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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
Mestrado Acadêmico em Saúde Pública
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
Mestrado Acadêmico em Saúde Pública
Análise da refratariedade do Aedes aegypti à
toxina binária do biolarvicida Bacillus
sphaericus
LÍGIA MARIA FERREIRA
RECIFE
2009
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LÍGIA MARIA FERREIRA
Análise da refratariedade do Aedes aegypti à toxina binária do
biolarvicida Bacillus sphaericus
Orientadora: Dra. Maria Helena Neves Lobo Silva Filha
Co-orientador: Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto
RECIFE
2009
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Saúde Pública do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências.
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LÍGIA MARIA FERREIRA
Análise da refratariedade do Aedes aegypti à toxina binária do
biolarvicida Bacillus sphaericus
Data da defesa: 24/03/2009
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Dr. Herbert Álvaro Abreu de Siqueira
Universidade Federal Rural de Pernambuco
_____________________________________________
Dr. Rafael Dhalia
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
_____________________________________________
Dra. Maria Helena Neves Lobo Silva Filha
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
_____________________________________________
Dr. Giovani Rota Bertani
Universidade Federal de Pernambuco
_____________________________________________
Dra. Cláudia Maria Fontes de Oliveira
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Saúde
Pública do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Fundação Oswaldo Cruz, para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências.
À minha família
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela presença constante em minha vida e por sempre me indicar os melhores
caminhos a seguir.
À minha mãe, Odete, e aos meus irmãos, Levi, Lívio e Lênio, pelo apoio e carinho
demonstrados e por serem diretamente responsáveis pela concretização de mais esta etapa da
minha vida.
À minha orientadora, Dra. Maria Helena, pela dedicação e paciência e pela oportunidade de
fazer parte da sua equipe.
Ao Dr. Osvaldo Pompílio, pela co-orientação e contribuição com o desenvolvimento do
trabalho.
À MSc. Tatiany Romão por ter sido também a co-orientadora deste trabalho e pela ajuda no
desenvolvimento dos experimentos.
Aos membros da banca pela valiosa contribuição na avaliação do trabalho.
À equipe do Núcleo de Plataformas Tecnológicas (NPT) do CPqAM pela contribuição com o
sequenciamento das amostras de DNA utilizadas no estudo.
A Christian Reis, pela valiosa ajuda com os experimentos de pull down, o que foi fundamental
na finalização do trabalho.
À Dra. Catherine Borgouin e Dra. Isabelle Thiery do Centro de Produção e Infecção de
anofelinos (CEPIA) do Instituto Pasteur pelo fornecimento das amostras de An. gambiae.
A todos do Departamento de Entomologia, pela contribuição com os experimentos no dia-a-
dia e pelos momentos agradáveis durante esses dois anos de trabalho.
A Alaíde Silva e Andréa Neves, da equipe do insetário do Departamento de Entomologia,
pela contribuição com as amostras biológicas utilizadas no estudo.
Aos colegas do Departamento de Microbiologia pela ajuda com os experimentos e pela
disponibilização de equipamentos e materiais.
Aos amigos, Ana Paula, Diogo, Flávio, Liliane, Maíra, Mariana, Marina, Marília, Narjara e
Rodrigo pelos momentos de diversão durante esses dois anos de mestrado.
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães pela infra-estrutura e ao CNPq pelo apoio
financeiro ao projeto.
A todos que, embora distantes, contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
Resta esse constante esforço para caminhar dentro do labirinto,
Esse eterno levantar-se depois de cada queda,
Essa busca de equilíbrio no fio da navalha,
Essa terrível coragem diante do grande medo, e esse medo
infantil de ter pequenas coragens.
(Vinícius de Moraes)
FERREIRA, L. M. Análise da refratariedade do Aedes aegypti à toxina binária do
biolarvicida Bacillus sphaericus. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) – Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2009.
RESUMO
O principal fator larvicida do Bacillus sphaericus para culicídeos é a protoxina Bin, que é
produzida sob a forma de um cristal. Quando ingerido pelas larvas o cristal é processado e a
toxina Bin reconhece e liga-se a receptores específicos do epitélio intestinal. O receptor em
Culex quinquefasciatus é uma α-glicosidase de 60 kDa, ligada à membrana intestinal por uma
âncora GPI, denominado Cqm1. Larvas de Aedes aegypti, são consideradas refratárias ao Bsp,
pois a toxina Bin não reconhece receptores no microvilli intestinal. No entanto, a análise do
genoma do Ae. aegypti, revelou o gene aam1 que codificaria uma proteína ortóloga e com
80% de identidade ao receptor Cqm1. O principal objetivo do estudo foi elucidar a base
molecular da refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp, que determina a ausência de ligação da
toxina Bin ao epitélio intestinal das larvas. Para tal, foi feita uma investigação da expressão da
proteína Aam1 e do perfil de α-glicosidases de Ae. aegypti, tendo como referência a análise
do receptor Cqm1. Os resultados mostraram que larvas e adultos de Ae. aegypti expressam
uma α-glicosidase de membrana de 70 kDa, reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1, e que se
trata potencialmente da proteína ortóloga Aam1. Esta proteína é expressa no microvilli
intestinal das larvas em níveis superiores à Cqm1, no entanto, não apresenta capacidade de
ligação específica à toxina Bin. Em uma segunda etapa, a avaliação de proteínas Aam1 e
Cqm1 recombinantes produzidas em um lisado de reticulócitos de coelho, mostrou que elas
não apresentaram capacidade de se ligar específicamente à toxina Bin. A falha de ligação da
proteína Cqm1 à toxina Bin indicou que o processamento pós-traducional, ausente neste
sistema de expressão, é crítico para a sua funcionalidade. Outra avaliação também
demonstrou que o tratamento da proteína Cqm1 nativa à temperatura de 100 °C aboliu a sua
funcionalidade, indicando, neste caso, que diferenças estruturais envolvidas na conformação
da proteína podem ser essenciais para a sua capacidade de ligação. Os resultados mostram que
as larvas de Ae. aegypti expressam a α-glicosidase Aam1 em grande quantidade no microvilli
da larvas, no entanto, outros fatores críticos para funcionalidade das proteínas como receptor,
tais como diferenças de estrutura protéica e/ou processamento pós-traducional, estão
relacionados à capacidade de ligação à toxina Bin e podem determinar o status de
refratariedade do Ae. aegypti .
Palavras-Chave: Aedes, controle biológico de vetores, toxinas bacterianas.
FERREIRA, L. M. Análise da refratariedade do Aedes aegypti à toxina binária do
biolarvicida Bacillus sphaericus. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) – Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2009.
ABSTRACT
Bacillus sphaericus produces crystalline inclusions which contain the Bin toxin, its major
insecticidal factor against culicide larvae. After ingestion by larvae the crystal is processed
and released in the midgut, where the Bin toxin recognizes and binds to specific receptors on
the epithelium. The receptor in Culex quinquefasciatus is a 60-kDa midgut membrane bound
α-glucosidase, named Cqm1. Aedes aegypti larvae are refractory to Bsp, due to the lack of
functional receptors in the midgut epithelium. However, analysis of Ae. aegypti genome
revealed the aam1 gene that encodes a protein ortholog with 80% of identity to Cqm1. The
major goal of this study was to elucidate the molecular basis of Ae. aegypti refractoriness to
Bsp. The first step was to evaluate the expression of the Aam1 protein, using the Cqm1
receptor as a reference. The results showed that a 70-kDa membrane-bound α-glucosidase,
recognized by anti-Cqm1 polyclonal antibody, is expressed in larvae and adults of Ae.
aegypti, and it could be Aam1. This protein is expressed on larvae midgut at higher levels that
Cqm1, however, it does not bind to Bin toxin. In a second set of experiments, Aam1 and
Cqm1 recombinant proteins were produced in a rabbit reticulocyte lysate system to assess its
capacity to interact with Bin toxin. These proteins failed to bind to the toxin, and it is likely
due the ineffective pos-translational processing of the protein by this system. Treatment of
native Cqm1 at 100 °C abolished its binding capacity, possibly due structural changes related
to protein folding, which might be essential for Bin toxin binding. This work showed that Ae.
aegypti larvae express the Aam1 α-glucosidase at high levels on midgut, however, other
critical factors that affect protein functionality, such as changes of protein structure and
correct pos-translational processing, are associated with the toxin binding capacity and can
underlie the Ae. aegypti refractoriness status.
Key Words: Aedes, biological control of vectors, bacterial toxins
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1. Ciclo de vida do Aedes aegypti............................................................. 19
Figura 2. Estrutura tridimensional das toxinas inseticidas produzidas pelo
Bacillus thuringiensis Cry3Aa e Cyt2Aa..............................................................
23
Figura 3. Receptores de toxinas Cry do Bacillus thuringiensis caracterizados
em larvas de insetos...............................................................................................
25
Figura 4. Micrografia eletrônica do Bacillus sphaericus..................................... 28
Figura 5. Alinhamento múltiplo no programa Clustal W da sequência de
aminoácidos do receptor da toxina Bin do Bacillus sphaericus em Culex
quinquefasciatus....................................................................................................
32
Figura 6. Principais etapas dos procedimentos experimentais............................. 39
Figura 7. Perfil de imunodetecção de α-glicosidases em extratos totais de
larvas e adultos de Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti.................................
51
Figura 8. Imunodetecção de proteínas do microvili intestinal de larvas com o
anticorpo anti-Cqm1..............................................................................................
52
Figura 9. Perfil da atividade α-glicosidase em gel em amostras de extrato total
de larvas e adultos de Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti............................
53
Figura 10. Perfil da atividade α-glicosidase em gel de frações de microvili
intestinal de larvas de culicídeos...........................................................................
54
Figura 11. Ensaio de afinidade entre os extratos de proteínas de microvili
intestinal solubilizadas de Culex quinquefasciatus (Cq) e Aedes aegypti (Ae) e a
toxina Bin do Bacillus sphaericus, imobilizada em suporte sólido, seguido de
imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1.............................................................
55
Figura 12. Separação eletroforética dos fragmentos de genes que codificam a
proteína Aam1 e suas respectivas proteínas parálogas, amplificados nas reações
de RT-PCR, a partir do mRNA de Aedes
aegypti....................................................................................................................
56
Figura 13. Ensaio de afinidade entre as proteínas recombinantes Aam1 de
Aedes aegypti e Cqm1 de Culex quinquefasciatus e a toxina Bin do Bacillus
sphaericus, imobilizada em resina de sefarose, seguido de imunodetecção com
anticorpo anti-Cqm1..............................................................................................
57
Figura 14. Separação eletroforética dos mRNAs obtidos no procedimento de
transcrição in vitro dos genes aam1 de Aedes aegypti e cqm1 de Culex
quinquefasciatus, a partir do cDNA obtido nas reações de RT-
PCR.........................................................................................................................
58
Figura 15. Separação eletroforética em SDS-PAGE 10% de proteínas Aam1-
35
S
e Cqm1-
35
S
de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, respectivamente,
produzidas através de tradução in vitro em reticulócitos de coelho e visualizadas
por autoradiografia.................................................................................................
58
Figura 16. Ensaio de pull down entre as proteínas Aam1-S
35
e Cqm1-S
35
e a
subunidade BinB
da toxina e entre as proteínas LmEIFG3-S
35
e LmEIF4A1 de
Leishmania sp., visualizados por autoradiografia. T. Proteínas
35
S traduzidas
sem incubação........................................................................................................
59
Figura 17. Ensaio de afinidade (pull down) entre os extratos-CHAPS de Culex
quinquefasciatus e Aedes aegypti nativos (N) ou desnaturados (D) e a
subunidade BinB imobilizada em resina glutationa sefarose (GS), seguido de
imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1..............................................................
61
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Receptores de toxinas inseticidas de bactérias entomopatógenas
presentes no epitélio intestinal de lepidópteros......................................................
.
26
Tabela 2. Receptores de toxinas inseticidas de bactérias entomopatógenas
presentes no epitélio intestinal de culicídeos vetores..............................................
27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aam1
Aedes aegypti maltase 1
Agm3
Anopheles gambiae maltase 3
ALP
Fosfatase alcalina
APN
Aminopeptidase-N
BB3
Binding buffer 3 – Tampão de ligação 3
BBMF
Frações de membrana de microvili intestinal
Bin
Binária
BSA
Albumina sérica bovina
Bsp
Bacillus sphaericus
Bti
Bacillus thuringiensis sorovar. israelensis
CADR
Caderina
CHAPS
3-[(3-Cholamidopropil)dimethilammonio]-1-propanosulfonato
Cpm1
Culex pipiens maltase 1
Cqm1
Culex quinquefasciatus maltase 1
CqSF
Colônia de C. quinquefasciatus sensível ao Bsp
Cry
Toxina do cristal
Cyt
Toxina citolítica
DDT
Dicloro-difenil-tricloro-etano
DEPC
Dimetil pirocarbonato
DNA
Ácido desoxiribonucléico
E.C.
Código enzimas dado pela Enzime Comission
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
GPI
Glicosilfosfatidil inositol
GS
Glutationa sefarose
GST
Glutationa S-tranferase
HEPES
Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2'-Etanossulfônico
IPTG
Isopropiltiogalactosídeo
KDa
Kilodalton
LB
Meio de cultura Luria-Bertani
Mtx
Toxina mosquitocida
NCBI
National Center for Biotechnology Information – Centro Nacional de
Informação Biotecnológica
NP-40
Nonidet P40
®
NPT
Núcleo de plataformas tecnológicas
pb
Pares de bases
PBS
Phosphate buffered saline – Tampão fosfato salina
PCR
Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da polimerase
PM
Peso molecular
PMSF
Fluoreto de fenilmetanilsulfonil
RecL
Colônia de Ae. aegypti Recife
RNA
Ácido ribonucléico
RT-PCR
Reverse-transcriptase - Polymerase Chain Reaction – Reação em
cadeia da polimerase utilizando a transcriptase reversa.
SDS
Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes
TA
Temperatura ambiente
TBE
Tris – borate – EDTA – Tris - ácido bórico – EDTA
TBS-T
Tris buffered saline - Tween 20 – Tampão Tris salina - Tween 20
UV
Ultravioleta
SUMÁRIO
Página
1 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA........................................................
17
2 REFERENCIAL TEÓRICO...........................................................................
19
2.1 Biologia de culicídeos....................................................................................
19
2.1.1 Culex quinquefasciatus Say 1823.................................................................
20
2.1.2 Aedes aegypti Linnaeus 1762.......................................................................
20
2.2 Controle de vetores........................................................................................
21
2.3 Bactérias entomopatógenas e seu modo de ação.........................................
21
2.4 Bacillus thuringiensis.....................................................................................
22
2.4.1 Bacillus thuringiensis sorovar. israelensis...................................................
23
2.4.2 Receptores das toxinas Cry...........................................................................
23
2.5 Bacillus sphaericus.........................................................................................
28
2.5.1 Toxinas inseticidas.......................................................................................
28
2.5.2 Toxina Bin....................................................................................................
29
2.5.3 Receptor da toxina Bin em culicídeos..........................................................
31
2.5.4 Resistência de Culex à toxina Bin................................................................ 33
2.5.5 α-glicosidases ortólogas ao receptor Cqm1 em Aedes aegypti....................
33
3 JUSTIFICATIVA............................................................................................. 35
4 PERGUNTA CONDUTORA.......................................................................... 36
5 HIPÓTESE........................................................................................................ 37
6. OBJETIVOS.................................................................................................... 38
6.1. Objetivo geral................................................................................................ 38
6.2. Objetivos específicos..................................................................................... 38
7 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 39
7.1 Procedimentos experimentais....................................................................... 39
7.2 Colônias de insetos......................................................................................... 40
7.3 Análise da expressão da proteína Aam1 nativa.......................................... 40
7.3.1 Preparação de proteínas nativas.................................................................... 40
7.3.1.1 Extrato total de larvas e adultos................................................................ 40
7.3.1.2 Frações ricas em microvili intestinal (BBMF) de larvas.......................... 41
7.3.1.3 Frações de proteínas de BBMF solubilizadas (extratos-CHAPS)............ 41
7.3.2 Ensaios de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1 ................................. 42
7.3.3 Perfil de α-glicosidases em gel.....................................................................
42
7.4 Clonagem e expressão das maltases Aam1 e Cqm1.................................... 43
7.4.1 Extração de RNA, RT-PCR e PCR do gene aam1....................................... 43
7.4.2 Clonagem e sequenciamento do gene aam1................................................. 44
7.4.3 Expressão e purificação de proteínas em Escherichia coli........................... 44
7.4.4 Mutagênese sítio-dirigida............................................................................. 45
7.4.5 Transcrição e tradução in vitro......................................................................
46
7.5 Ensaios de ligação com a toxina Bin............................................................ 47
7.5.1. Ensaios de afinidade.................................................................................... 47
7.5.2 Ensaios de pull-down.................................................................................... 48
7.6 Influência da conformação protéica na capacidade de ligação á toxina
Bin..........................................................................................................................
48
8 RESULTADOS................................................................................................. 50
8.1 Avaliação de proteínas nativas..................................................................... 50
8.1.1 Imunodetecção de proteínas com anticorpo anti-Cqm1............................... 50
8.1.2 Perfil de α-glicosidases................................................................................
52
8.1.3 Interação de proteínas nativas com a toxina Bin.......................................... 54
8.2 Avaliação de proteínas recombinantes........................................................ 55
8.2.1 Clonagem dos genes das α-glicosidases Aam1 e Cqm1..............................
55
8.2.2 Expressão das proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes em E. coli.............. 56
8.2.3 Avaliação das proteínas Aam1 e Cqm1 produzidas em E. coli.................... 57
8.2.4 Expressão das proteínas Aam1 e Cqm1 em lisado de reticulócitos de
coelho......................................................................................................................
58
8.2.5 Avaliação das proteínas Aam1 e Cqm1 produzidas em lisado de
reticulócitos de coelho............................................................................................
59
8.2.6 Influência da conformação protéica na capacidade de ligação á toxina Bin.
60
9 DISCUSSÃO..................................................................................................... 62
10 CONCLUSÕES............................................................................................... 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….. 68
APÊNDICE A – Manuscrito de artigo para submissão.........................................
77
APÊNDICE B – Participação em cursos, congressos, outros...............................
102
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 17
1 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
Biolarvicidas à base das bactérias Bacillus sphaericus (Bsp) e B. thuringiensis (Bt) são
eficazes para o controle de culicídeos e simulídeos, e têm sido utilizados em vários países,
inclusive no Brasil. O Bacillus sphaericus apresenta ação inseticida para culicídeos graças à
produção de cristais que causam a morte das larvas quando ingeridos. O principal fator tóxico
do Bsp, contido no cristal, é a toxina Bin. Este fator é produzido sob a forma de uma
protoxina heterodimérica, composta pelos polipeptídeos de 42- e 51- kDa denominados BinA
e BinB, respectivamente. Após a ingestão pelas larvas, o cristal protéico é solubilizado em pH
alcalino intestinal e a protoxina Bin é liberada no lúmen, onde é clivada por serina-proteases
em polipeptídeos de 39- e 43-kDa, que constituem a forma ativa da toxina. A toxina Bin
necessita reconhecer e ligar-se a receptores específicos no epitélio intestinal das larvas para
promover o efeito inseticida. A ligação da toxina aos receptores é uma etapa crucial no modo
de ação do Bsp em espécies susceptíveis tal como C. pipiens, C. quinquefasciatus, An.
stephensi e An. gambiae. Em Ae. aegypti, que é uma espécie naturalmente refratária ao Bsp, a
ligação da toxina aos receptores do microvili intestinal de larvas (BBMF) não foi detectada. O
principal objetivo deste estudo é identificar os mecanismos moleculares envolvidos na
refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp.
O receptor da toxina Bin em C. pipiens e C. quinquefasciatus já foi caracterizado e é
uma α-glicosidase de 60 kDa, ancorada à membrana apical do epitélio intestinal por uma
molécula de glicosil-fosfatidilinositol (GPI). Em An. gambiae verificou-se que a α-glicosidase
Agm3 (Anopheles gambiae maltase 3), ortóloga ao receptor Cqm1 e expressa no epitélio
intestinal das larvas desta espécie, foi capaz de ligar-se à toxina Bin in vitro (OPOTA et al.,
2008). A análise das seqüências de nucleotídeos, a partir da disponibilidade do genoma do Ae.
aegypti, revelou que essa espécie apresenta moléculas com substancial similaridade à Cqm1,
dentre elas, uma α-glicosidase que apresentou 80% de identidade, denominada neste estudo
Aedes aegypti maltase 1 (Aam1), que poderia ser, portanto, uma molécula com capacidade de
interagir com a toxina Bin.
A identificação da proteína Aam1 em Ae. aegypti gerou um importante
questionamento acerca dos mecanismos que determinam a refratariedade desse culicídeo ao
Bsp, que podem trazer conhecimentos importantes sobre o modo de ação do Bsp ao nível
molecular. Embora a análise de seqüências revele a presença do gene aam1, que codifica uma
molécula candidata ao receptor da toxina Bin em Ae. aegypti, estudos anteriores
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 18
demonstraram que não há ligação da toxina ao epitélio intestinal das larvas desse inseto. Tal
fato pode resultar da ausência de expressão desse gene nos insetos, da expressão em outra fase
do desenvolvimento, da expressão em níveis reduzidos, da expressão de uma proteína
desprovida de âncora GPI e, portanto, expressa sob a forma solúvel, ou ainda de diferenças
estruturais nas proteínas que sejam críticas para o seu reconhecimento e ligação com a toxina
Bin. A resistência de larvas de Culex ao Bsp, por exemplo, pode ser decorrente de mutações
no gene Cqm1, que passa a codificar proteínas Cqm1 desprovidas de âncora GPI e, portanto,
ausentes do microvili intestinal. Uma outra possibilidade é que a proteína Aam1 seja expressa
nas larvas de Ae. aegypti e não possua a capacidade de interagir com a toxina Bin, o que pode
ser decorrente de diferenças na sequência primária de aminoácidos ou de alterações na
conformação da proteína Aam1 que impeçam a interação.
A partir dos dados disponíveis, o objetivo desse estudo foi identificar os mecanismos
envolvidos na refratariedade do Ae. aegypti. Inicialmente foi realizada uma avaliação da
expressão da proteína Aam1 em todas as fases do desenvolvimento do Ae. aegypti e uma
investigação da sua presença dentre as α-glicosidases expressas nessa espécie. Em seguida,
proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes foram produzidas e submetidas a ensaios de interação
para avaliar a sua capacidade de interação com a toxina Bin. O conjunto de características
apresentadas por Ae. aegypti e C. quinquefasciatus, espécies refratária e susceptível,
respectivamente, constituem um modelo ímpar de estudo, que pode trazer conhecimentos
relevantes para a elucidação do modo de ação do Bsp. A compreensão da base da
refratariedade dessa espécie pode oferecer subsídios para ampliar o espectro de ação e
aperfeiçoar o uso do Bsp.
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 19
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Biologia de culicídeos
Os culicídeos pertencem à ordem Diptera e possuem grande importância médica por
estarem envolvidos na transmissão de agentes etiológicos de doenças para o homem. Espécies
dos gêneros Culex, Anopheles e Aedes podem ser vetores de patógenos humanos responsáveis
pela filariose, malária e dengue, respectivamente. Os culicídeos são holometábolos e o seu
desenvolvimento compreende as fases de ovo, quatro estádios larvais, pupa e adulto (Fig. 1).
A fase pré-imaginal ocorre no ambiente aquático onde as fêmeas depositam os seus ovos. O
ciclo de vida dura cerca de dez dias, desde o ovo até a emergência do adulto, embora possa
haver variações devido à influência de fatores como nutrição, temperatura, fotoperíodo e
umidade. Os insetos adultos se alimentam de seiva vegetal e as fêmeas realizam também
hematofagia, que é necessária para o desenvolvimento dos ovos. Após o desenvolvimento
embrionário, as larvas do 1º estádio (L1) eclodem e evoluem, passando por mais três estádios
(L2, L3 e L4) até chegarem à fase de pupa, a partir da qual ocorre a emergência da forma
adulta. As fêmeas podem realizar até quatro a cinco ciclos gonadotróficos durante a vida e,
devido ao seu hábito hematofágico, são capazes de adquirir agentes etiológicos de doenças e
transmiti-los de um hospedeiro vertebrado para outro (CONSOLI, 1994).
Figura 1. Ciclo de vida do Aedes aegypti
. Após o repasto sanguíneo as fêmeas (A) depositam os ovos (B) na
superfície da água. Estes eclodem e liberam as larvas (C), que em seguida evoluem para a fase de pupa (D), a
partir da qual emergem os adultos.
Adulto
Larvas
Pupa
Ovo
s
A
B
C
D
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 20
2.1.1 Culex quinquefasciatus Say 1823
C. quinquefasciatus é uma espécie cosmopolita que ocorre nas porções meridionais da
Ásia, na África, nas Américas e na Oceania. Possui ampla diversidade de criadouros, com
preferência pelos depósitos artificiais com água rica em matéria orgânica em decomposição e
detritos como os sistemas de esgoto, fossas e valetas (CONSOLI, 1994). O C.
quinquefasciatus é altamente antropofílico e endofílico e é a espécie predominante nas áreas
urbanas do Brasil, sendo encontrado com mais freqüência nos meses quentes e chuvosos. As
fêmeas realizam repasto sanguíneo no período crepuscular ou noturno e depositam cerca de
150 ovos agrupados sob a forma de jangada. Esta espécie é o vetor primário do nemátodo
Wuchereria bancrofti, agente etiológico da filariose linfática no Brasil, a segunda doença
mais comum transmitida por vetores. Estima-se que cerca de 120 milhões de pessoas estejam
infectadas pelo parasita e que mais de um bilhão se encontre sob risco em mais de 80 países
(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs102/en/). A ampla distribuição da doença está
associada ao crescimento desordenado da população e às condições precárias de saneamento,
que favorecem o desenvolvimento do vetor. Além da filariose, o C. quinquefasciatus também
pode ser vetor primário de alguns arbovírus como o vírus do Nilo ocidental, Oropouche, Saint
Louis e outros (GODSEY et al., 2005; FIGUEIREDO, 2007; MONDINI et al., 2007).
2.1.2 Aedes aegypti Linnaeus 1762
Originariamente descrito no Egito, o Ae. aegypti é considerado uma espécie
cosmopolita de ocorrência em regiões tropicais e subtropicais, e foi introduzido no Brasil no
final do século XV, provavelmente em embarcações com os primeiros navegantes europeus.
O Ae. aegypti foi erradicado de várias cidades brasileiras na década de 30 (SOPER, 1963),
mas foi reintroduzido devido à falta de manutenção das medidas de controle (WHO, 2007).
No Brasil a espécie ocorre, sobretudo, em áreas urbanas, geralmente no domicílio ou
peridomicílio humano. Seus criadouros preferenciais são os recipientes artificiais em locais
com pouca iluminação, que contenham água pobre em matéria orgânica. A densidade
populacional do Ae. aegypti é diretamente influenciada pela presença de chuvas e densidades
elevadas são encontradas nas estações com maiores índices pluviométricos. As fêmeas
possuem hábitos hematófagos diurnos, ao contrário do C. quinquefasciatus, porém
compartilham com esta espécie a predileção pelo ambiente domiciliar, o que facilita o contato
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 21
com o homem. A estratégia de oviposição do Ae. aegypti é diferente daquela adotada pelo C.
quinquefasciatus, pois em cada postura as fêmeas depositam ovos isolados, distribuídos em
diversos criadouros (CONSOLI, 1994). É o vetor primário do vírus da dengue no Brasil e em
diversos países, além de ser capaz de disseminar e transmitir o vírus da febre amarela no ciclo
urbano da doença (MUTEBI, 2004).
2.2 Controle de vetores
O controle populacional de vetores é uma ferramenta efetiva para interromper o ciclo
de transmissão de doenças. Entretanto, devido a certas características biológicas peculiares
dos culicídeos como elevada taxa reprodutiva, curto ciclo biológico e capacidade elevada de
colonizar habitats temporários, a sua redução populacional é um desafio nos programas de
controle de doenças como filariose e dengue. A partir da descoberta e utilização dos
inseticidas sintéticos de ação residual, na década de 40, foi possível controlar algumas
doenças provocadas por vetores e o diclorodifeniltricloroetano (DDT), da classe dos
organoclorados, foi o primeiro inseticida a ser amplamente utilizado (HEMINGWAY;
RANSON, 2000). As limitações desses inseticidas como o mecanismo de ação inespecífico e
a ação em organismos não-alvo, bem como a seleção de populações de insetos resistentes
decorrentes do seu uso prolongado (HEMINGWAY; RANSON, 2000), motivaram a busca
por métodos de controle mais seletivos. O controle biológico pode ser uma alternativa eficaz e
baseia-se na utilização de organismos vivos ou de suas toxinas para reduzir a densidade
populacional dos insetos. Dentre estes organismos, as bactérias entomopatógenas são
importantes agentes de controle biológico, sendo amplamente utilizadas em programas de
controle de vetores (REGIS et al., 2001).
2.3 Bactérias entomopatógenas e seu modo de ação
Os larvicidas à base de bactérias entomopatógenas do gênero Bacillus possuem
características que favorecem sua utilização em programas de controle tais como modo de
ação específico, segurança para o meio ambiente e facilidade de produção em larga escala. Os
larvicidas bacterianos ocupam lugar de destaque desde a década de 70 e representam cerca de
90% do mercado de bioinseticidas. Os biolarvicidas à base das bactérias Bacillus
thuringiensis (Bt) e B. sphaericus (Bsp) são eficazes para o controle de insetos de diferentes
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 22
ordens, e têm sido utilizados em vários países, inclusive no Brasil (OMS, 1993;
THIÉRY et
al., 1996; MITTAL, 2003; REGIS et al., 2001). Ambas as bactérias são bacilos Gram-
positivos, saprófitas de solos e ambientes aquáticos que, quando submetidas a condições
adversas, produzem esporos. Durante a fase de esporulação são produzidos cristais que
contém protoxinas com alto poder inseticida. O princípio ativo das preparações de
biolarvicidas é constituído por uma mistura de cristais ou esporos, e a sua eficácia pode ser
influenciada por diversos fatores físico-químicos e ambientais (MITTAL, 1993). Os cristais
agem por via oral e as larvas se alimentam no meio aquático por filtração, ingerindo os
cristais. Em seguida, os cristais são solubilizados no intestino dos insetos alvo, graças ao pH
alcalino (≅ 10), as protoxinas são liberadas no lúmen e, devido à ação de serina-proteases são
convertidas à forma de toxinas ativas, que interagem com receptores específicos presentes no
epitélio intestinal (LACEY, 2007). Tal interação desencadeia efeitos citopatológicos nas
células epiteliais intestinais que culminam com a morte dos insetos.
2.4 Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis é uma bactéria entomopatógena que possui mais de 70
sorovariedades, cujos cristais contém protoxinas das famílias Cry e Cyt, que possuem ação
larvicida, sobretudo para lepidópteros, coleópteros e dípteros. As toxinas Cry são alvo de
vários estudos acerca dos mecanismos que envolvem a interação toxina-receptor, devido à
ampla utilização de biolarvicidas a base de Bt e de plantas transgênicas que expressam essas
toxinas (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007). A ação das toxinas Cry e Cyt depende da
interação com receptores específicos nas células do epitélio intestinal das larvas de insetos e,
após a ligação aos receptores, ocorre a inserção da toxina na membrana, o que leva à
formação de poros nas células apicais (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007). A estrutura
terciária de algumas toxinas Cry revelou a existência de três domínios. O domínio I (N-
terminal) é formado por sete α-hélices e é responsável pela formação de poros na membrana,
enquanto que os domínios II e III, constituídos por folhas β, estão envolvidos na ligação da
toxina com receptores no epitélio intestinal (Fig. 2, Cry3Aa). As toxinas Cyt são toxinas
citolíticas e hemolíticas que possuem um único domínio α-β (Fig. 2, Cyt2Aa). Tais moléculas
atuam diretamente na membrana lipídica das células, podendo inserir-se na mesma e levar à
formação de poros (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007; GÓMEZ et al., 2007).
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 23
2.4.1 Bacillus thuringiensis sorovar. israelensis
O Bacillus thuringiensis israelensis, descoberto em 1976 por Goldberg e Margalit
(1977) e identificado posteriormente por de Barjac (1978), é específico para larvas de dípteros
e possui cristais com elevada toxicidade para larvas de mosquitos. Os cristais ativos contra
mosquitos comumente contêm as toxinas Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa e Cyt1Aa, que agem em
sinergia para causar a ação larvicida (CRICKMORE et al., 1995). Além de possuírem ação
tóxica para larvas de culicídeos, as toxinas do Bti também são ativas contra larvas de
simulídeos (LACEY, 2007). Os cristais devem ser ingeridos pelas larvas dos insetos-alvo para
que as toxinas sejam liberadas no lúmen intestinal, ativadas pelas proteases ali presentes e
interajam com receptores específicos para exercer a ação inseticida (PIGOTT; ELLAR, 2007).
O Bti, hoje amplamente utilizado como larvicida, é eficaz para o controle do Ae. aegypti pela
sua especificidade e alta atividade inseticida e representa uma alternativa ao uso dos
organofosforados (LEE; ZAIRI, 2005).
2.4.2 Receptores das toxinas Cry
A ação inseticida específica das toxinas Cry é devida à sua interação com receptores
presentes no epitélio intestinal das larvas alvo. Estudos acerca do seu modo de ação têm
demonstrado que algumas enzimas digestivas de insetos funcionam como receptores para as
Figura 2. Estrutura tridimensional das toxinas inseticidas produzidas pelo Bacillus thuringiensis
Cry3Aa e
Cyt2Aa. DI. Domínio estrutural I. DII. Domínio estrutural II. DIII.
Domínio estrutural III. Extraído de Bravo;
Gill; Soberón, 2007, com modificações.
Cry3Aa
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 24
toxinas Cry (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007). Estudos realizados em lepidópteros
demonstraram que a diminuição ou ausência de receptores no microvili intestinal está
relacionada ao desenvolvimento de resistência, o que comprova a importância da interação
toxina-receptor (JURAT-FUENTES; ADANG, 2004). Dentre as moléculas já caracterizadas
como receptores do Bt estão caderinas (CADR), aminopeptidases-N (APN), fosfatases
alcalinas (ALP), glicoconjugados e algumas metaloproteases (Fig. 3; Tabela 1) (KNIGHT et
al., 1994, VADLAMUDI et al., 1995, VAILATIS et al., 2001, JURAT-FUENTES; ADANG,
2004, OCHOA-CAMPUZANO et al., 2007). As caderinas representam uma ampla família de
glicoproteínas envolvidas nos processos de adesão e sinalização celular e, em lepidópteros
como Manduca sexta e Bombyx mori, caderinas são receptores da toxina Cry1A (GÓMEZ,
2007). As aminopeptidases estão principalmente localizadas no epitélio intestinal de insetos e
exercem funções essenciais na digestão de proteínas. Uma aminopeptidase-N de membrana de
120 kDa é o receptor da toxina Cry1Ac no lepidóptero M. sexta (KNIGHT et al, 1994, 1995;
SANGADALA et al., 1994) e, em espécies de anofelinos, duas outras aminopeptidases
também foram identificadas como receptores das toxina Cry do Bti ((LEHNINGER;
NELSON; COX, 1993, HUA et al., 1998, REED; CHANDLER; SANDEMAN, 1999,
WANG; ZHANG, 2005, ZHANG et al., 2008) (Tabela 2).
A maior parte dos receptores foi descrita para as toxinas Cry com ação para larvas de
lepidópteros, ao passo que a caracterização em larvas de dípteros tem sido escassa. Apenas
recentemente, o receptor da toxina Cry11Aa do Bti em Ae. aegypti foi caracterizado como
uma fosfatase alcalina de 65 kDa (FERNANDEZ, et al., 2005). Esta molécula se localiza
predominantemente em células intestinais nas regiões do ceco gástrico e intestino posterior
das larvas e está ligada à membrana por uma âncora GPI (FERNANDEZ, et al., 2006). O
atual conhecimento sobre as toxinas do Bt, bem como dos seus respectivos sítios-alvo no
intestino das larvas de insetos gerou grandes avanços para o uso de biolarvicidas à base destas
bactérias. Apesar da sua importância como agentes de controle, os biolarvicidas Bti e Bsp,
usados no controle de mosquitos, apresentam vários aspectos do seu modo de ação ainda não
elucidados.
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 25
Figura 3. Receptores de toxinas Cry do Bacillus thuringiensis caracterizados em larvas de insetos. CADR.
Caderina, APN. Aminopeptidase-N, ALP. Fosfatase alcalina, GCR.
Glicoconjugado. Extraído de Bravo; Gill;
Soberón, 2007.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 26
Tabela 1. Receptores de toxinas inseticidas de bactérias entomopatógenas presentes no epitélio intestinal de larvas de lepidópteros.
Espécie Toxina Receptores Peso (kDa) Referência
Bombix mori Cry1Aa
CADR
1
(Bt-R
175
)
APN
2
175
110
Nagamatsu et al., 1999
Hua et al., 1998
Helicoverpa armigera
Cry1Ac APN 120 Ingle et al., 2001
Heliothis virescens
Cry1Ac
APN
ALP
3
CADR
170
68
210
Luo et al., 1997
Jurat-Fuentes; Adang, 2004
Jurat-Fuentes; Adang, 2006
Lymantria dispar Cry1Aa Cry1Ab Glicoconjugado 270 Valaitis et al., 2001
Manduca sexta
Cry1Ac
Cry1Ab
APN
CADR (Bt-R
1
)
120
210
Knight et al., 1994
Vadlamudi et al., 1995
Pectinophora gossypiella Cry1Ac CADR (BtR) ND
4
Fabrick; Tabashnik, 2007
1
CADR - Caderina;
2
APN - Aminopeptidase;
3
ALP - Fosfatase alcalina;
5
ND - Não determinado.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 27
Tabela 2. Receptores de toxinas inseticidas de bactérias entomopatógenas presentes no epitélio intestinal de larvas de culicídeos.
Espécie Toxina Receptores Peso (kDa) Referência
Aedes aegypti Cry11Aa ALP
1
65 Fernandez et al., 2006
Anopheles gambiae Bin
α-Gli
2
(Agm3)
67 Opota et al., 2008
Anopheles gambiae Cry11Ba APN
3
106
Zhang et al., 2008
Anopheles quadrimaculatus Cry11Ba APN 100
Abdullah; Valaitis; Dean, 2006
Culex quinquefasciatus Bin
α-Gli
(Cqm1)
60 Romão et al., 2006
Culex pipiens Bin
α-Gli (Cpm1)
60
Silva-Filha et al., 1999;
Darboux et al., 2001
1
ALP - Fosfatase alcalina;
2
α
-Gli -
α
-Glicosidase;
3
APN – Aminopeptidase.
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 28
2.5 Bacillus sphaericus
O Bacillus sphaericus (Bsp) é uma bactéria Gram-positiva, saprófita de solos e
ambientes aquáticos que, quando submetida a condições adversas, produz esporos
arredondados, localizados na região terminal do esporângio em forma de raquete (Fig. 4). A
primeira linhagem inseticida do Bsp foi isolada em 1965, a partir de larvas mortas de Culiseta
incidens, entretanto esta linhagem possuía baixa atividade para larvas de mosquitos
(KELLEN, 1965). Posteriormente, novas linhagens com alto potencial larvicida foram
isoladas, incluindo a 1593 da Indonésia (SINGER, 1977), 2297 do Sri Lanka
(WICKREMESINGHE; MENDIS, 1980), 2362 da Nigéria (WEISER, 1984) e C3-41 da
China (ZHANG et al., 1987), o que levou ao desenvolvimento de biolarvicidas comerciais à
base dessa bactéria. As cepas do Bsp são agrupadas de acordo com as características
morfológicas e bioquímicas. A reação de aglutinação flagelar é o método de classificação
mais utilizado e reúne as cepas em diferentes sorotipos, sendo o mais importante o H5a5b,
que agrupa as cepas 1593, 2362 e C3-41, utilizadas para a produção industrial de
biolarvicidas. As toxinas produzidas pelo Bsp são eficazes contra espécies de Culex,
Anopheles, Mansonia e Aedes e possuem grande potencial como agente para o controle de
larvas de mosquitos, sendo amplamente utilizadas em programas de controle (LACEY, 2007).
No caso específico do Ae. aegypti, o Bsp não apresenta atividade larvicida, portanto, o
controle biológico deste vetor é realizado principalmente com o Bti, conforme descrito na
seção 2.4.1.
2.5.1 Toxinas inseticidas
O Bsp possui três classes de toxinas que apresentam atividade larvicida para dípteros:
as toxinas Mtx (toxinas mosquitocidas), produzidas na fase de crescimento vegetativo, a
Figura 4. Micrografia eletrônica do Bacillus sphaericus em fase de esporulação, mostrando o esporo (S) e o cristal
protéico (C) que possui ação larvicida para dípteros. Fonte: Kalfon et al. (1984), modificado.
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 29
toxina Bin (toxina binária) e as toxinas Cry48Aa e Cry49Aa, que são produzidas durante a
esporulação (CHARLES et al., 1996; JONES, et al, 2007).
Os principais tipos descritos da toxina Mtx são as proteínas Mtx1 (100 kDa), Mtx2 (31
kDa) e Mtx3 (36 kDa). Estas toxinas não apresentam uma contribuição importante para a
atividade larvicida de culturas esporuladas do Bsp, pois sofrem degradação por proteases,
visto que são secretadas no meio durante sua produção na fase vegetativa (THANABALU;
PORTER, 1995, CHARLES et al., 1996). Entretanto, quando expressas sob a forma
recombinante em Escherichia coli, as toxinas possuem alto poder larvicida para larvas de
dípteros (PARTRIDGE; BERRY, 2002; WEI et al., 2006).
Uma nova toxina binária, formada pelas toxinas Cry48Aa e Cry49Aa foi recentemente
identificada na cepa IAB59 do Bsp. A toxina Cry48Aa/Cry49Aa apresenta alta toxicidade
para C. quinquefasciatus quando administrada de forma purificada e em concentrações
equimolares. No entanto, cepas nativas que expressam essa nova toxina não possuem
atividade larvicida elevada, devido ao baixo nível de acúmulo da Cry48Aa, impedindo a
atividade tóxica que só ocorre na razão molar de 1:1 (JONES et al., 2007).
A toxina Bin é o principal fator responsável pela ação larvicida do Bsp para culicídeos
e se localiza no cristal, sob a forma de uma protoxina heterodimérica, composta por
polipeptídeos de 42- e 51- kDa (BinA/BinB), produzidos de forma equimolar (CHARLES,
1987; BAUMANN, et al., 1988). A toxicidade máxima é observada quando ambos os
componentes da toxina estão presentes em concentrações equimolares, o que indica a atuação
sinérgica entre eles e justifica a natureza binária desta toxina (NICOLAS et al., 1993;
CHARLES et al., 1997). Em larvas do gênero Culex, o componente BinB é responsável pelo
reconhecimento e ligação aos receptores nas células do epitélio intestinal, enquanto BinA
parece estar envolvido no mecanismo de toxicidade (NICOLAS et al., 1993).
2.5.2 Toxina Bin
A toxina Bin constitui o principal fator inseticida do Bsp e os biolarvicidas disponíveis
comercialmente são obtidos a partir de cepas produtoras dessa toxina, como a 1593, 2362 e
C3-41. A toxina Bin possui atividade inseticida decrescente para larvas dos gêneros Culex,
Anopheles e Aedes e a sua ação depende da interação com receptores no microvili intestinal
das larvas. A atividade do Bsp para diferentes espécies do gênero Aedes é variável, porém,
larvas de Ae. aegypti são consideradas refratárias à ação do Bsp, pois requerem concentrações
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 30
letais cerca de 100 vezes mais elevadas que aquelas utilizadas para larvas de Culex
(NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992).
Após a ingestão do cristal protéico, o mesmo é solubilizado em pH alcalino intestinal
(≅10) e a protoxina é liberada no lúmen. Graças à ação de serina-proteases, os componentes
BinA e BinB de 42 e 51 kDa, respectivamente, são clivados e atingem a sua forma ativa,
constituída de polipeptídeos de 39- e 43-kDa, respectivamente, que interagem com receptores
específicos do epitélio intestinal das larvas e promovem o efeito letal (BAUMANN et al.,
1985; BROADWELL; BAUMANN, 1987; NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992). Os
principais efeitos citopatológicos observados em células intestinais de larvas tratadas com Bsp
são danos nas microvilosidades, intumescimento das cristas mitocondriais, fragmentação do
retículo endoplasmático e vacuolização citoplasmática (CHARLES et al., 1987; SINGH; GIL,
1988; SILVA-FILHA; PEIXOTO, 2003, de MELO et al., 2008). Demonstrou-se que o
componente BinA da toxina é capaz de formar poros em membranas fosfolipídicas artificiais
(SCHWARTZ et al., 2001). O componente BinB também pode, em menor extensão,
promover as alterações, embora o seu principal papel seja o reconhecimento e interação com
os receptores do microvili (NICOLAS et al., 1993).
A especificidade da ação do Bsp é determinada pela ligação da toxina Bin a uma
classe de receptores específicos presentes na membrana apical do epitélio intestinal de larvas
de espécies susceptíveis dos gêneros Culex e Anopheles (NIELSEN-LEROUX e CHARLES,
1992; SILVA-FILHA et al., 1997). Foi demonstrado que a toxina Bin se liga de forma
específica a receptores presentes no microvilli intestinal de larvas de C. pipiens, C.
quinquefasciatus, An. stephensi e An. gambiae (NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992;
SILVA-FILHA et al., 1997, 2004). Em Ae. aegypti, espécie naturalmente refratária ao Bsp,
não foi possível detectar uma ligação significativa da toxina às preparações de BBMF
(NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992). O padrão de ligação da toxina Bin aos receptores
presentes em larvas de Culex ocorre de forma regionalizada no ceco gástrico e intestino
posterior, ocorre de forma mais disseminada em Anopheles, e é praticamente nula em Ae.
aegypti (NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992). Estudos de ligação da toxina Bin ao
microvili intestinal de larvas demonstram que a afinidade de ligação da toxina aos receptores
e a concentração destes no microvili está diretamente relacionada à susceptibilidade in vivo
das larvas (SILVA-FILHA et al., 1997). Assim, em espécies do complexo Culex, que são
altamente susceptíveis, a ligação é de alta afinidade e a concentração de receptores é elevada.
Lígia M. Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 31
Enquanto isso, em espécies menos susceptíveis como algumas espécies de Anopheles a
afinidade de ligação é inferior.
2.5.3 Receptor da toxina Bin em culicídeos
O receptor da toxina Bin em C. quinquefasciatus e C. pipiens, é uma α-glicosidase
(E.C. 3.2.1.20) de 60 kDa, ligada à membrana apical do epitélio intestinal através de uma
molécula de glicosil-fosfatidilinositol (GPI) (SILVA-FILHA et al., 1999; DARBOUX et al.,
2001; PAUCHET et al., 2005; ROMÃO et al., 2006). As α-glicosidases desempenham um
importante papel fisiológico na digestão de carboidratos e são produzidas como proteínas de
membrana ou solúveis no intestino dos insetos (CARNEIRO et al., 2004; ERTHAL; SILVA;
SAMUELS, 2007; SOUZA-NETO, et al., 2007). São responsáveis pela hidrólise de ligações
α-1-4 entre resíduos de glicose, principalmente em dissacarídeos e oligossacarídeos,
importantes componentes da dieta de insetos, e possuem atividade ótima em uma faixa de pH
entre 5,0 e 6,5 (TERRA; FERREIRA, 1994; KRAZIKOV; KARELOV; FIRSOV, 2001).
As α-glicosidases de Culex identificadas como receptores da toxina Bin foram
denominadas “C. pipiens maltase” 1 (Cpm1) e “C. quinquefasciatus maltase” 1 (Cqm1),
devido à sua homologia com as moléculas desta família de enzimas depositadas no banco de
dados de proteínas (SILVA-FILHA et al., 1999). A sequência protéica deduzida dos
receptores Cqm1 e Cpm1 apresenta 580 aminoácidos e, a partir da comparação com outras
seqüências depositadas no banco de dados de proteínas, podem ser encontradas maltases
ortólogas com alta homologia. As seqüências de proteínas ortólogas de C. pipiens (Cpm1-
Culex pipiens maltase 1) (AF222024), de Ae. aegypti (Aam1) (XP_001660909) e de An.
gambiae (Agm3) (EAA14808) apresentaram similaridades de 98, 80 e 78, respectivamente
(Fig. 5) (ROMÃO et al., 2006). Recentemente demonstrou-se que uma proteína Agm3
recombinante de An. gambiae é capaz de ligar-se à toxina Bin in vitro (OPOTA et al., 2008).
A seqüência completa do gene cqm1, obtida de C. quinquefasciatus, é composta de 1870
nucleotídeos, uma região codificante de 1743 pb, um primeiro íntron de 50 pb e um segundo
que pode variar de 55 a 57 pb, e está disponível no GenBank sob o número de acesso
DQ333335 (ROMÃO et al., 2006; CHALEGRE, 2008).
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 32
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Figura 5. Alinhamento múltiplo no programa Clustal W da sequência de aminoácidos do receptor da toxina Bin do Bacillus sphaericus em Culex
quinquefasciatus com sequências de proteínas ortólogas de outros dípteros. Estas sequências são de Culex pipiens (Cpm1), Aedes aegypti (Aam1)
e Anopheles gambiae (Agm3). Os aminoácidos idênticos estão marcados em preto e os similares estão mostrados em cinza. Quando necessário
foram inseridos gaps para permitir um melhor alinhamento.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti...
33
2.5.4 Resistência de Culex à toxina Bin
O estudo da resistência de Culex ao Bsp mostrou que a falha na ligação da toxina ao
microvili intestinal das larvas é o principal mecanismo envolvido, reforçando a importância
desta etapa no modo de ação do biolarvicida (NIELSEN-LEROUX et al., 2002; OLIVEIRA et
al., 2004). Quatro alelos dos genes cpm1 e cqm1 que conferem resistência ao Bsp, descritos
em estudos prévios, levam à produção de receptores não funcionais. Três destes alelos levam
à produção de proteínas truncadas e desprovidas de âncora GPI e, portanto, incapazes de
interagir com a toxina por não estarem disponíveis no epitélio intestinal (DARBOUX et al.,
2002, 2007; ROMÃO et al., 2006). Um quarto alelo codifica uma proteína ligada à membrana
por uma âncora GPI, no entanto, esta é incapaz de ligar-se à toxina, possivelmente devido a
alterações no sítio de ligação à toxina ou modificações na estrutura protéica (DARBOUX et
al., 2007). A caracterização destes alelos de resistência demonstrou que algumas mutações
podem levar à produção de proteínas que não possuem habilidade de ligar-se à toxina Bin. É
possível que a refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp possa estar relacionada à diferença na
seqüência primária de aminoácidos da proteína Aam1 ou diferenças estruturais da proteína,
visto que não ocorre ligação da toxina ao epitélio intestinal das larvas deste inseto.
2.5.5 α-glicosidases ortólogas ao receptor Cqm1 em Aedes aegypti
A análise de sequências no GenBank mostrou que um gene com alta homologia àquele
que codifica o receptor da toxina Bin em C. pipiens, C. quinquefasciatus e An. gambiae está
presente em Ae. aegypti (ROMÃO et al., 2006). A identidade de 80% entre as seqüências das
moléculas Aam1 e Cqm1 é elevada e motivou a investigação dos mecanismos moleculares
que determinam a refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp. Além do gene aam1 também foram
detectados outros genes (XP_001656785; XP_001649784), com similaridades de 67 e 76% ao
gene cqm1, respectivamente, e que codificam maltases parálogas em Ae. aegypti.
Considerando o potencial da proteína Aam1 interagir com a toxina Bin, a ausência de ligação
da toxina Bin ao microvili intestinal de Ae. aegypti pode resultar da ausência de expressão do
gene aam1 nos insetos, da expressão desse gene em outra fase do desenvolvimento, da
expressão em níveis indetectáveis pelos métodos utilizados, da produção de uma proteína
desprovida de âncora GPI e, portanto, expressa sob a forma solúvel, ou ainda de diferenças
estruturais nas proteínas que sejam críticas para o seu reconhecimento e ligação com a toxina
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti...
34
Bin. Uma segunda possibilidade é que a proteína Aam1 seja expressa nas larvas de Ae.
aegypti, porém não possua a capacidade de interagir com a toxina Bin, devido a diferenças na
sequência primária de aminoácidos ou de alterações na conformação da proteína Aam1 que
impeçam a interação.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 35
3 JUSTIFICATIVA
O Aedes aegypti é o principal vetor do vírus da dengue, doença de grande relevância
para a saúde pública que se tornou alvo de várias campanhas de controle no país. Além disso,
essa espécie pode ser um importante vetor do vírus da febre amarela no ciclo urbano da
doença. Devido às dificuldades enfrentadas no controle de vetores, a implementação de
métodos de controle biológico é de grande importância para minimizar os problemas gerados
pelo uso de inseticidas químicos. O Bsp é um importante componente de formulações
comerciais de biolarvicidas e, embora as larvas de Ae. aegypti sejam refratárias à toxina Bin,
dados prévios da nossa equipe demonstram que esta espécie possui um gene que codifica uma
molécula (Aam1) ortóloga ao receptor Cqm1 de C. quinquefasciatus. Este achado demonstra
que a análise comparativa das α-glicosidases Aam1 e Cqm1 de Ae. aegypti e C.
quinquefasciatus, espécies refratária e susceptível, respectivamente, constituem um modelo
ímpar para a compreensão do modo de ação da toxina Bin, e os conhecimentos obtidos
poderão dar subsídios para o desenvolvimento de estratégias moleculares para o
aperfeiçoamento da toxina Bin.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 36
4 PERGUNTA CONDUTORA
Qual a base molecular do mecanismo que determina o status de refratariedade do
Aedes aegypti ao biolarvicida Bacillus sphaericus?
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 37
5 HIPÓTESE
A ausência de transcrição do gene aam1 ou da expressão da proteína Aam1 na fase
larvar, bem como a expressão de uma proteína contendo diferenças críticas em relação à
proteína Cqm1, podem determinar a refratariedade do Aedes aegypti ao Bacillus sphaericus.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 38
6 OBJETIVOS
6.1 Objetivo geral
Identificar os fatores que determinam a refratariedade das larvas de Aedes aegypti ao
Bacillus sphaericus, a fim de gerar conhecimentos para a compreensão do modo de ação deste
biolarvicida.
6.2 Objetivos específicos
Avaliar a expressão da proteína Aam1 nas fases de larva e adulto de Ae.
aegypti, em relação à expressão da proteína Cqm1 de C. quinquefasciatus.
Comparar o perfil de α-glicosidases expressas em larvas e adultos de Ae.
aegypti e C. quinquefasciatus.
Avaliar se proteínas nativas do microvili intestinal de Ae. aegypti têm a
capacidade de ligar-se à toxina Bin.
Produzir proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes e avaliar a sua capacidade de
ligação à toxina Bin.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 39
7 MATERIAL E MÉTODOS
7.1 Procedimentos experimentais
Na primeira etapa dos procedimentos, larvas e adultos de Aedes aegypti e Culex
quinquefasciatus foram utilizados na preparação de amostras protéicas e estas foram
submetidas à imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1 e à avaliação do perfil de α-
glicosidases. Em um segundo momento, os genes aam1 e cqm1 foram clonados e a expressão
das respectivas proteínas recombinantes foi feita em células de Escherichia coli e em um
lisado de reticulócitos de coelho. As proteínas nativas e recombinantes foram submetidas a
ensaios de funcionalidade para verificar a sua capacidade de interação com a toxina Bin (Fig.
6).
Figura 6. Principais etapas dos procedimentos experimentais para a avaliação da
α
-glicosidase Aam1 de
Aedes aegypti
sob as formas nativa e recombinante.
Aam1 nativa Aam1 recombinante
Larvas e adultos
Proteínas
recombinantes
Funcionalidade
RNA de larvas
Extrato total e Frações
de microvili intestinal
Perfil de
α-glicosidases
Imunodetecção
RT-PCR e
Clonagem
Expressão em
reticulócitos
Expressão em
E. coli
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 40
7.2 Colônias de insetos
Foram utilizadas amostras de larvas e adultos de Ae. aegypti e C. quinquefasciatus, das
colônias RecL e CqSF, respectivamente, mantidas no insetário do Departamento de
Entomologia do CPqAM, sob as seguintes condições: temperatura de 26 ± 1 °C, umidade
relativa de 70% e fotoperíodo de 12:12h (claro:escuro). As larvas foram mantidas em água
declorada e alimentadas com ração para gatos. Os adultos foram alimentados com solução de
sacarose a 10% e as fêmeas também fizeram o repasto sanguíneo em aves (Gallus gallus). As
amostras de larvas de An. gambiae da linhagem G3 utilizadas neste estudo são provenientes
do Centro de Produção e Infecção de Anofelinos (CEPIA) do Instituto Pasteur (Paris), e foram
gentilmente cedidos pela Dra. Cathérine Bourgouin e Dra. Isabelle Thiery.
7.3 Análise da expressão da proteína Aam1 nativa
A finalidade desta etapa foi investigar a expressão da proteína Aam1 em amostras de
Ae. aegypti, utilizando a proteína Cqm1 de C. quinquefasciatus como padrão. Diferentes
amostras biológicas foram utilizadas para avaliação da expressão destas proteínas através de
imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1 e do perfil de α-glicosidases in gel.
7.3.1 Preparação de proteínas nativas
Para a análise das proteínas nativas foram obtidas amostras de complexidade biológica
decrescente, a saber, extrato total de proteínas de larvas e adultos, preparações ricas em
microvili intestinal de larvas (BBMF) e preparações de proteínas de BBMF solubilizadas
(extrato-CHAPS).
7.3.1.1 Extrato total de larvas e adultos
Para a obtenção do extrato total de proteínas, larvas do 1º ao 4º estádio e adultos de
Ae. aegypti e C. quinquefasciatus foram macerados em 10 µl de tampão PBS/Azida
(NaH
2
PO
4
2,1 mM, Na
2
HPO
4
14 mM, NaCl 150 mM, NaN
3
0,02%, pH 7,4), contendo 10
mM de fluoreto de fenilmetanilsulfonil (PMSF, Sigma) como inibidor de proteases. As
amostras foram centrifugadas a 1.500 g, durante 2 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 41
coletado e utilizado imediatamente nos ensaios de imunodetecção e atividade enzimática. A
concentração de proteínas das amostras foi mensurada segundo o método de Bradford,
utilizando uma curva de albumina sérica bovina (BSA) como padrão (BRADFORD, 1976).
7.3.1.2 Frações ricas em microvili intestinal (BBMF) de larvas
As preparações de BBMF foram obtidas a partir de larvas do 4º estádio de Ae. aegypti,
An. gambiae e C. quinquefasciatus armazenadas a – 80 ºC, segundo Silva-Filha et al. (1997).
Esta técnica baseia-se no isolamento de membranas apicais através da precipitação seletiva
das frações intestinais utilizando cátions divalentes (Mg
++
), seguida de centrifugação
diferencial. A dosagem de proteínas foi realizada de acordo com o item anterior e a qualidade
das amostras de BBMF foi avaliada através da determinação do enriquecimento da enzima α-
glicosidase (E.C. 3.2.1.20), comparando amostras de 10 µg de proteínas do extrato total de
larvas, obtido no início do processo, com amostras da fração de microvilosidades, obtida ao
final da preparação. As amostras foram incubadas em um volume final de 1 ml do tampão
citrato de sódio-fosfato 100 mM, pH 6,5, contendo 2 mM do substrato p-nitrofenil-α-D-
glicopiranosídeo (Sigma) a 37 ºC, durante 30 minutos. A atividade α-glicosidase das
preparações foi avaliada através da variação da absorbância a 405 nm, registrada em
espectrofotômetro.
7.3.1.3 Frações de proteínas de BBMF solubilizadas (extratos-CHAPS)
Nesta etapa, foram obtidas frações de proteínas do microvili intestinal das larvas,
solubilizadas com detergente CHAPS, segundo Silva-Filha et al. (1999). As amostras de
BBMF foram centrifugadas a 100.000 g, a 4 ºC, durante 14 minutos e o sedimento foi
incubado com o tampão TBSEA (Tris 19 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5)
contendo o detergente CHAPS na concentração final de 1%, sob agitação lenta, durante 1
hora a 4 ºC. Após a solubilização as preparações foram centrifugadas a 100.000 g, 4 ºC,
durante 14 minutos. O sobrenadante (extrato-CHAPS) foi coletado e armazenado a – 70 ºC
até a sua utilização. A dosagem de proteínas para avaliar o rendimento da solubilização dos
extratos e a atividade α-glicosidase, para mostrar o enriquecimento das preparações em
proteínas de membranas apicais, antes e após a solubilização, foi feita conforme descrito no
item 7.3.1.2.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 42
7.3.2 Ensaios de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1
O objetivo desta etapa foi demonstrar, através de imunodetecção com o anticorpo anti-
Cqm1, se as proteínas Aam1 e Agm3 são expressas em Ae. aegypti e An. gambiae,
respectivamente, seja no extrato de proteínas totais do insetos, seja em preparações de BBMF.
As amostras foram submetidas à separação eletroforética SDS-PAGE a 10% e as proteínas do
gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose do tipo ECL
(GE Healthcare)
que foi submetida à imunodetecção (Western-blot). A membrana foi bloqueada com leite
desnatado a 5% em tampão TBS-T (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0,2%, pH
7,4) por 1 h à temperatura ambiente (TA) e, em seguida, foi incubada com o anticorpo
primário anti-Cqm1 (1:100) produzido em coelhos, durante 16 h a 4 ºC, seguido de uma
incubação com um anticorpo anti IgG de coelho (1:10.000) conjugado à peroxidase
(Amersham). Entre cada uma das incubações foram realizadas lavagens da membrana como o
tampão TBS-T e a imunodetecção foi realizada por quimioluminescência, utilizando o sistema
ECL (GE Healthcare). O anticorpo anti-Cqm1 reconhece de forma específica o receptor
Cqm1 em extratos totais e microvili intestinal de larvas de C. quinquefasciatus (ROMÃO et
al., 2006). Ensaios preliminares demonstraram que este anticorpo é capaz de reconhecer
maltases ortólogas de outros dípteros. O anticorpo policlonal foi produzido no Laboratório de
Entomologia do CPqAM e submetido ao procedimento de imunoadsorção (MINSHAL;
STANDARD, 2004), com a finalidade de melhorar a capacidade de reconhecimento
específico.
7.3.3 Perfil de α-glicosidases em gel
Os ensaios de atividade enzimática em gel permitem a visualização do perfil α-
glicosidases produzidas nas fases pré-imaginal e adulta dos insetos. O perfil de C.
quinquefasciatus, previamente descrito em Romão et al. (2006), apresenta quatro bandas
catalíticas reprodutíveis, dentre elas, a α-glicosidase Cqm1, que migra com peso molecular
aparente de 83 kDa, sob condições semi-desnaturantes. A partir dessa análise, foi possível
estabelecer um padrão comparativo das amostras de Ae. aegypti e An. gambiae e C.
quinquefasciatus. Nesses ensaios foram utilizadas amostras de extrato total e BBMF
solubilizadas em tampão de Laemmli 2X (LAEMMLI, 1970) sem o agente redutor 2-
mercaptoetanol e sem aquecimento. As amostras protéicas (15 µg) foram submetidas a SDS-
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 43
PAGE 8% a 4 ºC e, após a migração eletroforética, o gel foi equilibrado três vezes em uma
solução aquosa de Triton X-100 a 2,5 % por 10 minutos, à TA. Em seguida, o gel foi
incubado em tampão citrato de sódio-fostato 100 mM pH 6,5 contendo 2 mM do substrato 4-
metilumbeliferil α-D-glicosídeo (SIGMA), por 20 minutos a uma temperatura de 37 ºC, sob
agitação leve. A visualização do perfil de bandas catalíticas das
α-glicosidases foi feita em
transiluminador de luz ultravioleta (UV).
7.4 Clonagem e expressão das maltases Aam1 e Cqm1
As proteínas Aam1 e Cqm1 foram produzidas sob a forma recombinante para
investigar a sua capacidade de ligação à toxina Bin. Para tal, os genes aam1e cqm1 foram
amplificados e clonados em vetores plasmidiais de expressão. Os clones obtidos foram
submetidos, quando necessário, a reações de mutagênese sítio-dirigida na sua sequência para
otimização do nível de expressão protéica. As proteínas recombinantes Aam1 e Cqm1 foram
produzidas através de dois sistemas: um procarioto, utilizando células de E. coli, e outro
eucarioto, que utiliza reticulócitos de coelho para a tradução protéica.
7.4.1 Extração de RNA, RT-PCR e PCR do gene aam1
Para a obtenção do RNA necessário à produção do cDNA do gene aam1 foi utilizado
um pool de 40 larvas ou adultos de Ae. aegypti e a extração do RNA total foi realizada
segundo Romão et al. (2006). O RNA total obtido foi purificado com fenol-clorofórmio e
quantificado por espectrofotometria a 260 e 280 nm. As reações de transcrição reversa (RT-
PCR), para a obtenção do cDNA, foram realizadas utilizando o primer oligo DT
20
(Invitrogen), que possui a capacidade de anelar à cauda poli-A de todos os mRNAs expressos
presentes na amostra de RNA total extraído. Para cada reação foram utilizados 13 µg do RNA
total obtido, 7,5 U de transcriptase reversa AMV (GIBCO) e 2 µM do primer Oligo DT
20
,
além de cada um dos rNTPs, durante 1 h a 37 ºC, segundo informações do fabricante.
A partir do cDNA obtido na etapa anterior, as reações de PCR foram realizadas
segundo Romão et al. (2006), utilizando primers específicos (F:
GCACTGCAGAGTTCGGCTGACGAGATG/R:GAAAAGCTTCTACACTAAGAAATACT
T) para o gene aam1 (NENE et al. 2007) disponível no GenBank. As amostras foram
amplificadas em um termociclador BIOMETRA
®
programado para as seguintes condições:
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 44
uma etapa de desnaturação a 94 ºC por 3 min, seguida de 35 ciclos a 94 ºC por 50 seg, 55 ºC
por 50 seg, 72 ºC por 120 seg e uma etapa final de 72 ºC por 10 min. As amostras
amplificadas foram analisadas em eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE (Tris
89 mM; ácido bórico 8,9 mM; EDTA 2 mM) 0.5X, corado com brometo de etídeo e
visualizado em um transiluminador de luz UV.
7.4.2 Clonagem e sequenciamento do gene aam1
Os produtos de amplificação do gene aam1, obtidos nas reações de PCR foram
purificados com o kit GFX DNA and Gel Band Purification
® (GE Healthcare)
. Em seguida,
os fragmentos foram inseridos no vetor plasmidial pGEM
®
-T Easy (Promega), segundo
instruções do fabricante. Os plasmídeos recombinantes obtidos foram utilizados na
transformação de células de E. coli cepa DH10B eletrocompetentes, segundo o instruções do
fabricante. Após o crescimento bacteriano, foram feitas preparações de DNA plasmidial pelo
método de lise alcalina, de acordo com Ausbel (1992), para a obtenção dos clones de
interesse. As preparações de DNA plasmidial foram digeridas com as endonucleases de
restrição Pst I e Hind III a 37 ºC e os fragmentos liberados foram purificados e subclonados
nos vetores plasmidiais de expressão pRSETc
® (
Novagem) e
pGEM3zf+® (Promega), para a
expressão protéica em E. coli ou por transcrição e tradução em lisado de reticulócitos de
coelho, respectivamente
. Os plasmídeos contendo o fragmento dos genes aam1 e cqm1 foram
enviados para sequenciamento automático no ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied
Biosytems) do Núcleo de Plataformas Tecnológicas (NPT) do CPqAM. Os “contigs” foram
montados no programa SeqMan (DNAStar), a partir dos eletroferogramas obtidos nas reações
de sequenciamento e as sequências foram editadas no programa EditSeq (DNAStar). A
identidade dos fragmentos foi confirmada pela comparação das seqüências obtidas com
aquelas disponíveis no GenBank, através da ferramenta BLASTp do NCBI
(
www.ncbi.nlm.nih.gov). As construções plasmidiais contendo o gene cqm1 utilizadas neste
estudo, foram obtidas previamente pela equipe, no âmbito do projeto.
7.4.3 Expressão e purificação de proteínas em Escherichia coli
O plasmídeo pRSETc contendo os genes aam1 ou cqm1 foi utilizado para a
transformação de células competentes de E. coli cepa BL21 star, a fim de obter a expressão
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 45
das respectivas proteínas. Após a transformação as células foram plaqueadas em meio de
cultura Luria-Bertani (LB) suplementado com ampicilina (100 µg/ml). Uma colônia da placa
foi selecionada para a sua propagação em meio LB líquido e a expressão das proteínas foi
induzida pela adição de isopropiltiogalactosídeo (IPTG), segundo Romão et al. (2006).
Alíquotas da cultura, antes e após a indução com o IPTG, foram centrifugadas a 5.000 g por
10 min a 4° C e o sedimento foi solubilizado em tampão de Laemmli 2X (LAEMMLI, 1970).
Para a avaliação da expressão das proteínas, as amostras foram submetidas à eletroforese em
SDS-PAGE a 10% e o gel foi corado com azul de Coomassie.
Para a obtenção das proteínas recombinantes sob a forma solúvel e posterior utilização
em ensaios de ligação, o sedimento obtido das culturas contendo as células foi dissolvido em
tampão PBS (NaH
2
PO
4
2.1 mM, Na
2
HPO
4
14 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4), e as células
foram lisadas em um sonicador (Ultrasonic Homogenizer – Cole Parmer) com 6 pulsos de 30
s e um intervalo de 1 minuto entre os pulsos, com uma amplitude de 50. Após a lise, a
amostra foi acrescida de Triton X-100 a 1% e centrifugada a 5.000 g por 10 min a 4° C. O
sobrenadante obtido foi utilizado na purificação protéica, através de cromatografia de
afinidade, utilizando a resina de agarose Ni-NTA (Qiagen), que possui afinidade pela cauda
de poli-histidinas presentes na extremidade N-terminal das proteínas recombinantes. A
eluição da proteína recombinante ligada à resina foi feita com tampão de lavagem (Na
2
HPO
4
50 mM, NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 6.0) contendo concentrações crescentes de
imidazol (0,02 a 1 M), conforme Romão et al. (2006). Amostras de cada eluato foram
submetidas a SDS-PAGE a 10% para avaliar a qualidade da purificação, conforme descrito
anteriormente. A capacidade de ligação à toxina Bin das proteínas Aam1 e Cqm1 obtidas
nessa etapa foi avaliada através dos ensaios de afinidade descritos no item 7.5.
7.4.4 Mutagênese sítio-dirigida
O procedimento de mutagênese sítio-dirigida foi realizado para promover um aumento
no nível de expressão das proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes produzidas em reticulócitos
de coelho. Foram inseridas mutações na seqüência de Kozak dos genes aam1 e cqm1 para
torná-la mais próxima da seqüência consenso. Esta seqüência está localizada imediatamente
antes do primeiro códon ATG na seqüência do gene e é responsável pelo melhor
reconhecimento do promotor pelo ribossomo durante a tradução. O procedimento foi
realizado de acordo com o protocolo do Kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 46
(Stratagene), segundo instruções do fabricante. Os fragmentos gênicos contidos no vetor
plasmidial pGEM3Zf+, obtidos na etapa anterior, foram submetidos à amplificação com a
enzima Pfu turbo DNA polimerase, utilizando primers de mutagênese específicos para a
região de interesse (aam1F: CTGCAGAGTTCGGCTGCCGCCATGCGGCTGTGTAGTG/
aam1R: CACTACACAGCCGCATGGCGGCAGCCGAACTCTGCAG; cqm1F:
CGACCTGCAGTCTCCGGCCACCATGCGACCGCTGGGAG/ cqm1R:
CTCCCAGCGGTCGCATGGTGGCCGGAGACTGCAGGTCG). Após a amplificação, a
eficácia do procedimento foi avaliada através de análise de seqüências conforme descrito no
item 7.4.2. Os plasmídeos contendo as mutações foram utilizados para a expressão das
proteínas recombinantes mutagenizadas por transcrição e tradução in vitro em lisado de
reticulócitos de coelho.
7.4.5 Transcrição e tradução in vitro
A reação de transcrição in vitro para a produção do mRNA das proteínas Aam1 e
Cqm1, foi feita a partir dos respectivos genes contidos no vetor pGEM3Zf+. O DNA
plasmidial foi digerido com a enzima de restrição Hind III e o DNA linear foi utilizado como
molde para a produção do mRNA. A reação foi realizada utilizando a enzima T7 RNA
polimerase (Promega), rNTPs (100 mM), tampão de transcrição e o nucleotídeo 7-
metilguanosina (CAP) (10 mM), que confere maior estabilidade ao mRNA na célula. A
incubação foi feita em um termociclador BIOMETRA
®
durante 90 minutos a 37
°C e os
mRNAs obtidos foram submetidos à extração com fenol-clorofórmio e analisados em
eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio e visualizado em um
transiluminador de luz UV.
Os mRNAs obtidos na etapa anterior foram utilizados no procedimento de tradução in
vitro, em um sistema que utiliza um lisado de reticulócitos de coelho (Rabbit Reticulocyte
Lysate
®
, Promega), na presença de todos os aminoácidos, exceto a metionina, T7 RNA
polimerase e metionina marcada com
35
S que permite a detecção das proteínas traduzidas por
autoradiografia. Foram utilizados nas reações 2,5 µl do lisado de reticulócitos (concentração
de 50%), 2 µl de metionina marcada com
35
S, 2 µl de um pool aminoácidos livre de
metionina e 10 µl do mRNA diluído 1:10 em água tratada com dimetil pirocarbonato (DEPC).
A reação foi conduzida em um termociclador BIOMETRA
®
a uma temperatura de 30 °C,
durante 90 minutos. Após a tradução, uma alíquota de 5 µl de cada amostra foi acrescida de
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 47
tampão de amostra de Laemmli 2X (LAEMMLI, 1970) e submetida a eletroforese SDS-
PAGE a 10%. Após a migração, o gel foi corado com azul de Comassie e submetido a um
processo de secagem a 65 °C durante uma hora. Para a visualização das proteínas, um filme
autoradiográfico Hiperfilm (Amershan) foi exposto ao gel durante 12 h à TA e, em seguida,
revelado para a detecção das proteínas-
35
S.
7.5 Ensaios de ligação com a toxina Bin
A finalidade desta etapa foi investigar se as proteínas Aam1 e Cqm1 nativas presentes
em extratos-CHAPS, ou as respectivas proteínas recombinantes, têm capacidade de ligar-se à
toxina Bin. Os ensaios consistem na incubação das proteínas em questão com a toxina Bin ou
a subunidade BinB da toxina, imobilizadas em um suporte sólido e em seguida as amostras
são submetidas à imunodetecção. Dois sistemas de ensaios de afinidade foram usados para
avaliar a interação, conforme descrito a seguir.
7.5.1. Ensaios de afinidade
Os ensaios de afinidade possuem a finalidade de avaliar a capacidade de ligação
específica das proteínas nativas ou recombinantes à toxina Bin, imobilizada covalentemente
em microesferas CNBr-activated Sepharose
TM
4B (Amersham). A toxina Bin utilizada nestes
ensaios é recombinante e foi produzida em culturas de B. thuringiensis cepa 4Q-82
transformada com o plamídeo pGSP10, contendo o gene que codifica a toxina Bin. A toxina
foi produzida sob a forma ativa e armazenada a 4 °C, segundo Nielsen-LeRoux e Charles
(1992). Os ensaios de afinidade foram conduzidos segundo Silva-Filha et al. (1999), a partir
da incubação entre a toxina Bin imobilizada sobre a resina de sefarose, esferas-Bin (30 µl), e
os extratos-CHAPS (20 µg de proteínas) ou as proteínas recombinantes (5 µg), em um volume
final de 100 µl em tampão PBS/Azida 0,02%, pH 7,4, durante 2 h à TA. As incubações foram
feitas na ausência ou na presença de um excesso de toxina Bin livre (40 µg), utilizada como
competidor. Após a incubação, as esferas-Bin foram recuperadas por centrifugação a 20.000
g, 4 ºC, por 15 minutos, solubilizadas em tampão de Laemmli 2X (LAEMMLI, 1970) e
submetidas a SDS-PAGE 10%. As proteínas do gel foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose, que foi submetida à imunodetecção, conforme descrito no item 7.3.2.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 48
7.5.2 Ensaios de pull-down
Os ensaios de afinidade do tipo “pull-down” possuem a finalidade de avaliar a
capacidade de ligação específica das proteínas nativas ou recombinantes à subunidade BinB
imobilizada em resina glutationa sefarose 4B
®
(GS) (Amersham), e foram realizados segundo
Dhalia et al. (2005). A subunidade BinB recombinante foi produzida fusionada a uma cauda
de glutationa S-transferase, em células de E. coli, conforme o item 7.4.4, para posterior
imobilização na resina GS. Para a realização do ensaio, 10 µl datoxina BinB imobilizada
sobre a resina GS (Bin-GS) foi incubada com os extratos-CHAPS (20 µg de proteínas) ou
com as proteínas recombinantes (5 µg) a 4 ºC, durante 2 h, sob agitação, em um volume final
de 200 µl de tampão BB3 (KCl 100 mM, MgCl
2
1 mM, HEPES 50 mM, NP40 0,2%, glicerol
5%). Para avaliar a especificidade da ligação, os extratos-CHAPS ou as proteínas
recombinantes foram incubados com a proteína glutationa S-tranferase (GST), imobilizada
sobre a resina (GS-GST). Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 1.500 g,
durante 2 min a 4 ºC. O sedimento de resina obtido foi solubilizado com tampão de Laemmli
2X (LAEMMLI, 1970) e as amostras foram submetidas a SDS-PAGE 10%. As proteínas do
gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, que foi submetida à
imunodetecção, conforme descrito no item 7.3.2. As proteínas recombinantes LmEIF4A1 e
LmEIFG3 oriundas de Leismania, cedidas pelo Departamento de Microbiologia do CPqAM,
foram utilizadas como controles nos ensaios, de acordo com as necessidades experimentais
(DHALIA, et al., 2005). Nesse controle positivo, a proteína LmEIF4A1 foi imobilizada sobre
a resina e incubada com a proteína LmEIFG3, pela qual possui afinidade específica.
7.6 Influência da conformação protéica na capacidade de ligação à toxina Bin
O objetivo desta etapa foi avaliar se o tratamento das proteínas nativas com
aquecimento e adição do agente redutor β-mercaptoetanol poderiam afetar a estrutura protéica
e influenciar na ligação à toxina Bin. Os extratos-CHAPS obtidos na etapa 7.3.1.3 foram
submetidos ao tratamento desnaturante utilizando aquecimento a 100 ºC e adição de β-
mercaptoetanol, além de variações de temperatura. As amostras foram submetidas aos
seguintes tratamentos: aquecimento de 45, 65 e 100 ºC durante cinco minutos ou tratamento
com tampão de Laemmli 2X e aquecimento a 100 ºC. Após o tratamento as amostras foram
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 49
avaliadas quanto à capacidade de ligação à toxina Bin através dos ensaios de pull down
conforme descrito no item 7.5.2.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 50
8 RESULTADOS
8.1 Avaliação de proteínas nativas
Na primeira etapa do trabalho a expressão das proteínas Aam1 e Cqm1 nativas, em
extrato total de larvas e adultos e amostras de BBMF de Ae. aegypti e C. quinquefasciatus, foi
analisada através de imunodetecção com anticorpo anti Cqm1 e do perfil de α-glicosidases
nas amostras. Em seguida, foi feita a avaliação da capacidade de interação das proteínas de
BBMF com a toxina Bin, através de ensaios de afinidade.
8.1.1 Imunodetecção de proteínas com anticorpo anti-Cqm1
A avaliação da expressão da proteína Aam1 em Ae. aegypti foi feita através de
imunodetecção com o anticorpo anti Cqm1 em extratos totais de larvas e adultos. Foi possível
observar uma banda de cerca de 70 kDa, que é expressa em todos os estádios larvais (Fig. 7A,
seta longa), bem como em adultos, embora a sua intensidade nestas amostras tenha sido
reduzida (Fig. 7A, seta curta). Em amostras de C. quinquefasciatus, utilizadas como
referência, foi observada uma banda com cerca de 60 kDa em todos os estádios larvais que
seria possivelmente correspondente ao receptor Cqm1 (Fig. 7B, seta longa). Em adultos foi
possível visualizar uma banda similar, mas com tamanho discretamente superior a 60 kDa
(Fig. 7B, seta curta). Devido à complexidade de proteínas presentes em extratos totais, o
anticorpo anti-Cqm1, embora imunoadsorvido, apresentou um padrão de reconhecimento
inespecífico de outras proteínas ou de formas degradadas das proteínas sob estudo. Os dados
indicam que as maltases Aam1 e Cqm1 são expressas em todas as fases do ciclo de vida de
Ae. aegypti e C. quinquefasciatus, respectivamente.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 51
A detecção imunológica das α-glicosidases presentes em preparações de BBMF de Ae.
aegypti mostrou a expressão de uma molécula semelhante ao receptor Cqm1 no microvili
intestinal de larvas, com alta especificidade (Fig. 8A, Ae). Esta molécula apresenta massa
molecular discretamente superior e é expressa com maior intensidade que a molécula Cqm1
detectada em amostras de BBMF de Culex (Fig. 8A). Em amostras de An. gambiae o
anticorpo anti-Cqm1 também reconheceu uma molécula de massa molecular similar porém,
em comparação com amostras de C. quinquefasciatus ou de Ae. aegypti, a sua expressão foi
reduzida, em vista da concentração de proteínas necessária para a sua detecção (25 µg) (Fig.
8B, Ag). Os dados obtidos nesta análise pelo anticorpo anti-Cqm1 revela que a maltase
ortóloga ao receptor Cqm1 de Culex é expressa no microvili intestinal das larvas de Ae.
aegypti em quantidade equivalente à observada em Culex, enquanto que em An. gambiae, que
é uma espécie suscetível ao Bsp, a intensidade da molécula reconhecida pelo antiCqm1 foi
menor. A imunodetecção também confirma que a proteína detectada em BBMF Ae. aegypti
possui um peso molecular superior à α-glicosidase Cqm1, e corrobora os dados obtidos em
amostras de extratos totais.
Figura 7. Perfil de imunodetecção de
α
-glicosidases em extratos totais de larvas e adultos de Aedes aegypti
(A) e Culex quinquefasciatus (B) com anticorpo anti-Cqm1. L1, L2, L3 e L4. Quatro estádios larvais. M.
Adulto macho. F. Adulto fêmea. Cq. Extrato total adulto de Culex quinquefasciatus. PM. Peso molecular em
kDa.
B
60
L1 L2 L3 L4 M F
40
50
70
80
PM
A
60
L1 L2 L3 L4 M F Cq
80
70
50
60
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 52
8.1.2 Perfil de α-glicosidases
Os ensaios enzimáticos em gel apresentam o perfil de α-glicosidases expressas durante
o desenvolvimento dos insetos. Dados prévios mostraram que o perfil de larvas de quarto
estádio de C. quinquefasciatus é composto por quatro bandas de clivagem e a α-glicosidase
Cqm1 migra com tamanho aparente de 83 kDa, em eletroforese sob condições semi-
desnaturantes (ROMÃO et al., 2006). Os resultados obtidos neste estudo revelaram que o
padrão de α-glicosidases é similar em amostras dos quatro estádios larvais de C.
quinquefasciatus (Fig. 9A, seta). Para os adultos o perfil também é composto por quatro
bandas catalíticas, no entanto, o padrão de migração difere daquele observado nas amostras de
larvas (Fig. 9A, M e F). Por outro lado, o perfil em extratos totais de larvas de Ae. aegypti é
composto por duas bandas catalíticas, uma delas com tamanho semelhante ao receptor Cqm1
(Fig. 9B, seta). Na análise de adultos de Ae. aegypti, verificou-se que o padrão difere daquele
observado nas larvas e, apesar de possuir intensidade reduzida, foram visualizadas três e duas
bandas para machos e fêmeas, respectivamente (Fig. 9B, M e F).
Figura 8. Imunodetecção de proteínas do microvili intestinal de larvas com o anticorpo anti-Cqm1. A. Curva
decrescente de amostras de proteínas (20 - 2,5 µg) de Culex quinquefasciatus (Cq) e Aedes aegypti (Ae). B.
Amostras de proteínas de C. quinquefasciatus (Cq, 2,5 µg) e Anopheles gambiae (Ag, 25 µg). PM. Peso
molecular em kDa.
Cq Ag
62
47,5
83
175
B A
20 10 5 2,5
20 10 5 2,5
Cq
Ae
82
64
49
PM
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 53
O perfil de α-glicosidases em amostras de BBMF foi mais elucidativo e, em Ae.
aegypti, foram detectadas quatro bandas catalíticas, diferente do observado em extrato total de
larvas, e uma delas apresenta tamanho semelhante à proteína Cqm1 de Culex (Fig. 10A,
painel à esquerda, seta). Após a detecção enzimática, o gel foi submetido à detecção
imunológica e verificou-se que a α-glicosidase presente em BBMF de Ae. aegypti, que possui
peso molecular discretamente inferior à Cqm1, é reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1 (Fig.
10A, painel à direita, seta). Em amostras de BBMF de An. gambiae, uma molécula com
tamanho similar à Cqm1 foi identificada, no entanto, não foi possível confirmar a sua
similaridade com a Cqm1, devido às dificuldades encontradas na imunodetecção desta
molécula (Fig. 10B, seta). Estes resultados demonstram que uma α-glicosidase ortóloga ao
receptor Cqm1, possivelmente a Aam1, é expressa sob a forma de proteína de membrana e
migra com peso molecular discretamente inferior à α-glicosidase Cqm1.
Figura 9. Perfil da atividade
α
-glicosidase em gel em amostras de extrato total de larvas e adultos de Culex
quinquefasciatus (A) e Aedes aegypti (B). L1, L2, L3 e L4. Quatro estádios larvais. M. Adulto macho. F.
Adulto fêmea. PM. Peso molecular em kDa.
M F
L1 L2 L3
L4
B
M F
L1 L2 L3
L4
A
83
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 54
8.1.3 Interação de proteínas nativas com a toxina Bin
A análise precedente revelou que em BBMF de Ae. aegypti há uma proteína
reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1, expressa em quantidade semelhante ao receptor
Cqm1. Esse achado apontou a necessidade de avaliar a capacidade de ligação desta proteína à
toxina Bin através de ensaios de afinidade. Nos ensaios de afinidade observou-se que a
proteína Cqm1 nativa presente nos extratos-CHAPS de Culex ligou-se à toxina Bin
imobilizada em resina de sefarose e foi visualizada uma banda com cerca de 60 kDa, quando a
incubação foi feita na ausência de competidor (Fig. 11A, Cq -). A especificidade da ligação
foi determinada pela ausência de interação em amostras que continham um excesso de toxina
Bin como competidor na incubação (Fig 11A, Cq +). Por outro lado, o extrato-CHAPS
contendo a proteína Aam1 nativa quando incubado na ausência do competidor, não foi capaz
de se ligar à toxina Bin (Fig. 11A, Ae -). Apesar da sua similaridade com a proteína Cqm1 e
abundância nas amostras de BBMF, a proteína Aam1 não tem habilidade de ligar-se à toxina
Bin.
A avaliação foi feita também através de ensaios de afinidade (pull down), nos quais a
subunidade BinB foi imobilizada em resina de glutationa sefarose (GS). Neste ensaio, a
proteína Cqm1 também foi capaz de se ligar à toxina Bin (Fig. 11B, Cq 2) e a ligação foi
específica, pois a banda de 60 kDa não foi observada quando o extrato foi incubado com a
glutationa S-transferase (GST) imobilizada sobre a resina GS, ao invés da subunidade BinB
Figura 10. Perfil da atividade
α
-glicosidase em gel de frações de microvili intestinal de larvas de culicídeos.
A. Amostras de C. quinquefasciatus (Cq) e An. gambiae (Ag) (esquerda). B. Amostras de C. quinquefasciatus
(Cq) e de Aedes aegypti (Ae) (direita). As proteínas do gel B foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose e submetidas á imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1. PM. Peso molecular em kDa.
115
82
64
Cq
Ag
B
PM
115
82
64
Cq
Ae
A
115
82
64
Cq
Ae
PM
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 55
(Fig. 11B, Cq 1). Quando o ensaio de afinidade foi realizado entre o extrato-CHAPS de Ae.
aegypti e a subunidade BinB da toxina, não foi visualizada nenhuma banda correspondente à
interação (Fig. 11B, Ae 2), de forma semelhante ao ensaio anterior.
8.2 Avaliação de proteínas recombinantes
Na segunda etapa do trabalho, as proteínas Aam1 e Cqm1 foram produzidas sob a
forma recombinante em E. coli e em lisado de reticulócitos de coelho, para avaliar a sua
capacidade de ligação à toxina Bin através de ensaios de afinidade.
8.2.1 Clonagem dos genes das α-glicosidases Aam1 e Cqm1
Os dados das etapas anteriores apontaram que, embora presente no microvili intestinal
das larvas de Ae. aegypti, a proteína Aam1 não é capaz de ligar-se à toxina Bin, o que levou à
obtenção de proteínas recombinantes para uma melhor avaliação destas moléculas. Após a
realização das reações de RT-PCR, foi obtido o cDNA do gene aam1 e as reações de PCR a
partir deste levaram à amplificação de um fragmento gênico com tamanho aproximado de
PM
70
60
50
PM
- + - + Ext. Cq
Cq Ae
A
70
60
50
1 2 Ext 1 2 Ext
Cq Ae
B
Figura 11. Ensaio de afinidade entre os extratos de proteínas de microvili intestinal solubilizadas de Culex
quinquefasciatus (Cq) e Aedes aegypti (Ae) e a toxina Bin do Bacillus sphaericus, imobilizada em suporte
sólido, seguido de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1. A. Ensaio entre os extratos e a resina Bin-
sefarose na presença (+) e na ausência (-) da toxina Bin livre, usada como competidor. B. Ensaio entre os
extratos e a resina Bin-GS (pull down). 1. Incubação com glutationa S-transferase. 2. Incubação com o
componente BinB da toxina Bin. Ext. Amostras de10 µg de proteínas de extratos-CHAPS, sem incubação.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 56
1.800 pares de bases (pb) (Fig. 12, aam1). Após a clonagem do fragmento no vetor pGEM
®
T-
easy e digestão dos plasmídeos com as enzimas de restrição utilizadas na clonagem, foi obtido
um fragmento gênico com tamanho correspondente ao fragmento amplificado por PCR (dados
não apresentados). A análise de seqüências confirmou a identidade do fragmento, que se
tratava do gene aam1 de interesse. Nesta etapa também foram desenhados primers para duas
α-glicosidases parálogas à Aam1, presentes em Ae. aegypti. Foi possível detectar a presença
do mRNA que codifica tais α-glicosidases através de reações de RT-PCR, que revelaram que
tais proteínas são expressas somente na fase adulta dos insetos (Fig. 12, P1 e P2). Estas
proteínas possuem expressão estágio-específica, pois não estão presentes nas larvas, ao
contrário do que ocorre com a maltase Aam1, expressa em todas as fases do ciclo de
desenvolvimento (dados não apresentados).
8.2.2 Expressão das proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes em E. coli
Para a produção das proteínas recombinantes em E. coli foram utilizados os
fragmentos gênicos clonados no vetor pRSETc
®
, que codificam proteínas truncadas de 45
kDa, que correspondem à porção N-terminal das proteínas Aam1 e Cqm1. As proteínas
recombinantes foram obtidas em quantidades suficientes para a utilização nos ensaios de
1650
PM aam1 P1 P2
2000
Figura 12. Separação eletroforética dos fragmentos de genes que codificam a proteína Aam1 e suas
respectivas proteínas parálogas, amplificados nas reações de RT-PCR, a partir do mRNA de Aedes aegypti.
aam1. cDNA que codifica a proteína Aam1. P1. cDNA que codifica a proteína paráloga 1. P2. cDNA que
codifica a proteína paráloga 2. PM. Marcador de peso molecular em pares de bases. Gel de agarose a 1%
visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 57
ligação e foram produzidas fusionadas a uma cauda de poli-histidinas para purificação por
cromatografia de afinidade, utilizando-se a resina Ni-NTA
®
agarose (Qiagen). As proteínas
Cqm1 e Aam1 produzidas migraram com peso molecular aproximado de 45 kDa em SDS-
PAGE (dados não apresentados).
8.2.3 Avaliação das proteínas Aam1 e Cqm1 produzidas em E. coli
A proteína Cqm1 recombinante produzida nesse sistema de expressão foi capaz de se
ligar às esferas-Bin na ausência de competidor e a ligação foi visualizada pela presença de
uma banda de 45 kDa após a imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1 (Fig. 13, Cq -).
Quando a incubação foi feita na presença de toxina Bin livre como competidor, a intensidade
da banda foi fortemente reduzida (Fig. 13, Cq +). A avaliação da proteína Aam1 recombinante
mostrou uma ligação com as esferas-Bin, de forma similar à interação observada para a Cqm1
(Fig. 13, Ae -). No entanto, a especificidade da ligação das proteínas Aam1 e Cqm1
recombinantes à toxina Bin não foi comprovada, pois quando utilizada a proteína
recombinante LmEIF4A1 de Leishmania, observou-se que a mesma também ligou-se à toxina
Bin (dados não apresentados). Por essa razão a interação destas proteínas recombinantes foi
considerada de natureza inespecífica.
50
40
60
-
+
-
+
Culex
Aedes
PM
Figura 13. Ensaio de afinidade entre as proteínas recombinantes Aam1 de Aedes aegypti e Cqm1 de Culex
quinquefasciatus e a toxina Bin do Bacillus sphaericus, imobilizada em resina de sefarose, seguido de
imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1. Ensaio realizado na presença (+) e na ausência (-) da toxina Bin
livre usada como competidor. PM. Peso molecular em kDa.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 58
8.2.4 Expressão das proteínas Aam1 e Cqm1 em lisado de reticulócitos de coelho
A transcrição e tradução em reticulócitos de coelho foi realizada a partir dos genes
aam1 e cqm1, que tiveram as suas sequências de “Kozak” modificadas através de mutagênese
sítio-dirigida, com a finalidade de melhorar a expressão das proteínas nesse sistema. No
processo de transcrição in vitro, os mRNAs foram produzidos a partir dos genes aam1 e cqm1
em quantidades adequadas e com sua integridade mantida para a produção das proteínas
recombinantes radiomarcadas com S
35
(Fig. 14). No procedimento de tradução in vitro as
proteínas recombinantes Aam1-
35
S e Cqm1-
35
S
foram produzidas e analisadas em SDS-
PAGE. A proteína Cqm1-
35
S migrou com peso molecular aproximado de 65 kDa, enquanto
que a ortóloga Aam1-
35
S apresentou um peso molecular aparente próximo de 70 kDa (Fig.
15).
aam1 cqm1
Figura 14. Separação eletroforética dos mRNAs obtidos no procedimento de transcrição in vitro dos genes
aam1 de Aedes aegypti e cqm1 de Culex quinquefasciatus, a partir do cDNA obtido nas reações de RT-PCR.
Gel de agarose a 1% visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta.
Figura 15. Separação eletroforética em SDS-PAGE 10% de proteínas Aam1-
35
S
e Cqm1-
35
S
de Aedes
aegypti e Culex quinquefasciatus, respectivamente, produzidas através de tradução in vitro em reticulócitos
de coelho e visualizadas por autoradiografia. PM. Marcador de peso molecular em kDa.
Cqm1 Aam1
70
50
60
80
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 59
8.2.5 Avaliação das proteínas Aam1 e Cqm1 produzidas em lisado de reticulócitos de coelho
Nesta etapa, o sistema de expressão eucarioto foi empregado para a produção das
proteínas Aam1 e Cqm1. As proteínas recombinantes-S
35
foram submetidas aos ensaios de
pull down para avaliação da interação com a toxina Bin. As proteínas Aam1-
35
S e Cqm1-
35
S
foram incubadas com a subunidade BinB da toxina imobilizada na resina GS ou com a
proteína GST imobilizada nesta resina, que foi utilizada como controle negativo do ensaio.
Nas incubações entre as proteínas Aam1-
35
S e Cqm1-
35
S e a subunidade BinB imobilizada, a
ligação não foi observada (Fig. 16, Aam1, 2 e Cqm1, 2) e nenhuma banda foi visualizada na
autoradiografia. A proteína LmEIFG3-
35
S
de Leishmania, obtida sob as mesmas condições e
utilizada como controle positivo do ensaio, foi capaz de ligar-se à proteína LmEIF4A1
imobilizada na resina, o que foi demonstrado pela presença de uma banda com tamanho de 70
kDa (Fig. 16, G3, 3). Nesse caso, a interação observada foi específica, pois quando a proteína
G3 foi incubada com a GST imobilizada sobre a resina, não ocorreu ligação (Fig. 16, G3, 1).
A ausência de ligação das proteínas Aam1 e Cqm1 sugere que o sistema de expressão
utilizado não é capaz de realizar os processamentos pós traducionais necessários à
funcionalidade destas proteínas.
50
40
60
70
80
T 1 2 T 1 2 T 1 3
Cqm1 Aam1 LmEIFG3
PM
Figura 16. Ensaio de pull down entre as proteínas Aam1-S
35
e Cqm1-S
35
e a subunidade BinB
da toxina e
entre as proteínas LmEIFG3-S
35
e LmEIF4A1 de Leishmania sp., visualizados por autoradiografia. T. Proteínas
35
S traduzidas sem incubação. 1. Proteína incubada com glutationa S-transferase. 2. Proteína incubada com a
subunidade BinB da toxina. 3. Proteína incubada com a proteína LmEIF4A1 de Leishmania. PM. Peso
molecular em kDa.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 60
8.2.6 Influência da conformação protéica na capacidade de ligação à toxina Bin
Os resultados obtidos com as proteínas recombinantes produzidas nos dois sistemas de
expressão mostraram que a proteína controle Cqm1, que tem capacidade comprovada de
interação com a toxina Bin, não apresentou capacidade ligação. Portanto, a finalidade desta
etapa foi avaliar o efeito da desnaturação das proteínas nativas na capacidade de ligação à
toxina Bin e a influência que a conformação protéica poderia exercer neste aspecto. Os
extratos-CHAPS contendo as proteínas Aam1 (Ae. aegypti) e Cqm1 (C. quinquefasciatus)
nativas ou desnaturadas foram testadas em ensaios de afinidade (pull down) com a subunidade
BinB da toxina. O extrato nativo de Culex foi capaz de ligar-se especificamente à toxina Bin e
uma banda com cerca de 60 kDa foi visualizada na imunodetecção (Fig. 17A, Culex, N2). A
ligação foi específica, pois a banda não foi observada quando a incubação foi feita com a
proteína GST imobilizada à resina (Fig. 17A, Culex, N1). Por outro lado, após o tratamento
deste extrato antes da incubação com a toxina, através de aquecimento a 100 °C e adição de
β-mercaptoetanol, o extrato teve a sua capacidade de ligação abolida (Fig. 17A, Culex, D2). O
extrato-CHAPS de Aedes, sob as formas nativa ou desnaturada, não foi capaz de ligar-se à
BinB e não foi visualizada nenhuma banda de interação na imunodetecção (Fig. 17A, Aedes,
N2 e D2). Quando o extrato de Culex foi testado após aquecimento a 45 e 100 °C observou-se
que a capacidade de ligação foi mantida (Fig. 17B, D2, 45 e D2, 100), enquanto que a ligação
foi abolida em amostras aquecidas a 65 °C (Fig. 17B, D, 65). Entretanto, o resultado positivo
da amostra aquecida a 100 °C foi artefatual, visto que a ligação também foi observada no
controle negativo utilizando a proteína GST (dados não apresentados). Os dados obtidos
demonstram que a ligação da proteína Cqm1 à toxina Bin depende da integridade da sua
estrutura protéica.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 61
Figura 17. Ensaio de afinidade (pull down) entre os extratos-CHAPS de Culex quinquefasciatus e Aedes
aegypti nativos (N) ou desnaturados (D) e a subunidade BinB imobilizada em resina glutationa sefarose
(GS), seguido de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1. A. Ensaio com os extratos nativos (N) ou
desnaturados pelo aquecimento a 100 °C e adição de β-Mercaptoetanol (D). B. Ensaio com o extratos-
CHAPS de C. quinquefasciatus nativo (N) ou submetido ao tratamento em diferentes temperaturas (D2). Ex.
Extrato-CHAPS (5 µg) sem incubação com a resina. 1. Extrato incubado com glutationa S-transferase. 2.
Extrato incubado com a subunidade BinB.
50
40
60
70
Ex 1 2 1 2 Ex 1 2 1 2
N
N
D
D
Cq
Ae
A
PM
50
40
60
70
Ex 1 2 45 65 100
N
D2 (
°
°°
°
C)
B
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 62
9 DISCUSSÃO
O Ae. aegypti é um importante alvo de programas de controle de vetores e o larvicida
mais utilizado para este fim é o Bti, visto que essa espécie é refratária à toxina Bin do Bsp.
Até o presente, pouco se sabe a razão pela qual esta espécie, taxonomicamente tão próxima às
espécies do complexo Culex, não é susceptível à toxina Bin. No presente estudo, a
disponibilidade do genoma do Ae. aegypti (NENE, et al., 2007) permitiu a identificação do
gene aam1, que codifica uma
α-glicosidase ortóloga (Aam1) e com alta homologia à α-
glicosidase Cqm1, que é o receptor da toxina Bin em C. quinquefasciatus.
Estudos prévios demonstraram que após a ingestão do cristal do Bsp e processamento
no lúmen intestinal de larvas de Ae. aegypti, a toxina Bin não reconhece receptores
específicos no microvili intestinal (NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992). Desta forma,
partiu-se da hipótese de que essa ausência de ligação poderia ser decorrente da quantidade
reduzida ou da ausência de receptores disponíveis, ou ainda que a maltase Aam1 fosse
expressa em outra fase do desenvolvimento, que não as larvas de quarto estádio. Para
investigar essas hipóteses, a expressão da proteína Aam1 de Ae. aegypti foi analisada através
de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1, com grande potencial de detecção específica de
proteínas ortólogas. Esta análise demonstrou a presença de uma proteína com massa
molecular aparente de 70 kDa nos extratos totais de larvas e adultos de Ae. aegypti. Esse
achado foi semelhante ao observado em amostras de larvas e adultos de C. quinquefasciatus,
nas quais foi detectada uma proteína com tamanho aproximado de 60 kDa, o que está de
acordo com a caracterização prévia do receptor nesta espécie (ROMÃO et al., 2006). Dados
de sequências apontaram que a proteína Cqm1 é constituída de 580 aminoácidos e apresenta
massa molecular esperada de 66 kDa, sendo essas características semelhantes àquelas
encontradas na proteína Aam1 (ROMÃO et al., 2006).
A imunodetecção de amostras de microvili intestinal (BBMF) de Ae. aegypti de fato
confirmou a expressão de uma proteína com cerca de 70 kDa em níveis semelhantes ou até
superiores ao receptor Cqm1. Esse resultado mostra que há uma α-glicosidase ortóloga à
Cqm1 em abundância no microvili intestinal de Ae. aegypti, reconhecida pelo anticorpo anti-
Cqm1, que potencialmente seria a Aam1, dada a considerável semelhança com a proteína
Cqm1, em termos de reconhecimento imunológico e massa molecular. A imunodeteção em
amostras de BBMF de An. gambiae demonstrou a presença de uma proteína reconhecida pelo
anti-Cqm1. Esta proteína potencialmente pode se tratar da maltase Agm3 de An. gambiae,
ortóloga e com 78% de identidade com a Cqm1, e que foi caracterizada recentemente como
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 63
receptor da toxina Bin nessa espécie (OPOTA, et al. 2008). A maltase de An. gambiae
identificada no presente estudo, apresenta um nível de expressão cerca de 10 vezes inferior ao
receptor Cqm1 de Culex, o que pode estar relacionado à menor susceptibilidade desse vetor à
toxina Bin do Bsp, bem como ao fato da ligação da toxina Bin às amostras de BBMF dessa
espécie ser menos intensa que em Culex (SILVA-FILHA, et al., 1997).
O receptor da toxina Bin em C. pipiens, C. quinquefasciatus e An. gambiae é uma
molécula da família das α-glicosidases, ligada ao epitélio intestinal por uma âncora GPI
(SILVA-FILHA et al., 1999; DARBOUX et al., 2002; PAUCHET et al., 2005, ROMÃO et
al., 2006; OPOTA et al., 2008). Nos ensaios qualitativos do perfil de α-glicosidases de Ae.
aegypti foram evidenciadas duas e três bandas catalíticas em larvas e adultos,
respectivamente. Em C. quinquefasciatus o perfil é composto por quatro bandas de clivagem
em larvas e adultos, conforme Romão et al. (2006), no entanto, existem diferenças em relação
ao padrão de migração e à intensidade das bandas entre essas fases do desenvolvimento. Por
se tratarem de amostras de proteínas totais, é possível que o perfil de bandas catalíticas nos
extratos não tenha sido bem evidenciado, ou que as diferenças observadas entre larvas e
adultos em ambas as espécies estejam relacionadas às diferenças existentes entre as dietas dos
indivíduos nestas duas fases do ciclo de vida. Alguns estudos demonstraram α-glicosidases
estágio-específicas em mosquitos (ZHENG, et al., 1995), sugerindo que o repertório dessas
enzimas pode estar relacionado à dieta ingerida (SOUZA-NETO et al., 2007). No presente
estudo foi possível detectar os mRNAs que codificam duas maltases, parálogas à proteína
Aam1, e que são expressas exclusivamente na fase adulta de Ae. aegypti, indicando que sua
expressão é estágio-específica.
O perfil de α-glicosidases obtido a partir de BBMF de larvas de Ae. aegypti e An.
gambiae foi mais elucidativo e mostrou perfil de quatro bandas catalíticas, de forma similar
ao padrão detectado nas larvas de Culex. Dentre as bandas observadas no perfil enzimático de
ambos os culicídeos, duas migram com tamanho próximo ao da proteína Cqm1 e uma delas
pode ser a ortóloga do receptor Cqm1 em Ae. aegypti e An. gambiae. Em Ae. aegypti, apenas
a proteína ligeiramente menor que a Cqm1 (78 kDa), foi reconhecida pelo anticorpo anti-
Cqm1. Esse resultado corrobora os dados de imunodetecção e sugerem que essa proteína seja
a maltase Aam1.
Como mencionado anteriormente, a sequência do gene cqm1 de C. quinquefasciatus
possui uma região codificadora (ORF) de 1743 nucleotídeos, que dá origem a uma proteína de
580 aminoácidos e massa molecular de aproximada de 66 kDa, de forma similar ao gene
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 64
aam1 (ROMÃO, et al., 2006). Os dados de imunodetecção de BBMF com anticorpo anti-
Cqm1, associados ao perfil de α-glicosidases sob condições semi-desnaturantes, apontaram
informações interessantes sobre essas proteínas. Em SDS-PAGE as proteínas Cqm1 e Aam1
migram com tamanho aproximado de 60 e 70 kDa, respectivamente, enquanto que sob as
condições semi-desnaturantes dos ensaios de enzimáticos, essas proteínas migram com
tamanho aproximado de 82 e 78 kDa, respectivamente. Diante do exposto, fica evidente que
existem diferenças estruturais entre as proteínas Aam1 e Cqm1 expressas no microvili
intestinal das larvas das respectivas espécies. De fato, os ensaios de afinidade para avaliação
da capacidade de ligação com a toxina Bin revelaram que a proteína Aam1, apesar de ser
abundante nos extratos de BBMF de Ae. aegypti, não apresentou habilidade de ligar-se à
toxina, o que está de acordo com os estudos prévios (NIELSEN-LEROUX; CHARLES,
1992).
Diante dos resultados de que a maltase Aam1 nativa não é capaz de ligar-se à toxina
Bin, foram obtidas proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes, em diferentes sistemas de
expressão, para avaliação das diferenças que pudessem interferir na ausência de ligação da
Aam1 à toxina Bin. As proteínas recombinantes truncadas de 45 kDa, inicialmente obtidas em
E. coli a partir dos genes aam1 e cqm1, foram capazes de se ligar à toxina Bin, porém a
ligação foi de natureza inespecífica, o que indica que as proteínas produzidas neste sistema
não são adequadas para a avaliação de funcionalidade. O ensaio de afinidade por si é
eficiente, pois quando foram utilizadas proteínas nativas, a ligação ocorreu de forma
específica.
As proteínas Aam1-
35
S
e Cqm1-
35
S produzidas em lisado de reticulócitos de coelho
apresentaram o tamanho esperado, entretanto, não foram capazes de se ligar à subunidade
BinB da toxina Bin nos ensaios de afinidade. A ausência de ligação da proteína Cqm1-
35
S,
que possui capacidade comprovada de interação com toxina Bin, sugere que o sistema de
expressão em lisado de reticulócitos, embora eucarioto, não possibilita o processamento
adequado das proteínas. É possível que modificações pós traducionais importantes para a
conformação protéica não sejam inseridas durante o processamento. A análise do gene cqm1
mostra a presença de quatro sítios de glicosilação na sua sequência, que indicam a inserção de
carboidratos à cadeia polipeptídica. As glicosilações estão entre as mais comuns e mais
importantes modificações pós-traducionais em proteínas de eucariotos e podem influenciar na
sua conformação e conferir maior estabilidade térmica (VARKI, 1993, SHENTAL-BECHOR;
LEVY, 2008). O sistema de tradução em lisado de reticulócitos de coelho pode conter
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 65
modificações pós-traducionais, incluindo acetilação, isoprenilação e fosforilação (WALTER;
BLOBEL, 1983), entretanto, não é capaz de inserir glicosilações (ZHOU et al., 2000;
WIERINGA et al., 2002). A ausência de glicosilações pode ter tido uma implicação na
ausência de funcionalidade da proteína Cqm1-
35
S, que é sabidamente capaz de ligar-se à
toxina Bin in vivo (NIELSEN-LEROUX; CHARLES, 1992; SILVA-FILHA et al. 1997;
OLIVEIRA et al., 2004; SILVA-FILHA et al., 2004, 2008). Estudos anteriores demonstraram
que algumas N-glicosilações podem estar implicadas na ligação da toxina Cry1Ac a uma
fosfatase alcalina que funciona como receptor dessa toxina no epitélio intestinal de larvas do
lepidóptero Heliothis virescens (JURAT-FUENTES; ADANG, 2004). É possível que a
ausência de ligação da proteína Aam1 à toxina Bin seja decorrente da ausência de
modificações pós-traducionais, ao contrário do que ocorre com a proteína Cqm1 nativa. A
análise da sequência da proteína Aam1 revelou que esta molécula possui sítios indicativos de
glicosilação, dois deles em posições semelhantes aos observados na proteína Cqm1,
entretanto, o padrão exato de glicosilação destas moléculas não é conhecido.
A avaliação da proteína Cqm1 tratada por aquecimento a 100 °C e pelo agente redutor
β-mercaptoetanol, demonstrou que sua capacidade de ligação à toxina Bin foi abolida. O
efeito isolado da temperatura na proteína Cqm1 nativa mostrou que sua funcionalidade foi
mantida a 45 °C e abolida nas temperaturas de 65 °C e 100 °C. A capacidade de ligação da
proteína à toxina, possivelmente foi mantida após o aquecimento a 45 °C por se tratar de uma
temperatura branda e que se encontra na faixa de estabilidade térmica da proteína (PONTOH;
LOW, 2002). Após o aquecimento a 65 °C a conformação terciária da proteína provavelmente
foi destruída e a molécula passou a um estado desnaturado, devido à inativação térmica.
Estudos realizados com algumas β-glicosidases mostram que há estabilidade na atividade
enzimática em uma faixa de temperatura entre 20 a 50 °C, enquanto que esta é perdida em
temperaturas acima de 60 °C (PONTOH; LOW, 2002). As alterações na conformação
protéica interferem na capacidade de interação da proteína Cqm1 com a toxina Bin, o que
indica que tal interação depende não somente da estrutura primária ou do epitopo de ligação
para a toxina, mas também da conformação final da proteína nativa. Conforme mencionado
anteriormente, as proteínas Aam1 e Cqm1 apresentam massas moleculares diferentes sob
condições semi-desnaturantes, o que indica que a estrutura protéica pode ser um fator
importante para as diferenças em relação à capacidade de ligação à toxina Bin entre essas
moléculas.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 66
Os resultados sugerem que a falha na ligação da toxina Bin à proteína Aam1 pode ser
ocasionada por alterações estruturais que ocorrem durante a tradução e o processamento
protéico. Duas principais hipóteses podem estar relacionadas à ausência de funcionalidade da
proteína Aam1. A primeira é que a existência de modificações na sequência primária da
proteína, no epitopo de ligação propriamente dito, ou ainda em outras regiões possam
interferir na conformação da proteína. No caso da proteína Cqm1, por exemplo, foi detectado
um alelo de resistência do gene cqm1 que codifica uma proteína mutante que, embora
expressa no microvili intestinal das larvas, não tem a capacidade de interagir com a toxina
Bin. A proteína mutante apresenta uma perda de cerca de 60 aminoácidos, que provocou uma
alteração no epitopo de ligação ou na sua conformação (DARBOUX et al., 2007).
Embora a homologia entre as proteínas Aam1 e Cqm1 seja alta e o grau de identidade
de 80% entre elas considerável (DARBOUX et al., 2001; ROMÃO et al., 2006; OPOTA et
al., 2007), os epitopos podem ser regiões compostas de um pequeno número de aminoácidos e
modificações discretas podem abolir a funcionalidade de uma proteína. Estudos prévios
realizados com o receptor da das toxinas Cry1A do Bt em lepidópteros, revelaram que o sítio
de ligação à toxina consiste em uma pequena sequência de aminoácidos e a alteração de um
único aminoácido afetou a interação toxina-receptor (XIE et al., 2005). Uma segunda hipótese
é que o processamento protéico pós-traducional não seja adequado e não proporcione a
conformação adequada da proteína. Neste estudo, os dados sugerem que modificações pós-
traducionais da proteína Cqm1, incluindo as glicosilaçoes, podem estar envolvidas na sua
capacidade de ligação com a toxina Bin. No caso da proteína Aam1, apesar da presença de
sítios de glicosilação, é possível que durante o processamento, tais modificações não sejam
inseridas ou que sejam inseridas de forma diferente daquelas presentes na proteína Cqm1 e,
portanto, inadequada.
Diante dos achados, faz-se necessária a utilização de um sistema de expressão protéica
em células de insetos, potencialmente capaz de promover o processamento pós-traducional
adequado nas proteínas Aam1 e Cqm1, para a avaliação da sua funcionalidade. A partir de um
sistema de expressão que produza a proteína Cqm1 funcional, será possível identificar as
regiões críticas envolvidas na interação toxina-receptor das proteínas Cqm1 e Aam1, através
do procedimento de mutagênese sítio-dirigida. Os conhecimentos produzidos acerca da base
molecular da ação da toxina Bin são de grande relevância para a compreensão do modo de
ação do Bsp e podem servir de subsídios para estratégias de aperfeiçoamento do espectro
inseticida deste agente de controle.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 67
10 CONCLUSÕES
Larvas e adultos de Ae. aegypti expressam uma α-glicosidase com massa molecular de
70 kDa no microvili intestinal e que potencialmente se trata da proteína Aam1,
ortóloga à proteína Cqm1.
A proteína Aam1 está presente em Ae. aegypti em quantidades consideráveis e, no
entanto, não é capaz de ligar-se à toxina Bin, o que determina o status de
refratariedade do vetor.
A proteína Aam1 apresenta diferenças estruturais em relação à proteína Cqm1, apesar
de seu alto grau de homologia.
O processamento pós-traducional da proteína Cqm1 é essencial para a capacidade de
ligação à toxina Bin.
A ausência de ligação da α-glicosidase Aam1 à toxina Bin pode ser ocasionada por
diferenças de estrutura protéica em relação à Cqm1 ou por diferenças no
processamento pós-traducional.
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 68
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APÊNDICE A – Manuscrito de artigo para submissão 1
2
3
For: Comparative biochemistry and physiology. Part B 4
Section: Biochemistry & molecular biology 5
6
Expressão da α
αα
α-glicosidase Aam1 de Aedes aegypti e avaliação da refratariedade ao B. 7
sphaericus 8
9
Lígia Maria Ferreira
1
, Tatiany Patrícia Romão
1
, Osvaldo Pompílio de-Melo-Neto
2
, Maria 10
Helena Neves Lobo Silva-Filha
1*
11
12
1
Departamento de Entomologia e
2
Departamento de Microbiologia do Centro de Pesquisas 13
Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, Recife-PE 50670-420, Brasil 14
15
*Autor para correspondência 16
Maria Helena Neves Lobo Silva-Filha 17
Departamento de Entomologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ 18
Av. Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, Recife-PE, 50670-420, Brazil 19
Tel: +55-81-21012553 20
Fax: +55-81-21012516 21
E-mail: [email protected] 22
23
Running head: Bacillus sphaericus binary toxin 24
25
26
27
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RESUMO 28
A ação da toxina Bin do Bacillus sphaericus em culicídeos depende da interação com 29
receptores no microvilli intestinal das larvas. A α-glicosidase de membrana de 60 kDa 30
(Cqm1), receptor da toxina Bin, confere o status de suscetibilidade de Culex quinquefasciatus, 31
enquanto que Ae. aegypti, é refratário ao Bsp, devido à ausência de receptores no microvilli. 32
No entanto, a análise do genoma do Ae. aegypti, revelou um gene que codifica a proteína 33
ortóloga Aam1 com 80% de homologia ao receptor Cqm1. O objetivo do estudo foi elucidar a 34
base da refratariedade do Ae. aegypti, baseado na investigação da proteína Aam1. Os 35
resultados mostraram que larvas de Ae. aegypti expressam uma α-glicosidase de membrana 36
de 70 kDa, reconhecida pelo anticorpo anti-Cqm1, e que se trata potencialmente da proteína 37
Aam1. Esta proteína é expressa no microvilli intestinal em níveis superiores à Cqm1, porém, 38
não apresenta capacidade de ligação à toxina Bin. As proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes, 39
produzidas em lisado de reticulócitos de coelho, não foram capazes de ligar-se com a toxina 40
Bin e este dado aponta que o processamento pós-traducional pode crítico para a sua 41
funcionalidade. O efeito da desnaturação por temperatura na funcionalidade da proteína Cqm1 42
nativa também demonstrou que a sua conformação é essencial para a capacidade ligação. Os 43
resultados mostram que, apesar da presença da proteína ortóloga Aam1 no microvilli intestinal 44
das larvas, alterações no processamento pós-traducional ou na estrutura da proteína impedem 45
que molécula funcione como receptor da toxina Bin. 46
47
Palavras-Chave: Controle biológico de vetores, toxinas bacterianas, Aedes 48
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INTRODUÇÃO 49
O Bacillus sphaericus (Bsp) é um biolarvicida eficaz para o controle de larvas de 50
culicídeos. Seu principal fator tóxico é a toxina Bin, produzida em um cristal protéico, sob a 51
forma de uma protoxina heterodimérica, composta pelos polipeptídeos de 42- e 51- kDa, 52
BinA e BinB, respectivamente (Charles, 1987; Baumann, et al., 1988). Após a ingestão pelas 53
larvas, o cristal é solubilizado em pH alcalino intestinal e a protoxina Bin é liberada no lúmen, 54
onde é clivada por serina-proteases em polipeptídeos de 39- e 43-kDa, que constituem a forma 55
ativa da toxina (Baumann et al., 1985; Broadwell e Baumann, 1987; Nielsen-Leroux e 56
Charles, 1992). A ligação da toxina a receptores específicos no epitélio intestinal é uma etapa 57
crucial no modo de ação do Bsp em espécies susceptíveis tais como C. pipiens, C. 58
quinquefasciatus, An. stephensi e An. gambiae. Em Ae. aegypti, uma espécie naturalmente 59
refratária ao Bsp, a ligação da toxina aos receptores do microvili intestinal de larvas não foi 60
detectada (Nielsen-Leroux e Charles, 1992; Silva-Filha et al., 1997). O receptor em C. 61
pipiens, C. quinquefasciatus e An. gambiae é uma α-glicosidase (E.C. 3.2.1.20) de 60 kDa, 62
ligada à membrana apical do epitélio intestinal através de uma molécula de glicosil-63
fosfatidilinositol (GPI), denominadas respectivamente, Cpm1, Cqm1 e Agm3 (Silva-Filha et 64
al., 1999; Darboux et al., 2001; Pauchet et al., 2005; Romão et al., 2006; Opota et al., 2007). 65
A análise de sequências no GenBank mostrou que um gene com alta homologia àquele que 66
codifica o receptor da toxina Bin em C. pipiens, C. quinquefasciatus e An. gambiae estaria 67
presente em Ae. aegypti (Romão et al., 2006). A identidade de 80% entre as seqüências das 68
moléculas Aam1 e Cqm1 é elevada e motivou a investigação dos mecanismos moleculares 69
que determinam a refratariedade do Ae. aegypti ao Bsp. A ausência de ligação da toxina aos 70
receptores no microvili intestinal de Ae. aegypti pode resultar da ausência de expressão do 71
gene aam1 nos insetos, da expressão desse gene em outra fase do desenvolvimento, da 72
expressão em níveis reduzidos, da produção de uma proteína desprovida de âncora GPI e, 73
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Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 80
portanto, expressa sob a forma solúvel, ou ainda de diferenças estruturais nas proteínas que 74
sejam críticas para o seu reconhecimento e ligação com a toxina Bin. Uma segunda 75
possibilidade é que a proteína Aam1 seja expressa nas larvas de Ae. aegypti e não possua a 76
capacidade de interagir com a toxina Bin, o que pode ser decorrente de diferenças na 77
sequência primária de aminoácidos ou de alterações na conformação da proteína Aam1 que 78
impeçam a interação. A análise comparativa das α-glicosidases Aam1 e Cqm1 de Ae. aegypti 79
e C. quinquefasciatus, espécies refratária e suscetível respectivamente, constitui um modelo 80
ímpar para a compreensão do modo de ação da toxina Bin. Diante do exposto, o principal 81
objetivo deste trabalho é identificar fatores que estejam envolvidos na refratariedade das 82
larvas de Ae. aegypti ao Bsp. 83
84
MATERIAL E MÉTODOS 85
2.1 Colônias de insetos 86
Foram utilizadas amostras de larvas e adultos de Ae. aegypti e C. quinquefasciatus, das 87
colônias RecL e CqSF, respectivamente, mantidas no insetário do Departamento de 88
Entomologia do CpqAM, segundo Chalegre et al. (2009). 89
90
2.2 Extrato total de larvas e adultos 91
O extrato total de proteínas de larvas e adultos foi obtido a partir da maceração de 92
espécimes em 10 µl de tampão PBS/Azida 0,02%/10 mM PMSF pH 7.4. As amostras foram 93
centrifugadas a 1.500 g, durante 2 minutos a 4 ºC e o sobrenadante foi utilizado 94
imediatamente nos ensaios. A dosagem de proteínas das amostras foi mensurada segundo 95
Bradford et al. (1976) utilizando uma curva de albumina sérica bovina (BSA) como padrão. 96
97
98
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2.3 Frações ricas em microvili intestinal (BBMF) de larvas 99
As preparações de BBMF foram obtidas a partir de larvas do 4º estádio, segundo 100
Silva-Filha et al. (1997). A dosagem de proteínas foi realizada de acordo com o item anterior 101
e a qualidade das amostras de BBMF foi avaliada através da determinação do enriquecimento 102
da enzima α-glicosidase (E.C. 3.2.1.20), segundo Silva-Filha et al. (1999). 103
104
2.4 Frações de proteínas de BBMF solubilizadas (Extratos-CHAPS) 105
Nesta etapa foram obtidas frações de proteínas do microvili intestinal das larvas, 106
solubilizadas com detergente CHAPS, segundo Silva-Filha et al. (1999). A dosagem de 107
proteínas, para avaliar o rendimento da solubilização dos extratos e a atividade α-glicosidase, 108
para estimar o enriquecimento das preparações em membranas apicais, antes e após a 109
solubilização com CHAPS, foi feita conforme descrito anteriormente. 110
111
2.5 Imunodetecção de proteínas com anticorpo anti Cqm1 112
Preparações de BBMF de Ae. aegypti e C. quinquefasciatus (2,5 a 20 µg) foram 113
submetidas à separação eletroforética SDS-PAGE a 10% e as proteínas do gel foram 114
transferidas para uma membrana de nitrocelulose que foi submetida a imunodetecção 115
utilizando o anticorpo primário anti-Cqm1, segundo Romão et al. (2006). 116
117
2.6 Ensaios de atividade
α
-glicosidase em gel 118
A análise do perfil de α-glicosidases foi realizada em amostras de BBMF (15 µg de 119
proteínas) segundo Romão et al. (2006). A visualização do perfil de bandas catalíticas das foi 120
feita em transiluminador de luz ultravioleta (UV). 121
122
123
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2.7 Clonagem e expressão dos genes aam1 e cqm1 124
A extração do RNA para a produção do cDNA do gene aam1 de Ae. aegypti foi feita a 125
partir um pool de larvas ou adultos, segundo Romão et al. (2006). O RNA foi purificado e as 126
reações de transcrição reversa (RT-PCR) foram realizadas utilizando o primer oligo DT
20
127
(Invitrogen), segundo instruções do fabricante. A partir do cDNA obtido, as reações de PCR 128
foram realizadas, utilizando primers específicos para o gene aam1 (Nene et al. 2007), 129
segundo Romão et al. (2006). O produto de amplificação do gene aam1 foi purificado com o 130
kit GFX DNA and Gel Band Purification
® (GE Healthcare) e
inserido no vetor plasmidial 131
pGEM
®
-T Easy (Promega), que foi utilizado na transformação de células de Escherichia coli 132
cepa DH10B eletrocompetentes, segundo instruções do fabricante. Plasmídeos contendo o 133
gene cqm1, previamente clonado por Romão et al. (2006) foram utilizados como controle. 134
Foram feitas preparações de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina, segundo Ausbel 135
(1992), e estas foram digeridas com as enzimas Pst I e Hind III a 37 ºC. Os fragmentos 136
liberados após a digestão foram subclonados no vetor
pGEM3zf+® (Promega), para a
137
expressão protéica através do sistema de tradução em lisado de reticulócitos de coelho.
Os 138
plasmídeos contendo os fragmentos dos genes aam1 e cqm1 foram sequenciados no ABI 139
Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytems). Os “contigs” foram montados no 140
programa SeqMan (DNAStar) e as sequências editadas no programa EditSeq (DNAStar). A 141
identidade dos fragmentos foi confirmada pela comparação das seqüências obtidas com 142
aquelas disponíveis no GenBank, através da ferramenta BLASTn do NCBI 143
(www.ncbi.nlm.nih.gov). 144
O procedimento de mutagênese sítio-dirigida foi realizado nos fragmentos aam1 e 145
cqm1, contidos no plasmídeo pGEM3Zf+, de acordo com o protocolo do Kit de mutagênese 146
sítio-dirigida QuikChange (Stratagene). A eficácia do procedimento foi avaliada através de 147
análise de seqüências conforme descrito anteriormente e os plasmídeos contendo as mutações 148
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foram utilizados para a expressão das proteínas recombinantes mutagenizadas em lisado de 149
reticulócitos de coelho. 150
151
2.8 Transcrição e tradução in vitro em reticulócitos de coelho 152
Os genes aam1 e cqm1 submetidos a mutagênese foram utilizados para a produção do 153
mRNA, segundo Romão et al. (2006). Os mRNAs obtidos foram utilizados no procedimento 154
de tradução in vitro, utilizando um lisado de reticulócitos de coelho (Rabbit Reticulocyte 155
Lysate
®
, Promega), segundo instruções do fabricante. Após a tradução, uma alíquota de cada 156
amostra foi submetida à eletroforese em SDS-PAGE a 10%, e gel submetido à secagem. Um 157
filme autoradiográfico Hiperfilm (Amershan) foi exposto ao gel durante 12 h à TA e, em 158
seguida, revelado para a detecção das proteínas marcadas com
35
S. 159
160
2.9 Ensaios de pull-down 161
Os ensaios de pull down foram realizados segundo Dhalia et al. (2005). Foram 162
utilizados 10 µl da toxina BinB imobilizada na resina GS (Bin-GS), incubada com os 163
extratos-CHAPS (20 µg de proteínas) ou com as proteínas recombinantes (5 µg). Para avaliar 164
a especificidade da ligação, as respectivas incubações foram feitas com a proteína glutationa 165
S-transferase (GST), imobilizada sobre a resina GS, que serviu como controle negativo. Após 166
a incubação, as amostras foram centrifugadas, 1.500 g, 2 min a 4 ºC, e o sedimento foi 167
submetido à eletroforese SDS-PAGE 10%, transferência para membrana de nitrocelulose, e 168
imunodetecção com anticorpo anti Cqm1. As proteínas recombinantes LmEIF4A1 e LmEIFG3 169
de Leismania foram utilizadas como controles nos ensaios, de acordo com as necessidades 170
experimentais. Além da avaliação de proteínas recombinantes, as proteínas nativas Cqm1 e 171
Aam1 de extratos-CHAPS também foram testadas em relação a sua habilidade de ligação com 172
a toxina Bin. Amostras previamente submetidas ao tratamento com temperaturas de 45, 65 e 173
Lígia M
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Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 84
100 ºC durante cinco minutos também foram avaliadas. Após o tratamento as amostras foram 174
avaliadas quanto à capacidade de ligação à toxina Bin através dos ensaios de pull down 175
conforme descrito anteriormente. 176
177
RESULTADOS 178
3.1 Expressão da proteína Aam1 e capacidade de interação com a toxina Bin 179
A imunodetecção de proteínas de Ae. aegypti, utilizando o anticorpo anti-Cqm1, 180
revelou que moléculas semelhantes ao receptor Cqm1 são expressas no microvili intestinal de 181
larvas desses insetos. Nas amostras de BBMF o anticorpo reconheceu com alta especificidade 182
uma proteína de cerca de 70 kDa, em paralelo ao reconhecimento da proteína Cqm1 de cerca 183
de 60 kDa, em amostras de BBMF de C. quinquefasciatus (Fig. 1). Esse dado revela que uma 184
proteína ortóloga ao receptor Cqm1 é expressa no microvili intestinal das larvas de Ae. 185
aegypti em quantidade equivalente àquela vista em C. quinquefasciatus. A imunodetecção 186
também confirma que a proteína de Ae. aegypti possui um peso molecular superior à α-187
glicosidase Cqm1. 188
O perfil de α-glicosidases em preparações de BBMF de Ae. aegypti é composto por 189
quatro bandas catalíticas e, duas delas, com tamanho semelhante à α-glicosidase Cqm1 (Fig. 190
2, painel à esquerda, Ae, seta). Após a detecção enzimática de α-glicosidases em Ae. aegypti, 191
o gel foi submetido à imunodetecção e o anticorpo anti-Cqm1 reconheceu especificamente a 192
α-glicosidase que possui massa molecular discretamente inferior à Cqm1 (Fig. 2, painel à 193
direita, Ae, seta). Este ensaio demonstrou que a massa molecular da Aam1 foi inferior à 194
Cqm1, ao contrário dos dados obtidos em SDS-PAGE, o que sugere a existência diferenças 195
estruturais entre essas proteínas. Os resultados obtidos nesta análise demonstram a expressão 196
de uma α-glicosidase de membrana de 70 kDa no microvilli intestinal de larvas de Ae. 197
aegypti, que seria potencialmente a proteína Aam1, ortóloga do receptor Cqm1. 198
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Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 85
A capacidade de interação destas proteínas nativas à toxina Bin foi avaliada em 199
ensaios de afinidade. Nestes ensaios a proteína Cqm1 nativa, presente em extratos-CHAPS foi 200
capaz de se ligar à à subunidade BinB imobilizada em resina (Fig. 3, Cq 2). A ligação foi 201
específica, pois a banda de 60 kDa não foi observada quando o extrato foi incubado com a 202
glutationa S-transferase (GST) imobilizada sobre a resina GS, amostra usada como controle 203
negativo do ensaio (Fig. 3, Cq 1). Na incubação com o extrato-CHAPS de Ae. aegypti não foi 204
observada interação, não sendo visualizada nenhuma proteína com capacidade de ligação à 205
subunidade BinB da toxina ((Fig. 3, Ae 2). 206
207
3.2 Produção de Aam1 e Cqm1 recombinantes e capacidade de interação com a toxina Bin 208
Devido à falha de ligação da proteína Aam1 nativa à toxina, foram obtidas proteínas 209
recombinantes através do processo de transcrição e tradução in vitro em lisado de reticulócitos 210
de coelhos. A análise em SDS-PAGE das proteínas obtidas neste sistema de expressão 211
mostrou que Cqm1-
35
S migrou com massa aproximada de 65 kDa (Fig. 4, Cq), enquanto que 212
a ortóloga Aam1-
35
S apresentou cerca de 68 kDa (Fig. 4, Ag). A interação das proteínas com 213
a toxina Bin foi testada através dos ensaios de pull down, entretanto, as proteínas Aam1-
35
S e 214
Cqm1-
35
S não mostraram capacidade de ligação com a subunidade BinB imobilizada e 215
nenhuma banda foi visualizada na autoradiografia (Fig. 5, Aam1 e Cqm1, 2). A proteína 216
Cqm1 nativa possui capacidade comprovada de interagir com a toxina Bin, entretanto, sob 217
forma recombinante obtida neste sistema, tal capacidade foi abolida. Este dado apontou que a 218
investigação de fatores que afetam a conformação da proteína seria relevante para o estudo. A 219
partir deste achado, o efeito da desnaturação na capacidade de ligação das proteínas nativas à 220
toxina Bin e a influência que a conformação protéica poderia exercer neste aspecto foram 221
avaliados. Os extratos-CHAPS contendo a proteína Cqm1 nativa mostrou capacidade de 222
interação com a toxina Bin em ensaios de pull down (Fig. 6, N-2) e a ligação foi específica, 223
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Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 86
pois na incubação feita com a proteína GST, utilizada como controle negativo, a banda não foi 224
detectada (Fig. 6, N-1). O tratamento do extratos-CHAPS de Culex com o aquecimento 225
mostrou que capacidade de ligação foi mantida em amostras aquecidas a 45 e 100 °C (Fig. 6, 226
D2-45 e D2-100), enquanto que foi reduzida ou abolida em amostras aquecidas a 65 °C (Fig. 227
6, D-65). Entretanto, verificou-se que a ligação do extrato aquecido a 100 °C à toxina foi 228
artefatual, visto que também foi observada no controle negativo utilizando a proteína GST 229
(dados não apresentados). Os dados sugerem que a integridade da conformação da Cqm1 é 230
essencial para a sua habilidade de interação com a toxina Bin visto que, sob estado 231
desnaturado, a proteína perde esta característica. 232
233
DISCUSSÃO 234
Estudos prévios demonstraram que a toxina Bin não reconhece receptores específicos 235
no microvili intestinal larvas de Ae. aegypti (Nielsen-leroux; Charles, 1992). Desta forma, 236
partiu-se da hipótese de que essa ausência de ligação poderia ser decorrente da quantidade 237
reduzida ou da ausência de receptores disponíveis, ou que a maltase Aam1 fosse expressa em 238
outra fase do desenvolvimento, que não as larvas de quarto estádio. Na análise da expressão 239
em amostras de microvili intestinal (BBMF) de Ae. aegypti foi detectada uma α-glicosidase 240
de membrana com cerca de 70 kDa, expressa em níveis aparentemente superiores ao receptor 241
Cqm1. Esse resultado indica que esta proteína potencialmente seria a Aam1, dada a 242
considerável semelhança com a proteína Cqm1, em termos de reconhecimento imunológico, 243
massa molecular e atividade enzimática. 244
O gene aam1 de Ae. aegypti, assim como gene cqm1 de C. quinquefasciatus possui 245
uma região codificadora (ORF) de cerca de 1743 nucleotídeos, que dá origem a uma proteína 246
de 580 aminoácidos e massa molecular esperada de 66 kDa (Romão, et al., 2006). Entretanto 247
os dados de imunodetecção e do perfil de α-glicosidases das proteínas Aam1 e Cqm1 248
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Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 87
apontaram que estas proteínas podem apresentar diferenças estruturais. Em SDS-PAGE as 249
proteínas Cqm1 e Aam1 apresentam massas de cerca de 60 e 70 kDa, respectivamente, 250
enquanto que sob as condições semi-desnaturantes dos ensaios de enzimáticos, estas proteínas 251
migram com tamanho aparente de 82 e 78 kDa, respectivamente. Esta diferença estrutural 252
poderia ser a razão pela qual a proteína Aam1, apesar de presente em abundância em 253
preparações de BBMF de Ae. aegypti, não apresenta capacidade de ligação com a toxina, o 254
que está em acordo com outros estudos que já haviam apontado esta falha de interação 255
(Nielsen-Leroux; Charles, 1992). 256
Proteínas Aam1 e Cqm1 recombinantes foram obtidas no sistema de expressão em 257
lisado de reticulócitos de coelho para avaliar as diferenças que pudessem interferir na 258
ausência de ligação da Aam1 à toxina Bin. Nos ensaios de afinidade as proteínas Aam1-
35
S
e 259
Cqm1-
35
S não foram capazes de se ligar à subunidade BinB, o que sugere que o sistema de 260
expressão em reticulócitos, embora eucarioto, não possibilita o processamento adequado das 261
proteínas. É possível que modificações pós-traducionais importantes para a conformação 262
protéica não sejam inseridas durante o processamento. A análise do gene cqm1 mostrou que 263
este contém quatro sítios de glicosilação na sua sequência, que indicam a inserção de 264
carboidratos à cadeia polipeptídica (Darboux et al., 2001; Romão et al., 2006). As 265
glicosilações estão entre as mais comuns e mais importantes modificações pós-traducionais 266
em proteínas de eucariotos e podem influenciar na sua conformação, conferirindo maior 267
estabilidade térmica (Varki, 1993, Shental-Bechor; Levy, 2008). O sistema de tradução em 268
lisado de reticulócitos de coelho pode produzir modificações pós-traducionais, incluindo 269
acetilação, isoprenilação e fosforilação (Walter; Blobel, 1983), entretanto, não é capaz de 270
inserir glicosilações (Zhou et al., 2000; Wieringa et al., 2002). A ausência de glicosilações 271
pode ser um aspecto crítico para a funcionalidade da proteína Cqm1-
35
S, visto que esta 272
proteína é sabidamente capaz de ligar-se à toxina Bin sob a forma nativa (Nielsen-Leroux e 273
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Charles, 1992; Oliveira et al., 2004; Silva-Filha et al. 1997, 1999, 2004, 2008; Romão et., 274
2006). Estudos anteriores demonstraram que N-glicosilações podem estar implicadas na 275
ligação da toxina Cry1Ac a uma fosfatase alcalina que é o receptor dessa toxina no epitélio 276
intestinal de larvas do lepidóptero Heliothis virescens (Jurat-Fuentes e Adang, 2004). 277
Outro dado relevante para a funcionalidade das proteínas é que o tratamento à 278
temperatura de 65 °C e 100 °C, aboliu a capacidade de ligação da proteína nativa Cqm1. 279
Nestas temperaturas a conformação terciária da proteína provavelmente foi destruída e a 280
molécula passou a um estado desnaturado. Estudos realizados com algumas β-glicosidases 281
mostram que há estabilidade na atividade enzimática em uma faixa de temperatura entre 20 a 282
50 °C, enquanto que esta é perdida em temperaturas acima de 60 °C (Pontoh e Low, 2002). 283
As alterações na conformação protéica interferem na capacidade de interação da proteína 284
Cqm1 com a toxina Bin, o que indica que tal interação depende não somente da estrutura 285
primária ou do epitopo de ligação para a toxina, mas também da conformação ou dobramento 286
final da proteína nativa. Conforme mencionado anteriormente, as proteínas Aam1 e Cqm1 287
apresentam massas moleculares diferentes sob condições semi-desnaturantes, o que indica que 288
a estrutura protéica pode ser um fator importante para as diferenças entre essas moléculas em 289
relação à sua capacidade de ligação à toxina Bin. 290
Duas principais hipóteses podem estar relacionadas à ausência de funcionalidade da 291
proteína Aam1. A primeira é que existam modificações da estrutura da proteína, no epitopo de 292
ligação propriamente dito, ou ainda em outras regiões que possam interferir na conformação 293
da proteína. Uma segunda hipótese é que o processamento protéico pós-traducional não seja 294
adequado e não proporcione a conformação adequada da proteína. Diante dos achados, faz-se 295
necessária a utilização de um sistema de expressão capaz de promover o processamento pós-296
traducional das proteínas a serem submetidas à avaliação de funcionalidade e identificação de 297
regiões críticas envolvidas na interação toxina-receptor. Os conhecimentos produzidos acerca 298
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da base molecular da ação da toxina Bin são de grande relevância para a compreensão do 299
modo de ação do Bsp e podem servir de subsídios para estratégias de aperfeiçoamento do 300
espectro inseticida deste agente de controle. 301
302
AGRADECIMENTOS 303
O trabalho teve o apoio do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq Brazil, 304
4711911/2006-2). 305
306
REFERÊNCIAS 307
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401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
411
. 412
413
414
415
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LEGENDAS DE FIGURAS 416
417
FIG. 1. Imunodetecção de proteínas do microvili intestinal de larvas de culicídeos com o 418
anticorpo anti-Cqm1. Curva decrescente de amostras de proteínas (20 - 2,5 µg) de Culex 419
quinquefasciatus (Cq) e Aedes aegypti (Ae). PM. Peso molecular em kDa. 420
421
FIG. 2. Perfil da atividade α-glicosidase em gel de amostras de microvili intestinal de larvas 422
de Culex quinquefasciatus (Cq) e de Aedes aegypti (Ae). As proteínas do gel foram 423
transferidas para uma membrana de nitrocelulose e submetidas á imunodetecção com 424
anticorpo anti-Cqm1. PM. Peso molecular em kDa. 425
426
FIG. 3. Ensaio de afinidade entre os extratos de proteínas de microvili intestinal solubilizadas 427
de Culex quinquefasciatus (Cq) e Aedes aegypti (Ae) e a toxina Bin do B. sphaericus 428
imobilizada em resina Bin-GS, seguido de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1. 1. 429
Incubação com glutationa S-transferase imobilizada na resina. 2. Incubação com o 430
componente BinB da toxina Bin. Ext. Amostras de10 µg de proteínas de extratos-CHAPS, 431
sem incubação. 432
433
FIG. 4. Separação eletroforética em SDS-PAGE 10% de proteínas Aam1-
35
S
e Cqm1-
35
S
de 434
Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, respectivamente, produzidas através de tradução in 435
vitro em reticulócitos de coelho e visualizadas por autoradiografia. PM. Marcador de peso 436
molecular em kDa. 437
438
FIG. 5. Ensaio de pull down entre as proteínas Aam1-S
35
e Cqm1-S
35
e a subunidade BinB
da 439
toxina e entre as proteínas LmEIFG3-S
35
e LmEIF4A1 de Leishmania sp., visualizados por 440
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autoradiografia. T. Proteínas
35
S traduzidas sem incubação. 1. Proteína incubada com 441
glutationa S-transferase. 2. Proteína incubada com a subunidade BinB da toxina. 3. Proteína 442
incubada com a proteína LmEIF4A1 de Leishmania. PM. Peso molecular em kDa. 443
444
FIG. 6. Ensaio de afinidade (pull down) entre os extratos-CHAPS de Culex, nativo (N) ou 445
submetido ao tratamento em diferentes temperaturas (D2), e a BinB imobilizada em resina 446
glutationa sefarose (GS), seguido de imunodetecção com anticorpo anti-Cqm1. 1. Extrato 447
incubado com glutationa S-transferase. 2. Extrato incubado com a subunidade BinB. Ex. 448
Extrato-CHAPS (5 µg) sem incubação com a resina. 449
450
451
452
453
454
455
456
457
458
459
460
461
462
463
464
465
466
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 96
FIG. 1
20 10 5 2,5 20 10 5 2,5
Cq
Ae
82
64
49
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 97
FIG. 2
115
82
64
Cq
Ae
PM
115
82
64
Cq
Ae
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 98
FIG. 3
70
60
50
1 2 Ext 1 2 Ext
Cq Ae
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 99
FIG. 4
Cqm1 Aam1
60
50
70
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 100
FIG. 5.
50
40
60
70
80
T 1 2 T 1 2 T 1 3
Cqm1 Aam1 LmEIFG3
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 101
FIG. 6
50
40
60
70
Ex 1 2 45 65 100
N
D2 (
°
°°
°
C)
PM
Lígia M
a
Ferreira Análise da refratariedade do Aedes aegypti... 102
APÊNDICE B – Participação em cursos, congressos e resumos publicados
1. X Simpósio de controle biológico – SICONBIOL, Brasília, 2007.
Resumos publicados
ROMÃO, T. P., FERREIRA, L. M., MELO NETO, O. P., SILVA FILHA, M. H. N. L.
Molecular basis for the resistance of Aedes aegypti to Bacillus sphaericus. In: XXXVI Reunião
anual da sociedade brasileira de bioquímica e biologia molecular, 2007, Salvador. Anais da
XXXVI Reunião anual da sociedade brasileira de bioquímica e biologia molecular, 2007.
FERREIRA, L. M., ROMÃO, T. P., MELO NETO, O. P., SILVA FILHA, M. H. N. L.
Clonagem e expressão do potencial receptor da toxina binária do Bacillus sphaericus em
Anopheles gambiae. In: X Simpósio de controle biológico, 2007, Brasília. Anais do X Simpósio
de controle biológico, 2007.
FERREIRA, L. M. Análise da expressão do receptor da toxina binária do biolarvicida Bacillus
sphaericus em culicídeos vetores. In: X Jornada de Pós-Graduação da Fiocruz, 2007, Rio de
Janeiro. Anais da X Jornada de Pós-Graduação da Fiocruz, 2007.
FERREIRA, L. M., ROMÃO, T. P., MELO NETO, O. P., FURTADO, A. F., SILVA FILHA,
M. H. N. L. Cloning and expression of the potential receptor of Bacillus sphaericus binary toxin
in Anopheles gambiae. In: 40th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, 2007,
Quebec. Abstracts of teh 40th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, v.
1, p. 40-40, 2007.
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