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URI – CAMPUS ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Screening de Microrganismos Produtores de
Carotenóides e Poligalacturonases
JAMILE ZENI
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos da URI-
Campus de Erechim, como requisito parcial à obtenção
do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área
de Concentração: Engenharia de Alimentos, da
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das
Missões – URI, Campus de Erechim.
ERECHIM, RS - BRASIL
JANEIRO DE 2009
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Screening de microrganismos produtores de carotenóides e
poligalacturonases
Jamile Zeni
Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de Pós-
Graduação em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários à
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de Concentração:
Engenharia de Alimentos.
Comissão Julgadora:
____________________________________
Prof. Geciane Toniazzo, D. Sc.
Orientadora
____________________________________
Prof. Eunice Valduga, D. Sc
Orientadora
____________________________________
Prof. Janaína Fernandes de Medeiros Bukert, D. Sc
FURG
____________________________________
Prof. Débora de Oliveira, D. Sc
URI – Campus de Erechim
Erechim, 27 de Janeiro de 2009.
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Dedicatória
A minha mãe e ao meu pai,
Leila e Ilário Zeni,
pelo amor e exemplo de vida
Obrigada por me ensinarem a nunca
desistir.
A minha irmã Camila, por ser tão
especial para mim.
Amo vocês!!!!!!
“Nunca deixe de fazer algo de bom que
seu coração lhe pede. O tempo poderá
passar e a oportunidade também.”
“Riscos”
Rir é correr risco de parecer tolo.
Chorar é correr o risco de parecer sentimental.
Estender a mão é correr o risco de se envolver.
Expor seus sentimentos é correr o risco de mostrar
seu verdadeiro eu.
Defender seus sonhos e idéias diante da multidão é
correr o risco de perder as pessoas.
Amar é correr o risco de não ser correspondido.
Viver é correr o risco de morrer.
Confiar é correr o risco de se decepcionar.
Tentar é correr o risco de fracassar.
Mas os riscos devem ser corridos,
porque o maior perigo é não arriscar nada.
Há pessoas que não correm nenhum risco,
não fazem nada, não têm nada e não são nada.
Elas podem até evitar sofrimentos e desilusões, mas
elas não conseguem nada,
não sentem nada, não mudam, não crescem,
não amam, não vivem.
Acorrentadas por suas atitudes, elas viram escravas,
privam-se de sua liberdade.
Somente a pessoa que corre riscos é livre!!!!
i
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Aos meus pais pelo amor, carinho, apoio, confiança e incentivo para a realização
deste trabalho.
À minha irmã Camila pelo amor.
Às minhas orientadoras Eunice Valduga e Geciane Toniazzo pela orientação, apoio
e tranqüilidade transmitidos em todos os momentos.
Ao Professor Rogério L. Cansian pelo apoio na etapa de análise de RAPD.
Aos colegas de trabalho Lídia, Rosicler e Karine pela ajuda em todos os momentos,
tornando o trabalho de pesquisa mais agradável e divertido.
Aos amigos e colegas do Laboratório, Daniela (Peke), Roger, Daiane, Lindomar,
Ieda e Laura pelo companheirismo e pelos momentos de descontração.
Aos meus amigos e colegas Daiane e Roger pelo apoio e pela amizade nos
momentos difíceis.
A todos os funcionários e professores do Curso de Engenharia de Alimentos da
URI– Campus de Erechim, que de alguma forma contribuíram para a minha formação e
realização deste trabalho.
A todas as outras pessoas que fizeram parte de minha vida até o fim desta jornada.
ii
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de
Alimentos como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia de Alimentos.
SCREENING DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE CAROTENÓIDES E
POLIGALACTURONASES
Jamile Zeni
Janeiro/2009
Orientadoras: Geciane Toniazzo e Eunice Valduga.
O objetivo do presente estudo foi o realizar screening de microrganismos visando a
bioprodução de carotenóides e enzimas pectinolíticas, especificamente poligalacturonases
(PG). Os microrganismos foram isolados de amostras de resíduos agroindustriais, laranja,
mamão, pêssego, melão, goiaba, banana, solo, farinha de trigo e de produtos processados
em decomposição. A bioprodução de carotenóides foi realizada em frascos agitados,
contendo 100 mL de meio (40 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de malte e 14 g/L de
peptona), 180 rpm, 25 °C por 100 horas. Na bioprodução de PG foram utilizados os
mesmos microrganismos isolados e utilizados para a produção de carotenóides, além das
linhagens identificadas como Penicillium camembertii (CT) ATCC 4845, Aspergillus niger
ATCC 16404, Aspergillus niger, Aspergillus. niger ATCC 1004, Aspergillus niger ATCC
9642, Penicillium notatum ATCC 9478, Penicillium duclauxii ATCC 9121, Penicillium
citrinum ATCC 28752, Penicillium digitatum ATCC 26821, Aspergillus oryzae ATCC
1003, P. variotii ATCC 22319, Pseudomonas putida, Sporidiobolus salmonicolor CBS
2636, Candida sp ATCC 34147 Hansenula sp. A técnica de RAPD foi utilizada como
ferramenta para identificação dos microrganismos isolados. No screening foram isolados e
selecionados 116 microrganismos, 16 leveduras, 65 bactérias e 35 fungos filamentosos. Os
microrganismos W8, K1 e B7 demostraram grande potencial para a produção de
carotenóides de pigmentação predominamtemente rósea com teor de carotenódes totais
818, 707 e 730 µg/L respectivamente. Entretanto, os microrganismos W1, Q3 e B3 de
pigmentação predominantemente amarela foram os grandes produtores com teores que
variaram de 1063 a 2563 µg/L. Na produção de poligalacturonases foram utilizados 93
microrganismos dos isolados e selecionados para a produção de carotenóides, destes 68
eram fungos filamentosos e 16 bactérias. As linhagens P. simplicissimum, A. niger ATCC
16404, A. niger ATCC 1004, A. niger ATCC 9642, Pseudomonas putida e os
microrganismos isolados W12, D2, H8, L1, K3, W35, W43, W44, W52, W23, W24, H9,
W18, L4 e T2 apresentaram unidades de atividades de PG superiores a 3 U/mL. Após o
estudo cinético da bioprodução de poligalacturonases obteve-se um aumento de até 13
vezes na atividade enzimática, sendo que o microrganismo identificado como W43
apresentou a maior atividade (45 U/mL). Com a análise de RAPD foi possível concluir que
os microrganismos isolados para a produção de pigmentos e enzimas pectinolíticas são de
espécies ou até gêneros diferentes não apresentando duplicação de cepas.
Palavras-Chave: Screening, microrganismos, carotenóides, poligalacturonases, RAPD.
iii
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial fulfillment of
the requirements for the Degree of Master in Food Engineering
SCREENING OF MICROORGANISMS FOR CAROTENOIDS AND
POLYGALACTURONASES PRODUCTION
Jamile Zeni
Janeiro/2009
Advisors: Geciane Toniazzo e Eunice Valduga.
The objective of this study was the screening of microorganisms aimed at bioproduction of
carotenoids and pectinolytic enzymes, specifically polygalacturonases (PG). The
microorganisms were isolated from samples of waste agroindustrials, orange, papaya,
peach, melon, guava, banana, soil, wheat flour and processed products in decomposition.
The bioproduction of carotenoids was carried out in agitated flanks containing 100 mL of
medium (40 g/L of glucose, 10 g/L malt extract and 14 g/L peptone), 180 rpm, 25 ° C for
100 hours. The production of PG used the same microorganisms isolated and used for the
production of carotenoids, in addition to the strains identified as P. camembertii (CT)
ATCC 4845, A. niger ATCC 16404, A. niger, A.niger ATCC 1004, A. niger ATCC 9642,
P. notatum ATCC 9478, P. duclauxii ATCC 9121, P. citrinum ATCC 28752, P. digitatum
ATCC 26821, A. oryzae ATCC 1003, P. variotii ATCC 22319, P. putida, S. salmonicolor
CBS 2636, Candida sp ATCC 34147 and Hansenula sp.
With the objective to verify possible duplication of strains the technique of RAPD wasused.
In the screening a total of 116 microorganisms: 16 yeasts, 65 bacteria and 35 fungi. The
microorganisms W8, K1 and B7 demonstrated great potential to produce carotenoids of
pigmentation red containing carotenoids total of 818, 707 and 730 µg/L, respectively. And
the microorganisms W1, Q3 and B3 presented a potencial of producing carotenoids of
pigmentation predominantly yellow were the major producers with content ranging from
1063 to 2563 µg/L. In the production of polygalacturonases used 93 microorganisms were
isolated and selected for production of carotenoids, these are 68 fungi and 16 bacteria. The
strains P. simplicissimum, A. niger ATCC 16404, A. niger ATCC 1004, A. niger ATCC
9642, Pseudomonas putida and microorganisms isolated and coded by W12, D2, H8, L1,
K3, W35, W43, W44, W52, W23, W24, H9, W18, L4 e T2 presented had units of PG
activity of more than 3 U/mL. After the study of kinetic bioprodução of polygalacturonases
activity an increases up to 13 times the activity of PG, and the microorganims identified as
W43 showed activity of 45 U/mL. The analysis of RAPD permited to conclude that the
isolated microorganisms are of different species or genera.
Keywords: Screening, microorganisms, carotenoids, polygalacturonases, RAPD.
iv
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS.................................................................................................... i
RESUMO.......................................................................................................................... ii
ABSTRACT...................................................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................... vii
LISTA DE TABELAS..................................................................................................... xii
INTRODUÇÃO................................................................................................................ xiv
CAPÍTULO 1: SCREENING DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE
CAROTENÓIDES
1.1 Introdução........................................................................................................... 3
1.2. Revisão Bibliográfica..............................................................................................
5
1.2.1. Considerações gerais sobre a produção de carotenóides............................... 5
1.2.2. Propriedades e Funções de carotenóides........................................................
5
1.2.3. Estrutura......................................................................................................... 7
1.2.4. Microrganismos produtores de carotenóides..................................................
8
1.2.5. Screening de microrganismos produtores de carotenóides.............................
11
1.2.6. Fatores que exercem influência na produção de carotenóides....................... 12
1.2.7. Extração e recuperação de carotenóides.........................................................
13
1.3. Material e métodos........................................................................
14
1.3.1 Isolamento e Seleção de Microrganismos Carotenogênicos ............................
14
1.3.2 Caracterização dos Microrganismos Isolados...................................................
14
1.3.3.Manutenção dos Microrganismos...................................................................
14
1.3.4 Bioprodução de Carotenóides............................................................................
15
1.3.5 Recuperação de Carotenóides Totais.................................................................
16
v
1.3.6. Metodologia analítica.........................................................................................
17
1.3.6.1. Determinação de carotenóides totais...........................................................
17
1.3.6.2. Determinação de Biomassa......................................................................... 17
1.3.6.3. Determinação de pH....................................................................................
18
1.4. Resultados e Discussão...........................................................................................
19
1.4.1. Isolamento e seleção de microrganismos carotenogênicos................................
19
1.4.2. Screening fermentativo para produção de carotenóides....................................
22
1.5. Conclusões................................................................................................................
29
1.6. Referências Bibliográficas........................................................................................
30
CAPÍTULO 2: SCREENING DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE
PECTINASES (POLIGALACTURONASES - PG)
1.Introdução.............................................................................................................. 38
2. Revisão Bibliográfica.............................................................................................. 40
2.1. Substâncias Pécticas....................................................................................... 40
2.2. Classificação e mecanismos de ação das pectinases...................................... 40
2.3. Aplicação Industrial das Pectinases................................................................ 42
2.4. Pectinases disponíveis no mercado................................................................ 44
2.5. Screening de microrganismos produtores de pectinases................................ 45
3. Material e métodos.................................................................................................. 48
3.1. Isolamento, seleção, manutenção e caracterização de microrganismos
pectinolíticos...............................................................................................................
49
3.2. Meio de cultura para determinação de atividade pectinolítica........................ 49
3.3. Determinação de atividade pectinolitica (PG)................................................ 49
3.3.1. Atividade de Poligalacturonase (PG).......................................................... 49
3.3.2. Cinética Enzimática..................................................................................... 50
4. Resultados e Discussão............................................................................................ 51
4.1. Screening de microrganismos pectinolíticos................................................... 51
4.2. Determinação de atividade pectinolitica.......................................................... 52
4.3. Determinação de pH........................................................................................ 62
4.4. Estudo cinético da medida de atividade de poligalacturonase........................ 67
vi
5. Conclusões............................................................................................................ 69
6. Referências Bibliográficas.................................................................................... 70
CAPÍTULO 3 – ANÁLISE GENÔMICA DO DNA DOS MICRORGANISMOS
ISOLADOS PARA PRODUÇÃO DE CAROTENÓIDES E PECTINASES PELA
TÉCNICA DE RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)
1.Introdução............................................................................................................... 78
2. Revisão Bibliográfica............................................................................................... 79
2.1. Técnica de RAPD................................................................................................ 79
3. Material e Métodos................................................................................................... 81
... 3.1 Microrganismos testados........................................................... 81
3.2 Técnicas de biologia molecular – RAPD............................................................ 81
3.2.1 Extração de DNA e seleção de primers........................................................... 81
3.2.1.2 Quantificação do DNA....................................................................................
82
3.2.1.3 Reação de amplificação de RAPD...................................................................
82
3.2.1.4 Amplificação de RAPD ..................................................................................
82
3.2.1.5 Análise eletroforética dos fragmentos amplificados....................................... 83
3.2.1.6 Análise dos dados............................................................................................
83
4. Resultados e Discussão.............................................................................................. 84
4.1 Análise de RAPD................................................................................................. 84
5. Conclusões................................................................................................................. 94
6. Referências Bibliográficas.........................................................................................
94
SUGESTÕES....................................................................................................................
95
APÊNDICE........................................................................................................................ 100
vii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Estrutura dos carotenóides: (a) Xantofilas – zeaxantina, luteína,
criptoxantina e astaxantina, respectivamente; (b) Carotenos –
neurosporeno, licopeno, β-caroteno e α-caroteno, respectivamente.
7
FIGURA 2
Inóculo 120 horas de fermentação, a 180 rpm mantido a 25 °C....... 16
FIGURA 3
Maceração das células dos microrganismos com nitrogênio líquido 17
FIGURA 4
Aspectos das colônias de microrganismos carotenogênicos isolados
das distintas procedências...................................................
21
FIGURA 5
Perfil da produção de carotenóides totais e específicos dos
microrganismos isolados de coloração rósea....................................
24
FIGURA 6
Perfil da produção de carotenóides totais e carotenóides específicos
dos microrganismos isolados (W1, Q3, B3, J8, B5, B6, W5, Q1,
G6, G3, W14, W4, G7, G8) com características visuais
amarelas.................................................................................
26
FIGURA 7
Perfil da produção de carotenóides totais e carotenóides específicos
dos microrganismos isolados (G10, G5, G9, J6, J3, W9, F2, N1, J4,
F3) com características visuais amarelas................
26
FIGURA 8
FIGURA 9
Relação da bioprodução de carotenoides totais e pH final dos
microrganismos de características visuais róseas.............................
Relação da bioprodução de carotenoides totais e pH final dos
microrganismos de características visuais amarelas.........................
28
FIGURA 10
Aspectos visuais dos carotenóides de coloração rósea e amarelas
após solubilização em metanol, respectivamente; A –
Microrganismo B7; B – Microrganismo W1....................................
29
FIGURA 11
Medida de Atividade de Poligalacturonase..................................... 50
viii
FIGURA 12
Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de
fermentação dos microrganismos.- (A) – S. salmonocollor (L),
Candida sp ATCC 34147, Hansunela sp (L), P. camembertii
ATCC 4845, A. niger ATCC 16404, A. niger, ;- (B)- A.niger
ATCC 1004, A. niger ATCC 9642, P. notatum ATCC 9478, W11,
W12 e B10........................................................................................
54
FIGURA 13
Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de
fermentação dos microrganismos.- (A) – D2, D1, E3, H3, H8, I8; -
(B)- L4, L5, L6, L10. L11. 12; -(C)- I14, J1, J6, K3, L1,,L2; -(D)-
M4, M6, S2, T2, W1e W13...............................................................
55
FIGURA 14
Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de
fermentação dos microrganismos.- (A)- P. duclauxii ATCC 9121,
P. citrinum ATCC 28752, P.digitatum ATCC 26821, R3, A.
oryzae ATCC 1003, O6; -(B)- I3 (B), P2 (B), G6 (B), S1 (B), O2
(B), I15 (B); -(C)- K3 (B), J9 (B), B4 (B), G1 (B), M1 (B), H5
(B); -(D)- W56, W1, K5 (B), Q2 (B), K6, (B) e U2 (B)...................
56
FIGURA 15
Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de
fermentação dos microrganismos.- (A)- W51, W57, W58, W53,
W54, W56, - (B)- W47, W46, W43, W44, W52, W45, -(C)- W39,
W40, W41, W50, W39, W38; -(D)- W33, W35, W37, W36, W42
e W38................................................................................................
57
FIGURA 16
Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de
fermentação dos microrganismos.- (A)- W29, W30, W31, B9,
W32, W34; -(B)- W19, W20, W21, W15, W16, W28; -(C)- W24,
W25, W26,H9, W17, W18; -(D)- P. variotti ATCC 22319, P.
putida, A.niger ATCC 9642, W27, W22 e W23.............................. 58
FIGURA 17
Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos – (A) - M1(B), H5(B), I3(B), P2(B), G6(B),
S1(B); - (B) - O2(B), K3(B), J9(B), S.salmonicolor (L), Candida
sp. ATCC 34147 e Hansenula sp. (L)............................................... 60
ix
FIGURA 18
Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos – (A) - P. camembertii ATCC 4845, A.niger
ATCC 16404, A.niger, A.niger ATCC 1004, P.notatum ATCC
9478, A.niger ATCC 9642; (B) – microrganismos isolados W11,
P. camembertii ATCC 4846, B10, D2, D1 e K3; (C ). – H3, H8,
I8, I14, J2 e J6; (D)- K8, L1, L2, L4, L5 e L6, respectivamente.....
61
FIGURA 19
Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos - (A)- L10, L11, L12, M4, M6 e S2; (B) – T2,
W2, W13, O6, R3 e P. duclauxii ATCC 9221; (C) – P. citratum
ATCC 28752, P. digitatum ATCC 26821, A. oryzae ATCC 2003,
W32, W34 e W23;- (C) - W35, W37, W36, W42, W38 e W39,
respectivamente....................................................................
62
FIGURA 20
Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos – (A) – W40, W41, W50, W49, W48, W47; - (B)
– W46, W43, W44, W52, W45 e W51, (C) – W57, W58, W51,
W54, W55, W56; (D) – W1, P. variotti ATCC 22319, A.niger
ATCC 9642, P. putida, W26e W27, respectivamente...................... 63
FIGURA 21
Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos – (A) – W22, W23, W24, W25, B9, H9;- (B) –
W17, W18, W19, W20, W21 e W15; (C) – W16, W28, W29,
W30, W31, K5(B);- (D) – Q2(B), U2(B), I15 (B), B4(B), J6 (B) e
G2(B), respecivamente......................................................................
64
FIGURA 22
Medida de atividade de PG em 24 horas de fermentação em
diferentes tempos de reação............................................................
65
FIGURA 23
Gel de agarose (1,4) demonstrativo obtido com o primer OPA 09
para os microrganismos isolados....................................................
83
FIGURA24
Gel de agarose (1,4) demonstrativo obtido com o primer OPA 12
onde 1 representa o microrganismos isolado de aspectos visuais
amarelo........................................................................................... 85
x
FIGURA 25
Gel de agarose (1,4) demonstrativo obtido com o primer OPA 12
onde 1 representa o microrganismos isolado de aspectos visuais
amarelo............................................................................................
86
FIGURA 26
Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de
estimativa de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por
RAPD dos fungos isolados de coloração rósea utilizados para a
bioprodução de carotenóides.......................................................... 88
FIGURA 27
Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de
estimativa de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por
RAPD das bactérias isoladas de coloração rósea utilizadas para a
bioprodução de carotenóides........................................................... 88
FIGURA 28
Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de
estimativa de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por
RAPD dos fungos isolados de coloração amarela utilizados para a
bioprodução de carotenóides........................................................
89
FIGURA 29
Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de
estimativa de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por
RAPD dos fungos isolados de coloração amarela utilizados para a
bioprodução de carotenóides........................................................
90
FIGURA 30
Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de
estimativa de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por
RAPD dos fungos produtores de poligalacturonases (PG).............
90
FIGURA 31
Medida de atividade de PG em 48 horas de fermentação em
diferentes tempos de reação.............................................................. 108
FIGURA 32
Medida de atividade de PG em 72 horas de fermentação em
diferentes tempos de reação.............................................................. 108
FIGURA 33
Medida de atividade de PG em 96 horas de fermentação,
respectivamente, em diferentes tempos de reação............................ 109
xi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Cianobactérias, algas e bactérias empregadas na bioprodução de
carotenóides..........................................................................................
10
TABELA 2
Fungos filamentosos e leveduras empregadas na bioprodução de
carotenóides..........................................................................................
11
TABELA 3
Microrganismos isolados de amostras de frutas, resíduos
agroindustriais e solo............................................................................
20
TABELA 4
Teor de carotenóides totais, biomassa, carotenóides específicos e
pH
final
dos microrganismos isolados de coloração rósea......................
23
TABELA 5
Teor de carotenóides totais, biomassa, carotenóides específicos e
pH
final
dos microrganismos isolados de características visuais
amarela.................................................................................................
25
TABELA 6
Pectinases comercializadas pelas empresas Lyven e Novozymes,
com os respectivos nomes comerciais, a origem da enzima e a
aplicabilidade do produto..................................................................... 44
TABELA 7
Cepas de microrganismos testados na produção de
poligalacturonase……………………………………....……………..
48
TABELA 8
Microrganismos isolados e selecionados no screening de
microrganismos pectinolíticos……………….……………………….
51
TABELA 9
Unidade de atividade de PG (U/mL) durante as 96 horas de
fermentação..........................................................................................
99
TABELA 10
Valores de atividade de PG (U/mL) encontados na cinética de reação
com variação do tempo a 40 minutos...................................................
107
TABELA 11
Número total e número de fragmentos polimórficos obtidos em cada
primer utilizado para os fungos de coloração rósea.............................
83
TABELA 12
Similaridade interpopulacional dos microrganismos de coloração
rósea......................................................................................................
84
TABELA 13
Número total e número de fragmentos polimórficos obtidos em cada
primer utilizado para microrganismos de coloração amarela.............. 84
xii
TABELA 14
Similaridade interpopulacional dos microrganismos de coloração
amarela.................................................................................................
85
TABELA 15
Número total e número de fragmentos polimórficos obtidos em cada
primer utilizado para os microrganismos pectinolíticos......................
86
TABELA 16
Similaridade interpopulacional dos fungos pectinolíticos....................
87
TABELA 17
Similaridade interpopulacional das bactérias pectinolíticas.................
87
Introdução
xiv
INTRODUÇÃO
A produção de corantes e enzimas tem crescido muito nestes últimos anos devido
aos avanços científicos na área, e principalmente pela utilização de microrganismos como
alternativa à síntese química e extração de plantas e/ou vegetais. Os produtos obtidos por
fermentação microbiana podem ser produzidos em curto prazo, em qualquer época do ano,
utilizando substratos de baixo custo com a vantagem de o Brasil ser rico em substratos
desta natureza. No caso específico de carotenóides, apresentam como vantagem adicional a
conotação natural, e neste sentido existe uma grande demanda por estes produtos.
Muitos microrganismos são capazes de produzir carotenóides e pectinases, porém
nem todos são industrialmente interessantes. Na produção de carotenóides, as leveduras
destacam-se pelo seu uso como fonte protéica, capacidade de crescimento em substratos de
baixo custo e alto teor de açúcar. Os tipos de carotenóides, pectinases e a quantidade
relativa destes podem variar dependendo das condições do meio de cultura e condições
operacionais. (KASHYAP et al., 2001; BOTELLA-PAIVA & RODRIGUEZ-
CONCEPCION, 2006). A produção de carotenóides pelo processo biotecnológico tem sido
investigada, destacando-se a produção pelas leveduras coloridas. Dentre os carotenóides
naturais mais estudados destacam-se a astaxantina, β-caroteno, toruleno e licopeno
(BOTELLA-PAIVA & RODRIGUEZ- CONCEPCION, 2006).
Os carotenóides são corantes naturais responsáveis pelas cores amarelo, laranja e
vermelho, utilizados nas indústrias alimentícia, farmacêutica, de cosméticos e ração. Além
de seu amplo uso como corantes e no enriquecimento de alimentos, também são utilizados
devido a sua atividade pró-vitamínica A, e as suas propriedades que resultam em possíveis
funções biológicas benéficas à saúde, tais como o fortalecimento do sistema imunológico e
a diminuição do risco de doenças degenerativas (certos tipos de câncer, doenças
cardiovasculares, degeneração macular e da catarata) (NIIZU, 2003).
As pectinases formam um grupo de enzimas que degradam substâncias pécticas,
hidrolisando ligações glicosídicas ao longo da cadeia carbônica. Podem ser
despolimerizantes ou desesterificantes e são produzidas por plantas, fungos filamentosos,
bactérias e leveduras. Algumas das aplicações destas enzimas nas indústrias de alimentos
incluem amadurecimento de frutas, clarificação e redução de viscosidade em sucos de
Introdução
xv
frutas, tratamento preliminar do suco de uva para indústrias vinícolas, extração de polpa de
tomate, fermentação de chá e chocolate, tratamento de resíduos vegetais, degomagem de
fibras nas indústrias têxtil e de papel, nutrição animal, enriquecimento protéico de
alimentos infantis e extração de óleos (KASHYAP et al., 2001; UENOJO & PASTORE,
2007; BHAT, 2000).
Na produção de pectinases destacam-se os fungos, em função de suas características
de reprodução e crescimento, adaptam-se a uma grande variedade de substratos, sendo
excelentes decompositores de material orgânico. Além disso, as pectinases produzidas por
fungos apresentam características importantes em bioprocessos, como estabilidade ao pH e
a temperatura (MARTIN et al., 2004). Outro fator que pode justificar a crescente utilização
de enzimas fúngicas na indústria de alimentos, é o fato dos fungos produtores de pectinases
possuírem o pH de atuação bem próximo ao pH da maioria dos sucos de frutas, o qual varia
de 3,0 a 5,5 (MOYO et al., 2003).
Face ao exposto, torna-se necessário o desenvolvimento de estudos de screening de
microrganismos produtores de carotenóides e pectinases, no sentido de isolar e selecionar
microrganismos de interesse específico, bem como técnicas de seleção, isolamento e
manutenção destes microrganismos, extração e recuperação dos compostos produzidos por
estes. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar microrganismos
produtores de carotenóides e Poligalacturonases (PG). Em paralelo fez-se uso da técnica de
biologia molecular – RAPD, visando identificar possíveis duplicações de cepas entre os
microrganismos isolados.
O presente trabalho foi dividido em capítulos de acordo com os assuntos abordados.
Cada um dos capítulos contempla um objetivo específico, encerrando o referencial teórico,
metodologia, resultados e discussões e conclusões pertinentes. O Capítulo 1 apresenta estes
itens para o screening de microrganismos produtores de carotenóides. O Capítulo 2 tem
como meta o isolamento e seleção de microrganismos produtores de pectinases,
especificamente poligalacturonases (PG). No Capítulo 3 apresenta dados/resultados
fererentes a análise genômica do DNA dos microrganismos isolados através da técnica
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).
Capítulo 1
1
CAPÍTULO 1 - SCREENING DE MICRORGANISMOS
PRODUTORES DE CAROTENÓIDES
Capítulo 1
2
SCREENING DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE CAROTENÓIDES
RESUMO
Os carotenóides podem ser produzidos naturalmente por leveduras, bactérias e fungos
filamentosos. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar microrganismos
produtores de carotenóides. Os microrganismos foram isolados de amostras de resíduos
agroindustriais, laranja, mamão, pêssego, melão, goiaba, banana, solo, farinha e de produtos
processados em decomposição. Os microrganismos foram inoculados em meio de cultura
PCA, e incubados a 28 °C por 24 a 48 horas. As culturas foram transferidas para um
erlenmeyer, contendo 100 mL de YM, e incubadas em shaker a 25 °C, 180 rpm, por 48 horas.
Após, 10 mL do pré-inoculo foi transferido para outro erlenmeyer contendo 90 mL de meio
de cultura (40 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de malte e 14 g/L de peptona), incubados a
25 °C, 180 rpm por 100 horas ao abrigo da luz, para a bioprodução de carotenóides. No
screening foram isolados e selecionados 116 microrganismos, sendo destes 16 leveduras, 65
bactérias e 35 fungos filamentosos. Os microrganismos W8, K1 e B7 demostraram grande
potencial para a produção de carotenóides de pigmentação predominamtemente rósea com
teor de carotenódes totais de 818, 730 e 707 µg/L respectivamente. Os microrganismos W1,
Q3 e B3 de pigmentação predominantemente amarela foram os grandes produtores de
carotenoides de pigmentação predominantemente amarela com teores que variam de 1063 a
2563 µg/L.
Palavras- chave: Screening, microrganismos, carotenóides.
Capítulo 1
3
1. INTRODUÇÃO
Os carotenóides são um grande grupo de pigmentos presentes na natureza, com cerca de
600 estruturas caracterizadas, sendo identificados de várias fontes, somente 40 são
encontrados em alimentos e alguns destes são utilizados industrialmente como corantes ou
substâncias bioativas em rações, cosméticos, alimentos e fármacos (JOHNSON &
SCHROEDER, 1995). Comercialmente, os carotenóides são usados como corantes
alimentícios e em suplementos nutricionais (pró-vitamina A), com um mercado global de
aproximadamente US$ 935 milhões/ano (FRASER & BRAMLEY, 2004).
Nos últimos vinte anos as evidências científicas dão importância aos carotenóides não
apenas pela ampla aplicação como corantes de alimentos e como precursores de vitamina A,
mas também pelos efeitos benéficos para a saúde humana com atividades biológicas
importantes destacando-se a inibição de doenças onde os radicais livres apresentam papel
fundamental, como arteriosclerose, catarata, degeneração macular, esclerose múltipla, câncer,
doenças degenerativas e cardiovasculares e fortalecimento do sistema imunológico
(BOTELLA-PAVÍA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006; MALDONADE et al., 2007;
AKSU & EREN, 2007).
A produção biotecnológica de carotenóides para a aplicação industrial, através de
microrganismos, tem sido assunto de destaque nos últimos anos, pois a grande maioria dos
carotenóides utilizados industrialmente é obtida por via química ou extração de plantas ou
algas. Porém, devido à preocupação com o uso de aditivos químicos nos alimentos, houve um
crescente interesse nos carotenóides obtidos naturalmente por processos biotecnológicos.
Além disso, a produção se dá em pequeno espaço, não estando sujeita às condições
ambientais como clima, estação do ano ou composição do solo; existe a possibilidade de
controlar as condições de cultivo para garantir a produção de carotenóides de maior
importância e a utilização de substratos de baixo custo (JOHNSON & SCHROEDER, 1995;
BOTELLA-PAVÍA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006; AKSU & EREN, 2007).
Os trabalhos que referenciam estudos sobre isolamento e seleção de microrganismos
produtores de pigmentos ainda são poucos. Sláviková & Vadkertiová (2003) isolaram
leveduras de amostras de solo, sendo que as leveduras predominantes (78 a 86 % do total)
foram identificadas como: Cryptococcus laurentii, Candida maltosa, Metschnikowia
pulcherrima e Sporobolomyces salmonicolor. Libkind & Broock (2006) realizaram
isolamento e seleção de leveduras produtoras de carotenóides, sendo que as mesmas foram
identificadas como R. mucilaginosa, R. colostri, Rhodosporidium babjevae, Sporobolomyces
Capítulo 1
4
longiusculus; Sporidiobolus patagonicus e Cryptococcus sp. Maldonade et al. (2007)
isolaram e selecionaram leveduras produtoras de carotenóides de ecossistemas brasileiros e
através das características morfológicas, de reprodução, testes fisiológicos e bioquímicos as
leveduras foram identificadas como Rhodotorula mucilaginosa - 137 e 135, Rhodotorula
graminis, Rhodotorula minuta e Sporobolomyces.
Neste sentido, o presente capítulo tem como objetivo apresentar o estudo realizado para
isolar e selecionar microrganismos produtores de pigmentos. Como forma de embasar
cientificamente os resultados obtidos, será apresentado um referencial teórico coerente ao
assunto, seguido pela descrição detalhada do procedimento experimental adotado. A
apresentação e discussão dos resultados e as conclusões encerram este capítulo.
Capítulo 1
5
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Este item apresenta informações sobre a bioprodução de carotenóides, abordando
definições, propriedades e funções dos carotenóides, aspectos industriais da produção,
microrganismos produtores, fatores que influenciam a bioprodução e processos de extração e
recuperação destes compostos.
2.1 Considerações gerais sobre a produção de carotenóides
A produção comercial de carotenóides a partir de microrganismos concorre
principalmente com a produção sintética por procedimentos químicos. Atualmente, os
carotenóides utilizados industrialmente são obtidos por via química ou extração de plantas
e/ou algas. Entretanto, devido à preocupação com o uso de aditivos químicos em alimentos,
houve um crescente interesse nos carotenóides obtidos naturalmente por processos
biotecnológicos.
Comercialmente, os carotenóides são usados como corantes alimentícios e em
suplementos nutricionais, com um mercado global de aproximadamente US$ 935
milhões/ano, sendo que somente a astaxantina representou cerca de US$ 150 milhões no ano
de 2000 e, com um valor expressivo de US$ 2000/kg (FRASER & BRAMLEY, 2004).
Segundo a Christian Hansen (2004), 38 % do corante utilizado industrialmente é
sintético, 32 % é natural e 18 % idêntico ao natural, sendo que o mercado de bebidas não-
alcoólicas, alimentos preparados e confeitaria são os líderes no mercado de corantes,
totalizando 65 % do consumo.
2.2 Propriedades e funções dos carotenóides
Os carotenóides são pigmentos naturais responsáveis pelas cores amarelo, laranja e
vermelho de muitos alimentos, tais como frutas, vegetais, gema de ovo, alguns peixes, como
salmão, truta e crustáceos (MALDONADE et al., 2007).
Além de colorir, os carotenóides possuem atividades biológicas importantes
destacando-se a inibição de doenças onde os radicais livres apresentam papel fundamental,
como arteriosclerose, catarata, degeneração macular, esclerose múltipla, câncer, doenças
degenerativas e cardiovasculares (MALDONADE et al., 2007; BHOSALE, 2004; AKSU &
EREN, 2007).
Capítulo 1
6
Nas indústrias de alimentos, os carotenóides são utilizados principalmente como
corante, com os objetivos de repor a cor perdida durante o processamento e armazenamento,
colorir os alimentos incolores e uniformizar a coloração de alguns produtos alimentícios. Mais
recentemente, com o crescente interesse pela saúde, os carotenóides também têm sido
adicionados aos alimentos devido as suas atividades biológicas, a fim de enriquecer o produto
alimentício. São também precursores de muitos compostos químicos importantes,
responsáveis pelo aroma de alguns alimentos, fragrâncias de algumas flores (SÁNCHEZ-
CONTRERAS et al., 2000), coloração específica e fotoproteção (MARASCO & SCHMIDT–
DANNERT, 2003).
Industrialmente, os carotenóides tais como β-caroteno e astaxantina são utilizados
como corantes naturais para alimentos ou adicionados em ração para aqüicultura (AKSU &
EREN, 2007). A astaxantina é um pigmento encontrado em animais aquáticos, tais como
lagosta, siri e camarão. Este pigmento protege contra radicais livres, peroxidação lipídica,
danos oxidativos ao colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL), oxidação dos ácidos
graxos poliinsaturados essenciais e proteção contra os efeitos da luz UV, membranas
celulares, células e tecidos (HU et al., 2006).
Devido à alta taxa de insaturação, fatores tais como calor, luz e ácidos ocasionam
isomerização dos carotenóides trans, que é a forma mais estável na natureza, para a forma cis,
promovendo ligeira perda de cor e atividade pró-vitamínica. Os carotenóides são também
susceptíveis às oxidações enzimáticas ou não enzimáticas, que dependem da estrutura do
carotenóide, disponibilidade de oxigênio, presença de enzimas, metais, pró-oxidantes e
antioxidantes, alta temperatura e exposição à luz (JOHNSON & SCHROEDER, 1995).
Os pigmentos podem absorver luz especificamente na região do ultravioleta (UV) e
visível do espectro, sendo que o restante é transmitido ou refletido, e apresentam cor. A
estrutura responsável pela absorção da luz é o grupamento cromóforo, que nos carotenóides se
caracteriza pelas duplas ligações conjugadas. Cada carotenóide é caracterizado por um
espectro de absorção eletrônica. Assim, a espectroscopia de absorção é uma importante
técnica na análise de carotenóides (GROSS, 1991).
Capítulo 1
7
2.3 Estrutura
Os carotenóides são isoprenóides lipofílicos sintetizados por todos os microrganismos
fotossintéticos (incluindo plantas, algas e cianobactérias), e também por algumas bactérias
não-fotossintéticas e fungos filamentosos. Duas classes de carotenóides são encontradas na
natureza: os carotenos, tais como β-caroteno, hidrocarbonetos lineares que podem ser
ciclizados em uma ou ambas as extremidades da molécula; e os derivados oxigenados de
carotenos, como luteína, violaxantina, neoxantina e zeaxantina, denominados xantofilas
(BOTELLA-PAVÍA & RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2006). A Figura 1 apresenta a
estrutura dos principais carotenóides.
Figura 1 - Estrutura dos carotenóides: (a) Xantofilas – zeaxantina, luteína, criptoxantina e
astaxantina, respectivamente; (b) Carotenos – neurosporeno, licopeno, β-caroteno e α-
caroteno, respectivamente (SILVA, 2004).
A maioria dos carotenóides são tetraterpenóides C
40
compostos de 8 unidades
isoprenóides, ligados de tal forma que a molécula é linear e simétrica, com a ordem invertida
no centro. A estrutura básica acíclica C
40
pode ser modificada por hidrogenação,
desidrogenação, ciclização ou oxidação. A característica de absorção de luz destes pigmentos
dá-se devido à cadeia de duplas ligações conjugadas que atua como cromóforo. São
necessárias, aproximadamente, sete ligações duplas conjugadas para que o carotenóide
apresente coloração. O sistema de duplas ligações conjugadas também confere a estes
pigmentos alta reatividade química, podendo ser facilmente isomerizados e oxidados
(PFANDER, 1987; OLIVIER & PALOU, 2000).
Capítulo 1
8
2.4 Microrganismos produtores de carotenóides
Os carotenóides podem ser biossintetizados por microrganismos fotossintetizantes,
como por exemplo, algas e cianobactérias (azuis e verdes), e por microrganismos não
fotossintetizantes como bactérias, fungos filamentosos e leveduras (JOHNSON &
SCHROEDER, 1995).
A produção de carotenóides pelo processo biotecnológico tem sido muito investigada,
destacando-se a produção comercial de β-caroteno pelo fungo Blakeslea trispora
(FEOFILOVA, 1994), pelas microalgas marinhas Dunaliella (BOROWITZKA et al., 1989), a
produção de astaxantina pela microalga de água doce Haematococcus sp. e pela levedura
Phaffia rhodozyma (JOHNSON & SCHROEDER, 1995).
A microalga Dunaliella é rica em β-caroteno e outros carotenóides de grande
aplicação. A Índia possui a maior indústria produtora desta microalga, onde o β-caroteno
destina-se ao uso farmacêutico. Outras grandes produtoras estão localizadas na Austrália,
Estados Unidos, China, Mongólia e Japão; pequenas plantas também são encontradas no
México, Chile, Cuba, Irã e Taiwan (DUFOSSÉ et al., 2005).
A produção industrial de astaxantina por Haematococcus também apresenta grande
interesse devido ao elevado valor comercial deste pigmento, e o grande crescimento do
mercado da aqüicultura. Os principais produtores mundiais estão localizados nos Estados
Unidos, Japão e Índia (DUFOSSÉ et al., 2005).
A capacidade do cultivo de leveduras em meios com alto teor de açúcar, torna estes
microrganismos industrialmente interessantes. As leveduras são microrganismos
predominantemente unicelulares, possuindo reprodução vegetativa por brotamento ou fissão.
A sua distribuição na natureza é ampla, podendo ser encontrada em folhas, frutos, grãos de
cereais e outros substratos contendo açúcares (SOUZA, 1969), e também em solos, águas, ar,
tecidos de alguns animais e insetos.
As leveduras pertencem à divisão Eumicota, classe Ascomicetes, Basidiomicetes e
Deutetromicetes. As leveduras ascomicéticas e basidomicéticas produzem esporos e
apresentam ciclo sexual já conhecido. As leveduras deutomicéticas, também conhecidas como
leveduras imperfeitas, não possuem ciclo sexual conhecido ou descrito, mas apresentam
morfologias semelhantes às leveduras ascomicéticas ou basidomicéticas (KREGER-VAN RIJ,
1984; PHAFF, 1990).
As leveduras são classificadas e identificadas através de características morfológicas e
fisiológicas. Para uma identificação mais específica, estudos bioquímicos e de exigências
Capítulo 1
9
nutricionais são mais relevantes que traços morfológicos e sexuais. A assimilação de
compostos de carbono são critérios importantes na taxonomia e identificação de leveduras,
que dependem de fontes de carbono orgânico para seu crescimento e obtenção de energia,
sendo os carboidratos os nutrientes de maior importância. Açúcares como glicose, frutose,
manose são assimilados por todas as espécies estudadas (BARNETT et al., 1983; SOUZA,
1969), enquanto que alguns oligossacarídeos, polissacarídeos, álcoois, ácidos orgânicos entre
outros são utilizados por apenas algumas espécies de leveduras (PHAFF, 1990).
As leveduras são capazes de utilizar diversas fontes de nitrogênio inclusive amônia,
entretanto a assimilação de nitratos, nitritos, aminoácidos e aminas é especifica para algumas
espécies (PHAFF, 1990). Leveduras tais como Xanthophyllomyces dendrorhous (FONTANA
et al., 1996), Rhodotorula glutinis (AKSU & EREN, 2007; TINOI et al., 2005), Rhodotorula
mucilaginosa (AKSU & EREN, 2005), Sporobolomyces (DAVOLI et al., 2004) e Phaffia
(LIU et al., 2006), Sporidiobolus salmonicolor (CBS 2636) (VALDUGA et al., 2008a-c)
estão sendo estudadas com a finalidade de maximização e/ou otimização da bioprodução de
carotenoides, visando à utilização industrial.
Na Tabela 1 são apresentados os microrganismos tecnologicamente interessantes com
potencial para ser empregados na bioprodução dos principais carotenóides.
Capítulo 1
10
Tabela 1 – Microrganismos empregados na bioprodução de carotenóides.
Espécies Referências
Cianobactérias
Anabaena variabilis Johnson & Schroeder, 1995
Aphanizomenon flos-aqua Johnson & Schroeder, 1995
Nostoc commune Johnson & Schroeder, 1995
Algas
Chlorela pyrenoidosa Johnson & Schroeder, 1995
Dictycoccus cinnabarinus Johnson & Schroeder, 1995
Dunaliella salina Aguilar et al., 2004
Dunaliella tertiolecta Fazeli et al., 2006
Haematococcus pluvialis Orosa et al., 2004
Spongiococcum excetricum Johnson & Schroeder, 1995
Bactérias
Mycobacterium brevicaie Johnson & Schroeder, 1995
Mycobacterium. lacticola Johnson & Schroeder, 1995
Rhodococcus maris Johnson & Schroeder, 1995
Fungos e leveduras
Blakeslea trispora Johnson & Schroeder, 1995
Dacrymyces deliquescens Johnson & Schroeder, 1995
Starr et al., 1976; Sutherland et al., 1996;
Phaffia rhodozyma
Liu et al., 2006; Parajó et al., 1998
Rhodosporidium sp Johnson & Schroeder, 1995
Rhodotorula glutinis Buzzini & Martini, 1999
Rhodotorula graminis Buzzini et al., 2005; Maldonade et al., 2007-2008
Rhodotorula mucilaginosa Buzzini & Martini, 1999; Maldonade et al., 2007-2008
Rhodotorula rubra Shih & Hang, 1996
Rhodotorula sp Bhosale & Grade, 2001
Sporidiobolus sp Johnson & Schroeder, 1995
Sporobolomyces roseus Davoli et al., 2004
S. ruberrimus Razavi & March, 2006
Sporidiobolus. salmonicolor Valduga et al., 2008a,b,c
Rhodotorula CRUB 0195 Libkind & Broock, 2006
S. roseus Davoli et al., 2004
Streptomyces chrestomyceticus Johnson & Schroeder, 1995
Capítulo 1
11
2.5 Screening de microrganismos produtores de carotenóides
Maldonade et al. (2008) selecionaram e identificaram leveduras encontradas no Brasil
capazes de produzir carotenóides. As leveduras pigmentadas (amarelo a vermelho) foram
isoladas de amostras de solos, folhas, frutos, flores e um alimento processado. Dos 242
microrganismos, somente cinco apresentaram coloração intensa entre amarelo e vermelho.
Com a identificação das leveduras baseada nas características morfológicas, de reprodução,
além dos testes fisiológicos e bioquímicos, classificou-se quatro linhagens como R.
mucilaginosa e uma como R. graminis. As linhagens de leveduras mostraram potencial como
microrganismos promissores para a produção comercial de carotenóides por fermentação.
Libkind & Broock (2006), isolaram novas linhagens de leveduras para a produção de
carotenóides e biomassa, as leveduras consideradas como potencias na produção de
carotenóides e biomassa foram estudadas usando o sulfato de amônia e uréia como fontes do
nitrogênio no meio sintético (MMS) e resíduos agro-industriais (melaço de bastão, xarope de
milho, extrato de malte cru) como fontes de carbono, a produção máxima (300 µg/g) do
pigmento foi conseguida pela levedura Rhodotorula CRUB 0195 e pelo Cryptococcus sp.
CRUB 1046. O β-caroteno e o toruleno foram os principais carotenóides encontrados.
2.6 Fatores que exercem influência na produção de carotenóides
A possibilidade da produção de corantes naturais em escala industrial, e o elevado
valor dos produtos tornam a produção biotecnológica de carotenóides uma área de intenso
estudo. A produtividade de um bioprocesso em um dado sistema depende das condições
nutricionais e físicas da cultura, afetando não somente o crescimento celular como a produção
de pigmento (LIU & WU, 2007). Sendo assim, os microrganismos acumulam vários tipos de
carotenóides como resposta ao estresse das condições ambientais (BHOSALE, 2004).
Melhorar a eficiência da biossíntese de carotenóides pode aumentar a produção.
Juntamente com as condições de cultivo, a biossíntese de carotenóides é conduzida pelo nível
e atividade das enzimas biossintéticas e o fluxo total de carbono do sistema sintetizante.
Assim, uma alta produção pode ser alcançada alterando-se o nível e a atividade destas
enzimas ou a via biossintética, pela utilização de uma abordagem molecular (BHOSALE,
2004).
Capítulo 1
12
A biossíntese de carotenóides naturalmente ocasiona mudanças do pH do meio de
fermentação, como conseqüência do crescimento de leveduras. De modo geral, o pH do meio
fermentativo decresce nas primeiras 72 horas de fermentação, seguido de uma elevação
durante a fase intensa de carotenogênese. A partir daí, o pH permanece constante indicando o
final do processo fermentativo (FRENGOVA et al., 1994).
A temperatura é um dos fatores ambientais mais importantes que influenciam o
crescimento e o desenvolvimento dos microrganismos, causando alterações em muitas vias
biossintéticas, inclusive na carotenogênese. Segundo Hayman et al. (1974) a temperatura
exerce controle na concentração de enzimas envolvidas na produção de carotenóides, e
mudanças na concentração enzimática definitivamente controlam o nível de carotenóides nos
microrganismos.
A produção e o acúmulo de carotenóides são positivamente afetados pela irradiação de
luz branca em algas, fungos e bactérias. Contudo, a intensidade e forma de iluminação variam
com o microrganismo. A teoria da foto indução pode ser descrita em dois aspectos, no
primeiro o efeito da luz sobre o crescimento do microrganismo exerce papel fundamental,
como estimulante da produção; o segundo aspecto considera que o acúmulo de carotenóides
na célula está associado com o aumento da atividade das enzimas envolvidas na biossíntese de
carotenóides (BHOSALE, 2004).
2.7 Extração e recuperação de carotenóides
A bioprodução industrial de carotenóides está bem estabelecida e vem se expandindo
comercialmente, porém as operações de extração e recuperação do produto contribuem para
aumento dos custos da produção. Assim, inúmeros trabalhos vêm sendo realizados visando
estudar a recuperação eficiente dos carotenóides intracelulares (VALDUGA et al., 2008c;
SARADA et al., 2006; PARK et al., 2007) e, conseqüentemente contribuindo para a redução
de custo com as operações de downstream.
Park et al. (2007) testaram cinco solventes para a ruptura das células de R. glutinis,
encontrando β-caroteno, toruleno e torularrodina no extrato. A mistura dos solventes
dimetilsufóxido (DMSO), éter de petróleo e acetona mostrou-se eficiente, gerando máxima
extração quando comparada aos solventes individuais.
Um método melhorado de extração de astaxantina de H. pluvialis sem
homogeneização foi desenvolvido por Sarada et al. (2006), a extração do solvente foi
Capítulo 1
13
facilitada pelo tratamento das células com HCl 4 N a 70 °C, onde se obteve uma extração de
90 % dos pigmentos sem homogeneização.
Em função da forte associação dos carotenóides com as células e, no sentido de
maximizar a extração dos pigmentos, Valduga et al. (2008c) testaram 11 métodos diferentes
de rompimento celular e extração com solventes. Foi constatado que quando utilizada a
combinação nitrogênio líquido e DMSO para ruptura celular e extração com mistura de
acetona e metanol (7:3), obteve-se a maior recuperação de carotenóides da levedura S.
salmonicolor cultivada em meio composto por 40 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de malte e
14 g/L de peptona.
Capítulo 1
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Isolamento e seleção de microrganismos carotenogênicos
As leveduras, bactérias e fungos filamentosos coloridos utilizados nos ensaios para
produção de carotenóides foram selecionados de amostras de frutas (laranja, mamão, ameixa
preta, pêssego, maçã, melão, goiaba, banana), casca de uva, solo de videiras, kiwi, solo de
kiwi, chás, folhas de laranjeiras e eucaliptos, produtos processados em decomposição e
farinhas de trigo.
As amostras coletadas foram inoculadas em placas contendo meio de cultura Potato
Dextrose Agar (PDA) e incubadas a 28 ºC por 5 a 7 dias. Após o crescimento de diversos
microrganismos em cada placa, estes foram repicados, um a um, para placas com PDA ou
PCA (Agar Padrão para Contagem) e incubadas novamente a 28 ºC por 5 a 7 dias. Os
microrganismos crescidos foram repicados sucessivamente até isolamento completo dos
mesmos.
3.2 Caracterização dos microrganismos isolados
A caracterização dos microrganismos foi realizada utilizando meio seletivo para
bactérias e leveduras, incubados em placas de Petri a 28 °C por 120 horas. O meio seletivo
para bactéria continha para cada 100 mL de PCA com 500 µL de nistatina (100 U/mL), e o
meio seletivo para levedura continha para cada 100 mL de PCA 50 µL de cloranfenicol
(52,5 mg/mL). O resultado é verificado com o crescimento ou não da cultura em meio
específico.
3.3 Manutenção dos microrganismos
Para preservar as culturas e diminuir o risco de alteração no perfil genético, foi
realizado o congelamento das culturas de fungos filamentosos em ultra freezer a –80 ºC
(MDF – U3086S - Sanyo). O procedimento de congelamento constou das seguintes etapas:
repique da cepa, incubação da cultura em meio sólido (para verificação das características
Capítulo 1
15
morfológicas de leveduras e bactérias) e líquido (específico para fungos filamentosos) e
temperatura de 25 ºC por 72 horas; adição de um agente crioprotetor estéril (glicerol 13 %,
p/v); homogeneização da mistura, sendo a suspensão aliquotada em microtubos estéreis
(1,5 mL), devidamente identificados; e congelamento imediato em ultra freezer a –80 ºC.
As cepas de leveduras e bactérias foram transferidas para tubos inclinados contendo o
meio PCA com a seguinte composição: 2,5 g/L de extrato de levedura (Merck), 5 g/L de bacto
peptona (Merck), 1 g/L de glicose (Nuclear) e 20 g/L de ágar (Difco) e incubados por
48 horas a 25 °C. Após este tempo de crescimento, os tubos contendo os microrganismos
foram conservados em óleo mineral a 4 °C em refrigerador (Brastemp). A repicagem foi
realizada a cada 2 meses. A cultura estoque também foi preservada em óleo mineral e em
geladeira (Consul). Todos os procedimentos foram realizados de forma asséptica
(STANBURY et al., 2000).
3.4 Bioprodução de carotenóides
O pré-inóculo foi preparado em frascos de Erlenmeyer de 250 mL, contendo 100 mL de
meio YM (Yeast Malt Extract) apresentando na composição 3 g/L
de extrato de levedura
(Vetec), 3 g/L
de extrato de malte (Acumedia), 5 g/L
peptona (Himedia), 10 g/L
de glicose
(Nuclear). Após preparo do meio, o mesmo foi esterilizado em autoclave (Phoenix, modelo
AV75) durante 15 minutos a 121 °C.
Após esterilização, estes frascos foram inoculados com suspensão de células,
provenientes de uma alçada e incubados a 25 ºC, 180 rpm por 48 horas. Em seguida, trasferiu-
se 10 mL deste pré-inóculo para o inoculo, preparados em frascos de Erlenmeyer de 250 mL,
contendo 90 mL de meio (40 g/L
glicose, 10 g/L
extrato de malte e 14 g/L
de peptona)
(VALDUGA et al., 2008a), estes frascos foram inoculados a 25 ºC, 180 rpm por 120 horas
(Figura 2).
Capítulo 1
16
Figura 2 - Pré-inóculo após 48 horas de fermentação, a 180 rpm mantido a 25 °C.
Os ensaios de bioprodução de carotenóides foram realizados em shaker com controle
de temperatura e agitação, no qual foram colocados Erlenmeyeres de 250 mL, contendo
90 mL de meio de fermentação (40 g/L
glicose, 10 g/L
extrato de malte e 14 g/L
de peptona)
e incubados a 25 ºC, 180 rpm, pH inicial de 4,0, por 120 horas e sem iluminação, conforme
condições definidas por Valduga et al.(2008ª).
Em ensaios preliminares da bioprodução estudou-se, também, a influencia de
diferentes fontes de nitrogênio: 3 g/L extrato de levedura, 5 g/L extrato de malte, 3 g/L
peptona. Os ensaios foram os realizados para os microrganismos K1 e B7, seguido da
codificação “t” (B7t e K1t).
3.5 Recuperação de carotenóides totais
As células foram centrifugadas a 3.000 × g, 5 ºC por 10 minutos (Eppendorf 5403) e
submetidas a sucessivas macerações em almofariz (Figura 3), após congelamento com N
2
líquido. Posteriormente, adicionou-se dimetilsufóxido - DMSO (Nuclear) na relação 2:1(v/v),
seguindo de aquecimento a 55 ºC/30 min (Fanem 102) e homogeneizações periódicas em
vortex (Phoenix AP-56). Em seguida, adicionou-se mistura de acetona (Quimex): metanol
(7:3, v/v), seguindo de centrifugações (3.000 ×g, 5 ºC, 10 min). O sobrenadante foi separado e
realizaram-se extrações sucessivas, até que o solvente e as células apresentam-se sem
coloração. O solvente foi evaporado em evaporador rotativo (Tecnal TE-210) a 35 ºC e os
pigmentos foram solubilizados em metanol (Merck) (VALDUGA et al. 2008c).
Capítulo 1
17
Figura 3 - Maceração das células com nitrogênio líquido.
3.6 Metodologia analítica
3.6.1 Determinação de carotenóides totais
A absorbância da amostra após extração foi medida em espectrofotômetro (Agilent
8553). A concentração total de carotenóides foi estimada através do valor medido da máxima
absorbância a 448 nm, utilizando a equação descrita por Davies (1976). O coeficiente de
absorbância utilizado foi o referente ao β-caroteno: E
1%
1cm =
2550, para o solvente metanol
(SILVA et al., 2004).
Os resultados da concentração de carotenóides foram expressos em termos de
carotenóides totais (µg/L) e em produção específica de carotenóides (µg/g). A produção
específica de carotenóides representa a concentração total de carotenóides (µg) em relação à
biomassa seca (g) de levedura obtida em 1 litro de meio fermentado (DAVIES, 1976).
Capítulo 1
18
3.6.2 Determinação da biomassa
As células foram centrifugadas a 3.000 × g e 5 ºC por 10 minutos. Após extração dos
carotenóides, as células foram lavadas com água destilada, centrifugadas e a massa celular foi
quantificada através de secagem em estufa (Fanem SE-320) a 105 ºC até peso constante.
3.6.3 Determinação do pH
O pH dos meios de cultivo foi determinado usando potenciômetro (DMPH-2,
Digimed).
Capítulo 1
19
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Este item visa apresentar os resultados obtidos durante a etapa do screening de
microrganismos produtores de carotenóides.
4.1 Isolamento e seleção de microrganismos carotenogênicos
A Tabela 3 apresenta a procedência e o número de microrganismos isolados. Observa-
se que foram isolados um total de 116 microrganismos. Os microrganismos isolados foram
procedentes de amostras de laranja, mamão, pêssego, maçã, melão, goiaba, banana, casca de
uva, solos de videiras, kiwi, solo de kiwi, ameixa preta, chás, produtos processados em
decomposição, amostras de farinha de trigo e amostras de eucaliptos e laranjeiras, sendo que a
maior quantidade de microrganismos isolados foram procedentes de amostras de farinhas (B),
mamão (I), banana prata (G), amostras de eucalipto, laranjeira, folhas de laranjeiras (W), solo
de videira (Q), produtos processados em decomposição (K) e melão (J), respectivamente. Por
observação em microscópio ótico e meio seletivo pôde-se verificar que foram isolados 16
leveduras, 65 bactérias e 35 fungos filamentosos. Observando-se a coloração das leveduras
isoladas, 5 apresentaram características carotenogênicas (W2, W8, B7, O3, K1); das bactérias
19 apresentaram pigmentação (Q1, Q3, G10, J3, J6, F3, N1, J8, J4, G9, G8, G7, G6, G5, G3,
B5, B3, B6 e F2) e dos fungos filamentosos 5 apresentaram coloração (W14, W5, W1, W4 e
W9).
Levando em consideração a possibilidade da obtenção de cepas fermentativas
produtoras de carotenóides, os microrganismos isolados de coloração desejada foram
utilizados no screening. A Figura 4 apresenta aspectos das colônias de fungos filamentosos,
leveduras e bactérias.
Capítulo 1
20
Tabela 3 - Microrganismos isolados de amostras de frutas, resíduos agroindustriais e solo.
Procedência das amostras (Códigos) Quantidades*
Farinhas (B) 11
Banana caturra (F) 5
Banana prata (G) 10
Pêssego (H) 7
Mamão (I) 11
Melão (J) 8
Goiaba (L) 6
Manga (M) 5
Ameixa preta (N) 3
Uva (O) 7
Mosto de uva (R) 3
Solo de videira (Q) 9
Maça (P) 3
Caqui (U) 2
Produtos processados em decomposição (K) 9
Amostras de eucalipto, laranjeira, folhas de laranjeiras (W)
11
Laranja (E) 1
Pêra (T) 2
Chás(D) 2
Kiwi (S) 1
Total 116
*Unidades
Os carotenóides podem ser produzidos por uma grande variedade de microrganismos,
incluindo bactérias, fungos filamentosos e leveduras. Na literatura a grande maioria dos
estudos relacionados a carotenóides enfatizam aspectos da bioprodução tais como a influência
da composição do meio de cultura e condições operacionais (BUZZINI & MARTINI, 1999;
SUTHERLAND et al., 1996; YAMANE et al., 1997; TINOI et al., 2005; RAZAVI &
MARCH, 2006; VALDUGA et al., 2007-2008 a,b,c; AGUILAR et al., 2004; MALISORN &
SUNTORNSUK, 2007; FAZELI et al., 2006; SHIH & HANG, 1996; BUZZINI &
MARTINI, 1999; AKSU & EREN 2007), mas raras são as informações que reportam
procedimentos de seleção, isolamento de microrganismos (MALDONADE et al., 2008,
LIBKIND & BROOCK, 2006) para a bioprodução de carotenóides, na busca de alternativas
de descobrir novos corantes.
Capítulo 1
21
Figura 4 – Aspectos das colônias de microrganismos carotenogênicos isolados das distintas
procedências.
Os trabalhos que referenciam estudos sobre isolamento, seleção e identificação de
microrganismos produtores de pigmentos ainda são poucos. Sláviková & Vadkertiová (2003)
identificaram as leveduras C. laurentii, C. maltosa, M. pulcherrima e S. salmonicolor.
Libkind & Broock (2005) isolaram, selecionaram e identificaram as leveduras R.
mucilaginosa, R. colostri, R. babjevae, S. longiusculus; S. patagonicus e Cryptococcus sp.
Maldonade et al. (2007) selecionaram e identificaram leveduras do Brasil capazes de produzir
carotenóides. As leveduras pigmentadas foram isoladas de solos, folhas, frutos, flores e
produtos processados. As colônias das leveduras que apresentaram coloração de amarelo a
vermelho foram re-isoladas e identificadas através de características morfológicas e de
reprodução, juntamente com os testes fisiológicos e bioquímicos, foram classificadas quatro
W
1
F2
K1
B7
Capítulo 1
22
linhagens como R. mucilaginosa -12, 108, 135 e 137, bem como uma cepas de R . graminis -
125.
4.2 Screening fermentativo para produção de carotenoides
As Tabelas 4 e 5 apresentam os resultados da bioprodução de carotenoides totais e
específicos, biomassa e pH
final
dos microrganismos carotenogênicos de características visuais
de pigmentação rósea e amarela, respectivamente. Os resultados obtidos atráves do screening
fermentativo realizado nas condições de operação apresentadas anteriormente apontaram
microrganismos potenciais para a produção de carotenoides. Dos microrganismos com
potencial carotenogênico de pigmentação (Tabelas 4 e 5), a procedência predominante de
isolamento foi de amostras de farinha de trigo (B3, B5, B6 e B7), resíduo de polpa de maçã
(W1 e W8), solo de videira (Q1 e Q3), banana caturra (G5 e G6), folha de laranjeira verde
(W5), melão (J8), e produtos processados em decomposição (K1), respectivamente.
De acordo com a Tabela 4 e a Figura 5 verifica-se que os microrganismos W8 (L), K1
(L) e B7 (L) demostraram grande potencial para a produção de carotenoides de pigmentação
predominamtemente rósea com teores de carotenoides totais 818, 730 e 707 µg/L,
respectivamente. Dentre estes microrganismos verifica-se que o W8 diferiu estatisticamente
(p<0,05) na produção de carotenoides totais em relação aos demais.
Em relação a bioprodução de carotenoides específicos destacam-se os microrganismos
com caracteristicas visuais róseas K1t (Tabela 4) com valor de 263 µg/g, que não difere
estatisticamente (p<0,05) do microrganismo B7t (216 µg/g). Maldonade et al. (2008)
avaliando leveduras brasileiras pigmentadas, obtiveram um conteúdo de carotenóides
específicos máximo de 132 µg/g para R. glutinis. Valduga et al. (2008a) para os ensaios de
otimização da bioprodução com S. salmonicolor obteve uma concentração específica de
carotenóides variando de 65 µg/g a 338 µg/g. Buzzini & Martini (2007) encontraram uma
concentração máxima de carotenóides específicos para as leveduras Sporidiobolus testadas de
184 µg/g para S. longiusculus, das Sporobolomyces, 82 µg/g para S. roseus, e das leveduras do
gênero Rhodotorula, uma concentração máxima de 138 µg/g para Rhodotorula sp. Buzzini &
Martini (2007) obtiveram uma produção de carotenóides totais de 613 µg/L e carotenóides
específicos de 35 µg/g, para a levedura S. salmonicolor CBS 490, com cultivo em frascos
agitados.
Capítulo 1
23
Tabela 4 - Teor de carotenóides totais, biomassa, carotenóides específicos e pH
final
dos
microrganismos isolados de coloração rósea.
Códigos**
Carotenóides
totais
(µg/L)*
Biomassa
(g/L)
Carotenóides
especificos
(µg/g)
pH
final
W8 (L) 818,56 ± 36,61 a 4,06 ± 0,28 b 201,61 ± 4,16 ab 3,47 ± 0,01 c
K1 (L) 729,72 ± 40,66 ab 2,77 ± 0,25 c 263,43 ± 14,52 a 8,22 ± 0,02 a
B7 (L) 707,15 ± 53,24 b 7,15 ± 0,72 a 98,90 ± 11,18 c 4,86 ± 0,62 b
W2 (L) 529,48 ± 25,81 c 6,69 ± 0,60 a 79,14 ± 11,18 c 3,91 ± 0,02 c
K1t (L) 495,83 ± 11,11 cd 2,71 ± 0,43 c 182,96 ± 30,13 b 8,16 ± 0,01 a
B7t (L) 463,03 ± 40,66 cd 2,14 ± 0,11 c 216,36 ± 7,22 ab 3,77 ± 0,02 c
O3 (L) 385,03 ± 56,57 d 5,27 ± 0,23 b 73,06 ± 16,44 c 3,53 ± 0,03 c
pH inicial ------------ ------------ ----------- 4,00 ± 0,01 c
* média ± desvio padrão seguida de letras iguais não diferem estatísticamente à nível de 5% (Teste de
Tukey)
** L - leveduras
Verifica-se que a produção de carotenóides totais poderá ser maximizada e/ou
otimizada se a composição do meio for modificada, o que é observado pelo ensaio B7t e K1t,
os quais continham em sua composição extrato de levedura, extrato de malte, e
peptona. Desta
forma, estes microrganismos apresentaram perfil diferenciado na produção de carotenóides
totais e na produção de carotenóides específicos, destacando-se a importância da otimização
de composição dos meios e de condições operacionais do processo, visando a maximização da
bioprodução de carotenóides.
A Figura 5 apresenta a produção de carotenóides totais e carotenóides específicos dos
microrganismos isolados de coloraçao rósea.
Capítulo 1
24
Figura 5 – Produção de carotenóides totais e específicos dos microrganismos isolados de
coloraçao rósea.
Em relação aos microrganismos com potencial carotenogênico de pigmentação
predominantemente amarela (Tabela 5 e Figuras 6 e 7), verifica-se que os microrganismos
identificados como W1, Q3 e B3 foram grandes produtores de carotenóides totais, diferindo
estatisticamente (p<0,05) com teores de 2563, 1400 e 1063 µg/L, respectivamente. Além
destes, outros microrganismos destacaram-se na bioprodução de carotenóides totais, tais como
J8, B5, B6, W5, Q1 e G6, com teores que variaram de 507 a 646 µg/L. No entanto, os demais
microrganismos apresentaram produção de carotenóides totais infeior a 474 µg/L.
Capítulo 1
25
Tabela 5 - Teor de carotenóides totais, biomassa, carotenóides específicos e pHfinal dos
microrganismos isolados de características visuais amarela.
Códigos** Carotenóides
totais
Biomassa
(g/L)
Carotenóides
específicos
pH
final
(µg/L)*
(µg/g)
W1(F)
2562,70 ± 20,96 a
10,75 ± 1,97 a
238,39 ± 0,00 d
5,94 ± 0,33 c
Q3(B)
1400,92 ± 68,00 b
3,30 ± 0,23 de
424,52 ± 70,90 c
6,46 ± 0,60 b
B3(B)
1062,57 ± 24,20 c
0,46 ± 0,07 h
2309,93 ± 67,93 a
4,70 ± 0,12 d
J8(B)
645,8 ± 30,86 d
5,35 ± 0,18 c
120,71 ± 3,62 e
4,58 ± 0,07 d
B5(B)
607,15 ± 4,03 d
3,52 ± 0,18 de
172,48 ± 53,95de
5,87 ± 0,06 c
B6(B)
579,09 ± 12,09 de
1,98 ± 0,36 fg
292,46 ± 73,90 d
3,48 ± 0,02 f
W5(F)
555,84 ± 8,76 de
1,67 ± 0,09 fg
33,43 ± 8,90 g
4,40 ± 0,01 d
Q1(B)
551,05 ± 47,51 de
1,42 ± 0,16 fg
388,06 ± 80,03 c
6,77 ± 0,15 b
G6(B)
507,06 ± 10,83 e
2,48 ± 0,20 ef
204,45 ± 58,18 d
4,37 ± 0,03 ed
G3(B)
473,64 ± 13,85 e
2,01 ± 0,25 fg
235,64 ± 14,70 d
4,41 ± 0,01 ed
W14(F)
441,62 ± 40,60 e
0,94 ± 0,13 g
469,80 ± 8,90 c
4,19 ± 0,01 ed
W4(F)
423,66 ± 2,36 e
4,53 ± 0,28 cd
93,52 ± 25,03 ef
8,03 ± 0,03 a
G7(B)
342,47 ± 21,72 f
6,53 ± 0,13 bc
52,44 ± 19,27 g
4,28 ± 0,38 ed
G8(B)
317,92 ± 17,08 fg
6,88 ± 1,10 bc
46,20 ± 3,62 g
3,59 ± 0,07 f
G10(B)
296,06 ± 12,14 fg
1,02 ± 0,07 g
290,25 ± 86,41d
2,80 ± 0,02 g
G5(B)
261,68 ± 53,73 fg
2,56 ± 0,41 e
102,21± 1,73 ef
4,91 ± 0,19 d
G9(B) 251,34 ± 9,51 fg
7,17 ± 0,19 b
35,05 ± 8,19 g
5,63 ± 0,30 c
J6(B)
248,40 ± 6,29 g
2,87 ± 0,55 e
86,55 ± 7,69 f
5,31 ± 0,08 c
J3(B)
228,32 ± 6,29 g
7,64 ± 0,08 b
29,88 ± 13,99 g
3,98 ± 0,06 f
W9(F)
222,09 ± 15,86 gh
0,37 ± 0,03 h
600,24 ± 38,11b
4,08 ± 0,02 e
F2(B)
133,43 ± 31,50 h
1,01 ± 0,06 g
132,10 ± 4,30 e
3,57 ± 0,04 f
N1(B)
106,69 ± 3,57 h
0,7 ± 0,04 gh
152,41±83,93 e
4,20 ± 0,06 ed
J4(B) 80,20 ± 0,67 i
1,89 ± 0,11 fg
42,43 ± 12,30 g
6,22 ± 0,02 bc
F3(B)
50,88 ± 10,90 i
0,46 ± 0,07 h
110,60 ± 31,67 e
3,57 ± 0,04 f
pH inicial
------------
------------
------------
4,00 ± 0,01 e
* média ± desvio padrão seguida de letras iguais não diferem estatísticamente à nível de 5% (Teste de
Tukey); ** (B) – Bactérias, (W) – Fungos filamentosos.
Capítulo 1
26
As Figuras 6 e 7 apresentam o teor de carotenoides totais e carotenoides específicos
dos microrganismos isolados com características visuais amarelas.
Figura 6 – Produção de carotenóides totais e carotenóides específicos dos microrganismos
isolados (W1, Q3, B3, J8, B5, B6, W5, Q1, G6, G3, W14, W4, G7, G8 com características
visuais amarelas.
Figura 7 – Produção de carotenóides totais e carotenóides específicos dos microrganismos
isolados (G10, G5, G9, J6, J3, W9, F2, N1, J4, F3) com características visuais amarelas.
Capítulo 1
27
Comparando os valores de pH, observa-se que os microrganismos W9, W14, N1, G3,
G6, G7 (Tabela 5) e B7t, O3, W8, W2 (Tabela 4 e Figura 5 ) o pH final não diferem
estatisticamente (p<0,05) e em relação ao pH inicial (4,0). Enquanto que os demais
microrganismos apresentaram alterações dos valores de pH durante a bioprodução. Para os
microrganismos produtores de pigmentos de coloração predominante rósea (Figura 8), com
pH na faixa de 4,0, obteve-se maior potencial carotenogênico. Resultado similar foi obtido
por Valduga et al. (2008 a,b), onde o pH 4,0 foi considerado ótimo para a produção de
carotenóides totais por S. salmonicolor CBS 2636 em meio sintético e agroindustrial, sendo
que a produção máxima de células e de carotenóides foram associadas e ocorrem
simultaneamente. Tinoi et al. (2005), com a levedura R. glutinis em meio agroindustrial
também observaram esta associação entre crescimento celular e produção de carotenóides.
Figura 8 – Correlação da bioprodução de carotenóides totais e pH final dos microrganismos
de características visuais róseas.
No entanto, os microrganismos B6, G8, J3, F2, F3 (Tabela 5) e W2, W8, O3 (Tabela
4) apresentaram valores de pH na faixa de 3,0; os identificados por B5, J6, W1, G9 (Tabela 5)
na faixa de 5,0; G10 (Tabela 5) com valor de 2,8; os microrganismos Q1, Q3, J4 (Tabela 5) na
faixa de 6,0; os identificados por W4 (Tabela 5) e K1 (Tabela 4) de 8,03 e 8,22,
respectivamente. Para os microrganismos produtores de pigmentos de coloração
predominante amarela com pH na faixa de 5,0 a 6,0, obteve-se maior potencial
carotenogênico (Figura 9). Estas diferenças significativas (p<0,05) do pH final em relação ao
inicial podem estar relacionadas a especificidade da biossíntese carotenogênica do
microrganismo e/ou a limitações de nutrientes do substrato.
Capítulo 1
28
De acordo com Frengova et al. (1994) a biossíntese de carotenóides ocasiona
mudanças do pH do meio de fermentação, como conseqüência do crescimento de leveduras.
De modo geral, o pH do meio fermentativo decresce nas primeiras 72 horas de fermentação,
seguida de elevação durante a fase intensa da carotenogênese. A partir daí o pH permanece
constante indicando o final do processo fermentativo.
Figura 9 – Correlação da bioprodução de carotenóides totais e pH final dos microrganismos
de características visuais amarelas.
Em relação à biomassa, destaca-se o microrganismo com característica visual amarela
W1 (Tabela 5) com valor de 10,7 g/L, o qual difere estatísticamente (p<0,05) dos
identificados por J3, G9, G8 e G7 com valores na faixa de 6,5 a 7,6 g/L. Os microrganismos
B7 e W2 com características visuais róseas (Tabela 4) não diferem estatísticamente (p<0,05),
apresentando maior crescimento celular (7,0 g/L) e diferindo em relação aos demais
microrganismos.
Ao comparar com dados da literatura (MALDONADE et al, 2008; VALDUGA et al,
2008a; BUZZINI & MARTINI, 2007; TINOI et al, 2005) verifica-se que a grande maioria
dos microrganismos carotenogênicos isolados (W8, K1, B7, W2, O3, W1, K3, B3, J8, B5, B6,
Capítulo 1
29
W5, G6, G3, W14 , W4 e G7) apresentam potencial de bioprodução de carotenoides,com
teores de carotenoides totais superiores a 340 µg/L. Ressalta-se que a bioprodução dos
microrganismos anteriormente citados e os demais isolados, poderá ser maximizada se
condições operacionais e as fontes de carbono e nitrogênio forem otimizadas
A Figura 10 apresenta as características visuais dos carotenóides totais após
solubilização em metanol.
Figura 10 – Aspectos visuais dos carotenóides de coloração rósea e amarela após
solubilização em metanol, respectivamente; A – Microrganismo B7; B – Microrganismo W1.
W1
B
7
Capítulo 1
30
5 - CONCLUSÕES
Através da seleção e isolamento de microrganismos estudou-se a bioprodução de
carotenóides dos microrganismos que apresentaram coloração amarela e rósea, permitindo
extrair as seguintes conclusões:
- Um total de 116 microrganismos foram isolados, dos quais 16 leveduras (6
carotenogênicas), 65 bactérias (20 carotenogênicas) e 35 fungos filamentosos (2
carotenogênicos);
- O teor máximo de carotenóides totais para os microrganismos W1 e W8 de
características visuais amarelas e róseas, foram de 2562,70 e 818,56 µg/L,
respectivamente;
- O teor máximo de carotenóides específicos para os microrganismos B3 e K1 de
características visuais amarelas e róseas foram de 2309,93 e 263,43 µg/g,
respectivamente;
- O pH final dos microrganismos com características visuais amarelas, codificados
como W14 (F), G3 (B), G6 (B), G7 (B), N1 (b) e W9 (F) não apresentaram diferença
significativa (p < 0,05) entre o pH inicial (4,0). O mesmo foi verificado para os
microrganismos W2 (L), W8(L), O3(L) e B7t(L) de características visuais róseas.
- A produção de biomassa relativa aos microrganismos de características visuais
amarelas variou de 0,37 a 10,8 g/L. Para os microrganismos com características
visuais róseas a concentração de biomassa variou de 2,14 a 7,15 g/L.
Capítulo 1
31
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo 2
36
CAPÍTULO 2 - SCREENING DE MICRORGANISMOS
PRODUTORES DE POLIGALACTURONASES
Capítulo 2
37
SCREENING DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE
POLIGALACTURONASES
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi o screening de microrganismos isolados de
amostras de resíduos agroindustriais, solos e de cepas identificadas, visando a produção de
enzimas pectinolíticas, especificamente poligalacturonase (PG). Os microrganismos foram
isolados de amostras de laranja, mamão, pêssego, melão, goiaba, banana, farinha de trigo e
de produtos processados em decomposição. As linhagens identificadas como Penicillium
simplicissimum, P. camembertii (CT) ATCC 4845, Aspergillus niger ATCC 16404, A.
niger, A.niger ATCC 1004, A. niger ATCC 9642, P. notatum ATCC 9478, P. duclauxii
ATCC 9121, P. citrinum ATCC 28752, P. brevicompactum, P. verrucosum, P. digitatum
ATCC 26821, A. oryzae ATCC 1003, Paecilomyces variotii ATCC 22319, Pseudomonas
putida, S. salmonicolor CBS 2636, Candida sp ATCC 34147 e Hansenula sp também
foram utilizados no estudo da produção de poligalacturonase. Os microrganismos isolados
foram inoculados em meio PCA, e incubadas a 28 °C por 48 horas. A atividade de PG foi
determinada pelo método do ácido dinitrosalicílico (DNS) em espectrofotômetro (540 ηm).
No screening de microrganismos produtores de poligalacturonase foram isolados e
selecionados um total de 92 microrganismos a partir dos 116 microrganismos isolados,
sendo 76 fungos filamentosos e 16 bactérias. As linhagens P. simplicissimum, A. niger
ATCC 16404, A. niger ATCC 1004, A. niger ATCC 9642, P. putida e os microrganismos
isolados e codificados como W12, D2, H8, L1, K3, W35, W43, W44, W52, W23, W24,
H9, W18, L4 e T2 apresentaram unidades de atividades de PG superiores a 3 U/mL. Após
o estudo cinético da bioprodução obteve-se um aumento de até 13 vezes na atividade de
PG, sendo que o microrganismo identificado como W43 apresentou atividade de 45 U/mL.
Palavras- chave: Screening, microrganismos, poligalacturonases, pectinases.
Capítulo 2
38
1. INTRODUÇÃO
As pectinases formam um grupo de enzimas que degradam substâncias pécticas,
hidrolisando ligações glicosídicas ao longo da cadeia carbônica. Podem ser
despolimerizantes ou desesterificantes e são produzidas por plantas, fungos filamentosos,
bactérias e leveduras. Diversas espécies de microrganismos como Bacillus, Erwinia,
Kluyveromyces, Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Pseudomonas, Penicillium e
Fusarium são conhecidos como bons produtores de pectinases (DE GREGÓRIO et al.,
2002; KASHYAP et al., 2001) podendo ser utilizados em escala industrial, pois cerca de
90 % das enzimas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura.
Algumas das aplicações destas enzimas nas indústrias de alimentos incluem
amadurecimento de frutas, clarificação e redução de viscosidade em sucos de frutas,
tratamento preliminar do suco de uva para indústrias vinícolas, extração de polpa de
tomate, fermentação de chá e chocolate, tratamento de resíduos vegetais, degomagem de
fibras nas indústrias têxteis e de papel, nutrição animal, enriquecimento protéico de
alimentos infantis e extração de óleos (UENOJO & PASTORE, 2007). As pectinases
foram uma das primeiras enzimas a serem utilizadas comercialmente nas preparações de
vinhos e sucos de frutas ao redor de 1930 (BHAT, 2000; KASHYAP et al., 2001;
UENOJO & PASTORE, 2007). Durante as duas últimas décadas, o uso de celulases,
hemicelulases e pectinases têm aumentado consideravelmente, especialmente nas
indústrias de alimentos, bebidas e vinhos, têxtil e de papel e celulose (BHAT, 2000).
Entretanto, uma enzima torna-se de valor comercial somente se houver demanda ou
possuir propriedades que atendam aos requerimentos técnicos e econômicos do processo
em escala industrial (BRAVO et al., 2000).
Diversas companhias na Europa (Novo Nordisk, Miles Kali-Chemie, Swiss Ferment
Co. Novartis, Roche), Estados Unidos (Miles Laboratories, Rohm and Raas Co.) e no
Japão (Kikkoman Shoyu Co.) produzem pectinases e preparações comerciais de pectinases
(BHAT, 2000; GUMMADI & PANDA, 2003). O mercado mundial de enzimas apresenta
valor comercial de US$ 2 bilhões de dólares anuais e vem crescendo a cada ano com taxas
de 8 a 10 %. Deste total, o Brasil participa com 5 % do mercado através de importações,
que segundo dados de 2005 do Ministério do Desenvolvimento chegaram a
US$ 100 milhões de dólares. A indústria de alimentos é a que mais tem se beneficiado com
o uso das enzimas, sendo utilizadas em 15 % dos processos industriais. Além disso, este
Capítulo 2
39
setor está em crescente expansão faturando aproximadamente R$ 1 trilhão em 2005, o que
representa um crescimento de 9,2 % em relação a 2004 (FAPEMIG, 2008). Desse total, a
indústria de sucos naturais teve uma produção de 111 milhões de litros entre janeiro e
março de 2007 representando um crescimento de 12,6 % em relação ao mesmo período de
2006.
Estudos de isolamento e seleção de microrganismos com potencial de produção de
poligalacturonases são demonstrados neste capítulo. Inicialmente será apresentado um
referencial teórico sobre o assunto, seguido pela descrição detalhada da metodologia
empregada e dos resultados com as respectivas discussões e conclusões.
Capítulo 2
40
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Substâncias Pécticas
Substâncias pécticas são macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular que
formam o maior componente da lamela média, uma fina camada de material adesivo
extracelular entre as paredes primárias de células de vegetais superiores (LIMBERG et al.,
2000). Quimicamente, são um complexo coloidal de polissacarídeos ácidos, composto de
resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações α -1,4, parcialmente esterificados por
grupos metil éster (KASHYAP et al., 2000; GUMMADI 2000 & LIMBERG 200) e parcial
ou completamente neutralizadas por uma ou mais bases (íons sódio, potássio ou amônio)
(KASHYAP et al., 2000; SAKAI et al., 1993). Ao contrário das proteínas, lipídeos e
ácidos nucléicos, e sendo polissacarídeos, as substâncias pécticas não possuem massa
molecular definida, variando de 25 a 360 kDa (SAKAI et al., 1993).
2.2 Classificação e mecanismos de ação das pectinases
A degradação da pectina está diretamente relacionada às mudanças da textura dos
frutos durante os estágios finais do amadurecimento. Estudos têm mostrado que esta
degradação difere significativamente entre os diversos tipos de frutos, ainda que os níveis
da atividade das pectinases sejam similares (HUBER et al., 2001).
As enzimas pécticas são produzidas por vegetais como cenoura, pêssego, frutas
cítricas, pepino, pêra e maçã, no trato intestinal de diversos insetos, nas células de fungos
filamentosos, leveduras e em certas bactérias. Contudo, são purificadas
predominantemente de espécies de Aspergillus (TEIXEIRA, 1997; VRIES et al., 2000).
As pectinases despolimerizam a pectina por hidrólise e transeliminação, bem como
por reações de desesterificação, isto é, hidrolisam a cadeia éster entre os grupos carboxila e
metil da pectina (DARTORA et al., 2001).
De acordo com o mecanismo de ação, as pectinases são classificadas em 1)
protopectinases, que hidrolisam a protopectina insolúvel originando pectina solúvel, 2)
esterases que catalisam a desesterificação da pectina pela remoção dos grupos metoxílicos,
e 3) despolimerases que catalisam a clivagem hidrolítica das ligações α (1,4) das cadeias
glicosídicas no ácido D – galacturônico (JAYANI et al., 2005).
Capítulo 2
41
No grupo das esterases estão classificadas as pectinesterases e no grupo das
despolimerizantes, as poligalacturonases (endopoligalacturonases e exopoligalacturonases)
e pectina liases (DARTORA et al., 2001; GAVA, 1998; WHITAKER, 1990). Jayani et al.
(2005) apresentam outra classificação mais extensa para as pectinases, na qual as
protopectinases figuram como despolimerizantes.
As protopectinases (PPases), também conhecidas por pectinosinases catalisam a
hidrólise da protopectina, originando ácido péctico e pectina, diminuindo a rigidez da
parede celular durante o amolecimento e o amadurecimento (JAYANI et al., 2005).
Existem dois tipos de PPases, sendo que o tipo A faz a clivagem na parte interna da
molécula do ácido poligalacturônico da protopectina enquanto o tipo B nas cadeias de
polissacarídeos que podem estar conectados à cadeia de ácido poligalacturônico e
constituintes da parede celular (JAYANI et al., 2005).
As pectinesterases (PE), são denominadas também de pectina metilesterase (E.C.
3.1.1.1), pectase e pectina metoxilase. Desesterificam a pectina por hidrólise, removendo
os grupos metoxílicos da molécula de pectina e de ácido pectínico resultando na formação
de ácido péctico (GAVA, 1998; MAYANS et al., 1997; WHITAKER, 1990).
A desesterificação da pectina ocorre linearmente ao longo da molécula, por
mecanismo em cadeia simples, comumente reduzindo a esterificação em 10 % (GAVA,
1998; MAYANS et al., 1997; WHITAKER, 1990). Durante a reação ocorre a quebra da
molécula da água e a adição de um hidrogênio a um carbono da ligação e adição do grupo
hidroxila a outro carbono, produzindo metano e pectina com baixo grau de metoxilação
(TRIBESS, 2003).
As pectinesterases estão presentes em todas as plantas, em quantidade muitas vezes
superior quando comparada com a quantidade de pectina disponível, a exemplo dos frutos
cítricos nos quais já foi constatada a presença dessas enzimas em grande quantidade. São
reconhecidas várias isoformas de PE, que variam em termoresistência e em número de
acordo com a fonte vegetal. Em suco de laranja existem pelo menos sete isoformas, com
pesos moleculares, resistência térmica e atividades diferentes (TRIBESS, 2003).
As poligalacturonases (PG), podem ser caracterizadas em função do substrato
(pectina, ácido péctico ou oligo D-galacturonatos) e também pelo modo de ação na
molécula do substrato, isto é, por clivagem de ligações glicosídicas ao acaso no interior da
molécula (endoatividade), sendo denominadas endopoligalacturonases [EndoPG
Capítulo 2
42
(E.C.3.2.1.15)], ou por clivagem de ligações terminais (exo-atividade) sendo denominadas
exopoligalacturonases [ExoPG ( E.C. 3.2.1.67)] (GAVA, 1998; WHITAKER, 1990).
As poligalacturonases necessitam de grupos carboxílicos livres para a catálise. A
presença de grupos metoxílicos na molécula de pectina pode inibir a atividade dessas
enzimas (DINU, 2001). A síntese por fungos filamentosos pode ser induzida por
substâncias pécticas e inibida pela presença de monossacarídeos facilmente
metabolizáveis, como glicose e frutose (SUBAKOV & EL`KINA, 2002).
A endoPG proporciona a produção de uma série de oligogalacturonatos e pouca
quantidade de mono e digalacturonatos enquanto a ExoPG produz relativamente alta
concentração de mono e/ou digalacturonatos (WHITAKER, 1990). As EndoPGs estão
envolvidas nos mecanismos de defesa das plantas por degradarem a parede celular vegetal.
Os oligômeros pécticos resultantes da ação dessas enzimas exercem ações defensivas (BAI
et al., 2004).
As pectina liases (PL), também chamadas transeliminases, despolimerizam pectina
com aproximadamente 65 a 98 % de esterificação, clivando as ligações glicosídicas no
carbono 4 e simultaneamente eliminando hidrogênio do carbono 5 (JAYANI et al., 2005;
MUTLU et al., 1999). De acordo com o substrato em que agem ou o mecanismo de ação,
pectinaliases são classificadas em endopoligalacturonato liases [EndoPGL (E.C. 4.2.2.2)],
exopolimetilgalacturonato liases [ExoPGL(E.C. 4.2.2.9)], endopolimetilgalacturonato
liases [EndoPMGL (E.C. 4.2.2.10)] e exopolimetilgalacturonato liases [ExoPMGL]
(JAYANI et al., 2005).
2.3 Aplicação industrial das pectinases
O estudo das pectinases tem sido considerado de grande importância, em razão da
aplicação nas indústrias que processam matéria-prima vegetal, para remoção de
substâncias pécticas, as quais inviabilizam o produto desejado (GHILDYAL et al., 1981;
WHITAKER, 1984).
Enzimas pectinolíticas são amplamente utilizadas no setor de alimentos, no
processamento de polpa de frutas e outras estruturas vegetais, na clarificação de sucos de
frutas e de vinhos para melhorar a aparência e aumentar o rendimento, isolamento de óleos
essenciais e pigmentos de cítricos (BAI et al., 2004; BARENSE et al., 2001; FILHO et al.,
Capítulo 2
43
1991; HOONDAL et al., 2002; MALVESSI & SILVEIRA, 2004; MOLINA et al., 2001;
PATIL & DAYANAND, 2005).
Para a extração e clarificação de sucos e vinhos têm sido utilizadas pectinases
ácidas enquanto que para o tratamento de vegetais, em outros ramos da indústria
alimentícia e para o processamento de fibras, como a juta, utiliza-se pectinases alcalinas
(HOONDAL et al., 2002).
Outros exemplos de aplicação de tais enzimas são na fabricação do papel, rações
para animais, fermentação de café e chá (DINU, 2001; HOONDAL et al., 2002; PATIL &
DAYANAND, 2005). Na indústria têxtil estão sendo desenvolvidas novas técnicas para o
processamento enzimático das fibras. Após o tratamento com pectinases puras as fibras
adquirem maciez sem perder resistência, resultado que ocorre também quando tratadas
com celulases (DARTORA et al., 2001; MOLINA et al., 2001).
Enzimas degradadoras de pectina têm sido empregadas para aumentar o conteúdo
de proteína de sucos naturais e na produção de alimentos para bebês, como purês de frutas
e legumes (DARTORA et al., 2001). Considerando que o processamento em escala
industrial requer agilidade e qualidade final, as enzimas pectinolíticas são componentes
importantes da tecnologia para a obtenção de sucos de frutas (SILVA et al., 1999). No
processamento de frutas, as pectinases promovem a desgeleificação da polpa durante a
maceração e extração do suco proporcionando a diminuição da viscosidade. As enzimas
agem desestabilizando as substâncias floculantes, provocam coagulação e precipitação com
conseqüente clarificação. Durante o tratamento enzimático aumenta o tamanho das
partículas insolúveis devido à redução da repulsão eletrostática entre as nuvens de
partículas, agrupando-as (BALISCHI et al., 2002; BARROS et al., 2004; GAVA, 1998;
SOLÍS - PEREIRA et al., 1993). Granada et al. (2001) relatam que em frutos como
morangos, cerejas, amoras e ameixas, o suco está retido dentro da estrutura celular e que
preparados enzimáticos promovem a quebra desta estrutura, dissolvendo os compostos
pectinolíticos e consequentemente liberando mais facilmente o suco.
Em geral, na fabricação de sucos de frutos com casca fina, inicialmente estes são
triturados e prensados. A ação dessas enzimas facilita os processos subseqüentes da
produção dos sucos e vinhos. Na produção de suco de maracujá as enzimas têm sido
adicionadas em uma etapa precedente à filtração, quando há a hidrólise enzimática da
estrutura vegetal resultando na degradação dos sólidos em suspensão e diminuição da
viscosidade, assim agiliza-se todo o processo (PAULA et al., 2004).
Capítulo 2
44
Barros et al. (2004) conseguiram diminuir 22,3 e 30 % a viscosidade de sucos de
abacaxi e cereja, respectivamente, com a utilização de uma mistura de enzimas contendo
pectinases, celulases e hemicelulases. Bastos et al. (2002) obtiveram maiores níveis de
extração da polpa de cupuaçu quando utilizaram enzimas pectinolíticas durante o
processamento. Granada et al. (2001) aumentaram o rendimento de sucos de amora-preta e
Mutlu et al. (1999) aumentaram a produção de suco de cenoura, ambos utilizando enzimas
pectinolíticas durante o processo de trituração.
Outros compostos internos da célula vegetal encontram-se aumentados nos sucos
quando extraídos com pectinases. Entre esses, os compostos fenólicos, que conferem
coloração, sabor e aroma, e os sólidos solúveis, aumentando assim os teores de açúcares e
de ácidos (BASTOS et al., 2002; GRANADA et al., 2001; NOGUEIRA et al., 2003).
2.4 Pectinases disponíveis no mercado
As empresas Lyven (França), Novozymes (Dinamarca), Novartis (Suíça) e Biocon
(Índia) (SILVA et al., 1999). Na Tabela 1 estão citadas enzimas pectinolíticas
comercializadas pelas empresas Lyven e Novozymes são algumas das mais importantes
produtoras mundiais de pectinases.
Tabela 6 – Pectinases comercializadas pelas empresas Lyven e Novozymes, com os
respectivos nomes comerciais, a origem da enzima e a aplicabilidade do produto.
Nome Comercial Origem Aplicabilidade
PECLYVE CP A. niger Clarificação de sucos de frutas
PECLYVE LI A. niger Liquefação de frutas e vegetais
LYVELIN A. niger Tratamento do linho
PECLYVE V A. niger Fabricação de vinhos
Pectinex Ultra SP-L Microrganismo* Processamento de frutos
Pectinex SMASH Microrganismo* Processamento de frutos
Pectinex AFP-L4 Microrganismo* Indústria de sucos
Pectinex AFP MAXXL Microrganismo* Indústria de sucos
Fonte: LYVEN (2005); NOVOZYMES (2005). * não reportado pelo fornecedor.
Capítulo 2
45
2.5 Screening de microrganismos produtores de pectinases
As pectinases são produzidas por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. A
composição dos complexos enzimáticos pectinolíticos varia entre as espécies de
microrganismos, portanto a seleção de isolados capazes de sintetizar enzimas adequadas é
um processo fundamental para o uso industrial (EL-REFAI et al., 1984; UEDA et al.,
1982).
Os fungos, em função de suas características de reprodução e crescimento,
adaptam-se a uma grande variedade de substratos, sendo excelentes decompositores de
material orgânico. Além disso, as pectinases produzidas por fungos apresentam
características importantes para a aplicação em bioprocessos, como estabilidade ao pH e à
temperatura (MARTIN et al., 2004).
Um outro fator que pode justificar a crescente utilização de enzimas fúngicas na
indústria de alimentos é o fato dos fungos produtores de pectinases possuírem o pH de
atuação bem próximo ao pH da maioria dos sucos de frutas, o qual varia de 3,0 a 5,5
(MOYO et al., 2003).
Preparações comerciais de pectinases são normalmente de origem fúngicas,
especialmente de Aspergillus e Penicillium, que exibem características de alta atividade de
endopoligalacturonase e de pectinaliase. Estas preparações de pectinases disponíveis no
mercado são compostas por pectinametilesterase, poligalacturonase e pectina liase. Além
do gênero Aspergillus e Penicillium, outros fungos filamentosos produtores de pectinases
são citados por Geocze (1994) e Castilho (1999), como: Fusarium. Sclerolinia, Monilia,
Coniolhyrium e Rhizopus dentre vários outros que vêm sendo avaliados como potentes
produtores de pectinases. Apesar da propriedade desses fungos quanto a produção de
pectinases, nem todos são aproveitáveis, já que alguns deles são produtores de várias
micotoxinas, que podem ser prejudiciais à saúde do homem (DALBOGE, 1997)
Apesar de existirem vários fungos produtores de pectinases, Jia & Wheals (2000),
afirmam que as enzimas pectinolíticas usadas na indústria de alimentos são
comercialmente produzidas em sua maioria por A. niger. Esta espécie de fungo produz
várias pectinases, incluindo pectinametilesterase (PME), poligalacturonase (PG) e pectina
liase (PL). As pectinases produzidas por A. niger são de grande importância, pois são
classificadas como GRAS (Generally Recognized As Safe), permitindo assim sua
aceitabilidade na indústria de processamento de alimentos. Além disso, a pectina liase
produzida por A. niger é a única enzima capaz de hidrolisar, sem ação prévia de outras
Capítulo 2
46
enzimas, pectinas altamente esterificadas, como a pectina de frutas.
Dalboge (1997) menciona que, apesar da extensa aplicação de pectinases de A. niger
no setor comercial, muitas apresentam baixa atividade de PG e alta atividade de PME e PL.
Além disso, o uso da mistura enzimática produzida por Aspergillus pode resultar em
decréscimo da estabilidade do suco de fruta pela precipitação dos derivados de pectina
desesterificado com íons de cálcio presente no suco e liberação de metanol para o sistema
digestivo. O autor resalta que pode inviabilizar a aplicação dessas enzimas na indústria
alimentícia. Atualmente, novos estudos estão sendo incentivados, buscando o
conhecimento e aplicação de pectinases obtidos de outros fungos no setor comercial.
O crescente aumento das pesquisas na área da enzimologia estimula a descoberta de
novos microrganismos a fim de aumentar a produtividade, a especificidade e a estabilidade
das enzimas (GEOK et al., 2003).
O screening de microrganismos produtores de enzimas é importante para o
desenvolvimento de enzimas e semi-purificação de processos futuros, podendo ser usado
para biocatálises e sínteses orgânicas (CARDERNAS et al., 2001).
Martín et al. (2004) estudaram a produção de pectina liase e poligalacturonase por
linhagens de fungos filamentosos isoladas, através de fermentação em estado sólido,
utilizando subprodutos agro-industriais. As Poligalacturonases de Moniliella sp mostraram
atividade máxima em pH 4,5 e pH da Pectina Liase em 10,0, enquanto o pH de
Poligalacturonase de Penicillium sp EGC5 apresentou pH ótimo em 4.5-5.0 e 9,0,
respectivamente.
Molina (2001) estudou 18 linhagens de fungos filamentosos, com o objetivo de
obter enzimas para a decruagem das fibras de matéria têxtil. As linhagens foram avaliadas
para a produção de enzimas pectinolíticas sob diversas circunstâncias de crescimento
(meio de cultura e temperatura do crescimento). A produção de pectinases foi medida por
índice enzimático no meio de pectina. Entre as linhagens testadas, o P. chrysogenum IFO
4626 (Q 176) mostrou o melhor desempenho.
Soares et al. (1999), isolaram, a partir de amostras de solo e de material vegetal em
decomposição, 168 linhagens bacterianas capazes de utilizar pectina de citrus como única
fonte de carbono. Destas, 102 foram positivas para a despolimerização da pectina, através
de ensaios em placa de Petri, nos quais foram detectados halos claros ao redor das
colônias. Entre essas, 30 % (50) foram consideradas ótimas ou boas produtoras de
poligalacturonases. O cultivo dessas linhagens através de fermentação submersa e semi-
Capítulo 2
47
sólida para a quantificação das poligalacturonases (PG) produzidas indicou que 6 linhagens
de Bacillus sp. foram as melhores produtoras da enzima (0,3 a 4,0 U/mL). As
características físico-químicas, como pH ótimos entre 6,0 e 7,0 e temperaturas ótimas entre
45 e 55 ºC, estabilidade à temperaturas acima de 40 ºC e pH neutros e alcalinos foram
determinadas.
Uenojo & Pastore (2007) testaram 104 linhagens de microrganismos, sendo 18
linhagens selecionadas para fermentar em meio líquido, contendo pectina para a
determinação de atividade de poligalacturonase (PG), destas 18 linhagens, somente 7
apresentaram unidades de atividade de PG superiores a 80 µmol de ácido
galacturônico/mL/min.
Capítulo 2
48
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Isolamento, seleção, manutenção e caracterização de microrganismos
pectinolíticos
A metodologia de isolamento, seleção, manutenção e caracterização dos
microrganismos foi realizada conforme descrito no Capítulo 1 deste trabalho. Ressalta-se
que somente 92 microrganismos isolados (76 fungos e 16 bactérias) foram utilizados para
bioprodução de poligalacturonases. Além dos microrganismos isolados neste trabalho,
também foram testadas algumas cepas já identificadas, com o objetivo de produzir
poligalacturonases conforme apresentado na Tabela 7.
Tabela 7 – Cepas de microrganismos testados na produção de poligalacturonases.
*1
Instituto de Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Brasil),
*2
Fundação
Instituto Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro Brasil),
*3
Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade
Regional Integrada (Erechim, Brasil), *
4
Centraalbureau Voor Schimmelcultures – Fungal Biodivesrity
Centre – Institute of the Royal Netherlands, Academy of arts and Sciences (KNAW).
Microrganismos Procedência
Aspergillus niger
*1
UFRJ
Aspergillus niger ATCC 16404
*2
FIOCRUZ
Aspergillus niger ATCC 9642
*2
FIOCRUZ
Aspergillus niger ATCC 1004
*2
FIOCRUZ
Aspergillus oryzae ATCC 1003
*2
FIOCRUZ
Penicillium citrinum ATCC 28752
*2
FIOCRUZ
Penicillium digitatum ATCC 26821
*2
FIOCRUZ
Penicillium notatum ATCC 9478
*2
FIOCRUZ
Penicillium camembertii (CT) ATCC 4845
*2
FIOCRUZ
Penicillium duclauxii ATCC 9121
*2
FIOCRUZ
Paecilomyces variotii ATCC 22319
*2
FIOCRUZ
Pseudomonas putida
*1
UFRJ
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
*3
URI
Candida sp. ATCC 34147
*2
Sporidiobolus salmonicolor CBS 2636
*4
FIOCRUZ
FBC
Capítulo 2
49
3.2 Meio de cultura para determinação de atividade pectinolitica
O meio líquido para crescimento microbiano e determinação de atividade
pectinolítica foi proposto por Kashyap et al. (2000), constituído de 1 % de extrato de
levedura, 1 % de pectina cítrica (Sigma), pH 5,5, autoclavado a 121 °C e 1 atm de pressão
por 15 minutos. Os microrganismos selecionados foram inoculados a 50 mL de meio e
incubados em shaker rotatório a 30 °C, 100 rpm por até 96 horas.
A cada 24 horas de fermentação as culturas foram centrifugadas a 3.000 x g por
10 minutos a 0 °C para separação do sobrenadante livre de células e posterior determinação
de atividade pectinolítica e medida de pH. O sobrenadante foi armazenado em congelador
a -18°C em frascos de vidro de 50 mL com tampa e posteriormente analisados.
3.3 Determinação da atividade pectinolítica
3.3.1 Atividade de poligalacturonase (PG)
A atividade pectinolítica de poligalacturonase (PG) foi determinada pela medida da
liberação de grupos redutores usando-se o método do ácido dinitrosalisílico (DNS),
proposto inicialmente por Miller (1995).
Inicialmente, preparou-se 1000 µL de substrato (solução 0,5 % de pectina cítrica
(Sigma) em tampão acetato pH 4,5) e incubou-se a 40 °C por 15 minutos para estabilização
de temperatura. A seguir, 500 µL de extrato enzimático foram adicionados ao substrato e a
reação incubada a 40 °C por 40 minutos. Após a adição de 1 mL de solução de DNS, a
mistura foi mantida em ebulição por 8 minutos para formação de cor, resfriada em banho
de gelo e adicionados 8,0 mL de solução 50 mM de tartarato duplo de sódio-potássio para
estabilização de cor (Figura 11).
A absorbância foi medida em espectrofotômetro Beckman Coutler, modelo DU640,
a 540 ηm, contra o branco. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de
enzima necessária para liberar 1 µmol de ácido galacturônico por minuto (U=µmol/min)
segundo uma curva padrão estabelecida com ácido α-D-galacturônico (Fluka Chemica,
massa molecular 212,16) como açúcar redutor. A atividade da poligalacturonase foi
Capítulo 2
50
expressa em unidade de atividade por mL (U/mL). As análises foram realizadas em
triplicatas de reação, bem como de leitura.
Figura 11 – Detalhe do processo para medida de Atividade de Poligalacturonases.
3.3.2 Cinética enzimática
Partindo dos resultados com os microrganismos que apresentaram maior potencial
de produção em 24, 48, 72 e 96 horas de fermentação, foi realizado um estudo cinético de
medida de atividade de PG em diferentes tempos de reação: 5, 10, 15, 20, 25, 30 e
40 minutos, respectivamente.
Capítulo 2
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Este item apresenta os resultados referentes ao screening de microrganismos produtores
de poligalacturonases (PG).
4.1 Screening de microrganismos pectinolíticos
A Tabela 8 apresenta a procedência dos microrganismos isolados para a produção
de poligalacturonases juntamente com a quantidade de microrganismos isolados de cada
amostra.
Tabela 8 - Microrganismos isolados e selecionados no screening de microrganismos
pectinolíticos.
Procedência das amostras
(Códigos)
Microrganismos
(unidades)
Farinhas (B) 3
Banana caturra (G) 1
Pêssego (H) 4
Mamão (I) 2
Melão (J) 2
Goiaba (L) 8
Manga (M) 3
Uva (O) 1
Mosto de uva (R) 1
Produtos processados em decomposição (K) 2
Amostras de eucalipto, laranjeira, folhas de laranjeiras (W) 49
Laranja (E) 1
Pêra (T) 1
Chás(D) 2
Kiwi (S) 1
Total 92
Capítulo 2
52
Os microrganismos isolados foram procedentes de amostras de laranja, mamão,
pêssego, maçã, melão, goiaba, banana, casca de uva, solos de videiras, kiwi, solo de kiwi,
ameixa preta, chás, produtos processados em decomposição, amostras de farinha de trigo e
amostras de folhas de eucalipto e laranjeira, sendo que a maior quantidadde de
microrganismos isolados (Tabela 8) foram procedentes de amostras de eucalipto,
laranjeira, folhas de laranjeiras (W), goiaba (L), pêssego (H), farinhas (B) e manga (M),
respectivamente. No screening de microrganismos produtores de pectinases
(poligalacturonases) foram isolados e selecionados um total de 93 microrganismos. Por
observação em microscópio ótico e meio seletivo, foram identificados 68 fungos
filamentosos e 16 bactérias.
Devido a importância destas enzimas em processos industriais é de grande
relevância estudos que visam o isolamento e seleção de microrganismos com potencial de
produção de pectinases, visando o isolamento de microrganismo de interesse a partir de
substratos de baixo custo, reduzindo custos de produção e de dependências externas de
exportação de enzimas. A literatura reporta alguns estudos de isolamento e seleção de
enzimas pectinolíticas não somente em processamento de alimentos, mas também para
outras aplicações industriais. Soares et al. (1999) isolaram 168 linhagens de bactérias,
sendo identificadas 6 linhagens de Bacillus sp. Kashyap et al. (2000) isolaram cepas de
Bacillus sp. de solos e residuos de frutas. Lima (2006) isolou um total de 50 cepas de
Aspergillus oriundos de solos.
4.2 Determinação de atividade pectinolítica.
A Tabela 9 (Apêndice I) e Figuras 12, 13, 14, 15 e 16 apresentam os resultados da
atividade de PG para as linhagens identificadas e os microrganismos isolados e
selecionados durante as 96 horas de fermentação. As cepas A. niger ATCC 1004, A. niger
ATCC 16404 e W43 nas 24 horas de fermentação e as W12, H8, L1, L4 e T2 nas 48 horas
de fermentação não diferiram estatisticamente (p<0,05) entre si, com atividades de PG de
aproximadamente 4 U/mL. Foi observado um descréssimo de atividade para a maioria dos
microrganismos, com exceção das linhagens W44, W52, W18 e K3 que apresentaram um
discreto incremento na sua atividade, nas 72 horas de fermentação com valores próximos a
3 U/mL. Esta redução na atividade possivelmente está relacionada à escassez de substrato
do meio de cultura e a variação de condições de fermentação, como por exemplo o pH.
Capítulo 2
53
Neste caso em específico, a maior produção enzimática está correlacionada com menores
valores de pH, (Figuras 17, 18, 19, 20 e 21).
Ueda et al. (1982) mostraram que variações no pH do meio de cultura provocaram
alterações no tipo, na quantidade e no tempo de produção de PG, PL e PME de A. oryzae
A3. Estes autores determinaram que a produção de PG foi maior em pH 4,0 inicial quando
comparada a meios com pH 6,0. Uma das razões pela qual as atividades de PG, PL e PME
variam com o pH do meio de cultura, pode estar relacionada com a estabilidade de cada
enzima ao pH do meio.
Outros autores verificaram que a maior produção de poligalacturonases ocorre em
pH ácido, geralmente em torno de 3,0 a 4,0 (AGUIAR et al., 1991; MARTINS et al.,
2007). Outra razão para a estabilidade e diminuição na atividade pectinolítica, observada
após um período de tempo específico para cada microrganismo, pode estar relacionada ao
consumo de algum composto essencial, aparecimento de um inibidor ou a própria
desnaturação das enzimas já sintetizadas (BAMBY et al., 1990) bem como a concentração
e idade do inóculo, tipo de microrganismos, composição do meio de cultura e da
temperatura de crescimento do microrganismo (PATIL & DAYANAND, 2005). Bravo et
al. (2000) também verificaram que a produção de pectinases por microrganismos é
influenciada pelas condições de cultivo, em particular, composição do meio de cultura, tipo
e concentração da fonte de carbono, período de incubação, estágio do ciclo de crescimento,
pH e temperatura de cultivo, além de outros fatores. Patil & Dayanand (2005), em estudos
com A. japonicus 586 mostraram que a produção das enzimas microbianas depende
principalmente do próprio microrganismo.
Ao comparar os resultados de PG (Tabela 9 Apêndice I) com os reportados na
literatura, pode-se observar que as atividades pectinolíticas (PG) foram semelhantes.
Galiotou-Panayotou et al. (1997), obtiveram 3,0 U/mL de PG por A. niger, através de
fermentação submersa em meio contendo pectina de citrus. Soares et al. (1999) isolaram
168 linhagens bacterianas capazes de utilizar pectina de citrus como única fonte de
carbono. Destas, 6 linhagens de Bacillus sp foram as melhores produtoras da enzima (0,3 a
4,0 U/mL). Soares et al. (2001) obtiveram cerca de 2,0 U/mL de PG, produzida por
Bacillus sp, através de fermentação em estado sólido de farelo de trigo. Lima (2006) isolou
um total de 50 cepas de Aspergillus oriundos de solos e borra oleosa, onde o A. tubingensis
Luc 40 F4C1, nas condições de cultivo estudadas excretou, a partir de 48 horas,
endopoligalaturonases (EndoPG) e exopoligalacturonases (ExoPG), determinando-se as
Capítulo 2
54
atividades máximas de EndoPG (0,50 U/mL) em 96 horas e ExoPG expressou atividade
máxima (0,10 U/mL) em 48 horas. Kawano et al. (2008) avaliaram o potencial de
diferentes linhagens de fungos filamentosos quanto a atividades enzimáticas sendo que a
maior atividade foi de 1,03 U/mL. Martins et al. (2008) em seu estudo com Thermoascus
aurantiacus, obtevieram a máxima atividade de PG de 5,0 U/mL.
FIGURA 12 - Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos.- (A) – S. salmonocollor (L), Candida sp ATCC 34147, Hansunela sp (L),
P. camembertii ATCC 4845, A. niger ATCC 16404, A. niger, ;- (B)- A.niger ATCC 1004,
A. niger ATCC 9642, P. notatum ATCC 9478, W11, W12 e B10.
(A) (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
U/mL
S.salmonicolor
(L)
Candida sp
ATCC 34147 (L)
Hansenula
sp (L)
P. camembertii
ATCC 4845
A. niger
ATCC 16404
A. niger
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
U/mL
A. niger
ATCC 1004
A.niger
ATCC 9642
P. notatum
ATCC 9478
W11
W12
B10
Capítulo 2
55
FIGURA 13 - Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos.- (A) – D2, D1, E3, H3, H8, I8; - (B)- L4, L5, L6, L10. L11. 12; -(C)- I14,
J1, J6, K3, L1,,L2; -(D)- M4, M6, S2, T2, W1e W13, respectivamente.
(C)
(D)
(A) (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
U/mL
D2
D1
E3
H3
H8
I8
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
U/mL
L4
L5
L6
L10
L11
L12
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
U/mL
I14
J1
J6
K8
L1
L2
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
U/mL
M4
M6
S2
T2
W1
W13
Capítulo 2
56
FIGURA 14 - Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos.- (A)- P. duclauxii ATCC 9121, P. citrinum ATCC 28752, P.digitatum
ATCC 26821, R3, A. oryzae ATCC 1003, O6; -(B)- I3 (B), P2 (B), G6 (B), S1 (B), O2
(B), I15 (B); -(C)- K3 (B), J9 (B), B4 (B), G1 (B), M1 (B), H5 (B); -(D)- W56, W1, K5
(B), Q2 (B), K6, (B) e U2 (B), respectivamente.
(A) (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
P. duclauxii
ATCC 9121
P. citrinum
ATCC 28752
P.digitatum
ATCC 26821
R3
A. oryzae
ATCC 1003
O6
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
I3 (B)
P2 (B)
G6 (B)
S1 (B)
O2 (B)
I15 (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
K3 (B)
J9 (B)
B4 (B)
G1 (B)
M1 (B)
H5 (B)
(C) (D)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W56
W1
K5 (B)
Q2 (B)
K6 (B)
U2 (B)
Capítulo 2
57
FIGURA 15 - Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos.- (A)- W51, W57, W58, W53, W54, W56, - (B)- W47, W46, W43, W44,
W52, W45, -(C)- W39, W40, W41, W50, W39, W38; -(D)- W33, W35, W37, W36, W42 e
W38, respectivamente.
(A) (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W51
W57
W58
W53
W54
W55
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W33
W35
W37
W36
W42
W38
(C)
(D)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W39
W40
W41
W50
W49
W48
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W33
W35
W37
W36
W42
W38
Capítulo 2
58
FIGURA 16 - Atividade de poligacturonases (U/mL) durante 96 horas de fermentação dos
microrganismos.- (A)- W29, W30, W31, B9, W32, W34; -(B)- W19, W20, W21, W15,
W16, W28; -(C)- W24, W25, W26,H9, W17, W18; -(D)- P. variotti ATCC 22319, P.
putida, A.niger ATCC 9642, W27, W22 e W23, respectivamente.
(A)
(B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W29
W30
W31
B9
W32
W34
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W19
W20
W21
W15
W16
W28
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
W24
W25
W26
H9
W17
W18
(C) (D)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
U/mL
Paecilomyces variotii ATCC 22319
Pseudomonas putida
A. niger ATCC 9642
W27
W22
W23
Capítulo 2
59
4.3 Determinação de pH
As amostras após a bioprodução foram retiradas a cada 24 horas, centrifugadas para
separação do sobrenadante para medida de pH e da atividade pectinolítica de PG. No
Apêndice II (Tabelas 18, 19, 20, 21 e 22) e as Figuras 17, 18, 19, 20 e 21 mostram a
variação de pH do meio durante as 96 horas de fermentação. Observa-se que em geral, há
um leve declínio de pH nas primeiras 24 horas de fermentação e a partir de 48 horas o
valor do pH volta a aumentar. Isto é evidenciado na maioria dos microrganismos
estudados, onde a atividade enzimática (Tabela 9, Apêndice I) sofre queda quando o pH
aumenta. A razão dessa alteração do pH pode ser explicada pela liberação de ácido
galacturônico no meio pela ação de enzimas pectinolíticas produzidas pelos
microrganismos durante as primeiras horas de fermentação. Após 48 horas de fermentação
observa-se aumento do pH devido ao consumo da fonte de nitrogênio disponível no meio
(UENOJO & PASTORE, 2007). O pH é considerado um importante parâmetro envolvido
na produção e manutenção de pectinases, pois alterações nos valores de pH podem
influenciar a atividade enzimática por meio de modificações conformacionais na molécula,
proporcionando assim alterações no seu sítio ativo, resultando na redução ou no aumento
da sua afinidade com o substrato (GARZÓN & HOURS, 1992). Geocze (1994) também
sugere que uma das razões pela qual a produção e atividade de enzimas pécticas variam
com o pH, também está relacionada com a estabilidade do pH de cada enzima
pectinolíticas.
Moyo et al. (2003) ressaltam que os fungos produtores de pectinases possuem pH
de atuação na faixa de 3,0 a 5,5. Martin et al. (2004) observaram atividade máxima de PG
por Moniliella sp em pH 4,5. Para Penicillum sp EGC5 o pH ótimo foi de 9,0. Para cepas
identificadas de Penicillum deste trabalho pode-se observar esta tendência, onde o P.
duclauxii ATCC 9121, e P. digitatum ATCC 26821 apresentaram atividade máxima de PG
(0,56 e 0,95 U/mL) em pH próximo de 9,0. Soares et al. (1999) ao isolarem linhagens de
Bacillus sp verificaram que o pH ótimo para a produção de PG situa-se entre 6,0 e 7,0.
Kashyap et al. (2000) estudaram o efeito do pH e da temperatura sobre o
crecimento microbiano demostrando que a máxima produção de pectinases foi ao redor do
pH 7,2 e a 37 °C houve a maior produção de enzimas. Fidurek et al. (1989), utilizando A.
niger, detectaram pectinases após 12 horas de cultivo, ocorrendo aumento progressivo
nessa produção com o passar do tempo, sendo o valor ideal de pH para a produção de
Capítulo 2
60
pectinases por A. niger. foi igual a 6,0. Por outro lado, Bracat et al. (1991) trabalhando
com A. formigatus determinaram que a atividade máxima de PG ocorre em pH 3,1.
FIGURA 17- Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos microrganismos – (A) -
M1(B), H5(B), I3(B), P2(B), G6(B), S1(B); - (B) - O2(B), K3(B), J9(B), S.salmonicolor
(L), Candida sp. ATCC 34147 e Hansenula sp. (L).
(A)
(B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
03
04
05
06
07
08
09
pH
M1 (B)
H5 (B)
I3 (B)
P2 (B)
G6 (B)
S1 (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
Q2 (B)
K6 (B)
U2 (B)
I15 (B)
B4 (B)
G1 (B)
Capítulo 2
61
FIGURA 18 - Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos microrganismos – (A)
- P. camembertii ATCC 4845, A.niger ATCC 16404, A.niger, A.niger ATCC 1004,
P.notatum ATCC 9478, A.niger ATCC 9642; (B) – microrganismos isolados W11, P.
camembertii ATCC 4846, B10, D2, D1 e K3; (C ). – H3, H8, I8, I14, J2 e J6; (D)- K8, L1,
L2, L4, L5 e L6, respectivamente.
(
C
)
(
D
)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
P.camembertii
ATCC 4845
A. niger
ATCC 16404
A. niger
A. niger
ATCC 1004
A. niger
ATCC 9642
P. notatum
ATCC 9478
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
W11
P.camembertii
(CT) ATCC 4846
B10
D2
D1
E3
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
H3
H8
I8
I14
J1
J6
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
K8
L1
L2
L4
L5
L6
(A)
(B)
Capítulo 2
62
FIGURA 19 - Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos microrganismos - (A)-
L10, L11, L12, M4, M6 e S2; (B) – T2, W2, W13, O6, R3 e P. duclauxii ATCC 9221; (C)
– P. citratum ATCC 28752, P. digitatum ATCC 26821, A. oryzae ATCC 2003, W32, W34
e W23; Figura 22 (C) - W35, W37, W36, W42, W38 e W39, respectivamente.
(C)
(D)
(A)
(B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
4
5
6
7
8
9
10
pH
L10
L11
L12
M4
L5
S2
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
T2
W1
W13
O6
R3
P. duclauxii ATCC 9121
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
4
5
6
7
8
9
pH
P. citrinum
ATCC 28752
P. digitatum
ATCC 26821
A. oryzae
ATCC 1003
W32
W34
W33
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
W35
W37
W36
W42
W38
W39
Capítulo 2
63
FIGURA 20 - Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos microrganismos – (A)
– W40, W41, W50, W49, W48, W47; - (B) – W46, W43, W44, W52, W45 e W51, (C) –
W57, W58, W51, W54, W55, W56; (D) – W1, P. variotti ATCC 22319, A.niger ATCC
9642, P. putida, W26e W27, respectivamente.
(A)
(B)
(C)
(D)
(A)
(B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
5
6
7
8
9
pH
W40
W37
W50
W49
W48
W47
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
5
6
7
8
9
pH
W46
W43
W44
W52
W45
W51
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
4
5
6
7
8
9
pH
W57
W58
W53
W54
W55
W56
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
4
5
6
7
8
9
pH
W1
P. variotii ATCC 22319
P. putida
A. niger ATCC 9642
W26
W27
Capítulo 2
64
FIGURA 21 - Variação de pH durante 96 horas de fermentação dos microrganismos – (A)
– W22, W23, W24, W25, B9, H9;- (B) – W17, W18, W19, W20, W21 e W15; (C) – W16,
W28, W29, W30, W31, K5(B);- (D) – Q2(B), U2(B), I15 (B), B4(B), J6 (B) e G2(B),
respecivamente.
(C)
(D
)
(A)
(B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
W17
W18
W19
W20
W21
W15
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
W16
W28
W29
W30
W31
K5 (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
3
4
5
6
7
8
9
pH
Q2 (B)
K6 (B)
U2 (B)
I15 (B)
B4 (B)
G1 (B)
30 40 50 60 70 80 90
Tempo (h)
4
5
6
7
8
9
pH
W22
W23
W24
W25
B9
H9
Capítulo 2
65
4.4 Avaliação cinética da medida de atividade de poligalacturonase (PG)
Partindo dos resultados do screening da medida de atividade de PG dos 108
microrganismos realizou-se um estudo cinético de medida de atividade de PG, para os 20
microrganismos que apresentaram atividades superiores a 3,0 U/mL em 24, 48, 72 e 96
horas de bioprodução, conforme demostrado na Tabela 10 e Figuras 28, 29, 30 e 31,
respectivamente.
Os maiores valores de atividade de PG para os microrganismos foram encontrados
em 5 minutos de reação, destacando-se os microrganismos W43, D2 e W23 (Figura 28 e
Tabela 10 em Apêndice III), com 24 horas de bioprodução com atividade de 45, 43 e
41 U/mL, respectivamente.
5 10 15 20 25 30 35 40
Tempo (min)
0
10
20
30
40
50
U/mL
A. niger 9642
K3
A. niger
ATCC 16404
W24
W43
D2
P. simplicissimum
W23
A. niger
ATCC 1004
Paecilomyces variotii
Figura 22 - Medida de atividade de PG em 24 horas de fermentação em diferentes tempos
de reação.
Raras são as informações que relacionam estudo cinético de medida de atividade
pectinolítica, Soares et al. (1999) realizaram estudo de medida de atividade de PG em
incubação a 40 °C e 10 minutos de reação, obtendo atividade de 0,3 a 0,8 U/mL por
Bacillus sp em fermentação submersa. Maller (2008) realizou a medida de atividade de PG
Capítulo 2
66
incubando por 10 minutos a 40 °C, obtendo atividade que variaram de 0,01 a 0,24 U/mL
utilizando fungo filamentoso A. niveus.
Com a realização deste estudo cinético verificou-se que a maior atividade de PG foi
encontada em 5 minutos de reação para todos os microrganismos testados, tendo um
aumento variando de 5 a 13 vezes mais em relação a atividade de PG medida com
40 minutos de reação como realizado no screening de atividade de PG. Ressalta-se que a
atividade pectinolítica poderá ser maximizada se outras variáveis de processo forem
otimizadas tais como: meio de cultura (substrato sintético e resíduo agroindustrial) e tipo
de processo fermentativo (submersa e/ou estado sólido), além de condições operacionais
(Temperatura, pH inicial, agitação e umidade).
Capítulo 2
67
5 - CONCLUSÕES
Através da seleção e isolamento de microrganismos estudou-se a bioprodução de
pectinases (Polimetilgalacturonases -PG) a partir de fungos filamentosos, leveduras e
bactérias. A seguir são apresentadas as principais conclusões deste capítulo:
- Um total de 108 microrganismos foram utilizados no estudo de bioprodução
de poligalacturonases. Destes microrganismos, 16 eram de linhagens obtidas de bancos de
cepas, 76 fungos filamentosos e 16 bactérias isolados e selecionados de diversas amostras
(solo, frutas, folhas, produtos em decomposição, etc.);
- Os microrganismos A. niger ATCC 16404, A. niger ATCC 1004, A. niger
ATCC 9642, P. putida, e os isolados e codificados por W12(F), D2(F), H8(F), L1(F),
K3(F), W35(F), W43(F), W44(F), W52(F), W23(F), W24(F), H9(F), B9(F), J6(F),
W18(F), L4(F) e T2(F) foram potenciais produtores de poligalacturonases, pois
apresentaram unidades de atividade de PG igual ou superior a 3 U/mL.
- Com a realização do estudo cinético da medida de atividade da PG para os
microrganismos com atividade maior que 3 U/mL, pode-se concluir que o tempo de
medida da atividade de PG foi reduzido de 40 para 5 minutos e desta forma proporcionou
um aumento da atividade de 5 a 13 vezes, dependendo do microrganismo estudado.
Capítulo 2
68
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo 3
74
CAPÍTULO 3 – ANÁLISE GENÔMICA DO DNA PELA
TÉCNICA DE RAPD (RANDOM AMPLIFIED
POLYMORPHIC DNA) DOS MICRORGANISMOS
UTILIZADOS PARA PRODUÇÃO DE CAROTENÓIDES E
POLIGALACTURONASES
Capítulo 3
75
ANÁLISE GENÔMICA DO DNA PELA TÉCNICA DE RAPD (RANDOM
AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) DOS MICRORGANISMOS UTILIZADOS
PARA PRODUÇÃO DE CAROTENÓIDES E POLIGALACTUTONASES
RESUMO
A análise genômica do DNA pela técnica de RAPD (random amplified polymorphic
DNA) dos microrganismos selecionados e isolados (54 microrganismos: 9 leveduras, 25
bactérias e 20 fungos filamentosos) para a bioprodução de carotenóides e
poligalacturonases (PG), foi realizada com o objetivo de verificar possíveis duplicações
de cepas. Os microrganismos produtores de carotenóides e as cepas que apresentaram
atividade pectinolítica acima de 3 U/mL foram submetidos a extração de DNA e
realizada análise por RAPD. Com a análise de RAPD não foi possível agrupar os
microrganismos em espécies ou gêneros tanto para os microrganismos produtores de
carotenóides como os produtores de poligalacturonases, ou seja, não indicando
duplicações de cepas.
Palavras- chave: Screening, carotenóides, poligalacturonases, RAPD.
Capítulo 3
76
1. INTRODUÇÃO
Atualmente pesquisas que envolvam a seleção de microrganismos, células
animais ou de plantas para a descoberta de novas enzimas capazes de catalisar reações
tendo como produtos compostos com alto valor agregado, têm despertado interesse de
pesquisadores da área. De acordo com De Conti et al. (2001) os microrganismos são de
particular interesse devido ao curto período de geração, e a grande diversidade de
processos metabólicos e enzimas envolvidas. Salientando-se que há um número
ilimitado de microrganismos na natureza que podem ser testados, os quais são bastante
diferentes entre si. Eles modificam e degradam uma variedade de moléculas orgânicas
complexas e, então, é de se esperar que pelo menos um deles catalise uma dada reação
de interesse.
Entretanto, o screening de microrganismos implica na seleção de cepas e devido
ao grande número de microrganismos selecionados existe a dificuldade de identificação
dos mesmos. Para obter um processo de screening mais eficiente, têm-se utilizado
técnicas de biologia molecular (GUTHRIE et al., 1992; HARRY et al., 2001;
WILLIAMS et al., 1991). A técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
tem-se mostrado extremamente útil para medir e caracterizar a variabilidade genética. A
irrestrita adoção de marcadores moleculares do tipo RAPD na detecção, diagnóstico e
determinação da diversidade genética deve-se, principalmente, a sua simplicidade de
uso, rapidez, segurança e amplitude dos resultados gerados. Além disso, o RAPD é uma
técnica simples que requer pequenas quantidades de DNA, não sendo necessário o
conhecimento prévio do genoma, sendo o nível de regiões polimórficas geralmente alto
(WILLIANS et al., 1991). Sendo assim, esta tem sido considerada uma das técnicas
mais viáveis para uso rotineiro, devido a sua rapidez e simplicidade na detecção de
variabilidade genética, especialmente em organismos haplóides, como é o caso dos
fungos (FUNGARO, 2000).
Neste sentido, o presente capítulo apresenta o estudo realizado para verificar
possíveis duplicações de microrganismos isolados e selecionados para a bioprodução de
carotenóides e poligalacturonases. Será apresentado um referencial teórico ao assunto,
seguido pela descrição detalhada do procedimento experimental adotado. A
apresentação e discussão dos resultados e as conclusões encerram este capítulo.
Capítulo 3
77
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
O RAPD é uma variação do PCR (reação da polimerase em cadeia), com duas
características distintas: utiliza um primer (seqüência iniciadora) único ao invés de um
par de primers; o primer único tem seqüência arbitrária e, portanto, sua seqüência alvo é
desconhecida (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
O RAPD é uma técnica simples que requer pequenas quantidades de DNA, não
necessitando o conhecimento prévio da biologia molecular dos organismos a serem
estudados, podendo ser aplicada a qualquer espécie. O polimorfismo entre os produtos
de amplificação é detectado freqüentemente e o nível de regiões polimórficas é
geralmente elevado. São úteis como marcadores genéticos e podem ser detectados
através do exame de um gel de agarose corado com brometo de etídio (WILLIAMS et
al., 1990, 1993; SILVEIRA et al., 2000).
A técnica consiste no anelamento do primer com o DNA alvo em ciclos de
amplificação a baixa estringência (especificidade), resultando em produtos de
amplificação que são característicos de um genoma em particular e denominado
fingerprinting. Sua alta capacidade discriminatória é útil para estudos epidemiológicos,
investigação de fontes de contaminação, relacionamento de isolados de origens
diferentes e identificação de isolados diferentes de uma mesma origem e na obtenção de
mapas genéticos (WILLIAMS et al., 1990; SILVEIRA et al., 2000).
Um alto grau de padronização e controle interno tornam-se necessários para se
obter perfis reprodutíveis de DNA. Há muitos parâmetros nos quais pequenas mudanças
alteram os perfis. Apesar do conceito da técnica ser simples, esses parâmetros devem
estar dentro de limites ótimos para reprodutibilidade; isto é, concentrações adequadas de
DNA, magnésio, primer e enzima, assim como o número de ciclos. Aumentando-se a
seqüência e o tamanho dos primers usados para RAPD pode-se obter um número
ilimitado de comparações possíveis entre os perfis, aumentando assim seu poder
discriminatório (SILVEIRA et al., 2000; ZHOU & JIAO, 2004). A principal limitação
do uso de marcadores RAPD é o baixo conteúdo de informações genéticas por loco.
Além disso, algumas bandas são de fácil interpretação enquanto outras são ambíguas.
Também pode-se citar a não discriminação dos genótipos heterozigotos dos
Capítulo 3
78
homozigotos e a baixa reprodutibilidade entre laboratórios (WILLIAMS et al., 1990;
SILVEIRA et al., 2000).
Alguns autores citam o RAPD como ideal no estudo do polimorfismo genômico;
o método tem sido usado para comparar diferenças intra e inter específicas em bactérias,
podendo ser usado tanto em DNA purificado como em extratos de células cultivadas em
caldo ou em agar (WILLIAMS et al., 1990; SILVEIRA et al., 2000). Embora seja
recente e apresente suas limitações, a técnica de RAPD tem sido aplicada com
resultados satisfatórios para vários microrganismos (SILVEIRA et al., 2000). Teixeira
et al. (2004) utilizaram marcadores RAPD na análise da diversidade genética de
isolados de Acremonium strictum, fungos obtidos de sementes de milho, provenientes
de diferentes regiões produtoras brasileiras. Pela análise do DNA, 25 primers OPERON
Technologies geraram polimorfismos, os quais tornaram possível e seguro o
agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de Fusarium verticillioides.
A técnica de RAPD pode também ser citada em estudos epidemiológicos. Zhou &
Jião (2004) investigaram a contaminação por Listeria monocytogenes em alimentos, em
mercados chineses, através de análise de RAPD. Baeza & Giannini (2004) realizaram a
diferenciação de cepas de Trichophyton rubrum (importante agente causal de
dermatomicose) por amplificação randômica de DNA polimórfico (RAPD). Foi
concluído que a análise por RAPD pode ser utilizada para estudos epidemiológicos.
Capítulo 3
79
3. MATERIAL E MÉTODOS
Com o intuito de identificar possíveis duplicações de cepas entre as culturas
isoladas e selecionadas, realizou-se primeiramente a extração e a quantificação do
DNA, em seguida foram preparadas reações de amplificação utilizando eletroforese em
gel de agarose, quando então foi realizada a análise dos dados.
3.1 Microrganismos testados
Um total de 54 microrganismos selecionados e isolados sendo 9 leveduras (A1,
W8, K7, K1, O5, W2, B7 e O3), 25 bactérias (B1, B5, I4,J5, J6, G5, Q3, Q1, G9, I15,
B3, G3, G7, N1, B6, J3, F2, F3, G8, J8, G6, J4, B5 e G10) e 20 fungos filamentosos (
W9, W4, W1, W5, W14, B9, H9, W24, H8, W52, W43, L4, L1, W44, W18, W23, T2,
W35, W12 e D2) foram utilizados para a extração e quantificação do DNA e análise do
RAPD.
3.2. Técnicas de biologia molecular – RAPD
3.2.1 Extração de DNA e seleção de primers
A extração do DNA dos fungos filamentosos, leveduras e bactérias foi baseado
no método de Roeder & Broda (1987). As culturas foram crescidas em meios YM.
Nitrogênio líquido foi adicionado a 300 mg do micélio em um almofariz, e com um
pistilo as células foram maceradas até um pó fino. Em seguida, este pó foi transferido
para tubos Eppendorf e 700 µL de tampão (3 %, v/v) SDS, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-
HCl, pH 8,0, 1 % (v/v) β-mercaptoetanol) foi adicionado. Cada amostra foi incubada
por 1h a 65 °C. Em seguida os tubos foram removidos, resfriados e a amostra foi
extraída com igual volume de clorofórmio-álcool isoamilíco (24:1, v/v) e centrifugada a
21.467 × g por 10 minutos. Este procedimento foi repetido por três vezes. Após isto,
foram adicionados 120 µL de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 600 µL de isopropanol
gelado. O conteúdo foi misturado por inversão, incubado em freezer por 30 minutos e
centrifugado por 5 minutos a 21.467 ×g. À suspensão foi acrescentado 500 a 700 µL de
tampão TE, lavada duas vezes com 500 µL de etanol 70 % e deixado secar. A seguir foi
ressuspendida novamente em 200 µL de tampão TE.
Para verificar se ocorreu a extração do DNA foi realizada uma corrida com 10 µL
de amostra mais 7 µL de TA, em gel de agarose 0,8 %, por 1 hora, em voltagem
Capítulo 3
80
constante de 90 Volts, em tampão TBE (0,089 M Trisma, 0,089 M ácido bórico e
0,008 M EDTA).
3.2.2 Quantificação do DNA
Para quantificação adicionou-se 20 µL de amostra em 980 µL de água Mili-Q
estéril. A quantificação foi realizada em espectrofotômetro UV a 260 nm e confirmação
da pureza e integridade em espectrofotômetro UV a 280 nm (proteína) (Agilent 8453) e
em gel de agarose 0,8 % (Gibco BRL) em TBE 1 X (0,89 M Tris, 0,89 M de H
3
BO
3
e
0,08 M EDTA). Fez-se as diluições visando obter uma concentração final de DNA de
10 ng/µL.
3.2.3 Reação de amplificação de RAPD
Foi utilizada a reação descrita por Williams et al. (1991), com algumas
modificações. Para um volume total de 25 µL: tampão de reação (50mM Tris-HCl pH
9,0, 50 mM KCl), dNTPs (200 mM de cada), 0,2 mM de primer, 3 mM de MgCl
2
,
0,25 mM de Triton-X-100, 1,5 U (unidades) de Taq DNA polymerase recombinant da
Invitrogen (Life Technologies, São Paulo, Brasil) e aproximadamente 40 ng de DNA
(4 µL de amostra).
Foram usados kits da OPA, OPF, OPH, OPW e OPY obtidos da Operon
Technologies, com 20 primers cada um, para identificar os primers que mostraram os
melhores resultados, tomando-se como base o número, intensidade e tamanho das
bandas. A reprodutibilidade e o polimorfismo gerado também foi considerado para
selecionar os kits.
3.2.4 Amplificação de RAPD
A amplificação foi realizada em termociclador MJ Rsearch Inc., Watertown, MA
(modelo PTC100
TM
Programmable Thermal Controller). O processo de amplificação
foi baseado na seguinte seqüência: 3 minutos a 92 ºC, 40 ciclos de 1 minuto a 92 ºC,
Capítulo 3
81
1 minuto a 35 ºC e 2 minutos a 72ºC. Em seguida, 3 minutos a 72 ºC e resfriamento a
4 ºC até a retirada das amostras.
3.2.5 Análise eletroforética dos fragmentos amplificados
A separação eletroforética foi realizada em gel de agarose 1,4 % em tampão
TBE 1X em cuba de eletroforese horizontal. A corrida foi efetuada com voltagem
constante de 90 Volts durante 3 horas. A coloração dos fragmentos foi realizada com
brometo de etídio e a observação feita sob luz ultravioleta. Os géis foram fotografados
pelo sistema fotográfico digital GEL-PRO (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
3.2.6 Análise dos dados
Na determinação da variabilidade genética, os dados obtidos através da
determinação da presença ou ausência de bandas formaram uma matriz que foi
analisada com auxílio do programa computacional NTSYS versão 1.7 (Rohlf, 1992)
(Numerical Taxonomy System of Multivariate Analysis System). Os dendrogramas
foram construídos pelo algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using
Arithmetic Averages), desenvolvido por Sokal & Michener (1958), utilizando-se o
coeficiente de similaridade de Jaccard.
Capítulo 3
82
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análises de RAPD
Devido à dificuldade de identificação morfológica, tanto dos fungos como das
bactérias e leveduras isolados e selecionados neste trabalho, procedeu-se uma análise
genética através de marcadores moleculares RAPD, visando-se identificar possíveis
duplicações de cepas dos microrganismos isolados e selecionados como produtores de
carotenóides e de poligalacturonases. Neste sentido, os microrganismos produtores de
carotenóides foram divididos em dois grupos, os de pigmentação rósea e amarela, sendo
que destes efetuou-se separadamente uma análise para bactérias e outra para fungos.
Para os microrganismos com atividade pectinolítica maior que 3 U/mL efetuou-se a
análise de bactérias e fungos separadamente.
Inicialmente foi realizada a seleção de primers para posterior análise de RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA), onde foram testados 40 primers pertencentes
aos kits de primers randômicos OPA, OPH, OPW e OPY da OPERON Technologies,
escolhidos aleatoriamente. As Tabelas 11, 13 e 15 apresentam os primers utilizados na
análise por RAPD com os microrganismos produtores de carotenóides de coloração
rósea e amarela, e a relação entre o número total de fragmentos e de fragmentos
polimórficos gerados pelos marcadores RAPD, respectivamente.
Na Tabela 11 foram considerados para a análise 8 primers, para os fungos e as
bactérias de coloração rósea, sendo observado 98 e 81 fragmentos com número médio
de fragmentos por primer de 12,25 e 10,12, respectivamente. Pode-se observar um alto
polimorfismo entre os microrganismos de coloração rósea analisados (Tabela 11) com
72,4 % e 81,48 %, respectivamente.
Capítulo 3
83
Tabela 11 - Número total e número de fragmentos polimórficos obtidos em cada primer
utilizado para os fungos e bactérias produtores de carotenóides de coloração rósea.
Fungos Bactérias
Primer
Seqüência
(5’ para 3’)
Total de
fragmentos
Fragmentos
polimórficos
Total de
fragmentos
Fragmentos
polimórficos
OPA 16 AGCCAGCGAA
9 6 8 6
OPA 20 GTTGCGATCC
7 1 7 1
OPA 09 GGGTAACGCC
18 16 17 16
OPA 12 TCGGCGATAG
10 8 10 8
OPW 18 TTCAGGGCAC
14 12 12 12
OPW 20 TGTGGCAGCA
12 9 12 9
OPY 15 AGTCGCCCTT
14 11 8 7
OPH 04 GGAAGTCGCC
14 8 7 7
Total de fragmentos 98 71 81 66
% de polimorfismo 72,44 81,48
A Figura 23 mostra a variabilidade observada dentre os microrganismos
isolados utilizando o primer OPA-09.
B 7 O 3 O 5 W 2 W 9 K 1 W 8 K 7 A 1 B 5 I 4 B 1
Figura 23 - Gel de agarose (1,4) demonstrativo obtido com o primer OPA 09 para os
microrganismos isolados.
Capítulo 3
84
O índice de similaridade (coeficiente de Jaccard) entre os fungos e bactérias de
coloração rósea variou entre 0,52 e 1,0 com média de 0,76 entre os mesmos (Tabela 12).
Este resultado indica a existência de uma alta variabilidade entre as cepas,
demonstrando tratar-se de espécies ou até gêneros distintos.
Tabela 12 - Similaridade interpopulacional dos microrganismos de coloração rósea.
Máximo Mínimo Médio Desvio Padrão
1,0 0,52 0,76 0,08
Na Tabela 13 foram considerados para a análise 7 primers, para os fungos e as
bactérias de coloração amarela sendo observado 94 e 63 fragmentos, com número
médio de fragmentos por primer de 13,42 e 9 pode-se observar um alto polimorfismo
entre os microrganismos de coloração amarela analisados (Tabela 13) 79,78 % e
92,06 %, respectivamente.
Tabela 13 - Número total e número de fragmentos polimórficos obtidos em cada primer
utilizado para microrganismos produtores de carotenóides de coloração amarela.
Fungos Bactérias Primers Seqüência (5’
para 3’)
Total de
fragmentos
Fragmentos
polimórficos
Total de
fragmentos
Fragmentos
polimórficos
OPA 16 AGCCAGCGAA
13 9 10 8
OPA 20 GTTGCGATCC 8 3 6 5
OPA 09 GGGTAACGCC 20 20 15 14
OPA 12 TCGGCGATAG 11 10 10 9
OPW 18 TTCAGGGCAC 12 11 8 8
OPY 15 AGTCGCCCTT 12 8 4 4
OPH 04 GGAAGTCGCC 18 14 10 10
Total de
fragmentos
94 75 63 58
% de
polimorfismo
79,78 92,06
Capítulo 3
85
A Figura 24 mostra a variabilidade observada dentre os microrganismos isolados
utilizando o primer OPA-12.
J8 G 10 B 3 J4 G 6 W 4 J 9 F 3 G 5 J6 J5 W 1 G 8 Q 3 Q 1 J3 F 2 G 7 N 1 W 5 B 6 W 14 K 3 G 3 W 9 G 9 G 6
Figura 24 - Gel de agarose (1,4) demonstrativo obtido com o primer OPA 12, onde 1
representa o microrganismos isolado de aspectos visuais amarelo.
O índice de similaridade (coeficiente de Jaccard) entre os fungos e bactérias
produtores de carotenóides de coloração amarela estudados neste trabalho variou entre
0,4 e 1,0 com média de 0,70 entre os mesmos (Tabela 14). Este resultado indica a
existência de uma alta variabilidade entre as cepas, indicando tratar-se de espécies ou
até gêneros distintos.
Tabela 14 - Similaridade interpopulacional dos microrganismos de coloração amarela.
Máximo Mínimo Médio Desvio Padrão
1,0 0,40 0,70 0,05
Na Tabela 15 foram considerados para a análise 10 primers, para os fungos e as
bactérias pectinolíticas sendo observado 100 e 98 fragmentos, com número médio de
fragmentos por primer de 10 e 9,8 pode-se observar um alto polimorfismo entre os
microrganismos pectinolíticos de 100,00 % e 92,85 %, respectivamente.
Capítulo 3
86
Tabela 15 - Número total e número de fragmentos polimórficos obtidos em cada primer
utilizado para os microrganismos pectinolíticos.
Fungos Bactérias
Primers
Seqüência
(5’ para 3’)
Total de
fragmentos
Fragmentos
polimórficos
Total de
fragmentos
Fragmentos
polimórficos
OPY 18 GTGGAGTCAG
12 12 10 10
OPA 17 GACCGCTTGT
12 12 11 10
OPH 03 AGACGTCCAC
11 11 9 8
OPA 12 TCGGCGATAG
10 10 7 7
OPW 18 TTCAGGGCAC
12 12 12 13
OPW 20 TGTGGCAGCA
9 9 14 13
OPY 15 AGTCGCCCTT 9 9 8 8
OPY 09 AGCAGCGCAC
11 11 6 6
OPY 01 GTGGCATCTC
10 10 8 5
OPW 16 CAGCCTSCCA 7 7 13 11
Total de fragmentos 100 100 98 91
% de polimorfismo 100 92,85
A Figura 25 mostra a variabilidade observada entre os microrganismos
pectinolíticos utilizando o primer OPY-15.
Figura 25 - Gel de agarose (1,4 %) demonstrativo obtido com o primer OPY-15 para os
microrganismos pectinolíticos.
Capítulo 3
87
O índice de similaridade (coeficiente de Jaccard) entre os fungos pectinolitícos
estudados neste trabalho variou entre 0,28 a 1,0 com média de 0,64 entre os mesmos
(Tabela 16). Para as bactérias pectinolíticas estudadas o índice de similaridade
(coeficiente de Jaccard) variou de 0,04 a 1,0 com média de 0,52 entre as mesmas
(Tabela 17). Estes resultados indicam a existência de uma alta variabilidade entre as
cepas, indicando tratar-se de espécies ou até gêneros distintos de fungos e bactérias.
Tabela 16 - Similaridade interpopulacional dos fungos pectinolíticos.
Máximo Mínimo Médio Desvio Padrão
1,0 0,28 0,64 0,07
Tabela 17 - Similaridade interpopulacional das bactérias pectinolíticas.
Máximo Mínimo Médio Desvio Padrão
1,0 0,04 0,52 0,06
As Figuras 26, 27, 28, 29 e 30 apresentam os dendrogramas obtidos para os
microrganismos produtores de carotenóides de coloração rósea, amarela e para os
microrganismos pectinolíticos, respectivamente. Analisando-se os dendrogramas
observa-se um alto polimorfismo, este resultado é importante, pois evita a duplicação
dos trabalhos nas etapas de otimização de produção e de purificação dos biocompostos.
Nos dendrogramas apresentados nas Figura 26 e 27, foram analisados os
microrganismos produtores de carotenóides de coloração rósea incluindo
microrganismos de coloração amarela e branca, com o intuito de verificar alguma
semelhança genética entre microrganismos de coloração diferente.
Capítulo 3
88
O3(L)
B7(L)
W2(L)
05(L)
K1(L)
K7(L)
W8(L)
W9(F)
A1(L)
0,52 0,6 0,68 0,76 0,84 0,92 1
Figura 26 - Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de estimativa
de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por RAPD dos fungos isolados de
coloração rósea utilizados para a bioprodução de carotenóides.
I4(B)
B5(B)
B1(B)
0,52 0,6 0,68 0,76 0,84 0,92 1
Figura 27 - Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de estimativa
de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por RAPD das bactérias isoladas de
coloração rósea utilizadas para a bioprodução de carotenóides.
Capítulo 3
89
Nos dendrogramas apresentados nas Figuras 28 e 29, foram analisados os
microrganismos produtores de carotenóides de coloração amarela incluindo
microrganismos de coloração rósea e branca, com o intuito de verificar alguma
semelhança genética entre microrganismos de coloração diferentes.
W2(L)
W14(F)
W5(F)
W1(F)
W4(F)
0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Figura 28 - Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de estimativa
de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por RAPD dos fungos isolados de
coloração amarela utilizados para a bioprodução de carotenóides.
Capítulo 3
90
G10(B)
B5(B)
J4(B)
G6(B)
J8(B)
B3(B)
G8(B)
F3(B)
F2(B)
J3(B)
B6(B)
N1(B)
G7(B)
G3(B)
B3(B)
I15(B)
G9(B)
Q1(B)
Q3(B)
G5(B)
J6(B)
J5(B)
0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Figura 29 - Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de estimativa
de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por RAPD dos fungos isolados de
coloração amarela utilizados para a bioprodução de carotenóides.
No dendrograma apresentado na Figura 30 foram analisados os fungos produtores
de poligalacturonases (PG).
D2(F)
W12(F)
W35(F)
T2(F)
W23(F)
W18(F)
W44(F)
L1(F)
L4(F)
W43(F)
W52(F)
H8(F)
W24(F)
H9(F)
B9(F)
0,28 0,4 0,52 0,64 0,76 0,88 1
Figura 30 - Dendrograma baseado em análise de agrupamento (UPGMA) de estimativa
de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por RAPD dos fungos produtores de
poligalacturonases (PG).
Capítulo 3
91
Para as bactérias com potencial de produção de poligalacturonases superior a
3 U/mL somente foram verificadas duas cepas, K3 e G6, não sendo necessária a
apresentação gráfica do dendrograma. Baseado na análise de agrupamento (UPGMA)
de estimativa de similaridade genética (coeficiente de Jaccard) por RAPD observa-se
uma similaridade de 0,26 % entre as mesmas.
Em relação à similaridade genética por RAPD dos microrganismos potenciais para
produção de caratenóides e poligalacturonases, a aplicação da técnica permitiu verificar
trata-se de microrganismos de espécies ou até gêneros distintos.
Capítulo 3
92
5 - CONCLUSÕES
Com a análise de RAPD não foi possível agrupar os microrganismos em espécies
ou gênero tanto para os microrganismos produtores de carotenóides como os de
poligalacturonases (PG). Um total de 53 microrganismos foram analisados neste
capítulo (9 leveduras, 25 bactérias e 20 fungos filamentosos), tratando-se de cepas
distintas.
Capítulo 3
93
-
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAEZA, L. C.; GIANNINI, M. J. S. M. Strain differentiation of Trichophyton rubrum
by randon amplification of polymorphic DNA polimórfico (RAPD). Revista do
Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 46, n. 6, Nov./Dec, 2004.
DE CONTI, R.; RODRIGUES, J. A. R.; MORAN, P. J. S. Biocatálise: Avanços
recentes. Química Nova, v. 24, n. 5, 2001.
FERREIRA E. M.; GRATTAPAGLIA D. Introdução ao uso de marcadores moleculares
em análise genética. Brasília: EMBRAPA/CENARGEN, 220 p, 1998.
FUNGARO, M. H. P. PCR na micologia. Biotecnologia: Ciência e Desenvolvimento, v.
3, p. 12 - 16, 2000.
GUTHRIE, P. A. I.; MAGILL C. W.; FREDERIKSEN, R. A. and ODVODY, G. N.
Random amplified polymorphic DNA markers: a system for identifying and
differentiating isolates of Colletotrichum graminicola. Phytopathology, v. 82, p.
832 - 835, 1992.
HARRY, M; JUSSEAUME, N.; GAMBIER, B. and GARNIER-SILLAM, E. Use of
RAPD markers for the study of microbial community similarity from termite
mounds and tropical soils. Soil Biology Biochemistry, v. 33, p. 417 - 427, 2001.
ROEDER, V. and BRODA, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.
Letters Applied Microbiology, v.1, p.17-20, 1987.
SILVEIRA, I. A.; OLIVEIRA, R. M.; CARVALHO, E. P.; CARVALHO, D.; PILON,
L. Aspectos gerais, positivos e negativos da utilização de marcadores PCR-
RAPD na identificação de microrganismos. Boletim SBCTA, v. 34, n.2, p. 77-83,
2000.
TEIXEIRA, H.; VIEIRA, M. G. C.; MACHADO, J. C. Marcadores RAPD na análise da
diversidade genética de isolados de Acremonium strictum. Fitopatologia
Brasileira, v. 29, n. 6, Nov./Dec, 2004.
WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.; LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.; TINGEY,
S. V. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, v.18, p. 6531-6535, 1990.
Capítulo 3
94
WILLIAMS, J.G.K.; HANAFEY, M. K.; RAFALSKI, J. A. and TINGEY, S. V.
Genetic analysis using Random Amplified Polymorphic DNA markers. Methods
in Enzymology, v. 218, p. 704 - 740, 1993.
WILLIAMS, M.N.V.; PANDE, N.; NAIR, S.; MOHAN, M. & BENNETT, J.
Restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction
products amplified from mapped loci of rice (Oryzae sativa L.) genomic DNA.
Theorical Applied Genetics, v. 82, p.489-498, 1991.
ZHOU, X.; JIAO, X. Investigation of Listeria monocytogenes contamination pattern in
local Chinese food market and the tracing of two clinical isolates by RAPD
analysis. Food Microbiology, v. 21, p. 695-702, 2004.
Sugestões
95
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Sugestões
96
Sugestões para trabalhos futuros
Através da experiência adquirida neste trabalho acerca dos screening de
microrganismos produtores de carotenóides e poligalacturonases, pode-se sugerir alguns
temas para trabalhos futuros:
Bioprodução de carotenóides:
- Identificar os microrganismos isolados no screening com maior potencial
carotenogênico;
- Avaliar a bioprodução de carotenóides, destes microrganismos, em frascos
agitados e em biorreator, variando a composição do meio sintético e as
condições operacionais empregando-se metodologia de planejamento de
experimentos visando a maximização e/ou otimização da produção;
- Identificar e caracterizar os carotenóides produzidos pelos microrganismos, por
cromatografia líquida (CLAE), com o objetivo de verificar o caminho
biossintético dos microrganismos;
- Investigar a utilização de substratos agroindustriais, de outras fontes de
nitrogênio (orgânico e inorgânico), carbono e/ou agentes químicos estimulantes
da carotenogênese (ácido mevalônico, difenilamina, ácido acético, β-ionona e
alguns aminoácidos) na bioprodução de carotenóides;
- Cultivar o microrganismo com maior produção de carotenóides em batelada
alimentada e/ou cultivo contínuo, e avaliar a possibilidade de reciclo de células,
a fim de aumentar o rendimento de carotenóides totais;
- Avaliar parâmetros cinéticos e estequiométricos da bioprodução de carotenóides
em frascos agitados e/ou biorreator.
Bioprodução de pectinases
- Identificar os microrganismos isolados no screening com maior potencial para a
produção de pectinases;
- Estudar a produção de outras pectinase (pectina liase (PL) e
polimetilgalacturonases (PMGL) dos microrganismos isolados e das cepas
identificadas;
- Avaliar a bioprodução de pectinase, destes microrganismos, em fermentação
submersa e sólida, variando a composição do meio sintético e/ou substratos
Sugestões
97
agroindustriais e as condições operacionais empregando-se metodologia de
planejamento de experimentos visando a maximização e/ou otimização da
produção;
- Avaliação cinética detalhada do processo fermentativo de produção de
pectinases;
- Aplicação de processos de purificação de pectinases;
- Verificar estabilidade enzimática frente pH e temperatura.
Apêndice
98
APÊNDICE
Apêndice
99
APÊNCIDE I – Atividade de PG (µmol/ml/min) durante as 96 horas de
fermentação para os 108 microrganismos testados.
Tabela 9 - Atividade de PG (µmol/mL/min) durante as 96 horas de fermentação para os
108 microrganismos testados.
Microrganismos 24h 48h 72h 96h
Identificados
P. variotii ATCC 22319
0,92±0,00fg 0,99±0,01i 0,44±0,01j 0,34±0,03h
P. putida
0,22±0,00ij 3,17±0,01b 2,29±0,01d 1,69±0,00c
A. niger ATCC 9642
1,26±0,02e 0,26±0,00m 0,31±0,01jl 0,00±0,01j
P.camembertii ATCC 4845
2,37±0,01c 2,42±0,02de 1,49±0,02fg 1,31±0,01d
A. niger ATCC 16404
3,65±0,09ab 3,20±0,07b 2,99±0,07a 2,91±0,10a
A. niger
2,78±0,07bc 0,71±0,02ij 0,41±0,03j 0,31±0,05h
A. niger ATCC 1004
4,16±0,11a 2,43±0,04de 1,70±0,03f 1,69±0,00c
A. niger ATCC 9642
3,27±0,23b 2,22±0,04e 1,43±0,02fg 1,08±0,08e
P.notatum ATCC 9478
2,85±0,04b 2,36±0,02de 1,48±0,04fg 0,83±0,03f
P. duclauxii ATCC 9121
0,53±0,04h 0,34±0,08l 0,08±0,01m 0,95±0,01ef
P. citrinum ATCC 28752
2,86±0,02b 2,94±0,00c 2,37±0,04cd 2,13±0,03b
P. digitatum ATCC 26821
0,54±0,02h 0,48±0,02jl 0,31±0,02jl 0,56±0,02g
A. oryzae ATCC 1003
1,29±0,02e 0,30±0,02l 1,04±0,03h 0,46±0,01gh
Candida sp ATCC 34147
0,48±0,02h 0,33±0,01l 0,44±0,02j 0,43±0,01gh
Hansenula sp.
2,20±0,02c 0,69±0,02j 2,64±0,00b 0,91±0,02ef
S. salmonicolor
0,89±0,01g 1,38±0,01gh 1,62±0,01fg 1,23±0,01d
Isolados e selecionados
W16(F)
0,38±0,01hi 0,20±0,00m 1,06±0,01h 2,86±0,00a
W28(F)
2,98±0,00b 2,19±0,00e 2,47±0,01c 2,14±0,00b
W29(F)
1,86±0,00cd 2,22±0,02e 1,72±0,01f 0,42±0,01gh
W30(F)
0,41±0,01hi 2,75±0,01cd 1,98±0,01e 1,62±0,02c
W31(F)
2,84±0,01b 1,90±0,01f 1,44±0,00fg 0,66±0,00fg
W23(F)
0,68±0,01g 3,12±0,01bc 3,05±0,01g 3,00±0,00g
W24(F)
3,15±0,00b 3,13±0,00bc 2,85±0,01ab 1,17±0,01de
W25(F)
0,87±0,01fg 0,59±0,01j 0,55±0,01ij 0,77±0,01f
W26(F)
0,75±0,01g 0,84±0,01i 0,37±0,01j 0,39±0,01gh
W27(F)
0,74±0,00g 0,79±0,01i 0,64±0,00i 0,80±0,01f
W22(F)
0,41±0,01hi 0,33±0,01l 0,28±0,01jl 0,12±0,01ij
W11(F)
1,54±0,01de 1,22±0,01h 0,26±0,01l 0,45±0,00gh
W12(F)
2,81±0,00bc 3,85±0,02a 1,97±0,03e 2,00±0,00b
B10(F)
1,84±0,02d 2,28±0,02e 1,32±0,01g 0,88±0,04ef
D2(F)
4,16±0,08a 2,83±0,04c 0,55±0,02ij 0,96±0,01ef
D1(F)
2,77±0,00bc 2,35±0,01de 0,48±0,02j 0,43±0,02gh
E3(F)
2,77±0,03bc 2,26±0,02e 0,64±0,02i 0,63±0,02g
Apêndice
100
Tabela 9 - Continuação
Microrganismos 24h 48h 72h 96h
Isolados e selecionados
J1(F)
2,43±0,01c 1,16±0,02hi 0,58±0,03ij 0,33±0,02h
J6(F)
1,76±0,02d 3,23±0,02b 1,03±0,03h 0,75±0,03f
K8(F)
1,64±0,01d 1,16±0,01hi 0,00±0,01m 0,51±0,04g
L1(F)
1,93±0,04cd 4,21±0,04a 2,51±0,01c 2,34±0,01b
L2(F)
1,53±0,00de 0,53±0,00jl 0,17±0,01l 0,25±0,04hi
L4(F)
2,59±0,01c 3,89±0,02a 1,59±0,01f 2,98±0,00a
L5(F)
0,31±0,06i 0,20±0,03m 0,06±0,03m 0,09±0,00j
L6(F)
2,99±0,00b 1,63±0,00fg 1,73±0,00f 0,64±0,06g
L10(F)
0,42±0,02hi 0,75±0,01j 0,14±0,03lm 0,00±0,03j
L11(F)
2,73±0,04bc 0,63±0,01j 0,20±0,00l 0,16±0,02i
L12(F)
1,54±0,02de 0,53±0,01jl 0,18±0,02l 0,26±0,02hi
M4(F)
2,60±0,03c 1,32±0,01gh 0,56±0,01ij 0,47±0,00gh
M6(F)
0,99±0,08f 0,54±0,02jl 0,21±0,03l 0,98±0,03ef
S2(F)
1,86±0,03cd 1,93±0,01f 0,56±0,05ij 0,55±0,04g
T2(F)
2,75±0,03bc 3,55±0,04ab 2,37±0,02cd 0,25±0,05hi
W1(F)
0,69±0,03g 0,47±0,03jl 0,24±0,04l 0,00±0,01j
W13(F)
1,42±0,02e 0,86±0,02i 1,08±0,00h 0,68±0,01fg
B9(F)
0,38±0,00hi 3,16±0,01b 2,37±0,00cd 0,13±0,00ij
H9(F)
0,09±0,01j 3,03±0,01c 2,49±0,02c 0,00±0,00j
W17(F)
0,11±0,01j 1,15±0,00hi 0,84±0,00hi 0,19±0,01i
R3(F)
2,49±0,01c 2,58±0,00d 2,27±0,02d 1,17±0,00de
W18(F)
0,00±0,00ll 3,04±0,01c 3,11±0,00a 1,13±0,00de
O6(F)
2,70±0,00bc 1,79±0,02fg 1,35±0,02g 1,23±0,04d
W32(F)
1,35±0,01e 0,55±0,01jl 1,28±0,00a 0,81±0,00f
W34(F)
1,84±0,02cd 0,62±0,01j 0,36±0,01jl 1,29±0,01d
W33(F)
0,43±0,00hi 0,36±0,01l 0,34±0,00jl 1,15±0,01de
W35(F)
1,64±0,00d 3,09±0,01c 2,72±0,01b 1,73±0,01c
W37(F)
0,67±0,03g 0,00±0,00n 0,00±0,00m 0,86±0,01f
W36(F)
0,65±0,00g 0,14±0,00mn 0,00±0,00m 0,67±0,00fg
W42(F)
1,19±0,00ef 2,13±0,00e 1,25±0,00g 1,91±0,01bc
W38(F)
0,60±0,00gh 1,23±0,01h 0,46±0,01j 0,17±0,00hi
W39(F)
0,45±0,00hi 1,55±0,02g 0,82±0,00hi 0,68±0,00fg
W40(F)
0,98±0,00f 1,78±0,01fg 1,04±0,01h 0,00±0,00j
W41(F)
1,53±0,01de 1,65±0,01fg 0,54±0,00ij 1,32±0,01d
W50(F)
1,55±0,01de 1,37±0,01gh 1,21±0,01gh 1,07±0,01e
W49(F)
1,07±0,01f 1,16±0,01hi 0,92±0,01h 0,97±0,01ef
W48(F)
1,71±0,00d 1,12±0,01hi 1,07±0,01h 0,94±0,00ef
W47(F)
1,05±0,01f 0,68±0,00j 0,57±0,01ij 0,66±0,09fg
Apêndice
101
Tabela 9 - Continuação
Microrganismos 24h 48h 72h 96h
Isolados e selecionados
W46(F)
1,85±0,01d 1,32±0,09gh 1,19±0,01h 1,27±0,00d
W43(F)
3,55±0,00ab 2,76±0,01c 1,97±0,01e 1,93±0,01bc
W44(F)
1,44±0,00e 2,86±0,02c 3,01±0,02a 1,98±0,03bc
W52(F)
1,43±0,01e 2,24±0,01e 3,03±0,01a 1,35±0,01d
W45(F)
1,96±0,02cd 2,40±0,03de 2,22±0,02d 1,03±0,01e
W51(F)
1,19±0,02ef 2,46±0,02d 2,77±0,05b 1,61±0,01cd
W57(F)
2,23±0,01c 1,52±0,01g 1,46±0,01fg 1,32±0,02d
W58(F)
1,78±0,00d 1,60±0,00fg 1,24±0,01g 1,69±0,01c
W53(F)
2,52±0,01c 1,24±0,01hi 1,57±0,0f 1,51±0,01cd
W54(F)
2,74±0,01bc 0,74±0,01j 1,76±0,0f 1,23±0,01d
W55(F)
1,23±0,01ef 0,86±0,01i 1,81±0,0f 1,37±0,01d
W56(F)
2,63±0,01bc 1,62±0,01fg 2,03±0,01e 1,20±0,02de
W1(F)
1,69±0,01d 0,92±0,01i 0,84±0,01hi 2,34±0,02b
W21(F)
0,36±0,01hi 0,14±0,01mn 0,88±0,02hi 0,31±0,01h
W19(F)
0,55±0,00h 0,54±0,00jl 0,92±0,01h 2,11±0,01b
W20(F)
2,73±0,02bc 2,36±0,00de 2,29±0,01d 1,72±0,01e
W15(F)
0,31±0,00i 0,32±0,00l 1,04±0,01h 0,17±0,00i
I3 (B) 1,25±0,00ef 0,86±0,00i 0,74±0,01i 1,93±0,01bc
P2 (B) 2,79±0,01bc 0,93±0,01i 0,85±0,01hi 2,94±0,01a
G6 (B) 2,04±0,01cd 0,00±0,01n 1,08±0,01h 2,46±0,01b
S1 (B) 1,07±0,01f 2,95±0,01c 1,90±0,01e 1,72±0,01c
O2 (B) 0,59±0,01h 0,47±0,01jl 0,46±0,01j 0,74±0,02f
K3 (B) 3,17±0,01b 3,18±0,01b 3,19±0,01a 0,74±0,02f
U2 (B)
1,60±0,01d 1,88±0,01fg 2,22±0,01d 0,71±0,01f
I15 (B)
1,13±0,01f 1,88±0,01fg 2,05±0,01f 1,20±0,02d
B4 (B) 1,53±0,02de 0,89±0,01i 0,28±0,01jl 1,46±0,04cd
G1 (B) 2,84±0,00b 1,38±0,02gh 0,23±0,02jl 1,16±0,04de
M1 (B) 0,44±0,01hi 0,00±0,00n 0,00±0,00m 0,00±0,00j
K6 (B)
2,30±0,01c 2,08±0,01f 2,57±0,01c 1,93±0,01bc
K5 (B)
2,14±0,01cd 1,73±0,00fg 1,77±0,01f 0,57±0,01g
Q2 (B)
2,10±0,00cd 1,21±0,00h 1,45±0,01g 1,23±0,01d
J9 (B) 1,77±0,01d 1,87±0,01f 1,93±0,01e 1,88±0,01b
H5 (B) 1,23±0,02ef 0,70±0,01j 0,25±0,02l 0,74±0,04f
H3(F)
2,76±0,02bc 2,35±0,02de 1,36±0,02g 0,87±0,01ef
H8(F)
2,25±0,02c 4,11±0,03a 1,45±0,03fg 1,36±0,04d
I8(F)
2,93±0,04b 2,93±0,02c 2,25±0,04d 1,35±0,01d
I14(F)
2,75±0,04bc 0,97±0,03i 0,65±0,02i 0,57±0,02g
*Média ± desvio padrão seguida de letras iguais em cada coluna dos tempos de fermantação não
diferem estatísticamente à nível de 5 % (Teste de Tukey); ** (F) Fungos Filamentosos, ***(B)
Bactérias
Apêndice
102
APÊNCIDE II – Evolução do pH dos microrganismos testados.
TABELA 18 – Variação de pH durante as 96 horas de fermentação dos fungos
filamentosos.
Fungos Filamentosos 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas
P.camembertii ATCC 4845
5,21 5,34 8,16 8,47
A. niger ATCC 16404
5,29 7,72 8,67 8,70
A.niger
4,18 7,64 9,16 9,22
A. niger ATCC 1004
3,54 3,67 5,13 5,41
A. niger ATCC 9642
3,80 4,34 4,92 5,96
P. notatum ATCC 9478
5,02 8,03 8,82 9,06
W11
5,02 5,60 7,92 7,87
W12
5,07 6,40 7,65 8,64
B10
7,29 6,64 7,18 6,92
D2
3,92 3,97 7,96 8,21
D1
4,63 4,71 6,27 8,47
E3
3,84 3,69 3,34 3,53
H3
4,08 3,76 4,13 4,38
H8
4,79 5,98 6,99 7,46
I8
4,91 4,86 6,21 7,71
I14
7,28 7,37 7,53 8,07
J1
7,51 7,94 8,43 8,78
J6
7,65 7,77 8,46 9,21
K8
4,68 4,30 5,47 5,64
L1
5,44 6,17 5,94 8,60
L2
4,67 5,47 6,91 7,24
Apêndice
103
TABELA 19 – Variação de pH durante as 96 horas de fermentação dos fungos
filamentosos.
Fungos Filamentosos 24 horas
48 horas
72 horas
96 horas
P. digitatum ATCC 26821
6,07 8,18 8,59 8,85
A. oryzae ATCC 1003
5,71 8,00 8,71 9,04
P. duclauxii ATCC 9121
5,99 7,46 8,66 8,77
P. citrinum ATCC 28752
7,51 7,56 7,87 8,50
L11
5,61 6,96 7,44 9,07
L12
6,51 6,79 8,37 8,79
M4
5,11 6,30 7,67 8,85
M6
7,82 8,87 8,63 8,31
S2
4,29 4,72 7,91 8,76
T2
4,94 5,80 6,40 6,48
W1
5,53 7,54 8,83 8,87
W13
5,95 7,65 7,73 8,66
R3
3,88 3,29 3,30 3,51
O6
4,02 5,62 7,91 8,92
L4
3,84 3,34 3,45 2,96
L5
7,02 7,56 7,25 7,60
L6
3,92 3,50 2,48 2,75
L10
5,24 6,38 8,83 9,16
Apêndice
104
TABELA 20 – Variação de pH durante as 96 horas de fermentação dos fungos
filamentosos.
Microrganismos 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas
P. variotii ATCC 22319
4,17 5,21 8,10 8,61
P. putida
6,46 7,31 8,24 9,05
A. niger ATCC 9642
6,94 6,40 8,05 8,58
W26
4,88 7,51 8,32 8,71
W27
4,89 8,05 8,87 9,00
W22
4,90 7,76 8,51 8,75
W23
4,63 4,53 7,35 8,44
W24
4,55 4,86 6,71 7,22
W25
5,01 5,03 6,71 7,12
B9
6,87 6,46 7,98 8,54
H9
5,40 7,63 8,30 8,72
W17
3,87 7,24 8,19 8,55
W18
4,31 5,24 8,14 8,63
W19
4,88 7,53 8,31 8,63
W20
5,59 7,69 8,39 8,57
W21
5,45 7,82 8,42 8,77
W15
6,31 7,71 8,53 8,71
W16
5,26 7,23 8,02 8,18
W28
4,19 4,60 8,02 8,71
W29
6,82 6,30 7,79 8,67
W30
4,34 6,69 7,76 7,90
W31
3,84 4,25 7,27 7,39
Apêndice
105
TABELA 21 – Variação de pH durante as 96 horas de fermentação dos fungos
filamentosos.
Microrganismos 24 horas 48 horas 72 hors 96 horas
W32
5,49 7,89 8,69 8,64
W34
4,12 5,56 6,19 8,71
W33
5,17 7,65 7,94 8,45
W35
4,97 7,73 7,94 8,45
W37
6,05 7,33 7,67 8,75
W36
6,17 7,95 8,20 8,82
W42
3,90 4,20 6,10 8,60
W38
6,76 7,58 8,39 8,86
W39
4,82 5,21 6,34 8,20
W40
6,47 6,92 7,52 8,91
W41
4,81 5,52 7,34 8,47
W50
7,23 6,71 7,21 7,04
W49
6,93 7,06 7,29 7,20
W48
6,38 6,22 6,55 6,38
W47
5,51 6,44 6,86 6,94
W46
7,54 6,47 6,87 6,94
W43
6,84 6,42 7,32 8,68
W44
5,40 7,52 8,22 8,84
W52
5,64 5,56 8,00 8,59
W45
5,71 6,72 8,19 8,85
W51
5,17 4,88 7,15 8,24
W57
6,17 7,49 8,44 8,68
W58
4,03 4,76 8,04 8,51
W53
4,31 7,33 7,96 8,62
W54
4,06 6,32 7,78 8,60
W55
4,01 4,08 7,47 8,39
W56
6,50 7,05 7,03 8,44
W1
6,75 8,18 8,23 8,17
Apêndice
106
TABELA 22 – Variação de pH durante as 96 horas de fermentação das bactérias e
leveduras testadas.
Microrganismos 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas
Candida sp ATCC 34147 (L)
7,30 8,85 8,93 8,98
Hansenula sp (L)
6,70 8,77 8,76 9,03
S. salmonicolor CBS 2636
4,10 6,96 8,20 8,21
U2 (B)
3,15 7,15 8,12 8,49
I3 (B)
3,89 4,81 7,56 8,06
I15 (B)
4,27 6,88 8,29 8,24
B4 (B) 5,1 7,22 7,19 7,11
G1 (B) 7,05 8,43 8,22 8,16
M1 (B) 5,33 5,54 7,26 7,73
H5 (B) 7,83 8,95 7,6 7,11
K5 (B)
5,15 6,80 8,18 8,59
Q2 (B)
5,52 6,57 8,27 8,16
k6 (B)
5,69 6,14 8,07 8,29
P2 (B)
4,05 4,23 7,11 7,43
G6 (B)
4,1 6,71 8,12 8,34
S1 (B)
5,13 6,13 6,47 6,94
O2 (B)
5,46 7,01 8,18 8,39
K3 (B)
5,03 5,2 7,94 8,14
J9 (B)
4,2 7,83 8,23 8,52
*(L) – Leveduras e (B) – Bactérias
Apêndice
107
APÊNDICE III
Tabela 10 - Valores de atividade de PG (U/mL) encontrados na cinética de reação (24, 48,
72 e 96 horas) com variação do tempo de 5 a 40 minutos.
Microrganismos Poligalacturonase (U/mL)
Reação: 24 horas
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
A. niger 9642
29,91
18,86 10,04 8,28 3,88 4,32 4,02 3,40
A. niger ATCC 16404
17,21
8,64 5,94 4,09 4,23 3,68 2,95 2,48
A. niger ATCC 1004
9,17 4,25 2,82 1,73 1,35 1,11 1,19 0,95
P. variotii
8,90 4,23 3,85 2,37 2,01 1,54 1,52 1,33
D2
43,51
22,46 16,17 10,78 9,37 7,70 6,58 5,30
W24
19,02
9,93 7,69 5,70 6,64 5,89 4,91 4,22
W23
41,50
14,05 11,82 7,49 5,17 5,35 5,04 3,67
W43
45,43
20,79 16,30 12,34 10,29 8,33 6,87 5,65
K3
16,02
9,51 6,20 4,81 3,76 3,27 2,70 2,48
Reação: 48 horas
A. niger ATCC 16404
25,92
14,01 9,05 6,12 5,62 4,44 3,81 3,65
P. putida
9,38 5,10 3,07 2,25 1,82 1,43 1,19 1,12
L4
7,28 4,08 2,58 1,91 1,64 1,41 1,29 0,99
J6
5,53 2,74 1,73 1,36 1,09 0,88 0,83 0,69
W18
11,48
5,94 1,56 3,31 2,74 2,42 2,18 1,83
W35
30,99
15,26 10,72 7,82 6,22 5,56 4,63 4,16
H8
13,60
6,57 4,33 3,44 2,68 2,28 1,96 1,63
K3
8,88 5,20 3,79 2,69 2,43 1,94 1,44 1,33
T2
24,70
13,14 8,19 6,74 5,20 4,65 3,65 3,08
W23
16,02
7,94 5,54 3,95 3,41 2,80 2,38 2,11
H9
14,39
7,56 4,83 4,05 2,98 2,76 2,14 1,82
L1
16,86
8,48 4,56 4,31 3,51 2,83 2,50 1,94
B9
26,27
13,34 8,85 6,55 5,57 4,53 3,85 3,33
W12
21,12
11,15 7,32 5,66 4,50 3,61 3,10 2,69
W24
35,01
17,39 11,42 8,01 6,68 5,67 4,92 4,37
Reação: 72 horas
K3
8,53 4,59 2,80 2,28 1,90 1,56 1,32 1,11
W23
16,40
6,89 3,72 2,10 2,85 1,98 1,89 1,04
W44
9,32 4,85 3,16 2,37 2,31 1,61 1,52 1,35
W18
14,80
8,29 5,16 3,98 3,13 2,75 2,07 2,07
W52
17,85
6,74 6,79 4,59 3,72 3,01 2,60 1,77
Reação: 96 horas
W23
8,33 3,01 2,06 3,76 2,23 1,64 1,35 1,50
Apêndice
108
Figra 31 - Medida de atividade de PG em 48 horas de fermentação em diferentes tempos
de reação.
Figura 32 - Medida de atividade de PG em 72 horas de fermentação em diferentes tempos
de reação.
Apêndice
109
Figura 33 - Medida de atividade de PG em 96 horas de fermentação, respectivamente, em
diferentes tempos de reação.
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