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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE FISICA DE SÃO CARLOS
DEPARTAMENTO DE FÍSICA E INFORMÁTICA
ERNANNI DAMIÃO VIEIRA
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA ELETRÔNICA NO
ESTUDO DE SISTEMAS DE INTERESSE
BIOLÓGICO
São Carlos
2009
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ERNANNI DAMIÃO VIERA
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA ELETRÔNICA NO
ESTUDO DE SISTEMAS DE INTERESSE
BIOLÓGICO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Física do Instituto de
Física de São Carlos da Universidade de
São Paulo, para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Física Aplicada.
Orientador: Prof. Dr. Antonio José da
Costa Filho
São Carlos
2009
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço de Biblioteca e Informação IFSC/USP
Vieira, Ernanni Damião
Ressonância magnética eletrônica no estudo de sistemas d
e
interesse biológico / Ernanni Damião Vieira.; orientador Antonio José
da Costa Filho.-- São Carlos, 2009.
140 p.
Tese (Tese em Ciência - Área de concentração: Física Aplicada)
– Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo.
1. RPE. 2. Superparamagnetismo. 3. Nicotina. 4. Surfatante
pulmonar. 5. Células-tronco. I.Título.
Este trabalho científico é dedicado à memória de minha mãe, por tudo que
sou e tudo que tenho conquistado.
À minha LINDA Rezinha, luz dos meus olhos e afago da minha alma, pelos
os maravilhosos momentos que temos vividos juntos.
Ao Prof. Otaciro Rangel Nascimento, meu pai científico, quem me acolheu
no grupo de Biofísica na árida época da graduação, instruiu-me na técnica
de RPE mostrando-me a arte de realizar uma boa medida.
Ao meu pai Damião Vieira, à dona Maria, aos meus irmãos Ivanildo e Edson,
aos meus sobrinhos Rian, Clemerson e Vitória; as minhas cunhadas
Simone, Margarida e Queite.
Agradecimentos
Agradeço ao professor Dr. Antonio José da Costa Filho pela orientação continuada
desde o meu mestrado há exatos sete anos, por mais uma oportunidade e pela
amizade.
Ao Dr. Lionel Gamarra Contreras, pela amizade, pela valiosa colaboração, pelo
empenho e impagável ajuda com que tem me prestado principalmente no final
desta tese.
A minha competente professora de inglês Solange Maimoni, pela amizade e
empenho com que tem me alfabetizado na língua inglesa, especialmente na escrita.
Ao meu companheiro e amigo Luís Guilherme (militar) pelas nossas proveitosas
discussões sobre RPE.
As minhas Princesinhas: Deinha e Yasmin, por tudo que representam pra mim.
À minha inesquecível professora de ciências Célia Ribeiro.
A minha amiga Jane, Dona Zoraide, primo Pedro, Mário Gaziro,
As pessoas do Grupo de Biofísica:
Prof. Zucolotto, Prof. Magon, Andressa, Profa. Ana Paula, minha amiga Sheila,
Profa. Leila, Beto, Ana Paula (Paulette), Fernando Lima, Fernando Melo, Débora,
Leandro, Zé Luis, Assuero, Baiano, Rony, Lia, Possato, Bel, Profa. Nelma, Joci, Luis
argentino, Camila, Débora-IC, Tatiana, Júlia, Dona Graça, Pámela, Natália, Estér,
Gigi...
Ás Bibliotecárias, pela simpatia e competência no atendimento, especialmente a
Neusa e Mara que tem me ajudado na formatação desta tese.
Ás Tias e Tios do “bandejão”, quem nos dão de comer todos os dias da semana.
Aos meus Tios e Tias, primos e primas.
Às funcionárias, funcionários, professoras e professores do IFSC.
À FAPESP, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro e científico ao longo de
desenvolvimento deste trabalho.
A mais longa jornada começa com um passo.
Provérbio Chinês
Antes tarde do que NUNCA!
Provérbio “Carriês”
Resumo
VIEIRA, E. D. Ressonância magnética eletrônica no estudo de
sistemas de interesse biológico. 2009. 140 p. Tese (Doutorado) –
Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos,
2009.
Neste trabalho de tese aplicamos a espectroscopia de Ressonância
Paramagnética Eletrônica (RPE) junto com a chamada técnica do “grupo
repórter”, aliada a simulação espectral por meio do programa NLSL, para
investigar a interação da nicotina dependente com membranas. Também
empregamos Ressonância Ferromangnética (RFM), que é uma técnica
similar em muitos aspectos ao RPE, para investigamos células-tronco
marcadas com nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro
(NSOF), previamente preparada no laboratório de nanotecnologia do
Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE). Os
resultados relativos à primeira parte da tese, mostraram que a nicotina
quando em meio ácido interage com a região da cabeça polar dos
fosfolipídios estudados e tem ação penetrante em meio básico. A interação
da nicotina com o DPPC resulta em uma desestabilização da fase gel do
fosfolipídio. Este fato pode estar relacionado com a ocorrência de doenças
respiratórias em tabagistas devido ao fato de que o DPPC é o maior
constituinte do complexo surfatante pulmonar. Na segunda parte, fomos
capazes de marcar células-tronco com nanopartículas superparmangéticas e
também quantificá-las pelo cálculo da área, dupla integral do espectro de
RFM das NOSF. Finalmente, fizemos uma caracterização das nanopartículas
por meio de experimentos de RFM dependente da variação de temperatura,
que confirmaram o comportamento superparamagnético das NOSF.
Palavras Chaves: RPE, Superparamagnetismo, Nicotina, Surfatante
pulmonar, Células-tronco.
Abstract
VIEIRA, E. D. Electron magnetic resonance in studies of biologically-
relevant systems. 2009. 140 p. Tese (Doutorado) – Instituto de Física de
São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2009.
In this work, we made use of the Electron Paramagnetic Resonance (EPR)
spectroscopy along with the so-called reporter group technique and
extensive spectral simulations by means of the software NLSL to investigate
the interaction of nicotine with model membranes. Besides that we also
employed Ferromagnetic Resonance (FMR), which is a technique similar in
many aspects to EPR, to investigate stem cells labeled with
superparamagnetic nanoparticles of iron oxide (NSOF) previously made at
the Nanotechnology Laboratory of the Instituto Israelita de Ensino e
Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE). The results concerning the first part of
our work showed that nicotine in acidic pH value interacts with the polar
headgroup region of the phospholipids under investigation, whereas it
penetrates the model membrane in alkaline pH value. Also, the interaction
of nicotine with DPPC resulted in destabilization of the phospholipid gel
phase. This fact could be related to some of the effects of nicotine in
respiratory diseases since DPPC is the major constituent of the pulmonary
surfactant complex. In the second part of our work, we were able to
successfully label stem cells with the superparamagnetic nanoparticles and
also quantify that labeling by calculating the area under the double
integrated NSOF FMR spectra. We also performed a characterization of the
nanoparticles by means of temperature-variation FMR experiments, which
showed that the iron oxide nanoparticled indeed had a superparamagnetic
behavior.
Key Words: EPR, Superparamantism, Nicotine, Lung Surfactants , Stem Cell
Sumário
1 Introdução Geral 10
1.1 Interações de Nicotina com Modelos de Membrana 14
1.2 Materiais e Métodos 20
1.2.1
Materiais 20
1.2.2
Preparação de Amostras 21
1.2.3
Medidas de RPE 22
1.2.4
Simulações de Espectros de RPE 23
1.3 Resultados e Discussão 29
1.3.1
Vesículas do Fosfolipídio DPPC com e sem nicotina
monitoradas por 5-PCSL e 16-PCSL
30
1.3.2
Vesículas do fosfolipídio POPC com e sem nicotina
monitoradas com marcadores 5-PCSL e 16-PCSL em pHs
ácido (~6) e básico (~10)
45
1.3.3
Discussão geral dos resultados 66
2 Nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro
como marcadores celulares
72
2.1 Fundamentos Teóricos 72
2.1.1
Introdução 73
2.1.2
Ferrofluidos 76
2.1.3
Células tronco CD133
+
80
2.1.4
Ressonância Ferromagnética 83
2.1.3
Características Físico-Químicas dos Óxidos de Ferro:
Magnetita e Maghemita
86
2.2 Materiais e Métodos 89
2.2.1
Marcador magnético: Descrição da amostra 89
2.2.2
Células-Tronco CD133
+
90
2.2.3
Metodologia de quantificação das NSOF 91
2.2.4
Detecção das células marcadas – Citometria de Fluxo 93
2.2.5
Visualização qualitativa das CD133
+
: Microscopia
Eletrônica de Transmissão
93
2.2.6
Medidas de Ressonância Ferromagnética 94
2.3 Resultados e Discussão 95
2.3.1
Caracterização Magnética do marcador celular 95
2.3.2
Detecção das Células Marcadas: Citometria de Fluxo 102
2.3.3
Visualização Qualitativa das Células Marcadas: MET 103
2.3.4
Construção da curva de calibração 105
2.3.5
Quantificação por FMR das células marcadas por NSOF 106
3 Conclusão 110
Referências
114
Apêndice A
126
Apêndice B
134
10
1 Introdução Geral
Projetos que se baseiam no estudo de problemas de interesse biológico,
em geral, envolvem sistemas complexos constituídos por uma grande quantidade
de entes e de graus de liberdade. Nos casos em que se busca o entendimento de
fenômenos em nível molecular, soma-se a essas dificuldades, a impossibilidade
de visualização direta dos processos sob investigação. É neste ponto que o uso
de técnicas que nos permitam obter informações moleculares de sistemas
intrincados assume seu papel de relevância dentro do que costumamos chamar
de Biofísica Molecular.
Dentre essas técnicas, ganharam destaque e ampla aplicabilidade aquelas
que se baseiam na utilização da interação entre radiação, nas mais diversas
faixas do espectro eletromagnético, e matéria. Por matéria entendemos sistemas
que podem ir desde os blocos fundamentais constituintes de macromoléculas
biológicas (aminoácidos, por exemplo), as próprias macromoléculas, até células e
tecidos. Cada metodologia experimental acaba por monitorar eventos distintos
em certa situação, originando dados também distintos e/ou complementares.
Assim, várias são as técnicas que têm gerado contribuições significativas para o
entendimento de problemas biológicos como a fluorescência, dicroísmo circular,
difração de raios X, infravermelho e absorção óptica, para citar apenas algumas.
No caso particular em que se insere nosso interesse de pesquisa e dentro
do qual se encaixa o presente trabalho de tese, restringimos nossa atenção à
obtenção de informações de sistemas microscópicos através de métodos que
empregam uma propriedade intrínseca das partículas que compõem a matéria, o
seu spin. Estamos, portanto, no campo de atuação das técnicas conhecidas como
11
Ressonâncias Magnéticas (RM). Em nosso caso, estamos interessados no spin de
elétrons desemparelhados em amostras como proteínas, membranas ou
compostos de íons de metais de transição. Em outros casos, o mesmo spin, mas
não eletrônico e sim nuclear, constitui a base da Ressonância Magnética Nuclear
(RMN), método que tem dado contribuições inigualáveis e que vão desde a
determinação da estrutura tridimensional de moléculas como proteínas até o uso
clínico em exames de tomografia por RMN.
Concentrando-nos no spin eletrônico, estamos portanto escolhendo a
Ressonância Magnética Eletrônica (RME). Esta, até meados da década de 50, era
quase exclusivamente área de atuação de físicos, com aplicações rotineiras a
uma variedade de problemas em química e biologia se estabelecendo
gradualmente. No que diz respeito a seu uso específico em problemas biológicos,
contribuições significativas foram dadas por George Feher (EUA), que introduziu
a técnica de ressonância dupla conhecida como ENDOR
(1)
, e Jack Freed (EUA),
que realizou os primeiros experimentos de ressonância eletrônica por
Transformada de Fourier
(2)
.
A técnica de RME em seu regime de onda contínua (CW) vem sendo
aplicada a estudos de sistemas de interesse biológico há muitos anos, sendo que
as contribuições daí provenientes são muito diversas. Vão desde a caracterização
de sítios de ligação de metais em materiais com possíveis aplicações
biológicas/médicas, passando por estudos da estrutura e dinâmica de
membranas biológicas e chegando ao estudo de processos reacionais em
proteínas. Grande parte de tais aplicações encontra-se descrita nos vários
volumes da série Biological Magnetic Resonance, editada por L.J. Berliner
(Plenum, New York),
(3)
na qual os trabalhos relacionados servem para dar uma
12
idéia da vasta contribuição de RME ao estudo de sistemas de interesse
biológicos.
Uma das maneiras mais eficazes de aliar a técnica de ressonância
magnética e os referidos problemas de interesse biológico consiste no uso de
sondas paramagnéticas conhecidas como marcadores de spin. Marcadores de
spin têm sido usados freqüentemente na busca por informações estruturais e
dinâmicas em macromoléculas,
(3)
mas a falta de sítios paramagnéticos ou com
afinidade por eles em muitos desses sistemas fez com que a sua aplicação fosse
sempre limitada. No entanto, o surgimento de moléculas como, por exemplo,
fosfolipídios marcados, via ligação covalente, com um radical do tipo nitróxido ou
a possibilidade de se realizar uma marcação de spin sítio dirigida conferiram à
RME um ampla aplicabilidade em problemas envolvendo modelos para
membranas fosfolipídicas e proteínas. Além desses fatores, RME ainda possui
resolução temporal compatível com aquela na qual normalmente ocorrem
fenômenos como mudanças conformacionais em membranas biológicas e em
estruturas de proteínas e a possibilidade da escolha de um marcador de spin que
melhor se adéqüe a um problema específico. É nesta modalidade de uso da RME
que se encontra a primeira parte de nosso trabalho e que envolve mudanças na
estrutura de modelos de membrana quando da presença de moléculas de baixo
peso molecular e quando da alteração de parâmetros externos como a
temperatura.
Outro objeto central de pesquisa em nosso grupo tem sido os estudos de
centros metálicos em sistemas de interesse biológico. Estes projetos têm um
caráter diferente em termos de abordagem necessária, mesmo que tal
abordagem seja também feita primordialmente através da técnica de ressonância
magnética. No caso de centros contendo íons de metais de transição, como ferro
13
e cobre, as medidas de ressonância magnética envolvem experimentos, em
geral, a temperaturas criogênicas e o sistema em si pode variar
consideravelmente seu estado de spin. A interpretação dos resultados
experimentais obtidos muda consideravelmente. Assim sendo, em relação aos
sistemas caracterizados pela presença de íons de metais de transição, temos
trabalhado intensamente com a caracterização via técnicas de ressonância
magnética de nanopartículas contendo íons de ferro e sua possível aplicação
médica. Neste caso, as nanopartículas de óxido de ferro possuem momentos
magnéticos de grande magnitude e são, portanto, chamadas de
superparamagnéticas. Este trabalho é resultado de uma colaboração entre nosso
grupo e o grupo do Dr. Lionel Gamarra, atualmente pesquisador do Hospital
Israelita Albert Einstein (São Paulo).
Baseado no exposto acima, podemos afirmar que os resultados
apresentados têm como linha central métodos de ressonância magnética para o
estudo de sistemas de interesse biológico. Os objetivos específicos e resultados
alcançados até o momento estão descritos nos capítulos subseqüentes. Para
maior clareza da apresentação, os objetos de estudo estão descritos
separadamente em duas partes da seguinte maneira: a parte 1 versa sobre os
estudos utilizando modelos de membrana biológica e a parte 2 descreve nossas
atividades no estudo de nanopartículas de ferro com potencial aplicação em
problemas biomédicos.
14
1.1 Interações de Nicotina com Modelos de Membrana
Pulmões de mamíferos são bolsas membranosas divididas em alvéolos,
pequenos sacos em forma de bolha com alta elasticidade que aumentam
bastante a área de superfície no momento das trocas gasosas. No processo de
troca gasosa, o oxigênio flui dos alvéolos para os capilares sanguíneos e o gás
carbônico deixa os capilares e difunde nos alvéolos. Neste processo, há
condensação de vapores resultando em uma tensão superficial na superfície
interna do alvéolo. Sem um mecanismo de defesa interno, o pulmão tende a
colapsar. Esta tendência é minimizada pela presença de substâncias que
reduzem a tensão superficial no interior da superfície interna do alvéolo para
valores muito baixos.
(1)
A substância que tem o papel de diminuir a tendência de
formação de gotículas e, consequentemente, diminui a tensão superficial de
líquidos formados na superfície dos alvéolos pulmonares dos mamíferos é
chamada de surfatante pulmonar. Este é composto principalmente de lipídios e
proteínas específicas, chamadas proteínas surfatantes.
(4,5,6)
A massa de lipídios
que compõe o complexo surfatante pulmonar corresponde a aproximadamente
90% do total, entre os quais 40% é formado por dipalmiltoilfosfatidilcolina
(DPPC), 30% de palmitoiloleolilfosfatidilcolina (POPC), 10 % de
palmitoiloleolilfosfatidilglicrol (POPG), 8% de outros fosfolipídios e 2% de lipídios
naturais. As proteínas surfatante desempenham um papel importante na
estrutura, função e metabolismo dos surfatantes. Quatro proteínas específicas
têm sido descritas:
(4)
SP-A (5%), SP-B(2%), SP-C (2%) e SP-D (1%). Estas
proteínas são sintetizadas e excretadas pelas células epiteliais tipo II dos
alvéolos pulmonares e são classificadas como hidrofílicas (SP-A e SP-D) e
15
hidrofóbicas (SP-B e SP-C). SP-A e SP-B têm papel importante na primeira linha
de defesa contra agentes patogênicos, bem como função regulatória na formação
da monocamada que diminui a tensão superficial.
(5)
Para abaixar a tensão superficial, a monocamada torna-se enriquecida do
fosfolipídio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-fosfatidilcolina (DPPC) que pode ocorrer por
processo de inserção durante a adsorção ou durante exclusão de outros
componentes do filme durante a redução de sua área. Além da função principal
de diminuir a tensão superficial, outras funções estão creditadas às proteínas
surfatantes: ativação de macrófagos alveolares, formação do tubo de mielina
secreção de fosfolipídios pelas células tipo II na monocamada, regulação e
ordenamento dos fosfolipídios e defesa contra bactérias e vírus.
(4)
Síndrome da angústia respiratória constitui a principal causa de
enfermidade ou morte em recém-nascidos oriundas da diminuição na produção
de surfatantes pelas células tipo II alveolares.
(7,8)
Estudos mostraram que esta
enfermidade tem alta incidência em crianças recém-nascidas de mães
fumantes.
(9)
Ademais, tem sido mostrado que o hábito de fumar diminui os níveis
de surfatante associado aos fosfolipídios na lavagem brônquio-alveolar.
(10)
Aproximadamente 1,3 milhões de tabagistas consomem anualmente, cerca
de 73 mil toneladas de nicotina embaladas em cigarros, principalmente nos
países em desenvolvimento.
(11)
No combusto do tabaco, a nicotina é o
componente mais importante. Distúrbios cardiovasculares, impotência, doença
de Parkinson, doença de Alzheimere e vários tipos de câncer são consequências
do uso de nicotina em tabagistas.
(12)
O tabaco contém cerca de 70 substâncias
cancerígenas distribuídas em três grupos principais: hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos, aminas aromáticas e nitrosaminas. A nicotina participa da
carcinogênese atuando como intermediária através da sua nitrosação,
16
produzindo nitrosaminas específicas. As nitrosaminas derivadas da nicotina
formam-se durante o processo de preparo do tabaco. Dentre as quatros
principais nitrosaminas [NNK2–4-(metilnitrosamina)-1-(3-piridil)-1-butanona,
NNN–N’-nitrosonornicotina, NAB–N’-nitrosoanabasina e NAT–N’-
nitrosoanabatina], a nitrosamina NNK2 possui maior potencial cancerígeno no
estômago, pâncreas, fígado, pele e pulmão.
(12)
Em tabagistas, a nitrosação se
processa pela ação de enzimas, tal como a hidroxilização do sistema citrocômico
P450 de fígado e do pulmão.
(13,14)
No metabolismo da nicotina os chamados
macrófagos são ativados liberando aril-hidroxilase-hidrocarbonetos, os quais
decompõem nitrosaminas, aminas aromáticas e hidrocarbonetos aromáticos
policiclos em metabólitos chamados epóxitos. Estes produzem adutos no DNA
com alto potencial mutagênico e cancerígeno.
(15)
A nicotina é um alcalóide vegetal produzido pela planta do tabaco
(Nicotiana tabacum) originária das Américas. Esta é uma amina terciária
composta de anéis de piridina e pirolidina como mostrada na Figura 1.1.1.
Figura 1.1.1 Estrutura molecular da nicotina: (−)-1-Methyl-2-(3-pyridyl)pyrrolidine
Apesar de uma extensa literatura a respeito de muitas doenças
relacionadas com o consumo do tabaco, principalmente o câncer de pulmão,
quase não há estudos sobre os efeitos da interação direta da nicotina com os
componentes constituintes dos surfatantes pulmonares. O estudo de sistemas
com base na composição de surfatantes pulmonares tem significância em
17
patologia, bioquímica e biofísica principalmente para se aprender acerca das
interações em nível molecular.
O estudo de estruturas biológicas do tipo membrana é, no entanto, de
difícil execução dada a sua complexidade estrutural e a sua obtenção não-trivial.
Uma das estratégias para enfrentar este problema é utilizar-se das chamadas
membranas modelo, cuja composição simples e de fácil controle permite a
investigação de propriedades específicas (por exemplo, composição de lipídios ou
ligação de drogas e fármacos, peptídeos e proteínas) das membranas biológicas
presentes em células vivas.
Neste sentido, a espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica
(RPE) aliada à técnica de “grupo repórter”
(16)
tem contribuído bastante para o
entendimento de sistemas biológicos. Especificamente, RPE é absorção de
radiação de microondas pelos elétrons desemparelhados quando estes estão na
presença de um campo magnético externo. Tais sistemas físicos ocorrem em íons
ou átomos de alguns metais de transição, em radicais livres ou em sondas
bioquímicas especiais chamadas marcadores de spin, largamente usados em
aplicações biológicas.
A base física da técnica é a interação entre o momento magnético
associado ao spin de um elétron desemparelhado e os campos magnéticos
externos e aqueles existentes na amostra. Espectros de RPE são usualmente
mostrados como a primeira derivada da absorção do espectro. Um espectro é
caracterizado por quatro parâmetros principais: intensidade, largura de linha,
fator g (definido pela posição da linha) e estruturas de multipletos. A intensidade
do espectro de RPE em solução pode fornecer informações a respeito da
concentração, a largura de linha está relacionada aos processos dinâmicos, o
fator g ao ambiente imediatamente próximo ao elétron desemparelhado e a
18
estrutura de multipletos (caracterizado pela constante de desdobramento A)
informa sobre a interação dos spins dos elétrons desemparelhados com os spin
dos núcleos vizinhos.
Ressonância Paramagnética Eletrônica tem sido largamente usada para se
obter informações da dinâmica molecular de polímeros. A estratégia adotada se
baseia na introdução de um radical estável com a finalidade de se investigar as
mudanças estruturais, dinâmicas e anisotrópicas no seu entorno. O radical
nitróxido tem sido o mais usado, sobretudo em estudos sobre dinâmica de
sistemas miméticos de membranas celulares.
O espectro de RPE do radical nitróxido é sensível a processos de
reorientação por causa da anisotropia oriunda das interações magnéticas entre o
momento magnético associado ao elétron desemparelhado e campo local, ou
seja, o campo magnético aplicado somado ao campo produzido pelo momento
magnético associado ao spin nuclear (
14
N) da molécula de nitróxido.
(3)
Ademais,
a dinâmica experimentada pelo radical nitróxido modula as interações
magnéticas e define, assim, uma escala de tempo e um tempo de correlação
típico τ
c
(tempo necessário para que a molécula “esqueça” sua última orientação
espacial) que caracteriza os regimes de movimento da moléculas repórter. Esses
regimes de movimento para o radical nitróxido são definidos pelo tempo τ
c
e pela
largura em frequência (∆ω) do espectro: quando τ
c
·∆ω ≈ 1, o regime é dito lento
(slow motion) para uma frequência dada; para tempos de correlação
extremamente curtos, o regime é dito rápido (fast motion); quando o tempo de
correlação é extremamente longo (sistema sem dinâmica, equivalente a amostra
sólida), o regime é dito limite rígido.
(17)
Um dos métodos empregados para obter as informações dos espectros do
radical nitróxido é aquele baseado na solução da equação estocástica de Liouville
19
(stochastic Liouville equation - SLE),
(18)
que pode ser considerado como uma
generalização semi clássica da equação máster de difusão.
(19)
Nesta descrição, os
spins eletrônico e nuclear são tratados como entidades quânticas, enquanto que
o movimento de reorientação é tratado classicamente e parametrizado em termo
de constantes de difusão rotacional. Para sistemas de membranas modelos,
como o descrito neste estudo, o marcador nitróxido está ligado covalentemente
em posições estratégicas da cadeia acila de um fosfolipídio que funciona como
repórter. Neste sistema, há dois parâmetros chave para a interpretação física dos
espectros: o parâmetro de ordem S
0
que está relacionado com o potencial de
orientação sentido pelo radical e o tensor de difusão rotacional R que reflete a
dinâmica sentida pelo grupo NO. Este tensor pode ser escrito em simetrias
diversas, em nosso caso simetria axial (R
prp
e R
pll
), e suas componentes estão
relacionadas com os tempos de correlação.
(17)
As informações quantitativas com
respeito a ambos os parâmetros S
0
e R
ptp
estão relacionadas com as fases que os
lipídios organizados em vesículas podem assumir com relação à variação de
temperatura, pH e composição. O parâmetro R
prp
ainda está relacionado com a
energia de ativação de fase quando a variável termodinâmica é a temperatura.
Assim é possível estimar a energia relacionada com uma fase lipídica e compará-
la com aquela que vem da interação de lipídios com moléculas de interesse
biológico.
No presente estudo, usamos espectroscopia de RPE de marcadores de spin
com o grupo repórter nitróxido aliada a um extenso processo de simulações
espectrais baseadas no pacote de programas NLSL
(19)
para investigar os efeitos
dependentes da temperatura e pH da interação da nicotina sobre as propriedades
físico-químicas de modelos de membrana constituídos por fosfolipídios
componentes dos surfatantes pulmonares. Mais especificamente, estudamos
20
vesículas multilamelares constituídas de fosfolipídios zwitterônicos
Dipalmitiilglicerolfosfatidilcolina (DPPC) e Palmitoiloleoilglicerolfosfatidilcolina
(POPC). O marcador de spin com o grupo repórter em diferentes posições da
cadeia acila do fosfolipídio palmitoil-steroil(n-DOXIL)glicerolfosfatidilcolina [n-
PCSL; n=5 e 16] foi adicionado às vesículas para monitorar as mudanças na
estrutura dinâmica da cadeia hidrofóbica dos fosfolipídios. Ademais faremos uma
análise comparativa entre a solução do combusto retido no filtro de um cigarro
de uma marca comercial disponível no mercado e o fosfolipídio POPC,
relacionando os efeitos da interação não específica da nicotina sobre os
fosfolipídios acima descritos.
1.2 Materiais e Métodos
No presente capítulo são apresentados os procedimentos de preparação de
amostras para medidas de RPE, processamento dos dados e simulação dos
espectros obtidos.
1.2.1 Materiais
Os fosfolipídios 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-Palmitoil-2-
Oleoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (POPC) e (1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-
fosfoglicerol (POPG), assim como os marcadores de spin 1-palmitoil-2-(n-doxil
21
stearoil) fosfatidilcolina (n=5 e 16; 5-,16-PCSL) foram adquiridos junto à
empresa Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) e a nicotina [(−)-1-Metil-2-(3-
piridil)pirrolidina, (-)Nicotina] da empresa Sigma Chem. Co. (St. Louis). Cigarro
adquirido comercialmente da marca Marlboro (king size), fabricado por Phillips
Morris Brasil Ind. e Com. LTDA, com as seguintes especificações: mistura de
tabaco, açucares, papel de cigarro, extratos vegetais e agentes de sabor,
alcatrão (10 mg), nicotina (0,8 mg) e monóxido de carbono (10 mg).
1.2.2 Preparação de Amostras
O procedimento aqui descrito é geral e vale para todas as amostras usadas
nos experimentos de RPE. Soluções estoque de lipídios em clorofórmio e
marcadores de spin em clorofórmio foram misturadas em tubo de vidro. A massa
total de lipídios em cada preparação foi de 1 mg e a concentração de marcador
de spin foi sempre mantida em 0,5 mol% dos lipídios presentes na amostra. Uma
vez misturados lipídios e marcador de spin, a solução final foi evaporada em
fluxo de N
2
, com os lipídios secos formando um filme fino nas paredes do tubo de
vidro. A fim de se garantir a completa eliminação de resíduos de clorofórmio das
amostras, estas são mantidas algumas horas em ultra-centrifugação sob vácuo
(Savant Speedvac plus-Thermo Quest). A seguir, a amostra é hidratada em
volume adequado de água milli-Q (pH 6), MiLLI-Q Plus-Millipore industria e
comércio LTDA e ou tampão acetato-borato-fostofato, 20mM e pH 10 (
especialmente para as medidas de POPC marcadas com 16-PCSL). Os lipídios
são, então, raspados das paredes do tubo, agitados em vórtex e a solução
22
sonicada por três minutos para cada um dos três ciclos de banhos quente e frio.
Em seguida, foi adicionado às amostras um volume específico de nicotina
(1:10
3
); agitados em vórtex e mantidos em repouso a temperatura ambiente por
pelo menos 1 hora para hidratação das membranas. Após a hidratação, as
amostras são centrifugadas até que se forme um “pellet” razoável para a
transferência das vesículas do tubo de vidro para um capilar adequado (I.D. 1,5
mm).
O procedimento para extrair a nicotina do cigarro usada no experimento
de RPE seguiu o protocolo: um cigarro como descrito acima foi fumado até muito
próximo do seu filtro através de uma seringa de sucção de 20 mL por
aproximadamente cinco minutos. O filtro foi incubado durante 16h em 10 mL de
água Milli-Q. A solução foi agitada, centrifugada e uma fração do sobrenadante
foi usada para determinar a concentração de nicotina através de seu coeficiente
de extinção.
1.2.3 Medidas de RPE
Os espectros de RPE foram medidos em um espectrômetro Varian modelo
E-109, operando em banda X (9,4 GHz) e equipado com uma cavidade
retangular. A variação de temperatura foi alcançada através do uso de um
sistema controlador de temperatura Varian E257-X. Os parâmetros de operação
do equipamento comuns a todas as amostras foram: frequência de modulação,
100 KHz; tempo de varredura, 3 minutos; constante de tempo, 128 ms;
varredura do campo magnético, 100 ou 150 G dependendo do mardador ;
23
potência de microondas, 15 mW e amplitude de modulação máxima do campo,
0,5 G. A temperatura foi monitorada com um termopar ferro-constantan,
conectado a um potenciômetro Fluke (2100A Digital Thermometer).os capilares
com as amostras foram colocadas em tubos de quartzo em banho de óleo
mineral comercial posicionados no centro da cavidade de ressonância. Este
procedimento foi necessário para garantir a estabilização da temperatura da
amostra dentro do capilar.
1.2.4 Simulações de Espectros de RPE
A quantificação da estrutura dinâmica dos modelos de membrana nas
várias situações encontradas no presente trabalho foi feita através de uma
abordagem de simulação espectral para a obtenção de parâmetros de ordem e
da taxas de difusão rotacional que caracterizem a dinâmica e a estrutura da
membrana na qual o marcador de spin encontra-se inserido. Isso é possível
através do pacote de programas NLSL desenvolvido Freed e colaboradores.
(20,18,19)
Esses programas baseiam-se na teoria estocástica de Liouville para cálculo
de espectros de EPR no regime de movimentos lentos, que para radicais
nitróxidos ocorre quando os tempos de correlação são da ordem de 10
-7
até 10
-9
s
(17)
A idéia principal para resolver o problema do cálculo de espectros de RPE
no regime de movimento lentos reside em se assumir que as flutuações na
orientação de uma molécula, definida por coordenadas Ω, podem ser tratadas
24
classicamente usando-se um operador Γ
Ω
(operador de Markov) que é
independente do tempo. A equação de difusão para a probabilidade P(Ω,t) de se
achar a orientação Ω em um tempo t é:
)t,(P
dt
)
t
,
(
dP
ΩΓ−=
Ω
Ω
.
(1.1.1).
Com essa hipótese, a equação de movimento do operador matriz densidade
ρ(Ω,t) podia ser dada por:
(21-24)
),()],(),,([
),(
tttHi
dt
td
ΩΓ−ΩΩ−=
Ω
Ω
ρρ
ρ
.
(1.1.2).
onde H(Ω,t) é o hamiltoniano de spin, que depende da orientação da molécula e
Γ
Ω
é o operador de relaxação representando a difusão rotacional molecular que,
no caso de membranas lipídicas, normalmente é definida em termos de um
tensor de difusão rotacional com simetria axial (R
prp
e R
pll
). A resolução da eq
1.1.2 no regime estacionário fornece os elementos da matriz densidade ρ(Ω,t)
para o problema em questão que, por sua vez, estão relacionados com o
espectro de RPE.
Muito mais útil em termos práticos do que o método em si para resolução
da eq 1.2.2 é o entendimento dos parâmetros usados durante os ajustes e seus
significados em termos da estrutura do modelo de membrana. Assim, uma
descrição semiqualitativa dos princípios básicos envolvidos nas simulações
espectrais certamente auxiliará na interpretação dos resultados obtidos.
Primeiramente, faz-se necessária a descrição dos diversos sistemas de referência
relevantes para as simulações em questão. Há quatro sistemas de coordenadas:
o sistema de difusão rotacional molecular
)z,y,x(
RRR
, o sistema do diretor local
)z,y,x(
ddd
, o sistema magnético
)z,y,x(
mmm
e o sistema de laboratório
)z,y,x(
LLL
.
25
Os sistemas de referência mais triviais de serem definidos e visualizados
são o sistema magnético
)z,y,x(
mmm
e o de laboratório, sendo este último,
como é usual, definido pela direção z do campo magnético estático. Em relação
ao sistema magnético são definidos os tensores
g
t
e
A
t
. Os eixos x
m
e z
m
são
definidos paralelos às direções da ligação N--O e do orbital 2p
z
do átomo de
nitrogênio, respectivamente; como mostrado na Figuras 1.2.1. O eixo y
m
é
definido de maneira a formar um sistema dextrogiro ortogonal com os outros
dois eixos.
O sistema do diretor local
)z,y,x(
ddd
é definido pela normal à superfície
da membrana em cada ponto da mesma (vetor diretor local). A normal é, então,
chamada de eixo z
d
, com (x
d
e y
d
arbitrariamente escolhidos). O diretor local é
usado para definir os ângulos ψ referentes ao efeito MOMD descrito abaixo.
Para a definição do sistema molecular
)z,y,x(
RRR
, notar-se que a
mobilidade rotacional de um marcador de spin é caracterizada por duas taxas de
difusão rotacional, R
prp
e R
pll
, que representam os valores principais de um tensor
de difusão com simetria axial. Na verdade, R
prp
e R
pll
representam uma
aproximação para os modos internos de rotação da cadeia e para o movimento
geral da mesma. O sistema de difusão molecular
)z,y,x(
RRR
é, portanto, aquele
no qual essas duas taxas são definidas. Mais especificamente, o eixo z
R
é tomado
como paralelo ao eixo principal de simetria do segmento da molécula onde
encontra-se ligado o radical nitróxido. Portanto, R
pll
e R
prp
são as taxas de difusão
rotacional em torno do eixo z
R
e de um eixo perpendicular a ele,
respectivamente. Em marcadores do tipo n-PCSL (n é a posição do radical NO ao
longo da cadeia lipídica, por exemplo 5, ou 16), z
R
é paralelo ao diretor local z
d
26
(i.e., à própria cadeia lipídica) e R
prp
representa o movimento oscilatório da
respectiva porção da cadeia lipídica.
Em relação ao sistema de difusão molecular são definidos, ainda, os
parâmetros de ordem do sistema. Estes parâmetros representam o potencial
orientador presente em membranas biológicas e que restringe a amplitude do
movimento rotacional das cadeias lipídicas. Isto é, quanto maior o potencial
orientador, menor será o intervalo de orientações disponível para o movimento
rotacional das cadeias. Mais precisamente, o potencial U(Ω), Ω representa os
ângulos de Euler dos eixos de difusão no sistema diretor, dá origem a uma
distribuição de moléculas ao longo de várias orientações em torno do eixo de
ordenamento local da membrana (diretor local). No caso de vesículas, existe,
ainda, uma distribuição desse diretor local representando cada um dos
segmentos da membrana na vesícula.
O parâmetro de ordem mais comumente usado S
0
é definido como:
∫
∫
−Ω
−Ω
=−θ==
)Tk/Uexp(d
D)Tk/Uexp(d
)1cos3(
2
1
DS
B
2
00B
22
000
,
(1.1.3).
onde k
B
é a constante de Boltzmannn, T é a temperatura absoluta. Esse
parâmetro indica o quanto o eixo molecular z
R
está alinhado com o vetor diretor
local z
d
. Um segundo parâmetro de ordem pode ser também definido
φθ=+=
−
2cossin
2
3
DDS
22
20
2
022
.
(1.1.4).
e indica o desvio da simetria cilíndrica do alinhamento molecular relativo à
superfície da membrana, ou seja, mede até que ponto há uma preferência de
alinhamento dos eixos moleculares x
R
vs. y
R
com relação ao diretor local. O
potencial U(Ω) é usualmente representado como uma expansão em harmônicos
esféricos generalizados,
(1.1.5)
27
( )
φθ+φθ−θ+
+
+θ−θ
+φθ+
−θ
=
φθ
−
4cossen
32
35
c2cossen1cos7
8
5
c
8
3cos30cos35
c2cossen
2
3
c
2
1cos3
c
Tk
),(U
4
44
22
42
24
40
2
22
2
20
B
,
onde Ω=(θ,φ) são os ângulos polar e azimutal do eixo de difusão z
R
em relação
ao sistema diretor local.
(18)
Os coeficientes
42402220
cec,c,c
são parâmetros
adimensionais representando a energia potencial de cada orientação.
Em espectros de vesículas lipídicas, o efeito de “Microscopic Order and
Macroscopic Disorder” (MOMD)
(17,18)
é levado em consideração durante as
simulações. Isto quer dizer que diferentes segmentos da membrana lipídica estão
aleatoriamente orientados em relação ao eixo z do laboratório (direção de
aplicação do campo magnético estático). O espectro no modelo MOMD pode ser
visto, então, como o espectro de uma amostra policristalina, sendo, portanto,
representado por uma superposição de espectros oriundos de todos os
fragmentos e que pode ser escrito como:
(17)
ψψψ
d )SS
c
MOMD
c
∫
±±
= sen(
.
(1.1.6).
onde
)(
ψ
±c
S
é o espectro de um fragmento da membrana cujo vetor diretor faz
um ângulo
ψ
com o eixo z do laboratório. Nas simulações aqui apresentadas, o
espectro teórico final foi sempre obtido pela média sobre cinqüenta diferentes
valores de ψ. Na Figura 1.2.1 fazemos um resumo esquematizado do que foi dito
acima em relação aos sistemas de eixos e estrutura geral das membranas. Na
primeira são apresentados os sistemas magnéticos
)z,y,x(
mmm
e moleculares
)z,y,x(
RRR
para o marcador de spin 16-PCSL. Daí conclui-se que é possível dizer
que 16-PCSL tem uma z-ordem (z
d
// z
R
). Portanto, os valores do parâmetro de
ordem S
0
dão uma medida de quanto os respectivos eixos z
R
(16-PCSL) alinham-
se com o diretor local z
d
.
28
Figura 1.2.1 Representação esquemática de alguns eixos dos sistemas de coordenadas usados nas
simulações dos espectros do marcador de spin 16-PCSL em membranas lipídicas. O eixo z
d
é o diretor
local da membrana, z
R
é o eixo de simetria da cadeia acila e, neste caso, é paralelo ao diretor local, R
pll
e
R
prp
são os valores principais do tensor de difusão, θ é o ângulo de inclinação da cadeia acila relativo ao
eixo z
R
e está relacionado com o parâmetro de ordem e x
m
, y
m
e z
m
são os eixos magnéticos do radical
nitróxido. Adaptado de BASSO, L. G. M.
(29))
Na Figura 1.2.2 visualiza-se a definição do ângulo de “tilt” ψ do vetor
diretor em relação à direção do campo magnético estático (eixo z
L
) e que leva ao
chamado efeito MOMD. O primeiro passo para a realização de uma simulação
utilizando o pacote de programas NLSL consiste na escolha de valores de partida
razoáveis para as grandezas R
prp,
R
pll
,
42402220
cec,c,c
e ∆
G
(alargamento
inomogêneo Gaussiano), onde o último é um parâmetro de largura de linha
adicional e que, essencialmente, representa a contribuição devido às interações
super-hiperfinas com prótons do solvente. Vale notar que nem todos coeficientes
da expansão do potencial U(Ω) são necessariamente usados. Em amostras de
fosfolipídios marcados com 16-PCSL a expansão do potencial de orientação U(Ω)
até c
20
é suficiente para se ter uma bom ajuste, já as marcadas com 5-PCSL a
29
expansão do potencial com os coeficientes
4020
cec
é suficiente. Ademais os
valores de entrada para os tensores
g
(
e
A
(
são usados de trabalhos
anteriores.
(28)
Figura 1.2.2 Representação esquemática de um domínio de membrana que apresenta ordenamento
molecular microscópico (ampliação de uma seção da bicamada à direita), mas que, globalmente, está
orientado aleatoriamente com relação ao eixo z
L
do laboratório. Nesta figura também é apresentada a
definição do ângulo de tilt
ψ
, que é o ângulo entre o diretor local de cada domínio e o eixo de aplicação do
campo magnético externo. (Figura adaptada das referências (25,26)
1.3 Resultados e Discussão
Neste capítulo, apresentamos os resultados obtidos a partir das medidas
de RPE de amostras contendo modelos de membranas constituídas de
fosfolipídios DPPC e POPC, na ausência e na presença da molécula de nicotina. O
objetivo foi investigarmos o efeito desta última sobre o comportamento
termotrópico dos modelos de membranas através do uso de sondas
paramagnéticas conhecidas como marcadores de spin (5-PCSL e 16-PCSL). Os
experimentos foram realizados em pH ácido (~6) e, em um dos casos, também
30
em pH básico (~10). Em pH 6, a nicotina encontra-se na sua forma
monoprotonada, enquanto que em pH 10, está na forma não-ionizada.
(29)
Junto com os espectros experimentais são apresentados espectros
calculados a partir de simulações espectrais com base no método desenvolvido
por Freed e colaboradores (Nonlinear Least-Squares Analysis - NLSL).
(18,19)
As
simulações são baseadas na solução da equação estocástica de Lioville,
assumindo-se o modelo de ordenamento microscópico, mas desordenado
macroscopicamente (Microscopic Order Macroscopic Disorder - MOMD).
(17)
Este
modelo é bastante apropriado para descrever fluidos anisotrópicos do tipo
fosfolipídios dispersos em excesso de água ou tampão. Os marcadores de spin
desempenham o papel de reportar mudanças estruturais no seu entorno.
1.3.1 Vesículas do Fosfolipídio DPPC com e sem nicotina
monitoradas por 5-PCSL e 16-PCSL
5-PCSL
Quando bicamadas lipídicas preparadas de fosfolipídios puros estão
sujeitas à variação térmica sob pressão atmosférica, frequentemente, sofrem
múltiplas transições de fase termotrópicas dependendo do intervalo de
temperatura em que se efetuam as medidas. Essas transições podem ser
detectadas por uma variedade de técnicas física. Dados oriundos de calorimetria
diferencial de varredura (DSC) mostram que o fosfolipídio DPPC exibe uma sub-
31
transição em torno de 19,0
o
C, pré-transição em 35,0
o
C e transição principal com
temperatura principal (T
m
) em 41,5
o
C
(30,31)
Nestas condições, quatro fases
lamelares são distinguíveis no intervalo de 0
o
C até 50
o
C: Lamelar cristalino (L
C
),
gel tilted (L
β´
), gel rippled (P
β´
) e líquido-cristalino (L
α
).
Com a finalidade de se verificar como a nicotina interage com vesículas
compostas pelo fosfolipídio DPPC em pH ácido (~6) e quais os efeitos sobre a
fluidez e transição de fase do fosfolipídio, foram realizadas medidas de RPE, na
ausência e na presença de nicotina, monitorada por moléculas marcadas na
posição 5 (5-PCSL) e 16 (16-PCSL) da cadeia acila do fosfolipídio. Os espectros
de RPE foram medidos em vesículas multilamelares, dispersas em excesso de
água mili-Q, de DPPC e DPPC/nicotina na razão molar 1000/1. A Figura 1.3.1
mostra alguns espectros experimentais para o marcador 5-PCSL em vesículas de
DPPC no intervalo de temperatura desde 6,9
o
C até 69,9
o
C, enquanto que a
Figura 1.3.2 exibe os espectros oriundos de vesículas de DPPC/nicotina com o
mesmo marcador de spin e no intervalo de temperatura entre 8,5
o
C e 64,2
o
C.
Uma análise qualitativa dos espectros experimentais no intervalo de
25,6
o
C até 43,0
o
C (Figura 1.3.1) para o sistema 5-PCSL/DPPC exibe mudanças
na forma da linha de campo central no intervalo entre 25,6
o
C e 27,0
o
C; 38,5
o
C e
mudanças na linha de campo baixo entre 38,5
o
C e 40,2
o
C. Analogamente, a
Figura 1.3.2 mostra uma alteração na linha de campo central entre 25,6
o
C e
26,9
o
C e na de campo baixo entre 39,7
o
C e 40,3
o
C para 5-PCSL/DPPC/Nicotina.
Isto sugere transição entre as fases lamelares L
C
e L
β´
/P
β
no intervalo térmico
(25,6
o
C e 27,0
o
C) bem como P
β´
e L
α
no intervalo 38,5
o
C e 40,2
o
C para a amostra
5-PCSL/DPPC. Para 5-PCSL/DPPC/nicotina não há deslocamento apreciável de
fases entre os intervalos análogos aos da amostra 5-PCSL/DPPC.
32
A fim de obtermos uma descrição quantitativa das mudanças observadas
nos espectros do marcador 5-PCSL incorporado a vesículas de DPPC e
DPPC/nicotina, procedemos com um processo de simulação espectral através do
programa NLSL.
(19)
O objetivo principal neste tipo de abordagem está na
caracterização da estrutura e dinâmica de um dado sistema mimético e suas
alterações frente a variações de parâmetros como a composição, temperatura e
ligação de moléculas. Para tanto, são utilizados os coeficientes de um potencial
restaurador (v. capítulo 1.2) e que resultam em um parâmetro de ordem (S
0
),
que fornece o grau de alinhamento da cadeia acila dos fosfolipídios em relação
ao vetor normal à bicamada lipídica, e uma taxa de difusão rotacional (R
prp
). Os
espectros calculados usando-se o referido programa estão também mostrados,
em linhas vermelhas, na Figura 1.3.1 para 5-PC/DPPC e na Figura 1.3.2 para 5-
PC/DPPC/nicotina. Os ajustes apresentaram, em geral, boa concordância com os
espectros experimentais para as várias temperaturas medidas. Nota-se que,
quanto mais baixa a temperatura, mais difícil o processo de simulação com
consequente piora na qualidade dos espectros calculados.
33
5-PCSL/DPPC pH 6
25,6
o
C
20,5
o
C
16,7
o
C
6,9
o
C
32,9
o
C
31,2
o
C
34,1
o
C
35,4
o
C
36,6
o
C
38,5
o
C
40,2
o
C
49,8
o
C
43,0
o
C
59,9
o
C
69,9
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.1 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos espectros simulados (linha vermelha)
medidos em vesículas de DPPC marcadas com 5-PCSL.
34
5-PCSL/DPPC/Nicotina
pH 6
25,6
o
C
20,5
o
C
15,5
o
C
8,5
o
C
32,1
o
C
30,5
o
C
36,6
o
C
34,7
o
C
28,1
o
C
38,0
o
C
40,3
o
C
39,7
o
C
26,9
o
C
38,7
o
C
54,6
o
C
64,2
o
C
46,1
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.2 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com uma componente (em
vermelho) medidos em vesículas de DPPC/nicotina marcadas com 5-PCSL.
35
O comportamento da membrana modelo em função da temperatura é,
portanto, refletido nos parâmetros estruturais calculados pelo programa NLSL. A
Figura 1.3.3 mostra a dependência do parâmetro de ordem S
0
em função da
temperatura e indica a existência de duas transições distinguíveis no intervalo de
temperatura medido tanto para a amostra 5-PCSL/DPPC como para 5-
PCSL/DPPC/Nicotina.
0 10 20 30 40 50 60 70
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
I
III
II
S
0
Temperatura (
o
C)
5-PCSL/DPPC
5-PCSL/DPPC/nicotina
Figura 1.3.3 Dependência do parâmetro de ordem S
0
com a temperatura obtido a partir dos ajustes
espectrais das amostras 5-PCSL/DPPC (quadrados) e 5-PCSL/DPPC/nicotina (círculos). As barras
verticais mostram possíveis transições de fases.
A taxa de difusão rotacional, que está relacionada com a dinâmica do
sistema através do parâmetro R
prp
, é mostrada na Figura 1.3.4. O parâmetro R
prp
sofre um decréscimo abrupto em torno de 30
o
C e uma segunda mudança
36
marcante é observada na vizinhança de 40
o
C, onde há um acréscimo também
abrupto.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
5
10
15
20
III
II
I
R
prp
(10
7
s
-1
)
Temperatura (
o
C)
5-PCSL/DPPC
5-PCSL/DPPC/Nicotina
Figura 1.3.4 Dependência de R
prp
com a temperatura obtida a partir dos ajustes espectrais das amostras:
5-PCSL/DPPC (quadrados) e 5-PCSL/DPPC/nicotina (círculos). As barras verticais mostram possíveis
transições de fases.
Para os dois parâmetros calculados no caso de vesículas de DPPC, pH
ácido, na ausência e presença de nicotina e monitoradas pelo marcador 5-PCSL,
localizado em uma região próxima à cabeça polar, não há mudanças
significativas no intervalo de temperatura medido. Em ambos os casos (S
0
e
R
prp
), duas mudanças abrutas dos parâmetros em questão são observadas (cerca
de 30 e de 40
o
C) atribuídas à pré-transição e à transição principal do sistema
modelo. Acreditamos que os espectros do marcador 5-PCSL, naturalmente largos
e de baixa resolução, não permitem distinguirmos com clareza fases como a de
subgel (Lc) e de gel (L
β’
). Sendo assim, nas Figuras 1.3.3 e 1.3.4 atribuímos a
região I à fase subgel (L
c
) e gel (L
β’
), a região II à fase gel rippled (P
β’
) e a região
III à fase líquido cristalino (L
α
)
37
Em relação aos efeitos da presença de nicotina em modelos de DPPC (pH
ácido) e sentido pelo marcador 5-PCSL (Figuras 1.3.3 e 1.3.4), temos que
poucas mudanças significativas são observadas, exceto por um leve acréscimo
de aproximadamente 1,5
o
C na temperatura da pré-transição quando da adição
da nicotina.
16-PCSL
De forma análoga ao procedimento executado para as amostras marcadas
com 5-PCSL, as amostras marcadas com 16-PCSL passaram pelo mesmo
tratamento tanto de execução de medidas como de ajuste espectral. As Figuras
1.3.5 e 1.3.6 exibem os espectros experimentais e seus respectivos ajustes para
a amostra 16-PCSL/DPPC medidos em temperaturas que vão de 6,8
o
C até 65,0
o
C e 16-PCSL/DPPC/nicotina (7,0
o
C até 63,5
o
C).
Neste caso, os espectros experimentais oriundos da região da fase gel
(entre as duas transições encontradas acima) apresentam claramente
características de espectro de duas componentes. De fato, os espectros relativos
à amostra 16-PCSL/DPPC medidos em 27,3
o
C e 29,4
o
C apresentam mudanças
marcantes em suas formas de linhas, sobretudo nas linhas de campo baixo e de
campo alto (setas na Figura 1.3.5). Estas mudanças podem ser interpretadas
como o aparecimento de uma segunda componente nos espectros medidos nesse
intervalo de temperatura. Ademais, uma análise cuidadosa nos espectros
medidos em 30,5
o
C e 33,5
o
C nos permite concluir que há também uma mudança
nos espectros, sobretudo na linha de campo alto. De modo semelhante ao que
38
foi constatado nos espectros da amostra 16-PCSL/DPPC, as amostra 16-
PCSL/DPPC/nicotina apresentam espectros com característica de duas
componentes a partir do espectro medido em 30,1
o
C até 41,2
o
C.
A existência de duas componentes em um espectro de RPE indica que o
marcador de spin sente, em média, dois ambientes estruturalmente distintos e
que é acessível dentro de uma escala de tempo lenta comparada com os tempos
característicos da técnica utilizada, neste caso algo na faixa de micro a
nanossegundo. O espectro resultante é, portanto, uma soma de duas
contribuições, com cada contribuição multiplicada pela respectiva população
relativa. O espectro do marcador 16-PCSL, localizado no final da cadeia acila, e
normalmente constituído de linhas muito estreitas apresenta resolução suficiente
para que mudanças dessa natureza sejam sentidas.
Além de alterações qualitativamente apresentadas acima, determinamos a
variação com a temperatura do parâmetro de ordem S
0
e da taxa de difusão
rotacional R
prp
obtidas a partir das simulações dos espectros de RPE. As Figuras
1.3.7 e 1.3.8 mostram estes resultados para as amostras 16-PCSL/DPPC e 16-
PCSL/DPPC/nicotina em pH ácido. Além do parâmetro de ordem e difusão,
apresentamos ainda na Figura 1.3.9 os dados referentes à variação com
temperatura das populações de cada componente espectral.
39
16-PCSL/DPPC pH 6
24,4
o
C
20,2
o
C
15,2
o
C
6,8
o
C
38,6
o
C
33,5
o
C
39,4
o
C
37,0
o
C
34,9
o
C
30,5
o
C
29,4
o
C
27,3
o
C
50,5
o
C
40,8
o
C
40,1
o
C
59,0
o
C
65,0
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.5 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com duas componentes
(em vermelho) medidos em vesículas de DPPC marcadas com 16-PCSL. As setas apontam para as mudanças na
forma de linha nos espectros medidos em 27,3
o
C e 29,4
o
C.
40
16-PCSL:DPPC/Nicotina
42,6
o
C
63,5
o
C
38,1
o
C
39,6
o
C
31,6
o
C
36,5
o
C
34,5
o
C
28,0
o
C
20,2
o
C
15,9
o
C
07,0
o
C
30,1
o
C
54,2
o
C
40,2
o
C
49,4
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.6 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com duas componentes
(em vermelho) medidos em vesículas de DPPC marcadas com 16-PCSL. As setas apontam para as mudanças na
forma de linha nos espectros medidos em 28,0
o
C e 30,1
o
C.
41
10 20 30 40 50 60 70
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
III
II
I
S
0
Temperatura (
o
C)
16-PCSL:DPPC componente 1
16-PCSL:DPPC componente 2
16-PCSL:DPPC/Nicotina componente 1
16-PCSL:DPPC/Nicotina componente 2
Figura 1.3.7 Dependência do parâmetro de ordem S
0
com a temperatura obtido a partir dos ajustes
espectrais das amostras 16-PCSL/DPPC (quadrados) e 16-PCSL/DPPC/nicotina (círculos). As barras
verticais mostram possíveis transições de fases.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
120
III
II
I
R
prp
(10
7
s
-1
)
Temperatura (
o
C)
16-PCSL:DPPC componente 1
16-PCSL:DPPC componente 2
16-PCSL:DPPC/Nicotina componente 1
16-PCSL:DPPC/Nicotina componente 2
Figura 1.3.8 Dependência da taxa de difusão rotacional R
prp
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 16-PCSL/DPPC (quadrados) e 16-PCSL/DPPC/nicotina (círculos). As barras
verticais mostram possíveis transições de fases.
42
10 20 30 40 50 60 70
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
III
II
I
Populações
Temperatura (
o
C)
16-PCSL:DPPC Componente 1
16-PCSL:DPPC Componente 2
16-PCSL:DPPC/Nicotina Componente 1
16-PCSL:DPPC/Nicotina Componente 2
Figura 1.3.9 Dependência da população de marcadores com a temperatura obtida a partir dos ajustes espectrais
das amostras 16-PCSL/DPPC (quadrados) e 16-PCSL/DPPC/nicotina (círculos). As barras verticais mostram
possíveis transições de fases.
Um resultado interessante que surge dos espectros do marcador 16-PCSL
das amostras estudadas diz respeito à existência de duas componentes
espectrais no intervalo de temperatura 30-40
o
C independentemente da presença
de nicotina. Nessas temperaturas, o sistema de membrana está na chamada fase
gel rippled (P
β’
) que seria estruturalmente heterogênea. Segundo os espectros
nas figuras acima, a fase lipídica no intervalo de 30-40
o
C é constituída por uma
mistura de regiões mais ordenadas e menos fluidas, que provavelmente se
assemelham à fase gel L
β’
(região I na Figura 1.3.7), com regiões apresentando
propriedades mais similares à fase L
α
(região III). Essa heterogeneidade da fase
P
β’
em membranas do fosfolipídio PC foi reportada anteriormente
(32-33)
e, mais
recentemente, investigada por Riske e colaboradores,
(34)
que discutem o papel
43
da pré-transição como início do processo de melting das cadeias observado na
transição principal de fosfolipídios.
Em relação às alterações decorrentes da adição de nicotina, pouco se
percebe do comportamento geral em função da temperatura dos parâmetros S
0
e
R
prp
(Figuras 1.3.7 e 1.3.8). No entanto, no intervalo de temperaturas em que há
coexistência de duas componentes, um tratamento mais detalhado pode ser feito
com base no modelo tradicional de van´t Hoff para processos químicos
envolvendo dois estados termodinâmicos. Este modelo baseia-se na seguinte
equação,
R
S
RT
H
Kln
∆
+
∆
−=
, onde K representa a constante de equilíbrio do
sistema; H, a entalpia e S, a entropia. R é a constante universal dos gases e T a
temperatura absoluta.
Assim, assumindo um processo em que moléculas de fosfolipídio podem
estar em uma fase mais ordenada do tipo gel (componente 1 dos espectros de
RPE) ou outra mais fluida (componente 2) e que estabelecem um equilíbrio
componente 1 ↔ componente 2, podemos calcular uma constante de equilíbrio K
a partir das populações de cada componente (Figura 1.3.9) como: K =
(componente 2)/(componente 1), onde os parêntese indicam concentração
(população). Com os valores de K determinados tanto na ausência quanto na
presença de nicotina, construímos gráficos de van´t Hoff que mostram a
dependência do ln K (logaritmo natural de K) com o inverso da temperatura
(Figura 1.3.10).
44
3.18 3.20 3.22 3.24 3.26 3.28 3.30
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
16PCSL/DPPC
Ajuste linear
16PCSL/DPPC/nicotina
Ajuste linear
ln K
1000/T (10
3
K
-1
)
Figura 1.3.10 Gráficos de van´t Hoff obtidos a partir das populações referentes às duas componentes
espectrais das amostras 16-PCSL/DPPC (preto) e 16-PCSL/DPPC/nicotina (vermelho) e mostradas na
Figura 1.3.9 (intervalo de temperatura entre 30-40
o
C).
Os gráficos de van’t Hoff para as amostras sem e com nicotina
apresentaram comportamento linear dentro do intervalo de temperatura onde
coexistem duas componentes nos espectros de RPE (Figura 1.3.10). Do
coeficiente angular desses gráficos, podemos calcular os valores da variação de
entalpia de transferência de um fosfolipídio da região associada à componente 2
(fluid-like) em relação à região da componente 1 (gel-like): ∆H = H
2
− H
1
.
Obtivemos, desta maneira, ∆H
sem
= +7,5 kcal/mol e ∆H
com
= +16,0 kcal/mol para
as amostras sem e com nicotina, respectivamente. Os valores de ∆H
determinados são positivos, indicando que o processo de transferência de uma
molécula de fosfolipídio da fase gel-like para fluida é entalpicamente
desfavorável. Além disso, o valor de ∆H na presença de nicotina é
aproximadamente o dobro daquele determinado na sua ausência.
45
Do coeficiente linear dos gráficos na Figura 1.3.10, podemos determinar o
valor da variação de entropia, na ausência e na presença de nicotina, para o
mesmo processo descrito acima. Encontramos ∆S
sem
= +23,2 cal/mol K e ∆S
com
=
+50,7 cal/mol K, onde ∆S = S
2
− S
1
. Em ambos os casos, a variação de entropia
é positiva, o que indica que o efeito de desordenamento das cadeias promovido
pelo aumento de temperatura deva ser o driving force do processo em questão.
Em relação à adição de nicotina, o valor de ∆S mais do que dobra na presença do
ligante, ou seja, a nicotina favorece, portanto, a desestruturação da parte
hidrofóbica do modelo de membrana, facilitando a transição da região gel-like
(componente 1 nos espectros de RPE) para a região mais fluida (componente 2).
1.3.2 Vesículas do fosfolipídio POPC com e sem nicotina
monitoradas com marcadores 5-PCSL e 16-PCSL em pHs ácido
(~6) e básico (~10)
Para investigarmos a dependência do efeito da nicotina em relação às
propriedades do modelo de membrana, realizamos medidas de RPE em um
sistema contendo o fosfolipídio POPC, caracterizado por cadeias hidrofóbicas
distintas (uma com 16 e outra com 18 carbonos) e com uma insaturação (ácido
oléico). Este fosfolipídio encontra-se na fase fluida para todo o intervalo de
temperatura em que foram realizados os experimentos de RPE. Apresentamos,
ainda, dados de RPE obtidos ao usarmos uma solução resultante da lavagem de
um filtro de cigarro comum, após sua queima, como descrito no capítulo 1.2. O
46
objetivo foi averiguarmos se os efeitos causados neste caso eram similares
àqueles observados para uma solução de nicotina.
Além disso, levando em conta o fato de que a nicotina possui grupos
químicos protonáveis e deve, portanto, ter cargas diferentes em diferentes
valores de pH, realizamos as medidas de RPE para dois valores de pH, sendo um
ácido (~6), em que a nicotina encontra-se monoprotonada, e outro básico (~10),
no qual a nicotina encontra-se na forma não-ionizada.
(29)
5-PCSL
As Figuras 1.3.11, 1.3.12 e 1.3.13 exibem alguns espectros experimentais
de RPE e seus respectivos ajustes calculados com o programa NLSL das amostras
5-PCSL/POPC medidos no intervalo de temperatura de 6,6
o
C até 59,2
o
C, 5-
PCSL/POPC/nicotina entre 5,6
o
C e 67,2
o
C e 5-PCSL/POPC/filtro entre 5,8
o
C e
65,0
o
C.
47
09,8
o
C
06,6
o
C
5-PCSL:POPC pH 6
16,0
o
C
21,7
o
C
25,1
o
C
29,8
o
C
34,7
o
C
45,8
o
C
51,0
o
C
55,0
o
C
3220 3240 3260 3280 3300 3320
59,2
o
C
Temperatura (
o
C)
Figura 1.3.11 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos espectros simulados (em vermelho)
através do programa NLSL medidos em vesículas de POPC (pH ~6) marcadas com 5-PCSL.
48
9,6
o
C
5,6
o
C
5-PCSL/POPC/nicotina pH 6
15,4
o
C
21,3
o
C
24,5
o
C
29,3
o
C
36,6
o
C
33,7
o
C
40,1
o
C
49,6
o
C
56,6
o
C
3220 3240 3260 3280 3300 3320
67,2
o
C
Temperatura (
o
C)
Figura 1.3.12 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com uma componente (em
vermelho) através do programa NLSL medidos em vesículas de POPC/nicotina (pH~6) marcadas com 5-PCSL.
49
9,8
o
C
5,8
o
C
5-PCSL/POPC/filtro pH 6
15,1
o
C
20,5
o
C
29,8
o
C
34,9
o
C
41,3
o
C
34,9
o
C
51,3
o
C
55,1
o
C
60,9
o
C
3220 3240 3260 3280 3300 3320
65,0
o
C
Temperatura (
o
C)
Figura 1.3.13 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com uma componente (em
vermelho) através do programa NLSL medidos em vesículas de POPC/filtro (pH~6) marcadas com 5-PCSL.
50
Os espectros foram simulados satisfatoriamente com uma única
componente em todo o intervalo de temperatura medido, o que é,
provavelmente, reflexo da existência de uma única fase fluida do fosfolipídio
POPC em todas as temperaturas acima de cerca de -2
o
C.
(35)
Calculados de cada
espectro através do programa de simulação, a Figura 1.3.14 exibe o parâmetro
de ordem S
0
em função da temperatura para as amostras 5-PCSL/POPC, 5-
PCSL/POPC/nicotina e 5-PCSL/POPC/filtro. Como esperado para o caso de POPC,
o parâmetro de ordem S
0
diminui monotonicamente em função da temperatura,
não se observando nenhuma mudança que possa ser atribuída a uma transição
de fase. Os valores de ordenamento obtidos nas temperaturas entre 5 e 30
o
C
são sempre menores quando comparados com aqueles determinados para o
mesmo marcador em vesículas de DPPC (Figura 1.3.3). Na presença de nicotina,
há uma redução no ordenamento das cadeias hidrofóbicas dos fosfolipídios já
perceptível mesmo com o marcador 5-PCSL, sugerindo que a nicotina interaja
mais facilmente com fases mais fluidas. Percebe-se, ainda, que o efeito causado
pela solução obtida a partir da lavagem de um filtro de cigarro comercial é
similar àquele observado com a solução de nicotina pura, mostrando que o filtro
continha realmente grande quantidade de nicotina.
51
0 10 20 30 40 50 60 70
0.3
0.4
0.5
0.6
S
0
Temperatura (
o
C)
5-PCSL/POPC pH 6
5-PCSL/POPC/nicotina pH 6
5-PCSL/POPC/filtro pH 6
Figura 1.3.14 Dependência do parâmetro de ordem S
0
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 5-PCSL/POPC (quadrados), 5-PCSL/POPC/nicotina (círculos), 5-
PCSL/POPC/filtro (losangos).
Analogamente, a Figura 1.3.15 expõe a taxa de difusão rotacional R
prp
para as amostras acima citadas. Novamente, o parâmetro em questão apresenta
comportamento que não indica mudanças associáveis com transição de fase dos
fosfolipídios, aumentando monotonicamente com o aumento da temperatura.
Aqui, o efeito de adição de nicotina foi o de promover uma pequena redução nos
valores de R
prp
em todo o intervalo de temperatura, o que sugere menor fluidez
da membrana na presença da nicotina. A solução oriunda da lavagem de filtro de
cigarro comercial induz o mesmo tipo de redução de fluidez na membrana.
Tomados conjuntamente com a diminuição de S
0
para temperaturas abaixo de
cerca de 30
o
C, nossos dados indicam que a nicotina, ao interagir com vesículas
de POCP em pH ácido, desordena o empacotamento das cadeias hidrofóbicas ,
52
que pode ser entendido como um aumento no valor médio do ângulo entre o eixo
longo da cadeia acila e o vetor diretor da bicamada, e diminui a taxa de difusão
do marcador em sua trajetória dentro do cone definido pelo mesmo ângulo citado
acima.
0 10 20 30 40 50 60 70
5
10
15
20
R
prp
(10
7
s
-1
)
Temperatura (
o
C)
5-PCSL/POPC pH 6
5-PCSL/POPC/nicotina pH 6
5-PCSL/POPC/filtro pH 6
Figura 1.3.15 Dependência da taxa de difusão rotacional R
prp
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 5-PCSL/POPC (quadrados), 5-PCSL/POPC/nicotina (círculos) e 5-
PCSL/POPC/filtro (losangos).
Do mesmo modo como descrito acima, expomos os espectros
experimentais e calculados das mesmas amostras tomados com base no 5-PCSL
marcador agora medido em pH básico (pH~10). Estes são mostrados nas Figuras
1.3.16 e 1.3.17. O parâmetro de ordem S
0
e a taxa de difusão rotacional R
prp
são
colocados nas Figuras 1.3.18 e 1.3.19, respectivamente.
53
5-PCSL/POPC pH 10
20,3
o
C
13,6
o
C
10,8
o
C
7,3
o
C
41,1
o
C
24,3
o
C
30,9
o
C
34,0
o
C
45,2
o
C
49,4
o
C
52,3
o
C
54,6
o
C
58,3
o
C
60,6
o
C
65,8
o
C
3180 3210 3240 3270 3300 3330 3360
68,1
o
C
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.16 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com uma componente
(em vermelho) através do programa NLSL medidos em vesículas de POPC (pH ~10) marcadas com 5-PCSL.
54
5-PCSL/POPC/nicotina
pH 10
19,4
o
C
15,8
o
C
9,8
o
C
7,6
o
C
41,2
o
C
25,5
o
C
31,7
o
C
36,2
o
C
45,4
o
C
53,7
o
C
51,8
o
C
49,7
o
C
56,0
o
C
58,1
o
C
60,3
o
C
62,5
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.17 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com uma componente
(em vermelho) através do programa NLSL medidos em vesículas de POPC/nicotina (pH~10) marcadas com 5-
PCSL.
55
0 10 20 30 40 50 60 70
0.3
0.4
0.5
0.6
S
0
Temperatura (
o
C)
5-PCSL/POPC pH 10
5-PCSL/POPC/nicotina pH 10
Figura 1.3.18 Dependência do parâmetro de ordem S
0
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 5-PCSL/POPC (quadrados) e 5-PCSL/POPC/nicotina (círculos) em pH~10.
0 10 20 30 40 50 60 70
5
10
15
20
R
prp
(10
7
s
-1
)
Temperatura (
o
C)
5-PCSL/POPC pH 10
5-PCSL/POPC/nicotina pH 10
Figura 1.3.19 Dependência da taxa de difusão rotacional R
prp
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 5-PCSL/POPC (quadrados) e 5-PCSL/POPC/nicotina (círculos) em pH~ 10.
56
As alterações promovidas pela adição de nicotina a vesículas de POPC em
pH básico e monitoradas na região próxima à cabeça polar pelo marcador 5-PCSL
são bastante similares àquelas observadas em pH ácido (Figuras 1.3.14 e
1.3.15): diminuição do parâmetro de ordem S
0
para temperaturas inferiores a
cerca de 30
o
C e pequena diminuição da taxa de difusão rotacional em todo o
intervalo de temperatura medido. Podemos concluir, então, que da perspectiva
do marcador 5-PCSL, a variação no pH da amostra, que leva a uma mudança na
carga líquida da nicotina que passa de monoprotonada (pH 6) para não ionizada
(pH 10), não afeta a estrutura dinâmica da vesícula após adição da nicotina.
Nada podemos afirmar a respeito da afinidade da nicotina pelas vesículas nos
dois valores de pH, pois não é possível determinarmos constante de ligação a
partir dos espectros de RPE obtidos para as amostras descritas. Se há um
aumento (ou diminuição) na constante de associação oriundo da variação do pH,
isto não é refletido na estrutura sentida pelo marcador na posição 5 da cadeia
hidrofóbica do fosfolipídio ao compararmos as amostras com nicotina em pH
ácido e básico.
16-PCSL
As figuras seguintes mostram os espectros experimentais e os respectivos
ajustes para as amostras 16-PCSL/POPC (Figura 1.3.20) e 16-
PCSL/POPC/nicotina (Figura 1.3.21) medidas em pH ácido (~6).
57
6,0
o
C
16-PCSL/POPC pH 6
20,4
o
C
14,8
o
C
9,8
o
C
29,8
o
C
25,3
o
C
35,0
o
C
40,4
o
C
45,0
o
C
49,7
o
C
55,1
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
60,0
o
C
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.20 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados (em vermelho) através do programa
NLSL medidos em vesículas de POPC em pH ~6 marcadas com 16-PCSL
58
6,2
o
C
16-PCSL/POPC/nicotina pH 6
20,0
o
C
15,0
o
C
9,8
o
C
30,5
o
C
25,3
o
C
34,8
o
C
40,2
o
C
44,9
o
C
50,2
o
C
54,9
o
C
3200 3220 3240 3260 3280 3300 3320
59,7
o
C
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.21 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados com uma componentes (em vermelho)
através do programa NLSL medidos em vesículas de POPC/nicotina (pH~6) marcadas com 16-PCSL.
59
Nas simulações dos espectros apresentados nas Figuras 1.3.20 e 1.3.21
apenas uma componente foi necessária em todo o intervalo de temperatura, o
que difere daquilo que havia sido observado no caso de vesículas de 16-
PCSL/DPPC e que ilustra mais uma vez o fato de termos vesículas compostas por
um fosfolipídio com comportamento termotrópico simplificado e que está, nas
temperaturas utilizadas, sempre na fase fluida. Das simulações espectrais,
obtivemos mais uma vez a dependência com a temperatura do parâmetro de
ordem S
0
(Figura 1.3.22) e da taxa de difusão rotacional R
prp
(Figura 1.3.23).
Nessas figuras, vemos que, como é característico para a região do final da cadeia
carbônica do fosfolipídio (centro da bicamada lipídica), os valores de S
0
são
substancialmente menores e os de R
prp
consideravelmente maiores do aqueles
obtidos próximo à cabeça polar (monitorada pelo marcador 5-PCSL - Figuras
1.3.18 e 1.3.19), mostrando que o centro da bicamada experimenta dinâmica
muito mais rápida e pouca estruturação dos fosfolipídios.
60
0 10 20 30 40 50 60
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
S
0
Temperatura (
o
C)
16-PSSL/POPC pH 6
16-PSSL/POPC/nicotina pH 6
Figura 1.3.22 Dependência do parâmetro de ordem S
0
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 16-PCSL/POPC (quadrados) e 16-PCSL/POPC/nicotina (círculos).
0 10 20 30 40 50 60
0
2
4
6
8
10
R
prp
(10
9
s
-1
)
Temperatura (
o
C)
16-PCSL/POPC pH 6
16-PCSL/POPC/nictotina pH 6
Figura 1.3.23 Dependência da taxa de difusão rotacional R
prp
com a temperatura obtida a partir dos
ajustes espectrais das amostras 16-PCSL/POPC (quadrados) e 16-PCSL/POPC/nicotina (círculos).
61
Ainda dos dados apresentados nas Figuras 1.3.22 e 1.3.23, vemos que a
adição de nicotina às vesículas de DPPC em pH ácido não induz mudanças
detectáveis nos espectros do marcador 16-PCSL, a menos de uma leve
diminuição da taxa de difusão rotacional para temperaturas acima de 30
o
C.
Provavelmente, a alta mobilidade e o baixo ordenamento sentido pelo marcador
16-PCSL na fase fluida do POPC é pouco influenciada pela presença de nicotina. É
interessante notar que, essa maior mobilidade do marcador 16-PCSL, que nos
ajudou a distinguir duas componentes espectrais no caso de vesículas de DPPC
em temperaturas correspondentes a uma fase do tipo gel, agora, no caso de
marcador em uma fase fluida, nos leve à pouca sensibilidade evidenciada nas
Figuras 1.3.22 e 1.3.23. Isto é, a maior resolução dos espectros do marcador 16-
PCSL é útil nos casos em que temos alguma organização do microambiente em
torno do marcador, como na fase gel de fosfolipídios, mas leva a uma
insensibilidade quando em situações de muito alta mobilidade e baixa ordem.
Tudo isto colocado conjuntamente nos leva a inferir que a nicotina tem efeito
desestabilizador sobre a fase fluida das vesículas de POPC restrito à região inicial
das cadeias hidrofóbicas dos fosfolipídios.
Assim como feito para o marcador 5-PCSL, conduzimos experimentos nas
amostras de 16-PCSL/POPC e 16-PCSL/POPC/nicotina em pH básico (~ 10). Os
espectros experimentais com os ajustes são mostrados nas Figuras 1.3.24 (16-
PCSL/POPC) e 1.3.25 (16-PCSL/POPC/nicotina). Já os parâmetros calculados a
partir das simulações são mostrados nas Figuras 1.3.26 (S
0
) e 1.3.27 (R
prp
).
Neste caso, um pequeno aumento no ordenamento das cadeias é observado até
cerca de 35
o
C. Acima desta temperatura, os valores de S
0
oscilam em torno de
zero, indicando que os ajustes perderam sensibilidade para os coeficientes do
potencial restaurador, o que é comum em situações de modelos de membrana
62
com ordenamento muito baixo. Mesmo para as temperaturas acima de 35
o
C, a
diferença obtida após adição de nicotina é de apenas cerca de 0,02 em S
0
.
Assim, em pH 10, os efeitos da nicotina em relação ao parâmetro de ordem das
cadeias na posição n=16 são, assim como em pH ácido, discretos. Em relação à
difusão do marcador 16-PCSL, o padrão observado em pH básico segue aquele
previamente determinado em pH ácido (Figura 1.3.23), com leve decréscimo da
mobilidade do marcador na presença de nicotina.
63
16-PCSL/POPC pH 10
25,1
o
C
21,5
o
C
16,0
o
C
8,3
o
C
31,8
o
C
40,9
o
C
46,4
o
C
48,5
o
C
54,2
o
C
59,2
o
C
66,1
o
C
3220 3240 3260 3280 3300 3320
68,6
o
C
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.24 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e seus respectivos simulados (em vermelho) através do
programa NLSL medidos em vesículas de POPC em pH ~10 marcadas com 16-PCSL.
64
16-PCSL/POPC/nicotina
pH 10
20,5
o
C
14,7
o
C
11,5
o
C
7,7
o
C
24,3
o
C
30,7
o
C
35,7
o
C
39,9
o
C
50,9
o
C
54,8
o
C
60,5
o
C
3220 3240 3260 3280 3300 3320
66,9
o
C
Campo Magnético (Gauss)
Figura 1.3.25 Espectros experimentais (linha preta) de RPE e suas respectivas simulações (em vermelho) através do
programa NLSL medidos em vesículas de POPC/nicotina em pH ~10 marcadas com 16-PCSL.
65
0 10 20 30 40 50 60 70
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Parâmetro de Ordem
Temperatura (
o
C)
16-PCSL/POPC pH 10
16-PCSL/POPC/nicotina pH 10
Figura 1.3.26 Dependência do parâmetro de ordem S
0
com a temperatura obtida a partir dos ajustes
espectrais das amostras 16-PCSL/POPC (quadrados) e 16-PCSL/POPC/nicotina (círculos), pH ~10.
0 10 20 30 40 50 60 70
1
2
3
4
5
6
7
8
R
prp
(10
8
s
-1
)
Temperatura (
o
C)
16-PC/POPC pH 10
16-PC/POPC/nicotina pH 10
Figura 1.3.27 Dependência da taxa de difusão rotacional R
prp
com a temperatura obtida a partir dos
ajustes espectrais das amostras 16-PCSL/POPC (quadrados) e 16-PCSL/POPC/nicotina (círculos),
pH~10.
66
1.3.3 Discussão geral dos resultados
O presente estudo mostra o efeito da interação da nicotina com dois dos
principais fosfolipídios que compõem os chamados surfatantes pulmonares (DPPC
e POPC) com base na variação de temperatura e pH.
A nicotina é uma molécula que apresenta dois grupos protonáveis: os dois
nitrogênios presentes em sua estrutura, cujos valores dos pK
a
’s são 3,04
e7,84
(29)
, ou seja, a molécula pode existir em três estados de ionização
dependendo do pH da solução. A dissociação dessa molécula é descrita,
portanto, como:
NHNHNHNHNHNH
98,704,3
↔↔
+++
.
Como exemplo, em pH 6,0 a nicotina está predominantemente na forma
monoprotonada NHNH
+
, ao passo que em pH 10,0, sua forma predominante é
não ionizada. As possíveis interações que podem ocorrer entre a nicotina e
vesículas de fosfolipídios dependem do pH da solução e dos estados de
protonação da molécula. Interação eletrostática, adsorção da molécula na região
da cabeça polar ou penetração da mesma na matriz lipídica são exemplos dos
tipos de interações que podem ocorrer.
Os dois fosfolipídios utilizados neste trabalho, DPPC e POPC, são
zwiteriônicos, ou seja, com carga total líquida nula. Assim, se tais fosfolipídios
são dispersos em uma solução levemente ácida (pH~6) na presença de nicotina
na forma monoprotonada, é esperado que haja uma maior interação desta
molécula com a região das cabeças polares (adsorção) destes fosfolipídios. Já em
pH básico (~10) e com a nicotina na forma não protonada, interações
67
eletrostáticas deixam de ter contribuição principal e esta molécula pode
apresentar uma maior capacidade de penetração nas membranas.
Com base no exposto acima, buscamos entender o efeito da presença da
nicotina sobre a estrutura dinâmica de sistemas modelo de membranas
constituídos pelos fosfolipídios DPPC e POPC. Este estudo concentrou-se na
investigação das mudanças no ordenamento e dinâmica das cadeias acila em
regiões próximas à cabeça polar dos lipídios (5-PCSL) e no centro da bicamada
(16-PCSL). Nossos resultados basearam-se no comportamento termotrópico do
parâmetro de ordem S
0
e da taxa de difusão rotacional R
prp
obtidos através do
uso intensivo de simulações espectrais.
Para o marcador 5-PCSL em vesículas de DPPC (pH ácido), verificamos
pouca ou nenhuma alteração significativa dos parâmetros oriundos das
simulações após adição de nicotina (Figuras 1.3.3 e 1.3.4). Por outro lado, no
caso de vesículas constituídas pelo fosfolipídio POPC, com comportamento
termotrópico simplificado (sempre em uma fase fluida dentro do intervalo de
temperaturas deste trabalho), observamos, em ambos os pHs investigados, que
a região próxima às cabeças polares mostrou um decréscimo em termos tanto de
ordenamento (Figuras 1.3.14 e 1.3.18) quanto de mobilidade (Figuras 1.3.15 e
1.3.19) para temperaturas inferiores a cerca de 30
o
C. O valor extremamente
elevado do marcador 5-PCSL em DPPC nessa faixa de temperaturas (algo em
torno de 0,9) provavelmente é o responsável pela incapacidade em detectarmos
mudanças. A fase fluida das vesículas de POPC deve facilitar a interação da
nicotina com este modelo de membrana. Cabe salientar que nossos dados de
RPE não nos permitem inferir magnitudes da referida interação e, portanto, não
podemos correlacionar, em princípio, magnitude dos efeitos observados com
maior ou menor afinidade da nicotina por um dado modelo de membrana.
68
Os resultados para o marcador 16-PCSL mostraram mudanças bastante
interessantes no caso das vesículas de DPPC na região que chamamos de fase
gel (entre cerca de 30 e 40
o
C). Neste intervalo de temperaturas, espectros de
RPE contendo duas componentes foram observados tanto na ausência quanto na
presença de nicotina (Figuras 1.3.5 e 1.3.6). Aqui, as simulações espectrais
deram contribuição única pois tornaram possível a determinação direta das
populações associadas com cada componente no espectro e, a partir delas,
fomos capazes de calcular parâmetros termodinâmicos como a variação de
entalpia (∆H) e de entropia (∆S) através de um gráfico de van’t Hoff (Figura
1.3.10) para os casos de vesículas sem e com nicotina adicionada. Os valores de
∆H e de ∆S obtidos foram ambos positivos, mostrando que a troca entre os dois
microambientes experimentados pelo marcador 16-PCSL, indo do ambiente mais
ordenado (gel-like) para aquele mais fluido, é um processo governado por
entropia. Além disso, vimos que a presença de nicotina, apesar de não causar
efeitos diretamente perceptíveis nos espectros de RPE, leva a aumento de ∆H e
de ∆S, facilitando o processo de transição para a região fluid-like.
Estudos anteriores mostram que o efeito de redução da tensão superficial
desempenhada pelo complexo surfatante é atribuída, principalmente, à presença
do fosfolipídio DPPC.
(40)
Isto significa que qualquer alteração na estrutura lipídica
deste fosfolipídio pode afetar indiretamente a função principal do surfatante
levando a uma disfunção do sistema surfatante provocando o aparecimento de
doenças respiratórias.
(38)
O mesmo tipo de comportamento não foi observado quando o marcador de
spin 16-PCSL foi incorporado a vesículas de POPC. A existência de uma fase
fluida em todo o intervalo de temperatura leva a uma insensibilidade dos
espectros desse marcador a mudanças que possam acontecer na estrutura da
69
bicamada. Assim, não observamos alterações significativas neste caso em
nenhum dos pHs (Figuras 1.3.22, 1.3.23, 1.3.26 e 1.3.27). Acreditamos que este
é um caso em que interações devam acontecer, mas simplesmente não
conseguimos detectá-las.
Nossos resultados apontam para uma desestabilização da estrutura do
modelo de membrana, principalmente na região próxima às cabeças polares,
após a adição de nicotina em estado monoprotonado, ou seja, pH ácido. Vale
lembrar que as mudanças observadas nos espectros do marcador 16-PCSL em
vesículas de DPPC não necessariamente mostram que a nicotina penetra na
membrana até o final das cadeias carbônicas. Muitas vezes, esse tipo de
mudanças espectral é vista apenas no espectro do marcador 16-PSCL, pois este
apresenta maior resolução (linhas estreitas) e que facilitam a visualização de
alterações no espectro.
Doenças respiratórias, como enfisema, são caracterizadas pela perda da
elasticidade normal do pulmão, elasticidade que ajuda a manter as vias aéreas
abertas (http://www.healthscout.com/ency/68/149/main.html). Estudos
anteriores mostraram que a ruptura da parede alveolar pode acontecer por causa
de uma diminuição da tensão superficial do surfatante alveolar.
(39)
A nicotina
parece ter um efeito desestabilizador (diminuição de estruturação, dano
estrutural) dos modelos por nós estudados, o que poderia ser estendido para se
entender o efeito sobre o surfatante pulmonar e uma possível relação com
doenças respiratórias.
Existem poucos estudos que tratam da interação da nicotina com
membranas modelo. Nos trabalhos encontrados, a nicotina exibe uma rápida
penetração através da epiderme
(41)
em membranas de mucosas
(29)
naturais,
principalmente em pH básico. O comportamento do parâmetro S
0
(Figura 1.3.26)
70
e R
prp
apontam nesta direção. Estudos realizados em cultura de células tipo II de
ratos, tratadas com fumaça de cigarro, mostram inibição da secreção estimulada
de fosfatidilcolina.
(10)
O comportamento dos parâmetros calculadas do ajuste
espectral de POPC tratado com lavagem de filtro de cigarro apresenta o mesmo
comportamento que aqueles tratados com nicotina, a inibição da secreção de
fosfatidilcolina pode estar relacionada com a interação direta da nicotina com
este fosfolipídio nas células do alvéolo pulmonar.
O estudo aqui apresentado não é, obviamente, suficiente para
caracterizarmos completamente o sistema fosfolipídio-nicotina, mas aponta no
sentido em que a nicotina interage com a região da cabeça polar em solução
ácida e tem ação penetrante em meio básico tendo como consequênica uma
desestruturação da matriz lipídica. Isto pode estar relacionado com muitas
doenças respiratórias em fumantes. Experimentos complementares serão
necessários a fim de termos um conjunto de dados suficiente para uma melhor
caracterização do sistema em pHs complementares. O fosfolipídio POPG é
também um componente importante na composição de surfatantes naturais e
desempenha um papel importante na adsorção da proteína surfatante SP-B na
matriz surfatante,
(4)
que por sua vez tem atividade funcional relacionada ao
ordenamento da bicamada lipídica. Ademais, como não existem trabalhos em
sistemas modelo que relacionam a interação da nicotina com o complexo lipídeo,
também estamos encaminhando experimentos no sentido de verificarmos e
caracterizarmos as relações interagentes da nicotina e lavagem de filtro de
cigarro com sistemas modelos do complexo DPPC/POPC/POPG nas proporções
naturais encontradas, em pHs ácido (~6) básico (~10) com variação de
temperatura.
71
72
2 Nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro como
marcadores celulares
2.1 Fundamentos Teóricos
N
o presente capítulo, apresentamos os fundamentos teóricos para
compreender o uso de suspensões coloidais à base de nanopartículas
superparamagnéticas de óxido de ferro (NSOF),
(42)
conhecida como ferrofluido,
para marcação de células-tronco. O estudo está direcionado à análise
quantitativa mediante a técnica de Ressonância Ferromagnética (RFM) da
concentração de NSOF após marcação das células tronco CD133
+
(Figura 2.1.1).
Figura 2.1.1 Esquema representativo da marcação de moléculas situadas na superfície de célula tronco
CD133
+
pelo anticorpo monoclononal anti-CD133 acoplado às nanopartículas superparamagnéticas de
óxido de ferro (NSOF).
73
2.1.1 Introdução
As chamadas nanopartículas ocupam a região de transição entre as
moléculas e estruturas macroscópicas. Estes materiais têm sido recentemente
empregados em muitas áreas do conhecimento tais como ciências dos materiais,
física, química e biologia.
(43)
Nanopartículas magnéticas são partículas notáveis
por apresentarem o fenômeno de superparamagnetismo,
(44)
fenômeno que surge
como conseqüência do tamanho finito e efeito de superfície que dominam o
comportamento magnético das mesmas.
(45)
Partículas de materiais
ferromagnéticos com dimensões críticas menores que 100 nm apresentam
monodomínios magnéticos.
(46)
Isto confere a estas partículas comportamentos
idênticos aos átomos paramagnéticos, porém com momentos magnéticos
extremamente grandes.
(44)
Por causa de seu comportamento superparamagnético à temperatura
ambiente, e condições particulares de estabilidade em água a pH neutro e
salinidade fisiológica (ferrofluido biocompativel), as nanopartículas têm sido
usadas como ferramentas tanto em diagnóstico quanto em terapias médicas.
(47)
Em aplicações in vivo, as partículas magnéticas devem ser protegidas por
matérias biocompatíveis a fim de prevenir formação de agregados,
biodegradação e mudanças na estrutura original aos sistemas biológicos
(48)
Partículas de óxidos de ferro tais como magnetita (Fe
3
O
4
) ou sua forma oxidada
maghemita (γ-Fe
2
O
3
) são as mais empregadas. Fatores como biocompatibilidade
74
e toxicidade fazem destes compostos importantes agentes em aplicações
biomédicas.
In vitro, as restrições são menos rigorosas, principalmente quanto ao
tamanho. No entanto, o maior desafio no uso de tais materiais está no método
de preparação, principalmente no que diz respeito ao tamanho e
consequentemente às propriedades magnéticas.
(49)
Tais características são
importantes, pois irão quantificar e qualificar o uso das partículas segundo sua
estrutura tanto na indústria como na medicina.
Testes de toxicidade e alterações morfológicas, alterações citométricas,
análise citogenética, cinética de eliminação e biodistribuição da suspensão
coloidal no organismo têm sido estudados mediante técnicas espectroscópicas
como a de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Ressonância Paramagnética
Eletrônica (RPE), Fluorescência de Raios X, Microscopia de Luz,
(50)
dentre outras.
Os chamados fármacos magnéticos constituem uma classe de fármacos
usada no diagnóstico clínico através da técnica de imagem por ressonância
magnética (IRM). Partícula nanomagnética é uma classe dos chamados agentes
de contraste usada em Ressonância Magnética Nuclear (RMN). O uso de tais
partículas tem como finalidade:
(51)
(1) realçar o contraste da imagem entre o
tecido doente e o tecido sadio e (2) indicar o estado da função orgânica ou da
corrente sanguínea. Muitos materiais têm surgido com potencial para agente
contrastante por IRM, podendo apresentar tanto características paramagnéticas
quanto superparamagnéticas.
(52)
Em se tratando de aplicabilidade, o uso de partículas nanoestruturadas
apresenta-se como uma área em expansão.
(53)
Em ciências biomédicas, tais
partículas estão sendo utilizadas na marcação e isolamento de células com a
finalidade de identificar e remover células tumorais, de separar seletivamente as
75
chamadas células tronco,
(54)
além de atuar na seleção de células apoptóticas
geneticamente transformadas ou de organelas celulares. O uso de nanopartículas
em vez de micropartículas magnéticas permite que se tenha um sistema de
suspensão estável em relação à sedimentação na ausência de um campo
magnético
(55)
As células-tronco são extremamente raras nos tecidos em que ocorrem. A
sua freqüência varia de 0,01% a 0,0001%.
(56)
A identidade de células tão raras
no meio de outras mais abundantes somente pode ser determinada com a
utilização de recursos técnicos apropriados. A identificação das células-tronco é
possível utilizando-se marcadores de superfície que, em conjunto, refletem as
características biológicas e funcionais das células de forma geral e permitem, por
outro lado, a individualização de um determinado tipo celular.
(42)
Entre os diversos tipos de identificação e quantificação de células-tronco,
tem-se usado nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (NSOF).
(57)
Estas são acopladas a um anticorpo específico para assim evidenciar a expressão
dos marcadores antígenos das células-tronco em estudo de identificação através
da imagem molecular
(58-61)
e por quantificação por Ressonância
Ferromagnética.
(56,57)
A Ressonância Ferromagnética (RFM) de nanopartículas é um experimento
análogo ao de RPE exceto pelo fato que os spins eletrônicos interagem na rede
ferromagnética (ou ferrimagnética) constituída de nanopartículas de
monodominios magnéticos. Assim, o momento magnético total de cada
nanopartícula precessiona em torno da direção do campo estático total, o qual é
a soma do campo estático externo e as contribuições internas, tais como o
campo anisotrópico da nanopartícula.
(62)
Esta técnica é bastante adequada para o
estudo e a detecção de nanopartículas ferromagnéticas
(63,64)
As partículas, grãos
76
de material magnético nano-estruturados representados por estruturas
cristalinas de óxido de ferro descritas pela fórmula geral Fe
3+
2
O
3
M
2+
O, onde M
2+
é
um íon de um metal divalente tal como o ferro, manganês, níquel, cobalto ou
magnésio, são dispersas em um fluido (fluído magnético). Para a síntese dos
agentes de contraste, pequenos cristais de magnetita Fe
3+
2
O
3
Fe
2+
O são
predominantemente usados.
(65)
2.1.2 Ferrofluidos
Ferrofluido é uma suspensão coloidal de pequenas partículas magnéticas
dispersas em um líquido suporte.
(66)
Uma das principais características de um
ferrofluido é sua estabilidade. Um ferrofluido tem que ser estável frente a forças
gravitacionais, gradientes de campo magnético e aglomeração de partículas
causada por interação dipolar ou interação tipo van der Waals. As condições
necessárias para sua estabilidade determinam o intervalo de tamanho das
partículas constituintes. Elas devem ser suficientemente pequenas para que a
agitação térmica e o movimento browniano possam se contrapor à aglomeração
promovida por gradientes de campo.
(67)
A ordem de magnitude aceitável para
tamanhos das partículas pode ser obtida através da energia térmica (k
B
T),
gravitacional (∆ρVgl) e magnética (µ
0
M
p
HV), onde k
B
é a constante de Boltzman,
T é a temperatura absoluta em Kelvins, ∆ρ é a diferença em densidade entre a
partícula e o líquido que a contém, V é o volume das partículas, g é a aceleração
da gravidade, l é a altura do líquido no campo gravitacional, µ
0
é a
permeabilidade do vácuo, M
p
é a magnetização da partícula e H é o campo
77
magnético. Assumindo uma partícula típica de magnetita Fe
3
O
4
de diâmetro d em
um recipiente com altura de 0,05 m suspensa em um fluido com densidade
relativa ∆ρ = 4300 kg/m
3
a uma temperatura de 300K, calcula-se que o seu
diâmetro é tal que,
(66)
1
Vgl
Tk
B
≥
ρ∆
(2.1.1)
ou seja, d ≤ 15nm. Já o trabalho para mover uma partícula (p.ex. magnetita)
com uma magnetização M
p
em um fluido de uma região onde o campo magnético
tem um valor H para outra onde o campo nulo é tal que:
1
HVM
Tk
p0
B
≥
µ
(2.1.2)
Para uma magnetização de 4,46x10
5
A/m (5600 Gauss) e um campo máximo de
8x10
4
A/m (~0,1 Tesla), temos que d ≤ 8nm. Isto mostra que a estabilidade em
gradiente de campo parece ser o maior fator limitante para os tamanhos das
partículas, pois exige que os mesmos sejam menores que 10 nm.
(67)
Estes critérios para a estabilidade assumem que as partículas permaneçam
pequenas para que não se aglomerem. Em tais condições, as partículas são como
pequenos dipolos e as interações dipolares tendem a aglomerá-las. Assim, a
distâncias muito curtas as forças de van der Waals entre as partículas são
atrativas. A energia térmica necessária para opor-se à aglomeração de origem
dipolar tem a mesma ordem de magnitude daquelas que se opõem à
sedimentação.
(68)
Porém, a aglomeração de origem van der Waals é irreversível,
pois a energia necessária para separar duas partículas uma vez aglomeradas é
muito grande. Isolar as partículas com uma camada de polímero surfatante
(interação estérica) ou carregando-as eletricamente (repulsão Coulombiana) são
78
as soluções encontradas para prevenir que as partículas fiquem muito próximas
uma das outras.
(68,69)
Os ferrofluidos do tipo surfactados são compostos por cadeias de polímeros
(sais de ácidos graxos) com uma das terminação polar tipo carboxila, hidroxila ou
amina, que pode adsorvê-lo na superfície da partícula magnética, e a outra com
afinidade pelo líquido suporte.
(70)
Em ferrofluidos surfactados à base de ferritas
magnéticas, o ácido dodecanóico é o agente estabilizante usado com o grupo
carboxila ligado fortemente a superfícies da nanopartícula e a cadeia alifática
(octano) voltada para o solvente. Em surfactados em meio aquoso, a
extremidade da molécula do surfatante voltada para o solvente deve apresentar
um grupo polar (carboxila, amino, hidroxila) participando de um equilíbrio tipo
ácido-base, ionizando-se positiva ou negativamente numa faixa ampla de
valores de pH. Quando isto ocorre, a estabilidade do ferrofluido será determinada
simultaneamente por repulsão estérica e eletrostática. Quando o grupo polar
ioniza em pH próximo ao pH neutro e salinidade em torno de 0,9% (condições
fisiológicas), o ferrofluido pode ser considerado biocompatível e, portanto,
adequado para uma grande variedade de aplicações biomédicas. Nos ferrofluidos
iônicos as partículas são carregadas. Deste modo, íons que possuem uma grande
densidade de carga positiva ou negativa mantêm-se afastados uns dos outros por
repulsão eletrostática em meio aquoso.
(71)
Algumas aplicações para os ferrofluidos surgem de seu caráter líquido e
magnético. Estas características têm a vantagem do material ser deformável e
assim adotar uma forma desejada, pode ser mantido em um lugar ou movê-lo
por meio de gradientes de campo.
(66)
Sendo composto de pequenas partículas
em uma variedade de solventes, o material pode ser incorporado em vários tipos
de substâncias ou material. Algumas dessas aplicações já foram industrializadas,
79
tais como lubrificação com transferência de calor, impressão, acelerômetro,
absorvedores de choques mecânico, etc
(66)
Atualmente há um grande espectro de
aplicações de ferrofluidos no campo da medicina e ciências biomédicas.
(72,73)
Uma
das aplicações mais comuns tem sido seu emprego como agente de contraste em
imagem médica por meio de RMN. Neste caso, não só há uma melhora no sinal
como também no contraste entre os tecidos.
(74-76)
O transporte de moléculas
ativas vem sendo também explorado através da marcação de células com
partículas magnéticas, o que torna possível localizá-las e quantificá-las.
(50)
A possibilidade de marcar células com agentes específicos que carregam
uma partícula magnética fixando-a em um alvo é uma estratégia que pode ser
explorada tanto no tratamento de tumores com conseqüente “queima” por meio
de aquecimento local usando um campo magnético externo, mas também com o
objetivo de reconhecimento. Nesta metodologia é preciso recobrir o material com
agentes específicos. Nos últimos anos os anticorpos monoclonais têm sido
bastante investigados e são os melhores candidatos para o recobrimento do
material magnético. Obviamente, várias questões estão envolvidas neste
procedimento como eficiência do processo de cobertura da nanopartícula
magnética, estabilidade da ligação anticorpo-superfície da nanopartícula pré-
recoberta até o nível de comprometimento da estereoquímica do sítio ativo.
Neste sentido, o uso de diversas técnicas de caracterização de nanoestruturas
magnética recoberta com biomoléculas se faz necessário para o sucesso da
metodologia.
80
2.1.3 Células tronco CD133
+
Células-tronco são células capazes de multiplicar-se e diferenciar-se nos mais
variados tecidos do corpo humano (sangue, ossos, nervos, músculos, etc.). Sua
utilização para fins terapêuticos pode representar talvez a única esperança para
o tratamento de inúmeras doenças.
As células-tronco existem em vários tecidos humanos, no cordão umbilical e em
células embrionárias na fase de blastócito. Entre estas células-tronco temos as
CD133
+
.
A marcação de sistemas biológicos, sobretudo das chamadas células-
tronco, com moléculas específicas vem se desenvolvendo com bastante sucesso
nos últimos tempos. Isto se deve ao desenvolvimento do primeiro antígeno
CD133 para ligação do anticorpo monoclonal AC133.
O antígeno CD133 é uma glicoproteína integral de membrana de 97 KDa,
que pertence a uma família molecular de proteínas 5TM com cinco domínios
transmembrana.
(78)
Esta estrutura glicoprotéica (5-TM) caracteriza-se pela
presença de um N-terminal extracelular, dois loops curtos intracelulares, dois
loops largos extracelulares e um C-terminal extracelular (Figura 2.1.2)
(79,80)
Esta
glicoproteína (5-TM) foi descrita como homologa a prominin (5-TM) de murinos
(PROML 1) e filogeneticamente conservada em Drosophila, Caenorhabditis
elegans e mamíferos,
(79,81)
estando especialmente associada com
prolongamentos de membrana plasmática e com desenvolvimento epitelial em
mamíferos.
(81,82)
81
CD133 pode ser um antígeno expresso em uma variedade de tecidos
incluindo rim, pâncreas, placenta e fígado fetal,
(87)
músculo esquelético e tecido
neural humano,
(83)
sugerindo importantes aplicações clínicas, com destaque para
a utilização das células-tronco progenitoras (AC133
+
) na engenharia tecidual,
onde se revelariam alguns aspectos fundamentais concernentes à capacidade de
auto-renovação das células-tronco somáticas entre outras aplicações.
(84)
Figura 2.1.2 Diagrama da topologia predita da cadeia polipeptídica de CD133 bem como o anticorpo
monoclonal AC133 ligado ao epitopo glicosilado na região extra celular. Os cilindros no diagrama
representam regiões transmembranos
(80)
As células CD133
+
estão presentes na medula óssea, no sangue de cordão
umbilical e no sangue periférico humano, sendo que frações AC133
+
da medula
óssea mostraram-se eficientes modelos de xenotransplantes, possuindo
precursores de granulócitos/macrófagos e de células dentríticas (CD34
+
)
(85)
Células-tronco CD133
+
, além de possuirem plasticidade hematopoética,
(86)
podem ser utilizadas em aplicações clínicas, sendo uma alternativa na utilização
de células CD34
+
, mais comumente utilizadas nos protocolos de transplantes.
(87)
O isolamento, cultivo e expansão in vitro dessas células (AC133
+
) ocorrem de
maneira similar às células CD34
+
,
(88)
além de grande parte delas co-expressarem
82
o antígeno CD34, que é encontrado principalmente em células hematopoéticas e
no endotélio vascular.
(89)
Em humanos, o anticorpo monoclonal AC133 pode se ligar em diferentes
epitopos, mas originalmente foi demonstrado que reage com antígeno de
superfície celular expresso em células-tronco humanas e em vários progenitores
celulares, incluindo aqueles derivados do sistema hematopoético.
(85,88)
A
expressão deste marcador também ocorre em outras células primitivas, tais
como hemangioblatos e retinoblastoma.
(90,85)
A expressão de células AC133
positivas (AC133
+
) ocorre durante toda a
ontogênese hematopoética humana, embora a proporção de sub-populações
celulares seja diferente em todo o desenvolvimento humano.
(91)
POWER et al.
(92)
relacionou doenças de artérias coronárias com a redução
de frações de três diferentes subtipos de células CD133
+
circulantes:
CD133
+
CD34
+
, CD133
+
CXCR4
+
e CD133
+
VEGFR2
+
. Esses dados indicam que o
significado funcional de frações celulares AC133
positivas (AC133
+
) transcendem
o tecido hematopoético previamente sugerido.
(83,85)
A expressão do antígeno CD133 também ocorre em progenitores neurais
(93,94)
bem como, em cânceres originados desses sistemas
(95)
tais como, tumores
neuroectodermais. Destaca-se ainda que efetuou o isolamento de células-tronco
neurais AC133
+
, bem como a reconstituição cerebral de camundongos neonatos
imunodeficientes (modelo de lesão neuronal).
(93)
83
2.1.4 Ressonância Ferromagnética
Uma experiência de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) de
partículas ferromagnéticas é denominada na literatura como Ressonância
Ferromagnética (RFM) ou, mais precisamente, Ressonância Superparamagnética
(RSP). Em amostras ferromagnéticas com estruturas de monodomínio, as
partículas carregam momento magnético gigante e, sob efeito da agitação
térmica, o sistema pode ser descrito como superparamagnético. Sistemas
ferromagnéticos que estão no regime superparamagnético podem ser
caracterizados como um sistema paramagnético com super spin eletrônico
efetivo S=1/2, ou seja, um sistema de dois níveis.
A
descrição fenomenológica da ressonância ferromagnética pode ser feita
com base na dinâmica do vetor magnetização M em um campo magnético
externo H, cujo movimento de precessão é descrito por
(96)
)(
ef
HMM
dt
d
r
r
r
×=
γ
(2.1.3)
onde γ é a razão giromagnética e H
ef
é um vetor que inclui os campos estático
(efetivo) e de microondas, bem como campos efetivos associados a torques
internos sobre o sistema de spins (v. abaixo).
Em sistemas ferromagnéticos, os spins vizinhos estão acoplados por meio
da interação de intercâmbio (exchange).
(97)
Assim, as excitações do sistema de
spins correspondem a precessões coletivas em torno da posição de equilíbrio. A
excitação de menor energia é o modo uniforme, no qual os spins precessionam
84
em torno de H mantendo-se paralelos uns aos outros, ou seja com a mesma
fase, como ilustrado na Figura 2.1.3(a). Neste caso, a interação entre os spins
não contribui para a freqüência de precessão, que é dada pela mesma expressão
da Eq. (2.1.3). Devido à interação entre os spins, o sistema tem também modos
coletivos nos quais a fase da precessão varia no espaço, chamados ondas de
spin. A Figura 2.1.3(b) ilustra uma onda de spin, na qual a diferença de fase do
primeiro ao último spin é 2π, correspondendo a um comprimento de onda. O
modo uniforme é, na realidade, uma onda de spin com comprimento de onda
infinito. À medida que o comprimento de onda diminui, aumenta o ângulo entre
spins vizinhos e, por conseguinte, aumenta a contribuição da energia de
intercâmbio para a energia da excitação.
Figura 2.1.3 Desenho esquemático mostrando (a) o modo uniforme e (b) de onda de spin em sistema
ferromagnético.
(98))
Como em RPE, a idéia básica de um experimento de ressonância
ferromagnética consiste em se aplicar um campo de microondas numa amostra
situada num campo magnético estático H
0
, e observar as linhas de absorção
ressonante. O campo magnético da radiação de microondas é aplicado
perpendicularmente ao campo estático, de modo que ele tende a perturbar os
spins e desviá-los da posição de equilíbrio. Quando a freqüência da radiação está
próxima da freqüência do modo uniforme, o campo de microondas produz o
movimento de precessão dos spins e a amostra absorve energia da radiação.
85
O campo magnético efetivo sentido pela nanopartícula magnética
(monodomínio magnético com momentos magnéticos gigantes) é dado pela
derivada primeira da densidade de energia livre da partícula com relação a
projeção do vetor magnetização na direção correspondente ao estado de
equilíbrio, ou seja,
(99)
|
eq
ef
M
H
∂
∂
−=
ε
.
(2.1.4)
A densidade de energia nesta equação tem contribuições de diferentes origens. A
primeira delas é a interação Zeeman tradicional em ressonâncias magnéticas.
Outra contribuição está relacionada a uma das características marcantes de
materiais magnéticos que é o efeito de desmagnetização. Ele resulta dos campos
criados pelos dipolos magnéticos não compensados nas superfícies da amostra.
Por fim, existe ainda uma contribuição referente às interações entre o campo
elétrico cristalino e os momentos magnéticos atômicos que tendem a dirigir a
magnetização local para certas direções de grande simetria do cristal. Estas
interações podem ser representadas por uma energia magnetocristalina, também
chamada de energia de anisotropia. A origem microscópica da anisotropia reside
no fato de que os spins dos elétrons interagem com os momentos orbitais,
através da interação L.S, e as cargas eletrônicas dos orbitais sofrem a ação do
campo elétrico cristalino. Sendo assim, o campo efetivo sentido pelos spins
contém contribuições tanto dos campos externos aplicados à amostra, quanto
dos campos efetivos que representam torques internos sobre os spins.
Portanto, na equação (2.1.2), a densidade de energia é dada por
(99)
MMKHM
ua
r
t
r
r
r
⋅⋅++⋅−=
ηµεε
00
2
1
)(
.
(2.1.5)
86
O primeiro termo de (2.1.5) é a energia Zeeman com relação ao campo estático
aplicado H
0
, o segundo é a energia magnética anisotrópica considerando que a
partícula possui simetria uniaxial e o último termo é a energia devido ao efeito
de desmagnetização, onde η é o tensor de desmagnetização da amostra,
(100)
considerando que a partícula tem forma elipsoidal. Estes dois últimos são
dependentes da orientação e provocam, portanto, a dependência angular do
espectro de RFM.
A resposta do sistema de spins à aplicação do campo de microondas é
representada através de uma susceptibilidade complexa, cuja componente
imaginária (χ’’) é a responsável pela potência média absorvida pela amostra,
originando o espectro de RFM. O desenvolvimento teórico que evidencia este fato
é análogo àquele utilizado no caso da RPE e encontra-se descrito em uma série
de textos clássicos.
(101,102)
2.1.5 Características Físico-Químicas dos Óxidos de Ferro:
Magnetita e Maghemita
A composição química de óxido de ferro (ferrites) tem a fórmula geral
(103)
OMOFe
++ 2
3
3
2
(2.1.6)
onde M
2+
é um íon metálico divalente tal como o ferro, manganês, níquel, cobalto
ou magnésio. A fórmula acima representa a magnetita quando o íon do metal
(M
2+
) é o ferro ferroso (Fe
2+
), ou seja;
43
2
3
3
2
OFeOFeOFe →
++
(2.1.7)
87
A magnetita possui estrutura de espinélio invertido, com metade dos os
íons Fe
3+
distribuídos nos sítios tetraédricos (sítio [A]) e o dos íons (Fe
2+
)
ocupando os sítios octaédricos (sítio {B}) do cristal com parâmetro de rede a
o
=
8,394 Å. Na temperatura ambiente há um salto eletrônico entre os sítios {B}
(Fe
2+
, 3d
6
) para o sítio [A] (Fe
3+
, 3d
5
) com intervalo de tempo da ordem de 10
-9
s. Este processo envolve baixa energia de ativação (10
-2
eV) e alta condutividade
elétrica (1,34x10 Ω). A escala de tempo envolvida neste processo permite tratar
o ferro formalmente como Fe
2,5+
, ou seja, igual número de íons férricos e ferroso.
Por outro lado, a magnetita torna-se isolante em temperaturas abaixo de 120K.
(94)
Para a magnetita os dois sítios catiônicos, um tetraédrico (ocupado por
Fe
3+
) e o outro octaédrico (ocupado por Fe
2+
) formam a base para a
interpretação das duas sub-redes magnéticas. Na temperatura do ambiente, os
spins dos sítios tetraédricos e octaédricos estão alinhados de formas
antiparalelas, com o sítio octaédricos ocupado com o dobro de átomos do que o
sítio tetraédrico, conseqüentemente há um momento magnético líquido de 4 µ
B
(µ
B
, magneton Bohr). Este tipo de arranjo de spin pode ser representado do
seguinte modo:
[
]
{
}
B
B
B
OFeFeFe
µµµ
455
4
233
++−↓↓↑
+++
.
(2.1.8)
Por outro lado a maghemita (γ-Fe
2
O
3
) não possui um caráter fortemente
magnético pois este oxido não possui estrutura estequiométrica do tipo espinélio,
pelo fato de não existir Fe
3+
suficiente para preenchimento de todos os sítios
tetraédricos sitio [A] e octaédricos sítio {B}. A estequiometria ideal corresponde
a x = 1/3 na série substitucional magnetita-maghemita.
[
]
{
}
4
3
21
2
31
3
OVFeFeFe
xxx
+
−
+
−
+
,
(2.1.9)
88
onde [ ] representando o sítio tetraédrico, { } sítio octaédrico e V vacância
catiônica. Sendo que x varia no intervalo 0 ≤ x ≤ 1/3. A célula unitária da
maghemita totalmente oxidada tem 21,33 íons Fe
3+
e 32 átomos de oxigênio.
Uma vez que a estrutura da magnetita e da maghemita são idênticas e que a
magnetita tem 2,67 átomos de ferro a mais que a maghemita, existem 2,67
vacâncias por unidade de célula. Isto tem como conseqüência uma contração da
célula unitária cúbica, provavelmente devido ao menor raio iônico do Fe
3+
(65
pm) comparado ao Fe
2+
(74 pm), nos sítios octaédricos. Caos as vacâncias
estejam ordenadamente localizadas no sítio octaédrico s, a maghemita apresenta
simetria tetragonal (a
o
= 8,340 Å), por outro lado se ocorrem aleatoriamente,
prevalece à simetria cúbica (a
o
= 8,350 Å).
(43)
A maghemita γ-Fe
2
O
3
e a magnetita Fe
3
O
4
, apresentam estruturas
cristalina semelhantes, onde os oxigênios conformam uma estrutura cúbica de
empacotamento compacto, ccp. A maghemita não pode apresentar a variedade
de Fe
2+
/Fe
3+
, uma vez que o Ferro só aparece com valência 3
+
. Na maghemita, a
relação entre os sítios [A] e {B} é de 0,6:1 e as longitudes de ligação são 2,094
Å e 1,876 Å, respectivamente. Ambos os materiais γ-Fe
2
O
3
e Fe
3
O
4
são
ferrimagnéticos, apresentando magnetizações de saturação à temperatura
ambiente de M
s
=90-92 meu/g e M
s
=70-80 meu/g, respectivamente.
O objetivo principal do presente estudo é a analise quantitativa da
concentração de NSOF (Fe
3
O
4
), mediante a técnica de ressonância
ferromagnética, onde estas nanopartículas se encontram acopladas a um
anticorpo monoclonal específico (AC133) evidenciando a expressão dos
marcadores antigênicos (CD133) das células-tronco CD133
+
de sangue de cordão
umbilical humano. Este estudo é auxiliado com as técnicas de citometria de fluxo
89
e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) realizadas nos laboratório de
nanotecnologia do Instituto de Ensino e Pesquisa Albert Einstein. As duas últimas
abordagens foram necessárias tendo em vista que a análise de citometria de
fluxo teve a finalidade de determinar se as células CD133 selecionadas por
cromatografia de afinidade realmente expressaram a glicoproteina trans-
membrana conhecida como CD133, bem como estabelecer a eficiência do
procedimento seletivo. A análise mediante a Microscopia Eletrônica de
Transmissão (MET) foi pertinente para observar a presença de anticorpos
acoplados às NSOF expressos na membrana das células
2.2 Materiais e Métodos
No presente capítulo apresentamos os materiais e métodos utilizados na
metodologia de quantificação da carga de ferro após a marcação das células
tronco CD133
+
. A quantificação foi realizada mediante a Ressonância
Ferromagnética(RFM).
2.2.1 Marcador magnético: Descrição da amostra
A marcação das células CD133
+
foi realizada em protocolo in vitro
utilizando anticorpo monoclonal anti-CD133 acoplado às NSOF de magnetita
(Miltenyi Biotec), como marcador celular. Estas nanopartículas estão na forma de
90
uma suspensão coloidal conhecida como ferrofluido ou fluido magnético contendo
0,1% de gelatina e 0,05% de acido de sódio, numa concentração de 200µg de
Fe/mL, que equivale a ∼3x10
11
partículas de NSOF em 2 µL. O ferrofluido se
encontra em condições fisiológicas, ou seja, pH neutro e salinidade de 0,09% de
Nacl.
(104-108)
A dispersão e distribuição de tamanho das nanopartículas, baseada
em uma distribuição log-normal,
(109)
indicam um diâmetro médio de (9,0±0,3)
nm.
2.2.2 CÉLULAS-TRONCO CD133
+
A) Separação e coleta das células do sangue do cordão umbilical
As células do sangue do cordão umbilical foram obtidas no centro de
obstetricia do Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo-Brasil, de voluntários
(n=5) sob consentimento escrito (CEP – IEPAE n
o
. 105/02). A coleta foi feita com
material esterilizado através de punctura da veia do cordão umbilical no
momento do nascimento e após o cordão umbilical ser removido. As células
mononucleares foram purificadas por centrifugação em sistema Ficoll-Paque
TM
Plus (GE Helthcare), de acordo com o método previamente publicado.
(110)
O
procedimento foi realizado no laboratório de nanotecnologia do Instituto Israelita
de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE).
91
B) Marcação magnética e isolamento das Células CD133
+
Após a separação das células mononucleares, a população de células
CD133
+
foi purificada usando-se NSOF (anti-CD133 mAb-coupled da empresa
Miltenyi Biotec). Para cada 10
8
células foi adicionado 100 µL de reagente
bloqueador FcR, para inibir receptores Fc não específico mediante ligação de
anticorpos às células alvos. Depois, as células foram marcadas por 100 µL de
CD133 totalizando um volume final de 500 µL/10
8
células. Estas foram incubadas
por 30 minutos num intervalo de temperatura de 4-8
o
C, seguidas por lavagem e
resuspensas em 500 µL de tampão. Em seguida, as células magneticamente
marcadas foram separadas em uma coluna colocada em um campo magnético
com separador apropriado. Neste processo, as células CD133
+
magneticamente
marcadas ficam retidas na coluna. A coluna foi, então, removida do campo
magnético e as células retidas foram coletadas.
2.2.3 Metodologia de quantificação das NSOF
Descreveremos a metodologia sugerida para a análise quantitativa de
NSOF nas células tronco CD133
+
através da técnica de RFM. A metodologia para
a quantificação dos NSOF, após a sua administração, é a seguinte:
92
a) Realizar uma prévia visualização qualitativa das células tronco CD133
+
para observar a localização das NSOF, assim como a conservação da
morfologia da célula, validando assim a posterior análise da quantificação.
b) Identificar os picos de RFM das NSPOF, entre outros que eventualmente
estejam presentes e que não correspondem aos NSOF administrados.
c) Construir a curva de calibração do ferrofluido utilizando diferentes
concentrações conhecidas as quais são proporcionais às áreas abaixo da
curva de absorção da ressonância das NSOF. Esta curva permite uma
interpolação indireta no processo de quantificação. Para a construção
desta curva, os parâmetros utilizados na aquisição dos dados por RFM,
assim como o volume da amostra de todas as concentrações, utilizadas
devem ser iguais.
d) Após garantir a presença das NSOF nas células, após identificação do pico
de ressonância correspondente aos NSOF e tendo em conta a curva de
calibração realizamos a quantificação das NSOF nas diferentes amostras.
Realizar as medidas de RFM das amostras em estudo, onde os parâmetros
utilizados na aquisição dos dados por RFM (não necessariamente os
mesmos parâmetros da curva de calibração) assim como o volume das
amostras em estudo devem ser iguais.
Realizar uma medida de RFM de uma concentração conhecida onde a área
de absorção desta, deve ser interpolada com a área da curva de calibração
(correspondente à concentração conhecida) para obter um “fator” que vai
multiplicar as áreas obtidas por RFM das amostras em estudo e assim
encontrar as concentrações correspondentes (calibração indireta).
93
2.2.4 Detecção das células marcadas – Citometria de Fluxo
Após a separação das células CD133 por cromatografia de afinidade, as
células CD133 foram caracterizadas por citometria de fluxo usando anticorpo
monoclonal comercial (Becton Dickinson, San Jose, CA and Miltenyi Biotec). Para
monitorar a expressão de marcador de superfície foi usado o anticorpo CD34
(clone 581) FITC – Conjugado, CD45 (clone 2D1) PerCPCy-5.5-conjugado e
CD133/2 (clone: AC141) APC-conjugado e o respectivo controle isotipo IgG1
FITC-conjugado, IgG1 PerCP Cy-5.5-conjugado e IgG1 APC-conjugado.
As células foram incubada à 4
o
C no escuro por 30 minutos e, em seguida,
forma lavadas e fixadas com 1% de paraformaldeído. Eventos celulares
fluorescentes foram registrados no citômetro de fluxo FACSARIA (BD Bioscience)
e filtrados usando-se o software FACSDIVA. A população de CD45
+
foi analisada
para a expressão de CD34 e CD133. As medidas de citometria de fluxo foram
realizadas no laboratório de nanotecnologia do IIEAPE.
2.2.5 Visualização qualitativa das CD133
+
: Microscopia Eletrônica
de Transmissão
Após a separação das células CD133, sua população foi fixada em 2,5% de
glutaraldeído em 0,2 M de tampão cacodilato por 2 horas à 4
o
C. Os
94
procedimentos rotineiros para as medidas de MET incluem lavagem, fixação,
contraste, desidratação e inclusão em resina até completa polimerização. Seções
ultrafinas foram obtidas com a ajuda de um Porter Blum utramicrotomo. As
seções ultrafinas foram colocadas em uma grade de cobre e fotografadas usando
um microscópico eletrônico por transmissão, PHILIPS CM/100 (Eindhoven,
Netherlands). O estudo por MET foi realizado no Laboratório de nanotecnologia
do IIEPAE.
2.2.6 Medidas de Ressonância Ferromagnética
As medidas de RFM foram realizadas em um espectrômetro de RPE Bruker
ELEXSYS E580 operando na freqüência de microondas de 9.5 GHz. Foi usada
uma cavidade retangular TE
102
e freqüência de modulação do campo estático de
100 kHz. A potência de microondas e amplitude de modulação foram ajustadas
em cada experimento para que obtivéssemos a melhor relação sinal-ruído sem
distorção e/ou saturação do espectro. As medidas com variação de temperatura
foram realizadas no mesmo equipamento com controle de temperatura feito
através de um sistema Oxford ITC503 que permite variação da temperatura da
amostra desde 4 K até temperatura ambiente.
95
2.3 Resultados e Discussão
Neste capítulo, apresentamos os resultados relativos ao uso de
nanopartículas de óxido de ferro para marcação das células tronco. Começamos
com a caracterização magnética do marcador celular, para em seguida
apresentar os resultados obtidos do processo de quantificação das NSOF após
marcação das células tronco.
2.3.1 Caracterização Magnética do marcador celular
A caracterização das NSOF que apresentam diferentes propriedades físico-
químicas é fundamental para sua posterior aplicação médica. As propriedades
físicas de um conjunto de monodomínios magnéticos em uma matriz
diamagnética dependem tanto dos parâmetros que caracterizam o composto
magnético, quanto da morfologia das nanopartículas. Estes sistemas de NSOF
vem sendo estudados por diferentes métodos experimentais com o objetivo
principal de explorar as propriedades desses materiais e assim aumentar seu
potencial de aplicabilidade.
Nesta parte de nosso trabalho, caracterizamos uma suspensão coloidal de
NSOF,
(74)
através da técnica de RFM, este material é usado como marcador
celular. Os experimentos de RFM são realizados da mesma maneira que
96
experimentos tradicionais de RPE, exceto pelo fato de as amostras conterem
monodomínios da ordem de alguns nanômetros. As medidas foram feitas com
variação da temperatura para que ganhássemos informação acerca das
propriedades superparamagnéticas da amostra e da dependência com a
temperatura de parâmetros como a largura de linha pico-a-pico, fator g e
número de spins.
O espectro de RFM do ferrofluido à temperatura ambiente está mostrado
na Figura 2.3.1 e, como é típico para este tipo de sistema, apresenta uma linha
larga centrada em torno de g~2. Uma análise da forma da linha pode ser
empregada para calcularmos a constante de anisotropia magnetocristalina K
1
através de um método proposto por Griscom
(111)
para o caso de monodomínios
esféricos. No espectro de RFM (derivada da absorção), identificamos os campos
de máxima (H
max
) e mínima (H
min
) intensidade do sinal e de máxima inclinação
(H
ms
) centrados, respectivamente, nos seguintes valores de g efetivo:
g
[100]
=(2,22±0,01); g
[110]
=(1,98±0,02) e g
[111]
=(1,89±0,01). A separação em
campo entre H
max
e H
min
é proporcional à anisotropia em campo H
a
. O valor de K
1
foi determinado a partir de H
a
(Figura 2.3.1) e das relações: H
a
= 2K
1
/M
s
e H
s
=
(4
π
/3)M
s
(erg G
-1
cm
-3
), onde H
s
é o campo de saturação para um NSOF e vale
cerca de 2 kG no caso do material ser magnetita
(111)
Assim, o valor obtido para
K
1
foi (1,2 ± 0,2) × 10
5
erg cm
-3
.
97
2400 3600
H
ms
H
min
H
max
ν
0
= 9,428 GHz
H
a
=2K
1
/M
s
H
s
=(2
π
/3)M
s
H
s
= 2KG
2/3H
a
H
a
g
[111]
g
[110]
g
[100]
Derivada da Absorção (U.A.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 2.3.1 Espectro de RFM de NSOF medido em 9,428 GHz e à temperatura ambiente. As relações
usadas para calcularmos K
1
estão mostradas no detalhe e os significados de H
a
, H
s
, H
max
, H
min
e H
ms
estão
colocados no texto.
Os espectros de RFM em função da temperatura desde 4 K até
temperatura ambiente estão mostrados na Figura 2.3.2. Os espectros
apresentaram forma de linha assimétrica, sem alterações na sua intensidade
pico-a-pico à medida que a temperatura foi elevada.
` No entanto, em espectros de RFM, incluindo-se aqueles apresentados na
Figura 2.3.2, tem-se observado a dependência com a temperatura do campo de
ressonância e da largura de linha do espectro.
(121)
O campo de ressonância tem
como base o campo magnético estático do espectrômetro, mas inclui também
contribuições do campo de anisotropia magnética e do campo de
desmagnetização Em um sistema macroscopicamente isotrópico, as partículas
magnéticas estão orientadas ao acaso, assim os espectros de ressonâncias são
mais estreitos. O campo magnético do espectrômetro tende alinhar os momentos
98
magnéticos, porém, as flutuações térmicas restabelecem a desorientação e como
resultado há um estreitamento no espectro de ressonância.
1000 2000 3000 4000 5000 6000
ν
0
=9,428
GHz
Campo Magnético (Gauss)
4 K
20 K
47 K
60 K
80 K
100 K
111 K
145 K
173 K
202 K
Intensidade (u.a.)
Figura 2.3.2. Dependência com a temperatura dos espectros de RFM medidos no intervalo de 4-300K.
Este comportamento pode ser entendido se adicionarmos um termo
dissipativo na equação (2.3.1) que rege a dinâmica dos momentos magnéticos
tendo já que há uma largura de linha finita. Na aproximação de baixo
amortecimento, válido para sistemas paramagnéticos diluídos, todas as equações
resultam em uma forma de linha Lorentziana. Considerando o caso de forte
amortecimento (ferromagnético ou ressonância superparamagnética em baixa
temperatura) as condições de ressonância são consideravelmente alteradas e a
expressão para a forma de linha depende da forma do termo de amortecimento.
Foi mostrado que o modo de ação da temperatura sobre os espectros de RFM em
99
temperaturas baixas é melhor descrito pela equação fenomenológica de Landau-
Lifschitz:
(99,113,114)
)]([)(
2
HMM
M
HMM
dt
d
r
r
r
r
r
r
r
××−×=
λ
γ
,
(2.3.1)
λ>0 é o chamado fator de amortecimento. Se o campo magnético aplicado é
suficiente para saturar a magnetização, a equação (2.3.1) leva à forma de linha
de absorção normalizada:
[
]
[ ][ ]
22
0
2
0
22
0
2
0
4
0
222
0
2
0
0
)()()()(
)()(
),,(
HHHHHHHH
HHHH
HHLL
HH
HH
H
⋅∆++⋅⋅∆+−⋅⋅
+⋅∆+⋅∆
=∆
π
,
(2.3.2)
onde o parâmetro largura de linha é dado por ∆
H
= λH
0
/|γM|. Contrastando com
as formas de linhas Lorentziana ou Gaussiana, a equação acima é caracterizada
por um campo de ressonância aparente dependente da largura de linha dado por
(99,113)
22
0
22
00
22
0
2
0
)(2
HH
H
r
HHH
H
H
H ∆−−∆+⋅
∆+
=
.
(2.3.3)
Isto mostra que o campo de ressonância diminui quando a largura de linha
aumenta. Ou seja, a diminuição da temperatura leva a um alargamento de linha
e deslocamento do campo de ressonância para valores menores, o que explica o
comportamento observado em nossos espectros (Figura 2.3.2), o que indica que
o comportamento das nanopartículas de óxido de ferro na amostra de interesse
deve ser superparamagnético
(115,116)
Para verificarmos a correlação entre posição da ressonância e largura de
linha descrita pela equação (2.3.3), mostramos na Figura 2.3.3, a variação do
campo de ressonância (δH
ressonância
= [H
ressonância
]
300K
− [H
ressonância
]
T
) em função da
largura de linha pico-a-pico (∆H
PP
= H
max
− H
min
) dos espectros de RFM nas várias
100
temperaturas medidas. No inserto da Figura 2.3.3, mostramos a variação com a
temperatura discutida acima para os parâmetros campo de ressonância e largura
de linha.
Em geral, para um sistema de partículas superparamagnéticas
apresentando uma distribuição estatística de formas e tamanhos, há uma relação
simples entre o expoente n de δH
ressonância
~ (∆H
PP
)
n
com a organização estrutural
das partículas:
(117)
n=2 para orientação parcial e n=3 para partículas orientadas
aleatoriamente na amostra. Do comportamento linear mostrado na Figura 2.3.3
e do ajuste linear feito, obtemos um valor de n=3,1, o que indica que o
comportamento as nanopartículas de magnetita estão isoladas, aleatoriamente
orientadas e são superparamagnéticas.
101
700 800 900 1000 1100 1200 1300
100
0 30 60 90 120 150 180 210
2800
3000
3200
3400
700
800
900
1000
1100
1200
1300
Experimental
Ajuste linear
δ
H
ressonância
(Gauss)
∆
H
PP
(Gauss)
δΗ
ressonância
= (∆Η
PP
)
n
n=3,1
H
ressonância
H
ressonância
(Gauss)
Temperatura (K)
∆
∆∆
∆H
PP
∆
∆
∆
∆
H
PP
(Gauss)
Figure 2.3.3 Dependência da variação do campo de ressonância δH
ressonância
em função da largura de
linha pico-a-pico ∆H
PP
. No inserto, a variação explícita com a temperatura de H
ressonância
e ∆H
PP
.
Portanto, a análise dos espectros de RFM dentro do intervalo de
temperatura 4-300 K confirma o estado superparamagnético das nanopartículas
de magnetita e mostra a forte dependência com a temperatura dos parâmetros
∆H
PP
e fator g.
102
2.3.2 Detecção das Células Marcadas: Citometria de Fluxo
Nas amostras estudadas, 98% das células CD45 expressadas,
caracterizam suas fontes hematopoiética. Após a seleção de CD45
+
, a expressão
de CD34 (progenitor marcado) foi analisada, as quais mostraram que 82% de
todas as células CD133
+
também expressaram CD34 (Figura 3.3.4A) indicando
seu fenótipo progenitor. A especificidade do teste foi considerada adequada de
acordo com um resultado negativo encontrado no controle isotipo mostrado na
(Figura 3.3.4B) Por fim, observamos que a eficiência da seleção de CD133
determinada pela análise de citometria de fluxo foi de 83,3%.
Figura 2.3.4 (A) O gráfico de citometria de fluxo mostra que CD133
+
/CD34
+
(82%), CD133-/CD34
+
(1,6%) and CD34
+
CD133
-
(9,2%) (B) Gráfico do controle isotipo mostra que não há coloração específica.
103
2.3.3 Visualização Qualitativa das Células Marcadas: MET
O destaque da densidade eletrônica granular nas superfícies das células
mostram a presença de anticorpos monoclonal ligados aos NSOF expressados na
membrana celular das células-tronco CD133
+
como mostra as Figuras 2.3.5A, B
e E. Este mesmo tipo de padrão não ocorre no grupo de células controle
mostrados na Figura 2.3.5G, isto porque estas células não expressam o antígeno
CD133 (Células-tronco CD133).
As células-tronco CD133
+
são caracterizadas por uma morfologia com um
núcleo ativo que ocupa quase toda a célula como mostra a Figura 2.3.5A e B.
Analisando a Figura 2.3.5C, observamos a presença dos NSOF no citoplasma
celular. Estas nanopartículas ligadas aos anticorpos expressados na membrana
celular foram incorporadas no interior da célula por processos de endocitose mais
precisamente por processo de pinocitose. Estas podem ser visualizadas na
micrografia eletrônica através da densidade eletrônica da partícula mostrada na
Figura 2.3.5C.
104
Figura 2.3.5 A-F MET das células-tronco CD133
+
; G, MET de células-tronco CD133
-
(controle); n,
núcleo; c, citoplasma; as setas indicam densidade eletrônica granular. Escala: (A, G), 1,00µm;
(B,C,E,F)0,25 µm; D, 0,50 µm.
Experimentos prévios evidenciaram uma densidade eletrônica
marcantemente forte na periferia do conteúdo celular sendo que a morfologia da
célula CD133
+
não foi conservada como mostra a Figura 2.3.5D. Isto ocorre
provavelmente devido a má fixação do material por meio de 2,5% de
105
glutaraldeído em 0,2M de tampão “cacodylate”. A MET revela um excesso de
densidade eletrônica de nanopartículas tanto na membrana celular como no
citoplasma mostrados nas Figuras 2.3.5C e F
2.3.4 Construção da curva de calibração
De acordo à metodologia de quantificação é necessária a construção de
uma curva de calibração. A linha característica no espectro de RFM do Fe
+3
contido no ferrofluido à base de magnetita se encontra aproximadamente em
g=2,1. A concentração de spins na amostra é calculada indiretamente através da
área sob a curva de absorção de RFM no intervalo do campo magnético onde
acontece a ressonância. Para determinar a constante de proporcionalidade entre
a concentração do ferro e a intensidade de RFM foi montada a curva de
calibração mostrada na Figura 2.3.6.
A curva de calibração foi montada usando diferentes concentrações do
marcador celular desde 0,04 µM até 3,58 mM em um volume de 2 µL. O espectro
típico de RFM do Marcador celular é mostrado em detalhe da Figura 2.3.1. A
forma de linha de absorção é típica de um espectro de monodomínios
ferromagnéticos discutidos anteriormente.
(111,118,114)
106
0,1 1 10 100 1000
0,1
1
10
100
2000 3000 4000
-1x10
3
0
1x10
3
Experimental
Ajuste linear
Intensidade da RFM (u.a.)
Mol de Ferro (10
-10
)
3,58 mM
2,76 mM
1,90 mM
1,25 mM
0,68 mM
0,04 mM
Intensidade (u.a.)
Campo Magnetico (Gauss)
Figure 2.3.6 Curva de calibração de FMR da concentração de NSOF relacionada como a área da curva de
absorção de ressonância em g = 2,1. No detalhe são apresentados os espectros típicos de FMR em
diferentes concentrações da magnetita contida no marcador celular.
2.3.5. Quantificação por FMR das células marcadas por NSOF
Para evidenciar a expressão do marcador antigênico CD133 pela célula em
estudo, realizou-se primeiramente o espectro de RFM somente dos grânulos
magnéticos (Figura 2.3.7), ou seja, do anticorpo monoclonal anti-CD133
acoplado a microesferas magnéticas compostas por NSOF (Miltenyi Biotec)
observando-se a ressonância em g=2,1, a qual provém dos spins do Fe
3+
que
107
interagem entre si, porém, apresentando um comportamento
superparamagnético
(74,120)
que caracteriza a presença de aglomerados. Este sinal
consiste de uma forte absorção, cuja grande largura é atribuída à forte interação
entre os íons de Ferro (cluster de íons Fe
3+
aglomerados por uma forte interação
de troca).
2000 3000 4000 5000
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
6000
2000 3000 4000 5000
-200
-100
0
100
200
NSOF
Células marcadas
Células não marcadas
Glutaraldeido
Campo Magnético (Gauss)
Derivada da absorção (U.A)
Figura 2.3.7 Espectros de RFM, mostrando a curva de absorção de ressonância do marcador das células,
células não marcadas, células marcadas e glutaraldeído. No detalhe realçam-se os espectros com
intensidade baixa.
Em seguida, foi obtido o espectro de RFM das células não marcadas
(CD133
-
) que serviram como controle, observando que o espectro não apresenta
nenhuma linha de ressonância.
108
Posteriormente foi obtido o espectro de FMR das células marcadas
(CD133
+
) (correspondente a 0,64x10
5
células marcadas contidas num volume
2µl) observando se uma linha de ressonância em g=2,1 mostrando assim a
presença das NSOF ligadas às células, sendo que estas se encontravam imersas
em fixador de glutaraldeído 2,5%.
Para garantir que as nanopartículas não estavam presentes no fixador,
este foi retirado por meio de centrifugação (1200 rpm por 10 min) das células
marcadas aspirando-o sobrenadante cuidadosamente. Foi obtido o espectro de
FMR do fixador extraído onde este mostrou a ausência FMR no glutaraldeído,
evidenciando assim a ausência de SPION fixador como é observada na detalhe
da Figura 2.3.7. Este resultado foi já evidenciado pelo estudo do MET onde
observamos que o anticorpo acoplado às nanopartículas se encontra ligado às
células CD133
+
.
A quantificação do número médio de partículas de ferro por célula foi
determinada a partir da área sob a curva de absorção de ressonância dos
espectros de RFM das células marcadas (Figura 2.3.7), através da interpolação
com a curva de calibração mostrada na Figura 2.3.6 encontrando que se tem
1.7x10
-13
mol de ferro (9,5 pg) ou 7,01x10
6
nanopartículas por célula.
Para realizar a quantificação das nanopartículas na célula mediante a
técnica de RFM, faz-se necessário realizar uma visualização qualitativa das
células marcadas. Isto foi necessário para assegurar-se que as nanopartículas
acopladas estejam ligadas à superfície do antígeno das células-tronco fornecendo
maior confiabilidade aos resultados quantitativos oriundos da RFM. O espectro de
RFM mostrado na Figura 2.3.8 correspondente a amostra de CD133
+
que
tínhamos comprovado uma forte na densidade eletrônica na periferia da célula.
Além disso, a morfologia não foi conservada como comentado anteriormente. Em
109
todas as células o sinal de RFM dos NSOF foi devido às nanopartículas acopladas
aos anticorpos que por sua vez estavam ligados as células. A análise do sinal
obtido para quantificação resulta em 1.64x10
-13
mol de ferro (9,4 pg) ou
6,77x10
6
nanopartículas por célula, em boa concordância com os resultado
obtidos com células bem marcadas (Figura 2.3.5. B). Portanto é necessária uma
análise morfológica prévia ao da análise quantitativa por RFM.
Figura 2.3.8 Espectro de absorção de RFM dos NSOF correspondente às celulas CD133+ que apresentam
uma forte marcação eletrondensa na periferia da célula como é mostrada no inset, na micrografia
110
3 Conclusão
A motivação principal dos estudos desenvolvidos neste trabalho foi aliar a
Ressonância Magnética Eletrônica (RME), ou seja, RPE e RFM à investigação em
nível molecular de sistemas de interesse biofísico.
Na primeira parte do trabalho usamos espectroscopia de RPE de
marcadores de spin com o grupo repórter nitróxido aliada a um extenso processo
de simulações espectrais baseadas no pacote de programas NLSL
(19)
para
investigar os efeitos dependentes da temperatura e pH da interação da nicotina
sobre as propriedades físico-químicas de modelos de membrana constituídos
separadamente, por dois dos principais fosfolipídios do chamados surfatantes
pulmonares DPPC e POPC. Este estudo objetivou investigar o tipo de interação
desempenhada pela nicotina em pH ácido de básico. Para tal usamos marcador
de spin com o grupo repórter em diferentes posições da cadeia acila do
fosfolipídio palmitoil-steroil(n-DOXIL)glicerolfosfatidilcolina [n-PCSL; n=5 e 16]
para monitorar as mudanças na estrutura dinâmica da cadeia hidrofóbica dos
fosfolipídios. Os resultados apontam que em pH ácido a nicotina interage na
região da cabeça polar e tem ação penetrante em meio básico. Um resultado
interessante é aquele que mostra que a nicotina perturba internamente a fase
gel do DPPC no sentido de desestabilizá-la. Isto foi verificado através do uso
indireto de ajuste espectral dos espectros experimentais medidos na presença do
marcado 16-PCSL, que apresentou uma composição de duas componentes
espectrais no intervalo de temperatura 30-40
o
C independentemente da presença
111
de nicotina. Neste no intervalo de temperaturas onde se observou a coexistência
de duas componentes um tratamento mais detalhado foi feito com base no
modelo tradicional de van´t Hoff para processos químicos envolvendo dois
estados termodinâmicos.
Os gráficos de van’t Hoff para as amostras sem e com nicotina
apresentaram um comportamento linear dentro do intervalo de temperatura
onde coexistem duas componentes nos espectros de RPE (Figura 1.3.10). Do
coeficiente angular desses gráficos foi calculado os valores da variação de
entalpia de transferência de um fosfolipídio da região associada à componente 2
(fluid-like) em relação à região da componente 1 (gel-like): ∆H = H
2
− H
1
.
Obtivemos, desta maneira, ∆H
sem
= +7,5 kcal/mol e ∆H
com
= +16,0 kcal/mol para
as amostras sem e com nicotina, respectivamente. Os valores de ∆H
determinados são positivos, indicando que o processo de transferência de uma
molécula de fosfolipídio da fase gel-like para fluida é entalpicamente
desfavorável. Além disso, o valor de ∆H na presença de nicotina é
aproximadamente o dobro daquele determinado na sua ausência.
Como o DPPC é o maior constituinte dos surfatante pulmonares e sua
função biológica está diretamente ligada à diminuição da tensão superficial dos
líquidos formados na superfície dos alvéolos pulmonares, a desestabilização em
sua fase gel, portanto, fase fisiologicamente importante pode levar ao
aparecimento de doenças respiratória em tabagistas. Vale lembrar que o
experimento foi realizado em uma solução ácida onde a nicotina encontra-se
predominantemente monoprotonada.
Este estudo não é conclusivo tendo em vista que deve-se realizar
experimentos das amostras investigada neste trabalho nos pH´s que não foram
possível realizar até o presente momento e com o POPG nas mesmas condições
112
de medidas. Ademais um sistema interessante para ser investigado seria a
composição lipídica de todos os fosfolipídios na presença e ausência de nicotina.
Na segunda parte, nós investigamos no sentido de quantificar células-
tronco de cordão umbilical marcado com nanopartículas superparamagnéticas de
óxido de ferro (NSOF), previamente preparada no laboratório de nanotecnologia
do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE). Este trabalho
é resultado de uma colaboração entre nosso grupo e o grupo do Dr. Lionel
Gamarra Contreras, atualmente pesquisador do Hospital Israelita Albert Einstein
(São Paulo). Especificamente, O estudo foi no sentido de analisar
quantitativamente, mediante a técnica de Ressonância Ferromagnética (RFM), a
concentração de NSOF após marcação das células tronco CD133
+
. Primeiro nós
apresentamos a metodologia sugerida para a análise quantitativa de NSOF nas
células tronco CD133
+
através da técnica de RFM. A metodologia para a
quantificação dos NSOF, trabalho a ser publicado. Seguido, caracterizamos uma
suspensão coloidal de NSOF,
(24)
através da técnica de RFM, este material é usado
como marcador celular. Os experimentos de RFM são realizados da mesma
maneira que experimentos tradicionais de RPE, exceto pelo fato de as amostras
conterem monodomínios da ordem de alguns nanômetros. As medidas foram
feitas com variação da temperatura para que ganhássemos informação acerca
das propriedades superparamagnéticas da amostra e da dependência com a
temperatura de parâmetros como a largura de linha pico-a-pico, fator g e
número de spins (Artigo aceito para publicação e exposto no apêndice A desta
tese.) Por último, aplicamos o método de quantificação das células como mostra
o artigo publicado e exposto no apêndice B.
Como perspectivas futuras, sugerimos após completar a série de
experimentos de interação de nicotina em sistemas modelos de surfatantes
113
pulmonares, investigar complexos surfatantes sintéticos disponíveis a fim de
correlacionarmos os tipos de interação investigadas nos dois sistemas. Em se
tratando de células-tronco, outros sistemas interessantes poderiam ser
investigados principalmente em sistemas In vivo.
114
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J. Phys.: Condens. Matter 21 (2009) 000000 (6pp) UNCORRECTED PROOF
Magnetic characterization by SQUID and
FMR of a biocompatible ferrofluid based
on Fe
3
O
4
L F Gamarra
1,2
, W M Pontuschka
3
, J B Mamani
3
,DRCornejo
3
,
T R Oliveira
3
, E D Vieira
4
, A J Costa-Filho
4
and E Amaro Jr
1,2
1
Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein, IIEPAE, 05651-901,
S˜ao Paulo, Brazil
2
Instituto de Radiologia, Faculdade de Medicina, USP, S˜ao Paulo, Brazil
3
Instituto de F´ısica, Universidade de S˜ao Paulo, S˜ao Paulo, Brazil
4
Instituto de F´ısica de S˜ao Carlos, USP, S˜ao Carlos, Brazil
E-mail: lgamarra@einstein.br
Received 17 July 2008, in final form 13 January 2009
Published
Online at stacks.iop.org/JPhysCM/21/000000
(Ed: Lauret)
Ascii/Word/JPCM/
cm286874/PAP
Printed 23/1/2009
Spelling US
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Abstract
Biocompatible superparamagnetic iron oxide nanoparticles of magnetite coated with dextran
were magnetically characterized using the techniques of SQUID (superconducting quantum
interference device) magnetometry and ferromagnetic resonance (FMR).
The SQUID magnetometry characterization was performed by isothermal measurements
under applied magnetic field using the methods of zero-field-cooling (ZFC) and field-cooling
(FC). The magnetic behavior of the nanoparticles indicated their superparamagnetic nature and
it was assumed that they consisted exclusively of monodomains. The transition to a blocked
state was observed at the temperature
T
B
= (43 ± 1) K for frozen ferrofluid and at (52 ±1) K
for the lyophilized ferrofluid samples. The FMR analysis showed that the derivative
peak-to-peak linewidth
(H
PP
), gyromagnetic factor (g), number of spins (N
S
), and spin–spin
relaxation time
(T
2
) were strongly dependent on both temperature and super-exchange
interaction. This information is important for possible nanotechnological applications, mainly
those which are strongly dependent on the magnetic parameters.
(Some figures in this article are in colour only in the electronic version)
Q.1
1. Introduction
Iron oxide nanoparticles are of considerable interest for
applications in nanotechnology due to their inherent properties,
such as superparamagnetism, high saturation fields, and
extra anisotropy contributions or shifted loops after field-
cooling, which is attributed to finite size and large surface
area [1]. Currently these nanostructured materials are applied
in various fields such as magnetic storage, biomedicine, and
catalysis [2–4].
The magnetic characterization of superparamagnetic iron
oxide nanoparticles (SPIONs) having different physical–
chemical configurations is fundamental in medical applica-
tions, including drug delivery [5], and hyperthermia cancer
treatment [6, 7], among others. They are also used as image
contrast agents in magnetic resonance imaging (MRI) [8, 9],
where the principle of this application is based on the
magnetic properties of the SPIONs. The physical properties
of an assembly of magnetically ordered monodomains in a
diamagnetic matrix depend on a number of parameters which
characterize the magnetic compound and on the morphology
of the nanoparticles. Such systems of superparamagnetic
nanoparticles are currently being investigated by a large variety
of techniques, where the main goals are to further explore the
properties of these materials and to increase their potential
for novel applications, taking into account that each potential
application requires different properties of the nanoparticles.
The objective of this paper is to perform the magnetic
characterization of a colloidal suspension of SPIONs recovered
with dextran used as a contrast agent for MRI. The
magnetic characterization was performed using the techniques
of superconducting quantum interference device (SQUID)
0953-8984/09/000000+06$30.00 © 2009 IOP Publishing Ltd Printed in the UK1
J. Phys.: Condens. Matter 21 (2009) 000000 L F Gamarra et al
magnetometry and ferromagnetic resonance (FMR). The FMR
analysis was carried out as a function of temperature in order
to understand the superparamagnetic features exhibited by
the SPIONs under investigation, as well as the temperature
dependence of parameters such as the peak-to-peak linewidth,
gyromagnetic factor, number of spins and spin–spin relaxation
time.
1.1. Ferromagnetic resonance
Electron paramagnetic resonance (EPR) of the ferromagnetic
particles, also known as FMR, is performed like any other EPR
experiment, except that the samples contain approximately
spherical aggregates of ferro or ferrimagnetic monodomains
of the order of a few nanometers. Thus, the total magnetic
momentum of each nanoparticle precesses about the direction
of the total magnetic static field, which is the sum of the
external static field, the internal contribution of the domain
magnetization and the anisotropic magnetic field of the local
lattice [10]. The FMR is adequate for the study [11]and
detection of ferromagnetic nanoparticles [12, 13]eveninthe
presence of soluble iron salts, which exhibit typical well-
defined spectra.
The magnetic resonance theory of the superparamagnetic
systems is described on the basis of a phenomenological
equation of motion for a classical magnetic momentum
µ
under ferromagnetic conditions of resonance [14, 15].
The magnetic fluids based on SPION present various
relaxation phenomena, which are directly related to the
orientation freedom degrees of the particle. The basic
phenomenon of FMR is the microwave absorption, which
is observed when the Larmor precession of the particles
equals the frequency of the standing waves in the microwave
cavity. The physical mechanism is essentially the same for
ferromagnetic solids and magnetic suspensions. However, in
ferrofluids, the FMR is considerably affected by two specific
characteristics. The first one stems from the smallness of
the particles and imparts a fluctuation component to the
magnetic moment motion. The second originates from the
mechanical mobility of the particles and results in a change in
the distribution of their anisotropy axes under the influence of
the external fields [16]. The underlying cause of both effects is
the thermal noise, meaning that they are strongly temperature-
sensitive.
Among the nanoparticles composed by spherical mon-
odomains (
∼10 nm), the reference value KV of the magnetic
anisotropic energy, where
K is the constant of anisotropy
and
V is the particle volume, can be easily compared with
the thermal energy
k
B
T . Because of this, together with any
regular movement, the magnetic momentum
µ of the particle
is submitted to considerable orientation fluctuations, including
those that reverse their direction. This effect is known as
superparamagnetism and it was predicted by N´eel [17].
2. Materials and methods
The sample was a colloidal suspension of iron oxide su-
perparamagnetic nanoparticles (Endorem
™—Guerbert, earlier
trade name AMI-25, Laboratoire Guerbert, France) consisting
of 126.500 mg of Fe
3
O
4
superparamagnetic nanoparticles
contained in 8 ml of water. The nanoparticles of 4.8–5.6 nm
size are coated with low-weight dextran (7–9 kDa) [18]of
hydrodynamic diameters between 80 and 150 nm. Besides
water, the solvent composition was 60.800 mg of dextran,
2.714 mg of citric acid, and 490.400 mg of
β-D-mannitol
(C
6
H
14
O
6
). The pharmacokinetics, toxicity, and relaxivity
of these superparamagnetic iron oxide particles have been
previously described [19–21]. The suspension is a ferrofluid
applied as a contrast agent in MRI for the detection of liver
lesions associated with an alteration in the reticular-endothelial
system (RES) [9].
The magnetic characterization was performed by SQUID
magnetometry and FMR. A commercial SQUID magnetometer
was employed to perform static and dynamic measurements
as a function of field, temperature, and driving frequency.
Zero-field-cooling (ZFC) and field-cooling (FC) curves were
recorded under applied magnetic fields up to 7 T, between 5
and 250 K to avoid the melting of the solid matrix (solvent).
The study using this technique was carried out with two types
of ferrofluid samples: (a) as a colloidal suspension and (b) as
a lyophilized ferrofluid in order to increase the concentration
of nanoparticles, keeping their size unaltered. The samples
were lyophilized on an Edwards lyophilizer, model E3M8-
Modulyo, operating at a temperature of
−50
◦
C and pressure
of 8
× 10
−3
Torr, working with a vacuum pump. This process
was carried out during a period of 27 h, yielding a material free
of humidity.
For magnetic measurements, as-prepared samples were
conditioned in closed containers before quenching the
magnetite/carrier mixture below its freezing point (
∼268 K).
The FMR spectra were obtained using a Bruker
ELEXSYS E580 spectrometer operating at X band (9.2 GHz)
and equipped with a rectangular microwave cavity operating
in the TE
102
mode. Experimental parameters were set to
avoid saturation and distortion of the signal. To obtain the
FMR spectra in the temperature range of 4–300 K, 3.5 mM of
SPIONs colloidal suspension sample in a volume of 10
μlwas
used. The temperature was controlled by an ITC503 Oxford
cryostat system.
3. Results and discussions
Magnetization curves (figure 1) obtained from SQUID
magnetometry measurements, taken in ZFC and FC modes
under an external field of
H = 100 Oe showed that the
transition to a blocked state occurs at the temperature
T
B−F
=
(
43 ± 1) K for frozen ferrofluid. On the other hand, it
can be clearly seen that the lyophilized ferrofluid sample had
a higher blocking temperature
T
B
= (52 ± 1) K. At the
irreversibility temperature (
T
Irr
) splitting of the ZFC and FC
curves was observed when the larger particles were changed
from the blocked state to the superparamagnetic state and vice
versa. For the case of the lyophilized ferrofluid and the frozen
ferrofluid sample, the following values
T
Irr−L
= (97 ± 1) K
and
T
Irr−F
= (220 ± 1) K were observed, respectively.
The changes in the temperatures
T
B
and T
Irr
showed the
2
J. Phys.: Condens. Matter 21 (2009) 000000 L F Gamarra et al
Figure 1. Magnetization curve for frozen (•) and lyophilized (◦)
samples. Lower and upper branches correspond to ZFC and FC data,
respectively. The arrows indicate the blocking temperature
T
B
and
the irreversibility temperature
T
Irr
.
effects of dipolar interactions, which tend to increase the
energy barriers of individual particles. According to the
size of monodomain particles, no indication of the Verwey
transition was observed. By comparing samples with different
average particle distances but identical particle distributions,
we inferred that in concentrated systems the contribution from
dipolar interactions can be of the same order as the anisotropy
energy barriers of noninteracting particles.
Contributions to anisotropy energy can originate from in-
trinsic anisotropies of the particles (shape, magnetocrystalline,
or stress anisotropies) or interparticle interactions (dipolar or
exchange). Inasmuch as these two mechanisms contribute to
modify the energy barrier, it is usually quite difficult to separate
both kinds of effects. The conditions during the lyophilization
assured that both samples have the same average particle size,
particle distribution, and particle shape. Therefore, such an
increase in anisotropy energy is not related to size/distribution
effects but to the decrease of the average distance between
particles.
Figure 2 shows the hysteresis cycles for the ferrofluid
samples measured at temperatures of 5, 10, 20, 30, 50, and
70 K. It is well known that after the initial magnetization,
the sample acquires a remnant magnetization even after the
removal of the external field. The field necessary to further
reduce the remnant magnetization to zero is defined as the
coercive field
H
c
, which is calculated from the hysteresis curve
(figure 2(a)). Figure 2(a) shows the existence of coercive field
at temperatures below the blocking temperature. Thus, it is
also observed that the material has a typical superparamagnetic
behavior, i.e. with almost zero coercivity, because during
the time elapsed in the measurement (
τ
m
), the particles are
in the superparamagnetic state at temperatures higher than
the blocking temperature (T
B
). As the temperature of the
system decreases, the hysteresis appears and consequently the
superparamagnetism disappears, where the thermal energy is
no longer sufficient to overcome the potential barrier created
Figure 2. Hysteresis cycles of the ferrofluid at different
temperatures. Inset (a): detail showing the reminiscent field with a
field range from
−400 to +400 Oe. Inset (b): coercive fields
measured in the blocking region of the ferrofluid sample.
Q.A
by the anisotropic energy, thereby blocking their magnetic
moments during the time
τ
m
.
The M(H) curves shown in figure 2(a) indicate the
development of a measurable coercive field below
T
B
, reaching
the field intensity
H
C
= 190 Oe for the temperature T =
5 K (see figure 2(b)). The saturation magnetization M
S
is
almost reached for applied fields of the order of 30 kOe,
suggesting no evidence of a magnetically hard particle surface,
as found in other nanostructured iron oxide particles [22]. The
ratio between the saturation and the remnant magnetization
R = M
R
/M
S
measured at 5 K is 0.27, smaller than the
theoretically expected
R = 0.5 value for noninteracting
randomly oriented particles [23]. It has been suggested that
R > 0.5andR < 0.5 values should be expected for
those systems with ferro and antiferromagnetic interactions,
respectively, as proposed by Hadjipanayis et al [24]. Thus,
the present
R = 0.27 value indicates that the interparticle
interactions are of antiferromagnetic nature.
The FMR spectrum at room temperature of ferrofluid
isshowninfigure3. The typical ferrofluid spectra
consisted of a broad line. The characteristic FMR absorption
line of precipitated fine grains, composed by ferro-or
antiferromagnetic monodomains [25, 26], is also observed in
pairs of iron ions (Fe
3+
and Fe
2+
) and/or clusters formed
in glassy matrices [27]. From the lineshape analysis it
was possible to determine the magnetocrystalline anisotropic
constant of first order
K
1
= (1.2 ± 0.2) × 10
5
erg cm
−3
,
following a method described in the literature [25]. This value
was determined by using the relations
H
a
= 2K
1
/M
S
and
H
S
= (4π/3)M
S
(erg G
−1
cm
−3
), where H
S
≈ 2kG[25].
It was considered that the SPIONs chemical composition
is Fe
3
O
4
[25], consisting of monodomains of spherical
geometry [26].
M
S
is the magnetization saturation of the
cubic crystal and
H
S
is the saturation field of a spherical
SPION. The derivative of FMR absorption shows a maximum
H
max
, a minimum H
min
, and a maximum of negative slope
3
J. Phys.: Condens. Matter 21 (2009) 000000 L F Gamarra et al
Figure 3. FMR spectrum of SPIONs recorded at room temperature.
Figure 4. Temperature dependence of the ferrofluid FMR spectra
obtained in the range of 4–300 K.
H
ms
whose values of effective g are g
[100]
= (2.22 ± 0.01),
g
[110]
= (1.98±0.02),andg
[111]
= (1.89±0.01), respectively.
The
H
a
value was obtained from the field separation between
the wing positions of
H
max
and H
min
, equal to 5/3ofH
a
,
asshowninfigure4.The
H
0
= H
max
− (2/3)H
a
was
obtained from the value of
g
0
= (hν/(β H
0
)) = (2.01 ±0.02),
with
ν = 9.428 GHz, where h is the Planck’s constant, ν
is the spectrometer microwave frequency and β is the Bohr
magneton.
FMR measurements were carried out at varying tempera-
tures from 4 K up to room temperature as shown in figure 4.
In general, the spectra were asymmetric and the peak-to-peak
amplitude of the derivative of absorption remained constant
through the entire temperature range. However, a lineshape
change was observed as temperature increased, leading to
successively narrower lines. This is due to the fact that in
a ferromagnetic randomly oriented dispersion, the absorption
linewidth turns out to be a monotonic function of temperature.
Figure 5. Temperature dependence of the gyromagnetic factors
g
[100]
, g
0
, g
[111]
of SPIONs.
Figure 6. Relationship between δ H
resonance
and H
PP
, showing an
exponent
n of order 3. In the inset, the variation of H
resonance
and
H
PP
as a function of temperature is illustrated.
At low temperature, the linewidth is large due to the particle
dispersion in the direction of the anisotropic field. As the
temperature increases, there is a tendency of isotropic magnetic
moments to be formed, thus reducing the linewidth [28].
The gyromagnetic factors
g
[100]
, g
0
of SPIONs decreased
monotonically with temperature, and in the case of
g
[111]
it
starts with a slight decrease, reaching a minimum at 150 K and
then increases slowly, as shown in figure 5.
In figure 6, the shift of the resonance field (
δ H
resonance
=
[H
resonance
]
300 K
−[H
resonance
]
T
) is plotted versus the peak-to-
peak linewidth (
H
PP
= H
min
− H
max
)oftheFMRspectrum
(derivative of the microwave absorption), and a straight line
was obtained assuming that the function is
nth power of
H
PP
. The inset shows the decrease of resonance field with
the increase in temperature.
H
resonance
is plotted versus H
PP
and it also shows the dependence of H
PP
with the associated
temperature. The curve
H
resonance
(T ) increase with the increase
4
J. Phys.: Condens. Matter 21 (2009) 000000 L F Gamarra et al
Figure 7. The spin–spin relaxation time (T
2
) and the spin number as
a function of temperature of ferrofluid.
in temperature, whereas H
PP
decreases with the increase in
temperature, as expected for the FMR of superparamagnetic
particles [29, 30]. Therefore, it is expected that the resonance
line broadening should be associated with the magnetization
blocking of the Fe
3
O
4
nanoparticles.
The variation of
H
PP
can be explained using a two-level
system and assuming thermal equilibrium. The FMR linewidth
isgivenby[31]:
H
PP
= L tanh
E
2kT
, L =
5gβSn
D
3
(1)
where
n is the number of magnetic centers, g is the
gyromagnetic factor,
D is the average intergrain distance, S
is the effective spin of the magnetic centers and E is the
energy barrier. Therefore,
L remains unchanged and the main
contribution to
H
PP
would be E. The weakening of the
magnetic coupling is the possible reason for the observed
decrease in the linewidth [30, 32].
In general, for a system of superparamagnetic particles
with statistical distribution of shapes and sizes, there is a
simple relationship between
n, the exponent of δ H
resonance
∼
(H
PP
)
n
, and the structural organization of the particles [33]:
n = 2 for partially oriented and n = 3 for randomly oriented
particles. To examine this power relationship, the data were
plotted as shown in figure 6 on a double logarithmic scale.
From the adjusted slope of
n ∼ 3(3.1), it is concluded that the
behavior of the magnetite nanoparticles is superparamagnetic,
isolated, and randomly oriented.
The number of unpaired electron spins in the sample
is proportional to the area under the absorption of FMR,
determined by
(H
PP
)
2
where is the peak-to-peak
height [34]. It is seen in figure 7 that the number of spins
decreased with the increase of temperature.
The spin relaxation process is characterized using a time
constant which is a function of the static magnetic field and
is dependent on the rate of absorption and dissipation of the
microwave energy. The spin–spin relaxation process is the
energy difference
E transferred to the neighboring electrons.
The relaxation time
T
2
can be determined from the peak-to-
peak linewidth according to the following equation, expressed
in units s
−1
:
1
T
2
=
√
3gβH
PP
¯
h
,
(2)
where
¯
h
is the Planck’s constant divided by 2π.
Figure 7 shows the variation of
T
2
with temperature.
The dipole–dipole interaction between the particles and the
super-exchange interaction between the magnetic ions through
oxygen ions are the two predominant factors which determine
the resonance parameters: the gyromagnetic
g-factor and
H
PP
. Strong dipolar interactions result in high values of
H
PP
and g-factor. In addition, a strong super-exchange
interaction produces small values of
H
PP
and g-factor [35].
The increase of temperature should increase the motion
of electrons, causing a stronger super-exchange interaction
between the cations through oxygen ions and thus a decrease
in
H
PP
and g-factor. Consequently, T
2
increases with the
increase in temperature. Another interesting observation is
the change of the log
δ H slope with temperature, as shown in
figure 7, with evidence of two types of relaxation rates. The
change in the relaxation rate of the superparamagnetic iron
oxide at
T = 75 K can be related with the change of magnetic
susceptibility [36]. The immediate interpretation is the change
from a partially oriented to a randomly oriented spin behavior.
It is closely analogous to the behavior of a glass crossing the
glass transition temperature
T
g
, but this phenomenon needs
further investigation.
4. Conclusion
From the ZFC and FC magnetization measurements, the
transition to a blocked state was observed at the temperature
T
B
= (43 ±1) K for frozen ferrofluid and at (52 ±1) Kforthe
lyophilized ferrofluid samples, showing the effects of dipolar
interactions in distributions of samples with identical size. The
magnetization results as a function of the external field showed
that for temperatures
T > T
B
the hysteresis cycle did not
exhibit coercivity, indicating the superparamagnetic behavior
of the material. However, on cooling below the blocking
temperature, the magnetization of the sample increased and the
hysteresis cycle became symmetric, showing a phase transition
from the superparamagnetic to the ferromagnetic state.
The analysis of the FMR spectra of the ferrofluid
measured in the range of temperatures 4–300 K confirmed the
superparamagnetic state above
T
B
and the strong dependence
of the parameters H
PP
, g-factor, N
S
,andT
2
on temperature.
It is known that this behavior of the measured parameters is
strongly governed by super-exchange interaction.
Acknowledgments
This work was supported by Instituto Israelita de Ensino e
Pesquisa Albert Einstein and the Brazilian agencies FAPESP
and CNPq.
5
J. Phys.: Condens. Matter 21 (2009) 000000 L F Gamarra et al
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6
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Journal: JPhysCM
Author: L F Gamarra et al
Short title: Magnetic characterization by SQUID and
FMR of a biocompatible ferrofluid based on Fe
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O
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APÊNDICE B
GAMARRA, L.F. et al. Quantitative ferromagnetic resonance analysis of
CD133 stem cells labeled with iron oxide nanoparticles. Journal of
Physics:condensed matter, v.20, n.204150, p.1-6, 2008.
IOP PUBLISHING JOURNAL OF PHYSICS: CONDENSED MATTER
J. Phys.: Condens. Matter 20 (2008) 204150 (6pp) doi:10.1088/0953-8984/20/20/204150
Quantitative ferromagnetic resonance
analysis of
CD133 stem cells labeled with
iron oxide nanoparticles
L F Gamarra
1
,LFPavon
1
,LCMarti
1
, W M Pontuschka
2
,
JBMamani
2
, A J Costa-Filho
3
, E D Vieira
3
, C A Moreira-Filho
1,4
and E Amaro Jr
1,5
1
Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein, IIEPAE,
S˜ao Paulo 05651-901, Brazil
2
Instituto de F´ısica, Universidade de S˜ao Paulo, S˜ao Paulo 05315-970, Brazil
3
Instituto de F´ısica de S˜ao Carlos, Universidade de S˜ao Paulo, S˜ao Carlos 13560-970, Brazil
4
Instituto de Ciˆencias Biom´edicas, Universidade de S˜ao Paulo-USP, S˜ao Paulo, Brazil
5
Instituto de Radiologia, Faculdade de Medicina, Universidade de S˜ao Paulo 05403-001,
Brazil
E-mail: lgamarra@einstein.br
Received 4 April 2008
Published 1 May 2008
Online at stacks.iop.org/JPhysCM/20/204150
Abstract
The aim of this work is to provide a quantitative method for analysis of the concentration of
superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION), determined by means of ferromagnetic
resonance (FMR), with the nanoparticles coupled to a specific antibody (
AC133), and thus to
express the antigenic labeling evidence for the stem cells
CD133
+
. The FMR efficiency and
sensitivity were proven adequate for detecting and quantifying the low amounts of iron content
in the
CD133
+
cells (∼6.16 ×10
5
pg in the volume of 2 μl containing 4.5 × 10
11
SPION).
The quantitative method led to the result of 1
.70 ×10
−13
mol of Fe (9.5 pg), or 7.0 ×10
6
nanoparticles per cell. For the quantification analysis via the FMR technique it was necessary to
carry out a preliminary quantitative visualization of iron oxide-labeled cells in order to ensure
that the nanoparticles coupled to the antibodies are indeed tied to the antigen at the stem cell
surface and that the cellular morphology was conserved, as proof of the validity of this method.
The quantitative analysis by means of FMR is necessary for determining the signal intensity for
the study of molecular imaging by means of magnetic resonance imaging (MRI).
1. Introduction
The use of superparamagnetic iron oxide nanoparticles
(SPION), coupled to a specific antibody, has been successfully
applied to label antigenic probes in molecular imaging,
especially magnetic resonance imaging (MRI) [1–3].
The cell in culture labeling with SPION, together with
MRI, provides a non-invasive method for study of the
destinations of cells transplanted in vivo [4, 5]. The cells may
be labeled using contrast agents on the basis on nanoparticles,
during their incubation in a culture, before their transplantation
into tissue.
Superparamagnetic (magnetic fluid) contrast agents with
a superparamagnetic core consisted of crystalline structures
based on iron oxide, described by the general formula
Fe
3+
2
O
3
M
2+
O, where M
2+
is a divalent metal ion such
as iron, manganese, nickel, cobalt or magnesium. For
the synthesis of the contrast agents, small Fe
3+
2
O
3
Fe
2+
O
(magnetite) crystals are mainly employed [6]. Preparatory
processes are of paramount importance—before the acquisition
of molecular images based on MRI of the stem cells labeled
with SPION. The process can be divided into the following
parts: quantitative evaluation and qualitative expression of
the antigens [3, 7], labeling efficiency [3, 8, 9], SPION
toxicity [8–10], cell viability [3, 9], proliferation [3, 8, 9]
and differentiation assays [8], qualitative visualization of
iron oxide-labeled cells [3], iron content quantitative
analysis [11, 12], among others.
0953-8984/08/204150+06$30.00 © 2008 IOP Publishing Ltd Printed in the UK1
J. Phys.: Condens. Matter 20 (2008) 204150 L F Gamarra et al
There are several techniques for performing iron content
quantitative analyses [11, 12], such as that using ferromagnetic
resonance (FMR) which is the electron paramagnetic
resonance (EPR) of small ferromagnetic particles. The only
difference is that the electron spins interact among themselves
in the lattice. This leads to a ferromagnetic or ferrimagnetic
order in the nanoparticles, assumed to be composed of
magnetic monodomains and having nearly spherical shape.
Thus, the total magnetic momentum of each nanoparticle is
precessing over the direction of the total static field, which is
the sum of the external static field, the internal contribution of
the domain magnetization and the anisotropic magnetic field
of the local lattice [13]. The magnetic fluids based on SPION
present physical mechanisms that are essentially the same for
ferromagnetic solids and magnetic suspensions. However,
in the ferrofluids the FMR is affected considerably by two
specific characteristics. The first one stems from the smallness
of the particles, and imparts a fluctuational component to
the magnetic moment motion. The second originates from
mechanical mobility of the particles and results in a change
of their anisotropy axis distribution under the influence of the
external fields [14].
For the molecular imaging purposes, a great deal of
interest has been focused on
CD133 stem cell labeling. This
antigen may be expressed in a variety of tissues including the
kidney, pancreas, placenta, fetal liver [15], skeletal muscles
and human neural tissue. This vast number of tissues suggests
an equal number of possible clinical applications, including,
among other interesting possibilities, the utilization of the
progenitor stem cells
CD133
+
in tissue engineering. The
antigen
CD133 is an integral glycoprotein of a 97 kDa
membrane that belongs to a molecular family of proteins 5-
TM [15, 16]. In the human body, the monoclonal antibodies
AC133 may be bonded together in different epitopes, but they
were originally demonstrated to react with a cellular surface
antigen expressed in human stem cells and in various cellular
progenitors, including those derived from the hematopoietic
system [15].
The aim of the present work is the quantitative analysis of
the SPION (Fe
3
O
4
) concentration by means of FMR, where the
nanoparticles are coupled to a specific monoclonal antibody
(
AC133) expressing the antigenic labeling evidence of the
stem cells
CD133
+
of the human blood and umbilical cord.
The study is completed using the techniques of flow cytometry
and transmission electron microscopy (TEM).
We first carried out a study to determine whether the cells
were actually expressing the trans-membrane glycoprotein
antigen
CD133, selected by affinity chromatography. The
second point was to establish the efficiency of the selection
procedure. The TEM analysis was used to detect the presence
of antibodies coupled with SPION attached on the cellular
membrane.
2. Materials and methods
The CD133 cell labeling was achieved by an in vitro
protocol using the monoclonal antibody anti-
CD133 coupled
to magnetic beads composed of SPION—Fe
3
O
4
(Miltenyi
Biotec). These nanoparticles (average diameter of 9
.0 ±
0.3 nm) are found in a colloidal suspension of a ferrofluid, or
magnetic fluid with the iron content of 200
μgml
−1
. Umbilical
cord blood was obtained from volunteer donors (
n = 5)
after the registering of their written consent (CEP-IEPAE
No. 105/02). Mononuclear cells were purified by density
gradient centrifugation (Ficoll-Paque
™ Plus (GE Healthcare)),
according to a modified method published previously [17]. The
CD133
+
cell population was purified using anti-CD133 mAb-
coupled magnetic beads (Miltenyi Biotec) according to the
manufacture’s instructions.
After
CD133
+
cell separation, the cell population
was characterized by flow cytometry using the following
monoclonal antibodies (Becton Dickinson, San Jose, CA, and
Miltenyi Biotec):
CD34 (clone: 581) FITC-conjugated, CD45
(clone: 2D1) PerCP Cy-5.5-conjugated and
CD133/2 (clone:
AC141) APC-conjugated and the respective isotype controls
IgG1 FITC-conjugated, IgG1 PerCP Cy-5.5-conjugated and
IgG1 APC-conjugated.
Cells were incubated with antibodies at 4
◦
C, in the
dark for 30 min, and then washed with PBS and fixed with
1% paraformaldehyde. A total of 105 fluorescent cellular
events were acquired in the FACSARIA flow cytometry (BD
Bioscience) and analyzed using FACSDIVA software. Briefly,
the analysis was performed by gating the cell population
for forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) followed
by gating only the
CD45
+
cells. Within the CD45
+
cell
population, cells were analyzed for expression of
CD34 and
CD133 markers.
After
CD133 cell separation, the cell population was fixed
in 2
.5% glutaraldehyde in 0.2 M cacodylate buffer for 2 h
at 4
◦
C. Later the routine procedure for TEM was carried
out, including washes, post-fixation, contrasting, dehydration
and inclusion in pure resin until complete polymerization
was achieved. Semithin and ultrathin sections were obtained
with the aid of a Porter Blum ultramicrotome. The ultrathin
sections were placed on copper grids and photographed using
a transmission electron microscope, PHILIPS
CM100.
The quantification of the average iron content per cell,
expressed as the average number of SPION per cell, was
attained by means of the technique of FMR. The characteristic
FMR of a ferrofluid compound, containing magnetite particles,
is observed as a broad line at about
g = 2.1. Since the
resonance spectrum is recorded as the derivative of absorption,
the number of resonant spins is proportional to the double
integral of the signal, yielding the area under the absorption
curve, measured over increasing values of the applied magnetic
field, sweeping the complete interval where the resonance
occurs. The constant of proportionality is determined using the
calibration curve, constructed by weighing known amounts of
ferrofluid which are directly correlated with the FMR signal
intensities equal to the areas under the absorption curves,
expressed in arbitrary units.
The calibration curve shown in figure 1 was constructed
using different concentrations of the commercial ferrofluid
Endorem (Endorem
™—Guerbert; earlier trade name AMI-
25, Laboratoire Guerbert, France). The concentrations covered
a range of 2
.6 μM–0.6 mM contained in the volume of 2 μl.
2
J. Phys.: Condens. Matter 20 (2008) 204150 L F Gamarra et al
Figure 1. Calibration curves of the FMR of the nanoparticle
concentration related to the area under the
g = 2.1 resonance
absorption curve. The inset shows a typical FMR spectrum of the
g = 2.1 line of magnetite contained in the ferrofluid Endorem™ used
in the data acquisition for the building of the curve calibration.
A typical FMR spectrum of the commercial ferrofluid is shown
in the inset of figure 1.
The FMR line intensity was determined from the area
under the absorption line (double integral of the resonance
at g = 2.1), which is proportional to the iron particle
concentration per mm
3
. This calibration curve is shown
in figure 1 (solid line). The FMR derivative of the
absorption spectrum is used to calculate the calibration curve,
obtained at room temperature (inset in figure 1). The
absorption lineshape is typical of a convoluted cubic crystal
powder pattern of the FMR of fine-grained precipitates of
ferromagnetic or ferrimagnetic single domains [18], also seen
when iron ion (Fe
3+
and Fe
2+
) dimers and/or clusters are
precipitated in glasses [19]. From this curve a positive first-
order magnetocrystalline anisotropy constant
K
1
= (1.2 ±
0.2) × 10
5
erg cm
−3
was determined from the relation H
a
=
2K
1
/M
s
, taking into account that the nanoparticles are of
magnetite.
M
s
is the maximum saturation magnetization of
the crystal, equal to
H
s
/(4π/3) erg G
−1
cm
−3
and H
s
≈
2 kG for magnetite. The nanoparticles were assumed to
be monodomains of spherical shape. From the maximum
(
H
max
), minimum (H
min
) wings and maximum negative slope
(
H
ms
) of the FMR spectrum, respectively, the effective g-
values are
g
[100]
= 2.28 ± 0.01, g
[110]
= 2.02 ± 0.02 and
g
[111]
= 1.94 ± 0.01. The value of H
a
is obtained from
the field separation between the positions of
H
max
and H
min
wings (equal to (5/3)H
a
). From H
0
= H
max
− (2/3)H
a
the
value of
g
0
= (hν/(βH
0
)) = 2.12 ± 0.02 is obtained, where
ν = 9.428 GHz, h is Planck’s constant, ν is the spectrometer
frequency and
β is the Bohr magnetron.
The derivative of the absorption of the FMR was obtained
using a Bruker EMX homodyne spectrometer, operating in the
X band, at the frequency of 9
.428 GHz, using a rectangular
TE
102
cavity with 100 kHz modulation.
3. Results and discussion
In our sample 98% of the cells were expressed by CD45,
which characterizes their hematopoietic source (data not
shown). After the selection of
CD45
+
events, the expression
of
CD34 (progenitor marker) was analyzed; it was found
that 82% of all
CD133
+
selected cells also express CD34
(figure 2(A)) indicating their progenitor phenotype. The
specificity of the test was considered adequate from the
negative result found in the isotype control (figure 2(B)). The
efficiency of
CD133 selection after flow cytometry analyses
was 83
.6%.
The ultrastructural analysis highlighted the presence
of electron dense granules in the cell surface. This
demonstrates the presence of
AC133 monoclonal antibodies
bound to SPION expressed in the cell membrane (
CD133
+
;
figures 3(A), (B), (E)) which does not occur in the cells of the
control group (figure 3(G)), since these cells do not express the
antigen
CD133 (CD133
−
).
The
CD133
+
cells have a round morphology and an
active nucleus that occupies almost the whole cell (figures 3(A)
and (B)).
Figure 2. (A) The flow cytometry graph shows CD133
+
/CD34
+
(82.0%), CD133
−
/CD34
+
(1.6%) and CD34
+
CD133
−
(9.2%).
(B) The isotype control graph shows that there was no non-specific staining.
(This figure is in colour only in the electronic version)
3
J. Phys.: Condens. Matter 20 (2008) 204150 L F Gamarra et al
Figure 3. ((A)–(F)) TEM of CD133
+
stem cells. (G) TEM of CD133
−
stem cells (control). n = nucleus, c = cytoplasm,
arrow
= electron dense granules. Scale: ((A), (G)) 1 μm; ((B), (C), (E), (F)) 0.25 μm; (D) 0.5 μm.
The SPION were also observed in the cell cytoplasm
(figure 3(C)). These nanoparticles bound to the antibodies
expressed in the cellular membrane were more probably
incorporated into the cell through the endocytosis process
(pinocytosis). They can be visualized using TEM as electron
dense particles (figure 3(C)).
Preliminary experiments performed by our group showed
a strong marking, electron dense in the periphery of the
cellular content, but the morphology of cell
CD133
+
was not
preserved (figure 3(D)), probably due to insufficient fixation
of the material for 2
.5% glutaraldehyde in 0.2 M cacodylate
buffer.
The TEM also revealed an excess of nanoparticles electron
dense in the cellular membrane, as well as in the cytoplasm
(figures 3(C), (F)).
First, we obtained the FMR spectrum only for the
magnetic beads (see figure 4) of the antigenic label, i.e.,
monoclonal antibody anti-
CD133, coupled to the SPION
(Miltenyi Biotec). The resonance was observed at
g = 2.1,
indicating the presence of multiple Fe
3+
spins interacting
and showing a superparamagnetic behavior [20, 21], which
characterizes the presence of agglomerates. This signal
consists of a strong absorption, broadened by the exchange
interaction between the Fe
3+
spins. A control sample with
4
J. Phys.: Condens. Matter 20 (2008) 204150 L F Gamarra et al
Figure 4. (A) FMR spectra, showing the derivative of the absorption curve of the isolated label, labeled cells, non-labeled control cells and
the glutaraldehyde. In the inset the resonance is compared with the enhanced spectrum of a control sample. (B) FMR derivative of the
absorption spectrum of SPION attached to the
CD133
+
cells that exhibit high electron densities in the cell periphery, as shown in the
TEM image of the inset.
CD133 control cells with no label was measured by means
of FMR and no resonance could be observed (see figure 4(A)).
Subsequently an FMR spectrum of the labeled
CD133
+
cells (0.64 ×10
5
labeled cells contained in the volume of 2 μl)
showed the resonance at
g = 2.1 (see figure 4(A)). This again
demonstrated the presence of SPION in the cells immersed in
the fixer glutaraldehyde 2.5%, attached to the cells as shown in
figure 4(A).
In order to be sure that the nanoparticles were not present
in the fixer, the latter was separated from the labeled cells
by 1200 rpm centrifugation, for 10 min, and the floating
substance was carefully removed. The FMR spectrum of the
fixer in the glutaraldehyde was taken and the absence of SPION
was confirmed (inset of figure 4(A)). This result was already
expected from the TEM morphological study, where it was
observed that the antibody coupled to the nanoparticles was
found tied to the
CD133
+
cells.
The quantification of the average iron content per cell
was determined from the area under the FMR absorption
curves of the labeled cells (figure 4(A)), by interpolation of
the calibration curve of figure 1. The iron content per cell was
1
.70 ×10
−13
mol (9.5 pg) or 7.0 ×10
6
nanoparticles per cell.
For the quantification by means of FMR of the number of
nanoparticles per cell, it was necessary to carry out a qualitative
visualization of iron oxide-labeled cells. This was necessary
in order to ensure that the nanoparticles coupled to antibodies
were attached to the surface antigen of the stem cell, providing
confirmatory information.
The FMR spectrum (figure 4(B)) of the
CD133
+
sample
confirmed a strong labeling of dense electron regions in the
periphery of the cell (see the inset of figure 4(B)). Moreover,
we have observed that the morphology was not conserved,
as explained previously. For all cells the FMR signal of
SPION was due to the nanoparticles coupled to the antibodies
which in turn are bonded into the cells. The analysis of
the signal obtained for the quantification gives the result of
1
.64 × 10
−13
mol of iron (9.4 pg) or 6.8 × 10
6
nanoparticles
per cell, in good agreement with the values obtained with well
labeled cells, for example, those of figures 3(B) and (G). It
is then necessary to perform a morphological analysis before
performing the quantitative FMR measurements.
4. Conclusion
The FMR method is an efficient technique for the
quantification of the iron concentration in stem cells. In
this work, FMR has allowed us to quantify the SPION
concentration in the
CD133
+
cells of small samples (volume
of the order of
μl). In practice, for ferromagnetic particles,
an area unit can be accurately measured, being equal to the
number of 4
.5 ×10
11
nanoparticles contained in the volume of
2
μl or about 6.16 ×10
5
pg of iron.
The information obtained from the FMR spectra of the
CD133
+
stem cells is similar to that obtained from the cells
where the morphology was not conserved. Thus, in order
for the FMR quantification method be valid, it is necessary
to perform a preliminary test of a qualitative visualization of
iron oxide-labeled cells (TEM), in order to make sure that the
nanoparticles coupled to the antibodies are effectively tied to
the antigen located at the surface of the stem cell, and that the
morphology of the cell was preserved.
Acknowledgments
This work was financed by Instituto Israelita de Ensino e
Pesquisa Albert Einstein (IIEP) and CNPq. We are grateful
to Lab. de Microscopia Eletrˆonica, UNESP de Rio Claro, SP-
Brazil, and Monika Iamonte for technical support.
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