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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
RODRIGO GOMES BELTRÃO
ANÁLISE DA DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA HUMANA
CULTIVADAS SOBRE DIFERENTES SUPERFÍCIES DE TITÂNIO
Porto Alegre
2009
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Livros Grátis
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PONTIFÍCIA UNIVERIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ANÁLISE DA DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
HUMANA CULTIVADAS SOBRE DIFERENTES SUPERFÍCIES DE
TITÂNIO
Rodrigo Gomes Beltrão
Tese apresentada como parte dos
requisitos obrigatórios para
obtenção do título de Doutor, pelo
Programa de Pós-Graduação da
Faculdade de Odontologia da
Pontifícia Universidade Católica
do Rio Grande do Sul.
Profa. Dra. Denise Cantarelli Machado
Orientadora
Porto Alegre
2009
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, pela minha família e por ter a oportunidade de
ajudar o próximo a recuperar sua saúde e sorrir.
Aos meus pais, Gilson e Maria Cecília, meus maiores exemplos, fonte de
amor, carinho e confiança. Os valores espirituais, sociais e profissionais ensinados
ao longo destes anos me ajudaram a crescer e conquistar meus sonhos. Devo a
vocês a minha vida.
À minha amada Helena, a maior incentivadora deste trabalho. Tua ajuda e
carinho nos momentos difíceis e em todas as fases do curso foram fundamentais e
nos fortaleceram. Esta conquista também é tua.
Ao meu filho que chegará no próximo ano. A tua luz foi a inspiração que
faltava para a finalização desta obra.
Ao meu irmão Renan, que ao meu lado cresceu, dividindo todos os
momentos mais importantes. A distância não separa os corações.
À Profa. Dra. Denise Cantarelli Machado, agradeço por tua paciência,
dedicação e amizade. Tua dedicação à pesquisa, simplicidade e carinho pelos que
te cercam é marcante e me servem de exemplo. Obrigado pelos ensinamentos e
pela oportunidade da tua orientação nesta pesquisa.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Cirurgia e Traumatologia
Bucomaxilofacial da FO-PUCRS. Seus ensinamentos contribuíram muito para
minha formação.
5
Ao meu amigo Christian Viezzer, tua ajuda e incentivo durante esta etapa
e a participação incansável e fundamental durante o processo de cultura celular
foram importantíssimas e serei eternamente grato por isso.
Ao meu colega e amigo Guilherme Fritscher, com o qual tive a
oportunidade de dividir conhecimentos e publicações durante este período.
Ao amigo Dr. Rafael Ott, obrigado pela participação neste estudo na etapa
de coleta das células da medula óssea.
Ao colega e amigo Paulo Henrique Luis de Freitas, tua ajuda, incentivo e
exemplo foram fundamentais.
À Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul por proporcionar o curso de doutorado. Aos Irmãos, Reitores,
Diretores, Professores e Funcionários, todo o meu agradecimento. O material
humano de uma instituição é o que ela tem de mais valioso.
Aos funcionários do Hospital São Lucas.
Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação da FO-PUCRS, Ana
Prestes, Davenir Brusch, Marcos Correia e Carlos Minossi pela ajuda dada ao
longo deste curso.
À CAPES pelo financiamento desta pesquisa.
À Biomet 3i do Brasil e Odontontodis LTDA, pelo apoio financeiro para este
trabalho.
6
RESUMO
Os implantes osseointegrados, em sua maioria, possuem algum tipo de
condicionamento da sua superfície que visa melhorar a osseointegração. O
mecanismo de diferenciação celular in vitro de células mesenquimais em
osteoblastos já é bastante conhecido e serve para avaliação das propriedades de
osteoindução e osteocondução de biomateriais. O presente estudo tem por
objetivo avaliar a adesão, proliferação e diferenciação das células da medula
óssea humana em superfícies de implantes de titânio com e sem deposição
discreta de fosfato de cálcio. As células foram obtidas a partir da medula óssea de
um doador humano. Foram selecionados 12 discos de titânio do tipo Bonelike®
(Biomet 3I, Brasil) com superfície tratada por duplo ataque ácido; Osseotite™
(Biomet 3I, USA) com superfície tratada por duplo ataque ácido e Nanotite™
(Biomet 3I, USA). Após 14 e 21 dias de cultura foi realizado PCR em tempo real
para avaliação da diferenciação celular e microscopia eletrônica de varredura para
avaliação da proliferação e adesão celular aos discos de titânio. Os resultados
indicaram que a rugosidade da superfície dos discos de titânio possibilita a
adesão, diferenciação e proliferação celular, que a síntese de ALP é maior na
superfície Bonelike e que as partículas de fosfato de cálcio demonstraram maior
grau de síntese de BGLAP e proliferação celular.
Palavras – Chave: célula da medula óssea, superfícies de implantes,
osteoindução, titânio.
7
ABSTRACT
Given that the majority of osseointegrated implants undergo some type of surface
conditioning in order to improve osseoitegration and that in vitro differentiation of
mesenchymal cells into osteoblasts is a mastered process that has been used for
evaluating a given biomaterial with regard to its osteinductive and osteoconductive
capabilities, the present work aims to evaluate the adhesion, proliferation and
differentiation of human bone marrow cells on titanium implant surfaces that have
or have not been treated by discrete calcium phosphate deposition. Human bone
marrow cells obtained from a single donor were cultured in media containing 12
titanium discs of one of the following: the Bonelike® (Biomet 3I, Brazil) with a
surface treated by double acid etching; the Osseotite™ (Biomet 3I, USA) with
similar surface treatment and the Nanotite™(Biomet 3I, USA). After 14 and 21
days of culture, real time PCR and SEM examinations were performed. From the
results we concluded that implant surface roughness allows cell adhesion,
differentiation and proliferation, the ALP synthesis is higher in Bonelike® and the
presence of calcium phosphate nanoparticles on an implant surface leads to
enhanced BGLAP synthesis and cell proliferation.
Key – Words: marrow cells, implants surfaces, osseoinduction, titanium.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Remoção de sangue medular da crista do ilíaco. 38
Figura 2: Separação das células medula óssea humana. 39
Figura 3: Células medula óssea humana separadas. 40
Figura 4: Discos de titânio cortados e colocados em cultura. 41
Figura 5: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Bonelike aos 14 dias de cultura.
47
Figura 6: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Bonelike aos 21 dias de cultura.
48
Figura 7: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Osseotite aos 14 dias de cultura.
48
Figura 8: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Osseotite aos 21 dias de cultura.
49
Figura 9: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Nanotite aos 14 dias de cultura.
49
Figura 10: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do
implante Nanotite aos 21 dias de cultura.
50
9
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Expressão da Fosfatase Alcalina (ALP) nos períodos de 14 e 21
dias de cultura sobre superfícies de titânio.
45
Gráfico 2: Expressão da Osteocalcina (BGLAP) nos períodos de 14 e 21
dias de cultura sobre superfícies de titânio.
46
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Expressão da Fosfatase Alcalina nos períodos de 14 e 21 dias de
cultura sobre superfícies de titânio.
46
Tabela 2: Expressão da Osteocalcina nos períodos de 14 e 21 dias de
cultura sobre superfícies de titânio.
47
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ALP Fosfatase Alcalina
β-2M Beta-2 microglobulina
BGLAP Osteocalcina
BMP Proteína morfogenética óssea
BMP-4 Proteína morfogenética óssea-4
cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar
CEP
CMI
Comitê de Ética em Pesquisa
Células Mesenquimais Indiferenciadas
CNS Conselho Nacional de Saúde
CO
2
Dióxido de carbono
°C Graus centígrados
OM
Dexametasona/ácido ascórbico/β
ββ
β-glicerolfosfato
DEPC Dietilpirocarbonato
D-MEM Meio de Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Ácido desoxirribonucléico
Dnase Deoxirribonuclease
dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
DPBS Dulbecco′s Phosphate-Buffered Salines
dT Dideoxitimidina
DTT Ditiotreitol
12
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EtBr Brometo de Etídio
FBS Soro fetal bovino
G Força gravitacional
GLA Proteína óssea gama carboxi-glutâmica
H
2
O Água
kDa Quilo-dalton
M Molar
rhBMP-4 Proteína morfogenética óssea/4 humana
recombinante
MgCl
2
Cloreto de magnésio
mL Mililitro
mM Milimolar
MQ MilliQ
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
OC Osteocalcina
OP Osteopontina
p/v peso/volume
PBS Salina tamponada com fosfato
PLA “Processed lipo-aspirate”
PUCRS Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul
qRT-PCR Transcrição reversa seguida de PCR em tempo real
13
rh Recombinante humana
RNA Ácido ribonucléico
Rnase Ribonuclease
RT-PCR Transcrição reversa seguida de PCR
SPP1 Osteopontina ou sialoproteína I
TGF-β Fator de crescimento e transformação-β
U Unidade
USA/EUA United States of América / Estados Unidos da
América
UV Ultravioleta
v/v volume/volume
VK Von Kossa
µL Microlitro
µm Micromolar
® Marca registrada
%
™
Por cento
“Trade marc”
14
SUMÁRIO:
_________________________________________________
15
SUMÁRIO:
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE GRÁFICOS
LISTA DE TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO 16
2. OBJETIVOS 20
3. REVISTA DA LITERATURA 22
3.1 Tecido Ósseo 23
3.2 Células Mesenquimais Indiferenciadas 24
3.3 Células Osteoprogenitoras 26
3.3.1 Pré-osteoblastos 27
3.3.2 Osteoblastos 27
3.4 Osteoindução 30
3.5 Marcadores da linhagem osteogênica 31
3.6 Superfícies de Titânio 32
4. METODOLOGIA 36
4.1 Considerações Bioéticas 37
4.2 Hipóteses 37
4.3 Amostra 38
4.3.1 Obtenção das células da medula óssea 38
4.3.2 Discos de Titânio 40
4.3.3 Composição dos grupos experimentais 41
4.4 Cultura das células da medula óssea sobre discos de titânio 41
4.5 Extração do ácido ribonucléico (RNA) total 42
4.6 Síntese do ácido deoxirribonucléico complementar (cDNA) 42
4.7 Reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real (qRT-PCR ) 42
4.8 Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das células da medula
óssea humana em cultura sobre superfícies de titânio 43
5. RESULTADOS 48
5.1 Expressão da proteína fosfatase alcalina, osteocalcina e osteopontina através de
PCR em tempo real 45
5.2 Avaliação de adesão e morfologia celular por MEV 47
6. DISCUSSÃO 51
7. CONCLUSÃO 57
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59
9. ANEXOS 65
16
INTRODUÇÃO:
_________________________________________________
17
1. Introdução:
O desenvolvimento tecnológico e científico da odontologia nas áreas de
implantodontia e cirurgia bucomaxilofacial para o tratamento de deficiências
ósseas que acometem uma grande quantidade de pacientes crescem de modo
acelerado em todo o mundo. Com a descoberta do fenômeno da osseointegração,
a reabilitação estética, funcional e psicológica tornou-se possível e hoje é uma
realidade difundida e comprovada clínica e cientificamente.
Atualmente, com o advento e domínio da biologia molecular, da engenharia
genética e das pesquisas de diferenciação celular a partir de células-tronco, a
odontologia está entrando em uma nova fase onde os tratamentos de regeneração
tecidual serão cada vez mais previsíveis, com melhores resultados e
procedimentos menos invasivos. Para tanto, cada vez mais o conhecimento do
fisiologismo humano se faz necessário. Entender o metabolismo celular, a síntese
de proteínas, as substâncias reguladoras das células e a gênese das mesmas são
o caminho a ser percorrido.
O tecido ósseo está constantemente passando por um processo
morfológico dinâmico seguindo sua formação original. Desta forma, o metabolismo
ósseo é mantido por um processo constante de reabsorção e neoformação em
resposta a mudanças físicas e biomecânicas. Este evento é controlado por dois
mecanismos: regulação sistêmica e local, através de hormônios reguladores dos
níveis de cálcio e fosfato. Junto a isso ainda existem os fatores de crescimento
que atuam sobre todas as células da estrutura óssea ajudando no processo de
reparo tecidual. (1-3).
O ciclo de vida de uma célula mesenquimal indiferenciada é um processo
regulado por cinco atividades fundamentais: ativação, proliferação, imigração,
diferenciação e sobrevivência (ou morte). (4).
18
O mecanismo de diferenciação celular in vitro de células da medula óssea
humana em osteoblastos já é dominado com a utilização de rhBMP-4. Esta
proteína óssea sintetizada em laboratório interfere positivamente nos períodos
iniciais de cultura. (5)
Atualmente algumas pesquisas têm conseguido cultivar estas células
diferenciadas em estruturas pré-fabricadas que as mantenham vivas e que
possam ser enxertadas em defeitos ósseos. Desta forma poderão ser produzidos
materiais de enxertia que contenham células ósseas e que dêem as cirurgias de
enxerto ósseo um prognóstico mais favorável e não dependam de acessos a
áreas doadoras. (6-8)
Os implantes osseointegrados, em sua maioria, possuem algum tipo de
condicionamento da sua superfície que permite uma maior área de contato ósseo
com o implante. Além disso, as microrrugosidades das superfícies dos implantes
permitem maior adesão da rede de fibrina formada no primeiro estágio da
osseintegração. Esta rede de fibrina é que permite uma migração mais efetiva dos
osteoblastos até a superfície do implante. Desta forma, a neoformação óssea
sobre estas estruturas se dá de maneira organizada e mais rápida uma vez que as
células tornam-se polarizadas em direção ao implante (9).
Atualmente existe uma série de diferentes tratamentos das superfícies dos
implantes te que vão desde a subfração por ataque ácido até a deposição discreta
de nanopartículas de fosfato de cálcio nestas superfícies.
Novas pesquisas têm surgido, demonstrando resultados promissores na
ossoeintegração de implantes com deposição discreta de fosfato de cálcio em
suas superfícies. (10-12)
19
Portanto, esta pesquisa tem o objetivo principal de cultivar células de
medula óssea humana em diferentes tipos de superfícies de titânio e avaliar a sua
proliferação e diferenciação em células ósseas.
20
OBJETIVOS:
_____________________________________________
21
2. Objetivos:
2.1 Avaliar a adesão e proliferação das células da medula óssea
humana em superfícies de implantes de titânio;
2.2 Avaliar a diferenciação em osteoblastos das células da
medula óssea humana em superfícies de implantes de titânio.
22
REVISTA DA LITERATURA:
_____________________________________________
23
3. Revista da Literatura:
3.1 Tecido Ósseo:
O osso difere-se dos demais tecidos que compõe o corpo humano por uma
extraordinária capacidade de crescer e manter contínuos remodelamento e
regeneração. Assim, os ossos mantém sua forma e propriedades físicas. (13)
O metabolismo ósseo envolve um processo contínuo de reabsorção e
neoformação ósseas onde dois mecanismos têm sido postulados para o controle
desse processo: a regulação sistêmica, que é realizada por meio de hormônios
reguladores da taxa de cálcio e fosfato, e regulação local, onde a participação de
fatores de crescimento que atuam sobre células mesenquimais indiferenciadas
resultará no processo conhecido de neoformação óssea. (1)
O tecido ósseo é um tecido complexo que está constantemente passando
por um processo morfológico dinâmico, seguindo sua formação inicial, seu
crescimento, seu reparo e sua remodelação, em resposta a mudanças físicas e
biomecânicas sofridas pelo corpo humano. (14)
O esqueleto humano está sujeito à constante remodelação, objetivando
manter o tecido ósseo com suas propriedades biomecânicas inalteradas. O
remodelamento e a cicatrização de fraturas ósseas são exemplos da capacidade
regenerativa do tecido ósseo graças à atuação das células mesenquimais
indiferenciadas estimuladas por fatores de crescimento. (15-16)
O tecido ósseo possui uma estrutura de proteínas fortalecida por fosfato de
cálcio, além de capacidade regenerativa, na qual todo o processo de formação
ocorre a partir de uma integração dinâmica de processos bioquímicos, celulares e
hormonais continuamente facilitados por um estado de deposição, reabsorção e
remodelação. Existem três parâmetros fundamentais na engenharia tecidual óssea
que vão determinar a capacidade de osteoindução: sinais osteoindutores solúveis
24
viabilidade das células mesenquimais indiferenciadas em responder e ter a
capacidade de se diferenciarem em células formadoras de osso, além da
produção de uma matriz extracelular adequada. (17)
3.2 Células Mesenquimais Indiferenciadas
As células mesenquimais indiferenciadas (CMIs) são células progenitoras
pluripotentes, que têm a propriedade de dividirem-se muitas vezes e em diversas
linhagens para a formação de tecidos esqueléticos, como, por exemplo,
cartilagem, osso, tendão, ligamento, estroma da medula óssea e tecido conjuntivo.
Essas células não são governadas por si só ou limitadas a um número fixo de
divisões mitóticas; a sua progênie é afetada por fatores intrínsecos e extrínsecos
que, combinados, são responsáveis pelo controle da expressão dos padrões
molecular e celular, resultando em tecidos específicos, com funções também
específicas, com base no seu repertório molecular. Ademais, durante a
progressão da célula mesenquimal indiferenciada até a finalização de seu
fenótipo, ela sofre a influência da regulação parácrina e da regulação autócrina,
quando a soma de todos esses sinais intrínsecos e extrínsecos define o
desenvolvimento e o fenótipo celulares. (18)
Além disso, o tecido ósseo adulto contém fatores que estimulam o reparo
ósseo, recapitulando o desenvolvimento embriológico e a morfogênese. (19)
As CMIs quando cultivadas in vitro e têm demonstrado a capacidade de dar
origem aos fenótipos celulares diferenciados das camadas germinativas do
embrião. Através de estudos com cultura de CMIs adultas retiradas da medula
óssea da crista de ilíaco de doadores humanos observou-se que a medula óssea
adulta contém uma quantidade de CMIs que contribuem para a regeneração de
tecidos mesenquimais como osso e cartilagem. Esse processo de diferenciação é
influenciado, significativamente, por nutrientes basais, densidade celular,
25
organização espacial, forças mecânicas, fatores de crescimento e citocinas. (5,16,
20-22)
No estroma da medula óssea encontra-se uma população heterogênea de
células que fornece suporte estrutural e fisiológico para as células
hematopoiéticas. Algumas destas células apresentam características de células-
tronco e possuem a propriedade de diferenciarem-se em osso, cartilagem,
adipócitos, além de atuarem como um suporte hematopoiético para os tecidos.
(23)
As CMIs são passíveis de regeneração do tecido ósseo. Assim, um meio
embrionário em tecidos adultos lesados pode ser recriado. Além disso, os autores
salientaram que tais células têm propensão a se aderir em cultura, permitindo-se
isolarem-se de outras células medulares, sendo possível verificar a sua
proliferação e a diferenciação não só em osteoblastos, mas também em
condroblastos, mioblastos e adipócitos. (24)
Células hematopoiéticas estão amplamente associadas com células do
estroma da medula óssea, tanto in vitro quanto in vivo. No entanto, quando essas
células do estroma estão em cultura, as hematopoiéticas bem diferenciadas são
normalmente removidas por técnicas de lavagens seletivas e aderência. (23, 25)
Em estudo realizado in vitro onde as células derivadas da medula óssea
foram transfectadas com o vetor de adenovírus recombinante contendo a BMP-2
humana foram colocadas em cultura, observou-se claramente a proliferação e a
diferenciação osteogênica das CMIs, enquanto que, in vivo, tais células, depois de
transplantadas no rádio de ratos, foram capazes de formar osso e cartilagem,
além de regenerar defeitos ósseos. (26)
26
Alguns autores destacam que a medula óssea contém células com um
grande potencial osteogênico, incluindo células precursoras osteogênicas
totalmente comprometidas com a osteogênese. (27,28)
Até atingirem a formação do adulto, as células-tronco vão se tornando
progressivamente restritas em sua capacidade de diferenciação, ficando cada vez
mais comprometidas com uma determinada função. Inicialmente, as populações
de células-tronco confinadas a um seleto grupo de tecidos (endoderma, ectoderma
ou mesoderma) são multipotentes, porém, com o processo de desenvolvimento,
algumas delas podem permanecer pluripotentes, capazes de se diferenciar em
uma ou mais linhagens. Outras células tornam-se progressivamente limitadas,
com a capacidade de gerar somente um tipo celular. Essa restrição parece ser o
resultado de mudanças adaptativas críticas e irreversíveis no núcleo celular. (4)
3.3 Células Osteoprogenitoras
A maioria das osteoprogenitoras presentes nas células da calvária de fetos
de ratos e derivadas do estroma da medula óssea de ratos adulto jovens em
cultura tem capacidade de renovação e tempo de vida limitados. Evidências
sugerem que existem, no mínimo, dois tipos distintos de populações de
osteoprogenitores. Uma população com capacidade de promover diferenciação in
vitro e outra, aparentemente menos diferenciada, que sofre diferenciação
osteoblástica somente após estímulos indutores específicos como dexametasona,
outros esteróides e fatores de crescimento como as proteínas morfogenéticas
ósseas. Tais substâncias aumentam o número de nódulos ou colônias ósseos nas
culturas de estroma da medula óssea e da calvária de ratos. (25, 29)
A maioria das pesquisas aponta que as CMIs, quando em cultura e na
presença de citocinas ativadoras do osso, sofrem osteopoiese, processo esse que
envolve a proliferação e a maturação de células precursoras primitivas até a
formação de osteoblastos funcionais, sendo que as células ósseas originadas das
27
CMIs comprometidas com a osteogênese são as células osteoprogenitoras, pré-
osteoblastos, osteoblastos e osteócitos. O autor acredita que, pelo fato de essas
células apresentarem um desenvolvimento contínuo ilimitado, não há,
conseqüentemente, diferença de comportamento entre elas. (27)
O caminho da diferenciação osteoblástica é modulado por interações entre
células progenitoras (osteoprogenitoras), suas vizinhas, a matriz envolvida e uma
ampla extensão de fatores solúveis, incluindo o de crescimento e transformação-β
(TGF-β), o fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), o semelhante à
insulina II (IGF-II), várias interleucinas, ácido retinóico, glucocorticóides,
estrógeno, hormônios da paratireóide, vitamina D e tiroxina. Vários membros da
família das BMPs são altamente efetivos nessa diferenciação. (4).
3.3.1 Pré-osteoblastos
Os pré-osteoblastos representam um estágio de transição entre uma alta
proliferação de células osteoprogenitoras e osteoblastos maduros, apresentando
baixos níveis de proteínas ósseas, como a fosfatase alcalina, a osteonectina e a
osteopontina, entre outras. Os pré-osteoblastos são predominantemente definidos,
morfologicamente baseados em sua localização adjacente à atividade dos
osteoblastos. Além do mais, essas células fornecem importantes informações à
resposta de fatores de crescimento, transdução de sinais e mineralização. (27)
3.3.2 Osteoblastos
As células osteoblásticas apresentam uma grande diversidade de
morfologias e atividades indo desde pré-osteoblastos com sua forma poligonal,
osteoblastos cuboidais, osteoblastos sintetizadores de matriz e osteócitos de
matriz embebidos na porção mineral até células que recobrem o osso, achatadas
e finas. Esses inúmeros morfotipos são geralmente considerados diferentes
28
estágios de maturação de uma única linhagem celular originada da proliferação e
da diferenciação de células osteoprogenitoras. (30)
Apesar de a exata seqüência de eventos ainda não ter sido completamente
entendida, acredita-se que os osteoblastos derivem de células-tronco pluripotentes
da medula óssea, por meio de um caminho de diferenciação compreendido por
uma série de estágios osteoprogenitores e pré-osteoblásticos. (31)
Análises cinéticas em colônias em crescimento celular mostraram que os
osteoprogenitores sofrem de nove a 10 alterações de população antes de surgir o
primeiro osteoblasto morfologicamente diferenciado nesta colônia em
desenvolvimento. (32)
Estudos sobre o efeito da idade na formação óssea ectópica induzida por
BMPs em ratos com um mês, 10 meses e 18 meses de vida, constataram que a
velocidade e a quantidade dessa formação de osso é reduzida significativamente
pelo avanço etário. A redução no anabolismo pode ser atribuída às mudanças nos
níveis de hormônios e dos fatores de crescimento. Dois mecanismos têm sido
postulados como principais causadores da diminuição da formação óssea
ectópica: a idade, que pode reduzir a migração de CMls, diminuindo o número de
precursores osteogênicos, bem como a inabilidade de células osteogênicas para
responder às BMPs. (33)
Os osteoblastos são células especializadas que atuam diretamente sobre a
formação óssea nos vertebrados. O tecido ósseo consiste, principalmente, de
cristais de hidroxiapatita e vários tipos de proteínas na matriz extracelular,
incluindo colágeno tipo I, osteocalcina, osteonectina, sialoproteína óssea e
proteoglicanos. Tanto esses cristais de hidroxiapatita quanto as proteínas são
regulados pelos osteoblastos e, além disso, a alta atividade enzimática da
fosfatase alcalina e a resposta a hormônios e a citocinas são características
importantes dos osteoblastos. (34)
29
A matriz extracelular do osso é composta por 90% de proteínas colágenas
(97% de colágeno tipo I e 3% de colágeno tipo V) e 10% de proteínas não-
colágenas (20% de osteocalcina, 20% de osteonectina, 12% de sialoproteínas,
10% de proteoglicanos, osteopontina, fibronectina, fatores de crescimento, BMPs
e outras), sendo todas elas proteínas sintetizadas pelos osteoblastos. (35)
Durante a embriogênese, o tecido ósseo é formado por dois caminhos
distintos: ossificação intramembranosa e endocondral. Independentemente disso,
os osteoblastos desempenham um único papel na formação de osso. (19)
No processo de ossificação intramembranosa, os osteoblastos são
diferenciados diretamente das CMIs. Contudo, no processo de ossificação
endocondral estas células mesenquimais diferenciam-se, primeiro, em
condrócitos, que formam uma matriz cartilaginosa onde os osteoblastos são
diferenciados imediatamente após a maturação hipertrófica destes condrócitos.
Este processo de desenvolvimento ósseo e cartilaginoso sugere que osteoblastos
e condroblastos têm origem de um mesmo progenitor celular. (34,36)
Quando mantidas sob condições de cultura adequadas, as células do
estroma da medula óssea de camundongos são capazes de formarem nódulos
ósseos. Estes representam o produto final da proliferação e da diferenciação das
células osteoprogenitoras, relativamente raras, presentes no início da população
celular. O processo de formação desses nódulos ósseos é dividido em três
estágios de desenvolvimento: a proliferação, o desenvolvimento da matriz
extracelular e a maturação e mineralização. O processo caracteriza-se por
diferentes genes associados à proliferação, à atividade do ciclo celular, bem como
à atividade e à heterogeneidade dos osteoblastos. (37)
Quando BMPs são implantadas em tecido subcutâneo de ratos, as CMIs
são estimuladas a criar um processo similar à ossificação endocondral. No
entanto, têm aumentado as evidências de que as BMPs podem induzir formação
30
óssea diretamente, sem a seqüência endocondral. As pesquisas demonstraram
que, em todos os grupos de ratos nos quais a BMP foi implantada, ocorreu
ossificação intramembranosa. (33)
Os osteoblastos são células primárias responsáveis pela formação óssea,
originadas de células mesenquimais osteoprogenitoras localizadas dentro do
tecido esquelético. Estudos demonstraram uma significativa resposta osteogênica
com alta atividade de fosfatase alcalina, deposição de cálcio e formação de
nódulos ósseos, em pesquisa in vitro.(5,38)
3.4 Osteoindução
A osteoindução é o processo que sustenta a mitogênese de células
mesenquimais indiferenciadas induzindo a formação de células osteoprogenitoras
com capacidade de formar novo osso. Diferentemente de materiais
osteocondutores, substâncias osteoindutoras provocam a formação óssea em
locais extra-esqueletais. (39)
A indução óssea é caracterizada por uma seqüência de fases que são a
quimiotaxia, a mitose e a diferenciação em cartilagem e/ou osso. A quimiotaxia e a
migração das células mesenquimais ocorrem no primeiro dia; a proliferação
(mitose), até o terceiro dia; a diferenciação em condroblastos, no quinto dia; a
cartilagem hialina, no sétimo dia; a calcificação da matriz hipertrófica da
cartilagem, no nono dia; a invasão vascular e angiogênese, no décimo dia; a
formação óssea no décimo e décimo primeiro dias; a remodelação do osso, no
décimo segundo ao décimo oitavo dia e a diferenciação in situ da medula
hematopoiética, do décimo oitavo ao vigésimo primeiro dia. (19)
Pesquisas sobre o efeito osteoindutor da BMP-2 recombinante em culturas
primárias de osteoblastos da calvária de fetos de ratos durante 20 dias
perceberam que essa linhagem osteoblástica sofreu um processo de proliferação
31
e diferenciação, tendo produzido nódulos ósseos que tinham a característica de
um osso trabeculado normal. (40)
A osteoindução caracteriza-se pela habilidade que algumas moléculas
possuem de promover a formação óssea. A osteoindução, para que ocorra, não
depende somente das células do hospedeiro, mas, também, da presença de CMIs
no local. A potencialidade da osteoindução vai depender da habilidade que uma
certa molécula e um determinado local tem para induzir células mesenquimais
indiferenciadas a formar osso. Para os autores, a formação óssea é influenciada
por muitos fatores, sendo o suprimento sangüíneo o mais importante, pois
aumenta a oxigenação tecidual e, conseqüentemente, a formação de colágeno, a
proliferação de fibroblastos e capilares, a atividade de osteoblastos e osteoclastos,
além da formação e da mineralização do calo ósseo. (41,42)
3.5 Marcadores da linhagem osteogênica
A osteopontina (SPP1) que é uma glicoproteína fosforilada pela matrix
extracelular mineralizada dos osteoblastos durante o desenvolvimento ósseo, em
que seu aumento é regulado pela vitamina D. Ela tem um papel crucial na larga
escala de formação da hidroxiapatita. (43)
A expressão da osteopontina é regulada fortemente em resposta aos níveis
elevados de fosfato extracelular. E numerosos outros fatores são conhecidos
como estimuladores, por exemplo, fosfatase alcalina que cliva fosfatos e permite
um meio básico para o início da mineralização. (44)
A osteocalcina (BGLAP), também conhecida como ácido gama carboxi-
glutâmico, é uma proteína de ligação com cálcio dependente de vitamina K.
Quimicamente, apresenta peso molecular de 6kDa e 49 aminoácidos. Ela tem em
sua conformação 3 ácidos gama carboxi(GLA) nas posições 17, 21 e 24 que são
32
conhecidos como mediadores fortes da ligação com hidroxiapatita, fosfato de
cálcio. Sendo assim, ela é descrita como um promotor e inibidor da mineralização.
Essa proteína é produzida exclusivamente pelos osteoblastos durante o processo
de síntese da matriz óssea; representado 20% das proteínas de matriz não
colagenosa. (45)
3.6 Superfícies de Titânio
A topografia microscópica das superfícies de titânio afeta a ativação,
adesão, orientação, morfologia e os movimentos celulares, bem como, a
expressão de genes. As modificações de superfície ainda podem recrutar os tipos
certos de células, manipular a expressão genética e comunicação entre as células
e finalmente guiar as propriedades dos tecidos neoformados (46-48).
A expressão de fosfatase alcalina de células ósseas é maior em discos de
titânio com superfície rugosa do que em discos polidos quando colocados na
presença de BMP2. Neste mesmo estudo, a expressão da osteocalcina foi mais
rápida nos discos com tratamento de superfície. (48)
A rugosidade do titânio modula a resposta celular para fatores locais e
sistêmicos provocando mudanças na expressão fenotípica e no estado de
maturação. (49)
A topografia das superfícies de implante tem efeitos distintos não só na
produção de mediadores químicos pelas células em contato, mas também na
atividade celular de células distantes o que caracteriza um efeito biorreator. (50)
A caracterização da superfície dos biomateriais é particularmente
importante para entender a biocompatibilidade dos mesmos. A modificação das
33
superfícies pode dar-se de várias formas e através das suas características
poderá haver maior ou menor interação com as células ósseas. (51)
Partículas de fosfato de cálcio na superfície de bioateriais aceleram a
cicatrização óssea provavelmente por um aumento da taxa de osteocondução
maior do que a taxa de formação óssea por si. (52)
A deposição de partículas de fosfato de cálcio em implantes de titânio traz
um efeito benéfico para a resposta de neoformação óssea durante a fase de
cicatrização. Além disso, a resposta óssea à superfície dos implantes depende
muito do local onde estes serão instalados. (53)
Após avaliação da manifestação de genes de células mesenquimais e pré-
osteoblasticas em diferentes tipos de superfície de implantes, constatou-se que a
rugosidade da superfície interfere na expressão de proteínas como a fosfatase
alcalina, osteocalcina e osteopontina. Contudo, a manifestação destas proteínas
não se dá de maneira semelhante entre os tipos de superfícies avaliadas, havendo
maior manifestação de cada uma delas em cada uma das três superfícies
avaliadas. (54)
A rugosidade das superfícies de biomateriais em culturas celulares pode
promover um atraso na manifestação genética - incluindo a fosfatase alcalina - e
na sua proliferação. Contudo, não há bloqueio da atividade celular. (55)
A reação do corpo ao material estranho implantado é governada por um
número de fatores que determinam se o implante vai ser aceito ou rejeitado pelo
organismo e se vai cumprir a sua função específica de suportar cargas
mastigatórias. Este é um dos maiores desafios principalmente no tratamento de
maxila atróficas. (56)
34
Ao ser avaliada a força necessária para remover implantes de superfícies
de duplo ataque ácido com e sem deposição discreta de fosfato de cálcio foi
demonstrado que, em tecido ósseo de ratos Wistar, a presença de fosfato de
cálcio na superfície dos implantes de titânio aumenta a força de osseointegração.
(10)
Na mesma linha de pesquisa, agora com humanos, as mesmas superfícies
foram avaliadas. Implantes foram colocados na região de tuberosidade da maxila
e após dois meses a área de contato ósseo foi medida. Os resultados foram
significativamente maiores nos implantes com nanopartículas de fosfato de cálcio,
o que segundo os autores demonstra uma osseointegração mais rápida dos
mesmos. (11)
A diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas da medula óssea
em superfícies de titânio tratadas com jateamento de sílica e ataque ácido e na
mesma superfície acrescida de cristais de hidroxiapatita foi estudada in vitro. Os
resultados mostraram que, na presença de partículas de hidroxiapatita na
superfície dos implantes, o fenótipo celular osteoblástico e a proliferação celular
mostraram-se significativamente maiores. (57)
Silva (2009) relatou que discos de titânio com diferentes tipos de
condicionamento ácido também manifestaram proliferação celular e síntese de
osteocalcina e osteopontina em relação a discos de titânio polido em cultura de
células mesenquimais na presença de BMP4. O estudo concluiu que a rugosidade
dos implantes acelera o processo de diferenciação celular, mas não o de
proliferação. (58)
A Superfície NanoTite™ aumenta as propriedades de cicatrização do tecido
periimplantar em locais de osso nativo maxilar quando comparada à superfície
Osseotite™. Esta diferença não foi percebida em locais de osso enxertado. (59)
35
Em estudo realizado em cães para avaliação da formação óssea
periimplantar de implantes com superfície tratada por duplo ataque ácido em
comparação com a mesma superfície acrescida de depósito de cristais de fosfato
de cálcio, não se observou diferença na neoformação óssea entre os dois tipos de
superfície. (60)
De acordo com Schwarz (2009), uma camada de partículas de fosfato de
cálcio reabsorvível em contato com surperfícies rugosas de titânio aumenta
significantemente a área de contato ósseo ao redor dos mesmos. Isto foi verificado
após 12 semanas de osseointegração destes implantes em fêmur de porcos. (61)
Em estudo realizado para a avaliação do contato ósseo em implantes com
tratamento de superfície por ataque ácido e na mesma superfície com deposição
de cristais de fosfato de cálcio colocados imediatamente após a exodontia de
prés-molares de cães, pode-se afirmar que não houve diferença entre as
superfícies em 4, 6 e 8 semanas. Desta forma, conclui-se que o local de
implantação (tamanho do alvéolo) tem maior influência no tratamento e que o
acréscimo de nanopartículas de fosfato de cálcio tem efeito limitado no processo
de osseointegração. (62)
A presença de nanopartículas de hidroxiapatita em estruturas de poli
epsilon caprolactone promoveu maior manifestação da fosfatase alcalina e a
atividade de osteocalcina em culturas de células mesenquimais de polpa dentária
em relação às mesmas estruturas sem as nanopartículas. (63).
36
METODOLOGIA:
_____________________________________________
37
4. Metodologia
4.1 Considerações Bioéticas
O presente estudo está em conformidade com os itens III.3.i e III.3.t das
Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos
(Resolução CNS 196/96), bem como com a diretriz número 12 das Diretrizes
Éticas Internacionais para Pesquisas Biomédicas Envolvendo Seres Humanos
(Council for International Organizations of Medical Sciences, CIOMS; 2002).
Neste estudo foram utilizados as mesmas células que foram usadas para o projeto
de pesquisa: Estudo in vitro sobre osteoindução e osteocondução utilizando
células de medula óssea associada a um meio de osso homólogo, já aprovado
pela comissão científica deste curso e pelo comitê de ética em pesquisa da
PUCRS sob registro CEP: 06/03481.
4.2 Hipóteses
H1 – As células da medula óssea humana aderem e diferenciam-se sobre a
superfície rugosa de implantes de titânio;
H2 – A presença de nanopartículas de fosfato de cálcio na superfície dos
implantes aumenta a proliferação celular;
H3 – A presença de nanopartículas de fosfato de cálcio na superfície dos
implantes aumenta a diferenciação celular;
38
4.3 Amostra
4.3.1 Obtenção das células da medula óssea:
As células utilizadas nesta pesquisa foram obtidas a partir da medula óssea
do osso do ilíaco de um doador humano voluntário, submetido à cirurgia de
enxerto ósseo em maxila. Este procedimento não acarretou ao paciente maior
morbidade ou riscos pós-operatórios.
Após acesso cirúrgico á área doadora, foi realizada uma punção na medula
óssea através da cortical óssea com um trocarter onde estava acoplada uma
seringa de 20 mL contendo 0,05 de heparina. (Figura 1)
. Figura 1: Remoção de sangue medular da crista do ilíaco.
Foi removida uma quantidade de sangue medular de aproximadamente 60
mL. O material foi transferido para um tubo estéril e armazenado em banho de
gelo até sua separação em gradiente de densidade. (Figura 2)
39
As células foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade
utilizando Histopaque ®-1077 (Sigma Diagnostics, USA). Para tanto, as células
foram re-suspensas com um volume igual ao de medula com meio de cultura D-
MEM (Dulbecco´s Modified Eagle Media; Invitrogen, USA), colocadas sobre ½ do
volume de Histopaque® e centrifugadas a 400g durante 30 minutos. A camada de
células mononucleares foi retirada e lavada com 50 mL de DPBS (Dulbecoo´s
Phosphate Buffered Saline; Invitrogen, USA) e centrifugada a 1500 rpm por 3
minutos. A viabilidade celular foi avaliada pelo método de exclusão com azul-tripan
em hemocitômetro (Optik Labor, USA) e as células ressuspensas a uma
densidade de 0,5 x 10
6
células/mL.
Figura 2: Separação das células da medula óssea.
40
Figura 3: Células da medula óssea separadas.
4.3.2 Discos de titânio
Foram selecionados 12 implantes de titânio da marca comercial Biomet 3I
com tratamentos de superfícies diferentes. Os implantes eram do tipo Bonelike®
(Biomet 3I, Brasil) com superfície tratada por jateamento com óxido de alumínio e
ataque ácido por ácido sulfúrico; Osseotite™ (Biomet 3I, USA) com superfície
tratada por duplo ataque ácido por ácido sulfúrico e ácido clorídrico e Nanotite™
(Biomet 3I, USA) com superfície tratada por duplo ataque ácido como a Osseotite,
porém com a deposição discreta de nanopartículas de fosfato de cálcio.
Todos os implantes tinham 04 mm de diâmetro e tiveram seus ápices
cortados em uma espessura de 01 mm. Este procedimento ocorreu em uma
câmara de fluxo laminar classe IIA, com material estéril e sob irrigação constante
com solução fisiológica 0,9%.
41
Figura 4: Discos de titânio cortados e colocados em meio de cultura.
4.3.3 Composição dos grupos experimentais:
Três grupos experimentais, cada um correspondente a um tipo de superfície
de implantes comerciais de titânio: BL (Bonelike®), OS (Osseotite™) e NT
(Nanotite™) em duplicata foram avaliados em dois períodos diferentes de cultura
de células da medula óssea humana correspondendo a 14 e 21 dias. Para os
mesmos períodos e para cada grupo, também em duplicata, foram colocadas as
mesmas células em cultura, porém sem contato com nenhuma das superfícies de
titânio estudadas. Estes poços de cultura compõem o grupo controle que servirá
para comparar a expressão gênica das células dos grupos teste.
4.4 Cultura de células da medula óssea sobre os discos de titânio
As células da medula óssea na concentração de 5x10
6
foram colocadas
para cultivo em placas de cultura com 12 poços (500 µL de suspensão celular por
42
poço). Cada poço continha um disco de titânio e a placa de cultura foi mantida a
37°C em estufa contendo 5% de CO
2
em meio D-MEM suplementado por 10% de
soro fetal bovino (FBS, Invitrogen, USA) inativado durante 30 min a 56°C contendo
1% de solução de penicilina-estreptomicina (10.000 g/ml, 10.000 µg/ml, Invitrogen,
USA) e 0,1% de gentamicina (100 mg/ml Invitrogen, USA).
4.5 Extração do Ácido Ribonucleico (RNA) total
O RNA total foi extraído utilizando-se o kit PureLink™ Micro-to-Midi Total
RNA Purification System, de acordo com as recomendações do fabricante. Tanto
a qualidade quanto a quantidade do RNA total extraído foram analisados por
espectrofotometria (A260/280) e por visualização em gel de agarose 1% (p/v)
corado com brometo de etídeo. As amostras foram tratadas com DNase I antes da
síntese do cDNA.
4.6 Síntese do Ácido Deoxirribonucleico complementar (cDNA)
Foram usados 5 µg de RNA total para síntese do cDNA utilizando-se o kit
RT² First Strand Kit (SABiosciences), conforme as recomendações do fabricante.
O cDNA obtido foi tratado com RNase H com a finalidade de degradar todos e
quaisquer mRNAs que serviram de molde para a sintese do cDNA, eliminando
qualquer contaminação cruzada com o mRNA.
4.7 Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR)
As análises pela QT-PCR foram realizadas utilizando o termociclador
iCycler iQ
TM
(BioRad Co.). Para reação da quantificação de marcadores de
diferenciação óssea foi utilizado o kit RT² qPCR Master Mixes (SABiosciences),
43
conforme as recomendações do fabricante, bem como os oligonucleotideos
iniciadores (primers) para os genes de fosfatase alcalina (PPH01311-E-200,
SABiosciences), osteocalcina (PPH01898-A-200, SABiosciences), osteopontina
(PPH0582-E-200, SABiosciences) e β-actina (PPH00073-E-200, SABiosciences).
As condições de QT-PCR foram: 94 °C por 1 minuto, seguido de 40 ciclos
de 94 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, 72 °C por 30 segundos e 60
°C por 35 segundos. No estágio final, 95°C por 15 segundos, 60°C por 1 minuto e
95°C por 15 segundos para determinar a curva de dissociação do produto
amplificado.
Para a mensuração, o valor do ciclo limiar (Ct), foi determinado pelo
termociclador. Os valores de Ct dos genes de interesse, fosfatase alcalina,
osteocalcina e osteopontina foram normalizados para o gene
β
-actina. E os
resultados foram analisados usando o método limiar crítico comparativo, 2
-∆∆Ct
e
foram expressos em comparação com os valores obtidos para as células do grupo
controle.
4.8 Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das células da
medula óssea humana em cultura sobre superfícies de titânio:
A análise das culturas celulares em superfícies de titânio através de MEV
foi relizada em um microscópio eletrônico da marca Philips, modelo XL 30 no
Laboratório de Engenharia da PUCRS. As amostras foram fixadas com
glutaraldeído a 2,5% e após desidratadas em banho de acetona seriado de 30% a
100%. Através do processo de sputtering as amostram tiveram sua superfície
coberta por uma fina camada de ouro para permitir sua visualização no
microscópio.
44
RESULTADOS:
45
5. Resultados
5.1 Expressão das proteínas fosfatase alcalina, osteocalcina e osteopontina
através de PCR em tempo real:
Nos resultados obtidos para a expressão da proteína fosfatase alcalina
(ALP) observou-se que aos 14 dias de cultura os grupos OS e NT apresentaram
0,008 e 0,001 número de vezes maior em relação ao controle. O grupo BL não
expressou ALP neste período. Aos 21 dias de cultura pode-se observar que houve
um aumento da expressão da ALP nos três tipos de superfície de titânio. O grupo
que apresentou os melhores resultados foi o BL com 1,46 número de vezes maior
em relação ao controle, seguido do OS e do NT com 0,42 e 0,026 número de
vezes maior do que controle respectivamente (Gráfico 1 e Tabela 1).
Gráfico 1: Expressão da Fosfatase Alcalina (ALP) nos períodos de 14 e 21
dias de cultura sobre superfícies de titânio. OS= 0,008(14 dias) e 0,42 (21
dias); NT= 0,001 (14 dias) e 0,026 (21 dias); BL= 0(14 dias) e 1,46 (21 dias).
46
Tabela 1: Expressão da Fosfatase Alcalina nos períodos de 14 e 21 dias de
cultura sobre superfícies de titânio.
Dias de Cultura
Grupo 14 21
OS 0,008 0,42
NT 0,001 0,026
BL 0 1,46
Nos resultados obtidos para a expressão da Osteocalcina (BGLAP) o único
grupo que expressou a proteína foi o NT com 0,108 número de vezes maior do
que o controle aos 14 dias de cultura. Aos 21 dias de cultura nenhuma das
superfícies permitiu a expressão de BGLAP.
Gráfico 2: Expressão da Osteocalcina (BGLAP) nos períodos de 14 e 21 dias
de cultura sobre superfícies de titânio. OS= 0(14 dias e 21 dias); NT= 0,108 (14
dias) e 0 (21 dias); BL= 0(14 dias e 21 dias).
47
Tabela 2: Expressão da Osteoclacina nos períodos de 14 e 21 dias de cultura
sobre superfícies de titânio.
Dias de Cultura
Grupo 14 21
OS 0 0
NT 0,108 0
BL 0 0
5.2 Avaliação de adesão e morfologia celular por MEV:
Pode-se observar na superfície dos implantes Bonelike a presença de
células da medula óssea humana aos 14 e aos 21 dias de cultura em um número
pequeno em relação aos outros grupos. Não foi possível visualizar uma
diferenciação na morfologia celular nos períodos observados.
Figura 5: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Bonelike aos 14 dias de cultura. Seta indica célula aderida à superfície.
48
Figura 6: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Bonelike em 21 dias de cultura. Seta indica célula aderida à superfície.
Nos resultados para o grupo OS, foi possível observar a presença de
células aos 14 e aos 21 dias de cultura. Nos dois períodos de observação, pode-
se perceber uma mudança na morfologia celular adquirindo características de
osteblastos e aderindo-se na superfície de titânio.
Figura 7: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Osseotite em 14 dias de cultura. Seta indica célula aderida á superfície.
49
Figura 8: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Osseotite em 21 dias de cultura. Seta indica célula aderida á superfície.
Em relação ao grupo NT pode-se perceber nas fotografias de MEV de 14 e
21 dias de cultura que há presença células. Não é possível perceber mudanças na
morfologia celular.
Figura 9: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Nanotite em 14 dias de cultura. Seta indica célula aderida á superfície.
50
Figura 10: Fotomicrografia eletrônica de varredura da superfície do implante
Nanotite em 21 dias de cultura. Seta indica célula aderida á superfície.
51
DISCUSSÃO:
52
6. Discussão
A compreensão do metabolismo e fisiologia óssea vem sendo pesquisado
há décadas, no entanto há muito ainda a ser esclarecido.
Vários autores definiram os princípios básicos para as pesquisas com
tecido ósseo e hoje as culturas de células ósseas é uma realidade em vários
centros com diversos objetivos. (1,13,18,19)
A organização celular do tecido ósseo é de importante compreensão na
área da Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial, pois participa da consolidação
de fraturas da reconstrução de defeitos ósseos e também da osseointegração dos
implantes dentários. (9, 56, 64)
A evolução da aplicação dos implantes dentários nas reabilitações
odontológicas tem apresentado resultados excelentes e a evolução destes
materiais tem contado com um avanço tecnológico impressionante, tanto para o
desenvolvimento de novas tecnologias como para as pesquisas básicas. (46,47)
A interação da superfície de titânio dos implantes dentários com o tecido
ósseo durante o processo de osseointegração é uma das linhas de pesquisa mais
atuais. A previsibilidade da osseointegração hoje leva ao desenvolvimento de
novas superfícies que permitam um menor período de cicatrização implantar
seguro e efetivo. (50,52)
A utilização de CMI da medula óssea humana já é uma realidade e sua
manipulação é simples e pode ser aplicada em várias pesquisas e na clínica
diária, ajudando muito na compreensão da fisiologia do tecido ósseo e no
desenvolvimento de biomateriais. (24,28,54)
53
Neste estudo, buscou-se analisar diferentes tipos de superfícies de
implantes caracterizadas por tratamentos semelhantes, contudo diferem quanto à
presença ou não de nanopartículas de fosfato de cálcio. Como a literatura
internacional vem demonstrando, este parece ser um ponto importante e
controverso quanto a real influência destas partículas na capacidade de
diferenciação celular e na osseointegração. (52,59,63)
Os diferentes resultados obtidos nesse estudo com relação aos diferentes
tipos de superfície como o caso das Bonelike, Osseotite e Nanotite estão de
acordo com o observado por Masaki et al (2005) que detectou padrões variáveis
de expressão das proteínas osteopontina, osteocalcina e fosfatase alcalina variam
de acordo com a rugosidade e tratamento da superfície de titânio. (54)
No trabalho de Ong et al (1997) a expressão da fosfatase alcalina foi maior
e da osteocalcina mais rápida nos discos de titânio rugoso do que nos discos de
superfície polida. Os pesquisadores utilizaram BMP2 como estimulador da
diferenciação celular e provavelmente por isso a expressão gênica de tais
proteínas pode ser detectada. É importante salientar que esses autores também
não detectaram a expressão de osteopontina, como ocorreu no presente estudo.
(48)
Neste estudo optou-se por não utilizar fatores de diferenciação que
pudessem interferir na diferenciação celular. Desta forma, somente a variável
superfície dos implantes de titânio e seu efeito na diferenciação, adesão e
proliferação celular foi investigada.
Ao se verificar que houve expressão de ALP nos três grupos e sendo eles
todos de superfície rugosa embora com diferenças quanto a presença de
nanopartículas de fosfato de cálcio percebe-se que os padrão de rugosidade da
superfície do grupo BL parece interferir positivamente para maior expressão da
mesma. Devido ao fato de que o grupo NT apresentou os piores resultados para
54
síntese de ALP, pode-se sugerir que a presença de fosfato de cálcio retarda ou
inibe a síntese dessa proteína.
Alguns autores sugerem que a rugosidade da superfície de implantes
retarda a manifestação de ALP e a superfície tratada (rugosa) torna mais rápida a
manifestação de BGLAP. (48)
Nos resultados desta pesquisa o Grupo NT apresentou síntese de
osteocalcina em 14 dias de cultura enquanto os outros grupos não. Pode-se
avaliar que no caso da síntese da osteocalcina, as partículas de fosfato de cálcio
provavelmente tenham sido responsáveis por esta diferença, uma vez que
estavam presentes somente neste grupo.
A rugosidade das superfícies de biomateriais em culturas celulares pode
promover um atraso na manifestação genética - incluindo a fosfatase alcalina - e
na sua proliferação. Contudo, não há bloqueio da atividade celular. (65)
Nos achados do presente trabalho também se observou que a ALP
apresentou um padrão crescente em todos os grupos sendo menor (ou de
manifestação mais lenta) no grupo NT, média no OS e maior no BL. Sendo assim,
provavelmente o fato de haver uma síntese menor de ALP não significa que houve
bloqueio da atividade celular. É importante compreender que no meio de cultura
celular deste estudo, não havia meios indutores como fatores de crescimento os
BMPs. Assim, a atividade celular dependia exclusivamente da sua relação com a
superfície de titânio.
O tratamento de superfícies de tinânio é importante para a manifestação do
fenótipo osteogênico, contudo os resultados de alguns estudos são melhores em
relação à síntese protéica pela presença de BMP4 no meio. (58)
55
Este fator foi evitado na pesquisa atual para permitir apenas a interferência
da rugosidade da superfície e da presença ou não de nanopartículas de fosfato de
cálcio. Desta forma, mesmo com resultados menores do que a literatura pode-se
observar que realmente as células da medula óssea humana parecem
comprometer-se com o fenótipo osteogênico sem a necessidade de indução por
outros fatores além da superfície de titânio.
Em estudos com arcabouços para cultura celular com e sem nanopartículas
de fosfato de cálcio observou-se estas interferem positivamente na maior síntese
de ALP e BGLAP. (63)
Novamente observa-se que a osteopontina não se manifestou como nesta
pesquisa. Outro ponto no qual se concorda com a literatura é que a BGLAP
provavelmente é mais sintetizada quando na presença de fosfato de cálcio.
Resultados semelhantes foram observados quando superfícies de titânio com
tratamento por jateamento de sílica e ataque ácido com ou sem cristais de
hidroxiapatita foram comparados. (57)
Provavelmente não se observou a expressão de osteopontina pelo fato de
que a indução celular é discreta em meios de cultura sem a presença de BMPs.
Contudo, a presença de fosfato de cálcio induziu a síntese de BGLAP e isto
provavelmente demonstra um maior potencial indutor deste tipo de superfície.
Desta forma, pode-se afirmar que os resultados obtidos estão de acordo
com o esperado pela literatura e que mesmo havendo um padrão um pouco
diferente em relação à fosfatase alcalina onde o grupo nanotite foi menor, embora
não tenha deixado de sintetizá-la. Na presença de fosfato de cálcio é quando a
síntese de osteocalcina atinge melhores resultados e por isso, provavelmente na
sua presença, mesmo tendo retardada sua síntese de fosfatase alcalina a
diferenciação celular parece ser mais efetiva.
56
A osteocalcina é uma proteína expressa em estágios mais tardios de
osteogênese e, portanto, sua presença no grupo nanotite manifesta a presença de
células num estágio mais avançado de diferenciação. Assim como em outros
estudos, não foi manifestada a síntese de osteopontina. (66,67,68)
Embora para alguns autores a superfície NanoTite™ aumente as
propriedades de osseointegração e cicatrização periimplantar. (10,59) Existem
outros autores afirmam que não houve diferença na área de contato ósseo entre
os implantes NanoTite™ e Osseotite™ em estudos com humanos e animais.
(61,62).
Pelo fato da proliferação celular ser maior na superfície do grupo NT e pela
morfologia celular estar mais diferenciada no grupo OS, pode-se sugerir que os
resultados esperados para as respostas de tratamentos clínicos destes implantes
em tecido ósseo sejam muito bons e permitam uma osseointegração mais rápida e
efetiva. No entanto, provavelmente a presença de nanopartículas sugere melhores
resultados de acordo com o que foi apresentado neste estudo.
É claro que os resultados clínicos destes tipos de implantes também irão
variar de acordo com a técnica cirúrgica, condições do paciente e principalmente a
qualidade do tecido ósseo como afirmam alguns autores. (62)
Sendo assim o presente estudo contribui no avanço e pesquisa de novas
tecnologias para melhorar o padrão de osseointegração dos implantes dentários e
também tem consciência de que os resultados deste tipo de pesquisa devem ser
somados a outros que se seguem. Assim, poderemos compreender claramente o
comportamento celular frente às novas modificações em superfícies de implantes
osteointegraveis.
57
CONCLUSÃO:
58
7 Conclusão
O estudo in vitro da diferenciação osteogênica de cultura de células
derivadas da medula óssea sobre diferentes superfícies de titânio possibilitou
concluir que:
• As células da medula óssea aderem-se as superfícies pesquisadas;
• As células da medula óssea proliferam nas diferentes superfícies
pesquisadas;
• A síntese de fosfatase alcalina é maior na superfície Bonelike;
• A presença de nanopartículas de fosfato de cálcio na estrutura dos
implantes induz a síntese de Osteocalcina;
59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. MOHAN, S.; BAYLINK, D. J. Bone growth factors. Clinical Orthopaedics and
Related Research. 1991; 263: 30-48.
2. MARX RE, CARLSON ER, EICHSTAEDT RM, SCHIMMELE SR, STRAUSS
JE, GEORGEFF KR. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone
grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1998; 85(6):638-46.
3. ANITUA E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the
preparation of future sites for implants. Int J Oral Maxillofac Implants.
1999;14(4): 529-35.
4. MUSCHLER, G. F.; MIDURA, R. J. Connective tissue progenitors: practical
concepts for clinical applications. Clinical Orthopaedics and Related Research.
2002; 395: 66-80.
5. LORO. Estudo in vitro da osteoindução de células da medula óssea humana.
Dissertação de Mestrado. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul,
137p, Porto Alegre, 2002.
6. GOMI, K. et al. Bone marrow genesis after subcutaneous delivery of rat
osteogenic cell-seeded biodegradable scaffolds into nude mice. Journal of
Biomedical Material Research. n. 21. Oct. 2004.
7. GUAN, L., DAVIES, J. E., Preparation and characterization of a highly
macroporous biodegradable composite tissue engineering scaffold. Journal of
Biomedical Material Research. n. 11. Oct. 2004.
8. DATTA, N. N., et al. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on
the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 2005; 26(9):
971-77.
9. DAVIES,J.E. Bone Engineering Workshop. 2000: Toronto, Canada
10. MENDES VC, DAVIES JE Discrete Calcium Phosphate Nanocrystals Render
Titanium Surfaces Bone Bonding Int J Oral Maxillofac Implant. 2007;22:484
11. ORSINI G, PIATTELLI M, SCARANO A, PETRONE G, PIATTELLI A, CAPUTI
S Randomized, controlled histologic and histomorphometric evaluation of
61
implants with nanometer-scale calcium phosphate added to the dual acid-
etched surface in the human posterior maxilla. J Periodontal 2007; 78:209-218
12. GOENÉ RJ, TESTORI T, TRISI P. Influence Of A Nanometer-Scale Surface
Enhancement On De Novo Bone Formation On Titanium Implants: A
Histomorphometric Study In Human Maxillae. Int J Periodontics Restorative
Dent. 2007; 27:211–219
13. URIST, M. R.; DELANGE, R. J.; FINERMAN, G. A. M. Bone cell differentiation
and growth factors. Science 1983; 220(4598): 680-86.
14. GRAY, Colin; BOYDE, Alan; JONES, Sheila. The isolation, culture, and
function assay of osteoclasts and osteoblasts. In: CELIS, Julio E. (Org.). Cell
biology: a laboratory handbook 1994; 142-148.
15. MURAGLIA, A.; CANCEDDA, R.; QUARTO, R. Clonal mesenchymal
progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a
hierarchical model. Journal of Cell Science 2000; 113(7): 1161-66.
16. FRITSCHER GN. Cultivo de células da medulla óssea humana sobre
membranas de colágeno bovino e arcabouços de ácido poliglicóico polilático
(PLGA). Dissertação de Mestrado. Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul, 118p, Porto Alegre, 2007.
17. RAMOSHEBI, L. N., et al. Tissue engineering: TGF-b superfamily members
and delivery systems in bone regeneration. Experimental Reviews in Molecular
Medicine. 2002 ,Disponível em : <http://www.expertreviews.org/02004969h.htm>.
Acesso em: 6 out. 2002.
18. CAPLAN, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research.
1991; 9(5): 641-50.
19. REDDI, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to
isolation of first mammalian morphogens. Cytokine & Growth Factor Reviews.
1997; 8(1):11-20.
20. SILVA T. Efeito da rugosidade de superfície de discos de titânio sobre a
proliferação e diferenciação de células de medula óssea humana. Dissertação de
Mestrado. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, 112p, Porto
Alegre, 2004.
21. SILVA JR. Análise in vitro da proliferação e diferenciação de células da medula
óssea humana cultivadas sobre discos de titânio e submetidas à irradiação com
laser não-cirúrgico. Tese de Doutorado. Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul, 128p, Porto Alegre, 2003.
62
22. PITTENGER M F, MACKAY A M, BECK S C, JAISWAL R K, DOUGLAS R,
MOSCA J D et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.
Science. 2008; 284(5411): 143-47.
23. KREBSBACH, P. H., et al. Bone marrow stromal cells: characterization and
clinical application. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine. 1999;
10(2):165-81.
24. PETITE, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nature
Biotechnology. 2000; 18(9): 959-63.
25. AUBIN, J. E. Advances in the osteoblast lineage. Biochemistry and Cell
Biology. 1998; 76(6): 899-910.
26. TURGEMAN, G., et al. Engineered human mesenchymal stem cells: a novel
platform for skeletal cell mediated gene therapy. The Journal of Gene Medicine.
2001; 3(3): 240-51.
27. LONG, M. W. Osteogenesis and bone-marrow-derived cells. Blood Cells,
Molecules & Diseases. 2001; 27(3): 677-90.
28. THALMEIER, K., et al. Mesenchymal differentiation and organ distribution of
established human stromal cell lines in NOD/SCID mice. Acta Haematologica.
2001; 105(3): 159-65.
29. AUBIN, J. E. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal
populations: role for heterotypic cell-cell interactions in osteoblast differentiation.
Journal of Cellular Biochemistry. 1999; 72(3): 396-410.
30. LURIA, E. A. et al. Bone formation in organ cultres of bone marrow. Cell and
Tissue Research. 1987; 248(2): 449-54.
31. PULEO, D. A. Dependence of mesenchymal cell responses on duration of
exposure to bone morphogenetic protein-2 in vitro. Journal of Cellular
Physiology. 1997; 173(1): 93-101.
32. MALAVAL, L., et al. Kinetics of osteoprogenitor proliferation and osteoblast
differentiation in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 1999; 74(4) : 616-27.
33. NAGAI, N., et al. Age effects on ectopic bone formation induced by purified
bone morphogenetic protein. International Journal of Oral and Maxillofacial
Surgery. 1999; 28(2): 143-50.
34. KATAGIRI, T.; TAKAHASHI, N. Regulatory mechanisms of osteoblast and
osteoclast differentiation. Oral Diseases. 2002; 8(3): 147-59.
63
35. ANSELME, K. Osteoblast adhesion on biomaterials. Biomaterials. 2000;
21(7):667-81.
36. MURATA, M., et al. Carrier-dependency of cellular differentiation induced by
bone morphogenetic protein in ectopic sites. International Journal of Oral and
Maxillofacial Surgery, 1998; 27(5): 391-96.
37. AUBIN, J. E. Bone stem cells. Journal of Cellular Biochemistry.
Supplement. 1998; 30; 73-82.
38. YAMAMOTO, N.; FURUYA, K.; HANADA, K. Progressive development of the
osteoblast phenotype during differentiation of osteoprogenitor cells derived from
fetal rat calvaria: model for in vitro bone formation. Biological & Pharmaceutical
Bulletin. 2002; 25(4): 509-15.
39. EINHORN, T. A. Enhancement of fracture-healing. The Journal of Bone and
Joint Surgery American Volume.1995; 77(6): 940-56.
40. CHEN, D., et al. Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) enhances BMP-3,
BMP-4, and bone cell differentiation marker gene expression during the induction
of mineralized bone matrix formation in cultures of fetal rat calvarial osteoblasts.
Calcified Tissue International. 1997; 60(3): 283-90.
41. YOON, S. T.; BODEN, S. D. Osteoinductive molecules in orthopaedics: basic
science and preclinical studies. Clinical Orthopaedics and Related Research,
2002; 395:33-43
42. OKUBO, Y., et al. Osteoinduction by recombinant human bone morphogenetic
protein-2 at intramuscular, intermuscular, subcutaneous and intrafatty sites.
International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery,2000; 29(1):62-6.
43. GERICKE A, QIN C, SPEVAK L, FUJIMOTO Y, BUTLER W T, SORENSEN E
S et al. Importance of phosphorylation for osteopontin regulation of
biOMineralization. Calcif Tissue Int.2005;77(1), 45-54.
44. BECK G R JR, ZERLER B, MORAN E. Phosphate is a specific signal for
induction of osteopontin gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(15):
8352-7
45. AKSU A E, Rubin P, Dudas J R, Marra K G. Role of gender and anatomical
region on induction of osteogenic differentiation of human adipose-derived stem
cells. Ann Plast Surg. 2008;60(3):306-22.
46. BRUNETTE DM. The effect of surface topography on cell migration and
adhesion. In: Ratner BD ed. Surface Characterization of Biomaterials. Amsterdam,
Netherlands: Elsevier Science Publishers: 1988; 203-17.
64
47. CHEROUDI B, MCDONNEL D, BRUNETTE DM. The effects of micromachined
surfaces on formation of bonelike tissue on subcutaneous implants as assessed by
radiography and computer image processing. J Biomed Mater Res. 1997; 34(3):
279-90.
48. ONG JL, CARNES DL, CARDENAS HL, CAVIN R. Surface roughness of
titanium on bone morphogenetic protein-2 treated osteoblast cells in vitro. Implant
Dent. 1997;6(1):19-24.
49. BOYAN BD, BATZER R, KIESWETTER K, et al. Titanium surface roughness
alters responsiveness of MG63 osteoblast-like cells to 1α, 25- (OH)2D3. J Biomed
Mater Res. 1998; 39(1): 77-85.
50. BOYAN BD, SCHWARTZ Z. Modulation of osteogenesis via implant surface
design. 2000, Apud: Davies,J.E. Bone Engineering Workshop, 2000: Toronto,
Canada
51. RATNER B. New in biomaterials science: a path to engineered biomaterials. J
Biomed Mater Res. 1993; 27: 837-50.
52. WIELAND M, HÄNGGI P, HOTZ W, TEXTOR M, KELLER BA, SPENCER ND.
Wavelength-dependent measurement and evaluation of surface topographies:
Aplication of a new concept of window roughness and surface transfer function.
Wear. 2000; 237(2): 231-52.
53. HAYAKAWA T, YOSHINARI M, NEMOTO K, WOLKE JG, JANSEN JA. Effect
of surface roughness and calcium phosphate coating on the implant/bone
response.Clin Oral Implants Res. 2000;11(4):296-304
54. MASAKI C, SCHNEIDER GB, ZAHARIAS R, SEABOLD D, STANFORD C.
Effects of implant surface microtopography on osteoblast gene expression. Clin
Oral Implants Res. 2005;16(6):650-6
55. SAADEH et al. Repair of a critical size defect in the rat mandible using
allogenic type I collagen. Craniofacial Surgery, 2001;12(6): 573-9.
56. BELTRÃO GC, DE ABREU AT, BELTRÃO RG, FINCO NF. Lateral
cephalometric radiograph for the planning of maxillary implant reconstruction.
Dentomaxillofac Radiol. 2007;36(1):45-50
57. WANG CY, ZHAO BH, AI HJ, WANG YW. Comparison of biological
characteristics of mesenchymal stem cells grown on two different titanium implant
surfaces. Biomed Mater. 2008;3(1):150-04.
58. SILVA TS, MACHADO DC, VIEZZER C, SILVA JÚNIOR AN, DE OLIVEIRA
MG Effect of titanium surface roughness on human bone marrow cell proliferation
and differentiation: an experimental study. Acta Cir Bras. 2009;24(3):200-5.
65
59. TELLEMAN G, ALBREKTSSON T, HOFFMAN M, JOHANSSON CB, VISSINK
A, MEIJER HJ, RAGHOEBAR GM. Peri-Implant Endosseous Healing Properties of
Dual Acid-Etched Mini-Implants with a Nanometer-Sized Deposition of CaP: A
Histological and Histomorphometric Human Study. Clin Implant Dent Relat Res.
2009;(23).
60. SCHLIEPHAKE H, AREF A, SCHARNWEBER D, RÖSLER S, SEWING A.
Effect of modifications of dual acid-etched implant surfaces on periimplant bone
formation. Part II: calcium phosphate coatings. Clin Oral Implants Res.
2009;20(1):38-44.
61. SCHWARZ ML, KOWARSCH M, ROSE S, BECKER K, LENZ T, JANI L. Effect
of surface roughness, porosity, and a resorbable calcium phosphate coating on
osseointegration of titanium in a minipig model. J Biomed Mater Res A.
2009;89(3):667-78.
62. VIGNOLETTI F, JOHANSSON C, ALBREKTSSON T, DE SANCTIS M, SAN
ROMAN F, SANZ M. Early healing of implants placed into fresh extraction sockets:
an experimental study in the beagle dog. De novo bone formation. J Clin
Periodontol. 2009;36(3):265-77.
63. YANG X, YANG F, WALBOOMERS XF, BIAN Z, FAN M, JANSEN JA.. The
performance of dental pulp stem cells on nanofibrous PCL/gelatin/nHA scaffolds. J
Biomed Mater Res A. 2009 (25).
65. SADER MS, BALDUINO A, SOARES GDE A, BOROJEVIC R. Effect of three
distinct treatments of titanium surface on osteoblast attachment, proliferation, and
differentiation. Clin Oral Implants Res. 2005 Dec;16(6):667-75
66. FANBURG, J. C., et al. Osteocalcin and osteonectin immunoreactivity in the
diagnosis of osteosarcoma. American Journal of Clinical Pathology,
1997;108(4): 464-73.
67. DERKX, P., et al. Immunolocalization and quantification of noncollagenous
bone matrix proteins in methylmethacrylate-embedded adult human bone in
combination with histomorphometry. Bone,1998; 22(4): 367-73.
68. MEYER, U., et al. Decreased expression of osteocalcin and osteonectin in
relation to high strains and decreased mineralization in mandibular distraction
osteogenesis. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery, 1999; 27(4): 222-7
66
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