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Centro de Ciências Agrárias
Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos
DESENVOLVIMENTO DE SIMBIÓTICO À BASE DE
Lactobacillus casei ADERIDO A FIBRAS VEGETAIS
DESIDRATADAS
KARLA BIGETTI GUERGOLETTO
Londrina
2009
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Centro de Ciências Agrárias
Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos
DESENVOLVIMENTO DE SIMBIÓTICO À BASE DE
Lactobacillus casei ADERIDO A FIBRAS VEGETAIS
DESIDRATADAS
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
e Doutorado em Ciência de Alimentos da
Universidade Estadual de Londrina, como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em Ciência
de Alimentos.
Mestranda: Karla Bigetti Guergoletto
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Garcia
Londrina
2009
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ii
KARLA BIGETTI GUERGOLETTO
DESENVOLVIMENTO DE SIMBIÓTICO À BASE DE
Lactobacillus casei ADERIDO A FIBRAS VEGETAIS
DESIDRATADAS
COMISSÃO EXAMINADORA
____________________________________
Prof
a
Dr
a
Sandra Garcia (orientadora)
Universidade Estadual de Londrina
____________________________________
Dr
a
. Kátia Sivieri
Unopar
____________________________________
Dr
a.
Luciana de Souza Neves
Ellendersen
Convidada
Londrina, 08 de julho de 2009
iii
À minha família,
meus pais Hélio e Cleuza
e meu irmão Gustavo, pelo amor,
confiança, estímulo e carinho incondicional
transmitidos por toda minha vida.
Ao meu noivo Waleyd, pelo amor,
carinho e por sempre me apoiar
em minhas decisões.
iv
“Bom mesmo é ir à luta com determinação,
abraçar a vida com paixão,
perder com classe e
vencer com ousadia,
porque o mundo pertence a quem se atreve,
e a vida é muito para ser insignificante”
(Charles Chaplin)
v
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida, e por se fazer presente em todos os
momentos, sempre guiando a mim e a todos que estiveram envolvidos neste
trabalho.
À Prof. Dra. Sandra Garcia, pela valiosa orientação, amizade, pelos
ensinamentos que proporcionaram meu crescimento pessoal e profissional e pela
confiança que despertou meu profundo respeito e admiração.
Aos docentes e funcionários do Departamento de Ciência e
Tecnologia de Alimentos da Universidade Estadual de Londrina pelos ensinamentos.
À Christian Hansen, na pessoa de Lucio Alberto Forti Antunes, pela
cultura probiótica de Lactobacillus casei (LC-1), que foi de primordial importância
para a realização da pesquisa.
À SL Alimentos, na pessoa de Melícia Galdeano, por gentilmente ter
cedido o farelo de aveia.
À Clariant, na pessoa de Aylton Hideki Sueta, pela inulina e pela
fibra de maçã utilizada no estudo.
À empresa Tovani Benzaquen com. Imp. Exp. e representações
Ltda, na pessoa de Leandro Tovani pela trealose fornecida ao estudo.
À Prof. Dra. Célia Guadalupe Tardeli de Jesus Andrade, ao Juca e
ao Osvaldo do Laboratório de Microscopia e Microanálise da Universidade Estadual
de Londrina (LMEM), pelo auxílio e ensinamentos durante as análises de
microscopia eletrônica de varredura.
Às estagiárias Natália e Lívia pela amizade, colaboração e incentivo
na execução dos experimentos.
vi
À Marciane Magnani, pela grande amizade, por sempre dispor-se a
ajudar e pela imensurável contribuição neste trabalho, partilhando seus
conhecimentos científicos, que foram de suma importância no desenvolvimento
desta pesquisa.
Aos amigos da turma de Mestrado, Fran, Romi, Lílian, Dani, Cássia,
Elis e Leo, que transformaram esses dois anos de convivência em verdadeira
amizade.
Às amigas Gislaine e Giselle pela amizade, apoio, conselhos e pelas
inesquecíveis e infalíveis “terapias” em grupo.
Aos companheiros de laboratório, em especial aos de Microbiologia
pelos momentos, sempre alegres, de trabalho.
À minha amiga Daniela, pela amizade, conselhos e apoio em todos
os momentos de insegurança.
À minha avó, primos e tios que sempre torceram para que as
“bactérias sobrevivessem”.
A todos que direta ou indiretamente auxiliaram no desenvolvimento e
conclusão deste trabalho.
vii
GUERGOLETTO, Karla Bigetti. Desenvolvimento de simbiótico à base de
Lactobacillus casei aderido a fibras vegetais desidratadas. 2009. Dissertação de
Mestrado em Ciência de Alimentos – Universidade Estadual de Londrina,
RESUMO
O aumento na procura por alimentos diversificados e que apresentem benefícios à saúde,
tem levado a indústria de alimentos funcionais a explorar novos produtos e processos.
Assim, este trabalho objetivou desenvolver um produto vegetal simbiótico. A biomassa de
Lactobacillus casei (LC-1) foi centrifugada e ressuspendida em solução salina estéril 0,85%
(p/v) para a homogeneização de 10g de farelo de aveia com aproximadamente 9% de β-
glucana, farinha de banana verde, fibra de maçã ou inulina. As amostras foram submetidas
a secagem à 45ºC sob vácuo até a umidade de 5,6 ± 1%. A viabilidade do LC-1 foi
determinada utilizando Agar MRS e as análises de umidade, pH e atividade de água foram
realizadas segundo métodos oficiais. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV)
foi realizada em cada uma das fibras adicionadas de LC-1 para verificar as possíveis
diferenças morfológicas ocorridas no microrganismo antes e após o processo de
desidratação. No farelo de aveia e na farinha de banana verde, fibras que obtiveram maior
sobrevivência celular, foram avaliados os efeitos da sacarose como estressor e da trealose
como protetor. A estabilidade do simbiótico foi avaliada em 28 dias. As amostras foram
armazenadas em saches de BOPP metalizado e estocadas nas temperaturas de 10, 25 e
40ºC e as análises microbiológicas e físico-químicas foram realizadas a cada 7 dias. A
resistência do LC-1 aderido ao farelo de aveia foi verificada simulando condições
gastrintestinais. Testes sensoriais de aceitação e triangular foram conduzidos adicionando
farelo de aveia e simbiótico a uma vitamina comercial. Os resultados mostraram que os
valores de atividade de água variaram entre 0,25 e 0,35, conforme propriedades de cada
fibra. O farelo de aveia e a farinha de banana verde, cujos pHs finais foram 5,7 e 5,4,
apresentaram as maiores recuperações celulares, 82 e 79% respectivamente, sendo que as
imagens de MEV mostraram células com poucas alterações morfológicas. A inulina e a fibra
de maçã apresentaram as menores sobrevivências, 45% e 66% e, valores de pH de 4,0 e
4,2 respectivamente. Na farinha de banana verde e no farelo de aveia, a adição de sacarose
e trealose apresentou efeito positivo na sobrevivência do LC-1. Por se tratar de um produto
desidratado, onde a estabilidade à temperatura ambiente é desejada, a maior viabilidade
celular no teste de armazenamento foi obtida com farelo de aveia sem adição dos açúcares,
chegando ao final do período com 7,4 ciclos log/g. Após simulação do suco gástrico e
intestinal (120 minutos em pH 1,55 e 150 minutos em pH 7,4), a viabilidade do
microrganismo aderido ao farelo de aveia foi mantida em 10
7
UFC/g, mostrando que o farelo
de aveia oferece proteção ao microrganismo em relação às células livres (10
2
UFC/g). No
teste triangular, foi verificado que o farelo de aveia na presença e ausência do probiótico
apresentaram diferenças sensoriais perceptíveis pelos provadores, mas ambos foram
considerados bem aceitos pelos consumidores, com índices de aceitação 77 e 76%
respectivamente. Portanto, o simbiótico desidratado utilizando farelo de aveia é uma
alternativa para a diversificação de produtos com propriedades funcionais.
Palavras-chave: probiótico, β-glucana, farinha de banana verde, fibra alimentar,
desidratação.
viii
GUERGOLETTO, Karla Bigetti. Development of a symbiotic based on
Lactobacillus casei adhered to dehydrated vegetal fibers. 2009. Dissertation in
Master`s degree in food science – Londrina State University,.
ABSTRACT
Increases in consumers demand for food variety showing benefit to health, has led
the functional food industry to explore new products and processes. Based on this,
the study aimed to develop a dehydrated vegetable synbiotic product. The
Lactobacillus casei (LC-1) biomass was centrifuged and resuspended in sterile saline
solution 0,85% (w/v) to homogenize 10g of oat bran with 9% of β-glucan, unripe
banana flour, apple fiber or inulin. The samples were subjected to vacuum drying at
45°C until the moisture content of 5,6 ± 1%. The vi ability of LC-1 was determined by
counting on MRS agar plates and analysis of moisture, pH and water activity was
performed by official methods. Analysis of scanning electron microscopy (SEM) was
carried out on each fiber to determine the possible morphological differences
occurred in cells before and after the dehydration process. The effect of sucrose and
trehalose as stressor and protectant was studied on fibers which presented the
highest cell survival. The stability of the dehydrated products was performed during
28 days. The samples were packaged in metalized BOPP sachets and stored at 10,
25 and 40ºC temperatures and the microbiological and chemical analysis conducted
every 7 days. The viability of LC-1 cells entrapped in oat bran was determined
simulating gastrointestinal conditions. Sensory triangular and acceptance tests were
conducted adding the probiotic with oat bran to a commercial vitamin. The results
showed that the values of water activity ranged between 0,25 and 0,35, depended on
each fiber properties. Oat bran and green banana flour, whose final pHs were 5,7
and 5,4, showed the highest cell recovery, 82 and 79% respectively, and SEM
images showed cells with few morphological changes. The inulin and apple fiber
showed the lowest viability, 45% and 66% and, pH values 4,0 and 4,2. In green
banana flour and oat bran, the addition of sucrose and trehalose before drying had a
positive effect on LC-1 survival. In the case of a dehydrated product, where
environmental temperature stability is desired, the best results were obtained with oat
bran without sugars, reaching 7,4 log cycles g
-1
at the end of storage time. After
gastric and intestinal simulation (120 minutes at pH 1.55 and 150 minutes at pH 7,4)
the viability of the microorganism on oat bran was maintained at 10
7
UFC g
-1
in
contrast with 10
2
UFC ml
-1
of free cells, showing protection by oat fiber. Triangular
test, showed differences between oat bran in presence or absence of probiotic,
perceived by sensory panelists, but both were accepted by consumers with
acceptance rates of 77 and 76% respectively. Therefore, the synbiotic is an
alternative for diversification of products with functional properties.
Keywords: probiotic,
β-glucan, unripe banana flour, dietary fiber, dehydration
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Estrutura química da inulina..................................................................24
FIGURA 2 – Ficha teste triangular.............................................................................40
FIGURA 3 – Ficha teste aceitação utilizando escala hedônica..................................40
FIGURA 4 – Curva de crescimento do Lactobacillus casei cultivado por 48 horas em
Caldo MRS a 37ºC.....................................................................................................41
FIGURA 5 – Médias percentuais de duas determinações com análises realizadas em
duplicatas de células de L. casei recuperadas após a secagem a vácuo a 45ºC. A:
Farelo de aveia, B: Farinha de banana verde, C: Fibra de maçã e D:
Inulina.........................................................................................................................43
FIGURA 6 – Farinha de banana verde antes (A) e após (B) aderência do L. casei e
secagem a vácuo à 45ºC...........................................................................................44
FIGURA 7 – Farelo de aveia antes (A) e após (B) aderência do L. casei e secagem a
vácuo à 45ºC..............................................................................................................44
FIGURA 8 – Fibra de maçã antes (A) e após (B) aderência do L.casei e secagem a
vácuo à 45ºC..............................................................................................................45
FIGURA 9 – Inulina antes (A) e após (B) aderência do L. casei e secagem a vácuo à
45ºC............................................................................................................................45
FIGURA 10 – Microscopia eletrônica de varredura do farelo de aveia (A e B) e
farinha de banana verde sem adição de L. casei (C e D) com aumentos de 700 e
2500 vezes.................................................................................................................46
FIGURA 11 – Microscopia eletrônica de varredura de fibra de maçã (A e B) e inulina
(C) sem adição de L. casei, com aumentos de 700 e 2500
vezes..........................................................................................................................47
FIGURA 12 – Microscopia eletrônica de varredura do farelo de aveia após adição de
L. casei, antes (A e B) e após secagem à 45ºC sob vácuo (C e D) com aumentos de
5.000 e 20.000 vezes.................................................................................................49
FIGURA 13 – Microscopia eletrônica de varredura da farinha de banana verde após
adição de L. casei antes (A e B) e após secagem à 45ºC sob vácuo (C e D) com
aumentos de 5.000 e 20.000 vezes...........................................................................50
x
FIGURA 14 – Microscopia eletrônica de varredura de: fibra de maçã após adição de
L. casei antes (A e B) e após secagem à 45ºC sob vácuo (C e D) e de inulina antes
(E) e após processo de secagem (F e G) com aumentos de 2.500 e 20.000
vezes..........................................................................................................................52
FIGURA 15 – Gráfico de superfície de resposta obtido após secagem de farinha de
banana verde com L. casei aderido, para as variáveis codificadas sacarose e
trealose, tendo como resposta a viabilidade do LC-1 em log de UFC/g....................54
FIGURA 16 – Gráfico de superfície de resposta obtido após secagem de farinha de
banana verde com L. casei aderido, para as variáveis codificadas sacarose e
trealose, tendo como resposta a viabilidade do LC-1 em log de
UFC/g.........................................................................................................................57
FIGURA 17 – Comportamento de lactobacillus casei aderidos ao farelo de aveia
armazenados por 28 dias, sob temperaturas de (▲) 10ºC, (■) 25ºC e (♦) 40ºC: (A)
sem tratamento e (B) tratado com 20g/L de sacarose e 0,4M de trealose................59
FIGURA 18 – Comportamento de Lactobacillus casei aderidos a farinha de banana
verde armazenados por 28 dias, sob temperaturas de (▲) 10ºC, (■) 25ºC e (♦) 40ºC:
(A) sem tratamento e (B) tratado com 20g/L de sacarose e 0,4M de trealose...........61
xi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Linhagens probióticas utilizadas por algumas empresas e seus
respectivos efeitos clínicos ......................................................................................21
TABELA 2 – Valores reais e codificados de adição de sacarose e trealose à farinha
de banana verde e os resultados da viabilidade do L. casei (LC-1).........................54
TABELA 3 – Valores reais e codificados do novo delineamento para a adição de
sacarose e trealose à farinha de banana verde e os resultados de viabilidade de L.
casei (LC-1)..............................................................................................................55
TABELA 4 – Valores reais e codificados de adição de sacarose e trealose ao farelo
de aveia e os resultados de viabilidade de L. casei (LC-1)......................................56
TABELA 5 – Média de duas repetições de análises realizadas em duplicatas dos
resultados obtidos para a umidade e pH, com e sem adição de sacarose e trealose,
durante o armazenamento de Lactobacillus casei aderido ao farelo de aveia, por 28
dias nas temperaturas de 10ºC, 25ºC e 40ºC...........................................................60
TABELA 6 – Média de duas repetições de análises realizadas em duplicatas dos
resultados obtidos para a umidade e pH, com e sem adição de sacarose e trealose,
durante o armazenamento de Lactobacillus casei aderido à farinha de banana
verde, por 28 dias nas temperaturas de 10ºC, 25ºC e 40ºC....................................62
TABELA 7 – Resultados obtidos para a atividade de água, com e sem adição de
sacarose e trealose, durante o armazenamento de Lactobacillus casei aderido ao
farelo de aveia e à farinha de banana verde e ao farelo de aveia, por 28 dias nas
temperaturas de 10ºC e 25ºC...................................................................................62
TABELA 8 – Sobrevivência média obtida para o L. casei, na forma livre e aderida
ao farelo de aveia, após diferentes tempos em simulação do trato gastrintestinal..64
TABELA 9 – Resultado obtido na análise de microrganismo patogênicos e
respectivos padrões microbiológicos exigidos pela legislação vigente para ‘farelo e
fibras de cereais, com ou sem mistura de farinhas’ encontrado no item 10 do anexo
I da Resolução RDC nº 12 da Anvisa.......................................................................65
xii
TABELA 10 - Médias de aceitação do teste de escala hedônica para as amostras
vitamina, vitamina adicionada de farelo de aveia e vitamina adicionada de farelo de
aveia com probiótico.................................................................................................66
xiii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................17
2.1 B
ACTÉRIAS
L
ÁCTICAS
(BAL)........................................................................................17
2.2 P
ROBIÓTICOS
.................................................................................................................19
2.3
F
IBRAS
A
LIMENTARES
.............................................................................................21
2.3.1 Inulina.....................................................................................................................23
2.3.2 Farinha de banana verde.....................................................................................25
2.3.3 Farelo de aveia......................................................................................................26
2.3.4 Fibra de maçã .......................................................................................................27
2.4 D
ESIDRATAÇÃO
..............................................................................................................29
2.4.1. Manutenção da Viabilidade celular....................................................................30
3 OBJETIVOS...........................................................................................................32
3.1 O
BJETIVO
G
ERAL
..........................................................................................................32
3.2 O
BJETIVOS
E
SPECÍFICOS
...............................................................................................32
4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................33
4.1 M
ICRORGANISMO
..........................................................................................................33
4.2 F
IBRAS
............................................................................................................................33
4.3 D
ETERMINAÇÃO DA FASE DE CRESCIMENTO
.................................................................33
4.4 O
BTENÇÃO DA BIOMASSA DE
LC-1 ...............................................................................34
4.5 A
DERÊNCIA DO MICRORGANISMO ÀS FIBRAS E PROCESSO DE DESIDRATAÇÃO
...........34
4.6 S
ELEÇÃO DAS
F
IBRAS
.....................................................................................................35
4.6.1 Determinação da viabilidade celular .......................................................................35
4.6.2 Análises Físico-Químicas ..........................................................................................35
4.7 M
ICROSCOPIA
E
LETRÔNICA
..........................................................................................36
4.8 A
VALIAÇÃO DOS EFEITOS DA SACAROSE COMO ESTRESSOR E DA TREALOSE COMO
PROTETOR CELULAR NA VIABILIDADE DO MICRORGANISMO ADERIDO ÀS FIBRAS
............36
4.9 A
VALIAÇÃO DURANTE ARMAZENAMENTO
....................................................................37
4.10 S
OBREVIVÊNCIA DO
LC-1
ADERIDO À FIBRA APÓS INCUBAÇÃO EM CONDIÇÕES
GASTRINTESTINAIS SIMULADAS
...........................................................................................37
4.10.1 Resistência à acidez .............................................................................................38
4.10.2 Resistência aos sais biliares.................................................................................38
4.11 A
NÁLISE
M
ICROBIOLÓGICA
........................................................................................38
4.12 A
NALISE
S
ENSORIAL
....................................................................................................39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................41
5.1 D
ETERMINAÇÃO DA FASE DE CRESCIMENTO
.................................................................41
5.2 S
ELEÇÃO DAS FIBRAS
.....................................................................................................42
5.3 M
ICROSCOPIA ELETRÔNICA
..........................................................................................45
5.4 A
VALIAÇÃO DOS EFEITOS DA SACAROSE COMO ESTRESSOR E DA TREALOSE COMO
PROTETOR CELULAR
............................................................................................................53
5.4.1 Farinha de banana verde......................................................................................53
5.4.2 Farelo de aveia.......................................................................................................55
5.5 A
RMAZENAMENTO
.........................................................................................................58
5.5.1 Farelo de aveia.......................................................................................................58
xiv
5.5.2 Farinha de banana verde......................................................................................61
5.6 S
OBREVIVÊNCIA DO
LC-1
ADERIDO À FIBRA APÓS INCUBAÇÃO EM CONDIÇÕES
GASTRINTESTINAIS SIMULADAS
...........................................................................................63
5.7
ANALISE MICROBIOLOGICA
...........................................................................................64
5.7 A
NÁLISE SENSORIAL
......................................................................................................65
6
CONCLUSÕES..................................................................................................68
REFERÊNCIAS.........................................................................................................69
ANEXOS....................................................................................................................77
15
1 INTRODUÇÃO
Alimentos funcionais são definidos como aqueles que contêm
substâncias que promovem efeitos benéficos à saúde, através da dieta normal, além
das necessidades nutricionais básicas. O consumo de alimentos funcionais pode
estar associado à prevenção dos riscos de algumas doenças crônicas porque em
sua composição são encontrados compostos bioativos, capazes de atuar como
moduladores dos processos metabólicos, prevenindo o surgimento de doenças
degenerativas.
Entre os compostos bioativos estão incluídos o betacaroteno, os
flavonoides, as fibras alimentares e os microrganismos probióticos, constituintes
normais dos alimentos ou adicionados a produtos industrializados.
As fibras alimentares normalmente são encontradas em alimentos
como frutas, verduras, legumes, grãos e cereais, que fazem parte da alimentação
humana diária. Apresentam como propriedade a capacidade de resistirem à ação
das enzimas digestivas humanas chegando intactas ao cólon, onde são
parcialmente hidrolisadas e fermentadas pela microbiota colônica. Diversos estudos
envolvendo fibras relatam seus benefícios para a saúde, tanto no tratamento como
na prevenção de doenças, como, diabetes, obesidade, constipação e câncer de
cólon.
Os microrganismos probióticos podem ser encontrados em
alimentos lácteos como iogurte e leites fermentados. Quando introduzidos no
sistema digestivo, através da alimentação, apresentam a capacidade de resistência
à acidez estomacal e à ação dos sais biliares, chegando à mucosa intestinal onde
ocorre a aderência e colonização. Os principais benefícios reportados pelo consumo
de alimentos contendo probióticos são a produção de vitaminas e enzimas digestivas
como a β-galactosidase, eliminação ou redução da ação de microrganismos
patogênicos, estímulo do sistema imune e alívio na constipação.
Uma alternativa para a manutenção dos microrganismos probióticos
no intestino é a promoção seletiva de bactérias benéficas através do consumo de
carboidratos indigeríveis. Estes compostos são chamados de prebióticos e
seletivamente estimulam a atividade ou o crescimento de bactérias benéficas no
cólon. Para tanto devem chegar ao intestino grosso e estimular o crescimento da
16
microbiota. Os produtos que contem probióticos e prebióticos são conhecidos como
simbióticos e a combinação de seus efeitos melhora a saúde pelo aumento dos
ingredientes alimentares funcionais.
Nos últimos anos, a diversidade de alimentos probióticos vem
aumentando significativamente no mercado e os probióticos podem ser encontrados
em leites não fermentados, sucos e cereais. Entretanto, há pouca informação sobre
a sobrevivência destes microrganismos em matrizes alimentares não lácteas,
tornando sua aplicação um grande desafio.
Considerando o crescente interesse dos consumidores por alimentos
com efeitos benéficos à saúde e a necessidade da indústria em diversificar os
alimentos funcionais, o objetivo do presente estudo foi o desenvolvimento de um
produto funcional composto de fibra alimentar desidratada contendo o probiótico
Lactobacillus casei (LC-1) aderido.
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
B
ACTÉRIAS
L
ÁCTICAS
(BAL)
As bactérias lácticas (BAL) foram descritas por Orla-Jensen (1919)
para nomear um grupo fisiológico de Gram-positivos que fermentam carboidratos a
ácido láctico ou a este e ácido acético, álcool e dióxido de carbono. Tem preferência
por condições não aeróbias porém, aerotolerantes, fermentadoras de carboidratos,
produtoras de ácido láctico, ácido tolerantes, não esporuladas e catalase negativas
(FULLER, 1992; VASILJEVIC; SHAH, 2008).
Dentre os principais gêneros,
destacam-se Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus e
Pediococcus. Alguns autores sugerem que o gênero Bifidobacterium pertença ao
grupo das bactérias lácticas, entretanto apresentam em seu DNA maiores
quantidades de conteúdo de pares de G+C (guanina-citosina) e assim diferenças
filogenéticas em relação aos outros gêneros (VASILJEVIC; SHAH, 2008).
Revisões taxonômicas destes gêneros sugerem que BAL
compreendem: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus, Weissella, Lactosphaera e Paralactobacillus (LEISNER et al., 2000).
BAL são subdivididas em dois grupos distintos com base no
metabolismo de carboidratos. O grupo das homofermentativas, que inclui
Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus e alguns Lactobacillus,
utilizam a via glicolítica para transformar a fonte de carbono principalmente em ácido
láctico. Já as heterofermentativas, que compreendem Leuconostoc, Weissella e
alguns Lactobacillus, produzem quantidades equimolares de lactato, CO
2
, etanol ou
acetato a partir da glicose utilizando a via fosfoquetolase (VASILJEVIC; SHAH,
2008).
Amplamente distribuídas, BAL tem sido utilizadas em todo o mundo
para melhorar a preservação, as características sensoriais e valor nutricional de uma
ampla variedade de produtos, como leite, carne e vegetais. Isso porque algumas
linhagens são capazes de converter açúcares, ácidos orgânicos, proteínas ou
gorduras em componentes de aroma e sabor e também podem contribuir para
18
melhorar a textura e a viscosidade de produtos fermentados por meio da síntese de
exopolissacarídeos (RUAS MADIEDO; HUGENHOLTZ; ZOON, 2002).
A maioria das bactérias do ácido láctico pertence ao gênero
Lactobacillus, que é heterogêneo, com variedades fenotípicas e propriedades
bioquímicas e fisiológicas diferenciadas (BERNARDEAU et al., 2007). Os
lactobacilos são os microrganismos probióticos mais conhecidos por causa da sua
associação com os populares produtos lácteos fermentados. O consumo destes
produtos, tais como o iogurte, é comumente associado a hábitos saudáveis.
Lactobacilos fazem parte da microbiota da boca, intestino delgado, cólon e vagina de
humanos (ELMER; MCFARLAND; MACFARLAND, 2007).
A fermentação de carboidratos pelos lactobacilos produz ácido
láctico, permitindo que os mesmos sobrevivam em ambientes ácidos, como o
estômago. Esta característica dá aos lactobacilos um nicho competitivo em
ambientes ricos em nutrientes e pode explicar, em parte, sua ação probiótica
(ELMER; MCFARLAND; MACFARLAND, 2007). A temperatura ideal de crescimento
está na faixa de 35-40ºC e pH 5,5-6,0, e compreendem diversas espécies
oficialmente reconhecidas, sendo as mais utilizadas para fins de aditivo dietético os
Lactobacillus acidophillus, L. rhamnosus e L. casei (PIMENTEL; FRANCKI;
GOLLÜCKE, 2005; BERNARDEAU et al, 2007).
Os L. casei são caracterizados por fermentar manitol, glicose,
galactose, manose, maltose e ribose e por não fermentar a rafinose e ramnose;
também por produzir L-lactato e apresentar forma de bastonetes curtos a longos,
com extremidades quadradas. São encontrados em leite, queijo, produtos lácteos de
maneira geral e em carnes. Formam dois tipos de colônias: disco ou lentes e, um
filamento que irradia para fora da colônia que aparece com a idade microbiana
(CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
Na imunoterapia, os L. casei são caracterizados por apresentar
capacidade de redução dos níveis de colesterol serico (BOTTAZZI, 1988), abrandar
sintomas da doença de Crohn, apresentar propriedades antimicrobianas e eficiência
contra diarréia provocada por rotavirus (ITSARANUWAT; AL-HADDAD; ROBINSON,
2003).
Além disso, alguns estudos têm demonstrado uma maior resistência
do L. casei em relação às outras espécies, quando submetido a situações de
19
estresse como secagem e desidratação (GARDINER et al., 2000) ou,
armazenamento sob baixas temperaturas (SENDRA et al., 2008).
2.2
P
ROBIÓTICOS
A palavra probiótico é derivada do grego e significa “em prol da
vida”. Seu significado foi utilizado pela primeira vez em 1953 por Kollath para
descrever a restauração da saúde por suplementos orgânicos e inorgânicos, em
pacientes subnutridos (VASILJEVIC; SHAH, 2008). Fuller (1992) redefiniu
probióticos como “um suplemento de microorganismos vivos que afeta
beneficamente o animal hospedeiro pelo melhoramento no seu balanço microbiano
intestinal”.
Embora ao longo dos anos, outros autores ofereceram suas versões,
a definição atualmente aceita é a sugerida pela FAO/WHO (2002), descrevendo
probiótico como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades
adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro. No Brasil, a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) define probióticos como microrganismos
vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos
benéficos à saúde do indivíduo (BRASIL, 2002).
Para a seleção de uma cultura microbiana como probiótica deve-se
verificar gênero, origem, patogenicidade, toxicidade, atividade metabólica,
propriedades intrínsecas, como resistência a antibióticos, segurança para o consumo
humano, sobrevivência em ambiente com baixo pH, tolerância à bile e capacidade
de adesão à mucosa intestinal. Além disso, a cultura deve estabilizar a microbiota
intestinal mantendo o ambiente desfavorável a patogênicos e ter a capacidade de
colonizar o trato gastrintestinal humano após sobreviver em produtos alimentares
durante o processamento e armazenamento (PIMENTEL; FRANCKI; GOLLÜCKE,
2005; MYERS, 2007; VASILJEVIC; SHAH, 2008).
Dentre as espécies de bactérias com propriedades probióticas estão
incluídas L. acidophilus, L. casei shirota, L. casei variedade rhamnosus, L. casei
variedade defensis, L. paracasei, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, B.
20
animalis (incluindo a subespécie B. lactis) B. longum, e Enteroccoccus faecium
(Brasil, 2007).
Os benefícios nutricionais dos alimentos contendo bactérias
probióticas e possíveis causas e mecanismos são: o aumento da motilidade no
intestino e alívio na constipação; melhora na digestibilidade com quebra parcial de
proteínas, gorduras e carboidratos; melhora no valor nutricional por elevação dos
níveis de Vitamina B e certos aminoácidos, como metionina, lisina e triptofano;
melhora na utilização da lactose por redução desta no produto e disponibilização da
lactase; ação antagonista a patogênicos entéricos com o controle de desordens,
como diarréia, colites, diverticulite e colites antibióticas pela acidificação, inibidores
microbianos e prevenção da adesão do patogênico. Além disso, colonização no
intestino pela sobrevivência ao ácido gástrico, resistência a lisozima, baixa tensão
superficial do intestino, aderência à mucosa intestinal, multiplicação no trato
intestinal e modulação do sistema imunológico; ação inibitória de alguns tipos de
câncer, em particular de cânceres do trato gastrointestinal pela degradação de pré-
carcinógenos em compostos inofensivos, redução de enzimas promotoras do câncer
e estímulo do sistema imune; ação hipocolesterolêmica por produção de inibidores
da síntese de colesterol ou uso do colesterol pela assimilação e precipitação com
desconjugação de sais biliares; e modulação imunológica por interação na formação
dos macrófagos, estímulo da produção de células supressoras de γ-interferon
(GOMES; MALCATA, 1999; SHAH, 2007).
Para manter os efeitos benéficos dos probióticos, a legislação
brasileira indica que a dose diária mínima deva ser de 10
8
-10
9
UFC, através de uma
ingestão de 100g de produto que contenha 10
6
-10
7
células viáveis por mL ou g
(BRASIL, 2007). Além disso, tais produtos devem ser consumidos regularmente
(GOMES; MALCATA, 1999).
A introdução de probióticos em alimentos é freqüente, embora sua
utilização apresente desafios quando em grande escala com relação à manutenção
da estabilidade e viabilidade durante armazenamento e uso (GIBSON, 2004/b). Na
Tabela 1 estão apresentadas algumas linhagens probióticas utilizadas por algumas
empresas e que estão disponíveis no mercado nacional e internacional, segundo
Typponen, Petaja e Mattila-Sandholm (2003) com adaptações.
21
Tabela 1: Linhagens probióticas utilizadas por algumas empresas e seus respectivos
efeitos clínicos
Linhagem Empresa /
País
Efeito clínico reportado
B. animalis
DN173010
Danone, Brasil Melhora o transito intestinal lento
L. acidophilus
La1
Néstle, Brasil Aderência às células intestinais
humanas, prevenindo aderência de
microrganismos patogênicos e
aumento da produção de anticorpos
L. rhamnosus
GG
Valio, Finlandia
Aderência às células intestinais
humanas, diminuição das atividades
enzimáticas fecais, prevenção da
diarréia, regulação da resposta imune,
prevenção e tratamento de alergias
alimentares.
L. johnsonii
La1
Nestlé, Suíça Regulação da microbiota intestinal,
melhora imunológica, coadjuvante no
tratamento de Helicobacter pylori.
L. casei
Shirota
Yakult, Japão Regulação da microbiota intestinal,
diminuição das atividades enzimáticas
fecais, prevenção da ocorrência de
câncer na superfície do trato urinário.
L. reuteri
SD2112
BioGaia, EUA Colonização do trato intestinal,
tratamento da diarréia.
L. plantarum
299V
Probi, Suécia Aderência às células intestinais
humanas, regulação da microbiota
intestinal.
B. lactis
Bb-12
Chr. Hansen,
Dinamarca
Tratamento/prevenção da diarréia,
regulação da microbiota intestinal,
melhora da constipação, regulação da
resposta imune, alivio dos sintomas da
alergia alimentar.
Fonte: Adaptado de TYOPPONEN
, PETAJA E MATTILA-SANDHOLM
, 2003
2.3 F
IBRAS
A
LIMENTARES
De acordo com a RDC nº 360 de 23 de janeiro de 2003, fibra
alimentar é qualquer material comestível que não seja hidrolisado pelas enzimas
endógenas do trato digestivo humano (BRASIL, 2003). Devido à porção da fibra que
é metabolizada a ácidos graxos voláteis no trato gastrointestinal, as fibras não
22
podem ser consideradas totalmente não disponíveis à nutrição humana
(CHARALAMPOPOULOS et al., 2002).
As fibras alimentares consistem em uma variedade de
polissacarídeos não amiláceos, que incluem a celulose, hemicelulose, inulina;
pectina, β-glucanas, gomas e lignina. As frutas, vegetais, cereais e legumes são os
alimentos mais ricos destes componentes, entretanto podem ser extraídos também
de fungos (GIBSON, 2004/a; SUGAWARA et al., 2004; FIGUEROLA et al., 2005).
Fibras alimentares dispõem de diferentes graus de solubilidade, aos quais estão
vinculadas diferentes funções gastrintestinais (ROBERFROID, 1993).
Considerando a solubilidade em água, as fibras classificam-se em
solúveis e insolúveis. As fibras solúveis caracterizam-se por formar géis e pela sua
capacidade de captar água. Ligam-se aos sais biliares no intestino, diminuindo sua
reabsorção, o que resulta em menos colesterol disponível no fígado para a síntese
de lipoproteínas. As fibras solúveis possuem também a propriedade de serem
fermentadas pelas bactérias colônicas dando origem a ácidos graxos de cadeia
curta, gás, água e energia, que, embora apresentem um efeito secundário,
contribuem também para o aumento do volume das fezes (PIMENTEL; FRANCKI;
GOLLÜCKE, 2005), e podem prolongar o esvaziamento gástrico e reduzir a
absorção de glicose (ROBERFROID, 1993). Alguns exemplos de fibras solúveis são
a pectina, hemicelulose, goma guar e a inulina (GIBSON, 2004/a).
As fibras insolúveis fazem parte da estrutura das células vegetais e
são encontradas principalmente em verduras, farelo de trigo e grãos integrais. Seus
principais efeitos metabólicos incluem aumento do volume e maciez das fezes,
aumento na freqüência da evacuação e diminuição do tempo de trânsito no cólon,
diminuição da constipação. Como são pouco fermentescíveis, retém água e
intensificam a proteção contra infecção bacteriana, entretanto não causam
mudanças significativas no metabolismo de carboidratos ou de lipídios
(ROBERFROID, 1993; PIMENTEL; FRANCKI; GOLLÜCKE, 2005).
Nos últimos anos, diversos pesquisadores vêm estudando a
interação entre fibras e bactérias probióticas. Segundo Saarela et al. (2006/b), além
das propriedades funcionais proporcionando uma melhora na saúde, as fibras
também podem agir tecnologicamente protegendo culturas probióticas em condições
de estresse como a liofilização, desidratação e armazenamento. Neste contexto
Sendra et al. (2008) obtiveram significativa melhora na sobrevivência de L. casei
23
durante 40 dias de estocagem a 4 ºC, quando 1% de fibras de frutas cítricas foram
adicionadas em leite fermentado e em Caldo MRS.
Algumas fibras alimentares são caracterizadas por apresentar efeito
prebiótico, que foram definidos como um “ingrediente alimentar não digerível que
afeta beneficamente o hospedeiro por estimular seletivamente o crescimento e/ou a
atividade de uma ou mais bactérias no cólon, e assim melhorar a saúde do
hospedeiro” (GIBSON, 2004/a).
De maneira geral, todos os oligossacarídeos e polissacarídeos que
apresentam atividade prebiótica são considerados fibras alimentares, mas nem
todas as fibras são alegadas como prebióticas (GIBSON, 2004/b). Um alimento
classificado como prebiótico não deve ser hidrolisado ou absorvido no intestino
delgado e deve ser metabolizado seletivamente, ao atingir o cólon, por número
limitado de bactérias benéficas, além de ser capaz de transformar a microbiota
colônica em uma microbiota saudável e de induzir efeito fisiológico importante para a
saúde. Dentre os ingredientes alimentares que melhor atendem a esses
requerimentos estão a inulina, frutooligossacarídeos (FOS), a β-glucana, amido
resistente e a lactulose (CHARALAMPOPOUS et al., 2002).
2.3.1 Inulina
A inulina é um carboidrato do grupo de polissacarídeos chamados
de frutanas. Apresenta grau de polimerização de 3 até mais de 60 unidades de
monômeros, principalmente de unidades de β-D-frutofuranosil, unidas entre si por
ligações β (2 → 1) e finalizadas com molécula de glicose (Figura 1). A fórmula
estrutural pode ser descrita como GFn, onde G representa a molécula de glicose, F
a molécula de frutose e n o número de unidades de frutose. Devido à sua
conformação estrutural, com ligações β (2-1), ambas, inulina e oligofrutose, resistem
a hidrólise pelas enzimas humanas digestivas, tendo propriedade importante de
fibras alimentares (ROBERFROID, 1993).
A Inulina é extraída de plantas de consumo freqüente tais como
como cebola, aspargos, trigo, banana, cebolinha, alho, mel, aveia, centeio e chicória
e sua concentração em cada planta depende muito da variedade, do tempo
24
decorrido desde a colheita até a utilização e das condições de estocagem
(ARAGON-ALEGRO et al., 2007).
Figura 1 - Estrutura química da inulina.
Fonte: ROBERFROID, (1993)
A inulina após extração e secagem, apresenta-se como um pó
branco, amorfo, higroscópico, com odor e sabor neutros. Tem densidade de
aproximadamente 1,35 e peso molecular de 1600 (HAULY; MOSCATO, 2002).
Na questão tecnológica, a alta solubilidade permite sua utilização em
leites e produtos lácteos. Devido às cadeias mais longas, a inulina possui a
capacidade de formar microcristais quando misturada à água e leite. Estes
microcristais interagem entre si para formar uma mistura cremosa e macia
promovendo a sensação de presença de gordura, sendo assim utilizada com
sucesso como substituta de gordura em recheios prontos, sobremesas congeladas e
molhos (NINESS, 1999; MONTAN, 2003).
Gibson et al. (1995) apud Gibson (2004/a), demonstraram que a
administração de inulina e oligofrutoses aumenta significativamente o número de
bactérias fecais produtoras do ácido lático, diminuindo o pH fecal e criando um
25
microambiente bactericida para bactérias putrefativas, desenvolvendo assim um
ambiente favorável à bactérias benéficas. Sob o mesmo aspecto Hond, Geypens e
Ghoos (2000) mostraram que o consumo de inulina pode aumentar a frequência e o
peso fecal, diminuindo os problemas com a constipação intestinal. Adicionalmente,
existem relatos de que a suplementação com inulina ou oligofrutose pode aumentar
a absorção de cálcio e magnésio no organismo (BROMMAGE et al., 1993; OHTA et
al., 1995)
.
Para a obtenção dos benefícios desejados, a ingestão média
recomendada para os humanos é estimada em 1 - 10 g / dia (VANLOO et al., 1995).
2.3.2 Farinha de banana verde
As frutas são importantes fontes de fibras solúveis e insolúveis e a
banana é uma das frutas mais consumidas no mundo, (
CORDENUNSI; SHIGA;
LAJOLO, 2008)
, sendo o Brasil um dos líderes mundiais de produção e consumo
(LEITE; MANCINI; BORGES, 2007).
A banana é um alimento altamente energético (cerca de 100kcal por
100g de polpa) com uma rica composição nutricional, composta de carboidrato rico
em fósforo (27%), apresentando regulares teores de cálcio, ferro, cobre, zinco, iodo,
manganês, cobalto, vitamina A, B1, B2 e vitamina C, além de ser considerado uma
das principais fontes de potássio para o consumo humano (ZAIDAN, et al., 1999;
LIMA; NEBRA; QUEIROZ, 2000). A banana também contém frutooligossacarideos
(FOS), que apresenta efeitos benéficos à saúde pelo estímulo ao crescimento de
bactérias lácticas no cólon humano, pela supressão de patógenos e pela redução
das concentrações de colesterol sérico (TSEN; LIN; KING, 2004).
Rabani et al. (2001) em estudo realizado com 62 crianças que
apresentavam quadro de diarréia, observaram redução no volume e melhora na
qualidade das fezes em 82% dos casos, além de redução da duração da
enfermidade, quando banana verde em pasta foi administrada junto com a dieta
Devido às dificuldades encontradas como sua alta perecibilidade, a
exportação in natura torna-se bastante difícil, sendo a industrialização uma
alternativa promissora para o aproveitamento integral da fruta, sem a perda das
26
qualidades nutricionais (NETO et al., 1998). Dentre os produtos de banana mais
conhecidos destacam-se purê, farinha, chips, enlatados, geléia, banana passa,
vinagre, vinho e suco (TSEN; LIN; KING, 2004).
A farinha de banana verde é um empreendimento bastante
promissor, podendo ser utilizada em vários setores industriais (NETO et al., 1998).
Para a produção da farinha, as bananas são lavadas em água corrente,
descascadas, cortadas em tiras finas, secas em forno ou ao sol, trituradas e, por fim,
peneiradas até a granulometria desejada (BARRET; SOMOGYI; RAMASWAMY,
2005).
Segundo estudo realizado por Juarez-Garcia et al. (2006), a farinha
de banana verde apresenta, em média, na sua composição 73,4% do conteúdo total
de amido, 17,5% de amido resistente e um nível de 14,5% de fibra dietética,
entretanto estes valores podem sofrer variações dependendo de fatores como o
estágio de maturidade da fruta e as diferentes características dos cultivares
(
RODRÍGUEZ-AMBRIZ et al., 2008).
No estudo de Fasolin et al. (2007) entre os
principais minerais encontrados na farinha de banana verde estão o fósforo
(190mg/100g de farinha), o potássio (158mg/100g de farinha) e o cálcio
(156mg/100g de farinha).
O amido resistente tem sido reconhecido como uma fibra funcional,
apresentando um importante papel na fisiologia digestiva. Similares aos
oligossacarídeos, especialmente frutooligossacarídeos, passa pela digestão e
fornece carboidratos fermentescíveis para as bactérias colônias
(CHARALAMPOPOUS et al., 2002).
2.3.3 Farelo de aveia
A aveia (Avena Sativa L.) é um cereal de excelente valor nutricional,
destacando-se dentre os outros cereais por apresentar um alto teor e qualidade
protéica, que varia de 12,40 a 24,50% no grão descascado, e por sua maior
porcentagem de lipídios, que variam de 3,01% a 10,90%, além de conter
aminoácidos, vitaminas e sais minerais distribuídos por todo o grão (SÁ et al., 2000).
O farelo de aveia consiste na camada mais externa do grão, que
27
contém a maior parte da fibra alimentar. De acordo com Wood (1993) para consumo
humano as indústrias que processam aveia produzem o farelo obtido pela moagem
da aveia e posterior separação da farinha por peneiragem e aspiração.
A porcentagem de fibra total encontrada na aveia varia entre 7,1% a
12,1%, sendo a variação em decorrência de diferenças entre cultivares e do método
de determinação utilizado. No farelo, o conteúdo de fibra alimentar é de 15% a 19%,
dentre estes 34% a 48% são fibras solúveis e o restante insolúveis (SHINNICK et al.,
1988).
Os principais componentes da fibra de aveia solúvel são as β-
glucanas, polissacarídeos lineares não ramificados, compostos por unidade de
glicose β-D-glicopiranosil unidas por ligações β- (1→3) e β- (1→4). São atribuídos à
β-glucana os principais efeitos fisiológicos da aveia (MALKKI; VIRTANEN, 2001). A
aveia apresenta em média entre 4,0% e 5,5% de β-glucanas, sendo o cultivar e as
condições climáticas os fatores de variações (SÁ et al., 2000).
Dentre os benefícios fisiológicos observados pelo consumo de aveia
e, conseqüentemente, β-glucana, destaca-se a redução no risco de doenças
crônicas como a diabetes e doenças do coração (WOOD; BEER, 1998).
A ação da β-glucana se dá pela alteração do metabolismo e
secreção de ácidos biliares, modificação das concentrações de ácidos graxos de
cadeia curta, diminuição da absorção de lipídios, modificação nos níveis de
hormônios pancreáticos e gastrointestinais. Além disso, ação na absorção e digestão
de proteínas e amido, ação sobre a saciedade, auxílio no combate à constipação
intestinal, efeito prebiótico, entre outros (WOOD; BERR, 1998; MALKKI; VIRTANEM,
2001).
2.3.4 Fibra de maçã
A maçã é reconhecidamente importante para a saúde humana,
devido ao conteúdo de compostos bioativos promotores de benefícios para o
consumidor regular. Dentre os compostos bioativos da maçã encontram-se os
polifenóis com função antioxidante, as pectinas e ácidos que promovem o equilíbrio
do transito gastrointestinal (
NEVES, 2005
). Devido à associação de suas fibras com
28
estes compostos, as fibras obtidas de maçã e de frutas cítricas, são consideradas
com qualidade superior à de outras fibras (FIGUEROLA et al., 2005).
Excelente fonte de fibras, com uma proporção bem balanceada entre
as frações solúveis e insolúveis, a maçã ajuda a reduzir níveis de colesterol no
sangue, reduzir a absorção de glicose e, por absorver quantidades de água no trato
intestinal, ajuda a prevenir a prisão de ventre (FIGUEROLA et al., 2005;
RUPASINGHE et al., 2008).
O principal subproduto do processamento da maçã, o bagaço,
representa de 20 a 40% da matéria-prima em função do nível tecnológico adotado.
Trata-se de um material altamente instável do ponto de vista microbiológico, com
elevado conteúdo de compostos fermentescíveis, e seu descarte pode acarretar
forte impacto ambiental. Entretanto, é excelente para fins biotecnológicos, como para
a produção de etanol, aromas, gás natural, ácido cítrico, pectinas e enzimas, além
de outros processos como extração de fibras e carvão vegetal (FERTONANI et al.,
2006).
Algumas propostas visando aproveitar a matéria sólida produzida
nas unidades industriais de maçã vêm sendo estudadas para aproveitamento como
ingrediente de alimentos formulados, produtos para panificação e outros (RAUPP et
al., 2000; RUPASINGHE et al., 2008). Conforme Rupasinghe et al. (2008) a casca
de maçã em pó possui 40% de fibra alimentar, sendo 10% fração insolúvel e 30 % a
fração solúvel.
As pectinas, substâncias coloidais de cadeias de ácido D-
galacturônico unidos por ligações glicosídicas α (1→4) (DENÉS et al., 2000) tem
efeitos fisiológicos e nutricionais, importantes para a saúde e a nutrição humana.
Algumas destas funções são determinadas pela estrutura química, enquanto outras
estão mais relacionadas a propriedades físicas. As pectinas são fibras alimentares,
pois não são digeríveis pelas enzimas produzidas pelos humanos e, embora não
seja absorvida pelo trato gastrointestinal, as pectinas podem ser fermentadas pela
microbiota colônica em dióxido de carbono (CO
2
), metano (CH
4
), hidrogênio (H
2
) e
ácidos graxos de cadeia curta, principalmente acetato, propionato e butirato (WANG;
PAGÁN; SHI, 2002).
29
2.4
D
ESIDRATAÇÃO
A maioria das culturas probióticas líquidas e congeladas necessitam
da cadeia do frio para armazenamento e distribuição, aumentando assim custos na
difusão de sua utilização. Entretanto a necessidade de baixa temperatura pode ser
reduzida ou eliminada através do uso de desidratados em pó, os quais são
potencialmente superiores aos produtos no estado líquido e ou congelado, no que
diz respeito à esterilidade e estabilidade (MENG et al., 2007).
A desidratação é freqüentemente utilizada como um meio para
estabilizar os probióticos e assim facilitar a estocagem, manuseio, transporte e
subseqüente uso e aplicações em alimentos funcionais. Porém, algumas culturas
desidratadas apresentam viabilidade mais baixa quando comparada às culturas
congeladas (SANTIVARANGKA; KULOZIK; FOERST, 2008/a).
A liofilização e a secagem em spray são as técnicas mais
conhecidas para a desidratação de culturas probióticas e lácticas. Entretanto, a
liofilização é a técnica mais difundida e utilizada por apresentar condições de
processo mais brandas do que na secagem por spray (MENG et al., 2007). Alguns
autores também citam o uso de estufa para a desidratação de produtos impregnados
com células bacterianas (BETORET et al., 2003) e comparado à liofilização, a
secagem por condução de calor é uma alternativa econômica para a preservação de
microrganismos (LINDERS et al., 1997).
Os mecanismos de inativação celular durante o processo de
secagem ainda não estão completamente elucidados, entretanto sabe-se que as
células bacterianas contêm cerca de 70 a 95% de água, e sua remoção impõe
obstáculos fisiológicos às células. Isto porque as moléculas de água contribuem para
a estabilidade das proteínas, DNA e lipídios além de conferir ordem estrutural às
células (SANTIVARANGKNA; KULOZIK; FOERST, 2008/a).
Lievense et al. (1994), estudaram o mecanismo de desidratação de
células de L. plantarum após a secagem a vácuo, sob a hipótese de que a enzima
DNase difunde-se para o interior da célula quando há dano na membrana celular.
Em conclusão relataram que os mecanismos de inativação celular por desidratação
e pelo emprego de temperatura são diferentes, e que a inativação por desidratação
causa danos maiores na membrana que a inativação térmica acima de 60ºC.
30
Para a produção de alimentos secos, a maioria dos métodos de
secagem envolve a passagem de ar aquecido, com umidade relativa controlada
sobre o alimento a ser desidratado, que pode estar parado ou em movimento. Em
função de sua maior disponibilidade, o ar é o meio mais utilizado na secagem de
alimentos e o seu controle também não apresenta maiores dificuldades (LINDERS et
al., 1997).
Dentre os vários métodos de secagem, a secagem a vácuo é
utilizada por permitir trabalhar a pressões baixas com temperaturas moderadas
menores que 100ºC, obtendo-se maiores taxas de evaporação da umidade e um
produto final de melhor qualidade, se comparado com a secagem tradicional com ar
quente (KROKIDA; ZOGZAS; MAROULIS, 1997). Adicionalmente, não necessita do
congelamento prévio do produto como na liofilização (SANTIVARANGKNA;
KULOZIK; FOERST, 2006), tornando sua utilização uma interessante alternativa
para a produção de alimentos desidratados.
2.4.1. Manutenção da Viabilidade celular
Uma variedade de protetores celulares, ou chamados solutos
compatíveis, podem ser adicionados ao meio para manter a viabilidade do
organismo probiótico durante o congelamento e/ou secagem. Este fenômeno,
chamado de anidrobiose, tem recebido a atenção de muitos pesquisadores, onde
carboidratos como a trealose, sacarose, glicose e lactose, são adicionados ao
substrato antes da fermentação, para auxiliar na adaptação dos probióticos ao
ambiente, ou são misturados diretamente com a biomassa bacteriana previamente
ao processo de secagem (CAPELA; HAY; SHAH, 2006; SANTIVARANGKNA;
KULOZIK; FOERST, 2006).
Os protetores podem agir de diversas maneiras de acordo com a
sua natureza. Estes mecanismos de proteção incluem estabilização dos constituintes
da membrana celular, formação de uma cobertura de proteção na proteína da
parede celular, aumento na temperatura de transição vítrea e formação de
interações fortes entre o protetor e a biomolécula, além disso, preparam as células
para o estresse hiperosmótico que ocorre durante o processo de secagem (MENG et
31
al., 2007; SANTIVARANGKA; KULOZIK; FOERST, 2008/b). Como o protetor é
acumulado dentro da célula, a diferença osmótica do ambiente interno e externo é
reduzida (CAPELA; HAY; SHAH, 2006). Dentre os protetores os mais utilizados
estão leite em pó desnatado, proteínas do soro, trealose, glicerol, betaína, adonitol,
sacarose, glicose, lactose e polímeros como a dextrana e o polietileno glicol (MENG
et al., 2007).
A trealose (α-D-glicopiranosil, α-D-glicopiranosídio) é um
dissacarídeo não redutor sintetizado por organismos procarióticos e eucarióticos,
sendo encontrado em leveduras, bactérias, mofos, algas, plantas e insetos
invertebrados (CONRAD et al., 2000). A ação deste açúcar se dá como um agente
de proteção das membranas celulares dos organismos durante condições de
estresse ambiental como tratamento térmico, desidratação e congelamento
(LINDERS et al., 1997; CONRAD et al., 2000; ZAYED; ROOS, 2004). Segundo
Ferreira et al. (2005) e Tymczszyn et al. (2007), uma maneira de efetivar o efeito do
protetor celular é induzir o acumulo dos solutos compatíveis pela célula, através da
adição de estressores ao meio de crescimento.
Além do uso de solutos compatíveis e açucares protetores, estudos
como o de Teixeira et al.(1997) e Corcoran et al. (2004) têm demonstrado a
influência de fatores da fisiologia celular e de condições de estocagem na
manutenção da viabilidade da bactéria probiótica durante a desidratação. Como
exemplos destes fatores estão a aplicação de condições de estresse suave antes da
desidratação, a fase de crescimento à qual a bactéria é submetida ao processo; a
composição do meio de crescimento, modificação genética das linhagens
probióticas; umidade relativa e a temperatura no armazenamento (MENG et al.,
2007; SANTIVARANGKA et al., 2008/b).
Dessa forma o emprego de protetores celulares e estressores pode
ser uma alternativa para aumentar a viabilidade de bactérias lácticas adicionadas a
alimentos a serem desidratados.
32
3 OBJETIVOS
3.1
O
BJETIVO
G
ERAL
Desenvolver um produto simbiótico vegetal desidratado, para ser
adicionado diretamente a alimentos, que atenda a quantidade mínima exigida pela
legislação vigente para produtos contendo fibras e probióticos.
3.2
O
BJETIVOS
E
SPECÍFICOS
Investigar a viabilidade de L. casei aderidos à farinha de banana
verde, farelo de aveia, fibra de maçã ou inulina submetidos à secagem a vácuo a
45ºC selecionando aquelas que permitam maior viabilidade celular;
Verificar por microscopia eletrônica a aderência do microrganismo
probiótico às fibras e a morfologia celular;
Avaliar o efeito da sacarose como estressor e da trealose como
protetor celular na viabilidade do Lactobacillus casei aderido a fibras;
Acompanhar a viabilidade do probiótico aderido às fibras que
apresentarem maior sobrevivência, com e sem adição do protetor e do estressor, por
28 dias, estocados nas temperaturas de 10ºC, 25ºC e 40ºC.
Estudar a sobrevivência do probiótico aderido à fibra durante
simulação do sistema gastrintestinal.
Adicionar o produto simbiótico a uma vitamina comercial e verificar
as diferenças sensoriais e aceitação pelos consumidores.
33
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 M
ICRORGANISMO
A cultura liofilizada de Lactobacillus casei (LC-1) foi gentilmente
cedida pela Christian Hansen (Valinhos, São Paulo, Brasil) para realização do
trabalho.
4.2
F
IBRAS
As matérias-primas utilizadas na presente pesquisa, denominadas
como “fibras”, foram: farinha de banana verde de variedade Musa spp. obtida
diretamente da empresa fabricante ROSITOS, contendo 9% de fibras (anexo A), o
farelo de Aveia (Oat Bran) fornecido pela empresa SL Alimentos, contendo mínimo
de 16% de fibras e 9-10% de β-glucana (anexo B), a fibra de maçã (Vitacel® AF
400) fornecida pela empresa Clariant, contendo 45% de fibras insolúveis e 15% de
solúveis das quais 9,3% são pectina (anexo C) e a Inulina (Beneo® GR – Marca
Orafti®) fornecida pela empresa Clariant contendo mais que 90% de inulina (anexo
D).
4.3
D
ETERMINAÇÃO DA FASE DE CRESCIMENTO
Partindo da cultura liofilizada, uma alçada do LC-1 foi inoculada em
Caldo Man Rogosa Sharp (MRS, Marca HIMEDIA) estéril e incubado a 37ºC por 18
horas. Decorrido este tempo, 1% (v/v) do pré-inoculo foi transferido para 100mL de
Caldo MRS estéril e o crescimento acompanhado por 48 horas. A determinação da
cinética de crescimento foi realizada em alíquotas retiradas nos tempos 0, 4, 6, 8, 9,
34
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 24 e 48 horas de crescimento, por contagem
em placas utilizando Agar MRS estéril e incubação a 37ºC por 48h.
4.4
O
BTENÇÃO DA BIOMASSA DE
LC-1
Para ativação da cultura liofilizada de LC-1, uma alçada foi inoculada
em 5mL de caldo MRS (HIMEDIA) e incubada a 37ºC por 15h. Decorrido este
tempo, 1% (v/v) foi novamente inoculado em 10mL de caldo e incubado a 37ºC, 15h
(pré-inóculo). Para obtenção da biomassa, 1% (V/V) do pré-inóculo foi transferido
para 300mL de caldo MRS e re-incubado nas mesmas condições. A biomassa foi
separada por centrifugação em centrífuga refrigerada (Eppendorf) a 14000g (10.000
rpm)10 min, 4ºC e lavada três vezes com solução salina 0,85% (p/v) estéril conforme
Zayed e Roos (2004) com modificações.
4.5
A
DERÊNCIA DO MICRORGANISMO ÀS FIBRAS E PROCESSO DE DESIDRATAÇÃO
A biomassa lavada foi ressuspendida em solução salina estéril
0,85% (p/v) em quantidade suficiente para homogeneização de 10g de cada uma
das fibras estudadas, sendo 6mL para inulina, 10mL para farelo de aveia, 11mL para
farinha de banana verde e 25 mL para fibra de maçã.
As amostras homogeneizadas foram mantidas à temperatura
ambiente durante 1h para aderência do LC-1 às fibras, conforme Saarela et al.
(2006/b). Após este período o pH da farinha de banana verde, fibra de maçã e
inulina foi ajustado para 5,5-6,0 com solução saturada de bicarbonato de sódio.
A secagem foi conduzida em estufa a vácuo (Quimis), a 45ºC até
aproximadamente 5,6 ± 1% de umidade (ZAYED e ROOS, 2004), que corresponde a
aproximadamente 25h para farinha de banana verde e farelo de aveia, 30h para a
fibra de maçã e 12h para inulina.
35
4.6
S
ELEÇÃO DAS
F
IBRAS
4.6.1 Determinação da viabilidade celular
Uma amostra de 1g de fibra seca com o LC-1 aderido foi reidratada
em 9mL de água peptonada 0,1% (p/v) estéril e mantida por 20 minutos a 37ºC com
agitação ocasional (SANTIVARANGKNA et al., 2006). Posteriormente, foram
realizadas diluições decimais adicionais em água peptonada 0,1% e inoculadas em
agar MRS, seguida de incubação a 37ºC por 72h (GARDINER et al., 2000). O
número de células viáveis foi determinado por contagem em placas antes e depois
da secagem
Para verificar as fibras que obtiveram maior sobrevivência celular
após a secagem, foi calculado o percentual de células recuperadas segundo
equação 1 (CORCORAN et. al. 2004):
% Células Recuperadas = log UFC/g final x 100 (Eq. 1)
log UFC/g Inicial
Onde: Log UFC/g final = contagem do número de células viáveis do L. casei aderido
às fibras logo após secagem;
Log UFC/g inicial = contagem do número de células viáveis do L. casei
aderido às fibras imediatamente antes da secagem.
O experimento foi conduzido com duas repetições genuínas em
duplicata e os resultados submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e teste de
Tukey, com significância de p≤0,10, analisados no programa computacional
Statistica 7.0.
4.6.2
Análises Físico-Químicas
Análises de pH, atividade de água (Aw) e umidade foram realizadas
em duplicatas após secagem de cada uma das fibras. O pH e o teor de umidade
36
foram determinados conforme normas oficiais do Instituto Adolfo Lutz (1985), e a Aw
mensurada diretamente no equipamento Aqualab CX-2.
4.7
M
ICROSCOPIA
E
LETRÔNICA
Para as análises de microscopia eletrônica de varredura, o material
foi fixado em glutaraldeído 3%, paraformaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio
0,1M pH 7,2, por um período de 12h a temperatura ambiente. Após a fixação
primária, as amostras foram lavadas em três banhos de tampão cacodilato de sódio,
pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio 1% no mesmo tampão por 2h à
temperatura ambiente e novamente lavadas em tampão. Em seguida o material foi
desidratado em série alcoólica crescente e seco ao ponto crítico no CPD 030 critical
point dryer (BAL-TEC AG, Balzers, Liechtenstein). As amostras secas foram
montadas em stubs de alumínio usando fita de carbono e cobertas com ouro
(Sputter coater – Baltec SCD 050). As imagens foram obtidas utilizando o
microscópio eletrônico de varredura FEI – Quanta 200 do Laboratório de Microscopia
Eletrônica e Microanálise da Universidade Estadual de Londrina (LMEM/ PPPG-
UEL).
4.8
A
VALIAÇÃO DOS EFEITOS DA SACAROSE COMO ESTRESSOR E DA TREALOSE COMO
PROTETOR CELULAR NA VIABILIDADE DO MICRORGANISMO ADERIDO ÀS FIBRAS
Nas fibras que permitiram a recuperação do maior número de
células viáveis de LC-1 conforme item 4.6, os efeitos da sacarose como estressor e
o da trealose como protetor celular, foram avaliados conforme planejamento fatorial
2 x 3 realizado no programa Statística 7,0. Em ensaios aleatórios foram estudadas
as concentrações de sacarose de 10g e 20g por litro de Caldo MRS, e de 0,1M,
0,25M e 0,4M para trealose (dados baseados na literatura). Previamente, as
diferentes concentrações de ambos os açúcares foram esterilizadas em filtro de
porosidade de 0,2 µm e diâmetro de 47 mm (Marca Schleicher & Schuell).
37
As soluções esterilizadas de sacarose (Marca Synth) foram
adicionadas ao caldo MRS estéril durante o cultivo celular. A trealose, com grau de
pureza maior que 98%, (cedida pela empresa Tovani Benzaquen com. Imp. Exp. e
Representações Ltda) foi adicionada à biomassa centrifugada e a mistura mantida
por 1 hora em temperatura ambiente (CONRAD et al., 2000). Após este tempo, a
mistura de biomassa e solução de trealose foi adicionada às fibras e homogeneizada
seguindo-se de secagem à vácuo a 45ºC por 25 horas. A viabilidade do LC-1 foi
determinada por contagem em placas com agar MRS e incubação por 72h à 37ºC
(GARDINER et al., 2000) e os resultados analisados com auxílio do programa
Statistica 7.0.
4.9
A
VALIAÇÃO DURANTE ARMAZENAMENTO
A estabilidade a 10ºC, 25ºC e 40ºC foi acompanhada durante 28
dias de armazenamento, em amostras sem adição de sacarose e trealose e com
adição nas concentrações que permitiram a recuperação do maior número de
células viáveis conforme item anterior. Porções de 10g do produto seco foram
embaladas em saches de BOPP metalizados hermeticamente selados. Análises de
viabilidade celular, pH, atividade de água (Aw) e umidade foram conduzidas a cada
7 dias, em duplicatas para cálculo da média de duas repetições dos tratamentos e o
gráfico foi plotado pelo programa computacional Microsoft Excel 2003.
4.10
S
OBREVIVÊNCIA DO
LC-1
ADERIDO À FIBRA APÓS INCUBAÇÃO EM CONDIÇÕES
GASTRINTESTINAIS SIMULADAS
Para a análise em condições gastrintestinais simuladas, a
resistência ao suco gástrico e intestinal foi realizada separadamente, em células
livres (controle) e aderidas ao farelo de aveia (fibra selecionada conforme itens 4.6 e
4.9), com e sem adição de estressor e protetor, em duplicatas com duas repetições,
38
seguindo-se o procedimento descrito por Krasaekoopt, Bhandari e Deeth (2004) com
modificações.
4.10.1 Resistência à acidez
Para o teste de tolerância ao ácido, 1mL do microrganismo cultivado
em Caldo MRS por 15 horas (controle) ou 1g do simbiótico desenvolvido (farelo de
aveia com LC-1 aderido), foi colocado em tubos com 9mL de solução estéril de HCl
0,08M contendo 0,2% de NaCl, pH 1,55, por 30, 60, 90 e 120 minutos e incubados a
37ºC. Após este período foram realizadas contagens em Agar MRS.
4.10.2 Resistência aos sais biliares
No teste de resistência aos sais biliares, 1mL do microrganismo
cultivado em Caldo MRS por 15 horas (controle) ou 1g do simbiótico foi transferido
para tubos contendo 9mL de suco intestinal simulado esterilizado (0,05M KH
2
PO
4
contendo 0,6% de sais biliares, pH 7,4) e incubados por 150 minutos a 37ºC. A
sobrevivência do LC-1 foi determinada por contagem em placas utilizando Agar
MRS.
4.11
A
NÁLISE
M
ICROBIOLÓGICA
Para garantir as condições microbiológicas e a segurança do
produto a ser oferecido aos provadores, análises de Staphylococcus aureus, bolores
e leveduras, Salmonella spp, Bacillus cereus, coliformes totais e coliformes à 45ºC,
foram realizadas segundo Silva et al. (2001).
39
4.12
A
NALISE
S
ENSORIAL
Como o produto formulado é destinado à adição imediata em
alimentos prontos para o consumo, para a realização dos testes sensoriais, foi
utilizado como veículo uma vitamina comercial em pó (Neston Vitamina sabor
mamão, maçã e banana, Nestlé®) preparada com leite integral UHT (CATIVA)
conforme instruções do fabricante, sendo 30g de vitamina em pó adicionadas a
200mL de leite.
Previamente à realização dos testes sensoriais, o projeto foi
submetido ao “Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da
Universidade Estadual de Londrina/Hospital Regional Norte do Paraná”, obtendo
como parecer “aprovado” (Protocolo nº 221/07) (Anexo E).
Para atender o consumo diário recomendado pelo Ministério da
Saúde do Brasil – ANVISA (BRASIL, 2007), para alimentos contendo probiótico e
fibra alimentar, deve-se adicionar 12g do simbiótico desenvolvido em 200mL de
vitamina. Seguindo esta proporcionalidade, os testes sensoriais foram conduzidos
adicionando 40mL das formulações em copos plásticos brancos codificados com
número de três dígitos aleatórios, aos quais foram oferecidas aos julgadores,
acompanhadas de água mineral.
Para verificar a existência de diferença entre uma amostra controle
(vitamina + farelo de aveia) e a amostra testada (vitamina + farelo de aveia com
probiótico), foi aplicado um teste triangular, com uma equipe treinada de 20
julgadores, utilizando ficha conforme Figura 2.
A aceitabilidade da vitamina, da vitamina adicionada de farelo de
aveia e da vitamina adicionada do produto probiótico, foi determinada realizando-se
o teste de aceitação com 51 provadores não treinados, utilizando escala hedônica
estruturada de nove pontos (Figura 3) e apresentação seqüencial das amostras. A
partir dos resultados, foi aplicada análise de variância (ANOVA), sendo p<0,05, e
calculados os índices de aceitação pelo programa computacional SAS 8.0.
40
TESTE TRIANGULAR
Nome:..................................................................................Data:.........................
Por favor, anote os códigos das amostras de vitamina, avalie-as da esquerda para a
direita e, assinale qual das três considerou diferente em relação a cor, textura ou odor e, se
desejado, faça comentários sobre as diferenças percebidas.
Comentários:
....................................................................................................................
.............................................................................................
Figura 2: Ficha teste triangular
TESTE DE ACEITAÇÃO
Nome:................................................................................. Data: ........................
Por favor, avalie a amostras de vitamina utilizando a escala abaixo, para dizer o quanto
gostou ou desgostou do produto e, se desejado, faça comentários sobre ele.
1- Desgostei muitíssimo
2- Desgostei muito
3- Desgostei
4- Desgostei ligeiramente
5- Não gostei nem desgostei
6- Gostei ligeiramente
7- Gostei
8- Gostei muito
9- Gostei muitíssimo
Código da amostra ________________ Nota ____________
Comentários:...............................................................................................................................
....................................................................................................................................................
.......................................................................................................................
Figura 3: Ficha teste de aceitação utilizando escala hedônica
41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1
D
ETERMINAÇÃO DA FASE DE CRESCIMENTO
Na figura 4 está apresentada a curva de crescimento do LC-1 em
48h de cultivo. No período que compreende 0 e 4 h, o LC-1 encontrava-se na fase
lag, de adaptação ao meio de cultivo, entre 5 e 13 h em sua fase de crescimento
exponencial ou log, na qual as células dividem-se ao máximo e entre 14 e 17 h o LC-
1 encontrava-se na fase estacionária, onde a velocidade de crescimento diminui até
que o número de células novas iguala-se ao de células mortas. A partir de 19 h de
cultivo, pode ser visualizada (Figura 4) a fase de morte celular, onde o LC-1
encontrava-se em declínio (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Curva de crescimento de
Lactobacillus casei e
m
Caldo MRS
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Tempo (horas)
Log UFC/g ou mL
Figura 4
: Curva de crescimento do Lactobacillus casei cultivado por 48 horas
em Caldo MRS a 37ºC
.
Quando uma bactéria entra em sua fase estacionária desenvolve
uma resistência geral ao estresse, sendo assim, mais resistente ao processamento e
armazenamento do que em sua fase log. Isto ocorre devido a exaustão das fontes
disponíveis de alimento que desperta uma resposta ao estresse e permite a
sobrevivência da população celular (MENG et al., 2007).
42
Neste contexto, Corcoran et al. (2004) submeteram células de L.
rhamnosus a secagem por spray-dryer, nas fases lag, log e estacionaria e obtiveram
50% de recuperação celular durante a fase estacionária, que foi superior à
recuperação da fase log (14%) e, da fase lag, (2%), onde as células demonstraram a
maior susceptibilidade. Dessa forma para o desenvolvimento do produto proposto no
presente estudo foi eleito o tempo de 15 h de cultivo do LC-1 com base nas
características de crescimento do L. casei em Caldo MRS a 37ºC.
5.2
S
ELEÇÃO DAS FIBRAS
As fibras utilizadas no presente estudo foram selecionadas com
base em seus possíveis efeitos prebióticos, que por favorecerem o crescimento dos
microrganismos beneficos no intestino (RASTALL; MAITIN, 2002), supostamente
poderiam auxiliar em sua sobrevivência durante e após a secagem.
Em ensaios preliminares foi constatado que na farinha de banana
verde, fibra de maçã e inulina, todas com valores de pH inferiores a 4,0 (dados não
mostrados), a sobrevivência do LC-1 após o processo de secagem foi baixa. Por
outro lado, no farelo de aveia cujo pH final ficou próximo de 5,7 a viabilidade celular
foi maior. Assim sendo, com exceção do farelo de aveia, foi realizado um ajuste de
pH para 5,5-6,0 com solução saturada de bicarbonato de sódio antes do processo
de secagem das fibras.
A figura 5 mostra as médias percentuais de células viáveis de LC-1
após a secagem de cada uma das fibras. A sobrevivência do LC-1 quando aderido à
farinha de banana verde e ao farelo de aveia não apresentou diferença significativa
ao nível de 90% sendo que ambas as fibras permitiram as maiores recuperações
celulares após secagem. Apesar de a inulina ser a fibra com propriedade prebiótica
mais conhecida e amplamente estudada, no presente estudo foi a que apresentou
menor sobrevivência celular após a secagem a vácuo à 45ºC, seguida pela fibra de
maçã.
A umidade das fibras após a secagem foi de 5,6 ± 1,0% e a Aw
variou de 0,25 a 0,35, conforme propriedades individuais de cada fibra (dados não
mostrados).
43
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
A B C D
Fibras
% de células recuperadas
Figura 5: Médias percentuais de duas determinações com análises realizadas
em duplicatas de células de L. casei recuperadas após a secagem a vácuo a
45ºC. A: Farelo de aveia, B: Farinha de banana verde, C: Fibra de maçã e D:
Inulina
Mesmo com o ajuste prévio do pH, ao final do processo de
desidratação, a inulina e a fibra de maçã apresentaram as menores viabilidades
celulares e valores de pH de 4,0 e 4,2 respectivamente. Em contrapartida, maiores
sobrevivências do LC-1 foram observadas para a farinha de banana verde e para o
farelo de aveia, cujos valores de pH foram 5,4 e 5,7 respectivamente. Estes
resultados estão de acordo com Saarela et al. (2006/b), que avaliaram a
sobrevivência e estabilidade sob armazenamento de L. rhamnosus aderido a
diferentes fibras, após o processo de liofilização e também observaram a menor
viabilidade na fibra de maçã e na inulina. Provavelmente a combinação dos 2
fatores, pH e injúria ocasionada pelo processo de secagem, podem ter contribuído
para resultado de ambos estudos (SAARELA et al, 2006/b).
As maiores viabilidades obtidas para o farelo de aveia e para a
farinha de banana verde podem ser justificadas pela composição de ambas, onde o
farelo de aveia utilizado apresentava um teor de β-glucanas de 9-10% e a farinha de
banana verde, grande quantidade de amido resistente que, juntamente a outros
compostos, como açúcares simples e compostos nitrogenados podem ter
contribuído para uma maior sobrevivência celular durante a secagem nestas fibras.
Segundo Michida et. al. (2006) alguns fatores podem contribuir para o aumento da
82%
79%
66%
45%
44
viabilidade celular em condições estressantes sendo que a composição do meio em
termos de açúcares solúveis e compostos nitrogenados, são os principais.
As figuras 6, 7, 8 e 9 mostram os aspectos da farinha de banana
verde, farelo de aveia, fibra de maçã e inulina, respectivamente, antes (A) e após (B)
a aderência do LC-1 e secagem à 45ºC sob vácuo. É possível observar que, após a
desidratação, as matérias-primas ficaram com aspecto granular ao invés de pó como
na sua forma inicial. Esta diferença, ocasionada pelo processamento, demonstra as
possíveis alterações na textura e sabor ocorridas nas fibras, tornando necessária
uma análise subsequente para verificar a aceitação pelos consumidores.
Figura 6: Farinha de banana verde antes (A) e após (B) aderência do L. casei e
secagem a vácuo à 45ºC.
Figura 7: Farelo de aveia antes (A) e após (B) aderência do L. casei e secagem a
vácuo à 45ºC.
45
Figura 8: Fibra de maçã antes (A) e após (B) aderência do L. casei e secagem a
vácuo à 45ºC.
Figura 9: Inulina antes (A) e após (B) aderência do L. casei e secagem a vácuo à
45ºC.
5.3
M
ICROSCOPIA ELETRÔNICA
As análises de microscopia eletrônica de varredura permitiram
visualizar as fibras e o comportamento do LC-1 aderido antes e após o processo de
secagem.
46
Figura 10: Microscopia eletrônica de varredura do farelo de aveia (A e B) e farinha
de banana verde (C e D) sem adição de L. casei, com aumentos de 700 e 2500
vezes.
47
Figura 11: Microscopia eletrônica de varredura de fibra de maçã (A e B) e Inulina (C)
sem adição de L. casei com aumentos de 700 e 2500 vezes.
48
Nas imagens obtidas para as matérias-primas, no farelo de aveia e
na farinha de banana verde (Figura 10) é possível verificar grandes estruturas ovais
referentes a grânulos de amido. Freitas e Tavares (2005) obtiveram imagens
semelhantes quando observaram amido de banana por microscopia eletrônica de
varredura. Adicionalmente, segundo Juarez-Garcia et al. (2006), a farinha de banana
verde apresenta em media 73% de amido em seu conteúdo total e Weber, Gutkoski
e Elias (2002) relataram em media 42% de amido para aveia.
Em contrapartida, foi observado nas imagens da fibra de maçã
estrutura em forma de “lascas” (Figura 11-A e B) e, para a inulina, devido à sua alta
solubilidade, não foram obtidas imagens nítidas de sua estrutura (Figura 11-C).
Nas imagens obtidas após adição do L. casei nas fibras, observa-se
que o microrganismo encontra-se aderido nas matrizes, que contêm amido, fibras,
proteínas e outros componentes residuais. Imagens semelhantes foram obtidas no
estudo de Michida et al. (2006), quando observaram células de L. plantarum
imobilizadas em fibra de malte e cevada.
No farelo de aveia adicionado de probiótico, antes (figura 12-A e B) e
após a secagem (figura 12-C e D), foi observada a presença de filamentos, que
aderem as bactérias ao farelo e bactérias entre si. Supostamente estes filamentos
são exopolissacarídeos excretados a partir do LC-1. Também foi verificada a
distribuição homogênea do LC-1 na amostra sem alterações morfológicas após a
secagem à vácuo.
A figura 13 mostra as imagens de microscopia para a farinha de
banana verde antes (A e B) e após a secagem (C e D). Semelhantemente ao
observado no farelo de aveia, a distribuição do LC-1 foi uniforme na amostra, com a
presença de exopolissacarídeos unindo as bactérias entre si e na farinha, sem
apresentar diferenças morfológicas antes e após a desidratação.
49
Figura 12: Microscopia eletrônica de varredura do farelo de aveia após adição de L.
casei, antes (A e B) e após secagem à 45ºC sob vácuo (C e D) com aumentos de
5.000 e 20.000 vezes.
Asteriscos: Grânulos de amido do farelo de aveia; Setas: L. casei aderido às
estrutura do farelo;
Detalhe: ponta de seta: Exopolissacarídeos
50
Figura 13: Microscopia eletrônica de varredura da farinha de banana verde após
adição de L. casei antes (A e B) e após secagem à 45ºC sob vácuo (C e D) com
aumentos de 5.000 e 20.000 vezes.
Asteriscos: Grânulos da farinha de banana verde; Setas: Exopolissacarídeos
51
Na fibra de maçã (figura 14) foi observada a presença de
exopolissacarídeos produzidos pelo LC-1 e diferença morfológica entre as células
antes (A e B) e após o processo de secagem (C e D). Além disso, foram observadas
células injuriadas, demonstrando a baixa sobrevivência observada na etapa de
avaliação das fibras para a fibra de maçã.
Nas análises da inulina antes (Figura 14-E) e após a secagem
(figuras 14-F e G) não foram observados exopolissacarídeos unindo as bactérias
entre si e bactérias na inulina. Nesta fibra, após a secagem, as células de LC-1
estavam em número consideravelmente menor do que nas demais fibras estudadas
e, a maioria das células apresentou-se injuriada, elucidando a baixa sobrevivência
obtida na etapa inicial deste estudo.
Os polissacarídeos produzidos a partir de bactérias, inclusive pelas
lácticas, são chamados de exopolissacarídeos (EPS) e embora neste estudo não
tenham sido quantificados, a visualização de EPS de L. casei pode indicar um
mecanismo de proteção em condições estressantes. Segundo Ruas-Madiedo,
Hugenholtz e Zoon (2002), esses polissacarídeos têm a função de proteção celular
contra, por exemplo, desidratação, fagocitose, ataque de bacteriófagos, antibióticos
ou compostos tóxicos e estresse osmótico. EPS também tem o papel na
identificação celular, na adesão em superfícies e na formação de biofilmes
facilitando a colonização a vários ecossistemas (RUAS-MADIEDO; HUGENHOLTZ;
ZOON, 2002).
As maiores sobrevivências encontradas para o farelo de aveia e
para a farinha de banana verde pode ser também explicada pela produção de EPS.
Schiavão-Souza et al. (2007) e Ayala-Hernandez et al. (2009) sugerem que sua
produção está ligada à presença de nutrientes justificando o resultado obtido, pois
além da β-glucana e do amido resistente, que apresentam efeitos prebióticos, estas
fibras apresentavam em sua composição carboidratos disponíveis e proteínas.
A fibra de maçã utilizada no estudo, mesmo em menor quantidade,
também apresentava em sua composição proteínas e carboidratos disponíveis e,
embora o microorganismo tenha encontrado subsídios para a produção de EPS, o
estresse ocasionado pela acidez do meio não permitiu maiores recuperações
celulares.
52
Figura 14: Microscopia eletrônica de varredura de: fibra de maçã após adição de L.
casei antes (A e B) e após secagem à 45ºC sob vácuo (C e D) e de Inulina antes (E)
e após do processo de secagem (F e G) com aumentos de 2.500 e 20.000 vezes.
Imagens A e C: asteriscos: Fibra de maçã; Imagem B: seta: Exopolissacarídeos;
Imagens C, D e G: seta: Células injuriadas; Imagens E e F: asteriscos: estrutura da
Inulina
;
53
5.4
A
VALIAÇÃO DOS EFEITOS DA SACAROSE COMO ESTRESSOR E DA TREALOSE COMO
PROTETOR CELULAR
5.4.1 Farinha de banana verde
Na avaliação da farinha de banana verde a maior viabilidade foi
obtida com 20g/L de sacarose e com 0,4M de trealose que correspondem
estatisticamente aos níveis codificados +1. Na Tabela 2 estão apresentados os
valores reais e codificados utilizados para a sacarose e trealose, e o resultado
correspondente observado para a viabilidade do LC-1 após secagem.
Após análise estatística, foi verificado que a sacarose e a trealose
têm efeito na sobrevivência do microrganismo, sendo que somente a trealose foi
significativa ao nível de 95% (p=0,02).
O aumento da concentração de trealose do nível -1 (0,1M) para +1
(0,4M), produziu um efeito positivo na sobrevivência do LC-1 de 1,77 ciclos log,
superior ao efeito da sacarose de 0,4 ciclos log na viabilidade celular, quando
aumentou do nível -1 (10g/L) para +1 (20g/L).
As curvas de superfície de resposta (figura 15) permitiram visualizar
que a região de maior viabilidade celular, é dada pelas maiores concentrações de
sacarose e de trealose.
O coeficiente de determinação (R
2
) do modelo obtido, que expressa
a porcentagem de respostas explicadas pelos efeitos das variáveis foi de 0,91
evidenciando a adequação do modelo. A partir do cálculo dos coeficientes foi
possível obter a seguinte equação ajustada para os dados experimentais:
Y= 6,84 + 0,20x
1
+ 0,88x
2
– 0,11x
2
2
(Eq. 2)
54
Tabela 2: Valores reais e codificados de adição de sacarose e trealose à farinha de
banana verde e os resultados da viabilidade do L. casei (LC-1)
Sacarose
valores
codificados
Trealose
valores
codificados
Sacarose
(g/L) valores
reais
Trealose
(M) valores reais
Log UFC/g de
farinha de banana
verde
-1 -1 10 0,1 6,00
-1 0 10 0,25 6,30
-1 +1 10 0,4 7,62
+1 -1 20 0,1 6,06
+1 0 20 0,25 7,08
+1 +1 20 0,4 7,98
A presença do termo quadrático de sinal negativo na equação indica
que a resposta está se aproximando da sua região de ótimo. Sendo o referido termo
dado pela trealose (x
2
), a melhor resposta estaria deslocada para uma região onde
uma maior concentração de trealose seria necessária para atingir uma maior
resposta.
Fitted Surface; Variable: Log UFC/g
1 2-level factors, 1 3-level factors, 6 Runs
DV: Log UFC/g; MS Residual=,0654
8
7,5
7
6,5
6
Figura 15: Gráfico de superfície de resposta obtido após secagem de farinha de
banana verde com L. casei aderido, para as variáveis codificadas sacarose e
trealose, tendo como resposta a viabilidade do LC-1 em log de UFC/g.
55
Para obter uma maior sobrevivência celular nesta fibra, foi proposto
um novo ensaio seguindo a tendência de aumento da resposta de acordo com o
modelo estatístico obtido. Assim sendo, as novas concentrações utilizadas para a
sacarose e trealose foram 21g/L, 22g/L, 23g/L, 24g/L e 0,475M; 0,55M; 0,625M;
0,7M respectivamente.
A Tabela 3 mostra os valores reais e codificados para a trealose e
sacarose, e a viabilidade do LC-1 após secagem à vácuo, para o novo ensaio
proposto na farinha de banana verde.
Tabela 3: Valores reais e codificados do novo delineamento para a adição de
sacarose e trealose à farinha de banana verde e os resultados de viabilidade de L.
casei (LC-1)
Sacarose
valores
codificados
Trealose
valores
codificados
Sacarose
(g/L) valores
reais
Trealose
(M) valores
reais
Log UFC/g
de farinha de
banana
verde
1,2 1,5 21 0,475 7,732
1,4 2,0 22 0,55 7,623
1,6 2,5 23 0,625 5,477
1,8 3,0 24 0,7 5,6
Como pode ser observado, o aumento das concentrações de
sacarose e de trealose não aumentou a viabilidade do LC-1 na farinha de banana
verde, conforme indicado pelo modelo estatístico. Supostamente o excesso de
protetor acumulado na célula ao invés de proteger o microrganismo durante a
desidratação, ocasionou um estresse osmótico não desejado, levando à morte
através da saída passiva de água, concordando com o observado por Santivarangka
et al., 2006.
5.4.2 Farelo de aveia
A Tabela 4 apresenta os valores reais e codificados dos ensaios da
sacarose e da trealose para o farelo de aveia, com os respectivos resultados
observados para células viáveis de LC-1 após a secagem. Assim como na farinha de
56
banana verde o melhor resultado foi obtido com 20g/L de sacarose e com 0,4M de
trealose, correspondentes aos níveis +1, sendo que este resultado pode ser
visualizado no gráfico de curvas de superfície de resposta (Figura 16).
Tabela 4: Valores reais e codificados de adição de sacarose e trealose ao farelo de
aveia e os resultados de viabilidade de L. casei (LC-1)
Sacarose
valores
codificados
Trealose
valores
codificados
Sacarose (g/L)
valores reais
Trealose
(M) valores
reais
Log UFC/g
farelo de aveia
-1 -1 10 0,1 7,75
-1 0 10 0,25 7,94
-1 +1 10 0,4 8,25
+1 -1 20 0,1 7,43
+1 0 20 0,25 8,38
+1 +1 20 0,4 8,70
A análise dos resultados com sacarose e com trealose revelaram
que ambos, bem como sua interação têm efeito na viabilidade do LC-1, sendo que
somente a trealose foi significativa ao nível de 95% (p=0,04).
A proporção entre os efeitos da trealose e da sacarose para o farelo
de aveia, permaneceu semelhante aos da farinha de banana verde, porém o efeito
do aumento da concentração de trealose foi de 0,88 ciclo log, e o da sacarose 0,19
ciclo log, inferiores aos efeitos encontrados para a fibra anterior. A interação entre os
dois protetores apresentou um efeito positivo de 0,38 ciclo log. É interessante
ressaltar que o efeito da sacarose foi baixo em relação ao da trealose e, embora não
significativo, sua interação teve um efeito positivo na sobrevivência do LC-1,
tornando interessante sua manutenção.
Ferreira et al. (2005) e Tymczszyn, Gómez-Zavaglia e Disalvo (2007)
relataram que quando lactobacilos crescem em meio contendo fatores de estresse
como a sacarose, o uso da trealose durante a secagem melhora a resistência do
microrganismo, aumentando sua sobrevivência.
O coeficiente de determinação (R
2
) ajustado do modelo foi 0,83, o
que representa um bom ajuste pois refere-se a dados microbiológicos. Os
coeficientes calculados para a viabilidade do LC-1 após a secagem a vácuo, em Log
UFC/g, permitiram desenhar a equação ajustada para os dados experimentais:
57
Y= 8,07 + 0,095x
1
+ 0,44x
2
+ 0,19x
1
x
2
(Eq.3)
Fitted Surface; Variable: Log UFC/g
1 2-level factors, 1 3-level factors, 6 Runs
DV: Log UFC/g; MS Residual=,09755
8,6
8,4
8,2
8
7,8
7,6
7,4
Figura 16: Gráfico de superfície de resposta obtido após secagem de farelo de aveia
com L. casei aderido, para as variáveis codificadas sacarose e trealose, tendo como
resposta a viabilidade do LC-1 em log de UFC/g.
Embora o modelo estatístico indicasse uma maior viabilidade celular
no farelo de aveia com o aumento das concentrações dos açúcares, não foram
realizados novos experimentos porque o número de células viáveis desejados para
um produto probiótico foi alcançado. Em adição, considerando os efeitos, seria
necessário o emprego de concentrações elevadas de sacarose e trealose para
aumentar consideravelmente a resposta, o que poderia não ocorrer devido ao
estresse do microrganismo, como foi observado na farinha de banana verde. Além
disso, poderia elevar demasiadamente os custos do produto inviabilizando sua
comercialização.
No presente estudo a concentração de 0,4M de trealose permitiu
maiores viabilidades celulares de LC-1, discordando de Gómez Zavaglia et al. (2003)
e Tymczyszyn, Gómez-Zavaglia e Disalvo. (2007), que relataram a maior
sobrevivência de L. bulgaricus para 0,25M de trealose com e sem a adição de
58
estressores ao meio de cultivo. Entretanto, nos estudos supracitados, a biomassa
era seca diretamente com o protetor e no presente trabalho o farelo de aveia e a
farinha de banana verde estavam em contato com o LC-1, ocasionando uma menor
interação entre o protetor e o microrganismo.
Após análise dos resultados, os testes de armazenamento foram
conduzidos sem adição de açúcares (controle) e com as concentrações de 20g/L de
sacarose e 0,4M de trealose, parâmetros determinados para a farinha de banana
verde e farelo de aveia na análise estatística.
5.5
A
RMAZENAMENTO
5.5.1 Farelo de aveia
A estabilidade do LC-1 aderido ao farelo de aveia durante os 28 dias
de estocagem para as diferentes temperaturas estudadas, com e sem os açúcares,
está apresentada na figura 15.
No farelo de aveia sem adição de sacarose e trealose (figura 17a), a
viabilidade do LC-1 durante o armazenamento diminuiu 0,7 e 0,6 ciclos log, atingindo
ao final do período 7,3 e 7,4 ciclos log
nas temperaturas de 10ºC e 25ºC
respectivamente, enquanto que a 40ºC, após 14 dias a população de lactobacilos
caiu 8 ciclos log. Com a adição dos açúcares, a maior estabilidade foi observada a
10ºC e a menor a 40ºC (figura 17b).
59
Figura 17: Comportamento de Lactobacillus casei aderidos ao farelo de aveia
armazenados por 28 dias, sob temperatura de (▲) 10ºC, (■) 25ºC e (♦) 40ºC: (A)
sem tratamento e (B) tratado com 20g/L de sacarose e 0, 4M de trehalose.
Conrad et al. (2000) demonstraram que a presença da trealose
durante a secagem de Lactobacillus acidophilus, aumentou a sobrevivência do
microrganismo durante o armazenamento à 37ºC por 70 dias. Outros estudos como
de Crowe, Reid e Crowe (1996), Carvalho et al. (2004), Meng et al. (2007) e
Santivarangkna et al. (2008/b) apontam o uso de açúcares protetores como
promissores para o armazenamento de células desidratadas de bactérias lácticas.
Porém, após a adição dos protetores no farelo de aveia, a viabilidade do probiótico
na temperatura de 25ºC, apresentou uma queda de 2,7 ciclos log ao final dos 28
dias de estocagem (17b). Este resultado pode ter sido ocasionado pelo sinergismo
entre o baixo pH obtido após a adição dos açúcares durante todo o período de
armazenamento (Tabela 5), os danos sofridos pelo microrganismo durante o
processo de secagem e a temperatura de estocagem. Por se tratar de um produto
seco, era desejável que nesta temperatura sua estabilidade se mantivesse, o que
representaria redução dos custos de armazenamento, facilitaria o manuseio e
transporte do produto até seu consumo.
O estudo na temperatura de 40ºC foi considerado importante, pelo
fato de os probióticos não refrigerados poderem sofrer alterações como grandes
variações de temperatura durante o transporte e armazenamento, o que
comprometeria sua viabilidade (SAARELA et al., 2006/b). Entretanto, segundo Meng
et al. (2007), a sobrevivência de uma bactéria probiótica durante a estocagem na
60
forma desidratada, é menor quanto maior a temperatura de armazenamento,
justificando o resultado observado nesta temperatura.
A fim de compreender o baixo valor de pH obtido nas fibras que
continham o protetor celular e verificar se este resultado era decorrente do açúcar,
foi realizada uma análise de pH de uma solução de trealose. A média encontrada de
três repetições foi de 6,5 ± 0,1 indicando assim outras possíveis causas para o
menor valor de pH do produto com protetor. No estudo de Sawitzki et al. (2007)
diversas linhagens de Lactobacillus plantarum isoladas de salsichas fermentadas
metabolizaram a trealose. Conforme Zayed e Roos (2004) o L. salivarius subsp.
salivarius é capaz de produzir ácido a partir da trealose, diminuindo o pH ao final de
84 horas de fermentação. No presente estudo, embora não determinado, o L. casei
pode ter fermentado a trealose durante as horas de secagem em baixa temperatura
e, assim diminuído o pH final.
Durante os 28 dias de armazenamento a variação nos percentuais de
umidade foi pequena e, não foram observadas mudanças que poderiam ser
decorrentes da adição do protetor e do estressor (Tabela 5).
Não foram realizadas analises de pH e umidade para as amostras
armazenadas a 40ºC após 14 e 21 dias com e sem açúcares, por não haver
sobrevivência de microrganismos.
Tabela 5: Média de duas repetições de análises realizadas em duplicatas dos
resultados obtidos para a umidade e pH, com e sem adição de sacarose e trealose,
durante o armazenamento de Lactobacillus casei aderido ao farelo de aveia, por 28
dias nas temperaturas de 10ºC, 25ºC e 40ºC.
Tempo
em
dias
% Umidade
sem protetor e
estressor
% umidade com
protetor e estressor
pH sem protetor e
estressor
pH com protetor e
estressor
10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC
0
4,8
±
0,5
5,4
±
0,5
5,6
±
0,6
5,6
±
0,8
5,9
±
0,7
5,2
±
0,5
5,80
±
0,1
5,82
±
0,08
5,92
±
0,5
4,57
±
0,05
4,21
±
0,1
4,11
±
0,1
7
4,8
±
0,5
5,5
±
0,5
6,3
±
0,5
5,2
±
0,8
5,7
±
0,7
4,8
±
0,5
5,92
±
0,04
5,93
±
0,05
5,96
±
0,5
4,21
±
0,06
4,27
±
0,1
4,05
±
0,05
14
4,6
±
0,4
5,0
±
0,5
5.0
±
0,6
5,7
±
0,6
6,3
±
0,5
nd 5,98
±
0,02
5,92
±
0,05
5.97
±
0,3
4,37
±
0,05
4,51
±
0,3
nd
21
4,3
±
0,3
4,5
±
0,5
nd 5,3
±
0,5
5,8
±
0,5
nd 5,63
±
0,2
5,56
±
0,3
nd 4,21
±
0,05
4,24
±
0,1
nd
28
4,9
±
0,5
4,7
±
0,5
nd 5,5
±
0,5
6,5
±
0,5
nd 5,98
±
0,01
5,90
±
0,06
nd 4,28
±
0,1
4,42
±
0,2
nd
nd: não determinado
61
5.5.2 Farinha de banana verde
A Figura 18 mostra a estabilidade do LC-1 aderido à farinha de
banana verde por 28 dias nas temperaturas de 10, 25 e 40ºC. Foi possível observar
que em todos os tratamentos, a viabilidade do probiótico nesta fibra foi menor em
relação ao farelo de aveia. Segundo Saarela et al. (2006/b), a quantidade de lipídios,
de alto valor nutricional, presente no farelo de aveia (~7%) também apresenta
função de proteção celular durante o armazenamento, o que pode justificar os
valores obtidos na farinha de banana verde cujo teor em lipídeos é menor.
Ao final dos 28 dias de estocagem, a viabilidade do LC-1 aderidos à
farinha de banana verde sem o protetor e o estressor, a 10ºC e 25ºC, teve
diminuição de 1,5 ciclos log e 2 ciclos log, respectivamente. Com a presença da
trealose, a 10ºC, obteve-se a mesma queda de 1,5 ciclos log na viabilidade do
microrganismo e, à 25ºC foi observado uma diminuição de 3 ciclos log ao final do
armazenamento. Na temperatura de 40ºC não foi possível recuperar células viáveis
de LC1 a partir do 14º dia de armazenamento.
Figura 18: Comportamento de Lactobacillus casei aderidos a farinha de banana
verde armazenados sob temperatura de (▲) 10ºC, (■) 25ºC e (♦) 40ºC: (A) sem
tratamento e (B) tratado com 20g/L de sacarose e 0,4M de trehalose
.
Na tabela 6 estão os valores de umidade e pH obtidos durante o
armazenamento por 28 dias da farinha de banana verde com o probiótico aderido,
nas temperaturas de 10, 25 e 40ºC com e sem trealose. Assim como no farelo de
aveia, houve uma perceptível variação nos valores de pH após adição dos açúcares.
62
Durante os 28 dias de armazenamento, o percentual de umidade do
produto desidratado com e sem tratamento, aumentou, o que pode explicar em parte
a menor viabilidade encontrada para a farinha de banana verde. Em adição, Zayed e
Roos (2004) relataram que a quantidade de água remanescente em produtos secos,
afeta a viabilidade da bactéria durante o armazenamento.
A Tabela 7 mostra os valores encontrados para a atividade de água
(aw) durante o período de armazenamento para as duas fibras com e sem sacarose
e trealose. É possível observar que os valores de aw variam conforme a fibra
estudada e com a presença ou ausência do protetor celular. Durante os 28 dias de
armazenamento estes valores acompanharam a variação dos valores de umidade.
Tabela 6: Média de duas repetições de análises realizadas em duplicatas dos
resultados obtidos para a umidade e pH, com e sem adição de sacarose e trealose,
durante o armazenamento de Lactobacillus casei aderido à farinha de banana verde,
por 28 dias nas temperaturas de 10ºC, 25ºC e 40ºC.
Tempo
em dias
% Umidade
sem protetor e
estressor
% umidade com
protetor e estressor
pH sem protetor e
estressor
pH com protetor e
estressor
10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC
0
6,2
±
1,0
5,4
±
0,5
5,2
±
0,8
4,9
±
0,5
5,4
±
0,5
5,7
±
0,3
5,33
±
0,02
5,52
±
0,1
5,63
±
0,05
4,47
±
0,03
4,43
±
0,02
4,38
±
0,3
7
6,6
±
1
5,6
±
0,6
5,4
±
0,8
5,8
±
0,5
5,6
±
0,5
6,0
±
0,3
5,38
±
0,05
5,52
±
0,1
5,62
±
0,05
4,38
±
0,03
4,42
±
0,02
4,33
±
0,03
14
7,4
±
0,8
6,4
±
0,5
5,8
±
0,8
6,7
±
0,5
6,4
±
0,5
6,6
±
0,5
5,33
±
0,03
5,59
±
0,1
5,7
±
0,07
4,52
±
0,06
4,54
±
0,05
4,40
±
0,05
21
7,5
±
0,8
6,8
±
0,5
nd 7,4
±
0,4
7,1
±
0,6
nd 5,46
±
0,05
5,62
±
0,1
nd 4,46
±
0,05
4,46
±
0,05
nd
28
7,7
±
1,0
7,2
±
0,5
nd 7,4
±
0,5
8,2
±
0,5
nd 5,36
±
0,2
5,68
±
0,06
nd 4,52
±
0,05
4,51
±
0,03
nd
Tabela 7: Resultados obtidos para a atividade de água, com e sem adição de
sacarose e trealose, durante o armazenamento de Lactobacillus casei aderido à
farinha de banana verde e ao farelo de aveia, por 28 dias nas temperaturas de 10ºC
e 25ºC.
Farelo de aveia Farinha de banana verde
Tempo
em dias
Atividade de água
sem protetor
Atividade de água
com protetor
Atividade de água
sem protetor
Atividade de água
com protetor
10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC 10ºC 25ºC 40ºC
0 0,365 0,260 0,254 0,342 0,322 0,355 0,352 0,259 0,245 0,432 0,421 0,429
7 0,210 0,201 0,295 0,417 0,394 0,330 0,358 0,239 0,235 0,427 0,455 0,468
14 0,206 0,278 0,320 0,370 0,402 nd 0,330 0,298 0,269 0,446 0,465 0,484
21 0,247 0,298 nd 0,310 0,372 nd 0,362 0,294 nd 0,430 0,444 nd
28 0,234 0,312 nd 0,420 0,412 nd 0,374 0,350 nd 0,465 0,494 nd
63
A partir destes resultados, foi constatado que o LC-1 apresentou
maior sobrevivência ao armazenamento quando aderido ao farelo de aveia do que
quando aderido à farinha de banana verde. Portanto, para os testes de resistência à
simulação de passagem no trato gastrintestinal foi utilizado apenas o farelo de aveia
com e sem trealose e sacarose.
5.6
S
OBREVIVÊNCIA DO
LC-1
ADERIDO À FIBRA APÓS INCUBAÇÃO EM CONDIÇÕES
GASTRINTESTINAIS SIMULADAS
Para determinar o efeito do pH acido do estômago na sobrevivência
do probiótico aderido ao farelo de aveia, um sistema in vitro foi utilizado e os
resultados estão apresentados na Tabela 8. Foi observado que quando as células se
encontravam livres, ou seja, sem aderência à fibra, após 120 minutos em pH 1,55
foram obtidas 10
2
UFC de células viáveis por mL de cultivo. Neste mesmo contexto,
após simulação ao suco intestinal (pH 7,4 e 150 minutos), o L. casei manteve sua
viabilidade (10
7
UFC/g). Também, nas células aderidas às fibras foi constatada uma
alta sobrevivência celular ao final dos 120 minutos em pH ácido. Estes resultados
estão de acordo com Michida et al. (2006), que demonstraram uma maior
estabilidade ao suco gástrico quando as células se encontravam imobilizadas em
fibras de malte e cevada do que quando cultivadas apenas em meio MRS.
Puupponen-Pimia et. al. (2002) relataram que o L. rhamnosus encapsulado em
grânulos de amido, tem suas propriedades físicas preservadas durante longos
períodos de armazenamento e durante passagem ao trato gastrintestinal.
Nas células aderidas ao farelo de aveia com e sem protetor, a
sobrevivência do LC-1 após 120 minutos em pH ácido foi 1 ciclo log maior na fibra
sem trealose do que na adicionada do açúcar. No ensaio utilizando sais biliares
também foi observado uma menor sobrevivência celular na fibra com o protetor.
Charalampopoulos et al. (2002) sugerem que a sobrevivência dos probióticos
durante o transito gastrintestinal é influenciada pelas propriedades físico-químicas
dos alimentos utilizados como carreadores celulares, sendo a capacidade de
tamponamento e o pH do meio os fatores significantes.
64
Portanto, assim como no teste de armazenamento, a presença do
protetor celular não garantiu uma maior sobrevivência do microrganismo, ou seja, a
fibra na sua forma natural forneceu os subsídios necessários para a proteção do LC-
1, concluindo dessa forma que a fibra que apresenta melhor condição para o
desenvolvimento do produto desidratado com fibras e probiótico, foi o farelo de aveia
sem adição de protetor celular.
Tabela 8: Sobrevivência média obtida para o L. casei, na forma livre e aderida ao
farelo de aveia, após diferentes tempos em simulação do trato gastrintestinal.
Sobrevivência
controle (UFC/g)*
Sobrevivência
aderido ao farelo
de aveia sem
trealose (UFC/g)*
Sobrevivência
aderido ao farelo
de aveia com
trealose (UFC/g)*
Inicial 7,2x10
8
6,2x10
7
5,2x10
8
30’ em pH 1,55 1,1 x10
6
2,0x10
7
4,0x10
7
60’ em pH 1,55 5x10
4
1,2x10
7
1,3x10
7
90’ em pH 1,55 < 10
3
1,2x10
7
7,5x10
6
120’ em pH 1,55 2,3x10
2
1,1x10
7
1,2x10
6
150’ em pH 7,4 1,3x10
8
2,2x10
7
1,9x10
6
*
Resultados de contagem em Agar MRS de duplicatas e com 2 repetições
5.7
ANALISE MICROBIOLOGICA
Análises microbiológicas foram conduzidas antes da sensorial para
garantia da segurança aos provadores, pesquisando microrganismos patogênicos e
indicadores de qualidade higiênica insatisfatória.
A Tabela 9 mostra os resultados obtidos para os microrganismos
analisados e o limite máximo estabelecido pela Resolução RDC nº12, de 12 de
janeiro de 2001 da ANVISA.
O produto formulado apresentou condições sanitárias satisfatórias,
de acordo com os padrões legais vigentes.
65
Tabela 9: Resultado obtido na análise de microrganismos patogênicos e
respectivos padrões microbiológicos exigidos pela legislação vigente para ‘farelo e
fibras de cereais, com ou sem mistura de farinhas’ encontrado no item 10 do anexo
I da Resolução RDC nº 12 da Anvisa.
Microrganismo
Resultado
Fibra com L.casei
aderido
Padrão segundo RDC
nº12
Bacillus cereus/g
< 1,0 x 10 5,0 x 10
3
Estafilococos coagulase
positivo
< 1,0 x 10 UFC/g
-
Coliformes totais 50 240 NMP
Coliformes à 45ºC/g - 11 NMP
Bolores e leveduras - 5,0 x 10
3
Salmonella sp ausente ausente
5.7
A
NÁLISE SENSORIAL
Segundo Ministério da Saúde do Brasil (BRASIL, 2007), para que um
produto contendo microrganismos probióticos possa utilizar a alegação de que
“contribui para o equilíbrio da flora intestinal”, deve conter, na porção diária do
produto pronto para o consumo, um mínimo de 10
8
-10
9
UFC do probiótico. No caso
dos produtos contendo fibras alimentares, para ser considerado fonte de fibras e
possa utilizar a alegação de que “auxiliam no funcionamento do intestino” deve
fornecer na porção diária um mínimo de 3 gramas de fibra quando for adicionada em
alimentos sólidos e 1,5 gramas quando adicionada em alimentos líquidos.
O teor de fibras do farelo de aveia utilizado no estudo era de 15
gramas de fibras em 100 gramas de farelo e, 10
7
-10
8
UFC de probiótico por grama
de farelo de aveia. Assim sendo, a ingestão diária mínima de 12 gramas do produto
desenvolvido, atende as exigências recomendadas pela legislação para o consumo
de fibras e probiótico e desta forma foram conduzidos os testes sensoriais.
Para verificar se os procedimentos e etapas aplicadas ao farelo de
aveia para a obtenção do produto probiótico seriam percebidos pelos consumidores,
um teste triangular e outro de aceitação foram aplicados.
66
No teste triangular realizado com 20 julgadores, 15 identificaram a
amostra diferente. Considerando a tabela nº 30 de Dutcosky (2007), as amostras de
vitamina com farelo de aveia (controle) e vitamina com farelo de aveia e probiótico
apresentam diferença significativa a nível de 0,01%, onde um mínimo de 14
respostas corretas seria necessário.
Neste teste, os provadores deveriam apenas analisar o produto de
maneira geral, entretanto foi observado nas amostras que continham apenas o farelo
sem o probiótico, o comentário de que o sabor e odor de aveia estavam mais
acentuados.
Como não se conhecia a aceitação da vitamina comercial utilizada
no estudo como veiculo e, no teste triangular as amostras de vitamina adicionada de
farelo de aveia com e sem probiótico apresentaram diferença sensorial, foi realizado
um teste hedônico com 51 provadores não treinados, para avaliar a aceitação de
cada uma das amostras.
Após análise variância (ANOVA) foi observado que as amostras
apresentaram diferença significativa a nível de 5% na avaliação da aceitação global
dos produtos. Aplicado o teste de Tukey, foi possível verificar que a amostra de
vitamina foi a mais aceita pelos provadores enquanto que as amostras de vitamina
com farelo de aveia e vitamina com farelo de aveia e probiótico foram igualmente
aceitas (Tabela 10).
Tabela 10: Médias de aceitação do teste de escala hedônica para as amostras
vitamina, vitamina adicionada de farelo de aveia e vitamina adicionado de farelo de
aveia com probiótico
Amostra Médias de aceitação *
Vitamina 7,7843ª
Vitamina + farelo de aveia 6,9412
b
Vitamina + farelo de aveia com
probiótico
6,8235
b
*Médias acompanhadas de letras iguais não diferem entre si a p ≥ 0,05
No teste de aceitação, foi utilizado escala hedônica estruturada com
nove pontos e, como a média da aceitação de todas as amostras estava acima do
valor médio estipulado (não gostei nem desgostei = 5), considera-se todos os
67
produtos bem aceitos pelos consumidores, sendo os índices de aceitação de 86,5%
para a vitamina, 77% para a vitamina adicionada de farelo de aveia e 76% para a
vitamina adicionada de farelo de aveia com probiótico.
68
6 CONCLUSÕES
Entre as fibras estudadas a farinha de banana verde e o farelo de
aveia foram as fibras que permitiram maior viabilidade do L. casei após secagem a
vácuo a 45ºC.
As células não apresentaram diferenças morfológicas após a
secagem a vácuo quando aderidas ao farelo de aveia e à farinha de banana verde.
Foi observada a produção de exopolissacarídeos aderindo as bactérias às fibras e
as bactérias entre si.
Os açúcares sacarose e trealose, utilizados como estressor e
protetor, respectivamente, demonstraram efeito de aumento da viabilidade do
probiótico aderido às fibras após o processo de desidratação.
Durante o armazenamento, o farelo de aveia sem adição de
protetores celulares mostrou ser o mais promissor para o desenvolvimento do
simbiótico em estudo, por manter o microrganismo viável segundo os parâmetros
exigidos pela Legislação Brasileira, por 28 dias em temperatura ambiente.
O L. casei quando aderido ao farelo de aveia apresenta maior
viabilidade durante simulação ao suco gástrico e intestinal.
O simbiótico desenvolvido apresentou diferenças sensoriais em
relação ao farelo de aveia adicionado à vitamina. Entretanto permaneceu bem aceito
pelos consumidores potenciais, com um índice de aceitabilidade de 76%.
Conclui-se que o desenvolvimento de um produto simbiótico vegetal
utilizando farelo de aveia é uma possibilidade de inovação para a indústria de
alimentos funcionais.
69
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77
ANEXOS
ANEXO A: Tabela nutricional Farinha de Banana Verde (Rositos)
Quantidade por porção de 100g
Carboidratos 73,33g
Lípídios 0g
Proteína 2,22g
Fibra alimentar total 9g
Sódio 90mg
Potássio 556mg
Magnésio 35,6mg
ANEXO B: Composição Farelo de aveia – Oat Bran (SL Alimentos)
Lípídios Máx. 9% (média 7,0 – 8,5%)
Proteína Mín. 18% (média 21 - 23%)
Cinzas 3%
Fibra alimentar total Mín. 16%
Fibra alimentar solúvel Mín. 6%
80
81
83
84
85
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