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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Pré-Penetração de Guignardia psidii em goiaba: influência da temperatura, duração do
molhamento, idade dos frutos e concentração de etileno e dióxido de carbono
Maria Eugenia Escanferla
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2007
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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Pré-Penetração de Guignardia psidii em goiaba: influência da temperatura, duração do
molhamento, idade dos frutos e concentração de etileno e dióxido de carbono
Maria Eugenia Escanferla
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Escanferla, Maria Eugenia
Pré-penetração de Guignardia psidii em goiaba: influência da temperatura, duração do
molhamento, idade dos frutos e concentração de etileno e dióxido de carbono / Maria
Eugenia Escanferla. - - Piracicaba, 2007.
85 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2007.
Bibliografia.
1. Dióxido de carbono 2. Etileno 3. Fungo fitopatogênico 4. Goiaba 5. Molhamento –
Duração 6. Pinta-preta 7. Temperatura – Influências I. Título
CDD 634.421
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
Maria Eugenia Escanferla
Bióloga
Pré-Penetração de Guignardia psidii em goiaba: influência da temperatura, duração do
molhamento, idade dos frutos e concentração de etileno e dióxido de carbono
Orientador:
Prof. Dr. NELSON SIDNEI MASSOLA JÚNIOR
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2007
3
Aos meus pais Luiz e Satie pelo amor e motivação dados durante todos os anos de minha
vida;
A minha irmã Ana Carolina pela amizade e bons momentos de diversão e descontração;
Ao Renato pelo companheirismo, apoio e carinho em todos os momentos;
As amigas Helen e Larissa sempre presentes trazendo alegria e amizade.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo amor e pela vida;
A Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP) e ao Setor de Fitopatologia,
pelas condições oferecidas;
Ao Professor Doutor Nelson Sidnei Massola Júnior pela orientação e amizade;
Ao CNPq pela bolsa concedida;
A professora Doutora Lilian Amorim pelo auxílio e orientação;
Ao produtor Ricardo Kumagai e sua esposa Cristina por contribuírem para elaboração de grande
parte dos experimentos e pela amizade;
As amigas Sylvia e Raquel por auxiliarem neste trabalho e pela amizade;
A todos os professores do Setor de Fitopatologia pela amizade e ensinamentos concedidos;
A todos os funcionários do Setor de Fitopatologia, em especial ao Jeferson e a Linda, pela
amizade e auxílio;
A todos os amigos do Setor de Fitopatologia, em especial a Cassiara e Sthela pela amizade;
Ao Professor Doutor Jacomino, a Gabriela e Marcos pelo auxílio e boa disposição para realização
de determinados experimentos;
Aos funcionários da biblioteca pela disposição em ajudar, bom humor e auxílio nas correções;
Ao Roberto Carvalho, Luciano Rosa e José Pavani pelo incentivo e pelos primeiros conceitos
formados na área de Fitopatologia;
As amigas Luzia e Edneia pela formação e amizade durante minha graduação;
A todos que indireta ou diretamente contribuíram para realização deste trabalho.
5
“Deus nos concede, a cada dia, uma página de
vida nova no livro do tempo. Aquilo que
colocarmos nela, corre por nossa conta.”
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei;
não fosse por elas, eu não teria saído do lugar...
As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo
as críticas nos auxiliam muito.”
Francisco Cândido Xavier
6
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................................ 8
ABSTRACT .................................................................................................................................. 10
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 12
Referências .................................................................................................................................... 14
2 DESENVOLVIMENTO............................................................................................................. 16
2.1 Revisão Bibliográfica .............................................................................................................. 16
2.1.1 A cultura da goiabeira........................................................................................................... 16
2.1.2 Pinta Preta............................................................................................................................. 18
2.1.3 Fatores ambientais................................................................................................................ 20
2.1.4 Apressório............................................................................................................................. 22
2.1.5 Quiescência........................................................................................................................... 24
Referências .................................................................................................................................... 26
3 PRÉ-PENETRAÇÃO DE Guignardia psidii EM GOIABA: EFEITO DA TEMPERATURA,
DURAÇÃO DO MOLHAMENTO E IDADE DO FRUTO......................................................... 32
Resumo.......................................................................................................................................... 32
Abstract.......................................................................................................................................... 33
3.1 Introdução................................................................................................................................ 34
3.2 Material e métodos .................................................................................................................. 36
3.2.1 Condução dos experimentos................................................................................................. 36
3.2.2 Obtenção e manutenção do isolado de G. psidii................................................................... 36
3.2.3 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de conídios
de G. psidii in vitro........................................................................................................................ 36
3.2.4 Obtenção dos frutos de goiabeira ......................................................................................... 37
3.2.5 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de conídios
de G. psidii em goiaba................................................................................................................... 38
3.2.6 Avaliação da pré-penetração de conídios de G. psidii em diferentes idades de frutos de
goiabeira ........................................................................................................................................ 39
3.3 Resultados................................................................................................................................ 40
7
3.3.1 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de conídios
de G. psidii in vitro........................................................................................................................ 40
3.3.2 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de conídios
de G. psidii em goiaba................................................................................................................... 44
3.3.3 Avaliação da pré-penetração de conídios de G. psidii em diferentes idades de frutos de
goiabeira ........................................................................................................................................ 49
3.4 Discussão................................................................................................................................. 52
3.5 Conclusão ................................................................................................................................ 59
Referências .................................................................................................................................... 59
4 EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE DIÓXIDO DE CARBONO E ETILENO
NA PRÉ-PENETRAÇÃO DE Guignardia psidii EM GOIABA.................................................. 65
Resumo.......................................................................................................................................... 65
Abstract.......................................................................................................................................... 66
4.1 Introdução................................................................................................................................ 67
4.2 Material e métodos .................................................................................................................. 69
4.2.1 Condução dos experimentos................................................................................................. 69
4.2.2 Obtenção e manutenção do isolado de G. psidii................................................................... 69
4.2.3 Efeito in vitro de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii 69
4.2.4 Efeito de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii em frutos
de goiabeira ................................................................................................................................... 70
4.3 Resultados................................................................................................................................ 72
4.3.1 Efeito in vitro de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii 72
4.3.2 Efeito de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii em frutos
de goiabeira ................................................................................................................................... 74
4.4 Discussão................................................................................................................................. 77
4.5 Conclusões............................................................................................................................... 79
Referências .................................................................................................................................... 79
ANEXOS....................................................................................................................................... 82
8
RESUMO
Pré-Penetração de Guignardia psidii em goiaba: influência da temperatura, duração do
molhamento, idade dos frutos e concentração de etileno e dióxido de carbono
A pinta preta provocada pelo fungo Guignardia psidii Ullasa e Rawal (Phyllosticta
psidiicola (Petrak) van der Aa) vem gerando perdas pós-colheita na produção de goiaba para
consumo in natura. Este trabalho buscou maiores informações sobre esta doença por meio do
estudo do efeito da temperatura, da duração do período de molhamento, do efeito dos gases
dióxido de carbono e etileno, e da idade dos frutos de goiabeira na pré-penetração de conídios de
G. psidii. Os estudos in vitro foram avaliados por meio de microscópio de luz e os in vivo por
meio de microscópio eletrônico de varredura, registrando-se a porcentagem de conídios
germinados, apressórios formados e apressórios melanizados (in vitro). O efeito da temperatura
(10 a 40ºC) e da duração do período de molhamento (6 a 48 in vitro e 6 a 24 horas in vivo) na
germinação, formação de apressórios e apressórios melanizados (in vitro) foram avaliados em
superfície de poliestireno e de frutos de goiabeira. Em ambas as superfícies, à medida que a
temperatura aumentou, observou-se o aumento gradual da germinação, formação de apressório e
apressório melanizado atingindo o máximo a 25ºC e duração de período de molhamento de 24
horas in vivo e 48 horas in vitro. Nessas condições, os valores obtidos foram 38% de conídios
germinados, 37,7% de apressórios formados e 32,7% de apressórios melanizados in vitro e 45,6%
de conídios germinados e 11,2% de apressórios formados in vivo. As taxas de germinação e
formação de apressório foram maiores no experimento in vivo. A germinação e formação de
apressório de conídios de G. psidii foram avaliadas em cinco diferentes idades de frutos: 10 dias,
35 dias, 60 dias, 85 dias e 110 dias. Observou-se o aumento gradual das variáveis avaliadas com
o aumento da idade do fruto, apresentando, em frutos com 10 dias, 8,4% de conídios germinados
e 3,2% de apressórios formados, enquanto os frutos com 110 dias apresentaram 43,2% de
conídios germinados e 26,4% de apressórios formados. O efeito das concentrações 0, 3, 6 e 12%
de dióxido de carbono e 0, 1, 3 e 6 ppm de etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii
foram avaliadas in vitro e in vivo. No experimento in vitro, o aumento das concentrações de
dióxido de carbono provocou queda na germinação dos conídios de G. psidii quando comparado
ao controle. No entanto, entre as concentrações deste gás a taxa de germinação manteve-se
estável. Portanto, no controle esta variável apresentou valor médio de 45,1% enquanto que nas
concentrações 3, 6 e 12% do gás passou para, respectivamente, 24,6%, 22,6% e 25,8%.
Entretanto, o aumento das concentrações deste gás provocou decréscimo progressivo da taxa de
formação de apressórios e apressórios melanizados. Na concentração de 3% de dióxido de
carbono houve 10,3% de apressórios formados e 5,4% de apressórios melanizados e na
concentração de 12%, esses valores foram reduzidos para 4,1% e 0,5%, respectivamente. No
entanto, no experimento in vivo, as taxas de germinação e formação de apressórios apresentaram
redução gradativa entre as concentrações 3 e 6% de dióxido de carbono, elevando-se novamente a
12%, passando de 28,2% de conídios germinados e 20,5% de apressórios formados na
concentração de 6% de dióxido de carbono para, respectivamente, 49,3% e 38,2% a 12% de
concentração desse gás. Esse comportamento pode ser explicado devido à remoção dos conídios
não germinados durante o preparo das amostras para visualização em microscópio eletrônico. O
etileno, tanto nos experimento in vitro quanto in vivo não apresentou efeito sobre a germinação e
formação de apressórios de G. psidii. Apresentando no controle in vitro 34,6% de conídios
9
germinados, 34,2% de apressórios formados e 29,9% de apressórios melanizados e na maior
concentração de etileno estudada (6 ppm) 26,7% de conídios germinados, 26,3% de apressórios
formados e 20,2% de apressórios melanizados. Nos ensaios in vivo, o controle apresentou 40% de
conídios germinados e 32,7% de apressórios formados e na maior concentração de etileno
estudada 49,3% de conídios germinados e 38,2% de apressórios formados.
Palavras-chave: Goiaba; Guignardia psidii; Pré-penetração; Temperatura; Período de
molhamento; Idade do fruto; Etileno; Dióxido de carbono
10
ABSTRACT
Pre-penetration of Guignardia psidii in guava: effect of temperature, wetness duration,
fruit age and concentrations of ethylene and carbon dioxide
The black spot caused by the fungus Guignardia psidii Ullasa and Rawal (Phyllosticta
psidiicola (Petrak) van der Aa) has been causing post-harvest losses of guava fruit for
consumption in natura. This work was designed to investigate the effects of temperature, wetness
duration, carbon dioxide and ethylene concentration, and guava fruit age on the pre-penetration of
G. psidii. The percentages of germinated conidia, formed appressoria and melanized appressoria
were evaluated in both in vitro and in vivo experiments, using a light microscope in the former
and a scanning electron microscope in the later. The effects of temperature (10 to 40ºC) and
wetness duration (6 to 48 hours in vitro and 6 to 24 hours in vivo) on the germination, appressoria
formation and melanized appressoria (in vitro) were evaluated on a polystyrene surface and on
the fruit’s surface. In both surfaces, as the temperature increased a gradual increase in conidia
germination, appressoria formation and melanized appressoria was observed, reaching maximum
at 25ºC with wetness duration being 24 hours in vivo and 48 hours in vitro. In these conditions,
the values obtained were 38.0% germinated conidia, 37.7% formed appressoria and 32.7%
melanized appressoria in vitro and 45.6% germinated conidia and 11.2% formed appressoria in
vivo. Conidia germination and appressoria formation rates were higher in the in vivo experiment.
G. psidii conidia germination and appressoria formation were evaluated at five different fruit
ages: 10 days, 35 days, 60 days, 85 days and 110 days. A gradual increase of the evaluated
variables was observed as the fruit’s age increased, presenting in fruits with 10 days, 8.4%
germinated conidia and 3.2% formed appressoria, while the fruits with 110 days presented 43.2%
germinated conidia and 26.4% formed appressoria. The effects of carbon dioxide concentration at
0, 3, 6 and 12% and ethylene at 0, 1, 3 and 6 ppm on the pre-penetration of G. psidii were
evaluated in vitro and in vivo. In the in vitro experiment an increase in the carbon dioxide
concentration provoked a decrease in G. psidii conidia germination when compared to the
control. However, between the gas concentrations tested, the germination rate was stable.
Therefore, in the control this variable presented a mean value of 45.1% while in the gas
concentration of 3, 6 and 12%, the mean values were, respectively, 24.6%, 22.6% and 25.8%.
However, increasing carbon dioxide concentration caused a progressive decrease in appressoria
formation and melanized appressoria rates. At a concentration of 3% carbon dioxide, there was
10.3% formed appressoria and 5.4% melanized appressoria and at 12% concentration these
values were reduced to 4.1% and 0.5%, respectively. Nonetheless, in the in vivo experiment, the
rates of germination and appressorium formation presented a gradual reduction between the 3 and
6% dioxide carbon concentrations, increasing again at 12%, increasing from 28.2% germinated
conidia and 20.5% formed appressoria at 6% carbon dioxide concentration to, respectively,
49.3% and 38.2% at 12% concentration of this gas. This behavior could be due to the removal of
the conidia that did not germinate, during the preparation of the sample for electron microscope
observation. Ethylene, in both the in vitro and in the in vivo experiments, showed no effect on G.
psidii germination and appressoria formation, presenting in the in vitro control, 34.6%
germinated conidia, 34.2% formed appressoria and 29.9% melanized appressoria and in the
highest ethylene concentration studied (6 ppm) 26.7% germinated conidia, 26.3% formed
appressoria and 20.2% melanized appressoria. In the in vivo assays, the control presented 40.0%
11
germinated conidia and 32.7% formed appressoria and in the highest ethylene concentration
studied 49.3% germinated conidia and 38.2% formed appressoria.
Keywords: Guava; Guignardia psidii; Pre-penetration; Temperature; Wetness period; Fruit Age;
Ethylene; Carbon dioxide
12
1 INTRODUÇÃO
O Brasil, terceiro maior produtor de frutas do mundo, atrás apenas da China e Índia, tem
aumentado gradativamente a participação no comércio mundial de frutas frescas e de derivados.
A produção de frutas no país em 2006 foi de aproximadamente 40,6 milhões de toneladas, porém
apenas 2% da produção foi exportada. No primeiro trimestre de 2007, as vendas nacionais
registraram alta de 15% em valores. A média mundial nesse mesmo período é inferior aos dados
registrados pelo Brasil. Em 2006 as exportações brasileiras de frutas frescas geraram divisas
superiores à US$ 480 milhões para o volume aproximado de 830 mil toneladas (INSTITUTO
BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – IBGE, 2007; INSTITUTO BRASILEIRO
DE FRUTAS - IBRAF, 2007).
As principais frutas vendidas ao exterior são a uva, melão, manga, banana, limões e limas,
maçã, laranja, melancia, abacaxi, tangerina, mamão, abacate, framboesa e goiaba. Tendo como
destino principal à União Européia, que hoje concentra 70% do volume das exportações
brasileiras. Devido ao grande potencial do Brasil como exportador e a necessidade de diversificar
o destino das exportações, o IBRAF fez um levantamento das oportunidades dos principais
mercados emergentes e vem realizando várias ações para alavancar as exportações de frutas
frescas e processadas (IBRAF, 2007). Entre estas, a goiaba (Psidium guajava L.) se destaca por
apresentar excelente qualidade nutricional e agradáveis características organolépticas (sabor e
aroma), apresentando teores consideráveis de vitamina C e outras vitaminas, açúcares, ferro,
cálcio e fósforo na polpa. Além disso, contém fibras e elevada digestibilidade, fatores que são
favoráveis à saúde humana (CARVALHO, 1994). Sendo as variedades de polpa branca
destinadas ao mercado in natura e as de polpa vermelha com dupla aptidão, mercado in natura e
indústria (GORGATTI NETTO et al., 1996).
A conscientização da população sobre a importância do consumo de alimentos saudáveis
na prevenção de doenças e na melhoria de qualidade de vida vem aumentando
consideravelmente. Isto tem resultado no aumento mundial de consumo de frutas, que
correspondem a alimento de ótima qualidade (AZZOLINI, 2002). Para os exportadores de frutas
brasileiras garantirem a competitividade no mercado internacional foi criada a Produção
Integrada de Frutas (PIF) em 1998/99, pelo PROFRUTA - Programa de Desenvolvimento da
Fruticultura, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Toda a produção
13
de frutas recentemente exportada para o mercado europeu exige esta certificação com objetivo de
garantir a segurança do alimento e de promover o desenvolvimento sustentável. No estágio atual,
o Sistema PIF já atingiu a consolidação de 17 espécies frutíferas (maçã, uva, manga, mamão,
citros, caju, coco, banana, melão, pêssego, goiaba, caqui, maracujá, fico, abacaxi, mangaba e
morango), sendo a goiaba validada no início de 2005 (ANDRIGUETO; NASSER; TEIXEIRA,
2006).
A grande perda de frutas e hortaliças após a colheita é realidade, principalmente nos
países em desenvolvimento, como o Brasil. Dentre os principais motivos, encontra-se a ação de
fitopatógenos os quais conquistam a planta viva como fonte de nutrientes e podem provocar
perdas pós-colheita. As fases iniciais do ciclo de vida de fungos fitopatogênicos de frutas e
vegetais envolvem a deposição do esporo na superfície do hospedeiro, germinação e produção de
estruturas de penetração ou penetração direta através de ferimentos ou aberturas naturais
(PRUSKY, 1996). A fase de pré-penetração abrange os eventos que ocorrem entre a germinação
e a penetração e merece extensiva atenção, visto que sua compreensão pode esclarecer como as
plantas são infectadas (BRUNELLI et al., 2005). No entanto, os sintomas de uma doença podem
se manifestar muito tempo depois dos estágios iniciais de infecção. Esta fase é conhecida como
período de quiescência, onde o patógeno tem o processo de ataque ao hospedeiro interrompido e,
sob circunstâncias específicas, pode se tornar ativo encerrando tal fase (JARVIS, 1994). Entre os
fatores que mostram influência na infecção de patógenos de plantas, encontram-se a temperatura,
o período de molhamento, idade do hospedeiro e diferentes concentrações de gases como o
dióxido de carbono e o etileno. O conhecimento da interação entre esses fatores e as diferentes
fases do ciclo da doença pode gerar medidas de controle mais eficazes e apropriadas.
Recentemente, a qualidade do fruto da goiabeira em pós-colheita vem sendo afetada pela
pinta ou mancha preta. Esta podridão é causada pelo fungo Guignardia psidii Ullasa e Rawal e o
anamorfo Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der Aa. Os sintomas da doença constituem-se,
inicialmente, de pontos deprimidos os quais evoluem rapidamente na superfície dos frutos de
forma concêntrica e tornam-se lesões de coloração preto-esverdeadas a marrom-escuras, que
podem apresentar na superfície frutificações do fungo, geralmente conidiomas picnidiais. Estas
lesões, geralmente com 1 a 2,5 cm de diâmetro, ocorrem em qualquer área do fruto, podendo
posteriormente coalescer (JUNQUEIRA et al., 2001; TOZETTO, 1995; TOZETTO; RIBEIRO,
1998).
14
Devido à importância da qualidade da goiaba para o consumo in natura e face à recente
constatação da importância da mancha preta, estudos sobre o agente causal se fazem necessários.
Este trabalho objetiva ampliar o conhecimento sobre o processo infeccioso da mancha preta,
especialmente no que se refere à importância de alguns fatores ambientais e da idade dos frutos
de goiabeira.
Referências
ANDRIGUETO, J.R.; NASSER, L.C.B.; TEIXEIRA, J.M.A. Produção integrada de frutas:
conceito, histórico e a evolução para o Sistema Agropecuário de Produção Integrada – SAPI.
Disponível em:
<http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/PAGE/MAPA/SERVICOS/PROTECAO_INTEG
RADA_DE_FRUTAS1/PROD_INTEGRADA_TEXTOS/PRODU%C7%C3O%20INTEGRADA
%20-%20SAPI.DOC>. Acesso em: 27 jul. 2006.
AZZOLINI, M. Fisiologia pós-colheita de goiabas “Pedro Sato”: estádios de maturação e
padrão respiratório. 2002. 100 p. Dissertação (Mestrado em Fisiologia e Bioquímica de Plantas) –
Escola de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2002.
BRUNELLI, K.R.; SOBRINHO, C.A.; CAVALCANTI, L.S.; FERREIRA, P.T.O.; CAMARGO,
L.E.A. Germinação e Penetração de Stenocarpella macrospora em Folhas de Milho.
Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 30, p.187-190, 2005.
CARVALHO, V.D. Qualidade e conservação pós-colheita de goiabas. Informe Agropecuário,
Belo Horizonte, v. 17, n. 179, p. 48-54, 1994.
GORGATTI NETTO, A.; GARCIA, A.E.; ARDITO, E.F.G.; GARCIA, E.C.; BLEINROTH,
E.W.; MATALLO, M.; CHITARRA, M.I.F.; BORDIN, M.R. Goiaba para exportação:
procedimentos de colheita e pós-colheita. Brasília: Embrapa, SPI, Frupex, 1996. 35 p. (Frupex.
Publicações Técnicas, 20).
INSTITUTO BRASILEIRO DE FRUTAS. Disponível em:
<http://www.ibraf.org.br/estatisticas/est_frutas.asp> Acesso em: 10 ago. 2007.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Disponível em:
<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/pam/2006/default.shtm> Acesso em: 13 ago.
2007.
JARVIS, W.R. Latent infection in pre- and postharvest environment. HortScience, St. Joseph, v.
29, p. 749-751, 1994.
JUNQUEIRA, N.T.V.; ANDRADE, L.R.M.; PEREIRA, M.; LIMA, M.M.; CHAVES, R.C.
Doenças da goiabeira no cerrado. Planaltina: EMBRAPA, 2001. 32 p. Disponível em:
<http://bbeletronica.cpac.embrapa.br/2001/cirtec/cirtec_15.pdf> Acesso em: 16 jul. 2007.
15
PRUSKY, D. Pathogen quiescence in postharvest diseases. Annual Review of Phytopathology,
Palo Alto, v. 34, p. 413-434, 1996.
TOZETTO, L.J. Caracterização, biologia e controle em pós-colheita de Guignardia psidii
Ullasa & Rawal [Phyllosticta psidiicola (Petr) van der Aa], agente causal de podridão em
frutos de goiabeira. 1995. 115 p. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) – Universidade de
Brasília, Brasília, 1995.
TOZETTO, L.J.; RIBEIRO, W.R.C. Tratamento pós-colheita de goiaba (Psidium guajava, L.)
contra podridão de Guignardia psidii. Revista Brasileira de Fruticultura, Cruz das Almas, v.
20, p. 229-234, 1998.
16
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 A cultura da goiabeira
A goiabeira (Psidium guajava L.) pertence à família Myrtaceae, a qual contém cerca de
102 gêneros e 3.024 espécies conhecidas, distribuídas e cultivadas, principalmente em países de
clima tropical e subtropical, onde apresentam plantas de porte variável, desde grandes árvores até
arbustos e trepadeiras (MANICA et al., 2001). A espécie tem origem na América tropical, mas é
muito conhecida pela grande adaptação de crescimento e produção em diferentes locais do
mundo, sendo no Brasil amplamente difundida da região Sul ao Nordeste. Os frutos são bagos
com tamanho, forma e coloração da polpa variáveis, dependendo da cultivar (GONZAGA
NETO; SOARES, 1995; MANICA et al., 2001).
Comparada às outras frutas tropicais, a goiaba destaca-se por excelentes qualidades
nutricionais, sendo considerada uma das frutas mais completas e equilibradas. Esta fruta é rica
em zinco, fibras, niacina, vitamina E e licopeno. Contém quatro vezes mais vitamina C que a
laranja, perdendo somente para a acerola, camu-camu e o caju, além de concentrar altas
quantidades de selênio, cobre, fósforo, magnésio, cálcio, ferro, ácido fólico e de vitaminas A e
complexo B. As excelentes propriedades organolépticas a tornam aproveitável tanto para o
consumo in natura quanto para a industrialização (MANICA et al., 2001).
O mercado da fruta in natura exige frutos uniformes quanto ao tamanho, forma e
coloração e preferem variedades de goiaba de polpa branca. Este mercado é ainda reduzido
devido principalmente à falta de qualidade do produto comercializado, o qual é reflexo da pós-
colheita inadequada, de precárias estruturas de comercialização e qualidade inferior da goiaba
brasileira, pois grande parte da produção destina-se a indústria, a qual é menos exigente nos
padrões de qualidade. As goiabas de polpa branca têm importância no Brasil, para a exportação
de frutos in natura. As cultivares de polpa vermelha são as preferidas pelo mercado interno para
o consumo como fruta fresca e para a indústria, as quais correspondem por quase a totalidade dos
plantios comerciais do Brasil. A polpa, de alto rendimento, pode ser transformada e
comercializada em forma de doces em pasta, sorvetes, compotas, geléias e sucos
(CHOUDHURY, 2001; MANICA et al., 2001).
17
O Brasil produziu 345.553 toneladas de goiaba em 2005, apresentando maior destaque de
produção os estados de São Paulo e Pernambuco. O estado de São Paulo produziu em 2005,
117.878 toneladas do fruto, ou seja, cerca de 34% da produção nacional (IBGE, 2007). A
Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo – CEAGESP, registrou no mesmo
ano o volume comercializado de 12.299 toneladas de goiaba, dos quais 3.095 toneladas eram
goiabas do tipo branca e 9.204 toneladas eram goiabas do tipo vermelha (FNP, 2007). A
exportação brasileira de goiaba em 2005 atingiu o patamar de US$ 128 mil e em 2006 de US$
190 mil (IBRAF, 2007). As variedades de polpa branca são preferidas para exportação como
descrito anteriormente, por apresentarem maior capacidade de conservação após a colheita
(GORGATTI NETTO et al., 1996).
Dentre as variedades de polpa branca destaca-se a Kumagai, a qual foi originada do
cruzamento da goiabeira Australiana com a IAC-4. Esta variedade caracteriza-se por apresentar
porte e vigor médio, com ramos longos, esparramados e de grande produtividade. Os frutos são
grandes, com 280 a 480 gramas, arredondados a oblongos, com a casca lisa, de consistência firme
e resistente, de coloração verde-amarelada quando maduros, apresentando polpa firme,
consistente, saborosa, levemente ácida, com a cavidade cheia e com poucas sementes (MANICA
et al., 2001). Esta variedade sempre atendeu ao mercado mais exigente, sendo produzida de
forma tecnicamente correta, ou seja, com poda drástica e ensacamento dos frutos. Atualmente é a
base da pequena exportação da goiaba brasileira (CEAGESP, 2007).
Os conhecimentos recentemente adquiridos sobre as vantagens proporcionadas à saúde
pela utilização de frutas frescas contribuíram para o incremento significativo no consumo desse
grupo de alimentos (CHOUDHURY, 2001). Deste modo, consumidores e clientes do atual
mercado global exigem cada vez mais qualidade mercadológica competitiva das frutas, pois se
preocupam com a segurança dos alimentos e a preservação do meio ambiente. Para os
exportadores de frutas brasileiras garantirem a competitividade no mercado internacional foi
criada a Produção Integrada de Frutas (PIF) em 1998/99, pelo Programa de Desenvolvimento da
Fruticultura (PROFRUTA), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA).
Atualmente, toda a produção de frutas exportada para o mercado europeu exige certificação. A
goiaba foi validada no início de 2005 e conta com 27 produtores, totalizando uma área de 75 ha e
300 toneladas produzidas (ANDRIGUETO; NASSER; TEIXEIRA, 2006).
18
2.1.2 Pinta Preta
A infecção da goiaba por microrganismos fitopatogênicos pode acontecer nos períodos de
produção, colheita e pós-colheita. As doenças pós-colheita em goiaba estão entre as principais
causas da antecipação da colheita desses frutos, tanto em pomares que praticam o ensacamento de
frutos, como naqueles que não o fazem. Como a maior parte das doenças pós-colheita só
apresenta sintomas em frutos maduros, a colheita de frutos verdes tornou-se estratégica para a
comercialização, pois, nesse estado, todos os frutos estão aparentemente sadios. Entretanto, à
medida que o amadurecimento ocorre, os sintomas expressam-se, em graus diversos de
severidade, a ponto de impedir o consumo dos frutos (BERGAMIN FILHO; AMORIM, 2007).
A qualidade do fruto da goiabeira em pós-colheita vem sendo afetada de maneira
significativa pela pinta ou mancha preta. Esta podridão é provocada pelo fungo Guignardia psidii
Ullasa e Rawal e o anamorfo Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der AA. O gênero Guignardia
pertence ao reino Fungi, filo Ascomycota, classe Dothideomycetes, ordem Botryosphaeriales e
família Botryosphaeriaceae (INDEXFUNGORUM, 2007). Espécies de Guignardia, incluindo o
estado anamórfico Phyllosticta, constituem importante grupo econômico de fungos
fitopatogênicos os quais são compostos aproximadamente de 40 espécies (HAWKSWORTH;
DAVID, 1989). As espécies de Phyllosticta, em geral, causam manchas foliares, mas também
atacam frutos ou hastes jovens (VAN DER AA, 1973).
Em 1953 a fase anamórfica do fungo foi relatada pela primeira vez, tendo sido encontrada
por Petrak em frutos de goiabeira procedentes do Havaí e denominada Phyllostictina psidiicola.
Van der AA em 1973 propôs a nova terminologia de Phyllosticta psidiicola. As formas
anamórficas e teleomórficas foram encontradas em Bangalore, Índia (ULLASA; RAWAL, 1984)
e recentemente na Venezuela (GONZÁLES; RONDÓN, 2005). Em Taiwan, a podridão
provocada pelo fungo Pestalotiopsis tornou-se menos severa e as causadas por Colletotrichum e
Phytophthora tornaram-se de menor importância comparadas à podridão em goiabas provocada
por P. psidiicola. A incidência deste fungo foi detectada na faixa de 80,2% a 94,5% nas
variedades de goiaba cultivadas no país, gerando grandes perdas na produção. Além disso, a
podridão por P. psidiicola em Taiwan apresentou maior incidência 5 dias após a colheita, levando
a constatação que o fungo apresentava período latente de infecção (LIN; LAI; TSAI, 2003). No
Brasil, G. psidii e o anamorfo P. psidiicola foram inicialmente relatados no Brasil por Tozetto e
19
Ribeiro (1993) causando podridão de frutos de goiabeira em pós-colheita no Distrito Federal.
Recentemente no Brasil, a pinta preta em goiaba foi relatada em elevada porcentagem na região
produtora de Campinas, no estado de São Paulo. No período de janeiro a novembro de 2005, a
incidência média do fungo G. psidii em frutos da variedade Kumagai foi de 18,6% e pico de
incidência de 58%, o qual ocorreu em abril (AMARAL et al., 2006).
Os sintomas da doença constituem-se inicialmente de pontos amarelados os quais
evoluem na superfície dos frutos formando lesões deprimidas, preto-esverdeadas a marrom-
escuras, as quais podem apresentar na superfície frutificações do fungo, geralmente conidiomas
picnidiais. Nas áreas próximas ou sob as lesões, a polpa apresenta podridão mole. As lesões são
circulares, geralmente com 1 a 2,5 cm de diâmetro e ocorrem em qualquer área do fruto, podendo
posteriormente coalescer. A infecção por G. psidii ocorre ainda nos frutos jovens permanecendo
em estado quiescente, até a maturidade (MANICA et al., 2001; TOZETTO; RIBEIRO, 1993,
1998).
Baseado na descrição de Ullasa e Rawal, (1984) e Gonzáles e Rondón (2005) este fungo
apresenta micélio denso, de coloração verde acinzentado a marrom-escuro ou preto, com
abundante micélio aéreo e também submerso em meio de cultura. Os ascocarpos são numerosos,
granulosos, solitários ou agregados, de formato peritecial com rostros longos e proeminentes. A
parede dos ascocarpos é estromática, composta de várias camadas de células
pseudoparenquimáticas, que são espessas e intensamente pigmentadas no exterior. Os ascos são
subclavados a cilíndricos, pedicelados, estipitados, bitunicados e com 8 esporos. Os ascósporos
são hialinos, unicelulares, granulados, de formato elipsóide, largos na região meridiana, com
apêndices mucilaginosos em uma ou ambas as extremidades. Na forma anamórfica o picnídio
apresenta forma variável, de coloração marrom a preto, encontrando-se solitários ou em grupos,
com paredes espessas compostas de diversas camadas de células marrom-escuras. Os conídios
são hialinos, unicelulares, com diversos pequenos grânulos esverdeados, formato elipsoidal e
provido de bainha gelatinosa e presença de apêndice apical.
20
2.1.3 Fatores ambientais
Fatores como a temperatura, duração do molhamento e presença de gases como o etileno e
o dióxido de carbono podem atuar no processo fisiológico de plantas e frutos assim como no
progresso de doenças. Deste modo, medidas de controle mais efetivas e adequadas podem ser
estabelecidas por meio do conhecimento da interação entre tais fatores e as diferentes fases do
ciclo da doença.
Dentre estes fatores, a temperatura é o mais estudado, tendo sido detectada sua influência
em todas as fases do ciclo de infecção, desde a germinação até a reprodução. Para cada
patossistema existe um ótimo de temperatura para o crescimento de fitopatógenos e uma
temperatura máxima e mínima, além da qual os fitopatógenos sobrevivem mas não são capazes
de se desenvolver (VALE; ZAMBOLIM, 1996).
Assim, algumas doenças são mais severas a baixas temperaturas, outras a altas
temperaturas, apesar do agente causal se desenvolver sobre ampla faixa de temperatura na
cultura. Por isso, os efeitos da temperatura sobre a doença, assim como outros fatores ambientais,
podem ser atribuídos por agirem sobre o patógeno, ou sobre o hospedeiro, ou sobre a interação
entre patógeno e hospedeiro (COLHOUN, 1973). O agente causal da mancha preta em frutos de
citros Guignardia citricarpa apresentou, em experimentos in vitro, aumento do percentual de
germinação dos ascósporos à medida que se estendeu a temperatura, na faixa entre 15 a 24°C
(TIMOSSI et al., 2003). Em Colletotrichum acutatum, agente causal da antracnose em morango,
a germinação e formação de apressório em folhas foram influenciados pela temperatura a qual foi
ótima entre 23 a 27,7ºC para germinação e 17,6 a 26,5ºC para o desenvolvimento do apressório
(LEANDRO et al., 2003).
Tanto a umidade relativa quanto o molhamento foliar desempenham importante papel no
desenvolvimento de doenças de plantas. A ocorrência de doenças em determinada região é
dependente da quantidade e da freqüência de água das chuvas bem como de outras fontes de
umidade como orvalho, neblina, umidade relativa do ar elevada e irrigação. Com algumas
exceções, praticamente todas as infecções de partes da planta sobre o solo são afetadas pela
umidade (VALE; ZAMBOLIM, 1996).
A maioria dos fungos depende da disponibilidade de filme de água no estado líquido para
germinar e causar infecção. Quando existe a necessidade de molhamento foliar, a duração pode
21
ser vital (COLHOUN, 1973; VALE; ZAMBOLIM, 1996). Em folhas de pêra, a média do número
de lesões de sarna provocadas por Venturia nashicola aumentou com o incremento da duração do
período de molhamento (LI et al., 2005). O aumento da duração do período de molhamento
elevou a porcentagem de ameixas com infecções latentes provocados pelo fungo Monilinia
fructicola, agente causal da podridão parda. Enquanto o aumento da temperatura diminuiu a
porcentagens de frutos com infecções latentes (LUO; MA; MICHILIDES, 2001). O mesmo
procedeu em pêssegos e cerejas, ambos tiveram maior incidência de infecção por M. fructicola à
medida que se aumentou a duração do período de molhamento, que corresponderam as máximas,
respectivamente, de 15 e 18 horas (BIGGS; NORTHOVER, 1988).
Embora o efeito da temperatura seja extremamente importante para o desenvolvimento de
epidemias, a umidade é mais limitante, devido o fato da temperatura favorável ao
desenvolvimento das doenças ocorrer em faixa maior que a faixa da umidade, e os limites de
temperatura máximo e mínimo favoráveis ao desenvolvimento da doença não erradicarem o
patógeno, mas apenas inibirem o desenvolvimento das epidemias, a menos que esses valores
persistam por tempos prolongados (ROTEM, 1978). Em plantas de girassol o aumento da
temperatura provocou incremento na severidade da mancha de alternaria provocada por
Alternaria helianthi até 30°C, a partir da qual decresceu de forma acentuada. No entanto, a não
ocorrência de infecção foi observada na ausência de molhamento foliar, dessa forma confirmou-
se a necessidade de água livre na superfície foliar para o estabelecimento da doença no
hospedeiro. Sendo necessárias o mínimo de 12 horas de molhamento foliar para a ocorrência da
infecção (LEITE; AMORIM, 2002). Em frutos de tomateiro ocorreu maior incidência de lesões
de podridões pós-colheita causadas por Fusarium verticillioides, Geotrichum candidum e
Rhizopus stolonifer em frutos incubados a 25
o
C. Entretanto, a presença de água livre na
superfície dos frutos de tomateiro foi desnecessária para a incidência de podridões causadas pelos
três fungos, embora os níveis de incidência tenham aumentado com o incremento do período de
molhamento, com exceção para R. stolonifer, o qual causou a incidência máxima de doença, na
ausência de molhamento (SILVEIRA et al., 2001).
O dióxido de carbono em determinadas concentrações pode influenciar no processo de
infecção de diversos fitopatógenos favorecendo ou evitando danos em frutos e vegetais
perecíveis. Sob elevados níveis de dióxido de carbono, a maioria dos patógenos são inibidos pela
redução na taxa de diversas funções metabólicas, resultando na diminuição da respiração
22
(ADAIR, 1971 apud SOMMER, 1985). O efeito inibitório de elevadas concentrações de dióxido
de carbono na atmosfera associada a baixas temperaturas foi observado no crescimento micelial e
germinação dos conídios de Botrytis cinerea, Rhizopus nigricans e outros fungos fitopatogênicos
(BROWN, 1922; BROOKS; BRATLEY; MCCULLOCH, 1936). O acréscimo de 5% dióxido de
carbono diminui o crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides a 12,5ºC e
Whetzelinia sclerotiorum a 5,5ºC, entretanto estimulou o fungo Monilinia fructicola em ambas
temperaturas (EL-GOORANI; SOMMER, 1979). No entanto, foi observado o aumento do
crescimento micelial em Penicillium expansum mediante a elevação dos níveis de dióxido de
carbono de 2,5 a 20%, apesar de inibir parcialmente a esporulação do fungo em elevada
concentração (BRACKMANN et al., 1996).
O etileno apesar de não ser o único fito hormônio a atuar no processo de amadurecimento
de frutos, é considerado o principal desta fase. Sendo biologicamente ativo em quantidades traço
e seus efeitos comercialmente importantes na agricultura (ABELES; MORGAN; SALTVEIT,
1992 apud AZZOLINI, 2002). O etileno, produzido pelo fruto ou inserido artificialmente, além
de estar ligado ao amadurecimento dos frutos, atua no processo de patogênese, acelerando ou
retardando doenças em frutos. Concentrações elevadas inibiram o crescimento do fungo
Fusarium oxisporum (LOCKHART, 1970 apud ABELES, 1973). O atraso do desenvolvimento
de Ceratocystis fimbriata em batata doce e em Gloeosporium album em maçãs também foram
relatados (STAHMANN; CLARE; WOODBURY, 1966; LOCKHART; FORSYTH; EAVES,
1968). Já a presença de 20 ppm de etileno resultou em maior podridão em morangos por Botrytis
cinerea (EL-KAZZAZ; SOMMER; FORTLAGE, 1983) e em experimento em in vitro e em
abacates, a exposição de conídios do agente causal da antracnose Colletotrichum gloeosporioides
a concentrações de etileno entre 5 e 45 ppm, estimulou a germinação dos conídios e formação de
apressório (PRUSKY; WATTAD; KOBILER, 1996).
2.1.4 Apressório
A iniciação, formação e ação do apressório são partes integrais do processo de infecção de
muitos fungos parasitas. Em algumas espécies, a formação do apressório pode ser obrigatória
para infecção, enquanto para outros pode ser opcional ou desnecessária. O desenvolvimento do
apressório passa pelas fases de iniciação, maturação e produção do peg de infecção ou
germinação. O papel do apressório é aderir firmemente ao substrato e penetrá-lo ou servir como
23
estrutura de sobrevivência, permanecendo dormente até que condições favoráveis permitam a
germinação e a infecção (EMMETT; PARBERY, 1975).
A formação do apressório inicia-se com o fim do elongamento do tubo germinativo ou da
hifa e o inchamento do ápice dos mesmos, além disso, pode ser séssil ao surgir diretamente do
conídio. O processo de inchamento se encerra com a formação do septo entre o conídio, a hifa ou
o tubo germinativo e a porção inchada (BAILEY et al., 1992; EMMETT; PARBERY, 1975). A
deposição de uma camada final de células na parede logo externamente a membrana plasmática
representa o estágio final da formação do apressório, nesta fase, em algumas espécies, o conídio
que o originou entra em colapso. Esta camada da parede, composta de melanina, envolve todo o
apressório, com exceção da região em contato com o substrato. Esta área com ausência de
melanina é chamada de poro do apressório. A camada de melanina é responsável pela coloração
escura do apressório quando observado em microscópio de luz (HOWARD, 1994) e tem função
de proteger seu conteúdo da irradiação danosa, além do papel crucial no processo de penetração
(BAILEY et al., 1992). Variações morfológicas durante a formação do apressório podem surgir
devido a uma série de fatores físicos, químicos e genéticos. O tempo também é fator importante
na formação do apressório, sendo que na maioria das espécies, leva de 6 a 12 horas sob condições
favoráveis (EMMETT; PARBERY, 1975).
A penetração por meio do apressório, em muitas plantas, ocorre logo após a formação das
estruturas de infecção. Pois, quanto mais tempo o fungo permanecer na superfície do hospedeiro,
mais vulnerável ele ficará a dessecação, a competição com habitantes do filoplano, aos
mecanismos de defesa do hospedeiro, a redução dos seus nutrientes de reserva e assim falhar no
processo de infecção. Fatores ambientais como temperatura do ar e do solo, macro e micro
umidades relativas, horas de molhamento foliar contínuo, grau de intensidade da luz e duração
dos períodos de luz e escuro são importantes durante esta fase (HOWARD, 1994).
Há três mecanismos propostos de penetração da cutícula através do apressório. Estes são
baseados na força mecânica, a secreção de enzimas com capacidade de degradação da cutícula e a
combinação de ambos os processos (BAILEY et al., 1992).
A elevada pressão de turgor dentro do apressório é o componente mecânico essencial para
a ocorrência da penetração do fungo no hospedeiro durante o processo de patogênese. Por meio
da redução da pressão de turgor por stress osmótico do apressório de Magnaporthe grisea, agente
causal da brusone do arroz, foi possível a inibição da penetração dos mesmos em membranas
24
sintéticas. Assim a penetração em membranas mais rígidas por apressório de M. grisea foi inibida
por pequenas diminuições no turgor no apressório, enquanto a penetração em membranas mais
macias foi sensível apenas a elevada diminuição do turgor (HOWARD et al., 1991).
Dois requisitos são necessários para gerar a pressão de turgor dentro do apressório.
Primeiro, é necessário a formação de uma camada de melanina na parede da célula do apressório
e segundo, o apressório deve aderir firmemente, ao substrato, selando com eficácia o poro do
apressório. O que sugere que a melanina age como barreira permeável, permitindo o aumento da
concentração de alguns solutos citoplasmáticos (HOWARD, 1994; HOWARD; FERRARI,
1989). A pressão de turgor em apressórios melanizados de Colletotrichum kahawae, agente
causal antracnose em café, demonstrou papel importante na penetração da cutícula de folhas e
grãos verdes, os quais apresentam pressão de turgor cerca de um terço da pressão do fungo. A
inibição da melanização dos apressórios reduziu a pressão de turgor gerando efeito negativo no
processo de infecção. No entanto, a inibição da atividade da cutinase não afetou a infecção,
demonstrando que a cutícula foi penetrada mecanicamente (CHEN et al., 2004).
A atividade enzimática também é importante para o sucesso do processo de infecção de
alguns fungos. A penetração do apressório pode requerer enzimas para dissolver ou amolecer a
cutícula do hospedeiro. No gênero Colletotrichum, por exemplo, evidências indicam que algumas
espécies necessitam da produção de cutinase, enzima capaz de dissolver a cutícula do hospedeiro,
para penetração enquanto para outras a penetração é alcançada predominantemente por meios
mecânicos (BAILEY et al., 1992). A enzima cutinase foi purificada em linhagens de C.
gloeosporioides e C. capsici crescidos em cultura líquida (DICKMAN; PATIL;
KOLATTUKUDY, 1982).
2.1.5 Quiescência
O processo de reação compatível entre um fungo patogênico e seu hospedeiro inicia-se
com a deposição do esporo sobre o tecido suscetível, sua germinação, formação e crescimento do
tubo germinativo e o surgimento de estruturas que participam da penetração (WYNN, 1981).
O conjunto de eventos que ocorre a partir do início da germinação do esporo até a
penetração da hifa infectiva no hospedeiro é denominado pré-penetração (AMORIM, 1995). O
entendimento desta fase permite esclarecer como as plantas são infectadas, colaborando, desta
25
maneira, na definição de estratégias que impeçam ou dificultem a penetração do patógeno
(BRUNELLI et al., 2005).
Os sintomas de uma doença podem se manifestar muito tempo depois dos estágios iniciais
de infecção. Verhoeff (1974) definiu como relação parasítica latente, dormente ou quiescente a
condição na qual o patógeno passa longos períodos durante a vida do hospedeiro em estágio
quiescente, até que, sob específicas circunstâncias, se torna ativo.
A quiescência pode ser imposta durante os vários processos de ataque do fungo, o que
sugere que deve ou pode ocorrer durante qualquer momento do processo, do conídio não
germinado, germinado à colonização. A ocorrência e manutenção do patógeno quiescente sobre
ou dentro do hospedeiro indica o equilíbrio dinâmico entre hospedeiro, patógeno e ambiente, sem
sintomas visíveis (PRUSKY, 1996).
Fatores intrínsecos aos fungos fitopatogênicos podem estar envolvidos no processo de
quiescência. Conídios de muitos fungos são produzidos juntamente com a matriz mucilaginosa a
qual facilita a liberação. Essa mucilagem é denominada matriz conidial e tem sido considerada
importante para a manutenção da capacidade de germinação dos conídios durante períodos de
stress ambiental. A matriz pode proteger os conídios de danos potenciais, efeitos extremos de
temperatura, dessecação, radiação por ondas curtas além de inibir a germinação prematura
(LOUIS; COOKE, 1985). Em superfície de poliestireno, a formação de apressório por conídios
de Monilinia fructicola, agente causal da podridão parda em nectarinas, passou de 10 para 95%
ao serem “lavados” para remoção de auto-inibidores e nutrientes residuais do meio de cultura.
Entretanto, em experimentos in vivo, a freqüência de apressório variou durante o
desenvolvimento do fruto, devido a fatores como hidrofobicidade e compostos químicos como
nutrientes e compostos voláteis do fruto (LEE; BOSTOK, 2006).
Infecções quiescentes são comuns em ampla variedade de cultura de frutos, vegetais e
flores. Na maioria dos frutos verdes, caules e vegetais jovens, os mecanismos que limitam a
agressão do patógeno são associados tanto com substâncias antimicrobianas pré-formadas ou com
fitoalexinas, enzimas, ou estruturas físicas de resistência. Assim, a agressão só inicia com a
ocorrência de determinadas mudanças fisiológicas e físicas, por exemplo, a liberação de
compostos voláteis como o etileno,
mudanças anatômicas na estrutura do fruto, aumento de
nutrientes (açúcares e ácidos orgânicos), declínio na concentração de compostos anti-fúngicos e
formação de ferimentos (PRUSKY, 1996). Em damasco o fungo Monilinia fructicola, agente
26
causal da podridão parda, se tornou ativo na presença dos compostos voláteis acetaldeído e etanol
produzidos pelo fruto durante o amadurecimento (CRUICKSHANK; WADE, 1992). Os autores
também demonstraram a ativação de infecções latentes em frutos imaturos e o crescimento do
tubo germinativo dos conídios do fungo in vitro, quando estes foram expostos às mesmas
concentrações de compostos voláteis detectados nos frutos maduros.
Evidências histológicas e avaliações de dureza em cascas sugerem que as células mais
externas da epiderme juntamente com a cutícula agem como barreira defensiva (MARTIN,
1964). Cultivares de pêssego significantemente mais resistentes apresentaram densa e grossa
epiderme comparada aos cultivares suscetíveis, e a resistência dos cultivares resistentes e
suscetíveis foi correlacionada com o atraso da penetração e períodos mais longos de incubação
para ocorrer infecção (ADASKAVEG; FELICIANO; OGAWA, 1991).
Simmonds (1963) discutiu quatro explicações possíveis para a latência em frutos: uma
toxina presente em frutos verdes, porém não em frutos maduros; as necessidades nutricionais do
patógenos não estarem de acordo com a composição do fruto imaturo; as energias necessárias
pelo fungo estarem somente de acordo quando o metabolismo do hospedeiro passar de imaturo
para a fase de maturação; e o potencial de enzima do fungo não ser o suficiente para permitir a
invasão de frutos imaturos, mas é suficiente para permitir a invasão de frutos maduros. Conídios
do fungo Colletotrichum musae, inoculados na superfície de frutos de banana verdes causaram
necroses nas células da epiderme dos mesmos e constatou-se que continham compostos
antifúngicos. Estas lesões necróticas não avançaram até a chegada do início do amadurecimento
do fruto, quando as concentrações destes compostos antifúngicos diminuíram de forma constante
(BROWN; SWINBURNE, 1980).
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32
3 PRÉ-PENETRAÇÃO DE Guignardia psidii EM GOIABA: EFEITO DA
TEMPERATURA, DURAÇÃO DO MOLHAMENTO E IDADE DO FRUTO
Resumo
A produção de goiaba para consumo in natura vem sendo afetada pela pinta preta
provocada pelo fungo Guignardia psidii Ullasa e Rawal (Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der
Aa), gerando perdas pós-colheita. Este trabalho teve como objetivo determinar o efeito da
temperatura, da duração do período de molhamento e de diferentes idades dos frutos de goiabeira
sobre a pré-penetração de conídios de G. psidii. Os estudos in vitro foram avaliados por meio de
microscópio de luz e os in vivo por meio de microscópio eletrônico de varredura. O efeito da
temperatura (10 a 40ºC) e da duração do período de molhamento (6 a 48 horas in vitro e 6 a 24
horas in vivo) na germinação, formação de apressório e apressório melanizado (in vitro) foram
avaliados. Nos experimentos in vitro, alíquotas de 40 µL de suspensão de 10
5
conídios/mL foram
depositadas em superfícies de poliestireno, as quais foram colocadas em caixas gerbox e
mantidas sob as diferentes temperaturas e períodos de molhamento. Nos experimentos in vivo,
alíquotas de 30 µL de suspensão com 10
5
conídios/mL foram depositadas na superfície de frutos
de goiabeira, os quais foram acondicionados em caixas plásticas e mantidos sob as diferentes
temperaturas e períodos de molhamento. Em seguida, a germinação e formação de apressórios
foram avaliadas em cinco diferentes idades de frutos: 10 dias, 35 dias, 60 dias, 85 dias e 110 dias.
A metodologia para inoculação dos frutos foi a mesma anteriormente descrita. Os frutos foram
mantidos a 25ºC e duração de período de molhamento de 24 horas. Observou-se, tanto in vitro
quanto in vivo, o aumento gradual da germinação, formação de apressórios e apressórios
melanizados (in vitro) à medida que se aumentou a temperatura. Todas as variáveis atingiram o
máximo a 25ºC e duração de período de molhamento de 24 horas in vivo e 48 horas in vitro,
correspondendo aos valores de 38% de conídios germinados, 37,7% de apressórios formados e
32,7% de apressórios melanizados in vitro e 45,6% de conídios germinados e 11,2% de
apressórios formados in vivo. A partir de 25
o
C, houve decréscimo em todas as variáveis
analisadas. A taxa de germinação foi maior no experimento in vivo, no entanto a formação de
apressórios foi menor. Observou-se o aumento gradual das variáveis avaliadas com o aumento da
idade do fruto, apresentando, em frutos com 10 dias 8,4% de conídios germinados e 3,2% de
apressórios formados, enquanto os frutos com 110 dias apresentaram 43,2% de conídios
germinados e 26,4% de apressórios formados. Assim, a temperatura, duração do período de
molhamento e a idade do fruto revelaram-se como importantes fatores que influenciam a fase de
pré-penetração de G. psidii em goiaba.
Palavras-chave: Goiaba; Guignardia psidii; Pré-penetração; Temperatura; Molhamento; Idade
dos frutos
33
PRE-PENETRATION OF Guignardia psidii IN GUAVA: EFFECT OF TEMPERATURE,
WETNESS DURATION AND FRUIT AGE
Abstract
Production of guava fruit for in natura consumption has been affected by the black spot
caused by the fungus Guignardia psidii Ullasa and Rawal (Phyllosticta psidiicola (Petrak) van
der Aa), generating postharvest losses. This work had the objective to determine the effect of
temperature, duration of wetness and guava fruit age over the pre-penetration of G. psidii. The in
vitro studies were evaluated by light microscope and the in vivo studies by scanning electron
microscope. The effect of temperature (10 a 40ºC) and duration of wetness (6 to 48 hours in vitro
and 6 to 24 hours in vivo) in germination, appressoria formation and melanized appressoria (in
vitro) were evaluated. In the in vitro experiments, aliquots of 40 μL conidial suspension with 10
5
conidia/mL were deposited on the surface of polystyrene Petri dishes, which where placed in
plastic boxes and maintained under the different temperatures and wetness periods. In the in vivo
experiments, aliquots of 30 µL conidial suspension with 10
5
conidia/mL were deposited on the
fruits surfaces, which were placed in plastic boxes and maintained under the different
temperatures and wetness periods. Afterwards, germination and appressoria formation were
evaluated in five different ages of the fruits: 10 days, 35 days, 60 days, 85 days and 110 days.
The methodology for the fruits inoculation was the same of the previously described. The fruits
were maintained at 25ºC and duration of wetness of 24 hours. It was observed, both in vitro and
in vivo, a gradual increase in germination, appressoria formation and melanized appressoria (in
vitro) as the temperature increased. All the variables reached the maximum at 25ºC and duration
of wetness of 24 hours in vivo and 48 hours in vitro, corresponding to the values of 38%
germinated conidia, 37.7% formed appressoria and 32.7% melanized appressoria in vitro and
45.6% germinated conidia and 11.2% formed appressoria in vivo. Temperatures above 25
o
C
decreased the variables analyzed. The germination rate was higher in the in vivo experiment,
however the appressoria formation was lower. It was observed a gradual increase in the analyzed
variables with the increase of the age of the fruit, presenting, in fruits with 10 days, 8.4%
germinated conidia and 3.2% formed appressoria, while fruits with 110 days presented 43.2%
germinated conidia and 26.4% formed appressoria. Therefore, temperature, duration of wetness
and age of the fruit showed to be important factors that influence the pre-penetration phase of G.
psidii in guava fruit.
Keywords: Guava; Guignardia psidii; Pre-penetration; Temperature; Wetness period; Fruit Age
34
3.1 Introdução
A goiaba destaca-se por apresentar excelente qualidade nutricional, o que tem contribuído
para o consumo in natura deste fruto. No estado de São Paulo, as principais variedades
produzidas para obtenção de frutos de mesa são Kumagai, Pedro Sato e Sassaoka (GUITERREZ;
WATANABE; SCHMIDT, 2002). A pinta preta, provocada pelo fungo Guignardia psidii e o
anamorfo Phyllosticta psidiicola foi relatada, recentemente, em elevada porcentagem em goiabas
provenientes da região produtora de Campinas, no estado de São Paulo. A incidência média do
fungo G. psidii em frutos da variedade Kumagai foi de 18,6% de janeiro a novembro de 2005,
atingindo pico de incidência de 58% em abril (AMARAL et al., 2006).
Os sintomas da doença constituem-se em lesões deprimidas, as quais se desenvolvem de
forma concêntrica, apresentando cor variando de preto-esverdeado a marrom-escuro, e que
podem apresentar frutificações do fungo, geralmente conidiomas picnidiais. As lesões ocorrem
em qualquer área do fruto, podendo posteriormente coalescer. A infecção por G. psidii ocorre
ainda nos frutos jovens permanecendo em estado quiescente, até a maturidade (TOZETTO;
RIBEIRO, 1993, 1998).
Diversos fatores podem influenciar na fase de infecção de fitopatógenos em hospedeiros,
entre estes se destacam a temperatura, o molhamento e a idade da planta ou órgão da mesma. O
estudo da interação entre esses fatores e a fase de infecção pode colaborar gerando medidas de
controle mais eficazes e apropriadas. A temperatura tem mostrado em diferentes patossistemas,
grande influência nos períodos de incubação e de latência, na freqüência de infecção, tamanho da
lesão e na severidade. Já a umidade mostra o maior efeito na freqüência de infecção, esporulação
e período infeccioso (ROTEM; COHEN; BASHI, 1978; ROTEM, 1978). Em experimentos in
vitro a melhor faixa de temperatura para germinação de Monilinia laxa, agente causal da
podridão parda em cerejas, foi entre 15 e 25ºC. A germinação foi evidente depois de 2 a 4 horas e
foi melhor na presença de água, apesar da germinação ter ocorrido na ausência de umidade. No
entanto, a ausência de umidade reduziu a germinação e o processo foi fortemente atrasado
(TAMM; FLUCKIGER, 1993). Já o fungo Monilinia fructicola, agente causal da podridão parda
também em frutos de cerejeira e em frutos de pessegueiro, apresentou faixa de temperatura ótima
para infecção dos frutos, respectivamente, entre 20 a 22,5ºC e 22,5 a 25ºC. Além disso, ambos os
35
frutos tiveram maior incidência de infecção por M. fructicola à medida que se aumentou a
duração do período de molhamento (BIGGS; NORTHOVER, 1988).
Infecções quiescentes parecem ocorrer devido a condições fisiológicas adversas impostas
pelo hospedeiro. Entre alguns mecanismos utilizados para explicar a resistência de frutos
imaturos ao ataque do fungo incluem a falta de nutrientes disponíveis, a presença de compostos
antifúngicos pré-formados, presença de compostos antifúngicos que podem ser induzidos e falta
de fatores os quais estimulem a patogenicidade do fungo (BENO-MOUALEM; PRUSKY, 2000).
Swinburne e Brown (1983) demonstraram que o patógeno Colletotrichum musae, causador da
antracnose em banana, evitou a exposição a compostos antifúngicos ao assegurar que parte dos
apressórios permanecesse quiescentes. Além disso, diversos fatores físicos podem estar
relacionados com a quiescência. Biggs e Northover (1989) relataram que a resistência de cerejas
a infecção por Monilinia fructicola estava correlacionada com a grossura da cutícula e das células
da parede.
A idade do hospedeiro no momento da infecção pode influenciar os processos de pré-
infecção e infecção de diversos fungos fitopatogênicos. Infecções geralmente se tornam ativas
quando o fruto amadurece. A infecção pode ocorrer vários dias ou semana antes dos sintomas
aparecerem (JARVIS, 1994). Mari et al. (2003) relatam três estágios em pêssego e damasco com
diferentes suscetibilidades ao fungo Monilinia laxa, agente causal da podridão parda. No
primeiro estágio a suscetibilidade dos frutos ao fungo foi alta, mas diminuiu no segundo estágio
durante o qual ocorre o endurecimento do caroço e no terceiro estágio, que correspondeu de 4 a 5
semanas antes do amadurecimento dos frutos, a suscetibilidade ao fungo aumentou. Frutos de
macieira nos estádios iniciais de desenvolvimento se mostraram altamente suscetíveis a sarna da
macieira, provocada pelo fungo Venturia inaequalis e tornaram-se gradativamente mais
resistentes com o amadurecimento (XU; ROBINSON, 2005).
Deste modo, este trabalho buscou estender os conhecimentos com relação ao processo
infeccioso da pinta preta, por meio do estudo da influência da temperatura, duração do
molhamento e idade dos frutos de goiabeira sobre a fase de pré-penetração de conídios de G.
psidii.
36
3.2 Material e métodos
3.2.1 Condução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Micologia e no Laboratório do
Núcleo de Apoio à Pesquisa / Microscopia Eletrônica Aplicada à Pesquisa Agropecuária
(NAP/MEPA) do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da
Universidade de São Paulo, campus “Luiz de Queiroz” na cidade de Piracicaba, no estado de São
Paulo.
3.2.2 Obtenção e manutenção do isolado de G. psidii
Os experimentos foram realizados com a forma anamórfica do fungo Guignardia psidii,
denominada Phyllosticta psidiicola. O isolado foi obtido de frutos doentes em campo comercial
no município de Campinas, no estado de São Paulo e identificado com base na literatura e por
meio do postulado de Koch. O isolado de G. psidii foi cultivado em meio Batata-Dextrose-Ágar
(BDA) e mantido em câmara de crescimento modelo E7 (Conviron, Canadá), a 25ºC + 1°C e sob
alternância de luz (12 horas claro/12 horas escuro).
3.2.3 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de
conídios de G. psidii in vitro
Conídios de G. psidii foram obtidos de colônias de 10 dias, cultivadas em meio BDA, a
25ºC +
1°C e sob alternância de luz (12 horas claro/12 horas escuro). Com auxílio de pincel e
água destilada autoclavada, conídios de G. psidii foram removidos da superfície das colônias. Em
seguida, a suspensão obtida foi filtrada em gaze esterilizada para retirar fragmentos de micélio e
centrifugada a 10.000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Após este procedimento, o
sobrenadante foi descartado e acrescentou-se novamente água destilada estéril para ressuspender
os conídios precipitados. A suspensão foi calibrada para 10
5
conídios/mL com auxílio da câmara
de Neubauer.
37
A centrifugação objetivou remover parte da matriz mucilaginosa que envolve os conídios.
Experimentos realizados previamente demonstraram que este processo permitiu aumento na
porcentagem de conídios germinados de G. psidii, facilitando assim os estudos realizados.
Alíquotas de 40 μL de suspensão de conídios foram depositadas na superfície de placas de
Petri de poliestireno. As placas foram mantidas em caixas gerbox forradas com 3 folhas de papel
filtro umedecidas com 15 mL de água destilada, para a obtenção de ambiente saturado de
umidade.
As caixas gerbox permaneceram em câmara de crescimento, nas temperaturas de 10, 15,
20, 25, 30, 35 e 40°C e períodos contínuos de molhamento de 6, 12, 24, 36 e 48 horas, em escuro
contínuo. Transcorrido cada tempo, a germinação dos conídios foi interrompida adicionando-se
15 µL de lactoglicerol em cada gota.
Em microscópio de luz Zeiss Axioskop 2 (Zeiss, Alemanha) foram registradas imagens
dos conídios para estudo e contados 100 conídios por gota, em aumento de 400 vezes, avaliando-
se as porcentagens de conídios germinados, apressórios formados e apressórios melanizados. O
conídio foi considerado germinado quando o tubo germinativo excedeu a metade do diâmetro do
esporo.
Os dados obtidos foram analisados por meio de regressões não-lineares, utilizando-se o
programa STATISTICA versão 6.0 (Stat Soft, EUA). Os dados foram ajustados ao modelo beta-
monomolecular Y=(B1*((T-B2)^B3)*((B4-T)^B5))*(B6*(1-B7*exp(-B8*M))), onde Y
representa a variável analisada, T representa a temperatura, M representa a duração do período
de molhamento, B2 e B4 correspondem, respectivamente, as temperaturas mínima e máxima, B1,
B3, B5, B6, B7 e B8 são parâmetros da equação, sem significado biológico.
O experimento foi realizado duas vezes, com seis repetições para cada tratamento. Os
valores apresentados correspondem ao primeiro experimento realizado.
3.2.4 Obtenção dos frutos de goiabeira
As goiabas utilizadas nos tratamentos pertencem à variedade ‘Kumagai’ e foram obtidas
junto a produtor da região de Campinas, no estado de São Paulo. Os frutos foram desinfestados
com hipoclorito de sódio 0,5% por 10 minutos, lavados em água corrente e deixados para secar
38
em temperatura ambiente, para posteriormente realizar os procedimentos de inoculação na
superfície dos frutos.
3.2.5 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de
conídios de G. psidii em goiaba
Conídios de G. psidii foram obtidos e a suspensão calibrada como descrito no item 3.2.3.
A inoculação foi feita por meio de deposição de alíquotas de 30 μL da suspensão na superfície
dos frutos de goiabeira em maturidade fisiológica, que consiste o estádio de desenvolvimento em
que o fruto continuará a ontogenia, mesmo que destacado da planta (WATADA et al., 1984). A
suspensão foi depositada em círculos de 0,5 cm de diâmetro, previamente demarcados, com o
auxílio de adesivos plásticos.
Para cada tratamento utilizaram-se 5 frutos, acomodados em bandeja plástica previamente
desinfestada com álcool 70%. Próximo aos frutos foi deixado um chumaço de algodão
umedecido para obtenção de ambiente saturado em água. As bandejas foram fechadas com filme
plástico transparente e permaneceram em BOD nas temperaturas de 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40°C
e períodos contínuos de molhamento de 6, 12 e 24 horas, em escuro contínuo.
Após estes períodos, amostras de tecidos inoculados foram retiradas com auxílio de
bisturi, e processadas para análise sob microscópio eletrônico de varredura (MEV), seguindo a
metodologia descrita por Kitajima e Leite (1999).
Para a microscopia eletrônica de varredura, as amostras circulares, com cerca de 0,5 cm
de diâmetro e 2-3 mm de espessura foram fixadas em fixador Karnovsky modificado
(glutaraldeído 2,5%; paraformaldeído 2%; CaCl
2
0,001 M e tampão cacodilato 0,05 M) por, no
mínimo, 2 horas. Após este procedimento, as amostras foram lavadas três vezes de 10 minutos
cada em tampão cacodilato de sódio 0,05 M pH 7 e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio
1% por 2 horas. Posteriormente, as amostras foram imersas três vezes de 10 minutos cada em
água destilada, seguidas de desidratação em série crescente de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%)
durante 10 minutos em cada concentração. Na concentração de 100% o procedimento foi
realizado três vezes. Em seguida, as amostras foram secas ao ponto crítico por meio de imersão
dos fragmentos em gás carbônico líquido, em aparelho de ponto crítico modelo CPD 030
(Balzers, Lichtenstein) e posterior fixação em suportes de alumínio (stubs) com fita dupla face de
39
carbono. Após este processo, os stubs com as amostras foram metalizados com vapor de ouro em
aparelho metalizador modelo MED 010 (Balzers Union, Lichtenstein), a 50 mA, por 180
segundos. As observações foram realizadas no Microscópio Eletrônico de Varredura LEO 435
VP (Zeiss, Inglaterra). Foram registradas imagens dos conídios para estudo e a avaliação
correspondeu a contagem de 100 conídios por amostra, avaliando-se as porcentagens de conídios
germinados e apressórios formados. O conídio foi considerado como germinado quando o tubo
germinativo excedeu a metade do diâmetro do mesmo.
Os dados obtidos foram analisados por meio de regressões não-lineares, utilizando-se o
programa STATISTICA versão 6.0 (Stat Soft, EUA) e foram ajustados ao modelo beta-
monomolecular descrito no item 3.2.3.
O experimento foi realizado duas vezes, com 5 repetições para cada tratamento. Os
valores apresentados correspondem ao primeiro experimento realizado.
3.2.6 Avaliação da pré-penetração de conídios de G. psidii em diferentes idades de frutos de
goiabeira
Frutos de goiabeira com cinco diferentes idades foram coletados. As idades dos frutos
corresponderam a aproximadamente 10 dias, 35 dias, 60 dias, 85 dias e 110 dias (diâmetros
aproximados de 1, 2, 3, 5 e 7 cm, respectivamente) após a queda das pétalas (Figura 1).
Figura 1 – Frutos de goiabeira de 5 diferentes faixas de idades. Da esquerda para direita: frutos com 10 dias, com 35
dias, com 60 dias, com 85 dias, com 110 dias
Alíquotas de 30 μL de suspensão de conídios de G. psidii obtidas e calibradas como
descrito no item 3.2.3 foram depositadas na superfície dos frutos, como descrito no item 2.2.5.
Cada tratamento foi acomodado em bandeja plástica como descrito no item 2.2.5 e permaneceram
40
em incubadora na temperatura de 25
o
C e duração de período de molhamento de 24 horas,
condições estas pré-estabelecidas por meio do experimento anterior.
Transcorrido este período, as amostras foram retiradas com auxílio de bisturi e preparadas
para visualização em MEV, seguindo a metodologia descrita por Kitajima e Leite (1999) citada
no item 2.2.5. Foram registradas imagens dos conídios para estudo e a avaliação correspondeu a
contagem de 100 conídios por amostra, avaliando-se as porcentagens de conídios germinados e
apressórios formados.
Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o programa PlotIT versão 3.2 (Scientific
Programming Enterprises, EUA).
O experimento foi realizado duas vezes, com 5 repetições por tratamento. Os valores
apresentados correspondem ao primeiro experimento realizado.
3.3 Resultados
3.3.1 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de
conídios de G. psidii in vitro
A equação se ajustou ao comportamento da germinação, formação de apressórios e
apressórios melanizados de conídios de G. psidii em relação ao período de molhamento e
temperatura testados (Tabela 1). A superfície de resposta para estimar a germinação dos conídios
foi descrita pela função Y=((6,165)*((T-(6,718))^(2,276))*(((41,463)-T)^(1,423)))*((0,005)*(1-
(0,993)*exp(-(0,431e-3)*M))). A superfície de resposta para a formação de apressórios foi
descrita pela função Y=((0,323e-5)*((T-(10))^(3,554))*(((43,414)-T)^(3,26)))*((0,202)*(1-
(0,981)*exp(-(0,006)*M))). O comportamento da melanização dos apressórios obedeceu a função
Y=((0,323e-5)*((T-(10))^(3,554))*(((43,414)-T)^(3,26)))*((0,202)*(1-(0,981)*exp(-
(0,006)*M))). Para todas as funções acima descritas, Y é a variável analisada, T é a temperatura
em ºC e M o período de molhamento em horas.
O parâmetro B
5
desta equação está relacionado à forma da curva e pode ser utilizado para
determinar a amplitude do intervalo de temperatura ótima para cada variável analisada
(BASSANEZI et al. 1998). Valores pequenos (próximo a zero) indicam que o componente em
estudo apresenta valor máximo em uma ampla faixa de temperatura ao redor da ótima. Observou-
41
se que, entre as 3 variáveis analisadas, o menor valor obtido para B5 foi para a germinação de
conídios, demonstrando que o intervalo de temperatura ótimo para germinação foi mais amplo
quando comparado ao das variáveis formação de apressórios e apressórios melanizados (Tabela
1).
Tabela 1 – Valores dos parâmetros e dos coeficientes de determinação do modelo beta-monomolecular Y=(B1*((T-
B2)^B3)*((B4-T)^B5))*(B6*(1-B7*exp(-B8*M))), onde Y representa as fases da pré-penetração
analisadas, T representa a temperatura, M representa a duração do período de molhamento, B2 e B4
correspondem, respectivamente, as temperaturas mínima e máxima, B1, B3, B5, B6, B7 e B8 são
parâmetros da equação, sem significado biológico
Fases da pré-
penetração (Y)
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 R
2
Germinação 6,165 6,718 2,276 41,463 1,423 5.10
-3
0,993 4.10
-4
0,934
Apressórios 3.10
-6
10 3,554 43,414 3,26 0,202 0,981 6.10
-3
0,965
Apressórios
melanizados
0,179 10 4,282 41,898 3,702 6.10
-7
1,004 0,002 0,968
À medida que se aumentou a temperatura e o período de molhamento, observou-se
aumento gradual na porcentagem de germinação (Figura 2), formação de apressórios (Figura 3) e
apressórios melanizados (Figura 4). Estas variáveis atingiram o máximo a 25ºC e duração de
período de molhamento de 48 horas, que corresponderam a 38% de conídios germinados, 37,7%
de apressórios formados e 37,2% de apressórios melanizados. A partir de 25
o
C, houve
decréscimo nas variáveis avaliadas. A germinação, formação de apressório e apressório
melanizado elevaram-se à medida que se aumentou a duração período de molhamento. A faixa de
temperatura favorável à germinação, formação de apressórios e apressórios melanizados foi entre
25 e 30ºC, pois apenas nestas temperaturas as variáveis apresentaram médias superiores a 30%
com 48 horas de molhamento (Anexo C). A 10, 15 e 40ºC houve baixa porcentagem de
germinação, atingindo médias, respectivamente, de 7,9%, 9,3% e 3,3% com 48 horas de duração
do molhamento. As formações de apressórios e de apressórios melanizados apresentaram níveis
muito baixos a 10 e 15ºC, atingindo médias, respectivamente, de 1,3% e 5,3% de apressórios
formados e 0,3% e 3,7% de apressórios melanizados com 48 horas de duração de molhamento. A
40ºC não foi observada a formação de apressórios.
42
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Figura 2 – Superfície de resposta da germinação de conídios de Guignardia psidii, em função da temperatura e do
período de molhamento in vitro, descrita pela função Y=((6,165)*((T-(6,718))^(2,276))*(((41,463)-
T)^(1,423)))*((0,005)*(1-(0,993)*exp(-(0,431e-3)*M))), em que Y é a porcentagem de germinação dos
conídios, T é a temperatura em ºC e M o período de molhamento em horas
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)
Figura 3 – Superfície de resposta da formação de apressórios por conídios de Guignardia psidii, em função da
temperatura e do período de molhamento in vitro, descrita pela função Y=((0,323e-5)*((T-
(10))^(3,554))*(((43,414)-T)^(3,26)))*((0,202)*(1-(0,981)*exp(-(0,006)*M))), em que Y é a média de
apressórios, T é a temperatura em ºC e M o período de molhamento em horas
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o
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(%
)
Figura 4 – Superfície de resposta da formação de apressórios melanizados por conídios de Guignardia psidii, em
função da temperatura e do período de molhamento in vitro, descrita pela função Y=((0,179)*((T-
(10))^(4,282))*(((41,898)-T)^(3,703)))*((0,603e-6)*(1-(1,004)*exp(-(0,002)*M))), em que Y é a
porcentagem de apressórios melanizados, T é a temperatura em ºC e M o período de molhamento em
horas
Verificou-se que os conídios de G. psidii apresentam formato ovalado, hialinos,
unicelulares, granulados com dimensões variando de 7 a 10 µm por 5 a 7 µm. Cada conídio gerou
apenas um apressório ou tubo germinativo, o qual geralmente terminou em um apressório, na
maioria dos casos melanizado e de formato globoso a oval (Figura 5). Além disso, visualizou-se a
35ºC a presença de conídios com apressórios apresentando alterações morfológicas quando
comparado aos apressórios formados nas demais temperaturas (Figura 5 N e U).
44
AB D
C
EFG
O
V
HI L
J
MN
PQ S
R
TU
AB D
C
EFG
O
V
HI L
J
MN
PQ S
R
TU
Figura 5 – Aspecto dos conídios de Guignardia psidii submetidos a diferentes períodos de molhamento e
temperaturas. Com 12 horas de período de molhamento, as temperaturas 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40ºC
(A a G respectivamente). Com 24 horas de período de molhamento, as temperaturas 10, 15, 20, 25, 30,
35 e 40ºC (H a O respectivamente). Com 48 horas de período de molhamento, as temperaturas 10, 15,
20, 25, 30, 35 e 40ºC (P a V respectivamente). Observados em microscópio de luz, aumento de 400x,
barra = 20 µm
3.3.2 Avaliação do efeito da temperatura e duração do molhamento na pré-penetração de
conídios de G. psidii em goiaba
O modelo beta-monomolecular se ajustou ao comportamento da germinação e formação
de apressórios de conídios de G. psidii em relação ao período de molhamento e temperatura
testados (Tabela 2). A superfície de resposta para estimar a germinação dos conídios pôde ser
descrita pela função Y=((1,03)*((T-(2,076))^(2,429))*(((46,534)-T)^(2,124)))*((0,279e-4)*(1-
(16,405)*exp(-(0,651)*M))). A superfície de resposta para explicar a formação de apressórios foi
descrita pela função Y=((0,351e-4)*((T-(10))^(4,276))*(((40,002)-T)^(3,532)))*((0,176e-3)*(1-
(4,694)*exp(-(0,385)*M))). Em ambas as funções, Y é a variável analisada, T é a temperatura em
ºC e M o período de molhamento em horas. Observou-se valor menor de B5 para a germinação,
demonstrando que o intervalo ótimo de temperatura para germinação foi mais amplo quando
comparado ao da formação de apressórios (Tabela 2).
45
Tabela 2 – Valores dos parâmetros e dos coeficientes de determinação do modelo beta-monomolecular Y=(B1*((T-
B2)^B3)*((B4-T)^B5))*(B6*(1-B7*exp(-B8*M))), onde Y representa as fases da pré-penetração
analisadas: germinação e formação de apressórios de conídios de Guignardia psidii, T representa a
temperatura, M representa a duração do período de molhamento, B2 e B4 correspondem,
respectivamente, as temperaturas mínima e máxima, B1, B3, B5, B6, B7 e B8 são parâmetros da equação,
sem significado biológico
Fases da pré-
penetração (Y)
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 R
2
Germinação 1,03 2,076 2,429 46,534 2,124 3.10
-5
16,405 0,651 0,826
Apressórios 3.10
-5
10 4,276 40,002 3,532 2.10
-4
4,694 0,385 0,644
Com o aumento da temperatura e do período de molhamento, observou-se o aumento
gradual da porcentagem de germinação (Figura 6) e formação de apressório (Figura 7) in vivo.
Estas variáveis atingiram o máximo a 25ºC e duração de período de molhamento de 24 horas, que
corresponderam aos valores médios de 45,6% de conídios germinados e 11,2% de apressórios
formados. A partir de 25
o
C, houve decréscimo nas variáveis avaliadas. Tanto a germinação
quanto a formação de apressório elevaram-se à medida que se aumentou a duração do
molhamento. A faixa de temperatura favorável a germinação foi entre 20ºC a 30ºC, pois somente
entre estas temperaturas esta variável atingiu média superior a 30% com 24 horas de molhamento
(Anexo A3). Nesta faixa de temperatura, a média de conídios germinados ultrapassou 40%
apenas a 25ºC, sendo, portanto a melhor temperatura para esta variável. A 15ºC e 35ºC a
germinação atingiu média de cerca de 20% e a 10ºC e 40ºC de cerca de 10% com 24 horas de
molhamento. Já a formação de apressório apresentou faixa favorável entre 25ºC e 30ºC (Anexo
A4), pois somente nestas temperaturas esta variável ultrapassou a média de 6% com 24 horas de
molhamento. A temperatura de 25ºC foi a mais adequada, apresentando média superior a 11% de
apressórios formados a 24 horas de molhamento.
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Figura 6 – Superfície de resposta da germinação de conídios de Guignardia psidii, em função da temperatura e do
período de molhamento in vivo, descrita pela função Y=((1,03)*((T-(2,076))^(2,429))*(((46,534)-
T)^(2,124)))*((0,279e-4)*(1-(16,405)*exp(-(0,651)*M))), em que Y é a porcentagem de germinação dos
conídios, T é a temperatura em ºC e M o período de molhamento em horas
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Figura 7 – Superfície de resposta da formação de apressórios por conídios de Guignardia psidii, em função da
temperatura e do período de molhamento in vivo, descrita pela função Y=((0,351e-4)*((T-
(10))^(4,276))*(((40,002)-T)^(3,532)))*((0,176e-3)*(1-(4,694)*exp(-(0,385)*M))), em que Y é a
porcentagem de apressórios formados, T é a temperatura em ºC e M o período de molhamento em horas
47
Em geral, em todas as temperaturas estudadas notaram-se conídios de formato ovalado,
que emitem apenas um apressório ou tubo germinativo, o qual pode terminar em apressório,
geralmente de formato globoso a oval (Figura 9C). A presença do apêndice apical nos conídios,
característica presente nesta espécie foi visualizada (Figura 8). Não se observou orientação do
crescimento dos tubos germinativos para locais específicos da superfície do fruto (Figura 9E),
ocorrendo aparentemente penetração direta na cutícula do fruto por meio dos apressórios. Outra
observação importante foi a emergência do tubo germinativo a partir de qualquer região do
conídio, não havendo local específico para tal, porém sempre formando-se próximo a região de
contato com o substrato. Com a formação do apressório e a transferência do conteúdo
protoplasmático do conídio para este, ocorreu, na maioria das vezes, o colapso do conídio e do
tubo germinativo quando presente (Figura 9D). Na temperatura de 35ºC não foi verificada a
presença de alterações morfológicas nos apressórios, como foi observada in vitro (Figura 9F).
ABABAB
Figura 8 - Aspecto de conídio de Guignardia psidii em microscópio eletrônico de varredura. (A) barra = 10µm; (B)
barra = 5 µm
48
AB
C
D
G
EF
AB
C
D
G
EF
Figura 9 – Aspecto dos conídios de Guignardia psidii em microscópio eletrônico de varredura, com 24 horas de
período de molhamento submetidos as temperaturas 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40ºC (A a G
respectivamente), barra = 20 µm
49
3.3.3 Avaliação da pré-penetração de conídios de G. psidii em diferentes idades de frutos de
goiabeira
Observou-se o aumento gradual da porcentagem de germinação e formação de apressório
com o aumento da idade da goiaba inoculada (Figura 10). A média de conídios germinados e
apressório formados na idade de 10 dias foram, respectivamente, de 8,4% e 3,2% (Figura 11A e
B), elevando-se gradativamente com o aumento da idade do fruto. Ao final, frutos com
maturidade fisiológica (com 110 dias) apresentaram média final de 43,2% de conídios
germinados e 26,4% de apressórios formados (Figura 11I e J).
À medida que a idade dos frutos aumentou, observaram-se nítidas mudanças em suas
superfícies. A superfície dos frutos mais jovens (10 dias) apresentou-se mais irregular e com
maior quantidade de tricomas quando comparada à superfície de frutos com mais idade (Figura
12).
Figura 10 – Germinação e formação de apressórios de conídios de Guignardia psidii em diferentes idades de fruto de
goiabeira
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
110 1010 60 3535 6085 85 110
Germina
ç
ão
(
%
)
A
p
ressórios
(
%
)
Idade do fruto
Idade do fruto
50
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J
AB
CD
EF
G
H
I
J
ABAB
CDCD
EFEF
G
H
G
H
I
J
I
J
I
J
Figura 11 - Aspecto dos conídios de Guignardia psidii em microscópio eletrônico de varredura a 25ºC e 24 horas de
período de molhamento sobre a superfície de frutos com 10 dias (A e B), 35 dias (C e D), 60 dias (E e F),
85 dias (G e H) e 110 dias (I e J); barra = 20 µm
51
AB
CD
E
AB
CD
E
Figura 12 - Aspecto em microscópio eletrônico de varredura da superfície dos frutos de goiabeira com 10 dias (A),
35 dias (B), 60 dias (C), 85 dias (D) e com 110 dias (E); barra = 50 µm
52
3.4 Discussão
A temperatura, a duração do período de molhamento e a idade do fruto se mostraram
importantes fatores, afetando a fase de pré-penetração de G. psidii. A germinação e a formação
de apressório dos conídios apresentaram, tanto in vitro quanto in vivo, superfícies de resposta
semelhantes nas quais se observou o aumento gradual da porcentagem de germinação e formação
de apressório a partir de 10ºC, atingindo máximo a 25ºC e decaindo até 40ºC. Tal resultado leva a
concluir que entre as temperaturas testadas, 25ºC corresponde à temperatura favorável à pré-
penetração de conídios de G. psidii. A maioria dos patógenos cresce melhor a temperaturas entre
24 a 26ºC (BROWN, 1922) e geralmente, a melhor temperatura para formação de apressório
coincide com aquela para a germinação do esporo (ISHIDA; AKAI, 1969; MIEHLE; LUKEZIC,
1972; SKOROPAD, 1967).
Tozetto (1995) estudou a influência da temperatura sobre a germinação de conídios de G.
psidii em folhas de celofane. O autor verificou o aumento do índice de germinação dos conídios a
partir de 14ºC, atingindo melhor índice na faixa entre 21 e 28ºC, e decaindo a 35ºC. Estes
resultados concordam com a faixa favorável à germinação obtida neste estudo. Os resultados
obtidos neste trabalho também foram similares aos obtidos em testes in vitro com conídios de
Guignardia bidwellii (Phyllosticta ampelicida), agente causador da podridão preta da uva. Neste
caso, observou-se o aumento progressivo da porcentagem de germinação na faixa entre 15 a
30ºC, seguido de decréscimo rápido em temperaturas acima de 30ºC (CALTRIDER, 1961). A
superfície de resposta de apressórios formados em testes in vitro com conídios de Guignardia
citricarpa (Phyllosticta citricarpa), agente causal da mancha preta dos citros, demonstrou maior
porcentagem de apressórios formados a 30ºC (NORONHA, 2002), valor próximo ao obtido para
G. psidii, o qual foi 25ºC. Estrada, Dodd e Jeffries (2000) obtiveram resultados similares de taxa
de apressórios melanizados in vitro e na superfície de frutos de mangueira para C.
gloeosporioides, com maior porcentagem a 30ºC que a temperaturas inferiores, porém a
freqüência de pegs de penetração foi mais alta a 25ºC. Sobre a faixa de temperatura favorável a
formação de apressórios de G. psidii, Tozzeto (1995) não verificou diferenças significativas nas
temperaturas de 21, 28 e 35ºC em folhas de celofane, apresentando assim faixa favorável mais
ampla que a obtida neste estudo.
Com relação às superfícies de resposta geradas por G. psidii in vivo, observa-se
semelhança em relação ao relatado por Spotts (1977). O autor observou aumento progressivo da
53
porcentagem de infecção de folhas de uva por conídios de G. bidwellii na faixa entre 10 a 26,5ºC,
seguido de decréscimo da mesma em temperaturas acima de 26,5ºC. Entretanto, temperaturas
mais amenas foram favoráveis para ocorrer a infecção do fungo Monilinia fructicola, agente
causal da podridão parda, em frutos de pessegueiro e cerejeira. A melhor temperatura para
infecção de M. fructicola em cereja foi entre 20 a 22,5ºC e de 22,5 a 25ºC em pêssego (BIGGS;
NORTHOVER, 1988).
Apesar da temperatura mais adequada para germinação de G. psidii in vitro e in vivo ter
sido a mesma (25ºC) com 24 horas de molhamento (AnexoB1), a média da porcentagem de
germinação in vitro de conídios de G. psidii foi expressivamente menor que a média obtida no
experimento in vivo, cujos valores foram respectivamente 20,8% e 45,6%. Muitos estudos são
realizados in vitro sob condições controladas e em água destilada esterilizada, os quais permitem
a manipulação e observação de estruturas delicadas durante o processo de pré-infecção e
infecção, porém tais condições não representam o estado natural (HOWARD, 1994). A diferença
entre a germinação in vitro e in vivo, permite concluir que há influência de estímulos exógenos,
presentes nos frutos maduros, na germinação dos conídios de G. psidii. Em frutos de abacateiro,
por exemplo, a cera presente na superfície do fruto induziu a germinação e formação de
apressório de conídios de Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da antracnose (PODILA;
ROGERS; KOLATTUKUDY, 1993). Em frutos maduros de tomateiro, abacateiro e bananeira, o
gás etileno produzido pelos frutos induziu a germinação e formação de apressório de
Colletotrichum gloeosporioides e Colletotrichum musae, agentes causais da antracnose
(FLAISHMAN; KOLLATUKUDY, 1994). No entanto, a germinação de conídios de P.
ampelicida sobre folhas de uva assim como em superfície de poliestireno foi superior a 90%
dentro do período de incubação de 60 a 90 minutos (KUO; HOCH, 1995). Buscando esclarecer
os fatores que influenciam a germinação dos conídios de P. ampelicida, Kuo e Hoch (1996)
demonstraram que a adesão dos conídios foi pré-requisito para a ocorrência da germinação e tal
fixação foi dependente do molhamento ou hidrofobicidade do substrato.
No entanto, a formação de apressórios foi menor nos experimentos in vivo quando
comparada aos experimentos in vitro. Enquanto nos experimentos in vivo essa variável
apresentou média de 11,2%, nos experimentos in vitro correspondeu a 20,8% (Anexo B2) a 25ºC
e 24 horas de molhamento. Isso sugere que a formação de apressórios dependeu de estímulo
diferente daquele relacionado à germinação dos conídios. De acordo com Emmett e Parbery
54
(1975), enquanto alguns autores afirmam que os fungos precisam da superfície de determinada
planta para formar apressórios, outros demonstram obter igualmente bons resultados com a
mesma espécie de fungo in vitro. Geralmente, apressórios se formam em hospedeiros suscetíveis
e resistentes, em tecidos vivos ou mortos e em ampla faixa de hospedeiros e não hospedeiros.
Embora a especificidade a superfície seja importante em alguns casos, geralmente parece não ser
regra (EMMETT; PARBERY, 1975). Existem trabalhos que relacionam a formação de
apressórios a estímulos físicos das superfícies sobre as quais o esporo germina. A dureza da
superfície pode em alguns casos ser fundamental. Com o aumento da dureza da superfície,
conídios germinados de Colletotrichum phomoides (Colletotrichum coccodes) produziram
proporções cada vez maiores de apressórios (VAN BURGH, 1950). Este fato poderia explicar a
maior formação de apressórios de G. psidii sobre o poliestireno.
Por meio do experimento in vitro, observou-se que a temperatura ótima e faixa favorável à
melanização dos apressórios de conídios de G. psidii, as quais foram respectivamente 25ºC e 25 a
30ºC (Anexo C3). Diversos trabalhos demonstram a necessidade da melanização do apressório
para que o processo de infecção seja bem sucedido. Apressórios de Colletotrichum lagenarium,
por exemplo, apresentaram como requisito para penetração a biossíntese de melanina, sendo
apressórios pigmentados e levemente pigmentados capazes de penetrar no substrato (KUBO et
al., 1982; KUBO; FURUSAWA; SHISHIYAMA, 1987). Apressórios de Magnaporthe grisea,
agente causal da brusone do arroz, tratados com inibidores da biossíntese da melanina se
tornaram incapazes de penetrar no hospedeiro, demonstrando que a melanina confere
patogenicidade ao facilitar o desenvolvimento de pressão elevada dentro do apressório
(HOWARD; VALENT 1996; MONEY; HOWARD, 1996).
Sobre à duração do período de molhamento, observou-se que, tanto in vitro quanto in
vivo, a germinação e a formação de apressório de conídios de G. psidii apresentaram as
porcentagens elevadas à medida que se aumentou a duração do período de molhamento. Sendo,
portanto necessário longo período de molhamento para o sucesso no processo de pré-penetração.
O aumento da taxa de germinação com o aumento da duração do molhamento também foi
observado em experimentos in vitro com conídios de Potebniamyces pyri, agente causal de
podridão em pêra (LIU; XIAO, 2005). Em pêssegos e cerejas a incidência de infecção provocada
por Monilinia fructicola também se elevou com o aumento da duração do período de molhamento
(BIGGS; NORTHOVER, 1988).
55
No entanto, a porcentagem de germinação máxima não atingiu a média de 50% mesmo
com a maior duração de molhamento estudada, a qual foi de 48 horas in vitro e 24 horas in vivo.
Enquanto que, com apenas 10 horas de incubação, mais de 80% dos conídios de determinado
isolado de C. gloeosporioides já haviam germinado em membrana de celofane, resultados estes
similares aos obtidos em superfície de frutos de mangueira (ESTRADA; DODD; JEFFRIES,
2000). O requisito de maior período de molhamento pode ser devido a necessidade do patógeno
de debilitar o tecido invadido, por meio de agentes tóxicos ou enzimáticos, e é possível que esta
exigência seja mais comum em espécies patogências fracas. Entretanto, um período de
molhamento longo também pode ser requerido para infecção de órgãos resistentes por espécies
virulentas (ROTEM, 1994).
Com relação ao experimento envolvendo diferentes idades de frutos, verificou-se aumento
gradual na germinação e formação de apressório de G. psidii com o aumento da idade do fruto,
indicando que frutos com mais idade favorecem o processo de infecção. Diversos autores
relataram que a proximidade da fase de amadurecimento de frutos favorece a expressão de
infecções, as quais podem surgir também durante a pós-colheita ou a senescência
(CRUICKSHANK; WADE, 1992; LUO et al., 2001; MARI et al., 2003; LUO; MICHAILIDES,
2003). Sob condições de campo, conídios de C. gloeosporioides dispersos pela chuva em
superfícies do hospedeiro podem manter o potencial para infectar e causar antracnose em frutos
de mangueira por período de várias semanas. Esses propágulos podem ser carregados para o
estágio de pós-colheita onde podem germinar e causar lesões nos frutos. Conídios com
capacidade de germinar foram retirados de superfícies de mangas maduras um mês após a
colheita. Conídios dispersados durante a fase inicial de desenvolvimento do fruto podem ter
menos chance de sobreviver já que são expostos a condições ambientais adversas por longo
tempo. Entretanto, conídios depositados tardiamente em frutos em desenvolvimento podem
persistir na superfície do hospedeiro, para infecções quiescentes ou após a colheita, onde o
ambiente é normalmente favorável para o crescimento do patógeno (ESTRADA; DODD;
JEFFRIES, 2000).
A germinação do conídio e a formação do apressório de Colletotrichum piperatum
mostraram ser atrasadas na superfície de pimentões imaturos, mas não em frutos maduros
(GROVER, 1971 apud PRUSKY, 1996). Geotrichum candidum produziu podridões em frutos de
tomateiro maduros com coloração avermelhada, porém pouca ou nenhuma infecção em frutos
56
menos maduros (WELLS; SPALDING, 1975). Em cerejeiras, a suscetibilidade dos frutos a
infecções pelo fungo Monilinia laxa, causador da podridão parda, aumentou com o
amadurecimento do fruto (XU; BERTONE; BERRIE, 2007). Entretanto, conídios de
Colletotrichum musae têm sido relatados germinando na superfície de frutos de bananeira verdes
e maduros, porém o último estimulou maior formação de apressórios (PRUSKY; PLUMBLEY,
1992).
A baixa porcentagem de germinação e formação de apressórios em frutos com 10 dias de
idade pode ter sido influenciada pela maior irregularidade e concentração de tricomas na
superfície do fruto, que podem ter dificultado a fixação dos conídios. Os tricomas são divididos
em tricomas glandulares ou não glandulares ou tectores. Os tricomas tectores são considerados
mecanismos estruturais de resistência pré-formados, pois a pilosidade dos órgãos vegetais evita a
formação do filme de água necessário para a germinação fúngica, além de evitar o contato direto
de células epidérmicas e estruturas de infecção do fungo (PASCHOLATI; LEITE, 1995). A
relação entre características foliares e a resistência à antracnose foi observada durante o estágio
de pré-infecção do patógeno Glomerella cingulata f.sp. phaseoli, agente causal da antracnose em
feijoeiro. Um cultivar resistente de feijoeiro apresentou maior pilosidade que outro suscetível.
Devido a esse fato, o cultivar suscetível apresentou maior quantidade de estruturas do patógeno
sobre a superfície foliar e, consequentemente, maior severidade de doença quando comparado ao
resistente (JERBA; RODELLA; FURTADO, 2005).
Outras barreiras mecânicas podem ser impostas pelo hospedeiro para interromper e
também atrasar ou prevenir completamente o processo de infecção. A cutícula pode servir como
barreira estrutural, a qual o fungo encontra dificuldade em penetrar, ou pode conter substâncias
contrárias ao desenvolvimento do fungo (MARTIN, 1964). Em nectarinas o desenvolvimento de
infecções quiescentes de M. fructicola aumentou à medida que a espessura da cutícula diminuiu
(MICHAILIDES; JOHNSON; MORGAN, 1992).
Outros fatores além de estruturas físicas podem estar relacionados com a baixa
porcentagem de desenvolvimento de G. psidii nas primeiras idades de fruto estudadas. Lee e
Bostok (2006) comentam que as características da superfície, como topografia e hidrofobicidade
superficial assim como fatores químicos como nutrientes e compostos voláteis podem possuir
alguma influência na formação de apressório do fungo Monilinia fructicola, agente causal da
podridão parda em nectarinas. A freqüência de apressórios produzidos por conídios de M.
57
fructicola dependeu do estádio fenológico de desenvolvimento do fruto, com numerosos
apressórios formados em frutos imaturos (estádio II) e nenhum apressório observado em frutos
maduros (estádio III). Os autores, em experimentos adicionais, testaram emanações voláteis de
diferentes estádios de nectarina e pêssego. Os resultados demonstraram que compostos voláteis
dos estádios iniciais I e II do fruto inibiram a formação de apressório e a germinação do conídio
cerca de 50%, enquanto que compostos voláteis do estádio mais avançado III do fruto elevaram a
germinação do conídio e da elongação do tubo germinativo, mas inibiram a formação de
apressório em quase todos os conídios germinados. Em maçã, a ausência de concentrações
críticas de compostos como a sacarose ou frutose na constituição química de frutos imaturos,
pareceu estar envolvida com a resistência dos mesmos a Botryosphaeria ribis, Glomerella
cingulata, Neofabraea malicorticis e Physalospora obtusa, agentes causais de podridão em maçã
(SITTERLY; SHAY, 1960).
Em manga, uma mistura de compostos antifúngicos foi encontrada em concentrações
fungitóxicas na casca de frutos não maduros resistentes ao fungo Alternaria alternata, agente
causal da mancha de alternaria (DROBY et al., 1986). Em abacate, o patógeno causador da
antracnose Colletotrichum gloeosporioides infectou frutos imaturos produzindo apressórios, os
quais permaneceram quiescente até a maturação do fruto. A quiescência deste patógeno em frutos
imaturos foi atribuída à presença de elevadas concentrações do antifúngico diene e do flavonóide
epicatequina, compostos presente na casca. A epicatequina inibiu enzimas pectolíticas do fungo,
as quais poderiam estar envolvidas no ataque do fungo (PRUSKY et al., 1982; WATTAD;
DINOOR; PRUSKY, 1994). O decréscimo da concentração do antifúngico diene e da
epicatequina durante o amadurecimento dos frutos foi sugerido como fator principal na ativação
de infecções quiescentes por C. gloeosporioides em abacate (PRUSKY; WATTAD; KOBILER,
1996).
Além disso, fatores intrínsecos ao patógeno também podem estar relacionadas. A auto-
inibição da germinação é fenômeno comum entre espécies de Colletotrichum, diversos
compostos químicos já foram relatados presentes na matriz mucilagem gerando este fenômeno.
Inibidores produzidos por C. gloeosporioides f. sp. jussiaea presentes na água de lavagem dos
conídios inibiram a própria germinação e a de C. fragariae mas não a de 16 outras espécies de
Colletotrichum. (TSURUSHIMA et al., 1995).
58
Com relação ao formato e tamanho dos conídios de G. psidii observados tanto in vitro
quanto in vivo estão de acordo com o relatado por Ullasa e Rawal, (1984), Gonzáles e Rondón
(2005) e Van der Aa (1973). Os autores descrevem conídios tipicamente unicelulares, globosos a
elipsóides, granulados, com parede fina e geralmente flexível. São pequenos, geralmente nesta
espécie variando entre 6 a 12 µm por 5 a 8 µm, com apressórios formando-se diretamente do
conídio ou do tubo germinativo. O apêndice apical visualizado em conídios de G. psidii também
se encontra presente em conídios de G. bidwellii (KUO; HOCH, 1995). Assim como em G.
psidii, conídios de G. citricarpa, cultivados sobre folhas de limão “Siciliano”, apresentaram um
único tubo germinativo por onde todo o conteúdo protoplasmático do esporo foi transferido para
o apressório. A formação de apressório neste fungo caracterizou-se por apresentar variações de
tamanho e forma (NORONHA, 2002). Conídios de G. bidwellii, sobre folhas de uva, também
apresentaram semelhanças com as características descritas para G. psidii. Conídios do agente
causal da podridão preta da uva apresentaram tubos germinativos que emergiram de qualquer
região da superfície do esporo e não apresentaram nenhum poro germinativo discernível
morfologicamente ou outro local pré-determinado envolvendo o posicionamento do tubo
germinativo, entretanto, a emergência do tubo germinativo era predominantemente em locais
próximos a interface conídio-folha. Geralmente, os apressórios eram sésseis em tubos
germinativos curtos (5 µm de comprimento) e ocasionalmente estes eram longos (20-40 µm).
Uma vez que o citoplasma havia migrado do conídio e do tubo germinativo para o apressório,
estas estruturas entravam em colapso (KUO; HOCH, 1996).
As alterações na morfologia dos apressórios foram observadas a 35ºC in vitro, porém não
in vivo. De acordo com Emmett e Parbery (1975), as variações morfológicas em apressórios
podem ser induzidas por diversos fatores. Dentre estes, os fatores físicos os quais incluem a
temperatura, disponibilidade de água, intensidade da luz e dureza da superfície e os fatores
químicos que incluem o complexo de compostos químicos agindo na superfície da planta e os
fatores genéticos. Neste caso, pode-se sugerir a influência da temperatura in vitro na morfologia
dos apressórios produzidos por conídios de G. psidii, porém um ou mais fatores adicionais
presentes nos frutos mantiveram o formato comum dos apressórios na mesma temperatura como,
por exemplo, a presença de compostos químicos na planta ou até a dureza da superfície.
59
3.5 Conclusão
A temperatura e duração de molhamento, bem como a idade dos frutos influenciaram
a fase de pré-penetração de Guignardia psidii. A germinação, formação de apressórios e
apressórios melanizados (in vitro) apresentaram melhores índices a 25ºC e maior duração de
molhamento (24 horas in vivo e 48 horas in vitro). Além disso, com o aumento da idade dos
frutos, maior foi a porcentagem de conídios germinados e apressórios formados. Assim, este
trabalho contribui para a compreensão das condições favoráveis à pré-infecção de G. psidii em
goiaba e consequentemente fornece subsídios para a definição de momento ideal para controle
desta doença.
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65
4 EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE DIÓXIDO DE CARBONO E
ETILENO NA PRÉ-PENETRAÇÃO DE Guignardia psidii EM GOIABA
Resumo
O aumento do mercado consumidor de frutos de goiabeira in natura está associado a
qualidade dos mesmos durante a pós-colheita. Recentemente, a pinta preta provocada pelo fungo
Guignardia psidii Ullasa e Rawal (Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der Aa) vem gerando
perdas pós-colheita na produção. Este trabalho buscou avaliar o efeito de diferentes
concentrações de dióxido de carbono (0, 3, 6 e 12%) e etileno (0, 1, 3 e 6 ppm) na pré-penetração
de G. psidii in vitro e in vivo. As diferentes concentrações dos gases foram, in vitro, injetadas em
recipientes herméticos de 1,7 L os quais continham placas de poliestireno com alíquotas de 40 µL
de suspensão de 10
5
conídios/mL e, in vivo, injetadas em recipientes herméticos de 3,7 L os quais
continham frutos inoculados, em suas superfícies, com 30 µL de suspensão de 10
5
conídios/mL.
Os estudos in vitro foram avaliados por meio de microscópio de luz e os in vivo por meio de
microscópio eletrônico de varredura. Nos experimentos in vitro, todas as concentrações de
dióxido de carbono testadas provocaram queda na germinação dos conídios quando comparadas
ao controle. Porém, entre as diferentes concentrações, não foram observados efeitos marcantes
nesta variável. Assim, no controle esta variável apresentou valor médio de 45,1% enquanto que
nas concentrações 3, 6 e 12% do gás passou para, respectivamente, 24,6%, 22,6% e 25,8%.
Entretanto, o aumento das concentrações do dióxido de carbono provocou decréscimo
progressivo da taxa de formação de apressórios e apressórios melanizados de G. psidii. No
controle houve 23,2% de apressórios formados e 18,1% de apressórios melanizados e na
concentração de 12% de dióxido de carbono, esses valores foram reduzidos para 4,1% e 0,5%,
respectivamente. No entanto, no experimento in vivo, as taxas de germinação e formação de
apressórios apresentaram redução gradativa entre o controle e as concentrações de 3 e 6% de
dióxido de carbono, elevando-se novamente a 12%, passando de 28,2% de conídios germinados e
20,5% de apressórios formados na concentração de 6% de dióxido de carbono para,
respectivamente, 49,3% e 38,2% a 12% de concentração desse gás. Esse comportamento pode ser
explicado devido à remoção dos conídios não germinados durante o preparo das amostras para
visualização em microscópio eletrônico. O etileno, tanto nos experimento in vitro quanto in vivo
não apresentou efeito sobre a germinação e formação de apressórios de G. psidii. Na
concentração controle, apresentou, in vitro, 34,6% de conídios germinados, 34,2% de apressórios
formados e 29,9% de apressórios melanizados e na maior concentração de etileno estudada (6
ppm) 26,7% de conídios germinados, 26,3% de apressórios formados e 20,2% de apressórios
melanizados. Nos ensaios in vivo, o controle apresentou 40% de conídios germinados e 32,7% de
apressórios formados e na maior concentração de etileno estudada, 49,3% de conídios
germinados e 38,2% de apressórios formados. Esses resultados indicam que a manipulação da
concentração de dióxido de carbono, durante a pós-colheita, pode contribuir para reduzir
infecções que ainda não se estabeleceram nos frutos.
Palavras-chave: Goiaba; Guignardia psidii; Pré-penetração, Dióxido de carbono; Etileno
66
EFFECT OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF CARBON DIOXIDE AND
ETHYLENE IN THE Guignardia psidii PRE-PENETRATION IN GUAVA FRUITS
Abstract
The increase in the consumption market of the guava fruit in natura is associated with the
quality of the fruits after postharvest. Recently, the black spot caused by the fungus Guignardia
psidii Ullasa and Rawal (Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der Aa) has been generating
postharvest losses in the production. This work evaluated the effect of different concentrations of
carbon dioxide (0, 3, 6 e 12%) and ethylene (0, 1, 3 e 6 ppm) in the pre-penetration of G. psidii in
vitro and in vivo. The gases different concentrations were, in vitro, injected in hermetic flasks of
1.7 L which contained polystyrene Petri dishes with aliquots of 40 µL conidial suspension with
10
5
conidia/mL and, in vivo, injected in hermetic flasks of 3.7 L which contained fruits inoculated
with aliquots of 30 µL conidial suspension with 10
5
conidia/mL on its surfaces. The in vitro
studies were evaluated by light microscope and the in vivo by scanning electron microscope. In
the in vitro experiments, all the concentrations of carbon dioxide tested provoked decrease in the
conidia germination when compared with the control. However, between the different
concentrations, it was not observed remarkable effects in this variable. Thus, in the control this
variable presented a mean value of 45.1% while in 3, 6 and 12% concentrations of this gas, it
passed to, respectively, 24.6%, 22.6% and 25.8%. However, the increase in the carbon dioxide
concentrations provoked a progressive decrease in the G. psidii appressoria formation and
melanized appressoria rates. In the control there was 23.2% formed appressoria and 18.1%
melanized appressoria and in the carbon dioxide concentration of 12%, these values were reduced
to 4.1% and 0.5%, respectively. However, in the in vivo experiment, the germination and
appressorium formation rates presented a gradual decrease between the control and the carbon
dioxide concentrations of 3 and 6%, rising again at 12%, going from 28.2% germinated conidia
and 20,5% formed appressoria at 6% of carbon dioxide, to, respectively, 49.3% and 38.2% at
12% of this gas. This behavior can be due to the removal of the non germinated conidia during
the samples preparation for the light microscope observation. Ethylene, both in the in vitro and in
the in vivo experiments, did not present effect over the G. psidii germination and appressorium
formation. The control concentration, presented in vitro, 34.6% germinated conidia, 34.2%
formed appressoria and 29.9% melanized appressoria and in the ethylene highest concentration
studied (6 ppm) 26.7% germinated conidia, 26.3% formed appressoria and 20.2% melanized
appressoria. In the in vivo assays, the control presented 40% germinated conidia and 32.7%
formed appressoria and in the ethylene highest concentration studied, 49.3% germinated conidia
and 38.2% formed appressoria. These results indicate that the manipulation of the carbon dioxide
during the postharvest, can contribute to reduce the infections that did not establish in the fruits
yet.
Keywords: Guava; Guignardia psidii; Pre-penetration; Carbon dioxide; Ethylene
67
4.1 Introdução
A elevada perecibilidade da goiaba, a qual a torna alvo fácil para o estabelecimento de
diversas doenças, é um problema enfrentado pelos produtores na comercialização desta fruta in
natura, tanto no mercado nacional, como no mercado internacional.
O dióxido de carbono (CO
2
), a determinadas concentrações pode influenciar no processo
de infecção de diversos fitopatógenos favorecendo ou evitando danos em frutos e vegetais
perecíveis. A adição de dióxido de carbono na atmosfera durante o armazenamento de cerejas foi
um eficiente método utilizado para reduzir a podridão parda provocada pelo fungo Monilinia
fructicola, durante o transporte ferroviário, antes do advento da refrigeração mecânica (DE
VRIES-PATERSON; JONES; CAMERON, 1991). Tratamentos com dióxido de carbono
provaram ser bastante efetivos reduzindo podridões pós-colheita causadas por fungos, por meio
da inibição de diversas funções metabólicas (SOMMER, 1985). Em nectarinas, 15% de dióxido
de carbono a 5ºC durante 16 dias provocaram efeito fungistático em Monilinia fructicola, agente
causal da podridão parda (AHMADI; BIASI; MITCHAM, 1999). Concentrações de 3% ou mais
o dióxido de carbono retardaram o crescimento de Geotrichum candidum, causador de podridão
mole em tomate (WELLS; SPALDING, 1975). Entretanto, o aumento na multiplicação do fungo
Fusarium oxysporum f. cubense foi observado mediante a elevação dos níveis de dióxido de
carbono entre concentrações de 2 a 25% (STOVER; FREIBERG, 1958).
O etileno (C
2
H
4
) é um simples hidrocarboneto que regula diversos processos metabólicos
e de desenvolvimento. Está envolvido na germinação de sementes, influencia no crescimento da
planta, estimula a senescência de órgãos vegetais e induz o amadurecimento de frutos. Além
disso, o etileno é funcional durante estresses abióticos e bióticos como elevadas temperaturas,
secas, ferimentos e infecções por diferentes patógenos (ABELES; MORGAN; SALTVEIT, 1992
apud GERAATS et al., 2003). O papel do etileno em interações planta-patógeno é complexo.
Este gás, em alguns casos liberado pelo fruto e em outros inserido de maneira artificial, atua no
processo de patogênese, acelerando ou retardando doenças em frutos. Concentrações de etileno
variando entre 8 a 200 ppm foram relatadas induzindo a resistência de batata doce a Ceratocystis
fimbriata (STAHMANN; CLARE; WOODBURY, 1966). Entretanto, a remoção do etileno em
câmaras para o armazenamento refrigerado de pêssegos não provocou efeito sobre a incidência de
podridões provocada por fitopatógenos (NAVA; BRACKMANN, 2001), e a inibição do etileno
68
durante a pós-colheita em goiabas não impediu o desenvolvimento de fungos fitopatogênicos,
quando estas completaram o amadurecimento (BASSETTO et al., 2002). Em tangerinas maduras
com coloração de casca verde e inoculadas com Colletotrichum gloeosporioides, a antracnose
iniciou-se após tratamento das frutas com concentrações de etileno entre 5 a 50 ppm (BROWN;
BARMORE, 1977).
A qualidade do fruto da goiabeira em pós-colheita vem sendo afetada pela pinta ou
mancha preta. Esta podridão é provocada pelo fungo Guignardia psidii Ullasa e Rawal e o
anamorfo Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der Aa, tornando os frutos inviáveis para o
consumo in natura. Recentemente no Brasil, a pinta preta foi relatada em frutos de goiabeira da
variedade Kumagai em elevada porcentagem na região produtora de Campinas, no estado de São
Paulo. A incidência média do fungo G. psidii, no período de janeiro a novembro de 2005, foi de
18,6%, com um pico de 58% em abril (AMARAL et al., 2006).
Os sintomas da doença constituem-se, inicialmente, de pontos amarelados os quais
evoluem rapidamente na superfície dos frutos, formando lesões deprimidas, preto-esverdeadas a
marrom-escuras, que podem apresentar, na superfície, frutificações do fungo, geralmente
conidiomas picnidiais. Nas áreas próximas ou sob as lesões, a polpa apresenta podridão mole. As
lesões são circulares, geralmente com 1 a 2,5 cm de diâmetro e ocorrem em qualquer área do
fruto, podendo posteriormente coalescer (MANICA et al., 2001; TOZETTO; RIBEIRO, 1998).
Além da idéia de que a infecção por G. psidii ocorra em frutos jovens, permanecendo em
estado quiescente, até a maturidade (LIN; LAI; TSAI, 2003; TOZETTO; RIBEIRO, 1993),
também existe a possibilidade de ocorrer durante a pós-colheita, por meio do contato entre frutos
doentes e sadios durante o período de armazenamento. Nesse contexto, a manipulação dos gases
no ambiente de armazenamento dos frutos poderia auxiliar no controle da doença, impedindo ou
retardando as infecções que ocorrem nessa fase.
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi verificar o efeito dos gases dióxido de carbono
e etileno sobre os processos de pré-penetração de G. psidii em goiaba.
69
4.2 Material e métodos
4.2.1 Condução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Micologia e no Laboratório do
Núcleo de Apoio à Pesquisa / Microscopia Eletrônica Aplicada à Pesquisa Agropecuária
(NAP/MEPA) do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola e no
Laboratório de Pós-Colheita de Plantas Hortícolas do Departamento de Produção Vegetal da
Universidade de São Paulo, campus “Luiz de Queiroz” na cidade de Piracicaba, no estado de São
Paulo.
4.2.2 Obtenção e manutenção do isolado de G. psidii
O isolado de G. psidii foi obtido de frutos doentes em campo comercial no município de
Campinas, no estado de São Paulo e identificado com base na literatura e por meio dos
postulados de Koch. Este isolado foi cultivado em meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e mantido
em câmara de crescimento modelo E7 (Conviron, Canadá), a 25ºC + 1°C e sob alternância de luz
(12 horas claro/12 horas escuro). Nestas condições, a fase assexuada do fungo, correspondente a
Phyllosticta psidiicola, colonizou e se reproduziu sobre o meio de cultura. Esta fase foi utilizada
em todos os experimentos do presente trabalho.
4.2.3 Efeito in vitro de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G.
psidii
Conídios de G. psidii foram obtidos de colônias de 10 dias, cultivadas em meio BDA, a
25ºC + 1°C e sob alternância de luz (12 horas claro/12 horas escuro). Com auxílio de pincel e
água destilada autoclavada, conídios de G. psidii foram removidos da superfície das colônias.
Em seguida, a suspensão obtida foi filtrada em gaze esterilizada para retirar fragmentos de
micélio e centrifugada a 10.000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Após este
procedimento, o sobrenadante foi descartado e acrescentou-se novamente água destilada estéril
para ressuspender os conídios precipitados. A suspensão foi calibrada para 10
5
esporos/mL com
70
auxílio da câmara de Neubauer. A centrifugação objetivou remover parte da matriz mucilaginosa
que envolve os conídios. Experimentos realizados previamente demonstraram que este processo
permitiu aumento na porcentagem de conídios germinados de G. psidii, facilitando assim os
estudos realizados.
Três alíquotas de 40 μl da suspensão foram depositadas na superfície de placas de
poliestireno. Cada placa foi mantida em recipiente hermético de 1,7 L, nos quais foram injetados
volumes de dióxido de carbono para obter concentrações de 3, 6 e 12%, além do controle (0%).
As concentrações testadas foram medidas, no início e no final do experimento, com auxílio do
aparelho PBI Dansensor modelo Check Mate 9900 O
2
/CO
2
(PBI Dansensor, Dinamarca). Da
mesma forma, em outros recipientes, foram testadas as concentrações 0, 1, 3 e 6ppm de etileno.
As concentrações de etileno foram medidas, no início e no final do experimento, com auxílio de
cromatógrafo a gás modelo TRACE 2000 CG (ThermoFinnigan, EUA). Os recipientes
permaneceram em temperatura ambiente (25°C ±3ºC) por 12 horas, em escuro contínuo.
Transcorrido o tempo, os recipientes foram abertos e a germinação dos conídios foi
interrompida adicionando-se 15 µL de lactoglicerol em cada gota. Em microscópio de luz Zeiss
Axioskop 2 (Zeiss, Alemanha) foram registradas imagens dos conídios para estudo e contados
100 conídios por gota, avaliando-se as porcentagens de conídios germinados, de apressórios
formados e de apressórios melanizados.
Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o programa PlotIT versão 3.2 (Scientific
Programming Enterprises, EUA). O experimento foi realizado duas vezes, com quatro repetições.
Os valores apresentados correspondem ao primeiro experimento realizado.
4.2.4 Efeito de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii em
frutos de goiabeira
Os frutos de goiabeira utilizados nos experimentos, pertencentes à variedade ‘Kumagai’,
foram obtidos junto a produtor da região de Campinas, no estado de São Paulo, e encontravam-se
em maturidade fisiológica segundo WATADA et al., (1984). Os frutos foram desinfestados com
hipoclorito de sódio 0,5% por 10 minutos, lavados em água corrente e deixados para secar em
temperatura ambiente, para posterior inoculação.
71
A inoculação das goiabas consistiu na deposição de uma gota com 30 µL de suspensão
com cerca de 10
5
conídios/mL, sobre suas superfícies previamente demarcadas com adesivos
plásticos. Cada goiaba inoculada foi depositada em recipiente hermético com capacidade de 3,7
L, contendo um chumaço de algodão umedecido com água destilada, para obtenção de ambiente
saturado em água. Em seguida, cada recipiente foi fechado para se injetar as concentrações de
gases a serem estudadas.
Foram testadas as concentrações 0, 3, 6 e 12% de dióxido de carbono e 0, 1, 3 e 6ppm de
etileno. O procedimento de calibração dos gases dentro dos recipientes foi realizado da mesma
maneira como descrito no item 4.2.3. Os recipientes permaneceram em temperatura ambiente
(25°C ±3ºC) por 12 horas, em escuro contínuo.
Transcorrido o período de incubação, as amostras foram retiradas com auxílio de bisturi e
preparadas para visualização em microscópio eletrônico de varredura, seguindo a metodologia
descrita por Kitajima e Leite (1999). Para a microscopia eletrônica de varredura, as amostras
circulares, com cerca de 0,5 cm de diâmetro e 2-3 mm de espessura foram fixadas em fixador
Karnovsky modificado (glutaraldeído 2,5%; paraformaldeído 2%; CaCl
2
0,001 M e tampão
cacodilato 0,05 M) por, no mínimo, 2 horas. Após este procedimento, as amostras foram lavadas
três vezes de 10 minutos cada em tampão cacodilato de sódio 0,05 M pH 7 e pós-fixadas em
solução de tetróxido de ósmio 1% por 2 horas. Posteriormente, as amostras foram imersas três
vezes de 10 minutos cada em água destilada, seguidas de desidratação em série crescente de
acetona (30, 50, 70, 90 e 100%) durante 10 minutos em cada concentração. Na concentração de
100% o procedimento foi realizado três vezes. Em seguida, as amostras foram secas ao ponto
crítico por meio de imersão dos fragmentos em gás carbônico líquido, em aparelho de ponto
crítico modelo CPD 030 (Balzers, Lichtenstein) e posterior fixação em suportes de alumínio
(stubs) com fita dupla face de carbono. Após este processo, os stubs com as amostras foram
metalizados com vapor de ouro em aparelho metalizador modelo MED 010 (Balzers Union,
Lichtenstein), a 50 mA, por 180 segundos. As observações foram realizadas no Microscópio
Eletrônico de Varredura LEO 435 VP (Zeiss, Inglaterra). Foram registradas imagens dos conídios
para estudo e a avaliação correspondeu à contagem de 100 conídios por amostra, avaliando-se as
porcentagens de conídios germinados e apressórios formados. O conídio foi considerado como
germinado quando o tubo germinativo excedeu a metade do diâmetro do mesmo.
72
Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o programa PlotIT versão 3.2 (Scientific
Programming Enterprises, EUA) . O experimento foi realizado somente uma vez, com cinco
repetições.
4.3 Resultados
4.3.1 Efeito in vitro de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G.
psidii
Nos experimentos in vitro, todas as concentrações de dióxido de carbono testadas
provocaram queda na germinação dos conídios quando comparadas ao controle. No entanto, entre
as concentrações estudadas, a germinação manteve-se estável.. No controle esta variável
apresentou valor médio de 45,1% enquanto que nas concentrações 3, 6 e 12% do gás passou para,
respectivamente, 24,6%, 22,6% e 25,8%. Porém, o aumento da concentração deste gás provocou
o decréscimo progressivo da média de apressórios formados e de apressórios melanizados, que
passaram de 23,2% de apressórios formados e 18,1% de apressórios melanizados no controle
para, respectivamente, 4,1% e 0,5% na concentração de 12% de dióxido de carbono (Figura 1).
Para o etileno, não foi possível verificar alterações na média das mesmas variáveis avaliadas com
o aumento das concentrações desse gás. O controle apresentou 34,6% de conídios germinados,
34,2% de apressórios formados e 29,9% de apressórios melanizados e, na maior concentração de
etileno estudada (6 ppm), 26,7% de conídios germinados, 26,3% de apressórios formados e
20,2% de apressórios melanizados (Figura 2).
Sob o microscópio de luz, verificou-se que com o aumento da concentração do dióxido de
carbono, foi visualizada a gradativa predominância de apressórios não melanizados (Figura 3A a
D). No entanto, com o aumento da concentração do etileno não foi visualizada diferença nas
estruturas analisadas de G. psidii (Figura 3E a H).
73
Figura 1 – Efeito in vitro de dióxido de carbono nas concentrações 0, 3, 6 e 12% sobre a germinação, formação de
apressórios e apressórios melanizados de conídios de Guignardia psidii
Figura 2 – Efeito in vitro do gás etileno nas concentrações 0, 1, 3 e 6ppm sobre a germinação, formação de
apressórios e apressórios melanizados de conídios de Guignardia psidii
ABC D
EFGH
ABC D
EFGH
Figura 3 – Aspecto dos conídios de Guignardia psidii submetidos a diferentes concentrações de dióxido de carbono e
etileno. Conídios submentidos a 0, 3, 6 e 12% de dióxido de carbono (A a D respectivamente). Conídios
submetidos a 0, 1, 3 e 6 ppm de etileno (E a H respectivamente). Observados em microscópio de luz,
aumento de 400x, barra = 20 µm
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0 3 6 9 12
0 3 6 9 12
0 3 6 9 12
Germinação (%)
Apressório (%)
Melanizado (%)
CO
2
(%) CO
2
(%) CO
2
(%)
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
C
2
H
4
(ppm) C
2
H
4
(ppm) C
2
H
4
(ppm)
Germinação (%)
Apressório (%)
Apr melanizado (%)
74
4.3.2 Efeito de dióxido de carbono e etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii em
frutos de goiabeira
As concentrações de 3% e 6% de dióxido de carbono proporcionaram redução gradativa
na germinação e formação de apressórios de G. psidii in vivo. Entretanto, na concentração de
12%, observou-se significativo aumento nestas duas variáveis. Numericamente, a germinação e a
formação de apressórios passaram, respectivamente, de 28,2% e 20,5% na concentração de 6%,
para 49,2% e 38,2% na concentração de 12% (Figura 4). Esse aumento, observado na maior
concentração do gás, poderia estar relacionado à remoção dos conídios não germinados, e,
portanto não aderidos à superfície dos frutos, pelos procedimentos necessários ao preparo das
amostras para visualização no microscópio de varredura. Detalhes dos esporos submetidos às
diferentes concentrações de dióxido de carbono podem ser observados na Figura 5.
O gás etileno não apresentou efeitos pronunciados nas variáveis analisadas. Para esse gás,
o controle apresentou 40% de conídios germinados e 32,7% de apressórios formados. Na
concentração de 6ppm, os valores dessas mesmas variáveis foram, respectivamente, 49,3% e
38,2% (Figura 5). Os esporos submetidos ao etileno podem ser visualizados na Figura 7.
75
Figura 4 – Efeito in vivo de dióxido de carbono nas concentrações 0, 3, 6 e 12% sobre a germinação e formação de
apressórios de conídios de Guignardia psidii
A
B
C
D
A
B
C
D
Figura 5 – Aspecto de conídios de Guignardia psidii sob efeito do dióxido de carbono nas concentrações 0, 3, 6 e
12% (respectivamente A, B, C e D) na superfície de frutos de goiabeira; barra = 10 µm
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0 3 6 9 12
0 3 6 9 12
CO
2
(%) CO
2
(%)
Germinação (%)
Apressório (%)
76
Figura 6 – Efeito in vivo do gás etileno nas concentrações 0, 1, 3 e 6 ppm sobre a germinação e formação de
apressórios de conídios de Guignardia psidii
AB
C
D
AB
C
D
Figura 7 – Aspecto de conídios de Guignardia psidii sob efeito do gás etileno nas concentrações 0, 1, 3 e 6 ppm
(respectivamente A, B, C e D); barra = 10 µm
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6
0 1 2 3 4 5 6
C
2
H
4
(ppm) C
2
H
4
(ppm)
Germinação (%)
Apressório (%)
77
4.4 Discussão
O aumento da concentração do dióxido de carbono in vitro reduziu a formação de
apressórios e apressórios melanizados de G. psidii, indicando a diminuição da capacidade de
infecção do fungo sob as concentrações testadas deste gás. O mesmo não ocorreu in vivo, onde se
observou o decréscimo das porcentagens de germinação de conídios e apressórios formados nas
concentrações 3 e 6% de dióxido de carbono como ocorreu in vitro, seguido, no entanto, do
aumento das mesmas na concentração de 12%. A elevada concentração do gás pode ter impedido
a adesão dos conídios sobre a superfície dos frutos. Consequentemente ocorreu remoção mais
acentuada de conídios não germinados durante o processamento das amostras para visualização
no microscópio eletrônico de varredura, gerando falso aumento da porcentagem de conídios
germinados.
Existem concentrações de dióxido de carbono que inibem, mas existem concentrações que
podem estimular crescimento e esporulação dos fungos, sendo que os níveis deletérios variam
muito com a espécie (TABAK; COOKE, 1968). O acréscimo de 5% de dióxido de carbono
diminuiu o crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides a 12,5ºC e Whetzelinia
sclerotiorum a 5,5ºC, entretanto estimulou o fungo Monilinia fructicola em ambas as
temperaturas (EL-GOORANI; SOMMER, 1979).
O controle do início do desenvolvimento de infecções provocadas pelo fungo Monilinia
fructicola em frutos de cerejeira melhorou com o aumento dos níveis de dióxido de carbono de
12 para 50%. A 50% de dióxido de carbono, o desenvolvimento da podridão parda em cerejas foi
completamente inibido por sete dias a 20ºC, porém os frutos desenvolveram a doença dentro de
dois a quatro dias depois de retornarem ao ar a 25ºC, indicando que este tipo de tratamento é
fungistático e não fungicida (DE VRIES-PATERSON; JONES; CAMERON, 1991). A exposição
de frutos de abacateiro a 30% de dióxido de carbono por 24 horas elevou os níveis do antifúngico
diene e do flavonóide epicatequina (composto capaz de inibir enzimas pectolíticas do fungo)
presentes na casca do fruto, atrasando o desenvolvimento de Colletotrichum gloeosporioides,
agente causal da antracnose (PRUSKY; PLUMBLEY; KOBILER, 1991; ARDI et al., 1998).
Entretanto, o fungo causador de podridões em maçã Penicillium expansum apresentou
crescimento in vitro expressivo quando submetido a concentrações de dióxido de carbono
variando entre 2,5 a 20%. Todavia, o elevado nível do gás inibiu parcialmente a esporulação do
78
fungo, principalmente a 20%, porém quando removido o gás e restabelecida a atmosfera normal,
as colônias retomaram o crescimento e esporulação (BRACKMANN et al., 1996). Concentrações
de dióxido de carbono entre 2 a 25% no ar, por 16 a 42 horas estimularam frequentemente a
multiplicação de Fusarium oxysporum f. cubense no solo. Devido a estes resultados, os fungos F.
oxysporum f. lycopersici, F. oxysporum f. nicotianae e F. oxysporum f. cucumerinum também
foram submetidos ao tratamento e a estimulação procedeu com 4% de dióxido de carbono
enriquecido no ar. Concentrações acima de 25% de dióxido de carbono no ar, por 48 horas, não
causaram a inibição da sobrevivência ou multiplicação dos fungos estudados. Experimentos
adicionais levaram a acreditar que a estimulação da multiplicação destas espécies de Fusarium
com dióxido de carbono pode ter sido provocada devido a participação deste gás, presente na
atmosfera do solo, nos processos metabólicos do fungo. Pois os resultados indicaram que o
dióxido de carbono, em concentrações normalmente encontradas na atmosfera do solo foram
fixadas por Fusarium oxysporum f. cubense (STOVER; FREIBERG, 1958).
O etileno não apresentou efeito na germinação e formação de apressórios, tanto in vitro
quanto in vivo. Este gás também não causou efeito no crescimento de Gloeosporium album
agente causal de podridões em maçãs, exceto sob baixas temperaturas (3,3ºC) onde inibiu o
crescimento do fungo (LOCKHART; FORSYTH; EAVES, 1968). Entretanto, em tecido de raiz
de variedade suscetível de batata doce, a exposição à concentrações de etileno variando entre 8 a
220 ppm induziu a resistência a infecção por Ceratocystis fimbriata. Neste caso, o etileno pode
ter agido como estímulo a mudanças metabólicas localizadas levando às reações de necrose e
hipersensibilidade em plantas infectadas (STAHMANN; CLARE; WOODBURY, 1966).
Concentrações de etileno variando de 1 a 1000 ppm, em experimentos in vitro a 20ºC,
estimularam a germinação de Penicillium digitatum, Penicillium italicum e Thielaviopsis
paradoxa, porém provocaram pouco ou nenhum efeito nos fungos Alternaria alternata, Botrytis
cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Monilinia fructicola, Penicillium expansum e Rhizopus
stolonifer (EL-KAZZAZ; SOMMER; KADER, 1983). O tratamento de tangerinas com etileno
em pós-colheita, visando modificar a cor da casca de verde para alaranjada, favoreceu a infecção
por Colletotrichum gloeosporioides (BROWN, 1975, BROWN; BARMORE, 1977). No entanto,
a antracnose não se desenvolveu em frutos maduros com 25% de coloração alaranjada expostos
ao etileno para homogeneização da cor. Testes histoquímicos da casca indicaram que fenóis e
lignina estavam presentes em associação com a hifa de infecção (BROWN, 1978). A exposição
79
de conídios do agente causal da antracnose Colletotrichum gloeosporioides a concentrações de 5
e 45 ppm de etileno, em abacate maduro, imaturo e in vitro, estimulou a germinação dos conídios
e formação de apressórios, mas não ativou o desenvolvimento de lesões precoces nos frutos
imaturos (PRUSKY; WATTAD; KOBILER, 1996), já que o desenvolvimento de lesões iniciadas
a partir de apressórios quiescentes de C. gloeosporioides em frutos está relacionado com o
decréscimo da concentração do antifúngico diene presente na casca, fato que ocorre com o
amadurecimento do fruto (PRUSKY; KEEN, 1993). Observou-se que frutos maduros de
abacateiro, inoculados com C. gloeosporioides e expostos ao etileno, apresentaram o
desenvolvimento de lesões na mesma velocidade que frutos não tratados com etileno. Em ambos
verificou-se que os níveis do antifúngico diene decaíram igualmente (PRUSKY; WATTAD;
KOBILER, 1996).
4.5 Conclusões
Os resultados permitem concluir que o dióxido de carbono, por apresentar efeito inibitório
sobre os processos de pré-penetração de G. psidii, possui maior potencial para uso no controle da
pinta preta da goiaba em pós-colheita. Mais estudos com relação ao uso deste gás se fazem
necessárias. Por exemplo, empregando-o associado a outras medidas de controle como a
refrigeração ou em associação com outros gases em atmosferas controladas. No entanto, o gás
etileno não provocou efeito sobre as variáveis estudadas, pertencentes à fase de pré-penetração de
G. psidii.
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80
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de CO
2
e O
2
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82
ANEXOS
83
Anexo A - Superfícies de resposta da germinação (A) e formação de apressórios (B) por conídios de Guignardia
psidii, em função da temperatura e do período de molhamento in vitro e superfícies de resposta da
germinação (C) e formação de apressórios (D) por conídios de G. psidii, em função da temperatura e do
período de molhamento in vivo, (A) descrita pela função Y=((,172836)*((T-
(6,66267))^(1,83021))*(((40,7201)-T)^(,939981)))*((,037301)*(1-(1,23561)*exp(-(,176584)*M))) e (B)
descrita pela função Y=((,016498)*((T-(9,90673))^(4,05899))*(((40,7107)-T)^(2,95846)))*((,611e-5)*(1-
(1,17224)*exp(-(,090582)*M))), (C) descrita pela função Y=((1,02989)*((T-
(2,07595))^(2,42938))*(((46,5336)-T)^(2,12356)))*((0,279e-4)*(1-(16,4046)*exp(-(0,650653)*M))), e
(D) descrita pela função Y=((0,351e-4)*((T-(9,99994))^(4,27578))*(((40,0019)-T)^(3,53199)))*((0,176e-
3)*(1-(4,69358)*exp(-(0,384784)*M))). Onde Y é a variável analisada, T é a temperatura em ºC e M o
período de molhamento em horas
10
10 15 20 25 30 35 40
6
12
18
24
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6
12
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14
10
6
2
10
10 15 20 25 30 35 40
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24
10
10 15 20 25 30 35 40
6
12
18
24
18
14
10
6
2
20
15
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5
10 15 20 25 30 35 40
6
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30
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10 15 20 25 30 35 40
6
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8
6
4
2
10 15 20 25 30 35 40
6
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18
24
1
2
43
Temperatura (ºC) Temperatura (ºC)
Molhamento (h)
Molhamento (h)
84
Anexo B - Superfícies de resposta da germinação (A) e formação de apressórios (B) por conídios de Guignardia
psidii, em função da temperatura e do período de molhamento até 24 horas in vitro, (A) descrita pela
função Y=((,172836)*((T-(6,66267))^(1,83021))*(((40,7201)-T)^(,939981)))*((,037301)*(1-
(1,23561)*exp(-(,176584)*M))) e (B) descrita pela função Y=((,016498)*((T-
(9,90673))^(4,05899))*(((40,7107)-T)^(2,95846)))*((,611e-5)*(1-(1,17224)*exp(-(,090582)*M))), em
que Y é a variável analisada, T é a temperatura em ºC e M o período de molhamento em horas
20
15
10
5
T
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m
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t
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(
h
)
G
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r
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i
n
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ç
ã
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(
%
)
1
2
85
Anexo C - Superfície de resposta da germinação (A), formação de apressório (B) e apressórios melanizados (C) por
conídios de Guignardia psidii, em função da temperatura e do período de molhamento in vitro, descritas
pelas funções (A) Y=((6,165)*((T-(6,718))^(2,276))*(((41,463)-T)^(1,423)))*((0,005)*(1-(0,993)*exp(-
(0,431e-3)*M))), (B) Y=((0,323e-5)*((T-(10))^(3,554))*(((43,414)-T)^(3,26)))*((0,202)*(1-
(0,981)*exp(-(0,006)*M))) e (C) Y=((0,179)*((T-(10))^(4,282))*(((41,898)-T)^(3,703)))*((0,603e-6)*(1-
(1,004)*exp(-(0,002)*M))), em que Y é a variável analisada, T é a temperatura em ºC e M o período de
molhamento em horas
30
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10 15 20 25 30 35 40
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48
1 2
3
Temperatura (ºC)
Temperatura (ºC)
Molhamento (h)
Molhamento (h)
Maria Eugenia Escanferla
Bióloga
Pré-Penetração de Guignardia psidii em goiaba: influência da temperatura, duração do
molhamento, idade dos frutos e concentração de etileno e dióxido de carbono
Orientador:
Prof. Dr. NELSON SIDNEI MASSOLA JÚNIOR
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2007
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