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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
SOLANGE REGINA SENA DE SOUZA
INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE DA RAIZ DE EUTERPE OLERACEA
MART. (AÇAÍ)
BELÉM-PA
2009
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SOLANGE REGINA SENA DE SOUZA
INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA RAIZ DE
Euterpe oleracea Mart. (Açaí)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal do Pará, como
requisito para obtenção do título de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
Orientador:
Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos
Co-Orientador:
Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa
BELÉM-PA
2009
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SOLANGE REGINA SENA DE SOUZA
INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DA RAIZ DE
Euterpe oleracea Mart. (Açaí)
Banca Examinadora:
________________________________________________
Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos
ORIENTADOR
________________________________________________
Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa
CO-ORIENTADOR
_______________________
1º EXAMINADOR
Prof. Dra. Marciene Ataíde de Andrade
_________________________________________________
2º EXAMINADOR
Prof. Dr. Adolfo Henrique Müller
Aprovada pela Comissão Avaliadora no dia 20 de março de 2009.
NOTA BIOGRÁFICA
A autora nascida em 05 de dezembro de 1979, natural de Santarém-PA,
iniciou sua vida acadêmica aos 19 anos quando foi aprovada no vestibular da Universidade
Federal do Pará, campus de Santarém-PA em 1999 no curso de Licenciatura em Ciências
Biológicas do qual cursou apenas dois anos, alterando assim sua trajetória para o curso de
Bacharelado em Farmácia no campus da UFPA de Belém-Pa através do processo seletivo de
mobilidade acadêmica conhecido popularmente como vestibulinho. Aprovada iniciou o curso
em fevereiro de 2001 e finalizou em agosto de 2004, seguida da habilitação em bioquímica
que foi concluída no final de 2005. Neste mesmo ano ocorreu seu casamento com Marlisson
seu então noivo que na época era estudante de engenharia mecânica também da UFPA. Em
seguida iniciou a preparação para a prova de mestrado que foi no início do ano seguinte em
2006. Foi aprovada e iniciou as disciplinas curriculares em agosto de 2006 e no ano seguinte
iniciou os experimentos na linha de pesquisa para a qual foi direcionada e apresentou maior
afinidade e experiência. Ao longo de sua jornada ocorreram alguns imprevistos e um deles foi
uma gravidez da qual não houve nenhum arrependimento e que veio somente a atrasar um
pouco o desenvolvimento e conclusão do seu trabalho, mas que não lhe impediu de perseverar
nos objetivos do trabalho proposto. Em maio de 2008 por motivos familiares foi morar na
cidade do Rio de Janeiro-RJ e então com a ajuda de seu co-orientador o professor Wagner
Barbosa da UFPA, que lhe indicou para a professora de farmacognosia da UFRJ Suzana
Leitão para trabalhar e concluir os experimentos do trabalho em seu laboratório, conseguiu
dar prosseguimento em suas atividades. A professora não só a aceitou como também lhe
ajudou bastante nos procedimentos experimentais que faltavam ser realizados fornecendo
algumas orientações necessárias. Graças a Deus e com a ajuda dessas e outras pessoas
conseguiu concluir e apresentar o seu trabalho de mestrado sobre a espécie Euterpe oleracea
Mart.(Açaí) em março de 2009 com grande êxito.
A meus pais Benedito Gomes e Sandra Regina;
Ao meu esposo Marlisson e minha filha Sofia;
E aos meus irmãos Sidney e Simone.
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida e por todas as oportunidades que tem me concedido.
A Universidade Federal do Pará (UFPA).
A Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
Ao orientador, Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos e Co-orientador Prof. Dr. Wagner Luiz
Ramos Barbosa pela orientação, ajuda e paciência a mim demonstrada em vários momentos
ao longo do curso e durante esta caminhada.
Ao Prof. Dr. José Maria Vieira Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas pela ajuda em vários momentos ao longo deste trabalho.
À professora do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFRJ Suzana
Guimarães Leitão pela cooperação neste trabalho, cedendo a mim um espaço físico, estrutura,
apoio e orientação nas etapas crucias em meu trabalho experimental.
À professora do Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais-NPPN da UFRJ Gilda Guimarães
Leitão pela ajuda e apoio que me concedeu sempre que solicitei.
À minha mais nova e querida amiga Érica, estudante de mestrado da faculdade de farmácia da
UFRJ, a quem devo muitos e muitos favores pois me ajudou bastante na realização dos
ensaios químicos.
Aos professores da Faculdade de Farmácia do PPGCF da UFPA pelo apoio e suas
contribuições neste trabalho.
Aos meus pais, Benedito Gomes de Souza e Sandra Regina Dourada Sena e meus irmãos,
cujo apoio, amor e incentivo ajudaram na realização deste trabalho.
Ao meu esposo Marlisson Sousa de Azevedo, por me incentivar e me ajudar bastante em
várias atividades e compartilhar comigo todos os momentos da minha vida e principalmente
deste trabalho com dedicação, amor e paciência às vezes.
Ao senhor Claudio, proprietário da fábrica de açaí que permitiu que eu fizesse a coleta do
material vegetal em sua propriedade.
Aos amigos do mestrado e a todos aqueles que de alguma forma participaram do processo
desenvolvimento deste trabalho.
“Tudo o que um sonho precisa para ser realizado é de
alguém que acredite que ele possa ser realizado.”
Autor desconhecido
RESUMO
Euterpe oleracea Mart. (Açaí) é uma Arecaceae de grande distribuição na região Norte do
Brasil, sendo nativa dos estados do Pará, Amapá, Maranhão, Tocantins e Mato Grosso.
Apresenta grande importância na alimentação e saúde da população dessas regiões e possui
uma larga utilização na medicina popular local. Seus frutos são tradicionalmente utilizados
como fonte de alimento por serem ricos em nutrientes e muito saborosos. Diversos estudos já
foram realizados com esta espécie utilizando os frutos como material vegetal analisado. Este
trabalho foi o primeiro a realizar um estudo fitoquímico e determinar a presença de compostos
químicos e a capacidade antioxidante das raízes desta espécie, parte vegetal também utilizada
na medicina popular para tratamento de várias enfermidades. Para obtenção de dados com
relação à droga vegetal foi realizado a granulometria do pó para caracterização da droga, a
qual veio mostrar que esta se enquadra na classificação de pó grosso, de acordo com a
Farmacopéia Brasileira 4
a
edição. Foi realizada a abordagem fitoquímica do extratos etanólico
bruto a qual detectou a presença de flavonóides, catequinas, açúcares redutores, taninos
catequinicos, esteróides e triterpenóides, já no extrato hidroacetônico foi detectada a presença
de flavonóides, taninos catequinicos, catequinas e açúcares redutores. A capacidade
antioxidante foi testada in vitro pelo ensaio do DPPH para o extrato hidroacetônico e suas
frações acetato de etila e aquosa, para o extrato etanólico bruto e suas frações. Quase todas as
amostras apresentaram no geral percentual de atividade antioxidante relativamente maior que
o padrão utilizado, pois os valores obtidos da CE
50
foram menores. O teor de fenóis totais foi
determinado com auxílio do método de Folin-Ciocalteau e os resultados para o extrato
hidroacetônico e fração aquosa mostraram valores de 55 e 77 mg de EAG/g de amostra,
respectivamente. Os espectros de RMN de
1
H das frações 6 e 14 mostraram a presença de
esteróides e derivados de ácidos graxos em mistura, e através das análises realizadas por CG-
EM dessas frações foi possível identificar os esteróides: estigmasterol, sitosterol, β-
sacharostenona, campesterol, estigmastenona e estigmastano-3,6-diona. Foram identificados
os seguintes ácidos graxos e derivados: o ácido dodecanóico (ácido láurico), ácido
tetradecanóico (ácido mirístico), ácido pentadecanóico, ácido hexadecanóico (ácido
palmítico), ácido octadecanóico (ácido esteárico), ácido decanóico (ácido cáprico), o aldeído
n-nonanal e o n-hexadecanoato de metila (éster metílico do ácido palmítico).
Palavra-chave: Euterpe oleracea Mart., capacidade antioxidante, DPPH, esteróides,
estigmasterol, sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona, estigmastano-3,6-
diona, ácidos graxos e derivados.
ABSTRACT
Euterpe oleracea Mart. (Açai) is an Arecaceae of large distribution in Northern Brazil native
from states of Pará, Amapá, Maranhão, Mato Grosso and Tocantins. It has great importance in
the diet and health of the population of these regions and has a wide use in taditionally local
medicine. Its fruits are used as food because they are rich in nutrients and very tasty. Several
studies have been conducted with this species using the fruit as the plant material analyzed.
This work was first to make a phytochemical study and determine the presence of chemical
compounds and antioxidant capacity of the roots of this species, part of the plant also used in
popular medicine for treatment of various diseases. For more details regarding the drug plant
was the size of the powder for characterization of the drug, which has shown that this falls in
the classification of bulk powder, according to which the Brazilian Pharmacopeia 4th edition.
Was performed the phytochemical approach of the crude ethanolic extract, which detected the
presence of flavonoids, catechins, reducing sugars, catechinic tannins, steroids and
triterpenoids and in the acetone/water extract was detected the presence of flavonoids,
catechinic tannins, catechins and reducing sugars. The antioxidant capacity was tested in vitro
by the DPPH test with the extract and the fractions aqueous and ethyl acetate, the crude
ethanolic extract and its fractions obtained by partition. Almost all samples showed the
general percentage of relatively higher antioxidant activity than the standard used, because the
EC
50
values were lower. The content of total phenols was determined using the Folin-
Ciocalteau method and the results for the acetone/water extract and aqueous fraction showed
values of 55 and 77 mg of EAG/g of sample respectively. The
1
H NMR spectra of the
fractions 6 and 14 showed the presence of steroids and fatty acid derivatives in mixture, and
the through the analysis for GC-MS of those fractions was possible to identify the steroids
stigmasterol, sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona and stigmastan-3, 6-
dione. Fatty acids and derivatives have been identified to dodecanoic acid (lauric acid),
tetradecanoic acid (myristic acid), pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid),
octadecanoic acid (stearic acid), decanoic acid (capric acid), the aldehyde n-nonanal, and n-
hexadecanoate of methyl (methyl ester of palmitic acid).
Keywords: Euterpe oleracea Mart., antioxidant capacity, DPPH, steroids, stigmasterol,
sitosterol, β-saccharostenone, campesterol, stigmastenone, stigmastan-3, 6-dione and fatty
acids and derivatives.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................... 20
2.1 ASPECTOS GERAIS ....................................................................................................... 20
2.1.1 Família Arecaceae ......................................................................................................... 20
2.1.2 Gênero Euterpe .............................................................................................................. 21
2.1.3 Euterpe oleracea Mart. .................................................................................................. 26
2.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE ...................................................................... 30
2.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA ESPÉCIE ............................................................. 31
2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE ................................................................. 31
2.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ..................................................................................... 32
2.5.1 Processos oxidativo ....................................................................................................... 32
2.5.2 Processo de oxidação lipídica ........................................................................................ 33
2.5.3 Ensaios com DPPH ........................................................................................................ 35
2.5.4 Substâncias antioxidantes .............................................................................................. 36
2.6 COMPOSTOS FENÓLICOS ........................................................................................... 37
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 38
3.1 GERAL ............................................................................................................................ 38
3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 38
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 39
4.1 PRODUTOS QUÍMICOS ................................................................................................ 39
4.1.1 Solventes, Reagentes e Soluções ................................................................................... 39
4.1.2 Reveladores ................................................................................................................... 40
4.2 EQUIPAMENTOS ........................................................................................................... 40
4.2.1 Para análise granulométrica ........................................................................................... 40
4.2.2 Para análise cromatográfica e espectroscópica .............................................................. 41
4.2.3 Para análise da capacidade antioxidante e teor de fenóis totais .................................... 41
4.3 MATERIAL VEGETAL .................................................................................................. 42
4.4 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA................................................................................... 43
4.5 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS ................................................................................. 43
4.5.1 Obtenção do Extrato etanólico bruto (EEB) .................................................................. 43
4.5.2 Obtenção das frações por partição sólido-líquido do extrato etanólico bruto. .............. 44
4.5.3 Obtenção do Extrato Hidroacetônico (EHA) ................................................................ 44
4.5.4 Partição liquído-líquido do extrato hidroacetônico com Acetato de etila e Água ......... 44
4.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS ...................................................... 45
4.7 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS .............................................................................. 45
4.7.1 Monitoração dos extratos e frações por CCD ................................................................ 45
4.7.2 Determinação da presença de catequina por CLAE analítica da fração acetato de etila
(FAEH) obtida do EHA. ..................................................................................... 46
4.7.3 Cromatografia em coluna (CC) da fração clorofórmio (FCE) obtida do EEB .............. 46
4.7.4 Cromatografia de Contra Corrente da FAEH obtida do EHA ....................................... 47
4.7.5 Cromatografia gasosa (CG) ........................................................................................... 47
4.7.6 Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (CG-EM) .......................... 48
4.8 ENSAIOS ANTIOXIDANTE IN VITRO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES ................... 48
4.9 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENÓIS TOTAIS (FT) NOS EXTRATOS E
FRAÇÕES .......................................................................................................... 49
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 52
5.1 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO PÓ ...................................................................... 52
5.2 EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO ............................................................................. 54
5.3 ABORDAGEM FITOQUÍMICA ..................................................................................... 55
5.4 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA POR CLAE DA FAEH ............................................ 56
5.5 TEOR DE FENÓIS TOTAIS ........................................................................................... 57
5.6 ESPECTRO DE RMN
1
H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 6. ................................. 58
5.7 ESPECTRO DE RMN
1
H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 14. ............................... 63
5.8 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................................. 71
6 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 76
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 78
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Foto de Euterpe oleracea Mart.(Açaí). .................................................................. 27
Figura 2 - Foto do cacho de frutos de Euterpe oleracea Mart. .............................................. 27
Figura 3 - Raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí). ............................................................. 42
Figura 4 - Esquema das etapas da preparação das soluções para a análise do teor de fenóis
totais. ................................................................................................................... 51
Figura 5 - Curva de distribuição granulométrica da droga vegetal. ....................................... 53
Figura 6 - Curvas cumulativas de resíduo e passagem da droga vegetal após tamisação. ..... 53
Figura 7 - Cromatografia em camada delgada das frações 1 a 18 obtidas por CC. ................ 54
Figura 8 – Presença de catequina na fração acetato de etila (FAEH) por CLAE ................... 56
Figura 9 - Curva padrão e equação da reta obtidas após os ensaios com ácido gálico nas
concentrações de 2,5; 5,0 ; 7,5; 10,0 e 12,5 µg/mL. ........................................... 57
Figura 10 - Espectro de RMN
1
H da fração 6 (300 MHz; CDCl
3
; relativo para TMS). ........ 58
Figura 11 - Ampliação da área que corresponde aos sinais de hidrogênios de 4,00 ppm a 5,50
ppm da fração 6. ................................................................................................. 59
Figura 12 - Cromatograma da fração 6 por CG-EM (TIC). ................................................... 60
Figura 13 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro do pico
12 eluído em 17,2 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido
hexadecanóico (ácido palmítico). ....................................................................... 61
Figura 14 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 38 eluído em 31,9 min (B) obtido por CG-EM proposto para o
estigmasterol. ...................................................................................................... 62
Figura 15 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 39 eluído em 33,5 min (B) obtido por CG-EM proposto para o
sitosterol (α-dihidrofucosterol). .......................................................................... 62
Figura 16 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 44 eluído em 35,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para a
substância estigmasta-3,5-dien-7-ona (β-sacharostenona). ................................ 63
Figura 17 - Espectro de RMN
1
H da fração 14 e ampliação da área com sinais de hidrogênios
de 0 a 2,50ppm (300 MHz; CDCl
3
; relativo para TMS)..................................... 64
Figura 18 - Cromatograma da fração 14 obtido da análise por CG-EM (TIC). ..................... 65
Figura 19 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 6 eluído em 12,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para o
ácido dodecanóico (ácido láurico). ..................................................................... 66
Figura 20 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 7 eluído em 14,9 min (B) obtido por GC-MS proposto para a
substância ácido tetradecanóico ou ácido mirístico. ........................................... 67
Figura 21 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 8 eluído em 16,1 min (B) obtido por CG-EM proposto para o
ácido pentadecanóico (pentadecílico). ................................................................ 67
Figura 22 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 10 eluído em 17,3 min (B) obtido por CG-EM proposto para o
ácido hexadecanóico (ácido palmítico). ............................................................. 68
Figura 23 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 13 eluído em 19,2 min (B) obtido por CG-EM proposto para o
ácido octadecanóico (ácido esteárico). ............................................................... 68
Figura 24 - Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante apresentada pelas
amostras EHA, FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5, 10
e 25 µg/mL frente ao radical DPPH 0,1 mM e com seus respectivos erros
padrões. ............................................................................................................... 72
Figura 25 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EHA,
FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5; 10 e 25 µg/mL
frente ao radical DPPH 0,3 mM com seus respectivos erros padrões. ............... 73
Figura 26 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EEBA,
FHA, FCA, FAEA, FMA e do padrão EGb (761) nas concentrações de 5; 10 e 25
µg/mL frente a radical DPPH 0,3mM com seus respectivos erros padrões. ...... 75
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura . ...... 22
Quadro 2 – Formas de uso dos componentes da espécie Euterpe oleracea Mart. (Açaí) ...... 29
Quadro 3 - Etapas da reação não enzimática mediada por radicais livres (ANTOLOVICH et
al, 2002) .............................................................................................................. 34
Quadro 4 - Resultados da Abordagem fitoquímica do extrato etanólico e hidroacetônico das
raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) ............................................................. 55
Quadro 5 – Estruturas dos compostos majoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e
14. ....................................................................................................................... 69
Quadro 6 – Estruturas dos compostos minoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e
14. ....................................................................................................................... 70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Análise granulométrica por tamisação do pó das raízes de Euterpe oleracea Mart.
(Açaí). ................................................................................................................. 52
Tabela 2 - Dados de RMN
1
H da fração 6 (300 MHz; CDCl
3
;relativo para TMS). ............... 59
Tabela 3 - Dados de RMN
1
H da fração 14 (300 MHz; CDCl
3;
relativo para TMS). ............ 63
Tabela 4 - Atividade antioxidante (%) e CE
50
do EHA, FAEH e FAH e do padrão EGb (761)
frente ao radical DPPH 0,1mM. ......................................................................... 71
Tabela 5 - Atividade antioxidante (%) e CE
50
do EHA, FAEH e FAH e do padrão EGb (761)
frente ao radical DPPH 0,3mM. ......................................................................... 73
Tabela 6 - Atividade antioxidante (%) e CE
50
do EEB, FH, FC, FAE e FM e do padrão EGb
(761) frente ao radical DPPH 0,1mM. ................................................................ 74
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AA% .................................... Percentual de Atividade Antioxidante
ABS ...................................... Absorbância
AcOEt .................................. Acetato de Etila
CC ........................................ Cromatografia em Coluna
CCD ..................................... Cromatografia em Camada Delgada
CCDP ................................... Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CCC ..................................... Cromatografia de Contra Corrente
CE
50
...................................... Concentração Eficiente 50%
CG ....................................... Cromatografia Gasosa
CG-EM ................................ Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massa
CLAE ................................... Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
d ............................................ Dubleto
dd .......................................... Duplo dubleto
DPPH
.
.................................. 2,2-difenil-1-picril-hidrazila radical
EAG ..................................... Equivalente de Ácido Gálico
EEB ...................................... Extrato Etanólico Bruto
EGb ...................................... Extrato de Ginkgo biloba
EHA ..................................... Extrato Hidroacetônico
FAEE ................................... Fração Acetato de Etila obtida do EEB
FAH ...................................... Fração Aquosa obtida do EHA
FAEH ................................... Fração Acetato de Etila obtida o EHA
FCE ...................................... Fração Clorofórmio obtida do EEB
FHE ...................................... Fração Hexano obtida do EEB
FME ..................................... Fração Metanólica obtida do EEB
Hoe 140 ................................ Antagonista do receptor de Bradicinina
Hz ......................................... Hertz
iNOS ..................................... Inibidor de Óxido Nítrico Sintetase
J ............................................ Constante de Acoplamento
K
+2
........................................ Íon Potássio
KCl ....................................... Cloreto de Potássio
MeOH .................................. Metanol
mg ......................................... Miligrama
min ....................................... Minuto
mL ........................................ Mililitro
mm ....................................... milímetro
mM ....................................... Milimolar
m/v ........................................ Massa/volume
m/z ........................................ Massa/carga
NE ......................................... Norepinefrina
NO ........................................ Óxido Nítrico
nm ......................................... Nanômetro
NPPEG ................................. Difenilborato de aminoetanol e polietilenoglicol
ppm ...................................... Partes por milhão
PT ......................................... Polifenóis totais
RMN
1
H ............................... Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1
RMN
13
C .............................. Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
sl ........................................... Singleto Largo
t ............................................. Tripleto
UV ........................................ Ultravioleta
µL ......................................... Microlitro
19
1 INTRODUÇÃO
O uso terapêutico de plantas medicinais parece ser tão antigo quanto a
espécie humana, o conhecimento químico e as propriedades antioxidantes destes são
relativamente recentes, especialmente nas duas últimas décadas onde observou-se um enorme
crescimento da investigação científica, envolvendo extratos brutos, frações ou componentes
isolados e/ou modificados (YUNES, 2001).
Euterpe oleracea Mart. (Açaí) é uma Arecaceae amplamente distribuída no
norte da América do Sul, de ocorrência frequente nas planícies inundadas da Amazônia
brasileira em especial no Estado do Pará. É popularmente conhecida no Brasil como
açaizeiro, onde apresenta elevado valor comercial e é considerado um importante alimento na
dieta da população amazônica (CPATU-EMBRAPA, 2007).
Diante das inúmeras citações sobre o uso popular dos frutos, raízes e
sementes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) para tratamento de diversos problemas de saúde e
sendo muito utilizada como alimento, verificou-se a importância de uma investigação
fitoquímica mais aprofundada sobre as raízes da espécie. Estas apresentam, segundo várias
citações, uso na medicina popular para o tratamento de verminoses (JARDIM et al., 2006),
diarréia, anemia (PLANTAMED, 2007), entre outras indicações.
A grande utilização e importância econômica e social desta espécie reforça
ainda mais a questão da pesquisa e o desenvolvimento de estudos complementares, não
apenas para confirmações dos dados de estudos anteriores, como também para obtenção de
novas informações acerca de tão importante espécie vegetal. É então muito importante buscar
conhecer a sua composição e avaliar suas atividades químicas e biológicas utilizando-se
métodologias padronizadas.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ASPECTOS GERAIS
2.1.1 Família Arecaceae
A família Palmae também denominada Arecaceae descrita por Antoine
Laurent de Jussieu, apresenta 203 gêneros nos quais estão distribuídas aproximadamente
2650 espécies tropicais que incluem árvores ou arbustos e raras trepadeiras (DI STASI et al.,
2002).
Apresentam caule do tipo estipe, não ramificados, com folhas terminais e
ocorrem também acaules com folhas que nascem rentes ao chão. Os principais gêneros
encontrados no Brasil são representados por espécies de grande valor econômico, usados
tanto na indústria de alimentos como para ornamentos. Destaca-se o gênero Euterpe, que
inclui o palmiteiro encontrado na mata atlântica e o açaízeiro na região amazônica (DI
STASI et al., 2002).
Segundo JOLY, (1998) a família Palmae ou Arecaceae é a única família
representante da ordem Principes, compreendendo um dos maiores grupos de plantas
pertencentes à classe das monocotiledôneas.
Dentre as classes de metabólitos secundários detectados nas espécies desta
família destacam-se os alcalóides, proantocianidinas, flavonóides, saponinas e sapogeninas
(SANTOS, 2001).
21
2.1.2 Gênero Euterpe
O gênero Euterpe é um dos mais de 200 gêneros pertencentes à família
Palmae (JOLY, 1998; SANTOS, 2001)
Congrega cerca de 28 espécies, ocorre nas Américas Central e do Sul e está
distribuído por toda bacia Amazônica. As três espécies que ocorrem com maior freqüência
são E. oleraceae, E. edulis e E. precatoria (GALOTTA & BOAVENTURA, 2005 ).
Dentro do gênero Euterpe, que compreende espécies muito semelhantes, E.
oleracea (Mart.) não é a única espécie conhecida como açaí, E. edulis (Mart.), E. badiocarpa
(Barbosa Rodrigues) e E. precatoria (Mart.) são também denominadas “açaí” enquanto E.
catinga (Wallace), E. controversa (Barb. Rodr.) e E. longibracteata (Barb. Rodr.) são
conhecidas como “açaí-chumbinho”, “açaí-chumbo” e “açaí-da-mata” respectivamente
(HENDERSON & SCARIOT, 1993).
Estudos fitoquímicos e farmacológicos são bastante limitados neste gênero,
sendo que dos frutos de E. oleraceae e E. edulis já foram isolados ácidos graxos, esteróides e
antocianinas (GALOTTA & BOAVENTURA, 2005).
Algumas das substâncias que já foram detectadas, isoladas e identificadas
em duas espécies do gênero Euterpe são apresentadas no Quadro 1 com seus respectivos
nomes, estruturas químicas, referências bibliográficas e parte utilizada no estudo.
22
Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura.
Espécie Substância (exemplos) Estrutura Parte
Euterpe oleracea
Mart.
- Cianidina-3-sambubiosideo, - R
1=
Sambubiose e R
2
=OH;
- Cianidina-3-glucosideo ; R
1
=glucose e R
2
=OH;
- Cianidina-3-rutinosideo; - R
1
=rutinose e R
2
=OH;
- Peonidina-3-glucosideo, - R
1
=glucose e R
2
=Ome;
- Peonidina-3-rutinosideo, - R
1
=rutinose e R
2
=Ome.
(SCHAUSS et al, 2006b; LICHTENTHÄLER et al.,
2005)
Frutos
- Homoorientina;
- Orientina;
(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et al., 2006b)
Frutos
-Isovitexina;
(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et al., 2006b)
Frutos
23
Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura.
Espécie Substância (exemplos) Estrutura Parte
Euterpe oleracea Mart.
- Taxifolina desoxihexose;
(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et
al., 2006a)
Frutos
- Cianidina-3-O-Glicosídeo;
- Cianidina-3-O-rutinosídeo;
(GALLORI et al, 2004;
L
ICHTENTHÄLER et al., 2005)
Frutos
Euterpe precatoria Mart.
- Ácido p-hidroxibenzóico.
(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005)
Raízes
24
Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura.
Espécie Substância (exemplos) Estrutura Parte
Euterpe precatoria Mart.
- R
1
=CH
3
;R
2
=H; α – amirina;
- R
1
=H; R
2
=CH
3;
β – amirina.
(GALOTTA & BOAVENTURA , 2005.)
Raízes
- Estigmast-4-n-6β-ol-3-ona.
(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005.)
Raízes e talos das
folhas
- R
1=
H; R
2
=OH; α-D-glicose;
- R
2
=OH; R
2
=H; β-D-glicose.
(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005)
Raízes
25
Quadro 1 - Substâncias químicas isoladas do gênero Euterpe já descritas na literatura.
Espécie Substância (exemplos) Estrutura Parte
Euterpe precatória
Mart.
- Lupeol.
(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005)
Raízes
- R= H; friedelan-3-ona;
- R= OH;28-hidroxi-friedelan-3-ona;
(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005)
Talos das
folhas
- R= H, β= OH, sitosterol;
-R=H, β= OH, ∆
22
estigmasterol;
-R=H, β-D-glicose, 3-β-D-glicopiranosídeo de β-
sitosterila;
-R= H, β-CH
3
(CH
2
)
14
COO-, palmitato de β-
sitosterila.
(GALOTTA & BOAVENTURA, 2005)
Raízes e talos das
folhas
26
2.1.3 Euterpe oleracea Mart.
É uma palmeira encontrada nas regiões de clima tropical e uma das
espécies mais abundantes nas várzeas da região amazônica. Sua distribuição se limita ao
norte da américa do sul (LICHTENTHÄLER et al, 2005). A espécie se desenvolve bem em
vários tipos de clima e solos, mas prefere regiões tropicais com temperatura média de 26ºC,
índice pluviométrico superior a 2.300mm e períodos de estiagem bem definidos (SANTOS,
2001).
Pertencente ao reino Plantae, divisão Magnoliophyta, classe Liliopsida,
ordem Arecales, família Arecaceae e gênero Euterpe. É uma palmeira multicaule (figura 1),
com até 25 estipes por touceira, estes nos indivíduos adultos, apresentam altura e diâmetro
variando de 3m a 20m e de 7cm a 18cm, respectivamente. Cada estipe sustenta, em sua
porção terminal, um conjunto de 8 a 14 folhas compostas, pinadas e de arranjo espiralado,
com 40 a 80 pares de folíolos, opostos ou subopostos. A inflorescência do açaizeiro é
infrafoliar e disposta quase horizontalmente. Nos dois primeiros terços de cada ráquila, as
flores estão dispostas em tríades, com cada flor feminina ladeada por duas flores masculinas.
No terço terminal das ráquilas encontra-se, normalmente, somente flores masculinas. As
inflorescências apresentam em média 80,5% de flores masculinas e 19,5% de flores
femininas. O fruto (figura 2) é uma drupa globosa, contendo resíduos florais, com diâmetro
variando entre 1cm e 2cm e peso médio de 1,5g. O epicarpo, nos frutos maduros, apresenta
coloração arroxeada quase preta ou verde, dependendo do tipo. O mesocarpo é polposo e
delgado, com espessura quase sempre igual ou inferior a 1mm e envolve o volumoso e duro
endocarpo o qual contém em seu interior uma semente, com embrião diminuto e abundante
endosperma ruminado (CPATU-EMBRAPA, 2007).
27
Figura 1 - Foto de Euterpe oleracea Mart.(Açaí).
Os frutos de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) possuem uma única semente,
que ocupa a maior parte de seu volume. Esta é revestida por fibras filamentosas que são
recobertas por uma fina camada comestível (mesocarpo e epicarpo), onde se inclui a polpa e
também a casca (DEL-POZO INSFRAN et al., 2004; LICHTENTHÄLER et al, 2005).
Os frutos devem ser colhidos na estação seca do ano, de agosto a dezembro
para se obter maior produção e melhor característica organoléptica (ROGEZ, 2000).
Figura 2 - Foto do cacho de frutos de Euterpe oleracea Mart.(Açaí)
Disponível em: www.cpatu.embrapa.br/...2008
28
Os açaizeiros passam por um estágio monocaule durante um a três anos.
Segundo OLDEMAN (1969), um regalo de raízes aéreas se forma na base da palmeira e
nesse regalo, no nível das cicatrizes foliares basais, se esboçam eixos laterais que são
verdadeiros ramos e não rebentos. O açaizeiro cresce formando touceiras agrupando os
rebentos sucessivos (ramificação na base) a partir de uma unidade de dispersão, onde se
apresenta sob a forma de uma palmeira cespitosa o que significa dizer que ela apresenta
novos estipes na sua base a cada ano (de 1 a 10) e que sua regeneração é teoricamente infinita
(ROGEZ, 2000).
No Estado do Pará, o açaizeiro predomina no estuário do rio Amazonas,
principalmente em pólos de várzea, mas também de terra firme e de igapó. O biótipo do
açaizeiro não é definido por um clima preciso. Um estudo realizado no Museu Paraense
Emílio Goeldi demonstrou que os açaizeiros crescem em terrenos pobres em fósforo,
nitrogênio, cálcio e magnésio (JARDIM & ROMBOLD, 1994). Os açaizeiros são de fato
adaptados a este tipo de solo por meio de dois mecanismos: a presença de bactérias que
fixam o nitrogênio na superfície aérea das raízes e a imponente massa de raízes capazes de
absorver os minerais necessários a seu crescimento em um importante volume de terra
(ROGEZ, 2000).
As palmeiras não tem pêlos absorventes, entretanto possuem micorrizos
simbióticos na superfície. O raizame do açaizeiro é muito largo (6 m ou mais) e superficial
(80% do volume são encontrados nos primeiros 30 cm do solo). É constituído de dois tipos
de raízes. As horizontais que formam na parte inferior do estipe um regalo vermelho,
cravam-se no solo (geotropismo positivo) e evoluem de forma horizontal à pequena
profundidade abaixo do humus. As partes expostas ao ar livre são cobertas de pneumatorizes,
orgãos cônicos brancos e de aspecto granuloso especializados na função respiratória. As
pneumatofores são oriundas das raízes horizontais e apresentam geotropismo negativo. Sua
29
parte aérea é marrom e lisa, coberta de pneumatorizes e um ápice marrom. Sua parte terrestre
é amarelada, lisa e abundantemente ramificada e desempenham a absorção (ROGEZ, 2000).
Estudo realizado na ilha do Combú sobre a composição florística e uso
popular de plantas medicinais oleaginosas, verificou que a raiz de Euterpe oleracea Mart.
(açaí), é empregada pela população local no tratamento de verminoses (JARDIM &
MEDEIROS, 2006) e das diarréias intestinais provocadas por amebas (COSTA, 1992).
Todos os componentes da espécie em estudo são utilizados, daí sua grande
importância econômica, social, cultural e medicinal para a população principalmente do norte
da América do Sul. Estas informações podem ser observadas com mais detalhes no quadro 2
a seguir.
Quadro 2 – Formas de uso dos componentes da espécie Euterpe oleracea Mart. (Açaí).
Componentes
Formas de uso
Frutos
Suco, creme, sorvete, licor, geléia, mingau, curtimento de couro,
adubo orgânico, produção de álcool, carburante e antidiarréico.
Palmito
Picles, salada, recheio, creme e ração animal.
Folhas
Cobertura de casa, parede, cesto, tapete, chapéu, esteira, adorno
caseiro, celulose, ração animal, adubo orgânico, cobertura morta,
sombreamento de sementeiras e plantas.
Estipe (caule)
Construção de casa, ponte, cerca, curral, lenha, celulose e isolamento
elétrico, Cacho Vassoura e adubo orgânico.
Raízes
Vermífugo.
Fonte: Destaque Amazônia, Órgão de divulgação do Museu Emílio Goeldi, 1985.
30
2.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE
Compostos polifenólicos como os flavonóides homoorientina, orientina,
isovitexina, taxifolina desoxi-hexose e as antocianinas cianidina-3-glicosídeo, cianidina-3-
rutinosídeo e derivados de cianidina e peonidina já foram identificadas através de métodos
cromatográficos e espectroscópicos em estudos realizados com a polpa dos frutos
(GALLORI et al, 2004; SCHAUSS et al, 2006b).
Dentre os principais componentes químicos presentes na espécie
destacamos: antocianinas, proantocianidinas e outros flavonóides, como a ciandina- 3-
glucosídeo e vílio-3-rutinosideo detectados como compostos predominantes (SCHAUSS et
al, 2006b).
Soma-se a cianidina-3-arabinosídeo e cianidina -3-arabinosil-arabinosídeo
que também foram identificadas segundo BOBBIO e colaboradores (2000).
Resveratrol e ácidos graxos foram encontrados em baixas concentrações,
19 aminoácidos, esteróis, sais minerais e outros nutrientes também foram identificados e
quantificados (SCHAUSS et al, 2006b). Soma-se o sitoesterol, β-esteróis totais e os esteróis
campesterol e estigmasterol também identificados na espécie (SCHAUSS et al, 2006b).
Estudos realizados por SILVA, (2007) foram detectados os seguintes
ácidos fenólicos: ácidos gálico, protocatecuico, p-OH-benzóico, vanílico, siríngico, verático,
ferúlico, p-cumárico, 3-(4-OH)-fenil-2(Z)-propenóico e 3-(3-metoxi-4-OH)-fenil-2(Z)-
propenóico dentre outros compostos.
31
2.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA ESPÉCIE
Euterpe oleracea Mart. (Açaí) é uma espécie rica em compostos
polifenólicos e antocianinas, cuja presença contribuiu para estudos e avaliações da
capacidade antioxidante da espécie (DEL POZO et al, 2004).
A capacidade antioxidante da polpa do fruto de Euterpe oleracea Mart.
(Açaí) foi avaliada, apresentando excelente atividade contra radicais peróxido, boa atividade
contra peroxinitrito e pouca atividade contra radicais hidroxila, comparado com frutos
europeus comuns. Esta atividade antioxidante foi também demonstrada nas sementes dos
frutos, para as quais também foram relatadas o uso popular na medicina local (RODRIGUES
et al, 2006).
O fruto de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) exibiu significante atividade
antioxidante em testes in vitro. A capacidade antioxidante da polpa congelada e seca e do pó
da casca do fruto foi avaliada através das diferenças químicas apresentadas frente às várias
fontes de radicais livres e apresentaram excepcional atividade contra o radical superóxido, o
maior efeito reportado atualmente contra o radical peroxil, medido pela capacidade de
absorvância do radical oxigênio e fraca atividade contra ambos radicais peroxinitrito e
hidroxil (SCHAUSS et al, 2006a).
2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ESPÉCIE
Estudo realizado com o extrato hidroalcoólico obtido da semente do açaí
induziu um efeito vasodilatador nos vasos mesentéricos de ratos que foram pré-contraídos
com norepinefrina (NE). O extrato induziu uma prolongada vasodilatação endotélio
dependente que foi significantemente reduzida por NG-nitro-L-arginina. Nos vasos pré-
32
contraídos com NE e KCl ou tratados com K
+2
bloqueador do canal Ca (Cálcio), o efeito do
extrato da semente do açaí foi significativamente reduzido, mas este efeito não foi afetado
pela indometacina, glibenclamida e 4-aminopiridina. Atropina, pirilamina, ioimbina e Hoe
140 reduziram significativamente o efeito vasodilatador de acetilcolina, histamina, clonidina
e bradicinina, mas não mudou o efeito vasodilatador do extrato dos caroços do açaí (ROCHA
et al, 2007).
Em estudo com as flores, frações de frutos de Euterpe oleracea Mart.
(Açaí), os resultados mostraram que as frações obtidas dos frutos foram as mais potentes em
inibir a produção de NO, seguido pelos extratos das flores. Somente em altas doses, algumas
frações reduziram a viabilidade celular. A redução na produção de NO não foi devida à
atividade eliminadora de NO, mas sim pela inibição da expressão de iNOS. O efeito mais
pronunciado foi observado nas frações que apresentaram concentração elevada de cianidina-
3-O-glicosídeo e cianidina-3-O-raminosídeo. Os resultados indicaram que as frações de
Euterpe oleracea Mart. (Açaí) inibem a produção de NO pela redução na expressão dos
níveis de iNOS (MATHEUS et al, 2006).
2.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
2.5.1 Processos oxidativo
A oxidação é uma transferência de elétrons de um átomo a outro e
representa uma parte essencial do nosso metabolismo, sendo que o oxigênio é o último
receptor no sistema de fluxo de elétrons que produz energia na forma de ATP (DAVIES,
1995). O metabolismo oxidativo é essencial para a sobrevivência das células, entretanto leva
a produção de radicais livres e outras espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e cloro, que
levam a modificações oxidativas no organismo (ANTOLOVICH et al., 2002).
33
Um radical livre é capaz de existir independentemente. Apresentam, em
geral, elevada instabilidade, meia vida curta e reagem rapidamente com diversos compostos e
podem atacar alvos celulares. Os radicais livres podem formar complexos com proteínas,
glicoproteínas, purinas e pirimidinas, formação de produtos de oxidação de tióis, peróxidos
lipídicos, polímeros, epóxidos, endoperóxidos e produtos de cissão, como alquenais e
hidroalquenais, que são citotóxicos.
A oxidação de tióis, a ligação covalente de alquenais com proteínas e a
modificação das glicoproteínas podem afetar a atividade de divisão de enzimas. Os processos
de transcrição e de tradução podem ser impedidos ou modificados, em função de lesões no
DNA, induzidas pelos radicais livres. O termo espécies reativas de oxigênio é um coletivo
que inclui não somente radicais de oxigênio como o radical superóxido (O
2
•) ou hidroxila
(OH•), mas, também, alguns derivados não radicalares, como o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e o ácido hipocloroso (HClO) (JORDÃO et al, 1998)
2.5.2 Processo de oxidação lipídica
A oxidação lipídica tem papel importante na deterioração de alimentos e
nas modificações oxidativas nas lipoproteínas de baixa densidade LDL (ANTOLOCICH et
al, 2002).
O processo de peroxidação lipídica pode ocorrer por meio de três rotas
diferentes:
a) Reação não enzimática mediada por radicais livres;
b) Foto oxidação não enzimática e não radicalar;
c) Reação enzimática (ANTOLOCICH et al, 2002).
34
A rota 1 é a via clássica de radicais livres, que leva à iniciação e rápida
propagação das cadeias de reações destrutivas, esta rota conta com as etapas de iniciação,
propagação, ramificação e término (ANTOLOCICH et al, 2002).
Quadro 3 - Etapas da reação não enzimática mediada por radicais livres (ANTOLOVICH et
al, 2002)
Iniciação
LH + R•
→
L• + RH
LH representa o substrato, por exemplo um lipídeo, sendo R
.
o radical livre iniciador. A
oxidação do lipídeo gera um radical alil altamente reativo (L·
), que rapidamente reage com o
oxigênio, formando o radical peroxil (LOO·
).
Propagação
Os radicais peroxil são os carreadores da cadeia de reações, que podem oxidar o lipídeo
produzindo hidroperóxidos lipídicos (LOOH), os quais podem se transformar em uma série de
substâncias como álcoois, aldeídos, cetonas, hidrocarbonetos e radicais alcoxil (LO·).
Ramificação
A quebra de hidroperóxidos lipídicos frequentemente envolvem catálises de íons de metais de
transição, em reações análogas àquelas com peróxidos de hidrogênio, resultando em radicais
lipídicos alcoxil e peroxil.
Término
Combinação de radicais para formar produtos não radicalares.
L• + O
2
→ LOO•
LOO• + LH → L•
+ LOOH
LOOH → LO•
+ HO•
2LOOH → LOO•
+ LO• + H
2
O
LOOH + M
n+
+ H
+
→ L• + M
(n+1)+
+ H
2
O
LOOH + M
(n+1)+
+ OH
-
→ LOO•
+ M
n+
+ H
2
O
LO•
+ LO•
LOO• + LOO• → Produtos não radicalares
LOO• + LO•
35
2.5.3 Ensaios com DPPH
Vários métodos são utilizados para determinar a atividade antioxidante em
extratos e substâncias isoladas. Um dos mais usados consiste em avaliar a atividade
seqüestrante do radical livre 2,2- difenil-1-picril-hidrazila-DPPH (SOUSA et al., 2007).
A avaliação da atividade sequestradora do radical livre DPPH se apresenta
como um teste de predição de uma potencial atividade antioxidante e pode ser empregado
para triagem de compostos químicos sintéticos e produtos naturais (MIRANDA & FRAGA,
2006).
O ensaio fundamenta-se na propriedade do DPPH apresentar uma forte
absorção no espectro visível, em 517 nm, de coloração violácea intensa, devido à presença de
elétrons livres. Quando o DPPH é colocado em presença de substâncias capazes de sequestrar
radicais livres, a absorção é inibida, resultando em uma descoloração estequiométrica em
relação ao número de életrons retirados e independente de qualquer atividade enzimática. O
grau de descoloração indica a capacidade sequestradora de radical livre (MATHIESEN et al,
1997).
Pela ação de um composto antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar
(R•), o DPPH• é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com
consequente desaparecimento da absorção que pode ser monitorada pelo decréscimo da
absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade
antioxidante ou seqüestrante de radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH• remanescente
no meio reacional. A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à
quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante
necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada
concentração eficiente (CE
50
) ou concentração inibitória (CI
50
). Quanto maior o consumo de
36
DPPH por uma amostra, menor será a sua CE
50
e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA
et al., 2007).
2.5.4 Substâncias antioxidantes
Denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em
concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou
inibem a oxidação do substrato. Os radicais formados a partir dos antioxidantes não são
reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados por reação com outro radical,
formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante (SOUSA et al.,
2007).
Substâncias antioxidantes desempenham papel importante na saúde através
de seus efeitos na modulação dos processos oxidativos que ocorrem no organismo. A
formação das espécies reativas de oxigênio e subsequente oxidação das moléculas biológicas
constitui um mecanismo de dano tecidual presente em vários processos patológicos como
inflamação, derrame, infarto do miocárdio, ateroesclerose, doença de Alzheimer e Parkinson
e em alguns tipos de câncer (OZBEN, 1998).
Atualmente os antioxidantes foram divididos em duas classes:
antioxidantes primários ou interruptores de cadeia e antioxidantes secundários ou
preventivos. Antioxidantes secundários são substâncias que retardam a velocidade de
oxidação, através da remoção do substrato ou quelação do oxigênio singleto. Já os
antioxidantes primários, podem inibir ou retardar a etapa de iniciação da cadeia, reagindo
com o radical lipídico, ou ainda inibir a etapa de propagação da cadeia, reagindo com os
radicais peroxila ou alcoxila (ANTOLOVICH et al, 2002).
37
2.6 COMPOSTOS FENÓLICOS
Os compostos polifenólicos pertencem a uma classe de metabólitos que
inclui uma diversidade de estruturas, das mais simples como os chiquimídeos a muito
complexas como os taninos e os glicosídeos. Possuem, pelo menos um anel aromático no
qual um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila (SIMÕES et al., 2001). As
substâncias fenólicas tendem a ser hidrossolúveis, pois ocorrem frequentemente combinadas
com açúcares como glicosídeos e se localizam geralmente no vacúolo das células
(HARBONE, 1989).
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos deve-se principalmente à
sua propriedade redutora oriunda da estrutura química. Esta característica desempenha papel
importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição,
agindo tanto na etapa de inibição como na propagação do processo oxidativo. Os
intermediários formados pela ação dos antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis,
devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias (SOUSA et
al, 2007).
Os flavonóides protegem os constituintes orgânicos contra o dano
oxidativo, podendo também contribuir para a prevenção de importantes doenças, como as
cardiovasculares, o envelhecimento e os cânceres (HANASAKI et al, 1994).
Existem vários relatos de que os flavonóides exibem uma grande variedade
de efeitos biológicos como a ação antibacteriana, antiviral, antiinflamatória e antialérgica
(HANASAKI et al, 1994), a ação vasodilatadora (DUARTE et al, 1993), além de inibirem in
vitro a peroxidação lipídica (SUGIHARA et al, 1999).
38
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
a) Investigação fitoquímica e determinação da capacidade antioxidante e
teor de compostos fenólicos nos extratos e frações das raízes de Euterpe
oleracea Mart (Açaí).
3.2 ESPECÍFICOS
a) Determinar o perfil fitoquímico dos extratos etanólico e hidroacetônico
obtidos a partir das raízes por meio de metodologias de fitoquímica
clássica;
b) Fazer a análise granulométrica do pó para caracterização da droga
vegetal;
c) Determinar o teor de fenóis totais na espécie;
d) Caracterizar a presença de compostos fenólicos, esteróides e
triterpenóides nos extratos e frações;
e) Determinar por meio de ensaios in vitro a capacidade antioxidante
apresentada pelos extratos e frações.
39
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no período de agosto 2006 a novembro
de 2009 nos Laboratórios de Análise Fitoquímica e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Pará-UFPA e no Laboratório de
Farmacognosia e de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio
de Janeiro-UFRJ.
O período para desenvolvimento dos experimentos e análises dos dados
incluindo a pesquisa bibliográfica e o desenvolvimento do trabalho como um todo foi de
agosto de 2006 a fevereiro de 2009.
4.1 PRODUTOS QUÍMICOS
4.1.1 Solventes, Reagentes e Soluções
a) Solventes de grau analítico (MTedia): acetato de etila, acetona, ácido
acético glacial, ácido fórmico, ácido sulfúrico conc., água destilada e
ultra pura (Mili-Q), clorofórmio, diclorometano, n-butanol, etanol,
hexano, metanol, éter etílico, éter de petróleo, anidrido acético.
b) Solução etanólica de cloreto férrico a 1% e 5%, lugol, ninhidrina a 1%,
ácido clorídrico conc., magnésio, hidróxido de amônio 6N e a 10%, ácido
clorídrico 6N, peróxido de hidrogênio 30 vol., nitroprussiato de sódio a
5%, hidróxido de sódio 1N e 2N, vanilina a 1%, carbonato de sódio a
25%, sulfato de sódio anidro, formaldeído a 4%, o-dinitrobenzeno a 5%,
cloridrato de hidroxilamina a 10%, solução metanólica de hidróxido de
potássio a 10%, p-dimetilaminobenzaldeído, tricloreto de antimônio,
40
reativo de Keede, Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Pascová e Fehling A
e B, NPPEG.
c) Radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) obtido da Sigma-Aldrich.
d) Padrão extrato de Ginkgo biloba (EGb 761) Tebonin® (40mg/mL)
produto comercial obtido do laboratório Altana-Pharma Ltda.
e) Reagente Folin-Ciocalteau 2N e o Padrão Ácido Gálico obtidos da
Sigma-Aldrich.
4.1.2 Reveladores
Os reveladores utilizados foram:
a) Reveladores físicos como luz ultra-violeta a 254 e 365 nm;
b) Reveladores químicos como Cloreto férrico, Folin-Ciocalteau diluído,
H
2
SO
4
a 20% e NPPEG.
4.2 EQUIPAMENTOS
4.2.1 Para análise granulométrica
a) Agitador de peneiras para análises granulométricas eletromagnético-
Bertel do Laboratório de Farmacotécnica da Faculdade de Farmácia da
UFPA;
b) Balança analítica-Gehaka BK 500 do Laboratório de Farmacotécnica da
Faculdade de Farmácia da UFPA;
c) Balança analítica-Bioprecisa FA2104N do Laboratório de Fitoquímica
da UFPA;
41
4.2.2 Para análise cromatográfica e espectroscópica
a) Sistema para Cromatografia Gasosa (CG): Cromatógrafo GC-2010
Shimadzu do Núcleo de pesquisa em Produtos Naturais (NPPN) da
UFRJ.
b) Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa: Cromatógrafo
modelo Shimadzu GC-MS-QP5000 do Nucleo de Pesquisa em Produtos
Naturais (NPPN) da UFRJ.
c) Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN
1
H) da marca Bruker operando a 400MHz da UFRJ.
d) Sistema para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência La Chrom 7000
Merck Hitachi do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de
Farmácia da UFRJ;
4.2.3 Para análise da capacidade antioxidante e teor de fenóis totais
a) Balança analítica Sartorius BP-2215 do Laboratório de Farmacognosia
da UFRJ;
b) Espectrofotômetro Shimadzu UV-mini 1240, do Departamento de
Produtos Naturais e Alimentos da UFRJ;
c) Pipetas analíticas Gilson de 5000µL, 1000µL, 200µL, 50 µL, 20µL e
ponteiras Zap com filtros.
42
4.3 MATERIAL VEGETAL
Um exemplar da exsicata da espécie Euterpe oleracea Mart. (Açaí)
identificada por Nascimento, M.P. do e onde o material coletado por Xavier-Junior, S.R. e
Lisboa, O.S.B., foi depositada no Herbário IAN da EMBRAPA com registro (nº.180979).
O material vegetal (figura 3) foi adquirido numa Fábrica de cultivo e
extração do Açaí, a qual trabalha com a exportação da polpa do fruto e que fica localizada na
ilha do Combú, próximo a cidade de Belém-PA, foi coletado no período da manhã, no mês
de abril de 2007, priorizando-se a coleta de raízes adultas. Obteve-se um total de 3 kg do
material vegetal que foi seco em estufa até estabilização do peso, triturado em moinho de
facas e pesado obtendo-se aproximadamente 1 kg de droga vegetal.
Figura 3 - Raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí).
43
4.4 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA
A determinação da granulometria do pó das raízes foi realizada com base
na Farmacopéia Brasileira 4
a
Edição (1988), empregando-se a técnica da granulometria por
tamisação de 10g de droga vegetal em tamises com aberturas nominais de malha de 2,00mm;
1,40mm; 710µm; 355µm; 250µm; 180µm, 125µm e um coletor, os quais foram tarados
individualmente. A droga vegetal foi submetida a vibrações de intensidade 7 por um período
de 30 minutos de acordo com o equipamento. Após a tamisação realizou-se a pesagem e
determinou-se a quantidade de pó da droga vegetal retida e a quantidade que passou por cada
tamis. A partir dos dados obtidos foi construída a tabela 1 e os gráficos (figuras 5 e 6)
representativos desta análise.
4.5 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
4.5.1 Obtenção do Extrato etanólico bruto (EEB)
Inicialmente 150g da droga vegetal foram deixados em maceração estática
por uma semana (7 dias) em etanol até saturação, sendo então filtrado à baixa pressão. A
solução obtida foi concentrada sob baixa pressão em evaporador rotativo a uma temperatura
média de 40ºC, armazenado para secagem em estufa, obtendo-se assim 5g do extrato
etanólico bruto seco.
O rendimento total obtido para este tipo de material vegetal foi de
aproximadamente 3,3%. A amostra foi conservada em geladeira para a realização dos testes
fitoquímicos, análises cromatogáficas e testes da atividade antioxidante. Outras partidas de
extrato etanólico das raízes foram preparadas posteriormente de acordo com as necessidades
e com a mesma técnica aqui descrita.
44
4.5.2 Obtenção das frações por partição sólido-líquido do extrato etanólico bruto.
Foram utilizados 5g do extrato etanólico bruto, o qual foi colocado em um
becker de 250 mL, em seguida adicionaram-se os solventes em ordem crescente de
polaridade diretamente sobre a amostra e suspendendo-a várias vezes com cada solvente até
esgotamento total da droga. Os solventes utilizados foram: hexano, clorofórmio, acetato de
etila e metanol. Foram obtidos 455mg da FHE, 400mg da FCE, 830mg da FAEE, e 790mg
da FME que foram monitoradas por CCD para avaliação da composição e posterior
refracionamento por CC da fração FCE.
4.5.3 Obtenção do Extrato Hidroacetônico (EHA)
Cerca de 100g das raízes secas e trituradas foram submetidas a maceração
sob agitação em agitador elétrico (mixer) utilizando os solventes acetona/água (70:30) como
líquido extrator, na proporção de 10% de droga (m/v) ou seja 100g do material vegetal para
1000mL dos solventes, em seguida a solução foi filtrada e concentrada a baixa pressão. Para
eliminação da água residual utilizou-se n-butanol e o extrato obtido foi seco em estufa
obtendo-se 2,68g com um rendimento final de 2,7% (RESENDE, 2007). Este procedimento
foi realizado várias vezes até esgotamento total da droga e obtenção de uma quantidade
razoável de extrato adequado para as análises posteriores.
4.5.4 Partição liquído-líquido do extrato hidroacetônico com Acetato de etila e Água
Uma amostra do extrato, aproximadamente 3,6g foi solubilizada em 500
mL de água destilada e submetida a filtração simples. O filtrado foi transferido para um funil
de separação de 2L e em seguida foram adicionados 200 mL de acetato de etila. O funil foi
45
agitado cuidadosamente por cerca de 5 minutos e deixado em repouso para decantar e separar
as fases. Este procedimento foi realizado por três vezes até esgotamento. As frações aquosa
(FAH) e acetato de etila (FAEH) foram armazenadas para posterior liofilização e concetração
sob baixa pressão respectivamente. Antes de ser concentrada, a FAEH foi tratada com sulfato
de sódio anidro para retirar a água residual, armazenada em frasco apropriado, seco em estufa
e finalmente pesada obtendo-se assim aproximadamente 1g com rendimento de 28% e a
massa da FAH liofilizada foi de 800mg com rendimento de 22%.
4.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS
A determinação das classes de metabólitos secundários foi realizada com
base no Manual de Análise Fitoquímica e Cromatográfica de Extratos Vegetais do
Laboratório de Fitoquímica (BARBOSA, 2004).
Foram realizados testes para as classes dos metabólitos secundários:
açúcares redutores, alcalóides, antraquinonas, azulenos, catequinas, carotenóides, derivados
da cumarina, depsídeos e depsidonas, derivados de benzoquinonas, esteróides e
triterpenóides, fenóis e taninos, flavonóides, glicosídeos cardíacos, polissacarídeos, proteínas
e aminoácidos, purinas, saponinas e sesquiterpenolactonas. Foram analisados os extratos
etanólico bruto e o hidroacetônico.
4.7 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
4.7.1 Monitoração dos extratos e frações por CCD
A Cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em
cromatoplacas padronizadas de alumínio com gel de sílica Alugram Sil G/UV
254
Macherey-
Nagel® de 0,20 mm de espessura. Para monitoração dos extratos e frações obtidas o sistema
46
de solventes utilizado foi hexano/acetato de etila em diferentes proporções (1:1, 8:2 e 7:3) e
os cromatogramas observados sob luz UV de 254nm e 365nm e revelados com H
2
SO
4
a 20%
seguido de aquecimento, com NP/PEG e solução de Folin.
4.7.2 Determinação da presença de catequina por CLAE analítica da fração acetato de
etila (FAEH) obtida do EHA.
Foi utilizado o sistema de cromatografia líquida de alta eficiência(CLAE)
La Chrom Merck Hitachi 7000 e eluido com uma coluna Resechrom (Regis) RP 18, L-7351
25cm/4,6mm I.D, interface D-7000. Detecção: DAD detector Lachron Merck L-7450A,
Bomba L-7100, integração do sinal em 240-260 nm e fluxo de 1mL/min.
Solução de 5mg/mL da FAEH foi preparada para a análise cromatográfica
por CLAE e utilizou-se o método I segundo o artigo de Moreira et al. (2005), com o
gradiente de Ácido acético em água 2,5% como solvente A e acetonitrila 100% como
solvente B, utilizando-se de 0-3 min 3% de B de forma isocrática; de 3-13 min 9% de B de
forma linear; de 13-18 min 11% de B de forma linear; de 18-25 min 18% de B de forma
linear; de 25-30 min 18% de B de forma isocrática; de 30-40 min 30% de B de forma linear
seguida pela lavagem da coluna por 10 min com acetonitrila.
4.7.3 Cromatografia em coluna (CC) da fração clorofórmio (FCE) obtida do EEB
Cerca de 1g da fração clorofórmio (FCE) foi fracionada por cromatografia
em coluna, empregando-se uma coluna de vidro de 56cm de comprimento por 2,4cm de
diâmetro. Como fase estacionária utilizou-se gel de sílica de fase normal e como eluentes:
hexano 100%, hexano/acetato de etila (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70,
20:80, 10:90), acetato de etila 100%, acetato de etila/metanol (90:10, 80:20, 70:30, 60:40,
47
50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90) e metanol 100%. Foram obtidas 160 frações,que foram
monitoradas por CCD com o eluente hexano/ acetato de etila (7:3) e a seguir (1:1). As
frações foram reunidas de acordo com o perfil apresentado nos cromatogramas, obtendo-se
assim 40 frações monitoradas por CCD, visualizadas no UV a 254nm e 365 nm e reveladas
com H
2
SO
4
a 20%. As frações 6, 7, 9, 12, 13 e 14 apresentaram-se mais interessantes de
acordo com o desenvolvimento das cromatoplacas após revelação e foram analisados por
RMN
1
H. As frações 6 e 14 foram analisadas por CG-EM posteriormente.
4.7.4 Cromatografia de Contra Corrente da FAEH obtida do EHA
Foram utilizados 50 mg da amostra, que foi solubilizada em 1mL da
mistura dos solventes utilizados, sendo 0,5mL da fase superior e 0,5mL da fase inferior. Os
solventes utilizados foram hexano/acetato de etila/metanol/água na proporção
(0,6:0,8:0,6:0,8). A fase superior foi considerada a fase móvel e a fase inferior a fase
estacionária. Foi utilizada uma coluna de 26mL, com fluxo de 1mL/min e a retenção da
coluna foi de 13mL (50%) da fase estacionária. Foram utilizados 80 tubos de ensaio para
coletar as frações e no tubo 53 foi desligada a rotação, pois já havia sido coletado duas vezes
o volume da coluna utilizada.
4.7.5 Cromatografia gasosa (CG)
A análise cromatográfica preliminar das frações 6 e 14 obtidas da da fração
clorofórmio (FCE) por CC, foi realizada nas seguintes condições: coluna utilizada DB-1MS,
solvente clorofórmio para solubilizar as amostras, gás de arraste Hélio, temperatura do injetor
60ºC – 290ºC a 10ºC/min permanente a 290ºC/15min (isotérmico).
48
4.7.6 Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (CG-EM)
Na análise por CG-EM das frações 6 e 14 obtidas da fração clorofórmio
(FCE) da CC, foi utilizada uma coluna ZB-5MS, solvente clorofórmio para solubilizar as
amostras, gás de arraste utilizado Hélio com fluxo de 1mL/min, temperatura do injetor de
270ºC e a variação foi de 10ºC/min. As análises foram realizadas em espectrômetro
por impacto de elétrons a 70eV e os resultados expressos em relação massa/carga
(m/z).
4.8 ENSAIOS ANTIOXIDANTE IN VITRO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES
Foi realizada a análise quantitativa da capacidade antioxidante para o EHA
e suas frações FAEH e FAH e para o EEB e suas frações FHE, FCE, FAEE e FME
comparando-as com o padrão EGb 761 . Foram construídas as tabelas com os dados da AA%
e CE
50
e os gráficos comparativos das análises das amostras e do padrão EGb (761). Os
ensaios foram realizados de acordo com a metodologia dos trabalhos descritos por Mensor et
al.(2001).
Foram pesados 20 mg de cada amostra e solubilizado em 20 mL do
solvente adequado no caso do extrato hidroacetônico em água e suas frações em metanol, ou
seja o mesmo solvente utilizado na preparação da solução de DPPH. A solução do padrão
utilizado EGb (761) foi preparado em metanol a 1,0 mg/mL para as posteriores diluições.
As amostras foram diluídas a concentrações finais de 250; 125; 50; 25;
10;7,5; 5, 2,5, 1,0 e 0,5 µg/mL em metanol, partindo-se da solução estoque de 1,0 mg/mL.
Foram utilizadas duas séries de testes com DPPH (0,1 mM e 0,3mM) de cada uma destas
soluções adicionou-se 1mL a 2,5 mL da solução de cada amostra (A). A mistura de 1mL de
49
Metanol e 2,5mL da solução-amostra foram usados como branco (B). A solução de DPPH
(1,0 mL; 0,1 mM ou 0,3mM) e 2,5mL de metanol foram usados como controle (C). As
reações transcorreram à temperatura ambiente e no escuro por 60 minutos. A seguir foram
realizadas as leituras das absorbâncias, a 517 nm. Os valores de absorbância foram
convertidos em atividade antioxidante percentual (AA%) usando a seguinte fórmula:
AA% = 100 – { [ (ABS
A
– ABS
B
) X 100 ] / ABS
C
}
Onde:
AA% - Atividade Antioxidante percentual;
ABS
A
- Absorbância de A (amostra);
ABS
B
- Absorbância de B (branco);
ABS
C
- Absorbância de C (controle).
Como padrão de atividade antioxidante foi usado extrato padronizado de
Ginkgo biloba (EGb 761), utilizando os mesmos procedimentos de diluições seriadas
executados com as amostras provenientes dos extratos. Todas as análises foram realizadas
em triplicata (MENSOR et al.,2001).
Após os cálculos dos percentuais de atividade antioxidante foram
calculados os valores da CE
50
do extrato, frações e do padrão para posteriomente serem
construídos os gráficos comparativos e representativos das análises (MENSOR et al., 2001).
CE
50
= Quantidade de antioxidante necessário para diminuir a concentração inicial de DPPH em 50%.
4.9 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENÓIS TOTAIS (FT) NOS EXTRATOS E
FRAÇÕES
Os extratos e frações foram analisados pelo método colorimétrico
utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau (ANDRADE et al., 2007) com algumas
50
modificações, para determinação do teor de fenóis totais. O ácido gálico foi usado para
elaboração da curva de concentração padrão. O teor de fenóis totais foi determinado por
interpolação dos dados das amostras na curva de calibração construída com o ácido gálico e
expressos como equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/g de amostra).
A solução estoque de ácido gálico também foi preparada em água destilada
a 1,0 mg/mL e foram realizadas diluições obtendo-se concentrações finais de 12,5; 10,0; 7,5;
5,0 e 2,5 µg/mL (ANDRADE et al, 2007).
Foi preparada uma solução estoque para as amostras EHA e FAH em água
destilada a 1,0 mg/mL para posteriores diluições. As amostras foram diluídas a
concentrações finais de 400, 200, 100, 50 e 25 µg/mL em água destilada, partindo-se da
solução estoque (1,0 mg/mL). A 0,5 mL da amostra foi adicionado 0,5 mL do reagente de
Folin-Ciocalteau 2N e 1,0 mL de água destilada. Após um período de 5 minutos foi
acrescentado aos tubos 0,5 mL de carbonato de sódio (Na
2
CO
3
) a 10%, sob agitação. Após 1
hora de incubação à temperatura ambiente, as absorbâncias foram medidas em
espectrofotômetro a 760 nm, usando água destilada como branco (Figura 4). Todas as leituras
foram realizadas em triplicata (ANDRADE et al, 2007).
Todas as etapas destes experimentos para determinação do teor de fenóis
totais no padrão e nas amostras encontram-se detalhadas na figura 4, onde são mostrados os
procedimentos, etapas e informações necessárias para realização do ensaio.
51
Figura 4 - Esquema das etapas da preparação das soluções para a análise do teor de fenóis
totais.
52
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados da atividade antioxidante e teor de fenóis totais obtidos com
as amostras testadas foram expressos neste trabalho como a média de três repetições (n=3) ±
desvio padrão da média e foram analisados utilizando análise de variancia unilateral
ANOVA. A análise estatística foi realizada utilizando o programa BioEstat 4.0 (AYRES et
al., 2005).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISE GRANULOMÉTRICA DO PÓ
Os resultados obtidos na análise granulométrica do pó das raízes do
açaizeiro estão apresentados na tabela 1. Os valores obtidos de fração retida, residual e
passagem percentual estão representados nos gráficos (figuras 5 e 6).
Tabela 1 - Análise granulométrica por tamisação do pó das raízes de Euterpe oleracea Mart.
(Açaí).
Abertura
de malha
(mm)
Peso dos
tamises (g)
Peso dos
tamises após
vibração (g)
Fração retida
percentual
(%)
Fração residuo
percentual (%)
Fração
passagem
percentual (%)
2,000 107,18 107,18 0 0 100
1,400 110,88 110,97 0,9 0,9 99,1
0,710 103,04 105,93 28,9 29,8 70,2
0,355 99,45 103,22 37,4 67,2 32,8
0,250 99,13 99,45 3,2 70,4 29,6
0,180 97,15 98,00 8,5 78,9 21,1
0,125 95,74 96,38 6,4 85,3 14,7
Coletor 0,86 1,38 5,2 90,5 9,5
53
A distribuição granulométrica é um fator importante na obtenção de um
extrato, pois um maior ou menor rendimento de extração está relacionado com a área de
superfície e dimensões das partículas em contato com o líquido extrator (CARDOSO, 2002).
A figura 5, que representa a curva de distribuição granulométrica da droga
triturada mostrou que a maior porcentagem de partículas ou seja mais de 65% encontram-se
na faixa granulométrica que varia de 0,355 a 0,710 mm.
Figura 5 - Curva de distribuição granulométrica da droga vegetal.
A figura 6 representa as curvas características de retenção e passagem da
droga triturada através da análise granulométrica por tamisação, empregando-se os dados
fornecidos pela tabela 1. O pó é considerado grosso de acordo com o que preconiza a
Farmacopéia Brasileira 4
a
edição, pois as partículas passam em quase 100 % pelo tamis de
abertura nominal de malha de 1,400mm e 32,8 % pelo tamis de abertura nominal de malha de
0,355mm. O diâmetro médio, calculado a partir do ponto de intersecção das retas foi de
aproximadamente 0,533mm.
Figura 6 - Curvas cumulativas de resíduo e passagem da droga vegetal após tamisação.
54
5.2 EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO
A fração clorofórmio (FCE) obtida do extrato etanólico bruto foi tratada em
coluna cromatográfica de gel de sílica de fase normal, conforme descrito no item 4.7.3. A
partir de 1g da amostra FCE foram obtidas 40 frações, as quais foram monitoradas por CCD
com o sistema de solvente hexano/acetato de etila (1:1) e posteriormente analisadas por
RMN
1
H. Destas frações, as 18 primeiras encontram-se ilustradas na cromatoplaca das figura
9 após revelação e o espectro de RMN
1
H obtido da fração 6 é mostrado na figura 10 e uma
ampliação na figura 11, ilustrando a estrutura de uma das substâncias detectadas.
As 18 primeiras frações obtidas da partição em clorofórmio por
fracionamento em CC que foram monitoradas por CCD estão apresentadas na figura 7 a
seguir.
Figura 7 - Cromatografia em camada delgada das frações 1 a 18 obtidas por CC.
Do fracionamento por CCC da fração acetato de etila (FAEH) foram
obtidas 4 frações, as quais foram monitoradas por CCD com o sistema de solvente
hexano/acetato de etila (1:1). O resultado não foi conclusivo, pois seriam necessários outros
fracionamentos, haja vista que não pôde ser realizado o isolamento de nenhuma substância
55
devido à pequena quantidade de material obtido, não sendo possível assim realizar outras
análises.
5.3 ABORDAGEM FITOQUÍMICA
O resultado da abordagem fitoquímica encontra-se representado no quadro
4, onde o extrato etanólico bruto (EEB) apresentou resultados positivos para as seguintes
classes de metabólitos secundários: açúcares redutores, catequinas, depsídeos e depsidona,
esteróides e triterpenóides, taninos catequinicos, flavonóides, glicosídeos cardíacos e
sesquiterpenolactonas. Enquanto o extrato hidroacetônico (EHA) apresentou resultados
positivos para os açúcares redutores, catequinas, taninos catequinicos, flavonóides e nos
testes específicos, obteve-se resultado positivo para catequinas e flavanonas. Os resultados
obtidos para estas classes de substâncias químicas estão de acordo com o que já se tem
detectado, identificado e isolado nesta espécie em estudos já realizados com os frutos
(SILVA, 2007).
Quadro 4 - Resultados da Abordagem fitoquímica do extrato etanólico e hidroacetônico das
raízes de Euterpe oleracea Mart. (Açaí)
Testes fitoquímicos
Extrato Etanólico Bruto
EEB
Extrato Hidroacetônico
EHA
Açúcares Redutores + +
Catequinas + +
Depsídeos e Depsidonas + -
Esteróides e Triterpenóides + -
Fenóis e Taninos + p/ taninos Catequinicos
+p/ taninos
catequinicos
Flavonóides + +
Glicosídeos Cardíacos + -
56
5.4 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA POR CLAE DA FAEH
A análise cromatográfica por CLAE da FAEH obtida do EHA, mostrou
através do cromatograma obtido a possível presença da substância catequina, caracterizada
pelo pico em 6,91min, que quando comparado com os dados apresentados na literatura
(MOREIRA, 2005) onde é mostrado pico com tempo de retenção em 6,8min o qual pode ser
considerado semelhante ao obtido na análise pois foram detectados utilizando o mesmo
método e nas mesmas condições. A seguir a estrutura da catequina e o cromatograma obtido
na análise (figura 8).
1,07
2,69
3,25
4,80
6,91
7,76
8,43
9,01
9,65
10,11
11,39
12,13
13,04
13,55
13,97
14,48
15,71
15,97
16,43
17,47
20,80
21,28
23,57
24,40
25,55
26,75
27,44
28,67
29,52
29,81
30,19
30,72
31,09
32,69
33,04
33,55
33,87
34,77
35,04
35,65
36,21
36,37
36,96
37,41
37,76
38,29
38,72
39,23
40,43
42,45
42,85
43,25
43,95
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Retention Time (min)
-0,10
0,00
0,10
0,20
0,30
Absorbance (AU)
Figura 8 – Presença de catequina na fração acetato de etila (FAEH) por CLAE.
57
5.5 TEOR DE FENÓIS TOTAIS
O ensaio para determinação dos teores de fenóis totais que está descrito no
item 4.9 teve o auxílio de uma curva padrão do ácido gálico (R
2
=0,993) representada na
figura 9, para expressar o teor de fenóis totais no extrato hidroacetônico (EHA) e sua fração
aquosa (FAH) em equivalente de ácido gálico por unidade de massa. O teor de fenóis totais
(mg de ácido gálico/g de amostra) para as amostras EHA e FAH foram de aproximadamente
55 e 77 respectivamente, as quais foram analisadas nas concentrações de 25, 50, 100, 200 e
400µg/mL. Os valores obtidos correspondem a média das três determinações para cada
concentração. Estes resultados mostram que o teor de fenóis totais presentes nas amostras
foram significativos, o que pode ser consequência da composição química das amostras,
caracterizadas pela predominância de compostos de alta polaridade e podem estar
relacionados com os elevados valores de atividade antioxidante (%) apresentada pelas
mesmas.
Figura 9 - Curva padrão e equação da reta obtidas após os ensaios com ácido gálico nas
concentrações de 2,5; 5,0 ; 7,5; 10,0 e 12,5 µg/mL.
58
5.6 ESPECTRO DE RMN
1
H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 6.
O espectro de RMN
1
H (figura 10) da fração 6 mostra sinais característicos
dos esteróides sitosterol e estigmasterol nas formas livre. O espectro apresentou um conjunto
de sinais em 0,65ppm a 2,40 ppm característicos de esqueleto esteroidal. O multipleto em
3,52 ppm é característico do hidrogênio oximetínico H-3 do sitosterol e do estigmasterol. O
singleto largo (sl) em 5,36 ppm é devido ao hidrogênio olefínico H-6 tanto para o sitosterol
como para o estigmasterol. A expansão do espectro de RMN
1
H (figura 11) da fração 6 exibe
ainda dois duplos dubletos (dd) em 5,04 ppm (J=7,0 Hz e J=15 Hz) e 5,17 ppm (J=7,0 Hz e
J=15 Hz), referentes, respectivamente, aos hidrogênios H-22 e H-23 da cadeia lateral do
essstigmasterol. Esses sinais estão de acordo com os dados da literatura para estas
substâncias (KUO & LI, 1997).
pp
m
(
t1
)
0.05.010.0
0
50
10
0
15
0
20
0
25
0
7.264
5.358
5.345
5.185
5.168
5.164
5.153
5.147
5.126
5.048
5.033
5.027
5.010
4.989
3.488
1.254
1.010
0.846
0.828
0.824
0.806
0.681
0.000
Figura 10 - Espectro de RMN
1
H da fração 6 (300 MHz; CDCl
3
; relativo para TMS).
59
Figura 11 - Ampliação da área que corresponde aos sinais de hidrogênios de 4,00 ppm a 5,50
ppm da fração 6.
Tabela 2 - Dados de RMN
1
H da fração 6 (300 MHz; CDCl
3
;relativo para TMS).
Hidrogênio δ (ppm) Multiplicidade J (Hz)
H
6
5,36
sl
-
H
22
5,17
dd
15 e 7,0
H
23
5,04
dd
15 e 7,0
A ampliação do espectro de RMN
1
H (figura 11) da fração 6 mostra sinais
na faixa de 4,00 a 4,40 ppm referentes a unidade de açúcar. Com apenas o espectro de RMN
1
H não foi possível identificar com segurança qual(ais) substância(s) glicosilada(s) está(ao)
presente(s) nessa fração. O espectro de RMN
13
C seria muito útil para essa análise, porém
não foi obtido. Pode-se especular a presença dos esteróides glicosilados estigmasterol e
sitosterol e/ou ainda a glicose livre. A análise por CG-EM da fração 6 não detectou essas
60
substâncias, o que pode estar associado à solubilização da amostra para injeção no
cromatógrafo.
A fração 6 foi submetida à análise por CG-EM nas condições
cromatográficas descritas no item 4.7.6. A figura 12 mostra o cromatograma desta fração,
onde os principais sinais estão indicados com seus respectivos valores de tempo de retenção.
Figura 12 - Cromatograma da fração 6 por CG-EM (TIC).
Os espectros de massas gerados a partir dos picos detectados na fração 6
analisada por CG-EM (figuras 13 a 16) foram correspondentes aos derivados de ácidos
graxos e esteróides e a comparação com espectros da biblioteca do aparelho levou a sugerir a
presença do ácido hexadecanóico (ácido palmítico) (pico 12, figura 13), estigmasterol (pico
38, figura 14), sitosterol (α-dihidrofucosterol) (pico 39, figura 15), estigmasta-3,5-dien-7-one
(β-sacharostenona) (pico 44, figura 16) que correspondem aos compostos majoritários, ou
seja que apresentaram percentuais de área dos picos acima de 4%. O sitosterol e o
61
estigmasterol estão presentes na fração 6, respectivamente, em 25,08% e 8,24%, portanto,
são os majoritários, o que está de acordo com a intensidade dos sinais observada no espectro
de RMN
1
H para essas substâncias. Além dessas, foram identificadas, também, as
substâncias minoritárias campesterol (5-ergostenol) (pico 37, figura 12), estigmastenona
(pico 45, figura 12), estigmastano-3,6-diona (pico 48, figura 12). Essas substâncias
minoritárias estão de acordo com os tipos de estruturas (esteróides) indicadas pela análise do
espectro de RMN
1
H da fração 6.
A identificação das substâncias foi feita através da biblioteca digital de
espectros do software do próprio aparelho e todas as estruturas propostas tiveram um alto
índice de similaridade. As estruturas das substâncias encontram-se ilustradas no quadro 5 e 6,
na página 69 e 70.
Figura 13 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro do pico
12 eluído em 17,2 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido hexadecanóico (ácido
palmítico).
62
Figura 14 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 38 eluído em 31,9 min (B) obtido por CG-EM proposto para o estigmasterol.
Figura 15 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 39 eluído em 33,5 min (B) obtido por CG-EM proposto para o sitosterol (α-
dihidrofucosterol).
63
Figura 16 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 44 eluído em 35,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para a substância
estigmasta-3,5-dien-7-ona (β-sacharostenona).
5.7 ESPECTRO DE RMN
1
H E CG-EM OBTIDOS DA FRAÇÃO 14.
O espectro de RMN
1
H (figura 17) da fração 14 apresentou sinais
característicos de ácidos graxos e derivados (KNOTHE, 2005). Dentre outros, o espectro
exibe o tripleto em 2,34 ppm e o multipleto em 1,61ppm atribuídos aos hidrogênios
metilênicos (CH
2
) α e β à carbonila, respectivamente. O sinal intenso em 1,27 ppm é devido
aos demais hidrogênios metilênicos da cadeia longa dos ácidos graxos. O conjunto de sinais
entre 0,90 e 0,60 ppm são relacionados aos grupos metílicos (CH
3
) terminais da mistura de
ácidos graxos.
Tabela 3 - Dados de RMN
1
H da fração 14 (300 MHz; CDCl
3;
relativo para TMS).
Hidrogênios δ(ppm)
CH
2
α carbonila
2,36 a 2,02
CH
2
β carbonila
1,65 a 1,59
CH
2
cadeia longa
1,27
CH
3
terminal
0,90 a 0,60
64
pp
m
(
t1
)
0.05.010.0
0
500
100
0
150
0
7.262
3.491
2.363
2.344
2.325
1.649
1.632
1.613
1.594
1.302
1.255
0.897
0.880
0.870
0.863
0.853
0.846
0.827
0.000
pp
m
(
t1
)
0.000.501.001.502.00
0
500
100
0
150
0
2.363
2.344
2.325
1.649
1.632
1.613
1.594
1.302
1.255
0.897
0.880
0.870
0.863
0.853
0.846
0.827
0.000
Figura 17 - Espectro de RMN
1
H da fração 14 e ampliação da área com sinais de hidrogênios de 0 a 2,50ppm (300 MHz; CDCl
3
; relativo para TMS).
65
A figura 18 mostra o cromatograma da fração 14 obtido com as condições
cromatográficas e espectroscópicas descritas no item 4.7.6. Os principais sinais estão
indicados com seus respectivos valores de tempo de retenção.
Figura 18 - Cromatograma da fração 14 obtido da análise por CG-EM (TIC).
A análise por CG-EM da fração 14 mostrou após comparação dos dados
obtidos com os da literatura através das semelhanças apresentadas pelos espectros, a presença
dos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: ácido dodecanóico (ácido láurico) (pico 6,
figura 19), ácido tetradecanóico (ácido mirístico) (pico 7, figura 20), ácido pentadecanóico
(ácido pentadecílico) (pico 8, figura 21), ácido hexadecanóico (ácido palmítico) (pico 10,
figura 22) e ácido octadecanóico (ácido esteárico) (pico 13, figura 23) que correspondem aos
compostos majoritários, ou seja que apresentaram percentuais de área dos picos acima de
5%. Foram identificados, ainda, como componentes minoritários o aldeído n-nonanal (pico 1,
figura 18), o ácido decanóico (ácido cáprico) (pico 4, figura 18) e o n-hexadecanoato de
66
metila (éster metílico do ácido palmítico) (pico 9, figura 18) onde são mostrados no quadro 6
da página 70. As substâncias identificadas por CG-EM estão de acordo com o previsto pela
análise de RMN
1
H da fração 14. Nesse espectro não é possível detectar o sinal do
hidrogênio do grupo aldeído, mas isso pode ser explicado pela baixa concentração do n-
nonanal nessa fração.
A identificação das substâncias foi feita através da biblioteca digital de
espectros do software do próprio aparelho e todas as estruturas propostas tiveram um alto
índice de similaridade.
Figura 19 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 6 eluído em 12,6 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido
dodecanóico (ácido láurico).
67
Figura 20 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 7 eluído em 14,9 min (B) obtido por GC-MS proposto para a substância ácido
tetradecanóico ou ácido mirístico.
Figura 21 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 8 eluído em 16,1 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido
pentadecanóico (pentadecílico).
68
Figura 22 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 10 eluído em 17,3 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido
hexadecanóico (ácido palmítico).
Figura 23 - Espectro de massa obtido da biblioteca digital do aparelho (A) e espectro de
massas do pico 13 eluído em 19,2 min (B) obtido por CG-EM proposto para o ácido
octadecanóico (ácido esteárico).
69
Quadro 5 – Estruturas dos compostos majoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e
14.
FRAÇÃO 6 FRAÇÃO 14
Ácido Hexadecanóico
Ácido Dodecanóico
Estigmasterol
Ácido Tetradecanóico
Sitosterol
Ácido Pentadecanóico
Sacharostenona
Ácido Hexadecanóico
Ácido Octadecanóico(ácido esteárico)
70
Quadro 6 – Estruturas dos compostos minoritários identificadas por CG-EM das frações 6 e
14.
FRAÇÃO 6 FRAÇÃO 14
Campesterol
O
n-Nonanal
Estigmastenona
O
Ácido n-Decanóico
Estigmastano-3,6-dione
Hexadecanoato de metila
71
5.8 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE
A avaliação da atividade antioxidante das amostras analisadas mostrou que
os extratos e frações de Euterpe oleracea Mart.(Açaí) são bem mais ativos em relação ao
padrão EGB (761) que foi utilizado e confirmam assim a forte atividade antioxidante que
esta espécie apresenta e que já foi demonstrada nos frutos.
Os resultados obtidos na avaliação da atividade antioxidante (AA%) frente
ao radical DPPH 0,1mM e as CE
50
das amostras EHA, FAEH, FAH e padrão EGb (761) nas
concentrações de 2,5; 5; 7,5; 10 e 25 µg/mL são mostradas na tabela 4. Um gráfico em barras
(figura 24) mostrou uma comparação entre as quatro amostras analisadas. As frações FAH e
FAEH apresentaram maior atividade antioxidante frente ao radical DPPH 0,1mM, pois foram
as que obtiveram os menores valores de CE
50
de 2,073 e 2,277 respectivamente, ou seja
diminuíram a concentração do DPPH em 50% com as menores concentrações, seguidas pelo
padrão EGb que apresentou CE
50
de 5,093.
Tabela 4 - Atividade antioxidante (%) e CE
50
do EHA, FAEH e FAH e do padrão EGb (761)
frente ao radical DPPH 0,1mM.
Concentração
(µg/mL)
AA (%)
EHA
(AA%)
FAEH
(AA%)
FAH
AA (%)
PADRÃO
2,5 10,835
58,082
29,130 12,789
5,0 25,933
83,837
53,641 48,668
7,5 43,694
84,014
81,350 54,174
10 60,036
83,304
84,725 83,304
25 77,975
86,146
80,639 89,876
CE
50
±DP 8,465±0,100
2,073±0,329
2,277±0,299 5,093±0,166
72
Figura 24 - Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante apresentada pelas
amostras EHA, FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5, 10 e 25 µg/mL
frente ao radical DPPH 0,1 mM e com seus respectivos erros padrões.
Os resultados obtidos na avaliação da atividade antioxidante (AA%) frente
ao radical DPPH 0,3mM e as CE
50
das amostras EHA, FAEH, FAH e o padrão EGb (761)
nas concentrações de 2,5; 5; 7,5; 10 e 25 µ/mL são apresentadas na tabela 5 e um gráfico em
barras (figura 25) mostra uma comparação entre as quatro amostras analisadas evidenciando
as diferenças obtidas nas diversas concentrações. As amostras FAEH e FAH foram as mais
potentes das quatro frente ao radical DPPH 0,3mM. Aprsentaram AA% relativamente alto
pois os valores de CE
50
obtidos foram de 7,55 e 9,363 respectivamente enquanto o padrão
21,16. A amostra EHA não atingiu a CE
50
com a maior concentração testada de 25µg/mL e
teve que ser calculada com o auxílio da equação da reta.
73
Tabela 5 - Atividade antioxidante (%) e CE
50
do EHA, FAEH e FAH e do padrão EGb (761)
frente ao radical DPPH 0,3mM.
Concentração
(µg/mL)
(AA%)
EHA
(AA%)
FAEA
(AA%)
FAA
(AA%)
PADRÃO
2,5 14,000 25,525 22,102 13,932
5,0 17,898 38,000 31,017 26,881
7,5 22,678 49,763 44,847 30,441
10 32,746 60,000 51,763 35,119
25 44,237 95,186 94,780 55,119
CE
50
±DP 27,906±0,369 7,550±0,385 9,363±1,092 21,161±1,309
Figura 25 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EHA,
FAEH, FAH e do padrão EGb (761) nas concentrações de 7,5; 10 e 25 µg/mL frente ao
radical DPPH 0,3 mM com seus respectivos erros padrões.
74
Os resultados obtidos na avaliação da atividade antioxidante (AA%) frente
ao radical DPPH 0,3mM e as CE
50
das amostras EEB, FHE, FCA, FAEA, FMA e padrão
EGb (761) nas concentrações de 5; 10; 25, 50 e 100 µg/mL são mostradas na tabela 6 e um
gráfico em barras (figura 26) mostra uma comparação das seis amostras analisadas
evidenciando as diferenças obtidas nas diversas concentrações. A amostra EEB foi a mais
potente das seis amostras apresentando uma atividade antioxidante (AA%) frente ao radical
DPPH 0,3mM bastante sigificativa pois a CE
50
de 5,46 bem menor que o do padrão utilizado
e das outras amostras analisadas. A amostra FHA não atingiu a CE
50
nem com a maior
concentração testada de 100µg/mL e teve que ser calculada com o auxílio da equação da reta,
isto mostra que quanto menos polar a amostra analisada menor é a AA% apresentada.
Tabela 6 - Atividade antioxidante (%) e CE
50
do EEB, FH, FC, FAE e FM e do padrão EGb
(761) frente ao radical DPPH 0,1mM.
Concentração
(µg/mL)
AA (%)
EEBA
(AA%)
FHA
(AA%)
FCA
AA (%)
FAEA
AA(%)
FMA
AA(%)
PADRÃO
5 46,523 10,547 12,803 16,484 14,922 17,930
10 83,789 11,328 14,961 24,492 23,984 22,070
25 92,031 12,148 24,844 43,906 47,539 63,164
50 93,711 18,438 52,344 74,688 73,008 86,953
100 87,031 23,906 74,492 88,867 87,617 90,859
CE
50
±DP
5,46
±0,11
275,85*
47,86
±1,43
29,95
±1,29
27,42
±4,25
20,20
±1,46
*A amostra FHA não chegou a alcançar a CE
50
nas concentrções testadas, então esta foi calculada com auxílio
da equação da reta obtida do gráfico, não sendo possível calcular o desvio padrão.
75
Figura 26 – Gráfico em barra comparativo da atividade antioxidante das amostras EEBA,
FHA, FCA, FAEA, FMA e do padrão EGb (761) nas concentrações de 5; 10 e 25 µg/mL
frente a radical DPPH 0,3mM com seus respectivos erros padrões.
76
6 CONCLUSÃO
Pelos resultados obtidos com a investigação fitoquímica dos extratos
etanólico (EEB) e hidroacetônico (EHA), a análise cromatográfica e espectroscópica das suas
respectivas frações, observa-se a presença, nas amostras, de compostos de alta polaridade
indicados nos ensaios de teor de fenóis totais e compostos de baixa polaridade como
derivados de ácidos graxos e esteróides, determinados por análises de RMN
1
H.
As análises por CG-EM das frações 6 e 14 levaram à obtenção de uma série
de espectros, os quais foram comparados com os espectros existentes na biblioteca do
aparelho, levando à identificação de substâncias das classes dos esteróides, de ácidos graxos
e derivados. As substâncias identificadas estão de acordo com o perfil fitoquímico indicado
nos resultados e na literatura para a espécie Euterpe oleracea Mart (Açaí).
Os esteróides caracterizados nas frações 6 e 14 foram o estigmasterol,
sitosterol, β-sacharostenona, campesterol, estigmastenona e estigmastano-3,6-diona. Os
ácidos graxos e derivados identificados foram o ácido dodecanóico (ácido láurico), ácido
tetradecanóico (ácido mirístico), ácido pentadecanóico, ácido hexadecanóico (ácido
palmítico), ácido octadecanóico (ácido esteárico), ácido decanóico (ácido cáprico), o aldeído
n-nonanal e o n-hexadecanoato de metila (éster metílico do ácido palmítico).
O resultado obtido na análise cromatográfica por CLAE da FAEH mostrou
a possível presença de catequina na amostra, o que é evidenciado pelo valor do tempo de
retenção apresentado pelo sinal, que pode ser considerado semelhante ao citado no artigo
usado com referência nesta análise.
No geral as amostras testadas apresentaram um percentual de atividade
antioxidante (AA%) bastante significativo em relação ao padrão EGb (761), com destaque
especial para as amostras FAH e FAEH testadas frente ao radical DPPH nas concentrações
77
de 0,1 e 0,3 mM, apresentando uma CE
50
de 2,073; 2,277 e de 7,55; 9,363 para as respectivas
amostras e nas respectivas concentrações de DPPH, estes bem menores que o do padrão
utilizado, ou seja o consumo de DPPH foi maior, e consequentemente as atividades
antioxidantes das amostras também foram maiores nas mesmas concentrações testadas com o
padrão EGb (761). A amostra EEB testada frente ao radical DPPH 0,3mM também
apresentou uma CE
50
de 5,46 valor bem significativo em relação ao CE
50
apresentado pelo
padrão EGb (761) que foi de 20,2 e de suas frações.
O teor de fenós totais encontrado para as duas amostras testadas EHA e
FAH foi de aproximadamente 55 e 77 (mg de ácido gálico/g de amostra), respectivamente, e
pode ser considerado relativamente alto quando comparado com outros valores encontrado
em estudos realizados com a espécie, já descritos na literatura.
A evidência de uma atividade antioxidante elevada nos extratos e frações
analisadas de Euterpe oleracea Mart. encorajam estudos com as substâncias e suas frações
obtendo um maior grau de pureza das amostras, a fim de se determinar e isolar os compostos
fenólicos presentes que de alguma forma estão relacionados com a atividade antioxidante
apresentada pelas amostras testadas. Vale ressaltar que este é o primeiro estudo químico e
fitoquímico realizado com as raízes de Euterpe oleracea Mart. até o momento.
78
7 REFERÊNCIAS
ANDRADE, C. A.; COSTA, C. K.; BORA, K.; MIGUEL, M. D.; MIGUEL O. G.; KERBER,
V. A. Determinação do conteúdo fenólico e avaliação da atividade antioxidante de Acacia
podalyrifolia A. Cunn. Ex G. Don, Leguminosae-mimosoideae. Revista Brasileira de
Farmacognosia, 17(2), 231 - 235, 2007.
ANTOLOVICH, M.; PRENZLER, P. D.; PATSALIDES, E.; McDONALD, S.; ROBARDS,
K. Methods for testing antioxidant activity. Analyst, 127, 183 - 198, 2002.
AYRES, M.; AYRES, M.JR.; AYRES, D.L.;SANTOS, A.A.S. BioEstat aplicações
estatísticas na área das ciências bio-médicas, 4ª Edição, editora mamirauá, 2005, p.39 – 40.
BARBOSA, W.L.R.; QUIGNARD, E.; TAVARES, I. C. C.; PINTO, L. N.; OLIVEIRA, F.
Q.; OLIVEIRA, R. M. Manual para análise fitoquímica e cromatográfica de extratos
vegetais, edição revisada, Belém, 2004. Disponível em:
<www.ufpa.br/propesp/rcientífica/link: textos diáticos/científicos> Acesso em: 25/03/2007.
BIANCO, E.M.; SANTOS, C.A.M.; Substâncias isoladas das folhas de Bauhinia
microstachya (Raddi) Macbr.(Caesalpiniaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia,
13(2), 93 - 99, 2003.
BOBBIO, F.; DRUZIAN, J. ABRAO, P.; BOBBIO, P.; FADELLI, S. Identification and
quantification of anthocyanins from the açaí fruit (Euterpe oleracea Mart.) Cienc. Tecnol.
Aliment. 20, 388 - 390, 2000.
CARDOSO, M.L.C. Desenvolvimento de metodologias analíticas e tecnológicas na
obtenção de extratos secos nebulizados de Heteropteris aphrodisiaca . Tese (Doutorado),
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho,
Araraquara, 2002.
COSTA, L. Goeldi pesquisa o açaí na várzea, Beira de Rio, Órgão informativo da
Universidade Federal do Pará, Belém-PA, Brasil, 5, 1972, 103, 1992.
CPATU-EMBRAPA (Belém, PA) Disponível em:
<http://www.cpatu.embrapa.br/Fruteiras/paginas/Acaizeiro.htm> Acesso em: 22/02/2007.
DAVIES, K.J. Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochemical Society Symposium,
v.61, 1 - 31, 1995.
DEL POZO-INSFRAN, D.; BRENES, C.H.; TALCOTT, S.T. Phytochemical Composition
and pigment Stability of Açaí (Euterpe oleracea Mart.). USA, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 52, 1539 - 1545, 2004.
DESTAQUE AMAZÔNIA. Órgão de divulgação do Museu Emílio Goeldi, 1985.
DI STASI, L.C.; LIMA, C.A.H. Plantas Medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica,
2ªEdição revista e ampliada. Editora UNESP, São Paulo, 2002, p.81 - 82.
79
DUARTE, J.; PEREZ-VIZCAINO F.; UTRILA, P.; JIMENEZ, J.; TAMARGO, J.;
ZARZUELO, A. Aminophylline preferentially inhibits chloroethylclonidine-insensitive α-
adrenoceptor-mediated contractions in rat aorta. General Pharmacology, 24, 857, 1359 -
1364, 1993.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA 4
a
Edição, Determinação granulométrica dos pós, P-V.2.11,
1988.
GALLORI, S.; BILIA, A.R.; BERGONZI, M.C.; BARBOSA, W.L.R.; VINCIERI, F.F.
Polyphenolic Constituents of fruit pulp of Euterpe oleracea Mart. (Açaí palm).
Chromatographia, 59, 739 – 743, 2004.
GALOTTA, A.L.Q.A.; BOAVENTURA, M.A.D. Constituintes químicos da raiz e do talo da
folha do açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae). Química Nova, 28(4), 610 - 613, 2005.
HACKETT, A.M. The metabolism of flavonoid compounds in mammals. In: Cody V.
MIDDLETON, E.; HARBONE J.B.; eds. Plant Flavonoids in Biology and Medicine.
Biochemical Pharmacological and structure Activity Relationships. New York: Alan R.
Liss, 177, 1986.
HANASAKI, Y.; OGAWA, S.; FUKUI, S. The correlation between active oxygens
scavenging and antioxidative effects of flavonoids. Free Radical Biol. Med., 16(6), 845 -
850, 1994.
HARBONE J.B. The flavonoids: advances in research since 1980. Chapman & Hall, New
York, New Phytologist, 111(3), 559 - 565, 1989.
HENDERSON, A.; SCARIOT, A. A formula da reserve Ducke, I: Palmae (Arecaceae). Acta
Amazonica, p.349 - 369, 1993.
JARDIM, M.A.G.; ROMBOLD, J.S. Effects of adubation and thinning on açai palm (Euterpe
oleracea Mart.) fruit yield from a natural population. Bol. Mus. Par. Em: Goeldi Botânica,
10(2), 283 - 293, 1994.
JARDIM, M.A.G.; MEDEIROS, T.D.S.; Plantas oleaginosas do Estado do Pará: composição
florística e usos medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia, 87(4), 124 - 127, 2006.
JOLY, A. Botanica: Introdução à taxonomia vegetal. 12ª ed. São Paulo: Companhia editora
Nacional, 1998, 704 - 708.
JORDÃO Jr., A.A.; Chiarello, P. G.; BERNARDES, M.S.M.; VANNUCCHI, H. Peroxidação
lipídica e etanol: papel da glutationa reduzida e da vitamna E. Medicina, 31, 434 - 449, 1998.
KNOTH, G.
1
H NMR spectroscopy of fatty acids and their derivates. Disponível em:
<http://www.lipidlibrary.co.uk.> Acesso em 30/04/2008.
KUO, Y.H.; LI, Y.C. Constituents of bark of Ficus microcarpa L.F. Journal of the Chinese
Chemical Society, 31(44): 321 - 325, 1997.
LICHTENTHÄLER, R.; RODRIGUES, R.; MAIA, J.; PAPAGIANNOPOULOS, M.;
FABRICIUS, H.; MARX, F. Total oxidant scavengeing capacities of açaí (Euterpe oleracea
Mart.) fruits. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 56 (1), 53 - 64, 2005.
80
MATHEUS, M.E.; FERNANDES, S.B.O.; SILVEIRA, C.S.; RODRIGUES, V.P.;
MENEZES, F.S.; FERNANDES, P.D. Inhibitory effects of Euterpe oleracea Mart. (Açai) On
nitric oxide production and iNOS expression. Journal of Ethnopharmacology, 107, 291 -
296, 2006.
MATHIESEN, L.; MALTERUD, K. E.; SUND. R. B. Free Radical Biol. Med., 22, 307,
1997.
MENSOR, L.L.; MENEZES, F.S.; LEITÃO, G.G.; REIS, A.S.; SANTOS, T.C.; COUBE,
C.S.; LEITÃO, S.G. Screening of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of
DPPH free radical method. Phytotherapy Research, 15, 127 - 130, 2001.
MIRANDA, A.L.P. DE; FRAGA, C.A.M. Atividade sequestradora de radical livre:
determinação do potencial antioxidante de substâncias biotaivas, dezembro, 2006.
MOREIRA, D.L.; LEITÃO, S.G.; GONÇALVES, J.L.S.; WUGG, M.D.; LEITÃO, G.G.
Antioxidant and antiviral properties of Pseudopiptadenia contorta (LEGUMINOSAE) and of
quebracho (Shinopsis sp.) extracts. Quimica Nova, 28(3), 421 - 425, 2005.
OLDEMAN, R.A.A. Estude biologique des pinotiéres de la Guyane Française, Cahiers
d’ORSTOM, Serie Biologie, 10, 1969.
OZBEN, T. Free Radical, Oxidative Stress and Antioxidants. Pathological and Physiologial
Significance, Plenum Press, New York, 1998.
PACHECO, L.; HAWKEN, P.; TALCOTT, S. Juice matrix composition and ascorbic acid
fortification effects on the phytochemical, antioxidant and pigment stability of açaí (Euterpe
oleracea Mart.). Food Chemistry, 105, 28 - 35, 2007.
PLANTAMED (http://www.plantamed.com.br/plantaservas/especies/Euterpe_oleracea.htm,)
acesso em: 14/06/2007.
RESENDE, F.O. Trichilia catigua: Avaliação Farmacognóstica, Fitoquímica e Biológica
in vitro. Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Maringá, Maringá, 2007.
ROCHA, A.P.M.; CARVALHO, L.C.R.M.; SOUSA, M.A.V.; MADEIRA, S.V.F.; SOUSA,
P.J.C.; TANO, T.; SCHINI-KERTH, V.B.; RESENDE, A.C.; SOARES DE MOURA, R.
Endothelium-dependent vasodilatador effect of Euterpe oleracea Mart. (Açai) extracts in
mesenteric vascular bed of the rat. Vascular Pharmacology, 46(2), 97 - 104, 2007.
RODRIGUES, R.B.; LICHTENTHALER, R.; ZIMMERMANN, B.F.;
PAPAGIANNOPOULOS, M.; FABRICIUS, H.; MARX, F.; MAIA, J.G.S.; ALMEIDA, O.
Total oxidant scavenging capacity of Euterpe oleracea Mart. (Açai) seeds and identification
of their polyphenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(12),
4162 - 4167, 2006.
ROGEZ, H. Açaí: Preparo composição e melhoramento da conservação. Belém EDUFPA,
51 - 53, 2000.
81
ROGEZ, H.; SILVA, E.M.; CASTRO, M.N.; LINS, K.J.C. Variações de composição do
açaí em função da origem do material genético dos açaizeiros (Euterpe oleracea Mart.).
In: Anais do 54º Congresso Nacional de Botânica – Desafios da Botânica Brasileira no Novo
Milênio: Inventário, Sistematização e Conservação da Diversidade Vegetal; Belém, 216 - 218,
2003.
SANTOS, G. Açaí (Euterpe oleracea): Aspectos químicos e farmacológicos. Dissertação
(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2001.
SCHAUSS, A.G.; WU, X.; PRIOR, R.L.; OU, B.; HUANG, D.; OWENS, J.; AGARWAL,
A.; JENSEN, G.S.; HART, A.N.; SHANBROM, E. Antioxidant Capacity and Other
Bioactivities of the Freeze-Dried Amazonian Palm Berry, Euterpe oleracea Mart. (Açaí).
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(22), 8604 - 8610, 2006a.
SCHAUSS, A.G.; WU, X.; PRIOR, R.L.; OU, B.; PATEL, D.; HUANG, D.N; KABABICK,
J.P. Phytochemical and Nutrient Composition of the Freeze-Dried Amazonian Palm Berry,
Euterpe oleracea Mart. (Acai). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(22), 8598
- 8603, 2006b.
SILVA, O. F. Estudo de Metodologias para a extração e Caracterização de Polifenóis de
Euterpe oleracea Mart.(Açaí), (Tese de Doutorado), Rio de Janeiro, UFRJ, 2007.
SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMAM, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.;
PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento – 3ªedição rev. -
Florianópolis, ed. Universidade/ UFRGS/ed. da UFSC, 2001, p.519.
SOUSA, C. M. M.; SILVA, H. R.; VIEIRA, G. M.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. L. S.;
ARAÚJO, D. S.; CAVLCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚJO, P. B. M.;
BRANDÃO, M. S.; CHAVES, M. H. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas
medicinais. Quimica Nova, 30(2), 351 - 355, 2007.
SUGIHARA, N.; ARAKAWA, T.; OHNISHI, M.; FURUNO, K. Free Radic. Biol. Med., 27,
1313, 1999.
YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B.; Plantas Medicinais sob a ótica da Química Medicinal
Moderna. Editora: Argos, UNOESC, Chapecó, 2001.
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