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VANESSA ROCHA
ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS TERMOSSENSÍVEIS
ATRAVÉS DE APLICAÇÃO DE PLASMA GERADO POR
DESCARGA COM BARREIRA DIELÉTRICA (DBD)
Dissertação apresentada à Faculdade de
Engenharia do Campus de Guaratinguetá,
Universidade Estadual Paulista, para a
obtenção do título de Mestre em Física na
área de Aplicação Tecnológica de Plasma.
Orientador: Prof. Dr. Konstantin Georgiev Kostov
Guaratinguetá
2009
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DADOS CURRICULARES
VANESSA ROCHA
NASCIMENTO 19.11.1982 – LIMEIRA / SP
FILIAÇÃO Sérgio Rocha
Ana Maria Kühl Rocha
2003/2006 Curso de Graduação
Física Médica no Instituto de Biociências do Campus
de Botucatu, Universidade Estadual Paulista – Unesp.
2007/2009 Curso de Pós-Graduação em Física, nível de Mestrado,
na Faculdade de Engenharia do Campus de
Guaratinguetá da Universidade Estadual Paulista.
de modo especial, à milha família que foi a grande incentivadora e apoiadora para que
eu continuasse meus estudos.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, fonte da vida, pela minha vida, minha
inteligência, minha família e meus amigos.
aos meus pais Sérgio e Ana, que apesar das dificuldades enfrentadas, sempre
incentivaram meus estudos,
ao meu orientador, Prof. Dr. Konstantin Georgiev Kostov por todo incentivo,
orientação, dedicação e auxílio, para que o estudo aqui apresentado pudesse ser
efetuado,
ao Prof. Dr. Roberto Yzumi Honda, por todo auxilio prestado,
ao Prof. Dr. Maurício Antônio Algatti pelas contribuições nesse estudo,
ao Prof. Dr. Rogério Pinto Mota por todo apoio dado,
ao técnico José Benedito Galhardo, pela grande ajuda prestada,
à Prof. Dra. Cristiane Yumi Koga Ito, por toda dedicação e auxílio no nosso
estudo e experimentação microbiológica,
ao Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia da Unesp de São
José dos Campos pelo apoio na realização da parte biológica dos experimentos, em
particular nas pessoas dos mestrandos Bruno Mello Matos e Guilherme Rodrigues
Teodoro, por todo auxilio prestado na parte microbiológica do trabalho.
Este trabalho contou com apoio da entidade
- CAPES, através do Programa de Fomento à Pós-Graduação (PROF).
“Há três maneiras de agir sabiamente:
a primeira pela meditação, que é a mais sábia
a segunda pela imitação, que é a mais fácil
a terceira pela experiência, que é a mais amarga”
Confúcio
ROCHA, V. Esterilização de materiais termossensíveis através da aplicação de
plasma gerado por Descarga com Barreira Dielétrica (DBD). 2009. 160f.
Dissertação (Mestrado em Física) – Faculdade de Engenharia do Campus de
Guaratinguetá, Universidade Estadual Paulista, Guaratinguetá, 2009.
RESUMO
Este trabalho teve por objetivo estudar a propriedade do plasma em pressão
atmosférica para esterilização de materiais termossensíveis. Para testar a propriedade
do plasma frio de esterilizar materiais termossensíveis, concentramos nossos
experimentos no plasma gerado por descarga com barreira dielétrica (DBD). Para
realizar nossos experimentos usamos os microrganismos Cândida albicans
ATCC18804, Escherichia coli ATCC23922, Bacillus subtilis ATCC19659, e
Staphylococcus aureus ATCC 6538. Primeiramente, realizamos descarga DBD sobre
uma placa de microtitulação contendo suspensões de microrganismos, mas
observamos que, neste caso, a descarga DBD não teve eficácia na esterilização, devido
a não penetração das entidades reativas (ozônio, UV), dentro desse volume de
microrganismos. Modificamos nosso sistema, colocando um eletrodo adaptado a uma
placa de Petri, e aplicamos a descarga DBD sobre os microrganismos em suspensão
semeados em Agar. Realizamos exposição de 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, com 1,1W de
potência, tensão de 40kV pico-a-pico e aproximadamente 1 cm de distância entre o
eletrodo superior e o meio de cultura. Observamos o crescimento dos meios de cultura
tratados (contagem de UFC) e analisamos a morfologia dos microrganismos tratados
em comparação com as amostras sem tratamento, através de microscopia eletrônica de
varredura (MEV). Através desses experimentos, pudemos observar que, no caso de
superfícies, o plasma é um método de esterilização eficiente e rápido. Isso porque,
durante a descarga são formados ozônio, fótons UV, e partículas livres carregadas, que
podem contribuir para o efeito esterilizante.
PALAVRAS-CHAVE: Esterilização, plasma, Descarga com Barreira Dielétrica
(DBD).
ROCHA, V. Sterilization of termosensitive materials through plasma generated
by a Dielectric Barrier Discharge (DBD). 2009. 160f. Dissertation (Master's degree
in Physics) - University of Engineering of the Campus of Guaratinguetá, from São
Paulo State University, Guaratinguetá, 2009.
ABSTRACT
The objective of this work was to investigate the application of plasma at
atmospheric pressure for sterilization of termosensitive materials. To test the capability
of cold plasma to sterilize termosensitive materials, we concentrated our study on the
plasma generated by a dielectric barrier discharge (DBD). In our experiments we used
the microorganisms Candida albicans ATCC18804, Escherichia coli ATCC23922,
Bacillus subtilis ATCC19659, and Staphylococcus aureus ATCC 6538. Firstly, we
produce a DBD discharge in a microtitulation plate containing suspensions of the
microorganism and no sterilization effect was observed. This is due to the fact that no
penetration of the reactivates species (ozone, UV) inside of the volume of
microorganisms. We modified our system, putting an adapted electrode on the cover of
a Petri plate, and we applied the DBD discharge on microorganisms in suspension
sowed in Agar. We used different times of treatment (2, 5, 10, 15 and 20 minutes),
with mean power of 1,1W, 40kV pick-to-pick voltage and approximately 1 cm of
distance between the superior electrode and the culture media. We evaluate the growth
on the treated culture media (counting the colony-forming unit - CFU) and also
analyzed the morphology of the treated microorganisms in comparison with the
samples without treatment, through scanning electronic microscopy (SEM). Through
these experiments, we could observe that, applied on a surfaces, the plasma is an
efficient and fast sterilization method. This is because during the discharge are formed
ozone, UV photons, and free particles, that can contribute to the effect of sterilization.
KEYWORDS: Sterilization, plasma, Dielectric Barrier Discharge (DBD).
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 3.1 – Matéria no estado gasoso e no estado de plasma ............................ 34
FIGURA 3.2 – (a) Sol emitindo radiação eletromagnética na faixa do ultravioleta
distante, (b) Efeito de blindagem de potenciais elétricos em plasmas, (c)
Resultante da força elétrica devido às várias n partículas carregadas numa dada
carga A. ..................................................................................................................... 38
FIGURA 3.3 – Evolução da temperatura do plasma (elétrons e partículas pesadas)
com a pressão, em um arco de plasma de mercúrio ................................................. 44
FIGURA 3.4 – Diagrama Temperatura-Densidade, mostrando os diferentes tipos de
plasma ....................................................................................................................... 45
FIGURA 3.5 – Configurações diferentes de reator com descarga DBD. ................ 48
FIGURA 3.6 – A forma típica da corrente e da voltagem de descarga DBD obtida
pelo reator de plasma que opera no laboratório de Plasma, FEG, UNESP. ............. 50
FIGURA 3.7 – Foto de micro-descargas em um reator de plasma com barreira
dielétrica. .................................................................................................................. 50
FIGURA 3.8 – Figura de Lissajous para o reator de plasma aplicado sobre uma
placa de microtitulação do laboratório de Plasma, FEG, UNESP ........................... 51
FIGURA 4.1 – Ilustração das três fases características da curva de sobrevivência dos
microrganismos proposta por Moisan et al. 2001 .................................................... 59
FIGURA 4.2 – S. aureus (a) amostra sem tratamento (b) 120 s de exposição ao plasma,
(c) 10 min. de exposição ao ozônio, e (d) 30 min. de exposição à lâmpada UV ..... 66
FIGURA 4.3 – E. coli (a) amostra sem tratamento (b) 120s de exposição ao plasma,
(c) 10 min. de exposição ao ozônio, e (d) 30 min. de exposição à lâmpada UV. ... 66
FIGURA 4.4 – Esquema da descarga DBD usada no experimento citado .............. 67
FIGURA 4.5 – Imagem de TEM feitas por Yue Ma et al. 2008:
(a) S. aureus antes do tratamento por plasma,
(b) S. aureus depois do tratamento por plasma,
(c) S. aureus antes do tratamento por plasma,
(d) S. aureus depois do tratamento por plasma. ...................................................... 73
FIGURA 4.6 – Imagem de SEM de E. coli com aumento de 2000 vezes
dos tratamentos de (a) 0 segundo, (b) 10 segundos, (c) 30 segundos,
(d) 50 segundos, (e) 70 segundos. (feitos por Choi et at. 2006). .............................. 76
FIGURA 4.7 – Imagem de SEM de E. coli com aumento de 10000 vezes
dos tratamentos de (a) 0 segundo, (b) 10 segundos, (c) 30 segundos,
(d) 50 segundos, (e) 70 segundos. (feitos por Choi et at. 2006). .............................. 76
FIGURA 4.8 – Diagrama esquemático do aparato de esterilização
para distinguir entre dano físico e químico na bactéria tratada com plasma. ........... 77
FIGURA 5.1 – Auto transformador Variac e transformador de alta tensão ............ 83
FIGURA 5.2 – Circuito de obtenção de medidas elétricas ...................................... 83
FIGURA 5.3 – Esquema do circuito de obtenção de medidas elétricas .................. 84
FIGURA 5.4 – Gráfico da curva de calibração de tensão do experimento .............. 85
FIGURA 5.5 – Configuração do reator formado pela placa de microtitulação ....... 87
FIGURA 5.6 – Configuração do reator formado interno a placa de Petri ............... 89
FIGURA 5.7 – Aparato experimental com eletrodo sobre tampa de vidro. ............. 91
FIGURA 5.8 – Reator de plasma e formação de descarga DBD ............................. 91
FIGURA 5.9 – Aparato experimental com eletrodo sobre tampa de plástico. ......... 92
FIGURA 6.1 – Figura de Lissajous para o experimento com placa de micro
titulação contendo suspensão em solução salina, com área compreendida de
92,51mJ ................................................................................................................... 96
FIGURA 6.2 – Figura de Lissajous para o experimento com placa de micro
titulação com suspensão em água, com área compreendida de 5,83mJ ................... 98
FIGURA 6.3 – Crescimento de C. albicans no Agar tratado ................................... 99
FIGURA 6.4 – Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões semeadas
Com área compreendida de 62,90mJ........................................................................ 100
FIGURA 6.5 – Crescimento de C. albicans em suspensões semeadas
tratadas com plasma, comparado com suspensões semeadas sem tratamento ......... 100
FIGURA 6.6 – Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões sobre
lamínulas, com área compreendida de 34,87mJ ....................................................... 101
FIGURA 6.7 – Crescimento de C. albicans em suspensões sobre lamínulas tratadas
com plasma, comparada com suspensões sobre lamínulas sem tratamento. ........... 102
FIGURA 6.8 – Crescimento de C. albicans tratadas com plasma, comparado
a culturas sem tratamento. ....................................................................................... 103
FIGURA 6.9 – Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões semeadas com
eletrodo sobre tampa de vidro, com área compreendida de 66,42mJ ...................... 104
FIGURA 6.10 –
Crescimento de C. albicans em suspensões semeadas tratadas
com plasma em 2, 5, 10 e 15 minutos (em duplicata).. ............................................ 104
FIGURA 6.11 – Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões
semeadas com eletrodo sobre tampa da placa de Petri ............................................. 105
FIGURA 6.12 – Crescimento de C. albicans com duplicata do a) controle, e com
tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos ................ 108
FIGURA 6.13 – Curva de sobrevivência de C. albicans ATCC18804 .................... 109
FIGURA 6.14 – Crescimento de C. albicans com duplicata do a) controle,
e com tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos,
f) 20 minutos ............................................................................................................. 111
FIGURA 6.15 – Curva de sobrevivência de C. albicans ATCC18804 .................... 112
FIGURA 6.16 – Exemplo de MEV de microrganismo C. albicans ......................... 113
FIGURA 6.17 – MEV com aumento de 2000x de C. albicans: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 114
FIGURA 6.18 – MEV com aumento de 7500x de C. albicans: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 115
FIGURA 6.19 – MEV com aumento de 15000x de C. albicans:
a) tratada em água, b) controle em água ................................................................... 116
FIGURA 6.20 – Crescimento de E. coli com duplicata do a) controle, e com
tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos ................ 118
FIGURA 6.21 – Curva de sobrevivência de E. coli
ATCC23922 ............................ 119
FIGURA 6.22 – Crescimento de E. coli com duplicata do a) controle, e com
tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos ................ 121
FIGURA 6.23 – Curva de sobrevivência de E. coli ATCC23922 ........................... 122
FIGURA 6.24 – Exemplo de MEV de microrganismo E. coli................................. 123
FIGURA 6.25 – MEV com aumento de 2000x de E. coli: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 124
FIGURA 6.26 – MEV com aumento de 7500x de E. coli: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 125
FIGURA 6.27 – MEV com aumento de 15000x de E. coli: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 126
FIGURA 6.28 – Crescimento de S. aureus com duplicata do a) controle,
e com tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos,
f) 20 minutos ............................................................................................................. 129
FIGURA 6.29 – Curva de sobrevivência de S. aureus ATCC 6538 ........................ 130
FIGURA 6.30 – Crescimento de S. aureus com duplicata do a) controle,
e com tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos,
f) 20 minutos ............................................................................................................. 132
FIGURA 6.31 – Curva de sobrevivência de S. aureus ATCC 6538 ........................ 133
FIGURA 6.32 – Exemplo de MEV de microrganismo S. aureus ............................ 134
FIGURA 6.33 – MEV com aumento de 2000x de S. aureus: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 135
FIGURA 6.34 – MEV com aumento de 7500x de S. aureus: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 136
FIGURA 6.35 – MEV com aumento de 15000x de S. aureus: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 137
FIGURA 6.36 – Crescimento de B. subtilis com duplicata do a) controle,
e com tratamentos de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos,
f) 20 minutos ............................................................................................................. 140
FIGURA 6.37 – Curva de sobrevivência de B. subtilis ATCC19659 ...................... 141
FIGURA 6.38 – Exemplo de MEV de microrganismo B.subtilis ............................ 142
FIGURA 6.39 – MEV com aumento de 2000x de B.subtilis: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 143
FIGURA 6.40 – MEV com aumento de 7500x de B.subtilis: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 144
FIGURA 6.41 – MEV com aumento de 15000x de B.subtilis: a) tratada em TSB,
b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água ................................. 145
LISTA DE TABELAS
TABELA 4.1 – Densidades típicas dos íons e átomos de oxigênio, de ozônio
e espécies carregadas nas descargas de plasmas ..................................................... 57
TABELA 5.1 – Curva de Calibração de Tensão ...................................................... 85
TABELA 6.1 – Tratamento de C. albicans em Agar úmido .................................... 107
TABELA 6.2 – Tratamento de C. albicans em Agar seco ....................................... 110
TABELA 6.3 – Tratamento de E.coli em Agar úmido ............................................ 117
TABELA 6.4 – Tratamento de E.coli em Agar seco ................................................ 120
TABELA 6.5 – Tratamento de S. aureus em Agar úmido ....................................... 128
TABELA 6.6 – Tratamento de S. aureus em Agar seco .......................................... 131
TABELA 6.7 – Tratamento de B.subtilis em Agar seco .......................................... 139
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS E SÍMBOLOS
DBD -
Descarga com Barreira Dielétrica
UFC -
Unidades Formadoras de Colônias
kHz -
quilohertz
kV -
quilo-volts
µ
C
-
micro Coulomb
Hz -
Hertz
º C -
graus Celsius
mg/ml -
miligramas por mililitro
IF -
Fator de Inativação
UV -
Ultravioleta
nm -
nanômetro
W -
Watts
PBS -
Phosphate buffered saline (Tampão Fosfato-salino)
ppm -
parte por milhão
TSB Tryptone Soya Broth
TSA Tryptone Soya Agar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 19
2 ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS ............................................................... 20
2.1 CONCEITOS IMPORTANTES ......................................................................... 20
2.2 MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO .................................................................. 21
2.2.1 Esterilização por calor seco (Estufa ou Forno de Pasteur) ........................ 22
2.2.2 Esterilização pelo Calor Úmido - Autoclavagem ........................................ 23
2.2.3 Esterilização por radiação gama .................................................................. 24
2.2.4 Esterilização por raios X ............................................................................... 25
2.2.5 Esterilização por radiações não ionizantes (raios UV)............................... 25
2.2.6 Esterilização por formaldeído e vapor de formaldeído ............................. 26
2.2.7 Esterilização por óxido de etileno – ETO .................................................... 27
2.2.8 Esterilização por produção de ozônio proveniente de descargas elétricas
(plasma) ................................................................................................................... 28
2.3 CONTROLE DE ESTERILIZAÇÃO ................................................................ 30
2.3.1 Indicadores ..................................................................................................... 31
2.4 DESINFECÇÃO ................................................................................................. 31
3 FÍSICA DO PLASMA ......................................................................................... 33
3.1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 33
3.2 CONCEITOS BÁSICOS DE IONIZAÇÃO ...................................................... 34
3.3 DEFINIÇÃO DE PLASMA ............................................................................... 37
3.3.1 Neutralidade Macroscópica .......................................................................... 38
3.3.2 Blindagem de Debye ...................................................................................... 39
3.3.3 Freqüência do Plasma ................................................................................... 42
3.4 TIPOS DE PLASMA ......................................................................................... 43
3.4.1 Plasma térmico, ou plasma em equilíbrio ................................................... 45
3.4.2 Plasma não térmico, ou plasma de não equilíbrio ...................................... 46
3.5 PLASMA EM PRESSÃO ATMOSFÉRICA ..................................................... 46
3.5.1 Jato de plasma ................................................................................................ 47
3.5.2 Descarga Corona ........................................................................................... 47
3.5.3 Descarga com Barreira Dielétrica (DBD) ................................................... 48
3.5.1.1 Aplicações da descarga DBD ....................................................................... 52
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 54
4.1 COMPARAÇÃO ENTRE TIPOS DE DESCARGA UTILIZADAS NA
ESTERILIZAÇÃO ................................................................................................... 54
4.1.1 Esterilização pelo uso de descarga corona .................................................. 54
4.1.2 Esterilização pelo uso de descarga glow (ou de brilho) .............................. 54
4.1.3 Esterilização pelo uso de jato de plasma à pressão atmosférica (APPJ) .. 55
4.1.4 Esterilização pelo uso de descarga de barreira resistiva .......................... 55
4.1.5 Esterilização pelo uso de descarga com barreira dielétrica ...................... 56
4.2 CINÉTICA QUÍMICA DA DESCARGA DE PLASMA .................................. 56
4.3 CINÉTICA DO PROCESSO DE INATIVAÇÃO DE BACTÉRIAS ............... 58
4.4 AGENTES DE INATIVAÇÃO DE BACTÉRIAS ............................................ 60
4.4.1 Efeito UV ........................................................................................................ 60
4.4.2 Efeito de Espécies Reativas ........................................................................... 61
4.4.3 Efeito de Partículas Carregadas................................................................... 62
4.5 MECANISMO DE MORTE CELULAR ........................................................... 62
4.6 DESCRIÇÃO DE ALGUNS EXPERIMENTOS REALIZADOS .................... 64
4.6.1 Suspensão em lamínulas lavadas com PBS ................................................. 64
4.6.2 Comparação através de microscopia eletrônica entre esterilização
por plasma, por ozônio e por radiação UV .......................................................... 65
4.6.3 Suspensão em lamínulas úmidas, e com acréscimo de solução salina ...... 67
4.6.4 Análise do estado dos componentes biológicos e bacteriófagos durante
inativação por descarga DBD ................................................................................ 69
4.6.5 Análise de extravasamento de K
+
e ácidos nucléicos após tratamento por
descarga DBD .......................................................................................................... 72
4.6.6 Experimento para comparação entre dano físico e químico nos
microrganismos causados por descarga DBD ...................................................... 75
4.6.7 Coagulação sanguínea e esterilização de tecidos por descarga com
barreira dielétrica no ar usando eletrodo flutuante ............................................ 77
4.6.8 Modelagem matemática da descontaminação por uso da descarga com
barreira dielétrica (DBD) ....................................................................................... 79
5 METODOLOGIA ................................................................................................ 81
5.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ................................................................... 81
5.2 REATOR DE PLASMA ..................................................................................... 82
5.3 PREPARAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA ................................................. 86
5.4 EXPERIMENTO COM SUSPENSÕES EM PLACA DE
MICROTITULAÇÃO .............................................................................................. 86
5.4.1 Placa de microtitulação com suspensões em solução salina ...................... 87
5.4.2 Placa de microtitulação com suspensões em água destilada ..................... 88
5.5 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO DENTRO DA
PLACA DE PETRI ................................................................................................... 88
5.5.1 Teste do Agar ................................................................................................. 89
5.5.1 Tratamento de suspensões semeadas no agar ............................................. 89
5.5.3 Tratamento de suspensões em lamínula ...................................................... 90
5.5.3 Tratamento em microrganismos crescidos ................................................. 90
5.6 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE TAMPA
DE VIDRO ............................................................................................................... 90
5.6.1 Tratamento de Suspensões semeadas no Agar ........................................... 91
5.7 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE A PLACA
DE PETRI ................................................................................................................. 92
5.7.1 Tratamento de Cândida albicans .................................................................. 93
5.7.2 Tratamento de Escherichia coli .................................................................... 93
5.7.3 Tratamento de Bacillus Subtilis .................................................................... 94
5.7.4 Tratamento de Staphylococcus aureus ......................................................... 94
5.8 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV) ............................................................................................. 95
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................... 96
6.1 EXPERIMENTO COM SUSPENSÕES EM PLACA DE
MICROTITULAÇÃO .............................................................................................. 96
6.1.1 Placa de microtitulação com suspensões em solução salina ...................... 96
6.1.2 Placa de microtitulação com suspensões em água destilada ..................... 97
6.2 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO DENTRO DA
PLACA DE PETRI ................................................................................................... 98
6.2.1 Teste do Agar ................................................................................................. 98
6.2.1 Tratamento de suspensões semeadas no Agar ............................................ 99
6.2.3 Tratamento de suspensões em lamínula ...................................................... 101
6.2.3 Tratamento em microrganismos crescidos ................................................. 102
6.3 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE TAMPA
DE VIDRO ............................................................................................................... 103
6.3.1 Tratamento de Suspensões semeadas no Agar ........................................... 103
6.4 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE A PLACA
DE PETRI ................................................................................................................. 105
6.4.1 Tratamento de Cândida albicans .................................................................. 106
6.4.1.1 Tratamento com Agar úmido........................................................................ 106
6.4.1.2 Tratamento com Agar seco ........................................................................... 109
6.4.1.3 Análise da estrutura e morfologia de Cândida albicans .............................. 112
6.4.2 Tratamento de Escherichia coli .................................................................... 116
6.4.2.1 Tratamento com Agar úmido........................................................................ 117
6.4.2.2 Tratamento com Agar seco ........................................................................... 120
6.4.2.3 Análise da estrutura e morfologia de Escherichia coli................................. 122
6.4.3 Tratamento de Staphylococcus aureus ......................................................... 127
6.4.3.1 Tratamento com Agar úmido........................................................................ 127
6.4.3.2 Tratamento com Agar seco ........................................................................... 130
6.4.3.3 Análise da estrutura e morfologia de Staphylococcus aureus ...................... 133
6.4.4 Tratamento de Bacillus Subtilis .................................................................... 138
6.4.4.1 Análise da estrutura e morfologia de Bacillus Subtilis................................. 141
7 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 147
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 151
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ....................................................................... 156
APÊNDICE A – Obtenção da Potência através da figura de Lissajous .................. 158
19
1 INTRODUÇÃO
Esse trabalho tem como objetivo estudar a física do plasma e suas aplicações em
processos de esterilização de materiais termossensíveis.
A esterilização é o processo de inativação de todos os microrganismos presentes
em determinado material ou ambiente. Atualmente, a melhor maneira de garantirmos a
destruição de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o
uso do calor (calor úmido – autoclave, ou seco – estufa, ou forno de Pasteur). Porém
devem ser estudados outros métodos para esterilização de materiais termossensíveis.
No âmbito da esterilização de materiais poliméricos termossensíveis empregados
na fabricação de ampla gama de produtos médicos hospitalares, os processos que
operam sob temperaturas compatíveis com estes materiais, gás de óxido de etileno e
radiação ionizante, agregam desvantagens importantes envolvendo, respectivamente,
aspectos de toxicidade ocupacional, ambiental e ao paciente.
As técnicas de esterilização por plasma oferecem grandes vantagens em relação
aos outros métodos, visto que, são efetivas em reduzir a carga microbiana em
superfícies e se desenvolve em temperatura ambiente, sem a utilização de gases
tóxicos.
Garate et al. 1998 explicou que atualmente o emprego do plasma na esterilização
só tem sido feito na etapa final do ciclo de esterilização com utilização de plasma de
peróxido de hidrogênio ou de ácido peracético, para eliminar os resíduos tóxicos
gerados.
Portanto, é necessário mais estudo para viabilizar o emprego da esterilização de
artigos médico-hospitalares por plasma, visto que ainda é preciso entender como as
variáveis físicas do plasma podem afetar os microrganismos.
20
2 ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS
Neste capítulo apresentaremos conceitos básicos sobre métodos de esterilização e
desinfecção de materiais, analisando as vantagens e desvantagens de cada método.
Esse estudo sobre os métodos de esterilização e desinfecção foi baseado
principalmente em Rutala 1996, Jacobs e Kowatsh 1993, e Kramer et al. 1996.
2.1 CONCEITOS IMPORTANTES
Esterilização é o processo que visa destruição total de todas as formas de vida,
formas vegetativas e esporuladas, de um material ou ambiente, através de métodos
físicos e/ou químicos.
Desinfecção consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos, na
forma vegetativa, presentes num material. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do
objeto, superfície ou local.
Limpeza é a remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os
procedimentos de desinfecção ou esterilização.
As características de um esterilizante ideal seriam:
• Alta eficácia: deve ser viruscida, bactericida, tuberculicida, fungicida
e esporicida.
• Ação rápida: deve esterilizar rapidamente.
• Grande penetração: deve penetrar em pacotes de materiais comuns e
em lumens.
• Compatibilidade com materiais: as alterações devem ser
imperceptíveis tanto na aparência quanto na função dos materiais, mesmo
depois de repetidas esterilizações.
• Não tóxico: não devem apresentar riscos à saúde do operador, do
paciente, e também não deve poluir o ambiente.
21
• Resistente à matéria orgânica: deve ter eficácia na presença de
quantidade razoável de matéria orgânica.
• Adaptabilidade: deve ser adequado para grandes ou pequenos locais
de instalação e ponto de uso.
• Capacidade de monitoração: deve ser monitorada de forma fácil e
acurada com uso de indicadores físicos, químicos e biológicos.
• Custo-efetivo: deve ter custo razoável de instalação e de operação.
Porém não existe um método de esterilização ideal, que satisfaça todos esses
parâmetros. Mas o plasma em pressão atmosférica pode cumprir alguns requisitos
importantes para um método de esterilização viável, como rapidez e não toxicidade.
2.2 MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Os métodos de esterilização estão divididos em:
• Métodos físicos: São métodos que empregam uso de calor úmido,
calor seco, e radiações ionizantes.
• Métodos químicos: São métodos que consiste em banhos ou lavagens
dos materiais em substâncias.
• Métodos físico-químicos: São métodos que envolvem uso de fatores
físicos e químicos (como o esterilizador por óxido de etileno, vapor à
baixa pressão de formaldeído, e o uso de gases ionizados como o plasma).
De forma geral os métodos físico-químicos são processos que são realizados com
baixas temperaturas. A esterilização a baixa temperatura é requerida para materiais
termossensíveis e/ou sensíveis à umidade.
22
2.2.1 Esterilização por calor seco (Estufa ou Forno de Pasteur)
Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140º C a 180º C, com
tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com
termostatos.
O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a
desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos microrganismos.
Segundo Goffi 1978, esse método é indicado para esterilizar vidrarias,
instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da
autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.
Existem dois tipos de estufas, segundo a distribuição de calor:
• Estufa de convecção por gravidade;
• Estufa de convecção mecânica (mais eficiente devido à distribuição de calor mais
uniforme).
Para ser eficiente, este processo depende de:
1. Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do
material.
2. Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados.
3. A colocação do material deve permitir a circulação do ar. Portanto, deve ser
mantida uma distância de dois centímetros entre as caixas.
4. O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material
na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.
Segundo Berry 1977, existem algumas desvantagens nesse tipo de esterilização
como a destruição de substâncias têxteis; exige um maior tempo para a esterilização
(comparado com autoclave); o aquecimento lento da estufa; a variação do tempo e a
temperatura necessários para diferentes objetos (porque o calor penetra lentamente nas
substâncias mais grossas); e a superexposição pode arruinar algumas das substâncias.
23
2.2.2 Esterilização pelo Calor Úmido – Autoclavagem
A autoclavagem é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos à
pressão de uma atmosfera. A penetração do vapor no material garante maior nível de
destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido.
Numa atmosfera úmida e a uma temperatura elevada, os microrganismos morrem
quando se dá a coagulação e desnaturação das enzimas e proteínas que fazem parte de
sua estrutura.
A morte dos germes pelo calor envolve uma relação tempo-temperatura.
Algumas experiências foram feitas por Berry 1977 para se determinar os tempos de
morte térmica de algumas bactérias. Por exemplo, células vegetativas de bactérias são
mortas de cinco a dez minutos à temperatura de 60-70ºC; células vegetativas de fungos
são mortas de cinco a dez minutos à temperatura de 50-60ºC; e esporos de fungos são
mortos de cinco a dez minutos à temperatura de 70-80ºC.
A esterilização a vapor é realizada em autoclaves, cujo processo possui fases de
remoção do ar, penetração do vapor, e secagem. A remoção do ar diferencia os tipos
de autoclaves.
A eficiência desse processo de esterilização depende de alguns fatores:
• Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente
embalados. Isso porque a presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue,
e outras secreções) protege o microrganismo da ação esterilizante.
• Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em
embalagens apropriadas, caso contrário, voltam a se contaminar com
microrganismos presentes no ambiente.
• O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura atinge
121º C.
• A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor
atinja todo o material por igual.
24
• Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso
deve ser novamente esterilizado.
O
principal problema desses métodos de alta temperatura é que pode alterar os
materiais poliméricos utilizados em cateteres e outros materiais sensíveis a
temperatura, como por exemplo, materiais usados em endoscopias, e outros materiais
hospitalares plásticos e elastoméricos que são utilizados na rotina clínica, terapêuticas
e cirúrgicas.
2.2.3 Esterilização por radiação gama
Segundo Guidolin et al. 1988, a energia radiante para esterilizações vem sendo
aplicada com sucesso nestes últimos anos. Produtos alimentícios, cosméticos,
materiais cirúrgicos descartáveis, vacinas, soros e outros produtos, são
descontaminados por radiações.
As radiações de alta energia causam ionização das moléculas, rompendo em
átomos ou grupos de átomos reativos. Os radicais hidroxilas, por exemplo, são
altamente reativos e destroem compostos celulares como DNA e proteínas.
A radiação eletromagnética derivada do decaimento do isótopo radioativo de
cobalto é a que se utiliza com maior freqüência na esterilização desses materiais.
Este tipo de energia, como a radiação gama, não aquece o produto, podendo,
assim, ser também aplicada a produtos biológicos que, na maioria das vezes, são
susceptíveis a temperaturas relativamente elevadas.
Os raios gama têm comprimentos de onda menores do que o tamanho dos
átomos,
o
Α
≤
1
λ
, por isso tem elevado poder de penetração. Os fótons de raio-gama
carregam muita energia causando grandes danos nas células, podendo esterilizar os
produtos até mesmo após terem sido acondicionados em embalagens.
25
Porém existe a desvantagem deste processo ser caro e perigoso, necessitando
uma equipe altamente especializada para manusear o equipamento.
2.2.4 Esterilização por raios X
Os raios X, com comprimento de onda de
m
810
1010
−−
≤≤
λ
, são utilizados
principalmente para esterilização de material farmacêutico e cirúrgico. Também são
usados no processo de esterilização de alimentos. Eles podem matar os
microrganismos responsáveis pela rápida deterioração de legumes e frutas.
Dois efeitos são responsáveis pela eliminação dos microrganismos: o dano direto
da radiação em moléculas importantes para o funcionamento dos microrganismos; e o
fenômeno de radiólise, que leva a formação de radicais livres que por sua vez são
responsáveis pelos danos ao microrganismo. Portanto, os raios X têm alta energia e
poder de penetração, causando a morte celular por atuar sobre os constituintes da
célula, DNA e proteínas celulares. Mas, também acarreta grande risco ocupacional.
2.2.5 Esterilização por radiações não ionizantes (raios UV)
As radiações ultravioletas (UV), com comprimento de onda entre 240 a 280 nm
(comprimentos que são absorvidas pelo DNA), são radiações de fraca energia e menor
poder de penetração.
Essas radiações, ao invés de ionizar uma molécula, excitam os elétrons,
resultando em uma molécula que reage diferente das moléculas não-irradiadas. Atuam
em nível de DNA, levando a formação de dímeros de timina no DNA, os quais
interferem com o processo de transcrição e replicação deste, levando a morte.
26
Além da baixa penetrabilidade, os dímeros de timina podem ser desfeitos por um
sistema de correção de erros no DNA presente nos microrganismos. Este sistema está
normalmente relacionado à exposição à luz visível, sendo conhecido como
fotoreativação.
Lâmpadas especiais que emitem luz UV, com comprimento de onda microbicida,
são utilizadas para matar microrganismos, apenas da superfície. São usados na
desinfecção do ar de gabinetes, recintos hospitalares (salas de operação), câmaras de
fluxos, etc. Estas radiações são altamente agressivas para a pele e para os olhos,
portanto não se deve trabalhar na presença delas sem a proteção adequada.
2.2.6 Esterilização por formaldeído e vapor de formaldeído
Formaldeído é um monoaldeído que existe na forma de gás solúvel em água.
Embora tenha sido usado durante muitos anos, seu uso foi reduzido com o
aparecimento do glutaraldeído. As principais desvantagens do formaldeído estão
relacionadas a menor rapidez de ação e maior carcinogenicidade.
O formaldeído apresenta-se ativo apenas na presença de umidade, necessária para
formação do grupo metanol. Ele interage com proteína, DNA e RNA. No entanto, é
difícil especificar acuradamente seu modo de ação na inativação bacteriana. Ele tem
um amplo espectro de ação, inclusive contra esporos. A exposição máxima no
ambiente é de 0,1 a 0,5 ppm, visto ser um gás tóxico, e tem de um a dois dias de
biodegradabilidade.
O vapor de formaldeído é gerado em máquina própria a partir de formaldeído a
concentração de 2%. O formaldeído é indicado para materiais termossensíveis,
embalados com papel grau cirúrgico, e costuma ser mais usado na Inglaterra. O
27
indicador biológico é o microrganismo Bacillus stearothermophillus. Esse processo é
feito com temperatura de 50 a 60º C, com tempo do ciclo de três horas e meia.
Como existe uma fase, chamada fase líquida, em que o formaldeído é extraído,
não há exposição do pessoal. No entanto, devem ser seguidas as normas de segurança
já que é tido como um produto que pertence à categoria de substâncias perigosas.
2.2.7 Esterilização por óxido de etileno – ETO
A ação do óxido de etileno se dá pela alquilação protéica do DNA e RNA,
prevenindo o metabolismo celular normal e a replicação microbiana.
O óxido de etileno tem sido o produto mais freqüentemente utilizado como
processo de baixa temperatura. Porém, alguns estados americanos têm requerido
redução da emissão de óxido de etileno de 90 a 99%, pelos seus efeitos nocivos.
O óxido de etileno é um produto altamente tóxico, na forma de gás. Apresenta
riscos tóxicos aos operadores e pacientes por ser provavelmente carcinogênico e por
ser inflamável.
Os clorofluorcarbonetos são usados como estabilizadores em combinação com o
óxido de etileno, mas a Agência de Proteção Ambiental Americana baniu a produção
dos clorofluorcarbonetos. Foram então desenvolvidas alternativas como 100% de
óxido de etileno ou com diferentes estabilizadores, como por exemplo, dióxido de
carbono, hidroclorofluorocarbonetos, vapor de peróxido de hidrogênio, ozônio, ácido
peracético e dióxido de carbono. As alternativas menos prejudiciais ao ambiente são:
•
8,5% de óxido de etileno e 91% de dióxido de carbono;
•
Mistura de óxido de etileno com hidroclorofluorocarbonetos;
•
100% de óxido de etileno.
O óxido de etileno é um gás inodoro, incolor, inflamável e explosivo. A adição
de estabilizantes, dióxido de cloro ou clorofluorcarboneto, reduz o risco de explosão.
28
No Brasil existe legislação específica sobre funcionamento de centrais de
esterilização por óxido de etileno. No entanto, as questões relacionadas aos ciclos, tipo
de gás e aeração não estão completas, embora constem os limites máximos de resíduos
aceitáveis para os diferentes tipos de materiais.
Os limites operacionais são definidos como 450 a 1200 mg/L, 29ºC a 65ºC, 45%
a 80%, e duas a cinco horas respectivamente. Dentro de certas limitações, o aumento
da concentração do gás pode reduzir o tempo necessário para esterilizar os materiais.
A vantagem desse processo é que podem ser esterilizados materiais sem danificá-
los. As desvantagens são o alto custo, alta toxicidade, e tempo longo do ciclo.
O ciclo possui cinco estágios, que inclui: preparo e umidificação, introdução do
gás, exposição, evacuação do gás e injeções de ar, que requerem aproximadamente
duas horas e meia, excluindo o período de aeração.
A aeração mecânica é de 8 a 12 horas à temperatura de 50ºC a 60ºC. A aeração
ambiental é de sete dias a 20ºC.
Os testes biológicos devem ser realizados no mínimo semanalmente, com o
bacilo B. subtilis, sempre na primeira carga e ao término de todas manutenções
preventivas e corretivas. Também pode ser usado indicador químico, que consiste na
identificação dos pacotes por fitas contendo um indicador químico.
Atualmente tem sido substituído pelo plasma de peróxido e pelo formaldeído a
2% a baixa temperatura.
2.2.8 Esterilização por produção de ozônio proveniente de descargas elétricas
(plasma)
As técnicas de esterilização por produção de ozônio (plasma) oferecem grandes
vantagens em relação aos outros métodos, visto que, são efetivas em reduzir a carga
microbiana e se desenvolve em temperatura ambiente, sem a utilização de gases
tóxicos.
O peróxido de hidrogênio aplicado na forma de vapor possui uma maior eficácia
na eliminação de microrganismo, sendo assim usado como agente esterilizante.
29
Conforme Gurley 1985, o mecanismo de ação deste se baseia na degradação do
próprio peróxido, que forma radicais livres responsáveis pela eliminação dos
microrganismos. Estes radicais danificam a membrana celular e proteínas importantes
para o correto funcionamento levando a morte.
Segundo Greene et al. 1993, o ozônio ataca primeiro a membrana bacteriana
pelos glicolipídeos ou aminoácidos como o triptofano e atua também nos grupos
sulfidrilas de certas enzimas, resultando na ruptura da atividade enzimática celular
normal. A morte bacteriana é rápida e freqüentemente atribuída a mudanças na
permeabilidade celular seguida pela lise celular. Entretanto a lise, provavelmente, não
é por um mecanismo primário de inativação, mas conseqüência de uma alta
concentração de oxidante. O ozônio também promove ação no material nuclear de
células bacterianas pela modificação nas bases purínicas e pirimidínicas dos ácidos
nucléicos.
De acordo com Korol et al. 1995, a destruição microbiana se reduz quando as
formas vegetativas e os esporos estão acompanhados de substâncias orgânicas que
atuariam como protetoras, limitando a penetração do desinfetante, e também no caso
do ozônio, porque os radicais livres formados por este elemento, reagem com as
substâncias orgânicas antes de alcançar os microrganismos.
Foram desenvolvidos comercialmente equipamentos que utilizam gerador de
ozônio para a esterilização, mas não como principal agente de esterilização e sim na
etapa final do processo, utilizando produtos como peróxido de hidrogênio
(STERRAD®) e ácido peracético (PLAZLYTE®).
O plasma de peróxido hidrogênio é indicado para esterilização de superfícies.
Usa-se embalagem de polipropileno, ou poliolefina. Não pode ser utilizada embalagem
de celulose pela alta absorção do peróxido por este tipo de material comprometendo o
término do ciclo.
Não é recomendado para bisfenol e epoxy ou componentes feitos de
polissulfonas ou poliuretano; náilon e celulose; Polimetil-metacrilato, policarbonato e
vinil acetato, isso porque esses materiais podem ficar quebradiços e terem problemas
de absorção. Também é contra indicado para pós, líquidos e materiais de fundo cego.
30
É o método indicado para artigos termossensíveis, como por exemplo, cateteres,
com no mínimo um milímetro de diâmetro interno e até dois metros; artigos metálicos
e de corte; equipamentos elétricos; endoscópios rígidos; equipamentos pneumáticos; e
matéria orgânica (Kyi et al. 1995).
A esterilização por geração de ozônio (plasma) não possui um indicador de
eficácia definido.
Deve se atentar as recomendações de uso por se tratar de um aparelho
extremamente sensível. Deve ser feita: limpeza com remoção completa de resíduos
orgânicos; secagem; embalagem; e selagem adequada. A temperatura de
funcionamento do equipamento está em torno de 45ºC. A duração do ciclo de
esterilização é de aproximadamente setenta minutos.
Não requer aeração, pois não deixa resíduo tóxico. É seguro para o ambiente e
para os profissionais.
O plasma de ácido peracético consiste em dois agentes ativos. O primeiro é o
ácido peracético (5%) com peróxido de hidrogênio (22%), e o segundo é o ácido
peracético com uma mistura de gás argônio com O
2
e H
2
do qual irá ser formado o
plasma. As fases de plasma são alternadas com fases de vapor.
2.3 CONTROLE DE ESTERILIZAÇÃO
É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se
trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia,
conhecimento detalhado do processo, etc), se qualquer uma destas variáveis for
negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente. O
controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos.
Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança
de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a
bactéria chamada B. subtilis, que por ser produtora de esporos, é uma eficiente
indicadora da qualidade do processo.
31
Este controle deve fazer parte da rotina do laboratório para garantir a saúde de
pacientes e isolamento correto dos microrganismos, como também biossegurança
ocupacional. Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo, através
de profissionais preparados para tal procedimento.
2.3.1 Indicadores
Os indicadores que demonstram a eficácia dos métodos de esterilização podem
ser mecânicos, químicos e biológicos.
•
Indicadores mecânicos: monitores de tempo, temperatura, pressão, relatórios
impressos computadorizados.
•
Indicadores biológicos: indicam que a esterilização foi efetiva através da
inativação dos indicadores. Os tipos de bacilos mais utilizados são os B. subtilis
para esterilização a baixa temperatura e B. stearothermophillus para esterilização a
vapor.
•
Indicadores químicos: são fitas, etiquetas adesivas, ou tintas impregnadas com
substâncias químicas termossensíveis específicas ao vapor, que ao serem retiradas
da autoclave deverão apresentar mudança de coloração. Existem diversos tipos de
indicadores químicos.
2.4 DESINFECÇÃO
Este processo pode ser realizado de forma física (pasteurização) e química
(desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto,
intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos
inativados.
32
1. Desinfecção de alto nível: Inativa todos os microrganismos, exceto esporos.
Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como “semicríticos”, ou
seja, que entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra.
2. Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa as bactérias na forma
vegetativa (inclusive Mycobacterium tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus. É
indicada para uso em itens classificados como “não-críticos”, ou seja, aqueles
materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra. (por exemplo,
estetoscópios, termômetros, gorro, máscara, refletor, etc).
3. Desinfecção de baixo nível: é a que inativa a maioria das bactérias na forma
vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus. É indicada também para
itens de uso “não-crítico”.
33
3 FÍSICA DO PLASMA
Neste capítulo apresentaremos conceitos básicos sobre a física do plasma, que
serão importantes no processo de esterilização estudado. Estudo baseado
principalmente em Chen 2006, Goldston e Rutherford 1995, Ichimaro 1980.
3.1 INTRODUÇÃO
Plasmas são comumente descritos como o “quarto estado da matéria”, com os
outros três primeiros sendo os estados sólido, líquido e gasoso. Na realidade, embora
essa definição não seja muito adequada, pois a passagem de um gás para a forma de
plasma não ocorre através de uma “transição de fase” bem definida, como nas
transições do estado sólido para líquido e deste para gás, certamente o plasma pode ser
considerado um estado distinto da matéria, caracterizado por possuir um número de
partículas eletricamente carregadas suficiente para afetar suas propriedades e
comportamento.
Num gás ordinário, cada átomo ou molécula contém um número igual de cargas
positivas e negativas; as cargas positivas no núcleo são cercadas por um igual número
de elétrons negativamente carregados, e cada partícula é eletricamente "neutra". Um
gás se torna um plasma quando a adição de calor ou outra forma de energia faz com
que um número significante de seus átomos libere alguns ou todos os seus elétrons.
Estes átomos que perdem elétrons ficam "ionizados", ou seja, com uma carga positiva
resultante, e os elétrons separados de seus átomos ficam livres para se mover pelo gás,
interagindo com outros átomos e elétrons. Neste caso se diz que também o gás se torna
um gás ionizado. Quando o número de átomos ionizados é relativamente pequeno, a
interação entre as partículas carregadas do gás ionizado é dominada por processos
colisionais, ou seja, que envolvem principalmente colisões binárias entre elas, como
em um gás neutro. Quando o número de partículas carregadas é substancial, a
34
interação entre as partículas carregadas é dominada por processos coletivos, ou seja, a
dinâmica de cada uma delas é determinada, em primeiro lugar, pelos campos elétricos
e magnéticos produzidos por todas as outras partículas carregadas do meio. Neste caso,
o gás ionizado passa a ser denominado plasma. Na Figura 3.1 podemos observar que
essa transição de um gás de átomos neutros e em seguida um gás de íons e elétrons
livres (plasma).
Figura 3.1 – Matéria no estado gasoso e no estado de plasma
.
3.2 CONCEITOS BÁSICOS DE IONIZAÇÃO
Todos os gases à temperatura ambiente são constituídos por moléculas ou
átomos, isto é, por partículas eletricamente neutras. Considerando uma colisão entre
duas partículas de um gás, se a energia cinética do movimento relativo das partículas é
maior do que a energia de ionização, kT > E
ion
, pode acontecer que uma das partículas
fica ionizada após a colisão, conforme a equação:
eAAAA ++→+
+
(3.1)
Dessa maneira, pode acontecer que neste gás estejam presentes não apenas
moléculas ou átomos (partículas neutras), mas também íons e elétrons (partículas
35
carregadas). A quantidade de partículas carregadas depende do número de colisões
com kT > E
ion
, e este número depende da quantidade de partículas rápidas. À
temperatura ambiente, partículas rápidas são muito raras, portanto o número de
colisões descritas pela equação 3.1 é extremamente pequeno. Observamos isso no fato
de todos os gases à temperatura ambiente serem constituídos apenas por moléculas ou
átomos. Íons e elétrons estão praticamente ausentes. Por exemplo, o ar em uma sala é
constituído pelas moléculas N
2
e O
2
. Quanto maior a temperatura, maior é o número de
partículas rápidas, e maior é o número de colisões com ionização, e maior é o número
de partículas carregadas.
Podemos definir o grau de ionização, α, como
ai
e
nn
n
+
=
α
(3.2)
A temperaturas elevadas, átomos podem perder não apenas um elétron, mas dois,
três, ou mais, dependendo da temperatura. Na equação 3.2, onde n
a
é a densidade da
espécie atômica, n
e
é a densidade de elétrons, n
i
significa a densidade de todos os íons
n
i
= n
+
+n
++
+..., e x são as frações dos íons simplesmente, duplamente, e triplamente
ionizados, onde:
i
n
n
x
+
+
=
i
n
n
x
++
++
=
i
n
n
x
+++
+++
=
Ionização pode acontecer não apenas nas colisões entre partículas neutras, como
na exemplificada pela equação 3.1, mas também nas colisões entre uma partícula
neutra e um elétron.
36
eeAeA ++→+
+
(3.3)
Um elétron é muito mais eficaz para a ionização do que uma partícula neutra.
Isto é, para as energias iguais e superiores a E
ion
, a probabilidade de ionização pelo
impacto de um elétron é muito maior. Por isso, o mecanismo de ionização é
usualmente o seguinte: os elétrons iniciais são produzidos através da reação descrita
pela equação 3.1. Depois cada um deles cria mais um elétron através da reação descrita
pela equação 3.3 e o número de elétrons duplica-se. A seguir, o número de elétrons
duplica-se mais uma vez, e assim por diante. Este mecanismo chama-se avalanche.
Um dos caminhos de criar um plasma é aquecer um gás. Tal aquecimento pode-
se realizar por meio de um campo elétrico externo aplicado ao gás. A produção de
calor é através do aquecimento Joule, P = jE. Como a corrente é produzida pelos
movimentos de íons e de elétrons, j = j
i
+ j
e
→ P = j
i
E + j
e
E. Os elétrons são muito
mais leves do que os íons, m
e
<< m
i
, então | j
e
| >> | j
i
|
e P ≈ j
e
E. Em outras palavras,
a energia do campo elétrico é fornecida principalmente aos elétrons. Os elétrons
transferem uma parte desta energia às partículas pesadas, isto é, átomos e íons. O
mecanismo de transferência é através das colisões, mas a troca de energia numa
colisão é pouca, devido à desigualdade das massas, m
e
<< m
i
.
Existem duas possibilidades de criação de plasma:
1. A pressão é alta, colisões entre elétrons e partículas pesadas são muitas, a
temperatura dos elétrons é aproximadamente igual à das partículas pesadas,
ou seja, T
e
≈ T
pesadas
.
2. A pressão é baixa ou intermediária, e a temperatura dos elétrons é maior que
das partículas pesadas, T
e
>T
pesadas
.
O plasma criado através da primeira maneira chama-se plasma térmico. Todas as
partículas neste plasma estão em equilíbrio térmico: T
e
≈ T
i
≈ T
neutro
. Em muitos casos,
este plasma está também em equilíbrio químico, onde todas as reações estão em
37
equilíbrio, em particular a reação de ionização, descrita pela equação 3.3, está
equilibrada pela reação inversa (de recombinação).
eAeA +→+
+
2
(3.4)
Os aparelhos para geração do plasma térmico são chamados de aquecedores de
arco (tochas de arco, ou plasmatron). Eles são usados para o processamento de
materiais, metalurgia, processos químicos, tratamento de detritos perigosos, entre
outros.
O plasma criado através da segunda maneira é de não-equilíbrio. Neste plasma os
elétrons estão quentes e as partículas pesadas (átomos, moléculas e íons) estão frias.
Por exemplo, plasma em lâmpadas luminescentes.
Ionização pode ser produzida não apenas em colisões entre partículas do plasma,
mas também por uma radiação externa ao gás. Por exemplo, cada centímetro cúbico do
ar numa sala contém aproximadamente dez íons, produzidos por raios cósmicos, que é
pouco, não se pode falar em plasma. Mas se a radiação for mais forte (por exemplo,
raios X da alta intensidade, ou uma radiação de um reator nuclear), plasma pode ser
produzido. Tal plasma também é de não-equilíbrio.
3.3 DEFINIÇÃO DE PLASMA
O plasma pode ser definido como um gás ionizado que contém uma mistura de
elétrons livres, íons e átomos neutros em proporções variadas que exibem um
comportamento coletivo provocado pelas forças de Coulomb de grande alcance.
O termo plasma foi utilizado na física pela primeira vez pelo físico americano,
Irving Langmuir no ano de 1928, quando estudava descargas elétricas em gases. A
palavra plasma oriunda do grego, que designa um material moldável, vem da medicina
onde é utilizada para apontar perturbação ou estado não distinguível.
38
Mais tarde, a definição foi estendida para definir o estado da matéria onde
átomos e/ou moléculas estão parcialmente ou totalmente ionizados, sendo que as
cargas apresentam um comportamento coletivo devido às interações Coulombianas. O
grau de ionização do plasma pode variar muito, dependendo da forma de obtenção
bem como de sua aplicabilidade.
Nem todas as sustâncias que contêm partículas carregadas podem ser
classificadas como plasma. Para que uma certa coleção de partículas carregadas e
neutras interagindo entre si apresente o comportamento coletivo de plasma é
necessário que ela satisfaça certos critérios como neutralidade macroscópica e a
blindagem de Debye.
Três principais fenômenos caracterizam a matéria no estado de plasma (veja
Figura 3.2): emissão de radiação eletromagnética, blindagem do campo elétrico das
cargas e oscilações coletivas devido às forças colombianas.
Figura 3.2 –
(a) Sol emitindo radiação eletromagnética na faixa do ultravioleta distante
(b) Efeito de blindagem de potenciais elétricos em plasmas,
(c) Resultante da força elétrica devido às várias n partículas carregadas numa dada carga A
(Figura obtida em Chen et al. 2006)
3.3.1 Neutralidade macroscópica
Na ausência de perturbações externas a quase neutralidade macroscópica é
característica fundamental do conceito plasma. Isso quer dizer que em condições de
equilíbrio (sem forças externas presentes), num volume de plasma suficientemente
39
grande para conter um número elevado de partículas, mas suficientemente pequeno
comparado com o comprimento característico de variação dos parâmetros
macroscópicos, tais como a densidade e a temperatura, a carga elétrica total é igual a
zero. No interior do plasma, os campos das cargas positivas e negativas microscópicas
cancelam-se entre si e a carga espacial liquida é zero para qualquer região
macroscópica, ou seja:
∑
=
+
i
ie
inn 0
(3.5)
Onde n
e
é a densidade de elétrons e n
i
a densidade de íons positivos.
Os plasmas podem diferir em muitos aspectos, e com base neles é que os
classificamos, como por exemplo: temperatura de elétrons e íons, densidade de
elétrons e íons, comprimento de Debye, etc. Um outro parâmetro importante na
descrição de um plasma é a presença de campos elétricos e/ou magnéticos.
A maioria dos plasmas estudados é do tipo gás ionizado produzidos por
descargas elétricas em gases a baixa pressão.
3.3.2 Blindagem de Debye
Uma propriedade fundamental do plasma é sua habilidade de blindar qualquer
potencial elétrico detectado dentro dele. Este fenômeno, conhecido como blindagem
de Debye, impede a ocorrência de um campo elétrico espontaneamente no interior do
plasma.
Considerando-se uma partícula do plasma, por exemplo, um íon positivo, o
campo elétrico radial induz uma separação de cargas na vizinhança do mesmo, o que
conduz à atração dos elétrons e a repulsão dos íons positivos. Esta separação de cargas
gera um potencial V simétrico em torno do íon positivo, cujo valor é função da
distância medida a partir do íon.
40
A concentração de íons positivos, n
+
, e elétrons, n
−
, é obtida pela função
distribuição de Boltzmann:
Tk
eV
p
B
enn
−
+
=
(3.6)
Tk
eV
p
B
enn =
−
(3.7)
Onde k
B
é a constante de Boltzmann, T a temperatura, suposta como sendo a
mesma para elétrons e íons, V o potencial elétrico, n
p
é a concentração de partículas
carregadas no plasma, que deve ser a mesma para partículas positivas e negativas do
gás, para satisfazer a condição de neutralidade macroscópica, e é a carga do elétron.
Supondo-se que a energia potencial de separação de cargas é muito menor que a
energia térmica, isto é:
TkeV
B
<<
(3.8)
Então se pode escrever (3.6) e (3.7) da seguinte forma:
−=
+
Tk
eV
nn
B
p
1
(3.9)
+=
−
Tk
eV
nn
B
p
1
(3.10)
Um parâmetro físico importante para a descrição do plasma é o comprimento de
Debye. Da equação de Poisson, tem-se:
0
2
ε
ρ
−=∇ V
(3.11)
onde ρ é a densidade de carga e ε
0
a permissividade elétrica do meio.
Como se tem simetria esférica a partir do centro do íon positivo, pode-se usar
coordenadas esféricas. Portanto, a equação (3.11) é reescrita como:
0
2
2
)(2)(
ε
ρ
−=
∂
∂
+
∂
∂
rr
rV
r
rV
(3.12)
Considerando-se somente uma espécie de íons, tem-se:
41
)(
−+
−= nne
ρ
(3.13)
Substituindo as equações (3.9) e (3.10) na equação (3.13):
kT
eV
n
p
2=
ρ
(3.14)
Substituindo (3.14) em (3.12) tem-se:
kT
eV
n
rr
rV
r
rV
p
0
2
2
2
)(2)(
ε
=
∂
∂
+
∂
∂
(3.15)
Resolvendo a equação (3.15), com a condição de V = 0 para r → ∞, tem-se:
−−=
2
1
0
2
0
exp
4 kT
en
r
r
e
V
p
επε
(3.16)
Nota-se que quando r → 0, o potencial se aproxima de e/4πε
0
r, que é o potencial
de uma carga puntiforme não blindada. Define-se o comprimento de Debye λ
d
, como:
2
1
2
0
=
en
Tk
e
eB
d
ε
λ
(3.17)
Tem-se:
−−=
d
r
r
e
V
λπε
exp
4
0
(3.18)
O comprimento de Debye estabelece a distância abaixo da qual, a influência do
campo elétrico de uma partícula carregada, é sentida pelas outras partículas do plasma.
Na distância acima do valor do comprimento de Debye, ocorre uma blindagem
de campos eletrostáticos de uma partícula carregada em relação às demais. O
comprimento de Debye, além de ser uma escala de distância, na qual, ocorre
blindagem de campos eletrostáticos, também define uma distância acima da qual, as
flutuações do potencial elétrico podem aparecer em um plasma. Este potencial é
devido à conversão de energia cinética térmica das partículas em energia potencial
eletrostática e vice-versa.
Define-se uma esfera de raio λ
d
, ou esfera de Debye, onde os campos
eletrostáticos originados fora dela, não contribuem significativamente para o campo
42
elétrico existente no seu interior. Conseqüentemente, cada carga do plasma interage
somente com cargas que permanecem dentro de sua esfera de Debye.
O número de elétrons N
d
, dentro da esfera de Debye é dado por:
2
3
2
3
1
0
3
4
=
en
kT
N
e
d
επ
(3.19)
Uma das condições para existência do plasma, é que a dimensão física do
sistema, L, seja muito grande comparada com comprimento de Debye, ou:
d
L
λ
>>
Uma outra condição resulta do efeito de blindagem dentro da esfera de Debye. O
número de elétrons no interior da esfera de Debye é muito grande:
1
3
>>
de
n
λ
Existem vários processos de obtenção de um plasma dependendo das
características exigidas em cada aplicação, como por exemplo, os plasmas produzidos
por descargas elétricas.
Dentro dos tipos de descargas o mais usual é a descarga luminescente ou
descarga “glow”. Esta é obtida pela aplicação ao gás, em pressão baixa, de tensões de
corrente continuas (cc) ou correntes alternadas (ac) ou ainda de radiofreqüência (RF)
ou microondas, dependendo das aplicações desejadas. A tensão pode ser aplicada entre
eletrodos internos, externos ou em uma bobina colocada ao redor do reator.
3.3.3 Freqüência do plasma
Outra propriedade importante do plasma é a estabilidade de sua neutralidade
macroscópica. Quando um plasma é instantaneamente perturbado do seu estado de
equilíbrio, o campo elétrico resultante das cargas espaciais internos provoca um
movimento coletivo das partículas carregadas que tende a restaurar a neutralidade
inicial do plasma. Esse movimento coletivo é caracterizado por uma freqüência natural
de oscilação conhecida como a freqüência do plasma. O período desta oscilação
43
natural constitui uma escala de tempo significativa com o qual pode ser comparado o
mecanismo dissipativo tendendo a destruir o movimento coletivo dos elétrons. A
freqüência de oscilação eletrônica do plasma é dada pela expressão:
2
1
0
2
=
e
e
pe
m
en
ε
ω
(3.20)
Onde m
e
é a massa do elétron.
Para garantir a existência desta oscilação é necessário que o tempo de colisões
entre a partícula carregada e a neutra seja superior ao período de oscilação do plasma.
Assim devemos ter uma densidade de partículas neutras limitada para garantir que
estas colisões sejam infreqüêntes.
3.4 TIPOS DE PLASMA
Os plasmas são categorizados como naturais ou de laboratório, e cobrem uma
grande faixa de temperatura e pressão.
Como exemplos de plasmas naturais citam-se corona solar, nebulosas, vento
solar, aurora boreal, descarga elétrica atmosférica, centro do Sol, ionosfera terrestre.
Com relação aos plasmas de laboratório, basicamente podem ser estabelecidas
duas subcategorias: plasmas térmicos (em equilíbrio termodinâmico local) e plasmas
frios (de não equilíbrio).
A Figura 3.3 mostra a influência da pressão na transição de uma descarga
luminescente com temperaturas iônicas e eletrônicas diferentes (T
e
>T
h
) para uma
descarga de arco.
44
Plasma de baixa pressão (10
-4
a 10
-2
kPa) geralmente não está em equilíbrio
térmico. A temperatura das partículas pesada é mais baixa que a temperatura
eletrônica. As colisões não elásticas entre elétrons e partículas pesadas são excitativas
ou ionizantes. Estas colisões não aumentam a temperatura das partículas pesadas.
Quando a pressão é aumentada, as colisões intensificam. Elas induzem tanto
reações químicas no plasma (através de espécies altamente reativas obtidas nas
colisões inelásticas), como aquecimento de partículas pesadas (através de colisões
elásticas). A diferença entre T
e
e T
h
fica reduzida e o estado do plasma se torna mais
próximo do equilíbrio, mas não o alcança.
A densidade da potência aplicada influencia muito o estado do plasma. Em geral,
uma potência de alta densidade induz plasmas em equilíbrio (por exemplo, plasmas de
arco) e uma potência de baixa densidade ou uma potência pulsada favorece plasmas de
não equilíbrio.
Dependendo do tipo de energia aplicada e da quantidade de energia transferida
ao plasma, as propriedades do plasma mudam, em termos de densidade eletrônica ou
temperatura. Estes dois parâmetros distinguem os plasmas em categorias diferentes,
apresentadas na Figura 3.4.
Figura 3.3 –
Evolução da temperatura do plasma (elétrons e partículas pesadas)
com a pressão, em um arco de plasma de mercúrio.
45
Figura 3.4 – Diagrama Temperatura-Densidade, mostrando os diferentes tipos de plasma.
3.4.1 Plasma térmico, ou plasma em equilíbrio.
O termo plasma térmico é empregado para descrever os gases que se apresentam
altamente ionizados quando aquecidos a altas temperaturas (entre 5000 e 50000K), em
pressões próximas à atmosférica.
Em geral são produzidos por descargas elétricas e caracteriza-se pela alta
densidade (partículas na ordem de 10
23
– 10
28
m
-3
) e pela proximidade entre as
temperaturas dos elétrons e das partículas pesadas, isto é, o estado termodinâmico do
plasma aproxima-se do equilíbrio termodinâmico local. Apresentam colisões
inelásticas entre os elétrons e as partículas pesadas criando um plasma de espécies
reativas, onde colisões elásticas aquecem as partículas pesadas.
46
Exemplos típicos de plasma térmicos são aqueles gerados por arcos voltaicos
transferidos, por tochas de plasma.
O plasma térmico é aplicado na industria para corte de metais, soldagem,
produção de aços especiais e de metais refratários, reciclagem de alumínio, deposição
de partículas em substratos, deposição de vapor químico, fusão de vidro, aquecimento
de produtos, tratamento de lixo hospitalar, destruição de materiais tóxicos, entre
outros.
3.4.2 Plasma não térmico, ou plasma de não equilíbrio.
São plasmas caracterizados pela grande diferença de temperatura dos elétrons e
das partículas pesadas, e pela baixa densidade de elétrons (número de partículas menor
que 10
20
m
-3
). Apresentam colisões inelásticas entre os elétrons e as partículas pesadas
induzindo um plasma reativo. Partículas pesadas são ligeiramente aquecidas por
algumas colisões elásticas.
São produzidos em laboratório por descargas elétricas, como coronas dc, coronas
pulsadas, microondas, centelhas transitórias, micro descargas em DBD.
3.5 PLASMA EM PRESSÃO ATMOSFÉRICA
Segundo Laurossi et al. 2001, plasmas em pressão atmosférica receberam mais
atenção recentemente em várias aplicações modernas, como modificações de
superfície de polímero, desinfecção biológica e química de meios, por que eles
possuem muitas vantagens, como: baixo custo; fácil implantação; não necessidade de
câmara, o que possibilita o tratamento de materiais de grandes volumes; entre outras.
Por isso, nosso trabalho focaliza-se nesse tipo de plasma, em especial o gerado
por descarga com barreira dielétrica (DBD).
47
3.5.1 Jato de plasma
O jato de plasma de pressão atmosférica (APPJ) é um dispositivo acoplado a um
capacitor que consiste em dois eletrodos coaxiais entre os quais um gás (hélio) flui em
altas taxas. O eletrodo central é excitado por rádio freqüência (RF) com freqüência de
megahertz. Os elétrons livres estão acelerados pelo campo da RF e entram em colisões
com as moléculas do gás. Estas colisões não elásticas são muito eficientes em produzir
várias espécies reativas (átomos excitados e moléculas, os radicais livres). As espécies
reativas podem reagir então com uma superfície colocada em proximidade do bocal.
Um jato de plasma atmosférico pode ser dividido em duas zonas: uma zona
central de plasma em equilíbrio, e uma zona periférica de não equilíbrio. Nesta região,
a temperatura das partículas pesadas é muito mais baixa que a dos elétrons.
Por exemplo, para um arco de argônio, operando com pressão de 300 kPa,
corrente de 300 a 400 A, pode-se chegar a um estado de equilíbrio na porção central.
Estas condições conduzem a uma densidade de elétron de 10
24
m
-3
no centro.
3.5.2 Descarga Corona
A descarga corona é um tipo de descarga elétrica que ocorre muito próximo ou
na pressão atmosférica, entre dois eletrodos com áreas e/ou formas diferentes e é
caracterizada pelo consumo relativamente baixo da energia elétrica. A corona é gerada
por um campo elétrico intenso associado com pequenas agulhas, fios ou pontas de um
eletrodo. Uma característica fundamental da descarga corona é que a temperatura dos
elétrons, T
e
, do plasma (T
e
>1eV) é muito maior do que a temperatura ambiente do gás
(T∼0,025eV). Os elétrons energéticos da descarga induzem excitação, ionização e
dissociação das moléculas, introduzindo ao mesmo tempo grande número de radicais
ativos que estimulam reações químicas diversas. Existem vários tipos de descargas
coronas em função da forma, da geometria e da configuração dos eletrodos utilizados,
bem como da polaridade e do tipo da tensão aplicada continua ou alternada.
48
Esse tipo de descarga tem sido usado para tratamento de materiais e controle da
poluição atmosférica.
3.5.3 Descarga com Barreira Dielétrica (DBD)
A descarga com barreira dielétrica (DBD), ou simplesmente descarga com
barreira, já é conhecida por mais de um século. Essa descarga é proveniente de uma
alta tensão alternada (geralmente alta voltagem entre 5 a 15 kV e freqüência de 60 a
10
5
Hz) aplicada entre dois eletrodos, sendo que o espaço entre eles é parcialmente
preenchido com um meio dielétrico. As primeiras investigações experimentais foram
relatadas por Werner Von Siemens em 1857. Foi ele quem propôs o nome de
“descarga silenciosa”, termo que ainda é muito utilizado nas literaturas inglesa, alemã
e francesa.
O esquema típico de um reator de descarga DBD é mostrado na Figura 3.5.
Figura 3.5 - Configurações diferentes de reator com descarga DBD.
Como conseqüência da presença de pelo menos uma barreira dielétrica, esta
descarga requer voltagem alternada para sua operação. A descarga DBD pode ser
obtida em freqüências entre 60 Hz até centenas de kHz e com formas diferentes da
tensão aplicada (tensão senoidal, pulsos retangulares ou com forma especial). Para
aplicações na industria é preferida tensão senoidal com freqüência entre 50 Hz e 500
49
kHz. Basicamente existem dois modos diferentes de operação da descarga silenciosa:
descarga com múltiplos filamentos ou micro-descargas que é mais comum e descarga
DBD difusa.
Normalmente a descarga DBD é operada no modo com filamentos que ocorre em
freqüências mais baixas (menos de kHz). A alta tensão alternada (entre 5 e 20 kV) de
um transformador elevador é aplicada entre dois eletrodos metálicos. Entre os
eletrodos é colocada uma camada fina de dielétrico (vidro, quartzo ou cerâmica). O
dielétrico pode cobrir um ou os dois eletrodos do reator. Existem duas configurações
típicas deste reator, em geometria plana e geometria cilíndrica. A conseqüência da
presença do dielétrico entre as placas de DBD é que o reator pode funcionar somente
com alta tensão alternada. Se o campo elétrico entre o dielétrico e o eletrodo livre é
suficientemente grande dentro do espaço vazio do reator iniciará uma descarga
elétrica. As formas típicas da voltagem e da corrente da descarga DBD são mostradas
na Figura 3.6. Os resultados foram obtidos no reator experimental desenvolvido para
esterilização de microrganismos sobre uma placa de microtitulação, no Laboratório de
Plasma, FEG, UNESP.
Observa-se que a corrente da descarga, apresentada por conjuntos de picos com
duração muito curta, flui somente quanto existe variação da tensão aplicada. O plasma
da descarga é constituído por várias micro-descargas (filamentary discharges) e pode
ser visto na Figura 3.7.
Figura 3.6 -
A forma típica da corrente e da voltagem de descarga DBD obtida pelo reator de plasma
que
opera no laboratório de Plasma, FEG, UNESP
Figura 3.7 -
Foto de micro
A constante dielétrica do material isolante e a taxa de variação da voltagem
aplicada determinam a corrente de deslocamento que ultrapassa o dielétrico e deve ser
igual a corrente da descarga no espaço vazio do reator. A função principal do
dielétrico é limitar a corrente da descarga, desta maneira evitando a formação de arco.
Para freqüências muito altas (acima de um MHz) a limitação da corrente através do
A forma típica da corrente e da voltagem de descarga DBD obtida pelo reator de plasma
opera no laboratório de Plasma, FEG, UNESP
.
Foto de micro
-
descargas em um reator de plasma com barrei
A constante dielétrica do material isolante e a taxa de variação da voltagem
aplicada determinam a corrente de deslocamento que ultrapassa o dielétrico e deve ser
igual a corrente da descarga no espaço vazio do reator. A função principal do
dielétrico é limitar a corrente da descarga, desta maneira evitando a formação de arco.
Para freqüências muito altas (acima de um MHz) a limitação da corrente através do
50
A forma típica da corrente e da voltagem de descarga DBD obtida pelo reator de plasma
descargas em um reator de plasma com barrei
ra dielétrica
.
A constante dielétrica do material isolante e a taxa de variação da voltagem
aplicada determinam a corrente de deslocamento que ultrapassa o dielétrico e deve ser
igual a corrente da descarga no espaço vazio do reator. A função principal do
dielétrico é limitar a corrente da descarga, desta maneira evitando a formação de arco.
Para freqüências muito altas (acima de um MHz) a limitação da corrente através do
51
dielétrico torna-se insuficiente e por isso os reatores DBD são operados em
freqüências moderadas.
Como pode ser visto na Figura 3.6, a descarga DBD é constituída de vários
picos de micro descargas, cada um com uma duração de alguns ns, é difícil medir
experimentalmente a corrente e a potencia média da descarga. No caso de correntes
alternadas um método simples e bastante eficaz para medir a potência média dissipada
e a defasagem entre a corrente e a tensão é através da figura de Lissajous (Fig. 3.8). Ao
invés de tentar medir a corrente de cada micro-descarga individual é melhor medir a
corrente integrada no tempo. Usa-se a carga acumulada sobre um capacitor ligado em
série ao reator que é proporcional a corrente média que flui no circuito. Então a figura
de Lissajous observada no osciloscópio é formada pela superposição de dois sinais: a
voltagem aplicada no reator de plasma com descarga DBD e a tensão nos terminais do
capacitor que é proporcional à carga acumulada sobre as placas do capacitor. A área
compreendida pela figura de Lissajous representa a energia consumida durante um
período. Então, quanto maior for esta área maior será a potência média dissipada. (veja
APÊNDICE A)
A inclinação dos lados do paralelogramo da figura de Lissajous apresenta a
capacitância equivalente do reator.
Figura 3.8 -
Figura de Lissajous para o reator de plasma aplicado sobre uma placa
de microtitulação do laboratório de Plasma, FEG, UNESP.
52
Quando a descarga silenciosa é operada sob condições especiais, geralmente em
freqüências mais altas (dezenas de kHz) e pressão igual ou um pouco abaixo da
pressão atmosférica em alguns gases tais como He, Ar, N
2
, ela pode transformar-se
para o modo difuso (atmospheric glow discharge). Esse modo de operação é
caracterizado por uma melhor uniformidade do plasma e, portando, é muito mais
vantajoso para tratamento e esterilização de materiais. Porém, a descarga em modo
difuso é instável e por isso difícil de ser controlada. Somente pequenas oscilações dos
parâmetros da descarga são suficientes para ela retornar ao modo normal de operação
com múltiplas micro-descargas. Portanto, para operar em modo difuso de descarga
DBD é preciso utilizar um gerador de tensão alternada bastante estável com freqüência
de operação variável que geralmente não é possível em escala industrial.
3.5.3.1 Aplicações da descarga DBD
Como foi dito anteriormente, a descarga DBD ocorre próximo ou na pressão
atmosférica e é capaz de produzir um plasma não-térmico em grande volume, um fato
que pode ser usado em diversas aplicações tecnológicas tais como:
a) Desenvolvimento de novas fontes de luz como, por exemplo, excimer lasers,
novas lâmpadas fluorescentes e telas de plasma. Quando uma descarga DBD
opera em atmosfera de gases nobres ou mistura de gases nobres com
halogênios, é gerada intensa radiação ultravioleta UV. Então essa descarga é
uma fonte eficiente e barata de luz UV que tem importantes aplicações
tecnológicas. Se, um material fluorescente, como o fósforo é usado, a luz UV
proveniente da descarga DBD poderá ser transformada em luz visível. Neste
principio operam as novas lâmpadas para iluminação baseadas na descarga
DBD, que são muito mais eficientes e econômicas do que as lâmpadas
incandescentes.
b) Geração de ozônio que obtém aplicação para esterilização de material
hospitalar, tratamento de águas residuais provenientes das indústrias,
desinfecção de material biológico etc. Uma das aplicações mais importantes das
53
descargas silenciosas é a da produção de O
3
. Em atmosfera de oxigênio ou ar
uma descarga DBD, que tem duração de apenas alguns minutos, é capaz de
produzir grande quantidade de Ozônio.
c) Reatores de plasma para controle de poluição atmosférica (gases, vapores e
partículas). Aplicação de descarga DBD para controle de gases poluentes (NOx,
SOx, hidrocarbonos) e para a destruição de componentes venenosos (VOCs,
C
2
F
6
, NF
3
) recebem atenção significativa nos últimos anos. A vantagem desta
técnica baseada na descarga DBD é que durante o processo é possível realizar a
decomposição de diversos componentes simultaneamente com grande
eficiência de remoção.
d) Tratamentos a plasma são freqüentemente usados para modificar as
propriedades da superfície de vários polímeros. Algumas propriedades
importantes para as aplicações tecnológicas dos polímeros são a adesão,
hidrofobicidade, hidrofilicidade, oleofobicidade. Elas basicamente determinam
como a superfície de um polímero irá reagir com água, óleo ou outro reagente.
Estudos mostram que o tratamento de polímeros com descarga DBD pode
alterar significativamente estas propriedades. A descarga silenciosa pode ser
usada para a deposição de filmes poliméricos, para a alteração da rugosidade da
superfície de diferentes materiais e também para limpeza e ativação da
superfície de diversos polímeros tais como polipropileno, poliamida, polietileno
e outros. Tratamento de polímeros com descarga DBD, por alguns minutos,
pode aumentar significativamente a energia superficial.
e) A descarga DBD tem se mostrado importante no tratamento de madeira a
plasma, que modifica o ângulo de contato da superfície e a madeira torna-se
mais impermeável para água. Descarga DBD pode ser usada também para
tratamento de tecidos, na área biomédica para esterilização e na biologia para o
controle de insetos.
f)
Tratamento e esterilização de materiais com descarga silenciosa são aplicações
mais recentes da descarga DBD com grande relevância para indústria e são os
objetivos principais do presente projeto de pesquisa.
54
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste capítulo iremos mostrar o que tem sido estudado sobre esterilização usando
plasma.
4.1 COMPARAÇÃO ENTRE TIPOS DE DESCARGA UTILIZADAS NA
ESTERILIZAÇÃO
4.1.1 Esterilização pelo uso de descarga corona
Siemens, em 1857, foi o primeiro a sugerir o uso de uma descarga corona para
gerar ozônio para desinfetar suprimentos de água. Este foi o primeiro uso registrado de
plasma para a inativação de microrganismos.
Garate et al. 1998 usou uma descarga corona, com gás inerte como o hélio e
argônio, para destruir concentrações de até 10
10
células/ml de
Escherichia
coli, e
esporos de B. subtilis em menos de 15 minutos.
4.1.2 Esterilização pelo uso de descarga glow (ou de brilho) em pressão
atmosférica
Laroussi et al. 1996 mostrou que pode ser usada descarga glow à pressão
atmosférica para destruir células de Pseudomonas fluorecens. Ele usou suspensões das
bactérias em placas de Petri colocadas em um eletrodo coberto com dielétrico. Os
eletrodos foram colocados dentro de uma câmara com uma mistura de gases
(principalmente hélio). Ele obteve destruição completa de concentrações de
10
6
células/ml em menos de 10 minutos.
55
4.1.3 Esterilização pelo uso de jato de plasma à pressão atmosférica (APPJ)
Herrmann et al. 1999 usou o APPJ para inativar esporos de Bacillus globigii. Ele
constatou que houve redução de sete ordens de grandeza na concentração original de
B. globigii em aproximadamente 30 segundos.
Brandenburg et al. 2007 realizou experimentos com jato de plasma de argônio
excitado por RF, e também com descarga propagada por microondas, para tratar
instrumentos médicos. Eles testaram esporos de B. atrophaeus, S. aureus, e E. coli, e
observaram que para ambas as fontes, a esterilização dos materiais testados foi
eficiente.
4.1.4 Esterilização pelo uso de descarga de barreira resistiva
Richardson et al. 2000 e Laroussi et al. 2001 observaram uma redução de quatro
ordens de grandeza na concentração original de B. subtilis em aproximadamente 10
minutos. Eles também observaram que RBD inativa os esporos de B. subtilis, mas não
tão efetivamente quanto as células vegetativas. Nestas experiências, eles usaram uma
mistura de gás de 97% e 3% de hélio e oxigênio, respectivamente.
Alexeef et al. 2007, tratou superfícies contaminadas com suspensões de E. coli,
Pseudomonas fluorescens, e bacteriófago
λ
-fago, usando uma descarga de barreira
resistiva em pressão atmosférica. Ele observou que nos primeiros dez minutos de
tratamento ocorreu a esterilização da superfície. A esterilização foi bem mais rápida
com o acréscimo de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), já que em apenas um minuto
houve esterilização completa de E. coli, e de
λ
-fago em cinco minutos. Eles
construíram um gerador de plasma por descarga com barreira resistiva em pressão
atmosférica com volume relativamente grande. Foi gerada uma alta tensão dc de 30kV,
e freqüência de 60Hz. Eles também realizaram teste com gás nitrogênio e com filtro
elétrico, podendo observar assim que a esterilização ocorre pela combinação de tais
processos e pelos produtos de oxigênio gerados, como ozônio.
56
4.1.5 Esterilização pelo uso de descarga com barreira dielétrica
Segundo Kanasawa et al. 1998, a descarga com barreira dielétrica (DBD) tem
sido muito estudada para processos de geração de ozônio, e também tem sido aplicada
em modificação de superfície, controle de poluição, excitação de lasers de CO2, entre
outras aplicações.
Xingmin et al. 2006 mostrou, pelo método de descarga com barreira dielétrica,
que técnicas de esterilização por plasma estão em rápido desenvolvimento, visto ser
um método efetivo, simples, rápido e sem resíduos tóxicos. Em seus experimentos, ele
usou microrganismos na forma vegetativa, Staphylococcus aureus (representando
bactérias Gram positivas) e E. coli (representando bactérias Gram negativas), e na
forma de esporo, B. subtilis var niger. Esses microrganismos em suspensão foram
semeados sobre lamínulas de acrílico e tratados com plasma gerado por DBD, com
quatro tempos de exposição diferente 30, 60, 90 e 120 segundos. Observou-se, através
da curva de sobrevivência, que a forma vegetativa era mais suscetível ao efeito de
inativação que o esporo. Comparando as duas formas vegetativas empregadas em seu
experimento, Xingmin et al. 2006, notou que E. coli é mais suscetível ao efeito de
inativação que S. aureus porque tem estrutura peptídeo glicólica mais fina. Isso porque
o plasma induzido por DBD destrói a estrutura exterior das bactérias.
4.2 CINÉTICA QUÍMICA DA DESCARGA DE PLASMA
Segundo Gaunt et al. 2006, as propriedades químicas das descargas de plasmas
não térmicas são determinadas através de colisões entre elétrons e outros componentes
do plasma.
No ar, reações químicas são principalmente iniciadas pelo impacto de elétrons
com oxigênio e nitrogênio. Assim, entre os produtos básicos destas colisões estão o
57
oxigênio atômico, o oxigênio metastável e o nitrogênio, com colisões reativas
subseqüentes que produzem uma mistura de espécies neutras e iônicas.
Descargas em pressão atmosféricas diferem das descargas de baixa pressão pelas
espécies neutras reativas como oxigênio atômico, oxigênio singlet, e ozônio, ao invés
de íons.
Além disso, existem reações de superfície, quando se considera exposição de
amostras biológicas, que está relacionado ao dano oxidativo causado por descargas de
gás à pressão atmosférica em ar ou a presença de oxigênio. As espécies reativas mais
significantes são ozônio (O
3
), oxigênio atômico (O), íon metaestável (O
*-
),
superóxidos (O
2
*-
), peróxidos (O
2
-2
ou H
2
O
2
), e radicais de hidroxila (OH
*
).
A Tabela 4.1 resume as densidades típicas de algum íon e espécies carregadas em
vários dispositivos de plasma, segundo dados obtidos por Gaunt et al. 2006.
Tabela 4.1 –
Densidades típicas dos íons e átomos de oxigênio, de ozônio e espécies carregadas
nas descargas de plasmas.
Fonte
Densidades Típicas (cm
-
3
)
O
+
+ O
*
-
+ O
2
*
-
O O
3
Espécies carregadas
Descarga em
baixa pressão
10
10
10
14
<10
10
10
8
-10
13
Arco 10
15
10
18
<10
10
10
16
-10
1
9
Corona 10
10
10
12
10
18
10
9
-10
13
DBD 10
10
10
12
10
18
10
12
-10
15
Tocha de Plasma 10
12
10
16
10
16
10
11
-10
12
Em descarga corona e DBD, ozônio é o produto principal da reação, enquanto em
outras fontes de plasma, átomos de oxigênio representam uma proporção maior das
espécies reativas. Nas descargas DBD, as espécies de oxigênio carregadas são
rapidamente extinguidas dentro micro ou milissegundos.
Radicais de hidroxila são espécies altamente reativas formada pelas descargas,
que podem causar dano significativo à maioria das moléculas biológicas. A presença
de vapor de água em um gás usado na descarga resulta na formação de hidroxila por
dissociação da molécula de H
2
O por impacto eletrônico e por reações eletrônicas de
átomos de oxigênio excitados e moléculas de nitrogênio.
58
É provável que os radicais hidroxila sejam formados também durante reações na
superfície da membrana dos microrganismos.
Ar seco é usado na maioria dos dispositivos de plasma, visto que o vapor de água
reduz o número de microdescargas, e assim o volume de plasma. Por exemplo, uma
descarga glow é operada com menos de 14% de umidade relativa para se obter uma
discarga uniforme, segundo Gaunt et al. 2006.
A presença de superóxidos é de difícil detecção, visto que tem vida curta e não
fica acumulado. Sua presença em ar ionizado é assumida mais freqüente quando
peróxido de hidrogênio é encontrado. Esse radical pode ser gerado pela combinação de
um elétron com uma molécula de oxigênio, e sua química pode envolver reação iônica
com água de agrupamentos hidratados. Decomposição espontânea acontece por uma
reação denominada desmutação.
Peróxidos de hidrogênio é um produto da ionização do ar na presença de água ou
vapor de água, e é gerado pela maioria das ionizações. Também pode ser formado na
superfície de células na presença de íons no ar.
4.3 CINÉTICA DO PROCESSO DE INATIVAÇÃO DE BACTÉRIAS
Um parâmetro de medida de cinética, que é extensivamente usado por
pesquisadores é o chamado valor D (valor Decimal). O valor D é o tempo exigido para
reduzir uma concentração original de microrganismos em 90%. Neste caso, o valor D
é expresso em unidade de tempo.
Outro parâmetro que é de grande importância para sistemas práticos é o fator de
inativação (IF). O IF é a porcentagem de morte de uma população microbiana por um
tratamento particular, que depende da contagem inicial (antes do tratamento).
As curvas de sobrevivência têm formas diferentes dependendo do tipo de
microrganismo, o tipo do meio de cultura dos microrganismos, e o método de
exposição (exposição direta, ou exposição indireta – tem contato só com as espécies
reativas, mas não com o próprio plasma).
Moisan et al. 2001 afirma que existem três fases no processo de esterilização em
pressão baixa, conforme podemos ver exemplificado na Figura 4.1.
59
Figura 4.1 –
Ilustração das três fases características da curva de sobrevivência dos
microrganismos proposta por Moisan et al. 2001.
A primeira fase do processo de esterilização, que apresenta um valor D mais
curto, é principalmente devido à ação de radiação UV em esporos isolados ou na
primeira camada de esporos empilhados.
A segunda fase, que tem a cinética mais lenta, é atribuída a um processo lento de
erosão da membrana dos microrganismos, através de espécies ativas.
Finalmente, a terceira fase entra em ação depois que esporos foram inativados
pela fase 2, conseqüentemente, permitindo que o UV atinja o material genético dos
esporos ainda vivos. Foi observado que o valor D desta fase esta perto do valor D da
primeira fase.
É importante notar que a explicação dada anteriormente ainda está em debate, e
não é aplicável ao caso de plasmas de pressão atmosférica onde foi mostrado que UV
faz um papel secundário no processo mortal.
60
4.4 AGENTES DE INATIVAÇÃO DE BACTÉRIAS
Trata-se principalmente à radiação ultravioleta (UV), espécies reativas, e de
partículas carregadas (elétrons e íons). O efeito do calor não faz parte desta discussão,
uma vez que a temperatura das amostras sob tratamento é mantida próxima à
temperatura ambiente ou, pelo menos abaixo de um valor conhecido para causar dano
celular.
4.4.1 Efeito UV
O UV afeta as células de bactérias por induzir a formação de dímeros timina no
DNA. Isso inibe a capacidade da bactéria de se replicar.
Ao comparar a cinética de inativação de bactéria por radiação UV com lâmpada
de vapor de mercúrio, Laroussi et al. 1996 concluiu que UV não era o principal agente
de inativação. Essa conclusão foi apoiada pelo trabalho de Herrmann et al. 1999 que
expôs B. globigii ao plasma APPJ com o efluente bloqueado por uma janela de
quartzo. O quartzo é transparente para a radiação UV. Não foi observada redução
substancial na fase inicial da concentração de bactérias.
Uma possível explicação para estes resultados, talvez seja o fato de que a
inativação celular por UV só ocorre quando o seu comprimento de onda está dentro da
“gama germicida” (220 nm a 280 nm) e sua dose (expressa em watts.s/cm) é alta o
suficiente.
A maior parte das experiências de plasma à pressão atmosférica, simplesmente
não resulta na emissão de qualquer dose de radiação UV substancial, nos
comprimentos de onda germicida. Os curtos comprimentos de onda, que podem ser
gerados, não têm comprimentos suficientes para propagação e profundidade de
penetração para causar danos letais, especialmente para a exposição indireta. Assim, o
UV gerado pelo plasma em pressão atmosférica não satisfaz as condições germicidas,
portando a radiação UV não têm um efeito pronunciado.
61
4.4.2 Efeito de Espécies Reativas
As espécies reativas (O
3
, O
+
, OH, etc.) desempenham um importante papel nas
suas características germicida. Herrmann et al. 1999, Richardson et al. 2000, e
Kuzmichev et al. 2001 mostraram experimentalmente que as descargas que contêm
oxigênio têm um forte efeito germicida. Ele comparou os resultados obtidos por
tratamento com jato de plasma à pressão atmosférica (APPJ) com e sem oxigênio.
Verificou que o valor D, no caso de ausência de oxigênio assume um valor mais
elevado do que no caso quando o oxigênio é adicionado.
Richardson et al. 2000 mostrou que a descarga RBD tornou-se mais eficaz, em
inativar B. subtilis (formas vegetativa e esporulada), quando oxigênio foi misturado ao
hélio. Uma mistura contendo 3% de oxigênio produziu os melhores resultados.
Depois de experimentar com diferentes misturas de gás, Kuzmichev et al. 2001
concluiu que os melhores efeitos bactericidas são alcançados na presença de oxigênio
e ar úmido.
Na presença de umidade, o radical hidroxila, OH, também desempenha um papel
significativo em atacar quimicamente as estruturas exteriores das células bacterianas.
No caso do ar, a produção de NO e NO
x
acrescenta letalidade ao processo. E, claro, a
presença do O
2
no ar ou em descargas contendo uma mistura de oxigênio leva à
geração de ozônio (O
3
). O ozônio interfere na respiração celular, tendo um forte efeito
bactericida.
Outro método de obter um plasma rico em radicais ativos é acrescentando
pequenas quantidades de peróxido de hidrogênio, H
2
O
2
(na forma de aerossol, por
exemplo) em um volume da descarga. Yamamoto et al. 2001 relatou uma eficácia de
inativação reforçada (com um valor D de 15 segundos). Usando uma descarga corona
de argônio com uma mistura de H
2
O
2
na forma spray para inativar E. coli.
62
4.4.3 Efeito de Partículas Carregadas
Em altas pressões e com energias relativamente baixas, espera-se que
bombardeamento de células bacterianas por partículas carregadas venha a
desempenhar algum papel na destruição de microrganismos.
A maior parte dos pesquisadores tem negligenciado esse papel dos elétrons e íons
no processo de inativação bactérias. No entanto, Mendis et al. 2000 sugeriu que
partículas carregadas possam desempenhar um papel muito significativo na ruptura da
membrana externa das células bacterianas, principalmente em bactérias Gram-
negativas, que possui uma membrana irregular.
Mendis et al. 2000 afirma que as alterações morfológicas observadas
experimentalmente por Laroussi et al. 1996, usando microscopia eletrônica, apóia essa
alegação.
As bactérias normais têm diferença de potencial e as cargas elétricas na
membrana da célula podem ajudar as bactérias a absorver nutriente. Se as bactérias são
tratadas com uma voltagem alta, a estrutura da membrana da célula e a distribuição de
cargas da membrana podem ser destruídas. Além disso, com o efeito penetrante do
fluxo de partícula de alta velocidade na estrutura exterior de bactérias, poderia ser
destruída a parede da célula, e o citoplasma seria liberado causando a morte das
bactérias.
4.5 MECANISMO DE MORTE CELULAR
Várias propostas têm sido sugeridas para o mecanismo de destruição celular.
Moisan et al. 2001 sugeriu que UV, com os seus efeitos conhecidos sobre o material
genético, desempenha um papel primordial, seguido pela erosão da membrana celular,
induzida por UV, que, por sua vez, é seguido por decapagem da membrana celular
através de espécies reativas. As espécies reativas reagem quimicamente com o
biomaterial das células formando compostos voláteis. No entanto, essa seqüência de
63
eventos não é aplicável ao caso dos plasmas de alta pressão onde o UV não
desempenha um papel importante.
Montie et al. 2000 propõe três mecanismos de morte para o plasma de alta
pressão.
1) Peroxidação lipídica resultante da susceptibilidade dos ácidos graxos
insaturados a ataques de radicais hidroxila,
2) Oxidação de proteína resultante da susceptibilidade à oxidação dos
aminoácidos;
3) Oxidação do DNA resultante da formação de bases, que são geradas através de
reações com radicais oxigênio.
Laroussi et al. 1996 e Montie et al. 2000 mostraram que na bactéria E. coli
(Gram-negativas), a membrana externa rompe após curtas exposições ao plasma (10 a
30 segundos). Montie et al. 2000 afirma que a rápida ruptura da membrana de
bactérias Gram-negativas é devido a alterações da membrana lipídica causada pela
formação de peróxido de ácidos graxos.
Mendis et al. 2000 sugeriu que a ruptura da membrana de bactérias Gram-
negativas é causada pelo acúmulo cargas na superfície externa da membrana. As
bactérias Gram-positivas não apresentam alterações morfológicas visíveis. No entanto,
vários tipos de bactérias Gram-positivas tiveram uma redução da viabilidade celular.
Uma possível explicação é que algumas espécies reativas geradas pelo plasma
são capazes de difundir através da robusta membrana externa, e de reagir diretamente
com o biomaterial no interior da célula. Estas reações poderiam comprometer a
integridade de toda a célula, que conduz à sua morte, ou pode simplesmente tornar a
célula inativa.
Laroussi et al. 2001, realizaram experimentos sub-letais, e observaram que esses
experimentos afetaram as funções metabólicas das células, sem necessariamente
matar. Eles expuseram E. coli a pequenas doses de plasma e acompanharam a
evolução heterotrófica, em relação aos controles, para observar se houve mudanças nas
atividades enzimáticas. Observaram que a utilização de determinados nutrientes pelas
células expostas pode aumentar ou diminuir. O que indica que o plasma pode ser
utilizado apenas para alterar o comportamento metabólico dos microrganismos. Este
64
recém-descoberto efeito de biomanipulação dos plasmas frios pode potencialmente
levar a novas e interessantes aplicações biológicas.
4.6 DESCRIÇÃO DE ALGUNS EXPERIMENTOS REALIZADOS
4.6.1 Suspensão em lamínulas lavadas com PBS
Xingmin et al. 2006 realizou testes com uma forma vegetativa (E. Coli e S.
Aureus) um esporo (B. Subtilis var niger), usando um plasma de baixa-temperatura
produzido por descarga de barreira dielétrica (DBD). Os microrganismos foram
preparados em suspensão com concentração de 10
6
/ml.
Foi usado como dielétrico para a descarga DBD, um painel de resina de epóxi
com uma espessura de 0,5 mm, colocada num dos eletrodos. A suspensão foi colocada
em lamínula esterilizada (2cm x 2cm). Foram usadas quatro amostras experimentais e
um controle. As lamínulas com as suspensões de bactérias foram colocadas entre os
eletrodos e tratadas com plasma de baixa-temperatura. Quatro tempos de exposição
foram usados (30, 60, 90 e 120 segundos). O valor de pico da voltagem externa do
dispositivo experimental era 10 kV e a potência da descarga era 0,3 W. Cada lamínula
foi posta num tubo e lavada com PBS. Depois essa suspensão foi semeada em meio de
cultura e após incubação, as colônias foram contadas e as curvas de sobrevivência
foram feitas.
As amostras tratadas por cerca de 120 segundos foram observadas com
microscópio eletrônico. Os resultados da microscopia eletrônica mostraram que antes
do tratamento, o contorno de S. aureus e E. coli estavam intactas e o citoplasma
simétrico. O esporo de B. subtilis var niger tinha forma redonda, superfície lisa e
circunferência intacta.
Depois do tratamento com plasma por 120 segundos, a forma da maioria de S.
aureus e E. coli não estava mais intacta, e havia um grande número de fragmentos de
bactérias. A superfície de algumas bactérias que não estavam quebradas ficou áspera e
65
a circunferência borrada. O tamanho do esporo de B. Subtilis var niger foi aumentado
e sua forma ficou irregular. Alguns cortes foram vistos claramente em sua superfície.
Os resultados da microscopia eletrônica mostraram que o plasma destruiu a
estrutura exterior das bactérias. A forma vegetativa era mais suscetível ao efeito de
inativação que o esporo. Assim, pode-se concluir que os efeitos da alta voltagem e
fluxo de partícula de alta velocidade que penetram pela estrutura exterior das bactérias
podem exercer um papel dominante durante o processo.
4.6.2 Comparação através de microscopia eletrônica entre esterilização por
plasma, por ozônio e por radiação UV.
Sun et al. 2007 fez experimentos de tratamento de S. Aureus (Gram positivas) e
E. coli (Gram negativas) usando descarga de barreira dielétrica (DBD). Quatro tempos
de tratamento, 30, 60, 90, e 120 segundos, foram usados. Nesse caso também foi
aplicada a descarga sobre as lamínulas com bactérias em suspensão e depois lavadas
com PBS. O valor do pico de voltagem aplicado era 10 kV e a potência da descarga
era 0,3 W. Após 24 horas de incubação a 37º C, as UFC foram contadas.
Microscopia eletrônica foi usada para estudar o efeito de inativação e as
mudanças estruturais nas bactérias devido à ação da descarga DBD, do gerador de
ozônio, e da lâmpada UV (254 nm).
Resultados experimentais mostraram que o tempo de inativação das bactérias era
diferente usando métodos diferentes. Aproximadamente 120 segundos com DBD,
10 minutos com gerador de ozônio, e 30 minutos com lâmpada UV.
Observamos na figura 4.2 a comparação dos resultados da microscopia
eletrônica. Na amostra sem tratamento, tratada com ozônio e tratada com UV
observamos as estruturas intactas, mas houve modificações estruturais de S. aureus
após o tratamento com plasma.
66
Figura 4.2– S. aureus (a) amostra sem tratamento (b) 120 s de exposição ao plasma,
(c) 10 min. de exposição ao ozônio, e (d) 30 min. de exposição à lâmpada UV
MEV com aumento de 10000 vezes (1cm equivale a 0,7
µ
m)
Figura 4.3– E.coli (a) amostra sem tratamento (b) 120 s de exposição ao plasma,
(c) 10 min. de exposição ao ozônio, e (d) 30 min. de exposição à lâmpada UV
MEV com aumento de 10000 vezes (1cm equivale a 0,7
µ
m)
Na figura 4.3 observamos também que somente após o tratamento com plasma
ocorreram significativas modificações estruturais de E. coli.
Depois do tratamento com DBD por 120 segundos, foram observados fragmentos
bacterianos de S. aureus e E. coli em grande número. Foi observado dano na
67
integridade estrutural das bactérias tratadas. Porém, as bactérias inativadas ainda
mantiveram integridade depois do tratamento usando o gerador de ozônio ou a
lâmpada de UV. Por isso Sun et al. supõe que partículas carregadas e radicais livres
ativos têm maior efeito na esterilização por plasma.
4.6.3 Suspensão em lamínulas úmidas, e com acréscimo de solução salina.
O efeito de esterilização de B. subtilis e E. coli foi investigado usando plasma de
DBD a pressão atmosférica por Tanino et al. 2007.
A figura 4.4 ilustra o reator de descarga com barreira dielétrica. Uma folha de
Teflon de dois milímetros foi fixada, como uma barreira de dielétrica, no eletrodo
(100mm x 100mm).
Figura 4.4 – Esquema da descarga DBD usada no experimento citado.
A voltagem, a freqüência da forma de onda da voltagem aplicada e a potência
média eram 24kV pico-a-pico, 34kHz e 230W, respectivamente.
As amostras (uma seca à temperatura ambiente, e outra úmida) foram colocadas
sobre os eletrodos.
Foi examinado o efeito do tempo de tratamento de 1, 2, 3 e 4 minuto(s) para o
método seco. O número de sobreviventes diminuiu com tempo de tratamento
crescente, e a esterilização completa foi alcançada depois de 4 minutos de tratamento.
O valor D do método seco era aproximadamente 40 segundos.
68
Para o método úmido, onde a amostra foi usada imediatamente após ser colocada
sobre a lamínula, o tempo de tratamento foi de 10, 20, 30 e 40 segundos. O efeito de
esterilização também aumentou com o tempo de tratamento e a esterilização completa
foi alcançada depois de 40 segundos. O efeito de esterilização deste método foi muito
mais alto que do método seco e o valor D era só 7 segundos neste caso.
Os resultados experimentais do teste de esterilização a seco e úmido sugerem que
a água aumenta o efeito de esterilização devido à produção de radicais OH. Além
disso, desarranjo elétrico da membrana da célula também é outra possível explicação
do aumento de esterilização na presença de água, isso porque a corrente que flui pelos
esporos é aumentada, e a presença de água poderiam ter induzido a transição dos
esporos
1
para alimentar as células que são menos resistentes.
Embora o método úmido seja muito efetivo, sua aplicação é um pouco limitada.
Então, foi modificado o método seco. Adicionando à amostra seca 0,1ml de água pura,
antes do teste de esterilização. O tratamento foi feito com 230W, 34kHz. O número
dos sobreviventes diminuiu com tempo de tratamento crescente. Esterilização
completa foi alcançada depois de 70 segundos de tratamento, e o valor de redução
decimal (valor D) era aproximadamente 12 segundos. O efeito de esterilização deste
método foi mais alto que do método seco, mas ligeiramente mais baixo que o do
método úmido. Isto pode ser, possivelmente, porque os esporos foram coagulados e
acumulados durante preparação da amostra seca. Assim os radicais não podem
difundir para dentro dos esporos acumulados.
Para examinar o efeito da condutividade da suspensão de esporo, foram feitos
experimentos de esterilização com o método seco modificado adicionando água
salgada. Os resultados mostram que a adição de 4g/L de sal aumentou o efeito de
esterilização. Por outro lado, uma adição de 8 e 10g/L de sal diminui o efeito da
esterilização, isso porque se os esporos estiverem cobertos com líquido altamente
condutivo, eles são protegidos eletricamente e desarranjo elétrico da membrana pode
ser suprimido.
____________________
1
Em situações adversas o microrganismo se torna um esporo, sendo envolvido por uma parede celular
que o protege até as condições ambientais se mostrarem novamente favoráveis à sua germinação.
69
4.6.4 Análise do estado dos componentes biológicos e bacteriófagos durante
inativação por descarga DBD.
Plasmas de pressão atmosféricos não-térmicos tem sido recentemente aplicados
no campo biomédico, mas para levar estas aplicações adiante, é muito importante
saber os efeitos causados pelo plasma nas células e componentes celulares,
especialmente nas membranas, proteínas, e DNA, a nível molecular.
Para tanto, Yasuda et al. 2008, fez um estudo da esterilização de esporos de
Bacillus subtilis, semeados em lamínulas de vidro, usando DBD a pressão atmosférica,
com 40 kV pico a pico de voltagem, freqüência de 2kHz, e potência média de 8,8W.
Os resultados mostraram que o método de esterilização de plasma é realizado a
uma velocidade relativamente alta para esporos de B. subtilis comparado com métodos
convencionais. Tratamento de plasma com adição de H
2
O mostrou ter um desempenho
mais alto comparado com o método seco (Tanino et al. 2007). Tirando proveito da
destruição da parede celular através da aplicação de DBD, um método de extração
universal de DNA de micróbios que não usa enzimas digestoras de parede celular
também foi proposto por Yasuda et al. 2008.
Além da esterilização, é interessante conhecer os estados de componentes
biológicos antes da inativação celular (doses não letais).
Yasuda et al. 2008 realizou experiências com suspensões de bactérias e
bacteriófagos. A investigação foi focalizada na análise de membrana, proteína, e DNA
após tratamento com DBD atmosférico em E.coli e sistema bacteriófago-λ. Foi usado
como eletrodo para descarga DBD, uma malha de aço conectada a alta tensão e uma
placa de alumínio aterrada. Uma folha de Teflon de dois milímetros foi fixada no
eletrodo de alta tensão como barreira dielétrica. Uma fonte de alta tensão ac foi usada
para gerar a descarga uniforme na abertura de ar de três milímetros. A voltagem era de
40 kV pico-a-pico (ajustada por osciloscópio), a freqüência era de 2kHz e a potencia
útil de 8,8W (calculada pelo método da figura de Lissajous). Um pedaço de filme PET,
de 90x30mm
2
, foi coberto por meio de cultura gelatinoso. Esse filme PET com o meio
gelatinoso foi seco por 5 minutos e deixado 24h sob luz UV. Depois, 20 µL de
70
suspensão das amostras foram espalhadas sobre o filme PET e logo em seguida foi
aplicado plasma em pressão atmosférica. As suspensões das amostras foram
recuperadas em um microtubo, lavando a superfície do filme PET com 100µL de água
destilada. Nas amostras recuperadas foram feitas experiências de estimação de
sobrevivência, medida de fluorescência, análise de proteína, análise de DNA, e
observação microscópica.
Segundo os experimentos de Yasuda et al. 2008, podemos observar que a
aplicação de DBD atmosférico para esterilização bacteriana, mantendo as células em
uma solução de água, tem as seguintes vantagens experimentais:
1) o estado biologicamente ativo das células pode ser investigado.
2) as condições circunvizinhas das células podem ser controladas acrescentando
substâncias químicas à solução.
3) a eficiência da inativação bacteriana é maior do que usando amostras secas,
debaixo das mesmas condições elétricas.
Pela curva de sobrevivência de E.coli, Yasuda et al. 2008, observou uma redução
decimal da concentração inicial em 30 segundos de tratamento, e esterilização
completa foi alcançada após 40 segundos de tratamento. Pela medida de intensidade de
GFP (Green Fluorescent Protein) em E. coli depois do tratamento com DBD,
observou-se que a intensidade diminuiu com o aumento do tempo de tratamento, e
inativação completa da função de GFP foi vista depois de 40 segundos de tratamento.
Yasuda et al. 2008 sugeriram que essa diminuição foi causada pela desnaturação
irreversível ou modificação química das células.
A análise de DNA das células tratadas, através de eletroforese em gel de agarose,
mostrou que o padrão do cromossomo não mudou até 30 segundos de tratamento de
DBD. Um pouco de degradação na amostra foi vista em 40 segundos de tratamento, o
que pode ter sido causado pela acidez aumentada da amostra de DNA. Yasuda et al.
2008 concluiu que o cromossomo do DNA não degradou notavelmente durante
inativação das células de E.coli.
Da mesma forma foi observado que o tratamento DBD não interfere no RNA
ribossômico.
71
Pela análise em microscopia, observou-se que com o aumento do tempo de
tratamento, as paredes das células ficam destruídas e, portanto, as células ficam
interconectadas entre si. Yasuda et al. 2008 concluiu que danos na membrana das
células são essenciais para esterilização bacteriana através de plasma de baixa
temperatura.
Yasuda et al. 2008 fez experimentos de tratamento com DBD em bacteriófagos,
que normalmente não têm membrana e consistem somente em proteínas e ácidos
nucléicos. Nesse caso, o número de fagos infecciosos diminuiu depressa e a inativação
completa foi alcançada depois de 30 segundos de tratamento. A taxa de inativação foi
mais alta que a de E.coli, debaixo das mesmas condições elétricas. Também foi feita
análise de eletroforese e foram observadas degradações mais rápidas das proteínas,
quando comparado com tratamento de E. coli. Embora a taxa de degradação das
proteínas tenha sido mais lenta em comparação com a taxa de inativação dos fagos, o
tempo de desaparecimento das proteínas e de inativação dos fagos coincidiu. Por isso,
foi sugerido que a membrana celular tem função protetora para o DNA contra a
descarga DBD.
Com base nesses experimentos, concluiu-se que, na fase inicial de esterilização,
algumas proteínas foram depressa e irreversivelmente inativadas por desnaturação ou
modificação de substância química, como oxidação e redução, mas não por
degradação. Não só a destruição de membrana ou dano no DNA, mas a inativação
rápida de proteínas pode ter um papel significativo na esterilização por DBD. Por
exemplo, a inativação ribossômica interrompe a síntese de proteína e causa a morte da
célula, mesmo com o DNA mantido intacto.
Investigação do processo de inativação em outras proteínas celulares pode trazer
elucidações ao mecanismo de esterilização através de aplicação de DBD.
72
4.6.5 Análise de extravasamento de K
+
e ácidos nucléicos após tratamento por
descarga DBD
Yue Ma et al. 2008 realizou experimentos com descarga DBD a pressão
atmosférica para tratamento de E. coli e S. aureus. O reator consistia em dois eletrodos
de alumínio cobertos com placas de quartzo de 2mm (superior) e 1 mm (inferior). A
descarga é gerada por alta tensão alternada, cujos parâmetros foram de 30 kV pico-a-
pico, freqüência de 60 kHz, e distancia de três milímetros. Para prevenir contaminação
microbiana, antes de cada experiência, a superfície interna foi limpa com álcool 75%,
e o dispositivo de reação foi colocado sob lâmpada UV por duas horas. Em lamínulas
de vidro foram colocadas 50 µl das suspensões dos microrganismos (E. coli e S.
aureus) e tratadas com DBD. Depois essas suspensões foram transferidas para tubos
de teste por lavagem das lamínulas com 2 ml de PBS. As amostras foram mantidas
líquidas para análises. Foi feita microscopia eletrônica de transmissão para observar a
integridade das células, e um analisador de bioquímica semi-automático foi usado para
medir a concentração de K
+
na suspensão tratada. Além disso, um espectrofotômetro
de UV visível (UVS) foi empregado para inspecionar as concentrações de proteína e
ácidos nucléicos. Com estes métodos, o dano nas células tratadas por plasma foi
analisado.
Yue Ma et al. 2008 observou que com 10 segundos de tratamento as células de S.
aureus estavam quase todas mortas, enquanto a E. coli demorou 7 segundos. Isso
porque a parede das células Gram-positivas contém uma camada de peptideoglicanos
mais espessa.
Das amostras tratadas por 5 segundos e das amostras sem tratamento, foram feitas
imagens de TEM (×50000), conforme observado na Figura 4.5.
73
Figura 4.5 –
Imagem de TEM feitas por Yue Ma et al. 2008: (a) S. aureus antes do tratamento por
plasma, (b) S. aureus depois do tratamento por plasma, (c) S. aureus antes do tratamento
por plasma, (d) S. aureus depois do tratamento por plasma.
Yue Ma et al. 2008 observou que antes do tratamento a membrana da célula era
lisa, mas depois do tratamento ela ficou significativamente áspera. Também, observou-
se que as membranas ficaram rompidas e o citoplasma extravasado.
Yue Ma et al. 2008 fez experiências adicionais para descobrir o estado de
vazamento das células depois do tratamento com plasma. A suspensão bacteriana
tratada foi centrifugada a 2000×g por 10 minutos, e então, foram coletados os
precipitados. O K
+
foi destilado e a concentração medida por um analisador de
bioquímica semi-automático com o comprimento de onda de 620 nm. As
concentrações de K
+
extravasados no precipitado das suspensões de S. aureus e E. coli
aumentaram com o tempo de exposição ao tratamento de 0 a 10 segundos. Depois de
10 segundos, a concentração de K
+
nas duas suspensões bacterianas se tornaram
saturadas. As concentrações de proteínas e ácido nucléico foram medidas por
procedimentos semelhantes ao de K
+
, mas a suspensão bacteriana foi centrifugada a
5000×g por 5 minutos. A densidade óptica (DO) do precipitado foi medida por UVS
(com 280 nm para proteína e 260 nm para ácido nucléico). Isso porque o valor da
74
densidade ótica é proporcional à concentração do elemento. Observou-se que as
concentrações de proteínas e ácido nucléico de S. aureus e E. coli aumentaram
nitidamente com o tempo de exposição até quatro segundos, e depois, a concentração
diminuiu com a extensão do tempo de exposição. Depois que o tempo de exposição
excedeu 10 segundos, a taxa decrescente da concentração permaneceu praticamente
constante.
A ação de campo elétrico aplicado em esterilização de bactéria foi explorada por
Yue Ma et al. 2008, através de um experimento com 60 segundos de tratamento e
variação da voltagem, aumentada até a voltagem de descarga crítica. Nesta
experiência, a voltagem crítica era aproximadamente 12 kV. Observou-se que com os
aumentos de voltagem aplicados, o numero de sobreviventes de S. aureus e E. coli não
mudaram muito. Assim, Yue Ma et al. 2008, em seu experimento, concluiu que é
improvável que o campo elétrico tenha contribuição significativa na inativação
bacteriana.
Yue Ma et al. 2008, considera que em plasma de pressão atmosférica, a maior
parte da radiação UV produzida é reabsorvido no plasma e não atinge a superfície
tratada. Mas, a descarga DBD pode criar espécies reativas, como átomos de oxigênio,
ozônio, moléculas de oxigênio metaestáveis, peróxidos, superóxidos, e radicais de
hidroxila, e todos eles são bactericidas. Essas espécies reativas podem oxidar a
membrana das células e causar o vazamento do citoplasma, resultando nas
concentrações de K
+
, proteína, e ácido nucléico aumentadas nas suspensões
bacterianas. Porém, com o tempo de exposição ao plasma estendido, as proteínas
extravasadas e o ácido nucléico são oxidados gradualmente pelas espécies reativas,
conduzindo à diminuição da concentração deles nas suspensões, mas o K
+
não pode
ser oxidado, e assim, sua concentração satura.
Assim, Yue Ma et al. 2008, concluiu que as espécies reativas têm o papel
principal no processo de inativação.
75
4.6.6 Experimento para comparação entre dano físico e químico nos
microrganismos causados por descarga DBD.
Choi et at. 2006, produziu um sistema de esterilização eficiente que utiliza DBD
pulsado, analisando o efeito germicida através de espectroscopia óptica de emissão
(OES). Foi usada uma suspensão de E. coli em 0,9% de solução salina. Essa suspensão
foi inoculada sobre lamínulas de vidro. Depois de secar a temperatura ambiente por
duas horas, as lamínulas foram colocadas na abertura de ar do reator sob uma placa de
alumínio para tratamento de DBD. Para o tratamento, Choi et at. 2006 usou freqüência
de 1kHz e tensão de 11 kV.
Depois do tratamento, as lamínulas foram colocadas em suspensão salina e
mexidas por 10 minutos para remoção e dispersão das colônias de E. coli. Essa solução
foi diluída em 10
-1
e semeadas em placas de petri com agar. O número de UFC foi
contado depois de 24 horas de incubação a 37ºC.
Para a observação em microscópio eletrônico (SEM) da morfologia da E. coli as
lamínulas foram cobertas por L-lisina, para desenvolver adesão entre células e a placa.
Depois, as lamínulas foram cobertas por uma fina camada de ouro e as morfologias
observadas por SEM.
Choi et al. 2006 observou que conforme aumenta o tempo de tratamento, maior é
o poder de esterilização. As figuras 4.6 e 4.7 mostram as imagens de SEM da E.coli
com aumento de 2000 e 10000 vezes.
76
Figura 4.6 –
Imagem de SEM de E. coli com aumento de 2000 vezes dos tratamentos de:
(a) 0 segundo, (b) 10 segundos, (c) 30 segundos, (d) 50 segundos, (e) 70 segundos.
(feitos por Choi et at. 2006).
Figura 4.6 –
Imagem de SEM de E. coli com aumento de 10000 vezes dos tratamentos de:
(a) 0 segundo, (b) 10 segundos, (c) 30 segundos, (d) 50 segundos, (e) 70 segundos.
(feitos por Choi et at. 2006). (1cm equivale a 0,7
µ
m)
77
Estas imagens indicam que o tratamento com plasma separa as colônias de E.
coli e corroem a superfície do esporo ou divide os esporos em muitos pedaços.
Para determinar qual o processo predominante (físico ou químico) Choi et al.
2006, realizou o seguinte experimento: Inoculou E. coli, B. subtilis e Pseudomonas
aeruginosas no meio de cultura em placa de Petri. Sob a placa de Petri foi colocado
um eletrodo de cobre fixo. Além disso, uma placa de alumina com um eletrodo de
cobre foi colocada sobre a placa de Petri com o meio de cultura a uma distância de 1
mm, funcionando como barreira dielétrica. Para esta experiência, foi aplicado 18kV
pulsado com de 2 kHz, e tempo de duração de tratamento foi de um minuto. (veja
Figura 4.8).
Figura 4.8 –
Diagrama esquemático do aparato de esterilização usado por Choi et at. 2006,
para distinguir entre dano físico e químico na bactéria tratada com plasma.
Para confirmar a esterilização química através de espécies neutras durante o
tratamento, duas amostras de cada bactéria foram tratadas com papel manteiga (papel
impermeável transparente) tampando a região do plasma para excluir as espécies
químicas neutras. Deste experimento pode-se observar o efeito químico entre amostras
com ou sem papel manteiga. No caso de amostras com papel manteiga, também houve
78
esterilização. Assim, podemos concluir que o dano causado por substâncias químicas
(ozônio, oxigênio atômico, etc) também é importante para esterilização através do
plasma.
4.6.7 Coagulação sanguínea e esterilização de tecidos por descarga com barreira
dielétrica no ar usando eletrodo flutuante.
Foi propostos por Fridman et al. 2006 e Kalghatgi 2007 métodos de tratamento
direto de tecido vivo que acontece a temperatura e pressão ambiente sem dano de
tecido visível ou microscópico. A descarga com barreira dielétrica, usando eletrodo
flutuante, é eletricamente segura para uso em humanos e pode ser usada para
esterilização completa da flora da pele em segundos, e formação de coágulo de sangue
em segundos de tratamento. Além disso, Fridman et al. 2007 pesquisou o uso de
descarga com barreira dielétrica com eletrodo flutuante, para promoção de apoptose
em células cancerosas (melanomas).
Tecido vivo de animal ou humano, que contém muita água e uma constante
dielétrica relativamente alta, tem a exigida capacidade alta para armazenamento de
carga e, então, pode ser empregado facilmente como o eletrodo flutuante (FE) da
DBD. Neste caso o plasma é gerado entre o tecido vivo e o outro eletrodo.
O plasma gerado deste modo pode ser aplicado diretamente a um tecido humano
vivo sem aquecimento ou dano químico do mesmo. Além da esterilização de tecido, o
plasma coagula o sangue rapidamente. Foi observada a catálise no processo natural de
coagulação de sangue.
Com o tratamento com plasma, observaram redução do tempo de coagulação do
sangue. Visualmente, uma gota de sangue tirada de um doador saudável coagula em
aproximadamente 15 min, enquanto uma gota semelhante tratada 15 segundos com
plasma coagula em menos de 1 minuto. Tratamentos em órgãos mostraram resultados
semelhantes sem qualquer dano visível ou microscópico do tecido. Isso porque, foi
observada mudança significativa em concentrações de proteína do plasma sangüíneo
depois do tratamento, acelerando o processo de coagulação.
79
Descargas elétricas convencionais (pressão alta e baixa e temperatura) são
conhecidas pela sua capacidade de esterilizar várias superfícies. A vantagem do
sistema FE-DBD proposto é sua capacidade de esterilizar tecido animal ou humano
vivo sem qualquer dano para o tecido tratado, em até 5 minutos de tratamento.
Para quantificar a extensão de esterilização e determinar possíveis fatores
responsável, foram feitos testes uma grande quantidade de bactérias obtida em swab de
tecido de cadáver cultivada em agar sangue (10
9
ufc/ml). Esses meios de cultura foram
tratados com plasma. Também foi feito teste da viabilidade do agar após tratamento
com plasma. Observou-se a esterilização da flora bacteriana sem danos aos tecidos.
4.6.8 Modelagem matemática da descontaminação por uso da descarga com
barreira dielétrica (DBD)
Para entender o mecanismo de desativação rápida, um estudo de caracterização
numérica foi executado por Gallagher et al. 2007 para identificar qual fator do plasma
(espécies químicas ativas e carregadas e espécies excitadas) é mais efetivo para
esterilização. Como cada tipo de microrganismo tem uma composição celular diferente
e respostas diferentes a fatores externos, eles construíram um modelo que pode
descrever a cinética de desinfecção para todos os tipos de microrganismos no plasma
de DBD. Este modelo utiliza uma cinética química aproximada que usa equações de
taxa de crescimento para descrever as mudanças nas concentrações de um
microorganismo viável considerando o efeito de cada fator do plasma individualmente.
A equação diferencial seguinte descreve a taxa de mudança em concentração de um
microorganismo viável [M] com tempo:
[
]
[ ][ ]
,
1
i
n
i
i
AMk
dt
Md
∑
=
−=
(4.1)
onde n é o número de espécies do plasma que interagem com microorganismos, k
i
é a
taxa constante de reação dada como volume por unidade de tempo, [M] é a
concentração por unidade de volume de microrganismos viáveis, A
i
é a concentração
80
por unidade de volume da i-ésima espécie. A concentração [M] é específica para uma
determinada experiência. O número n e a concentração [A] de espécies interagindo é
dependente do tipo de descarga de plasma, e k
i
é uma constante específica do tipo da
espécie A
i
.
As constantes de taxa de reação podem ser derivadas de dados experimentais
básicos pela fórmula seguinte:
[ ]
,
1
ln
,
tA
S
k
i
mi
⋅
=
(4.2)
onde S é a fração de microrganismos sobreviventes, e t é o tempo de exposição. O
produto [A
1
].t também é conhecido como tempo de contato (CT). As constantes de
taxa de reação são derivadas de dados empíricos.
A partir desse modelo, Gallagher et al. 2007 realizou um estudo de
caracterização numérica simples para quantificar o efeito da esterilização de três
fatores do plasma (O
3
, OH, e UV) em bactérias E. coli tratadas no sistema DBGD. Os
resultados mostram que a hidroxila tem um efeito significativo (responsável
por ~13.5% das mortes); porém, ozônio e UVC têm um efeito desprezível num tempo
de exposição muito curto (~1 ms). Estas estimativas numéricas devem ser ampliadas
para incluir outras espécies quimicamente ativas: radicais (por exemplo, oxigênio
atômico), partículas carregadas (íons e elétrons), e moléculas eletronicamente
excitadas para caracterizar completamente e quantificar o efeito de esterilização do
plasma de DBD. Para alcançar isto devem ser providos dados experimentais do efeito
individual destas espécies em diferentes microrganismos.
81
5 METODOLOGIA
Neste capítulo vamos descrever como realizamos os experimentos de
esterilização de meios de culturas pelo uso do plasma.
5.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
•
Reator de plasma confeccionado no laboratório de Plasma da Faculdade de
Engenharia de Guaratinguetá;
•
Estufa para esterilização (170ºC/1h ou 160ºC/2h);
•
Autoclave;
•
Estufa de incubação 37ºC;
•
Erlenmeyer;
•
Agar Sabouraud;
•
Meio de cultura líquido TSB (Tryptone Soya Broth);
•
Agar TSA (Tryptone Soya Agar);
•
Balança de alta precisão da marca
Metller Toledo, modelo AB204, com capacidade de
10mg - 210g, erro de 1 mg e desvio de 0,1mg;
•
Bicos de Bunsen;
•
Placas de Petri;
•
Tubos de ensaio 13x10cm;
•
Água destilada;
•
Solução salina 0,85%;
•
Alça bacteriológica de Platina;
•
Espectrofotômetro da marca Micronal modelo B582;
•
Cubetas para espectrofotometria;
•
Escala de McFarland;
•
Alças de Drigalski;
•
Micropipeta estéril e ponteiras azuis (capacidade de 100 µl a 1000 µl);
•
Micropipeta estéril e ponteiras amarelas (capacidade de 10 µl a 100 µl);
82
•
Placas de microtitulação com 96 poços;
•
Lamínulas de vidro;
•
Lamínulas de silício;
•
Glutaraldeído 2,5%;
•
Álcool (25%, 50%, 75% e 100%);
•
Tubos Falcon;
•
Microscópio eletrônico de varredura (JEOL modelo JSM - 5310) do laboratório de
sensores e materiais (LAS) do INPE em São José dos Campos;
•
Candida albicans ATCC18804, Escherichia coli ATCC23922, Bacillus Subtilis
ATCC19659, e Staphylococcus aureus ATCC 6538, cedidos pela Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos (Unesp);
•
Software Origin 6.0.
5.2 REATOR DE PLASMA
O reator é constituído por dois eletrodos submetidos a altas tensões alternadas
(dezenas de kV) e permeados pelo ar em pressão atmosférica. Entre os eletrodos foi
colocado um material dielétrico (a própria placa de Petri ou de microtitulação com o
meio de cultura foi utilizada como dielétrico).
Devido à presença do dielétrico, a descarga DBD é caracterizada por um grande
número de rápidas microdescargas, distribuídas aleatoriamente no tempo e no espaço
entre os eletrodos.
A tensão empregada no reator vem de um gerador de tensão variável, operando a
60 Hz, constituído de um auto transformador Variac (gera tensão alternada entre 0 e
110V) e de um transformador de alta tensão, que eleva uma tensão eficaz de entrada de
110V a uma tensão de saída de, aproximadamente, 40 kV pico-a-pico. Para limitar a
corrente no circuito e proteger o transformador no caso de um curto-circuito, é usada
uma resistência de aproximadamente 1k
Ω.
83
A figura 5.1 mostra o transformador Variac e o transformador de alta tensão
usado nos nossos experimentos.
Figura 5.1 – Auto transformador Variac e transformador de alta tensão.
As medidas elétricas do reator DBD foram feitas usando um osciloscópio de
quatro canais (Tektronix TDS 320). Para medir a tensão aplicada ao reator foi usada
uma sonda de alta tensão (Tektronix P6015A), que atenua o sinal enviado ao
osciloscópio em 1000 vezes. A corrente na descarga foi obtida medindo-se a queda de
potencial sobre um resistor de 1200 Ω, ligado em série ao circuito.
A Figura 5.2 mostra o circuito e o osciloscópio usados para obter as medidas
elétricas de nossos experimentos. E a Figura 5.3 mostra um esquema do circuito de
medidas.
Figura 5.2 – Circuito de obtenção de medidas elétricas
.
84
Figura 5.3 – Esquema do circuito de obtenção de medidas elétricas
.
A determinação experimental da potência consumida em cada ciclo da descarga
foi realizada pelo método da figura de Lissajous, obtida plotando a carga transportada
nas microdescargas em função da tensão periódica aplicada. A área interna da figura
formada em um ciclo corresponde à energia elétrica distribuída ao plasma num período
(potência). A carga foi calculada experimentalmente medindo-se a tensão sobre um
capacitor de 0,91 µF ligado em série ao circuito. Assim a potência consumida em um
ciclo foi obtida pelo produto entre a freqüência da tensão ac (60 Hz) e a área interna da
figura de Lissajous.
Após a padronização dos experimentos, fizemos uma curva de calibração
conforme os dados da Tabela 5.1 e gráfico da Figura 5.4. Assim pudemos monitorar a
voltagem utilizada nos experimentos através de um multímetro ligado na saída do
Variac, cuja tensão mantivemos abaixo de 120V.
85
Tabela 5.1 – Curva de Calibração de Tensão
Osciloscópio (kV pp)
Multímetro (V) Escala do Variac
(unidade relativa)
1,4 3 5
3,4 10 10
5,4 16 15
7,2 21 20
9,12 26 25
11,2 33 30
13,2 38 35
15 44 40
17,2 50 45
19 55 50
21 61 55
23 67 60
24,8 73 65
27 79 70
28,8 85 75
30,8 91 80
32,8 96 85
35 103 90
36,8 108 95
38,5 114 100
40 118 103
Figura 5.4 – Gráfico da curva de calibração de tensão do experimento
.
86
5.3 PREPARAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA E DAS SUSPENSÕES
Esterilizamos o erlenmeyer e as alças de Drigalski, em estufa 170º C/1h.
Os tubos de ensaio com tampão de algodão e gaze, as ponteiras da micropipeta, e
os tubos de ensaio com solução fisiológica foram esterilizados em autoclave (121ºC
por 15 min.).
No erlenmeyer estéril, diluímos o meio de cultura apropriado (medido com
balança de precisão), em água destilada, depois esterilizamos esse erlenmeyer em
autoclave.
Colocamos o meio de cultura estéril em placas de Petri estéril, após solidificar,
colocamos em geladeira com a tampa voltada para baixo.
Semeamos as amostras dos microrganismos a serem utilizados no meio de
cultura frio usando alça de platina, e armazenamos em estufa 37 ºC por 24 horas.
Após 24 horas, fizemos suspensão celular, fixando a concentração através de
espectrofotometria ou, em alguns casos, pela escala de turvação de McFarland.
5.4 EXPERIMENTO COM SUSPENSÕES EM PLACA DE MICROTITULAÇÃO
Inicialmente, montamos um sistema reator de plasma por descarga DBD, que
consiste num dispositivo dielétrico posicionado entre dois eletrodos, alimentados por
alta tensão alternada, com freqüência de 60 Hz, tensão de 40 kV pico-a-pico.
Usamos uma placa de microtitulação contendo os microrganismos, como
dielétrico do nosso sistema, e os eletrodos foram adaptados na placa para que não
houvesse nenhum risco de contaminação durante os experimentos.
A figura 5.5 mostra a configuração do experimento com placa de microtitulação,
com o eletrodo de alta tensão fixado na parte superior e o eletrodo aterrado na parte
inferior.
87
Figura 5.5 – Configuração do reator formado pela placa de microtitulação
.
5.4.1 Placa de microtitulação com suspensões em solução salina
Para diminuir a distância entre os eletrodos, visto que a placa possui grandes
dimensões, as suspensões celulares foram feitas em solução salina.
Os poços da placa de microtitulação foram apenas parcialmente preenchidos
(150µl) para que houvesse quantidade de ar suficiente para formação de ozônio, visto
que o ozônio pode ser um dos agentes ativos na esterilização.
Para realizar nossos experimentos de esterilização por plasma, usamos
primeiramente o fungo C. albicans. Fizemos suspensão celular de 20 amostras (19
fenótipos e 1 padrão), em solução fisiológica. Na amostra padrão (ATCC18804),
fixamos a concentração de aproximadamente 10
6
/ml através de espectrofotometria
(comprimento de onda de
530 nm
e densidade ótica de 0,286), e igualamos as demais
amostras por turvação. Depois, colocamos 150 µl de cada suspensão em 20 poços de
uma placa de microtitulação, adaptada para servir com dielétrico do nosso sistema.
Realizamos a descarga DBD sobre a placa, com dois diferentes tempos de
exposição (1 minuto e 3 minutos). Logo em seguida, semeamos 100 µl da suspensão,
de cada poço, em Agar Sabouraud, em placas de Petri.
Após 24 horas de incubação, tentamos realizar a contagem das Unidades
Formadoras de Colônias (UFC), para traçar a curva de sobrevivência de cada amostra.
Através da curva de sobrevivência dos microrganismos analisados e comparação com
88
diferentes tempos de exposição ao plasma, queríamos analisar a eficácia da inativação
de microrganismos por exposição ao plasma gerado através de descarga com barreira
dielétrica.
5.4.2 Placa de microtitulação com suspensões em água destilada
Conforme observado em Tanino et al. 2007, uma concentração de sal maior que
4g/L pode diminuir o efeito da esterilização. Por isso resolvemos realizar experimentos
em placa de microtitulação usando suspensões em água destilada. Além disso, através
dos resultados obtidos, achamos necessário aumentar o tempo de exposição.
Novamente usamos o fungo C. albicans. Fizemos suspensão celular de quatro
amostras (três fenótipos e um padrão – ATCC18804), em água destilada. Fixamos a
concentração de aproximadamente 10
6
/ml através da escala de turvação de
McFarland. Depois, colocamos 100 µl de cada suspensão em 4 poços de uma placa de
microtitulação, adaptada para servir com dielétrico do nosso sistema.
Realizamos a descarga DBD sobre a placa, com quatro diferentes tempos de
exposição (2, 5, 10 e 15 minutos). Logo em seguida, semeamos os 100 µl da
suspensão, de cada poço, em Agar Sabouraud, em placas de Petri.
Após 24 horas de incubação, analisamos os resultados.
5.5 – EXPERIMENTO COM O ELETRODO DE ALTA TENSÃO DENTRO DA
PLACA DE PETRI
Fizemos algumas modificações no sistema de geração de descarga DBD,
montando os eletrodos de alta tensão na tampa da placa de Petri, com o eletrodo
superior no interior da placa. Antes de utilizar esse sistema nos experimentos,
desinfetamos a tampa com o eletrodo através de uma descarga com água oxigenada.
89
A Figura 5.6 mostra a configuração do sistema com o eletrodo superior no
interior da placa de Petri.
5.5.1 Teste do Agar
Aplicamos 10 minutos de descarga DBD numa placa de Petri contendo apenas
Agar Sabouraud. Após o tratamento, semeamos 100 µl de suspensão de C. albicans
ATCC18804 na concentração de 10
5
/ml na escala de turvação de McFarland, para
observar a funcionalidade do agar após aplicação da descarga. Após 24h de incubação
à 37ºC, observamos os resultados.
Figura 5.6 – Configuração do reator formado interno a placa de Petri
5.5.2 Tratamento de Suspensões semeadas no Agar
Usamos suspensão de C. albicans ATCC18804 na concentração de 10
5
/ml na
escala de turvação de McFarland. Colocamos 100µl dessa suspensão num meio de
cultura apropriado, dentro da placa de Petri adaptada com os eletrodos. Aguardamos
Lateral
Superior
90
15 minutos para a suspensão se distribuir uniformemente no meio de cultura.
Aplicamos 10 minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos
os resultados.
5.5.3 Tratamento de suspensões em lamínula
Usamos suspensão de C. albicans ATCC18804 na concentração de 10
5
/ml na
escala de turvação de McFarland. Colocamos 10µl dessa suspensão sobre uma
lamínula. Colocamos a lamínula dentro da placa de Petri adaptada com os eletrodos.
Aplicamos 10 minutos de descarga DBD. Logo após as descargas, lavamos a lamínula
com 1 ml de solução PBS. Da suspensão resultante, semeamos 100µl em meio de
cultura e após 24h de incubação à 37ºC, observamos os resultados.
5.5.4 Tratamento em microrganismos crescidos
Aplicamos descarga DBD por 10 minutos, diretamente sobre uma placa de Petri
com meio de cultura com C. albicans ATCC18804 semeado 24 horas antes do
experimento. Logo após a descarga, semeamos meia alça de platina por técnica de
esgotamento em outra placa de Petri. Após 24h de incubação a 37ºC, analisamos os
resultados.
5.6 – EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE TAMPA DE
VIDRO
Primeiramente, diminuímos o diâmetro do eletrodo para evitar a formação de
arcos. Visto que o Agar é condutor, foi necessário colocar um dielétrico encostado ao
eletrodo superior. Por isso, colocamos uma tampa de vidro sobre a placa de Petri, e
91
colocamos o eletrodo, sobre esse sistema. Desta forma observamos a formação de
descarga DBD mais estável sem a formação de arcos. A figura 5.7 mostra como
posicionamos a placa de Petri semeada, sobre os eletrodos e o dielétrico de vidro.
Figura 5.7 – Aparato experimental com eletrodo sobre tampa de vidro.
Podemos observar a formação de plasma no nosso experimento na figura 5.8.
Figura 5.8 – Reator de plasma e formação de descarga DBD
.
5.6.1 Tratamento de Suspensões semeadas no Agar
Usamos suspensão de C. albicans ATCC18804 na concentração de 10
5
/ml na
escala de turvação de McFarland. Colocamos 100µl dessa suspensão em agar
Sabouraud, dentro da placa de Petri. Colocamos a tampa de vidro e o eletrodo por
Eletrodo
de alta
tensão
Eletrodo
aterrado
Placa
de
Petri
92
cima. Aguardamos 15 minutos para a suspensão aderir ao meio de cultura. Aplicamos
2, 5, 10 e 15 minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos
os resultados.
5.7 – EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE A PLACA
DE PETRI
Visto que, para a configuração com a tampa de vidro sobre o eletrodo superior,
era necessário abrir a placa de Petri, existia o risco de contaminação do meio de
cultura. Por isso modificamos novamente a configuração do experimento, para que a
tampa da própria placa de Petri de plástico servisse como dielétrico do sistema.
Também, colocamos o cabo de alta tensão ligado ao eletrodo inferior, apoiado sobre
um suporte e o eletrodo superior foi aterrado, garantindo maior segurança na
realização dos experimentos. Assim, a distância entre o eletrodo e o meio de cultura
foi de aproximadamente um centímetro. A figura 5.9 mostra a nova configuração.
Figura 5.9 – Aparato experimental com eletrodo sobre tampa de plástico
.
Garantimos a formação de uma descarga sem arcos por manter o meio de cultura
mais seco, por colocá-lo em fluxo laminar com a chama acesa por aproximadamente
uma hora, antes de semear os microrganismos. Assim pudemos realizar experimentos
93
com diferentes microrganismos, como bactérias Gram-positivas e Gram-negativas,
esporos e fungos.
5.7.1 – Tratamento de Candida albicans
Preparamos uma suspensão com o fungo C. albicans ATCC18804 em água
destilada na concentração de 10
4
células/ml, padronizada por espectrofotômetro
(comprimento de onda de
530 nm
e densidade ótica de 0,269), e diluímos em 10
-1
,
colocando 1ml dessa suspensão em 9ml de água destilada.
Semeamos 100µl dessa suspensão em Agar Sabouraud, dentro da placa de Petri.
Aguardamos 15 minutos para a suspensão aderir ao meio de cultura. Aplicamos 2, 5,
10, 15 minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os
resultados.
Repetimos o experimento com o Agar mais seco (deixamos uma hora em fluxo
laminar com a chama
do bico de Bunsen
acesa). Aplicamos 2, 5, 10, 15 e 20 minutos de
descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os resultados.
5.7.2 – Tratamento de Escherichia coli
Preparamos uma suspensão de E. coli ATCC23922 em água destilada na
concentração de 10
4
células/ml, padronizada por espectrofotômetro (comprimento de
onda de 590 nm e densidade ótica de 0,306). Diluímos em 10
-4
, colocando 0,1ml dessa
suspensão em 9,9ml de água destilada, e da suspensão resultante colocamos 0,1ml em
9,9ml de água destilada.
Semeamos 100µl dessa suspensão em Agar TSA, dentro da placa de Petri.
Aguardamos 15 minutos para a suspensão aderir ao meio de cultura. Aplicamos 2, 5,
10, 15 e 20 minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os
resultados.
94
Repetimos o experimento com o Agar mais seco (deixamos uma hora em fluxo
laminar com a chama
do bico de Bunsen
acesa). Aplicamos 2, 5, 10, 15 e 20 minutos de
descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os resultados.
5.7.3– Tratamento de Staphylococcus aureus
Preparamos uma suspensão de S. aureus ATCC 6538 em água destilada na
concentração de 10
4
células/ml, padronizada por espectrofotômetro (comprimento de
onda de 490 nm e densidade ótica de 0,363), e diluímos em 10
-4
, colocando 0,1ml
dessa suspensão em 9,9ml de água destilada, e da suspensão resultante, colocamos
0,1ml em 9,9ml de água destilada.
Semeamos 100µl dessa suspensão em agar TSA, dentro da placa de Petri.
Aguardamos 15 minutos para a suspensão aderir ao meio de cultura. Aplicamos 2, 5,
10, 15 e 20 minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os
resultados.
Novamente, repetimos o experimento com o Agar mais seco (deixamos uma hora
em fluxo laminar com a chama do bico de Bunsen acesa). Aplicamos 2, 5, 10, 15 e 20
minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os resultados.
5.7.4 – Tratamento de Bacillus Subtilis
Preparamos uma suspensão de B. subtilis ATCC19659 em água destilada na
concentração de 10
5
células/ml, padronizada por espectrofotômetro (comprimento de
onda de 307 nm e densidade ótica de 0,166). Diluímos em 10
-4
, colocando 0,1ml dessa
suspensão em 9,9ml de água destilada, e novamente, colocando 0,1ml da suspensão
resultante em 9,9ml de água destilada.
Deixamos a placa de Petri com Agar por uma hora em fluxo laminar com a
chama
do bico de Bunsen
acesa, para secar a placa, antes de semear.
Semeamos 100µl dessa suspensão em agar TSA, dentro da placa de Petri.
Aguardamos 15 minutos para a suspensão aderir ao meio de cultura. Aplicamos 2, 5,
95
10, 15 e 20 minutos de descarga DBD. Após 24h de incubação à 37ºC, observamos os
resultados.
5.8 – PREPARO DAS AMOSTRAS PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV)
Para analisar o efeito do tratamento a plasma, gerado por descarga com barreira
dielétrica, sobre a estrutura morfológica dos microrganismos, realizamos microscopia
eletrônica de varredura (MEV).
Usamos suspensão em água destilada dos microrganismos C. albicans, E. coli, B.
subtilis e S. aureus, na concentração de 10
5
/ml na escala de turvação de McFarland. E,
para garantir a fixação dos microrganismos, também usamos esses mesmos
microrganismos semeados em meio de cultura líquido TSB e Sabouraud (para C.
albicans).
Colocamos 10µl dessas suspensões sobre lamínulas de silício esterilizadas para
análise de MEV dos microrganismo sem tratamento e com tratamento. Para o
tratamento, as lamínulas foram colocadas dentro de placas de Petri adaptadas com os
eletrodos. Aplicamos 15 minutos de descarga DBD, para cada microrganismo.
Para fixar os microrganismos sobre as lamínulas, colocamos sobre elas
Glutaraldeído 2,5%, e aguardamos uma hora. Depois, realizamos a desidratação,
mergulhando as lamínulas em tubos Falcon com frações crescentes de álcool (25%,
50% e 75% durante 20 minutos cada, e 100% durante uma hora). Depois, colocamos
as lamínulas sobre gaze estéril dentro de uma placa de microtitulação com 12 poços, e
deixamos over night na estufa a 37 ºC.
Nas lamínulas já fixadas e desidratadas, foi efetuada a deposição de filme de
ouro com espessura de 10 nm. E, em seguida, análise de microscopia eletrônica de
varredura, com tensão de trabalho de 15 kV e distância de trabalho de 10 mm.
Analisamos e comparamos as imagens de MEV para observar se houve algum
dano morfológico nos microrganismos tratados por descarga DBD.
96
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Nesse capítulo abordaremos os resultados obtidos através dos experimentos
descritos no capítulo 5
.
6.1 – EXPERIMENTO COM SUSPENSÕES EM PLACA DE MICROTITULAÇÃO
Através de nosso experimento com aplicação de plasma sobre placas de
microtitulação contendo suspensão de microrganismos em suspensão salina e em água
destilada, obtivemos os seguintes resultados.
6.1.1 Placa de microtitulação com suspensões em solução salina
Através de nosso experimento com aplicação de plasma sobre placas de
microtitulação contendo suspensão de microrganismos em solução salina, obtivemos
gráfico da Figura 6.1, o qual mostra a figura de Lissajous (carga transportada nas
microdescargas em função da tensão periódica aplicada).
Figura 6.1 –
Figura de Lissajous para o experimento com placa de microtitulação contendo
suspensão em solução salina, com área compreendida de 92,51mJ.
97
A determinação experimental da potência consumida em cada ciclo da descarga
foi realizada pelo método da figura de Lissajous. A área interna da figura formada em
um ciclo corresponde à energia elétrica distribuída ao plasma num período. Assim a
potência consumida em um ciclo foi obtida pelo produto entre a freqüência da tensão
ac (60 Hz) e a área interna da figura de Lissajous dividida por 1,5 períodos, resultando
em 3,7W.
Porém com esse método de tratamento, não observamos nenhum efeito do
plasma nas culturas celulares. Elas cresceram iguais ao controle (sem aplicação de
plasma).
Uma possível explicação para esse resultado é que o soro utilizado nos
tratamentos é condutor, portando a descarga acontece somente no espaço de ar. Nesse
espaço há formação de ozônio que é muito ativo quimicamente. Porém, o efeito dele é
localizado somente numa camada fina de microrganismos que estão na superfície. No
volume dos poços da placa não acontece nada porque o ozônio não difunde para dentro
do soro.
Na descarga, também são formados fótons UV que penetram no soro, mas
aparentemente não teve nenhum efeito no nosso experimento com C. albicans.
6.1.2 Placa de microtitulação com suspensões em água destilada
Através de nosso experimento com aplicação de plasma sobre placas de microtitulação
contendo suspensão de microrganismos em água destilada, obtivemos a
figura de Lissajous
(Figura 6.2), cuja potência foi calculada em 0,23W.
Novamente observamos que as culturas cresceram iguais ao controle. O plasma
não teve nenhum efeito observável no crescimento das culturas celulares.
Novamente acreditamos que o motivo desse resultado seja a dificuldade do
ozônio penetrar no volume de microrganismos, e formação insignificativa de UV na
gama germicida.
98
Figura 6.2 –
Figura de Lissajous para o experimento com placa de microtitulação
contendo suspensão em água, com área compreendida de 5,83mJ.
6.2 – EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO DENTRO DA
PLACA DE PETRI
Através de nosso experimento com aplicação de plasma sobre placas de Petri
com eletrodo superior adaptado internamente à placa e eletrodo inferior aterrado,
obtivemos os seguintes resultados.
6.2.1 Teste do Agar
No experimento de aplicação de descarga DBD no Agar, obtivemos a figura de
Lissajous, e calculamos a potência de aproximadamente 1,4W. Porém, devido a
99
condutividade do agar, houve muita formação de arcos, sendo que a figura de
Lissajous apresentou uma forma bem irregular.
Conforme podemos observar na figura 6.3, após 24 horas de incubação, os
microrganismos cresceram normalmente. O que comprova que não houve danos no
agar.
Figura 6.3 – Crescimento de C. albicans no Agar tratado.
6.2.2 Tratamento de Suspensões semeadas no Agar
Para os experimentos de tratamento de suspensões semeadas no Agar, obtivemos
a figura de Lissajous (Figura 6.4) e calculamos a potência de aproximadamente 2,5W.
Também observamos nessa figura a presença de bastante ruído, devido aos arcos
formados entre o eletrodo superior e o Agar condutor.
100
Figura 6.4 –
Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões semeadas,
com área compreendida de 62,90mJ.
Na Figura 6.5 podemos observar que houve redução no número de UFC (unidade
formadora de colônias). Porém, ainda foi necessário aprimorar a técnica de tratamento
a fim de obtermos melhores resultados (aumentar tempo e potência, e diminuir
concentração inicial para conseguir realizar a contagem de microrganismos). Como as
colônias ficaram acumuladas em algumas regiões da placa de Petri, não foi possível
fazer a contagem das UFC. E também a descarga foi bem instável devido à formação
de arcos.
Figura 6.5 –
Crescimento de C. albicans em suspensões semeadas tratadas com plasma,
comparado com suspensões semeadas sem tratamento.
Controle
Tratamento
101
6.2.3 Tratamento de suspensões em lamínula
Para os experimentos de tratamento de suspensões sobre lamínulas de vidro,
obtivemos a figura de Lissajous (Figura 6.6) e calculamos a potência de
aproximadamente 1,4W. Existem interferências causadas por arcos devido à presença
de solução salina.
Figura 6.6 –
Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões sobre lamínulas,
com área compreendida de 34,87mJ.
A figura 6.7 mostra o resultado comparado ao controle, onde a lamínula não foi
submetida à aplicação de descarga.
102
Figura 6.7 –
Crescimento de C. albicans em suspensões sobre lamínulas tratadas com plasma,
comparada com suspensões sobre lamínulas sem tratamento.
O resultado obtido foi o crescimento de nenhum microrganismo. Porém, visto
que estamos estudando formas vegetativas (e não esporos), não podemos afirmar com
certeza, que o método de esterilização teve total eficiência. Também esse resultado não
se aproxima da realidade das contaminações de instrumentos.
6.2.4 Tratamento em microrganismos crescidos
Através do experimento de tratamento de microrganismos crescido, foi obtida a
figura de Lissajous
e
foi calculada a potência de aproximadamente 1,1W. Porém, essa
potência não pode ser considerada bem distribuída no volume, devido a grande
número de arcos. A descarga se tornou bem instável e a figura de Lissajous bem
irregular.
Observamos que nesse caso, a aplicação da descarga não teve nenhum resultado,
visto que os microrganismos cresceram normalmente (Veja figura 6.8).
Controle
Tratamento
103
Figura 6.8 –
Crescimento de C. albicans tratadas com plasma, comparado culturas sem
tratamento.
Uma possível explicação para esse fato é que estamos aplicando a descarga num
volume de microrganismos, não havendo penetração dos agentes esterilizantes, como
ozônio e UV, que têm um efeito apenas localizado numa fina camada da superfície da
cultura de microrganismo, não resultando em esterilização.
6.3 EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE TAMPA DE
VIDRO
Através de nosso experimento com aplicação de plasma sobre placas de Petri
com eletrodo de alta tensão sobre uma tampa de vidro e eletrodo inferior aterrado, e
contendo suspensão de microrganismos em solução salina, obtivemos os seguintes
resultados.
6.3.1 Tratamento de Suspensões semeadas no Agar
A figura 6.9 Apresenta a figura de Lissajous medida neste experimento. Através
dessa figura, calculamos a potência de aproximadamente 2,7W.
Controle
Tratamento
104
Na Figura 6.10 podemos observar que, conforme aumentamos o tempo do
tratamento por plasma, houve redução no número de unidades formadoras de colônias
(UFC). E no tempo de 15 minutos houve esterilização completa da placa.
Figura 6.9 –
Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões semeadas com eletrodo
sobre tampa de vidro, com área compreendida de 66,42mJ.
Figura 6.10 – Crescimento de C. albicans em suspensões semeadas tratadas com plasma
em 2, 5, 10 e 15 minutos (em duplicata).
105
Porém, as colônias ficaram acumuladas em regiões da placa de Petri, não sendo
possível fazer a contagem das Unidades formadoras de colônias (UFC). Por isso é
necessário fazer a semeadura inicial com uma menor concentração de microrganismos,
para podermos quantificar nosso método. Além disso, modificamos o reator para não
precisar abrir a tampa da placa de Petri durante o tratamento, garantindo assim a
ausência de contaminação.
6.4 – EXPERIMENTO COM ELETRODO DE ALTA TENSÃO SOBRE A PLACA
DE PETRI
Através de nosso experimento com aplicação de plasma sobre placas de Petri
com eletrodo de alta tensão sobre a tampa da placa e eletrodo inferior aterrado,
contendo suspensão de microrganismos em solução de água destilada, obtivemos a
figura de Lissajous (Figura 6.11), e calculamos a potência de aproximadamente 1,1W.
Figura 6.11 – Figura de Lissajous para o tratamento em suspensões semeadas com
eletrodo sobre tampa da placa de Petri, com área compreendida de 26,81mJ.
106
6.4.1 Tratamento de Candida albicans
Pudemos comparar os resultados de dois experimentos com C. albicans,
um com
Agar úmido e outro com Agar seco em fluxo laminar.
6.4.1.1 Tratamento com Agar úmido
No tratamento de C. albicans semeada em meio de cultura sem secagem em
fluxo laminar, pudemos observar que houve redução no número de UFC (veja a Figura
6.12), mas como houve a formação de arcos devido à presença de umidade na placa, a
descarga não foi efetiva para esterilização do meio, visto que em presença de arcos a
energia da descarga é localizada preferencialmente o interior do arco.
A tabela 6.1 mostra os resultados obtidos nas contagens de UFC de C. albicans,
tratada com 2, 5, 10 e 15 minutos. Também apresentamos os resultados do logaritmo
de morte (KL) e porcentagem de morte (IF). As experiências foram feitas com duas
repetições, assim pudemos analisar a média das repetições. Como a descarga DBD em
meio úmido não era estável, não observamos boa reprodutibilidade nos valores. Por
isso refizemos o experimento deixando o Agar secar em fluxo laminar com a chama do
bico de bunsen acesa.
107
Tabela 6.1 – Tratamento de C. albicans em agar úmido
108
Figura 6.12 –
Crescimento de C. albicans com duplicata do a) controle, e com tratamentos
de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos.
O gráfico da Figura 6.13 mostra a curva de sobrevivência por aplicação do
plasma de descarga com barreira dielétrica desse experimento. Conforme explicado na
Tabela 6.1, os resultados não tiveram boa reprodutibilidade, e não foi alcançada
esterilização das amostras.
109
Figura 6.13 – Curva de sobrevivência de C. albicans
ATCC18804
.
Pudemos observar que esse processo não foi eficiente em esterilizar as amostras
de C. albicans em até 15 minutos de tratamento. Porém observamos boa
reprodutibilidade no comportamento da curva do processo de desinfecção.
6.4.1.2 Tratamento com Agar seco
Com o tratamento de amostras semeadas em Agar seco em fluxo laminar com a
chama do bico de bunsen acesa, houve rápida redução no número de UFC de C.
albicans. Isso porque com a ausência de umidade no meio, não teve formação de
arcos, garantindo uma descarga bem distribuída no volume. Assim, com 10 minutos de
tratamento, já observamos a esterilização completa da placa (conforme observamos na
Figura 6.14).
A tabela 6.2 mostra os resultados obtidos nas contagens de UFC de C. albicans,
tratada com 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, com repetição. Analisamos os resultados do
110
logaritmo de morte (KL) e porcentagem de morte (IF) dos experimentos e da média,
observamos que o tratamento alcançou os parâmetros ideais de esterilização, num
tempo relativamente curto. E os resultados apresentaram boa reprodutibilidade.
Também pudemos calcular o tempo de redução decimal (D-valor) de 4,2 minutos.
Tabela 6.2 – Tratamento de C. albicans em Agar seco
O gráfico da Figura 6.15 mostra a curva de sobrevivência por aplicação do
plasma de descarga com barreira dielétrica, segundo os dados da tabela 6.2.
111
Figura 6.14 –
Crescimento de C. albicans com duplicata do a) controle, e com tratamentos
de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos, f) 20 minutos.
112
Figura 6.15 – Curva de sobrevivência de C. albicans
ATCC18804
.
Assim, pudemos concluir que o tratamento com Agar seco foi eficiente para
esterilizar as culturas de C. albicans.
6.4.1.3 Análise da estrutura e morfologia de Candida albicans
C. albicans é uma espécie de fungo diplóide. Em determinadas condições ele se
desenvolve como uma pseudo-hifa, que se caracteriza por uma célula alongada que se
propaga por uma gemulação unipolar, apresentando um aspecto de um cordão de
contas (ver Figura 6.16).
113
Figura 6.16 –
Exemplo de MEV de microrganismo C. albicans semeados em meio de
cultura com aumento de 7500 vezes. (1cm equivale a 1
µ
m)
Realizamos análise de MEV das amostras de C. albicans para observar se o
tratamento causou alguma alteração na morfologia dos microrganismos.
Pudemos observar pelas Figuras Figura 6.17, 6.18 e 6.19 a comparação entre as
amostras tratadas com 15 minutos de descarga DBD e as amostras sem tratamento.
Na Figura 6.17 observamos as amostras com um aumento de 2000 vezes. Através
de menores aumentos, observamos que os microrganismos estavam homogeneamente
distribuídos na lamínula, porém formando ilhas, principalmente nos microrganismos
em suspensão de água destilada. Podemos observar que as amostras tratadas, tanto as
semeadas em TSB (a) quanto em solução de água destilada (c), apresentaram as
células mais murchas e quebradas (indicado pela seta vermelha), quando comparado
com as amostras sem tratamento (b e d).
114
Figura 6.17 –
MEV com aumento de 2000x (1cm equivale a 3,2
µ
m) de C. albicans:
(a) tratada em TSB, b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água.
a)
b)
c)
d)
115
Na Figura 6.18, observamos as amostras com um aumento de 7500 vezes.
Novamente, podemos observar que as amostras tratadas apresentam as células mais
murchas e quebradas, quando comparado com as amostras sem tratamento (embora
algumas células da amostra sem tratamento apresentem deformidades, provavelmente,
pelo método de fixação usado). Também observamos nas amostras em suspensão de
água destilada a formação de uma certa cápsula e pseudo-hifas (indicado pela seta
azul), tanto nas amostras tratadas quanto nas sem tratamento.
Figura 6.18 –
MEV com aumento de 7500x (1cm equivale a 1
µ
m) de C. albicans:
(a) tratada em TSB, b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água.
a)
b)
c)
d)
116
Na Figura 6.19, observamos as amostras em suspensão de água destilada com um
aumento de 15000 vezes. A formação das pseudo-hifas e a diferença entre as amostras
tratadas e sem tratamento ficam mais evidentes.
Figura 6.19 –
MEV com aumento de 15000x (1cm equivale a 0,42
µ
m) de C. albicans:
a) tratada em água, b) controle em água.
Pudemos notar que o fungo C. albicans apresentou sua estrutura danificada após
o tratamento com descarga DBD. Comparando com os resultados obtidos pelas curvas
de sobrevivência, observamos que com esse tempo de tratamento (quinze minutos)
pudemos conseguir esterilização completa das placas. Assim, observamos que a
descarga DBD causa alterações na morfologia desses microrganismos, e essas
alterações podem ser as principais responsáveis pela inativação. Essas alterações se
devem principalmente devido às reações das espécies químicas geradas na descarga
com a membrana dos microrganismos.
6.4.2 Tratamento de
Escherichia coli
Pudemos comparar os resultados de dois experimentos com E. coli,
um com Agar
úmido e outro com Agar seco em fluxo laminar.
a)
b)
117
6.4.2.1 Tratamento com Agar úmido
Através do tratamento de E. coli semeada em meio de cultura sem secagem em
fluxo laminar, pudemos obter os dados da tabela 6.3, que mostra os resultados de duas
repetições e da média nas contagens de UFC de E. coli, tratada com 2, 5, 10, e 15
minutos. Assim pudemos comparar os resultados do logaritmo de morte (KL) e
porcentagem de morte (IF). Esses resultados obtidos no tratamento de E. coli são
apresentados na Figura 6.20, onde pudemos observar que houve redução no
número de
UFC nas amostras de E. coli, conforme aumentamos o tempo de tratamento por
plasma.
Tabela 6.3 – Tra
tamento de E.coli com Agar úmido.
Tratamento 1 UFC IF(%) KL
Controle 1092 Ideal = 100 Ideal = 3,038
2 minutos 332 69,6 0,517
5 minutos 305 72,1 0,554
10 minutos 267 75,5 0,612
15 minutos 155 85,8 0,848
Tratamento 2 UFC IF(%) KL
Controle 1003 Ideal = 100 Ideal = 3,001
2 minutos 436 56,5 0,362
5 minutos 341 66,0 0,468
10 minutos 336 66,5 0,475
15 minutos 290 71,1 0,539
Média UFC IF(%) KL
Controle 1047,5 Ideal = 100 Ideal = 3,020
2 minutos 384 63,3 0,436
5 minutos 323 69,2 0,511
10 minutos 301,5 71,2 0,541
15 minutos 222,5 78,6 0,673
O gráfico da Figura 6.21 mostra a curva de sobrevivência da E. coli por aplicação
do plasma de descarga com barreira dielétrica.
118
Figura 6.20 –
Crescimento de E. coli com duplicata do a) controle, e com tratamentos de
b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos.
119
Figura 6.21 – Curva de sobrevivência de E.coli
ATCC23922
.
Apesar de o microrganismo E. coli ser uma bactéria Gram-negativa, cuja
membrana é mais fina, e teoricamente, segundo a literatura, mais fácil de ser
esterilizada, não conseguimos alcançar a esterilização completa com quinze minutos
de tratamento. Isso pode ter ocorrido devido à presença de umidade nos meios de
cultura que não foram colocados em fluxo laminar, resultando na formação de arcos
durante a descarga.
Porém, observamos uma diminuição no número de microrganismos com o
aumento do tempo de tratamento, e com dez minutos de tratamento já conseguimos
alcançar cerca de 70% de inativação. Sendo, portanto, um método de desinfecção.
Conforme observado na Figura 6.21, no processo de inativação de E. coli, o
número de UFC cai no início rapidamente, porém, acima de cinco minutos observa-se
redução gradual de UFC. Esse comportamento se aproxima do modelo proposto por
Moisan et al. 2001.
Porém, para confirmar ou descartar o efeito de esterilização por descarga DBD
de bactérias Gram-negativas precisaríamos realizar mais testes com uso de agar seco
em fluxo laminar.
120
6.4.2.2 Tratamento com Agar seco
A amostra de E. coli, semeadas em Agar seco durante aproximadamente uma
hora em fluxo laminar com a chama do bico de Bunsen acesa, apresentou rápida
redução no número de UFC após o tratamento com a descarga DBD, conforme
observamos na Figura 6.22.
A tabela 6.4 mostra os resultados obtidos nas contagens de UFC de E. coli,
tratada com 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, com repetição. A tabela 6.4 também apresenta
os resultados do logaritmo de morte (KL) e porcentagem de morte (IF) dos
experimentos e da média.
Os resultados apresentaram boa reprodutibilidade. Também pudemos calcular o
tempo de redução decimal (D-valor) de 3,25 minutos.
Tabela 6.4 – Tratamento de E. coli em Agar seco
Tratamento 1 UFC IF(%) KL
Controle 639 Ideal = 100 Ideal = 2,805
2 minutos 147
77,0 0,638
5 minutos 7
98,9 1,960
10 minutos 3
99,5 2,328
15 minutos 2
99,7 2,504
20 minutos 1
99,8 2,805
Tratamento 2 UFC IF(%) KL
Controle 596 Ideal = 100 Ideal = 2,775
2 minutos 74
87,6 0,906
5 minutos 5
99,2 2,076
10 minutos 2
99,7 2,474
15 minutos 2
99,7 2,474
20 minutos 0
100
2,775
Média UFC IF(%) KL
Controle 617,5 Ideal = 100 Ideal = 2,791
2 minutos 110,5
82,1 0,747
5 minutos 6
99,0 2,012
10 minutos 2,5
99,6 2,392
15 minutos 2
99,7 2,490
20 minutos 0,5
99,9 3,092
121
O gráfico da Figura 6.23 mostra a curva de sobrevivência por aplicação do
plasma de descarga com barreira dielétrica, segundo os dados da tabela 6.4.
Figura 6.22 –
Crescimento de E.coli com duplicata do a) controle, e com tratamentos
de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos, f) 20 minutos.
122
Figura 6.23 – Curva de sobrevivência de E. coli
ATCC23922.
Assim, pudemos concluir que o tratamento com Agar seco foi eficiente para
esterilizar as culturas de E. coli.
Novamente notamos um comportamento de rápida redução inicial no número de
microrganismos, seguido de uma redução mais lenta.
Apesar de não termos conseguido esterilização completa nas duas repetições,
observamos, nas duas medidas, que com apenas 5 minutos de tratamento já tínhamos
mais de 98% de morte dos microrganismos, sendo, portanto um processo rápido de
esterilização.
6.4.2.3 Análise da estrutura e morfologia de
Escherichia coli
O microrganismo E. coli é uma bactéria bacilar Gram-negativa simbionte do
homem. Possui a forma de um bacilo (ver Figura 6.24) e pertence à família das
Enterobacteriaceae. E. coli são aeróbias e anaeróbias facultativas. O seu habitat
123
natural é o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente.
Possui múltiplos flagelos dispostos em volta da célula.
Figura 6.24 – Exemplo de MEV de microrganismo E.coli, com aumento
de 15000 vezes
(1cm equivale a 0,42 µm)
.
Para observar se o tratamento causou alguma alteração na morfologia dos
microrganismos, realizamos análise de MEV das amostras de E. coli.
Pudemos observar pelas Figuras 6.25, 6,26 e 6.27 a comparação entre as
amostras tratadas com 15 minutos de descarga DBD e as amostras sem tratamento.
Na Figura 6.25 observamos as amostras com um aumento de 2000 vezes. Nesse
aumento, não conseguimos visualizar detalhes e diferenças entre as amostras sem e
com tratamento. Apenas pudemos observar o comportamento e distribuição
homogênea do microrganismo na lamínula.
Na Figura 6.26 (7500 vezes), principalmente nas amostras em água destilada,
observamos que os microrganismos apresentam rugosidade e estão quebrados. Porém,
a amostra sem tratamento também apresenta microrganismos deformados.
Acreditamos que a técnica usada para fixação dos microrganismos nas lamínulas possa
ter causado tais danos, bem visíveis na E. coli pelo fato de ser uma bactéria Gram-
negativa e, portanto, com membrana mais fina.
124
Figura 6.25 –
MEV com aumento de 2000x (1cm equivale a 3,2
µ
m) de E. coli (a) tratado
em TSB, b) controle em TSB, c) tratado em água, d) controle em água.
a
b)
c)
d)
125
Figura 6.26 –
MEV com aumento de 7500x (1cm equivale a 1
µ
m) de E. coli (a) tratado
em TSB, b) controle em TSB, c) tratado em água, d) controle em água.
a
)
b)
c)
d)
126
Na Figura 6.27 (aumento de15000 vezes), observamos que os microrganismos
apresentam-se agrupados e podemos observar que tanto nas amostras tratadas como
nas sem tratamento existe um grande número de microrganismos rugosos e quebrados.
Figura 6.27 –
MEV com aumento de 15000x (1cm equivale a 0,42
µ
m) de E. coli (a) tratado
em TSB, b) controle em TSB, c) tratado em água, d) controle em água.
Visto que nas amostras sem tratamento já aparecem microrganismos murchos e
rugosos, não podemos concluir se a descarga DBD tem ou não efeito sobre a
morfologia de E. coli.
a)
c) d)
b)
127
Os resultados apresentados na curva de sobrevivência de E. coli, com uso de
Agar seco, mostram que esse microrganismo foi bastante sensível a descarga DBD,
tendo rápida redução na concentração inicial de microrganismos.
Acreditamos que a descarga DBD tenha algum efeito sobre a estrutura
morfológica de E. coli, porém, para confirmar esses resultados necessitaríamos realizar
microscopia eletrônica de varredura com outro método de fixação, que não acarrete
danos a morfologia do microrganismo.
6.4.3 Tratamento de
Staphylococcus aureus
Comparamos os resultados de dois experimentos com S. aureus,
um com Agar
úmido e outro com Agar seco em fluxo laminar.
6.4.3.1 Tratamento com Agar úmido
Os resultados do tratamento de S. aureus semeado em meio de cultura sem
secagem em fluxo laminar, são apresentados nas Figuras 6.28 e 6.29.
A tabela 6.5 mostra os resultados das repetições e da média dos dados obtidos
nas contagens de UFC de S. aureus, tratado com 2, 5, 10, 15 e 20 minutos. Também
comparamos os resultados do logaritmo de morte (KL) e porcentagem de morte (IF)
das repetições e da média.
Pela Figura 6.28, pudemos observar que houve redução no número de UFC,
conforme aumentamos o tempo de tratamento por plasma. Porém, visto que o meio de
cultura apresentava umidade, não foi possível garantir uma descarga homogênea em
todos os tratamentos, por isso observamos algumas discrepâncias. Assim, esse
experimento não apresentou boa reprodutibilidade. E visto que o S. aureus é uma
bactéria Gram-positiva, cuja membrana é mais espessa, a esterilização é mais difícil.
128
Tabela 6.5 – Tratamento de S. aureus
com Agar úmido.
Podemos observar que a segunda medida para o tratamento de vinte minutos
apresentou um resultado bem discrepante, isso pode ter sido causado pela presença de
umidade no meio de cultura, já que o mesmo não foi seco em fluxo laminar antes de
semear os microrganismos.
O valor de redução decimal para o tratamento de S. aureus da primeira medida, visto
que a segunda teve resultados discrepantes, foi de aproximadamente 13 minutos. Porém, não
podemos considerar como um valor confiável, já que não conseguimos repetir esse resultado
numa segunda tentativa.
129
Figura
6.28
–
Crescimento de S.aureus com duplicata de: a) controle
e com tratamentos de:
b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos, f) 20 minutos.
130
O gráfico da Figura 6.29 mostra a curva de sobrevivência de S. aureus por
aplicação do plasma de descarga com barreira dielétrica.
Figura 6.29 – Curva de sobrevivência de S.aureus
ATCC 6538
.
O tratamento de S. aureus foi não conclusivo. Porém, houve esterilização total
para um dos tratamentos. Precisaríamos de mais experimentos para descartar ou
confirmar esse método de esterilização para microrganismos Gram-positivos. Por isso
repetimos o experimento com Agar seco em fluxo laminar.
6.4.3.2 Tratamento com Agar seco
As amostras de S. aureus foram semeadas em Agar seco durante
aproximadamente uma hora em fluxo laminar com a chama do bico de bunsen acesa.
131
Após o tratamento com descarga DBD, as amostras apresentaram rápida redução
no número de UFC (conforme observamos na Figura 6.30).
A tabela 6.6 mostra os resultados obtidos nas contagens de UFC de S. aureus e os
resultados do logaritmo de morte (KL) e porcentagem de morte (IF) dos experimentos
e da média, das amostras tratada com 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, com repetição.
Observamos que os resultados apresentaram boa reprodutibilidade. Também pudemos
calcular o tempo de redução decimal (D-valor) de 1,85 minutos.
Tabela 6.6 – Tratamento de S. aureus em Agar seco
Tratamento 1 UFC IF(%) KL
Controle 1056 Ideal = 100 Ideal = 3,024
2 minutos 14
98,7 1,877
5 minutos 3
99,7 2,546
10 minutos 3
99,7 2,546
15 minutos 1
99,9 3,024
20 minutos 1
99,9 3,024
Tratamento 2 UFC IF(%) KL
Controle 998 Ideal = 100 Ideal =
2,999
2 minutos 8
99,2 2,096
5 minutos 3
99,7 2,522
10 minutos 2
99,8 2,698
15 minutos 1
99,9 2,999
20 minutos 0
100 2,999
Média UFC IF(%) KL
Controle 1027 Ideal = 100 Ideal = 3,012
2 minutos 11
98,9 1,970
5 minutos 3
99,7 2,534
10 minutos 2,5
99,8 2,614
15 minutos 1
99,9 3,012
20 minutos 0,5
99,9 3,313
O gráfico da Figura 6.31 mostra a curva de sobrevivência de S. aureus por
aplicação do plasma de descarga com barreira dielétrica, segundo os dados da tabela
6.6.
132
Figura 6.30 –
Crescimento de S.aureus com duplicata do a) controle, e com tratamentos
de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos, f) 20 minutos.
133
Figura 6.31 – Curva de sobrevivência de
S.aureus
ATCC 6538.
Assim, pudemos concluir que o tratamento com Agar seco foi eficiente para
esterilizar as culturas de S. aureus.
Com a ausência de umidade, conseguimos manter uma descarga estável, assim, a
esterilização foi eficiente e rápida. Com apenas 2 minutos de tratamento já alcançamos
aproximadamente 99% de morte dos microrganismos.
6.4.3.3 Análise da estrutura e morfologia de
Staphylococcus aureus
S. aureus, também conhecido como estafilococo dourado, é uma espécie de
estafilococo coagulase-positivos. Têm forma esférica (cocos), cerca de um micrômetro
de diâmetro, e formam grupos com aspecto de cachos de uvas (ver Figura 6.32) com
cor amarelada, devido à produção de carotenóides.
134
Figura 6.32 – Exemplo de MEV de microrganismo S. aureus com aumento
de 10000 vezes (
1cm equivale a 0,7 µm)
.
Realizamos análise de MEV das amostras de S. aureus, para observar a estrutura
morfologia dos microrganismos e ver ser o tratamento por plasma causou alguma
alteração.
Pudemos observar pelas Figuras Figura 6.33, 6.34, 6.35 e 6.36 a comparação
entre as amostras tratadas com 15 minutos de descarga DBD e as amostras sem
tratamento.
Na Figura 6.33 observamos as amostras com um aumento de 2000 vezes. Nesse
aumento, não conseguimos visualizar detalhes e diferenças entre as amostras sem e
com tratamento. Apenas pudemos observar o comportamento e distribuição do
microrganismo na lamínula. Observamos que as amostra ficaram distribuídas
homogeneamente nas lamínulas, porém a amostra tratada em suspensão de água
destilada apresentou formação de ilhas de microrganismos.
135
Figura 6.33 –
MEV com aumento de 2000x (1cm equivale a 0,42
µ
m) de de S. aureus (a) tratado
em TSB, b) controle em TSB, c) tratado em água, d) controle em água.
No aumento de 7500 vezes, conforme a Figura 6.34, observamos que algumas
células da amostra tratada semeada em meio de cultura líquido TSB, apresentaram-se
a)
b)
c) d)
136
murchas e quebradas quando comparado às células da amostra no mesmo meio de
cultura sem tratamento. Porém ainda não observamos grandes diferenças nesse
aumento.
Na Figura 6.35, observamos o aumento de 15000 vezes, e pudemos ver, mais
claramente, que as amostras tratadas, tanto em água destilada, quanto em meio de
cultura líquido, apresentaram algumas células murchas e estouradas.
Figura 6.34 –
MEV com aumento de 7500x
(1cm equivale a 1 µm)
de S. aureus
(a) tratada
em TSB, b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água.
a) b)
c) d)
137
Pudemos observar que, apesar de algumas células apresentarem danos na sua
estrutura, existem muitas células intactas nas amostras tratadas.
Porém, as amostras sem tratamento apresentaram as células completamente
intactas quando comparadas com as amostras tratadas, por isso não podemos descartar
o efeito da descarga DBD sobre a estrutura dos microrganismos Gram-positivos,
causando conseqüente inativação.
Além disso, temos que lembrar que as células que não tiveram sua estrutura
comprometida não necessariamente sobreviveram ao processo de esterilização, elas
podem ter sido inativadas sem ocorrer o rompimento de sua membrana, o que condiz
com os resultados apresentados na curva de sobrevivência dos microrganismos no
tratamento com Agar seco, onde houve rápida esterilização.
Figura 6.35 –
MEV com aumento de 15000x
(1cm equivale a 0,42 µm)
de S. aureus
(a) tratada em TSB, b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água.
a) b)
c) d)
138
6.4.4 Tratamento de Bacillus Subtilis
Visto que, nos tratamentos com C. albicans, E. coli e S. aureus, observamos que
os resultados foram mais favoráveis quando utilizamos o Agar seco em fluxo laminar,
realizamos o tratamento com o bacilo B. subtilis somente utilizando placas de Petri
com meio de cultura seco. Os resultados são apresentados nas Figuras 6.36 e 6.37.
Conforme aumentamos o tempo de tratamento por plasma, pudemos observar
que houve rápida redução no número de UFC das amostras de B. subtilis tratadas. Em
torno de 10 minutos de tratamento já observamos esterilização completa das placas.
Conforme podemos observar na Figura 6.36.
A tabela 6.7 mostra os resultados obtidos nas contagens de UFC de B. subtilis,
tratado com 2, 5, 10, 15 e 20 minutos. Também comparamos os resultados do
logaritmo de morte (KL) e porcentagem de morte (IF) das repetições e da média das
repetições. Observamos que em torno de dois minutos conseguimos inativar em torno
de 70% dos bacilos.
139
Tabela 6.7 – Tratamento de B.subtilis
com Agar seco.
Observamos uma boa reprodutibilidade nos testes com B. subtilis, e pudemos
calcular o valor de redução decimal em torno de 4,1 minutos.
140
Figura 6.36 – Crescimento de B.subtilis com duplicata do a) controle, e com tratamentos
de b) 2 minutos, c) 5 minutos, d)10 minutos, e) 15 minutos, f) 20 minutos.
141
O gráfico da Figura 6.37 mostra a curva de sobrevivência de B. subtilis por
aplicação do plasma de descarga com barreira dielétrica.
Figura 6.37 – Curva de sobrevivência de B.subtilis
ATCC19659.
O tratamento do bacilo B. subtilis foi eficiente para esterilização, com um
comportamento bem parecido com o de C. albicans, segundo nossos experimentos.
6.4.4.1 Análise da estrutura e morfologia de Bacillus Subtilis
O Bacillus subtilis é uma espécie de bactéria Gram-positiva (veja Figura 6.38)
que é uma saprófita comum do solo e da água. Organismo esporulado, não patogênico,
graças à sua termofilia é utilizado no monitoramento e validação de ciclos de
esterilização por calor seco e óxido de etileno, realizados em estufas ou fornos de
esterilização e autoclaves para gás óxido de etileno, respectivamente.
142
Figura 6.38 – Exemplo de MEV de microrganismo B. subtilis com aumento
de 7500 vezes
(1cm equivale a 1 µm)
.
A fim de observar se houve alguma alteração na morfologia dos microrganismos
B. subtilis, realizamos análise de MEV das amostras.
Pudemos observar pelas Figuras Figura 6.39, 6,40 e 6.41 a comparação entre as
amostras tratadas com 15 minutos de descarga DBD e as amostras sem tratamento.
Na Figura 6.39 observamos as amostras com um aumento de 2000 vezes. Nesse
aumento, não conseguimos visualizar detalhes e diferenças entre as amostras sem e
com tratamento. Apenas pudemos observar o comportamento e distribuição do
microrganismo na lamínula. Observamos que amostra sem tratamento semeada em
meio de cultura líquido TSB não teve boa fixação.
Na Figura 6.40, com aumento de 7500 vezes, podemos observar que as amostras
tratadas apresentaram fragmentos de células e células quebradas e deformadas. Mas as
amostras de controle também ficaram um pouco deformadas, novamente atribuímos
esse fato ao nosso método de fixação. Mas pudemos notar as diferenças entre as
amostras tratadas e sem tratamento.
Essa diferença é acentuada quando observamos o aumento de 15000 vezes
(Figura 6.41). Na amostra tratada semeada em TSB, observamos as células estouradas
e na amostra tratada em suspensão de água destilada, observamos vários fragmentos de
microrganismos.
143
Figura 6.39 –
MEV com aumento de 2000x (1cm equivale a 0,42
µ
m) de B.subtilis (a) tratado
em TSB, b) controle em TSB, c) tratado em água, d) controle em água.
a)
b)
c)
d)
144
Figura 6.40 –
MEV com aumento de 7500x
(1cm equivale a 1 µm)
de
B.subtilis (a) tratada
em TSB, b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água.
a)
b)
c) d)
145
Pudemos observar que o bacilo B. subtilis apresentou grande sensibilidade tanto
ao tratamento quanto ao processo de fixação dos microrganismos nas lamínulas, assim,
muitas células ficaram danificadas. Mas, podemos notar que com o tratamento, houve
maior número de células fragmentadas, o que está de acordo com os resultados vistos
Figura 6.41 –
MEV com aumento de 15000x (1cm equivale a 0,42
µ
m) de B.subtilis
(a) tratada em TSB, b) controle em TSB, c) tratada em água, d) controle em água.
a)
b)
c)
d)
146
nas curvas de crescimento, onde conseguimos obter, com cerca de 10 minutos de
tratamento, a esterilização completa. Assim, observamos que a descarga DBD causa
alterações na morfologia dos esporos de bactéri
as Gram-positivas, e essas alterações
podem ser as principais responsáveis pela morte da bactéria.
147
7 CONCLUSÕES
A esterilização por plasma em pressão atmosférica oferece várias vantagens
sobre outras técnicas de esterilização, como, por exemplo: eficiência de esterilização
extremamente alta; esterilização muito rápida; configuração flexível e altamente
versátil que conforma vários contornos de superfície; possibilidade de controlar o
processo devido à baixa inércia do sistema (comparado a técnicas de desinfecção
térmicas); não tem desperdício de calor ou de materiais; pode ser integrado facilmente;
e não geram resíduos tóxicos. Porém, a esterilização por geração de ozônio (plasma)
não possui um indicador de eficácia definido.
Observamos que os protocolos propostos na literatura não funcionam em
volumes de suspensões, isso porque, em nossos experimentos iniciais de tratamento de
microrganismos em suspensão salina e suspensão de água destilada em placas de
microtitulação, não ocorreram esterilização nem desinfecção. Uma possível explicação
para esse resultado é que o efeito dos componentes ativos do plasma (ozônio, UV e
partícula carregadas) é localizado somente numa fina camada de microrganismos que
estão na superfície. No volume dos poços da placa não há penetração desses
componentes, não ocorrendo, portanto, esterilização.
O mesmo ocorre no caso do tratamento de microrganismos crescidos em placa de
Petri, em que não ocorre esterilização devido a não penetração dos componentes ativos
no volume de microrganismos crescidos. Além disso, há ocorrência de arcos devido à
condutividade do meio que reduz a eficiência do processo.
Porém para aplicação em superfície (lamínula ou suspensão semeada em Agar),
obtivemos resultados de redução significativa no número de microrganismos.
Visto que a aplicação sobre lamínulas, apesar de apresentar uma rápida e total
esterilização, não condiz com a realidade microbiológica, concluímos que a melhor
configuração para nosso reator seria o tratamento de microrganismos semeados em
placas de Petri com os eletrodos adaptados externamente (evitando a formação de
arcos e também a contaminação do meio de cultura), e separação entre o meio e o
eletrodo de aproximadamente um centímetro, resultando numa potência de 1,1 Watts.
148
Após os tratamentos de 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, pudemos notar que o fungo C.
albicans em meio de cultura seco em fluxo laminar apresentou esterilização com
tempo de tratamento de aproximadamente 10 minutos e o tempo de redução decimal
(D-valor) foi de 4,2 minutos.
Esses resultados foram compatíveis com as imagens obtidas por microscopia
eletrônica de varredura, onde o fungo C. albicans apresentou sua estrutura danificada
após o tratamento com descarga DBD por quinze minutos. Assim, observamos que a
descarga DBD pode causar alterações na morfologia desses microrganismos, e essas
alterações podem ser as principais responsáveis pela inativação.
O bacilo B. subtilis foi esterilizado em cerca de 10 minutos de tratamento, e o
tempo de redução decimal em torno de 4,1 minutos.
Nas imagens feitas por microscopia eletrônica de varredura das amostras,
tratadas por quinze minutos com descarga DBD, notamos que a estrutura do
microrganismo ficou bastante danificada, com muitas células fragmentadas, o que está
de acordo com os resultados vistos nas curvas de morte. Assim, observamos que a
descarga DBD pode causar alterações na morfologia dos esporos de bactérias Gram-
positivas, e essas alterações podem ser as principais responsáveis pela morte da
bactéria.
A bactéria Gram-negativa E. coli, quando tratada em meio de cultura úmido,
apresentou uma certa resistência ao tratamento, isso porque houve a formação de
arcos, o que compromete nosso processo, já que não podemos garantir uma boa
distribuição de descargas no volume. Porém, observamos uma diminuição no número
de microrganismos com o aumento do tempo de tratamento, e com dez minutos de
tratamento já conseguimos alcançar cerca de 70% de inativação. Sendo, portanto,
nesse caso, um eficiente método de desinfecção.
No entanto, quando tratamos de E. coli semeada em Agar seco, observamos uma
rápida esterilização. Com apenas cinco minutos de tratamento já conseguimos uma
redução de aproximadamente 98%. O tempo de redução decimal (D-valor) foi em
torno de 3,25 minutos.
Nas análises das imagens de microscopia eletrônica, não pudemos concluir se
houve alterações estruturais em E. coli após o tratamento com descarga DBD, visto
149
que nas amostras sem tratamento já aparecem microrganismos murchos e rugosos, isso
porque a membrana das bactérias Gram-negativas é mais fina, e nosso método de
fixação sobre as lamínulas pode ter causado tal dano estrutural em E. coli.
A bactéria Gram-positiva S. aureus por ter a estrutura da membrana mais robusta
é mais difícil de ser esterilizada. Em nossos experimentos com Agar úmido, houve
redução no número de UFC, conforme aumentamos o tempo de tratamento por plasma.
Em uma das amostras tratadas conseguimos observar uma redução de 99,95% do
número de microrganismos em 20 minutos de tratamento, e o tempo de redução
decimal de aproximadamente 13 minutos. Porém, não podemos considerar como um
valor confiável, já que não conseguimos repetir esse resultado numa segunda tentativa,
isso porque, como o meio de cultura apresentava umidade, não foi possível garantir
uma descarga homogênea em todos os tratamentos.
Com o tratamento de S. aureus, semeada em meio de cultura previamente seco
em fluxo laminar, conseguimos bons resultados no processo de esterilização. Com a
ausência de umidade, conseguimos manter uma descarga estável, assim, a esterilização
foi eficiente e rápida. Com apenas 2 minutos de tratamento já alcançamos
aproximadamente 99% de morte dos microrganismos. O tempo de redução decimal (D
valor), nesse caso, foi de aproximadamente 1,85 minutos.
Nas imagens feitas por microscopia eletrônica de varredura das amostras tratadas
por quinze minutos, pudemos observar que algumas células apresentaram danos na sua
estrutura, por isso não podemos descartar o efeito da descarga DBD sobre a estrutura
dos microrganismos Gram-positivos, causando sua inativação.
Através desses experimentos pudemos concluir que o plasma em pressão
atmosférica, gerado por descarga com barreira dielétrica pode ser eficiente para
esterilização ou desinfecção de diferentes formas de microrganismos.
Observamos também, em nossos experimentos, que a configuração e os
parâmetros elétricos do nosso reator de descarga DBD, não permite a presença de
umidade nas placas de Petri. Somente em ambiente seco podemos garantir a formação
de uma descarga DBD estável.
Na microscopia eletrônica de varredura pudemos observar que quase todos os
microrganismos tratados com a descarga DBD durante 15 minutos, tiveram sua
150
integridade morfológica comprometida. Houve ruptura da parede celular e em alguns
casos extravasamento do citoplasma. Podemos atribuir tais danos físicos às reações
químicas causadas pelas espécies reativas formadas nas descargas, e também ao efeito
das partículas carregadas. Com a exposição do citoplasma e do material genético,
outros componentes ativos na descarga, como UV e ozônio podem agir diretamente, e
assim, inativar os microrganismos.
Para viabilizar esse processo de esterilização por plasma com descarga com
barreira dielétrica, precisamos obter uma eficácia maior, através do uso de uma fonte
com freqüência mais alta. Este dispositivo ajudará a diminuir o tempo de exposição ao
plasma. Precisamos também realizar mais experimentos, a fim de fazer analise
estatística.
151
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158
APÊNDICE A – Obtenção da Potência através da figura de Lissajous
A determinação experimental da potência consumida na descarga por barreira
dielétrica mostra-se complicada porque a potência é consumida em um grande número
de microdescargas com duração em um curto intervalo de tempo.
Podemos utilizar as figuras de Lissajous formadas por superposição entre a
voltagem e a carga para determinar a potência média na descarga, segundo o trabalho
original de Manley 1943.
A idéia é utilizar uma corrente integrada no tempo, referente à carga, ao invés de
utilizar os picos de corrente das microdescargas individualmente. Isso pode ser feito
utilizando um capacitor em série ao experimento de descarga. Pode-se ser
rigorosamente mostrado que a área de um ciclo fechado de um gráfico de voltagem em
função da carga corresponde à energia consumida durante um período deste ciclo.
A forma desta figura de Lissajous obtida contém informações importantes sobre
a descarga. Para um circuito de capacitância pura, a figura de Lissajous resulta em uma
linha reta; a adição de uma resistência resulta em uma elipse. Na maioria das
aplicações de descargas por barreiras dielétricas, a figura assemelha-se a um
paralelogramo ideal, como mostrado na Figura A1, de onde a voltagem da descarga, a
capacitância efetiva do intervalo de descarga e o dielétrico podem ser obtidos.
Os declives das linhas na figura de Lissajous representam as capacitâncias do ar e
do dielétrico do reator. Manley 1943 assumiu que o plasma da descarga DBD enchia a
área entre os eletrodos de forma que a capacitância do dielétrico poderia ser obtida
através do declive da figura de Lissajous durante o período da descarga.
159
Figura A1 -
Esquema do diagrama de Lissajous. Os declives AC e BD representam a capacitância
do
dielétrico, e os declives AB e CD a capacitância do reator. V
m
e V
0
são a tensão máxima
aplicada e a tensão de ruptura (tensão mínima para inicializar a descarga), respectivamente.
Durante o período sem a formação de descarga DBD (fase carregada), a abertura
entre os eletrodos está cheia com ar, ou um gás, de forma que os declives AB e CD
representam a capacitância total no reator, C
T
,
que consiste em dielétrico e ar.
Durante o período da descarga o plasma enche toda a abertura entre os eletrodos.
Então, os declives de BD e CA representam a capacitância do material dielétrico no
reator, C
d
. Então, sendo C
a
a capacitância do ar, temos que:
• Fase carregada: Declive AB / CD (= C
T
):
daT
CCC
111
+=
.
• Fase de descarga: Declive BD / CA (= C
d
).
Segundo Manley 1943, a energia (W) dissipada na descarga DBD pode ser obtida
da área da figura de Lissajous e é determinada por:
,4
00
+
−= V
C
CC
VVCW
d
da
md
(A1)
160
onde V
0
é a tensão de ruptura, e V
m
é a tensão máxima aplicada. C
d
e C
a
são as
capacitâncias do dielétrico e do ar entre os eletrodos, respectivamente. Como vimos,
essas capacitâncias são obtidas pelos declives da figura de Lissajous nos períodos com
e sem a formação da descarga DBD, respectivamente.
A potência dissipada correspondente (P) é expressa por:
,4
00
+
−= V
C
CC
VVfCP
d
da
md
(A2)
onde f é a freqüência operacional. Como as cargas superficiais no dielétrico são
consumidas para sustentar a descarga, a capacitância do dielétrico tem um papel
importante na descarga DBD. O consumo das cargas superficiais é proporcional à
freqüência operacional, de forma que a potência máxima é dissipada na freqüência
operacional ótima.
As capacitâncias da descarga DBD dependem da distância de abertura entre os
eletrodos, do tamanho e da forma dos eletrodos, e da constante dielétrica do material
dielétrico. Então, a freqüência ótima varia com a configuração do reator, e a potência
máxima dissipada pode ser obtida da Equação A2 usando a freqüência ótima:
.
'
'
'4
000
+
−= V
C
CC
VVCfP
d
da
mdMax
(A3)
A densidade da potência dissipada (definida como a potência dissipada no
volume da descarga) varia com a capacitância do reator que é proporcional à área A do
eletrodo e inversamente proporcional à distância de abertura d de um reator planar.
Assim, assume-se que a capacitância, C, no reator é simplesmente:
,
d
A
C
T
ε
=
(A4)
onde
,
0
ε
ε
k
T
=
com
,/10.854,8
22212
mNC
−
=
ε
e k é a constante dielétrica da
barreira dielétrica.
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