ads:
Anderson Martins Pilon
RESPOSTAS BIOQUÍMICA, FISIOLÓGICA E
COMPORTAMENTAL DE ANTICARSIA GEMMATALIS
(LAGARTA DA SOJA) AO INIBIDOR DE SERINO-
PROTEASES BENZAMIDINA
Tese apresentada à Universidade Federal
de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola para obtenção do
título de Doctor Scientiae.
Viçosa
Minas Gerais - Brasil
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
RESPOSTAS BIOQUÍMICA, FISIOLÓGICA E
COMPORTAMENTAL DE ANTICARSIA GEMMATALIS
(LAGARTA DA SOJA) AO INIBIDOR DE SERINO-
PROTEASES BENZAMIDINA
Tese apresentada à Universidade Federal
de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola para obtenção do
título de Doctor Scientiae .
APROVADA: 26 de fevereiro de 2008.
______________________________ _______________________________
Prof. Wellington Garcia Campos Prof . Joel Antônio de Oliveira
(Co-orientador)
______________________________ ______________________________
Prof. Claúdio Lisias Mafra de Siqueira Dr. Thiago Rennó dos Mares-Guia
_________________________________________
Prof
a
. Maria Goreti de Almeida Oliveira
(Orientadora)
Viçosa
Minas Gerais - Brasil
2008
ads:
A Deus.
À meus familiares.
À minha mãe Lúcia Martins Pilon.
À meu pai Odemar Pilon.
À minha irmã Franciny Martins Pilon.
4
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, pela oportunidade de realização do curso.
Ao Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), onde se
realizou o trabalho de tese.
À professora Maria Goreti de Almeida Oliveira, pela orientação, pela
presença, pelo estímulo e, acima de tudo, pela amizade que demonstrou no decorrer
do curso.
Ao CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro.
Ao professor Raul Narciso Guedes, pela co-orientação, pelas sugestões na
parte estatística e na discussão dos resultados.
Ao professor Joel Antônio de Oliveira, pela co-orientação e pelo auxílio na
discussão dos resultados.
Aos estudantes de Iniciação Científica Fabrício e Fernanda que muito me
ajudaram para a realização deste trabalho e pela amizade e convívio.
Aos meus companheiros e amigos de república, Ângelo e Marcos pelas
críticas e sugestões durante a realização deste trabalho.
Aos meus amigos Christiano, Fabrícia, Franciny, Jeanne, Ronnie, Rita,
Denise, Camila, Edson, Liliane, Raimundo, Regina, Rejane, Neizinho, Adercil, Pedro,
Arlindo, Eduardo, Gisele, Lilian, Angélica, Newton, Anderson, Márcio, Aloísio,
Gláucia, Márcia e José Fausto, pela amizade e agradável convivência.
Ao secretário Eduardo Pereira Monteiro do Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, pela atenção e amizade.
A todas as pessoas que, de algum modo, contribuíram para o êxito deste trabalho.
5
BIOGRAFIA
ANDERSON MARTINS PILON, filho de Lúcia Martins Pilon e Odemar Pilon,
nasceu em 20 de outubro de 1979, na cidade de Vitória, Estado do Espírito Santo.
Em maio de 2002, graduou-se no curso de Agronomia na Universidade
Federal de Viçosa.
Em fevereiro de 2004 obteve o título de Magister Scientiae em Bioquímica
Agrícola na UFV.
Em março de 2004, iniciou o curso de Doutorado em Bioquímica Agrícola na
UFV, submetendo-se à defesa de tese em 26 de fevereiro de 2008.
6
ÍNDICE
Abstract V
Resumo VII
1. Introdução geral 1
2. Revisão da literatura 5
2.1. Interação Planta-Inseto 5
2.2. Enzimas Digestivas dos Insetos 8
2.3. Proteases de insetos 10
2.4. Inibidores de proteases
13
2.5. Ação dos inibidores de proteases em insetos 15
2.6. Inibidores de proteases benzamidinas
17
2.7. A cultura da soja
17
2.8. Anticarsia gemmatalis (Hübner 1818) (Lepidoptera: Noctuidae) 18
3. Objetivos 21
3.1. Objetivo geral 21
3.2. Objetivos específicos
21
4. Materiais e Métodos 22
4.1. Criação da Lagarta da Soja (Anticarsia gemmatalis Hübner)
22
4.2. Preparo da Dieta Artificial 23
4.3. Ataque de lagarta da soja
24
4.4. Obtenção das mudas
24
4.5. Aplicação do inibidor nas plantas 25
4.6. Obtenção do extrato enzimático do intestino médio da lagarta 25
4.7. Determinação da Concentração de Proteína
26
7
4.8. Obtenção do extrato foliar
26
4.9. Determinação da Atividade Proteásica 26
4.10. Determinação da Atividade Amidásica Tripsina-like 27
4.11. Determinação da Atividade Esterásica de Tripsina-like 27
4.12. Determinação da Atividade cisteíno protease 27
4.13. Determinação de inibidores de proteases
28
4.14. Estudo da biologia de Anticarsia gemmatalis 29
4.15. Teste de preferência de lagartas a folhas com ou sem os inibidores
de proteases benzamidinas
29
4.16. Teste de preferência de pouso e oviposição em plantas com ou
sem os inibidores de proteases benzamidinas
30
4.17. Análises estatísticas
30
5. Resultados e discussão. 31
5.1. Efeito de pulverizações com benzamidina na preferência alimentar
de lagartas Anticarsia gemmatalis em plantas de soja.
31
5.2. Efeito de pulverizações com benzamidina na preferência de pouso
de mariposas de Anticarsia gemmatalis.
33
5.3. Efeito de pulverizações com benzamidina na preferência de
oviposição de mariposas de Anticarsia gemmatalis.
36
5.4. Efeito de diferentes concentrações de benzamidina pulverizadas em
plantas de soja no ganho de peso de Anticarsia gemmatalis.
38
5.5. Efeito de diferentes concentrações de benzamidina pulverizada em
plantas de soja na mortalidade de Anticarsia gemmatalis.
41
5.6. Determinação dos níveis de inibidores de proteases presentes nos
extratos foliares
43
5.7. Atividade proteásica do intestino médio de A. gemmatalis.
45
5.8. Atividade amidásica do intestino médio de A. gemmatalis. 49
5.9. Atividade esteárica do intestino médio de A. gemmatalis.
52
8
5.10. Atividade de cisteíno protease no intestino médio de A.
gemmatalis.
57
6. Conclusões 60
7. Referências Bibliográficas 61
9
Abstract
PILON, Anderson Martins, M.S., Universidade Federal de Viçosa (Federal University
of Viçosa), MG, BRAZIL. February, 2008. BIOCHEMICAL, PHYSIOLOGICAL AND
BEHAVIORAL RESPONSE OF ANTICARSIA GEMMATALIS WHEN SUBMITTED
TO TREATMENTS WITH PROTEASE INHIBITORS. Orienter: Maria Goreti de
Almeida Oliveira. Advisor: Raul Narciso Carvalho Guedes and Angelo Pallini .
The insects are responsible for great losses in Agriculture. In the attempt to control
them, new alternatives that are not based on agrochemicals have been searched. In
the coevolution involving plants and insects, the plants developed defense mechanisms
against the attack of insects. Amongst these mechanisms the production of protease
inhibitors is distinguished. It is postulated that, when a plant is attacked or wound, it
favors an increase in the levels of proteases inhibitors in the wounded region (local
response) and or all over the plant (systemic response). In this insect-plant
interaction, the insects can develop defense mechanisms against the protease
inhibitors produced by the plant. This possibility demands a closer study of the
behavior of the mid intestine proteolytic enzymes of the insects, starting from the
chronic ingestion of protease inhibitors at the moment of the attack to the plant. Many
investigations have been demonstrating the potential of proteases inhibitors in
compromising insect development. An important plague in the soy culture is the
lepidoptera Anticarsia gemmatalis (Hübner). In this context the present work was
based on verifying to the behavioral effects, in the post-embryonic development and
in the A.gemmatalis digestive proteases after the ingestion of the serine-proteases
inhibitor, benzamidine, sprayed on soy plants of the CAC-1 variety and its triple-null
genotype, in six different concentrations: 0.0, 0.15, 0.30, 0.45, 0.60 and 0.75%. The
benzamidine intervened in the behavioral response of Anticarsia gemmatalis larvae
and butterflies, which had preference for plants that had not been sprayed with
benzamidina. The post-embryonic development was also affected reducing the
weight gain and increasing the mortality. Anticarsia gemmatalis in situation of chronic
inhibitor ingestion presented adaptative responses like a hyperproduction of sensible
and/or insensitive to the trypsin-like proteases and the capacity to sintethise other
10
proteases as it is the case of cysteine proteases. Therefore, these data suggest that
the employment of protease inhibitors can be a promising strategy in the control of
Anticarsia gemmatalis in the soy culture.
11
Resumo
PILON, Anderson Martins, D.S., Universidade Federal de Viçosa, Fevereiro de 2008.
RESPOSTAS BIOQUÍMICA, FISIOLÓGICA E COMPORTAMENTAL DE
ANTICARSIA GEMMATALIS (LAGARTA DA SOJA) AO INIBIDOR DE SERINO-
PROTEASES BENZAMIDINA. Orientadora: Maria Goreti de Almeida Oliveira. Co-
orientadores: Raul Narciso Carvalho Guedes, Maurílio Alves Moreira, Joel Antônio
de Oliveira e Márcia Rogéria de Almeida Lamêgo.
Os insetos são responsáveis por grandes perdas na Agricultura. Na tentativa
de controlá-los, têm-se buscado novas alternativas que não sejam baseadas em
agroquímicos. Na coevolução entre plantas e insetos, as plantas desenvolveram
mecanismos de defesa contra o ataque de insetos. Dentre estes mecanismos,
destaca-se a produção de inibidores de protease. É postulado que, quando uma
planta é atacada ou ferida, ela propicia um aumento nos níveis de inibidores de
proteases na região ferida (resposta local) e ou em toda a planta (resposta
sistêmica). Nesta interação inseto-planta, os insetos podem desenvolver
mecanismos de defesa contra os inibidores de proteases produzidos pela planta.
Esta possibilidade demanda um conhecimento mais elaborado do comportamento
das enzimas proteolíticas do intestino médio dos insetos, a partir da ingestão crônica
de inibidores de protease no momento do ataque à planta. Muitas pesquisas vêm
demonstrando o potencial dos inibidores de proteases em comprometer o
desenvolvimento do inseto. Uma praga que se destaca na cultura da soja é o
lepidóptera, Anticarsia gemmatalis (Hübner). Neste contexto, o presente trabalho
fundamentou-se em verificar os efeitos comportamentais no desenvolvimento pós-
embrionário e nas proteases digestivas de A.gemmatalis quando ingeriram o inibidor
de serino-proteases benzamidina aplicado em plantas de soja da variedade CAC-1 e
seu genótipo triplo-nulo, em seis diferentes concentrações: 0,0; 0,15; 0,30; 0,45;
0,60; e 0,75%. A benzamidina interferiu na resposta comportamental de lagartas e
mariposas de Anticarsia gemmatalis, as quais tiveram preferência por plantas que
não receberam pulverizações com benzamidina. O desenvolvimento pós-
embrionário também foi afetado reduzindo o ganho de peso e aumentando a
mortalidade. Anticarsia gemmatalis em situação de ingestão de inibidores
12
apresentou respostas adaptativas como a capacidade de sintetizar cisteíno
proteases. Portanto, estes dados sugerem que a utilização de inibidores de protease
possa ser uma estratégia promissora no controle de Anticarsia gemmatalis na
cultura da soja.
13
1. Introdução geral
Estima-se que as perdas provocadas por pragas e doenças na agricultura
mundial atinjam 37% da produção, dos quais cerca de 10-20% sejam devidos aos
insetos (Silva-Filho e Falco, 2000; Ferry et al., 2006). Os insetos não apenas
provocam perdas na produtividade diretamente pelo ao ataque herbívoro, mas
também indiretamente por atuarem como vetores de vários patógenos de plantas
(Hilder e Boulter, 1999). Essas perdas ocorrem mesmo com o uso extensivo de
pesticidas e fungicidas e, na ausência de tais medidas de proteção, tais perdas
podem ser ainda maiores. Segundo Lawrence e Koundal (2002), as perdas
estimadas em culturas ao redor do mundo sem o uso de pesticidas ou outras
estratégias de controle não-químico atingem 70% da produção, representando um
prejuízo de 400 bilhões de dólares.
Embora atualmente os métodos de controle de pragas ainda se concentrem
basicamente na utilização de agroquímicos (Lawrence e Koundal, 2002), o alto custo
para o desenvolvimento de novos produtos cujas formulações devam se adequar às
pragas cada vez mais resistentes ao seu uso, as conseqüências ambientais
inaceitáveis, como a contaminação da cadeia alimentar e cursos de água, e a
própria pressão de consumidores contra essa prática têm provocado uma revolução
no controle de pragas na agricultura moderna.
A soja Glycine max (L.) Merril é um dos produtos agrícolas de maior
importância para o Brasil, ocupando lugar de destaque na pauta de exportação,
sendo plantada praticamente em todo território nacional. Ocupa extensas áreas nas
regiões sul e centro-oeste tendo posição de destaque no país como fonte de
proteína e de óleo vegetal, para consumo interno ou como gerador de divisas,
através das exportações. Os países maiores produtores de soja são também os
maiores exportadores, sendo o principal os Estados Unidos, seguidos pelo Brasil e
Argentina. No âmbito nacional a soja ocupa o segundo lugar entre os principais
produtos agrícolas, ocupando essa posição há vários anos (Embrapa, 2006). Dada a
sua importância econômica, os problemas ocasionados pelo ataque de pragas são
consideráveis face aos prejuízos que causam à produção e à qualidade dos grãos
ou sementes (Magrini et al., 1999).
14
O levantamento da safra 2006/2007 feito em janeiro de 2007 pela Conab
(Companhia Nacional de Abastecimento) prevê que a área cultivada com soja nesta
safra seja de 20,7 milhões de hectares, com uma produção de 54,87 milhões de
toneladas (Companhia Nacional de Abastecimento, 2007). A cultura da soja está
sujeita ao ataque de pragas durante todo o seu ciclo, e os insetos, principalmente na
fase larval, representam um importante prejuízo, pois afetam tanto a planta quanto a
semente, podendo reduzir substancialmente a qualidade de ambas, causando
perdas significativas da produção da cultura (Andrade et al., 2004).
Entre os insetos que trazem conseqüências econômicas mais significativas na
soja, destaca-se Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). É
conhecida como lagarta da soja, sendo um inseto desfolhador que começa a se
alimentar da epiderme inferior e do mesófilo da folha jovem. A partir do segundo
ínstar a lagarta já consegue se alimentar da folha inteira chegando a promover a
completa desfolhação da planta. Quando a folhagem é removida, ataca outras
partes da planta. O desfolhamento compromete o enchimento das vagens, com
conseqüente redução da produção de grãos. O ciclo de vida da lagarta da soja se
completa em cerca de quatro semanas durante o verão, tendo sua duração
aumentada no outono.
No combate à pragas agrícolas é crescente a busca por desenvolvimento de
compostos de menor custo, que sejam mais específicos e menos poluentes, como
os biopesticidas, além do uso cada vez mais freqüente de práticas de engenharia
genética, que permitem que genes de resistência de qualquer origem (planta,
animal, microrganismo, sintético) sejam utilizados nos programas de melhoramento
de plantas (Hilder e Boulter, 1999; Andrade et al. 2004). Em 2003 nos Estados
Unidos, a cultura de seis espécies de plantas, inclusive a soja, modificadas com um
único gene de resistência a insetos, resultou em uma produção adicional de 2,4
milhões de toneladas de alimentos e uma redução do uso de 21.000 toneladas de
pesticidas (Christou et al., 2006). Assim, a exploração de mecanismos de resistência
endógena das plantas ao ataque dos insetos herbívoros tem sido uma alternativa de
controle de pragas (Gatehouse, 2002; Ferry et al., 2004).
Para escapar do ataque de organismos fitopatogênicos e herbívoros, as
plantas desenvolveram variados e eficientes mecanismos de resistência, explorando
15
as diferenças fisiológicas e bioquímicas existentes entre elas e seus herbívoros.
Qualquer característica capaz de afetar a performance dos insetos, aumentando
aptidão darwiniana da planta em ambientes com herbívoros, pode ser considerada
uma defesa. Em geral, tais defesas são constitutivas, de ocorrência independente de
qualquer injúria e com sua intensidade variando no decorrer do processo de
maturação e envelhecimento fisiológico dos tecidos vegetais. Entre elas estão
incluídas proteínas com propriedades entomotóxicas, como as α-amilases, inibidores
de proteases, globulinas, lecitinas e quitinases (Mello e Silva-Filho, 2002; Pilon et al.,
2006), que normalmente estão presentes em sementes e órgãos vegetativos de
leguminosas (Sales et al., 2001; Franco et al., 2002).
Em nosso grupo de pesquisa constatamos que plantas de soja respondem ao
ataque de insetos através da Via das Lipoxigenases. Por esta via são ativados
genes que codificam para inibidores de proteases. Assim, plantas de soja atacadas
por insetos produzem aumento de inibidores de proteases (Silva et al. 2002, Silva et
al. 2004, Fortunato et al. 2007). A ingestão dos inibidores pelos insetos herbívoros
interfere no processo de degradação das proteínas no intestino médio sendo,
portanto, considerados agentes antimetabólicos por causarem deficiência protéica
nos insetos. Os seus efeitos são atribuídos à sua interferência direta na digestão
protéica, diminuindo a biodisponibilidade de aminoácidos, prejudicando a síntese de
proteínas necessárias ao crescimento, desenvolvimento e reprodução dos insetos.
Há ainda outra hipótese de que os inibidores afetem o desenvolvimento de forma
indireta, através de um mecanismo de “feedback”, que levaria a uma hiperprodução
de proteases digestivas para compensar os baixos níveis de aminoácidos
biodisponíveis, deslocando aminoácidos para a síntese de mais proteases em
detrimento de outras proteínas essenciais (Oliveira et al. 2005; Pilon et al. 2006 ).
Os inibidores de proteases apresentam grande potencial por reduzirem ou
impedirem a atividade das enzimas digestivas dos insetos, causando-lhes
desnutrição e redução do desenvolvimento, podendo chegar até à morte (Oliveira et
al. 2005, Pilon et al, 2006, Moreira 2007). Entretanto, no caso de genes de
inibidores, para que isto ocorra é necessário que estes inibidores sejam
selecionados levando-se em consideração a fisiologia do inseto e a bioquímica de
sua digestão (Franco et al., 2002, Oliveira et al. 2005, Xavier et al. 2005).
16
Neste contexto, buscamos compreender melhor o mecanismo de interação
entre a lagarta da soja [A. gemmatalis (Hübner)] e a planta da soja [Glicine max (L.)
Merrill] realizando um estudo bioquímico fisiológico e comportamental de
A.gemmatalis que ingeriram o inibidor de serino-proteases benzamidina aplicado em
plantas de soja da variedade CAC-1 e seu genótipo triplo-nulo, em seis diferentes
concentrações: 0.0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 %. buscando uma melhor
compreensão da bioquímica e fisiologia do inseto durante a interação planta-inseto.
17
2. Revisão da literatura
2.1. Interação Planta-Inseto
As plantas e os insetos nos ecossistemas naturais estão continuamente
interagindo de forma complexa. Os insetos propiciam às plantas atividades
benéficas como a polinização e defesa, já as plantas podem prover aos insetos
abrigo, local para ovoposição e alimentação, demostrando uma estreita relação
associativa entre esses organismos. Em contrapartida existem insetos que atacam
as plantas e, dependendo da intensidade de herbivoria, podem ser extremamente
prejudiciais podendo levar até mesmo à morte destas (Panda e Khush, 1995).
Na coevolução das plantas e dos insetos, as plantas evoluíram com
desenvolvimento de diferentes mecanismos de defesa contra o ataque dos insetos,
como barreiras físicas e defesas químicas, além de complexas vias de sinalização
(Falco et al., 2001). Existem diferentes mecanismos de defesa química destacando-
se a síntese de proteínas (Haruta et al., 2001), a liberação para o ambiente de
compostos voláteis objetivando a atração de predadores dos insetos herbívoros
(Birkett et al., 2000), a síntese de metabólitos secundários (Baldwin, 2001;
Kliebenstein, 2001) e o aumento de tricomas na epiderme de folhas e caule (Fordyce
e Agrawal, 2001) (Figura I).
Em resposta aos mecanismos de defesa das plantas, os insetos
desenvolveram estratégias para contornar as barreiras impostas pelas plantas, em
se incluem a metabolização e seqüestro de compostos tóxicos (Scott e Wen, 2001;
Nishida, 2002), mecanismos de fuga (Zangerl, 1990) e alteração nos padrões de
expressão gênica (Silva et al, 2001) (figura I)
18
Figura I – Interações entre plantas e insetos
Fonte: Mello & Silva-Filho, 2002.
As proteínas de defesa demonstram ser uma excelente estratégia de controle.
Estas podem ser produzidas constitutivamente em tecidos que são particularmente
vulneráveis ao ataque de insetos, tais como sementes e folhas, ou podem ser
induzidos por danos mecânicos, como ocorre quando um inseto se alimenta de uma
folha (Jouanin et al, 1998). Entretanto, muitas destas proteínas também são tóxicas
aos mamíferos, o que indica que devam ser cautelosamente estudadas para o uso
como mecanismo de proteção de plantas contra insetos (Silva-Filho & Falco, 2000).
Entre essas proteínas estão incluídas enzimas como quitinases, lectinas e inibidores
de protease (Ryan, 1990, Silva et al., 2002).
Os inibidores de proteases são naturalmente produzidos pelas plantas e estão
intimamente relacionados ao mecanismo de defesa delas à herbivoria. Seus níveis
em folhas são extremamente baixos e podem ser rapidamente elevados quando a
planta é mecanicamente danificada pelo inseto ou mediante a liberação de elicitores
(Rakwal et al., 2001). Além da resposta local verifica-se que sinais específicos
originários dos tecidos danificados são transportados via floema, acarretando
19
aumento nos níveis de inibidores de proteases por toda a planta, caracterizando esta
resposta como sistêmica (Jongsma e Bolter, 1997). Os inibidores de proteases de
planta funcionam como substratos específicos das proteases digestivas dos insetos,
formando um complexo estável no qual a proteólise é limitada e extremamente lenta
(Tiffin e Gaut, 2001).
Enfim, a ingestão crônica de inibidores de protease pelo inseto acarreta uma
deficiência em aminoácidos essenciais, a qual influencia no seu crescimento e
desenvolvimento, podendo eventualmente ocasionar sua morte pela inibição das
proteases digestivas ou por uma hiperprodução destas enzimas, reduzindo a
disponibilidade de aminoácidos essenciais para a síntese de outras proteínas
(Jongsma e Bolter, 1997; Pompermayer et al., 2001). Assim, a ingestão de inibidores
de proteases, prolongando o desenvolvimento dos insetos herbívoros, também o faz
com o período de tempo em que os inimigos naturais (predadores) podem ser
atraídos para a planta atacada através de compostos voláteis liberados por ela,
promovendo dessa maneira o controle da praga (Baldwin, 2001).
Na evolução das plantas e dos insetos, os insetos herbívoros parecem ter
desenvolvido estratégias de contraposição às defesas de plantas, uma vez que
alguns se alimentam de uma larga variedade de espécies de plantas (polífagos),
podendo ser seletivos ou utilizar partes mais desejáveis, restringido deste modo os
compostos tóxicos produzidos pelas plantas. Outros restringem sua alimentação a
uma ou poucas espécies de plantas (insetos monófagos) e evoluíram sistemas
enzimáticos que podem desintoxicar tecidos (Ruppert e Barnes, 1996). Com os
inibidores de proteases produzidos pelas plantas não é diferente. Quando a planta
produz um inibidor que atua sobre uma enzima de uma determinada classe de
proteases, o inseto produz proteases de classes diferentes que poderão degradar
inclusive o inibidor protéico produzido por esta planta e desta forma impede a sua
ação prejudicial (Silva-Filho & Falco, 2000).
Em uma visão global verificamos que, na evolução de insetos e plantas, estes
desenvolveram mecanismos ecológicos, bioquímicos e fisiológicos de contornar os
efeitos negativos da interação inseto-planta. Após a ingestão de inibidores de
proteases que poderiam causar impactos negativos no seu desenvolvimento, os
20
insetos contornam a situação, mediante aumento da atividade das enzimas no trato
digestivo ou síntese de enzimas não sensíveis ao inibidor (Paulillo et al., 2000; Zhu-
Salzman 2003). Além disso, os insetos podem também resistir à ação dos inibidores
de protease através da modificação do espectro ou atividade relativa de várias
hidrolases digestivas (Patankar et al., 2001), a hidrólise de inibidores protéicos
através de proteases insensíveis (Girard et al., 1998) e da diminuição da
sensibilidade das enzimas aos inibidores através da formação de oligomêros de alto
peso molecular insensíveis aos inibidores (Brito et al., 2001).
As plantas desenvolveram também estratégias muito eficientes de defesa
contra as proteases dos insetos como o aumento da síntese de inibidores nos
tecidos (Rakwal et al., 2001), assim como um aumento na síntese de uma gama de
inibidores que possuem atividade contra várias proteases (Christeller et al., 1998).
Desenvolveram também a produção de inibidores bifuncionais que atuam contra
amilases e proteinases (Roy e Gupta, 2000), o aumento da complexidade dos
inibidores com propriedades bioquímicas diferentes por meio da produção de
isoinibidores (Tiffin e Gaut, 2001) e a expressão de inibidores específicos para as
enzimas do trato digestivo dos insetos (Falco et al., 2001) .
2.2. Enzimas Digestivas dos Insetos
Insetos são excelentes modelos para o estudo da função intestinal
principalmente porque existem espécies adaptadas a quase todos os tipos de habitat
e de hábitos alimentares diversos. Além disso, o intestino é a maior interface entre o
inseto e o ambiente. Portanto, é essencial o entendimento do processo digestivo
para o desenvolvimento de métodos de controle biológico, como é o caso do uso de
plantas transgênicas no controle de insetos fitófagos. A ocorrência de diferentes
enzimas digestivas no canal digestivo de insetos deve-se, principalmente, à
composição química da dieta ingerida. É possível que todos os insetos tenham
enzimas digestivas complementares àquelas utilizadas primariamente, em
quantidades relativas que mudam em resposta à composição da dieta (Terra e
Ferreira, 1994).
21
Para crescerem, se desenvolverem e se reproduzirem os insetos requerem os
mesmos aminoácidos essenciais aos mamíferos. Esses aminoácidos essenciais
devem ser obtidos de uma dieta protéica e para isso os insetos aparentemente
alimentam-se de todos os compostos orgânicos, de madeira a folhas, flores, raízes,
tubérculos, néctar, sementes, animais vivos, restos de outros organismos, sangue e
de outros insetos, fungos e bactérias (Murdock e Shade, 2002; Fortunato et al.,
2007). Essa plasticidade teria sido conferida pela diversidade de enzimas digestivas
presentes no intestino médio dos insetos que conferem as habilidades de consumir e
utilizar com eficiência os recursos alimentares de que dispõem justificando o “status”
de pragas de cultivos agrícolas e alimentos armazenados que muitos insetos
possuem (Terra et al., 1996).
As proteases digestivas catalisam a produção de peptídeos e aminoácidos de
uma dieta protéica e são encontradas na região do intestino médio do trato digestivo
dos insetos. As peptidases – (peptídeo hidrolases, EC 3.4) agem em ligações
peptídicas. Neste grupo estão incluídas as proteases (endopeptidases, EC 3.4.21-
24) e exopeptidases (EC 3.4.11-19). As proteases são divididas em quatro
subclasses, de acordo com o seu mecanismo catalítico: serino proteases, cisteíno
proteases, aspártico proteases e metalo proteases.
A organização do processo digestivo depende da compartimentalização das
enzimas digestivas e do fluxo do intestino médio que são responsáveis pela
translocação das enzimas e produtos da digestão. Segundo Terra et al. (1996b) a
digestão de polímeros dos alimentos (proteínas, amido, celulose e hemicelulose) no
intestino dos insetos acontece em três fases:
▪ inicial – nesta fase ocorre a diminuição da massa molecular dos
polímeros através da ação de hidrolases como tripsina, α-amilase, celulase e
hemicelulase;
▪ intermediária – os oligômeros resultantes da primeira fase são
hidrolisados em dímeros ou em dipeptídeos por hidrolases tais como a α-amilase e
aminopeptidase;
▪ final – ocorre a digestão final dos dímeros que são transformados em
monômeros por hidrolases tais como dipepetidases, maltase e celobiase.
22
Estes mesmos autores propõem que a digestão inicial ocorra no espaço
endoperitrófico, a digestão intermediária e a final ocorre no espaço ectoperitrófico e
células do intestino médio, respectivamente.
As enzimas atravessam a membrana peritrófica e chegam ao espaço
ectoperitrófico acompanhando os alimentos à medida que são fracionados. Depois,
voltam para o interior da membrana peritrófica, na porção inicial do intestino médio.
A água passa pelo espaço ectoperitrófico até chegar aos cecos, nos quais é
absorvida (Terra et al, 2000).
O intestino médio das Lepidópteras é alvo de vários estudos relacionados ao
processo de digestão, mecanismo secretor de enzimas, caracterização de proteases
digestivas, absorção e movimento de íons, já que várias espécies desta ordem são
insetos de grande interesse econômico, pois atacam variedades comerciais como
cereais, algodão, leguminosas entre outros. Santos e colaboradores em 1986
demonstraram que não existe digestão no intestino anterior em larvas de Erinnyis
ello (Lepidoptera: Sphingidae).
Em Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) foram encontrados
resultados similares. Dados obtidos com larvas Manduca sexta (Sphingidae)
mostraram que a atividade da tripsina é recuperada no lúmen do intestino médio
anterior, sendo que a maioria do mRNA para tripsina é encontrada na porção
mediana do intestino médio. Estes resultados levaram à proposição, por estes
autores, de que esta enzima é secretada por células da porção mediana do intestino
médio e carreada pelo espaço ectoperitrófico para o intestino médio anterior. Esta
organização espacial do processo digestivo é provavelmente comparável na maioria
das larvas, parecendo também ser similar em Lepidópteras adultas (Ferreira et al,
1994 citados por Terra et al, 1996 a e b).
2.3. Proteases de insetos
As proteases digestivas de insetos catalisam a produção de peptídeos e
aminoácidos de uma dieta protéica e são encontradas na região do intestino médio
do trato digestivo dos insetos. As serino-proteases são as enzimas mais estudadas,
sendo seus representantes mais conhecidos a tripsina e a quimiotripsina. As serino
proteases participam de uma grande diversidade de processos fisiológicos que
23
incluem, além da digestão, ativação de proteínas específicas como nas cascatas de
coagulação no sistema imune de insetos e plantas (Wilson et al., 1997) e no
desenvolvimento e produção de peptídeos biologicamente ativos (Gill et al., 1996).
Dentro do grupo das serino proteases, tripsinas e quimiotripsinas são as
enzimas mais encontradas. As tripsinas clivam, preferencialmente, as cadeias
protéicas no lado carboxila dos aminoácidos básicos, como arginina e lisina. São
inibidas por TLCK, que age sobre a histidina do centro ativo da enzima(Shaw e
Mares-Guia, 1965). O valor da massa molecular da tripsina varia entre 20 e 35 KDa
e seu valor de pI está entre 4-5. Seu pH ótimo de atividade é alcalino, entre 8 e 9
(Terra et al., 1994). Contudo as tripsinas isoladas de Lepidópteras possuem um pH
ótimo maior do que os valores de pH encontrados em intestinos médios de outros
insetos (Lemos et al., 1992).
As atividades de enzimas tripsina-like são amplamente estudadas em várias
espécies de Lepidópteras e diversas ordens como Coleóptera, Auchenorrhyncha,
Blattodea e Díptera (Muharsini et al., 2001; Foissac et al., 2002; Wagner et al., 2002;
Lopes & Terra, 2003, Oliveira et al., 2005; Xavier et al., 2005). Algumas de suas
propriedades assemelham-se às das tripsinas de vertebrados. No entanto,
determinadas características da tripsina de insetos contrastam com as tripsinas de
vertebrados, como pH ótimo de atividade, peso molecular, sensibilidade a íon, ponto
isoelétrico e sensibilidade aos inibidores de proteases da planta. Foi verificado que
as tripsinas de insetos não são ativadas ou estabilizadas por íons cálcio e são
instáveis em pH ácido (Sakal et al., 1988). O efeito de íons cálcio foi avaliado na
atividade de uma protease presente no intestino médio de A. gemmatalis, onde foi
observado um aumento de atividade na presença de 10 - 30 mM de CaCl
2
(Oliveira
et al., 2005). Em vertebrados, o íon cálcio impede a agregação de moléculas da
enzima protegendo-a da autólise e desnaturação por calor, induzindo uma mudança
conformacional em sua estrutura para uma forma mais compacta, a qual é
necessária para a atividade catalítica (Sipos & Merkel, 1970).
Estudos realizados em larvas de Spodoptera littoralis (Lepidoptera:
Noctuidae) e em Melolontha melolontha (Coleoptera: Scarabaeidae) sobre o efeito
de íons cálcio na atividade de tripsina em presença de EGTA e/ou EDTA, quelantes
de cálcio demonstraram que esta enzima sofreu pequena queda em sua atividade
24
(5%). Esse resultado sugere que o cálcio talvez possa ter uma função na enzima
desses insetos, provavelmente, como co-fator (Lee et al., 1995; Wagner et al.,
2002).
Oliveira et al. (2005) purificaram parcialmente a enzima tripsina-like de A.
gemmatalis. A fração parcialmente purificada mostrou três bandas com atividade
proteolítica e pesos moleculares de 66,000, 71,000 e 91,000 em gel SDS-PAGE.
Ensaios de especificidade enzimática, usando sete peptídeos sintéticos contendo 13
resíduos de aminoácidos diferenciando somente no 5º resíduo foram realizados,
tendo tripsina e quimotripsina como controle. Somente os peptídeos contendo os
aminoácidos lisina e arginina (específicos para tripsina) foram clivados por ambas,
tripsina e enzima parcialmente purificada. Esses resultados demonstraram que o
intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease tripsina-like.
Xavier et al. (2005) identificaram e caracterizaram proteases ligadas à
membrana presentes no intestino médio de A. gemmatalis. Seus resultados
demonstraram que o extrato enzimático insolúvel foi capaz de hidrolisar a caseína, e
o substratos sintéticos L-BApNA e L-TAME. Usando L-BApNA como substrato, a
atividade foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim,
EDTA, PMSF, TLCK, benzamidinas e aprotinina, foram todos capazes de inibir a
atividade, com maior inibição observada com TLCK e benzamidinas. De acordo com
estes resultados, concluiu-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis
possui tripsina-like ligada à membrana. Com o propósito de caracterizar melhor a
atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para o extrato insolúvel. O
pH ótimo usando L-BApNA e L-TAME foi 8,5 e 8,0, respectivamente e a temperatura
ótima foi de 50
o
C para ambos substratos. O efeito de cálcio na atividade foi
investigado usando L-BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na
concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K
Mapp
para L-BApNA e L-TAME foram
de 0.23 mM e 95,4 mM, respectivamente.
Múltiplas isoenzimas de tripsinas têm sido reconhecidas e o seqüenciamento
da multifamília de genes codificadores de tripsinas de insetos tem recebido recente
foco de atenção (Mazumdar-Leigton et al., 2000; Mazumdar-Leigton et al., 2001; DE
Leo et al., 2001). As proteases induzidas explicam o desenvolvimento da resistência
do inseto aos inibidores de proteases presentes em plantas nativas ou transgênicas
25
(Jogsma et al., 1995; Broadway, 1995, 1996; Brown et al., 1997; Brito et al., 2001).
Cisteíno-proteases são enzimas proteolíticas que agem via ataque
nucleofílico do ânion sulfeto, no sítio ativo, à ligação peptídica (Kunakbaeva et al.,
2003). O sítio ativo de uma cisteíno protease é composto por um resíduo de cisteína,
de asparagina e de histidina na tríade catalítica. O ataque nucleofílico do grupo tiol
da cisteína ao carbono da carbonila do substrato resulta num intermediário
tetraédrico. Uma ligação covalente acil-enzima é formada após a clivagem da
ligação peptídica. A hidrólise da acil-enzima leva à regeneração da enzima livre
(Baird et al., 2006).
2.4. Inibidores de proteases
A resistência de planta pode incluir a síntese de antibióticos, alcalóides e
terpenos (Franco et al., 1999), sendo que os mais importantes componentes dos
mecanismos de proteção são compostos proteináceos, os quais incluem enzimas,
como -1,3-glucanases e quitinases, lecitinas, polifenóis oxidases (PPO’s), inibidores
de proteases (IP’s) e -amilases (Valueva e Mosolov, 2004). As proteínas em
resposta à injúria podem ter um papel direto ou indireto (i) na limitação do dano
induzido pelo ataque de insetos; (ii) no extermínio de patógenos oportunistas que
invadem os locais injuriados e (iii) no desenvolvimento da resistência induzida que
protege a planta de subseqüentes ataques de pestes e patógenos (Walling, 2000;
Silva et al., 2002, 2004; Monteiro et al., 2004; Ferreira et al., 2004, 2005).
As -amilases são endoamilases responsáveis por catalisar a hidrólise das
ligações glicosídicas -1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos e sua inibição
impede o desenvolvimento e crescimento de muitos insetos (Franco et al., 1999). Os
mecanismos de ação desses inibidores ainda não foram totalmente desvendados,
mas sabe-se que sua ação depende tanto do tempo quanto do pH. Coleópteros
apresentam pH intestinal ácido, enquanto em lepidópteros, o pH é alcalino. Nesse
sentido, os complexos formados por uma das isoformas dos inibidores de -
amilases só são ativos dentro de uma faixa estreita de pH, atuando em
determinados herbívoros (Franco et al., 1999).
26
As proteases podem ser classificadas em quatro grandes classes: serínicas,
cisteínicas, aspárticas e metalo-proteases com base em comparações de seus sítios
ativos, mecanismos de ação e estrutura tridimensional (Mares-Guia e Shaw, 1965;
Franco et al., 1999). Os inibidores dessas enzimas são classificados como
endopeptidases quando hidrolisam ligações internas e exopeptidades quando
hidrolisam ligações N ou C-terminais e sua variedade é muito grande (Mares-Guia e
Shaw, 1965).
Os Inibidores de protease foram caracterizados como proteínas defensivas e
tiveram seu papel reconhecido na defesa de plantas quando se observou que larvas
de certos insetos eram incapazes de se desenvolver normalmente em soja (Haq et
al., 2004), embora dispusessem de grande quantidade de alimento. Suas
concentrações nos tecidos vegetais são controladas na sua síntese. Em geral, são
encontrados em plantas das famílias Brassicaceae, Curcubitaceae, Fabaceae,
Salicicaceae, Glycinaceae, Leguminosae e Solanaceae (Karban e Baldwin, 1997).
A maioria desses inibidores são moléculas pequenas, estáveis e fáceis de
purificar e são encontrados nos órgãos reprodutivos, de reserva e vegetativos das
plantas. A soja crua contém cerca de 6 % de inibidores que atuam sobre as
proteases ao nível do trato gastrintestinal do inseto, indisponibilizando o
fornecimento de aminoácidos para o organismo (Whitaker, 1994).
Os inibidores de proteases de soja são constituídos pelo Inibidor de Tripsina
Kunitz (KTI) e pelo inibidor de tripsina e quimotripsina Bowman-Birk (BBI). Cerca de
80% da inibição da atividade tríptica de grãos de soja é causada pela ação do KTI.
Estes antinutrientes apresentam especificidade de inibir as enzimas proteolíticas e,
conseqüentemente, reduzem a digestão protéica de alimentos, proporcionando
diminuição no ganho de peso e crescimento dos animais. Desta forma, para
aumentar o valor nutricional da soja e seus produtos, há necessidade de
processamentos térmicos para inativá-los (Miura et al, 2001). O inibidore de soja
Bowman Birk (BBI) tem massa molecular em torno de 8 kDa e o Kunitz (KTI) tem
massa em torno de 21 kDa (Xavier-Filho e Campos, 1989).
Em tecidos de planta mais vulneráveis ao ataque do herbívoro, essas defesas
são constitutivas, como, nas sementes em que também podem ser utilizados como
proteínas de reserva. Podem também ser induzidos, por danos mecânicos, por
27
exemplo, quando o inseto se alimenta em uma folha (Silva-Filho e Falco, 2000).Os
inibidores de protease estão presentes nos órgãos reprodutivos, de reserva e
vegetativos das plantas e são regulados nesses tecidos durante o desenvolvimento
ontogenético da planta ou por variáveis ambientais (intensidade da luz ou
concentração de CO
2
) (Broadway e Missurelli, 1990).
Os mais altos níveis de IP’s foram encontrados em folhas jovens de plantas
efêmeras (Silva et al., 2002; Haq et al., 2004; Ferreira et al., 2005) ou em folhas
jovens de plantas maduras (Broadway e Missurelli, 1990), o que demonstra o maior
investimento da planta para defender suas partes mais nutritivas e,
conseqüentemente, mais expostas à herbivoria. Seu acumulo pode ser local ou
distal ao local do dano, podendo atingir concentrações de 200 g/g. Cerca de 3 a 4 h
após a injúria, os níveis de mRNA que atuam na tradução dos IP’s elevam-se e se
mantêm ativos por até 8h, com suas concentrações apresentando uma meia vida de
até 12 h. Após a tradução pelo mRNA, os inibidores de proteases são acumulados
no vacúolo central das células vegetais, persistindo por até 1 semana (Karban e
Baldwin, 1997).
Localmente, os IP’s são ativos contra nematóides, vírus, bactérias e
patógenos fúngicos (Haq et al., 2004), podendo ter um efeito cumulativo em plantas.
Para nematóides, plantas de Arabidopsis thaliana modificada com genes PI
(cistatina Oc-I delta D86) de uma variedade de arroz promoveram a perda da
atividade intestinal da proteinase cisteína, enquanto em outra espécie de
nematóides as fêmeas não alcançaram o tamanho mínimo requerido para a
produção de ovos (Haq et al., 2004).
2.5. Ação dos inibidores de proteases em insetos
Insetos fitófagos apresentam serino e cisteíno-proteases como principais
enzimas digestivas (Haq et al., 2004) sendo que, em afídeos, as proteases
presentes no trato digestivo são cisteínicas. Nesses insetos, a atividade dos IP’s não
é significativa porque sua dieta é à base de nitrogênio e com baixa quantidade de
proteína. Em coleópteros, há uma ampla faixa de proteases intestinais e em
lepidópteras as proteases serínicas são as mais comuns. Entre as proteases
28
serínicas, as tripsinas e quimiotripsinas são as enzimas mais comumente
encontradas (Oliveira et al., 2005).
O modo de ação dos IP’s consiste em formar os complexos proteína-proteína
com essas enzimas, resultando na sua inativação (Mosolov et al., 2001). A inibição
de uma enzima proteolítica é competitiva e ocorre pela ligação do sítio ativo da
enzima (substrato) à região reativa do inibidor (sítio reativo) no intestino médio do
inseto (Silva-Filho e Falco, 2000). Esses IP’s são altamente específicos, limitando a
proteólise do substrato às suas enzimas cognatas (Karban e Baldwin, 1997).
A formação do complexo enzima-inibidor ocorre rapidamente, mas sua
dissociação é lenta e resulta na enzima livre e em um inibidor clivado, que sofre
desnaturação (Franco et al., 1999). As interações entre enzima e inibidor ocorrem
por interações do tipo forças de van der Waals, ligações de hidrogênio e pontes
dissulfeto, envolvendo ainda a formação de uma ligação peptídica (Oliveira et al.,
1993; Franco et al., 1999).
Os inibidores de proteases são considerados agentes antimetabólicos
levando a uma deficiência protéica nos insetos. Sua atividade antibiótica é atribuída
à interferência na digestão protéica que diminui a disponibilidade de aminoácidos
prejudicando a síntese de proteínas necessárias ao crescimento, desenvolvimento e
reprodução (Oliveira et al., 1993; Silva-Filho e Falco, 2000; Xavier et al., 2005;
Oliveira et al., 2005). No entanto, esse processo pode ser mais elaborado. Um
mecanismo de feedback leva o inseto à hiperprodução de proteases para
compensar a perda de atividade de suas enzimas digestivas (Silva-Filho e Falco,
2000; Oliveira et al., 2005). Esse processo promove depleção dos aminoácidos
essenciais ao metabolismo do inseto, resultando no retardo do seu crescimento
(Oliveira et al., 2005). Nos casos em que a enzima também está envolvida em
processos como o de muda e na síntese de neuropeptídeos, os inibidores
perturbariam essa atividade, retardando o crescimento e o desenvolvimento da larva
(Karban e Baldwin, 1997).
2.6. Inibidores de proteases benzamidinas
29
A benzamidina é uma amida aromática, inibidor sintético competitivo da
tripsina, apresentando Ki de 1,0 mM (Mares-Guia et al., 1981). A benzamidina,
quando presente no meio reacional em baixas concentrações, posiciona-se no sítio
de especificidade, sítio S1, da tripsina onde é estabilizada por interações
hidrofóbicas no bolso hidrofóbico e por interações eletrostáticas entre seu
grupamento amidina e um resíduo carboxílico pertencente a um ácido aspártico
localizado no fundo do bolso do sítio S1 (Mares-Guia e Shaw, 1965; Mares-Guia et
al., 1981, Oliveira et al., 1993). A bis-benzamidina apresenta uma ligação diazo-
amino entre dois anéis benzamidínicos e comporta-se como um inibidor competitivo
parabólico da tripsina (Junqueira et al., 1992; Oliveira et al., 1993).
2.7 A cultura da soja
A soja Glycine max (L.) Merril é originária de clima temperado, tendo-se
adaptado bem aos climas subtropicais e tropicais. No Brasil, ocupa extensas áreas
nas regiões sul e centro-oeste tendo posição de destaque no país como fonte de
proteína e de óleo vegetal para consumo interno ou como gerador de divisas,
através das exportações. Os países maiores produtores de soja são também os
maiores exportadores, sendo o principal os Estados Unidos, seguidos pelo Brasil e
Argentina. No âmbito nacional a soja ocupa o segundo lugar entre os principais
produtos agrícolas, ocupando essa posição há vários anos (Embrapa, 2006). Dada a
sua importância econômica, os problemas ocasionados pelo ataque de pragas são
consideráveis face aos prejuízos que causam à produção e à qualidade dos grãos
ou sementes (Magrini et al., 1999).
A cultura da soja praticamente encontra-se sujeita ao ataque de insetos
durante todo o seu ciclo. Logo após a emergência, insetos como a lagarta rosca
Agrotis ipsilon (Hüfnagel) (Lepidoptera: Noctuidae), os percevejos castanhos
Scaptocoris castanea (Perty) (Hemiptera: Cydnidae) e Atarsocoris brachiariae
(Becker) (Hemiptera: Cydnidae), os córos e a broca-do-colo Elasmopalpus
lignosellus (Zeller) (Lepidoptera: Pyralidae) podem atacar as plântulas.
Posteriormente, a lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera:
Noctuidae), a lagarta falsa-medideira Chrysodeixis (Pseudoplusia) includens
30
(Walker) (Lepidoptera: Noctuidae) e a broca-das-axilas Epinotia aporema
(Walsinhgan) (Lepidoptera: Tortricidae) atacam as plantas durante a fase vegetativa
e, em alguns casos, até durante a floração. No início da fase reprodutiva, é comum o
ataque de percevejos Nezara viridula (Linnaeus) (Hemiptera: Pentatomidae),
Piezodorus guildinii (Westwood) (Lepidoptera: Pentatomidae) e Euschistus heros
(Fabricius) (Hemíptera: Pentatomidae), que causam danos desde a formação das
vagens até o desenvolvimento final das sementes. Além destas, a soja pode ser
atacada por outras espécies de insetos, em geral menos importantes do que as
referidas anteriormente (Embrapa, 2006). Nesse sentido, o uso de cultivares
resistentes às pragas é uma das soluções mais viáveis para tentar diminuir o
impacto de herbívoros.
2.8. Anticarsia gemmatalis (Hübner 1818) (Lepidoptera: Noctuidae)
A lagarta A. gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das maiores
pragas da soja (Glycine max). Ela consome a folha iniciando seu ataque pela
epiderme inferior e mesófilo e, após o segundo ínstar, a lagarta da soja consome a
folha inteira. A lagarta alimenta-se inicialmente da metade superior ou do terço
superior de plantas de soja, podendo passar às folhas inferiores e, a seguir, para
tecidos terminais dos caules. Sob altas infestações, ela pode também se alimentar
das ramas e vagens pequenas (Roberts e Guillebeau, 1999). É considerada
primariamente uma praga das leguminosas, embora tenham sido registrados surtos
em algodoeiro (Hinds e Osterberge, 1931), arroz (Tarragó et al., 1977) e pastagens
(Wille, 1943).
A lagarta da soja é uma praga desfolhadora bastante problemática em culturas
brasileiras. Mesmo em baixas densidades populacionais, este inseto causa grandes
danos à lavoura de soja, que vão desde o desfolhamento até a destruição completa
da planta. É um inseto mastigador que se alimenta de folhas jovens. Quando a
folhagem é removida, ela ataca outras partes da planta. O desfolhamento compromete
o enchimento das vagens, com conseqüente redução da produção de grãos
(Embrapa, 2001).
31
Apesar de a soja ser um dos principais hospedeiros primários da A. gemmatalis,
sua larva é capaz de se alimentar de muitas outras espécies incluindo amendoim,
kudzu (Pueraria thunbergiana), feijão de cavalo (Cannavalia sp), algodão, ervilha,
erva daninha do café e, folhas de trevo entre outras (Waters e Barfield 1989). A
lagarta da soja é nativa das áreas tropicais e subtropicais do hemisfério ocidental
sendo uma habitante permanente da América tropical.
O ciclo de vida da lagarta da soja se completa em cerca de quatro semanas
durante o verão, sendo de maior duração no outono. O número de gerações
depende da dispersão e a chegada dos adultos. Os ovos são brancos, ligeiramente
ovais e com tamanho entre 1 mm a 2 mm de diâmetro e aplainado em sua superfície
de baixo. O ovo possui suportes proeminentes, sendo branco só até antes de
chocar, quando se torna rosa. Os ovos são postos separadamente do lado abaxial
da folha, entretanto quando se tem alta infestação podemos encontrar ovos também
na superfície adaxial das folhas, nos pecíolos e até mesmo no caule (WATSON,
1916).
Larvas recém chocadas se alimentam da casca do ovo do qual irão, emergir
deixando somente a porção presa à folha. Existem normalmente seis ínstares no
estágio larval da lagarta da soja. As larvas variam extremamente em coloração e
marcas durante os ínstares. A maioria das lagartas possui uma linha negra
longitudinal e linhas brancas estreitas, amarelas ou rosas. A larva gasta cerca de
dois dias no primeiro instar e cresce de 2,5 mm a 6 ou 7 mm antes da muda. A
cabeça é marrom clara, arredondada e bilobada. O corpo da lagarta no primeiro
instar é uniformemente verde-claro sem nenhuma faixa longitudinal. As pseudopatas
do segmento abdominal 3 e 4 são menores do que as dos segmentos 5 e 6. No
segundo instar, a borda negra da linha lateral aparece e o primeiro par de
pseudopatas abdominais está cerca de um quarto maior do que o terceiro par. O
Segundo par de pseudopatas está 50% maior do que o terceiro. O segundo instar
termina em 3 ou 4 dias, tendo a larva cerca de 9 mm de comprimento. O terceiro
ínstar também termina em 3 ou 4 dias e a lagarta pode alcançar 16 mm em
comprimento. O quarto e o quinto instares terminam em 3 ou 4 dias e podem
alcançar 25 mm de comprimento. Durante o sexto ínstar a lagarta da soja torna-se
gradualmente maior e pode chegar a medir 48 mm. O sexto instar termina no quinto
32
dia, sendo que até este ponto se passaram 25 dias. No estágio pré-pupal a larva
reduz em tamanho para 25 mm de comprimento e torna-se marrom com poucas
linhas longitudinais (Watson, 1916).
A pupa da A. gemmatalis é verde clara por volta de um dia de idade, quando
então se torna marrom. É de textura lisa e mede de 18 a 20 mm de comprimento e
de 4 a 6 mm de largura. Ela vive diretamente embaixo da superfície do solo em uma
profundidade de cerca de 2 cm. Suas células são frágeis. A mariposa adulta é
variável em formas e coloração com uma envergadura de 30 a 38 mm. A asa da
mariposa de A. gemmatalis varia de cinza, marrom amarelado claro, ou marrom
avermelhado escuro. A ponta das asas é marrom claro com uma linha de pontos
claros próxima à margem. Uma linha diagonal escura estende através das duas
asas quando estas estão completamente estendidas (Barbara, 2001).
Vários parasitóides atacam a lagarta da soja. O parasitóide predominante é
Winthemia rufopicta (Bigot) (Diptera: Tachinidae). Os parasitóides podem variar de
ano a ano e de local para local. Os predadores desta lagarta são generalistas os
quais se alimentam de outras lagartas. Dentre estes predadores observamos os
besouros, Calosoma sayi Dejean, Calleida decora (Fabricius) e Poecilus chalcites
(Say) (todos Coleoptera: Carabidae) e vários outros. Predadores vertebrados como
os pássaros, sapos, e roedores também agem como inimigos naturais da lagarta da
soja. Este tipo de predação tem-se mostrado insignificante no controle desta lagarta
(Barbara, 2001).
Na tentativa de controlar o ataque destas pragas, tem-se buscado novos
métodos que não sejam baseados em agroquímicos, os quais, apesar de
aumentarem a produtividade, causam sérios danos ambientais, contaminação dos
operadores rurais e proporcionam a seleção de indivíduos resistentes entre as
espécies que se estão combatendo. A engenharia genética de plantas oferece a
possibilidade de se introduzirem genes de resistência às pragas, que codificam para
inibidores de proteases (Jouanin et al, 1998).
33
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Este trabalho teve por objetivo geral realizar estudos bioquímicos e
fisiológicos sobre o mecanismo de interação planta-inseto utilizando A. gemmatalis e
plantas de soja em presença de inibidor de proteases benzamidinas. Neste contexto,
objetivou-se avaliar o efeito de inibidores de proteases aplicados em folhas de soja
sobre os parâmetros biológicos, bioquímicos, fisiológicos e comportamentais de
Anticarsia gemmatalis.
3.2. Objetivos específicos
Determinar o efeito na atividade proteolítica de proteases do intestino da lagarta
da soja quando alimentadas com plantas de soja da variedade CAC-1 e seu
genótipo CAC-1 TN, submetidas à pulverização com diferentes concentrações de
inibidores de proteases benzamidinas;
Determinar o efeito na atividade amidásica de proteases tripsina-like do intestino
da lagarta da soja quando alimentadas com plantas de soja, submetidas à
pulverização com diferentes concentrações de inibidores de proteases
benzamidinas;
Determinar o efeito na atividade esterásica de proteases tripsina-like do intestino
da lagarta da soja quando alimentadas com plantas de soja, submetidas à
pulverização com diferentes concentrações de inibidores de proteases
benzamidinas;
Avaliar a produção de inibidores de proteases pelas plantas quando atacadas
pela lagarta da soja, assim como quando submetidas à pulverização com
diferentes concentrações de inibidores de proteases benzamidinas;
Estudar a biologia e comportamento de A. gemmatalis quando alimentadas com
plantas de soja submetidas à pulverização com diferentes concentrações de
inibidores de proteases benzamidinas.
34
4. Materiais e Métodos
4.1. Criação da Lagarta da Soja (Anticarsia gemmatalis Hübner)
Ovos de A. gemmatalis foram obtidos do Centro Nacional de Pesquisa da
Soja (CNPSo), Londrina, Paraná, e mantidos no laboratório de Criação de insetos do
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de
Viçosa, a 26 2C de temperatura, 70 10% de umidade relativa. A lagarta da soja
apresenta ciclo biológico com duração entre três e quatro semanas e seus adultos
foram obtidos de pupas colocadas em placas de Petri no interior de gaiola telada de
50 x 50 cm revestida internamente com folhas de papel sulfite, A4.
Após quatro dias as mariposas emergiram, e foram alimentadas com solução
nutritiva composta de mel (10,5g), cerveja (350mL), sacarose (60g), ácido ascórbico
(1,05g), nipagin (1,05g) e água (1050mL), embebida em um chumaço de algodão
colocado no fundo da gaiola, sobre uma placa de Petri.
A postura de A. gemmatalis ocorreu após três dias, na superfície do papel
que reveste internamente a gaiola. Estas folhas de papel foram retiradas e cortadas
em tiras de 2,5 cm de largura x 10 cm de comprimento e colocadas em copos
plásticos de 500 mL com um orifício circular na tampa de, aproximadamente, 2 cm
onde está acoplada uma tela de filó. Estes copos foram então transferidos para uma
câmara climatizada a 25C, umidade relativa de 60 10% e fotoperíodo de 14 horas
mantido por “timers” acoplados a lâmpadas tipo luz-do-dia.
Após dois ou três dias ocorreu a eclosão dos ovos, quando se iniciou a
alimentação das larvas de A. gemmatalis baseada na metodologia de Hoffman-
Campo et al. (1985), com um cubo de dieta artificial em cada copo plástico. Nos
experimentos para os estudos dos parâmetros biológicos, as lagartas foram
alimentadas com folhas de soja pulverizadas com as soluções contendo triton X-100
e benzamidina nas concentrações 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60;e 0,75% (p/v).
4.2. Preparo da Dieta Artificial
35
A dieta artificial possui a seguinte composição (Quadro 1).
Quadro 1- Composição da dieta artificial utilizada no experimento com
lagartas (g/100g de mistura)
Ingredientes
Controle
Feijão mulatinho (cozido)
1
4,80
Levedo de cerveja
1
2,4
Germe de trigo
1
3,8
Proteína de soja
1
3,8
Caseína
2
1,9
Agar-agar
3
1,34
Ácido ascórbico
2
0,23
Ácido sórbico
4
0,11
Solução vitamínica
1
0,38
Nipagin
4
0,19
Formol 40%
1
0,23
1
Obtido no comércio de Viçosa, MG
2
Obtido da Sigma
3
Obtido da Isofar- Indústria comércio de produtos químicos Ltda.
4
Obtido da Synth- LabSynth produtos para laboratório Ltda
Estes ingredientes foram processados e misturados, nesta ordem, com o
auxílio de um liqüidificador industrial. A mistura foi autoclavada por 1 hora à pressão
de 1,5 kgf/cm
2
, em seguida foi transferida novamente para o liqüidificador, misturada
e adicionada de ácido ascórbico (6 g), ácido sórbico (3 g), nipagin (metilparabeno) (5
36
g), formol 40% (6 mL) e 10 mL de solução vitamínica composta por niacinamida (1
mg), pantoenato de cálcio (1 mg), tiamina (0,25 mg), riboflavina (0,50 mg), piridoxina
(0,25 mg), ácido fólico (0,25 mg), biotina (0,02 mg), inositol (20 mg), água (1L); até
formar uma pasta homogênea que foi então transferida ainda quente para recipientes
plásticos com tampa. A pasta obtida era resfriada em câmara germicida
acondicionada com luz ultravioleta e conservada a 4
0
C.
4.3. Ataque de lagarta da soja
Plantas de soja no estádio V3 de desenvolvimento foram submetidas a uma
lagarta em cada trifolíolo. Após 6, 12, 24 e 48 horas, os três folíolos da primeira folha
trifoliolar foram coletados para posterior obtenção de extratos foliares, e as lagartas
removidas nesses períodos.
4.4. Obtenção das mudas
Foram utilizadas plantas de soja (Glycine max (L.) Merrill) variedade
comercial CAC-1 e o seu genótipo CAC-1 TN “Triplo –Nulo”, com sementes
alteradas por manipulação genética, com e sem os genes que codificam as
lipoxigenases, obtidas pelo Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja do
BIOAGRO/UFV.
As mudas foram cultivadas até o estádio V2 sem histórico de aplicação de
qualquer produto foliar. Foram obtidas três plantas de cada genótipo de soja, em
vaso com capacidade para 4,0 kg de solo, em condições de casa de vegetação. As
mudas foram pulverizadas com as devidas soluções de inibidores de proteases, de
acordo com o tratamento utilizado. Imediatamente decorridos os tempos de ataque
das lagartas, de cada tratamento, os três folíolos da primeira folha foram coletados,
congelados em nitrogênio líquido e armazenados a –80
0
C, para a determinação de
inibidores de proteases.
4.5. Aplicação do inibidor nas plantas
37
Foram preparadas seis gaiolas com dimensões de 1m x 1m x 1m, recobertas
com organza, cada gaiola contendo 24 vasos, cada vaso 3 plantas, portanto 72
mudas de soja, sendo cada gaiola correspondente a um tratamento. No tratamento
controle as plantas foram pulverizadas com uma solução aquosa de Triton X-100
0,01% (v/v) e as plantas dos tratamentos testes pulverizadas com uma solução
aquosa contendo Triton X-100 0,01% (v/v) e acrescentada de inibidores de
proteases do tipo benzamidinas, de acordo com o tratamento nas concentrações de
0,15, 0,30, 0,45, 0,60 e 0,75% (p/v).
Em cada vaso, com 3 plantas de soja no estádio V3 de desenvolvimento, foi
colocada uma lagarta de 4º ou 5º instar (instares em que a lagarta se alimenta mais
vorazmente) no primeiro trifólio de cada planta.
A pulverização das mudas de acordo com os tratamentos foi realizada com as
lagartas nas folhas, como ocorre em uma aplicação no campo. De cada gaiola foram
retirados 6 vasos (totalizando 18 lagartas) em cada um dos seguintes períodos: 6,
12, 24 e 48 horas depois de realizada a pulverização. As mudas retiradas não
retornaram às gaiolas. As lagartas retiradas tiveram os intestinos extraídos para
obtenção do extrato enzimático para posteriores análises.
4.6. Obtenção do extrato enzimático do intestino médio das lagartas
Os intestinos médios foram extraídos após dissecação das lagartas em
presença de HCl 10
-3
M a 4ºC e acondicionados em tubos plásticos de 2 mL
contendo 1 mL de HCl 10
-3
M. Os extratos enzimáticos foram obtidos pelo
rompimento celular resultante de nove ciclos de congelamento em nitrogênio líquido
e descongelamento em banho-maria a 37°C (Oliveira et al., 2005). Após os ciclos,
frações de 1 mL do extrato foram centrifugadas em tubos plásticos de 2 mL com
tampas a 100.000 g por 30 min a 4°C. O sobrenadante contendo o material solúvel
foi retirado e mantido a -18°C para determinação da concentração de proteína e
atividade enzimática.
4.7. Determinação da Concentração de Proteína
38
As determinações das concentrações de proteínas do intestino de lagarta
foram realizadas de acordo com método do ácido bicinconínico (Smith et al.,1985),
utilizando como padrão uma solução 2,0 mg/mL de Albumina Sérica Bovina, sendo
que as absorbâncias foram monitoradas espectofotometricamente a 562nm.
4.8. Obtenção do extrato foliar
O preparo do extrato bruto foi realizado a 4
º
C, de acordo com o método
descrito por Ohta et al. (1986). As folhas pesadas e imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido foram trituradas em almofariz. O pó obtido foi macerado em
tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5, na proporção de 1:3 (p/v) e em seguida
centrifugado a 17.200 g por 60 minutos a 4
º
C, segundo metodologia modificada por
Batista et al. (2002). O sobrenadante, denominado extrato bruto, foi utilizado para as
determinações da concentração de proteína total e da concentração de inibidor de
proteases.
4.9. Determinação da Atividade Proteásica do Intestino Médio de A.
gemmatalis.
As atividades proteásicas foram determinadas segundo o método descrito por
Tomarelli et al. (1949) utilizando-se azocaseína 2% (p/v) como substrato em tampão
Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, 37°C. A mistura reacional consistiu em 50 L de substrato e
60 L de extrato enzimático, sendo incubada por 30 minutos a 37°C. A reação foi
interrompida pela adição de 240 L de ácido tricloroacético (TCA) 10% (p/v). Após a
parada de reação as amostras foram homogeneizadas em vortex e mantidas em
repouso no gelo por 15 minutos. Em seguida, os tubos plásticos de 2 mL com
tampas contendo as amostras foram centrifugados a 8.000 g por 5 minutos a 25°C
para remoção da proteína precipitada. Uma alíquota de 240 L do sobrenadante foi
transferida para tubos contendo 280 L de NaOH 1M. A atividade foi determinada no
sobrenadante com leituras de absorbâncias a 440 nm. O experimento foi realizado
em uma série de três repetições e em triplicatas.
39
4.10. Determinação da Atividade Amidásica Tripsina-like do Intestino Médio de
A. gemmatalis.
A atividade amidásica foi realizada pelo método descrito por Erlanger et al.
(1961), utilizando-se o substrato cromogênico L-BApNA, a 25C em tampão Tris-HCl
0,1 M, pH 8,2 contendo 20 mM de CaCl
2
e 1% (v/v) de dimetilformamida (DMF).
As velocidades iniciais foram determinadas pela formação do produto p-
nitroanilida, pela medida da absorvância a 410 nm em função do tempo, utilizando-
se para os cálculos o coeficiente de extinção molar de 8800 (M
-1
x cm
-1
) para o
produto. Os experimentos foram realizados em uma série de três repetições e em
triplicatas.
4.11. Determinação da Atividade Esterásica de Tripsina-like do Intestino Médio
de A. gemmatalis.
A atividade esterásica foi realizada pelo método descrito por Hummel (1959),
utilizando-se o substrato N-α-p-tosil-L-arginina metil éster (L-TAME) na concentração
final de 0,1 mM a 25
o
C em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,2 contendo 20 mM CaCl
2
.
As velocidades foram determinadas através da medida da absorvância a 247
nm em função do tempo (2,5 minutos), utilizando-se para os cálculos o coeficiente
de extinção molar de 540 M
-1
.cm
-1
para o produto. O experimento foi realizado em
uma série de três repetições e em triplicatas.
4.12. Determinação da Atividade Cisteíno Protease do Intestino Médio de A.
gemmatalis.
A determinação da atividade de cisteino-proteases foi realizada adaptando-se
o método de Erlanger et al. (1961). Foram pipetados 0,59 mL de tampão Tris-HCl
0,1 M contendo Dietiltiotriol 1mM, pH 8,0, 10 µL do extrato enzimático do intestino e
0,1 mL do inibidor benzamidina 10 mM.. Essa mistura foi incubada por 15 minutos à
40
temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado 0,5 mL do substrato L-BApNA 1,2
mM.
As velocidades foram determinadas através da medida da absorvância a
410nm em função do tempo (2,5 minutos), utilizando-se para os cálculos o
coeficiente de extinção molar de 8800 M
-1
.cm
-1
para o produto. O experimento foi
realizado em uma série de três repetições e em triplicatas.
4.13. Determinação de Inibidores de Proteases.
A presença de inibidores de proteases no extrato foliar foi determinada
utilizando-se tripsina bovina. A atividade tríptica, na presença de inibidores, consiste
no seguinte procedimento analítico: a) para a análise do teste: 50 L do extrato; 500
L de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,2, contendo 20 mM de cloreto de cálcio, e 50 L da
solução de tripsina 4,7 x 10
-5
M foram adicionados em um tubo de ensaio; b)Para o
controle da enzima foram adicionados, em outro tubo de ensaio, 550 L de Tris-HCl
0,1 M, pH 8,2, contendo 20 mM de cloreto de cálcio e 50 L da solução de tripsina
4,7 x 10
-5
M. c) Para o Branco: 600
L de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,2, contendo 20 mM
de cloreto de cálcio
Essa mistura contida em ambos os tubos (teste e controle da enzima,
respectivamente) foi incubada por cinco minutos, à temperatura ambiente. Após o
tempo de incubação, 500 L da mistura de incubação, do teste e do respectivo
controle, foram retirados e adicionados a outro tubo com 500 L de Tris-HCl 0,1 M,
pH 8,2, contendo 20 mM de cloreto de cálcio e 500 L da solução de L-BApNA 1,2
mM. A absorvância da solução foi determinada a 410 nm durante 2,5 minutos de
reação. As análises foram feitas numa série de três repetições. Os resultados
obtidos foram convertidos em mg de tripsina inibida por grama de proteína, de
acordo com a seguinte equação:
mg de tripsina inibida/grama de proteína =
Px1.000xC
BxA
em que
41
A = absorvância a 410 nm do controle – absorvância a 410 nm da amostra;
B = diluição da amostra;
P = concentração, em g/mL, de proteína dos extratos; e
C = fator de tripsina, ou seja, o produto da atuação de 1 g de tripsina
ativa sobre o substrato L-BApNA dá uma leitura de absorvância em 410 nm de 0,019
(Kakade et al., 1974).
4.14. Estudo da biologia de Anticarsia gemmatalis
Larvas de primeiro ínstar de A. gemmatalis, provenientes da criação-estoque,
foram colocadas em potes plásticos de 200 mL, cada um contendo 5 lagartas. Cada
tratamento correspondeu a um total de 12 potes, logo 60 lagartas.
Os potes foram cobertos com uma tampa plástica com orifício central de 1 cm
de diâmetro, recoberto por tecido de organza, e mantidos em câmara climatizada
sob condições controladas de temperatura em torno de 25ºC
As lagartas de A. gemmatalis, foram criadas com folhas de soja pulverizadas
com os inibidores de proteases do tipo benzamidinas e com folhas de soja sem os
inibidores de proteases. As folhas foram fornecidas de acordo com o tratamento,
com os pecíolos envoltos em algodão umedecido em água para mantê-la túrgida,
conforme a metodologia de Holtz (2001). Diariamente, por ocasião da substituição
das folhas, os potes foram limpos, retirando-se fezes e resíduos alimentares. As
lagartas foram alimentadas até o início do período de pré-pupa. Foram observados
os pesos das lagartas em dias alternados para avaliar o ganho de peso e a
mortalidade.
4.15. Teste de preferência de lagartas a folhas com ou sem os inibidores de
proteases benzamidinas
Para este teste foram utilizadas lagartas de 4º ínstar obtidas da criação de
rotina do laboratório.
A solução contendo os inibidores benzamidinas foi preparada nas seguintes
concentrações: 0,00; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75% (p/v), solubilizada em água e
42
adicionada de 1% de Triton X-100. A aplicação das soluções contendo o inibidor de
proteases foi feita através da pulverização em plantas de soja de estádio V3,
plantadas em tubetes de 8 cm de diâmetro e 20 cm de profundidade.
Em cada gaiola descrita anteriormente foram colocadas 10 plantas
eqüidistantes de forma circular, sendo cada planta correspondente a um tratamento.
O suporte dos tubetes foi uma superfície de isopor perfurada (que serviu de arena).
Os tratamentos foram distribuídos para que dois tratamentos iguais não ficassem
próximos (Figura i). Foram liberadas 30 lagartas no centro da arena e retiradas após
vinte minutos. A seguir tornaram a ser liberadas no centro da arena.e as
observações foram feitas nos períodos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 e 12 horas onde
as lagartas foram retiradas e contadas as presentes em cada tratamento. Para cada
período de tempo o processo se repetiu com a substituição das lagartas.
Figura i) Plantas de soja dispostas na arena.
4.16. Teste de preferência de pouso e oviposição em plantas com ou sem os
inibidores de proteases benzamidinas
Para realizar este teste foram utilizadas fêmeas adultas de A. gemmatalis,
obtidas da criação base do laboratório.
A solução contendo os inibidores benzamidinas foram preparadas nas
seguintes concentrações: 0,00; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75% (p/v), solubilizada em
água e adicionada de 1% de Triton X-100. A aplicação das soluções contendo o
43
inibidor de proteases foi feita através da pulverização em plantas de soja de estádio
V3, plantadas em tubetes de 8 cm de diâmetro e 20 cm de profundidade. Em cada
gaiola descrita anteriormente foram colocadas 10 plantas eqüidistantes de forma
circular, sendo cada planta correspondente a um tratamento. Os tubetes foram
encaixados em uma superfície de isopor perfurada. Os tratamentos foram
distribuídos para que dois tratamentos iguais não ficassem próximos, conforme
(Figura i).
Na realização deste teste foram liberadas dez fêmeas e foram observadas em
quais plantas elas estavam após 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 minutos, foram
feitas 5 repetições. Como este lepidóptero é de hábito noturno estes testes foram
realizados à noite (21:00h) e para visualizá-los foi utilizada uma lanterna com luz
ultravioleta, não afetando assim o comportamento destes insetos uma vez que este
comprimento de onda não é percebido por este lepidóptero.
Após 24 horas da soltura das mariposas as plantas foram retiradas e as
posturas foram contadas.
4.17. Análises estatísticas
Os dados foram submetidos à análise de regressão utilizando o programa
TableCurve 3D Windows versão 2.0 e os modelos escolhidos foram plotados no
programa SigmaPlot, versão 7.0 (SPSS, 2001).
44
5. Resultados e discussão.
5.1. Efeito de pulverizações com benzamidina na preferência alimentar de
lagartas Anticarsia gemmatalis em plantas de soja
Observando-se as figuras 1 e 2 podemos verificar que houve efeito
significativo entre a proporção de lagartas versus a concentração de inibidor.
Podemos verificar que a proporção de lagartas em plantas controle que não
receberam pulverizações com benzamidina, é superior do que em plantas
pulverizadas com o inibidor. Isto demonstra que lagartas de Anticarsia gemmatalis
apresentam uma não preferência por plantas de soja que receberam aplicações de
inibidores. Esse efeito foi mais acentuado na concentração de 0,45% de
benzamidina.
Concentração de Benzamidina %(p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Proporção de Lagartas
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Figura 1- Preferência da lagarta por plantas de soja CAC -1 pulverizadas com o
inibidor de protease benzamidina em diferentes concentrações. Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z =
45
0.24 - 1.01x + 1.09x
2
+ 0.002y (não houve efeito expressivo do tempo de exposição)
e os parâmetros :R
2
= 0.59; F
3,326
= 157.48; p < 0.0001.
Concentração de Benzamidina %(p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Proporção de Lagartas
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Figura 2- Preferência da lagarta por plantas de soja CAC -1 TN pulverizadas com o
inibidor de protease benzamidina em diferentes concentrações. Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z =
0.24 - 1.00x + 1.07x2 + 0.002y (não houve efeito expressivo do tempo de exposição)
e os parâmetros : R
2
= 0.50; F
3,326
= 106.95; p < 0.0001.
Já Oliveira (2006) ao trabalhar com lagartas do lepidóptero Thyrinteina
leucoceraea submetidas ao teste de preferência em plantas de eucalipto e goiaba
pulverizadas com inibidor de protease benzamidina não observou diferença
significativa para nenhuma das concentrações estudadas do inibidor.
Em soja, Lin e Fischer (1990) avaliaram o efeito sobre a preferência alimentar
do coleóptero Epilachna varivestis por plantas sadias e após o ataque do lepidóptero
Pseudoplusia includens, estes autores verificaram que as plantas injuriadas por P.
includens foram rejeitadas pelo coleóptero. Possivelmente esse efeito poderia ser
decorrente do acúmulo de metabólicos secundários em plantas atacadas. Os
46
mecanismos de resistência em soja compreendem fatores químicos e físicos,
podendo ser constitutivos ou indutivos (KOGAN, 1976). Injúrias causadas por
insetos em folhas provocam o aumento do nível de resistência em folhas não
atacadas da mesma planta (REYNOLDS and SMITH, 1985). Esse fenômeno foi bem
estudado em tomate e batata, nos quais se verificou que qualquer tipo de ferimento
ou injúria nos tecidos vegetativos da planta leva à liberação de uma substância
chamada PIIF (fator indutivo de inibidor de protease) no sistema vascular da planta,
sendo rapidamente transportada para outros tecidos, onde é iniciado o processo de
acúmulo de inibidores de protease (RYAN, 1978).
5.2. Efeito de pulverizações com benzamidina na preferência de pouso de
mariposas de Anticarsia gemmatalis.
Observando-se as figuras 3 e 4) verificamos que houve um efeito significativo
entre a visitação de mariposas versus a concentração de inibidor e o tempo de
exposição. Podemos verificar ainda que a proporção de mariposas em plantas
controle as quais não receberam pulverizações com benzamidina é bem maior do
que em plantas pulverizadas com o inibidor. Estes dados demonstram que as
mariposas de A. gemmatalis têm preferência por visitar plantas que não tenham sido
pulverizadas com benzamidina, o que sugere a possibilidade de haver uma maior
postura de ovos nessas plantas.
47
Concentração de Benzamidina
0 20 40 60 80
Numero de Pousos
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Figura 3- Preferência de pouso de mariposas por plantas de soja CAC-1
pulverizadas com o inibidor de protease benzamidina em diferentes concentrações.
Esses dados foram submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear
com duas variáveis independentes (concentração de benzamidina e o tempo)
obtendo-se a equação z = 0.82 + 2.76e
-x
- 91.07/y
2
e os parâmetros : R
2
= 0.58;
F
2
,
189
= 130.11; p < 0.0001.
Concentração de benzamidina
0 20 40 60 80
Número de pousos
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
48
Figura -4 Preferência de pouso de mariposas por plantas de soja CAC-1
pulverizadas com o inibidor de protease benzamidina em diferentes concentrações.
Esses dados foram submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear
com duas variáveis independentes (concentração de benzamidina e o tempo)
obtendo-se a equação z = 01.29 - 0.08x
0.5
+ 2.36e
-x
e os parâmetros : R
2
= 0.63;
F
2,237
= 201.55; p < 0.0001.
A seleção de um hospedeiro seja pela qualidade ou ausência de inimigos
naturais é normalmente realizada pela fêmea (Mayhew, 1997). O sucesso dos
descendentes está ligado ao comportamento de escolha de lepidópteros por sítios
de oviposição, já que lagartas apresentam baixa mobilidade (Singer, 1986; Renwick,
1989). Isto é importante, pois compostos produzidos por plantas após o ataque dos
herbívoros podem afetar o desenvolvimento deles (Doughty et al., 1995) e ter maior
importância em lagartas de primeiro estádio de desenvolvimento.
O padrão de escolha de fêmeas de A. gemmatalis sugere a idéia de este
herbívoro estar adaptado a reconhecer compostos que podem interferir
negativamente no desempenho de seus descendentes. Apesar de pouco tempo de
contato com esse hospedeiro, a produção de compostos seja, possivelmente,
semelhante. Uma das rotas conhecidas de produção de compostos voláteis e IP em
plantas é a via das lipoxigenases que leva a produção do ácido jasmônico e esse
composto pode agir na ativação e expressão de genes que codificam para a
produção de inibidores de proteases (Farmer e Ryan 1972).
Silva et al. (2002 e 2004) e Fortunato et al. (2004 e 2007) demonstraram que
plantas de soja atacadas por A. gemmatalis respondem através da produção de
inibidores de proteases tripsinas-like.
5.3. Efeito de pulverizações com benzamidina na preferência de oviposição
de mariposas de Anticarsia gemmatalis
49
Observando-se a Figura 5 na qual foi realizada uma regressão simples não
linear podemos verificar que houve um efeito significativo entre o número de ovos
depositados na planta e a concentração de inibidor. Trata-se de uma correlação
negativa, ou seja, quanto maior a concentração de benzamidina menor a quantidade
de ovos depositados nas plantas de soja. Portanto, menor oviposição em folhas
tratadas com inibidores de proteases.
Concentração de benzamidina %(p/v)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
Número de ovos depositados
5
10
15
20
25
30
35
40
45
CAC-1
y = 29.87 - 23.75x
0.5
[R
2
= 0.39; F
1,48
= 30.78; p < 0.0001]
CAC-1 TN
y = 39.49 - 32.79x
0.5
[R
2
= 0.37; F
1,48
= 28.62; p < 0.0001]
Figura 5 - Avaliação da preferência de mariposas por oviposição em plantas
de soja CAC-1 e CAC-1 TN pulverizadas com o inibidor de protease benzamidina
em diferentes concentrações.
Resultados semelhantes foram encontrados em T. leucoceraea por Oliveira
(2006) onde a maioria das fêmeas desse lepidóptero ovipositaram em plantas de
eucalipto e goiaba sem o inibidor benzamidina, mostrando preferência por plantas
nas quais seus descendentes possam ter maior sucesso reprodutivo.
50
A literatura relata que fêmeas de herbívoros lepidópteros podem escolher
hospedeiros através de substâncias voláteis, nutrientes, fagoinibidores e
fagoestimulantes (Eisemann e Rice, 1985; Mc Innis, 1989; Oi e Mau, 1989; Messina,
1990). Estudando a oviposição de Anthonomus grandis em 16 cultivares de
algodoeiro, contendo teores de gossipol, um composto fenólico, formado por
aldeídos e terpenos, biossintetizado por plantas do gênero Gossypium da família
Malvaceae, Hedin (1995) observou que 100% das fêmeas ovipositaram em
cultivares com baixo teor de gossipol.
O mesmo parece ter ocorrido com fêmeas de A. gemmatalis, onde estas
podem ter percebido a presença do inibidor benzamidina sobre as folhas das
plantas, evitando realização de posturas, uma vez que inibidores de proteases
podem reduzir o desenvolvimento e performance de seus descendentes
(Pompermayer et al. 2001; Pilon et al. (2006).
Os IPs podem, então, inibir a oviposição de A. gemmatalis. Isto mostra a
possibilidade de utilização destes inibidores de proteases como parte de programas
de Manejo Integrado de Pragas (MIP) em plantios de soja, pois, como já
demonstrado para outros herbívoros, a presença desses compostos pode reduzir o
desempenho desses organismos, reduzindo os danos e a pressão desse herbívoro
sobre esse hospedeiro.
5.4. Efeito de diferentes concentrações de benzamidina pulverizada em
plantas de soja no ganho de peso de Anticarsia gemmatalis.
Podemos observar nas Figuras 6 e 7 que houve um decréscimo no
crescimento, uma vez que o ganho de peso final de lagartas alimentadas com folhas
de soja pulverizadas com o inibidor de protease benzamidina foi significativamente
menor do que em lagartas alimentadas com folhas de soja sem o inibidor
benzamidina. Uma explicação para este fato seria que a presença da benzamidina
esteja inibindo serino proteases tripsina-like do intestino do inseto diminuindo a
biodisponibilidade de aminoácidos essenciais à biossíntese de proteínas importantes
para o seu crescimento, desenvolvimento e manutenção do inseto, comprometendo
assim o seu desenvolvimento.
51
Tempo(dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Peso(mg)
0
50
100
150
200
250
300
Concentração 0% de benzamidina
Concentraçao 0,15% de benzamidina
Concentração 0,30% de benzamidina
Concentração 0,45% de benzamidina
Concentração 0,60% de benzamidina
Concentração 0,75% de benzamidina
Figura 6 - Avaliação do ganho de peso de lagartas A. gemmatalis alimentadas com
folhas da variedade de soja CAC-1, pulverizadas com diferentes concentrações do
inibidor de protease benzamidina. Esses dados foram submetidos à análise
estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis independentes
(concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z = 11.26 + 53.16x
+ 0.50y
2.5x
e os parâmetros : R
2
= 0.95; F
2,33
= 306.57; p < 0.001.
52
Tempo (Dias)
0 2 4 6 8 10 12
Peso(mg)
0
50
100
150
200
250
0% de Benzamidina
0,15 % de Benzamidina
0,30 % de Benzamidina
0,45% de Benzamidina
0,60% de Benzamidina
0,75% de Benzamidina
Figura 7 - Avaliação do ganho de peso de lagartas A. gemmatalis alimentadas com
folhas da variedade de soja CAC-1, pulverizadas com diferentes concentrações do
inibidor de protease benzamidina. Esses dados foram submetidos à análise
estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis independentes
(concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z = 29.59 -
17.37x
1.5
+ 7.30y
2
e os parâmetros : R2 = 0.97; F2,27 = 412.00; p < 0.001.
Estes resultados são condizentes com os de Broadway e Duffey (1986a), nos
quais a incorporação do inibidor de tripsina de soja (SBTI) e o inibidor de protease
de batata em dieta resultou em um decréscimo na taxa de crescimento dos
Lepidópteros Heliothis zea e Spodoptera exigua. Outros inibidores têm dado
resultados semelhantes como oryzacistatina , que retarda o crescimento de
Tribolium castaneum (Michaud et al., 1995); da mesma forma, o inibidor
Multicistatina de batata reduz o crescimento de Diabrotica virgifera virgifera (Orr et
al., 1994). Esta, quando alimentada com soyacistatina N, tem sua atividade digestiva
comprometida conturbando também o seu crescimento e desenvolvimento (Zhao et
al., 1996; Koiwa et al., 1998 e 2000).
53
Moreira (2007) quando alimentando lagartas de A. gemmatalis com dieta
acrescida de bis-benzamidina verificou uma redução inicial nas taxas de
crescimento, resultando em menor ganho de peso pelas lagartas quando
comparadas àquelas que consumiram dieta sem a adição de bis-benzamidina,
sugerindo que o mesmo efeito possa ter ocorrido em A. gemmatalis alimentada com
benzamidina, uma vez que o inibidor desde os primeiros dias afetou o ganho de
peso das lagartas (figuras 6 e 7). Isto pode ter propiciado menores ganhos de peso
no final da fase larval. Consequentemente, uma fase larval prejudicada pode afetar o
peso da pupa e prejudicar a performance dos adultos formados.
Mcmanus e Burgess (1995), também verificaram esse efeito em larvas de
Spodoptera litura que após ingestão crônica de inibidores tiveram uma redução do
crescimento apenas no 1º instar o que acarretou menores ganhos de peso até 12
dias, e as lagartas, no final do ciclo, tiveram seus pesos pouco discrepantes.
Por outro lado, Koiwa et al. (1998) verificaram que o inibidor de soyacystatina-
N causa impactos negativos no crescimento e desenvolvimento de Callosobruchus
maculatus apenas nos três primeiros instares. A partir do quarto instar até a fase
pré-pupa, o inseto demonstrou ter uma taxa de recuperação dos efeitos negativos
dos 3 primeiros instares.
5.5. Efeito de diferentes concentrações de benzamidina pulverizada em
plantas de soja na mortalidade de Anticarsia gemmatalis.
Podemos observar na figura 8, em que foi realizada uma regressão linear,
efeito significativo de aumento da mortalidade em decorrência do acréscimo de
inibidor benzamidina.
54
Concentração de benzamidina % (p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Mortalidade (%)
10
20
30
40
50
60
70
CAC
y = 26.95 + 38.25x
[R
2
= 0.89; F
1,4
= 15.11; p = 0.02]
TN
y = 38.29 + 26.85x
[R
2
= 0.77; F
1,4
= 12.91; p = 0.02]
Figura 8 - Avaliação da mortalidade de lagartas A. gemmatalis alimentadas
com folhas da variedade de soja CAC-1 e TN, pulverizadas com diferentes
concentrações do inibidor de protease benzamidina.
Resultados semelhantes foram encontrados quando se alimentou
Leptinotarsa decemlineata com E64, inibidor sintético de císteino protease. O
resultado foi um atraso no crescimento, aumento na mortalidade e diminuição da
taxa de fecundidade de adultos (Wolfson e Murdock, 1987; Bolter e Latoszek-Green,
1997).
Pilon et al. (2006) basearam se na determinação da digestibilidade e seus
efeitos no crescimento e desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis quando
alimentadas com o inibidor de tripsina benzamidina em dieta artificial. Foi verificado
que a adição de benzamidina alterou significativamente a digestibilidade do alimento
proteico. Tal alteração está correlacionada com impactos negativos ocasionados na
fase larval desse inseto, tais como aumento do ciclo larval, diminuição de ganho de
peso e aumento da mortalidade.
Visôtto (2007), buscando verificar o papel das bactérias intestinais no
processo digestivo e no desenvolvimento de A. gemmatalis após a ingestão de dieta
55
artificial contendo tetraciclina, demonstrou que a redução da microbiota afetou
significativamente a atividade proteolítica no intestino de A. gemmatalis, sugerindo
que o aumento da mortalidade em larvas, pode estar correlacionado com a
microbiota reduzida. Neste sentido, os inibidores de proteases apresentam grande
potencial por reduzirem ou impedirem a atividade das enzimas digestivas produzidas
pela A. gemmatalis e a sua microbiota, causando-lhes desnutrição e redução do
desenvolvimento, aumentando, assim, a mortalidade das lagartas.
Moreira (2007) verificou que a ingestão do inibidor bis-benzamidina em dieta
por A. gemmatlis provocou uma redução inicial nas taxas de crescimento afetando
significativamente a biomassa incorporada pelas lagartas durante a fase larval, o
que resultou em menor ganho de peso pelas lagartas quando comparadas àquelas
que consumiram dieta sem a adição de bis-benzamidina.
5.6. Determinação dos níveis de inibidores de proteases presentes nos
extratos foliares
Podemos observar nas figuras 9 e 10 mostram que mesmo em presença da
benzamidina, as plantas de soja pulverizadas com benzamidina após o ataque de A.
gemmatalis, tiveram aumentos na inibição tríptica, . Estes resultados mostram que
conforme verificado por Silva et al.(2002 e 2004) e Fortunato et al. (2004 e 2007) as
plantas de soja responderam ao ataque do inseto através da produção endógena de
inibidores de proteases uma vez que ocorre aumento da inibição tríptica com o
tempo. Além da benzamidina pulverizada na planta ocorre também a produção de
inibidor endógeno pelas plantas de soja de ambos genótipos CAC-1 E CAC-TN.
56
Concentração de Benzamidina % (p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Micrograma de tripsina inibida/mg de proteína
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 9 – Determinação dos níveis de inibidores em folhas de soja da
variedade CAC 1, pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas
concentrações de benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60; e 0,75 % (p/v) e coletadas
nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas de ataque de lagartas A. gemmatalis. Esses dados
foram submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas
variáveis independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a
equação z = 5,07 +301,6x + 1,03y – 2,65,5X
2
– 0,02y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,65;
F
5,67
=30,60; p<0,0001.
57
Concentração de Benzamidina % ( p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Micrograma de tripsina inibida/mg de proteína
0
50
100
150
200
250
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 10 - Determinação dos níveis de inibidores em folhas de soja da
variedade CAC-1 TN, pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas
concentrações de benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60; e 0,75 % (p/v) e coletadas
nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas de ataque de lagartas A. gemmatalis. Esses dados
foram submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas
variáveis independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a
equação z = 6,36+448,54x+1,05y -467,6x
2
-0,02y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,48; F
5,66
=
14,99; P<0,0001
Marinho (2006) observou aumento na produção de inibidores pelas plantas de
eucalipto e goiaba após a aplicação de benzamidina e com ataque de Thyrinteina
leucoceraea nos tempos de 12 e 24 horas de ataque ao eucalipto e goiaba
respectivamente. No entanto ocorreu um declínio na produção de inibidores 48
horas após aplicação do Inibidor de protease. Plantas de amieiro (Alnus glutinosa)
também responderam ao ataque de Agelastica alni com aumento da produção de
inibidores de proteases (Tscharntke et al., 2001).
Em nosso estudo pudemos verificar que, independentemente da aplicação de
benzamidina, ocorreu a produção de inibidores endógenos, os quais são relatados
58
na literatura, serem componentes de defesa das plantas. Estes dados indicam que a
pulverização de plantas com inibidor benzamidina não foi eficiente no processo de
defesa da planta uma vez que ocorreu aumento de inibidor endógeno.
Provavelmente, o caminho mais promissor de controle utilizando essa via bioquímica
fosse a produção de cultivares que expressem maiores níveis de inibidores ou
expressem inibidores mais potentes, mas que sejam produzidos pela planta.
No entanto, a pulverização com benzamidina foi importante nos parâmetros
biológicos dos insetos, uma vez que acarretou impactos negativos no
desenvolvimento das lagartas e no aumento da mortalidade. Com isso podemos
sugerir que o inibidor benzamidina possa ser uma estratégia no controle da lagarta
da soja, uma vez que, além de proporcionar aumento da defesa endógena da soja,
ele proporciona impactos negativos no desenvolvimento pós-embrionário das
lagartas, além de influenciar no comportamento do inseto como a não preferência
alimentar e a baixa oviposição em plantas de soja pulverizadas com benzamidina.
Neste estudo verificamos também que plantas de soja do genótipo CAC-1-TN,
utilizadas no programa de melhoramento da soja da UFV se comportam
semelhantemente à variedade CAC-1 na produção de inibidores, estando em
conformidade com proposto por Carvalho et al. (1997), que trabalharam com
sementes de vários genótipos de soja contrastando para ausência e presença de
genes que codificam lipoxigenases e KTI. Eles demostraram que a eliminação
genética de lipoxigenases nas sementes diminuía os níveis de KTI. Verificaram,
ainda, que a produção de KTI em sementes estava relacionada com os níveis de
lipoxigenases. Portanto, a Via das Lipoxigenases estaria envolvida com o
mecanismo bioquímico de produção de KTI em sementes. Assim, os resultados
obtidos mostraram também, que a manipulação genética feita na semente, com a
retirada das lipoxigenases para diminuir o beany flavor e a retirada do inibidor de
proteases Kunitz, fator antinutricioanal , com o objetivo de obter um grão de soja de
melhor qualidade para a agroindústria, não afetou a expressão dos genes de
inibidores de proteases e de lipoxigenases em folhas os quais têm sido relatados
como componentes importantes no mecanismo de defesa de plantas a insetos e
patógenos.
59
5.7. Atividade proteásica do intestino médio de A. gemmatalis
Podemos observar na figura 11 que a atividade proteásica do intestino da
lagarta é decrescente até a concentração 0,45% de benzamidina em relação ao
controle onde começa a ser crescente nas concentrações 0,60 e 0,75%. Isso mostra
que concentrações até 0,45% de benzamidina juntamente com os inibidores
produzidos pela soja, reduzem significativamente a atividade proteolítica. Por outro
lado, em concentrações maiores como 0,60 e 0,75% de benzamidina, o inseto
provavelmente esteja utilizando os aminoácidos obtidos das folhas consumidas para
a síntese de proteases digestivas, buscando contornar o efeito da presença de
inibidores. Tal fato explica um menor ganho de peso e um aumento da mortalidade
para tais concentrações. Como observado em A. gemmatalis quando alimentada
com altos teores de inibidor tripsina, outros Lepdopteras como Spodoptera littoralis
se adaptam a inibidores de proteases com uma grande produção de proteases
digestivas (De Leo et al.,1998).
Concentração de Benzamidina %(p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Atividade A440/mg de proteína
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 11 – Atividade Proteásica do extrato do intestino de lagartas A.
gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1 pulverizadas com inibidor de
protease benzamidina nas concentrações de benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e
60
0,75 %(p/v), nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas de ataque da soja. Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação
z=0,2155 – 0,73x + 0,007y + 0,88x
2
– 0,0001y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,39; F
5,67
;
P=0,0001.
Com a ingestão crônica de inibidores, a biodisponibilidade de aminoácidos
estaria sendo utilizada para a síntese de mais proteases ao invés da biossíntese de
outras proteínas necessárias ao crescimento e desenvolvimento do inseto, isso
poderia levá-lo à morte.
Na figura 12, assim como ocorrido na Figura 11, a atividade proteásica é
decrescente até a concentração 0,45% onde começa a ser crescente no tratamento
0,60%. Isto demonstra que plantas CAC-1 TN respondem igualmente a plantas
CAC-1 na síntese de inibidores de protease.
Concentração de Benzamidina %(p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Atividade A440/mg de proteína
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 12 – Atividade Proteásica do extrato do intestino de lagartas A. gemmatalis
alimentadas de plantas de soja CAC-1 TN pulverizadas com inibidor de protease
benzamidina nas concentrações de benzamidina 0, 0.15, 0.30, 0.45, 0.60 e 0.75
61
%(p/v), nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas de ataque da soja. Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z=
0,22 -0,82x + 0,008y + 0,97x
2
- 0,0001y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,51; F
5,67
=17,41; p
< 0,0001.
Os insetos podem superar os efeitos dos inibidores de proteases de diversas
formas, tais como: pela hiperprodução de proteases (Broadway, 1995), pela indução
da atividade de novas proteases insensíveis ao inibidor (Jogsma et al., 1995;
Broadway, 1995; Bolter e Jogsma, 1995; Zhu–Salzman et al. 2003; Pilon et al. 2006;
Marinho 2006; Moreira 2007)), pela ligação dos inibidores de proteases a proteases
não alvo (Michaud, et al., 1995) ou pela ativação enzimática das tripsina-like
(Oliveira et al., 1993).
Lagartas de lepidópteros polífagos têm a capacidade de responder a
mudanças na qualidade nutricional da dieta e/ou agentes antimetabólicos, como os
inibidores de proteases, alterando suas proteases digestivas. As mudanças podem
ser qualitativas, caracterizando-se pelo aumento nos níveis de proteases intestinais
para manter a digestão nos níveis ideais, ou quantitativas, que incluem a síntese de
isoformas insensíveis às quais o inibidor seria incapaz de se ligar e, portanto, inibir
(Srinivasan et al., 2006). Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) é um inseto
herbívoro generalista, mas tem o repolho como sua planta hospedeira preferida.
Quando alimentadas em dieta protéica contendo inibidor de proteases extraído de
folhas de repolho, as lagartas de T. ni tiveram sua digestibilidade protéica
aumentada devido à síntese de outras proteases (Broadway, 1995).
5.8. Atividade amidásica do intestino médio de A. gemmatalis.
Podemos observar na figura 13 que atividade versus concentração de
benzamidina mostra uma atividade amidásica crescente somente até a
concentração 0,45% e, deste ponto em diante foi decrescente, demonstrando que
62
benzamidina pode ser uma excelente estratégia no controle de A. gemmatalis em
plantas de soja da variedade CAC-1.
Concentração de Benzamidina % (p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Aividade específica microMS-1mg(proteína)-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 13 – Atividade Amidásica nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas do extrato do
intestino de lagartas A. gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1
pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas concentrações de
benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 % (p/v). Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z=
2,20 +2,44x -0,06y -5,03x
2
+0,0011y
2
e os parâmetros : R
2
=0,67, F
5,67
=25,82;
P<0,0001.
Efeito parecido foi observado por Moreira (2007), que alimentou lagartas A.
gemmatalis com dieta artificial acrescida do inibidor de serino protease berenil e
verificou uma queda na atividade tríptica na medida em que se aumentava a
concentração do inibidor.
Brodway (1995), estudando as espécies de lepdopteras Pieris rapae, Pieris
napi, Plutella xylostella, Trichoplusia ni, Lymantria dispar e Helicoverpa zea,
observou que estes insetos apresentaram atividades de tripsina e quimotripsina,
63
sendo que índices muito maiores de atividade eram atribuídos a tripsinas. Do
mesmo modo, inibidores de tripsina mostraram-se muito mais eficientes. Estes
resultados sugerem que inibidores de tripsina na defesa de plantas ao ataque de
Lepdopteras são muito eficientes, uma vez que a digestão desses insetos é mais
dependente de tripsinas-like.
Resultado semelhante observou na figura 14, que mostra o perfil de atividade
amidásica de lagartas alimentadas com plantas de soja do genótipo TN pulverizadas
com o inibidor benzamidina.
Verificamos que esse aumento significativo na biossíntese de tripsinas,
sugere que esteja ocorrendo uma hiperprodução de tripsinas like. É provável que
essas tripsinas sejam sensíveis ao inibidor benzamidina e, para responder à
demanda da dieta, a lagarta tenha produzido mais enzimas, o que pode ser
observado com aumento da atividade.
Concentração de Benzamidina % (p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Aividade específica microMS-1mg(proteína)-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 14 – Atividade Amidásica nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas do extrato de
intestino de lagartas A. gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1 TN
pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas concentrações de
benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 % (p/v). Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
64
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z =
0,78 + 3,60x 0,01y - 3,85x
2
-0,0003y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,29; F
5,67
=6,95;
P<0,0001.
Zhu–Salzman et al. (2003) estudando C. maculatus, utilizando cisteíno
protease como principal enzima na digestão de proteínas, verificaram que altas
concentrações de Soyacistatina N (ScN) na dieta deste inseto, induziam a síntese de
cisteíno protease diferenciada e resistente ao inibidor. A síntese de tripsinas
insensíveis à ação de inibidores proteolíticos está descrita na literatura como sendo
uma estratégia de defesa empregada também por lepidópteros como Spodoptera
frugiperda, que não teve o seu crescimento e desenvolvimento afetados pela
ingestão de inibidor SBTI extraído de sementes de soja (Paulillo et al. 2000). Isto foi
verificado pelo fato de que expressaram endopeptidases com baixa susceptibilidade
ao inibidor, enquanto H. virescens produziu isoformas de tripsina ao alimentarem-se
em folhas de tabaco (Brito et al. 2001), uma de suas plantas hospedeiras
caracterizada por conter altos níveis de defesas químicas. A adaptação à ingestão
de IP’s pela síntese de proteases insensíveis também já foi identificada em outras
espécies da família Noctuidae como Helicoverpa zea, T. ni, Agrotis ipsilon e H.
armigera (Mazundar-Leighton e Broadway, 2001; Chougule et al., 2005, Volpicella
et al., 2006).
5.9. Atividade esterásica do intestino médio de A. gemmatalis.
Nas figuras 15 e 16, Observa-se que houve uma redução da atividade em
todas as concentrações de benzamidina, em relação ao controle, com ausência de
benzamidina.
65
Concentração de Benzamidina
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Atividade Micromolar s
-1
mg de proteína
-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 15 – Atividade esterásica nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas do extrato de
intestino de lagartas A. gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1
pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas concentrações de
benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 % (p/v). Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z =
0,85 -3,18x+0,008y+3,42x
2
-0,0002y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,59; F
5,67
= 24,46; P<
0,0001.
66
Concentraçao Benzamidina %(p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
micromolar S-1 mg(proteína)-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 16 – Atividade esterásica nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas do extrato do
intestino de lagartas A. gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1 TN
pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas concentrações de
benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 % (p/v). Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z =
0,92 -2,15x -0,01y +2,08x
2
+0,0002y
2
e os parâmetros : R
2
= = 0,43; F
5,67=
13,85; P<
0,0001.
Diante dos resultados apresentados, verificamos que houve um decréscimo
da atividade tríptica e pouca atividade esterásica, o que nos leva a sugerir que A.
gemmatalis possa estar produzindo outras proteases como forma de defesa à
ingestão crônica de benzamidina, como observado em coleópteros os quais
apresentam uma reconfiguração da expressão das enzimas digestivas, quando as
larvas foram alimentadas em dietas com inibidores de proteases. Tribolium
castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e Callosobruchus maculatus (Coleoptera:
Bruchidae), duas pragas de grãos armazenados, seriam capazes de alterar o perfil
de suas enzimas proteolíticas entre aspartil, cisteíno e serino-proteases quando
67
alimentadas em dietas acrescidas de inibidores de cisteíno e serino-proteases, E-64,
KTI e Soyacistatin (Oppert et al., 2005; Zhu-Salzman et al., 2003), ou mesmo
reconfigurar a expressão da principal enzima digestiva (Ahn et al., 2007).
5.10. Atividade de cisteíno proteases no intestino médio de A. gemmatalis.
Na figura 17 verificamos que houve incremento de atividade de cisteíno
protease em todas as concentrações, principalmente nos tempos 6,12 e 48 horas.
Embora na figura 18 o teste não tenha sido significativo a 5% de probabilidade
verificamos que nos tempos 6 e 12 horas tende a apresentar um aumento na
atividade de cisteíno proteases em decorrência da aplicação de benzamidina na
concentração de 0,75%.
Concentração de Benzamidina % (p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Micromolar S
-1
mg(proteína)
-1
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 17 – Atividade de cisteíno protease nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas do
extrato do intestino de lagartas A. gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1
pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas concentrações de
benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 % (p/v). Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
68
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação z =
0,73 -0,28x -0,03y+1,03x
2
+0,0006y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,31; F
5,67
= 7,60;
P<0,0001.
Concentração de Benzamidina % (p/v)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Micromolar S
-1
mg(proteína)
-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
Figura 18 – Atividade de cisteíno protease nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas do
extrato do intestino de lagartas A. gemmatalis alimentadas de plantas de soja CAC-1
TN pulverizadas com inibidor de protease benzamidina nas concentrações de
benzamidina 0; 0,15; 0,30; 0,45; 0,60 e 0,75 % (p/v). Esses dados foram
submetidos à análise estatística de regressão múltipla não linear com duas variáveis
independentes (concentração de benzamidina e o tempo) obtendo-se a equação .z=
0,34 -0,14x+0,01y+0,18x
2
-0,0002y
2
e os parâmetros : R
2
= 0,12; F5,67=2,36; P=
0,618.
Resultados semelhantes foram observados por Marinho (2006) com
acréscimo de atividade de cisteíno proteases, quando alimentou lagartas de
Thyrinteina leucoceraea com plantas de eucalipto e goiaba pulverizadas com o
inibidor benzamidina. Provavelmente a lagarta da soja esteja produzindo cisteíno
proteases em presença de inibidor de serino proteases como adaptação. Sendo
69
inibidas as serino proteases do intestino, o inseto poderia estar produzindo mais
serino proteases como também cisteíno proteases para digerir a sua dieta.
Estudos têm indicado que insetos da ordem Coleoptera sintetizam
naturalmente mais de uma classe de proteases. Girard e colaboradores (1998)
verificaram que Phaedon cochleariae na sua digestão proteíca utiliza mutiplas
enzimas proteolíticas que envolvem endo e exopeptidases. Em gel de atividade, são
detectadas duas formas de cisteíno proteases, quatro formas de serino proteases
principalmente elastase, e um pequeno residual de atividade atribuída a aspartil
proteases. Aspartil e cisteíno proteases foram encontradas em Leptinotarsa
decemlineata (Thie e Houseman,1990; Michaud et al., 1995 a) e em larvas de
Phyllotreta cruciferae (Rymerson e Bodnaryk, 1995). Outros resultados mostram que
Coleópteras, na sua digestão protéica, requerem a presença conjunta de aspartil,
cisteíno e serino proteases Callosobruchus maculatus (Gatehouse e Boulter, 1983;
Silva e Xavier-Filho, 1991; Zhu-Salzman et al., 2003) e Tribolium castaneum (Liang
et al., 1991; Chen et al., 1992; Blanco-Labra et al., 1996). Isso explicaria a
adaptalidade destes insetos a uma diversidade de plantas.
Oliveira et al. (2005) descreveram as tripsinas like como as principais enzimas
digestivas de A. gemmatalis, responsáveis pela digestão de proteínas. No entanto,
em nossos estudos, verificamos a ocorrência de cisteíno proteases, quando as
lagartas são alimentadas com plantas de soja CAC-1 pulverizadas com
benzamidina. Verificamos que o aumento de atividade proteásica nas maiores
concentrações (0,60 e 0,75%) provavelmente seja devido a atividade esterásica e
atividade de cisteíno proteases. Por outro lado, verificamos que, quando lagartas A.
gemmatalis foram alimentadas com plantas de soja CAC-1 TN pulverizadas com
benzamidina nas concentrações (0,60 e 0,75%), não houve variação na atividade de
cisteíno proteases, mas ocorreram aumentos nas à atividade amidásica e
esterásica, podendo estar havendo um aumento na biossíntese de serino proteases.
70
6. Conclusões
Plantas CAC-1 e CAC-1 TN responderam de em os todos testes de forma
similar, demonstrando que alteração genética no genótipo TN, que promoveu a
eliminação dos genes lox1, lox2 e lox3, não afetou a biossíntese foliar de inibidores
proteolíticos.
Este trabalho permitiu concluir que benzamidina compromete os parâmetros
biológicos do inseto, alterando o comportamento de lagartas e mariposas de
Anticarsia gemmatalis, as quais tiveram preferência alimentar no caso das lagartas e
de pouso e oviposição no caso das mariposas, por plantas que não receberam
pulverizações com benzamidina. Benzamidina também afetou o desenvolvimento
pós-embrionário de A. gemmatalis reduzindo o ganho de peso e aumentando a
mortalidade.
Plantas pulverizadas com benzamidina respondem com aumento nos níveis
inibidores endógenos de plantas de soja CAC-1 e CAC-1 TN. Uma estratégia para o
controle de A. gemmatalis seria a utilização de plantas geneticamente modificadas
expressando maiores concentrações de inibidor ou expressando inibidores mais
potentes.
Os experimentos demonstraram que lagartas A. gemmatalis apresentaram,
como mecanismo de defesa ao inibidor benzamidina, a capacidade de sintetizar
cisteíno proteases. Um sistema de controle da lagarta da soja deverá,
provavelmente, ser realizado com uma associação de inibidores de serino proteases
e de cisteíno proteases.
71
7. Referências Bibliográficas
ANDRADE, F.G.; NEGREIRO, M.C.C.; FALLEIROS, Â.M.F. Aspectos dos
mecanismos de defesa da lagarta da soja Anticarsia gemmatalis (Hübner,1818)
relacionados ao controle biológico por Baculovirus anticarsia (AGMNPV). Arq.
Inst. Biol.,v.71, p.391-398, 2004.
BAIRD, I.R.; MOSI, R.; OLSEN, M.; CAMERON, B.R.; FRICKER, S.P.; SKERLJ, R.T.
’3 + 1’ mixed-ligand oxorhenium(V) complexes and their inhibition of the cysteine
proteases cathepsin B and cathepsin K. Inorganica Chimica Acta, 359: 2736–
2750. 2006.
BALDWIN, I.T., 2001. An ecologically motivated analysis of plant-herbivore
interactions in native tobacco. Plant Physiology 127(4): 1449-1458.
BARBARA, K.A. “Featured Creatures – Velvetbean Caterpillar”. University of Florida.
Number: EENY-151.September 2000. http://creatures.ifas.edu/ field/velvetbean.
Htm Acesso em outubro de 2001.
BATISTA, R. B.; OLIVEIRA, M. G. A.; PIRES, C. V.; PIOVESSAN, N. D.; REZENDE,
S. T. & MOREIRA, M. A. Caracterização bioquímica e cinética de lipoxigenases
de plantas de soja submetidas à aplicação de ácidos graxos poliinsaturados.
Pesq. Agrop. Bras., 37 (11): 1517-1524, 2002.
BIRKETT, M. A., Campbell, C. A. M., Chamberlain, K., Guerrieri E., Hick A. J.,
Martin, J.L., Matthes M., Napíer, J. A., Petterson, J., Pickett, J. A., Poppy G.M.,
Pow. E. M., Pye, B. J., Smart, L. E., Wadhams, G. H., Wadhams, L.J., Woodcock,
C. M. New role for cis-jasmone as an insect semiochemical and in plant defense.
Proc. Natl Acad. Sci. USA 97: 9329-9334, 2000.
BLANCO-LABRA, A., Martinez-Gallardo, N.A., Sandoval- Cardoso, L., Delano-Frier,
J. Purification and characterization of a digestive cathepsin D proteinase isolated
from Tribolium castaneum larvae (Herbst). Insect. Biochem. Mol. Biol: 95-100,
1996.
BOLTER, C.J. E JONGSMA, M.A., 1995. Colorado potato beetles (leptinotarsa
decemlineata) adapt to protease inhibitor induced in potato leaves by methyl
jasmonate. J. Insect Physiol. 41: 1071-1078.
72
BOLTER, C.J., LATOSZECK-GREEN, M., 1997. Effect of chronic ingestion of the
cysteine protease inhibitor, E-64, on Colorado potato beetle gut proteinases.
Entomologia Experimentalis et Applicata 83(3): 295-303.
BOWN, D.P.; WILKINSON, H.S.; GATEHOUSE, J.A. Differentially regulated inhibitor-
sensitive and insensitive protease genes from the phytophagous insect pest,
Helicoverpa armigera, are members of complex multigene families. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, v.27, p.625-638, 1997.
BRITO, L.O.; LOPES, A.R.; PARRA, J.R.P.; TERRA, W.R.; SILVA-FILHO, M.C.
Adaptation of tobacco budworm Heliothis virescens to proteinase inhibitors may be
mediated by the synthesis of new proteinases. Comparative Biochemistry and
Physiology, Parte B, v.128, p.365-375, 2001.
BROADWAY, R. M. & DUFFEY, S. S. Plant proteinase inhibitors: mechanism of
action and effect on the growth and digestive physiology of larval Heliothis zea and
Spodoptera exigua. J. Insect Physiol., 32 (10): 827-833, 1986.
BROADWAY, R. M. Are insects resistant to plant proteinase inhibitors? J. Insect
Physiol., 41: 107-116, 1995.
BROADWAY, R. M. Dietary proteinase inhibitors alter complement of midgut
proteases. Arch. Insect Biochem. Physiol., 32: 39-53, 1996.
BROADWAY, R.M., MISSURELLI, D.L., 1990. Regulatory mechanisms of tryptic
inhibitory activity in cabbage plants. Biochemistry 29 (12): 3721-3725.
BROWN, D. P.; WILKINSON, H. S. & GATEHOUSE, J. A. Differentially regulated
inhibitor-sensitive and insensitive protease genes from the phytophagous insect
pest, Helicoverpa armigera, are members of complex multigene families. Insect
Biochem. Mol. Biol., 27: 625-638, 1997.
CHEN, H., GONZALES-VIGI, E., WILKERSON, C.G., HOWE, GA., 2007. Stability of
plant defense proteins in the gut of insect herbivores. Plant Physiology
143(4):1954-1967.
Chougule, N.P., Giri, A.P., Sainani, M.N., Gupta, V.S., 2005. Gene expression patterns
of Helicoverpa armigera gut proteases. Insect Biochemistry and Molecular Biology
35: 355-367.
73
CHRISTELLER, J.T., Farley, P.C., Ramsay R.J., Sullivan, P. A., W. A. Purification,
characterization and clonning of an aspartic proteinase inhibitor from squash
phloem exudate. Eur. J. Biochem. 254: 160-167., 1998.
CHRISTOU, P.; CAPELL, T.; KOHLI,A.; GATEHOUSE, J.A.; GATEHOUSE, A.M.R.
Recent developmets and future prospects in insect pest control in transgenic
plants. Trends in Plant Science, v.11, p.302-308, 2006.
COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO- Conab. 4º Levantamento de grãos
2006/2007- Jan/2007. [26 de janeiro 2007].
(http://www.conab.gov.br/conabweb/download/safra/4levsafra.pdf).
DE LEO, F.; BOTTINO, M.B.; CECI, L.R.; GALLERANI, R.; JOUANIN,L. Effects of a
mustard trypsin inhibitor expressed in different plants on three lepidopteran pests.
Insect Biochemistry and Molecular Biology, v.31, p.593-602, 2001.
EISEMANN, CH & RICE, MJ 1985. Oviposition behaviour of Dacus tryoni: the effects of
some sugars and salts. Entomologia Experimentalis et Applicata, 39:61-71.
EMBRAPA, CENTRO NACIONAL DE PESQUISA DE SOJA, 2006. Tecnologia de
produção de soja – região central do Brasil 2007. Londrina. 225p.
EMBRAPA, CENTRO NACIONAL DE PESQUISA DE SOJA, 2006. Tecnologia de
produção de soja – região central do Brasil 2007. Londrina. 225p.
EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa de Soja. Recomendações técnicas para
cultura da soja na região central do Brasil. Londrina. 245p. 2001.
Entomologia Experimentalis et Applicata 118(3): 185-192.
ERLANGER, B.F., KOKOWSKY, N., COHEN, W., 1961. The preparation and
properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Archives of Biochemistry
and Biophysics 95: 271-278.
ERLANGER, B.F.; KOKOWSKY, N.; COHEN, W. The preparation and properties of
two new chromogenic substrates of trypsin. Archives of Biochemistry and
Biophysics, 95:271-278, 1961.
74
FALCO, M.C., Marbach, P. A. S., Pompermayer, P., Lopes, F.C.C., Silva-Filho, M. C.
Mechanisms of sugarcane response to herbivory. Genet. Mol. Biol. 24: 113-122,
2001.
FERREIRA, C. C. A.; OLIVEIRA, M. G. A.; BRUMANO, M. H. N.; GUEDES, R. N. C.;
ALMEIDA, F. T. DE; SILVA, C. H. O. & MOREIRA, M. A. Lack of seed
lipoxygenases does not affect soybean defense against removal of reproductive
tissue. Bioscien. J., 21: 49-55, 2005.
FERREIRA, C. C. A.; OLIVEIRA, M. G. A.; OLIVEIRA, J. A.; ALMEIDA, F. T. DE;
PIRES, C. V.; PIOVESSAN, N. D. & MOREIRA, M. A. Caracterização bioquímica
e cinética de lipoxigenases de plantas de soja submetidas a remoção dos
primórdios florais. Cien. e Agrotecnol., 28: 263-270, 2004.
FOISSAC, X.; EDWARDS, M.; DU, J. P.; GATEHOUSE, A. M. R. & GATEHOUSE, J. A.
Putative protein digestion in a sapsucking homopteran plant pest (rice brown plant
hopper, Nilaparva lugens: Delphacidae) – identification of trypsin-like and cathepsin
B-like proteases. Insect Biochem. Mol. Biol., 32: 967-978, 2002.
FOISSAC, X.; EDWARDS, M.; DU, J. P.; GATEHOUSE, A. M. R. & GATEHOUSE, J.
A. Putative protein digestion in a sapsucking homopteran plant pest (rice brown
plant hopper, Nilaparva lugens: Delphacidae) – identification of trypsin-like and
cathepsin B-like proteases. Insect Biochem. Mol. Biol., 32: 967-978, 2002.
FORDYCE, J.A. e AGRAWAL, A. A. The role of plant trichomes and caterpillar group
size on growth and defense of the pipevine swallowtail Battus philenor. J. Animal
Ecol. 70: 997-1005, 2001.
FORTUNATO, F.S., OLIVEIRA, M.G.A., BRUMANO, M.H.N., SILVA, C.H.O.,
GUEDES, R.N.C., MOREIRA, M.A., 2007. Lipoxygenase-induced defense of
soybean varieties to the attack of the velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis
Hübner). Journal of Pest Science. (Aceito para publicação)
FRANCO, O.L., MELO, F.R., SILVA, M.C.M.DA, SÁ, M.F.G.DE., 1999. Inibidores de
enzimas digestivas e a obtenção de plantas resistentes. Biotecnologia, Ciência e
Desenvolvimento 11: 36-40.
75
FRANCO, O.L., RIGDEN, D.J., MELO, F.R., GROSSI-DE-SÁ, M.F., 2002. Plant
alpha-amylase inhibitors and their interaction with insect alpha-amylases-structure,
function and potential for crop protection. European Journal of Biochemistry
269(2): 397-412.
GATEHOUSE, A. e BOULTER, D. Assessment of the antimetabolic effects of trypsin
inhibitors from cowpea ( Vigna unguiculata) and other legumes on development of
the bruchid beetle Callosobruchus maculatus. J. Sci. Food Agric. 34: 345-350,
1983.
GATEHOUSE, A.M.R., NORTON, E., DAVISON, G.M. , 1999. Digestive proteolytic
activity in larvae of tomato moth, Lacanobia oleracea: effects on plant protease
inhibitors in vitro and in vivo. Journal of Insect Physiology45(6): 545-558.
GATEHOUSE, J.A. Plant resitance towards insect herbivores: a dynamic interaction.
New Phytologist, v.156, p.145-169, 2002.
GILL, I.; LÓPEZ-FANDIÑO, R.; JORBA, X. & VULFSON, E. N. Biologically active
peptides and enzymatic approaches to their production. Enz. and Microb.
Technol., 18: 162-183, 1996.
GIRARD, C., Le Métayer, M., Zaccomer, B., Bartlet, E., Williams, I., Bonadé-Bottino,
M., Pham-delegue, M.H., Jounain, L. Growth stimulation of beetle larvae reared on
a transgenic oilssed rape expressing a cysteine proteinase inhibitor. J. Insect
Physiol. 44: 263-270, 1998b.
GIRARD, C., Métayer, M., L., BONADÉ-BOTTINO, M., PHAM-DELÈGUE, M-
H.,JOUNAIN, L. High level of resistence to proteinase inibitors may be conferred
by proteolytic cheavage in bettle larval. Insect Biochem. Mol. Biol. 28: 229-237,
1998.
HAQ, S.K., ATIF, S.M., KHAN, R.H., 2004. Protein proteinase inhibitor genes in
combat against insects, pests, and pathogens: natural and engineered
phytoprotection. Archives of Biochemistry and Biophysics 431(1): 145-159.
HARUTA, M., Major, J.J., Christopher, M.E., Patton, J.J., Constabel C.P. A kunitz
trypsin inhibitor gene family from trembling aspen ( Populus tremuloides Michsc.):
76
clonning, functional expression, and induction by wounding and herbivory. Plant
Mol. Biol. 46: 347-359, 2001.
HILDER, V.A.; BOULTER, D. Genetic engineering of crop plants for insect
resistance- a critical review. Crop Protection, v.18, p.177-191, 1999.
HINDS, W.E., OSTERBERGER, B.A., 1931. The soybean caterpillar in Lousiana.
Journal of Economic Entomology 24:1168-1173.
HOFFMANN-CAMPO, C.B., OLIVEIRA, E.B., MOSCARDI, F., 1985. Criação massal
da lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis). EMBRAPA, Serviço de produção de
informação, Brasília. 23p.
HOLTZ, A.M. Interações tritróficas afetando os surtos de pragas em Myrtaceae.
104p. Dissertação (Mestrado em Entomologia) – Universidade Federal de Viçosa,
Viçosa, MG, 2001.
HUMMEL, B.C.W., 1959. A modified spectrophtometric determination of
chymotrypsin, trypsin and trombin. Canadian Journal Biochemistry Physiology 37:
1393-1399.
JONGSMA, M.A.; BOLTER, C. The adaptations of insects to plant proteinase
inhibitors. Journal of Insect Physiology, v.43, p.885-895, 1997.
JONGSMA,M.A.; BAKKER, P.L.; PETRS, J.; BOSCH, D.; STIEKEMA, W.J.
Adaptation of Spodoptera exigua larvae to plant proteinase inhibitors by induction
of gut proteinase activity insensitive to inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.92,
p.8041-8045, 1995.
JOUANIN L.; BONADÉ-BOTTINO, M.; GIRARD, C.; MORROT, G.; GIBAND, M.
Transgenic plants for insect resistance. Plant Science 131:1-11, 1998.
JUNQUEIRA. R.G., SILVA, E., MARES-GUIA, M. 1992. Competitive parabolic
inhibition of bovine trypsin by bis-benzamidines. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research 25 (9): 873-887.
KAKADE, M.L., RACKIS, J.J., McGHEE, J.E., PUSKI, G. (1974). Determination of
trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved
procedure. Cereal Chem., 51: 376-382.
77
KARBAN, R., AGRAWAL, A.A., THALER, J.S., ADLER, L.S., 1999. Induced plant
responses and information content about risk of herbivory. TREE 14 (11): 443-7.
KARBAN, R., BALDWIN, I.T., 1997. Induced responses to herbivory. Chicago
University Press, 319 p.
KLIEBENSTEIN, D. J., Kroymann, J., Brown, P., Figuth, A., Pedersen D.,
Gershenzon, J., Mitchell-Olds T. Genetic control of natural variation in Arabidopsis
glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126: 8811-8825, 2001.
KOGAN, M.; GOEDEN, R. D. The host-plant ranger of Lema trilineata Daturaphila
(Coleoptera: Crisomelidae). Annals of the Entomological Society of America, v. 63,
n. 4, p. 1175-1180, 1970.
KOIWA, H., Shade, R.E. Zhu- Salzman, K., D’Urso, M.P., Murdock, L.L., Bressan,
R.A. and Hasegawa, P.M. A plant defensive cystatin(soyacystatin) targets
cathepsin 1-like digestive cysteine proteinases(DvCALs) in the larval midgut of
western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera). FEBS Lett. 471: 67-70,
2000.
KOIWA, H., Shade, R.E. Zhu- Salzman, K., Subramanian, L., Murdock, L.L.,
Nielsen,S.S., Bressan, R.A. and Hasegawa, P.M. Phage display selection can
differentiate insecticidal activity of soybean cystatins. Plant J. 14: 371-379, 1998.
KUNAKBAEVA, Z., CARRASCO, R., ROZAS, I. An approximation to the mechanism
of inhibition of cysteine proteases: nucleophilic sulfur addition to Michael acceptors
type compounds. Journal of Molecular Structure 626: 209–216, 2003.
LAWRENCE, P.K.; KOUNDAL, K.R. Plant protease inhibitors in control of
phytophagous insects. Electronic Journal of Biotechnology, v.5, p93-109, 2002.
LEE, M.J. & ANSTEE, J.H. Endoproteases from the midgut of larval Spodoptera
littoralis includes a chymotrypsin-like enzyme with an extended binding site. Insect
Biochem. and Mol. Biol., 25 (1): 49-61, 1995.
LEMOS, F.J.A.; TERRA, W.R. A high yield preparation of Musca domestica larval
midgut microvilli and the subcellular distribution of amylase and trypsin. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, v.22, p.433-438, 1992a.
78
LIANG, C., Brookhart, G. Feng, G.H., Reeck, G. R., Kramer, K. J. Inhibition of
digestive proteinases of stored grain Coleoptera by oryzacystatin, a cysteine
proteinase inhibitor from rice seed. FEBS Lett. 278: 139-142, 1991.
LIN, H. M.; FISCHER, D. Induced resistance in soybean to the Mexican bean beetle
(Coleoptera: Coccinellidae): comparisions of inducing fators. Environmental
Entomology, v. 19, p.1852-1857, 1990.
LOPES, A.R.; JULIANO, M.A.; JULIANO, L.; TERRA, W.R. Coevolution of insect
trypsins and inhibitors. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, v.55,
p.140-152, 2004.
MAGRINI, E.A., BOTELHO, P.S.M., SILVEIRA NETO, S., 1999. Biology of Anticarsia
gemmatalis Hübner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae) in the soybean crop. Scientia
agricola 56(3): 547-555.
MARES-GUIA, M., SHAW, E., 1965. Studies on the active center of trypsin. The
binding of amidines and guanidines as models of the substrate side chain. Journal
of Biological Chemistry 240: 1579-1585
MARES-GUIA, M.; ROGANA, E.; AMORIN, A.F.; MAGALHÃES-ROCHA, N.M.
Kinetic evidence for a two-state, hybrid model for the trypsin activation by
modifiers. The Journal of Biological Chemistry. 256: 1661-1668, 1981.
MARINHO, J.S. Viçosa: Resposta Bioquímica de Lagartas de Thyrinteina
leucoceraea (Lepidoptera: Geometridae), Submetidas ao Inibidor de Serino-
Proteases BenzamidinaUFV, 2006. 62p. Dissertação (Mestrado em Entomologia)-
Universidade Federal de Viçosa, 2006.
MAZUMDAR-LEIGHTON & BROADWAY, R. M. Transcriptional induction of diverse
midgut trypsins in larval Agrotis ipsilon and Helicoverpa zea feeding on the
soybean trypsin inhibitor. Insect Biochem. Mol. Biol., 31: 645-657, 2001.
MAZUMDAR-LEIGHTON, S.; BABU, C. R. & BENNETT, J. Identification of novel
serine proteinase gene transcripts in the midguts of two tropical insect pests,
Scirpophaga incertulas (Wk) and Helicoverpa arnigera (Hb). Insect Biochem. Mol.
Biol., 30: 57-68, 2000.
79
MCMANUS, M.T., BURGESS, E.P.J., 1995. Effects of soybean (Kunitz) trypsin
inhibitor on growth and digestive proteases of larvae of Spodoptera littura. Journal
of Insect Physiology 41(9): 731-738.
MELLO, M.O., SILVA-FILHO, M.C., 2002. Plant-insect interactions: an evolutionary
arms race between two distinct defense mechanisms. Brazilian Journal of Plant
Physiology 14(2): 71-81.
MICHAUD D. Avoiding protease-mediated resistance in herbivorous pests. Trends
Biotechnol. 15: 4-6, 1997.
MICHAUD D., Bernier-Vadnais N., Overney S. and Yelle S. Constitutive espression
of digestive cysteine proteinase forms during development of the Colorado potato
beetle. Leptinotarsa decemlineata say (coleoptera: Chrysomelidae). Insect
Biochem. Mol. Biol. 25: 1041-1048, 1995.
MIURA, E.M.Y.; BINOTTI, M.A.R.; CAMARGO, D.S.; MIZUBUTI, I.Y.; IDA, E.I.
Avaliação biológica de soja com baixas atividades de inibidores de tripsina e
ausência do inibidor Kunitz. Archivos Latinoamericanos de Nutrição 2001, vol 51,
n. 2, p.1-8.
MONTEIRO, M.R.P., COSTA, N.M.B., OLIVEIRA, M.G.A., PIRES, C.V., MOREIRA,
M.A., 2004. Qualidade protéica de linhagens de soja com ausência do inibidor de
tripsina Kunitz e das isoenzimas lipoxigenases. Revista de Nutrição da PUCCAMP
17(2): 195-205.
MOREIRA, L.F. Viçosa: Eficiência Alimentar, Atividade Proteolítica e
Desenvolvimento Pós-Embrionário de Anticarsia Gemmatalis (Lepidoptera:
Noctuidae) Exposta ao Inibidor de Serino-Proteases, Bis-Benzamidina UFV, 2007.
85p. Dissertação (Mestrado em Entomologia)-Universidade Federal de Viçosa,
2007.
MUHARSINI, S.; DALRYMPLE, B.; VUOCOLO, T.; HAMILTON, S.; WILLANDSEN,
P. & WIJFFELS, G. Biochemical and molecular characterization of serine
proteases from larvae Chrysomya bezziana, the old screwworm fly. Insect
Biochem. Mol. Biol., 31: 1029-1040, 2001.
80
MURDOCK, L.L., SHADE, R.E., 2002. Lectins and protease inhibitors as plant
defense against insects. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(22): 6605-
6611.
NISHIDA, R. Sequestration of defensive substances from plants by lepdoptera.
Annu. Rev. Entomol. 47: 57-92, 2002.
OHTA, H.; IDA, S.; MIKAMI, B.; MORITA, Y. Changes in lipoxygenase components
of rice seedling during germination. Plant Cell Physiology. 22(5): 911-918, 1986.
OLIVEIRA, C.L. Viçosa: EFEITO DO INIBIDOR DE PROTEASE, BENZAMIDINA, NO
FORRAGEAMENTO DE Thyrinteina leucoceraea E NO SEU PREDADOR
Podisus nigrispinus. UFV, 2006. 51p. Dissertação (Mestrado em Entomologia)-
Universidade Federal de Viçosa, 20067.
OLIVEIRA, J. A.; OLIVEIRA, M. G. A.; GUEDES, R. N. C.& SOARES, M. J.
Morphology and preliminary enzyme characterization of the salivary glands from
the predatory bug Podisus nigrispinus. Bull. Entomol. Research, 96: 1-8, 2006.
OLIVEIRA, M. G. A.; DE SIMONE, S. G.; XAVIER, L. P. & GUEDES, R. N. C. Partial
purification and characterization of digestive trypsin-like proteases from the velvet
bean caterpillar, Anticarsia gemmatalis. Comparative Biochem. and Physiol., 140
(B): 369-380, 2005.
OLIVEIRA, M.G.A., ROGANA, E., ROSA, J.C., REINHOLD, B.B., ANDRADE, M.H.,
GREENE, L.J. ; MARES-GUIA, M., 1993. Tyrosine 151 is part of the substrate
activation binding site. Journal of Biological Chemistry 268(4): 26893-26903.
ORR, G.L., Strickland, J.A., Walsh, T.A. Inhibition of Diabrotica larval growth by a
multicystatin from potato tubers. J. of Insect Physiol. 40: 893-900, 1994.
PANDA, N. e KHUSH, G. S. Host plant resistance to insects. C.A.B. International,
Wallingford, 1995.
PATANKAR, A. G., Giri, A. P., Harsulkar, A. M., Sainani, M. N., Deshpande, V. V.,
Ranjekar, P. K., Gupta, V. S. Complexity in specifities and expression of
Helicoverpa armigera gut proteinases explains polyphagous nature of the insect
pest. Insect Biochem. Mol. Biol. 31: 453-464, 2001.
81
PAULILLO, L.C.M.S.; LOPES, A.R.; CRISTOFOLETTI, P.T.; PARRA, J.R.P.;
TERRA, W.R.; SILVA- FILHO, M.C. Changes in midgut endopeptidase activity of
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidade) are responsible for adaptation to
soybean proteinase inhibitors. J. Econ. Entomol., v.93, p. 892-896, 2000.
PILON, A.M., OLIVEIRA, M.G.A., GUEDES, R.N.C., 2006. Protein digestibility,
protease activity, and post-embryonic development of the velvetbean caterpillar
(Anticarsia gemmatalis) exposed to the trypsin-inhibitor benzamidine. Pesticide
Biochemistry and Physiology 86(1): 23-29.
POMPERMAYER, P., Terra W. R., Parra J. R. P., Falco M.C., Silva-Filho M.C.
Effects of soybean proteinase inhibitor on development, suevival and reproductive
potential of the sugarcane borer, Diatraea saccharalis. Entomol. Exp. Appl. 99: 79-
85, 2001.
RAKWAL R. e AGRAWAL G.K., Jwa N.S. Characterization of a rice (Oryza sativa L.)
Bowman-Birk proteinase inhibitor: tightly light regulated induction in response to
cut, jasmonic acid, ethylene and protein phosphatase 2 A inhibitors. Gene. 263:
189-198, 2001.
ROBERTS, P. e GUILLEBEAU, P. "Velvetbean caterpillar- Anticarsia gemmatalis
(Hübner)." The University of Georgia Entomology: Georgia IPM- integrated pest
management.1999”.http://www.gaipm.org/top50/ velvetbean. html. Acesso em
outubro de 2001.
ROY I. e GUPTA M. N. Purification of a “doublehesded” inhibitor of alpha-
amylase/proteinase K from wheat germ by expanded bed chromatography.
Bioseparation. 9: 239-245, 2000.
RUPPERT, E.E. e BARNES, R.D. Zoologia de invertebrados. Sexta edição. São
Paulo. Roca. p 804-840, 1996.
RYAN, C. A. Proteinase inhibitors in plant leaves a biochemical model for pest-
induced natural plant protection. TIBS, july 1978. p. 148-50.
RYAN, C.A. Genes for improving defences against insects and pathogens. Annu.
Rev. Phytopathol., 92: 245-449, 1990.
82
RYMERSON, R.T., e BODNARYK, R.P. Gut proteinase activity in insect pests of
canola. Can. Ent. 127: 41-48, 1995.
SAKAL, E.; APPLEBAUM, S. W. & BIRK, Y. Purification and characterization of
Locusta migratoria chymotrypsin. Int. J. Pept. Prot. Res., 32: 590-598, 1988.
SALES, M.P., GERHARDT, J.R., GROSSI-DE-SÁ, M.F., XAVIER-FILHO, J., 2000.
Do legume storage proteins play a role in defending seeds against bruchids? Plant
Physiology 124(2): 515-522.
SANTOS, C. D.; RIBEIRO, a. F. & TERRA W. R. Differential centrifugation, calcium
precipitation and ultrasonic disruption of midgut cells of Erinnyis ello caterpillars.
Purification of cell microvilli and interferences concerning secretory mechanisms.
Canadian J. of Zool., 64: 490-500, 1986.
SCOTT J.G. e WEN Z. M. Cytochromes P
450
of insects: the tip of the iceberg. Pest
Manag. Sci. 57: 958-967, 2001.
SILVA C. P. e XAVIER-FILHO J. Comparison between the levels of aspartic and
cysteine proteinases of the larval midguts of Callosobruchus Maculatus (F.) and
Zabrotes subfasciatus ( Boh.) (Coleoptera: Bruchidae). Comp. Biochem. Physiol.
99B: 529-533, 1991.
SILVA C. P., Terra W. R., De Sá M. F. G., Samuels R. I., Isejima E. M., Bifano T.D.,
Almeida J.S. Induction of digestive - amylases in larvae of zabrotes subfasciatus
(Coleoptera: Bruchidae) in response to ingestion of common bean - amylases
inhibitor 1. J. Insect Physiol. 47: 1283-1290, 2001.
SILVA, F.B., OLIVEIRA, M.G.A., BRUMANO, M.H.N., PIRES, C.V., OLIVEIRA, J.A.,
PILON, A.M., PIOVESAN, N.D., MOREIRA, M.A., 2004. Função bioquímica da via
das lipoxigenases em plantas de soja submetidas ao ataque de mosca branca
(Bemisia argentifolii). Ciência e Agrotecnologia 28(2): 409-416.
SILVA, F.B.; OLIVEIRA, M. G. A.; BATISTA, R.B.; PIRES, C.V.; XAVIER, L.´P.
PIOVESAN, N.D.; OLIVEIRA, J.A.; JOSÉ, I.C.; MOREIRA, M.A. Função fisiológica
de lipoxigenases de folhas de soja submetidas ao ataque de lagarta (Anticarsia
gemmatalis Hübner.) Arquivos do Instituto Biológico, v.69, p.67-74, 2002.
83
SILVA-FILHO, M.C.; FALCO, M.C. Interação planta inseto- Adaptação dos insetos
aos inibidores de proteinases produzidas pelas plantas. Biotecnologia-Ciência e
Desenvolvimento, v.12, p.38-42, 2000.
SIPOS, T. & MERKEL, J. R. An effect of calcium ions on the activity, heat stability,
and structure of trypsin. Biochemistry, 9 (14): 2766-2775, 1970.
SMITH, M. C. Expression, mechanisms and chemistry of resistance in soybean,
Glycine max (L.) Merr. to the soybean looper, Pseudoplusia includens (Walker).
Insect Science and its Application, Nairobi, v. 6, n. 3, p. 243-248, 1985.
SMITH, P.K., KROHN, R.I., HERMANSON, G.T., MALLIA, A.K., GARTNER, F.H.,
PROVENZANO, M.D., FUJIMOTO, E.K., GOEKE, N.M., OLSON, B.J., KLENK,
D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem.,
15:76-85.
SRINIVASAN, GIRI, A.P.; GUPTA, V.S. Structural and functional diversities in
lepidopteran serine proteases. Cellular & Molecular Biology Letters, v.11, p.132-
154, 2006.
TARRAGÓ, M.F.S., SILVEIRA NETO, S., CARVALHO, S., BARBIN, D., 1977.
Influência de fatores ecológicos na flutuação populacional das lagartas da soja,
Anticarsia gemmatalis Hübner e Rachiplusia nu (Guen) em Santa Maria-RS. Anais
da sociedade Entomológica do Brasil 6(2):180-193.
TERRA, W., FERREIRA, C., BAKER, J.E., 1996. Digestive enzymes. In: Lehane, M.
J. and Billingsley, P. F. (eds) Biology of the Insect Midgut. Chapman & Hall,
Cambridge, pp. 206-235, 1996.
TERRA, W.R., FERREIRA, C., 2000. A digestão dos insetos. In: Medeiros, M.A. As
pragas também morrem pela boca. Pesquisa Fapesp 54:.20-27.
TERRA, W.R., FERREIRA, C.; BAKER, J.E. Compartimentalization of digestion. In:
Lehane,M.J.; Billingsley, R.F., Biology of the Insect Midgut. Chapman & Hall,
London, p.206-231,.1996a.
TERRA, W.R.; FERREIRA, C. Insect digestive enzymes: compartimentalization and
function. Comp. Biochem. Physiol., v.109B, p.1-62, 1994.
84
TERRA, W.R.; FERREIRA,, C.; JORDÃO, B.P.; DILON, R.J. Digestive enzymes. In:
Lehane,M.J.; Billingsley, R.F., Biology of the Insect Midgut. Chapman & Hall,
London, p.154-194,.1996b.
THIE N. M. R. e HOUSEMAN J. G. Identification of cathepsin B, D, and H in the
larval midgut of Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata Say
(Coleoptera Chrysomelidae). Insect Biochem. 20: 313-318, 1990.
TIFFIN P. e GAUT B. S. Molecular evolution of the wound-induced serine protease
inhibitor wip 1 in zea and related genera. Mol. Biol. Evol. 18: 2092-2101, 2001.
TIFFIN P. e GAUT B. S. Molecular evolution of the wound-induced serine protease
inhibitor wip 1 in zea and related genera. Mol. Biol. Evol. 18: 2092-2101, 2001.
TOMARELLI, R.M., CHARNEY, J., HARDING, M.L. 1949. Journal Laboratory Clinical
Medical 34: 428.
TROWBRIDGE, C. G.; Krehbiel, A., Laskowshi, M. Jr. Substrate activation of trypsin.
Biochemistry, 2 : 843-50, 1963.
VALUEVA, T.A., MOSOLOV,V.V., 2004. Role of inhibitors of proteolytic enzymes in
plant defense against phytopathogenic microorganisms. Biochemistry 69 (11):
1305-1309.
VISOTTÔ, L.E. Viçosa: FUNÇÃO BIOQUÍMICO-CINÉTICA E FISIOLÓGICA DE
ENZIMAS DIGESTIVAS PRODUZIDAS PELA MICROBIOTA PRESENTE NO
TRATO INTESTINAL DE Anticarsia gemmatalis ENVOLVIDAS NO MECANISMO
DE INTERAÇÃO PLANTA-INSETO. UFV, 2007. 88p. Dissertação (Doutorado em
Bioquimica Agricola)-Universidade Federal de Viçosa, 2007.
VOLPICELLA, M.; CECI, L.R.; CORDEWENER, J.; AMERICA,T.; GALLERANI, R.;
BODE, W.; JONGSMA, M.A.; BEEKWILDER, J. Properties of purified gut trypsin
from Helicoverpa zea, adapted to proteinase inhibitors. Eur. J. Biochem., v.270,
p.10-19, 2003.
WAGNER, W.; MÖHRLEN, F. & SCHNETTER, W. Characterization of the proteolytic
enzymes in the midgut of the European Cockchafer, Mellontha melolontha
(Coleoptera: Scarabaeidae). Insect Biochem. Mol. Biol., 32: 803-814, 2002.
85
WALLING, L.L., 2000. The myriad plant responses to herbivores. Journal of Plant
Growth Regulation 19(2): 195-216.
WATERS, D.J., BARFIELD, C.S., 1989. Larval development and consumption by
Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) fed various legume species.
Environmental Entomology 18(6): 1006-1010.
WATSON, J.R., 1916. Life history of the velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis
Hübner). Journal of Economic Entomology 9: 521-528.
WHITAKER, J. R. Principles of enzimology for the food sciences. New York: M.
Dekker, 1994. 625 p.
WILLE, J.E., 1943. Entomologia Agricola del Peru. Estacion Experimental Agricola
de la Molina. 468p.
WILSON, I.; VOGEL, J. & SOMERVILLE, S. Signalling pathways: A common theme
in plants and animals? Current Opinion in Biol., 7 (3): 175-178, 1997.
WOLFSON, J.L., Murdock, L.L. Suppression of larval Colorado potato beetle growth
and development by digestive proteinase inhibitors. Entomologia Exp. Appl.. 44:
235-240, 1987.
WOLFSON, J.L., Murdock, L.L.. Diversity in digestive proteinase activity mong
insects. J. Chem. Ecol. 16: 1089-1102, 1990.
XAVIER, L.P. Viçosa: Caracterização Bioquímica de Proteases do Intestino de
Anticarsia gemmatalis Envolvidas no Mecanismo de Interação Planta-Inseto. UFV,
2002. 84p. Dissertação (Mestrado em Agroquímica)-Universidade Federal de
Viçosa, 2002.
XAVIER, L.P.; OLIVEIRA, M.G.A.; GUEDES, R.N.C.; SANTOS, A.V. & DE SIMONE,
S.G. Trypsin-like activity of membrane-bound midgut proteases from Anticarsia
gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae). Europ Journal of Biochem., 102: 147-153,
2005.
XAVIER-FILHO, J. & CAMPOS, F. A. P. Proteinase inhibitors. In CHEECKE, P. R.
(Ed) Toxicants of Plant Origin. Boca Raton, CCR Press. v. 3, 1-27, 1989.
86
ZANGERL A. R. Furanocoumarin induction in wild parsnip: evidence for a induced
defense against herbivores. Ecology. 71: 1926-1936, 1990.
ZHAO, Y., Botella, M.A., Subramanian, L., Niu, X.M., Nielsen, S.S., Bressan, R.A.
and Hasegawa, P.M. Two wound-inducible soybean cysteine proteinase inhibitors
have greater insect digestive proteinase inhibitory activities than a constitutive
homolog. Plant Physiol. 111: 1299–1306, 1996.
ZHU-SALZMAN, K., Koiwa,H., Salzman, R.A., Shades, R.E. e Ahn, J.E. 2003.
Cowpea bruchid Callosobruchus maculatus uses a three-component strategy to
overcome a plant defensive cysteine protease inhibitor. Insect Mol. Biol.. 12(2):
135-145.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
