( PDF ) Atividade antiplasmódica e citotoxicidade de Esenbeckia febrifuga (A.St-hil.) Juss. ex Mart. (Rutaceae) e de espécies do gênero aspidosperma (Aapocynaceae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FACULDADE DE FARMÁCIA

Maria Fâni Dolabela

ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA E CITOTOXICIDADE DE Esenbeckia febrifuga

(A.St-Hil.) Juss. ex Mart. (RUTACEAE) E DE ESPÉCIES DO GÊNERO Aspidosperma

(APOCYNACEAE).

Belo Horizonte

2007

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Maria Fâni Dolabela

ATIVIDADE ANTIPLASMÓDICA E CITOTOXICIDADE DE Esenbeckia febrifuga (A.St-Hil.)

Juss. ex Mart. (RUTACEAE) E DE ESPÉCIES DO GÊNERO Aspidosperma (APOCYNACEAE).

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências

Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Alaíde Braga de Oliveira,

Faculdade de Farmácia, UFMG, Belo Horizonte.

Co-Orientadora: Dra. Marinete Marins Póvoa, Instituto

Evandro Chagas, Ananindeua.

Belo Horizonte

2007

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Dolabela, Maria Fâni.

D659a

Atividade antiplasmódica e citotoxicidade de Esenbeckia

febrífuga (A.St-Hil.) Juss. Ex Mart. (Rutaceae) e de espécies do

gênero Aspidosperma (Apocynaceae) / Maria Fani Dolabela. – 2008.

179 f. : il.

Orientadora: Profa. Dra. Alaíde Braga de Oliveira, Faculdade de

Farmácia, UFMG, Belo Horizonte

Co-Orientadora: Dra. Marinete Marins Póvoa, Instituto Evandro

Chagas, Ananindeua

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais,

Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas.

1. Alcalóides – Teses. 2. Aspidosperma – Teses. 3. Esenbeckia

febrifuga – Teses. 4. Atividade antiplasmódica – Teses. 5.

Citotoxicidade – Teses. 6. Índice de seletividade – Teses. I. Título.

II. Oliveira, Alaíde Braga de. III. Póvoa, Marinete Marins. IV.

Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia.

CDD:615.321

COLABORADORES

1- FITOQUÍMICA

Prof. Dr. Fernão Castro Braga, Faculdade de Farmácia, UFMG

Profa. Dra. Rose L. P. Jácome, Faculdade de Farmácia, UFMG

2- CULTIVO DE Plasmodium falciparum

Ms. Salma de Oliveira Gomes, Departamento de Parasitologia, IEC

3- COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL

Prof. Dr. Júlio A. Lombardi, UNESP, Rio Claro, SP.

A parte de fitoquímica foi realizada no Laboratório de Fitoquímica da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. O cultivo do P.

falciparum e a atividade antiplasmódica foram realizados no Laboratório de Malária da

Seção de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas, em Ananindeua, PA.

Este trabalho faz parte de projetos coordenados pela Profa. Dra. Alaíde Braga de Oliveira e

financiado pelos: 1- Edital Universal CNPq n

. 019/2004 Processo n

.474642/2004-6; 2-

CNPq- DPT- CGSAU Doenças negligenciadas; 3- Projeto apresentado ao CNPq no âmbito

do Edital MCT/CNPq no. 14/2006 Programa Sul-Americano de Apoio às Atividades de

Cooperação em Ciência e Tecnologia – PROSUL

A minha alma espera somente em Deus; Dele vem a minha salvação. Só Ele é a minha rocha e a

minha salvação; é a minha defesa, não serei grandemente abalado.

Salmo 52: 1-2.

DEDICATÓRIAS

Dedico este trabalho a Deus, a minha filha e ao meu marido.

- Deus:

“ Eu exaltarei, ó Deus, rei meu, e bendirei o teu nome pelos séculos dos séculos.

Cada dia te bendirei, e louvarei o teu nome pelos séculos dos séculos.

Grande é o Senhor, e muito digno de louvor, e a sua grandeza inescrutável.”

Salmos 145: 1-3.

- Minha filha- Luíza Dolabela Barneche :

“ Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como

um metal que soa ou como um sino que tine.

E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência, e

ainda que tivesse toda a fé de tal maneira que transportasse os montes, e não tivesse amor,

nada seria.” I Aos Coríntios 13: 1-2

Meu marido- Varli Luiz Barneche:

”Quando encontrar alguém e esse alguém fizer

seu coração parar de funcionar por alguns segundos,

preste atenção: pode ser a pessoa

mais importante da sua vida.

Se os olhares se cruzarem e, neste momento,

houver o mesmo brilho intenso entre eles,

fique alerta: pode ser a pessoa que você está

esperando desde o dia em que nasceu.

Se o toque dos lábios for intenso, se o beijo

for apaixonante, e os olhos se encherem

d'água neste momento, perceba:

existe algo mágico entre vocês.

Se o 1º e o último pensamento do seu dia

for essa pessoa, se a vontade de ficar

juntos chegar a apertar o coração, agradeça:

Algo do céu te mandou

um presente divino : O AMOR.

Carlos Drumond de Andrade”

AGRADECIMENTOS

A Profa. Alaíde Braga de Oliveira pela orientação desta tese, onde sua boa

disposição e colaboração foram fatores de estímulos para realização da parte experimental e

escrita deste trabalho.

A Dra. Marinete M. Povoa, pela valiosa contribuição e por ter possibilitado a

realização da parte experimental dos ensaios antiplasmódicos, através do fornecimento de

laboratório e técnicos muito qualificados.

A Dra. Luzia Helena de Carvalho pelas valiosas contribuições para a realização da

parte experimental deste trabalho.

A Profa. Rose L.P.Jácome, Prof. Fernão C. Braga, Ms. Salma G.Oliveira, José

Maria N. Souza e José Mario V. Peres pelos valiosos ensinamentos e colaborações para

realização da parte experimental.

Aos amigos do Instituto Evandro Chagas- Eduardo Mota, Joyce Favacho e Luiz

Dikson e da Faculdade de Farmácia- UFMG pela boa convivência durante a realização

deste trabalho.

Aos Coordenadores dos Cursos de Farmácia e Enfermagem do Centro Universitário

do Pará (CESUPA) que sempre contribuíram me liberando ou remanejando minhas

atividades acadêmicas para poder executar as atividades relacionadas a tese.

Aos colegas do CESUPA, Profa. Mônica Moraes , Profa. Lourdes Garcez e Prof.

Davi J. Oliveira pela valiosa amizade, carinho e força nos momentos difíceis desta jornada.

RESUMO

Na busca de antimaláricos 6 espécies do gênero Aspidosperma (Apocynaceae) foram objeto

de estudo: A. cylindrocarpon, A. olivaceum, A. parvifolium, A. ramiflorum, A. spruceanum

e A. tomentosum, além de Esenbeckia febrifuga (Rutaceae). Estas espécies são utilizadas,

popularmente, para tratamentos de malária e febres, no Brasil e outros países da América

do Sul. Os extratos em solventes orgânicos de diferentes partes destas espécies foram

submetidos a prospecção por cromatografia em camada delgada de sílica gel (CCDS) e

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a ensaios in vitro com os clones W2 e 3d7

do Plasmodium falciparum e a avaliação da citotoxicidade em culturas de células VERO. A

prospecção por CCDS mostrou a presença de alcalóides em todas as espécies de

Aspidosperma analisadas e os perfis dos diferentes extratos foram obtidos por CLAE- FR.

Todos os extratos apresentaram atividade antiplasmódica, sendo determinadas as CI

entre

0,98 a 65,0 µg⁄mL. O extrato etanólico de cascas [ETOH-P (Cs)] de A. parvifolium foi

submetido à extração ácido-base sendo separadas as frações correspondentes a substâncias

neutras (APN) e básicas⁄alcalóides totais (APT) que se mostraram mais ativas que o extrato

etanólico original. Uleína foi isolada a partir do APT e apresentou CI

0,75 + 0,10 e 11,90

+ 0,10 µg⁄mL frente aos clonses W2 e 3d7, respectivamente. A citotoxicidade (CC50) de

ETOH-P (Cs), APT, APN e uleína, em culturas de células VERO, foi baixa para ETOH-P

(Cs) de A. parvifolium e citotoxicidade moderada para as frações e uleína (100 < CC

500 µg⁄mL) e os índices de seletividade (IS= CC

⁄CI

) foram: A citotoxicidade (CC

) e

os índices de seletividades (IS= CC

⁄CI

) para a atividade antiplasmódica foram: ETOH-P

(Cs): CC

>500µg⁄mL, IS (W2) >15,27 e IS (3d7) >24,38; APT-1: CC

299,7 µg⁄mL, IS

(W2)= >305,82 e IS (3d7)=39,28; APN-1; CC

= 449,3µg⁄mL, IS (W2)= 29,91 e IS (3d7)=

25,31 e uleína: CC

= 374,6 µg⁄mL, IS (W2)= 500,0 e IS (3d7)= 31,47. O extrato etanólico

de caules [ETOH-P (Ca)] de E. febrifuga forneceu 8 substâncias: 2 cumarinas (bergapteno e

isopimpinelina), 4 quinolonas (skimmiamina, kokusaginina, γ-fagarina e flindersiamina), 1

liminoide (rutaevina) e 1 acridona (1-hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona). Nos ensaios de

atividade antiplasmódica in vitro, ETOH-P (Ca) mostrou-se moderadamente ativo (CI

15,5 + 0,75 µg⁄mL, W2; 21,0 + 1,41 µg⁄mL, 3d7) e apresentou baixa citotoxicidade para

células VERO (CC

>500µg⁄mL

)

. Das substâncias avaliadas a mais ativa foi a

skimmiamina (CI

= 19,5 + 0,71 µg⁄mL, W2; 43,0 + 1,41 µg⁄mL, 3d7). Estes são os

primeiros relatos sobre química de E. febrifuga, atividade antiplasmódica in vitro do extrato

etanólico de caules e substâncias isoladas. São também, inéditos os resultados relatados

sobre atividade antiplasmódica e citotoxicidade de diversos extratos orgânicos das 6

espécies de Aspidosperma avaliadas, bem como das frações resultantes do fracionamento

de A. parvifolium.

Palavras-chave: 1- Alcalóides, 2-Aspidosperma; 3- Esenbeckia febrifuga; 4- Atividade

antiplasmódica; 5- Citotoxicidade; 6-Índice de seletividade

ABSTRACT

Aiming to discover new antimalarial agents, extracts from six plant species belonging to the

genus Aspidosperma (Apocynaceae), A. cylindrocarpon, A. olivaceum, A. parvifolium, A.

ramiflorum, and A. tomentosum, besides Esenbeckia febrifuga (Rutaceae), were screened

for antiplasmodial activity and cytotoxicity. Some of these species are traditionally used to

treat malaria and or fever in Brazil and other Latinamerican countries. Extracts in organic

solvents of different parts of these plants have had their chromatographic profiles registered

by TLC and HPLC and were assayed in vitro against Plasmodium falciparum W2 and 3d7

clones as well on cultured VERO cells for cytotoxicity. Phytochemical prospection by TLC

has indicated the presence of alkaloids in all of the six species, as expected for plants

belonging to the genus Aspidosperma, and HPLC-RP profiles were registered in acidic

conditions as suggested for alkaloid analysis. All the extracts assayed have shown

antiplasmodial activity with IC

values ranging from 5.0 to 65.0 µg/mL. Acid-base

separation of the ethanol extract from A. parvifolium stem bark [EtOH-P(Cs)] has afforded

fractions of neutral (APN) and basic (total alkaloids, APT) compounds which, for the

Aspidosperma species, were more active as antiplasmodial than the crude EtOH extracts.

Uleine was isolated from APT by a combination of silica gel and Sephadex LH-20 open

column chromatography and has shown IC

of 0.75 ± 0.10 and 11.90 ± 0.10 µg/mL against

W2 and 3d7 clones of P. falciparum, respectively. Cytotoxicity (CC

) for EtOH-P(Cs),

APT, APN and uleine ranged from low to moderate (100<CC

>500 µg/mL). Selectivity

index (SI = CC

Vero cells/IC

P. falciparum) was more favourable (>300) for APT, APN

and uleine than for the crude EtOH extract (<25). From the ethanol extract of E. febrifuga

stems, 8 compounds were isolated: 2 coumarins (bergaptene and isopimpinelin), 4

quinolones (skimmiamine, kokusagenine, γ-fagarine and flindersiamine), 1 limonoid

(rutaevine) and 1 acridone (1-hydroxy-3-methoxy-N-methylacridone). Skimmiamine was

the most active of the alkaloids assayed (IC

= 19.5 ± 0.7 µg/mL, W2; 43.0 ± 1.4 µg/mL,

3d7). However it was less active than the crude extract (IC

= 15.5 ± 0.8 µg/mL, W2; 21.0

± 1.4 µg/mL, 3d7) indicating the presence of non isolated active compounds in the extract.

These are the first report on the chemical composition of E. febrifuga, the in vitro

antiplasmodial activity of its stems EtOH extract and of pure compounds isolated from this

Rutaceae plant species. The results on the antiplasmodial activity and cytotoxicity of the

extracts from the six species of Aspidosperma, as well of APN, APT and uleine from A.

parvifolium, are reported by the first time in this thesis.

Key words: 1- Alkaloids, 2-Aspidosperma; 3- Esenbeckia febrifuga; 4- Antiplasmódial

activity; 5- Citotoxicy; 6-Selectivity index

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

P. vivax Plasmodium vivax

P. falciparum Plasmodium falciparum

A. cylindrocarpon Aspidosperma cylindrocarpon

A. olivaceum Aspidosperma olivaceum

A. parvifolium Aspidosperma parvifolium

A. spruceanum Aspidosperma spruceanum

A. tomentosum Aspidosperma tomentosum

rpm Rotações por minuto

min Minuto

Concentração inibitória 50%

Concentração citotóxica 50%

IS Índice de seletividade

CIM Concentração inibitória mínima

RPMI Roswell Park Memorial Institute

MEM Meio Mínimo Essencial (Eagle-MEM)

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanolsulfônico

SFB Soro fetal bovino

MTT Sal de tetrazolio

APN1 Fração de neutros 1 de A. parvifolium

APA-1 Fração aquosa ácida 1 de A. parvifolium

API-1 Fração interface 1 de A. parvifolium

APAA Fração aquosa alcalina de A. parvifolium

APT-1 Fração de alcalóides totais 1 de A. parvifolium

APTC Fração de alcalóides totais cloroformica de A. parvifolium

APA-2 Fração aquosa ácida 2 de A. parvifolium

APT-2 Fração de alcalóides totais 2 de A. parvifolium

EFN Fração de neutros de E. febrífuga

EFA Fração aquosa ácida de E. febrífuga

EFAA Fração aquosa alcalina de E. febrífuga

EFT Fração de alcalóides totais de E. febrífuga

HCl Ácido Clorídrico

OH Hidróxido de amônio

Ácido sulfúrico

NaCl Cloreto de sódio

Dióxido de carbono

UV Ultra-violeta

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

Rh+ Fator Rh+

H Trítio

W2 Clone de P. falciparum resistente a cloroquina e sensível a mefloquina

3d7 Clone de P. falciparum sensível a cloroquina

Células VERO

RP-18

Células de rins de macaco verde

Fase reversa, C

SUMÁRIO

da página

Resumo

Abstract

Abreviaturas e símbolos

Índice de Figuras

Índice de Quadros

Índice de Tabelas

Estruturas químicas

1- INTRODUÇÃO 22

2-OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA

2.1- Objetivo Geral

2.2.- Objetivos específicos

2.3- Justificativa

3-REVISÃO DA LITERATURA

3.1- O gênero Aspidosperma: posição taxonômica, alcalóides, etnofarmacologia

e atividades biológicas

3.1.1- Posição taxonômica

3.1.2- Alcalóides indólicos

3.1.3- Etnofarmacologia

3.1.4- Revisão da literatura sobre as espécies de Aspidosperma avaliadas no

presente trabalho: descrição botânica, atividades biológicas e alcalóides

3.1.4.1- Aspidosperma parvifolium

3.1.4.2- Aspidosperma cylindrocarpon

3.1.4.3- Aspidosperma olivaceum

3.1.4.4- Aspidosperma ramiflorum

3.1.4.5- Aspidosperma spruceanum

3.1.4.6- Aspidosperma tomentosum

3.2- Esenbeckia febrífuga: posição taxonômica, fitoquímica, etnofarmacologia e

atividades biológicas

4- MATERIAL

4.1- Equipamentos

4.2 - Solventes e Reagentes

4.3- Reagentes para revelação e fases estacionárias para CCDS

4.4- Componentes do meio de cultura e de outras soluções utilizadas nos

cultivos

4.5- Material plástico

4.6- Soluções especiais utilizadas neste trabalho

4.6.1- Soluções Reveladoras para CCDS

4.6.1.1- Reagente de Dragendorff

4.6.1.2- Anisaldeído/ ácido sulfúrico

4.6.1.3- Reagente de Liberman- Buchard

4.6.1.4- Solução de hidróxido de potássio a 5%

4.6.1.5- Solução de cloreto de alumínio

4.6.1.6- NP/PEG

4.6.2- Solução utilizada como fase móvel em CLAE

4.6.2.1- Tampão fosfato (NaH

⁄ H

)

4.6.3- Soluções utilizadas durante o cultivo do P. falciparum

4.5.6.1- Meio de cultivo: Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial

Institute) e meio completo

4.6.3.2- Soluções utilizadas no descongelamento do parasito

4.6.3.3- Solução utilizada na sincronização do parasito

4.7- Coloração de gota espessa e esfregação

4.7.1- Solução estoque de Giemsa

4.7.2- Água tamponada

4.7.3- Azul de metileno

4.8- Material biológico

4.8.1- Clones de P. falciparum

4.8.2- Plasma humano

4.8.3- Hemácias humanas

4.9- Material Vegetal

5- MÉTODOS

5.1- Preparação dos extratos e caracterização fitoquímica

5.1.1- Obtenção dos extratos

5.1.2- Extração ácido-base

5.2- Estudos fitoquímicos

5.2.1- Prospecção fitoquímica por cromatografia em camada delgada de sílica

gel (CCDS)

5.2.2- Perfis por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

5.2.2.1- Preparo das amostras

5.2.2.2- Condições cromatográficas

5.2.2.2.1- Condição cromatográfica 1

5.2.2.2.2- Condição cromatográfica 2

5.2.2.2.3- Condição cromatográfica 3

5.2.2.2.4- Condição cromatográfica 4

5.2.2.3- Injeção das amostras

5.2.3- Análises em CLAE acoplado a detector com arranjos de diodos (DAD).

5.2.3.1- Condição cromatográfica

5.2.4- Fracionamento da fração de alcalóides totais (APT-1) obtida por

extração ácido-base do extrato etanólico de A. parvifolium

5.2.4.1- Por coluna cromatográfica

5.3-Avaliação da atividade antiplasmódica

5.3.1- Descongelamento dos clones de P. falciparum

5.3.2- Cultivo do P. falciparum

5.3.3- Coloração de gota espessa e esfregaço e determinação da parasitemia

5.3.4- Sincronização dos parasitos

5.3.5- Congelamento dos clones P. falciparum

5.3.6- Preparo das placas de 96 poços utilizadas nos ensaios

5.3.7- Microteste utilizando [ 8

H]-hipoxantina

5.3.8- Microteste tradicional

5.4- Avaliação da citotoxicidade (CC

)

5.4.1- Ensaio colorimétrico do MTT

5.4.2- Cálculo do índice de seletividade

5.5- Alguns parâmetros utilizados neste trabalho, para avaliar a atividade

antiplasmódica, citotoxicidade e índice de seletividade

6- RESULTADOS

6.1- Obtenção de extratos, caracterização fitoquímica, atividade antiplasmóduica

e citotoxicidade das espécies de Aspidosperma

6.1.1- Obtenção dos extratos

6.2- Análise e caracterização dos extratos

6. 2.1- Cromatografia em Camada Delgada de Sílica

6.2.2- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

63- Atividade antiplasmódica e citotoxicidade

6.4-Fracionamento do extrato etanólico da cascas de A. parvifolium

6.4.1- Descrição da obtenção do extrato etanólico das cascas, frações e

caracterização por cromatografia em camada delgada e cromatografia de alta

eficiência

6.4.2- Isolamento e identificação da uleína

6.4.3- Atividade antiplasmódica do extrato etanólico de cascas de A.

parvifolium, frações e APT 13-16 (8) (uleína) pelos métodos tradicional

(RIECKMAN et al., 1978 modificado por CARVALHO, 1990) e radioisotópico

(DESJARDINS et al., 1979)

6.4.4- Citotoxicidade em células VERO, pelo método do MTT (TWENTNAN e

LUSCOMBE, 1987) de extrato etanólico de cascas de A. parvifolium, frações e

APT 13-16 (8) (uleína) e índice de seletividade (IS)

6.5- Esenbeckia febrífuga: fracionamento do extrato etanólico de caules,

caracterização fitoquímica, atividade antiplasmódica, citotoxicidade e índices de

seletividade

6.5.1- Fracionamento do extrato etanólico de caules de E. febrifuga.

6.5.2- Caracterização fitoquímica: análises em cromatografia em camada

delgada de sílica gel e cromatografia líquida de alta eficiência do ETOH-P (Ca) de

E. febrifuga, frações e substâncias

6.5.3- Atividade antiplasmódica, citotoxicidade e índice de seletividade de

extrato etanólico de caules de E. febrifuga, frações e substâncias

104

108

109

110

112

114

7-DISCUSSÃO

7.1- Comparação dos resultados obtidos para atividade antiplasmódica da

cloroquina e mefloquina com os dados da literatura

7.2- Relação entre os dados da literatura e os resultados obtidos para

7.2.1- Aspidosperma cylindrocarpon

7.2.2- Aspidosperma olivaceum

7.2.3- Aspidosperma ramiflorum

7.2.4- Aspidosperma spruceanum

7.2.5- Aspidosperma tomentosum.

7.3- A. parvifolium:análises fitoquímicas, atividades antiplasmódica, citotoxicidade

e índices de seletividade

7.3.1- Estudos fitoquímicos

7.3.2- Atividade antiplasmódica, citotoxicidade e IS do ETOH-P (Cs) de A.

parvifolium, frações e uleína

7.3.2.1- Correlação dos resultados obtidos nos estudos fitoquímicos a atividade

antiplsmódica in vitro

7.3.2.2- Ensaio radioisotópico do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium e

frações

7.3.2.3- Citotoxicidade de extrato etanólico de cascas de A. parvifolium, frações e

APT 13-16/ uleína (18)

7.4- Relação entre dados da literatura e os resultados obtidos para Esenbeckia

febrifuga.

7.4.1- Estudos fitoquímicos e cromatográficos em CCDS e CLAE, atividade

antiplasmódica e citotoxicidade

7.5- Análise da atividade antiplasmódica dos extratos, frações e substâncias

117

118

119

120

121

122

123

125

126

128

131

134

8- CONCLUSÕES 137

9-REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 138

10- ANEXOS 153

Anexo 1- Cromatogramas obtidos em análises em CLAE de extratos de espécies de

Aspidosperma e uleína

Anexo 2- Trabalho (aceito)

Anexo 3- Resumos apresentados em Congresso

153

162

177

ÍNDICE DE FIGURAS

da página

Figura 1: Ciclo de vida dos parasitos da malária humana 23

Figura 2: Distribuição de malária no mundo, perfil da resistência a cloroquina e a

sulfadoxina.

Figura 3: Núcleo indólico e suas formas reduzida e oxidada 34

Figura 4: Alguns tipos de alcalóides indólicos isolados de espécies do gênero

Aspidosperma

Figura 5: Aspidosperma parvifolium: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca

e madeira

Figura 6: Aspidosperma cylindrocarpon: árvore, inflorescência, frutos, sementes,

casca e madeira

Figura 7: Aspidosperma ramflorum: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca

e madeira

Figura 8: Aspidosperma spruceanum: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca

e madeira

Figura 9: Aspidosperma tomentosum: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca

e madeira

Figura 10: Esenbeckia febrifuga: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca e

madeira

Figura 11: Fluxograma da extração ácido-base do extrato etanólico de cascas de A.

parvifolium

Figura 12: Extração ácido-base a partir dos extratos etanólicos de cascas de A.

parvifolium e E. febrifuga

Figura 13: Diferentes estágios do P. falciparum 83

Figura 14: Esquema da placa de 96 poços utilizada nos ensaios para a atividade

antiplasmódica

Figura 15: Cromatografia em camada delgada de sílica do extrato etanólico de

cascas A. parvifolium, frações e uleína

100

Figura 16: Cromatogramas de extrato etanólico de cascas de A. parvifolium, frações

e uleína

101

Figura 17: Cromatogramas obtidos na análise em CLAE acoplado a detector com

arranjos de diodos (DAD), do extrato etanólico de cascas de A. pavifolium

(Apocynaceae), APT- 1 e APT13-16 (8)

103

Figura 18: Cromatogramas, obtidos por CLAE, de uleína, APT 13-16 (7) e APT 13-

16 (8).

105

Figura 19: Espectro no IV de APT 13-16 (8) 106

Figura 20: Espectro no UV de APT 13-16 (8), obtido em CLAE acoplado a detector

com arranjos de diodos (DAD)

107

Figura 21: Espectro de massa por impacto eletrônico de APT 13-16 (8) 107

Figura 22: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, do extrato etanólico de

caules de E. febrifuga e frações

113

Figura 23: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, do extrato etanólico de

caule-folhas de A. cylindrocarpon

153

Figura 24: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de A. olivaceum

154

Figura 25: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de A.

ramiflorum

156

Figura 26: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de A.

spruceanum 158

Figura 27: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de etanólicos de

A.tomentosum.

160

ÍNDICE DE QUADROS

da página

Quadro 1: Estruturas químicas da quinina e quinolinas antimaláricas sintéticas 25

Quadro 2: Estruturas químicas de algumas drogas antimaláricas 27

Quadro 3: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. marcgravianum e

A. excelsum

Quadro 4: Estruturas químicas da elipticina, elipticinium e aspidocarpina 39

Quadro 5: Estruturas químicas de subincanandinas E e F 40

Quadro 6: Estrutura química da β-yoimbina

Quadro 7: Estruturas químicas de alcalóides com atividade antiplasmódica

isolados de A. pyrifolium e A. megalocarpon

Quadro 8: Estruturas químicas de alcalóides isolados de G. sericium 42

Quadro 9: Estruturas químicas de substâncias isoladas de A. parvifolium 44

Quadro 10: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. cylindrocarpon 48

Quadro 11: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. olivaceum 49

Quadro 12: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. ramiflorum 50

Quadro 13: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A spruceanum 53

Quadro 14: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. tomentosum 55

Quadro 15: Estruturas químicas de substâncias isoladas de espécies do gênero

Esenbeckia

Quadro 16: Estruturas químicas de alcalóides de Aspidosperma submetidos a ensaios in

vitro para atividade antiplasmódica e citotoxicidade descritos na literatura

130

Quadro 17: Estruturas químicas dos alcalóides furanoquinolinicos da Tabela 35 135

ÍNDICE DE TABELAS

de página

Tabela 1: Substâncias isoladas de espécies pertencentes ao gênero Aspidosperma 61

Tabela 2: Substâncias isoladas de espécies pertencentes ao gênero Esenbeckia 62

Tabela 3: Prospecção por CCDS e classes de metabólitos secundários nos extratos

e frações: classes pesquisadas, eluentes e reveladores utilizados

Tabela 4: Dados referentes à coluna cromatográfica em sílica gel do APT-1 (1,0g) 79

Tabela 5: Dados referentes à coluna cromatográfica aberta do APT- F13- 16

(300mg)

Tabela 6: Esquema utilizado no preparo das placas utilizadas nos ensaios 84

Tabela 7: Condições de preparação dos extratos, quantidade do pó das plantas e

rendimentos dos processos extrativos

Tabela 8: Resultados das análises, por CCDS e CLAE de extratos de espécies

pertencentes ao gênero Aspidosperma (Apocynaceae)

Tabela 9: Resultados da avaliação da atividade antiplasmódica e citotoxicidade de

extratos de espécies pertencentes ao gênero Aspidosperma (Apocynaceae)

Tabela 10: Índices de seletividade (IS) para extratos obtidos de diferentes espécies

de Aspiodsperma (Apocynaceae) ensaiadas para citotoxicidade e atividade

antiplasmódica

Tabela 11: Rendimentos nas extrações de alcalóides a partir do extrato etanólico

de cascas de A. parvifolium

Tabela 12: Análise do extrato etanólico de cascas de Aspidosperma parvifolium

(Apocynaceae), frações e uleína, em CCDS e CLAE

100

Tabela 13: Análise em CLAE acoplado a detector com arranjos de diodos (DAD),

do extrato etanólico de A. pavifolium (Apocynaceae), APT-1 e APT13-16 (8)

104

Tabela 14: Tempos de retenção da uleína, das frações APT 13-16 (7) e APT 13-16

(8)

105

Tabela 15: Atividade antiplasmódica, in vitro, pelo método tradicional, do extrato

etanólico de cascas de A. parvifolium, frações e APT 13-16 (8) (uleína)

108

Tabela 16: Avaliação da atividade antiplasmódica, in vitro, pelo método

radioisotópico, do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium, frações e APT 13-

16 (8) (uleína)

109

Tabela 17: Citotoxicidade e índice de seletividade de extrato etanólico de cascas

de Aspidosperma parvifolium, frações e uleína

110

Tabela 18: Rendimento da extração ácido-base a partir do extrato etanólico de

caules de Esenbeckia febrifuga

111

Tabela 19: Prospecção fitoquímica por CCDS e análises em CLAE do extrato

etanólico de E febrifuga, frações e susbstâncias.

113

Tabela 20: Atividade antiplasmódica, in vitro, através do método tradicional, do

extrato etanólico, frações e substâncias de E. febrifuga

115

Tabela 21: Atividade antiplasmódica, in vitro, pelo método radioisotópico, do

extrato etanólico de caules de E.febrifuga, frações e substâncias

115

Tabela 22: Citotoxicidade e índice de seletividade de extrato etanólico de caules

de E. febrifuga e frações

116

Tabela 23: Atividade antiplasmódica da cloroquina e mefloquina pelos métodos

tradicionais e radioisotópico encontradas no presente trabalho e descritas na

literatura

117

Tabela 24: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica de A. cylindrocarpon

118

Tabela 25: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica de A. olivaceum 119

Tabela 26: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica de A. ramiflorum

121

Tabela 27: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica de A. spruceanum

122

Tabela 28: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica de extratos etanólicos A. tomentosum

123

Tabela 29: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica para o extrato etanólico de cascas de A.parvifolium, frações e

uleína

125

Tabela 30: Correlação entre os resultados obtidos no microteste tradicional e o

método isotópico

127

Tabela 31: Comparação do efeito antiplasmódico, citotoxicidade e índice de

seletividade da uleína a outros alcalóides indólicos de Aspidosperma descritos na

literatura

130

Tabela 32: Comparação do IS da uleína com os IS da cloroquina e mefloquina

descritos na literatura

131

Tabela 33: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade

antiplasmódica de E. febrifuga e frações

132

Tabela 34: Correlação entre os resultados obtidos no microteste tradicional e o

método radioisotópico

133

Tabela 35: Comparação da atividade antiplasmódica de E. febrifuga dos alcalóides

de E. febrifuga com os dados da literatura

134

Tabela 36: Comparação das atividades antiplasmódicas dos extratos avaliados 135

Tabela 37: Comparação das atividades antiplasmódicas das frações avaliados 136

Tabela 38: Comparação das atividades antiplasmódicas das frações avaliados 136

ÍNDICE DAS ESTRUTURAS QUÍMICAS

das páginas

1- Quinina 25

2-Mefloquina 25

3- Cloroquina 25

4- Halofantrino 28

5- Artemisina 28

6- Atovacona 28

7- Artemeter 28

8- Arteer 28

9- Artesunato de sódio 28

10- Lapachol 28

11- Lumefantrina 28

12- Indol (benzopirrol) 34

13a-Oxindol 34

13b- Oxindol 34

14- Diidroindol 34

15- Secondina 36

16- Harmano 36

17- Elipticina 36, 39, 49, 129

18- Uleina 36, 44, 49, 55, 129

19- Epiuleína 36,44, 49, 55

20- Usambaresina 36

21- 10-11-Dimetoxipicrofilina 38

22- Diidrocorinateol 38

23-Tetraidrosecamina 38

24- Desmetoxicarboniltetraidrosecamina 38

25- Metoxitubotaiwina 38

26- Didesmetoxicarboniltetraidrosecamina 38

27- Elipticínium 39

28- Aspidoscarpina 39, 49

29- Subincanandina E 40

30- Subincanandina F 40

31- β- yoimbina

32- N-formil- aspidospermidina 41, 130

33- Aspidospermina 41

34- Geissoschizolina 42

35- Geissoschizolina N

- óxido 42

36- 1,2- Desidrogeissoschizolina 42

37- Flavopereirina 42

38-N- metiltetraidroelipticina 44

39- Aparicina 44, 49, 129

40- Desmetiluleína 44

41-Lupeol 44

42- Estigmasterol 44

43- Refractina 48

44- Pirifolina 48

45- Pirifolidina 48

46- N-cinamoilcilindrocarina 48

47- N-acetilcilindrocarina 48

48- Cilindrocarina 48

49- N-benzoilcilindrocarina 48

50- N- metilcilindrocarina 48

51- 12- Desmetoxi-N-acetilcilindrocarina 48

52- 19- Hidroxicilindrocarina 48

53- N-diidrocinomoil-19-hidroxicilindrocarina 48

54- N-acetil-19-hidroxicilindrocarina 48

55- N-cinamoil-19-hidroxicilindrocarina 48

56- N-formilcilindrocarpinol 48

57- Cilindrocarpinol 48

58- N-acetilcilindrocarpinol 48

59- Olivacina 49

60- 10- Metoxigeissochizol 50

61- Ramiflorina A 50

62- Ramiflorina B 50

63- Aspidoalbina 53

64- Acetilaspidoalbina 53

65- Desmetilaspidolimidina 53

66- Limatinina 55

67- Limonina 58

68- Kokusaginina 58, 112

69- Dictamina 58

70- Skimmiamina 58, 112, 134

71- y-Fagarina 58, 112

72- Maculina 58

73- Flindersiamina 58, 112, 134

74- Bergapteno 58,112

75- 8- Hidroxibergapteno 58

76- Isopimpinelina 58, 112

77- Xantotoxina 58

78- Pimpinelina 58

79- Chalepina 58

80- Arilquinolonas 59

81- Arilquinolonas 59

82- Espatulenol 59

83- β-sitosterol

84- Valenol 60

85- Arilquinolona 60

86- Arilquinolona 60

87- Kampferol-3-O-ramnosídeo 60

88- Quercetina-3-0-ramnosídeo 60

89-

1-Hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona (HMMA)

112

90- Rutaevina 112

91-10-Metoxi-aspidospermidina 130

92- Aspidospermidina 130

93- Palosina 130

94- Aspidolimidina 130

95- Haplopidina 134

96- Acronidina 134

1- INTRODUÇÃO

A malária é uma doença infecciosa cujos agentes etiológicos são protozoários do

gênero Plasmodium, filo Apicomplexa, classe Sporozoa, ordem Hemosporidiida e família

Plasmodidae. Quatro espécies de plasmódios infectam o homem:

- Plasmodium malariae, agente da febre quartã, muito encontrada no continente africano;

foi descoberto por Laveran, em 1881, e Grassi e Faletti, em 1890;

- Plasmodium vivax, responsável pela terçã benígna, sendo este o principal agente causador

de malária no Brasil; foi descoberto por Grassi e Faletti, em 1890;

- Plasmodium falciparum, responsável pela terçã malígna, isto é, pela forma mais grave da

doença; foi descoberto por Welch, em 1897; e

- Plasmodium ovale, causador de uma forma de terçã benigna, encontrada nos continentes

africano e asiático; foi descoberto por Stephens, em 1922.

O Plasmodium se reproduz por dois processos distintos: a reprodução assexuada,

denominada esquizogonia, que se desenvolve no hospedeiro vertebrado, e a reprodução

sexuada que ocorre no mosquito. Ao picar o homem, o mosquito, do gênero Anopheles,

inocula os esporozoítos, que permanecem no sangue por tempo reduzido e vão para os

hepatócitos, onde se multiplicam assexuadamente, dando origem aos esquizontes teciduais,

que amadurecem e liberam os merozoítos. Alguns merozoítos vão parasitar as hemácias,

onde sofrem maturação transformando-se em trofozoítos que se multiplica por

esquizogonia sangüínea, originando os esquizontes. Assim, as hemácias parasitadas se

rompem e liberam os merozoítos que irão parasitar outras hemácias (Figura 1, pg. 23),

iniciando-se os sintomas da doença.

Figura 1: Ciclo de vida dos parasitos da malária humana.

A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera a malária o maior problema de

saúde pública, pois, estima-se que, a cada ano, cerca de 300 a 500 milhões de pessoas sejam

infectadas, sendo os países da África responsáveis por 90% dos casos (Figura 2, pg. 24). A

mortalidade, em especial em crianças menores de cinco anos e gestantes, é bem expressiva,

chegando a ocorrer mais de um milhão de óbitos por ano (MINISTÉRIO DA SAÚDE-

BRASIL, 2006).

Nas Américas, o Brasil é o país que mais registra casos de malária, sendo os estados

da Amazônia Legal (AC, AP, AM, MA, MT, AP, RO, RR, TO) são responsáveis por

99,7% dos casos nacionais (Figura 2, pg. 24) (MINISTÉRIO DA SAÚDE- BRASIL, 2006).

Figura 2: Distribuição de malária no mundo, perfil da resistência a cloroquina e a sulfadoxina.

Fonte: Ridley, 2002.

A evidente necessidade de tratar a malária conduziu a descoberta de vários

fármacos. A quimioterapia da malária teve início no século XVII. Os jesuítas que vieram

para a América do Sul observaram que os índios do Perú utilizavam plantas do gênero

Cinchona spp (família Rubiaceae), conhecidas popularmente por quinas, para o tratamento

de doenças febrís. Estudos fitoquímicos de Cinchona spp, realizados na Europa, levaram ao

isolamento na França, por Pelletier e Caventou, no início do século XIX, da quinina (1) que

apresentou atividade antimalárica.

Até a 2

Guerra Mundial, a quinina (1) era o único agente antiparasitário eficaz

frente à malária. Após a introdução de derivados sintéticos, como a mefloquina (2) e

cloroquina (3), a quinina (1) foi descartada (Quadro 1, pg. 25). Entretanto, com o

aparecimento de cepas resistentes de Plasmodium, a quinina (1) foi reintroduzida.

Os fármacos utilizados para o tratamento da malária humana classificam-se com

base em suas ações seletivas sobre as diferentes fases do ciclo biológico do parasito.

Fármacos que atuam sobre as formas hepáticas em desenvolvimento, ou em latência são

denominados esquizonticidas teciduais. Aqueles que atuam sobre os parasitos eritrocíticos

são chamados de esquizonticidas sangüíneos. O último grupo de fármacos antimaláricos é

dos gametocidas, isto é, que atuam nos gametócitos, impedindo a transmissão para o

mosquito.

A terapêutica da malária humana visa, principalmente, a interrupção da

esquizogonia sangüínea, responsável pela patogenia e manifestações clínicas da doença.

Entretanto, devido à diversidade de formas do ciclo biológico, é também objetivo da

terapêutica propiciar a erradicação das formas latentes do parasito no ciclo tecidual

(hipnozoítos) do P. vivax, evitando-se assim, as recaídas tardias (MINISTÉRIO DA

SAÚDE- BRASIL, 2005).

Quadro 1: Estruturas químicas da quinina e quinolinas antimaláricas sintéticas.

Quinina Mefloquina

(1) (2)

Cloroquina

(3)

A cloroquina (3), por apresentar baixa toxicidade e ser economicamente viável, foi

amplamente utilizada no tratamento da malária, durante muitos anos. Durante a guerra do

Vietnã, as forças armadas dos Estados Unidos observaram que os parasitos da malária eram

resistentes à cloroquina. Atualmente, parasitos resistentes a cloroquina e a sulfodoxina

encontram-se distribuídos em várias regiões do mundo (Figura 2, pg.24). Então, iniciou-se

um programa intensivo de pesquisa de novos agentes antimaláricos, onde foram testados

mais de 300.000 compostos, sendo dois compostos ativos contra cepas resistentes ao P.

falciparum: a mefloquina (2), um quinolinometanol, e o halofantrino (4), um

fenantrenometanol (FOLEY e TILLEY, 1998). Os fármacos mais recentemente

introduzidos são a artemisinina (5) e a atovacona (6) (Quadro 2, pg. 27).

A artemisinina (5) é uma substância ativa da Artemísia annua, de uso milenar na

China, tendo sido isolada em 1972. Derivados semi-sintéticos como artemeter (7), arteeter

(8) e artesunato de sódio (9) também se encontram em uso clínico (Quadro 2, pg. 27)

(ROSENTHAL et al., 2003). A atovacona (6) é uma naftoquinona sintética, um análogo do

lapachol (10), que é freqüente em espécies de Tabebuia, gênero ao qual pertencem os ipês,

árvores que ocorrem na América do Sul (MIRAGLIA, 1991).

Em relação ao mecanismo de ação dos fármacos antimaláricos ainda existem

algumas controversas. Os parasitos utilizam a hemoglobina dos eritrócitos como fonte

alimentar. A hemoglobina é transportada para dentro de um compartimento acídico do

parasito, conhecido como vacúolo alimentar, e é quebrada por enzimas proteolíticas,

chamadas plasmecinas, em peptídeos que, posteriormente, são degradados a aminoácidos

(EGAN et al., 1999). O resíduo livre, o heme ou ferriprotoporfirina IX (Fe(III)PPIX), que é

tóxico ao parasito, é polimerizado formando um composto inerte, insolúvel e não tóxico, o

pigmento malárico hemozoína.

Existem algumas evidências que a interação entre os antimaláricos esquizonticidas

sangüíneos com o grupo heme [ferriprotoporfirina IX (Fe(III)PPIX)] interferindo na

cristalização da hemozoína (SULIVAN Jr. et al., 1998), porém, existem divergências sobre

como isto ocorre (EGAN et al., 1999).

A resistência do P. falciparum e, em menor grau, do P. vivax, constitui um sério

problema de saúde pública. No Brasil, o P. falciparum resistente a cloroquina é muito

freqüente na Amazônia legal, onde também já foram encontrados parasitos multiresistentes.

Assim, preconiza-se o tratamento com associações de antimaláricos que tem como

objetivos melhorar a eficiência do tratamento e com sensível diminuição no

desenvolvimento de resistência (GIAO e VRIES, 2001).

Atualmente, o Ministério da Saúde do Brasil recomenda, para o tratamento da

malária causada pelo P. vivax, a cloroquina e a primaquina. Para o tratamento da malária

falciparum humana recomenda-se a associação artemeter (7) e lumefantrina (11) (Coartem).

A escolha do derivado da artemisinina (5), o artemeter (7), para esta associação,

fundamenta-se no fato de não haver registro de cepas do P. falciparum resistentes a esta

droga. As principais mutações, responsáveis pela resistência do P. falciparum, ocorre, nos

gene pcfcrt e pfmdr1 e confere altos níveis de resistência a cloroquina, porém não interfere

na atividade da artemisinina e derivados. O gene candidato a conferir resistência à

artemisina e derivados, já identificado, foi o PfATPse6 (FERREIRA et al., 2007).

Atualmente, existe necessidade de buscar novos agentes antimaláricos que sejam

eficazes contra cepas do P. falciparum resistentes a cloroquina, promovendo a cura em

tempo razoável (3 dias), para garantir adesão ao tratamento, sejam seguros e de baixo custo

(FIDOCK et al., 2004).

Neste contexto, as plantas têm dado importante contribuição, como a quinina (1) e a

artemisinina (5). A mais ampla avaliação de plantas superiores para atividade antimalárica

foi publicada em 1947, sendo que cerca de 600 espécies vegetais foram examinadas in vivo

empregando-se P. galinaceum, em galinhas, além de P. cathenierium e P. lophurae, em

patos, destacando-se as atividades de representantes das famílias Amaryllidaceae e

Simaroubaceae. O total de extratos ativos foi relativamente baixo já que a atividade em

malária aviária não é, necessariamente, indicadora de atividade antimalárica em humanos e

estes resultados desestimularam as investigações na área (PHILLIPSON e WRIGHT,

1991). Um levantamento da literatura indicou que 1200 espécies vegetais são empregadas

nos três continentes para o tratamento da malária (WILLCOX e BODEKER, 2004).

Quadro 2: Estruturas químicas de algumas drogas antimaláricas.

Halofantrino (4) Artemisinina (5)

Atovacona (6) Artemeter (7)

Arteter (8) Artesunato de sódio (9)

Lapachol (10) Lumefantrina (11)

A atividade antiplasmódica de alcalóides tem sido amplamente relatada na

literatura, sendo que no período de 1990 a 2000 mais de uma centena de substâncias ativas

desta classe foram descritas e algumas mais potentes que a cloroquina, conforme revisão

recente (SAXENA et al., 2003). Muitas vezes estes alcalóides foram isolados de plantas

tradicionalmente utilizadas para o tratamento da malária, em diferentes regiões do mundo.

A importância da pesquisa de plantas tradicionalmente utilizadas no tratamento da

malária, seja na busca de novos fármacos, ou objetivando a validação do seu uso medicinal

e⁄ou o desenvolvimento de fitoterápicos eficazes e seguros, consta de um artigo submetido

para publicação nos Anais da Academia Brasileira de Ciências, em que somos um dos

autores e encontra-se em anexo (OLIVEIRA et al., 2007). Nesta revisão estão descritos os

ensaios in vitro mais utilizados para a avaliação da atividade antiplasmódica, sendo dado

um maior destaque aos ensaios descritos por Rieckman e col.(1978), onde a parasitemia é

determinada em análises microscópica, e por Desjardins e col (1979), que é um método

radioisotópico onde é utilizada a [H

]- hipoxantina. Além disso, outras metodologias mais

recentes são discutidas nesta revisão, dentre estas o método que utiliza cepa de P.

falciparum contendo proteína fluoresente (SANCHES et al., 2007), método fluorimétrico

que utiliza PicoGreen para avaliar a susceptibilidade de parasitos a agentes

antiplasmódicos (QUASHIE et al., 2006). Também, alguns métodos bioquímicos baseados

em ensaios colorimétricos foram descritos, como por exemplo, aquele para detecção da

desidrogenase lática (OLIVEIRA et al., 2007).

2- OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA

2.1- OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade antiplasmódica de extratos obtidos de espécies pertencentes ao

gênero Aspidosperma (família Apocynaceae) e de Esenbeckia febrifuga (A.St-Hil.) Juss. ex

Mart. (família Rutaceae); realizar o estudo fitoquímico de extratos de uma das espécies

ativas e determinar a citotoxicidade de extratos, frações e substância(s) pura(s) ativa(s).

2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a- Avaliar a atividade antiplasmódica de extratos obtidos a partir de diferentes partes

de plantas das seguintes espécies: A. cylindrocarpon Muell. Arg., A. olivaceum

Muell. Arg., A. parvifolium A. DC., A. ramiflorum Mgf., A. spruceanum Benth. ex.

Muell. Arg., A. tomentosum Mart. e Esenbeckia febrifuga (A.St-Hil.) Juss. ex Mart..

b- Realizar estudos fitoquímicos preliminares dos extratos obtidos.

c- Realizar estudo fitoquímico de extrato e/ou fração ativa de uma espécie vegetal a

ser selecionada de acordo com os resultados obtidos nos estudos fitoquímicos

preliminares.

2.3- JUSTIFICATIVA

Considerando que a família Apocynaceae é uma reconhecida fonte de alcalóides

(BOLZANI et al., 1987 e JÁCOME, 1998) justifica-se a proposta de avaliação da atividade

antiplasmódica de extratos de espécies do gênero Aspidosperma, pertencentes a esta

família. Essa abordagem baseia-se em critérios válidos para a seleção de espécies vegetais

para avaliação de atividade antiplasmódica:

1)- Etnobotânica: espécies de Aspidosperma são empregadas no tratamento da

malária, em diferentes continentes (BARBOSA et al., 2003);

2)- Etnofarmacologia: Aspidosperma megalocarpon mostrou atividade antimalárica

(WENIGER et al., 2001) e

3)- Quimiotaxonomia: espécies do gênero Aspidosperma já forneceram alcalóides

indólicos com atividade antimalárica (MITAINE-OFFER et al., 2002).

A inclusão do estudo da Esenbeckia febrifuga (A. St-Hil.) Juss. ex Mart. tem como

objetivo dar continuidade ao trabalho iniciado em 1990 pela Profa. Alaíde Braga de

Oliveira, em colaboração com o Prof. H. Wagner (Institut für Pharmazeutische Biologie der

Universität München, Alemanha), com o apoio do CNPq (Processo n

.91.03006/90-7). A

atividade antiplasmódica, in vivo, do extrato aquoso de cascas desta espécie foi

anteriormente relatada (CARVALHO et al., 1991).

Na seleção da espécie para fracionamento foram levadas em consideração as seguintes

informações:

1- Extratos de A. olivaceum mostraram-se ativos em P. falciparum, e isto deve estar

relacionado à presença dos alcalóides elipticina, aspidocarpina (ANDRADE-NETTO et al.,

2007). A citotoxicidade da elipticina e da olivacina, agentes antitumorais, tem sido relatada

em diferentes trabalhos científicos (MARINI et al., 1983 e Le MÉE et al., 1998). Por isso,

optou-se por selecionar uma planta que não contivesse elipticina e olivacina.

2- A maioria dos extratos testados das demais espécies de Aspidosperma apresentou CI

superior a 10 µg⁄mL e, analisando os dados da literatura, conclui-se que:

a)- Devido a sua complexidade química, isto é, a presença de diferentes alcalóides indólicos

(GILBERT et al., 1960; ANTONACCIO, 1960; DJERASSI et al., 1960 e 1961; BOLZANI

et al., 1987), o estudo fitoquímico da A. cylidrocarpon seria muito complexo e por isso,

excluiu-se esta espécie.

b)- As demais espécies apresentavam atividade antiplasmódica e complexidade de

composição em alcalóides semelhantes, porém a espécie A. parvifolium já havia sido

estudada pelos pesquisadores do grupo (JÁCOME, 1998 e JÁCOME et al., 2004), o que

com certeza, facilitaria o fracionamento biomonitorado. Assim, optou-se pela A.

parvifolium para dar continuidade ao trabalho.

3- REVISÃO DA LITERATURA

3.1- O gênero Aspidosperma: posição taxonômica, alcalóides, etnofarmacologia e

atividades biológicas

3.1.1- Posição taxonômica

O gênero Aspidosperma pertence à família Apocynaceae que inclui cerca de 200

gêneros e 2000 espécies. Espécies deste gênero ocorrem em regiões tropical e subtropical,

desde o México até a Argentina, encontrando-se em diferentes habitats, como nos cerrados

da região centro sul do Brasil, áreas inundadas nas margens de rios da Amazônia, Paraguai,

Argentina, México e regiões em elevação do Perú e Bolívia (WOODSON, 1951 apud

JÁCOME, 1998 e FERREIRA NETO, 1988 apud JÁCOME, 1998).

O número de espécies é bastante controverso. A última revisão do gênero é a mais

usada para determinações taxonômicas, e considera 52 espécies distribuídas em 9 séries

(WOODSON, 1951 apud JÁCOME, 1998). Em uma reavaliação, 18 espécies foram

incluídas no gênero (FERREIRA NETO, 1988 apud JÁCOME, 1998 e MARCONDES e

KINOSHITA, 1996).

De espécies do gênero Aspidosperma já foram isolados cerca de 250 alcalóides

indólicos (BOLZANI et al., 1987; JÁCOME, 1998; PEREIRA et al., 2007). Esta classe de

alcalóides ocorre mais frequentemente em plantas das famílias Apocynaceae, Loganiaceae

e Rubiaceae que pertencem à ordem Gentianales. As Apocináceas das quais foram isolados

alcalóides indólicos pertencem à sub-família Plumerioideae K. Schumann. Na tribo

Plumeriae, sub-tribo Aspidospermatinae, encontram-se os gêneros Aspidosperma e

Geissospermum (LEEUWENBERG, 1980). Estas relações taxonômicas são mostradas a

seguir:

Classe: Magnoliopsida

Ordem: Gentianales

Família: Apocynaceae

Sub- família: Plumerioidae

Tribo: Plumeriae

Sub-tribo: Aspidospermatinae

Gêneros: Diplorhynchus

Aspidosperma

Geissospermum

3.1.2- Alcalóides indólicos

Estruturalmente os alcalóides indólicos caracterizam-se por apresentar o núcleo indol

(benzopirrol) (12), uma forma oxidada deste, o oxindol (13 a e b), ou a forma reduzida,

diidroindol (14) (Figura 3, pg. 34).

Figura 3: Núcleo indólico e suas formas reduzida e oxidada.

[H]

[O]

Indol

(benzopirrol)

(12)

Oxindol

(13ª)

Oxindol

(13b)

Diidroindol

(14)

Os alcalóides indólicos encontrados em espécies de Aspidosperma são classificados em

dois grupos:

1- Alcalóides indólicos simples, com um sistema indólico derivado biogeneticamente

do triptofano, alguns apresentando um esqueleto piridino-indólico. Este grupo

possui poucos representantes em Aspidosperma (<20) e pode ser exemplificado por

secondina (15), harmano (16) e elipticina (17) (Figura 4, pg. 36);

2- Alcalóides indolomonoterpênicos, biogeneticamente derivados do triptofano, via

condensação da triptamina como a secologanina, um monoterpeno. A este grupo

pertence a grande maioria dos alcalóides de Aspidosperma (>200). Estes alcalóides

podem apresentar uma grande diversidade estrutural, compreendendo dez diferentes

classes (SCHRIPSEMA et al., 1999). O tipo aspidospermano é, aqui, exemplificado

por uleína (18), epiuleína (19) e usambarensina (20) (Figura 4, pg. 36).

A Figura 4 (pg. 36) mostra, de forma esquemática, a origem biogenética das 2 classes de

alcalóides de Aspidospema: alcalóides indólicos simples e alcalóides

indolomonoterpênicos.

3.1.3- Etnofarmacologia

Em relação ao uso tradicional e à atividade farmacológica de espécies deste gênero

muito pouco se encontra registrado na literatura. Levantamento etnofarmacológico

realizado no município de Igarapé Mirim (PA, Brasil) revelou que a população local utiliza

cascas de Aspidosperma, entre as quais, A. auriculatum, para o tratamento de malária e

febre (BARBOSA et al., 2003).

De modo geral, na Amazônia, algumas espécies de Aspidosperma são utilizadas pelas

populações indígenas e caboclas (MILLIKEN, 1997), para vários fins medicinais, como o

tratamento de inflamações do útero e ovário, diabetes, câncer, como contraceptivo e

tratamento da malária. As espécies mais utilizadas são A. nitidum, A. marcgravianum, A.

carapanauba e A. desmantun (BRANDÃO et al., 1992 e MILLIKEN, 1997).

A espécie A. quebracho-blanco é usada como febrífugo, para o tratamento de asma,

bronquite, enfisema e febre (BOWN, 1995). A. excelsum é indicada para problemas

estomáquicos e indigestão (CHEVALIER, 1996).

COOH

Triptofano

Triptamina

Alcalóides indolomonoterpênicos

Alcalóides indó-

licos simples

Secondina (15)

Harmano (16)

Elipticina (17)

Usambaresina (20)

Figura 4: Alguns tipos de alcalóides indólicos isolados de espécies do gênero Aspidosperma.

Fonte: SCHRIPSEMA et al, 1999 e JÁCOME, 1998).

Uleína (18):

, R

Epiuleína (19): R

H, R

+ Secologanina

5´

6´

O extrato etanólico de peroba-rosa (Aspidosperma sp) mostrou-se muito ativo em

Proteus mirabilis (GRANATO et al., 2005). A atividade antibacteriana de extratos

etanólicos de outras espécies de Aspidosperma, como A. dispermum, A. olivaceum, A.

pyrifolium, A. pyricollum, A. polyneuron e A. ramiflorum foi observada em bactérias Gram

positivas e negativas (OLIVEIRA et al., 2005).

Extratos etanólicos de cascas e de frações de sete espécies de Aspidosperma, coletadas

na Reserva de Ducke, Manaus, foram avaliados quanto à toxicidade para larvas de Artemia

franciscana na concentração de 500 µg⁄mL. Os extratos apresentaram baixa toxicidade (0-

64%), com exceção do extrato de A. nitidum que causou 97% de letalidade das larvas. As

frações alcaloídicas de A. aracanga, A. desmanthun e A. nitidum apresentaram letalidade >

90%. Estes mesmos extratos e frações foram avaliados quanto à letalidade para larvas (3º

estágio) de Aedes aegypti. Os extratos etanólico foram, em geral, inativos; apenas A.

marcgravianum causou 10% de letalidade. As frações alcaloídicas apresentaram atividade

de fraca a moderada (letalidade de 10 a 47%) (HENRIQUE, 2007).

Atividades de extratos de espécies de Aspidosperma estudadas neste trabalho serão

descritas nos ítens referentes à sua revisão de literatura.

Em triagem para atividade antimicrobiana de constituintes químicos de plantas do

Suriname, alcalóides de A. marcgravianum foram testados em Bacillus subtilis e

Staphylococcus aureus. O alcalóide 10,11-dimetoxipicrafilina (21) não foi ativo nestas

bactérias. O diidrocorinanteol (22) mostrou atividade moderada para essas bactérias e

tetraidrosecamina (23) e 16-desmetoxicarbometoxitetraidrosecamina (24) foram muito

ativas para as duas bactérias (VERPOORTE et al., 1982). Seis alcalóides, isolados de A.

excelsum mostraram-se ativos em B. subtilis e suas concentrações inibitórias mínimas

(CIM) foram: 11-metoxitubotaiwina (25) (0,23 µg⁄mL); tetraidrosecamina (23) (0,11

µg⁄mL); 16-desmetoxicarboniltetraidrosecamina (24) (0,07 µg⁄mL) e

didesmetoxicarboniltetraidrosecamina (26) (0,10 µg⁄mL) (VERPOORTE et al., 1983).

Quadro 3: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. marcgravianum e A excelsum.

COOC

10,11-dimetoxipicrafilina

(21)

Diidrocorinanteol

Tetraidrosecamina (23)- R

=COOCH

, R

(22)

Desmetoxicarbometoxitetraidrosecamina

(24)-

= COOCH

, R

Didesmetoxicarboniltetraidrosecamina (26)-

OCH

N H

11- Metoxitubotaiwina (25)

Fonte: JÁCOME, 1998.

Também, foi avaliada a atividade anticâncer de substâncias isoladas de espécies de

Aspidosperma, destacando-se os trabalhos com a elipticina (17) e seus derivados sintéticos,

dos quais o elipticinium (acetato de 2-metil-9-hidroxielipticínio) (27), é comercializado

com o nome de Celiptium (Elipticinium) (27), na França, para o tratamento do câncer de

mama (CRAGG e NEWMANN, 2005).

As subincanandinas E (29) e F(30), isoladas de A. subincanum, apresentaram

atividade citotóxica in vitro em células de linfoma murino L1210 (CI

= 0,03 e 2,4 µg/mL,

respectivamente) e em carcinoma epidermóide humano KB (CI

= 4,4 e 4,8 µg/mL,

respectivamente) (Quadro 5, pg. 41) (KOBAYASHI et al., 2002).

Trabalho recente demonstrou que elipticina (17) e aspidocarpina (28) (Quadro 4, pg.

40) apresentaram maior atividade antiplasmódica, in vitro, que a quinina, no clone K1

(Plasmodium falciparum multi-resistente, originário do Quênia) (ANDRADE-NETTO et

al., 2007).

Quadro 4: Estruturas químicas da elipticina, elipticínium e aspidoscarpina.

AcO-

Elipticina (17) Elipticinium (Celeptium) (27)

COCH

Aspidocarpina (28)

Legenda: JÁCOME, 1998.

Quadro 5: Estruturas químicas das subincanandinas E e F.

Subincanandina E Subincanandina F

(29) (30)

Legenda: JÁCOME, 1998.

Outras atividades já relatadas foram os efeitos da β-yoimbina (31) na disfunção

erétil e a inibição de receptor adrenérgico alfa (Quadro 6, pg. 40) (SPERLING et al., 2002 e

CAMPOS et al., 2006).

Quadro 6: Estrutura química da β-yoimbina.

ββ

β-yoimbina

(31)

Legenda: JÁCOME, 1998.

Mitaine-Offer e cols. (2002) isolaram de A. pyrifolium e A. megalocarpon onze

alcalóides com esqueleto aspidospermano e avaliaram sua atividade antiplasmódica (cepas

sensível e resistente a cloroquina) e citotoxicidade. Destes alcalóides, sete são tetracíclicos,

apresentando grupo etila livre, e mostraram CI

entre 3,2 e 15,4 µM, após 72h de

exposição. Entretanto, quatro alcalóides pentacíclicos mostraram reduzida atividade

antiplasmódica, isto é, CI

entre 22,6 e 52,6 µM. Avaliou-se, também, a associação

alcalóide e cloroquina, tendo observado sinergismo nas seguintes associações: cloroquina -

N-formil-aspidospermidina (32) e cloroquina– aspidospermina (33) (Quadro 7, pg. 41). Em

relação à citotoxicidade (células NiH 3T3), os alcalóides com alta atividade antiplasmódica

apresentaram menor citotoxicidade.

Quadro 7: Estruturas químicas de alcalóides com atividade antiplasmódica isolados de A.

pyrifolium e A. megalocarpon.

N-formil-aspidospermidina (32):

R = HCO, R

= H, R

= H

Aspidospermina (33):

R = H, R

= H, R

= H

Fonte: MITAINE-OFFER et al., 2002.

Outro gênero pertencente à família Apocynaceae, que também apresentou atividade

antiplasmódica, é o Geissospermum. De G. sericeum (Sagot) Benth. & Hoolp.f. foram

obtidos três alcalóides indólicos, geissoschizolina (34), geissoschizolina N

-óxido (35) e

1,2-desidrogeissoschizolina (36), além de um alcalóide β-carbolínico, a flavopereirina (37)

(Quadro 8). O extrato hidroetanólico das cascas e os alcalóides isolados foram avaliados in

vitro contra cepas K1 e T9-96 de P. falciparum. Das substâncias testadas, a flavopereirina

(37) foi a mais ativa apresentando CI

de 11,53 e 1,83 µM, respectivamente. Porém

quando comparada a cloroquina (CI

0,32 e 0,03 µM), a flavopereirina mostrou atividade

antiplasmódica inferior. A flavopereirina (37) mostrou-se, também, mais citotóxica dentre

as quatro substâncias, quando avaliada em cultura de células KB (CI

= 10,7 µM), sendo

mais citotóxica que a cloroquina (CI

=20,4 µM) (Quadro 8, pg. 42) (STEELE et al., 2002).

Espécies de Geissospermum são utilizadas popularmente no tratamento da malária no

Brasil (MILLIKEN, 1997).

Quadro 8: Estruturas químicas de alcalóides isolados de G. sericeum.

Geissoschizolina (34)

Geissoschizolina N

-óxido (35)

1,2-desidrogeissoschizolina (36) Flavopereirina (37)

Fonte: STEELE et al., 2002

Considerando a disponibilidade de material vegetal para realização deste trabalho, as

seguintes espécies de Aspidosperma foram coletadas e sua atividade antiplasmódica

avaliadas: A. cylindrocarpon; A. olivaceum; A. parvifolium; A. ramiflorum; A. spruceanum

e A. tomentosum. Neste capítulo serão descritos os aspectos botânicos, químicos e

biológicos destas espécies.

3.1.4- Revisão de literatura sobre as espécies de

Aspidosperma

avaliadas no presente

trabalho: descrição botânica, atividades biológicas e alcalóides

3.1.4.1-

Aspidosperma parvifolium

É conhecida, popularmente, como guatambu, peroba ou pau-pereira. Em termos

botânicos, esta espécie se caracteriza por possuir folhas glabras, membranáceas, de

coloração prateada na parte inferior, de 5-10 cm de comprimento. A árvore possui 10-15 m

de altura, com o tronco de 40-60 cm de diâmetro. Produz, anualmente, grande quantidade

de sementes que são amplamente disseminadas pelo vento. Floresce no final do mês de

agosto com surgimento da nova folhagem. O desenvolvimento da planta no campo é

rápido, podendo atingir 3,5-4,0 m aos 2 anos (LORENZI, 1992). Na Figura 5 (pg.45) têm-

se a foto da árvore, de suas flores, frutos, sementes, casca e madeira.

A madeira de seu tronco é dura e resistente, sendo utilizada na construção civil como

vigas e tacos para assoalhos. A árvore também é utilizada para fins ornamentais em

paisagismo (LORENZI, 1992).

Do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium foram isolados os alcalóides N-

metiltetraidroelipticina (38) (BRUNELL e CASA, 1967), uleína (18), epiuleína (19),

aparicina (39), desmetiluleina (40), além de um triterpeno, o lupeol (41), e um esteróide, o

estigmasterol (42) (JÁCOME et al., 2004). A uleína (18) já foi obtida de outras espécies de

Aspidosperma, como A. olivaceum (GILBERT et al., 1965) e A. tomentosum (ARNDT et

al., 1967). Os alcalóides isolados de A. parvifolium encontram-se listados na Tabela 1 (pg.

61) e suas estruturas são mostradas no Quadro 9 (pg.44).

O extrato etanólico de cascas de A. parvifolium avaliado quanto à letalidade em Artemia

salina e inibição de calos, induzidos por Agrobacterium tumefaciens, em discos de batatas,

demonstrou um elevado potencial antitumoral, isto é, a concentração letal 50% (CL

) foi

103,8 µg⁄ml para a Artemia salina e, nesta concentração, houve inibição de 94,4% da

formação dos calos em discos de batata. Este extrato apresentou, também, atividade anti-

Trypanosoma cruzi (DOLABELA, 1997). A toxicidade observada em Artemia salina,

provavelmente está relacionada à presença de alcalóides indólicos.

Uma mistura de alcalóides indólicos, contendo predominantemente a uleína (18) (53%)

reduziu a secreção ácida no estômago de roedores, e esta redução pode estar relacionada ao

bloqueio da bomba H+,K+-ATPase (BAGGIO et al., 2005). Outro alcalóide indólico,

presente em A. parvifolium, a aparicina (39), foi submetido ao ensaio para atividade

antifúngica, porém não foi observada inibição do crescimento do microorganismo

(HERNANDEZ e PEREZ, 1977).

Quadro 9: Estruturas químicas das substâncias isoladas de A. parvifolium.

N- metiltetraidroelipticina (38)

Uleína (18):

= C

; R

= H

Epiuleína (19):

=H; R

= C

Desmetiluleína (39)

H CH

Aparicina (40)

Lupeol (41)

Estigmasterol (42)

Fonte: JÁCOME et al., 2004

Figura 5: Aspidosperma parvifolium: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca e madeira.

Fonte: LORENZI, 1992.

3.1.4.2-

Aspidosperma cylindrocarpon

Aspidosperma cylindrocarpon ocorre nos Estados de São Paulo, Mato Grosso,

Goiás Minas Gerais onde é conhecida como peroba-iquira, peroba-de-Lagoa-Santa, peroba-

de-Minas e peroba-rosa. Esta planta apresenta de 4 a 12 m de altura, ramos relativamente

delgados, folhas ovais e lanceoladas-elipticas, agudamente acuminadas a obtusas;

inflorescência em panícula, subterminal na axila das folhas mais elevadas (CORRÊA,

1984). A Figura 6 (pg. 47) mostra a árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca e

madeira desta espécie.

A toxicidade dos extratos etanólicos de caules e folhas de A.cylindrocarpon foi

avaliada em Artemia salina observando-se que, neste modelo, os extratos mostraram-se

pouco tóxicos (CI

> 500 µg⁄ mL) (GARCIA, 2000). Não foram encontrados na literatura

informações sobre os usos tradicionais e outras atividades biológicas de A. cylindrocarpon.

Os alcalóides isolados desta planta estão listados na Tabela 1 (pg. 61) e suas

estruturas e de outras substâncias isoladas de A cylindrocarpon encontram-se no Quadro 10

(pg.48).

3.1.4.3-

Aspidosperma olivaceum

É uma árvore grande e frondosa, com tronco de casca áspera e acinzentada; folhas

longo-pencioladas, lanceoladas e espatuladas, agudas, na base estreitamento em pecíolo,

ondulada nas margens, glabras ou com pêlos esparsos. As flores são pequenas, brancas,

dispostas em cimeiras, alternando com os ramos (CORRÊA, 1984).

No Brasil, ocorre desde a Bahia até o Rio Grande do Sul, e é conhecida,

popularmente, como gipio, guatambu-marfim (Paraná), pau-cetim, pequiá-amarelo (Bahia),

pequiá-branco e pequiá-marfim. Na Argentina, é conhecida como guatambu-amarillo ou

guantambu-saiyu (CORRÊA, 1984).

A. olivaceum não faz parte das 52 espécies consideradas por Woodson (1951),

sendo aceitos como sinonímia os nomes A. pyricollum Muell. Arg. fide Woodson, 1951 e A.

pyricollum Muell. Arg. fide Zuloaga, F. (1996) (MOBOT, 2007).

Em relação à atividade anticâncer, a olivacina (59), um isômero natural da elipticina

(17), mostrou-se ativa em várias linhagens de células tumorais (JAZTOLD-HOWORKO et

al., 1994) e a hidroxilação na posição 9 aumenta a afinidade da substância pelo DNA

levando ao aumento da citotoxicidade e da atividade antitumoral (MALLONE et al., 2000).

As substâncias isoladas de extratos obtidos de A. olivaceum encontram-se descritas

na Tabela 1 (pg. 61) e suas estruturas no Quadro 11 (pg. 49).

Figura 6: A. cylindrocarpon: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca e madeira.

Fonte: LORENZI, 1992

Quadro 10: Estruturas químicas dos alcalóides isolados de A. cylindrocarpon.

COCH

Refractina (43):

, R

e R

=H; R

= CHO; R

= OCH

Pirifolidina (45)

Pirifolina (44):

e R

=H; R

= CHO; R

= OCH

N-cinamoilcilindrocarina (46):

=OCH

; R

=COCH=CHC

N-acetilcilindrocarina (47):

=OCH

; R

=COCH

Cilindrocarina (48):

=OCH

; R

;

N-benzoilcilindrocarina (49):

=OCH

; R

=COC

N-metilcilindrocarina (50):

=OCH

; R

=CH

12-desmetoxi-N-aceticilindrocarina (51):

=H; R

=COCH

19-hidroxicilindrocarina (52):

=OCH

; R

;

=OH

N-diidrocinamoil-19-hidroxicilindrocarina (53):

=OCH

; R

=COCH

N-acetil-19-hidroxicilindrocarina (54):

=OCH

; R

=COCH=CHC

=OH

N-cimamoil-19-hidroxicilindrocarina (55):

=OCH

; R

=COCH

=OH

N-formilcilindrocarpinol (56)

: R

=H; R

=OCH

=CHO

Cilindrocarpinol (57):

=H; R

=OCH

N-acetilcilindrocarpinol (58)

: R

=H; R

=OCH

=COCH

Fonte: JÁCOME, 1998.

Quadro 11: Estruturas químicas dos alcalóides isolados de A. olivaceum.

Elipticina

Uleína (18):

, R

(17)

Epiuleína (19)

: R

H, R

COCH

Aspidocarpina Aparicina

(28) (39)

Olivacina

(59)

Fonte: JÁCOME, 1998.

3.1.4.4-

Aspidosperma ramiflorum

É uma árvore nativa da mata atlântica do sudeste brasileiro. Floresce, no estado do

Rio de Janeiro, no período de junho a julho, sendo conhecida, popularmente, como pequiá-

doce e tambú. Árvore grande, ramos lisos ou verrucosos, cinzento-escuros, folhas curto-

pecioladas, elípticas, obtusas ou um pouco agudas nas extremidades, limbo de 7-9 cm de

comprimento e de 30-40 mm de largura, escuras, saliente nervadas, com 8-10 nervuras

secundárias de cada lado; flores curtíssima pediceladas, brancas, dispostas em cimeiras nos

ramos laterais, brácteas ovado-lanceoladas, hirto-ferrigíneas, lacínias calicinais oblongo-

ovadas e ovário-glabro (CORRÊA, 1984). Na Figura 7 (pg. 51) encontram-se as fotografias

da árvore, inflorescências, sementes, casca e madeira de A. ramiflorum.

O extrato alcaloídico de cascas de A. ramiflorum foi ativo frente às formas

promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis e L. (V.) brasiliensis, sendo este mais

efetivo na L. (L) amazonensis (FERREIRA et al., 2004). Uma fração resultante da

separação cromatográfica do extrato alcaloídico mostrou-se altamente ativa contra B.

subtilis (CIM= 15,6 µg⁄mL) e S. aureus (CIM= 31,3 µg⁄mL) e inativa contra bactérias Gram

negativas (TANAKA et al., 2006). O fracionamento forneceu uma fração alcaloídica ativa

contra C. neoformans (CIM< 15,6 µg⁄mL) e dermatófitos (CIM de 62,5-125) (SOUZA et

al., 2006).

O extrato metanólico das cascas de A. ramiflorum foi moderamente ativo frente à

Bacillus subtilis (CIM= 250 µg⁄mL), Staphylococcus aureus (CIM= 250 µg⁄mL) e inativo

para Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (CIM > 1000 µg⁄mL) (TANAKA et al.,

2006). O extrato metanólico de A. ramiflorum também apresentou moderada atividade

antifúngica, frente ao Cryptococcus neoformans (CIM de 62,5 - 250 µg⁄mL) e fraca

atividade contra dermatófitos (CIM de 500 a 1000 µg⁄mL) (SOUZA et al., 2006).

As substâncias isoladas de A. ramiflorum encontram-se listadas na Tabela 1 (pg. 61)

e as estruturas químicas são mostradas no Quadro 12 (pg. 50).

Quadro 12: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. ramiflorum.

10-Metoxigeissoschizol Ramiflorina A (61): 17α

(60) Ramiflorina B (62): 17β

Fonte: JÁCOME, 1998.

Figura 7: Aspidosperma ramiflorum: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca e madeira.

Fonte: LORENZI, 1992.

3.1.4.5-

Aspidosperma spruceanum

Conhecida, popularmente, como amargoso, peroba, araracanga, pau-amarelo,

pequiá-marfim, quina-da-mata e guatambu, esta espécie ocorre desde a amazônia até os

estados de São Paulo e Minas Gerais, sendo maior a sua freqüência nas matas de altitude da

Serra da Mantiqueira, em Minas Gerais. A árvore pode ter 5-20 m, dotada de copa

arredondada, com ramos sem lenticelas e com pêlos diminutos dando uma aparência

farinhenta. O tronco pode ter de 30-40 cm de diâmetro e ser revestido por uma grossa

camada de cortiça. Folhas curto-pecioladas, coriáceas, discolores, de 6-10 cm de

comprimento, com a fase superior glabra e a inferior densa pubérula, com pilosidade

levemente ferruginosa. O fruto é deiscente, com 8 a 10 sementes (Figura 8, pg. 52)

(LORENZI, 1992).

Figura 8: Aspidosperma spruceanum: árvore, inflorescência, frutos, sementes, casca e madeira.

Fonte: LORENZI, 1992.

Os alcalóides isolados de A. spruceanum estão listados na Tabela 1 (pg. 61) e suas

estruturas químicas são mostradas no Quadro 13 (pg. 53).

Quadro 13: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. spruceanum.

Aspidoalbina (63): R = C

CO, R

= OCH

, R

= OCH

Acetilaspidoalbina (64): R = CH

CO, R

= OCH

, R

= H

Desmetilaspidoslimidina (65): R = C

CO, R

= OCH

, R

= OH

Fonte: JÁCOME, 1998.

3.1.4.6- Aspidosperma tomentosum

É conhecida, popularmente, por peroba-do-campo, peroba-do-cerrado, pau-pereira-

do-campo, taroba e pau-pereiro-do-campo. Ocorre nos estados do Piauí, Bahia, Minas

Gerais, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Tocantins e São Paulo. Também é

encontrada no Paraguai e Bolívia (LORENZI, 1992).

Esta planta lactescente, de 5-8 m de altura, com ramos grossos, tronco tortuoso com

20-30 cm de diâmetro, com casca grossa e corticosa. Folhas quase sésseis, quando novas

densamente alvo-tomentosas, de 9-26 cm de comprimento por 4-10 cm de largura. Esta

planta possui flores pequenas, branco-tomentosas e muito perfumadas, reunidas em

cimeiras terminais. O fruto é semi-lenhoso, deiscente, contendo 4-8 sementes (Figura 9,

pg.54) (LORENZI, 1992).

O extrato etanólico do caule de A. tomentosum mostrou-se ativo em ensaios in vitro

com a forma tripomastigota do Trypanossoma cruzi, agente etiológico da doença de

Chagas. Da fração alcaloídica, isolou-se a uleína (18) que eliminou completamente o

parasito do sangue na concentração de 0,31 mg⁄mL (ABREU e SILVA et al., 2002).

Utilizando-se o modelo de Artemia salina, avaliou-se a toxicidade dos extratos

brutos obtidos de caules, frutos e folhas de A. tomentosum, observando-se que, neste

modelo, os extratos mostraram-se pouco tóxicos (CI

> 500 µg⁄ mL) (GARCIA, 2000).

Figura 9: Aspidosperma tomentosum: árvore, inflorescências, frutos, sementes, casca e madeira.

Fonte: LORENZI, 1992.

Os alcalóides isolados de A. tomentosum estão listados na Tabela 1 (pg. 61) e suas

estruturas são mostrados no Quadro 14 (pg. 54).

Quadro 14: Estruturas químicas de alcalóides isolados de A. tomentosum.

COCH

Uleína (18):

, R

Limatinina (66)

Epiuleína (19):

H, R

Fonte:

JÁCOME, 1998.

3.2-

Esenbeckia

febrífuga

: posição taxonômica, fitoquímica, etnofarmacologia e

atividades biológicas

Pertence a família Rutaceae Juss. que está distribuída em regiões tropicais,

subtropicais e temperadas do mundo, sendo constituída por 1600 espécies. No Brasil,

ocorrem 182 espécies pertencentes a 29 gêneros (BARROSO et al., 1986), entre as quais

têm-se os gêneros Zanthoxylum L. e Esenbeckia Kunth. (MELO e ZICKEL, 2004).

Esenbeckia é um dos quatro gêneros que formam a subtribo Pilocarpinae, tribo

Galipeae (anteriormente Cusparieae), subfamília Rutoideae e família Rutaceae. A

monografia desta subtribo foi descrita na “Flora Neotropica by Kaastra”, em 1982, e

contém catalogadas vinte e seis espécies pertencentes a este gênero. Trabalho mais recente,

relata a existência de mais duas espécies presentes no Brasil e adjacências da Bolívia

(PIRANI, 1999).

Em termos fitoquímicos, este gênero se caracteriza pela presença de alcalóides

quinolínicos, furanoquinolínicos e acridonas (DREYER et al., 1980; GUILHON et al.,

1994; OLIVEIRA et al., 1996 e SIMPSOM e JACOBS, 2005); cumarinas e

furanocumarinas (DREYER et al., 1980; GUILHON et al., 1994; OLIVEIRA et al., 1996;

TRANI et al., 1997; RIOS e DELGADO, 2002 e SIMPSOM e JACOBS, 2005);

flavonóides (KUBO, 1991); limonóides (OLIVEIRA et al., 1996); derivados do ácido

cinâmico (GUILHON et al., 1994) e triterpenos (RIOS e DELGADO, 1992). Na Tabela 2

(pg. 62) consta à relação das substâncias isoladas de espécies pertencentes a este gênero, e

no Quadro 15 (pg. 58) são mostradas as estruturas químicas de representantes dos diversos

tipos estruturais.

Em termos de uso como planta medicinal, muito pouca informação consta na

literatura sobre o gênero Esenbeckia. E. yaxhoob Lundell é utilizada pela população de

Yucatán (Penísula de Yucatán, México) para o tratamento de doenças do trato

gastrintestinal (MATA et al., 1998).

Esenbeckia febrifuga, conhecida popularmente como três-folhas-vermelhas, quina-

do-mato e laranjeira-do-mato (CARVALHO et al., 1991; MELO e ZICKEL, 2004), pode

ser encontrada na Argentina, Paraguai e Brasil, ocorrendo nos estados do Ceará, Mato

Grosso, Paraná, Rio de Janeiro, São Paulo e Pernambuco (Agreste) (MELO e ZICKEL,

2004). Em geral, esta planta é encontrada em florestas semidecíduas da bacia do Paraná e

na parte elevada da floresta atlântica, mas com baixa ocorrência em floresta de restinga

(LORENZI, 1992). Na figura 10 (pg. 57) encontram-se fotografias da árvore, folhas, frutos,

sementes, cascas e madeira de E. febrífuga.

Em termos de composição química e atividade farmacológica existem,

relativamente, poucas informações sobre E. febrifuga. Desta planta foi isolado o aurapteno

(99), que se mostrou ativo na inibição do crescimento de formas promastigotas de culturas

axênicas de Leishmania major (NAPOLITANO et al., 2004).

Carvalho e cols. (1991) demonstraram, em ensaios in vivo, em camundongos

infectados com P. berghei, que o extrato aquoso de casca/talo desta planta, na dose de 1,0

g/kg, inibiu em 43% a multiplicação do parasito.

Figura 10: Esenbeckia febrifuga: árvore, inflorescências, frutos, sementes, casca e madeira.

Fonte:

LORENZI, 1992.

De extratos obtidos de diferentes espécies pertencentes ao gênero Esenbeckia já

foram isoladas várias substâncias que estão relacionadas na Tabela 2 (pg. 62) e algumas

estruturas químicas são mostradas no Quadro 15 (pg. 58).

Quadro15: Estruturas químicas de substâncias isoladas de espécies pertencentes ao gênero

Esenbeckia.

1- Limonóides

Limonina (67)

2- Furanoquinolinas

Kokusaginina (68)

: R

= R

= H; R

= R

= OCH

Maculina (72):

Dictamina (69):

= R

= H

Flindersiamina (73):

=H; R

-OCH

Skimmiamina (70):

R1 = R

= OCH

; R

= R

= H

γ γ

-Fagarina (71):

R1 = OCH

; R

= R

= H

3- Furanocumarinas

OCH

O O

Bergapteno (74):

R=OCH

, R”= H

Pimpinelina Chalepina

8-Hidroxibergapteno (75):

R= OCH

, R”=OH

(78)

(79)

Isopimpinelina (76):

R=R”= OCH

Xantoxina (77):

R=H; R”= OCH

Quadro 15: Continuação

4- 2- Arilquinolonas

OCH

(80)

R=H

(81)

R=OCH

5- Sesquiterpenos

Espatulenol (82)

6- Esteróides Triterpeno

ββ

- sitosterol (83)

Valenol (84)

7- 2- 2-Aquilquinolonas

OCH

OCH3

CH3

85 86

8- Flavonóides

Ram

Kampferol-3-O-ramnosídeo (87) Quercetina-3-O-ramnosídeo (88)

Fonte:

OLIVEIRA, 1995.

Tabela 1: Substâncias isoladas de espécies pertencentes ao gênero Aspidosperma.

Espécies Substância isolada (número da estrutura

química)

Referências

A. cylindrocarpon

Refractina (43); pirifolina (44); pirifolidina

(45), N-cinamoilcilindrocarina (46); N-

acetilcilindrocarina (47); cilindrocarina (48);

N-benzoilcilindrocarina (49); N-

metilcilindrocarina (50); 12-desmetoxi-N-

aceticilindrocarina (51); 19-

hidroxicilindrocarina (52); N-diidrocinamoil-

19-hidroxicilindrocarina (53); N-acetil-19-

hidroxicilindrocarina (54); N-cimamoil-19-

hidroxicilindrocarina (55); N-

formilcilindrocarpinol (56); cilindrocarpinol

(57) e N-acetilcilindrocaspinol (58).

GILBERT et al., 1960;

ANTONACCIO, 1960;

DJERASSI et al., 1961;

DJERASSI et al., 1962

e BOLZANI et al.,

1987.

A. olivaceum

Elipticina (17); uleína (18); epiuleína (19);

aparicina (39); aspidocarpina (28) e olivacina

(59).

GILBERT et al., 1965.

A. parvifolium

N- metiltetraidroelipticina (38); uleína (18);

epiuleína (19); desmetiluleína (40); aparicina

(39); lupeol (41) e estiigmasterol (42).

JÁCOME, 1998 e

JÁCOME et al., 2004

A. ramiflorum

Ramiflorina A (61); ramiflorina B (62); β-

yoimbina (31) e 10-metoxigeissoschizol (60).

MARQUES et al., 1996

A. spruceanum

Aspidoalbina (63); acetilaspidoalbina (64) e

desmetilaspidolimidina (65).

GILBERT et al., 1965

A. tomentosum

Uleína (18); epiuleína (19) e limatinina (66). ARNDT et al., 1967

Tabela 2:

Substâncias isoladas de espécies pertencentes ao gênero Esenbeckia

Espécies Substâncias isoladas Referências

E. almawillia

Kaastra

2-Alquilquinolin-4-ona alcalóide; isopimpinelina;

chalepina; flindersiamina e maculosidina.

GUILHON et al., 1994;

OLIVEIRA et al., 1996 e

BARROS FILHO et al.,

2004

E. conspecta

Kunth

β-Sitosterol; ácido oleico; ácido palmítico;

espatulenol; clovandiol; felopterina; 8-metoxi-N-

metilflindersina; flindersiamina; maculosidina e

glicosídeo de β-sitosterol.

RIOS et al., 2002

E. febrifuga (A.St-

Hil.)

Aurapteno

NAPOLITANO et al., 2004

E.grandiflora

Matius

Kokusaginina; maculina; flindersiamina;

xantotoxina e pimpinelina.

OLIVEIRA et al., 1996

E. grandiflora

Martius subsp

brevipetiolata

Kaastra

Pimpinelina; isopimpinelina; xantoxina; 5-

senecioil-xantotoxina; 3-(1’,1’-dimetilalil)-

columbianetina; kokusaginina; flindersiamina; γ-

fagarina; skimiamina; delbina; diidrochalconas

M-1 e M-2; kampferol-3-O-ramnosídeo e

quercitin-3-O-ramnosídeo.

TRANI et al., 2004

E. litoralis Kunth Rutaevina; limonina; bergapteno; 8-

hidroxibergapteno;isopimpinelina; kukosaginina;

imperatorina; felopterina; alomimperatorina; 1-

hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona; dictamina;

evolitrina; maculina e skimmianina.

DREYER, 1980

E. ovata Kunth

Friedelina; lupenona; cariofileno β-óxido; lupeol;

β-sitosterol; bergapteno; isopimpinelina;

xantotoxina; felopterina e criptomeridiol.

RIOS e DELGADO, 2002

E.stenphani

Ramos

β-Sitosterol; cariofileno- β-óxido; friedelina e

valenol.

RIOS e AGUILAR-

GUADARRAMA, 2000

E. yaxhoob Lindell 2-Tridecanona

MATA et al., 1998

E. yaaxhokob Flindersiamina e espatulenol.

AGUILAR- GUADAR-

RAMA e RIOS, 2004

4- MATERIAL

4.1- Equipamentos

Estufa com circulação de ar Fanem, modelo 315/9

Moinho de facas Marconi, modelo 6294

Evaporador rotatório Buchi, modelo R 114, com banho-maria modelo 480

Ultra-som Thornton, modelo T14

Banho- maria Procimed, modelo 129/4

Centrifuga Fanem, modelo 205-N

Aparelho de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência MercK-Hitachi constituído de

injetor automático (AS-2500), detector UV-VIS L450, bomba L-6200 A., integrador

AS-2500 e coluna para CLAE ODS C-18 Lichropher (250 x 4,0 mm i.d.), 5mm, Merck

50983

Aparelho de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência WATERS 2695, equipado com

detector WATERS 2996- Photodiode Array Detector

Sistema de purificação de água Millipore, Milli-Qplus

Destilador de água Biopar Ltda, modelo: BD 5L

Lâmpada de luz ultravioleta Spectroline, modelo ENF-240C

Lâmpada de luz ultravioleta Spectroline, modelo 977C

Balança analítica Mettler Toledo, modelo AB 204, precisão de 0,1mg

Balança de prato externo Micronal, modelo B-160, precisão de 1mg

Balança de prato externo Núcleo, modelo PR1000, precisão de 10mg

Fluxo Laminar Veco

Beta-cintilador 1450, Wallac, Trilux, Liquid Scintillation & Luminescence Counter

Coletor de células Harvester 96, Mach III

Leitor de Elisa Bio- Rad, model 550, microplate reader

Shaker Innova 2100

- Microscópio Axiostar Zeiss

4.2- Solventes e Reagentes

Água destilada

Água deionizada

Etanol grau comercial

Solventes P.A (Merck, Aldrich e Reagen): acetato de etila, acetona, etanol,

diclorometano, hexano, metanol

Solvente grau CLAE (Merck): acetonitrila

Ácido hexanosulfônico sal sódico Sigma

Ácidos grau P.A. (Merck): ácido acético glacial, ácido 3,5-dinitrobenzóico, ácido

sulfúrico, ácido clorídrico e ácido fosfórico.

Hidróxido de amônio P.A. (Merck)

Substâncias de Referência: rutina; uleína, ácido ursólico; eugenol, obtidos no

laboratório de Fitoquímica; saponina (Riedel de Haen, Seelze-Honnover).

Cloroquina e Mefloquina (WHO In vitro Micro test, Plate, VCRV, USM, Malaysia)

- Ortofosfato dissódico anidro (Merck).

- Ortofosfato monobásico anidro (Merck).

- Azul de metileno medicinal (Sigma).

4.3- Reagentes para revelação e fases estacionárias para CCDS:

anisaldeído

(Merck); cloreto de alumínio (Fluka); subnitrito de bismuto (Farmos); iodeto de

potássio (Merck); hidróxido de potássio (Reagem); difenilboriloxietilanina (Merck);

polietilenoglicol 4000= PEG (Merck); Sílica gel (60G Merck, artigo 7731); Sephadex

LH-20 (Sigma), cromatofolhas de sílica gel 60 (20x20 cm), Merck.

4.4-Componentes do meio de cultura e de outras soluções utilizadas nos cultivos:

dextrose (Merck); sulfato de gentamicina (Industria Química e Farmacêutica Schering);

solução de Glicerol (Fenwal Laboratories); heparina (Roche Químicos e Farmacêuticos

S.A.); HEPES- N-2-hidroxietil piperazina-N’-2-etano ácido sulfônico (Sigma); RPMI 1640

livre acido e sem hipoxantina (Gibco Laboratories); fosfato de sódio dibásico hepta-

hidratado (Merck); fosfato de sódio dibásico dodeca-hidratado (Synth); fosfato de potássio

monobásico (Merck); bicarbonato de sódio (Merck); iodeto de Potássio (Merck); meio

MEM (Gibco Laboratories); Sal de tetrazolium- MTT (Sigma); [8-

H]-Hipoxantina 1mCi

(Amersham Biosciences).

4.5- Material plástico

- Placas com 96 poços; garrafas de 50 mL; garrafas de 250mL;

placas Petri de 15 mL; tubos de 15mL e 50mL (Falcon).

4.6- Soluções especiais utilizadas neste trabalho

4.6.1- Soluções Reveladoras para Cromatografia em Camada Delgada de Sílica Gel

4.6.1.1-

Reagente de Dragendorff

(WAGNER et al., 1984)

A solução A continha: 0,850g de subnitrito de bismuto; 10,0 mL de ácido

acético e 40,0 mL de água destilada. A solução B continha 8,0 g de iodeto de potássio

dissolvido em 20,0 mL de água destilada.

Estas duas soluções foram combinadas, na proporção de 1:1, resultando uma

solução estoque. Para pulverização nas placas cromatográficas foi feita a diluição de 2,0

mL de solução estoque com 4,0mL de ácido acético glacial e 20,0 mL de água destilada.

Além deste reagente, visando intensificar a coloração das manchas

alaranjadas provenientes da revelação com reagente de Dragendorff, as placas foram

reveladas, também com solução metanólica de ácido sulfúrico a 5% (5,0 mL de ácido

sulfúrico diluído em metanol q.s.p 100,0 mL).

4.6.1.2-

Anisaldeído/ ácido sulfúrico

(WAGNER et al., 1984)

Dissolveram-se 5,5 mL de anisaldeído em 10 mL de ácido acético glacial,

em seguida adicionou-se 85,0 mL de metanol e, por último, ácido sulfúrico concentrado

(5,0 mL).

4.6.1.3-

Reagente de Lieberman-Burchard

(WAGNER et al., 1984)

Em banho de gelo, adicionaram-se 5 mL de anidrido acético, 5 mL de ácido sulfúrico e

50 mL de etanol (P.A). As placas foram pulverizadas em seguida, aquecidas a 100º C por

5-10 min.

4.6.1.4- Solução de hidróxido de potássio 5% em etanol

(WAGNER et al., 1984)

Dissolveram-se hidróxido de potássio (5 g) em 100 mL de etanol. Esta solução foi

pulverizada nas placas de CCDS e avaliaram-se as manchas no visível e sob luz UV 365

nm.

4.6.1.5-

Solução de cloreto de alumínio

a 10% em etanol

(WAGNER et al., 1984)

Dissolveram-se 10 g de cloreto de alumínio em etanol (q.s.p.100 mL). Esta solução foi

pulverizada nas placas de CCDS e avaliaram-se as manchas no visível e sob luz UV 365

nm.

4.6.1.6- NP/PEG

(WAGNER et al., 1984)

Preparou-se uma solução metanólica a 1% de difenilboriloxietilamina (NP) e uma

solução etanólica de polietileneglicol –4000 (PEG). No momento da utilização, misturou-se

10mL de NP com 8 mL de PEG, pulverizou-se as placas com esta solução e observou-se as

manchas com lâmpada de UV 365 nm.

4.6. 2- Solução utilizada como fase móvel em CLAE

4.6.2.1- Tampão fosfato (NaH

PO4/H

)

Preparou-se uma solução 0,1 M de fosfato de sódio dibásico. O ajuste do pH para

2,6 e 5,0 foi feito utilizando o ácido fosfórico. A este tampão fosfato foi adicionado 2,5 mM

de sal sódico de ácido hexanosulfônico.

4.6.3- Soluções utilizadas durante o cultivo do

falciparum

4.6.3.1- Meios de cultivo:

Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) e meio

completo

Em 900,0 mL de água bidestilada dissolveu-se 10,4 g do pó de RPMI 1640.

Adicionaram-se 5,94 g de tampão HEPES, 40 mg de gentamicina e completou-se o volume

para 1000 mL com água bidestilada. Homogeneizou-se, filtrou-se em membrana

esterilizante e estocou-se a 4º C (solução de uso imediato) e a 70

C negativos (solução de

uso tardio).

O meio completo foi preparado adicionando-se plasma humano (grupo sangüíneo

do tipo A+) à solução do meio RPMI (9:1). Para cada 100 mL de meio foi adicionado 2,1

mL solução de bicarbonato de sódio 10% (pH 7,2-7,4).

4.6.3.2- Soluções utilizadas no descongelamento do parasito

a- Solução A: cloreto de sódio a 12% (p/v)

Dissolveu-se o cloreto de sódio (6 g) em água bidestilada (q.s.p. 50 mL), filtrou-se a

solução em membrana de 0,22 µ e estocou-se a 4

b- Solução B: cloreto de sódio a 1,6%

A solução B foi preparada dissolvendo-se 1,6 g de cloreto de sódio em água

bidestilada (q.s.p. 100 mL). A solução foi filtrada em membrana de 0,22 µ e estocada a 4

c- Solução C: cloreto de sódio glicosado

Dissolveram-se 0,9 g de cloreto de sódio e 0,2 g de glicose em água destilada (q.s.p.

100 mL). A solução foi filtrada em membrana de 0,22 µ e estocada a 4

4.6.3.3- Solução utilizada na sincronização do parasito

Para a sincronização do parasito utilizou-se uma solução aquosa contendo 5% de

sorbitol e 0,5% de glicose. Esta solução foi filtrada em membrana de 0,22 µ e estocada a 4

4.7- Coloração de gota espessa e esfregaço

4.7.1- Solução estoque de Giemsa

Dissolveu-se 1 g de Giemsa em 54 mL de glicerol, resfriou-se, adicionou-se 84 mL

de metanol e deixou-se por 24h a 37º C, com agitação. Filtrou-se e armazenou-se em vidro

âmbar. Esta solução foi diluída, na proporção 1:20 com água tamponada (50 µL/ 1000 µL),

antes de sua utilização.

4.7.2- Água tamponada (pH 6,8)

A água tamponada continha 9,3 g de fosfato de potássio monobásico; 10,84 g de

fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado e água destilada (qsp. 500 mL). Homogeneizou-

se, filtrou-se.

4.7.3- Azul de metileno

Triturar 1,0g de azul de metileno, 3,0g de ortofosfato dissódico anidro e 1,0g de

ortofosfato monobásico anidro. Dissolver em 1,25mL de água bidestilada, homogeinizar e

filtrar.

4.8-Material biológico

4.8.1- Clones de

P. falciparum

lones W2 e 3d7 foram gentilmente cedidos pela Dra. Luzia Helena de Carvalho,

Centro de Pesquisas René Rachou-CPRR, FIOCRUZ, Belo Horizonte, Minas Gerais,

Brasil. O clone W2 é originário da Indochina e é sensível a mefloquina e resistente a

cloroquina. O clone 3d7 é proveniente da África, sendo sensível a cloroquina.

4.8.2- Plasma humano

O plasma foi cedido pelo Banco de Sangue HEMOPA, Belém, PA. Os pacientes

doadores eram pertencentes ao grupo sangüíneo A fator Rh positivo, sendo o sangue

colhido com citrato de sódio e centrifugado a 500G por 20 minutos. O plasma sobrenadante

foi isolado, aliquotado e conservado sob refrigeração.

4.8.3- Hemácias humanas

As hemácias foram colhidas de doador cujo sangue é do tipo O+. O sangue foi

colhido assepticamente, armazenado em tubo contendo CPDA (Citrato Fosfato Dextrose

Adenosina) a 4ºC por 30 dias. Semanalmente, uma alíquota deste sangue foi transferida

para um tubo contendo heparina e centrifugado (600G/10min), sendo o plasma e a camada

de leucócitos desprezados. Após duas lavagens com meio RPMI 1640, as hemácias foram

re-suspensas em meio completo na proporção 1:1 e estocadas a 4

C, por 1 semana.

4.9- Material vegetal

As cascas de A. parvifolium. foram coletadas em Paracatú e sua determinação

taxonômica foi realizada pelo Prof. Dr. Júlio Antônio Lombardi, do Depto de Botânica,

Instituto de Ciências Biológicas, UFMG. Uma exsicata foi depositada no Herbário do ICB,

UFMG, Belo Horizonte.

As amostras de folhas e galhos das espécies A. ramiflorum, A. spruceanum e A.

olivaceum foram coletadas no Campus da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),

Belo Horizonte, em setembro de 2003, pelo Prof. Dr. Júlio Antônio Lombardi, àquela época

no Depto de Botânica, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG, e atualmente na UNESP-

Rio Claro, SP. Também a determinação taxonômica foi feita pelo mesmo Professor. As

exsicatas de A. ramiflorum e A. spruceanum foram depositadas no Herbário do ICB,

UFMG, Belo Horizonte, MG, sob os registros BHCB 848 e BHCB 46274, respectivamente.

Os caules de Esenbeckia febrifuga foram coletados no Campus da UFMG, Belo

Horizonte, MG e uma exsicata foi depositada no Herbário do ICB, UFMG, Belo Horizonte,

sob o registro número 3825.

Todo o material vegetal foi lavado em água corrente, à temperatura ambiente, e

submetido a dessecação, em estufa com circulação de ar, mantendo-se a temperatura entre

35 - 40

C. Após a secagem foi reduzido a pó, em moinho de facas, e acondicionados em

frascos de vidros hermeticamente fechados. De parte deste material (no mínimo 100 g)

preparou-se o extrato etanólico de cada espécie por percolação, ou em aparelho de Soxlet

com diclorometano e etanol.

5- METODOS

5.1- Preparação dos extratos e caracterização fitoquímica

5.1.1- Obtenção dos extratos

Uma parte do pó de cada planta foi submetida à extração por percolação exaustiva, com

etanol a 96

GL. O percolato obtido foi concentrado em rotavapor, 50

C, sob pressão

reduzida, fornecendo resíduos que foram armazenados em dessecador até peso constante.

Outra parte do pó foi tratada com hidróxido de amônio, colocado em cartucho e

extraído, sucessivamente, em aparelho de Soxhlet, com diclorometano e etanol 96

GL. Os

percolatos obtidos foram concentrados em evaporador rotatório, a 50

C, sob pressão

reduzida, fornecendo resíduos que foram armazenados em dessecador até peso constante.

5.1.2- Extração ácido-base

Ao extrato etanólico de cascas de A. parvifolium (10,0 g) adicionaram-se pequeno

volume de etanol (<10 mL) e HCl aquoso a 3% (250 mL). Filtrou-se em funil de haste com

filtro de papel pregueado e separou-se a solução aquosa ácida que foi extraída com

diclorometano (3 x 250 mL), obtendo-se uma camada de diclorometano (APN-1), uma

camada aquosa ácida (APA-1) e uma interfase (API-1). A APA-1 adicionou-se NH

OH até

pH 9 e extraiu-se com diclorometano (3 x 250 mL), obtendo-se uma camada aquosa

alcalina (APAA) e uma camada orgânica (APT). APAA ainda foi extraída com clorofórmio

(1 x 250 mL), obtendo-se a camada clorofórmica (APTC). O fluxograma deste processo

encontra-se na Figura 11 (pg. 73).

Os extratos etanólicos de cascas de A.parvifolium (10,0 g) e de caules de E.

febrifuga (97,1 g) foram solubilizados em reduzido volume de etanol (<10 mL) e HCl

aquoso a 1N (250 mL) seguindo-se de extração com diclorometano (3 x 250 mL), obtendo-

se uma camada de diclorometano (APN-2 e EFN) e uma camada aquosa ácida (APA-2 e

EFA). A esta se adicionaram NH

OH até pH 9 e extraiu-se com diclorometano (3 x 250

mL), obtendo-se uma camada aquosa alcalina (APAA e EFAA) e uma camada orgânica

(APT-2 e EFT). O fluxograma destas extrações encontra-se na Figura 12 (pg. 74).

Extrato etanólico de cascas de A. parvifolium (10g)

1- Etanol/HCl aquoso a 3%

2-Filtração

Solução aquosa ácida Resíduo

1- Diclorometano

Camada Orgânica Camada aquosa ácida

APN-1 API APA-1

1- NH

OH (pH 9)

2- Diclorometano

Camada aquosa alcalina Camada orgânica

APAA APT-1

Clorofórmio

APAA APTC

Figura 11: Fluxograma da extração ácido-base do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium.

Legenda:

APN1- fração diclorometano (neutros), API-1- fração intermediária, APA-1 camada aquosa ácida, APAA-

camada aquosa alcalina, APT1- fração alcaloídica diclorometano e APTC- fração alcaloídica clorofórmica.

Extratos etanólicos de cascas de

A. parvifolium e caules de E. febrifuga

1-EtOH / HCl 1N

2- Extração com diclorometano

Camada orgânica Camada aquosa ácida (APA-2 ou EFA)

(APN-2 ou EFN)

1- NH

OH até pH 9

2-Extração com diclorometano

Camada orgânica Camada aquosa alcalina

(APT-2 ou EFT) (APAA ou EFAA)

Figura 12:

Fluxograma da extração ácido-base a partir dos extratos etanólicos de cascas de

A. parvifolium e de caules de E. febrifuga.

Legenda:

APN2 e EFN- fração diclorometano de neutros, APT2 e EFT- fração alcaloídica diclorometano, APAA e

EFAA- camada aquosa alcalina.

5.2.- Estudos fitoquímicos

5.2.1- Prospecção fitoquímica por cromatografia em camada delgada de sílica gel

(CCDS)

As amostras foram pesadas (mínimo de 10 mg) e solubilizadas em solventes

adequados, em ultra-som, por 20 min. e aplicadas em cromatofolhas de sílica gel 60 (20x

10 cm). A pesquisa de diferentes classes de metabólitos foi realizada de acordo com as

indicações da Tabela 3 (pg. 75).

Tabela 3: Prospecção por CCDS e classes de metabólitos secundários nos extratos e

frações: classes pesquisadas, eluentes e reveladores utilizados.

Classes de metabó-

litos/ Referências

Eluentes Reveladores Observações

Alcalóides/

Wagner et al., 1984

Acetato de etila:

metanol: água

(100:13,5:10).

Tolueno: acetato de

etila: dietilamina (70:

20:10).

UV 253 e 365 nm

Reagente de Dra-

gendorff (RD)

UV: Manchas

fluorescentes amarelas e

azuis. RD:Manchas

marrons e alaranjadas

2-Esteróides e Triter-

penos/ Wagner et al.,

1984.

Acetato de etila:

metanol: água

(77:15:8)

Diclorometano:

acetato de etila (1:1)

Anisaldeído-H

Liberman-Burchard

(LB)

LB-Triterpenos

pentaciclicos livres-

manchas pardas a

vermelhas; Esteróide

livre-azuis seguidas de

verde permanente.

3- Flavonóides/

Wagner et al., 1984

Acetato de etila: ácido

fórmico: ácido acético:

água (50:6,5:6,5:13)

Clorofórmio: acetato

de etila (60:40)

UV 253 e 365 nm

Solução de Cloreto de

alumínio a 10%

UV253:fluorescência

escura ou amarela;

UV 365: fluorescência

azul, verde ou amarelo;

AlCl

: intensificação da

fluorescência.

4- Cumarinas/ Wagner

et al., 1984

Acetato de etila: metanol

(70:30)

UV 253 e 365 nm

Solução de hidróxido de

potássio a 5%

UV 365: Fluorescência

azul, preta ou amarelo;

KOH- intensificação da

fluorescência.

5- Saponinas/ Wagner

et al., 1984

Clorofórmio: metanol

(95:5)

Anisaldeido- ácido

sulfúrico

Manchas violáceas

5.2.2- Perfís por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

5.2.2.1- Preparo das amostras

Quantidades exatas dos extratos e frações (10 a 20 mg) foram solubilizadas em 1,0

mL de metanol, os frascos foram deixados em banho de ultra-som por 30 minutos ou até

máxima dissolução. Após a solubilização, estas amostras foram centrifugadas por 10

minutos a 10.000 rpm, a fração solúvel foi transferida para o frasco para CLAE e os perfis

cromatográficos foram determinados utilizando diferentes fases móveis para A. parvifolium

e tampão fosfato pH 2,6: acetonitrila para as demais plantas.

5.2.2.2- Condições cromatográficas

A escolha das fases móveis foi realizada com base em diferentes trabalhos

científicos. O comprimento de onda escolhido para leitura das amostras de Aspidosperma

(λ=300 nm) baseou-se no espectro no UV da uleína (JÁCOME, 1998).

5.2.2.2.1- Condição cromatográfica 1

Coluna: RP-18

Eluente: gradiente de solução tampão fosfato pH 2,6 (A) e acetonitrila (B), 0 min 85% de A

e 15% de B, em 30 min. 60% de A e 40% de B, em 40 min. 20% de A e 80% de B e em 50

min. 85% de A e 15% de B.

Temperatura: 30

Detecção: UV a 300 nm.

Fluxo: 1 mL/min. por 50 min.

(STÖCKIGT et al., 2002; TIKHOMIROFF e JOLICOEUR,

2002).

5.2.2.2.2- Condição cromatográfica 2

Coluna: RP-18

Eluente: gradiente de solução tampão fosfato pH 2,6 contendo 2,5 mM de sal sódico de

ácido hexanosulfônico (A) e acetonitrila (B), 0 min. 85% de A e 15% de B, em 30 min.

60% de A e 40%de B, em 40 min. 20% de A e 80% de B e em 50 min 85% de A e 15% de

Temperatura: 30

Detecção: UV a 300 nm.

Fluxo: 1 mL/min. por 50 min.

(STÖCKIGT et al., 2002).

5.2.2.2.3- Condição cromatográfica 3

Coluna: RP-18

Eluente: água (A) e acetonitrila (B), 0 min. 85% de A e 15% de B, em 30 min. 60% de A e

40% de B, em 40 min. 20% de A e 80% de B e em 50 min. 85% de A e 15% de B.

Temperatura: 30

Detecção: UV a 210 nm.

Fluxo: 1 mL/min. por 50 min..

5.2.2.2.4- Condição cromatográfica 4

Coluna: RP-18

Eluente: gradiente de solução tampão fosfato pH 2,6 (A) e acetonitrila (B), 0 min. 85% de

A e 15% de B, em 30 min. 60% de A e 40% de B, em 40 min. 20% de A e 80% de B e em

50 min. 85% de A e 15% de B.

Temperatura: 30

Detecção: UV a 2100 nm.

Fluxo: 1 mL/min. por 50 min..

5.2.2.3- Injeção das amostras

Foi utilizado como controle negativo a acetonitrila; foram analisados os extratos, as

frações de neutros, as frações de alcalóides totais e as substâncias puras. Para identificação

dos picos no extrato etanólico de cascas de A. parvifolium foram feitas co-injeções com

uleína e aparicina. A fim de verificar a repetitividade dos resultados, foram feitas duas

análises, sendo que, em cada vez, utilizou-se uma nova amostra do extrato.

5.2.3-Análise em CLAE acoplado a detector com arranjos de diodos (DAD)

5.2.3.1- Condição cromatográfica

Coluna: RP-18

Eluente: gradiente de solução de ácido fosfórico a 0,1% v/v (A) e acetonitrila (B); 0 min.

95% A e 5% de B; 60 a 65 min. 5% de A e 95% de B; 70 min. 95% de A e 5% de B.

Temperatura: 40

Detecção: UV 210 nm

Fluxo: 1 mL/min. por 50 min..

O preparo das amostras e o modo de injeção foram semelhantes àqueles de outras

análises realizadas no CLAE (5.2.2.1). As diferenças nas condições utilizadas nesta análise

fundamentam-se em JÁCOME (1998).

5.2.4- Fracionamento da fração de alcalóides totais (APT-1) obtida por extração

ácido-base do extrato etanólico de

A. parvifolium

5.2.4.1- Por cromatografia de coluna

A fração APT1 (1,0 g) foi solubilizada em metanol, incorporada em sílica gel (1,0

g) e submetida à cromatografia em coluna aberta, empacotada com 50 g de sílica gel

(0,063-0,200 mm) e n-hexano. Para eluição, empregaram-se misturas de solventes de

polaridade crescente, conforme Tabela 4 (pg. 79). Foram recolhidas frações de volume

variável e estas foram reunidas de acordo com seus perfís cromatográficos, resultando em

20 frações, denominadas de APT- F1 a 20.

Tabela 4: Dados referentes à coluna cromatográfica em sílica gel do APT-1 (1,0 g).

Eluente (volume) Frações Massa (mg)

1- Hexano (200 mL) APP- F1 3,1

2- Hexano: Diclorometano 1:1 (250 mL) APT- F2 6,8

3- Diclorometano (450 mL) APT- F3

APT- F4

4,3

2,3

4- Diclorometano: Acetato de Etila 9:1 (280 mL) APT- F5 4,6

5- Diclorometano: Acetato de Etila 1:1 (350 mL) APT- F6

APT- F7

3,2

1,9

6- Acetato de Etila (700 mL) APT- F8

APT- F9

APT- F10

0,9

1,5

7- Acetato de Etila: Metanol 1:1 (600 mL) APT- F11

APT- F12

APT- F13

APT- F14

APT- F15

1,0

176,0

331,0*

8- Metanol (300 mL) APT- F16

APT- F17

1,0

1.7

9- Metanol: Água 1:1 (500 mL) APT- F18

APT- F19

APT- F20

151,0

90,0

200

Total 981,8

Fase estacionária: sílica gel (50,0g); coluna de diâmetro de 2 cm e altura de 20 cm

Leganda:

* As frações 13, 14, 15 e 16 foram reunidas e após a reunião determinou-se a massa.

A fração APT- F12 (176,0 mg) foi submetida a cromatografia em coluna utilizando-

se com a fase estacionária o Sephadex LH-20 (diâmetro da coluna 2 cm e altura 26 cm), e

como fase móvel o metanol. Foram obtidas 18 frações denominadas de APT-F12 (1 a 18).

As frações APT- F13, APT- F14, APT- F15 e APT- F16 foram reunidas e submetidas à

cromatografia em coluna de sílica gel (300mg) (0,063-0,200 mm) e como fase móvel

utilizaram-se misturas de solventes de polaridade crescente, sendo obtidas 21 frações

denominadas de APT-F13-16 (1 a 21). O esquema utilizado na eluição está mostrado na

Tabela 5 (pg. 80).

Tabela 5: Dados referentes à coluna cromatográfica aberta do APT- F13-16 (300 mg).

Eluente (volume) Fração Massa (mg)

1-Clorofórmio (220 mL) APT- F13-16 (1)

APT- F13-16 (2)

APT- F13-16 (3)

APT- F13-16 (4)

1,2

0,6

0,9

0,6

2- Clorofórmio: Metanol 9,5: 0,5 (440

mL)

APT- F13-16 (5)

APT- F13-16 (6)

APT- F13-16 (7)

APT- F13-16 (8)

APT- F13-16 (9)

APT- F13-16 (10)

APT- F13-16 (11)

1,2

0,5

20,1

29,1

21,2

23,2

9,6

APT- F13-16 (12)

APT- F13-16 (13)

APT- F13-16 (14)

APT- F13-16 (15)

1,2

1,5

2,8

3- Clorofôrmio: Metanol 9,0: 1,0 (150

mL)

APT- F13-16 (16)

APT- F13-16 (17)

APT- F13-16 (18)

3,2

2,6

3,2

4- Metanol (100 mL) APT- F13-16 (19) 21,5

5- Metanol: Água 1:1 (200 mL) APT- F13-16 (20)

APT- F13-16 (21)

105,2

Total 295,6

Fase estacionária: Sephadex LH-20; coluna: diâmetro da coluna 2 cm e altura 26 cm.

A fração APT- F13-16 (10 a 11) (33,0 mg) foi submetida à cromatografia em coluna

de Sephadex LH- 20 (diâmetro 2 cm e altura 26 cm), fase móvel metanol, obtendo-se 28

frações.

A fração APT- F12 (4-9) também foi submetida cromatografia em coluna de

Sephadex LH-20 (diâmetro 2 cm e altura 26 cm), utilizando-se como fase móvel o metanol,

obtendo-se 33 frações.

Todas as frações que apresentaram uma única mancha em CCDS, [APT- F13-16

(7); APT- F13-16 (8)], foram submetidas às seguintes análises: 1

Perfil em CLAE, 2

espectrometria no UV e IV; espectrometria de massa. Os resultados destas análises foram

comparados aos dados contidos na tese de doutorado de Jácome (1998), para confirmação.

5.3- Avaliação da atividade antiplasmódica

5.3.1-Descongelamento dos clones de

P. falciparum

A amostra foi retirada do crio-banco do Laboratório de Malária, IEC, Ananindeua,

PA, e colocada em banho–maria (37,5

C). Após completo descongelamento, adicionou-se,

para cada 1 mL da suspensão, 0,4 mL de solução A (NaCl a 12%), gota a gota, com

agitação, e após a adição a solução final foi deixada em repouso por 5 min..

Após repouso, acrescentaram-se 9,0 mL da solução B (NaCl a 1,6%), gota a gota,

agitando-se levemente e centrifugou-se (2000 rpm/10 min.), separou-se e desprezou-se o

sobrenadante e ao sedimento adicionaram-se 9,0 mL de solução C (NaCl a 0,9% e glicose a

0,5%), em condições semelhantes a B. O sedimento obtido foi diluído em 20,0 mL de meio

completo contendo 20% de plasma, e distribuído em 2 placas Petri.

5.3.2- Cultivo do

Plasmodium falciparum

O cultivo foi realizado de acordo com Trager e Jensen (1976) e Jensen e Trager

(1977). Após o descongelamento e, até ser observado que o crescimento do parasito estava

em fase exponencial, utilizaram-se meio completo contendo 20% de plasma (do grupo

sangüíneo O Rh+). Uma vez em crescimento exponencial, passaram-se a utilizar meio

completo contendo 10% plasma. A cultura foi mantida em estufa a 37

C, em atmosfera de

3 a 5% de CO

, conseguida através da queima de vela, em dessecador.

A parasitemia foi diariamente determinada e, quando maior que 6%, a placa era

submetida à sincronização com sorbitol ou diluída.

5.3.3.- Coloração de gota espessa e esfregaço e determinação da parasitemia

Diariamente, durante o cultivo de P. falciparum, uma gota de material foi retirada e

utilizada para a confecção de lâmina contendo a gota espessa e o esfregaço. A gota espessa

foi secada à temperatura ambiente, seguindo-se sua desemoglubinização com azul de

metileno e coloração com Giemsa, por 20 min.. O esfregaço foi secado em temperatura

ambiente, fixado com metanol e corado com Giemsa, por 20 min.. As lâminas foram

lavadas com água tamponada, secadas à temperatura ambiente e examinadas ao

microscópio óptico, com objetiva de imersão (1000x).

As parasitemias nos esfregaços corados foram determinadas pela contagem do número

de hemácias infectadas em 2000 células, no caso de parasitemia elevada (>10%). No caso

de parasitemia menor que 10%, fazia-se uma estimativa do número de hemácias por campo,

e calculava-se o número de campos que deveriam ser contados para se obter um total de

5.000 a 10.000 hemácias.

Quando o objetivo era realizar a sincronização ou microteste, determinava-se-se a

parasitemia diferencial, onde se contavam, no total, 100 parasitos classificando-os como

trofozoítos ou esquizontes. Na Figura 13 estão representadas às diferentes formas do

parasito.

5.3.4- Sincronização dos parasitos

De placas contendo predominantemente trofozoítos e com parasitemia maior que

6%, o meio era removido e era adicionada uma solução aquosa contendo 5% de sorbitol e

0,5% de glicose. Após 10 a 15 min. adicionava-se o meio completo e centrifugava-se por 5

min.. O sobrenadante era desprezado, adicionava-se meio completo e novamente era

determinada a parasitemia diferencial (Figura 13) (CARVALHO, 1990). Após 48h da

sincronização, caso fosse observada a predominância de trofozoitos (>90%), realizava-se o

ensaio.

5.3.5-Congelamento dos clones

P. falciparum

O congelamento dos clones foi realizado de acordo com a técnica descrita por

Meryman e Hornblower (1972). Os parasitos foram congelados em uma solução de glicerol

a 57% (Glycerolyte). O sangue infectado contendo, predominantemente, trofozoítos

(parasitemia > 10%), foi centrifugado a 2000 rpm/ 10 min., sendo desprezado o

sobrenadante. Para cada 1,0 mL de sedimento adicionaram-se 1,0 mL de glycerolyte, a

suspensão foi distribuída em ampolas e estocadas em nitrogênio líquido.

Figura 13: Diferentes estágios do P. falciparum.

5.3.6- Preparo das placas contendo 96 poços utilizadas nos ensaios

As amostras foram pesadas em balança analítica (extratos e frações= 10 mg e

substâncias puras= 1 mg) e solubilizadas em metanol (10 mg foram solubilizados em 10

mL e 1 mg em 1 mL). Em seguida foram feitas diluições sucessivas (1 mL de solução : 1

mL de metanol), e a distribuição nas placas contendo 96 poços (Figura 14, pg. 84) foi feita

de acordo com esquema mostrado na Tabela 6 (pg. 84).

Figura 14: Esquema da placa de 96 poços utilizada nos ensaios para atividade antiplasmódica.

Legenda: na posição vertical colunas de 1 a 12 e na posição horizontal linhas de A a H.

Tabela 6: Esquema utilizado no preparo das placas utilizadas nos ensaios.

Método utilizando a [8-

H] hipoxantina Microteste tradicional

Colunas Linhas Amostras Colunas Linhas Amostras

1-6 A Controle 1-12 A Controle

7-12 A Controle solvente 1-12 B Controle solvente

1-6 B

20 µg da amostra

⁄poço

1-12 C

20 µg da amostra

⁄poço

7-12 B Hemácias não

parasitadas

1-12 D

10 µg da amostra

⁄poço

1-6 C

20 µg da amostra

⁄poço

1-12 E

5 µg da amostra

⁄poço

1-6 D

10 µg da amostra

⁄poço

1-12 F

2,5 µg da amostra

⁄poço

1-6 E

5 µg da amostra

⁄poço

1-12 G

1,25 µg da amostra

⁄poço

1-6 F

2,5 µg da amostra

⁄poço

1-12 H

0,625µg da amostra

⁄poço

1-6 G

1,25 µg da amostra

⁄poço

- - -

1-6 H

0,625µg da amostra

⁄poço

- - -

As placas permaneciam destampadas dentro do fluxo laminar até completa

evaporação do metanol, sendo depois tampadas, lacradas e guardadas a -4º C, até o

momento do ensaio. Nos ensaios isotópicos, adicionou-se uma solução de dimetilsufóxido a

0,05% à suspensão contendo os parasitos (parasitemia 1% e hematócrito 2,5%). No

microteste tradicional, esta solução a 0,05% de dimetilsulfóxido só foi adicionada para

extratos e frações com baixa hidrossolubilidade. Caso não fosse possível determinar a CI

novas placas eram preparadas contendo outras diluições.

5.3.7- Microteste utilizando [8-

H]-hipoxantina

Ensaio realizado de acordo com a técnica descrita por Desjardins e col (1979).

Setenta e duas horas antes da realização do experimento, os parasitas eram cultivados em

meio sem hipoxantina. A sincronização do cultivo foi feita 48 h antes do experimento.

Como controles utilizaram-se: 1- solução contendo hemácias parasitadas com a mesma

parasitemia e hematocrito das “amostras testes”, onde se adicionou a hipoxantina e

considerou-se como 100% de emissão; 2- solução contendo apenas hemácias não

parasitadas com o mesmo hematócrito das demais amostras onde se adicionou a

hipoxantina; 3- solução contendo hemácias parasitadas com a mesma parasitemia e

hematócrito das demais amostras, onde não se adicionou a hipoxantina; e 4-substâncias

cuja atividade como esquizonticida sangüíneo encontram-se amplamente descritas na

literatura (cloroquina e mefloquina).

Inicialmente, foram utilizadas as concentrações descritas na Tabela 6 (pg. 84). Quando

os resultados obtidos nestas concentrações não permitiram o calculo da CI

, novas

diluições foram realizadas e o ensaio foi refeito. Para cada ensaio foram utilizados 6 poços

por concentração e o ensaio foi repetido, no mínimo, 2 vezes.

Para a realização dos ensaios utilizou-se uma suspensão do parasito com parasitemia de

1,0%, hematócrito 2,5% e este foi distribuído (200 µL ⁄poço) em placas contendo os

extratos⁄frações⁄substâncias em diferentes concentrações. Após a distribuição, as placas

foram mantidas em estufa a 37

C, em atmosfera de 3 a 5% de CO

obtida através da

queima de vela, em dessecador. Após 24 h, adicionou-se 0,5 Ci de [8-

H]-hipoxantina para

cada poço.

As placas retornaram para a estufa por mais 18 h, e após este período, foram mantidas a

–20

C por, no mínimo, 24 h. A leitura foi realizada em beta-cintilador, e de posse destes

dados, calculou-se a CI

, utilizando-se o Graph Pad Prism 4,0 para este cálculo.

5.3.8-

Microteste tradicional

A metodologia utilizada neste ensaio foi descrita por Rieckmann e cols. (1978)

modificada por Carvalho (1990). A forma de preparo da placa e as concentrações

utilizadas, inicialmente, neste ensaio estão descritas no item 5.3.6 e Tabela 6 (pg. 84).

Neste ensaio utilizaram-se os seguintes controles: 1- controle sem substância e sem

solvente, sendo sua parasitemia considerado o 100% experimental; 2- Controle do solvente,

onde a parasitemia deve ser igual a do controle 1; 3- controle positivo, onde foi utilizada

uma droga antimalárica (cloroquina ou mefloquina) em diferentes concentrações.

Cultivos sincronizados contendo, predominantemente, trofozoítos (>90%), eram

diluídos para 0,5%, o hematócrito ajustado para 2,5% e distribuídos em placas contendo o

extratos⁄frações⁄substâncias em diferentes concentrações. Após 24 e 48 h trocava-se o meio

adicionando-se nova dose do extrato ou substância. Após setenta e duas horas foram

confeccionados os esfregaços. No esfregaço determina-se a parasitemia percentual.

De posse das parasitemias percentuais, calculou-se a CI

utilizando-se o método

Graph Pad Prism 4,0.

5.4- Avaliação da citotoxidade (CC

) em células VERO

A avaliação da citotoxicidade foi realizada no Departamento de Microbiologia,

Instituto de Ciências Biológicas, UFMG, pelo Ms. Geraldo Célio Brandão, sob orientação

da Profa. Dra. Erna Geessen Kroon.

5.4.1- Ensaio colorimétrico do MTT

Placas de 96 poços foram preparadas com suspensão de células VERO (Células de

rins de macaco verde) (aproximadamente 40.000 células/cavidade) em meio de cultura

MEM 5% soro fetal bovino (SFB), e foram incubadas por 24 horas, em estufa a 37

C, em

atmosfera contendo 5% de CO

para formação da monocamada.

Após a formação da monocamada celular, o meio de cultura foi removido, e em

seguida, foram adicionadas soluções de substâncias testes (200 µL) em concentrações que

variaram entre 500 e 4 µg/mL, em 4 replicatas para cada concentração. As placas foram

novamente incubadas em estufa a 37

C, em atmosfera contendo 5% de CO

Após de 48 horas de incubação, o sobrenadante foi removido e, em seguida, foram

adicionados 28 µl de uma solução de sal de tetrazolio (MTT) (2 mg/mL em tampão

fosfato), em cada cavidade. As placas foram incubadas por 1 h. e 30 min. a 37°C; após este

tempo de incubação, foram adicionados 130 µL de dimetilsufoxido, em cada cavidade para

dissolver os cristais de formazana. As placas foram mantidas em agitação, por 15 min.

(Shaker) e a densidade ótica (DO) foi determinada em 492 nm (DO

492

) em leitor de

microplacas. A multiplicação celular foi comparada com controles sem tratamento

(controle negativo) sendo os ensaios foram conduzidos simultaneamente (TWENTNAN e

LUSCOMBE, 1987).

A toxidade celular foi expressa em termos de concentração citóxica a 50% (CC

A porcentagem citotóxica é calculada como [(A-B)/A]x100, onde A e B são a DO

492

(densidade ótica) dos poços onde estão presentes células não tratadas (A) e tratadas (B),

respectivamente.

5.4.2- Cálculo do índice de seletividade

O índice de seletividade foi calculado pela razão entre a CC

e a CI

, obtida no

microteste tradicional (MITAINE-OFFER et al., 2002).

5.5- Alguns parâmetros utilizados neste trabalho, para avaliar a atividade

antiplasmódica, citotoxicidade e índice de seletividade

Na avaliação da atividade antiplasmódica pelo método tradicional (RIECKMANN

et al., (1978) modificada por CARVALHO, 1990), e radioisotópico (DESJARDINS et al.,

1979) adotou-se o esquema onde, de acordo com a faixa de valores da CI

extratos⁄frações⁄substâncias, eram classificadas: CI

< 10,0 µg⁄mL- ativos; CI

entre 10 a

100 µg⁄mL- moderadamente ativos e CI

> 100 µg⁄mL- inativos (BASCO et al.,1994).

Na citotoxicidade para células VERO, pelo método colorimétrico do MTT,

estabeleceu-se que extratos⁄frações⁄substâncias com CC

< 100 µg⁄mL foram considerados

muito tóxicos; 100 > CC

> 500 µg⁄mL, moderadamente tóxicos e CC

> 500 µg⁄mL, baixa

toxicidade.

Em relação ao índice de seletividade (IS) considerou-se: IS < 100- baixo; 100< IS <

300 moderado e IS > 300- elevado (WRIGTH et al., 1994).

6- RESULTADOS

6.1- Obtenção de extratos, caracterização fitoquímica, atividade antiplasmódica e

citotoxicidade das espécies de

Aspidosperma

6.1.1- Obtenção dos extratos

Na Tabela 7 (pg. 89) estão listados parte da planta, método utilizado para extração,

solvente e rendimentos de cada tipo de extrato obtido de A. olivaceum, A. ramiflorum e A.

spruceanum. Observa-se que os melhores rendimentos, em geral, foram obtidos nos

extratos de folhas (Tabela 7, pg. 89).

Tabela 7: Condições utilizadas na preparação dos extratos, quantidade do pó das plantas e

rendimentos dos processos extrativos.

Parte da Planta Método de

Extração

Solvente Quantidade do

pó (g)

Quantidade de

extrato (g)

Rendimento (%)

Aspidosperma olivaceum

DCL 11,8269 12,1 Folhas (Fo) Soxhlet (S)

ETOH

98,0

8,2041 8,4

Percolação (P) ETOH 116,0 2,3302

DCL 3,4140 4,3

Caules (Ca)

Soxhlet (S)

ETOH

79,3

0,5259

DCL 1,475 2,3 Cascas (Cs) Soxhlet (S)

ETOH

65,4

5,4136

Aspidosperma ramiflorum

Percolação (P) ETOH 100,0 31,8352 31,8

DCL 12,8300 8,6

Folhas (Fo)

Soxhlet (S)

ETOH

150,0

11,4363 7,6

Percolação (P) ETOH 168,0 23,9785 14,3

DCL 2,5503 2,4

Caules (Ca)

Soxhlet (S)

ETOH

104,0

9,0125 8,7

DCL 1,4853 2,0 Cascas (Cs) Soxhlet (S)

ETOH

72,6

0,7853 1,1

Aspidosperma spruceanum

Percolação (P) ETOH 100,0 19,5067 19,5

DCL 4,0578 12,1

Folhas (Fo)

Soxhlet (S)

ETOH

33,5

4,1230 12,3

Percolação (P) ETOH 64,0 2,2389 3,5

DCL 0,4262 0,4

Caules (Ca)

Soxhlet (S)

ETOH

104,0

0,9040 0,9

Percolação (P) ETOH 64,1 2.2334 3.5

DCL 1,4467 4,3

Cascas (Cs)

Soxhlet (S)

ETOH

33,8

0,4902 1,5

Legenda:

DCL- diclorometano e ETOH- etanol.

Os extratos de A. cylindrocarpon e A. tomentosum foram preparados por Abreu e col.

(2002) e Garcia (2000) neste laboratório. As amostras utilizadas encontravam armazenadas

sob refrigeração (-20º C).

6.2- Análise e caracterização dos extratos

6.2.1- Cromatografia em Camada Delgada de Sílica

Inicialmente, foi realizada uma prospecção fitoquímica dos extratos etanólicos e

diclorometano, os resultados estão na Tabela 8 (pg. 94).

Prospecção fitoquímica de caules-folhas de A. cylindrocarpon mostrou a presença de

alcalóide, triterpenos ou esteróides e saponinas (Tabela 8, pg. 94).

Análises em CCDS dos extratos de A. olivaceum demonstraram que os extratos DCL-S

(Fo), DCL-S (Ca), DCL-S (Cs) e ETOH-P (Cs) provavelmente contenham saponinas. Para

triterpenos⁄esteróides, os seguintes extratos apresentaram resultados positivos: DCL-S (Fo),

ETOH-S (Fo) e ETOH-P (Ca). A presença de flavonóides foi detectada em ETOH-S (Ca),

DCL-S (Cs) e ETOH-P (Cs). Com os extratos DCL-S (Ca), ETOH-P (Ca), DCL-S (Cs) e

ETOH-P (Cs) foram obtidos resultados positivos para alcalóides (Tabela 8, pg. 94).

Os extratos ETOH-P (Fo), DCL- S (Fo), ETOH-S (Fo), DCL-S (Ca) e DCL-S (Cs) de

A. ramiflorum revelaram, positivamente, em CCDS, para saponinas, triterpenos-esteróides,

flavonóides e alcalóides. O extrato ETOH-P (Ca) revelou positivamente para flavonóides e

alcalóides, enquanto que, o extrato ETOH-S (Ca) contem alcalóides. Em nenhum extrato se

observaram cumarinas (Tabela 8, pg. 94).

CCDS dos extratos de A. spruceanum demonstrou ausência de flavonóides e cumarinas.

Apenas os extratos obtidos das cascas (ETOH-P, DCL-S e ETOH-S) da planta revelaram

positivamente para alcalóides, enquanto que, para saponinas, todos os extratos, exceto

ETOH-S (Fo), foram positivos. Em relação aos triterpenos e esteróides, os únicos extratos

que não revelaram de forma positiva foram ETOH-S (Fo) e ETOH-S (Ca) (Tabela 8, pg.

95).

O extrato etanólico obtido de caules (Ca) de A. tomentosum revelou positivamente, em

CCDS, para alcalóides, triterpenos, esteróides e flavonóides. Os extratos etanólicos de

frutos (Fr), folhas (Fo) e sementes (Se) revelaram, em CCDS, para triterpenos, esteróides e

saponinas. Em Fr e Se foram observados resultados positivos para alcalóides e para os

extratos de folhas e frutos obtiveram-se resultados positivos para flavonóides (Tabela 8, pg.

95).

6.2.2- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Para o extrato ETOH-P de A. cylindrocarpon (Ca-Fo) quando se utilizou a fase móvel

sem ou com o sal sódico do ácido hexanosulfõnico os picos tiveram tempos de retenção de

1,46 e 1,58 min, e estes são, provavelmente, os picos relacionados alcalóides presentes

neste extrato (Anexo 1, pg.153; Tabela 8, pg. 94).

Nas análises por CLAE, realizados com os extratos de A. olivaceum, utilizou-se

como substância de referência a uleína, que apresentou tempo de retenção de 2,15 min.

Picos com tempos de retenção próximos foram observados nos extratos DCL-S (Fo) (TR=

2,36 min), DCL (Ca) (TR= 2,24 min) e DCL-S (Cs) (TR= 2,24 min). Outros extratos

apresentaram picos intensos que, provavelmente, estão relacionados a alcalóides: ETOH-P

(Ca) (TR= 1,03 e 1,36 min) e ETOH-S (TR= 1,05 e 1,35 min) (Anexo 1, pg. 154; Tabela 8,

pg. 94) , porém não foi possível realizar co-injeções, pois não se dispunha dos padrões de

alcalóides de A. olivaceum e nem de quantidade suficiente de uleína para fazer as co-

injeções.

Nos extratos de A. ramiflorum, os picos mais intensos, provavelmente relacionados

a alcalóides, tiveram os seguintes tempos de retenção (TR): ETOH-P (Ca), TR= 1,08 e 1,34

min e DCL-S (Cs), TR= 1,37 min. Os demais extratos apresentaram picos de baixa

intensidade (Anexo 1, pg. 156; Tabela 8, pg. 94).

Todos os extratos de A. spruceanuam, quando submetidos às análises em CLAE,

apresentaram pico com TR entre 1,10 a 1,17 min. Além deste pico foram observados no

extrato ETOH- (Fo) pico com TR= 1,50 min e para DCL-S (Fo) picos com TR= 1,51 e 1,92

min. Os resultados estão indicados na Tabela 8 (pg. 95) e no Anexo 1 (pg. 158).

Nos estudos e A. tomentosun realizados em CLAE utilizou-se como substância de

referência a uleína, observando-se que apresentou TR= 2,15min. Picos com tempos de

retenção entre 1,13- 1,18 min foram observados nos cromatogramas de todos os extratos.

Os resultados obtidos em CLAE encontram-se na Tabela 8 (pg. 95) e no Anexo 1 (pg. 160).

6.3- Atividade antiplasmódica e citotoxicidade

Para realização dos ensaios que avaliaram a atividade antiplasmodica utilizou-se

concentração onde a inibição do P. falciparum foi próximo de 100%, concentração(ões) em

que a inibição foi entre 90 a 60%, concentrações cuja a inibição era entre 60 a 40% e

concentrações menores cujo inibição foi inferior a 40%. Desta forma foi possível traçar

uma curva e determinar as concentrações inibitórias. No presente trabalho serão mostradas

apenas as concentrações inibitórias cinqüenta por cento (CI

) e noventa por cento (CI

)

(Tabela 9, pg. 96). Alguns extratos, classificados como ativos no P. falciparum (CI

< 10

µg⁄mL), foi submetido ao ensaio citotoxicidade utilizando células VERO, sendo

determinada a concentração citotóxica cinqüenta por cento (CC

) (Tabela 9, pg. 96).

Quando se utilizam modelos in vivo (animal) pode-se obter a dose letal cinqüenta

por cento (DL

) e a dose efetiva cinqüenta por cento (DE

) e através da divisão da DL

pela DE

obtem-se o índice terapêutico (IT). Caso se utilizem modelos in vitro, o índice

equivalente ao IT é o índice de seletividade (IS) que obtido pela divisão da CC

pela CI

(Tabela 10, pg. 97).

A atividade antiplasmódica do extrato etanólico de A. cylindrocarpon foi moderada

(CI

entre 10 a 100 µg⁄mL) para os clones W2 e 3d7. Em relação à cloroquina e à

mefloquina (controles positivos), este extrato mostrou-se com menor atividade

antiplasmódica, e a citotoxicidade para células VERO foi baixa (CC

> 500 µg⁄mL), sendo

os índices de seletividade 11,36 (W2) e 12,82 (3d7) (Tabela 9, pg. 96 e Tabela 10, pg. 98).

Os extratos DCL-S (Fo), ETOH- S (Fo), DCL-S (Ca), DCL-S (Cs) e ETOH-S (Cs)

de A. olivaceum mostraram alta atividade em W2 (CI

< 10 µg/mL); em 3d7 todos os

extratos, exceto DCL-S(Fo), foram muito ativos (CI

< 10 µg/mL) (Tabela 9, pg. 96). Os

extratos DCL-S (Fo), DCL-S (Ca) e ETOH-S (Cs) apresentaram baixa citotoxicidade para

células VERO (CC

> 500 µg⁄mL), porém seus índices de seletividade foram baixos (IS <

100) (Tabela 9, pg. 96 e Tabela 10, pg. 98).

Os extratos de A. ramiflorum que apresentaram maior atividade antiplasmódica em

ambos os clones (CI

<10 µg⁄mL) foram DCL-S (Fo) e DCL-S (Cs). O extrato mais ativo

em 3d7 foi ETOH-S (Ca), porém sua atividade em W2 foi moderada (Tabela 9, pg. 96). Os

extratos DCL-S (Ca) e DCL-S (Cs) de A. ramiflorum foram submetidos aos ensaios de

citotoxicidade, e mostraram-se pouco tóxicos (CC

> 500 µg⁄mL), porém seus índices de

seletividade foram baixos (IS < 100) (Tabela 9, pg. 96 e Tabela 10, pg. 98).

Os extratos DCL-S (Ca) e DCL-S(Cs) de A. spruceanum mostraram-se muito ativos

em W2 (CI

< 10 µg⁄mL). DCL-S (Ca) também foi muito ativo em 3d7, porém as

atividades antiplasmódica destes extratos foram menor que da cloroquina e mefloquina. Os

demais extratos de A. spruceanum, exceto CLOR-P (Ca) e ETOH-P (Fo), apresentaram

atividade antiplasmódica moderada em 3d7. Em W2 os extratos mostraram atividade

moderada, exceto DCL-S (Ca) e DCL-S(Cs) (Tabela 9, pg. 97). O extrato diclorometano de

cascas de A. spruceanun apresentou citotoxicidade moderada (100 < CC

< 500 µg⁄mL) e

baixo índice de seletividade (IS < 100) (Tabela 9, pg. 97 e Tabela 10, pg. 98).

Os extratos etanólicos obtidos de diferentes partes de A. tomentosum

apresentaram

atividade antiplasmódica moderada em W2 (CI

entre 20 e 27 µg/mL). Os extratos

etanólicos obtidos de caules, folhas e frutos apresentaram atividade antiplasmódica

moderada em 3d7 e o de sementes mostrou-se muito ativo em 3d7 (CI

= 3,03 µg/mL). As

de todos os extratos foram maiores que as CI

da cloroquina e mefloquina (Tabela 9,

pg. 97). O extrato etanólico de sementes de A. tomentosum também apresentou CC

> 500

µg⁄mL, porém o IS (3d7) foi moderado (>165,02) (Tabela 9, pg. 97 e Tabela 10, pg. 98).

Tabela 8:

Resultados das análises, por CCDS e CLAE de extratos de espécies pertencentes

ao gênero Aspidosperma (Apocynaceae).

CCCDS CLAE Espécies Parte

planta

Extrato⁄

técnica

Classes de metabólitos Condição usada na análise

(min.)

Aspidosperma

cylindrocarpon

Caules-

Folhas

ETOH-P A, T,E e S C1 e C2=1,46 e 1,58

Folhas

DCL

T, E e S C1= 1,20 e 2,36

Folhas

ETOH

T e E C1= 1,15

Caules

ETOH

A, T e E C1= 1,03 e 1,36

Caules

DCL

A e S C1= 1,30 e 2,24

Caules

ETOH

F C1= 1,15 e 2,20

Casca

DCL

A, S e F C1= 1,30 e 2,24

A. olivaceum

Casca ETOH-S

A, S e F C1= 1,05 e 2,10

Uleína

Cascas ETOH-P

A C1= 2,15

Folhas

ETOH

A, S, T, E e F C1=1,40 e 2,10

Folhas

DCL

A, S, T, E e F C1= 1,44 e 2,30

Folhas

ETOH

A, S, T, E e F C1= 1,20; 1,38 e 2,39

Caules

ETOH

A e F C1= 1,24; 1,56; 1,88 e 2,92

Caules

DCL

A, S, T, E e F C1= 1,42 e 2,12

Caules

ETOH

A C1= 1,38

Casca

DCL

A, S, T, E e F C1= 1,37 e 8,48

A. ramiflorum

Casca ETOH-S

A e F C1=1,88 e 2,92

Continua

Continuação da Tabela 8

CCCDS CLAE Espécies Parte da

planta

Extrato⁄

técnica

Classes de

metabólitos

Condição usada

na análise (C) =

tempo de

retenção (min.)

Folhas

ETOH-P

S, T e E C1 = 1,14 e 1,50

Folhas DCL- S

S, T e E C1 = 1,17; 1,51

e 1,92

Folhas

ETOH- S

ND C1 = 1,12

Caules

DCL- S

S, T e E C1 = 1,17

Caules

ETOH-S

S C1 = 1,14

Cascas

ETOH-P

A, S, T e E C1 = 1,13

Cascas

DCL- S

A, S, T e E C1 =1,11

A spruceanum

Cascas ETOH-S

A, S, T e E C1 =1,1º

Caules ETOH-P A, T,E e F C1 = 1,14; 1,32;

9,3 e 19,18

Folhas ETOH-P S, T, E e F C1 = 1,18

Frutos ETOH-P A, S, T, E e F C1 = 1,13 e 1,39

A. tomentosum

Sementes ETOH-P A, S, T e E C1 =1,18 e 1,79

C1: Condição 1

- Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B); T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A:

20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo=

1 ml/min; detecção: λ 300 nm e coluna RP-18.

C2: Condição 2

- Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 + 2,5 mM de sal

sódico de ácido hexanossulfônico (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min:

60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min;

detecção: λ 300 nm e coluna RP-18.

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada de sílica; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; TR- tempo

de retenção; ETOH- etanol; DCL- diclorometano; P- percolação; S- extração em aparelho de Soxhlet; A- alcalóides; T-

triterpenos; E- esteróides; F- flavonóides; C- cumarinas e S- saponinas; ND- não determinado.

Tabela 9: Resultados da avaliação da atividade antiplasmódica e citotoxicidade de extratos de

espécies pertencentes ao gênero Aspidosperma (Apocynaceae).

Clone W2 Clone 3d7

Células

VERO

Extratos

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄ml) +

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄mL)

Aspidosperma cylindrocarpon

ETOH-P- Ca-

44,0 + 6,36 104,5 + 6,36 39,0 + 2,83 89,0 + 7,07 >500

A. olivaceum

DCL-S(Fo) 7,0 +0,2 23,0 + 0,2 25,5 + 2,12 49,5 + 6,3 >500

ETOH- S (Fo) 7,0 +0,71 26,5 + 0,71 5,0 + 2,80 24,5 + 2,10 ND

DCL-S (Ca) <6 ND <6 ND >500

DCL-S (Cs) <6 ND <6 ND ND

ETOH-S (Cs) 5,0 + 2,8 24,5 +2,8 7,0 + 0,42 26,5 + 0,71 >500

A. ramiflorum

ETOH-P (Fo) 32,8 + 1,13 61,75 + 1,13 20,5 + 0,71 60,5 + 0,71 ND

DCL-S (Fo) <6 ND <6 ND ND

ETOH-P (Ca) 36,5 + 0,20 100,0 + 0,20 48,0 + 1,1 103,0 + 1,4 ND

DCL-S(Ca) ND ND 9,5 + 1,41 27,0 + 1,41 >500

ETOH-S (Ca) 19,75 + 0,35 30,75 + 0,35 0,98 + 0,03 16,0 + 2,8 ND

DCL- S(Cs) <6 ND <6 ND >500

Continua

Continuação da Tabela 9:

Clone W2

Clone 3d7

Célula VERO

Extratos

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄mL)

+ DP

(µg⁄mL)

A. spruceanum

ETOH-P (Fo) 65,0 + 4,2 107,8 + 0,71 >100 ND ND

DCL- S (Fo) 23,25 + 0,35 47,0 + 2,83 35,0 + 4,2 63,5 + 0,7 ND

ETOH- P (Ca) 29,52 + 0,71 ND 41,5 + 2,12 101,5 + 9,1 ND

DCL- S (Ca) <6,0 ND < 6,0 ND 109,6

CLOR-P (Ca) 37,0 +7,1 102,0 + 2,8 >100 ND ND

ETOH-P (Cs) 26,25 + 4,07 48,50 + 3,18 14,0 + 4,2 30,0 + 2,83 ND

DCL- S(Cs) < 6,0 ND 15,75 + 1,76 28,5 + 0,71 ND

ETOH-S (Cs) 28,01 + 3,51 52,03 + 2,83 19,0 + 2,83 50,5 + 2,12 ND

A. tomentosum

ETOH-P (Ca) 26,50 + 3,50 54,75 + 1,09 25,00 + 4,24 61,00 + 4,24

ETOH-P (Fo) 23,75 + 1,06 47,00 + 2,83 27,00 + 5,66 47,00 + 5,66

ETOH-P (Fr) 20,52 + 1,41 37,53 + 0,71 38,55 + 1,06 99,54 + 4,95

ETOH-P (Se) 24,51 + 3,56 54,75 + 1,09 3,03 + 0,20 27,03 + 0,20 >500

Controles positivos

Cloroquina 0,02 + 0,002 ND 0,0013 +

0,0001

0,0020 +

0,0001

Mefloquina 0,0165+

0,002

0,0895 + 0,02 0,048 +

0,0007

0,0975 +

0,0007

Legenda:

= Concentração inibitória 50%; CI

= Concentração inibitória 90%; CC

= Concentração citotóxica

50%;DP= desvio padrão; W2- clone resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina;

DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-S (Fo)- extrato etanólico de folhas

obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-P (Ca)- extrato etanólico de caules obtido por percolação; DCL-S (Ca)- extrato

diclorometano de caules obtido em aparelho de Soxhlet; DCL-S (Cs)- extrato diclorometano de cascas obtido em aparelho

de Soxhlet; ETOH-P (Cs)- extrato etanólico de cascas obtido em aparelho de Soxhlet; CLOR (Ca)- extrato clorofórmico

de caules obtido em aparelho de Soxhlet e ND- não determinado.

Tabela 10: Índices de seletividade (IS) para extratos obtidos de diferentes espécies de

Aspiodsperma (Apocynaceae) ensaiadas para citotoxicidade e atividade antiplasmódica.

Espécies Extratos

(µg⁄ml)

IS (W2) IS (3d7)

A. cylindrocarpon ETOH-P- Ca-Fo >500 >11,36 > 12,82

DCL

S(Fo)

>500 >71,43 >19,61

DCL

S (Cs)

>500 > 83,33 > 83,33

A. olivaceum

ETOH-S (Cs) >500 > 100,00 > 71,43

DCL

S (Fo)

>500 ND > 52,63 A. ramiflorum

DCL-S(Ca) >500 > 83,33 > 83,33

A. spruceanum

DCL- S (Ca) 109,6 18,27 >18,27

A. tomentosum ETOH-P (Se)

>500 >20,4 >165,02

Legenda:

= Concentração citotóxica 50%;DP= desvio padrão; W2- clone resistente a cloroquina e sensível a

mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina; IS- índice de seletividade; DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de folhas

obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-S (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-P (Ca)-

extrato etanólico de caules obtido por percolação; DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em aparelho de

Soxhlet; DCL-S (Cs)- extrato diclorometano de cascas obtido em aparelho de Soxhlet e ETOH-P (Cs)- extrato etanólico

de cascas obtido em aparelho de Soxhlet.

6.4- Fracionamento do extrato etanólico de cascas de

A. parvifolium

6.4.1- Descrição da obtenção do extrato etanólico das cascas, frações e caracterização

por cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência

O extrato etanólico de cascas de A. parvifolium foi submetido a dois processos

extrativos (Figura 9, pg.73 e Figura 10, pg. 74), sendo obtidas as frações de neutros e

alcalóides totais. Os rendimentos de cada processo extrativo encontram-se na Tabela 11

(pg. 99). Visando facilitar a distinção das frações adotou-se que as frações do processo

extrativo 1 sempre teriam o número 1 (APN-1, APT-1 e APTC) e a do processo 2 o número

2 (APN-2 e APT-2).

O extrato etanólico e as frações foram submetidos a análises cromatográficas em

CCDS e CLAE, utilizando-se a uleína como controle para alcalóides. Na prospecção

fitoquímica do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium, por CCDS, foi detectada a

presença de alcalóides e flavonóides. O fracionamento de APN levou ao isolamento do

lupeol, estigmasterol e aparicina e no fracionamento de APT foram isolados uleína e

epiuleina (JÁCOME, 1998 e JÁCOME et al., 2004).

Tabela 11: Rendimentos nas extrações de alcalóides a partir do extrato etanólico de cascas de A.

parvifolium.

Processo extrativo 1 (Figura 9, pg. 73) Processo extrativo 2 (Figura 10, pg.

74)

Massa (g) Rendimento

(%)

Massa (g) Rendimento

(%)

ETOH-P 55,2 - ETOH-P 10,0 -

APN-1 8,7 15,8 APN-2 0,5 5,4

APT-1

(

diclorometano)

3,8 7,0 APT-2 1,7 17,3

APTC 1,1 0,5 NO NO NO

Legenda:

APN-1- fração de neutros 1; APT-1- fração alcaloídica 1; APTC fração alcaloídica obtida com clorofórmio,

NO- não foi obtida neste processo.

No presente trabalho, em todas as amostras analisadas, foram detectados alcalóides,

triterpenos e esteróides, e as análises foram negativas para cumarinas. No extrato etanólico,

APN-1 e APN-2 observaram-se, ainda, a presença de saponinas. Já, no extrato etanólico,

APT-1 e APT-2 foi observada a presença de flavonóides. Os resultados encontram-se

sumarizados na Tabela 12 (pg. 100).

100

A Figura 15 (pg. 100) mostra uma placa cromatográfica (CCDS) revelada com

anilsaldeído- ácido sulfúrico, onde a coloração azul aparece em todas as amostras e está

relacionada à presença dos alcalóides.

Nas análises por CLAE, os TRs dos picos, provavelmente relacionados a alcalóides do

extrato etanólico de A. parvifolium, frações e uleína estão na Tabela 12 (pg. 100) e os

cromatogramas são mostrados na Figura 16 (pg. 101 e 102).

Tabela 12: Análise do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium (Apocynaceae) e frações em

cromatografia em camada delgada de sílica e cromatografia líquida de alta eficiência.

CCDS CLAE: TR (min) Amostras

Classes de metabólitos Condição usada na análise (C)

= tempo de retenção (min.)

Extrato A, T, E, F e S 1,38; 1,89; 4,36; 7,64 e 9,56

APN-1 A, E e S 1,30 e 1,87

APN-2 A, T, E, F e S 1,41 e 2,16

APT-1 A, E e F 1,54 e 2,14

APT-2 A, T, E e S 1,41 e 2,09

Uleína (18) A 2,15

Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): acetonitrila (B); T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min:

60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min;

detecção: λ 300 nm e coluna RP18.

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada de sílica; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; TR- tempo

de retenção; APN-1- fração de neutros 1, APT-1- fração alcaloídica 1; APN-2- fração de neutros 2 e APT-2- fração

alcaloídica 2.

1 2 3 4 5 6

Figura 15: Cromatografia em camada delgada de sílica gel do extrato etanólico de cascas de A.

parvifolium, frações e uleína.

Legenda: Eluente: acetato de etila: metanol: água (100:13,5:10). Revelador: anisaldeído- ácido sulfúrico. 1-

Extrato etanólico; 2- APN-2; 3- APT-2; 4-APN-1; 5-APT-1 e 6- Uleina.

101

a- ETOH-P

b- APN-1

c- APN-2

d- APT-1

102

e- APT-2

f- Uleína

Figura 16: Cromatogramas de extrato etanólico de cascas de A. parvifolium, frações e uleína.

Condição: Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min:

80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; Detecção:λ 300 nm.

Legenda:

APN-1- fração de neutros 1, APT-1- fração alcaloídica 1; APN-2- fração de neutros 2 e APT-2- fração

alcaloídica 2.

O ETOH-P, APT-1 e uleína (18) foram ainda submetidos à CLAE acoplado a

espectometria de ultra-violeta (DAD). Os perfis cromatográficos e os espectros no UV dos

picos principais estão mostrados na Figura 17 (pg. 103). Nestas análises, utilizou-se coluna

RP-18, como fase móvel uma solução de ácido orto-fosfórico a 0,1%: acetonitrila,

temperatura de 40º C e detecção a λ= 210nm (KEINÄNEN et al., 2001) (Figura 17, pg. 103

e Tabela 13, pg. 104). Na Tabela 13 (pg., 104) estão indicados os TRs dos picos mais

intenso (% área > 5,0%).

103

a- ETOH-P

b- APT-1

c- Uleína

Figura 17: Cromatogramas obtidos na análise em CLAE acoplado a detector com arranjos de

diodos (DAD), do extrato etanólico de cascas de A. pavifolium (Apocynaceae), APT-1 e uleína.

Condição: Coluna RP-18; Eluente gradiente de solução de ácido fosfórico a 0,1% v/v (A) e acetonitrila (b); 0 min 95%A e

5% de B; 60 a 65 min 5% de A e 95% de B; 70 min 95%A e 5% de B. Temperatura: 40

C. Detecção: λ 210nm. Fluxo:

1mL/min por 70 min.

104

Tabela 13: Análise em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector com arranjos de

diodos (DAD), do extrato etanólico de cascas de A. pavifolium (Apocynaceae), APT-1 e uleína.

TR (min) % área

ETOH-P 4,489

6,336

7,826

9,094

13,482

5,65

31,31

6,55

5,05

5,63

APT-1 20,782

22,974

28,500

30,663

8,51

7,94

22,14

58,97

APT-13-16 (8)

25,782

33,510

9,15

85,21

Condição: Coluna RP-18; Eluente gradiente de solução de ácido fosfórico a 0,1% v/v (A) e acetonitrila (b); 0 min 95%A e

5% de B; 60 a 65 min 5% de A e 95% de B; 70 min 95%A e 5% de B. Temperatura: 40

C. Detecção: λ 210nm. Fluxo:

1mL/min por 70 min.

Legenda:

TR= tempo de retenção; ETOH-P: extrato etanólico de cascas de A. parvifolium; APT1= fração de alcalóides 1.

6.4.2- Isolamento e identificação da uleína

ETOH-P (Cs) de A. parvifolium foi submetido a extração ácido-base sendo obtida a

fração alcaloídica (APT1), Desta fração, após cromatografias sucessivas em coluna de

Sephadex LH-20 e sílica gel, obtiveram-se duas frações, APT-13-16 (7) e APT-13-16 (8)

que apresentaram uma mancha única em CCDS (reveladores: anisaldeído-ácido sulfúrico e

reagente de Dragendorff). Comparação com amostra de uleína isolada por Jácome (1998)

mostrou tratar-se desta substância. Os cromatogramas por CLAE destas frações

confirmaram tratar-se da uleína (Figura 18, pg. 105), sendo observados picos com TRs 2,19

min, para as duas frações e de 2,24 min, para a uleína de referência. Nos três

cromatogramas observou-se um pico de um componente minoritário (∼10% área relativa),

com TR de 1,38 min (Figura 18, pg. 105 e Tabela 14, pg. 105), o qual corresponde,

provavelmente, a epiuleína.

105

a- Uleína

b- APT-13-16 (7)

c- APT-13-16 (8)

Figura 18:

Cromatogramas, obtidos por CLAE, de uleína,

APT-13-16 (7) e APT-13-16 (8).

Condições: Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min:

80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1mL/min; Detecção: λ 300 nm.

Tabela 14: Tempos de retenção da uleína e das frações APT -13-16 (7) e APT- 13-16 (8).

Uleína APT- 13-16 (7) APT- 13-16 (8)

Tempo de retenção

(min)

2,24 2,19 2,19

Condições utilizadas para a eluíção:

Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min:

85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A:

15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1mL/min; Detecção: λ 300 nm.

106

O espectro no IV de

APT-13-16 (8)

(Figura 19, pg. 106) apresentou absorções

correspondentes a deformação axial de ligações N-H (3176 cm

-1

), estiramento C-H (2931

-1

), estiramento da ligação C=C em sistema aromático aquela correspondente

deformação de quatro hidrogênios adjacentes em anel aromático orto-dissubstituído, no

caso o anel indólico (Figura 19, pg. 106). Este espectro mostrou muita semelhança com

aquele da uleína (JÁCOME, 1998), como era de se esperar.

Figura 19: Espectro no IV de APT-13-16 (8).

No espectro no UV (Figura 20, pg. 107), foram observados bandas de absorção nos

seguintes λ: 207,3 e 304,2 nm. O λ máximo de absorção em maior comprimento de onda,

304,2 nm, no espectro de APT-13-16 (8) é menor do que aquele da uleína (309nm) o que é

explicado pela s utilização de solução de ácido fosfórico 0,1% e acetonitrila como fase

móvel (KEINÄNEN et al., 2001), ao invés de água e acetonitrila (JÁCOME, 1998).

107

Figura 20: Espectro no UV de APT-13-16 (8), obtido em CLAE acoplado a detector com arranjos

de diodos (DAD).

Condição: Coluna RP-18; Eluente gradiente de solução de ácido fosfórico a 0,1% v/v (A) e acetonitrila (b); 0 min 95%A e

5% de B; 60 a 65 min 5% de A e 95% de B; 70 min 95%A e 5% de B. Temperatura: 40

C. Detecção: λ 210nm. Fluxo: 1

mL/min por 70 min.

O espectro de massa de APT-13-16 (8) apresentou o íon molecular esperado, em

m⁄z 266, devendo corresponder à uleína, com os principais fragmentos m⁄z 237, 223, 209,

194 e 180u, conforme proposta de Manske e Rodrigo (1965) (Figura 21, pg. 107 e Figura

22, pg. 108).

Figura 21: Espectro de massa por impacto eletrônico de APT-13-16 (8).

Fonte: Jacome, 1998

108

Visando concluir a identificação estrutural da substância APT-13-16 (8) foram

realizadas análises em Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN

H) e de

carbono – 13 (RMN

C) e os resultados obtidos foram comparados aos resultados de

Jácome (1998) confirmando tratar-se de uma mistura contendo predominantemente a uleína

e baixo percentual de epiuleína.

6.4.3- Atividade antiplasmódica do extrato etanólico de cascas de

A. parvifolium

frações e APT 13-16 (8) (uleína) pelos métodos tradicional (RIECKMAN

et al

., 1978

modificado por CARVALHO, 1990) e radioisotópico (DESJARDINS

et al.

, 1979)

No clone W2, ETOH-P (Cs) de A. parvifolium e APN-1 mostraram-se

moderadamente ativos, CI

32,75 + 1,06 e 15,02 + 2,83 µg⁄mL, respectivamente. As outras

frações e APT13-16 (8) / uleína (18) mostraram-se ativas (CI

< 10 µg⁄mL). No clone 3d7,

o extrato etanólico e as frações de neutros (APN-1 e APN-2) apresentaram atividade

antiplasmódica moderada, já as frações alcaloídicas (APT-1 e APT-2) e APT13-16 (8) /

uleína (18) foram ativas (CI

< 10 µg⁄mL). Todas as amostras avaliadas foram menos

potentes que a cloroquina e a mefloquina (Tabela 15, pg.108).

Tabela 15: Atividade antiplasmódica, in vitro, pelo método tradicional, do extrato etanólico de

cascas de A. parvifolium, frações e APT-13-16 (8) (uleína).

W2 3d7

(µg⁄mL)+

Cloroquina 0,02 + 0,002 ND 0,0013 + 0,0001 0,0020 + 0,0001

Mefloquina 0,0165+0,002 0,0895+0,002 0,048 + 0,0007 0,0975+0,0007

ETOH-P (Cs) 32,75 + 1,06 74,50 + 1,34 20,51 + 0,70 38,00 + 4,26

APN-1 15,02 + 2,83 60,02 + 1,56 17,75 + 0,35 31,50 + 1,06

APN-2 9,75 + 0,35 24,25 + 1,06 10,50 + 0,35 20,75 + 0,35

APT-1 0,98 + 0,20 4,05 + 0,20 7,63 + 0,31 15,02 + 2,80

APT-2 1,25 + 0,35 6,25 + 0,76 2,45 + 1,55 8,50 + 0,71

APT13-16 (8) /

uleína (18)

0,75 + 0,10

1,91 + 0,10

11,90 + 0,10

23,25 + 2,50

Legenda:

clone W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; clone 3d7- sensível a cloroquina; CI

- concentração

inibitória 50%; DP- desvio padrão; ETOH-P: extrato etanólico de cascas de A. parvifolium obtido por percolação; APN-1-

fração de neutros 1 (Figura 8, pg. 73); APN-2- fração de neutros 2 (Figura 9, pg. 74); APT-1- fração de alcalóides totais 1

(Figura 8, pg. 73); APT-2- fração de alcalóides totais 2 (Figura 9, pg. 74).

109

Além da avaliação da atividade antiplasmódica pelo método tradicional

(RIECKMAN et al., 1978 modificado por CARVALHO, 1990), o ETOH-P (Cs) de A.

parvifolium e frações (APN-1; APN-2; APT-1 e APT-2) foram submetidos ao ensaio

radioistópico em que a atividade antiplasmódica foi determinada através da capacidade do

parasito de incorporar a hipoxantina tritiada, [8

-H]- hipoxantina (DESJARDINS et al.,

1979). Os resultados obtidos nestas determinações encontram-se na Tabela 16 (pg. 109).

O ETOH-P (Cs) de A. parvifolium e APN-1 mostraram atividade antiplasmódica

moderada para os clones W2 e 3d7. As demais frações apresentaram atividade moderada

em 3d7 e mostraram-se ativas em W2 (Tabela 16, pg.109).

Tabela 16: Avaliação da atividade antiplasmódica, in vitro, pelo método radioisotópico, do extrato

etanólico de cascas de A. parvifolium e frações.

(µg⁄mL) + SD

W2 3d7

Cloroquina 0,018 + 0,0005 0,002 + 0,0004

Mefloquina 0,044 + 0,0077 0,052 + 0,0056

ETOH-P (Cs) 42,51 + 6,33 38,20 + 0,33

APN-1 38,02 + 3,76 18,2 + 1,75

APN-2 4,5 +0,45 33,25 +3,29

APT-1 8,0 + 1,19 43,05 +4,30

APT-2 5,6 + 0,83 ND

Legenda:

clone W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; clone 3d7- sensível a cloroquina; CI

- concentração

inibitória 50%; DP- desvio padrão; ETOH-P: extrato etanólico de cascas de A. parvifolium obtido por percolação; APN-1-

fração de neutros 1 (Figura 8, pg. 73); APN-2- fração de neutros 2 (Figura 9, pg. 74); APT-1- fração de alcalóides totais 1

(Figura 8, pg. 73); APT-2- fração de alcalóides totais 2 (Figura 9, pg. 74); ND- não determinado.

6.4.4- Citotoxicidade em células VERO, pelo método do MTT (TWENTNAN e

LUSCOMBE, 1987) de extrato etanólico de cascas de

A. parvifolium

, frações e APT-

13-16 (8) (uleína) e índice de seletividade (IS)

Além da atividade antiplasmódica, foi avaliada a citotoxicidade do ETOH-P (Cs) A.

parvifolium, frações (APN-1 e APT-1) e uleína, em células VERO (Tabela 17, pg. 110). O

ETOH-P (Cs) mostrou-se pouco tóxico para células VERO (CC

> 500 µg⁄mL), enquanto

que as frações e a APT13-16 (8) / uleína (18) mostraram uma citotoxicidade moderada (100

< CC

< 500 µg⁄mL). Quando se determinou o IS utilizando-se as CI

obtidas para o clone

110

W2 (Tabela 15, pg. 108) observou-se que, quanto mais pura a amostra, maior seu índice de

seletividade, isto é, a uleína apresentou IS mais alto do que o extrato e as frações APN-1 e

APT-1. Porém quando se utilizam os resultados obtidos com o clone 3d7 (Tabela 15, pg.

108), as alterações nos IS são discretas e menos favoráveis (Tabela 17, pg.110).

Tabela 17: Citotoxicidade e índice de seletividade de extrato etanólico de cascas de Aspidosperma

parvifolium, frações e

APT 13-16 (8) /uleína

(µg⁄mL)

IS (W2) IS (3d7)

ETOH-P (Cs)

>500 >15,27 >24,38

APN-1

449,3 29,91 25,31

APT-1

299,7 305,82 39,28

APT 13-16 (8) /uleína

(18)

374,6 500,00 31,47

Legenda:

- concentração inibitória 50%; IS- índice de seletividade; APN- 1- fração de neutros 1 (Figura 8, pg. 73) e

APT-1- fração de alcalóides totais 1 (Figura 8, pg. 73).

6.5-

Esenbeckia febrífuga:

fracionamento do extrato etanólico de caules,

caracterização fitoquímica, atividade antiplasmódica, citotoxicidade e índices de

seletividade

6.5.1- Fracionamento do extrato etanólico de caules

Ao ETOH-P (Ca) de E. febrifuga (97,1 g) adicionou-se etanol (50 mL) e HCl 1 N

(150 mL). Homogeneizou-se e extraiu-se com diclorometano (150 mL/ 3x) separando-se

uma camada de diclorometano (EFN, E. febrifuga neutros), uma camada aquosa ácida

(EFA-1, E. febrifuga aquosa ácida 1) e uma camada intermediária (EFI-1, E. febrifuga

intermediária 1). EFA-1 foi alcalinizada com NH

OH até pH 9 e extraiu-se com

diclorometano, obtendo-se, novamente, três frações: diclorometano (EFT, E. febrifuga

alcalóides totais); aquosa alcalina (EFAA, E. febrifuga aquosa alcalina) e intermediária

(EFI-2, Esenbeckia febrifuga intermediária -2) (Figura 9, pg. 74). A Tabela 18 (pg.111)

mostra os rendimentos obtidos.

111

Tabela 18: Rendimento da extração ácido-base a partir do extrato etanólico de caules de

Esenbeckia febrifuga.

Caules

Extrato(g) Rendimento

ETOH-P (Ca) 97,10

EFN

7,73 8,0%

EFI-1 1,78 1,8%

EFT 9,78 10,1%

EFI-2 1,46 1,5%

EFAA 76,30 78,5%

Total 97,06 99,9%

Legenda:

ETOH-P (Ca): extrato etanólico de caules de E. febrífuga obtido por percolação; EFN: E.febrifuga neutros;

EFI-1: E. febrifuga intermediária 1; EFT: E. febrifuga alcalóides totais; EFAA: E. febrifuga aquosa alcalina e EFI-2: E.

febrifuga intermediária 2.

O ETOH-P (Ca) foi submetido a estudo fitoquímico na Fakultät für Chemie und

Pharmazie der Ludwig-Maximillians-Universität, Munique, Alemanha, pelo grupo do Prof.

Dr. Hildebert Wagner, no âmbito de Projeto de Cooperação Internacional apoiado pelo

convênio CNPq⁄ DLR (Alemanha). Foram isoladas e identificadas 8 substâncias:

kokusaginina (68), skimmiamina (70), γ- fagarina (71), flindersiamina (73), 1-hidroxi-3-

metoxi-N-metilacridona (HMMA) (89), bergapteno (74), isopimpinelina (76) e rutaevina

(90) (Quadro 16, pg. 112) (Anexo 2, 162, DOLABELA et al., 2007).

112

Quadro 16: Estruturas químicas das substâncias isoladas do extrato etanólico de caules de

Esenbeckia febrifuga.

OCH

Kokusaginina (68)

: R

= R

= H; R

= R

= OCH

Skimmiamina (70):

= R

= OCH

; R

= R

= H

Flindersiamina (73)

γ γ

-fagarina (71):

= OCH

; R

= R

= H

O OH

OCH

HMMA- 1-Hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona (89)

Bergapteno (74):

R=OCH

, R”= H

Isopimpinelina (76):

R=R”= OCH

Rutaevina (90)

Fonte:

DOLABELA et al., 2007

6.5.2- Caracterização fitoquímica: análises em cromatografia em camada delgada de

sílica gel e cromatografia líquida de alta eficiência do ETOH-P (Ca) de

E. febrifuga

frações e substâncias isoladas

113

O extrato e frações resultantes dos processos extrativos foram submetidos à

prospecção fitoquímica, em CCDS (Tabela 19, pg. 113 e Figura 22, pg. 113- 114). Os

alcalóides, rutaevina, bergapteno e isopimpinelina foram utilizados como substâncias de

referência nas análises em CCDS e CLAE. Nas análises em CLAE, utilizaram-se duas

diferentes fases móveis e os resultados estão mostrados na Tabela 19 (pg. 113) e Figura 22

(pg. 113-114).

Tabela 19: Prospecção fitoquímica por CCDS e análises em CLAE do extrato etanólico de E

febrifuga, frações e susbstâncias.

CLAE: TR (min) CCDS (Tabela 3,

pg.75)

C1 C2

ETOH-P (Ca) S, T, E, C e F

5,5- HMMA

12,27- Isopimpinelina

18,98- Skimmiamina

23,47- Flindersiamina

32,19- HMMA

EFN (Ca) S e C

12,24 Isopimpinelina

18,98- Skimmiamina

19,74- Rutaevina

23,44- Flindersiamina

32,22- HMMA

EFT (Ca) S e C

2,68- Skimmiamina

12,18 Isopimpinelina

15,90- Rutaevina

18,83- Skimmiamina

23,36- Flindersiamina

32,03- HMMA

Skimmiamina (70) -

2,59 18,36

Flindersiamina (73) -

4,26 23,36

HMMA (89) -

5,43 32,72

Bergapteno (74) -

16,58 19,67

Isopimpinelina (76) -

12,40 -

Rutaevina (90) -

16,06 19,22

Condição 1 (C1): Coluna RP-18; Fase móvel: agua (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A:

20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo=

1 mL/min; comprimento de onda 210 nm.

Condição 2 (C2): Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T=

5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B.

Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 210 nm.

Legenda:

ETOH-P (Ca): extrato etanólico de caules de E. febrifuga obtido por percolação; EFN- E. febrifuga neutros;

EFT- E. febrifuga alcalóides totais;

HMMA- 1-Hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona.

114

a- ETOH-P (Ca) (C1) b- ETOH-P (Ca) (C2)

c- EFN (C1) d- EFN (C2)

e- EFT (C1) f- EFT (C2)

Figura 22: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, do extrato etanólico de caules de E.

febrifuga e frações.

Condição 1 (C1): Coluna RP-18; Fase móvel: agua (A): Acetonitrila (B). Fase móvel: agua (A): Acetonitrila (B). T= 0

min: 90% A: 10% B; T= 60 min: 20% A: 80% B; T= 70 min: 90% A: 10% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 ml/min;

comprimento de onda 210 nm.

115

Condição 2 (C2): Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T=

5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B.

Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 210 nm.

Legenda:

EFN- E. febrífuga neutros e EFT- E. febrifuga alcalóides totais.

6.5.3- Atividade antiplasmódica, citotoxicidade e índices de seletividade do extrato

etanólico de

E. febrifuga

, frações e substâncias isoladas

O extrato etanólico de caules de E. febrifuga mostrou-se moderadamente ativo nos

clones W2 e 3d7. O processo extrativo ao qual foi submetido este extrato não contribuiu

para a melhoria na atividade antiplasmódica, visto que, as frações obtidas tiveram CI

pouco mais elevadas que a do extrato. As substâncias puras obtidas foram moderamente

ativas (y-fagarina e skimmiamina) e inativas (rutaevina e 1-HMMA). A flindersiamina foi

inativa para 3d7 e sua CI

para W2 foi próxima à faixa considerada inativa. Todas as

amostras apresentaram atividade antiplasmódica inferior a cloroquina e mefloquina (Tabela

20, pg. 115).

Tabela 20: Atividade antiplasmódica, in vitro, através do método tradicional, do extrato etanólico

de caules de E. febrifuga, frações e substâncias isoladas.

W2 3d7

(µg/mL) +

Cloroquina 0,02 + 0,002 ND 0,0013 + 0,0001 0,0020 + 0,0001

Mefloquina 0,0165+0,002 0,0895+0,002 0,048 + 0,0007 0,0975+0,0007

ETOH- Ca 15,5 + 0,71 26,5 + 0,71 21,0 + 1,41 38,01 + 2,80

EFN 26,5 + 0,70 47,5 + 9, 1 ND ND

EFT 30,5 + 2,12 70,0 + 1,40 34,5 + 3,5 78,0 + 8,5

Flindersiamina 95,0 + 4,21 >100 >100 >100

Skimmiamina 19,5 + 0,71 33,5 + 0,71 43,0 + 1,41 >100

HMMA >100 ND >100 ND

γ-Fagarina

36,0 + 2,8 87,5 + 1,9 25,0 + 4,2 49,5 + 12,2

Rutaevina >100 ND >100 ND

egenda:

W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- sensível a cloroquina; CI

- concentração inibitória

50%; DP- desvio padrão; ETOH-P (Ca): extrato etanólico de caules de E. febrifuga obtido por percolação; EFN- E.

febrifuga neutros; EFT- E. febrifuga alcalóides totais;

HMMA- 1-Hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona; ND- não

determinado.

O ETOH- P (Ca) de E. febrifuga, frações e algumas das substâncias isoladas foram

submetidos a ensaios, in vitro, para atividade antiplasmódica utilizando a [8-

H] -

hipoxantina (DESJARDINS et al., 1979) (Tabela 21, pg. 115).

116

Tabela 21: Atividade antiplasmódica, in vitro, pelo método radioisotópico, do extrato etanólico de

caules de E.febrifuga, frações e substâncias isoladas.

[8-

H]-Hipoxantina

W2 3d7

(µg/ml) + DP CI

(µg/mL) +

Cloroquina 0,018 + 0,0005 0,002 + 0,0004

Mefloquina 0,044 + 0,0077 0,052 + 0,0056

ETOH-P (Ca) 21,75 + 2,29 38,01 + 2,80

EFN 49,20 + 4,09 29,60 + 4,15

EFT 34,5 + 3,5 39,50 + 5,63

Flindersiamina ND 68,01 + 8,68

Skimmiamina ND 54,10 + 5,26

Legenda:

W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- sensível a cloroquina; CI

- concentração inibitória

50%; DP- desvio padrão; ETOH-P (Ca): extrato etanólico de caules de E. febrifuga obtido por percolação; EFN- E.

febrifuga neutros e EFT- E. febrifuga alcalóides totais, ND- não determinado.

Além da avaliação da atividade antiplasmódica, o ETOH-P (Ca) de E. febrifuga e

frações foram submetidos a ensaio de citotoxicidade em células VERO, sendo determinada

a CC

, e a partir da divisão da CC

pela CI

50,

foram calculados os índices de seletividade

(Tabela 22, pg. 116).

Tabela 22: Citotoxicidade e índice de seletividade de extrato etanólico de caules de E. febrifuga e

frações.

(µg/mL)

IS (W2) IS (3d7)

ETOH-P (Ca) > 500 32,3 >23,8

EFN 364,9 23,5 ND

EFT 171,3 5,6 4,9

Legenda:

W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- sensível a cloroquina; CC

- Concentração citotóxica

50%, IS- índice de seletividade e ND- não determinado.

117

7- DISCUSSÃO

7.1- Comparação dos resultados obtidos para atividade antiplasmódica da cloroquina

e mefloquina com os dados da literatura

Para avaliação da atividade antiplasmódica dos extratos⁄frações⁄substâncias

utilizaram-se como antimaláricos de referência, difosfato de cloroquina e a mefloquina,

sendo calculadas as CI

destas drogas para os clones W2 e 3d7. Visando avaliar a

influência dos materiais e métodos utilizados no trabalho e o cálculo das CI

, compararam-

se estes resultados aos descritos na literatura (MACKINNON et al., 1997; KAPADIA et

al., 2001 e ANDRADE NETO et al., 2007), sendo observado que as CI

obtidas foram

próximas às descritas na literatura. Por não ter sido encontrado na literatura CI

para o

clone 3d7, comparou-se sua CI

àquele de outro clone sensível a cloroquina (D6). De

modo geral, as CI

obtidas neste trabalho estão na mesma faixa daquelas descritas na

literatura (Tabela 23, pg. 117).

As pequenas diferenças observadas nos valores das CI

podem estar relacionadas às

diferenças metodológicas (tradicional e radioisotópica), às diferenças entre os profissionais

que realizam os ensaios e, ainda, às diferenças relacionadas aos equipamentos e outros

produtos utilizados.

Tabela 23: Atividade antiplasmódica da cloroquina e mefloquina pelos métodos tradicionais e radioisotópico

encontradas no presente trabalho e descritas na literatura.

Substâncias

estrutura)

Clone Tradicional- CI

(µg⁄mL)

Radioisotópico CI

(µg⁄mL)

Referência

W2 0,023 0,018 Nesta tese Cloroquina (3)

3d7 0,0013 0,0020 Nesta tese

W2 0,0165 0,044 Nesta tese Mefloquina (2)

3d7 0,048 0,052 Nesta tese

Cloroquina(3) K1 0,46 - ANDRADE NETO et

al., 2007.

Cloroquina (3) W2 - 0,0295 MACKINNON et al.,

1997

Cloroquina (3) D6 - 0,0013 MACKINNON et al.,

1997

Mefloquina (2) W2 - 0,0014 MACKINNON et al.,

1997

Mefloquina (2) D6 - 0,0075 MACKINNON et al.,

1997

Cloroquina (3) W2 0,012 KAPADIA et al., 2001

Cloroquina (3) D6 0,0046 KAPADIA et al., 2001

118

Legenda:

clone W2: resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; Clone 3d7: sensível a cloroquina; clone D6: sensível

a cloroquina e resistente a mefloquina; CI

- concentração inibitória 50%

7.2- Relação entre dados obtidos da literatura e os resultados obtidos para

7.2.1-

Aspidosperma cylindrocarpon

De A. cylindrocarpon já foram isolados vários alcalóides indólicos (Tabela 1, pg. 61

e Quadro 10, pg. 48), sendo sua presença no extrato ETOH-P (Ca-Fo) confirmada em

CCDS e em CLAE. Esperava-se, em CLAE observar vários picos relacionados aos

alcalóides, porém isso não ocorreu. Sabe-se que os alcalóides desta planta são

estruturalmente semelhantes (MANSKE e RODRIGO, 1965) e por isso, podem possuir

tempos de retenção semelhantes e haver sobreposição dos picos (Anexo 1, pg. 153).

A atividade antiplasmódica de ETOH-P (Ca-Fo) de A. cylindrocarpon foi moderada

(CI

entre 10 a 100 µg⁄mL) para os clones W2 e 3d7 (Tabelas 9, pg. 96 e Tabela 24, pg.

119). O ETOH-P (Ca-Fo) de A. cylindrocarpon pode conter uma concentração de

alcalóides intermediária, visto que nas folhas, em geral, o teor de alcalóides é baixo, já nas

cascas do caule o teor de alcalóides é mais elevado (SCHRIPSEMA et al., 1999).

Apesar ETOH-P (Ca-Fo) de A. cylindrocarpon possuir baixa citotoxicidade (CC

500

µg⁄mL), seu índice de seletividade é baixo (Tabela 10, pg. 98 e Tabela 24, pg. 118).

Tabela 24: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica de

A. cylindrocarpon.

Alcalóides Atividade antiplasmódica Extrato

CCDS CLAE (pico e TR)* W2 3d7

ETOH-P (Ca-Fo) + 2 intensos, TR= 1,46

e 1,58 min

Moderada moderada

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada de sílica gel; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; W2-

clone resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina; + positivo.

Condição 1- Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B); T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5

min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura=

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 300 nm.

Condição 2- Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 + 2,5 mM de sal sódico de ácido hexanossulfônico (A):

Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A:

80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 300 nm.

*- Tabela 8 (pg. 94) e Anexo 1 (pg. 153)

7.2.2-

Aspidosperma olivaceum

119

A. olivaceum já foram isolados uleína (18), epiuleína (19), olivacina (59), elipticina

(17), aparicina (39) e aspidoscarpina (28) (GILBERT et al., 1965) (Tabela 1, pg.61 e

Quadro 11, pg. 49). Portanto, esperava-se observar nos cromatogramas, obtidos por CLAE

de extratos desta planta, vários picos relacionados a alcalóides, o que, entretanto não

ocorreu (ANEXO 1, pg.154 e Tabela 8, pg. 94). Provavelmente, esteja ocorrendo à

superposição de picos, o que pode estar relacionado às similaridades entre as estruturas

químicas (epiuleína e uleína são isômeros e olivacina e elipticina também são isômeros).

Os resultados obtidos em CCDS, CLAE e microteste foram correlacionados (Tabela

25, pg. 120). Os extratos que revelaram positivamente para alcalóides em CCDS

apresentaram picos intensos em CLAE, provavelmente relacionados aos alcalóides, e

mostraram-se muito ativos no microteste tradicional (W2 e 3d7). Extratos que não

revelaram em CCDS, mostraram picos de baixa intensidade em CLAE e mostraram menor

atividade antiplasmódica, exceto ETOH- S (Fo). Estes resultados sugerem que a atividade

antiplasmódica deve estar relacionada aos alcalóides, pois quanto mais intenso(s) o(s)

pico(s) relacionado(s) aos alcalóides de maior a atividade (Tabela 25, pg. 119 e Anexo 1,

pg.154). A atividade antiplasmódica de alcalóides presentes em A. olivaceum, elipticina

(17) e aspidoscarpina (28), já foram recentemente descritas (ANDRADE-NETTO et al.,

2007). Também a citotoxicidade de elipticina (17) e olivacina (59) tem sido relatada e a

questão do IS será melhor discutida no item 7.3.

Outro alcalóide que pode estar presente em extratos de A. olivaceum e cuja

atividade antiplasmódica foi demonstrada neste trabalho, é a uleína. Em síntese, esta

atividade dos extratos de A. olivaceum deve estar relacionada à presença de mais de um

alcalóide indólico.

Tabela 25: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica de A.

olivaceum.

Alcalóides Atividade antiplasmódica Extratos

CCDS CLAE (pico)* W2 3d7

DCL-S(Fo) - 2 Reduzido, TR= 1,20 e 2,36

min

Moderada Ativo

ETOH- S (Fo) - 1 Reduzido, TR= 1,15 min Ativo Ativo

DCL-S (Ca) +

2 Intenso, TR= 1,30 e 2,24 min Ativo Ativo

DCL-S (Cs) +

2 Intenso, TR= 1,30 e 2,24 min Ativo Ativo

ETOH-S (Cs) +

2 Intenso, TR= 1,05 e 2,10 min Ativo Ativo

Lenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada de sílica gel; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; W2-

clone resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina; + positivo; DCL-S (Fo)- extrato

120

diclorometano de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-S (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido em aparelho de

Soxhlet; DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em aparelho de Soxhlet; DCL-S (Cs)- extrato diclorometano

de cascas obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-P (Cs)- extrato etanólico de cascas obtido em aparelho de Soxhlet.

- Tabela 8 (pg. 98) e Anexo 1 (pg. 154)

7.2.3-

Aspidosperma ramiflorum

Todos os extratos de A. ramiflorum revelaram positivamente para alcalóides em

CCDS, porém apenas os extratos ETOH-P (Ca) e DCL-S (Cs) apresentaram picos intensos,

provavelmente relacionados a alcalóides, em CLAE (Anexo 1, pg. 156). As condições

cromatográficas utilizadas em CLAE foram padronizadas utilizando-se o extrato etanólico

de cascas de A. pavifolium, que contém uleína (18), epiuleína (19), aparicina (39) e

desmetiluleína (40) (JÁCOME, 1998), e estes alcalóides são estruturalmente diferentes dos

alcalóides presentes em A. ramiflorum [ramiflorina A e B (61 e 62), 10-metoxigeissoschizol

(60) e β-yoimbina (31)] (MARQUES et al., 1996 e JÁCOME, 1998). Estas diferenças

estruturais dos alcalóides, e as condições adotadas no CLAE podem não ser adequadas para

determinar o perfil dos extratos de A. ramiflorum.

Em relação à atividade antiplasmódica, os extratos DCL-S (Fo), DCL-S (Ca),

ETOH-S (Ca) e DCL- S (Cs) foram muito ativos em 3d7, enquanto que apenas os extratos

DCL-S (Fo) e DCL (Cs) mostraram-se ativos em W2 (Tabela 9, pg.96 e Tabela 26, pg.

121). A atividade antiplasmódica de extratos de A. ramiflorum deve estar também,

relacionada às ramiflorinas A e B.

A atividade anti-protozoário de A. ramiflorum foi descrita por Ferreira e cols.

(2004). O extrato alcaloídico mostrou-se ativo contra Leishmania (L.) amazonensis (DL

47 µg⁄mL) e esta deve estar relacionada à ramiflorina A (61) e B (62) (FERREIRA et al.,

2004). Também, o extrato metanólico, frações obtidas por extração ácido-base, ramiflorina

A (61) e ramiflorina B (62) mostraram-se ativos em bactérias Gram positivas (TANAKA et

al., 2006).

121

Tabela 26: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica de

A. ramiflorum.

Alcalóides Atividade antiplasmódica** Extratos

CCDS CLAE* W2 3d7

ETOH-P (Fo) + TR1,40 e 2,10 min moderada Moderada

DCL-S (Fo) + 2 pouco intensos, TR=1,44 e

2,30 min

ativo Ativo

ETOH-P (Ca) + 4 intensos, TR=1,24; 1,56; 1,88

e 2,92 min

moderada Moderada

DCL-S(Ca) + 2 pouco intensos, TR= 1,42 e

2,12 min

NT Ativo

ETOH-S (Ca) + 1 pouco intenso, TR= 1,38 min Moderada Ativo

DCL- S(Cs) + 2 intenso, TR= 1,37 e 8,48min ativo Ativo

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada de sílica gel; CLAE- cromatografia de alta eficiência; W2- clone

resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina; ETOH-P (Fo)- extrato etanólico de

folhas obtido por percolação; DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-P (Ca)-

extrato etanólico de caules obtido por percolação; DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em aparelho de

Soxhlet; ETOH-S (Ca)- extrato etanólico de caules obtido em aparelho de Soxhlet e DCL-S (Cs)- extrato diclorometano

de cascas obtido em aparelho de Soxhlet; NT- não testado.

- Tabela 8 (pg. 94) e Anexo 1 (pg. 156)

** Tabela 9 (pg. 96)

7.2.4-

Aspidosperma spruceanum

De A. spruceanum já foram isolados aspidoalbina (62), acetilaspidoalbina (63) e

desmetilaspidolimidina (64) (GILBERT et al., 1965), logo se esperava a presença

alcalóides em CCDS (Anexo 1, pg. 158; Tabela 8, pg. 95 e Tabela 27, pg. 122). Apenas os

extratos obtidos das cascas revelaram positivamente, o que pode estar relacionado ao fato

de as cascas, em geral apresentarem maior teor de alcalóides. Em CLAE, foram observados

picos intensos, com baixos TRs, possivelmente devidos a alcalóides, em todos os extratos,

exceto em ETOH (Fo) e ETOH-S (Ca). No cromatograma (CLAE) de DCL-S (Fo)

observam-se 3 picos de intensidades semelhantes enquanto que, nos outros tem-se 1 pico

intenso, com TR< 5 min. Neste caso, poderia estar ocorrendo superposição de picos o que

se justificaria por uma possível semelhança estrutural de alcalóides presentes (Tabelas 8,

pg. 95; Tabela 27, pg. 122 e Anexo 1, pg. 158 ).

Os extratos com maior atividade antiplasmódica foram aqueles obtidos com

diclorometano em aparelho de Soxhlet (Tabela 9, pg. 97 e Tabela 27, pg. 122). Este método

favorece a extração de alcalóide presentes nas cascas de caules, e estes, são provavelmente

os responsáveis pela atividade antiplasmódica (Tabela 9, pg. 97 e Tabela 27, pg. 122).

122

Tabela 27: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica de

A. spruceanum.

Alcalóide Atividade antiplasmódica**

Extratos

CCDS CLAE* W2 3d7

ETOH-P (Fo) -

3 intensos, TR=1,14 e 1,50

moderada inativo

DCL- S (Fo) -

1 intenso, TR=1,17; 1,51 e 1,92

moderada moderada

DCL- S (Ca) -

1 intenso, TR=1,17

ativo ativo

CLOR-P (Ca) -

moderada inativo

ETOH-P (Cs) +

1 intenso, TR=1,13

moderada moderada

DCL- S(Cs) +

1 intenso, TR=1,11

ativo moderada

ETOH-S (Cs) +

1 intenso, TR=1,1

moderada moderada

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada em sílica gel; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; W2-

clone resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina; ETOH-P (Fo)- extrato etanólico de

folhas obtido por percolação; DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; ETOH-S Fo)-

extrato etanólico de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em

aparelho de Soxhlet; CLOR-P (Ca)- extrato clorofórmico de galhos obtido por percolação; g- ETOH-P (Cs)- extrato

etanólico de cascas obtido por percolação; h- DCL-S (Cs)- extrato diclorometano de cascas obtido em aparelho de Soxhlet

e i- ETOH-P (Cs)- extrato etanólico de cascas obtido em aparelho de Soxhlet.

*- Tabela 8 (pg. 95) e Anexo 1 (pg. 158)

**- Tabela 9 (pg. 97)

7.2.5-

Aspidosperma tomentosum

Uleína (18), epiuleína (19) e limatinina (66) já foram isolados de A. tomentosum

(ARNDT et al., 1967). De fato, em CCDS, foram observadas as manchas provavelmente

relacionadas aos alcalóides (reagente Dragendorff). Em CLAE, nos cromatogramas dos

extratos obtidos de A. tomentosum observam-se que os picos, possivelmente relacionados

aos alcalóides, estão superpostos. Esta superposição dos picos deve estar relacionada ao

fato das semelhanças estruturas dos alcalóides presentes nesta planta (Tabela 8, pg. 95 e

Tabela 28, pg. 123).

A atividade antiplasmódica de extratos de A. tomentosum, em geral, foi moderada

(Tabela 9, pg. 97 e Tabela 28, pg. 123). No presente estudo, a atividade antiplasmódica da

uleína foi demonstrada, e esta substância pode ser a principal responsável pela atividade

antiplasmódica do extrato etanólico obtido das sementes de A. tomentosum no clone 3d7

(Tabela 9, pg. 97; Tabela 28, pg. 123 e Anexo 1, pg.160).

123

O extrato etanólico das sementes de A. tomentosum mostrou-se ativo no clone 3d7 e,

por isso sua citotoxicidade foi avaliada, sendo observada uma baixa citotoxicidade (CC

500 µg⁄mL). O IS para 3d7 foi moderado e para W2 foi baixo (Tabela 10, pg. 98).

Tabela 28: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica de

extratos etanólicos A. tomentosum.

Alcalóides Atividade antiplasmódica

CCDS CLAE* W2 3d7

ETOH-P (Ca)

+ Intenso, TR=1,14; 1,32; 9,3 e

19,18

moderada moderada

ETOH-P (Fo)

- Intenso, TR=1,18 moderada moderada

ETOH-P (Fr)

+ Intenso, TR=1,13 e 1,39 moderada moderada

ETOH-P (Se)

+ Intenso, TR=1,18 e 1,79 moderada Ativo

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada em sílica gel; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; W2-

clone resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- clone sensível a cloroquina; ETOH-P (Ca): extrato etanólico de

caules obtidos por percolação; ETOH-P (Fo): extrato etanólico de folhas obtidos por percolação; ETOH-P (Fr): extrato

etanólico de frutos obtidos por percolação e ETOH-P (Se): extrato etanólico de sementes obtidos por percolação.

- Tabela 8 (pg. 95) e Anexo 1

(pg. 160 )

**- Tabela 9 (pg. 97)

7.3-

A. parvifolium

: análises fitoquímicas, atividades antiplasmódica, citotoxicidade e

índice de seletividade

7.3.1- Estudos fitoquímicos

Em todas as amostras analisadas em CCDS foram detectados alcalóides, triterpenos e

esteróides, e as análises foram negativas para cumarinas. No ETOH-P (Cs), APN-1 e APN-

2 revelaram positivamente para saponinas. Já, no ETOH-P (Cs), APT-1 e APT-2 foi

observada a presença de flavonóides (Tabela 12, pg. 100), sendo que estes resultados estão

de acordo com Jácome e cols. (2004).

O ETOH-P (Cs) de A. parvifolium e as frações foram submetidos a análises

cromatográficas em CCDS, utilizando-se a uleína-se como referência para alcalóides. Na

prospecção fitoquímica do ETOH-P (Cs) de A. parvifolium, por CCDS, foi detectada a

presença de alcalóides e flavonóides (JÁCOME et al., 2004). O fracionamento anterior de

APN levou ao isolamento do lupeol, estigmasterol e aparicina e do fracionamento de APT

foram isolados uleína e epiuleina (JÁCOME, 1998 e JÁCOME et al., 2004).

A Figura 15 (pg. 100) mostra uma placa cromatográfica (CCDS) revelada com

anilsaldeído- ácido sulfúrico, onde a coloração azul aparece em todas as amostras e está

relacionada à presença dos alcalóides, como se pode deduzir a partir da mancha de uleína.

124

Para a análise por CLAE, foi realizada previamente uma padronização (resultados não

mostrados no presente trabalho), e selecionada a melhor condição analítica:

- Coluna RP-18;

- Temperatura de eluição=30

- Fluxo=1 mL⁄ min.;

- Detecção= UV 300 nm;

- Fase móvel: Tampão fosfato pH 2,6 (A) e Acetonitrila (B); T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5

min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min:

85% A: 15% B.

A coluna de fase reversa (RP- 18) é muito eficaz na análise qualitativa e quantitativa de

alcalóides (FALKENHAGEN et al., 1993). Porém, substâncias básicas podem interagir com os

grupos silanóis (Si-O-H) da fase estacionária, aumentando seu tempo de retenção e interferindo,

também, na intensidade dos picos. A fim de reduzir o tempo de retenção dos alcalóides pode-se usar

uma fase móvel contendo tampão fosfato em pH 2,5 (GERASIMENKO et al., 2001). Nestas

condições, os alcalóides estarão na forma de sais (R

-H) que, sendo muito polares, serão eluídos

rapidamente da coluna e apresentarão valores baixos para os tempos de retenção (TR).

O maior problema da utilização de fase móvel com pH 2,5 está relacionado à coluna,

uma vez que pH muito ácido pode danificar a fase reversa, podendo ocorrer à quebra da

ligação éter do grupo C18 ao silanol, reduzindo sua vida útil. Visando minizinar este efeito

do pH ácido sobre a coluna, a temperatura foi reduzida de 40º C para 30º C.

Os alcalóides indólicos de A. parvifolium apresentam máximos de absorção no UV em

torno de 210 e 300 nm (JÁCOME, 1998). Após alguns experimentos utilizando-se os

comprimentos de onda de 210 nm e 300 nm, observou-se que, em 210 nm, vários picos

apareciam no cromatograma e estes, em sua maioria, não estavam relacionados aos

alcalóides. Já quando se utilizou 300 nm os picos relacionados aos alcalóides estavam

presentes, mas os picos relacionados às outras substâncias não eram observados. Então,

conclui-se que o mais adequado seria trabalhar a 300 nm, visto que se queria traçar o perfil

cromatográfico preferencialmente dos alcalóides indólicos.

125

As vantagens das condições adotadas foram: 1- boa repetividade nos tempos de

retenção, isto é, os extratos⁄frações⁄substâncias foram submetidos a várias análises (no

mínimo três), em dias diferentes, sendo observados praticamente, os mesmos tempos de

retenção; 2- nas condições adotadas, os alcalóides estão protonados e por isso possuem

tempos de retenção (TR) baixos, sendo observados seus picos no início dos cromatogramas

(Figura 16, pg. 101-102 e Tabela 13, pg. 104).

7.3.2- Atividade antiplasmódica, citotoxicidade e índice de seletividade do ETOH-P

(Cs) de

A. parvifolium

, frações e uleína

7.3.2.1- Correlação dos resultados obtidos nos estudos fitoquímicos e a atividade

antiplasmódica

vitro

O fracionamento do extrato etanólico de cascas de A. parvifolium levou ao aumento

da atividade antiplasmódica (Tabela 15, pg. 109 e Tabela 29, pg. 126), o que,

provavelmente, está relacionado ao fato de as frações APT-1 e 2 conterem maiores teores

de uleína que o extrato etanólico. Porém, as análises em CCDS e CLAE demonstraram que

tanto o extrato como as frações contêm alcalóides (Tabela 12, pg. 100; Figura 15, pg. 100;

Figura 16, pg. 101-102 e Tabela 29, pg. 125).

Tabela 29: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica

para o extrato etanólico de cascas de A.parvifolium, frações e APT 13-16 (8)/ uleína.

Alcalóides Atividade antiplamódica**

CCDS CLAE* W2 3d7

ETOH-P (Cs) + intenso Moderada Moderada

APN-1 + Intenso Moderada Moderada

APN-2 + Intenso Ativa Moderada

APT-1 + intenso Ativa Ativa

APT-2 + Intenso Ativa Ativa

APT 13-16

(8)/uleína

+ intenso Ativa Ativa

Legenda:

CCDS- cromatografia em camada delgada; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; clone W2-

resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; clone 3d7- sensível a cloroquina; APN-1- fração de neutros 1 (Figura 11,

pg. 73); APN-2- fração de neutros 2 (Figura 12, pg. 74); APT-1- fração de alcalóides totais 1 (Figura 11, pg. 73); APT-2-

fração de alcalóides totais 2 (Figura 12, pg. 74).

*- Tabela 12, pg. 100; Figura 16, pg. 101-102.

**-Tabela 15, pg. 109.

Vale ressaltar que, quando se compara a CI

(

32,75 + 1,06

µg⁄mL

)

do ETOH-P (Cs)

de A. parvifolium à CI

do extrato metanólico da Artemisia annua (CI

= 3,9 µg⁄mL), de

onde foi isolada a artemisinina (5), ou ao extrato metanólico de Cinchona calisaya (CI

126

0,5 µg⁄mL), sendo que deste gênero foi isolada a quinina (1), fica ainda mais claro que o

ETOH-P (Cs) de A. parvifolium apresenta uma atividade antiplasmódica moderada. No

entanto, APT-1, APT-2 e APT 13-16(8)/ uleína (18)são mais ativas no clone de P.

falciparum W2 que o extrato metanólico de A. annua (Tabela 15, pg. 108).

7.3.2.2- Ensaio radioisotópico de extrato etanólico de cascas de

A. parvifolium

frações

Este ensaio fundamenta-se no seguinte princípio: os parasitos para amadurecerem,

nas hemácias, necessitam de hipoxantina que está contida no meio. No presente ensaio, a

hipoxantina incorporada pelo parasito é radioativa, [8

H]- hipoxantina, que emite radiação

beta, sendo a emissão proporcional à incorporação da hipoxantina e, portanto, indicativa da

concentração de parasitas viáveis.

Quando se comparam as CI

obtidas no microteste tradicional (Tabela 15, pg. 108)

com as CI

obtidas no microteste com hipoxantina (Tabela 16, pg. 109), observa-se que as

últimas, em geral, são mais elevadas, o que é explicado pelo fato de que, quando se utiliza a

hipoxantina, o tempo de exposição à amostra é menor (42h em estufa seguida de

armazenamento a -20º C) do que aquele no ensaio tradicional (72h). Outro fator que pode

estar favorecendo a menor CI

no ensaio tradicional é a exposição a mais de 1 dose, isto é,

no tempo zero os parasitos entram em contato com a 1ª dose; após 24 e 48h o meio é

removido e adicionadas novas doses, 2ª e 3ª doses respectivamente, sendo o efeito final a

somatória das 3 doses (CARVALHO, 1990). Já, quando se utiliza a hipoxantina radioativa,

no tempo zero, o parasito entra em contato com a dose da amostra

(extrato⁄frações⁄substâncias), 24h após adiciona-se a [8

H]-hipoxantina e após a18h o

cultivo é armazenado a -20º C para que ocorra a hemólise e possa ser realizada a medida da

radiação β (DESJARDINS et al. 1979).

Quando se consideram os parâmetros descritos por Basco e cols. (1994), em que, de

acordo com as CI

as substâncias são classificadas como ativas (CI

< 10 µg⁄mL);

moderadamente ativas (CI

entre 10 a 100 µg⁄mL) e inativas (CI

> 100 µg⁄mL), observa-

se uma boa correlação entre os resultados obtidos nos dois ensaios, isto é a maioria das

127

amostras moderadamente ativas pelo método tradicional foram moderadamente ativas no

ensaio com [8

H] hipoxantina. As amostras foram ativas em ambos os métodos (Tabela 30,

pg. 127).

Quando se emprega o método tradicional para avaliar a atividade antiplasmódica

das amostras tem-se como desvantagem a necessidade de pessoa treinada para realizar a

leitura das lâminas e, em geral esta leitura é muito demorada devido ao elevado número de

lâminas a serem examinadas ao microscópio. As vantagens deste método são: a boa

repetitividade dos resultados percentuais e a observação da morfologia dos parasitos.

No caso da hipoxantina marcada, as vantagens são a facilidade e a rapidez das

leituras, que são realizadas em um β-cintilador. As desvantagens desta técnica são: o custo

mais elevado, uma vez que é necessário um equipamento de custo razoável (U$ 40,000); a

utilização de produto radioativo; a menor repetitividade dos resultados, além de não ser

possível observar a morfologia do parasito.

O ensaio utilizando a hipoxantina marcada é uma ferramenta muito útil quando se

tem um número elevado de amostras a avaliar. Uma vez realizada a triagem e identificadas

às amostras ativas, o ideal é realizar o microteste tradicional com estas amostras para

confirmar a atividade e avaliar os aspectos morfológicos dos parasitos.

Tabela 30: Correlação entre os resultados obtidos no microteste tradicional e o método isotópico.

Microteste tradicional* Microteste radioisotópico**

W2 3d7 W2 3d7

ETOH-P (Cs) moderada moderada moderada moderada

APN-1 moderada moderada moderada moderada

APN-2 Ativa moderada ativa moderada

APT-1 Ativa Ativa ativa moderada

APT-2 Ativa Ativa ativa ND

Legenda:

clone W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; clone 3d7- sensível a cloroquina; APN- 1- fração de

neutros (Figura 11, pg. 73); APN- 2- fração de neutros (Figura 12, pg. 74); APT-1- fração de alcalóides totais (Figura 11,

pg. 73); APT-2- fração de alcalóides totais (Figura 12, pg. 74); ND- não determinado.

*- Tabela 15, pg. 109.

**- Tabela 16, pg. 110.

7.3.2.3- Citotoxicidade de extrato etanólico de cascas de

A. parvifolium

, frações e APT

13-16 (8)/ uleína (18)

O ETOH-P (Cs) A. parvifolium mostrou-se pouco tóxico para células VERO (CC

> 500 µg⁄mL) enquanto que as frações APN-1 e APT-1 e a

APT-13- 16 (8) /uleína

(18)

128

mostraram uma toxicidade moderada (100 < CC

< 500 µg⁄mL). Quando se determinou o

índice de seletividade utilizando-se os resultados obtidos para o clone W2 (Tabela 15, pg.

108) observou-se que quanto mais pura a amostra, maior seu índice de seletividade. Porém

quando se utilizam os resultados obtidos para o clone 3d7 (Tabela 15, pg. 108), as

alterações nos índices de seletividade são discretas e menos favoráveis (Tabela 17, pg.

110).

Alcalóides isolados de outras espécies pertencentes ao gênero Aspidosperma já

foram submetidos a ensaios para avaliar a atividade antiplasmódica e a citotoxicidade. De

A. pyrifolium e A. megaloncarpon foram isolados 12 alcaloídes indólicos com esqueleto

aspidospermano. Todos os alcalóides foram submetidos ao ensaio, in vitro em P.

falciparum (FcM29 clone resistente a cloroquina), pelo método da hipoxantina marcada

(DESJARDINS et al., 1979 e VALENTIN et al., 1997). Destes alcalóides, apenas 6 foram

submetidos a avaliação de citotoxicidade em cultura de células de linhagem de fibrablastos

humanos (NiH2T3), o que permitiu a determinação do índice de seletividade (IS). Estes

resultados encontram-se na Tabela 31 (pg. 131) (MITAINE-OFFER et al., 2002).

Henrique (2007) isolou de A. vargasii a elipticina (17) e a N-metiltetradiroelipticina

(38). Estes alcalóides foram submetidos ao ensaio in vitro em P. falciparum (K1 clone

multiresistente) pelo método tradicional. Utilizando diferentes linhagens celulares tumorais

(HL-60, MDA- MB, HCT e SF295) determinou-se a citotoxicidade pelo método

colorimétrico do MTT. Os resultados estão na Tabela 31 (pg. 130) (ANDRADE- NETO et

al., 2007 e HENRIQUE, 2007).

A elipticina (17) e a N-metiltetraidroelipticina (38) foram os alcalóides com maior

atividade antiplasmódica, porém mostraram-se muito citotóxicas, sendo seus índices de

seletividade muito baixos (Tabela 31, pg. 131). Dos alcalóides testados por Mitaine-Offer e

cols (2002), 10-metoxi-aspidospermidina (91), N-formil-aspidospermidina (32) e

aspidospermidina (92) foram os mais ativos, porém mostraram-se muito citotóxicos e seus

índices de seletividade também foram baixos (Tabela 31, pg. 130 e Quadro 16, pg. 129).

129

A APT 13-16 (8)/ uleína (18) mostrou atividade antiplasmódica menor que a

elipticina (17) e N-metiltetradiroelipticina (38), porém foi menos citotóxica e seu índice de

seletividade foi mais elevado. Avaliando o binômio risco: benefício, pode-se concluir que a

APT 13-16 (8)/ uleína (18) apresenta um maior potencial a candidato a fármaco

antimalárico do que a elipticina (17) e a N-metiltetradiroelipticina (38).

Comparando os índices de seletividade (IS) relatados para uleína (18) e cloroquina

observam-se valores bastantes diversos (Tabela 32, pg. 131). Wright e cols (1993)

relataram que o IS da cloroquina é 376, isto é, menor que aquele encontrado para uleína

(IS= 500). Já em outros trabalhos, a cloroquina apresentou maior IS que a uleína (WRIGHT

et al., 1994; LIKHITWITAYAWUID et al., 1993). Em relação à mefloquina (2), o IS da

uleína (18) foi próximo desta droga (LIKHITWITAYAWUID et al., 1993) (Tabela 32, pg.

131). Esta diversidade de valores está relacionada a diferentes cepas de P. falciparum e

linhagens celulares empregadas na determinação da CI

e CC

, respectivamente.

Quadro 16: Estruturas químicas de alcalóides de Aspidosperma submetidos a ensaios in vitro para atividade

antiplasmódica e citotoxicidade descritos na literatura.

C H

Elipticina (17) Uleína (18)

Elipticinium (27) N- Metiltetraidroelipticina (38)

AcO

130

C H

OCCH

N-formil-aspidospermidina (32):

R=HCO; R

=OCH

e R

10-metoxi-aspidopermidina (91):

R=R

=H e R

=OCH

Aspidolimidina (94)

Aspidopermidina (92):

R=CH

CO; R

=OCH

e R

Palosina (93):

R=C

CO; R

=OCH

e R

Fonte:

JÁCOME, 1998.

Tabela 31: Comparação do efeito antiplasmódico, citotoxicidade e índice de seletividade da APT

13-16 (8)/ uleína (18) a outros alcalóides indólicos de Aspidosperma spp descritos na literatura.

Alcalóide

(µM) CC

(µM)

IS Referência

APT 13-16 (8)/

uleína (18)

2,8 (W2) 1408,3 500,0 Nesta tese

10-metoxi-aspi-

dospermidina (91)

3,2 (FcM29) 72,1 (NIH2T3) 22,7 MITAINE-OFFER et

al., 2002

N-formil-aspi-

dopermidina (32)

5,6 (FcM29) 87,1 (NIH2T3) 15,6 MITAINE-OFFER et

al., 2002

Aspidopermidina

(92)

5,6 (FcM29) 46,2 (NIH2T3) 8,3 MITAINE-OFFER et

al., 2002

Palosina (93) 12,7 (FcM29) 40,8 (NIH2T3) 3,2 MITAINE-OFFER et

al., 2002

Aspidoslimidina

(94)

49,5 (FcM29) 13,0 (NIH2T3) 0,3 MITAINE-OFFER et

al., 2002

Elipticina (17) 0,073 (K1) 0,44-6,18 * 6,03-84,64 ANDRADE-NETTO

et al., 2007;

HENRIQUE, 2007

N-metiltetra-

diroelipticina (38)

0,69 (K1) 13,7-26,67* 19,8-38,6 HENRIQUE, 2007

Legenda:

- concentração inibitória 50%; CC

- concentração citotóxica 50%; IS- índice de seletividade; µM-

micromolar. Clones W2 e FcM29 clone resistente a cloroquina; clone K1- multi-resistente; NiH2T3- células de linhagem

de fibroblastos humano e * outras linhagens celulares.

131

Tabela 32: Comparação do IS da APT 13-16 (8)/ uleína (18) com os IS da cloroquina e mefloquina

descritos na literatura.

Substância IS Referências

APT 13-16 (8)/ uleína (18) 500 Nesta tese

Cloroquina (3) 376 WRIGHT et al., 1993

Cloroquina (3) 981 WRIGHT et al., 1994

Cloroquina (3) 8000 LIKHITWITAYAWUID et al., 1993

Mefloquina (2) 588 LIKHITWITAYAWUID et al., 1993

7.4

Relação entre dados da literatura e os resultados obtidos para

Esenbeckia

febrifuga

E. febrifuga, conhecida popularmente como quina-do-mato, é utilizada na medicina

tradicional brasileira para o tratamento de febre e malária. Estudos em camundongos

infectados com P. berghei, demonstraram redução de 18% da parasitemia sangüínea na

dose de 1,0 g⁄Kg⁄ dia (CARVALHO, 1990). Baseado nestas informações selecionou-se esta

planta para estudos fitoquímicos, avaliação da atividade antiplasmódica e citotoxicidade.

7.4.1- Estudos fitoquímicos e cromatográficos em CCDS e CLAE, atividade

antiplasmódica e citotoxicidade

Inicialmente, o extrato etanólico de caules de E. febrifuga foi submetido à extração

ácido-base (Figura 12, pg. 74). Em seguida, extrato e frações foram submetidos a análises

cromatográficas (Tabela 19, pg. 114).

Placas cromatográficas (CCDS) contendo o extrato de E. febrifuga, frações e os

alcalóides isolados deste extrato pelo grupo do Prof. Dr. H. Wagner (Universidade de

Munique, Alemanha), apresentaram fluorescência azul, porém não revelaram pelo reagente

de Dragendorff (Tabela 19, pg. 113 e Tabela 33, pg. 132). Resultados negativos para

alcalóides, obtidos em CCDS quando reveladas com reagente de Dragendorff, não

significam ausência destes metabólitos. Quinolonas e acridonas são lactamas e, como

amidas, são bases muito fracas o que pode justificar a não reação com o reagente de

Dragendorff. Outro revelador utilizado foi anisaldeído-ácido sulfúrico, porém os alcalóides

desta planta também não revelaram, com este reagente.

132

Extratos obtidos de espécies pertencentes ao gênero Esenbeckia podem conter

diferentes metabólitos secundários, como alcalóides quinolínicos, furanoquinolínicos,

quinolonas e acridonas (DREYER et al., 1980; GUILHON et al., 1994; OLIVEIRA et al.,

1996 e SIMPSOM & JACOBS, 2005); cumarinas e furanocumarinas (DREYER et al.,

1980; GUILHON et al., 1994; OLIVEIRA et al., 1996; TRANI et al., 1997; RIOS &

DELGADO, 2002 e SIMPSOM & JACOBS, 2005); flavonóides (KUBO, 1991); liminóides

(OLIVEIRA et al., 1996); derivados do ácido cinâmico (GUILHON et al., 1994) e

triterpenos (RIOS & DELGADO, 1992).

Em CLAE, as condições empregadas permitiram identificar os picos relacionados

aos alcalóides isolados em todas as amostras [ETOH-P (Ca), EFN e EFT], sendo que todas

as amostras também apresentaram atividade antiplasmódica moderada (Tabela 19, pg. 114

e Tabela 33, pg.133). Analisados os resultados obtidos em CCDS e CLAE das frações

obtidas a partir de ETOH-P (Ca) E. febrifuga, pode-se concluir que a extração ácido-base

não foi eficaz para separar os alcalóides desta planta (Tabela 33, pg. 132).

Tabela 33: Correlação entre os resultados obtidos em CCDS, CLAE e atividade antiplasmódica de

E. febrifuga e frações.

Alcalóides* Atividade antiplasmódica**

CCDS CLAE W2 3d7

ETOH-P (Ca) - + moderada Moderada

EFN - + moderada ND

EFT - + moderada Moderada

Legenda:

W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- sensível a cloroquina; CCDS- cromatografia em

camada delgada em sílica gel; CLAE- cromatografia líquida de alta eficiência; + positivo; - negativo; ETOH- P (Ca)-

extrato etanólico de caules de E. febrífuga obtido por percolação;

EFN- E. febrifuga neutros e EFT- E. febrifuga

alcalóides totais; ND- não determinado.

*- Tabela 19, pg. 113, Figura 18, pg. 113-114.

**- Tabela 20, pg. 115.

Quando se comparam os valores de CI

obtidos pelos métodos tradicional e

radioisotópico observam-se variações numéricas, porém estas se mantêm na mesma faixa

de atividade moderada (Tabela 34, pg. 133).

De acordo com Carvalho (1990), o extrato de caules de E. febrifuga apresentou

atividade parcial em ensaios in vivo contra as formas sangüíneas do Plasmodium berghei,

na dose de 1000 mg⁄ kg de camundongo. A atividade antiplasmódica moderada in vitro (P.

falciparum) aqui descrita vem confirmar estes resultados.

133

O processo extrativo ao qual foi submetido este extrato não contribuiu para a

melhoria na atividade antiplasmódica, visto que, as frações obtidas apresentaram valores de

um pouco mais elevados que aquele do extrato (Tabela 20, pg. 115). Além disso, as

frações EFN e EFT mostraram-se mais tóxicas e com menor IS (Tabela 22, pg. 116).

As substâncias puras avaliadas foram moderamente ativas (

γ-fagarina

skimmiamina) e inativas (rutaevina e HMMA). A flindersiamina foi inativa para 3d7 e sua

para W2 foi próxima à faixa considerada inativa. Todas as amostras apresentaram

atividade antiplasmódica inferior a cloroquina e mefloquina (Tabela 20, pg. 115 e Tabela

34, pg. 133), confirmando, mais uma vez, que o potencial antimalárico desta espécie, de

suas frações e substâncias é baixo.

Tabela 34:

Correlação entre os resultados obtidos no microteste tradicional e o método

radioisotópico.

Microteste tradicional* Método radioisotópico** Amostra

W2 3d7 W2 3d7

Cloroquina Ativo ativo ativo Ativo

Mefloquina Ativo ativo ativo Ativo

ETOH-P (Ca) Moderada moderada moderada Moderada

EFN Moderada ND moderada Moderada

EFT Moderada moderada moderada Moderada

Flindersiamina Moderada inativo ND Moderada

Skimmiamina Moderada moderada ND Moderada

Legenda: W2- resistente a cloroquina e sensível a mefloquina; 3d7- sensível a cloroquina;

ETOH- P

(Ca)- extrato etanólico de caules de E. febrífuga obtido por percolação;

EFN- E. febrifuga neutros e EFT- E.

febrifuga alcalóides totais; ND- não determinado.

* Tabela 20, pg. 115.

** Tabela 21, pg. 115.

Quando e comparam os resultados obtidos (CI

) para as substâncias isoladas de E.

febrifuga, observa-se que a skimmiamina (70) apresentou atividade antiplasmódica

moderada neste trabalho e quando avaliada por BASCO e cols.(1994), outros alcalóides

quinolínicos, como por exemplos haplopidina (95), kokusaginina (68), e outras acridonas

como, por exemplo acronicidina (96) (Tabela 35, pg. 134), mostraram-se ativas em W2. A

da γ-fagarina (71) obtida neste trabalho foi próxima à descrita na literatura

(RANDRIANARIVELOJOSIA et al., 2003), as diferenças observadas devem estar

relacionadas aos clones usados para determinação da atividade antiplasmódica (Tabela 35,

pg. 134).

134

Tabela 35:

Comparação da atividade antiplasmódica dos alcalóides de E. febrifuga com os

dados da literatura.

Presente trabalho Dados da

literatura

Substâncias

(µg/mL) CI

(µg/mL)

Referencia

Skimmiamina (70) 19,5 14,1 BASCO et al., 1994

Flindersiamina (73) 95,0 Nesta tese

HMMA (89) >100 Nesta tese

γ-Fagarina (71)

36,0

22,6

RANDRIANARIVELOJOSIA

et al. 2003

Haplopidina (95) ND 8,34 BASCO et al., 1994

Kokusaginina (68) ND 7,7 BASCO et al., 1994

Acronicidina (96) ND 5,72 BASCO et al., 1994

*clone FcM29.

Quadro 17:

Estruturas químicas dos alcalóides furanoquinolinicos da Tabela 35.

OCH

Kokusaginina (68):

= OCH

; R

= H

Flindersiamina (73)

Skimmiamina (70):

= OCH

; R

= H

Haplopina (95):

= OCH

; R

= OH; R

= H

Acronicidina (96):

= R

= OCH

; R

= H

O OH

OCH

HMMA (89)

7.5- Análise da atividade antiplasmódica dos extratos, frações e substâncias.

135

Das 7 espécies estudadas, aquela com maior número de extratos com atividade

antiplasmódica foi A. olivaceum, seguida de A. ramiflorum e A. spruceanum. Das demais

espécies, todos os extratos testados foram moderamente ativos nos clones W2 e 3d7 de P.

falciparum (Tabela 36, pg. 135).

Entre os extratos ativos observa-se que todos foram obtidos por alcalinização do pó

da planta com hidróxido de amônio, seguida da extração, em aparelho de Soxhlet, com

diclorometano (6 extratos ativos) e etanol (2 extratos ativos) (Tabela 36, pg. 135).

Tabela 36: Comparação das atividades antiplasmódicas dos extratos avaliados.

Extratos

(µg/mL) – W2

ATIVOS (CI

< 10 µg/ml)

ETOH-S de A. olivaceum (Cs)

5,0

DCL-S de A. olivaceum (Ca)

< 6,0

DCL-S de A. olivaceum (Cs)

<6,0

DCL-S

de A. ramiflorum

(Fo)

< 6,0

DCL- S

de A. ramiflorum

(Cs)

< 6,0

DCL- S

de A. spruceanum

(Cs)

< 6,0

DCL-S de A. olivaceum (Fo)

7,0

ETOH- S de A. olivaceum (Fo)

7,0

MODERADAMENTE ATIVOS (CI

10 a 100 µg/mL)

ETOH-P E. febrífuga (Ca) 15,5

ETOH-S

de A. ramiflorum

(Ca)

19,75

ETOH-P de A. tomentosum (Fr)

20,52

DCL- S de A. spruceanum (Fo)

23,25

ETOH-P de A. tomentosum (Fo)

23,75

ETOH-P de A. tomentosum (Se)

24,51

ETOH-S de A. spruceanum (Ca) 26,25

ETOH-P de A. tomentosum (Ca)

26,50

ETOH-S de A. spruceanum (Cs) 28,01

ETOH-P de A. spruceanum (Ca) 29,52

ETOH-P de A. parvifolium (Cs)

32,75

ETOH-P

de A. ramiflorum

(Fo)

32,8

ETOH-P

de A. ramiflorum

(Ca)

36,5

CLORO-P de A. spruceanum (Ca)

37,0

ETOH-P de A. cylindrocarpon (Fo-Cs) 44,0

ETOH-P de A. spruceanum (Fo)

65,0

Legenda:

W2- resistente a cloroquina; CI

- concentração inibitória 50%; ETOH-P: extrato etanólico obtido por

percolação; ETOH-S- extrato etanólico obtido em aparelho de Soxhlet; DCL-S- extrato diclorometano obtido em aparelho

de Soxhlet; CLORO-P extrato clorofòrmico obtido por percolação; Ca- caules; Cs- cascas; Fo- folhas; Fr- frutos e Se-

sementes.

136

As frações APT-1, APT-2 e APN-2, obtidas pela extração ácido-base do ETOH-P

(Cs) de A. parvifolium, apresentaram atividade antiplasmódica para o clone W2. Já as

demais frações mostraram atividade antiplasmódica moderada para o clone W2 (Tabela 37,

pg. 136). O processo de extração ácido-base levou a frações/substâncias com maior

atividade antiplasmódica, no caso de A. parvifolium, porém não foi observado melhora da

atividade com o fracionamento de E. febrifuga.

Tabela 37: Comparação das atividades antiplasmódicas das frações avaliadas.

Fração

(

µµ

g⁄ml) + DP

Classificação

APT-1 0,98 + 0,20 Ativo

APT-2 1,25 + 0,35 Ativo

APN-2 9,75 + 0,35 Ativo

APN-1 15,02 + 2,83 Moderadamente ativo

EFN 26,5 + 0,7 Moderadamente ativo

EFT 30,5 + 2,12 Moderadamente ativo

Legenda:

= concentração inibitória 50%; DP= desvio padrão; APN-1- fração de neutros 1 (Figura 8); APN-2- fração

de neutros 2 (Figura 9); APT-1- fração de alcalóides totais 1 (Figura 8); APT-2- fração de alcalóides totais 2 de A.

parvifolium (Figura 9); EFN- E. febrifuga neutros; EFT- E. febrifuga alcalóides totais.

Do fracionamento do ETOH-P (Cs) de A. parvifolium isolou-se a uleína que foi

ativa em P. falciparum. Do ETOH-P (Ca) de E. febrifuga foram isoladas: a skimmiamina

(69), γ-fagarina (70) e flindersiamina (72) que foram moderadamente ativas; HMMA (100)

e rutaevina (90) mostraram-se inativas para o clone W2 (Tabela 38, pg. 136).

Tabela 38: Comparação das atividades antiplasmódicas das frações avaliados.

Fração

(µ

µµ

µg⁄ml) + DP

Classificação

Uleína (18) 0,75 + 0,10 Ativo

Skimmiamina (70) 19,5 + 0,71 Moderadamente ativo

γ- Fagarina (71)

36,0 + 2,8 Moderamente ativo

Flindersiamina (73) 95,0 + 4,21 Moderadamente ativo

HMMA (89) >100 Inativo

Rutaevina (93) >100 Inativo

Comparando-se o potencial antimalárico dos extratos ETOH-P (Cs) A. parvifolium e

ETOH-P (Ca) E. febrifuga, frações e substâncias puras fica evidente que A. parvifolium

(APT-1 e 2) parece superior a E. febrifuga. Ensaios in vivo deverão ser realizados.

137

8- CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos, conclui-se que para obtenção de extratos com

atividade antiplasmódica, a partir de espécies pertencentes ao gênero Aspidosperma, o

melhor processo de extração é submeter o pó da planta ao tratamento com base, seguindo-

se extração em aparelho de Soxhlet, com diclorometano. Para caracterização

cromatográfica em CCDS, utilização de anisaldeído - ácido sulfúrico para revelação

mostrou-se mais adequada do que o reagente Dragendorff, sendo observadas manchas azuis

para os alcalóides indólicos. Para as análises em CLAE o uso de fase móvel com pH ácido

mostrou-se mais adequada. A espécie com maior número de extratos com atividade

antiplasmódica foi a A. olivaceum. O fracionamento do extrato etanólico de cascas de A.

parvifolium levou a obtenção de uma fração alcaloídica e uma substância (uleína) com alto

potencial antimalárico e bom índice de seletividade.

O estudo fítoquímico em CCDS do extrato etanólico de caules de E. febrifuga,

frações e alcalóides isolados demonstraram que não ocorre revelação dos alcalóides com o

Reagente de Dragendorff e estes não tiveram mancha característica com anaisaldeído -

ácido sulfúrico, porém, quando sob luz UV, observam-se manchas fluorescentes azuis

relacionadas aos alcalóides. Estudos em CLAE não permitiram estabelecer as melhores

condições cromatográficas para análise desta planta e seus produtos. A atividade

antiplasmódica do extrato etanólico de caule desta planta, frações e substâncias isoladas,

em geral, foi moderada. O ETOH-P (Ca) de E. febrifuga e frações apresentaram baixos

índices de seletividade.

Em síntese, as frações de alcalóides totais de A. parvifolium (APT-1 e APT-2)

apresentaram um elevado potencial a candidatos a desenvolvimento de um fitoterápico para

o tratamento da malária.

138

9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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10- ANEXOS

10.1- Anexo 1: Cromatogramas obtidos em análises em CLAE de extratos de espécies

Aspidosperma

e uleína.

10.1.1- Cromatogramas do extrato etanólico de caule-folhas de

A. cylindrocarpon

Condição 1

Condição 2

Figura 23: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, do extrato etanólico de caule-folhas de A.

cylindrocarpon

Condição 1- Coluna RP18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B); Condição 2- Coluna RP-18; Fase

móvel: tampão fosfato pH 2,6 + 2,5 mM de sal sódico de ácido hexanossulfônico (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A:

15% B; T= 5 min: 80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B.

Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 300 nm.

154

10.1.2- Cromatogramas de extratos de

A. olivaceum

e uleína.

a- Uleína

b- DCL-S(Fo)

c- ETOH- S (Fo)

d- ETOH-P (Ca)

155

e- DCL-S (Ca)

f- ETOH-S (Ca)

g- DCL-S (Cs)

h- ETOH-S (Cs)

Figura 24:

Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de A. olivaceum.

156

Condição: Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A: 20% B;

T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1

mL/min; comprimento de onda 300 nm e coluna RP-18.

Legenda:

a- ETOH-P (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido por percolação; b- DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de

folhas obtido em aparelho de Soxhlet; c- ETOH-S (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; d-

DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em aparelho de Soxhlet; e- ETOH-S (Ca)- extrato etanólico de caules

obtido em aparelho de Soxhlet; f- CLORO-P (Ca)- extrato clorofórmico de galhos obtido por percolação; g- ETOH-P

(Cs)- extrato etanólico de cascas obtido por percolação; h- DCL-S (Cs)- extrato diclorometano de cascas obtido em

aparelho de Soxhlet e i- ETOH-P (Cs)- extrato etanólico de cascas obtido em aparelho de Soxhlet.

10.1.3- Cromatogramas de extratos de

A. ramiflorum

a- DCL-S (Fo)

b- ETOH- S (Fo)

c- ETOH-P (Ca)

157

d- DCL-S(Ca)

e- ETOH-S (Ca)

f- DCL- S(Cs)

158

g- ETOH-S (Cs)

Figura 22:

Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de A. ramiflorum.

Condição: Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min:

80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 300 nm.

Legenda:

a- ETOH-P (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido por percolação; b- DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de

folhas obtido em aparelho de Soxhlet; c- ETOH-S (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; d-

DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em aparelho de Soxhlet; e- ETOH-S (Ca)- extrato etanólico de caules

obtido em aparelho de Soxhlet; f- CLORO-P (Ca)- extrato clorofórmico de galhos obtido por percolação; g- ETOH-P

(Cs)- extrato etanólico de cascas obtido por percolação; h- DCL-S (Cs)- extrato diclorometano de cascas obtido em

aparelho de Soxhlet e i- ETOH-P (Cs)- extrato etanólico de cascas obtido em aparelho de Soxhlet.

10.1.4- Cromatogramas de extratos de

A. spruceanum

a- ETOH-P (Fo)

b- DCL-S (Fo)

159

c- ETOH-S (Fo)

d- ETOH-P (Ca)

e- DCL-S (Ca)

f- ETOH-S (Ca)

160

g- ETOH-P (Cs)

h- DCL-S (Cs)

i- ETOH-S (Cs)

Figura 23: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de A. spruceanum.

Condição: Coluna RP-18; Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min:

80% A: 20% B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1 mL/min; comprimento de onda 300 nm.

Legenda:

a- ETOH-P (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido por percolação; b- DCL-S (Fo)- extrato diclorometano de

folhas obtido em aparelho de Soxhlet; c- ETOH-S (Fo)- extrato etanólico de folhas obtido em aparelho de Soxhlet; d-

DCL-S (Ca)- extrato diclorometano de caules obtido em aparelho de Soxhlet; e- ETOH-S (Ca)- extrato etanólico de caules

obtido em aparelho de Soxhlet; f- CLORO-P (Ca)- extrato clorofórmico de galhos obtido por percolação; g- ETOH-P

(Cs)- extrato etanólico de cascas obtido por percolação; h- DCL-S (Cs)- extrato diclorometano de cascas obtido em

aparelho de Soxhlet e i- ETOH-P (Cs)- extrato etanólico de cascas obtido em aparelho de Soxhlet.

161

10.1.5- Cromatogramas de extratos de

A. tomentosum

a- Uleina

b- Caules

c- Folhas

162

d- Frutos

e- Sementes

Figura 24: Perfís cromatográficos, obtidos por CLAE, dos extratos de etanólicos de A.tomentosum.

Condição: Fase móvel: tampão fosfato pH 2,6 (A): Acetonitrila (B). T= 0 min: 85% A: 15% B; T= 5 min: 80% A: 20%

B; T= 30 min: 60% A: 40% B; T= 40 min: 20% A: 80% B; T= 50 min: 85% A: 15% B. Temperatura= 30

C; Fluxo= 1

mL/min; comprimento de onda 300 nm e coluna RP-18.

163

Anexo 2:

10.2- Artigo aceito na revista PHYTOMEDICINE

In vitro

Antiplasmodial Activity of Extract and Constituents from

Esenbeckia

febrifuga

, a Plant Traditionally Used to Treat Malaria in the Brazilian Amazon

Maria Fâni Dolabela,º Salma G. Oliveira,

José Maria Souza Nascimento,

José Maria

Veloso Peres,

Hildebert Wagner,

Marinete Marins Póvoa

,§

and Alaíde Braga de

Oliveiraº*

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos,

6627, 31270-901 Belo Horizonte , MG, Brazil; Laboratório de Malária, Instituto Evandro

Chagas, BR 316, Km 7, Ananindeua, CEP 67030-070,

PA, Brazil;. Fakultät für Chemie

und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München, Butenandtstrasse 5-13,

Haus F, Room F5.02681377 München-Grosshadern, Germany.

* To whom correspondence should be addressed. Tel: +55 31 3499 6972 Fax: +55 31 3499 6935

E-mail: alaidebraga@terra.com.br

º Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG

Instituto Evandro Chagas

Ludwig-Maximilians-Universiät München

164

Esenbeckia febrifuga (Rutaceae) is a plant traditionally used to treat malaria in the Brazilian

Amazon region. Ethanol extract of stems displayed a good antiplasmodial activity against

Plasmodium falciparum strains W-2 (IC

15.5 ± 0.71 µg/ml) and 3 D7 (IC

21.0 ± 1.4 µgml).

Two coumarins (bergaptene 1and isopimpinellin 2), five alkaloids (flindersiamine 3, kokusaginine

4, skimmianine 5, γ-fagarine 6 and 1-hydroxy-3-methoxy-N-methylacridone, 7), besides a

limonoid (rutaevine 8), have been isolated by the first time from this species. Antiplasmodial

activity of compounds 3, 5-8 has been evaluated in vitro against P. falciparum strains and the

furoquinolines 5 and 6 were the most potent displaying IC

values <50 µg/ml; flindersiamine (3)

showed a weak activity while alkaloid 7 and rutaevine (8) were inactive (IC

>100 µg/ml).

165

Malaria is one of the major parasitic diseases in the tropical and subtropical regions

of the world and its aethiological agents are protozoans of the genus Plasmodium. It is

responsible for over 1 million deaths each year and approximately 3.2 billion people, living

in 107 countries, are presently at risk. Over 80% of malaria deaths occur in Africa and

15%, in Asia. In the Americas, 14% of the population is at risk although the mortality is

relatively low in this region. The emergence of chloroquine resistant strains of P.

falciparum, the most deadly species of malaria parasites, the resistance of vectors

(Anopheles spp) to insecticides, in combination with poverty and lack of good quality

health care, are the main causes for the increase of malaria morbidity and mortality.

In general, Brazil reports approximately 40% of the total number of malaria cases in

the Americas, of which almost 99% occurs in the Legal Amazon Region, where 12% of the

population of the country lives. An increase in the number of cases began in the 1980’s and

a peak of 610.878 cases has been reported in 2000. An improvement in the epidemiological

situation in 2006 has been related to the Plan for Intensification of Control Measures in the

Amazon (PICAM), initiated in 2000. In 2003, a National Program for Malaria Control

(PNCM) was created by the Ministry of Health, an effort to strengthen the health services

to provide conditions for rapid diagnosis, adequate treatment of the cases, control of

vectors, fast detection of outbreaks and thus push on the measures to control malaria in the

country (WHO, 2005). In 2001, a malaria network, the RAVREDA (Rede Amazônica de

Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas) was created and has gathered several

American malarious countries, including Brazil. Besides monitoring the antimalarial drug

resistance in the region, this network is also evaluating the susceptibility of the Anopheles

vectors to insecticides. The Malaria Laboratory at Evandro Chagas Institute, state of Pará,

under the coordination of Dr. Marinete M. Póvoa, is participating in this program for

166

evaluation of parasites drug resistance, diagnosis methods and quality, entomology and

control of malaria vectors.

There is a consensus that new drugs to treat malaria are urgently needed. Many

approaches to antimalarial drug discovery are available.

3-5

Investigation of plant-derived

compounds is a valid strategy and this approach can benefit from traditional knowledge of

populations from malarious regions. Natural products afforded two of the most important

currently available drugs to treat malaria falciparum, quinine and artemisinin. The first one,

a quinoline alkaloid, was isolated from Cinchona species used for treatment of fevers

and/or malaria by South America Peruvian indians and has been a template for the

synthesis of chloroquine, the most widely used antimalarial drug. Artemisinin is

responsible for the antimalarial activity of Artemisia annua, a species of millenar traditional

use in China. The development of artemisinin derivatives has been a major advance in the

chemotherapy of malaria.

It is estimated that 80% of world’s population depends on herbal remedies for

treatment of diseases. Indeed, in malaria endemic areas, plant remedies are still widely used

but mostly without assurance of their efficacy. Validation of traditionally used plants to

treat malaria is important and requires clinical trials

6,7

which must be preceded by

phytochemical and toxicological studies that are necessaries to guarantee efficacy and

safety of herbal preparations (phytomedicines). Furthermore, knowledge of active

compounds of a medicinal plant is important for development of standardized preparations

for pre-clinical and clinical assays.

The genus Esenbeckia Kunth.(family Rutaceae, sub-family Rutoideae) includes ca

30 species natives to the tropical Americas

Previous chemical studies on species of this

167

genus revealed the presence of typical rutaceous metabolites like coumarins, alkaloids,

flavonoids, limonoids and terpenoids.

8-15

Esenbeckia febrifuga

(

A. St.-Hil.) A. Juss. ex Mart., popularly known in Brazil as

“quina-do-mato” and “tres folhas”, is used for the treatment of fever and/or malaria by

inhabitants of the Brazilian Amazon region. An aqueous bark/stalk extract of this species

has been previously assayed in vivo against Plasmodium berghei –infected mice, at a dose

of 1.0 g/kg, and was shown to be partly active, causing 43% inhibition of parasite

multiplication.

16,17

In this paper we report on the phytochemistry of E. febrifuga and the in vitro

evaluation against P. falciparum of an ethanol extract from stems of this species, as well of

five out of the eight compounds isolated. The susceptibilities were assessed against both

chloroquine – sensitive (CQS) (3D7) and chloroquine - resistant (CQR) (W-2) strains of P.

falciparum

Results and Discussion

Phytochemical investigation of an ethanol extract from stems of E. febrifuga,

collected at the municipality of Belo Horizonte, state of Minas Gerais, Brazil, led to the

isolation of 2 coumarins (bergaptene 1and isopimpinellin 2), 4 furoquinoline alkaloids

(flindersiamine 3

kokusaginine 4

skymmianine 5

and γ-fagarine (6

1 acridone (1-

hydroxy-3-methoxy-N-methylacridone, 7

)

besides a limonoid (rutaevine, 8).

These

compounds have been identified by comparison of physical and spectroscopic data with

those reported in the literature and are described by the first time for this species. Recently,

a new coumarin, named aurapten (7-geranyloxycoumarin), has been isolated from this

168

species and showed significant in vitro growth inhibition (IC

of 30 µM) of Leishmania

major promastigotes.

The in vitro antiplasmodial activities of the crude ethanol extract and of isolated

compounds against chloroquine - sensitive (CQS) (3D7) and chloroquine - resistant (CQR)

(W-2) strains of P. falciparum are depicted in Table 1, together with those of the control

drugs chloroquine and mefloquine. For comparison purposes, in the table are also included

data previously reported for furoquinoline and acridone alkaloids from rutaceous plant

species. Earlier studies by Basco et al..(1994)

on the in vitro activity of furoquinoline and

acridone alkaloids reported the results on IC

values expressed in µg/ml, the following

criteria being adopted: IC

<10 µg/ml, good activity; IC

>100 µg/ml, inactive, IC

of 10-

50 µg/ml, moderate activity and IC

of 50-100 µg/ml, low activity. However, more

recently, Muriithi et al.(2002)

expressed the IC

values in µM and has considered as

inactive compounds showing IC

>100 µM, of limited (moderate?) activity, compounds

with IC

of 1-20 µM and of low activity those acridones displayng IC

of 20-60 µM. In

this paper, the criteria considered by Basco et al. (1994)

are being adopted although the

values are being expressed in µM.

Kokusaginine (4) and the coumarins 1and 2 were not tested. Of the five compounds

assayed, skimmianine (5) was the most active against W-2 strain (CQR) with an IC

value

of 75.3 ± 2.74 µM (19.5 ± 0.71 µg/ml) which is higher then that reported previously for the

same strain (IC

54.4 µM or 14.1 µg/ml), by the

H-hypoxanthine method.

γ−Fagarine

(6) was more active against the 3D7 clone (CQS) (IC

109.8 ± 18.3 µM or 25.0 ± 4.2

µg/ml). γ-Fagarine (6) and skimmianine (5) displayed moderate activities against both W-2

and 3D7 strains (IC

157.2 ± 12.2 and 166.0 ± 5.4 µM or 36.0 ± 2.8 and 43.0 ± 1.41 µg/ml,

169

respectively) while flindersiamine (3) showed low activity against both clones (IC

348.0

± 35.8 and 265.6 ± 12.8 µM or 95.0 ± 4.2 and 72.5 ± 3.5 µg/ml, respectively). Acridone 7

and rutaevine (8) were inactive (IC

> 100 µM) against the assayed P. falciparum clones.

The most active furoquinolines 5 and 6 showed relatively weak antiplasmodial effect

compared to chloroquine and mefloquine (Table 1).

Furoquinoline and acridone alkaloids have been isolated from plants belonging to

the Rutaceae family.

21,22

Earlier studies reported the activity of several acridone alkaloids

against P. yoelli both in vitro and in vivo

23,24

as well the in vitro activity of furoquinolines

and acridones against P. falciparum.

The results obtained for the furoquinolines 3, 5 and 6, are consistent with those

reported by Basco et al. (1994)

and other recent publications on the antiplasmodial

activity of rutaceous alkaloids. Skimmianine(5), γ-fagarine (6) and dictamine (9) were

isolated from Zanthoxylum tsihanimposa, a bitter Rutaceae endemic to Madagascar, whose

leaf and bark decoctions are used alone or in mixture with other plants for treatment of

malaria. The IC

values of these alkaloids against the FcM29 strain of P. falciparum

(CQR) were of 134.3, 98.4 and 332.1 µM (30.0, 25.0 and 66.0 µg/ml), respectively, 5 and 6

being thus significantly more potent then 9.

.In comparison with data

for the FcM29

strain, lower IC

values have been observed for skimmianine (5) against W-2 strain (CQR),

in the present investigation (IC

75.3 ± 2.74 µM or 19.5 ± 4.2 µg/ml), and earlier by Basco

et al. (1994)

(IC

54.4 µM or 14.1 µg/ml) while γ-fagarine (9) displayed a higher IC

value (157.2 ± 12.2 µM or 36.0 ± 2.8 µg/ml) and the 3D7 strain showed similar

susceptibility as FcM29 (IC

109.8 ± 8.3 µM versus 98.4 µM or 25.0 ± 4.2 µg/ml versus

25.5 µg/ml). Skimmianine (5) was one of the antiplasmodial alkaloids from Teclea

170

trichocarpa (Rutaceae), a species used in Kenyan traditional medicine for various purposes,

including treatment of malaria. It showed a moderate activity against HB3 (CQS) and K1

(CQR) strains of P. falciparum (IC

47.5 ± 0.42 and 59.0 ± 0.32 µM, respectively).

So far, the most potent antiplasmodial furoquinoline alkaloid yet described is

acronydine (10) which showed an IC

of 7.0 µM (2.18 µg/ml) against W-2 strain. It is

proposed that the pyran ring would be important for enhancing the antiplasmodial activity

of furoquinolines, similarly as it is considered for acridone alkaloids.

The only acridone alkaloid isolated from E. febrifuga, in the present

investigation, was 1-hydroxy-3-methoxy-N-methyl-acridone,7), obtained previously from

callus cultures of Ruta graveolens (Rutaceae)

27,28

and whose occurrence is reported in

Mexican Esenbeckia species

besides Fagara macrophylla (Rutaceae).

This acridone (8)

was inactive against 3D7 and W-2 strains (IC

>100 µM) what is a surprise when compared

to arborinine (11) which presents only one more methoxy group and showed a good activity

against HB3 and K1 strains of P. falciparum (IC

3.85 ± 0.11 and 9.34 ± 0.37 µM or 0.98

± 0.39 and 2.38 ± 1.30 µg/ml, respectively). However, melicopicine (1,2,3,4-tetramethoxy-

N-methylacridone) (12) was inactive and normelicopicine (13), the 1-demethyl derivative

of melicopicine, has shown good activity against both the strains (IC

8.25 ± 0.12 and 14.7

± 0.26 µM, respectively) what led the authors to suggest that the presence of a 1-hydroxyl

group in these compounds is essential for the antiplasmodial activity.

An opposite effect

was observed for a series of pyranoacridones for which the presence of a chelated hydroxyl

group resulted in a complete loss of antiplasmodial activity and the methoxy group in the

same position was crucial for the activity.

As previously observed, these contradictory

171

observations are indicating that structure-activity relationships in acridone alkaloids are

rather complex.

Conclusion

. This study reports by the first time the phytochemistry of E. febrifuga

which was shown to contain both furoquinoline (3-6) and acridone (7) alkaloids, besides

coumarins(1-2) and a limonoid (rutaevine) (8) and the evaluation of the antiplasmodial in

vitro activity of an ethanol extract from the stems of this species as well of compounds 3, 5-

8. The antiplasmodial furoquinoline alkaloids skimmianine (5), γ-fagarine (6),

flindersiamine (3) and kokusaginine (4), the last one not tested but its activity was

previously described (W-2 strain, 29.7 µM; HB3 strain, 89.2 µM)

are responsible, at least

in part, for E. febrifuga activity, and would explain the traditional use of this plant to treat

malaria in the Brazilian Amazon region. However, it does not preclude the presence of

other active constituents in the aqueous extract which has been shown to be partly active in

vivo against P. berghei – infected mice.

Therefore, non isolated chemical constituents

may have higher activity and/or synergistic effects would be taking place. As far as we are

concerned the evaluation of the antiplasmodial activity of 7 and 8 is reported here by the

first time. Some acridone alkaloids occurring in other rutaceous plants disclosed good

antiplasmodial activity but 7, the only one isolated from E. febrifuga, was assayed by the

first time and was inactive. Rutaevine (8), a limonoid, occurs in some species of

Esenbeckia.

Further studies are needed for validation of this Brazilian traditional remedy.

Experimental Section

172

Isolation of chemical constituents.

Stems of a tree growing at Campus Pampulha -

UFMG, Belo Horizonte, state of Minas Gerais, Brazil, were collected and dried at 50

C, in

an oven with circulating air. A voucher specimen is deposited at the BHCB - UFMG

(number 3825). Powdered stems (1.3 kg) were exhaustively extracted by percolation with

EtOH; the combined extracts were concentrated in rotavapor and dried under vacuum to

afford 92 g of the crude extract. Chromatography of this extract (75 g), on a silica gel

column (Merck 60 (0.040-0.063 mm) eluting initially with hexane – chloroform (80:20)

and then increasing the proportions of chloroform followed by chloroform, then chloroform

with increasing proportions of methanol, and finally with methanol, led to fractions which

were combined according to the similarity on TLC (Merck 60 G) profiles. Repetition of the

chromatographic separations and crystallization led to the isolation of compounds 1-8

which were identified by analysis of their spectrometric data. Mass spectra were recorded at

70eV on a Kratos MS80 RFA (Manchester, UK). NMR spectra were recorded on

chloroform-d (compounds 1-7) and on DMSO-d

(8) on a Bruker AM-360 (360.136 MHz )

and on a JEOL GSX 400 N (3999.65 MHz), at Fakultät fur Chemie und Pharmazie der

Ludwig-Maximillians-Universität, Munich, Germany.

Antiplasmodial Assay.

Parasite strains were kept in continuous cultures in human

erythrocytes suspended in RPMI 1640 suplemented with 10% human serum according to

the method described by Trager and Jensen(1976).

The antiplasmodial activity of the

extract and test compounds was performed in 96-well tissue culture plates as described by

Rieckman et al.(1978)

with modifications reported by Carvalho et al.(1991).

Twofold

serial dilutions of test samples dissolved in sterile methanol were placed in microtiter plates

and diluted with culture medium (RPMI 1640 plus 10% human serum). A suspension of

173

parasitized erythrocytes (0.5%-1% parasitaemia, 2.5% hematocrit) containing mainly

trophozoites was added to the wells to give a final volume of 100 µl. Chloroquine was used

as positive control and uninfected and infected erythrocytes were included as negative

controls. The plates were incubated at 37

C and after 24 and 48 h the culture medium was

replaced with fresh medium with or without test samples. Samples were taken 24 h later,

smeared, Giemsa stained and microscopically examined to determine the percentage of

parasitaemia by counting 5,000 erythrocytes. The results were expressed as the means IC

of 3 independent experiments for each sample. The Student’s t test was used to compare the

inhibition of the two different P. falciparum strains.

Acknowledgements. To Dr. Luzia H. Carvalho, Laboratory of Malaria, Centro de

Pesquisas Renée Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, State of Minas Gerais, Brazil, for P.

falciparum strains (3D7 and W-2) and for kindly supporting the Doctorate student Maria

Fâni Dolabela with protocols for P. falciparum culture, in vitro assays and for valuable

discussions. Research Fellowship (IA) by CNPq to ABO is fully aknoweledged.

References and Notes

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(18) Isolation and identification of chemical constituents from E. febrifuga stems were

carried out at Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximillians-Universität,

Munich, Germany, as part of an International Cooperation Project within the CNPq

(Brazil)/DLR(Germany) agreement.

175

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176

Table 1. In vitro activities of extract and compounds

3, 5-8

from Esenbeckia febrifuga

against Plasmodium falciparum strains and some literature data.

Activity against P. falciparum, IC

µM

Plasmodium falciparum strains

3D7

W-2

HB3

FcM29

E. febrifuga Extract 21.0 ± 1.4* 15.5 ± 0.71*

Compounds

Flindersiamine 3 265.6 ± 12.8 348.0 ± 35.3

Kokusaginine 4 29.7 89.2 60.6

Skimmianine 5 166.0 ± 5.4 75.3 ± 2.7 54.4 60.6 47.5±0.42 59.0 ± 0.32 134.3

g-Fagarine 6 109.8 ± 18.3 157.2 ± 12.2 98.4

Alkaloid 7 >100 >100

Rutaevine 8 >100 >100

Dictamine 9 332.1

Acronydine 10 7.0 38.9

Arborinine 11 3.85 ± 0.11 9.34 ± 0.37

Melicopicine 12 95.9 188.1 >100 >100

Normelicopicine 13 8.25 ± 0.12 14.7 ± 0.26

Chloroquine 0.0013 0.023

*: µg/ml

a: This paper

b: Basco et al. (1994)

c: Muriithi et al. (2002)

d: Randrianarivelojosia et al. (2003)

177

1 : R = H

2 : R = OMe

3 : R1 = OMe; R2 R3 = OCH

O; R4 = H

4 : R1 = R4 = H; R2 = R3 = OMe

5 : R1 = R2 = OMe; R3 = R4 = H

6 : R1 = OMe; R2 = R3 = R4 = H

9 : R1 = R2 = R3 = R4 = H

11 : R1 = OH; R2 = R3 = OMe; R4 = H

12 : R1 = R2 = R3 = R4 = OMe

13 : R1 = OH; R2 = R3 = R4 = OMe

OMe

MeO

178

Anexo 3: Resumos apresentados em Congresso

179

180

181

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