( PDF ) Seleção e avaliação funcional de fatores potencialmente envolvidos com interações entre plantas e nematóides parasitas

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

MOLECULAR

Seleção e avaliação funcional de fatores potencialmente

envolvidos com interações entre plantas e nematóides parasitas

Doutorando: Djair dos Santos de Lima e Souza.

Orientador: Prof. Dr. Cezar Martins de Sá.

Co-orientador: Dra Maria Fátima Grossi de sa

Novembro 2008 - Brasília

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

MOLECULAR

Seleção e avaliação funcional de fatores potencialmente envolvidos

com interações entre plantas e nematóides parasitas

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia

Molecular do Departamento de Biologia Celular da UnB, como

parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em

Biologia Molecular.

Doutorando: Djair dos Santos de Lima e Souza.

Orientador: Prof. Dr. Cezar Martins de Sá.

Co-orientador: Dra Maria Fátima Grossi de sa

Novembro 2008 - Brasília

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BANCA EXAMINADORA

Dra. Ildinete Silva Pereira

Departamento de Biologia Celular

Universidade de Brasília – UnB

Dr. Juvenil Enrique Cares

Departamento de Fitopatologia

Universidade de Brasília – UnB

Dra. Ilka Maria Vasconcelos

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular

Universidade Federal do Ceará – UFC

Dr. Ricardo Henrique Kruger

Departamento de Biologia Celular

Universidade de Brasília – UnB

Dr. Cezar Martins de Sá (Orientador)

Departamento de Biologia Celular

Universidade de Brasília – UnB

Novembro 2008 - Brasília

“A todos os colegas

que contribuíram

para a realização

desse trabalho”

Massas de ovos de M. incognita (por: Ruben Gapasin, PhD

Leyte State University)

Agradecimentos

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular do Departamento de Biologia Celular

da UnB pelo curso de qualidade, indispensável para a minha formação.

A orientadora, Doutora Maria Fátima Grossi de Sá, pelo apoio e incentivo, amizade e exemplo.

Resumo essa experiência profissional como a mais proveitosa e que me levou ao maior

crescimento pessoal e profissional até agora.

Ao orientador Doutor Cezar Martins de Sá, pela orientação, pelas conversas críticas e

esclarecedoras e, principalmente, pela paciência durante o meu doutorado.

Gostaria de agradecer em especial a todas as pessoas que torceram por mim desde o começo

dessa verdadeira jornada, uma história individual, mas que não seria possível se não fosse pelo

apoio desses amigos. Em todos os momentos que passei e que me queixei, tive apoio, palavras

e atitudes de incentivo, que me fizeram continuar apesar das frustrações, dificuldades e muitas

limitações. Então, gostaria de agradecer com igualdade ao Gustavo Ramos, Eduardo Romano,

Brener Marra, Thales Rocha, Charles Dayler, Cláudio Picanço, Rodrigo Osório, Aulus

Barbosa, José Cesarmildo, Norma Santos, Adão, Erick, Ivaldo Muchagata, Felipe Bodens, José

Edílson, Octávio Franco, Vandré, Fátima Grossí e a muitos outros. Peço desculpas se esqueci

de alguém, mas podem ter certeza, a gratidão existe.

Gostaria de agradecer também a toda equipe do LIMMP, cujo trabalho beneficia a todos os

membros.

Ao CNPq pelo apoio financeiro que me foi dado durante a realização do trabalho.

A alegria pode prescindir da razão, mas reflexão

sem compreensão é vazia. Existe satisfação em

meramente observar o mundo, mas essa

satisfação pode ser aprofundada quando a visão

da mente consegue penetrar na superfície das

coisas para enxergar as conexões existentes.

P.W. Atkins.

vii

BIOGRAFIA.

Djair dos Santos de Lima e Souza, filho de Luiz Damasceno de Lima e Souza e Ivonilde dos

Santos de Lima e Souza, nasceu em 07 de abril de 1977, na cidade de Natal no Rio Grande do

Norte.

Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do

Norte (UFRN: 1997 - 2001). Durante todo esse período, participou de atividades de pesquisa

como estagiário do Laboratório de Ecofisiologia de Peixes do Departamento de Fisiologia

(UFRN), concluindo bacharelado no Laboratório de Biologia pesqueira do Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN, com publicações acadêmicas em revistas e congressos.

No ano de 2003, concluiu o Mestrado em Bioquímica pelo Departamento de

Bioquímica da UFRN, com ênfase em química e função glicosidases de invertebrados

marinhos.

Atualmente cursa Doutorado em Biologia Molecular pelo Departamento de Biologia

Celular da Universidade de Brasília, desenvolvendo trabalhos nas áreas de química de

proteínas, química de metabólitos secundários em bebidas destiladas e plantas e genômica

funcional aplicada ao entendimento das interações entre plantas e patógenos.

As atividades acadêmicas estão sendo desenvolvidas no Laboratório de Interações

Moleculares de Plantas e Pragas (LIMMP) da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,

sob a coordenação da Doutora Maria Fátima Grossi de Sá.

viii

ÍNDICE

ÍNDICE ii

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS vi

INTRODUÇÃO GERAL 1

Nematóides – biologia, origem, evolução, filogenia 1

Nematóides: desenvolvimento como parasitas de plantas 3

Ciclo de vida dos fitonematóides endoparasitas sedentários obrigatórios 6

Nematóides de cisto (

Heterodera, Globodera) 7

Nematóides formadores de galhas (

Meloidogyne) 9

Aspectos particulares e econômicos do gênero Meloidogyne 10

Alternativas para o controle de M. incognita 13

O uso de plantas transgênicas no mundo –

perspectivas para a aplicação de plantas GMs

para o controle de fitonematóides. 16

OBJETIVO GERAL 18

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 18

CAPITULO 1. Análise dos produtos de expressão de plantas

infectadas com fitonematóides, visando à seleção de genes de

resistência ao nematóide de galhas M. incognita 19

RESUMO 19

ABSTRACT 24

INTRODUÇÃO 25

Resistência natural de plantas a nematóides 25

Mecanismos de defesa vegetal, considerações gerais 25

Prospecção de genes de resistência naturais (NEM-R) expressos

em plantas infectadas com nematóides 30

O papel da proteômica no entendimento das interações entre

nematóides e plantas 31

RESULTADOS E DISCUSSÃO – esse tópico

foi dividido em 3 artigos acompanhantes 33

ARTIGO 1. Identification of genes in cotton potentially involved

in resistance to Meloidogyne incognita) 33

ARTIGO 2. “Plant–pathogen interactions: what is proteomics

telling us? 53

ARTIGO 3. Rooteomics: The Challenge of Discovering Plant

Defense-Related Proteins in Roots 69

CAPÍTULO 2 – Validação funcional de genes potencialmente envolvidos

com o parasitismo de Meloidogyne incognita

RESUMO 78

ABSTRACT 79

INTRODUÇÃO 80

Potenciais genes de parasitismo de Meloidogyne incognita e outros

endoparasitas sedentários 80

A genômica funcional como ferramenta para o estudo das interações

entre plantas e fitonematóides

Genômica estrutural e funcional : considerações gerais 86

RNA de interferência (histórico) 88

Os microRNAs 90

Os siRNAs 94

Os piRNAs 96

O sistema de interferência por RNA em procariotos 98

Técnica de RNA de interferência aplicada ao controle de fitonematóides 100

MATERIAIS E MÉTODOS

Manutenção de populações de Meloidogyne incognita em tomateiros

Extração de Meloidogyne incognita de raízes de tomateiros infectadas 103

Extração de RNA total de fêmeas e síntese do cDNA 104

Subclonagem dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 em pGEM-T easy 104

Hibridização “in situ whole mounth” 105

Clonagem dos genes

2E07, 7E12 e 17H02 em vetores para expressão

de dsRNA e superexpressão de proteínas em fusão com GFP em plantas 106

Transformação de plantas de fumo 108

Desafio das plantas transgênicas expressando dsRNA 109

Avaliação da expressão das proteínas de secreção 2E07 e 7E12 em fusão com GFP 109

Inóculo e avaliação do perfil da infecção das plantas por

Meloidogyne incognita 109

Preparação das raízes para a microscopia 110

Imunodetecção da GFP nas plantas transgênicas 110

RESULTADOS 111

Clonagem dos potenciais genes de parasitismo de Meloidogyne incognita 111

Hibridização in situ 114

Transformação de plantas de fumo 115

Expressão ectópica dos genes de parasitismo 2E07, 7E12 116

Inóculo e avaliação do perfil da infecção das plantas por Meloidogine incognita 116

Avaliação microscópica das células gigantes 119

Expressão ectópica de dsRNA em plantas de fumo 122

DISCUSSÃO 124

102

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DO TRABALHO 132

REFERÊNCIAS 134

ANEXO

Trabalhos publicados durante o Doutorado 144

ÍNDICE DE FIGURAS

INTRODUÇÃO GERAL

Figura 1. As três possíveis relações entre vertebrados, artrópodes

e nematóides 2

Figura 2. Ciclo de vida dos fitonematóides endoparasitas sedentários 11

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Figura 1. Desenho esquemático demonstrando os dois principais modelos

de reconhecimento na interação planta patógeno 28

CAPÍTULO 2

INTRODUÇÃO

Figura 1. Desenho esquemático mostrando a estratificação de um nematóide

parasita de planta típico 84

Figura 2. Modelo de interação planta-nematóides para a formação do sítio de

alimentação dos fitonematóides 85

Figura 3. Esquema do mecanismo de silenciamento gênico via micro-RNAs

em animais 92

Figura 4. Sistema geral de microRNAs em plantas 93

Figura 5. Sistemas de silenciamento baseados em siRNAs 95

xii

Figure 6. Modelo Ping-pong para a produção de piRNAs 97

Figura 7. Sistema de silenciamento análogo ao RNAi de eucariotos,

proposto para procariotos 99

Figura 8. Desenho esquemático da passagem dos siRNAs da planta

hospedeira para o nematóide parasita 101

MATERIAL E MÉTODOS

Figura 1.

Desenho esquemático das construções para expressão de dsRNA e das

proteínas de secreção de M eloidogyne incognita, codificadas pelos genes 2E07,

7E12 e 17H02 (construções pk72E07, pk77E12 e pk717H02 em tabaco 108

RESULTADOS

Figura 1. Alinhamentos das sequencias AF531160 (2E07), AF531166 (7E12),

AY134437 (17H02) com os genes subclonados 113

Figura 2. Localização da expressão do gene 2E07 exclusivamente na glândula

esofagiana dorsal de Meloidogyne incognita, por hibridização in situ

“Whole mount” 114

Figura 3. Obtenção de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) por transformação

de discos foliares 115

Figura 4. Dot blot utilizando 400 g dos extratos protéicos de raízes das plantas

de Nicotiana tabacum não transformadas 116

Figura 5. Plantas de Nicotiana tabacum inoculadas com J2 de Meloidogyne

incognita e coletadas em diferentes pontos da curva de tempo exibindo galhas

de tamanhos diferentes 117

Figura 6. Avaliação do numero de galhas de plantas de Nicotiana tabacum

carreando os genes, 2E07 e 7E12 coletadas 08, 16 e 28 dias após a inoculação

com J2 de Meloidogyne incognita 118

Figura 7. Teste de avaliação da eclosão de juvenis de Meloidogyne incognita

de plantas transformadas e controle após 45 dias da inoculação com o nematóide 119

Figura 8. Análise histopatológica das raízes de Nicotiana tabacum 08 dias

xiii

após a inoculação com Meloidogyne incognita 120

Figura 9. Análise histopatológica das raízes de Nicotiana tabacum 08 dias

após a inoculação com

Meloidogyne incognita 121

Figura 10. Análise da resistência de plantas transgênicas expressando dsRNA

contra os transcritos dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 de Meloidogyne incognita 123

ÍNDICE DE TABELAS

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Lista de primers utilizados para a amplificação dos genes 2E07, 7E12

e 17H02 a partir de cDNAs extraídos de fêmeas de Meloidogyne

incognita

107

ABREVIATURAS

ADP – “adenosine diphosphate”, difosfato de adenosina

ATP – “adenosine triphosphate”, trifosfato de adenosina

Avr - “avirulence factor”, fator de avirulência

cDNA - DNA complementar

DNA - “deoxyribonucleic acid “, ácido desoxirribonucléico

2DE - “two-dimensional gel electrophoresis”, eletroforese bidimensional

dsRNA - “double strand RNA” RNA fita dupla

ESTs - “expressed sequence tags”, etiquetas de transcritos

GMs - geneticamente modificados

xiv

ISR – “induced systemic resistance” resistência sistêmica induzida

J2 - juvenil de segundo estádio

J1 - juvenil de primeiro estádio

miRNAs – “microRNAs”, microRNAs

MS - “mass spectrometry”,

espectrometria de massa

PAMPs/MAMPs - “pathogen-associated molecular patterns/microbe-associated

molecular patterns padrões moleculares associados à patógenos/padrões moleculares

associados a micróbios

PCR – “polymerase chain reaction” - reacção em cadeia pela polimerase

piRNAs - “Piwi-associated RNAs” RNAs associados a proteínas Piwi

PRs - “pathogenesis-related proteins”, proteínas relacionadas a patogênese

PRRs - “Pattern recognition receptors” ,receptores de reconhecimento padrão

RNA - “ribonucleic acid “, ácido ribonucléico

RNAi - “RNA interference” RNA de interferência

siRNA - “small interfering RNA” pequeno RNA interferente

RKN – “root-knot nematodes”, nematóides de galhas nas raízes

ROS – “reactive oxygen species”, espécies reativas de oxigênio

rRNA - “ribosomal RNA ” RNA ribossomal

NEM-R - “Nematode Resistance Gene” Gene de Resistência a Nematóides

LRR - “Leucine Rich Region” região rica em leucina

NBS - “Nucleotide Binding Site” Sítio de Ligação a Nucleotídeos

GFP - “green fluorescent protein” Proteína Verde Fluorescente

HR - “hypersensitive response” resposta de hipersensibilidade

SAR - “systemic acquired resistance” resistência sistêmica adquirida

INTRODUÇÃO GERAL

Nematóides – biologia, origem, evolução, filogenia.

Nematóides são os animais multicelulares mais abundantes no planeta terra

considerando o número de indivíduos. São encontrados em fontes termais, no solo, água

doce, água salgada, no gelo polar e em relações parasitárias (Coghlan 2005). São

caracterizados como animais triblásticos, protostômios, pseudocelomados. Possuem corpo

cilíndrico, alongado e não segmentado, exibindo simetria bilateral. O sistema digestivo é

completo e os sistemas respiratório e circulatório são ausentes. O sistema excretor dos

nematóides é composto por dois canais longitudinais (renetes-formato de H) e o sistema

nervoso é parcialmente centralizado em forma de anel nervoso ao redor da faringe. Muitas

espécies são microscópicas, embora uma espécie parasita da baleia cachalote possa atingir

13 metros de comprimento (Wilkpédia). Com relação aos parasitas de plantas, estes podem

variar de 0,25 mm a 12 mm, sendo que a maioria possui entre 1 e 2 mm (Maggenti 1981).

Estes fantásticos helmintos possuem uma longa história evolutiva originada em

meados do cambriano a cerca de 550 milhões de anos atrás, o que resultou na grande

diversidade atual que inclui microbívoros terrestres e marinhos, predadores da meiofauna,

herbívoros e parasitas de animais e plantas (Mitreva, Blaxter et al. 2005). Durante o

processo evolutivo, a adaptação destes organismos intersticiais aos mais diversos habitats

gerou uma profusão de formas, atingindo um número astronômico de espécies estimado

entre 100 000 a 100 000 000. Atualmente, o nosso conhecimento fica limitado a cerca de

25 000 espécies descritas, sendo que a maioria das formas ainda não descobertas são,

provavelmente, representantes da meiofauna bentônica marinha. Adicionalmente, devido

às grandes lacunas no registro fóssil, torna-se pouco provável acessar a ancestralidade dos

nematóides (Blaxter 2003; Meldal, Debenham et al. 2007). Atualmente, este problema de

ancestralidade gera longas discussões e as análises filogenéticas de organismos modelo,

baseadas em seqüências ortólogas e de RNA ribossomal 18S (rRNA), alinhadas por

ferramentas bioinformáticas, têm agrupado os nematóides de formas diferentes no reino

animal, levando ao surgimento de três hipóteses: a primeira afasta estes vermes

pseudocelomados dos vertebrados e artrópodes (hipótese celomada); a segunda agrupa os

nematóides com outros organismos que também sofrem mudas, os artrópodes (hipótese

ecdizoa) e finalmente a terceira que relaciona os nematóides mais proximamente dos

vertebrados (hipótese III Figura 1) (Aguinaldo, Turbeville et al. 1997; Blair, Ikeo et al.

2002; Dopazo and Dopazo 2005).

À ciência, portanto, resta a tarefa de analisar e compreender os diferentes grupos

taxonômicos hoje existentes, tendo em vista que a falha no registro fóssil já mencionada e

a relativa confusão gerada pelas diferentes perspectivas das análises computacionais (in

silico), não permitem que voltemos a fita da evolução para contar a história dos nematóides

na terra.

A filogenia molecular divide os nematóides em três classes maiores, as quais são

posteriormente separadas em cinco clados: Dorylaimia (clado I); Enoplia (clado II);

Chromadorea (clado III); Tylenchina (clado IV) e Rabditina (clado V). É importante

Celomada (hipótese I) Ecdizoa (hipótese II) (hipótese III)

Figura 1. As três possíveis relações entre vertebrados, artrópodes e nematóides

(Adaptado de Blair, Ikeo et al. 2002).

salientar que, as irradiações de nematóides de vida livre para parasitas de animais ou

plantas foram, provavelmente, eventos evolutivos separados e todos os maiores clados

definidos pela análise molecular possuem representantes parasitas de animais ou plantas

(Blaxter 2003; Parkinson, Mitreva et al. 2004; Mitreva, Blaxter et al. 2005).

Nematóides: desenvolvimento como parasitas de plantas.

O parasitismo geralmente indica uma associação onde o explorador danifica o

hospedeiro, mas não o mata, quando a morte do hospedeiro ocorre, o parasito é

considerado fracamente adaptado (Blaxter 2003). Na realidade, este tipo de relação,

obviamente afeta em grande ou em menor escala os processos fisiológicos normais do

hospedeiro e isso pode acarretar na diminuição da expectativa de vida do mesmo. Das

cerca de 25.000 espécies de nematóides já classificadas, grande parte é parasita (Blaxter

2003). Isso se deve ao fato de que muito provavelmente, a humanidade prioriza o estudo

das espécies que ameaçam a sua existência, ou de suas fontes de alimento como plantas e

animais.

Apesar disso, uma considerável parte dos estudos envolvendo nematóides é

concentrada no organismo modelo Caenohabidits elegans Maupas, 1900, e estes trabalhos

têm contribuído para os avanços em pesquisas biomédicas relacionadas com o mal de

Alzheimer, diabetes, obesidade, dentre outras (Bird, Blaxter et al. 2005). Estima-se que

membros do filo Nematoda habitam a terra a cerca de 1 bilhão de anos e este grupo gerou a

grande diversidade de formas atuais (Wang, Meyers et al. 1999). O parasitismo de plantas

por nematóides tornou-se em parte possível, após a origem das plantas terrestres em um

período entre 425 e 490 milhões de anos atrás. Baseado no registro fóssil pode-se afirmar

com certo grau de segurança que o parasitismo das plantas superiores pelos nematóides

teve o seu início a cerca de 150 milhões de anos atrás (Maggenti 1981).

Este fato indica que plantas e nematóides terrestres coexistem e co-evoluem há um

grande período de tempo. Apesar disso, o conhecimento sobre a origem e a distribuição das

especializações morfológicas, bioquímicas, genéticas e comportamentais, que

transformaram organismos de vida livre em parasitas altamente adaptadas a diversos

tecidos e espécies vegetais ainda é bastante limitado (Baldwin, Nadler et al. 2004). Como

já mencionado antes, os principais clados do filo nematoda possuem parasitas, mas vamos

enfatizar aqui apenas os grupos de parasitas de plantas. No clado I Dorylaimia, os parasitas

de plantas são representados pelas famílias Longidoridae e Trichodoridae. O parasitismo

de plantas nestas famílias é limitado a espécies ectoparasitas migratórias (Maggenti 1981).

Os membros da família Trichodoridae são importantes parasitas de muitas culturas

incluindo plantas ornamentais e muitas espécies dessa família são vetores de vírus de

plantas do gênero Tobravirus (Zheng, Jiang et al. 2004). Os tricodorídeos se concentram

nos ápices radiculares, onde se alimentam das células superficiais. Esta característica do

parasitismo inibe o crescimento das raízes por afetar as células meristemáticas, tornando as

raízes curtas e grossas também conhecidas como raízes anãs (Almeida and Decraemer

2005).

A família Longidoridae, representada principalmente pelos gêneros Longidorus e

Xiphinema, também são vetores de vírus de plantas. Durante o parasitismo, estes

nematóides inibem a elongação radicular, entretanto estimulam a proliferação celular

(Maggenti 1981). O clado Dorylamia contém microbívoros como Trichodorus (Blaxter

2003). No clado IV Tylenchina, estão os gêneros de nematóides endoparasitas sedentários

obrigatórios (

Meloidogyne, Heterodera, Globodera), estes são os mais danosos à

economia agrícola mundial (Blaxter 2003). A este clado também pertencem os nematóides

de lesões (Pratylenchus), que são endoparasitas migradores que seguem se alimentando no

córtex das raízes criando túneis que favorecem a entrada de patógenos secundários.

O surgimento, entretanto das diferentes espécies de nematóides de plantas nos

referidos clados, constituíram eventos isolados e geraram uma diversidade de formas

parasitas que se alimentam de todos os tecidos da planta hospedeira incluindo raiz, caule,

folhas, flores e sementes. Portanto, com ênfase no tipo da estratégia alimentar, podemos

classificar os nematóides em ectoparasitas migradores e sedentários, semi-endoparasitas

migradores e sedentários e endoparasitas migradores e sedentários (Lambert and Bekal

2002).

Os nematóides ectoparasitas como Xiphinema e Longidorus vivem na superfície

externa das plantas usando o estilete para se alimentar das células das raízes. Estes

parasitas podem possuir longos estiletes para alcançar as células mais profundas, sendo que

algumas espécies podem formar sítios de alimentação. O próximo grupo, de acordo com o

modo alimentar, consiste dos semi-endoparasitas. Eeste grupo inclui nematóides que

penetram parcialmente na raiz da planta hospedeira e formam um sítio de alimentação

permanente, onde se alimentam de forma sedentária. Um exemplo típico deste grupo é o

nematóide Rotylenchulus reniformis Linford and Oliveira, 1940, um importante patógeno

do algodão (Lambert and Bekal 2002; Agudelo, Robbins et al. 2005). Outros nematóides

da família Hapolaimidae são semi-endoparasitas migradores que não formam sítios de

alimentação. Finalmente, os endoparasitas sedentários constituem o grupo considerado

mais bem adaptado ao parasitismo de plantas e de difícil controle, por passar a maior parte

do ciclo de vida no interior das raízes onde induzem estruturas de alimentação

especializadas, originadas às vezes a partir de uma única célula (Meloidogyne) ou a partir

da fusão de mais de 200 células (Heterodera, Globodera) (Williamson and Gleason 2003).

A este grupo em especial será dado maior ênfase no tópico abaixo.

Ciclo de vida dos fitonematóides endoparasitas sedentários.

No presente tópico, vamos nos referir as principais características do ciclo de vida

dos fitonematóides dos gêneros

Heterodera, Globodera e Meloidogyne. Com base em

aspectos comuns aos gêneros, o desenvolvimento destes fitoparasitas altamente

especializados se inicia no ovo, onde a embriogênese é seguida de uma primeira muda,

quando o juvenil J1 se transforma em J2, que eclode do ovo e segue o gradiente de

exsudados da raíz hospedeira (Hirsch, Bauer et al. 2003). A interação destes exsudatos com

as moléculas presentes nas secreções e estruturas sensoriais dos nematóides ainda é pouco

conhecida, entretanto, sabe-se que a sinalização é recíproca e alguns fatores que já foram

identificados em plantas e nematóides confirmam esta afirmação. Dentre estes fatores

podemos destacar a proteína anfidial gp32, de Meloidogyne que é muito importante

durante o processo de orientação do nematóide no solo. Essa glicoproteína (Perry 1996).

Adicionalmente, muitos metabólitos secundários como o terpenoide glicinoeclepina

A, exsudados de raízes de plantas estão envolvidos na indução da eclosão em nematóides

de cisto (Masamune, Anetai et al. 1982). Quando encontra a raíz, o juvenil infectivo J2

inicia o processo de penetração na zona meristemática, logo abaixo da coifa, onde por meio

de choques mecânicos promovidos pelo estilete (órgão em forma de lança localisado na

cavidade oral e e que é a interface do trato digestivo do nematóide com o meio, aliados à

ação de enzimas digestivas lançadas na saliva do parasita (glucanases, pectato liases,

poligalacturonases), o nematóide consegue penetrar a raíz e iniciar a sua busca pela célula

no cilindro vascular que darão origem ao sítio de alimentação, passando, então, mais três

mudas até se tornar um parasita adulto. Após formado o sítio de alimentação, o nematóide

se alimenta de forma sedentária e reproduz, aumentando assim a infecção na planta

hospedeira (Niebel, Gheysen et al. 1994).

Uma vez formado o sítio de alimentação, o nematóide vai depender desta estrutura

para terminar o seu desenvolvimento e reprodução. Se o sítio se torna não funcional, o

nematóide morre, se o nematóide morre o sítio também se desfaz, indicando que este

último necessita de estímulos contínuos do nematóide para permanecer ativo (Goverse, de

Engler et al. 2000). Apesar dos aspectos comuns acima citados, os nematóides de cisto

(Globodera, Heterodera) e os formadores de galhas nas raízes (Meloidogyne) possuem

diferenças marcantes nos seus ciclos de vida e, por isso, serão detalhados separadamente

neste tópico.

Nematóides de cisto (Heterodera, Globodera).

Os nematóides de cisto possuem este nome uma vez que após a fecundação e a

produção de ovos, a fêmea morre e pode permanecer por vários anos no solo como um

cisto repleto de ovos. Quando o solo apresentar condições favoráveis, como o

desenvolvimento de plantas hospedeiras, os J2s dos nematóides de cisto, irão eclodir. Do

ovo emerge o juvenil infectivo J2 (ou, juvenil de segundo estádio), que penetra numa ponta

de raíz e o ciclo se repete. Quando penetram as raízes hospedeiras, os nematóides de cisto

iniciam a migração em direção ao cilindro vascular. O J2 migra inter e intracelularmente,

separando ou rompendo as células em seu caminho com o auxílio do estilete. Em seguida,

o nematóide seleciona uma célula que será o ponto de partida para a formação do sítio de

alimentação (Williamson and Gleason 2003).

Dependendo da espécie, os nematóides de cisto podem formar suas estruturas de

alimentação em diversos tecidos. As espécies Heterodera avenae Wollenweber, 1924,

nematóide da aveia e Heterodera schachtii Schmidt, 1871, parasita da beterraba,

selecionam como célula sincicial inicial, uma célula do periciclo ou procâmbio.

Adicionalmente,

Globodera Rostochiensis Wollenweber, 1923, o nematóide dourado da

batata escolhe uma célula totalmente diferenciada do córtex para iniciar a formação do

sincício.

Heterodera glycines Ichinohe, 1952, pode desenvolver um sítio a partir de células

do córtex, endoderme, periciclo ou floema. A partir destes dados pode-se concluir que o

sítio de alimentação de nematóides de cisto pode ser formado a partir de células já

diferenciadas e indiferenciadas (Goverse, de Engler et al. 2000). Quando o J2 seleciona

uma célula sincicial inicial, esta responde alargando plasmodesmas existentes com células

adjacentes. A seguir, os protoplastos das células vizinhas se unem após o surgimento de

aberturas na parede celular. Isso continua durante o desenvolvimento do sincicio que acaba

incorporando centenas de células.

Durante este processo também é observada atividade mitótica. Uma vez que o J2

inicia a formação do sincício, o nematóide então se desenvolve e após três mudas se torna

adulto. Os nematóides de cisto geralmente se reproduzem de forma sexuada e o macho

adulto abandona o interior da raíz para fecundar a fêmea que está parcialmente inserida na

raíz mas com a porção posterior voltada para o meio externo. Os juvenis que eclodem dos

ovos, migram no solo para infectar novas raízes (Niebel, Gheysen et al. 1994; Williamson

and Gleason 2003) (Figura 2A).

Nematóides formadores de galhas (Meloidogyne).

Ao contrário dos nematóides de cisto que não possuem um ponto preferencial para a

penetração, os J2s dos nematóides de galhas penetram na região adjacente a ponta da raíz e

migram até o ápice radicular onde a ausência de endoderme diferenciada permite que eles

entrem no cilindro vascular. Em seguida, os J2s migram intercelularmente atravessando a

lamela media com o auxilio do estilete e de enzimas digestivas da saliva (Niebel, Gheysen

et al. 1994). Assim como os nematóides de cisto, os nematóides de galhas também

escolhem uma célula em especial para iniciar o sítio de alimentação. Mais precisamente,

escolhem de 2-12 células do parênquima do xilema na zona de diferenciação da raíz.

Acredita-se que a escolha desta célula pelo nematóide possa estar relacionada com o

estatus de diferenciação ou por sinais químicos emitidos pela célula e captados pelo

parasita (Goverse, de Engler et al. 2000).

Ao contrário dos nematóides de cisto, os nematóides de galhas induzem e se

alimentam de vários sítios de alimentação e cada sítio é formado por uma única célula (a

célula gigante). O primeiro sinal da gênese das células gigantes em volta da cabeça do

parasito é o aparecimento de várias células binucleadas. Mitoses adicionais sem citocinese

geram células multinucleadas, enquanto as células circunvizinhas do córtex e periciclo se

dividem dando origem a galha na raiz. Outras modificações que ocorrem para a formação

das células de alimentação incluem invaginação na membrana plasmática. Os nematóides

ingerem o citoplasma destes sítios de alimentação e após três mudas se transformam em

fêmeas produtoras de ovos. Estas por sua vez, permanecem no interior das raízes e

depositam os ovos envoltos por uma matriz gelatinosa o que resulta em uma massa de ovos

na superfície externa da raiz. Quando os J2s eclodem no solo, eles se movimentam em

direção ao ponto de entrada novamente e o ciclo se repete (Figura 2B) (Niebel, Gheysen et

al. 1994; Goverse, de Engler et al. 2000; Davis and Mitchum 2005).

Como discutido acima, os sítios de alimentação das principais espécies de

fitonematóides são iniciados a partir de células específicas em condições naturais. Por

outro lado, em condições experimentais tanto os nematóides de cisto quanto os formadores

de galhas podem formar sítios em hipocótilos e folhas (Goverse, de Engler et al. 2000).

Este fato indica que existem outros fatores, talvez comportamentais, envolvidos na escolha

da célula que dará início os sincícios e as células gigantes.

Aspectos particulares e econômicos do gênero Meloidogyne.

Os nematóides do gênero Meloidogyne são os fitonematóides mais importantes para a

agricultura mundial. Estes patógenos radiculares estão adaptados ao parasitismo de quase

todas as culturas produtoras de alimentos e fibras no mundo, infectando mais de 1700

hospedeiros. O hábito endoparasita sedentário aliado a partenogênese (apomixia) da

maioria das espécies resulta em uma maior adaptação em relação a outros fitonematóides,

considerando que estes organismos estão protegidos no interior das raízes durante a maior

parte do ciclo de vida e, adicionalmente, a partenogênese permite que a população de

parasitas em uma raíz aumente consideravelmete em um curto intervalo de tempo (Lilley,

Devlin et al. 1999; Trudgill and Blok 2001; Huang, Dong et al. 2006).

Figura 2. Ciclo de vida dos nematóides endoparasitas sedentários (A) ciclo de vida

dos nematóides de cisto. (B) ciclo de vida dos nematóides de galhas.

www.apsnet.org/.../SoyCystNema/discycle.htm.

O juvenil J2O juvenil J2

(B)

(A)

O juvenil J2O juvenil J2

(B)

(A)

(A)(A)

(B)

(A)(A)

(B)

Cerca de 92 espécies de Meloidogyne são atualmente válidas no mundo, sendo que

metade destas espécies foi descoberta nas duas últimas décadas (De Waele and Elsen

2007). Em uma perspectiva mundial, os fitonematóides em geral são responsáveis por

perdas agrícolas que chegam a 12,3% (Sasser and Freckman 1986), o que numa estimativa

mais recente pode ultrapassar 125 bilhões de dólares anuais (Chitwood 2002).

A maioria destes danos é atribuida aos nematóides de galhas, sendo que as espécies

M. incognita, Meloidogyne javanica Treub, 1885, Meloidogyne arenaria Neal, 1889 e

Meloidogyne hapla Chitwood, 1949, recebem maior destaque pois contribuem para 95%

das perdas causadas por todos os nematóides formadores de galhas e M. incognita, por ser

o mais importante destes patógenos, atualmente merece um grande destaque (Huang, Allen

et al. 2006). Esta espécie é a de mais ampla distribuição, sendo encontrada em todas as

áreas temperadas e tropicais, até o limite mínimo de temperatura > 3º C. Só no México,

M.incognita é responsável por mais de 20% das perdas horticulturais (Trudgill and Blok

2001).

Atualmente mais de 100.000 ESTs de fitonematóides já estão disponíveis para

estudos no Genome Sequence Center (http//www.nematode.net), incluindo H. glycines,

Pratylenchus penetrans, Globodera rostochiensis, M. arenaria, M. hapla e M. javanica. A

espécie que possui o maior número de ESTs seqüenciadas é

M. incognita (19,000), fato

que abre amplas possibilidades para o controle deste nematóide, com base no bloqueio da

expressão destes genes ou das proteínas por eles codificadas. Apesar deste grande número

de seqüências, maior ênfase tem sido dada aos potenciais genes de parasitismo, expressos

nas glândulas esofagianas e que codificam para proteínas de secreção que constituem o

parasitoma, ou seja, o conjunto de proteínas produzidas pelos fitonematóides e lançadas

nos tecidos das plantas a partir da saliva dos parasitas durante a penetração, migração,

estabelecimento e manutenção das células gigantes (Davis, Hussey et al. 2004; Vanholme,

De Meutter et al. 2004).

Alternativas para o controle de M. incognita.

Atualmente, M. incognita é o nematóide patogênico mais importante para

agricultura mundial. A preocupação com o controle destes organismos é refletida inclusive

nos artigos publicados para esta espécie, que são consideravelmente mais numerosos do

que os publicados para outras espécies de fitonematóides, exemplificando o nematóide de

cisto da soja

H. glycines (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez). O crescimento das

pesquisas para o controle de fitonematóides é compreensível, tendo em vista que a

população humana mais que dobrou nos últimos 40 anos, e o aumento na produção de

alimentos aliada à necessidade da diminuição das perdas agrícolas causadas por pragas e

patógenos são tarefas urgentes para garantir o alimento para as gerações futuras (De Waele

and Elsen 2007).

Hoje em dia o controle de fitonematóides no mundo é feito por métodos

tradicionais como a rotação de culturas, o uso de variedades resistentes e o uso de

nematicidas sintéticos. A rotação de culturas significa alternar culturas naturalmente

hospedeiras dos fitonematóides com plantas não hospedeiras. Este método é importante

para evitar que as populações de fitonematóides atinjam níveis econômicos severos. Um

exemplo consiste no uso da Crotalaria no lugar de plantas hospedeiras de espécies de

Meloidogyne (Wang, Mitchum et al. 2005).

A maior limitação desta técnica reside no fato de que as espécies de Meloidogyne,

principalmente o M. incognita, são polífagas, tendo como hospedeiros um grande número

de culturas (Trudgill and Blok 2001; Huang, Dong et al. 2006). O uso de variedades

resistentes, também é uma alternativa bastante utilizada no controle de fitonematóides,

entretanto esta estratégia também possui limitações que incluem a resistência restrita a

algumas espécies ou raças de fitonematóides. Por serem fontes de resistência naturais, o

estudo desses genótipos e de seus genes de resistência (genes R ou Nem-R) é bastante atual

(Williamson and Kumar 2006). Como exemplos, podemos citar o gene

Mi1 de tomate, que

confere resistência específica aos nematóides

M. incognita, M. javanica e M. arenaria

(Milligan, Bodeau et al. 1998; Vos, Simons et al. 1998; Seah, Yaghoobi et al. 2004); Gpa2,

que confere resistência específica a populações de G. pallida em batata (Van der Vossen,

Van der Voort et al. 2000) e o gene Hspro-1 que cofere resistência a H. schachtii (Cai,

Kleine et al. 1997; Thurau, Kifle et al. 2003).

O uso de nematicidas sintéticos, por sua vez, constitui uma das estratégias mais

utilizadas no mundo atualmente. Por definição, nematicidas são compostos químicos que

matam nematóides. Existem duas categorias de nematicidas geralmente utilizados, os

fumigantes como brometo de metila, cloropicrina e 1,3 dicloropenos. Estes compostos são

produzidos como líquidos que vaporizam rapidamente e se movem nos espaços de ar no

interior do solo.

Os nematicidas não fumigantes são classificados como nematicidas de contato que

atingem os nematóides no solo e os nematicidas sistêmicos que são absorvidos pelas

plantas e passam para os nematóides durante a sua alimentação. A limitação ao uso de

nematicidas vem crescendo cada vez mais devido aos efeitos tóxicos causados pelos

mesmos ao ambiente e aos seres humanos (McBride, Mikkelsen et al. 2000). Para

substituir futuramente estes compostos, alternativas como o uso de nematicidas naturais, o

controle biológico e a introdução de resistência em plantas por transgenia estão sendo

estudados. Os nematicidas naturais ou fitocompostos são metabólitos secundários

produzidos naturalmente pelas plantas e incluem grandes grupos de terpenóides,

compostos fenólicos e compostos nitrogenados. Estas moléculas muitas vezes presentes em

plantas antagonistas constituem uma excelente alternativa ao uso de nematicidas sintéticos

(Chitwood 2002). Uma alternativa para o combate aos fitonematóides é o uso de

formulados de microrganismos (controle biológico) como bactérias ou fungos nematófagos

(Tian, Yang et al. 2007).

Finalmente, uma estratégia também promissora para o controle de fitonematóides

consiste na introdução de resistência em plantas agronomicamente importantes via

transgenia. Este método permite uma seleção mais específica de alvos no nematóide

levando ao controle eficiente desses parasitos, pela interferência em seus sistemas:

digestivo, nervoso ou reprodutor através do uso de inibidores de enzimas digestivas,

anticorpos, toxinas e outras biomoléculas que atuem em alguma etapa do ciclo de vida do

parasito. Embora as plantas transgênicas resistentes a nematóides ainda não tenham

chegado ao mercado, muitos trabalhos já foram desenvolvidos e mostram a eficiência do

método. Neste caso, a expressão do inibidor de proteinase cisteínica, a orizocistatina

conferiu a plantas de Arabidopsis resistência contra M. incognita. Por outro lado a

expressão de um inibidor de proteinase serínica, a esporamina, levou a resistência a H.

schachtii

em beterraba (Urwin, Lilley et al. 1997; Cai, Thurau et al. 2003). A produção de

um neurodepressor, o ácido gama aminobutílico (GABA), em plantas de tabaco conferiu

resistência ao nematóide das galhas

M. incognita (McLean, Yevtushenko et al. 2003).

Adicionalmente, (Li, Wei et al. 2007) demonstraram, pela primeira vez, utilizando plantas

transgênicas de tomate, que a toxina Cry6A de Bt conferiu resistência a M. incognita.

Apesar do efeito de toxinas Cry ter sido relacionado na maioria das vezes a insetos, estudos

prévios já demonstraram a ação tóxica de proteínas da família Cry5 e Cry6 contra

nematóides (Wei, Hale et al. 2003).

O uso de plantas transgênicas no mundo – perspectivas para a aplicação de plantas

GMs para o controle de fitonematóides.

Apesar das restrições ao seu uso em muitos lugares do mundo, as lavouras GMs são uma

realidade, e, após 13 anos de cultivo comercial, são cada vez mais adotadas por muitos

países. Essa adoção se deve, principalmente, ao retorno financeiro e ao ganho ambiental

que resulta desse plantio. O aumento na renda dos agricultores pobres, também reflete a

importância das lavouras GMs para aliviar a situação dos que sofrem com fome no mundo

(James, 2007). Entre os anos de 1970 e 2006, a população mundial aumentou, de, 3 bilhões

para 6,5 bilhões de habitantes, o que significa, um considerável aumento no números de

famintos (De Waele and Elsen, 2007).

A biotecnologia agrícola é uma importante ferramenta para aumentar a

disponibilidade de alimentos em regiões, onde o aumento crescente da população humana

torna o alimento um fator limitante. Além disso, o aumento na produção de vegetais

produtores de fibras, como o algodão e dos usados para a extração de biocombustíveis

(cana de açúcar, milho) é bastante importante para nações emergentes como o Brasil. O

Brasil hoje é o terceiro país em área plantada de lavouras GMs (15 milhões de hectares),

perdendo apenas para os Estados Unidos e Argentina, respectivamente. Podemos citar

vários exemplos dos benefícios da utilização de lavouras GMs. O primeiro ponto consiste

na possibilidade de se aumentar à produtividade e a produção de certas cultivares de

plantas (James, 2007). Em segundo lugar, a criação de plantas resistentes a estresses

abióticos como a seca, o estress salino e o estress de congelamento (Gao, Zhang et al,

2008; Xue, Peng et al, 2009), pode ser muito importante em regiões com condições

climáticas, ou de solo, inadequadas para a agricultura.

Adicionalmente, o ganho ambiental pela diminuição com o uso de pesticidas nas

lavouras GMs pode ser representado pelo Coeficiente de Impacto Ambiental (EIQ), uma

medida composta baseada nos diversos fatores que contribuem ao impacto ambiental

líquido de um ingrediente ativo individual. Esse coeficiente indicou uma redução de 15,5%

no impacto ambiental, que correspondeu a uma diminuição de 289.000 toneladas métricas

de ingrediente ativo, de 1996 a 2006, devido ao plantio de plantas transgênicas (James,

2007).

Atualmente, a maioria das áreas plantadas com plantas GMs no mundo, são

ocupadas por plantas que carregam genes codantes para toxinas cry, de Bacillus

thuringiensis (Bt). Quando ingeridas pelo inseto alvo, as toxinas cry se inserem na

membrana das células epiteliais do intestino, criando poros, e provocando um desbalanço

eletrolítico que leva o inseto a morte (Carlini and Grossi de Sá, 2002; Roh, Choi et al.

2007). Dos US$6,9 bilhões gerados com o mercado global de produtos GM, em 2007,

US$3,2 bilhões foram oriundos do milho Bt, US$2,6 bilhões de soja Bt, US$0,9 bilhões de

algodão Bt e US$0,2 bilhões de canola Bt (James, 2007). Os lucros gerados com as plantas

Bt reforçam o potencial de mercado das plantas GMs para o presente e futuro. Nesse

sentido, muitos trabalhos foram desenvolvidos até o momento, com o objetivo de criar

plantas transgênicas com potencial agrícola. E, em adição as plantas Bt resistentes a insetos

e a outras comercializadas atualmente, como as resistentes a herbicidas, já foram criadas

plantas que exibem tolerância a estresses abióticos (Gao, Zhang et al, 2008) e outras

resistentes a diferentes patógenos como bactérias (Huang, Liu et al. 2007), fungos (Shah,

Raghupathy et al, 2009) e nematóides (Huang, Dong et al. 2006). Além dessas, outras

pesquisas estão sendo desenvolvidas em vários laboratórios do mundo, com o intuito de

gerar plantas GMs candidatas ao uso comercial. Para o controle de fitonematóides, que são

o foco desse estudo, já foram criadas plantas transgênicas por meio de diferentes

estratégias. Seja para a expressão de inibidores de proteinases de nematóides (Urwin,

Lilley et al. 1997; Cai, Thurau et al. 2003), toxinas de Bt (Li, Wei et al. 2007) e RNA

interferente (Huang, Dong et al. 2006). O ataque ao patógeno, utilizando essas diferentes

estratégias demonstra um grande potencial para o desenvolvimento da agricultura pelo uso

de plantas transgênicas.

OBJETIVO GERAL.

- Gerar conhecimento científico para o combate ao nematóide das galhas M.

incognita.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

- Avaliar o perfil da expressão gênica em raízes de algodão (Gossypium hirsutum L.)

IAC 98/708 susceptível e IAC 96/414 resistente ao nematóide de galhas, infectadas

M. incognita raça 3, visando identificar genes potencialmente envolvidos com a

resistência a esse patógeno.

- Avaliar a importância de três novos genes expressos exclusivamente em glândula

dorsal de

M. incognita (AY134437 – 17H02 ; AF531166 – 7E12 ; AF531160 – 2E07)

e codantes de proteínas com estruturas primárias desconhecidas, mas potencialmente

envolvidas com o parasitismo desse a partir da expressão ectópica dos referidos genes

e de seus dsRNAs correspondentes em plantas de tabaco.

CAPÍTULO 1

A minha participação nesse trabalho consistiu na ajuda na extração de material

RNA, análise das seqüências da biblioteca e redação do artigo.

Análise dos produtos de expressão de plantas infectadas com fitonematóides, visando

à seleção de genes de resistência ao nematóide de galhas

M. incognita.

RESUMO

A cultura do algodão (Gossypium hirsutum) sofre perdas significativas na sua

produção, devido ao ataque de fitonematóides, especialmente o nematóide de galhas M.

incognita. Visando estudar os mecanismos envolvidos na resistência, foram construídas

bibliotecas de ESTs de raiz de algodão resistente e susceptível a esse nematóide. As

variedades de algodão resistente (IAC 96/414) e susceptível (IAC 98/708), cedidas pelo

Institituto Agronômico de Campinas em São Paulo, foram desafiadas com o nematóide de

galhas com o objetivo de identificar genes expressos diferencialmente nas plantas

resistente e susceptível, durante a presença do nematóide. Cada planta foi inoculada com

1.200 J2s de M. incognita, depositados homogêneamente com a pipeta ao redor da base da

raiz. As raízes das plantas de cada variedade foram coletadas após 2, 4 e 18 dias após a

inoculação. Essas raízes foram acondicionadas imediatamente em nitrogênio líquido e

mantidas em freezer a -80 ºC até o momento da extração dos RNAs. Para a construção das

bibliotecas, foi determinada a reunião dos RNAs extraídos das plantas coletadas com 2, 4,

18 dias. Ambas as bibliotecas foram desenvolvidas com o kit "Superscript Plasmid System

with Gateway Technology for cDNAs synthesis and Cloning". Os cDNAs foram então

seqüênciados, e a montagem das seqüências das duas bibliotecas foi realizada em conjunto,

de forma a se buscar genes que estivessem sendo diferencialmente expressos. Os dados

gerados resultaram em 2.262 seqüências para as bibliotecas de raíz de algodão resistente e

susceptível. A montagem resultou em 1.827 grupos, sendo 234 contigs e 1.593 singlets. No

presente estudo, foram identificados vários genes que podem estar associados com defesa a

nematóides, outros patógenos, além de proteínas envolvidas com resposta a estresse

abiótico. Esse efeito pode ser produzido pela ação do nematóide que ativa rotas de defesa

no hospedeiro que levam à expressão de diversos genes de resistência (Giebel 1976;

Potenza, Thomas et al. 2001; Johnk, Hietala et al. 2005). A ativação de rotas que levam à

resistência do algodão ao nematóide de galhas pode ser sinalizada pela expressão de genes

relacionados à resposta de hipersensibilidade (HR) no hospedeiro. Dentre essess genes,

destacaram-se a chaperona Hsp90 (FL684416), superóxido dismutase (FL684415),

proteína indutora de resposta de hipersensibilidade (FL684432), proteina com domínio

LRR (FL684418). Esses genes já foram relacionados com o mecanismo de resistência a

patógenos, que leva a ativação da resposta de hipersensibilidade nas plantas atacadas. As

respectivas atividades das proteínas codificadas por esses genes serão comentadas a seguir.

No início, quando a célula vegetal entra em contato com moléculas elicitoras (Avr)

produzidas pelo patógeno ou pela ação do mesmo, ocorre a ativação de enzimas como

NADPH-oxidases que promovem a transformação do oxigênio (O

) em íons superóxido

(O-) uma espécie reativa de oxigênio, em seguida ocorre o formação e o acúmulo de

peróxido de hidrogênio (H

) por dismutação espontânea do O

a H

ou quando essa

dismutação é catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD). Essa enzima promove a

produção do H

numa velocidade 10

vezes maior que na reação espontânea. Na

presença de certos íons, o H

pode ser convertido em espécies de oxigênio ainda mais

reativas (ROS), que se ligam a proteínas, inibem a ação de enzimas e causam danos ao

DNA. Exemplo disso é a conversão do H

, na presença de Fe

, para OH

, altamente

tóxico. Apesar da morte celular que ocorre nas imediações das injúrias, o peróxido de

hidrogênio tem um importante papel na ativação de genes de resistência vegetal que

inibem a propagação na planta, da necrose provocada pela resposta de hipersensibilidade.

Em seguida, à ativação dos genes de resistência ocorre a resposta sistêmica adquirida

(SAR), onde várias outras microexplosões oxidativas ocorrem longe do sítio de infecção

pelo patógeno, levando à propagação da expressão dos genes de resistência (Resende,

Salgado et al., 2003). Relatos também indicam que a morte celular não depende apenas do

peróxido de hidrogênio, mas sim da sua interação sinergistica com o oxido nítrico

(Iakimova, Michalczuk et al., 2005). Sendo assim, a enzima superóxido dismutase,

identificada no presente estudo, pode estar relacionada tanto com a produção da HR em

combate ao patógeno, quanto à ativação de outros genes que podem ou não estar

associados à resistência a M. incognita no algodão. A quinase dependente de cálcio

(FL684434) é também relatada como proteína de defesa de plantas contra patógenos, pois

quando ocorre um influxo de cálcio na célula vegetal, provocado por um stress, as quinases

dependentes de cálcio podem iniciar uma cascata de transdução de sinal que levam a

resposta de hipersensibilidade (Romeis, Piedras et al. 2000). A chaperona Hsp90 participa

no dobramento de proteínas R, que atuam na defesa em resposta ao ataque de patógenos

(De la Fuente van Bentem, Vossen et al. 2005). Como exemplo, a Hsp90 é essencial na

resistência do tomate a M. incognita, por interação com a proteína codificada pelo gene

Mi-1 (Bhattarai, Li et al. 2007). Já é sabido que os domínios LRR são freqüentes em

proteínas de sinalização que atuam em mecanismos de defesa de plantas (Diévart and

Clark 2004). É comum para muitos genes de resistência a nematóides o aparecimento de

domínios LRR que são associados com a interação proteína proteína para o

reconhecimento de moléculas Avr ou de membros da cascata de transdução de sinal que

leva à resistência (Williamson and Kumar, 2006; Mehta, Magalhães et al., 2008; Fuller,

Lilley et al., 2008). A proteína indutora de resposta de resposta de hipersensibilidade atua

no reconhecimento do patógeno que, por fim, irá disparar o mecanismo da resposta de

hipersensibilidade na planta (Rostoks, Schmierer et al. 2003). Outros genes que foram

expressos na biblioteca de algodão resistente podem estar ligados à resistência a outros

stresses bióticos ou abióticos, e não necessariamente estão relacionados com a resistência à

nematóides. Como exemplo, podemos citar os polipeptídios reversivelmente glicosilados

(FL684417) cuja função não é bem conhecida. Entretanto, um peptídeo dessa família,

chamado de S1UPRG1 encontrado em plantas de tomate, interage com a proteína V1 do

capsídio do geminivirus TLCV, podendo estar relacionada com uma nova via onde o

polipeptídio do hospedeiro interage com a proteína V1, levando a uma interação

compatível entre a planta e o patógeno (Selth, Dogra et al. 2006). As proteínas com

domínios de dedos de zinco, como a seqüência encontrada na biblioteca do algodão

resistente (FL684423), são fatores de transcrição que atuam na via de resposta a patógenos

em diversas plantas (Park, Kim et al. 2007). A expressão do gene para a isoflavorna

redutase (FL684412), pode estar relacionada com a síntese de metabólitos secundários em

resposta ao patógeno. Resultados similares de expressão foram obtidos para uma cultivar

resistente de alfafa (Potenza, Thomas et al. 2001). Com relação à peroxiredoxina

(FL684425) esta já é uma proteína conhecida, que atua na defesa contra patógenos

(Rouhier, Gelhaye et al. 2004). A proteína de resistência Brassinazole (FL684426)

participa da síntese do hormônio brassinolídeo, que participa na indução da resistência em

plantas (Nakashita, Yasuda et al. 2003). A proteína Skp1 (FL684427) é um componente

do sistema de ubiquitina ligases que mediam a degradação de proteínas pela unidade 26S

do proteossomo. A participação dessa proteína em processos de resistência de plantas já foi

documentada (Kottapalli, Sarla et al. 2006).

A proteína conhecida como ciclofilina (FL684428) participa no processo de

sinalização para a ativação das defesas de

Arabidopsis contra Pseudomonas syringae

(Coaker, Falick et al. 2005). Além disso, uma ciclofilina isolada de repolho chines

Brassica campestris demonstrou efeito anti-fúngico contra diversos patógenos, mas

principalmente na inibição do crescimento de Botrytis cinerea (Lee, Park et al. 2007). As

proteínas V-SNARE (FL684429) são proteínas de membranas que participam no processo

de liberação extracelular por exocitose, de proteínas relacionadas com a resistência das

plantas (Robatzek 2007). Quitinases são enzimas que atuam na hidrólise da quitina e

podem estar relacionadas em processos de resistência a patógenos quitinosos, em uma série

de organismos, ou no metabolismo da quitina no próprio organismo. A biblioteca do

algodão resistente apresentou uma quitinase de classe IV (FL684430). Essas enzimas

pertencem ao grupo das PR3, que são proteínas relacionadas à patogênese em plantas

(Kasprzewska 2003). O fator despolimerizante de actina (FL684431) pode estar

relacionado com o mecanismo de defesa do hospedeiro contra fungos fitopatogênicos. Esse

efeito foi observado para o fator despolimerizante de actina encontrado em cevada (Miklis,

Consonni et al. 2007). As enzimas do tipo endo-1,3-D-glucosidases já foram relatadas

como proteínas de defesa vegetal no controle de fungos (Okinaka, Mimori et al. 1995) e de

fitonematóides (Giebel 1976). A proteína dirigente de expressão já foi relacionada com

mecanismos de defesa vegetal em resposta a injúrias (Ralph, Park et al. 2006). Cinnamoyl-

CoA redutase (FL684435) foi apontada como uma proteína de defesa via sinalização em

arroz (Kawasaki, Koita et al. 2006). Em duas recentes revisões, nos indentificamos

diversas proteínas produzidas diferencialmente em plantas infectadas por nematóides

(Mehta, Brasileiro et al., 2008; Mehta, Magalhães et al., 2008). As seqüências

correspondentes a genes com potencial de expressão diferencial estão sendo analisadas e

serão amplificadas para utilização em experimentos de Northern blotting, a fim de

confirmar seus níveis de expressão experimentalmente. Posteriormente, essas seqüências

poderão ser utilizadas na transformação de plantas com o intuito de produzir variedades de

interesse agronômico resistentes ao nematóide.

ABSTRACT

Meloidogyne incognita is a destructive nematode responsible for heavy damage to

economically important plants, including cotton (Gossypium hirsutum) the most important

fiber crop worldwide. The control of this pathogen is heavily centered on chemical

nematicides, which are toxic to humans and the environment, harmful to non-target

organisms and expensive. Alternatively, resistant varieties of cotton obtained from

conventional breeding programs represent an attractive strategy for the control of M.

incognita. In this context, the aim of the work reported here was to analyze the gene

expression profile of cotton plants infected with M. incognita in order to understand the

mechanisms involved with resistance. EST libraries of cotton genotypes resistant to or

susceptible to infection by M. incognita were constructed and sequenced, generating 2,262

sequences that were assembled into 1,827 groups (234 contigs and 1,593 singlets). The

results showed genes differentially expressed in both resistant and susceptible cotton. After

manual annotation, 20 genes were found to be expressed exclusively in the resistant cotton

genotype, with functions related to pathogen recognition (1), signal transduction (7),

defense mechanisms (10) and protein transport and activation (2). The functions of these

genes acting coordinately could indicate the existence of a cotton defense pathway against

nematode attack. These data show the complexity in plant defense responses, and indicate

some candidate genes for validation and use through transformation in other agronomically

important plants.

INTRODUÇÃO

Resistência natural de plantas a nematóides.

Mecanismos de defesa vegetal, considerações gerais.

Para se protegerem da ação de pragas e patógenos as plantas possuem uma série de

mecanismos de defesa, que incluem desde barreiras físicas e químicas pré-formadas como

a parede celular e os metabólitos secundários tóxicos e a expressão de proteínas de defesa

em resposta a pragas e patógenos. Adicionalmente, as plantas também podem responder ao

ataque de patógenos com um tipo de morte celular programada chamada de resposta de

hipersensibilidade (HR). Comparadas aos animais, as plantas possuem as desvantagem de

não produzirem anticorpos circulantes ou linhagens de células imunes dedicadas, por isso

cada célula vegetal deve conhecer autonomamente os diversos patógenos e lançar as

respostas de defesa adequadas (McDowell and Simon, 2008).

Os mecanismos moleculares de defesa vegetal são divididos em dois tipos: a

imunidade inata ou resistência de não hospedeiro e a resistência de hospedeiro. A

imunidade inata permite que as plantas se defendam contra diversas espécies de patógenos

ou contra todos os isolados de uma espécie de patógeno (Iriti and Faoro, 2007). Nesse

caso, o mecanismo de reconhecimento do patógeno pela planta envolve receptores que

reconhecem padrões moleculares comuns a diversos microorganismos, chamados de

padrões moleculares associados à patógenos/padrões moleculares associados a micróbios

(PAMPs/MAMPs) (He, Shan et al., 2007).

Esses padrões incluem flagelina bacteriana, fragmentos de quitina da parede celular

de fungos, lipopolissacarídeos, peptidoglicanos além de uma série de proteínas comuns a

diversos microorganismos patogênicos ou não patogênicos (Nurnberger and Lipka, 2005).

Os PAMPs são geralmente reconhecidos por receptores de reconhecimento padrão

expressos na superfície das células da planta (PRRs), que na realidade são similares aos

produtos dos genes R das plantas. A interação entre PAMPs e PRRs dispara as vias de

sinalização para os mecanismos de defesa vegetal impedindo o progresso do patógeno

(Jones and Dangl, 2006; He, Shan et al., 2007).

Quando os patógenos conseguem superar a resistência de não hospedeiro, a planta

se torna susceptível, se torna hospedeira. Entretanto, com o tempo, a planta hospedeira

pode co-evoluir com o patógeno passando a produzir receptores que reconhecem

moléculas efetoras liberadas pelos patógenos (produtos dos genes Avr), ou então, o

patógeno pode passar a produzir moléculas que serão então reconhecidas por receptores já

existentes nas plantas (produtos dos genes R) (Dangl and McDowell, 2006). Sendo assim, a

planta se torna resistente a um determinado isolado ou a vários isolados da espécie do

patógeno. Essa hipótese ficou conhecida como a hipótese da interação gene a gene,

proposta por Flor (1971) sugerindo que o sucesso da resistência hospedeira depende da

interação de dois fatores, um do patógeno, que é o produto do gene de avirulência (Avr) e

outro da planta, o produto do gene de resistência (R).

O mecanismo de interação gene a gene foi demonstrado em um trabalho realizado

com genótipos de arroz resistentes ao fungo Magnaporthe grisea. O gene Pi-ta do arroz

codifica para uma proteína de resistência R com domínios NBS-LRR, chamada LDR. No

referido trabalho, foi demonstrado que a proteína de avirulência AVR-Pita do fungo M.

grisea, quando expressada em sua forma ativa dentro das células vegetais, induz a

resistência na planta ao fungo. No mesmo trabalho foi demonstrado, por experimentos in

vitro que a proteína LDR, se liga especificamente a proteína AVR-Pita. Adicionalmente

deleções aminoacídicas tanto na proteína LDR, quando na AVR-Pita, resultaram na perda

de resistência na planta, indicando que a resistência do arroz, ao fungo M. grisea é

dependente da ligação direta entre a proteína de resistência LDR e a proteína de avirulência

AVR-Pita, fatos que suportam a hipótese da interação gene a gene (Jia, McAdams et al,

2000). Por outro lado, os produtos dos genes de avirulência dos patógenos (Avr) nem

sempre interagem diretamente com a proteína R, mas sim com outro receptor da planta,

sensibilizando assim a proteína R indiretamente e ativando os mecanismos de resistência.

Essa hipótese ficou conhecida como a hipótese guarda. Os elementos desse mecanismo

incluem uma proteína endógena da planta hospedeira, denominada de “guardee”, que

interage ou é modificada pelo efetor produzido pelo patógeno (Avr). Essa interação é

percebida quimicamente pela proteína de resistência R, nesse caso chamada de proteída

guarda, a qual ativa a resistência do hospedeiro (Dangl and McDowell, 2006).

O exemplo mais bem estudado que demonstra a hipótese guarda, diz respeito à

interação entre os efetores AvrRpm1 e AvrB de Pseudomonas syrngae com as proteínas

RIN4 e RPM1 de Arabidopsis thaliana. Quando liberadas nas células da planta, AvrRpm1

e AvrB fosforilam a proteína RIN4 e em uma planta susceptível, que não produz a proteína

de resistência RPM1, essa fosforilação provoca a inibição das defesas basais da planta,

potencializando assim o crescimento do patógeno. Por outro lado, em uma planta

resistente, a fosforilação de RIN4 que estará associada a RPM1, ativa a resistência mediada

por essa última proteína, diminuindo assim o progresso do patógeno. No referido exemplo,

RIN4 é a proteína endógena denominada “guardee” e RPM1 é a proteína R, também

chamada de guarda no modelo da hipótese guarda (Mackey, Holt III et al, 2002). A figura

1 descreve a hipótese da interação gene a gene e a hipótese guarda.

Como observado nos modelos acima citados, as plantas dispõem de uma série de

genes de resistência (genes R) que irão reconhecer direta ou indiretamente o patógeno e

ativar em seguida as defesas das plantas. A maioria dos genes R codificam para proteínas

que possuem um sítio de ligação a nucleotídeos (NBS) e um domínio chamado de região

Avr

Prote

end

gena.

Prote

end

gena.

(A)

(B)

Resposta ao patógeno

Avr

Prote

end

gena.

Prote

end

gena.

(A)

(B)

Resposta ao patógeno

Figura 1. Desenho esquemático demonstrando os dois principais modelos de reconhecimento na interação

planta patógeno. (A) hipótese da interação gene a gene: explica que o sucesso da resistência de hospedeiro

depende da interação de dois fatores, o produto de um gene de avirulência do patógeno (Avr ) e o produto

de um gene de resistência da planta (R). (B) hipótese guarda: explica que o reconhecimento do efetor

(Avr) do patógeno pela planta não necessáriamente ocorre por interação direta entre esse Avr e a proteína

de resistência (R) do hospedeiro, a qual pode reconhecer a ligação entre Avr e uma proteína endógena do

hospedeiro, denominada “guardee” e assim ativando a resistência da planta.

rica em leucina (LRR) (Dangle and Jones, 2001). O domínio LRR é conhecido pela função

de ligação e reconhecimento da proteína efetora do patógeno (Avr), por outro lado o

domínio NBS tem o papel de ligação a nucleotídeos e promove a troca de ADP por ATP,

resultando na iniciação da transdução de sinal que vai levar a ativação dos mecanismos de

resistência na célula vegetal (DeYoung and Innes, 2006). Essa ativação desencadeia

frequentemente um tipo de morte celular no sítio da infecção, que é conhecida como

resposta de hipersensibilidade (HR). A resposta de hipersensibilidade resulta em um

acúmulo de tecido morto em volta da região onde o patógeno se encontra, impedindo assim

o seu avanço (Moffett, Franham et al., 2002). Concomitantemente com a indução local da

HR, ocorre em partes distantes da planta, longe do sítio da infecção, a ativação da

expressão de genes de defesa que codificam para proteínas relacionadas à patogênese

(PRs), como as quitinases, defensinas, osmotinas, inibidores de proteinases dentre outras.

Adicionalmente, ocorrem mudanças na composição da parede celular e a síntese de

fitoalexinas relacionadas à defesa vegetal. Esse tipo de resistência não localizada é

denominada resistência sistêmica adiquirida (SAR) e contribui para o bloqueio do avanço

do patógeno. Esse tipo de resistência é media pelo ácido salicílico (Durrant and Dong,

2004). Adicionalmente a SAR, pode ocorrer um outro tipo de resistência sistêmica,

induzida por rizobactérias não patogênicas, a resistência sistêmica induzida (ISR), essa é

mediada pelas rotas do ácido jasmônico e etileno, não resultando em produção de PRs

(Pieterse, Van der Ent. et al, 2007).

As rotas que determinam a resistência das plantas aos patógenos são bastante

complexas e não inteiramente compreendidas, entretanto a busca e aplicação dos genes R

em programas de melhoramento vegetal são de grande importância para a obtenção de

plantas resistentes a vírus, bactérias, fungos e nematóides.

Prospecção de genes de resistência naturais (NEM-R) expressos em plantas

infectadas com nematóides.

Atualmente, pesquisas direcionadas a obtenção de plantas transgênicas resistentes a

fitonematóides, apontam o uso eficiente de metabólitos secundários vegetais como

fitoalexinas, a aplicação de organismos para o controle biológico e a obtenção de plantas

transgênicas expressando inibidores de enzimas digestivas, toxinas cry, RNA de

interferência e os genes de resistência natural a nematóides (Nem-R) (Williamson and

Kumar, 2006; Gao, Starr et al. 2008).

Esses genes Nem-R, pertencem ao grupo de genes de defesa das plantas chamados

de genes R, anteriormente referidos nesse trabalho. Uma série desses genes já foram

clonados e caracterizados, de acordo com as espécies e raças de nematóides as quais eles

conferem resistência (Fuller, Lilley et al, 2008). Dentre eles podemos citar os genes: Mi1.2

de Solanum peruvianum que confere resistência a M. incognita, M. javanica e M. arenaria;

Hs1

pro – 1

de Beta procumbens, que confere resistência a Heterodera schactii (Cai, Kleine et

al, 1997), o gene Gpa2 de Solanum tuberosum que confere resistência a Globodera pallida

(Van der Vossen, Van der Voort et al, 2000), Gro1-4 de Solanum tuberosum que confere

resistência a Globodera rostochiensis (Paal, Henselewski et al, 2004) e o gene Hero A que

promove resistência contra raças de

G. pallida e G. rostochiensis (Ernst, Kumar et al,

2002; Sobczak, Avrova et al, 2005). Adicionalmente, a busca de novos genes NEM-R

continua, pela aplicação de estratégias genômicas para a seleção de genes portadores de

domínios LRR e NBS, expressos diferencialmente em plantas infectadas com nematóides.

Essas seqüências com função desconhecida, porém codificadores de domínios conservados

do tipo NBS ou LRR têm sido definidas como análogos de genes de resistência (RGAs)

(Yaish, Saenz et al

., 2004).

Diversos trabalhos relatam essa resposta após a infecção pelo nematóide

(Williamson 1998; Jung and Wyss 1999; Seah, Miller et al. 2000; Sobczak, Avrova et al.

2005). A resistência mediada pelos genes NEM-R é limitada a algumas espécies ou raças

de nematóides. Entretanto, a busca por genes análogos aos NEM-R conhecidos em plantas

como algodão, café, cana de açúcar e soja, por exemplo, pode ser uma alternativa para a

ampliação desse espectro de resistência conhecido até agora. A habilidade dos genes R em

conferir resitência as maiores classes de patógenos de plantas incluindo bactérias, vírus,

fungos e nematóides é bem conhecida em muitas espécies de plantas (Lehmann, 2002;

Mehta, Brasileiro et al., 2008).

O papel da proteômica no entendimento das interações entre nematóides e

plantas.

A proteômica pode ser denominada como a tecnologia que complementa os estudos

genômicos. Ou seja, é a análise, identificação e caracterização das proteínas que são

realmente expressas em um tecido, ou organismo. Enquanto a genômica fornece

informações de seqüências que serão potencialmente expressas (Malloy and Witzmann,

2002). Atualmente a proteômica atingiu um estado avançado com a associação das técnicas

de gel bidimensional (2DE), que permite a separação de proteínas em larga escala e a

espectrometria de massa (MS), utilizada para identificar as proteínas individualmente de

acordo com suas massas moleculares.

Além disso, os espectrômetros de massa, aliados à ferramentas computacionais e a

protocolos de digestão de proteínas, permitem o sequenciamento dessas proteínas isoladas

pela eletroforese bidimensional, gerando assim iformação de seqüência e gerando dados

para os estudos de genômica funcional (Mehta, Magalhães et al, 2008). A exemplo das

bibliotecas de ESTs, os estudos proteômicos também estão sendo aplicados para avaliar a

expressão de potenciais proteínas de resistência em plantas, sob condições diversas de

stress abiótico (Jellouli, Ben Joira et al, 2008), ou sob ataque de vários patógenos como

vírus (Brizard, Carapito et al, 2006; Casado-Vela, Selles et al 2006), bactérias (Jones,

Thomas et al, 2004), fungos (Kim, Kim et al, 2004; Lee, Bricker et al, 2006) e nematóides

(Bellafiore, Shen et al, 2008). Os estudos de proteômica envolvendo nematóides parasitas

de plantas, ainda são bastante escassos (Jaubert, Ledger, et al, 2002; Bellafiore, Shen et al,

2008), entretanto o campo de estudo está aberto para a descoberta de novas proteínas de

resistência vegetal, produzidas sob o estímulo dos fitonematóides. Esses estudos,

juntamente com os estudos genômicos geram perspectivas para a aplicação de estratégias

moleculares para o controle desses parasitas em plantas transgênicas de interesse

econômico (Mehta, Magalhães et al, 2008).

RESULTADOS E DISCUSSÃO.

ARTIGO1.

ARTIGO 2.

ARTIGO 3.

CAPÍTULO 2 – Validação funcional dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 potencialmente

envolvidos com o parasitismo de

M. incognita.

No presente estudo, os ensaios com as plantas transgênicas expressando as proteínas

2E07 e 7E12 em fusão com GFP, foram realizados pelo Dr. Thales Lima Rocha da

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e pelo Dr. Gilbert Engler do INRA

(Sophia-Antipolis, França).

RESUMO

Os fitonematóides do gênero Meloidogyne estão entre os mais prejudiciais para a

economia agrícola mundial. Estes fitoparasitas são responsáveis por 95% de todas as

perdas causadas por nematóides das galhas no mundo e por perdas estimadas em mais de

US$ 80 bilhões/ano. A gravidade das perdas causadas por meloidoginoses tem estimulado,

há décadas, programas de melhoramento direcionados na obtenção de variedades

resistentes sem que, no entanto resultados satisfatórios tenham sido atingidos. Por outro

lado, as técnicas de genômica funcional se constituem em importantes ferramentas na

descoberta de função e identificação de genes essenciais para o fitoparasitismo, cujos

produtos gênicos podem ser utilizados como moléculas alvo para o controle de

fitonematóides. O presente estudo tem como objetivo avaliar a função dos genes novos,

2E07, 7E12 e 17H02, expressos exclusivamente em glândulas esofagianas de M. incognita.

Estes genes foram subclonados em vetores GATEWAY para expressão de RNAi e

superexpressão de proteínas fusionadas a GFP. As construções foram utilizadas em

transformação por Agrobacterium tumefasciens e as plantas transgênicas expressando as

proteínas de secreção de M. incognita em fusão com GFP, foram analisadas quanto ao

fenótipo externo e por microscopia das raízes infectadas. Para as construções contendo

2E07 e 7E12 (gf2E07 e gf7E12), ocorreu desenvolvimento maior das galhas e das células

gigantes em relação às plantas-controle durante todo o experimento (8,16 e 28 dias pos-

inoculos). Adicionalmente, o número de nematóides eclodidos em 24 e 48 horas foi

significativamente superior para a progênie das fêmeas que se alimentaram nas plantas

transgênicas em relação aos controles. Este fato pode estar relacionado com um

desenvolvimento prematuro das células gigantes nas plantas transgênicas infectadas com o

nematóide. As plantas transgênicas para a expressão de dsRNAs (construções pk72E07,

pk77E12 e pk717H02) mostraram alto grau de resistência ao nematóide de galhas (85-

91%), enquanto as plantas controle foram bastante susceptíveis ao parasita de acordo com

o teste de Tukey (p< 0,001).

ABSTRACT

M. incognita plant-parasitic nematodes present worldwide, are intensively studied

because of the damage caused to a large variety of agronomically important crops. Several

reports indicate that proteins from the

M. incognita. dorsal gland might play an important

role to allow proper establishment of a functional nematode feeding site. The precise role

of these proteins in the process of feeding cell development is unknown. To gain inside

into the function of these secreted M. incognita proteins, we constitutively (ectopically)

expressed the nematodes dorsal gland protein 2E07 and 7E12 in tobacco plants. It was

found that the size of galls at 8 and 16 days after nematode infection was higher in

transgenic plants compared to control plants. Eggs from nematodes in transgenic plants

hatched faster than those in control plants. Histological analysis of nematode induced galls

in transgenic plants clearly shows a different morphology. Giant feeding cells harbor more

vacuoles and an increased amount of cell wall invaginations. The Giant feeding cells in

transgenic plants, showed also higher volume than non transgenic controls. These results

suggest that the presence of the 2E07 and 7E12 proteins in tobacco accelerates the giant

cell and gall development. This assumption is supported by our data illustrating faster gall

formation and egg eclosion in transgenic plants. Additionally transgenic plants expressing

dsRNAs against transcripts of the genes 2E07, 7E12 and other dorsal gland gene the

17H02 showed high resistance to M. incognita compared with control plants, according the

Tukey test (p< 0,001).

INTRODUÇÃO

Potenciais genes de parasitismo de M. incognita e outros endoparasitas

sedentários.

Para desenvolver uma relação parasitária com a planta hospedeira, os nematóides do

gênero Meloidogyne, assim como outros fitonematóides, possuem adaptações morfológicas

especiais: um estilete (espécie de lança ulilizada para romper os tecidos radiculares e

permite a troca de solutos entre o parasita e a planta) glândulas secretórias associadas com

o esôfago, que produzem secreções liberadas através do estilete nos tecidos do hospedeiro.

Os anfídeos, um par de órgãos sensoriais na região cefálica, que também produzem

secreções associadas com a localização e reconhecimento da planta pelo nematóide, além

de diversas outras estruturas necessárias para o parasitismo.

Os nematóides das galhas, assim como outros tilenquídeos, possuem três glândulas

secretórias conectadas ao esôfago (duas ventrais e uma dorsal). Estas produzem proteínas e

as armazenam em grânulos envolvidos por membrana. No momento da secreção, os

grânulos liberam as proteínas de secreção no lúmen do esôfago por exocitose e, em

seguida, o bulbo esofágico bombeia este material para o estilete, por onde a saliva será

lançada (Figura 1). Estudos demonstraram que ainda dentro do ovo, os J2s desenvolvem as

glândulas subventrais que armazenam grânulos secretórios (Baum, Davis et al. 2007). Na

transição entre a penetração, indução e manutenção do sítio de alimentação em nematóides

de galhas e nematóides de cisto, as glândulas subventrais vão diminuindo a sua atividade e

a glândula dorsal se enche de grânulos e aumenta muito de tamanho (Hussey 1989;

Hussey, Davis et al. 2002; Davis, Hussey et al. 2004; Baum, Hussey et al. 2007).

Diversos trabalhos utilizando principalmente estratégias genômicas têm revelado

um grande número de genes potencialmente envolvidos com o parasitismo. Estes estudos

indicam que durante a fase infectiva, o J2 pré-parasita, lança secreções produzidas nas

glândulas subventrais, que estão principalmente relacionadas com a penetração e a

migração nas raízes. Neste caso já foram identificadas várias enzimas envolvidas na

degradação de parede celular em espécies dos gêneros Heterodera, Globodera e

Meloidogyne, onde podemos destacar: as β-1,4-endoglucanases e proteinas de ligação à

celulose (Smant, Stokkermans et al. 1998; Rosso, Favery et al. 1999; Wang, Meyers et al.

1999; Goellner and Caudill 2000; Goellner, Wang et al. 2001; Yan, Smant et al. 2001),

poligalacturonases (Jaubert, Ledger et al. 2002) e pectato liases (Gao, Allen et al. 2003).

Além da quebra das ligações covalentes da parede celular pelas enzimas acima citadas,

foram evidenciadas em nematóides de cisto, proteínas conhecidas como expansinas,

capazes de romper ligações não covalentes na parede celular (Qin, Kudla et al. 2004). Por

outro lado, algumas proteínas sintetizadas nas glândulas subventrais poderiam estar

envolvidas em outras etapas do parasitismo, como a indução de sítios de alimentação.

Dentre elas, podemos citar a calreticulina (CRT) de M. incognita (Jaubert, Ledger et al.

2002) e a corismato mutase (CM) de M. javanica (Lambert, Allen et al. 1999).

Adicionalmente, o peptídeo 16D10 de saliva de M. incognita, também se mostrou

importante para o controle de processos celulares no hospedeiro (Huang, Allen et al. 2006).

A atividade da glândula dorsal se torna maior nos estágios parasitários mais

avançados (Davis, Hussey et al. 2000), o que sugere que os produtos dessa glândula, em

sua maioria, estariam mais relacionados à indução e manutenção dos sítios de alimentação.

Por outro lado, a análise do parasitoma de H. glycines revelou seqüências para corismato

mutase na glândula dorsal, indicando o papel dos produtos desta glândula para o controle

dos processos celulares da planta hospedeira (Gao, Allen et al. 2003). No referido trabalho,

a presença da corismato mutase, exclusivamente na glândula dorsal de H.glycines,

contrasta com o seu aparecimento exclusivo nas glândulas subventrais de M. javânica e

Globodera pallida (Lambert, Allen et al. 1999; Jones, Reavy et al. 2004). Estas

divergências confirmam a necessidade de estudos mais detalhados que determinem o real

papel de cada glândula e de seus produtos para o estabelecimento e manutenção das

relações parasitárias com o hospedeiro. Uma evidência mais forte do papel destas proteínas

na regulação dos processos celulares do hospedeiro durante a indução e manutenção dos

sítios de alimentação é a expressão da corismato mutase de M. javanica (Mj CM-1) em

raízes de soja produziu um fenótipo caracterizado por baixos níveis de auxinas devido ao

fato que a corismato mutase do nematóide degrada o principal substrato para a formação de

auxina que é o corismato (Doyle and Lambert 2003).

Este evento pode estar relacionado com a etapa de iniciação da célula gigante.

Posteriormente, outro peptídeo da glândula dorsal de H. Glycines, o HG-SYV46 foi

expresso em plantas de Arabidopsis, causando efeitos fenotípicos como a terminação

prematura do meristema apical, após a regulação negativa da expressão do fator de

transcrição WUSCHEL (Wang, Mitchum et al. 2005). Apesar destes resultados fenotípicos

que sinalizam para a função das proteínas do secretoma de fitonematóides, determinadas

proteínas de secreção não exerceram qualquer efeito quando expressas em células de

plantas-modelo. É o caso da proteína de extensão de ubiquitina de H. schachtii Hs-Ubi1 e

da proteína 14-3-3 de

M. incognita, que quando expressas em células BY-2 de tabaco, não

provocaram nenhuma alteração celular evidente (Jaubert, Ledger et al. 2002; Tytgat,

Vanholme et al. 2004). Estes resultados sugerem que algumas proteínas de secreção não

atuam sozinhas, necessitando da ação de outras proteínas para exercer um efeito fenotípico

observável durante a gênese do sítio de alimentação. Outros grupos de proteínas já foram

identificados como pertencentes ao secretoma dos fitonematóides endoparasitas

sedentários e permanecem sem função conhecida, por não terem sido ainda validadas

quanto à função, embora estudos

in silico demonstrem pertencerem a famílias gênicas

específicas. É o caso das proteínas de localização nuclear de H. glycines, RanBPM de G.

Rostochiensis (glândula dorsal), SXP/RAL-2 de M.incognita (glândulas subventrais),

anexina de H. glycines (glândula dorsal), dentre outras (Gao, Allen et al. 2003; Tytgat,

Vercauteren et al. 2005; Baum, Davis et al. 2007; Elling, Mitreva et al. 2007). Uma outra

parcela dos genes expressos em glândulas de secreção dos fitonematóides endoparasitas

sedentários codifica para proteínas sem seqüência ou domínios conhecidos. Entretanto,

devido à específica expressão glandular e à presença de peptídeo sinal de secreção, estes

genes são classificados como potenciais genes de parasitismo.

Normalmente, a primeira evidência a ser considerada para a seleção de um gene

alvo de parasitismo ou de resistência é a sua similaridade com outros genes conhecidos.

Evidências recentes revelam que a maioria dos genes expressos nas glândulas esofagianas

de M. incognita e H.glycines, são totalmente novos, indicando que a tarefa de elucidar as

funções biológicas das proteínas de secreção codificadas por estes genes em nematóides,

será mais difícil do que se pensava (Gao, Allen et al. 2003; Huang, Gao et al. 2003). A

figura 2 representa o modelo de interação planta nematóide esquematizando as prováveis

proteínas e seus efeitos na célula hospedeira precursora, que irá formar o sítio de

alimentação.

Bulbo mediano do

esôfago

Anfídios

Estiletete

Poro secretório/excretório

Glândula dorsal

Glândulas

subventrais

Intestino

Cutícula

Bulbo mediano do

esôfago

Anfídios

Estiletete

Poro secretório/excretório

Glândula dorsal

Glândulas

subventrais

Intestino

Cutícula

Figura 1. Desenho esquemático mostrando a estratificação de um nematóide parasita de

planta típico. Onde o estilete é uma estrutura em forma de lança por onde o nematóide se

alimenta; os anfídeos são órgãos sensoriais utilizados dentre outras coisas para a

localização da planta no solo; a glândula dorsal e as glândulas subventrais são estruturas

salivares do parasita; a cutícula é uma estrutura externa acelular produzida pelas células da

epiderme e que protege o corpo do nematóide; o bulbo mediano do esôfago é uma

estrutura muscular usada pelo nematóide para bombear substanciais ao longo do esôfago

(Adaptado de Vanholme, De Meutter et al, (2004)

EPC

PSLN

UBQ, SKP1, RING-H2

CLV

Ampola da glândula

Anfídio

Estilete

Tradução do

mRNA

Corismato

Degradação via

proteossomo

EPC

PSLN

UBQ, SKP1, RING-H2

CLV

Ampola da glândula

Anfídio

Estilete

Tradução do

mRNA

Corismato

Degradação via

proteossomo

Figura 2. Modelo de interação planta-nematóides para a formação do sítio de alimentação dos

fitonematóides. Onde EPC correspondem as enzimas de degradação de parede celular como xilanases,

glucanases. PSLN correspondem as proteínas de localização nuclear que podem ter alguma função na

regulação da expressão gênica do hospedeiro durante o parasitismo; UBQ, SKP1 e RING-H2 podem estar

relacionadas com a marcação de proteínas de defesa do hospedeiro para a degradação dessas pelo

proteossomo, facilitando o parasitismo; PH é uma proteína do hospedeiro; CLE peptídeo da família

CLAVATA potencialmente importante para a diferenciação do sítio de alimentação; CM corresponde a

corismato mutase, enzima metabólica envolvida com o controle dos níveis de auxina, podendo levar a

rediferenciação celular para a formação do sítio de alimentação; TS significa transdução de sinal a partir da

interação entre a proteína do nematóide e a proteína do hospedeiro (Adaptado de Davis, Hussey et al.,

2004).

A genômica funcional como ferramenta para o estudo das interações entre plantas

e fitonematóides.

Genômica estrutural e funcional : considerações gerais.

A genômica tem evoluído bastante nos últimos anos para o entendimento da

estrutura e função dos genomas. A genômica estrutural pode fornecer informações valiosas

sobre uma dada proteína, apenas por comparação de seqüências identificadas com

seqüências já conhecidas, ou apartir da técnica de modelagem de proteínas, que permite

fazer inferências sobre a estrutura final de uma proteína, apartir de sua seqüência e dessa

forma fazer predições a respeito de prováveis funções e ligantes ou substratos para essas

proteínas. Entretanto, essas informações ainda não são suficientes para se determinar a real

função de muitas proteínas em um determinado sistema celular (Forouhar, Kuzin et al,

2007). Sendo assim, a genômica funcional surge como uma alternativa para se chegar mais

perto da função dos genes. Dessa forma, a genômica funcional é definida como a aplicação

de abordagens experimentais para estudar as funções dos genes, utilizando para isso, as

informações geradas pela genômica estrutural (Hiendleder, Bauersachs et al, 2005). As

técnicas empregadas na genômica funcional são diversas e nos permitem identificar a

expressão temporal e espacial dos genes em um organismo, um tecido, ou uma célula.

Além disso, a expressão de certos genes pode dar informações valiosas a respeito de

fenótipos ou de produtos da atividade das proteínas codificadas por esses genes. O

bloqueio da expressão de um gene, também é de grande importância atualmente, para a

determinação de sua função. Uma das técnicas mais utilizadas na genômica funcional é a

construção de bibliotecas de ESTs. Essas bibliotecas nos permitem identificar quais RNAs

mensageiros (mRNAs) estão sendo expressos num organismo, em um dado momento, seja

durante o seu desenvolvimento, ou durante um stress abiótico, ou quando o organismo está

exposto ao ataque de um patógeno. A construção de bibliotecas de ESTs é bastante

utilizada para a busca de potenciais genes de resistência, diferencialmente expressos em

variedades de plantas resistentes a patógenos (Ishihara, Sakurai et al, 2004; Schaff, Nielsen

et al, 2007; Shi and Wang, 2008). Aliada a construção de bibliotecas de ESTs, a técnica de

microarranjos permite medir a expressão relativa de transcritos de um determinado

organismo ou tecido. Nesse caso, sondas de DNA são fixadas em uma superfície carregada

positivamente e em seguida, os cDNAs da amostra, marcados com fluorocromos

específicos, são hibridizados com as sondas na lâmina de microarranjos. O sinal do

fluorocromo é captado por “scaners” e em seguida pode-se obter a abundância relativa dos

transcritos. Adicionalmente, a técnica de microarranjos também permite avaliar em larga

escala a expressão diferencial de genes em um dado evento da vida do organismo como

uma doença, por exemplo (Plomin and Schalkwyk, 2007; Shi and Wang, 2008).

Adicionalmente, a técnica de hibridização in situ permite avaliar a distribuição espacial de

um transcrito em um tecido, a partir da hibridização de uma sonda de ácido nucléico

marcada, com o RNA mensageiro alvo, reverso e complementar a sonda (Huang, Gao et al,

2003). Uma outra metodologia importante para a genômica funcional é o uso de fusões

traducionais para identificar a distribuição espacial de uma proteína expressa. Por exemplo,

quando uma proteína é traduzida em fusão com GFP, a emissão da fluorescência por essa

última, pode ser captada por um microscópio de fluorescência e assim pode-se determinar

a localização da expressão de uma proteína em um dado compartimento celular (Jaubert,

Ledger et al. 2002; Tytgat, Vanholme et al. 2004). Adicionalmente, a técnica de PCR em

tempo real é bastante utilizada para amplificar e simultaneamente quantificar o DNA

amplificado em tempo real (Gachon, Mingam et al, 2004). Essa técnica tem sido aplicada

em muitos trabalhos para medir o nível de expressão de genes em uma determinada

amostra. Além disso, aliada a técinica de RNA de interferência, a PCR em tempo real

permite avaliar o nível de silenciamento de um gene provocado pelo RNAi (Huang, Allen

et al, 2006). A técnica de RNAi é uma das ferramentas mais importantes da genômica

funcional e será comentada com maiores detalhes nos tópicos a seguir.

RNA de interferência (histórico).

A genética reversa permite a investigação de possíveis fenótipos que podem

resultar de seqüências identificadas in silico. Considerando os avanços recentes, podemos

classificar o RNA de interferência como uma das principais ferramentas da genética

reversa. A inibição da expressão de um gene pelo fenômeno do RNA anti-senso foi

descoberta em procariotos e serviu provavelmente como base para o entendimento dos

mecanismos atualmente conhecidos para a regulação da expressão gênica mediada por

RNA nos seres vivos. Nesse caso, serão comentadas aqui, as descobertas históricas que

levaram ao desenvolvimento dessa ciência.

Em um dos primeiros trabalhos na área, Willard e colaboradores sugeriram que um

RNA antisenso para transcritos do gene cro pode reduzir a síntese do produto desse gene

nas infecções, levando assim a lisogenia (Spiegelman, Reichardt et al, 1972). Em seguida,

chegou-se a importante descoberta que a replicação do plasmídeo ColE1 é inibida quando

um RNA antisenso se anela com o oligonucleotídeo envolvido na iniciação da replicação.

Dessa forma, foi mostrada a importância do RNA anti-senso na regulação da replicação do

DNA em procariotos (Polisky, 1988).

Um artigo considerado um marco nas pesquisas com RNAi em eucariotos, foi

publicado por Napoli, Lemieux et al. (1990). Nesse trabalho, os autores introduziram uma

cópia extra do gene para chalcona sintase (CHS) em plantas de petúnia, objetivando uma

maior produção de antocianinas, para obter assim, pétalas mais pigmentadas. O

experimento resultou, entretanto, com parte das plantas transgênicas apresentando pétalas

totalmente brancas, devido à supressão da cópia natural e da cópia quimérica do gene.

Sendo assim, o fenômeno hoje conhecido como RNA de interferência ou RNAi, foi

classificado inicialmente como co-supressão (Napoli, Lemieux et al. 1990).

Um outro importante relato histórico sobre os estudos de RNAi ocorreu quando

Lee, Feinbaum, et al. (1993), descobriram que a expressão de lin-4 leva ao

desenvolvimento temporal normal de diversos eventos pós embrionários em C. elegans. O

gene lin-4 regula negativamente a expressão do gene heterocronico lin-14, criando um

decrescimo temporal na proteina Lin-14. Em mutantes não funcionais para lin-4, a proteína

Lin-14 se acumula na célula, disparando de forma precoce eventos tardios para o estado

larval específico, incluindo mudas adicionais. Foi observado que lin-4 não codifica para

uma proteína, mas sim para duas formas de RNAs de 22 e 61 nucleotídeos, que são

complementares em sequencia a região 3´ não traduzida do mRNA para lin14. De acordo

com esses resultados, foi sugerido que transcritos de lin-4 regulam a tradução de lin-14 por

interação antisenso (RNA-RNA) (Lee, Feinbaum et al. 1993). Este foi à primeira

identificação do que se chama hoje de microRNAs.

O papel do RNAi no processo de resistência a vírus em plantas foi primeiramente

observado em plantas de tabaco transgênicas expressando a proteína do capsídeo do vírus

TEV. Os transformantes desenvolveram inicialmente os sintomas da doença, mas depois

de 3-5 semanas essas plantas recuperaram o fenótipo saudável. Foi observado que o nível

de acúmulo dos transcritos do transgene, nas plantas recuperadas foi de 12 a 22 vezes

menor do que nas plantas transgênicas não inoculadas. Indicando que a resistência

adquirida pelas plantas inoculadas pode estar relacionada à destruição do RNA mensageiro

da proteína viral pela própria planta transgênica. Esses resultados levaram à conclusão de

que a resistência do tabaco ao TEV vírus e o nível de acúmulo de transcritos do transgene

são mediados em nível celular por uma atividade citoplasmática a qual resulta na

inativação de RNAs mensageiros específicos. O processo ficou conhecido como resistência

a vírus mediada por RNA (Lindbo, Silva-Rosales et al. 1993).

Os estudos sobre inibição da expressão gênica mediada por RNA prosseguiram e

em 1978, onde Fire e colaboradores demonstraram que a injeção de RNA de fita dupla foi

consideravelmente mais potente para o silenciamento do gene unc22 em C. elegans, do que

a administração das fitas senso e anti-senso separadamente. A via de silenciamento que

parte de um RNA dupla fita, ao invés do RNA anti-senso que não causou efeito fenotípico

observável, ficou conhecida como RNA de interferência ou RNAi (Fire, Xu et al. 1998).

Atualmente, alguns sistemas celulares específicos relatam a participação de pequenos

RNAs no silenciamento gênico em eucariotos. As principais formas de RNAs não codantes

para proteínas em eucariotos são classificadas como microRNAs(miRNAs), pequenos

RNAs de interferência (siRNAs) e os Piwi RNAs (pi) RNAs (Matranga and Zamore

2007; Shabalina and Koonin 2008). Detalhes desses três mecanismos serão discutidos

separadamente abaixo:

Os microRNAs.

Os microRNAs são produtos da expressão de vários genes do genoma de eucariotos

que, por sua vez, não são traduzidos em proteínas. Os microRNAs podem levar ao

silenciamento de genes através da degradação ou bloqueio de RNAs mensageiros

específicos. Eles são sintetizados como longos precursores e se apresentam como

estruturas em dupla fita, em forma de haste com volta (stem-loop), chamados micro RNAs

primários ou pri-miRNAs (Shabalina and Koonin 2008). Como descrito para os animais,

ainda no núcleo, essas estruturas são processadas pelo complexo chamado de

microprocessador, formado pela Drosha, uma RNAse do tipo III, juntamente com a

proteína de ligação a RNA DGCR8 e algumas outras proteínas. Os produtos da clivagem

pela Drosha são estruturas em forma de grampos com aproximadamente 65 pares de base

de comprimento e são chamados de pré-miRNAs (Hoefig and Heissmeyer 2008). Essas

formas de RNAs são então exportadas do núcleo para o citoplasma pela ação da exportina

5. No citoplasma os pré-miRNAs são clivados em microRNAs de aproximadamente 22

pares de bases por outra RNAse do tipo III, a DICER. Uma das fitas desse microRNA

maduro é captada por um complexo final de proteínas chamado complexo de silenciamento

induzido pelo microRNA. Esse complexo contém uma proteína da família argonauta que é

responsável pela ligação aos RNAs que são captados pelo complexo miRISC. Em contraste

com o sistema de siRNAs os microRNAs não formam pareamento perfeito com o RNA

mensageiro e não sinalisam para a degradação do mesmo. O que ocorre é uma hibridização

imperfeita na região 3´ não traduzível do RNA mensageiro, levando a uma inibição direta

da tradução e não a uma degradação do RNA mensageiro. A inibição da tradução pelo

miRNA se deve ao pareamento imperfeito dessa molécula com o mRNA alvo, sendo

assim, um único microRNA pode silenciar vários mRNAs. Por outro lado, o pareamenteo

perfeito é mais específico e não leva a inibição da tradução, mas sim a degradação do

mRNA alvo (Matranga and Zamore 2007; Boyd 2008; Garcia 2008) (Figura 3).

Em plantas, os micro RNAs primários são clivados por uma enzima do tipo

DICER, a DCL1. Nesse processo, também ocorre a associação das proteínas CBp80,

HYL1 e SE, antecedendo a gênese do microRNA. As duplexes de microRNAs são então

metilados pela proteína HEN1 para evitar degradação. A exportação do microRNA do

Ribossomo

Citoplasma

Núcleo

A B

Ribossomo

Citoplasma

Núcleo

A B

Figura 3. Esquema do mecanismo de silenciamento gênico via micro-RNAs em animais (adaptado de Boyd

2008).A. Primeira etapa, onde os micro RNAs primários (Pri-miRNAs) são transcritos a partir do molde de DNA

no núcleo pela RNA polimerase II (RNA Pol II); B. O complexo microprocessador, formado pelas proteínas

Drosha, DGCR8 e outras, capta os Pri-miRNAs, gerando os pre-miRNAs, produtos da ação da Drosha; C. Os

pre-miRNAs são transportados para o citoplasma onde serão clivados pela enzima DICER, gerando os

microRNAs; D. Uma das fitas do microRNA pode se ligar em sítios diferentes de uma região 3’ não traduzível

de um mRNA, levando ao silenciamento desse apenas por ligação e não por degradação.

núcleo para o citoplasma é provavelmente feita pelo homólogo da exportina 5 de humanos,

a proteína HSTY de Arabidopsis. Finalmente, os microRNas são captados e separados

pela proteína argonauta no complexo RISC que pode direcionar a degradação do RNA

mensageiro alvo ou simplesmente a inibição da tradução. (Matranga and Zamore 2007;

Boyd 2008) (Figura 4).

Figura 4. Sistema geral de microRNAs em platas. Os micro RNAs primários (pri-miRNA) são

clivados pela proteína tipo DICER a DCL1, havendo també associação das proteínas CBp80,

HYL1 e SE. Depois de formado, o microRNA (miR/miR*), é metilado ainda no núcleo pela

proteína HEN1 e então transportado para o citoplasma pela HST. A partir daí ele é captado pelo

complexo RISC que direciona a inibição da tradução do mRNA alvo, ou a sua clivagem via

AGO1 (adaptado de Garcia 2008).

Inibição da tradução Clivagem do mRNA

Citoplasma

Núcleo

Inibição da tradução Clivagem do mRNA

Citoplasma

Núcleo

Os siRNAs.

A interferência por RNA guiada por siRNAs é uma resposta eucariótica a ácidos

nucléicos externos e uma defesa primária para plantas e muitos animais. Os siRNAs foram

descobertos por Hamilton and Baulcombe (1999). Os siRNAs podem ser produzidos a

partir de produtos intermediários da replicação viral, de transcrição convergente, de

transcritos que se auto-anelam produzindo o grampo de RNAs de fita dupla(dsRNa) ou

por fim apartir de dsRNAs experimentalmente introduzidos no organismo (Matranga and

Zamore 2007). Os siRNAs são formados após a degradação do RNA dupla fita pela

DICER e são estruturas de cerca de 21 pares de bases com uma extremidade 3´ contendo

2 nucleotídeos livres. Geralmente se classifica os siRNAs em dois tipos; aqueles que

derivam diretamente do processamento do longo RNA dupla fita (dsRNA) (Figura 5A) e

aqueles que requerem uma RNA polimerase, a RdRP (Figura 5B). Nesse caso, uma fita do

siRNA primário é acoplada pela proteína argonauta 1 que o hibridiza com o RNA

mensageiro alvo. O fragmento então sofre reamplificação pela RdRP. No caso das plantas,

a dupla fita regenerada é novamente clivada pela DICER e, em seguida, o siRNA é captado

por uma segunda proteína argonauta que desacopla a dupla fita e hibridiza a fita antisenso

com o RNA mensageiro alvo levando à degradação do mesmo. Nesse momento, os

produtos da DICER são muito mais abundantes do que os siRNAs primários. Esse sistema

de reamplificação mediado pela RdRP promove um aumento no número das moléculas

efetoras e, por fim, um incremento na potência e persistência do silenciamento. Esse efeito

foi observado inicialmente quando moléculas de RNA dupla fita adiministradas ao

nematóide C. elegans foram suficientes para levar o efeito do silenciamento até a prole do

nematóide. Enquanto em plantas um siRNA dupla-fita é formado duas vezes pela DICER,

em C. elegans, o siRNA é apenas a fita antisenso resultante da amplificação pela RdRP e

possui de 2 a 3 fosfatos na extremidade 5´, diferentemente o siRNA produto da DICER que

apresenta apenas um grupo fosfato (Chu and Rana 2008; Garcia 2008; Shabalina and

Koonin 2008).

dsRNA longo

Dicer

siRNA

Complexo de

carregamento RISC

Dcr-2

R2D2

SAM

SAH

Ago2

Ago2 pre-RISC

SAM

SAH

Ago2 RISC

2’-O-me

Hen1

2’-O-me

Ago

2’-O-me

Dicer

siRNA primário

1’ Ago

...AAA

pppG

...AAA

pppG

RdRP RdRP

Dicer

5’-ppp

siRNAs secundários

2’Ago

5’-ppp

5’-p

dsRNA longo

Dicer

siRNA

Complexo de

carregamento RISC

Dcr-2

R2D2

SAM

SAH

Ago2

Ago2 pre-RISC

SAM

SAH

Ago2 RISC

2’-O-me

Hen1

2’-O-me

Ago

2’-O-me

Dicer

siRNA primário

1’ Ago

...AAA

pppG

...AAA

pppG

RdRP RdRP

Dicer

5’-ppp

siRNAs secundários

2’Ago

5’-ppp

5’-p

Figura 5. Sistemas de silenciamento baseados em siRNAs. (A) modelo de sistema se siRNA não

dependente de RdRP nos modelos mosca e planta. Onde, inicialmente, uma molécula de dsRNA é clivada

em siRNAs pela dicer; nas moscas o complexo de carregamento do RISC formado pela DICER-2 (Dcr-2) e

R2D2 forma o complexo RISC com a proteína argonauta-2. Esse complexo é denominado de pré-RISC. A

proteína argonauta-2 separa, por clivagem uma das fitas do siRNA, deixando apenas uma das fitas no

complexo agora chamado de holo-RISC. Esse último vai direcionar a degradação do mRNA alvo. Tanto

em moscas como nas plantas ocorre metilação da região 3’ livre do siRNA, para impedir que o mesmo seja

degradado. (B) modelo de siRNA dependente de RdRP. Nesse modelo, antes da degradação final do

mRNA ocorre a formação inicial de uma fita simples a partir do siRNA primário pela ação da argonauta 1.

Essa fita antisenso será então hibridizada com um mRNA alvo, que vai servir como molde para a

reamplificação da dupla fita mediada por RdRP (Adaptado de Matranga and Zamore 2007).

Os piRNAs.

Os piRNAs, são formas de pequenos RNAs regulatórios encontrados em células

germinativas de eucariotos. Esses piRNAs possuem entre 24 a 30 nucleotídeos de extensão

e esse comprimento indica que os piRNAs não são formados pela ação da DICER, a qual

produz fragmentos de 21 a 23 nucleotídeos. Os piRNAs podem ser originados a partir de

um arranjo randômico de fragmentos de transposons que pode produzir uma mistura de

piRNAs senso e antisenso. Os piRNAs mais abundantes, são originados a partir de

seqüências antisenso de retrotransposons e esses RNAs se associam preferencialmente a

proteínas argonautas como Piwi e Aubergina (Aub).

Por outro lado, piRNAs senso se associam preferencialmente com a proteína

Argonauta 3 (Ago3) (Klattenhoff and Theurkauf, 2008). Todas essas proteínas pertencem a

uma subclasse distinta de proteínas argonautas, as proteína Piwi, que incluem aubergina, e

Ago3 em moscas, Smedwi em planarias, Siwi em ouriços do mar e Hiwi em humanos.

(Kim 2006; Matranga and Zamore 2007).As proteínas Piwi, Aub e Ago3, quando em

complexo com piRNAs podem clivar RNAs alvo entre as posições 10 e 11 da fita guia. A

fim de explicar melhor o mecanismo de silenciamento via piRNAs, foi criado um modelo

chamado de “ping-pong” (Aravin, Hannon et al, 2007; Klattenhoff and Theurkauf, 2008),

baseado em experimentos realizados com

Drosophila.

Segundo esse modelo, a proteína Ago3 ligada ao piRNA fita senso e cataliza a

clivagem da fita antisenso. Os produtos da clivagem se associam então com Aub ou Piwi e

no complexo ocorre uma nova clivagem, gerando piRNAs antisenso maduros com o

cumprimento de 23 a 30 nucleotídeos. Os complexos de proteínas Argonautas com

piRNAs antisenso vão se ligar e clivar os RNAs de fita senso gerando piRNAs senso

precursores que, se associam, com Ago3 (Figura 6). Uma clivagem nesse ponto produz

piRNAs senso maduros, completando assim o ciclo. Apesar do modelo proposto “ping

pong”, pouco se sabe ainda acerca do ciclo dos piRNAs em diferentes organismos

eucariotos (Aravin, Hannon et al, 2007; Klattenhoff and Theurkauf, 2008)

Fita senso

Fita antisenso

Clivagem

dirigida por

homologia

Clivagem

dirigida por

homologia

Clivagem

Squash?

Zuchini?

Clivagem

Metilação

Fita senso

Fita antisenso

Clivagem

dirigida por

homologia

Clivagem

dirigida por

homologia

Clivagem

Squash?

Zuchini?

Clivagem

Metilação

Figure 6. Modelo Ping-pong para a produção de piRNAs (A) A proteína Ago3 se liga a fita senso dos

piRNAs (azul) e promove a clivagem de transcritos antisenso alvos (vermelho) (B) Aubergina (Aub) e

outras proteínas da classe Piwi se ligam então ao piRNA precursor, o qual é processado para o seu

comprimento final. Essa etapa pode ser catalizada por nucleases como “Squash” e “Zucchini”. (C) A

proteína Hen1 de Drosophila metila a extremidade 3´dos piRNAs. (D) O complexo Aub–piRNA

antisenso cataliza a clivagem de transcritos senso (azul) de piRNAs (E) Ago3 se liga aos precursores

senso de piRNA, os quais são então, processados e (F) metilados como descrito para as fitas de piRNAs

antisenso (Adaptado de (Klattenhoff and Theurkauf, 2008)).

O sistema de interferência por RNA em procariotos.

Uma recente hipótese demonstra um sistema de RNAi presente em procariotos.

Nesse caso, seqüências de mais de 200 genomas procarióticos revelaram repetições em

tandem de 20-40 pares de pases separadas por seqüências espaçadoras de 25-40 pares de

bases. As repetições são parcialmente palindromicas e são chamadas de CRISPRs. Essas

seqüências são transcritas e processadas em RNAs pequenos, do tamanho de uma repetição

e um espaçador. Nas proximidades das CRISPRs são encontrados grupos de genes

conservados chamados genes Cas.

Predições de seqüências sugerem que esses genes codificam para nucleases,

helicases, polimerases e para motivos de ligação a DNA/RNA. Por essas razões, foi

construído um modelo hipotético de RNA interferente para procariotos. Segundo esse

modelo, primeiramente ocorre a transcrição das seqüências CRISPRs, que são clivadas em

RNAs pequenos. Esses RNAs são captados por proteínas chamadas proteínas misteriosas

associadas a repetições (RAMP) e uma provável nuclease. Esse complexo se liga então ao

RNA ou DNA alvo que é clivado pela nuclease (Makarova, Grishin et al. 2006; Molloy

2007). O modelo para o sistema de RNAi em procariotos é baseado em análises em sílico,

sendo necessárias maiores evidências para se entender o mecanismo proposto Figura 7.

Fator de transcrição

específico (COG1517?)

Transcrição

RNA

polimerase

pre-psiRNA

policistrônico

p-dicer (Helicase+HD-

Hydrolase)

(COG1203? COG2254?)

Dobramento

do RNA

Processamento do

RNA (rápido?)

Processamento do

RNA (lento?)

pre-psiRNA

75-100 nt

p-slicer

(COG1468? COG4343?

COG1857?)

RAMP

p-dicer

psiRNA

25-45 nt

p-RISC

Anelamento com o

RNA-alvo

p-RISC

Clivagem do RNA-alvo

mRNA de fago ou

plasmidio

Fator de transcrição

específico (COG1517?)

Transcrição

RNA

polimerase

pre-psiRNA

policistrônico

p-dicer (Helicase+HD-

Hydrolase)

(COG1203? COG2254?)

Dobramento

do RNA

Processamento do

RNA (rápido?)

Processamento do

RNA (lento?)

pre-psiRNA

75-100 nt

p-slicer

(COG1468? COG4343?

COG1857?)

RAMP

p-dicer

psiRNA

25-45 nt

p-RISC

Anelamento com o

RNA-alvo

p-RISC

Clivagem do RNA-alvo

mRNA de fago ou

plasmidio

Figura 7. Sistema de silenciamento análogo ao RNAi de eucariotos,

proposto para procariotos (adaptado de Makarova, Grishin et al. 2006).

Nesse modelo se especula que um fator de transcrição específico ativa a

transcrição de um pre-psiRNA policistrônico. A síntese desse RNA é

catalisada por uma RNA polimerase, em seguida o RNA é clivado em

pre-psiRNAs menores (75-100 nt) por uma p-dicer. Por fim os pre-

psiRNAs são novamente processados pela p-dicer, resultando na

formação dos psiRNAs maduros, com 25-45 nt de comprimento. Os

psiRNAs de ligam a RAMP e se anelam com o mRNA alvo. Por fim, esse

complexo recruta uma p-slicer formando, assim, o complexo p-RISC

análogo ao RISC eucariótico.

100

Técnica de RNA de interferência aplicada ao controle de fitonematóides.

Atualmente, o RNA de interferência é utilizado amplamente em estudos visando à

elucidação da função de genes específicos para melhor conhecimento da química celular.

Adicionalmente, inúmeros estudos com foco no controle de doenças de plantas e animais,

incluindo humanos, têm demonstrado excelentes resultados que reforçam a importância do

RNAi, como ferramenta biotecnológica fundamental para a medicina, agricultura,

piscicultura, dentre outras ciências.

A introdução de dsRNA em nematóides parasitas de plantas tem sido feita desde

2002 pelo método de soaking (Urwin, Lilley et al. 2002) e, atualmente, alguns genes de

espécies de Meloidogyne já foram silenciados com sucesso usando esta técnica (Bakhetia,

Charlton et al. 2005; Fanelli, Di Vito et al. 2005; Rosso, Dubrana et al. 2005; Shingles,

Lilley et al. 2007). A eficiência do RNAi para o controle de fitonematóides foi confirmada

in vivo, com fumo (Yadav, Veluthambi et al. 2006) e Arabidopsis (Huang, Allen et al.

2006).

No primeiro trabalho, plantas transgênicas de fumo expressando dsRNA contra

uma integrase e um fator de splicing de M. incognita foram extremamente resistentes ao

patógeno. Plantas de Arabidopsis expressando dsRNA contra o gene 16D10 de M.

incognita

apresentaram alta resistência contra o referido patógeno, que ao ingerir o

citoplasma das células do hospedeiro sofreu o efeito do RNA interferente, que resultou na

diminuição dos transcritos do gene

16D10 no nematóide, prejudicando o ciclo de vida do

mesmo (Huang, Dong et al. 2006). Estes dados revelam que a expressão de dsRNA em

plantas leva ao silenciamento eficiente de genes alvo expressos no nematóide que parasita

ativamente a raíz (Figura 8). Adicionalmente, a expressão de dsRNA em plantas

101

hospedeiras se mostrou uma excelente estratégia para o controle de M. incognita (Huang,

Dong et al. 2006; Yadav, Veluthambi et al. 2006).

Raíz da planta

Nematóide se alimentando

dsRNA

Dicer

siRNA

Complexo RISC

Clivagem do mRNA alvo

Raíz da planta

Nematóide se alimentando

dsRNA

Dicer

siRNA

Complexo RISC

Clivagem do mRNA alvo

Figura 8. Desenho esquemático da passagem dos siRNAs da planta hospedeira para

o nematóide parasita. Onde, uma planta transgênica está expressando um dsRNA

homólogo a um mRNA alvo no nematóide; os dsRNAs são processados ainda na

planta gerando os siRNAs. Esses são sugados para o trato digestivo do nematóide

através do estilete. Os siRNAs são captados pelo complexo RISC do nematóide que

promovem a degradação do mRNA alvo. Adaptado de Gheysen and Vanholme

(2007).

102

MATERIAL E MÉTODOS.

Manutenção de populações de M. incognita em tomateiros.

É comum para uso em pesquisa, proceder a constante multiplicação de nematóides

em seus hospedeiros naturais. Geralmente, são utilizadas as culturas mais susceptíveis ao

respectivo parasita para que se tenha o maior rendimento em número de indivíduos da

população, além de garantir uma maior economia de espaço nas casas de vegetação. A

manutenção de populações de nematóides do gênero Meloidogyne é bastante simples,

principalmente devido à facilidade de encontrar o hospedeiro mais conveniente, tendo em

vista que estes parasitas são generalistas, infectando mais de 1700 espécies de plantas

(Huang, Dong et al. 2006).

Plantas como quiabo, feijão, ervilha e tomate são propícias para a manutenção

destes nematóides. Para aplicação, neste estudo foram utilizadas plantas de tomateiro

Solanum lycopersicum, da variedade susceptível Santa Cruz ‘Kada Gigante’. As plantas

foram acondicionadas em casas de vegetação, em condições controladas de temperatura e

humidade, em vasos plásticos contendo cerca de 3 kg de solo autoclavado acrescido de

substrato (plantmax) e vermiculita. Quando atingiram cerca de 40 cm de altura, já

apresentando grande volume radicular, as plantas foram transferidas para solo contendo

nematóides e ovos do inóculo anterior e após 2-3 meses as plantas foram utilizadas para a

extração de fêmeas, J2 e ovos, usados para testes de susceptibilidade, extração de DNA,

RNA, hibridização in situ, dentre outras aplicações. Passados três meses o tomateiro

começou a apresentar danos severos, devido à alta taxa de reprodução de M. incognita, que

se reproduz por partenogênese.

103

Extração de Meloidogyne incognita de raízes de tomateiros infectadas.

Os protocolos de extração utilizados neste trabalho são bastante simples, mas

diferenciados de acordo com a necessidade do estudo. Para obtenção de ovos visando a

extração de proteínas usadas em estudos de proteômica, ou de DNA ou RNA para estudos

genômicos, procedeu-se a remoção das raízes infectadas do solo, as quais foram lavadas e,

em seguida, cortadas em pequenos fragmentos com uma tesoura. Em seguida, os

fragmentos foram processados em liquidificador durante 3 minutos em solução de

hipoclorito de sódio 0,5%, para que houvesse a emulsificação da matriz gelatinosa, que é

um complexo mucopolissacarídico ácido contendo enzimas digestivas de parede celular

(Spiegel and Cohn 1985). Em seguida, o extrato da raiz foi passado e lavado com água, em

um conjunto de peneiras variando entre 20-500 mesh, para remoção do hipoclorito e

fracionamento do extrato.

Os ovos coletados na peneira de 500 mesh foram, então, precipitados com caolin,

em uma centrifugação a 3000 rpm durante 1 min, e o sobrenadante descartado. Em

seguida, o precipitado foi ressuspendido em sacarose 30% e novamente centrifugado sob

as mesmas condições. O sobrenadante então, contendo os ovos menos densos que os

fragmentos radiculares e o solo contaminante, flutuaram no sobrenadante (colchão de

sacarose) sendo posteriormente lavados na peneira de 500 mesh anteriormente ao uso.

Quando os ovos foram usados para testes de susceptibilidade ou para a eclosão de juvenis

de segundo estádio (J2) “in vitro” para a realização de bioensaios, não se fez necessário o

colchão de sacarose.

Quando o objetivo da extração foi a obtenção de fêmeas do parasita, o

procedimento realizado após a lavagem e o corte das raízes divergiu das extrações

anteriores. Primeiramente, os fragmentos radiculares foram colocados em uma solução

104

20% de extrato de Aspergillus niger contendo pectinase e, a suspensão resultante, foi

deixada durante 18 horas sob leve agitação à temperatura ambiente. Posteriormente, a

suspensão onde as fêmeas estavam expostas pela degradação da parede celular da raiz após

o tratamento com pectinase, foi lavada em um conjunto de peneiras dispostas na seguinte

ordem da superior à inferior: 20, 48, 100 mesh, sendo as fêmeas coletadas na peneira de

100 mesh. As fêmeas extraídas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e

acondicionadas a – 80  C anteriormente à extração do RNA.

Extração de RNA total de fêmeas e síntese do cDNA.

Com o objetivo de obter o cDNA a ser usado como molde para as reações de PCR,

foi inicialmente extraído o RNA total de fêmeas utilizando o kit RNeasy (Qiagen) de

acordo com as instruções do manual de utilização do kit, usando resina de sílica gel para

purificar o RNA. Para a síntese do cDNA, foram utilizados 2 μg de RNA total por reação e

o oligo dT como iniciador da reação da transcriptase reversa MMLV.

Subclonagem dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 em pGEM-T easy.

Com o objetivo de detectar os verdadeiros componentes do parasitoma de M.

incognita Huang, Gao et al. (2003) produziram uma biblioteca de cDNA a partir do RNA

total que foi micro aspirado da secreção das glândulas esofagianas do parasita. Esta

biblioteca gerou uma série de seqüências que foram filtradas in silico com base na

existência de peptídeo sinal para secreção, o que resultou em redução significativa dos

candidatos. Por fim Huang, Gao et al. (2003) fizeram uma hibridização in situ em larga

escala com o objetivo de filtrar os genes exclusivamente expressos nas glândulas.

105

Cerca de 90% das seqüências, codificaram para genes sem função conhecida. Por

este motivo, neste estudo, foram selecionadas 20 destas seqüências pioneiras a serem

validadas funcionalmente por meio de RNA de interferência e superexpressão em plantas

transgênicas, para determinar o papel das mesmas no parasitismo por M. incognita. Para

isso, foram desenhados primers na tentativa de amplificar as seguintes seqüências:

AF531160 (2E07); AF531161 (2G02); AY135363 (2G10); AF531162 (4D01); AY135364

(4D03); AY135362 (5G05); AF531163 (6F06); AF531164 (6G07); AF531165 (7A01);

AF531166 (7E12); AF531168 (7H08); AY135365 (10G02); AY134437 (17H02);

AY142116 (19F07); AY142118 (25B10); AY134439 (30H07); AY134441 (31H06);

AY134443 (34F06); AY134444 (35A02); AY142120 (Mipsg30). Utilizando cDNA de

fêmeas e juvenis de segundo estádio (J2), foram feitos várias rodadas de PCR, que

resultaram na amplificação de bandas de tamanho esperado, visto em gel de agarose para

os genes: 2E07, 7E12, 17H02. Seguindo as clonagens, as bandas foram excisadas do gel e

o DNA, correspondente, foi purificado utilizando o kit GENE CLEAN II (Q – Biogene).

Os genes foram inseridos no vetor pGEMT Easy e o produto da ligação foi utilizado para

transformar Escherichia. coli via eletroporação. As colônias positivas foram submetidas à

extração de DNA plamidial e os genes foram seqüenciados para confirmação.

Hibridização “in situ whole mount”.

Para se avaliar a distribuição espacial da expressão, assim como para estudos de

avaliação de silenciamento gênico, foi utilizada a técnica de hibridização in situ com

sondas senso e anti-senso marcadas com digoxigenina, produzidas a partir da transcrição

reversa dos fragmentos clonados no vetor comercial pGEMT-easy, usando RNA

polimerases T7 e SP6. Inicialmente as construções produzidas em pGEMT-easy foram

106

linearizadas com as enzimas de restrição NcoI e SalI para a síntese das sondas anti-senso e

senso, respectivamente. Em seguida, o plasmídio linearizado foi submetido a um processo

de limpeza pelo método de extração fenol/clorofórmio (1:1). Após a limpeza do plasmídio

foi realizada a transcrição das sondas de acordo com as instruções do DIG RNA labeling

kit (SP6/T7) da Roche

. As fêmeas de M. incognita recém extraídas das raízes pelo

método já descrito foram separadas dos restos radiculares por pipetagem individual e

colocadas imediatamente em solução de fixação de paraformaldeido 2%.

Clonagem dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 em vetores para expressão de dsRNA

e superexpressão de proteínas em fusão com GFP em plantas.

O sistema gateway permite uma clonagem eficiente de um produto de PCR que

possui, flanqueando as suas extremidades, os sítios de recombinação attB1 (fita senso) e

attB2 (fita anti-senso), para um vetor destino qualquer que possua os sítios de

recombinação attR1 e attR2. Inicialmente o produto de PCR foi recombinado para um

vetor intermediário que carrega os sítios attP1 e attP2 (pDONR). A recombinação entre os

sítios attB-attP foi catalisada pela enzima BP clonase. Esta recombinação converteu um

sítio attP em attL e o vetor pDONR, que recebeu o inserto agora passou a ser denominado

pENTR (vetor de entrada). Por fim, o gene é clonado em um vetor final, o vetor destino.

No sistema gateway qualquer vetor destino possui os sítios de recombinação attRs. Sendo

assim, usando uma outra recombinase, a LR clonase, pode-se recombinar um gene

individualmente para qualquer vetor destino gerando o clone de expressão desejado. No

presente trabalho, fragmentos de aproximadamente 500pb dos genes potencialmente

envolvidos na fitopatogenicidade foram subclonados no vetor de origem pDONR™221(

recombinação pela BP clonase) do kit de clonagem “PCR Cloning System with Gateway

107

Technology”, sendo, então, transferidos por recombinação (recombinação pela LR clonase)

para os vetores destino pk7GWIWG2(I) para a expressão de dsRNA em plantas e

pk7WGf2 para expressão de proteínas em fusão com GFP.

Para isso foi necessário re-amplificar os genes de interesses com oligos contendo

os sítios de recombinação attB1 (senso) e attB2 (antisenso). A lista de oligos (primers),

usados no presente trabalho pode ser acessada na tabela 1. Após as PCRs, bandas de

tamanho esperado para os genes 2E07, 7E12 e 17H02 (aproximadamente 500 pb) foram

identificadas em gel de agarose.

Tabela 1. Lista de primers utilizados para a amplificação dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 a partir

de cDNAs extraídos de fêmeas de M. incognita.

Gene Acesso Primer senso Primer antisenso

2E07

AF531160 5'–

GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA

AGC AGG CTT AGC AGG CGA TCG AAG

CGC TTC A–3´

5´-

GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA

AGC TGG GTC TCA CAT TTT CAT AGT

ACA AGC-3´

7E12

AF531166 5'–

GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA

AGC AGG CTT AGC AGG CGA TCG AAA

TGC ATC-3´

5´-

GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA

AGC TGG GTC TTA AAC AGT ATT AGC

TCT TCC-3´

17H02

AY134437 5'–GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA

AGC AGG CTT AGT GAA TAC AGG CAT

TCC GAG C-3´

5´-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA

AGC TGG GTC TTA GTT CAT CAT ATT

TTT GC-3´

Os produtos das PCRs foram então clonados no vetor pDONR™221 para obter

clones de entrada (pENTR). Os clones de entrada foram recombinados para vetores

destino ((pk7GWIWG2(I), pk7Wgf2)), gerando os vetores de expressão (Figura 1).

108

Figura 1. Desenho esquemático das construções para expressão de dsRNA e das proteínas

de secreção de M .incognita, codificadas pelos genes 2E07, 7E12 e 17H02 (construções

pk72E07, pk77E12 e pk717H02 em tabaco. (A) Construção para a expressão de dsRNA

em plantas de fumo (B) Construção para a super-expressão das proteínas de secreção

(

gf2E07, gf7E12 e gf17H02). BE e BD correspondem a borda esquerda e borda direita do

DNA de transferência, respectivamente. GPS corresponde ao gene codante para a proteína

de secreção de

M. incognita, que pode ser 2E07, 7E12 ou 17H02. GFP corresponde à

proteína fluorescente “green fluorescent protein” e Kan representa o gene de resistência a

canamicina, o npt2. GPS representa os genes para as proteínas de secreção 2E07, 7E12 e

17H02 e t é o terminador do promotor 35S

Transformação de plantas de fumo.

As construções gf2E07, gf7E12 e gf17H02 para a expressão das proteínas de

secreção em fusão com GFP e dos dsRNAs (construções pk72E07, pk77E12 e pk717H02),

foram eletroporadas para a linhagem EHA 105 de Agrobacterium tumenfasciens. Os clones

positivos para cada construção foram utilizados para a transformação de plantas de

Nicotiana tabacum (xantii) usando o método das co-culturas de discos foliares

multiplicadas in vitro, de acordo com a metodologia prescrita por Horsch, Fry et al. (1985).

INTRON

GPS

35S

Kan

INTRON

GPS

35S

Kan

GPS

35S t

Kan

GFP

GPS

35S t

Kan

GFP

109

Desafio das plantas transgênicas expressando dsRNA.

O inóculo para o desafio das plantas transgênicas de fumo foi produzido em casa de

vegetação, onde os transformantes primários (T0), plantados em vasos com 3 kg de solo,

foram inoculados com 10000 ovos de M.incognita, enquanto as progênies (T1) das

linhagens T0 resistentes, acondicionadas em jarros com 400 g de substrato, foram

desafiadas com 3000 ovos do nematóide. Passados 45 dias, as raízes foram removidas e

coradas com floxina, um corante usado para a visualização das massas de ovos. Os ovos

totais de cada raiz foram extraídos com hipoclorito de sódio 0,5% e contados em

microscópio com o auxílio de uma câmara de Peters. Para a avaliação da resistência de

todas as plantas a M. incognita foi determinado o número total de ovos por grama de raiz,

onde foram comparadas as plantas contendo as construções pk72E07, pk77E12 e

pk717H02 com as plantas controles não transgênicas. A diferença na massa de terra entre

os dois experimentos se deveu a necessidade de fazer o segundo experimento com maires

propoções de raiz por volume de jarro.

Avaliação da expressão das proteínas de secreção 2E07 e 7E12 em fusão com GFP.

Inóculo e avaliação do perfil da infecção das plantas por

M. incognita.

Cerca de 600 J2s foram inoculados por planta de tabaco N. tabucum (Var. Xantii)

cultivadas em casas de vegetação. Passados 45 dias após a inoculação, as raízes foram

removidas individualmente, lavadas com água corrente e processadas para a extração dos

ovos segundo a metodologia prescrita por Hussey and Barker (1973). Os ovos obtidos

foram contados com auxílio de câmaras de Peters para a avaliação do sucesso reprodutivo

dos nematóides. Com o objetivo de avaliar o efeito das plantas transgênicas sobre a

110

progênie de M. incognita, foram romovidas 40 massas de ovos das plantas trangênicas e

dos controles. O número de J2s eclodidos depois de 24h e 48h foi determinado.

Preparação das raízes de N. tabacum para a microscopia.

Com o objetivo de avaliar o perfil microscópio das células gigantes durante o

parasitismo, foi estabelecida uma curva de tempo de 08, 16 e 28 dias após a inoculação.

Em cada um desses momentos, foram coletados amostras do meristema apical e dos

internódulos das raízes secundárias de 5 plantas por construção e das plantas controles. Os

fragementos de raiz foram então fixados em glutaraldeído 2% e em seguida desidratados

sequencialmente em soluções de etanol a 10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % e por fim 100 %.

O material foi em seguida, emblocado em resina Technovit 7100 (EMS cat. n. 14655). Os

blocos foram então cortados com o auxílio de um micrótomo MICRON HM 360 (2-4 µm).

Os cortes foram corados com azul de toluidina e visualizados em microscopia de campo

claro.

Imunodetecção da GFP nas plantas transgênicas.

Cerca de 1g de raízes de cada planta foi utilizado para obter os extratos proteicos a

serem avaliados. Amostras removidas após 16 dias da infecção pelo nematóide foram

trituradas em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,0, contendo cloreto de sódio 20 mM,

2 mM de DTT e 0,1% de PMSF. As amostras foram então deixadas em agitação leve

durante duas horas e, em seguida, submetidas a uma centrifugação (8,000 x g por 30

minutos) a 4 ºC. Os sobrenadantes das centrifugações foram separados dos precipitados e

constituíram os extratos brutos. Para determinar a concentração de proteínas em cada

amostra, foi utilizado o método de Bradford (Bradford 1976). Para a realização do

111

imunoensaio “Dot Blot”, foram utilizados entre 50-450 g de proteínas em cada ensaio. As

amostras de proteínas foram então precipitadas com acetona segundo Hames and

Rickwood (1981) e ressuspendidas em 50 l de tampão fosfato salino (PBS). As proteínas

foram então transferidas para a membrana “Imobilon-P”, tratada previamente com metanol

usando um concentrador a vácuo (Bio-Rad). Após esse período, as membranas foram

transferidas para um tubo falcon de 50 mL coberto com papel alumínio. A membrana ficou

imersa na solução de bloqueio (tampão fosfato salino) e o tubo foi agitado a 4 ºC durante 2

horas. Depois disso, cada membrana foi lavada três vezes em tampão fosfato salino pH 7,5,

contendo 5 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, Tween 20 (1%), e leite (1%). A membrana foi,

em seguida, incubada durante a noite em agitação a 4 ºC com o anticorpo Anti-GFP

(1:5000) de coelho (fração IgG) conjugado com Fluor 594 (Alexa - Invitrogen). Após esse

procedimento, as membranas foram lavadas três vezes em PBS pH 7.5, contendo Tris-HCl

5 mM, NaCl 15 mM e Tween 20 (1%). Por fim as membranas foram analisadas em

microscópio de fluorescência.

RESULTADOS.

Clonagem dos potenciais genes de parasitismo de M. incognita.

Baseado nas seqüências descritas por Huang, Gao et al. (2003), foram clonados três

genes novos, ou seja, que não apresentam domínio conservado ou qualquer similaridade

com as seqüências não redundantes do GeneBank (GeneBank,

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). A subclonagem dos fragmentos de PCR demonstrou que

as seqüências correspondem aos genes AY134437 – 17H02; AF531166 – 7E12 ;

AF531160 – 2E07, clonados inicialmente por Huang, Gao et al (2003) (Figura 1 A, B, C).

112

Alinhamento de nucleotídeos

2E07subcl GCAGGCGATCGAAGCGCTTCAACCTCTACCGGTTGTACAACCTATTTTGGCTTGCTTGAT 60

2E07 GCAGGCGATCGAAGCGCTTCAACCTCTACTGGTTGTACAACCTATTTTGGAATGCTAGAT 60

***************************** ******************** **** ***

2E07subcl CATGCGGATACCAAGGAAAATAACACAAGAAAAACTTTCAAACCCAACGATAAAACCAAA 120

2E07 CATGCGGATACCAAGGAAAATAACAAAAGAAAAACTTTCAAACCCAACGATAAAACCATA 120

************************* ******************************** *

2E07subcl TCCAACACCTTGCAAGTGACTGGTGGGGCAATGTTCAGCAATACCTCGGTGGCGTTGGTT 180

2E07 TCCAACACTTTGCAAGTGATTGGTGGGACAAAGTTCAGCAATACCTCGGTGGCGTTGGTT 180

******** ********** ******* *** ****************************

2E07subcl GTCGGTGATAAGGCGTTATGTATGGCTAAGACAGGAAGTTCAGACGATTGCGGAATGCGC 240

2E07 GTCGGTGATGAGGTGTTATGTATGGCTAAGACAGGAGGTTCAGGCGATTGCGGAATGCGC 240

********* *** ********************** ****** ****************

2E07subcl TACGATGCTTTGACTGGAACAATGAAATTTATCATTTCTGATAATATTACTGTTGAAGTT 300

2E07 TACGATGCGTTGACTGGATCAATGAAATTTATCATTTCTGATAATATTATTGTTGAGGTT 300

******** ********* ****************************** ****** ***

2E07subcl CCATTTGAAGACGTTTTTTTCTTCACCGACAACAAGTGTGTCATCCAGCTTGTAAGCTAC 360

2E07 CCATTTGAAGGCGTTTTTTTCTTCACCGACAACAAGTGTGTCATCCAGCTTGTAGGCTAC 360

********** ******************************************* *****

2E07subcl GATAATAAAACTAATAAAACTCTTCTCAAAATTAATGATGTCGACTTCAAAATTATCCCT 420

2E07 GATATTAAAACTAATATAACTCTTCTCAAAATTAATGATGTCGACTTCAAAATTGTCCCT 420

**** *********** ************************************* *****

2E07subcl ACTGATAAGAAAATTTCCCCGAAGGCTTGTACTATGAAAATGTGA 465

2E07 ACTGATAAGAAAATTTCCCCGAAGGCTTGTACTATGAAAATGTGA 465

*********************************************

Alinhamento de aminoácidos

2E07subcl AGDRSASTSTGCTTYFGLLDHADTKENNTRKTFKPNDKTKSNTLQVTGGAMFSNTSVALV 60

2E07 AGDRSASTSTGCTTYFGMLDHADTKENNKRKTFKPNDKTISNTLQVIGGTKFSNTSVALV 60

*****************:**********.********** ****** **: *********

2E07subcl VGDKALCMAKTGSSDDCGMRYDALTGTMKFIISDNITVEVPFEDVFFFTDNKCVIQLVSY 120

2E07 VGDEVLCMAKTGGSGDCGMRYDALTGSMKFIISDNIIVEVPFEGVFFFTDNKCVIQLVGY 120

***:.*******.*.***********:********* ******.**************.*

2E07subcl DNKTNKTLLKINDVDFKIIPTDKKISPKACTMKM 154

2E07 DIKTNITLLKINDVDFKIVPTDKKISPKACTMKM 154

* *** ************:***************

Alinhamento de nucleotídeos

7E12subcl GCAGGCGATCCAAATGCATCAGCTTCAAGCCCTGGTTGTATGCAGGTTGCAACCCTTATT 60

7E12 GCAGGCGATCGAAATGCATCAGCTTCAAGCCCTGGTTGTATGCAGGTTGCAACCCTTATT 60

********** *************************************************

7E12subcl CATACAGGGGAAATTCGCCCAGCAAAAGCAAACAAACCAGGTGTACAAAATACTCTAAAA120

7E12 CATATAGGGGAAATTCGCCCAGCAAAAGCAAACAAACCAGGTGTACAAAATACTCTAAAA120

**** *******************************************************

7E12subcl ATGTCTGGAAATGTTCAAACATTCACAACTACTCAACTGACATTACAAGTAGCTGGGCAA180

7E12 ATGTCTGGAAATGTTCAAACATTCAAAACTACTCAAGTGACATTACAAGTAGCTGGGCAA180

************************* ********** ***********************

7E12subcl GAGCCTTGTACCGTTAAAATTAATAATGGTGAAACCAAATGTAAAATAACCGGAGATGAA240

7E12 GAGCCTTGTACCGTTAAAATTAATAATGGCGAAACCAAATGTAAAATAACCGGAGATGAA240

***************************** ******************************

7E12subcl CTAAATGGAAAATTAATTTTCAAAACTGAAAAAGGAACTGAAACTTCTGCTTCTTTCGAA300

7E12 TTAAATGGAAAATTAATTTTCAAAACTGAAAAAGGAACTGAAATTTCTGCTTATTTCGAA300

****************************************** ******** *******

7E12subcl CAGGCTAAATTCTTTTCTGAAAATAAGTGTGTTATTGAGCTTGACACTTATAACAAGGAA360

7E12 CTGGTTCCATTATTTTCTGAAAATAAGTGTGTTATTGAACTTGACACTTATAACAAGGAA360

* ** * *** ************************** *********************

(A)

(B)

113

7E12subcl ACCCATGAAACTAAACTTAAAATTAATGGGAAATATTTTATGATTAAAAAGAAGGAAGGT420

7E12 ACCCATGAAACTAAACTTAAAATTAATGGAAATAATTTTATGATTAAAAAGAAGGAAGGT420

***************************** ** **************************

7E12subcl AGTGTGTCAATTAAGTGTGGTGGAAGAGCTAATACTGTTTAA 462

7E12 AATGTGTCAATTAAGTGTGGTGGAAGAGCTAATACTGTTTAA 462

* ****************************************

Alinhamento de aminoácidos

7E12subcl AGDPNASASSPGCMQVATLIHTGEIRPAKANKPGVQNTLKMSGNVQTFTTTQLTLQVAGQ 60

7E12 AGDRNASASSPGCMQVATLIHIGEIRPAKANKPGVQNTLKMSGNVQTFKTTQVTLQVAGQ 60

*** ***************** **************************.***:*******

7E12subcl EPCTVKINNGETKCKITGDELNGKLIFKTEKGTETSASFEQAKFFSENKCVIELDTYNKE 120

7E12 EPCTVKINNGETKCKITGDELNGKLIFKTEKGTEISAYFELVPLFSENKCVIELDTYNKE 120

********************************** ** ** . :****************

7E12subcl THETKLKINGKYFMIKKKEGSVSIKCGGRANTV 153

7E12 THETKLKINGNNFMIKKKEGNVSIKCGGRANTV 153

**********: ********.************

Alinhamento de nucleotídeos

17H02subcl GTGAATACAGGCATCCCGAGCGGATCTTCTCCACCCTCTTCTGCTTGTGACACTTACAAG 60

17H02 GTGAATACAGGCATTCCGAGCGGATCTTCTCCACCCTCTTCTGCTTGTGAGACTTACAAG 60

************** *********************************** *********

17H02subcl GGCAAAATTGAGCACATGCCAGAAACCGCCAGAAAAATTGAATGGAAGGAAAATACTCCC 120

17H02 GGCAAAATTGAGCACATGCCAGAAACCGCCAGAAAAATTGAATGGAAGGAAAATACTCCC 120

************************************************************

17H02subcl GGAGGAAAGCATTCAATCCTTAAAAAGTCTATTCAAGGTCTAGACAAAGTAACCCTCAAA 180

17H02 GGAGGAAAGCATTTAATCCTTAAAAAGTCTATTCAAGGTCTAGACAAAGTAACCCTCAAA 180

************* **********************************************

17H02subcl ATTGAAGGCAAAGAATGTAGTGCTTCCCTCAACAACCCTGGAACATGTCAAGTCGATGGA 240

17H02 ATTGAAGGCAAAGAATGTAGTGCTTCCCTCAACAACCCTGGAACATGTCAAGTCGATGGA 240

************************************************************

17H02subcl CAGTCCCATGCCGGTCAATTAGTCTTTGTAACTTCAAAGGCTAAAATTGAGGTTGACTTT 300

17H02 CAGTCCCATGCCGGTCAATTAGTCTTTGTAACTTCAAAGGCTAAAATTGAGGTTGACTTT 300

************************************************************

17H02subcl GGGGAAGCTCAAATCTTCTCAGGGAACAAGTGCGAGATTGAAATTGAGAAGTATGACCGT 360

17H02 GGGGAAGCTCAAATCTTCTCTGGGAACAAGTGCGAGATTGAAATTGAGAAGTATGACCGT 360

******************** ***************************************

17H02subcl GCTACCTACGTAACTCTAATCAAAATTAATGGGGGTGACTTCAAAATTACGCCTGATTCG 420

17H02 GCTACCTACGTAACTCTAATCAAAATTAATGGGGGTGACTTCAAAATTACGCCTGATTCG 420

************************************************************

17H02subcl CCACCTATGCCGATGCCATGCAAAAATATGATGAACTAA 459

17H02 CCACCTATGCCGATGCCATGCAAAAATATGATGAACTAA 459

***************************************

Alinhamento de aminoácidos

17H02subcl VNTGIPSGSSPPSSACDTYKGKIEHMPETARKIEWKENTPGGKHSILKKSIQGLDKVTLK 60

17H02 VNTGIPSGSSPPSSACETYKGKIEHMPETARKIEWKENTPGGKHLILKKSIQGLDKVTLK 60

****************:*************************** ***************

17H02subcl IEGKECSASLNNPGTCQVDGQSHAGQLVFVTSKAKIEVDFGEAQIFSGNKCEIEIEKYDR 120

17H02 IEGKECSASLNNPGTCQVDGQSHAGQLVFVTSKAKIEVDFGEAQIFSGNKCEIEIEKYDR 120

************************************************************

17H02subcl ATYVTLIKINGGDFKITPDSPPMPMPCKNMMN 152

17H02 ATYVTLIKINGGDFKITPDSPPMPMPCKNMMN 152

********************************

Figura 1. Alinhamentos das sequencias AF531160 (2E07), AF531166 (7E12), AY134437

(17H02) com os genes subclonados. Onde (A) corresponde ao alinhamento do gene 2E07

original com o subclonado 2E07subcl, (B) corresponde ao alinhamento do gene 7E12

original com o subclonado 7E12subcl (C) corresponde ao alinhamento do gene 17H02

original com o subclonado 17H02subcl. Nos alinhamentos de nucleotídeos, “*” significa

que os mesmos são idênticos entre as seqüências e o espaço em branco indica que os

(C)

114

nucleotídeos são diferentes. No alinhamento de proteínas, “*”significa que os aminoácidos

são idênticos, dois pontos “:” significa que os resíduos de aminoácidos são fortemente

semelhantes, apenas um ponto”.” indica que os resíduos são fracamente semelhantes e o

espaço significa que são diferentes em todos os aspectos.

Hibridização in situ.

A hibridização in situ utilizada nesse estudo confirmou que a expressão do gene

2E07 é exclusivamente localisado na glândula esofagiana dorsal do parasita, ratificando os

resultados descritos anteriormente por Huang, Gao et al. (2003)(Figura 2).

Estilete.

Glândula

esofagiana

dorsal.

Bulbo mediano

do esôfago.

Figura 2. Localização da expressão do gene 2E07 exclusivamente na glândula

esofagiana dorsal de M. incognita, por hibridização in situ “Whole mount”.

115

Transformação de plantas de fumo.

As folhas não transgênicas usadas como controle não desenvolveram calos como

esperado e morreram (Figura 3A). Folhas de plantas transgênicas desenvolveram calos e

em seguida plântulas que enraizaram e foram transferidas individualmente para tubos

isolados com meio e canamicina (Figura 3 B-C). Quando atingiram cerca de 10 cm, as

plantas resistentes á canamicina que enraizaram foram transferidas para solo em casa de

vegetação e depois de aclimatadas transferidas para vasos maiores (Figura 3D).

Figura 3. Obtenção de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) por

transformação de discos foliares. (A) Fragmentos foliares

amarelados de plantas não transgênicas mortos pela ação da

canamicina; (B) calos e plântulas desenvolvidos na periferia dos

discos foliares; (C) plântulas obtidas a partir da regeneração dos

calos; (D) plantas de 4 meses acondicionadas em solo em casa de

vegetação.

116

Expressão ectópica dos genes de parasitismo 2E07, 7E12.

O resultado deste experimento demonstrou a presença da proteína GFP nos

extratos de raízes da plantas 2E07, 7E12 e do controle positivo. A intensidade de

fluorescência emitida pelo extrato da planta 2E07 foi maior do que aquela observada para o

extrato da planta

7E12, indicando um maior nível de expressão protéica daquele mutante.

Nenhuma emissão de fluorescência foi observada para o controle negativo (Figura 4).

Controle - Controle + 2E07 7E12

Inóculo e avaliação do perfil da infecção das plantas por M. incognita.

Durante todo o período de avaliação (08, 16 e 28 dias após os inóculos), as plantas

transgênicas 2E07 e 7E12 apresentaram galhas de tamanhos maiores e mais alongadas

quando comparadas às galhas das raízes das plantas controle não transgênicas (Figura 5).

Figura 4 - Dot blot utilizando 400



g dos extratos protéicos de raízes das

plantas de

Nicotiana tabacum não transformadas (controle -) e

transformadas com os genes 2E07 e 7E12, específicos da glândula

esofagiana dorsal de Meloidogyne incognita e, 50 g de extratos protéicos

de raízes de plantas transformadas com o gene GFP (controle +).

117

Figura 5. Plantas de Nicotiana tabacum inoculadas com J2 de M. incognita e coletadas em

diferentes pontos da curva de tempo exibindo galhas de tamanhos diferentes. Onde

podemos observar que, as galhas desenvolvidas na raiz da planta controle não-transgênica

se desenvolveram mais lentamente e se apresentaram menores do que as raízes trangênicas

2E07 e 7E12 considerando todos os pontos da curva de tempo, 08, 16 e 28 dias.

O número médio de galhas observado para cada uma das 16 plantas dos diferentes

mutantes, após 08 e 16 dias de infecção, foram significativamente maiores do que o

observado para a media de galhas de cada uma das 16 plantas utilizadas como controle de

acordo com o teste de Tukey p < 0,001 (Figura 6). Após 28 dias de infecção, uma média

de 600 galhas foram observadas tanto para as plantas controle quanto para as plantas

transformadas (Figura 6). Estes resultados indicam que o processo e formação das galhas

aconteceu de maneira mais rápida nas plantas transformadas do que nas plantas controle

reforçando os dados observados nas análises morfológicas.

118

Figura 6 - Avaliação do numero de galhas de plantas de Nicotiana

tabacum carreando os genes, 2E07 e 7E12 coletadas 08, 16 e 28 dias

após a inoculação com J2 de Meloidogyne incognita.

O teste de avaliação da eclosão de J2 usando massas de ovos isoladas 45 dias após a

infecção das plantas controle e transformadas apresentou uma grande variação, porém, o

número de J2 recuperados foi significativamente nos mutantes comparado-os aos controles

não transgênicos de acordo com o teste de Tukey (p<0,001)(Figura 7).

Controle 2E07

700

600

500

400

300

200

100

7E12

Número de galhas

08 dias

16 dias

28 dias

Controle 2E07

700

600

500

400

300

200

100

7E12

Número de galhas

08 dias

16 dias

28 dias

119

Avaliação microscópica das células gigantes.

Os resultados da avaliação microscópica das células gigantes das plantas controle e

transformadas de N.tabacum exibiram morfologia e tamanhos bastante variados. Nas

galhas das raízes das plantas transgênicas 2E07 (Figura 8) e 7E12 (Figura 9), as células

gigantes se apresentaram mais volumosas, com invaginações na membrana plasmática bem

mais pronunciadas do que nas plantas controle. Adicionalmente, o número das células

vizinhas nos mutantes, foi evidentemente mais acentuado do que nas plantas não

transgênicas.

600

400

300

200

100

500

Controle 2E07 7E12

J2s eclodidos após 24h

J2s eclodidos após 48h

Número de J2 eclodidos

600

400

300

200

100

500

Controle 2E07 7E12

J2s eclodidos após 24h

J2s eclodidos após 48h

Número de J2 eclodidos

Figura 7. Teste de avaliação da eclosão de juvenis de Meloidogyne

incognita de plantas transformadas e controle após 45 dias da inoculação

com o nematóide.

120

Controle

10X

Controle

Figura 8. Análise histopatológica das raízes de Nicotiana tabacum 08 dias após a

inoculação com Meloidogyne incognita. Onde controle, corresponde a planta não

transgênica usada no experimento e 2E07 é a planta transgênica com 8 dias de

inoculo. CG = célula gigante; IN = invaginação; V = vacúolo; N = núcleo; Nem =

nematóide; CV = células vizinhas.

Nem

Controle

2E07

Nem

Controle

2E07

100m

Nem

Controle

2E07

Nem

Controle

2E07

100m

121

Controle

Figura 9. Análise histopatológica das raízes de Nicotiana tabacum 08 dias após a

inoculação com Meloidogyne incognita. Onde controle, corresponde a planta não

transgênica usada no experimento e 7E12 é a planta transgênica com 8 dias após a

inoculação. CG = célula gigante; IN = invaginação; V = vacúolo; N = núcleo; Nem =

nematóide; CV = células vizinhas.

Nem

Controle

7E12

Nem

Controle

7E12

100m

Nem

Controle

7E12

Nem

Controle

7E12

100m

122

Expressão ectópica de dsRNA em plantas de fumo.

As plantas transgênicas contendo os genes 2E07, 7E12 ou 17H02 conferiram

resistência ao nematóide, sendo que o percentual de resistência variou de 85-91%. O

número médio de ovos por grama de raiz, considerando as três construções foi

significativamente menor do que o ocorrido para as plantas controle segundo o teste de

Tukey (p < 0.001) (Figura 10 A). Algumas plantas contendo a construção pk717H02 se

mostraram praticamente imunes ao inoculo, não apresentando sequer uma galha ou massa

de ovos externa ou ovos internos (Figura 10 C), enquanto que as plantas transformadas

com o vetor desarmado se mostraram repletas de massas de ovos quando coradas com

floxina (Figura 10 B).

123

Figura 10. Análise da resistência de plantas transgênicas expressando dsRNA contra os transcritos

dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 de Meloidogyne incognita. (A) Média do número de ovos por grama

de raiz, em plantas de fumo, 45 dias após a inoculação. Cada planta foi desafiada com 10000 ovos de

M. incognita. Como controle positivo da infecção foram usadas plantas de tabaco transformadas com

o vetor desarmado. (B e C) Raízes de Nicotiana tabacum após 45 dias da inoculação com 10.000

ovos de M. incognita, onde as raízes da planta controle (vetor) se encontram repletas de massas de

ovos reveladas pelo corante floxina e as das plantas transgênicas (pk717H02) que aparentemente não

apresentam nenhuma massa de ovos.

Vetor pk7Mi1 pk7Mi7 pk7Mi18

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Ovos por grama de raíz

Controle

pk72E07

pk77E12

17H02

Vetor pk7Mi1 pk7Mi7 pk7Mi18

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Ovos por grama de raíz

Controle

pk72E07

pk77E12

17H02

pk717H02

Vetor pk7Mi1 pk7Mi7 pk7Mi18

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Ovos por grama de raíz

Controle

pk72E07

pk77E12

17H02

Vetor pk7Mi1 pk7Mi7 pk7Mi18

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Ovos por grama de raíz

Controle

pk72E07

pk77E12

17H02

pk717H02

124

DISCUSSÃO.

O principal foco deste estudo foi avaliar a participação de três genes novos no

processo de parasitismo de M. incognita. Para isso, foram utilizadas plantas hospedeiras

expressando dsRNA específicos para transcritos dos referidos genes. Adicionalmente,

construções para superexpressão destas proteínas de secreção foram introduzidas em

plantas de fumo com o objetivo de avaliar seus efeitos nas raízes do hospedeiro. Apesar

das discrepâncias (polimorfismos), as seqüências aqui utilizadas a princícpio foram

descritas por Huang, Gao et al., (2003). Identificar e caracterizar genes de nematóides, são

excelentes estratégias para o entendimento de processos biológicos vitais como a

alimentação, desenvolvimento, sinalização, reprodução e longevidade (Antoshechkin and

Sternberg 2007; Mukhopadhyay and Tissenbaum 2007), bem como para a compreensão

das interações de vários nematóides parasitas com seus hospedeiros (Gheysen and

Vanholme, 2007; Knox, Geldhof et al. 2007). Um grande número destas seqüências

obtidas por projetos de genômica ou transcriptômica, entretanto, codificam para proteínas

com função desconhecida (genes novos), considerando também os nematóides parasitas de

plantas e animais (Ghedin, Wang et al. 2004; Parkinson, Mitreva et al. 2004).

Surpreendentemente, em bibliotecas que incluem apenas genes especificamente expressos

nas glândulas esofagianas de M. incognita e H. glycines, o percentual de seqüências

pioneiras atinge cerca 89% e 72%, para as duas espécies, respectivamente (Gao, Allen et

al. 2003; Huang, Gao et al. 2003), indicando que grande parte dos genes expressos nas

glândulas esofagianas destas espécies de fitonematóides é constituída de proteínas novas,

sem domínios e seqüências conhecidas, o que não nos permite classificá-las

funcionalmente em famílias gênicas específicas.

125

Adicionalmente, é freqüente ocorrer discrepâncias entre as classificações das

sequncias in silico e a atividade biológica da proteína após sua validação funcional. Como

exemplo, pode ser citado o inibidor ativo de xilanase isolado de arroz, que possui estrutura

primária similar às quitinases da família GH18 (Durand, Hughes et al. 2005). Além de

serem novos, os genes selecionados no presente estudo são exclusivamente expressos na

glândula dorsal de M. incognita em estádios avançados do parasitismo como mostra a

hibridização in situ (Figura 2).

Como já foi mencionado, na transição entre penetração na raiz hospedeira e a

indução e manutenção do sítio de alimentação, a glândula dorsal do parasita se desenvolve

e acumula uma grande quantidade de grânulos protéicos. Estas evidências contribuem com

a hipótese de que é na glândula dorsal de fitonematóides endoparasitas sedentários onde é

expressa a maioria dos fatores relacionados com o controle das funções celulares do

hospedeiro para a sustentação do parasitismo (Baum, Davis et al. 2007).

A expressão dos genes 2E07 e 7E12 não ocasionou alterações fenotípicas externas

observáveis nas plantas de fumo transgênicas em relação às plantas controles não

transgênicas. Por outro lado, a avaliação das plantas infectadas com M. incognita após 08,

16 e 28 dias, revelou diferenças nos sintomas das raízes causados pelos parasitas. Essas

diferenças sugerem que a expressão das proteínas de secreção nas plantas transgênicas,

somado à ação dos fitonematóides, podem provocar um desenvolvimento prematuro dos

sintomas do parasitismo. Dentre esses, pode ser citado o desenvolvimento de galhas nas

raízes, que apareceram bem evidentes nas plantas transgênicas após 8 dias das inoculações,

enquanto que nos controles não transgênicos não foram evidenciadas galhas nesse

momento. Nos demais períodos de coleta (16 e 28 dias), as galhas nas raízes também se

apresentaram maiores nas plantas transgênicas, reforçando a hipótese do desenvolvimento

126

precoce. Outra análise que suporta essa inferência é o número de galhas formadas por raíz.

Esse número foi significativamente maior para as plantas transgênicas aos 08 e aos 16 dias

da inoculação, entretanto, após 28 dias, o número médio de galhas por planta transgênica

não foi estatisticamente diferente das plantas controle. Adicionalmente, o número de J2s

após a eclosão dos juvenis das plantas transgênicas (24 h e 48 h) foi significativamente

maior do que nas plantas controle. Isso sugere que o desenvolvimento precoce dos

sintomas do parasitismo se reflete também na maior freqüência de eclosão de juvenis dos

ovos depositados nas raízes transgênicas. Essa análise foi feita no final do ciclo dos

nematóides, 45 dias após a inoculação. A avaliação histológica das raízes das plantas

infectadas demonstrou diferenças morfológicas entre as células gigantes formadas nas

plantas transgênicas e não-transgênicas. As diferenças mais marcantes incluem maior

volume da célula gigante e invaginações mais acentuadas da membrana plasmática nas

plantas transgênicas, comparando-se com os controles que demonstraram um formato

celular mais alongado com invaginações pouco evidentes. Essas diferenças sugerem que o

desenvolvimento e amadurecimento das células gigantes podem estar acontecendo de

forma mais acelerada nas plantas transgênicas expressando 2E07 e 7E12. Esses resultados

indicam que as referidas proteínas são importantes para o desenvolvimento dos sítios de

alimentação pelos nematóides de galhas.

Já foi demonstrado que a expressão de genes oriundos de patógenos nos tecidos de

plantas hospedeiras pode levar a uma repetição de certos sintomas resultantes do

parasitismo, indicando assim a importância e, às vezes, a função das proteínas presentes

em um parasitoma. Como exemplo, a expressão de um único gene, o pthA do patógeno

Xanthomonas citri em laranja (Citrus sinensis), é suficiente para provocar divisão e

hipertrofia celular, e ainda morte celular nas plantas transgênicas (Duan, Castaneda et al.

127

1999). O primeiro gene de um nematóide parasita de plantas a ser caracterizado dessa

forma, foi o da corismato mutase de M. javanica (Doyle and Lambert 2003). Nesse

trabalho, a expressão da corismato mutase I de M. javanica em raízes de soja levou a um

fenótipo de raízes laterais reduzidas ou abortadas. A partir deste resultado, acredita-se que

a corismato mutase do nematóide, quando secretada no citoplasma da planta, pode

degradar o corismato, alterando, assim, a via do siquimato, o que pode resultar dentre

outras alterações, na diminuição drástica nos níveis de auxina plastidial, causando o

referido fenótipo. Acredita-se que este evento seja essencial para o início da formação do

sítio de alimentação. Outra proteína que está sendo relacionada a eventos que levam à

formação dos sítios de alimentação é o peptídeo secretório Hg-SYV4 de H. glycines, que

possui motivo C-terminal da família CLAVATA3 de plantas. Quando expresso em plantas

de Arabidopsis, o peptídeo Hg-SYV4 regulou negativamente o fator de transcrição

WUSCHEL, levando a uma redução na população de células meristemáticas, à terminação

prematura do meristema apical e o desenvolvimento de flores sem o gineocio central

(Wang, Mitchum et al. 2005). Finalmente, a expressão de um pequeno peptídeo secretório

de M. incognita (16D10) em A. thaliana leva a um aumento na taxa de divisão celular no

meristema radicular, por interação com um fator de transcrição da familia SCARECROW.

Este é o primeiro relato de interação regulatória entre proteínas de plantas e nematóides,

sendo um importante ponto a ser explorado na compreensão do modelo de interação

planta-nematóide (Huang, Dong et al. 2006; Baum, Davis et al. 2007).

Em outros trabalhos, a expressão de potenciais genes de parasitismo de

fitonematóides em fusão com GFP revelou apenas a localização subcelular e não a função

das proteínas de secreção. Por exemplo, a expressão de uma nova proteína de extensão de

ubiquitina Hs-Ubi1 de H. schachtii em células BY-2 de tabaco levou a um acúmulo do

128

sinal da GFP no núcleo da célula (Tytgat, Vanholme et al. 2004). Por outro lado, uma outra

proteína, a 14-3-3, de secreção de M. incognita, quando expressa em células BY-2,

apresentou um acúmulo preferencialmente citoplasmático, considerando a emissão da

fluorescência pela GFP fusionada (Jaubert, Ledger et al. 2002). A diferença na localização

destas proteínas quando expressas em células hospedeiras constitui mais um importante

resultado a contribuir com o entendimento das interações entre plantas e seus nematóides

parasitas. Uma outra técnica usada neste trabalho, na tentativa de elucidar as funções dos

genes 2E07, 7E12 e 17H02, foi o RNA de interferência (RNAi). Este mecanismo é

diferente da superexpressão em fusão com GFP, que permite ver o efeito da proteína de

secreção do nematóide nos tecidos da planta hospedeira. Pelo contrário, o RNAi provoca a

degradação de um RNA mensageiro que possui seqüência complementar, levando ao

silenciamento do gene alvo (Bakhetia, Charlton et al. 2005). Este processo de nocaute por

RNA pode levar a uma mudança de fenótipo, perda ou diminuição da capacidade infectiva

se o gene for importante para o parasita, revelando assim um potencial alvo para o controle

desses fitopatógenos radiculares. O RNA de interferência foi pela primeira vez descrito em

C.elegans, onde a administração de dsRNA ao respectivo nematóide, pela técnica de

soaking, levou ao silenciamento de um gene específico (Fire, Xu et al. 1998).

Esta técnica também foi aplicada em nematóides de plantas, onde se utilizou os

neurotransmissores octopamina (nematóides de cisto) e resorcinol (nematóides de galhas)

para induzir a larva J2 a se alimentar do dsRNA do meio (Urwin, Lilley et al. 2002; Rosso,

Dubrana et al. 2005). Atualmente outras rotas para a administração do RNAi em

fitonematóides já são conhecidas e incluem: absorção via anfidios, poro

excretório/secretório e ovos ou ingestão de plantas transgênicas expressando dsRNA

(Huang, Allen et al. 2006; Yadav, Veluthambi et al. 2006; Lilley, Bakhetia et al., 2007). Os

129

resultados obtidos aqui até o momento demonstraram que a introdução de dsRNAs

homólogos aos transcritos dos genes 2E07, 7E12 e 17H02 em N. tabacum resultou em

plantas com alta resistência ao parasita M. incognita. Os níveis de resistência variaram de

85% a 91%, e as diferenças entre as plantas dsRNA positivas e os controles foram

significativas de acordo com o teste de Tukey (p < 0,001), n = 3-11.

Outros trabalhos já demonstraram anteriormente que a expressão de dsRNA em

plantas hospedeiras leva ao silenciamento de genes alvo no nematóide que se alimenta da

planta. No primeiro trabalho (Yadav, Veluthambi et al. 2006), plantas transgênicas de

fumo expressando dsRNA contra uma integrase e um fator de splicing de M. incognita se

tornaram altamente resistentes. Neste caso, poucas plantas (Fator de splicing - 2 de 25;

integrase – 6 de 19) apresentaram galhas pequenas e contendo fêmeas mal formadas e

transparentes. Em um outro trabalho, (Huang, Allen et al. 2006) demonstraram que plantas

transgênicas de Arabidopsis adquiriram resistência de até 96% ao expressarem dsRNA

contra transcritos do gene 16D10 Huang, Gao et al. (2003) de glândula salivar de M.

incognita. Estes resultados foram bastante similares aos obtidos neste estudo para os genes

2E07, 7E12 e 17H02, contribuindo para o fato de que plantas transgênicas expressando

dsRNA, contra genes envolvidos com a fitopatogenicidade, podem ser uma importante

ferramenta para o controle de fitonematóides. Adicionalmente, plantas de soja expressando

dsRNA específico para a proteína mais abundante do esperma (MSP) de H. glicynes

suprimiram em cerca de 32% a reprodução do parasita, comparando com as plantas

controle. Surpreendentemente, a inoculação destes ovos da progênie em outras plantas

dsRNA-MSP resultou em uma resistência de 75%, sendo este o primeiro relato de que o

efeito do RNAi em um nematóide parasita de planta pode passar para a progênie do

mesmo, afetando a sua capacidade de infectar o hospedeiro (Steeves, Todd et al. 2006).

130

Em contradição a estes resultados, expressão de dsRNA em plantas de tabaco

contra transcritos MjTis11, um fator de transcrição expresso em ovos e em fêmeas

produtoras de ovos, não resultou em qualquer resistência a M. javanica. Este gene foi

selecionado tendo em vista que o nocaute de homólogos no nematóide C.elegans levou a

um fenótipo letal (Fairbairn, Cavallaro et al. 2007). Este resultado exemplifica que não só a

presença ou o nível de expressão de um gene é suficiente para determinar a sua

importância, tornando-se necessário o uso de técnicas de genética reversa (RNAi)

complementando técnicas como a hibridização in situ, microarranjos, PCR em tempo real

dentre outras. Vários outros trabalhos utilizando a técnica de “soaking” para a

administração de dsRNAs em fitonematoides têm revelado que o silenciamento de

proteinases, quitina sintases, celulases, pode levar à incapacidade ou diminuição da

capacidade de desenvolvimento de um nematóide que infecta uma planta. Em um desses

trabalhos, o nocaute de genes de proteinases cysteínicas e de uma proteína tipo lectina

levou a alteração da proporção sexual favorecendo machos e prejudicou o estabelecimento

dos nematóides do cisto nas raízes (Urwin, Lilley et al. 2002). Neste caso, foi utilizada a

técnica de “soaking” utilizando um neurotransmissor (octopamina) para induzir os juvenis

infectivos (J2s) a se alimentarem das moléculas do meio, incluindo dsRNA. Logo em

seguida foi demonstrado que o neurotransmissor a ser aplicado em nematóides formadores

de galhas (Meloidogyne) seria o resorcinol ou resorcina (Rosso, Dubrana et al. 2005).

A partir daí a aplicação de RNA de interferência em nematóides parasitas de

plantas utilizando o “soaking” já demonstrou a participação de diversos genes no

parasitoma de fitonematóides. Em um desses trabalhos, (Chen, Rehman et al. 2005)

alimentaram juvenis de segundo estádio (J2) de G. rostochiensis com dsRNAs contra uma

glucanase (Gr-eng) e uma proteína de secreção dos anfidios deste parasita (gr-ams-1). O

131

tratamento com Gr-eng dsRNA reduziu significativamente a capacidade dos nematóides

penetrarem na raiz, indicando que o nematóide precisa desta celulase para romper os

tecidos da raiz enquanto penetra na planta. No tratamento com gr-mas-1 dsRNA, os

nematóides foram incapazes de localizar a raiz no solo e, por isso, o potencial de

penetração dos juvenis foi bastante reduzido. Imergindo ovos de

M. artiellia em uma

solução de dsRNA contra a sua quitina sintase, foi prejudicial ao desenvolvimento dos

ovos e inibiu a eclosão dos juvenis (Fanelli, Di Vito et al. 2005). A introdução da dual

oxidase dsRNA em J2 de

M. incognita via soaking levou a uma diminuição significativa

no número de fêmeas estabelecidas na raiz e, conseqüentemente, de ovos depositados. A

dual oxidase está provavelmente envolvida na síntese da cutícula do nematóide, que é

muito importante na fase que precede a ecdise e na expansão do corpo da fêmea (Bakhetia,

Charlton et al. 2005).

Juntamente com as recentes publicações acima citadas, os resultados obtidos neste

trabalho constituem uma importante contribuição para o entendimento do modelo de

interação, plantas-fitonematóides. Além disso, a resistência adquirida pelas plantas

expressando o dsRNA confirmam, que o RNA de interferência é uma estratégia promissora

a ser utilizada para a criação de plantas transgênicas resistentes a M. incognita.

132

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DO TRABALHO.

CONCLUSÕES

 Os genes de resistência expressos diferencialmente na biblioteca de cDNA de algodão

podem estar relacionados com mecanismos de resistência que levam a resposta de

hipersensibilidade, resposta sistêmica adquirida e a resposta vegetal ao estresse abiótico.

 As plantas de tabaco transformadas com os genes 2E07, 7E12 em fusão com GFP

apresentaram aspecto normal. Porém, quando infectadas com os nematóides apresentaram

uma evolução prematura da doença. Esse fato pode ser confirmado em vários

experimentos, principalmente os de microscopia, onde as células gigantes nas plantas

transgênicas apresentaram evolução prematura passados 8 dias dos inóculos, sendo mais

volumosas e com invaginações mais pronunciadas do que nas plantas controle.

 As plantas transgênicas expressando dsRNAs contra transcritos dos genes 2E07, 7E12 e

17H02 foram significativamente resistentes ao nematóide de galhas M. incoginia.

PERSPECTIVAS

É de grande interesse para a economia agrícola, a criação de cultivares transgênicos

com alta e ampla resistência a nematóides. A introdução de um dsRNA em plantas nos

permite silenciar até grupos gênicos em pragas ou patógenos, desde que sejam

selecionadas regiões conservadas das seqüências. Os resultados obtidos neste trabalho

indicam que a expressão em plantas do dsRNA para o genes de oriundos do parasita pode

ser uma boa estratégia a ser aplicada em cultivares de grande importância agronômica e

que são extremamente afetadas por espécies do gênero Meloidogyne. Como exemplos,

133

podemos salientar o café, o algodão e a cana-de-açúcar. Além disso, serão realizadas

avaliações de risco do dsRNA em campo e em mamíferos, assim como ensaios de

citotoxidade. Este trabalho abre caminho para a utilização de outros genes de parasitismo

de fitonematóides, como alvos para a criação de plantas transgênicas resistentes

expressando dsRNA. Os resultados obtidos com a superexpressão dos genes

2E07 e 7E12

em plantas de tabaco podem ser usados para incrementar os conhecimentos sobre a

interação planta-nematóide. Os genes diferencialmente expressos na biblioteca do algodão

resistente ao nematóide de galhas serão avaliados quanto ao potencial, em plantas

transgênicas modelo, visando a criação de novas cultivares de interesse econômico.

134

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ANEXO. Publicações.

Artigos

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Patente publicada

Marra, B.M. ; Sá, M.F.G., Souza, D.S.L. Ginani M. (2007) “Processo De Uso Do

Abrandador Quitosana, Como Removedor De Congêneres Secundários Tóxicos De

Destilados, Principalmente Da Aguardente De Cana Ou Cachaça” PI 0601586 -7 A

145

Comunicado técnico.

Rocha, T.L., Costa, P.H.A., Magalhães, J.C.C., Carneiro, R.M.D.G., Oliveira Neto, O.B.,

Souza, D.S.L., Firmino, A.A.P, Fragoso, R.R., Vasconcelos, E.A.R., Cia, E., Grossi-

De-Sá, M.F. Análise proteômica de raízes de algodoeiro resistente e susceptível

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Meloidogyne incognita. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,

2007, 11 p. (Comunicado Técnico 162).

Documentos da EMBRAPA

Rocha T.L., Evaristo R.G.S., Silva, L.P., Souza, D.S.L., Marra, B.M., Costa, P.H.A.,

Magalhães, J.C.C., Silva, M.C.M., Grossi-De-Sá, M.F. Metabolômica: Aplicações e

Perspectivas. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2006, 38 p. (Documentos

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Capítulo de livro

Romano, E., Souza, D.S. L., Grossi-de-Sá, M.F. Estratégias Moleculares para

Contenção de Organismos Geneticamente Modificados. In: Betânia F. Quirino. (Org.).

REVOLUÇÃO DOS TRANSGÊNICOS. 1 ed. Rio de Janeiro: Editora Interciência

Ltda, 2008, v. 1, p. 1-172.

Textos em jornais de notícias/revistas

Grossi-de-Sá, M.F., Oliveira-Neto, O.B., Souza, D.S.L., Romano, E. Biotcnologia do

algodão no Brasil: os benefícios do algodão transgênico. Cotton business, p. 30 - 33, 01

abr. 2007.

146

Livros Grátis
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