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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-graduação em Ciências farmacêuticas
Dissertação de Mestrado
Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem
de antimicrobianos em plasma humano
DANILO CÉSAR GALINDO BEDOR
RECIFE – PE
JANEIRO DE 2007
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Livros Grátis
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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-graduação em Ciências farmacêuticas
Dissertação de Mestrado
Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem
de antimicrobianos em plasma humano
Dissertação aprovada pelo Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro
deCiências da Saúde da Universidade Federal de
Pernambuco, como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Davi Pereira de Santana
Co - orientador: Prof. Dr.Eduardo Jesus de Oliveira
Danilo César Galindo Bedor
Mestre
Recife/2007
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Bedor, Danilo César Galindo
Desenvolvimento e validação de métodos
bionalíticos para dosagem de antimicrobianos em
plasma humano / Danilo César Galindo Bedor. –
Recife : O Autor, 2007.
x, 60 folhas : il., tab., fig.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CSS. Ciências Farmacêuticas, 2007.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Farmacocinética - Biodisponibilidade. 2.
Farmacocinética – Método bioanalítico. . I. Título.
615.012 CDU (2.ed.) UFPE
615.03 CDD (22.ed.) CCS2007-20
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Celso Pinto de Melo
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Jane Sheila Higino
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Samuel Daniel de Souza Filho
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Beat Saegesser Santos
À minha mãe Arlete
por tudo que ela batalhou para dar uma boa condição de vida a mim e meus irmãos
e aos meus irmãos (Bedor, Charles e Cheila)
AGRADECIMENTOS
Família:
Agradeço por todas as oportunidades que me foram propiciadas no decorrer da minha
vida. Especialmente a minha mãe, incansável batalhadora em prol de um futuro digno para mim e
meus irmãos. Ao meu irmão Bedor, pessoa a qual tenho como referência, por toda ajuda dada
durante a minha vida. A minha irmã Cheila por todo o carinho e pelo exemplo e ao meu irmão
Charles pelos ensinamentos. A vocês meu imenso OBRIGADO!!!
Mestres:
Serei eternamente grato à contribuição dada pelo meu orientador e hoje amigo Prof°. Dr.
Davi Pereira de Santana pelos ensinamentos não só técnico-científicos, mas também humanos e
lições de vida. Davi, meu muito obrigado.
Ao meu co-orientador Prof°. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira pelas várias lições e
engajamento neste trabalho mesmo à distância.
Ao Dr. Luis Renato Pires de Abreu pela alavancada nos conhecimentos da bioanálise.
Quero agradecer também a uma pessoa foi (é) de fundamental importância na minha
formação. Iram Moreira Mundim do Instituto de Ciências Farmacêuticas ICF- Goiânia-GO
NUDFAC:
Agradeço a participação e apoio, na realização dos ensaios, de todos que compõem e
compuseram o NUDFAC: André Menezes, André Correia, Carlos César, Carlos Eduardo, Davi,
Henrique, Iguaci, Júlio, Katiana, Luis Renato, Marema, Margarete, Priscila, Raquel, Talita,
Vanessa.
AMIGOS e COLEGAS:
A lista é grande.... Luli, Fábio Henrique, Henrique Fischer, Marcelo Albuquerque, Osman
Jucá, Leila Bastos, Benígno, Marcão, Modinha, Mônica Felts, Ana Paula (Japinha), Thiago
(cubiludo), Xicoloco, , Prof°. Lívio, Leila e Larissa, que vem me dando muita força nesta etapa
final, colegas de turma (graduação e mestrado). Agradeço a todos pela participação em todas as
etapas da minha vida, cada um de vocês me ensinou (ensina) algo importante.
Agradeço especialmente a meu amigo e irmão Augusto (só aí seria uma página) obrigado
por tudo cara.
A Júnior Ceará por toda colaboração e empenho como preceptor durante um ano no
estágio do controle de qualidade do LAFEPE, muito do que aprendi devo a você, obrigado.
Meu amigo Lamartine por compartilhar toda a vida acadêmica em todas empreitadas de
movimento estudantil e por ter sido responsável pelo meu ingresso na pesquisa, iniciação
científica (agradeço também ao meu primeiro orientador Prof°. Dr. Pedro Rolim Neto) valeu Zé
Lamas.
Aos funcionários e docentes do Departamento de Ciências Farmacêuticas - UFPE.
Aos membros da Banca Examinadora.
Aos voluntários e equipe de trabalho dos estudos.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
I
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS.................................................................................. IV
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................................... VI
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................VIII
RESUMO....................................................................................................................................... IX
ABSTRACT ......................................................................................................................................X
1. Introdução.................................................................................................................................... 1
2. Revisão da literatura.................................................................................................................... 3
2.1 Política de medicamentos genéricos 3
2.2 Desenvolvimento de métodos bioanalíticos 3
2.2.1 Aspectos relevantes ........................................................................................................ 4
2.3 Métodos de extração e “clean-up” de amostras 7
2.3.1 Extração Líquido-Líquido .............................................................................................. 9
2.3.2.Extração em Fase Sólida .............................................................................................. 11
2.4. Métodos cromatográficos 17
2.4.1. Classificação................................................................................................................ 17
2.4.1.1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ............................................. 18
2.4.2. Separação Cromatográfica........................................................................................... 19
2.4.2.1. Fase móvel............................................................................................................ 21
2.4.2.2. Fase Estacionária.................................................................................................. 21
2.4.3. Sistemas de detecção ................................................................................................... 23
2.5 Cromatografia Líquida-Espectrometria de massas / Espectrometria de Massas
(CL-EM/EM) 25
2.5.1. Espectrometria de massas (EM) .................................................................................. 25
2.5.1.1. Fontes de ionização .............................................................................................. 27
2.5.1.1.1. “Electrospray” (ESI)...................................................................................... 28
2.5.1.2. Filtro de massas .................................................................................................... 29
2.5.1.2.1. Quadrupolo seqüencial .................................................................................. 30
2.5.1.3. Sistema de detecção.............................................................................................. 34
2.5.1.3.1. Multiplicadores de elétrons ........................................................................... 34
3. Objetivos.................................................................................................................................... 35
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
II
3.1. Objetivo geral 35
3.2 Objetivos Específicos 35
4. Artigo 3...................................................................................................................................... 36
Abstract 37
4.1. Introduction: 38
4.2. Experimental 39
4.2.1. Chemical and reagents................................................................................................. 39
4.2.2 LC-UV and LC-MS/MS instruments ........................................................................... 40
4.2.3 Chromatography conditions ......................................................................................... 40
4.2.4 Mass spectrometer conditions ...................................................................................... 41
4.2.5. Solid phase extraction of samples ............................................................................... 41
4.2.6. Preparation of standard and quality control samples................................................... 42
4.2.7. Study design ................................................................................................................ 42
4.3. Results and discussion 43
4.3.1. Method development................................................................................................... 43
4.3.1.1. LC-UV optimization............................................................................................. 43
4.3.1.1.2. LC-MS/MS.................................................................................................... 43
4.3.1.1.2.1. LC optimization...................................................................................... 43
4.3.1.1.2.2. MS/MS optimization .............................................................................. 44
4.4. Method Validation 44
4.4.1. Selectivity.................................................................................................................... 44
4.4.2. Ion suppression............................................................................................................ 47
4.4.3. Linearity ...................................................................................................................... 47
4.4.4. Recovery...................................................................................................................... 48
4.4.5. Precision and Accuracy ............................................................................................... 48
4.4.6. Stability studies ........................................................................................................... 49
4.5. Statistical analyses, pharmacokinetics parameters 51
4.6. Discussion 52
4.7. Conclusion 54
References 55
5. Conclusões................................................................................................................................. 57
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
III
6. Perspectivas ............................................................................................................................... 59
7. Referências bibliográficas ......................................................................................................... 60
8. Anexo A (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido) ........................................................ 61
8. Anexo B (Artigo 1).................................................................................................................... 64
8. Anexo C (Artigo 2).................................................................................................................... 81
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
IV
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
BPFC: Boas Práticas de Fabricação e Controle
CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-EM/EM: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas
seqüencial
CG – EM: Cromatografia gasosa acoplada Espectrometria de Massas
PPT: Precipitação de proteínas
ELL: Extração Líquido-Líquido
EFS: Extração em Fase Sólida
CLAE-UV: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por Ultravioleta
NUDFAC: Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético
UFPE: Universidade Federal de Pernambuco
MS: Ministério da Saúde
CNS: Conselho Nacional de Saúde
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
CCS: Centro de Ciências da Saúde
CBIO: Centro de Bioequivalência
CEP: Comitê de Ética em Pesquisa
OMS: Organização Mundial da Saúde
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
FM: Fase Móvel
FE: Fase Estacionária
EM: Espectrometria de Massas
C
máx
: Concentração plasmática máxima
T
máx
: Tempo para atingir o C
máx
T
1/2
: Tempo de meia vida
LIQ: Limite Inferior de Quantificação
LSQ: Limite Superior de Quantificação
AUC
0-Clast
: Área Sob a Curva do tempo zero ao último ponto de concentração quantificada
AUC
0-∞
: Área Sob a Curva do tempo zero ao último infinito
FQ: Físico-Químico
BD: Biodisponibilidade
AUC: Área sob a Curva
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
V
PTFE: Plitetrafluoretileno
PM: Peso molecular
CLAE-FR: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa
UV-Vis: Ultravioleta – Visível
m/z. Relação massa/carga
API: “Atmospheric pressure ionization”
APCI: “Atmospheric pressure Chemical ionization”
ESI: “Electrospray”
EM/EM: Espectrometria de massas seqüencial
IE: Impacto de Elétrons
IQ: Ionização Química
IT-EM: “Ion Trap – quadrupolo”
TOF: “Time of Flight”
FT-EM: “Transformado de Fourier – quadrupolo”
DC: Potencial elétrico fixo
RF: Radiofreqüência
SIM: “Selected Ion Monitoring”
Q1: Quadrupolo 1
Q2: Quadrupolo 2
Q3: Quadrupolo 3
CGL – Cromatografia Gás-Líquido
CGS - Cromatografia Gás-Sólido
CFS – Cromatografia de Fluido Supercrítico
CLL – Cromatografia Líquido-Líquido
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CLS – Cromatografia Líquido-sólido
CTI – Cromatografia de troca iônica
CET – Cromatografia por exclusão de tamanho
CFL – Cromatografia de fase quimicamente ligada.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
VI
LISTA DE FIGURAS
Revisão bibliográfica
Figura 1. Fluxograma de desenvolvimento de métodos bioanalíticos 6
Figura 2. Mostra um esquema de ELL clássico com utilização de funil de separação. 9
Figura 3. Fluxograma de desenvolvimento de método para extração líquido-líquido 10
Figura 4. Esquema de extração em fase sólida 15
Figura 5. Guia para seleção de sorvente e solvente para eluição (SNYDER, 1997) 16
Figura 6. Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma fase
estacionária (líquido ou sólido) e uma fase móvel (líquido ou gás). 17
Figura 7. Tipos de cromatografia de acordo com o estado físico da * Fase móvel e
** Fase estacionária. 18
Figura 8. Componentes essenciais de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência. 19
Figura 9. Triângulo de seleção de fases móveis (adaptado de CIOLA, 1998) 22
Figura 10. Componentes do espectrômetro de massas e suas diversas técnicas 26
Figura 11. Representação esquemática da fonte de “Electrospray” 29
Figura 12. Representação esquemática de um quadrupolo com relação RF/DC constante 31
Figura 13. Modos de operação do quadrupolo seqüencial em desenvolvimento de métodos
bioanalíticos 33
Figura 14. Esquema de um detector multiplicador de elétrons 34
Artigo 3
Figure 1.The structural formule of Sulfamethoxazole (A), Trimethoprim (B), Benznidazole (C)
and Ciprofloxacin (D). 39
Figure 2. The full scan mass spectra of sulfamethoxazole (A) and trimethoprim (B). 45
Figure 3. The product ion mass spectra of sulfamethoxazole (A) and trimethoprim (B). 46
Figure 4. Representative chromatograms of extracted blank plasma sample (A and C) and
extracted plasma samples previously spiked with analyties (B and D) at the LLOQ (0.5
µg/mL for SMZ and 0.05µg/mL for TMP). Top traces are for mass spectrometry
detection and bottom ones for UV detection. 47
Figure 5. The averaged plasma concentration-versus-time curves for sulfamethoxazole (A) and
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
VII
Trimethoprim (B) after administration of the reference and test formulations
(suspensions) SPE-LC-MS/MS. 52
Figure 6. The averaged plasma concentration-versus-time curves for sulfamethoxazole (A) and
Trimethoprim (B) after administration of the reference and test formulations
(suspensions) HPLC-UV. 52
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
VIII
LISTA DE TABELAS
Revisão bibliográfica
Tabela 1. Características que influenciam no desenvolvimento de métodos bioanalíticos 5
Tabela 2. Exemplos de sorventes utilizados em extração em fase sólida 14
Tabela 3. Sistemas de distribuição de analitos entre uma fase móvel e outra estacionária. 20
Artigo 3
Table 1. Inter-assay precision and recovery of sulfamethoxazole in human plasma 49
Table 2. Inter-assay precision and recovery of trimethoprim in human plasma 49
Table 3. Sulfamethoxazole (A) and trimethoprim (B) stability data 51
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
IX
RESUMO
A política nacional de medicamentos genéricos (Lei n° 9.787 de 10 de fevereiro de 1999) é um
instrumento que vem ampliando o acesso a medicamentos de qualidade (seguros e eficazes). Para
tanto é necessário que métodos de análise em matrizes biológicas com uma maior seletividade e
sensibilidade para quantificação de fármacos e/ou metabólitos sejam desenvolvidos e validados
para posterior utilização em estudos de farmacocinética comparada (bioequivalência). No Brasil
ainda é escasso o número de profissionais com formação acadêmica (Técnico-científica) para a
condução de estudos de biodisponibilidade comparada, sobretudo na etapa analítica. Com o
intuito de colaborar com a implementação desta política, o presente trabalho tem como objetivo
desenvolver e validar métodos de análise de duas classes de antibióticos (Sulfonamidas e
Fluoroquinolonas) em plasma humano e posterior aplicação na avaliação biofarmacêutica de
diferentes formulações. Durante a formação foi realizado um aumento da complexidade das
técnicas utilizadas desde a extração líquido-líquido (ELL) e utilização de cromatografia líquida
de alta eficiência com detecção por absorção no ultravioleta (CLAE-UV), extração em fase sólida
(EFS) com auxílio de CLAE-UV e EFS seguida de cromatografia líquida de alta eficiência com
detecção por espectrometria de massas em “tandem” (CL-EM/EM). O desenvolvimento e
validação de métodos bioanalíticos vai desde a seleção de sistemas cromatográficos e de
detecção, técnica de extração e “clean-up” que gerem cromatogramas de qualidade, avaliação da
estabilidade de fármacos na matriz biológica até o cumprimento dos critérios de aceitação das
seqüências analíticas contendo amostras dos voluntários. Dentre as fluoroquinolonas o objeto de
estudo foi o norfloxacino (NFX) comprimido de 400mg. Para extração e “clean-up” das
amostras em plasma humano utilizou-se o método por ELL seguido de quantificação por CLAE-
UV. Em meio às muitas sulfonamidas o objeto de estudo foi composto de duas formulações da
associação de sulfametoxazol + trimetoprima (SMZ + TMP). Determinou-se simultaneamente a
SMZ + TMP em plasma humano após administração da forma farmacêutica (FF) cápsula (400mg
+ 80mg) através de método de extração e “clean-up” em fase sólida “off-line” com posterior
quantificação por CLAE-UV e após a administração da FF suspensão (400mg + 80mg / 10mL)
por CL-EM/EM com ionização à pressão atmosférica através da técnica de eletronebulização
(“Electrospray, ESI”) em modo positivo. A biodisponibilidade dos fármacos, a parir das formas
farmacêuticas, foi avaliada através da análise estatística de parâmetros como Área sob a Curva
(ASC), concentração plasmática máxima (C
máx
) segundo as normas (RE 898 de 29 de maio de
2003) da ANVISA. Os métodos analíticos foram desenvolvidos e validados segundo a RE 899 de
29 de maio de 2003 da ANVISA mostrando-se lineares, precisos, exatos e robustos frente ao
elevado “throughput” de amostras. O método EFS-CL-MS/MS mostrou-se mais robusto pela
maior limpeza dos interferentes da matriz plasmática e pelo menor tempo de análise (2.5 min) por
amostra, diminuindo os resíduos de solventes da fase móvel bem como no procedimento de
extração mostrando-se menos tóxico aos analistas e ao meio ambiente. Todos os métodos
desenvolvidos se configuraram como ferramentas suficientemente capazes de discriminar a
biodisponibilidade comparada dos medicamentos testados.
Palavras-chave: Norfloxacino, Sulfametoxazol + Trimetoprima, Bioequivalência, ELL, EFS,
CLAE-UV, CL-EM/EM.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
X
ABSTRACT
The Brazilian policy for generic drugs (Bill n° 9.787, 10th of February, 1999) is improving the
access to quality medicines by the Brazilian population. However, it makes it necessary to have
analytical methods for the quantification of drugs in biological matrices with better selectivity
and sensitivity for both drugs and metabolites so that they can be applied to comparative
pharmacokinetics studies (bioequivalence). In Brazil there is still a scarcity of human resources
with academic training for conducting comparative bioequivalence studies, especially for the
analytical steps. With the purpose of helping to implement this policy, the present work had the
aim of develop and validate analytical methods to quantify two classes of antibiotics
(sulphonamides and fluoroquinolones) in human plasma and to apply these methods to the
biopharmaceutical evaluation of different formulations of these drugs. During the development of
the methods, the complexity of the techniques used increased from liquid-liquid extraction (LLE)
with UV detection (HPLC-UV) through solid phase extraction (SPE) with HPLC-UV and also
solid phase extraction with detection using tandem mass spectrometry (HPLC-ESI MS/MS). The
development and validation of bionalytical methods encompass the selection of the
chromatographic systems and the detection strategy, extraction technique for sample clean-up so
that quality chromatograms are obtained, stability studies in the biological matrix, and the
compliance with system suitability and quality control requirements for the chromatographic
runs. Amongst the fluoroquinolones, the one selected for the study was norphloxacin (NFX) 400
mg tablets. For extraction and clean-up in human plasma we used LLE followed by quantification
using HPLC with UV detection. Amidst the many sulphonamides, the one used in our study was
a formulation of sulphametoxazole and trimetoprim (SMZ + TMP). We determine SMZ and
TMP simultaneously in human plasma after administration of the formulations: hard gelatin
capsules with 400mg + 80mg of SMZ and TMP respectively by offline SPE with quantification
by HPLC-UV and a suspension 400mg + 80mg of SMZ and TMP/ 10mL) by HPLC-ESI-
MS/MS. The bioavailability of the drugs in the formulations was evaluated through statistical
analysis of plasma concentration data, using parameters such as area under curve (AUC) and
maximum plasma concentration (C
max
) using the criteria set forward by the Brazilian Sanitary
Agency – ANVISA (Bill RE 898, 29
th
, May, 2003). The methods proved to be linear, precise,
accurate and rugged considering the high sample throughput. The HPLC-ESI-MS/MS method
proved to be more rugged since it allowed a better clean-up of plasma interferents from the
samples, and a shorter analysis time (2.5 min), decreasing the amount of solvent residue
generated. All the methods developed were able to discriminate the comparative bioavailability
of the formulations studied..
Key Words: Norphloxacin, Sulphametoxazole + Trimetoprim, Bioequivalence, LLE, SPE,
HPLC-UV, HPLC-MS/MS.
01
Introdução
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
1
1. Introdução
A Lei dos Medicamentos Genéricos (Lei n° 9.787) entrou em vigor dia 10 de
fevereiro de 1999) com o objetivo de estimular a concorrência e a variedade de oferta no
mercado de medicamentos, melhorar a qualidade dos mesmos, reduzir os preços e facilitar o
acesso da população aos tratamentos.
A implantação desta política tem colaborado para o aprimoramento da fabricação,
controle e garantia de qualidade dos medicamentos no país, introduzindo conceitos como
equivalência farmacêutica, biodisponibilidade e bioequivalência. A aplicação prática de tais
conceitos, aliada ao cumprimento das Boas Práticas de Fabricação e Controle de Qualidade
(BPFC) fornecem bases técnicas e científicas para assegurar a intercambialidade entre o
genérico e seu respectivo medicamento de referência (STORPIRTIS et al, 2004; ZAPATER
& HORGA, 1999).
Para dar sustentação a essa política, é de fundamental importância que centros
especializados na condução de estudos de farmacocinética comparada tenham métodos de
análise para quantificação de fármacos em matrizes biológicas, desenvolvidos e validados.
As técnicas de detecção mais utilizadas nesse tipo de estudo são:
¾ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com os seguintes detectores:
9 Ultravioleta;
9 Fluorescência;
9 Eletroquímicos.
9 Espectrômetro de massas (CL-EM/EM).
¾ Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM).
¾ Ensaios competitivos (radioimunoensaio e enzimaimunoensaio).
Outro aspecto importante é o domínio das técnicas de extração e “clean-up” das amostras
biológicas. Dentre as mais utilizadas destacam-se:
¾ Extração Precipitação de proteínas (PPT);
¾ Extração Líquido-Líquido (ELL);
¾ Extração em fase sólida (EFS) “Off-line” e “On-line”.
É de suma importância para a sustentabilidade dessa política que centros públicos se
especializem não só se equipando para utilização das tecnologias acima citadas, mas também
na capacitação de profissionais para utilização dessas técnicas e condução de estudos de
bioequivalência.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
2
O desenvolvimento e validação para análise de fármacos em meios biológicos passa por
importantes etapas desde o acúmulo de conhecimento das características físico-químicas e
farmacocinéticas, seleção das melhores condições cromatográficas, de extração e “clean-up”,
ensaios de estabilidade das amostras, qualidade dos cromatogramas, até o cumprimento dos
critérios de aceitação das seqüências analíticas contendo amostras dos voluntários.
O objetivo do estudo aqui relatado é de colaborar para implementação da política de
medicamentos genéricos no país a partir do desenvolvimento e validação de métodos
bioanalíticos no centro de biodisponibilidade / bioequivalência do Núcleo de
Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético do Departamento de Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Pernambuco (NUDFAC-UFPE) e o aprimoramento técnico-
científico na utilização de técnicas desde ELL a SPE com detecção por CLAE-UV e CL-
EM/EM.
O objeto de estudo foi o desenvolvimento e validação de métodos de quantificação em
plasma humano de representantes de duas classes de antibióticos (Fluoroquinolonas e
Sulfonamidas) e aplicação em estudos de bioequivalência.
O Norfloxacino, fármaco pertencente à classe de antibióticos das fluoroquinolonas, foi
eleito pela larga utilização na atenção básica à saúde para o tratamento de infecções do trato
urinário. O método desenvolvido e validado neste estudo utilizou ELL para recuperação e
“clean-up” e cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por absorção no
ultravioleta (CLAE-UV).
As sulfonamidas também são utilizadas no tratamento de infecções urinárias e quando
associadas à trimetoprima são empregadas no tratamento de bronquites e sinusites. Foram
desenvolvidos e validados dois métodos para quantificação em plasma humano da associação
de sulfametoxazol + trimetoprima através de CLAE-UV e de cromatografia líquida acoplada
à espectrometria de massas em “tandem” (CL-EM/EM) ambas antecedidas de extração em
fase sólida.
Os estudos conduzidos pelo NUDFAC - UFPE seguiram as orientações da resolução
196/96 do Ministério da Saúde – Conselho Nacional de Saúde (MS/CNS) a qual está pautada
nos quatro princípios fundamentais da bioética: beneficência, não maleficência, autonomia e
justiça. Todos os voluntários foram informados do objetivo do estudo e assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido – TCLE (ANEXO A) contidos nos protocolos de estudos
clínicos que foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE - CCS).
Revisão da
literatura
02
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
3
2. Revisão da literatura
2.1 Política de medicamentos genéricos
Para que os medicamentos genéricos se tornassem uma realidade concreta, foi
necessária a adoção de um conjunto de normas e regras, resultantes de um longo processo.
Hoje, o Brasil, amparado em vários instrumentos legais, vem colhendo os frutos de ações e
decisões de políticas públicas continuadas, que não buscaram apenas resultados de curto
prazo, mas procuraram sedimentar, em bases mais permanentes, tanto a oferta (incentivo à
produção, abreviação dos processos de registro), quanto a demanda (campanhas publicitárias
para informar a população da existência dos genéricos) pelos medicamentos genéricos
(GONÇALVES, 2005).
Em 1999, foi aprovada a Lei 9.787 que instituiu os medicamentos genéricos no Brasil,
seguindo o modelo conceitual adotado por países europeus, pelos Estados Unidos, Canadá e
recomendado pela OMS. A Lei 9.787, Lei dos Genéricos foi sancionada em 10 de fevereiro
de 1999 e regulamentada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 10 de
agosto de 1999, com a publicação da Resolução nº 391, estabelecendo os critérios para
produção, controle de qualidade, testes de bioequivalência e biodisponibilidade, registro,
prescrição e dispensação dos genéricos.
O anexo B trata-se de um artigo que relaciona a realização de um estudo de
bioequivalência com a legislação brasileira vigente. Este estudo aponta as exigências legais
para a condução de um estudo de farmacocinética comparada além de indicadores
econômicos do crescimento do mercado de medicamentos genéricos.
2.2 Desenvolvimento de métodos bioanalíticos
O desenvolvimento do método é a etapa mais importante nos estudos de
bioequivalência, visto que a confiabilidade dos resultados desses estudos está na dependência
direta da etapa analítica. O método de quantificação deve apresentar sensibilidade,
especificidade / seletividade para cada analito, precisão e exatidão além de ser relativamente
simples, de modo a minimizar os erros (GONÇALVES, 2005).
Durante esta etapa é de suma importância o monitoramento de todos os passos do
método de preparação e análise das amostras, os quais envolvem os processos de extração,
separação, purificação, identificação e quantificação do fármaco na matriz biológica. Toda a
metodologia deve estar devidamente validada antes da realização do estudo, apresentando
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
4
todos os parâmetros de validação previamente estabelecidos (BRESSOLE, et al, 1996;
CAUSON, 1997), e devem ser realizados estudos prévios de estabilidade na matriz biológica
em questão.
No desenvolvimento de métodos bioanalíticos, para quantificação de fármacos em
matrizes biológicas e sua aplicação em estudos de farmacocinética comparada, fatores de
diversas naturezas têm que ser estudados, o que exige do pesquisador conhecimento nas áreas
da química analítica, bioquímica e biofarmácia (NASCIMENTO, 2004).
Um bom desenvolvimento de método requer tantas injeções quantas forem necessárias
para alcançar o resultado final desejado. O ideal é que cada injeção realizada deve contribuir
para o resultado final, evitando desperdício no funcionamento do equipamento (SNYDER,
1997).
O desenvolvimento de um método cromatográfico nem sempre é uma tarefa simples,
visto que, um número substancial de parâmetros pode influenciar no resultado final
(ARDREY, 2003)
2.2.1 Aspectos relevantes
Uma das etapas que exige muito critério por parte do pesquisador é a escolha da técnica
analítica adequada e do método de extração do(s) fármaco(s) da matriz biológica em questão.
Para tanto, é necessário o acúmulo de conhecimento sobre as características físico-químicas
do analito assim como das suas características biofarmacotécnicas e farmacocinéticas.
A TABELA 1 mostra quais as principais características do analito que o pesquisador deve
ter conhecimento para o início do desenvolvimento de um método bioanalítico.
O desenvolvimento de métodos para análise de fármacos em matrizes biológicas exige um
procedimento criterioso de tomada de decisões, como descrito na FIGURA 1. A qualidade de
uma análise é construída durante a concepção do método, validada na fase de verificação de
parâmetros indicadores da confiabilidade analítica do laboratório e do método escolhido ou
desenvolvido para se obter o resultado e confirmada na fase da sua utilização.
As características físico-químicas do(s) analito(s) têm que ser conhecidas, pois as técnicas
analíticas mais utilizadas na atualidade utilizam a cromatografia como princípio de separação
seja esta líquida ou gasosa acoplada a diversos detectores: ultravioleta, fluorescência,
espectrômetro de massas, além de obter subsídios para um desenvolvimento racional de
métodos eficazes (altas recuperações, precisão e exatidão) na extração da matriz biológica.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
5
Tabela 1. Características que influenciam no desenvolvimento de métodos bioanalíticos
Características Etapa do método Influência no método
pKa
Extração /
Detecção
Recuperação / Ionização
(EM)
Solubilidade Extração Recuperação
Polaridade FM e FE
Separação
cromatográfica
Termosensibili-
dade
Extração /
Detecção
Degradação do
composto
Físico-químicas
Peso molecular
Detecção
(CL-EM/EM)
Transição de massa
C
máx
/ T
máx
(Absorção)
LIQ Método de detecção
Metabólitos
(Distribuição /
Metabolização)
Extração /
Detecção
Quantificação do
metabólito / separação
cromatográfica
T
1/2
(Distribuição /
Eliminação)
№ de análises ↑ “Throughput”
Farmacocinéticas
Variabilidade
interindividual
№ de análises ↑ “Throughput”
Biofarmacotécnicas
Sistemas de
liberação
controlada
№ de análises ↑ “Throughput”
Em contrapartida, as características biofarmacotécnicas e farmacocinéticas se configuram
como elementos de elevada importância para que durante o desenvolvimento do método de
análise aspectos como o limite inferior e o superior de quantificação (LIQ e LSQ,
respectivamente) além do número de amostras a serem quantificadas durante a etapa analítica
sejam bem dimensionados.
A partir dessas informações será determinada a faixa linear bem como o tipo de detecção a
ser utilizado para a quantificação do maior número de amostras provenientes dos pontos de
coleta da etapa clínica, além da necessidade de um maior “clean-up” para um menor desgaste
do sistema cromatográfico levando a um menor número de interrupções para lavagem do
sistema.
A determinação do LIQ pode ser fonte de erros no cálculo da relação entre a área sob a
curva de zero ao último tempo de concentração quantificada (AUC
0-Clast
) e a área sob a curva
de zero a infinito (AUC
o-∞
).A RE 397 de 12 de novembro de 2004 especifica que a razão
entre AUC
0-Clast
/ AUC
o-∞
deve ser no mínimo 80% (BRASIL, 2004). O conhecimento da
concentração plasmática máxima (C
máx
) após a administração do medicamento é de
fundamental importância para garantir a quantificação do maior número de pontos de coleta.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
6
NÃO
Informações do fármaco e
da matriz (FQ e BD)
Escolha e otimização do detector
Escolha do método
cromatográfico: FM, FE
Otimização da cromatografia
(simetria do pico)
Sensibilidade
NÃO
SIM
Escolha do
p
adrão interno
Separação
cromatográfica?
NÃ
Desenvolvimento do
método de extra
ç
ão
O método é
Especifico / seletivo?
Recuperação
Carry over?
Lavagem do
Autoinjetor
(1º passo)
(2º passo)
(
1º
p
asso
)
(
2º
p
asso
)
SIM
SIM
SIM
NÃ
SIM
NÃ
SIM
Validação do método e Estudo de
estabilidade das amostras na matriz
biológica
Método linear entre:
LIQ ≤ 10% do C
máx
e LS
Q
>C
máx
NÃ
O
Redefinir intervalo
(diluições)
Linearidade
FQ – Físico-Químico
BD - Biodisponibilidade
Figura 1. Fluxograma de desenvolvimento de métodos bioanalíticos
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
7
O LIQ deve estar dentro de valores no mínimo inferiores a 10% do C
máx
para a garantia da
relação entre AUC
0-Clast
/ AUC
o-∞
.
Um outro fator que interfere no cálculo da relação acima citada são os tempos de
coletas das amostras dos voluntários baseados no tempo de meia vida (T
1/2
) do fármaco no
organismo. A partir deste parâmetro pode-se planejar com acuidade o intervalo entre os
pontos e qual o último ponto de coleta.
O LSQ tem a sua importância também pautada no valor do C
máx
para que na
quantificação das amostras dos voluntários não apareçam valores acima da faixa linear
comprovada. Caso isso ocorra é necessário a realização de diluições nestas amostras e
posterior quantificação dentro da faixa linear do método analítico desenvolvido e validado.
Portanto, a faixa linear de trabalho é um dos parâmetros mais importantes no
desenvolvimento para garantir a quantificação correta dos parâmetros farmacocinéticos de
C
máx
e AUC, os quais, são parâmetros farmacocinéticos determinantes da bioequivalência
entre duas formulações.
A quantidade de amostras a serem injetadas depende do número de voluntários e do
número de pontos de coleta, que serão dependentes de fatores como a variabilidade inter-
individual do fármaco e do tempo de meia vida (T
1/2
) (CHOW, S.C. & LIU, J.P., 2000). O
elevado número de amostras envolvidas é um dos fatores limitantes de alguns métodos
trazendo assim a necessidade de métodos mais eficientes de extração e “clean-up” de
amostras.
2.3 Métodos de extração e “clean-up” de amostras
A quantificação de fármacos em amostras biológicas, sobretudo em plasma de
voluntários e/ou pacientes, coletadas em estudos clínicos de farmacocinética têm sido
procedimento usual na determinação da segurança e eficácia de medicamentos (QUEIROZ &
LANÇAS, 2005). As técnicas mais utilizadas lançam mão da cromatografia como
procedimento de separação, identificação e quantificação com diversos detectores:
ultravioleta, fluorescência, eletroquímico e espectrômetro de massas.
Matrizes biológicas complexas como sangue, plasma, urina, saliva e fluido cérebro
espinhal e tecidos contêm grande quantidade de compostos endógenos que podem interferir
no método analítico (GONÇALVES, 2005). O conhecimento dessas matrizes e da
farmacocinética do princípio ativo ordena o desenvolvimento das técnicas de extração e
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
8
detecção utilizadas para assegurar especificidade / seletividade para a determinação do limite
de quantificação e da faixa linear.
Em estudos de farmacocinética comparada a matriz mais comumente utilizada é o
plasma. Para a dosagem de fármacos a partir de uma matriz complexa como o plasma faz-se
necessário um pré-tratamento das amostras. Os componentes endógenos presentes são
potenciais interferentes em análises cromatográficas (QUEIROZ, et al, 2001).
O pré-tratamento das amostras tem a finalidade de eliminar os interferentes (“Clean-
up”), extrair o fármaco com altas recuperações e, em determinadas ocasiões, pré-concentrar,
quando se faz necessário um aumento na sensibilidade do método (QUEIROZ &LANÇAS,
2005).
A presença de interferentes que compõem a matriz plasmática é um dos fatores que
fazem com que métodos bioanalíticos com a utilização de técnicas de CLAE-UV tenham
tempos de análise longos por amostra para que haja separação cromatográfica entre os picos
de interferentes, analito e padrão interno. Na técnica de CL-EM/EM, uma outra conseqüência
da presença de interferentes é a supressão iônica causada pela co-eluição dos interferentes
com o analito provocando uma competição entre analitos e interferentes na fonte de íons no
momento da ionização das moléculas, diminuindo a sensibilidade do método.
O desenvolvimento de métodos de extração, “clean-up” e enriquecimento de amostras
é uma etapa de extrema importância para pureza dos picos cromatográficos (especificidade /
seletividade) e para a sensibilidade.
O desenvolvimento de métodos de extração é relacionado com as propriedades dos
analitos de interesse, o limite inferior de quantificação desejado, a natureza da matriz, o tipo
de cromatografia utilizada para a etapa de separação e o tipo de detector utilizado para a
quantificação (HENNION, 1999)
As técnicas mais comumente utilizadas para extração e concentração de compostos
presentes em fluidos biológicos têm sido: precipitação de proteínas, extração líquido-líquido e
extração em fase sólida (BARRIONUEVO, 2001; ALNOUTI, et al, 2005).
O elevado número de amostras analisadas em um estudo de bioequivalência exige um
alto grau de “clean-up” para eliminação de interferentes, proteção da coluna cromatográfica e
de todo sistema cromatográfico e de detecção.
Amostras bem limpas aumentam a durabilidade do sistema cromatográfico através de
uma maior proteção à coluna e de um menor acúmulo de sujeira nos detectores por exemplo,
no percurso óptico da célula de um detector de ultravioleta ou no cone de amostragem do
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
9
espectrômetro de massas, propiciando um maior número de análises consecutivas com um
menor número de paradas para lavagem do sistema.
2.3.1 Extração Líquido-Líquido
A extração líquido-líquido (ELL) é um processo de separação que se utiliza da
propriedade de imiscibilidade de líquidos com a separação de misturas líquidas heterogêneas
como mostrado na FIGURA 2. Nesta técnica de extração ocorre a partição do analito entre as
duas fases imiscíveis (orgânica e aquosa) (QUEIROZ, et al, 2001).
Líquidos imiscíveis
Figura 2. Mostra um esquema de ELL clássico com utilização de funil de separação.
Para o desenvolvimento de método de extração utilizando solventes orgânicos como
extratores é necessário o conhecimento das características físico-químicas do analito, tais
como: polaridade, pKa, solubilidade, coeficiente de partição.
O pKa da molécula em estudo tem extrema relevância quando se trata de fármacos
ionizáveis pois a partição entre as fases depende do estado em que o composto se encontra
levando-se me consideração o pKa e o pH do meio, conforme a equação abaixo:
pH = log pKa – log [H
+
] / log [A
-
] (1)
Para a obtenção de um método eficiente, com “clean-up” e recuperação adequada, o
analito deve encontrar-se na forma não-ionizada para ocorrer uma partição entre as fases com
uma maior concentração na fase orgânica.
A ELL apresenta vantagens e desvantagens na sua utilização. Dentre as vantagens
podemos citar o baixo custo e a boa aplicabilidade em um amplo espectro de compostos, com
extratos limpos, boas recuperações e boa reprodutibilidade. A formação de emulsão entre a
fase aquosa e a fase orgânica durante o processo de agitação o alto nível de resíduos tóxicos
ao meio ambiente e aos profissionais (NETO & NUNES, 2003) além dos processos
demorados frente ao elevado número de amostras se caracterizam como as principais
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
10
desvantagens da ELL além de não se apresentar adequada para a extração de compostos
altamente polares.
As estratégias de extração de fármacos dependem da natureza da matriz biológica e
das propriedades físico-químicas do analito em particular. Na extração líquido-líquido, o uso
de procedimentos de múltiplas etapas envolvendo extração e re-extração em fase orgânica e
aquosa com o controle apropriado do pH e da concentração iônica, podem extrair um analito
seletivamente da matriz biológica, bem como reduzir a quantidade de interferentes e
contaminantes no extrato final (SNYDER, 1997).
A FIGURA 3 mostra as etapas de um procedimento de desenvolvimento de extração
líquido-líquido para utilização em métodos bioanalíticos.
Informações do fármaco, do PI
e da matriz (FQ e BD)
Escolha do solvente orgânico
Es
p
ecificidade ?
S
IM
Boa recuperação ?
≥ 60%
N
Ã
O
S
IM
Alterar pH da amostra ?
Alterar volume do solvente
de extração?
NÃO
S
IM
Separação
cromatográfica
Evaporação do solvente
orgânico e volume de
resus
p
ensão
LIQ ≤ 10% do C
máx
?
NÃO
S
IM
N
Ã
O
Reprodutível ?
Otimização de volume de
solvente, tempo de agitação e
velocidade de centrifugação
N
Ã
O
SIM
Validação do método e Estudo de
estabilidade das amostras na matriz
biológica
Figura 3. Fluxograma de desenvolvimento de método para extração líquido-líquido
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
11
O ANEXO C deste trabalho trata-se de um artigo sobre desenvolvimento e validação de
um método bioanalítico utilizando ELL e CLAE-UV para quantificação de norfloxacino em
plasma humano e a sua aplicação em um estudo de bioequivalência.
2.3.2.Extração em Fase Sólida
A Extração em Fase Sólida (EFS) é uma técnica de separação líquido-sólido baseada
nos mecanismos de separação da cromatografia líquida de baixa pressão, também conhecida
como cromatografia clássica (LANÇAS, 2004).
Em meados da década de 70 a EFS surgiu como uma nova técnica utilizada na
diminuição dos problemas existentes na quantificação de compostos em matrizes complexas
como o plasma humano. Os primeiros cartuchos surgiram em 1978, enquanto que em 1979
surgiram os cartuchos em forma de seringa e na década de 1980 surgiram as pré-colunas para
acoplamento “on line” com sistemas de cromatografia líquida (HENNION, 1999).
Hoje em dia, a extração em fase sólida se configura como uma das ferramentas mais
poderosas e mais empregadas para a extração e/ou pré-concentração de analitos presentes em
matrizes complexas (QUEIROZ, et al, 2001)
As vantagens mais significativas da EFS em relação à ELL são:
9 Relativamente mais rápida;
9 Obtenção de recuperações relativamente mais altas;
9 Boa precisão e exatidão;
9 Extratos muito limpos;
9 Capacidade de processar pequenos e grandes volumes de amostras;
9 Cartuchos e colunas de extração descartáveis;
9 Análise de analitos voláteis;
9 Não há formação de emulsões;
9 Obtenção de uma alta seletividade pela variedade de fases sólidas e
procedimentos de extração disponíveis (LINGEMAN & HOEKSTRA-
OUSSOREN, 1997).
Um grande aumento na utilização da EFS se deu nos últimos cinco ou seis anos com o
aparecimento de novos formatos da fase estacionária (sorvente), avanços em automação e
introdução de novos tipos de sorventes (HENNION, 1999).
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
12
A extração em fase sólida dispõe de vários tipos distintos de fases extratoras que
proporcionam diferentes mecanismos de interação com os analitos favorecendo, desta forma a
seletividade analítica (QUEIROZ & LANÇAS, 2005)
Os mecanismos de retenção e eluição dos analitos pela fase sólida ocorrem pelas
interações entres as moléculas dos analitos, fase estacionária e a fase móvel assim como na
cromatografia clássica. As forças intermoleculares envolvidas nestas interações são do tipo:
iônicas, van der Waals, eletrostáticas, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de
hidrogênio.
Entretanto, um problema chave ainda permanece no desenvolvimento de métodos por
EFS. A primeira decisão a ser tomada pelo analista é a seleção do tipo de sorvente a ser
utilizado para a separação do analito dos interferentes da matriz. Por muitos anos utilizou-se
fases estacionárias a base de sílica, em especial derivados de n-alquilsilica, como sorventes
universais nas extrações em fase sólida. Hoje diversos tipos de sorventes foram introduzidos
no mercado, inclusive sorventes utilizados para retenção de compostos polares (HENNION,
1999).
Um dos grandes avanços no desenvolvimento de materiais utilizados como sorventes
foi a implementação de co-polímeros com partes hidrófobas e hidrofílicas que podem atuar
tanto na extração de compostos polares como de compostos não-polares.
A nova geração de polímeros (
®
Oasis da Waters e
®
Abselut da Varian) foi
desenvolvida para utilização na extração de um amplo espectro de compostos, isto é,
lipofílicos, hidrofílicos, ácidos, bases e compostos neutros utilizando o mesmo sorvente e com
passos simples desde o condicionamento dos cartuchos (HENNION, 1999) até a eluição final.
Uma outra vantagem dos polímeros é o fato da reprodutibilidade da recuperação não ser
afetada pelo tempo de secagem entre a etapa de condicionamento e equilíbrio do cartucho
(LANÇAS, 2004), enquanto que para os sorbentes convencionais o processo de
condicionamento e equilíbrio precisa ser repetido caso o leito do sorbente seque entre estas
fases.
Este fato é de extrema importância quando se trata de estudos com um elevado
número de amostras que necessariamente precisam ser extraídas em conjunto, a exemplo de
estudos de farmacocinética comparada.
A TABELA 2 mostra os materiais mais utilizados nos recheios, os quais se
assemelham aos materiais utilizados na cromatografia líquida.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
13
Para entender o processo de extração é necessário a compreensão das interações entre
o analito, a matriz, o sorvente e os solventes utilizados no processo de extração (HENNION,
1999) e responder algumas questões fundamentais (SNYDER, 1997):
9 Quais as interferências que sabemos existir no processo?
9 Qual a natureza do solvente da amostra?
9 Existe possibilidade de escolha do solvente da amostra?
9 Qual o principal objetivo da separação da amostra em questão?
As respostas podem ser encontradas na revisão da literatura referente ao analito em
questão e outras vão depender dos objetivos da análise.
A escolha das condições experimentais durante o desenvolvimento de um método de
extração envolve seleção do formato, modo de extração, seleção da fase sólida, do solvente da
amostra e do solvente de eluição, entre outras (LANÇAS, 2004).
A seleção do formato do cartucho vai depender da natureza e da quantidade de
amostras a serem analisadas. Atualmente o formato mais comumente utilizado é o cartucho na
forma de seringa (FIGURA 4) usualmente de polipropileno, com a fase estacionária retida
entre dois discos (“frits”) de polietileno (HENNION, 1999; LANÇAS, 2004).
O segundo formato mais popular é o disco que apresenta a vantagem da não formação
de caminhos preferenciais o que ocorre com o formato de seringa. É produzido com a fase
estacionária imobilizada em uma matriz inerte como o politetrafluoretileno (PTFE)
(HENNION, 1999).
Existe também a microextração em fase sólida que se utiliza de fibras de sílica
modificadas quimicamente como fase estacionária. Esta técnica reduz a quantidade de
solvente utilizado na dessorção dos analitos, além da variabilidade de tipos de fases
estacionárias das seringas (LANÇAS, 2004).
A seleção da fase sólida, isto é, do sorvente, geralmente segue os critérios utilizados
para escolha da fase estacionária utilizada na cromatografia líquida. Uma visão geral do
desenvolvimento do método por EFS é mostrada na FIGURA 5. Um guia para seleção do
sorvente preferencial é mostrado baseado nas características do analito como, solubilidade em
água versus solubilidade em solvente orgânico e forma iônica versus forma não iônica
(SNYDER, 1997).
Outro ponto fundamental no desenvolvimento de métodos de EFS é a seleção do
solvente de preparação da amostra, que seguirá as mesmas regras utilizadas na extração
líquido-líquido, em relação ao pH do meio e o pKa da molécula. Ou seja, para haver retenção
do analito, este deve estar na forma não iônica.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
14
Tabela 2. Exemplos de sorventes utilizados em extração em fase sólida
NÃO POLARES
C
18
Octadecilsilano
≡ Si – (CH
2
)
17
– CH
3
C
8
Octilsilano
≡ Si – (CH
2
)
7
– CH
3
C
2
Etilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
3
C
1
Metilsilano
≡ Si – CH
3
PH Fenilsilano
≡ Si –
CH Ciclohexilsilano
≡ Si –
POLARES
FL Florisil
MgO
3
Si
AL Alumina
Al
2
O
3
Si Sílica
≡ Si – OH
CN Cianopropilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– CN
2OH Diolsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– O – CH
2
– CH – CH
2
OH OH
NH
2
Aminopropilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– NH
2
PSA N-propiletilenodiaminossilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– NH – CH
2
– CH
2
– NH
2
TROCA IÔNICA
SCX Benzenossulfonilpropilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– – SO
-
3
H
+
PRS Sulfonilpropilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– SO
-
3
Na
+
CBA Caxrboximetilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– COOH
DEA Dietilaminopropilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– N(CH
2
– CH
3
)
2
SAX Trimetilaminopropilsilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– N
+
(CH
3
)
3
Cl
-
PSA N-propiletilenodiaminossilano
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– NH – CH
2
– CH
2
– NH
2
COVALENTE
PBA Ácido fenilborônico
≡ Si – CH
2
– CH
2
– CH
2
– NH –
B(OH)
2
A escolha do modo de extração vai depender do grau de “clean-up” requerido, o que
está relacionado diretamente com a complexidade da matriz utilizada além de considerações
sobre a natureza físico-química do analito. O analito pode ser eluído diretamente após o
carregamento do cartucho ou podem existir passos de lavagem do cartucho.
Na lavagem busca-se a eluição dos interferentes mantendo o analito retido no sorvente
para posterior eluição. A escolha dos solventes a serem utilizados nas etapas de lavagem e
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
15
eluição vai estar diretamente relacionada com as características físico-químicas do analito e
da matriz tais como polaridade e solubilidade.
A FIGURA 4 mostra esquematicamente que a extração em fase sólida utilizada para
quantificação de analitos em estudos com a presença de matrizes complexas, como plasma
humano, em geral segue cinco passos básicos:
1. Ativação do material sorvente;
Condicionamento
2. Equilíbrio do sorvente;
3. Introdução da amostra;
4. “Clean-up” da amostra;
5. Eluição do analito.
Figura 4. Esquema de extração em fase sólida
Eluição
do analito
Equilíbrio Ativação
Introdução da
Amostra
“Clean-up” da
Amostra
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
16
Tipo CEX AEX n – BPC LSC RPC n – BPC LSC RPC
Fases
- COOH
(WCX), - SO
3
H
(SCX)
Amino
(WAX), 1,2-diamino
(WAX), Quat.
Amino (SAX)
- CN, diol,
Amino
1,2-diamino
SiO
2
,
Florisil,
Alumina
C
18
, C
8
,
Cycloexyl, -CN
Phenyl, C
2
, C
4
,
- CN, diol,
Amino
1,2-diamino
SiO
2
,
Florisil,
Alumina
C
18
, C
8
,
Cycloexyl, -CN
Phenyl, C
2
, C
4
,
Solventes para
eluição
Tampões ácidos Tampões básicos
C
6
, CHCl
3
,
CH
2
Cl
2
Acetona
MeoH, IPA
C
6
, CHCl
3
,
CH
2
Cl
2
EtOAc
MeoH, IPA
C
6
, CH
2
Cl
2
MeoH, H
2
O
C
6
, CHCl
3
,
CH
2
Cl
2
Acetona
MeoH, IPA
C
6
, CHCl
3
,
CH
2
Cl
2
EtOAc
MeoH, IPA
C
6
, CH
2
Cl
2
MeoH, H
2
O
Amostra orgânica
PM < 2000
Cationico Anionico Polar Polar
Moderadamente
Polar
Moderadamente
Polar
Apolar Apolar
Solúvel em
água?
Iônico
Não-Iônico
Solúvel em
solvente orgânico?
Figura 5. Guia para seleção de sorvente e solvente para eluição (SNYDER, 1997)
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antimicrobianos em plasma humano
17
2.4. Métodos cromatográficos
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma
mistura, realizada através da distribuição destes compostos em duas fases, que estão em contato
íntimo. Durante a passagem da fase móvel (FM) sobre a fase estacionária (FE), os componentes
da mistura são distribuídos entre as duas, de tal forma que cada um deles é seletivamente retido
pela FE, resultando em migrações diferenciais desses compostos (FIGURA 6) possibilitando
assim análises qualitativas e/ou quantitativas (COLLINS, 1995; CIOLA, 1998; NETO &
NUNES, 2003).
Figura 6. Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma fase
estacionária (líquido ou sólido) e uma fase móvel (líquido ou gás).
2.4.1. Classificação
A classificação simplifica e auxilia o estudo da cromatografia. Esta pode ser classificada
de diversas formas dependendo do interesse e tendo como base de classificação diferentes
fatores, tais como, fase móvel, fase estacionária, processo de separação ou tipo de soluto como
mostra a figura 4.(NETO & NUNES, 2003; NASCIMENTO, 2004).
De acordo com a FIGURA 7 podemos observar que a cromatografia pode ser subdividida
em CGL – Cromatografia Gás-Líquido; CGS - Cromatografia Gás-Sólido; CFS – Cromatografia
de Fluido Supercrítico; CLL – Cromatografia Líquido-Líquido; CCD – Cromatografia em
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18
Camada Delgada; CLS – Cromatografia Líquido-sólido; CTI – Cromatografia de troca iônica;
CET – Cromatografia por exclusão de tamanho; CFL – Cromatografia de fase quimicamente
ligada. (CIOLA, 1998).
Alguns trabalhos vêm sendo desenvolvidos na tentativa de unificar os vários sistemas
cromatográficos existentes em um único equipamento, capaz de trabalhar com fases móveis em
diferentes estados físicos. Um dos principais limitantes para o desenvolvimento de sistemas de
cromatografia unificada é o sistema de detecção (MÜHLEN & LANÇAS, 2004).
Cromatografia
Figura 7. Tipos de cromatografia de acordo com o estado físico da * Fase móvel e ** Fase
estacionária.
2.4.1.1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A CLAE é uma técnica de separação que, em menos de trinta anos passou a ser um dos
métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos (TONHI et al, 2002) e
atualmente se destaca na química analítica pela capacidade de realizar análises qualitativas e
Gás Fluido
supercrítico
Líquido
Líquido
*
**
Sólido
Líquido Líquido
Sólido Sólido
Adsorvente
Peneira
molecular
CGL CGS
Adsorvente
Quimicamente
li
g
ada
Adsorvente
Resina / Gel
CFS
CFS CLL/CCD CLS / CTI
CET / CFL
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antimicrobianos em plasma humano
19
quantitativas em amostras ambientais, farmacêuticas, biológicas e em alimentos, dentre outras
(RIBANI et al, 2004).
A CLAE é um sistema de separação automatizado que funciona com uma fase móvel
passando por uma fase estacionária sob alta pressão o que originalmente levou à denominação de
Cromatografia Líquida de Alta Pressão. Esta terminologia foi trocada por “Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência”, quando se constatou que o grande aporte da técnica era a melhor
capacidade de separação cromatográfica e não a maior pressão e com o desenvolvimento de
partículas de sílica peliculares porosas, o que permitiu operar-se dentro de fluxos e pressões
menores, e com maior grau de eficiência no processo de separação (NETO & NUNES, 2003).
Um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência como mostra a FIGURA 8 é
composto por alguns componentes essenciais (NETO & NUNES, 2003; NASCIMENTO, 2004;
GONÇALVES, 2005) que são responsáveis pela separação cromatográfica:
Figura 8. Componentes essenciais de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência. A)
reservatório de fase móvel; B) bomba de alta pressão; C) injetor de amostra; D) coluna
cromatográfica; E) detector; F) sistema de aquisição de dados.
2.4.2. Separação Cromatográfica
A seleção criteriosa do par fase móvel / fase estacionária é de suma importância para
eficiência da separação cromatográfica dos componentes de uma amostra, a partir das diferentes
possibilidades de interação físico-química entre as moléculas e as fases móvel e estacionária. A
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20
TABELA 3 mostra seis diferentes sistemas de distribuição de analitos entre essas duas fases
(NETO & NUNES, 2003).
Na utilização da CLAE estima-se que mais de 90% dos laboratórios de análise espalhados
pelo mundo utilizam pelo menos um método que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa
(CLAE -FR) (TONHI et al, 2002).
Na cromatografia líquida de alta eficiência com coluna de fase reversa (CLAE-FR) o
mecanismo de retenção dos analitos é proporcionado pelo particionamento da porção lipofílica da
molécula dentro da fase estacionária, levando a um maior tempo de retenção do analito em
colunas com fases mais apolares (COLLINS, 1995).
As fases reversas apresentam algumas vantagens tais como: utilização de fases móveis
menos tóxicas e de menor custo, como metanol-água, acetonitrila-água e tampões, fases
estacionárias estáveis de vários tipos distintos, rápido equilíbrio da coluna pós mudança de fase
móvel, maior rapidez em análises e boa reprodutibilidade dos tempos de retenção (TONHI et al,
2002), características estas muito importantes para análises de estudos de farmacocinética
comparada que utilizam uma quantidade muito elevada de amostras em um curto espaço de
tempo.
Tabela 3. Sistemas de distribuição de analitos entre uma fase móvel e outra estacionária.
01 – Fase normal Fase estacionária é polar e a fase móvel é
menos polar.
02 – Fase reversa Fase estacionária é apolar e a fase móvel é
mais polar.
03 – Troca - iônica Fase estacionária incorpora íons fixados a
ela, os quais por sua vez retêm contra-íons.
Íons da amostra presentes na fase móvel
podem deslocar os contra-íons originais,
fixando-se em seu lugar.
04 - Complexante Fase estacionária incorpora grupos
quelantes fixados a ela, os quais por sua vez
retêm analitos por complexação.
05 – Exclusão por tamanho Fase estacionária contém poros de
dimensões determinadas que capturam
moléculas menores e excluem as maiores.
06 – Associação a receptor biológico Fase estacionária incorpora receptores
elaborados por sistemas biológicos fixados
a ela, os quais por sua vez retêm analitos
que tenham afinidade pelos mesmos.
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antimicrobianos em plasma humano
21
Um outro fator a ser considerado em CLAE-FR é a composição da fase móvel utilizada.
Em cromatografia de fase reversa quanto maior a quantidade de solvente orgânico na fase móvel,
mais rapidamente o analito será eluído, cabendo ao analista adequar a coluna cromatográfica e a
fase móvel para melhor eficiência do processo de separação (RIBANI, et al,2004). Para tanto, é
necessário algum conhecimento das características físico-químicas dos analitos e das forças
intermoleculares envolvidas no processo para propor a melhor combinação entre fase estacionária
e fase móvel para a obtenção da separação desejável.
2.4.2.1. Fase móvel
A fase móvel é um dos fatores primordiais para o sucesso da separação cromatográfica, desde
a sua composição até o fluxo com que a mesma elui a fase estacionária. A escolha da composição
leva em conta uma grande variedade de fatores, onde os principais são (CIOLA, 1998):
¾ Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, a partição, a adsorção e, portanto a
separação;
¾ Propriedades físicas que afetam a possibilidade de detecção;
¾ Propriedades físicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores e colunas;
¾ Propriedades que afetam a segurança (toxidez, inflamabilidade, etc.);
¾ Por fim, mas não por último, o seu custo (muitos bons solventes, mesmo que comercialmente
disponíveis, têm seus preços proibitivos).
A FIGURA 9 mostra um esquema proposto em 1979 por Snyder e Kirkland onde
encontramos uma classificação de acordo com a utilização de solventes em CLAE (CIOLA,
1998).
A seleção dos solventes que irão fazer parte da composição da fase móvel deve ser realizada
de maneira a satisfazer as necessidades de manuseio seguro, eficiência cromatográfica e de baixo
custo para análise.
2.4.2.2. Fase Estacionária
Durante as décadas de 70 e 80 a cromatografia foi praticada principalmente em colunas de
diâmetro interno em torno de milímetros, com comprimento variando de 10 a 25 centímetros.
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22
Estas dimensões foram alteradas a partir da constatação de que diminuindo-se o tamanho das
partículas da fase estacionária de 10 microns para 5 microns, podia-se diminuir o comprimento da
Solventes
com
k * e α **
satisfatórios
Solventes
com K *
satisfatório
Solventes com propriedades
físicas boas
Todos os
solventes
Legenda:
Re
g
ião onde todos os fatores necessários
p
ara se
p
ara
ç
ão são satisfatórios
Fatores de ca
p
acidade k convenientes mas
,
fator de se
p
ara
ç
ão α não satisfatório
Pro
p
riedades físicas ade
q
uadas e Fato
r
es de ca
p
acidade K e fator de se
p
ara
ç
ão α não conveniente
Materiais
q
ue devido as suas
p
ro
p
riedades físicas não
p
odem ser utilizados em CL
* k – fator de capacidade: é o tempo de retenção da molécula na coluna cromatográfica,
refletindo o tempo decorrido entre a injeção da amostra e sua detecção e pode ser calculado
através da equação 1 (NASCIMENTO, 2004; CIOLA, 1998).
K = Vr – Vo / Vo donde, (X)
Vo é o volume morto da coluna
Vr é o volume de retenção do analito
** α – fator de seletividade: é a capacidade do sistema de diferenciar dois compostos de uma
mesma amostra entre si e pode ser calculado pela equação 2 (NASCIMENTO, 2004, CIOLA,
1998)
α = t
2
– t
0
/ t
1
– t
o
donde, (X)
t
0
é o tempo de retenção de substância não retida pela coluna, também chamado de tempo morto
da coluna
t
1
e t
2
são os tempos de retenção dos analitos na mesma análise cromatográfica
Figura 9. Triângulo de seleção de fases móveis (adaptado de CIOLA, 1998)
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antimicrobianos em plasma humano
23
coluna para a metade, mantendo-se a mesma eficiência de separação. A variação no diâmetro
interno das colunas motivou o surgimento das colunas denominadas microbore, semi-microbore e
capilares para cromatografia líquida. Esta miniaturização, além de haver permitido considerável
economia com solventes, fases estacionárias e amostras, possibilitou ainda uma ampliação do
campo da cromatografia líquida, incluindo o acoplamento com espectrometria de massas
(ARDREY, 2003).
A mais de 30 anos a sílica tem sido o material de partida preferido para a preparação das
fases estacionárias para CLAE-FR por apresentar características de ser mecanicamente estável a
altas pressões, ser modificada com facilidade, ter suas características bastante estudadas e,
portanto, conhecidas além de ser comercialmente disponível em uma grande variedade de
tamanhos de partículas, formas e tamanhos de poros (TONHI et al, 2002).
Existem dois aspectos que limitam a utilização de fases baseadas em sílica: a não
homogeneidade da sua superfície (TONHI et al, 2002 apud BERTHOD, 1991; NAHUM &
HORVÁTH, 1981) e a instabilidade frente a fases móveis tanto ácidas quanto básicas (TONHI et
al, 2002).
Nos últimos anos as colunas cromatográficas à base de sílica vêm sendo substituídas por
colunas que contêm polímeros com grupos hidrofílicos e lipofílicos, o que se torna importante
para a análise de fármacos visto que a maioria destes apresentam tanto grupamentos polares
quanto apolares em suas estruturas e podem atuar em de pH de 2.0 a 8.0 (SILVA, et al, 2004).
Apesar de mais de trinta anos na pesquisa e do alto padrão alcançado pela tecnologia de
colunas cromatográficas alguns problemas ainda persistem. Portanto novas estratégias vêm sendo
delineadas para obtenção de colunas mais eficientes. Neste sentido as colunas fases monolíticas
surgiram possibilitando a utilização de com fluxos elevados (> 5 mL/min) sem perdas
significativas de eficiência de separação (FARIA, et al, 2006)
2.4.3. Sistemas de detecção
O detector mede as mudanças de concentração através de alguma propriedade físico-
química (absorção no ultravioleta, potencial de oxido-redução, índice de refração, fluorescência,
etc) ou da massa dos compostos da amostra que está deixando a coluna do sistema
cromatográfico. A interpretação dos dados registrados pelo detector produz informações
quantitativas e qualitativas sobre a amostra e seus constituintes. A escolha de um detector
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
24
depende da sua sensibilidade, seletividade, precisão e exatidão adequadas para a execução e
tempo da análise empregada (GONÇALVES, 2005).
As características ideais de um detector para qualquer sistema cromatográfico seriam um
sistema com alta sensibilidade assim como alta seletividade, boa resposta a um grande número de
classes de compostos e habilidade na detecção de misturas complexas permitindo um elevado
“throughput” (PEREIRA, et al, 2005).
Detectores fotométricos medem as mudanças na absorção de luz monocromática ou a
fluorescência; detectores de índice de refração medem as mudanças do índice de refração do
efluente da coluna, enquanto que os eletroquímicos e por condutividade medem as mudanças das
características elétricas da solução (CIOLA, 1998; SKOOG et al., 2002; NETO & NUNES,
2003). Apesar da grande variedade de detectores para CLAE a quantificação plasmática de
medicamentos através da CLAE com leitura através da fluorescência ou ultravioleta é a mais
freqüentemente utilizada na atualidade (GONÇALVES, 2005).
Os detectores disponíveis no mercado mais utilizados são:
¾ Detectores de absorbância no ultravioleta e visível (UV-VIS);
¾ Detectores de fluorescência;
¾ Detectores eletroquímicos;
¾ Detectores de massas
Outros:
¾ Detectores de índice de refração
¾ Detectores de condutividade elétrica
De acordo com Langerwerf e cols, o tempo médio de corrida de uma amostra através da
CLAE varia em torno de 10 min (fluorescência) a 15 min (ultravioleta - UV) e em torno de 20
min quando da utilização de detecção eletroquímica, em função do tempo necessário para uma
resolução efetiva entre o pico do analito e de interferentes potenciais.
Este tempo é drasticamente reduzido para 3 min quando se utiliza a cromatografia líquida de
alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas de triplo quadrupolo CL-EM/EM, sobretudo
no modo de aquisição de íons por MRM (monitoramento de reações múltiplas) (GONÇALVES,
2005), devido a sua grande seletividade, o que permite a quantificação do analito, mesmo sem a
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
25
completa resolução cromatográfica de outros interferentes, desde que estes não interfiram no
processo de ionização do analito.
Esses dados demonstram a rapidez da CL-EM/EM se comparada com os outros métodos
referidos acima e, se aliarmos a isso a quantidade potencial de amostras utilizadas para a
determinação de fármacos em matrizes biológicas representa um enorme ganho, sobretudo na
área bioanalítica (OLIVEIRA, 2002).
Em conseqüência disto e do sistema CL-EM/EM reunir todas as características de um
detector ideal (PEREIRA, et al, 2005) este vem ganhando, progressivamente, espaço no campo
bioanalítico, inclusive no Brasil.
2.5 Cromatografia Líquida-Espectrometria de massas / Espectrometria de Massas
(CL-EM/EM)
2.5.1. Espectrometria de massas (EM)
Desde o seu aparecimento há cerca de 100 anos atrás, a espectrometria de massas vem se
tornando uma ferramenta largamente utilizada na pesquisa científica. A sua utilização,
possivelmente, é responsável pela simplificação da pesquisa científica em campos do
conhecimento como descoberta de novos isótopos, determinação exata de peso molecular,
caracterização de novos elementos, análise quantitativa de gases, identificação e quantificação
rápida de resíduos de poluentes e fármacos em diversas matrizes.
O espectrômetro de massas é um instrumento com a capacidade de determinação
da massa molar de compostos eletricamente carregados. Via de regra o espectrômetro pode ser
entendido como um instrumento composto por uma fonte de íons, um separador (filtro de massas)
que na realidade mede a relação massa/ carga (m/z) e um detector (MORAES & LAGO, 2003).
Embora existam diferentes mecanismos de filtragem e detecção, a etapa de ionização dos
compostos é a que tem a maior variedade de técnicas, fato decorrente da natureza diversa das
amostras e das espécies de interesse (MORAES & LAGO, 2003).
A FIGURA 10. mostra esquematicamente a composição de um espectrômetro de massas e
as principais técnicas utilizadas na fonte de íons, filtro de massas e detecção dos compostos.
A espectrometria de massas é utilizada na análise de amostras sólidas, líquidas ou gasosas
contendo espécies voláteis ou não e com aplicações voltadas desde a análise elementar até a
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
26
composição de proteínas que requerem diferentes processos de ionização (MORAES & LAGO,
2003).
Sistema de Vácuo
“INLET”
Fonte de
Íons
Filtro de
Massas
Detector
Processador
de dados
Sample plate
Target
HPLC
GC
Sonda de
inserção
direta
MALDI
Electrospray
APCI
FAB
EI
CI
TOF
TOF/TOF
MS (Single)
MS/TOF
MS/MS
Ion trap
Magnetic sector
FTMS
Microchannel plate
Electron multiplier
“Hybrid”
PC’s
Figura 10. Componentes do espectrômetro de massas e suas diversas técnicas
As aplicações da espectrometria de massas tiveram mudanças significativas na década de
80. Essas mudanças aconteceram pela necessidade de desenvolvimento de métodos capazes de
produzir íons de moléculas não voláteis ou termolábeis, características freqüentemente
encontradas em amostras estudadas por bioquímicos e biólogos (NASCIMENTO, 2004)
O desenvolvimento de técnicas de ionização à pressão atmosférica (“Atmospheric
pressure ionization , API”), tais como ionização química a pressão atmosférica (“Atmospheric
pressure chemical ionization , APCI”) e a ionização por eletronebulização (“Electrospray, ESI”)
possibilitaram a união viável de duas poderosas ferramentas analíticas, a espectrometria de
massas com a CLAE, tornando-as um único método CLAE-EM robusto e aplicável a uma grande
variedade de amostras em diversas matrizes (LAGERWERF et al, 2000 e PEREIRA et al, 2005)
Em 2004, Nascimento revisou a utilização da combinação das técnicas de CLAE e EM
que vem sendo estudada há duas décadas. Os grupos pioneiros de pesquisa na área foram os de
Tal’rose et al. (1972), Horning et al. (1974), Caroll et al. (1981), Scott et al. (1974). Já no
desenvolvimento instrumental tivemos alguns nomes como: Arpino et al. (1979), Brower et al.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
27
(1984), Ishii et al. (1985), Hennion et al. (1984; 1990), Vestal et al. (1978), Caprioli et al. (1990)
e Fenn et al. (1985; 1990).
Nos últimos anos a utilização da EM, após o advento da ESI, se difundiu entre as mais
variadas ciências e o número de publicações subiu de aproximadamente treaentas em 1993 para
próximo a duas mil em 2004 (CROTTI, et al, 2006)
Mesmo com a evolução acima mencionada, a espectrometria de massas, como relatado
por Pereira et al em 2005, ainda é tratada, no Brasil, como uma ferramenta analítica praticamente
restrita à pesquisa acadêmica (raras exceções), quando já há no mercado brasileiro demanda para
profissionais especializados em CLAE-EM/EM.
A EM está fortemente inserida na rotina das indústrias farmacêuticas, desde a pesquisa de
novos fármacos e formulações até o controle de qualidade (PEREIRA et al, 2005) e validações de
processos de limpeza (KOLODSICK et al, 2006).
No Brasil, a utilização de CLAE-EM/EM para análise de amostras em plasma humano
vem ganhando cada vez mais importância econômica e de controle da segurança e eficácia de
medicamentos. Esse aumento deu-se através da promulgação da Lei 9.787 de 1999 que
regulamentou o medicamento genérico no país.
Neste capítulo vamos nos restringir a falar sobre a interface entre a cromatografia líquida
de alta eficiência e a espectrometria de massas utilizando “electrospray” como fonte de
ionização, o quadrupolo seqüencial (EM/EM) como filtro de massas e como detector o
multiplicador de elétrons.
2.5.1.1. Fontes de ionização
Os métodos de ionização clássicos, impacto de elétrons (IE), ionização química (IQ) e a
ionização por desorção, são disponíveis para ionização do analito quando este se encontra no
estado gasoso. Estas técnicas ainda apresentam desvantagens quanto ao uso de alta energia com
processo de colisão em cascata, um aquecimento altamente localizado e criação de íons a partir
dos nêutros, levando a processos de formação e fragmentação de novos íons (KERBALE &
TANG, 1993).
Nos últimos anos, um grande progresso tem sido alcançado no desenvolvimento de novos
métodos de ionização. Condições mais brandas para formação do íon permitem a ionização das
substâncias sem a formação de fragmentos nesta etapa (NIESSEN & TINKE, 1995)
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
28
Na última década as fontes de ionização a pressão atmosférica vêm contribuindo com
bastante sucesso no acoplamento da CLAE com a EM para análise de compostos farmacêuticos
em matrizes biológicas. As fontes de ESI e APCI são as mais comumente utilizadas
(SOUVERAIN, 2004).
A escolha entre ESI e APCI depende primariamente da natureza do analito (Iônico em
solução, termosensibilidade), diâmetro das partículas da amostra e o diâmetro de partícula da
coluna utilizada (NIESSEN, 1998a). A fonte de ionização suporta fluxos de fase móvel mais altos
o que favorece o uso de colunas com diâmetros de partículas maiores.
2.5.1.1.1. “Electrospray” (ESI)
Em 1968 Dole e colaboradores realizaram experimentos com espécies poliméricas onde o
“electrospray” foi sugerido como um possível método de ionização para a espectrometria de
massas, embora seus experimentos não tenham sido convincentes pois o poliestireno não foi
ionizado em solução. Em 1984 Yamashita e Fenn demonstraram a aplicabilidade da fonte de
electrospray” como um método de ionização branda (YAMASHITA & FENN, 1984)
Apesar da técnica de “electrospray” (ou eletronebulização, ESI) ser considera como uma
fonte de ionização, na realidade o ESI é um processo de transferência de íons pré-existentes em
solução para a fase gasosa levando a crer que a ionização propriamente dita (transformação de
uma espécie neutra em um íon) é um efeito secundário (MORAES & LAGO, 2003).
Em estudo publicado em 2003, Moraes & Lago mostraram que de 1980 a 2000, o número
aproximado de publicações usando ESI passou de 100 para 7800 sendo que 80% dos estudos
estão relacionados com análise de biomoléculas e de compostos orgânicos.
O grande aumento na utilização desta técnica como fonte de ionização para análises
através da espectrometria de massas deve-se ao fato da grande maioria dos processos químicos e
bioquímicos ocorrerem em fase líquida, envolvendo muitas vezes compostos pouco voláteis
(MORAES & LAGO, 2003).
A ionização por “electrospray” envolve a formação de um “spray” eletrostático, a partir
do qual são geradas pequenas gotas carregadas e destas são liberados os íons (FIGURA 11). A
implementação de uma fonte ESI é relativamente simples, comparando-se com outras fontes para
espectrometria de massas.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
29
É necessária uma fonte de alta tensão (1000 a 7000 V) que esteja em contato com a
solução contendo eletrólitos. Tipicamente, esta solução é bombeada através de um capilar com
diâmetro interno de 50 a 100 μm com uma vazão inferior a 10 μL/min. No caso de fluxos
menores que 1 μL/min, o processo é chamado de “nanoelectrospray” (MORAES & LAGO,
2003).
O capilar deve estar posicionado entre 1 a 3 cm de um contra eletrodo que conduz, através
de um orifício, ao sistema de amostragem do espectrômetro de massas. O alto campo elétrico na
ponta do capilar gera um acúmulo de cargas na superfície do líquido por migração eletroforética,
havendo uma deformação na gota que recebe o nome de cone de Taylor (COLE, 1997).
À medida que o solvente evapora com o auxílio de gases nebulizantes e secante, há um
aumento da densidade de cargas da gota e, no momento em que esta densidade de cargas é capaz
de vencer a tensão superficial do líquido, há um colapso e fissão da gota ascendente formando
gotas menores descendentes. As gotas descendentes sofrem o mesmo processo de desolvatação
da gota ascendente, formando novas gotículas cada vez menores, com menor massa, porém com
maior densidade de cargas que as gotas ascendentes (COLE, 1997).
CLAE
Gás de
Nebulização
Alta voltagem
“Curtain gas”
Analisador
de
m
assas
Figura 11. Representação esquemática da fonte de “Electrospray”
2.5.1.2. Filtro de massas
Existe um grande número de diferentes métodos de separação (analisadores) usados na
espectrometria de massas e cada um apresenta vantagens e desvantagens. Após a ionização é
necessário separar os íons pelas diferentes relações massa/carga (m/z) para posterior
quantificação através da intensidade relativa do sinal de cada grupo de íons (ARDREY, 2003).
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30
Os analisadores de massa são os principais responsáveis pela especificidade e
sensibilidade destes tipos de detectores. Os quatro principais tipos de analisadores são:
quadrupolos (forma de barras); íon trap (IT-EM); tempo de vôo (“time of flight”, TOF) e
transformada de Fourier (FT-EM). Devido principalmente a fatores econômicos os três primeiros
são os mais usados, sendo o quadrupolo o mais largamente utilizado em estudos de quantificação
(NASCIMENTO, 2004)
2.5.1.2.1. Quadrupolo seqüencial
A espectrometria de massas quadrupolar seqüencial é uma técnica auto-confirmatória que
pode ser operada de vários modos, refletindo diferentes experimentos (ARDREY, 2003)
O instrumento com analisador quadrupolar é baseado em quatro barras paralelas numa
área quadrangular onde o feixe de íons é focalizado no eixo central destas barras (FIGURA 12),
um potencial elétrico fixo (DC) e um potencial de radiofreqüência (RF) são aplicados nas barras
diagonais e opostas. Para uma dada combinação de RF e DC, íons com uma razão m/z específica
assumem uma trajetória estável e são transmitidos pelo quadrupolo para alcançarem o detector,
enquanto outros íons com razões m/z diferentes colidem com as barras dos quadrupolos em uma
trajetória instável, e são neutralizados. Um quadrupolo pode operar basicamente de duas
maneiras: No modo SIM (“selected ion monitoring”), uma combinação fixa de voltagens DC e
RF (ou um número limitado destas combinações) é aplicada ao quadrupolo, de forma que apenas
um (ou um número reduzido) de íons de razões m/z específicas são transmitidos pelo quadrupolo.
No modo de operação “SCAN”, a voltagem DC é varrida entre uma faixa de valores, o que
permite que íons com valores m/z dentro de uma determinada faixa pré-selecionada sejam
transmitidos seqüencialmente pelo quadrupolo. Um espectro de massas é obtido combinando os
componentes de tensão DC e RF de maneira sincronizada (BRASIL, 2002).
A análise seqüencial utiliza dois ou mais analisadores, os quais podem estar em seqüência
no espaço ou no tempo. O primeiro analisador é utilizado como filtro para o primeiro íon
(“Parent ion”), podendo ser operado no modo “SCAN” ou SIM, enquanto os outros analisadores
monitoram os fragmentos gerados pelo primeiro íon, e também podem ser operados no modo
SCAN ou SIM. Esses fragmentos podem ser gerados por colisão contra um gás inerte, geralmente
argônio ou nitrogênio.
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antimicrobianos em plasma humano
31
A espectrometria de massas seqüencial oferece grandes vantagens em relação à
espectrometria de massas simples, pois a separação das amostras é efetuada em escala de tempo
de milissegundos com uma grande sensibilidade em relação às espectrometria de massas simples
(SKOOG et al, 2002) e permite a utilização de modos de operação muito seletivos, o que se torna
fundamental na análise de matrizes complexas como plasma e amostras ambientais.
Figura 12. Representação esquemática de um quadrupolo com relação RF/DC constante
Na bioanálise é muito comum a utilização do sistema de seqüência no espaço como a
CLAE-EM/EM, que utiliza dois quadrupolos em seqüência no espaço. Esta instrumentação
permite a operação do equipamento em diferentes técnicas.
A FIGURA 13 mostra que no desenvolvimento de métodos bioanalíticos é comum a
utilização dos seguintes modos:
9 “Full scan” em que em que o primeiro (MS1 scan) ou o segundo (MS2 scan)
quadrupolos (Q1 ou Q3 respectivamente) são operados em modo “SCAN”,
varrendo uma faixa específica de razões m/z, enquanto o outro opera apenas com
voltagem RF, transmitindo assim todos os íons para o detector. Neste modo de
operação o gás da célula de colisão (Q2) deve estar desligado;
9 “Parent scan” onde o primeiro quadrupolo (Q1) é é operado no modo “SCAN”
varrendo íons dentro de uma faixa pré-determinada de massas, que são
transmitidos à câmara de colisão (Q2). O segundo quadrupolo (Q3) é operado no
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
32
modo SIM, configurado para uma razão m/z correspondente ao íon filho gerado
do composto de interesse. Desta forma, pode-se determinar para um determinado
íon filho, qual o íon pai que o gerou.
9 “Daugther scan” após a saída do íon selecionado em Q1 (operado no modo
SIM), este entra na célula de colisão (Q2) onde colide com o gás inerte e gera
fragmentos. Todos os fragmentos passarão pelo segundo analisador (Q3, operado
em modo “SCAN”) e para o detector, , o que gera um espectro de massas do íon
pai de interesse selecionado em Q1. Este experimento é geralmente realizado para
determinar-se quais os íons filhos mais abundantes de uma substância.
9 “Constant Neutral loss” os analisadores Q1 e Q3 estão selecionados em “full
scan” e Q2 está com o gás de colisão ligado, é informado a perda de massa entre
o “Parent ion“ e o “Daughter ion” e tem-se a confirmação se o fragmento
(“Daughter ion”) realmente é proveniente do íon precursor (“Parent ion“),
técnica auto-confirmatória;
9 “Multiple Reaction Monitoring, MRM” os analisadores Q1 e Q3 são operados
no modo “SCAN” e Q2 está com o gás de colisão ligado. Porém Q1 e Q3 operam
de forma simultânea, mas com uma diferença fixa de voltagem DC (offset), o que
permite a transmissão de íons ao detector apenas quando estes perdem por colisão
um fragmento de razão m/z correspondente ao offset de voltagem entre Q1 e Q3.
Desta forma, apenas compostos cujo “parent ion” colida com o gás de colisão e
perca um determinado fragmento são detectados. Este modo de detecção é
particularmente útil em estudos de metabolômica e em estudos das modificações
pós translacionais de proteínas.
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antimicrobianos em plasma humano
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SCAN
SIM
Parent SCAN
MS 1, Q 1 Q 2 MS 2, Q 3
SCAN
FULL SCAN
MS 1, Q 1
Q 2
MS 2, Q 3
SCAN
SIM
SCAN
Daugther SCAN
MS 1, Q 1 Q 2 MS 2, Q 3
SCAN
SCAN
Constant Neutral
MS 1, Q Q MS 2, Q
SIM
SIM
MRM
MS 1, Q Q MS 2, Q
Figura 13. Modos de operação do quadrupolo seqüencial em desenvolvimento de métodos
bioanalíticos
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
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2.5.1.3. Sistema de detecção
Os íons selecionados pelos analisadores chegam até o detector onde serão transformados
em um sinal mensurável. Os detectores podem ser divididos em três grandes grupos. O primeiro
grupo agrupa detectores do tipo placas fotosensíveis e as gaiolas de Faraday e relacionam o sinal
diretamente à quantidade de íon que passa pelo quadrupolo.
O segundo agrupa os detectores multiplicadores de elétrons, os foto-multiplicadores e as
placas microcanais que amplificam a quantidade de sinal recebida.
2.5.1.3.1. Multiplicadores de elétrons
Detecta os íons que conseguiram passar todo o trajeto, ou seja, se adequaram à relação
entre as voltagens de RF e DC. Este detector multiplica a corrente elétrica , acelerando os
elétrons na superfície de um eletrodo: através da colisão dos íons na superfície de um eletrodo
são criados elétrons primários, estes são atraídos pela superfície do segundo eletrodo, onde se
chocam, produzindo elétrons secundários, sendo estes em maiores números. Este processo é
repetido uma outra vez, transmitindo o sinal em números através da contagem de elétrons por
segundo que é diretamente proporcional à quantidade de íons que chegam ao detector.
Estes detectores encontram-se sob a forma de buzina como mostrado na FIGURA 14. Este
formato facilita a multipliccação dos elétrons através da aplicação das voltagens alternadas para
atração, multiplicação e transmissão dos elétrons.
Figura 14. Esquema de um detector multiplicador de elétrons
03
Objetivos
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
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3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Desenvolver e validar novas metodologias analíticas por cromatografia líquida de alta
eficiência acoplada à detector de ultravioleta (CLAE-UV) e espectrômetro de massas (CL-
EM/EM) adequadas para extração e quantificação de fármacos antimicrobianos da classe das
fluoroquinolonas (norfloxacino) e das sulfonamidas (sulfametoxazol + trimetoprima), a partir de
amostras plasmáticas provenientes da etapa clínica de estudos de bioequivalência realizados no
Centro de Bioequivalência do Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cósmetico da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE / NUDFAC - CBIO).
3.2 Objetivos Específicos
Elaboração e submissão ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Centro de Ciências da
Saúde (CCS) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) de protocolos de estudos de
Biodisponibilidade relativa/Bioequivalência;
Planejamento, desenho dos estudos e tamanho da amostra (número de voluntários);
Comparação da eficiência de diferentes métodos de extração tais como: extração líquido-
líquido, extração em fase sólida “off line”.
Desenvolvimento e validação da extração e quantificação das amostras biológicas, utilizando
o método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção através de absorção no
ultravioleta (CLAE-UV) e acoplada a Espectroscopia de massas (CL-EM/EM);
Comparação dos métodos por CLAE-UV e CL-EM/EM aplicados nos estudos de
biodisponibilidade comparada.
Avaliação da estabilidade dos fármacos em plasma humano;
Obtenção e análise das amostras biológicas dos voluntários;
Determinação dos parâmetros farmacocinéticos;
Tratamento estatístico dos dados das concentrações encontradas nos pontos de coleta
definidos no protocolo de estudo.
A
rtigo 0
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4. Artigo 3 1
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Simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in human
plasma for high throughput analysis: Comparison of
SPE-LC-UV and SPE-LC-MS/MS
BEDOR, D.C.G
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.; GONÇALVES, T.M
1
; FERREIRA, M.L.L.
1
; SOUSA, C. E. M. de
1
;
MENEZES,A.L.
1
;OLIVEIRA, E.J.
2
, SANTANA, D. P. de
1
.
1
Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético, Rua Professor Arthur de Sá s/n, Cidade
Universitária, CEP 50740-520, Recife, Pernambuco, Brasil, e-mail: [email protected]13
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Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba (LTF-UFPB)
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Simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in human
plasma for high throughput analysis: Comparison of SPE-LC-UV and SPE-
LC-MS/MS
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Abstract. The comparison of two methods based on SPE with SPE-LC-UV and SPE-LC-MS/MS
for the simultaneous quantification of sulphamethoxazole (SMZ) + trimetoprim (TMP) is
presented. The methods were validated and proved to be accurate (RSD<10% for both SMZ and
TMP), precise and selective. The LLOQ for the SPE-LC-MS/MS method was approximately six
times lower for both TMP and SMZ than that of the SPE-LC-UV (125 x 750 pg on column for
trimetoprim and 1250 x 7500 pg for sulphamethoxazole). The total run time for the SPE-LC-
MS/MS was 2.5 minutes per sample as opposed to 18.0 minutes for the SPE-LC-UV method. The
method with MS detection revealed to be more rugged than the method with UV detection. The
methods were successfully applied to comparative pharmacokinetics studies.
Keywords: Sulfamethoxazole, Trimetoprim, High-throughput, SPE-LC-MS/MS, SPE-LC-UV.
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4.1. Introduction: 1
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Sulfonamides are highly effective chemotherapeutic drugs [1], which are often prescribed for the
treatment of many human and animal infections [2]. The use of sulfonamides has increased over
time especially in combination with trimethoprim. Common sulfonamides in clinical practice
include, sulfadiazine, sulfadimidine, sulfamethoxazole and sulfanilamide, administered either
alone or in association with and trimethoprim [3]. Sulfamethoxazole (5-methyl-3-
sulfanilamidoisoxazole), SMX [4], Figure 1. is a sulfonamide antibiotic of broad spectrum that
competitively inhibits the bacterial enzyme dihydropteroate synthetase [5] and Trimethoprim
(2,4-diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-pyrimidine), TMP [4] figure 1.is a dihydrofolate-
reductase inhibitor [5].Both drugs block the folic acid metabolism and produce a synergistic
antibacterial activity. Several studies describe the analysis of sulfonamides by HPLC-UV [5-11],
LC-MS [11-16] and LC-MS/MS [11,16,17] for pharmacokinetic studies and determination in
pharmaceuticals products, food products or veterinary samples. Quantification of low
concentrations of sulfonamides in complex matrices is common in many fields, including
analysis of trace levels in foodstuffs, biological and environmental monitoring and
pharmacokinetic studies. When sample throughput is an important consideration, such as in
pharmacokinetic applications, the development of rugged methods with short analysis times
becomes an important consideration [18,19]. The aim of this study was to compare the
performance of SPE-LC-UV and SPE-LC-MS/MS methods validated for the analysis of human
plasma samples with respect to their selectivity, sensitivity and capacity for high-troupught
analysis of samples in complex matrices.
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A
B
C
D
Figure 1.The structural formule of Sulfamethoxazole (A), Trimethoprim (B), Benznidazole (C)
and Ciprofloxacin (D).
4.2. Experimental
4.2.1. Chemical and reagents
Sulfamethoxazole and Trimethoprim reference standard were acquired from the Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS, Rio de Janeiro, Brazil). Benznidazole
(BNZ), used as internal standard (I.S.) in the SPE-LC-MS/MS was obtained from Laboratório
Farmacêutico do Estado de Pernambuco and ciprofloxacin (CPX), used as I.S. for the SPE-LC-
UV method was purchased from the United States Pharmacopea (Rockville, MD, EUA).
Chromatography grade methanol and acetonitrile was purchased from J.T. Baker
(Phillipsburg,
NJ, EUA); phosphoric acid was analytical grade and the water was purified using a MilliQ
®
system from Millipore (Molsheim, France).
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4.2.2 LC-UV and LC-MS/MS instruments 1
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HPLC was done using a chromatograph composed of two pumps (LC 10ADvp), a column oven
(CTO 10Avp), a DAD detector (SPDM 10AVvp) a UV/VIS detector (SPD 10AVvp) configured
to acquire data at 280 nm, an autosampler (SIL 10ADvp), a system controller (SCL 10Avp) and
the software Class-vp 6.2 all from Shimadzu (Kyoto, Japão).The LC-MS/MS was done using a
chromatograph composed of one pump of low quaternary gradient (LC 10ADvp), an autosampler
(SIL 10ADvp), a degasser (DGU-14A), a system controller (SCL 10Avp) all from Shimadzu
(Kyoto, Japão), a Quattro-LC triple quadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray
ionization source for mass detection and the software Masslynx v3.5 (Micomass, Manchester,
UK). For sample extraction a Jouan M23i refrigerated centrifuge (St. Herblaim, França) was
used. Samples were stored at -70 ºC in a REVCO freezer (Ascheville, NC, EUA) freezer until
analysis.
4.2.3 Chromatography conditions
For the LC-UV method, chromatographic separation was achieved using a Purospher® star C18
column (Merck, Darmstadt, Germany) with 125 x 4,0 mm and 5 µm particle size coupled to a
C18 4,0 x 3,0 mm security guard column from (Phenomenex, Torrance, CA, EUA). The mobile
phase consisted of 20 mM sodium hydrogen phosphate buffer (adjusted to pH 3.0 with
phosphoric acid) and acetonitrile (89:11, v/v) which was filtered, degassed and pumped at a flow
rate of 2.0 mL/min. The column oven was set at 40 ºC and the injected volume was 15 µL with
an analysis time of 18.0 minutes. For the LC-MS/MS method, chromatographic separation was
performed on a Gemini C
18
column (150mm x 4.6mm i.d., 5µm particle size) coupled to a C18
4,0 x 3,0 mm security guard column both from Phenomenex. Isocratic elution of the analytes
from the column was achieved with a mobile phase consisting of acetonitrile-water (50:50 v/v) at
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a flow rate of 2.5 mL/min. The column was maintained at room temperature. Before use, the
mobile phase was filtered through a 0.45µm nylon membrane. The injection volume was 5µL and
the analysis time was 2.5 min per sample.
4.2.4 Mass spectrometer conditions
The HPLC eluent was split 1:10 to 250µL/min. into the mass spectrometer. The electrospray
ionization mass spectrometer was operated in the positive ion mode (ESI+) and set-up in multiple
reaction-monitoring (MRM) mode. Nitrogen served as desolvation gas at 383 L/h. The dwell time
was 0.8s for each compound, the inter-channel delay and the inter-scan delay were 0.1s. The ion
transitions selected for MRM detection were: m/z 253.96→108.07, 291.02→230.02 and
261.41→91.43 for SMZ, TMP and IS, respectively.
4.2.5. Solid phase extraction of samples
Oasis® HLB SPE cartridges from Waters 1cc, 30mg (Massachusetts, Ireland) were
previously conditioned with 1.0mL of methanol followed by 1.0ml of water. For SPE, the
conditioning, sample application, washing and elution steps were performed with the aid of a
centrifuge operated at 3.400rpm during 2min at approximately 23ºC. Human plasma samples
containing SMZ and TMP (250µL) were transferred to a 2.0mL polypropylene tubes and 50µL of
I.S. solution (BNZ, 500µg/mL) was added, followed by vortex mixing for the LC-MS/MS
method. Phosphoric acid 0.25% (200µL) was added and the resulting mixture was passed through
the cartridge. The cartridges were washed with 1.0mL of water and the antibiotics and I.S. were
eluted with 500µL of acetonitrile:water (50:50 v/v). The eluted solution was homogenized and
5µL was directly injected into the LC-MS/MS system. For the LC-UV method, samples were
extracted using a similar procedure excepted for the I.S. used (50µL of a CPX solution at
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80µg/mL) and the elution step which was than with 500µL of acetonitrile. The acetonitrile was
transferred to 2 mL glass vials and the solvent was evaporated to dryness at 40 ºC under a stream
of nitrogen. The residue was redissolved in 250µL of mobile phase. The injection volume was
15µL.
4.2.6. Preparation of standard and quality control samples
A stock solution of both sulfamethoxazole and trimethropim were prepared by dissolving
accurately weighed SMZ and TMP in acetonitrile:water (50:50 v/v) to yield a final concentration
of 1.0 mg/mL. Working solutions of SMZ and TMP were obtained by step-wise dilution of the
stock solution. Internal standard stock solutions (1.0mg/mL) were prepared in water, with further
dilution to 500µg/mL (BNZ) for a working solution for the LC-MS/MS method and with further
dilution to 80µg/mL (CPX) for a working solution for the LC-UV method. All these solutions
were stored at 4ºC and were brought to room temperature before use. Plasma standards were
prepared by spiking each working standard in blank human plasma. The concentration range for
human plasma calibration curve was 0.5 – 60.0 µg/mL and 0.05 – 5.0 µg/mL for SMZ and TMP,
respectively. Quality control (QC) samples at three different concentrations (1.5, 25.0 and 50.0
µg/mL for SMZ and 0.15, 1.5 and 4.0µg/mL for TMP) were also prepared with blank human
plasma, but spiked with independently prepared stock standard solution.
4.2.7. Study design
The bioequivalence studies were conducted using an experimental design of two way crossover,
open-label, balanced, two period, two sequence, randomized study in 26 healthy volunteers from
18 to 45 years. All volunteers were required to sign an informed consent form, and the clinical
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protocol had the approval of the Ethics Committee from the Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE).
4.3. Results and discussion
4.3.1. Method development
4.3.1.1. LC-UV optimization
HPLC linked with photodiode array ultraviolet detector (DAD) has proven to be an important
tool in the identification of compounds [20]. In our case the DAD was used for the selection of
the best wavelength (230nm) to maximize the signal of compounds and minimize the signal of
plasma interferents. The chromatography conditions, especially the composition of mobile phase
were optimized through several trials to achieve good resolution and symmetric peak shapes for
the analytes and I.S. The composition of the mobile phase was optimized by varying, the
percentage and pH of the sodium hydrogen phosphate buffer and percentages and type of organic
component (Methanol and Acetonitrile). Finally 20mM sodium monobasic phosphate pH 3.0:
acetonitrile (89:11, v/v) was choice due to the better separation, higher sensitivity and selectivity
for the UV signal of analytes.
4.3.1.1.2. LC-MS/MS
4.3.1.1.2.1. LC optimization
The optimization of the mobile phase for mass spectrometry detection was done by varying the
percentage of organic solvent (methanol or acetonitrile) and modifier used to improve
electrospray ionization in positive mode – formic acid. Although ionization efficiency was higher
in the presence of 0.1% aqueous of formic acid, this modifier favoured the formation of sodium
adduct of sulfamethoxazole precursor ion. For this reason, acetonitrile-water (50:50 v/v) was
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adopted as mobile phase since it represented the best compromise between separation efficiency
and stability of the MS signal.
4.3.1.1.2.2. MS/MS optimization
The full scan positive electrospray mass spectra of SMZ and TMP and their product ion mass
spectra are shown in figs 2 and 3, respectively. SMZ, TMP and I.S. gave protonated parent ions
[M + H]
+
at m/z 253.96, 291.02 and 261.41, and the most abundant if each fragment ions were
observed at m/z 108.07, 230.02 and 91.30., respectively. The source temperature was optimized
to 100 ◦C, desolvation temperature was 350 ◦C, and desolvation gas flow was 383Lh−1. The
capillary voltage was set at 3.0 kV, while optimized cone voltage values for SMZ, TMP and I.S.
were 20V in all cases. The collision energy was optimized for SMZ, TMP (25V in both cases)
and 20V for IS. The multiplier was set at 700V and argon was used as the collision gas at a
pressure of 1.88 e
-3
psi in the collision cell.
4.4. Method Validation
4.4.1. Selectivity
The described method used solid phase extraction, reversed-phase HPLC for separation of
sulfamethoxazole, trimethoprim and internal standard (BNZ and CPX for MS and UV detection,
respectively) and was shown to be selective for the analyties and their internal standard (Figure
4). No interfering peaks were observed with the same retention time of analyte and I.S. when
both UV or mass spectrometry detection was used for the analysis of plasma samples from
different volunteers, including lipemic and hemolysed ones. When Ciprofloxacin was used as
internal standard of SMZ and TMP with mass spectrometry detection, poor peak shape and
symmetry was observed for CPX using the chromatographic conditions optimized for the
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detection of SMZ and TMP. Since mass spectrometry detection is not compatible with the use of
inorganic buffer salts such as phosphates (used successfully for the separation of CPX in the LC-
UV method), benznidazole was used as I.S. in the LC-MS/MS method.
A
Sulfamethoxazole, mol wt: 253.96
NH
2
S
O
O
NH
O
N
CH
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Trimethoprim, mol wt: 291.02
B
Figure 2. The full scan mass spectra of sulfamethoxazole (A) and trimethoprim (B).
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Figure 3. The product ion mass spectra of sulfamethoxazole (A) and trimethoprim (B).
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Seletividade_ Branco Plasma 01-Sep-200601:29:03
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
Time
0
Figure 4. Representative chromatograms of extracted blank plasma sample (A and C) and
extracted plasma samples previously spiked with analyties (B and D) at the LLOQ (0.5 µg/mL
for SMZ and 0.05µg/mL for TMP). Top traces are for mass spectrometry detection and bottom
ones for UV detection.
4.4.2. Ion suppression
In the case of SMZ, TMP and their internal standard (benznidazole), there was no significant ion
suppression in the region where the analyte and internal standard were eluted. No significant
matrix effect was observed.
4.4.3. Linearity
The calibration curve of SMZ was linear over the range from 0.5 to 60 µg/ml (0.5, 1.0, 3.0, 10.0,
15.0, 30.0, 40.0 and 60.0 µg/ml) for both the LC-UV method (r
2
= 0.995772 ± 0.002781, n=13)
100
%
0
100
%
0
100
%
31_08_06_NUD_10_06_Validação_68 MRM of 3 Channels ES+
291.02 > 230.02
3.13e3
1.00
0.46
31_08_06_NUD_10_06_Validação_68 MRM of 3 Channels ES+
261.41 > 91.3
3.16e3
0.42
31_08_06_NUD_10_06_Validação_68 MRM of 3 Channels ES+
253.96 > 108.01
3.16e3
1.05
A B
0.14
CV Sulfa 0.5 u
g
/mL e Tri 0.05 u
g
/mL 27-Sep-200617:47:04
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
Time
0
%
100
0
100
%
0
100
%
27_09_06_NUD_10_06_Reanálise_e_Diluição_03 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels ES+
291.02 > 230.02
1.27e3
Area
0.91;228
27_09_06_NUD_10_06_Reanálise_e_Diluição_03 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels ES+
261.41 > 91.3
7.87e3
Area
1.36;2883
27_09_06_NUD_10_06_Reanálise_e_Diluição_03 Sm (Mn, 2x3) MRM of 3 Channels ES+
253.96 > 108.01
1.29e3
Area
1.64;222
Minu tes
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Volts
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
Volts
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.006 0.006
(Trimetoprima)
5.140
(Ciprofloxacina)
(Sulfame toxazo l)
Detector A (230nm)
20_03_06_Validação_Especificidde_Branco_Normal
20_03_06_Validação_Especificidde_02
Name
Retention Time
Minu tes
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Volts
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
Volts
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
Trimetoprima 3.887 0.047
Ciprofloxacina 6.467 0.000
Sulfametoxazol 10.510 0.508
Detector A (230nm)
20_03_06_Validação_Linearidade_0.5_e_0.05ugmL
20_03_06_Validação_Linearidade_15
Name
Retention Time
ISTD concentration
C D
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antimicrobianos em plasma humano
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and the LC-MS/MS method r
2
= 0.992988 ± 0.005353, n=13). For the quantification of
sulfamethoxazole, a linear least-squares regression with a weighting factor of 1/x was used for
both methods, while the quantification of TMP was linear over the range from 0.05 to 5.0 µg/ml
(0.05, 0.10, 0.30 0.60, 1.0, 2.0, 3.0 and 5.0 µg/ml) for the both the LC-UV method (r
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2
= 0.998257
±0.001094, n=13) and the LC-MS/MS method r
2
= 0.993888 ±0.004237, n=13) used a weighting
factor of 1/x and 1/x
2
for the LC-UV and LC-MS/MS method, respectively.
4.4.4. Recovery
The SPE process used in both the methods was identical. The mean recovery of SMZ and TMP in
both the methods was 93,47% and 93,40% respectively. The mean recovery of the internal
standard was of 73.66% and 94.29% for Ciprofloxacin and benznidazole respectively. The
Ciprofloxacin was used in LC-UV method and the benznidazole was used in LC-MS/MS method.
Tables 1 and 2 show the recovery of SMZ and TMP at three concentration levels.
4.4.5. Precision and Accuracy
The results for inter-assay precision and accuracy for the quality control samples at
concentration levels of 1.5, 25.0 and 50.0 µg/ml for SMZ and at a concentration of 0.15, 1.5, 4.0
µg/ml for TMP are summarized in Table 1 and 2. The intra-assay precision varied from 2.06 to
11.75% for sulfamethoxazole and from 4.50 to 13.74 for trimethoprim for the LC-MS/MS
method and from 0.93 to 8.49% for SMZ and from 2.32 to 13.10% for TMP in the LC-UV
method. The intra-assay precision for samples at the LLOQ was 5.64% for sulfamethoxazole and
7.65% for trimethoprim using LC-MS/MS and 6.11% for SMZ and 1.35% for TMP when using
the LC-UV, method.
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antimicrobianos em plasma humano
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1 Table 1. Inter-assay precision and recovery of sulfamethoxazole in human plasma
Accuracy (%) Analyte Conc. Added.
(µg/mL)
Conc. Found (±SD)
(µg/mL)
Precision
RSD (%)
Recovery (%) R.E.* (%)
N
0.5 0.489 (± 0.038) 7.79 n.d. -2.11 18
1.5 1.540 (± 0.117) 7.58 89.28 2.70 18
25.0 25.127 (± 1.755) 6.97 93.84 0.51 18
SPE-HPLC -UV
50.0 51.382 (±2.400) 4.67 97.30 2.76 18
0.5 0.525 (± 0.043) 8.22 n.d. 5.07 18
1.5 1.491 (± 0.094) 6,32 84.93 - 0.59 18
25.0 26.467 (± 2.873) 10.85 91.07 5.87 18
SPE-LC-MS/MS
50.0 52.484 (± 3.770) 7.18 9103 4.97 18
2
3
4
Table 2. Inter-assay precision and recovery of trimethoprim in human plasma
Accuracy (%) Analyte Conc. Added.
(µg/mL)
Conc. Found (±SD)
(µg/mL)
Precision
RSD (%)
Recovery (%) R.E.* (%)
n
0.05 0.048 (± 0.007) 7.92 n.d. - 4.53 18
0.15 0.152 (± 0.012) 5.75 72.38 1.29 18
1.50 1.543 (± 0.089) 4.54 82.07 2.90 18
SPE-HPLC -UV
5.00 4.197 (± 0.191) 14.30 86.43 4.93 18
0.05 0.049 (± 0.005) 10.85 n.d. -2.13 18
0.15 0.147 (± 0.013) 9.17 86.02 -1.91 18
1.50 1.562 (± 0.166) 10.63 97.91 4.11 18
SPE-LC-MS/MS
5.00 3.834 (± 0.270) 7.03 89.22 -4.15 18
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* R.E. = relative error
4.4.6. Stability studies
Table 3 lists data for benchtop, autosampler, freeze/thaw and storage stability. Benchtop stability
was investigated to ensure that sulfamethoxazole and trimethoprim remained stable in plasma
samples at room temperature for a time period to cover sample preparation. Two sets of plasma
samples at concentrations of 0.5 and 50.0 µg/ml to sulfamethoxazole and at concentrations of
0.15 and 4.0 µg/ml to trimethoprim were left at room temperature (23ºC) for 6h. The samples
were then processed and analyzed. The results indicated that SMZ and TMP were stable during
the exposure period. Due to the need for occasional delayed injection or reinjection of extracted
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samples, stability of SMZ and TMP in the final solution was evaluated in the autosampler at
room temperature (23ºC). A group of QC samples at two concentrations of 0.5 and 50.0 µg/ml for
sulfamethoxazole and at concentrations of 0.15 and 4.0 µg/ml for trimethoprim were extracted,
loaded onto the autosampler and kept in the autosampler for 33 h before injection. The
quantitative results indicated (Table 3) that SMZ and TMP were stable in the autosampler for at
least 33 h. Freeze-thaw stability was evaluated for SMZ and TMP using QC samples at two
concentrations. The QCs were submitted to two freeze-thaw cycles, each cycle consisting of
removing the QCs from the freezer, thawing them unassisted to room temperature, keeping
samples at room temperature for 3 h and re-freezing at - 70ºC. The samples were processed along
with a standard curve and concentrations were determined. The results indicated that SMZ and
TMP had an acceptable stability after three freeze-thaw cycles in human plasma. The storage
stability at - 70ºC was also tested using QCs samples. The stability was closely monitored during
validation and sample analysis periods, and no degradation of the compounds was observed. The
10-week stability data is also listed in Table 3. The results indicated that SMZ and TMP did not
show evidence of significant degradation in plasma for at least 10 weeks.
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1 Table 3. Sulfamethoxazole (A) and trimethoprim (B) stability data
(A)
Sulfamethoxazole (n=6)
Stability Nominal conc.
(µg/mL)
Found conc.
Average (± SD) (µg/mL)
CV
(%)
Accuracy
(%)
1.50 1.513 (± 0.005) 0.33 + 0.86 Bench top stability
A
50.0 49.984 (± 0.85) 1.70 - 0.03
1.50 1.501 (± 0.082) 5.46 + 0.06 Autosampler stability
B
50.0 50.351 (± 1.138) 2.26 + 0.70
1.50 1.544 (± 0.014) 0.90 + 2.93 Freeze-thaw stability
C
50.0 47.189 (± 0.609) 1.29 - 5.62
1.50 1.576 (± 0.04) 2.54 + 5.06 10-week storage stability
D
50.0 54.408 (± 3.15) 5.78 + 8.81
2
(B)
Trimethoprim (n=6)
Stability Nominal conc.
(µg/mL)
Found conc.
Average (± SD) (µg/mL)
CV
(%)
Accuracy
(%)
0.15 0.155 (± 0.01) 6.45 + 3.33 Bench top stability
A
4.00 4.271 (± 0.07) 1.63 + 6.77
0.15 0.139 (± 0.006) 4.32 - 7.30 Autosampler stability
B
4.00 4.081(± 0.109) 2.67 + 2.02
0.15 0.146 (± 0.001) 0.68 - 2.66 Freeze-thaw stability
C
4.00 4.155 (± 0.016) 0.38 + 3.87
0.15 0.163 (± 0.01) 6.13 + 8.67 10-week storage stability
D
4.00 3.995 (± 0.22) 5.50 - 0.12
A
Exposed at room temperature (23ºC) for 6 h 3
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B
Kept at 23ºC for 33h
C
After three freeze-thaw cycles
D
Stored at - 70ºC
4.5. Statistical analyses, pharmacokinetics parameters
Figure 4 and 5 shows the averaged plasma concentration-versus-time curves for
sulfamethoxazole and trimethoprim after administration of the reference and test formulations.
The reference formulation was Bactrin
®
(Roche) at dosage of 800 mg SMZ + 160 mg TMP
administered either as an oral suspension (Figure 4) or as hard gelatin capsules (Figure 5). The
test formulations were administered at same dose regimen and consisted also of an oral
suspension (Figure 5) or capsules (Figure 6).
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Curva média de decaimento plasmático
(n=26)
0
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50
0 102030405060
Tempo (horas)
Concentração plasmática (ug/mL)
Referência
Teste
Curva média de decaimento plasmático
(n=26)
0
2
0 1020304050
Tempo (horas)
Concentração plasmática (ug/mL)
Referência
Teste
A
Curva média de decaimento plasmático
(n=26)
0
10
20
30
40
50
0 102030405060
Tempo (horas)
Concentração plasmática (ug/mL)
Re aferênci
Teste
C
2
urva média de decaimento plasmático
(n=26)
0
0 1020304050
Tempo (horas)
Concentração plasmática (ug/mL)
Referência
Teste
Figure 5. The averaged plasma concentration-versus-time curves for sulfamethoxazole (A) and
Trimethoprim (B) after administration of the reference and test formulations (suspensions) SPE-
LC-MS/MS.
Time (h)
B
B
A
Figure 6. The averaged plasma concentration-versus-time curves for sulfamethoxazole (A) and
Trimethoprim (B) after administration of the reference and test formulations (Capsules) HPLC-
UV.
4.6. Discussion
In many bioanalytical applications, sample preparation and total analysis time can significantly
reduce the throughput of an analytical procedure [14,21,22]. In this study the comparison of the
SPE-LC-UV with SPE-LC-MS/MS method showed that although both methods demonstrated
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good precision, accuracy and linearity. The SPE-LC-MS/MS method had an analysis time of only
2.5 minutes, reducing the total analysis time by a factor of 7. Apart from the gain in productivity,
shorter analysis time also reflect less solvent residues. The SPE-LC-MS/MS also revealed more
rugged during its application to a bioequivalence study involving the analysis of more than 1800
samples, with no loss in sensitivity, efficiency or selectivity (Table 4). When compared to the
LC-UV method the mass spectrometric method required less intervention for column clean-up,
revealing that the higher organic solvent content in the mobile phase was important in removing
matrix components that could otherwise build up in the column, having a detrimental effect on
the separation efficiency.
Table 4. The advantages of LC-MS/MS method
LC-UV LC-MS/MS
Total run Time 18 min (1 Volunteer per day) 2.5 min (4 volunteers per day)
System clean-up Once after each volunteer
(56 samples)
Once every 6 volunteers
(300 samples)
Extraction
procedure
8 steps 5 steps (direct injection of eluate)
LLOQ (on column) 750 pg (TRI)
7500 pg (SULFA)
125 pg (TRI)
1250 pg (SULFA)
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The solid phase extraction method developed for SMZ and TMP produced good and reproducible
recovery of the analyties and internal standards, but the LC-UV method required solvent removal
under a stream of nitrogen before redissolving the residue in mobile phase for injection I to the
chromatograph, while with the LC-MS/MS method the sample was eluted in the mobile phase
and directly injected. This contributed to increase even further the sample throughput of the mass
spectrometric method.
Finally, the LC-MS/MS method was approximately 7 times more sensitive with on column limits
of quantification of 7500 pg on column for SMZ and 750 pg on column for TMP. Thus, the mass
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spectrometric method developed here can be applied to the determination of sulfonamides trace
levels usually found in the analysis of foodstuffs, biological and environmental monitoring.
4.7. Conclusion
We developed two methods for simultaneous quantification of sulfamethoxazole and
trimethoprim in human plasma. The advantage of using SPE is that it gives cleaner and consistent
extracts with minimum matrix effect. A good precision, accuracy and linearity were obtained
over a human plasma concentration range of 0.5 to 60 µg/ml of SMZ and 0.05 to 5.0 µg/ml of
TMP. The SPE-LC-MS/MS revealed more robust front to high throughput of samples for the
lesser time of analysis (2,5 min) for sample, diminishing the residues of solvent of the mobile
phase revealing less toxic to the analysts and the environment. This method was rugged and was
successfully applied to bioequivalence study. The study was able to demonstrate bioequivalence
(comparision of AUC
o-t
, AUC
o-inf.
, C
max
) between the two formulations with a 90% confidence
interval. From the results of all the validation parameters, we conclude that the both method can
be highly useful for the therapeutic drug monitoring both for analysis of routine samples of single
dose or multiple dose pharmacokinetics and also for the clinical trial samples with precision,
accuracy and high throughput.
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References 1
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27
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29
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32
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05
Conclusões
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
57
5. Conclusões
Diante dos resultados expostos nos estudos apresentados nesta dissertação é possível concluir:
A elaboração de protocolo de estudos clínicos com seres humanos deve ser pautada no
respeito às considerações bioéticas, baseada em quatro princípios: Beneficência, Não-
maleficência, Justiça e Autonomia. Para a condução dos estudos de biodisponibilidade
comparada além dos princípios da bioética é necessário levar em consideração as resoluções da
ANVISA.
O delineamento correto do estudo é de fundamental importância para evidenciar se há
diferença no perfil farmacocinético das formulações estudadas. O número de voluntários traduz a
capacidade (poder) do teste estatístico explicar o fenômeno observado.
A extração em fase sólida mostrou-se uma técnica com um maior poder de “clean-up” e de
recuperação além de uma maior precisão que a extração líquido-líquido. O maior “clean-up” das
amostras foi verificado por uma maior durabilidade da coluna cromatográfica. A extração
líquido-líquido gerou um maior volume de resíduo de solventes orgânicos e mostrou-se um
processo mais tedioso.
O métodos por CLAE-UV desenvolvidos para análise de norfloxacino e sulfametoxazol +
trimetoprima em plasma humano apresentaram especificidade, precisão, exatidão, robustez frente
ao elevado throughput e faixa linear adequadas à utilização em ensaios de farmacocinética
comparada.
O método desenvolvido utilizando a técnica de CLAE-EM/EM apresentou uma maior
capacidade de resistir ao elevado throughput de amostras.Um dos fatores foi o baixo tempo de
análise (2.5 minutos por amostra). O auxílio do preparo das amostras de plasma por extração em
fase sólida aliada a alta especificidade da espectrometria de massas triplo quadrupolar (técnica
autoconfirmatória) que eliminou a interferência de picos endógenos.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
58
Os métodos foram utilizados na avaliação da estabilidade dos compostos no fluído biológico
(plasma). Os fármacos mostraram-se com estabilidade adequada à realização de estudos de
bioequivalência.
Os produtos:
9 norfloxacino comprimidos 400mg (Teste) e Floxacin
®
(Referência);
9 sulfametoxazol + trimetoprima cápsulas 400 + 80mg (Teste) e Bactrim
®
(Referência)
9 sulfametoxazol + trimetoprima suspensão 400 + 80mg / 10 mL (Teste) e Bactrim
®
(Referência)
podem ser considerados bioequivalentes segundo os critérios estabelecidos pela ANVISA
(Agencia Nacional de Vigilância Sanitária) e a FDA (Food and Drug Administration).
06
Perspectivas
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
59
6. Perspectivas
O presente trabalho apresenta uma evolução no emprego de técnicas analíticas para a
quantificação de fármacos em matrizes biológicas assim como dos processos de preparo de
amostras utilizados.
A automatização dos processos de preparo de amostras através da técnica de extração em
fase “on-line” hifenada com a cromatografia líquida e com a espectrometria de massas é uma
evolução na diminuição de etapas com intervenção humana. Gera uma maior confiabilidade na
reprodutibilidade dos resultados, assim como a diminuição do uso de solventes tóxicos ao ser
humano e ao meio ambiente. A redução do tempo de análise também corrobora para uma menor
geração de resíduos advindos da fase móvel.
Temos como perspectiva a utilização de extratores de fase sólidos automatizados
acoplados à CL-EM/EM e à CL-UV para a simplificação das análises de amostras em matrizes
biológicas.
07
Referências
Biblio
g
rá
f
icas
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
60
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A
nexo
A
(TCLE)
8. Anexo A (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO.
Estudo de Bioequivalênciade de comprimidos de ________________, em voluntários sadios.
Você está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Sua participação é importante,
porém, você não deve participar contra a sua vontade. Leia atentamente as informações abaixo e
faça qualquer pergunta que desejar, para que todos os procedimentos desta pesquisa sejam
esclarecidos.
O abaixo – assinado, nome, idade, declara que é de livre espontânea vontade que está
participando como voluntário do projeto de pesquisa supracitado, de responsabilidade dos
médicos/pesquisadores responsáveis: Profº Dr. Davi Santana (Farmacêutico) e Dr. Gustavo
Correia Lima (Médico).
O abaixo-assinado está ciente que:
i- O objetivo da pesquisa é verificar se comprimidos de ___________, da Indústria
__________ atingem níveis plasmáticos equivalentes aos obtidos a partir de
comprimidos de ___________ ® da ___________.
ii- Durante o estudo, será internado duas vezes por até _____ horas a cada período, com
o intervalo de no mínimo 7 meia-vidas. Nas duas fases do estudo será administrado
_____________ na forma de ___________ e serão coletadas ______ amostras por
fase, de sangue de 8mL cada, através de cateter.
iii- A participação neste estudo não tem objetivo de submetê-lo a um tratamento
terapêutico, portanto não existe benefício terapêutico, todavia os riscos são bastante
limitados, por se tratar de uma única dose, sendo esta empregada usualmente na
clínica.
iv- A administração oral de __________ de maneira continuada pode causar efeitos
colaterais de pouca intensidade como diarréia, cefaléia, tontura, fadiga, dor muscular e
prisão de ventre. Efeitos colaterais menos comuns incluem aqueles que acometem o
SNC (confusão, delírio, alucinações, fala arrastada e cefaléias), os quais ocorrem
principalmente com a administração IV desses fármacos, podem ocorrer ginecomastia
em homens e galactorréia em mulheres. Esses efeitos são observados, sobretudo após
uso prolongado de cimetidina em altas doses. Entretanto o aparecimento de efeitos
indesejáveis após administração de dose única de __________ tem menor
probabilidade de ocorrer. Além dos efeitos citados, a administração de qualquer
medicamento pode causar reações imprevisíveis.
v- Será submetido, antes da e após a internação, aos seguintes exames laboratoriais: de
sangue (hemograma, transaminases, fosfatase alcalina, bilirrubina total, proteínas,
colesterol, glicose, triglicérides, uréia, creatinina e ácido úrico), de urina (sumário de
urina) e de coração (eletrocardiograma). Sorologias para HIV, hepatites B e C serão
realizados apenas antes da primeira internação.
vi- Obteve todas as informações necessárias para poder decidir conscientemente sobre a
participação no referido ensaio clínico.
vii- Tem a liberdade de desistir ou interromper a participação neste estudo no momento
que desejar, sem necessidade de qualquer explicação e sem que isto venha interferir
no seu atendimento médico desta instituição.
viii- Os resultados obtidos durante este ensaio serão mantidos em sigilo, e o Centro de
Bioequivalência não identificará o voluntário por ocasião da exposição e/ou
publicação dos mesmos.
ix- Durante o período de 180 dias a partir da data da assinatura deste termo, o voluntário
estará assegurado (Seguro de Vida em Grupo).
x- Caso surja alguma intercorrência, deverá procurar o serviço de ambulatório médico do
Hospital Infantil da Fundação Manoel Almeida e solicitar que o mesmo contate os
responsáveis pelo ensaio clínico, nos telefones abaixo.
xi- A Unidade Clínica o manterá informado e prestará qualquer tipo de esclarecimento
em relação ao progresso da pesquisa, conforme solicitação do voluntário.
xii- Poderá contatar a Secretaria da Comissão de Ética para apresentar recursos ou
reclamações em relação ao ensaio clínico. (Av. Prof. Moraes Rego S/n, Faculdade de
Medicina- CCS, 3º andar- Universidade Federal de Pernambuco- Cidade Universitária
-Recife-PE, Fone: .081-2122-8588)
xiii- De acordo com os valores previamente estabelecidos (R$ ______ por internação), os
voluntários serão ressarcidos das despesas e tempo despendidos na realização do
supracitado estudo clínico.
xiv- É condição indispensável, para participação no ensaio clínico, que esteja em boa
saúde e, portanto, não esteja no momento sob tratamento médico ou fazendo uso de
quaisquer drogas ou medicações.
xv- Os benefícios desse estudo para os voluntários serão conferidos pelo check-up gratuito
antes e depois do internamento e a contribuição que os mesmos estarão dando para
consolidação da política de medicamentos genéricos no nosso País. Qualquer
problema que eventualmente apareça durante o estudo e que tenha ligação direta com
o mesmo, o voluntário será encaminhado aos serviços hospitalares pertinentes.
Recife,
_________________________________
Assinatura do voluntário
_______________________________ ______________________________
Assinatura Testemunha 1 Assinatura Testemunha 2
Caso surja alguma intercorrência, deverá procurar o serviço de ambulatório médico do Hospital infantil da
Fundação Manoel Almeida e solicitar que o mesmo contate os responsáveis pelo ensaio clínico, nos telefones abaixo.
(os telefonemas podem ser efetuados a cobrar)
Prof. Dr. Davi Santana (Farmacêutico) Dr. Gustavo Correia Lima (Médico)
Fone/Fax: 0XX81 3302-6593/99755975 Fone/Fax:0xx81 3441.5455
Obs.: O voluntário deve rubricar todas as páginas.
A
nexo B
(Artigo 1)
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antimicrobianos em plasma humano
8. Anexo B (Artigo 1)
Norfloxacin bioequivalence studies analyzed in face of the Brazilian Generic Drugs Policy
Catia Panizzon Dal Curtivo
a*
, Carmen Maria Donaduzzi
a
, Danilo César Galindo Bedor
b
, Talita
Mota Gonçalves
b
, Eduardo Borges de Melo
c*
and Davi Pereira de Santana
b
a
Laboratório Farmacêutico Prati & Donaduzzi Cia Ltda, Toledo, Estado do Paraná, Brasil
b
Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Brasil
c
Curso de Farmácia, Universidade Estadual do Oeste do Paraná(UNIOESTE), Brasil*
Short title: Norfloxacin bioequivalence and Brazilian Generic Drugs Policy
*Adress: 2069 Universitária St, Pharmacy School, 85819-110, Cascavel, PR, Brazil,
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
ABSTRACT: Quality and low cost drugs are available to the brazilian population since 1999
when the Brazilian Generic Drugs Policy was established. This report deals with the general
criteria required by the brazilian legislation for a drug to be labeled as a generic. As an example
the pharmaceutical bioequivalence of a reference product (Floxacin, Merck Sharp & Dhome) and
a test formulation (Norfloxacin Generic, Prati & Donaduzzi) is illustrated. The pharmacokinetic
profiles were evaluated after oral administration to 26 healthy volunteers. The study was made
through an open, crossover and one dosage randomized assay. Samples were analyzed by High
Performance Liquid Chromatography (HPLC-UV). Pharmacokinetic parameters evaluated were
AUC
o-inf
, AUC
o-t
, C
max,
T
max
, T
1/2
, besides others like distribution volume, half-life for drug
elimination and depuration. Three parameters, (AUC
0-inf
, AUC
o-t
, and C
max
) were statistically
compared to determine the bioequivalence between the two drugs. Analysis of Variance
(ANOVA) showed no significant differences between the two formulations and the 90%
confidence limit (80%-125%) is accepted for bioequivalence. Based on statistical analysis the test
formulation is considered bioequivalent to the originator and able to be classified as generic.
Key words: bioequivalence; Brazilian Drugs Policy; generic pharmaceutical products;
norfloxacin.
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Introduction
The Brazilian Generic Drugs Policy inserted in the National Drugs Policy is the main instrument
that directs the actions of the Brazilian Ministry of Health in the field of pharmaceutical products.
Up to 1999, Brazil had only brand name and similar drugs but not generic. After February 10
th
1999, Law n
0
9787, known as The Generics Law, established the drugs legal basis and attributed
powers to ANVISA (National Agency for Sanitary Vigilance) to implement the rules and
conditions for drugs registration and guarantees of product quality.
The establishment of a generic policy involved several feeding lines and articulated
actions for its complete effectiveness. To regulate actions considered fundamental to the process
development, resolutions were implemented to insure quality, dispensation and
commercialization of generic drugs, besides the amplification of centers and reference systems
for conducting the bioequivalence tests.
Generic Drugs Policy improved control of drugs prices practiced by the Brazilian´s
Pharmaceutical Industries, allowed effective market competition, as well as the selection of
reference products and priorities for generics production. In addition, quality, safety and efficacy
requisites were revised including the monitoring of Good Manufacturing Practices (GMP) in the
pharmaceutical industry and the regular control of drugs quality [3].
Several advantages were introduced by generic drugs; (i) cost reductions in health
treatments; (ii) greater consumer awareness of existing alternative choices [4]; (iii) regulation of
clinical studies, and of rules/procedures for generic registration; and (iv) regulation of
prescription and dispensation of generics by pharmaceutical care services [3]. As a result the
generics share in the healthcare market increased substantially and consolidated the growth and
strength of national companies, as confirmed by the wide acceptance of generic drugs by the
population and healthcare professionals [2]. Currently, generics in medical prescriptions are up to
13.15% [1].
The sale market for generics pharmaceutical products has been steadily growing through
the years. During 2001 it showed a 12% monthly growth and its market share increased from
1.73% to 4.37%. In April 2003, sales reached 7.3% in a non-expanding general pharmaceutical
market and in parallel to a loss of market sales of reference drugs even after a significant
reduction in their prices [5]. Sale surveys show a growth of 218% since the year 2000, and today
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
generics are 27.68% of the Brazilian market. In relation to all pharmaceutical products its market
share is 9.68%. The 27% growth in the last five years corresponds to savings of around 47%[6].
Generic drugs are equivalent pharmaceutical products demonstrating the same efficacy,
safety and quality as the reference or originator product. They contain the same active principle
in the same pharmaceutical forms as the originator and are produced after patent expiry or
renounce of other exclusivity rights. They should be designated by a Common Brazilian
Denomination (DCB) or in its absence by an International Non-proprietary Name (INN) [7].
A drug is considered to be a generic product when its interchangeability with the
reference product is demonstrated by pharmaceutical equivalence or bioequivalence studies [8].
Pharmaceutical equivalence determines that both drugs, generic and reference, have the
same drug (same base, salt or ester of therapeutically active moiety) in the same dosage and
pharmaceutical form, which may be demonstrated in in vitro tests according to pharmacopoeia
especifications or other quality standards. Specifically, the tests relate to identity, dosage, purity,
potency, uniformity of contents, disintegration times and dissolution velocity (if necessary) [9].
In bioequivalence studies it is possible to demonstrate not only that two formulations (test
and reference) having the same active principle are therapeutically interchangeable when
administered in the same dosage and by the same way, but also determine pharmacokinetic
standards related to bioavailability. This, in turn, defines the rate and extent at which the active
substance is absorbed by the body and if it reached the site of action in a concentration
therapeutically efficient [11].
The drug is bioavailable when it is transferred unaltered from the pharmaceutical form to
the systemic circulation, able to interact with the corresponding receptors and unleash the
pharmacological effect [11]. Two drugs are, thus, bioequivalent when they do not show
statistically significant differences in absorption velocity and quantities absorved, both measured
in assays obeying the same standards [2].
Bioavailability is evaluated by data on blood concentration and based on three
pharmacokinetic parameters: (i) peak plasma concentration (C
max
), which represents the maximal
blood concentration after oral administration of the drug and is directly related to the drug
absorved fraction; (ii) time of peak blood concentration (T
max
), a parameter related to absorption
velocity and determinant of peak concentration after oral administration; and (iii) area under the
concentration-time curve (AUC), considered to be the main parameter in bioavailability
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
determinations. It represents the fraction entering the circulation, independently of absorption
velocity [12]. These data and the results of the analysis of variance (ANOVA) should be
available when registering a drug as a generic [18].
It should be mentioned that Brazilian legislation allows registration of generic drug
without bioequivalence studies in very special cases. In these, pharmaceutical equivalence is
sufficient as long as the absorption process does not interfere with therapeutic activity [10]. The
drugs in this category contain highly soluble and permeable drugs, absolute bioavailability
superior to 90% and pharmaceutical forms allowing dissolution rates of 85% in 15 minutes. In
general they consist of aqueous parenteral formulations, oral solutions (without excipients
affecting absorption), aqueous ophthalmic preparations, non-systemic topical and otological
products, inhalation products and nasal sprays and drugs of oral use containing non-absorbable
drugs [2,5].
The present report deals with the bioequivalence studies of two tablet formulations of
norfloxacin, the reference being Floxacin®, of the Merck Sharp & Dhome, and the test
Norfloxacin Generic, producted by Prati & Donaduzzi Pharmaceutical Industry. They were
evaluated by comparing blood plasma pharmacokinetic parameters according to ANVISA
determinations [13].
Norfloxacin is a broad spectrum antimicrobial agent chemically characterized as a
fluoroquinolone , specifically 1-ethyl-6-fluoro-1,4dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-3-quinoline
carboxylic acid, C
16
H
18
FN
3
O
3
. It is a compound active against gram-positive and negative
bacteria, by inhibiting bacterial DNA synthesis and it is bactericidal. It is usually utilized in the
treatment of urinary tract affections [14,15].
Objectives
The study aims to (i) determine the pharmaceutical bioequivalence of 400mg tablets of the test
drug Norfloxacino, (Prati & Donaduzzi) to 400mg tablets of the reference, Floxacin (Merck,
Sharp and Dhome) , according to the National Drugs Policy; and (ii) set a parallel between study
development and results found and verity if these fit into the Brazilian legislation on generic
drugs.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
Materials and methods
Test drug: Norfloxacin Generic - 400 mg tablets
Producer: Prati & Donaduzzi
Lot: PilotoA
Manufacture date: 09/2004
Validity date: 09/2006
Reference drug: Floxacin® - 400mg tablets
Producer: Merck Sharp and Dhome
Lot: FH031
Manufacture date: 08/2004
Validity date: 02/2007
Legislation
The list of directives shown in Table 1 are published by ANVISA and available on-line aims at
regulating bioequivalence studies in Brazil and detailing the results that are necessary for the
registration procedure. These rules were followed in this study and the most important ones are
discussed next. The clinical protocol was approved by the Committee on Ethics in Research of of
the Federal University of Pernambuco (UFPE)under the number CAAE 028/2005-CEP/CCS-
UFPE.
Place of study
The study was a joint project with the Núcleo de Desenvolvimento Farmaceutico e Cosmético
(NUDFAC) of the Federal University of Pernambuco, Pernambuco, Brazil. The clinical stage
was conducted at the Clinical Center of the Childrens Hospital, Foundation Manoel Almeida,
located at 95 Parnamirim Avenue, Recife, PE. The Generic Drugs Law has specific requirements
for places where bioequivalence studies are conducted. The premises should be exclusive for
clinical research, forbidding joint occupation by volunteers and sick patients. The patient rooms
and infirmaries should be well lighted and ventilated with beds and sanitary facilities in good
hygienic conditions and in sufficient number and having a nursing station close by. A Intensive
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antimicrobianos em plasma humano
Therapy Unit (ITU), local or mobile should be available together with emergency transportation
and the materials necessary for reversal of cardiopulmonary arrest. An electric generator should
be available in the venues used for the clinical studies, which should be conducted by an able
professional [16,19].
Table 1. ANVISA directives for studies on pharmaceutical equivalence and bioequivalence.
Title URL
Directive for relative bioavailability/
bioequivalence tests for drugs
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89
6_03re.htm
Directive for protocol and technical
reports elaboration in bioequivalence
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89
4_03re.htm
Directive for elaboration of technical
reports on bioavailability/bioequivalence
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89
5_03re.htm
Directive for conducting studies on
pharmaceutical equivalence and
elaboration of the respective technical
reports
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/90
0_03re.htm
Directive for dissolution assays of
oral solid pharmaceutical forms for
immediate liberation(OSFFIL)
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/90
1_03re.htm
Directive for planning and performing
statistical analysis of results in relative
bioavailability/bioequivalence studies
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89
8_03re.htm
Directive for validation of analytical and
bioanalytical methods
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89
9_03re.htm
Directive for exemption and substitution
of bioequivalence
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89
7_03re.htm
Human subjects in the study
According to the Brazilian Law on Generic Drugs, volunteers in bioequivalence studies should
present the following pre-requisites: good health, corroborated by clinical evaluation and clinical
laboratory tests, as well as mental health and emotional conditions to participate in the study. The
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antimicrobianos em plasma humano
volunteer should be an adult, 18 to 50 years old, weighing around ±15% of the ideal Body Mass
Index (BMI), and sign the informed consent document [20]
The 26 volunteers in this study, were healthy adults with average age 22.8 years, average
weight and height, 69.26 kg and 1.73m, respectively. They were evaluated by medical
consultations, anamnesis, physical exams, electrocardiograms, clinical laboratory
tests(hematological, biochemical, total urine, parasitological and serological) and psychological
evaluation. The subjects were warned not to take any drug, four weeks prior to starting in the
study.
Drugs administration and collection of samples
According to the manual on Good Administration Practices in bioavailability and bioequivalence
procedures, dosage administration by a nurse, pharmacist or an able professional, under medical
supervision, should follow the protocol. Physicians should supervise volunteers during the hours
after drug administration and sample collection following the drug pharmacokinetic
characteristics. Collection times described in the protocol should be rigorously followed.
In the present report, the study was conducted as an open, crossover assay, using
randomized single dosages of two formulations of norfloxacin. The volunteers were admitted to
the clinic at 10 p.m. on the day prior to the drug administration. They had a regular meal and at
11 p.m., a light luncheon; after 12 p.m. they fasted until 12
a.m. in the following day. The single
drug dose (400mg tablet) was administered at 8
a.m. with 240mL of water. Lunch was served at
12 a.m., afternoon snack at 4 p.m., supper at 7:30 p.m., night snack at 10 p.m. and breakfast at 8
a.m. the following morning. Liquids were allowed ad libitum after meals, excepting the ones
containing xanthines (coffee, tea and colas) up to 10 a.m. and then liberated. The period of
interment was 36 hours during which 16 samples were collected from each subject. The 8mL
blood samples were collected by a heparinized butterfly at times: 0h; 0.5h; 1.0 h; 1.25 h;1.5
h;1.75 h;2.0 h;2.5 h;3.0 h;4.0 h;6.0 h;8.0 h;10.0 h;14.0 h; 18.0h; 24.0h. Diets, established by
professional nutritionists did not interfere with the pharmacokinetic study.
Blood samples were centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes, the plasma was separated and
kept frozen at -20°C until assayed. After a washout period of 7 days the tests were repeated to
complete the volunteer transitions.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
Chromatography conditions
Norfloxacin serum concentrations were determined by High Efficiency Liquid Chromatography
(HPLC-UV) in a Shimadzu equipment fitted with a UV-280nm detector and software
Shimadzu/Class-VP5.32),using column and pre-column Gemini C18 5m(150x4.6 mm) and a
pre-column securityguard TM C18 10m (4x3.0 mm). The mobile phase was
acetonitrile/phosphate buffer, pH 3.5, elution at 1.2mL/min, oven temperature, 40
o
C, volume of
injection 50L, analysis time 14 minutes. The method was previously validated according to the
directive for validation of analytic and bioanalytic methods [21].
Pharmacokinetic Analysis
Pharmacokinetic data in bioequivalence studies derive from drug concentration vs time curves
obtained by quantification of the biological samples collected in predetermined times as already
described [16]. To determine drugs bioequivalence three measurements are fundamental: the area
under the concentration x time curve (AUC); the observed peak concentration (C
max
) and the time
to attain this concentration (T
max
).
According to Sweetamm [23], norfloxacin has an oral bioavailability of 30 to 40% and a
C
max
of 1.5 g/mL after administration of a single dose of 400mg in a T
max
of 1-2 hours.
Korolkovas [24] reports C
max
of 1.4-1.6 g/mL, 1-2 hours after administration of 400mg
norfloxacin in a single dose.
Statistical Analysis
The Directive on Planning and Performing Statistical Analysis of results in relative
bioavailability/bioequivalence studies, indicates that parameters AUC and C
max
should be
analyzed
using the log ratio of individual values for the test and reference drugs and T
max
as an
individual difference between the drugs tested. Both tests, parametric and non-parametric will be
employed to analyze the variables. The drugs will be considered as bioequivalent, in rate and
extent of absorption, if the 90% confidence interval of AUC
inf,
AUC and Cmax of the test
geometrical mean lies entirely between the confidence intervals 80-125% of the reference drug
geometrical mean.
Analysis were conducted with the help of the following softwares: WinNonLin
Professional Network Edition, Version 1.5m [25]; Bioequivalence program for two-period Cross-
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
over Studies-Version 3.4[26]; Microsoft Excel version 7.0 [27] and Graph Pad Prism Version
2.01[28].
Results and Discussion
Norfloxacin was well tolerated by volunteers. Determination of the 90% confidence interval for
the mean differences should be based on the least squares means of data as logs and on the
residual square mean in the ANOVA analysis of variance. Antilogs of the confidence limits
constitute the 90% confidence interval for the ratio of geometric means of test and reference
drugs. Mean bioequivalence is considered when this confidence interval lies between 80 and
125% [18].
Table 2 shows the pharmacokinetic parameter values for the two brands (test and
reference) of 400mg norfloxacin tablets. The confidence interval for the ratio of C
max
means was
85.36% (lower limit) and 111.69% (upper limit) through the shortest. The values for the westlake
were 86.43% (lower limit) and 113.57% (upper limit). Mean C
max
calculated by the method of
least squares for the reference drug was 89.60 and 89.29 for the test, resulting in a
ratio(C
max
test/C
max
ref) of 97.64 and a test power (%) for C
max
of 86.50.
Table 2. Pharmacokinetic parameters of norfloxacin 400mg tablets (mean standard deviation,
n = 26)
Pharmacokinetic
parameter
Floxacin
(reference)
Generic Norfloxacin
(test)
AUC
0-t
(ng/mL.h) 5532.00±31.7
5285.79±32.7
AUC
0-inf
(ng/mL.h) 6029.12 ±29.3
5961.32±29.6
Cmax (ng/mL)
1072.75±33.6 1047.67±33.6
Tmax(h)
1.79±43.3 1.61±49.5
T
1/2
5.38±23.6 6.40±42.4
Kel (h/h)
0.14±27.3 0.12±26.0
Vd (mL)
559326.42±40.7 671928.81±51.7
Cl_F (mL/h)
72797.45±34.2 74295.85±36.8
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
The area under the concentration-time curve from zero time (0) to the time of the last
sample collection (t), AUC
(0-t)
had lower and upper confidence limits of 85.02 and 106.50 ,
respectively, by the shortest and by the westlake the values were respectively, 86.98 and 113,02.
The AUC
(0-t)
means calculated by the least squares were 123.425 for the reference drug and
122.709 for the test resulting in a ratio (test/ref) of 95.15 and a test power (%) for AUC
(0-t)
of
94.69.
When the area under the concentration-time curve was calculated from time zero (0) to
infinite (inf), AUC
(0-inf)
the upper and lower confidence limits by the shortest were 88.62 and
109,60, respectively, and 89.32 and 110.68 by the westlake. The mean AUC
(0-inf)
calculated for
the reference and test drugs by the least squares, were 137.182 and 136.950 resulting in a ratio
(test/ref) of 98.55 and a power of test (%) for AUC
(0-inf)
of 94.41.
According to Korolkovas [24], norfloxacin has a C
max
of 1.4-1.6g/mL after 1-2 hours
administration. In the results reported here, the reference has a C
max
of 1.07g/mL and the test
1.05 g/mL and T
max
values of 1.79 for the reference drug and 1.61 for the test. AUC is an
important parameter in bioequivalence evaluating studies. The other two, C
max
and T
max
are also
considered in this study since they show plasma characteristics and may affect the drug
therapeutic activity
The mean concentration-time profile for norfloxacin for the two formulations is shown in
Figure 1, and indicate that the mean plasma concentration profiles of the two brands were closely
similar and superimposable.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
Figure 1. Mean plasma concentration of norfloxacin after oral administration of a single dose of
two brands to 26 healthy human volunteers.
The most important objectives in the bioequivalence tests is to assure the safety and
efficacy of the generic drugs [29].
Conclusion
The implementation of the Brazilian Generic Drugs Policy was a landmark in the growth of the
country's drug market.
The generic drugs segment intensified regulation by agencies like the National Agency for
Sanitary Vigilance (ANVISA), mainly by enforcing the Good Manufacturing Practices. As a
result the population could get safe and efficient products at a lower cost and concepts as
pharmaceutical equivalence, bioavailability and bioequivalence were introduced. It can be
demonstrated by these studies that generic drugs and reference ones are equivalent, that is, they
may be interchanged. This report shows that the test product, Norfloxacin Generic Prati &
Donaduzzi and the reference Floxacin® are bioequivalent as it was statistically demonstrated by
analysis of variance (ANOVA) and by confidence intervals (80%-125%) for
Cmax,
AUC
(0-inf
) and
AUC
(0-t
).
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
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analíticos e bioanalíticos. ANVISA: Brasília, 2003.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
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Bioequivalence Assessment. Biopharm. Drug Dispos 2005: 26: 205-
210.
A
nexo C
(Artigo 2)
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
8. Anexo C (Artigo 2)
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A NEW METHOD FOR THE
QUANTIFICATION OF NORFLOXACIN BY HPLC-UV AND ITS
APPLICATION TO A COMPARATIVE PHARMACOKINETIC STUDY AND
TOLERABILITY IN HUMAN VOLUNTEERS.
Danilo César Galindo Bedor
1
, Talita Mota Gonçalves
1
, Leila Leal Bastos
1
, Carlos
Eduardo Miranda de Sousa
1
, Luis Renato Pires de Abreu
1
, Eduardo Jesus de Oliveira
3
,
Davi Pereira de Santana
1*
1
Núcleo de desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético – Universidade Federal de
Pernambuco – NUDFAC/UFPE
2
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica – Universidade Federal da Paraíba
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
Development and Validation of a Method for the Quantification of
Norfloxacin by HPLC-UV and its Application to a Comparative
Pharmacokinetic Study in Human Volunteers.
ABSTRACT
The development and validation of a simple and accurate method based on HPLC with
ultraviolet detection for the quantification of norfloxacin (NFX) in human plasma and its
application to a bioequivalence study between two norfloxacin formulations is described.
NFX and the internal standard (cyprofloxacin) were extracted from plasma using liquid-
liquid extraction. Chromatographic separation of norfloxacin, cyprofloxacin and plasma
interferents was achieved with a C-18 column and a mobile phase consisting of 20 mM
sodium hydrogen phosphate buffer pH 3.0 and acetonitrile (88:12, v/v) and quantitation
was done at 280 nm. The method was linear from 25 to 3000 ng.mL
-1
(r
2
≥ 0.997578),
and norfloxacin and cyprofloxacin had an average recovery from plasma of 93.9% and
91.2% respectively. The RSD of inter-day quality control samples at the lower limit of
quantification was less than 15%. After a single oral dose (400 mg) of norfloxacin
administered to healthy human volunteers using a randomized 2x2 crossover design,
pharmacokinetic parameters (AUC
0-t
, AUC
0-∞
, C
máx
, t
1/2
) were derived from the plasma
concentration curves for both formulations. Pharmacokinetic analysis of the data showed
that the two formulations were bioequivalent, while no adverse reactions to the drug
were observed.
Keywords: norfloxacin, HPLC, bioequivalence, pharmacokinetics.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
Desenvolvimento e validação de um método para quantificação de
norfloxacino por cromatografia líquida de alta eficiência e aplicação a
estudo de farmacocinética comparada em voluntários humanos
Resumo
Desenvolvimento e validação de um simples e preciso método por CLAE-UV para
quantificação de norfloxacin (NFX) em plasma humano e aplicação em um estudo de
bioequivalência entre duas formulações. NFX e o padrão interno (ciprofloxacino, PI)
foram extraídos do plasma através de extração líquido-líquido. A separação
cromatográfica do NFX, do PI e dos interferentes do plasma foi realizada com uma
coluna C-18 e fase móvel composta de tampão fosfato de sódio pH 3.0 e acetonitrila
(88/12, v/v) e quantificado em 280 nm. A linearidade do método foi de 25 a 3000 ng.mL
-
1
(r
2
≥ 0.997578) e a recuperação média de NFX e PI foi de 93.9% e 91.2%
respectivamente. A precisão do método no nível do limite inferior de quantificação foi
menor que 15%. Foi administrada uma dose de NFX (400mg) por via oral a voluntários
humanos em um estudo aberto, aleatório e cruzado 2x2 entre duas formulações. Os
parâmetros farmacocoinéticos (AUC
0-t
, AUC
0-∞
, C
máx
, T
1/2
) foram observados a partir da
curva de concentração versus tempo. A análise farmacocinética mostrou que as duas
formulações são bioequivalentes entre si. Nenhum efeito adverso foi observado.
Keywords: norfloxacino, CLAE, bioequivalência, farmacocinética.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
1. INTRODUCCTION:
Norfloxacin (1-ethyl-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-7(1-piperazinly)-3-quinoline carboxylic
acid) (FIGURE 1) is a large spectrum synthetic fluoroquinolone antibiotic which is
structurally related to nalidixic acid (CÓRDOBA-BORREGO et al 1999) (FIGURE 2). The
addition of a fluorine atom at C-6 and a piperazine ring at C-7 has increased its potency
in relation to other fluoroquinolonas (ESPINOSA-MANSILLA et al 2006). Norfloxacin is
synthesized by heating 1-ethyl-6-fluor-7chloro-1,4-dihydro-4-oxoquinoline-3carboxylic
acid (ECA) with piperazine (RAO 2004). Norfloxacin solutions are photosensitive to
sunlight and to fluorescent light (CÓRDOBA-BORREGO et al 1999).
6
7
8
5
N
1
2
3
4
N
NH
F
C
2
H
5
COOCH
3
O
FIGURE 1. The structural formule of Norfloxacin
NN
O
COOH
1
2
3
45
6
7
8
FIGURE 2. The structural formule of nalidixic acid
Norfloxacin is well tolerated and widely used against both gram-positive and
gram-negative infections, including Neisseria gonorrheae, gentamycin-resistant
Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus. influenzae, and methicillin-resistant
Staphylococcus Aureus (MRSA)
(CÓRDOBA-BORREGO et al 1999; RAO and
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
NAGARAJU 2004; LIM et al 2002). It is mainly used in the treatment of urinary,
respiratory and gastrointestinal tract infections (RAO 2004).
Norfloxacin is rapidly absorbed after oral administration (with 35 to 40% oral
bioavailability). After an oral dose of 400mg, plasma peak concentration (around 1,60
µg/mL) is achieved within 3 hours. Plasma half-life is 5 hours (FARINOTTI 1991).
Approximately 30% of the administered dose is eliminated unaltered by the kidneys,
producing high concentrations in urine (VÍLCHEZ et al 2001). Indeed, norfloxacin is
frequently used to treat urinary infections with a 400 mg dose twice-daily regimen
(MASCHER AND KIKUTA 1998).
High performance liquid chromatography methods have been used in the
determination of norfloxacin in biological fluids and in pharmaceutical dosage forms
(CARLUCCI 1998). There are several methods in the literature for norfloxacin
quantification in human plasma and in animal tissues employing different extraction and
detection strategies. Amongst those are liquid-liquid extraction with ultraviolet detection
(WALLIS et al 1995), and protein precipitation with UV (SAMANIDOU et al 2003)
or
fluorescence detection (WELL et al 1998)
. More recent methods include liquid
chromatography coupled to mass spectrometry detection (TOUSSAINT et al 2002;
BALLESTEROS et al 2003). Although these methods are suitable for the determination
of norfloxacin in plasma, the limit of quantification of the UV-based methods is around
100ng.mL
-1
. While mass spectrometry provides a much higher sensitivity, the technique
is not available to many laboratories. Thus, in order to accurately represent the
elimination phase of the plasma-concentration-versus-time curve, we developed a
simple and accurate method based on HPLC with UV detection and a lower limit of
quantification of 25 ng.mL
-1
.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
The method was developed, validated and applied to the bioequivalence study of
two 400 mg tablets of norfloxacin. The study involved a single oral dose of 400 mg of
norfloxacin in an open, randomized, 2x2 crossover design using 26 healthy volunteers
aged 18-45 years (22.8 average) and a washout period of 7 days.
2. Experimental:
2.1. Chemicals
Norfloxacin reference standard was acquired from the Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Saúde (INCQS, Rio de Janeiro, Brazil) and cyprofloxacin
(internal standard) from the United States Pharmacopea (Rockville, MD, EUA). HPLC-
grade methanol and acetonitrile was purchased from J.T. Baker
(Phillipsburg, NJ, EUA)
and chloroform from Merck (Darmstadt, Germany). Sodium hydrogen phosphate and
phosphoric acid were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Water was purified
using a MilliQ
®
system from Millipore (Molsheim, France). Floxacin
®
(Merck Sharp &
Dhome) and the formulation test 400 mg tablets were purchased from the local
pharmacy.
2.2. Equipament
High performance liquid chromatography was done using a chromatograph
composed of two pumps (LC 10ADvp), a column oven (CTO 10Avp), a UV/VIS detector
(SPD 10AVvp) configured to acquire data at 280 nm, an autosampler ( SIL 10ADvp),
and a system controller (SCL 10Avp) all from Shimadzu (Kyoto, Japão). For sample
extraction a Jouan M23i refrigerated centrifuge (St. Herblaim, França) was used.
Samples were stored at -70 ºC REVCO (Ascheville, NC, EUA) freezer until analysis.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
2.3. Chromatography
Chromatographic separation was achieved using a Gemini
®
C18 column
(Phenomenex, Torrance, CA, EUA) with 150 x 4,6 mm and 5 µm particle size coupled to
a C18 4,0 x 3,0 mm precolumn (also from Phenomenex). The mobile phase consisted of
20 mM sodium hydrogen phosphate buffer (adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid) and
acetonitrile (88:12, v/v) which was filtered, degassed and pumped at a flow rate of 1.2
mL/min. The column oven was set at 40 ºC and the injected volume was 50 µL.
Quantitation of norfloxacin was done by measuring the response (area) of norfloxacin in
relation to the response of cyprofloxacin (internal standard).
2.4. Sample preparation
2.4.1. Preparation of working solutions and quality control standards
The stock solutions of norfloxacin (at 1.0 mg.mL
-1
) were prepared by dissolving
the substance in methanol:water (1:1 v/v) acidified with 30 µL of formic acid and the
internal standard stock solution (at 1.0 mg.mL
-1
) was prepared in methanol:water (1:1
v/v). The working solutions of norfloxacin were prepared in mobile phase (see
chromatography above) to cover a range of concentrations from 25 to 3000 ng.mL
-1
. The
internal standard working solution was also prepared in mobile phase at a concentration
of 4000 ng.mL
-1
. The calibration curves for norfloxacin were prepared in human plasma
at concentrations of 25, 50, 100, 300, 600, 1000, 1500, 2500 e 3000 ng.mL
-1
. Quality
control samples were also prepared in human plasma at the following concentrations:
150, 1200 e 2250 ngmL
-1
(low, medium and high quality controls respectively).
2.4.2. Sample preparation
Plasma samples (250 µL) were transfered to a 2 mL polypropylene vial to which
internal standard (50 µL, 4000 ng.mL
-1
) and 1 mL of chloroform was added. The
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
samples were centrifuged at 10.000 rpm for 1 minute. The vials were then frozen and
the aqueous layer discarded. The organic phase was transferred to 2 mL glass vials
and the solvent was evaporated to dryness at 40 ºC under a stream of nitrogen. The
residue was redissolved in 250 µL of mobile phase, of which 200 µL was transfered into
250 µL glass vials and placed in the autosampler for analysis. The injection volume was
50 µL.
2.5. Clinical Protocol
The bioequivalence study was conducted in 26 volunteers from 18 to 45 years
(average of 22.8 years old), with an average weight of 69.26 Kg (body mass index
around 15% of ideal). The volunteers were submitted to an evaluation including
anamnesis, psychological tests, electrocardiogram, and laboratory tests (hematological,
serological and biochemical tests) four weeks before the beginning of the study. All
volunteers were required to sign an informed consent form, and the clinical protocol had
the approval of the Ethics Committee. The volunteers were hospitalized in two occasions
separated by a washout period of 7 days. At each period the volunteers (randomly
assigned to the test or reference formulation) received in fasted state a single tablet of
400 mg of norfloxacin ingested with the aid of 240 mL of water. The 16 blood samples
were collected by a heparinized butterfly at 0.0, 0.5, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5, 3.0,
4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 14.0, 18.0 e 24.0 hours after dosing. At each time point, 8 mL of
blood was withdrawn from the braquial vein and were transfered to glass containing
EDTA. Blood samples were centrifuged at 2500 rpm and plasma was stored in
polypropylene cryogenic tubes at -70ºC until analysis.
2.6. Validation
2.6.1. Selectivity
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
Selectivity was evaluated by extracting plasma samples from a pool of plasma,
including a lipemic and hemolysed plasma. The absence of interfering peaks at the
same retention time of analytes or internal standard was considered as evidence for
selectivity.
2.6.2. Linearity
Calibration curves were constructed using linear regression (with concentration
as 1/x) within the range of 25 – 3000 ng.mL
-1
of norfloxacin.
2.6.3. Recovery
Recovery of analyte was evaluated by comparing the response of norfloxacin in
each quality control samples (150, 1200 e 22500 ng.mL
-1
) with the response of
norfloxacin in solutions prepared with the same nominal concentration. Recovery of
internal standard was calculated in the same manner, but only at the working
concentration (4000 ngmL
-1
).
2.6.4. Precision and accuracy
For precision and accuracy studies, samples were prepared at 3 concentration
levels (low, medium and high quality controls, corresponding to 150, 1200 e 22500
ng.mL
-1
respectively) with 5 replicates each, and were analysed in the same day (intra-
day precision and accuracy), or prepared and analysed in 3 consecutive days (inter-day
precision and accuracy).
2.7. Stability studies
The stability of the solutions and plasma samples was also evaluated during
method validation. Norfloxacin stock solutions were analysed at two concentration levels
(low and high quality control, corresponding to 150 and 22500 ng.mL
-1
respectively) both
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
recently prepared or after 7 days stored at 4 ºC. The stability of norfloxacin was also
evaluated in post-extracted samples kept in the autosampler at room temperature (23
ºC) for 6 or 24 hours, as well as in plasma samples kept at -70 ºC for 62 days and after
being submitted to 3 freeze-thawing cycles (24 hours each cycle). All samples described
above were compared to freshly prepared norfloxacin samples at the same
concentration level.
2.8. Statistical anlysis, pharmacokinetics parameters
Maximum plasma concentration (C
max
) and the time to reach it (T
max
) were
derived directly from plasma concentration-versus-time curves. The area under the
concentration-versus-time curve from 0 – 24h (AUC
0-t
) was derived using the trapezoidal
rule. The elimination constant (K
e
) was obtained using linear regression of the
elimination phase data points and the plasma half-life (t
1/2
) was derived from the relation
t
1/2
= ln2.K
e
-1
. The values of C
max
and
AUC
0-t
were compared using parametric (ANOVA)
and non-parametric (Wilcoxon) statistical analysis..
2.9. Tolerability
Tolerability was evaluated through clinical observation and monitoring of vital
signs such as arterial pressure, body temperature and pulse rate at baseline and at the
end of each period and subject interview regarding the potential presence of adverse
events (AEs) during the study. Tolerability was
3. Results and Discussion
3.1. Selectivity
The described method used reversed-phase HPLC for separation of norfloxacin from
cyprofloxacin (internal standard) and was shown to be selective for the analyte and its
internal standard (retention times for norfloxacin and cyprofloxacin were 10.5 e 12.4
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
min respectively). No interfering peaks were observed with the same retention time of
the analytes when plasma samples (including lipemic and hemolysed ones) from
different volunteers were analysed (FIGURE 3).
Minutes
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
Volts
0.000
0.002
0.004
Detector A (280nm)
22_03_05_Nud_04_05_Validação_Seletividade_Plasma_Lipêmico
22_03_05_Nud_04_05_Validação_Seletividade_04
Minutes
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
Volts
0.000
0.002
0.004
Detector A (280nm )
22_03_05_Nud_04_05_Validação_Seletividade_Plasma_Normal
22_03_05_Nud_04_05_Validação_Seletividade_00
A B
0.015
Mi snute
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
Volts
0.000
0.002
0.004
Detector A (280nm )
22_03_05_Nud_04_05_Validação_Seletividade_Plasma_Hemolisado
22_03_05_Nud_04_05_Validação_Seletividade_05
Minutes
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
Volts
0.000
0.005
0.010
Detector A (280nm)
05_05_05_NUD_04_05_Vlt_02_CPF_CQM_1200 ng/mL
05_05_05_NUD_04_05_Vlt_01_CPF_01
C D
FIGURE 3. Chromatograms of Selectivity: A) normal plasma, B) Hemolysed plasma, C)
Lipemic plasma and D) analyte (norfloxacin) and internal standard (ciprofloxacin)
respectively.
3.2. Linearity
Linearity was demonstrated from 25 – 3000 ng.mL
-1
. TABLE I show data from
calibration curves prepared in different days throughout the application of the method.
Each point was analysed in triplicate. The average correlation coefficient was 0,9976.
The lower limit of quantification was determined to be 25 ng.mL
-1
, which improved the
accuracy of estimation of AUC
0-t
when compared to AUC
0-inf.
.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
TABLE I.The precision and accuracy of points of calibration curves
Nominal value
(ngmL
-1
)
Observed value
(ngmL
-1
)
(Average ± SD) (n=13)
Precision
(%)
Accuracy (%)
25 25,17 ± 0,83 3.3 100,68
50 49.73 ± 0,33
0,67 99,5
100 99,16 ± 1,31
1,32 99,2
300 319,09 ± 22,83 7,15 106,4
600 600,99 ± 2,13 0,36 100,2
1500 1536,29 ± 61,42 4,00 102,4
2500 2427,58 ± 23,36 0,96 97,1
3000 2887,63 ± 73.63 2,55 96,3
3.3. Recovery
The average recovery for norfloxacin in plasma was 82,34%, 93,97%, 97,25%
(n=15) for the low, medium and high quality control samples respectively (150, 1200 e
2250 ng.mL
-1
), with an average of 91,19%. The average recovery of the internal
standard was 93,91%, evaluated at 4.0 µg.mL
-1
.
3.4. Precision and accuracy
The intraday and interday precision and accuracy of the method for each
norfloxacin concentration level (150, 1200 e 2250 ngmL
-1
) and for the lower limit of
quantification (25 ngmL
-1
) are presented in TABLE II. The relative standard deviation for
the quality control samples and for the LLOQ were respectively 2.46, 1.47, 1.16 e 10.6%
and accuracy was 105.1, 103.2, 108.9 and 108.6% respectively.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
TABLE II. Inter - and Intra-day precision and accuracy for Norfloxacin
Intra-day (ngmL
-1
) (n=5) Inter-day (ngmL
-1
) (n=15)
Day 1 Day 2 Day 3
Nominal
value
(ngmL
-1
)
Average ± SD Average ± SD Average ± SD Average ± SD Prec. Acc.
25 27,191± 1,16 27,721± 1,22 26,311± 1,02 26,075± 1,76 6,75 104,3
150 160,285±4,85 157,615±5,96 169,241± 4,16 162,380± 6,95 4,28 108,3
1200 1238,441±18.2
5
1286,710±66,9
0
1340,121±
32,28
1288,424±
59,32
4,60 107,4
2250 2451,103±50,8
9
2449,544±69,3
9
2537,510±
29,50
2479,386±
73,85
2,98 110,2
Intra-day (ngmL
-1
) (n=5) Inter-day (ngmL
-1
) (n=15)
Day 1 Day 2 Day 3
Nominal
value
(ngmL
-1
)
Average ± SD Average ± SD Average ± SD Average ± SD Prec. Acc.
25 27,191± 1,16 27,721± 1,22 26,311± 1,02 26,075± 1,76 6,75 104,3
150 160,285±4,85 157,615±5,96 169,241± 4,16 162,380± 6,95 4,28 108,3
1200 1238,441±18.2
5
1286,710±66,9
0
1340,121±
32,28
1288,424±
59,32
4,60 107,4
2250 2451,103±50,8
9
2449,544±69,3
9
2537,510±
29,50
2479,386±
73,85
2,98 110,2
3.5. Stability studies
Norfloxacin stock solutions (1mg.mL
-1
) remained stable when stored at –4 ºC for 7
days or when stored at room temperature up to 24 hours. When stored at –70 ºC for
62 days, spiked plasma samples of norfloxacin presented losses of 1.9 and 3.0% for
concentrations of 150 and 2250 ng.mL
-1
respectively, in the others stability studies
(stock solutions, post-extracted samples and 3 freeze-thawing cycles) norfloxacin did
not show evidence of significant degradation.
3.6. Pharmacokinetic parameters
FIGURE 4 shows the averaged plasma concentration-versus-time curves for
norfloxacin after administration of the reference (Floxacin
®
Merck Sharp & Dhome, 400
mg tablets) and test formulations. TABLE III shows the pharmacokinetic parameter
values for the two brands (test and reference) of 400 mg norfloxacin tablets.
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
FIGURE 4. The averaged plasma concentration-versus-time curves for
Norfloxacin after administration of the reference and test formulations.
Mean of Pharmacokinetics profile
(n=26)
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tempo (h)
concentração ug/mL
Referência
Teste
The confidence interval (90%) for the ratio of C
máx
means was 85.36% (lower
limit) and 11.69% (upper limit) through the shortest. Mean C
máx
calculated by method of
least squares for the reference drug was 89.60 and 89.29 for the test, resulting in a ratio
(C
máx
test/ C
máx
reference) of 97.64 and a test power of 86.50%.
The area under the concentration-time curve from zero time to the time of the last
sample collection, AUC
(0-t)
had lower and upper confidence limits (90%) of 85.02 and
106.50, respectively, by the shortest. The AUC
(0-t)
means calculated by method of least
squares were 123.425 for the reference drug and 122.709 for the test drug resulting in a
ratio (test/reference) of 95.15 and a test power for AUC
(0-t)
of 94.69%.
When the area under the concentration-time curve from zero to infinite, AUC
(0-inf)
the lower and upper confidence limits (90%) by the shortest were 88.62 and 109.6,
respectively. The mean AUC
(0-inf)
calculated for the reference and test formulation by the
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
least squares, were 137.182 and 136.950 resulting in a ratio (test formulation/reference
formulation) of 98.55 and a power of test of 94.41%.
Pharmacokinetic parameter
Test formulation
(mean ± SD)
Reference
formulation
AUC
(0-t)
(ng/mL.h)
5532 ± 31.7 5285.79 ± 32.7
AUC
(0-inf)
(ng/mL.h)
6029.12 ± 29.3 5961.32 ± 29.6
C
max
(ng/mL)
1072.75 ± 33.6 1047.67 ± 33.6
T
máx
1.79 ± 43.3 1.61 ± 49.5
T 1/2 5.38 ± 23.6 6.40 ± 42.4
K
el
(h/h) 0.14 ± 27.3 0.12 ± 26.0
Vd (mL) 559326.42 ± 40.7 671928.81 ± 51.7
Cl (mL/h) 72797.45 ± 34.2 74295.85 ± 36.8
TABLE III. Pharmacokinetic parameter for test and reference formulations
3.7. Tolerability
No adverse effect was noticed during the period in which the volunteers were
hospitalized and both formulations were well tolerated.
4. Conclusion
We described here the development of a new, selective, precise and accurate
method for the quantification of norfloxacin in human plasma using HPLC with UV
detection and liquid-liquid sample extraction which was applied to a bioequivalence
study. The developed method is suitable for pharmacokineticstudies of norfloxacin with
a lower limit of quantification of 25 ngmL
-1
, which represents less than 2,5% of
norfloxacin´s C
max
, and thus can be applied to estimation of pharmacokinetic parameters
Bedor, DCG -Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para dosagem de
antimicrobianos em plasma humano
which are dependable of data points from the elimination phase such as AUC
0-inf
. The
method was applied to the analysis of more than 1200 samples with good accuracy and
precision (less than 15% RSD). The study was able to demonstrate bioequivalence
(comparision of AUC
o-t
, AUC
o-inf.
, C
max
) between the two formulations with a 90%
confidence interval. Ahead of the clinical observations carried through during and after
the study no adverse effect was observed, showing a good tolerability to the both
formulations.
Acknowledgements
The authors wish to thank CNPq/CAPES and ANVISA-DF for financial support. Our
gratitude for Iram Mundim for technical support.
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