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ANDREA FIALHO DE SOUZA LIMA
DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS
MUCOADESIVAS DE CLARITROMICINA
PARA TRATAMENTO DO
HELICOBACTER PYLORI
Belo Horizonte
Faculdade de Farmácia da UFMG
2008
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ANDREA FIALHO DE SOUZA LIMA
DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS
MUCOADESIVAS DE CLARITROMICINA PARA
TRATAMENTO DO HELICOBACTER PYLORI
Belo Horizonte
Faculdade de Farmácia da UFMG
2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Gilson Andrade Ramaldes
Co-Orientadora: Profa Mônica Cristina de Oliveira
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“É graça divina começar
bem. Graça maior persistir
na caminhada certa. Mas a
graça das graças é não
desistir nunca.”
Dom Hélder Câmara
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo, pela minha vida, inteligência, saúde e determinação.
Ao professor Gilson, pela orientação e pelos ensinamentos proporcionados
durante este trabalho.
À professora Mônica, co-orientadora, pela orientação precisa em momentos muito
importantes.
À professora Cristina pela dedicação e competência em seu apoio nas fases
iniciais dos trabalhos.
Aos professores do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pela amizade e
colaboração.
Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pelo carinho recebido,
pela amizade, ajuda e sugestões.
Ao Eduardo, técnico do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, pelos auxílios
constantes.
Aos meus pais pelo apoio, carinho, amor e educação recebida.
Aos meus irmãos e à Camila pelo amor e amizade.
E, especialmente, ao meu marido Julio pelo amor e carinho diário, apoio,
compreensão e força para realizar essa etapa.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................
viii
LISTA DE TABELAS.......................................................................................
xi
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................
xiii
RESUMO.........................................................................................................
xiv
ABSTRACT…………………………………………………………………………
xv
INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................
16
REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................
17
1 Estômago......................................................................................................
17
2 Helicobacter pylori........................................................................................
25
3 Claritromicina................................................................................................
28
4 Tratamento da infecção por H. pylori............................................................
30
5 Formas farmacêuticas de retenção gástrica.................................................
34
5.1 Quitosana..................................................................................................
41
5.2 Alginato de sódio.......................................................................................
42
5.3 Colestiramina.............................................................................................
43
5.4 Ácido poliacrílico........................................................................................
43
5.5 Carbopol....................................................................................................
44
5.6 Carbopol 934P...........................................................................................
46
6 Microesferas.................................................................................................
46
OBJETIVOS.....................................................................................................
50
1 Objetivo geral................................................................................................
50
2 Objetivos específicos.................................................................................... 50
EXPERIMENTAL.............................................................................................
51
1 Reagentes e outros materiais.......................................................................
51
2 Métodos........................................................................................................
52
2.1 Doseamento da claritromicina...................................................................
52
2.1.1. Tempo de retenção e simetria do pico..................................................
53
2.1.2 Linearidade.............................................................................................
53
2.1.3 Precisão..................................................................................................
54
2.1.3.1 Repetibilidade......................................................................................
54
2.1.3.2 Precisão intermediária.........................................................................
55
2.1.4 Seletividade............................................................................................
55
2.1.5 Tempo de retenção relativo da claritromicina e da 6,11-O-
metileritromicina...............................................................................................
57
2.1.6 Comparação entre padrão primário e secundário de claritromicina.......
58
2.2 Microesferas de claritromicina...................................................................
59
2.2.1 Preparação das microesferas.................................................................
59
2.2.2 Caracterização morfológica....................................................................
63
2.2.2.1 Microscopia óptica de luz....................................................................
63
2.2.2.2 Microscopia eletrônica de varredura....................................................
64
2.2.3 Taxa de encapsulação da claritromicina nas microesferas....................
64
2.2.3.1 Teor total de claritromicina nas microesferas......................................
64
2.2.3.2 Claritromicina adsorvida na superfície das microesferas....................
65
2.2.3.3 Teor de claritromicina no líquido da primeira lavagem........................
66
2.2.4 Liberação in vitro da claritromicina presente nas microesferas..............
66
2.2.4.1 Doseamento da claritromicina por espectrofotometria no ultravioleta
(UV)..................................................................................................................
66
2.2.4.2 Preparação do líquido gástrico simulado.............................................
67
2.2.4.3 Seletividade do método espectrofotométrico.......................................
68
2.2.4.4 Interferência do líquido gástrico simulado no doseamento da
claritromicina por CLAE...................................................................................
69
2.2.4.5 Estabilidade da claritromicina na presença do líquido gástrico
simulado...........................................................................................................
69
2.2.4.6 Liberação in vitro da claritromicina das microesferas..........................
70
2.2.5 Mucoadesão in vitro................................................................................
71
RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................
72
1 Doseamento da claritromicina por CLAE......................................................
72
1.1 Tempo de retenção e simetria do pico...................................................... 72
1.2 Linearidade................................................................................................ 78
1.3 Precisão..................................................................................................... 80
1.3.1 Repetibilidade......................................................................................... 80
1.3.2 Precisão intermediária............................................................................ 80
1.3.3 Seletividade............................................................................................ 81
1.3.4 Tempo de retenção relativo entre claritromicina e 6,11-O-
metileritromicina...............................................................................................
84
1.4 Doseamento do padrão secundário de claritromicina............................... 86
2 Microesferas................................................................................................. 88
2.1 Tamanho e morfologia............................................................................... 88
2.2 Taxa de encapsulação da claritromicina nas microesferas....................... 91
2.3 Liberação in vitro da claritromicina das microesferas................................ 92
2.3.1 Doseamento da claritromicina por espectrofotometria no ultravioleta
(UV).................................................................................................................
92
2.3.2 Seletividade do método de dosagem da claritromicina no UV... 94
2.3.3 Estabilidade do padrão de claritromicina no líquido gástrico
simulado...........................................................................................................
94
2.3..4 Estudos de liberação in vitro..................................................................
95
2.4 Mucoadesão in vitro...................................................................................
98
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS..................................................................
104
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 105
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Anatomia do estômago (FOX & WANG, 2007)..........................
17
Figura 2 - Anatomia das glândulas gástricas (SCHUBERT & PEURA,
2008)...........................................................................................................
19
Figura 3 - Modelo ilustrando os receptores das células parietais e da
transdução (SCHUBERT & PEURA, 2008).................................................
21
Figura 4 - Estrutura da mucina gástrica......................................................
24
Figura 5 - Fórmula estrutural da claritromicina........................................... 29
Figura 6 - Estrutura química da quitosana (SMART, 2005)........................
41
Figura 7 - Estrutura do alginato mostrando resíduos de ácido D-
manurônico e de ácido L-gulurônico (GOMBOTZ & WEE, 1998)...............
42
Figura 8 - Representação esquemática das seqüências de
poliguluronato do alginato reticulado com íons cálcio (GOMBOTZ &
WEE, 1998).................................................................................................
43
Figura 9 - Estrutura química do ácido poliacrílico, R = alil sacarose ou alil
pentaeritritol (carbopols); ou divinil glicol (policarbofil) (SMART, 2005)......
44
Figura 10 - Estrutura química e molecular da forma ácida das resinas de
carbopol (SINGLA et al., 2000)...................................................................
45
Figura 11 - Hidratação da resina de carbopol: (a) uma molécula da
resina parcialmente solvatada e não neutralizada (dispersão). (b) uma
molécula da resina neutralizada e completamente solvatada (mucilagem)
(SINGLA et al., 2000)..................................................................................
45
Figura 12 - Descrição esquemática do processo de mucoadesão com
microesferas................................................................................................
48
Figura 13 - Dispersão de etilcelulose, carbopol e claritromicina................ 60
Figura 14 - Aspecto da mistura de parafina light e Span............................
60
Figura 15 - Início da adição da dispersão à mistura de parafina light e
span.............................................................................................................
61
Figura 16 - A mistura foi ficando mais turva à medida que se adicionava
a dispersão..................................................................................................
61
ix
Figura 17 - Aspecto da dispersão após o término da emulsificação..........
61
Figura 18 - Aspecto da dispersão após a evaporação da acetona............
62
Figura 19 - Aspecto da dispersão após a evaporação do etanol...............
62
Figura 20 - Fotografia das microesferas após lavagem com éter de
petróleo........................................................................................................
63
Figura 21 - Eluição cromatográfica da fase móvel sem claritromicina
durante 30 minutos por CLAE (n=3)............................................................
72
Figura 22 - Eluição cromatográfica de uma solução de claritromicina a
200 µg/mL em fase móvel por CLAE (n=3).................................................
73
Figura 23 - Eluição cromatográfica exploratória de fase móvel contendo
200 µg/mL de claritromicina durante 60 minutos por CLAE (n = 3)............
74
Figura 24 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 50 µg/mL de
claritromicina por CLAE (n = 3)...................................................................
76
Figura 25 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 100 µg/mL
de claritromicina por CLAE (n = 3)..............................................................
76
Figura 26 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 200 µg/mL
de claritromicina por CLAE (n = 3)..............................................................
77
Figura 27 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 300 µg/mL
de claritromicina por CLAE (n = 3)..............................................................
77
Figura 28 - Representação gráfica de três curvas padrões de
claritromicina, obtidas por CLAE em dias diferentes...................................
78
Figura 29 - Representação gráfica da curva padrão de claritromicina,
obtidas a partir das três curvas padrões por CLAE nas concentrações de
20 a 60 µg/mL(n=9). Y = 855,37 X - 617; coeficiente de determinação (r
2
)
de 0,9999 e desvio padrão relativo (%DPR) igual a 0,47%.......................
79
Figura 30 - Eluição cromatográfica de etilcelulose dispersa em metanol
por CLAE (n = 3)..........................................................................................
82
Figura 31 - Eluição cromatográfica de carbopol disperso em metanol por
CLAE (n = 3)................................................................................................
82
Figura 32 - Eluição cromatográfica dos constituintes das microesferas
brancas dispersas em metanol por CLAE (n = 3)........................................
83
x
Figura 33 - Eluição de claritromicina padrão na concentração teórica de
200 µg/mL por CLAE (n = 3).......................................................................
83
Figura 34 - Eluição cromatográfica por CLAE de claritromicina a 200
µg/mL (n=3).................................................................................................
85
Figura 35 - Eluição cromatográfica por CLAE de 6,11-O-metileritromicina
a 200 µg/mL (n=3).......................................................................................
85
Figura 36 - Eluição cromatográfica por CLAE de claritromicina a 200
µg/mL mais 6,11-O-metileritromicina a 200 µg/mL (n=3)...........................
86
Figura 37 - Eluição cromatográfica por CLAE do padrão secundário de
claritromicina na concentração de 200 µg/mL (n=3)...................................
87
Figura 38 - Eluição cromatográfica por CLAE do padrão primário de
claritromicina na concentração de 200 µg/mL (n=3)...................................
88
Figura 39 - Microscopia eletrônica de varredura das microesferas de
claritromicina. Ampliação de 5.000 vezes (escala indicada).......................
89
Figura 40 - Microscopia eletrônica de varredura das microesferas de
claritromicina. Ampliação de 10.000 vezes (escala indicada).....................
89
Figura 41 - Microscopia eletrônica de varredura das “microesferas” sem
claritromicina. Ampliação de 5.000 vezes (escala indicada).......................
90
Figura 42 - Representação gráfica da curva padrão de claritromicina
obtida a partir das três curvas padrões pelo método espectrofotométrico
nas concentrações de 10 a 50 µg/mL (n = 3). Y = 0,0179x - 0,015;
coeficiente de determinação (r
2
) de 0,9929 e desvio padrão relativo
(%DPR) igual a 5,27%.................................................................................
94
Figura 43 - Mucosa de rato após incubação sem microesferas e
lavagem com solução salina.......................................................................
99
Figura 44 - Mucosa de rato após adição de microesferas, incubação e
lavagem com solução salina pH 1,2............................................................
99
Figura 45 - Mucosa de rato após adição de microesferas, incubação e
lavagem com solução salina pH 5,0............................................................
99
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Exemplo de polímeros mucoadesivos (SALAMAT-MILLER et al.,
2005)........................................................................................................
39
Tabela 2 - Tempo de retenção, área e altura da eluição cromatográfica da
fase móvel sem claritromicina durante 30 minutos por CLAE (n=3)..............
73
Tabela 3 - Tempo de retenção, área e altura da eluição cromatográfica de
uma solução de claritromicina a 200 µg/mL em fase móvel por CLAE
(n=2)
74
Tabela 4 - Tempo de retenção, área e altura da eluição cromatográfica
exploratória da fase móvel contendo 200 µg/mL de claritromicina durante
60 minutos por CLAE (n=3)............................................................................
75
Tabela 5 - Tempo de retenção e área da eluição cromatográfica por CLAE
da fase móvel contendo diferentes concentrações
de claritromicina (n=3)
75
Tabela 6 - Resultados estatísticos obtidos para as soluções padrões de
claritromicina em fase móvel para as diferentes concentrações utilizadas
na construção da curva de calibração por CLAE...........................................
79
Tabela 7 - Resultados
do teste de repetibilidade para a validação do
doseamento cromatográfico de claritromicina por CLAE (n=3).....................
80
Tabela 8 - Resultados do teste de precisão intermediária, em três dias,
para validação do doseamento cromatográfico de claritromicina por CLAE
(n=9)................................................................................................................
81
Tabela 9 - Resultados do teste de seletividade utilizando etilcelulose,
carbopol, microesferas sem claritromicina e solução padrão de
claritromicina a 200 µg/mL dispersos em metanol (n=3)................................
81
Tabela 10 - Tempo de retenção e a área dos picos cromatográficos por
CLAE de claritromicina 200 µg/mL, 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL e
claritromicina 200 µg/mL + 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL (n=3)...........
84
Tabela 11 - Tempo de retenção e área dos picos cromatográficos por
CLAE do padrão primário e secundário de claritromicina, ambos a 200
µg/mL (n=3)....................................................................................................
87
Tabela 12 – Teor total de claritromicina presente nas microesferas (n=3)....
91
xii
Tabela 13 – Claritromicina adsorvida na superfície das microesferas (n=2).
92
Tabela 14 - Construção de curva de calibração para determinação da
claritromicina por UV (n = 3)...........................................................................
93
Tabela 15 – Teor de claritromicina presente nas microesferas após 2 e 4
horas de incubação em 10 mL de meio gástrico artificial contendo leite
(n=3). Os cálculos foram feitos utilizando a equação da reta de 10 a 50
µg/mL..............................................................................................................
95
Tabela 16 – Teor de claritromicina presente nas microesferas após 2 e 4
horas de incubação em 10 mL de meio gástrico artificial contendo leite
(n=3). Os cálculos foram feitos utilizando a equação da reta de 10 a 50
µg/mL..............................................................................................................
96
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
CCK2 Colecistocinina
ECL Células tipo enterocromafins
STP-repeats Seqüências de repetição rica em serina, treonina e prolina
CMMI Complexo motor migrante interdigestivo
H. pylori Helicobacter pylori
PPI Inibidores de bombas de prótons
TRG Tempo de retenção gástrico
PGEF-ME Microesferas de ácido gástrico de poliglicerol
CPD Microesferas de ácido gástrico de poliglicerol contendo carbopol
disperso
CPC Microesferas de ácido gástrico de poliglicerol contendo carbopol
envolvendo a superfície externa
ANP Peptídeos natriuréticos atrial
CCK2 Colecistocinina
HCl Ácido clorídrico
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
xiv
RESUMO
Helicobacter pylori, uma bactéria gram negativa, habita o estômago de
aproximadamente metade da população mundial. A infecção causada por esta
bactéria está associada com certos tipos de inflamações gastroduodenais
podendo levar ao desenvolvimento de gastrite aguda ou crônica, úlcera gástrica
ou duodenal e câncer gástrico. A claritromicina, um agente antibiótico macrolídeo,
tem sido utilizado como terapia de primeira linha no tratamento do Helicobacter
pylori associado ao metronidazol ou amoxicilina e um inibidor da bomba de
prótons. Entretanto, há uma elevada taxa de falha na erradicação completa da
infecção utilizando este tratamento, a qual pode estar ligada ao curto tempo de
residência e instabilidade dos antimicrobianos no estômago. O objetivo desse
trabalho foi preparar microesferas de claritromicina mucoadesivas e de liberação
controlada na mucosa gástrica visando aumentar sua eficácia clínica no
tratamento do Helicobacter pylori. Primeiramente, foi necessário validar o método
de doseamento da claritromicina por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE). Em seguida, microesferas mucoadesivas contendo claritromicina foram
preparadas utilizando etilcelulose como matriz e carbopol 934P como polímero
mucoadesivo. Depois, estas microesferas foram caracterizadas em relação ao
tamanho, morfologia e perfil de liberação da claritromicina em um meio gástrico
artificial contendo leite como padrão alimentar. Por fim, um estudo de mucoadesão
in vitro foi efetuado. Os resultados mostraram que foi possível validar o método de
doseamento da claritromicina por CLAE, que as microesferas apresentaram uma
forma esférica e tamanho de 1 a 2 µm, que aproximadamente 30% da
claritromicina encapsulada nas microesferas foi liberada após 4 horas, sugerindo
uma ação prolongada, e ainda, que in vitro as microesferas aderem à mucosa
gástrica. Estes resultados serão posteriormente confirmados in vivo antes de
propor a utilização desse novo sistema para o tratamento do Helicobacter pylori.
Palavras chaves: Claritromicina, microesferas mucoadesivas. carbopol,
etilcelulose, Helicobacter pylori
xv
ABSTRACT
Helicobacter pylori, a gram negative bacterium, habitats the stomach of
about half of the world population. The infection caused by this bacterium is
associated with some types of gastroduodenal inflammatory diseases that can
reach the stage of an acute or chronic gastritis, gastric or duodenal ulcer and
gastric cancer. Clarithromycin, a macrolide antimicrobial agent, has been adopted
as a first therapy line for H. pylori infection treatment associated to the
metronidazole or to the amoxicillin and a proton pump inhibitor. However there is a
high rate of failure in completely infection eradication using this treatment, which
can be related to the short permanency time and instability of the antimicrobials
agents in stomach. The target of this work was to prepare clarithromycin
mucoadhesive microspheres with controlled liberation in the gastric mucosa for
improving its clinical efficacy for the Helicobacter pylori infection treatment. Firstly,
It has been necessary to validate the method for the quantification of clarithromycin
by high efficiency liquid chromatography (CLAE). In the following step,
mucoadhesive microspheres with clarithromycin were been prepared using as
ethylcellulose as the matrix and carbopol 934P as the mucoadhesive polymer.
After, these microspheres have been characterized due to their size, morphology
and release profile of the clarithromycin in an artificial gastric mean with milk as an
alimentary standard. At the end, an in vitro mucoadhesion study has been
performed. The results have made evident that it was possible validating
clarithromycin quantification method by CLAE, microspheres have presented
spherical shape and size from 1 to 2 µm, about 30% of the clarithromycin
entrapped in the microspheres has been released after 4 hours and they suggest a
long time action, and besides, that microspheres adhere in vitro to the gastric
mucosa. These results will be after confirmed in vivo before of proposing this new
system for Helicobacter pylori treatment
Keywords:
Clarithromycin, mucoadhesive microspheres, carbopol, ethylcellulose, Helicobacter
pylori
16
INTRODUÇÃO GERAL
O Helicobacter pylori (H. pylori), uma bactéria gram negativa que geralmente na
infância coloniza a mucosa gástrica, constitui um importante fator de risco para
várias doenças gastrintestinais podendo persistir por toda a vida sem tratamento
específico. A infecção pelo H. pylori está associada com certos tipos de
inflamações gastroduodenais podendo levar ao desenvolvimento de gastrite aguda
ou crônica, úlcera gástrica ou duodenal e câncer gástrico (STADE, 2003). Sua
prevalência varia de 20 a 50% em países industrializados e de aproximadamente
80% nos países em desenvolvimento (LEE et al., 2008).
No tratamento desta infecção é recomendada uma terapia tripla que
corresponde ao uso de dois antibióticos em combinação com um inibidor de
bomba de prótons (PPI). Essa terapia, que é de primeira linha em populações com
prevalência de resistência à claritromicina menor que 15 a 20%, utiliza um PPI em
dose padrão, 500 mg de claritromicina e 1 g de amoxicilina duas vezes ao dia. Em
populações com prevalência de resistência ao metronidazol menor que 40% a
associação de um PPI, claritromicina e 400 ou 500 mg de metronidazol é
preferível. Entretanto, a taxa de erradicação é baixa, aproximadamente 80%. As
principais causas que contribuem para a falha do tratamento são a falta de adesão
dos pacientes e a resistência aos antibióticos (WOLLE & MALFERTHEINER,
2007). Outras razões para a incompleta erradicação do H. pylori podem estar
ligados ao curto tempo de residência do agente antimicrobiano, claritromicina ou
amoxicilina, no estômago e a instabilidade desses antimicrobianos em meio ácido
(NAGAHARA et al., 1998; LIU et al., 2005).
Nosso estudo pretende desenvolver e avaliar um novo produto tecnológico,
microesferas mucoadesivas de claritromicina, com o objetivo de aumentar a
eficácia terapêutica do tratamento do Helicobacter pylori através da redução da
dose empregada no tratamento, o que leva a uma maior adesão do paciente, e um
maior tempo de contato e de residência do antimicrobiano na mucosa gástrica,
com conseqüente erradicação das doenças gastroduodenais causadas por esse
microrganismo.
17
REVISÃO DA LITERATURA
1 Estômago
O estômago consiste de três regiões topográficas denominadas de fundo, corpo
e antro. O fundo e o corpo compreendem 80% do órgão e o antro 20% (Figura 1)
(KLEINMAN, 2008).
Figura 1 - Anatomia do estômago (FOX & WANG, 2007).
O estômago possui três funções motoras que são armazenamento, mistura e
esvaziamento. A parte proximal do estômago, fundo e corpo, atua como um
reservatório para os materiais não digeridos e é responsável pelo esvaziamento
de líquidos. Os líquidos são eliminados do estômago devido à pressão
intragástrica que é gerada por contrações musculares na região do corpo do
estômago. A parte distal do estômago, antro, é responsável pela trituração e
mistura dos alimentos sólidos e atua como uma bomba para o esvaziamento dos
18
sólidos através de ações propelentes. Portanto, através da secreção de suco
gástrico e contrações do estômago na região do antro os alimentos são triturados
e amassados promovendo a mistura e homogeneização (HEJAZI & AMIJI, 2003).
A ingestão de comida e a distensão do estômago induzem a secreção de 2 a 3
litros de suco gástrico por dia, que é constituído principalmente por HCl,
pepsinogênio, muco e água e é influenciado pela quantidade e viscosidade do
alimento ingerido e pelo conteúdo de proteína. O HCl promove a desnaturação
ácida das partículas de alimento, ativa o pepsinogênio e mata a maioria das
bactérias ingeridas. Ondas peristálticas originadas da parede do estômago
propagam-se em direção ao antro ocasionando mistura do conteúdo antral e
forçando-o em direção ao piloro. A primeira porção de alimento passa diretamente
para o duodeno desencadeando o fechamento do esfíncter pilórico. Ocorre
novamente mistura do conteúdo gástrico que foi impelido de volta e os sólidos são
evacuados pelo piloro lentamente e regularmente. Durante esse processo o
estômago transforma seu conteúdo em uma mistura denominada quimo que é
constituída por solução aquosa, gorduras e sólidos. As ondas peristálticas
intensas promovem o esvaziamento antral, permitindo que o conteúdo gástrico
passe através do piloro para o duodeno. O tamanho das partículas que passam do
estômago para o duodeno são menores que 1 a 2 mm entretanto 90% dos
alimentos sólidos são esvaziadas como partículas menores que 0,25 mm em
diâmetro (DRESSMAN et al., 1998; KONG & SINGH, 2008).
A mucosa do estômago é constituída de diferentes tipos celulares incluindo
células superficiais e várias células secretoras localizadas nas glândulas gástricas
que são invaginações tubulares originadas a partir do assoalho do estômago. Na
região do corpo e fundo estão localizadas as glândulas oxínticas enquanto na
região do antro estão localizadas as glândulas pilóricas (Figura 2) (SCHUBERT &
PEURA, 2008).
19
Figura 2 - Anatomia das glândulas gástricas (SCHUBERT & PEURA, 2008).
As glândulas oxínticas são organizadas em unidades tubulares verticais. Cada
unidade consiste de uma região apical contendo uma abertura, um istmo e a
região glandular, a qual é representada na parte inferior da unidade e é formada
de um colo e de uma base. Na região do istmo localizam-se as células
progenitoras responsáveis pela formação de todas as células epiteliais gástricas.
As células mucosas produtoras de muco localizam-se acima da região do istmo
em direção ao lúmen, as células parietais que são responsáveis pela produção de
ácido clorídrico localizam-se na região mediana e mais inferior da glândula, já as
células zimogênicas predominam na base da glândula e secretam pepsinogênio e
leptina. No interior da glândula também estão contidas células neuroendócrinas
como as células tipo enterocromafins (ECL) que contém histamina, células D que
contém somatostatina e amilina, células enterocromafins que contém peptídeos
natriuréticos atrial (ANP) e células tipo A ou Gr que contém gelim e obestatim. Nas
glândulas pilóricas estão presentes as células G secretoras de gastrina, células D
20
contendo somatostatina cuja função nessa região é exercer um controle parácrino
da secreção gástrica pelas células G. As glândulas pilóricas também contêm
células enterocromafins e células tipo K ou células Gr. A secreção ácida gástrica
está sujeita a uma complexa regulação por mediadores endócrinos, parácrinos e
neurócrinos que interagem extensivamente. Os principais estimulantes são a
histamina, a gastrina e a acetilcolina (POHL et al., 2008). Esses agentes
interagem com receptores associados aos dois principais sinalizadores de
transdução sendo adenilato ciclase no caso da histamina e intracelular de cálcio
no caso de gastrina e acetilcolina. Cada um desses agentes atua diretamente
estimulando a célula parietal ou indiretamente modulando a secreção pelas
células neuroendócrinas (SCHUBERT & PEURA, 2008).
A histamina, produzida pelas células tipo enterocromafins, estimula a produção
e a secreção ácida diretamente ligando-se aos receptores H2 das células parietais
ou indiretamente ligando-se aos receptores H3 das células D inibindo a
somatostatina e conseqüentemente estimulando histamina e a secreção ácida. A
gastrina, produzida pelas células G, é o principal estimulante de secreção ácida
durante a ingestão de alimentos. Ela media uma ação estimulante nas células
parietais indiretamente, induzindo a liberação de histamina pelas células tipo
enterocromafins ao se ligar aos seus receptores CCK2 (colecistocinina 2), e
diretamente ligando-se a receptores CCK2 das células parietais, sendo este de
menor importância fisiológica. A acetilcolina, liberada pelos neurônios entéricos
pós-ganglionares, estimula a liberação de secreção ácida diretamente ligando-se
aos receptores muscarínicos M3 localizados nas células parietais. A acetilcolina
também estimula a secreção ácida indiretamente por ativação dos receptores M2
e M4 localizados nas células D para inibir a secreção de somatostatina e
conseqüentemente remover o controle exercido por esse peptídeo sobre a
gastrina, ECL e células parietais (Figura 3) (POHL et al., 2008; SCHUBERT &
PEURA, 2008).
21
Figura 3 - Modelo ilustrando os receptores das células parietais e da transdução
(SCHUBERT & PEURA, 2008).
O trato gastrintestinal é constituído por quatro camadas: a mucosa (camada
mais interna), a submucosa, a camada muscular externa e a serosa. A mucosa é
coberta por uma camada de muco secretada pelas células epiteliais que
constituem a camada mais superficial da mucosa. No estado em jejum o pH do
estômago varia de 0,8 a 2,0 devido a secreção de íons hidrogênio. A ingestão de
alimentos causa o aumento do pH para 4 ou 5 devido aos efeitos de diluição e
tamponamento. A secreção de bicarbonato no duodeno neutraliza o ácido gástrico
aumentando o pH para aproximadamente 5,5 no estado alimentado ou em jejum
(VARUM et al., 2008). A mucosa gástrica mantém sua integridade estrutural e
funcional apesar da contínua exposição a fatores nocivos, incluindo HCl 0,1 mol/L
e pepsina que são capazes de digerir tecidos. Sob condições normais, a
22
integridade da mucosa é mantida por mecanismos de defesa, os quais incluem
fatores pré-epiteliais caracterizado pela barreira muco-bicarbonato-fosfolipídeos e
pela barreira epitelial caracterizada pela justaposição das células epiteliais e
secreção de bicarbonato, muco, fosfolipídeos, peptídeos e prostaglandinas. Outros
mecanismos de defesa importantes estão ligados à contínua renovação celular, ao
contínuo fluxo sanguíneo através dos capilares da mucosa, a inervação sensorial
e a geração de prostaglandinas e ácido nítrico. A lesão da mucosa pode ocorrer
quando os fatores nocivos oprimem a defesa intacta da mucosa ou quando a
defesa da mucosa é prejudicada (LAINE et al., 2008). A primeira linha de defesa
da mucosa é formada por gel mucoso, bicarbonato e fosfolipídeos que cobrem a
superfície da mucosa. O pH do lúmen gastroduodenal se aproxima de 2 enquanto
que na camada adjacente ao epitélio o pH é aproximadamente neutro (pH 7). Este
gradiente de pH que ajuda a proteger a membrana mucosa da digestão pela
pepsina, uma enzima ácido-dependente, é mantido pela secreção de íons
bicarbonato
e pelo muco produzidos pelas células epiteliais gástricas
(BARDONNET et al., 2006). Como resultado da erosão ocasionada por proteases
luminal e fratura mecânica, a mucina precisa ser constantemente secretada para a
preservação da camada de muco. Em condições fisiológicas normais a secreção
do muco é proporcional ao processo de erosão e, portanto, mantém uma
adequada proteção da camada (HOU et al., 2003). Embora a secreção de muco
possa variar dependendo da idade, sexo, localização no corpo e condições de
saúde, a média de renovação do muco é de aproximadamente 6 horas (SERRA et
al., 2008). A renovação celular contínua das células progenitoras mantém a
integridade estrutural da mucosa. O epitélio é continuamente renovado por uma
proliferação bem coordenada e controlada de células progenitoras permitindo a
substituição de células epiteliais velhas ou agredidas. A completa substituição da
superfície epitelial gástrica ocorre entre 3 a 7 dias, enquanto meses são
requeridos para substituir as células glandulares (LAINE et al., 2008).
O muco protege a mucosa gástrica contra agressões físicas ou químicas
através de uma variedade de mecanismos (KLEINMAN, 2008). Sua função
primária é lubrificar e proteger o epitélio contra dano mecânico causado pela
23
presença do alimento, enzimas digestivas, toxinas, carcinógenos e radicais livres.
Ele provê um micro ambiente de pH estável para as células subjacentes e atua
como uma barreira de difusão entre o lúmen e o epitélio (VARUM et al., 2008). A
camada do muco varia de 100 a 200 µm em espessura dependendo da
localização gástrica (BARDONNET et al., 2006) e é composto por duas camadas:
a primeira camada está aderida firmemente à mucosa gástrica e a camada
seguinte que representa 40 a 60 % do muco, está em contato com o lúmen e
adere frouxamente à camada mucosa (HOU et al., 2003). O muco gástrico é
composto por aproximadamente 95% de água, mas também contém mucinas,
lipídeos, ácidos graxos, fosfolipídeos, colesterol e proteínas. As mucinas,
principais componentes responsáveis pela elevada viscosidade do muco, são
macromoléculas glicoproteicas extracelulares, com massa molar variando de 0,5 a
20 KDa. Do ponto de vista polimérico, as mucinas são copolímeros em bloco
constituídos por blocos ramificados e não ramificados. Os dois tipos de blocos
possuem esqueleto protéico em sua constituição sendo que os blocos ramificados
possuem cadeias oligossacarídicas altamente ramificadas ligadas a eles e
representam 75% do comprimento do esqueleto protéico. Nos blocos ramificados
os principais aminoácidos presentes são serina, treonina e prolina. As cadeias
laterais oligossacarídicas compostas por 2 a 19 monômeros exibem moderada
ramificação e são constituídas por galactose, fucose, n-acetilglucosamina, n-
acetilgalactosamina e ácido siálico (ácido N-acetilneurâmico), além de traços de
manose e sulfato. Os oligossacarídeos são ligados à cadeia polipeptídica através
de ligações O-glicosídicas e organizados em uma configuração “bottle-brush”
sobre o núcleo protéico, onde as cadeias ramificadas são mais estendidas que as
não ramificadas. Os açúcares são importantes para manter a conformação
estendida da mucina. Os blocos não ramificados são regiões que possuem poucos
oligossacarídeos O-glicosilados, contêm alguns oligossacarídeos N-ligados e são
ainda regiões ricas em aminoácidos cisteína e aminoácidos como aspartato e
glutamato que parecem estar envolvidas em dimerização através de formação de
ligações dissulfeto e subseqüentemente polimerização dos dímeros para formar
multímeros. Estas regiões têm uma composição de aminoácidos mais
24
representativa de proteínas globulares e têm sua conformação dependente da
composição de aminoácidos e do meio de solução, sendo possíveis três
conformações: rigid helix, random coil e compact globules (PEPPAS & HUANG,
2004). O núcleo protéico é organizado em distintas regiões sendo uma região
central glicosilada compreendida por sequências de repetições rica em serina,
treonina e prolina (STP repeats) e outra região rica em cisteína que se localiza em
carboxila e amino terminal ou intercaladas entre STP-repeats (Figura 4) (HONG et
al., 2005; BANSIL & TURNER, 2006).
Figura 4 - Estrutura da mucina gástrica. (a) Monômero de mucina gástrica
consistindo de regiões glicosiladas e regiões de pouca glicosilação; (b) símbolos
dos diferentes domínios; (c) formação de dímeros por ligação de duas unidades
monoméricas via ligações dissulfeto na região não glicosilada; (d) formação de
multímeros (HONG et al., 2005).
Uma molécula de mucina é composta por 4 subunidades e cada subunidade é
constituída por domínios-T. Cada domínio-T é composto por um bloco peptídico
ramificado e um ou dois blocos peptídicos não ramificados terminais. Em solução
aquosa, o esqueleto protéico é neutro ou hidrofóbico enquanto as cadeias
oligossacarídicas são altamente hidrofílicas. Portanto se a densidade das cadeias
25
oligossacarídicas for muito alta e as cadeias forem longas, outras moléculas
somente terão contato com as cadeias hidrofílicas dos oligossacarídeos,
protegendo o segmento protéico. Além disso, a função das cadeias de açúcares
ramificadas na conformação estendida é principalmente devido ao primeiro ou
segundo resíduo de açúcar enquanto os outros resíduos são menos importantes
(PEPPAS & HUANG, 2004). A carga elétrica das glicoproteínas é determinada
pela presença de ácido siálico (pka aproximadamente 2,6) e resíduos de sulfato
presente em grupos esterificados (HOU et al., 2003; BARDONNET et al., 2006).
2 Helicobacter pylori
O H. pylori é uma bactéria gram negativa que habita atualmente o estômago de
aproximadamente 50% da população mundial (ALGOOD & COVER, 2006; FOX &
WANG, 2007). Inicialmente, esta bactéria foi chamada de Campylobacter pyloridis
e posteriormente Campylobacter pylori, mas, devido às características genéticas,
estruturais e morfológicas específicas foi classificada em um novo gênero, o
Helicobacter (STADE, 2003). A morfologia do H. pylori, observada à microscopia
ótica e eletrônica, é homogênea, apresentando-se com estrutura encurvada ou
espiralada, de superfície lisa e extremidades arredondadas. Eles são móveis,
possuem de 4 a 6 flagelos, medem aproximadamente 0,5 a 0,1 µm de largura e 3
µm de comprimento, podem distribuir–se de maneira focal, segmentar ou difusa ao
longo da mucosa gástrica, localizando-se no interior ou por baixo da camada de
muco que recobre o epitélio da superfície do estômago. O H. pylori possui
capacidade excepcional de aderência e é adaptado para colonizar somente a
mucosa gástrica, sendo encontrado raras vezes em área de metaplasia intestinal.
No duodeno a bactéria pode colonizar áreas de metaplasia gástrica. A afinidade
do H. pylori pelas células mucíparas gástricas deve-se à composição neutra do
muco gástrico, que difere dos mucopolissacarídeos ácidos produzidos pelas
células caliciformes da metaplasia intestinal (LADEIRA et al., 2003).
A infecção pelo H. pylori apresenta distribuição universal, embora seja
significativamente menos prevalente nos países industrializados em todas as
26
faixas etárias, é adquirida principalmente na infância e adolescência, entretanto, a
infecção é seguida por um longo período de fase de quiescência onde há uma
gastrite crônica de intensidade variável, mas com sintomas mínimos, ou seja, a
maioria dos indivíduos infectados permanece assintomática (FOX & WANG,
2007). A taxa de prevalência aumenta com a idade e isso parece ser devido ao
contínuo risco de infecção. Em indivíduos com idade superior a 60 anos a curva
de prevalência atinge um patamar ou entra em leve declínio. Quanto aos fatores
de risco que influenciam a prevalência e a transmissão do H. pylori, estudos
constataram que além da idade às baixas condições de saneamento básico e
maior densidade de moradia parecem ser as variáveis mais importantes. O
mecanismo exato de transmissão da bactéria continua desconhecido, embora
saiba-se que a bactéria só consegue alcançar a mucosa gástrica pela boca por se
tratar de microrganismo não invasivo (KODAIRA et al., 2002) e a transmissão
acontece principalmente dentro das famílias (MALATY, 2007). A presença do H.
pylori associada com certos tipos de inflamações gastroduodenais podem levar ao
desenvolvimento de gastrite aguda ou crônica, úlcera gástrica ou duodenal e
câncer gástrico. A localização da úlcera e o desenvolvimento de câncer dependem
do tipo e localização da gastrite (STADE, 2003), por exemplo, gastrite crônica
predominantemente antral está relacionada à úlcera duodenal e representa menor
risco de desenvolvimento de câncer gástrico do que a gastrite presente
concomitantemente no antro e corpo. Estudos demonstraram que a gastrite
crônica foi mais intensa em indivíduos com câncer gástrico do que em indivíduos
com úlcera duodenal, ou seja, adenocarcinoma gástrico foi freqüentemente
encontrado em áreas de inflamação crônica e em áreas de atrofia gástrica e
metaplasia intestinal. Apesar disso, somente 10 a 15% dos indivíduos infectados
com H. pylori desenvolvem úlcera péptica e estima-se que o risco de
desenvolvimento de câncer gástrico seja aproximadamente de 1 a 3%. Já a úlcera
péptica tende a se desenvolver em pacientes com 20 ou 30 anos enquanto câncer
gástrico surge décadas mais tarde (FOX & WANG, 2007). Apesar de todas estas
informações, H. pylori é uma espécie muito diversificada e o risco de adquirir
27
câncer pode ser aumentado com cepas que possuem genes associados à
virulência, e ainda, devido aos fatores genéticos e ambientais (CONWAY, 2005).
A resistência ao ácido clorídrico é de vital importância na patogênese do H.
pylori, visto que, sem esse atributo biológico, a bactéria não teria condições de
colonizar a mucosa gástrica. A bactéria sintetiza a enzima urease que atua
promovendo a hidrólise da uréia, presente em condições fisiológicas no suco
gástrico, levando à produção de amônia e dióxido de carbono e disparando
mecanismos que possibilitam a entrada de uréia em seu interior e o refluxo de
urease. A urease atua como receptor de H
+,
gerando pH neutro no interior e
exterior da bactéria o que confere a esta bactéria resistência à acidez gástrica. Os
níveis de íons amônio produzidos pelo processo de hidrólise da uréia, podem ser
tóxicos para as células epiteliais superficiais gástricas e causar lesão epitelial
(CONWAY, 2005). Além de ser caracterizada por possuir uma alta atividade de
urease, a bactéria produz uma variedade de enzimas como superóxido dismutase,
catalase e arginase que conferem proteção contra a atividade lítica de macrófagos
e neutrófilos, impedindo uma resposta eficaz do hospedeiro. A forma espiralada e
alta motilidade da bactéria permitem que ela resista ao esvaziamento gástrico e
permaneça na mucosa gástrica. Entretanto mesmo com múltiplos mecanismos de
adaptação ácida, H. pylori permanece susceptível ao meio ácido podendo
sobreviver somente por poucos minutos em presença de baixo pH luminal. Por
esse motivo esta bactéria na fase precoce de colonização necessita atravessar a
camada de muco que protege o epitélio gástrico e permanecer próximo à
superfície epitelial onde o pH é próximo da neutralidade, como estratégia para
minimizar sua exposição ao meio ácido. Tal camada é formada por um gel
viscoelástico que confere proteção química e mecânica ao revestimento epitelial,
inclusive contra bactérias. No entanto, lipases e proteases sintetizadas pelo H.
pylori degradam a camada de muco facilitando sua progressão e os seus flagelos
lhes conferem a propriedade de motilidade, habilitando a sua penetração na
mucosa gástrica (LADEIRA et al., 2003). Além disso, a habilidade do H. pylori em
se mover e controlar sua orientação espacial através de respostas quimiotáticas é
essencial para a sua colonização. Já no interior da mucosa gástrica
28
aproximadamente 20% destas bactérias são encontradas aderidas às superfícies
das células, sendo ainda encontradas também nos espaços intercelulares e
algumas vezes dentro das células epiteliais (ALGOOD & COVER, 2006; AMIEVA
& EL-OMAR, 2008).
3 Claritromicina
A claritromicina é um antibiótico macrolídeo semi-sintético derivado da
eritromicina A que assim como ela possui um anel lactâmico de 14 membros ao
qual se ligam os dois desoxi – açúcares, cladinose e desosamina, nas posições 3
e 5 respectivamente, através de ligações β – glicosídicas, que confere a
claritromicina um caráter básico. A claritromicina difere estruturalmente da
eritromicina A somente pela metilação de um grupo hidroxila na posição 6 do anel
lactâmico (KANFER et al.;1998). A presença do grupo metil nessa posição resulta
em maior estabilidade da claritromicina em meio ácido, redução de efeitos
adversos gastrintestinais e aumento do espectro de atividade antimicrobiana
contra uma variedade de microrganismos gram positivos e gram negativos,
aeróbicos e anaeróbicos quando comparada com a eritromicina (MORGAN et al.;
1991; GAN et al., 1992). Como a eritromicina não possui o grupo metila, ela sofre
degradação ácida com mais facilidade e alguns dos produtos de degradação
gerados, estão associados ao aumento da motilidade gastrintestinal e podem
contribuir para efeitos adversos gastrintestinais (AHFS, 2000). Além disso, como a
claritromicina não possui duplas conjugadas no anel lactâmico, não há
absorvância significativa no ultravioleta sendo obtida apenas em baixos
comprimentos de onda (Figura 5).
29
Figura 5 - Fórmula estrutural da claritromicina.
A claritromicina possui fórmula molecular C
38
H
69
NO
13
e massa molar de 748
(USP, 2006a). Ela é uma base fraca cujo pKa é igual a 9,2, existindo na forma
ionizada no estômago mesmo em pH neutro (GRUBEL & CAVE, 1998). A
estabilidade ótima da claritromicina foi observada em uma faixa de valores de pH
entre 5 e 8 em solução aquosa tamponada e amostras de suco gástrico. Em
valores de pH abaixo de 5 a taxa de degradação aumentou acentuadamente
sendo que sua meia vida de degradação em valores de pH 2 foi aproximadamente
de 1 hora (ERAH et al., 1997). A claritromicina se apresenta como um pó
cristalino, de cor branca, inodoro, com ponto de fusão entre 217
0
C a 225
0
C e é
praticamente insolúvel em água, solúvel em acetona, ligeiramente solúvel em
acetonitrila, etanol e metanol; e altamente solúvel em tampão fosfato em valores
de pH de 2 a 5 (Farmacopéia Brasileira, 2003; MOFFAT et al, 2004). A
solubilidade da claritromicina em tampão fosfato diminui com a elevação dos
valores de pH tornando-se constante acima de pH 9, e sua solubilidade em água
diminui com o aumento da temperatura (NAKAGAWA et al., 1992). Quimicamente
a claritromicina é o (2R, 3S ,4S, 5R, 6R, 8R, 10R,11R, 12S,13R) – 3 – (2, 6 -
Dideoxy - 3 – C, 3 – O – dimethyl – α – L – ribohexopyranosyloxy) – 11, 12 –
dihydroxy – 6 – methoxy – 2, 4, 6, 8, 10, 12 – hexamethyl – 9 – oxo – 5 – (3, 4, 6, -
trideoxy – 3 – dimethylamino – β – D – xylohexopyranosyloxy) pentadecan –13 –
olide (MOFFAT et al., 2004)
30
A claritromicina é bacteriostática, embora possa ser bactericida em altas
concentrações ou contra microrganismos altamente suscetíveis. Quando
administrada por via oral, ela sofre rápida absorção pelo trato gastrintestinal,
porém sua biodisponibilidade é reduzida entre 52% e 55% devido ao rápido
metabolismo de primeira passagem (CHU et al., 1992a; RODVOLD, 1999;
MOFFAT et al., 2004) e sua concentração plasmática máxima é alcançada entre
1h30 a 3 horas após a administração do fármaco (CHU et al.,1992b). A formulação
padrão de claritromicina pode ser administrada com ou sem alimento (CHU et
al.,1992c). A claritromicina e seu metabólito ativo, a 14-hidroxiclaritromicina,
distribuem-se amplamente por todo o tecido e atingem concentrações
intracelulares elevadas, geralmente superiores as concentrações séricas. A
ligação de claritromicina às proteínas plasmáticas e o seu tempo de meia vida de
eliminação dependem da dose e varia de 3 a 4 horas e de 5 a 7 horas, quando
ingeridas 2 vezes ao dia doses variando de 250 a 500 mg. O tempo de meia vida
de eliminação do metabólito ativo 14-hidroxiclaritromicina é aproximadamente de 5
a 6 horas e de 7 horas, quando são ingeridas 2 vezes ao dia doses de 250 e 500
mg (MOFFAT et al., 2004). A quantidade de claritromicina excretada de modo
inalterado na urina varia de 20 a 30%, dependendo da dose administrada e da
formulação.
4 Tratamento da infecção por H. pylori
Nas reuniões dos consensos de Maastricht o grupo europeu para o estudo do
Helicobacter revisou as diretrizes para o tratamento da infecção por H. pylori. A
erradicação do H. pylori foi fortemente recomendada para pacientes com úlcera
péptica gastroduodenal ativa ou cicatrizada, incluindo as lesões complicadas,
linfoma tipo MALT de baixo grau, gastrite atrófica, pós-ressecção de câncer
gástrico, em familiares de primeiro grau dos pacientes com câncer gástrico, na
condição do anseio do paciente e em pacientes com dispepsia não investigada
dependendo da prevalência de H. pylori. O tratamento também foi considerado em
várias outras condições como anemia ferropriva de causa obscura e púrpura
31
trombocitopênica idiopática. Quanto aos pacientes dispépticos, os membros do
consenso de Maastricht consideraram recomendável a estratégia de pesquisar e
erradicar H. pylori, empregando um teste não invasivo para pacientes sem sinais
de alarme e com idade abaixo dos 45 anos. Foi sugerido que o ponto de corte da
idade podia variar entre os países dependendo da prevalência de câncer gástrico.
Até recentemente, os resultados dos estudos verificando o impacto da erradicação
de H. pylori na prevenção do câncer gástrico ainda não foram definidos e
permanece para ser decidido se a indicação será amplamente aceita (CONWAY,
2005; CHEY et al., 2007; MALFERTHEINER et al., 2007; WOLLE &
MALFERTHEINER, 2007).
Os esquemas de tratamento do H. pylori recomendados atualmente não são
totalmente efetivos, possuindo uma taxa de erradicação de 80 a 95 %. A primeira
linha de terapia para erradicar H. pylori idealmente seria um tratamento rápido, de
fácil administração, bem tolerável e de custo relativamente baixo, entretanto, o
objetivo principal de qualquer tratamento para combatê-lo é a erradicação da
infecção em um maior número possível de pacientes (SCARPIGNATO, 2004).
Embora H. pylori seja sensível a muitos antibióticos in vitro, estudos in vivo
revelaram que poucos antibióticos promoveram eficácia clínica. As razões para
isso são o inadequado acúmulo do antibiótico no tecido gástrico, a inadequada
eficácia do antibiótico no nicho ecológico do H. pylori e o rápido desenvolvimento
de resistência pelo patógeno (LABENZ, 2001). A bactéria pode residir abaixo da
mucosa gástrica aderente, no epitélio gástrico, limitando o acesso da droga a esse
sítio. Além disso, o meio hostil do estômago reduz a biodisponibilidade do
antibiótico no sítio de ação contribuindo para falha no tratamento (CONWAY,
2005). O antibiótico com o maior potencial de erradicação em monoterapia in vivo
é o macrolídeo claritromicina, entretanto, a monoterapia para combater H. pylori é
contra-indicada devido à baixa taxa de erradicação, atingindo aproximadamente
30% em diversos estudos (LABENZ, 2001). A combinação de drogas é essencial
para maximizar a chance de erradicação da infecção e minimizar o risco de
resistência bacteriana. Tem sido recomendado o uso de dois antibióticos em
combinação com um inibidor de bomba de prótons (PPI). A terapia tripla utilizando
32
um PPI em dose padrão, claritromicina de 500 mg e amoxicilina de 1 g ou
metronidazol de 400 ou 500 mg, duas vezes ao dia, permanece a terapia de
primeira linha em populações com prevalência de resistência à claritromicina
menor que 15 a 20%. Em populações com prevalência de resistência ao
metronidazol menor que 40%, a associação de PPI, claritromicina e metronidazol
é preferível. Em cepas susceptíveis, essa combinação resulta em uma melhor taxa
de erradicação que a combinação de PPI, claritromicina e amoxicilina (WOLLE &
MALFERTHEINER, 2007).
A duração da terapia é controversa. Na Europa a duração do tratamento é de
sete dias enquanto que nos Estados Unidos são recomendados 10 dias ou mais.
As alternativas para terapia tripla incluem terapia quádrupla, terapia seqüencial e
terapia tripla utilizando antimicrobianos como levofloxacina, rifabutina e
furazolidona (VAKIL & MEGRAUD, 2007). A terapia quádrupla, composta por PPI,
tetraciclina, metronidazol e um sal de bismuto é uma alternativa às terapias de
primeira linha em áreas de alta prevalência de resistência a antibióticos
(MALFERTHEINER et al., 2007). Esse tratamento permanece a principal opção de
terapia de segunda linha se ele não foi usado como medicação de primeira linha,
entretanto, sal de bismuto não é disponível em alguns países devido à sua
suposta toxidade (WOLLE & MALFERTHEINER, 2007). Os principais problemas
relacionados com esse regime de tratamento estão ligados ao grande número de
comprimidos ou cápsulas que precisam ser ingeridos e a duração da terapia. Por
outro lado, as principais vantagens dessa terapia são o baixo custo e o regime de
tratamento permanecer efetivo nas áreas onde a resistência à claritromicina é alta.
Nos Estados Unidos, utilizando a terapia quádrupla, subsalicilato de bismuto (150
mg de bismuto por comprimido), tetraciclina 500 mg e metronidazol 250 mg são
administrados em uma dose de 2, 1 e 1 comprimidos, respectivamente, 4 vezes ao
dia. A terapia seqüencial é a mais recente inovação no tratamento de H. pylori. Ela
é um tratamento de 10 dias que consiste em administrar um PPI e 1 g de
amoxicilina, duas vezes ao dia por um período de 5 dias, seguido por terapia tripla
composta por PPI, claritromicina 500 mg e tinidazol 500 mg, duas vezes
diariamente por um período de 5 dias. Uma série de estudos realizados na Itália
33
tem mostrado excelentes resultados utilizando esse regime de tratamento. O
mecanismo preciso para o sucesso da terapia seqüencial não é conhecido. Sabe-
se que a bactéria pode desenvolver canais de efluxo para claritromicina, o qual
rapidamente transfere a droga para fora da célula bacteriana, impedindo a sua
ligação ao ribossomo. A amoxicilina atua na parede celular bacteriana
enfraquecendo-a, portanto, a fase inicial do tratamento pode prevenir o
desenvolvimento de canais de efluxo por enfraquecer a parede celular bacteriana.
De particular interesse foi o sucesso da terapia seqüencial em pacientes com
cepas resistentes à claritromicina, apresentando taxa de erradicação de 91%
enquanto a terapia tripla padrão foi de 29% (VAKIL & MEGRAUD, 2007). Além
desses, outros três regimes de tratamento contendo rifabutina, levofloxacina ou
furazolidona têm apresentado sucesso em terapias de erradicação de segunda ou
terceira linha de tratamento em experimentos na Europa e na Ásia (VAKIL &
MEGRAUD, 2007). Devido às variedades ligadas a clínica e da disponibilidade dos
antibióticos nos diferentes países nenhuma recomendação específica foi dada
para o tratamento de terceira escolha, exceto realizar o teste de susceptibilidade.
Antibióticos como fluoroquinolona, levofloxacina e rifabutina têm sido avaliados
mais como tratamentos de primeira escolha com PPI e amoxicilina que
retratamento, com um bom índice de sucesso (MALFERTHEINER et al., 2007)
No segundo consenso brasileiro sobre Helicobacter pylori, além do esquema de
tratamento mundialmente indicado, outros dois regimes de tratamento contendo
furazolidona foram também recomendados devido ao custo bastante acessível e
por ser particularmente útil para os pacientes com impedimento para o uso de
amoxicilina, evidenciando excelente índice de erradicação do microrganismo,
embora ocorra um maior número de efeitos adversos. O esquema terapêutico
corresponde à combinação de claritromicina de 500 mg e furazolidona de 200 mg
administradas duas vezes ao dia e um PPI padrão administrado uma vez ao dia,
durante sete dias. Também a combinação de furazolidona de 200 mg administrada
duas vezes ao dia, cloridrato de tetraciclina de 500 mg administrado quatro vezes
ao dia e um PPI administrado uma vez ao dia, durante sete dias foi incluída como
forma de oferecer opção terapêutica envolvendo antimicrobianos que hoje se
34
encontram disponíveis para a população na rede do sistema único de saúde,
entretanto, um estudo nacional indicou menor erradicação do H. pylori desse
tratamento quando comparado ao regime utilizando claritromicina. Caso ocorra
falência de um dos tratamentos iniciais propostos pelo consenso, recomendou-se
ainda mais duas tentativas de tratamento, com duração de 10 a 14 dias, não se
estendendo ou repetindo o esquema inicial (COELHO & ZATERKA, 2005).
A eficácia de um antibiótico contra H. pylori in vivo é basicamente influenciado
pela sua concentração na mucosa gástrica, sua estabilidade e sua atividade
antibacteriana. Esses três aspectos são influenciados pela acidez gástrica e
também por drogas anti-secretoras (LABENZ, 2001). Na terapia de erradicação do
H. pylori os inibidores da bomba de prótons aumentam o pH intragástrico
favorecendo várias ações farmacológicas importantes, como o aumento da
estabilidade e eficácia dos antibióticos. Além disso, promovem a redução do
esvaziamento gástrico levando ao aumento do tempo de residência do antibiótico
no estômago e promovem a diminuição da viscosidade do muco ocasionando
aumento da penetração dos antibióticos na camada mucosa (SCARPIGNATO,
2004). Como o crescimento do H. pylori é mais pronunciado em uma faixa estreita
de pH, entre 5 e 7, esta terapêutica adjuvante, além de promover melhor atividade
dos antimicrobianos pH-dependentes, irá facilitar a replicação bacteriana, fase
esta em que os microrganismos se tornam mais vulneráveis à ação de alguns
antibióticos, como por exemplo com a claritromicina que interfere na síntese
protéica. A redução do volume da secreção gástrica pelos anti-secretores também
contribui para uma ação mais eficaz dos antimicrobianos ao aumentar sua
concentração na mucosa gástrica (COELHO et al., 2004).
5 Formas farmacêuticas de retenção gástrica
Vencer as barreiras fisiológicas do trato gastrintestinal humano é o principal
desafio para o sucesso do desenvolvimento de sistemas retentivos gástricos. Além
da espessa camada protetora de muco, os padrões de motilidade gastrintestinal
também são obstáculos para a liberação de drogas no estômago (CONWAY,
35
2005). Portanto, torna-se necessário compreender a relação entre esvaziamento
gástrico da forma farmacêutica e a motilidade gástrica (HEJAZI & AMIJI, 2003).
Como o tempo de residência gástrico é geralmente curto em condições de jejum e
variável no estado alimentado, mesmo altas doses de antibióticos podem não
atingir concentrações desejáveis no sítio de ação. Portanto o desenvolvimento de
formas farmacêuticas orais com tempo de residência gástrico prolongado é
desejável. O tempo de residência gástrico da formulação farmacêutica dependerá
da fase do complexo motor migrante interdigestivo (CMMI) que estará ativa
quando ela for administrada. O sistema de retenção gástrica deverá ser capaz de
resistir às forças do CMMI por um período prolongado. É geralmente aceito que
para formulações de sistema de dosagem unitário o diâmetro da partícula deverá
ser maior que 15 mm para prolongar o tempo de retenção, especialmente durante
o estado de jejum (BARDONNET et al., 2007). Apesar de ter sido mostrado que a
administração de omeprazol prolonga o tempo de residência gástrico, o efeito da
alimentação no esvaziamento gástrico é muito mais significativo (CONWAY,
2005). Embora muitos sistemas retentivos gástrico tenham sido desenvolvidos,
poucos obtiveram êxito em melhorar o tempo de residência gástrico (HEJAZI &
AMIJI, 2003).
Nas duas últimas décadas, numerosas formulações têm sido designadas para
prolongar o tempo de retenção gástrico. Elas podem ser classificadas em
intumescíveis, alta densidade, flutuantes e mucoadesivas. Os sistemas
intumescíveis utilizam polímeros que intumescem quando entram em contato com
o fluido gástrico aumentando de tamanho de modo que não consigam passar
através do piloro, assim, o sistema fica retido no estômago por um longo período
de tempo. O equilíbrio entre o intumescimento e a velocidade de degradação do
polímero é essencial para obter boa resposta farmacológica e evitar efeitos
secundários (BARROCAS et al., 2007). A densidade da forma farmacêutica
determina a localização do sistema no estômago. Sistemas que possuem menor
densidade que o conteúdo gástrico podem flutuar na superfície, enquanto
sistemas de alta densidade são encontrados no fundo do estômago. Ambas as
posições podem isolar o sistema farmacêutico do piloro. Os sistemas de alta
36
densidade têm como objetivo fixar-se no fundo do estômago e resistir aos
movimentos peristálticos. Densidade de aproximadamente 2,5 g/cm
3
parece ser
fundamental para obtenção de um tempo de residência gástrico significativamente
prolongado. Embora resultados animadores tenham sido relatados em ruminantes,
a eficácia em seres humanos não foi observada. Os sistemas flutuantes possuem
densidade menor que o conteúdo gástrico e permanecem flutuando no estômago
por um período de tempo prolongado com o potencial para liberar a droga
continuamente. Estes sistemas dependem da presença de alimento para retardar
o esvaziamento e de uma quantidade de líquido suficiente no estômago para
permanecer flutuando (BARDONNET et al., 2006). Os sistemas mucoadesivos
utilizam polímeros naturais ou sintéticos com o objetivo de prolongar o tempo de
retenção gástrico (TRG) e controlar a liberação do fármaco. A adesão dos
polímeros à membrana mucosa pode ser mediada por processos de hidratação,
ligação química ou mecânica, ou ainda, mediada por receptores (BARROCAS et
al., 2007). Em relação aos sistemas flutuantes, os sistemas mucoadesivos têm a
vantagem de não depender da presença de conteúdo gástrico para permanecer
no estômago (JACKSON et al., 2000).
Mucoadesão pode ser definida como o fenômeno de ligação de polímeros
naturais ou sintéticos à superfície mucosa (SERRA et al., 2008; VARUM et al.,
2008). As vantagens desse sistema são: adesão localizada da droga facilitando a
absorção no local desejado, facilidade para revestimento de tecidos danificados e
a lubrificação de certas regiões (cavidades oral, ocular e vaginal). Como principal
desvantagem deve-se considerar que, como as ligações mucoadesivas têm
natureza muito heterogênea, é extremamente difícil identificar o tipo de ligação e
os grupos envolvidos na mucoadesão (SMART, 2005). Sistemas de liberação de
drogas mucoadesivas para o trato gastrintestinal requerem um potencial adesivo
mais potente que sistemas de aplicação tópica, cavidade nasal, mucosa oral
(bucal, sublingual ou gengival), reto ou pele, porque o sistema necessita aderir sob
condições dinâmicas. Além disso, uma forma farmacêutica pesada e volumosa,
como por exemplo, um comprimido, pode se destacar da mucosa e ser esvaziada
para o trato gastrintestinal (AKIYAMA et al., 1995).
37
As mucinas, presentes no trato gastrintestinal, contêm numerosos grupos
capazes de formar ligações de hidrogênio, tais como, grupos hidroxilas das
cadeias oligossacarídicas ramificadas, grupos amidas da cadeia protéica e alguns
grupos carboxílicos ou sulfatos nos segmentos terminais das cadeias ramificadas.
Entretanto, o meio aquoso exerce um importante efeito nas interações entre as
cadeias poliméricas porque somente doadores e aceptores de ligações de
hidrogênio fortes, comparado com moléculas de água, podem formar interações
efetivas mucina-polímero. Nesse sentido, os grupos hidroxilas das cadeias de
açúcares ramificadas podem não ser importantes sítios para formação de ligações
de hidrogênio em solução aquosa porque sua habilidade em formar estas ligações
não é consideravelmente mais forte que a água. Também os grupos localizados
nas cadeias polipeptídicas ramificadas podem não ser importantes para a
interação mucina-polímero devido à sua estrutura bottle-brush, onde os
segmentos protéicos são praticamente cobertos pelas cadeias laterais hidrofílicas,
fazendo que esses grupos não estejam disponíveis para as interações
intercadeias. Portanto, ácidos carboxílicos e grupos sulfatos localizados nas
terminações das cadeias laterais é que poderão exercer uma importante função
em formar ligações de hidrogênio com os polímeros. Como as ligações de
hidrogênio iônicas são mais fortes que as ligações de hidrogênio neutras, e como
o ácido siálico e os açúcares sulfatados estão negativamente carregados em pH
superior a 3, sua habilidade é mais forte que a água para formar ligações de
hidrogênio (PEPPAS & HUANG, 2004).
Os polímeros mucoadesivos são classificados quanto à forma de adesão em
polímeros de primeira e de segunda geração. Os polímeros de primeira geração
aderem às mucosas não especificamente através de interações hidrofóbicas,
ligações de hidrogênio ou interações eletrostáticas. Já os de segunda geração são
capazes de formar ligações covalentes com o muco e células adjacentes exibindo
melhores interações químicas. Polímeros mucoadesivos tiolados, que formam
apenas ligações covalentes com o muco, e as lecitinas que possuem a
propriedade de se ligar a certos acúcares da membrana celular são exemplos de
polímeros de segunda geração (SALAMAT-MILLER et al., 2005). Entre os
38
polímeros contendo grupos tiolados podemos citar o polímero carbofil conjugado
com cisteína que exerce forte mucoadesão devido às ligações dissulfeto
covalentes formadas entre o polímero modificado e as mucinas que também
possuem domínios ricos em cisteína. As lecitinas possuem a propriedade de se
ligar em carboidratos com considerável especificidade, podem reconhecer e se
ligar especificamente em receptores da membrana celular e têm forte afinidade
pela mucina da camada mucosa (PEPPAS & HUANG, 2004). Os polímeros
mucoadesivos de primeira geração são geralmente macromoléculas hidrofílicas
que contêm numerosos grupos funcionais que podem ser hidroxila, carboxila,
amina ou amida, capazes de estabelecer ligações de hidrogênio e possuem a
propriedade de sofrer hidratação e intumescência quando são colocados em
contato com uma solução aquosa. Esses materiais necessitam sofrer hidratação
para adquirirem propriedades adesivas, mas quando essa é excessiva resulta na
formação de uma mucilagem escorregadia e na perda das propriedades adesivas
(MORTAZAVI, 1995). LEUNG & ROBSON (1990) sugeriram que uma quantidade
suficiente de água é necessária para hidratar e expandir as cadeias mucoadesivas
disponibilizando os sítios adesivos para a formação de ligações criando poros ou
canais para difusão das cadeias do polímero e mobilizando as cadeias do
polímero para interpenetração. Entretanto se uma quantidade de água excessiva
estiver disponível, o polímero hidratado começa a formar gel e eventualmente uma
mucilagem escorregadia resultando em perda das propriedades mucoadesivas,
pois ele dissolve na água disponível. Em outro estudo, PEPPAS & BURI (1985)
verificaram que as características do polímero necessárias para mucoadesão
como ter grupos de ligações de hidrogênio fortes, cargas iônicas fortes, elevada
massa molar e flexibilidade suficiente das cadeias e propriedades de energia de
superfície favorecem o espalhamento dentro do muco.
Os polímeros mucoadesivos podem ser classificados quanto à sua origem,
(natural ou sintética); à sua solubilidade em água (solúveis ou insolúveis), e ainda,
quanto à carga iônica da sua superfície (catiônicos, aniônicos ou neutros)
(SALAMAT-MILLER et al., 2005). Alguns exemplos de polímeros utilizando esta
classificação estão apresentados na Tabela 1. Além dessa classificação os
39
polímeros também podem ser classificados em biodegradáveis e não
biodegradáveis; hidrofílicos, hidrogéis ou termoplásticos; e ainda; homopolímeros,
heteropolímeros ou blendas. Polímeros hidrofílicos são aqueles que intumescem
indefinidamente em contato com água e eventualmente sofrem completa
dissolução, enquanto os hidrogéis são polímeros que intumescem em água com
limitada capacidade de intumescimento. Polímeros termoplásticos incluem os que
não sofrem erosão e os polímeros bioerosíveis semicristalinos que geram ácidos
carboxílicos quando são degradados (VASIR et al., 2003).
Tabela 1 - Exemplo de polímeros mucoadesivos (SALAMAT-MILLER et al., 2005).
Critério Categoria Exemplos de polímeros mucoadesivos
Seminatural /
Natural
quitosana, ácido hialurônico, pectina,
alginato de sódio
Origem
Sintética derivados da celulose, derivados do ácido
poliacrílico (carbopol, policarbofil,poliacrilatos),
polivinilpirrolidona, polímeros tiolados
solúvel ácido poliacrílico, alginato de sódio Solubilidade
em água
insolúvel carbopol, quitosana, policarbofil
Catiônica quitosana
Aniônica carbopol, carboximetilcelulose, pectina, ácido
poliacrílico, alginato de sódio,
carboximetilcelulose de sódio
Carga
Neutra álcool polivinílico, polivinilpirrolidona
Cinco teorias têm sido propostas para o mecanismo de mucoadesão:
adsorção, difusão, eletrônica, fratura e hidratação (SALAMAT-MILLER et al., 2005;
SMART, 2005; SERRA et al., 2008).
Adsorção: o polímero adere à membrana mucosa devido a ação de forças
secundárias fracas como interações de Van Der Waals, hidrofóbicas ou ligações
de hidrogênio. Apesar destas forças individualmente apresentarem um caráter
40
fraco, um determinado número de interações conjuntas poderá ao todo produzir
uma intensa força adesiva.
Difusão: é a interpenetração e o conseqüente emaranhamento entre as cadeias
do polímero e as cadeias poliméricas do muco após um contato inicial entre esses
dois polímeros. A flexibilidade suficiente da cadeia polimérica, a adequada
exposição da superfície de contato de ambos os polímeros, as estruturas químicas
similares e o coeficiente de difusão do polímero estão entre os fatores que
influenciam a interdifusão da cadeia macromolecular.
Eletrônica: ocorre formação de uma camada elétrica dupla na interface com a
subseqüente adesão devido às forças atrativas resultantes das diferenças na
estrutura eletrônica das faces.
Fratura: relata a força requerida para promover a separação entre as duas
superfícies envolvidas por forças bioadesivas.
Hidratação ou molhabilidade: avalia a habilidade de um líquido em se espalhar
espontaneamente sobre uma superfície biológica. Esta teoria é
predominantemente aplicada a sistemas líquidos bioadesivos como um pré-
requisito para o desenvolvimento da adesão.
Em geral, concorda-se que o processo envolvido no fenômeno da mucoadesão
possa ser descrito em etapas. Inicialmente, a umidade e o intumescimento do
polímero permitiria um íntimo contato com o tecido; secundariamente, a
interpenetração das cadeias do polímero e emaranhamento entre as cadeias do
polímero e a mucina seria atingida; finalmente a formação de ligações químicas
fracas seria possível (SERRA et al., 2008). Portanto várias interações fisico-
químicas ocorrem para consolidar, fortalecer e conseqüentemente prolongar a
mucoadesão. Os fatores contribuintes para aumento da força de adesão
polímero/mucosa estão ligados à umidade, que favorece as interações de Van Der
Waals e as ligações de hidrogênio, e à carga positiva dos polímeros, que interage
com grupos negativamente carregados que se encontram presentes na camada
mucosa. Os fatores que influenciam o mecanismo de mucoadesão estão ligados à
massa molar e flexibilidade do polímero, ao intumescimento e pH do meio. A
massa molar do polímero otimizado para o processo de mucoadesão está entre
41
10
4
e 4 × 10
6
Da, sendo que as moléculas de massas molares maiores possuem
hidratação lenta, o que dificulta a liberação dos grupos responsáveis pela
interação com o substrato. A flexibilidade das cadeias do polímero proporciona
aumento da interpenetração e fixação do polímero. O intumescimento de
polímeros solúveis em água promove diminuição da mobilidade das correntes do
polímero. Já sistemas poliméricos com alta densidade de grupos ionizáveis, como
resinas de carbopol e quitosanas, a variação de pH deve ser controlada para
evitar prejuízos à mucoadesão (SMART, 2005). As propriedades de alguns
polímeros mucoadesivos estão descritas a seguir.
5.1 Quitosana
A quitosana é um polímero natural e biodegradável, biocompatível, não tóxico e
bioadesivo. A molécula de quitosana é um copolímero composto por unidades de
N-acetil-glicosamina e D-glicosamina, sendo esta última predominante (Figura 6).
Ela é obtida a partir da desacetilação da quitina. A quitosana é uma base fraca
com um valor de pKa do resíduo de D-glicosamina de aproximadamente 6,2 - 7,0
sendo portanto insolúvel em valores de pH neutro e alcalino. Em meio ácido os
grupos amino do polímero são protonados resultando em um polissacarídeo
solúvel, positivamente carregado que possui uma alta densidade de cargas
positivas (HEJAZI & AMIJI, 2003). Na forma catiônica, os grupos amino iônicos
dos resíduos de D-glicosamina interagem com ácido siálico na mucosa gástrica
por interação eletrostática (HEJAZI & AMIJI, 2002).
Figura 6 - Estrutura química da quitosana (SMART, 2005).
42
5.2 Alginato de sódio
O alginato de sódio é um polímero não tóxico, bioadesivo, biocompatível e
biodegradável (GEORGE & ABRAHAM, 2006). Possui capacidade de sofrer
gelação em meio aquoso em temperatura ambiente (BAJPAI & TANKHIWALE,
2006). Alginatos são copolímeros lineares, não ramificados de ácido β-D-
manurônico (M) e α-L- gulurônico (G). Os monômeros M e G são unidos por
ligações glicosídicas formando blocos homopoliméricos M ou G e blocos
heteropoliméricos MG (CHING et al., 2008) (Figura 7).
Figura 7 - Estrutura do alginato mostrando resíduos de ácido D-manurônico e de
ácido L-gulurônico (GOMBOTZ & WEE, 1998).
A principal propriedade dos alginatos é a sua habilidade para formar gel por
reações com íons divalentes. A gelação e reticulação dos polímeros de alginato de
sódio são adquiridas principalmente pela mudança dos íons sódio dos ácidos
gulurônicos por cátions divalentes como Ca
2+
ou Al
3+
, e a abundância desses
grupos gulurônicos para formar a estrutura característica de “casca de ovo”
(Figura 8) (GEORGE & ABRAHAM, 2006).
Resíduos de ácido D-manurônico Resíduos de ácido L-Gulurônico
43
Figura 8 - Representação esquemática das seqüências de poliguluronato do
alginato reticulado com íons cálcio (GOMBOTZ & WEE, 1998).
5.3 Colestiramina
A colestiramina é uma resina que possui propriedades mucoadesivas
potenciais. Estudos prévios sugerem que ela apresenta tempo de residência
gástrica prolongado e a habilidade de cobrir a mucosa gástrica uniformemente. As
propriedades mucoadesivas da colestiramina ocorrem provavelmente devido às
interações eletrostáticas com o muco que em valores de pH maior ou igual a 2
encontra-se carregado negativamente. Após a aderência da resina à camada
mucosa, parece que somente a taxa de renovação do muco seria um fator
limitante para adesão. A colestiramina não parece ser deslocada por contrações
normais do estômago cheio ou por constantes lavagens do muco devido aos
alimentos sólidos, às bebidas ou ao suco gástrico (JACKSON et al., 2000).
5.4 Ácido poliacrílico
A alta solubilidade em água limita acentuadamente o uso de ácido poliacrílico
como um carreador mucoadesivo de drogas porque ele pode ser dissolvido antes
que a droga seja liberada através da membrana (Figura 9). Em pH maior que 4-5
44
a força de interação entre ácido poliacrílico e muco torna-se menor. Esse fato
indica que os grupos carboxílicos no ácido poliacrílico são efetivos como sítios de
interação somente em sua forma ácida. A mucina torna-se carregada
negativamente em pH maior que 2-3, portanto, em pH maior que 5, tanto o ácido
poliacrílico quanto a mucina encontram-se carregadas negativamente
ocasionando interações eletrostáticas repulsivas (PEPPAS & HUANG, 2004)
Figura 9 - Estrutura química do ácido poliacrílico, R = alil sacarose ou alil
pentaeritritol (carbopols); ou divinil glicol (policarbofil) (SMART, 2005).
5.5 Carbopol
Carbopol é um polímero carboxivinílico de massa molar extremamente elevada
(700.000 a 4 bilhões), disponível como pó leve e seco e que quimicamente é
formado por poliácidos acrílicos reticulados com alil sacarose, alil éteres ou
pentaeritritol. Eles diferem quanto à massa molar, tipos e densidade do agente
reticulante e quanto ao solvente utilizado na reação de polimerização (NEAU et al.,
1996). As resinas de carbopol possuem temperatura de transição vítrea de 100 a
105
0
C, pKa 6,0 ± 0,5 e entre 56-58% de grupos carboxílicos (SINGLA et al.,
2000). Os polímeros de carbopol são substâncias hidrofílicas insolúveis em água
que intumescem formando uma dispersão coloidal quando dispersos em água
(LUBRIZOL CORPORATION, 2007). A estrutura química e molecular da forma
ácida das resinas de carbopol está representada na Figura 10.
45
Figura 10 - Estrutura química e molecular da forma ácida das resinas de carbopol
(SINGLA et al., 2000).
A alta percentagem de grupos carboxílicos permite a este polímero ser
hidratado em água. Quando dispersas em água, as moléculas de carbopol
hidratam parcialmente e se tornam um pouco viscosas. Após neutralização com
uma base solúvel em água, as moléculas da resina hidratam completamente com
um acentuado aumento da viscosidade. Os grupos carboxílicos do carbopol
dissociam-se acentuadamente em meio alcalino. Repulsões eletrostáticas entre os
grupos carboxílicos negativamente carregados causam desenrolamento e
expansão da molécula, resultando em hidratação do polímero e formação de gel
(Figura 11). Além da natureza hidrofílica do carbopol, sua estrutura reticulada e
insolúvel em água, o torna um candidato potencial para uso em desenvolvimento
de sistemas de liberação controlada de drogas (SINGLA et al., 2000).
Figura 11 - Hidratação da resina de carbopol: (a) uma molécula da resina
parcialmente solvatada e não neutralizada (dispersão). (b) uma molécula da resina
neutralizada e completamente solvatada (mucilagem) (SINGLA et al., 2000).
As resinas de carbopol têm sido amplamente utilizadas em combinação com
outros polímeros particularmente celulose (hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose,
46
hidroxipropilcelulose) os quais formam a matriz das microesferas. Como o
carbopol é um poliânion, é bastante provável que ele possa formar complexos com
excipientes não iônicos ou catiônicos ou com os ingredientes ativos da
formulação, modificando o perfil de liberação e características bioadesivas da
formulação (SINGLA et al., 2000).
5.6 Carbopol 934P
O Carbopol 934P é um polímero sintético de elevada massa molar do ácido
acrílico reticulado com éteres alílicos de sacarose. Ele contém de 56 a 68% de
grupos carboxílicos que parcialmente dissociam-se em solução aquosa
produzindo uma estrutura enrolada e flexível (USP, 2006b). A formação do gel de
carbopol depende da repulsão eletrostática entre os grupos carboxílicos aniônicos
e consiste de grupos de partículas hidratadas intimamente ligadas. A formação da
camada espessa de gel inibe a penetração de água, resultando em lenta liberação
da droga do gel de carbopol. Estas propriedades do carbopol são desvantajosas
para sistemas de liberação oral. Carbopol designado com a letra P é o único
aceito para ser utilizado por via oral ou em mucosas porque possui um baixo teor
residual de benzeno (WADE & WELLER,1994a). Por esse motivo, o Carbopol
934P tem sido investigado extensivamente pelas indústrias farmacêuticas, além
de ter uma alta viscosidade em baixa concentração e baixa toxicidade
(NAKANISHI et al., 1998).
6 Microesferas
Microesferas são partículas poliméricas com diâmetro variando entre 1 e 1.000
µm capazes de conduzir e controlar a liberação do fármaco no local desejado.
Quando essas microesferas são envolvidas com um ou mais polímeros
bioadesivos capazes de ligar às mucosas, elas passam a ser denominadas de
microesferas mucoadesivas. Neste caso, além de conduzir e controlar a liberação
do fármaco, as microesferas mucoadesivas se ligam à camada de mucina da
47
mucosa aumentando o contato e o tempo de residência dessa forma farmacêutica
no local de ação. Isto faz com que o número de administrações do medicamento
possa diminuir (SMART, 2005).
NAGAHARA et al. (1998) demonstraram que 47% das microesferas compostas
de carboxivinil e curdlan contendo amoxicilina permaneceram aderidas à mucosa
do estômago após 2 horas e 20% após 4 horas. LIU et al. (2005), utilizando
microesferas mucoadesivas compostas de etilcelulose e carbopol 934 P,
demonstraram que a amoxicilina encapsulada nas microesferas ficou protegida da
degradação em meio ácido, enquanto que a amoxicilina livre foi rapidamente
degradada. E ainda, o teste de liberação in vitro revelou que aproximadamente
90% da droga foi liberada em pH 1 após 4 horas de incubação, enquanto no teste
de liberação in vivo durante o mesmo tempo, 63,6% das microesferas ainda
permaneceram no estômago. HEJAZI & AMIJI (2003) desenvolveram estudos
utilizando quitosanas como polímero e tetraciclina como fármaco. Os resultados
em animais demonstraram que não ocorreu um tempo prolongado de residência
gastrintestinal sendo que o perfil de concentração de tetraciclina no estômago
após administração das microesferas foi similar ao da solução aquosa de
tetraciclina. Em um outro estudo, eles demonstraram que as propriedades de
mucoadesão melhoraram e que as microesferas ficaram mais resistentes ao suco
gástrico, sendo que 10% delas permaneceram no estômago dos animais em jejum
por 10 horas depois da administração (HEJAZI & AMIJI, 2004). Outros grupos de
pesquisadores têm produzido microesferas ligadas covalentemente a lecitinas com
objetivo de obter uma mucoadesão específica a carboidratos. MONTICI et al.
(2001) produziram micropartículas e nanopartículas conjugadas com lecitina. Os
resultados apresentaram boa adesão in vitro, porém, outros pesquisadores
sugerem que in vivo as lecitinas se ligam ao muco, mas, que elas são
constantemente eliminadas devido ao fluxo peristáltico (BARDONNET et al.,
2006). AKIYAMA et al. (1995) produziram três tipos de microesferas em estudos
de mucoadesão: microesferas de ácidos graxos de ésteres de poliglicerol (PGEF-
ME), PGEF-ME contendo carbopol disperso (CPD-ME) e PGEF-ME contendo
carbopol envolvendo a superfície externa (CPC-ME). Apenas CPD-ME apresentou
48
capacidade mucoadesiva. A partir do momento que as CPC-ME entraram em
contato com a água, as partículas de carbopol formaram uma camada de gel ao
redor das microesferas e rapidamente a camada gelatinosa se separou do núcleo
das microesferas devido à perda de afinidade do gel hidrofílico pelo núcleo. Por
outro lado as partículas de carbopol dispersas hidrataram de dentro das
microesferas para a superfície quando CPD-ME entraram em contato com a água.
A hidratação das partículas de carbopol foi fortemente associada com as
microesferas. CPD-ME aderiram à mucosa levando parte das partículas de
carbopol hidratadas (Figura 12).
Figura 12 - Descrição esquemática do processo de mucoadesão com
microesferas. (a), PGEF-ME; (b), CPC-ME; (c), CPD-ME; (1), droga; (2), PGEF;
(3), camada externa de carbopol; (4), camada de carbopol hidratada; (5), carbopol
disperso; carbopol hidratado (AKIYAMA et al., 1995)
Microesfera
mucoadesiva
49
Geralmente, os estudos publicados utilizaram como agente antimicrobiano
amoxicilina ou tetraciclina e como polímero mucoadesivo polivinilpirrolidona, ácido
poliacrílico, quitosana ou outro polímero (NAGAHARA et al., 1998; CUÑA et al.,
2001; HEJAZI & AMIFI, 2004; LIU et al., 2005, CHUN et al., 2005, MAJITHIYA &
MURTHY, 2005). Ao nosso conhecimento, nenhum dos estudos utilizou como
agente antimicrobiano a claritromicina e como polímeros associados o carbopol e
etilcelulose. Assim, este trabalho tem por objetivo desenvolver um sistema
composto de microesferas mucoadesivas de carbopol contendo claritromicina
visando um futuro emprego na erradicação do Helicobacter pylori.
50
OBJETIVOS
1 Objetivo geral
Desenvolver um sistema composto de microesferas mucoadesivas contendo
claritromicina e avaliar in vitro sua estabilidade, perfil de liberação e capacidade de
mucoadesão.
2 Objetivos específicos
• Avaliar o método de doseamento da claritromicina por cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE);
• Desenvolver formulações de microesferas mucoadesivas contendo
claritromicina;
• Avaliar o teor de encapsulação da claritromicina nas microesferas;
• Caracterizar as microesferas com relação a sua morfologia e diâmetro;
• Avaliar in vitro a estabilidade e a velocidade de liberação da claritromicina
presente nas microesferas;
• Avaliar in vitro a capacidade de mucoadesão do sistema desenvolvido.
51
EXPERIMENTAL
1 Reagentes e outros materiais
A claritromicina foi gentilmente cedida pelo Laboratório Medley (Brasil). O
fosfato monobásico de potássio, acetona, álcool etílico absoluto e o éter de
petróleo foram adquiridos da Labsynth (Brasil). Os demais reagentes utilizados
foram: metanol (Tedia, Estados Unidos), 6,11-O-metileritromicina (Ind-Swifr
Laboratories Limited, Índia); acetato de sódio anidro e ácido acético (Vetec
Química Fina Ltda, Brasil), ácido clorídrico (F. Maia Indústria e Comércio Ltda,
Brasil), monooleato de sorbitol (MB Biomedicals, Estados Unidos), óleo mineral
light (Favap, Brasil), Ethocel 20cp (Colorcon, Estados Unidos), cloreto de sódio
(Merck, Alemanha) e Carbopol 934P NF (Noveon/Lubrizol Corporation, Estados
Unidos). Os solventes foram de grau analítico e as demais substâncias químicas
de grau reagente. Todos eles foram utilizados sem purificação adicional. Os filtros
com 0,45 µm de porosidade Minisart e Millex, o pré-filtro modelo SLHVBZ5NZ e o
dispositivo de ultrafiltração Microcon y M-3 de 3.000 Daltons foram adquiridos da
Millipore (Brasil).
Os seguintes equipamentos foram utilizados:
- cromatógrafo líquido de alta eficiência equipado com bomba modelo 515, injetor
automático modelo 717 plus; detector espectrofotométrico UV modelo 2487,
conectado ao computador apresentando o programa Millenium versão 2.15.01
(Waters, Estados Unidos);
- centrífuga Baby l; modelo 206-BL (Fanem, Brasil);
- rotavapor AG CH-9233, modelo R-210 (Buchi Labortechnik, Suíça);
- espectrofotômetro, modelo UV-160A (Shimadzu, Japão);
- microscópio eletrônico de varredura, modelo JSM-840A (Jeol, Estados Unidos);
- liofilizador E-C (Modulyo, Inglaterra);
- centrífuga (Jowan, França);
- agitador Eurostar (Ika Labortecknik, Alemanha);
- microscópio ótico Olympus CBA (Micronal, Brasil)
52
2 Métodos
2.1 Doseamento da claritromicina
Na tentativa de validar o método de doseamento da claritromicina por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizamos a metodologia descrita
na FARMACOPÉIA BRASILEIRA (2003) e na USP (2006a). Usando uma coluna
de fase reversa capeada C18 (Hyperclone, 5 µm, 150 x 4,6 mm, Phenomenex,
USA) ocorreram picos assimétricos que persistiram mesmo após várias tentativas
de otimização da fase móvel. Em seguida, com o objetivo de melhorar a simetria
do pico utilizamos uma outra coluna cromatográfica também de fase reversa e
capeada C18 (Ace, 3 µm,150 x 4,6 mm, ACT, Escócia). Essa coluna apresentou
algumas desvantagens como um longo tempo para estabilizar a linha de base e
uma elevação da pressão após algumas injeções, apesar de ter sido feita uma
limpeza adequada. A pressão da coluna aumentou de aproximadamente 2.600 psi
para 3.400 psi, inviabilizando seu uso. Tentativas foram realizadas com o objetivo
de recuperar a coluna, mas, sem sucesso.
Finalmente, o doseamento da claritromicina foi feito baseado nas condições
cromatográficas acima descritas (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2003; USP,
2006a), mas, com algumas alterações, tais como, a escolha de uma nova coluna e
modificação do pH da fase móvel. A fase móvel foi preparada misturando 65
partes de metanol e 35 partes de solução de fosfato de potássio monobásico
0,067 mol/L com pH ajustado para 4 com ácido fosfórico 85% (V/V), e
adicionalmente, ela foi filtrada em membrana de celulose de 0,45 µm e
degaseificada em banho de ultra-som durante 15 minutos antes do uso. As
seguintes condições cromatográficas foram utilizadas.
- coluna: Luna, C18, 5 µm, 240 x 4,6 mm, Phenomenex, Estados Unidos;
- fase móvel: metanol/tampão fosfato 0,067 mol/L pH 4 (65/35 partes);
- fluxo: 1mL/min;
- volume de injeção: 20 µL;
- detecção: UV em 210 nm;
- temperatura: 50
0
C.
53
2.1.1 Tempo de retenção e simetria do pico
Preparou-se uma solução estoque de 1 mg/mL de claritromicina pesando
analiticamente 50 mg de padrão secundário de claritromicina e transferindo
quantitativamente para um balão volumétrico âmbar de 50 mL. Acrescentou-se 30
mL de metanol e levou-se ao ultra-som por 30 minutos. Em seguida, o volume do
balão foi completado com metanol. Foram transferidas alíquotas de 1,25; 2,5; 5,0
e 7,5 mL da solução estoque para balões volumétricos de 25 mL. Completou-se o
volume dos balões com fase móvel, obtendo-se, assim, soluções padrões com as
seguintes concentrações: 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL e 300 µg/mL. Após a
estabilização da coluna, nas condições do ensaio, todas as soluções padrões
diluídas foram filtradas em membranas de celulose de 0,45 µm e 20 µL foram
injetados no cromatógrafo em triplicata.
2.1.2 Linearidade
O estudo da linearidade foi avaliado através da plotagem de cada concentração
de claritromicina no eixo das abscissas e das relações entre a média das áreas de
cada uma delas. Aplicando-se a regressão linear pelo método dos mínimos
quadrados obteve-se a equação da reta e o coeficiente de correlação (r) ou
coeficiente de determinação (r
2
). Foram obtidas três curvas em 3 dias diferentes
para serem reunidas em uma única curva padrão. Preparou-se uma solução
estoque de 1 mg/mL de claritromicina pesando analiticamente 50 mg de padrão
secundário de claritromicina e transferindo quantitativamente para um balão
volumétrico âmbar de 50 mL. Acrescentou-se 30 mL de metanol e levou-se ao
ultra-som por 30 minutos. Em seguida, o volume do balão foi completado com
metanol. Foram transferidas alíquotas de 500 e 750 µL e 1; 1,25 e 1,5 mL da
solução estoque de claritromicina 1 mg/mL para balões volumétricos de 25 mL.
Completou-se o volume dos balões com fase móvel, obtendo-se, assim, soluções
padrões com as seguintes concentrações: 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL, 50
µg/mL e 60 µg/mL. Nos experimentos realizados no primeiro e segundo dia,
54
Também foram obtidas soluções padrões com as concentrações de 5 µg/mL, 10
µg/mL, 80 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL e 300 µg/mL. Para preparar essas
soluções foram transferidas alíquotas de 125 e 250 µL e 2; 2,5; 5 e 7,5 mL da
solução estoque para balões volumétricos de 25 mL, completando-se o volume do
balão com fase móvel. Todas as soluções padrões diluídas foram filtradas antes
das análises em membranas de celulose de 0,45 µm e 20 µL foram injetados no
cromatógrafo em triplicata. No experimento do terceiro dia cada diluição foi
realizada em triplicata para avaliar precisão intra-dia e cada solução foi injetada
uma única vez.
Para verificar se as três curvas poderiam ser reunidas em uma única curva
padrão, realizou-se o teste de b (inclinação da reta) formulando-se a hipótese nula
de que as inclinações das retas obtidas não diferiam estatisticamente.
2.1.3 Precisão
A precisão de um método analítico está relacionada com a dispersão das
medidas ao redor do seu valor médio. A precisão representa o grau de
concordância entre os resultados de análises individuais, quando o mesmo
procedimento é aplicado repetidamente a múltiplas análises de uma mesma
amostra homogênea, em idênticas condições de teste (USP, 2006). A precisão é
expressa matematicamente como desvio padrão ou desvio padrão relativo
(coeficiente de variação). A precisão do método foi avaliada quanto à
repetibilidade (precisão intra-dia) e a precisão intermediária (precisão inter-dia).
2.1.3.1 Repetibilidade
A repetibilidade refere-se ao uso do procedimento analítico em um mesmo
laboratório, por um curto período de tempo, usando o mesmo analista e o mesmo
equipamento (BRASIL, 2003). Por considerar a mesma condição é também
chamada de precisão intra-corrida. O teste foi executado avaliando o desvio
55
padrão e desvio padrão relativo das áreas dos picos correspondentes às soluções
de claritromicina nas concentrações de 20, 30, 40, 50 e 60 µg/mL.
2.1.3.2 Precisão intermediária
A precisão intermediária expressa a concordância entre os resultados do
mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, por analistas diferentes e/ou
equipamentos diferentes (BRASIL, 2003). O teste foi realizado avaliando-se o
desvio padrão e o desvio padrão relativo das áreas obtidas a partir das injeções
das soluções padrões de claritromicina utilizadas para a construção de três
curvas, em dias diferentes de calibração.
2.1.4 Seletividade
O teste de seletividade ou especificidade de um determinado procedimento é a
sua capacidade de diferenciar e de quantificar a substância de interesse na
presença de outros componentes da amostra (GUIDANCE, 2001). A seletividade
foi realizada pelo método CLAE comparando cromatogramas obtidos das
amostras de etilcelulose, carbopol e microesferas brancas (sem claritromicina)
com uma solução padrão de claritromicina a 200 µg/mL em fase móvel. Antes de
injetar 20 µL de cada amostra no cromatógrafo, cada uma delas foi filtrada em
membrana de celulose de 0,45 µm. O seguinte procedimento foi feito para cada
uma das amostras.
Etilcelulose: pesou-se 0,0258 grama de etilcelulose, que foi transferido para um
balão volumétrico de 10 mL. Adicionou-se 8 mL de metanol, levou-se ao ultra-som
por 30 minutos e em seguida o volume do balão foi completado com metanol. A
solução foi filtrada a vácuo utilizando membrana de celulose de 0,45 µm. Em
seguida uma alíquota de 2,5 mL dessa solução foi retirada e transferida para um
balão volumétrico de 10 mL. O volume do balão foi completado com fase móvel.
56
Carbopol: pesou-se 0,0042 grama de carbopol, que foi transferido para um balão
volumétrico de 10 mL. Adicionou-se 8 mL de metanol, levou-se ao ultra-som por
30 minutos e posteriormente completou-se o volume do balão com metanol. A
solução foi filtrada a vácuo utilizando membrana de celulose de 0,45 µm. Em
seguida uma alíquota de 1,4 mL foi retirada e transferida para um balão
volumétrico de 10 mL. O volume do balão foi completado com fase móvel.
Microesferas brancas: pesou-se analiticamente 0,04 grama de microesferas sem
claritromicina (microesferas brancas) e transferiu-se para um balão volumétrico de
10 mL. Adicionou-se 8 mL de metanol, levou-se ao ultra-som por trinta minutos
para dissolver as microesferas brancas e completou-se o volume do balão para 10
mL. Em seguida, a dispersão foi filtrada utilizando membrana de celulose de 0,45
µm. Foi retirada do filtrado, uma alíquota de 2,5 mL sendo transferidos
posteriormente para um balão volumétrico de 10 mL e o volume completado com
fase móvel.
Solução estoque de claritromicina a 1 mg/mL: pesou-se analiticamente 25 mg
de padrão secundário de claritromicina e este foi transferido quantitativamente
para um balão volumétrico de 25 mL. Adicionou-se 15 mL de metanol no balão
que foi posteriormente levado ao ultra-som por 10 minutos. Em seguida o volume
do balão foi completado com metanol. Essa solução foi filtrada em membrana de
celulose de 0,45 µm e 20 µL foram injetados no cromatógrafo. Uma alíquota de
2,0 mL da solução estoque de claritromicina foi transferida para um balão
volumétrico de 10 mL e o volume do balão foi completado com fase móvel. Foi
obtida uma solução de claritromicina padrão na concentração teórica de 200
µg/mL.
57
2.1.5 Tempo de retenção relativo da claritromicina e da 6,11-O-
metileritromicina
Durante a síntese de drogas farmacêuticas muitas impurezas podem ser
produzidas. Algumas fontes dessas impurezas são solventes, reagentes,
subprodutos de reações, intermediários de reações e produtos de degradação. As
três últimas fontes geralmente produzem compostos que são estruturalmente
relacionados à droga farmacêutica e são comumente referidos como substâncias
relacionadas. A substância relacionada 6,11-O-metileritromicina, provavelmente a
principal impureza derivada da síntese de claritromicina, possui propriedades de
absorção em comprimento de onda semelhante a claritromicina e pode ser
sintetizada com alto grau de pureza (MORGAN et al., 1990).
Foram injetadas no cromatógrafo soluções de claritromicina 200 µg/mL,
solução de 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL e solução de claritromicina 200
µg/mL + 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL, com o objetivo de avaliar a resolução
e comparar com o resultado descrito na FARMACOPÉIA BRASILEIRA (2003). A
Farmacopéia Brasileira informa que a resolução entre os picos de claritromicina e
6,11-O-metileritromicina não deve ser menor que 2 e os tempos de retenção
relativos são de aproximadamente 0,75 para a claritromicina e 1 para 6,11-O-
metileritromicina. Isso quer dizer que o tempo de retenção da claritromicina
corresponde a 75% do tempo de retenção da 6,11-O-metileritromicina.
Solução estoque de claritromicina utilizada nos experimentos: após pesar
analiticamente 50 mg de padrão secundário de claritromicina, este foi transferido
quantitativamente para um balão volumétrico âmbar de 50 mL e em seguida foi
adicionado 30 mL de metanol. Levou–se ao ultra-som por 30 minutos e
posteriormente o volume foi completado com metanol, obtendo-se uma solução de
concentração igual a 1 mg/mL.
58
Solução de trabalho de claritromicina: alíquotas de 5 mL da solução estoque 1
mg/mL foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL e o volume foi
completado com fase móvel. A concentração da solução obtida foi 200 µg/mL.
Solução padrão de 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL: pesou–se exatamente
o equivalente a 5 mg de 6,11-O-metileritromicina que foi transferido
quantitativamente para um balão volumétrico âmbar de 5 mL. O volume foi
completado com metanol, obtendo-se uma solução com concentração igual a 1
mg/mL.
Solução de trabalho de 6,11-O-metileritromicina : alíquotas de 2 mL da solução
estoque acima foi transferida para um balão volumétrico de 10 mL e o volume foi
completado com fase móvel. A concentração da solução obtida foi 200 µg/mL.
Solução padrão de claritromicina 200 µg/mL + 6,11-O-metileritromicina 200
µg/mL: foram retirados 2 mL da solução de 6,11-O-metileritromicina de
concentração igual a 1 mg/mL e transferidos para um outro balão de 10 mL. Logo
em seguida foi adicionado 2 mL de solução de claritromicina de concentração
igual a 1 mg/mL. O volume do balão foi completado com fase móvel. A
concentração de claritromicina e dimetileritromicina da solução final obtida foi 200
µg/mL para ambas.
2.1.6 Comparação entre padrão primário e secundário de claritromicina.
Com o objetivo de avaliar a qualidade da claritromicina (Laboratório Medley,
Brasil) utilizada nos nossos experimentos, foram preparadas soluções de
claritromicina a 200 µg/mL utilizando como padrão primário a claritromicina cedida
pelo Laboratório de Controle de Qualidade (CEDAFAR-UFMG, Brasil) e como
padrão secundário a claritromicina utilizada nos experimentos. A solução estoque
e a solução de trabalho do padrão primário de claritromicina foram preparadas de
modo idêntico às soluções de padrão secundário.
59
Solução estoque do padrão secundário de claritromicina 1 mg/mL: após
pesar analiticamente 50 mg de padrão secundário de claritromicina, este foi
transferido quantitativamente para um balão volumétrico âmbar de 50 mL e em
seguida foi adicionado 30 mL de metanol. Levou-se ao ultra-som por 30 minutos e
posteriormente o volume foi completado com metanol, obtendo-se uma solução de
concentração igual a 1 mg/mL.
Solução de trabalho do padrão secundário de claritromicina 1 mg/mL: uma
alíquota de 5 mL da solução estoque 1 mg/mL foi transferida para um balão
volumétrico de 25 mL e o volume foi completado com fase móvel. A concentração
da solução obtida foi 200 µg/mL.
2.2 Microesferas de claritromicina
2.2.1 Preparação das microesferas
As microesferas foram preparadas pelo método de emulsificação/evaporação
do solvente (LIU et al., 2005). Este método pode ser esquematicamente dividido
em 4 etapas.
1
a
Etapa - Preparo da dispersão de carbopol em solução de etilcelulose e de
claritromicina
Após pesar analiticamente 0,2106 g de padrão secundário de claritromicina, ele foi
transferido quantitativamente para um balão volumétrico âmbar de 10 mL. Em
seguida completou-se o volume do balão com acetona. Pesou-se 0,55 g de
etilcelulose que foi transferida lentamente para um frasco contendo 21 mL de
álcool etílico absoluto e 1 mL de acetona, sob agitação magnética constante. Após
dissolver a etilcelulose, adicionou-se a solução de claritromicina (0,2106 g) em
acetona preparada previamente. O aspecto foi de uma solução límpida. Em
60
seguida, após pesar 0,0914 g de carbopol ele foi disperso em uma solução de
etilcelulose contendo claritromicina. O aspecto foi de uma dispersão turva e de cor
branca (Figura 13). O sistema permaneceu sob agitação magnética por 24 horas.
Figura 13 - Dispersão de etilcelulose, carbopol e claritromicina.
2
a
Etapa - Emulsificação
Cinco vírgula vinte e cinco gramas de span 80 foi adicionado lentamente a 168 mL
de parafina light 70. A mistura foi homogeneizada por 5 minutos com auxílio de
uma espátula e apresentou um aspecto transparente e amarelado (Figura 14).
Figura 14 - Aspecto da mistura de parafina light e Span.
A dispersão de carbopol em solução de etilcelulose e claritromicina foi vertida
lentamente à mistura de parafina light e span sob agitação de 600 rpm utilizando
um agitador eurostar. A mistura permaneceu sob agitação a 600 rpm por 60
minutos. O aspecto foi de uma dispersão turva amarelada (Figuras 15, 16 e 17).
61
Figura 15 - Início da adição da dispersão à mistura de parafina light e span.
Figura 16 - A mistura foi ficando mais turva à medida que se adicionava a
dispersão.
Figura 17 - Aspecto da dispersão após o término da emulsificação.
62
3
a
Etapa - Evaporação do solvente
A dispersão contendo as microesferas foi levada ao rotavapor para eliminar a
acetona e o etanol. O rotavapor foi programado para evaporar a acetona (Figura
18) e em seguida programado para evaporar o etanol (Figura 19). As condições
em que se processou a evaporação da acetona foi uma pressão de vapor igual a
123 mbar, temperatura ambiente e duração de 30 minutos. As condições em que
se processou a evaporação do etanol foi uma pressão de vapor igual a 23 mbar,
temperatura ambiente e duração de 1 hora e 30 minutos. Após a evaporação, a
mistura permaneceu no balão até o dia seguinte, quando foi lavada com éter de
petróleo visando eliminar o óleo e o span.
Figura 18 - Aspecto da dispersão após a evaporação da acetona.
Figura 19 - Aspecto da dispersão após a evaporação do etanol.
4ª Etapa - Lavagem das microesferas para eliminar o óleo e o span
63
Para realizar o processo de lavagem das microesferas, adicionou-se 40 mL de
éter de petróleo à mistura acima contida no balão. Em seguida, ela foi distribuída
em volumes de 10 mL em tubos falcon e centrifugada a 16.000 rpm por 5 minutos.
O sobrenadante foi desprezado e ao sedimento foi acrescentado 10 mL de éter de
petróleo. Após misturar este sedimento com o éter, a mistura resultante foi
centrifugada a 16.000 rpm por 5 minutos. Este procedimento foi repetido por três
vezes com o objetivo de eliminar o span e a parafina light. Finalmente, o
sedimento foi levado ao rotavapor para eliminar o éter de petróleo. As condições
em que se processou a evaporação do éter de petróleo foi uma pressão de vapor
igual a 306 mbar, temperatura ambiente e duração de 4 horas. O aspecto final foi
de um sólido úmido, discretamente amarelado e não esferoidal (Figura 20). As
microesferas sem claritromicina foram preparadas de modo semelhante ao
preparo de microesferas contendo claritromicina.
Figura 20 - Fotografia das microesferas após lavagem com éter de petróleo
2.2.2 Caracterização morfológica
2.2.2.1 Microscopia óptica de luz
Para confirmar a formação de microesferas utilizando o método acima descrito,
0,04 g de microesferas foi dispersa em 3 mL de água. Uma gota da dispersão foi
então colocada em uma lâmina para microscopia e coberta por uma lamínula. Em
seguida adicionou-se uma gota de óleo de imersão e examinou-se ao microscópio
óptico de luz (aumento da imagem em 1.000 vezes).
64
2.2.2.2 Microscopia eletrônica de varredura
A avaliação da morfologia e tamanho das microesferas contendo claritromicina
foi realizada por microscopia eletrônica de varredura utilizando o equipamento Jeol
modelo JSM – 840A (Estados Unidos). Uma pequena quantidade de microesferas
foi fixada em uma placa, metalizada com ouro por aproximadamente 5 minutos, e,
em seguida, analisada por microscopia eletrônica de varredura.
2.2.3 Taxa de encapsulação da claritromicina nas microesferas
2.2.3.1 Teor total de claritromicina nas microesferas
O teor total (encapsulada e adsorvida) de claritromicina presente nas
microesferas foi determinado. A claritromicina e a etilcelulose são solúveis em
metanol e o carbopol é insolúvel. A etilcelulose é a responsável pela formação da
matriz das microesferas e o carbopol confere a elas suas propriedades
mucoadesivas. Portanto, é possível destruir as microesferas com o uso de
metanol.
Foram preparados 3 lotes de microesferas contendo claritromicina cujos pesos
foram de 1,0478 g; 1,1402 g e 1,0943 g para o primeiro, segundo e terceiro lote,
respectivamente. Pesou-se analiticamente 0,04 g de microesferas de cada lote
produzido contendo valores teóricos de 8,01 mg; 7,36 mg e 7,67 mg de
claritromicina, as quais foram transferidas para três balões volumétricos de 10 mL.
Em cada balão, adicionou-se 8 mL de metanol e levou-se ao ultra-som por trinta
minutos para dissolver as microesferas. Após resfriar, completou-se o volume dos
balões para 10 mL com metanol obtendo-se dispersões de concentrações teóricas
de 0,80; 0,73 e 0,76 mg de claritromicina/mL. Em seguida, cada dispersão foi
filtrada utilizando membranas de 0,45 µm. Uma alíquota de 1,4 mL do filtrado de
cada dispersão foi transferida para um balão volumétrico de 10 mL e o volume foi
completado com fase móvel. Obteve-se então três dispersões com concentrações
teóricas de 112; 103 e 107 µg de claritromicina/mL para o primeiro, segundo e
65
terceiro lote, respectivamente. Estas dispersões foram filtradas em membranas de
celulose de 0,45 µm e 20 µL foram injetados no cromatógrafo.
2.2.3.2 Claritromicina adsorvida na superfície das microesferas
Para determinar o teor de claritromicina possivelmente adsorvida na superfície
das microesferas, foram utilizados os dois primeiros lotes de microesferas
preparados conforme acima descritos, ou seja, os lotes que possuíam 1,0478;
1,1402 g de microesferas.
Sabendo-se que a claritromicina é solúvel em solução de fosfato de potássio
monobásico 0,067 mol/L pH 4, em 8 mL dessa solução adicionou-se sob agitação
magnética 0,04 g de microesferas, os quais continham teoricamente massas de
8,01 e 7,36 mg de claritromicina para o primeiro e o segundo lote,
respectivamente. As dispersões permaneceram sob agitação por 15 minutos e em
seguida foram transferidas quantitativamente para dois balões volumétricos de 10
mL. O volume de cada balão foi completado obtendo-se duas dispersões de
concentrações teóricas de 0,80 e 0,73 mg de claritromicina/mL. Em seguida, as
dispersões foram filtradas através de membranas de 0,45 µm com o objetivo de
recolher a claritromicina não encapsulada no material que foi permeado, ou seja, a
claritromicina adsorvida na superfície externa das microesferas. Foi retirada uma
alíquota de 2,5 mL de cada um dos lotes, as quais foram transferidas para dois
balões volumétricos isoladamente e o volume de cada um deles foi completado
para 10 mL com fase móvel. Após isso, obteve-se teoricamente concentrações de
claritromicina de 200 e 184 µg/mL para o primeiro e segundo lote,
respectivamente. As soluções foram filtradas em membranas de celulose de 0,45
µm e 20 µL foram injetados no cromatógrafo.
66
2.2.3.3 Teor de claritromicina no líquido da primeira lavagem
Este processo de extração foi realizado com o objetivo de determinar a
ocorrência de perda de massa de claritromicina durante o processo de lavagem
das microesferas com éter de petróleo.
O sobrenadante obtido da primeira centrifugação durante o processo de
lavagem das microesferas com éter de petróleo foi reservado e o volume foi de
200 mL. Um volume de 100 mL desse líquido foi transferido para um funil de
separação. Adicionou-se ao funil de separação 100 mL da solução de fosfato de
potássio monobásico 0,067 M pH 4 com o objetivo de extrair a claritromicina da
mistura oleosa. Após agitação ocorreu a formação de duas fases: uma fase
formada por uma emulsão e uma outra pela fase oleosa. No dia seguinte
adicionou-se NaCl a mistura com o objetivo de desestabilizar a emulsão
considerando que o NaCl compete com o éter de petróleo pela solvatação da
água. O sistema passou a ser constituído por três fases: fase aquosa, fase
constituída provavelmente por éter de petróleo e óleo e fase oleosa. A fase
aquosa foi retirada do funil de separação e armazenada na geladeira. Para o
doseamento por CLAE foi retirada uma alíquota de 4 mL da fase aquosa que foi
transferida para um balão volumétrico de 10 mL e o volume do balão foi
completado com fase móvel. Essa solução foi então filtrada em membrana de
celulose de 0,45 µm e 20 µL foram injetados no cromatógrafo.
2.2.4 Liberação in vitro da claritromicina presente nas microesferas
2.2.4.1 Doseamento da claritromicina por espectrofotometria no ultravioleta
(UV)
A determinação analítica de claritromicina por CLAE foi utilizada para investigar
o teor de claritromicina presente nas microesferas. Entretanto, para determinar a
taxa de liberação da claritromicina das microesferas foi necessário desenvolver
um método espectrofotométrico no ultravioleta com o objetivo de obter uma curva
67
linear em concentrações mais baixas que a obtida por CLAE. Na literatura verifica-
se um número limitado de informações sobre doseamento de claritromicina
utilizando um método espectrofotométrico. O método utilizado nesse estudo foi
baseado em algumas informações fornecidas por MAJITHIYA & MURTHY (2005).
Para obtenção da curva padrão pesou-se exatamente o equivalente a 50 mg de
padrão secundário de claritromicina que foi transferido quantitativamente para um
balão volumétrico de 50 mL e o volume foi completado com metanol. Obteve-se
então uma solução de claritromicina contendo 1.000 µg/mL. Dessa solução foi
retirada uma alíquota de 10 mL que foi transferida para um balão volumétrico de
50 mL e o volume do balão foi completado também com metanol, obtendo-se uma
solução estoque de claritromicina contendo 200 µg/mL. Fazendo cada diluição em
triplicata, foram transferidas alíquotas de 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 e 500 µL da
solução de claritromicina a 200 µg/mL para frascos âmbar e em seguida foram
acrescentados a cada frasco respectivamente 500, 475, 450, 400, 300, 200, 100 e
zero µL de metanol. Finalmente, adicionou-se 1,5 mL de ácido clorídrico
concentrado em cada frasco, obtendo-se por frasco um volume final igual a 2 mL.
Após estas diluições foram obtidas soluções padrões de claritromicina com as
seguintes concentrações teóricas: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg/mL. A
absorbância destas soluções foi medida também em triplicata utilizando-se cubeta
de quartzo em comprimento de onda de 485 nm (Shimadzu UV-160 A, Japão).
Como branco usou-se uma solução de metanol e ácido clorídrico. A média das
absorvâncias foi plotada no gráfico em função das seguintes concentrações: 10
µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL e 50 µg/mL.
O fator de resposta (FR) foi determinado dividindo-se o valor encontrado nas
absorbâncias pela concentração da solução preparada. O coeficiente de variação
(CV%), que expressa a precisão do método, também foi determinado.
2.2.4.2 Preparação do líquido gástrico simulado
O líquido gástrico simulado utilizado nesse experimento foi produzido baseado
no método descrito por JANTATRID et al. (2008) que propõem a utilização de leite
68
na composição do líquido gástrico simulado com o objetivo de reproduzir um
padrão alimentar. De acordo com esses autores a presença de leite permite
observar uma possível interação de medicamentos administrados por via oral com
os alimentos, no nosso caso microesferas de claritromicina. Os testes foram feitos
na presença e na ausência de claritromicina.
Solução de ácido acético 100 µg/mL: 1 mL de ácido acético glacial foi
transferido para um balão de 10 mL que teve seu volume completado com água
destilada.
Solução tampão de ácido acético/acetato: 1,386 g de NaCl e 0,244 g de acetato
de sódio anidro foram transferidos quantitativamente para um balão volumétrico de
100 mL. Em seguida adicionou-se 1 mL de solução de ácido acético 100 µg/mL e
completou-se o volume do balão com água destilada para 100 mL.
Líquido simulado gástrico: 40 mL da solução tampão de ácido acético/acetato
acima preparada foi adicionada a 50 mL de leite pasteurizado integral contendo
3,5% de gordura. A mistura foi mantida sob agitação magnética constante e o
valor do pH encontrado foi 6,19. Para ajustar o valor do pH para 5 adicionou-se 23
mL de solução de HCl 0,1 N. O volume final do líquido gástrico foi igual a 113 mL
e o sistema permaneceu sob agitação magnética constante por cinco minutos.
2.2.4.3 Seletividade do método espectrofotométrico
Para avaliar se os constituintes do líquido gástrico simulado interferem no
doseamento da claritromicina utilizando o método espectrofotométrico,
inicialmente filtrou-se uma alíquota de líquido gástrico simulado sem claritromicina
utilizando um filtro Millex com poros de 0,45 µm com o objetivo de retirar as
gotículas de gordura do leite. Em seguida, filtrou-se novamente o líquido obtido da
primeira filtração a uma rotação de 14.000 g até obter um volume de 300 µL
utilizando um filtro Microcon constituído por membrana regenerada de 3.0000
69
Daltons com o objetivo de reter as proteínas solúveis do leite. O filtrado obtido foi
congelado com nitrogênio líquido e liofilizado por 24 horas. Após adicionar ao
liofilizado 100 µL de HCL, a dispersão formada foi centrifugada a 5.000 rpm
durante 1 minuto. Retirou-se 75 µL do sobrenadante obtido da centrifugação e
adicionou-se a ele 25 µL de metanol. Por fim, foram feitas leituras no
espectrofotômetro utilizando uma cubeta de quartzo (Hellma, Alemanha).
2.2.4.4 Interferência do líquido gástrico simulado no doseamento da
claritromicina por CLAE
Um dos objetivos desse experimento foi avaliar a interferência do líquido
gástrico simulado contendo leite no doseamento da claritromicina por CLAE. Outro
objetivo importante foi avaliar a eficiência dos dois filtros Millex e Microcon em
minimizar estas interferências. Pesou-se 10 mg de padrão secundário de
claritromicina que foi transferido para um recipiente contendo 113 mL de líquido
gástrico simulado. O sistema permaneceu sob agitação magnética por 15 minutos.
Posteriormente, filtrou-se uma alíquota em filtro Millex com poros de 0,45 µm, e,
em seguida, filtrou-se novamente o líquido obtido da primeira filtração a uma
rotação de 14.000 g por 40 minutos utilizando um filtro Microcon com poros de
3.000 Daltons. O filtrado foi injetado no cromatógrafo.
2.2.4.5 Estabilidade da claritromicina na presença do líquido gástrico
simulado
Um miligrama de padrão secundário de claritromicina que foi transferido
para um recipiente contendo 100 mL de líquido gástrico simulado contendo leite. O
sistema permaneceu sob agitação magnética por 1 hora. Em seguida, filtrou-se
uma alíquota deste líquido gástrico contendo a claritromicina utilizando um filtro
Millex com poros de 0,45 µm e o líquido obtido dessa primeira filtração foi ainda
submetido a uma rotação de 14.000 g até obter um volume de 500 µL utilizando
um filtro Microcon com poros de 3.000 Daltons. O filtrado obtido foi congelado com
70
nitrogênio líquido e liofilizado por 24 horas. Após adicionar ao liofilizado 100 µL de
HCL, a dispersão formada foi centrifugada a 5.000 rpm durante 1 minuto. Retirou-
se 75 µL do sobrenadante obtido da centrifugação e adicionou-se a ele 25 µL de
metanol. Por fim, foram feitas leituras no espectrofotômetro utilizando uma cubeta
de quartzo (Hellma, Alemanha).
2.2.4.6 Liberação in vitro da claritromicina das microesferas
Pesou-se 1,19 mg de microesferas contendo teoricamente 0,1 mg de
claritromicina que foi transferido para um recipiente contendo 10 mL de líquido
gástrico simulado contendo leite. O sistema permaneceu sob agitação magnética
por 2 ou 4 horas. Em seguida transferiu-se todo o conteúdo do recipiente para um
tubo falcon e este foi centrifugado a 12.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
separado do sedimento com auxílio de uma pipeta automática. Filtrou-se uma
alíquota do sobrenadante utilizando um filtro Millex com poros de 0,45 µm e filtrou-
se novamente o líquido obtido da primeira filtração a uma rotação de 14.000 g até
obter um volume de 1.400 µL e 950 µL para o teste de liberação de 2 e 4 horas
respectivamente, utilizando um filtro Microcon com poros de 3.000 Daltons. O
filtrado obtido foi congelado com nitrogênio líquido e liofilizado por 24 horas. Após
adicionar ao liofilizado 125 µL e 100 µL de HCL para o teste de liberação de 2 e 4
horas respectivamente, a dispersão formada foi centrifugada a 5.000 rpm durante
1 minuto. Retirou-se 75 µL do sobrenadante obtido da centrifugação e adicionou-
se a ele 25 µL de metanol. Por fim, foram feitas leituras no espectrofotômetro
utilizando uma cubeta de quartzo (Hellma, Alemanha).
O sedimento que permaneceu no tubo falcon contendo as microesferas foi
lavado com água e centrifugado a 20.000 rpm por 15 minutos. Essa etapa foi
realizada por 3 vezes. Em seguida foi congelado com nitrogênio líquido e levado
ao liofilizador por 24 horas. Ao sólido obtido adicionou-se 200 µL de metanol e
este foi levado ao ultra-som por 20 minutos para dissolver as microesferas. Em
seguida completou-se novamente o volume da dispersão para 200 µL e esta foi
filtrada em membrana de celulose de 0,45 µm. Para análise da claritromicina que
71
permaneceu nas microesferas após 2 horas retirou-se uma alíquota de 10 µL para
o do filtrado e adicionou-se a ela 15 µL de metanol e 75 µL de HCl para realizar a
leitura no espectrofotômetro. Para análise da claritromicina que permaneceu nas
microesferas 4 horas retirou-se uma alíquota de 25 µL do filtrado e adicionou-se a
ela 75 µL de HCl para realizar a leitura no espectrofotômetro
2.2.5 Mucoadesão in vitro
A bioadesão in vitro das microesferas foi avaliada de acordo com o método
preconizado por RANGA RAO & BURI (1989). Sintetizando, três ratos foram
deixados em jejum durante a noite e no dia seguinte seus estômagos foram
removidos e lavados com solução salina. Em seguida os estômagos foram
cortados em 3 pedaços de 2 cm de comprimento por 1 cm de largura. Em 2
pedaços foram adicionadas microesferas de claritromicina. Em um terceiro pedaço
nada foi adicionado. As amostras foram estocadas em placas de Petri à
temperatura ambiente e ambiente úmido. Após 20 minutos de repouso as
amostras foram lavadas com solução salina pH 1,2 ou pH 5,0 por 5 minutos a uma
taxa de 22 mL/minuto/amostra. O mesmo procedimento de lavagem foi feito para
as amostras que não continham microesferas. Após lavagem as amostras de
mucosa foram fotografadas.
72
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1 Doseamento da claritromicina por CLAE
1.1 Tempo de retenção e simetria do pico
Após a injeção de fase móvel sem claritromicina foram obtidos 5 picos
cromatográficos representados na Figura 21. Na Tabela 2 estão registrados os
resultados dos tempos de retenção, área e altura dos picos cromatográficos
obtidos. Observa-se que o último pico cromatográfico teve tempo de retenção de
3,617 minutos.
Figura 21 – Eluição cromatográfica da fase móvel sem claritromicina durante 30
minutos por CLAE (n=3)
73
Tabela 2 – Tempo de retenção, área e altura da eluição cromatográfica da fase
móvel sem claritromicina durante 30 minutos por CLAE (n=3)
Tempo de retenção (min) Área Altura
2,150 9052 1398
2,667 9859 1559
2,983 9050 718
3,350 233027 15831
3,617 515257 16001
A Figura 22 representa o cromatograma obtido após eluição cromatográfica da
fase móvel contendo 200 µg/mL de claritromicina. O cromatograma apresenta 4
picos cromatográficos, sendo que os três primeiros picos são relacionados aos
constituintes da fase móvel e o último pico é da claritromicina padrão a 200 µg/mL.
Observe que o pico da claritromicina é simétrico e bem definido. Na Tabela 3
estão representados os resultados dos tempos de retenção, área e altura dos
picos obtidos.
Figura 22 - Eluição cromatográfica de uma solução de claritromicina a 200 µg/mL
em fase móvel por CLAE (n=3)
74
Tabela 3 - Tempo de retenção, área e altura da eluição cromatográfica de uma
solução de claritromicina a 200 µg/mL em fase móvel por CLAE (n=2)
Tempo de retenção (min) Área Altura
2,750 36956 4555
3,333 235026 14196
3,617 394613 12709
11,500 183601 8453
Foi realizada uma corrida exploratória após injeção de solução de claritromicina
padrão 200 µg/mL em fase móvel. A injeção foi de 20 µL. Como observado no
cromatograma representado pela Figura 23, durante a corrida exploratória de 60
minutos, nenhum pico apareceu após o tempo de retenção da claritromicina
indicando que o método é seletivo para análise de solução de claritromicina
padrão em fase móvel. Na Tabela 4 estão representados os resultados dos
tempos de retenção, área e altura dos picos obtidos.
Figura 23 – Eluição cromatográfica exploratória de fase móvel contendo 200
µg/mL de claritromicina durante 60 minutos por CLAE (n = 3)
75
Tabela 4 - Tempo de retenção, área e altura da eluição cromatográfica
exploratória da fase móvel contendo 200 µg/mL de claritromicina durante 60
minutos por CLAE (n=3)
Tempo de retenção (min) Área Altura
2,167 2636 292
2,750 49829 5046
3,333 556026 14398
11,583 183115 8369
Os cromatogramas obtidos da injeção de 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, e
300 µg/mL estão representados nas Figuras 24, 25, 26 e 27 respectivamente. De
acordo com os resultados indicados na Tabela 5, observa-se que a área
aumentou proporcionalmente ao aumento da concentração de claritromicina para
os picos com tempo de retenção entre 11,317 e 11,500. Os tempos de retenção
dos picos anteriores são relacionados à fase móvel que é o solvente da solução
de claritromicina injetada. Esses resultados confirmam o tempo de retenção da
claritromicina.
Tabela 5 - Tempo de retenção e área da eluição cromatográfica por CLAE da fase
móvel contendo diferentes concentrações de claritromicina (n=3)
Concentração (µg/mL) Tempo de retenção (min)
Área
50 11,317
11,317
11,300
41351
40104
41834
100 11,250
11,250
11250
84564
85899
85287
200 11,583
11,500
11,500
183115
183601
183400
300 11,183
11,200
11,183
276001
275340
276200
76
Figura 24 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 50 µg/mL de
claritromicina por CLAE (n = 3)
Figura 25 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 100 µg/mL de
claritromicina por CLAE (n = 3)
77
Figura 26 - Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 200 µg/mL de
claritromicina por CLAE (n = 3)
Figura 27 – Eluição cromatográfica da fase móvel contendo 300 µg/mL de
claritromicina por CLAE (n = 3)
Conclui-se com estes resultados que os componentes da fase móvel não
interferem no tempo de retenção da claritromicina e que o pico apresentou boa
simetria. Além disso, observa-se na Tabela 5 que a área do pico aumentou
proporcionalmente ao aumento da concentração, confirmando o tempo de
retenção da claritromicina.
78
1.2 Linearidade
A Figura 28 apresenta três curvas padrões da claritromicina obtidas em dias
diferentes com as respectivas equações da reta e os coeficientes de determinação
(r
2
). A análise de regressão da curva revelou linearidade adequada dentro da faixa
de concentração trabalhada (20 a 60 µg/mL). Na Tabela 6 estão registrados os
resultados das áreas obtidas assim como a média dos valores das áreas
absolutas mais o erro padrão das médias (média ± EP) e os fatores de retenção
obtidos a partir das injeções de diferentes concentrações de claritromicina. Estes
dados foram utilizados para construção da curva padrão e para os cálculos do
fator de resposta e o coeficiente de variação (desvio padrão relativo) do fator de
resposta e da curva padrão.
Figura 28 - Representação gráfica de três curvas padrões de claritromicina,
obtidas por CLAE em dias diferentes.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
y = 837,1x - 6,5 ; r
2
= 0,9993
y = 866,7x - 674,6; r
2
= 0,9994
y = 898x - 2969,1; r
2
= 0,9985
Concentração (µg/mL)
Área
79
20 30 40 50 60
10000
20000
30000
40000
50000
y = 855,3x - 617,7
Y Axis Title
X axis title
Tabela 6 - Resultados estatísticos obtidos para as soluções padrões de
claritromicina em fase móvel para as diferentes concentrações utilizadas na
construção da curva de calibração por CLAE.
Concentração
(µg/mL)
Média das áreas ± sd Fator de resposta DPR (%)
20 16.647 ± 226 832 1,35
30 24.885 ± 873 830 3,50
40 33.580± 435 839 1,29
50 42.051 ± 981 841 2,33
60 50.833 ± 697 847 1,37
sd = desvio padrão, DPR = desvio padrão relativo
A Figura 29 mostra a representação gráfica da curva padrão final, obtida a
partir da média dos pontos das três curvas.
Figura 29 - Representação gráfica da curva padrão de claritromicina, obtidas a
partir das três curvas padrões por CLAE nas concentrações de 20 a 60
µg/mL(n=9). Y = 855,37 X - 617; coeficiente de determinação (r
2
) de 0,9999 e
desvio padrão relativo (%DPR) igual a 0,47%.
80
1.3 Precisão
1.3.1 Repetibilidade
No experimento do terceiro dia cada diluição foi realizada em triplicata para
avaliar precisão intra-dia e cada solução foi injetada uma única vez. A Tabela 7
mostra as médias das áreas dos picos obtidas em triplicata e em um mesmo dia,
para as cinco concentrações de claritromicina, utilizadas para a construção da
curva padrão, com os respectivos desvios absolutos e relativos.
Tabela 7 - Resultados
do teste de repetibilidade para a validação do doseamento
cromatográfico de claritromicina por CLAE (n=3)
Concentração
(µg/mL)
Média das áreas ± sd Fator de resposta DPR (%)
20 16.480 ± 53 824 0,32
30 23.940 ± 704 798 2,94
40 33.268 ± 501 832 1,50
50 42.674 ± 1.467 853 3,43
60 50.225 ± 303 837 0,60
sd = desvio padrão, DPR = desvio padrão relativo
O método apresentou o desvio padrão relativo (ou coeficiente de variação) na
faixa de 0,32 a 3,43% para todas as concentrações analisadas, valores bem
inferiores ao valor máximo de 15%, o que demonstra boa precisão do método,
quanto a repetibilidade.
1.3.2 Precisão intermediária
A precisão intermediária foi determinada pelo cálculo do desvio padrão relativo
dos valores das áreas dos picos, obtidos em triplicata, em três dias diferentes para
as cinco concentrações de claritromicina utilizadas na construção da curva padrão.
Os resultados estão apresentados na Tabela 8.
81
Tabela 8 - Resultados do teste de precisão intermediária, em três dias, para
validação do doseamento cromatográfico de claritromicina por CLAE (n=9).
Concentração
(µg/mL)
Média das áreas ± sd Fator de resposta DPR (%)
20 16.647 ± 226 832 1,35
30 24.885 ± 873 830 3,50
40 33.570 ± 435 839 1,29
50 42.051 ± 981 841 2,33
60 50.833 ± 697 847 1,37
sd = desvio padrão, DPR = desvio padrão relativo
1.3.3 Seletividade
A seletividade do método foi determinada a fim de assegurar que as respostas
obtidas nas condições padronizadas provêm somente da substância analisada. Os
resultados do teste de seletividade utilizando a etilcelulose dissolvida em metanol,
carbopol disperso em metanol, microesferas sem claritromicina dissolvida em
metanol encontram-se na Tabela 9.
Tabela 9 - Resultados do teste de seletividade utilizando etilcelulose, carbopol,
microesferas sem claritromicina e solução padrão de claritromicina a 200 µg/mL
dispersos em metanol (n=3)
Amostra
Média
das áreas
dos picos
Tempo de
retenção entre
9,000 e 9,800
Concentração
obtida
(µg/mL)
Etilcelulose dispersa em metanol - - -
Carbopol disperso em metanol - - -
Microesferas sem claritromicina
dispersas em metanol
- - -
Solução padrão de claritromicina
a 200µg/mL
164.716 9,383 193,3
82
As Figuras 30, 31, 32 e 33 e representam os cromatogramas obtidos a partir da
injeção de etilcelulose dissolvida em metanol, carbopol disperso em metanol,
microesferas sem claritromicina dissolvida em metanol e solução padrão de
claritromicina a 200 µg/mL. De acordo com os resultados acima, conclui-se que o
método de doseamento de claritromicina é seletivo.
Figura 30 - Eluição cromatográfica de etilcelulose dispersa em metanol por CLAE
(n = 3).
Figura 31 - Eluição cromatográfica de carbopol disperso em metanol por CLAE (n
= 3).
83
Figura 32 – Eluição cromatográfica dos constituintes das microesferas brancas
dispersas em metanol por CLAE (n = 3).
Figura 33 - Eluição de claritromicina padrão na concentração teórica de 200
µg/mL por CLAE (n = 3).
84
1.3.4 Tempo de retenção relativo entre claritromicina e 6,11-O-
metileritromicina
As Figuras 34, 35 e 36 representam respectivamente os cromatogramas por
CLAE da solução de claritromicina a 200 µg/mL, da solução de 6,11-O-
metileritromicina a 200 µg/mL e das soluções de claritromicina a 200 µg/mL +
6,11-O-metileritromicina a 200 µg/mL. Na Tabela 10 estão representados o tempo
de retenção e a área dos picos cromatográficos. O tempo de retenção relativo da
claritromicina foi 0,69 e do 6,11-O-metileritromicina foi 1,0. O tempo de retenção
relativo descrito pela farmacopéia utilizando fase móvel com pH 4 foi de 0,75 para
a claritromicina e 1,0 para 6,11-O-metileritromicina. O tempo de retenção relativo
obtido nesse experimento, 0,69 foi apenas 10% menor que 0,75.
Tabela 10 - Tempo de retenção e a área dos picos cromatográficos por CLAE de
claritromicina 200 µg/mL, 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL e claritromicina 200
µg/mL + 6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL (n=3)
Concentração (µg/mL) Tempo de retenção
(min)
Área
Claritromicina 200 µg/mL 6,233 151.992
6,11-O-Metileritromicina 200 µg/mL 9,067 192.812
Claritromicina 200 µg/mL +
6,11-O-metileritromicina 200 µg/mL
6,250
9,050
153.738
206.748
85
Figura 34 – Eluição cromatográfica por CLAE de claritromicina a 200 µg/mL (n=3).
Figura 35 - Eluição cromatográfica por CLAE de 6,11-O-metileritromicina a 200
µg/mL (n=3).
86
Figura 36 - Eluição cromatográfica por CLAE de claritromicina a 200 µg/mL mais
6,11-O-metileritromicina a 200 µg/mL (n=3).
Posteriormente, um teste foi feito utilizando soluções de 6,11-O-
metileritromicina e de claritromicina preparadas 1 dia antes da análise
cromatográfica. O cromatograma não acusou a presença da 6,11-O-
metileritromicina, indicando que esta substância sofre degradação em solução
(dados não mostrados). Este resultado sugere que a solução de 6,11-O-
metileritromicina deve ser preparada no dia do experimento.
1.4 Doseamento do padrão secundário de claritromicina
Na Tabela 11 estão registrados o tempo de retenção e a área dos picos
cromatográficos por CLAE dos padrões primário e secundário de claritromicina,
ambos na concentração de 200 µg/mL. Observa-se que os tempos de retenção e
as áreas são aproximadamente iguais indicando que o padrão secundário de
claritromicina utilizado nos experimentos apresenta qualidade satisfatória.
87
Tabela 11 - Tempo de retenção e área dos picos cromatográficos por CLAE do
padrão primário e secundário de claritromicina, ambos a 200 µg/mL (n=3)
Padrão de claritromicina
(200 µg/mL)
Tempo de retenção
(min)
Área
Primário 5,883 88706
Secundário 5,867 83701
Os dois cromatogramas apresentaram quatro picos. Observa-se nas Figuras
37 e 38 que não houve presença de nenhum pico cromatográfico após o pico da
claritromicina.
Figura 37 – Eluição cromatográfica por CLAE do padrão secundário de
claritromicina na concentração de 200 µg/mL (n=3).
88
Figura 38 – Eluição cromatográfica por CLAE do padrão primário de claritromicina
na concentração de 200 µg/mL (n=3).
2 Microesferas
2.1 Tamanho e morfologia
A caracterização das microesferas foi feita por microscopia óptica e microscopia
eletrônica de varredura. Através da microscopia óptica foi possível confirmar a
obtenção das microesferas e determinar o seu tamanho, distribuição e forma. A
maioria das microesferas apresentou tamanho de 1 a 2 µm e forma arredondada.
As imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura confirmaram estes
resultados (Figuras 39 e 40). Entretanto, não ocorreu formação de microesferas
quando a claritromicina não foi adicionada durante o preparo das microesferas
(Figura 41).
89
Figura 39 - Microscopia eletrônica de varredura das microesferas de
claritromicina. Ampliação de 5.000 vezes (escala indicada)
Figura 40 - Microscopia eletrônica de varredura das microesferas de
claritromicina. Ampliação de 10.000 vezes (escala indicada)
90
Figura 41 – Microscopia eletrônica de varredura das “microesferas” sem
claritromicina. Ampliação de 5.000 vezes (escala indicada)
As microesferas contendo claritromicina foram preparadas pelo método de
emulsificação/evaporação do solvente de acordo o preconizado por LIU et al.
(2005). Esse método é freqüentemente utilizado para encapsular drogas insolúveis
ou pouco solúveis em água (LI et al., 2008). O polímero mucoadesivo utilizado foi
o carbopol. Como ele é um poliânion, é bastante provável que ele possa formar
complexos com excipientes não iônicos ou catiônicos ou com os ingredientes
ativos da formulação, modificando o perfil de liberação e características
bioadesivas da formulação (SINGLA et al., 2000). Resinas de carbopol têm sido
amplamente utilizadas em combinação com outros polímeros, particularmente
celulose (hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose). Nós
escolhemos como matriz das microesferas a etilcelulose, um polímero
biocompatível, de baixo custo e estável em uma ampla faixa de pH, ou seja, ele
pode ser capaz de proteger o fármaco dos fluídos do trato gastrintestinal.
As microesferas apresentaram tamanho variando entre 1 e 2 µm e forma
arredondada. Já as produzidas por LIU et al. (2005) utilizando o mesmo método e
91
polímeros, porém, numa dispersão mais concentrada tiveram um tamanho
variando entre 400 e 1000 µm. Sabe-se que quando a concentração dos
polímeros aumenta, a viscosidade da fase interna também aumenta, resultando
em aumento do tamanho das microesferas devido à menor capacidade de
formação de glóbulos menores durante a fase de emulsificação (O’DONNELL &
MCGINITY, 1997). Em estudos mais recentes, LI et al. (2008) confirmaram que o
tamanho das microesferas aumenta exponencialmente com o aumento da
viscosidade.
2.2 Taxa de encapsulação da claritromicina nas microesferas
O teor total de claritromicina presente nas microesferas, encapsulada e
adsorvida, foi quantificado. Obteve-se um total de 40,00% ± 0,38% de
claritromicina (Tabela 12).
Tabela 12 – Teor total de claritromicina presente nas microesferas (n=3)
Concentração de claritromicina (µg/mL)
Amostra
Teórica Real
%
Encapsulação
1 112 44,71 39,72
2 103 41,82 40,44
3 107 42,83 39,73
Média ± sd - - 40,00 ± 0,38
sd = desvio padrão
O teor de claritromicina adsorvida na superfície das microesferas foi igual a
4,24% ± 0,44 p/p (Tabela 13).
92
Tabela 13 – Claritromicina adsorvida na superfície das microesferas (n=2)
Concentração de claritromicina (µg/mL)
Amostra
Teórica Real
%
Encapsulação
1 200 9,30 4,55
2 184 7,44 3,93
Média ± sd - - 4,24 ± 0,44
sd = desvio padrão
Considerando que a quantidade total de claritromicina, encapsulada e
adsorvida, presente nas microesferas foi de 40% ± 0,38%, que desse total 4,24%
± 0,44 estava adsorvida na superfície externa, pode-se concluir que 35,76% da
claritromicina estava encapsulada nas microesferas.
Provavelmente os 60% restantes foram eliminados durante as etapas de
lavagens empregadas no processo de preparação das microesferas. No líquido da
primeira lavagem foi encontrado 7,08% do valor total teórico (dados não
mostrados). Este baixo teor nos faz supor que nem toda massa de claritromicina
presente na fase oleosa migrou para a fase aquosa durante o processo de
extração da claritromicina.
2.3 Liberação in vitro da claritromicina das microesferas
2.3.1 Doseamento da claritromicina por espectrofotometria no ultravioleta
(UV)
As absorbâncias das soluções de claritromicina nas concentrações de 2,5; 5;
10; 20; 30; 40 e 50 µg/mL foram preparadas e lidas em triplicata no UV
(comprimento de onda de 485 nm) em espectrofotômetro Shimadzu (UV-160 A,
Japão) com o objetivo de se fazer uma curva de calibração. Como a absorvância
foi inferior a 0,1 para as concentrações de 2,5 e 5 µg/mL, optou-se em continuar
os experimentos com concentrações de claritromicina igual ou superior a 10
µg/mL. Como branco usou-se uma solução de metanol e ácido clorídrico. A média
das absorvâncias foi plotada no gráfico em função das seguintes concentrações:
93
10, 20, 30, 40 e 50 µg/mL. Na Tabela 14 estão registrados os resultados para a
construção da curva de calibração. Pode-se verificar que o fator de resposta
somente foi constante a partir de uma concentração de 20 µg de claritromicina por
mL. Após todos os resultados apresentados podemos concluir que a análise da
claritromicina por CLAE e por UV somente nos fornecerá dados confiáveis quando
a concentração da claritromicina for ao mínimo 20 µg/mL.
Tabela 14 - Construção de curva de calibração para determinação da
claritromicina por UV (n = 3)
Concentração
(µg/mL)
Fator de resposta
X 1.000
Média do fator
de resposta ± sd
10 13,76
20 18,33
30 17,73
40 17,97
50 17,14
16,98 ± 1,85
CV% = 10,92
sd = desvio padrão
A Figura 42 mostra a representação gráfica da curva padrão final, obtida a
partir da média dos pontos das três curvas.
94
10 20 30 40 50
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Y = 0,0179x - 0,015
Absorvância
Concentração (µg/mL)
Figura 42 - Representação gráfica da curva padrão de claritromicina obtida a
partir das três curvas padrões pelo método espectrofotométrico nas concentrações
de 10 a 50 µg/mL(n = 3). Y = 0,0179x - 0,015; coeficiente de determinação (r
2
) de
0,9929 e desvio padrão relativo (%DPR) igual a 5,27%.
2.3.2 Seletividade do método de dosagem da claritromicina no UV
No comprimento de onda de 485 nm não ocorreu absorvância de nenhum
constituinte do meio líquido gástrico simulado indicando que o método é seletivo
para o doseamento da claritromicina por UV.
2.3.3 Estabilidade do padrão de claritromicina no líquido gástrico simulado
Após dispersar no líquido gástrico simulado 10 mg de claritromicina, foi
quantificada uma massa de 6,2 mg por CLAE, correspondendo a 62% p/v da
massa total acrescentada ao meio. Portanto, aproximadamente 3,8 g de
claritromicina provavelmente podem ter se ligado aos componentes do leite ou não
95
se dissolveram no meio artificial. Resultado similar foi obtido por análise
espectrofotométrica quando se incubou 1 mg de padrão de claritromicina no
mesmo meio. Nesse caso, foi encontrada 58,6% da claritromicina adicionada ao
meio. Pode-se concluir que aproximadamente 40% da claritromicina se liga às
proteínas do leite, presentes no líquido gástrico artificial, ou não são capazes de
solubilizar nesse meio. A claritromicina após permanecer no líquido gástrico por 15
minutos ou uma hora, apresentou resultados similares.
2.3.4 Estudos de liberação in vitro
Utilizando a equação da reta entre 10 a 50 µg/mL verifica-se que a
claritromicina liberada das microesferas após 2 e 4 horas de incubação foram
respectivamente iguais a 30,84± 4,65% e 39,21 ± 2,00% (Tabela 15). Entretanto,
se os cálculos fossem feitos utilizando a equação da reta de 20 a 50 µg/mL, os
resultados seriam praticamente os mesmos, respectivamente 29,43 ± 4,00 % e
37,83 ± 2,18 %, apesar do fator de resposta desta reta não ser constante.
Tabela 15 – Teor de claritromicina presente nas microesferas após 2 e 4 horas de
incubação em 10 mL de meio gástrico artificial contendo leite (n=3). Os cálculos
foram feitos utilizando a equação da reta de 10 a 50 µg/mL.
% de claritromicina liberada das microesferas Amostra
Após 2 horas de incubação Após 4 horas de incubação
1 29,18 37,66
2 27,25 38,52
3 36,10 41,47
Média ± sd 30,84 ± 4,65 39,21 ± 2,0
sd = desvio padrão
96
O teor de claritromicina que permaneceu nas microesferas após 2 e 4 horas de
incubação no meio gástrico artificial foram respectivamente iguais a 51,82 ± 4,78%
e 28,94 ± 0,266% (Tabela 16).
Tabela 16 – Teor de claritromicina presente nas microesferas após 2 e 4 horas de
incubação em 10 mL de meio gástrico artificial contendo leite (n=3). Os cálculos
foram feitos utilizando a equação da reta de 10 a 50 µg/mL.
% de claritromicina presente nas microesferas Amostra
Após 2 horas de incubação Após 4 horas de incubação
1
54,12
28,88
2
55,02
28,72
3
46,32
29,24
Média ± sd
51,82 ± 4,78
28,94 ± 0,266
sd = desvio padrão
Estudos de liberação de claritromicina foram realizados em fluido gástrico
simulado pH 1 por diversos autores (MAJITHIYA & MURTHY, 2005; RAMTEKES
et al.; 2006; RAMTEKES & JAIN, 2008). Outros estudos utilizaram solução tampão
fosfato salina pH 7,4 em meio PBS (RAMTEKES et al.; 2006; RAMTEKES & JAIN,
2008). CHUN et al. (2005) realizaram testes de liberação em meios com valores
de pH iguais a 2; 4 e 6,8 mas não especificaram a composição do meio.
Entretanto uma simples solução aquosa tamponada não representa todos os
aspectos das condições fisiológicas do trato gastrointestinal (JANTRATID et al.;
2008). Várias tentativas têm sido feitas para simular o fluido gastrointestinal no
estômago em jejum, como fluido gástrico simulado com pH igual a 1,2 contendo
pepsina (USP, 2006) e fluido gástrico simulado com pH igual a 1,6 contendo
pepsina e baixas quantidades de sais biliares e lecitina (VERTZONI et al.; 2005).
Este segundo meio parece ser mais apropriado que o proposto pela USP (2006)
porque uma tensão superficial reduzida no meio é criada pela concentração
fisiológica de pepsina em vez de surfactante sintético.(JANTRATID et al.; 2008).
Neste estudo foi utilizado o meio de liberação proposto por JANTRATID et al.
97
(2008) porque consideramos que este meio reproduz melhor a composição do
fluido gástrico que os meios propostos anteriormente. Portanto os resultados in
vitro obtidos neste experimento provavelmente prevêem melhor como seriam os
resultados in vivo quando comparados com outros estudos que anteriormente
utilizaram claritromicina.
Os fatores que afetam a liberação da droga estão diretamente relacionados
com a estrutura da matriz onde a droga está contida, com as propriedades
químicas associadas com a droga e o polímero e são atribuídos a massa molar do
polímero, ao tamanho das microesferas, a morfologia, a distribuição e a
constituição do sistema de liberação. O perfil de liberação ideal seria a obtenção
de uma taxa de liberação constante com o tempo. Entretanto em muitos casos os
perfis de liberação das drogas são mais complicados e freqüentemente contém
dois dos principais processos de expulsão que são o burst inicial de liberação do
fármaco da superfície e a taxa de liberação dependente da difusão e degradação,
sendo esta geralmente um estágio mais constante. A degradação das
microesferas poliméricas está relacionada com a massa molar do polímero.
Estudos mostraram que em esferas contendo polímero com cadeias de baixa
massa molar, a quantidade de produtos de degradação aumentou com o tempo
causando diminuição da massa molar dos polímeros das microesferas, entretanto,
para microesferas feitas com polímeros de elevada massa molar, a quantidade de
produto de degradação e a massa molar do polímero permaneceram constantes
por um longo período de tempo. Evidências sugeriram que a variação do perfil de
degradação ocorreu devido às diferenças na temperatura de transição vítrea (tg) e
cristalinidade associada com polímeros de diferentes massas molares. Um estudo
relatou que o perfil da taxa de liberação da droga em partículas contendo
polímeros de baixa massa molar foi relativamente constante enquanto que em
partículas contendo polímeros de elevada massa molar a liberação foi inicialmente
mais elevada e seguida por uma diminuição que então novamente aumentou
sugerindo a presença de dois mecanismos de liberação quando são utilizados
polímeros de elevada massa molar. O processo de degradação é o principal
mecanismo de liberação quando são utilizados polímeros de baixa massa molar
98
depois do estágio de burst inicial. O processo de difusão em que o fármaco é
liberado lentamente seguido pelo processo de degradação ocasionando rápida
liberação da droga são os principais mecanismos de liberação quando são
utilizados polímeros de elevada massa molar. Considerando a cristalinidade das
microesferas, estudos anteriores sugeriram que a degradação ocorre primeiro em
regiões amorfas das microesferas, seguida por uma degradação mais lenta nas
regiões cristalinas. Além disso, o perfil de liberação também depende do tamanho
das microesferas, sendo que a taxa de liberação da droga diminuiu com aumento
das microesferas. Também é de se supor que a porosidade tem um importante
efeito nas características de liberação da droga, porque um grande número de
poros pode influenciar acentuadamente a taxa de expulsão da droga (FREIBERG
& ZHU, 2004).
Verificamos no estudo anterior que um elevado percentual de claritromicina se
liga às proteínas do leite, presentes no líquido gástrico artificial ou não são
capazes de solubilizar nesse meio, apesar de não termos trabalhado em condição
sink. Apesar disso, nosso estudo demonstrou que aproximadamente 30% da
claritromicina encapsulada nas microesferas poderá ser liberada após 4 horas de
incubação in vitro.
2.4 Mucoadesão in vitro
O teste de mucoadesão in vitro foi realizado lavando a mucosa de ratos com
solução salina/HCl pH 1,2 ou 5,0 com objetivo de comparar as propriedades
mucoadesivas das microesferas nesses dois meios. O meio ácido gástrico com pH
em torno de 5,0 representa o estado alimentado enquanto meio ácido gástrico
com pH em torno de 1,2 representa o estado de jejum. A Figura 43 representa
uma mucosa de rato após ter sido lavada com solução salina. Já as próximas
figuras foram obtidas após adição das microesferas, incubação e lavagem com
solução salina pH 1,2 (Figura 44) ou 5,0 (Figura 45). Aproximadamente 60% das
microesferas permaneceram nas mucosas após serem lavadas com solução
salina, independente do pH da solução salina empregada, pH 1,2 ou 5,0.
99
Figura 43 - Mucosa de rato após incubação sem microesferas e lavagem com
solução salina
Figura 44 - Mucosa de rato após adição de microesferas, incubação e lavagem
com solução salina pH 1,2
Figura 45 - Mucosa de rato após adição de microesferas, incubação e lavagem
com solução salina pH 5,0
100
LIU et al. (2005) utilizaram microesferas de carbopol contendo amoxicilina para
estudar a mucoadesão quantitativamente in vitro e in vivo. Eles verificaram que
93,5 ± 2.4% das microesferas permaneceram no estômago após serem lavadas
com solução salina/HCl pH 1,3, fluxo 22 mL/min por 5 minutos, indicando que as
microesferas contendo carbopol aderem fortemente à mucosa gástrica. Apesar de
termos afirmado anteriormente que aproximadamente 60% das nossas
microesferas permaneceram no estômago após lavagem com solução salina pH
1,2 ou 5,0, o nosso estudo de mucoadesão foi preliminar, ele não foi quantitativo.
No presente trabalho, desenvolveu-se e avaliou-se um novo produto
tecnológico, microesferas mucoadesivas de claritromicina, com o objetivo de
aumentar a eficácia terapêutica do tratamento do Helicobacter pylori através da
redução da dose empregada no tratamento, o que leva a uma maior adesão do
paciente, e um maior tempo de contato e de residência do antimicrobiano na
mucosa gástrica, com conseqüente erradicação das doenças gastroduodenais
causadas por esse microrganismo.
Também nesse sentido, diversos outros estudos foram feitos. NAGAHARA et al
(1998) desenvolveram microesferas mucoadesivas contendo amoxicilina utilizando
carboxivinil e curdlan (um polissacarídeo) como polímeros. 47% das microesferas
permaneceram aderidas à mucosa do estômago após 2 horas e 20% após 4
horas. HEJAZI & AMIJI (2003; 2004) desenvolveram vários estudos utilizando
quitosanas como polímero mucoadesivo associado à crosslinking e tetraciclina
como fármaco. Os resultados em animais demonstraram que não ocorreu um
tempo prolongado de residência gastrintestinal sendo que o perfil de concentração
de tetraciclina no estômago após administração das microesferas foi similar à
solução aquosa de tetraciclina. Em um outro estudo, eles utilizaram glioxal como
crosslinking e quitosanas. As propriedades de mucoadesão melhoraram e as
microesferas ficaram mais resistentes ao suco gástrico sendo que 10% delas
permaneceram no estômago dos animais em jejum por 10 horas depois da
administração. O perfil de concentração de tetraciclina foi maior no estômago
contendo microesferas produzidas com glioxal que em solução aquosa e em
microesferas sem crosslinking. Alguns grupos de pesquisadores têm produzido
101
microesferas ligadas covalentemente a lecitinas com objetivo de obter uma
mucoadesão específica. As lecitinas são capazes de se ligar a carboidratos com
considerável especificidade (BARDONNET et al., 2006). EZPELETA et al. (1999)
produziram nanopartículas de gliadina conjugada com lecitina e MONTICI et al.
(2001) produziram micropartículas e nanopartículas conjugadas com lecitina. Os
resultados apresentaram boa adesão in vitro, porém, sabe-se que in vivo as
lecitinas se ligam ao muco o qual é constantemente eliminado devido ao fluxo
peristáltico (BARDONNET et al., 2006). Também MAJITHIYA & MURTHY (2005)
desenvolveram microesferas de quitosanas contendo claritromicina pelo método
de emulsificação e utilizando glutaraldeído como agente formador de ligações
cruzadas. O tamanho das partículas foi dependente da formulação utilizada e
variou de 42 a 71,5 µm. A razão droga/polímero utilizada também alterou as taxas
de mucoadesão e de droga encapsulada. Além disso, o volume do agente
reticulante e o tempo de agitação interferiram na força de adesão, provavelmente
devido à diminuição da disponibilidade de grupos amino e hidroxilas livres da
molécula de quitosanas para interagir com a membrana celular. Os testes de
liberação foram realizados utilizando apenas duas formulações e observou-se que
com o aumento da taxa de crosslinking a taxa de liberação da droga foi menor
sendo esse fato devido ao aumento da densidade da matriz das microesferas
resultando numa diminuição da permeabilidade do soluto. Todas as formulações
liberaram 50% da droga encapsulada em 2 horas depois da qual a liberação foi
lenta. CHUN et al. (2005) desenvolveram microesferas mucoadesivas contendo
claritromicina ou amoxicilina preparadas através de complexação entre polímero
de ácido poliacrílico (PAA) e polivinilpirrolidona (PVP) pelo método de difusão do
solvente. A eficiência de encapsulação da amoxicilina foi de 57,5% e da
claritromicina foi de 93,5% devido a maior interação de claritromicina com PAA. As
microesferas apresentaram forma esférica, superfície lisa e tamanho de 62,7 µm
para amoxicilina e de 65,4 µm para claritromicina. Em pH 2 a quantidade total de
claritromicina liberada inicialmente aumentou com o tempo e depois diminuiu. A
diminuição no perfil de liberação foi devido à degradação que ocorreu em baixo
pH. A taxa de liberação inicial dominou a taxa de degradação, mas, depois
102
ocorreu o inverso. O perfil de liberação de claritromicina começou a diminuir uma
hora após o estudo de liberação. Quando o pH do meio aumentou, a liberação de
claritromicina também aumentou devido à dissolução da matriz de PAA/PVP.
Estudos prévios sobre polímeros mucoadesivos de ácidos poliacrílicos têm
sugerido a importância de grupos carboxílicos não ionizados no processo de
mucoadesão. O pka do carbopol 934P é igual a 5,79 (MORTAZAVI, 1995) e acima
desse ponto, os grupos carboxílicos são ionizados em uma maior extensão,
reduzindo as ligações de hidrogênio (LUBRIZOL CORPORATION, 2002).
Carbopol 934P pode formar ligações de hidrogênio no estado não ionizado com
grupos aceptores de prótons como os grupos hidroxila, portanto, é possível que
ele possa formar ligações de hidrogênio com os constituintes do gel mucoso
carregado negativamente. Em meio gástrico com pH≤5, uma quantidade menor
que 10% dos grupos carboxílicos do carbopol estarão ionizados. Nessas
condições, as ligações de hidrogênio com os polissacarídeos ou as proteínas da
mucina é provavelmente o principal mecanismo de bioadesão. LIU et al. (2005)
desenvolveram microesferas mucoadesivas contendo etilcelulose como matriz e
carbopol 934 P como polímero mucoadesivo utilizando o método de evaporação e
emulsificação. Eles demonstraram que a amoxicilina livre foi rapidamente
degradada em meio ácido, entretanto amoxicilina encapsulada nas microesferas
ficaram protegidas da degradação. O teste de liberação in vitro revelou que
aproximadamente 90% da droga foi liberada em pH 1 dentro de 4 horas enquanto
que no teste de liberação in vivo durante o mesmo tempo, 63,6% das microesferas
ainda permaneceram no estômago. Após administração de dosagem única, as
microesferas mucoadesivas contendo amoxicilina produziram melhor eficácia que
quando foi utilizado amoxicilina em forma de pó.
Para a realização desse nosso trabalho, primeiramente, nós validamos a
metodologia de dosagem da claritromicina por CLAE. Em seguida, microesferas
de claritromicina foram desenvolvidas e caracterizadas. Depois, estudos de
liberação em um meio gástrico simulado contendo leite (MGSL), recentemente
proposto (JANTATRID et al., 2008), foram realizados após 2 e 4 horas de
incubação no MGSL. Por fim, um estudo preliminar de mucoadesão in vitro foi
103
realizado. Sem dúvida alguma a maior dificuldade no desenvolvimento ocorreu na
primeira fase do trabalho, validação da metodologia de dosagem da claritromicina
por CLAE. Estudos posteriores in vitro e in vivo serão realizados com o objetivo de
melhor compreender o fenômeno de mucoadesão, assim como, o real potencial
desse sistema em erradicar o H. pylori.
104
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
O método cromatográfico desenvolvido atendeu satisfatoriamente a
necessidade do estudo realizado, apesar de ter apresentado limitações para o
doseamento da claritromicina durante os testes de liberação in vitro devido à
linearidade da curva analítica ser somente para concentrações mais elevadas. O
método espectrofotométrico adotado para realização destes testes de liberação in
vitro indicou resultados que possibilitaram o doseamento da claritromicina
liberada, mas, sugere-se a necessidade do desenvolvimento futuro de métodos
aplicáveis a este aspecto visando a determinação de índices mais seguros de
pequenas concentrações de claritromicina liberada.
O encapsulamento de claritromicina em microesferas mucoadesiva é uma
alternativa interessante para o tratamento de H. pylori. Utilizando etilcelulose, um
polímero biocompatível e de baixo custo, associado ao carbopol, um polímero
mucoadesivo, foi possível obter microesferas mucoadesivas para utilização em
meio ácido. Para uma continuidade do desenvolvimento dos trabalhos há espaço
para se estudar a influência de variáveis no processo de preparação dessas
microesferas, com o objetivo de otimizar o processo, e talvez, a encapsulação
simultânea de dois fármacos diferentes.
As microesferas mostraram-se capazes de liberar o fármaco por um período
de tempo prolongado em um meio líquido simulado gástrico que reproduz
adequadamente a composição do fluido gástrico. Desenvolvimentos futuros
poderão avaliar com maior profundidade as características do perfil de liberação
de claritromicina nesse meio utilizando essas microesferas, e, a partir dos
resultados obtidos otimizar o processo de produção das microesferas.
As microesferas aderiram à mucosa gástrica durante o teste de
mucoadesão in vitro. Como perspectiva para que o sistema mucoadesivo
comprove seu potencial de mucoadesão gástrica, estudos in vivo detalhados
devem ser realizados para a continuidade dos estudos para a erradicação do H.
pylori.
105
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