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MELISSA ALVARENGA HADDAD
EFEITOS DA OZONIOTERAPIA SOBRE PARÂMETROS CLÍNICOS,
HEMATOLÓGICOS E DA BIOQUÍMICA SANGÜÍNEA EM EQÜINOS
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária, para
obtenção do Título de Magister
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
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ii
Conhecer aos outros é sabedoria;
Conhecer-se a sí mesmo é iluminação;
O domínio dos outros requer força;
O domínio de sí mesmo requer fortaleça.
Aquele que sabe que tem suficiente é rico.
Perseverânça é um sinal de querer poder.
Aquele que fica resiste.
Morrer, porém não apodrecer é estar presente eternamente.
Lao Tsu
Se a medicina é moderna ou antiga não é o que interessa,
e sim, si esta cura.
Jen-Hsu Lín
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iii
A minha família pelo verdadeiro apoio a todo momento, tanto pessoal como
profissional, sobretudo à enorme e infinita paciência e fortaleza da minha mãe Inês
Maria; ao sentido de união dos meus irmãos Rigoberto G. e Mauricio e da minha
cunhada Carolina, que os levaram a superar inúmeras dificuldades; e que a minha
busca para um futuro melhor sirva de exemplo para os meus sobrinhos Rigoberto
Andrés, Diego Antonio e Crista Maria.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por cada dia, por mais uma oportunidade, e pela fortaleza e luz que
me possibilitaram superar as dificuldades encontradas a cada dia.
À Profª. Maria Verônica de Souza, por sua imediata aceitação em me orientar,
pelo ensinamento profissional e de vida, por me mostrar o essencial sentido da
eficiência, pelo carinhoso acolhimento, conselhos, fortaleça e firmeza naqueles
momentos que mais precisei; por estender a sua mão amiga e, muitas vezes, a
proteção de mãe. Obrigada por acreditar em mim e me incentivar a cada dia com o
próprio exemplo. O sucesso dos projetos depende da mão de todos os integrantes da
equipe!
À Profª. Marlene Isabel Vargas Viloria, por me escutar em várias ocasiões, por
todos os momentos de conselho, pelo incentivo, por me receber como uma filha no
seu lar e me permitir cuidar de suas mascotes.
Aos meus Co-Orientadores, os Professores José Dantas Ribeiro Filho e
Laércio dos Anjos Benjamin, pelo apoio e constante disponibilidade para colaborar
neste trabalho.
Ao Profº. José Ivo Ribeiro Júnior, pelo tempo a mim dedicado e paciência em
responder aos meus questionamentos.
À senhora Rosinéia Aparecida da Cunha, pela paciência e colaboração, sempre
que lhe procurei.
Aos Professores do DVT, Andréa Pacheco Batista Borges, José Antônio
Viana, Cláudio César Fonseca, Joaquim Hernán Patarroyo Salcedo, Luiz Gonzaga
Pompermayer, Marco Túlio David das Neves (in memorian), Ricardo Junqueira del
Carlo e Paulo Renato dos Santos Costa, os quais tive oportunidade de reencontrar, de
dar-lhes um abraço e voltar a compartilhar uma sala de aula.
Aos funcionários do DVT (Adão, Cláudio, Celinho, Cláudio, José de Oliveira,
Maninha e Sidney) que, apesar de não havermos compartilhado muito tempo, sempre
me receberam com um sorriso e com uma mão amiga.
À Universidade Federal de Viçosa, por mais um título.
Ao Departamento de Veterinária, por me abraçar uma segunda vez.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa.
v
À Escuela Agrícola Panamericana, minha primeira Alma Mater, por me
permitir executar a parte experimental deste trabalho e pelo ensinamento de vida:
Labor Omnia Vincit.
Ao Clube Hípico de Zamorano, pela disponibilidade dos eqüinos e das
instalações para a realização desta pesquisa.
Ao Dr. John Jairo Hincapié, pela confiança e incentivo no desenvolvimento
desta pesquisa, pela supervisão na parte experimental, motivação e tranqüilidade
permanentemente transmitida, por me estender sempre uma mão amiga e por me
inspirar sobre a nobreza da nossa profissão e da qualidade de trabalho na mesma.
Ao senhor Gerardo Benavides, pelo apoio, companhia, paciência e verdadeira
dedicação, sem horários, durante a execução do trabalho de campo.
Ao senhor Emilio Chavarria, pela sua colaboração na execução do
experimento.
Àquelas pessoas do corpo administrativo do Departamento de Ciência e
Produção da Escuela Agrícola Panamericana, que me apoiaram, inclusive fora do
horário de expediente.
À Clínica Veterinários de Eqüinos, por me abrir as portas, possibilitando a
realização de parte dos exames laboratoriais.
À Drª. Diana Mercedes Echeverria, por sua orientação profissional, apoio,
amizade e pelas árduas horas de trabalho que compartilhamos durante a fase
experimental.
Ao Laboratório Molina, por permitir a realização de parte das análises
laboratoriais.
À Drª. Maria Antonieta Molina e a sua equipe de trabalho, (virgula) pelo
ânimo, incentivo e dedicação a esta pesquisa.
Aos meus amigos e irmãos, Carlos Espinoza, José Oscar Murillo, Maria
Yumbla e Miriam Comis, que me acompanharam, ouviram e tiveram paciência neste
difícil, mas gratificante andar.
Um especial agradecimento e reconhecimento à minha amiga, minha irmã,
Jessie Galo, pela sua ajuda e apoio incondicional no momento menos esperado.
Aos meus amigos, que apesar da distância ou tempo, sempre permaneceram
por perto: Alejandra Sierra, Diana Osorto, Eduardo Alencar, Elena Toro, Frederico
Paes, Gina Canales, Jessie Inestroza, Kátia Atoji, Maria del Pilar Paz, Maria E.
vi
Fernández, Neila Ribeiro, Onofre de la Cruz Verdu Arnaldos, Sandra Enríquez e
Yessenia Hernández.
A todas aquelas pessoas que me ajudaram em casa, durante a minha ausência,
um infinito agradecimento por cuidar do ser que me trouxe à vida.
Aos eqüinos... meu profundo respeito e agradecimento por me inspirar e
ajudar a conciliar o entendimento que a compaixão pode trazer, além de uma resposta
diferente e surpreendente no paciente. Uma integração inesquecível!
vii
BIOGRAFIA
Melissa Alvarenga Haddad, nascida em 26 de maio de 1975 na cidade de
Tegucigalpa, M.D.C, em Honduras na América Central.
Formada pela Escuela Agrícola Panamericana, localizada no vale de El
Zamorano, Francisco Morazán, do mesmo país, como Técnico Superior em
Agronomia no ano de 1996. Logo após cursou Medicina Veterinária na Universidade
Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil, obtendo seu título de Médico Veterinário no
ano de 2002.
Em seguida, foi convidada para participar do Programa de Estágios no exterior
pela Escola Agrícola Panamericana, trabalhando na fazenda Town and Country
Farms, na cidade de Micanopy e no Hospital de Eqüinos Peterson and Smith, na
cidade de Ocala, ambos no estado da Flórida, nos Estados Unidos de Norte América.
De volta ao país de origem realizou consultorias na área de nutrição eqüina, no
projeto de capacitação para fazendeiros organizados em centros de colheita e
esfriamenro do leite (CREL), apoiado pela Escola Agrícola Panamericana, assim
como pela Secretaria de Agricultura (através do SENASA), Direção de Ciência e
Tecnologia (DICTA) e pelo Banco Interamericano de Desenvolvimento (BID).
Posteriormente prestou serviços à Secretaria de Agricultura, dentro da Direção do
Serviço Nacional de Sanidade Agropequaria (SENASA).
Em 2005 ingressou no Programa de Pós-graduação do Departamento de
Veterinária da Universidade Federal de Viçosa, com conclusão do mestrado em
dezembro de 2006.
viii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS...................................................................................................x
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................xvi
RESUMO...................................................................................................................xxii
ABSTRACT..............................................................................................................xxiii
CAPITULO I - Considerações Gerais.
Introdução geral.............................................................................................................1
Revisão de literatura geral.............................................................................................2
Material e métodos........................................................................................................7
Animais..............................................................................................................7
Sensibilização dos animais à ozonioterapia.......................................................8
Tratamento de manutenção................................................................................8
Parâmetros clínicos avaliados............................................................................9
Parâmetros laboratoriais avaliados...................................................................10
Obtenção de amostras.......................................................................................10
Técnicas utilizadas para determinação dos parâmetros laboratoriais
Hemograma completo......................................................................................11
Fibrinogênio.....................................................................................................11
Glicose, creatina quinase (CK) e gama glutramiltransferase (GGT)...............11
Análise estatística.............................................................................................12
Referências bibliográficas............................................................................................15
CAPITULO II - Comportamento de parâmetros hematológicos e bioquímicos
sangüíneos no período de repouso durante aplicação de ozônio em eqüinos.
Resumo.........................................................................................................................18
Abstract........................................................................................................................19
Introdução....................................................................................................................20
Revisão de literatura.....................................................................................................21
Resultados e discussão.................................................................................................23
Conclusões...................................................................................................................34
Referências bibliográficas...........................................................................................35
ix
CAPITULO III - Monitoramento de parâmetros hematológicos e bioquímocos durante
ozonioterapia em eqüinos.
Resumo.........................................................................................................................39
Abstract........................................................................................................................40
Introdução.....................................................................................................................41
Revisão de literatura.....................................................................................................42
Resultados e discussão.................................................................................................44
Conclusões....................................................................................................................81
Referências bibliográficas............................................................................................82
CAPITULO IV – Ozonioterapia em eqüinos: efeitos principais e da interação do sexo
e dose administrada sobre parâmetros hematológicos e da bioquímica sangüínea.
Resumo.........................................................................................................................88
Abstract........................................................................................................................89
Introdução....................................................................................................................90
Revisão de literatura.....................................................................................................91
Resultados e discussão.................................................................................................92
Conclusões..................................................................................................................108
Referências bibliográficas..........................................................................................109
CAPITULO V - Comportamento, monitoramento e efeitos da ozonioterapia sobre a
freqüência cardíaca e respiratória de eqüinos no período de recuperação.
Resumo.......................................................................................................................113
Abstract......................................................................................................................114
Introdução...................................................................................................................115
Revisão de literatura...................................................................................................116
Resultados e discussão...............................................................................................118
Conclusões.................................................................................................................134
Referências bibliográficas..........................................................................................135
x
LISTA DE TABELAS
CAPITULO II
TABELA 1 - Estimativas dos parâmetros de hematócrito (%), hemoglobina (g dL
-1
),
eritrócitos (x10
6
µL
-1
) e leucócitos (x10
3
µL
-1
), em função do tempo de
repouso (H) para cada combinação (tratamento x sexo) e período de
aplicação...............................................................................................25
TABELA 2 - Estimativas dos parâmetros de segmentados (x10
3
µL
-1
), bastonetes
(x10
3
µL
-1
) e linfócitos (x10
3
µL
-1
), em função do tempo de repouso
(H) para cada combinação (tratamento x sexo) e período de
aplicação...............................................................................................27
TABELA 3 - Estimativas dos parâmetros de monócitos (x10
3
µL
-1
), eosinófilos (x10
3
µL
-1
) e basófilos (x10
3
µL
-1
), em função do tempo de repouso (H) para
cada combinação (tratamento x sexo) e período de aplicação.............28
TABELA 4 - Estimativas dos parâmetros de plaquetas (por campo) e glicose (mg dL
-
1
), em função do tempo de repouso (H) para cada combinação
(tratamento x sexo) e período de aplicação. ........................................29
TABELA 5 - Estimativas dos parâmetros de fibrinogênio (mg dL
-1
), creatina quinase
(U L
-1
) e gama glutamiltransferase (U L
-1
), em função do tempo de
repouso (H) para cada combinação (tratamento x sexo) e período de
aplicação...............................................................................................32
CAPITULO III
TABELA 1 – Valores mínimos, máximos e médios do hematócrito (%) em eqüinos
machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio (Aplicações
1-9).....................................................................................................46
xi
TABELA 2 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de hemoglobina
(g dL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de
ozônio (Aplicações 1-9).......................................................................48
TABELA 3 – Valores mínimos, máximos e médios dos eritrócitos (x10
6
μL
-1
) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9).................................................................................50
TABELA 4 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de leucócitos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9)..........................................................52
TABELA 5 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de segmentados
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL
de ozônio (Aplicações 1-9)...................................................................55
TABELA 6 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de bastonetes
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL
de ozônio (Aplicações 1-9)...................................................................58
TABELA 7 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de linfócitos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9)..........................................................60
TABELA 8 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de monócitos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9)..........................................................63
TABELA 9 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de basófilos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9)..........................................................65
xii
TABELA 10 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de eosinófilos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9)..........................................................67
TABELA 11 – Valores mínimos, máximos e médios de plaquetas (por campo) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9).................................................................................69
TABELA 12 – Valores mínimos, máximos e médios de glicose (mg dL
-1
) em eqüinos
machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio (Aplicações
1-9).......................................................................................................72
TABELA 13 – Valores mínimos, máximos e médios de fibrinogênio (mg dL
-1
) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9)...................................................................................74
TABELA 14 – Valores mínimos, máximos e médios de creatina quinase (U L
-1
) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9).................................................................................76
TABELA 15 – Valores mínimos, máximos e médios da gama glutamiltransferase (U
L
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de
ozônio (Aplicações 1-9).....................................................................78
CAPITULO IV
TABELA 1 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre o hematócrito (%) em cada período de
aplicação...............................................................................................93
TABELA 2 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a hemoglobina (g dL
-1
) em cada período de
aplicação...............................................................................................95
xiii
TABELA 3 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os eritrócitos (x10
6
µL
-1
) em cada período de
aplicação...............................................................................................96
TABELA 4 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os leucócitos totais (x10
3
µL
-1
) em cada período
de aplicação..........................................................................................97
TABELA 5 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os segmentados (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação...............................................................................................98
TABELA 6 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os bastonetes (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação...............................................................................................99
TABELA 7 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os linfócitos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.............................................................................................100
TABELA 8 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os monócitos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.............................................................................................101
TABELA 9 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os eosinófilos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.............................................................................................102
TABELA 10 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os basófilos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação...........................................................................................102
xiv
TABELA 11 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre as plaquetas (por campo) em cada período de
aplicação...........................................................................................103
TABELA 12 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a creatina quinase (U L
-1
) em cada período de
aplicação...........................................................................................103
TABELA 13 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a gama glutamiltransferase (U L
-1
) em cada
período de aplicação.........................................................................104
TABELA 14 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a glicose (mg dL
-1
) em cada período de
aplicação...........................................................................................105
TABELA 15 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre o fibrinogênio (mg dL
-1
) em cada período de
aplicação...........................................................................................106
CAPITULO V
TABELA 1 - Estimativas dos parâmetros freqüência cardíaca (FC) e freqüência
respiratória (FR) em função do tempo de recuperação (T) para cada
combinação (tratamento x sexo) e período de aplicação..................120
TABELA 2 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência cardíaca (bpm) antes da aplicação do ozônio,
considerando os dias de aplicação......................................................128
TABELA 3 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência cardíaca (bpm) até 10 minutos após a aplicação
do ozônio, considerando os dias de aplicação....................................129
xv
TABELA 4 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência cardíaca (bpm) até 20 minutos da aplicação do
ozônio, considerando os dias de aplicação.........................................131
TABELA 5 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência respiratória (rpm) antes da aplicação do
ozônio, considerando os dias de aplicação.........................................131
TABELA 6 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência respiratória (rpm) até 10 minutos após a
aplicação do ozônio, considerando os dias de aplicação....................132
TABELA 7 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência respiratória (rpm) até 20 minutos após a
aplicação do ozônio, considerando os dias de aplicação....................133
xvi
LISTA DE FIGURAS
CAPITULO III
FIGURA 1 – Estimativas do hematócrito (%) em MT500 (machos tratados com 500
mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados
com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o
período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de controle, LM:
limite médio, LIC: limite inferior de controle. (Aplicações de 1-
9)...........................................................................................................47
FIGURA 2 – Estimativas da hemoglobina (g dL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9)...............................................................................49
FIGURA 3 – Estimativas de eritrócitos (x10
6
µL
-1
) MT500 (machos tratados com 500
mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados
com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o
período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de controle, LM:
limite médio, LIC: limite inferior de controle. (Aplicações de 1-
9).............................................................................................................51
FIGURA 4 – Estimativas de leucócitos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle. (Aplicações
de 1-9).....................................................................................................53
xvii
FIGURA 5 – Estimativas de segmentados (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9)...............................................................................56
FIGURA 6 – Estimativas de bastonetes (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9)...............................................................................59
FIGURA 7 – Estimativas de linfócitos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9)...............................................................................61
FIGURA 8 – Linfócito com granulações azurófilas detectado durante o período de
aplicação do ozônio..............................................................................61
FIGURA 9 – Estimativas da freqüência de linfócitos com granulações azurófilas (%)
em MT500 (machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas
com 500 mL), MT1000 (machos tratados com 1000 mL) e FT1000
(fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o período de aplicação do
ozônio...................................................................................................62
xviii
FIGURA 10 – Estimativas de monócitos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9).............................................................................64
FIGURA 11 – Estimativas de basófilos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9)...............................................................................66
FIGURA 12 – Estimativas de eosinófilos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9).............................................................................68
FIGURA 13 – Estimativas de plaquetas (/por campo) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9).............................................................................70
FIGURA 14 – Estimativas de glicose (mg dL
-1
) em MT500 (machos tratados com 500
mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9).............................................................................73
xix
FIGURA 15 – Estimativas de fibrinogênio (mg dL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações de 1-9).............................................................................75
FIGURA 16 – Estimativas de creatina quinase (U L
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
(Aplicações 1-9).................................................................................77
FIGURA 17 – Estimativas de gama glutamiltransferase (U L
-1
) em MT500 (machos
tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite
superior de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de
controle. (Aplicações de 1-9).............................................................79
CAPITULO V
FIGURA 1 – Estimativas da freqüência cardíaca (bpm) imediatamente antes de cada
aplicação. MT500 (machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas
tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados com1000 mL) e
FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL). LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de
controle...............................................................................................121
xx
FIGURA 2 – Estimativas da freqüência cardíaca (bpm) até 10 minutos depois da
administração do ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500
mL), MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas
tratadas com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite
médio, LIC: limite inferior de controle............................................122
FIGURA 3 – Estimativas da freqüência cardíaca (bpm) até 20 minutos depois da
administração de ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle..........................................................123
FIGURA 4 – Estimativas da freqüência respiratória (rpm) imediatamente antes da
administração do ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle..........................................................124
FIGURA 5 – Estimativas da freqüência respiratória (rpm) até 10 minutos depois da
administração de ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle..........................................................125
xxi
FIGURA 6 – Estimativas da freqüência respiratória (rpm) até 20 minutos depois da
administração do ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle..........................................................126
xxii
RESUMO
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, dezembro de
2006. Efeitos da ozonioterapia sobre parâmetros clínicos, hematológicos e da
bioquímica sangüínea em eqüinos. Orientadora: Maria Verônica de Souza, Co-
Orientadores: John Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos
Benjamim.
O objetivo deste estudo foi avaliar em eqüinos submetidos a ozonioterapia, os
parâmetros hematológicos (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais,
segmentados, bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e
da bioquímica sangüínea (glicose, fibrinogênio, creatina quinase e gama
glutamiltransferase), segundo o comportamento imediato (até 24 horas) entre
aplicações da mistura do gás (período de repouso), assim como as tendências,
positivas e/ou negativas durante o período de aplicação do ozônio e a influência da
dose, sexo ou interação destes fatores nestes parâmetros. Também foram monitorados
o comportamento, tendências e efeitos do ozônio sobre parâmetros fisiológicos, como
freqüência cardíaca (FC) e respiratória (FR) durante o período de recuperação (até 20
minutos após a ozonioterapia). Para isso, foram utilizados 12 eqüinos mestiços sadios,
sendo 6 machos e 6 fêmeas, com idades compreendidas entre 4 e 20 anos. Os animais
foram submetidos à ozonioterapia, mediante administração de 500 ou 1000 mL da
mistura do gás, por via intravenosa, a cada três dias, por um período total de 24 dias.
Os animais foram divididos em quatro grupos: MT500, MT1000, FT500 e FT1000,
sendo machos (M) que receberam 500 mL e 1000 mL e, fêmeas (F) que receberam
500 e 1000 mL, respectivamente. Os diferentes efeitos do ozônio sobre os parâmetros
hematológicos e da bioquímica sangüínea foram inicialmente estudados durante o
período de repouso (1, 6 e 24 horas após cada aplicação de ozônio), e para as
freqüências cardíaca e respiratória, esta avaliação imediata foi durante o período de
recuperação (até 20 minutos após cada aplicação de ozônio). Além disso, os
parâmetros foram avaliados ao longo do tempo do período experimental. Os
resultados demonstraram que os únicos parâmetros que sofreram efeito linear durante
o período de repouso foram a contagem total de plaquetas e a concentração de glicose
e de gama glutamiltransferase, que revelaram concentração aumentada (plaquetas) ou
diminuída (glicose e gama glutamiltransferase). Foram observadas tendências
positivas após ozonioterapia, mediante aumento nos valores do hematócrito e
xxiii
eritrócitos, sendo que, com relação aos últimos, as fêmeas mostraram médias
superiores. Também ocorreu aumento na concentração dos segmentados, ainda que de
forma tardia. Adicionalmente, foi possível verificar aumento transitório nos valores
dos bastonetes, assim como comprovar o aumento na contagem das plaquetas e o
efeito hipoglicemiante em todos os eqüinos. Com relação às enzimas, somente a gama
glutamiltransferase apresentou uma elevação inicial bastante evidente, com posterior
redução em todos os grupos. Com relação ao sexo, os resultados demonstraram que
este foi um fator de relevância na concentração dos eritrócitos (p<0,05) em resposta à
ozonioterapia, sendo que as fêmeas revelaram valores médios mais altos deste
parâmetro, independentemente da dose do ozônio administrada. Por fim, com relação
aos parâmetros freqüência cardíaca (FC) e respiratória (FR), observou-se aumento na
FC (p>0,05) e FR (p<0,05) em todos os eqüinos expostos ao ozônio, independente do
sexo, dose ou da interação destes fatores. Transcorridos o período de recuperação (até
20 minutos posteriores à ozonioterapia), os valores médios desses parâmetros
diminuíram, sendo um indício de que a terapia auxilia no condicionamento cárdio-
respiratório dos eqüinos. Efeitos adversos não foram observados nos animais em
decorrência da administração do ozônio pela via intravenosa durante o período
experimental.
xxiv
ABSTRACT
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, December
2006. Effects of ozone therapy on equine clinical, hematological and blood
biochemistry parameters. Adviser: Maria Verônica de Souza, Co-Advisers: John
Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos Benjamim.
The purpose for this study was to evaluate equine hematological (hematocrit,
hemoglobin, erythrocytes, leukocytes, neutrophils, bands, lymphocytes, monocytes,
basophils, eosinophils and platelets) and biochemical parameters (glucose, fibrinogen,
creatine kinase and gamma glutamyltransferase) submitted to ozone therapy, in behalf
of the immediate response pattern (the following 24 hours) in between the gas mixture
applications (resting period), as well as the positive and/or negative tendencies during
the application period and the dose and sex influence or the interaction of these
factors on the parameters. Moreover, pattern, tendency and effects of ozone therapy
over heart (HR) and respiratory (RR) rates during the recovery period (up to 20
minutes after ozone therapy) were monitored. Twelve cross bred horses, 6 males and
6 females, between 4 and 20 years old were exposed to ozone therapy through the
intravenous application of 500 and 1000 mL of the gas mixture, every three days,
during 24 days. Four groups were conformed: MT500, MT1000, FT500 and FT1000,
which comprised males (M) and females (F) receiving 500 and 1000 mL of ozone,
respectively. The different ozone effects over the hematological and blood
biochemistry parameters were at first studied during the resting period (1, 6 and 24
hours after each ozone application) and for heart and respiratory rates this immediate
evaluation was during the recovery period (until 20 minutes after each ozone
application). Furthermore, the parameters were assessed during the experimental time.
The results revealed that only the platelets count and glucose and gamma
glutamyltransferase concentrations, revealed a linear pattern in response to ozone
therapy during the resting period. The former was increased (platelets) and the others
diminished (glucose and gamma glutamyltransferase). Positive tendencies were
observed after ozone therapy through the hematocrit and erythrocytes values increase,
the later count was greater within the mares. Also an augment was registered on
neutrophils count even though in a later phase. Furthermore, a transient augment in
bands count, platelets and a hypoglycemic effect within each experimental group was
xxv
seen. Only gamma glutamyltransferase showed an evident initial increase with a later
decrease in each group. According to sex, the results revealed that this was a relevant
factor on the erythrocytes blood count (p<0.05) in response to ozone therapy, where
the females showed higher mean values of this parameter, independently of the
administered dose. Finally, related to the heart rate (HR) and respiratory frequency
(RF), the results revealed an increase in HR (p>0.05) and RF (p<0.05) in all horses
exposed to ozone, independent on sex, dose or the interaction between these factors.
After the recovery period (until 20 minutes after ozone therapy), the HR and RR mean
values decreased, fact that could imply preconditioning on the horses
cardiorespiratory performance. Adverse effects induced by ozone were not observed
in the animals through the intravenous application during the experimental period.
1
CAPITULO I
CONSIDERAÇÕES GERAIS
INTRODUÇÃO GERAL
Desde os mais remotos tempos, têm-se buscado formas alternativas de
tratamento com terapias economicamente viáveis e eficientes. Entre estas formas
relata-se a ozonoterapia, que é uma forma de tratamento que utiliza uma mistura de
oxigênio-ozônio (O
2
-O
3
), mediante a passagem de oxigênio puro por uma descarga
elétrica de alta voltagem e alta freqüência. Este tratamento é realizado por um
equipamento de eletromedicina, que produz um gás com distintas concentrações de
ozônio.
Após penetrar no organismo, o ozônio é capaz de melhorar a oxigenação e,
conseqüentemente, o metabolismo, o que contribui para a eliminação de produtos
tóxicos gerados pelo catabolismo celular e para a regulação dos mecanismos de defesa
imunológica, inclusive com efeito imunomodulador (Recio del Pino et al., 1999).
O poder oxigenante do ozônio é superior ao do oxigênio, uma vez que
estimula diferentes sistemas enzimáticos protetores do organismo (Díaz et al., 2001).
Mais especificamente no sangue, melhora a circulação sangüínea através dos
capilares, mediante discreto aumento da pressão arterial, assim como das propriedades
reológicas do sangue, aumentando a capacidade de distribuição e absorção do
oxigênio nos eritrócitos (Pérez et al., 2003). Como resultado, ocorre uma notável
melhora na microcirculação e, conseqüentemente, do oxigênio para os tecidos,
intensificando a regeneração (Hernández & González, 2001) e cicatrização tecidual
(Recio del Pino et al., 1999). Adicionalmente, possui ação bactericida, fungicida e
viricida (Guerra et al., 1999); reduz a agregação plaquetária, além de atuar como
antiálgico, antiinflamatório e estimulante do sistema reticuloendotelial (Hernández &
González, 2001).
O presente estudo visou a verificação de mudanças (positivas ou negativas) em
parâmetros sob avaliação, mediante a aplicação do ozônio (O
2
-O
3
) em equinos
clinicamente sadios, com a finalidade de se obter uma maior inserção da ozonioterapia
em protocolos da prática veterinária.
2
REVISÃO DE LITERATURA GERAL
O ozônio, que em grego significa “cheiroso”, foi descoberto em 1840 por
Christian Frederick Schönbein, ao submeter o oxigênio a uma descarga elétrica
(Hernández & González, 2001). Porém, o primeiro relato da sua utilização em
medicina humana ocorreu durante a primeira guerra mundial, quando o Dr. Albert
Wolf utilizou o gás no tratamento tópico para desinfecção de feridas e na
potabilização da água.
O ozônio, composto por três átomos de oxigênio, tende a se degradar
rapidamente devido ao seu forte poder oxidativo (Recio del Pino et al., 1999), não
resultando em resíduos tóxicos, já que ao entrar no organismo, se converte
instantaneamente em oxigênio (González et al., 1999). Sendo assim, a ozonioterapia
atua melhorando os parâmetros reológicos e a circulação sangüínea, por aumentar a
elasticidade da hemácia, favorecendo a chegada do oxigênio nos tecidos (Pérez et al.,
2003). Ao reagir com ácidos graxos insaturados da membrana, o ozônio origina
peróxidos hidrófilos que estimulam a formação de compostos desoxigenantes, que
agem sobre a oxihemoglobina, para liberar o oxigênio, aumentando assim a
distribuição deste nos tecidos (Hernández & González, 2001).
A melhora na perfusão dos tecidos danificados permite a chegada de
componentes humorais, o que auxilia no controle da inflamação. O ozônio tem
afinidades com o grupo sulfidrila, que é característico dos aminoácidos essenciais
como a cisteína e a metionina, o que lhe permite intervir no metabolismo das
proteínas (Pérez et al., 2003), contribuindo assim para a produção de citocinas, síntese
de anticorpos e ativação dos linfócitos T, o que melhora significativamente a
oxigenação e o metabolismo celular por meio da vasodilatação (Clive et al., 2004).
Também aumenta a resposta enzimática antioxidativa (Guerra et al., 1999; Clive et
al., 2004), o que lhe confere um papel imunorregulador.
O ozônio também age sobre o mecanismo hemostático, por meio da inibição
no aumento de cálcio plasmático induzido pelo colágeno e trombina, o que pode
resultar na inibição da agregação plaquetária (Díaz et al., 2001). Atua diminuindo a
viscosidade do sangue e do plasma, por redução das macromoléculas plasmáticas e da
capacidade de formação de coágulo, o que pode ser constatado pelo aumento no
tempo de trombina (TT), fator von Willebrand (vWF) e do plasminogênio (t-PA),
assim como pela diminuição do fibrinogênio (Zee & De Monte, 2001).
3
Adicionalmente, aumenta a fluidez da membrana do eritrócito e diminui a capacidade
de aglutinação dos glóbulos vermelhos e, no interior dessas células, acelera a glicólise
(Bulies, 1996).
Segundo Bulies (1996), o ozônio também age nos mecanismos de oxi-redução
(NADH-NADPH), ativando a via da pentose/fosfato (via alternativa do ciclo de Krebs
para a glicólise), o que incrementa a transformação da glicose.
Esse gás, que tem alto poder oxidante de forma seletiva, age sobre a camada
fosfolipídica da membrana dos eritrócitos desenvolvendo uma cadeia de reações dose-
dependente, que pode ser benéfica ou deletéria ao organismo (Giunta et al., 2001).
Quando em contato com o sangue, provoca a formação de espécies reativas de
oxigênio (ROS). Com a formação dos ROS e radicais livres, o sistema antioxidante
endógeno é ativado. Se a formação da espécie reativa supera o sistema de defesa, o
organismo começa a sofrer o estresse oxidativo, com a degradação subseqüente de
lipídeos, proteínas e DNA, com conseqüente dano celular. Entretanto, em
concentrações adequadas, o ozônio promove o processo oxidativo celular, mas de
forma benéfica, já que também ativa o sistema antioxidante endógeno. Parte do gás é
inibida por este mesmo sistema de defesa e o restante reage com ácidos graxos
poliinsaturados, gerando peróxido de hidrogênio (molécula não ionizada) e produtos
de oxidação lipídica (Tylicki et al., 2003).
O aumento de peróxido de hidrogênio gera um processo celular tóxico que é
transferido ao ambiente intraplasmático, onde então é neutralizado pela glutationa
reduzida (GSH), que faz parte do sistema endógeno não-enzimático de defesa contra o
estresse oxidativo. Esta decresce durante a ozonioterapia, devido ao consumo celular
aumentado durante o tratamento (Tylicki et al., 2003).
No metabolismo celular normal, constantemente se produz energia (adenosina
trifosfato -ATP), sendo o oxigênio um elemento importante para esta produção. Em
casos de isquemia, este processo é interrompido, e o ATP é degradado em adenosina
monofosfato (AMP) e adenosina. Esta última, extracelularmente, é metabolizada em
inosina e hipoxantina. Quando a oxigenação é adequada, a hipoxantina é degradada
em ácido úrico pela xantina-desidrogenase (XD). Em casos de hipoxia, a XD é
convertida em xantina-oxidase (XO), tendo como resultado um acúmulo de
hipoxantina. Subseqüentemente, na reperfusão, a XO interfere na conversão da
hipoxantina em radicais superóxidos que reagem com as membranas celulares,
ocasionando lesão (Abreu, 2003).
4
A via xantina/xantina oxidase tem efeitos deletérios no organismo, gerando
espécies reativas de oxigênio em animais com quadro de isquemia. O tratamento
prévio com a ozonioterapia tem mostrado uma diminuição significativa no acúmulo
de xantina e, portanto, na produção de espécies reativas de oxigênio, o que afirma o
seu efeito antioxidante. Adicionalmente, estudos realizados em humanos e na espécie
eqüina têm demonstrado redução na concentração das transaminases aspartato
aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e do lactato (Scrollavezza et
al., 1997; Zee & De Monte, 2001).
Pela sua alta capacidade de interação com os ácidos graxos insaturados na
membrana fosfolipídica (ozonólise), que leva à formação de peróxidos hidrofílicos,
ocorre a detoxificação de sustâncias, como por exemplo, os radicais livres (Tylicki et
al. 2003). Além disso, devido ao fato de que processos enzimáticos não inativam o
ozônio, tem-se reconhecido o seu poder bactericida, viricida e fungicida (Pérez et al.,
2003). Os efeitos bactericidas ocorrem pela interrupção da integridade dos
fosfolipídios e lipoproteínas da membrana citoplasmática e da parede celular das
bactérias (Bulies, 1996; Clive et al., 2004), sendo que as Gram negativas são as mais
sensíveis ao ozônio, mediante a peroxidação desses componentes de membrana. Seu
efeito viricida é por causar danos na região do capsídeo, já que este é estruturado por
fosfolipídios e glicoproteínas, mas a sensibilidade do vírus é muito variável. O
mecanismo fungicida ainda não é muito bem compreendido; entretanto já foi
demonstrado o poder inibitório do ozônio sobre estes agentes (Hernández &
González, 2001).
A vida média do ozônio é de 40 minutos a 25°C. Após este tempo, se
decompõe em oxigênio, dependendo da temperatura ambiental. Sendo assim, produtos
ozonizados devem ser produzidos imediatamente antes da sua utilização (Bulies et al.,
1997). Em medicina humana, utilizam-se concentrações de ozônio-oxigênio entre 1 e
100 µg mL-
1
(Hernández & González, 2001). Em veterinária, utilizam-se as
concentrações de 6, 30 e 50 µg mL-
1
(Scrollavezza et. al., 1997; Ogata & Nagahata,
2000; Alves et. al., 2004).
Na medicina humana, a ozonioterapia vem sendo utilizada em distintos tipos
de tumores; em afecções inflamatórias (conjuntivite, estomatite, hepatite, pancreatite,
cistite, glomerulonefrite, endometrite, epididimite, orquite, osteomielite, tendinite,
espondilite anquilosante, septicemia); em feridas, eczemas, úlceras, gangrenas e
psoríase; anemias; processos isquêmicos e arteriosclerose; glaucoma, diabetes; asma;
5
tétano; hérnia de disco lombar, mialgia, neuropatias e osteoartrite. Também tem sido
utilizada nos casos de amebíase, giardíase, babesiose, bartonelose, brucelose, doença
de chagas, erlichiose, coronavirose, leishmaniose, listeriose, salmonelose,
toxoplasmose e, inclusive, na intoxicação alimentar (Al-Dalien et al., 1999; Recio Del
Pino et al., 1999; Espinosa et al., 2000; Piloto & Urrutia, 2000) e no choque séptico
(Zamora et al., 2001). A via de administração nesta espécie pode ser a intravenosa,
intramuscular, subcutânea, intra-articular, assim como por insuflação vaginal e retal.
Também pode ser realizada a autohemotransfusão (extração e ozonização de sangue,
que posteriormente é administrado ao paciente) e o tratamento tópico (com gás ou
óleo ozonificado) (Guerra et al., 1999; Hernández & González, 2001).
Na medicina veterinária, ainda são poucos os relatos de afecções tratadas pela
ozonioterapia. Em suínos, aves e coelhos têm-se utilizado a aplicação tópica de óleo
ozonizado para acelerar a cicatrização, com uma ou duas aplicações por dia, durante
uma semana (Camps et al., 2003; Navil et al., 2004). Em vacas leiteiras com mastite
clínica aguda, a terapia tem sido utilizada por via intra-mamária, por um período de
três semanas, sendo um tratamento a cada dois dias na primeira semana e,
posteriormente, um único tratamento semanal (Ogata & Nagahata, 2000). Em
eqüinos, há relatos da sua aplicação em afecções locomotoras (sinovite da bursa do
osso navicular; osteoartrite da articulação interfalangiana distal; tenopatia no local de
inserção do tendão do músculo flexor digital profundo) (Pastoriza, 2002), tratamento
de processos isquêmicos (Alves et al., 2004) e na diminuição dos efeitos negativos do
metabolismo aeróbico/anaeróbico, em condições de máximo esforço em animais de
corrida (Scrollavezza et al., 1997), sendo neste último, utilizado um protocolo de
aplicação a cada três dias. Segundo Alves et al. (2004), a utilização do ozônio é uma
possível alternativa no tratamento de eqüinos acometidos por abdome agudo, já que as
propriedades bioquímicas do ozônio induzem à modulação de enzimas antioxidantes,
o que leva a um efeito conservador do trato gastrointestinal.
A ozonoterapia é reconhecida e aplicada em Cuba, vários países da Europa e
Ásia. Alguns estados norteamericanos estão legalizando a sua utilização como terapia
alternativa (Scrollavezza et al., 1997; Ogata & Nagahata, 2000; Hernández &
González, 2001; Di Paolo et al., 2004). No Brasil, o tratamento com ozônio medicinal
vem sendo realizado desde 1975, após a sua introdução pelo médico paulista Heinz
Konrad. Desde o ano de 1995, a Dra. Claudia Catelani Cardoso (UNIFENAS-MG)
vem utilizando a ozonioterapia na área clínica, com pesquisas avaliando as atividades
6
antiinflamatórias e cicatrizantes do óleo ozonizado (oleozon) e na prevenção de
osteomielite. Também o Dr. Glauco de Souza Brito, do Departamento de Imunologia
Clínica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo vem estudando os
efeitos do gás desde 2003. Além disso, durante a I Conferência Internacional sobre o
uso médico e odontológico do ozônio, realizada em Santo André/SP (17 a 19/09/04),
se constituiu a Sociedade Brasileira do Ozônio.
São raros os efeitos colaterais registrados em humanos. Entretanto, o ozônio
pode ser irritante e tóxico quando administrado por via respiratória, podendo
ocasionar alterações na densidade do tecido pulmonar, irritação do epitélio traqueal e
bronquial, além de enfisema (Di Paolo et al., 2004), o que pode resultar em
dimunuição da resistência a agentes infecciosos.
Os sinais de intoxicação descritos na espécie humana são os seguintes: tosse,
congestão nasal, irritação das vias aéreas superiores, dor na região peitoral,
dificuldade ou dor ao respirar, falta de ar, dor de cabeça, fadiga, mudanças no campo
visual, epífora, diminuição na freqüência cardíaca e na pressão arterial. Por outro
lado, todos esses efeitos dependem da dose e da exposição prolongada ao ozônio
(González et al., 1999). Em bovinos pode ocorrer hipoglicemia transitória
1
.
Apesar das propriedades terapêuticas do ozônio em diversos sistemas, ainda
são poucos os trabalhos científicos em animais domésticos. Nesse sentido, é preciso
investigar melhor a ozonioterapia para que se possa implementar efetivamente a sua
utilização na Medicina Veterinária.
_____________________________________
1
Comunicação pessoal. Dr. John Jairo Hincapié. Escuela Agrícola Panamericana , Honduras. Tel. (504)-776-
6140, ext. 2216. E-mail: [email protected]
7
MATERIAL E MÉTODOS
A parte experimental da pesquisa foi realizada entre os meses de janeiro e abril
de 2006, na Escuela Agrícola Panamericana (EAP), no Vale de El Zamorano,
Honduras.
Os exames complementares foram realizados no Laboratório Molina e no
Centro de Diagnóstico Médico Veterinário (DIMEVET) da Clínica de Veterinários de
Eqüinos (VETEQUI), na cidade de Tegucigalpa, Honduras.
Um estudo piloto foi realizado antes do experimento propriamente dito,
utilizando-se dois animais que não pertenceram ao grupo experimental, com a
finalidade de se verificar o comportamento dos parâmetros que foram posteriormente
avaliados nos animais durante a pesquisa.
A realização deste estudo foi aprovada pelo Conselho de Ética do
Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais,
Brasil.
Animais
Foram utilizados doze eqüinos mestiços de Quarto de Milha com Puro Sangue
Andaluz e de Quarto de Milha com Peruano, sendo seis machos e seis fêmeas, com
idades compreendidas entre 4 e 20 anos (média de 11 anos). Os critérios abaixo
relacionados foram utilizados para a seleção desses animais:
a. Se mostrar clinicamente sadio durante a realização do exame físico.
b. Apresentar parâmetros hematológicos e da bioquímica sangüínea dentro dos valores
considerados como de referência para a espécie.
c. As fêmeas não poderiam estar gestantes nem lactantes.
Após a seleção, os animais foram semi-confinados em baias abertas e anexas a
um pequeno piquete, sendo alimentados com feno de capim estrela (Cynodon
nlemfuensis) e ração (proteína: 15%, gordura mínima: 3%, umidade máxima: 13%,
fibra máxima: 10% e cinzas máximas: 10%). A água foi deixada ad libitum.
Todos os animais foram vermifugados 30 dias antes do início do experimento.
Durante a realização da fase experimental, os animais foram levados dos
piquetes anexos para as baias de confinamento para receberem a aplicação do ozônio.
As baias apesar de abertas possuíam telhado, de forma que, os animais não eram
8
expostos ao sol, reduzindo assim, a possibilidade de alterações que levassem ao
estresse térmico, além de modificações na freqüência cardíaca e respiratória e nos
parâmetros hematológicos e da bioquímica sangüínea que seriam avaliados no estudo.
Sensibilização dos animas à ozonioterapia
Para a sensibilização dos eqüinos a ozonioterapia, foram colhidos 250 mL de
sangue da veia jugular, mediante a utilização de bolsas de flebotomia, contendo o
anticoagulante citrato de sódio a 3,8%. Posteriormente, este sangue foi ozonizado com
250 mL de ozônio a uma concentração de 30 g mL-
1
, segundo a técnica utilizada por
Scrollavezza et al. (1997). O aparelho ozonizador utilizado foi da marca
Meditrónica
®1
, sendo conectado a um tanque portátil de oxigênio de 2000 lb.
Imediatamente após a ozonização do sangue ex vivo, realizou-se a
autohemotransfusão.
Tratamento de manutenção
Após a sensibilização (tempo zero, Quadro 1), os animais foram submetidos a
dois tratamentos, sendo o T500, aquele em que seis eqüinos, três fêmeas (F) e três
machos (M), receberam por via intravenosa, uma dose crescente da mistura oxigênio-
ozônio, chegando a um volume total de 500 mL de gás. No segundo tratamento
(T1000), os outros seis animais (três fêmeas e três machos) também receberam uma
dose crescente da mistura do gás, porém o volume máximo foi de 1000 mL (Quadro
1). Foi utilizado como veículo para aplicação do gás, 250 mL de solução salina a
0,9%. As aplicações dos tratamentos foram realizadas a cada três dias, perfazendo um
total de nove aplicações por tratamento. Desta maneira foram formados quatro grupos
de trabalho MT500, FT500, MT1000 e FT1000.
A dosagem final recebida pelos eqüinos foi de 35 e 70 µg kg
-1
no tratamento
de 500 e 1000 mL, respectivamente. A concentração da mistura de gás foi de 30 µg
mL
-1
.
______________________
1
Acupuntura de Equinos: Carretera 42 #7 A sur 92, Apto. 1203, Balsos de Oviedo, Medellín, Colombia
9
QUADRO 1 – Concentrações do ozônio utilizadas na sensibilização e períodos
de aplicações nos eqüinos.
Sensibilização
(AHT)
Tratamento 500 mL ozônio (O
3
)
(T500)
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
250
500
500
500
500
500
500
500
500
0
Sensibilização
(AHT)
Tratamento 1000 mL ozônio (O
3
)
(T1000)
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
250
500
750
1000
1000
1000
1000
1000
1000
0
AHT: autohemotransfusão ozonizada.
Durante a fase experimental os animais continuaram recebendo água ad
libitum, porém com restrição alimentar, até que fosse efetuada a coleta de sangue
correspondente a uma hora (1h) após à ozonioterapia, quando então recebiam somente
feno de capim estrela (Cynodon nlemfuensis). Este jejum alimentar teve como
principal finalidade evitar coleta de amostras com valores glicêmicos alterados pela
alimentação. Adicionalmente, como a chegada do alimento ao cólon ocorre em torno
de três horas após a sua ingestão (Stein, 2002), aliado ao fato de que o amido pode
aumentar o nível glicêmico num prazo de 2 a 3 horas, com retorno aos valores
normais em seis horas (Casalecchi, 2003), a última amostragem do dia foi realizada
seis horas após o acesso ao feno, sem que fosse fornecido ração ao animal.
Houve acompanhamento dos eqüinos por pelo menos dois médicos
veterinários durante a fase de sensibilização e manutenção dos tratamentos, para que
se pudesse intervir prontamente caso o bem-estar do animal não estivesse sendo
mantido.
Parâmetros clínicos avaliados
Todos os animais foram submetidos a exame físico diário, onde foram
avaliados os parâmetros freqüência cardíaca (batimentos por minuto - bpm),
freqüência respiratória (respirações por minuto - rpm) e temperatura retal.
Além disso, como parte do exame clínico, foram avaliados o tempo de
preenchimento capilar (TPC) e a coloração das mucosas as mucosas e o tempo de
preenchimento capilar (TPC).
10
Esses parâmetros foram considerados normais de acordo com as classificações
descritas por Speirs (1999) para a espécie eqüina.
Parâmetros laboratoriais avaliados
Amostras de sangue foram colhidas para realização de hemograma
(hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados, bastonetes,
linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e contagem total de plaquetas) e de
plasma ou soro para a determinação dos valores dos parâmetros bioquímicos
(fibrinogênio, glicose, creatina quinase - CK e gama glutamiltransferase - GGT), que
se repetiu durante todo o experimento.
Os parâmetros foram analisados imediatamente antes e em três tempos (1, 6 e
24 horas) após administração do ozônio, perfazendo um total de 36 amostras por
animal durante todo o período experimental. Adicionalmente, foi realizada uma
medição três dias após a última administração do ozônio, perfazendo um total de 444
amostras.
Obtenção das amostras
Amostras de sangue (5 mL) foram colhidas por punção da veia jugular, em
tubos de vidro a vácuo, contendo o anticoagulante EDTA tripotássico, para realização
de hemograma completo.
Para a determinação da concentração da glicose, creatina quinase e gama
glutamiltransferase, foram colhidos 10 mL de sangue em tubos de vidro a vácuo sem
anticoagulante, também por punção da veia jugular. Essas amostras foram submetidas
à sedimentação em temperatura ambiente e, posteriormente, por centrifugação a 3.500
rpm durante 10 minutos, para a obtenção do soro.
A concentração do fibrinogênio foi determinada mediante a colheita de 5 mL
de sangue em tubos de vidro a vácuo contendo o anticoagulante citrato de sódio
(3,8%). A amostra foi centrifugada por 10 a 15 minutos a 3.500 rpm, para a obtenção
do plasma, que foi transferido para tubos de polietileno.
As amostras de sangue, soro e plasma foram mantidas sob refrigeração em
recipientes térmicos contendo gelo até posterior análise, que não excedeu de um total
de 10 horas.
11
A primeira amostragem, efetuada antes das aplicações do ozônio (0 h), durante
todo o período experimental (até o 27º dia), foi realizada às 7:00 horas, quando a
temperatura ambiente estava mais confortável (entre 28-32 °C).
Técnicas utilizadas para a determinação dos parâmetros laboratorias
Hemograma completo
A contagem do número de hemácias (células x 10
6
L-
1
) e leucócitos totais
(células x 10
3
L-
1
), assim como a mensuração da hemoglobina (g dL-
1
) e hematócrito
(%) foi realizada mediante a utilização do aparelho semi-automático Cell Dyn 400
1
.
A contagem das plaquetas foi determinada nos esfregaços sanguíneos
realizados, mediante visualização em microscópio da marca Olympus CX31
2
.
A determinação do diferencial de células brancas também foi realizada
utilizandose microscopia de luz.
Fibrinogênio
Para a determinação do fibrinogênio (mg dL
-1
) utilizou-se o aparelho
Humaclot Duo
3
, que é um coagulômetro que realiza a mensuração desse parâmetro
mediante um sistema óptico, que detecta uma variação repentina na densidade óptica,
quando um coágulo é formado.
Glicose, Creatina quinase (CK) e Gama glutamiltansferase (GGT)
Para a análise da glicose (mg dL
-1
), CK (U L
-1
) e GGT (U L
-1
) foram
utilizados kits específicos para cada parâmetro. A leitura foi realizada sob o
fundamento de química seca, mediante fotometria de refletância, utilizando o aparelho
da marca Reflotron®
4
.
________________________________
1
Rankin Biomedical Corporation: 14515 Mackey Road, Ste. 100 Holly, MI 48442, USA.
2
International Medical Equipment: 170 Vallecitos De Oro, San Marcos, CA 92069, USA.
3
Comercializadora de Productos para Laboratorios Ltda..: Santafé de Bogotá, calle 106, No. 29-76, Colombia .
4
Boehringer Mannheim Corporation: 9115 Hague Road, Indianapolis, IN 46256, USA.
12
Análise estatística
A estatística abaixo descrita variou com o objetivo de cada capítulo.
Capítulo II: em cada grupo (MT500, MT1000, FT500 e FT1000), as características
hematológicas (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados,
bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica
sangüínea (fibrinogênio, glicose, CK e GGT) foram avaliadas ao longo do período de
aplicação (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 dias), assim como imediatamente antes (0
hora) e após cada aplicação do ozônio (1, 6 e 24 horas).
O estudo compreendeu uma análise de regressão, para avaliar o
comportamento de todas as características em função do tempo de amostragem
(horas) em cada período de aplicação (dias) e para cada combinação estudada, cujos
coeficientes foram testados pelo teste t a 5% de probabilidade.
Capítulo III: em cada grupo (MT500, MT1000, FT500 e FT1000), as características
hematológicas (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados,
bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica
sangüínea (fibrinogênio, glicose, CK e GGT) foram avaliadas ao longo do período de
aplicação (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 dias).
No dia 27, as características também foram avaliadas para se verificar a
durabilidade dos resultados depois de realizado o último período de aplicação do
ozônio, porém sem que o mesmo fosse administrado aos animais.
Com o objetivo de monitorar o comportamento médio das características ao
longo do período de aplicação, se construíram gráficos de controle de Shewhart,
para cada combinação, sendo a linha média (LM) constituída pela média amostral
geral e os limites de controle inferior (LIC) e superior (LSC), estimados para k=3.
Capítulo IV: foi realizado um esquema fatorial 2x2, relativo aos fatores aplicação de
ozônio com duas dosagens (T500=concentração máxima de 500 mL, e
T1000=concentração máxima de 1000 mL) e sexo (M: macho e F: fêmea),
distribuídos segundo o desenho inteiramente casualizado com três repetições.
Em cada tratamento (MT500, MT1000, FT500 e FT1000), as características
hematológicas (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados,
bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica
13
sangüínea (glicose, CK, GGT e fibrinogênio) foram avaliadas ao longo do período de
aplicação (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 dias).
Para a análise do fatorial 2x2 em cada período de aplicação, os resultados das
características avaliadas foram constituídos pelas médias de todos os tempos de
amostragem. Para isso, foi realizado o teste F, com o objetivo de verificar os efeitos
principais dos dois fatores e da interação entre eles, até 5% de probabilidade, em cada
período de aplicação separadamente.
Os principais efeitos dos dois fatores foram definidos como a diferença no
valor da resposta quando se passa da dossagem T500 para a T1000 ou do sexo F para
o M. Assim, os efeitos positivos foram estimados quando os valores da dosagem
T1000 e do sexo M foram maiores que os da dosagem T500 e do sexo F,
respectivamente. Caso contrário, as estimativas dos efeitos seriam negativas.
No caso da interação, os efeitos positivos foram obtidos quando a média dos
tratamentos MT1000 e FT500 foram maiores que a média dos tratamentos MT500 e
FT1000. Caso contrário, os efeitos seriam negativos.
Capítulo V: em cada grupo (MT500, MT1000, FT500 e FT1000) estudado, os
parâmetros FC e FR foram avaliados ao longo do período de aplicação (0, 3, 6, 9, 12,
15, 18, 21 e 24 dias), assim como imediatamente antes (0 horas) e após cada aplicação
do ozônio (10 e 20 minutos).
A primeira parte do estudo compreendeu uma análise de regressão, para
estudar a relação de dependência dos parâmetros estudados em função do tempo de
recuperação (T) em minutos, para cada período de aplicação (dias) e tratamento, a 5%
de probabilidade pelo teste t.
O segundo estudo foi realizado com o objetivo de monitorar o comportamento
da FC e FR ao longo do período de aplicação (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 dias),
assim foram construídos gráficos de controle de Shewhart, para cada tratamento,
sendo a linha média (LM) constituída pela média amostral e os limites de controle
inferior (LIC) e superior (LSC), estimados para k=3.
Na terceira parte do estudo foi realizado um esquema fatorial 2x2, relativo aos
fatores aplicação do ozônio com dois níveis (T500=concentração máxima de 500 mL,
e T1000=concentração máxima de 1000 mL) e sexo (M: macho e F: fêmea),
distribuídos segundo o desenho inteiramente casualizado com três repetições. Todos
os grupos foram avaliados ao longo do período de aplicação (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21
14
e 24 dias). Para isso, foi realizado o teste F, com o objetivo de verificar os principais
efeitos dos dois fatores e da interação entre eles, até 5% de probabilidade.
Para a análise do fatorial 2x2 e para a construção dos gráficos de controle, em
cada período de aplicação, os resultados dos parâmetros avaliados foram constituídos
pelas médias de todos os tempos de amostragem.
15
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18
CAPITULO II
COMPORTAMENTO DE PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E
BIOQUÍMICOS SANGÜÍNEOS NO PERIODO DE REPOUSO DURANTE
APLICAÇÃO DE OZÔNIO EM EQÜINOS
RESUMO
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, dezembro de
2006. Efeitos da ozonioterapia sobre parâmetros clínicos, hematológicos e da
bioquímica sangüínea em eqüinos. Orientadora: Maria Verônica de Souza, Co-
Orientadores: John Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos
Benjamim.
O objetivo deste estudo foi avaliar, in vivo, o comportamento dos parâmetros
hematológicos (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados,
bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica
sangüínea (glicose, fibrinogênio, creatina quinase e gama glutamiltransferase),
durante o tempo de repouso entre aplicações de ozonioterapia. Para isso, foram
utilizados 12 eqüinos mestiços sadios, sendo 6 machos e 6 fêmeas, com idades
compreendidas entre 4 e 20 anos. Os animais foram submetidos à ozonioterapia,
mediante administração de 500 ou 1000 mL da mistura do gás, por via intravenosa, a
cada três dias, por um período total de 24 dias. Os animais foram divididos em quatro
grupos: MT500, MT1000, FT500 e FT1000, sendo machos (M) que receberam 500
mL e 1000 mL e, fêmeas (F) que receberam 500 e 1000 mL, respectivamente. Os
resultados demonstraram que os únicos parâmetros que sofreram efeito linear durante
o período de repouso foram a contagem total de plaquetas e a concentração de glicose
e de gama glutamiltransferase, que revelaram concentração aumentada (plaquetas) ou
diminuída (glicose e gama glutamiltransferase).
Palavras-chave: cavalos, ozonioterapia, hematologia, bioquímica sangüínea.
19
ABSTRACT
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, December
2006. Effects of ozone therapy on equine clinical, hematological and blood
biochemistry parameters. Adviser: Maria Verônica de Souza, Co-Advisers: John
Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos Benjamim.
The purpose for this study was to assess, in vivo, the hematological
(hematocrit, hemoglobin, erythrocytes, leukocytes, neutrophils, bands, lymphocytes,
monocytes, basophils, eosinophils and platelets) and biochemical parameters (glucose,
fibrinogen, creatine kinase and gamma glutamyltransferase) pattern, within the resting
period in between each ozone application. Twelve cross bred horses, 6 males and 6
females, between 4 and 20 years old were exposed to ozone therapy through the
intravenous application of 500 and 1000 mL of the gas mixture, every three days,
during 24 days. Four groups were conformed: MT500, MT1000, FT500 and FT1000,
which comprised males (M) and females (F) receiving 500 and 1000 mL of ozone,
respectively. Only the platelets count and glucose and gamma glutamyltransferase
concentrations, revealed a linear pattern in response to ozone therapy during the
resting period. The former was increased and the others diminished.
Key-words: horses, ozone therapy, hematology, blood biochemistry.
20
INTRODUÇÃO
Na procura de métodos menos invasivos, mais baratos, porém eficazes e
menos nocivos à saúde, é cada vez mais evidente o interesse por protocolos
medicamentosos alternativos ou complementares aos tratamentos convencionais.
A ozonioterapia é considerada uma forma de medicina alternativa por ainda
não estar completamente elucidado o seu mecanismo de ação no organismo. No
entanto, vários desses mecanismos já constituem linhas de pesquisa e protocolos de
tratamento na medicina humana, estando ainda poucos explorados na medicina
veterinária.
As pesquisas realizadas já demonstram como o ozônio é eficaz no tratamento
de algumas afecções, sendo descritos alguns dos efeitos biológicos que este
desencadeia no organismo humano e animal, embora a maioria da literatura científica
tenha sido desenvolvida sob ambiente in vitro (Bocci 1994a).
Estes efeitos biológicos conferem ao ozônio propriedades terapêuticas que
possibilitam sua utilização na área médica, com baixas porcentagens de risco ou de
efeitos secundários ao ser aplicado pela via de administração adequada (Barroetabeña
et al., 2002; Escarpanter, 2005).
As interpretações na hematologia e da bioquímica sangüínea resultam
complicadas por terem marcadas diferenças segundo a raça, atividade,
condicionamento, idade e sexo do animal sob avaliação (Lumsden et al., 1980,
Ribeiro et al., 2004, Santos, 2006).
Com o intuito de promover a pesquisa e aplicação da ozonioterapia em
medicina veterinária, o objetivo deste estudo foi observar o comportamento imediato
(até 24 horas) entre aplicações da mistura do gás, dos parâmetros hematológicos
(hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados, bastonetes,
linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica sangüínea
(glicose, fibrinogênio, creatina quinase e gama glutamiltransferase), com a finalidade
de verificar o efeito sobre os parâmetros acima mencionados durante o tempo de
repouso e, se possível, detectar qual o melhor momento para realizar eficientemente a
amostragem.
21
REVISÃO DE LITERATURA
Sánchez et al. (1998), constataram, ao aplicar azeite ozonizado em curativos
de feridas de pele em ratos, ação estimuladora do processo de fibroplasia. Matsumoto
et al. (2001), utilizaram por via tópica azeite de oliva ozonizado, com êxito na
regressão de feridas crônicas e fistulas pós-cirúrgicas em pacientes humanos. Já
Camps et al. (2003), demonstraram a eficiente cicatrização de feridas após castração
de suínos da raça Yorkshire, com aplicações tópicas diárias de óleo ozonificado por
cinco dias.
No estudo da influência do ozônio sobre o processo de cicatrização em
camundongos, Sánchez et al. (1998), consideraram períodos maiores de avaliação: 24
horas, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28 e 32 dias depois de realizados tratamentos diários com
óleo de girassol e ozônio por sete dias consecutivos. Neste caso as avaliações foram
realizadas pela observação de alterações macroscópicas e microscópicas.
Verrazo et al. (1995) ao estudar parâmetros hemorreológicos (deformabilidade
de eritrócitos, porcentagem do hematócrito e concentração do fibrinogênio) em
pacientes humanos com doença arterial vaso-oclusiva, realizaram amostragens em três
tempos, 30 minutos antes, 15 minutos e 24 horas após o primeiro e último tratamento
com ozonioterapia ou terapia hiperbárica. Estes autores conseguiram detectar
alterações significativas no aumento da filtrabilidade dos eritrócitos e, com isto,
diminuição da viscosidade do sangue depois de transcorridos 15 minutos (p<0,001) do
primeiro tratamento e 24 horas após o último (p<0,05). O fibrinogênio diminuiu
significativamente (p<0,05), entretanto, os autores concluíram que estes resultados
foram transitórios por não se repetirem depois de transcorridas 24 horas.
Ohtsuka et al. (2006) ao avaliarem a ativação imune, in vivo, em vacas sadias
e sob alguma alteração inflamatória, após a administração de ozônio via
autohemotransfusão, realizaram amostragens antes da AHT e no 1, 2, 3, 4, 5, 7 e 14
dias depois da mesma. Ainda que não imediatas, as amostragens sangüíneas
realizadas, conseguiram determinar alterações significativas na contagem dos
linfócitos e monócitos no terceiro e quarto dia, respectivamente.
Quando avaliados fatores ativadores de plaquetas em porquinhos da índia
(Cavia porcellus), Wright et al. (1994) realizaram amostragens imediatamente após
exposição in vitro das plaquetas ao ozônio, dentro do minuto seguinte à exposição ao
22
gás, conseguindo observar alterações na concentração do fator ativador de plaquetas
(PAF) que pode alterar a contagem desse parâmetro.
Como pode ser observado, tempos diferentes têm sido considerados em vários
estudos realizados com ozônio; porém, nenhum sustenta o porquê do determinado
protocolo nem mesmo discute qual o protocolo ideal para a amostragem dos
parâmetros avaliados.
23
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em nenhum momento do período experimental, os animais demonstraram
incômodo ou alteração do comportamento devido à ozonioterapia ou imediatamente
após a mesma, assim como após as atividades diárias.
Entretanto, um dos animais apresentou um ferimento acidental, que ocorreu na
época da oitava aplicação.
Durante avaliação clínica diária, os eqüinos não apresentaram sinais de
alteração, encontrando-se todos com parâmetros clínicos dentro dos considerados
como de referência para a espécie eqüina. Os valores médios de temperatura corporal,
freqüência cardíaca e respiratória foram de 37,01 °C, 34 bpm e de 24 rpm,
respectivamente. As mucosas se mantiveram de cor rosácea e, úmidas e a tempo de
preenchimento capilar inferior a dois segundos, tal como descrito por Speirs (1999),
para a espécie eqüina.
Um discreto aumento da freqüência cardíaca e/ou respiratória poderia ser
observado, já que o estresse pode elevar estes parâmetros (Fernandes, 1997).
Durante a aplicação do ozônio, foi possível escutar, sem a utilização de
estetoscópio, os movimentos intestinais dos animais, particularmente 5 minutos após
o início da aplicação da mistura do gás. Além disso, todos os animais defecavam ao
redor de meia hora após a aplicação do ozônio, o que pode sugerir estímulo ou ação
do ozônio sobre os mecanismos do trato gastrointestinal. Pérez et al. (2003) avaliaram
pacientes humanos com a síndrome de má absorção intestinal causada por Giardia
lamblia, no entanto os autores não mencionaram achados semelhantes ao nosso.
Alves et al. (2004), estudaram o processo de isquemia e reperfusão no jejuno
de eqüinos, demonstrando o efeito de proteção tecidual do ozônio sobre lesões de
reperfusão no trato gastrointestinal ainda que a via de administração tenha sido a
intravenosa.
O termo, tempo de repouso, utilizado neste estudo considera o período antes e
mais próximo após cada aplicação de ozônio (0, 1, 6 e 24 horas), quando foram
realizadas as coletas de sangue, sem que houvesse uma nova administração da mistura
do gás.
De maneira geral, como demonstrado nas Tabelas de 1 a 5, os parâmetros
hematológicos avaliados (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos,
segmentados, bastonetes, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos), não
24
determinaram (p>0,05) um comportamento característico influenciado pela
ozonioterapia em função do tempo de repouso (0, 1, 6 e 24 horas) durante as nove
aplicações da mistura do gás; com exceção de alguns parâmetros, que revelaram
alguma resposta (p<0,05) à terapia neste período de repouso, porém não em todos os
períodos de aplicação. Desta maneira, estes achados indicam que até 24 horas após
aplicação da mistura do gás não houve variações (p>0,05) nos valores dos parâmetros
avaliados, o que reflete a semelhança entre os valores médios ou que o
comportamento dos mesmos não demarcou um padrão linear.
Os valores do hematócrito (%) como apresentados na Tabela 1 refletem um
comportamento constante sem variações no tempo de repouso, indicando que os
valores médios para cada combinação estudada, foram similares (p>0,05) em cada
período de aplicação, concordando com os relatos de Bocci (2004), que não encontrou
alterações na concentração do hematócrito em diferentes trabalhos com humanos
utilizando a autohemotransfusão ozonizada.
Os valores da concentração da hemoglobina (Tabela 1), também foram
similares (p>0,05), no entanto as fêmeas mostraram em dois períodos de aplicação um
efeito positivo (p<0,05) da ozonioterapia no período de repouso. Quando tratadas com
500 mL após o segundo período de aplicação, o efeito foi de incremento na
concentração de hemoglobina de aproximadamente 0,141 g dL
-1
/hora, durante o
período de repouso e; quando tratadas com 1000 mL após o terceiro período de
aplicação o efeito positivo foi de aproximadamente 0,572 g dL
-1
/hora. Embora estes
discretos aumentos não sejam consistentes, poderiam estar relacionados com a reação
imediata do ozônio sobre células endoteliais, que segundo Bocci & Aldinucci (2004) e
López (2005), leva a liberação do óxido nítrico para interagir com a hemoglobina,
resultando em S-nitrosohemoglobina, encarregada das reações à distância, com
relação ao transporte desta substância a outros sitios, modulando assim, através da
vasodilatação, o efeito sobre a microcirculação e a oxigenação tissular.
Os valores médios na concentração de eritrócitos (Tabela 1) resultaram
similares (p>0,05) durante o período de repouso quando os animais receberam 500
mL da mistura de ozônio; a diferença de quando receberam 1000 mL, quando foi
observado o efeito da ozonioterapia neste período mencionado. Para os machos, o
comportamento resultou negativo (p<0,05) diminuindo aproximadamente 0,037
eritrócitos x10
6
µL
-1
/hora e; nas fêmeas, o efeito após a terceira e quarta aplicação, foi
de aumento (p<0,05) de 0,087 e 0,033 eritrócitos x10
6
µL
-1
/hora, respectivamente.
25
Uma possível diminuição pode indicar uma baixa porcentagem de hemólise
(Bocci, 2004), em resposta ao estresse oxidativo na membrana celular dos eritrócitos
(Sentürk et al., 2001), porém não de maneira intensa, uma vez que este é um efeito
transitório e seletivo (Verrazo et al., 1995; Zimran et al., 1999), não resultando em
risco à saúde do animal exposto ao ozônio.
TABELA 1 - Estimativas dos parâmetros de hematócrito (%), hemoglobina (g dL
-1
),
eritrócitos (x10
6
µL
-1
) e leucócitos (x10
3
µL
-1
) em função do tempo de
repouso (H) para cada combinação (tratamento x sexo) e período de
aplicação.
Parâmetro
Combinação
Tratamento x
Sexo
Período de
Aplicação
Equação de Regressão
R
2
Hematócrito
MT500
1-9
Y
= 38,22
-
FT500
1-9
Y
= 40,46
-
MT1000
1-9
Y
= 40,63
-
FT1000
1-9
Y
= 41,44
-
Hemoglobina
MT500
1-9
Y
= 9,26
-
FT500
1; 3-9
2
Y
= 10,48
Y
ˆ
= 10,5024+0,140554*H
-
0,89
MT1000
1-9
Y
= 10,12
-
FT1000
1-2; 4-9
3
Y
= 10,45
Y
ˆ
= 10,2068+0,571876*H
-
0,80
Eritrócitos
MT500
1-9
Y
= 7,80
FT500
1-9
Y
= 9,36
MT1000
1-7; 9
8
Y
= 7,90
Y
ˆ
= 8,71705 0,0378985*H
-
0,80
FT1000
1-2; 5-9
3
4
Y
= 8,87
Y
ˆ
= 8,58148+0,0872826*H
Y
ˆ
= 9,12284+0,0329667*H
-
0,94
0,94
Leucócitos
MT500
1-9
Y
= 7,55
-
FT500
1-9
Y
= 9,14
-
MT1000
1-9
Y
= 8,48
-
FT1000
1-9
Y
= 8,14
-
H = tempo de repouso em horas. * Significativo pelo teste t (p<0,05). MT500: machos tratados com
500 mL, MT1000: machos tratados com 1000 mL, FT500: fêmeas tratadas com 500 mL, FT1000:
fêmeas tratadas com 1000 mL.
26
No tempo de repouso não houve diferença (p>0,05) entre os valores médios na
contagem de leucócitos totais, como apresentado na Tabela 1. Na realidade, esta
ausência de efeito está presente durante todo o período experimental, concordando
com os achados de Terasaki et al. (2001) e Ohtsuka et al. (2006) na espécie bovina.
O comportamento dos segmentados no período de repouso resultou constante,
refletindo médias similares no período de repouso. Com relação aos bastonetes, foram
observadas algumas respostas à ozonioterapia durante o tempo de repouso (Tabela 2).
Os valores médios na concentração de bastonetes nos machos tratados com a menor
dose (500 mL) foram similares (p>0,05) dentro dessas horas de estudo; já as fêmeas
que receberam esta mesma dosagem, após a quinta e sexta aplicação apresentaram
aumento de 0,006 e 0,002 bastonetes x10
3
µL
-1
/hora, respectivamente. Similarmente,
quando a dose foi elevada a 1000 mL, o comportamento linear positivo (p<0,05) nos
machos foi na razão de 0,021 bastonetes x10
3
µL
-1
/hora após a sexta aplicação e, nas
fêmeas, o comportamento (p<0,05) foi de aumento (0,002 x10
3
µL
-1
/hora) e diminuição
(0,001 x10
3
µL
-1
/hora) após a primeira e quinta aplicação, respectivamente.
Estes achados durante o tempo de repouso foram considerados como isolados
e não relevantes pelo fato de terem ocorrido em apenas um ou dois períodos de
aplicação, além de mostrarem padrões de aumento e diminuição, o que não sugere um
comportamento uniforme durante o tempo de repouso. Ainda assim, o aumento na
contagem destas células pode estar associado a um possível efeito direto sobre a
medula óssea, tal como mencionado por Margalit et al. (2001), ao liberar estas células
de rara ocorrência na circulação periférica dos animais.
Ao avaliar a concentração de linfócitos no tempo de repouso (Tabela 2)
somente observou-se um comportamento decorrente da aplicação da ozonioterapia,
após a segunda e quarta aplicação, com uma diminuição (0,188 x10
3
µL
-1
/hora) e
aumento (0,070 x10
3
µL
-1
/hora) de linfócitos, respectivamente quando administrados
500 mL nas fêmeas. Quando aplicados 1000 mL nos machos a resposta positiva
(p<0,05) foi na razão de 0,017 linfócitos x10
3
µL
-1
/hora no oitavo período.
Para os monócitos (Tabela 3), a resposta à ozonioterapia nos machos que
receberam 500 mL, após o sexto e oitavo períodos de aplicação (p<0,05) mostrou
aumento nestas células na razão de 0,003 e 0,006 monócitos x10
3
µL
-1
/hora
respectivamente. Nas fêmeas submetidas à mesma dosagem da mistura do gás
observou-se que após a sexta aplicação (p<0,05) a concentração aumentou em 0,019
monócitos x10
3
µL
-1
/hora. É possível que estas células respondam de forma mais tardia
27
à exposição do ozônio, como relatado por Zee & De Monte (2001) em humanos com
úlceras flebostáticas, com ocorrência mais tardia no aparecimento destas células no
processo de reparação tissular.
TABELA 2 - Estimativas dos parâmetros de segmentados (x10
3
µL
-1
), bastonetes
(x10
3
µL
-1
) e linfócitos (x10
3
µL
-1
) em função do tempo de repouso (H)
para cada combinação tratamento x sexo e período de aplicação.
Parâmetro
Combinação
Tratamento x
Sexo
Período
de
Aplicação
Equação de Regressão
R
2
Segmentados
MT500
1-9
Y
= 4,38
-
FT500
1-9
Y
= 3,84
-
MT1000
1-9
Y
= 4,96
-
FT1000
1-9
Y
= 4,82
-
Bastonetes
MT500
1-9
Y
= 0,04
-
FT500
1-4; 7-9
5
6
Y
= 0,05
Y
ˆ
= 0,0213186+0,00605567*H
Y
ˆ
= 0,0127257+0,00211066*H
-
0,89
0,85
MT1000
1-5; 7-9
6
Y
= 0,05
Y
ˆ
= 0,0137769+0,0210572*H
-
0,90
FT1000
2-4; 6-9
1
5
Y
= 0,06
Y
ˆ
= 0,00503734+0,00249944*H
Y
ˆ
= 0,03337776 0,00134764*H
-
0,94
0,81
Linfócitos
MT500
1-9
Y
= 2,63
-
FT500
1; 3; 5-9
2
4
Y
= 4,44
Y
ˆ
= 5,99115 0,187955 *H
Y
ˆ
= 3,80844+0,0699546 *H
-
0,92
0,83
MT1000
1-7; 9
8
Y
= 2,83
Y
ˆ
= 2,08309+0,0171071 *H
-
0,99
FT1000
1-9
Y
= 2,68
-
H = tempo de repouso em horas. * Significativo pelo teste t (p<0,05). MT500: machos tratados com
500 mL, MT1000: machos tratados com 1000 mL, FT500: fêmeas tratadas com 500 mL, FT1000:
fêmeas tratadas com 1000 mL.
O comportamento dos valores médios na concentração de eosinófilos (Tabela
3) durante o período de repouso foi similar (p>0,05), sendo apenas observado um
aumento (p<0,05) de 0,006 eosinófilos x10
3
µL
-1
/hora nos machos que receberam 500
mL da mistura do gás, depois de realizado o nono período de aplicação.
28
Quando a concentração de basófilos (Tabela 3) foi avaliada no período de
repouso, a resposta à ozonioterapia foi observada (p<0,05) nos machos e nas fêmeas
com a menor dose após a sexta aplicação, no entanto de forma diferenciada, com
aumento destas células (0,001 x10
3
µL
-1
/hora) para os machos e diminuição (0,002
x10
3
µL
-1
/hora) para as fêmeas. Quando as fêmeas receberam 1000 mL da mistura do
gás, novamente houve (p<0,05) diminuição (0,002 x10
3
µL
-1
/hora) após o sétimo
período de aplicação.
Da mesma forma como ocorreu com a contagem diferencial de outras células
da linhagem branca, o comportamento da concentração de basófilos no tempo de
repouso, apresentou resposta à ozonioterapia; porém, de forma isolada.
TABELA 3 - Estimativas dos parâmetros de monócitos (x10
3
µL
-1
), eosinófilos (x10
3
µL
-1
) e basófilos (x10
3
µL
-1
) em função do tempo de repouso (H) para
cada combinação tratamento x sexo e período de aplicação.
Parâmetro
Combinação
Tratamento x
Sexo
Período de
Aplicação
Equação de Regressão
R
2
Monócitos
MT500
1-5; 7; 9
6
8
Y
= 0,15
Y
ˆ
=0,182071+0,00331344*H
Y
ˆ
=0,231433+0,00558931*H
-
0,93
0,99
FT500
1-5; 7-9
6
Y
= 0,17
Y
ˆ
=0,0918225+0,0191949*H
-
0,90
MT1000
1-9
Y
= 0,21
-
FT1000
1-9
Y
= 0,15
-
Eosinófilos
MT500
1-8
9
Y
= 0,24
Y
ˆ
=0,199253+0,00627923*H
-
0,82
FT500
1-9
Y
= 0,24
-
MT1000
1-9
Y
= 0,27
-
FT1000
1-9
Y
= 0,30
-
Basófilos
MT500
1-5; 7-9
6
Y
= 0,10
Y
ˆ
=0,0356242+0,00139258*H
-
0,97
FT500
1-5; 7-9
6
Y
= 0,06
Y
ˆ
=0,0616924 0,00246568*H
-
0,92
MT1000
1-9
Y
= 0,11
-
FT1000
1-6; 8-9
7
Y
= 0,08
Y
ˆ
=0,0506193 0,00214442*H
-
0,99
H = tempo de repouso em horas. * Significativo pelo teste t (p<0,05). MT500: machos tratados com
500 mL, MT1000: machos tratados com 1000 mL, FT500: fêmeas tratadas com 500 mL, FT1000:
fêmeas tratadas com 1000 mL.
29
A contagem das plaquetas e a concentração da glicose nos eqüinos expostos ao
ozônio revelaram uma resposta à ozonioterapia com um comportamento linear
(p<0,05) durante o tempo de repouso (Tabela 4).
TABELA 4 - Estimativas dos parâmetros de plaquetas (por campo) e glicose (mg dL
-
1
), em função do tempo de repouso (H) para cada combinação
(tratamento x sexo) e período de aplicação.
Parâmetro
Combinação
Tratamento x
Sexo
Período de
Aplicação
Equação de Regressão
R
2
Plaquetas
MT500
2; 4-6; 9
1
3
7
8
Y
= 9,93
Y
ˆ
=7,20903+0,155824
*
H
Y
ˆ
=13,4277 0,184216
*
H
Y
ˆ
=7,49631+0,0972502
*
H
Y
ˆ
=9,52895 0,0359937
*
H
-
0,96
0,99
0,82
0,92
FT500
1-9
Y
= 10,12
-
MT1000
1-4; 6; 9
5
7
8
Y
= 10,04
Y
ˆ
= 6,99955+0,193606
*
H
Y
ˆ
=7,81958+0,120054
*
H
Y
ˆ
= 8,30226+0,122289
*
H
-
0,98
0,99
0,95
FT1000
4; 6-9
1
2
3
5
Y
= 9,30
Y
ˆ
= 7,07914+0,650570*H
Y
ˆ
= 11,8039 0,103734*H
Y
ˆ
= 12,2166 0,135480*H
Y
ˆ
=9,455227+0,167449*H
-
0,96
0,86
0,95
0,95
Glicose
MT500
1-2; 4-6; 8
3
7
9
Y
= 85,31
Y
ˆ
=89,7125 0,511290
*
H
Y
ˆ
=76,5410+0,403309
*
H
Y
ˆ
=82,6550 0,299575
*
H
-
0,99
0,88
0,83
FT500
1-3; 6-9
4
5
Y
= 91,20
Y
ˆ
=93,4118 0,334854
*
H
Y
ˆ
=90,3720 0,413593
*
H
-
0,92
0,90
MT1000
1-6; 8-9
7
Y
= 88,32
Y
ˆ
= 83,0709+0,980103
*
H
-
0,92
FT1000
1-6; 9
7
8
Y
= 85,02
Y
ˆ
= 75,8185+1,27074
*
H
Y
ˆ
= 79,9106 0,278784
*
H
-
0,95
0,86
H = tempo de repouso em horas. * Significativo pelo teste t (p<0,05). MT500: machos tratados com
500 mL, MT1000: machos tratados com 1000 mL, FT500: fêmeas tratadas com 500 mL, FT1000:
fêmeas tratadas com 1000 mL.
30
O único grupo sob avaliação que apresentou os valores médios na contagem
de plaquetas similares (p>0,05), durante todo o período foram as fêmeas quando
receberam 500 mL de ozônio. Quando os machos receberam 500 mL da mistura do
gás, refletiram uma resposta à ozonioterapia durante o tempo de repouso após a
primeira, terceira, sétima e oitava aplicação (Tabela 4), o que indica um
comportamento linear (p<0,05) para este parâmetro. Porém, a escolha do momento
mais adequado para a avaliação destes parâmetros de amostragem até as 24 horas
subseqüentes à ozonioterapia, dependerá do interesse clínico, ou seja, se o relevante
for determinar os valores máximos, o ideal seria realizar a amostragem imediatamente
depois de realizada a ozonioterapia. Por outro lado, cabe mencionar que estas
respostas observadas (aumento e diminuição) na contagem de plaquetas, não definem
claramente o comportamento da característica neste tempo de estudo, mas pode estar
indicando certa alteração na fluidez do sangue, já mencionada na literatura científica
(Bocci, 1994a; Giunta et al., 2001), além da resposta plaquetária no momento mais
próximo à administração da mistura do gás (Wright et al., 1994; Valacchi & Bocci,
1999; Díaz et al., 2001).
Na tentativa de elucidar o comportamento no tempo de repouso da
concentração da glicose, observou-se a resposta à ozonioterapia nos machos tratados
com 500 mL em três períodos de aplicação, o que reflete um comportamento linear
(p<0,05) deste parâmetro no tempo referido. Como este é um parâmetro que diminui
por efeito do ozônio (Al Dalien et al., 1999; Barroetabeña et al., 2002) e até 24 horas
continuaria a diminuir, a amostragem para avaliação do mesmo está indicada até as 24
horas, quando se deseja verificar o máximo efeito na diminuição da glicose e, com
isto poder prevenir um quadro de hipoglicemia transitória decorrente da
ozonioterapia. Já as fêmeas tratadas com a mesma quantidade (500 mL) da mistura do
gás apresentaram resposta (p<0,05) à ozonioterapia durante o tempo de repouso, após
a quarta e a quinta aplicação, com diminuição na concentração deste parâmetro 0,335
e 0,414 mg dL
-1
/hora, respectivamente.
Quando os machos receberam 1000 mL de ozônio, somente foi observada
resposta à terapia após o sétimo período de aplicação, com aumento na concentração
da glicose em 0,980 mg dL
-1
/hora. Já as fêmeas que receberam esta mesma dosagem,
mostraram diferentes (p<0,05) respostas à ozonioterapia na sétima e oitava aplicação,
com aumento (1,271 mg dL
-1
/hora) e diminuição (0,279 mg dL
-1
/hora),
respectivamente, na concentração da glicose, o que não permite demarcar um
31
comportamento definido deste parâmetro neste tempo, por apresentar efeito somente
em um ou dois períodos de aplicação.
Quando estudados os valores médios da concentração do fibrinogênio no
tempo de repouso (Tabela 5), estes não variaram ou definiram um comportamento
constante (p>0,05) em resposta a ozonioterapia. Os machos tratados com 500 mL
apresentaram uma resposta somente após a última aplicação da mistura do gás,
diminuindo a concentração deste parâmetro em 0,550 mg dL
-1
/hora. Por outro, lado as
fêmeas que receberam a mesma dose, apresentaram um aumento na concentração do
fibrinogênio de forma linear durante o tempo de repouso após a quarta aplicação
(1,307 mg dL
-1
/hora). Quando os machos receberam 1000 mL da mistura do gás,
ocorreu aumento de 4,077 mg dL
-1
/hora na concentração do fibrinogênio após a
terceira aplicação. Apesar destes achados, o comportamento não foi constante, não
sendo observado nas demais aplicações de ozônio durante o período experimental.
Com relação à concentração da enzima creatina quinase (Tabela 5) observou-
se de modo geral que não houve efeito (p>0,05) da ozonioterapia durante o tempo de
repouso. Apenas foi detectado que os machos que receberam o tratamento de 500 mL
apresentaram após a nona aplicação, aumento (p<0,05) de 9,484 U L
-1
/hora na
concentração dessa enzima. Entretanto, quando tratados com 1000 mL da mistura do
gás ocorreu (p<0,05) diminuição (2,132 U L
-1
/hora) e aumento (4,078 U L
-1
/hora)
após a terceira e a oitava aplicação, respectivamente. Não se observou qualquer
influência (p>0,05) no tempo de repouso nas fêmeas submetidas a ambos os
tratamentos.
Comportamento linear, em resposta a ozonioterapia, ocorreu (p<0,05) com a
gama glutamiltransferase (Tabela 5), durante o tempo de repouso nos machos tratados
com 500 mL da mistura do gás. A tendência deste parâmetro foi a diminuição na
concentração desta enzima durante este tempo de repouso, podendo ser recomendada
a amostragem próxima às 24 horas depois de realizada a terapia, quando a finalidade é
a verificação de uma redução na concentração deste parâmetro. Quando tratados com
1000 mL de ozônio, os machos apresentaram diminuição na concentração da GGT em
0,238 U L
-1
/hora, após o sétimo período de aplicação.
Este efeito além de imediato pode ser acumulativo, indicando adaptação à
terapia, tal como mencionado por Bocci (2004), podendo estar relacionado com o
aumento no trabalho muscular cardíaco pelo incremento no fluxo sangüíneo (Sunnen,
1989; Giunta et al., 2001).
32
TABELA 5 - Estimativas dos parâmetros de fibrinogênio (mg dL
-1
), creatina quinase
(U L
-1
) e gama glutamiltransferase (U L
-1
), em função do tempo de
repouso (H) para cada combinação (tratamento x sexo) e período de
aplicação.
Parâmetro
Combinação
Tratamento x
Sexo
Período de
Aplicação
Equação de Regressão
R
2
Fibrinogênio
MT500
1-8
9
Y
= 136,06
Y
ˆ
=142,147 0,550101*H
-
0,80
FT500
1-3; 5-9
4
Y
= 145,04
Y
ˆ
=121,411+1,30715 *H
-
0,81
MT1000
1-2; 4-9
3
Y
= 137,46
Y
ˆ
=127,931+4,07670
*
H
-
0,97
FT1000
1-9
Y
= 140,43
-
Creatina Quinase
MT500
1-8
9
Y
= 207,75
Y
ˆ
=151,747+9,48424 *H
-
0,93
FT500
1-9
Y
= 215,37
-
MT1000
1-2; 4-7; 9
3
8
Y
= 208,64
Y
ˆ
=229,984+2,13228*H
Y
ˆ
=218,730+4,07780*H
-
0,89
0,98
FT1000
1-9
Y
= 212,59
-
Gama
glutamiltransferase
MT500
2; 5-8
1
3
4
9
Y
= 11,79
Y
ˆ
=12,1411-0,0285267*H
Y
ˆ
=16,3640-0,0383635*H
Y
ˆ
=8,33607+0,0184641*H
Y
ˆ
=10,9401 0,192265 *H
-
0,80
0,98
0,95
0,98
FT500
1-7
8
9
Y
= 6,52
Y
ˆ
=6,52224 0,0289984*H
Y
ˆ
=10,6360 0,230668 *H
-
0,88
0,98
MT1000
1-6; 8-9
7
Y
= 13,80
Y
ˆ
=12,8675 0,238381 *H
-
0,92
FT1000
1-7
8
9
Y
= 20,44
Y
ˆ
=16,6698 0,0754527*H
Y
ˆ
=15,0122 0,248560 *H
-
0,83
0,88
H = tempo de repouso em horas. * Significativo pelo teste t (p<0,05). MT500: machos tratados com
500 mL, MT1000: machos tratados com 1000 mL, FT500: fêmeas tratadas com 500 mL, FT1000:
fêmeas tratadas com 1000 mL.
No tempo de repouso não houve diferença (p>0,05) entre os valores médios na
contagem de leucócitos totais, como apresentado na Tabela 1. Na realidade, esta
33
ausência de efeito está presente durante todo o período experimental, concordando
com os achados de Terasaki et al. (2001) e Ohtsuka et al. (2006) na espécie bovina.
Linder (2000), ao proporem variáveis da bioquímica sangüínea para avaliar o
desempenho esportivo em eqüinos, menciona que níveis altos de GGT podem
demonstrar desempenho negativo em animais da espécie.
O aumento inicial na concentração de GGT, observado neste estudo, revela
esse efeito de esforço em todos os grupos.
A avaliação do comportamento das fêmeas não constatou uma resposta linear
à ozonioterapia na concentração da GGT. Ficou evidenciado que, após a oitava e nona
aplicação houve diminuição (p<0,05) na concentração desta enzima em 0,029 e 0,231
U L
-1
/hora, respectivamente, quando aplicados 500 mL. Diminuição também foi
observada nestes mesmos períodos após aplicação de 1000 mL de ozônio (0,075 e
0,248 U L
-1
/hora, respectivamente).
Diante dos resultados obtidos, recomenda-se que quando os parâmetros
contagem total de plaquetas, concentração da glicose e da GGT forem avaliados com
a finalidade de se verificar a eficácia da ozonioterapia em eqüinos, que estes sejam
determinados não somente durante a administração da mistura do gás, mas também
após cada aplicação, tendo em vista que apresentam um comportamento linear no
tempo de repouso.
34
CONCLUSÕES
Nas condições do presente estudo experimental e com base nos resultados obtidos
pode-se concluir que:
1. Os parâmetros bastonetes, plaquetas, glicose e gama glutamiltransferase
sofrem efeito do ozônio nas seguintes 24 horas depois de realizada a
ozonioterapia, sendo neste caso recomendado a realização seriada de
amostragens neste período, quando se deseja verificar variação na
concentração destes parâmetros.
2. Existe pouco efeito da ozonioterapia no período de repouso nos parâmetros
hemoglobina, eritrócitos, linfócitos, eosinófilos, monócitos, basófilos,
fibrinogênio e creatina quinase.
3. Não existe efeito do ozônio nos parâmetros hematócrito, leucócitos totais e
segmentados nas 24 horas após administração da mistura do gás, não sendo
assim necessária a amostragem imediata (até 24 horas) para a avaliação dos
mesmos.
4. A exposição de eqüinos sadios a 500 e 1000 mL da mistura terapêutica de
ozônio, mediante autohemotransfusão não acarreta alterações clínicas.
35
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39
CAPITULO III
MONITORAMENTO DE PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E
BIOQUÍMICOS DURANTE OZONIOTERAPIA EM EQÜINOS
RESUMO
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, dezembro de
2006. Efeitos da ozonioterapia sobre parâmetros clínicos, hematológicos e da
bioquímica sangüínea em eqüinos. Orientadora: Maria Verônica de Souza, Co-
Orientadores: John Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos
Benjamim.
O objetivo deste estudo foi monitorar, in vivo, as tendências dos parâmetros
hematológicos (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados,
bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica
sangüínea (glicose, fibrinogênio, creatina quinase e gama glutamiltransferase), após
ozonioterapia em eqüinos. Para isso, foram utilizados 12 eqüinos mestiços, sendo 6
machos e 6 fêmeas, com idades compreendidas entre 4 e 20 anos. Os animais foram
submetidos a ozonioterapia, mediante administração de 500 ou 1000 mL da mistura
do gás, por via intravenosa, a cada três dias, por um período total de 24 dias. Antes,
porém, foram divididos em quatro grupos: MT500, MT1000, FT500 e FT1000, sendo
machos (M) que receberam 500 mL e 1000 mL e, fêmeas (F) que receberam 500 e
1000 mL, respectivamente. Os resultados demonstraram uma tendência positiva após
ozonioterapia, mediante aumento nos valores do hematócrito e eritrócitos, sendo que,
com relação aos últimos, as fêmeas mostraram médias superiores. Também ocorreu
aumento na concentração dos segmentados, ainda que de forma tardia.
Adicionalmente, foi possível verificar aumento transitório nos valores dos bastonetes,
assim como comprovar o aumento na contagem das plaquetas e o efeito
hipoglicemiante em todos os eqüinos. Com relação às enzimas, somente a gama
glutamiltransferase apresentou uma elevação inicial bastante evidente, com posterior
redução em todos os grupos.
Palavras-chave: cavalos, ozônio, hematologia, bioquímica sangüínea.
40
ABSTRACT
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, December
2006. Effects of ozone therapy on equine clinical, hematological and blood
biochemistry parameters. Adviser: Maria Verônica de Souza, Co-Advisers: John
Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos Benjamim.
The purpose for this study was to monitor, in vivo, the hematological
(hematocrit, hemoglobin, erythrocytes, leukocytes, neutrophils, bands, lymphocytes,
monocytes, basophils, eosinophils and platelets) and biochemical (glucose,
fibrinogen, creatine kinase and gamma glutamyltransferase) parameters tendencies,
after ozone therapy was applied in horses. Twelve cross bred horses, 6 males and 6
females, between 4 and 20 years old were exposed to ozone therapy through the
application of 500 and 1000 mL of the gas mixture, intravenously, every three days,
during 24 days. Four groups were conformed: MT500, MT1000, FT500 and FT1000,
which comprised males (M) and females (F) receiving 500 and 1000 mL of ozone,
respectively. The results demonstrate a positive tendency with increased hematocrit
and erythrocytes, the later count was greater within the mares. Neutrophils count was
increased in a later phase. Furthermore, a transient augment in bands count, platelets
and a hypoglycemic effect within each experimental group was seen. Only gamma
glutamyltransferase showed an evident initial increase with a later decrease in each
group.
Key-words: horse, ozone, hematology, blood biochemistry
41
INTRODUÇÃO
Os parâmetros hematológicos e da bioquímica sangüínea em eqüinos podem
variar segundo a fase etária, fisiológica, sexo, raça, exercício ou atividade física
(Lumsden et al., 1980, Ribeiro et al., 2004, Santos, 2006), sendo assim importante
verificar o comportamento e a tendência de alguns desses parâmetros quando se
introduz uma nova terapia aos animais.
Ainda é escassa a literatura científica a respeito dos efeitos da ozonioterapia
sobre os parâmetros hematológicos e bioquímicos de interesse na espécie eqüina. Por
outro lado, algumas informações estão disponíveis sobre as células vermelhas em
humanos (Bocci, 2004), células brancas em bovinos (Ogata & Nagahata, 2000;
Terasaki et al., 2001, Ducusin et al., 2003; Ohtsuka et al., 2006) e plaquetas de
porquinhos da india (Wright et al., 1994) submetidos a tratamento com ozônio.
Adicionalmente, em eqüinos, o único trabalho disponível avaliou o efeito da aplicação
de ozônio, através da autohemotransfusão, sobre o lactato de animais de corrida
(Scrollavezza et al., 1997).
Com o intuito de promover a pesquisa e aplicação em medicina veterinária da
ozonioterapia, o objetivo deste estudo baseou-se em monitorar parâmetros
hematológicos (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos totais, segmentados,
bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica
sangüínea (glicose, fibrinogênio, creatina quinase e gama glutamiltransferase),
mediante a observação das tendências, positivas e/ou negativas destes durante o
período de aplicação in vivo de ozônio em eqüinos.
42
REVISÃO DE LITERATURA
A ozonioterapia já vem sendo utilizada amplamente em medicina humana na
Europa, Ásia, Cuba e, atualmente, está despertando interesse na área de medicina
veterinária nestas mesmas regiões e na América Latina e Estados Unidos, como uma
alternativa ou complemento dos protocolos terapêuticos tradicionais pela sua
eficiência e baixo custo.
Alguns estudos mencionam as vias de aplicação (Guerra et al., 1999; Ogata &
Nagahata, 2000; Hernández & Gonzalez, 2001; Camps et al., 2003; Clavo et al.,
2003), sendo a respiratória a única não indicada para a realização da ozonioterapia, já
que pode ocasionar lesões endoteliais, inflamação e aumento da permeabilidade (Noa
et al., 1991).
Existem estudos avançados sobre os efeitos do ozônio, porém aqueles básicos
que elucidem mecanismos são poucos, o que dificulta as interpretações dos possíveis
efeitos desta terapia, sendo assim considerada como um tratamento alternativo.
Na opinião de Viebahn (1985), o ozônio tem propriedades como bactericida,
fungicida, viricida e sobre a circulação sangüínea.
Alguns trabalhos vêm pesquisando a resposta das células vermelhas (Bocci,
1994a; Zimran et al., 1999) e brancas (Margalit et al., 2001; Deaton et al., 2005),
quando expostas ao ozônio.
Os eritrócitos são o principal alvo do ozônio, provavelmente, pela superfície
de contato que estes apresentam ao gás quando administrado no organismo. Pela
reação oxidativa de membrana, pela melhoria nos aspectos reológicos das hemácias e,
com isto, a circulação e distribuição do oxigênio para os tecidos, que passam a ser
mais eficientes (Bocci, 1994a; Zimran et al., 1999).
Margalit et al. (2001) e Deaton et al. (2005), mencionam que a ozonioterapia
promove uma leucocitose com neutrofilia que, segundo os últimos autores, se deve ao
aumento da capacidade de motilidade e adesão dos polimorfosnucleares (PMNs), o
que intensifica a atividade fagocitária destas células. Adicionalmente, a exposição in
vivo ao ozônio pode resultar em efeito direto sobre a mielopoiese (Bocci, 1994a;
Margalit et al., 2001).
A aplicação da mistura do gás in vitro em células PMNs, de vacas sadias, com
mastite e febre do leite, pode ocasionar tanto efeitos positivos como negativos,
dependendo se o animal esta ou não sadio (Ducusin et al., 2003).
43
Bocci (1994b) e Ohtsuka et al. (2006), relatam o efeito do ozônio sobre células
mononucleares. O primeiro descreve que o ozônio pode ser um indutor de citocinas,
tais como interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6), interferon (INFβ, INFγ), fator estimulador
de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de necrose tumoral α
(TNF α) e fator transformador de crescimento β (TGFβ), melhorando com isto a
produção de imunoglobulinas e regulando o sistema imune. Já os segundos autores,
mencionam a produção de citocinas após aplicação da mistura do gás por
autohemotransfusão (AHT) ozonizada, sendo a resposta humoral mais marcada em
animais sadios. Os animais com processos inflamatórios mostram uma resposta
particularmente do tipo celular.
A resposta inflamatória induzida pela exposição à mistura do gás oxigênio-
ozônio pode estar relacionada ao aumento do fator de ativação plaquetária (PAF), o
que incluiria também aumento nos níveis dos eucosanoides (Díaz et al., 2001).
Tem sido mencionada a possibilidade da ativação de fibroblastos pelo ozônio e
a importância na síntese de colágeno durante o processo de cicatrização; este e outros
aspectos como aumento na quimiotaxia de células fagocitárias e liberação de
citocinas, refletem a importância do ozônio em reduzir o tempo de cicatrização de
feridas (Filippi, 2001).
44
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em nenhum momento do período experimental, os animais demonstraram
incômodos ou alteração do comportamento durante a ozonioterapia ou imediatamente
após a mesma, assim como após as atividades diárias.
Durante avaliação clínica diária os eqüinos não apresentaram sinais de
alteração, encontrando-se todos com parâmetros clínicos dentro dos considerados
como de referência para a espécie eqüina. Os valores médios de temperatura corporal,
freqüência cardíaca e respiratória foram de 37,01 °C, 34 bpm e de 24 rpm,
respectivamente. As mucosas se mantiveram de cor rosácea e, úmidas e a taxa de
preenchimento capilar inferior a dois segundos, tal como descrito por Speirs (1999),
para a espécie eqüina. Entretanto, um dos animais apresentou um ferimento acidental,
que ocorreu na época da oitava aplicação.
Um discreto aumento da freqüência cardíaca e/ou respiratória poderia ser
observado, já que o estresse pode elevar estes parâmetros (Fernandes, 1997).
Durante a aplicação do ozônio, foi possível escutar, sem a utilização de
estetoscópio, os movimentos intestinais dos animais, particularmente 5 minutos após
o início da aplicação da mistura do gás. Além disso, todos os animais defecavam ao
redor de meia hora após a aplicação do ozônio, o que pode sugerir estímulo ou ação
do ozônio sobre os mecanismos do trato gastrointestinal. Pérez et al. (2003) avaliaram
pacientes humanos com a síndrome de má absorção intestinal causada por Giardia
lamblia e tratados com ozônioterapia. No entanto os autores não mencionaram achado
semelhante ao nosso.
Alves et al. (2004), estudaram o processo de isquemia e reperfusão no jejuno
de eqüinos, demonstrando o efeito de proteção tecidual do ozônio sobre lesões de
reperfusão no trato gastrointestinal ainda que a via de administração tenha sido a
intravenosa.
Os resultados apresentados nas tabelas e figuras demonstrados a seguir
refletem o efeito da ozonioterapia nos parâmetros avaliados durante todo o período
experimental. O tempo zero corresponde ao início deste, onde os animais ainda não
tinham sido expostos à mistura do gás. O tempo dez reflete médias dos resultados de
amostragens obtidas após três dias de realizada a última aplicação do ozônio.
Os valores médios da porcentagem do hematócrito, resultantes da aplicação de
ozônio (Tabela 1), encontraram-se dentro dos valores referenciais (26-53%) para a
45
espécie em estudo (Schalm et al., 1975; Meyer et al., 1995; Jain 1993, Menesis et al.,
1993, Taylor & Hillyer, 1997). No entanto, no período de aplicação do ozônio (Figura
1) foi possível observar uma tendência geral a um aumento no valor deste parâmetro
nas combinações avaliadas, a exceção dos machos quando foram tratados com a
menor dose (500 mL), os quais mostraram valores menores quando comparados com
as fêmeas que receberam a mesma dose (500 mL). Neste grupo houve inclusive, no
início da ozonioterapia, diminuição dos valores médios, sendo inferiores ao do limite
inferior de controle (LIC) quando realizada a terceira aplicação. A maioria dos
valores médios da concentração do hematócrito nos eqüinos encontrou-se acima do
limite médio de controle (LM) durante a segunda metade do período experimental.
Uma curva crescente até o final do período de aplicação foi mais evidente nas fêmeas
tratadas com 1000 mL da mistura do gás, sendo esta tendência mais discreta nos
machos tratados com esta mesma dose. Nos demais animais (MT500 e FT500), este
aumento também foi observado, entretanto de forma ainda mais discreta.
Estes resultados indicam que os valores do hematócrito aumentam à medida
que são realizadas as sessões da ozonioterapia, demonstrando um possível efeito
acumulativo e dose dependente desta característica. Efeito similar acumulativo e dose
dependente foram descritos por Bocci (1994a) e Valacchi & Bocci (1999), em
humanos, Plopper et al. (1994), Wright et al. (1994) e Deaton et al., (2005) em ratos,
porquinhos da índia (Cavia porcellus), e eqüinos, respectivamente, que definiram a
resposta pela dose e tempo de exposição à mistura do gás.
Já Verrazo et al. (1995) e Giunta et al. (2001), não encontraram mudanças na
concentração do hematócrito, quando utilizada a ozonioterapia em pacientes humanos
com doença arterial oclusiva periférica, apesar de terem observado alterações em
outros parâmetros hemoreológicos relacionados, tal como a viscosidade do sangue,
através de um viscosímetro digital e filtrabilidade dos eritrócitos, utilizando um filtro
de policarbonato de 5 µm de diâmetro, sob pressão negativa de 20 cm de água,
expressando os valores em eritrócitos filtrados por minuto, indicando o tempo
utilizado para filtrar 1 mL de sangue.
46
TABELA 1 – Valores mínimos, máximos e médios do hematócrito (%) em eqüinos
machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio (Aplicações
1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
33,00 - 44,2
38,00
35,8 - 41,00
37,67
36,80 - 41,4
38,63
32,70 – 37,20
34,90
1
37,38 - 38,00
37,78
36,50 – 40,28
37,93
35,00 – 43,73
38,27
34,23 – 38,6
35,86
2
33,30 – 41,15
38,49
37,63 – 41,28
39,94
31,03 – 48,48
40,56
38,30 – 39,43
38,83
3
30,83 – 39,58
35,64
40,50 – 42,10
41,32
37,15 – 42,48
39,78
38,53 – 48,78
42,97
4
31,85 – 40,80
36,94
41,85 – 42,50
42,08
36,55 – 45,53
39,61
40,08 – 44,70
42,48
5
35,93 – 45,05
40,38
39,63 – 40,8
40,24
33,25 – 49,68
39,88
39,20 – 42,33
40,27
6
38,78 – 41,20
39,70
35,73 – 43,25
40,43
36,25 – 47,45
41,53
38,25 – 49,60
43,88
7
35,83 – 41,5
38,16
39,93 – 41,48
40,57
40,25 – 41,75
41,03
37,90 – 46,18
41,06
8
35,63 – 40,9
38,23
41,30 – 43,35
42,03
36,58 – 45,00
39,53
37,85 – 44,25
40,98
9
35,95 – 41,43
38,68
36,23 – 45,03
41,98
38,25 – 50,6
42,66
39,35 – 49,85
45,82
10
40,00 – 44,30
41,53
36,50 - 49,40
44,87
34,20 – 52,80
41,50
40,50 – 49,80
44,17
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Os valores médios da concentração de hemoglobina (g dL
-1
) obtidos nas
quatro combinações avaliadas durante a ozonioterapia (Tabela 2), se mantiveram
dentro dos considerados como de referência (8-19 g dL
-1
) para a espécie eqüina
(Schalm et al., 1975; Jain 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor &
Hillyer, 1997). Ao monitorar estes valores durante o período da ozonioterapia (Figura
2), observa-se uma estabilidade nos valores, não ocorrendo mudanças significativas
ao longo do período de aplicação. Entretanto, no final do período de aplicação todos
os grupos avaliados mostraram um aumento neste parâmetro hematológico. O grupo
de machos tratados com 500 mL de ozônio apresentou os valores mais baixos em
relação aos demais grupos, desde o início até o final do período de aplicação, porém
sempre mantendo-os dentro dos limites normais para a espécie. As fêmeas tratadas
tanto com 500 como com 1000 mL de ozônio mantiveram valores de hemoglobina
47
mais altos e acima do limite médio de controle. Já os machos tratados com 1000 mL
mostraram valores de hemoglobina próximos ao limite médio.
32,00
34,00
36,00
38,00
40,00
42,00
44,00
46,00
48,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Hematócrito (%)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 1 – Estimativas do hematócrito (%) em MT500 (machos tratados com 500
mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados
com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o
período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de controle, LM:
limite médio, LIC: limite inferior de controle (Aplicações 1-9).
As discretas alterações observadas foram provavelmente devido à ação do
ozônio, já que não poderia ser decorrente de uma atividade física mais intensa que,
segundo a literatura científica (Pérez et al., 1997; Martínez et al., 2000; Householder
& Douglas 2005; Stoiber et al., 2005) é umas das causas do aumento na concentração
de hemoglobina pela demanda de uma maior concentração de oxigênio, já que neste
estudo houve padronização do exercício físico realizado durante todo o período
experimental. Sob condições de exercício, pode aumentar a concentração de oxigênio
circulante, o que está relacionado com o aumento na concentração da hemoglobina
(Mancini et al., 2003). É possível que a ozonioterapia também melhore a distribuição
do oxigênio no organismo, mediante o incremento na concentração de hemoglobina.
48
TABELA 2 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de hemoglobina
(g dL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de
ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
7,30 – 10,10
9,10
9,30 – 10,40
9,90
9,90 – 13,1
11,07
9,00 – 11,40
10,13
1
8,45 – 10,35
9,37
8,80 – 10,43
9,73
9,60 – 12,63
10,69
8,78 – 11,48
10,09
2
8,40 – 10,43
9,21
9,33 – 10,90
10,33
9,40 – 13,05
10,92
9,08 – 11,18
10,13
3
8,10 – 10,28
9,25
9,28 – 10,93
10,23
9,45 – 11,93
10,53
9,68 – 11,68
10,49
4
8,48 – 10,28
9,28
8,95 – 11,05
10,10
9,15 – 11,88
10,21
8,95 – 11,15
10,33
5
8,53 – 10,18
9,19
9,00 – 10,43
9,91
9,65 – 12,50
10,73
8,60 – 11,20
10,19
6
8,25 – 10,65
9,34
9,48 – 11,15
10,48
9,48 – 11,95
10,63
9,05 – 11,93
10,48
7
8,63 – 9,93
9,08
9,03 – 10,20
9,76
10,30 – 11,2
10,62
9,18 – 11,63
10,53
8
8,53 – 9,98
9,13
9,08 – 11,00
10,23
9,65 – 11,28
10,22
9,10 – 11,78
10,69
9
8,83 – 10,63
9,51
9,10 – 11,43
10,48
9,95 – 11,65
10,53
9,78 -12,13
11,13
10
8,60 – 11,30
9,90
8,30 – 12,40
10,87
9,90 – 12,80
11,03
10,20 – 12,10
11,20
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
A concentração média de eritrócitos (x10
6
µL
-1
), obtida nos animais durante as
aplicações do ozônio (Tabela 3), encontrou-se dentro dos valores referenciais (5,5-13
x10
6
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al., 1975; Jain 1993; Meyer et al., 1995;
Taylor & Hillyer, 1997). No entanto, se evidencia uma tendência geral de aumento
dos valores médios na concentração deste parâmetro nas quatro combinações
estudadas (Figura 3).
Quando os machos foram tratados com 500 mL da mistura do gás,
apresentaram uma queda nos valores médios de eritrócitos com a terceira aplicação,
porém estes valores retornaram para próximos aos do valor médio de controle e
alcançaram uma relativa estabilidade posteriormente. Quando tratados com a maior
dose (1000 mL) responderam com um discreto aumento, no entanto estes valores
foram inferiores ao valor médio calculado. Quando foram as fêmeas que receberam a
menor dose (500 mL), estas apresentaram valores mais estáveis e próximos aos do
49
limite superior de controle (LSC), diferente de quando receberam 1000 mL, quando
responderam com aumento mais evidente até o final do período experimental. As
fêmeas tratadas com ambas as doses apresentaram os valores médios na concentração
de eritrócitos maiores quando comparadas com os valores médios obtidos nos machos
durante todo o período de aplicação da mistura do gás.
8,00
8,50
9,00
9,50
10,00
10,50
11,00
11,50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Hemoglobina (g dL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 2 – Estimativas da hemoglobina (g dL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite interior de controle
(Aplicações 1-9).
Apesar de Schalm et al. (1975) relatar que fêmeas de raça Quarto de Milha
podem apresentar valores médios na concentração de parâmetros da linha vermelha
(entre eles os eritrócitos) maiores que os dos machos da mesma raça, é visível a
diferença da resposta à ozonioterapia entre machos e fêmeas, sendo as últimas mais
responsivas às aplicações de ozônio, conseguindo valores mais altos na contagem de
eritrócitos independente da quantidade da mistura do gás utilizada. Adicionalmente,
diferente do mencionado por Schalm e colaboradores em 1975, Moran & Araya
50
(2003) relataram que, sob condições normais, seria mais comum encontrar valores
maiores na concentração de eritrócitos nos machos, por estímulo da testosterona sobre
a eritropoiese. Esta informação reforça o efeito da ozonioterapia encontrado nas
fêmeas deste estudo.
TABELA 3 – Valores mínimos, máximos e médios dos eritrócitos (x10
6
μL
-1
) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
7,16 – 8,59
7,66
6,90 – 7,83
7,40
8,97 – 9,98
9,32
6,51 – 8,96
7,44
1
7,14 – 7,91
7,55
6,89 – 7,75
7,26
8,53 – 9,39
9,04
6,88 – 9,49
7,77
2
7,00 – 8,72
7,90
7,43 – 8,43
7,84
8,02 – 10,25
9,24
7,76 – 9,27
8,36
3
6,23 – 8,55
7,26
7,81 – 8,11
7,92
8,87 – 9,16
9,04
7,55 – 11,15
8,99
4
6,55 – 8,92
7,61
8,00 – 8,73
8,26
8,66 – 9,89
9,31
9,03 – 9,84
9,38
5
7,45 – 8,85
8,37
7,57 – 8,73
8,08
8,89 – 10,76
9,55
7,96 – 10,16
8,81
6
7,65 – 8,80
8,10
7,34 – 8,35
7,91
9,12 – 10,07
9,53
7,77 – 11,71
9,46
7
7,15 – 8,82
7,74
7,73 – 8,45
8,00
8,90 – 10,06
9,57
7,78 – 9,63
8,88
8
7,22 – 8,13
7,80
7,86 – 8,78
8,42
8,74 – 9,57
9,26
7,87 – 10,62
9,01
9
6,88 – 8,88
7,85
7,32 – 8,42
8,00
8,86 – 10,87
9,64
7,69 – 11,85
9,81
10
7,72 – 9,14
8,29
7,61 – 9,81
8,61
7,80 – 11,58
9,56
8,77 – 10,54
9,88
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Ao longo do experimento, os animais não foram submetidos a outras
atividades ou esforços superiores aos que estavam condicionados a trabalhar,
adicionalmente os encarregados do manejo dos animais durante as atividades
experimentais foram os mesmos durante todo o período experimental, inclusive não
foram presenciadas alterações climáticas. Deste modo, se descarta a possibilidade de
que o possível aumento nos valores dos eritrócitos, assim como do hematócrito, seja
51
devido a fatores mencionados pela literatura científica como estresse, medo,
atividades para as quais os animais não estavam habituados ou por mudanças
climáticas que pudessem alterar estes parâmetros (Gill & Wanska, 1978; Pérez et al.,
1997; Martínez et al., 2000; Householder & Douglas 2005), decorrentes de uma
contração esplênica. Acredita-se realmente que foi devido ao efeito exercido pela ação
de várias aplicações do ozônio.
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
8,50
9,00
9,50
10,00
10,50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Eritrócitos (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 3 – Estimativas de eritrócitos (x10
6
µL
-1
) MT500 (machos tratados com 500
mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados
com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o
período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de controle, LM:
limite médio, LIC: limite inferior de controle (Aplicações 1-9).
Os valores médios da contagem de leucócitos (x10
3
µL
-1
) obtidos nos animais
durante as aplicações de ozônio (Tabela 4), encontraram-se dentro dos limites
referenciais (5,4-14,3 leucócitos x10
3
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al., 1975;
Jain 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer, 1997).
Durante a fase inicial do período de aplicação da mistura do gás, os machos
responderam de maneira estável quando receberam a menor dose (500 mL) e de forma
52
mais variável quando receberam 1000 mL da mistura do gás, inclusive ambos, os
grupos de machos, com aumento na concentração deste parâmetro após a sétima e
sexta aplicação, respectivamente. Além disso, os machos quando tratados com 500
mL de ozônio, apresentaram em geral, valores médios inferiores na concentração de
leucócitos (Figura 4) em relação aos outros grupos em estudo. As fêmeas que
receberam a mesma dosagem (500 mL) apresentaram inicialmente os valores médios
mais altos e na sua maioria estes valores foram superiores ao do limite médio (LM)
quando comparados com os valores médios deste parâmetro nos eqüinos das outras
combinações avaliadas (MT500, MT1000 e FT1000), exceto no sétimo e oitavo
períodos de aplicação da mistura do gás, onde os machos que receberam 1000 mL as
superaram. Adicionalmente, este grupo (FT500) demonstrou um decréscimo nos
valores médios particularmente após a terceira aplicação, que se estabilizaram até a
oitava aplicação da mistura do gás.
TABELA 4 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de leucócitos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
4,60 – 9,00
7,40
6,00 – 8,50
7,20
8,80 – 13,90
10,60
6,30 – 9,40
7,90
1
5,63 – 9,18
7,54
6,40 – 8,73
7,83
8,18 – 11,00
9,37
6,60 – 9,03
7,80
2
5,6 – 8,95
7,70
7,53 – 10,68
8,63
9,80 – 10,63
10,09
6,70 – 9,08
8,04
3
5,73 – 8,70
7,43
6,38 – 8,95
7,48
8,05 – 10,15
9,14
7,1 – 9,20
8,28
4
6,08 – 8,68
7,59
7,55 – 9,23
8,26
7,73 – 9,68
8,65
6,67 – 8,88
8,09
5
5,45 – 9,88
7,42
6,35 – 8,40
7,68
7,85 – 9,75
9,03
6,80 – 8,65
7,57
6
5,50 – 8,73
6,83
6,63 – 10,20
8,14
7,70 – 10,53
8,98
7,55 – 9,98
8,85
7
5,83 – 9,48
7,67
6,18 – 14,53
9,85
8,50 – 9,40
9,04
7,35 – 8,68
8,17
8
6,03 – 10,4
7,99
6,23 – 11,25
8,83
7,48 – 10,25
8,63
7,23 – 9,4
8,03
9
5,53 – 11,35
7,76
6,30 – 12,73
9,21
8,98 – 10,70
9,61
7,35 – 9,85
8,48
10
6,8 – 11,8
8,47
6,40 – 11,30
8,83
7,20 – 11,30
9,20
7,6 – 9,50
8,50
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
53
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
8,50
9,00
9,50
10,00
10,50
11,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Leucócitos (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 4 – Estimativas de leucócitos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Apesar da variabilidade na concentração dos leucócitos totais observada
quando os machos receberam 1000 mL da mistura do gás, observou-se que na fase
final do período experimental, houve um aumento pronunciado, o que provavelmente
pode ter sido decorrente de um ferimento sofrido por um dos indivíduos do grupo.
Ainda assim o efeito de aumento tardio dos valores médios de leucócitos pode ser
observado em todos as combinações avaliadas neste estudo. A maioria dos valores
médios obtidos com a aplicação de 1000 mL da mistura do gás nas fêmeas foram
menores que as do limite médio calculado, porém no final, apreciaram-se valores
discretamente acima dessa média.
Valores mais altos de leucócitos são comumente encontrados nas fêmeas e se
devem, em geral, à concentração de neutrófilos segmentados e linfócitos (Jain, 1993).
Por outro lado, sabe-se que a contagem de leucócitos totais aumenta em processos
inflamatórios, porém também está descrito que a ozonioterapia pode promover
leucocitose com ativação do sistema imune por melhorar o sistema fagocitário, pela
54
ação bactericida dos leucócitos e pela produção de imunoglobulinas (Terasaki et al.,
2001). Entretanto Ohtsuka et al. (2006), mencionaram ausência de variação na
contagem dos leucócitos totais após autohemotransfusão ozonizada em vacas com
doença inflamatória. Na opinião dos autores mais do que uma resposta imune celular,
a ozonioterapia acarreta uma resposta do tipo humoral e, conseqüentemente, células
específicas da linhagem branca podem ser mais frequentemente estimuladas.
Adicionalmente, segundo os autores, este tipo de resposta à ozonioterapia pode diferir
quando aplicada em animais sadios e em animais sob processo inflamatório. Devido a
variabilidade encontrada com relação ao comportamento na contagem dos leucócitos
totais em estudos científicos anteriores e na presente pesquisa, fica demonstrado a
necessidade de novos experimentos na área, particularmente pelo fato da
ozonioterapia estar sendo utilizada na medicina veterinária, pelo seu efeito positivo
em processos inflamatórios para o tratamento de metrite e retenção de placenta
(Scrollavezza et. al., 1997), mastite (Ogata & Nagahata, 2000), flegmão interdigital
agudo (Scrollavezza et al., 2002) em vacas leiteiras e no tratamento de dor lombar em
eqüinos (Vigliani et al., 2005).
Alguns dos valores médios da contagem de segmentados, obtidos nos animais
durante as aplicações de ozônio (Tabela 5), encontraram-se discretamente acima
daqueles considerados de referência (2,26-4,75 segmentados x10
3
µL
-1
) para a espécie
eqüina (Schalm et al., 1975; Jain 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995;
Taylor & Hillyer, 1997). A exceção de um animal que apresentou um ferimento no
final do período experimental, os demais se mostraram aparentemente sadios durante
todo o experimento. O maior valor encontrado no grupo dos machos tratados com
1000 mL da mistura do gás (MT1000) foi possivelmente decorrente do ferimento,
anteriormente mencionado em um dos animais do grupo.
Apesar das oscilações na contagem dos segmentados, existiu uma tendência a
um aumento na segunda metade do período de aplicação de ozônio (Figura 5), com
posterior redução, inclusive tendo transcorrido três dias após o término da aplicação
do ozônio (período 10, Figura 5). Quando aplicados 1000 mL da mistura do gás, tanto
as fêmeas como os machos apresentaram valores médios acima do limite médio e
superior de controle, na segunda metade do período das aplicações, porém com
redução subseqüente até o final do experimento.
55
TABELA 5 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de segmentados
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL
de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
3,31 – 5,59
4,64
1,98 – 3,98
3,24
3,48 – 4,46
4,20
2,08 – 5,04
3,79
1
4,15 – 4,91
4,56
2,56 – 5,28
4,27
2,35 – 4,08
3,15
3,50 – 4,88
4,36
2
3,74 – 4,92
4,15
3,63 – 5,41
4,39
2,82 – 5,90
4,15
4,24- 4,72
4,46
3
3,83 – 4,41
4,08
3,74 – 4,05
3,86
2,81 – 3,76
3,27
4,78 – 5,42
5,01
4
3,82 – 4,98
4,46
4,26 – 5,12
4,71
3,07 – 4,55
3,77
3,46 – 4,98
4,39
5
3,90 – 4,57
4,13
3,21 – 4,94
4,17
3,26 – 5,53
4,38
3,73 – 4,40
4,11
6
3,60 – 3,92
3,74
4,12 – 6,07
5,11
3,81 – 5,15
4,30
5,13- 6,70
6,11
7
4,30 – 5,14
4,81
4,14 – 10,17
6,72
4,38 – 4,70
4,52
4,52 – 5,68
5,14
8
4,34 – 5,69
4,92
4,16 – 7,37
5,93
3,90 – 4,09
3,97
3,94 – 5,59
4,91
9
3,66 – 5,65
4,44
3,13 – 8,14
5,41
2,70 – 4,82
3,95
3,86 – 5,42
4,86
10
4,08 -5,44
5,25
3,20 – 9,27
5,27
2,23 – 3,91
3,01
3,57 – 5,04
4,45
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
O aumento destas células na circulação sangüínea ocorre como resposta a
vários fatores, entre eles a taxa de granulocitopoiese; a liberação a partir da medula
óssea; liberação da reserva marginal; vida média destas células e a sua migração aos
diferentes tecidos (Jain, 1993). A secreção aumentada de epinefrina, devido ao
estresse e à atividade física prolongada ou intensa pode causar neutrofilia,
principalmente por liberação de células do pool marginal. Entretanto, os eqüinos do
presente estudo mostraram-se bastante tranqüilos durante a ozonioterapia, pelo que se
acredita que este aumento na contagem dos neutrófilos seja decorrente do estímulo
direto sobre a medula óssea, tal como mencionado por Remigio et al. (1999).
Os neutrófilos entram na circulação a partir da medula óssea, sendo a meia
vida vascular destas células entre 7 e 14 horas, em diferentes espécies animais e
humanos, para em seguida passarem aos tecidos (Jain, 1993). Assim, o aumento total
observado destas células na corrente sangüínea foi provavelmente decorrente da
56
ozonioterapia, realizada a cada três dias, e o seu efeito sobre a medula óssea. Também
foi observada uma maior resposta quando utilizada uma maior dose de ozônio nos
eqüinos, o que sugere uma resposta ao ozônio do tipo dose-dependente. Esta resposta
ao ozônio com diferentes tipos de células, tem sido descrita na literatura científica
(Bocci, 1994a; Plopper et al., 1994; Wright et al., 1994; Valacchi & Bocci, 1999;
Deaton et al., 2005).
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Segmentados (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 5 – Estimativas de segmentados (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Bocci (1994a) menciona que o efeito do ozônio sobre os PMNs, se deve ao
aumento na atividade fagocitária mediante estímulo direto do ozônio sobre estas
células para produção e/ou liberação de citocinas (IFNγ, TNFα e IL-8) ou mesmo
estas citocinas liberadas estimulam mais células, para potencializar a possível resposta
imune celular e/ou humoral. Entretanto, segundo o autor deve-se ter cautela, já que
em altas concentrações, o ozônio pode apresentar um efeito deletério.
57
Os resultados obtidos sugerem que o ozônio estimula a primeira linha de
defesa orgânica (segmentados) sendo, no entanto, necessárias várias aplicações para
se conseguir este estímulo, o que reforça o efeito acumulativo da ozonioterapia,
mencionada na literatura científica (Bocci, 1994a; Plopper et al., 1994; Wright et al.,
1994; Valacchi & Bocci, 1999; Deaton et al., 2005).
Os valores médios da concentração de bastonetes (x10
3
µL
-1
) obtidos nos
animais durante as aplicações de ozônio (Tabela 6), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (0-0,1 x10
3
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al.,
1975; Jain 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer, 1997).
Os bastonetes (Figura 6) mostraram uma tendência peculiar em todos os
eqüinos avaliados, que apresentaram a partir da primeira aplicação do ozônio um
aumento na concentração dessas células e depois de certo número de aplicações, os
valores médios diminuíram, oscilaram e finalmente se aproximam dos iniciais,
quando cessou a aplicação da mistura do gás.
Os machos quando receberam 500 mL da mistura do gás mostraram valores
médios abaixo do limite médio, a exceção de quando foi administrada a quarta
aplicação. Já as fêmeas com a mesma dose, mostraram valores médios acima do limite
médio de controle, entre a segunda e quinta aplicação. Os eqüinos que receberam a
maior quantidade de ozônio (1000 mL), apresentaram valores médios com maiores
diferenças entre si, superando inclusive o limite de controle superior.
Os bastonetes são formas imaturas de neutrófilos (Jain, 1993) e o seu
aparecimento na corrente sangüínea nos eqüinos do estudo, se deve possivelmente a
intensificação na produção celular pela medula óssea, o que pode ser decorrente de
uma ação direta do ozônio sobre este órgão granulocitopoiético. O rápido aumento na
concentração de bastonetes particularmente ao se utilizar a dose mais elevada do
ozônio, sugere uma resposta dose-dependente, tal como descrito por outros autores em
diferentes espécies (Bocci, 1994a; Plopper et al., 1994; Wright et al., 1994; Valacchi
& Bocci, 1999; Deaton et al., 2005).
Os valores médios da concentração dos linfócitos (x10
3
µL
-1
) obtidos durante
as aplicações do ozônio nos animais (Tabela 7), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (1,5-7,7 x10
3
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al.,
1975; Jain, 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer, 1997).
58
TABELA 6 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de bastonetes
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
0,00 – 0,00
0,00
0,00 – 0,00
0,00
0,00 – 014
0,04
0,00 – 0,00
0,00
1
0,000 – 0,028
0,009
0,000 – 0,022
0,013
0,000 – 0,037
0,012
0,000 – 0,045
0,015
2
0,000 – 0,043
0,019
0,027 – 0,169
0,110
0,027 – 0,122
0,074
0,017 – 0,091
0,057
3
0,000 – 0,098
0,042
0,053 – 0,096
0,080
0,025 – 0,115
0,067
0,115 – 0,192
0,162
4
0,043 – 0,120
0,085
0,019 – 0,046
0,035
0,048 – 0,150
0,092
0,034 – 0,155
0,092
5
0,017 – 0,041
0,028
0,021 – 0,238
0,135
0,059 – 0,073
0,068
0,000 – 0,054
0,024
6
0,000 – 0,11
0,042
0,000 – 0,414
0,164
0,000 – 0,058
0,027
0,000 – 0,135
0,062
7
0,000 – 0,058
0,019
0,000 – 0,066
0,034
0,023 – 0,085
0,044
0,000 – 0,037
0,012
8
0,000 – 0,060
0,037
0,000 – 0,028
0,015
0,000 – 0,041
0,022
0,000 – 0,037
0,012
9
0,000 – 0,041
0,023
0,000 – 0,000
0,000
0,000 – 0,054
0,025
0,000 – 0,025
0,015
10
0,00 - 0,00
0,00
0,00 – 0,00
0,00
0,00 - 0,00
0,00
0,00 – 0,00
0,00
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Ao se monitorar a resposta dos linfócitos à ozonioterapia (Figura 7) observa-se
que os valores médios de maneira geral sofreram um decréscimo na fase intermediária
do período de aplicação. A exceção das fêmeas que receberam 500 mL da mistura do
gás, os valores nesta fase foram inclusive inferiores ao limite médio calculado. Após
esta fase de decréscimo, ocorreu um discreto aumento na concentração de linfócitos
com as últimas aplicações da mistura do gás.
Ohtsuka et al. (2006), detectaram em vacas com processos inflamatórios,
um aumento gradativo na população de linfócitos, do tipo auxiliar (CD4
+
), depois de
realizada autohemotransfusão. Linfocitose também foi descrita por Terasaki et al.,
(2001) após autohemotransfusão em bezerros, inclusive com incremento na produção
de algumas citocinas. Já Bocci (1994b) descreve a ativação discreta de células
mononucleares ex vivo em humanos com o vírus da imunodeficiência adquirida,
59
esclarecendo a possibilidade de ativação de linfócitos para a modulação do sistema
imune, inclusive com baixo risco de toxicidade.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Bastonetes (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 6 – Estimativas de bastonetes (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Após administração do ozônio, foi observado que alguns linfócitos
apresentavam granulações azurófilas sugestivas de células Natural Killer (NK)
(Figura 8). Uma vez constatado este achado, foi verificada a sua freqüência durante o
período de aplicações da mistura do gás (Figura 9) nos quatro grupos estudados.
O monitoramento da presença dessas células com granulações azurofílicas durante as
nove aplicações do azônio revelou uma diminuição progressiva na sua freqüência de
aparecimento até a quinta aplicação da mistura do gás, porém após o sétimo período,
observou-se um aumento em todos os grupos de eqüinos sob avaliação.
60
TABELA 7 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de linfócitos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
1,15 – 3,87
2,34
2,84 – 3,74
3,36
3,73 – 10,15
5,83
2,40 – 4,42
3,45
1
1,22 – 4,06
2,61
2,99 – 3,47
3,21
4,29 – 8,36
5,82
2,22 – 3,97
2,90
2
1,30 – 4,83
3,06
1,89 – 6,32
3,56
4,38 – 6,57
5,49
1,98 – 3,86
3,15
3
1,26 – 4,48
2,82
2,04 – 4,30
2,98
3,76 – 6,55
5,44
1,63 – 3,80
2,55
4
1,06 – 4,51
2,59
2,32 – 3,37
2,98
3,27 – 6,22
4,38
2,52 – 3,39
2,96
5
1,07 – 4,67
2,63
2,46 – 2,88
2,67
3,28 – 4,63
4,02
1,73 – 3,57
2,61
6
1,35 – 4,60
2,60
1,71 – 2,98
2,22
3,13 – 5,97
4,14
1,76 – 2,67
2,12
7
1,18 – 3,91
2,31
1,82 – 3,01
2,38
3,21 – 4,39
3,78
2,33 – 3,12
2,60
8
1,11 – 4,06
2,39
1,88 – 2,78
2,23
3,14 – 5,97
4,16
1,89 – 3,45
2,67
9
1,09 – 5,19
2,80
2,65 – 3,91
3,18
3,64 – 7,41
5,02
2,35 – 3,82
3,06
10
1,09 – 5,78
2,71
1,47 – 3,96
2,97
4,39 – 8,36
5,83
2,89 – 3,42
3,09
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Entre os eqüinos que receberam 500 mL, os machos mostraram valores
maiores quando comparados com as fêmeas. Quando a dose aplicada nos eqüinos foi
de 1000 mL da mistura do gás, entre a terceira e sexta aplicação, os valores
porcentuais destas células se mantiveram similares entre fêmeas e machos, para logo
após a sétima aplicação as fêmeas virem a apresentar valores médios mais elevados.
61
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Linfócitos (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 7 – Estimativas de linfócitos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
FIGURA 8 – Linfócito com granulações azurófilas detectado durante o período de
aplicação do ozônio.
62
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Periodo de aplicação
Linfocitos com granulações azurófilas (%)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
FIGURA 9 – Estimativas da freqüência de linfócitos com granulações azurófilas (%)
em MT500 (machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas
com 500 mL), MT1000 (machos tratados com 1000 mL) e FT1000
(fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o período de aplicação do
ozônio (Aplicações 1-9).
O aparecimento dessas granulações pode estar associado ao estímulo dos
produtos de reação do ozônio sobre a medula óssea, sendo este um dos locais de
origem destas células. A atividade citotóxica mediada por linfócitos, envolve a
ativação de células do tipo T (antígeno-dependentes) e ativação de células NK. Estas
células da imunidade inata (inespecífica) e que se caracterizam morfologicamente por
apresentarem granulações azurófilas no seu citoplasma, possuem a capacidade de
poder agir sobre células infectadas, através das enzimas contidas nestas granulações
(Jain, 1993). Villarrubia et al., (1996) compararam a ativação de linfócitos NK entre
humanos não infectados e infectados por Leishmania aethiopica, onde os primeiros
apresentaram ativação destas células após estímulo de citocinas derivadas de
linfócitos B.
Este achado também sugere que o ozônio ativa mecanismos de
reconhecimento na membrana celular, alertando o sistema imune innato, demonstrado
pela presença destas células. É importante destacar, no entanto que, segundo Ohtsuka
et al. (2006), a resposta à ozonioterapia em animais sadios é mais de caráter humoral,
63
diferente da resposta observada em animais com processos inflamatórios, que é
particularmente do tipo celular.
Os valores médios na concentração dos monócitos (x10
3
µL
-1
) obtidos durante
as aplicações do ozônio nos animais (Tabela 8), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (0-1 x10
3
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al., 1975;
Jain, 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer, 1997).
TABELA 8 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de monócitos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
0,00 – 0,34
0,12
0,07 – 0,26
0,17
0,00 – 0,46
0,18
0,00 – 0,50
0,24
1
0,06 – 0,20
0,12
0,11 – 0,18
0,14
0,11 – 0,30
0,18
0,05 – 0,26
0,15
2
0,09 – 0,20
0,15
0,06 – 0,59
0,28
0,02 – 0,25
0,13
0,05 – 0,25
0,17
3
0,12 – 0,22
0,17
0,10 – 0,37
0,25
0,12 – 0,18
0,14
0,18 – 0,28
0,22
4
0,07 – 0,14
0,10
0,17 – 0,23
0,21
0,12 – 0,26
0,19
0,13 – 0,30
0,23
5
0,07 – 0,25
0,16
0,10 – 0,33
0,25
0,17 – 0,37
0,24
0,09 – 0,20
0,15
6
0,14 – 0,25
0,21
0,15 – 0,23
0,18
0,17 – 0,32
0,23
0,05 – 0,18
0,11
7
0,10 – 0,31
0,19
0,02 – 0,65
0,25
0,19 – 0,25
0,22
0,13 – 0,15
0,13
8
0,11 – 0,42
0,27
0,05 – 0,34
0,16
0,02 – 0,29
0,13
0,04 – 0,14
0,10
9
0,11 – 0,20
0,15
0,09 – 0,32
0,18
0,04 – 0,43
0,20
0,04 – 0,22
0,11
10
0,07 – 0,35
0,17
0,09 – 0,57
0,27
0,00 – 0,50
0,25
0,17 – 0,30
0,23
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Observa-se na Figura 10 um comportamento bastante variável na concentração
dos monócitos durante todo o período de aplicação do ozônio. Tanto nos machos
como nas fêmeas tratados com 500 mL da mistura do gás, (MT500 e FT500) existiu
uma tendência a aumentar a concentração dos monócitos até a oitava e quinta
aplicação, respectivamente. A resposta observada nos machos tratados com 1000 mL,
64
apesar de variável, ocasionou valores médios acima do limite médio calculado (Figura
10). As fêmeas que receberam a maior dose (1000 mL) responderam com uma
diminuição ao receberem a primeira aplicação da mistura do gás, apresentando depois
um aumento na concentração dos monócitos até o quarto período de aplicação, sendo
que, posteriormente, apresentaram valores médios em decréscimo até o término do
período experimental. Ao retirar a aplicação do ozônio, os valores médios na
concentração de monócitos aumentaram em todos os grupos em estudo.
Ao se monitorar a concentração dos monócitos frente à administração de
diferentes doses da mistura do gás, nota-se um aumento mais rápido na quantidade
dessas células depois de administrada a maior dose, ou seja, 1000 mL, o que sugere o
efeito dose-dependente descrito na literatura científica (Bocci, 1994a; Plopper et al.,
1994; Wright et al., 1994; Valacchi & Bocci, 1999; Deaton et al., 2005).
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Monócitos (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 10 – Estimativas de monócitos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
65
Os valores médios da concentração dos basófilos (x10
3
µL
-1
) obtidos durante
as aplicações de ozônio nos animais (Tabela 9), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (0-0,29 x10
3
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al.,
1975; Jain, 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer, 1997).
A exceção dos machos tratados com 500 mL da mistura do gás, que
inicialmente (até o quinto período de aplicação) apresentaram um aumento discreto na
concentração dos basófilos (Figura 11), os demais animais apresentaram diminuição
na concentração destas células. Também pode ser observado que com o avançar das
aplicações a concentração deste parâmetro tende a aumentar. Após três dias de haver
retirado o ozônio dos animais, os valores médios diminuíram, exceto nas fêmeas que
receberam anteriormente 1000 mL da mistura do gás.
TABELA 9 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de basófilos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
0,00 – 0,09
0,02
0,00 – 0,21
0,14
0,14 – 0,27
0,21
0,00 – 0,32
0,13
1
0,01 – 0,06
0,04
0,04 – 0,09
0,06
0,06 – 0,09
0,07
0,02 – 0,19
0,08
2
0,00 – 0,21
0,10
0,05 – 0,10
0,07
0,00 – 0,05
0,03
0,05 – 0,12
0,08
3
0,03 – 0,26
0,11
0,04 – 0,16
0,10
0,03 – 0,05
0,04
0,05 – 0,11
0,08
4
0,02 – 0,26
0,10
0,10 – 0,15
0,13
0,02 – 0,05
0,03
0,02 – 0,19
0,11
5
0,00 – 0,26
0,12
0,06 – 0,17
0,16
0,02 – 0,07
0,05
0,05 – 0,15
0,10
6
0,02 – 0,07
0,05
0,04 – 0,12
0,09
0,00 – 0,12
0,05
0,07 – 0,10
0,09
7
0,02 – 0,17
0,08
0,04 – 0,15
0,11
0,06 – 0,18
0,11
0,00 – 0,08
0,03
8
0,03 – 0,28
0,14
0,09 – 0,23
0,14
0,06 – 0,08
0,06
0,00 – 0,09
0,04
9
0,00 – 0,19
0,09
0,13 – 0,23
0,18
0,03 – 0,14
0,07
0,04 – 0,19
0,09
10
0,00 – 0,07
0,03
0,00 – 0,19
0,12
0,00 – 0,09
0,03
0,17 – 0,48
0,28
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
66
Ainda não existem relatos sobre a relação específica do ozônio sobre os
basófilos. Como estas células também podem ser produzidas na medula óssea (Jain,
1993) e devido ao efeito da ozonioterapia sobre a medula (Remigio et al., 1999), pode
haver estímulo no aparecimento dos basófilos no sangue periférico. Também é
possível que haja uma associação com antigenicidade, por ser uma das funções dos
basófilos. Adicionalmente, sabe-se que a produção de basófilos é antigênico-
específica regulada por citocinas específicas produzidas por linfócitos T ativados
(Jain, 1993), podendo esta ativação ocorrer devido à exposição ao ozônio.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Basófilos (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 11 – Estimativas de basófilos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados com
500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos
tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL),
durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Os valores médios da concentração de eosinófilos (x10
3
µL
-1
), obtidos nos
animais durante as aplicações de ozônio (Tabela10), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (0-1x10
3
µL
-1
) para a espécie eqüina (Schalm et al., 1975;
Jain, 1993; Menesis et al., 1993, Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer, 1997).
67
Tanto as fêmeas como os machos permaneceram com valores estáveis nas
primeiras aplicações do ozônio (exceto FT1000), com discreta diminuição na
concentração dos eosinófilos após a segunda aplicação do ozônio, que foi seguida por
um aumento na concentração destas células (Figura 12). Quando utilizada a menor
dose (500 mL de ozônio), as fêmeas comparadas com os machos que receberam a
mesma quantidade da mistura do gás, atingiram valores na concentração de
eosinófilos acima do limite médio de controle, com as últimas aplicações do ozônio.
Já quando os eqüinos receberam a maior dose (1000 mL), a resposta sobre a
concentração dos eosinófilos foi mais evidente, atingindo inclusive valores acima do
limite médio de controle. Da mesma forma que aconteceu com a concentração dos
basófilos, ao cessar o fornecimento do ozônio, as fêmeas (F1000) continuaram
apresentando valores médios altos, ainda que dentro da faixa de normalidade para a
espécie.
TABELA 10 – Valores mínimos, máximos e médios da concentração de eosinófilos
(x10
3
μL
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000
mL de ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
0,14 – 0,36
0,27
0,00 – 0,60
0,29
0,00 – 0,18
0,14
0,16 – 0,38
0,29
1
0,12 – 0,32
0,20
0,07 – 0,23
0,14
0,07 – 0,18
0,13
0,25 – 0,35
0,29
2
0,18 – 0,24
0,21
0,05 – 0,47
0,21
0,13 – 0,27
0,20
0,11 – 0,15
0,13
3
0,13 – 0,28
0,21
0,19 – 0,23
0,21
0,12 – 0,24
0,19
0,16 – 0,41
0,27
4
0,20 – 0,32
0,25
0,14 – 0,32
0,20
0,10 – 0,30
0,19
0,26 – 0,36
0,31
5
0,27 – 0,40
0,35
0,17 – 0,46
0,29
0,20 – 0,40
0,28
0,41 – 0,67
0,58
6
0,15 – 0,26
0,20
0,12 – 0,74
0,39
0,19 – 0,29
0,23
0,18 – 0,62
0,36
7
0,20 – 0,31
0,25
0,08 – 0,51
0,36
0,23 – 0,65
0,37
0,20 – 0,28
0,24
8
0,16 – 0,29
0,24
0,03 – 0,54
0,36
0,21 – 0,34
0,29
0,21 – 0,49
0,31
9
0,19 – 0,28
0,25
0,16 – 0,45
0,26
0,21 – 0,43
0,34
0,32 – 0,39
0,35
10
0,14 – 0,48
0,31
0,00 – 0,53
0,21
0,07 – 0,11
0,09
0,08 – 0,67
0,45
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
68
Da mesma forma que mencionado para os basófilos, como o ozônio atua sobre
a medula óssea (Remigio et al., 1999), e esta é responsável pela produção dos
eosinófilos (Jain, 1993), é possível que o aumento na concentração dessas células
durante o período experimental seja decorrente da ozonioterapia.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Eosinófilos (x10
3
µL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 12 – Estimativas de eosinófilos (x10
3
µL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Os valores médios da concentração de plaquetas (plaquetas/campo), obtidos
nos animais durante as aplicações de ozônio (Tabela 11), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (5-17,5 plaquetas/campo) para a espécie eqüina (Schalm et
al., 1975; Jain, 1993; Menesis et al., 1993; Meyer et al., 1995; Taylor & Hillyer,
1997).
Após as primeiras aplicações do ozônio observou-se um acréscimo acentuado
na contagem das plaquetas (Figura 13) em todos os eqüinos, independente do sexo
(fêmeas ou machos) ou da dose da mistura do gás (500 ou 1000 mL) administrada,
69
chegando inclusive a valores acima do limite superior de controle. Após a quinta e
sexta aplicação, houve uma marcada redução nos valores que se aproximaram dos
iniciais. Posteriormente ocorreu oscilação na contagem das plaquetas, porém os
valores se mantiveram acima do limite médio após o término da aplicação do ozônio.
As plaquetas têm um papel importante no que se refere a fluidez do sangue, da
mesma forma que o hematócrito, os eritrócitos circulantes e a concentração das
proteínas no sangue e plasma (Birchard, 1997; Stoiber et al., 2005). Segundo Zee &
De Monte (2001), o ozônio age diminuindo a viscosidade do sangue e do plasma em
humanos, por redução das macromoléculas plasmáticas e da capacidade de formação
de coágulo, o que pode ser constatado pelo aumento no tempo de trombina (TT), fator
von Willebrand (vWF) e do plasminogênio (t-PA), assim como pela diminuição do
fibrinogênio.
TABELA 11 – Valores mínimos, máximos e médios de plaquetas (por campo) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
6,00 – 9,00
7,67
7,00 – 9,00
8,00
8,00 – 10,00
9,00
7,00 – 7,00
7,00
1
6,75 – 10,00
8,42
8,25 – 9,50
8,75
8,00 – 9,33
8,78
6,50 – 8,25
7,58
2
11,25 – 13,00
12,33
9,25 – 13,00
10,92
10,50 – 11,25
10,83
10,00 – 13,00
11,00
3
10,25 – 14,00
12,00
10,00 – 11,50
11,33
11,00 – 13,50
12,42
9,75 – 12,25
11,25
4
11,00 – 13,00
11,92
8,75 – 13,50
11,75
9,25 – 13,25
11,58
9,25 – 12,50
11,00
5
6,75 – 10,25
8,75
7,00 – 10,00
8,5
9,00 – 12,50
11,17
8,25 – 15,75
10,75
6
8,00 – 8,75
8,25
6,25 – 8,50
7,42
7,25 – 8,75
8,42
9,00 – 9,50
9,17
7
7,75 – 9,25
8,25
7,00 – 10,00
8,75
8,00 – 12,00
9,83
7,25 – 9,00
8,33
8
7,75 – 12,00
9,25
8,75 – 9,50
9,25
7,75 – 10,50
9,33
9,00 – 10,75
9,75
9
6,25 – 11,75
8,42
8,00 – 12,25
9,97
7,50 – 10,00
9,17
7,25 – 9,00
8,25
10
6,00 – 12,00
10,00
9,00 – 13,00
11,33
8,00 – 15,00
11,00
7,00 – 14,00
10,67
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
70
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
12,00
13,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Plaquetas (/campo)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 13 – Estimativas de plaquetas (por campo) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL) durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Também por ação direta do ozônio sobre a membrana dos eritrócitos ocorre
aumento na fluidez da mesma e diminuição na capacidade de aglutinação dessas
células, resultando em diminuição da viscosidade do sangue (Bulies, 1996).
O aumento na quantidade de plaquetas por campo, presente nos animais deste
estudo pode ser decorrente da liberação do fator de ativação plaquetária (PAF) que,
segundo Wright et al. (1994), é devido à ação seletiva do ozônio sobre as membranas
celulares, clivando principalmente o ácido araquidônico e produzindo este mediador
lipídico, através da ação das fosfolipases (PLA
2
, PLC, PLD).
Não houve diferença no comportamento com relação ao sexo ou dose
utilizada, sendo estes resultados diferentes dos obtidos por Wright et al. (1994), ao
estudar plaquetas in vitro de porquinhos da índia (Cavia porcellus), expostas ao
ozônio.
Ainda com relação a ação do ozônio sobre as membranas das plaquetas,
Wright et al. (1994), mencionaram que ocorre um aumento na permeabilidade
71
celular, que atua como um sinal para a ativação de processos fibrinogênicos. Esta
resposta pode ser direta à mistura do gás ou mesmo aos subprodutos da reação do
ozônio.
É possível que a resposta fisiológica à exposição ao ozônio seja inicialmente
de fluidificação do sangue, tal como descrito pela literatura científica (Verrazo et al.,
1994) para a espécie humana. Entretanto em eqüinos, baseado nos resultados obtidos
no presente estudo, é possível que algum fator seja responsável pelo aumento na
concentração das plaquetas, o que possivelmente contrapõe os resultados obtidos em
outras espécies.
Os valores médios da concentração de glicose (mg dL
-1
) obtidos nos animais
durante as aplicações do ozônio (Tabela 12), encontraram-se dentro dos considerados
como referenciais (75-115 mg dL
-1
) para a espécie eqüina (Meyer et al., 1995;
Kaneko et al., 1997).
A Figura 14 mostra claramente a redução na concentração da glicose, quando
realizada a primeira aplicação do ozônio (exceto FT500), porém com discreto
aumento após este achado nas fêmeas tratadas. Em geral, apesar de algumas
oscilações, os valores médios da glicose diminuíram até o final do período de
aplicações. Durante a quarta e nona aplicação observaram-se valores de glicose
abaixo do limite médio e, em ocasiões, do limite inferior de controle nos machos
tratados com a menor dose (MT500) e nas fêmeas que receberam a maior dose
(FT1000).
As fêmeas que receberam a menor dose apresentaram os valores mais altos na
concentração da glicose do que os demais grupos.
A redução da glicose pelo ozônio pode ser decorrente de glicólise, já
mencionada por Bulies (1996) em humanos. Segundo Viebahn (1985), além da via
glicolítica normal através da hexoquinase, a transformação metabólica da glicose
induzida pelo ozônio acontece através da via do ciclo da pentose. Outro aspecto que
pode ser mencionado é o aumento da atividade muscular que, segundo Mutis & Pérez
(2005), resulta em glicólise ao induzir o trabalho muscular cardíaco.
72
TABELA 12 – Valores mínimos, máximos e médios de glicose (mg dL
-1
) em eqüinos
machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio (Aplicações
1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
83,00 – 132,00
110,67
80,90 – 146,00
121,97
63,90 – 87,50
79,17
75,20 – 111,00
92,07
1
90,65 – 100,50
93,96
88,30 – 106,73
98,23
92,33 – 98,50
94,78
81,73 – 93,13
86,90
2
86,65 – 99,25
93,97
96,25 – 98,00
97,17
98,75 – 110,75
102,75
89,25 – 100,50
93,83
3
82,00 – 90,25
85,75
83,25 – 91,50
86,58
85,25 – 111,75
96,83
86,25 – 103,00
93,83
4
82,78 – 86,78
84,35
85,50 – 91,85
87,94
86,55 – 96,90
90,82
78,10 – 83,30
81,22
5
78,00 – 84,00
81,00
78,00 – 85,00
82,00
83,00 – 90,25
87,17
70,00 – 85,00
78,33
6
77,00 – 82,25
79,08
76,00 – 83,50
79,50
85,50 – 87,50
86,50
78,00 – 84,50
81,17
7
76,00 – 84,00
79,67
80,00 – 109,00
90,67
82,00 – 88,00
85,33
76,00 – 92,00
85,67
8
77,00 – 83,50
79,50
79,00 – 110,25
89,83
80,25 – 88,75
84,17
77,00 – 79,00
77,75
9
75,00 – 85,00
80,33
78,00 – 98,00
85,67
86,00 – 93,00
89,00
76,00 – 83,00
79,00
10
71,00 – 90,00
80,00
79,00 – 91,00
83,00
80,00 – 88,00
84,00
78,00 – 85,00
81,67
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Os valores médios da concentração de fibrinogênio (mg dL
-1
) obtidos nos
animais durante as aplicações de ozônio (Tabela 13), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (100-400 mg dL
-1
) para a espécie eqüina (Meyer et al.,
1995; Kaneko et al., 1997).
O comportamento da concentração do fibrinogênio foi semelhante nos quatro
grupos (Figura 15), revelando um discreto aumento com algumas oscilações ao longo
do período de aplicação do ozônio. Nos machos e fêmeas que receberam 500 mL de
ozônio, esta tendência foi mais linear. Quando o tratamento foi com 1000 mL da
mistura do gás, os valores médios obtidos nos machos foram variáveis, porém os
valores finais após a retirada do ozônio ainda eram superiores aos iniciais. As fêmeas
que receberam 1000 mL da mistura do gás apresentaram uma redução inicial (segunda
aplicação) na concentração do fibrinogênio, para aumentar progressivamente na fase
intermediária do período experimental, a medida que eram realizadas as aplicações da
73
mistura do gás, atingindo valores acima do limite médio de controle (LM) e
alcançando, posteriormente, valores mais estáveis.
70,00
80,00
90,00
100,00
110,00
120,00
130,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Glicose (mg dL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 14 – Estimativas de glicose (mg dL
-1
) em MT500 (machos tratados com 500
mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados
com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL), durante o
período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior de controle, LM:
limite médio, LIC: limite inferior de controle (Aplicações 1-9).
Este aumento na concentração do fibrinogênio com uma tendência a diminuir
após a retirada da aplicação da mistura do gás reflete um efeito transitório,
conseqüente da administração da mistura do gás, tal como encontrado por Verrazo et
al. (1995), ao realizar cinco aplicações de ozônio, mediante autohemotransfusão em
pacientes humanos, com doença arterial oclusiva periférica, onde os efeitos nesta
proteína não eram mais observados após 24 horas de administrado o último
tratamento. Segundo os autores, esta resposta pode ser decorrente de uma alteração
transitória na estrutura molecular do fibrinogênio, em resposta à presença
momentânea de radicais livres derivados da ação da ozonioterapia.
74
TABELA 13 – Valores mínimos, máximos e médios de fibrinogênio (mg dL
-1
) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio.
(Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
120,00 – 147,60
131,07
115,90 – 123,70
119,83
132,20 – 138,50
135,47
100,70 – 132,40
116,10
1
135,75 – 144,50
139,44
113,85 – 127,30
122,37
134,94 – 138,00
136,28
117,73 – 133,53
125,23
2
120,15 – 140,43
131,59
123,35 – 137,95
130,56
131,90 – 139,38
136,17
112,70 – 117,65
114,75
3
125,45 – 136,68
129,57
118,50 – 209,53
159,53
139,45 – 144,58
141,98
127,35 – 153,55
139,62
4
117,70 – 146,28
133,43
121,00 – 155,70
134,91
129,45 – 135,05
131,54
129,18 – 159,25
141,24
5
121,35 – 159,48
138,62
120,15 – 167,60
141,34
138,00 – 160,43
148,58
123,73 – 161,25
144,25
6
123,13 – 153,88
137,98
106,68 – 143,40
126,38
143,35 – 155,85
149,83
123,80 – 220,28
159,46
7
141,53 – 161,43
149,88
132,43 – 161,95
145,47
145,18 – 163,63
155,75
142,7 – 160,28
148,87
8
107,28 – 150,78
127,97
123,45 – 166,08
147,60
137,4 – 159,53
145,05
128,98 – 160,70
143,70
9
128,15 – 147,38
137,88
122,88 – 193,95
150,54
134,68 – 156,23
143,44
131,25 – 166,43
145,74
10
110,70 – 152,20
133,80
155,20 – 227,10
186,93
99,60 – 131,40
118,87
121,60 – 164,30
143,47
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Na opinião de Senior et al. (1986), este aumento do fibrinogênio é bastante
importante nos processos de cicatrização. Neste sentido, o tratamento tópico com
ozônio vem sendo utilizado para a redução do tempo de retração de feridas em
diferentes espécies (Sánchez et al., 1998; Carreira & Almagro, 2000; Matsumoto et
al., 2001; Camps et al., 2003).
Os valores médios da CK (U L
-1
), obtidos nos animais durante as aplicações
de ozônio (Tabela 14), encontraram-se dentro dos considerados como referenciais
(60-330 U L
-1
) para a espécie eqüina (Meyer et al., 1995; Kaneko et al., 1997;
Radostits et al., 2002).
75
100,00
110,00
120,00
130,00
140,00
150,00
160,00
170,00
180,00
190,00
200,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Fibrinogênio (mg dL
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 15 – Estimativas de fibrinogênio (mg dL
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Ao se monitorar este parâmetro observa-se uma tendência variável, mas ao
mesmo tempo similar entre os grupos. Apesar da variação, os valores médios
oscilaram próximos aos do valor médio de controle, demonstrando inclusive esta
variabilidade após a retirada da aplicação do ozônio, momento no qual, os animais
que receberam a menor dose (500 mL) mostraram uma tendência a elevação dos
valores médios, enquanto nos que receberam a maior dose (1000 mL) ocorreu uma
diminuição (Figura 16).
Esta é uma enzima muito sensível que pode se elevar em concentração sérica
tanto por lesão muscular como pela reação na membrana celular ou pelo aumento na
permeabilidade da mesma (Martínez, et al., 2000; Hinchcliff et al., 2004). Também
pela exposição a radicais livres resultantes da exposição ao ozônio (Zee & De Monte,
2001; Tylicki et al., 2003).
76
TABELA 14 – Valores mínimos, máximos e médios de creatina quinase (U L
-1
) em
eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de ozônio
(Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
155,00 – 239,00
195,67
174,00 – 321,00
233,00
255,00 – 618,00
456,67
169,00 – 287,00
223,67
1
174,50 – 245,75
201,83
166,68 – 279,50
234,39
202.33 – 312,67
254,17
168,00 – 281,75
212,25
2
192,88 – 353,65
275,36
137,63 – 301,45
211,31
206,33 – 426,15
279,95
209,55 – 394,40
298,84
3
170,98 – 241,63
198,30
109,35 – 327,48
213,46
118,80 – 174,75
141,83
148,80 – 189,35
174,73
4
116,00 – 219,75
179,50
144,25 – 228,00
179,00
170,00 – 180,25
175,58
189,50 – 218,25
199,42
5
160,20 – 245,83
197,17
130,58 – 270,43
191,21
179,35 – 344,30
238,79
182,73 – 205,33
191,33
6
139,20 – 334,95
225,95
151,85 – 234,93
190,03
158,70 – 314,45
236,53
229,13 – 193,50
210,71
7
130,28 – 241,25
173,19
122,98 – 216,70
173,13
146,63 – 247,30
186,43
151,73 – 301,43
212,18
8
146,00 – 253,00
210,67
188,00 – 346,75
250,33
192,00 – 256,50
218,83
176,25 – 245,50
213,92
9
184,50 – 277,50
225,25
194,25 – 417,00
272,17
181,25 – 216,50
199,17
162,50 – 239,75
199,00
10
221,00 – 593,00
361,67
109,00 – 191,00
153,00
197,00 – 290,00
243,00
124,00 – 185,00
158,33
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
Os valores na concentração da CK podem retornar ao normal em 24 a 48 horas
depois de realizado o exercício pelo animal e quando este não é efetuado de forma
contínua (Mutis & Pérez, 2005), conseqüentemente as oscilações evidenciadas neste
trabalho durante o período de aplicações podem ser explicadas pelo protocolo
instituído, com administração da mistura do gás a cada três dias. De forma contrária,
os efeitos de membrana poderiam ser evidenciados de forma mais estável ou
crescente, dependendo das condições de trabalho e da resposta aos radicais livres
decorrentes do estresse oxidativo pelo exercício (Martínez, et al., 2000).
77
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
350,00
400,00
450,00
500,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Creatina quinase -CK- (U L
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 16 – Estimativas de creatina quinase (U L
-1
) em MT500 (machos tratados
com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL), MT1000
(machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas com 1000
mL), durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite superior
de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle
(Aplicações 1-9).
Segundo Bocci (1994b), o trabalho cardíaco pode ser estimulado no início da
ozonioterapia, pelo aumento no volume circulatório decorrente do aumento na fluidez
do sangue e/ou pela vasodilatação, com a liberação do óxido nítrico das células
endoteliais ou mesmo pelo ajuste do diâmetro vascular, pelo que a resposta fisiológica
do animal se reflete no aumento do trabalho muscular cardíaco e, com isto, no
aumento na concentração da CK (Birchard, 1997). Entretanto, apesar de haver
ocorrido aumento na concentração desta enzima acima do limite superior de controle
após algumas aplicações, o protocolo de aplicação do ozônio, a cada três dias pode
não ter sido suficiente para manter elevados os valores da creatina quinase.
Os valores médios da gama glutamiltransferase (U L
-1
), obtidos durante as
aplicações do ozônio nos animais (Tabela 15), encontraram-se dentro dos
considerados de referência (4-44 U L
-1
) para a espécie eqüina (Meyer et al., 1995;
Kaneko et al., 1997; Radostits et al., 2002), ressaltando que o grupo das fêmeas
78
tratadas com a maior dose, apresentou os valores mais altos desde o início até o final
do período de aplicação do ozônio.
TABELA 15 – Valores mínimos, máximos e médios da gama glutamiltransferase (U
L
-1
) em eqüinos machos e fêmeas, tratados com 500 e 1000 mL de
ozônio (Aplicações 1-9).
Aplicações
Machos
Fêmeas
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
T500
Min-Max
(Média)
T1000
Min-Max
(Média)
0
4,99 – 24,90
12,35
6,51 – 18,00
12,37
4,99 – 5,92
5,30
9,78 – 48,1
23,39
1
4,99 – 24,78
11,92
5,65 – 17,73
11,64
4,99 – 6,10
5,37
7,72 – 46,13
21,81
2
8,48 – 32,45
16,80
9,75 – 27,00
18,78
7,43 – 10,35
9,06
10,68 – 56,1
27,94
3
7,65 – 31,70
16,07
9,15 – 21,93
16,82
6,68 – 10,53
8,64
12,63 – 50,05
26,22
4
4,99 – 15,18
8,48
5,27 – 20,63
12,69
5,15 – 6,19
5,53
4,99 – 33,4
16,00
5
5,19 – 20,70
10,63
5,02 – 18,35
11,98
5,34 – 5,94
5,69
6,39 – 37,6
18,13
6
5,48 – 22,18
11,26
6,03 – 22,98
13,92
5,35 – 5,65
5,54
7,28 – 31,23
16,26
7
4,99 – 18,33
9,77
6,06 – 15,02
11,02
5,89 – 6,09
5,98
6,12 – 31,78
15,42
8
6,15 – 19,03
10,51
5,79 – 19,50
12,81
4,99 – 8,10
6,30
7,20 – 31,28
16,09
9
5,34 – 17,37
9,45
4,99 – 16,02
10,85
5,60 – 15,10
8,85
6,34 – 25,53
13,09
10
5,00 – 16,20
10,93
5,00 – 12,30
9,60
5,00 – 5,24
5,08
5,00 – 22,20
11,13
T500: 500 mL da mistura do gás administrados, T1000: 1000 mL da mistura do gás administrados.
A tendência observada nos quatro grupos foi bastante semelhante com valores
máximos após as primeiras aplicações, seguido por uma acentuada diminuição após a
quarta aplicação da mistura do gás, para em seguida se manter mais estável até o final
do período experimental (Figura 17). Após o término das aplicações, houve uma
tendência a redução na concentração da GGT, exceto nos machos tratados com a
menor dose (500 mL).
79
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de aplicações
Gama Glutamiltransferase -GGT- (U L
-1
)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 17 – Estimativas de gama glutamiltransferase (U L
-1
) em MT500 (machos
tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com 1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL) durante o período de aplicação de ozônio. LSC: limite
superior de controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de
controle (Aplicações 1-9).
Os eqüinos que receberam a menor dose do ozônio apresentaram, na maior
parte do experimento, valores médios de concentração de GGT inferiores e abaixo do
limite médio de controle. Os machos tratados com 1000 mL da mistura do gás
mantiveram valores médios bastante próximos a esse limite médio, já as fêmeas que
receberam esta mesma dose apresentaram valores médios discretamente acima deste.
A avaliação deste parâmetro também é importante no diagnóstico e
acompanhamento do trabalho muscular. O aumento dos níveis de GGT sérico pode
estar associado à sobrecarga no treinamento em alguns eqüinos. Animais com baixo
rendimento podem apresentar até quatro vezes mais aumento na concentração de
GGT, sem que haja evidência laboratorial de problema hepático. A fonte desta
atividade elevada ainda é incerta, porém nota-se retorno aos níveis de referência com
30 a 60 dias, caso não haja outro estímulo para sua produção (Hinchcliff et al., 2004).
O aumento na concentração da GGT após a segunda aplicação pode estar
relacionado com o aumento no débito cardíaco ocasionado pelo ozônio, mencionado
80
por Bocci (1994a) como decorrente do aumento da pressão arterial, devido a liberação
do oxido nítrico pelas células endoteliais. Segundo Birchard (1997), elevação da
pressão pode resultar em aumento no fluxo sangüíneo para o coração e, com isto,
maior trabalho é exercido pelas fibras musculares cardíacas. Por outro lado, a
estabilização dos valores médios nos animais deste estudo após o aumento inicial
pode ser decorrente do adequado condicionamento cardio-muscular dos equinos.
Esta adaptação ao estresse oxidativo causado pelo ozônio é descrito por Bocci
(2004) e Sunnen (1989), sendo fundamental que as aplicações sejam administradas de
forma contínua e lenta e nas concentrações adequadas (10-80 µg mL
-1
) (Plopper et al.,
1994).
81
CONCLUSÕES
Nas condições do presente estudo experimental e com base nos resultados obtidos
pode-se concluir que:
1. Existe tendência positiva sobre os valores do hematócrito em eqüinos expostos
à ozonioterapia, caracterizada pelo aumento deste parâmetro após três a cinco
aplicações.
2. A ozonioterapia tem efeito positivo sobre os eritrócitos de eqüinos,
caracterizado pelo aumento na concentração deste parâmetro, particularmente
nas fêmeas, após pelo menos três aplicações.
3. Resposta tardia, porém positiva, caracterizada pelo aumento na concentração
dos segmentados, é observada durante ozonioterapia em eqüinos.
4. Resposta transitória, porém positiva, caracterizada pelo aumento na
concentração dos bastonetes é observada durante ozonioterapia em eqüinos.
5. Independente do sexo e da dose administrada, eqüinos expostos à
autohemotransfusão com ozônio respondem inicialmente com aumento na
contagem de plaquetas.
6. Existe tendência positiva sobre os valores de glicose em eqüinos expostos à
ozonioterapia, caracterizada pela diminuição gradativa, porém transitória,
deste parâmetro a partir da terceira aplicação.
7. A ozonioterapia apresenta efeito positivo sobre a gama glutamiltransferase de
eqüinos, caracterizado pelo aumento, com posterior diminuição na
concentração deste parâmetro, apartir da terceira aplicação.
8. A exposição de eqüinos sadios a 500 e 1000 mL da mistura terapêutica de
ozônio, mediante autohemotransfusão não acarreta alterações clínicas.
82
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88
CAPITULO IV
OZONIOTERAPIA EM EQÜINOS: EFEITOS PRINCIPAIS E DA
INTERAÇÃO DO SEXO E DOSE ADMINISTRADA SOBRE PARÂMETROS
HEMATOLÓGICOS E DA BIOQUÍMICA SANGÜÍNEA
RESUMO
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, dezembro de
2006. Efeitos da ozonioterapia sobre parâmetros clínicos, hematológicos e da
bioquímica sangüínea em eqüinos. Orientadora: Maria Verônica de Souza, Co-
Orientadores: John Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos
Benjamim.
O objetivo deste estudo foi avaliar, in vivo, os efeitos do sexo e da dosagem de
ozônio, sobre parâmetros hematológicos (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos,
leucócitos totais, segmentados, bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos,
eosinófilos e plaquetas) e da bioquímica sangüínea (glicose, fibrinogênio, creatina
quinase e gama glutamiltransferase), durante o período de aplicação da mistura do
gás. Para isso, foram utilizados 12 eqüinos mestiços, sendo 6 machos e 6 fêmeas, com
idades compreendidas entre 4 e 20 anos. Os animais foram submetidos à
ozonioterapia, mediante administração de 500 ou 1000 mL da mistura do gás, por via
intravenosa, a cada três dias, por um período total de 24 dias. Antes, porém, foram
divididos em quatro grupos: MT500, MT1000, FT500 e FT1000, sendo machos (M)
que receberam 500 mL e 1000 mL e, fêmeas (F) que receberam 500 e 1000 mL,
respectivamente. Os resultados demonstraram que o sexo foi um fator de relevância
na concentração dos eritrócitos (p<0,05) em resposta à ozonioterapia, sendo que as
fêmeas revelaram valores médios mais altos deste parâmetro, independentemente da
dose de ozônio administrada.
Palavras-chave: ozônio, cavalos, hematologia.
89
ABSTRACT
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, December
2006. Effects of ozone therapy on equine clinical, hematological and blood
biochemistry parameters. Adviser: Maria Verônica de Souza, Co-Advisers: John
Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos Benjamim.
The objective for this study was to evaluate, in vivo, the sex and ozone dose
effects, over hematological (hematocrit, hemoglobin, erythrocytes, leukocytes,
neutrophils, bands, lymphocytes, monocytes, basophils, eosinophils and platelets) and
blood biochemistry parameters (glucose, fibrinogen, creatine kinase and gamma
glutamyltransferase), during the application period. Twelve cross bred horses, 6 males
and 6 females, between 4 and 20 years old were exposed to ozone therapy through the
application of 500 and 1000 mL of the gas mixture, intravenously, every three days,
for 24 days. Four groups were conformed: MT500, MT1000, FT500 and FT1000,
which comprised males (M) and females (F) receiving 500 and 1000 mL of ozone,
respectively. The results revealed that sex was a relevant factor on the erythrocytes
blood count (p<0.05) in response to ozone therapy, where the females showed higher
mean values of this parameter, independently of the administered dose.
Keywords: ozone, horses, hematology.
90
INTRODUÇÃO
Não há muitos trabalhos em medicina veterinária avaliando os efeitos da
ozonioterapia, onde se comparem diferentes concentrações da mistura do gás ou
diferença dos efeitos determinados pelo sexo. Em geral, os artigos nesta área
comparam um protocolo convencional, com a ozonioterapia, demonstrando os
benefícios desse tratamento alternativo (Gracer & Bocci, 2005; Méndez et al., 2005).
Adicionalmente, a maioria dos trabalhos é realizada sob condições in vitro (Ducussin
et al., 2003), sendo assim importante o estudo in vivo (Camps et al., 2003) tanto em
animais sadios como enfermos, já que a resposta pode ser diferente (Ohtsuka et al.,
2006). Nesse sentido, com a finalidade de se detectar possíveis diferenças no
protocolo terapêutico da autohemotransfusão ozonizada em eqüinos, o objetivo deste
estudo foi verificar se existe influência da dose, do sexo ou interação destes fatores
sobre parâmetros hematológicos (hematócrito, hemoglobina, eritrócitos, leucócitos
totais, segmentados, bastonetes, linfócitos, monócitos, basófilos, eosinófilos e
plaquetas) e da bioquímica sangüínea (glicose, fibrinogênio, creatina quinase e gama
glutamiltransferase), em animais submetidos à ozonioterapia e, com isto, poder
estabelecer se existe alguma diferença no momento de instituir um protocolo para
fêmeas e machos, segundo o efeito desejado depois de realizado o tratamento.
91
REVISÃO DE LITERATURA
Apesar de todos os avances relacionados com descobertas científicas em
estudos realizados com o ozônio médico, são poucos os trabalhos que comparam
resultados nos pacientes humanos ou animais em estudo, pelo sexo; porém, alguns já
comparam diferentes dosagens utilizadas e demonstram o efeito dose-dependente do
ozônio. Desta maneira, Bocci (1994a), descrevendo possíveis mecanismos de ação em
humanos quando instituída a autohemotransfusão, menciona o efeito dose-
dependente, relacionando-o também com o tempo de exposição ao gás.
Plopper et al. (1994), estudaram o sistema antioxidante em pulmões de ratos,
fêmeas e machos e, concluíram que existe efeito dose-dependente do gás e do tempo
de exposição ao mesmo, na ativação de enzimas antioxidantes. Por outro lado, os
autores não fizeram referência aos resultados obtidos com relação ao sexo dos
animais.
Wright et al. (1994), estudaram in vitro, o efeito do ozônio sobre a ativação de
fosfolipases em plaquetas de porquinhos da índia (Cavia porcellus), utilizando doses
entre 0,05 e 1,0 ppm e, concluíram que houve uma maior ativação das plaquetas
quando a maior dosagem foi utilizada.
Deaton et al. (2005), avaliaram a resposta antiinflamatória e antioxidante em
eqüinos sadios e com obstrução recorrente das vias aéreas, quando estes foram
expostos à inalação de ozônio, sendo constatado que uma dosagem menor (0,25
versus 0,80 ppm), provoca uma menor lesão no epitélio pulmonar.
92
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em nenhum momento do período experimental, os animais demonstraram
incômodo ou alteração do comportamento durante a ozonioterapia ou imediatamente
após a mesma, assim como após as atividades diárias.
Durante avaliação clínica diária os eqüinos não apresentaram sinais de
alteração, encontrando-se todos com parâmetros clínicos dentro dos considerados
como de referência para a espécie eqüina. Os valores médios de temperatura corporal,
freqüência cardíaca e respiratória foram de 37,01 °C, 34 bpm e de 24 rpm,
respectivamente. As mucosas se mantiveram de coloração rosáceas e úmidas e a taxa
de preenchimento capilar inferior a dois segundos, tal como descrito por Speirs
(1999), para a espécie eqüina. Entretanto, um dos animais apresentou um ferimento
acidental, que ocorreu na época da oitava aplicação.
Um discreto aumento da freqüência cardíaca e/ou respiratória poderia ser
observado, já que o estresse pode elevar estes parâmetros (Fernandes, 1997).
Durante a aplicação do ozônio, foi possível escutar, sem a utilização de
estetoscópio, os movimentos intestinais dos animais, particularmente 5 minutos após
o início da aplicação da mistura do gás. Além disso, todos os animais defecavam ao
redor de meia hora após a aplicação do ozônio, o que pode sugerir estímulo ou ação
do ozônio sobre os mecanismos do trato gastrointestinal. Pérez et al. (2003) avaliaram
pacientes humanos com a síndrome de má absorção intestinal causada por Giardia
lamblia tratados com ozonioterapia, no entanto os autores não mencionaram achado
semelhante ao nosso.
Alves et al. (2004), estudaram o processo de isquemia e reperfusão no jejuno
de eqüinos, demonstrando o efeito de proteção tecidual do ozônio sobre lesões de
reperfusão no trato gastrointestinal ainda que a via de administração tenha sido a
intravenosa.
Nas Tabelas de 1 a 15 encontram-se os valores médios obtidos a partir de cada
parâmetro hematológico e da bioquímica sangüínea dos eqüinos avaliados, por
dosagem de ozônio (500 mL ou 1000 mL) e sexo (machos ou fêmeas), nos diferentes
dias de aplicação.
Ao se avaliar as Tabelas 1, 4, 7, 10, 11, 12 e 13 observa-se que não houve
efeito (p>0,05) da ozonioterapia sobre os valores do hematócrito, leucócitos totais,
linfócitos, basófilos, plaquetas, creatina quinase, e gama glutamiltransferase
93
respectivamente, que fossem diferenciados pelo tratamento, sexo ou a interação
destes. Isto pode ser constatado ao observar a semelhança dos valores médios de cada
parâmetro avaliado durante todo o período de aplicações.
Ao se avaliar as Tabelas 2, 5, 6, 8, 9, 14 e 15 observa-se que houve ao menos
um efeito (p<0,05) do ozônio em algum dos períodos de aplicação seja pela dosagem,
sexo ou interação destes sobre os valores da hemoglobina, segmentados, bastonetes,
monócitos, eosinófilos, glicose e fibrinogênio, respectivamente. Entretanto, este não
foi um achado de relevância clínica no estudo, por não apresentar o mesmo
comportamento nos outros períodos de aplicação.
TABELA 1 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre o hematócrito (%) em cada período de
aplicação.
Hematócrito (%)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
37,78
38,49
35,64
36,94
40,38
39,70
38,16
38,23
38,68
T500
Fêmea
38,27
40,56
39,78
39,61
39,88
41,53
41,03
39,53
42,66
T1000
Macho
37,93
39,94
41,32
42,08
40,24
40,43
40,57
42,03
41,98
T1000
Fêmea
35,86
38,83
42,97
42,48
40,27
43,88
41,06
40,98
45,82
Efeito
Dosagem
-1,13
-0,14
4,43
4,00
0,13
1,54
1,22
2,61
3,23
Sexo
0,79
-0,47
-2,89
-1,53
0,24
-2,64
-1,68
-0,13
-3,91
Interação
1,29
1,59
1,24
1,14
-0,27
-0,81
1,19
1,17
0,08
CV(%)
7,63
12,84
9,30
9,03
12,40
10,97
6,82
7,97
12,51
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
Apesar das mudanças nos valores médios não apresentarem significância
(p>0,05) na maioria dos parâmetros avaliados, cabe ressaltar que o hematócrito
(Tabela 1) nas fêmeas, quando receberam a menor dose da mistura do gás em
avaliação (500 mL), apresentou-se na maioria dos períodos de aplicação, com valores
médios maiores do que nos machos. Quando administrados 1000 mL, os valores não
apresentaram uma diferença pelo sexo nem pelo tratamento (p>0,05), porém pode ser
observado, ainda que não significativamente uma diferença pelo tratamento utilizado,
em que os valores médios atingidos foram, em sua maioria, superiores quando
comparados com o grupo T500. Adicionalmente, pode ser observado que para as
quatro combinações avaliadas, os valores médios no final do período de aplicações
94
foram maiores em relação aos valores iniciais, demonstrando o efeito acumulativo da
ozonioterapia para este parâmetro hematológico. Também pode ser observado que
depois de realizados os dois primeiros períodos de aplicação nas fêmeas com a maior
dose (1000 mL), estas apresentaram valores menores, quando as mesmas foram
comparadas no período total, o que pode inferir uma discreta hemólise ao utilizar uma
maior dosagem nas fêmeas, como já relatado com pacientes humanos (Zimran et al.,
1999; Bocci, 2004), sem implicar risco aos pacientes sob tratamento, particularmente
se a hemólise é pequena. Adicionalmente, a partir do terceiro período de aplicação
estes animais recuperam os valores até o final do experimento. Esta ausência (p>0,05)
da resposta à ozonioterapia sobre o hematócrito, também foi descrita por Bocci
(2004), sendo resultante da não modificação do volume eritrocítico induzido pela
terapia.
Para a hemoglobina (Tabela 2) não se observaram efeitos (p>0,05) da
ozonioterapia determinados pelo sexo ou pela dosagem, exceto quando realizada a
sétima aplicação, onde houve efeito negativo (p<0,05) do sexo, tendo as fêmeas as
maiores médias, independentes da quantidade da mistura do gás nelas administrada.
Apesar de não haver efeito (p>0,05) do sexo nos demais períodos de aplicação,
verificou-se esta mesma tendência nos valores médios do parâmetro ao longo do
período experimental quando utilizados os 500 mL de ozônio. Quando foram
administrados 1000 mL da mistura do gás, os valores da hemoglobina das fêmeas e
machos foram similares. No final do período experimental, com a nona aplicação
pode-se observar um discreto aumento nos valores de hemoglobina nos animais de
três grupos avaliados (MT500, MT1000, FT1000).
Turrent & Menéndez (2001), mais do que elevação ou diminuição da
hemoglobina ressaltam o aumento da saturação desta com oxigênio, após cinco
sessões de ozônio através da autohemotransfusão em pacientes humanos em estado
crítico. Esta opinião é compartida por Giunta et al. (2001), que mencionaram haver
uma maior liberação de oxigênio para os tecidos. Estes autores não encontraram
influência do tratamento, sexo ou interação destes em humanos tratados com ozônio.
95
TABELA 2 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a hemoglobina (g dL
-1
) em cada período de
aplicação.
Hemoglobina (g dL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
9,37
9,21
9,25
9,28
9,19
9,34
9,08
9,13
9,51
T500
Fêmea
10,69
10,92
10,53
10,21
10,73
10,63
10,62
10,22
10,53
T1000
Macho
9,73
10,33
10,23
10,10
9,91
10,48
9,76
10,23
10,48
T1000
Fêmea
10,09
10,13
10,49
10,33
10,19
10,48
10,53
10,69
11,13
Efeito
Dosagem
-0,11
0,17
0,47
0,47
0,09
0,50
0,29
0,79
0,78
Sexo
-0,84
-
0,76
-0,77
-0,56
-0,91
-0,65
-
1,15
*
-0,78
-0,84
Interação
0,48
0,95
0,51
0,35
0,63
0,65
0,38
0,31
0,18
CV(%)
12,58
12,67
10,63
11,80
11,94
11,85
8,29
10,46
10,59
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
Gill e Wanska (1978) ao avaliarem índices hematológicos em eqüinos da raça
PSI, observaram mudanças associadas a alterações estacionais onde, no inverno, os
valores de hemoglobina diminuíam em ambos os sexos. Nas condições do presente
estudo não ocorreram mudanças bruscas na temperatura nem na umidade do
ambiente, sendo a temperatura média ao redor de 30°C, o que permitia conforto aos
animais.
Nazifi et al. (2003), também mencionaram que o sexo, assim como a idade,
não interferem na concentração de hemoglobina de eqüinos em condições normais.
Čebulj-Kadunc et al. (2002), quando avaliaram os parâmetros hematológicos
em cavalos Lipizanos em repouso, encontraram diferença significativa determinada
pelo sexo, onde as éguas avaliadas apresentaram valores médios inferiores quando
comparadas com os garanhões. Exceção foi observada nos animais com idade entre
um e dois anos, onde as fêmeas apresentaram valores superiores.
Schalm et al. (1975), descrevem também que as raças Quarto de Milha e PSI
costumam apresentar valores menores de hemoglobina nos machos. Os animais
incluídos neste estudo possuem porcentagem desta raça na sua genética, o que poderia
justificar os discretos valores mais elevados da hemoglobina nas fêmeas.
Adicionalmente, os animais são resultado do cruzamento com a raça Andaluza que,
segundo Čebulj-Kadunc et al. (2002), apresenta valores similares de hemoglobina
com a raça Quarto de Milha.
96
Na avaliação da concentração dos eritrócitos, observa-se o efeito (p<0,05) do
sexo a partir da quarta aplicação do ozônio (Tabela 3), independente da quantidade
administrada. Esta diferença é observada desde o início do período de aplicações
(p>0,05), no entanto o aumento (p<0,05) na concentração dos eritrócitos é, como
mencionado acima, apenas observado a partir da quarta aplicação, fato a considerar
quando se deseja alcançar um efeito do ozônio sobre este parâmetro. Todos os valores
ao final do período experimental foram maiores quando comparados com os valores
iniciais dos grupos sob avaliação.
Segundo Bocci (1994a), os eritrócitos compreendem o principal alvo dentro da
corrente sangüínea, devido ao contato entre a mistura do gás e as membranas destas
células.
TABELA 3 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os eritrócitos (x10
6
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Eritrócitos (x10
6
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
7,55
7,90
7,26
7,61
8,37
8,10
7,74
7,80
7,85
T500
Fêmea
9,04
9,24
9,04
9,31
9,55
9,53
9,57
9,26
9,64
T1000
Macho
7,26
7,84
7,92
8,26
8,08
7,91
8,00
8,42
8,00
T1000
Fêmea
7,77
8,36
8,99
9,38
8,81
9,46
8,88
9,01
9,81
Efeito
Dosagem
-0,77
-0,47
0,31
0,36
-0,51
-0,14
-0,22
0,19
0,16
Sexo
-1,00
-0,93
-1,43
-1,41*
-0,96
-
1,49
*
-1,36*
-1,02
-
1,80
*
Interação
0,49
0,41
0,36
0,29
0,22
-0,06
0,48
0,44
-0,01
CV(%)
10,49
10,27
13,54
8,53
10,72
12,76
8,94
9,61
14,80
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
Os valores médios na concentração de eritrócitos diferenciados pelo sexo
podem estar relacionados com o componente genético dos animais deste estudo, já
que como mencionado anteriormente, são descendentes da raça Quarto de Milha que,
de acordo com Schalm et al. (1975), os machos apresentaram menores valores na
contagem destas células. No entanto, se comparado com os valores do hematócrito, os
dos eritrócitos se mostraram maiores nas fêmeas durante todo o período experimental.
97
Neste estudo ficou demonstrado que para se obter aumento na contagem dos
eritrócitos pela ozonioterapia, são necessários pelo menos quatro períodos de
aplicação da mistura do gás.
É importante mencionar que quando se utiliza o ozônio numa dosagem
adequada, a hemólise resultante é muito baixa, tal como mencionado por Zimran et al.
(1999) e Margalit et al (2001). Segundo Verrazo et al. (1995), esta lise das células
vermelhas é seletiva, somente alterando a membrana dos eritrócitos pela ação de
produtos de reação do ozônio com os fosfolipídios de membrana.
A contagem dos leucócitos totais (Tabela 4), não respondeu (p>0,05) à
ozonioterapia, de maneira que mostrasse alguma diferença pelo sexo, tratamento ou a
interação destes, sendo que as médias dos quatro grupos estudados foram similares.
Nossos resultados corroboram com os de Turrent & Menéndez (2001) e
Méndez et al. (2005), em estudos com pacientes humanos, que não especificam efeito
do ozônio sobre a contagem de leucócitos totais e sim mais especificamente sobre
determinadas células do diferencial da linha branca. Ohtsuka et al. (2006), estudando
vacas sadias e com processos inflamatórios, não observaram alterações significativas
na contagem total de leucócitos após autohemotransfusão.
TABELA 4 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os leucócitos totais (x10
3
µL
-1
) em cada período
de aplicação.
Leucócitos Totais (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
7,54
7,70
7,43
7,59
7,42
6,83
7,67
7,99
7,76
T500
Fêmea
9,37
10,09
9,14
8,65
9,03
8,98
9,04
8,63
9,61
T1000
Macho
7,83
8,63
7,48
8,26
7,68
8,14
9,85
8,83
9,21
T1000
Fêmea
7,80
8,04
8,28
8,09
7,57
8,85
8,17
8,03
8,48
Efeito
Dosagem
-0,64
-0,55
-0,41
0,05
-0,61
0,59
0,66
0,12
0,16
Sexo
-0,90
-0,90
-1,25
-0,45
-0,75
-1,43
0,16
0,07
-0,56
Interação
0,93
1,49
0,46
0,61
0,86
0,72
1,53
0,72
1,29
CV(%)
17,80
16,60
15,61
13,52
18,28
19,08
27,17
22,95
27,34
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
98
Segundo Valacchi & Bocci (1999), uma discreta diminuição na contagem de
leucócitos totais pode ocorrer sem implicação de lesão a estas células, após
administração de ozônio via autohemotransfusão, já que este gás induz a quimiotaxia
de células do diferencial, por estímulo de citocinas, com aumento das mesmas na
circulação periférica até o local do processo inflamatório. Entretanto, Bocci (1994b)
menciona uma leucocitose relativa por neutrofilia em pacientes humanos que
receberam autohemotransfusão ozonizada.
Ao se avaliar os valores médios dos segmentados (Tabela 5) observaram-se
efeitos (p<0,05) da ozonioterapia determinados pela dosagem depois de realizadas a
terceira e sexta aplicações, inclusive com uma interação (p<0,05) destes fatores na
terceira aplicação. No entanto, estes efeitos não traduzem um comportamento
biológico definido e relevante, pois não houve continuidade.
TABELA 5 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os segmentados (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Segmentados (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
4,56
4,15
4,08
4,46
4,13
3,74
4,81
4,92
4,44
T500
Fêmea
3,15
4,15
3,27
3,77
4,38
4,30
4,52
3,97
3,95
T1000
Macho
4,27
4,39
3,86
4,71
4,17
5,11
6,72
5,93
5,41
T1000
Fêmea
4,36
4,46
5,01
4,39
4,11
6,11
5,14
4,91
4,86
Efeito
Dosagem
0,46
0,27
0,77
*
0,43
-0,12
1,59*
1,27
0,98
0,93
Sexo
0,66
-0,04
-0,17
0,51
-0,09
-0,78
0,94
0,98
0,52
Interação
-
0,75
-0,04
-
0,98
*
-0,19
0,16
-0,22
0,65
0,04
0,03
CV(%)
23,49
22,88
8,46
15,29
18,21
15,55
30,16
20,05
33,12
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
Margalit et al. (2001), descrevendo os efeitos terapêuticos do ozônio,
relataram sobre a importância deste como antiinflamatório, já que o gás aumenta a
motilidade e adesão dos polimorfonucleares, a partir da circulação periférica,
induzindo assim a uma leucocitose com neutrofilia. Bocci (1994b) e Sánchez et al.
(1998) também mencionaram sobre o aumento da atividade fagocitária destas células.
99
Ainda assim, não existem relatos sobre o efeito do ozônio sobre estas células,
pelos fatores em avaliação contemplados neste estudo (tratamento, sexo ou interação
destes). Existe sim um efeito do gás diretamente o sobre os neutrófilos, seja in vitro
(Bocci, 1994a) ou in vivo (Deaton et al., 2005).
Deaton et al. (2005) estudando eqüinos sadios e com obstrução das vias
aéreas, constataram que, após exposição ao ozônio por inalação, os animais enfermos
apresentaram uma resposta inflamatória maior, determinada pela contagem de
neutrófilos em lavagens bronco-alveolares. Segundo os autores, isto reforça a
importância do ozônio na indução à migração destas células para o local do processo
inflamatório.
Ao se examinar os dados apresentados na Tabela 6, nota-se efeito (p<0,05) da
dosagem sobre a concentração dos bastonetes depois de realizada a terceira aplicação.
Os animais que receberam 1000 mL de ozônio apresentaram maior estímulo na
contagem destas células imaturas, o que sugere que uma dose mais elevada de ozônio
poderia induzir uma resposta mais ativa da medula óssea na liberação destas células
na circulação sangüínea. A indução da mielopoiese é sugerida por Margalit et al.
(2001), ao estudar a exposição in vitro de neutrófilos ao ozônio.
TABELA 6 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os bastonetes (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Bastonetes (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
0,01
0,02
0,04
0,08
0,03
0,04
0,02
0,04
0,02
T500
Fêmea
0,01
0,07
0,07
0,09
0,07
0,03
0,04
0,02
0,03
T1000
Macho
0,01
0,11
0,08
0,04
0,14
0,16
0,03
0,01
0,00
T1000
Fêmea
0,02
0,06
0,16
0,09
0,02
0,06
0,01
0,01
0,02
Efeito
Dosagem
0,00
0,04
0,07*
-0,02
0,03
0,08
-0,00
-0,02
-0,02
Sexo
-0,00
-0,00
-0,06
-0,03
0,04
0,06
0,00
0,01
-0,01
Interação
-0,00
0,06
-0,03
-0,02
0,08*
0,04
0,02
-0,01
-0,01
CV(%)
158,25
75,81
47,11
59,47
89,29
163,48
114,51
107,28
114,90
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
100
Também houve um efeito diferenciado (p<0,05) (interação dos fatores) após a
quinta aplicação, demonstrando que neste período de aplicação a menor dose do
ozônio (500 mL) foi capaz de estimular mais as fêmeas, enquanto uma maior dose foi
necessária para estimular a concentração deste parâmetro nos machos. Por outro lado,
estes efeitos encontrados no terceiro e quinto períodos não foram observados nos
demais. Além disso, a variabilidade encontrada numa mesma combinação de
tratamento, sexo e período de aplicação foi alta, o que confere à característica uma
certa imprecisão, pelo que se sugere um estudo mais detalhado no que se refere a este
parâmetro, para a verificação do real efeito do ozônio determinado pelo sexo,
tratamento ou a interação destes, ainda que haja relatos de resposta à ozonioterapia
neste tipo de células em humanos, in vivo (Bocci, 1994b) e in vitro (Margalit, et al.,
2001).
De uma forma geral, não foram constatados efeitos (p>0,05) do sexo, dosagem
ou pela interação destes sobre a contagem dos linfócitos, tal como apresentado na
Tabela 7. Por outro lado, alguns autores (Bocci, 1994a; Sánchez et al., 1998; Terasaki
et al., 2001; Ohtsuka et al., 2006) já relataram ativação de linfócitos na produção de
citocinas, regulando assim o sistema imune ou a resposta humoral do animal após
ozonioterapia; embora não fizessem referência ao sexo, tratamento ou à interação
entre estes.
TABELA 7 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os linfócitos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Linfócitos (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
2,61
3,06
2,82
2,59
2,63
2,60
2,31
2,39
2,80
T500
Fêmea
5,82
5,49
5,44
4,38
4,02
4,14
3,78
4,16
5,02
T1000
Macho
3,21
3,56
2,98
2,98
2,67
2,22
2,38
2,23
3,18
T1000
Fêmea
2,90
3,15
2,55
2,96
2,61
2,12
2,60
2,67
3,06
Efeito
Dosagem
-1,16
-0,92
-1,36
-0,52
-0,68
-1,20
-0,56
-0,83
-0,79
Sexo
-1,46
-1,01
-1,09
-0,89
-0,66
-0,72
-0,85
-1,10
-1,05
Interação
1,76
1,42
1,53
0,90
0,72
0,82
0,62
0,67
1,17
CV(%)
38,52
43,75
39,47
38,46
36,56
45,31
30,98
41,33
44,55
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
101
Na Tabela 8 está demonstrado o efeito (p<0,05) da dosagem sobre a
concentração dos monócitos depois de realizada a sexta aplicação do ozônio,
momento no qual com a menor dose (500 mL) foi possível atingir maiores valores
para este parâmetro. Porém, assim como ocorreu com outros parâmetros avaliados,
este efeito não foi persistente. Ainda assim, observando os valores médios destas
células, se percebe que estes se mantiveram praticamente similares em todo o período
de aplicações.
TABELA 8 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os monócitos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Monócitos (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
0,12
0,15
0,17
0,10
0,16
0,21
0,19
0,27
0,15
T500
Fêmea
0,18
0,13
0,14
0,19
0,24
0,23
0,22
0,13
0,20
T1000
Macho
0,14
0,28
0,25
0,21
0,25
0,18
0,25
0,16
0,18
T1000
Fêmea
0,15
0,17
0,22
0,23
0,15
0,11
0,13
0,10
0,11
Efeito
Dosagem
-0,00
0,09
0,07
0,07
-0,00
-
0,07
*
-0,01
-0,07
-0,03
Sexo
-0,03
0,07
0,03
-0,06
0,01
0,02
0,04
0,10
0,02
Interação
0,03
0,05
-0,00
0,03
0,09
0,05
0,07
-0,04
0,06
CV(%)
57,73
86,13
41,87
34,46
51,38
33,39
93,75
82,39
84,87
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
Na primeira e quinta aplicações de ozônio observaram-se efeitos da
ozonioterapia diferenciados (p<0,05) pelos fatores dosagem e sexo sobre a contagem
dos eosinófilos (Tabela 9). Este efeito demonstra que as fêmeas foram menos
responsivas ao aumento na concentração de eosinófilos durante os períodos acima
mencionados, quando foram administrados 500 mL do ozônio. Já os machos foram
menos estimulados quando administrados 1000 mL da mistura do gás. No entanto,
este efeito não foi relevante e consistente, não ocorrendo efeitos similares durante as
demais aplicações do ozônio. Adicionalmente, os valores médios foram similares em
todo o período experimental para todos os grupos.
102
A contagem de basófilos não resultou alterada pela ozonioterapia, de maneira
diferenciada pelo sexo, dosagem ou a interação destes (Tabela 10), sendo todos os
valores médios similares (p>0,05) ao longo do período experimental. Por outro lado,
estes resultados similares (p>0,05) podem indicar que a ozonioterapia, com as duas
dosagens avaliadas neste estudo, in vivo, não acarreta clinicamente, hipersensibilidade
em eqüinos.
TABELA 9 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os eosinófilos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Eosinófilos (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
0,20
0,21
0,21
0,25
0,35
0,20
0,25
0,24
0,25
T500
Fêmea
0,13
0,20
0,19
0,19
0,28
0,23
0,37
0,29
0,34
T1000
Macho
0,14
0,21
0,21
0,20
0,29
0,39
0,36
0,36
0,26
T1000
Fêmea
0,29
0,13
0,27
0,31
0,58
0,36
0,24
0,31
0,35
Efeito
Dosagem
0,05
-0,04
0,04
0,04
0,12
0,16
-0,00
0,07
0,01
Sexo
-0,05
0,05
-0,02
-0,03
-0,11
0,00
-0,00
-0,00
-0,10
Interação
-
0,11
*
0,04
-0,04
-0,08
-
0,18
*
0,03
0,12
0,06
0,00
CV(%)
41,34
63,29
36,95
35,13
32,60
68,56
57,14
57,03
35,46
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
TABELA 10 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre os basófilos (x10
3
µL
-1
) em cada período de
aplicação.
Basófilos (x10
3
µL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
0,04
0,10
0,11
0,10
0,12
0,05
0,08
0,14
0,09
T500
Fêmea
0,07
0,03
0,04
0,03
0,05
0,05
0,11
0,06
0,07
T1000
Macho
0,06
0,07
0,10
0,13
0,16
0,09
0,11
0,14
0,18
T1000
Fêmea
0,08
0,08
0,08
0,11
0,10
0,09
0,03
0,04
0,09
Efeito
Dosagem
0,02
0,01
0,02
0,05
0,04
0,04
-0,02
-0,02
0,06
Sexo
-0,03
0,03
0,05
0,05
0,07
-0,00
0,03
0,09
0,05
Interação
0,01
-0,04
-0,02
-0,02
-0,01
0,00
0,05
0,01
0,04
CV(%)
78,32
80,44
87,32
88,49
79,73
60,28
77,51
81,95
69,53
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
103
Não se observou resposta à ozonioterapia sobre a concentração de plaquetas
(Tabela 11), CK (Tabela 12) e GGT (Tabela 13) determinada pelo sexo, dosagem ou
interação destes (p>0,05). Apesar disso, cabe ressaltar que foi observado aumento na
contagem deste parâmetro após a segunda aplicação em todas as combinações
estudadas.
TABELA 11 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre as plaquetas (por campo) em cada período de
aplicação.
Plaquetas (por campo)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
8,42
12,33
12,00
11,92
8,75
8,25
8,25
9,25
8,42
T500
Fêmea
8,78
10,83
12,42
11,58
11,17
8,42
9,83
9,33
9,17
T1000
Macho
8,75
10,92
11,33
11,75
8,50
7,42
8,75
9,25
9,97
T1000
Fêmea
7,58
11,00
11,25
11,00
10,75
9,17
8,33
9,75
8,25
Efeito
Dosagem
-0,43
-0,63
-0,92
-0,38
-0,33
-0,04
-0,50
0,21
0,32
Sexo
0,40
0,71
-0,17
0,54
-2,33
-0,96
-0,58
-0,29
0,49
Interação
0,76
-0,79
0,25
0,21
0,08
-0,79
1,00
-0,21
1,24
CV(%)
12,60
12,30
12,44
16,67
26,94
9,75
16,25
15,70
22,39
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
TABELA 12 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a creatina quinase (U L
-1
) em cada período de
aplicação.
Creatina quinase (U L
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Tratamento
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
201,83
275,36
198,30
179,50
197,17
225,95
173,19
210,67
225,25
T500
Fêmea
254,17
279,95
141,83
175,58
238,79
236,53
186,43
218,83
199,17
T1000
Macho
234,39
211,31
213,46
179,00
191,21
190,03
173,13
250,33
272,17
T1000
Fêmea
212,25
298,84
174,73
199,42
191,33
210,71
212,18
213,92
199,00
Efeito
Tratamento
-4,68
-22,58
24,03
11,67
-26,71
-30,87
12,84
17,38
23,38
Sexo
-15,10
-46,06
47,60
- 8,25
-20,87
-15,63
-26,14
14,12
49,63
Interação
37,24
-41,47
-8,87
-12,17
20,75
- 5,05
-12,90
22,29
23,54
CV(%)
24,10
36,59
33,37
19,84
30,55
31,16
32,74
25,28
31,46
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
104
No caso das plaquetas, este aumento permaneceu até a quarta aplicação, o
pode ter ocorrido em resposta à liberação de fatores que estimulam a agregação
plaquetária, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o fator
transformador de crescimento (TGF) β-1, porém sem risco de coagulação do sangue,
tal como mencionado em humanos por Valacchi & Bocci (1999).
Ao avaliar a resposta in vitro de plaquetas de porquinhos da índia (Cavia
porcellus) expostos a diferentes concentrações de ozônio, Wright et al. (1994),
observaram que quanto mais elevada era a concentração do gás, maior o estímulo para
a liberação do fator ativador de plaquetas (PAF).
TABELA 13 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a gama glutamiltransferase (U L
-1
) em cada
período de aplicação.
Gama glutamiltransferase (U L
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
11,92
16,80
16,07
8,48
10,63
11,26
9,77
10,51
9,45
T500
Fêmea
5,37
9,06
8,64
5,53
5,69
5,54
5,98
6,30
8,85
T1000
Macho
11,64
18,78
16,82
12,69
11,98
13,92
11,02
12,81
10,85
T1000
Fêmea
21,81
27,94
26,22
16,00
18,13
16,26
15,42
16,09
13,09
Efeito
Dosagem
8,08
10,43
9,16
7,34
6,90
6,69
5,34
6,05
2,82
Sexo
-1,81
-0,71
-0,99
-0,18
-0,60
1,69
-0,31
0,47
-0,82
Interação
-8,36
-8,46
-8,41
-3,12
-5,55
-4,03
-4,09
-3,75
-1,42
CV(%)
97,23
81,09
75,96
84,52
87,13
77,64
80,90
73,06
70,79
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação.
O aumento na concentração de GGT após a segunda e terceira aplicação, pode
ser decorrente de esforço muscular cardíaco (Martínez, et al., 2000, Hinchcliff et al.,
2004) propiciado pela ação do ozônio, pelo aumento do fluxo sangüíneo e, pelo débito
cardíaco, como também mencionado por Bocci (1994b) em humanos. O ozônio
também pode aumentar os níveis do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e
cortisol no sangue (Gracer & Bocci, 2005), ocasionando um efeito inotrópico
positivo, além de aumentar a atividade hepática pela relação dessas substâncias com a
glicogenólise neste órgão. Cabe ressaltar que, quando utilizada a menor dose, os
valores médios de GGT foram inferiores durante o período experimental.
105
Com relação a resposta da glicose à ozonioterapia (Tabela 14), foi observada
interação (p<0,05) entre os fatores dosagem e sexo, sobre a concentração desta, após
realizada a quarta aplicação da mistura do gás, observando-se que nos machos a dose
menor foi capaz de promover a diminuição (p<0,05) na concentração da glicose, ao
contrário das fêmeas, que no mesmo período de aplicação, necessitou da dose mais
alta (1000 mL) para apresentar este efeito hipoglicemiante. Além disso, foi observado
que após realizada a sexta aplicação, ocorreu resposta à ozonioterapia influenciada
pelo sexo (p<0,05) sobre os valores médios da glicose, onde os machos mostraram os
menores valores médios. Como estas respostas só foram observadas em dois
momentos ao longo do período experimental, elas foram consideradas como não
relevantes. Por outro lado, cabe ressaltar que, se observou um discreto aumento nas
fêmeas, depois de realizada a segunda aplicação de ozônio, o que provavelmente
poderia estar relacionado a um estímulo hormonal, possivelmente associado ao
aumento de cortisol. Segundo Gracer & Bocci (2005) este efeito pode ocorrer após
autohemotransfusão em humanos.
TABELA 14 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre a glicose (mg dL
-1
) em cada período de
aplicação.
Glicose (mg dL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
93,96
93,97
85,75
84,35
81,00
79,08
79,67
79,50
80,33
T500
Fêmea
94,78
102,75
96,83
90,82
87,17
86,50
85,33
84,17
89,00
T1000
Macho
98,23
97,17
86,58
87,94
82,00
79,50
90,67
89,83
85,67
T1000
Fêmea
86,90
93,83
93,83
81,22
78,33
81,17
85,67
77,75
79,00
Efeito
Dosagem
-1,80
-2,86
-1,08
-
3,01
-
3,92
-2,46
5,67
1,96
-
2,33
Sexo
5,25
-2,73
-9,17
0,13
-1,25
-
4,54
*
-
0,33
3,71
-1,00
Interação
6,07
6,06
1,92
6,60*
4,92
2,88
5,33
8,38
7,67
CV(%)
6,82
5,80
9,42
4,23
5,91
3,55
11,00
11,21
7,75
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
Aproximadamente a partir da terceira aplicação da mistura do gás, os valores
médios de glicose diminuiram inclusive de forma consistente nos grupos que
106
receberam a menor dose, sendo claramente perceptível que os valores médios neste
período foram inferiores aos iniciais, o que sugere um efeito hipoglicemiante do
ozônio nos eqüinos estudados, que segundo a literatura científica (Al-Dalien et al.,
1999; Barroetabeña et al., 2002), se deve ao estímulo da utilização da glicose no
metabolismo celular. Este achado deve ser levado em consideração quando utilizada a
ozonioterapia.
Quando avaliada a concentração do fibrinogênio (Tabela 15) observou-se uma
resposta à ozonioterapia diferenciada pela dosagem (p<0,05), já na primeira e segunda
aplicação, sendo que quando instituída apenas a menor dose, independente do sexo do
animal, se conseguiram valores médios maiores na concentração deste parâmetro.
Após a segunda aplicação, ocorreu uma interação entre dosagem e sexo
(p<0,05), refletindo esta os valores médios maiores nas fêmeas que receberam 500
mL da mistura do gás. Já nos machos, este efeito foi observado após administração da
dose mais elevada. Entretanto, apesar dos resultados terem sido interessantes, não foi
uma resposta consistente.
TABELA 15 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem
de ozônio e sexo sobre o fibrinogênio (mg dL
-1
) em cada período de
aplicação.
Fibrinogênio (mg dL
-1
)
Combinações
Período de aplicação de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
139,44
131,59
129,57
133,43
138,62
137,98
149,88
127,97
137,88
T500
Fêmea
136,28
136,17
141,98
131,54
148,58
149,83
155,75
145,05
143,44
T1000
Macho
122,37
130,56
159,53
134,91
141,34
126,38
145,47
147,60
150,54
T1000
Fêmea
125,23
114,75
139,62
141,24
144,25
159,46
148,87
143,70
145,74
Efeito
Dosagem
-14,06
*
-11,23
*
13,80
5,59
-0,81
-0,98
-5,65
9,14
7,48
Sexo
0,15
5,62
3,75
-2,22
-6,44
-22,47
-4,63
-6,59
-0,38
Interação
-3,02
10,19*
16,16
-4,11
3,53
-10,62
1,23
10,49
5,18
CV(%)
4,53
5,27
16,99
10,51
13,27
20,39
7,62
13,11
7,75
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
Sexo (−): fêmeas; dosagem (−): 500 mL. CV: coeficiente de variação. * Significativo pelo teste F
(p<0,05).
Ainda assim, estes dados são importantes quando a ozonioterapia for utilizada
em processos de reparação tissular em eqüinos, já que o aumento na concentração
deste parâmetro é fundamental para o processo de cicatrização, sendo esta terapia já
107
utilizada em outras espécies com essa finalidade (Wrigth, et al., 1994; Verrazzo, et
al., 1995; Sánchez, et al., 1998).
108
CONCLUSÕES
Nas condições da presente estudo experimental e com base nos resultados obtidos
pode-se concluir que:
1. Existem pequenas diferenças, significativas ou não, nas respostas
diferenciadas pelos sexos ou dosagens estudadas, para os parâmetros
hematológicos (hematócrito, hemoglobina, leucócitos totais, linfócitos,
basófilos, monócitos e plaquetas) e da bioquímica sangüínea (creatina quinase,
gama glutamiltransferase).
2. Em alguns parâmetros hematológicos (segmentados, bastonetes e eosinófilos)
e da bioquímica sangüínea (glicose e fibrinogênio), pode ocorrer interação
entre os fatores sexo e dosagem, mas de ordem relativamente baixa.
3. Existe influência determinada pelo sexo em resposta a ozonioterapia sobre a
concentração dos eritrócitos nas fêmeas.
4. A exposição de eqüinos sadios a 500 e 1000 mL da mistura terapêutica de
ozônio, mediante autohemotransfusão não acarreta alterações clínicas.
109
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113
CAPITULO V
COMPORTAMENTO, MONITORAMENTO E EFEITOS DA
OZONIOTERAPIA SOBRE A FREQÜÊNCIA CARDÍACA E
RESPIRATÓRIA DE EQÜINOS NO PERÍODO DE RECUPERAÇÃO
RESUMO
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, dezembro de
2006. Efeitos da ozonioterapia sobre parâmetros clínicos, hematológicos e da
bioquímica sangüínea em eqüinos. Orientadora: Maria Verônica de Souza, Co-
Orientadores: John Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos
Benjamim.
O objetivo deste estudo foi monitorar, in vivo, o comportamento, tendências e
efeitos do ozônio, sobre parâmetros fisiológicos, como freqüência cardíaca (FC) e
respiratória (FR) durante o período de recuperação (até 20 minutos após a
ozonioterapia). Para isso, foram utilizados 12 eqüinos mestiços, sendo 6 machos e 6
fêmeas, com idades compreendidas entre 4 e 20 anos. Os animais foram submetidos a
ozonioterapia, mediante administração de 500 ou 1000 mL da mistura do gás, por via
intravenosa, a cada três dias, por um período total de 24 dias. Antes, porém, foram
divididos em quatro grupos: MT500, MT1000, FT500 e FT1000, sendo machos (M)
que receberam 500 mL e 1000 mL e, fêmeas (F) que receberam 500 e 1000 mL,
respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que houve aumento na FC
(p>0,05) e FR (p<0,05) em todos os eqüinos expostos ao ozônio, independente do
sexo, dose ou da interação destes fatores. Transcorridos o período de recuperação, os
valores médios desses parâmetros diminuíram, o que é indício de que a terapia ajuda
no condicionamento cárdio-respiratório dos eqüinos.
Palavras chave: ozônio, cavalos, exame físico, condicionamento.
114
ABSTRACT
HADDAD, Melissa Alvarenga, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, December
2006. Effects of ozone therapy on equine clinical, hematological and blood
biochemistry parameters. Adviser: Maria Verônica de Souza, Co-Advisers: John
Jairo Hincapié, José Dantas Ribeiro Filho e Laércio dos Anjos Benjamim.
The objective of this study was to monitor, in vivo, pattern, tendency and
effect of ozone therapy over heart (HR) and respiratory (RR) rates during the
recovery period (up to 20 minutes after ozone therapy). Twelve cross bred horses, 6
males and 6 females, between 4 and 20 years old were exposed to ozone therapy
through the application of 500 and 1000 mL of the gas mixture, intravenously, every
three days, for 24 days. Four groups were conformed: MT500, MT1000, FT500 and
FT1000, which comprised males (M) and females (F) receiving 500 and 1000 mL of
ozone, respectively. The results revealed an increase in HR (p>0.05) and RR (p<0.05)
in all horses exposed to ozone, independent on sex, dose or the interaction between
these factors. After the recovery period, the HR and RR mean values decreased, fact
that could imply preconditioning on the horses cardiorespiratory performance.
Keywords: ozone, horses, physical exam, conditioning.
115
INTRODUÇÃO
Os eqüinos sejam atletas ou incorporados em rotinas de trabalho realizam
esforços musculares que demandam um adequado condicionamento, para evitar o
desgaste e lesões decorrentes de um manejo inadequado.
A determinação dos valores de freqüência cardíaca (FC) e respiratória (FR)
pode ser útil na avaliação do desempenho e condicionamento físico dos eqüinos,
determinados em conjunto com outras variáveis. Não existem na literatura científica,
artigos que demonstrem a eficácia da ozonioterapia no condicionamento de eqüinos
atletas. Em geral, os trabalhos fazem referência ao condicionamento frente ao estresse
oxidativo que a terapia oferece. Em alguns aspectos, os efeitos da ozonioterapia são
similares a aqueles efeitos decorrentes de um exercício de baixo impacto tanto em
animais como na espécie humana. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar
o comportamento e monitorar os valores de freqüência cardíaca e respiratória, assim
como verificar os efeitos da ozonioterapia sobre estes parâmetros em eqüinos.
116
REVISÃO DE LITERATURA
O poder oxigenante do ozônio é superior ao do oxigênio, uma vez que
estimula diferentes sistemas enzimáticos protetores do organismo (Díaz et al., 2001).
Mais especificamente no sangue, melhora a circulação sangüínea através dos
capilares, mediante discreto aumento da pressão arterial, assim como das propriedades
reológicas do sangue, aumentando a capacidade de distribuição e absorção do
oxigênio nos eritrócitos (Pérez et al., 2003).
Está descrita na literatura científica a concentração terapêutica adequada do
ozônio em humanos (Bocci 1994; Al-Dalien et al., 1999; Zee & De Monte, 2001;
Tylicki et al., 2003; Zamora et al., 2005), porém a aplicação da ozonioterapia em
medicina veterinária ainda é muito limitada. Sabe-se dos efeitos nos aspectos
hemorreológicos e como esta terapia melhora a circulação sangüínea (Carreira &
Almagro, 2000; Giunta et al., 2001; Bocci & Aldinucci, 2004), mas não existem
relatos sobre a ação do ozônio sobre parâmetros clínicos.
Os sinais de intoxicação pelo ozônio descritos na espécie humana são os
seguintes: tosse, congestão nasal, irritação das vias aéreas superiores, dor na região
peitoral, dificuldade ou dor ao respirar, falta de ar, dor de cabeça, fadiga, mudanças no
campo visual, epífora, diminuição na freqüência cardíaca e na pressão arterial. Por
outro lado, todos esses efeitos dependem da dose e da exposição prolongada ao
ozônio (González et al., 1999).
Além dos parâmetros sangüíneos básicos para a determinação do bom
condicionamento físico do animal, como o hematócrito e o lactato, é importante o
acompanhamento do comportamento de variáveis como FC e FR, já que estas
oferecem um panorama do condicionamento e resposta física do animal (Barker &
Warren-Smith, 2005; Cottin et al., 2005).
Segundo Lekeux & Art (1994), a FR reflete a troca gasosa, que é a principal
função do sistema respiratório, sendo expressa pelo número de movimentos
respiratórios por minuto (rpm). Na opinião de Speirs (1999), a FR na espécie eqüina
pode variar entre 18 a 20 rpm. Já Silva et al. (2005), consideram que durante o
período de repouso o eqüino pode apresentar entre 12 e 20 rpm.
A FC é expressa pelo número de batimentos por minuto (bpm) (Clayton,
1991), variando entre 25 e 50 bpm no eqüino em repouso. Speirs (1999) relata valores
entre 30 a 40 bpm para a espécie eqüina.
117
Fatores como dor, aumento da temperatura corporal e o exercício elevam a FR
(Clayton, 1991). Já a FC pode aumentar por problemas psicossomáticos (Fernandes,
1997), dor, afecções (Clayton, 1991), entre outros.
O exercício de baixo impacto tem sido associado a modificações nos aspectos
hemorreológicos, mais especificamente na fluidez do sangue em animais sob
adequado manejo de treinamento. Durante o exercício, ocorre a vasodilatação
periférica, que favorece a máxima distribuição de oxigênio. Entretanto, também é
importante que este sangue tenha a fluidez suficiente para percorrer os vasos
sangüíneos com mínima resistência, assim a deformabilidade e agregação eritrocitária
também têm um importante papel na melhoria da circulação para o tecido muscular e
outras regiões em que o aporte de oxigênio é fundamental para a realização da
atividade física. Em contrapartida, o exercício acarreta um estímulo adrenérgico que
promove a contração esplênica, levando ao aumento do hematócrito, da contagem
eritrocitária e, conseqüentemente, da viscosidade do sangue, o que pode ocasionar
redução no transporte de oxigênio. Além disso, fatores intrínsecos dos eritrócitos
como agregação e deformabilidade, também influenciam na resistência do fluxo
sangüíneo (Stoiber et al., 2005). Porém, ao se aplicar ozônio nos animais se produz
uma vasodilatação e, conseqüentemente, diminuição da agregação eritrocitária, pelo
que o aumento na contagem destas células não seria um fator limitante no
desempenho do animal. Na opinião de Birchard (1997), como o ozônio acarreta
aumento no fluxo sangüíneo para o coração, um maior trabalho é exercido pelas fibras
musculares cardíacas. Nesse sentido, a freqüência cardíaca poderia ser aumentada em
função deste fenômeno, para favorecer o transporte do oxigênio aos tecidos, tal como
descrito por Stoiber et al (2005). Evans & Rose (1988) mencionam que o aumento da
freqüencia cardíaca em eqüinos Puro Sangue de Corrida pode estar relacionado com o
volume de oxigênio utilizado pelo animal, sendo acompanhado por um aumento na
freqüência respiratória.
Está descrita na literatura científica a concentração terapêutica adequada do
ozônio em humanos (Bocci 1994; Al-Dalien et al., 1999; Zee & De Monte, 2001;
Tylicki et al., 2003; Zamora et al., 2005), porém a aplicação da ozonioterapia em
medicina veterinária ainda é muito limitada. Sabe-se dos efeitos nos aspectos
hemorreológicos e como esta terapia melhora a circulação sangüínea (Carreira &
Almagro, 2000; Giunta et al., 2001; Bocci & Aldinucci, 2004), assim como outros
efeitos terapêuticos ao instituir a mesma.
118
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em nenhum momento do período experimental, os animais demonstraram
incômodos ou alteração do comportamento durante a ozonioterapia ou imediatamente
após a mesma, assim como após as atividades diárias.
Durante avaliação clínica diária os eqüinos não apresentaram sinais de
alteração, encontrando-se todos com parâmetros clínicos dentro dos considerados
como de referência para a espécie eqüina. Os valores médios de temperatura corporal,
freqüência cardíaca e respiratória foram de 37,01 °C, 34 bpm e de 24 rpm,
respectivamente. As mucosas se mantiveram de coloração rosáceas e úmidas e a taxa
de preenchimento capilar inferior a dois segundos, tal como descrito por Speirs
(1999), para a espécie eqüina. Entretanto, um dos animais apresentou um ferimento
acidental, que ocorreu na época da oitava aplicação.
Um discreto aumento da freqüência cardíaca e/ou respiratória poderia ser
observado, já que o estresse pode elevar estes parâmetros (Fernandes, 1997).
Durante a aplicação do ozônio, foi possível escutar, sem a utilização de
estetoscópio, os movimentos intestinais dos animais, particularmente 5 minutos após
o início da aplicação da mistura do gás. Além disso, todos os animais defecavam ao
redor de meia hora após a aplicação do ozônio, o que pode sugerir estímulo ou ação
do ozônio sobre os mecanismos do trato gastrointestinal. Pérez et al. (2003) avaliaram
pacientes humanos com a síndrome de má absorção intestinal causada por Giardia
lamblia tratados com ozonioterapia, no entanto os autores não mencionaram achado
semelhante ao nosso.
Comportamento da freqüência cardíaca e respiratória antes e durante o período
de recuperação após a aplicação de ozônio em eqüinos
Considerou-se tempo de recuperação aquele decorrido até 20 minutos depois
de realizada a aplicação da mistura de ozônio e oxigênio.
A finalidade de se avaliar o comportamento foi verificar a existência de
alguma modificação nos parâmetros avaliados ao longo do tempo, para em seguida
realizar estudos mais específicos.
Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram a baixa (p>0,05) incidência
de efeito da ozonioterapia no tempo de recuperação sobre a FC ao longo do período
119
de aplicações do ozônio. Nota-se que o grupo das fêmeas que recebeu 500 mL da
mistura do gás apresentou aumento da FC em 0,4 bpm após o quarto período de
aplicação, e redução em 0,3 bpm após a nona administração do ozônio (Tabela 1). Já
quando as fêmeas receberam 1000 mL da mistura do gás, a FC aumentou em 0,8 bpm,
após o quarto período de aplicação.
Com relação à FR, observa-se influência (p<0,05) da ozonioterapia no tempo
de recuperação. Em todos os grupos, independente da dose e do sexo, houve uma
tendência ao aumento da FR no referido tempo. Estes resultados demonstram o
esforço aumentado do sistema respiratório dos animais em estudo.
Monitoramento da freqüência cardíaca e respiratória antes e imediatamente
após ozonioterapia em eqüinos
A tendência dos valores médios de freqüência cardíaca, antes de cada
aplicação do ozônio, nos quatro grupos avaliados, foi de diminuição (Figura 1), já que
com o passar do tempo os animais já estavam adaptados à rotina instituída para a
ozonioterapia, que foi realizada pelos mesmos técnicos, durante todo o período
experimental, o que certamente reduziu o estresse nos animais, que poderia vir a
estimular, por uma descarga adrenérgica, a liberação de hormônios que induziriam
uma resposta inotrópica positiva (aumento do débito cardíaco e, conseqüentemente,
da freqüência cardíaca), conforme descrito por Spinosa et al. (2002) e Cottin et al.
(2005).
Transcorridos até 10 minutos da administração do ozônio, observou-se uma
maior variabilidade nos valores médios de FC (Figura 2), inclusive com uma
tendência a valores máximos, considerados como normais para a espécie eqüina, que
segundo a literatura científica (Speirs, 1999; Orsini & Divers, 2003) pode variar entre
28 e 44 bpm.
Todos os grupos apresentaram uma diminuição na FC após as primeiras três
aplicações, provavelmente porque ainda eram baixas as concentrações da mistura do
gás no organismo. Adicionalmente, tanto os machos como as fêmeas que receberam a
menor dose (500 mL), mostraram valores mais próximos ao limite médio calculado.
120
TABELA 1 - Estimativas dos parâmetros freqüência cardíaca (FC) e freqüência
respiratória (FR) em função do tempo de recuperação (T) para cada
combinação (tratamento x sexo) e período de aplicação.
Parâmetros
Combinação
Tratamento x
Sexo
Período de
Aplicação
Equação de Regressão
R
2
FC
MT500
1-9
Y
= 30,67
-
FT500
1-3;5-8
4
9
Y
= 34,48
Y
ˆ
= 28,6667+0,40000*T
Y
ˆ
= 34,3333 0,30000*T
-
0,92
0,96
MT1000
1-9
Y
= 36,40
-
FT1000
1-3;5-9
4
Y
= 37,67
Y
ˆ
= 30,7778+0,76667*T
-
0,97
FR
MT500
1
2
3
4-7;9
8
Y
ˆ
= 17,6667+0,50000*T
Y
ˆ
= 10,6667+0,80000*T
Y
ˆ
= 12,3333+0,30000*T
Y
= 16,93
Y
ˆ
= 14,3333+0,50000*T
0,75
0,92
0,96
-
0,99
FT500
1;3;5-9
2
4
Y
= 24,99
Y
ˆ
= 17,3333+0,14000*T
Y
ˆ
= 13,0000+1,10000*T
-
0,97
0,98
MT1000
1;3;7-9
2
4
5
6
Y
= 27,47
Y
ˆ
= 13,0000+0,90000*T
Y
ˆ
= 18,0000+1,20000*T
Y
ˆ
= 15,6667+0,90000*T
Y
ˆ
= 12,0000+0,40000*T
-
0,96
0,75
0,91
1,00
FT1000
1;3;5-6
2
4
7
8
9
Y
= 27,00
Y
ˆ
= 12,3333+1,70000*T
Y
ˆ
= 14,6667+1,40000*T
Y
ˆ
= 10,6777+0,80000*T
Y
ˆ
= 13,3333+1,00000*T
Y
ˆ
= 12,0000+0,60000*T
-
0,88
0,90
0,92
0,95
1,00
T = tempo de recuperação em minutos. MT500: machos tratados com 500 mL, MT1000: machos
tratados com 1000 mL, FT500: fêmeas tratadas com 500 mL, FT1000: fêmeas tratdas com 1000 mL.
*: Significativo pelo teste t (p<0,05)
Este aumento na freqüência cardíaca após 10 minutos da aplicação da mistura
do gás pode ser decorrente do aumento no fluxo sangüíneo, por regulação no diâmetro
vascular. Segundo Birchard (1997), a resposta vascular, em eqüinos, é dependente de
121
valores adequados de hematócrito, débito cardíaco e de alterações na viscosidade do
fluxo sangüíneo.
25
27
29
31
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35
37
39
41
43
45
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Período de aplicações
Freqüência cardíaca (bpm)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 1 – Estimativas da freqüência cardíaca (bpm) imediatamente antes de cada
aplicação. MT500 (machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas
tratadas com 500 mL), MT1000 (machos tratados com1000 mL) e
FT1000 (fêmeas tratadas com 1000 mL). LSC: limite superior de
controle, LM: limite médio, LIC: limite inferior de controle.
A diminuição da viscosidade do sangue, que leva a um aumento no débito
cardíaco, é decorrente da ação do ozônio sobre componentes celulares do sangue,
como plaquetas e eritrócitos, ativando as primeiras para a inibição da liberação de
fatores de coagulação, diminuindo a agregação plaquetária. Estes efeitos já foram
demonstrados por Wright et al. (1994) em cobaias, assim como por Valacchi & Bocci
(1999) e Díaz et al. (2001) em humanos. Por outro lado, os eritrócitos também são
afetados na sua permeabilidade de membrana, com alteração na sua elasticidade, o
que permite uma otimização da circulação sangüínea, como mencionado na literatura
científica (Zimran et al., 1999; Gornick & Gutsze, 2000; Giunta et al., 2001). No
endotélio a reação é para a liberação do oxido nítrico, permitindo uma vasodilatação,
por atuar na regulação do diâmetro vascular (Bocci & Aldinucci, 2004).
122
25
27
29
31
33
35
37
39
41
43
45
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Período de aplicações
Freqüência cardíaca (bpm)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 2 – Estimativas da freqüência cardíaca (bpm) até 10 minutos depois da
administração do ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle.
Tendo transcorrido até 20 minutos após a administração do ozônio, observa-se
que a variabilidade continua entre os grupos durante o período experimental, porém os
limites desta variabilidade são menores (Figura 3), quando comparados com os limites
da FC até 10 minutos após a terapia. Isto indica uma possível adaptação à terapia,
além do que existe uma tendência à redução nos valores de FC, o que demonstra um
discreto condicionamento no esforço cardíaco.
Evans (2000) e Gómez et al. (2004), mencionaram que a FC é um bom
indicador de adaptação em diferentes intensidades de exercício em eqüinos. Na
opinião de Evans (2000) se após 30 minutos de realizado exercício, a FC mostra-se
elevada, é sinal de estresse, seja pela não adaptação ao trabalho ou por distúrbio
metabólico. Este autor descreve, em diferentes raças de eqüinos de esporte, como um
aumento nos valores do hematócrito, eritrócitos e hemoglobina, eleva a capacidade de
transporte de oxigênio. Sendo assim, ao aumentar o fluxo sangüíneo, a FC também
aumenta, para que ocorra de maneira mais eficiente a distribuição do oxigênio para os
123
tecidos, principalmente para o músculo esquelético de eqüinos de esporte e trabalho.
Adicionalmente, Evans (2000), relata a importância da FC como fator limitante para a
determinação do máximo consumo de oxigênio pelo animal, já que este, originado dos
pulmões, será impulsionado pelo coração para a circulação sangüínea, para finalmente
chegar aos tecidos-alvo.
25
27
29
31
33
35
37
39
41
43
45
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Período de aplicações
Freqüência cardíaca (bpm)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 3 – Estimativas da freqüência cardíaca (bpm) até 20 minutos depois da
administração de ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle.
Gómez et al. (2004), compararam a FC de eqüinos de salto da raça Holsteiner,
em diferentes tempos após realização de exercício, com os valores iniciais de repouso.
Os autores demonstraram que a FC diminuía paulatinamente no decorrer do período
experimental. Estes resultados indicaram a adaptação dos eqüinos à exigência do
programa de treinamento imposto, e demonstraram que quando um eqüino sob a
mesma exigência de esforço apresenta uma menor FC, indica que o animal esta
124
impulsionando uma determinada quantidade de sangue com menor esforço,
ressaltando a sua aptidão física.
Teixeira-Neto et al. (2004), compararam a FC em eqüinos de enduro, no
tempo de repouso e em diferentes tempos de avaliação, após realização de exercício.
Os autores descrevem o aumento da FC após a chegada dos animais ao local de
avaliação, porém depois de transcorridos 10 minutos, houve recuperação dos valores
da FC, que se assemelham aos do tempo de repouso, demonstrando o adequado
condicionamento dos eqüinos para aquele nível de esforço.
Monitorando a freqüência respiratória imediatamente antes da administração
do ozônio, se observa que os valores médios se mantiveram próximos aos valores do
limite médio de controle (Figura 4), na maior parte do período experimental.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Período de aplicações
Freqüência respiratória (respirações/minuto)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 4 – Estimativas da freqüência respiratória (rpm) imediatamente antes da
administração do ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle.
125
Tendo transcorrido 10 minutos da administração do ozônio observou-se
variação nos dados e como os limites máximos de FR aumentaram (Figura 5) com
relação àqueles obtidos antes da aplicação da mistura do gás.
10
15
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30
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45
50
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Período de aplicações
Freqüência respiratória (respirações/minuto)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 5 – Estimativas da freqüência respiratória (rpm) até 10 minutos depois da
administração de ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle.
Os machos que receberam 500 mL da mistura do gás, apresentaram valores
mais baixos de FR em comparação com os demais grupos em estudo. Nas fêmeas que
receberam esta mesma dose a FR reduziu no terço médio do período experimental,
com posterior elevação. Por outro lado, o grupo de fêmeas tratadas com 1000 mL de
ozônio, apresentaram valores mais altos de FR na primeira metade do período de
aplicações, com posterior redução nos valores, que se mostraram inferiores aos do
limite médio de controle.
Depois de transcorridos 20 minutos da administração do ozônio nos eqüinos,
os valores médios da FR se encontraram praticamente similares aos obtidos nos 10
minutos do tempo de recuperação, porém com menor flutuação, mostrando um padrão
126
mais similar entre os grupos (Figura 6), com diminuição da FR após o quinto período
de aplicação que, a exceção do MT1000, os demais grupos apresentaram valores
médios inferiores no final do período experimental, quando comparados aos valores
iniciais.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Período de aplicações
Freqüência respiratória (respirações/minuto)
MT500
FT500
MT1000
FT1000
LSC
LM
LIC
FIGURA 6 – Estimativas da freqüência respiratória (rpm) até 20 minutos depois da
administração do ozônio em cada período de aplicação. MT500
(machos tratados com 500 mL), FT500 (fêmeas tratadas com 500 mL),
MT1000 (machos tratados com1000 mL) e FT1000 (fêmeas tratadas
com 1000 mL). LSC: limite superior de controle, LM: limite médio,
LIC: limite inferior de controle.
Estes dados demonstram o condicionamento dos animais, pela diminuição da
FC anteriormente mencionada, como da FR, já que no decorrer do período
experimental ocorre uma elevação na FC e FR até 10 minutos após a terapia, no
entanto apesar destes valores serem maiores do que os iniciais, depois de transcorridos
20 minutos, os animais recuperaram estas freqüências, atingindo valores similares aos
iniciais. Com isto, demonstram a adaptação ao esforço cardio-respiratório estimulado
pela ozonioterapia.
Evans (2000) menciona que uma quantidade maior de oxigênio arterial
aumenta o consumo máximo do mesmo. No caso do animal em exercício, este
127
aumento na oferta de oxigênio, se deve à contração esplênica, aumentando o número
de eritrócitos, o hematócrito e a concentração de hemoglobina no sangue e,
conseqüentemente, a capacidade de oxigenação dos tecidos. Neste estudo inferimos
efeitos similares em resposta à ozonioterapia; porém, a origem dos eritrócitos
provavelmente não seja a contração esplênica, mas sim pelo estímulo do ozônio sobre
a granulocitopoiese na medula óssea, tal como mencionado por Remigio et al. (1999).
Desta maneira esta capacidade de oxigenação se torna verdadeiramente
eficiente, com o aumento da freqüência cardíaca, importante na impulsão de sangue
rico em oxigênio, até os diferentes tecidos e na elevação da freqüência respiratória,
fundamental para a troca gasosa.
Gómez et al. (2004), acreditam que o treinamento não ocasione um aumento
no volume respiratório e sim um incremento na elasticidade pulmonar, de forma que,
o tecido pulmonar otimiza a velocidade de troca gasosa alveolar, que com o tempo
acarreta aumento da amplitude respiratória. Os autores mencionam que dentro de um
programa de treinamento, a diminuição da FR se deve a uma eficiente resposta
aeróbica, já que a capacidade de oxigenação melhora com o aumento das células
vermelhas e de hemoglobina no sangue. Adicionalmente, a modulação da FR se dá
por meio do equilíbrio de quimioreceptores arteriais presentes na artéria aorta (para
pressão parcial de oxigênio) e na artéria carótida (para pressão parcial de dióxido de
carbono), o que permite um intercâmbio gasoso mais adequado no suprimento dos
diferentes requerimentos metabólicos.
Efeitos da ozonioterapia sobre a freqüência cardíaca e respiratória antes e
imediatamente após a administração da mistura do gás
Os valores médios de freqüência cardíaca (FC) e respiratória (FR) dos eqüinos
sob avaliação, quando administradas as diferentes doses do ozônio, durante todo o
período de aplicações, foram de 34 bpm e de 24 rpm respectivamente, sendo estes
valores considerados como dentro ou discretamente acima dos limites de referência
para a espécie eqüina, que são de 30 a 40, para a FC e de 8 a 18, para a FR (Speirs,
1999; Orsini & Divers, 2003).
Embora a freqüência respiratória estivesse um pouco acima do estabelecido
como normal, os animais não demonstraram sinais de desconforto durante as
128
aplicações da mistura do gás. Adicionalmente, trabalho realizado em eqüinos sadios
da raça Pantaneira demonstrou que estes valores podem oscilar entre 24,8 e 29,3 para
a FR no período de repouso (Silva et al., 2005).
Ao avaliar a freqüência cardíaca, no dia da terceira aplicação, imediatamente
antes da administração do ozônio (Tabela 2), se observam valores diferentes (p<0,05)
determinados pela dosagem, onde aqueles animais que receberiam 1000 mL da
mistura do gás, apresentaram as maiores médias. Porém, este achado não foi
considerado relevante neste momento do estudo, já que os animais se encontravam em
repouso e não tinham recebido a aplicação do ozônio. Estes dados demonstram a
normalidade da freqüência cardíaca antes de começar cada aplicação nos grupos
experimentais, o que esteve presente durante todo o período de aplicações.
TABELA 2 – Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência cardíaca (bpm) antes da aplicação do ozônio,
considerando os dias de aplicação.
Freqüência cardíaca antes da ozônioterapia
Combinações
Período de aplicações de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
30
32
28
30
30
26
30
30
28
T500
Fêmea
40
36
30
28
30
26
30
34
34
T1000
Macho
38
34
34
36
32
30
30
38
40
T1000
Fêmea
44
36
38
30
30
34
32
32
30
Efeitos
Dosagem
6,00
1,00
7,00*
4,00
1,00
6,00
1,00
3,00
4,00
Sexo
-8,00
-3,00
-3,00
4,00
1,00
-2,00
-1,00
1,00
2,00
Interação
2,00
1,00
-1,00
2,00
1,00
-2,00
-1,00
5,00
8,00
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
* Significativo pelo teste F (p<0,05).
Quando avaliada a freqüência cardíaca imediatamente após (até 10 minutos) a
aplicação do ozônio (Tabela 3), observa-se após a segunda aplicação uma resposta à
ozonioterapia influenciada (p<0,05) pela dosagem e sexo sobre os valores médios da
freqüência cardíaca. Nesse sentido, quando foram administrados 1000 mL da mistura
do gás se observaram os maiores valores médios deste parâmetro. Com relação ao
sexo, as fêmeas foram as mais responsivas, independente da dose utilizada, elevando
os valores médios deste parâmetro. Também foram observados em alguns momentos,
129
valores discretamente acima daqueles de referência para a espécie. No entanto, ao
longo do experimento, este parâmetro se manteve com valores menores a partir do
quinto período de aplicação, quando comparados com os valores iniciais.
Adicionalmente, a FC de eqüinos sadios das raças Brasileiro de Hipismo, Bretã, Puro
Sangue de Corrida e de eqüinos mestiços pode chegar a 44,24±8,32, 37,81±9,72,
39,41±7,17 e 39,37±8,60 bpm, respectivamente (Paludo et al., 2002).
TABELA 3 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência cardíaca (bpm) até 10 minutos após a aplicação
do ozônio, considerando os dias de aplicação.
Freqüência Cardíaca até 10 minutos após a ozonioterapia
Combinações
Período de aplicações de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
34
32
30
38
32
32
34
32
28
T500
Fêmea
44
40
34
34
36
36
34
34
32
T1000
Macho
40
38
34
42
38
36
36
38
44
T1000
Fêmea
44
44
38
40
38
42
28
36
30
Efeitos
Dosagem
3,00
5,00*
4,00
5,00
4,00
5,00
-2,00
4,00
7,00
Sexo
-7,00
-7,00*
-4,00
3,00
-2,00
-5,00
4,00
0,00
5,00
Interação
3,00
1,00
0,00
-1,00
2,00
-1,00
4,00
2,00
9,00
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
* Significativo pelo teste F (p<0,05).
Apesar da baixa variabilidade nos valores médios de FC, esta pode ser um
processo de adaptação à ozonioterapia e decorrente de aplicações contínuas com uma
baixa concentração de ozônio, resultando em um menor esforço cardíaco. Este
processo de adaptação já foi descrito por Bocci & Aldinucci (2004) em pacientes
humanos.
Gibbs et al. (1995), mencionaram que quando a freqüência cardíaca não
retorna aos seus valores normais em um determinado tempo, pode indicar inadequado
condicionamento do animal, resultando em muitos casos em fadiga muscular e,
conseqüentemente o aparecimento de lesões.
A FC pode aumentar em decorrência de mudanças reológicas no sangue,
decorrentes da interação dos seus componentes com o ozônio, aumentado desta forma
a fluidez do sangue e o fluxo sangüíneo e, conseqüentemente, o debito cardíaco
130
(Carreira & Almagro, 2000; Zee & De Monte, 2001; Barroetabeña et al., 2002;
Machin et al., 2004). A viscosidade diminui em resposta à diminuição e alteração
transitória e estrutural do fibrinogênio, assim como devido à ativação das plaquetas
pelo ozônio, reduzindo a quantidade de cálcio citosólico nesses componentes e, assim,
diminuindo a sua agregação, além de reduzir fatores de crescimento relacionados com
a coagulação, como o fator de crescimento e transformação Beta 1 (TGFβ-1) e o fator
de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) (Zee & De Monte, 2001; Toros et al.,
2005). O aumento do oxido nítrico a partir das células endoteliais aumenta o fluxo
sangüíneo e a regula o diâmetro vascular, o que também pode elevar o esforço
cardíaco, imediatamente após a exposição ao ozônio (Valacchi & Bocci, 2000; Zee &
De Monte, 2001; Bocci & Aldinucci, 2004). Também existe a reação na membrana
dos eritrócitos, aumentando sua filtrabilidade e melhorando sua atividade reológica
(Barroetabeña et al., 2002).
Segundo Cottin et al. (2005), um maior alongamento das fibras cardíacas do
ventrículo esquerdo, reduz a resistência do miocárdio, aumentando a freqüência
cardíaca com conseqüente aumento no débito cardíaco.
Depois de transcorridos até 20 minutos após a aplicação do ozônio (Tabela 4),
observou-se efeito da ozonioterapia de maneira diferenciada (p<0,05) determinada
pelo sexo, após a primeira aplicação, momento no qual a freqüência cardíaca nas
fêmeas se mostrou com os valores médios mais altos, independente da dose
administrada. Após a oitava aplicação, observou-se novamente efeito da terapia,
sendo neste período determinada por uma interação (p<0,05) entre os fatores sexo e
dosagem; momento em que os machos apresentaram uma menor alteração quando
utilizada a dose de 500 mL de ozônio. Por outro lado, este efeito foi apenas observado
em dois períodos de aplicação, não sendo assim considerado relevante.
A exceção dos machos tratados com 1000 mL do ozônio, observou-se no final
do período de estudo, que os valores médios da FC foram menores do que os iniciais,
o que pode ser por adaptação e/ou melhora no rendimento cardíaco dos animais com a
ozonioterapia. Na opinião de Gibbs et al. (1995), a determinação da FC no período de
recuperação após exercício em eqüinos é de relevante consideração, já que permite
reconhecer o início de fadiga muscular mediante a avaliação da freqüência cardíaca.
131
TABELA 4 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência cardíaca (bpm) até 20 minutos da aplicação do
ozônio, considerando os dias de aplicação.
Freqüência cardíaca até 20 minutos após a ozonioterapia
Combinações
Período de aplicações de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
34
36
28
30
30
26
30
30
28
T500
Fêmea
38
38
32
36
34
32
32
34
28
T1000
Macho
34
38
30
36
36
34
34
40
36
T1000
Fêmea
40
42
34
45
32
38
32
32
28
Efeitos
Dosagem
1,00
3,00
2,00
7,67
2,00
7,00
2,00
4,00
4,00
Sexo
-5,00
*
-3,00
-4,00
-7,67
0,00
-5,00
0,00
2,00
4,00
Interação
-1,00
-1,00
0,00
-1,67
4,00
1,00
2,00
6,00*
4,00
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
* Significativo pelo teste F (p<0,05).
Ao avaliar a freqüência respiratória (Tabela 5), antes das aplicações do ozônio,
não foram constatadas diferenças (p>0,05) nos valores médios dos animais em estudo,
influenciadas pelo tratamento, sexo ou a interação destes durante o período
experimental.
TABELA 5 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência respiratória (rpm) antes da aplicação do
ozônio, considerando os dias de aplicação.
Freqüência respiratória antes da ozônioterapia
Combinações
Período de aplicações de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
16
12
12
16
14
12
14
14
12
T500
Fêmea
24
16
12
12
14
12
14
14
12
T1000
Macho
20
14
14
14
14
12
14
22
16
T1000
Fêmea
16
16
16
12
12
12
12
12
12
Efeitos
Dosagem
-2,00
1,00
3,00
-1,00
-1,00
0,00
-1,00
3,00
2,00
Sexo
-2,00
-3,00
-1,00
3,00
1,00
0,00
1,00
5,00
2,00
Interação
6,00
1,00
-1,00
-1,00
1,00
0,00
1,00
5,00
2,00
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
* Significativo pelo teste F (p<0,05).
132
Nesse período de avaliação, os animais estavam em repouso e não tinham
recebido ozônio, por conseguinte, estes dados demonstram a normalidade da
freqüência respiratória nos animais dos diferentes grupos experimentais.
Quando avaliado o mesmo parâmetro até 10 minutos após cada aplicação do
ozônio (Tabela 6), nota-se que quando realizada a terceira aplicação, existiu um efeito
(p<0,05) da ozonioterapia sobre a FR influenciado pelo sexo. Neste período, as
fêmeas apresentaram freqüência respiratória mais elevada, sendo bem acima dos
considerados como normais para a espécie eqüina (Speir, 1999; Orsini & Divers,
2003; Silva et al., 2005). Entretanto, este efeito somente foi constatado nesta
aplicação, pelo que foi considerado como de pouca relevância, embora na maioria dos
períodos de aplicação as fêmeas apresentaram valores médios de FR mais elevados.
TABELA 6 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência respiratória (rpm) até 10 minutos após a
aplicação do ozônio, considerando os dias de aplicação.
Freqüência respiratória até 10 minutos após a ozonioterapia
Combinações
Período de aplicações de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
26
16
16
22
18
14
26
20
14
T500
Fêmea
40
34
37
26
26
26
44
30
22
T1000
Macho
40
20
22
38
28
16
28
44
36
T1000
Fêmea
42
22
40
34
36
24
16
26
18
Efeitos
Dosagem
8,00
-4,00
4,67
12,00
10,00
0,00
-13,00
10,00
9,00
Sexo
-8,00
-10,00
-19,33
*
-0,00
-8,00
-10,00
-3,00
4,00
5,00
Interação
6,00
8,00
1,33
4,00
-0,00
2,00
15,00
14,00
13,00
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
* Significativo pelo teste F (p<0,05).
Este aumento imediato na FR pode ter sido decorrente de uma maior
necessidade em se intensificar as trocas gasosas, processo descrito por Evans (2000) e
Gómez et al. (2004) em eqüinos. Segundo Hinchcliff et al. (2004), isto ocorre em
eqüinos atletas, com a finalidade de melhorar o transporte de oxigênio que aumenta
em decorrência de um maior débito cardíaco, pelo aumento na quantidade dos
eritrócitos, o que acarreta um maior volume de oxigênio disponível para o consumo e
distribuição nos diferentes tecidos. Estes autores também mencionam a importância
133
do trabalho em sincronia do aparelho cardiovascular e respiratório, que permitem a
distribuição de oxigênio. Birchard (1997) também faz referência acerca do aumento
na capacidade de transportar oxigênio com o aumento do hematócrito e do débito
cardíaco, o que resulta em uma resposta respiratória, com melhora na distribuição do
oxigênio nos tecidos.
Ao se avaliar os valores médios da FR em até 20 minutos após a aplicação do
ozônio (Tabela 7), observa-se que houve uma resposta (p<0,05) à ozonioterapia
determinada pelo sexo após a segunda e terceira aplicações, períodos em que as
fêmeas revelaram valores médios mais altos deste parâmetro, em comparação com os
machos, independente da dose de ozônio utilizada (500 ou 1000 mL). Apesar desta
resposta (p<0,05), somente em dois períodos de aplicação do ozônio, pode ser
constatado que os valores médios de FR nas fêmeas durante quase todo o período
experimental, se mantiveram mais altos.
TABELA 7 - Médias e estimativas dos efeitos principais e da interação da dosagem e
sexo sobre a freqüência respiratória (rpm) até 20 minutos após a
aplicação do ozônio, considerando os dias de aplicação.
Freqüência respiratória até 20 minutos após a ozonioterapia
Combinações
Período de aplicações de ozônio
Dosagem
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T500
Macho
26
28
18
24
18
14
22
24
14
T500
Fêmea
34
44
30
34
26
24
40
28
16
T1000
Macho
32
32
18
38
32
20
24
46
36
T1000
Fêmea
34
50
34
40
34
24
28
32
24
Efeitos
Dosagem
3,00
5,00
2,00
10,00
11,00
3,00
-5,00
13,00
15,00
Sexo
-5,00
-17,00
*
-14,00
*
-6,00
-5,00
-7,00
-11,00
5,00
5,00
Interação
3,00
-1,00
-2,00
4,00
3,00
3,00
7,00
9,00
7,00
T500: tratamento com 500 mL da mistura do gás. T1000: tratamento com 1000 mL da mistura do gás.
* Significativo pelo teste F (p<0,05).
134
CONCLUSÕES
Nas condições do presente estudo experimental e com base nos resultados obtidos
pode-se concluir que:
1. Após ozonioterapia ocorre aumento na freqüência respiratória, com posterior
redução da mesma no decorrer das aplicações.
2. A quantidade de ozônio administrada por autohemotransfusão, assim como o
sexo dos animais não são fatores relevantes que influenciam na alteração das
freqüências cardíaca e respiratória em função da ozonioterapia.
3. Animais tratados com ozonioterapia apresentam um adequado
condicionamento cardio-respiratório, sendo possivelmente uma opção para
melhorar o desempenho de eqüinos atletas.
135
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