras moléculas sinalizadoras preliminares (Neill et al., 2003).
Foi relatado que o ON participa da modulação de sinais de transdução em vias
metabólicas de células vegetais afetando os níveis de mensageiros secundários
39
como o GMPc , ADPRc e Ca
+2
(Durner et al., 1998; Pagnussat et al., 2003
Pagnussat et al., 2004).
O tratamento com ON reduziu os efeitos causados pelo sal na emissão de
raízes laterais (Fig. 2). Este fato pode estar associado, entre outros fatores, à
atuação do ON promovendo o crescimento radicular (Gouvêa et al., 1997). O
aumento na concentração de ON parece estar envolvido na via de sinalização de
auxina, aumentando os níveis de GMPc e cálcio e ativando proteínas kinases
envolvidas no desenvolvimento de raízes adventícias e raízes laterais (Pagnussat
et al., 2002; Pagnussat et al., 2003; Lanteri et al., 2006; Correa-Aragunde et al.,
2004).
Os estresses ambientais em plantas refletem em maior geração de EROs.
Danos oxidativos gerados por estresse salino têm sido freqüentemente relatados
em raízes expostas a altas concentrações de sal (Hernandéz e Almansa et al.,
2001; Sekmen et al., 2007). A peroxidação lipídica consiste na oxidação de
lipídeos pelo H
2
O
2
, sendo freqüentemente usada com um indicador de estresse
oxidativo em plantas submetidas à salinidade (Sekmen et al., 2007). Os
resultados do presente trabalho mostram que o sal aumentou os níveis de
peroxidação lipídica (Fig. 5) e o SNP minimizou estes efeitos talvez por ser capaz
de induzir enzimas antioxidantes (Fig. 6).
Muitos trabalhos têm indicado que a aquisição da tolerância ao estresse
salino pode ser conseqüência do controle eficiente do estresse oxidativo
(Hernández e Alamansa, 2002, Bartels e Sunkar, 2005; Sekmen et al., 2007). As
peroxidases são consideradas antioxidantes que protegem as células contra
danos causados pelo H
2
O
2
. Sua alta atividade tem sido associada com a
tolerância à salinidade (Bartels e Sunkar, 2005; Sekmen et al., 2007). A atividade
de GPX e APX foi aumentada durante o estresse salino, entretanto a atividade de
CAT não foi alterada (Fig. 6). O tratamento com doador de ON resultou
igualmente no aumento destas enzimas. O ON é relatado como indutor de
enzimas antioxidantes durante estresse por calor reduzindo o estresse oxidativo
(Song et al., 2006), e como mediador da sinalização dependente de ABA e
peróxido na ativação de MAPK envolvidas na cascata de sinalização de enzimas
antioxidantes (Zhang et al., 2006).
Dentre os efeitos do estresse imposto pelo NaCl está a alteração da
fotossíntese (Zhao et al., 2007). A energia capturada pela clorofila a pode ser
40
direcionada para fotoquímica, expressa por qP, emitida em fluorescência ou
convertida a calor (qN e NPQ). A dissipação por calor está associada ao ciclo das
xantofilas que protegem o aparato fotossintético contra o excesso de luz (Krause
e Weis, 1991; Muller et al., 2001). O qP não variou com os tratamentos (Fig. 8A),
entretanto, o NPQ aumentou durante o estresse salino, e no tratamento de
NaCl+SNP (Fig. 8 B). Durante o estresse salino, o estresse osmótico e iônico
gerado reduz a atividade de enzimas relacionadas à fotoquímica, resultando em
uma maior dissipação de energia, tendo, portanto explicados os valores de NPQ
acrescidos no tratamento salino.
O transporte de elétrons entre os fotossistemas é calculado pela equação
que inclui a eficiência efetiva do PSII e a radiação fotossinteticamente ativa. A
eficiência efetiva de PSII decresce com acréscimo da irradiação e mais elétrons
acumulam no aceptor no PSII, havendo um relativo acréscimo no quenching não
fotoquímico. O aumento do quenching não fotoquímico pode ser correlacionado
ao decréscimo na taxa relativa de transporte de elétrons entre os fotossistemas
(Ralph e Gademann, 2005). O tratamento com SNP e SNP+PTIO também reduziu
o ETR, mostrando que possivelmente outras moléculas além do ON geradas na
decomposição do SNP possuem efeitos na cadeia transportadora de elétrons. A
cadeia transportadora de elétrons cloroplastídica possui diversas proteínas
contendo metais de transição, que são moléculas alvo para ligação do ON
(Yamasaki et al., 1999; Takahashi e Yamasaki, 2002). Isto explica a redução do
transporte de elétrons encontrada com este tratamento. Os sítios de ação de ON
encontram-se no PSII, entre a QA e QB (Diner e Petrouleas, 1990) evitando que
ocorra a redução de QA, no resíduo de tirosina da proteína D2 (Sanakis et al.,
1997) e no complexo de oxidação da água (Schansker et al., 2002).
O ON foi relatado como inibidor da síntese de ATP durante a fosforização
oxidativa em animais (Brookes et al., 1999) e plantas (Yamasaki et al., 1999).
Entretanto, visto que a inibição é temporária e a atividade das enzimas
relacionadas é completamente restabelecida com a remoção do ON, a idéia de
que esta molécula seja apenas um inibidor da fotofosforilação ou mesmo da
fosforilação oxidativa tem sido questionada, sendo sugerido o termo regulador ou
modulador para esta molécula (Yamasaki et al., 1999; Shunichi e Yamasaki,
2002).
41
O rendimento quântico máximo (F
v
/F
m
) é usado como indicador do efeito
ambiental, pois mede o potencial de dissipação fotoquímica de energia, sendo
proporcional à eficiência fotoquímica máxima do PSII. A curva de luz mostrou o
decréscimo nos valores de Fv’/Fm’ em plantas tratadas com NaCl (Fig. 7B).
Os acréscimos de NPQ encontrados no tratamento salino podem ser
correlacionados ao decréscimo de ETR (Fig. 7A). Resultados semelhantes foram
encontrados por Ghanem et al (2008), no qual plantas de tomate tiveram a razão
Fv’/Fm’ reduzida e o NPQ aumentado em função do estresse salino. O tratamento
com SNP manteve os valores de Fv’/Fm’ maiores nas plantas que foram tratadas
com sal, entretanto este tratamento reduziu este parâmetro em alguns pontos da
curva. Resultados semelhantes foram encontrados por Wodala et al (2008), no
qual observaram que o doador de ON livre de cianeto, GSNO, reduziu a taxa
Fv’/Fm’, sendo observado também a redução de qP durante o tratamento com
GSNO.
A inibição do crescimento radicular durante o estresse salino é explicada
por alguns autores como o desvio de energia do crescimento para a manutenção
do metabolismo e direcionando parte da energia para transporte e distribuição
iônica e síntese de solutos para osmorregulação (Bartels e Sunkar 2005; Chaves
et al., 2008).
Quando plantas são submetidas ao estresse salino, podem sobreviver e
crescer através de processos adaptativos como a compartimentalização do sal e
o transporte de íons para fora da célula. Assim, o controle do movimento de íons
através da membrana plasmática e do tonoplasto para manter uma baixa
concentração de Na
+
no citoplasma é essencial para a tolerância à salinidade
(Binzel e Ratajczak, 2002; Janicka-Russak e Klobus, 2007).
O estresse salino induziu a atividade hidrolítica e de transporte de prótons
da P-ATPases e da V-ATPase (Fig. 10). O transporte foi mais estimulado que a
hidrólise, dando uma idéia do aumento do acoplamento dessas enzimas devido à
presença do sal. Esse resultado vai ao encontro das observações de Ballesteros
et al (1996) no que se refere a um maior acoplamento na H
+
-ATPase do tipo P,
embora esses autores tenham visto inibição da atividade hidrolítica. O estímulo
das bombas de vacúolo em resposta ao sal é amplamente relatado (Hassidim et
al., 1986; Barkla et al., 1995; Wang et al., 2001; Zhang et al., 2006). A atividade
42
da V-ATPase e da V-PPase foi aumentada pelo tratamento com NaCl assim como
o transporte de H
+
, havendo maior destaque para a V-ATPase.
O uso de SNP também resultou na indução destas enzimas. A H
+
-ATPase
de membrana foi ativada em mais de 3 vezes pelo ON (Fig. 10), resultado que vai
ao encontro do observado por Zhao et al, (2004), que sugerem a participação do
ON como molécula reguladora da atividade de P-ATPase durante o estresse
salino em calos. O mesmo foi reportado por Zhang et al., (2007), que incluíram o
H
2
O
2
na rota de estímulo da bomba via ON. Resultado semelhante foi encontrado
por Zhang et al., (2006), que demonstraram uma conexão entre a transdução de
sinal do ON e o aumento da tolerância à salinidade, através da estimulação da
atividade e transporte de H
+
da V-ATPase e V-PPase em folhas de milho. Esse
estímulo esteve associado ao aumento do co-transporte Na
+
/H
+
.
A RN participa de uma das vias de produção de ON nas plantas, no qual a
redução de nitrito a ON é dependente de NAD(P)H (Yamasaki et al., 1999). A
produção de ON pela redução do nitrito compete com a redução do nitrato a
nitrito, pois a RN possui Km para nitrato de 50 µM e nitrito de 100 µM, sendo
desta forma a produção de ON dependente da concentração de nitrato. Além da
RN citoplasmática a produção de ON também está associada a enzimas ligadas a
membrana (Ni-Nor) (Rockel et al., 2002). Durante condições normais, os níveis de
nitrato são de 1 a 5 mM e de nitrito de 10 µM. Nestas condições não seria
esperado a produção de ON via redutase do nitrato (Crawford et al., 2006),
entretanto alguns autores afirmam ser a enzima essencial na produção de ON
mesmo em condições não estressantes (Desikan et al.,
2002; Garcia-Mata e
Lamattina, 2001). Os resultados apontam que a enzima RN participa da produção
de ON em raízes de milho em condições não estressantes, uma vez que foi
observada a redução da fluorescência emitida pela presença de ON pelo inibidor
da atividade de RN, o tungstato de sódio (Na
2
WO
4
) (Fig. 11).
Durante o tratamento salino foi observado acréscimos da fluorescência
emitida pela sonda DAF-2 em pontas de raíz (Fig. 11). Este fato pode ser
correlacionado à indução de NADPH oxidase e produção de EROs durante o
estresse salino, sendo estes fatos relacionados à indução na síntese de ON por
RN e ATNOA1 (Zhang et al., 2007; Neill et al., 2008; Corpas et al, 2009).
Plantas tratadas com NaCl e tungstato de sódio, tiveram redução da
fluorescência, sendo possível inferir que a RN é em parte responsável também
43
pelo acréscimo de ON nas raízes durante o estresse salino (Fig. 11). Entretanto, é
necessário ressaltar que o tungstato de sódio também inibe a produção de ABA
hormônio, que também está relacionado à indução de EROs durante o estresse
salino e síntese de ON (Zhang et al, 2007). Durante o estresse salino é relatado a
redução do conteúdo de nitrato em folhas e raízes de tomate e milho (Debouba et
al., 2006 a; Abd-El Baki et al., 2000). Nestas condições onde há redução dos
níveis de nitrato e incremento dos níveis de nitrito, possivelmente haveria
aumento nos níveis de ON durante o estresse salino.
O tratamento com L-Name, inibidor da enzima NOA1, reduziu a
fluorescência em condições não estressantes e, semelhante ao tratamento com
tungstato, reduziu a fluorescência durante o estresse salino, mostrando que assim
como a RN, a NOA1 participa da produção de ON em raízes de milho durante o
estresse salino. Este resultado vem ao encontro do trabalho de Zhang et al.,
(2007), no qual foi observado a indução da atividade de NOA1, bem como a
emissão de ON em calos de Populus euphratica pelo NaCl. Zhao et al., (2004)
não observam alterações na emissão de ON em calos durante o estresse salino,
entretanto Zhao et al., (2007) observaram a redução da fluorescência de DAF em
raízes de Arabidopsis, sendo esta redução atribuída à redução da atividade de
NOA 1, mesmo sem ser analisada a participação da RN neste trabalho. Já Zhang
et al., (2006) observaram o aumento transiente de ON em folhas de milho tratadas
com NaCl não nomeando nenhuma enzima especifica como a responsável por
este aumento.
A produção de óxido nítrico durante o estresse salino possivelmente ocorre
de maneira diferente na parte aérea, já que foi observado que a enzima RN é
inibida pela salinidade (Fig. 9 B), sendo especulada a participação de outra forma
de produção, como a realizada pela enzima NOA1.
Além das vias enzimáticas propostas para a produção de ON, existe a via
não enzimática. Essa via depende da redução de nitrito no apoplasto em pH ácido
e ambiente redutor (Stöhr e Ullrich, 2002). É possível que exista um papel chave
das bombas de H
+
nesse processo de acidificação, na qual a ativação da ATPase
de membrana por NaCl e ON acidifica o apoplasto levando a produção de mais
ON. A quantidade e o pico de produção de ON nesse processo seriam
fundamentais para indução de resistência à salinidade, tanto por retro-ativar a P-
ATPase e sinalizar para estimulação ou repressão da produção de mais ON,
44
quanto para auxiliar a manutenção da exclusão de Na
+
(ou compartimentalização
no vacúolo) e absorção de K
+
.
A participação do ON durante o estresse salino em raízes foi resumida em
um modelo proposto com base nos resultados obtidos neste trabalho (Figura 12)
Conclusão
Neste trabalho foi possível verificar a minimização dos efeitos da salinidade
em raíz e parte aérea pelo tratamento com o doador de ON. O tratamento com
SNP induziu a atividade de enzimas antioxidantes possibilitando a redução da
peroxidação lipídica em raízes. Foi verficado aumento da produção de ON
durante o estresse salino, sendo esta produção atribuída principalmente a RN e
possivelmente a NOA 1. O tratamento com o doador de ON induziu também a
atividade de P-ATPase, V-ATPase e PPase, comprovando a hipótese da
participação desta molécula na modulação de bombas de prótons. Estes dados
sugerem que durante o estresse salino há aumento da produção de ON e que
esta molécula participa da via de indução de enzimas antioxidantes e modula os
sistemas primários de transporte de H
+
, auxiliando desta forma na redução do
estresse oxidativo e osmótico promovidos pela salinidade.
Há a necessidade de novos estudos para confirmar a participação das
enzimas envolvidas na produção de ON, bem como avaliar a via não enzimática
de produção de ON durante o estresse salino. É necessário também investigar se
a resposta na modulação das bombas durante o estresse salino é dependente da
presença de ON, ou seja, se esta molécula atua como sinalizador modulando as
ATPases e PPase durante o estresse salino.
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+
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Figura 1 – Comprimento de raiz principal obtido em plantas de milho. Controle;
150 mM de NaCl; 200 µM de SNP (doador de óxido nítrico); 200 µM SNP+200 µM
de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+200 µM de SNP; 150
mM de NaCl+ 200 µM de SNP+ 200 µM de PTIO; 300 µM de tungstato (inibidor
da enzima redutase do nitrato) e 200 µM de PTIO. Colunas marcadas com um (*,
P<0,05) asterisco indicam a diferença significativa pelo teste de Dunnett.
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
NaCl+SNP+PTIO
Tungstato
PTIO
0.0
2.5
5.0
7.5
*
*
*
*
Comprimento da raiz
principal (cm)
53
Controle
NaCl
SNP
NaCl+SNP
NaCl+SNP+PTIO
0
1
2
3
4
5
6
*
*
*
*
Numero de raízes laterais
Figura 2 – Número de raízes laterais emitidas. Controle, 150 mM de NaCl; 200 µM
de SNP (doador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+ 200 µM de SNP; 150 mM de
NaCl+ 200 µM de SNP+ 200 µM de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico). Colunas
marcadas com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste
de Dunnett.
54
Figura 3 – Massa fresca de plantas de milho. (A)- Raiz; (B)-Parte Aérea. Controle;
150 mM de NaCl; 200 µM de SNP (doador de óxido nítrico); 200 µM de SNP+ 200
µM de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+ 200 µM de SNP;
300 µM de tungstato (inibidor da enzima redutase do nitrato). Colunas marcadas
com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste de
Dunnett.
0.1
0.2
0.3
0.4
A
*
Massa de raiz
fresca (g)
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
Tungstato
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
B
*
*
Massa de parte aérea
fresca (g)
55
Figura 4- Massa seca de plantas de milho. (A)- Raiz; (B)-Parte Aérea. Controle,
150 mM de NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido nítrico); 150 µM de SNP+ 150
µM de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM de SNP;
300 µM de tungstato (inibidor da enzima redutase do nitrato). Colunas marcadas
com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste de
Dunnett.
0.01
0.02
0.03
0.04
A
Massa de raiz
seca (g)
*
*
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
Tungstato
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
B
*
*
Massa de parte aérea
seca (g)
56
Figura 5 – Conteúdo de MDA em raízes de milho. Controle, 150 mM de NaCl; 150
µM de SNP (doador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM de SNP; 150 mM
de NaCl+ 150 µM de SNP+150µM de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico).
Colunas marcadas com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa
pelo teste de Dunnett.
Controle
NaCl
NaCl+SNP
NaCl+SNP+PTIO
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
*
MDA (nmol. g
-1
MF)
57
Figura 6 – Atividade de enzimas antioxidantes em raízes de milho. (A)- Enzima
Catalase (CAT); (B)- Enzima Guaiacol Peroxidase (GPX); (C)- Enzima Ascorbato
Peroxidase (APX). Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido
nítrico); 150 µM de SNP+ 150 µM de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150
mM de NaCl+150 µM de SNP. Colunas marcadas com um asterisco (*, P<0,05)
indicam a diferença significativa pelo teste de Dunnett.
0.1
0.2
0.3
A
Catalase
(mM H
2
O
2
min
-1
mg
-1
PTN)
1
2
3
4
5
B
Guaiacol Peroxidase
(nM min
-1
mg
-1
PTN)
*
*
*
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
0
1
2
3
4
C
*
*
Ascorbato Peroxidase
(mM min
-1
mg
-1
PTN)
*
58
Figura 7- Fluorescência da clorofila a (A) taxa relativa de transporte de elétrons
(TRTE); (B) eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm) e Fv’/Fm’; Controle, 150 mM
de NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido nítrico); 150 µM de SNP+ 150 µM de
PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM de SNP. Colunas
marcadas com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste
de Dunnett.
0 2 5 0 5 0 0 7 50 1 0 00 1 2 5 0 15 0 0 1 75 0 2 0 00
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
C o ntro le
S NP
S NP+P T IO
Na C l
Na C l+S NP
A
*
*
*
*
FFF (m M . m
-2
.s
-1
)
TRTE
0 73 143 231 336 529 748 1184 1779
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0 .5
0 .6
0 .7
0 .8
C o n tr o le
S NP
S NP +P T IO
Na C l
Na C l+ SN P
B
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
F F F ( m M m
-2
.s
-1
)
Fv/Fm e Fv'/Fm'
Fv/Fm
59
Figura 8 – Fluorescência da clorofila a.em plantas de milho (A) “quenching”
fotoquímico (qP) (B) “quenching” não-fotoquímico (NPQ) ; Controle, 150 mM de
NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido nítrico); 150 µM de SNP+ 150 µM de
PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM de SNP. Colunas
marcadas com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste
de Dunnett.
0.25
0.50
0.75
1.00
A
qP
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
0.000
0.025
0.050
0.075
B
NQP
*
*
60
Figura 9 – Atividade da enzima redutase do nitrato (RN) em plantas de milho. (A)-
Raízes; (B)- Folhas. Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido
nítrico); 150 µM de SNP+ 150 µM de PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150
mM de NaCl+150 µM de SNP; 300 µM de tungstato (inibidor da enzima redutase
do nitrato). Colunas marcadas com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença
significativa pelo teste de Dunnett.
.
10
20
30
40
A
Atividade da RN
(
m
moles NO
2
h
-1
. g
-1
MF)
*
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
Tungstato
0
50
100
150
B
*
Atividade da RN
(
m
moles NO
2
h
-1
. g
-1
MF)
*
61
Figura 10 – Atividade hidrolítica e de transporte de prótons. A e B - Atividade de
P-ATPase; C e D- V-ATPase; E e F – PPase. Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM
de SNP (doador de óxido nítrico); 150 µM de SNP+ 150 µM de PTIO
(seqüestrador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM de SNP. Colunas
marcadas com um asterisco (*, P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste
de Dunnett.
10
20
30
40
C
V-ATPase
m
mol Pi .mg
-1
.min
-1
*
**
*
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
0.0
0.5
1.0
F
*
*
*
Controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCL+SNP
0
10
20
30
40
50
E
*
PPase
m
mol Pi. mg
-1
.min
-1
*
10
20
30
40
50
A
P-ATPase
m
mol. mg
-1
.min
-1
*
*
*
DF
Vo
0.5
1.0
B
*
*
*
*
*
0.5
1.0
D
*
*
*
*
*
*
62
Controle
SNP
SNP+PTIO
PTIO
L-Name
GSNO
GSNO+PTIO
Tungstato
NaCl
NaCl+L-Name
NaCl+Tungstato
0
50
100
150
*
*
*
*
*
*
*
DAF-2-DA
Relaive Fluorescence (%)
Figura 11- Determinação da presença de ON utilizando sonda DAF-2. Controle,
150 µM de SNP (doador de óxido nítrico); 150 µM SNP+150 µM PTIO
(seqüestrador de óxido nítrico); 150 µM PTIO; 200 µM L-Name; 150 µM GSNO
(doador de óxido nítrico); 150 µM GSNO+150 µM PTIO; 300 µM tungstato
(inibidor da redutase do nitrato); 150 mM NaCl; 150 mM NaCl + 200 µM L-Name;
150 mM NaCl + 300 µM tungstato. Colunas marcadas com um asterisco (*,
P<0,05) indicam a diferença significativa pelo teste de Dunnett.
PTIO L-Name L-Name+NaCl
Tungstato+NaCl Tungstato GSNO GSNO+PTIO
SNP SNP+PTIO NaCl
Controle
63
Figura 12- Modelo esquemático da participação do óxido nítrico como sinalizador
durante o estresse salino
NaCl
Ó
XIDO NÍTRICO
(ON)
Auxilia no
ajustamento iônico
Atividade de ATPases e
PPase
Redução do
estresse oxidativo
reduzindo níveis de
MDA
Atividade de
enzimas
antioxidantes
Raízes
RN / NOA1
?
Acidificação do
apoplasto
?
Indução é independente de
ON ?
64
PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E INTERAÇÃO COM ÁCIDO ABSCÍSICO NA
MODULAÇÃO DE BOMBAS DE PRÓTONS E ENZIMAS ANTIOXIDANTES
DURANTE O ESTRESSE SALINO
Mirella Pupo Santos
1
, Daniel Basílio Zandonadi
2
, Arnoldo Rocha Façanha
2
,
Ricardo Bressan-Smith
1
1
Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias (CCTA) Laboratório de Melhoramento Genético
Vegetal - LMGV, Setor de Fisiologia Vegetal.
2
UENF-, Centro de Biociências e
Biotecnologia- CBB, Laboratório de Biologia Celular e Tecidual. Av. Alberto
Lamego 2000, CEP 28013-620, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil.
Palavras-chave: Ácido abscisico; mutante sitiens, óxido nítrico, ATPases
Resumo
A relação entre o ABA e o gás óxido nítrico (ON) tem sido mostrada durante a
resposta vegetal a diferentes estresses abióticos, incluindo a salinidade. No
presente trabalho buscou-se a participação do ON na rota de sinalização
promovida por ABA e a possibilidade da uma rota independente de ABA na
mediação de respostas ao estresse salino. Foi possível observar que o ABA é
necessário na indução de enzima antioxidante em plantas controle (wt) e que
durante o estresse salino, possivelmente o ON atue como sinalizador após
(downstream) o ABA ou que participe possivelmente de uma via independente
65
deste fitormônio. A atividade de bombas de prótons foi estimulada pelo NaCl e
pelo SNP, havendo um efeito sinérgico quando aplicados em conjunto em plantas
não mutante (wt) e sitiens. Além da ativação pós-traducional da ATPase do tipo P,
foi observado um aumento de três vezes no nível de RNAm (LHA4) dessa enzima
nas raízes do tomateiro sitiens em comparação ao wt pela análise de RT-qPCR
em tempo real. LHA4 aumentou em quatro vezes devido ao ON em plantas wt e
apenas 25 % em plantas sitiens. O NaCl aumentou a expressão relativa de LHA4
em plantas wt em cerca de 50 %, mas reduziu em cerca de 3 vezes em plantas
sitiens. O estresse salino induz à produção de ON em raízes do genótipo wt,
entretanto reduziu nas plantas mutantes. Esta produção parece ser dependente
de enzimas produtoras de ON, como a redutase do nitrato. O balanço da ativação
entre as bombas de H
+
associado à síntese de ON e indução de enzimas
antioxidantes pode compor um dos mecanismos de controle de resposta ao
estresse salino em plantas.
Abstract
Nitric oxide production and interaction with ABA in proton pumps regulation
and antioxidant enzymes stimulation during salt stress
The relationship between abscisic acid (ABA) and the gas nitric oxide (NO) has
been shown during the plant response to the different abiotic stresses, including
salinity. This study was carried out to verify the NO role in the ABA signalling
pathway and the possibility of an independent ABA route in mediating responses
to salt stress. It was shown that ABA is required to antioxidant enzymes’ activation
in wild type (wt) plants during salt stress and that NO possibly act as a signal
downstream ABA pathway or even using an ABA-independent pathway. The
proton pump activity was stimulated by NaCl and NO donor (SNP), and there was
a synergistic effect when applied combined in wt and mutant plants defective in
ABA production (sitiens). Besides the P-type ATPase post-translational activation,
it was observed an increase in the mRNA level of LH4 isoform of this enzyme in
roots of tomato sitiens compared with wt, using real time RT-qPCR. SNP
increased 4-fold the LHA4 transcripts in wt plants and only 25 % in sitiens plants.
NaCl increased around 50 % the relative expression of LHA4 in wt plants and
suppressed the expression of this isoform in mutant plants (around 3-fold). The
66
NO production was induced by the salt stress in the wt genotype roots, however
there was a reduction in mutant plants. This production seems to be dependent of
NO enzymes producers such as the nitrate reductase. The concerted H
+
pumps
activation associated to the NO production and antioxidant enzymes activity can
be part of a response control mechanism to salt stress in plants.
Key Word: abscisic acid, nitric oxide, proton pump, antioxidant, salt stress
Introdução
O fitormônio ácido abscísico (ABA) está relacionado à regulação de
respostas adaptativas das plantas a estresses ambientais, como o fechamento
estomático, a produção de prolina (Chaves et al., 2008; Bartels e Sunkar, 2005) e
o desenvolvimento radicular (Deak e Malamy, 2005). Participa ainda de muitas
vias de crescimento e desenvolvimento, incluindo síntese de proteínas em
sementes, dormência e a promoção da tolerância à dessecação de sementes
(Chaves et al., 2008; Bartels e Sunkar, 2005).
As plantas sob estresse hídrico ou salino apresentam incrementos do
conteúdo de ABA, principalmente na parte radicular (Jia et al., 2002). Além do
acúmulo de ABA durante o estresse, há a geração de espécies reativas de
oxigênio (EROs) e moléculas associadas a defesa contra estes radicais (Sminorff,
1993; Jiang e Zhang, 2001; Jiang e Zhang, 2002).
Tem sido documentado que o ABA causa o acréscimo de superóxido (O
-
2
)
(Jing e Zhang, 2002) e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (Jiang e Zhang, 2001; Jiang
e Zhang, 2002) e que possui envolvimento na indução da atividade e da
expressão gênica de enzimas antioxidantes como, a superóxido desmutase
(SOD) (Zhu e Scandalios, 1994; Guan e Scandalios, 2000) e a catalase (CAT)
(Jiang e Zhang, 2001).
O estudo da participação do hormônio ABA em rotas de sinalização vegetal
pode ser realizado com mutantes hormonais. Existem vários mutantes deficientes
na produção de ABA (Taylor et al., 2000), entre estes há o mutante sitiens, que
possui mutação no gene responsável pela produção da última enzima da rota de
produção de ABA, a ABA aldeído oxidase (AAO). Estas plantas possuem
germinação precoce havendo viviparidade, ou seja, germinação de sementes
67
dentro do fruto. Possuem baixa condutância hidráulica (Nagel et al., 1994;
Holbrook et al., 2002), desenvolvimento vegetal mais lento, com menor massa de
parte aérea seca e alongamento radicular reduzido, sendo esta última
característica atribuída ao aumento dos níveis de etileno nestas plantas (Groot e
Karssen, 1992; Ni e Bradford, 1993; Spollen et al., 2000; Aroca et al., 2008).
Possui sensibilidade ao estresse salino (Makela et al., 2003), entretanto, é
considerado resistente a Botrytis cinerea (Asselbergh et al., 2007).
O óxido nítrico (ON) é um gás lipofílico, de tamanho reduzido e moderada
solubilidade em água. Reage rapidamente com moléculas que tenham elétrons
desemparelhados (Neill et al., 2008). Foi relatado que o ON participa da
modulação de sinais de transdução em vias metabólicas afetando os níveis de
mensageiros secundários como o GMPc, ADPRc e Ca
+2
(Durner et al., 1998;
Pagnussat et al., 2003; Pagnussat et al., 2004).
Uma das vias de síntese de ON nas plantas é feita pela redutase do nitrato
(RN), por meio da redução de nitrito para ON usando NADPH como doador de
elétrons (Desikan et al., 2002; Stöhr et al., 2001, Stöhr e Stremiau, 2006). A
AtNOA1 é uma enzima produtora de ON recentemente descoberta em
Arabidopsis (Guo et al., 2003; Crawford et al., 2006). O ON pode também ser
produzido por reações não enzimáticas, como a redução de nitrito no apoplasto
por acidificação do pH em resposta à giberelina e ao ABA ou, por meio de reação
química na presença de carotenóides e luz (Bethke et al., 2004; Stöhr e Ullrich,
2002).
A molécula de ON tem se revelado capaz de influenciar vários processos
em vegetais tais como: crescimento de raízes (Gouvêa et al.,1997), germinação
de sementes (Belini e Lamattina, 2000), fotomorfogênese (Pagnussat et al.,
2003), lignificação de parede celular (Ferrer e Ros Barceló, 1999), senescência
(Magalhães et al., 2000), movimento de estômatos (Neill et al., 2002; Garcia-Mata
e Lamattina, 2002), aumento da disponibilidade de ferro (Graziano et al., 2002;
Murgia et al., 2002), funcionalidade mitocondrial (Zottini et al., 2002) e de
cloroplastos (Takahashi e Yamasaki, 2002), defesa contra patógenos (Delledonne
et al., 1998; Delledonne et al., 2001) e sinalização celular durante o estresse
hídrico, salino e de calor (Zhang et al., 2006; Song et al., 2006).
O ON é relatado como mediador de respostas hormonais em particular
mediando efeitos de hormônios e moléculas envolvidas em estresses abióticos.
68
Recentemente, o ON foi relatado como indutor de tolerância ao déficit hídrico, por
atuar como mensageiro secundário de ABA durante o fechamento estomático,
(Garcia-Mata e Lamattina, 2003), aumentar a síntese de proteínas Lea e induzir
enzimas antioxidantes (Lamotte et al., 2004; Lamote et al., 2006; Zhang et al.,
2007) e aumentar a atividade de bombas de prótons (Zhao et al., 2004; Zhang et
al., 2006).
O objetivo deste trabalho foi estudar a interação entre o hormônio ABA e o
ON em processos fisiológicos durante o estresse salino, utilizando para tal o
mutante na produção de ABA, sitiens. Para essa finalidade, o presente trabalho
pretende responder algumas questões: O estresse salino induz ou não a
produção de ON nos dois genótipos? A atividade de enzimas antioxidantes é
estimulada pelo ON? Este estímulo é dependente da presença de ABA? A
produção de ON é dependente da atividade da enzima RN e de ABA? O ON
modula a atividade de ATPases e PPase e a expressão de P-ATPase? Esta
modulação ocorre em plantas silvestres e no mutante sitiens?
Material e Métodos
Material vegetal
Foram utilizadas sementes de plantas não mutantes (wt) e sitiens (st) de
tomateiro (Solanum lycopersicum var. Alicia Craig), provenientes do
Departamento de Ciências Horticulturais do Instituto de Genômica de Plantas e
Biotecnologia da Universidade Texas A&M, adquiridas por intermédio da
Professora Marla L. Binzel.
As sementes germinadas em vasos contendo vermiculita foram mantidas
em sala de germinação durante 1 semana. Após este período as plantas foram
transferidas para casa de vegetação e mantidas por 5 dias em aclimatação. As
plantas foram transferidas para meio hidropônico (solução de Hoagland 1/5 da
força). A cada semana foi realizada a reposição dos nutrientes e aumentada a
força da solução de Hoagland até obter força 1. Estas plantas foram mantidas
nestas condições por 1 mês e depois utilizadas nos experimentos.
69
Tratamentos realizados
Plantas de tomate (wt) e sitiens, quatro dias após a germinação, foram
tratadas com doses crescentes de NaCl (50, 150 e 200 mM), com o doador de ON
o SNP (nitroprussiato de sódio) e PTIO (seqüestrador de ON) nas concentrações
variadas (50, 150 e 200 mM) durante três dias para determinação da dose
adequada a ser utilizada dos experimentos posteriores. Estas doses foram
determinadas com base no crescimento radicular e da parte aérea, bem como
com base nas doses mais utilizadas na literatura.
Após este experimento prévio, plantas de tomateiro wt e sitiens, cultivadas
sob as mesmas condições descritas anteriormente, foram tratadas com: (1) 150
mM de NaCl; (2) 150 µM de SNP (doador de ON); (3) 150 mM de NaCl + 150 µM
de SNP; (4) 200 µM SNP + 200µM de PTIO (seqüestrador de ON); (5) 200 µM de
L-Name (inibidor da síntese de ON pela NOA1); (6) 300 mM de tungstato de sódio
(Na
2
WO
4
), (inibidor da enzima redutase do nitrato e da síntese de ABA) e; (7) 150
mM de NaCl+ 300 mM tungstato. Após 24 h foram analisadas as seguintes
características: atividade da redutase do nitrato (RN), atividade das enzimas
antioxidantes (catalase, guaiacol peroxidase e ascorbato peroxidase), atividade
das bombas de H
+
(ATPase tipo P, tipo V e V-PPase) e detecção de óxido nítrico.
Os mesmos tratamentos foram realizados para o experimento de maior
duração (7 dias). Neste foram realizadas as seguintes análises: teores de
clorofilas e de pigmentos carotenóides, peroxidação lipídica e integridade de
membrana.
Fotossíntese e trocas gasosas
A taxa fotossintética líquida (An, µmol m
-2
s
-1
), a condutância estomática
(gs, mol m
-2
s
-1
), a transpiração (E
a
mmol
-2
s
-1
) e o déficit de pressão de vapor
entre a folha e o ar (DPV
folha-ar
kPa) foram determinados usando o analisador de
gases no infravermelho (IRGA), acoplado a um sistema portátil de medição das
trocas gasosas, modelo LI-6200 (LI-COR, USA).
70
Comparação anatômica das folhas de wt e sitiens
Fixação e Desidratação de material botânico
Foram retiradas três folhas de cada um dos 10 indivíduos silvestres (wt) e
sitiens em um total de 30 folhas. Fragmentos do terço médio da lâmina foliar
foram fixados em campo em uma solução de glutaraldeído 2,5 %,
paraformaldeído 4,0 % e tampão cacodilato 0,05 M em pH 7,2, lavados neste
mesmo tampão cacodilato e pós-fixados em uma solução de tetróxido de ósmio 1
% e tampão cacodilato 0,05 M, à temperatura ambiente. Após nova lavagem em
tampão cacodilato 0,05 M, os fragmentos foram desidratados em uma série
crescente de acetona (50 %, 70 %, 90 % e 3 vezes 100 %).
Microscopia óptica
Após a desidratação, os fragmentos foram submetidos à etapa de
infiltração onde a acetona foi substituída gradualmente pela resina epóxi (Epon
812). As amostras em resina pura foram colocadas em formas e levadas à estufa
a 65 °C por 48 h para a polimerização e obtenção de blocos. Com um
ultramicrótomo (Reicheit Ultracut S) foram retirados cortes semifinos de 0,70 µm
de espessura com o auxilio de faca de vidro, no sentido transversal. As secções
foram coradas com azul de toluidina 1 %, por 1 minuto. As lâminas foram seladas
com Entelan® e observadas em microscopia de campo claro (Axioplan ZEISS).
Caractreísticas quantitativas
A espessura da lâmina, mesofilo, parênquima paliçádico e parênquima
lacunoso foi calculada a partir de secções transversais do terço médio da lâmina
foliar. As imagens obtidas foram processadas e analisadas utilizando sistema
digital de processamento de imagens Analysis SIS LINK/Oxford – Zeiss. Foram
examinados 25 campos para cada indivíduo, calculando-se a média aritmética e o
desvio padrão dos resultados obtidos.
A significância das diferenças entre os parâmetros anatômicos
quantitativos mensurados foi determinada por teste t.
71
Extração e quantificação de açúcares
Folhas totalmente expandidas nas raízes foram coletadas, lavadas em
água deionizada e secas cuidadosamente em papel absorvente. Amostras de 0,3
g, sem as nervuras centrais foram congeladas em nitrogênio líquido (N
2
líquido) e
imediatamente armazenadas em freezer -70 ºC para posterior análise de
carboidratos solúveis.
As amostras de tecido foliar foram maceradas em N
2
líquido até a obtenção
de um pó fino, contendo polivinilpolipirrolidona (PVPP) a 10 % (p/v), ácido
ascórbico 50 mM, com posterior adição de 1 mL de etanol (ETOH) 80 %. Após
serem vortexados, os microtubos foram selados e levados a banho-maria a 70 ºC
por 90 minutos. Depois de retirados do banho, os microtubos foram centrifugados
a 13000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. Os sobrenadantes foram coletados em
frascos previamente identificados e os pellets ressuspendidos em 1 mL de ETOH
80 % centrifugados nas mesmas condições anteriores. Os sobrenadantes
resultantes foram adicionados aos provenientes da primeira centrifugação e
armazenados a -20 ºC para posteriores quantificações de glicose, frutose e
sacarose. Os pellets foram novamente ressuspendidos em 1 mL de ETOH 80 %,
centrifugados nas mesmas condições anteriores, com posterior descarte do
sobrenadante.
Os teores de glicose, frutose, sacarose foram quantificados conforme
metodologia descrita por Sttit (1989), onde reações acopladas enzimaticamente
reduzem o NAD
+
, o qual é determinado em leitor de microplacas a 340 nm. Para
tanto, 10 mL do extrato foi adicionado a 133 mL de tampão A (Imidazole 100mM,
MgCl
2
5 mM, NAD
+
2 mM, ATP 1 mM, dlicose-6-fosfato desidrogenase 2U mL
-1
pH 7.4) e 102 mL de H
2
O ultrapura. Para a determinação de glicose, adicionou-se
5 mL do preparado da enzima hexoquinase (EC 2.7.1.1) a 1,5 U realizando-se
leituras a cada 10 minutos até que os valores estabilizaram-se. Para a
determinação de frutose, adicionou-se 5 mL do preparado da enzima fosglicose
isomerase (EC 5.3.1.9) a 3 U realizando-se leituras a cada 10 minutos até que os
valores estabilizaram-se. Para a determinação de sacarose, adicionou-se 5 mL do
preparado da enzima invertase (EC 3.2.1.26) a 5 U realizando-se leituras a cada
10 minutos até que os valores estabilizaram-se.
72
Determinação do conteúdo de clorofila a e b e carotenóides totais
Foi pesado 100 mg de tecido fresco e foram colocados em tubos de
ensaio, contendo 5 mL de dimetilsulfoxido (DMSO), protegidos da luz com papel
alumínio, ficando no escuro por 72 h como proposto por Hiscox e Israelstam
(1979). Após a extração com o DMSO, foi retirada uma alíquota para leitura nos
comprimentos de onda de 649 e 665 nm e 710 nm no leitor de placas. Os teores
de clorofila total a, b e carotenóides foram determinados a partir das equações:
Clorofila
a
= 12.47A
665
– 3.62A
649
; Clorofila
b
= 25.06A
649
– 6.5A
665
; Carotenóides =
(1000A
480
– 1.29C
a
– 53.78C
b
)/220, e expressos em µg/mL, segundo Wellburn
(1994).
Fluorescência da clorofila a
A cinética da emissão da fluorescência da clorofila a foi medida na terceira
folha (contando do ápice para a base da planta) completamente expandida,
utilizando-se um fluorímetro modulado Mini-Pam (Walz, Alemanha). As variáveis
foram obtidas seguindo-se uma curva de resposta à luz, a qual tinha oito períodos
consecutivos de iluminação com intensidade crescente, resultando nos seguintes
parâmetros: eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm), o “quenching” fotoquímico
(qP) e o “quenching” não-fotoquímico (qN) e a taxa relativa de transporte de
elétrons (TRTE).
Determinação da peroxidação lipídica
A estimativa da peroxidação de lipídios das membranas de raízes e folhas
foi feita pela medida do conteúdo de malondialdeído (MDA), de acordo com
Dhindsa, et al (1981). Foram retiradas 5 gramas de tecido fresco e maceradas em
5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 0,1 % na presença de polivinil polipirrolidona
(PVPP) na proporção de 1:1,5. O homogenato foi centrifugado a 10.000 g por dez
minutos. Um mililitro do sobrenadante foi retirado e adicionado a 4 mL de uma
mistura formada por TCA 20 % e TBA 0,5 % (ácido tiobarbitúrico). O extrato foi
submetido a 95
0
C por 30 minutos, seguindo-se de rápido resfriamento em gelo. A
amostra foi lida a 535 e 600 nm. A concentração de MDA foi determinada
73
utilizando o coeficiente de extinção de 155 mM. cm
-1
) e expressa em nmol.mg
-1
de
tecido fresco.
Determinação da integridade de membrana
A determinação de integridade de membrana (PIR) das células foi realizada
de acordo com Vasquez-Tello et al. (1990), com modificações. Dez discos de 1
cm de diâmetro (100mg de cada tecido), foram lavados três vezes em água
ultrapura e colocados imersos em 10 mL de água ultrapura em um tubo de ensaio
durante 24 h, à temperatura de 8
0
C. As leituras de condutividade (condutividade
livre – CL) foram realizadas no condutivímetro Quimis, modelo Q-405 A2. Os
tubos após a primeira leitura foram submetidos à temperatura de 80
0
C, por 30
minutos em banho-maria e colocados a 8
0
C por 24 horas. Após esse período, foi
determinada novamente a condutividade (condutividade total – CT). A
porcentagem de integridade de membrana (PIM) foi calculada pela fórmula, PIM =
[1-(CL/CT)] x 100.
Determinação da atividade da redutase do nitrato
Utilizou-se o método in vivo, descrito por Jaworski (1971) para
determinação da atividade da redutase do nitrato em folhas e raízes de milho.
Para tal, foram retirados discos foliares de 0,5 cm de diâmetro ou fragmentos de
raízes e pesados para obtenção de, aproximadamente, 200 mg de tecido fresco.
Os discos foliares ou os fragmentos de raízes foram colocados em meio de
incubação, composto por tampão fosfato pH 7,5, KNO
3
, propanol e triton e
submetidos ao vácuo por 3 minutos. As amostras foram levadas para o banho-
maria a 30ºC por 40 minutos com agitação constante em total obscuridade
(envolto com papel alumínio). A atividade da enzima foi estimada pela quantidade
de NO
2
–
liberada na solução de incubação, medida em espectrofotômetro, a 540
nm, e expressa em µmoles de NO
2
–
.h
-1
. g
-1
de matéria fresca.
Atividade de enzimas antioxidantes
Preparação de extrato enzimático
74
Após cada tratamento, um grama de raízes foi macerado em nitrogênio
líquido em gral de porcelana na presença de PVPP, na proporção de 5 % (p/v)
para a concentração final de tampão a ser utilizado. Após a obtenção de um pó
fino, foi acrescentado tampão na proporção de 1:4 (p/v). O tampão de extração
era composto por 100 mM de fosfato de potássio, 1 mM de EDTA e 3 mM de DTT
com pH ajustado para 7,5. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g por 30
minutos a 4 ºC. Em seguida, o sobrenadante coletado foi distribuído em tubos,
congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -70 ºC. A determinação do
conteúdo de proteína foi realizada pelo método de Bradford (1976).
Determinação da atividade da catalase (CAT)
A atividade da CAT foi determinada de acordo com Jiang e Zhang, (2001),
com algumas modificações. O ensaios foram realizados utilizando o tampão
fosfato 50 mM com pH 7,0 e concentração final de H
2
O
2
de 15 mM. A reação foi
iniciada com adição de 15 µL do extrato enzimático e as leituras de absorvância
foram realizadas em espectrofotômetro, monitorando a decomposição de H
2
O
2
a
240 nm (ε = 36mM. cm
-1
) durante 1 min, após o início da reação. O branco foi
composto de meio de reação livre de H
2
O
2
. A atividade da CAT foi expressa em
µmol min
-1
mg
-1
de proteína.
Determinação da atividade da guaiacol peroxidase (GPX)
A atividade da GPX foi determinada por mensuração da taxa de oxidação
de guaiacol a tetraguaicol por monitoramento do acréscimo, na absorvância a 470
nm (ε= 26,6 mM. cm
-1
), de acordo com o método usado por Zhang e Kirkham
(1994), com algumas modificações. O meio de reação foi composto de 5 mM de
guaiacol, 1,2 mM de H
2
O
2
em 50 mM tampão fosfato de sódio pH 6,0. A reação foi
iniciada com adição de 10 µL de extrato enzimático. Foi utilizado como branco o
meio de reação livre de extrato enzimático. A atividade da GPX foi expressa em
µmol min
-1
mg
-1
de proteína.
75
Determinação da atividade da ascorbato peroxidase (APX)
A atividade da APX foi determinada de acordo com Jiang e Zhang, (2001).
Para isso, o meio de reação foi preparado com, 0,5 mM de ácido ascórbico, 1 mM
de EDTA, 1 mM de H
2
O
2
em 50mM tampão fosfato de potássio pH 7,0. A reação
foi iniciada com a adição de 30 µL do extrato enzimático e as leituras de
decréscimo de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro a 290 nm (ε=
2,8 mM cm
-1
), monitorando a oxidação de ascorbato, tendo, como branco, o meio
de reação livre de H
2
O
2
e extrato enzimático. A atividade da APX foi expressa em
µmol min
-1
mg
-1
de proteína.
Determinação da atividade das bombas de H
+
Preparação da fração microssomal
As frações microssomais contendo vesículas de membrana plasmática e
de tonoplasto foram isoladas do material vegetal, através de centrifugação
diferencial, essencialmente como descrito por Giannini e Briskin (1987).
Após pesado, o material vegetal (2 g) foi homogeneizado em meio
tamponado em gral de porcelana, onde o volume de tampão utilizado foi 1,5X a
quantidade de material fresco. A maceração foi processada no gelo. O tampão de
extração é constituído de sacarose 250 mM, glicerol 10 %, Mops-BTP 100 mM, 2
mM EDTA, 2 mM DTT, 2 mM PMSF, 0,4 % de PVP-40T, 0,3 % BSA, 100 mM de
KCl. (pH 8,0). O homogenato foi filtrado em membrana Miracloth (Calbiochem). O
extrato foi centrifugado a 3000 x g por 10 minutos a 4
o
C para a remoção das
células não rompidas e impurezas. O sobrenadante foi centrifugado em
ultracentrífuga a 10.000 x g por 10 minutos a 2
o
C para separação das
mitocôndrias (precipitado). O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 100.000
g por 40 minutos a 2
o
C para obtenção da fração microssomal (membrana de
vacúolo e membrana plasmática). Após centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e o pellet foi ressuspendido em meio de ressuspensão (volume de
500µL). O meio de ressuspensão foi constituído contendo glicerol 15 %, tris-HCl
20 mM (pH 7,6), 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT e PMSF 1 mM. Este material foi
armazenado a -70 ºC em diferentes alíquotas.
76
Hidrólise de ATP e PPi
As atividades ATPasicas foram determinadas colorimetricamente,
consistindo na determinação de Pi liberado durante a hidrólise do ATP, segundo o
método descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com modificações propostas por
Façanha e De Meis (1998). As reações foram iniciadas com a adição da proteína
e finalizadas através da adição de 5 % (m:v) de ácido tricloroacético gelado. O
meio de reação composto foi composto de 50 mM de Tris-BTP (pH 7,0), 100 mM
de KCl, 5 mM de MgSO
4
, 0,2 mM de Na
2
MoO
4
, 0,2 mM de Na
2
VO
4
-
e 1 mM de
ATP. Ao meio de reação foi adicionado 30 µg de proteína por mL. A revelação do
Pi hidrolisado foi realizada mediante a adição da mistura contendo molibidato de
Amônio 2 % em H
2
SO
4
2 % + Ácido Ascórbico 1 % (100:1). Após 5-10 minutos,
realizou-se a leitura em leitor de microplaca Modelo µQuant, Bio Tek instruments,
NC, em comprimento de onda de 750 nm.
Transporte de H
+
O gradiente de prótons foi medido monitorando a taxa de decréscimo da
fluorescência (DF) da sonda fluorescente metacromática, 9-amino-6-cloro-2-
metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de comprimento de onda de 415
nm e a emissão captada a 485 nm, utilizando-se um espectrofluorímetro (modelo
F 4500, HITACHI, Japan). O meio de reação foi composto de 10 mM Mops-BTP
(pH 7.0), 100 mM KCl, 5 mM MgSO
4
, 250 mM sacarose, 2 mM ACMA, 1 mM de
ATP ou PPi e 30 µg de proteína/ml. Após atingir o equilíbrio entre efluxo e influxo
de prótons, utilizou-se 20 µL de FCCP ou NH
4
Cl para dissipar o gradiente
formado. A partir dos dados obtidos foi determinada a velocidade inicial (V
0
) e a
variação da fluorescência máxima (DF
máx
).
Detecção de ON
As imagens para detecção de ON foram realizadas com a sonda 4,5-
diaminofluoreceina diacetato (DAF-2 DA) em microscópio ótico de fluorescência
(Zeiss Axioplan com câmera digital Canon A640 acoplada). Raízes de plântulas
de tomate com 5 dias de idade tratadas por 72h foram mantidas em tampão 10
77
mM de Hepes-BTP pH 7,5 com 10 µM da sonda DAF-2 DA por 40 minutos. As
amostras foram lavadas 3 vezes com o tampão Hepes-BTP e analisadas em
seguida no microscópio (excitação: 488 nm, emissão: 495-575 nm). As imagens
foram analisadas pelo programa ImageJ
TM
. Raízes sem adição DAF-2 DA foram
utilizadas como controle negativo. As características de obtenção de imagens
pela câmera foram mantidas idênticas durante a aquisição de todas as imagens e
não sofreram nenhum tipo de processamento ou tratamento. Pelo menos 5
amostras foram analisadas em 4 experimentos independentes.
Expressão relativa de RNAm
Extração de RNA total
Foram macerados 100-200 mg de tecido radicular fresco com auxílio de
almofariz e pistilo, na presença de N
2
líquido. O macerado foi transferido para
tubos de microcentrífuga (1,5 mL) novos e livres de RNAse. Ao material foi
adicionado 1 mL do reagente TRIZOL (Life Technologies). Em seguida, a amostra
foi centrifugada a 12000 g por 10 minutos a 8 °C e o sobrenadante transferido
para um novo tubo. Foi adicionado a este 500 mL de clorofórmio, sendo o tudo
levado à agitação por 2 min à temperatura ambiente. Logo após, foi realizada
outra centrifugação a 12000 g por 15 minutos a 8 °C, sendo o sobrenadante
transferindo para outro tubo, ao qual foi adicionado 500 mL de isopropanol. O
material foi misturado por inversão e incubado por 10 minutos à temperatura
ambiente. Posteriormente, a mistura foi centrifugada a 12000 g, 10 min e 8 °C,
descartando-se, em seguida, o sobrenadante e adicionando-se sobre o sedimento
resultante 1 mL de etanol 75 % e agitado. A amostra foi novamente centrifugada,
7500 g por 5 minutos a 4 °C e o sobrenadante descartado. O sedimento foi seco a
37 °C por aproximadamente 10 minutos, sendo posteriormente ressuspenso com
50 mL de água-DEPC. Uma alíquota (1 mL) de cada amostra de RNA total foi
submetida à eletroforese em gel de agarose-DEPC 1 % para quantificação,
fotodocumentação e confirmação da qualidade. O material restante foi
armazenado em freezer -70 °C até o momento de uso posterior.
Transcrição Reversa (RT) seguida da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
78
Foram utilizados 1-2 µg de RNA total para produção de cDNAs. A síntese
foi realizada com o kit High capacity cDNA Reverse transcription (Applied
Biosystems, USA). Uma PCR com gradiente de temperatura foi realizada a fim de
confirmar a especificidade dos primers e a temperatura de melting real. Foi
realizada a eletroforese em gel de agarose 1.2 % com tampão TAE para a
confirmação dos produtos de PCR com os primers específicos (Tabela 1).
O cDNA sintetizado descrito no item anterior foi utilizado como molde
para as reações no termociclador Light Cycler 1.5 (Roche). Os componentes da
reação foram preparados para a concentração final indicada: 2.4 µL de MgCl
2
(4
µM), 0,6 µL do primer direto (0,6 µM), 0,6 µL do primer reverso (0,6 µM), 2 µL do
componente LightCycler e 13 µL de água ultrapura. Os 19 µL do meio foram
adicionados ao capilar o vidro e adicionado 1 µL de cDNA.
As expressões relativas do RNA mensageiro (RNAm) dos genes de
interesse LHA4 (Lycopersicum esculetum H
+
-ATPase isoforma 4 de membrana
plasmática) e do controle endógeno TUB (TUBulina) (tabela 1) foram comparadas
utilizando-se um teste não paramétrico de modo pareado fixo de realocação ao
acaso (Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test®) como descrito por
Pfaffl et al. (2001 e 2002).
Delineamento experimental e análises estatísticas
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado (DIC)
com 5 repetições por tratamento, ambos os experimentos, de 1 ou 7 dias,
foram realizados três vezes. Foi realizada a análise de variância (ANOVA) para a
avaliação de todas as características. Os experimentos comparativos entre
plantas silvestres (wt) e sitiens foram analisados estatisticamente usando o teste t
(P< 0,05). A diferença entre mais de dois tratamentos em relação foi determinada
pelo teste de média DMS (P < 0,05). As análises foam realizadas no programa
Sisvar (Ferreira, 1999).
7 9
Tabela 1. Informações das seqüências de primers utilizados nos experimentos.
Definição da seqüência
Número de
acesso
GenBank
Tamanho
produto
(pb)
Nome do
primer
Seqüência do primer
Forward
5’-TGGATTGCTACCCCTCTTTG-3’
L. esculentum plasma P-ATPase
(LHA4) gene, mRNA sequence
U72148
148
LHA4
Reverse
5’-TATTCCCATTCCAAGCCTAC-3’
Forward
5’-ACTGGAGCTGGAAAGCATGT-3’
S. lycopersicum cDNA clone Tubulin
alpha chain, mRNA sequence
BG791276
99
TUB
Reverse
5’-GTGAAAGAGCTGCCGGTAAG-3’
80
Resultados
A Fig.1 é uma foto ilustrativa na qual é possível observar as diferenças do
fenótipo entre as plantas wt e mutantes.
A lâmina foliar do tomateiro apresenta-se anfiestomática e a superfície
coberta por cutícula na superfície adaxial e abaxial (Fig. 2). Em secção
transversal, ambos os genótipos exibem epiderme unisseriada com células de
formato tabular, recobertas por uma cutícula delgada. Os estômatos em plano
transversal revelam que suas células estomáticas se localizam ligeiramente acima
do nível das demais células epidérmicas.
Em estudos anatômicos foi possível observar modificações anatômicas na
planta mutante (sitiens) quando comparada à planta wt. Em corte transversal da
lâmina foliar apresenta-se o mesofilo dorsiventral consistindo de parênquima
fotossintetizante diferenciado em parênquima paliçádico e lacunoso. Nas plantas
wt o parênquima paliçádico é formado por 2 a 3 estratos de células subjacentes à
epiderme adaxial. Suas células estão dispostas perpendicularmente à superfície
da lâmina foliar e apresentam poucos espaços intercelulares. Próximo à epiderme
abaxial encontra-se o parênquima lacunoso, formado por 4 a 5 estratos de células
com formas e disposição irregulares, gerando espaços celulares de dimensões
variadas. Enquanto na planta mutante o parênquima paliçádico é formado por 1 a
2 estratos de células subjacentes à epiderme adaxial, dispostos não tão
perpendicularmente à superfície da lâmina foliar e apresentam muitos espaços
intercelulares. O parênquima lacunoso é formado por 3 a 4 estratos de células
com formas e disposição irregulares e, comparativamente à planta wt, apresenta
menor compactação (Fig. 2).
A epiderme adaxial apresenta-se encurtada na planta mutante em 25 %,
entretanto, não foi estatisticamante diferente da planta wt (Tabela 2). Já a
epiderme abaxial apresenta-se estatisticamente menor que a planta wt. A
espessura da lâmina foliar e do mesofilo encontrado no mutante é 36 % menor
que o encontrado na planta wt. A espessura do parênquima paliçádico e
esponjoso é cerca de 40 % e 35 % menos espesso, entretanto, a espessura do
parênquima esponjoso não distinguiu estatisticamente da planta wt (Tabela 2).
Foi observado que a condutância estomática e a taxa de transpiração são
maiores no mutante apresentando taxas de 63 % e 23 %, respectivamente,
81
maiores que no genótipo wt. A taxa de fotossíntese líquida encontrada no
genótipo wt foi de 20 µmol. m
-2
. s
-1
e no mutante de 16,9 µmol. m
-2
.s
-1
, não sendo
diferentes estatisticamante. O déficit de pressão de vapor entre a folha e o ar
(DPV) foi maior no sitiens apresentando valor 56 % maior que genótipo wt (Fig. 3).
Os parâmetros de fluorescência da clorofila a Fv/Fm, qP, qN, NPQ e TRTE
foram analisados em plantas wt e mutantes. Os resultados mostram que a razão
Fv/Fm e Fv’/Fm’ foi menor em plantas mutantes em todos os pontos da curva de
luz (Fig. 4A). Os valores de NPQ e qN foram superiores em plantas sitiens em
todos os pontos da curva de luz (Fig. 4B e 4D). As plantas mutantes
apresentaram valores de qP menores que os encontrados em plantas wt (Fig.
4C).
As dosagens de açúcares solúveis em raízes mostraram que as
concentrações destes foram maiores no sitiens (Fig. 5). A concentração de
glicose no sitiens foi 74 % maior que no genótipo wt. As plantas mutantes também
apresentaram aumento no teor de frutose e sacarose em 115 %, 50 %,
respectivamente. Resultados semelhantes foram encontrados nas folhas
analisadas (Fig. 6). O sitiens apresentou as maiores taxas dos açúcares
analisados, havendo incremento de 126 %, 82 % e 64 % em glicose, frutose e
sacarose, respectivamente
A concentração de clorofila a não diferiu estatisticamente entre os
genótipos (Fig. 7A). O genótipo wt apresentou pouca modificação no conteúdo de
clorofila a quando tratado com NaCl, com redução não significativa de 5%.
Entretanto, quando as plantas do genótipo mutante foram submetidas à salinidade
houve redução significativa de 24 % desta característica. O doador de ON reduziu
o efeito do sal mantendo o nível de clorofila a semelhante ao controle na planta
sitiens. O tratamento NaCl+SNP+PTIO reduziu os teores de clorofila a em 27 %
na planta mutante.
O mutante sitiens possui a concentração de clorofila b 5 % maior que o
conteúdo encontrado nas plantas wt, entretanto, este acréscimo não é
significativo. O tratamento salino reduziu de forma não significativa a
concentração deste pigmento em ambos os genótipos. Os resultados com o
tratamento com SNP ou NaCl+SNP+PTIO não deferiram do tratamento salino
(Fig. 7C).
82
O teor de carotenóides encontrado no genótipo mutante é 40 % maior que
no genótipo wt, entretanto, esta concentração não foi considerada
estatisticamente diferente. As plantas wt praticamente não apresentaram
modificações no conteúdo de carotenóides totais com o tratamento salino. Plantas
mutantes tratadas com NaCl ou NaCl+SNP ou NaCl+SNP+PTIO apresentaram
aumento não significativo dos teores de carotenóides quando comparado ao
controle, já quando comparado com planta controle wt ou tratada com NaCl
apresenta-se estatisticamente maior na planta mutante. O genótipo wt não
apresentou variações nas concentrações de carotenóides com os tratamentos
NaCl+SNP ou NaCl+SNP+PTIO (Fig. 7C).
Os níveis de malondialdeído (MDA) de raízes foram aumentados de forma
não siginicativa no genótipo wt, já no genótipo mutante o tratamento salino
apresentou acréscimo significativo de 60 %. O tratamento NaCl+SNP em plantas
wt teve os níveis de MDA semelhantes ao controle, já nas plantas mutantes este
tratamento reduziu os efeitos do NaCl mantendo os níveis de MDA semelhantes
ao controle. O tratamento com NaCl+SNP+PTIO não alterou a concentração de
MDA nas plantas wt mais aumentou signficativamente nas mutantes (Fig. 8 A).
O tratamento salino aumentou os teores de MDA em folhas de plantas wt e
no mutante em 29 % e 35 %, respectivamente. Entretanto, o aumento foi
significativo somente nas plantas mutantes (Fig. 8 B). O ON reduziu os efeitos
gerados pelo sal, onde a concentração de MDA foi semelhante ao controle em
ambos os genótipos. O tratamento com NaCl+SNP+PTIO não diferiu no genótipo
wt mas aumentou significativamente os níveis de MDA nas folhas das plantas
mutantes.
A integridade da raiz na planta mutante é cerca de 10 % menor em
comparação com a planta wt, entretanto, esta diferença não é significativa (Fig. 9
A). Quando as plantas foram submetidas ao tratamento salino não houve redução
significativa da integridade da raiz da planta wt, mas isto ocorreu na planta
mutante com redução de 21 %. O tratamento com SNP em conjunto com NaCl
minimizou os efeitos da salinidade nas raízes, reduzindo pela metade a perda de
integridade em plantas wt. Em plantas mutantes a perda de integridade reduziu
para 13 % em relação ao controle.
A integridade de folhas nas plantas mutantes apresenta-se 20 % inferior às
plantas wt, entretanto, esta diferença não foi significativa (Fig. 9 B). O tratamento
83
salino reduziu drasticamente a integridade na planta mutante, cerca de 70 %, não
sendo alterada na planta wt. O tratamento com o doador de ON reduziu os efeitos
do sal em plantas mutantes, com redução da perda de integridade. As plantas wt
tratadas com NaCl+SNP+PTIO apresentaram valores semelhantes ao controle, já
nas plantas mutantes houve redução significativa de 48 %.
As atividades de enzimas antioxidantes em plantas sitiens possuem a
atividade superior à encontrada nas plantas wt. A enzima catalase (CAT)
apresentou atividade 3 vezes maior em sitiens comparadas a wt (pelo teste t). O
tratamento salino aumentou de forma significativa a atividade da enzima CAT das
plantas wt, 73 %, entretanto, não alterou a atividade desta enzima nas plantas
mutantes. O ON aumentou significativamente em 2,5 vezes a atividade de CAT
em plantas wt, já nas plantas mutantes a indução foi de apenas 31 %. (Fig. 10 A e
10-B).
As plantas sitiens possuem a atividade da enzima guaiacol peroxidase
(GPX) quase 4 vezes superior à da planta wt (pelo teste t). O tratamento salino
aumentou em 1,5 vezes a atividade de GPX em plantas wt, já a planta mutante
teve acréscimo não significativo de 32 % na atividade desta enzima (Fig. 10 C e
10 D). As plantas que foram tratadas com SNP exibiram a atividade enzimática 2
vezes maior que a planta controle, havendo o incremento não significativo de
apenas 24 % nas plantas sitiens. O tratamento salino em conjunto ao SNP
aumentou 1,4 vezes a atividade desta enzima em plantas normais e 32 %, de
forma não significativa, em plantas mutantes. O tratamento com tungstato, inibidor
da atividade da RN e da produção de ABA, ou o tratamento de tungstato+sal não
alterou significativamente a atividade da enzima em ambos os genótipos.
A antioxidante ascorbato peroxidase (APX) apresentou maior atividade em
plantas mutantes, cerca de 80 % maior que a encontrada em plantas wt (pelo
teste t). Plantas wt submetidas à salinidade apresentaram acréscimo de 46 % na
atividade desta enzima, já as plantas mutantes apresentaram aumento de 93 %
(Fig. 10 E e 10 F). O tratamento com o doador de óxido nítrico, o SNP, aumentou
em 96 % e 93 % a atividade em plantas wt e mutantes, respectivamente. A
atividade de APX com o tratamento NaCl+SNP foi aumentada 47 % em plantas wt
e 100 % em plantas mutantes. O tratamento com tungstato não alterou
significativamente a atividade da enzima APX em ambos os genótipos. A
84
combinação NaCl+ tungstato não alterou a atividade em plantas wt e resultou na
indução de 88 % da atividade encontrada nas plantas mutantes.
A redutase do nitrato de raiz de sitiens apresentou atividade 20 % inferior a
wt, entretanto, não sendo estatisticamente diferente (Fig. 11 A). O estresse salino
reduziu de forma não significativa, a atividade de RN em plantas wt. Já nas
plantas mutantes a atividade foi reduzida significativamente em 42 %. O SNP
aumentou de forma não significativa a atividade em ambos os genótipos. As
plantas sitiens submetidas ao tratamento NaCl+SNP tiveram redução não
significativa da atividade de RN. O tratamento SNP+PTIO não diferiu dos
controles em ambos os genótipos. O tratamento com o inibidor da atividade de
RN, tungstato, reduziu a atividade em 36 e 22 % em wt e sitiens. A atividade da
RN em plantas submetidas ao tratamento NaCl+SNP+PTIO foi reduzida de forma
não significativa em ambos os genótipos.
O NaCl reduziu a atividade da RN em folhas em 48 % no genótipo wt e 56
% no mutante (Fig. 11 B). Plantas wt tratadas com SNP tiveram aumento de 32 %
na atividade da RN, já nas sitiens este aumento foi de 54 %. O tratamento
NaCl+SNP reduziu a atividade de RN em 15 %, 2 % em plantas wt e mutante,
respectivamente, mantendo a atividade desta enzima semelhante ao da planta
controle. O tratamento SNP+PTIO não alterou e reduziu a atividade de RN de
forma significativa. A atividade da RN foi reduzida por seu inibidor em 45 % e 56
% em wt e sitiens. O tratamento NaCl+SNP+PTIO reduziu a atividade da RN em
44 % nas plantas WT e 53 % nas plantas sitiens.
A atividade hidrolítica da H
+
-ATPase tipo P em raízes de plantas wt foi
incrementada em 2 vezes pelo tratamento salino e SNP (Fig. 12 A). A atividade
desta enzima nas plantas tratadas com SNP+PTIO e PTIO, não foi alterada de
forma significativa. O tratamento NaCl+SNP induziu a hidrólise em quase 3 vezes.
O transporte de H
+
foi aumentado pelo tratamento com sal ou com SNP. O
aumento em ΔF (quantidade de prótons transportados) e na velocidade inicial de
transporte de prótons (V
0
) com o tratamento salino foi 48 % e 29 %,
respectivamente. O tratamento com SNP aumentou o ΔF em 26 % e a V
0
em 35
%. O tratamento com SNP+PTIO aumentou em 21 % o ΔF e não modificou a V
0
.
O tratamento NaCl+SNP aumentou o ΔF e a V
0
em 41 % e 61 %, respectivamente
(Fid. 12 B).
85
A V-ATPase apresentou atividade incrementada pelo tratamento salino, e
pelo doador de ON, entretanto, não foi significativa (Fig. 12 C). O tratamento com
NaCl induziu a 42 % a atividade hidrolítica de V-ATPase em raízes. Plantas
tratadas com SNP apresentaram indução de 67 % na atividade hidrolítica desta
enzima. A H
+
-ATPase vacuolar foi induzida em 17 % por SNP+PTIO e reprimida
em 58 % pelo tratamento com PTIO somente. O tratamento com sal e o doador
de ON induziu a atividade desta enzima em 82 %. O ΔF observado para a V-
ATPase aumentou 1,7 vezes em plantas tratadas com NaCl e 1 vez no tratamento
com SNP. Plantas tratadas com SNP+PTIO tiveram o transporte reduzido em 50
%. O tratamento NaCl+SNP aumentou em 2,5 vezes o ΔF. A V
0
foi aumentada em
77 % e 31 % por NaCl e SNP, respectivamente. A V
0
de plantas tratadas com
SNP+PTIO foi reduzida em 37%. Plantas que foram tratadas com NaCl+SNP
tiveram incremento de 100 % na Vo desta enzima (Fig. 12 D).
A atividade hidrolítica da V-PPase foi aumentada por NaCl e NaCl+SNP em
1,4 vezes e por SNP em 1,8 vezes. O tratamento com SNP+PTIO induziu em 75
% a hidrólise e o tratamento com PTIO reduziu a atividade em 47 % (Fig. 12 E). O
transporte de prótons promovidos pela V-PPase apresentou o ΔF e a Vo
aumentados em 52 % e 43 % pela salinidade. O mesmo aconteceu em plantas
tratadas com SNP apresentando acréscimos de 31 % e 35 % em ΔF e Vo,
respectivamente. O tratamento com SNP+PTIO resultou na redução de 32 % em
ΔF não havendo diferenças em V
0.
Plantas submetidas ao NaCl +SNP
apresentaram 58 % de aumento em ΔF e uma Vo 75 % maior (Fig. 12 F).
Nas plantas mutantes a atividade hidrolítica de P-ATPase em raiz
apresentou-se maior durante o tratamento salino, cerca de 1,5 vezes e durante o
tratamento com SNP 2,5 vezes. (Fig. 13 A). O tratamento NaCl+SNP aumentou
2,7 vezes a atividade hidrolitica de P-ATPase. O tratamento SNP+PTIO não
alterou a atividade desta enzima.
A atividade hidrolitica da V-ATPase em raízes de plantas mutantes não foi
alterada com o tratamento salino, entretanto, aumentou com o tratamento com
SNP em 52 %. O tratamento salino combinado ao SNP resultou em uma atividade
29 % maior. O tratamento com SNP+PTIO aumentou a hidrólise cerca de 10 %
(Fig. 13 B).
A V-PPase apresentou indução da atividade no tratamento com NaCl e
SNP, cerca de 25 %. O tratamento destes dois tratamentos em conjunto resultou
86
em aumento de 13 % e o tratamento com SNP+PTIO não diferiu do controle (Fig.
13 C). Não foi possível obter vesículas com atividade de transporte de H
+
nas
raízes de plantas mutantes (Fig. 13 A).
O tratamento salino em wt aumentou a fluorescência em cerca de 20 %,
mostrando que possivelmente o estresse salino induz a produção de ON nestas
plantas (Fig. 14). O tratamento com PTIO reduziu a fluorescência em 40 %. O
tungstato, L-Name e o tratamento combinado de ambos reduziram a fluorescência
em 35 %, 20 % e 40 %, respectivamente.
O tratamento salino reduziu a produção de ON nas plantas sitiens em 50
%. Os inibidores, tungstato e L-Name reduziram em 15 % e 30 % a fluorescência.
O tratamento combinando os dois inibidores resultou no decréscimo de 38 %, e o
seqüestrador de ON reduziu o sinal em 15 % (Figura 15).
Foi observado que o tomateiro sitiens apresenta 3 vezes o nível de RNAm
da H
+
-ATPase de membrana plasmática (LHA4) nas raízes do tomateiro em
comparação ao wt através de análise de RT-qPCR em tempo real (Fig. 16). O
LHA4 aumentou cerca de 4 vezes devido ao ON em plantas wt e apenas 25 % em
plantas sitiens. Já a exposição ao NaCl aumentou em 50 % o nível de LHA4 em
plantas wt, enquanto que o nível do RNAm desse gene nos mutantes não foi
alterado.
O aspecto visual das folhas de plantas wt e sitiens sob os diferentes
tratamentos é apresentado na figura 17.
Os resultados estão resumidos no esquema representado na figura 18.
Discussão
As plantas mutantes apresentam a lâmina foliar significativamente menos
desenvolvida em comparação às plantas wt, principalmente em função do menor
desenvolvimento dos parênquimas paliçádico e lacunoso (Fig. 2). Nas plantas
mutantes nota-se também no mesofilo um arranjo menos desenvolvido e menos
compactado, conseqüentemente formando um mesofilo composto por um menor
número de células (Fig. 2, Tabela 2).
Resultados próximos a estes foram observados no mutante pac, que
possui redução da produção de clorofila e ABA. Nestas plantas há redução do
número de células no mesofilo e aumento do espaço entre estas. Como o ABA
87
parece estar envolvido na diferenciação do mesofilo em parênquima esponjoso e
paliçádico, é atribuído a este hormônio parte do desenvolvimento anormal deste
mutante, entretanto, deve ser ressaltado que estas plantas possuem também
outras carateristicas, como a redução da produção de clorofila que afeta também
a diferenciação do mesofilo (Holding, et al., 2000).
Unyayar et al., (2004) observaram que quando plantas de tomateiro
mutantes na produção em ABA, notabilis, foram tratadas com ABA exógeno havia
um acréscimo no número de vasos do xilema. A aplicação de ABA reduziu a área
foliar e o tamanho das células da epiderme de Triticum aestivum (Quarrie e
Jones, 1977). Em Tradescantia virginiana a aplicação de ABA parece estar
relacionada ao aumento do número de estômatos e a da espessura e área foliar
(Franks e Farquhar, 2001). Plantas mutantes exibem área foliar reduzida além de
ter menor massa seca e fresca quando comparada à planta wt (Tal, 1966).
O ABA tem sido relacionado ao desenvolvimento de raízes, caule e folhas.
Entretanto, poucos trabalhos trazem o estudo anatômico em plantas mutantes na
produção desse hormônio. A maior parte dos trabalhos estuda o efeito da
aplicação exógena de ABA na anatomia e não a sua ausência endógena ou
mesmo sensibilidade reduzida, havendo, portanto, pouquíssima literatura para
utilizar como exemplo em comparações.
As taxas fotossintéticas encontradas não diferiram entre os genótipos,
havendo um pequeno decréscimo nas plantas mutantes (Fig. 3A). Este
decréscimo apesar de não significativo poderia ser explicado pelo aumento da
concentração de sacarose encontrada nas folhas da planta mutante (Fig. 6),
sendo este um fator importante na modulaçao da fotossíntese (Price et al., 2004;
Gupta e Kaur, 2005).
A condutância estomática nas plantas mutantes é superior à encontrada na
wt (Fig. 3D), sendo isto claramente explicado pelas baixíssimas concentrações de
ABA (Holbrook et al., 2002; Makelã et al., 2004). Estas plantas apresentam
potencial de água extremamente baixo, com baixo turgor e condutância hidráulica
(Nagel et al., 1994). Como o turgor celular é importante para o fechamento
estomático, estas plantas possuem seus estômatos permanentemente abertos no
escuro, quando as folhas estão murchas ou mesmo quando são tratadas com
acetato de fenilmercúrio, um indutor do fechamento estomático (Tal, 1966). A taxa
88
de transpiração em plantas mutantes encontrada é explicada pela elevada
condutância estomática, favorecendo a perda de água pelos estômatos (Fig. 3C).
A razão Fv/Fm indica a proporção de luz absorvida pela clorofila a e que
possivelmente foi utilizada em atividade fotoquímica, como tal, informa a
quantidade de elétrons transportados, sendo um indicativo da fotossíntese (Baker
e Rosenqvist, 2004). Foram observadas diferenças significativas entre os
genótipos do rendimento quântico potencial representado pela razão Fv/Fm. O
parâmetro Fv’/Fm’, que indica a eficiência fotoquímica efetiva, também mostrou-
se menor no genótipo mutante (Fig. 4A). Estes resultados podem ser atribuídos
às características deste genótipo como, o baixo conteúdo relativo de água que
afeta de forma considerável proteínas relacionadas à fotossíntese (Chaves et al.,
2002)
A relação Fv/Fm é determinada pela rapidez na remoção ou transferência
de elétrons da quinona receptora do FSII. Baixas taxas de TRTE refeltem na
redução de Fv/Fm, estes fatos são relacionados com a taxa de consumo dos
produtos do transporte fotossintético de elétrons, ATP e NADPH. O decréscimo
na eficiência de carboxilação pode ser um dos fatores que explicam a redução da
taxa de consumo de ATP e NADPH (Baker e Rosenqvist, 2004). A restrição no
consumo de elétrons pode resultar em decréscimo de Fv/Fm e aumento de NPQ.
Plantas mutantes apresentaram redução em Fv/Fm, maior NPQ e redução na
TRTE (Fig. 4). Maiores valores de NPQ podem indicar uma menor eficiência de
utilização da energia no ciclo de Calvin.
A plantas mutantes também apresentaram menor qP (Fig. 4C). O qP
representa a extinção da fluorescência para processos fotoquímicos, ou que mais
energia foi extinta em processos primários das reações fotoquímicas. Maior qP
sugere que a ativação das enzimas de carboxilação foi mais rápida na planta wt
(Krause e Weis, 1991). Desta forma, pode ser afirmado que a eficiência do
fotossistema de plantas mutantes é deficitária, além disto, devido a elevadas
taxas de transpiração, possivelmente a eficiência do uso da água durante a
fotossíntese é muito menor, sendo este um dos fatores que contribuem para as
características destas plantas para redução do crescimento e desenvolvimento
nestas plantas.
Plantas mutantes apresentaram altas concentrações de açúcares solúveis
nas folhas e raízes em comparação com as plantas wt (Figs. 5 e 6). O aumento
89
das concentrações destes açúcares pode estar relacionado ao ajuste osmótico
nestas plantas. O acúmulo de açúcares é relatado em algumas plantas e parece
estar relacionado à resistência destas ao estresse osmótico (Chaves et al., 2008).
Neste caso, mesmo sem o estresse abiótico, o acúmulo se deve à tentativa de
manter o equlibrio osmótico celular devido à condutância estomática e taxas de
transpiração destas plantas (Tal, 1966).
A redução na concentração de clorofila é um dos efeitos primários da
salinidade sobre a fotossíntese durante o estresse salino (Salama et al.,1994). O
tratamento salino reduziu as concentrações de clorofila a de forma significativa
nas plantas mutantes, entretanto, não na planta wt. (Fig. 7B). A redução dos
teores de clorofila durante o estresse osmótico é resultante do aumento na
degradação ou inibição da síntese deste pigmento (Sultana et al., 1999; Santos,
2004). A redução dos pigmentos fotossintéticos é relatada principalmente em
genótipos mais sensíveis a mudanças osmóticas (Moran et al., 1994; Loggini et
al., 1999).
O tratamento com o doador de ON manteve as concentrações de clorofila a
em plantas mutantes tratadas com NaCl semelhante ao controle. Resultados
semelhantes foram encontrados por Zhang et al., (2006), no qual plantas de milho
tratadas com NaCl tiveram redução dos teores de clorofila total, sendo este efeito
revertido pelo tratamento com SNP. Graziano et al., (2002) observaram aumento
da concentração de clorofila pelo tratamento com SNP em plantas deficientes em
ferro, sendo este aumento acompanhado pelo acúmulo de transcritos da proteína
D1 e de uma subunidade de rubisco.
Os carotenóides são pigmentos acessórios na absorção e transferência de
energia radiante, e protetores da clorofila no tocante à foto oxidação (Gilmore,
1997). O teor de carotenóides encontrado em plantas sitiens é maior que o
encontrado em plantas wt, sendo este acrescido com o tratamento salino (Fig.
7C). A via de produção de ABA tem como precursor os carotenóides, sendo esta
talvez a explicação para acúmulo dos precursores em plantas mutantes na
produção deste hormônio. O carotenóide zeaxantina é um dos percursores na
rota de síntese de ABA, está presente em altas concentrações em plantas
mutantes de Arabdopisis na produção de ABA (aba) (Rock e Zeevaart, 1991;
Rock et al., 1992).
90
Plantas submetidas à salinidade apresentam aumento na produção de
espécies reativas de oxigênio (EROs) que reagem com lipídicos produzindo
compostos como o malondialdeído (MDA). Em decorrência da peroxidação
lipídica, os níveis de MDA aumentam durante o estresse e, portanto são utilizados
como indicativo de danos sofridos pelos tecidos vegetais (Hernandez e Almansa,
2002). Plantas mutantes tiveram aumento significativo das concentrações de MDA
em raízes e folhas com o tratamento salino (Fig. 8) Estas plantas são sensíveis ao
estresse salino (Makelã et al., 2004), devido à baixa condutância hidráulica e
reduzido potencial de água nas folhas e raízes. Possivelmente devido ao estresse
iônico combinado ao estresse osmótico gerado houve maior indução de espécies
reativas de oxigênio resultando em maiores concentrações de MDA.
O aumento de MDA em plantas mutantes também pode indicar menor
proteção e eficiência dos mecanismos de eliminação de radicais livres contra os
danos oxidativos gerados pelo estresse salino. Interessante ressaltar que a
atividade de enzimas antioxidantes nas plantas mutantes é muito maior que a
encontrada em plantas wt, entretanto, a porcentagem de aumento destas
atividades durante o estresse salino foi menor nas plantas mutantes, com
exceção da APX (Fig. 10C). Possivelmente a produção de radicais livres, como o
peróxido, é alta nestas plantas explicando, desta forma, a alta atividade das
enzimas em condições normais de crescimento Estas plantas mutantes
apresentaram altas taxas de produção de peróxido, entretanto, durante o estresse
biótico (Asselbergh et al., 2007), sendo portanto necessário o estudo das
concentrações deste radical livre também em condições de estresse abiótico
O tratamento com SNP minimizou os efeitos do sal sobre a peroxidação
lipídica das plantas mutantes (Fig. 8), sendo este efeito atribuído ao aumento de
enzimas antioxidantes geradas pelo tratamento com ON (Fig. 10). Resultados
semelhantes foram observados por Li et al., (2008) e Zhao et al., (2007), no qual
foi verificado a redução dos níveis de MDA em plantas tratadas com um doador
de ON.
A integridade em raízes e folhas foi afetada pelo estresse salino em ambos
os genótipos havendo redução significativa apenas em plantas mutantes (Fig. 9).
A integridade em folhas de plantas mutantes foi drasticamente afetada pela
salinidade, talvez por ser esta, a área que foi primeiramente e intensamente
afetada durante estresse osmótico (Jia et al., 2002). O tratamento com doador de
91
ON minimizou os efeitos do sal. (Fig. 9), possivelmente por reduzir o estresse
oxidativo gerado (Fig. 10). Resultados semelhantes foram encontrados em folhas
de milho expostas ao estresse salino no qual foi observado a redução do
extravasamento de eletrólitos, ou seja manutenção da integridade de membranas,
pelo tratamento com SNP (Zhang et al., 2006; Li et al., 2008).
A atividade de enzimas antioxidantes foi estimulada pelo sal no genótipo
wt, entretanto, no mutante deficiente na produção de ABA o tratamento salino não
causou mudanças significativas (Fig. 10). O ABA é relatado como sinalizador da
via de indução de enzimas antioxidantes (Jiang e Zhang, 2001), entretanto, há
controvérsias da participação deste hormônio e das EROs na indução dos
mecanismos antioxidativos. Existem trabalhos no qual o ABA induz a produção de
EROs, ou seja, este hormônio atua upstream das EROs na via de indução e
expressão de enzimas antioxidantes (Guan e Scandalios, 2000; Jiang e Zhang,
2002; Zhang et al., 2006; Zhang et al., 2007). Entretanto, há autores que
acreditam que a produção de ABA é estimulada pela presença das EROs durante
o estresse, sendo a atuação deste hormônio downstream às EROs (Shninozaki e
Yamaguchi-Schinozaki, 1997). De acordo com os resultados encontrados
possivelmente durante o estresse, a presença de ABA é necessária para indução
da atividade de enzimas antioxidantes (Fig. 10), sendo este fato comprovado com
o inibidor da síntese de ABA, o tungstato. Na figura 10 pode ser observado que o
tratamento salino combinado ao tungstato inibiu a ação promovida pelo NaCl,
sendo possível inferir que a atuação do ABA seria upstream das EROs na
indução das enzimas antioxidantes. Nas plantas mutantes onde a produção de
ABA é baixa, o tratamento com sal ou sal+tungstato não modificou a atividade
enzimática. Entretanto, assim como na planta wt, o ON induziu em sitiens a
atividade de todas as enzimas analisadas, evidenciando a participação de ON
abaixo (downstream) do ABA e que possivelmente há rotas de indução de
enzimas antioxidantes independentes da produção de ABA, uma vez que plantas
mutantes apresentam alta atividade destas enzimas.
A “produção” de ON é elevada em plantas sitiens, sendo esta molécula
possivelmente a responsável pelas altas atividades destas enzimas em uma rota
independente da produção de ABA, entretanto, há necessidade de novos
experimentos para investigar esta hipótese. Estes resultados estão de acordo
com Zhang et al., (2007), no qual o óxido nítrico induzido por H
2
O
2
na via de
92
sinalização promovida pelo ABA parece atuar como indutor da atividade de
enzimas antioxidantes.
O tratamento salino reduziu a atividade da enzima RN em ambos os
genótipos (Fig 11), entretanto, a atividade em raízes de plantas wt não foi afetada
signficativamente (Fig. 11 A). O decréscimo em ambos os genótipos foi maior nas
folhas, semelhante aos resultados encontrados por Debouba et al., (2007), no
qual estes autores observaram a redução da atividade da RN nas folhas mas não
nas raízes de tomate durante o estresse salino.
Nas plantas mutantes houve o decréscimo da atividade de RN também nas
raízes possivelmente devido a estado osmótico desta planta que afeta de maneira
significativa a atividade desta enzima (Viegas et al., 1999). O estresse salino além
de alterar a osmolaridade celular (Viegas et al., 1999), reduz a concentração de
nitrato, sendo este um dos fatores atribuídos à inibição da atividade desta enzima
(Abd-El Baki et al., 2000; Debouba et al., 2007).
A fluorescência relativa à presença de ON foi aumentada com o tratamento
salino no genótipo wt (Fig. 14), resultados semelhantes foram encontrados por
Zhang et al., (2006), que observaram o aumento transiente de ON em folhas de
milho tratadas com NaCl. Durante o estresse salino as concentrações de ABA e
EROs aumentam nas raízes e estas duas moléculas têm sido correlacionadas
positivamente com o aumento de ON (Zhang et al., 2007). O tratamento com
tungstato, o inibidor da síntese de ABA e da enzima RN, reduziu
significativamente a fluorescência, mostrando que esta enzima, bem como
provavelmente a presença de ABA, é responsável em parte pela síntese de ON
em plantas wt sob condições normais e possivelmente durante o estresse salino.
A planta mutante apresenta maior fluorescência de DAF-2 que as plantas
wt (pelo teste t). Entretanto, na presença de NaCl, houve a redução da
fluorescência (Fig.15). Este fato pode ser atribuído à redução drástica da
atividade da RN durante o estresse salino nestas plantas e a falta da produção de
ABA nestas condições (Fig. 11). O tratamento com tungstato também reduziu
parcialmente a fluorescência durante condições normais mostrando que a RN
esta relacionada à sintese de ON nestas plantas.
Com base nos resultados pode-se inferir que a RN é responsável pelo
acréscimo de ON nas raízes durante o estresse salino, entretanto, não pode ser
descartada a hipótese da participação de NOA1 na produção de ON durante o
93
estresse salino, uma vez que Zhao et al., ( 2004), obseraram a redução da
atividade de NOA e da fluorescência de DAF durante o estresse em raízes de
Arabidopsis.
Dentre os processos de resposta ao estresse salino estão a
compartimentalização do Na
+
no vacúolo e sua exclusão do citoplasma, ambos
altamente dependentes do gradiente eletroquímico gerado pelas bombas de H
+
nas membranas celulares (Binzel e Ratajczak, 2002). Tanto a atividade de
hidrólise das bombas quanto o transporte de H
+
realizado por elas foram
estimulados pela aplicação exógena de NaCl (Fig. 12). A regulação da H
+
-ATPase
de membrana e de vacúolo, bem como a da H
+
-PPase vacuolar em resposta ao
NaCl foi demonstrada por outros autores (Matsumoto e Chung., 1988; Barkla et
al., 1999; Zhang et al., 2006; Janicka-Russak et al., 2007). A ativação dessas
enzimas durante a exposição ao sal poderia ser mediada por ON? Os resultados
de Zhao et al., (2004) sugerem que sim. Os autores demonstram que existe uma
ativação da H
+
-ATPase de membrana plasmática tanto sob tratamento com NaCl
quanto com SNP em calos de Phragmites communis resistentes à salinidade.
Quando aplicados em conjunto, SNP e sal ativaram ainda mais a ATPase. Os
calos não resistentes mantiveram um nível alto de ativação quando sal e SNP
foram aplicados em conjunto, mas ainda menor do que a aplicação isolada de
NO. Nesse caso é possível que o NO tenha induzido a uma maior resistência ao
estresse na espécie suscetível. O ON foi capaz de aumentar o transporte de H
+
de maneira semelhante ao sal (Fig. 12). A aplicação conjunta de NaCl e NO
aumentou a atividade de hidrólise em todas as enzimas no mesmo patamar da
aplicação isolada desses tratamentos. Vale ressaltar que o transporte de H
+
foi
afetado de maneira semelhante, com aparente efeito sinergístico somente na V-
ATPase. É possível que as bombas sejam ativadas pelo NaCl de maneira
dependente do ON em plantas de tomate.
A quantidade de ABA aumenta em raízes durante o estresse salino (Binzel
e Dunlap, 1995; Janicka-Russak et al., 2007). Alguns genes são regulados
positivamente ou negativamente pela presença de sal (>100 mM de NaCl) através
do aumento de ABA (Binzel e Dunlap, 1995). As atividades de hidrólise e de
transporte de H
+
das ATPase de membrana plasmática de vacúolo são
aumentadas tanto por 200 mM de NaCl quanto por 50 µM de ABA em raízes de
pepino (Janicka-Russak et al., 2007). Por outro lado, a acumulação de transcritos
94
para a subunidade A da V-ATPase não é dependente da presença de ABA como
parece ser o nível de transcritos para a H
+
-ATPase de membrana plasmática
(Binzel e Dunlap, 1995; Janicka-Russak et al., 2007).
Apenas a aplicação exógena de ABA, no entanto, poderia não ser bom
indicativo da sua influência sobre a atividade das bombas de H
+
. O efeito do sal e
do NO observado nas enzimas de plantas wt seria o mesmo em plantas
deficientes na produção de ABA? Os dados apresentados na Figura 13 mostram
que não: (1) O perfil de respostas das 3 enzimas em relação ao tratamento foi
qualitativamente diferente nas plantas mutantes; (2) quantitativamente existe uma
diferença muito grande entre wt e sitiens, onde o último possui atividade de
hidrólise muito maior; (3) embora a P-ATPase e V-PPase sejam ativadas por NaCl
e NO, a V-ATPase só é ativada por ON ou ON +NaCl. A ausência de ABA,
portanto, altera o balanço de ativação das bombas. Além disso, não foi possível
observar nenhuma atividade de transporte de H
+
nas plantas sitiens, mostrando
que a ausência de ABA também alterou a capacidade das raízes em se proteger
contra o estresse oxidativo, que pode ter afetado a estabilidade das membranas,
fato crucial para a manutenção do gradiente eletroquímico.
No presente trabalho foi avaliada a expressão relativa do RNAm do gene
LHA4 de tomate (Lycopersicum esculetum H
+
-ATPase isoforma 4 de membrana
plasmática) (Fig. 16). A expressão relativa baseou-se na relação de expressão do
gene alvo (LHA4) em relação ao gene de referência tubulina (TUB). Essa
abordagem é adequada para maior parte das finalidades de investigação de
mudanças fisiológicas prováveis no nível de expressão gênica (Pfaffl et al., 2002).
Apesar dos relatos de mudanças moderadas na atividade das bombas de
H
+
em relação ao estresse salino (Hassidim et al., 1986; Janicka-Russak e
Klobus, 2007), existem poucos exemplos da regulação da H
+
-ATPase do tipo P
em nível de transcrição (Gaxiola et al., 2007). Sabe-se que a salinidade tem
influência direta nos níveis endógenos de fitormônio, em especial o ABA e auxina
(Binzel e Dunlap, 1995). Em plantas wt de tomate o nível de transcritos para PM
ATPase (isoforma LHA1) é aumentado pela exposição das plantas por 24h a 150
mM de NaCl (Binzel, 1995). Até onde se sabe, não existe nenhum estudo
relatando a influência da ausência do ABA endógeno no nível transcrito da
ATPase de membrana plasmática. No presente trabalho pode-se observar que o
mutante em ABA possui um nível de expressão de RNAm em raízes quase 3
95
vezes maior do que plantas wt (Fig. 16). O efeito do ON no nível de transcritos
para a ATPase foi bastante pronuciado, alcançando um estímulo na expressão
relativa de 4 vezes nas plantas wt. Interessante observar que as plantas sitiens
quando crescidas na presença de ON ativaram o nível dos mesmos transcritos
em apenas 25 %. O nível endógeno de transcritos parece ser suficientemente alto
no mutante, acarretando certa insensibilidade do mesmo ao tratamento com ON
no que tange à expressão do RNAm da H
+
-ATPase. Em plantas wt o nível de
transcritos foi aumentado em 50 % na preseça de NaCl, enquanto que em plantas
sitiens não houve alteração. Essa manutenção dos níveis de transcritos durante o
estresse salino em plantas sitiens sugere que a ausência de ABA pode atrapalhar
a regulação da P-ATPase em nível transcripcional.
Em tomate, o efeito estimulatório de açúcares (glicose, frutose e sacarose)
na expressão da isoforma LHA4 da H
+
-ATPase parece ser específico, já que o
estresse osmótico induzido por manitol e 3-ometil glicose não alterou a expressão
dessa isoforma (Mito et al., 1996). Os autores observaram ainda que a
abundância de transcritos para o gene LHA4 tem boa relação com o crescimento
(aumento de 2,5 vezes em tecidos em expansão). A seqüência de aminoácidos
da proteína codificada pelo gene LHA1 e LHA4 tem elevada similaridade (95 %)
com a seqüência do gene PMA4 de tabaco (Nicotiana plumbaginifolia). Essa
isoforma de ATPase de membrana quando expressa em tabaco, em uma forma
constitutivamente ativa, resultou em plantas com crescimento superior e com
tolerância à salinidade aumentada (Gévaudant et al., 2007).
Foi possível observar um aumento no acúmulo de glicose, frutose e
sacarose em sitiens em relação ao wt. Isso se correlaciona fortemente com a
indução da atividade e níveis de transcritos observados para ATPase. Existe uma
relação clara entre a ausência de ABA, aumento no nível de açúcares e a
regulação da atividade da H
+
-ATPase tanto em nível transcripcional quanto pós-
traducional estabelecidos pela primeira vez nesse trabalho.
Conclusão
Com base nos resultados foi possível observar que o genótipo mutante
apresenta diferenças na fluorescência da clorofila, entretanto isto não se refletiu
em redução significativa na taxa fotossíntetica. Estas plantas mostraram grande
96
susceptibilidade ao estresse salino, sendo este fator explicado por características
inerentes a este genótipo e possivelmente em função da redução da produção de
ON observada nas raízes desta planta. A produção durante o estresse salino em
raízes foi atribuído, em grande parte a RN, pelo fato desta enzima ser reduzida de
forma considerável durante o estresse em plantas mutantes.
Foi possível observar que o ABA é necessário na indução de enzima
antioxidante em plantas wt e que durante o estresse salino possivelmente o ON
atue como sinalizador abaixo (downstream) do ABA na sinalização da via
promovida por este hormônio. Já nas plantas mutantes o estresse salino não
induziu a atividade destas enzimas, sendo isto atribuído à redução da produção
de ON, levando a inferir que o ON participe na indução de enzimas antioxidantes
também na ausência do ABA, participando possivelmente de uma via
independente de ABA.
O ON minimizou efeitos danosos provocados pelo tratamento salino
reduzindo a peroxidação lipídica e mantendo a integridade de membranas, sendo
estes fatores atribuídos à indução das antioxidantes e das bombas de prótons
participando como modulador das respostas geradas durante o estresse. O
balanço da ativação entre as bombas de H
+
associado à síntese de ON pode
compor um dos mecanismos de controle de resposta ao estresse salino em
plantas de tomateiro.
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104
Figura 1- Foto ilustrativa dos genótipos de tomateiro Solanum lycopersicum L.
Controle (wt) Mutante (Sitiens)
105
Figura 2. Corte transversal da lâmina foliar de L. sp. (A) Planta controle (wt), (B)
Planta mutante sitiens. Fv: feixes vasculares. St: estômatos. Barra: 50 µm.
106
Tabela 2- Cortes transversais em folhas de plantas de tomateiro controle (wt) e
mutantes sitiens (sit). *P <0,05 pelo Teste t de Student.
Medidas Foliares Genótipo
Média ± S.D.
wt 183 ± 41
Espessura da lâmina (µm)
sit
117 ± 23 *
wt 156 ± 36
Espessura do mesofilo (µm)
sit
99 ± 21 *
wt 81 ± 19
Espessura parênquima paliçádico (µm)
sit
50 ± 13 *
wt 76 ± 25
Espessura parênquima esponjoso (µm)
sit 49 ± 14
wt 16 ± 5
Espessura da epiderme adaxial (µm)
sit 12 ± 4
wt 12 ± 5
Espessura da epiderme abaxial (µm)
sit
10 ± 3 *
107
Figura 3– Medidas da taxa de fotossíntese e trocas gasosas em plantas de
tomateiro controle (wt) e sitiens. (A) Taxa fotossintética; (B) Déficit de pressão de
vapor entre folha-ar (DPV); (C) Transpiração; (D) Condutância estomática. Os
dados representam médias ± desvio padrão: *P<0,05, pelo Teste t de Student.
10
20
C
*
Transpiração
(mmol.m
-2
.s
-1
)
0.5
1.0
B
DPV (KPa)
*
0.0
0.5
1.0
D
Condutancia Estomatica
(mol.m
-2
.s
-1
)
*
10
20
30
A
wt
sitiens
Taxa Fotossintética
(mmol.m
-2
.s
-1
)
108
Figura 4– Medidas da fluorescência da clorofila a em plantas de tomateiro
controle (wt) e mutante sitiens. (A) Fv/Fm e Fv’/Fm’; (B) NPQ; (C) qP; (D) qN.; (E)
Taxa relativa de transporte de elétrons (TRTE) * P <0,05 pelo Teste t de Student.
0 43 90 150 225 363 523 847 1295
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
C
FFFmm. m
-2
.s
-1
qP
*
*
*
*
*
*
*
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
wt
sitiens
A
*
*
*
*
*
*
*
Fv/Fm
0.25
0.50
0.75
1.00
B
*
*
*
*
*
*
*
NPQ
0 43 90 150 225 363 523 847 1295
D
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
FFF mm. m
-2
.s
-1
qN
0 250 500 750 1000 1250 1500
0
5
10
15
wt
sitiens
E
**
FFF (mm.m
-1
.s
-1
)
TRTE
109
Figura 5- Teores de açúcares em raízes de tomateiro controle (wt) e mutante
sitiens. (A) Glicose; (B) Frutose; (C) Sacarose. Os dados representam médias ±
desvio padrão: *P<0,05, representam as diferenças significativas pelo Teste t de
Student.
50
100
150
A
wt
sitiens
Glicose
(nmol.mg
-1
)
*
25
50
75
Sacarose
(nmol.mg
-1
)
C
*
10
20
30
40
B
Frutose
(nmol.mg
-1
)
*
110
Figura 6- Teores de açúcares em folhas de tomateiro controle (wt) e mutante
sitiens. (A) Glicose; (B) Frutose; (C) Sacarose. Os dados representam médias ±
desvio padrão: *P<0,05, representam as diferenças significativas pelo Teste t de
Student.
50
100
150
A
wt
sitiens
Glicose
(nmol.mg
-1
)
*
25
50
75
100
Frutose
(nmol.mg
-1
)
B
*
0
10
20
30
40
50
Sacarose
(nmol.mg
-1
)
C
*
111
Figura 7- Teores de pigmentos em plantas controle (wt) e mutante sitiens. (A)
Clorofila a; (B) Clorofila b. (C) Carotenóides totais. Controle, 150 mM de NaCl;
150 mM NaCl+150 µM SNP(doador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM
SNP+150µM PTIO (seqüestrador de óxido nítrico). Médias seguidas da mesma
letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As barras
representam ± desvio padrão.
10
20
30
wt
sitiens
Clorofila a
(mg. g
-1
MF)
c
c
c
ab
c c
bc
ab
controle
NaCl
NaCl+SNP
NaCl+SNP+PTIO
0
10
20
Carotenóides Totais
(mg. g
-1
MF)
a
ab
a
a
a
b
b
b
10
20
30
a
Clorofila b
(mg. g
-1
MF)
a
a
a
a
a
a
a
112
Figura 8 - Concentração de malondialdeído (MDA) em plantas de tomateiro
controle (wt) e sitiens. (A) Raízes; (B) Folhas. Controle, 150 mM de NaCl; 150 mM
NaCl+150 µM SNP(doador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+150 µM
SNP+150µM PTIO (seqüestrador de óxido nítrico). Médias seguidas da mesma
letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As barras
representam ± desvio padrão.
0.005
0.010
0.015
0.020
wt
sitiens
A
a
a
ab
b
a
ab ab
b
Controle
NaCl
NaCl+SNP
NaCl+SNP+PTIO
0.005
0.010
0.015
0.020
B
ab
ab
a
bc
a
ab
ab
bc
MDA
(µmol. g
-1
)
113
Figura 9- Porcentagem de integridade de membranas em tomateiro controle (wt) e
sitiens. (A); Raízes; (B) Folhas. Controle, 150 mM de NaCl; 150 mM NaCl+150 µM
SNP(doador de óxido nítrico); 150 mM de NaCl+ 150 µM SNP+ 150µM PTIO
(seqüestrador de óxido nítrico). Médias seguidas da mesma letra não diferem
estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As barras representam ± desvio
padrão.
25
50
75
100
WT
sitiens
A
c
bc
abc
a
bc
ab
ab
a
Controle
NaCl
NaCl+SNP
NaCl+SNP+PTIO
0
25
50
75
100
B
c
c
c
a
c
b
c
a
Integridade (%)
114
Figura 10- Atividade de enzimas antioxidantes em raízes de tomateiro controle
(wt) e sitiens. (A) Enzima catalase wt; (B) Enzima catalase em sitiens; (C) Enzima
Guaiacol Peroxidase (GPX) em wt; (D) Enzima Guaiacol Peroxidase (GPX) em
sitiens. (E) Enzima Ascorbto Peroxidase (APX) em wt. (F) Enzima Ascorbato
Peroxidase (APX) em sitiens. Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM de SNP (doador
de óxido nítrico); 150 mM NaCl+150 µM SNP; 300 µM tungstato (inibidor da
redutase do nitrato) e 150 mM NaCl+300 µM tungstato. Médias seguidas da
mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As
barras representam ± desvio padrão.
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
A
wt
Catalase
(
m
M. min
-1
. mg
-1
)
a
a
a
bc
c
bc
B
sitiens
a
ab
b
a
a
b
2.5
5.0
7.5
C
a
ab
bc
b
a
a
Guaiacol Peroxidase
(
m
M. min
-1
. mg
-1
)
D
a
a
a
a
a
a
Controle
NaCl
SNP
NaCl+ SNP
Tungstato
Tungs+NaCl
0.0
2.5
5.0
7.5
Ascorbato Peroxidase
(mM. min
-1
. mg
-1
)
E
a
b
c
a
b
ab
Controle
NaCl
SNP
NaCl+SNP
Tungstato
Tungs + NaCl
F
a
ab
b
b
ab
b
115
Figura 11- Atividade da redutase do nitrato em plantas controle (wt) e sitiens. (A)
Raízes; (B) Folhas. Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido
nítrico); 150 mM NaCl+150 µM SNP; 150 µM SNP+150 µM PTIO (seqüestrador
de óxido nítrico); 300 µM tungstato (inibidor da redutase do nitrato) 150 mM de
NaCl+150 µM SNP+150µM PTIO. Médias seguidas da mesma letra não diferem
estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As barras representam ± desvio
padrão.
ef
bcde
cde
cde
cde
cde
a
ab
abcd
abc
f
cde
abcd
de
de
cd
ab
a
f
f
d
cd
d
bcd
ab
a
a
ab
10
20
30
40
A
wt
sitiens
Controle
NaCl
SNP
NaCl+SNP
SNP+PTIO
tungstato
NaCl+SNP+PTIO
0
250
500
750
1000
B
RN
(µmol NO
2
. h
-1
. g
-1
MF)
116
Figura 12- Atividade hidrolítica de ATP e de transporte de H+ de ATPases e
PPase em raízes de plantas controle (wt). (A); Atividade hidrolítica de ATP de P-
ATPase; (B) Transporte de H+ em P-ATPase; (C) Atividade hidrolítica de ATP de
V-ATPase; (D) Transporte de H+ em V-ATPase; (E) Atividade hidrolítica de ATP
de PPase; (F) Transporte de H+ em PPase. Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM
de SNP (doador de óxido nítrico); 150 mM NaCl+150 µM SNP ; 150 µM SNP+150
µM PTIO (seqüestrador de óxido nítrico); 150µM PTIO ;150 mM de NaCl+150 µM
SNP. Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo
teste DMS a 5 %. As barras representam ± desvio padrão.
5
10
15
20
A
P-ATPase
mmol Pi mg
-1
min
-1
a
b
a
b
a
b
DF
Vo
2.5
5.0
7.5
B
5
10
15
20
V-ATPase
m
mol Pi. mg
-1
. min
-1
C
ab
bc
bc
abc
a
c
2.5
5.0
7.5
D
controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
PTIO
NaCl+SNP
0
10
20
30
40
E
ab
c
c
PPase
mmol mg
-1
min
-1
bc
a
c
controle
NaCl
SNP
SNP+PTIO
NaCl+SNP
0.0
0.5
1.0
F
117
10
20
30
40
50
V-ATPase
mmol Pi mg
-1
min
-1
B
a a
c
b
ab
50
100
150
P-ATPase
m
mol Pi mg
-1
min
-1
A
a
b
bc
c
a
Controle
NaCl
SNP
NaCl+SNP
SNP+PTIO
0
10
20
30
40
PPase
m
mol Pi mg
-1
min
-1
C
a
b
b
ab
ab
Figura 13- Atividade hidrolítica de ATP e de transporte de H+ de ATPases e
PPase em raízes de plantas sitiens. (A); Atividade hidrolítica de ATP de P-
ATPase; (B) Atividade hidrolítica de ATP de V-ATPase; (C) Atividade hidrolítica de
ATP de PPase. Controle, 150 mM de NaCl; 150 µM de SNP (doador de óxido
nítrico); 150 mM NaCl+150 µM SNP ; 150 µM SNP+ 150 µM PTIO (seqüestrador
de óxido nítrico). Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente
entre si pelo teste DMS a 5 %. As barras representam ± desvio padrão.
118
Figura 14 - Microscopia ótica de fluorescência em raízes de tomateiro controle
(wt). Controle; 150µM PTIO (seqüestrador de óxido nítrico) 150 mM de NaCl; 300
µM tungstato de sódio (inibidor da enzima redutase do nitrato); 200 µM L-Name
(inibidor da NOA1); 300 µM tungstato+ 200 µM L-Name. Médias seguidas da
mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As
barras representam ± desvio padrão.
Controle
PTIO
NaCl
Tungstato
L-Name
Tungstato+L-Name
0
100
a
a
a
b
c
d
Fluorescência (%)
DAF 2DA
119
Figura 15 - Microscopia ótica de fluorescência em raízes de tomateiro mutante
sitiens Controle; 150µM PTIO (seqüestrador de óxido nítrico) 150 mM de NaCl;
300 µM tungstato de sódio (inibidor da enzima redutase do nitrato); 200 µM L-
Name (inibidor da NOA1); 300 µM tungstato+ 200 µM L-Name. Médias seguidas
da mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste DMS a 5 %. As
barras representam ± desvio padrão.
Controle
PTIO
NaCl
Tungstato
L-Name
Tungst+ L-Name
0
50
100
Fluorescencia (%)
DAF-2DA
c
b
a
a
b
b
120
Controle
SNP
NaCl
Controle
SNP
NaCl
0
1
2
3
4
5
wt
sitiens
Expressão Relativa do RNAm
Figura 15- Expressão de RNAm em plantas controle (wt) e mutantes sitiens,
através de RT-qPCR em tempo real. Tratamentos: H
2
0 (controle); 150 µM de SNP
e 150 mM de NaCl. As plantas foram expostas aos tratamentos por 24h. A razão
de expressão foi calculada com base no nível de expressão do gene estudado
(LHA4) em plantas wt controle. Os níveis de RNAm foram normalizados em
relação ao gene controle (Tubulina). As barras representam o erro calculado pelo
programa REST
®
.
1 2 1
Figura 17- Foto ilustrativa do efeito dos tratamentos em folhas de tomateiro. (A) controle (wt) (B) Mutante sitiens.
A barra corresponde a 1 cm.
122
Figura 18- Modelo esquemático da participação do óxido nítrico como sinalizador
durante o estresse salino.
+ NaCl
ON
wt
Atividade
Enzimas antioxidantes
ON
+ NaCl
sit
+ ON
+ ON
+ ON
Atividade e
expressão de
bombas de H
+
+ ON
123
4. RESUMOS E CONCLUSÕES
O fitormônio ácido abscísico (ABA) está relacionado à regulação de
respostas adaptativas a estresses ambientais. As plantas sobre estresse salino
apresentam incrementos do conteúdo de ABA, principalmente na parte radicular.
O ABA está relacionado ao acréscimo de EROs e está envolvido na indução da
atividade e a expressão gênica de enzimas antioxidantes. Para o estudo da
participação do hormônio ABA em rotas de sinalização em plantas, têm sido
desenvolvidos mutantes hormonais, como o sitiens. O óxido nítrico (ON) é um gás
presente em vias metabólicas afetando os níveis de mensageiros secundários. O
ON é relatado como mediador de respostas hormonais em particular mediando
efeitos de hormônios e moléculas envolvidas em estresses abióticos. Neste
trabalho foi possível verificar a minimização dos efeitos da salinidade em raíz e
parte aérea pelo tratamento com o doador de ON em plantas de milho. O
tratamento com SNP induziu a atividade de enzimas antioxidantes possibilitando a
redução da peroxidação lipídica em raízes. Foi verificado aumento da produção
de ON durante o estresse salino, sendo esta produção atribuída principalmente a
RN e possivelmente a NOA 1. O tratamento com o doador de ON induziu também
a atividade de P-ATPase, V-ATPase e PPase comprovando a hipótese da
participação desta molécula na modulação de bombas de prótons. Os estudos
com plantas mutantes em ABA mostraram a grande susceptibilidade ao estresse
salino, sendo este fator explicado por características inerentes a este genótipo e
possivelmente em função da redução da produção de ON observada nas raízes
124
desta planta. A produção durante o estresse salino em raízes foi atribuído, em
grande parte a RN, pelo fato desta ser reduzida de forma considerável durante o
estresse em plantas mutantes. Foi possível observar que o ABA é necessário na
indução de enzima antioxidante em plantas contorle (wt) e que durante o estresse
salino possivelmente o ON atue como sinalizador abaixo na sinalização da via
promovida pelo ABA. O ON minimizou efeitos danosos provocados pelo
tratamento salino, reduzindo a peroxidação lipídica e mantendo a integridade de
membranas, sendo estes fatores atribuídos à indução das antioxidantes e das
bombas de prótons participando como modulador das respostas geradas durante
o estresse. O balanço da ativação entre as bombas de H
+
associado à síntese de
ON pode compor um dos mecanismos de controle de resposta ao estresse salino.
Há a necessidade de novos estudos para confirmar a participação das enzimas
envolvidas na produção de ON, bem como avaliar a via não enzimática de
produção de ON durante o estresse salino. É necessário também investigar se a
resposta na modulação das bombas durante o estresse salino é dependente da
presença de ON, ou seja, se esta molécula é essencial para a modulação de
ATPases e PPase durante o estresse salino.
125
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