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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
RENATA PASCOAL ILLANES
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE
CONFIRMAÇÃO PARA ESTERÓIDES ANABOLIZANTES
ENDÓGENOS POR CG/C/EMRI.
ESTEROIDAL E
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
RENATA PASCOAL ILLANES
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE
CONFIRMAÇÃO PARA ESTERÓIDES ANABOLIZANTES
ENDÓGENOS POR CG/C/EMRI.
ESTUDO PILOTO DO PERFIL
ESTEROIDAL E
NDÓGENO DA POPULAÇÃO BRASILEIRA
RIO DE JANEIRO
2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE
CONFIRMAÇÃO PARA ESTERÓIDES ANABOLIZANTES
ESTUDO PILOTO DO PERFIL
NDÓGENO DA POPULAÇÃO BRASILEIRA
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RENATA PASCOAL ILLANES
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE CONFIRMAÇÃO PARA
ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ENDÓGENOS POR CG/C/EMRI.
ESTUDO PILOTO DO PERFIL ESTEROIDAL ENDÓGENO DA POPULAÇÃO
BRASILEIRA
Dissertação de mestrado apresentada ao programa
de Pós-graduação em Química do Instituto de
Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ), como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Orientador: Professor Dr. Henrique Marcelo Gualberto Pereira
Rio de Janeiro
2009
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I 29 Illanes, Renata Pascoal.
Desenvolvimento e validação de método de confirmação para
esteróides anabolizantes endógenos por CG/C/EMRI. Estudo
piloto do perfil esteroidal endógeno da população brasileira /
Renata Pascoal Illanes. 2009
X, 131f.: il.
Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Instituto de Química, Rio de Janeiro, 2009.
Orientador: Henrique Marcelo Gualberto Pereira
1. Controle de dopagem. 2. Cromatografia gasosa/combustão/
espectrometria de massas por razão isotópica. 3. Esteróides
anabolizantes endógenos. 4. Método de confirmação. 5. Validação.
6. Perfil endógeno. I. Pereira, Henrique Marcelo Gualberto
(Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de
Química. III. Título.
CDD: 547.73
Renata Pascoal Illanes
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE CONFIRMAÇÃO PARA
ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ENDÓGENOS POR CG/C/EMRI.
ESTUDO PILOTO DO PERFIL ESTEROIDAL ENDÓGENO DA POPULAÇÃO
BRASILEIRA
Dissertação de mestrado apresentada ao programa
de Pós-graduação em Química do Instituto de
Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ), como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Aprovada por:
________________________________________________________
Prof. Dr. Henrique Marcelo Gualberto Pereira (Orientador – IQ/UFRJ)
________________________________________________________
Prof. Dr. Francisco Radler de Aquino Neto (IQ/UFRJ)
________________________________________________________
Profa. Dra. Monica Costa Padilha (NPPN/UFRJ)
________________________________________________________
Dra. Silvana do Couto Jacob (INCQS/Fiocuz)
Rio de Janeiro, 7 de agosto de 2009.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Henrique Marcelo Gualberto Pereira, por todos os
conselhos e pela contribuição fundamental a minha formação científica, expandindo
significativamente os horizontes de meu conhecimento técnico inicial.
Ao Prof. Dr. Francisco Radler de Aquino Neto, pela oportunidade ímpar de
aprendizado ao participar de um grupo de pesquisas como o LADETEC e por toda a
estrutura fornecida para a realização deste trabalho.
A Profª. Dra. Monica Costa Padilha e sua equipe da triagem IV, por todo o
apoio e pela realização das análises do perfil esteroidal das amostras envolvidas
neste estudo.
Aos componentes da triagem II Vinícius Sardela, Mariani das Neves e Letícia
Coli, assim como a todos os companheiros do LAB DOP pelo auxílio e
disponibilidade constantes.
A Profª. Dra. Débora de Almeida Azevedo pela oportunidade de desenvolver
meu projeto no LAGOA, assim como aos demais componentes do LAGOA, pelo
apoio e convívio diários.
A todos os integrantes do grupo LADETEC que participaram de forma direta
ou indireta para a realização deste trabalho.
As queridas amigas Giselle Oliveira, Thaís Reis, Telma Fagundes, Samantha
Soares, Alessandra Araújo, Tatiana Vidal, Viviane Araújo e Fernanda Caldas pelo
companheirismo, apoio e incentivo constantes.
Aos amigos da PGQ Wagner Cabral, Jéssica Vicente, Dayse Bastos, Prof.
Ademário Íris, Otávio Maioli, Daniel Bastos, Elisângela Santos e Aline Campos, por
todos os momentos compartilhados.
Aos voluntários deste estudo, pelo espírito de cooperação científica.
Aos amigos que sempre acreditaram em mim, mesmo nos momentos em que
o mestrado representava apenas uma meta distante.
A minha mãe Teresinha Pascoal, por ter feito tudo o que estava ao seu
alcance para que eu chegasse até aqui.
Ao meu noivo Gustavo Tormena, meu maior incentivador e motivador nesta e
em todas as próximas empreitadas de minha vida.
“É melhor tentar e falhar,
que preocupar-se e ver a vida passar.
É melhor tentar, ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias frios em casa me esconder.
Prefiro ser feliz embora louco,
que em conformidade viver.”
MARTIN LUTHER KING
RESUMO
ILLANES, Renata Pascoal. Desenvolvimento e validação de método de
confirmação para esteróides anabolizantes endógenos por CG/C/EMRI. Estudo
piloto do perfil esteroidal endógeno da população brasileira. Rio de Janeiro,
2009. Dissertação (Mestrado em Química) - Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009
O presente trabalho buscou desenvolver e validar um método de confirmação
de esteróides anabolizantes endógenos por cromatografia gasosa acoplada ao forno
de combustão e à espectrometria de massas por razão isotópica (CG/C/EMRI). O
desenvolvimento do método de confirmação foi baseado na adaptação da
contribuição de Maître et al. O método desenvolvido foi validado à luz das Normas
Internacionais para Laboratório da WADA, sendo posteriormente empregado nos XV
Jogos Pan-americanos em amostras declaradas como atípicas por perfil esteroidal.
Através do emprego desta técnica foi possível a identificação de um resultado
analítico adverso que resultou em retirada de medalha. Além disso, foi realizado um
estudo piloto do perfil endógeno da população brasileira, que envolveu a análise de
104 amostras oriundas de voluntários não-atletas saudáveis do sexo masculino. A
importância deste estudo está na diversidade genética da população brasileira e na
ausência de dados disponíveis sobre a mesma. Esses resultados foram comparados
com 55 resultados oriundos de amostras atípicas dos Jogos Pan-americanos a fim de
avaliar a adequação dos critérios utilizados atualmente para o envio de amostras
para análise de confirmação por CG/C/EMRI. Este estudo revelou diferenças
significativas entre as duas populações. No entanto, é necessário ampliar o número
de amostras para uma avaliação mais efetiva destas diferenças, assim como analisar
as amostras dos voluntários por CG/C/EMRI para o estabelecimento de valores
típicos de δ
13
C da população brasileira.
Palavras-chave: Controle de dopagem, cromatografia gasosa/combustão/
espectrometria de massas por razão isotópica, esteróides anabolizantes endógenos,
método de confirmação, validação, perfil endógeno.
ABSTRACT
ILLANES, Renata Pascoal. Desenvolvimento e validação de método de
confirmação para esteróides anabolizantes endógenos por CG/C/EMRI. Estudo
piloto do perfil esteroidal endógeno da população brasileira. Rio de Janeiro,
2009. Dissertação (Mestrado em Química) - Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009
This study aimed to develop and to validate a method for confirmation of
anabolic endogenous steroids by gas chromatography coupled to a combustion oven
and isotope ratio mass spectrometry (GC/C/IRMS). The development of the
confirmation method was based on the contribution from Maître et al. The method
was validated in the light of the International Standard for Laboratories from WADA
and subsequently applied in the XV Pan American Games in samples reported as
atypical by steroid profile. By using this technique it was possible to identify an
adverse analytical finding that led to withdrawal of medal. Furthermore, there was
realize a pilot study of the endogenous profile of the Brazilian population, that
involved the analysis of 104 samples from volunteer non-athletes healthy males. The
importance of this study is related to the genetic diversity of the Brazilian population
and in the absence of available data on it. These results were compared with results
from 55 atypical samples of the Pan American Games in order to valuate the
adequacy of the criteria currently used for sending samples for analysis for
confirmation by GC/C/IRMS. This study showed significant differences between the
two populations. However, it is necessary to increase the number of samples for a
more effective evaluation of these differences as well as to analyse the samples from
volunteers by GC/C/IRMS to the establishment of typical values of δ
13
C of the
Brazilian population.
Keywords: Doping control, gas chromatography/combustion/isotope ratio mass
spectrometry, endogenous anabolic steroids, confirmation method, validation,
endogenous profile.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Resultados analíticos adversos reportados no ano de 2007 pelos
laboratórios acreditados pela Agência Mundial Antidopagem. Distribuição por classes
farmacológicas reportadas. ....................................................................................... 21
Figura 2. Resultados analíticos adversos de agentes anabolizantes reportados pelos
laboratórios acreditados pela Agência Mundial Antidopagem no ano de 2007.
Comparação entre casos pelo abuso de agentes endógenos e exógenos. .............. 21
Figura 3. (A) Estrutura geral dos esteróides; (B) Fórmula estrutural da molécula de
testosterona, explicitando a classificação dos aneis A,B,C e D. ............................... 22
Figura 4. Ilustração de um corte transversal da glândula adrenal. ............................ 23
Figura 5. (A) Metabolismo do anel A: redução nas posições 5α e 5β de 3-ceto-4-eno-
esteróides; (B) Configuração dos anéis A/B de isômeros 5α e 5β. ........................... 25
Figura 6. Esquema simplificado do metabolismo dos esteróides endógenos.
Formação da testosterona e metabólitos a partir do colesterol. ................................ 26
Figura 7. Sistemática da análise do perfil endógeno. Diagnóstico e gerenciamento de
resultados atípicos para perfil endógeno alterado. ................................................... 30
Figura 8. Ilustração com exemplos típicos de valores de δ
13
C agrupados de acordo
com sua origem ao longo da escala abundância natural de
13
C.. ............................. 33
Figura 9: Representação de um sistema CG/C/EMRI............................................... 36
Figura 10: Método de preparo de amostras para análise por CG/C/EMRI (Maître et
al., 2004). .................................................................................................................. 40
Figura 11. Esquema do preparo de amostras para análise por CG/C/EMRI. ........... 51
Figura 12. Teste de vazamento do sistema: (A) Válvula de backflush aberta e (B)
Válvula de backflush fechada. .................................................................................. 57
Figura 13. Teste de vazamento do sistema: Avaliação da transferência. ................. 57
Figura 14. Avaliação do desvio padrão entre pulsos de CO
2
. ................................... 58
Figura 15. Avaliação da intensidade máxima do sinal de CO
2
de referência. ........... 59
Figura 16. Cromatograma de massas de um padrão de alcanos onde estão
identificados os pulsos de CO
2
da corrida (1) e os alcanos C
16
-C
22
. ........................ 60
Figura 17. Resultados de uma série histórica de C
21
. ............................................... 60
Figura 18. Cromatograma de um controle da qualidade dos esteróides acetilados: 19-
noretio (1), Etio (2), And (3), Bdiol (4), Adiol (5), 11-cetoetio (6) e PD (7). Os pulsos
de CO
2
estão indicados em (8). ................................................................................ 62
Figura 19. Cromatograma da fração 2 do controle de qualidade negativo, contendo:
acetato de etiocolanolona (2) e acetato de androsterona (3). ................................... 65
Figura 20. Cromatograma da fração 3 do controle da qualidade negativo, contendo:
acetato de 5β-androstanodiol (4), acetato de 5α-androstanodiol (5), acetato de
pregnanodiol (7) e pulsos de CO
2
(8). ....................................................................... 65
Figura 21. Cromatograma da fração 2 de uma amostra, onde estão indicados:
acetato de etiocolanolona (2), acetato de androsterona (3) e pulsos de CO
2
(8). .... 68
Figura 22. Cromatograma da fração 3 de uma amostra, onde estão indicados:
acetato de 5β-androstanodiol (4), acetato de 5α-androstanodiol (5), acetato de
pregnanodiol (7) e pulsos de CO
2
(8). ....................................................................... 68
Figura 23. Resultados para avaliação do arraste da fração 2. Comparação entre os
valores de δ
13
C entre controles negativos (QC NEG) e controles positivos (QC POS)
injetados consecutivamente. ..................................................................................... 69
Figura 24. Resultados para avaliação do arraste da fração 3. Comparação entre os
valores de δ
13
C entre controles negativos (QC NEG) e controles positivos (QC POS)
injetados consecutivamente. ..................................................................................... 70
Figura 25. Resultados de precisão intermediária da Etiocolanolona: (A) QC negativo;
(B) QC positivo. ......................................................................................................... 71
Figura 26. Resultados de precisão intermediária da Androsterona: (A) QC negativo;
(B) QC positivo. ......................................................................................................... 72
Figura 27. Resultados de precisão intermediária do 5β-androstanodiol: (A) QC
negativo; (B) QC positivo. ......................................................................................... 73
Figura 28. Resultados de precisão intermediária do 5α-androstanodiol: (A) QC
negativo; (B) QC positivo. ......................................................................................... 74
Figura 29. Resultados de precisão intermediária do pregnanodiol: (A) QC negativo;
(B) QC positivo. ......................................................................................................... 75
Figura 30. Resultados de robustez da etiocolanolona. ............................................. 77
Figura 31. Resultados de robustez da androsterona. ............................................... 78
Figura 32. Resultados de robustez do 5β-androstanodiol. ........................................ 78
Figura 33. Resultados de robustez do 5α-androstanodiol. ....................................... 79
Figura 34. Resultados de robustez do pregnanodiol. ................................................ 79
Figura 35. Resultados de linearidade da Etiocolanolona.. ........................................ 81
Figura 36. Resultados de linearidade da Androsterona.. .......................................... 82
Figura 37. Resultados de linearidade da Androsterona. ........................................... 83
Figura 38. Estudo de linearidade dos esteróides da fração 2: acetato de
etiocolanolona (2) e acetato de androsterona (3). .................................................... 83
Figura 39. Resultados de linearidade do 5β-androstanodiol. .................................... 84
Figura 40. Resultados de linearidade do 5α-androstanodiol. .................................... 85
Figura 41. Resultados de linearidade do Pregnanodiol............................................. 86
Figura 42. Distribuição das concentrações de androsterona em 104 voluntários não-
atletas. ...................................................................................................................... 88
Figura 43. Distribuição das concentrações de etiocolanolona em 104 voluntários não-
atletas. ...................................................................................................................... 88
Figura 44. Distribuição das concentrações de 5α-androstanodiol em 104 voluntários
não-atletas. ............................................................................................................... 89
Figura 45. Distribuição das concentrações de 5β-androstanodiol em 104 voluntários
não-atletas. ............................................................................................................... 89
Figura 46. Distribuição das concentrações de pregnanodiol em 104 voluntários não-
atletas. ...................................................................................................................... 90
Figura 47. Distribuição das concentrações de DHEA em 104 voluntários não-atetas.
.................................................................................................................................. 90
Figura 48. Distribuição das concentrações de testosterona em 104 voluntários não-
atletas. ...................................................................................................................... 91
Figura 49. Distribuição das concentrações de epitestosterona em 104 voluntários
não-atletas. ............................................................................................................... 91
Figura 50. Distribuição da razão T/E em 104 voluntários não-atletas. ...................... 93
Figura 51. Distribuição da razão And/Etio em 104 voluntários não-atletas. .............. 93
Figura 52. Distribuição da razão Adiol/Bdiol em 104 voluntários não-atletas. ........... 94
Figura 53. Distribuição das concentrações de androsterona das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de
2007. ......................................................................................................................... 96
Figura 54. Distribuição das concentrações de etiocolanolona das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de
2007. ......................................................................................................................... 96
Figura 55. Distribuição das concentrações de 5α-androstanodiol das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de
2007. ......................................................................................................................... 97
Figura 56. Distribuição das concentrações de 5β-androstanodiol das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-Americanos de
2007. ......................................................................................................................... 97
Figura 57. Distribuição das concentrações de pregnanodiol das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de
2007. ......................................................................................................................... 98
Figura 58. Distribuição das concentrações de DHEA das 55 amostras declaradas
como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007. ... 98
Figura 59. Distribuição das concentrações de testosterona das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de
2007. ......................................................................................................................... 99
Figura 60. Distribuição das concentrações de epitestosterona das 55 amostras
declaradas como atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de
2007. ......................................................................................................................... 99
Figura 61. Distribuição da razão T/E das 55 amostras declaradas como atípicas por
perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007. .............................. 100
Figura 62. Distribuição da razão T/E das 55 amostras declaradas como atípicas por
perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007. A amostra cujo valor
de epitestosterona apresentava-se suprimido foi retirada. ...................................... 100
Figura 63. Distribuição da razão And/Etio das 55 amostras declaradas como atípicas
por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007. ........................ 101
Figura 64. Distribuição da razão Adiol/Bdiol das 55 amostras declaradas como
atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007. ........... 101
Figura 65. Cromatograma da fração 2 da amostra declarada como adversa pelo uso
de testosterona e/ou precursores nos Jogos Pan-americanos do Rio de Janeiro, onde
estão indicados: acetato de etiocolanolona (2), acetato de androsterona (3) e pulsos
de CO
2
(8). .............................................................................................................. 105
Figura 66. Cromatograma da fração 3 da amostra declarada como adversa pelo uso
de testosterona e/ou precursores nos Jogos Pan-americanos do Rio de Janeiro, onde
estão indicados: acetato de 5β -androstanodiol (4), acetato de 5α-androstanodiol (5),
acetato de pregnanodiol (7) e pulsos de CO
2
(8). ................................................... 106
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Resultados analíticos adversos reportados pelos laboratórios acreditados
na Agência Mundial Antidopagem devido ao uso de agentes anabólicos endógenos
em 2007. ................................................................................................................... 22
Tabela 2. Composição da solução de padrão interno. .............................................. 47
Tabela 3. Concentrações utilizadas no estudo de linearidade. ................................. 55
Tabela 4. Condições empregadas na avaliação da robustez. ................................... 77
Tabela 5. Resultados do estudo de linearidade da Etiocolanolona. .......................... 81
Tabela 6. Resultados do estudo de linearidade da Androsterona. ............................ 82
Tabela 7. Resultados do estudo de linearidade do 5β- androstanodiol. ................... 84
Tabela 8. Resultados do estudo de linearidade do 5α-androstanodiol. .................... 85
Tabela 9. Resultados do estudo de linearidade do Pregnanodiol. ............................ 86
Tabela 10. Resultados de δ
13
C (‰) para os esteróides androsterona, etiocolanolona,
5α-androstanodiol, 5β-androstanodiol e pregnanodiol da amostra declarada como
adversa pelo uso de testosterona e/ou precursores nos Jogos Pan-americanos do
Rio de Janeiro. ........................................................................................................ 106
ABREVIAÇÕES
δ
13
C
Delta de Carbono 13
And Androsterona
Adiol
5α-androstanodiol
Bdiol
5β-androstanodiol
CG Cromatografia Gasosa
CG/C/EMRI Cromatografia Gasosa acoplada ao
forno de combustão e à Espectrometria
de Massas por razão isotópica
CG/EM Cromatografia Gasosa acoplada à
Espectrometria de Massas
COB Comitê Olímpico Brasileiro
DHEA Deidroepiandrosterona
DHT Diidrotestosterona
DP Desvio padrão
E Epitestosterona
EAA Esteróides anabolizantes androgênicos
EEA Esteróides endógenos androgênicos
EFS Extração por fase sólida
Etio Etiocolanolona
IE Ionização por elétrons
FSH Hormônio folículo-estimulante
GnRH Hormônio gonadotrópico hipotalâmico
ICSH Hormônio de estimulação de célula
intersticial
ISL
International Standard for Laboratories,
Norma internacional para laboratórios
INMETRO
Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial
LH Hormônio luteinizante
LQ Limite de quantificação
Mix A
Mistura padrão de n-alcanos (C
16
-C
30
) do
Laboratório de Biogeoquímica da
Universidade de Indiana (EUA)
PD Pregnanodiol
PI Padrão interno
QC NEG Controle da qualidade negativo
QC POS Controle da qualidade positivo
RAA Resultado analítico adverso
RAT Resultado atípico
T Testosterona
Wada, AMA
World Anti-doping Agency, Agência
Mundial antidopagem
ESTRUTURAS DOS COMPOSTOS CITADOS
HO
H
O
O
11-cetoetiocolanolona
(5β
ββ
β-androstan-3α
αα
α-ol-11,17-
diona)
HO
H
O
19-noretiocolanolona
5β
ββ
β-androstan-3α
αα
α-ol-17-ona)
HO
H
OH
5α
αα
α-androstanodiol
(5α
αα
α-androstan-3α,
α,α,
α,17β
ββ
β-diol)
HO
H
OH
5β
ββ
β-androstanodiol
(5β
ββ
β-androstano-3α,
α,α,
α,17β
ββ
β-diol)
O
O
Androstenodiona
(4-androsteno-3,17-diona)
HO
H
Androstenol
(16,(5α
αα
α)-androsten-3α
αα
α-ol)
HO
H
O
Androsterona
(5
α
-androstan-3
α
-ol-17-ona)
HO
Colesterol
(5-colesten-3β
ββ
β-ol)
HO
O
Deidroepiandrosterona
(DHEA)
(5-androsten-3β
ββ
β-ol-17-ona)
H
OH
O
Diidrotestosterona (DHT)
(5
α
αα
α
-androstan-17
β
ββ
β
-ol-3-ona)
O
OH
Epitestosterona
(4-androsten-17α
αα
α-ol-3-ona)
HO
H
O
Etiocolanolona
(5
β
ββ
β
-androstan-3
α
-ol-17-ona)
OH
HO
H
Pregnanodiol
(5β
ββ
β-pregnano-3α
αα
α, 20α
αα
α-diol)
HO
H
OH
OH
Pregnanotriol
(5β
ββ
β-pregnano-3α
αα
α,17α,
α,α,
α,20α
αα
α-triol)
O
HO
Pregnenolona
(5-pregnen-3α
αα
α-ol-20-ona)
O
O
Progesterona
(4-androsteno-3,20-diona)
O
OH
Testosterona
(4-androsten-17β
ββ
β-ol-3-ona)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... ...20
1.1 CONTROLE DE DOPAGEM NO ESPORTE .................................................... 20
1.2 ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ANDROGÊNICOS ..................................... 22
1.2.1 Biossíntese dos esteróides androgênicos .................................................. 23
1.2.2 Metabolismo dos Esteróides Endógenos Androgênicos (EEA).................. 24
1.2.3 Atividades farmacológicas ......................................................................... 26
1.3 ABUSO DE ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ENDÓGENOS ........................ 27
1.3.1 Esteróides endógenos androgênicos ......................................................... 27
1.3.2 Perfil esteroidal endógeno – Comparação inter-indivíduos ........................ 28
1.3.3 Perfil esteroidal endógeno – Comparação intra-indivíduo ......................... 30
1.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A FORNO DE COMBUSTÃO E À
ESPECTROMETRIA DE MASSAS POR RAZÃO ISOTÓPICA .............................. 31
1.4.1 Princípios da técnica de razão isotópica .................................................... 32
1.4.2 Relação entre os mecanismos de fixação do CO
2
nas plantas e o controle
de dopagem ........................................................................................................ 33
1.4.3 Sistema CG/C/EMRI .................................................................................. 35
1.4.4 Preparação de amostra para a análise de esteróides por CG/C/EMRI –
Revisão da literatura ........................................................................................... 36
1.4.5 Proposta de análise de esteróides endógenos segundo Maître et al. ........ 39
1.4.6 Critérios para interpretação de resultados obtidos por CG/C/EMRI ........... 40
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 42
3 EXPERIMENTAL ................................................................................................... 43
3.1 ACREDITAÇÕES E GARANTIA DA QUALIDADE ........................................... 43
3.2 PADRÕES DE REFERÊNCIA .......................................................................... 43
3.3 SOLVENTES E REAGENTES ......................................................................... 44
3.4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ..................................................................... 44
3.5 PREPARO DE SOLUÇÕES ............................................................................. 45
3.5.1 Soluções utilizadas nas análises de esteróides por CG/EM e por
CG/C/EMRI ......................................................................................................... 45
3.5.2 Soluções utilizadas nas análises de esteróides por CG/EM ...................... 46
3.5.3 Soluções utilizadas nas análises de esteróides por CG/C/EMRI ............... 47
3.6 COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ................................................................ 47
3.7 ANÁLISE DE ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ANDROGÊNICOS EM URINA
POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS ................................................................................................................ 48
3.7.1 Preparação de amostras para análise no sistema CG/EM ........................ 48
3.7.2 Condições cromatográficas empregadas no sistema CG/EM .................... 49
3.8 ANÁLISE DE ESTERÓIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA GASOSA
ACOPLADA A FORNO DE COMBUSTÃO ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS POR RAZÃO ISOTÓPICA ...................................................................... 49
3.8.1 Composição dos lotes analíticos ................................................................ 49
3.8.2 Preparação de amostras para análise no sistema CG/C/EMRI. ................ 50
3.8.3 Condições cromatográficas empregadas no sistema CG/C/EMRI ............ 52
3.9 PROCEDIMENTOS PRÉ-ANÁLISE ................................................................. 52
3.10 ANÁLISE DE ALCANOS ................................................................................ 53
3.11 ANÁLISE DE MISTURA DE ESTERÓIDES ACETILADOS ............................ 53
3.12 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ............................................................................ 54
3.12.1 Especificidade .......................................................................................... 54
3.12.2 Interferência de matriz ............................................................................. 54
3.12.3 Arraste ..................................................................................................... 54
3.12.4 Precisão intermediária ............................................................................. 54
3.12.5 Robustez .................................................................................................. 55
3.12.6 Limite de quantificação (LQ) .................................................................... 55
3.12.7 Linearidade .............................................................................................. 55
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 56
4.1 PROCEDIMENTOS PRÉ-ANÁLISE ................................................................. 56
4.1.1 Teste de vazamento do sistema ................................................................ 56
4.1.2 Teste de estabilidade do sistema ............................................................... 57
4.2 ANÁLISE DE MISTURA DE ESTERÓIDES ACETILADOS .............................. 61
4.3 DESENVOLVIMENTO DA METODOLOGIA .................................................... 63
4.4 RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA OBTIDA PARA OS ESTERÓIDES DE
INTERESSE NA MATRIZ ....................................................................................... 64
4.5 VALIDAÇÃO DA MÉTODO .............................................................................. 66
4.5.1 Especificidade ............................................................................................ 67
4.5.2 Interferência de matriz ............................................................................... 68
4.5.3 Arraste ....................................................................................................... 69
4.5.4 Precisão intermediária ............................................................................... 70
4.5.5 Robustez .................................................................................................... 77
4.5.6 Limite de quantificação (LQ) e linearidade ................................................. 80
4.6 ESTUDO PILOTO DO PERFIL ESTEROIDAL ENDÓGENO BRASILEIRO ..... 87
4.6.1 Estudo piloto do perfil esteroidal baseado nas concentrações dos
esteróides de interesse ....................................................................................... 87
4.6.2. Estudo piloto do perfil esteroidal baseado nas razões entre esteróides. .. 92
4.7 PERFIL ESTEROIDAL DAS AMOSTRAS ATÍPICAS POR PERFIL
ENDÓGENO ALTERADO NOS XV JOGOS PAN-AMERICANOS ......................... 95
4.8 ESTUDO DA RAZÃO ISOTÓPICA DE RESULTADOS ATÍPICOS DOS XV
JOGOS PAN-AMERICANOS ............................................................................... 105
5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................... 108
6 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 110
APÊNDICE 1 – Perfil esteroidal dos voluntários ...................................................... 116
APÊNDICE 2 – Amostras com perfis esteroidais atípicos analisadas nos XV Jogos
Pan-Americanos ...................................................................................................... 119
APÊNDICE 3 – Resultados das análises por CG/C/EMRI nos XV Jogos Pan-
americanos .............................................................................................................. 121
ANEXO 1 – Formulário para coleta de amostras de voluntários .............................. 123
ANEXO 2 – Artigo sobre as análises de confirmação de esteróides anabolizantes
endógenos por CG/C/EMRI nos XV Jogos Pan-americanos ................................... 124
20
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONTROLE DE DOPAGEM NO ESPORTE
Segundo a Agência Mundial Antidopagem (World Antidoping Agency, WADA),
considera-se como uma violação ao código do controle de dopagem a utilização de
substâncias ou métodos descritos na Lista de Substâncias Proibidas (Prohibited List,
WADA, 2009). Tais substâncias são capazes de aumentar artificialmente o
desempenho esportivo, podendo ser prejudiciais à saúde do atleta e, com certeza,
contrários ao espírito esportivo (WADA, 2009).
A dopagem contraria os princípios fundamentais do Olimpismo, do esporte e
da medicina do esporte, sendo proibida tanto sua prática, quanto recomendar,
propor, autorizar, relevar ou facilitar o uso de qualquer substância ou método proibido
(COB, 2008).
A cada momento surgem substâncias que são usadas por atletas para o
aumento do rendimento no esporte, incluindo diuréticos, estimulantes, beta-
bloqueadores, glicocorticosteróides, hormônios peptídicos, dentre outros (Prohibited
List, WADA, 2009).
Destacam-se os esteróides anabolizantes androgênios (testosterona e seus
derivados) que são facilmente encontrados no “mercado negro” de diversos países.
(AQUINO NETO, 2001)
De acordo com dados divulgados pela WADA, resultados referentes ao ano de
2007 mostram que 223.998 amostras foram analisadas pelos laboratórios
acreditados pela entidade. Aproximadamente 2% destas resultaram em Resultados
Analíticos Adversos (RAA) (WADA, 2008).
Associando cada RAA gerado à respectiva classe farmacológica, como
apresentado na lista de substâncias proibidas, constata-se que os agentes
anabólicos foram a principal classe abusada por atletas, representando
aproximadamente 48% do total de RAA reportados, o que equivale a 2.322 casos. A
segunda classe mais abusada por atletas foram os estimulantes, com 793 casos, o
equivalente a 16% do total de RAA.
A figura 1 apresenta a distribuição dos RAA por classe farmacológica segundo
a classificação da lista de substâncias proibidas da WADA.
21
Figura 1. Resultados analíticos adversos reportados no ano de 2007 pelos laboratórios acreditados
pela Agência Mundial Antidopagem. Distribuição por classes farmacológicas reportadas.
Essa maior incidência do abuso de agentes anabolizantes tem se repetido ao
longo dos anos, o que pode ser explicado pelos aumentos de massa muscular e
agressividade, associados ao uso desses fármacos (MARAVELIAS et al., 2005).
Os agentes anabolizantes são usualmente subdivididos em endógenos e
exógenos. Em 2007, 70% dos RAA reportados pelo uso de agentes anabolizantes
tiveram origem da detecção de esteróides classificados como endógenos (Figura 2).
Figura 2. Resultados analíticos adversos de agentes anabolizantes reportados pelos laboratórios
acreditados pela Agência Mundial Antidopagem no ano de 2007. Comparação entre casos pelo abuso
de agentes endógenos e exógenos.
47,88%
16,35%
11,88%
8,23%
7,40%
5,94%
0,85%
0,56%
0,43%
0,49%
Agentes anabólicos
Estimulantes
Canabinoides
Beta agonistas
Diuréticos e outros agentes
mascarantes
Glicocorticosteróides
Hormônios e substâncias
relacionadas
Beta
-
bloqueadores
Narcóticos
Outros
30,10%
69,90%
Exógenos
Endógenos
22
A tabela 1 apresenta as substâncias endógenas detectadas e reportadas
como RAA pelos laboratórios acreditados na WADA no ano de 2007.
Tabela 1
.
Resultados analíticos adversos reportados pelos laboratórios acreditados na Agência
Mundial Antidopagem devido ao uso de agentes anabólicos endógenos em 2007.
Agente anabólico
Ocorrência
% dentro da classe
Testosterona
1.607
99,01
Prasterona
(DHEA)
7
0,43
6α
-
OH
-
androstenodiona
3
0,18
Etiocolanolona
2
0,12
Androsterona
2
0,12
Precursores de
testosterona
1
0,06
5
-
androstenodiona
1
0,06
Total
1.623
100,00
O grande número de RAA reportados pelo abuso de esteróides anabolizantes
endógenos evidencia a importância do desenvolvimento de métodos e pesquisa
sobre a detectabilidade dessa classe de substâncias proibidas.
1.2 ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ANDROGÊNICOS
Os esteróides formam um grande grupo de compostos lipossolúveis, que têm
uma estrutura básica de 17 átomos de carbono dispostos em quatro anéis não
planares condensados (Figura 3).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Figura 3. (A) Estrutura geral dos esteróides; (B) Fórmula estrutural da molécula de testosterona,
explicitando a classificação dos aneis A,B,C e D.
A
B
23
Os esteróides androgênicos referem-se aos hormônios sexuais masculinos. O
termo androgênico é de origem grega, onde andro significa homem e gennan,
produzir (CUNHA et al., 2004).
Os esteróides anabolizantes androgênicos (EAA) referem-se à classe dos
hormônios sexuais masculinos, promotores e mantenedores das características
sexuais associadas à masculinidade e do status anabólico dos tecidos somáticos.
Constituem-se em um grupo de compostos naturais ou sintéticos formados pela
testosterona (T, Figura 3B) e seus derivados, cuja indicação terapêutica clássica está
associada à situações de hipogonadismo, câncer de mama, osteoporose e outros
quadros de deficiência do metabolismo protêico (LISE et al., 1999; SILVA et al.,
2002).
1.2.1 Biossíntese dos esteróides androgênicos
Os EAA são produzidos pela glândula supra-renal e pelas gônadas. As
glândulas adrenais ou supra-renais são estruturas bilaterais situadas sobre os rins.
São envolvidas por uma cápsula fibrosa, sendo formadas por dois tipos distintos de
tecidos: a medula (parte central), que funciona como uma extensão do sistema
nervoso e o córtex (camada externa), que sintetiza e excreta hormônios esteróides
(Figura 4) (VOET et al., 2002).
Figura 4. Ilustração de um corte transversal da glândula adrenal. Adaptação do original - Universidade
McGill.
24
O córtex produz e excreta uma diversidade de hormônios, sendo dividido em
três zonas, cada uma com características anatômicas específicas. A zona
glomerulosa é responsável pela secreção de hormônios mineralocorticóides, que
regulam a excreção de sal e de água pelos rins. A zona fasciculada é responsável
pela produção dos hormônios glicocorticosteróides, que afetam o metabolismo de
carboidratos, proteínas e de lipídios e influenciam uma grande variedade de outras
funções vitais, incluindo reações inflamatórias e a capacidade de lidar com estresse.
A zona reticular é responsável pela produção dos hormônios sexuais ou esteróides
androgênicos, que afetam o desenvolvimento e a função sexual. No entanto, os
hormônios esteróides são produzidos em pequenas quantidades pelo córtex adrenal.
(SILVA, 2005; VOET et al., 2002).
Nas gônadas, tanto os androgênios como os estrogênios (hormônios sexuais
femininos) são sintetizados pelos testículos e ovários, com o predomínio de
androgênios nos testículos e de estrogênios nos ovários. As células de Leyding nos
testículos produzem aproximadamente 95% da T, principal hormônio androgênico.
Logo, apenas 5% da T circulante são produzidas pelo córtex adrenal (MARQUES et
al., 2003; VOET et al., 2002).
As secreções endócrinas do hipotálamo, hipófise anterior e gônadas controlam
o sistema reprodutor masculino. O hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) do
hipotálamo atua na hipófise anterior para liberar tanto o hormônio folículo-estimulante
(FSH), que estimula a gametogênese, como o hormônio luteinizante, que no sexo
masculino é também denominado hormônio de estimulação de célula intersticial
(ICSH). O ICSH estimula a secreção de androgênios pelas células de Leydig, dentre
os quais, a testosterona (RANG et al., 2001).
A síntese dos hormônios esteróides ocorre a partir do colesterol, fazendo com
que tais hormônios apresentem esqueleto esteroidal. O colesterol forma, após
sucessivas oxidações, a pregnenolona, principal precursor dos hormônios
androgênicos (SILVA et al., 2002).
1.2.2 Metabolismo dos Esteróides Endógenos Androgênicos (EEA)
Durante a cascata metabólica dos esteróides androgênicos, responsável pela
conversão de pregnenolona em T, ocorre também a formação de
25
deidroepiandrosterona (DHEA) e de androstenodiona. Todos esses androgênios são
posteriormente convertidos em testosterona, no fígado. (SILVA et al., 2002).
A etapa principal do metabolismo do anel A de esteróides 3-ceto-4-eno, como
a T, é a redução da dupla ligação entre C4 e C5, catalisada por duas enzimas
diferentes, 5α-redutase e 5β-redutase. Tais reações de fase I promovem a formação
de um centro assimétrico em C5, com configurações 5α e 5β (Figura 5).
O
O
H
O
H
5β
ββ
β-redutase
5α
αα
α-redutase
5α
αα
α-isômero 5β
ββ
β-isômero
H
Configuração 5α
αα
α
(
((
(anéis A/B em posição trans)
H
Configuração 5β
ββ
β
(
((
(anéis A/B em posição cis)
Figura 5. (A) Metabolismo do anel A: redução nas posições 5α e 5β de 3-ceto-4-eno-esteróides; (B)
Configuração dos anéis A/B de isômeros 5α e 5β. Extraído de SCHÄNZER,1997.
Um esquema simplificado do metabolismo dos esteróides a partir do colesterol
é apresentado na Figura 6.
A
B
26
Figura 6. Esquema simplificado do metabolismo dos esteróides endógenos. Formação da testosterona
e metabólitos a partir do colesterol. Adaptação de Saudan et al., 2004.
Cabe destacar que o pregnanodiol (PD) tem como precursor a progesterona.
Portanto, a PD está em um ramo diferente da cascata metabólica quando comparado
a T. Com isso, é possível inferir que o consumo de T não afeta a formação de PD.
Tal fato tem sido usado como argumento para seu uso como marcador do uso de T e
precursores. Tal utilização será discutida de forma mais apropriada no item 1.4.6.
1.2.3 Atividades farmacológicas
As atividades farmacológicas da T, seus precursores e metabólitos ativos são
tipicamente divididas entre os efeitos androgênicos e os efeitos anabólicos.
Os efeitos androgênicos são relacionados especificamente com a função
reprodutora e com o desenvolvimento de características sexuais secundárias.
HO
HO
O
O
O
HO
O
O
O
O
OH
HO
H
O
HO
H
OH
O
H
HO
OH
H
HO
OH
HO
H
Colesterol
Pregnenolona Progesterona Pregnanodiol
DHEA
Androstenodiona Testosterona
Androsterona Etiocolanolona
5α−androstanodiol 5β−androstanodiol
27
Os efeitos anabólicos dizem respeito, de maneira geral, à estimulação do
crescimento e maturação dos tecidos não-reprodutores, influenciando o aumento da
massa muscular, força, velocidade de recuperação dos músculos pós-esforço e
controle dos níveis de gordura corporal. Além disso, o efeito de andrógenos no
cérebro, frequentemente resulta em uma sensação de euforia associada ao aumento
da agressividade. Sendo assim, a atividade anabólica dos esteróides androgênicos
endógenos é a motivação do seu uso com fins profissionais por atletas de vários
níveis, assim como o uso por não-atletas, com fins meramente estéticos (SJÖQVIST
et al., 2008; MARAVELIAS et al., 2005; CUNHA et al., 2004).
1.3 ABUSO DE ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ENDÓGENOS
1.3.1 Esteróides endógenos androgênicos
Quando produzidos pelo organismo humano, os hormônios são, por definição,
endógenos. Desta forma, os esteróides androgênicos biossintetizados a partir do
colesterol são denominados Esteróides Endógenos Androgênicos (EEA). No entanto,
o termo tem sido vulgarmente empregado ao se fazer referência aos esteróides
sintéticos (exógenos), mas com estrutura química idêntica à dos endógenos. Desta
forma, quando diagnosticado o consumo de um fármaco deste tipo, usualmente diz-
se que ocorreu o abuso de um composto endógeno, mesmo que este tenha, a rigor,
origem exógena. (CAWLEY & FLENKER, 2008; BAUME et al., 2006).
Doravante fica pactuado que, nesse trabalho, assim como nos trabalhos
presentes na literatura que versam sobre o abuso de esteróides endógenos para fins
de dopagem, o termo “abuso de esteróides endógenos” faz referência ao uso de
esteróides sintéticos com estrutura idêntica aqueles biossintetizados.
Por apresentarem estrutura indêntica aos de ocorrência natural, a simples
detecção desses esteróides na urina de um atleta não constitui uma violação do
código de controle de dopagem (CATLIN & COWAN, 1992). A necessidade de
estratégias mais elaboradas acabam por tornar a análise mais refinada e de
diagnósticos mais elaborados.
28
1.3.2 Perfil esteroidal endógeno – Comparação inter-indivíduos
O primeiro passo no diagnóstico do abuso de esteróides endógenos está na
quantificação dos mesmos na urina. Os valores encontrados são então comparados
com o que é considerado o perfil esteroidal típico, originado a partir, principalmente,
dos estudos de Manfred Donike e seu grupo de pesquisa (DONIKE et al., 1982 apud
BOWERS, 1999).
O perfil esteroidal urinário está baseado na consideração das concentrações e
razões de vários hormônios, com destaque para a T, epitestosterona (E),
diidrotestosterona (DHT), androsterona (And), etiocolanolona (Etio),
deidroepiandrosterona (DHEA), 5α-androstano-3,17-diol (Adiol) e 5β-androstano-
3,17- diol (Bdiol) (MARECK et al., 2008).
A via metabólica que promove a formação da epitestosterona carece de
elucidação completa (CATLIN et al., 2002, AGUILERA et al., 2002). Entretanto, está
bem estabelecido que a interconversão entre os epímeros T e E não ultrapassa a
5%. Tal premissa torna a razão T/E um dos parâmetros mais estáveis na análise do
perfil endógeno (MARECK-ENGELKE et al., 1993 e 1995).
Alterações dos valores hormonais urinários de um indivíduo em relação aos
valores de referência do perfil esteroidal de um determinado grupo podem indicar a
administração de esteróides anabolizantes sintéticos (MARTINEZ et al., 2003).
Outros fatores podem exercer influência significativa no perfil esteroidal, dentre eles
parâmetros metodológicos tais como eficiência de hidrólise, coeluições, eficiência da
derivatização e interferência de matriz e ação de microorganismos (MARECK et al.,
2008).
Investigações a respeito da estabilidade do perfil esteroidal também
mostraram que os níveis dos hormônios sexuais no plasma e na urina estão
relacionados com a variabilidade genética de grupos diferentes. Tal relação foi
definitivamente demonstrada pelos resultados provenientes da análise realizada por
ocasião dos Jogos Olímpicos de Barcelona, em 1992 (DE LA TORRE et al., 1997).
Os resultados permitiram a visualização da diferença entre as razões T/E de atletas
caucasianos e atletas de origem asiática. Esta diferença genotípica também consiste
num fator que pode influenciar os valores do perfil esteroidal da população brasileira.
Dado o grau de miscigenação notório a essa população em particular, evidencia-se a
29
necessidade do estudo do perfil endógeno dentro deste universo. A literatura carece
de dados a respeito dos valores urinários de referência para essa população.
A comparação dos valores urinários de um indivíduo com os dados do perfil
típico de uma população é denominada de estratégia de comparação inter-
indivíduos. Tal abordagem permite a classificação de uma amostra como suspeita,
gerando, pelas normas da WADA, um resultado atípico (RAT). Entretanto, não
fornece informações suficientes para a geração de um resultado analítico adverso.
Baseada nos relatos da literatura, a WADA normatizou os procedimentos dos
laboratórios por ela acreditados através da divulgação, em 2004, do documento
técnico Reporting and evaluation guidance for testosterone, epitestosterone, T/E ratio
and other endogenous steroids (Guia de comunicação e avaliação para
Testosterona, Epitestosterona, razão T/E e outros esteróides endógenos) -
TD2004EAAS. Tal documento sugere os critérios que indicam quais amostras
merecem investigação adicional por alteração no perfil endógeno após a abordagem
inter-indivíduo. Os critérios são:
• Valor da relação testosterona/epitestosterona (T/E) igual ou superior a 4,
• Concentração de testosterona ou epitestosterona (equivalente à fração
glicuconjugada) superior a 200 ng/mL,
• Concentração de androsterona ou etiocolanolona (equivalente à fração
glicuconjugada) superior a 10.000 ng/mL,
• Concentração de DHEA (equivalente à fração glicuconjugada) superior a 100
ng/mL.
Considera-se ainda que qualquer alteração em outros parâmetros endógenos
que desperte a suspeita do analista é justificativa aceitável para a investigação
adicional de uma determinada amostra.
Desse modo a declaração de um RAA pelo uso de esteróides endógenos está
sujeita a realização de etapas complementares. Atualmente, a complementação
exigida está baseada em duas abordagens distintas que podem ser aplicadas de
modo complementar, como está ilustrado na figura 7:
i) comparação intra-indivíduos
ii) análise por razão isotópica.
30
Figura 7. Sistemática da análise do perfil endógeno. Diagnóstico e gerenciamento de resultados
atípicos para perfil endógeno alterado.
1.3.3 Perfil esteroidal endógeno – Comparação intra-indivíduo
Uma vez a amostra sendo classificada como atípica, quando comparada ao
perfil endógeno da população de referência (estratégia de comparação inter-
indivíduo), uma das possibilidades de investigação complementar é a comparação do
perfil endógeno presente na amostra suspeita com os mesmos parâmetros oriundos
de outras amostras do próprio atleta, obtidas ao longo de um período de tempo pré-
definido.
Em homens, valores individuais da razão T/E tem mostrado variações
inferiores a 30%. Em mulheres, usualmente se observam concentrações baixas de
alguns esteróides urinários, tal como a T e, principalmente a E. Por vezes, essas
concentrações se aproximam do limite de detecção do método de análise. Por esse
motivo, variações típicamente de 60% podem ser encontradas (Technical Document
– TD2004EAAS, 2004).
Uma vez deflagrado, o estudo longitudinal deve ser conduzido de modo a
estabelecer o valor da razão T/E individual basal, a partir de pelo menos 3
resultados, excluindo a amostra suspeita. A média, desvio padrão e coeficiente de
Resultado atípico?
Análise intra-indivíduo
Estudo longitudinal
Procedimentos iniciais de análise.
Avaliação do perfil endógeno.
Abordagem inter-indivíduos
EMRI
Liberação de laudo
negativo para uso de T
ou precursores
SIM NÃO
Resultado analítico adverso?
Liberação de laudo
positivo para uso de T
ou precursores
Indicação para estudo
longitudinal
NÃO
SIM
31
variação devem ser calculados a partir desses 3 valores basais. Se, por ventura, a
razão T/E da amostra suspeita, quando comparada ao valor basal, usando a
avaliação estatística apropriada, for diagnosticada como significativamente diferente,
será caracterizado o uso de T ou precussores, e por conseguinte um RAA.
Na interpretação dos resultados do estudo longitudinal, a comparação entre
valores obtidos a partir dos procedimentos iniciais de análises (fração total) e aqueles
obtidos a partir de métodos de confirmação (fração glicuconjugada) é admissível.
O mesmo procedimento pode ser adotado para quaisquer parâmetros
endógenos além da razão T/E que excedam os intervalos usualmente encontrados
em humanos, inferidos a partir da comparação inter-indivíduos (Technical Document
– TD2004EAAS, 2004).
1.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A FORNO DE COMBUSTÃO E À
ESPECTROMETRIA DE MASSAS POR RAZÃO ISOTÓPICA
As análises usando cromatografia gasosa acoplada a forno de combustão e à
espectrometria de massas por razão isotópica (CG/C/EMRI) têm demonstrado um
grande potencial na identificação da administração de esteróides endógenos. Esta
técnica tem sido amplamente utilizada na complementação dos dados do
procedimento inicial de análise do perfil esteroidal (CAWLEY et al., 2004).
Três áreas de pesquisa importantes envolvendo esteróides endógenos através
da CG/C/EMRI têm sido destacadas:
• Aumento na eficiência dos procedimentos iniciais de análise por CG/EM na
identificação de amostras suspeitas, dentro da maioria das amostras negativas
analisadas pelos laboratórios. Apenas essas amostras seriam submetidas à
confirmação por CG/C/EMRI.
• Investigação da variação natural dos valores de δ
13
C em populações de
diferentes etnias, com o objetivo de estabelecer intervalos de referência,
dando suporte a geração de critérios relacionados à detecção de abuso de
esteróides endógenos por atletas.
• Desenvolvimento da capacidade de confirmação da administração de
esteróides. Embora isto imponha um desafio significativo, investigações
posteriores proverão informação valiosa para o metabolismo de esteróides e
resultarão num avanço no uso das técnicas CG/EM e CG/C/EMRI.
32
1.4.1 Princípios da técnica de razão isotópica
O átomo de carbono (C) apresenta 3 isótopos, denominados
12
C,
13
C e
14
C
que são encontrados na natureza nos percentuais de 98,89%, 1,11% e 10
-10
%,
respectivamente. O isótopo
14
C, menos abundante, é radioativo, apresentando
decaimento a uma taxa constante. Tal característica o torna útil na datação de
materiais tais como os fósseis (FREITAS et al., 2002).
Como
13
C e
12
C são isótopos estáveis, a razão
13
C/
12
C praticamente não se
altera. No entanto, pode sofrer variações devido ao fracionamento isotópico
observado durante os processos biológicos, físicos e químicos. Em geral, adota-se
como padrão de referência o carbonato proveniente da Formação Pee Dee (Pee Dee
Belemnite ou PDB), um molusco fóssil do período Cretáceo encontrado na Carolina
do Sul, Estados Unidos (FREITAS et al., 2002, AGUILERA et al., 1996).
A abundância relativa de isótopos estáveis é, por convenção, referida em
relação ao isótopo mais pesado. Esta convenção é expressa pela notação “delta” e
seus valores são expressos em unidades de percentil ou partes por mil (δ
13
C ‰)
(SESSIONS, 2006).
Os valores de δ
13
C para um determinado analito são calculados de acordo
com a equação 1:
Equação 1:
δ
13
C (‰) = R
amostra
– R
CO2
x 1000
R
CO2
Onde:
R
amostra
= razão isotópica
13
C/
12
C obtida para a amostra;
R
CO2
= razão isotópica
13
C/
12
C obtida para o gás de referência CO
2
.
Valores de δ
13
C positivos representam um enriquecimento do isótopo pesado
em relação ao padrão internacional, enquanto valores negativos representam uma
diminuição da quantidade do isótopo pesado (SESSIONS, 2006). Isto significa que
materiais enriquecidos isotopicamente apresentam maior teor de
13
C e, por
conseguinte, maiores valores de δ
13
C. Por outro lado, valores menores de δ
13
C
representam uma redução no teor do isótopo mais pesado, ocorrendo o chamado
33
“empobrecimento isotópico”. A variação isotópica de alguns grupos pode ser
observada na figura 8.
Figura 8. Ilustração com exemplos típicos de valores de δ
13
C agrupados de acordo com sua origem ao
longo da escala abundância natural de
13
C. Extraída de Meier-Augenstein (1999).
1.4.2 Relação entre os mecanismos de fixação do CO
2
nas plantas e o controle de
dopagem
Todo o carbono das moléculas biológicas é, em última instância, proveniente
do CO
2
fixado através de fotossíntese (SAUDAN et al., 2006). O colesterol, principal
precursor dos esteróides endógenos, não escapa a essa regra.
No tecido das plantas, a principal fonte de variação da relação
13
C/
12
C está
nos diferentes mecanismos de fixação do dióxido de carbono (CO
2
) durante a
fotossíntese. Embora durante o ciclo fotossintético, o fracionamento isotópico seja
pouco expressivo, ele permite classificar os vegetais terrestres em três grupos
distintos: plantas C
3
(vegetações arbóreas de florestas tropicais), C
4
(gramíneas e
ciperáceas) e CAM (orquidáceas e cactáceas), onde apenas os dois primeiros grupos
34
são importantes a esta dissertação devido a seu papel direto ou indireto na dieta
humana. (FREITAS et al., 2002).
Em plantas com fotossíntese C
3
, o CO
2
é reduzido a fosfoglicerato (cuja
molécula tem três átomos de carbono), por uma enzima que discrimina o
13
CO
2.
Nas
plantas de fotossíntese C
4
, o CO
2
é reduzido a ácido aspártico ou málico (com quatro
átomos de carbono nas moléculas), por uma enzima que não discrimina tanto o
13
CO
2.
Isto leva a um maior teor de
13
C nas plantas C
4
do que nas plantas C
3
(FREITAS et al., 2002).
A dieta humana é composta por nutrientes derivados de uma mistura variável
de plantas que seguem os ciclos fotossintéticos C
3
e C
4
. Como a dieta fornece os
componentes essenciais para a esteroidogênese, os hormônios esteróides
apresentam valores de δ
13
C intermediários entre os provenientes dos dois tipos de
plantas (FLENKER et al., 2008). Já o material utilizado na produção de hormônios
sintéticos é tipicamente derivado dos fitoesteróides da soja, uma planta C
3
. Portanto,
esses esteróides terão redução na quantidade de
13
C, apresentando valores de δ
13
C
menores que os dos hormônios naturais. Embora esta diferença na razão isotópica
entre hormônios sintéticos e naturais seja pequena, é a base para a investigação
referente ao abuso de esteróides endógenos por atletas (ROGERSON & TROUT,
1999).
Com relação à influência da dieta, um importante estudo com atletas foi
realizado por Saudan et al. (2006) ao longo de dois anos através do monitoramento
dos valores de δ
13
C dos metabólitos And, Etio e Bdiol, juntamente com PD e
androstenol. Os atletas, residentes na Suíça, passaram de um a dois meses no
Quênia ou na África do Sul, respeitando as dietas locais. O estudo revelou que o
enriquecimento de
13
C causado pela mudança de dieta mostrou-se mais significativo
quanto maior o período de permanência na África, bem como nos primeiros dias de
retorno à Suíça. No entanto, essas alterações dos valores de δ
13
C dos esteróides
analisados não foram suficientes para levar a um resultado falso positivo nas
análises de controle de dopagem. É interessante ressaltar que a influência da dieta
foi observada apenas nas análises por CG/C/EMRI, uma vez que a razão T/E, obtida
por CG/EM, manteve-se inalterada.
35
1.4.3 Sistema CG/C/EMRI
A espectrometria de massas por razão isotópica (EMRI) é uma técnica usada
para a análise isotópica rápida de Hidrogênio (H), Nitrogênio (N), Carbono (C),
Oxigênio (O) e enxofre (S). A técnica consiste na transformação dos analitos por
queima total nos gases H
2
, N
2
, CO
2
, CO e SO
2
, respectivamente. De modo
subsequente, esses gases são analisados em um espectrômetro de massas sensível
à detecção de isótopos (MEIER-AUGENSTEIN,1999).
Um sistema CG/C/EMRI utiliza a cromatografia gasosa como método de
separação, além de uma interface de combustão antes da análise por EMRI (Figura
9). Após a eluição da amostra pela coluna cromatográfica, a mesma sofre oxidação
em forno a 950°C, gerando CO
2
, H
2
O e óxidos de nitrogênio. Dependendo do escopo
da análise, os gases gerados são carreados para um forno de redução a 640°C,
onde os óxidos de nitrogênio são convertidos a nitrogênio gasoso. Nessa etapa, a
água é convertida a H
2
que, juntamente com o CO
2
, são carreados pela fase móvel
para o detector de massas (MEIER-AUGENSTEIN,1999).
Entre os capilares e o forno de oxidação, existe um sistema pneumático
(válvula de backflush) usado para direcionar os efluentes capilares para a fonte do
espectrômetro de massas ou para uma linha de descarte (purga), sendo mantido um
fluxo constante de He em todo o processo (BRAND, 1996).
Para a molécula de CO
2
, são monitorados simultaneamente os sinais dos três
principais íons obtidos a partir dos isótopos de C e O: m/z 44 (
12
C
16
O
16
O), m/z 45
(
13
C
16
O
16
O) e m/z 46 (
12
C
18
O
16
O e
12
C
17
O
17
O). Desta forma, a razão m/z 45/44 reflete
a relação
13
C/
12
C (AGUILERA et al., 1996).
Os gases formados são introduzidos na fonte de íons, operando no modo de
ionização eletrônica. Após a ionização, as espécies ionizadas são aceleradas e
separadas por um analisador de massas do tipo campo magnético, sendo detectadas
por coletores do tipo copo de Faraday, posicionados ao longo do plano focal do
espectrômetro (BRAND, 1996).
36
Figura 9: Representação de um sistema CG/C/EMRI. Adaptada de Meier-Augenstein (2002).
Usualmente, a análise de esteróides endógenos androgênicos requer
equipamentos que apresentem duas particularidades em relação ao hardware:
i) ausência de forno de redução, pois nenhum composto analisado é
nitrogenado;
ii) sistema de detecção com apenas três coletores de Faraday, pois todos os
esteróides são convertidos a CO
2
.
1.4.4 Preparação de amostra para a análise de esteróides por CG/C/EMRI – Revisão
da literatura
Apesar de ter aplicação relativamente recente no escopo do controle de
dopagem, a CG/C/EMRI tem se constituído em uma técnica valiosa, apresentando
avanços sucessivos e importantes, inclusive no que se refere aos métodos de
preparo de amostras.
No primeiro trabalho publicado utilizando a técnica na detecção de esteróides,
Becchi et al. (1994) propuseram um método de confirmação para abuso de T em
amostras que apresentassem resultados da razão T/E > 6, critério utilizado a época
pelo Comitê Olímpico Internacional. Foi possível demonstrar que a administração de
37
T alterava os valores de δ
13
C dos esteróides excretados. O método empregou a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para isolamento da T, Bdiol, DHEA e
colesterol da matriz. Em seguida, as frações sofreram acetilação pela reação com
anidrido acético e piridina, e posterior análise por CG/C/EMRI. Na ocasião foi
proposto um volume de amostra de 50 mL, uma quantidade extremamente alta tendo
em vista que a amostra ainda deve ser submetida a uma série de outros
procedimentos, de modo a cumprir todo o escopo do controle de dopagem. A partir
deste trabalho ficou demonstrado o potencial da CG/C/EMRI na confirmação do
abuso de T.
Em 1996, buscando ampliar o método proposto, Aguilera et al. (1996)
desenvolveram o monitoramento simultâneo de 2 esteróides precursores (colesterol
e androstenodiol) e dois metabólitos (Adiol e Bdiol) da T. O método empregava entre
30 e 40 mL de urina. Nesse trabalho, iniciou-se a discussão sobre a influência de
fatores como dieta, gênero e etnia nos valores de δ
13
C dos hormônios endógenos.
Além disso, a avaliação da razão T/E > 6 mediante comparação com os resultados
de δ
13
C obtidos nas amostras analisadas corroborou com o dado de que, embora
seja um ótimo indicador da administração de T, a razão T/E não pode ser
considerada como um parâmetro definitivo de diagnóstico, evidenciando a
necessidade de investigações adicionais antes da configuração de um RAA.
A diferença entre os valores de δ
13
C
dos androstanodióis e do pregnanodiol
(PD) foi estudada por Shackleton et al. (1997), podendo ser utilizada como eficiente
indicador da administração de T através de seu emprego como referência endógena.
Horning et al. (1997) realizaram estudos de excreção após a administração de
undecanoato de T, que comprovaram a efetividade da CG/C/EMRI como ferramenta
de diagnóstico. Para tal, avaliaram-se os valores de δ
13
C de T e dos metabólitos
Adiol e Bdiol, bem como as taxas de excreção de T e dos metabólitos A, Etio, Adiol e
Bdiol, além da variação dos valores da razão T/E.
Devido às dificuldades técnico-logísticas envolvidas na purificação e
isolamento de analitos por cromatografia líquida, Aguilera et al. (1999) propuseram a
simplificação dos procedimentos visando possibilitar a preparação de um número
maior de amostras em rotina. Duas modificações sugeridas merecem destaque:
i. Diminuição do volume de amostra para 10 mL, promovendo uma economia
considerável de amostra;
38
ii. Substituição da etapa de cromatografia líquida por sucessivas extrações em
fase sólida, promovendo o aumento na velocidade e dinâmica do preparo
amostras simultaneamente.
Balizados por essas idéias, Flenker et al. (1999) descreveram um método com
o objetivo de obter informações para um maior número de esteróides relevantes ao
diagnótico em um mesmo ensaio. Desta forma, obtiveram valores de δ
13
C tanto para
os Adiol e Bdiol como para And e Etio, e pelo menos de uma referência endógena,
PD ou pregnanotriol.
Devido à complexidade intrínseca ao método, as análises de CG/C/EMRI tem
se destinado a um pequeno número de amostras. Na tentativa de quebrar esse
paradigma, Aguilera et al. (2000) propuseram um método de análise extremamente
rápido, destinado a etapa de triagem, compatível com a liberação de um lote analítico
em até 24 horas. Tal abordagem minimalista incluía apenas uma etapa de extrações
em fase sólida. Em contrapartida, o método apresenta sensibilidade adequada
apenas para a detecção de And e Etio, os metabólitos da T excretados em maior
concentração. Segundo o próprio autor, uma desvantagem adicional do método é a
impossibilidade de empregar a estratégia de referência endógena na interpretação
dos resultados.
Uma análise dos artigos publicados sobre os métodos de preparação de
amostras evidencia claramente a existência de duas tendências, a priori,
antagônicas:
i. Métodos que envolvem uma purificação das amostras com CLAE
(preparativa), com ou sem etapas adicionais de extração usando EFS.
ii. Métodos mais simples e rápidos usando exclusivamente EFS e/ou extrações
líquido-líquido (ELL).
Por proporcionarem extratos mais limpos e concentrados, os métodos que
seguem a primeira tendência (i) usualmente são mais abrangentes, sendo capazes
de analisar vários esteróides diferentes, mesmo aqueles que são excretados em
concentrações de poucos ng/mL (AYOTTE et al., 2006; HEBESTREIT et al., 2006).
Tais características trazem como vantagem a maior possibilidade de
caracterização de um RAA por abuso de T ou precursores. Complementarmente, tais
métodos são excelentes ferramentas para a pesquisa em metabolismo de esteróides
usando CG/C/EMRI.
39
Já os métodos que seguem a segunda tendência (ii) são mais rápidos e de
logística mais simples. Entretanto, detectam poucos analitos, basicamente, os
principais metabólitos da T, como And, Etio, Adiol e Bdiol.
Pouco já se discutiu a respeito de protocolos de validação para métodos por
CG/C/EMRI. Aguilera et al. (2001) foram os pioneiros, propondo que os parâmetros
linearidade, precisão do instrumento, repetitividade e reprodutibilidade fossem
avaliados. Estabeleceram ainda um teste de conformidade do sistema como garantia
de que o equipamento estaria adequado às análises diárias e um critério para
aceitação do lote de amostras analisadas. Este trabalho foi uma das bases para a
validação do método proposto nesta dissertação.
1.4.5 Proposta de análise de esteróides endógenos segundo Maître et al.
Maître et al. (2004), realizaram estudo de excreção mediante a administração
de undecanoato de T, aprimorando a metodologia para análise dos metabólitos And,
Etio, Adiol e Bdiol e da referência endógena PD, conforme procedimento
apresentado na figura 10.
O método incluía 3 etapas de extração por fase sólida, sendo a última
responsável pelo fracionamento dos esteróides de interesse de acordo com a
polaridade dos mesmos na forma acetilada.
O método proposto por Maître et al. segue a tendência de uma preparação de
amostra mais simples e rápida. Dada a exigência de liberação de resultados em um
curso prazo observada pelo advento dos XV Jogos Pan Americanos, o método foi
escolhido como base para a implementação da técnica de CG/C/EMRI no LAB DOP
– LADETEC/IQ – UFRJ.
40
Figura 10: Método de preparo de amostras para análise por CG/C/EMRI (Maître et al., 2004).
1.4.6 Critérios para interpretação de resultados obtidos por CG/C/EMRI
Quando um parâmetro do perfil esteroidal indica a necessidade de estudo
posterior, o valor de δ
13
C
expresso em unidades de delta por mil (δ‰) do mesmo ou
de seus metabólitos são medidos e comparados com um esteróide presente na
amostra que não tenha sido, em tese, afetado pela sua administração. Tal estratégia
recebe o nome de referência endógena, visto que uma substância de ocorrência
natural é empregada como controle. A partir da comparação entre os valores de δ
13
C
de um analito e da referência endógena, obtêm-se o chamado “delta do valor de
delta”, ou seja, ∆ δ
13
C. Como estabelecido pela WADA no documento técnico
10 mL de urina
Fração 1 (eluição com
acetonitrila:água, 75:25 e 50:50)
Fração 2 (eluição
com acetonitrila)
Centrifugação (2500 rpm)
EFS – C
18
500mg / eluição com metanol/ Evaporação em atmosfera inerte
Hidrólise enzimática
EFS – C
18
500mg / eluição com acetonitrila
Evaporação em
atmosfera inerte
Derivatização
Evaporação em
atmosfera inerte
Ressuspensão com
acetonitrila:água, 50:50
EFS – C
18
1000mg / Fracionamento
Secagem com
pentóxido de fósforo
Androsterona e
etiocolanolona
5α-androstanodiol,
5β-androstanodiol
e pregnanodiol
41
TD2004EAAS de 2004, quando o ∆ δ
13
C for superior a 3, a diferença é considerada
significativa.
Assim, os resultados serão reportados como consistentes com a
administração de um esteróide.
O pregnanodiol, pregnanotriol, colesterol, 11-hidroxi-androsterona ou 11-
cetoetilcolanolona são alguns exemplos mais comuns de referência endógena
descritos na literatura. Dependendo de qual esteróide se suspeita da administração,
os esteróides analisados podem ser: T, E, And, Etio, Adiol, Bdiol, DHEA, ou qualquer
outro esteróide que se considere relevante (MARECK et al., 2008).
Caso a baixa concentração do esteróide de referência impossibilite sua
medida, a WADA recomenda que o resultado da análise seja reportado como
inconclusivo, a menos que os valores da razão isotópica para os metabólitos sejam
inferiores a - 28‰
(Technical Document – TD2004EAAS, 2004).
Alternativamente, tem sido proposta a comparação dos valores de δ
13
C
de um
determinado esteróide com o intervalo observado para o mesmo esteróide em uma
determinada população. Embora este critério ainda não tenha sido oficialmente
incorporado nas regras da WADA, e por isso não sustente um RAA, essa abordagem
mostra-se útil no diagnóstico dos resultados.
Trabalhos como o de Baume et al. (2006) têm buscado avaliar a variação
intra-individual para os valores de δ
13
C. Flenker et al. (2008) apresentaram os
valores de δ
13
C para uma população de referência de não-usuários de esteróides,
com o objetivo de que estes dados fossem utilizados como suporte na avaliação dos
valores de δ
13
C nas análises de controle de dopagem. O estabelecimento do
intervalo de valores de δ
13
C dos metabólitos de uma população de referência
também são foco do extenso trabalho de Cawley et al. (2008), que realizaram o
estudo do perfil de 1262 amostras, apontando que a variação inter-individual pode
ser esperada mediante fatores como dieta, etnia, gênero e idade, dentro e entre
diferentes populações.
42
2 OBJETIVOS
• Desenvolver, a partir da proposta de Maître et al. (2004), um método analítico
para o diagnóstico do abuso de testosterona e/ou precursores através da
detecção de androsterona, etiocolanolona, 5α-androstanodiol e 5β-androstanodiol
por cromatografia gasosa acoplada a forno de combustão acoplado a
espectrometria de massas por razão isotópica.
• Validar o método proposto a luz das recomendações do International Stardard for
Laboratories da WADA.
• Empregar o método proposto em amostras reais proveniente de atletas
profissionais submetidos ao controle de dopagem dos XV Jogos Pan-
americanos.
• Desenvolver um estudo piloto para a avaliação do perfil endógeno da população
brasileira.
• Avaliar a adequação dos critérios da WADA na caracterização de resultados
atípicos considerando o perfil endógeno da população brasileira.
43
3 EXPERIMENTAL
3.1 ACREDITAÇÕES E GARANTIA DA QUALIDADE
Os procedimentos analíticos descritos na presente dissertação foram
realizados no Laboratório de Controle de Dopagem (LAB DOP), laboratório
associado ao Laboratório de Apoio ao Desenvolvimento Tecnológico (LADETEC)
localizado no Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ). O LAB DOP – LADETEC / IQ – UFRJ é acreditado pela WADA para
realização de controle de dopagem e pela ANVISA para análises em toxicologia
forense. O LAB DOP – LADETEC / IQ – UFRJ possui acreditação do Instituto
Nacional de Metrologia, Qualidade e Normatização (INMETRO) pela norma ABNT
NBR ISO/IEC 17025, fazendo parte da Rede Brasileira de Laboratórios de Ensaio
(RBLE - Inmetro).
Todos os equipamentos, vidrarias e demais materiais volumétricos utilizados
nessa dissertação foram, quando pertinente, calibrados pelo Laboratório de
Calibração (LAB CAL). Esse laboratório também é integrante do LADETEC, sendo
acreditado pelo INMETRO segundo a norma ABNT NBR ISO/IEC 17025 para
Laboratórios da Rede Brasileira de Calibração (RBC).
3.2 PADRÕES DE REFERÊNCIA
Os padrões de referência etiocolanolona, 5α-androstano-3α,17β−diol, 5β-
androstano-3α,17β−diol, 5β-pregano-3α,20α−diol, 11-cetoetiocolanolona e 19-
noretiocolanolona foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).
Androsterona foi obtido da Fluka (Buchs, Suiça). 17α-metiltestosterona foi obtida da
Serva (Heidelberg, NY, EUA). [2,2,4,4-
2
H] etiocolanolona, [2,2,3,4,4-
2
H]
androsterona-glicuronídeo, [16,16,17-
2
H] testosterona e [16,16,17-
2
H]
epitestosterona foram doadas pelo Instituto de Bioquímica da Universidade de
Esportes da Alemanha (Colônia, Alemanha).
A mistura de hidrocarbonetos contendo n-alcanos (C
16
a C
30
) com valores de
δ
13
C certificados foi obtida do Laboratório de Biogeoquímica da Universidade de
Indiana (Bloomington, IN, EUA)
44
3.3 SOLVENTES E REAGENTES
Enzima com atividade
β
-glicuronidase proveniente de E. coli, foi adquirida da
Boehringer Mannheim (Düsseldorf, Alemanha).
N-metil-N-trimetilsililtrifluoracetamida (MSTFA) foi adquirida da Chem Fabrik
(Waldstetten, Alemanha). Iodeto de amônio e etanodiol foram adquiridos da Sigma
Chemical CO (St. Louis, MO, EUA), hidróxido de potássio p.a., pentóxido de fósforo
p.a., fosfato de sódio monobásico monohidratado p.a. e bicarbonato de
potássio p.a. foram adquiridos da Merck (Darmstald, Alemanha).
Acetona com grau pesticida, acetonitrila e metanol com grau HPLC foram
adquiridos da Tedia (Fairfield, OH, EUA) para análise de resíduos. Acetato de etila
com grau HPLC e anidrido acético foram adquiridos da Spectrum Chemical Co.
(Torrance, CA, EUA). Piridina foi adquirida da Merck (Darmstald, Alemanha).
Foi utilizada água bidestilada para o preparo das soluções tampão e solução
de KOH e água deionizada para o preparo das soluções de acetonitrila:H
2
O.
3.4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Para o preparo das amostras nos dois métodos foram utilizados os seguintes
materiais e equipamentos: cartuchos para extração por fase sólida com adsorvente
do tipo C
18
, 500 mg, com capacidade para 3 mL e coluna de sílica fundida Factor
Four (50 % fenil – 50 % metilsiloxano), obtidos da Varian Inc. (Palo Alto, CA, EUA),
extrator para fase sólida – F prep sep 24 – port vacuum manifold, obtido da Fisher
Chemicals (Fairlawn, NJ, EUA), bomba de vácuo Welch – Mod. n°2534B-01, obtida
da Gardner Denver Thomas, Inc. (Niles, IL, EUA), vórtex Maxi Mix II - Barnsted /
Thermolyne (Dubuque, Iowa, EUA) , centrífuga Legend RT, obtida da SORVALL
(Asheville, NC, EUA), banho termostatizado: Pierce Reacti-Therm III - módulo de
aquecimento e Pierce Reacti-vap III - módulo de evaporação, obtidos da Fisher
Chemicals (Fairlawn, NJ, EUA) e pipetas automáticas (0,5-10µL, 10-100 µL, 100-
1000 µL e 500-5000 µL), obtidas da Eppendorf (Hamburg, Alemanha).
Demais equipamentos utilizados: Ultra-som BRANSON – Modelo 3210R-MT
(Danbury, EUA), Estufa – NOVA ÉTICA – Modelo 400-4ND (Vargem Grande
45
Paulista, São Paulo, Brasil), pHmetro – Denver, mod.215 (Arvada, CO, EUA),
densímetro – ATAGO CO. LTD – série 9711050 (Itabachi-Ku, Tokyo, Japão),
balança – SARTORIUS – modelo BP210D – 5 casas decimais (Goettingen,
Alemanha) e balança – DENVER INSTRUMENT COMPANY – modelo AA-200DS
– 4 casas decimais (Denver, Colorado, EUA), geladeira Frost Free metalfrio –
ANTHONY CAT 770 REFLECTIVE – modelo 7000 (São Paulo, SP, Brasil) e
câmara fria a – 20°C para a estocagem das amostras biológicas.
Para a análise do perfil esteroidal foi utilizado um sistema de Cromatografia
Gasosa acoplado a um Espectrômetro de Massas – Modelo 6890-5973, obtido da
AGILENT TECHNOLOGIES (Santa Clara, CA, EUA).
Para a análise da razão isotópica foi utilizado um sistema de cromatografia
Gasosa – Modelo K8880100 acoplado a um forno de combustão GC/CIII – Modelo
Delta/ MAT 252 e a um espectrômetro de massas com detecção por razão
isotópica – Modelo Delta Plus Advantage, obtidos da Thermo Finnigan (Bremen,
Alemanha).
3.5 PREPARO DE SOLUÇÕES
3.5.1 Soluções utilizadas nas análises de esteróides por CG/EM e por CG/C/EMRI
Soluções padrão estoque foram preparadas na concentração de 1 mg/mL em
metanol grau pesticida, a partir de cada padrão de referência. Foram pesados 10
mg do padrão de referência em balança analítica com precisão de 5 casas decimais,
em balão volumétrico de 10 mL e o volume foi completado com metanol
pesticida até a marca de referência. A solução resultante (solução mãe) foi
homogeneizada em vórtex por 20 segundos, armazenada em frasco de vidro âmbar
com tampa e mantida sob refrigeração a - 20°C.
Soluções padrão de trabalho de 10 ng/µL foram preparadas em balão
volumétrico de 10 mL. Adicionou-se quantitativamente 100 µL da solução mãe (1
mg/mL) e o volume foi completado com metanol grau pesticida até a marca de
46
referência. A solução resultante foi homogeneizada em vórtex por 20 segundos e
devidamente armazenada.
Solução tampão fosfato de sódio 0,8 M (pH 7) foi preparada pela
solubilização de 17,6 g de NaH
2
PO
4
H
2
O e 34,6 g de Na
2
HPO
4
em 460 mL de
água destilada à temperatura ambiente. A solução tampão foi armazenada a
temperatura ambiente, em lugar fresco e ventilado, apresentando validade de 3
meses.
Solução de enzima de uso foi preparada a partir da adição de 5 mL de água
destilada ao conteúdo do frasco original onde a enzima é comercializada. A solução
resultante foi transferida para um balão volumétrico de 50 mL e a operação repetida
mais 2 vezes. O balão volumétrico foi avolumado com água destilada até a marca de
referência. A solução foi homogeneizada e armazenada em tubos de plástico com
capacidade para 2 mL em câmara fria.
3.5.2 Soluções utilizadas nas análises de esteróides por CG/EM
Solução tampão carbonato:bicarbonato de potássio 20% (pH 10) foi
preparada pela solubilização de 40,0 g de K
2
CO
3
e 40,0 g de KHCO
3
em 320 mL
de água destilada à temperatura ambiente. A solução tampão foi armazenada a
temperatura ambiente, em lugar fresco e ventilado, apresentando validade de 3
meses.
A solução de KOH 0,5 M foi preparada pela dissolução de 1,4 g de KOH em
50 mL de água destilada, ajustando-se o pH para 12 com solução de HCl 1M. A
solução foi armazenada à temperatura ambiente, apresentando validade de uma
semana.
O controle de hidrólise foi preparado pela adição de 20 µL do padrão interno
conjugado da solução de D5-androsterona- glicuronídeo a cada 2 mL de urina,
obtendo-se uma concentração em urina de 500 ng/mL.
47
Solução de padrão interno (ISTD) foi adquirida do laboratório de controle de
dopagem do Instituto de Bioquímica da Universidade de Esportes de Colônia
(Alemanha) e sua composição está apresentada na tabela 2.
Tabela 2. Composição da solução de padrão interno.
Compostos
Concentração da
solução (µg/mL)
Concentração em
urina (ng/mL)
Etiocolanolona-d4
25
50
17
α
-metiltestosterona
25
100
Testosterona-d3
4,5
250
Epitestosterona-d3 0,75 500
Solução derivatizante mãe foi preparada em um frasco de vidro âmbar com
tampa foram pesados 20mg de NH
4
I e adicionados 1 mL de MSTFA e 60 µL de 2-
mercaptoetanol. O frasco foi tampado, agitado em vórtex por 20 segundos e
aquecido até solubilização total do NH
4
I. O armazenamento foi em dessecador,
com prazo de validade de 15 dias.
Solução derivatizante de uso foi preparada pela transferência de 1 mL da
solução mãe para frasco de vidro âmbar com tampa de vidro esmerilhada, sendo
adicionados 9 mL de MSTFA. O frasco f oi tam pad o, e agitado em vórtex por
20 segundos. O armazenamento foi em dessecador contendo sílica gel azul.
3.5.3 Soluções utilizadas nas análises de esteróides por CG/C/EMRI
Soluções de acetonitrila e água foram preparadas utilizando os solventes
puros (acetonitrila:água) nas seguintes proporções: 35:65, 50:50 e 75:25. As
soluções são preparadas com um volume final de 100 mL.
3.6 COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
As pesquisas que envolvem a participação de indivíduos em seus protocolos
se defrontam com dilemas de ordem ética, cuja solução requer uma reflexão apoiada
48
por preceitos estabelecidos por resoluções e por parte dos pesquisadores. Por isso,
foi criada a Resolução 196/96, que se fundamenta nos principais documentos
internacionais que emanaram declarações e diretrizes sobre pesquisas que
envolvem seres humanos. Além disso, necessitam de aprovação prévia pelo Comitê
de Ética em Pesquisa, alocados em instituições de ensino e pesquisa no território
nacional.
O presente trabalho não envolveu a administração de substâncias para sua
realização, tendo sido analisadas amostras de urina de voluntários brasileiros e
também de atletas profissionais participantes dos XV jogos pan-americanos de 2007.
A geração de urina por voluntários e posterior aproveitamento dos dados
gerados foi garantida pelo processo 168/02 depositado do Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
3.7 ANÁLISE DE ESTERÓIDES ANABOLIZANTES ANDROGÊNICOS EM URINA
POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
3.7.1 Preparação de amostras para análise no sistema CG/EM
A 2 mL de urina foram adicionados 20µL de ISTD e 20µL de D5-androsterona-
glicuronídeo, com agitação em vórtex por 20 segundos. Adicionou-se em seguida
750 µL de tampão fosfato 0,8 M pH 7,0 e 50 µL de
β
-glicuronidase de E. c oli, com
agitação em vórtex por mais 20 segundos. A amostra foi então submetida à
hidrólise por uma hora a 50°C. Foram adicionados 500 µL de solução tampão
carbonato de potássio a 20% pH 9 – 10 e 5 mL de TBME sob agitação por 5
minutos e em seguida centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos. A fase orgânica foi
transferida, com auxílio de pipeta Pasteur, para outro tubo e o solvente foi
evaporado sob fluxo de N
2
a 40°C. Os tubos foram mantidos em dessecador a vácuo
contendo pentóxido de fósforo e lentilhas de hidróxido de potássio por 30 minutos
para posterior derivatização com 100 µL de solução derivatizante de uso e
aquecimento por 20 minutos a 60°C para injeção de 3µL em CGAR-EM.
49
3.7.2 Condições cromatográficas empregadas no sistema CG/EM
As análises de agentes anabólicos em urina humana foram realizadas em um
sistema de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM)
Agilent (Palo Alto, EUA) equipado com um injetor automático modelo 7683 com
controle eletrônico de pressão. Temperaturas de operação do detector de massas
quadrupolar modelo 5973; linha de transferência, 280°C; fonte iônica, 220°C;
interface, 280 °C; quadrupolo, 150 °C. Detecção por monitoramento seletivo de íons
com um tempo de varredura de 20 milisegundos. Ionização por impacto de elétrons
a 70 eV. Condições de operação do cromatógrafo modelo 6890: Injetor, 280 °C;
coluna, 140 °C (temperatura inicial, 0 min) gradiente de 40 °C/min até 180 °C; 3,0
°C/min até 230 °C; 40 °C/min até 300 °C; gás carreador He, fluxo total, 18,4 ml/min
(fluxo constante); pressão, 16,0 psi; velocidade linear média, 38 cm/s; 3 µL de
amostra injetada com divisão de fluxo na razão 1:10. Pulso de pressão, 25 psi (0,85
min). Encamisamento de vidro (liner) da HP de 6 mm x 1 mm e volume interno
de 0,9 mL foi usado. Dentro do encamisamento, 0,017 mg de lã de vidro
desativada foram compactadas entre 23 e 33 mm a partir do topo. Coluna capilar de
sílica fundida HP-1 (17,0 m x 0,2 mm x 0,11 µm de espessura de filme de fase
estacionária).
3.8 ANÁLISE DE ESTERÓIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA GASOSA
ACOPLADA A FORNO DE COMBUSTÃO ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS POR RAZÃO ISOTÓPICA
3.8.1 Composição dos lotes analíticos
Os lotes analíticos submetidos à análise por CG/C/EMRI foram compostos por
seqüência de alcanos, controle de derivatização, controles da qualidade negativos,
controles da qualidade positivos e amostras.
Os controles da qualidade negativos e positivos processados
concomitantemente com as amostras. O controle de derivatização foi preparado e
introduzido no lote de análise no momento da derivatização das amostras. O preparo
deste controle encontra-se descrito detalhadamente no item 3.11.
50
O controle da qualidade negativo consistiu em uma amostra de urina
conhecida, oriunda de indivíduo não atleta e de perfil esteroidal típico.
O controle da qualidade positivo consistiu em urina de criança previamente
extraída em cartucho C18 de 200 mg, com capacidade para 6 mL. Cada amostra
desta urina foi fortificada com os esteróides de interesse nas seguintes
concentrações: 19-noretiocolanolona (500ppb), androsterona e etiocolanolona
(1500ppb), 5α-androstano-3α,17β−diol, 5β-androstano-3α,17β−diol, e 5β-pregano-
3α,20α−diol (200ppb).
Cada lote analítico foi analisado no sistema CG/C/EMRI respeitando a
seguinte ordem de injeção:
• Seqüência de alcanos
• Controle de derivatização
• Controle da Qualidade Negativo da fração 2 (QC Neg - F2)
• Amostras – Fração 2
• Controle da Qualidade Positivo da fração 2 (QC Pos - F2)
• Controle da Qualidade Negativo da fração 3 (QC Neg - F3)
• Amostras – Fração 3
• Controle da Qualidade Positivo da fração 3 (QC Pos - F3)
• Controle de derivatização
3.8.2 Preparação de amostras para análise no sistema CG/C/EMRI.
10 mL de amostra foram divididos em duas alíquotas de 5 mL. A cada alíquota
de 5 mL, foram adicionados 20 µL do padrão interno 19-noretiocolanolona e 1 mL de
tampão fosfato (0,8M). Após agitação em vórtex por 20 segundos, foram adicionados
100 µL de enzima β-glicuronidase de E.coli. As amostras foram novamente agitadas
e então submetidas à hidrólise por uma hora na faixa de temperatura de 60-65°C.
As amostras hidrolisadas foram submetidas à primeira extração por fase sólida
com cartuchos de 3 mL, do tipo C18, 500 mg. Os cartuchos foram previamente
ativados com 2 mL de metanol, seguidos de 2 mL de água. Ambas as alíquotas de 5
mL foram adicionadas a um único cartucho. Após a eluição da amostra, o cartucho
foi lavado com 6 mL água e a eluição realizada com 6 mL de acetonitrila. Os eluatos
foram evaporados cuidadosamente em atmosfera inerte de N
2
, na faixa de
51
temperatura de 60-65°C. A derivatização foi realizada pela adição de 50 µL de
piridina e de 50 µL de anidrido acético, por uma hora na faixa de temperatura de 60-
65°C.
Em seguida foi realizada a evaporação da piridina sob fluxo de nitrogênio e a
ressuspensão do resíduo com 3 mL de solução de acetonitrila:água na proporção de
35:65, respectivamente. As amostras foram agitadas em vórtex por 2 segundos e
submetidas à segunda etapa de extração por fase sólida, a fim de realizar o
fracionamento dos esteróides de interesse. Foram recolhidas as seguintes frações:
Fração 1 - eluição com 6 mL de acetonitrila:água (50:50).
Fração 2 - eluição com 6 mL de acetonitrila:água (75:25).
Fração 3 - eluição com 6 mL de acetonitrila.
As frações eluídas foram novamente submetidas à evaporação em atmosfera
inerte e finalmente recuperadas em acetato de etila de acordo com a concentração
esteroidal indicada pela análise por CG/EM.
Um esquema simplificado da preparação das amostras por CG/C/EMRI é
apresentado na figura 11:
Figura 11. Esquema do preparo de amostras para análise por CG/C/EMRI.
10 mL de urina
Hidrólise enzimática
EFS – C
18
500mg / eluição com acetonitrila
Evaporação em
atmosfera inerte
Derivatização
Evaporação em
atmosfera inerte
Fração 2 (eluição com
acetonitrila:água, 75:25)
Fração 3 (eluição com
acetonitrila)
Ressuspensão com
acetonitrila:água, 35:65
EFS – C
18
500mg / Fracionamento
Androsterona e
etiocolanolona
Fração 1 (eluição com
acetonitrila:água, 50:50)
Adiol, Bdiol e
Pregnanodiol
52
3.8.3 Condições cromatográficas empregadas no sistema CG/C/EMRI
Cromatógrafo a gás Thermo Finnigan Trace CG modelo K8880100 equipado
com amostrador automático AS3000 Thermo Electron Corporation acoplado a
espectrômetro de massas com detecção por Razão Isotópica (EMRI) Thermo
Finnigan (Delta Plus Advantage). Gás carreador hélio 5.0 a 1 mL/min, em modo de
fluxo constante. Coluna capilar VF-17 (50% fenil – 50% metilsiloxano, 30 m, 0,25 mm
D.I., espessura de filme 0,25 µm). Temperatura do injetor 250
o
C. Modo de injeção: 1
µL sem divisão de fluxo. Encamisamento de vidro desativado SGE (3 mm D.I.) sem
preenchimento de lã de vidro. A programação de temperatura do CG foi: temperatura
inicial do forno 70
o
C (tempo de espera de 1 minuto) em seguida elevação até 270
o
C
com gradiente de 30
o
C/min, depois até 280
o
C com 0,6
o
C/min (tempo de espera de 3
minutos) e a 300
o
C com 5
o
C/min (tempo de espera de 5 minutos). Temperatura do
Forno de Oxidação 950
o
C. Condições de operação do espectrômetro de massas por
razão isotópica: alto vácuo 10
-6
mBar, pré-vácuo 10
-3
mBar. Massas dos isótopos de
carbono monitorados: 44,45,46 e voltagem de ionização 70eV.
3.9 PROCEDIMENTOS PRÉ-ANÁLISE
3.9.1 Teste de vazamento
A primeira etapa do teste de vazamento foi realizada através do
monitoramento do sinal do gás Argônio existente no sistema com a válvula de
backflush aberta e, posteriormente, com a válvula de backflush fechada.
Em seguida foram injetados 3 mL de ar atmosférico para avaliar a
transferência de amostra mediante o sinal de Argônio obtido nesta etapa.
3.9.2 Teste de estabilidade do sistema
O teste de estabilidade foi realizado pela avaliação do desvio padrão entre 10
pulsos de CO
2
de uma corrida e do acompanhamento da intensidade do sinal de
CO
2
.
53
As condições para a realização destes testes foram as seguintes:
• Gás de referência (CO
2
): Pressão de 20 psi
• Gás carreador (He): Pressão de 15 psi
• Forno de oxidação: 950 °C
• Temperatura do forno: 40-50 °C
• Temperatura do injetor: 250 °C, modo de injeção com divisão de fluxo 1:20
• Alto vácuo na faixa de 10
-6
mBar e pré-vácuo na faixa de 10
-3
mBar
3.10 ANÁLISE DE ALCANOS
A seqüência de injeção de alcanos foi realizada imediatamente após os
procedimentos pré-análise, constituindo-se como primeira parte de cada lote
analítico. Foi realizada através da injeção em triplicata de uma solução padrão de
alcanos com valores de δ
13
C certificados. Para este estudo, foi utilizado o padrão de
alcanos com estruturas de 16 a 30 carbonos (C
16
-C
30
) do Laboratório da
Universidade de Indiana (IN, EUA). Os valores de δ
13
C encontrados para o alcano
com 21 carbonos (C
21
) foram tratados em uma planilha Excel com o objetivo de
estabelecer uma série histórica para diagnóstico do sistema.
3.11 ANÁLISE DE MISTURA DE ESTERÓIDES ACETILADOS
A mistura de padrões de esteróides foi preparada a partir da adição de 20 µL
das soluções padrões dos seguintes esteróides: Androsterona, etiocolanolona, 5α-
androstanodiol, 5β-androstanodiol, pregnanodiol, 11-cetoetiocolanolona e 19-
noretiocolanolona. A mistura foi preparada em tubo de ensaio, sendo submetida aos
procedimentos de derivatização, simultaneamente às demais amostras e controles
de cada lote analítico. Após derivatizada a mistura foi submetida à evaporação em
atmosfera inerte e recuperada em 30 µL de acetato de etila.
54
3.12 VALIDAÇÃO DO MÉTODO
3.12.1 Especificidade
Foi avaliada através da resolução cromatográfica obtida para os esteróides de
interesse. Em especial, entre isômeros como androsterona e etiocolanolona e entre
5α-androstanodiol e 5β-androstanodiol. A resolução foi verificada através da
avaliação do cromatograma obtido pela injeção de uma mistura contendo todos os
esteróides pertinentes ao estudo após a derivatização.
3.12.2 Interferência de matriz
Foi avaliada através da observação de interferentes oriundos da matriz. Para
isto, foram analisadas as frações 2 e 3 de amostras reais.
3.12.3 Arraste
Avaliado mediante a comparação entre os valores de δ
13
C dos esteróides do
controle da qualidade negativo e do controle da qualidade positivo, injetados em 10
lotes analíticos.
3.12.4 Precisão intermediária
Foi avaliada através da análise dos resultados dos esteróides acetilados
androsterona, etiocolanolona, 5α-androstanodiol, 5β-androstanodiol e pregnanodiol
provenientes de controles da qualidade negativos e positivos, preparados em dias
diferentes e por operadores diferentes.
55
3.12.5 Robustez
Foram avaliadas as variáveis: analista, temperatura de hidrólise, temperatura
de evaporação da acetonitrila e temperatura de derivatização.
3.12.6 Limite de quantificação (LQ)
Foi avaliado a partir da estimativa da linearidade do método. Foi estimado
como o limite de quantificação do método a menor concentração em que o valor de
δ
13
C mostrou-se estável, considerando como parâmetro o intervalo de +/- 2 vezes o
desvio padrão (+/- 2DP) da série histórica.
3.12.7 Linearidade
Amostras de urina de criança de 3 anos previamente extraídas com cartucho
com fase C
18
(200mg) foram fortificadas com os esteróides androsterona,
etiocolanolona, 5β-androstenodiol, 5α-androstenodiol e pregnanodiol, em sete níveis
de concentração conforme tabela 3.
Tabela 3. Concentrações utilizadas no estudo de linearidade.
Níveis de
concentração
Androsterona e
etiocolanolona
(ng/mL)
5α
αα
α-androstanodiol e
5β
ββ
β-androstanodiol
(ng/mL)
Pregnanodiol
(ng/mL)
1
500 50 100
2
1000 100 250
3
3000 250 500
4
6000 500 1000
5
9000 1000 2000
6
12000 1500 3000
7
15000 2000 4000
As amostras foram injetadas com volumes de ressuspensão de 100 µL para a
fração 2 e de 30 µL para a fração 3.
56
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 PROCEDIMENTOS PRÉ-ANÁLISE
Os procedimentos inerentes às avaliações de vazamento e de estabilidade do
sistema CG/C/EMRI encontram-se descritos no item 3.9 da parte experimental dessa
dissertação. Tais procedimentos asseguram a solidez dos resultados, se constituindo
em um fator crítico, inclusive, em caso de contestação dos possíveis resultados
analíticos adversos. A relevância desses procedimentos como etapa anterior a
análise das amostras está demonstrada pela necessidade da inclusão dos resultados
dos mesmos na cadeia de custódia das amostras.
Todos os experimentos envolvendo a medição de δ
13
C presentes nessa
dissertação foram realizados após a avaliação dos resultados dos testes de
vazamento e estabilidade.
4.1.1 Teste de vazamento do sistema
O procedimento tem por objetivo identificar possíveis vazamentos nas
conexões do sistema CG/C/EMRI. Tais vazamentos são passíveis de propiciar perda
de amostra e, por conseguinte, instabilidade nas medidas de δ
13
C dos analitos.
De acordo com as especificações do fabricante (Eng. Celso Jardim, Sens do
Brasil, comunicação pessoal), a voltagem medida com a válvula de backflush aberta
deve ser inferior 10 mV. Já a diferença recomendada entre os sinais na condição de
backflush aberto x backflush fechado deve ser em torno de 40 mV.
A figura 12 apresenta um resultado típico do teste de vazamento, onde a
conformidade com as recomendações do fabricante foi alcançada.
57
Figura 12. Teste de vazamento do sistema: (A) Válvula de backflush aberta e (B) Válvula de backflush
fechada. Resultado em conformidade com as recomendações do fabricante.
A Figura 13 apresenta um resultado típico do teste de transferência, cujo
desempenho está em conformidade com as especificações do fabricante. O sinal
referente à injeção de 3 µL de ar atmosférico deve ser superior a 2000 mV.
Figura 13. Teste de vazamento do sistema: Avaliação da transferência. Sinal superior a 2000 mV após
injeção de 3 µL de ar atmosférico.
A voltagem encontrada, superior a 5000 mV, indica ausência de perda de
amostra considerando todo o percurso do sistema de análise, desde a injeção até a
detecção.
4.1.2 Teste de estabilidade do sistema
A
B
58
A avaliação é realizada através da análise do gás CO
2
, responsável pelo
balizamento do δ
13
C de todos os analitos (maiores detalhes vide item 4.2). Nas
análises por CG/C/EMRI, utilizou-se o CO
2
especificação 4.5 (grau de pureza de
99,995%), referenciado por uma mistura de n-alcanos (C
16
a C
30
) com valores de
δ
13
C certificados.
A estabilidade do sistema foi baseada na verificação da repetitividade dos
valores de δ
13
C obtidos após pulsos consecutivos de CO
2
. O critério de aceitabilidade
utilizado foi um desvio padrão máximo de 0,05 ‰ após 10 medições consecutivas
dos valores de δ
13
C do CO
2
. Em cada dia de análise, o procedimento foi repetido até
o alcance do critério estabelecido. A figura 14 apresenta um resultado típico obtido
quando o teste de estabilidade atinge o critério de aceitação.
Figura 14. Avaliação do desvio padrão entre pulsos de CO
2
. Desvio padrão obtido para análises
sucessivas do gás de referência inferior a 0,05‰.
Como parte da avaliação pré-análise do sistema, realizou-se o monitoramento
da resposta de intensidade máxima do sinal de CO
2
de referência obtida pelo
instrumento, mantendo-se constante a pressão manométrica deste gás junto a
Interface GCCIII. A figura 15 apresenta um resultado típico de voltagem encontrada.
59
Figura 15. Avaliação da intensidade máxima do sinal de CO
2
de referência.
Os valores da voltagem ao longo de um determinado período não devem
variar significativamente. Caso isto ocorra, significa que as lentes eletrostáticas que
compõem o sistema de espectrometria de massas necessitam de focalização, a fim
de otimizar as condições de melhor geração e transmissão do íon CO
2
+
até os
coletores (Eng. Celso Jardim, Sens do Brasil, comunicação pessoal).
4.2 ANÁLISE DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ALCANOS COM VALORES DE δ
13
C
CERTIFICADO
O procedimento de análise da solução padrão de alcanos com valores de δ
13
C
certificados encontra-se descrito no item 3.10. Antes da análise de cada lote
analítico, a solução de alcanos foi injetada no sistema CG-C-EMRI em triplicada.
A figura 16 apresenta um cromatograma típico proveniente da injeção de
solução de alcanos de referência.
60
Figura 16. Cromatograma de massas de um padrão de alcanos onde estão identificados os pulsos de
CO
2
da corrida (1) e os alcanos C
16
-C
22
.
Através da injeção do padrão de alcanos, realizou-se a avaliação das medidas
obtidas para os valores de
δ
13
C
para o alcano C
21
. Estes valores foram inseridos em
planilha eletrônica Excel, permitindo a construção uma série histórica destes
resultados.
Os limites de aceitabilidade previamente definidos foram +/- duas vezes o
desvio padrão dos valores da série histórica. Tais limites foram atualizados
automaticamente a cada novo valor inserido. A figura 16 apresenta um exemplo de
série histórica empregada na avaliação da precisão do sistema CG/C/EMRI.
Figura 17. Resultados de uma série histórica de C
21
. A linha preta representa o valor teórico de δ
13
C
(-30,45 ‰), presente no certificado do padrão de alcanos. A linha azul representa a média (-29,14 ‰)
obtida pela análise da série histórica. As linhas vermelhas representam +/- duas vezes o desvio
padrão obtido para os valores de δ
13
C.
C21 (Mistura A)
δ
13
C (‰)
Amostras
C16
C17
C18
C19
C20
C21
C22
1
1
SÉRIE HISTÓRICA DO C
21
(MISTURA A)
61
A obtenção de uma série histórica permite observações importantes acerca
dos resultados obtidos. Tomando, por exemplo, a série histórica apresentada na
figura 17, pode-se considerar que:
i. A média dos valores médios obtidos encontra-se próxima ao valor teórico;
ii. Os valores obtidos situaram-se entre os limites de +/- 2DP;
iii. Os valores obtidos oscilam acima e abaixo da média.
A variação dos valores acima e abaixo da média é importante por indicar a
ausência de erro sistemático. Os erros sistemáticos têm um valor definido, causa
determinável e são de mesmo sinal e magnitude para cada repetição da medida
realizada do mesmo modo, levando a uma tendência (SKOOG et al., 2002).
Caso a série histórica comece a apresentar valores distantes do tabelado e/ou
erro sistemático, o CO
2
de referência deve ter seu valor de δ
13
C recalibrado.
Somente após este conjunto de avaliações apresentarem resultado
satisfatório, iniciou-se o desenvolvimento do método a partir da análise de padrões.
Com relação ao critério adotado para avaliação dos resultados de uma série
histórica, cabe salientar que a escolha de +/- 2DP foi feita de modo arbitrário dentre
os disponíveis na literatura. A escolha de critério semelhante pode ser encontrada no
trabalho desenvolvido por Aguilera et al. (2001). Apesar deste critério ser o mais
difundido, é possível encontrar alternativas, como por exemplo +/- 3DP.
Combinações de +/- 1DP, +/- 2DP e +/- 3DP dentro de uma mesma série histórica
também já foram propostas.
4.2 ANÁLISE DE MISTURA DE ESTERÓIDES ACETILADOS
Os procedimentos referentes à análise dos esteróides acetilados estão
descritos no item 3.11. Esta mistura representa o controle de derivatização, parte do
controle da qualidade do método.
Um cromatograma típico obtido na análise desses padrões após o
procedimento de acetilação é apresentado na figura 18, onde podem ser observados
pulsos de CO
2
antes e após a eluição dos esteróides. Estes pulsos são utilizados
como referência para o cálculo dos valores de δ
13
C dos analitos. Utilizou-se o pulso
imediatamente anterior à saída do primeiro analito para referenciar a amostra.
Figura 18
. Cromatograma de um controle da
(2), And (3), Bdiol (4), A
diol (5), 11
A faixa de intensidade do sinal (mV) sugerida pela assistência técnica é entre
1000-
2000mV, servindo como parâmetro do desempenho do sistema. Neste
cromatograma foi possível avaliar que o par etiocolanolona e androsterona,
respectivamente picos 2 e 3 na fi
cromatográfica. Essa condição é relatada na literatura crítica, servindo de marcador
para o desempenho da coluna cromatográfica ou necessidade de oxidação da
cerâmica do forno de combustão.
acetilados
foi realizado segundo a equação 2, extraída de Aquino Neto & Nunes
(2003):
Equação 2:
R
S
Onde:
t
R(x+1)
= tempo de
retenção d
t
R(x)
=
tempo de retenção d
W
b
(x+1)
= largura da base do pico d
W
b
(x)
= largura da base do pico do acetato de Etio
Desta forma, R
S
= 2
. Cromatograma de um controle da
qualidade dos esteróides acetilados: 19
diol (5), 11
-cetoetio (6) e PD (7). Os pulsos de CO
2
estão indicados em
A faixa de intensidade do sinal (mV) sugerida pela assistência técnica é entre
2000mV, servindo como parâmetro do desempenho do sistema. Neste
cromatograma foi possível avaliar que o par etiocolanolona e androsterona,
respectivamente picos 2 e 3 na fi
gura 18, apresentam o pior resultado de resolução
cromatográfica. Essa condição é relatada na literatura crítica, servindo de marcador
para o desempenho da coluna cromatográfica ou necessidade de oxidação da
cerâmica do forno de combustão.
O cálculo da resolução
entre estes esteróides
foi realizado segundo a equação 2, extraída de Aquino Neto & Nunes
S
= 2
.
(
t
R(x+1)
–
t
R(x)
)
W
b
(x+1)
+ W
b
(x)
retenção d
o acetato de And
tempo de retenção d
o acetato de Etio
= largura da base do pico d
o acetato de And
= largura da base do pico do acetato de Etio
= 2
.
(950,0-936,2)/ 10,2+10,2 ⇒ R
S
= 1,35.
62
qualidade dos esteróides acetilados: 19
-noretio (1), Etio
estão indicados em
(8).
A faixa de intensidade do sinal (mV) sugerida pela assistência técnica é entre
2000mV, servindo como parâmetro do desempenho do sistema. Neste
cromatograma foi possível avaliar que o par etiocolanolona e androsterona,
gura 18, apresentam o pior resultado de resolução
cromatográfica. Essa condição é relatada na literatura crítica, servindo de marcador
para o desempenho da coluna cromatográfica ou necessidade de oxidação da
entre estes esteróides
foi realizado segundo a equação 2, extraída de Aquino Neto & Nunes
= 1,35.
63
Apesar de inferior a 1,5, considerou-se a resolução aceitável, observando que,
nas condições analíticas adotadas, não se observa efeito de matriz para esses
esteróides (item 4.4). Além disso, a sobreposição entre as áreas dos picos foi
pequena.
Cabe ressaltar que uma vez que os padrões de esteróides utilizados haviam
sido preparados em metanol, até que esta análise apresentasse resolução adequada
para todos os esteróides acetilados, não poderia ser dado prosseguimento às
análises em matriz (urina).
4.3 DESENVOLVIMENTO DA METODOLOGIA
Após a avaliação da resolução e da intensidade de sinal obtidos para os
esteróides acetilados no sistema CG-C-EMRI, iniciou-se a adaptação do método
descrito por Maître et al. (2004) e apresentada no item 1.4.5. O método desenvolvido
está detalhado no item 3.8, onde se destacam como principais alterações:
Adição do padrão interno 19-noretiocolanolona ao início da análise ao
invés de acetato de androstanol adicionado nas frações de esteróides
acetilados, ao final do processo;
Eliminação da primeira etapa de extração por fase sólida para purificação
da amostra;
Realização da etapa de hidrólise da amostra original;
Utilização de volumes de eluentes menores;
Eluição de 3 frações na última extração por fase sólida;
Ressuspensão da amostra em acetato de etila ao invés de cicloexano.
A adição do padrão interno 19-noretiocolanolona foi efetuada ao início da
análise, de modo que este esteróide fosse submetido ao mesmo tratamento dos
demais analitos.
Fica evidente que a alteração mais significativa do método original ocorreu nos
primeiros procedimentos, com a eliminação da primeira extração por fase sólida,
visando diminuir o tempo de análise. Desta forma, a hidrólise foi realizada
diretamente na amostra de urina. Sugeriu-se a divisão da amostra em duas alíquotas
de 5 mL, com o objetivo de assegurar a eficiência desta etapa.
64
Sugeriu-se ainda a redução dos volumes de solvente nas eluições dos analitos
na etapa de extração por fase sólida, com conseqüente redução do tempo gasto com
a evaporação.
Na última extração por fase sólida, sugeriu-se o fracionamento da amostra em
3 partes, de acordo com a polaridade da mistura de solventes. Desse modo, previu-
se a eluições dos esteróides acetilados na seguinte ordem:
Fração 1: 11-cetoetiocolanolona;
Fração 2: 19-noretiocolanolona, etiocolanolona e androsterona;
Fração 3: 5β-androstanodiol, 5α-androstanodiol e pregnanodiol.
Após devidamente evaporadas, as 3 frações foram retomadas em acetato de
etila, em volume coerente com a concentração indicada na análise do perfil
esteroidal. Tal preocupação em relação ao volume de ressuspenção encontra
relevância pela reconhecida perda de linearidade do sistema, característica da
técnica de razão isotópica.
A escolha do acetato de etila em detrimento do cicloexano deveu-se ao maior
ponto de ebulição do primeiro, reduzindo a evaporação do solvente e conseqüente
concentração das amostras no carrossel do injetor automático.
4.4 RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA OBTIDA PARA OS ESTERÓIDES DE
INTERESSE NA MATRIZ
Uma vez que a qualidade dos resultados obtidos pela GC/C/EMRI está
intrinsecamente associada à separação cromatográfica dos analitos, fez-se
necessário avaliar a resolução alcançada para os esteróides de interesse na matriz
urina.
Para isso, amostras provenientes de voluntários, escolhidas como controle da
qualidade negativo, foram analisadas seguindo o método proposto. As figuras 19 e
20 apresentam os cromatogramas obtidos para as frações 2 e 3, respectivamente.
Figura 19
. Cromatograma da fração 2 do controle de qualidade negativo, conten
etiocolanolona (2)
e acetato de androsterona (3
Figura 20. Cromato
grama da fração 3 do controle da
androstanodiol (4
), acetato de 5
Na ampliação
da figura 19,
qualidade negativo a
presentam resolução semelhante à
análise dos
esteróides acetilados sem matriz
resolução 1,5, a análise do sinal referente à razão m
. Cromatograma da fração 2 do controle de qualidade negativo, conten
e acetato de androsterona (3
).
grama da fração 3 do controle da
qualidade negativo, contendo: acetato
), acetato de 5
α-androstanodiol (5), acetato de pregnanodiol
(7
da figura 19,
os esteróides And
e Etio acetilados do controle da
presentam resolução semelhante à
quela obtida quando da
esteróides acetilados sem matriz
. Apesar de não ser observada
resolução 1,5, a análise do sinal referente à razão m
/z 45/44 demonstra que não há
2
3
65
. Cromatograma da fração 2 do controle de qualidade negativo, conten
do: acetato de
qualidade negativo, contendo: acetato
de 5β-
(7
) e pulsos de CO
2
(8).
e Etio acetilados do controle da
quela obtida quando da
. Apesar de não ser observada
/z 45/44 demonstra que não há
66
coeluição significativa entre os dois esteróides. Caso contrário, o sinal oriundo do
primeiro pico afetaria o sinal do analito seguinte.
Já na figura 20, observa-se um número maior de picos cromatográficos,
resultado da presença de outros esteróides além daqueles de interesse. Embora esta
fração apresente, a priori, um cromatograma mais complexo, o método possibilitou a
identificação dos dióis Bdiol e Adiol, além da referência endógena PD (picos 3, 4 e 5,
respectivamente), sem coeluições entre eles ou outro componente da matriz.
Após a adaptação do método de Maître et al. (2004), foi possível observar
pontos dissonantes da idéia original. Ao contrário do que se esperava, não foi
possível identificar o acetato de 11-cetoetiocolanolona na fração 1, uma vez que o
ruído observado foi muito alto (dado não apresentado). Tal ruído inviabilizou a
identificação de qualquer pico cromatográfico. Este fato representa uma limitação do
método, uma vez que a 11-cetoetiocolanolona seria empregada como referência
endógena para os acetatos de androsterona e etiocolanolona, detectados na fração
2.
Apesar dessa limitação o método mostrou-se eficiente na análise dos principais
metabólitos da testosterona e seus precursores. Tal análise mostrou-se viável em um
tempo de análise de via úmida de aproximadamente 9 horas. Tal período é
compatível com a dinâmica necessária à liberação de resultados de um evento cuja
necessidade de liberação de resultados é de até 48 horas.
4.5 VALIDAÇÃO DA MÉTODO
O método proposto foi validado a luz das recomendações do International
Standard for Laboratories (ISL) (WADA, 2008). Tal documento recomenda que todo o
método empregado em etapas de confirmação para fins de controle de dopagem
deva ser validado.
Os critérios recomendados para a validação do método podem ser divididos
em duas categorias, de acordo com os analitos investigados:
• Substância sem limite de corte (Non-threshold substance): Quando o
método prevê a detecção de um analito integrante da Lista de Substâncias
Proibidas. A simples detecção do analito configura uma violação ao
regulamento antidopagem.
67
• Substância com limite de corte (Threshold substance): Quando o método
prevê a detecção e quantificação de um analito onde, apenas acima de um
determinado valor pré-estabelecido, fica configurada uma violação do
código antidopagem.
Como a validação para esse último caso tende a apresentar um rigor analítico
maior, essa foi a abordagem escolhida para a validação do método.
4.5.1 Especificidade
A especificidade do método proposto foi avaliada através do procedimento
experimental descrito no item 3.12.1.
Segundo o ISL, a especificidade representa a capacidade do método em
detectar somente as substâncias de interesse, discriminando-a entre outros
compostos estruturalmente relacionados, como por exemplo os isômeros And e Etio,
e os isômeros Adiol e Bdiol.
Para a técnica de CG/C/EMRI, o tempo de retenção é o único parâmetro
qualitativo disponível na identificação de um analito. Por questões logísticas, foi
estipulado que somente em caso de resultados presumíveis, as amostras seriam
analisadas por CG/EM, de modo a garantir a inexistência de co-eluição de algum
interferente endógeno com os esteróides de interesse. Ou seja, as amostras que
apresentassem valores de δ
13
C compatíveis com a administração de T ou
precursores, somente após análise por CG/EM passariam a ser consideradas como
adversas. Cabe ressaltar que a necessidade de injeções no sistema CG/EM em caso
de resultados presumíveis admite que a complexidade da matriz empregada na
análise requer uma apreciação pormenorizada de cada amostra em particular.
No método proposto, a especificidade foi avaliada considerando-se a
resolução no sistema CG/C/EMRI para o caso de resolução mais crítica. Uma vez
que o método proporcionou uma resolução próxima a 1,5 no caso dos isômeros And
e Etio (Figura 19), o mesmo foi considerado específico. O método foi capaz de
detectar somente as substâncias de interesse, discriminando-as entre outros
compostos estruturalmente relacionados.
68
4.5.2 Interferência de matriz
O efeito da matriz no método proposto foi avaliado através do procedimento
experimental descrito no item 3.12.2.
Segundo o ISL, o parâmetro indica a capacidade do método de eliminar
possíveis interferências na detecção da substância proibida devido à presença de
outros componentes da matriz.
Esta avaliação foi realizada pela análise dos cromatogramas das frações 2 e 3
de amostras reais, como pode ser visto nas figuras 21 e 22.
Figura 21. Cromatograma da fração 2 de uma amostra, onde estão indicados: acetato de
etiocolanolona (2), acetato de androsterona (3) e pulsos de CO
2
(8).
Figura 22. Cromatograma da fração 3 de uma amostra, onde estão indicados: acetato de 5β-
androstanodiol (4), acetato de 5α-androstanodiol (5), acetato de pregnanodiol (7) e pulsos de CO
2
(8).
2
3
8
8
5
4
7
8
8
69
De acordo com os cromatogramas apresentados, é possível observar que
mesmo na fração 3, onde são detectados vários compostos além dos esteróides de
interesse, é possível identificá-los sem a interferência de outros componentes da
matriz.
Mais uma vez cabe ressaltar que, em caso de resultados presumíveis, é
necessário investigar a possibilidade de coeluições entre o esteróide de interesse e
algum endógeno presente através da técnica de CG-EM.
4.5.3 Arraste
A inexistência de arraste dos analitos entre as amostras analisadas pelo
método proposto foi avaliada através do procedimento experimental descrito no item
3.12.3.
Os dados que avaliam este efeito estão apresentados nas figuras 23 e 24,
onde cada ponto corresponde ao valor de δ
13
C obtido pela injeção sequencial de um
QC NEG e um QC POS.
Figura 23. Resultados para avaliação do arraste da fração 2. Comparação entre os valores de δ
13
C
entre controles negativos (QC NEG) e controles positivos (QC POS) injetados consecutivamente.
-37,00
-35,00
-33,00
-31,00
-29,00
-27,00
-25,00
-23,00
-21,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
δ
δ
δ
δ
13
C (‰)
Análise
Avaliação do arraste - Fração 2
Etiocolanolona
-
QC NEG
Androsterona
-
QC NEG
Etiocolanolona - QC POS
Androsterona - QC POS
70
Figura 24. Resultados para avaliação do arraste da fração 3. Comparação entre os valores de δ
13
C
entre controles negativos (QC NEG) e controles positivos (QC POS) injetados consecutivamente.
A variação entre os resultados obtidos, observada principalmente na fração 2,
está associada à variação na intensidade dos sinais de cada amostra, visto que por
ocasião destas análises não houve ajuste do volume de ressuspensão de modo a
enquadrar o sinal de cada amostra entre 1.000 e 2.000 mV, conforme sugerido
posteriormente pela assistência técnica.
Na fração 2 (Figura 23) pode-se observar que não há aproximação entre os
valores de δ
13
C dos QC NEG e QC POS injetados. Tal observação indica que não
houve contaminação entre as injeções, caso contrário seria observado o
deslocamento dos valores de δ
13
C dos QC POS para valores próximos aos dos QC
NEG. Baseado nessa observação, conclui-se que não houve arraste.
O mesmo raciocínio aplica-se às injeções provenientes da fração 3 (Figura
24), referente às determinações dos valores de δ
13
C para dióis.
4.5.4 Precisão intermediária
A precisão intermediária do método proposto foi avaliada através do
procedimento experimental descrito no item 3.12.4.
Segundo o ISL, a precisão intermediária representa a capacidade de repetição
de resultados considerando momentos diferentes de realização das análises e
operadores diferentes na manipulação das amostras.
-37,00
-35,00
-33,00
-31,00
-29,00
-27,00
-25,00
-23,00
-21,00
0 2 4 6 8 10
δ
δ
δ
δ
13
C (‰)
Análise
Avaliação do arraste - Fração 3
Bdiol
-
QC NEG
Adiol - QC NEG
Preganodiol
-
QC NEG
Bdiol
-
QC POS
Adiol - QC POS
Preganodiol - QC POS
71
Para esta avaliação,
foram preparados quatro conjuntos de controles
negativos e quatro conjuntos de controles positivos durante cinco dias, perfazendo
um total de 20 amostras. Cinco analistas revezaram-se aleatoriamente na realização
das análises. Do total de amostras analisadas, duas foram eliminadas por não
apresentarem valores de relação sinal/ruído que permitissem a avaliação da
δ
13
C.
Os valores de
δ
13
C
encontrados para os esteróides presentes nesses controles são
apresentados nas figuras 25 a 29.
Figura 25. Resultados de precisão intermediária da Etiocolanolona: (A) QC negativo; (B) QC positivo.
-29,00
-28,00
-27,00
-26,00
-25,00
-24,00
-23,00
-22,00
-21,00
-20,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
Avaliação da precisão intermediária
Etiocolanolona - Controle da qualidade negativo
-38,00
-36,00
-34,00
-32,00
-30,00
-28,00
-26,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
Avaliação da precisão intermediária
Etiocolanolona - Controle da qualidade positivo
A
B
72
Figura 26. Resultados de precisão intermediária da Androsterona: (A) QC negativo; (B) QC positivo.
-26,00
-25,00
-24,00
-23,00
-22,00
-21,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
Avaliação da precisão intermediária
Androsterona - Controle da qualidade negativo
-36,00
-35,00
-34,00
-33,00
-32,00
-31,00
-30,00
-29,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média
-
3DP
Avaliação da precisão intermediária
Androsterona - Controle da qualidade positivo
A
B
73
Figura 27. Resultados de precisão intermediária do 5β-androstanodiol: (A) QC negativo; (B) QC
positivo.
-28,00
-27,00
-26,00
-25,00
-24,00
-23,00
-22,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
Avaliação da precisão intermediária
5β-androstanodiol - Controle da qualidade negativo
-39,00
-37,00
-35,00
-33,00
-31,00
-29,00
-27,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média
-
3DP
Avaliação da precisão intermediária
5β-androstanodiol - Controle da qualidade positivo
A
B
74
Figura 28. Resultados de precisão intermediária do 5α-androstanodiol: (A) QC negativo; (B) QC
positivo.
-28,00
-27,00
-26,00
-25,00
-24,00
-23,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
Avaliação da precisão intermediária
5α-androstanodiol - Controle da qualidade negativo
-38,00
-37,00
-36,00
-35,00
-34,00
-33,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média
-
3DP
Avaliação da precisão intermediária
5α-androstanodiol - Controle da qualidade positivo
A
B
75
Figura 29. Resultados de precisão intermediária do pregnanodiol: (A) QC negativo; (B) QC positivo.
Avaliando a fração 2 dos experimentos, constatou-se que todos valores de
δ
13
C obtidos para a Etio situaram-se dentro dos limites de +/- 2 DP e apenas um
resultado de And proveniente de QC POS, situou-se acima do limite de 2DP. No
entanto, esse resultado não ultrapassou o limite de 3DP.
Na avaliação dos esteróides acetilados provenientes da fração 3, os
resultados observados foram os seguintes:
-26,00
-25,00
-24,00
-23,00
-22,00
-21,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
Avaliação da precisão intermediária
Pregnanodiol - Controle da qualidade negativo
-37,00
-36,00
-35,00
-34,00
-33,00
-32,00
-31,00
-30,00
0 5 10 15 20
δ
13
C (‰)
Amostras
Dados
Média
Média + 2DP
Média
-
2DP
Média + 3DP
Média
-
3DP
Avaliação da precisão intermediária
Pregnanodiol - Controle da qualidade positivo
A
B
76
Bdiol: Um resultado proveniente de QC NEG situou-se abaixo do limite de -2DP. No
entanto, não ultrapassou -3DP.
Adiol: Dois resultados provenientes de QC POS situaram-se acima do limite de 2DP.
No entanto, não ultrapassaram 3DP.
PD: Um resultado proveniente de QC POS situou-se abaixo do limite de -2DP. No
entanto, não ultrapassou -3DP. Dois resultados provenientes de QC NEG situaram-
se abaixo do limite de -2DP. No entanto, não ultrapassaram -3DP.
Apesar de, a priori, terem sido obtidos resultados fora dos limites de tolerância
pré-estabelecidos, considerou-se que:
i. Nenhum valor apresentou-se fora do limite de ±3DP. Como ressaltado
anteriormente, tal critério é uma alternativa observada na literatura para a
avaliação dos resultados de razão isotópica;
ii. A variação de +/- 3DP não transforma o valor de δ
13
C proveniente de um
controle positivo, em um valor característico de uma amostra negativa;
iii. Um resultado analítico adverso para razão isotópica merecerá a repetição da
análise sempre que houver um desvio dos valores de δ
13
C dos controles;
iv. Uma amostra que gera resultado analítico adverso merecerá repreparações;
v. As maiores variações foram encontradas nas análises dos dióis, como
esperado pela menor concentração esperada desses metabólitos na urina;
vi. A grande variação de analistas, em um pequeno espaço de tempo, pode ter
resultado nas variações dos valores de δ
13
C observadas. Em análises desse
tipo, para maior segurança em relação à cadeia de custódia, um único analista
procura realizar o procedimento do início ao fim;
vii. Tais variações não foram observadas em análises posteriores, sendo
documentadas na série histórica, usada na análise dos resultados em rotina.
Considerando-se os argumentos supracitados, o método foi considerado
adequado em relação à avaliação da precisão intermediária.
77
4.5.5 Robustez
Segundo o ISL, a robustez indica a capacidade do método em produzir
resultados similares no que diz respeito às menores variações nas condições
analíticas. Como todas as condições críticas à reprodutibilidade dos resultados
devem ser controladas, em quatro dias consecutivos foram preparadas quatro
amostras (controles da qualidade positivos), variando-se condições importantes
deste preparo. As condições empregadas estão dispostas na tabela 4.
Tabela 4. Condições empregadas na avaliação da robustez.
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
Temperatura de hidrólise
60
o
C 65
o
C 65
o
C 65
o
C
Temperatura de evaporação
60
o
C 65
o
C 65
o
C 60
o
C
Temperatura de derivatização
60
o
C 65
o
C 60
o
C 60
o
C
Outro fator de extrema importância na garantia de robustez do método é a
variação de analistas. Para avaliar esta influência, cinco analistas revezaram-se de
forma aleatória no preparo dessas amostras. Os resultados estão disponíveis nas
figuras 30-34, onde estão representados os dias: 1 (amostras 1-4), 2 (amostras 5-8),
3 (amostras 9-12) e 4 (amostras 13-16).
Figura 30. Resultados de robustez da etiocolanolona.
-32,5
-32
-31,5
-31
-30,5
-30
-29,5
-29
0 2 4 6 8 10 12 14 16
δ
13
C (‰)
Amostras
Avaliação da robustez - Etiocolanolona
Dados
Média
Média + 2DP
Média
-
2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
78
Figura 31. Resultados de robustez da androsterona.
Figura 32. Resultados de robustez do 5β-androstanodiol.
-33,5
-33
-32,5
-32
-31,5
-31
0 2 4 6 8 10 12 14 16
δ
13
C (‰)
Amostras
Avaliação da robustez - Androsterona
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média
-
3DP
-36
-35
-34
-33
-32
-31
-30
0 2 4 6 8 10 12 14 16
δ
13
C (‰)
Amostras
Avaliação da robustez - 5β
ββ
β-androstanodiol
Dados
Média
Média + 2DP
Média - 2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
79
Figura 33. Resultados de robustez do 5α-androstanodiol.
Figura 34. Resultados de robustez do pregnanodiol.
Tanto a Etio quanto a And apresentaram todos os resultados de δ
13
C dentro
do intervalo de ± 2DP, variando entre eles em menos de duas unidades por mil.
Desta forma, para os esteróides acetilados provenientes da fração 2, considerou-se o
método robusto.
-36,500
-36,000
-35,500
-35,000
-34,500
0 2 4 6 8 10 12 14 16
δ
13
C (‰)
Amostras
Avaliação da robustez - 5α-androstanodiol
Dados
Média
Média + 2DP
Média
-
2DP
Média + 3DP
Média - 3DP
-34,5
-34
-33,5
-33
-32,5
-32
-31,5
-31
-30,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
δ
13
C (‰)
Amostras
Avaliação da robustez - Pregnanodiol
Dados
Média
Média + 2DP
Média
-
2DP
Média + 3DP
Média
-
3DP
80
Na avaliação dos esteróides acetilados provenientes da fração 3, os
resultados observados foram os seguintes:
Bdiol: Um valor acima do limite de 2DP cerca de 1,0‰;
Adiol: Um valor acima do limite de 2DP cerca de 0,1‰;
PD: Um valor abaixo de limite de – 2DP cerca de 0,2‰.
Pelo mesmo conjunto de argumentos apresentados no item 4.4.4, o método foi
considerado adequado para o critério de robustez. Adiciona-se a isso o fato de todos
os equipamentos estarem incluídos no sistema de calibração e verificação de
desempenho como reza a norma ISO 17025 (vide item 3.1).
4.5.6 Limite de quantificação (LQ) e linearidade
Segundo o ISL, deve ser demonstrado que um método destinado a
quantificação de uma determinada substância tenha um limite de quantificação
estabelecido. Usualmente, estima-se esse limite pela relação sinal/ruído (S/R) obtida
em uma determinada concentração em conjunto com a precisão obtida por essa
concentração em particular.
No caso específico da técnica de razão isotópica, o fator de maior relevância é
a estabilidade do valor de δ
13
C a medida que a concentração do analito em particular
varia.
As concentrações empregadas no estudo de linearidade do sistema foram
escolhidas por abranger, segundo a literatura, a faixa mais representativa dos
esteróides em estudo.
Após a observação dos sinais de resposta dos picos cromatográficos dos
analitos, algumas amostras foram concentradas ou diluídas mediante evaporação ou
adição do solvente (acetato de etila) de modo a obter uma melhor intensidade de
sinal para os picos cromatográficos. Tal recomendação é inerente a técnica visto que
reconhecidamente a linearidade do sistema é um fator crítico na interpretação dos
resultados.
Os resultados obtidos a fim de avaliar os itens 3.12.6 e 3.12.7 estão
disponíveis nas tabelas 5-9 e nas figuras 35-41.
81
Tabela 5. Resultados do estudo de linearidade da Etiocolanolona.
Etiocolanolona
Nível Concentração (ng/mL) Volume (µL) Sinal (mV)
δ
13
C(‰)
1 500 30 400 -33,256
2 1000 50 635 -33,132
3 3000 100 1800 -32,747
4 6000 200 1770 -32,937
5 9000 400 1780 -33,062
6 12000 800 750 -33,481
7 15000 1000 790 -33,407
Figura 35. Resultados de linearidade da Etiocolanolona. Dados estatísticos: média = -33,15 ‰,
coeficiente de variação = -0,78 ‰, desvio padrão = 0,26 ‰.
Na detecção da Etio, o método mostrou-se linear para concentrações de 500 a
15.000 ng/mL, pois os valores de δ
13
C desta faixa mantiveram-se dentro dos limites
de +/- 2 DP. A intensidade dos sinais desta faixa variou entre 400 e 1800 mV.
Antes de determinar o limite de quantificação (LQ) para um esteróide, duas
considerações devem ser feitas:
i. Por tratar com analitos endógenos, neste estudo usou-se como matriz a ser
fortificada, urina de criança cujos hormônios foram previamente extraídos.
Obviamente, tal procedimento reduz acentuadamente o ruído em relação a uma urina
típica proveniente de um adulto;
ii. Dependendo do background da amostra, um sinal de 400 mV possivelmente não
apresentaria relação S/R satisfatória.
-33,8
-33,6
-33,4
-33,2
-33
-32,8
-32,6
0 3000 6000 9000 12000 15000
δ
13
C (‰)
Concentração em ng/mL
Avaliação da linearidade - Etiocolanolona
Dados
média
média+2DP
média-2DP
82
Como os esteróides da fração 2 costumam apresentar concentrações
elevadas na urina, realisticamente, o limite de quantificação estabelecido para a
etiocolanolona foi de 1000 ng/mL.
No entanto o limite de quantificação sugerido de 1000 ng/ mL, não impede que
amostras abaixo desta concentração apresentem pico cromatográfico com relação
sinal/ruído (S/R) segura para a determinação do valor de δ
13
C, cabendo uma análise
crítica da equipe técnica responsável pela análise.
A tabela 6 apresenta dos valores obtidos na avaliação da linearidade do
método quando o analito de interesse é a androsterona.
Tabela 6. Resultados do estudo de linearidade da Androsterona.
Androsterona
Nível Concentração (ng/mL) Volume (µL) Sinal (mV)
δ
13
C(‰)
1 500 30 200 -32,565
2 1000 50 580 -33,974
3 3000 100 1700 -33,899
4 6000 200 1800 -33,94
5 9000 400 1810 -33,95
6 12000 800 780 -33,98
7 15000 1000 850 -33,927
Figura 36. Resultados de linearidade da Androsterona. Dados estatísticos: média = -33,75 ‰,
coeficiente de variação = -1,55 ‰, desvio padrão = 0,52 ‰.
Neste caso, o valor de
δ
13
C referente ao primeiro nível se encontrava fora do
limite de ±2DP. Logo, este nível foi eliminado e foram avaliados os resultados obtidos
após tal exclusão (Figura 37).
-35
-34,5
-34
-33,5
-33
-32,5
-32
0 3000 6000 9000 12000 15000
δ
13
C (‰)
Concentração em ng/mL
Avaliação da linearidade - Androsterona
Dados
média
média+2DP
média-2DP
83
Figura 37. Resultados de linearidade da Androsterona. Dados estatísticos: média = -33,95 ‰,
coeficiente de variação = -0,09 ‰, desvio padrão = 0,03 ‰.
Sendo assim, o estudo indicou linearidade para concentrações de 1000 a
15.000 ng/mL de And, apresentando valores de δ
13
C respeitando os limites de +/-
2DP.
A intensidade dos sinais observados variou entre 600 e 1800 mV,
aproximadamente. Logo, o valor sugerido para LQ da And é de 1000 ng/mL, cabendo
a consideração feita para a Etio em relação à análise crítica caso a caso.
Para ilustrar esta avaliação, o cromatograma referente ao segundo nível de
concentrações do estudo de linearidade da fração 2 está apresentado na figura 38.
Figura 38. Estudo de linearidade dos esteróides da fração 2: acetato de etiocolanolona (2) e acetato
de androsterona (3).
-34,1
-34
-33,9
-33,8
0 3000 6000 9000 12000 15000
δ
13
C (‰)
Concentração em ng/mL
Avaliação da linearidade - Androsterona
Dados
média
média+2DP
média-2DP
2
3
84
Na fração 3, as concentrações referentes ao primeiro nível de concentração
dos dióis, não apresentaram pico cromatográfico passível de integração confiável.
Por isto os resultados apresentados contam somente com 6 níveis de concentrações.
Tabela 7. Resultados do estudo de linearidade do 5β- androstanodiol.
5β
ββ
β- androstanodiol
Nível Concentração (ng/mL) Volume (µL) Sinal (mV)
δ
13
C(‰)
1 50 25 x x
2 100 25 210 -36,31
3 250 25 550 -36,417
4 500 30 1180 -36,405
5 1000 40 700 -36,407
6 1500 60 700 -36,718
7 2000 70 610 -36,666
Figura 39. Resultados de linearidade do 5β-androstanodiol. Dados estatísticos: média =
-36,49 ‰, coeficiente de variação = -0,45 ‰, desvio padrão = 0,16 ‰.
O método mostrou-se linear para concentrações de 100 a 2.000 ng/mL de
Bdiol, pois os valores de δ
13
C desta faixa mantiveram-se dentro dos limites de +/- 2
DP. A intensidade dos sinais desta faixa variou entre 200 e 1200 mV,
aproximadamente.
Como uma intensidade de 200 mV não transmite segurança acerca da relação
S/R, o limite de quantificação indicado para o 5β-androstanodiol foi de 250 ng/mL,
mais uma vez cabendo a análise crítica acerca do ruído observado por uma amostra
em particular.
-36,9
-36,7
-36,5
-36,3
-36,1
0 500 1000 1500 2000
δ
13
C (‰)
Concentração em ng/mL
Avaliação da linearidade - 5β-androstanodiol
Dados
média
média+2DP
média
-
2DP
85
Tabela 8. Resultados do estudo de linearidade do 5α-androstanodiol.
5α
αα
α- androstanodiol
Nível Concentração (ng/mL) Volume (µL) Sinal (mV)
δ
13
C(‰)
1 50 25 x x
2 100 25 180 -38,158
3 250 25 730 -38,354
4 500 30 1340 -38,401
5 1000 40 860 -38,318
6 1500 60 850 -38,371
7 2000 70 730 -38,414
Figura 40. Resultados de linearidade do 5α-androstanodiol. Dados estatísticos: média = -38,34 ‰,
coeficiente de variação = -0,24 ‰, desvio padrão = 0,09 ‰.
No caso do Adiol, o método mostrou-se linear para concentrações de 100 a
2.000 ng/mL, visto que os valores de δ
13
C desta faixa mantiveram-se dentro dos
limites de +/- 2 DP. A intensidade dos sinais desta faixa variou entre 200 e 1350 mV,
aproximadamente.
De forma análoga ao Bdiol, uma intensidade de 200 mV não transmite
segurança acerca da relação S/R. No entanto, indicar como LQ a concentração de
250 ng/mL excluiria grande parte das amostras, sabendo-se que a concentração no
Adiol normalmente é a mais baixa entre os metabólitos analisados neste estudo.
Sendo assim, o limite de quantificação indicado para a 5α-androstanodiol fica
sendo 100 ng/mL, desde que apresente pico cromatográfico com relação sinal/ruído
(S/R) segura para a determinação do valor de
δ
13
C.
-38,6
-38,5
-38,4
-38,3
-38,2
-38,1
0 500 1000 1500 2000
δ
13
C (‰)
Concentração em ng/mL
Avaliação da linearidade - 5α-androstanodiol
Dados
média
média+2DP
média
-
2DP
86
Tabela 9. Resultados do estudo de linearidade do Pregnanodiol.
Pregnanodiol
Nível Concentração (ng/mL) Volume (µL) Sinal (mV)
δ
13
C(‰)
1 100 25 x x
2 250 25 460 -35,968
3 500 25 1140 -36,153
4 1000 30 1900 -36,223
5 2000 40 1090 -36,159
6 3000 60 1310 -36,634
7 4000 70 1170 -36,322
Figura 41. Resultados de linearidade do Pregnanodiol. Dados estatísticos: média = -36,24 ‰,
coeficiente de variação = -0,62 ‰, desvio padrão = 0,22 ‰.
O método mostrou-se linear para concentrações de 250 a 4.000 ng/mL de
Pdiol, pois os valores de δ
13
C desta faixa mantiveram-se dentro dos limites de +/- 2
DP. A intensidade dos sinais desta faixa variou entre 450 e 1900 mV,
aproximadamente.
Dentre os dióis, a referência endógena PD normalmente apresenta
concentrações mais elevadas, além de eluir em uma região cromatográfica
usualmente livre de interferentes. Foi possível indicar o limite de quantificação de 250
ng/mL.
Cabe considerar que estas análises permitiram estimar as concentrações nas
quais os esteróides And, Etio, Adiol, Bdiol e PD possam ser detectados por
CG/C/EMRI. Desta forma, mediante a determinação do perfil esteroidal é possível
avaliar onde a análise por CG/C/EMRI através do método proposto seja viável, de
modo a evitar desperdício de tempo e material.
-36,8
-36,5
-36,2
-35,9
-35,6
0 1000 2000 3000 4000
δ
13
C (‰)
Concentração em ng/mL
Avaliação da linearidade - Pregnanodiol
Dados
média
média+2DP
média
-
2DP
87
4.6 ESTUDO PILOTO DO PERFIL ESTEROIDAL ENDÓGENO BRASILEIRO
As amostras utilizadas no estudo piloto do perfil esteroidal foram analisadas
seguindo protocolo analítico descrito no item 3.7.
Como população-alvo selecionou-se 104 indivíduos brasileiros, não-atletas, do
sexo masculino, na faixa etária entre 18-40 anos. Esses indivíduos cederam
amostras de urina livremente, respondendo o questionário padrão de voluntários
(Anexo 1). Nesse questionário foi declarada a abstinência em relação a drogas de
abuso ou qualquer medicamento que potencialmente tenha influência no perfil
endógeno.
O perfil esteroidal endógeno foi avaliado em relação às concentrações e
razões entre os principais esteróides usualmente analisados para o diagnóstico do
abuso de testosterona ou precursores (item 1.3).
As planilhas contendo todos os resultados de perfil esteroidal estão
disponíveis no apêndice 1.
4.6.1 Estudo piloto do perfil esteroidal baseado nas concentrações dos esteróides de
interesse
As figuras 42-49 apresentam as distribuições das concentrações dos
esteróides de androsterona, etiocolanolona, 5α-androstanodiol, 5β-androstanodiol,
pregnanodiol, DHEA, testosterona e epitestosterona.
88
0 2000 4000 6000 8000 1000012000140001600018000
0
5
10
15
20
25
30
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
0
5
10
15
20
25
30
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
Figura 42. Distribuição das concentrações de androsterona em 104 voluntários não-atletas.
Figura 43. Distribuição das concentrações de etiocolanolona em 104 voluntários não-atletas.
89
0 400 800 1200 1600 2000 2400
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
0 200 400 600 800 1000
0
5
10
15
20
25
30
35
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
Figura 44. Distribuição das concentrações de 5α-androstanodiol em 104 voluntários não-atletas.
Figura 45. Distribuição das concentrações de 5β-androstanodiol em 104 voluntários não-atletas.
90
0 1000 2000 3000 4000 5000
0
10
20
30
40
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
0 100 200 300 400 500
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
Figura 46. Distribuição das concentrações de pregnanodiol em 104 voluntários não-atletas.
Figura 47. Distribuição das concentrações de DHEA em 104 voluntários não-atetas.
91
0 50 100 150 200 250 300 350
0
10
20
30
40
50
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
Figura 48. Distribuição das concentrações de testosterona em 104 voluntários não-atletas.
Figura 49. Distribuição das concentrações de epitestosterona em 104 voluntários não-atletas.
92
A luz dos critérios estabelecidos pela WADA para o encaminhamento de
amostras para análise por CG-C-EMRI descritos no item
1.3.2 (
Technical Document –
TD2004EAAS, 2004) é possível fazer observações interessantes em relação aos
dados observados no estudo piloto. Principalmente em relação a androsterona,
etiocolonolona, DHEA, testosterona e epitestosterona, esteróides que apresentam
valores limites explicitados no documento técnico.
Com relação aos esteróides androsterona e etiocolanolona:
No estudo piloto com não atletas brasileiros foram observados nove casos de
androsterona, dois casos de etiocolonolona e oito casos onde ambos os esteróides
apresentaram valores acima de 10.000 ng/mL. Por esses valores cerca de 18% do
total de amostras seriam diagnosticadas como apresentando perfil esteroidal atípico.
Com relação ao esteróide DHEA:
No estudo piloto com não atletas brasileiros foram observados 17 casos onde
a concentração de DHEA apresentou valor acima de 100 ng/mL. Outros 22 casos
foram observados onde além do DHEA apresentar valores acima de 100 ng/mL outro
esteróide apresentou concentração acima do estabelecido pelo documento técnico
da WADA, o que representa 37,5% do total de amostras. A avaliação isolada deste
critério foi responsável por aproximadamente 16%.
Com relação aos esteróides testosterona e epitestosterona:
No estudo piloto com não atletas brasileiros foram observados nove casos de
testosterona, quatro casos de epitestosterona e quatro casos onde ambos os
esteróides apresentaram concentração acima de 200 ng/mL . Desta forma, cerca de
16% do total de amostras sugeriram perfil esteroidal atípico.
4.6.2. Estudo piloto do perfil esteroidal baseado nas razões entre esteróides.
As figuras 50-52 apresentam as distribuições das razões T/E, And/Etio e
Adiol/Bdiol.
93
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
5
10
15
20
25
30
35
T(área) / E(área)
Frequência das observações
Frequência das observações
Figura 50. Distribuição da razão T/E em 104 voluntários não-atletas.
Figura 51. Distribuição da razão And/Etio em 104 voluntários não-atletas.
0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60
70
[And]/[Etio]
94
0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4
0
10
20
30
40
50
Frequencia das observações
[Adiol]/[Bdiol]
Frequência das observações
Figura 52. Distribuição da razão Adiol/Bdiol em 104 voluntários não-atletas.
Por eliminar possíveis erros sistemáticos oriundos da calibração no processo
de quantificação, a análise das razões entre esteróides é uma poderosa ferramenta
de diagnóstico. A única razão explicitada pela WADA no documento técnico é a T/E.
Este critério representa o mais estável entre os estabelecidos pela WADA
através do Technical Document – TD2004EAAS (2004), uma vez que apresenta
poucas variações intra-indivíduo mediante variação nas concentrações de T e E.
Pelos dados obtidos pelo estudo piloto foi possível observar que:
Para a razão T/E:
Oito voluntários apresentaram valores da razão T/E ≥ 4, o que representa
aproximadamente 8% do total, resultando em um número bem mais aceitável de
amostras indicadas à análise de confirmação por CG/C/EMRI do que o sugerido
pelos demais critérios.
Tanto para as concentrações como para as razões entre os esteróides que
não são explicitadas pelo documento técnico TD2004EAAS a geração de um
histórico de valores constitui-se de uma ferramenta valiosa de diagnóstico.
95
Os dados aqui apresentados devem ser encarados como preliminares, visto
que são resultados de um número pequeno de voluntários. Estabelece-se como
etapa futura a ampliação do número de voluntários de modo a obter dados mais
representativos da população brasileira.
Também como etapa futura, estabelece-se a análise das amostras de
voluntários diagnosticadas como atípicas por perfil endógeno alterado pela técnica de
CG/C/EMRI. Essa ferramenta poderá auxiliar no estabelecimento de intervalos de
referência mais realísticos para o perfil endógeno, potencialmente diminuindo o
número de amostras direcionadas a etapa de confirmação por CG/C/EMRI.
De modo a traçar uma comparação entre os valores de perfil esteroidal da
população brasileira com a população geral, os dados de perfil esteroidal de
amostras diagnosticadas como atípicas durante os Jogos Pan-americanos do Rio de
Janeiro sofreram análise similar à apresentada nos itens 4.6.1 e 4.6.2.
4.7 PERFIL ESTEROIDAL DAS AMOSTRAS ATÍPICAS POR PERFIL ENDÓGENO
ALTERADO NOS XV JOGOS PAN-AMERICANOS
Os Jogos Pan-americanos de 2007 foram realizados do Rio de Janeiro, sendo
o LAB DOP – LADETEC / IQ – UFRJ o laboratório responsável pela realização do
controle de dopagem.
O evento envolveu 5.633 atletas de 47 países e 56 disciplinas esportivas
diferentes. No total, 1.274 amostras foram analisadas em 8 procedimentos iniciais de
análise diferentes, incluindo a análise do perfil endógeno esteroidal (item 3.7). A
logística e os resultados deste evento foram detalhados por Pereira et al. (2008).
Do total de amostras analisadas, 55 (4,5%) apresentaram perfil endógeno
classificado como atípico. As planilhas contendo os perfis esteroidais dessas
amostras estão disponíveis no apêndice 2.
A distribuição do perfil endógeno (concentrações e razões) dessa população
em particular está apresentada nas figuras 53 - 64.
96
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
0
5
10
15
20
25
Androsterona
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
0
5
10
15
20
Etiocolanolona
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
Figura 53. Distribuição das concentrações de androsterona das 55 amostras declaradas como atípicas
por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
Figura 54. Distribuição das concentrações de etiocolanolona das 55 amostras declaradas como
atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
97
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
5
10
15
20
25
30
35
5
β
-androstanodiol
Concentração em ng/mL
0 50 100 150 200 250 300 350
0
5
10
15
20
25
5α-androstanodiol
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
10
15
20
Frequência das observações
Figura 55. Distribuição das concentrações de 5α-androstanodiol das 55 amostras declaradas como
atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
Figura 56. Distribuição das concentrações de 5β-androstanodiol das 55 amostras declaradas como
atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-Americanos de 2007.
98
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
5
10
15
20
25
30
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
5
10
15
20
Frequência das observações
Concentração em ng/mL
Figura 57. Distribuição das concentrações de pregnanodiol das 55 amostras declaradas como atípicas
por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
Figura 58. Distribuição das concentrações de DHEA das 55 amostras declaradas como atípicas por
perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
99
0 25 50 75 100 125 150 175
0
5
10
15
20
Frequencia de observações
Concentração em ng/mL
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
10
20
30
40
Concentração em ng/mL
10
15
20
Frequência das observações
10
15
20
Frequência das observações
10
15
20
Frequência das observações
Figura 59. Distribuição das concentrações de testosterona das 55 amostras declaradas como atípicas
por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
Figura 60. Distribuição das concentrações de epitestosterona das 55 amostras declaradas como
atípicas por perfil endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
100
0 4 8 12 16 20 2 4 28 32 36 40
0
10
20
30
Frequencia das observações
T(área) / E(área)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
5
10
15
20
T(área) / E(área)
10
15
20
Frequência das observações
Figura 61. Distribuição da razão T/E das 55 amostras declaradas como atípicas por perfil endógeno
alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
O valor discrepante de T/E foi causado provavelmente pela baixa
concentração de E (0,3 ng/mL) dessa amostra em particular, o que prejudica a
análise deste esteróide e, por conseguinte, a estimativa da razão T/E. Para facilitar a
comparação, este valor foi retirado da análise. Os resultados estão dispostos na
figura 60.
Figura 62. Distribuição da razão T/E das 55 amostras declaradas como atípicas por perfil endógeno
alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007. A amostra cujo valor de epitestosterona apresentava-se
suprimido foi retirada.
101
0 1 2 3
0
5
10
15
20
25
30
Frequencia das observações
[And] / [Etio]
0,0 0,4 0,8 1,2 1,6
0
5
10
15
20
[Adiol] / [Bdiol]
10
15
20
Frequência das observações
10
15
20
Frequência das observações
Figura 63. Distribuição da razão And/Etio das 55 amostras declaradas como atípicas por perfil
endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
Figura 64. Distribuição da razão Adiol/Bdiol das 55 amostras declaradas como atípicas por perfil
endógeno alterado nos Jogos Pan-americanos de 2007.
102
A partir da análise do perfil endógeno das amostras declaradas atípicas foi
possível avaliar que:
Com relação às concentrações absolutas de androsterona e etiocolanolona:
Três amostras apresentaram concentrações desses esteróides acima de
10.000 ng/mL, sendo duas para androsterona e uma para etiocolanolona. Isso
representa menos de 0,3% de todas as amostras analisadas nos Jogos e cerca de
5% do total de amostras encaminhadas para a análise de confirmação por
CG/C/EMRI. Cabe considerar que nenhum desses casos evoluiu para um resultado
analítico adverso.
Na comparação entre a população constituinte do estudo piloto e a população
de amostras atípicas dos Jogos foi possível observar uma diferença significativa,
onde na primeira população ocorreu um percentual bem superior (18%) de amostras
com concentrações acima da 10.000 ng/mL.
Com relação às concentrações absolutas dos dióis - 5β-androstanodiol, 5α-
androstanodiol e pregnanodiol:
Para o 5α-androstanodiol, a faixa de concentração das amostras atípicas dos
Jogos Pan-americanos apresentou valores máximos de 350 ng/mL, sendo que
aproximadamente 85% dos resultados se situaram até 150 ng/mL. Na população do
estudo piloto, a faixa se estende até 1000 ng/mL, sendo que aproximadamente 83%
dos resultados se situaram até 400 ng/mL.
Para o 5β-androstanodiol, a faixa de concentração das amostras atípicas dos
Jogos Pan-Americanos vai até 1400 ng/mL, sendo que aproximadamente 80% dos
resultados se situaram até 400 ng/mL. Na população do estudo piloto, a faixa se
estende até 2400 ng/mL, sendo que aproximadamente 81% dos resultados se
situaram até 800 ng/mL.
Para o pregnanodiol, a faixa de concentração das amostras atípicas dos Jogos
Pan-Americanos vai até 4000 ng/mL, sendo que aproximadamente 95% dos
resultados se situaram até 2000 ng/mL. Na população de referência, a faixa se
estende até 5000 ng/mL, sendo que aproximadamente 93% dos resultados se
situaram até 2000 ng/mL.
Com relação à concentração absoluta de DHEA:
103
A avaliação da concentração de DHEA foi o critério responsável por 25 perfis
esteroidais atípicos, ou seja, cerca de 40% de todas as amostras encaminhadas para
a análise de confirmação por CG/C/EMRI e 2% do total de amostras dos Jogos Pan-
americanos. Cabe considerar que nenhum desses casos evoluiu para um RAA.
Na população de indivíduos não atletas brasileiros, observaram-se 17 casos
onde o único critério acima do limite foi a concentração de DHEA superior a 100
ng/mL (16% do total). Outros 22 casos tiveram além desse parâmetro, um outro
esteróide com concentração elevada. Esse total perfaz 37,5% do total de amostras.
Na avaliação de ambas as populações, pode-se inferir que o critério de 100
ng/mL parece ser por demais rigoroso, acarretando um número exagerado de
amostras a serem confirmadas por CG/C/EMRI. Tal argumento é corroborado por
publicações recentes onde se sugere um limite de 300 ng/mL para o diagnóstico de
uma amostra como atípica.
Com relação às concentrações absolutas de testosterona e epitestosterona:
Este critério não foi responsável por nenhum perfil esteroidal atípico nos jogos
Pan-americanos.
Na população de integrante do estudo piloto, foram observados os seguintes
resultados acima do valor de corte de 200 ng/mL: nove casos de testosterona, quatro
casos de epitestosterona e quatro casos para ambos. Desta forma, cerca de 16% do
total de amostras sugeriram perfil esteroidal atípico.
Com relação à razão T/E:
29 amostras apresentaram razão T/E superior ou igual a 4,0 nos Jogos Pan-
americanos perfazendo cerca de 2,5% do total de amostras analisadas.
Considerando apenas os resultados atípicos, a razão T/E equivaleu a 53% de todas
as amostras encaminhadas para a análise de confirmação por CG/C/EMRI.
Um destes casos evoluiu para um resultado analítico adverso.
Na população de não atletas, apenas 8 voluntários apresentaram valores de
T/E ≥ 4, o que representa um percentual bem inferior de amostras indicadas à
análise por CG/C/EMRI do que as sugeridas pelos demais critérios.
104
Indubitavelmente, a razão T/E constitui-se no critério mais estável entre os
estabelecidos pela WADA através do Technical Document – TD2004EAAS (2004).
A razão T/E apresenta variações máximas de 30% em homens, sendo,
portanto uma ferramenta útil na elaboração de estudos longitudinais provenientes de
amostras atípicas.
Com relação a razão And/Etio:
Nas amostras atípicas dos Jogos Pan-americanos, aproximadamente 95% dos
resultados da razão And/Etio foram distribuídos até o valor máximo de 2, sendo que
nenhum apresentou razão superior a 3.
Na população de não atletas brasileiros, aproximadamente 84% dos
resultados de razão And/Etio foram distribuídos até o valor máximo de 2, sendo que
apenas cerca de 4% do total apresentou razão superior a 3.
Com relação a razão Adiol/Bdiol:
Foi possível observar que os valores da razão Adiol/Bdiol provenientes das
amostras dos Jogos Pan-americanos variaram significativamente até 1,4, enquanto
que na população de não atletas, a distribuição foi significativa até o valor Adiol/Bdiol
igual a 2.
Existem diferenças marcantes nos valores encontrados entre as populações
avaliadas, principalmente quando são analisadas as concentrações absolutas dos
esteróides.
Apenas uma investigação adicional envolvendo, obrigatoriamente, um maior
número de voluntários será capaz de afirmar se tal diferença é resultado de uma
particularidade da população brasileira, fruto da diversidade genética intrínseca a
essa população. Além disso, a análise das amostras por CG/C/EMRI pode fornecer
informações valiosas a respeito de possíveis alterações nos valores de
concentrações frutos do uso de substâncias exógenas.
De imediato, não pode ser descartada a existência de desvios decorrentes da
calibração no processo de quantificação visto que o intervalo entre a realização das
análises das duas populações foi de aproximadamente 20 meses. Tal hipótese será
investigada futuramente, quando um conjunto limitado de amostras será repreparado
para a avaliação dos resultados.
105
4.8 ESTUDO DA RAZÃO ISOTÓPICA DE RESULTADOS ATÍPICOS DOS XV
JOGOS PAN-AMERICANOS
Após a conclusão das etapas de desenvolvimento/adaptação e validação, o
método proposto e objeto dessa dissertação foi aplicado às amostras declaradas
como atípicas por alterações no perfil endógeno nos XV Jogos Pan-americanos.
O total, 55 amostras, foram encaminhadas para confirmação por CG/C/EMRI,
de acordo com procedimento descrito no item 3.8.
Todos os valores de δ
13
C (‰) obtidos para os esteróides androsterona,
etiocolanolona, 5α-androstanodiol, 5β-androstanodiol e pregnanodiol destas
amostras são apresentados no apêndice 3.
O período médio de preparação de cada lote foi de 9 horas, possibilitando a
liberação de resultados em 24 horas quando negativas. Em caso de suspeita, a
amostra era repreparada, aumentando assim o período de liberação do resultado.
Dois operadores se revezaram na preparação das amostras, enquanto um
terceiro profissional teve a responsabilidade de manter o equipamento nas condições
de desempenho pré-estabelecidas. Tal estratégia teve que ser adotada tendo em
vista a dinâmica da competição.
Cada lote analítico foi injetado somente após a verificação de que os valores
de δ
13
C dos alcanos de referência estavam coerentes com a série histórica.
Dentre as 55 amostras analisadas, uma foi declarada como um resultado
analítico adverso e os cromatogramas estão disponíveis nas figuras 65 e 66.
Figura 65. Cromatograma da fração 2 da amostra declarada como adversa pelo uso de testosterona
e/ou precursores nos Jogos Pan-americanos do Rio de Janeiro, onde estão indicados: acetato de
etiocolanolona (2), acetato de androsterona (3) e pulsos de CO
2
(8).
2
3
8
8
106
Figura 66. Cromatograma da fração 3 da amostra declarada como adversa pelo uso de testosterona
e/ou precursores nos Jogos Pan-americanos do Rio de Janeiro, onde estão indicados: acetato de 5β -
androstanodiol (4), acetato de 5α-androstanodiol (5), acetato de pregnanodiol (7) e pulsos de CO
2
(8).
Tal amostra apresentou como alteração do perfil endógeno a razão T/E (5,2).
O resultado foi considerado adverso após a avaliação do valor de δ
13
C dos dióis em
relação a referência endógena pregnanodiol (tabela 10). Critério de diagnóstico:
∆δ
13
C > 3.
Tabela 10. Resultados de δ
13
C (‰) para os esteróides androsterona, etiocolanolona, 5α-
androstanodiol, 5β-androstanodiol e pregnanodiol da amostra declarada como adversa pelo uso de
testosterona e/ou precursores nos Jogos Pan-americanos do Rio de Janeiro.
Etiocolanolona
Androsterona
B
diol
A
diol
Pregnanodiol
Fração 2
-24,90 -25,45 - - -
Fração 3
- - -25,51 -31,42 -22.25
Comparação dos valores de δ
13
C entre 5α-androstanodiol e pregnanodiol:
|δ
13
C 5α-androstanodiol| - |δ
13
C pregnanodiol| = 9,17
Comparação dos valores de δ
13
C entre 5β-androstanodiol e pregnanodiol:
|δ
13
C 5β-androstanodiol| - |δ
13
C pregnanodiol| = 3,26
Apesar de, a rigor, dois metabólitos preencherem o critério de positividade da
análise, observa-se uma grande diferença entre os valores de ∆δ
13
C para o 5α-
androstanodiol. A interpretação dessa amostra pode ser considerada como um caso
limite, visto que o resultado analítico adverso foi declarado baseado,
predominantemente, no valor de
δ
13
C
de apenas um metabólito, o 5α-androstanodiol.
4
5
7
8
8
107
O resultado encontra respaldo na literatura, uma vez que os dióis são
reconhecidos como melhores marcadores para o consumo de testosterona e/ou
precursores do que os demais metabólitos (SHACKLETON et al., 1997).
Pode-se inferir que o consumo da substância dopante não foi recente, doutro
sim, um número maior de metabólitos apresentaria alterações nos valores de δ
13
C.
Tal padrão de utilização vem a ser bastante característico, visto que são
necessários vários meses para a observação do aumento da massa muscular, e
frequentemente o consumo é interrompido várias semanas antes da competição,
visando burlar o controle de dopagem.
O resultado não foi contestado pelo atleta, que veio posteriormente a ser
condenado por violação do código do controle de dopagem por uso de substância
proibida (AGUILERA et al., 2009/ ANEXO 2).
108
5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Foi desenvolvido um método de confirmação para esteróides anabolizantes
androgênicos por CG/C/EMRI, de acordo com as necessidades vislumbradas
pelos XV Jogos Pan-americanos;
• O método desenvolvido foi validado à luz do estabelecido pelo Internacional
Standard for Laboratories da Agência Mundial Antidopagem.
• O método desenvolvido mostrou-se eficiente na detecção do abuso de
testosterona e/ou precursores para avaliação dos valores de δ
13
C dos
esteróides androsterona, etiocolanolona, 5α-androstanodiol, 5β-
androstanodiol e pregnanodiol.
• O método desenvolvido foi aplicado satisfatoriamente nos XV Jogos Pan-
americanos, sendo capaz de identificar um resultado analítico adverso pelo
uso de testosterona ou precursores. Não houve contestação do resultado;
• Foi realizado um estudo piloto do perfil esteroidal da população brasileira a
partir da análise de 104 voluntários não-atletas e saudáveis, do sexo
masculino.
• Os dados do perfil esteroidal da população de referência foram confrontados
com os provenientes de resultados atípicos dos XV Jogos Pan-americanos.
• Como esperado, as razões entre esteróides mostraram maior relação entre
as populações estudadas do que a observação das concentrações
absolutas.
• A análise dos resultados para as concentrações do DHEA na urina de
atletas, em conjunto com os valores de razão isotópica para as mesmas
amostras, corrobora dados recentes da literatura. Esses trabalhos indicam
que o critério atualmente adotado pela WADA para o encaminhamento de
109
uma amostra para análise por CG/C/EMRI baseado nesse hormônio ([DHEA]
> 100 ng/mL), acarreta em um número logisticamente proibitivo de re-
preparações.
• Maiores considerações a respeito do perfil endógeno da população brasileira,
caracterizada pela heterogeneidade, serão possíveis a partir do aumento do
número de indivíduos.
• Uma vez a técnica tendo sido implantada no laboratório, deixa-se como
perspectiva futura a avaliação dos valores de δ
13
C característicos da
população brasileira.
110
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116
APÊNDICE 1 – Perfil esteroidal dos voluntários
Voluntário
[And] [Etio] [Adiol] [Bdiol] [PD] [DHEA]
[T] [E] T/E
1 1377,69 1260,72 129,83
199,89 412,78 0,00 17,13 28,72 0,7
2 1386,79 2038,51 148,63
233,66 891,38 28,89 56,25 49,26 1,3
3 810,13 742,20 144,52
467,32 320,79 13,65 22,65 8,23 3,1
4 1043,17 1402,10 162,52
404,52 617,33 34,97 33,40 11,34 3,3
5 1986,50 1077,51 127,65
75,59 188,55 23,85 1,76 21,13 0,1
6 689,30 624,38 67,68 228,45 178,29 10,48 17,29 5,41 3,6
7 2348,05 1612,94 279,71
521,13 286,88 24,34 36,81 16,95 2,4
8 906,70 713,25 127,21
144,62 149,34 0,00 13,55 30,89 0,5
9 1530,13 1270,56 235,46
749,11 342,15 19,55 39,69 15,56 2,9
10 762,37 500,41 90,16 85,54 333,19 21,44 22,59 11,94 2,1
11 1501,62 3283,65 151,71
921,69 1087,37
21,06 26,29 5,51 5,1
12 789,43 766,75 89,39 87,25 200,49 15,17 13,66 8,70 1,8
13 113,49 241,33 41,50 37,44 36,90 11,55 4,32 10,24 0,5
14 1352,95 1409,59 79,30 245,98 825,69 17,60 19,11 10,26 2,1
15 2899,24 1364,33 350,26
372,50 668,82 45,43 43,31 23,34 2,1
16 997,80 1092,30 60,16 58,49 313,97 10,79 0,00 14,45 0,0
17 1933,10 2456,19 133,33
191,84 464,52 0,00 56,01 57,65 1,1
18 496,87 1247,49 44,17 143,84 575,16 10,18 13,22 3,70 4,0
19 1133,25 440,64 143,24
152,06 147,09 23,31 31,70 10,54 3,4
20 1087,93 515,45 87,17 119,77 159,16 14,68 16,51 14,05 1,3
21 1378,72 1546,03 152,25
335,03 369,55 21,06 9,16 4,84 2,1
22 641,14 425,31 129,22
103,67 393,10 0,00 28,99 45,30 0,7
23 848,51 1398,60 76,99 245,08 883,48 10,78 29,40 4,01 8,2
24 976,73 952,11 113,77
266,69 318,94 11,56 22,71 10,23 2,5
25 3515,30 2466,41 388,35
599,53 916,94 42,82 44,03 39,86 1,2
26 1593,07 1271,66 213,90
321,51 359,77 25,19 19,45 21,90 1,0
27 2987,81 3508,03 381,19
905,40 609,68 28,72 57,29 41,79 1,5
28 1928,72 1783,49 188,91
525,68 484,16 15,03 44,60 24,39 2,1
29 1940,28 1625,45 173,50
179,67 525,24 45,46 2,06 65,85 0,0
30 817,53 689,75 63,49 55,55 156,80 0,00 1,91 19,80 0,0
31 7474,24 7341,18 369,55
982,61 701,85 0,00 222,52
287,90
0,9
32 6774,24 4833,18 191,57
140,69 1438,91
110,85
12,35 117,48
0,1
33 5316,69 4587,17 215,28
569,93 1105,65
87,48 115,59
88,79 1,5
34 2973,00 6478,90 190,82
536,51 1506,37
88,65 40,18 51,28 0,9
35 5205,52 3691,46 226,46
345,58 355,48 69,49 36,61 35,80 1,1
36 4476,80 2965,68 202,96
503,88 212,02 71,65 84,31 62,93 1,5
37 3508,49 1267,58 152,46
134,88 268,98 0,00 103,40
91,81 1,3
38 12386,76
5411,56 552,34
792,62 1285,13
117,94
186,43
85,13 2,5
39 6902,12 8532,66 275,83
1314,06
1627,61
136,38
157,75
62,88 2,8
40 9209,63 3296,68 332,68
246,61 511,73 136,98
55,61 42,28 1,5
41 1040,99 726,87 33,91 107,09 99,30 16,96 10,42 19,88 0,6
42 6428,70 4338,10 257,20
469,45 1214,16
72,80 73,12 105,72
0,8
43 11797,46
12406,37
310,82
958,88 1048,93
196,57
145,22
42,50 3,8
44 3507,05 1898,59 183,67
304,32 279,24 64,04 65,99 73,70 1
45 7793,45 5227,78 133,45
90,08 645,73 104,88
9,24 68,52 0,2
46 16901,88
10090,81
814,44
1179,93
931,74 239,81
229,52
183,38
1,4
47 11544,32
4979,59 450,90
879,15 642,13 233,09
222,87
73,60 3,4
117
Voluntário
[And] [Etio] [Adiol] [Bdiol] [PD] [DHEA]
[T] [E] T/E
48 8659,10 6364,39 265,59
945,46 3854,97
96,63 154,69
225,21
0,8
49 7140,84 6291,43 435,99
926,87 1563,68
79,78 147,81
98,42 1,7
50 6470,41 3759,13 228,56
101,33 541,90 89,85 9,05 72,19 0,1
51 7247,51 5023,33 249,13
369,10 1355,87
102,87
99,33 44,49 2,5
52 6002,31 4823,92 288,23
163,77 900,50 74,39 11,64 49,81 0,3
53 14419,60
7317,73 962,44
1366,03
1341,08
275,95
198,75
137,24
1,6
54 3369,32 3949,78 86,50 349,10 844,99 55,21 50,81 30,41 1,9
55 5376,05 5710,36 318,60
240,73 1744,53
72,13 12,10 93,50 0,1
56 6934,96 8078,73 243,52
944,58 2032,83
123,47
110,45
40,89 3
57 6375,57 5037,63 270,86
951,53 770,37 118,15
181,55
224,12
0,9
58 4432,41 3096,63 167,13
433,17 494,83 39,87 80,02 17,00 5,3
59 2562,42 3215,45 61,60 169,68 575,25 0,00 60,77 58,80 1,2
60 4682,14 2644,11 146,16
379,13 516,68 97,92 86,57 69,88 1,4
61 11991,78
5819,42 344,05
883,47 1007,16
146,61
156,03
38,59 4,5
62 6762,16 6266,08 267,16
772,81 1900,77
88,91 121,41
124,33
1,1
63 12356,34
8796,10 365,97
1050,14
1047,89
179,33
134,69
245,83
0,6
64 8231,96 7990,97 189,87
518,04 1244,17
89,57 73,83 46,29 1,8
65 5317,25 3870,21 141,94
236,32 451,24 77,39 62,43 71,10 1
66 6723,50 3057,59 275,37
180,86 977,81 77,47 113,28
44,92 1,6
67 7027,36 11744,75
346,98
2192,16
3636,05
198,85
186,79
43,38 4,8
68 5123,76 3168,81 82,10 51,74 351,65 55,79 11,17 54,50 0,2
69 4806,55 6192,25 138,24
151,54 1938,19
102,99
15,79 71,41 0,2
70 11437,98
3340,17 418,27
445,00 1057,11
168,73
174,91
57,92 3,4
71 4095,09 2777,86 146,68
725,30 537,73 73,43 120,25
107,17
1,3
72 14251,54
9263,29 336,60
478,35 975,24 260,34
111,82
135,33
0,9
73 14330,66
6697,73 311,11
559,31 1401,22
133,00
83,92 176,01
0,5
74 8974,01 3737,19 313,79
297,83 860,25 159,94
125,64
91,09 1,5
75 5589,97 4587,28 289,41
1038,80
941,84 111,30
88,89 30,42 3,3
76 5511,48 3449,20 169,88
314,33 494,85 60,14 55,76 23,77 2,6
77 14156,20
10628,28
481,39
729,57 1293,92
285,75
219,13
209,96
1,2
78 17322,64
17346,42
745,45
2371,88
4660,33
258,94
248,67
126,36
2,2
79 8315,37 2126,67 223,69
353,86 315,11 78,63 91,58 89,69 1,1
80 7667,59 2462,20 180,46
182,25 550,12 83,74 39,36 39,74 1,1
82 5044,63 5028,18 195,45
353,80 896,73 72,73 30,08 73,80 0,5
83 9343,93 5379,76 373,51
460,62 999,66 189,13
67,63 153,02
0,5
84 4746,40 4191,65 143,41
515,81 915,21 61,79 83,62 99,75 0,9
85 3769,89 1637,79 180,00
159,96 238,65 57,49 78,33 40,26 2,2
86 9484,78 7859,66 497,65
1572,58
943,55 132,35
181,92
115,77
1,8
87 7353,77 5465,03 395,90
700,47 617,30 115,86
176,39
166,98
1,2
88 13936,76
6601,74 509,74
712,01 997,25 341,02
268,22
90,43 3,3
90 3197,14 3315,73 125,27
342,26 809,88 52,11 49,87 16,08 3,5
91 2740,16 2339,24 104,98
380,25 713,39 22,47 44,37 31,82 1,6
92 9543,69 4857,52 417,52
434,19 1059,79
146,25
75,07 135,45
0,6
93 6232,31 3440,28 152,80
302,38 691,86 73,40 29,71 33,93 1
94 6487,90 1004,64 279,07
187,95 279,92 120,93
228,85
56,47 4,6
95 8844,34 5185,82 238,71
136,39 438,31 193,63
27,44 166,55
0,2
96 9330,61 5873,11 431,63
233,01 812,56 142,14
7,27 129,37
0,1
97 17842,58
17260,06
622,98
574,39 2798,66
485,01
435,95
166,90
2,9
98 16353,47
15988,31
757,42
697,85 2151,12
374,34
216,03
292,85
0,8
99 7130,60 5391,20 247,92
688,37 820,38 174,12
207,50
49,69 4,7
100 12485,79
12094,30
514,04
475,42 1934,01
282,30
302,27
168,73
2
118
Voluntário
[And] [Etio] [Adiol] [Bdiol] [PD] [DHEA]
[T] [E] T/E
101 7845,12 9627,24 429,72
1187,34
1582,52
216,95
186,59
238,10
0,9
102 4257,09 4723,61 166,42
771,12 749,04 73,86 100,18
39,39 2,9
103 16510,08
16139,83
814,28
750,60 2260,98
257,65
227,15
307,18
0,8
104 5200,44 5041,42 301,59
606,32 1390,92
153,06
89,32 81,38 1,2
105 4181,01 3226,59 140,75
559,81 522,34 53,59 107,03
55,46 2,2
106 7039,05 12669,04
495,75
1299,88
1844,43
160,29
248,85
170,70
1,6
119
APÊNDICE 2 – Amostras com perfis esteroidais atípicos analisadas nos XV Jogos
Pan-Americanos
Amostra [And] [Etio] [Adiol] [Bdiol] [PD] [DHEA]
[T] [E] T/E
1 7276,6 9851,9 120,8 166,5 2192,3
188,9 31,6 28,6 1,2
2 15224,4
9817,2 335,9 611,4 926,5 126,5 89,3 166,9
0,6
3 4943,5 14219,9
146,0 491,9 1644,3
135,7 90,0 58,3 1,7
4 9209,0 4584,7 249,3 419,6 1949,5
97,9 64,1 17,2 4,2
5 6833,3 5105,7 204,4 214,2 1054,2
84,7 171,5
58,6 4,3
6 1900,9 1989,5 88,3 93,9 646,7 44,8 8,3 2,4 4,0
7 6033,0 9880,1 306,7 1303,6
2716,6
197,0 167,5
128,0
1,7
8 5213,5 9112,9 240,4 411,3 1193,8
116,0 71,8 81,8 1,0
9 6751,7 6341,4 249,3 822,3 1593,6
122,3 90,4 101,2
1,0
10 1263,6 6147,9 26,2 293,8 979,9 58,1 76,9 21,6 4,2
11 3617,0 3041,4 91,7 72,7 390,0 154,2 11,3 76,2 0,2
12 3059,3 3666,2 18,2 60,7 1503,9
134,5 12,5 7,9 1,7
13 8016,9 5844,6 76,7 72,1 1999,4
203,3 39,4 18,4 2,3
14 6446,0 8097,2 137,5 310,9 1819,4
206,3 100,1
112,6
0,9
15 2213,9 2216,2 159,2 416,4 369,0 57,5 83,0 20,6 4,3
16 2653,0 2802,9 123,5 216,4 614,1 126,1 97,5 70,2 1,5
17 2515,5 4360,3 42,5 24,6 1501,4
220,0 19,6 11,5 1,9
18 2357,1 2982,0 33,7 35,8 603,5 202,2 34,5 29,1 1,4
19 7534,7 5583,7 200,2 253,0 1254,5
289,3 71,9 48,0 1,7
20 57,9 108,5 1,6 9,1 36,8 4,4 1,7 0,3 7,2
21 5786,5 9346,2 130,4 667,1 3630,8
388,4 47,1 43,2 1,3
22 8961,5 3337,4 127,4 200,6 345,8 147,1 119,3
195,1
0,7
23 3439,5 3382,7 83,9 377,1 654,5 109,7 48,5 14,0 3,9
24 2613,7 2295,9 50,3 97,1 1392,9
136,7 17,0 13,3 1,5
25 3029,3 3726,8 81,7 156,3 481,9 151,6 55,0 59,3 1,0
26 4794,1 2257,5 113,5 233,3 518,9 26,1 82,1 11,9 7,3
27 959,7 1339,4 6,8 55,6 242,3 23,6 8,1 0,3 37,0
28 296,4 497,4 10,2 31,8 93,2 12,0 22,1 5,5 4,2
29 2364,8 1882,5 102,4 229,9 341,1 82,1 88,4 14,5 6,4
30 2296,4 3006,0 129,5 431,5 387,5 82,8 53,0 11,8 4,7
31 317,7 193,0 6,9 17,2 76,7 4,5 6,1 1,4 4,5
32 494,2 481,1 10,8 40,6 62,6 12,1 10,2 2,6 4,4
33 12820,9
4265,0 110,2 80,8 1394,3
143,7 20,5 22,2 1,0
34 9377,3 5676,3 43,1 117,3 1551,2
195,5 36,5 24,7 1,6
35 3187,6 2886,6 100,3 152,7 620,7 46,7 29,8 6,7 4,2
36 4805,0 6972,0 56,5 179,0 996,6 233,5 31,2 30,9 1,1
37 188,9 334,3 2,4 13,9 129,0 12,3 2,0 0,4 4,8
38 1408,0 1368,4 58,5 104,9 172,9 43,9 59,1 10,5 5,9
39 1935,3 1776,1 42,2 145,7 420,3 32,9 42,0 9,1 4,7
40 282,7 203,6 2,6 2,4 39,0 5,1 6,2 1,5 4,3
41 3779,3 2161,7 96,4 180,8 400,7 132,6 54,5 29,0 2,0
42 964,0 1412,3 27,7 50,3 156,9 16,1 40,4 5,1 8,3
43 2265,1 2591,3 15,3 73,0 339,8 105,5 16,5 4,0 4,7
44 2588,3 1940,4 79,0 313,4 346,2 47,6 89,8 17,3 5,9
45 2098,8 2043,6 47,1 140,9 367,5 77,6 40,1 10,4 4,4
46 4549,0 2400,6 161,5 119,7 275,6 137,0 79,3 70,4 1,2
120
Amostra [And] [Etio] [Adiol] [Bdiol] [PD] [DHEA]
[T] [E] T/E
47 2522,8 1374,2 65,9 175,4 241,2 57,3 65,6 10,5 6,4
48 297,1 436,8 7,0 14,3 65,1 7,7 8,1 1,5 5,5
49 3683,2 3556,9 38,5 43,0 961,7 142,8 12,3 16,4 0,8
50 3138,3 2189,8 121,9 216,1 192,3 92,5 48,8 77,9 0,7
51 1349,1 1902,2 31,6 303,1 824,4 43,0 54,2 13,0 4,4
52 2561,9 1530,2 43,1 47,8 189,1 33,5 29,0 6,1 5,0
53 2063,4 2074,7 45,8 139,5 749,8 24,5 59,5 13,5 4,6
54 2679,9 1968,1 78,8 158,4 222,7 61,0 104,0
23,0 4,6
55 3419,4 2068,2 100,7 143,5 337,6 76,2 138,4
23,9 6,0
121
APÊNDICE 3 – Resultados das análises por CG/C/EMRI nos XV Jogos Pan-
americanos
Amostra
δ
13
C (‰)
And
δ
13
C (‰)
Etio
δ
13
C (‰)
Adiol
δ
13
C (‰)
Bdiol
δ
13
C (‰)
PD
1 -23,16 -27,63 -26,81 -27,82 -25,73
2 -21,11 -24,08 -25,22 -26,78 -23,55
3 -21,90 -22,44 N.A. -25,60 -22,83
4 -22,41 -25,20 -25,96 -26,65 -23,93
5 -23,59 -25,49 -23,94 -24,21 -23,57
6 -24,07 -26,41 -24,38 -25,44 -23,36
7 -24,38 -26,30 -24,95 -25,89 -25,42
8 -24,29 -26,33 -24,66 -26,52 -25,33
9 -22,84 -24,87 -24,34 -26,05 -24,34
10 -22,03 -24,72 -25,39 -26,82 -25,21
11 -23,75 -25,46 N.A. N.A. -25,75
12 -24,70 -26,72 N.A N.A. -27,95
13 -23,82 -25,89 N.A. N.A. -26,19
14 -25,14 -26,76 -27,06 -27,60 -27,16
15 -20,32 -21,65 -25,05 -24,88 -25,70
16 -23,18 -24,41 -26,70 -26,71 -24,69
17 -22,39 -22,78 -25,42 -22,37 -25,55
18 -23,24 -22,92 -23,61 -25,47 -24,13
19 -23,89 -24,43 -22,12 -26,99 -25,80
20 -24,86 -25,66 N.A. N.A. N.A.
21 -25,63 -25,67 -27,48 -27,03 -26,06
22 -23,67 -25,22 -26,27 -26,62 -24,58
23 -23,32 -24,39 -26,32 N.A. -24,24
24 -21,22 -23,10 -24,34 -24,75 -22,67
25 -22,94 -24,51 -26,77 -26,61 -23,95
26 -23,93 -24,88 -26,65 -26,14 -25,89
27 -25,94 -26,16 -27,34 -26,25 -25,00
28 -25,15 -25,53 -21,10 -26,17 -24,78
29 -21,25 -22,60 N.A. -25,90 -23,05
30 -24,33 -25,54 -27,95 -25,07 -23,98
31 -24,55 -24,165 N.A. N.A -23,43
32 -22,17 -21,56 N.A. -23,32 -21,19
33 -22,48 -26 -29 -27,66 -22,61
34 -22,86 -26,13 -25,33 -25,62 -23,60
35 -22,88 -25,10 N.A. -25,98 -22,73
36 -25,63 -29,31 N.A. N.A. -25,26
37 -23,53 -25,99 N.A. N.A. -24,88
38 -23,40 -25,12 -26,34 -26,18 -23,48
39 -22,01 -25,07 -26,07 -26,49 -23,55
40 -20,29 -23,35 N.A. N.A. N.A.
41 -23,97 -25,31 N.A. -27,23 -23,73
42 -23,97 -25,31 N.A. -27,40 -24,34
43 -23,02 -23,139 N.A. -26,45 -24,83
44 -23,23 -24,301 -26,06 -24,75 -24,08
45 -24,29 -24,174 N.A. -25,41 -24,69
46 -23,10 -23,979 -25,92 -24,73 -22,77
122
Amostra
δ
13
C (‰)
And
δ
13
C (‰)
Etio
δ
13
C (‰)
Adiol
δ
13
C (‰)
Bdiol
δ
13
C (‰)
PD
47 -24,03 -24,867 -24,84 -23,92 -22,47
48 -21,22 -22,521 N.A. N.A. -22,43
49 -21,95 -22,588 N.A. N.A. -23,79
50 -22,21 -22,987 -26,57 -25,54 -26,72
51 -20,46 -21,147 -25,01 -24,22 -22,88
52 -23,35 -24,549 N.A. N.A. -24,53
53 -22,15 -23,115 -25,91 -25,28 -23,27
54 -21,60 -22,578 -25,87 -25,15 -22,66
55 -21,58 -21,918 -26,85 -27,46 -25,18
123
ANEXO 1 – Formulário para coleta de amostras de voluntários
UFRJ - INSTITUTO DE QUÍMICA
LABORATÓRIO DE APOIO AO
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
Protocolo de Coleta e Acompanhamento de Amostras
Humanos
RT Método 5.260
Código do paciente:
____________________________
Medicamento: ____________________
(Uso restrito ao laboratório)
Dosagem: _______________________
Via de administração:_________
______
Sexo:
( ) Masculino
( ) Feminino
Uso de contraceptivo
( ) Não
( ) Sim
( ) Espermicida Nome: __________________________
( ) Pílula Nome: __________________________
Altura:
___________ metros
Idade:
___________ anos
Peso:
___________ Kg
Cor / Raça
( ) Caucasiano
( ) Negro
( ) Oriental, asiático
( ) Outras origens étnicas
( ) Pardo
Tipo: ____________________________
Pratica esporte
( ) Sim
( ) Amador ( ) Profissional
( ) Não
Características ( ) Falta de enzima ligadas a digestão. (ex. alergia a leite)
metabólicas especiais ( ) Problemas de digestão
( ) Outros Tipo: ____________________________
Dieta ( ) Vegetariano
( ) Não vegetariano Tipo: ____________________________
•
Fonte predominante
( ) Animal Tipo: ____________________________
de gordura na dieta
( ) Vegetal (ex. óleo de soja,
Tipo: ____________________________
etc.)
•
Fonte predominante
( ) Suíno ( ) Bovino
de car
ne na dieta
( ) Aves
( ) Peixe
•
Dieta suplementar
( ) Proteína ( ) Vitaminas
Tipo: ____________________________
( ) Outros
Medicação administrada
Nome: _________________
Via :
( ) Oral
( ) Injetável
_______________________
( ) Nasal
( ) Inalável
_______________________ ( ) Outros:
_______________
_______________________ _______________
• Uso prolongado
( ) Sim ( ) Não
Tempo decorrido desde a última administração: _____________ Horas
Observações
124
ANEXO 2 – Artigo sobre as análises de confirmação de esteróides anabolizantes
endógenos por CG/C/EMRI nos XV Jogos Pan-americanos
125
126
127
128
129
130
131
Livros Grátis
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Milhares de Livros para Download:
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