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GISELE RODRIGUES DA SILVA
DESENVOLVIMENTO DE IMPLANTES INTRA-
OCULARES CONSTITUÍDOS DE POLIURETANOS
BIODEGRADÁVEIS E ACETATO DE DEXAMETASONA
BELO HORIZONTE
FACULDADE DE FARMÁCIA – UFMG
2009
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GISELE RODRIGUES DA SILVA
DESENVOLVIMENTO DE IMPLANTES INTRA-
OCULARES CONSTITUÍDOS DE POLIURETANOS
BIODEGRADÁVEIS E ACETATO DE DEXAMETASONA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito à obtenção do título de Doutor
em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Armando da Silva Cunha Junior
Co-orientador: Prof. Dr. Rodrigo Lambert Oréfice
BELO HORIZONTE
FACULDADE DE FARMÁCIA – UFMG
2009
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“Para ser grande, sê inteiro: nada
Teu exagera ou exclui.
Sê todo em cada coisa. Põe quanto és
No mínimo que fazes.
Assim em cada lago, a lua toda
Brilha, porque alta vive.”
Fernando Pessoa
4
Dedico este trabalho
aos meus pais, Lourdes e Geraldo,
pelo amor incondicional, incentivo e apoio
aos meus irmãos, Leonardo e Fabinho,
pelo companheirismo e amizade
ao Marcílio,
pelo amor incondicional e carinho
ao Armando e ao Rodrigo,
pela valiosa contribuição em todas as
etapas do desenvolvimento deste
trabalho
5
AGRADECIMENTOS
Meu Deus, eu te agradeço porque Tu és a sombra fresca que me cobres durante todos os dias.
Eu te agradeço porque - invisível, carinhoso, envolvente - Tu cuidas de mim em todas as
horas.
Ao professor Dr. Armando da Silva Cunha Junior por ter me presenteado com as idéias desta
tese, pela orientação e pelo privilégio de ter a sua amizade e confiança.
Ao professor Dr. Rodrigo Lambert Oréfice pela orientação, oportunidade de convivência e
por sempre ser extremamente atencioso.
À professora Dra. Francine Behar-Cohen pelo profissionalismo, competência e por ter me
recebido em seu laboratório.
À professora Dra. Eliane Ayres pela generosidade em me ensinar a preparar e fornecer os
polímeros usados neste trabalho.
À professora Dra. Sandra Aparecida Moura pelo incentivo, ajuda e amizade.
Ao professor Dr. Gerson Antônio Pianetti pela confiança.
À Juliana Saliba pelos conselhos, apoio e amizade.
À Brigitte Goldenberg pelos conselhos, apoio e por sempre ser muito amável.
Ao Diego e à Laurinha pela ajuda constante, paciência e dedicação ao trabalho.
Meus sinceros agradecimentos a todos os outros, aqui e ali, que tornaram este trabalho
possível.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
09
LISTA DE TABELAS
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
14
RESUMO
16
ABSTRACT
18
1 INTRODUÇÃO
20
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
24
2.1 Anatomia ocular
25
2.1.1 Cavidade orbital e pálpebras 25
2.1.2 Bulbo ocular 25
2.1.3 Córnea 26
2.1.4 Esclera 27
2.1.5 Lente 27
2.1.6 Íris e corpo ciliar 27
2.1.7 Coróide 28
2.1.8 Retina 28
2.1.9 Corpo vítreo 31
2.2 Implantes intra-oculares
31
2.2.1 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis 32
2.2.1.1 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis para o tratamento da
retinite por CMV
32
2.2.1.2 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis para o tratamento das uveítes
não infecciosas
34
2.2.1.3 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis para o tratamento das doenças
relacionadas à retinopatia diabética
36
2.2.1.4 Implantes intra-oculares não biodegradáveis contendo células para o
tratamento das desordens da retina
37
2.2.2 Implantes intra-oculares biodegradáveis 38
2.2.2.1 Implantes intra-oculares biodegradáveis para o tratamento da retinite por
citomegalovírus
42
2.2.2.2 Implantes intra-oculares biodegradáveis para o tratamento das uveítes 43
2.2.2.3 Implantes intra-oculares biodegradáveis para o tratamento da 46
7
vitreoretinopatia proliferativa
2.3 Síntese dos poliuretanos
49
2.4 Poliuretanos aplicados na oftalmologia
53
3 OBJETIVOS
61
4 MATERIAIS
63
5 MÉTODOS
66
5.1 Desenvolvimento e caracterização dos implantes à base de poliuretanos
biodegradáveis e ACT
67
5.1.1 Síntese das dispersões aquosas de poliuretanos (PUD5 e PUD6) 67
5.1.2 Incorporação do acetato de dexametasona (ACT) 69
5.1.3 Formação dos implantes de poliuretanos e acetato de dexametasona 70
5.1.4 Caracterização dos implantes de poliuretanos e acetato de dexametasona 71
5.1.4.1 Espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) 71
5.1.4.2 Difração de raios-X (XRD) 71
5.1.4.3 Espalhamento de raios-X em baixo ângulo (SAXS) 71
5.2 Estudo de degradação in vitro dos poliuretanos
71
5.2.1 Degradação in vitro dos poliuretanos 71
5.2.2 Caracterização dos poliuretanos degradados 72
5.2.3 Teste de citotoxicidade dos produtos de degradação 72
5.3 Estudo de liberação in vitro do acetato de
dexametasona a partir dos
implantes
72
5.4 Estudo de biocompatibilidade in vitro dos poliuretanos
73
5.4.1 Cultura de células ARPE-19 sobre os poliuretanos 73
5.4.2 Adesão celular sobre os poliuretanos 73
5.4.3 Proliferação celular sobre os poliuretanos 74
5.4.4 Microscopia eletrônica de varredura 74
5.4.5 Imunofluorescência 75
5.5 Estudo de biocompatibilidade in vivo dos poliuretanos
75
5.5.1 Animais 75
5.5.2 Implantação dos poliuretanos no espaço subretiniano e corpo vítreo 76
5.5.3 Avaliação histopatológica 76
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
78
6.1 Desenvolvimento e caracterização dos implantes à base de poliuretanos
79
8
biodegradáveis e ACT
6.2 Estudo de degradação in vitro dos poliuretanos
86
6.3 Estudo de liberação in vitro
do acetato de dexametasona a partir dos
implantes
97
6.4 Estudo de biocompatibilidade in vitro dos poliuretanos
98
6.5 Estudo de biocompatibilidade in vivo dos poliuretanos
105
7 CONCLUSÕES
109
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
112
9 ANEXOS
122
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Corte sagital vertical do olho humano adulto.
26
Figura 2 – Corte histológico da retina humana. As dez camadas da retina são:
camada pigmentar (A), camada dos segmentos externo e interno (cones e
bastonetes) (B), camada limitante externa (C), camada nuclear externa (D),
camada plexiforme externa (E), camada nuclear interna (F), camada plexiforme
interna (G), camada ganglionar (H), camada de neurofibras (I) camada limitante
interna (J).
29
Figura 3 – Formação da ligação uretano.
50
Figura 4 – Reações dos isocianatos.
51
Figura 5 – Diagrama esquemático das micelas dos pré-polímeros catiônicos (a) e
aniônicos (b) dispersas em água.
53
Figura 6 – Queratoprótese feita de poliuretano.
54
Figura 7 – Fotografias das etapas 1 a 4 de inserção e retirada do dispositivo
dilatador da pupila feito de poliuretano. Etapa 1 - a extremidade do dispositivo é
introduzida na câmara anterior por meio de uma incisão corneana. Etapa 2 - um
instrumento é introduzido na incisão corneana para auxiliar o posicioamento da
parte superior do dispositivo. Etapa 3 - a esfíncter da íris é completamente
capturada pelo dispositivo, e consequentemente, a pupila se dilata. Etapa 4 - o
dispositivo é retirado e a pupila retorna ao seu diâmetro original.
56
Figura 8 – Hidrólise da ligação éster gerando ácido carboxílico e álcool.
57
Figura 9 – Hidrólise da ligação uretano gerando álcool, amina e dióxido de
carbono.
57
Figura 10 – Representação esquemática da síntese das dispersões aquosas de
poliuretanos (PUD5 e PUD6).
70
Figura 11 –
Implantes constituídos dos poliuretanos [(A) PUD5 e (B) PUD6] e de
acetato de dexametasona.
70
Figura 12 – Espectros FTIR do PUD5 puro (12-a), ACT puro (12-b), PUD5
contendo ACT (12-c) e subtração espectral entre PUD5 contendo ACT e PUD5
puro (12-d).
79
Figura 13 - Espectros FTIR do PUD6 puro (13-a), ACT puro (13-b), PUD6
contendo ACT (13-c).
80
Figura 14 – Padrões XRD para PUD6 puro (14-a), PUD6 contendo ACT (14-b) e
ACT puro (14-c).
81
10
Figura 15 – Curvas SAXS para PUD5 puro (15-a), PUD5 contendo ACT (15-b),
PUD6 puro (15-c) e PUD6 contendo ACT (15-d).
84
Figura 16 – Dados SAXS processados por tratamento matemático para aumentar
a resolução dos picos de espalhamento pequenos. No topo da figura: exemplo de
como os dados SAXS foram explorados neste trabalho para aumentar a resolução
de picos de espalhamento pequenos: (16-a) dados SAXS originais; (16-b) ajuste
de Guinier dos dados originais; (16-c) resultado da subtração entre os dados
originais e ajuste Guinier.
84
Figura 17 – Invariante Q extraída dos dados de espalhamento SAXS para PUD5
e PUD6 contendo ACT.
85
Figura 18 - Padrões XRD para PUD5 não degradado (PUD5_0) (18-a), PUD5
submetido à biodegradação por 4 meses (18-b) (PUD5_4). O padrão XRD para a
PCL pura (18-c) foi incluído como referência.
86
Figura 19 - Padrões XRD para PUD6 não degradado (PUD6_0) (19-a), PUD6
submetido à biodegradação por 4 meses (19-b) (PUD6_4). O padrão XRD para a
PCL pura (19-c) foi incluído como referência.
87
Figura 20 - Curvas SAXS para PUD5 não degradado (PUD5_0) (20-a) e PUD5
submetido a 4 meses de biodegradação (PUD5_4) (20-b).
88
Figura 21 - Curvas SAXS para PUD6 não degradado (PUD6_0) (21-a) e PUD6
submetido a 4 meses de biodegradação (PUD6_4) (21-b).
88
Figura 22 –
Porcentagem de perda de massa do PUD5 e PUD6 em condições
fisiológicas simuladas (tampão fosfato pH 7,4, temperatura de 37
o
C e agitação de
30 rpm). Os dados obtidos representam a média ± desvi
o padrão (n = 3 para cada
poliuretano).
89
Figura 23 - Espectros FTIR do PUD5 não degradado (PUD5_0) (23-a) e do
PUD5 submetido à biodegradação por 4 meses (PUD5_4) (23-b).
91
Figura 24 - Espectros FTIR do PUD6 não degradado (PUD6_0) (24-a) e do
PUD6 submetido à biodegradação por 4 meses (PUD6_4) (24-b).
91
Figura 25 – Principais bandas de absorção FTIR observadas para os poliuretanos
(PUD5_0 e PUD6_0) não degradados e submetidos à biodegradação (PUD5_4 e
PUD6_4).
92
Figura 26 – Absorvâncias normalizadas das principais bandas de absorção FTIR
do PUD5 e PUD6 antes (PUD5_0 e PUD6_0) e após a biodegradação (PUD5_4
e PUD6_4).
94
Figura 27 – Deconvolução da região espectral da carbonila (C=O): PUD5_0
(antes da biodegradação) e PUD5_4 (após biodegradação).
94
Figura 28 – Região espectral C-O. 95
11
Figura 29 – Porcentagem de células ARPE-19 viáveis incubadas numa mistura
de solução de produtos de degradação dos poliuretanos PUD5 e PUD6, coletada
após 4 meses de degradação dos polímeros, e meio de cultura, nas proporções de
1:10 e 3:10 (n
= 5 para cada PUD e controle, para cada proporção). A viabilidade
das células incubadas no meio de cultura contendo os produtos de degradação foi
expressa em relação à viabilidade das células incubadas no meio de cultura sem
os produtos de degradação (controle), fixada em 100%.
96
Figura 30 – Perfis de liberação acumulada in vitro
do acetato de dexametasona
(ACT) a partir de PUD5 e PUD6. Os dados representam média ± desvio padrão (n
= 4 para cada poliuretano).
98
Figura 31 – Adesão das células ARPE-19 nas superfícies PUD5 e PUD6 após 8
horas em cultura. Os dados foram expressos como sendo a porcentagem de
células aderidas em relação ao controle (n = 15 para cada poliuretano e para o
controle). As porcentagens de células aderidas sobre os poliuretanos não
apresentaram diferença estatística significativa (teste t de Student - p < 0,05)
após 8 horas em cultura. As porcentagens de células aderidas sobre o controle e
poliuretanos apresentaram diferença estatística significativa (ANOVA - p < 0,05)
após 8 horas de incubação.
99
Figura 32 – Cinética de proliferação das células ARPE-19 nas superfícies
controle, PUD5 e PUD6. Os dados foram expressos como sendo a média dos
núcleos ± desvio padrão em cada tempo (n
= 15 para cada poliuretano e controle,
para cada dia) (p < 0.05).
100
Figura 33 –
Microscopia eletrônica de varredura de pequenos aglomerados de
células ARPE-
19 arredondadas sobre as superfícies de PUD5 (A) e PUD6 (C),
após 1 dia em cultura. Ampliação das micrografias: c
élulas com microvilosidades
apicais sobre PUD5 (B), e células alongadas sobre PUD6 (D) com projeções
PUD6 (E).
102
Figura 34 – Micrografias das células ARPE-
19 nas superfícies do controle (A),
PUD5 (C) e PUD6 (E) demonstrando a marcação das fibras de act
ina com
faloidina FITC após 7 em cultura. Micrografias (B), (D) e (F) representam a fusão
das fibras de actina e dos núcleos, marcados com iodeto de propídeo. Barra -
100
µm.
103
Figura 35 – Zônulas de oclusão formadas entre as células ARPE-19 adjacentes
nas superfícies do controle (A), PUD5 (B) e PUD6 (C) após 15 dias em cultura.
As zônulas de oclusão foram reveladas devido à marcação da ocludina (cor
verde). Barra - 500 µm.
105
Figura 36 – Observação macroscópica do PUD5 (A) e PUD6 (B) implantados por
15 dias no espaço subretiniano
de olhos de ratos. Os filmes de poliuretanos se
apresentam na forma triangular e cor branca. Corte histológico do olho mostrando
que PUD5 (C) (4 X) e PUD6 (D) (20 X) se encontram no espaço subretiniano
: os
poliuretanos estão
degradados devido ao processo de fixação dos bulbos oculares;
os círculos (O) indicam as camadas
da retina sobre os poliuretanos. Cortes
histológicos da retina localizada sobre os poliuretanos PUD5 (E) e PUD6 (F) (60
106
12
X). A arquitetura da retina foi bem preservada, mas observaram-
se pequenas
áreas de descontinuidade das camadas celulares da retina [PUD6 (F)].
Figura 37 – Cortes histológicos das camadas
da retina após a implantação do
PUD5 (A) e PUD6 (C) na cavidade vítrea de olhos de ratos (40 X) e am
pliação
dos mesmos: PUD5 (B) e PUD6 (D) (80 X). Os cortes histológicos foram obtidos
15 dias após a introdução dos poliuretanos e demonstram a integridade da
arquitetura das camadas da retina.
107
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Formulação (% em massa) das dispersões aquosas de poliuretano.
69
Tabela 2 – Atribuições das bandas FTIR para PUD5 e PUD6.
90
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-FU 5-fluoruracila
ACT Acetato de dexametasona
AF Acetato de fluocinolona
ARPE-19
Células epiteliais pigmentares da retina
at-RA All-trans ácido retinóico
CMV Citomegalovírus
CHP Cis-hidroxiprolina
CNTF Fator neurotrófico ciliar
CNTF-α Receptor α do fator neurotrófico ciliar
CsA Ciclosporina A
DBTDL Di-butil di-laurato de estanho
DMEM Meio de cultura – Dubelcco’s modified Eagle Medium
DMPA Ácido dimetilpropiônico
EVA Poli(etileno-co-acetato de vinila)
FDA Food and Drug Administration
FTIR Infravermelho por transformada de Fourier – Reflexão Total Atenuada
HAART Terapia anti-retroviral altamente ativa
HDI Hexametileno diisocianato
H
2
MDI 4,4
’
-diciclohexilmetano diisocianato
HZ Hidrazina
IOP Pressão intra-ocular
IPDI Isoforona diisocianato
MM Massa molecular
MTT Dosagem colorimétrica baseada na conversão mitocondrial do sal de
tetrazólio
PBS Tampão fosfato pH 7,4
PCL Poli(ε-caprolactona)
PEG Poli(etileno glicol)
PGA Poli(glicólico)
PGLC Copolímero glicólico-co-láctico-co-caprolactona
PLA Poli(D,L-láctico)
PLGA Poli(D,L-láctico-glicólico)
PMMA Polimetil metacrilato
POE Poli(orto-éster)
PUD5 Dispersão aquosa do poliuretano 5
PUD6 Dispersão aquosa do poliuretano 6
PVA Álcool polivinílico
PVR Vitreoretinopatia proliferativa
REP Células epiteliais pigmentares da retina
15
SAXS Espalhamento de raios-X em baixo ângulo
SFB Soro fetal bovino
SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida
TEA Trietilamina
t-PA Ativador plasminogênio tecidual
XRD Difração de raios-X
16
RESUMO
O tratamento de doenças do segmento posterior do olho é limitado pela dificuldade no
transporte de doses efetivas de fármacos para o vítreo, retina e coróide. Apesar dos fármacos
administrados por via sistêmica atingirem o segmento posterior do olho, as barreiras oculares
naturais dificultam a absorção, e doses elevadas dos fármacos são requeridas para a
manutenção da concentração dos fármacos em níveis terapêuticos eficazes dentro do olho.
Injeções intravítreas são capazes de transportar os fármacos para o segmento posterior do
olho, mas é uma técnica invasiva, pouco tolerada pelos pacientes e apresenta riscos de
infecções oculares e danos aos tecidos. Visando a obtenção de níveis terapêuticos adequados
de fármacos no segmento posterior do olho por longos períodos, sistemas de liberação
poliméricos implantados diretamente no vítreo estão sendo investigados para o tratamento de
várias doenças vítreo-retinianas. Neste trabalho, poliuretanos denominados PUD5 e PUD6,
derivados de poli(e-caprolactona) e poli(etileno glicol), foram produzidos baseados em
dispersões aquosas destes polímeros, e o acetato de dexametasona foi incorporado às
dispersões aquosas destes poliuretanos. A partir desta incorporação, implantes constituídos de
poliuretanos e acetato de dexametasona foram desenvolvidos e explorados como dispositivos
intra-oculares de liberação controlada do fármaco, destinados ao tratamento de doenças
inflamatórias graves que acometem o segmento posterior do olho. Estes implantes foram
caracterizados por FTIR, XRD e SAXS, e também foram submetidos ao estudo de liberação
in vitro do acetato de dexametasona. Adicionalmente, os filmes de poliuretanos puros foram
submetidos aos estudos de biodegradação in vitro e biocompatibilidade in vitro e in vivo. As
diferentes técnicas de caracterização revelaram que o acetato de dexametasona manteve sua
integridade química após dispersão nas matrizes poliméricas, e que o mesmo conduziu a uma
nova morfologia do PUD5, enquanto que alterações significativas não foram detectadas na
nanoestrutura do PUD6. Os sistemas poliméricos propiciaram a liberação controlada do
acetato de dexametasona por um período prolongado, sem que picos de liberação do fármaco
fossem detectados, representando uma vantagem dos sistemas. O processo de biodegradação
dos poliuretanos conduziu à perda de massa e à formação de cristalitos, devido à hidrólise das
ligações éster da poli(caprolactona) presentes nos segmentos macios destes biomateriais. Os
segmentos rígidos, formados pelas ligações uretano, foram preservados durante a
biodegradação. Além disso, células ARPE-19 incubadas em meio de cultura contendo os
produtos de degradação de PUD5 e PUD6 apresentaram viabilidade, indicando que os
17
mesmos não apresentaram efeitos citotóxicos significantes. Os poliuretanos demonstraram
biocompatibilidade in vitro, uma vez que as células ARPE-19 foram capazes de aderir,
migrar, proliferar e formar uma monocamada altamente organizada e funcional sobre as
superfícies poliméricas. Os poliuretanos também demonstraram biocompatibilidade in vivo,
uma vez que sinais de inflamação e desorganização dos tecidos oculares não foram detectados
após implantação de PUD5 e PUD6 no espaço subretiniano e vítreo de olhos de ratos.
Portanto, PUD5 e PUD6, poliuretanos biodegradáveis e biocompatíveis, possibilitaram o
desenvolvimento de implantes intra-oculares de liberação controlada de acetato de
dexametasona, destinados ao tratamento de doenças oculares que atingem o segmento
posterior do olho.
Palavras-chaves: poliuretano, acetato de dexametasona, implante intra-ocular, sistema de
liberação controlada de fármacos, segmento posterior do olho
18
ABSTRACT
The treatment of diseases of the posterior segment of the eye is limited by the difficulty in
delivering effective doses of the drug to the vitreous, retina and choroid. Despite of systemic
drug administration reaches the posterior segment of the eye, the natural ocular barriers make
difficult the absorption, and high doses of the drug are required to maintain the therapeutic
range of the drug. Intravitreal injection can deliver drugs to the posterior segment of the eye,
but it is an invasive technique and shows risk of infections and damages in ocular tissues.
Aiming to reach adequate therapeutic range of the drugs in the posterior segment of the eye
for long periods, controlled drug release systems implanted in the vitreous have been
investigated for the treatment of several ocular diseases. In this study, polyurethanes, PUD5
and PUD6, derived from poly(e-caprolactone) and poly(ethylene glycol), were synthesized
based on aqueous dispersion of these polymers, and dexamethasone acetate was incorporated
into the aqueous dispersion of the polyurethanes. Implants constituted by biodegradable
polyurethanes and dexamethasone acetate were developed and explored as intraocular devices
for controlled drug delivery for the treatment of posterior segment diseases of the eye. The
implants were characterized by FTIR, XRD and SAXS and were submitted to the in vitro
drug release study. Additionally, the pure polyurethane films were submitted to in vitro
biodegradation and in vitro and in vivo biocompatibility studies. The different techniques of
characterization revealed that dexamethasone acetate preserved its chemical integrity after
incorporation into the polymeric matrices, and the drug leaded to the new morphology of
PUD5, while alterations were not detected in the nanostructure of PUD6. The polymeric
systems provided controlled dexamethasone acetate release for a long period, and it was not
observed liberation burst of the drug, which represented an advantage of these systems. The
biodegradation process of the polyurethanes leaded to the mass loss and formation of
crystallites, due to the hydrolysis of ester bonds present in poly(caprolactone) segments. The
hard segments, based on urethane bonds, were preserved during the biodegradation.
Moreover, APRE-19 cells cultured with medium containing the degradation products from the
polyurethanes showed viability, indicating their non-cytotoxic effect. The polyurethanes
showed in vitro biocompatibility, since ARPE-19 cells were able to adhere, migrate,
proliferate and form an organized and functional layer onto the polymeric surfaces. The
polyurethanes showed also in vivo biocompatibility, since no inflammatory response and
disorganization of the ocular tissues were observed after implantation of PUD5 and PUD6 in
19
the subretinal space and vitreous of mices’ eyes. Therefore, PUD5 and PUD6, biodegradable
and biocompatible polyurethanes, provided the development of intraocular implants for the
controlled release of dexamethasone acetate, applied to the treatment of diseases of the
posterior segment of the eye.
Keywords: polyurethane, dexamethasone acetate, intraocular implant, controlled drug release
systems, posterior segment of the eye
20
1 INTRODUÇÃO
Introdução
__________________________________________________________________________________
21
As retinites, uveítes e retinopatias são doenças oculares graves que acometem o segmento
posterior do olho e que frequentemente conduzem à deficiência visual ou à perda completa
da visão. O tratamento destas doenças representa um desafio, uma vez que o olho apresenta
barreiras naturais, constituídas pelo epitélio e endotélio da córnea, epitélio da retina e
endotélio vascular da retina, que dificultam a penentração dos fármacos no interior do bulbo
do olho.
Geralmente o tratamento destas doenças oculares é realizado por meio das injeções
subconjuntivais e intravítreas de fármacos ou por administração sistêmica. As injeções
subconjuntivais apresentam a desvantagem de não possibilitarem o controle da concentração
do fármaco que atinge o vítreo. Os fármacos administrados pela via sistêmica somente
poderão atingir o segmento posterior do olho se ultrapassarem, primeiramente, a barreira
hemato-retiniana. Como apenas uma pequena quantidade de alguns fármacos ultrapassa esta
barreira, várias doses sistêmicas são requeridas para a manutenção da concentração dos
fármacos em níveis terapêuticos eficazes dentro do olho. Esta abordagem não é viável para
fármacos potentes e com índice terapêutico estreito, pois podem provocar sérios efeitos
adversos e tóxicos ao paciente (HUGHES et al., 2005; YASUKAWA et al., 2001, AMO e
URTTI, 2008). A utilização da via intravítrea minimiza a ocorrência de efeitos sistêmicos
adversos. Porém, a rápida circulação sanguínea na coróide e na retina promove a diminuição
da meia-vida dos fármacos, reduzindo, rapidamente, suas concentrações a níveis
subterapêuticos. Para que os níveis se mantenham dentro da faixa terapêutica, são necessárias
injeções repetidas, as quais podem causar desconforto para o paciente e conseqüentemente, a
descontinuidade da terapia, além de hemorragia vítrea, endoftalmite, catarata e descolamento
da retina (OGURA et al., 2001; YASUKAWA et al., 2001). O aumento da dose do
medicamento poderia prolongar a eficácia das injeções individuais, mas também poderia
provocar picos de concentração do fármaco dentro do olho, expondo o paciente aos efeitos
tóxicos indesejáveis.
Os implantes intra-oculares representam método alternativo viável para o alcance de níveis
terapêuticos de fármacos no interior do olho. Os implantes intra-oculares são vantajosos, pois
inseridos após a barreira hemato-retiniana, liberam o fármaco diretamente no local de ação;
de forma controlada e por tempo prolongado (o que é ideal para pacientes com doenças
oculares crônicas); reduzindo a possibilidade de efeitos adversos que freqüentemente estão
Introdução
___________________________________________________________________________
22
associados com a administração de fármacos pela via sistêmica (BOURGES et al., 2006;
YASUKAWA et al., 2005).
Os implantes intra-oculares podem ser preparados a partir de diferentes polímeros
reconhecidamente biocompatíveis, que podem ser não-biodegradáveis ou biodegradáveis
(DASH e CUDWORTH II, 1998). Os implantes intra-oculares não-biodegradáveis
apresentam a vantagem de controlar a liberação do fármaco, numa cinética previsível, por
períodos prolongados. Porém, ao contrário dos implantes intra-oculares biodegradáveis, estes
sistemas devem ser removidos cirurgicamente do olho após a liberação total do fármaco, o
que representa risco para o paciente e é uma desvantagem marcante dos implantes não-
biodegradáveis. Por esta razão, os polímeros biodegradáveis naturais e sintéticos têm sido
amplamente investigados para o desenvolvimento destes dispositivos de implantação intra-
ocular (JAIN et al., 2000).
Poliuretanos especialmente projetados podem ser degradados por hidrólise dos grupos
polares inseridos em sua arquitetura macromolecular (SANTERRE et al., 2005). Poliuretanos
biodegradáveis e biocompatíveis podem ser preparados utilizando poliésteres de elevada
massa molar, tais como a poli(ε-caprolactona) (PCL). O grupo éster alifático da PCL pode
ser hidrolisado gerando produtos de degradação não tóxicos (FERNÁNDEZ et al., 2006).
Entretanto, a taxa de biodegradação dos poliuretanos constituídos de PCL é reduzida à
medida que a massa molecular da PCL é aumentada. Poli(etileno glicol) (PEG) é amplamente
usada como co-monômero na síntese de poliuretanos ou copolímeros em bloco
biodegradáveis e biocompatíveis, não só porque este componente controla a taxa de
biodegradação dos polímeros devido à sua hidrofilicidade (LEE et al., 2001; GUAN et al.,
2004), mas também devido à sua ausência de antigenicidade e imunogenicidade, e formação
de produtos de degradação não tóxicos (PIAO et al., 2003). Logo, poliuretanos que tiram
proveito das propriedades mecânicas proporcionadas pela PCL e das altas taxas de
degradação do PEG podem ser utilizados em aplicações biomédicas diversas que demandam
materiais flexíveis, e têm sido reportadas por diversos autores (GUAN et al., 2005; GUAN et
al., 2004; MAHKAM et al., 2003).
Neste trabalho, poliuretanos biodegradáveis e biocompatíveis, derivados de PCL e PEG,
foram produzidos baseados em dispersões aquosas destes polímeros. O acetato de
dexametasona, um fármaco antiinflamatório esteroidal amplamente utilizado na oftalmologia,
Introdução
___________________________________________________________________________
23
foi incorporado às dispersões aquosas dos poliuretanos. A partir desta incorporação,
implantes constituídos de poliuretanos biodegradáveis e acetato de dexametasona foram
desenvolvidos e explorados como dispositivos intra-oculares de liberação controlada do
fármaco, destinados ao tratamento de doenças inflamatórias graves que acometem o
segmento posterior do olho.
24
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Revisão bibliográfica
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25
2.1 Anatomia ocular
2.1.1 Cavidade orbital e pálpebras
O bulbo do olho é protegido pelas pálpebras e órbita, que forma uma cavidade óssea
no crânio com várias fissuras e forames que permitem a passagem dos nervos,
músculos e vasos. Na órbita, uma membrana de tecido conjuntivo denominada
cápsula de Tenon, o tecido adiposo e seis músculos extra-oculares sustentam e
alinham o bulbo ocular para a visão. As pálpebras apresentam inervação sensorial
densa, e em conjunto com os cílios, protegem o bulbo ocular contra lesões mecânicas
e químicas. Movimentos coordenados dos músculos orbiculares, levantador das
pálpebras e de Müller ajudam a distribuir as lágrimas sobre a córnea e conjuntiva. A
superfície externa das pálpebras é coberta por uma camada fina de pele; a superfície
interna é revestida pela parte palpebral conjuntiva, uma mucosa vascularizada em
continuidade com a conjuntiva bulbar. Na reflexão das conjuntivas palpebral e bulbar,
há um espaço conhecido como fórnix, que se localiza em posições superior e inferior
por trás das pálpebras superior e inferior, respectivamente. Em geral, os fármacos
tópicos são aplicados no fórnix inferior, também conhecido como fundo-de-saco
inferior (HARDMAN e LIMBIRD, 2003).
2.1.2 Bulbo ocular
O bulbo ocular é constituído de duas esferas modificadas fundidas uma à outra. A
anterior (que é formada pela córnea) tem raio menor (7,8 mm) que a posterior
(formada pela esclera) que possui 12 mm de raio. A junção das duas é denominada
limbo. Adicionalmente, o bulbo ocular é formado por três camadas ou túnicas
concêntricas que envolvem os meios transparentes: camada externa ou de sustentação
(córnea e esclera), média ou vascular (íris, corpo ciliar e coróide – estruturas que
formam a uvéa) e interna ou sensorial (retina) (Figura 1). Finalmente, o bulbo ocular
pode ser dividido em dois segmentos: anterior e posterior. O segmento anterior
compreende córnea, íris, corpo ciliar e lente e é preenchido pelo humor aquoso. O
segmento posterior compreende o complexo retina-coróide e é preenchido pelo corpo
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26
vítreo. A esclera reveste parte do segmento anterior (excetuando-se a parte revestida
pela córnea) e posterior (HARDMAN e LIMBIRD, 2003).
Figura 1 – Corte sagital vertical do olho humano adulto.
Fonte - http://webvision.med.utah.edu/anatomy.html
2.1.3 Córnea
A córnea é uma estrutura transparente que refrata a luz antes que esta atinja a pupila e
entre no interior do bulbo do olho. Ela é uma estrutura avascular, e por isso recebe
nutrientes provenientes do humor aquoso e oxigênio proveniente do meio ambiente.
Ela apresenta 5 camadas distintas: epitélio, membrana de Bowman, estroma,
membrana de Descement e endotélio. Estas camadas desempenham funções
fisiológicas diferentes. As células epiteliais são achatadas e formam junções
intercelulares localizadas na sua superfície apical. Estas junções funcionam como
barreiras à difusão dos fármacos administrados no segmento anterior do olho. A
membrana de Bowman mantém a integridade e a organização epitelial (SNEEL e
LEMP, 1998; MANNERMAA et al., 2006).
A penetração de fármacos nos tecidos oculares anteriores, via absorção trans-corneal,
é determinada por dois fatores: o tempo de contato do fármaco com o olho e a
permeabilidade do fármaco na córnea. A permeabilidade na córnea pode acontecer
por meio da difusão passiva, da difusão facilitada ou pelo transporte ativo. O
transporte ativo e a difusão facilitada requerem a expressão de transportadores pelo
Revisão bibliográfica
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27
epitélio corneal. A difusão passiva não é dependente dos transportadores, mas
somente acontece se o fármaco apresenta coeficientes de partição e de difusão
apropriados para transpor a bicamada lipídica das membranas celulares
(MANNERMAA et al., 2006).
2.1.4 Esclera
A esclera (a parte branca do olho) é a camada mais externa do segmento anterior e se
estende até o segmento posterior. A esclera forma uma camada protetora aos tecidos
intra-oculares e é um suporte que se mantém estável durante variações da pressão
interna e movimentos do olho, os quais poderiam perturbar o processo de visão
devido a distorções na retina, na lente ou no diafragma da íris. Esta estabilidade,
essencial para a visão, é propiciada pela organização e propriedades viscoelásticas dos
tecidos conectivos da esclera (WATSON e YOUNG, 2004).
2.1.5 Lente
A lente é uma estrutura transparente e biconvexa. Situa-se posteriormente a íris e a
pupila e está ligada ao corpo ciliar por meio do ligamento suspensor. O ligamento
suspensor pode relaxar ou distender de acordo com os movimentos das fibras
musculares conectadas ao corpo ciliar. Este processo leva à acomodação da lente,
possibilitando-a refratar precisamente a luz na retina (SNELL e LEMP, 1998). A lente
e a córnea recebem nutrientes provenientes do humor aquoso, uma vez que estas
estruturas não possuem vasos sanguíneos. O humor aquoso é produzido pelas células
do corpo ciliar, passa através da pupila e é drenado pelo canal de Schlemn. Como
resultado deste processo, o bulbo apresenta uma pressão intraocular mensurável, a
qual é dependente do balanço entre a taxa de produção do humor aquoso e a taxa de
drenagem deste líquido (LLOYD et al., 2001).
2.1.6 Íris e Corpo ciliar
A íris é a porção colorida do olho, que impede o espalhamento da luz dentro do bulbo.
O corpo ciliar se situa posteriormente a íris. Esta estrutura é responsável pelo
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fornecimento de nutrientes a córnea e a lente, e também pela remoção de catabólitos
por meio do humor aquoso (líquido produzido pelas células do corpo ciliar). A íris
controla o tamanho da pupila, pois está conectada com fibras musculares que relaxam
e contraem de acordo com uma resposta autônoma à variação da luz recebida
(LLOYD et al., 2001).
2.1.7 Coróide
A coróide se estende do corpo ciliar ao nervo óptico. Ela é mais espessa na região
posterior e gradualmente se torna mais fina ao se aproximar da região anterior.
Encontra-se firmemente ligada à esclera, na região do nervo óptico, onde as artérias
ciliares posteriores e os nervos ciliares penetram no olho. Esta estrutura prove
nutrientes para as células da retina, uma vez que é altamente vascularizada. A retina e
a coróide são separadas pela membrana de Bruch (LLOYD et al., 2001;
COLTHURST et al., 2000).
2.1.8 Retina
A retina é funcionalmente constituída de duas partes: a neuroretina ou retina sensorial
e a camada de células do epitélio pigmentar da retina. Contudo, a retina é dividida em
10 camadas na direção da órbita para o corpo vítreo, a saber: (1) camada pigmentar;
(2) camada dos segmentos externo e interno (cones e bastonetes); (3) camada
limitante externa; (4) camada nuclear externa; (5) camada plexiforme externa; (6)
camada nuclear interna; (7) camada plexiforme interna; (8) camada ganglionar; (9)
camada de neurofibras; (10) camada limitante interna (Figura 2).
A camada dos segmentos externo e interno é constituída pelas células fotosensíveis da
retina ou fotorreceptores denominados cones e bastonetes. Existem aproximadamente
100 milhões de bastonetes e 5 milhões de cones no olho humano. Eles são compostos
do segmento interno, segmente externo, núcleo e axônio. O segmento externo dos
fotorreceptores contém rodopsina e estão em contato com as microvilosidades das
células epiteliais pigmentares da retina. A função dos fotorreceptores é converter a
energia luminosa em impulso elétrico que será propagado pelas células bipolares, e
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29
em seguida, pelas células ganglionares, as quais os axônios constituem o nervo óptico,
transmitindo a informação até o córtex visual. A camada limitante externa é por onde
passa a parte interna dos fotorreceptores. Esta camada é constituída por desmossomas
que ligam as células de Muller entre elas e com os fotorreceptores. A camada nuclear
externa contém os núcleos dos fotorreceptores. A camada plexiforme externa é
constituída pelas junções entre os axônios dos fotorreceptores e dendritos das células
bipolares da retina. A camada nuclear interna é constituída pelos núcleos das células
bipolares, horizontais, Muller e amácrinas. Encontram-se nesta camada os capilares
dos vasos centrais da retina. A camada plexiforme interna representa a sinapse entre
as células bipolares e as células ganglionares. A camada ganglionar é constituída
principalmente pelos núcleos das células ganglionares. A camada das neurofibras é
constituída pelos axônios das células ganglionares e gliais e de vasos derivados da
artéria central da retina. A camada limitante interna forma o limite interno da retina
(RODIECK, 2003).
Figura 2 – Corte histológico da retina humana. As dez camadas da retina são: camada
pigmentar (A), camada dos segmentos externo e interno (cones e bastonetes) (B),
camada limitante externa (C), camada nuclear externa (D), camada plexiforme externa
(E), camada nuclear interna (F), camada plexiforme interna (G), camada ganglionar
(H), camada de neurofibras (I) camada limitante interna (J).
As células epiteliais pigmentares da retina (RPE) (camada pigmentar) formam uma
monocamada de células hexagonais. Estima-se que o olho adulto contenha cerca de 4
a 6 milhões de células RPE. Posteriormente, o epitélio pigmentar se encontra sobre a
membrana de Bruch. Lateralmente, as células do epitélio são unidas por meio das
zônulas de oclusão, zônulas de aderência e desmossomas (BRON et al., 1998). As
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zônulas de oclusão constituem as junções intercelulares caracterizadas pela fusão das
membranas celulares de duas células RPE adjacentes. Estas junções são à base da
barreira hemato-retiniana externa, uma vez que elas impedem a difusão passiva de
substâncias da circulação coroidiana à retina neurosensorial. A superfície apical
(anterior) das células RPE está em frente ao espaço subretiniano. O espaço
subretiniano é ocupado pelos segmentos externos dos fotoreceptores e a matriz
extracelular secretada, em sua grande maioria, pelas células epiteliais. O espaço
subretiniano é limitado anteriormente pela camada limitante externa, formado pelas
zônulas de aderência que se aderem aos fotorreceptores. O pólo apical das células
RPE apresenta numerosas microvilosidades que estão em contato direto com a
camada do segmento externo dos fotorreceptores. Além disso, as células RPE
apresentam grânulos de melanina.
As células epiteliais pigmentares da retina são responsáveis por diversas funções que
são indispensáveis para o sistema visual. As células RPE transportam íons, água e
metabólitos que vêm do espaço subretiniano para o sangue, e também transportam os
nutrientes, tais como, glicose, retinol e ácidos graxos provenientes do sangue para os
fotorreceptores. As células RPE são também responsáveis pela fagocitose dos
segmentos externos dos fotorreceptores. Os segmentos externos dos fotorreceptores
são digeridos, e substâncias essenciais, tais como o retinal, são recicladas e reenviadas
aos fotorreceptores a fim de restaurar a sua sensibilidade à luz. Adicionalmente, as
células RPE são capazes de secretar uma variedade de fatores de crescimento que
ajudam a manter a integridade estrutural dos fotorreceptores e do endotélio dos
capliares da coróide. Além disso, as células RPE também secretam fatores
imunossupressores que são importantes no estabelecimento do privilégio imune do
olho. Finalmente, o processo de visão começa quando a rodopsina, presente nos
fotorreceptores, absorve a energia luminosa. A rodopsina, que constitui o pigmento
visual, é uma molécula transmembrana formada por uma proteína, a opsina, e pelo
isômero 11 cis-retinal. No momento em que um fóton é absorvido pela rodopsina, o
11 cis-retinal é isomerizado em 11 trans-retinal, que se desloca da opsina. Esta
isomerização culmina na hiperpolarização dos fotorreceptores que origina o influxo
nervoso visual que será enviado ao cérebro. Paralelamente, o 11 trans-retinal é
reduzido em 11 trans-retinol, que por sua vez, é isomerizado pelas células RPE em 11
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cis-retinol. Este é estocado sob a forma de éster ou óxido em 11 cis-retinal. O 11 cis-
retinal é então secretado pelas células RPE no espaço subretiniano, que por sua vez, é
recaptado pelos fotorreceptores, a fim de reconstituir a rodopsina. Devido a estas
diferentes e complexas funções, as células RPE são essenciais para a visão, e a falha
em uma destas funções pode levar à degeneração da retina, diminuição da acuidade
visual e cegueira (STRAUSS, 2005).
2.1.9 Corpo vítreo
O corpo vítreo é constituído de colágeno, proteínas do plasma e ácido hialurônico.
Esta última substância proporciona viscosidade ao corpo vítreo, pois forma um gel em
baixas concentrações. O corpo vítreo está em contato direto com a retina, corpo ciliar
e porção posterior da lente. O corpo vítreo é capaz de promover estabilidade aos
componentes posteriores do olho, atenuando o estresse que pode ser gerado à retina,
devido aos súbitos movimentos. Esta observação é justificável quando se considera
que a primeira etapa no processo de descolamento da retina é sua separação do corpo
vítreo (LLOYD et al., 2001).
2.2 Implantes intra-oculares
Os implantes intra-oculares são sistemas de liberação controlada de fármacos
preparados a partir de diferentes polímeros reconhecidamente biocompatíveis,
biodegradáveis ou não biodegradáveis. A inserção intra-ocular dos implantes deve ser
realizada por meio de procedimento cirúrgico. Em geral, eles são introduzidos no
vítreo a partir de uma incisão na pars plana do olho, que se situa posteriormente à
lente e anteriormente à retina. Embora a técnica cirúrgica seja invasiva, os implantes
apresentam diversas vantagens que sobrepõem os transtornos provocados pelo ato
cirúrgico. Estas vantagens são: (1) ultrapassar a barreira hemato-retiniana,
possibilitando a liberação do fármaco em níveis terapêuticos diretamente no sítio de
ação; (2) possibilitar a liberação do fármaco por tempo prolongado; (3) evitar os
efeitos colaterais associados frequentemente às injeções intravítreas e administração
sistêmica; (4) diminuir a quantidade de fármaco necessário para o tratamento.
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2.2.1 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis
Os implantes intra-oculares podem ser confeccionados a partir de vários tipos de
polímeros não-biodegradáveis que controlam a cinética dos fármacos nos sistemas de
liberação. Os implantes poliméricos não-biodegradáveis apresentam-se em dois tipos:
matriciais (sistemas monolíticos) e reservatórios. No sistema matricial, o fármaco é
disperso, homogeneamente, na matriz polimérica ou absorvido na superfície. A
difusão lenta do fármaco através da matriz polimérica proporciona a sua liberação
controlada. No sistema reservatório, o fármaco está envolvido por uma membrana não
degradável e permeável. Neste sistema, o fluido (água) se difunde através da
membrana, dissolvendo o fármaco e criando uma solução saturada no interior do
reservatório. Uma vez que há uma solução saturada, o fármaco se difunde para o
exterior numa taxa de liberação em estado estacionário que persiste pela maior parte
do período de implantação. Essa taxa de liberação, baseada na lei de Fick, é
determinada pela área de liberação, pela espessura da cobertura polimérica, pela
forma do implante e pela difusibilidade do fármaco a partir da cobertura polimérica.
Os polímeros comumente utilizados no processo de manufatura destes implantes são o
silicone, o álcool polivinílico (PVA) e o poli(etileno-co-acetato de vinila) (EVA).
Polímeros, tais como silicone e PVA, são livremente permeáveis a uma variedade de
fármacos lipofílicos, devido ao seu caráter hidrofóbico, e mantém íntegro o
reservatório do fármaco. O EVA é impermeável à maioria dos fármacos e é utilizado
como uma cobertura em torno do reservatório para diminuir a velocidade de difusão
do fármaco através do implante (BOURGES et al., 2006; YASUKAWA et al., 2005;
DASH e CUDWORTH II, 1998; SMITH et al., 1992).
2.2.1.1 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis para o tratamento da retinite
por citomegalovírus
A retinite por citomegalovírus (CMV) é a infecção oportunista ocular de maior
prevalência em pacientes com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA).
Existem duas formas clínicas de retinite por CMV. A forma fulminante é
caracterizada pela necrose da retina posterior e hemorragia. Neste caso, os pacientes
freqüentemente apresentam perda de visão. A outra forma é reconhecida como uma
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lesão granular na retina periférica com ou sem hemorragia. Os implantes intravítreos
de ganciclovir são indicados para o tratamento da retinite por CMV, pois reduzem a
freqüência de infecções recorrentes que poderiam resultar em perda de visão, o que é
inevitável em pacientes que não respondem satisfatoriamente à terapia HAART
(Highly Active Antiretroviral Therapy) (VRABEC, 2004).
Diversos estudos foram conduzidos com o intuito de desenvolver implantes intra-
oculares não-biodegradáveis de ganciclovir destinados ao tratamento da retinite por
CMV em pacientes com SIDA (ASHTON et al., 1992; SANBORN et al., 1992;
MARTIN et al., 1994; CHARLES e STEINER, 1996). Estes estudos, realizados em
animais e em humanos, levaram ao desenvolvimento e a aprovação do Vitrasert
Ò
(Bausch & Lomb, USA), em 1996, pela Food and Drug Administration (FDA)
(BOURGES et al., 2006).
O Vitrasert
Ò
é um implante intra-ocular de liberação controlada de 4,5 mg de
ganciclovir. Este implante não-biodegradável do tipo reservatório é constituído de um
comprimido de ganciclovir recoberto por PVA/EVA. O Vitrasert
Ò
foi desenvolvido
antes da evolução da terapia anti-retroviral, quando a expectativa de vida dos
pacientes era de aproximadamente 12 meses, o que impedia a avaliação das possíveis
complicações do implante ao longo do tempo. Com a introdução da HAART, a
expectativa de vida dos pacientes com SIDA aumentou significantemente, e o
tratamento da retinite por CMV, bem como as complicações associadas com a
utilização do implante e ao procedimento cirúrgico, puderam ser avaliadas por um
período prolongado. Dentre as complicações cirúrgicas relatadas, a hemorragia vítrea
foi a mais comum. Também aconteceram hemorragias operatórias principalmente
durante o procedimento de retirada do implante. Dentre as complicações pós-
operatórias relacionadas especificamente com o implante, cita-se o aparecimento de
feridas, que foram observadas em 1 dia e 28 meses após a cirurgia de implantação; e o
deslocamento do implante, que foi a única complicação observada após 3 anos. Há
também o relato de complicações possivelmente relacionadas com o implante, a
saber: catarata, descolamento da retina, hemorragia vítrea, hipotonia, formação de
membrana epiretinal, edema macular e endoftalmites. Estas complicações foram mais
comuns durante os primeiros 2 anos de implantação, o que leva a crer que a incidência
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das mesmas está associada a múltiplos fatores e não unicamente devido à presença do
implante. Observou-se também que a incidência de descolamento da retina foi menor
em pacientes no esquema de tratamento HAART e aqueles que haviam se
reconstituído imunologicamente. Portanto, pacientes que apresentavam maior controle
da infecção, devido à administração dos medicamentos anti-retrovirais sistêmicos,
apresentaram menores riscos de descolamento da retina, e que a presença dos
implantes em longos períodos não implicou num aumento substancial dos riscos de
descolamento. Em resumo, os resultados da pesquisa, realizada entre 1995 e 2001,
sugeriram que as complicações diretamente relacionadas com o procedimento de
implantação ou a presença do implante no olho são incomuns, mas podem ocorrer ao
longo de 7 anos, o que indica a necessidade de selecionar os casos em que o implante
deve ser utilizado. Evidenciou-se também que o uso contínuo do implante, associado
à HAART, realmente protege contra a perda de visão, em virtude de sua habilidade
em modular os fatores relacionados com a doença (KAPPEL et al., 2006).
2.2.1.2 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis para o tratamento das uveítes
não infecciosas
Uveíte é o termo originalmente utilizado para designar inflamações da uvéa (estrutura
do olho formada pela íris, corpo ciliar e coróide), embora na prática também seja
usado para designar inflamações que acometem a retina, o nervo óptico e o corpo
vítreo (HERRERO-VANRELL e REFOJO, 2001). O tratamento das uveítes
infecciosas ou não-infecciosas requer terapia farmacológica com esteróides,
imunossupressores, antibióticos ou todos estes fármacos em conjunto, para suprimir
processos inflamatórios crônicos ou prevenir a recorrência em casos específicos
(YASUKAWA et al., 2004). Estas inflamações instaladas na uvéa podem provocar a
diminuição da acuidade visual até a perda completa da visão. Para minimizar tais
efeitos, implantes intra-oculares de liberação controlada de fármacos devem ser
utilizados.
O Retisert
Ò
, um implante intra-ocular de liberação controlada de acetato de
fluocinolona (AF), foi desenvolvido e é comercializado pela empresa americana
Bausch & Lomb, para o tratamento de uveítes não infecciosas que afetam o segmento
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posterior do olho. O Retisert
Ò
é constituído de um comprimido de AF, celulose
microcristalina, estearato de magnésio e PVA. Este comprimido é revestido por um
elastômero de silicone que apresenta um orifício de liberação. Uma membrana
semipermeável de PVA está posicionada entre o comprimido e o orifício, para criar
uma barreira para a difusão e liberação do fármaco. Estudos clínicos realizados em
pacientes com uveíte não infecciosa severa demonstraram a eficácia do Retisert
Ò
, uma
vez que o AF, liberado em aproximadamente 30 meses, reduziu significantemente a
recorrência da doença, possibilitou o aumento da acuidade visual, e diminuiu a
necessidade das terapias tópica, sistêmica e periocular suplementares. A progressão da
catarata e o aumento da pressão intra-ocular (IOP) foram os efeitos adversos
relacionados à utilização do Retisert
Ò
(JAFFE et al., 2006).
Estudos realizados por Debra et al. (2007) confirmaram que o aumento da IOP é um
dos principais efeitos adversos relacionados ao uso do Retisert
Ò
. A incidência e a
magnitude do aumento da IOP foram significativas nos olhos que receberam o
implante, sendo necessário tratamento farmacológico ou procedimento cirúrgico para
diminuir a IOP. Portanto, a elevação da IOP é um evento adverso que frequentemente
pode estar associado ao tratamento com o Retisert
Ò
, mas que deve ser balanceado
com a eficácia do implante intravítreo em reduzir as uveítes recorrentes. Logo, os
pacientes devem ser conscientizados da possibilidade real de aumento da IOP e
prepará-los para a necessidade de monitorá-la periodicamente e para o risco
significante de desenvolvimento de glaucoma.
Outros estudos foram conduzidos no intuito de desenvolver dispositivos não
biodegradáveis intra-oculares de liberação controlada de fármacos destinados ao
tratamento das uveítes não infecciosas. Estes estudos estão descritos a seguir.
Cheng et al. (1995) confeccionaram implantes não-biodegradáveis para a liberação
sustentada de dexametasona para o tratamento de uveíte experimental em olhos de
coelhos. Estes implantes foram altamente efetivos na supressão da inflamação
induzida por aproximadamente 105 dias. Sugeriu-se que os mesmos poderiam ser
eficazes no tratamento de uveítes posteriores crônicas em pacientes que não toleraram
as terapias sistêmica e periocular.
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Jaffe et al. (1998) prepararam implantes de PVA/EVA destinados à administração
intravítrea de ciclosporina A (CsA) para o tratamento de uveíte experimental em olhos
de coelhos. Os cortes histológicos demonstraram que os olhos não tratados
apresentavam inflamação exacerbada e desorganização das camadas de células da
retina, enquanto que os olhos que receberam os implantes contendo CsA apresentaram
uma redução significante da inflamação e a arquitetura da retina foi preservada. Além
disso, os implantes liberaram o fármaco em níveis terapêuticos por, no mínimo, 6
meses, sem que o fármaco fosse detectado na circulação sanguínea. Portanto, os
implantes não-biodegradáveis de CsA foram eficazes na supressão do processo
inflamatório induzido em olhos de coelhos, e este sistema poderia ser útil em
pacientes que apresentam uveíte posterior crônica, e que são intolerantes às terapias
sistêmica com imunossupressora.
Okabe et al. (2003) desenvolveram implantes de PVA/EVA de aplicação intra-
escleral para liberação controlada de betametasona. Os implantes liberaram
betametasona numa cinética de pseudo ordem zero por 4 semanas. As concentrações
de betametasona na coróide e retina permaneceram acima das concentrações efetivas
para suprimir vários processos inflamatórios por, no mínimo, 28 dias. Estes resultados
sugeriram que a via intra-escleral também pode ser considerada para a implantação de
sistemas de liberação controlada de fármacos destinados ao tratamento das uveítes
posteriores.
2.2.1.3 Implantes intra-oculares não-biodegradáveis para o tratamento das doenças
relacionadas à retinopatia diabética
A retinopatia diabética é a segunda maior causa de cegueira em pacientes adultos nos
países ocidentais, correspondendo a cerca de 19% dos casos de cegueira. A
maculopatia diabética, cuja principal manifestação é o edema macular, é a causa mais
frequente de perda significativa da função visual em diabéticos, com prevalência de
18 a 20%, tanto em pacientes com diabetes tipo I quanto em pacientes com diabetes
tipo II. A perda visual pelo diabetes pode ser evitada ou minimizada com controle
clínico adequado e a realização de tratamentos local e sistêmico. Na retinopatia
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diabética, o rompimento da barreira hemato-retiniana permite o extravasamento de
líquidos e constituintes plasmáticos (principalmente lipoproteínas) para o espaço
insterticial da retina, levando à formação dos edemas. O edema pode ser focal ou
difuso e se manifesta clinicamente como retina espessa e opacificada. No edema
focal, há áreas de vazamento a partir das lesões capilares específicas, que pode estar
associado aos exsudatos duros (precipitação de resíduos lipídicos, após a reabsorção
do fluido derivado do extravasamento de lipoproteínas plasmáticas). No edema
difuso, há dilatação capilar e vazamento devido às quebras extensas na barreira
hemato-retiniana, sendo que os exsudatos duros são menos comuns (MOTTA et al.,
2008).
O tratamento da retinopatia diabética, e consequentemente, do edema macular
diabético deve ser realizado por meio de diferentes abordagens nas vertentes da
prevenção, intervenção e restauração. No tratamento preventivo, deve-se administrar
medicamentos anti-hipoglicemiantes e anti-hipertensivos; na intervenção, deve-se
utilizar esteróides intravítreos, antiangiogênicos e antiproliferativos; e finalmente na
restauração, a abordagem cirúrgica é necessária (ÁVILA, 2003).
Implantes não-biodegradáveis contendo AF, destinados ao tratamento do edema
macular diabético, estão sendo avaliados em estudos clínicos de fase III. Estes
implantes, denominados Illuvien
Ò
(Allimera Sciences Products), são pequenos tubos
de 3,5 mm de comprimento e 0,37 mm de diâmetro que devem ser inseridos no vítreo
por meio de uma injeção ao invés de uma incisão cirúrgica, e possibilitaram a
liberação controlada de AF por 24 a 36 meses.
2.2.1.4 Implantes intra-oculares não biodegradáveis contendo células para o
tratamento das desordens da retina
Recentemente, McDonald et al. (2007) demonstraram a funcionalidade de uma nova
abordagem terapêutica destinada ao tratamento das desordens da retina em pacientes
(estudos clínicos de fase I). Trata-se de um implante intraocular não-biodegradável
que contém células humanas epiteliais pigmentares da retina encapsuladas capazes de
produzir o fator neurotrófico ciliar (CNTF). O CNTF é uma proteína da família da
Revisão bibliográfica
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38
interleucina-6 que se liga ao receptor CNTF-α presente nas células epiteliais
pigmentares da retina, cones, bastonetes, células ganglionares da retina e seus
axônios. Quando o CNTF se liga ao receptor, há a ativação do mecanismo regulado
por quinases em cones e bastonetes, o que induz a neuroproteção. Pacientes com
retinite pigmentosa que receberam estes implantes intravítreos apresentaram melhora
da acuidade visual. Além disso, os implantes não provocaram efeitos adversos, tais
como aumento da IOP, descolamento da retina, infecção ou inflamação severa.
Adicionalmente, as células do implante liberaram CNTF em níveis terapêuticos por 6
meses. Os resultados obtidos nesta pesquisa encorajam a realização de estudos
clínicos de fase II e III para investigar se CNTF diminui a neurodegeneração e
prolonga as funções visuais.
Em resumo, os implantes intra-oculares não-biodegradáveis apresentam a vantagem
de controlar a liberação do fármaco, numa cinética previsível, por períodos
prolongados. Além disso, elevadas concentrações do fármaco são quantificadas no
vítreo, e baixas concentrações são detectadas no humor aquoso ou no sangue. Porém,
ao contrário dos implantes intra-oculares biodegradáveis, estes sistemas devem ser
removidos cirurgicamente do olho após a liberação total do fármaco, o que representa
risco para o paciente e uma desvantagem inerente dos implantes não-biodegradáveis.
Por esta razão, diversos estudos vêem sendo realizados visando o desenvolvimento de
implantes intra-oculares de liberação controlada de fármacos constituídos de
polímeros biodegradáveis.
2.2.2 Implantes intra-oculares biodegradáveis
Os implantes constituídos de polímeros biodegradáveis também se apresentam em
dois tipos: matriciais (sistemas monolíticos) e reservatórios. No sistema matricial, o
polímero se degrada lentamente nas condições fisiológicas e o fármaco é liberado à
medida que acontece a degradação. Neste caso, o fármaco também pode ser liberado
por difusão através dos poros da matriz. No sistema reservatório, a membrana se
degrada numa velocidade mais lenta que a de difusão do fármaco (DASH e
CUDWORTH II, 1998; FIALHO et al., 2003).
Revisão bibliográfica
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39
Uma grande variedade de polímeros biodegradáveis naturais ou sintéticos tem sido
estudada para o desenvolvimento dos implantes. Dentre os polímeros naturais citam-
se as albuminas bovina e humana, colágeno, gelatina e hemoglobina. Porém, o uso
destes polímeros é limitado devido ao alto custo e pureza questionável. Dentre os
polímeros sintéticos citam-se as poliamidas, poliaminoácidos, polialquil-a-ciano
acrilatos, poliuretanos, poliacrilamidas, poliésteres, poli(orto-ésteres) (POE), polímero
poliglicólico (PGA), copolímero poli(D,L-láctico-glicólico) (PLGA) e polímero
poli(D,L-láctico) (PLA) (JAIN, 2000).
Os polímeros dos ácidos láctico e glicólico (PGA, PLA e PLGA) são poliésteres
alifáticos que podem ser degradados por hidrólise enzimática ou não-enzimática. As
ligações éster destes polímeros são suscetíveis à degradação hidrolítica nas condições
fisiológicas, e os produtos de degradação gerados, os ácidos láctico e glicólico, são
metabólitos naturais do organismo, que entram no ciclo de Krebs, e são finalmente
metabolizados em gás carbônico e água (YASUKAWA et al., 2005, CHANDRA e
RUSTGI, 1998).
O PGA apresenta rápida taxa de degradação, com perda de massa entre 6 e 12 meses.
Entretanto, os produtos de degradação rapidamente gerados levam à acidificação do
meio, o que limita a aplicação biológica do PGA puro, fazendo com que ele seja
utilizado na preparação de co-polímeros que não apresentam a desvantagem acima
mencionada (MAURUS e KAEDING, 2004).
O PLA é sintetizado a partir do ácido láctico, que por sua vez, apresenta duas formas
opticamente ativas: ácido L-láctico e ácido D-láctico. A polimerização destes
monômeros leva à formação de PLA semicristalino, altamente hidrofóbico, e com
taxas de degradação extremamente lentas, que variam conforme o grau de
cristalinidade do polímero, bem como a porosidade da matriz. Por outro lado, a
polimerização de misturas racêmicas dos ácidos L-láctico e D-láctico resulta na
formação do PLA amorfo, que sofre perda de massa entre 12 e 16 meses devido à
hidrólise (NAIR e LAURENCIN, 2007).
Revisão bibliográfica
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40
A taxa de degradação do PLGA varia conforme a proporção dos ácidos láctico e
glicólico na matriz polimérica e a massa molecular do polímero. A utilização do
PLGA tem sido extensivamente investigada como biomaterial para liberação
controlada de fármacos e para suporte na engenharia de tecidos, já que este polímero
apresenta taxas de degradação controláveis, excelente biocompatibilidade e aprovação
do FDA para uso em humanos (NAIR e LAURENCIN, 2007).
A poli(e-caprolactona) (PLC) é um poliéster semicristalino e hidrofóbico, que é
sintetizado a partir da polimerização dos monômeros e-caprolactona. A PCL sofre
degradação hidrolítica devido à presença das ligações éster. Entretanto a taxa de
degradação da PCL é relativamente lenta (2 a 3 anos) (BORUGES et al., 2006; NAIR
e LAURENCIN, 2007). A degradação lenta, a excelente biocompatibilidade e a alta
permeabilidade aos fármacos são características da PCL que vem sendo exploradas
para o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de fármacos no interior
do olho (PEYMAN et al., 1996, DONG et al., 2006, FIALHO et al., 2008).
Os implantes intra-oculares contendo polímeros biodegradáveis, tais como o PLA,
PLGA ou PCL, podem ser preparados pelas técnicas de moldagem, extrusão e
preparação de filmes. Na moldagem, o polímero e o fármaco podem ser aquecidos e
submetidos à compressão em moldes de tamanho e forma desejados. Na extrusão, o
polímero e o fármaco são propulsionados continuamente, sob pressão, através de
áreas de alta temperatura, provocando a fusão e a compactação da mistura de pós na
forma do implante. A preparação de filmes pode ser realizada por meio de fusão e
pressão do polímero e do fármaco ou por adição de solução. No método de adição de
solução, os componentes são solubilizados no solvente apropriado, seguido pela
evaporação do solvente. O filme seco é removido da superfície (KIMURA e OGURA,
2001).
Em geral, implantes preparados por compressão dispõem um perfil trifásico de
liberação do fármaco, a saber: (1) a fase inicial é derivada da liberação de uma dose
maior do fármaco presente na superfície da matriz polimérica, e é dependente da área
superficial total do implante, da porcentagem de fármaco adicionada ao implante, e da
solubilidade aquosa do fármaco. Portanto, quanto maior a área superficial do sistema,
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41
maior a concentração e hidrofilia do fármaco adicionado, maior a probabilidade de
acontecerem efeitos tóxicos devido à exacerbação da fase inicial; (2) a fase de difusão
caracterizada pela liberação gradual do fármaco devido à sua dissolução e a erosão da
superfície da matriz polimérica. Esta fase é regulada pela velocidade de degradação
do polímero, a área superficial total do implante, a porcentagem de fármaco
adicionado e a solubilidade aquosa do fármaco; (3) a fase final é caracterizada pela
hidrólise no interior da matriz e liberação repentina de uma dose mais elevada de
fármaco. A liberação de uma dose elevada de fármaco é possivelmente problemática e
representa uma desvantagem dos sistemas biodegradáveis (YASUKAWA et al.,
2002).
Os poli(orto-ésteres) (POE) são polímeros biodegradáveis hidrofóbicos especialmente
projetados para a liberação controlada de fármacos. Desde 1970, quatro famílias de
POE têm sido investigadas em aplicações biomédicas. As famílias POE I e POE II
não são usadas na oftalmologia. O POE III apresenta cadeias poliméricas altamente
flexíveis, sendo um gel a temperatura ambiente. A natureza viscosa deste polímero
possibilita a incorporação de agentes terapêuticos na matriz sem a necessidade de
utilizar solventes. Além disso, POE III pode ser injetado diretamente no olho com
agulhas apropriadas. A taxa de degradação do POE III pode ser acelerada pela
incorporação de substâncias ácidas na matriz polimérica, uma vez que POE III
apresentam ligações sensíveis a variação do pH. Já a incorporação de substâncias
básicas estabiliza a matriz polimérica (BOURGES et al., 2006; NAIR e
LAURENCIN, 2007). A biocompatibilidade intracameral e intravítrea de POE III foi
extensivamente investigada. Observou-se que a biocompatibilidade intracameral é
dependente da quantidade de polímero injetada na câmara anterior. Quando 50 µL
foram administrados, o polímero degradou em 2 semanas, e as observações clínicas
demonstraram boa biocompatibilidade do POE III, sem toxicidade dos tecidos
oculares ou aumento da IOP. A injeção de volumes maiores, 100 µL de POE III, foi
inadequada porque o contato direto do material com o endotélio corneal provocou
edema reversível e inflamação na câmara anterior, que regrediu após alguns dias. A
administração intravítrea de POE III foi bem tolerada, pois resposta inflamatória não
foi desenvolvida. Além disso, o polímero se degradou lentamente no vítreo
(EINMAHL et al., 2000). Apesar das características atrativas do POE III em
Revisão bibliográfica
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aplicações oculares, a consistência do gel e a dificuldade em produzí-lo em escala
industrial são limitações deste polímero. O POE IV apresenta degradação apreciável
devido à incorporação de segmentos curtos baseados nos ácidos láctico e glicólico na
matriz polimérica. A taxa de degradação pode variar de dias a meses, de acordo com a
proporção de segmentos ácidos adicionados. A biocompatibilidade do POE IV foi
investigada no espaço subconjuntival, intracameral, intravítreo e supracoroidal de
olhos de coelhos (EINMAHL et al., 2003). Após a injeção subconjuntival, o polímero
foi bem tolerado e degradou completamente em cerca de 5 semanas. Na injeção
intracameral, a biocompatibilidade do polímero foi satisfatória e a degradação na
câmara anterior não foi completa ao final de 6 meses. Após as injeções intravítrea e
supracoroidal, o polímero se degradou em aproximadamente 3 e 6 meses,
respectivamente, e a biocompatibilidade foi excelente sem respostas inflamatórias
detectáveis.
2.2.2.1 Implantes intra-oculares biodegradáveis para o tratamento da retinite por
citomegalovírus
Kunou et al. (1995) prepararam implantes biodegradáveis a base de PLGA (75:25) e
25% (p⁄p) de ganciclovir destinados ao tratamento da retinite por CMV. Estes
implantes apresentaram um perfil trifásico de liberação do fármaco. Na primeira fase,
cerca de 40% do fármaco foi liberado em apenas 1 semana. Na fase difusional, cerca
de 10% do ganciclovir foi liberado em 8 semanas, e na fase final, que aconteceu
durante 4 semanas, aproximadamente 100% do princípio ativo foi liberado. Houve o
desaparecimento completo do implante após 5 meses de implantação, devido à
hidrólise não enzimática do PLGA.
As principais desvantagens dos implantes a base de co-polímeros dos ácidos láctico e
glicólico são a liberação de uma grande quantidade de fármaco (overdose) na etapa
final, e a dificuldade em prolongar e aumentar a taxa de liberação do fármaco na etapa
difusional. Para tentar superar tais complicações, Kunou et al. (2000) prepararam
implantes contendo uma mistura de PLA com diferentes massas moleculares (70-kDa
e 50-kDa), na proporção 80:20. Estes sistemas propiciaram uma liberação mais
homogênea de ganciclovir na etapa final, e também tiveram uma melhor taxa de
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liberação de fármaco na fase difusional, com duração prolongada (mais de 25
semanas). Sugeriu-se que o PLA de alto peso molecular restringiu a degradação do
PLA de baixa massa molecular, e que este segundo pôde regular a liberação do
fármaco durante a fase difusional, devido à formação mais lenta de poros na matriz.
Adicionalmente, o PLA de baixa massa molecular sofreu hidrólise, mas a associação
ao PLA de massa molecular elevada impediu a quebra da estrutura, e
consequentemente à liberação de grande quantidade de fármaco na etapa final. Estes
implantes biodegradáveis apresentaram um perfil de liberação do ganciclovir, por
tempo prolongado, comparável ao perfil de liberação de sistemas não-biodegradáveis.
2.2.2.2 Implantes intra-oculares biodegradáveis para o tratamento das uveítes
O Surodex
Ò
(Oculex Pharmaceuticals, Sunnyvale, Califórnia) é um sistema
monolítico constituído de PLGA e 60 µg de dexametasona que estão
homogeneamente dispersos. Este implante biodegradável é utilizado após a cirurgia
de catarata com o intuito de evitar inflamações. Inicialmente, foi demonstrado que
este sistema, implantado na câmara anterior de olhos de coelhos, proporcionava a
liberação controlada da dexametasona numa cinética de ordem zero, durante 7 dias. A
segurança deste implante foi demonstrada em estudos toxicológicos de Fase I
(protocolo FDA número 94001). Em seguida, estudos em humanos foram realizados
com o intuito de comparar os desempenhos do Surodex
Ò
e de um colírio contendo
0,1% de dexametasona, em olhos de pacientes que se submeteram a cirurgia de
extração da catarata e implantação de lente intra-ocular. Os resultados mostraram que
o Surodex
Ò
foi mais efetivo na redução do processo inflamatório pós-cirúrgico (TAN
et al., 2001). Wadood et al. (2004) também compararam a segurança e eficácia do
Surodex
Ò
e de um colírio contendo 0,1% de dexametasona, em pacientes que se
submeteram a facoemulsificação. Novamente, o Surodex
Ò
se mostrou mais efetivo
contra o desenvolvimento de resposta inflamatória. Portanto, de acordo com os
estudos realizados, podem-se considerar três vantagens importantes destes implantes
intra-camerais em relação aos colírios oftálmicos: (1) utilização de quantidade menor
de fármaco, e conseqüente redução das reações adversas e da toxicidade sistêmica; (2)
controle da liberação do fármaco no segmento anterior numa cinética de ordem zero;
(3) redução das complicações em pacientes que não administram corretamente os
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colírios devido à baixa adesão à terapia. Atualmente, o Surodex
Ò
está sendo avaliado
em estudos clínicos de fase III (SEAH et al., 2005).
O Posurdex
Ò
(Allergan) é um implante intravítreo biodegradável constituído de
PLGA e dexametasona. Este sistema de liberação controlada tem sido estudado em
pacientes que apresentam edema macular persistente provocado por retinopatia
diabética, oclusão de veias, uveítes e síndrome Irvine-Gass (estudos clínicos na Fase
III) (AMO e URTTI, 2008). Kuppermann et al. (2007) pesquisaram a eficácia e
segurança do Posurdex
Ò
contendo 350 e 700 µg de dexametasona, durante 6 meses,
em 315 pacientes com edema macular persistente por, no mínimo, 90 dias. Os
resultados mostraram que em 3 meses de tratamento, 35% e 24% dos pacientes que
receberam a dose de 700 µg e 350 µg de dexametasona, respectivamente,
apresentaram melhora de 10 letras ou mais na acuidade visual, e 18% dos pacientes
tratados com 700 µg de fármaco melhoraram 15 letras ou mais na acuidade visual.
Concluiu-se que o Posurdex
Ò
contendo a maior dose de dexametasona é mais eficaz
no tratamento do edema macular persistente. Os resultados obtidos até o momento
indicaram que o Surodex
Ò
e o Posurdex
Ò
poderão ser importantes no tratamento de
uveítes dependendo do esquema posológico necessário (AMO e URTTI, 2008).
Fialho et al. (2006) prepararam implantes biodegradáveis de PLGA contendo 1000 µg
de dexametasona visando o tratamento de desordens inflamatórias que acometem o
segmento posterior do olho. Os implantes foram inseridos no vítreo de olhos de
coelhos por meio de uma incisão na pars plana. O fármaco foi liberado por 8
semanas, dentro da faixa terapêutica necessária para suprimir uma inflamação ocular
(0,15 a 4,00 µg⁄mL). Além disso, demonstrou-se a biocompatibilidade dos implantes,
uma vez que reações tóxicas não foram observadas por meio de eletrorretinografia e
exame histológico. Os resultados satisfatórios obtidos e a semelhança entre estes
implantes e o Posurdex
Ò
encorajam estudos adicionais para a aplicação clínica destes
sistemas.
Dong et al. (2006) prepararam implantes intravítreos constituídos de CsA e do
copolímero glicólico-co-láctico-co-caprolactona (PGLC) que foram utilizados no
tratamento de uveíte crônica experimental induzida em olhos de coelhos. Os
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resultados obtidos demonstraram que a inflamação nos olhos dos animais que não
receberam o implante ou que receberam doses orais de CsA foi mais severa do que
nos olhos dos animais que se beneficiaram do tratamento com os implantes
biodegradáveis. A terapia sistêmica foi intencionalmente incluída neste estudo para
comparar a toxicidade do fármaco administrado por via oral e por meio do implante
intra-ocular. Observou-se que os animais que receberam a CsA por via oral
apresentaram distúrbios renais e hepáticas graves, com grande risco de falência dos
órgãos; enquanto que os animais dos outros grupos não apresentaram estes mesmos
problemas. Por outro lado, a concentração de CsA liberada no olho, a partir dos
implantes, estava dentro da faixa terapêutica necessária para suprimir uma resposta
inflamação, além de não induzirem toxicidade aos tecidos oculares.
Fialho et al. (2008) desenvolveram implantes intravítreos biodegradáveis contendo
PCL e dexametasona. Estes implantes liberaram concentrações de dexametasona in
vitro que poderiam suprimir vários processos inflamatórios e que não causariam
reações tóxicas aos tecidos oculares. Além disso, estes sistemas foram bem tolerados
após 30 dias de implantação em olhos de coelhos, uma vez que células inflamatórias
não foram detectadas no vítreo ou na câmara anterior. No estudo de liberação in vivo
utilizando olhos de coelhos, o fármaco foi liberado em concentração terapêutica por
mais de 9 meses.
Kim et al. (2008) desenvolveram implantes biodegradáveis intraesclerais constituídos
de PLA e acetato de triancinolona. Concentrações do princípio ativo liberado foram
mensuradas no vítreo, humor aquoso, retina e coróide de olhos de coelhos após 1, 2,
4, 8 e 12 semanas de implantação. A triancinolona foi proporcionalmente liberada no
humor aquoso, retina e coróide por 4 semanas. Entretanto, o fármaco não foi
detectado no humor aquoso em 8 semanas e na retina e coróide em 12 semanas após a
implantação. A triancinolona foi quantificada em concentrações constantes no vítreo
durante 12 semanas. A razão pela qual a triancinolona foi detectada no vítreo por mais
tempo que na retina, coróide e humor aquoso pode estar relacionada ao maior
clearance do fármaco por meio dos vasos sanguíneos coroidais. Apesar dos resultados
promissores obtidos, novos estudos devem ser conduzidos com o intuito de se avaliar
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se concentrações sistêmicas do fármaco poderão ser detectadas e se existirão efeitos
tóxicos nas células epiteliais pigmentares da retina.
2.2.2.3 Implantes intra-oculares biodegradáveis para o tratamento da
vitreoretinopatia proliferativa
A vitreoretinopatia proliferativa (PVR) é o processo no qual há migração e
proliferação de células no espaço subretiniano, no vítreo e na retina, que levam a
formação de membranas fibrosas constituídas de células do epitélio pigmentar da
retina, células gliais, macrófagos e fibroblastos. Estas membranas fibrosas contrácteis
conduzem ao descolamento da retina e conseqüente perda da visão (YASUKAWA et
al., 2004). Acredita-se que a PVR poderia ser inibida impedindo simultaneamente o
curso de formação da doença que é dividido em três fases: inflamação, proliferação
celular e cicatrização, a qual conduz a tração da retina. Portanto, para tratar a PVR é
necessária a utilização de dispositivos intravítreos de liberação controlada de
fármacos, seguida da cirurgia corretiva de descolamento da retina (ZHOU et al.,
1998).
Existem diversos estudos que reportaram o tratamento da PVR experimental, induzida
em olhos de coelhos, a partir da utilização de dispositivos intra-oculares contendo
diferentes antimetabólitos, capazes de inibir o mecanismo de proliferação celular.
Rubsamen et al. (1994) prepararam implantes intravítreos de PLGA contendo 1 mg de
5-fluoruracila (5-FU) que permitiram a liberação do antimetabólito na concentração
entre 1 e 13 µg/L durante 14 dias. Esta liberação sustentada auxiliou na involução da
PVR, uma vez que a retina de 8 dos 9 coelhos utilizados permaneceu aderida. Por
outro lado, apenas 1 animal do grupo controle (aquele que recebeu implante sem 5-
FU) não apresentou descolamento da retina.
Yasukawa et al. (2002) prepararam implantes a partir de uma mistura de PLGA e
várias concentrações de cis-hidroxiprolina (CHP). Os implantes de PLGA 65:35 (MM
= 103.000) contendo 20% de CHP e os de PLGA 50:50 (MM = 93.000) contendo
15% de CHP foram selecionados para realização do estudo in vivo, baseado no perfil
de liberação trifásico in vitro. Porém, estes implantes foram efetivos no tratamento da
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doença apenas na primeira semana, pois a taxa da liberação do princípio ativo e a
duração da fase difusional não foram satisfatórias. Para tentar superar estes
problemas, um implante de PLGA 65:35 e outro de PLGA 50:50 foram inseridos
juntos nos olhos dos coelhos, e estes diminuíram a incidência de descolamento da
retina de 89% para 57%, 28 dias após a implantação. A diminuição da incidência de
descolamento da retina foi similar aquela observada quando 20 µg de CHP foram
diretamente injetadas em olhos de coelhos com PVR induzida. Dois implantes de
PLGA 50:50 também foram implantados juntos e estes não apresentam efeito
inibitório significante da PVR. Estes resultados sugeriram que os perfis de liberação
combinados de diferentes implantes são mais efetivos na inibição da incidência de
descolamento da retina em olhos com PVR.
Dong et al. (2006) desenvolveram implantes de PLGA contendo 420, 650 e 1.040 µg
de all-trans ácido retinóico (at-RA). Os implantes com a menor concentração de at-
RA falharam na inibição da PVR. Por outro lado, os implantes com as maiores doses
de at-RA apresentaram efeito anti-proliferativo satisfatório, com a liberação do
antimetabólito em altas concentrações durante 8 semanas.
Em todos os estudos anteriormente relatados, os fármacos liberados no vítreo não
provocaram reações tóxicas aos tecidos oculares e os implantes biocompatíveis
apresentaram a potencialidade de aplicação clínica. Mas, para que estes implantes
possam ser futuramente utilizados em pacientes, estudos adicionais deverão ser
conduzidos para que se possa solucionar algumas questões ainda pendentes, tais como
a necessidade de manter altas concentrações dos agentes terapêuticos durante a etapa
de proliferação celular na PVR, o que induzirá mudanças não só na constituição
polimérica do implante, mas também na proporção entre fármaco e polímero. Além
disso, serão necessários estudos detalhados da farmacocinética intra-ocular dos
diferentes antimetabólitos.
Implantes à base de POE IV (POE
70
LA
30
, Mm = 6900) e 5-FU puro, 5-FU associado à
dexametasona ou dexametasona pura foram preparados com o intuito de prevenir a
PVR experimental em olhos de coelhos. A PVR induzida foi clinicamente classificada
da seguinte maneira: grau 0 - não há PVR; grau 1 - membranas epiretinais; grau 2 -
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tração focal, vasos anormais e tortuosidade; grau 3 - descolamento localizado da
retina; grau 4 - descolamento extensivo da retina e descolamento peripapilar; grau 5 -
descolamento total da retina, dobras fixas e descontinuidade da retina. Os implantes
que continham POE IV puro não afetaram o desenvolvimento da PVR, e os graus 4 e
5 foram observados. Por outro lado, os graus 2 e 3 foram observados em olhos
tratados com POE contendo 1% de 5-FU ou 1% de dexametasona. Os olhos tratados
com POE contendo os dois princípios ativos apresentaram o menor grau de PVR (1,0
± 0,5), demonstrando que a combinação destes fármacos em sistemas POE IV foi
mais eficaz no tratamento da PVR (BOURGES et al., 2006).
Zhou et al. (1998) prepararam implantes de PLGA contendo 3 agentes terapêuticos: 5-
FU (antimetabólito), triancinolona (antiinflamatório esteroidal) e o ativador
plasminogênio tecidual (t-PA) (agente trombolítico). Estes agentes poderiam prevenir
a PVR por meio de três mecanismos distintos: (1) inibição da proliferação celular; (2)
inibição da resposta inflamatória; (3) inibição da formação da matriz de fibrina.
Estudos de liberação in vitro demonstraram que o 5-FU e a triancinolona foram
liberados numa taxa de 1 µg/dia durante 4 semanas e 10 a 190 µg/dia durante 2
semanas. Após 2 dias, o t-Pa foi liberado numa taxa de 0,2 a 0,5 µg/dia em 2 semanas.
Apesar dos resultados promissores, estes implantes multi-fármacos ainda devem ser
avaliados in vivo.
Observam-se que pesquisas foram realizadas com implantes intra-oculares contendo
apenas uma substância anti-proliferativa, enquanto que outros estudos foram
conduzidos com implantes contendo dois ou mais fármacos, uma vez que a
administração de múltiplos agentes terapêuticos potencializaria a eficácia do
tratamento da PVR, já que as etapas de proliferação e migração celular, e de síntese
das membranas seriam conjuntamente atacadas.
Portanto, para o tratamento das doenças intra-oculares crônicas, faz-se necessária a
elaboração de implantes que possibilitem a liberação controlada e prolongada do
princípio ativo exatamente no local de ação. Entretanto, exaustivos estudos pré-
clínicos e clínicos deverão ser realizados para avaliar a eficácia e segurança dos
diversos implantes intra-oculares até então desenvolvidos.
Revisão bibliográfica
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Como descrito nesta revisão, os implantes não biodegradáveis permitem a liberação
controlada dos fármacos e o tratamento de doenças oculares experimentais e em
pacientes, mas devem ser removidos após a liberação completa do princípio ativo. Por
outro lado, os implantes biodegradáveis não precisam ser removidos do olho, pois
serão degradados e absorvidos ou excretados pelo organismo, o que elimina a
necessidade de nova cirurgia para remoção do reservatório vazio, aumentando a
adesão do paciente à terapia. Entretanto, o desenvolvimento de sistemas
biodegradáveis é mais complicado do que o desenvolvimento de sistemas não
biodegradáveis, pois algumas variáveis devem ser consideradas. Por exemplo, a
cinética de degradação do polímero in vivo deve acontecer numa taxa constante para
manter a liberação do princípio ativo dentro da faixa terapêutica. Entretanto, a taxa de
degradação destes sistemas pode ser afetada pelas variações de pH e temperatura
corporal. Outra variável que deve ser considerada é a lenta difusão do fármaco a partir
da matriz polimérica. A difusão acontence mais lentamente que a degradação do
sistema. Logo, ajustes devem ser realizados na composição química do polímero
utilizado na preparação do implante para miminizar o problema relatado. Enfim,
desafios devem ser considerados e ultrapassados a fim de se elaborar implantes
biodegradáveis que possibilitem a liberação prolongada do princípio ativo dentro da
faixa terapêutica para o efetivo tratamento das doenças intra-oculares graves.
2.3 Síntese dos poliuretanos
Poliuretanos são polímeros nos quais a cadeia principal é composta por seções
alifáticas ou aromáticas R e R
’
fixadas pela ligação uretano (Figura 3), enquanto que
R
’
é um radical alifático ou aromático do monômero diisocianato, e R é um grupo
derivado de um poliol [poli(éter) ou poli(éster)]. A síntese dos poliuretanos é baseada
num processo de poli-adições que envolve os diisocianatos, os polióis com grupos
hidroxila e os extensores de cadeia (KRÓL, 2007).
A decisão entre usar um diisocianato aromático ou alifático vai depender da aplicação
a que se destina o poliuretano a ser preparado. De uma maneira geral, os diisocianatos
alifáticos dão origem a poliuretanos mais flexíveis e resistentes às intempéries. Os
Revisão bibliográfica
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50
diisocianatos aromáticos dão origem a poliuretanos mais viscosos. Isso muitas vezes
dificulta a preparação de poliuretanos isentos de solventes. Os monômeros alifáticos
mais usados são o hexametileno diisocianato (HDI), o isoforona diisocianato (IPDI) e
o 4,4’-diciclohexilmetano diisocianato (H
12
MDI) (AYRES, 2006).
Figura 3 – Formação da ligação uretano.
Fonte – TATAI et al., 2007
Os isocianatos são compostos altamente reativos, pois possuem o grupo NCO com
ligações duplas que reagem prontamente com compostos que contêm hidrogênios
reativos, gerando produtos de adição. As reações básicas dos isocianatos com
diferentes reagentes estão apresentadas na Figura 4. Os isocianatos reagem com
hidroxilas para formar uretanos (a), e com aminas para formar uréias (b). Os
isocianatos também reagem com a água formando, inicialmente, um ácido carbâmico
instável, o qual decompõe gerando amina (c). A amina é um reagente nucleofílico que
reage com o isocianato, gerando uréias (d). Outros produtos, tais como o biureto (e) e
o alofanato (f) podem ser gerados a partir das reações dos isocianatos. Além disso,
reações secundárias também podem acontecer, em menor escala, levando à formação
de anéis uretidiona (g), isocianurato (h), e carbodiimina (j) (CHATTOPADHYAY e
RAJU, 2007). Estas reações secundárias podem acontecer durante a síntese e
estocagem e são inconvenientes na formação dos poliuretanos.
Os polióis utilizados na preparação dos poliuretanos podem ser poli(ésteres) ou
poli(éteres), tais como a poli(e-caprolactona) e o poli(etilenoglicol), respectivamente.
Os poliésteres são polímeros termoplásticos que apresentam ligações éster em sua
constituição química. Os poli(éster uretanos) são vulneráveis à hidrólise na ligação
éster, levando à formação de ácido carboxílico e álcool. Esta instabilidade hidrolítica
das ligações éster é uma característica importante em se tratando de poliuretanos
biodegradáveis. Os poli(éteres) são polímeros que apresentam ligações éter em sua
constituição química e são menos vulneráveis a hidrólise do que os poli(ésteres).
Revisão bibliográfica
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51
Figura 4 – Reações dos isocianatos.
Fonte - CHATTOPADHYAY e RAJU, 2007
Os catalisadores devem ser adicionados à síntese dos poliuretanos para tornar mais
rápida a reação entre o diisocianato e a hidroxila do poliol. Vários catalisadores
podem ser utilizados na formação do uretano, tais como, as aminas terciárias,
especialmente o 1,4-diazabiciclo-[2,2,2]-octano (DABCO), e os compostos
organometálicos, principalmente os dibutiltindilauratos (DBTDL) e os
dibutiltindioctanatos (KRÓL, 2007).
Poliuretanos segmentados podem ser descritos como copolímeros em blocos lineares.
Um bloco do polímero consiste de um diol poli(éster) ou poli(éter) flexível de cadeia
longa. Esse bloco é usualmente chamado de segmento macio, pois incorpora o caráter
elastomérico ao polímero. O segundo bloco do co-polímero é o segmento rígido
formado pela reação de diisocianatos com extensores de cadeia, com dióis ou trióis de
baixa massa molar ou com diaminas, dando origem a ligações uretano ou uréia que
são altamente polares e promovem a coesão do polímero. Os dois tipos de segmentos
tendem a uma micro-separação de fases de maneira a formar micro-domínios. De
modo geral, a segregação é mais pronunciada com poli(éteres) do que com
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52
poli(ésteres) porque a estrutura do éter é menos polar e interage menos com os
segmentos mais polares de uretano e uréia (CRAWFORD et al., 1998).
O interesse pela síntese de poliuretanos segmentados dispersos em água tem
aumentado nos últimos anos, devido à redução da emissão de solventes orgânicos,
potenciais poluidores do ambiente, e também devido à possibilidade de síntese de
biomateriais.
Uma dispersão aquosa de poliuretanos é um sistema binário coloidal, no qual as
partículas de poliuretano estão dispersas em água. Usualmente, os poliuretanos não
são solúveis em água, e para que a dispersão aquosa possa ser formada é necessária a
incorporação de grupos hidrofílicos aos polímeros pela adição de emulsificante. O
emulsificante é um diol que contém um grupo iônico (carboxilato, sulfonato ou
amônio quaternário) ou um grupo não iônico [óxido poli(etileno)]
(CHATTOPADHYAY e RAJU, 2007). Os poliuretanos que contém grupos iônicos
são chamados ionômeros e o processo para obtê-los é denominado processo do pré-
polímero.
Os pré-polímeros catiônicos podem se auto-organizar em micelas com os grupos
hidrofílicos carregados positivamente localizados na superfície e as cadeias
hidrofóbicas concentradas no interior das micelas. Formam-se ligações de hidrogênio
entre os grupos hidrofílicos e as moléculas de água, e então as micelas são solvatadas
pela água. Para a preparação dos pré-polímeros catiônicos, o 3-dimetilamino-1,2-
propanodiol pode ser utilizado para promover a dispersão aquosa dos poliuretanos, e
em seguida, acontece a neutralização com um ácido fraco (CHATTOPADHYAY e
RAJU, 2007).
Os pré-polímeros aniônicos são formados a partir da incorporação de ácido
dimetilpropiônico (DMPA) aos polímeros, seguida da neutralização dos grupos
carboxílicos do DMPA com a trietilamina (TEA). O íon carboxílico do DMPA é
hidrofílico e serve como um centro aniônico nos poliuretanos, bem como
emulsificador interno. Os grupos hidrofílicos aniônicos se localizam na superfície das
micelas e permitem a distribuição homogênea das mesmas na água. A Figura 5 mostra
Revisão bibliográfica
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53
o diagrama esquemático das micelas dos pré-polímeros catiônicos (a) e aniônicos (b)
dispersas em água (CHATTOPADHYAY e RAJU, 2007).
Figura 5 – Diagrama esquemático das micelas dos pré-polímeros catiônicos (a) e
aniônicos (b) dispersas em água.
Fonte - CHATTOPADHYAY e RAJU, 2007
Após a realização da dispersão dos poliuretanos em água, faz-se posteriormente uma
reação denominada extensão de cadeia, na qual o pré-polímero terminado em NCO
reage com um diol de baixa massa molecular para formar ligações uretano, ou com
grupos NH
2
para formar ligações uréia. Neste caso, será produzido poli (uretano-
uréia). Geralmente os grupos NCO residuais são medidos pelo método de titulação
com n-butilamina. A concentração de NCO residual é importante para a determinação
da quantidade de extensor de cadeia a ser adicionado para a reação equimolar com o
pré-polímero (AYRES, 2006).
2.4 Poliuretanos aplicados na oftalmologia
Os poliuretanos são biomateriais amplamente utilizados na confecção de dispositivos
médicos, pois apresentam propriedades mecânicas excelentes associadas à
biocompatibilidade. Válvulas cardíacas, membranas de diálise, cateteres, próteses
ortopédicas e implantes mamários são exemplos de dispositivos fabricados a partir de
poliuretanos bioestáveis (JIANG et al., 2007).
Revisão bibliográfica
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54
Os poliuretanos não biodegradáveis também já foram empregados no
desenvolvimento de dispositivos oculares. Por exemplo, Lee et al. (2000)
desenvolveram queratopróteses destinadas à readaptação visual de pacientes que
sofreram queimadura química na córnea. Pacientes que receberam o dispositivo
apresentaram alta tolerabilidade e aumentaram a acuidade visual significativamente
após 8 meses de implantação. A queratoprótese projetada é constituída de uma parte
óptica feita com polimetil metacrilato (PMMA), de uma esfera de poliuretano, e alças
de polipropileno (Figura 6). As alças de polipropileno permitiram a ancoragem do
dispositivo na esclera não danificada. A maioria das queratopróteses é fixada na
córnea danificada, resultando em complicações não somente na capacidade curativa
corneana, mas também em problemas de rejeição do dispositivo.
Figura 6 – Queratoprótese feita de poliuretano.
Fonte - LEE et al., 2000
Nuyts et al. (1999) demonstraram que um poliuretano, denominado NeuroPatch, pode
ser utilizado no fechamento provisório de perfurações corneanas. O NeuroPatch é um
poliuretano microporoso, de fácil manipulação, que apresenta excelente
biocompatibilidade. Um pedaço de Neuro-Patch de 2 mm foi suturado sobre a
perfuração corneana de um paciente, e após um mês, a sutura foi retirada e a lesão
havia se reconstituído, sem sinais de inflamação no segmento anterior.
Existem pacientes que são refratários aos medicamentos dilatadores da pupila. A não
dilatação da pupila pode impedir a visualização e a utilização dos instrumentos
necessários durante uma cirurgia de catarata. Os métodos atualmente utilizados para
promover a dilatação da pupila apresentam limitações. Kershner (2001) desenvolveu
Revisão bibliográfica
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55
um dispositivo alternativo de dilatação da pupila que pode ser utilizado durante o
procedimento cirúrgico de remoção da catarata. Este dispositivo temporário foi
projetado à base de um poliuretano biocompatível, flexível e com excelente memória
de forma, pois após a introdução no olho, ele retoma o seu tamanho original de
aproximadamente 8 mm.
Na Figura 7 está demonstrado o mecanismo de utilização do dispositivo dilatador da
pupila feito de poliuretano. Na etapa 1, o dispositivo é removido do suporte estéril e a
extremidade distal está embebida com uma pequena quantidade de hialuronato de
sódio. Na etapa 2, esta extremidade do dispositivo é introduzida na câmara anterior
por meio de uma incisão corneana. Na etapa 3, um instrumento é introduzido na
incisão corneana para auxiliar o posicioamento da parte superior do dispositivo. Na
etapa 4, a esfíncter da íris é completamente capturada pelo dispositivo, e
consequentemente, a pupila se dilata. Ao término da cirurgia de remoção de catarata,
o dispositivo é retirado e a pupila retorna ao seu diâmetro original.
Este dispositivo foi utilizado em 30 pacientes que se submeteram à cirurgia de
remoção de catarata. Complicações operatórias, tais como dano da esfíncter da íris ou
sangramento não foram observadas durante a operação. O tamanho médio da pupila
destes pacientes, antes da cirurgia, era de aproximadamente 3,2 mm, e após a inserção
do dispositivo era de cerca de 7,8 mm, e após a retirado do dispositivo era de
aproximadamente 4,3 mm.
Os poliuretanos vêm sendo investigados como suporte para diversos tipos de células,
inclusive células de tecidos oculares. William et al. (2005) estudaram a possibilidade
de utilização de poliuretanos não biodegradáveis, comercialmente disponíveis, como
suporte de células epiteliais pigmentares da retina (RPE). Supos-se que estes
poliuretanos, denominados Pellethane
Ò
, Tecoflex
Ò
, Zytar
Ò
, permitiriam o
estabelecimento de uma monocamada de células RPE, e que seriam posteriormente
transplantados no espaço subretiniano como auxiliares na terapia celular.
Revisão bibliográfica
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56
Figura 7 – Fotografias das etapas 1 a 4 de inserção e retirada do dispositivo dilatador
da pupila feito de poliuretano. Etapa 1 - a extremidade do dispositivo é introduzida na
câmara anterior por meio de uma incisão corneana. Etapa 2 - um instrumento é
introduzido na incisão corneana para auxiliar o posicioamento da parte superior do
dispositivo. Etapa 3 - a esfíncter da íris é completamente capturada pelo dispositivo, e
consequentemente, a pupila se dilata. Etapa 4 - o dispositivo é retirado e a pupila
retorna ao seu diâmetro original.
Fonte - KERSHNER, 2001
Os resultados obtidos demonstraram que Pellethane
Ò
e Tecoflex
Ò
não favoreceram a
adesão e proliferação das células RPE, enquanto que sobre o Zytar
Ò
, as células
proliferaram e apresentaram morfologia normal. Sugeriu-se que a superfície do
Zytar
Ò
, mais hidrofílica que as superfícies dos outros poliuretanos, permitiu o
estabelecimento de interações com as proteínas do soro, que são essenciais para a
ancoragem inicial das células RPE. Uma vez aderidas, estas células proliferaram e
formaram uma monocamada sobre a superfície do biomaterial. Em seguida, os
poliuretanos Pellethane
Ò
e Tecoflex
Ò
foram tratados com a técnica gás-plasma, com o
intuito de aumentar a hidrofilia das superfícies destes polímeros devido à
incorporação de grupos polares funcionais, que poderiam otimizar a interação com as
proteínas do soro requeridas para a adesão celular. Os resultados obtidos foram
satisfatórios, uma vez que as células RPE aderiram e proliferaram sobre as superfícies
tratadas dos poliuretanos, e formaram uma monocamada de células funcionais.
Atualmente, observa-se uma nova tendência, ou seja, a substituição dos dispositivos
de aplicação terapêutica temporária por dispositivos biodegradáveis que poderiam
Revisão bibliográfica
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57
ajudar o corpo a reparar e regenerar os tecidos danificados. Num sentido mais amplo,
surge a necessidade de desenvolvimento de poliuretanos e outros biomateriais
biodegradáveis auxiliares em novas tecnologias biomédicas, tais como, a engenharia
de tecidos, a medicina regenerativa, os sistemas de liberação controlada de fármacos e
as nanotecnologias (NAIR e LAURENCIN, 2007).
A suscetibilidade dos poliuretanos a biodegradação é extremamente dependente da
sua composição química, ou seja, da biodegradação dos poli(ésteres) e poli(éteres),
presentes no segmento macio. As ligações éster alifáticas em poli(éster uretanos)
sofrem degradação hidrolítica (Firgura 8), enquanto que os poli(éter uretanos) estão
envolvidos em fenômenos degradativos de formação crack e propagação.
Adicionalmente, os poli(éter uretanos) que contém metais têm sido objeto de
oxidações catalisadas por produtos de corrosão dos componentes metálicos
(SANTERRE et al., 2005). As ligações uretano também podem sofrer degradação
hidrolítica, mas estudos indicam que grupos hidrolisáveis presentes no segmento
macio são preferencialmente clivados, e estes conduzem a taxa de degradação
hidrolítica dos poliuretanos (Figura 9) (WANG et al., 1997).
Figura 8 – Hidrólise da ligação éster gerando ácido carboxílico e álcool.
FONTE – TATAI et al., 2007
Figura 9 – Hidrólise da ligação uretano gerando álcool, amina e dióxido de carbono.
FONTE – TATAI et al., 2007
As enzimas também promovem a degradação dos poliuretanos. Apesar das enzimas
serem planejadas para interações altamente específicas com substratos biológicos
particulares, algumas são capazes de reconhecer substratos “não naturais”, tais como
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58
os poliuretanos (SANTERRE et al., 2005). Estudos feitos por Aktusu et al. (1998)
demonstraram que as esterases apresentam um domínio hidrofóbico, que possibilita a
adsorção na superfície do polímero, e um domínio catalítico, que promove a hidrólise
da ligação éster. Estudos realizados por Labow et al. (2002) demonstraram que as
enzimas colesterol esterase e carboxil esterase (obtidas a partir da ruptura de
macrófagos derivados de monócitos, presentes em abundância em dispositivos
removidos do corpo e secretores de muitas enzimas hidrolíticas), foram capazes de
degradar poliuretanos e as evidências apontaram uma contribuição significativa das
mesmas na degradação in vivo de biomateriais poliméricos. Adicionalmente, Wang et
al. (1997) investigaram os produtos de degradação de um poliuretano em contato com
a enzima colesterol esterase, e concluíram que a clivagem enzimática do poliuretano
foi predominantemente associada às ligações éster do segmento macio e não às
ligações uretano, o que também ocorre em degradações hidrolíticas dos poliuretanos.
Estudos têm sido realizados a fim de investigar os mecanismos de degradação
oxidativa dos poliuretanos. Diferentes condições têm sido exploradas para tentar
mimetizar o ambiente oxidativo in vivo. Sabe-se que este ambiente oxidativo pode ser
formado devido à presença de células do sistema imune, que tentam degradar o
biomaterial. Os mecanismos de degradação oxidativa de poliuretanos são totalmente
dependentes da constituição química dos segmentos rígidos e macios, e da
susceptibilidade dos mesmos em serem oxidados.
A complexidade do ambiente in vivo possibilita que outros mecanismos de
degradação sejam ativados, além dos hidrolíticos, enzimáticos e oxidativos. Múltiplos
parâmetros bioquímicos e celulares podem estar diretamente envolvidos na
biodegradação, e quando existem danos provocados pela degradação do biomaterial
ou ausência de biocompatibilidade, a resposta inflamatória aguda é iniciada
imediatamente, caracterizada pela vasodilatação local transitória e aumento da
permeabilidade capilar. Em seguida, há uma fase retardada e subaguda, caracterizada
por infiltração de leucócitos e células fagocitárias. Por último, há uma fase
proliferativa crônica, na qual ocorrem degeneração tissular e fibrose (MARQUES,
2004).
Revisão bibliográfica
______________________________________________________________________
59
A avaliação da biocompatibilidade dos biomateriais é realizada por meio de estudos
de toxicidade in vitro e in vivo. Os estudos de citotoxicidade in vitro são feitos por
meio da análise qualitativa de células colocadas em contato com o biomaterial. Esta
análise envolve o exame morfológico das células e os distúrbios homeostáticos
celulares, caracterizados por mudanças bioquímicas. Os estudos de citotoxicidade in
vivo envolvem a implantação do biomaterial no local ao qual se destina. Uma fase
inflamatória aguda sempre acontece após a implantação de qualquer material. Se a
ação deletéria do material permanece, a resposta crônica se instala, conduzindo a
falhas no implante. A avaliação do tipo e extensão da resposta inflamatória é baseada
em análises histológicas dos tecidos ao redor do implante. A presença e a quantidade
de certos tipos de células, tais como, neutrófilos, monócitos, macrófagos, eosinófilos,
linfócitos, fibroblastos e células gigantes, na interface do tecido-implante, são
indicativas da resposta gerada pelo implante. Estas células, quando ativadas,
produzem enzimas hidrolíticas, responsáveis pela lesão tissular (MARQUES, 2004).
Diversos poliuretanos biodegradáveis e biocompatíveis têm sido investigados em
diferentes aplicações biomédicas, principalmente na engenharia de tecidos
(ADHIKARI et al., 2008; GOGOLEWSKI e GORNA, 2007; CHIA et al., 2006;
YEGANEH et al., 2005; GUAN et al., 2005; POUSSARD et al., 2004; GRAD et al.
2003). A extensiva utilização dos poliuretanos nesta área está relacionada com as
características extremamente atrativas destes biomateriais, listadas a seguir: (1)
porosidade elevada, que permite o estabelecimento e proliferação de células, e
também a fácil nutrição destas células pelos vasos sanguíneos; (2) propriedades
mecânicas controláveis, pois estas são dependentes da estrutura química, porosidade,
método de fabricação, cristalinidade, etc; (3) taxas de degradação controláveis, o que
é fundamental pois à medida que a matriz polimérica se degrada, acontece o
preenchimento simultâneo do espaço resultante pelo tecido em crescimento; (4)
formação de produtos de degradação que podem ser absorvidos ou excretados pelo
organismo, e que consequentemente não geram efeitos tóxicos para o organismo; (5)
excelente biocompatibilidade com os tecidos e hemocompatibilidade (no caso de
poliuretanos que estarão em contato direto com o sangue). As tentativas para
aumentar a hemocompatibilidade dos poliuretanos se baseiam na inserção de grupos
Revisão bibliográfica
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funcionais carregados negativamente nos segmentos rígidos, que por sua vez, irão
repelir as proteínas sanguíneas.
Outras aplicações biomédicas podem ser propostas para os poliuretanos
biodegradáveis e biocompatíveis, como por exemplo, a possibilidade de torná-los
sistemas de liberação controlada de fármacos, a partir da incorporação prévia destes
fármacos. Estes sistemas poderiam ser implantados em órgãos ou tecidos específicos,
para o tratamento de doenças crônicas diretamente no sítio de ação. Na oftalmologia,
os sistemas de liberação de princípios ativos poderiam ser implantados no olho, e
permitiriam o tratamento de doenças oculares graves que acometem o segmento
posterior do olho, já que estes dispositivos distribuiriam o princípio ativo no próprio
local de ação, em níveis terapêuticos eficazes, por um período de tempo prolongado e
com risco mínimo de efeitos colaterais local e sistêmico.
Neste trabalho, poliuretanos biodegradáveis e biocompatíveis, derivados de PCL e
PEG, foram produzidos baseados em dispersões aquosas destes polímeros. Acetato
de dexametasona, um fármaco antiinflamatório esteroidal amplamente utilizado na
oftalmologia, foi incorporado às dispersões aquosas dos poliuretanos. A partir desta
incorporação, implantes constituídos de poliuretanos biodegradáveis e acetato de
dexametasona foram desenvolvidos e explorados como dispositivos intra-oculares de
liberação controlada do fármaco, destinados ao tratamento de doenças inflamatórias
graves que acometem o segmento posterior do olho.
61
3 OBJETIVOS
Objetivos
__________________________________________________________________________________
62
Objetivo geral
- Desenvolver implantes intra-oculares constituídos de poliuretanos biodegradáveis e acetato
de dexametasona, destinados à liberação controlada deste fármaco no segmento posterior do
olho para o tratamento de doenças oculares inflamatórias graves.
Objetivos específicos
- Desenvolver e caracterizar os implantes à base de poliuretanos e acetato de dexametasona.
- Avaliar o perfil de degradação in vitro dos poliuretanos.
- Avaliar o perfil de liberação in vitro do acetato de dexametasona a partir dos implantes.
- Avaliar a biocompatibilidade in vitro e in vivo dos poliuretanos.
63
4 MATERIAIS
Materiais
__________________________________________________________________________________
64
Acetato de dexametasona 99,99% - Sigma-Aldrich
Ácido clorídrico 1 mol/L - Merck
Ácido dimetilol propiônico 98,3% – Fluka
Anticorpo primário anti-ocludina (rabbit anti-occludin) – Zymed Laboratories
Anticorpo secundário Alexa Flúor 488 (goat anti-rabbit Alexa 488) – Molecular Probes
Azul de bromofenol
Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltertrazólio – Sigma Chemical
Células epiteliais pigmentares da retina (ARPE-19) – linhagem de células ARPE-19
cedidas pelo Prof. Dr. Hjelmeland (Universidade da Califórnia, EUA)
Dibutil dilaurato de estanho M
n
= 631,55 g/mol – Miracema Nuodex
Di-n-butilamina
Etanol absoluto – Merck
Faloidina FITC – Sigma-Aldrich
Gel Mount - Biomeda
Glutaraldeído - Sigma-Aldrich
Hexametildisilazina - Sigma-Aldrich
Hidrazina 64% - Arch Química Brasil Ltda.
Iodeto de propídeo - Sigma-Aldrich
Isoforona diisocianato – Desmodur I Bayer
Isopropanol – Merck
LabTek de 4 poços - Nunc
TM
(Nalge Nunc International)
Meio de cultura Dubelcco’s modified Eagle meio/Ham’s F-12 – Invitrogen-Gibco
Meio de inclusão historesina – Leica Historesin Embedding Kit (7022 31731)
Meio de infiltração historesina – Leica Historesin Embedding Kit (7022 31731)
Metanol - Merck
Ouro - Balzer MD 010
p-formaldeído - Merck Eurolab
Poli(ε-caprolactona) diol MM = 1000 g/mol – Tone
TM
Polyol 2221 Dow
Poli(ε-caprolactona) diol MM = 2000 g/mol – Tone
TM
Polyol 0249 Dow
Poli(etileno glicol) MM = 1500 g/mol – Sigma-Aldrich
Soro fetal bovino – Invitrogen-Gibco
Tetróxido de ósmio - Merck
Trietilamina 98% - Vetec
Tripsina-EDTA – Gibco 25300
Métodos
________________________________________________________________________
65
Triton X-100 - Sigma-Aldrich
Tolueno - Merck
66
5 MÉTODOS
Métodos
________________________________________________________________________
67
5.1 Desenvolvimento e caracterização dos implantes à base de poliuretanos
biodegradáveis e acetato de dexametasona
5.1.1 Síntese das dispersões aquosas de poliuretanos (PUD5 e PUD6)
Prepararam-se as dispersões aquosas de poliuretanos (Tabela 1) pelo método
convencional do pré-polímero e todo o procedimento de síntese foi realizado em
ambiente de N
2
. Transferiram-se quantidades exatas de poli(ε-caprolactona) (PCL 1000,
PCL 2000), poli(etileno glicol) (PEG 1500) e ácido dimetilol propiônico (DMPA) para o
reator. Agitou-se por cerca de 30 minutos, a temperatura de 60 °C, para que os polióis e o
DMPA se dissolvessem completamente. Adicionou-se ao reator quantidade exata de
isoforona diisocianato (IPDI) para uma razão NCO/OH = 2,3. Aqueceu-se a mistura
reacional a 70-75 ºC, por 2 horas. Em seguida, adicionou-se o catalisador dibutil dilaurato
de estanho (DBDLT) e manteve-se a temperatura a 70-75 ºC por 1 hora. Resfriou-se a
mistura reacional a 50-60 ºC e retiraram-se 10 g do pré-polímero para determinação da
porcentagem teórica de grupos NCO residual. A determinação titulométrica dos grupos
NCO residuais deve ser próxima à porcentagem teórica, calculada por meio da equação 1
(AYRES, 2006).
pp
OHNCO
T
m
nn
NCO
42100)(
%
´
-
=
(1)
em que:
%NCO
T
= porcentagem teórica calculada de grupos NCO residuais
n
NCO
= número de equivalente-grama do isocianato
n
OH
= somatório do número de equivalente-grama de todos os reagentes hidroxilados
m
pp
= massa total do pré-polímero
Para realizar a titulação, colocaram-se 50 mL de solução de di-n-butilamina e 10 g do
pré-polímero em erlenmeyer de 500 mL. Aqueceu-se até iniciar a ebulição. Após o
resfriamento, adicionaram-se 100 mL de metanol e 2 gotas de azul de bromofenol.
Titulou-se com ácido clorídrico 1 mol/L até a mudança da cor para amarelo claro.
Realizou-se ensaio em branco. Evidenciou-se o ponto de viragem pela mudança de cor de
Métodos
________________________________________________________________________
68
azul para levemente amarelado. Calculou-se a porcentagem de NCO residual por meio da
equação 2 indicada abaixo (AYRES, 2006).
amostra
amostrabranco
p
fVV
NCO
202,4)(
%
´
´
-
=
(2)
em que:
V
amostra
= volume em mL de HCl 1 mol/L consumido na titulação
V
branco
= volume em mL de HCl 1 mol/L consumido na titulação de di-n-butilamina
f = fator de correção da concentração de HCl 1 mol/L
p
amostra
= peso da amostra
Para preparar a solução de di-n-butilamina pesaram-se 206,8 g de di-n-butilamina,
adicionou-se quantidade suficiente de tolueno que garantiu a dissolução completa de di-
n-butilamina e completou-se o volume para 2 litros com o mesmo solvente (AYRES,
2006).
Adicionou-se trietilamina (TEA) ao pré-polímero com grupos NCO terminais, a fim de
neutralizar 100% dos grupos carboxílicos do DMPA. Calculou-se a quantidade de TEA
utilizando a equação 3. Manteve-se a temperatura a 40
o
C, por 40 minutos, sob agitação
vigorosa (AYRES, 2006).
m = n
´
101 (3)
em que:
m = massa de trietilamina
n = número de equivalentes-grama de grupamentos carboxílicos obtidos dividindo-se a
massa de DMPA usada no pré-polímero por 134 que é o equivalente grama do DMPA em
relação ao grupamento carboxílico
101 = equivalente-grama da trietilamina
Em seguida, dispersou-se o pré-polímero neutralizado em água e imediatamente após
adicionou-se a hidrazina (HZ), como extensor de cadeia, para finalização da síntese.
Manteve-se a temperatura da dispersão aquosa a 40
o
C, por 1 hora. Calculou-se a
quantidade de HZ substituindo os termos da equação 4, que leva em consideração a
Métodos
________________________________________________________________________
69
porcentagem de grupos NCO residuais, encontrada por meio da titulação (AYRES,
2006).
42
64,0
16
100
÷
ø
ö
ç
è
æ
´
÷
÷
ø
ö
ç
ç
è
æ
´
=
p
pp
NCO
m
m
(4)
em que:
m = massa de hidrazina (equivalente = 16 g/mol e concentração de 64%)
m
pp
= massa de pré-polímero
NCO
P
= %NCO obtido na titulação
42 é o equivalente-grama do grupamento NCO
Como descrito na Tabela 1, produziram-se dois tipos de dispersões aquosas de
poliuretanos: (1) PUD5 contendo apenas poli(ε-caprolactona) no segmento macio e (2)
PUD6 contendo poli(ε-caprolactona) e poli(etileno glicol) no segmento macio. Na Figura
10 é mostrada uma representação esquemática da síntese de PUD5 e PUD6 (AYRES,
2006).
Tabela 1 – Formulação (% em massa) das dispersões aquosas de poliuretano
a
IPDI PCL
1000
PCL
2000
PEG
1500
DMPA TEA H
2
O HZ NCO
T
%
NCO
P
%
PUD-5
8,58 4,85 9,09 - 0,97 0,73 74,70 1,08 7,80 7,58
PUD-6
8,58 4,85 8,36 0,73 0,97 0,73 74,70 1,08 7,88 7,50
a
0,01 % de DBDLT baseado nas quantidades de IPDI, PEG e DMPA
% NCO
T
– porcentagem de grupos NCO terminais calculada pela equação (1).
% NCO
P
– porcentagem de grupos NCO terminais calculada pela equação (2) após
titulação da amostra.
5.1.2 Incorporação do acetato de dexametasona (ACT)
Dissolveram-se 300 mg de ACT nas dispersões aquosas de poliuretanos, por meio de
agitação vigorosa por 60 minutos, visando obter concentração de 5% (p/p) de fármaco.
Métodos
________________________________________________________________________
70
Figura 10 – Representação esquemática da síntese das dispersões aquosas de poliuretanos
(PUD5 e PUD6).
5.1.3 Formação dos implantes de poliuretanos e acetato de dexametasona
As dispersões aquosas de poliuretanos que continham ACT dissolvido foram transferidas
para moldes de Teflon® e deixadas a temperatura ambiente por 7 dias. Em seguida, os
filmes formados foram colocados em estufa e mantidos a 60
o
C, por 24 horas, para a pós-
cura. Prepararam-se também filmes sem ACT. Os filmes foram cortados no formato de
círculos de 4,5 mm de diâmetro (Figura 11).
(A)
(B)
Figura 11 – Implantes constituídos dos poliuretanos [(A) PUD5 e (B) PUD6] e de acetato
de dexametasona.
Métodos
________________________________________________________________________
71
5.1.4 Caracterização dos implantes de poliuretanos e acetato de dexametasona
5.1.4.1 Espectroscopia na região do infravermelho (FTIR)
A espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) foi
realizada em espectrofotômetro Perkin Elmer, modelo Spectrum 1000. Obtiveram-se os
espectros dos filmes usando-se a técnica de Reflexão Total Atenuada (ATR), na faixa de
4000 a 650 cm
-1
, a partir de 32 varreduras com resolução de 4 cm
-1
.
5.1.4.2 Difração de raios-X (XRD)
A difração de raios-X foi realizada em difratômetro de raios-X Philips modelo PW 3710
com alvo de cobre (l = 1,54 Ǻ) e equipado com filtro de níquel. Foram feitas varreduras
a partir de 2θ na faixa de 1 a 90° a uma taxa de 1°/min.
5.1.4.3 Espalhamento de raios-X em baixo ângulo (SAXS)
Os espectros de espalhamento de raios-X em baixo ângulo foram coletados usando a
linha SAS do Laboratório Nacional de Luz Síncrontron (LNLS, Brasil). As condições de
análise foram: l = 1,608 Ǻ e tempo de coleta de 900 s. Os espectros foram corrigidos
quanto ao background (espectro parasita) e não homogeneidade do detector.
5.2 Estudo de degradação in vitro dos poliuretanos
5.2.1 Degradação in vitro dos poliuretanos
A degradação in vitro dos filmes de poliuretanos foi realizada em incubadora, a 30 rpm e
37
o
C. Colocaram-se os filmes (n = 3 para cada poliuretano) em frascos de vidro
contendo 3 mL de PBS. Em intervalos de tempo pré-estabelecidos, os filmes foram
removidos do PBS, lavados com água deionizada e secadas por 48 horas em dessecador à
vácuo a temperatura ambiente. A perda de massa foi calculada por meio da equação 5
(GUAN et al., 2005). Os resultados obtidos foram expressos como sendo a média ±
desvio padrão.
Métodos
________________________________________________________________________
72
Perda de massa (%) = 100 ´ m
i
/ m
f
(5)
em que:
m
i
= massa inicial do poliuretano
m
f
= massa final do poliuretano no intervalo de tempo pré-estabelecido
5.2.2 Caracterização dos poliuretanos degradados
Os filmes de poliuretanos degradados foram caracterizados por meio das técnicas de
FTIR, XRD e SAXS conforme descrito anteriormente.
5.2.3 Teste de citotoxicidade dos produtos de degradação
Avaliou-se a viabilidade de células humanas do epitélio pigmentoso da retina (ARPE-19)
em contato com os produtos de degradação dos poliuretanos por meio da dosagem
colorimétrica baseado na conversão mitocondrial do sal de tetrazólio (MTT). As células
foram semeadas na densidade de 2 ´ 10
4
em placas de poliestireno de 96 poços. Após 24
horas, incubaram-se as células em uma mistura de solução contendo os produtos de
degradação do poliuretano, coletada após 4 meses de degradação, e meio de cultura
DMEM contendo 10% de SFB, nas proporções de 1:10 e 3:10 (GUAN et al., 2005). Após
48 horas, removeu-se o meio de incubação e adicionaram-se 100 µL de sal de tetrazólio
(1 mg/mL em PBS) em cada poço. Após 2 horas de incubação a 37
o
C, as células foram
lisadas com 100 µL de isopropanol, e os valores de absorvância foram medidos a 570 nm
versus 630 nm usando o leitor BioRad (San Diego, CA) (VALAMANESH et al., 2007).
Os resultados obtidos foram expressos como sendo a média ± desvio padrão. Os dados
foram avaliados quanto à normalidade e a significância estatística foi investigada por
meio da análise de variância de uma classificação (ANOVA). Valor p menor que 0,05 foi
considerado significante.
5.3 Estudo de liberação in vitro do acetato de dexametasona a partir dos implantes
A liberação in vitro do acetato de dexametasona a partir dos implantes foi realizada em
incubadora, a 30 rpm e 37
o
C. Colocaram-se os implantes (n = 4 para cada implante) em
frascos de vidro contendo 3 mL de PBS. Em intervalos de tempo pré-estabelecidos, 1 mL
Métodos
________________________________________________________________________
73
do meio de incubação foi coletado e 1 mL de PBS recém preparado foi adicionado a cada
frasco. Quantificou-se o acetato de dexametasona liberado no meio por cromatografia
líquida de alta eficiência (GARCIA et al., 2003). O método analítico foi previamente
validado considerando os seguintes parâmetros: linearidade, precisão, exatidão e limites
de quantificação e detecção. A porcentagem de fármaco liberado a cada tempo foi
expressa como sendo a média ± desvio padrão. Os dados obtidos para PUD5 e PUD6
foram avaliados quanto à normalidade e a significância estatística foi investigada por
meio do teste t de Student. Valor p maior que 0,05 foi considerado significante.
Observou-se que o tempo de retenção do acetato de dexametasona liberado a partir dos
implantes era particamente idêntico ao tempo de retenção do fármaco padrão.
Considerando este fato, sugeriu-se que o acetato de dexametasona liberado dos implantes
se apresentava íntegro e ativo no meio de incubação.
5.4 Estudo de biocompatibilidade in vitro dos poliuretanos
5.4.1 Cultura de células ARPE-19 sobre os poliuretanos
Os filmes de poliuretanos foram esterilizados por meio da exposição à luz ultravioleta (λ
= 254 nm) por 60 minutos cada lado. Os filmes esterilizados foram caracterizados por
meio da técnica FTIR. Os espectros FTIR obtidos revelaram que as absorções típicas dos
poliuretanos foram preservadas após a exposição à luz ultravioleta. Os filmes
esterilizados foram transferidos para o LabTek de 4 poços. Incubaram-se as células sobre
os poliuretanos e controle de poliestireno na densidade de 2 x 10
4
células/poço. Utilizou-
se o meio de cultura DMEM associado a 10% de SFB. Mantiveram-se as placas em
estufa a 37
o
C contendo 5% de CO
2
.
5.4.2 Adesão celular sobre os poliuretanos
Após 8 horas de incubação, aspirou-se o meio de cultura e lavaram-se as células sobre os
filmes de poliuretanos e do controle com PBS (n = 3 para cada poliuretano e controle).
Fixaram-se as células com uma solução de para-formaldeído 4% em PBS por 15 minutos.
As células fixadas foram lavadas novamente com PBS por 5 minutos, e imersas em
solução Triton X-100 0,3% em PBS por 15 minutos. Após lavagem com PBS por 5
Métodos
________________________________________________________________________
74
minutos, os núcleos das células foram marcadas com solução de iodeto de propídeo em
PBS (1:100) por 10 minutos, a temperatura ambiente. Finalmente, lavaram-se as células
com PBS, por 5 vezes consecutivas, em intervalos de 5 minutos, e 1 vez com água
destilada. Montaram-se as lâminas utilizando Gel Mount. As células foram visualizadas
por meio do microscópio Olympus IX70 acoplado à câmara digital. Cinco campos foram
fotografados por poliuretano e controle (total de 15 campos por superfície). Contaram-se
os núcleos de cada campo de visão. O número médio de núcleos na superfície do controle
foi estabelecido como sendo 100% e o número médio de núcleos ± desvio padrão em
cada superfície polimérica foi calculado como sendo a porcentagem em relação ao
controle. Os dados obtidos para controle e poliuretanos foram avaliados quanto à
normalidade e a significância estatística foi investigada por meio da análise de variância
de uma classificação (ANOVA). Valor p menor que 0,05 foi considerado significante. Os
dados obtidos para os poliuretanos PUD5 e PUD6 foram comparados estatisticamente por
meio do teste t de Student. Valor p maior que 0,05 foi considerado significante.
5.4.3 Proliferação celular sobre os poliuretanos
Após 1, 2, 7 e 15 dias em cultura, as células sobre os filmes de poliuretanos e controle
foram submetidas ao mesmo procedimento descrito no item Adesão celular sobre os
poliuretanos. Os resultados obtidos foram expressos como sendo a média do número de
núcleos ± desvio padrão em cada superfície polimérica e controle. Os dados obtidos para
controle e poliuretanos foram avaliados quanto à normalidade e a significância estatística
foi investigada por meio da análise de variância de uma classificação (ANOVA). Valor p
menor que 0,05 foi considerado significante. Os dados obtidos para os poliuretanos
PUD5 e PUD6 foram comparados estatisticamente por meio do teste t de Student. Valor
p maior que 0,05 foi considerado significante.
5.4.4. Microscopia eletrônica de varredura
Após 1 dia em cultura, as células sobre os filmes de poliuretanos foram fixadas em
solução de glutaraldeído 4% em PBS por 60 minutos a temperatura ambiente. Lavaram-
se as células com PBS, por 3 vezes consecutivas, em intervalos de 10 minutos, a
temperatura ambiente. Procedeu-se pós-fixação com a solução de tetróxido de ósmio 2%
em PBS (1:1) por 30 minutos a temperatura ambiente. As células foram desidratadas
Métodos
________________________________________________________________________
75
numa série etanólica progressiva (50, 70, 95 e 100%), a 4
o
C, em intervalos de 5 minutos
e 2 vezes consecutivas para cada concentração de etanol. Em seguida, os filmes de
poliuretanos, contendo as células, foram transferidos para dessecador e foram embebidos
em hexametildisilazano, para induzir a secagem das células. Em seguida, os filmes foram
colados num suporte de alumínio e as células foram metalizadas com ouro por meio de
pulverização catódica. As células foram examinadas por meio do microscópio eletrônico
JEOL 840A a 10 kV. Este procedimento foi realizado conforme instruções do Serviço de
Microscopia Eletrônica da Universidade Pierre e Marie CURIE – Paris VI.
5.4.5 Imunofluorescência
Após 7 em cultura, as células sobre os filmes de poliuretanos e controle foram
submetidas ao mesmo procedimento descrito no item Adesão celular sobre os
poliuretanos. Após a marcação dos núcleos com iodeto de propídeo, as fibras de actina
foram marcadas com uma solução de Faloidina FTIC em PBS (1:250) por 30 minutos a
temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas, inseridas em Gel Mount e
fotografadas utilizando o microscópio Olympus IX70 acoplado à câmara digital.
Após 15 dias em cultura, as células sobre os filmes de poliuretanos e controle foram
fixadas em solução de para-formaldeído 4% em PBS por 30 minutos a temperatura
ambiente. As células fixadas foram incubadas em solução Triton X-100 0,1% em PBS
por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se a solução do anticorpo primário anti-ocludina
(rabbit anti-occludin) em PBS contendo 0,1% de Triton X-100 (1:100) por 60 minutos.
Lavaram-se as células com PBS, 2 vezes consecutivas, por 10 minutos, e adicionou-se a
solução do anticorpo secundário Alexa Flúor 488 (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit) por
60 minutos, ao abrigo da luz. Finalmente, as células foram lavadas com água destilada,
inseridas em Gel Mount e fotografadas utilizando o microscópio Olympus IX70 acoplado
à câmara digital.
5.5 Estudo de biocompatibilidade in vivo dos poliuretanos
5.5.1 Animais
Métodos
________________________________________________________________________
76
Utilizaram-se 16 ratos da raça Lewis fêmeas, com idade média de 2 meses e pesando
entre 100 e 120 g. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais com ração e água
ad libitum, em ambiente com temperatura e umidade controladas. Os experimentos foram
realizados de acordo com as normas da Association for Research in Vision and
Ophthalmology (ARVO) para uso de animais em pesquisa em oftalmologia. Este estudo
também foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Federal de Minas Gerais.
5.5.2 Implantação dos poliuretanos no espaço subretiniano e corpo vítreo
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, utilizou-se um microscópio de operação
(OM-5, TAKAGI, Nagano, Japão). Os ratos foram anestesiados com injeção
intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (80 mg/kg) e cloridrato de
xilasina (20 mg/kg) e os olhos receberam anestesia local de oxibuprocaína 0,4%. A
pupila foi dilatada usando tropicamida (Mydrin P 1%). Para introdução do poliuretano no
espaço subretiniano, realizou-se incisão na conjuntiva no quadrante temporal superior.
Realizou-se incisão na esclera à 2 mm do limbo, e em seguida, uma incisão na coróide.
Uma tesoura microcirúrgica foi utilizada para revelar o espaço subretiniano. O
poliuretano foi introduzido no espaço subretiniano em direção ao pólo posterior. A
esclera e conjuntiva foram suturadas com fio absorvível. Para introdução do poliuretano
no vítreo, realizou-se incisão na conjuntiva no quadrante temporal superior. Realizou-se
incisão na esclera à 2 mm do limbo. Introduziu-se o poliuretano no vítreo. A esclera e
conjuntiva foram suturadas com fio absorvível. Imediatamente após a cirurgia, o fundo
do olho foi examinado para verificar se houveram danos na retina ou sinais de
hemorragia. Os animais que apresentaram estes problemas foram removidos do estudo e
não foram incluídos nos resultados.
5.5.3 Avaliação histopatológica
Os ratos foram sacrificados com dose letal de pentobarbital (100 mg/kg) 2 semanas após
a implantação, e os olhos foram imediatamente enucleados e fixados com solução de
para-formaldeído 4% e glutaraldeído 0,5% em PBS por 2 horas. Os bulbos oculares
fixados foram lavados com PBS por 2 horas, e desidratados com etanol 70% e 95% por 2
horas cada concentração. Em seguida, realizou-se uma incisão próxima à junção córnea-
Métodos
________________________________________________________________________
77
esclera, incubaram-se os bulbos em uma mistura de etanol 95% e meio de infiltração
historesina (1:1) por 2 horas. Finalmente, incubaram-se os bulbos em meio de infiltração
historesina por 12 horas à temperatura de 4
o
C. Ao término do tempo previsto, os bulbos
foram inseridos no meio de inclusão historesina, que por sua vez, estava presente num
molde plástico. Aguardou-se a polimerização do meio de inclusão historesina, e então,
colocou-se a tampa sobre o molde plástico. Esta tampa apresentava um orifício central
que possibilitou a introdução de pequena quantidade de meio de inclusão historesina.
Aguardou-se novamente a polimeração do meio de inclusão recém acrescentado.
Transferiu-se o molde plástico com tampa para banho de gelo, por 30 minutos, e em
seguida, transferiu-se para estufa a 37
o
C por 24 horas. As seções semifinas de 5 µm de
espessura foram coradas com azul de toluidina para análise por microscopia de luz
(microscópio Olympus IX70 acoplado à câmara digital).
Preparou-se o meio de infiltração historesina conforme instrução do fabricante (Leica):
acrescentou-se 0,5 g de peróxido de dibenzoíla (Activator) em 50 mL de 2-(hidroxietil)-
metacrilato (Basic Resin), sob agitação. O meio de infiltração historesina foi conservado
a 4
o
C e ao abrigo da luz.
Os procedimentos acima descritos para realização do Estudo de bicompatibilidade in
vitro dos poliuretanos (exceto a Microscopia Eletrônica de Varredura) e do Estudo de
biocompatibilidade in vivo dos poliuretanos foram fornecidos pelo Laboratório de
Histopatologia de Doenças Oculares e Inovações Terapêuticas pertencente ao Instituto
Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (INSERM) e localizado no Instituto de Cordelier –
Paris.
78
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
79
6.1 Desenvolvimento e caracterização dos implantes à base de poliuretanos
biodegradáveis e acetato de dexametasona
Na Figura 12 estão representados os espectros FTIR para PUD5 puro (Figura 12-a),
ACT puro (Figura 12-b), PUD5 contendo ACT (Figura 12-c) e o resultado da subtração
espectral entre PUD5 contendo ACT e PUD5 puro (Figura 12-d). Absorções típicas de
poliuretanos foram detectadas no espectro das Figuras 12-a e 12-c, tais como (JEAN et
al., 2007): 3297 cm
-1
- estiramento de aminas primárias que participam de ligações de
hidrogênio; 2921-2851 cm
-1
- estiramento dos grupos –CH
2
assimétrico e simétrico;
~1450 cm
-1
- deformação do grupo –CH
3
; 1730 cm
-1
– estiramento dos grupos carbonila
presentes no uretano, uréia e éster. Não foram detectadas bandas em aproximadamente
3500 cm
-1
que corresponderiam às aminas livres, significando que todas as aminas
formaram ligações de hidrogênio com grupos polares, tais como as carbonilas dos
grupos uretano, uréia e éster. O espectro equivalente à subtração espectral entre PUD5
contendo ACT e PUD5 puro (Figura 12-d) evidenciou as bandas de absorção referentes
ao ACT, que também foram observadas no espectro correspondente ao ACT puro
(Figura 12-b). Absorções típicas do ACT foram detectadas, tais como: 1650-1730 cm
-1
–
estiramento dos grupos carbonila presentes no éster e cetona; ~882 cm
-1
- deformação do
grupo C-F.
Figura 12 – Espectros FTIR do PUD5 puro (12-a), ACT puro (12-b), PUD5 contendo
ACT (12-c) e subtração espectral entre PUD5 contendo ACT e PUD5 puro (12-d).
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
80
Na Figura 13 estão representados os espectros FTIR para PUD6 puro (Figura 13-a),
ACT puro (Figura 13-b), PUD6 contendo ACT (Figura 13-c). Absorções típicas de
poliuretanos foram detectadas no espectro das Figuras 13-a e 13-c, tais como: 3329 cm
-1
-
estiramento de aminas primárias que participam de ligações de hidrogênio; 2800-3000
cm
-1
- estiramento dos grupos –CH
2
assimétrico e simétrico; ~1460 cm
-1
- deformação
do grupo –CH
3
; 1730 cm
-1
– estiramento dos grupos carbonila presentes no uretano,
uréia, éster e éter. Uma banda pouco intensa foi detectada em aproximadamente 3500
cm
-1
que corresponde às aminas livres, ou seja, que não participaram de ligações de
hidrogênio com grupos polares. Observou-se também uma banda intensa em 1101 cm
-1
,
característica de deformação axial assimétrica da ligação C-O-C de éteres alifáticos, que
ocorre entre 1150 e 1085 cm
-1
(SILVERSTEIN, 2000). Absorções típicas do ACT foram
detectadas no espectro da Figura 13-c, semelhantes aquelas presentes no espectro da
Figura 13-b, a saber: 1650-1730 cm
-1
– estiramento dos grupos carbonila presentes no
éster e cetona e ~893 cm
-1
- deformação do grupo C-F.
Figura 13 - Espectros FTIR do PUD6 puro (13-a), ACT puro (13-b), PUD6 contendo
ACT (13-c).
Os resultados obtidos a partir da análise dos espectros FTIR indicaram que as absorções
típicas dos grupos funcionais do ACT foram preservadas após incorporação aos sistemas
poliméricos, sugerindo que a integridade química do fármaco foi mantida. Além disso,
estes resultados também demonstraram o sucesso do método de incorporação do ACT
nos sistemas poliméricos.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
81
Na Figura 14 está representado o padrão de difração de raios-X (XRD) para PUD6 puro
(Figura 14-a). Bandas de difração amplas foram observadas em 2θ = 20
o
e 2θ = 40
o
,
demonstrando a natureza amorfa deste polímero segmentado. A detecção da natureza
amorfa do PUD6 deveu-se à presença da poli(ε-caprolactona) de baixa massa molecular
(MM = 1,000 e 2,000 g/mol), incapaz de cristalizar como poli(ε-caprolactonas) de alta
massa molecular. Na Figura 14, os padrões XRD de PUD6 contendo ACT (Figura 14-b)
e ACT puro (Figura 14-c) também estão representados. Os picos de difração do ACT
não puderam ser visualizados no padrão XRD do PUD6 ACT (Figure 14-b), sugerindo a
inexistência de aglomerados cristalinos do fármaco dentro da estrutura polimérica, e
indicando também que o ACT se encontrava disperso e dissolvido na matriz. O mesmo
tipo de resultado foi obtido para PUD5 puro e PUD5 contendo ACT.
Figura 14 – Padrões XRD para PUD6 puro (14-a), PUD6 contendo ACT (14-b) e ACT
puro (14-c).
O espalhamento de raios-X em baixo ângulo (SAXS) é uma técnica de caracterização
amplamente utilizada para avaliar a morfologia de nanocompósitos poliméricos,
copolímeros em bloco e polímeros segmentados (ORÉFICE et al., 2005; CHU et al.,
2001). SAXS aplicado a poliuretanos, por exemplo, fornece uma série de informações
relacionadas à síntese dos polímeros e as mudanças na morfologia das fases em função
da composição química dos sistemas (AYRES, 2006).
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
82
Uma segunda fase de dimensões coloidais em uma matriz de densidade eletrônica
constante apresenta espalhamento de raios-X em baixo ângulo se existir diferenças de
densidades eletrônicas entre as fases. Para sistemas bifásicos, como sistemas poliméricos
constituídos de microfases separadas, a invariante Q descreve a variação de densidade
eletrônica em todo o polímero e fornece uma boa estimativa do grau de separação das
fases (LI et al., 2002). A invariante Q pode ser obtida pela integração q
2
I(q) dos ângulos
de espalhamento. A invariante Q pode ser definida pela equação (6).
(6)
em que:
I(q) = intensidade do feixe de espalhamento
q = (4p/l)sin(θ/2), sendo θ o ângulo de espalhamento, l o comprimento de onda do
feixe de raios-X.
Δη = média do contraste de densidade eletrônica
Φ = volume da fração de fase dispersa
V = volume de irradiação
Neste trabalho, SAXS foi utilizado para fornecer informações a respeito do efeito da
arquitetura macromolecular dos poliuretanos na morfologia dos polímeros e no
fenômeno de separação de microfases. SAXS foi também utilizado para estudar como a
incorporação de ACT nos sistemas poliméricos afetou a morfologia. Além disso, SAXS
foi aplicada para analisar a estrutura de nanodomínios criada pela separação de
microfases derivada da baixa compatibilidade entre os segmentos macio e rígido das
cadeias dos poliuretanos e como estes domínios foram modificados pela incorporação do
fármaco.
Os dados de espalhamento de raios-X de baixo ângulo em função do vetor de
espalhamento (q) para os sistemas PUD5 e PUD6 são apresentados na Figura 15. As
curvas de espalhamento para o PUD5 puro (Figura 15-a) apresentou um pico de
espalhamento pouco intenso e amplo em valores de q próximos a 0,72 nm
-1
. O valor de q
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
83
na altura máxima do pico (q
max
) pode ser convertido na distância entre fases (L) por
meio da equação de Bragg (L = 2p/ q
max
, L ~ 8,7 nm para PUD5). Este pico de
espalhamento está relacionado com a separação de fase típica de poliuretanos, na qual os
domínios rígidos, baseados em ligações uretano, não foram compatíveis com os
domínios macios, baseados em unidades polióis. O formato da curva de espalhamento
para PUD5 foi alterada após a incorporação do ACT (Figura 15-b). O pico de
espalhamento, gerado devido ao processo de separação de fases nos poliuretanos, se
tornou menos perceptível para PUD5 contendo ACT. Além disso, as intensidades de
espalhamento em valores baixos de q aumentaram quando o ACT foi incorporado ao
PUD5. Estes fatos podem ser associados com a presença de novas regiões de
espalhamento e estruturas menos definidas com diferentes tamanhos, uma vez que o
ACT provavelmente interagiu com os segmentos macios e rígidos do PUD5, alterando o
curso do processo de separação de microfases, levando à estabilização da nova
nanoestrutura do sistema. A fim de revelar com mais detalhes os picos de espalhamento
escondidos pelo background, um procedimento matemático foi usado para filtrar os
dados de espalhamento relacionados com a difração de Bragg dentro de um background
devido ao espalhamento do tipo Guinier (KOO et al., 2002). Este procedimento
matemático envolve ajustar, à curva experimental, uma combinação de fatores ligados a
um decaimento exponencial (espalhamento de Guinier) e uma função Gausiana (capaz
de identificar os picos de difração de Bragg). Na Figura 16 está demonstrada a utilidade
deste procedimento matemático em aumentar a resolução dos picos de espalhamento
para os sistemas PUD5 e PUD6. Observou-se que o pico de espalhamento principal do
PUD5 se deslocou para valores menores de q após a incorporação do ACT. Este
deslocamento para q menor pode significar que as moléculas do ACT podem ter
interagido com os segmentos do poliuretano, levando à densificação dos domínios
rígidos hidrofílicos, e conseqüentemente, ao estiramento das cadeias dos domínios
macios (VELANKAR et al., 2000).
Na Figura 15 também estão representadas as curvas de espalhamento para PUD6 (Figura
15-c) e PUD6 contendo ACT (Figura 15-d). Observou-se que a introdução de ACT não
alterou significativamente o perfil de espalhamento do sistema PUD6, sugerindo que a
morfologia deste poliuretano não apresentou modificações detectáveis após a introdução
do fármaco. Estes dados de espalhamento associados com PUD6 e PUD6 ACT também
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
84
foram convertidos matematicamente a fim de permitir a identificação de picos de
espalhamento fracos, tais como o pico em 0,28 nm
-1
(L = 22 nm) (Figura 16).
Figura 15 – Curvas SAXS para PUD5 puro (15-a), PUD5 contendo ACT (15-b), PUD6
puro (15-c) e PUD6 contendo ACT (15-d).
Figura 16 – Dados SAXS processados por tratamento matemático para aumentar a
resolução dos picos de espalhamento pequenos. No topo da figura: exemplo de como os
dados SAXS foram explorados neste trabalho para aumentar a resolução de picos de
espalhamento pequenos: (16-a) dados SAXS originais; (16-b) ajuste de Guinier dos
dados originais; (16-c) resultado da subtração entre os dados originais e ajuste Guinier.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
85
O grau de separação de microfases em poliuretanos pode ser estudado mais
eficientemente pelo cálculo da invariante Q (equação 6). Na Figura 17 estão
representados os resultados deste tipo de cálculo em função do vetor de espalhamento q
para os sistemas PUD5 e PUD6. Valores mais altos da invariante Q foram obtidos para o
poliuretano PUD5 contendo ACT, indicando que esta amostra possui fases com
densidades eletrônicas mais bem definidas e que espalhou significativamente raios-X.
Estes resultados também sugeriram que a incorporação de ACT no PUD5 conduziu a um
rearranjo das fases, nas quais as moléculas do fármaco poderiam estar preferencialmente
próximas dos domínios rígidos hidrofílicos, e, portanto, aumentaram a diferença de
densidade eletrônica, enquanto que a presença de ACT em PUD6 não provocou
mudança na separação de fases do PUD6 puro, possivelmente porque as moléculas do
ACT foram distribuídas ao longo dos segmentos macios e rígidos.
Figura 17 – Invariante Q extraída dos dados de espalhamento SAXS para PUD5 e PUD6
contendo ACT.
Conclui-se, portanto, que foi possível incorporar o ACT nos poliuretanos
biodegradáveis. As dispersões aquosas de poliuretanos permitiram a incorporação do
princípio ativo por simples mistura, a temperatura ambiente, sem a necessidade de uso
de solventes. Esta característica é considerada extremamente interessante, pois pode ser
aplicada a outros princípios ativos termolábeis ou frágeis. Os resultados FTIR sugeriram
que o fármaco introduzido às matrizes poliméricas não apresentou modificações
químicas detectáveis. Os resultados SAXS possibilitaram a identificação dos efeitos da
incorporação do ACT na morfologia dos polímeros. A incorporação do fármaco no
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
86
PUD5 (sistema que contém apenas PCL no segmento macio) conduziu a uma nova
morfologia do sistema, enquanto que alterações significativas não foram detectadas na
nanoestrutura do PUD6 (sistema que contém PCL e PEG no segmento macio).
6.2 Estudo de degradação in vitro dos poliuretanos
Na Figura 18 estão representados os padrões de difração de raios-X (XRD) para o PUD5
não submetido ao processo de degradação e para o PUD5 após 4 meses de
biodegradação. É possível observar que o PUD5 apresentava uma natureza basicamente
amorfa e se tornou parcialmente cristalina após incubação. Uma explicação para este fato
é que provavelmente a hidrólise das ligações químicas da PCL resultou na quebra de
cadeias poliméricas, permitindo o empacotamento mais eficiente destas cadeias e a
formação dos cristalitos. Na Figura 18 também está representado o padrão XRD para a
PCL pura. Este padrão foi incluído para demonstrar que a fase cristalina gerada a partir
da hidrólise do poliuretano pode estar associada com uma fase cristalina da PCL.
Figura 18 - Padrões XRD para PUD5 não degradado (PUD5_0) (18-a), PUD5 submetido
à biodegradação por 4 meses (18-b) (PUD5_4). O padrão XRD para a PCL pura (18-c)
foi incluído como referência.
Na Figura 19 estão representados os padrões XRD para o PUD6 não submetido ao
processo de degradação e para o PUD6 após 4 meses de biodegradação. Como
observado para o PUD5, os segmentos macios do PUD6 provavelmente se cristalizaram
devido à hidrólise das ligações éster da PCL. A quebra destas ligações permitiu maior
mobilidade e liberdade das cadeias de pequena massa molecular, levando ao seu
empacotamento numa estrutura cristalina.
0 10 20 30 40 50 60 70
80
90 100
2
q
Intensidade (relativa)
(a) PUD5_0
(b) PUD5_4
(c) PCL
(a)
(b)
(c)
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
87
Figura 19 - Padrões XRD para PUD6 não degradado (PUD6_0) (19-a), PUD6 submetido
à biodegradação por 4 meses (19-b) (PUD6_4). O padrão XRD para a PCL pura (19-c)
foi incluído como referência.
Na Figura 20, o espectro de espalhamento de raios-X de baixo ângulo (SAXS) para o
sistema PUD5 não degradado apresentou um pico de espalhamento amplo em q = 0,52
nm
-1
. Após 4 meses de biodegradação, este pico de espalhamento não pode ser
claramente visualizado. Por outro lado, a intensidade do espalhamento foi aumentada
particularmente em baixos valores de q, indicando que provavelmente as lamelas
cristalinas presentes no segmento macio atuaram como sítios de espalhamento de raios-
X. A presença das lamelas cristalinas mudou a estrutura do material de um sistema de
duas fases (PUD5 não degradado) para um sistema de três fases. Esta estrutura mais
complexa contendo múltiplos sítios de espalhamento foi responsável pelo aumento do
espalhamento dos raios-X e a restrição da estrutura de microfase típica dos poliuretanos.
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
2
q
Intensidade (relativa)
(a) PUD6_0
(b) PUD6_4
(c) PCL
(a)
(b)
(c)
(b)
(b)
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
88
Figura 20 - Curvas SAXS para PUD5 não degradado (PUD5_0) (20-a) e PUD5
submetido a 4 meses de biodegradação (PUD5_4) (20-b).
A curva SAXS para o PUD6 não degradado, apresentada na Figura 21, mostrou que a
incorporação de PEG no segmento macio provocou a modificação significativa da
nanoestrutura típica destes poliuretanos, uma vez que o principal pico de espalhamento
de raios-X foi deslocado para valores de q menores (quando comparado ao PUD5), o
que indica que a distância entre os domínios rígidos foi aumentada como conseqüência
do alto grau de mistura de fases. A presença de lamelas cristalinas formadas durante a
biodegradação do PUD6 resultou na formação de uma nanoestrutura mais complexa, e
consequentemente, na presença de múltiplos picos de espalhamento que se
sobrepuseram, levando a um perfil de espalhamento com picos não definidos.
Figura 21 - Curvas SAXS para PUD6 não degradado (PUD6_0) (21-a) e PUD6
submetido a 4 meses de biodegradação (PUD6_4) (21-b).
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
89
A biodegradação in vitro do PUD5 e PUD6 foi demonstrada pela perda de massa dos
filmes, imersos em tampão fosfato pH 7,4 mantido à temperatura de 37
o
C e agitação a 30
rpm. Estas condições foram utilizadas para tentar simular o ambiente encontrado no
vítreo. Como apresentado na Figura 22, o PUD6 apresentou perda de massa maior que
aquela exibida pelo PUD5 ao longo de 38 semanas de realização do experimento. A
maior taxa de biodegradação do PUD6 pode ser associada à sua maior hidrofilicidade,
devido à presença do PEG no segmento macio. O PEG favoreceu a penetração e difusão
da água na matriz polimérica, o que aumentou a taxa de hidrólise dos grupos éster
presentes no PCL, assim como a formação de produtos de degradação de baixa massa
molecular. Adicionalmente, os segmentos contendo PEG hidrofílico possivelmente
interagiram com os segmentos rígidos polares, conduzindo a maior mistura de fases no
PUD6 (como detectado pelo SAXS), o que poderia aumentar a permeabilidade à água, e
consequentemente, aumentar a degradação hidrolítica deste polímero. Ao contrário do
PUD6, o poliuretano PUD5 apresenta uma estrutura mais hidrofóbica, o que
provavelmente diminuiu a penetração e difusão da água nas cadeias do polímero,
resultando numa menor taxa de degradação hidrolítica. Estes resultados são similares
àqueles descritos por Zhang et al. (2007), que descreveram que poliuretanos contendo
maior proporção de PEG no segmento macio exibiram maior absorção de água, maior
taxa de degradação in vitro, e ainda menor resistência mecânica no estado hidratado.
0 10 20 30 40
50
60
70
80
90
100
PUD5
PUD6
Tempo de biodegradação (semanas)
Perda de massa (%)
Figura 22 – Porcentagem de perda de massa do PUD5 e PUD6 em condições fisiológicas
simuladas (tampão fosfato pH 7,4, temperatura de 37
o
C e agitação de 30 rpm). Os dados
obtidos representam a média ± desvio padrão (n = 3 para cada poliuretano).
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
90
Os espectros FTIR para o PUD5 e PUD6 antes e após 4 meses de biodegradação estão
representados nas Figuras 23 e 24, respectivamente. As bandas FTIR típicas dos
poliuretanos podem ser visualizadas nestes espectros e estão descritas na Tabela 2. A
presença de PEG no PUD6 não introduziu uma banda de absorção nova no espectro do
PUD6 quando comparado com o espectro do PUD5, simplesmente porque os grupos
químicos presentes no PEG estão também presentes nos outros componentes do
poliuretano.
Tabela 2. Atribuições das bandas FTIR para PUD5 e PUD6.
Banda Origem Frequência (cm
-
1
) Atribuição
1 N–H
O-H
~3300 Vibração N-H com ligação de
hidrogênio e do O-H
2 –CH
2
~2900 Modos de vibração de estiramento
assimétricos do metileno
–CH
2
~2800 Modos de vibração de estiramento
simétricos do metileno
3 C=O ~1630 Vibração de estiramento do C=O da
uréia com ligação de hidrogênio
~1660 Vibração de estiramento do C=O da
uréia livre
~1700 Vibração de estiramento do C=O do
uretano com ligação de hidrogênio
~1720 Vibração de estiramento do C=O do
uretano livre
1750-1725 Modos de vibração de estiramento do
C=O do éster
4 >N–H 1640–1540 Modos de vibração de amida
sencundária
5 –CH
2
1470–1430 Modos de vibração de deformação
assimétrica do metileno
6 C–N 1292–1226 Modos de vibração de estiramento de
amida terciária
7 C–O–C
1192 Vibração de estiramento do éter
1150 Vibração de estiramento do éter
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
91
Figura 23 - Espectros FTIR do PUD5 não degradado (PUD5_0) (22-a) e do PUD5
submetido à biodegradação por 4 meses (PUD5_4) (22-b).
Figura 24 - Espectros FTIR do PUD6 não degradado (PUD6_0) (23-a) e do PUD6
submetido à biodegradação por 4 meses (PUD6_4) (23-b).
Na Figura 25 está indicado que as principais bandas de absorção associadas com os
poliuretanos estão presentes em todos os sistemas e que a freqüência de cada banda não
foi significativamente deslocada devido ao teste de biodegradação realizado com os
materiais. Por outro lado, observou-se que a absorvância de algumas bandas FTIR foi
dependente de alguns fatores, tais como a biodegradação e a morfologia.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
92
1000
1500
2000
2500
3000
3500
PUD5_0 PUD5_4 PUD6_0 PUD6_4
Número de onda da banda de absorção (cm
-1
)
N–H (ligação de H) e O-H CH2 (estiramento asim.)
CH2 (estiramento sim.) C=O
Uréia livre Amida secundária
CH2 (dobramento) Amida terciária
C-O (cristais) C-O (amorfa)
Figura 25 – Principais bandas de absorção FTIR observadas para os poliuretanos
(PUD5_0 e PUD6_0) não degradados e submetidos à biodegradação (PUD5_4 e
PUD6_4).
Na Figura 26 estão indicados os valores de absorvância das principais bandas de
absorção dos sistemas de poliuretanos. A fim de se obter maiores informações sobre os
grupos carbonila em diferentes ligações e expostos a diferentes ambientes químicos, um
procedimento de deconvolução matemática foi realizado numa ampla região de absorção
do C=O (entre 1750 e 1600 cm
-1
), para demonstrar freqüências de absorção mais
específicas e descritas na Tabela 2. Por exemplo, na Figura 27 encontra-se representado
o procedimento de deconvolução aplicado para o PUD5 antes e após o teste de
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
93
biodegradação. Os resultados obtidos pela deconvolução foram normalizados dividindo-
se o valor da banda de absorção pela soma deste valor adicionado ao valor de absorção
da banda presente em 1460 cm
-1
(referência – vibração de deformação do CH
2
). Os
valores de absorvância normalizados estão indicados na Figura 26, e estes revelaram
informações importantes, a saber:
(1) a absorvância normalizada da carbonila da uréia e do uretano com ou sem ligação de
hidrogênio aumentou para os dois polímeros após o período de biodegradação. Uma vez
que a técnica de FTIR com Reflexão Total Atenuada monitora a superfície das amostras
em até 3 µm, o resultado observado pode significar que as cadeias pequenas contendo
C=O produzidas pela hidrólise das ligações éster da PCL teriam mobilidade suficiente e
estariam mais livres para movimentar para a superfície. Adicionalmente, um aumento na
concentração das carbonilas livres é usualmente associado com um aumento na mistura
de fases; ou seja, a hidrólise das ligações éster aumentou a natureza hidrofílica dos
domínios macios, aumentando sua compatibilida em relação ao domínio polar rígido e
conduzindo a maiores níveis de mistura de fase.
(2) Diferenças significantes na absorvância de amidas secundárias (presentes nos
segmentos rígidos) não puderam ser notadas, o que seria uma indicação de que os
segmentos rígidos foram preservados durante a biodegradação.
(3) O modo de vibração de estiramento das ligações C-O das cadeias de poli(éster) nos
cristalitos foi observado em comprimento de onda próximo a 1192 cm
-1
. Entretanto, as
conformações da cadeia de poli(éster) que não apresentavam os níveis de simetria e
organização da fase cristalina, tiveram vibrações de estiramento das ligações próximas a
1160cm
-1
. Como pode ser visualizada na Figura 26 (e na Figura 28), a biodegradação
conduziu ao aumento na absorvância normalizada correspondente a 1192 cm
-1
para os
dois poliuretanos. Este resultado está de acordo com aqueles obtidos por difração de
raios-X, que demonstraram que o teste de biodegradação provocou a cristalização dos
segmentos macios. Adicionalmente, considerando que não foram observadas
modificações na banda correpondente a 1160 cm
-1
e que houve aumento da absorvância
em 1192 cm
-1
, sugeriu-se que a concentração das ligações C-O aumentou devido a
degradação hidrolítica das ligações éster e também aconteceu a migração dos segmentos
macios livres para a superfície. Na Figura 28 está indicado como as bandas C-O
cristalinas e amorfas estavam dispostas no espectro do PUD5 antes e após a
biodegradação.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
94
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
C=O livre (uréia) C=O livre (uretano) Amida secundária C-O (cristais)
A
b
s
o
r
b
â
n
c
i
a
(
r
e
l
a
t
i
v
a
)
PUD5_0
PUD5_4
PUD6_0
PUD6_4
(1650cm
-1
)
(1724cm
-1
)
(1540cm
-1
)
(1192cm
-1
)
Figura 26 – Absorvâncias normalizadas das principais bandas de absorção FTIR do
PUD5 e PUD6 antes (PUD5_0 e PUD6_0) e após a biodegradação (PUD5_4 e PUD6_4)
Figura 27 – Deconvolução da região espectral da carbonila (C=O): PUD5_0 (antes da
biodegradação) e PUD5_4 (após biodegradação).
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
95
Figura 28 – Região espectral C-O.
Neste estudo, os reagentes usados como precursores dos poliuretanos foram
cuidadosamente selecionados, de modo que o processo de degradação hidrolítica fosse
favorável, e que os possíveis produtos de degradação não fossem tóxicos e solúveis em
água. A fim de verificar a não citotoxicidade dos produtos de degradação destes
poliuretanos, as células do epitélio pigmentar da retina (ARPE-19) foram cultivadas em
contato direto com estes produtos de degradação, e a viabilidade celular foi avaliada por
meio do teste de conversão mitocondrial do sal de tetrazólio (MTT).
As células ARPE-19 foram incubadas, por 48 horas, em uma mistura de solução
contendo os produtos de degradação dos poliuretanos, coletada após 4 meses de
biodegradação in vitro dos polímeros, e meio de cultura, nas proporções 1:10 e 3:10. Na
Figura 29 está representada a porcentagem de células viáveis (aquelas que estiveram em
contato direto com os produtos de degradação do PUD5 e PUD6) em relação ao controle
(células que não estiveram em contato com os produtos de degradação). Na proporção
1:10, a viabilidade das células submetidas aos produtos de degradação do PUD5 e PUD6
foi similar à viabilidade das células do controle (99,46% ± 3,86 e 95,88% ± 2,10,
respectivamente). Na proporção 3:10, a viabilidade das células incubados com os
produtos de degradação do PUD5 e PUD6 diminui ligeiramente (94,67 ± 2,00 and 92,37
± 3,39, respectivamente). Entretanto, a análise estatística (ANOVA) demonstrou que não
existe diferença estatisticamente significativa entre a viabilidade das células ARPE-19
cultivadas em meio de cultura adicionado de solução de produtos de degradação dos
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
96
poliuretanos e cultivadas em meio de cultura simples (controle), em ambas as proporções
avaliadas (p > 0,05). De acordo com os resultados obtidos, sugeriu-se que os produtos de
degradação dos poliuretanos PUD5 e PUD6 apresentaram um efeito citotóxico não
significante, e que diferenças consistentes em citotoxicidade dos produtos de degradação
de cada poliuretano não foram visualizadas. Entretanto, considerou-se que existe uma
limitação neste teste de citotoxicidade in vitro: a concentração dos produtos de
degradação dos poliuretanos pode não ser representativa daquela que poderia existir in
vivo, uma vez que, a taxa de biodegradação in vivo de biomateriais pode ser mais elevada
que a taxa de biodegradação em condições fisiológicas simuladas.
(1:10) (3:10)
0
25
50
75
100
Controle
PUD5
PUD6
% Células viáveis
Figura 29 – Porcentagem de células ARPE-19 viáveis incubadas numa mistura de
solução de produtos de degradação dos poliuretanos PUD5 e PUD6, coletada após 4
meses de degradação dos polímeros, e meio de cultura, nas proporções de 1:10 e 3:10
(n
= 5 para cada PUD e controle, para cada proporção). A viabilidade das células
incubadas no meio de cultura contendo os produtos de degradação foi expressa em
relação à viabilidade das células incubadas no meio de cultura sem os produtos de
degradação (controle), fixada em 100%.
Concluiu-se, portanto, que estes polímeros apresentaram perda de massa progressiva ao
longo de 38 semanas em condições fisiológicas simuladas. As ligações éster da PCL no
segmento macio foram preferencialmente hidrolisadas, e esta degradação provavelmente
favoreceu a mobilidade das cadeias de baixa massa molecular, levando à formação de
uma estrutura cristalina. Sugeriu-se também que a hidrólise das ligações éster da PCL
aumentou a natureza hidrofílica dos domínios macios, aumentando a sua interação com
os domínios rígidos polares e mudando a estrutura de separação de fases típica dos
poliuretanos. As células ARPE-19 incubadas em meio de cultura contendo os produtos
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
97
de degradação dos poliuretanos nas proporções de 1:10 e 3:10 apresentaram viabilidade,
indicando que os mesmos não apresentam efeitos citotóxicos significantes.
6.3 Estudo de liberação in vitro do acetato de dexametasona a partir dos implantes
Na Figura 30 estão representados os perfis de liberação acumulada in vitro do ACT a
partir de PUD5 e PUD6. Os sistemas poliméricos propiciaram a liberação controlada do
fármaco que, por sua vez, pôde ser dividida em três estágios diferentes. Durante as
primeiras 10 semanas, cerca de 12% e 18% do ACT foi lentamente liberado a partir do
PUD5 e PUD6, respectivamente. Neste primeiro estágio, considera-se que a liberação do
fármaco foi controlada por um processo de difusão através de poros e canais recém-
formados ou pré-existentes. No segundo estágio, que aconteceu entre 10 e 30 semanas
de teste, cerca de 70% e 80% do ACT foi liberado a partir de PUD5 e PUD6,
respectivamente. Neste segundo estágio, as rápidas dissolução e difusão do fármaco
foram atribuídas ao aumento da permeabilidade aquosa das matrizes poliméricas, devido
à degradação hidrolítica das ligações éster presentes no PCL do segmento macio. Esta
degradação resulta na formação de novos canais aquosos que passaram a conectar a
superfície ao interior das matrizes. No terceiro estágio, a menor taxa de liberação do
ACT pôde ser observada novamente para ambos os polímeros, como conseqüência da
redução da concentração de ACT dentro dos materiais. Em 46 semanas, quase 100% do
fármaco foi liberado dos sistemas. Sugere-se que o ACT, presente no interior dos
polímeros, tenha sido liberado por difusão através dos canais de água. Neste momento, a
água pôde mover-se livremente no interior do ambiente, e a degradação do polímero
ocorreu de maneira homogênea (KUNOU et al., 2000). Por esta razão, não se observou
um pico de liberação do ACT, o que representou uma vantagem destes sistemas. Se
ocorresse uma degradação intensa, a espessura da matriz polimérica poderia alterar o
perfil de liberação do ACT, e em casos extremos, uma dose excessiva de fármaco
poderia ser liberada.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
98
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
PUD5 ACT
PUD6 ACT
Tempo (semanas)
Liberação acumulada
do ACT (%)
Figura 30 – Perfis de liberação acumulada in vitro do acetato de dexametasona (ACT) a
partir de PUD5 e PUD6. Os dados representam média ± desvio padrão (n = 4 para cada
poliuretano).
A síntese de poliuretanos biodegradáveis baseados em PCL e PEG tem sido reportada
por diversos autores (GUAN et al., 2005; GUAN et al., 2004; MAHKAM et al., 2003), e
estes demonstraram que existe uma relação entre a estrutura química destes poliuretanos
e a biodegradação. Sugeriu-se que o PCL aumenta a cristalinidade dos poliuretanos,
enquanto que o PEG aumenta a hidrofilicidade e absorção aquosa. Neste trabalho,
considerou-se que a inserção de cadeias hidrofílicas (PEG) na estrutura macromolecular
do poliuretano biodegradável PUD6 favoreceu a penetração da água na matriz
polimérica, e conseqüentemente, favoreceu o aumento da taxa hidrolítica das ligações
éster dos segmentos contendo PCL, permitindo a maior difusão do fármaco para o meio
e provocando um ligeiro aumento na taxa de liberação do ACT em relação à taxa de
liberação deste fármaco pelo PUD5. Entretanto, a análise estatística, utilizando o teste t
de Student não pareado, revelou que os perfis de liberação in vitro do ACT a partir de
PUD5 e PUD6 não apresentaram diferença estatisticamente significativa (p < 0,05),
sugerindo que a introdução de apenas 3% de PEG no segmento macio do PUD6 não foi
suficientemente grande para provocar uma modificação significativa nos perfis de
liberação do ACT.
6.4 Estudo de biocompatibilidade in vitro dos poliuretanos
A adesão das células ARPE-19 nas superfícies do PUD5, PUD6 e controle foi expressa
como sendo a média dos núcleos por campo de visão (%) ± desvio padrão, após 8 horas
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
99
de incubação (Figura 31). Observou-se que a taxa de adesão celular na superfície de
PUD5 (86,57 ± 6,33%) foi superior à taxa de adesão celular na superfície de PUD6
(81,59 ± 7,54%). Entretanto, as porcentagens de células aderidas em ambos os polímeros
não apresentaram diferença estatisticamente significativa (teste t-Student, p < 0,05) após
8 horas de cultura. Por outro lado, a análise de variância (ANOVA) demonstrou que
existe diferença estatisticamente significativa entre as taxas de adesão celular sobre os
poliuretanos e controle (p < 0,05) em 8 horas de incubação.
Controle PUD5 PUD6
0
25
50
75
100
% células aderidas
Figura 31 – Adesão das células ARPE-19 nas superfícies PUD5 e PUD6 após 8 horas
em cultura. Os dados foram expressos como sendo a porcentagem de células aderidas em
relação ao controle (n = 15 para cada poliuretano e para o controle). As porcentagens de
células aderidas sobre os poliuretanos não apresentaram diferença estatística
significativa (teste t de Student - p < 0,05) após 8 horas em cultura. As porcentagens de
células aderidas sobre o controle e poliuretanos apresentaram diferença estatística
significativa (ANOVA - p < 0,05) após 8 horas de incubação.
A taxa de proliferação das células ARPE-19 nas superfícies do PUD5, PUD6 e controle
foi expressa como sendo a média dos núcleos por campo de visão ± desvio padrão, em 1,
2, 7 e 15 dias de incubação (Figura 32). Em 2 dias, a densidade celular foi similar nas
superfícies do controle, PUD5 e PUD6 (205 ± 7,54, 200 ± 10,43 e 195 ± 9,58,
respectivamente). Em 7 dias, o número de núcleos aumentou significativamente sobre as
superfícies do controle, PUD5 e PUD6 (290 ± 10,71, 242 ± 5,41 e 221 ± 1,31,
respectivamente). Em 15 dias, a densidade celular sobre PUD5 e PUD6 (402 ± 5,81 e
371 ± 9,85, respectivamente) foi cerca de três vezes maior do que a densidade celular
obtida no primeiro dia de incubação, demonstrando que houve proliferação celular
intensa em ambos os substratos. Em relação ao controle, a densidade celular foi de
aproximadamente quatro vezes maior (525 ± 7,01). Observou-se, portanto, a seguinte
ordem de proliferação celular sobre os substratos: controle > PUD5 > PUD6. A análise
estatística (ANOVA) demonstrou que existe diferença estatisticamente significativa
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
100
entre as taxas de proliferação celular sobre os poliuretanos e controle (p < 0,05) em
todos os dias de incubação. Por outro lado, a média do número de núcleos contados
sobre as superfícies de PUD5 e PUD6 em 1, 2, 7 e 15 dias de incubação não apresentou
diferença estatisticamente significativa (teste t-Student, p < 0,05).
1 2 7 15
0
100
200
300
400
500
600
Controle
PUD5
PUD6
Dias
Número de células
por campo de visão
Figura 32 – Cinética de proliferação das células ARPE-19 nas superfícies controle,
PUD5 e PUD6. Os dados foram expressos como sendo a média dos núcleos ± desvio
padrão em cada tempo (n
= 15 para cada poliuretano e controle, para cada dia) (p <
0.05).
Neste estudo, os poliuretanos biodegradáveis foram usados como substratos para a
adesão e proliferação das células ARPE-19. Sabe-se que PUD5 e PUD6 apresentam uma
estrutura complexa que consiste em domínios hidrofóbicos e hidrofílicos criados pela
micro separação de fases derivada da baixa compatibilidade entre os segmentos macios e
rígidos. PUD5 apresenta uma separação de fases mais bem definida, enquanto que o
PUD6 exibe maior grau de mistura de fases possivelmente porque existem interações
entre os segmentos rígidos polares e o PEG hidrofílico presente nos segmentos macios, o
que conduz a uma estrutura menos heterogênea (da SILVA et al., 2009). As diferenças
nas estruturas macromoleculares destes poliuretanos poderiam promover modificações
nos perfis de adsorção de proteínas do soro, e conseqüentemente, modificações nas
interações entre as células e os substratos. De acordo com Zhang et al. 2007, as cadeias
de PEG podem se deslocar para as superfície dos polímeros, em contato com o ambiente
aquoso, provocando repulsão de proteínas e prevenindo a aproximação das células.
Entretanto, os perfis de adesão e proliferação das células ARPE-19 nas superfícies dos
polímeros PUD5 e PUD6 não apresentaram diferença estatisticamente significativa (teste
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
101
t de Student, p < 0,05), sugerindo que a introdução de apenas 3% de PEG no segmento
macio do PUD6 não foi suficientemente grande para prevenir a adsorção de proteínas do
soro. Portanto, sugere-se que a adsorção de proteínas nas superfícies poliméricas
aconteceu devido às diversas interações hidrofóbicas e hidrofílicas estabelecidas entre os
grupos funcionais das proteínas e os domínios dos poliuretanos, culminando na adesão e
proliferação celular.
Adicionalmente, a carga eletrostática presente na superfície dos biomateriais representa
outro fator importante que poderia influenciar a adsorção de proteínas do soro. PUD5 e
PUD6 apresentam superfícies carregadas negativamente devido à presença dos grupos
carboxílicos (COO
-
) provenientes do ácido dimetilol propiônico (DMPA), inseridos nos
segmentos rígidos durante o processo de síntese. Estas cargas negativas distribuídas nas
superfícies destes polímeros provavelmente promoveram interações eletrostáticas com as
proteínas do soro, resultando na sua adsorção, que foi auxiliar na ancoragem das células
ARPE-19.
Sugere-se, portanto, que o fenômeno de adsorção de proteínas nas superfícies PUD5 e
PUD6 se deveu aos diferentes tipos de interações estabelecidas entre elas, incluindo
hidrofílicas, hidrofóbicas e eletrostáticas, que por sua vez, foram essenciais para o
estabelecimento das interações entre as células e os substratos.
A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para avaliar a morfologia das células
ARPE-19 aderidas nas superfícies de PUD5 e PUD6 após 1 dia em cultura. A descrição
da morfologia celular é similar para ambos os polímeros. Parte das células apresentava
forma arredondada e estavam em processo de adesão sobre os substratos (Figura
33.A,B,C). Estas células foram visualizadas em áreas de maior densidade celular. A outra
parte das células exibiu forma alongada e achatada, e apresentava projeções (Figura
33.D,E). Estas células de forma irregular foram observadas em áreas de baixa densidade
celular, sugerindo que as mesmas apresentavam mobilidade sobre os substratos e,
portanto, não estavam extensivamente conectadas às superfícies poliméricas.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
102
PUD5 (A)
PUD5 (B)
PUD6 (C)
PUD6 (D)
PUD6 (E)
Figura 33 – Microscopia eletrônica de varredura de pequenos aglomerados de células
ARPE-19 arredondadas sobre as superfícies de PUD5 (A) e PUD6 (C), após 1 dia em
cultura. Ampliação das micrografias: células com microvilosidades apicais sobre PUD5
(B), e células alongadas sobre PUD6 (D) com projeções PUD6 (E).
Após 7 dias em cultura, as células ARPE-19 alcançaram confluência sobre PUD5 e
PUD6, e cobriram toda a superfície polimérica como uma monocamada organizada. A
marcação com faloidina revelou fibras de actina intensamente concentradas ao redor de
todo o perímetro das células, sendo auxiliares na adesão das células aos substratos
(KORTE et al., 1995). A actina se apresentou também na forma de grandes filamentos
distribuídos em paralelo, na parte superior do citoplasma celular, e inseridos na
membrana intercelular de células adjacentes, propiciando conexão entre elas. A marcação
com iodeto de propídeo demonstrou que os núcleos ocupavam a região central das
células, e que não estavam sobrepostos, sugerindo a formação da monocamada celular.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
103
Células binucleadas foram observadas, o que representou a divisão celular. Esta descrição
morfológica das células ARPE-19 confluentes sobre as superfícies de PUD5, PUD6 e
controle está ilustrada na Figura 34. As áreas são representativas de toda a população
celular presente nos polímeros.
Controle (A)
Controle (B)
PUD5 (C)
PUD5 (D)
PUD6 (E)
PUD6 (F)
Figura 34 – Micrografias das células ARPE-19 nas superfícies do controle (A), PUD5 (C)
e PUD6 (E) demonstrando a marcação das fibras de actina com faloidina FITC após 7 em
cultura. Micrografias (B), (D) e (F) representam a fusão das fibras de actina e dos
núcleos, marcados com iodeto de propídeo. Barra - 100 µm.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
104
Observou-se que à medida que o número de células aumentou nos substratos, o tamanho
das células regrediu gradativamente, e elas adquiriram a forma poligonal. Portanto, pode-
se afirmar que a forma celular foi influenciada diretamente pela densidade celular
(HADLOCK et al., 1999; CASTERLLARIN et al., 1998). Sugere-se ainda que a forma
das células epiteliais tornou-se mais homogêneo devido ao estabelecimento de interações
dos filamentos de actina em duas regiões diferentes: (1) com a membrana intercelular de
células adjacentes (um local de adesão célula-célula); (2) em todo o perímetro das
células, representando largas superfícies de adesão (um local de adesão célula-substrato).
Embora as células endoteliais sobre os polímeros tenham alcançado um nível de
organização adequado, sua forma não foi tão uniforme quando aquela vista em células
epiteliais no próprio tecido. Este fato pode ser atribuído às diferenças existentes entre os
sistemas de cultura artificiais e o ambiente natural (BURKE et al., 1996).
A zônula de oclusão é formada por moléculas adesivas transmembrana, tais como a
ocludina. Elas atuam como uma barreira à difusão dos solutos para o espaço intracelular
(TSUKITA et al., 1991). Neste estudo, as células ARPE-19 sobre PUD5 e PUD6
apresentaram a habilidade de expressarem ocludina. Este fato representa não só a
funcionalidade das células epiteliais, mas também o estabelecimento de interações entre
as células (Figure 35).
Conclui-se, portanto, que PUD5 e PUD6 foram citocompatíveis, uma vez que
possibilitaram o estabelecimento de importantes interações com as células ARPE-19,
permitindo sua adesão, migração, proliferação e manutenção sobre os substratos, as quais
são essenciais para a formação de uma monocamada epitelial. A marcação dos filamentos
de actina revelou uma rede complexa que estava conectada com a membrana intercelular
e também compuseram as fibras de estresse. A identificação da expressão de ocludina
demonstrou a funcionalidade das células epiteliais nas superfícies de PUD5 e PUD6.
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
105
Controle (A)
PUD5 (B)
PUD6 (C)
Figura 35 – Zônulas de oclusão formadas entre as células ARPE-19 adjacentes nas
superfícies do controle (A), PUD5 (B) e PUD6 (C) após 15 dias em cultura. As zônulas
de oclusão foram reveladas devido à marcação da ocludina (cor verde). Barra - 500 µm.
6.5 Estudo de biocompatibilidade in vivo dos poliuretanos
Os poliuretanos PUD5 e PUD6 foram inseridos no espaço subretiniano de olhos de ratos,
e a avaliação histológica foi realizada 15 dias após a implantação (Figura 36).
Hemorragia coroidal ou subretiniana não foi observada após a implantação dos
polímeros. Além disso, os sistemas poliméricos foram bem tolerados, uma vez que sinais
da inflamação não foram visualizados. Os tecidos oculares, que não estiveram em contato
direto com os polímeros, não apresentaram anormalidades. A retina sobre os polímeros
apresentou arquitetura preservada, mas foram observadas pequenas áreas de
descontinuidade das camadas que compõem a retina. A desorganização destas camadas
celulares foi atribuída à espessura dos polímeros implantados (100 µm), que era
suficientemente grande para comprometer a integridade destas células. Para evitar a
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
106
descontinuidade das camadas da retina, deve-se simplesmente diminuir a espessura dos
poliuretanos a serem implantados.
PUD5 (A)
PUD6 (B)
PUD5 (C)
PUD6 (D)
PUD5 (E) PUD6 (F)
Figura 36 – Observação macroscópica do PUD5 (A) e PUD6 (B) implantados por 15 dias
no espaço subretiniano de olhos de ratos. Os filmes de poliuretanos se apresentam na
forma triangular e cor branca. Corte histológico do olho mostrando que PUD5 (C) (4 X) e
PUD6 (D) (20 X) se encontram no espaço subretiniano: os poliuretanos se encontram
degradados no espaço subretiniano (a degradação ocorreu durante o processo de fixação
dos bulbos oculares); os círculos (O) indicam as camadas da retina sobre os poliuretanos.
Cortes histológicos da retina localizada sobre os poliuretanos PUD5 (E) e PUD6 (F) (60
X). A arquitetura da retina foi bem preservada, mas observaram-se pequenas áreas de
descontinuidade das camadas celulares da retina [PUD6 (F)].
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
107
Os poliuretanos PUD5 e PUD6 foram também inseridos no corpo vítreo dos olhos de
ratos, e a avaliação histológica foi realizada 15 dias após a implantação. Os sistemas
poliméricos foram bem tolerados, uma vez que sinais da inflamação não foram
observados nos olhos dos animais. A cavidade vítrea manteve-se íntegra, e não foram
visualizadas células inflamatórias neste tecido. Outros tecidos que compõem o olho, tais
como, córnea, íris, corpo ciliar, coróide, esclera, nervo óptico não apresentaram
anormalidades. As camadas da retina também foram especialmente analisadas e
constatou-se que a arquitetura da neuroretina e das células epiteliais pigmentares da retina
estava completamente preservada (Figura 37).
PUD5 (A)
PUD5 (B)
PUD6 (C)
PUD6 (D)
Figura 37 – Cortes histológicos das camadas da retina após a implantação do PUD5 (A) e
PUD6 (C) na cavidade vítrea de olhos de ratos (40 X) e ampliação dos mesmos: PUD5
(B) e PUD6 (D) (80 X). Os cortes histológicos foram obtidos 15 dias após a introdução
dos poliuretanos e demonstram a integridade da arquitetura das camadas da retina.
A biocompatibilidade intraocular deve ser avaliada em todos os tecidos do olho onde os
materiais estarão em contato. Considerando que os polímeros biodegradáveis PUD5 e
PUD6 serão aplicados como sistema de liberação controlada de acetato de dexametasona
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
108
destinado ao tratamento de doenças inflamatórias do segmento posterior do olho, fez-se
necessária a implantação destes polímeros puros em dois sítios oculares frequentemente
envolvidos como via de acesso aos dispositivos intraoculares (espaço subretiniano e
corpo vítreo), para posterior investigação da biocompatibilidade in vivo nos diversos
tecidos do olho. Além disso, os produtos de degradação destes polímeros também estarão
em contato direto com as estruturas oculares e estarão sujeitos ao transporte e aos
sistemas difusionais de eliminação, que podem ser através da retina (EINMAHL et al.,
2000) para os sistemas biodegradáveis implantados no corpo vítreo. Portanto; faz-se
necessário novamente o acesso da biocompatiblidade in vivo em várias partes do olho.
PUD5 e PUD6 foram altamente tolerados pelos tecidos oculares, uma vez que estes se
apresentavam totalmente íntegros após 15 dias de implantação dos poliuretanos. A
arquitetura da retina mostrou-se preservada na presença dos polímeros. Células
envolvidas no processo inflamatório, tais como leucócitos, neutrófilos, macrofágos ou
células gigantes, não foram observadas no espaço subretiniano; nas camadas da retina ou
no vítreo. Além disso, os polímeros implantados no espaço subretiniano não foram
envolvidos por cápsula fibrótica perceptível e não se observou necrose dos tecidos
adjacentes ao sítio de implantação. Estes resultados são melhores do que aqueles
apresentados por Foulds et al. (1988), após implantação supracoroidal de um poliuretano
hidrofílico. Neste estudo foram observadas: (1) resposta macrofágica mononuclear contra
o polímero; (2) fibrose da coróide adjacente ao sítio de implantação; (3) fusão
corioretinal. Em algumas espécies, a fibrose da coróide pode conduzir à atrofia completa
da retina, enquanto que em outras, pode existir proliferação reacionária de células RPE
atróficas (EINMAHL et al., 2002). Finalmente, os resultados obtidos após inserção dos
poliuretanos no vítreo são interessantes como àqueles apresentados por Einmahl et al.
(2000). Neste estudo, a biocompatibilidade intravitreal do POE foi avaliada e considerou-
se que este polímero viscoso foi bem tolerado, como observado por oftalmoscopia
indireta e avaliação histológica de todos os tecidos oculares, especialmente a retina.
Conclui-se, portanto, que os resultados obtidos neste estudo demonstraram a excelente
biocompatibilidade in vivo dos poliuretanos PUD5 e PUD6 frente ao diversos tecidos
oculares, especialmente a retina, e demonstraram também que estes polímeros são
biomateriais promissores para aplicação intra-ocular.
109
7 CONCLUSÃO
Conclusão
________________________________________________________________________
110
Foi possível incorporar o ACT nos poliuretanos biodegradáveis. As dispersões aquosas
de poliuretanos permitiram a incorporação do princípio ativo por simples mistura, a
temperatura ambiente, sem a necessidade de uso de solventes. Os resultados FTIR
demonstraram que o fármaco introduzido às matrizes poliméricas não apresentou
modificações químicas detectáveis. Os resultados SAXS possibilitaram a identificação
dos efeitos da incorporação do ACT na morfologia dos polímeros. A incorporação do
fármaco no PUD5 conduziu a uma nova morfologia do sistema, enquanto que alterações
significativas não foram detectadas na nanoestrutura do PUD6.
Os poliuretanos foram submetidos ao estudo de biodegradação in vitro por 4 meses em
condições fisiológicas simuladas. Os resultados FTIR indicaram que os segmentos
rígidos dos biomateriais foram preservados durante o teste de biodegradação, e que as
ligações ésteres da PCL incorporada aos segmentos macios foram hidrolisadas. Os
resultados XRD também indicaram que os grupos ésteres da PCL presentes nos
segmentos macios hidrolisaram, levando à reorganização de uma fase amorfa, e
conseqüente cristalização da fase. Como a biodegradação do PUD5 e PUD6 induziu a
formação de lamelas cristalinas, uma nanoestrutura complexa se formou, resultando no
aumento do espalhamento dos raios-X em baixo ângulo. Adicionalmente, os produtos de
degradação destes poliuretanos não apresentaram citotoxicidade frente às células do
epitélio pigmentar da retina.
Os sistemas poliméricos propiciaram a liberação controlada do ACT por 46 semanas.
Observou-se que a inserção de cadeias hidrofílicas (PEG) na estrutura macromolecular
do poliuretano biodegradável PUD6 favoreceu a penetração da água na matriz
polimérica, e conseqüentemente, favoreceu o aumento da taxa hidrolítica das ligações
éster dos segmentos contendo PCL, permitindo a maior difusão do fármaco para o meio
e provocando um ligeiro aumento na taxa de liberação do ACT em relação à taxa de
liberação deste fármaco pelo PUD5.
PUD5 e PUD6 foram citocompatíveis, uma vez que possibilitaram o estabelecimento de
importantes interações com as células ARPE-19, permitindo sua adesão, migração e
proliferação, as quais foram essenciais para a formação de uma monocamada epitelial
funcional sobre os poliuretanos.
Conclusão
________________________________________________________________________
111
PUD5 e PUD6 apresentaram biocompatibilidade intraocular, uma vez que sinais de
inflamação ou necrose dos tecidos oculares não foram observados após 15 dias de
implantação dos poliuretanos no espaço subretiniano e vítreo de olhos de ratos. Além
disso, os tecidos oculares que estiveram ou não em contato com os poliuretanos se
apresentavam completamente preservados, e a arquitetura da retina se mateve íntegra,
sem quaisquer anormalidades.
112
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122
9 ANEXOS
Anexos
________________________________________________________________________
123
Artigos científicos publicados
da Silva, G. R.; Silva-Cunha A. Jr.; Ayres, E.; Oréfice, R. L. Effect of the
macromolecular architecture of biodegradable polyurethanes on the controlled delivered
of ocular drugs. Journal of Materials Science: Materials in Medecine, v. 20, p. 481-
487, 2009.
da Silva, G. R.; Ayres, E.; Moura, S. A. L.; Cara, D. C.; R. L. Oréfice; Silva-Cunha A.
Jr. Controlled release of dexamethasone acetate from biodegradable and biocompatible
polyurethane and polyurethane nanocomposite. Journal of Drug Targeting, v. 17(5), p.
374-383, 2009.
Artigos científicos submetidos para publicação
da Silva, G. R.; Silva-Cunha A. Jr.; Behar-Cohen, F.; Ayres, E.; Oréfice, R. L.
Biodegradation of polyurethanes and nanocomposites to non-cytotoxic degradation
products. Acta Biomaterialia.
da Silva, G. R.; Silva-Cunha A. Jr.; Behar-Cohen, F.; Ayres, E.; Oréfice, R. L. In vitro
ocular drug release from biodegradable polyurethane nanocomposites. Journal of
Biomedical Materials.
da Silva, G. R.; Siqueira, R. C.; Jorge, R.; Silva-Cunha A. Jr. Controlled drug delivery
systems for the treatment of diseases of the posterior segment of the eye. Revista da
Associação Médica Brasileira.
Trabalhos apresentados em congresso
1) Release of dexamethasone from biodegradable polyurethane nanocomposites.
Gisele Rodrigues da Silva, Armando da Silva Cunha Junior, Eliane Ayres, Rodrigo
Lambert Oréfice.
8
th
World Biomaterials Congress – 2008
2) Incorporação e cinética de liberação de sais de dexametasona à partir de poliuretano
biodegradável contendo nanopartícula de argila.
Gisele Rodrigues da Silva, Armando da Silva Cunha Junior, Eliane Ayres, Rodrigo
Lambert Oréfice.
9
o
Congresso Brasileiro de Polímeros - 2007
Anexos
________________________________________________________________________
124
3) Controlled release of dexamethasone salts incorporated in biodegradable
polyurethanes and polyurethanes containing clay nanoparticles
Gisele Rodrigues da Silva, Eliane Ayres, Rodrigo Lambert Oréfice, Armando da Silva
Cunha Junior.
6
th
International Congress of Pharmaceutical Science - 2007
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