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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Resistência de cultivares de batata (Solanum tuberosum) à sarna
comum (Streptomyces spp.) e mecanismo de ação da fitotoxina
taxtomina A em sorgo (Sorghum bicolor): aspectos bioquímicos e
ultraestruturais
Ely Oliveira Garcia
Dissertação apresentada para obtenção do título
de Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2008
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Ely Oliveira Garcia
Engenheiro Agrônomo
Resistência de cultivares de batata (Solanum tuberosum) à sarna comum
(Streptomyces spp.) e mecanismo de ação da fitotoxina taxtomina A em sorgo
(Sorghum bicolor): aspectos bioquímicos e ultraestruturais
Orientador:
Prof. Dr. SÉRGIO FLORENTINO PASCHOLATI
Dissertação apresentada para obtenção do título
de Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2008
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Garcia, Ely Oliveira
Resistência de cultivares de batata (Solanum tuberosum) à sarna comum (Streptomyces
spp.) e mecanismo de ação da fitotoxina taxtomina A em sorgo (Sorghum bicolor): aspectos
bioquímicos e ultraestruturais / Ely Oliveira Garcia. - - Piracicaba, 2008.
92 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Batata 2. Bioquímica vegetal 3. Fitopatógenos 4. Microscopia eletrônica 5. Sorgo
6. Streptomyces 7.Toxinas I. I. Título
CDD 633.491
G216r
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
A Deus, por sua fidelidade nas realizações.
Aos meus pais Luiz e Joselina, e meus irmãos Eliseu e Elias.
DEDICO
4
AGRADECIMENTOS
Aos pesquisadores Dr. Russel King (Agriculture and Agri-Food Canada,
Research Branch, Fredericton Research Center - Canada), professor Dr. Keijji Hasumi
(Tokio Noko University - Japão), Dr. Carlos Roberto Casela (Embrapa Milho e Sorgo),
Dra. Suzete L. Destéfano, Dr. Júlio Rodrigues Neto, Dr. Luis Otávio S. Beriam e
Msc. Irene Gatti de Almeida (Instituto Biológico de São Paulo – Setor de Bacteriologia)
pelo apoio e fornecimento de material para o desenvolvimento desta obra.
Ao professor Dr. Sérgio F. Pascholati, não apenas pela orientação, mas pela
grande amizade e apoio para o desenvolvimento desta obra.
A todos os professores do setor de Fitopatologia da Esalq, que souberam ensinar
muito mais do que apenas técnicas, mas também respeito e humildade.
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia e Bioquímica, Fitopatológica, Silvia
Blumer, Leonardo Toffano, André Boldrin Beltrame, Marizete de Fátima Pimentel
Godoy, Patrícia Cia, Dirceu Macagnan, Maria Cristina Canale Rappussi da Silva, Odair
José Kuhn, Marisa Silveira Almeida Renaud Faulin, Nívea Maria Tonucci Zanardo,
Ricardo Ferrari Silva, Maurício Batista Fialho e Ariana Elisei Vilela pelo convívio alegre
e descontraído.
Aos amigos Ivan Fisher, Fabrício, Davi, Ana Carolina Alves, Bárbara, Isolda,
Alessandra, Vanessa, Raphaelle, Érika, Renata Gomes e Eliane pelos bons momentos
compartilhados.
Aos funcionários do setor de Fitopatologia da Esalq, em especial a Carmem,
Heloísa, Fernanda, Rodolfo, Pedro, Liliane, Márcia, e Sylvia, que participaram de
alguma forma em atividades referentes a esta tese.
5
A todos que de uma forma ou de outra participaram da realização desta obra.
A Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP pela
concessão de bolsa de estudos.
6
SUMÁRIO
A
RESUMO....................................................................................................................... 9
ABSTRACT.................................................................................................................... 11
1
AINTRODUÇÃO.........................................................................................................
13
Referências.................................................................................................................... 15
2ARESISTÊNCIA DE CULTIVARES DE BATATA A ISOLADOS DE Streptomyces
spp. EXIBINDO DIFERESTES NÍVEIS DE PRODUÇÃO DE CONCANAMICINAS, E
SENSIBILIDADE DE TUBÉRCULOS À FITOTOXINA TAXTOMINA A........................
18
Resumo......................................................................................................................... 18
Abstract......................................................................................................................... 19
2.1 Introdução ................................................................................................... 19
2.2 Desenvolvimento ........................................................................................ 21
2.2.1 Revisão bibliográfica .................................................................................. 21
2.2.1.1 Importância econômica da cultura da batata .............................................. 21
2.2.1.2 Sarna comum da batata e espécies de Streptomyces relacionadas .......... 21
2.2.1.3 Fitotoxinas de Streptomyces spp. ............................................................... 23
2.2.2 Material e métodos ...................................................................................... 33
2.2.2.1 Resistência de cultivares de batata à sarna comum .................................. 33
2.2.2.1.1 Planta teste .................................................................................................. 33
2.2.2.1.2 Isolados de Streptomyces spp. ................................................................... 33
2.2.2.1.3 Produção e extração das fitotoxinas ........................................................... 34
2.2.2.1.4 Identificação da fitotoxina taxtomina A ........................................................ 35
2.2.2.1.5 Quantificação da concentração de concanamicinas A e B e taxtomina A
nos extratos .................................................................................................
36
2.2.2.1.6 Reação de cultivares comerciais ao patógeno............................................. 37
2.2.2.1.7 Plantio dos tubérculos e condução do ensaio ............................................. 37
2.2.2.1.8 Avaliação dos resultados ............................................................................. 38
2.2.2.2 Sensibilidade de tubérculos de cultivares de batata a taxtomina A ............ 40
2.2.3 Resultados e discussão .............................................................................. 41
7
2.2.3.1 Resistência de cultivares de batata à sarna comum ................................... 41
2.2.3.1.1 Identificação e quantificação da produção de fitotoxinas pelos isolados de
Streptomyces spp. .......................................................................................
41
2.2.3.1.2 Reação dos cultivares de batata ao patógeno ............................................ 46
2.2.3.2 Sensibilidade de cultivares de batata a taxtomina A ................................... 52
2.3 Conclusões .................................................................................................. 54
Referências ................................................................................................................... 54
3 ATERAÇÕES ULTRAESTRUTURAIS E BIOQUÍMICAS CAUSADAS PELA
TAXTOMINA A, PRODUZIDA por Streptomyces spp., SOBRE PLÂNTULAS DE
SORGO (Sorghum bicolor) ............................................................................................
60
Resumo ......................................................................................................................... 60
Abstract ......................................................................................................................... 60
3.1 Introdução ..................................................................................................... 61
3.2 Desenvolvimento .......................................................................................... 63
3.2.1 Revisão bibliográfica .................................................................................... 63
3.2.2 Material e métodos ....................................................................................... 71
3.2.2.1 Obtenção e purificação da taxtomina A ....................................................... 71
3.2.2.2 Alterações ultraestruturais causados pela taxtomina A ............................... 73
3.2.2.2.1 Bioensaio com a fitotoxina ........................................................................... 73
3.2.2.2.2 Preparação de amostras para MET ............................................................. 73
3.2.2.2.3 Ultramicrotomia ............................................................................................ 74
3.2.2.3 Alterações bioquímicas causados pela taxtomina A .................................... 74
3.2.2.3.1 Bioensaio com a fitotoxina ........................................................................... 74
3.2.2.3.2 Avaliação da redução do crescimento ......................................................... 75
3.2.2.3.3 Quantificação de clorofilas A e B ................................................................. 75
3.2.2.3.4 Permeabilidade seletiva da membrana plasmática ...................................... 75
3.2.2.3.5 Bioensaio de fitoalexinas .............................................................................. 76
3.2.3 Resultados e discussão ............................................................................... 76
8
3.2.3.1 Alterações ultraestruturais causados pela taxtomina A ............................... 76
3.2.3.2 Alterações bioquímicas causados pela taxtomina A .................................... 80
3.2.3.3 Correlações entre as análises ultraestruturais e bioquímicas ...................... 84
3.3 Conclusões ................................................................................................... 86
Referências ................................................................................................................... 86
ANEXO .......................................................................................................................... 91
9
RESUMO
Resistência de cultivares de batata (Solanum tuberosum) à sarna comum
(Streptomyces spp.) e mecanismo de ação da fitotoxina taxtomina A em
sorgo (Sorghum bicolor ): aspectos bioquímicos e ultraestruturais
O gênero Streptomyces constitui-se em um grupo diferenciado de
procariotos fitopatogênicos, por serem morfologicamente similares aos fungos e
produzirem diversos importantes metabólitos secundários. A sarna comum da
batata é principal doença causada pelo gênero. O principal agente causal da
doença, Streptomyces scabies, produz fitotoxinas denominadas concanamicinas,
porém, não foi comprovada a importância da produção das mesmas na
agressividade dos isolados de S. scabies. Dessa forma, neste trabalho procurou-
se avaliar a reação dos cultivares mais plantados no Brasil a isolados de S.
scabies exibindo diferentes níveis de produção de concanamicinas. O nível de
produção de concanamicinas A e B de dez isolados de Streptomyces spp. foi
avaliado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e dois isolados (
produtor de alto nível da toxina; baixo produtor) foram selecionados e utilizados na
avaliação da resistência de seis cultivares de batata em casa de vegetação. Vasos
contendo o substrato esterilizado receberam a suspensão de esporos bacterianos
junto com os tubérculos sadios no momento do plantio e após quatro meses, a
severidade da doença foi avaliada. Os resultados demonstraram aumento na
agressividade do isolado produtor de elevadas quantidades de concanamicinas
apenas sobre os cultivares Mondial, Monalisa e Asterix. Por sua vez, os resultados
da avaliação do nível de resistência ao patógeno demonstraram que os cultivares
Monalisa, Ágata, Asterix e Cupido são suscetíveis e os cultivares Atlantic e
Mondial mostraram-se resistentes aos dois isolados de Streptomyces spp.
avaliados. Por outro lado, a fitotoxina taxtomina A é a toxina mais frequentemente
produzida pelas espécies fitopatogênicas de Streptomyces spp. O estudo do
mecanismo de ação desta fitotoxina poderá auxiliar no entendimento de sua
contribuição no desenvolvimento da doença. A taxtomina A é uma fitotoxina não
específica e causa efeitos semelhantes em plantas de diferentes famílias
botânicas. Desta forma, modificações citológicas, ultraestruturais e bioquímicas
induzidas pela taxtomina A foram analisadas em plântulas de sorgo. Os tecidos
foram tratados com taxtomina A e avaliados após sete dias do tratamento.
Observou-se desorganização em todas as células dos tecidos tratados com a
taxtomina A. A membrana plasmática das células do mesofilo foliar foi retraída e
destacada da parede celular em diversos pontos. Entretanto, o plasmalema não
pareceu rompido. O efeito sobre a permeabilidade seletiva da membrana
plasmática também foi avaliado bioquimicamente, onde foi observado aumentos
na saída de eletrólitos. Os cloroplastos apresentaram deformações na superfície e
perda de turgidez. Estas deformações provavelmente contribuíram para a redução
do teor de clorofilas A e B. As plântulas também apresentaram elevado acúmulo
10
de fitoalexinas do tipo deoxiantocianidinas. Desta forma, conclui-se que a
taxtomina A age principalmente sobre a membrana plasmática e organelas
membranosas. Em contrapartida, o acúmulo de fitoalexinas evidencia que
concentrações mínimas desta toxina podem ser exploradas como eliciador da
resposta de defesa em plantas.
Palavras-chave: Streptomyces spp.; Solanum tuberosum; Sorghum bicolor;
Taxtomina A; Concanamicinas; Sarna comum da batata;
Microscopia eletrônica de transmissão
11
ABSTRACT
Resistance of potato cultivars (Solanum tuberosum) to common scabies
(Streptomyces spp.) and action mechanism of the phytotoxin thaxtomin A in
sorghum (Sorghum bicolor): biochemical and ultrastructural aspects
The genus Streptomyces is a different prokaryote phytopathogen group,
being morphologically similar to fungi and able to produce several important
secondary metabolites. The potato common scabies is the main plant disease
caused by the members of the genus. The main causal agent of the plant disease,
Streptomyces scabies, is able to produce the phytoxins concanamycins. However,
the importance of these toxins in the aggressiveness of S. scabies strains was not
proven. This research aimed to evaluate the reaction of main potato cultivars used
in Brazil to Streptomyces spp. strains, exhibiting different levels of concanamycins
production. The toxin production by several strains was quantified by high
performance liquid chromatography (HPLC) and two strains (higher and lower
producers) were chosen and used for resistance evaluation of six potato cultivars
under greenhouse. Pots containing sterile substratum received a suspension of
bacterial spores and the healthy seed tubers at the same time. After four months,
the level of disease was evaluated and the results showed increasing in
aggressiveness for the higher concanamycins producer only in the Mondial,
Monalisa and Asterix cultivars. For the two strains, the cultivars Atlantic and
Mondial were resistant and the cultivars Monalisa, Cupido, Ágata and Asterix were
susceptible. On the other hand, the thaxtomin A is the main phytotoxin of plant
pathogenic Streptomyces spp. Therefore, the study of the thaxtomin A action
mechanism is important to explain its contribution to disease development. The
thaxtomin A is not a specific toxin and causes similar effect in several plants of
different botanical families. Thus, the cytological, ultrastructural and biochemical
modifications induced by thaxtomin A were evaluated in sorghum seedlings. Leaf
tissues of seedlings were treated with high levels of thaxtomin A and evaluated 7
days after treatment. Cytological disorganization was observed in all treated cells.
The plasmma membrane of the cells of immature leaves was detached from the
wall in several places. However, plasmmalema did not seem degraded. The
chloroplasts had showed significant deformations in the surface and volume
reduction. Theses changes in chloroplasts probably contributed for the reduction of
chlorophylls A and B levels. The sorghum seedlings also showed high phytoalexin
accumulation (deoxiantocianydins) in response to thaxtomin A treatment. Thus, the
thaxtomin A acts mainly on plasmma membrane and membranous organelles,
causing plasmolises, cell disorganization, deformations in chloroplasts and
chlorophyll reduction in sorghum seedlings. Finally, the accumulation of
phytoalexins in response to thaxtomin A treatment points out it potential to induce
resistance in plants.
12
Keywords: Streptomyces spp.; Solanum tuberosum; Sorghum bicolor;
Concanamycins; Thaxtomin A; Potato common scab; Electron
transmission microscopy
13
1 INTRODUÇÃO
O gênero Streptomyces constitui-se em um grupo diferenciado de
fitopatógenos se distinguindo dos demais procariotos por serem filamentosos, não
septados, como os fungos (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004; LORIA et al.,
2008). O gênero é conhecido pela capacidade de produção de metabólitos
secundários, destacando-se diversos antibióticos, como a estreptomicina
(GOODFELLOW; WILLIAMS; MORDARSKI, 1988; MADIGAN; MARTINKO;
PARKER, 2004). Estes compostos auxiliam na sobrevivência destas bactérias e
garantem a competitividade com a microbiota no solo. Outro metabólito conhecido
como abamectina, princípio ativo do Vertimec
®
, foi isolado de Streptomyces
avermectilis, sendo amplamente utilizado como acaricida e inseticida na
agricultura. Os genes que codificam estes compostos já foram clonados e
caracterizados (MURACAMI et al., 1986).
Fitotoxinas são compostos secundários de baixa massa molecular
produzidos por fitopatógenos com a capacidade de afetar o metabolismo da célula
da hospedeira e/ou sua estrutura, a ponto de causar a sua morte. As fitotoxinas
não têm ação enzimática ou hormonal, mas interferem com a seletividade e/ou a
estrutura das membranas plasmática, do retículo endoplasmático e das organelas,
como mitocôndrias e cloroplastos. Podem ainda agir como inibidores enzimáticos
ou funcionar como antimetabólitos, provocando deficiências nutricionais (DURBIN,
1981).
As espécies fitopatogênicas do gênero Streptomyces, possuem seu
mecanismo de patogenicidade ligado a produção de fitotoxinas, dentre as quais se
destacam as concanamicinas e a taxtomina A. As concanamicinas são toxinas que
se classificam como não-seletiva ou não-específica capaz de causar danos em
diferentes culturas de diferentes famílias botânicas. Bioensaios com esta fitotoxina
purificada mostraram drástica redução de crescimento em plântulas de alfafa,
arroz e rabanete (NATSUNAME et al. 2005). As concanamicinas são inibidores da
ATPase, não só de plantas, mas também de vários microrganismos (HUSS et al.,
2002) e sua produção foi relatada apenas para S. scabies., principal agente causal
da sarna comum da batata. Em contrapartida, as taxtominas foram relatadas para
14
maioria das espécies fitopatogênicas. Apesar de sua importância, o mecanismo de
ação da taxtomina A, ainda não é perfeitamente conhecido. Esta atua
principalmente sobre a deposição de celulose na parede de células vegetais e
altera a permeabilidade seletiva da membrana plasmática (LORIA; KERS; JOSHI,
2006; LORIA et al., 2008). Secções transversais das raízes e dos caules de
plantas tratadas com taxtomina A revelaram que o tecido sofre deformações
devido à hipertrofia celular, mas, não ocorrendo aumento no número de células
(LEINER et al., 1996). Células meristemáticas de raízes de batata tratadas com
taxtomina A apresentaram a atividade mitótica reduzida, bem como a
desorganização dos cromossomos condensados (LORIA et al., 1997). Em
contrapartida, a fitotoxina taxtomina A tem demonstrado propriedades eliciadoras,
provocando acúmulo de fitoalexinas em sorgo (Sorghum bicolor) e induzindo
resistência em plantas (GARCIA; PASCHOLATI; ALMEIDA, 2007). Por se tratar de
um dipeptídio, sua absorção e translocação nas plantas é facilitada, além disso, a
taxtomina A em baixas concentrações pode causar hipertrofia em tecidos vegetais
(FRY; LORIA, 2002).
Durante os últimos 20 anos, diversas revisões abordaram a seleção in
vitro de genótipos de plantas resistentes a doenças (HELGESON ; DEVERALL,
1983; WENZEL, 1985; DAUB, 1986) e a utilização de fitotoxinas na seleção de
plantas resistentes a fitopatógenos (DURBIN, 1981; HENSEL; HOLDEN, 1996;
WALTON, 1996; HUANG, 2001). O avanço da biotecnologia e a utilização destes
compostos fitotóxicos poderão auxiliar na seleção de plantas resistentes ao
patógeno. Assim, uma direção interessante para estes estudos é a seleção de
material vegetal resistente em sistemas in vitro e a conseqüente aplicação no
controle genético da doença (LEBEDA et al., 2001).
A resistência varietal representa uma das principais formas de controle de
doenças. O controle genético proporciona redução no uso de defensivos e o
conseqüente aumento de lucro para o produtor. A sarna comum da batata era uma
doença considerada por muitos anos sem importância no Brasil, mas
recentemente, a sua importância vem crescendo. A literatura descreve perdas de
até 83% para alguns dos cultivares de batata mais plantados no Brasil (NUNES,
15
2002). O histórico da cultura da batata no Brasil indica um aumento no número de
reclamações sobre a ocorrência da sarna comum nestes últimos anos (FISCHER
et al., 2005), a qual constitui-se em doença de elevada gravidade seja pelos
prejuízos causados ou pela dificuldade de seu controle. Adicionalmente, no Brasil,
não se conhece o grau de resistência das cultivares de batata mais importantes à
sarna comum.
Neste trabalho foram conduzidos experimentos objetivando verificar a
resistência de cultivares de batata a isolados de Streptomyces spp. exibindo
diferentes níveis de produção de concanamicinas, o desenvolvimento de um
método in vitro utilizando a taxtomina A para seleção de genótipos resistentes ao
patógeno e o estudo do mecanismo de ação da taxtomina A, avaliando-se
alterações bioquímicas, fisiológicas e ultraestruturais em tecidos de sorgo.
Referências
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18
2 RESISTÊNCIA DE CULTIVARES DE BATATA À ISOLADOS DE
Streptomyces spp. EXIBINDO DIFERESTES NÍVEIS DE PRODUÇÃO DE
CONCANAMICINAS, E SENSIBILIDADE DE TUBÉRCULOS Á FITOTOXINA
TAXTOMINA A
Resumo
A sarna comum da batata é causada por diferentes espécies bacterianas
pertencentes ao gênero Streptomyces. Os prejuízos causados pela doença em
nosso país são pouco conhecidos em função da ausência de levantamentos.
Porém, recentemente a ocorrência desta doença começou a crescer e
consideráveis perdas foram relatadas. A avaliação do nível de resistência dos
principais cultivares de batata plantados no Brasil é necessário para o controle
genético da doença. O principal agente causal da doença, Streptomyces scabies,
produz um tipo de fitotoxina, denominada concanamicinas, isolada de lesões de
sarna comum. Porém, até o momento não foi comprovada a importância da
produção das concanamicinas na agressividade dos isolados de S. scabies.
Dessa forma, neste trabalho procurou-se avaliar a reação dos cultivares de batata
mais plantados no Brasil a isolados de Streptomyces spp. com diferentes níveis de
produção de fitotoxinas. O nível de produção de concanamicina A e B de dez
isolados de Streptomyces spp. foi avaliado por cromatografia líquida de alta
pressão (HPLC). Dois isolados foram selecionados, sendo o primeiro produtor de
alta quantidade de concanamicinas e o segundo baixo produtor. Estes isolados
foram utilizados para avaliação da resistência dos seis cultivares de batata, sendo
que após quatro meses, os resultados demonstraram aumento na agressividade
do isolado produtor de altos níveis de concanamicinas apenas sobre os cultivares
Mondial, Monalisa e Asterix. Os cultivares Monalisa, Ágata, Asterix e Cupido
mostraram-se suscetíveis e os cultivares Atlantic e Mondial mostraram-se
resistentes aos dois isolados avaliados. Foram também realizados ensaios
visando avaliar a sensibilidade de tubérculos dos cultivares de batata á fitotoxina
taxtomina A. Os resultados demonstraram similaridade da reação ao patógeno e a
sensibilidade á taxtomina A. Desta forma, se conclui que outros fatores podem
estar envolvidos, além da produção de fitotoxinas na agressividade dos isolados
de Streptomyces spp.
Palavras-chave: Solanum tuberosum; Taxtomina A; Concanamicinas; Sarna
comum da batata; Streptomyces spp.
19
RESISTANCE OF POTATO CULTIVARS TO Streptomyces spp. EXHIBTING
DIFFERENT LEVELS OF CONCANAMYNS PRODUCTION, AND SENSIBILITY
OF POTATO TUBERS TO THAXTOMIN A
Abstract
Potato common scab is caused by different bacterial species from the genus
Streptomyces. In Brazil, the losses caused by this disease are unknown yet.
However, recently the occurrence of the disease started to increase. The
evaluation of the resistance levels of the main potato cultivars grown in Brazil is
necessary to disease control. The main causal agent of the plant disease,
Streptomyces scabies, produces the phytotoxins concanamycins. However, the
importance of this phytotoxin production in the aggressiveness is not proven yet.
Thus, this work evaluated the reaction of potato cultivars planted in Brazil against
Streptomyces spp. strains with different levels of phytotoxin production. The
production level of concanamicyns A and B from ten Streptomyces spp. strains
was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). Two strains
were selected, the first a higher producer and the second one a lower
concanamycins producer. The same strains were used to evaluate the resistance
of six potato cultivar under green house. After four months, the results showed
increased aggressiveness for the higher concanamycins producer only in the
Mondial, Monalisa and Asterix cultivars. For the two strains, the cultivars Atlantic
and Mondial were resistant and cultivars Monalisa, Cupido, Ágata and Asterix were
susceptible. An assay for thaxtomin A sensibility was also carried out with sections
of potato tubers. The results were similar to these seen for the pathogen
aggressiveness and the potato thaxtomin sensibility. Thus, it is concluded that
other factors can be involved in aggressiveness, besides the phytotoxins
production in Streptomyces spp. strains.
Keywords: Potato common scab; Streptomyces spp.; Solanum tuberosum;
Concanamicyns; Thaxtomin A
2.1 Introdução
O principal objetivo da fitopatologia é o controle de doenças de plantas, o
que gera grande investimento em pesquisa. Portanto, o controle e a prevenção
das doenças devem ser considerados no uso de medidas que reduzam o impacto
ambiental. O uso de cultivares resistentes proporciona redução no uso de
20
defensivos e o conseqüente aumento de lucros para o produtor e a redução no
impacto ambiental (CAMARGO; BERGAMIN FILHO, 1995).
O histórico da cultura da batata no Brasil indica um aumento no número de
reclamações sobre a ocorrência da sarna comum nestes últimos anos (FISCHER
et al., 2005), a qual constitui-se em doença de elevada gravidade seja pelos
prejuízos causados ou pela dificuldade de seu controle. Adicionalmente, não se
conhece em nosso meio, o grau de resistência dos cultivares de batata à sarna
comum.
A sarna comum é uma doença relatada em todas as áreas produtoras de
batata do mundo (LORIA et al., 1997). Visto que a cultura da batata ocupa lugar
de destaque na economia mundial entre as demais culturas destinadas a
alimentação, a sarna comum se constitui em fator de perdas econômicas.
Os mecanismos de defesa das plantas envolvem barreiras químicas pré e
pós-formadas que conferem resistência a uma variedade de patógenos. Os
mecanismos de ataque dos patógenos envolvem um arsenal bioquímico, onde se
podem destacar as toxinas. Porém, as toxinas produzidas por bactérias
fitopatogênicas possuem papel potencial na seleção in vitro de genótipos de
plantas resistentes a doenças (LEBEDA et al., 2001).
S. scabies, principal agente causal da sarna comum da batata, produz dois
tipos de fitotoxinas, denominadas concanamicinas e taxtominas (NATSUNAME et
al., 2005). A literatura descreve uma correlação entre os níveis de produção de
taxtomina A e a capacidade de causar doença pelos isolados do patógeno (KING
et al., 1996). Porém, recentemente, alguns trabalhos científicos evidenciaram a
possível participação de outros fatores, como a produção de concanamicinas,
enzimas, entre outros, na agressividade dos isolados Desta forma, é necessário
se avaliar a influencia de outros fatores na agressividade dos isolados de
Streptomyces spp (PARK et al., 2003).
Este trabalho avaliou o nível de resistência á sarna comum dos principais
cultivares de batata plantados no Brasil, utilizando-se isolados de Streptomyces
spp. com diferentes níveis de produção de concanamicinas, avaliando-se a
participação desta toxina na agressividade dos mesmos. Procurou-se também
21
desenvolver um teste in vitro utilizando a taxtomina A, como ferramenta auxiliar na
seleção de cultivares de batata resistentes á sarna comum.
2.2 Desenvolvimento
2.2.1 Revisão Bibliográfica
2.2.1.1 Importância econômica da cultura da batata
A cultura da batata (Solanum tuberosum L.) atualmente ocupa o quarto
lugar em importância mundial entre as culturas destinadas à alimentação
(FIGUEIRA, 2003). A produção brasileira de tubérculos é de aproximadamente 2,9
milhões de toneladas provenientes de uma superfície cultivada de 135.000
hectares (FAO, 2008). O Estado de São Paulo contribui com aproximadamente
780.000 ton distribuídas em 32.000 ha (BRASIL, 2008). A cadeia produtiva
envolve considerável volume de recursos e significativa mão-de-obra, estimando-
se que 25.000 famílias ocupam-se diretamente na produção (PEREIRA; DANIELS,
2003). Em relação ao custo de produção da cultura, os principais componentes
são: sementes (35 %), fertilizantes (15 %), defensivos (15 %) e mão-de-obra (10
%) (EMBRAPA, 1999). Neste cenário, a preocupação em melhorar a qualidade
fitossanitária e reduzir os custos de produção é uma constante dos pesquisadores
(FAVORETTO, 1990).
2.2.1.2 Sarna comum da batata e espécies de Streptomyces relacionadas
A sarna comum da batata se caracteriza pela formação de lesões
corticosas, superficiais ou profundas, as quais causam depreciação dos
tubérculos, especialmente aqueles destinados ao comércio in natura (SOUZA
DIAS; IMAUTI, 2005). Esta doença é causada por bactérias pertencentes a
diferentes espécies do gênero Streptomyces, as quais são Gram positivas,
formadoras de esporos em cadeias e pseudomicélio filamentoso, estruturas estas
normalmente encontradas em fungos. As cadeias de esporos originam-se a partir
22
da fragmentação de hifas aéreas que se formam acima do substrato. A forma da
cadeia de esporos, espiralada ou retilínea, é uma importante característica
taxonômica (SHIRLING; GOTTIEB, 1966; LORIA et al., 2001). A espécie mais
comum, relatada em diferentes regiões onde a batata é cultivada, é Streptomyces
scabies (Thaxt.) Lambert & Loria (LORIA et al., 1997). No Brasil, acredita-se que
está espécie também seja a mais freqüente, porém demanda-se de levantamentos
que confirmem essa informação.
Espécies de Streptomyces constituem-se em grupo distinto de
fitopatógenos, possuindo características similares as dos fungos. Seus filamentos
penetram e colonizam a matéria orgânica presente no solo. A nutrição se dá pela
secreção de enzimas hidrolíticas, que degradam o substrato orgânico quebrando-o
em moléculas assimiláveis (LORIA; KERS; JOSHI, 2006). Estas bactérias são
gram positivas e possuem alta proporção de guanina e citosina no DNA, e muitas
espécies possuem apenas um único cromossomo linear (LIN et al., 1993).
Mais de 500 espécies de Streptomyces já foram descritas, sendo a grande
maioria representada por saprófitas. Com comentado, apenas uma pequena parte
destas espécies são fitopatogênicas, sendo as infecções limitadas aos órgãos
subterrâneos e os primeiros sintomas que aparecem são do tipo necrótico (LORIA
et al., 1997).
Outras espécies do gênero Streptomyces podem atacar a batata, causando
sintomas do tipo sarna comum ou lesões superficiais. Ao todo pelo menos 13
espécies distintas de Streptomyces incidem sobre a cultura: S. scabies, S.
acidiscabies, S. caviscabies, S. turgidiscabies, S. euroeiscabiei, S. stelliscabiei, S.
reticuliscabiei, S. luridiscabiei, S. puniciscabiei, S. niveiscabiei, S. aureofaciens, S.
setonii e S. sampsonii. Destaca-se também Streptomyces ipomoeae que ataca a
batata-doce (DESTÉFANO; RODRIGUES NETO, 2006). As espécies de
Streptomyces que infectam a batata podem também atacar outras culturas como
beterraba, rabanete, repolho, nabo amendoim, salsa e cucurbitáceas (JONES,
1931; LORIA et al., 1997).
As interações entre as diferentes espécies de Streptomyces exibindo
distintos graus de agressividade e variabilidade fisiológica, com as diferentes
23
variedades de batata exibindo diferentes níveis de resistência ao patógeno, podem
dar origem a diferentes sintomas, além da sarna comum. Um deles é a sarna
reticulada caracterizada por lesões superficiais necróticas e ásperas limitadas à
periderme do tubérculo, as quais assumem aspecto de rede (BANG, 1979;
SCHOLTE; LABRUYERE, 1985). Porém, estas nunca ocorrem em elevação ou
profundidade como a sarna comum. Uma variante da sarna reticulada é a sarna
ferruginosa, que adicionalmente às lesões com aspecto de rede, apresenta
coloração avermelhada nas regiões sintomáticas (HARRISON, 1962).
Adicionalmente à S. scabies, as espécies S. aureofacies e S. griseus são listadas
como responsáveis pela sarna reticulada e ferruginosa (FAUCHER et al., 1993).
No Brasil, a sarna comum e a reticulada podem causar significativas perdas
econômicas, porém relatos a respeito da ocorrência desses patógenos em nosso
meio são escassos. Estudos envolvendo a identificação de isolados nacionais são
de extrema importância para o conhecimento das populações que ocorrem em
nosso meio, sendo indispensáveis para estudos epidemiológicos, bem como para
a elaboração de estratégias de controle da doença (DESTÉFANO; RODRIGUES
NETO, 2006).
2.2.1.3 Fitotoxinas de Streptomyces spp.
Fitotoxinas são moléculas de baixo peso molecular (<1000 daltons), e
ativas em baixas concentrações fisiológicas (10
-6
– 10
-8
M) (GOODMAN; KIRALY;
WOOD, 1986). Estas podem interferir em passos metabólicos essenciais a planta
e/ou desencadear mecanismos de defesa da mesma (PASCHOLATI, 1995).
Fitobactérias sintetizam toxinas por uma questão de sobrevivência
(JENNINGS et al., 1998). Uma vez que as plantas são reservatórios abundantes
de nutrientes, a produção de fitotoxinas é um das muitas e sofisticadas
ferramentas de que o patógeno dispõe para combater os mecanismos de defesa
da planta e poder utilizar esses nutrientes. Do ponto de vista do fitopatógeno, se é
que ele tem um, a planta é apenas mais um habitat ou um nicho repleto de
nutrientes que ele pode utilizar se conseguir (ABRAMOVITCH; MARTIN, 2004).
24
As fitototoxinas bacterianas são compostos de classificação química
variada, sendo que todas as fitotoxinas são não seletivas, sendo ativas a diversas
famílias botânicas (JENNINGS et al., 1998).
Especulações a respeito da possível produção de fitotoxinas como
mecanismo de patogenicidade de Streptomyces datam do início do século
passado (FELLOWS, 1926). Porém, a confirmação dessa hipótese somente
concretizou-se com o trabalho de Russel King e colaboradores (KING et al., 1989),
que isolaram e caracterizaram uma fitotoxina responsável pela necrose de tecidos
de tubérculos de batata. A fitotoxina teve a sua estrutura definida e caracterizada
como sendo uma molécula de 4-nitroindol-3-il contendo 2,5-dioxopiperazina, um
dipeptídeo (Figura 1 A), derivado da fenilalanina e um aminoácido triptofano com
radical nitrato (KING et al., 1989) (Figuras 1 B e C). A biosíntese da taxtomina, um
dipeptídio, ocorre por via não-ribosomal (LORIA et al,. 2008). Esta fitotoxina
passou a ser chamada de “Taxtomina” em homenagem ao pesquisador Roland
Thaxter, o qual foi o primeiro a estabelecer a relação entre S. scabies e a sarna da
batata (KING; LAWRENCE, 1996).
A hipótese que sustenta a taxtomina como sendo uma das principais
características responsáveis pela patogenicidade de Streptomyces é a correlação
existente entre a produção da toxina e a agressividade do respectivo isolado
Figura 1 -
Estruturas da taxtomina (A), principal fitotoxina de Streptomyces spp., e dos aminoácido
que a compõem: aminoácido triptofano com um radical nitrato (B) e a fenilalanina (C)
A
B
C
25
(KING et al., 1991). Mutantes de S. scabies, com reduzida produção da fitotoxina,
mostraram-se também menos agressivos ou mesmo não patogênicos (GOYER et
al., 1998). Taxtominas são fitotoxinas do tipo não seletivas uma vez que em baixas
concentrações (0,1 µM) interferem no crescimento de plantas de diferentes
famílias botânicas, sejam estas mono ou dicotiledôneas (LEINER et al., 1996).
Healy et al. (2000) compararam os sintomas obtidos pelo tratamento de
tubérculos de batata imaturos, utilizando o extrato do filtrado do meio cultivo de
isolados de S. acidiscabies em meio líquido, reproduziram sintomas análogos aos
da inoculação do patógeno. Os mesmos autores justificam a reprodução destes
sintomas pelo fato da bactéria produzir taxtomina A no meio de cultivo.
A análise molecular de genes ligados a patogenicidade em S. scabies
esclareceu a base genética das doenças classificadas como sarna comum e sarna
profunda (LORIA; KERS; JOSHI, 2006). Com base no conhecimento atual do
mecanismo da ação e da sintomatologia proporcionada pelas taxtominas, pode-se
afirmar que a grande maioria das espécies de Streptomyces que induzem estes
sintomas possui a capacidade de sintetizar taxtominas confirmada. As espécies de
Streptomyces que produzem somente sintomas de sarna reticulada ou de sarna
ferruginosa são excluídas desta generalização. Dessa maneira, essas doenças
são causadas por outras espécies de Streptomyces, com exceção daquelas que
causam a sarna comum, e a produção de taxtominas não esta envolvida na
patogenicidade. A presença de infecções na raiz parece ser importante para o
aparecimento da doença ocasionada pelos agentes causais da sarna reticulada ou
ferruginosa.
Atualmente, é conhecida mais de uma dezena de diferentes análogos de
taxtominas (Figura 2) (LORIA et al., 1997). Um mesmo isolado de Streptomyces
spp. pode produzir diferentes análogos, porém, a taxtomina A é encontrada em
maior proporção em tecidos sintomáticos de batata. Segundo King et al. (1991), a
proporção de taxtomina A em relação a taxtomina B, o segundo análogo mais
abundante, é de 20:1.
26
Figura 2 - Estruturas das taxtominas produzidas por espécies fitopatogênicas de
Streptomyces. Taxtomina A (composto n°1) é a mais abundante destas
fitotoxinas produzidas por S. scabies em tecidos de batata. Por sua vez, a
taxtomina C (composto n°3) é produzida por S. ipomeae, agente causal da
sarna em batata doce.
(Adaptado de LORIA et al., 1997)
Composto R
1
R
2
R
3
R
2
R
4
R
5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
27
As lesões de sarna em batata-doce são causadas por S. ipomoeae, que
produz principalmente as taxtomina C e A. As diferenças na regulação da
produção da toxina, dos locais de infecção e da gama de hospedeiros tornam esse
sistema interessante para a análise comparativa entre os agentes causais da
sarna da batata. Entretanto, a análise genética das características patogênicas em
S. ipomoeae ainda está incompleta (LORIA; KERS; JOSHI, 2006).
Segundo Loria et al. (1995), as taxtominas podem ser produzidas tanto em
secções de tubérculos de batata quanto em meio de cultivo in vitro. Estes autores
quantificaram a produção de taxtomina A produzida pelo patógeno, a partir do seu
cultivo em diferentes meios de cultura e observaram que o caldo obtido a partir da
cocção de grãos de aveia em água, proporcionaram os resultados mais
reprodutíveis para diferentes isolados do patógeno.
Além das taxtominas identificadas por King et al. (1992), S. scabies,
principal agente causal da sarna comum da batata, também produz um segundo
tipo de toxinas chamadas de concanamicinas (NATSUNAME et al., 1996, 1998,
2001, 2005). A função das concanamicinas na agressividade dos isolados ainda
não foi completamente esclarecida. Os análogos mais comuns são
concanamicinas A e B (Figura 3).
Concanamicina A
Concanamicina B
Figura 3 - Estrutura moleculares das fitotoxinas conacanamicina A e B, produzidas por
Streptomyces scabies.
28
As concanamicinas são toxinas que se classifica como não-seletiva ou não-
específicas capazes de causar danos em diferentes culturas de diferentes famílias
botânicas. Bioensaios com esta fitotoxina purificada mostraram redução de
crescimento em plântulas de alfafa, arroz e rabanete. Sabe-se que o principal
mecanismo de ação das concanamicinas é a inibição da ATPase em estruturas ou
organelas membranosas, como os vacúolos (HUSS et al., 2002). Porém este e
outros mecanismos de ação, bem como o efeito sobre plântulas de diferentes
famílias botânicas, ainda não foram completamente esclarecidos (HUSS et al.,
2002; NATSUNAME et al., 2005).
Em vistas dos resultados obtidos para os vários agentes causais da sarna
comum, nos quais se observou a capacidade de produção de fitotoxinas e o
envolvimento destas no mecanismo de agressividade/patogenicidade, Natsuname
et al. (2005), isolaram uma nova toxina presente em lesões de sarna ferruginosa
em tubérculos de batata no Japão, as toxinas FD-891 (Figura 4).
FD-891
Figura 4 - Estrutura da fitotoxina FD-891 produzida por Streptomyces chelomiomii e
Streptomyces sp, agentes causais da sarna ferruginosa da batata
Foi constado que isolados de Streptomyces spp. e S. chelloniomii, agentes
causais da sarna ferruginosa produziam a fitotoxina FD-891 também in vitro em
condições análogas das de produção de taxtominas e concanamicinas (Tabela 1).
Esta toxina também pertence a família das macrolinas, como as concanamicinas.
Constatou-se que a capacidade de causar lesões em secções de tubérculos de
29
batata do cultivar Irish Cobbler é 100 vezes menor do que a da taxtomina A
(Figura 5) (NATSUNAME et al., 2005).
Apesar de possuírem estrutura molecular diferentes, ambas as toxinas
produzidas por espécies fitopatogênicas de Streptomyces spp. possuem ação e
sintomas destas toxinas sobre diferentes plântulas são semelhantes, provocando
redução de crescimento em plântulas tratadas com as mesmas (Figura 6).
Tabela 1 - Produção de fitotoxinas por espécies de Streptomyces, agentes causais da sarna
comum e da sarna ferruginosa.
(Adaptado de NATSUNAME et al., 2005)
Produção de fitotoxina
(µg/mL de meio)
Isolado Origem
geográfica
Taxtomina A Concanamicina A + B FD-891
Agentes causais da sarna comum
S. scabies JCM 7914T
S. acidiscabies JCM 7913T
S. turgidiscabies IFO 16080T
EUA
EUA
Japão-Hokkaido
2,50
5,31
2,37
0,086
Nd
Nd
Nd
a
Nd
Nd
Agentes causais da sarna ferruginosa
S. cheloniumii MAFF 304020
Streptomyces sp.
MAFF 225003
MAFF 225004
MAFF 225005
MAFF 225006
Japão-Chiba
Japão-Chiba
Japão-Chiba
Japão-Hokkaido
Japão-Ibaraki
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
1,7
12,5
0,1
0,7
6,1
a
Nd - Não detectado. Limite de detecção de 0,003 ug/mL para taxtomina A; 0,002 ug/mL para concanamicina A + B;
0,004 ug/mL para FD-891.
30
Figura 5 - Atividade necrótrófica da fitotoxina FD-891 e da taxtomina A em discos de tubérculos
de batata 72 horas após a aplicação das mesmas
(Adaptado de NATSUNAME et al., 2005)
Figura 6 - Efeito da taxtomina A, concanamicinas A e B e toxina FD-891 em plântulas de arroz
(Oryza sativa), rabanete (Raphanus sativus) e Alfafa (Alfafa sp.). Cada barra
representa a média de 9 plântulas
(Adaptado de NATSUNAME et al., 2005)
31
As condições favoráveis para a produção de toxinas pelos isolados de
Streptomyces spp. muitas vezes podem ser similares as do crescimento, produção
de hifas aéreas ou esporulação favoráveis no solo. As condições do solo
adequadas para a ocorrência da sarna da batata têm sido por muito tempo um
tópico de estudo (KEINATH; LORIA, 1989; LORIA et al., 2001). Horsfall e
colaboradores relataram que a severidade da sarna da batata é inversamente
proporcional ao pH do solo e relacionada ao índice do cálcio solúvel nos solos
(HORSFALL et al., 1954). Goto (1985) também descreveu que a severidade desta
doença é afetada pelo pH do solo e pelo teor de cálcio solúvel. Outros autores
discordaram, afirmando que a incidência de sarna está correlacionada com o solo
pH mas não com a concentração do cálcio. Davis et al. (1976) relataram que o
tratamento do solo com fosfato reduziu a porcentagem de sarna, além de mudar a
morfologia das lesões. As diferenças nos resultados obtidos sobre o
relacionamento entre as condições do solo e o aparecimento da sarna da batata
podem ser atribuídas à diversidade do patógeno. A diferenciação das hifas aéreas
dos actinomicetos, geralmente está relacionada à produção de metabólitos
secundários, bem como a esporulação responsável para a propagação da doença
no solo.
Natsuname et al. (2001) avaliaram a influencia do pH, fonte de fósforo,
cálcio e temperatura sobre a produção das toxinas por S. scabies e S.
acidiscabies. Para tanto, avalio-se a produção de taxtomina A e concanamicinas
em meio de aveia-ágar. Os resultados demonstraram a influência destes fatores
na produção de toxinas e que a variabilidade genética dos isolados
proporcionaram níveis de influência distintos destes fatores na produção das
toxinas (Figura 7).
32
Figura 7 - Crescimento bacteriano e produção de taxtomina A e concanamicina por quatro isolados de
Streptomyces spp., causadores da sarna da batata. Os isolados foram pré-incubados em
meio de aveia líquido e crescidos em 28°C por 3 dias em agitador orbital (150 rpm). Uma
alíquota de 0,5 mL foi adicionada a 10 placas (9 cm diâmetro) contendo 10 mL de meio
de aveia-ágar (pH 6.5) (meio basal) ou meio modificado. As placas foram incubadas a
28°C por 14 dias. A massa micelial foi separada do meio em água quente (70°C), filtrado
e avaliada através de pesagem. A produção de fitotoxinas foi determinada por
cromatografia líquida (HPLC) usando culturas provenientes de cinco placas de Petri. A
produção de concanamicina está expressa pela somatória da quantidade total do
concanamicina A e B.
Legendas: Controle (meio de aveia-ágar padrão); EGTA (etileno glicol tetraacético ácido,
agente quelante de Ca
2+
); Fonte de fosfato (tampão KH
2
PO
4
- Na
2
HPO
4
, pH 6.5).
*não detectado (aproximadamente 0.2 pg / placa para os valores de concentração de
concanamicinas A + B)
(Adaptado de NATSUNAME et al., 2001).
33
2.2.2 Material e Métodos
2.2.2.1 Resistência de cultivares de batata á sarna comum
2.2.2.1.1 Planta teste
Foram usados tubérculos sadios de batata (Solanum tuberosum L.) das
cultivares Ágata, Asterix, Cupido, Monalisa, Mondial e Atlantic, por serem estas as
mais plantas atualmente no país (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA BATATA -
ABBA, 2006). Os tubérculos sadios dessas variedades foram fornecidos pela
Associação Brasileira da Batata (ABBA), Itapetininga/SP.
2.2.2.1.2 Isolados de Streptomyces spp.
Nestes ensaios foram utilizados dez isolados de Streptomyces spp obtidos
de diferentes cultivares de batata (Tabela 2), provenientes da Coleção de Culturas
de Fitobactérias do Instituto Biológico de São Paulo (IBSBF), Campinas, SP.
34
Tabela 2 – Identificação e procedência dos isolados de Streptomyces spp. utilizados no ensaio de
seleção com base no nível de produção de fitotoxinas.
2.2.2.1.3 Produção e extração das fitotoxinas
Para a produção e extração das fitotoxinas concanamicinas (A e B) e
taxtomina A, foi adotada a metodologia de Loria et al. (2001). Os isolados,
preservados por liofilização, foram resuspensos em solução salina (NaCl 0,85 %),
previamente esterilizada por autoclavagem, e semeados na superfície de meio
extrato de aveia ágar, sendo mantidos por 20 dias em temperatura de 28
o
C.
Para a caracterização da produção de fitotoxinas dos isolados, os mesmos
foram cultivados em meio de cultura de extrato de aveia liquido contido em
erlenmeyers de 250 mL. O referido meio foi obtido pela cocção de 40 g de aveia
por 20 min em água, sendo posteriormente filtrado em gaze, sendo o volume
completado para 1000 mL e o pH ajustado em 7,2, através da adição de solução
Isolado
Procedência
(n° IBSBF)
(País e/ou Estado)
(Cultivar)
2472
Holanda
Caesar
2499
Holanda Baraka
2509
França Eden
2147
Brasil, BA Monalisa
2
2
5
5
0
0
1
1
Brasil, SP Monalisa
2502
Brasil, SP
AÁgataA
2524
Brasil, MG Monalisa
2
2
5
5
0
0
3
3
Brasil, BA Monalisa
2500
Brasil, SP Monalisa
2507
Brasil, BA
AÁgataA
IBSBF - Instituto Biológico de São Paulo, Bactérias Fitopatogênicas
35
de NaOH 1 M. Cada erlenmeyer recebeu 100 ml de meio de aveia líquido e 3
discos de micélio, obtidos com furador de rolha, de regiões uniformes e
intensamente esporuladas das respectivas colônias de cada isolado de
Streptomyces spp., e cultivadas em placas de Petri, com meio sólido de extrato de
aveia ágar (28
o
C; 20 dias).
Cada isolado foi cultivado em triplicata sob agitação orbital (150 rpm) em
temperatura de 28
o
C por 4 dias, quando o conteúdo de cada frasco foi filtrado em
papel de filtro Whatmann n
o
1. De cada repetição, 15 mL do filtrado foi transferido
para um funil de separação, onde se procedeu a extração da toxina com 25 mL de
acetato de etila. A seguir, foi coletada a fração referente ao acetato de etila e o
filtrado submetido novamente à extração em mais 25 mL do solvente. As duas
fases de acetato de etila, contendo a taxtomina A, foram combinadas,
desidratadas com sulfato de sódio anidro, e o solvente evaporado sob vácuo. O pó
resultante foi resuspenso em 2 mL de metanol e armazenado para a realização
dos ensaios e posterior comparação do nível de produção de fitotoxinas entre os
10 isolados.
2.2.2.1.4 Identificação da fitotoxina taxtomina A
A taxtomina A foi identificada por cromatografia de camada delgada -TLC
(TLC= Thin layer chromatography), conforme a técnica usada por Goyer et al.
(1998). Para tanto, os extratos provenientes dos diferentes isolados foram
aplicados em placas de TLC, contendo sílica gel 60 em espessura de 250 µm. O
solvente utilizado foi clorofórmio/metanol na proporção de 9:1 (v/v). A taxtomina A
foi identificada com base no coeficiente relativo de retenção - R
f
(R
f
= Retention
factor) das amostras e da taxtomina A purificada fornecida pelo Dr. Russel R. King
(Agriculture and Agri-Food Canada, Research Branch, Fredericton Research
Center – Fredericton, Canadá). Considerou-se produtor de taxtomina A, o isolado
em cujo extrato foram detectadas bandas com o mesmo R
f
da taxtomina A
purificada.
36
2.2.2.1.5 Quantificação da concentração de concanamicinas A e B e
taxtomina A nos extratos
Para a quantificação da concentração de concanamicinas A e B e taxtomina
A presentes nos extratos adotou-se a técnica de Goyer et al. (1998), com algumas
modificações. A concentração de fitotoxinas foi determinada por Cromatografia
líquida de alta pressão (HPLC- High performance liquid chromatography). Para a
quantificação da concentração de concanamicinas A e B, foi utilizada coluna C18
medindo 3,9 mm x 125 mm, contendo partículas de sílica de 10 µm. As amostras
foram eluídas isocraticamente em acetonitrila e água Mili-Q (60:40; v/v) por 30 min
em fluxo de 1,0 mL.min
-1
, sendo, as mesmas monitoradas em 280 nm, usando–se
detector acoplado com luz ultravioleta. Uma curva padrão foi estabelecida usando-
se concentrações conhecidas de concanamicinas A e B purificadas (Anexo –
Figuras 1 e 2) fornecidas pelo Dr. Keiiji Hasumi (Department of Applied Biological
Science - Tokyo Noko University – Tokio, Japão), sendo os resultados expressos
em microgramas de toxina por mililitro de metanol. Os teores de concanamicinas
A e B em cada extrato, correspondente a cada isolado, foram somados e
expressos em microgramas de concanamicinas A + B por mililitro de metanol,
conforme descrito por Natsuname et al. (2005).
Seguindo os mesmos passos da quantificação das concanamicinas A e B, a
concentração de taxtomina A foi determinada em HPLC utilizando-se a mesma
coluna. As amostras foram eluida isocraticamente em acetonitrila e água Mili-Q
(25:75; v/v) por 30 min em fluxo de 1,0 mL.min
-1
, sendo monitorada a 380 nm,
usando–se detector equipado com luz ultravioleta. Uma curva padrão foi
estabelecida usando-se concentrações conhecidas de taxtomina A purificada
(Anexo – Figura 3). Os resultados foram expressos em microgramas de taxtomina
A por mililitro de metanol. Os dados foram analisados em esquema inteiramente
casualizado, e havendo diferença significativa entre as médias, estas foram
comparadas pelo teste de Tukey (5 % de probabilidade).
37
2.2.2.1.6 Reação de cultivares comerciais ao patógeno
Nesta etapa foi estudada, em condições de casa-de-vegetação, a
susceptibilidade dos seis cultivares de batata mais plantadas no País a dois
isolados de Streptomyces spp. A escolha desses dois isolados foi feita com base
nos resultados da etapa anterior, sendo selecionado um isolado produtor de alta
quantidade de concanamicina A + B e um isolado produtor de baixa quantidade
das mesmas, visando-se avaliar a participação desta toxina na agressividade dos
isolados. Os mesmos dois isolados possuíam o nível de produção de taxtomina A
estatisticamente idêntico, a fim de se avaliar apenas o efeito das concanamicinas
na agressividade dos isolados (isolados com níveis de produção de
concanamicinas distintos, mas com o mesmo nível de produção de taxtomina A).
O solo utilizado foi previamente esterilizado, sendo composto de terra,
esterco bovino curtido e areia, na proporção de 2:2:1 (v/v/v), acrescido de três
gramas/vaso da formulação química 4-14-8 (FISCHER et al., 2005). O pH do
substrato foi mantido em torno de 6,3, pela adição de CaCO
3
,
por ser apropriado à
infecção pelo patógeno (LAPWOOD; HERING, 1970). O substrato foi distribuído
em vasos com capacidade para 2 Kg e os primeiros 10 cm de solo foram
inoculados com 20 mL de suspensão de esporos de Streptomyces spp., cuja
concentração foi previamente ajustada para A
540
= 0,1 (BOUCHEK-MECHICHE et
al., 2000).
2.2.2.1.7 Plantio dos tubérculos e condução do ensaio
Os tubérculos dos diferentes cultivares foram previamente desinfestados
em hipoclorito de sódio (0,5 %), por 15 min, enxaguados em água destilada por
mais 15 min e plantados no dia posterior a infestação do solo em número de um
tubérculo/vaso. Cada combinação cultivar/isolado teve quatro repetições. Como
controle, tubérculos de batata foram plantados em solo não infestado com o
patógeno. Foi realizada uma adubação de cobertura com nitrato de cálcio na
proporção de seis gramas por vaso, quando as plantas apresentavam cerca de 20
cm de altura, aproximadamente aos 25 dias do plantio, visto o aumento da relação
Ca/P favorecer à infecção dos tubérculos pela bactéria Streptomyces (DAVIS et
38
al., 1972). Cada vaso foi regado individualmente procurando-se manter a umidade
do solo baixa, principalmente durante a fase de tuberização, também como forma
de favorecer a infecção dos tubérculos (LAPWOOD; HERING, 1970; RISTAINO;
AVERRE, 1992).
O monitoramento de pragas e doenças foi realizado diariamente, efetuando-
se o controle do ácaro branco (Polyphagotarsonemus latus) com acaricida a base
de Abamectina (Vertimec
®
) e o controle da traça da batata (Phthorimaea
operculella) com inseticida a base de Spinosad (Tracer
®
), que embora não tenham
registro para a cultura da batata são os mais efetivos e disponíveis. Efetuou-se o
tutoramento das plantas para um melhor desenvolvimento destas.
2.2.2.1.8 Avaliação dos resultados
Com a senescência de 50 % das plantas, em torno de 120 dias após o
plantio, foi avaliada a severidade da sarna comum em cada um dos oito maiores
tubérculos de batata em cada repetição, por meio da escala diagramática proposta
por James (1971) (Figura 8). Onde, nota 1= 0 % da superfície do tubérculo
recoberta por sarna; nota 2= 0,1 a 1,0 %; nota 3= 1,1 a 10 %; nota 4= 10,1 a 25 %
e nota 5= 25,1 a 50 %. A severidade da doença, de cada uma das seis repetições,
foi obtida pela média aritmética da severidade dos nove tubérculos avaliados.
Os dados foram analisados em esquema fatorial, tendo dois fatores
(cultivar X isolado). O fator cultivar teve seis níveis constituídos pelos seis
diferentes cultivares, enquanto o fator isolado teve três níveis (dois isolados +
controle). As médias foram comparadas pelo teste de Tukey (5 %), e sendo
observada interação isolado/cultivar foram realizados os desdobramentos
necessários. Para a análise estatística dos resultados, os dados originais foram
transformados em √(x+0,5), onde x = % de área do tubérculo doente, sendo em
seguida submetidos à análise de variância e teste de Tukey para comparação de
médias.
39
Figura 8 - Escala diagramática desenvolvida para a avaliação da severidade de sarna comum
(Streptomyces spp.) em tubérculos de batata
(Adaptado de James, 1971)
40
2.2.2.2 Sensibilidade de tubérculos de cultivares de batata a taxtomina A
Neste ensaio foram utilizada taxtomina A proveniente do isolado 2147 e
purificada por TLC. A produção e extração da toxina foram realizadas utilizando-se
à mesma metodologia descrita no item 2.2.2.1.3, sendo a mesma purificada de
acordo com a técnica de Leiner et al. (1996). Para tanto, o extrato metanólico
contendo a fitotoxina foi aplicado em placas de TLC Whatmann LKC-18F, medindo
20x20 cm, com 250 µm, de espessura, usando como solvente clorofórmio e
metanol 9:1 (v/v). Bandas de coloração amarela que co-migraram com a fitotoxina
purificada foram removidas e eluídas em metanol. A quantificação da taxtomina A
foi determinada em HPLC aplicando-se as amostras em coluna C18, as quais
foram eluídas em metanol (Item 2.2.2.1.4).
O teste de sensibilidade de tubérculos de batata a taxtomina A foi
executado seguindo a metodologia desenvolvida por Loria et al. (1995). Para
tanto, minitubérculos de batata dos cultivares Ágata, Asterix, Cupido, Monalisa,
Mondial e Atlantic, produzidos em casa-de-vegetação a partir de plantas com 2
meses de idade, foram lavados com água e sabão, descascados e desinfestados
superficialmente com hipoclorito de sódio 2%. Discos de porções centrais dos
tubérculos, medindo 1,5 cm de diâmetro e 5 mm de espessura, foram obtidos com
o auxílio de um furador de rolha. Os fragmentos de tubérculos foram distribuídos
em placas de Petri, sendo que cada placa recebeu cinco discos acondicionados
sobre um disco de papel de filtro umedecido. Sobre os discos de tubérculos de
cada variedade foram depositados 10 µL de solução de taxtomina A purificada em
diferentes concentrações. Para se evitar o escorrimento da solução de taxtomina
A sobre os discos de tubérculos, os mesmos receberam discos de papel de filtro
autoclavado (0,4 cm de diâmetro) na região onde se depositou a solução de
taxtomina A. As concentrações utilizadas foram de 25, 50 e 100 µg taxtomina A /
mL de metanol, o que correspondia a deposição de 0,25; 0,5 e 1 µg de taxtomina
A por disco de tubérculo de batata. Para cada concentração foram feitas seis
placas contendo cinco discos cada. Como controle, na superfície dos fragmentos
de tubérculos de batata foi depositado apenas o extrato do meio em metanol. As
placas contendo os diferentes tratamentos foram vedadas com filme de polietileno
41
e foram mantidas em temperatura de 28 °C por 24 h, quando se efetuou a
avaliação quanto à presença ou não de manchas necróticas na região do
tubérculo, onde foi depositada a fitotoxina.
Os dados, referentes à dose mínima necessária de taxtomina A para induzir
necrose nos discos de tubérculos de batata dos diferentes cultivares foram
analisados em esquema fatorial composto por dois fatores (dose x cultivares). O
fator dose foi composto por três níveis, representados pelas três doses (25, 50,
100 µg taxtomina A/ mL) e o fator cultivar pelos seis cultivares. Havendo diferença
entre as médias estas foram comparadas pelo teste de Tukey (5% de
probabilidade), sendo que, para todas as análises utilizou-se o software SAS para
Windows.
Todos os ensaios foram repetidos duas vezes no tempo em um intervalo de
20 dias e constatado a equivalência estatística entre ambos, foi apresentada
apenas a primeira repetição.
2.2.3 Resultados e Discussão
2.2.3.1 Resistência de cultivares de batata à sarna comum
2.2.3.1.1 Identificação e quantificação da produção de fitotoxinas pelos
isolados de Streptomyces spp.
A produção de taxtomina A por parte de cada um dos 10 isolados de
Streptomyces spp., identificada por cromatografia de camada delgada (TLC)
(Figura 9), revelou que todos os isolados produziram a taxtomina A, exceto o
isolado IBSBF 2509 (Tabela 3).
42
Figura 9 - Cromatografia de camada delgada (TLC) aplicada aos produtos das extrações em acetato de
etila de isolados de Streptomyces spp., cultivados em meio de aveia líquido, evidencian do a
produção de taxtomina A. Em A observa-se a placa de TLC sob luz visível e em B sob luz
ultravioleta (UV - 254 nm). Na extremidade inferior de cada uma das duas placas de TLC
está a legenda discriminando o número do isolado bacteriano, a taxtomina A purificada (T) e
o meio controle (C). A seta indica a banda relativa a taxtomina A
A
B
T C 2509 2504 2502 2507 2501 T C 2509 2504 2502 2507 2501
43
A quantificação das concanamicinas A e B e da taxtomina A, efetuada por
cromatografia líquida (HPLC), foi realizada comparando-se o perfil (área) destas
fitotoxinas com a curva padrão. O tempo de retenção médio obtido foi de 22,8 min
para a taxtomina A, 20,7 min para a concanamicina A e 15,2 min para a
concanamicina B.
Para a comparação da capacidade de produção de concanamicinas A e B
dos isolados, avaliou-se inicialmente individualmente (Tabela 4). Posteriormente,
conforme descrito por Natsuname, Ryu e Abe, (1996) e Natsuname et al. (2008),
foi considerado o somatório dos dois análogos da toxina, concanamicina A + B,
em vista das mesmas exibirem o mesmo mecanismo de ação, que envolve a
inibição da ATPase, não só de plantas, mas também de vários microrganismos
(HUSS et al., 2002).
Tabela 3 - Produção de taxtomina A por isolados de Streptomyces spp., utilizados no ensaio de
seleção dos isolados com base no nível de produção de fitotoxinas
,
Isolado
( n° IBSBF)
Produção de taxtomina A:
2472
+
2499
+
2509
-
2147
+
2
2
5
5
0
0
1
1
+
2502
+
2524
+
2
2
5
5
0
0
3
3
+
2500
+
2507
+
* +) produz; -) não produz
I IBSBF- Instituto Biológico de São Paulo, Bactérias Fitopatogênicas
44
Tabela 4 - Produção de concanamicinas A e B e taxtomina A in vitro pelos 10 isolados de
Streptomyces spp., provenientes de batatas. Avaliação realizada após 4 dias de
cultivo em meio líquido de aveia (28°C) sob agitação orbital (150 rpm).
µg toxina / mL meio
Concanamicinas
Isolado de
Streptomyces spp.
(IBSBF)
A B A + B
Taxtomina A
2501
5,3 9,1
14,4 a*
17,7 a
2502 1,0 4,9
5,88 c
18,4 a
2124 1,1 4,1
5,2 cd
14,5 b
2172 0,6 1,3
1,9 de
13,8 b
2503 0,3 1,9
2,2 de
12,1 bc
2147 1,1 2,3
3,4 d
7,5 c
2507
0,1 0,3
0,4 e
18,1 a
2500 2,6 5,9
8,5 b
4,7 d
2499 1,1 1,6
2,7 de
2,3 de
2159 Nd ** Nd Nd
Nd
C.V. (%) 13,17
12,5
* Médias seguidas da mesma letra na mesma coluna, não diferem significativamente no teste de
Tukey a 5% de probabilidade.
* *Nd : não detectado.
IBSBF - Instituto Biológico de São Paulo, Bactérias Fitopatogênicas
Para igualar o efeito da produção de taxtomina A na análise da
agressividade dos isolados exibindo níveis distintos de produção de
concanamicinas, no decorrer da seleção, buscou-se selecionar isolados com
mesma capacidade de produção de taxtomina A, sendo mais freqüentemente
observados altos níveis de produção de taxtomina A, como os isolados IBSBF
2501, 2502 e 2507 (Tabela 4).
45
Quanto aos níveis de produção de concanamicina, quando comparados
individualmente à produção de concanamicinas A e B, se nota um maior nível de
produção de concanamicina B do que A. Estes resultados foram similares aos
obtidos por Natsuname et al. (1996), onde muitos isolados japoneses da bactéria
também produziam mais concanamicina B do que A.
Quando se analisou o somatório concanamicina A + B, apenas o isolado
IBSBF 2501, destacou-se pelo alto nível de produção das toxinas (Tabela 4) e, de
forma geral, os níveis de produção de concanamicinas foram relativamente
inferiores aos de taxtomina A (Tabela 4). Em contrapartida, outros trabalhos
demonstram que a produção de concanamicinas por isolados S. scabies pode ser
maior que a produção de taxtomina A (NATSUNAME et al., 1996; 2001).
Através destes resultados foi possível selecionar dois isolados para a
condução dos ensaios em casa-de-vegetação, um isolado produtor de alta
quantidade concanamicinas A e B (IBSBF 2501) e um segundo produtor da
mesma quantidade de taxtomina A e pouco produtor concanamicinas A e B
(IBSBF 2507). A figura 10 mostra a coloração do meio de cultivo dos isolados
selecionados. Pode-se observar que os dois isolados produzem mesmo nível de
taxtomina A, sendo estatisticamente semelhantes, desta forma igualando o efeito
da taxtomina A para os dois isolados (Tabela 4).
46
Figura 10 - Aspecto do meio de cultivo dos dois isolados selecionados de Streptomyces spp.,
provenientes de batatas, crescidos por 4 dias (28°C) sob agitação orbital (150 rpm).
Isolados IBSBF 2501 (produtor de altos níveis de concanaminas), IBSBF 2507
(produtor baixos níveis de concanaminas) e o controle (meio de aveia). Ambos os
isolados apresentam níveis estatisticamente equivalentes de produção de taxtomina
A (cor amarela).
2.2.3.1.2 Reação dos cultivares de batata ao patógeno
A severidade da sarna comum nas diferentes cultivares de batata, e a
agressividade dos isolados de Streptomyces spp. em função das cultivares e
isolados variaram significativamente (p<0,05) (Tabela 5). Os resultados da
avaliação da reação dos cultivares aos dois isolados, realizada em casa de
vegetação, revelou o nível de resistência dos seis cultivares e a agressividade dos
isolados sobre cada cultivar.
47
Tabela 5 - Porcentagem de sarna comum em tubérculos de cultivares de batata, em relação aos
isolados de Streptomyces spp. IBSBF 2501 (produtor de altos níveis de concanaminas)
e IBSBF 2507 (produtor de baixos níveis de concanaminas)
Isolado
Cultivar
2501
2507
Cupido 24,75* b**A*** 25, 03 a A
Asterix 26,98 b A 17,73 b B
Monalisa 36,19 a A 26,18 a B
AÁgataA
27,20 b A 26, 02 a AB
Mondial 5,21 cd A 1,38 c B
Atlantic 3,87 d A 2,19 c AB
C.V. (%) 20,31
* Severidade avaliada com base em porcentagem (%) de área lesionada.
** Avaliação de resistência de cultivares: letra minúscula - Médias seguidas da mesma letra na
mesma coluna, não diferem significativamente no teste de Tukey a 5% de probabilidade.
*** Avaliação de agressividade de isolados: letra maiúscula - Médias seguidas da mesma letra na
mesma linha, não diferem significativamente no teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A interação cultivar/isolado foi comprovada, visto que cada isolado produziu
níveis de doença com severidade diferencial em cada cultivar. Como exemplo,
para o isolado IBSBF 2501, proveniente do cultivar Monalisa (Brasil, BA), do mais
suscetível para o mais resistente, temos os cultivares Monalisa, Asterix, Cupido,
Ágata, Mondial e Atlantic. Em termos de resistência dos cultivares, conclui-se que
os cultivares Atlantic e Mondial mostraram-se mais resistentes e, quando
apresentavam lesões, estas eram superficiais e pequenas. Desta forma, esses
cultivares de batata são mais apropriados para o plantio em regiões com histórico
da doença.
Em termos de agressividade dos isolados, conclui-se que o isolado IBSBF
2507 proveniente do cultivar Ágata (Brasil, MG), é mais agressivo aos cultivares
48
Ágata, Cupido e Monalisa, enquanto que o isolado IBSBF 2501 (Monalisa – Brasil,
Bahia) é mais agressivo ao cultivar Monalisa, onde os níveis de severidade da
doença se destacaram em comparação aos demais cultivares e em relação ao
isolado IBSBF 2507.
No tocante a participação das concanamicinas A e B na agressividade dos
isolados IBSBF 2501 (produtor de altos níveis) e IBSBF 2507 (produtor de baixos
níveis) (Figura 11), se evidenciou a maior agressividade do isolado IBSBF 2501,
apenas quando comparados nos cultivares Mondial, Monalisa e Asterix, onde se
obteve maior severidade da doença quando comparado à severidade produzida
pelo isolado IBSBF 2507. Isto se deve ao fato a sensibilidade dos genótipos
avaliados á concanamicinas ser diferente. Desta forma, aparentemente as
concanamicinas possuem caráter secundário na determinação da doença.
No tocante a participação da taxtomina A, na agressividade dos isolados
IBSBF 2501 e IBSBF 2507 (produtores de altos níveis de taxtomina A) (Tabela 4),
observou-se que os cultivares classificados como suscetíveis realmente exibiram
altos níveis de sintomas em resposta aos isolados produtores de taxtomina A.
A literatura já havia demonstrado à participação da taxtomina A na
capacidade de causar doença pelos isolados de Streptomyces (KING et al., 1991;
GOYER et al., 1998; LORIA et al., 2006). Mutantes de S. scabies, com reduzida
produção da fitotoxina, mostraram-se também menos agressivos ou mesmo não
patogênicos (GOYER et al., 1998).
Em contrapartida, Park et al. (2003), utilizando a mesma técnica de
identificação e quantificação da taxtomina A por HPLC, observaram que alguns
isolados patogênicos de Streptomyces spp. não produziam taxtomina A em meio
de aveia líquido e em secções de tubérculos. Os mesmos autores deixaram claro
que são poucos os trabalhos descrevendo outros fatores de patogenicidade, além
da produção de taxtomina A. Faucher et al. (1995) descreveram a produção de
enzimas hidrolíticas como um fator importante na patogenicidade, e envolvidas na
formação das lesões da sarna comum profunda.
Os resultados deste presente trabalho mostraram também a importância do
uso de diferentes isolados para a discriminação da reação dos genótipos de
49
batata, em função da interação diferencial entre cultivar/isolado. Apesar da
resistência dos cultivares ser do tipo horizontal, esta se mostrou ser influenciada
também pela variabilidade do patógeno.
A Figura 11 mostra os sintomas de sarna comum profunda provocados pelo
isolado IBSBF 2501 proveniente do cultivar Monalisa (Brasil, BA). Comparando-se
os sintomas ocasionados pelo isolado nos diferentes cultivares de batata,
percebe-se que nos cultivares Monalisa, Cupido, Asterix e Ágata as lesões são do
tipo sarna comum profunda e, nos cultivares Atlantic e Mondial as lesões são
semelhantes às de sarna comum superficial, visto que são mais resistentes.
As lesões de sarna comum profunda causadas pelo isolado IBSBF 2501
sobre o cultivar Monalisa se destacaram dos demais cultivares, sendo possível
encontrar tubérculos totalmente mumificados pelo patógeno, fato incomum para
esta doença, visto que o patógeno ataca as camadas mais superficiais dos
tubérculos.
50
Controle
Substrato infestado Cultivar
Monalisa
Cupido
Asterix
Ágata
Mondial
Atlantic
Figura 11 - Sintomas de sarna comum, provocados pelo isolado IBSBF 2501 proveniente do cultivar
Monalisa (Brasil, BA) de Streptomyces spp., em tubérculos de batata. A primeira coluna
representa o controle e a segunda coluna representa os sintomas apresentados, após 4
meses do plantio e infestação do substrato autoclavado. Os cultivares estão
apresentados em ordem de resistência para este isolado: de cima para baixo estão os
cultivares Monalisa, Cupido, Asterix, Ágata (mais suscetíveis), Mondial e Atlantic (mais
resistentes). Barra = 1 cm
51
A variabilidade nos níveis de resistência das cultivares de batata à sarna
comum e na agressividade dos isolados de S. scabies observados neste trabalho,
assemelham-se aos descritos na literatura para outras cultivares e isolados da
bactéria, em que a resistência é quantitativa e a grande maioria das cultivares são
suscetíveis (PASCO et al., 2005, HULTUNEN et al., 2005; KOBAYASHI et al.,
2005).
O nível de inóculo empregado neste trabalho foi preciso (20 mL de
suspensão de esporos A
540
= 0,1 / vaso, aproximadamente 10
2
ufc / g solo
(BOUCHEK-MECHICHE et al., 2000), podendo ser considerado elevado quando
comparado aos níveis que ocorrem naturalmente no campo. Segundo Kobayashi
et al. (2005), a severidade apresentou crescimento linear com o aumento
logarítmico (log
10
) da densidade de inóculo. Entretanto, segundo o mesmo autor,
as concentrações maiores de inóculo (10
5
-10
7
ufc/g solo) permitiram a obtenção
de resultados mais consistentes, sem a ocorrência de escapes, em relação à
resistência de cultivares de batata. A avaliação preliminar de cultivares de batata
para resistência a sarna comum em menor escala (vasos), sob condições
controladas de inóculo do patógeno, tipo de solo e umidade, caracteriza-se em
passo importante para estudos subseqüentes em condições de campo. Nessas
condições, a resposta à sarna é frequentemente variável em função das variações
climáticas anuais durante o período crítico de desenvolvimento da doença e
variações na infestação do solo, razão pela qual são necessários ensaios de
vários anos para se obter resultados confiáveis (PASCO et al., 2005).
A classificação de cultivares quanto à resistência à sarna comum deverá
oferecer uma importante ferramenta no controle integrado da doença. Outros
estudos são requeridos para se padronizar a metodologia, especialmente com
referência ao nível de inóculo e composição do substrato. A caracterização dos
isolados de Streptomyces nacionais seria de extrema importância, pois a
suscetibilidade das cultivares pode variar com a espécie/raça da bactéria
(BOUCHEK-MECHICHE et al., 2000; PASCO et al., 2005).
52
2.2.3.2 Sensibilidade de cultivares de batata à taxtomina A
A sensibilidade dos cultivares á diferentes doses de taxtomina A, também
possibilitou discriminar a sensibilidade dos mesmos á fitotoxina (tabela 6), sendo
os mesmos foram similares aos exibidos pelos isolados IBSBF 2501 e IBSBF 2507
do patógeno. Os cultivares Cupido, Ágata e Monalisa, Asterix, suscetíveis aos dois
isolados, mostraram-se mais sensíveis à fitotoxina taxtomina A, onde as secções
de tubérculos de batata dos cultivares suscetíveis apresentaram lesões necróticas
de coloração marrom escuras na região onde se depositava a fitotoxina e
escurecimento do tecido em geral (Figura 12). Os cultivars Mondial e Atlantic,
resistentes ao patógeno, se demonstraram menos sensíveis á fitotoxina,
apresentando menor número de lesões.
Tabela 6 – Avaliação da sensibilidade de discos de minitubérculos de batata de diferentes
cultivares á concentrações crescentes de taxtomina A (0,25; 0,50; 1,00 µg de
taxtomina A / disco de tubérculo). Os dados estão expressos em número médio de
discos com lesões necróticas
Concentração (µg / ml)
Cultivar
0,25 0,50 1,00
Cupido 1,33 b* 1,33 b 4,00 b
ÁgataA
3,33 a 4,00 a 8,00 a
Monalisa 0,67 c 0,67 bc 3,33 c
Asterix 0,00 d 0,33 cd 3,33 c
Mondial 0,00 d 0,00 d 0,00 d
Atlantic 0,00 d 0,33 cd 0,00 d
C.V. (%) 22,66
* Médias seguidas da mesma letra na coluna, não diferem significativamente no teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
53
Figura 12 - Reação de discos de minitubérculos de batata do cultivar Monalisa, a fitotoxina
taxtomina A purificada (1 µg / disco) após 24 horas da aplicação. Em A, observa-se
a disposição dos discos em placa de Petri e em B, observa-se um disco tratado
apresentando lesão necrótica no centro, escurecimento do tecido e no lado direito o
controle com o meio. Barra = 1 cm
A taxtomina A é classificada como uma fitotoxina não-seletiva (não-
específica), sendo fator de agressividade ou determinante secundário de
patogenicidade, visto que contribui para a severidade da doença. As fitotoxinas
não-seletivas são tóxicas a várias espécies de plantas, independentemente das
mesmas serem ou não hospedeiras do microrganismo toxigênico (PASCHOLATI,
1995). Este fato foi demonstrado para a taxtomina A, visto que a mesma se mostra
tóxica tanto a plantas dicotiledônias e monocotiledônias (LORIA et al., 1997; FRY;
LORIA, 2002; SCHEIBLE et al., 2003; TEGG et al., 2005).
A sensibilidade dos
cultivares de batata a taxtomina A não é o único fator ligado à resistência ao
patógeno, visto que o mesmo produz outras toxinas, como as concanamicinas
(NATSUNAME et al., 2005), proteínas nec1 (LORIA et al., 2008), enzimas
hidrolíticas (FAUCHER et al., 1995), além de outros mecanismos bioquímicos de
ataque que ainda não avaliados.
54
2.3 Conclusões
Os cultivares Atlantic e Mondial mostraram-se resistentes aos dois isolados
de Streptomyces scabies avaliados. Os demais cultivares comportaram-se como
suscetíveis, mas os níveis de suscetibilidade foram influenciados pela
agressividade/especificidade dos isolados. Desta forma, a grande maioria dos
cultivares de batata plantadas no Brasil, mostrou-se suscetível à sarna comum.
Foi possível comprovar a influência da produção de concanamicinas na
agressividade dos isolados de Streptomyces spp. apenas quando avaliada sobre
os cultivares Mondial, Monalisa e Asterix. Aparentemente, estes cultivares são
mais sensíveis a esta toxina.
Os cultivares de batata com maiores níveis de resistência à sarna comum
apresentaram menor sensibilidade à fitotoxina taxtomina A. Porém, esta fitotoxina
possui aparentemente caráter secundário na determinação dos sintomas da
doença.
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60
3 ATERAÇÕES ULTRAESTRUTURAIS E BIOQUÍMICAS CAUSADAS PELA
TAXTOMINA A, PRODUZIDA por Streptomyces spp., SOBRE PLÂNTULAS DE
SORGO (Sorghum bicolor)
Resumo
As modificações citológicas, ultrastruturais e bioquímicas induzidas pela
taxtomina A, fitotoxina produzida por Streptomyces spp., foram analisadas em
plântulas de sorgo visando à compreensão do mecanismo de ação desta toxina.
Os tecidos foram tratados com taxtomina A e avaliados após 7 dias do tratamento.
Observou-se desorganização em todas as células dos tecidos tratados com a
taxtomina A. A membrana plasmática das células do mesofilo foliar mostrou-se
retraída e destacada da parede celular em diversos pontos. Entretanto, o
plasmalema não pareceu rompido. O efeito sobre a permeabilidade seletiva da
membrana plasmática também foi avaliado bioquimicamente, onde foi observado
aumento da saída de eletrólitos no meio. Os cloroplastos apresentaram
deformações na superfície e perda de turgidez. Estas deformações provavelmente
contribuíram para a redução do teor de clorofilas A e B, no tecido avaliado. As
plântulas também apresentaram elevado acúmulo de fitoalexinas do tipo
deoxiantocianidinas. Desta forma, conclui-se que a taxtomina A age
principalmente sobre a membrana plasmática, provocando alterações na
permeabilidade seletiva, plasmólise, desorganização celular e atuando sobre
cloroplastos, provocando deformações e redução no teor de clorofila dos tecidos
de plântulas de sorgo. Em contrapartida, o acúmulo de fitoalexinas evidencia que
concentrações mínimas desta toxina podem ser exploradas para utilização como
eliciador da resposta de defesa em plantas.
Palavras-chave: Streptomyces spp.; Taxtomina A; Sorghum bicolor L; Fitotoxinas;
Mecanismo de ação; Efeitos ultraestruturais; Patogenicidade
ULTRASTRUCTURAL AND BIOCHEMICAL EFFECTS CAUSED BY THE
THAXTOMIN A, PRODUCED BY Streptomyces spp., IN SORGHUM
SEEDLINGS (Sorghum bicolor).
Abstract
The cytological, ultrastructural and biochemical changes induced by the
thaxtomin A, phytotoxin produced by plant pathogenic species of Streptomyces
spp., was evaluated in sorghum seedlings to understand the phytotoxin action
mechanism. Health leaf tissue of sorghum (Sorghum bicolor) seedlings was treated
61
with high levels of thaxtomin A and evaluated after seven days of the treatment. In
all treated cells with thaxtomin A it was observed significant cytological
disorganization. The plasmma membrane of immature leaf cells was detached
from the cell wall in several places. However, the plasmalemma did not seen
disorganized. In addition, it was observed increases in the permeability of plasmma
membrane. The chloroplasts showed deformations in surface and volume
reduction. These deformations in chloroplasts probably contributed for the
reduction of chlorophyll A and B levels. The sorghum seedlings also showed high
phytoalexins accumulation (deoxiantocianydins). Thus, it can concluded that the
thaxtomin acts mainly on the plasmma membrane and membranous organelles,
causing changes in permeability, plasmolyses, cell disorganization, deformation in
chloroplasts and chlorophylls reduction in treated sorghum seedlings. In fact, the
accumulation of phytoalexins evidenced that minimum concentrations of this toxin
can be exploited as elicitor in resistance induction by stimulating the plant defense
mechanisms against pathogens.
Keywords: Streptomyces spp.; Thaxtomin A; Sorghum bicolor L; Phytotoxins;
Action mechanism; Ultrastructural effects; Pathogenicity
3.1 Introdução
Fitotoxinas estão envolvidas na agressividade de diversos patógenos
bacterianos. Em 1989, um novo grupo de fitotoxinas associado à fitopatógenos do
gênero Streptomyces foi descoberto e nomeado de taxtominas (KING et al., 1989).
Este grupo de fitotoxinas consiste basicamente em uma molécula de 4-nitroindol-
3-il contendo 2,5-dioxopiperazina. A taxtomina A, a principal toxina produzida por
Streptomyces scabies, é um dipepitídio composto pelo aminoácido alanina com
um radical fenil e um aminoácido triptofano nitratado (KING et al., 1992). S.
scabies é o principal agente causal da sarna comum, uma doença caracterizada
por lesões corticosas superficiais, elevadas ou profundas em tubérculos de batata
(Solanum tuberosum L.) (GOYER et al., 1996) e raízes de outras plantas, tais
como a beterraba (Beta vulgaris L.), cenoura (Daucus carota L.), e de nabo
(Brassica rapa L.) (GOYER; BEAULIEU, 1997). S. scabies inibe também o
crescimento de plântulas de rabanete (Raphanus sativus L.), alfafa (Medicago
sativa L.), couve-flor (Brassica oleracea L.), couve-nabiça (Brassica napus L.) e
nabo (LEINER et al., 1996).
62
A taxtomina A possui papel importante na agressividade de isolados de S.
scabies. Mutantes de S. scabies, com reduzida produção da fitotoxina, mostraram-
se também menos agressivos ou mesmo não patogênicos (GOYER et al., 1998).
Como a maioria de fitotoxinas bacterianas (MITCHELL, 1984; PATIL, 1974), a
taxtomina A não é uma toxina específica e, certamente, induz deformações em
caules e nas raízes de diversas plantas do grupo das monocotiledôneas e
dicotiledôneas. As taxtominas, em baixas concentrações (0,1 µM), interferem no
crescimento de plantas de diferentes famílias botânicas (LEINER et al., 1996).
A aplicação da taxtomina A em tubérculos imaturos da batata induz
sintomas diferentes. Em baixas concentrações provoca sintomas como a
proliferação e a expansão celular e em altas concentrações causa erupções,
rachaduras e escurecimento do tecido ao redor da zona da aplicação
(LAWRENCE; CLARK; KING, 1990). Secções transversais das raízes e dos
caules de plantas tratadas revelaram que o tecido sofre deformações devido à
hipertrofia celular e não ocorre o aumento do número de células (LEINER et al.,
1996). Células meristemáticas de raízes de batata tratadas com taxtomina A
apresentaram a atividade mitótica reduzida, bem como a desorganização dos
cromossomos condensados (LORIA et al., 1997). Posteriormente, Fry e Loria
(2002), estudando células de fumo tratadas com a fitotoxina, observaram que
células do tecido tratado apresentavam grande aumento no número de células
binucleadas. A aplicação da taxtomina A em folhas maduras de batata, rabanete,
tomate, e beterraba resultou em necrose nas áreas tratadas (GOYER et al., 1997).
Os estudos ultraestruturais do efeito da taxtomina A na integridade de células de
tubérculos imaturos de batata já foram relatados previamente (STEIN et al., 1994).
Este trabalho teve como objetivo descrever as mudanças morfológicas,
ultraestruturais e bioquímicas em tecidos de sorgo (Sorghum bicolor) induzidas
pela aplicação da fitotoxina taxtomina A.
63
3.2 Desenvolvimento
3.2.1 Revisão Bibliográfica
As bactérias do gênero Streptomyces são conhecidas principalmente pela
sua capacidade de produzir metabólitos secundários importantes, como
antibióticos (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004). A produção de taxtominas,
entre outras fitotoxinas, é uma característica importante entre as poucas espécies
do gênero que são fitopatogênicas.
Através dos esforços do pesquisador canadense Russel King e
colaboradores (KING et al., 1989) foi isolada e caracterizada uma fitotoxina de
Streptomyces scabies, responsável pela necrose de tecidos de tubérculos de
batata. Esta fitotoxina passou a ser chamada de “Taxtomina” em homenagem ao
pesquisador Roland Thaxter, o qual foi o primeiro a estabelecer a relação entre S.
scabies e a sarna da batata (KING; LAWRENCE, 1996).
A análise molecular de genes ligados a patogenicidade em S. scabies
esclareceu a base genética das doenças classificadas como sarna comum e sarna
comum profunda (LORIA; KERS; JOSHI, 2006). Com base em nosso atual
conhecimento do mecanismo da ação e da sintomatologia proporcionada pelas
taxtominas, todas as espécies de Streptomyces que produzem estes sintomas de
sarna podem sintetizar as taxtominas. As espécies de Streptomyces que
produzem somente sintomas de sarna reticulada ou de sarna ferruginosa são
excluídas desta generalização. Estas doenças são causadas por outras espécies
de Streptomyces, à exceção daquelas que causam a sarna comum e a produção
de taxtomina não esta envolvida. As lesões de sarna em batata doce são
causadas por Streptomyces ipomoeae, que produz também um outro membro da
família das taxtominas, a taxtomina B. As diferenças na regulação da produção de
toxina, dos locais da infecção, e gama de hospedeiros torna-se um sistema
intrigante para a análise comparativa entre os agentes causais da sarna da batata.
Entretanto, a análise genética de características patogênicas em S. ipomoeae está
ainda incompleta (LORIA; KERS; JOSHI, 2006).
Atualmente foram identificados vários análogos da taxtomina A (LORIA et
al., 1997). Um mesmo isolado de Streptomyces spp. pode produzir diferentes
64
análogos, porém, a taxtomina A é encontrada em maior proporção em tecidos
sintomáticos de batata. Segundo King et al. (1991), a proporção de taxtomina A
em relação a taxtomina B, o segundo análogo mais abundante, é de 20:1.
A taxtomina A e outros membros da família das taxtominas induzem
necroses em tecidos expostos de tubérculos da batata e produzem sintomas
similares aos de sarna em tubérculos imaturos da batata (RISTAINO; AVERRE,
1992, LORIA; KERS; JOSHI, 2006). Estas atividades biológicas sugerem que as
taxtominas possuem um papel importante na patogenicidade e produção de
lesões em tecidos de plantas hospedeiras. A concomitância da produção de
taxtominas em espécies causadoras de sarna em muitos isolados de diversas
regiões geográficas e do relacionamento quantitativo entre a produção da toxina e
a agressividade, além da ausência da produção por espécies saprofíticas suporta
a hipótese de que esta toxina está relacionada à agressividade ou mesmo a
patogenicidade em tubérculos da batata (CLARK; LAWRENCE, 1981; HOOKER,
1981; LORIA et al., 1997).
A via de biosíntese da taxtomina A é não-ribosomal e envolve sintetases de
peptideos, uma P450 monooxigenases, e uma sintetase do óxido nítrico, a qual
está ligada a nitratação da toxina (Figura 1 a). Esta sintetase do óxido nítrico é
igualmente responsável pela produção de óxido nítrico por estreptomicetos
durante a relação do hospedeiro com o microrganismo fitopatogênico, sugerindo
que o óxido nítrico possa ter papel adicional durante o processo da infecção
(LORIA et al., 2008).
Os genes biossintéticos de taxtominas são regulados
transcripcionanalmente por um regulador da família de AraC/XylS, TxtR, o qual é
conservado em estreptomicetos patogênicos e codificado dentro do conjunto de
genes de biossíntese da taxtomina. A proteína TxtR liga-se especificamente a
celobiose, um indutor conhecido da biossíntese do taxtomina, sendo a mesma
essencial para a expressão dos genes biossintéticos (Figura 1 b). Um segundo
gene da virulência em espécies fitopatogênicas de Streptomyces, nec1, codifica
uma nova proteína secretada que possui função de suprimir respostas da defesa
da planta. Os genes da taxtomina e os nec1 biossintéticos são contido em um
65
grande conjunto de genes de patogenicidade, sendo que a transferência deste
conjunto aos estreptomicetos explica provavelmente a emergência rápida de
novas espécies fitopatogênicas. A seqüência recentemente disponibilizada do
genoma de S. scabies fornecerá informações adicionais sobre os mecanismos
utilizados por espécies de Streptomyces nas interações planta-patógeno (LORIA
et al., 2008).
66
Figura 1 - (a) A biosíntese da taxtomina A é não ribosomal e envolve as enzimas de síntese de
peptídeo (TxtA e B), uma monooxigenase P450 (TxtC), e uma sintetase do óxido
nítrico (NOS). As etapas da via de biossíntese que não foram completamente
elucidadas são indicadas por (??). (b) Os genes conhecidos na biosíntese da
taxtomina A são agregados junto ao cromossomo e conservados nas espécies
produtoras de taxtomina. Os genes biossintéticos estão mostrados em cinza e os
genes reguladores em preto.
(Adaptado de LORIA et al., 2008)
(
a
)
67
A hipótese principal que sustenta a taxtomina como sendo uma das
principais características responsáveis pela patogenicidade de Streptomyces é a
correlação existente entre a produção da toxina e a agressividade do respectivo
isolado (KING et al., 1991). Mutantes de S. scabies, com reduzida produção da
fitotoxina, se mostraram também menos agressivos ou mesmo não patogênicos
(GOYER et al., 1998). Healy et al. (2000) compararam os sintomas obtidos pelo
tratamento de tubérculos de batata jovens utilizando o filtrado do cultivo de
isolados de S. acidiscabies em meio líquido, e reproduziram sintomas análogos
aos resultantes quando da inoculação do patógeno.
As taxtominas são fitotoxinas do tipo não seletivas ou inespecíficas, uma
vez que em baixas concentrações (0,1 µM) interferem no crescimento de plantas
de diferentes famílias botânicas, sejam estas mono ou dicotiledôneas (LEINER et
al., 1996).
A sintomatologia produzida pela taxtomina A sugere que esta toxina possui
diversos alvos potenciais nas células vegetais, incluindo a membrana plasmática,
organelas, os vários componentes do citoesqueleto e a parede celular (FRY;
LORIA, 2002; TEGG et al., 2005). Aumentos no volume celular em hipocótilos de
plântulas de cebola e rabanete e em culturas da suspensão de fumo, em resposta
ao tratamento com 0.05-1.0 µ M de taxtomina A, como já comentado sugerem que
esta fitotoxina interage com um ou mais alvos conservados de células vegetais
(Figura 2).
As células da coifa de raízes de cebola tratadas com taxtomina A, nas
concentrações 0,0-10,0 µM, apresentaram inibição do crescimento da raiz. Além
disso, houve um aumento do número de células binucleadas ou com formato
irregular. Por sua vez, a taxtomina A nas concentrações de 1.0-3.0 µM inibiu a
elongação normal de protoplastos de fumo, demonstrando um possível efeito no
desenvolvimento da parede da célula (Fry; Loria, 2002).
68
Figura 2 - Cortes transversais de hipocótilos de plântulas de cebola (b) e rabanete (d)
apresentando hipertrofia celular em resposta a taxtomina A. As plântulas de cebola
ou rabanete foram crescidas em meio ágar-água contendo taxtomina (cebola - 0,05
µM; rabanete - 0,075 µM). Compare os resultados do material tratado com os dos
tecidos controle: a) cebola; c) rabanete. Barra = 200µm
(Adaptado de
Fry; Loria, 2002).
c d
b a
69
As células da coifa de raízes de cebola tratadas com taxtomina A, nas
concentrações 0,0-10,0 µ M, apresentaram inibição do crescimento da raiz. Além
disso, houve um aumento do número de células binucleadas ou com formato
irregular (FRY; LORIA, 2002). Por sua vez, a taxtomina A nas concentrações de
1.0-3.0 µM inibiu a elongação normal de protoplastos de fumo, demonstrando um
possível efeito no desenvolvimento da parede da célula.
A taxtomina A já teve seus efeitos avaliados em várias plantas, como
Arabidopsis (TEGG et al., 2005). Até o momento não é conhecida exatamente a
maneira pela qual as taxtominas causam necrose em tubérculos de batata ou
nanismo em plântulas de outras espécies vegetais, porém acredita-se que o alvo
seja conservado em células vegetais e não conservado em fungos e bactérias,
uma vez que estes últimos são insensíveis à toxina (LORIA et al., 1997). Ensaios
inicias demonstraram que as taxtominas causam alterações no fluxo de íons,
como o Ca
++
e H
+
, através da membrana plasmática (TEGG et al., 2005) (Figura
3). A indução de morte celular programada por taxtominas foi observada por Duval
et al. (2005). Em contrapartida, Scheible et al. (2003) acreditam que o sítio de
ação da referida fitotoxina esteja ligado ao bloqueio da biossíntese de celulose.
70
Figura 3 - Um possível modelo da ação e sinalização da fitotoxina taxtomina A em células
vegetais. A taxtomina A desencadeia um influxo de cátions Ca
2+
, provocando um
aumento principalmente na concentração de íons Ca
2+
no citosol. Este processo é
amplificado por um possível “feedback” [Ca
2+
induzido Ca
2+
liberado de organelas
internas, como retículo endoplasmático (RE) ou vacúolo]. Elevadas concentrações
de Ca
2+
no citosol provocam aumento na atividade das bombas de H
+
da
membrana plasmática (MP). A parede destas células ficam enfraquecidas,
aumentado a habilidade do patógeno de penetrar através dos tecidos das plantas
suscetíveis
(Adaptado de FRY; LORIA, 2002)
71
3.2.2 Material e Métodos
3.2.2.1 Obtenção e purificação da taxtomina A
A taxtomina A foi obtida e purificada da fase aquosa de uma cultura de S.
scabies (IBSBF - 2147) crescida em meio líquido de aveia por 4 dias a 25 ºC
(LORIA et al., 2006). A cultura foi filtrada em papel Whatmann n
o
2 e a fase
aquosa foi extraída duas vezes em acetato de etila, sendo utilizado um volume de
acetato de etila igual a 1,5 vezes maior que o volume da fase aquosa (LORIA et
al., 2001). O extrato de taxtomina A em acetato de etila foi aplicado em placas de
TLC (“Thin Layer Chromatography”); (sílica 60) juntamente com o padrão da
taxtomina A purificada. Para separação em TLC se utilizou os solventes
clorofórmio-metanol 9:1 (v/v). Sendo as bandas de coloração amarela, que
exibiram o mesmo Rf (“Retection Factor”) que a taxtomina A purificada, foram
recuperadas através da eluição com clorofórmio-metanol 7:3 (v/v). Este
procedimento foi realizado uma segunda vez com o mesmo extrato, para se
confirmar a pureza da amostra de taxtomina A (GOYER et al., 1996).
Para a quantificação da taxtomina A purificada, adotou-se a técnica de
Goyer et al. (1998), na qual a concentração de taxtomina A é determinada com
auxílio de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC- High performance liquid
chromatography). Foi utilizada coluna C18 medindo 3,9 mm x 125 mm, contendo
resina com partículas de 10 µm e as amostras foram eluidas isocraticamente em
acetonitrila e água ultra pura (25:75; v/v) por 30 min em fluxo de 1,0 mL.min
-1
,
sendo monitorada a 380 nm, usando–se um detector de ultravioleta. Uma curva
padrão foi estabelecida usando-se concentrações conhecidas de taxtomina A
purificada (Anexo – Figura 3). Os resultados foram expressos em microgramas de
toxina por mililitro de metanol.
A figura 4 esquematiza as etapas de obtenção e purificação da taxtomina A,
proveniente de Streptomyces spp.
72
Figura 4 - Esquema de obtenção e purificação da fitotoxina taxtomina A, a partir de um isolado de
Streptomyces spp.
Repicagem e cultivo em meio líquido de aveia (pH 7,2) em agitador orbital
(
150 r
p
m
)
a 28
o
C
p
or 4 dias.
Filtragem em papel de filtro Whatman N° 2
Cultivo do isolado IBSBF – 2147 de Streptomyces spp. em meio aveia-ágar
(pH 7,2) a 28
o
C por 12 dias
Partição do filtrado da fase aquosa com acetato de etila (1:1,5; v/v)
Evaporação do acetato de etila e resuspenssão em metanol p.a.
Purificação em cromatografia de camada delgada (TLC) e recuperação de
bandas corres
p
ondentes a taxtomina A.
Raspagem da sílica referente as bandas de taxtomina A purificada e
dissolução em água ultra pura
Centrifugação a 1000 g por 10 minutos, separação da fase aquosa e descarte
da sílica precipitada
Quantificação em HPLC (eluição isocrática de acetonitrila : água ultra pura
(25 / 75%) por 30 min em fluxo de 1,0 mL.min
-1
e monitormento a 380 nm).
Armazenamento da taxtomina A purificada em freezer (-20 °C)
73
3.2.2.2 Alterações ultraestruturais provocadas pela taxtomina A
3.2.2.2.1 Bioensaio com a fitotoxina
Para o estudo do mecanismo de ação da taxtomina A e alterações
ultraestruturais provocadas por esta toxina em células vegetais, sementes de
sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench], do cultivar BRS-501, foram desinfestadas
em hipoclorito de sódio 1% (15 min), lavadas e embebidas em água, a
temperatura ambiente por 12 h. Após este período foram enroladas em folhas de
papel de germinação umedecidas e incubadas no escuro a 28°C por 7 dias
(NICHOLSON et al., 1988). As plântulas formadas foram individualmente medidas
e cortadas, sendo utilizado apenas os 4 cm superiores dos mesocótilos contendo
os coleóptilos, medindo-se a partir do ápice dos mesocótilos e descartando-se a
parte inferior e raízes do mesmo. Estes mesocótilos foram colocados em tubos de
ensaios de 1 cm de diâmetro contendo 300 µL de solução de taxtomina A, nas
concentrações de 0 e 200 µg taxtomina A/ mL de água. Preparou-se também um
controle com o extrato do meio de aveia, utilizado para o cultivo da bactéria. No
interior de cada tubo foram colocados 3 mesocótilos, sendo utilizados 4 tubos para
cada concentração de taxtomina A (cada tubo correspondendo a uma repetição).
Posteriormente, os tubos foram fechados com filme plástico e incubados em
câmara de crescimento tipo B.O.D. (28°C; 12 h de fotoperíodo) por 7 dias. Desta
maneira, foram obtidas plântulas apresentado ou não sintomas e adequadas para
as avaliações por microscopia eletrônica de transmissão (MET).
3.2.2.2.2 Preparação de amostras para MET
As preparações e as observações das amostras para a MET foram
realizadas no NAP/MEPA da ESALQ/USP. Os coleóptilos de tecidos tratados com
taxtomina A nas concentrações 0 e 200 µg foram coletados, cortados e imersos
em solução fixativa (Karnovisk's modificado), pH 7,2 por um período de 24 h,
lavados em tampão cacodilato (três vezes de 10 min), pós-fixados em tetróxido de
ósmio 1% em água por 1 hora, lavados por duas vezes de 15 min em água
destilada, transferidos para solução a 0,5 % de citrato de uranila durante 12h a
74
4°C e em seguida, lavados novamente em água destilada e desidratados em
gradiente de acetona (30, 50, 70, 90 e 100 % por três vezes). Em seguida, o
material foi incluído em gradiente crescente de Spurr/acetona 30 % (8h), 70 % 12
h e 100 % duas vezes por 24 h cada, sendo os espécimes montados em moldes e
colocados para polimerizar em estufa a 70°C por 48 h (ALVES, 2003; BOZZOLA;
RUSSELL, 1999).
3.2.2.2.3 Ultramicrotomia
Os blocos obtidos foram levados a um aparelho de "Trimming" para a
retirada dos excessos. Em seguida, secções semifinas (0,85 µm) e ultrafinas (100
nm) foram cortadas usando-se um Ultramicrotomo Reichrt-jung (ultracut E), com o
auxílio de navalha de vidro. Os cortes ultrafinos (80-100 nm) foram coletados em
telinhas de cobre (“copper slot grids”) e secos em raques de alumínio cobertos
com formvar (ROWLEY; MORAN, 1975; BOZZOLA; RUSSELL, 1999). As secções
foram pós-contrastadas em citratato de uranila, seguido por acetato de chumbo
por 3 min cada e, em seguida, examinadas em microscópio eletrônico de
transmissão Zeiss EM 902A a 30 kv (ALVES, 2003; BOZZOLA; RUSSELL, 1999).
3.2.2.3 Alterações bioquímicas provocadas pela taxtomina A
3.2.2.3.1 Bioensaio com a fitotoxina
Novamente, mesocótilos foram obtidos conforme descrito no item 3.2.2.2 e
colocados em tubos de ensaios de 1 cm de diâmetro contendo solução de
taxtomina A, nas concentrações 0, 25, 50, 100, 150, 200 µg toxina/ mL de água.
Fez-se também um controle com o extrato do meio de aveia, utilizado para o
cultivo da bactéria. No interior de cada tubo foram colocados 3 mesocótilos, sendo
feitos 4 tubos para cada concentração de taxtomina A (cada tubo correspondendo
a uma repetição). Posteriormente, os tubos foram fechados com filme plástico e
incubados em câmara de crescimento tipo B.O.D. (28°C; 12 h de fotoperíodo) por
7 dias. Desta maneira, foram obtidas plântulas com diferentes níveis de sintomas
e adequadas para os bioensaios de produção de fitoalexinas, crescimento e
75
quantificação de clorofilas A e B. Todos os ensaios foram repetidos 2 vezes em
um intervalo de 20 dias para a confirmação dos resultados.
3.2.2.3.2 Avaliação da redução do crescimento
Após o período de incubação e antes das avaliações dos demais parâmetros,
os mesocótilos de cada tratamento foram medidos, visando-se avaliar o efeito da
taxtomina A no crescimento das plântulas.
3.2.2.3.3 Quantificação de clorofilas A e B
As porções superiores dos mesocótilos de sorgo (coleóptilos) foram
cortadas e coletadas apenas 0,1 g por repetição. Estas amostras de tecido vegetal
foram colocadas em tubos tipo eppendorf, contendo 2 mL de acetona 80 %,
utilizada sempre a 4 °C, sendo todo o procedimento realizado protegendo-se as
amostras da luz pelo uso de papel alumínio. Em seguida, estas foram maceradas
em almofariz e filtradas através de papel de filtro Whatman n° 1, sendo o volume
completado para 4 mL com acetona 80 %. Determinou-se a absorbância das
amostras a 663 nm para a determinação da clorofila A e 645 nm para a clorofila B
em espectrofotômetro, sendo o conteúdo de clorofilas de cada amostra expresso
em mg de clorofila / grama de tecido fresco (g.t.f.) (ARNON, 1949;
HAMMERSCHMIDT; NICHOLSON, 1977).
3.2.2.3.4 Permeabilidade seletiva da membrana plasmática
Os mesocótilos foram previamente tratados com taxtomina A, conforme o
item (ítem 3.2.2.2.1) (15 mesocótilos por repetição e 5 repetições por tratamento)
com o objetivo de se avaliar as alterações provocadas pela taxtomina A na
condutividade elétrica da membrana plasmática de células vegetais. As secções
de tubérculos foram previamente tratadas com 20 µL de solução de taxtomina A
(0, 25, 50, 100 e 200 µg taxtomina A / mL água deionizada). Periodicamente, a
condutividade elétrica da membrana foi avaliada com auxílio de um condutivímetro
(HI 9043, Hanna Istruments) em solução de sacarose 0,1 M. Para isto, 1 g das
amostras foram tratadas com 20 µL de solução de taxtomina A, incubadas por 12
76
horas e avaliadas após este período. O controle correspondeu aos mesocótilos
tratados apenas com o produto de extração do meio de cultivo da bactéria, além
da avaliação da condutividade elétrica da solução de sacarose, para se evitar as
interferências provocadas pelas variações de temperatura no ambiente.
3.2.2.3.5 Bioensaio de fitoalexinas
No ensaio de produção de fitoalexinas, mesocótilos previamente tratados
com taxtomina A, conforme o item 3.2.2.2.1 (3 mesocótilos por repetição e 5
repetições por tratamento), foram cortados e uma porção de 2,5 cm pesada,
cortada em pequenos segmentos e colocadas em tubos tipo eppendorf, contendo
1,4 mL de metanol 80% acidificado (0,1% HCl; v/v). Os segmentos de mesocótilos
foram mantidos a 4 °C no metanol por 96 h para extração dos pigmentos e a
absorbância foi determinada a 480 nm (NICHOLSON et al., 1987, 1988; SNYDER;
NICHOLSON, 1990). Os dados foram expressos em absorbância a 480 nm por
grama de tecido fresco (Abs 480 nm/g.t.f.).
3.2.3 Resultados e Discussão
3.2.3.1 Alterações ultraestruturais provocadas pela taxtomina A
Para analisar os efeitos associados com a fitotoxina taxtomina A purificada,
a principal toxina produzida pelo isolado de Streptomyces spp. IBSBF – 2147, a
mesma foi aplicada em tecidos de sorgo e os tecidos foram avaliados após sete
dias do tratamento. As imagens de MET trouxeram mais evidências da ação da
fitotoxina taxtomina A sobre membranas de células vegetais de plantas de
diferentes famílias botânicas, como o sorgo. Em cortes transversais do mesofilo
foliar dos coleóptilos de sorgo, tratados com solução de taxtomina A (200 µg/mL),
pode-se observar um grande número de células plasmolisadas, apresentando
descolamento da membrana plasmática da parede celular em vários pontos ou
totalmente, o que não ocorreu em plantas não tratadas, ou somente tratadas com
o meio de cultivo da bateria (Figura 5). Neste tipo de corte foi possível observar
deformação em cloroplastos. Em contraste com o controle, os cloroplastos
77
perderam sua forma túrgida e passaram a apresentar deformações na superfície
(Figura 6).
De forma geral, observou-se uma desorganização no citoplasma e
organelas de células tratadas com a taxtomina A, quando comparadas ao controle
(Figuras 5 e 6). Os núcleos das células tratadas com taxtomina A apresentavam
morfologia irregular, apresentando invaginações ou lóbulos na carioteca (Figura
5A e 6A). Além disso, observaram-se com maior freqüência células binucleadas
(Figura 6A), conforme já descrito na literatura por Fry e Loria (2002), por avaliação
em microscopia de luz.
Conforme esperado, a fitotoxina não atuou sobre a morfologia das fibras
presentes em vasos condutores no tecido foliar (resultados não apresentados).
Isto se deve ao fato das fitotoxinas atuarem principalmente sobre estruturas
membranosas, como organelas e membrana plasmática de células vegetais
(PATIL, 1974). Em contrapartida, observou-se irregularidades na superfície das
paredes internas e externas das células de tecidos tratados com taxtomina A
(Figuras 5 e 6), isto deve ser devido a deposição irregular de celulose nas
paredes, conforme descrito por Scheible et al. (2003).
78
Figura 5 – Eletromicrografias de transmissão de células do mesofilo foliar de coleóptilos de sorgo,
tratados ou não com a fitotoxina taxtomina A. Em A e B observam-se células do tecido
tratados com taxtomina A (200 µg / mL), apresentando plasmólise (setas) e ausência de
cloroplastos. Em C e D observa –se células do tratamento controle, tratadas apenas com
o meio de cultivo da bactéria, na ausência da toxina. Nota-se organização celular normal,
ausência de plasmólise (setas) e presença de cloroplastos.
D
C
A B
79
Figura 6 – Eletromicrografias de transmissão de células do mesofilo foliar de coleóptilos de sorgo,
tratados ou não com a fitotoxina taxtomina A. Em A e B observa-se células de tecidos
tratados com taxtomina A (200 µg / mL) apresentando deformação nos cloroplastos
(setas) e desorganização do citoplasma. Pode-se observar em A também uma célula
binucleada apresentando invaginações nos núcleos. As imagens C e D representam
células do tratamento controle, tratadas apenas com o meio de cultivo da bactéria, na
ausência da toxina, apresentando cloroplastos com morfologia e turgidez normais.
DC
A B
80
3.2.3.2 Alterações bioquímicas provocadas pela taxtomina A
As diferentes concentrações de taxtomina A provocaram níveis de
sintomas gradativos nas plântulas de sorgo tratadas (Figura 7). O bioensaio
revelou a redução no teor de clorofilas A e B e no crescimento das plântulas em
função das diferentes doses de taxtomina A (Figuras 7, 8 e 9). Estes resultados
comprovam o uso da avaliação do teor de clorofilas A e B como parâmetros de
avaliação de estresse causados por doenças e metabólitos de patógenos em
plantas (HAMMERSCHMIDT; NICHOLSON, 1977).
Os resultados dos bioensaios com mesocótilos de sorgo demonstraram o
claro efeito da fitotoxina na indução de fitoalexinas do tipo deoxiantocianidinas
(Figuras 7 e 10). Estas fitoalexinas servem como fatores bioquímicos de
resistência pós-formados (PASCHOLATI, 1995). Nos dois ensaios observou-se
um maior acúmulo de fitoalexinas na concentração 100 µg taxtomina A/ mL de
água, conforme apresentado nas Figuras 7 e 10. Em concentrações acima de 150
µg taxtomina A/ mL observa-se a morte progressiva dos mesocótilos, o que
justifica a redução na produção de fitoalexinas. Outras alterações morfológicas
foram observadas, como: a formação de radicelas apenas no controle e nos
mesocótilos; o tratamento com 200µg taxtomina A ocorreu necroses no meristema
apical após 1 dia, justificando o crescimento nulo obtido nesta dose, conforme
apresentado na Figura 7.
81
Figura 7 - Mesocótilos de sorgo com sete dias tratados com diferentes concentrações de
taxtomina A proveniente de Streptomyces spp. As letras mostram as diferentes
concentrações de taxtomina A.: “m” ´corresponde ao meio (controle) e as diferentes
concentrações 0, 50, 100, 150, 200 ug/mL taxtomina A. Observa-se redução de
crescimento e acúmulo de fitoalexinas em função das concentrações de taxtomina A
0
1
2
3
4
0 50 100 150 200 250
µg taxtomina A / mL meio
Mg clorofila / g tecido fresco
Clorofila A
Clorofila B
Figura 8 – Alterações nas concentrações de clorofila A e B em plântulas de sorgo tratadas com
diferentes concentrações de taxtomina A e com o extrato do meio de cultivo de
Streptomyces spp. Avaliação após sete dias do tratamento. Média ± Desvio Padrão
82
0
1
2
3
4
0 50 100 150 200
µg taxtomina A / mL meio
Abs. 480 nm / g tecido
Figura 10 – Acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo tratados com diferentes
concentrações de taxtomina A e incubados (25°C e fotoperíodo de 12 h.). Os
dados estão expressos em Abs 480 nm / grama de tecido fresco (g.t.f.). Avaliação
após sete dias do tratamento. Média ± Desvio Padrão
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200
µg taxtomina A / mL meio
Comprimento (cm)
Figura 9 – Alterações no crescimento em plântulas de sorgo tratadas com diferentes
concentrações de taxtomina A. Avaliação após sete dias do tratamento. Média ±
Desvio Padrão
83
Os bioensaios envolvendo a permeabilidade seletiva das membranas,
realizados com mesocótilos de sorgo tratados com taxtomina A, comprovam o
efeito da toxina na membrana plasmática (Figura 11). Observou-se o aumento
significativo da condutividade elétrica dos tecidos de sorgo, o que comprova a
alteração da permeabilidade seletiva das membranas celulares.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 50 100 150 200
µg taxtomina A / mL meio
Condutividade elétrica (mS)
Figura 11 – Alterações na permeabilidade seletiva da membrana plasmática de tecidos das
plântulas de sorgo tratados com diferentes concentrações de taxtomina A. Os dados
estão expressos em micro-Simens (mS) em função da diferenças na condutividade
da membrana na solução de sacarose onde o tecido foi imerso. Avaliação após sete
dias do tratamento. Média ± Desvio Padrão
Conforme comentado, o aumento na condutividade elétrica (Figura 11)
demonstra que esta toxina altera a permeabilidade seletiva da membrana
plasmática, o que pode ser reforçado pelo fato da taxtomina A alterar o fluxo de
íons, como Ca
++
e H
+
(TEGG et al., 2005). Estes resultados podem ser somados a
hipótese de Scheible et al. (2003), os quais acreditam que o principal sítio de ação
da fitotoxina taxtomina A, seja o bloqueio da biossíntese de celulose.
84
3.2.3.3 Correlações entre as análises ultraestruturais e bioquímicas
Para analisar especificamente os efeitos associados à fitotoxina taxtomina
A purificada, a principal toxina produzida pelo isolado de S. scabies IBSBF – 2147,
a mesma foi aplicada em tecidos de sorgo e os tecidos foram avaliados após sete
dias do tratamento. Os resultados das análises de MET e os resultados das
análises bioquímicas dos tecidos tratados com taxtomina A foram complementares
e em alguns casos similares. A membrana plasmática das células do mesofilo
foliar mostrou-se retraída e destacada da parede celular em diversos pontos, sem
o rompimento da mesma. Aparentemente, em todas as células dos tecidos do
mesofilo foliar tratadas com a taxtomina A se observou desorganização
significativa e deformações dos cloroplastos e perda de tugidez. Estas
deformações nos cloroplastos foram seguidas pela redução do teor de clorofilas A
e B no tecido avaliado. As plântulas também apresentaram um elevado acúmulo
de fitoalexinas, de forma semelhante à presença do patógeno. Desta forma, doses
mínimas da toxina poderiam ser exploradas devido a sua capacidade eliciadora,
induzindo os mecanismos de defesa da planta.
A taxtomina A induziu alterações ultraestruturais, fisiológicas e bioquímicas
nas células de sorgo similares aquelas causadas por outras fitotoxinas em outras
plantas. Por exemplo, Alternaria spp. produz AM-toxina e AK-toxina que induzem
invaginações da membrana plasmática (KOHMOTO et al., 1976; PARK et al.,
1976; PARK 1978). Além disso, a taxtomina A afeta a forma do núcleo induzindo a
formação de lóbulos (FRY; LORIA, 2002). Os núcleos no tecido de beterraba
tratado com cercosporina apresentaram também lóbulos (STEINKAMP et al.,
1981). A taxtomina A induz a deposição de material elétron-denso amorfo nas
paredes de células de tubérculos da batata (STEIN et al., 1994). A justaposição da
parede celular foi relatada também em muitos estudos ultraestruturais que
envolvem toxinas, como por exemplo, vitorina (HANCHEY, 1981), AM-toxina I, e
AK-toxina (PARK, 1978). Stein et al. (1994) estudaram aspectos citológicos de
lesões de sarna da batata e relataram à presença de células com paredes grossas
e amarronzadas. Estes autores mostraram também a ação da taxtomina A na
85
formação de depósitos de um material denso em ambos os lados das paredes
celulares.
O efeito da fitotoxina taxtomina A sobre a redução do teor de clorofilas
descrito neste trabalho, foi descrito também para outras toxinas bacterianas, como
a tabtoxina de Pseudomonas syringae pv. tabaci em folhas de fumo. A tabtoxina
provocou nas primeiras 16 horas redução da atividade fotossintética e nos teores
das clorofilas A e B (TURNER; DEBBAGE, 1982).
Certamente, a taxtomina A, como diversas outras fitotoxinas, como a
amilovorina (GOODMAN, 1972; HUANG; GOODMAN, 1976; GOODMAN; KIRALY;
WOOD, 1986), fusicoccina (HANCHEY, 1981), e a vitorina (HANCHEY; WEELER;
LUKE, 1968), induzem a plasmólise. (WALTON, 1996; WENZEL, 1985).
Entretanto, o mecanismo pelo qual a taxtomina A é envolvida na alteração da
integridade de células vegetais é ainda desconhecido. Stein et al. (1994)
mostraram que as células de tecido de tubérculos de batata tratadas com a
taxtomina apresentaram desorganização muito similar às células do tecido
infectado por S. scabies. As plântulas tratadas com taxtomina A exibiram
hipertrofia e não apresentaram aumento do número de células (LEINER et al.,
1996), e em seus sistemas radiculares as células meristemáticas exibiram drástica
redução da atividade mitótica (LORIA et al. 1997). Loria et al. (2001) sugeriram
que a taxtomina A pode afetar a estrutura citoesqueletal na divisão celular da
planta. Neste trabalho, as células de sorgo tratadas com a taxtomina A não
mostraram nenhuma hipertrofia; o que pode ser devido a alta concentração da
toxina aplicada no tecido (200 µg) ou à natureza da espécie vegetal avaliada.
Porém, o efeito da taxtomina A observado mais freqüentemente foi à ação sobre a
membrana plasmática de células de sorgo, com a conseqüente indução de
plasmólise.
86
3.3 Conclusões
A taxtomina A atua principalmente sobre a membrana plasmática de células
vegetais, provocando alterações na permeabilidade seletiva da membrana,
plasmólises, invaginações no núcleo, desorganização celular e atuando sobre
cloroplastos, provocando deformações e redução no teor de clorofilas dos tecidos
de plântulas de sorgo. Em contrapartida, o acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos
de sorgo evidencia que concentrações mínimas desta toxina podem atuar como
eliciadores da resposta de defesa em plantas.
Referências
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91
ANEXO
92
y = 10403x + 5420,8
R
2
= 0,9993
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 102030405060
µg concanamicina A / mL
unidades de área
Figura 1 - Curva padrão da concentração de concanamicina A por unidades de área determinada
por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
y = 397,68x - 226,8
R
2
= 0,9999
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 20 40 60 80 100 120
µg concanamicina B / mL
unidades de área
Figura 2 - Curva padrão da concentração de concanamicina B por unidades de área determinada
por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
y = 4405,8x - 2482,6
R
2
= 0,9959
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 102030405060
µg taxtomina A /mL
unidades de área
Figura 3 - Curva padrão da concentração de taxtomina A por unidades de área determinada por
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
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