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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
Respostas metabólicas e genéticas do acará-açu,
Astronotus ocellatus (Perciformes: Cichlidae),
mediante exposição ao petróleo
Joana Castro Pinto Ruivo Domingos
Manaus - AM
2006
Dissertação apresentada ao Programa
Integrado de Pós-Grad
uação em
Biologia Tropical e Recursos Naturais
– PPGBTRN –
INPA/UFAM, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de mestre em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.
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II
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
Respostas metabólicas e genéticas do acará-açu,
Astronotus ocellatus (Perciformes: Cichlidae),
mediante exposição ao petróleo
Joana Castro Pinto Ruivo Domingos
Orientadora: Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e Val
Manaus - AM
2006
Dissertação apresentada ao Programa
Integrado de Pós-
Graduação em
Biologia Tr
opical e Recursos Naturais
– PPGBTRN –
INPA/UFAM, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de mestre em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.
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III
FICHA CATALOGRÁFICA
D671 Domingos, Joana Castro Pinto Ruivo
Respostas metabólicas e genéticas do acará-açu,
Astronotus
ocellatus
(Perciformes: Cichlidae), mediante exposição ao petróleo/
Joana Castro Pinto Ruivo Domingos. –2006
xf. 54p
Dissertação (mestrado)–INPA/UFAM, 2006
1. Biomarcadores 2. Petróleo 3. Acará-açu
CDD 19. ed. 597.580415
SINOPSE:
O trabalho teve como objetivo avaliar as respostas metabólicas e genéticas do
acará-açu (Astronotus ocellatus
), mediante exposição ao petróleo, com o fim de
definir biomarcadores capazes de detectar estágios precoces de c
ontaminação
por este poluente. Os resultados mostraram que a espécie acará-
açu é boa
indicadora de contaminação por petróleo se usados como biomarcadores a
enzima glutationa-S-
transferase, a concentração endógena de produtos
celulares oxidados (TBARS), a p
ercentagem de anormalidades eritrocíticas e a
expressão do gene CYP1A.
IV
Agradecimentos
À minha orientadora, Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e Val e ao Dr.
Adalberto Luís Val, pela orientação deste trabalho, pelo exemplo de como fazer
ciência, pelo apoio profissional e pela atenção e carinho que tiveram comigo.
A toda a equipe LEEM, em particular à Maria de Nazaré Paula da Silva, Roziete
Mendes Araújo, Carolina Fernandes S de Souza, Rafael Mendonça Duarte,
Alzira Miranda de Oliveira e Luciano Ricardo Pinheiro, pela ajuda prestada, sem
eles este trabalho não teria sido possível.
Ao Dr. Sérgio Ricardo Nozawa e Dra. Mônica Stropa Nozawa pelas contribuições
e orientação na parte molecular do trabalho.
Aos meus amigos Adília Nogueira, Leonardo Rodrigues e David Santana, pela
intimidade das nossas conversas.
À minha família, pela liberdade de me deixar voar.
Ao meu marido, Simão Bolívar, sempre presente, no pior e no melhor!
A CAPES, pela bolsa concedida.
Ao curso de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva,
pela oportunidade.
Aos financiadores dos projetos PIATAM (FINEP e Petrobras) e PRONEX
(FAPEAM & CNPq).
V
Resumo
A exploração de petróleo na Amazônia trouxe preocupações quanto ao possível
impacto dessa atividade no ecossistema. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar
biomarcadores metabólicos e genéticos, no acará-açu (Astronotus ocellatus), capazes
de detectar condições subletais e de exposição crônica ao petróleo e assim poder
alertar para estágios precoces de contaminação. Foram distribuídos 160 indivíduos por
16 tanques de 150L. Metade dos tanques foi submetida a uma concentração subletal de
petróleo correspondente a metade da CL50 (18,2 mL/L). Um indivíduo por tanque foi
retirado em cada um dos seguintes tempos de exposição: 0h, 12h, 24h, 48h, 96h, 192h,
384h e 384h de recuperação. Não foram observadas alterações significativas do
hematócrito, do número de eritrócitos e dos índices hematimétricos. No entanto, os
valores da concentração de hemoglobina e metahemoglobina mostraram uma relação
significativa (p<0,05) de aumento com o tempo de exposição, em relação ao grupo
controle. A atividade da catalase aumentou no grupo exposto no período 12 horas. Por
sua vez, a atividade da enzima glutationa-S-transferase (GST) mostrou ser
significativamente maior no grupo exposto nos períodos 12, 24, 48, 96 e 192 horas A
concentração endógena de produtos celulares oxidados e a percentagem de
anormalidades eritrocíticas também mostraram um aumento significativo no grupo
exposto. O gene CYP1A mostrou uma expressão diferenciada, aumentando com o
tempo de exposição. Em conclusão, podemos sugerir que a espécie Astronotus
ocelllatus é boa indicadora de contaminação por petróleo se usada a enzima GST, a
VI
concentração endógena de produtos celulares oxidados, a percentagem de
anormalidades eritrocíticas e a expressão do gene CYP1A como biomarcadores.
VII
Abstract
Therefore, the main discovery of petroleum in the middle of Amazon basin and its
exploration has brought environmental concerns related to the possible impacts that this
activity might produce. The main objective of this work was to identify metabolic and
genetic bioindicators in oscar (Astronotus ocellatus) that may be useful for detecting
signs of chronic or subletal exposure to petroleum. We exposed 8 groups of fish (n=8) to
subletal concentration of petroleum for different periods of time (0, 12, 24, 48, 96, 192
and 384 hours and recover for 384 hours). The results indicated no significant
alterations in hematocrit, in number of erythrocytes and in hematimetric indexes.
However, hemoglobin concentration increased (p<0.05) in experimental animals
exposed to crude oil. Similarly, methemoglobin levels increased throughout exposure.
Catalase (CAT) activity showed no significant differences among control and
experimental groups. On the other hand, glutathione-S-transferase (GST) activity
increased in all exposed groups. The endogen concentration of oxidized cellular
products, revealed by the reactive substances to tiobarbituric acid (TBARS) increased in
experimental groups from 12 hours on. Also, similar increase was observed in the
percentage of erythrocytic abnormalities (ANE). Investigation of CYP1A gene
expression resulted in increasing levels in the amount of mRNA in experimental animals,
corroborating this gene as a good biomarker for environmental monitoring. In
conclusion, we can suggest that the species Astronotus ocellatus is a good indicator of
oil contamination when parameters such as GST levels, endogen concentration of
VIII
oxidated celular products (TBARS), percentage of erythrocytic abnormalities and
expression of the gene CYP1A are analyzed.
IX
Índice
1. Introdução 1
1.1 O ecossistema amazônico 1
1.2 Estação petrolífera da bacia do rio Urucu 2
1.3 O Petróleo 3
1.4.Biologia do Astronotus ocellatus 5
1.5 Toxicologia 7
1.5.1.Biomarcadores 8
1.6 Genotoxicologia 11
1.6.1 Marcadores moleculares 12
1.7 Objetivos 14
1.7.1 Geral 14
1.7.2 Específicos 14
2. Material e métodos 15
2.1 Série experimental 15
2.1.1.Hematócrito 16
2.1.2.Concentração de hemoglobina 16
2.1.3.Determinação da taxa de metahemoglobina 17
2.1.4 Contagem de eritrócitos 17
2.1.5 Constantes corpusculares 18
2.1.6 Anormalidades nucleares eritrocíticas 18
2.1.7 Concentração endógena de produtos celulares oxidados 18
2.1.8 Atividade da glutationa S-transferase 19
2.1.9 Atividade da catalase 20
2.1.10 Expressão do gene CYP1A 20
2.2 Tratamento estatístico 23
3. Resultados 24
3.1 Mortalidade 24
3.2 Parâmetros hematológicos 24
3.3 Enzimas antioxidantes 29
X
3.3.1 Atividade da catalase 29
3.3.2 Atividade da glutationa-S-transferase 30
3.4 Avaliação de danos celulares 31
3.4.1 Concentração de produtos celulares oxidados 31
3.4.2 Anormalidades nucleares eritrocíticas 33
3.5 Expressão do gene CYP1A 33
4. Discussão 35
4.1 Parâmetros hematológicos 35
4.2 Enzimas antioxidantes 36
4.3 Avaliação de danos celulares 38
4.3.1 Concentração endógena de produtos celulares oxidados 38
4.3.2 Anormalidades nucleares eritrocíticas 39
4.4 Expressão do gene CYP1A 40
5. Conclusões 41
6. Referências bibliográficas 42
XI
Lista de Figuras
Figura 1. Indivíduo adulto de Astronotus ocellatus...........................................................5
Figura 2. Possíveis vias de biotransformação dos xenobióticos....................................10
Figura 3. Relação dos valores de hematócrito de Astronotus ocellatus, de indivíduos
expostos ao petróleo, com seus respectivos controles, nos diversos períodos.............24
Figura 4. Relação dos valores de concentração de hemoglobina de Astronotus
ocellatus expostos ao petróleo com seus respectivos controles, nos diversos
períodos..........................................................................................................................25
Figura 5. Variação da diferença entre o grupo exposto e o grupo controle dos níveis de
concentração de hemoglobina ao longo do tempo. * diferença estatística significativa (P
< 0,05).............................................................................................................................26
Figura 6. Relação do número de eritrócitos circulantes, de Astronotus ocellatus, de
indivíduos expostos ao petróleo com seus respetivos controles, nos diversos
períodos..........................................................................................................................26
Figura 7. Valores de taxa de Metahemoglobina de Astronotus ocellatus para indivíduos
expostos ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos de
tempo..............................................................................................................................27
Figura 8. Valores de Volume Corpuscular Médio (A), Hemoglobina Corpuscular Média
(B) e Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (C), de Astronotus ocellatus,
para indivíduos expostos ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos
períodos de tempo..........................................................................................................28
XII
Figura 9. Atividade da CAT em Astronotus ocellatus expostos ao petróleo e seus
respectivos controles, nos diversos períodos.................................................................29
Figura 10. Atividade da GST em Astronotus ocellatus expostos ao petróleo e seus
respectivos controles, nos diversos períodos..................................................................30
Figura 11. Variação da diferença entre o grupo exposto e o grupo controle da atividade
da GST ao longo do tempo. * diferença estatística significativa (P < 0,05)....................31
Figura 12. Concentração endógena de produtos celulares oxidados em Astronotus
ocellatus expostos ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos....32
Figura 13. Variação da diferença entre o grupo exposto e o grupo controle da
concentração endógena de produtos celulares oxidados ao longo do tempo................32
Figura 14. Percentagem de anormalidades eritrocíticas em Astronotus ocellatus
expostos ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos...................33
Figura 15. Expressão do gene CYP-1A nos momentos 0 e 12 horas (A); 24 e 48 horas
(B) e 96 horas e recuperação (96h). c - amostras referentes aos indivíduos controle. p -
amostras referentes aos indivíduos expostos................................................................34
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. O ecossistema amazônico
A Amazônia ocupa uma área superior a 4 milhões de quilômetros quadrados,
aproximadamente metade do território brasileiro, abriga um terço das florestas tropicais
do mundo e o sistema fluvial mais extenso e de maior massa liquida da Terra, drenando
mais de sete milhões de quilômetros quadrados de terra (Sioli, 1983). Sendo coberta
pela maior floresta tropical do planeta, esta região compreende um elevado número de
habitats aquáticos como rios, lagos, paranás, igarapés, praias fluviais, igapós e áreas
de várzea, possuindo cada um deles as suas próprias características biológicas e físico-
químicas. Esta enorme variedade favoreceu a existência de uma grande diversidade de
animais aquáticos, possuindo, a bacia amazônica, a ictiofauna mais diversificada de
todas as bacias hidrográficas (Junk, 1983). Assim, peixes de quase todos os grupos,
desde os mais primitivos aos mais especializados, podem ser encontrados na
Amazônia, contribuindo para as 4475 espécies de água doce já descritas para a região
Neotropical. A este número elevado acrescentam-se ainda cerca de 1550 espécies
ainda não descritas, num total que atinge 6025 espécies (Reis et al., 2003).
Como característica ambiental mais importante do ecossistema amazônico
destaca-se a flutuação anual do nível das águas, que provoca uma oscilação por vezes
superior a 10 metros em frente ao porto de Manaus. Durante o período da cheia,
apenas a copa das árvores permanece emersa, formando-se um sem número de novos
habitats disponíveis para os peixes (Simone et al., 2003).
Um outro fator determinante na bacia amazônica, é a quantidade de oxigênio
presente na água. Este fator depende de inúmeros processos, tais como fotossíntese,
respiração, luz, decomposição orgânica, difusão do oxigênio, vento, profundidade,
temperatura e também da flutuação do nível das águas (Val & Almeida-Val, 1999a). A
Amazônia apresenta ainda, como particularidade, diferentes tipos de água,
distinguindo-se em água preta, água branca e água clara, aos quais se podem associar
diferentes características químicas e biológicas (Sioli, 1984). O conjunto destes fatores
2
faz da Amazônia um ecossistema delicado e extremamente vulnerável à ação
antrópica. Esta tem sido referida como a principal causa de deterioração ambiental que
coloca as espécies tropicais em risco (Trajano, 1997).
Nas últimas duas décadas, reservas de petróleo e gás natural foram localizadas
na Amazônia brasileira, tendo sua exploração iniciado no final da década de 80.
Embora métodos de segurança venham sendo implementados com rigor eventuais
acidentes podem ocorrer. Assim, dependendo da época do ano, um derramamento de
petróleo poderá afetar não somente o leito do rio, mas também a área de floresta
alagada e estender-se, assim, por uma vasta região, trazendo graves conseqüências às
espécies que ocupam esses habitats (Val & Almeida-Val, 1999b).
1.2. Estação petrolífera da bacia do rio Urucu
A estação petrolífera da bacia do rio Urucu explora petróleo e gás natural desde
1988. Localizada a 650 km de Manaus, a estação integra a Unidade de Negócios de
Exploração e Produção da Petrobrás na Bacia do Solimões - UN-BSOL. Esta é a maior
reserva terrestre de gás natural do Brasil, com cerca de 100 bilhões de metros cúbicos
comprovados. Nesta região estão localizados os 50 maiores poços terrestres
produtores de gás natural, entre os 75 que apresentam maior produção no país.
Atualmente, os 60 poços produtores de Urucu têm uma produção média de
petróleo e gás liquefeito de 57 mil barris/dia e de gás natural, de 10 milhões de metros
cúbicos/dia, volume que posiciona o Estado do Amazonas como o segundo produtor do
país, sendo que a produção de óleo e gás do Urucu representa 4% da produção total
do país. O petróleo extraído é transportado por meio de um óleoduto até ao terminal de
Coari, cidade localizada na margem do rio Solimões. Desta cidade, segue em balsas
até as refinarias de Manaus (Cadernos Petrobrás, 2005).
Na Amazônia não existem registros de graves incidentes decorrentes desta
exploração, apesar de se saber que pequenos derramamentos têm ocorrido ao longo
destes anos. Contudo a própria atividade de extração coloca o ecossistema em
3
contacto com o poluente trazendo-o para a superfície juntamente com água de
formação (Cadernos Petrobrás, 2005).
1.3. O petróleo
O crescimento exponencial da população humana, associado ao
desenvolvimento tecnológico e conseqüente sofisticação do modo de vida, aumentaram
a demanda por energia em larga escala, levando ao aumento da exploração deste
recurso não renovável. Assim, hoje, o petróleo é sinônimo de riqueza e poder e, por
isso, a sua exploração inclui áreas remotas e de grande vulnerabilidade, como a
Amazônia.
O petróleo é uma substância que ocorre naturalmente, originada pela
decomposição incompleta, ao longo de milhares de anos, de material orgânico, vegetal
ou animal, depositado entre os estratos sedimentares. Através do tempo geológico e
devido a fenômenos de temperatura e pressão causados pelos movimentos da crosta
terrestre, esse material é convertido em petróleo, podendo então migrar até a superfície
ou ficar retido em jazidas (Kingston, 2002).
Depois de extraído, o petróleo é transportado por meio de embarcações,
caminhões, vagões, ou tubulações (oleodutos e gasodutos), às vezes por uma longa
extensão, até chegar às refinarias localizadas nos grandes centros urbanos. Apesar de
serem implementados sérios e meticulosos protocolos de segurança quer para a
manutenção das explorações petrolíferas, quer no transporte do petróleo, os riscos de
ocorrerem incidentes são ainda grandes. Assim, os impactos ambientais de um
derramamento de petróleo são freqüentemente noticiados mundialmente devido às
graves e súbitas transformações que provocam nos ecossistemas. Estima-se que cerca
de cinco milhões de toneladas de petróleo, por ano, são derramadas no ecossistema
marinho (Val & Almeida-Val, 1999b).
Visualmente, o petróleo apresenta-se como uma substância negra ou castanha
escura, oleosa, inflamável e menos densa do que a água. À temperatura ambiente o
petróleo pode ser encontrado nas três diferentes fases: gasosa, denominada gás
4
natural; liquida, denominada óleo cru e uma fase sólida; ou semi-sólida conhecida como
asfalto. A fase liquida é formada por uma complexa mistura de compostos orgânicos,
75% dos quais são hidrocarbonetos (Brauner et al., 1999). Quimicamente é possível
distinguir estes compostos em dois grupos: alcanos, de cadeia longa, e hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos (PAHs) e alifáticos, como benzeno, tolueno e quantidades
significantes de enxofre, vanádio, nitrogênio e níquel. Os PAHs são voláteis e embora
estejam presentes em pequenas concentrações são tidos como os mais perigosos para
o ambiente (Val & Almeida-Val, 1999b; Brauner et al., 1999). Por outro lado, os
hidrocarbonetos de cadeia longa podem persistir no ambiente aquático por longos
períodos de tempo.
Quando ocorre um derramamento de petróleo, em um ambiente aquático, um
elevado número de reações acontece, tais como: fotólise, espalhamento, evaporação,
dispersão, emulsificação, biodegradação, dissolução, oxidação e sedimentação. Os
compostos primários e secundários, que se formam através destas reações, reagem
diretamente com o ambiente aquático causando efeitos fisiológicos e toxicológicos nos
organismos e indiretamente afetando os seus habitats (Val & Almeida-Val, 1999b).
Devido à sua pouca solubilidade, o petróleo cria uma barreira física de caráter
viscoso entre a superfície da água e o ar, limitando a penetração da luz na coluna de
água e, conseqüentemente, diminuindo a quantidade de oxigênio disponível.
Em caso de derramamento, a degradação do petróleo ocorre naturalmente por
meio de processos físico-químicos envolvendo oxidação e processos biológicos levados
a cabo por microorganismos aquáticos. No entanto, para que a degradação ocorra
completamente, este processo pode demorar, em casos extremos, até 20 anos. Mas
mesmo que a recuperação do ambiente marinho ocorra em poucos anos, a estrutura
das comunidades é profundamente modificada exigindo um tempo longo de
recuperação, ou podendo nunca recuperar a sua estrutura inicial (Depledge, 1999;
Kingston, 2002). Estudos realizados no Peru mostram que o impacto fisiológico deste
tipo de contaminante resultou em alterações ecológicas profundas levando à extinção
de muitas espécies de peixes (Maco, 1996).
5
Na Amazônia, muitas espécies desenvolveram respiração aérea como
adaptação aos períodos de baixa disponibilidade de oxigênio e até anoxia, como é o
caso do pirarucu (Arapaima gigas) que usa a bexiga natatória modificada como um
pulmão (Junk, 1983). Além do pirarucu, muitas outras espécies desenvolveram
adaptações para respirar diretamente o ar atmosférico. No caso de um derramamento,
estas espécies ficariam diretamente em contacto com o petróleo ingerindo quantidades
do composto juntamente com o ar (Brauner et al., 1999). Contudo, grande parte dos
estudos concentra-se na análise de concentrações sub-letais da fração solúvel do
petróleo (WSF) que inclui os hidrocarbonetos aromáticos. Brauner e colaboradores
(1999) demonstraram distúrbios na regulação iônica, estresse respiratório, diminuição
da oxigenação do sangue e aumento do hematócrito em peixes expostos ao petróleo.
1.4. Biologia do Astronotus ocellatus
Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831), figura 1, é conhecida como acará-açu e
oscar (inglês), e pertence à família Cichlidae, ordem dos Perciformes (Kullander, 2003).
Figura 1. Indivíduo adulto de Astronotus ocellatus.
É uma espécie exclusiva de água doce e encontra-se distribuída no Peru, Brasil,
Colômbia e Guiana Francesa, tendo sido coletados indivíduos ao longo das bacias
hidrográficas dos rios Amazonas, Ucayali, Solimões, Içá, Negro, Oyapock e
Approuague (Kullander, 2003). Na Amazônia, esta espécie encontra-se geralmente em
6
águas lentas, em áreas de várzea, onde encontra refúgios, como troncos e ramos
submersos, pois passam grande parte do tempo em repouso.
Como características distintivas, esta espécie apresenta: corpo oval; cabeça,
olhos e boca grandes; primeira nadadeira dorsal constituída por raios duros; segunda
nadadeira dorsal arredondada, composta por raios moles; nadadeira anal constituída
por raios duros na parte anterior e de extremidade arredondada; base dos raios moles
das nadadeiras dorsal e anal coberta de escamas; mancha ocelar preta circundada por
um anel laranja, localizada na região peduncular da nadadeira caudal; juvenis
identificados por listras onduladas de coloração branca e laranja e numerosas manchas
brancas distribuídas ao acaso na cabeça.
Indivíduos desta espécie podem viver entre 10-20 anos, chegando a medir 33 cm
e a pesar, aproximadamente, 1kg. A sua dieta natural inclui pequenos peixes,
crustáceos, gastrópodes, larvas de insetos e insetos aquáticos. Apesar de passar
grande parte do seu tempo inativa, esta espécie é capaz de preparar embustes e nadar
rapidamente pequenas distâncias para capturar presas (Kullander, 2003).
Não possui dimorfismo sexual aparente, embora, geralmente, os machos
apresentem comprimentos superiores e padrões de coloração mais intensos. A espécie
apresenta comportamento territorialista, não realiza migrações e forma casais na época
de reprodução partilhando vários cuidados, como escolha do local de desova, defesa
do ninho e proteção dos juvenis. Uma única desova pode envolver cerca de 1000-2000
ovos, sendo que a eclosão depende da temperatura da água, mas geralmente ocorre
dentro de 3 a 4 dias. Os seus predadores incluem peixes, pássaros e répteis (Kullander,
2003).
É uma espécie de interesse comercial, sendo muito popular como espécie de
aquário na América do Norte e Europa. Na Amazônia, é também muito usada como
alimento pela população humana.
Estudos anteriores demonstraram que a habilidade desta espécie em sobreviver
até 6 horas em condições de hipoxia e anoxia (Muusze et al., 1998), depende do
tamanho do indivíduo e é diferente ao longo da vida dos animais (Almeida-Val et al.,
2000). Assim, ao contrário dos adultos, habitantes de águas mais profundas, os juvenis
7
são facilmente encontrados na superfície da coluna de água onde a disponibilidade de
oxigênio é maior, ficando, em casos de derramamento de petróleo, mais expostos a
processos de contaminação (Val & Almeida-Val, 1999b; Almeida-Val et al., 2000).
Esta espécie foi escolhida para este trabalho essencialmente pelo seu local de
ocorrência próximo à estação petrolífera; pela sua territorialidade e ausência de
migração, que permite associar os indivíduos ao local de coleta; pelo seu interesse
comercial; pela experiência anterior do Laboratório de Ecofisiologia e Evolução
Molecular (LEEM) sobre os efeitos de ambientes hipóxicos sobre a espécie e seus
principais ajustes metabólicos e, pela determinação prévia da CL
50
(96 horas) para o
petróleo, o que facilitou o desenvolvimento do presente projeto.
1.5.Toxicologia
Grande parte dos recursos ecológicos do planeta encontra-se em regiões
geográficas específicas tais como as zonas costeiras e as grandes bacias hidrográficas.
Devido ao atrativo desses recursos, cerca de 3 bilhões de pessoas vivem nas suas
proximidades e delas dependem para obtenção de alimento e bens industriais. Tal
realidade gera um sem número de impactos capazes de alterar os ecossistemas,
destruir habitats e pôr em risco a qualidade de vida das populações e comunidades
naturais (Shailaja & D’ Silva, 2003; Moore et al., 2004).
Mudanças ambientais podem resultar em respostas adaptativas, estresse,
doenças e mudanças na biodiversidade. Agentes e estressores incluem fatores naturais
e antropogênicos tais como: aumento do nível do mar, aumento de radiação UV,
mudanças climáticas, hipoxia, descargas industriais, pesticidas, desmatamento, etc.
Assim, a toxicologia têm se ocupado do estudo da toxicidade de várias drogas,
pesticidas e compostos químicos, sua ação sobre a saúde humana e o seu efeito no
ambiente (Rydzynski, 2006).
Muitos esforços e um grande investimento econômico têm sido feitos no sentido
de identificar estágios precoces de contaminação passíveis de causar desequilíbrio
ecológico. Sinais de estresse nos níveis de organização molecular, celular e fisiológica
8
podem gerar biomarcadores capazes de ilustrar cenários de baixa performance dos
indivíduos e, deste modo prevenir futuras patologias e danos à saúde ambiental (Moore
et al., 2004).
1.5.1 Biomarcadores
Um biomarcador é definido como uma resposta biológica (bioquímica, celular,
fisiológica ou comportamental) a um ou mais poluentes químicos, sendo o nível dessa
resposta uma medida da sua concentração (Camus et al., 1998; Depledge, 1999).
Biomarcadores têm sido úteis para estabelecer correlações entre o nível de exposição a
um poluente e o nível de dano causado a organismos sentinela (Moore et al., 2004).
Organismos sentinela são designados bioindicadores e são organismos
escolhidos para monitorar a qualidade de ambientes sob risco de contaminação. Eles
indicam os efeitos biológicos dos poluentes antes que a presença desses possa causar
danos nos níveis hierárquicos superiores da organização biológica (espécie, população
ou comunidade). Entre outras características, a escolha de um bioindicador recai sobre
duas principais características, são elas: a sua ampla distribuição, e uma relação
dose/resposta capaz de refletir a concentração do poluente no ambiente (Silva et al.,
2003).
Diversos biomarcadores têm sido considerados úteis na detecção de exposição
subletal de peixes a agentes poluentes, entre eles as enzimas ligadas ao sistema de
defesa antioxidante (Porte et al., 1991; Livingstone, 1993; Bainy et al.,1996; Smith &
Gagnon, 1998; Kruner &.Westernhagen, 1999).
Espécies reativas de oxigênio (ERO) são moléculas que podem unir-se a
componentes celulares, produzindo severos danos, tais como mutagênese,
carcinogênese, peroxidação de lipídios e oxidação de proteínas (Sies, 1993; Bainy et
al., 1993; Storey, 1996). Elas são produzidas normalmente nos seres vivos como
consequência de diversos processos metabólicos, como a respiração.
9
Assim, os organismos possuem sistemas de defesa antioxidante (SDA) capazes
de manter as concentrações de ERO em níveis compatíveis com as funções celulares
(Halliwell & Gutteridge, 1999).
As defesas antioxidantes, que protegem os sistemas biológicos de danos
provocados por ERO, compreendem três etapas: prevenção (sistemas de homeostase
metálica na prevenção do estresse oxidativo); intercepção (sistemas antioxidantes
enzimáticos) e reparo dos danos causados (Picada et al., 2003).
Duas enzimas antioxidantes amplamente estudadas são a catalase (CAT) e
superóxido dismutase (SOD) (Heffner & Repine, 1989; Geracitano et al., 2000; Picada
et al., 2003).
A contaminação derivada da exploração petrolífera é um problema que hoje
inclui o ecossistema amazônico, mas pouco se conhece sobre o impacto destes
poluentes nos peixes tropicais (Shailaja & D’ Silva, 2003). Estudos de acompanhamento
ambiental, capazes de avaliar o impacto destes contaminantes em várias espécies são
essenciais para detectar condições subletais e limites de toxicidade prevenindo
situações de contaminação que possam se tornar irreversíveis, com graves
conseqüências ecológicas (Camus et al., 1998; Aas et al., 2000).
Com o intuito de avaliar o impacto da exploração petrolífera, particularmente, a
quantidade de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH), tidos como os
componentes mais tóxicos para o ambiente, vários biomarcadores têm sido estudados,
na maioria, associados ao citocromo P
450
(Camus et al., 1998; Aas et al., 2000; Shailaja
& D’ Silva, 2003).
O citocromo P
450
é uma superfamília de enzimas envolvidas no metabolismo
oxidativo de compostos endógenos e exógenos, como hormônios e compostos
xenobióticos. Estas enzimas são tidas como as mais importantes em processos de
biotransformação, e uma vez que a sua indução ou inibição é conseqüência da
concentração de poluente, têm sido amplamente usadas em estudos de toxicologia
como biomarcadores (Camus et al., 1998; Rice et al., 2000; Aas et al., 2000; Matsuo et
al., in press; Baliharová et al., 2004; Moore et al., 2004).
10
Um exemplo é a forma CYP1A, envolvida na oxidação de poluentes como os
hidrocarbonetos derivados do petróleo, transformando-os em formas menos complexas
facilmente excretadas pelos organismos. A maioria dos xenobióticos é submetida a
biotransformação em duas fases. De acordo com Guecheva & Henriques (2003) as
reações de Fase I incluem oxidação, redução e hidrólise. Durante esta fase muitos
compostos são convertidos em metabólitos altamente reativos. Já as reações de Fase II
são geralmente de desintoxicação, envolvendo a conjugação dos metabólitos com um
substrato endógeno, como a glutationa, por enzimas transferases. Como resultado
deste processo os metabólitos tornam-se hidrofílicos e possíveis de serem excretados
(Fig. 1).
Figura 2. Possíveis vias de biotransformação dos xenobióticos.
A indução do gene CYP1A por poluentes envolve a ativação de um receptor
especifico que conduz o composto xenobiótico ao núcleo onde interage com
seqüências reguladoras especificas estimulando a expressão do gene CYP1A. O
metabolismo dos PAHs pelo CYP1A resulta na biotransformação desses compostos em
formas também tóxicas capazes de alterar o DNA na sua estrutura e função (Moore et
al., 2004; Incardona et al., 2005; Matsuo et al., in press).
11
Dois biomarcadores amplamente usados na detecção de PAHs são as enzimas
7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD), que age na fase I, e a glutationa S-transferase
(GST), que atua na fase II (Shailaja & D’ Silva, 2003). A atividade de ambas pode ser
relacionada com a indução da expressão do gene CYP1A e, por isso, com a exposição
aos contaminantes derivados do petróleo.
1.6. Genotoxicologia
A evolução do conhecimento dos organismos vivos em nível da genética
molecular trouxe o desenvolvimento de novas ferramentas muito eficazes no campo da
ecotoxicologia (Silva et al., 2003; Moore et al., 2004).
A genotoxicologia, denominada também de genética toxicológica, pode ser
definida como o setor da genética que estuda as mudanças na estrutura e função do
DNA dos organismos, causadas por compostos xenobióticos (Depledge, 1994;
Theodorakis, 2000; Silva et al., 2003). Parte dos objetivos deste ramo de pesquisa recai
sobre a avaliação dos ecossistemas, investigando o grau de contaminação destes com
genotoxinas e, sobretudo, identificando efeitos adversos tais como redução do fitness
(adaptabilidade), alterações nas frequências gênicas e variação da variabilidade gênica
em populações e comunidades, expostas a poluentes (Depledge, 1994).
A diversidade genética de uma população pode ser considerada como um
bioindicador da vulnerabilidade de uma população natural a agentes causadores de
estresse (D’ Surney et al. 2001).
Segundo Bickham et al. (1999), acidentes de exposição aguda a poluentes, tais
como grandes derramamentos de petróleo são mais mediáticos, embora os casos de
contaminação crônica sejam bem mais frequentes e capazes de levar a consequências
catastróficas na estrutura das populações. Weis & Weis (1989) sugerem que quando os
organismos são cronicamente expostos a concentrações sub-letais de um poluente a
tendência é ocorrer uma seleção de genótipos resistentes. Também foi sugerido por
Andersson et al. (1988) que os indivíduos sobreviventes a uma exposição de 96 h, na
concentração letal (CL
50
), representariam genótipos resistentes dentro de uma
12
população. Deste modo correlações entre a diversidade genética e impacto de
poluentes vêm sendo encontradas com importância significativa no monitoramento de
áreas contaminadas e na escolha de indivíduos em casos de necessidade de
repovoamento (Depledge, 1994, 1999).
D’Surney e colaboradores (2001) sugerem que o primeiro passo para uma
melhor compreensão da relação entre agentes estressores e a variabilidade genética
de uma população, será identificar marcadores moleculares ligados à resistência ou
sensibilidade a um agente estressor em particular e em seguida procurar um conjunto
de marcadores genéticos capazes de avaliar o nível de resposta de uma população a
esse agente.
Alguns testes de genotoxicidade têm sido usados, tais como: cometa,
anormalidades nucleares eritrocíticas (ENA), expressão da CYP1A, entre outros.
1.6.1.Marcadores moleculares
Mutação, migração, seleção e deriva genética são fatores naturais capazes de
influenciar a freqüência gênica das populações. Porém, como foi descrito
anteriormente, diversos fatores derivados da ação humana podem causar estresse ao
ambiente e afetar, da mesma forma, as freqüências gênicas, quer aumentando a taxa
de mutação, quer atuando sobre a seleção natural.
Estes fatores provocam diferenças na estrutura das populações, podendo
diminuir a diversidade dentro de uma população, aumentar o nível de homozigotos
(homozigozidade) e “inbreeding”. Estudos sobre a variação genética entre populações
impactadas e não impactadas ajudam a revelar a relação entre a exposição ao fator de
estresse e a diversidade existente.
Diversos métodos têm sido aplicados como marcadores moleculares, na
detecção de variação genética, destacando-se entre eles: aloenzimas, RAPD (randomly
amplified polymorphic DNA), RFLP (restriction site polymorphisms), sequênciamento de
DNA nuclear e mitocondrial, microssatélites, entre outros (Bickham et al., 1999).
13
Características como distribuição aleatória no genoma, co-dominância e elevado
grau de polimorfismo fazem dos microssatélites os marcadores mais apropriados para
estes estudos (Coughlan et al., 1998; Jamieson, 1999; Dimsoski & Toth, 2000). Este
tipo de marcador vem sendo usado desde o início da década de 80, após a descoberta
da PCR (polymerase chain reaction), respondendo a questões importantes sobre
evolução e conservação (Balloux & Lugon-Moulin, 2002).
Microsatélites são seqüências de DNA, usualmente menores que 100 pares de
bases, formadas por um conjunto de 1 a 6 nucleotídeos repetidos “in tanden”
(Jamieson, 1999; Norris et al., 1999; Zane et al., 2002). Segundo o tamanho da unidade
de repetição, estes podem ser classificados em microssatélites dinucleotídeos,
trinucleotídeos, tetranucleotídeos, etc. São ainda classificados de acordo com o padrão
de repetição, diferenciando-se em perfeitos, se são constituídos apenas por uma
unidade de repetição; compostos, se apresentam mais do que uma unidade de
repetição; e interrompidos se são formados por uma única unidade de repetição
interrompida por um ou mais nucleotídeos (Hancock, 1999). O isolamento e a
caracterização destes marcadores exige o conhecimento prévio de seqüências
flanqueadoras que permitam o acoplamento de “primers” específicos. Para atingir este
conhecimento é necessária a pesquisa em bancos de dados genômicos. Caso não
exista informação sobre o organismo em estudo, é necessário fazer o seqüenciamento
do DNA para identificar locos de microssatélites, sendo exigido um mínimo de 5 locos
informativos para estudos com este tipo de marcadores (Lunt et al., 1999; Zane et al.,
2002). Locos homólogos podem ser amplificados em espécies relacionadas utilizando
os mesmos “primers” (Jamieson, 1999; Dimoski & Toth, 2000; Zane et al., 2002).
Com uma vasta aplicação, os microssatélites vêm sendo usados para
identificação individual em análises de parentesco, análise forense, diagnóstico
molecular de doenças, proteção de espécies cultivares, melhoramento genético,
análises de pedigree, genética de populações naturais e etc. (Lunt et al., 1999; Norris et
al., 1999; Jamieson, 1999; Dimoski & Toth, 2000; Zane et al., 2002).
14
1.7. Objetivos
1.7.1. Geral
Pretende-se, com este trabalho, contribuir para a conservação das riquezas
hidrológicas do ecossistema amazônico criando instrumentos capazes de avaliar
estágios precoces de contaminação por petróleo.
1.7.2. Específicos
• Verificar, sob o aspecto hematologico, de que modo reage a espécie Astronotus
ocellatus quando exposta a uma situação crônica de exposição ao petróleo;
• Verificar de que modo, nesta espécie, se relaciona exposição crônica ao
petróleo, com a formação de anomalias nucleares eritrocíticas, assim como
concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS);
• Verificar de que modo, nesta espécie, se relaciona a exposição crônica ao
petróleo com a atividade das enzimas GST e catalase;
• Verificar de que modo se relaciona, nesta espécie, a exposição crônica ao
petróleo com a expressão do gene CYP1A,
15
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Série experimental.
Teste de sensibilidade ao petróleo em concentração subletal (metade da CL50).
Análise de parâmetros hematológicos e de estresse oxidativo (TBARS) Expressão
das enzimas GST e Catalase. Expressão do gene CYP.
Os exemplares de Astronotus ocellatus foram adquiridos na fazenda Santo
Antônio, localizada no quilômetro 82 da rodovia AM 010. Daí, foram transportados para
o Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA), onde foram aclimatados por 15 dias, em tanques de
500 l com aeração constante e renovação de água de dois em dois dias. Durante esse
período de tempo foram alimentados uma vez ao dia com ração comercial.
No desenho experimental, foram utilizados 160 indivíduos da espécie Astronotus
ocellatus, separados por 16 tanques de 150 l. Após um período de aclimatação de 48
horas, metade dos tanques foi exposta a uma concentração de petróleo correspondente
a metade da CL50 (18,2 ml/l). Os tanques restantes foram utilizados como controle. A
alimentação foi suspensa durante o ensaio experimental e todos os tanques
permaneceram com aeração constante. O petróleo utilizado foi trazido de Urucu e é
caracterizado como óleo leve, contendo cerca de 7% de nafta e baixos níveis niquel e
vanadium.
Retirou-se um indivíduo por tanque, em cada período de tempo: 0, 12, 24, 48,
96, 192 e 384 horas, com os quais se mediram os parâmetros descritos a seguir. Após
o período 384 horas os indivíduos expostos ao petróleo foram transferidos para novos
tanques onde permaneceram por um período de recuperação de 384 horas, com
aeração constante, renovação de água e alimentação diária. Os indivíduos do grupo
controle tiveram o mesmo tratamento. Após esse tempo foram analisados os mesmos
parâmetros anteriores.
Os peixes usados foram medidos com régua de precisão 0,1 centímetros e
pesados em balança semi-analítica com precisão de 0,01 grama. Em média, os
indivíduos mediam 12,5 ± 0,7 cm e pesavam 70,1 ± 5,9 g.
16
2.1.1 Hematócrito (Ht)
Para a análise dos parâmetros hematológicos, o sangue dos indivíduos foi
coletado por meio de punção da veia caudal, com auxílio de seringas previamente
heparinizadas.
Duas amostras de sangue de cada indivíduo foram separadas em tubos de
microhematócrito. Posteriormente, uma das extremidades do tubo, foi vedada com fogo
e os tubos foram colocados numa centrifuga de microhematócrito FANEN Mod. 211. As
amostras foram centrifugadas a 12000 rpm durante 10 minutos. A leitura da
percentagem de sedimentação dos eritrócitos foi realizada com auxílio de um cartão
padronizado.
2.1.2.Concentração de hemoglobina [Hb]
A concentração de hemoglobina foi determinada pelo método da
cianomethohemoglobina, descrito por Kampen & Zijlstra (1964). Este método consiste
em colocar 10 µl de sangue num tubo de ensaio contendo 2 ml de solução de Drabkin
(KCN 0,5g; KH
2
PO
4
1,4g; K
3
[Fe(CN)
6
] 2,0 g em 1 litro de água destilada). Após
agitação, os tubos permaneceram 15 minutos em repouso para efetivação da hemólise.
O conteúdo do tubo foi, então, colocado numa cubeta de acrílico e a absorvância foi
medida num espectrofotômetro Genesis-2, em 540 nm.
A determinação da concentração de hemoglobina (em gramas por 100ml de
sangue) foi obtida pela seguinte equação:
[Hb] (g/dl) = absorvância (540 nm) x 0,146 x diluição da amostra,
Onde: 0,146 = fator de correção
17
2.1.3 Determinação da taxa de metahemoglobina (MetaHb)
A taxa de metahemoglobina foi determinada segundo o método descrito por
Benesch et al. (1973), que consiste na mistura de 25 µl de uma amostra de sangue em
1,5 ml de tampão fosfato 35 mM, pH 7,3. A mistura foi agitada num agitador automático
de tubos e centrifugada por 5 minutos a 3000rpm numa centrífuga da marca FANEM,
modelo 204NR. A absorbância da mistura foi medida num espectrofotômetro, em 560,
576 e 630 nm. A determinação da taxa de metahemoglobina foi calculada pelo
somatório das fórmulas descritas a seguir, sendo o valor encontrado corrigido
relativamente à concentração total de hemoglobina. Os resultados foram expressos em
%.
OxyHb = (Abs.576 x (1,013) - Abs.630 x (0,3269) - Abs.560 x (0,7353)) x 10
-4
DeoxyHb= (Abs.560 x (1,373) - Abs.576 x (0,747) - Abs.630 x (0,737)) x 10
-4
FerriHb = (Abs.630 x (2,985) + Abs.576 x (0,194) - Abs.560 x (0,4023)) x 10
–4
2.1.4 Contagem do número de eritrócitos (RBC)
A contagem dos eritrócitos consiste em colocar num tubo de ensaio uma amostra
de 10 µl de sangue diluída em 2 ml de Formol Citrato (3,8 g de citrato de sódio; 2,0 ml
formol e água destilada q.s.p. 100 ml). Após homogeneização, a contagem dos
eritrócitos foi realizada em câmara de Neubauer, com auxílio do microscópio óptico
Motic Profissional, objetiva de 40x. O número de eritrócitos foi expresso em milhões de
células por milímetro cúbico de sangue (10
6
/mm
3
), seguindo a seguinte equação:
RBC= nº de células x A x D
onde: A= correção para a área analisada da câmara de Neubauer =50;
D= fator de diluição
18
2.1.5 Constantes corpusculares
As constantes corpusculares, volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina
corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM)
foram determinadas utilizando as fórmulas descritas por Brow (1976):
VCM (µm
3
) = (Ht) x 10/RBC
HCM (pg) = [Hb] x 10/RBC
CHCM (%) = [Hb] x 100/(Ht)
2.1.6 Anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE)
Os esfregaços sangüíneos foram fixados com metanol por 10min e, depois de
secos, corados com uma solução May-Grünwald por 2 minutos, May-Grünwald e água
destilada 1:1 por 10 minutos e Giemsa e água destilada 1:6 por 10 min. Em seguida
foram lavados com água destilada e secos à temperatura ambiente (Sanchez-Galan et
al. 1998). Segundo Carrasco & Noaa. (1990) as lesões nucleares dividem-se em quatro
categorias: micronúcleo (M), núcleo lobado (L), núcleo segmentado (S) e núcleo em
forma de rim (K). Assim, as anomalias descritas foram contadas em 1000 células
adultas de cada indivíduo, utilizando-se para tal, o microscópio ótico da marca MOTIC
com aumento de 100X. O resultado foi expresso em porcentagem (%) de ANE,
considerando-se a soma de todas as lesões (M+L+S+K) encontradas.
2.1.7 Concentrações Endógenas de Produtos Celulares Oxidados (TBARS)
A avaliação de estresse oxidativo ou peroxidação lipídica foi realizada pela
determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) descrito por
Ohkawa et al. (1979). Para tal, 100 µl de plasma foram diluídos em 0,89ml de tampão
tris-HCl 60mM pH 7,4; 1,0 ml de ácido tricloroacético (TCA) 30% e 1,0 ml de ácido
tiobarbitúrico (TBA) 0,73%. As amostras, após agitadas em “vortex”, foram aquecidas
19
em banho-maria (100ºC) durante uma hora, resfriadas e posteriormente lidas em
espectrofotômetro Genesis-2 a 535nm. Os valores da concentração de produtos
oxidados foram expressos em nmoles/ml de plasma.
2.1.8 Atividade da glutationa S-transferase (GST)
Os níveis de atividade enzimática foram determinados no fígado dos animais.
Para tal, um pedaço de fígado, 0,1g a 0,2g foi homogeneizado numa solução tampão
feita com TRIS Base, 20 mM (EDTA, 1 mM; sacarose, 0,5 mM; KCl, 0,15 mM e fluoreto
de fenilmetilsulfonil, 0,1 mM; pH 7.6) numa proporção de 1:3 (tecido:tampão). Após
homogeneização, o material foi centrifugado a 9000xg, a 4ºC, por meia hora.
Posteriormente, o sobrenadante foi separado em alíquotas para dosagem da atividade
enzimática, tanto da GST, como da Catalase.
Para analisar a atividade da GST seguiu-se o protocolo descrito por Habig et al.
(1974) e Habig & Jakoby (1981). O ensaio enzimático deu-se da seguinte forma:
Adicionou-se 980 µl de tampão de reação, 0,1 M (3,4025 g de fosfato de potássio
monobásico, KH2PO4; 4,355 g de fosfato de potássio dibásico, K2HPO4; 500 ml de
água MilliQ; pH 7), 10 µl de CDNB, 0,1 M (0,02026 g de 1-cloro-2,4 di-nitrobenzeno, 1
ml de etanol 100%) na cubeta de referência. Na cubeta da amostra adicionou-se 960 µl
de tampão de reação, 10 µl de CDNB, 10 µl de GSH (0,03073 g de GSH; 1 ml de
tampão de reação 0,1 M) e 20 µl de amostra. O conteúdo das cubetas foi
homogeneizado por inversão, utilizando-se parafilme para cobrir as cubetas. A leitura
foi realizada no espectrofotômetro Genesys 2 a 340 nm. A atividade enzimática foi,
então, calculada usando-se a seguinte fórmula:
AE = (variação ABS/ minuto * diluição da amostra)/ 9,6 * volume da amostra em
mL
A atividade enzimática foi, então, expressa em Unidades de GST/ g de tecido fresco.
20
2.1.9 Atividade da catalase (CAT)
Uma porção de fígado, 0,1g a 0,2g, foi homogeneizada seguindo-se o mesmo
protocolo utilizado para o cálculo da actividade da GST.
A atividade da catalase foi estimada segundo Aebi (1984). Uma vez obtido o
homogeneizado procedeu-se do seguinte modo:
Adicionou-se 990 µl de meio de reação 10 mM (100 µl de H2O2, 30%¸100 ml de
água MilliQ; descartados 10 ml da solução e acrescentados 5 ml de tampão de
Catalase e 4 ml de água MilliQ) e 10 µl de amostra, a uma cubeta de quartzo. O
decréscimo da absorbância foi lido num espectrofotômetro a 240 nm, durante um
minuto, a cada 15 segundos.
O tampão de Catalase foi preparado da seguinte forma: 6,055 g de Tris-HCl;
0,07305 g de EDTA e 50 ml de água MilliQ, pH 8.
A atividade enzimática foi calculada usando-se a seguinte equação:
AE = (variação ABS/ minuto * diluição da amostra)/ (0,071 * volume da amostra em
mL
O resultado foi expresso em Unidades de catalase/ g de tecido fresco
2.1.10 Expressão do gene CYP1A
A expressão do gene CYP1A foi realizada durante 96 horas. Ao fim desse
tempo, os indivíduos expostos foram transferidos para tanques limpos, onde
permaneceram, por igual período de tempo, com aeração constante, renovação de
água e alimentação diária.
Extração de RNA
Retirou-se entre 0,1µg a 0,5 µg de tecido do fígado, o qual foi homogeneizado
em 500 µl de Trizol. Todo o processo de homogeneização decorreu sobre gelo. O
material foi centrigugado a 10000 rpm, durante 10 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi,
21
então, transferido para um novo tubo eppendorf, ao qual se adicionou 300 µl de
clorofórmio gelado. Misturou-se por inversão e centrifugou-se, desta vez a 12000 rpm,
por 15 minutos, a 4ºC.
Em novos tubos eppendorf adicionou-se 700 µl de isopropanol gelado e juntou-
se o sobrenadante obtido. Misturou-se, mais uma vez, por inversão e as amostras
foram deixadas 10 minutos à temperatura ambiente, antes de serem levadas à
centrifuga, a 12000 rpm, por 10 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o
pellet lavado com 500 µl de etanol a 75%. Após centrifugar a 9000 rpm, por 5 minutos,
a 4ºC, o etanol foi retirado e acrescentou-se 100 µl de água MilliQ acrescida de DEPC
(Dietil pirocarboneto, 97%).
O RNA, assim extraído, foi guardado no frezeer a -80ºC
Quantificação de RNA
O RNA foi quantificado utilizando-se o espectrofotômetro. Para tal, 4 µl de
amostra foram diluídos em 1 ml de água MilliQ. A absorbância foi obtida a 260 nm. Os
resultados foram expressos em µg/ ml, após as devidas correções de diluição.
Para o cálculo utilizou-se a seguinte relação: 1 O D = 40 µg/ ml
Transformação em cDNA
As amostras foram preparadas do seguinte modo: 1 µl de oligo dt; 4 µl de
tampão; 4 µl de dNTP; 5 µg de RNA e água MilliQ para perfazer um volume de 20 µl. As
amostras, assim preparadas foram colocadas no termociclador programado da seguinte
forma: 5 minutos a 65 ºC, após este tempo acrescentou-se 0,5 µl de transcriptase
reversa, 1 hora a 37 ºC e 70 ºC por 10 minutos.
Amplificação do gene CYP
Para a amplificação do gene CYP prepararam-se as amostras de acordo com o
protocolo: 5 µl de cDNA; 1 µl de dNTP; 1 µl de cada primer específico; 1 µl de MgCl2; 5
22
µl de tampão taq; 0,5 µl de taqpolimerase e água MilliQ até perfazer um volume de 50
µl. As amostras foram colocadas no termociclador com a seguinte programação: 2
minutos a 92ºC; 30 ciclos de 30 segundos a 92ºC, 45 segundos a 47ºC, 1 minuto a
72ºC; 5 minutos a 72ºC. Por último as amostras foram mantidas a 4ºC.
Verificação dos produtos PCR
Para visualizar a expressão do gene CYP, as amostras foram aplicadas em gel
de acrilamida (5 ml de uma solução de acrilamida 36% e bis-acrilamida 1%; 300 µl de
TAE 50x; 125 mg de PSA, 10%;10 µl de TEMED e 10 ml de água MilliQ). Após a corrida
eletroforética, (90volts) o gel foi corado com nitrato de prata.
23
2.2 Tratamento Estatístico
Os resultados obtidos na serie experimental foram analisados e apresentados
sob a forma de média e erro padrão da média. O nível de significância utilizado em
teste estatístico foi de P <
0,05. A significância das diferenças entre médias foi feita por
meio do teste t.
24
3. RESULTADOS
3.1. Mortalidade
Ao longo do experimento não houve mortalidade nos momentos 0, 12, 24, 48 e
96 horas. Em 192 horas, a taxa de mortalidade do grupo exposto aumentou para 12,5%
e em 384 horas para 37,5%. No grupo controle nenhum indivíduo morreu. Durante o
tempo de recuperação correspondente a 384 horas a taxa de mortalidade foi 0% nos
dois grupos.
3.2 Parâmetros hematológicos
Os valores de hematócrito (Ht) representados na figura 3 mostram que este
parâmetro não sofreu alteração ao longo do tempo de exposição.
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Hematócrito (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Exposição
Controle
Figura 3. Relação dos valores de hematócrito, de Astronotus ocellatus, de indivíduos expostos ao
petróleo, com seus respetivos controles, nos diversos períodos.
25
Por sua vez, os valores de concentração de hemoglobina [Hb] (figura 4)
aumentaram até às 192 horas. Neste parâmetro, a diferença entre o grupo exposto e o
grupo controle mostra-se significativa nos períodos 12, 24, 48, 96 e 192 horas. A maior
diferença encontrada foi no período de 48 horas deixando de haver diferença estatística
no período de 384 horas. Após o período de tempo de recuperação não houve
diferença estatística entre os dois grupos de indivíduos. É possível verificar uma
variação dos valores encontrados no grupo controle ao longo do tempo de experimento.
Com o fim de subtrair no grupo exposto os fatores que fazem variar o controle foi
desenhado o gráfico da diferença entre a resposta do grupo exposto e do grupo
controle ao longo do tempo (figura 5). Assim é possível visualizar um aumento continuo
da concentração de hemoglobina ao longo de 48 horas no grupo exposto em relação ao
grupo controle.
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Concentração de hemoglobina (g/dl)
0
2
4
6
8
10
12
Exposição
Controle
Figura 4. Relação dos valores de concentração de hemoglobina, de Astronotus ocellatus, de
indivíduos expostos ao petróleo com seus respectivos controles, nos diversos períodos. * diferença
estatística significativa em relação ao grupo controle (P < 0,05).
*
*
*
*
*
26
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Concentração de hemoglobina (g/dl)
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Figura 5. Variação da diferença entre o grupo exposto e o grupo controle dos níveis de
concentração de hemoglobina ao longo do tempo.
A figura 6 ilustra o número de eritrócitos (RBC) observados durante o
experimento. Não se verificou diferença estatística entre o grupo controle e o grupo
exposto em nenhum momento.
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Contagem de eritrócitos circulantes (10
6
/mm
3
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Exposição
Controle
Figura 6. Relação do número de eritrócitos circulantes, de Astronotus ocellatus, de indivíduos
expostos ao petróleo com seus respectivos controles, nos diversos períodos.
27
Os valores de taxa de metahemoglobina (figura 7) mostraram-se
significativamente diferentes nos períodos 24, 48 e 96 horas, onde essa diferença foi
máxima. Após o tempo de recuperação não se verificou diferença entre os dois grupos
de indivíduos.
*
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
metaHb%
0
10
20
30
40
50
Exposto
Controle
Figura 7. Valores de taxa de Metahemoglobina, de Astronotus ocellatus, para indivíduos expostos
ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos de tempo. * diferença estatística
significativa em relação ao grupo controle (P < 0,05).
A figura 8 ilustra os índices hematimétricos, volume corpuscular médio (VCM),
hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular
média (CHCM), respectivamente. Apenas os valores de CHCM, no período de 12, 24 e
48 horas, mostraram diferença estatística em relação ao controle.
*
*
*
28
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Volume corpuscular médio (VCM, um
3
)
0
50
100
150
200
250
300
350
Exposição
Controle
A
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Hemoglobina corpuscular média (HCM, pg)
0
20
40
60
80
100
120
140
exposição
controle
B
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM, %)
0
10
20
30
40
50
Exposição
Controle
C
Figura 8. Valores de Volume Corpuscular Médio (A), Hemoglobina Corpuscular Média (B) e
Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (C), de Astronotus ocellatus, para indivíduos expostos
ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos.
*
*
*
29
3.3 Enzimas antioxidantes
3.3.1 Atividade da catalase (CAT)
A atividade da catalase (figura 9) não mostrou ser significativamente diferente
entre os animais expostos ao petróleo e seus controles, com exceção do período de 12
e 384 horas, neste último período o grupo controle é significativamente maior.
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Atividade da Catalase (umol min
-1
g
-1
)
0
1
2
3
4
Exposição
controle
Figura 9. Atividade da CAT, em Astronotus ocellatus, em indivíduos expostos ao petróleo e seus
respectivos controles, nos diversos períodos. * diferença estatística significativa em relação ao grupo
controle (P < 0,05).
*
*
30
3.3.2 Atividade da glutationa-S-transferase (GST)
A atividade da GST (figura 10) mostrou valores significativamente diferentes
entre o grupo exposto e o grupo controle nos momentos de tempo 12, 24, 48, 96 e 192
horas. A diferença entre os dois grupos de indivíduos aumentou ao longo do tempo e foi
máxima em 96 horas, período após o qual essa diferença diminuiu deixando de ser
significativa no período de 384 horas de exposição (figura 11). Após a recuperação não
se verificou diferença estatística entre os animais expostos ao petróleo e o grupo
controle.
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Atividade GST (umol min
-1
g
-1
)
0
50
100
150
200
250
Exposição
Controle
Figura 10. Atividade da GST, em Astronotus ocellatus, em indivíduos expostos ao petróleo e seus
respectivos controles, nos diversos períodos. * diferença estatística significativa em relação ao grupo
controle (P < 0,05).
*
*
*
*
*
31
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Atividade GST (umol min
-1
g
-1
)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Figura 11. Variação da diferença entre o grupo exposto e o grupo controle da atividade da GST ao longo
do tempo.
3.4 Avaliação de danos celulares
3.4.1. Concentração endógena de produtos celulares oxidados (TBARS)
A concentração endógena de produtos celulares oxidados (figura 12) nos
indivíduos expostos ao petróleo mostrou-se estatisticamente diferente do controle nos
períodos de tempo 12, 24, 48 e 96 horas, onde se verifica um aumento muito acentuado
dos valores de TBARS no grupo exposto ao petróleo. A maior diferença, entre os
animais expostos e o controle foi verificada no período de 24 horas. A partir das 24
horas, essa diferença diminui, deixando de existir diferença estatística depois das 192
horas (figura 13). Os valores obtidos após 384 horas de recuperação não mostram
diferença estatística entre os dois grupos de indivíduos.
32
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
TBARS (nmoles/ ml de plasma)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Exposição
Controle
Figura 12. Concentração endógena de produtos celulares oxidados, em Astronotus ocellatus, em
indivíduos expostos ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos de tempo. *
diferença estatística significativa em relação ao grupo controle (P < 0,05).
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
TBARS (nmoles/ml de plasma)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Figura 13. Variação da diferença entre o grupo exposto e o grupo controle da concentração endógena de
produtos celulares oxidados ao longo do tempo.
*
*
*
*
33
3.4.2 Anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE)
A percentagem de anormalidades nucleares eritrocíticas (figura 14) mostrou ser
estatisticamente diferente entre os animais expostos e o grupo controle, a partir das 24
horas. Essa diferença acentuou-se no período de 48 horas, período após o qual a
diferença entre os dois grupos de animais diminui, deixando de ser estatisticamente
diferente após o período de 192 horas. Após o período de recuperação, o número de
anormalidades eritrocíticas diminui, sendo os valores encontrados semelhantes aos do
grupo controle.
Tempo (h)
0 12 24 48 96 192 384 rec
Anormalidades eritrocíticas (%)
0
5
10
15
20
25
30
Exposição
Controle
Figura 14. Percentagem de anormalidades eritrocíticas, em Astronotus ocellatus, em indivíduos expostos
ao petróleo e seus respectivos controles, nos diversos períodos. * diferença estatística significativa em
relação ao grupo controle (P < 0,05).
3.5. Expressão do gene CYP1A
A figura 15 é o resultado da corrida eletroforética das amostras de Astronotus
ocellatus, em gel de acrilamida. Foi utilizado o padrão 1Kb DNA ladder (1µg /µl) da
*
*
*
34
Invitrogen. No primeiro gel (figura 15 A) observa-se o resultado obtido, utilizando-se 30
ciclos de PCR na etapa de amplificação. O segundo gel (figura 15 B) é o resultado
obtido reduzindo o número de ciclos durante a apmplificação para 26. No primeiro gel
(figura 15 A) é possível observar que houve amplificação do gene CYP1A, mas não é
possível notar diferença entre os vários tempos de exposição. Comparando a
intensidade das bandas obtidas em cada momento verifica-se, no segundo gel (figura
15 B), um aumento progressivo ao longo do tempo, assim como uma maior intensidade
das amostras referentes ao grupo exposto relativamente ao controle. Após o tempo de
recuperação de 96 horas os indivíduos anteriormente expostos ao petróleo exibiram
bandas de maior intensidade do que os indivíduos pertecentes ao grupo controle.
A
B
Figura 15. Expressão do gene CYP1A, em Astronotus ocellatus, resultado de 30 ciclos de PCR (12, 24,
48 e 96 horas) (A); resultado de 26 ciclos de PCR (0, 12, 24, 48, 96 horas e recuperação) (B). c -
amostras referentes aos indivíduos controle, p - amostras referentes aos indivíduos expostos ao petróleo,
rec-recuperação.
12c 12p 24c 24p 48c 48p 96c 96p
0
c 0p 12c 12p 24c 24p 48c 48p 96c 96p c rec
35
4. Discussão
4.1 Parâmetros hematológicos
Os parâmetros hematológicos são considerados indicadores da saúde de todo o
organismo e amplamente usados em diversos estudos, particularmente de impacto de
poluentes (Adhikari et al, 2004; Ribeiro et al, 2006).
Têm sido feitos trabalhos relacionando os parâmetros hematológicos com
situações de estresse, tais como condições de hipoxia e anoxia. (Medeiros et al., 1983;
Adhikari et al, 2004).
A presença de petróleo na água resulta numa diminuição da disponibilidade de
oxigênio (Val & Almeida-Val, 1999a). Assim, é esperado que a exposição dos indivíduos
a este contaminante provoque um ajuste fisiológico maximizando a transferência de
oxigênio do meio ambiente para o tecido. Apesar de não terem sido notadas alterações
do hematócrito e do número de eritrócitos não ter apresentado diferenças estatísticas
entre o grupo exposto e o controle, esse fato pôde ser observado nos resultados
obtidos que dizem respeito à concentração de hemoglobina. Este parâmetro aumentou
significativamente no grupo exposto, indicando um investimento do organismo em
captar oxigênio. Esse mesmo fato traduz-se nos valores de concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM).
Também de acordo com o que acontece em condições de hipoxia foi verificado
um aumento da metahemoglobina no grupo exposto. A elevação deste parâmetro
também está relacionada com o estresse oxidativo (Moraes et al, 2006). No estado
normal, o ferro inserido no grupo “heme” da hemoglobina encontra-se no estado
reduzido ou ferroso (Fe
++
) entretanto, situações de estresse que elevam a concentração
de produtos com potencial oxidativo, oxidam o ferro, mudando-o para o estado férrico
(Fe
+++
) tornando a hemoglobina não funcional, assim denominada metahemoglobina
(Naoum et al, 2004).
O fato do grupo controle exibir valores altos de metahemoglobina, a partir das
192 horas de experimento, pode estar relacionado com o aumento da concentração de
amônia e, por conseguinte, nitrito na água, uma vez que não houve renovação de água
36
(Naoum et al, 2004; Moraes et al, 2006). O aumento de nitrito na água induz a um
estado de estresse oxidativo.
4.2 Enzimas antioxidantes
Entre os principais sistemas de defesas antioxidantes (SDA) encontram-se a
catalase (CAT) e a glutationa S-transferase (GST) (Geracitano et al., 2000;
Schitzendubel et al., 2001; Silva et al., 2003; Trenzado et al., 2006).
Em situações de estresse os SDA são ativados para defender o organismo das
modificações químicas ambientais, sendo essenciais para a sobrevivência dos
organismos (Bonga, 1997; Moore et al., 2004).
A CAT é uma ferro-hemoenzima presente nos peroxissomos.sendo responsável
pela conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Fígado, rins e eritrócitos
são os principais órgãos onde esta enzima pode ser encontrada (Halliwell & Gutteridge,
1999).
A GST é uma enzima importante no processo de catálise da conjugação do
tripeptídio glutationa (GSH) com xenobióticos ou componentes celulares danificados
pelas espécies reativas de oxigênio (ERO) (Mak et al., 1996; Storey, 1996; Dixton et al.,
2002).
Em situações de estresse, como no caso de exposição ao petróleo, é esperado
um aumento da atividade das enzimas CAT e GST, uma vez que a concentração de
ERO tende a aumentar. Trabalhos de exposição a poluentes em peixes ilustram essa
relação (Gabryelak & Klekot, 1985; Roméo & Gnassia-Barelli, 1997; Venugopal et al.,
1997; Choi et al., 2000; Ribeiro et al., 2002).
No entanto, Marcon (1995) observou, em tambaqui, uma diminuição da CAT
quando este foi submetido à hipoxia. Paralelamente, observou um aumento da
glutationa peroxidase, sugerindo que houve uma substituição da atividade da CAT por
esta enzima no balanceamento dos níveis de peróxido de hidrogênio. O mesmo tipo de
resultados, utilizando tilápias, foi evidenciado por Bainy et al. (1996) e por Trenzado et
al. (2006), usando truta arco-íris.
37
Neste trabalho, uma hipótese semelhante pode ser levantada se compararmos
os valores encontrados para a CAT e GST. A enzima CAT teve um aumento
significativo nas primeiras 12 horas, nos indivíduos expostos, período após o qual se
verificou uma diminuição da atividade da enzima, sendo que a partir desse momento a
GST se tornou mais expressiva como enzima presente no papel de desintoxicação do
organismo, atingindo o seu máximo de atividade em 192 horas. Posteriormente,
observou-se uma diminuição da atividade da GST, deixando de ser significativa no
período de tempo de 384 horas. Este resultado sugere que, após 384 horas de
exposição ao petróleo, houve uma diminuição da capacidade dos indivíduos em
degradar o peróxido de hidrogênio e em desintoxicar o organismo, o que pode ser
ilustrado por uma elevada mortalidade dos animais expostos nesse período (37,5%).
Nos indivíduos controle, a GST não sofreu grandes alterações da sua atividade
ao longo do tempo. Já a catalase, no grupo controle, surge significativamente mais
elevada no período de 384 horas. É importante salientar que todos os indivíduos
deixaram de ser alimentados durante todo o período experimental, assim como não
houve renovação de água. Sugere-se então, que o aumento da atividade da CAT nos
indivíduos controle está relacionada com alterações metabólicas associadas à hipoxia
e debilidade física, e que para esse mesmo momento, os indivíduos expostos ao
petróleo não tiveram a mesma capacidade de reação.
Os valores encontrados após o período de recuperação mostram que os
indivíduos diminuem a atividade destas enzimas quando deixam de estar em contacto
com o petróleo.
De um modo geral, os resultados da atividade das duas enzimas parecem
mostrar que a GST desempenha um papel mais importante na desintoxicação do
petróleo do que a CAT. A atuação imediata da CAT parece evidenciar o efeito redutor
do petróleo na disponibilidade do oxigênio, logo após a contaminação.
38
4.3 Avaliação de danos celulares
4.3.1Concentração endógena de produtos celulares oxidados (TBARS)
Como resultado da ação das ERO sobre os ácidos graxos polinsaturados e
fosfolipídios ocorre peroxidação lipídica causando ruptura da membrana celular. A
concentração endógena de produtos celulares oxidados, substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) é uma medida dos níveis de peroxidação lipídica.
A peroxidação lipídica é um fenómeno natural que ocorre nos organismos,
mesmo sem estresse oxidativo (Passi et al., 2004), no entanto, em situações de
estresse, os níveis de TBARS tendem a aumentar (Andersson et al., 1988; Marcon et
al., 1997; Wilhelm et al., 1993).
Neste trabalho pôde-se observar, de acordo com o esperado, um aumento
significativo dos níveis de TBARS nos animais expostos ao petróleo.
A diferença entre os animais expostos e o controle foi máxima no período de 24
horas, indicando um rápido acúmulo de produtos celulares oxidados por parte dos
indivíduos expostos.
Após o período de 96 horas, notou-se um aumento dos níveis de TBARS nos
indivíduos controle, deixando de se verificar diferença estatística em relação aos
indivíduos expostos. Isto pode ser explicado por razões de ordem metabólica, uma vez
que todos os tanques deixaram de ter renovação de água. Assim, mesmo os indivíduos
controle, no decorrer do experimento, se encontraram em condições de estresse
oxidativo, respondendo com o aumento dos níveis de peroxidação lipídica. Contudo,
avaliando o gráfico da diferença de resposta do grupo exposto e do grupo controle
(figura 13) podemos dizer que os resultados obtidos mostram claramente o efeito
estressante do petróleo no acará-açu.
39
4.3.2 Anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE)
Segundo Carrasco et al. (1990) as lesões nucleares dividem-se em quatro
categorias: micronúcleo (M), núcleo lobado (L), núcleo segmentado (S) e núcleo em
forma de rim (K).
Dentre elas, os micronúcleos têm sido amplamente usados como um indicador
genotóxico, para avaliar o efeito da exposição dos organismos a substâncias químicas
(Pacheco & Santos, 1997; Villela et al., 2002).
Micronúcleos são pequenos corpúsculos, semelhantes ao núcleo em forma e
estrutura, sendo cerca de um terço do seu tamanho. São causados por agentes físicos,
químicos ou biológicos, capazes de interferir no processo de ligação dos cromossomos
às fibras do fuso mitótico. Resultam assim, da perda de material cromossômico, que por
não se unir ao fuso mitótico fica isolado no citoplasma formando a sua própria
membrana nuclear (Maluf & Erdtmann, 2003). Este tipo de teste detecta mutagênese
cromossômica em eucariotos e danos do fuso mitótico (Villela et al., 2002).
Este tipo de anormalidades nucleares é produzido naturalmente pelos
organismos devido a erros no processo de divisão celular (Heddle et al., 1991).
Para que sejam visualizadas anormalidades nucleares eritrocíticas é necessário
que ocorra uma divisão celular após o evento mutagênico (Villela et al., 2002). Isso
explica por que os resultados de ANE foram significativamente expressivos mais tarde
(período de 24 horas) do que os resultados enzimáticos e de TBARS que mostraram
resposta significativa logo no período de 12 horas.
Os resultados obtidos mostram que a exposição ao petróleo fez aumentar, ao
longo do tempo, a percentagem de ANE nos indivíduos expostos.
A perda de significado estatístico das diferenças entre os dois grupos de
indivíduos (exposto e controle) no período de 192 horas, pode ser explicada da mesma
forma que para os parâmetros anteriores.
40
4.4 Expressão do gene CYP1A
O gene CYP1A está envolvido na desintoxicação do organismo, atuando na
oxidação de poluentes como os hidrocarbonetos derivados do petróleo, transformando-
os em formas menos complexas, facilmente excretadas (Guecheva & Henriques, 2003).
Como seria de esperar, os resultados mostram um aumento da expressão deste
gene nos indivíduos expostos ao petróleo, em relação ao controle. Ao longo do tempo
de exposição a expressão vai sendo maior, mostrando que ao fim de 96 horas existe
uma maior ativação do gene CYP1A na espécie Astronotus ocellatus, quando exposta
ao petróleo. Estes resultados corroboram dados obtidos por outros autores em
trabalhos de exposição de peixes a diversos tipos de contaminantes (Levine et al.,
1999; Meyer et al., 2002; Williams et al., 2003; Malis et al., 2006). Após o tempo de
recuperação, não foi possível verificar uma diminuição da expressão do gene CYP1A,
indicando que 96 horas não é tempo suficiente para que essa possa ocorrer e
mostrando que esse gene pode ser um bom bioindicador de exposição crônica do
animal ao petróleo.
41
5. Conclusões
1. A concentração de hemoglobina e a concentração de metahemoglobina no
sangue de indivíduos de Astronotus ocellatus podem ser consideradas como
diagnóstico de situações de estresse.
2. A atividade da CAT não é um bom biomarcador para a exposição de Astronotus
ocellatus ao petróleo.
3. A espécie Astronotus ocellatus pode ser usada como bioindicadora de exposição
ao petróleo quando a GST é usada como biomarcador.
4. A espécie Astronotus ocellatus pode ser usada como bioindicadora de exposição
ao petróleo quando a concentração de produtos celulares oxidados (TBARS) é
usada como biomarcador.
5. A espécie Astronotus ocellatus pode ser usada como bioindicadora de exposição
ao petróleo quando a percentagem de ANE é usada como biomarcador.
6. A espécie Astronotus ocellatus pode ser usada como bioindicadora de exposição
ao petróleo quando a expressão do gene CYP1A é usada como biomarcador.
42
6. Referências bibliográficas
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