( PDF ) Efeitos do resveratrol sobre as células estreladas hepáticas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

BIOQUÍMICA

Efeitos do resveratrol sobre as células estreladas

hepáticas.

Izabel Cristina Custodio de Souza

Orientador: Prof

. Dr

. Fátima T. Costa Rodrigues Guma

Co-orientador: Prof

. Dr

. Regina Maria Guaragna

Porto Alegre, 2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

BIOQUÍMICA

Efeitos do resveratrol sobre as células estreladas

hepáticas.

Izabel Cristina Custodio de Souza

Orientador: Prof

. Dr

. Fátima T. Costa Rodrigues Guma

Co-orientador: Prof

. Dr

. Regina Maria Guaragna

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

- Bioquímica, como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em

Bioquímica.

Porto Alegre, 2009

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“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento

envolvido e não na vitória propriamente dita”.

Mahatma Gandhi

iii

AGRADECIMENTOS

Às minhas filhas, Victória e Valentina e ao meu esposo, Clair Gralha,

pela paciência com minhas demasiadas irritações e ao amor que sempre me

dedicaram.

À minha mãe e minha irmã, pela força com as crianças e por todo o

amor a mim dedicado.

À minha orientadora Fátima Guma, pela orientação, atenção, carinho e

apoio, mesmo sabendo dos meus limites para desenvolver este trabalho, ela

acreditou que eu conseguiria.

À minha co-orientadora Regina Guaragna, pela orientação, atenção e ao

apoio dedicado.

Ao Leo, meu amigo, meu braço direito e esquerdo, por toda ajuda no

laboratório e pelas trocas de idéias.

À Carmem Gottfried, pela força moral, orientação e apoio.

À Aline Gerlach, pela ajuda na bancada e com os experimentos.

À Claudia, Eduardo, Lica e Josiane, pela ajuda com os experimentos.

Aos meus amigos por não cansarem de me ouvir falar sobre a “tese”.

Aos colegas dos laboratórios 21, 23 e 32 pelo auxílio com os materiais,

equipamentos e bancada.

À Cléia e a Simone, sempre atenciosas e dedicadas.

Aos funcionários do Departamento de Bioquímica.

APRESENTAÇÃO

Esta tese está apresentada da seguinte maneira:

PARTE I

Introdução contendo referências da literatura que fundamentam este

trabalho.

Objetivos gerais e específicos do presente trabalho.

PARTE II

Capítulo I: Artigo publicado no periódico Molecular and Celular Biochemistr.

Capítulo II: Manuscrito a ser submetido ao periódico Liver International.

Capítulo III: Resultados complementares

PARTE III

Discussão contendo a interpretação dos resultados apresentados na

presente tese.

Conclusões.

REFERÊNCIAS

ANEXOS

Lista de Figuras.

Lista de Tabelas

SUMÁRIO

PARTE I

I.1 RESUMO

........................................................................................................................................................07

I.2 ABSTRACT

..................................................................................................................................................08

I.3 LISTA DE ABREVIATURAS

...........................................................................................................09

I.4 INTRODUÇÃO............................................................................................................................................12

I.4.1 Célula Estrelada Hepática

.............................................................................................................12

I.4.2 Resveratrol

.................................................................................................................................................15

I.4.2.1 Resveratrol e proliferação celular

............................................................................18

I.4.2.2 Resveratrol e ciclo celular

.............................................................................................20

I.4.2.3 Resveratrol e apoptose

....................................................................................................21

I.4.3 Sirtuína1 (SIRT 1)

.................................................................................................................................22

I.4.4 Receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs)

...............23

I.4 OBJETIVOS.................................................................................................................................................25

I.4.1 Objetivo Geral

.........................................................................................................................................25

I.4.2 Objetivos Específicos

........................................................................................................................25

PARTE II

II.1 CAPÍTULO I: ARTIGO PUBLICADO......................................................................................27

II.2 CAPÍTULO II: MANUSCRITO A SER SUBMETIDO

...................................................35

II.3 CAPÍTULO III: RESULTADOS COMPLEMENTARES

..........................................59

PARTE III

III.1 DISCUSSÃO

.............................................................................................................................................64

III.2 CONCLUSÃO

..........................................................................................................................................75

REFERÊNCIAS

.................................................................................................................................................76

LISTA DE FIGURAS

......................................................................................................................................88

LISTA TABELAS

..............................................................................................................................................88

PARTE I

I.1 RESUMO

As células estreladas hepáticas (HSC) são pericitos específicos do fígado, são células

armazenadoras de gordura e produzem componentes de matriz extracelular. As HSCs ao

serem ativadas, proliferam, perdem as gotas lipídicas e aumentam a secreção de matriz

extracelular. O controle da modulação fenotípica e da proliferação das HSCs é de suma

importância para entendermos a fibrose hepática. Esta pesquisa foi realizada com a linhagem

celular GRX (representativa das HSCs murinas) obtida a partir de reações fibrogranulomatosas

inflamatórias. Estudos anteriores, em nosso laboratório, pesquisaram a ação de diferentes

drogas sobre a modulação destas células, tais como: retinol, pentoxifilina, indometacina e

insulina. Tem sido relatado que o resveratrol (3,4,5 trihidroxiestilbeno) (RSV) tem ação

antioxidante, antiinflamatória, antiproliferativa bem como tem capacidade de ativar ou inibir a

transcrição de enzimas envolvidas na regulação de vários eventos celulares, por exemplo

metabolismo de lipídeos. Por isso, procuramos utilizar o RSV, um polifenol natural presente na

casca das uvas e conseqüentemente em grande quantidade de vinhos tintos, neste modelo

celular. As células GRX foram cultivadas (12, 24 e 120 h) em meio DMEM com 5% SFB

acrescido ou não de RSV (100 nM, 1µM ou 100 µM) e retinol (RHO) (5µM). Nossos estudos

demonstraram que tratamento por 120 h com RSV (100nM e 1µM) inibiu a proliferação das

células GRX diminuindo em 35% o número de células. Analisando o efeito de 1µM de RSV

sobre o ciclo celular e a apoptose, verificamos que após 120 h de tratamento houve um

aumento das células na fase S e Sub-G1. Constatou-se condensação e fragmentação nuclear,

sugerindo um possível efeito pró-apoptótico do RSV sobre a célula GRX. Observou-se que o

tratamento com RSV (100 nM) por 5 dias não induziu a formação de gotas lipídicas nas células

GRX. Porém ao acrescentar RSV+RHO, constatou-se que o RSV não interferiu na síntese e

acúmulo de lipídios, provocado pelo RHO (5µM). Propondo que a lipogênese neste modelo de

tratamento possa estar associada com a ação da sirtuina (deacetilase NAD-dependente) e do

PPARγ (receptores ativados por proliferadores de peroxissomos), determinou-se a expressão

do mRNA destas duas proteínas. Observou-se que o RSV (100 nM) aumenta a expressão do

mRNA da sirtuina 1 (SIRT1) e diminui a expressão de PPARγ. Porém, o tratamento com

RSV+RHO provocou uma redução na expressão da SIRT1, alterando a relação

PPARγ/SIRT1, promovendo a síntese de lipídios. Nossos dados mostraram que após 24h de

tratamento, o RSV não alterou a incorporação de acetato [C

] em triacilglicerídios (TG),

enquanto que, o RHO ou RSV+RHO aumentaram a incorporação do marcador nestes

lipídios. O depósito de TG permaneceu constante, porém a síntese diminuiu com o tempo de

tratamento. Acredita-se que estes compostos atuam por mecanismos moleculares diferentes

modulando o metabolismo de lipídios. Sugerimos, de acordo dados da literatura, que o RHO

atua via receptor nuclear LXR formando um heterodímero com PPARγ, favorecendo a

lipogênese. Por outro lado, o RSV ativa a SIRT1, que reprime o PGC1α (coativador do

PPARγ). Logo, a inibição do PPARγ pelo RSV inibe consequentemente a lipogênese.

Concluímos que o resveratrol apresenta um efeito anti-proliferativo, pró-apoptótico sem induzir

o fenótipo lipocítico nas células GRX. Desta forma, se mantém em equilíbrio, no espaço de

Disse, as células mesenquimais quiescentes e ativadas, contribuindo para restabelecer a

homeostase hepática.

I.2 ABSTRACT

The hepatic stellate cells (HSC) are liver-specific pericytes, as well as fat-

storing cells and they are also responsible for the extracellular matrix

components production. When activated, HSCs lose lipid droplets and increase

extracellular matrix secretion. The phenotypical modulation and the HSCs

proliferation control have paramount importance to understand the hepatic

fibrosis. This research has been carried out with the GRX cell line (HSCs

murine representative) which was obtained from inflammatory

fibrogranulomatous reactions. Previous studies in our laboratory investigated

the action of different drugs on the modulation of these cells, such as: retinol,

pentoxifilin, indomethacin and insulin. Resveratrol (RSV) has been referred to

as having antioxidant, antiinflammatory and antiproliferative action (3,4,5

trihidroxiestilbeno), as well as the capacity to activate or inhibit the transcription

of enzymes involved in the regulation of several cell events, as, for example,

lipid metabolism Therefore, we used RSV, which is a natural polyphenol found

in the grapes skin and, consequently, in large amounts of red wine, in this cell

model. The GRX cells were cultivated (12, 24 and 120 h) in medium DMEM with

5% SFB added RSV or not (100 nM, 1µM or 100 µM) and retinol (RHO) (5µM).

Our studies demonstrated that a 120 h treatment with RSV (beginning with 100

nM) inhibited GRX cells proliferation, thus decreasing the cell number in 35%.

Assessing the effect of 1µM RSV on the cell cycle and the apoptosis, we found

that, after this treatment period, there was an increase of cells in phases S and

Sub-G1. Nuclear condensation and fragmentation were observed, which

suggested a probable pro-apoptotic RSV effect on the GRX cell. The RSV (100

nM) 120 h treatment did not induce lipid droplets formation in the GRX cells.

However, RSV did not interfere in the synthesis or accumulation of lipids

caused by RHO (5µM), when RSV+RHO were added. Considering that the

lipogenesis in this treatment model might be associated with sirtuin action

(deacetilase NAD-dependent) and PPARγ (receptors activated by peroxisome

proliferators), the mRNA expression of these two proteins was determined. RSV

(100 nM) proved to increase sirtuin mRNA expression 1 (SIRT1) and decrease

PPARγ.expression. However, the treatment with the RSV+RHO caused a

reduction in the SIRT1 expression thus alterating the relation PPARγ/SIRT1,

which promoted the lypid synthesis. Our data showed that after the 24-hour

treatment RSV did not change acetate incorporation [C

] in triacylglicerides

(TG), whilst RHO or RSV+RHO increased the marker incorporation in these

lipids. The TG deposit remained constant, but the synthesis diminished during

the treatment period. It appears that these compounds act through different

molecular mechanisms when modulating lipids metabolism. According to

literature data, we suggest that RHO acts via LXR nuclear receptor, thus

forming an heterodímer with PPARγ, which favors lypogenesis. On the other

hand, RSV activates SIRT1, which inhibits PGC1α (PPARγ coactivator).

Therefore, the PPARγ inhibition by RSV consequently inhibits lypogenesis. We

concluded that RSV presents pro-apoptotic, anti-proliferative effect, without

inducing lypocytic phenotype in the GRX cells. By this means the mesenquimal

activated quiescent cells keep their balance at the Disse space, thus

contributing with the hepatic homeostasis restoration.

I.3 LISTA DE ABREVIATURAS

AGL – Ácido Graxo Livre

AH109A – Células de Hepatoma (Ascites)

A431 – Linhagem Celular de Carcinoma Epidermal

AMPK – Proteína Quinase Ativada por AMP

BCL-2 – Proteína Oncogênica Inibidora de Apoptose

CaCo-2 – Linhagem Celular de Carcinoma Epidermal

CDKs – Ciclinas Dependentes de Quinases

CEMC7H2 – Linhagem de Leucemia Linfocítica

C/EBP – Proteína Estimuladora de Ligação a CCAAT

C6 – Células de Glioma

ECM – Matriz Extracelular

ERK1/2 – Proteínas Quinases Reguladas por Sinais Extracelulares

Ero1-Lα – Oxidoredutase de Reticulo Endoplasmático

FAK – Quinase de Adesão Focal

Fox01 – Fator de Transcrição Associado a Supressão de Tumores

GRX – Célula Estrelada Hepática - murina

GW647 – Agonista do PPARα

GW501516 – Agonista do PPARδ/β

HepG2 – Células de Carcinoma Hepatocelular

HSCs – Células Estreladas Hepáticas

HL-60 – Células de Leucemia Promielítica

JB6 – Linhagem Celular de Carcinoma Epidermal

Jurkat – Célula-T Leucêmica

INDO – Indometacina

INK4A – Inibidor de CDKs

INS – Insulina

Ku70 – Fator de Transcrição Associado ao Ciclo Celular

LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade

LNCap – Linhagem Celular de Câncer de Próstata

L1210 – Células de Leucemia murina

LXR – Receptores X do fígado (Liver X receptors)

MAPK – Proteína Quinase Ativada por Mitógenos

MCF-7 – Linhagem celular de câncer de mama

MIO – Miofibroblasto

MMP – Metaloproteinases

Molt4 – Células de Leucemia Linfoblástica

NF-κB – Fator Nuclear Kappa -B

p53 – Proteína Supressora de Tumores (via regulação do ciclo celular)

P16 –

Proteína envolvida Regulação do Ciclo Celular

PGC-1α – Coativador-1 do PPARγ

PKC – Proteína Quinase C

PPRE – Elemento Responsivo ao PPAR

PTX – Pentoxifilina

RSV – Resveratrol

RHO – Retinol

RR – Ribonucleotídeo Redutase

RXR – Receptor do 9-cis Ácido Retinóico

α- SMA – alfa-actina de músculo Liso

SIRT1 – Sirtuína - 1

SREBP – Proteína 1c Ligadora do Elemento Regulado por Esteróis

3T3-L1 – pré-adipócitos

TG – Triacilglicerídios

TIMP – inibidor de metaloproteínases de matriz tecidual

TZD – Tiazolidinedionas

U937 – Células de Leucemia Monocítica

I.4 INTRODUÇÃO

I.4.1. Célula Estrelada Hepática

A fibrose é a principal fisiopatologia decorrente de uma injúria crônica ao

fígado, é um processo comum na insuficiência hepática e é responsável por

muitas complicações clínicas no estágio final das doenças deste órgão.

Inicialmente representa um processo passivo, pelo qual, a morte celular leva à

condensação do estroma preexistente (Hartroft et al., 1951). A fibrose foi

redefinida pela World Health Organization em 1978 como “a presença de

excesso colágeno devido formação de novas fibras” (Anthony et al., 1978).

Atualmente, é conhecida como fazendo parte de um processo dinâmico e

contínuo de remodelagem de matriz extracelular (ECM) em um quadro de

injúria crônica hepática, levando a um excessivo acúmulo de várias proteínas

extracelulares, proteoglicanas e carboidratos (Wheeler et al., 2001; Bataller e

Brenner, 2005). Embora, o processo já tenha sido parcialmente elucidado, as

células estreladas hepáticas (HSCs) tem sido responsabilizadas pela

fibrogênese, indepedente de, sua base etiológica (Wheeler et al., 2001; Bridle

et al., 2003). O entendimento dos mecanismos moleculares fisiopatológicos

que envolvem estas células é fundamental para o desenvolvimento de terapias

antifibrogênicas (Moreira, 2007).

As HSCs, conhecidas como células de “Ito”, lipocíticas ou perisinusoidais

específicas do fígado, encontradas em um estado quiescente no espaço de

Disse (entre os hepatócitos e os sinusóides) são armazenadoras de gordura

(Wake, 1971). Durante a lesão hepática crônica, as HSCs se diferenciam para

um fenótipo miofibroblástico ativado que se caracteriza por uma acentuada

proliferação e secreção de componentes de matriz extracelular (Blonhoff e

Wake, 1991; Bissel, 1992) como colágeno do tipo I, II, IV e V, laminina e

elastina, com a predominância do colágeno do tipo I (Battaller e Brenner,

2005). A ativação das HSCs é acompanhada pela perda das gotas lipídicas

ricas em vitamina A, por uma reorganização e expressão de proteínas de

citoesqueleto, como α- actina de músculo liso (α- SMA) e desmina (figura 1)

(Kisseleva e Brenner, 2006).

PROLIFERAÇÃO

CÉLULA ATIVADA

MATERIAL DE

MATRIZ

EXTRACELULAR

MATERIAL DE

MATRIZ EM

DEGRADAÇÃO

PERDA DE GOTAS

LIPÍDICAS

FIGURA 1. Célula Estrelada Hepática em um processo de injúria do fígado. Modificado de

Friedman, (2000)

As HSCs participam do reparo e da regeneração da homeostase da

matriz extracelular hepática, desta forma, a capacidade das HSCs de

expressarem um duplo fenótipo é um aspecto intrigante (Blonhoff e Wake,

1991; Bissel, 1992). Estudos detalhados sobre o fenótipo expresso por células

estreladas quiescentes ou ativadas mostraram que estas representam uma

população celular heterogênea, em termos de sua função e expressão de

proteínas citoesqueléticas (Guma et al., 2001).

Para estudos in vitro a linhagem celular GRX parece ser um modelo

interessante, apresenta características morfológicas e bioquímicas das culturas

primárias do tecido conjuntivo hepático humano (Monteiro e Borojevic,1987). A

linhagem GRX é representativa das HSCs murinas, foi obtida a partir de

reações fibrogranulomatosas inflamatórias induzidas em fígado de

camundongo, após infecção por Schistosoma mansoni (Borojevic et al., 1985).

Expressa dois fenótipos, o miofibroblástico e o lipocítico (Borojevic et al., 1985)

semelhante à célula estrelada hepática in vivo. As células com o fenótipo

miofibroblástico apresentam morfologia estrelada, poligonal ou alongada,

secretam colágeno do tipo I e laminina, apresentam extensivos desmossomos

e estão apoiadas à membrana basal. Em condições de cultura padrão, esta

linhagem é altamente proliferativa e após atingir confluência, as células se

sobrepõem em camadas não uniformes formando “vales e montanhas”,

característica de linhagens de músculo liso. Sob determinadas condições

diminuem a proliferação e acumulam gotas lipídicas (Borojevic et al., 1985).

Estudos anteriores, em nosso laboratório, pesquisaram a ação de

diferentes drogas: sobre as células GRX: retinol (RHO), pentoxifilina (PTX),

indometacina (INDO) e insulina (INS). Estas quando tratadas com RHO

diminuíram a proliferação e a produção de colágeno, aumentaram a adesão ao

substrato e a síntese de fibronectina, mostrando uma reorganização do

citoesqueleto com o acúmulo progressivo de gotas lipídicas, correspondendo

ao fenótipo quiescente in vivo (Margis e Borojevic, 1989; Borojevic et al., 1990;

Guaragna et al., 1991).

A PTX, potente inibidor da metil-xantina fosdiesterase, testado como

antifibrogênico e antioxidante, diminui a proliferação das células GRX,

entretanto necessita estar associada ao RHO para induzir a transformação

para o fenótipo lipocítico (Cardoso et al., 2003). A indometacina, um inibidor da

ciclooxigenase-1, promove a diferenciação do fenótipo miofibroblástico para

lipocítico, quando associada ou não a insulina. Esta última, a INS, aumenta

muito a proliferação desta linhagem celular, o que impede sua transformação

em lipócito. Somente a partir de 20 dias de tratamento com INS se tem

depósito intracelular de triacilglicerídios. Estes resultados sugerem uma estreita

necessidade de diminuição de proliferação para alterações fenotípicas

(Guaragna et al., 1991; Cardoso et al., 2003).

I.4.2 Resveratrol (RSV)

O composto polifenólico resveratrol (3,5,4’ triidroxi-trans-estilbeno) é um

fitoquímico que ocorre naturalmente e pode ser encontrado em setenta e duas

espécies de plantas. Entre as espécies cultivadas para alimento existem as

videiras (uvas), amendoeiras (amendoim) e várias ervas (chá verde, chá

branco) (Jang et al., 1997). A função fisiológica exata não é conhecida, mas o

RSV pode ter um papel de proteção à planta contra infecções por fungo e

resistência às doenças (Joe et al., 2002). Este polifenol é sintetizado pela

enzima RSV sintase, principalmente na casca da uva, a partir de três moléculas

de malonil-CoA e uma de 4-coumaroil-CoA (King et al., 2006).

Baliga et al., 2005, relatam que a concentração de RSV encontra-se em

torno de (1,5-3 mg/L) em vinho tinto e (50-100 µg/g em cascas de uvas secas).

Nos chás verde e branco (Polygonum cuspidatum) a concentração é de

aproximadamente (0,524 mg/g – 1,65 mg/g) provavelmente estas são as

principais fontes deste polifenol nas dietas (Baur e Sinclair, 2006). Por outro

lado, os níveis de RSV nos vinhos variam devido à composição do solo,

exposição ao sol, infecção por fungos e quanto ao processo de fabricação e

conservação dos vinhos (Soleas et al., 1997). O RSV é um estilbeno

encontrado nas isoformas trans-resveratrol, cis-resveratrol e ainda como

resveratrol-glicosídeo, mas sua maior atividade biológica esta relacionada à

forma trans (figura 2) (Waterhouse, 2002). A biodisponibilidade do RSV, após

administração oral, tanto em humanos quanto em animais é bastante baixa. A

metabolização do RSV envolve os processos de glucuronidação e sulfatação

(Walle et al., 2004). Alguns estudos com animais sugerem que mesmo as

pequenas doses biodisponíveis são suficientes para a sua atividade

quimiopreventiva (Tessitore et al., 2000; Banerjee et al., 2002; Li et al., 2002).

Trans-resveratrol Cis-resveratrol

Figura 2. Estrutura química dos isômeros trans-resveratrol e cis-resveratrol (Signorelli et al.,

2005)

Estudos mostram que o RSV livre nas concentrações menores que 2µM,

pode ser detectável no sangue de humanos, após 1h da ingestão oral de

alimentos e/ou bebidas e que o fígado é um dos maiores sítios de

concentração do RSV (Walle et al., 2004; Meng et al., 2004). Os hepatócitos

apresentam um duplo papel, além de ser o maior sítio de acúmulo do RSV, são

responsáveis pela sua bio-conjugação e eliminação (Notas et al., 2006).

O RSV é absorvido, metabolizado e em torno de 75% é excretado via

fezes e urina (Wenzel et al., 2005). Em particular, no plasma a forma sulfatada

é menor que a forma glucuronida, experimentos usando sulfotransferases

recombinantes mostraram que esta forma encontra-se predominantemente no

intestino (Walle et al., 2004).

A albumina parece ser um dos transportadores plasmático do RSV

(Jannin et al., 2004). O transporte de RSV via membrana plasmática ocorre por

difusão passiva e facilitada (mediado por carreadores ainda não conhecidos)

(Lançon et al., 2004).

A ação antioxidante, anti-inflamatória, antiproliferativa do RSV e sua

habilidade em ativar e inibir a transcrição e a atividade de enzimas na

regulação de vários eventos celulares, associado à carcinogênese, tem sido

alvo de várias pesquisas (Joe et al, 2002).

Estudos mostram que o RSV inibe a agregação plaquetária, podendo ser

um dos mecanismos pelo qual o vinho tinto exerce um efeito cardioprotetor

(Soleas et al., 1997; Wang et al., 2002). Um possível efeito protetor do trans-

resveratrol na oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL), resultando

em uma atividade antitrombogênica vascular foi mostrado por Chen et al.,

(2007).

Lu and Serrero, 1999 mostraram que o RSV age como um antagonista

do estrógeno, levando à inibição do crescimento das células MCF-7 (linhagem

celular de câncer de mama). Bowers et al., (2000) mostrou que além da ação

antagonista, o RSV exerce uma ação agonista ao estrógeno em células MCF-7

dependendo do tipo de receptor e dos elementos responsivos ao estrógeno. O

RSV também está associado à reorganização de citoesqueleto, aumentando a

formação de filipódios e uma diminuição no número de adesões focais e

atividade da FAK (quinase de adesão focal), exercendo um efeito inibitório

sobre a migração celular em câncer de mama (Azios et al., 2005).

I.4.2.1 Resveratrol e proliferação celular

As propriedades quimiopreventivas do RSV foram primeiramente,

relatadas por Jang e colaboradores em 1997. Que demonstraram a sua ação

inibitória nos três maiores estágios da carcinogênese: iniciação, promoção e

progressão celular. O RSV reduziu o desenvolvimento de lesões pré-

neoplásicas em cultivos in vitro de glândulas mamárias de camundongo e inibiu

a tumorogênese em modelo de câncer de pele de camundongo (Jang et al.,

1997). Vários estudos demonstraram o efeito antiproliferativo do RSV em

células epiteliais de mama humana (Mgbonyebi et al., 1998; Subbaramaiah et

al., 1999; Pozo-Guisado et al., 2002 e Dubuisson et al., 2002), em células de

epiderme de camundongo (JB6) e em linhagem celular de carcinoma epidermal

(CaCo-2 e A431) (Huang et al.,1999 e Ahmad et al., 2001).

O RSV, também reduz a viabilidade celular e capacidade de síntese de

DNA de células de leucemia promielocítica de humanos (HL-60), induzindo

apoptose via BCL-2 (proteína oncogênica, isolada das células-B de linfoma,

inibidora da apoptose, localizada principalmente na membrana externa

mitocondrial, retículo endoplasmático e envoltório nuclear) ( Surh et al., 1999).

Em 2000, Kampa e colaboradores mostraram que muitos dos polifenóis

presentes no vinho, incluindo o RSV, inibem a proliferação de linhagens

celulares de câncer de próstata em humanos. Em 2002, Narayanan et al.,

sugeriram que a modulação de várias vias de sinalização pelo RSV, estaria

envolvida na inibição do crescimento de muitas linhagens celulares de câncer

de próstata LNCaP.

Carbo et al. (1999), demonstraram que o RSV diminuiu

significativamente a proliferação de células tumorais em ratos Wistar machos,

inoculados com ascites do hepatoma (AH-130 Yoshida) e que esta resposta

pode estar associada a uma parada no ciclo celular na fase G2/M e a indução

de apoptose. Outros estudos mostraram que altas concentrações de RSV (100

e 200 µM) inibem a proliferação e a invasão de células AH109A. Entretanto,

uma concentração intermediária (50µM) apresentava um menor efeito anti

proliferativo e concentrações na faixa de 25µM somente suprimiam a invasão

celular. Os autores sugerem que a atividade anti-invasiva do RSV é

independente da atividade antiproliferativa (Kozuki et al., 2001).

Em 2004, Olson e colaboradores, mostraram que o RSV inibe dois

estágios cruciais da ativação de fibroblastos cardíacos: proliferação e

diferenciação, que são parâmetros fisiológicos determinantes da fibrose

cardíaca, diminuindo consideravelmente a produção total de componentes de

ECM no miocárdio.

Em 1998, Kawada e colaboradores mostraram que o RSV é um potente

inibidor da proliferação das células estreladas hepáticas em cultura. Notas et al.

(2006) e Stervbo et al. (2006) demonstraram em células de carcinoma

hepatocelular (HepG2) que o tratamento com concentrações variáveis de RSV

(10

-12

- 10

-6

M), produzia um efeito antiproliferativo, que era dose e tempo

dependente. Já, Kirimlioglu e colaboradores (2008) sugeriram que em ratos

submetidos à hepatectomia, o RSV pode ser responsável pelo processo de

regeneração, exercendo uma ação antiproliferativa e próapoptotica sobre os

hepatócitos.

I.4.2.2 Resveratrol e ciclo celular

O ciclo celular é definido como o intervalo entre duas divisões mitóticas

sucessivas resultando na produção de duas células-filhas. O ciclo é dividido em

quatro fases: G1, S, G2 (interfase) e fase M (Mitose), caso a progressão celular

seja interrompida na fase S, a célula permanece no estado de repouso

denominado fase G0. O ciclo celular é controlado pelas ciclinas e pelas

proteínas quinases dependentes de ciclinas (CDKs) (Lu et al., 2005).

As células de leucemia promielocítica (HL-60) tratadas com RSV

apresentaram uma inibição do crescimento celular, indução de apoptose,

parada do ciclo celular nas fases S-G2 e diferenciação mielomonocítica

(Clement et al., 1998; Ragione et al., 1998). Outros pesquisadores sugerem

que o RSV induz a parada no ciclo celular na fase S por redução na síntese de

DNA (Ragione et al., 1998; Ahmad et al., 2001).

Os efeitos na progressão do ciclo celular podem também ser explicados

pela inibição direta da atividade da ribonucleotideo redutase (RR) (Fontecave et

al., 1998) e da DNA polimerase (Sun et al., 1998). A RR existe em todas as

células vivas e catalisa o passo limitante na síntese dos deoxiribonucleotídeos

necessários para síntese do DNA. Outros estudos mostraram que o RSV inibe

a RR em células L1210 de leucemia murina (Fontecave et al., 1998). A

ribonucleotídeo redutase é um alvo promissor na terapia do câncer e doenças

causadas por protozoários (Cory 1988; Louie et al., 1999; Melo et al., 2000;

Finch et al., 2000). Em fibroblastos normais e células de fibrosarcoma foi

observado que a inibição da síntese de DNA foi induzida diretamente pela

interação específica do RSV com a DNA polimerase (Stivala et al., 2001).

A linhagem celular de leucemia linfocítica (CEM-C7H2) apresenta uma

deficiência funcional de p53 (proteína responsável pela proliferação celular) e

de p16 (proteína do ciclo celular de mamíferos, supressora das atividades de

CDKs). Estas células, quando tratadas com RSV sofrem uma parada do ciclo

celular na fase S e entram em apoptose. Quando as mesmas células foram

transfectadas com p16/INK4A o tratamento com RSV levou a uma parada no

ciclo celular em G0/G1 e reduziu significativamente a percentagem de células

apoptóticas (Bernhard et al., 2000; Stewart

et al., 2003; Ghazizadeh et al.,

2005).

Altas concentrações de RSV induzem um aumento significativo do

número de células MCF-7 nas fases G0/G1, diminuindo nas demais fases do

ciclo celular (Pozo-Guisado et al., 2004). No entanto, em linhagens de câncer

de próstata, tratadas com diferentes concentrações de RSV, é observado um

aumento moderado do número de células na fase S (Sgambato, 2001),

sugerindo que, em linhagens de câncer de próstata, o RSV interrompe a

transição da fase G1/S do ciclo celular.

I.4.2.3 Resveratrol e apoptose

Apoptose é a morte celular geneticamente programada. O processo de

apoptose caracteriza-se por: 1- retração e condensação celular; 2- perda de

adesão intercelular; 3- fragmentação da cromatina; 4- fragmentação celular em

corpos apoptóticos. As caspases, enzimas da família de cisteína-aspartato

proteases, são fundamentais na iniciação e no desenvolvimento deste

processo (Earnshaw et al., 1999).

Em 2002, Roman e colaboradores, mostraram que o RSV induz

apoptose envolvendo mecanismos dependentes e independentes de caspases

em células-B de leucemia crônica. Em células de glioma (C6), Zhang W e

colaboradores (2006) mostraram que o RSV induz apoptose in vitro, não

ocorrendo o mesmo em fibroblastos 3T3, indicando a caspase-3 como o

principal mediador neste processo.

Estudos com uma variedade de linhagens celulares de câncer humano,

demonstraram que o RSV é capaz de induzir apoptose dependente de p53 via

ERK1/2 mediada por proteínas supressora de oncogênese (Lin et al., 2008).

Linhagens celulares de câncer humano: MCF7 (carcinoma mamário),

HepG2 (hepatoblasma), U937 (leucemia monocítica), Molt4 (leucemia

linfoblástica) e Jurkat (célula-T leucêmica), apresentaram diferentes graus de

indução de apoptose pelo RSV dependendo da via sinalização ativada (Nigro et

al., 2007).

Células de carcinoma hepatocelular (HepG2) tratadas com

concentrações variáveis de RSV, além do efeito antiproliferativo, são induzidas

a apoptose (Stervbo et al., 2006).

Muitos trabalhos mostram o efeito do RSV sobre o ciclo celular e

apoptose, por mecanismos que envolvem a modulação de ciclinas, regulação

da p16 e p53, rotas mediadas por PKC e dependentes de MAPK (Delmas et al.,

2002; Chen et al., 2004; Shih et al., 2004; Zhang P et al., 2006)

I.4.3 Sirtuína (SIRT1)

A SIRT1 (sirtuína 1) é um gene ortólogo de mamífero, homólogo ao Sir2,

gene regulador do silenciamento da informação, encontrado em leveduras. É

uma deacetilase NAD

-dependente agindo como um grande sensor metabólico

dos níveis de NAD

. Modula o metabolismo e a sobrevivência celular, desta

forma, está envolvido na senescência e apoptose (Xiuyun Hou et al., 2008). A

superexpressão da SIRT1 atenua a adipogênese em células 3T3-L1 (pré-

adipócitos), reprimindo a expressão do PPARγ (Picard et al., 2004). Em

hepatócitos, o RSV diminui o acúmulo de lipídios, induzidos por alta

concentração de glicose. Este efeito protetor do RSV pode estar associado à

ativação da SIRT1 e AMPK (proteína quinase ativada por AMP) (Xiuyun Hou et

al., 2008).

Em pré-adipócitos 3T3-L1 a ativação da SIRT1 pelo RSV reduz a

secreção de adiponectina (proteína secretada pelos adipócitos, que regula a

homeostasia dos lipídios e da glicose e potencia a ação da INS a nível

hepático) (Qiang et al., 2007). Entretanto, não foi observado efeito sobre a

expressão de adipsina (proteína secretada pelo tecido adiposo com função

imunológica). Através da inibição genética e farmacológica da SIRT1, Xiuyun

Hou e colaboradores (2008) mostraram que os polifenóis estimulam a AMPK e

suprimem o acúmulo de lipídios pelo menos em parte pela ativação da SIRT1.

I.4.4 Receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPARs)

Os PPARs (receptores ativados por proliferadores de peroxissomos) são

fatores de transcrição da família de receptores nucleares, envolvidos com a

modulação do metabolismo (Tavares et al., 2007). Os PPARs apresentam três

isoformas distintas : PPAR α, PPAR β e PPAR γ. Estes receptores têm sido

alvo de estudos para o tratamento de doenças metabólicas (Isseman et al.,

1990). São identificados inúmeros ligantes, tais como: ácidos graxos e

derivados de eicosanóides e prostaglandinas. As tiazolidinedionas (TZD),

derivadas do ácido linoléico e prostaglandinas, são ligantes específicos dos

PPARs, promovendo a adipogênese, aumentando a sensibilidade à INS e

diminuindo os ácidos graxos livres circulantes (AGL) (Costa e Duarte, 2006).

Picard e colaboradores (2004) demonstraram que o PPARγ promove a

adipogênese em pré-adipócitos-3T3-L1 e que este efeito pode ser revertido

após tratamento com RSV, correlacionando inversamente a expressão do

PPARγ com a da SIRT1. Também foi observado que o RSV apresenta efeito

sobre a expressão do PPARγ e da SIRT1 em células de câncer de colorretal

(Ulrich et al., 2006). Em fígado normal, a expressão do PPARγ é mínima em

hepatócitos, porém o acúmulo de triacilglicerídios nestas células tem sido

associado a um aumento da expressão do PPARγ. Isto sugere que o PPARγ

desempenha um papel estimulador da lipogênese (Chao et al., 2000).

Estudando o efeito do retinol e da indometacina sobre a modulação de

fenótipo da linhagem GRX, nosso grupo de pesquisa observou que estes

compostos estimulam a expressão dos mRNA dos PPAR γ e α e diminuem a

expressão do mRNA do PPARβ. Estes resultados sugerem que o RHO e a

INDO induzem mudança fenotipica (miofobroblasto para lipócito) por inibirem

os genes envolvidos na oxidação e dissipação de energia, assim como

aumentam a expressão dos genes da lipogênese. Desta forma, a modulação

do PPARγ, durante o processo de ativação das HSCs pode ter um efeito

antifibrótico por induzir a manutenção do fenótipo quiescente (Guimarães et al.,

2007).

I.5 OBJETIVOS

I.5.1Objetivo geral

Investigar o efeito do RSV sobre os mecanismos moleculares envolvidos

na proliferação e diferenciação das células estreladas hepáticas (linhagem

GRX).

I.5.2 Objetivos específicos

a) Analisar a ação de concentrações crescentes de RSV (1nM a 1µM)

sobre a proliferação, viabilidade e ciclo celular da linhagem GRX;

b) Avaliar o efeito do RSV sobre a transformação fenotípica nas células

GRX (miofibroblasto para lipócito);

c) Avaliar o efeito do RSV sobre a expressão mRNA de PPARγ, PPARα

e SIRT1;

d) Avaliar o efeito do RSV sobre a incorporação de acetato em lipídios.

PARTE II

CAPÍTULO I

Artigo publicado no periódico Molecular Cellular Biochemistry

Resveratrol inhibits cell growth by inducing cell cycle arrest

in activated hepatic stellate cells.

Izabel C. Souza, Leo Anderson M. Martins, Barbara P. Coelho, Ivana Grivicich,

Regina M. Guaragna , Carmem Gottfried, Radovan Borojevic, Fátima Costa

Rodrigues Guma

CAPÍTULO II

Manuscrito a ser submetido à Liver International

Lipid accumulation in a HSC cell line is linked to the PPARs and SIRT1

ratio

Guma, FCR

1,*

; de Souza, ICC

1,2

; Andrade, CMB

; Guimarães, ELM

; Martins,

LAM

; Borojevic, R

; Margis, R

; Guaragna, RM

Lipid accumulation in a HSC cell line is linked to the

PPARγ and SIRT1 ratio.

Guma, FCR

1,*

; de Souza, ICC

1,2

; Andrade, CMB

; Guimarães, ELM

; Martins,

LAM

; Borojevic, R

; Margis, R

; Guaragna, RM

1: Depto de Bioquímica, ICBS, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil

2: ULBRA, Canoas, RS, Brasil

3: Departamento de Histologia e Embriologia, ICB, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ

* Corresponding author :

Dra Fátima Costa Rodrigues Guma

Departamento de Bioquímica, ICBS, UFRGS

Rua Ramiro Barcelos 2600-anexo

Porto Alegre, RS, Brasil

CEP: 90035-003

Fone: +55 51 3308 5546 FAX: +55 51 3308 5535

e-mail:

[email protected]

Running Title: PPARγ/SIRT1 ratio and HSC lipid accumulation.

ABSTRACT:

BACKGROUND: Hepatic stellate cell (HSC) is a key step in the

development of liver fibrosis. PPARγ expression decreased markedly with the

activation of HSC. Sirtuins (SIRT) are highly conserved NAD

-dependent

protein deacetylases; SIRT1 has recently been shown to suppress PPAR_

activity. Resveratrol (RSV) is a polyphenol compound and in mammals it

possesses the ability to activated SIRT1, reducing fat accumulation, increasing

free fatty acid release and inhibiting the adipogenesis. GRX cell line represents

the HSC activated phenotype and could be induced to quiescent phenotype by

retinol. AIMS: The possible involvement of RSV and retinol (RHO) on SIRT1

and PPARs expression was evaluated in this study. METHODS: The quiescent

phenotype differentiation process was visualized by light microscopy after Oil

red O staining. Expression of Sirt1 and PPARγ was detected with qRT-PCR.

Lipid synthesis was monitored by acetate incorporation and triacylglicerides

(TG) quantification was used as an index of lipid accumulation. RESULTS: In

our experimental model RSV stimulated SIRT1 mRNA. RSV did not induce the

lipocyte phenotype because the PPARγ activity was repressed.

CONCLUSIONS: The impact of the SIRT1 increasing on GRX leads to the

repression of genes involved in PPARγ-mediated fat storage and can result in

the maintenance of myofibroblast phenotype. Consequently, we hypothesized

that the ratio between PPARγ/SIRT1 mRNA could be considered directly

involved in the homeostasis of liver connective tissue, and may actively

participate in pathogenesis of hepatic fibrosis or cirrhosis.

Key Words: Hepatic stellate cells, GRX cell line, Resveratrol, PPARγ, SIRT1,

Lipid accumulation

INTRODUCTION:

Hepatic fibrosis, a precursor of liver cirrhosis, is a consequence of severe

liver damage occurred in many patients with chronic liver disease and involves

the abnormal accumulation of extracellular matrix (ECM) (1), the discovery of

stellate cell-activation from a quiescent vitamin A-storing cell to a proliferative

myofibroblast remains among the most informative discoveries to understanding

the mechanistic basis of hepatic fibrosis progression and regression (2). HSCs

activation is a highly pleiotropic process and dramatic phenotypic changes

require global reprogramming of HSCs gene expression that, in turn, must be

orchestrated by long-term changes in the expression and/or activity of key

transcription factors of the HSCs genome (3). The authors hypothesized the

importance of the study on the function of transcription factors that are active in

quiescent HSCs, and showed that PPARγ expression decreased markedly with

the activation of HSCs. Their study also showed that PPARγ plays an important

role in maintaining the quiescent phenotype. In a previous study we have

demonstrated PPARγ mRNA was increased in quiescent like phenotype of GRX

cells, a murine HSC cell line (4).

PPARα, PPARδ/β, and PPARγ form a subgroup of the nuclear receptor

superfamily and, upon ligand binding, regulate the expression of several genes

mainly involved in lipid metabolism (5). PPARs, which are activated by long-

chain polyunsaturated fatty acids, are also one of the few examples of nutrient-

regulated transcription factors. Hence, it has been suggested that these

receptors play a central role in sensing nutrient levels and in modulating their

metabolism. PPARα promotes fatty acid metabolism by inducing the

expression of genes involved in the transport of fatty acids within the cell and

the mitochondria, as well as those coding for many enzymes of the β-oxidation

pathway (6). The functions of PPARδ/β remain largely mysterious. In vitro,

activation of PPAR δ/β in adipocytes and skeletal muscle cells promotes fatty

acid oxidation and utilization (7). PPARγ is expressed primarily in adipose

tissue and promotes fat storage by increasing adipocyte differentiation and

transcription of a number of lipogenic proteins (8, 9). It was reported that

PPARγ expression is ten-fold higher in hepatic tissues than in peripheral-blood

mononuclear cells, but the functional activities of PPARγ in the liver remain

largely unknown (3).

Sirtuins are highly conserved NAD

-dependent protein deacetylases (10-

12). SIRT1 also regulates fat metabolism and glucose homeostasis by

interacting with the nuclear receptor PPARγ through nuclear receptor

corepressor (N-CoR) to repress adipogenesis (13), modifying the PPARγ

coactivator PGC-1α to regulate hepatic glucose homeostasis (14, 15) and

regulating levels of insulin secreted by pancreatic β cells (16, 17).

Putative anti-fibrogenic drugs mainly include agents able to reduce

inflammation, agents able to reduce HSC activation, agents with a pro-apoptotic

potential for HSC, agents with antioxidant effects, and agents able to increase

fibrillar ECM degradation. Numerous studies have attributed a beneficial role in

a number of pathologies to resveratrol (RSV; 3,5,4’-trihydroxystilbene), a

naturally occurring phytoalexin found in red wines and grape juice, which has

shown to reduce the synthesis of lipids in rat liver (18) and 3T3-L1 adipocytes

(13), inhibit the synthesis of eicosanoids in rat leukocytes (19) interfere in

arachidonate metabolism (20), and inhibit the activity of some protein kinases

(21). RSV decreased proliferation and induced apoptosis and cell cycle arrest

in various cell lines. In rat HSCs, 100 µM of RSV reduced the level of cyclin D1,

a cell cycle-related protein (22). Recently, we demonstrated that treatment with

nanomolar concentrations of RSV cell proliferation, induced an S phase arrest

and has pro-apoptotic effects in activated GRX cells (23).

In this study, we demonstrated that the expression of lipocyte phenotype

in GRX cells is dependent of the relation between the PPARγ / SIRT1

transcripts and the correlation of this modulation with the lipids metabolism of

GRX cells.

MATERIAL AND METHODS

Cell culture and treatments:

The murine HSC cell line, GRX, was established by Borojevic (24) and kindly

provided by the Cell Bank of Rio de Janeiro (HUCFF, UFRJ, RJ). Cells were

routinely maintained in Dulbecco’s Modified Minimum Essential Medium

(DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA,USA) supplemented with 5% fetal bovine

serum (FBS, Cultilab, Campinas, Br) and 2 g/L HEPES buffer, pH 7.4 under

C and 5% CO

conditions. The cells were plated (5 x 10

cells/mL) and

cultured for 24 h to reach 60-70% of confluence before retinol (RHO) and/or

resveratrol (RSV) treatment. In the experimental series, GRX cells were treated

with the 5 µM RHO, 100 nM RSV or with both (RSV+RHO) for 12h, 24h or 120

h, the routinely cultured cells were used as normal controls.

All-trans-retinol (RHO) was dissolved in ethanol (0.1% final concentration) (both

from Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA). The concentration of all-

trans-retinol in the stock solution was determined by ultra-violet absorption at

325 nm, using the molar extinction coefficient (

) of 52.770 cm

−1

, (4, 25).

Resveratrol (RSV) (Sigma Inc., Saint Louis, MO, USA) was dissolved in ethanol

(Merck, Darmstadt, Germany) to a stock concentration of 100 mM and diluted in

culture medium to final concentrations of 100 nM, just before use. Intracellular

lipid droplets were identified by standard staining with Oil-Red-O (Sigma) (23).

RNA extraction, cDNA synthesis and Real-time PCR

RNA was isolated using the TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, California,

USA). Approximately 2 µg of total RNA were added to each cDNA synthesis

reaction using the SuperScript-II RT pre-amplification system (Invitrogen).

Reactions were performed at 42ºC for 1 h using the primer T23V (5’ TTT TTT

TTT TTT TTT TTT TTT TTV). PCR amplification was carried out using specific

primer pairs designed Oligo Calculator version 3.02

(

http://basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html) and synthesized by RW-Genes

(RJ, Brazil). The sequences of the primers used are listed in Table 1. Total RNA

and cDNA were generated as described in RT-PCR analysis. Real-time PCRs

were carried out in an Applied-Biosystem 7500 real-time cycler and performed

in quadruplicate. Reaction settings were composed of an initial denaturation

step of 5 min at 94ºC, followed by 40 cycles of 10 s at 94ºC, 15 s at 60ºC, 15 s

at 72ºC and 35 s at 60ºC for data acquisition; samples were kept for 2 min at

40ºC for annealing and then heated from 55 to 99ºC with a ramp of 0.1ºC/sec to

acquire data to produce the denaturing curve of the amplified products. Real-

time PCRs were carried out in a 20 µl final volume composed of 10 µl of each

reverse transcription sample diluted 50 to 100 times, 2 µl of 10 times PCR

buffer, 1.2 µl of 50 mM MgCl

, 0.4 µl of 5 mM dNTPs, 0.4 µl of 10 µM primer

pairs, 3.95 µl of water, 2.0 µl of SYBRgreen (1:10,000 Molecular Probe), and

0.05 µl of Platinum Taq DNA polymerase (5 U/µl) (Invitrogen). The primers used

for real time PCRs were the same used in RT-PCR analysis. All results were

analyzed by the 2

-∆∆CT

method (26) . β-actin was used as the internal control

gene for all relative expression calculations (27).

Lipid Synthesis

Lipid synthesis was monitored by acetate incorporation. Cells were

mantained in standard or treatment medium (RSV, RHO, RSV+RHO) for 24 h or

120 h and than incubated with 0.1 uCi/mL [14C] acetate (Amersham) for 16 h.

After incubation, lipids were extracted from the cell layer by method of (28)

Folch et al. (195..). The chloroform phase was dried under nitrogen and

analyzed by TLC on G-60 silica-gel aluminium plates with hexane: ethyl ether:

acetic acid (90:10:1; v/v/v). Radioactive lipids were visualized by exposition of a

radiographic film at -70°C, and their relative content was determined by

densitometric scanning of the X-ray film in a CS 930 Shimadzu UV/vis

densitometer. The standards were stained by Comassie Brilliant Blue R-250

(Sigma) (29).

Quantification of triacylglicerides content

Lipid content was quantified using commercially available assay reagent. In

brief, GRX grown in 24-well plates were treated as described above in Cell

Cultures and Treatments, and on 120 h, cells were assayed for lipid content

according to the manufacturer’s instructions (Triglycerides Liquiform Labtest,

MG, Brasil). The experiments were performed with at least 6 replicates per

treatment and repeated 3 times.

Protein quantification

The protein sediments obtained after lipid extractions were dissolved in 1.0 N

NaOH and measured as described by Peterson (30) using bovine serum

albumin as standard

Statistical Analysis

Data represent mean ± standard error of mean (SEM). Statistical analysis was

performed by ANOVA followed by Duncan post hoc, using the statistical

program, SPSS 10.0 for Windows. The values were considered statistically

different when p<0.05.

RESULTS:

Effect of RSV in the induction of GRX differentiation to lipocyte:

Through Oil red O staining, we could see that GRX cells treated with RHO and

RVS+RHO were filled with fat droplets and acquired characteristics of lipocytes.

In comparison, cells that were treated only with RSV were similar to untreated

cells (Myo) and didn`t accumulate fat droplets (Figure 1).

Effect of RSV in the time-spatial expression of PPARγ and Sirt1 mRNA

during the GRX differentiation to lipocyte:

In parallel with the establishment of lipocyte phenotype retinol produced

an increase in PPARγ transcripts (4). Here we demonstrated that RHO

treatment increased PPARγ mRNA as soon as 12 h. At 24 h all culture groups

presented an increase in the PPARγ mRNA, but in the groups treated with RHO

and RHO+RSV there was a two-fold increase when compared to Myo and RSV

groups. After 5 days (120 h) the expression was not affected by RSV treatment

and decreased significantly in RHO plus RSV-treated cells as compared with

RHO treated group (figure 2). By Western blot we observed the expression of

the PPARγ protein in all experimental groups (data not shown).

Under all experimental conditions the expression of SIRT1 mRNA

increases gradually with the culture time. Specifically, after 120 h Sirt1 mRNA

expression in the RSV treatment was significantly higher than in the other

groups. At this treatment time, Sirt1 mRNA expression in the RSV+RHO-treated

cells was lower than the other groups (Figure 2). These results indicate that, like

demonstrated by other cells, SIRT1 mRNA expression could be induced by

RSV in GRX cells.

The figure 2b showed the relationship between PPARγ and SIRT1 mRNA

expression. After 120 h this relation demonstrated the prevailing of the SIRT1

transcripts upon the PPARγ transcripts in Myo and RSV treated cells. In all

other times and experimental groups the transcription of PPARγ was

predominant above SIRT1.

RSV effect on lipogenesis and lipid accumulation

The lipid synthesis was analyzed through incorporation of [

C] acetate after 24

h and 5 days treatment. The results showed in figure 3-A demonstrated that in

RHO and RSV+RHO-treated cells the incorporation of acetate in triacylglicerol

was increased after 24h and the same rate of incorporation was observed in

RHO group after 120 h treatment (figure 3-B) After 120 h, besides the lower

acetate incorporation in the RSV+RHO group, the triacylglicerol accumulation

was similar to RHO (Figures 3-B and 4). This last result is in accordance with

the results of Oil red O stain presented in figure 1.

DISCUSSION

PPARs are important for the regulation of lipid and glucose metabolism,

cell proliferation and differentiation, adipogenesis, and inflammatory signaling in

numerous tissues (31). GRX cell represent liver connective myofibroblasts, that

may switch between two phenotypes: myofibroblasts and lipocytes. The

discovery that PPARγ expression is down modulated during HSC activation

suggests that its ligands exert antifibrotic effects and highlights a possible

involvement of this transcription factor in liver fibrosis. SIRT1 plays a role in a

wide variety of processes, including stress resistance, metabolism and

differentiation. Resveratrol activate SIRT1, which reduce fat accumulation,

increasing free fatty acid release and inhibiting the adipogenesis. The possible

involvement of RSV and RHO on SIRT1 and PPARs expression was evaluated

in this study.

GRX cells cultivated in standard culture medium or treated with RSV by

120 h presented myofibroblast phenotype (Figure 1). At this time SIRT1 mRNA

expression was increased related to PPARγ. After this time, RSV down

regulated PPARγ, that returning to basal levels (Figure 2a). The ‘de novo’

synthesis of TG represents only 10 % of total acetate incorporation and the cells

do not accumulate lipids (Figures 1 e 3a). When the cells where treated RHO or

RSV+RHO for 120 h the mRNA-PPARγ was increased significantly. The ratio

PPARγ/SIRT1 was increased when the cells where treated only with RHO or

associated with RSV (Figure 2b). RHO is the responsible for lipogenesis

because it increased significantly the incorporation of acetate radioactive in TG

(figure 3). After 120 h, the cells treated with combinated drugs did not stimulate

the ‘de novo‘ synthesis of TG, however the lipids depots was increased and the

phenotype was changed. We believe that the PPARγ mRNA transcription

stimulation at 24 h of RSV+RHO treatment (Figure 2a) was responsible for the

phenotype switch and lipid accumulation as showed in Figures 1, 3 and 4.

The PPARα mRNA expression was not modulated by RHO or by RSV in

GRX cells (date not shown). This was already observed by Guimarães (4) that

related modulation of this nuclear receptor only by indomethacin and not by

RHO. These results are indicative, that in GRX cells treated with RHO or

RSV+RHO the lipid homeostasis was not dependent of PPARα action.

After 24 h the treatment with RHO and RSV+RHO induced an

overexpression of PPARγ transcription. At this time, the lipogenesis was

intensified; the synthesis of lipids was increased and approximately 50% of

acetate was incorporated in TG (Figure 3a). Furthermore, the ratio

PPARγ/SIRT1 mRNA was maximal after 24 h and returned to the basal

expression after 120 h treatment (Figure 2b), when lipocytes have already

constituted the lipid droplets (Figure 1). These results are in accordance with

Vicente (32), who showed that several enzymes of lipid metabolism are

upregulated in early stages of GRX cells lipocyte induction. The ratio

PPARγ/SIRT1 mRNA expression was definitively important for lipocyte induction

in our model.

Ours results demonstrated that resveratrol did not activate PPARγ mRNA

expression and the lipogenesis in GRX cells (Figure 1 and Figure 3). These

results corroborate with others authors, who showed that RSV did not promote

the differentiation of pre-adipocytes into adipocytes (33). We hypothesized that

RSV bound to SIRT1 and controlled transcriptional co-regulators such as

PGC1α or by directly interacting with transcription factors modulating PPARγ.

Then, the impact of the SIRT1 increasing on GRX leads to the repression of

genes involved in PPARγ-mediated fat storage and can consequently result in

the maintenance of myofibroblast phenotype.

Consequently, the ratio between PPARγ/SIRT1 mRNA could be

considered directly involved in the homeostasis of liver connective tissue, and

may actively participate in pathogenesis of hepatic fibrosis or cirrhosis. The

controls involved in the switch between lipocyte and myofibroblast phenotypes,

occurring either under normal or pathologic conditions. These results suggest

that PPARγ is possibly a key regulator in the early stages of lipocyte

differentiation. Soon, drugs that modulate PPARγ can control the HSC

phenotypic transformation.

Recently studies have shown that PPARγ heterodimerizes with the

retinoid-X receptor (RXR) and binds to DNA at the peroxisome proliferator-

response element (PPRE) activating transcription of enzymes that controlling

the capacity to storage lipids in the adipocytes (34) and hepatocytes (35).

PPARγ-RXR can be activated by ligands specific for either receptor, the

presence of both ligands can result in a cooperative effect on the transactivation

of target genes. The results suggest that the cooperative effects of PPARγ and

RXR-specific ligands may occur at the level of selective coactivator recruitment

(36). Endogenous PPARγ ligands such as fatty acids or their metabolites and

RXR ligands such as 9-cis-retinoic acid naturally exist in cells. Thus these

naturally occurring ligands would lead to a basal activity often observed for

PPARγ without the addition of exogenous ligand (36). It could explain the level

of mRNA PPARγ expression in GRX cell in early stages of culture. But when

the GRX cells were treated with ROH-RXR ligand, it potentiated the effect of

these endogenous PPAR ligands.

These results should open a new paradigm of a novel cross-talk of

nutritional transcription factors in energy metabolism where the nuclear

concentrations of each receptors and ligands are crucial for nutritional

regulation of metabolism lipid.

PPARγ is now shown to serve as a key transcription factor for HSC

quiescence as it is considered as master regulated for adipogenesis. If HSC is

similar to adipocytes, HSC quiescence should be facilitated by a group of

adipogenic transcription factors besides PPARγ.

Sirtuins, a family of proteins, interact with PGC-1α, a coactivator that

regulates cellular metabolism. SIRT1 regulates the activity of a variety of

transcription factors and transcriptional co-regulators such as PPARγ. SIRT1

binds to PGC-1α, and inactivates PPARγ. This leads to the repression of genes

involved in PPARγ-mediated fat storage and consequently results in

mobilization of free fatty acid.

SIRT1 exerts at least some of its effects in vivo by modulating positively

LXRs (37). SIRT1 deacetylates LXR and promote cholesterol efflux and lipid

homeostasis in cells (37). In our cellular model, SIRT1 mRNA expression

increases after treatment with RSV, but decreases in the presence of RHO. Our

findings raise a possibility that SIRT1 may have a role in modulating

transcription factors, such as PPARγ and LXR.

A role for the selective recruitment of coactivator either co-repressor

complexes by specifics ligands must be considered to reverse the

morphological and biochemical characteristics of activated HSC.

In conclusion, in our model RSV stimulated SIRT1 mRNA after 120 h of

treatment. RSV did not induce the lipocyte phenotype because the PPARγ

activity was repressed. Moreover, when associated with RHO, a RXR ligand,

RSV did not block the action of RHO because RSV could modulate LXR that

forms a heterodimer with RXR. Consequently the LXR-RXR-PPARγ recruited

nuclear receptor coactivators, modulating lipogenesis (fat storage) in HSC and

lipids homeostasis.

Acknowledgments:

F.C.R. Guma, R. Borojevic and R. Margis are recipients of research

fellowships from CNPq. This work was supported by CNPq, FAPERJ,

FAPERGS, and PROPESQ-UFRGS.

REFERENCES:

1. CHENG Y, PING J, XU H D, FU H J, ZHOU Z H. Synergistic effect of a

novel oxymatrine-baicalin combination against hepatitis B virus replication,

alpha smooth muscle actin expression and type I collagen synthesis in vitro.

World J Gastroenterol 2006; 12(32): 5153-9.

2. FRIEDMAN S L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology

2008; 134(6): 1655-69.

3. CHENG Y, PING J, XU L M. Effects of curcumin on peroxisome

proliferator-activated receptor gamma expression and nuclear

translocation/redistribution in culture-activated rat hepatic stellate cells. Chin

Med J (Engl) 2007; 120(9): 794-801.

4. GUIMARAES E L, FRANCESCHI M F, ANDRADE C M, GUARAGNA R

M, BOROJEVIC R, MARGIS R, et al. Hepatic stellate cell line modulates

lipogenic transcription factors. Liver Int 2007; 27(9): 1255-64.

5. DESVERGNE B. PPARdelta/beta: the lobbyist switching macrophage

allegiance in favor of metabolism. Cell Metab 2008; 7(6): 467-9.

6. PETERS J M, CATTLEY R C, GONZALEZ F J. Role of PPAR alpha in

the mechanism of action of the nongenotoxic carcinogen and peroxisome

proliferator Wy-14,643. Carcinogenesis 1997; 18(11): 2029-33.

7. WANG Y X, LEE C H, TIEP S, YU R T, HAM J, KANG H, et al.

Peroxisome-proliferator-activated receptor delta activates fat metabolism to

prevent obesity. Cell 2003; 113(2): 159-70.

8. TEBOUL M, ENMARK E, LI Q, WIKSTROM A C, PELTO-HUIKKO M,

GUSTAFSSON J A. OR-1, a member of the nuclear receptor superfamily that

interacts with the 9-cis-retinoic acid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;

92(6): 2096-100.

9. SONG C, KOKONTIS J M, HIIPAKKA R A, LIAO S. Ubiquitous receptor:

a receptor that modulates gene activation by retinoic acid and thyroid hormone

receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91(23): 10809-13.

10. IMAI S, ARMSTRONG C M, KAEBERLEIN M, GUARENTE L.

Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent

histone deacetylase. Nature 2000; 403(6771): 795-800.

11. LANDRY J, SUTTON A, TAFROV S T, HELLER R C, STEBBINS J,

PILLUS L, et al. The silencing protein SIR2 and its homologs are NAD-

dependent protein deacetylases. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97(11): 5807-

11.

12. SMITH J S, BRACHMANN C B, CELIC I, KENNA M A, MUHAMMAD S,

STARAI V J, et al. A phylogenetically conserved NAD+-dependent protein

deacetylase activity in the Sir2 protein family. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;

97(12): 6658-63.

13. PICARD F, KURTEV M, CHUNG N, TOPARK-NGARM A, SENAWONG

T, MACHADO DE OLIVEIRA R, et al. Sirt1 promotes fat mobilization in white

adipocytes by repressing PPAR-gamma. Nature 2004; 429(6993): 771-6.

14. NEMOTO S, FERGUSSON M M, FINKEL T. SIRT1 functionally interacts

with the metabolic regulator and transcriptional coactivator PGC-1{alpha}. J Biol

Chem 2005; 280(16): 16456-60.

15. RODGERS J T, LERIN C, HAAS W, GYGI S P, SPIEGELMAN B M,

PUIGSERVER P. Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of

PGC-1alpha and SIRT1. Nature 2005; 434(7029): 113-8.

16. BORDONE L, MOTTA M C, PICARD F, ROBINSON A, JHALA U S,

APFELD J, et al. Sirt1 regulates insulin secretion by repressing UCP2 in

pancreatic beta cells. PLoS Biol 2006; 4(2): e31.

17. MOYNIHAN K A, GRIMM A A, PLUEGER M M, BERNAL-MIZRACHI E,

FORD E, CRAS-MENEUR C, et al. Increased dosage of mammalian Sir2 in

pancreatic beta cells enhances glucose-stimulated insulin secretion in mice.

Cell Metab 2005; 2(2): 105-17.

18. ARICHI H, KIMURA Y, OKUDA H, BABA K, KOZAWA M, ARICHI S.

Effects of stilbene components of the roots of Polygonum cuspidatum Sieb. et

Zucc. on lipid metabolism. Chem Pharm Bull (Tokyo) 1982; 30(5): 1766-70.

19. KIMURA Y, OHMINAMI H, ARICHI H, OKUDA H, BABA K, KOZAWA M,

et al. Effects of Various Coumarins from Roots of Angelica dahurica on Actions

of Adrenaline, ACTH and Insulin in Fat Cells. Planta Med 1982; 45(7): 183-7.

20. RAGAZZI E, FROLDI G, FASSINA G. Resveratrol activity on guinea pig

isolated trachea from normal and albumin-sensitized animals. Pharmacol Res

Commun 1988; 20 Suppl 5: 79-82.

21. RAYALAM S, DELLA-FERA M A, YANG J Y, PARK H J, AMBATI S,

BAILE C A. Resveratrol potentiates genistein's antiadipogenic and proapoptotic

effects in 3T3-L1 adipocytes. J Nutr 2007; 137(12): 2668-73.

22. KAWADA N, SEKI S, INOUE M, KUROKI T. Effect of antioxidants,

resveratrol, quercetin, and N-acetylcysteine, on the functions of cultured rat

hepatic stellate cells and Kupffer cells. Hepatology 1998; 27(5): 1265-74.

23. SOUZA I C, MARTINS L A, COELHO B P, GRIVICICH I, GUARAGNA R

M, GOTTFRIED C, et al. Resveratrol inhibits cell growth by inducing cell cycle

arrest in activated hepatic stellate cells. Mol Cell Biochem 2008; 315(1-2): 1-7.

24. BOROJEVIC R, MONTEIRO A N, VINHAS S A, DOMONT G B,

MOURAO P A, EMONARD H, et al. Establishment of a continuous cell line from

fibrotic schistosomal granulomas in mice livers. In Vitro Cell Dev Biol 1985;

21(7): 382-90.

25. MARGIS R, BOROJEVIC R. Retinoid-mediated induction of the fat-

storing phenotype in a liver connective tissue cell line (GRX). Biochim Biophys

Acta 1989; 1011(1): 1-5.

26. LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data

using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods

2001; 25(4): 402-8.

27. GUIMARAES E L, FRANCESCHI M F, GRIVICICH I, DAL-PIZZOL F,

MOREIRA J C, GUARAGNA R M, et al. Relationship between oxidative stress

levels and activation state on a hepatic stellate cell line. Liver Int 2006; 26(4):

477-85.

28. FOLCH J, LEES M, SLOANE STANLEY G H. A simple method for the

isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957;

226(1): 497-509.

29. BOROJEVIC R, GUARAGNA R M, MARGIS R, DUTRA H S. In vitro

induction of the fat-storing phenotype in a liver connective tissue cell line-GRX.

In Vitro Cell Dev Biol 1990; 26(4): 361-8.

30. PETERSON G L. A simplification of the protein assay method of Lowry et

al. which is more generally applicable. Anal Biochem 1977; 83(2): 346-56.

31. KERSTEN S, DESVERGNE B, WAHLI W. Roles of PPARs in health and

disease. Nature 2000; 405(6785): 421-4.

32. VICENTE C P, GUARAGNA R M, BOROJEVIC R. Lipid metabolism

during in vitro induction of the lipocyte phenotype in hepatic stellate cells. Mol

Cell Biochem 1997; 168(1-2): 31-9.

33. RAYALAM S, DELLA-FERA M A, BAILE C A. Phytochemicals and

regulation of the adipocyte life cycle. J Nutr Biochem 2008; 19(11): 717-26.

34. JUVET L K, ANDRESEN S M, SCHUSTER G U, DALEN K T, TOBIN K

A, HOLLUNG K, et al. On the role of liver X receptors in lipid accumulation in

adipocytes. Mol Endocrinol 2003; 17(2): 172-82.

35. SCHULTZ J R, TU H, LUK A, REPA J J, MEDINA J C, LI L, et al. Role of

LXRs in control of lipogenesis. Genes Dev 2000; 14(22): 2831-8.

36. YANG W, RACHEZ C, FREEDMAN L P. Discrete roles for peroxisome

proliferator-activated receptor gamma and retinoid X receptor in recruiting

nuclear receptor coactivators. Mol Cell Biol 2000; 20(21): 8008-17.

37. LI X, ZHANG S, BLANDER G, TSE J G, KRIEGER M, GUARENTE L.

SIRT1 deacetylates and positively regulates the nuclear receptor LXR. Mol Cell

2007; 28(1): 91-106.

FIGURE LEGENDS:

Figure 1: Phase contrast images of GRX cells. Myo: GRX in standard culture

medium; RSV: GRX after 120 h treatment with RVS 100 nM; RHO: GRX after

120 h treatment with RHO 5µM; RSV+RHO: GRX after 120 h treatment with

RHO 5µM plus RVS 100 nM. N = nucleus; LD = lipid droplet stained with Oil

Red O.

Figure 2: Relative mRNA expression of peroxisome proliferator-activated

receptor gamma (PPARγ) or sirtuin 1 (SIRT1). (a) GRX-hepatic stellate cell cells

were left untreated, maintaining the myofibroblast phenotype (Myo), or treated

with 100nM resveratrol (RSV), or 5µM retinol (RHO), or 5µM retinol plus 100nM

resveratrol (RSV+RHO) for 12 , 24 or 120 hours and the relative transcript

levels were measured by real-time polymerase chain reaction. (b) represents

the PPARγ/Sirt1 expression ratio. Data represent means ± SEM, means without

a common letter (PPARγ) or capital letters (SIRT1) are statistically different, p <

0.05. ANOVA/ SNK post hoc.

Figure 3: [

C] Acetate incorporation into phospholipids (PL) and

triacylglycerols (TG). GRX-hepatic stellate cell cells were left untreated,

maintaining the myofibroblast phenotype (Myo), or treated with 100nM

resveratrol (RSV), or 5µM retinol (RHO), or 5µM retinol plus 100nM resveratrol

(RSV+RHO) for (A) 24 h or (B) 120 h. They were incubated for subsequent 16

h with radiolabeled acetate, lipids were extracted, and analyzed as described

Material and Methods. Results are expressed as percentage (%) of total

radioactivity incorporated and correspond to densitometric analysis of TLC-

autoradiographic film of two experiments done in triplicate. Means without a

common letter (PL) or symbol (TG) are statistically different, P<0.05.

ANOVA/SNK post hoc.

Figure 4: Accumulation of triacylglicerol in GRX lipid droplets. Cells were

treated as described Material and Methods for 120 h. Lipid content was

quantified using commercially available assay reagent (Triglycerides Liquiform

Labtest, MG, Brasil).The triacylglicerol content was detertermined Results are

expressed as mg TG/ mg protein. Means without a common letter are

statistically different, P<0.05. ANOVA/SNK post hoc.

Table 1: Primers used for real time PCR

forward primer reverse primer

PPARγ

5'-TGGAATTAGATGACAGTGACTTGG 5'-CTCTGTGACGATCTGCCTGAG

SIRT1

5'-GGCTTGAGGGTAATCAATACCTG 5'-AAACTTGGACTCTGGCATGTG

β-actin

5'-TATGCCAACACAGTGCTGTCTGG 5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT

FIGURE 1:

FIGURE 2:

12h 24h 120h

Treatment Time

PPAR

/ SIRT1

Myo

RSV

RHO

RHO+RSV

FIGURE 3:

FIGURE 4:

CAPÍTULO III

RESULTADOS COMPLEMENTARES

Efeito do resveratrol, retinol e resveratrol associado ao retinol

sobre a organização do citoesqueleto de actina nas células GRX.

Introdução

Estudos detalhados sobre o fenótipo expresso por células estreladas

hepáticas quiescentes ou ativadas mostraram que estas representam uma

população celular heterogênea, em termos de sua função e expressão de

proteínas citoesqueléticas (Guma et al, 2001). A origem deste tipo celular é

considerada miogênica devido à expressão de actina de músculo liso (α-SMA)

(Pinzani, 1999). Os receptores de adesão de integrinas estabelecem conexão

entre a matriz extracelular e a fibra citoesquelética da actina, emitindo

movimentos e sinais bioquímicos através da membrana plasmática

(Calderwood et al, 2000).

O presente estudo tem por objetivo mostrar o efeito do RSV, RHO e

RSV+RHO sobre a organização do citoesqueleto de actina na linhagem celular

GRX. Observamos que o tratamento com RSV provocou alterações no

citoesqueleto de actina sem que ocorra a diferenciação diferenciação

fenotípica.

Materiais e Métodos

Cultura celular

As células GRX foram obtidas do banco de células do Rio de Janeiro

(Universidade Federal do Rio de Janeiro). As células foram mantidas em meio

Dulbecco`s (DMEM, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA)

suplementado com 5% soro fetal bovino (FBS) (Cultilab, Campinas, SP) e

tampão 2 g/L HEPES, pH 7.4, sob uma atmosfera contendo 5% CO2.

Tratamento Celular

As células foram plaqueadas sobre lamínulas em placas de 24 poços (5

x 10

células/poço). Após, 24h as culturas foram tratadas por 120 h com meio

suplementado com RSV (100 nM); RHO(5µM) ou RSV+RHO, nas mesmas

doses,

Imunocitoquímica das células GRX

Após o tratamento as células foram fixadas em 4% de paraformaldeído

tamponado por 30 min, permeabilizadas com 0,5% Triton X-100 em PBS, 3

vezes por 10 min. Incubadas com PBS contendo 3% albumina bovina (BSA)

por 1 h à 37ºC para bloquear os sítios não específicos. Após as lamínulas

foram incubadas com rodamina/faloidina (3.3 mM, 1:100 diluição em PBS) por ,

20 min). As lamínulas foram montadas em Fluorsave. As imagens foram

adquiridas em microscópio confocal (Carl Zeiss LSM5 Pascal laser scanning

confocal microscope) com argon/helium/neon laser e em objetiva de 63x (1.4)

com óleo de imersão.

Resultado e Conclusão

O RSV induz a fragmentação das fibras de actina (Figura 1). Na mesma

figura pode-se observar que nos lipócitos induzidos por RHO + RSV a

presença de fragmentos difusos ou granulares de actina na zona perinuclear e

em torno das gotas lipídicas como acontece no tratamento apenas com RHO

(Mermelstein et al. ,2001).

No fenótipo lipocítico as extensões citoplasmáticas são reduzidas e

essa condição corresponde, sobretudo, a mudança na organização do

citoesqueleto (Guma et al., 2001).

Figura 1. Efeito do resveratrol (RSV), retinol (RHO) e RSV associado ao RHO sobre a

organização do citoesqueleto de actina nas células GRX evidenciado pela marcação

com rodamina-faloidina. As células foram tratadas com 100nM RSV, RHO 5µM e

RSV+RHO nas mesmas concentrações. Myo = miofibroblasto

PARTE III

III.1 DISCUSSÃO

O resveratrol (RSV) é uma fitoalexina com potente ação terapêutica.

Nestes últimos anos o interesse por este composto tem aumentado e muitos

estudos têm mostrado o efeito protetor do RSV em diferentes patologias (Baur

e Sinclair, 2006).

O fígado tem sido alvo de muitas pesquisas que evidenciam o efeito

protetor do RSV, pois os hepatócitos são os maiores sítios de bioacumulação,

de bioconjugação e de eliminação deste composto. Portanto, é interessante

elucidar seus efeitos na biologia da célula hepática (Notas et al., 2006).

Estudos em culturas celulares indicam que o RSV pode modular várias vias

metabólicas envolvendo crescimento celular, apoptose e inflamação (Athar et

al., 2007).

Estudos epidemiológicos têm atribuído aos alimentos e bebidas ricas em

RSV um papel benéfico em numerosas patologias. Muitas pesquisas são

direcionadas para o câncer hepatocelular, e apesar das limitações do cultivo

celular, estudos com células HepG2 tratadas com RSV em concentrações

compatíveis com as encontradas nos alimentos e bebidas, tentam reproduzir in

vitro a ação benéfica do RSV (Notas et al., 2006).

Em mamíferos o RSV tem sido associado à ativação de genes como o

da sirtuína1 (SIRT1) levando a uma mobilização de ácidos graxos em tecido

adiposo branco através da repressão do gene do PPARγ (Picard et al., 2004).

Nos hepatócitos o RSV previne o acúmulo de gotas lipídicas (Baur e Sinclair,

2006). Em adipócitos 3T3-L1, está envolvido com a ativação da lipólise e com a

indução da apoptose. Muitos autores têm sugerido que o resveratrol modula

processos metabólicos através do bloqueio da adipogênese. (Rayalam et al.,

2007; Yang et a l, 2008).

A regeneração tecidual desencadeada pela proliferação dos hepatócitos

é necessária para o reparo e sobrevivência do tecido hepático após uma injúria

aguda, transplante ou em doenças crônicas, como cirrose e fibrose (Taub R.,

2004). O estímulo para a proliferação dos hepatócitos depende da interação

destes com outros tipos celulares hepáticos, onde se incluem as células

estreladas hepáticas (HSCs) (Taub R., 2004). Alvo das injúrias, as HSCs

diferenciam-se para miofibroblastos, secretam matriz extracelular (ECM) e

fatores de crescimento que induzem a proliferação dos hepatócitos (Balabaud

et al., 2004). Embora, a diferenciação das HSCs seja considerada um processo

fundamental para a indução da regeneração hepática, os mecanismos

moleculares que regulam a transição para o reparo e suporte das células no

fígado ainda são pouco entendidos (Passino et al., 2007).

O nosso grupo de pesquisa tem estudado os mecanismos que levam à

transformação fenotípica da célula GRX representativa das HSCs murinas que

apresenta fenótipo miofibroblástoide, podendo ser induzida a expressar o

fenótipo lipocítico semelhante as HSCs em estado quiescente. Considerando

as ações do RSV descritas em outras linhagens celulares (Notas et al., 2006),

este trabalho teve como objetivo analisar os efeitos deste composto sobre a

linhagem GRX, visando estudar efeitos hepatoprotetores para esta fitoalexina.

Utilizando tratamentos de 1nM a 1µM, doses similares as que são

biodisponibilizadas após a metabolização de alimentos no sistema

gastrointestinal, mostramos que o RSV apresentou efeito inibitório sobre a

proliferação das células GRX, induziu um aumento no número de células na

fase S do ciclo celular e um efeito pró-apoptótico (Capitulo I).

Observamos uma diminuição no crescimento celular em cerca de 35%, o

que está em concordância com o descrito em linhagens hepáticas como

HepG2 (Notas et al., 2006). Esses e outros autores mostraram que o efeito do

RSV sobre a proliferação celular é devido a sua ação sobre o ciclo celular.

Stervbo e colaboradores (2006) mostraram que a ação do RSV sobre a

proliferação e o ciclo celular depende do tempo de tratamento e das

concentrações usadas.

Como nas células GRX, Ragione e colaboradores (1998) também

mostraram em células HL-60, que o RSV causa uma parada do ciclo celular na

fase S. Os autores sugerem que esse efeito decorre de uma diminuição na

síntese de DNA devido à inibição da ribonucleotideo redutase e da DNA

polimerase.

Outro aspecto interessante a ser considerado é a ação do RSV em

induzir a apoptose (Joe et al., 2002; Garvin et al., 2006; Zhang W et al., 2006 e

Kern et al., 2007). Nossos resultados mostraram um maior percentual de

células em apoptose quando tratadas por 120 h com RSV com 100 nM e 1 µM

de RSV .

As células estreladas hepáticas são pericitos específicos que contribuem

para a angiogênese durante o desenvolvimento, regeneração e injúria hepática.

Dados na literatura mostram que a apoptose e/ou a reversão das células

ativadas para o fenótipo quiescente podem ser alvo da terapia antifibrogênica

(Friedman, 2008). Malhi e Gores (2008) sugerem que a modulação diferencial

da apoptose nos hepatócitos e nas HSCs poderia resultar em benefícios

terapêuticos para a injuria hepática. Assim, tratamentos que reduzem a

apoptose dos hepatócitos diminuiriam a inflamação enquanto a apoptose nas

HSCs resultaria em redução da fibrogênese.

Alguns pesquisadores consideram a apoptose um potencial fator para as

células estreladas hepáticas ativadas. Estas células são mais suscetíveis a

este processo e sofrem morte celular espontânea, pela ativação de um

receptor mediador de morte ou ainda morrem por privação de soro in vitro ou

por sinalização de citoquinas (Battaler et al., 2005).

A senescência das células estreladas hepáticas pode ser um importante

processo para diminuição da proliferação e favorecimento da regeneração das

células parenquimais hepáticas. O aumento da atividade colagenolítica,

através das metaloproteínases (MMP), é o principal mecanismo envolvido na

resolução da fibrose (Battaler et al., 2005). Estas enzimas são secretadas por

muitos tipos celulares e requerem modificação pós-translacional para se

tornarem ativas. Uma vez ativadas elas podem ser inibidas por seus inibidores

naturais como: TIMP (inibidor de MMP de matriz tecidual). As MMP de matriz,

especificamente as colagenases intersticiais (MMP-1, 9 e 13) são as

responsáveis pela clivagem do colágeno tipo1, mantendo a arquitetura

hepática normal. Por outro lado, o aumento da expressão de TIMP-1 resulta na

inibição das MMP, favorecendo a progressão da fibrose. Portanto, a apoptose

das HSCs elimina não somente a maior fonte de produção de colágeno, mas

também a maior fonte de produção de TIMP-1, levando ao aumento da

atividade das MMP, colagenases intersticiais, e a subsequente degradação de

ECM (Iridale et al., 2001). A reversão da fibrose hepática também pode estar

associada à interleucina 10 (IL10) que é estimulada durante a ativação das

células estreladas gerando uma sinalização autócrina de feedback negativo

limitando a migração das células para o reparo tecidual (Wang et al., 1998;

Thompson et al., 1998). Desta forma, citoquinas solúveis podem reprimir a

ativação das HSCs por induzirem a reconstituição da ECM subendotelial.

Sabe-se também, que quando HSCs são cultivadas sobre componentes de

membrana basal (substrato matrigel) permanecem quiescentes (Olaso et al.,

2001).

Nas células GRX, o RSV, nas doses e tempos testados neste trabalho,

não desencadeou a formação de gotas lipídicas, portanto não induziu a

diferenciação para o fenótipo lipocítico. Entretanto, quando adicionado ao meio

de cultura junto com agentes que sabidamente induzem o fenótipo lipocítico,

como o retinol (RHO) (Capítulo II) e a indometacina (INDO) (dados não

mostrados), não impediu a diferenciação celular, como mostrado na figura 3

(Capítulo II).

Com o intuito de entender o processo de diferenciação das células GRX

miofibroblásticas para lipócito, (Guimarães et al. 2007) analisaram a expressão

do mRNA de fatores de transcrição, tais como: PPARα, PPARδ/β e PPARγ.

Estes fatores estão ligados à diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos

descritos recentemente por (Joosen et al. 2008). Em condições basais de

cultura, quando apresentam fenótipo de miofibroblasto, as células GRX

expressam os fatores de transcrição PPARα, PPARδ/β e PPARγ. Trabalhos

anteriores mostram que após a indução da diferenciação lipocítica das células

GRX com a INDO ou com RHO houve um aumento nos níveis do mRNA do

PPARγ , enquanto os de PPARδ/β diminuíram. Já o tratamento com INDO

levou, também, a um aumento na expressão do mRNA do PPAR-α (Guimarães

et al., 2007). Além disso, estas drogas modulam a expressão de outros genes

adipogênicos, como: LXRα, C/EBPα e SREBP1 na linhagem GRX (Guimarães

et al., 2007).

Os PPARs são importantes na regulação do metabolismo dos lipídios e

da glicose, na proliferação e diferenciação celular, na adipogênese e em vários

tecidos sinalizam processos inflamatórios (Kersten et al., 2000). Sua ação

depende da formação de heterodímeros com o receptor do ácido 9-cis retinóico

(RXR) (Werman et al., 1997).

Vários estudos mostram que o agonista do PPARα, o GW647 aumenta a

oxidação de ácidos graxos e induz à expressão do mRNA de genes envolvidos

na captação de ácidos graxos e β-oxidação (Muoio et al., 2002; Granlund et al.,

2005). In vitro, a ativação do PPARδ/β promove a oxidação e utilização de

ácidos graxos em adipócitos e células musculares esqueléticas (Reddy e

Hashimoto, 2001). O agonista do PPARδ/β, o GW501516 atenua o aumento de

tecido adiposo, por ativar os genes que promovem o catabolismo de lipídios e

desacoplamento mitocondrial em músculo esquelético de camundongos

submetidos à dieta rica em lipídios (Cho et al., 2008). O PPARγ promove a

diferenciação para adipócito por induzir armazenamento de lipídios e a

transcrição de várias proteínas lipogênicas (Tontonoz et al., 1994; Roosen et

al., 2001).

O processo de diferenciação adiposa é complexo, envolvendo a

modulação dos PPARγ, PPARα e PPARδ/β. Estes receptores nucleares podem

promover a diferenciação celular, quando ativados isoladamente ou associados

a diferentes indutores. A razão entre PPARγ e β pode ser controlada por

agonistas comuns a ambos PPARs, regulando a adipogênese e estimulando a

oxidação de ácidos graxos (Cho et al., 2008). Também foi relatado que

agonistas comuns aos PPARα e β promovem a hiperlipidemia, a resistência à

insulina e aumentam o risco de aterosclerose (Cho et al., 2008). Além disso, foi

demonstrado que o clofibrato, um ligante de PPARα, aumenta a diferenciação

das células HL-60 induzidas pelo ácido retinóico e trans-retinol (Balakumar et

al., 2007). Ligantes endógenos como os ácidos graxos insaturados, se ligam

aos três PPARs, estimulando mais fortemente o PPARα, enquanto que os

ácidos graxos saturados apresentam uma fraca ligação aos PPARs em geral

(Barrera et al., 2008).

Outro grupo de receptores nucleares, os LXRs ( Liver X receptors -

receptores X do fígado), desempenha um papel crucial na regulação da síntese

de ácidos biliares, lipogênese e no metabolismo de colesterol (Peet et al.,

1998; Alberti et al., 2001). O LXRβ é expresso ubiquamente (Song et al., 1994;

Teboul et al., 1995), enquanto o LXRα é expresso predominantemente em

tecidos conhecidos com funções importantes no metabolismo de lipídios, como

o fígado, intestino delgado, rim, músculo esquelético e tecido adiposo entre

outros (Apfel et al., 1994; Repa et al., 2000). Recentemente, estudos

mostraram que o LXRα controla a capacidade de estocar lipídios pelos

adipócitos (Juvet et al., 2003) e hepatócitos (Schultz et al., 2000). Os mesmos

autores também mostram que o LXRα é um gene alvo do PPARγ em adipócitos

e em hepatócitos.

Considerando a importância de xenobióticos provenientes da dieta, que

possam constantemente modular a expressão de genes, procuramos avaliar o

mecanismo molecular da ação do RSV, sobre as células estreladas hepáticas.

Desta forma, avaliamos a expressão de mRNA de PPARs e da SIRT1 nestas

células quando tratadas com RSV.

Nossos resultados mostraram que o RSV não alterou, na GRX, a

expressão do mRNA do receptor nuclear PPARγ, envolvido na lipogênese.

Estes resultados corroboram com os descritos anteriormente, que mostram que

o RSV não promoveu a diferenciação de miofibroblasto em lipócito. Entretanto,

quando adicionamos RHO juntamente com RSV, observamos um aumento

significativo na expressão do mRNA do PPARγ, embora menor que o

encontrado nas células tratadas somente com RHO (Figura 2; Capitulo II). Por

outro lado, o tratamento por 120 h com 100 nM de RSV não modulou a

expressão do mRNA do PPARα (dados não mostrados). Guimarães et al.,

(2007) observaram um aumento da expressão do mRNA do PPAR-α após a

indução da diferenciação lipocítica das células GRX com a INDO.

Como vários trabalhos mostram que o RSV é um potente ativador da

expressão do mRNA e atividade da SIRT1 e que esta reprime a atividade do

PPARγ (Picard et al., 2004; Wood et al., 2004; Howitz et al., 2003; Yeung et al.,

2004), resolvemos verificar o nível de expressão desse modulador de PPARγ

nas células GRX tratadas com RSV.

A SIRT1 é uma deacetilase nuclear envolvida na modulação do PPARγ.

Rodgers e colaboradores (2005) descreveram a relação da SIRT1 com o

envelhecimento e também e com o metabolismo hepático da glicose, através

da regulação do co-ativador 1 do PPARγ (PGC-1-alfa). Também foi descrito

que em hepatócitos a SIRT1 está associada fisicamente com PGC-1α e que

regula a atividade de vários fatores de transcrição e co-reguladores

transcricionais, tais como p53, Ku70, FoxO1, NF-kB, PPARγ e p300 (Leibiger e

Berggren, 2006).

A SIRT1 está associada à modulação da expressão gênica em

diferentes tecidos, tais como: fígado, cérebro, tecido adiposo, células beta do

pâncreas e músculo. É regulada positivamente por NAD

, por isso é

dependente das flutuações das concentrações deste cofator. A atividade da

SIRT1 responde ao “status” nutricional. No jejum, a SIRT1 inativa o PPARγ

através da ligação aos co-repressores PGC-1-α e PGC-1-β, levando a

repressão de genes induzidos pelo PPARγ e que estão envolvidos no

armazenamento de lipídios. Qiang e colaboradores (2007) mostraram que a

supressão da SIRT1 ativa PPARγ através da expressão do Ero1-Lα

(oxidoredutase de retículo endoplasmátco), estimulando a secreção de

adiponectina em adipócitos maduros.

Nossos resultados mostraram que a expressão do mRNA da SIRT1

aumenta com o tempo de cultura, independente do tratamento com RSV e/ou

RHO. O RHO não tem ação sobre a expressão do mRNA da SIRT1. (Figura 2;

Capitulo II), o tratamento com 100 nM de RSV por 120 h provocou um aumento

significativo nos transcritos de SIRT1 em comparação com os outros grupos

experimentais. Já, o tratamento conjunto com RSV+RHO, pelo mesmo tempo,

fez com os níveis de expressão de SIRT1 fossem significativamente menores

que os encontrados nos outros grupos.

Como já descrito anteriormente o RHO modulou positivamente o PPARγ

provocando a lipogênese, constatada nas imagens mostradas na figura 1

(Capítulo II) e pela incorporação de [C

]-acetato em triacilglicerídios (TG)

(Figura 3A e B; Capitulo II).

Em nosso modelo celular, o RSV modulou positivamente a expressão do

mRNA da SIRT1, mas não ativou a expressão do mRNA do PPARγ após 120 h

(Figura 2; Capitulo II ), consequentemente não estimulou a síntese e acumulo

de TG (Figuras 3 e 4; Capitulo II). Sendo que, após 120 h, o aumento da

expressão da SIRT1 no grupo RSV foi significativamente maior que nos outros

grupos. Entretanto, quando tratamos as células com RSV+RHO por 120 h,

verificamos que ocorreu diferenciação fenotípica, comprovada pela alteração

na morfologia e pelo acúmulo de gotas lipídicas.

O tratamento com RSV por 24h induziu um aumento significativo da

expressão do mRNA do PPARγ em todos os grupos experimentais, inclusive

nos miofibroblastos. É interessante salientar, que esse aumento foi maior no

grupo tratado com RSV+RHO. Após 120 h, os níveis de transcritos de PPARγ

diminuem quando comparados aos encontrados após 24 h de tratamento;

voltando aos níveis basais (12 h de tratamento) nos miofibroblastos e no grupo

RSV. Nos grupos RHO ou RSV+RHO a diminuição da transcrição foi menor,

mantendo os níveis de transcrição significativamente aumentados em relação

aos grupos miofibroblastos e RSV.

A relação entre os níveis de transcrição de PPARγ e SIRT 1 (figura 2b,

Capítulo II) indica que predominância da expressão de SIRT1 sobre a do

PPARγ, como acontece nos grupos miofibroblastos e RSV (120 h), impede a

indução do fenótipo lipocítico. Esta constatação é reforçada pelos experimentos

mostrados nas figuras 1, 3 e 4 (Capítulo II).

Esses resultados nos levam a sugerir a existência de uma relação

mínima gerando um balanço entre as expressões desses dois genes. Assim, o

RSV sozinho por não induzir o aumento de PPARγ e estimular a expressão da

SIRT1 não desencadeia a diferenciação lipocítica nas células GRX.

Especificamente com o objetivo de entender o efeito do RSV sobre a

síntese e acúmulo de lipídios das células GRX, monitoramos a incorporação de

acetato radioativo em TG e o conteúdo destes. Após 24 h de tratamento com

RHO ou com RSV+RHO verificamos um aumento significativo de incorporação

de acetato em TG. A análise da relação PPARγ/SIRT1 (figura 2b, Capítulo II)

reforça a hipótese da necessidade de predominância da expressão de PPARγ

sobre a de SIRT1; em ambos os grupos experimentais a expressão do PPARγ

é aproximadamente cinco vezes maior que a da SIRT1.

Os níveis de expressão de PPARγ diminuem com o aumento do tempo

(120 h) de tratamento em todos os grupos experimentais. Por outro lado, a

expressão da SIRT1 continua crescendo. Quando analisamos a incorporação

de acetato em TG após 120 h de tratamento, verificamos que esta permanece

aumentada somente no grupo RHO. No entanto, o conteúdo de TG é

semelhante nos grupos RHO e RSV+RHO V (figuras1, 3 e 4, Capitulo II).

Nossos resultados colocam em discussão a possível relação da SIRT1

em modular fatores de transcrição, como PPARγ. Assim, o RSV pode alterar a

razão PPARγ/SIRT1 regulando o metabolismo de lipídios, mas não participando

do processo de transformação fenotípica da célula GRX.

III.2 CONCLUSÕES:

 O RSV apresenta uma ação anti-proliferativa e pró-apoptótica sobre as

células GRX;

 O RSV pode apresentar uma ação quimioprotetora no fígado.

 O RSV não altera o fenótipo miofibroblástico destas células;

 O RSV provoca alteração na organização do citoesqueleto de actina;

 O RSV não impede a ação do RHO na lipogênese e na indução de

fenótipo ;

 O tratamento simultâneo com RSV+RHO, mostra um efeito estimulador

do RHO sobre a expressão do mRNA do PPARγ se sobrepondo ao

efeito do RSV, resultando em lipogênese;

 Quando a expressão do mRNA da SIRT1 é favorecida pelo RSV, a

lipogênese não é estimulada;

 O aumento da expressão do mRNA do PPARγ em relação a SIRT1 é

indispensável para a lipogênese nesta linhagem;

REFERÊNCIAS

Ahmad N, Adhami V M, Afaq F, Feyes DK, and Mukhtar H (2001). Resveratrol

causes waf-1/p21-mediated G1-phase arrest of cell cycle and induction

of apoptosis in human epidermoid carcinoma A431 cells. Clin. Cancer

Res., 7: 1466–73.

Alberti S, Schuster G, Parini P, Feltkamp D, Diczfalusy U, Rudling M, Angelin B,

Bjorkhem I, Pettersson S, J Â, Gustafsson (2001). Hepatic cholesterol

metabolism and resistence to dietary cholesterol in LXRβ-deficient mice.

J. Clin. Invest., 107: 565-573.

Anthony PP, Ishak KG, Nayak NG, Poulsen HE, Scheuer PJ, Sobin LH

(1978).The morphology of cirrhosis: recommendations on definition,

nomenclature, and classification by a working group sponsored by

theWorld Health Organization. J Clin Pathol., 31:395–414.

Apfel R, Benbrook D, Lernhardt Ortiz MA, Salberg G, Pfahl M, (1994). A novel

orphan receptor specific for a subset of thyroid hormone-responsive

elements and its interaction with the retinoid/thyroid hormone receptor

subfamily. Mol. Cell. Biol., 14: 7025-35.

Athar M, Back JH, Tang X, Kim, KH Kopelovich L, Bickers DR, Kim AL (2007).

Resveratrol: A review of preclinical studies for human cancer prevention.

Toxicology and Applied Pharmacology, 224: 274-283.

Azios NG and Dhamawardhane SF (2005). Resveratrol and Estradiol Exert

Disparate Effects on Migration, Cell Surface Actin Structures, and Focal

Adhesion Assembly in MDA-MB-231 Human Breast Cancer cells.

Neoplasia, 7:2: 128-140.

Balabaud C, Sage PB, Desmoulière A (2004). The role of hepatic stellate cells

in liver regeneration. Journal of Hepatology, 40: 1023-26.

Balakumar P, Rose M, Singh M, (2007). PPAR ligands: are they potential

agents for cardiovascular disorders?

Pharmacology, 80: 1-10.

Balliga MS and Katiyar SK (2005). Chemoprevention of photocarcinogenesis by

selected dietary botanicals. Photochemical & Photobiological Sciences,

5:243-253.

Banerjee S, Bueso-Ramos C, Aggarwal BB, (2002) Suppression of 7,12-

Dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinogenesis in rats by

resveratrol: role of nuclear factor-kappa B, cyclooxygenase 2, and matriz

metalloprotease 9, Cancer Res., 62:4945-54.

Barrera G, Toaldo C, Pizzimenti S, Cerbone A, Pettazzoni P, Dianzani M,

Ferreti C, (2008). The Role of PPAR Ligands in Controlling Growth-

Related Gene Expression and their Interaction with Lipoperoxidation

Products. PPAR Research, 2008:1-15.

Bataller R and Brenner DA, (2005). Liver fibrosis. The Journal of Clinical

Investigation, 115:209–218.

Baur JA and Sinclair DA (2006). Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo

evidence. Nature Reviews/Drugs Discovery, 5:493-506.

Bernhard D, Tinhofer l, Tonko M, Hübi H, Ausserlechner MJ, Greil R, Kofler R,

Csordas A (2000). Resveratrol causes arrest in the S-phase prior to Faz-

independent apoptosis in CEM-C7H2 acute leukemia cells. Cell Death

and Differentiation, 7:834-42.

Bissel DM, (1992) Lipocyte activation and hepatic fibrosis. Gastroenterology,

102:1803-05.

Blonhoff R, Wake K (1991) Perisinusoidal stellate cell os the liver : important

roles in retinal metabolism and fibrosis. FASEB J., 5:271-277.

Borojevic R, Monteiro AN, Vinhas SA, Domont GB, Mourao PA, Emonard H,

Grimaldi G, Jr., Grimaud JA (1985). Establishment of a continuous cell

line from fibrotic schistosomal granulomas in mice livers. In Vitro Cell Dev

Biol., 21:382-390.

Borojevic R, Guaragna RM, Margis R, Dutra HS (1990) In vitro induction of the

fat-storing phenotype in a liver connective tissue cell line-GRX. In Vitro

Cell Dev Biol., 26:361-368.

Bowers JL, Tyulmenkov VV, Jernigan SC, Klinge CM, (2000). Resveratrol acts

as a mixed agonist/antagonist for estrogen receptors α and β.

Endocrinology, 141:3657–3667.

Bridle KR, Crawford DHG, Ramm GA (2003). Identification and characterization

of the hepatic stellate cell transferring receptor. Am J Pathol., 162:1661–

67.

Carbo N, Costelli P, Baccino FM, Lopez-Soriano FJ and Argiles JM (1999).

Resveratrol, a natural product present in wine, decreases tumour growth

in a rat tumour model. Biochem. Biophys. Res. Commun., 254: 739-43

Cardoso CCA, Paviani ER, Cruz LA, Guma FCR, Borojevic R and Guaragna

RM, (2003). Effect of pentoxifilline on arachidonic acid metabolism,

neutral lipid synthesis and accumulation during induction of the lipocyte

phenotype by retinol in murine hepatic stellate cell. Molecular and

Cellular Biochemistry, 254:37-46.

Clement MV, Hirpara JL, Chawdhury SH, and Pervaiz, S, (1998)

Chemopreventive agent resveratrol, a natural product derived from

grapes, triggers CD95 signaling-dependent apoptosis in human tumor

cells. Blood, 92: 996–1002.

Chao L, Samuels B M, Mason M M, Vinson C, Arioglu E, Gavrilova O, Reitman

M, (2000).

Adipose tissue is required for the antidiabetic, but not for the

hypolipidemic, effect of thiazolidinediones. J Clin. Invest., 106(10)-1221-

28.

Chen Y, Tseng SH, Lai HS, Chen WJ (2004). Resveratro-induced cellular

apoptosis and cell cycle arrest in neuroblastoma cells and antitumor

effects on neuroblastoma in mice. Surgery, 136:57-66.

Chen YJ, Wang JS and Chow SE, (2007). Resveratrol Protects Vascular

Endothelial Cell from Ox-LDL-induced Reduction in Antithrmbogenic

Activity. Chinese Journal of Phisiology, 50:22-28.

Cho MC, Lee K, Paik SG, Yoon DY, (2008). Peroxisome Proliferators-Activated

Receptor (PPAR) Modulators and Metabolic Disorders. PPAR Research,

2008:679137-50.

Cory JG, (1988). Ribonucleotide reductase as a chemotherapeutic target. Adv.

Enzyme Regul., 27: 437-455.

Costa JV and Duarte JS, (2006). Tecido adiposo e adipocinas (review). Acta

Med Port, 19:251-256

Delmas D, Passily-Degrace P, Jannin B, Malki MM and Latruffe N, (2002).

Resveratrol, a chemopreventive agent, disrupts the cell cycle control of

human SW 480 colorectal tumor cells. International Journal of Molecular

Medicine, 10:193-199.

Dubuisson JG, Dyess DL and Gaubatz JW, (2002). Resveratrol modulates

human mammary epithelial cell O-acetyltransferase, sulfotransferase,

and kinase activation of the heterocyclic amine carcinogen N-hydroxy-

PhIP. Cancer Lett,182: 27-32.

Earnshaw WC, Martins LM and Kaufmann SH, (1999). Mammalian

caspases:structure, activation, substrates,and functions during apoptosis.

Annu. Rev.Biochem, 68:383–424

Finch RA, Liu MC, Grill SP, Rose WC, Loomis R, Vasquez KM, Cheng YC,

Sartorelli AC, (2000).Triapine (3-aminopyridine -2-

carboxaidehydethiosemicarbazone) : A potente inhibitor of ribonucleotide

reductase activity with broad spectrum antitumor activity. Biochem.

Pharmacol., 59: 981-983.

Fontecave M, Lepoivre M, Elleingand E, Gerez C, and Guittet O, (1998)

Resveratrol, a remarkable inhibitor of ribonucleotide reductase. FEBS

Lett., 421: 277–279.

Friedman SL, (2000). Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated

celluler response to tissue injury. J Biol Chem., 275:2247-2250.

Friedman SL, (2008). Mechanisms of Hepatic Fibrogenesis. Gastroenterology,

134:1658-69.

Garvin S, Öllinger K, Dabrosin C, (2006). Resveratrol induces apoptosis and

inhibits angiogenesis in human breast cancer xenografts in vivo. Cancer

Letters, 231:113-122.

Ghazizadeh M, Jin E, Shimizu H, Fujiwara M, Arai A, Ohaki Y, Takemura

T,Kawanami O, (2005). Role of cdk4, p16

INK4

, and RbExpression in the

Prognosis of Bronchioloalveolar Carcinomas. Respiration, 72:68-73.

Granlund L, Larsen LN, Nebb HI, Pedersen JI, (2005). Effects of structural

changes of fatty on lipid accumulation in adipocytes and primary

hepatocytes. Biochemica and Biophysica Acta, 1687:23-30

Guaragna RM, Trugo L, Borojevic R, (1991). Neutral lipid synthesis and

accumulation during in vitro induction of the lipocyte phenotype in hepatic

conective tissue cells. Biochem Biophys Acta, 1085:29-39.

Guimarães EL, Francheschi MFS, Andrade CMB, Guaragna RM, Borojevic R,

Margis R, Bernard EA and Guma FCR, (2007). Hepatic stellate cell

modulates lipogenic transcription factors. Liver International, 27:1255-64.

Guma FCR, Mello TG, Mermelstein CS, Fortuna VA, Wofchuk ST, Gottfried

C, Guaragna RM, Costa ML, Borojevic R, (2001). Intermediate filaments

modulation in vitro model of the hepatic stellate cell activation or

conversion into the lipocyte phenotype. Biochem Cell Biol, 79:409-417.

Hartroft WS, Ridout JH (1951) Pathogenesis of cirrhosis produced by choline

deficiency; escape of lipid from fatty hepatic cysts into the biliary and

vascular systems. Am J Pathol. 27:951–989.

Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin

R, Chung E, Kisilewski A, Zhang LL, Scherer B and Sinclair DA, (2003).

Small molecule activators of sirtuins extend Sacharomyces cerevisae

lifespan. Nature, 425:191-196.

Huang C, Ma WY, Goranson A and Dong Z, (1999). Resveratrol suppresses

cell transformation and induces apoptosis through a p53-dependent

pathway. Carcinogenesis (Lond.), 20: 237–242.

Iredale JP, (2001). Hepatic stellate cell behavior resolution of liver injury. Semin.

Liver Dis. 21:427–36.

Isseman I, Green S, (1990). Activation of a member of the steroid hormone

receptor superfamily by peroxissome proliferators. Nature, 347:645-649.

Jang M, Cai L, Udeani, GO, Slowing KV, Thomas CF, Beecher CW, Fong HH,

Farnsworth NR, Kinghorn A D, Mehta RG, Moon RC, and Pezzuto JM,

(1997). Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product

derived from grapes. Science (Wash. DC), 275: 218-220.

Jannin B, Menzel M, Berlot JP, Delmas D, Lançon A, Latruffe N, (2004).

Transport of resveratrol, a cancer chemopreventive agent to cellular

targets: plasmatic protein binding and cell uptake. Biochemical

Pharmacology, 68:1113-18.

Joe A, Liu H, Suzuki M, Vural ME, Xiao D and Weinstein IB, (2002).

Resveratrol Induces Growth Inhibition, S-phase Arrest, Apoptosis, and

Changes

in Biomarker Expression in Several Human Cancer Cell lines. Clinical

Cancer Research, 8:893-903.

Joosen AMC, Barker AHF, Kersten S and Westerterp KR, (2008). The PPARγ

ligand rosiglitazone influences traicylglycerol metabolism in nonobese

males, without increasing the transcriptional activity of PPARγ in the

subcutaneous adipose tissue. Britsh Journal of Nutrition, 99:487-493.

Juvet LK, Andresen SM, Schuster G, Dalen KT, Tobin KAR, Hollung K, Haugen

F, Jacinto S, Ulven K, Bamberg K, Gustafsson JA, Nebb HI, (2003). On

the role of Liver X receptor in lipid accumulation in adipocytes. Mol.

Endcrinol., 17: 172-182.

Kampa M, Hatzoglou A, Notas G, Damianaki A, Bakogeorgou E, Gemetzi C,

Kouroumalis E, Martin PM and Castanas E, (2000). Wine antioxidant

polyphenols inhibit the proliferation of human prostate cancer cell lines.

Nutr Cancer , 37: 223-233.

Kawada N, Seki S, Inque M and Kuroki T, (1998). Effect of Antioxidants,

Resveratrol, Quercetin, and N-Acetylcysteine, on the Functions of

Cultured Rat Hepatic Stellate Cells and Kuppfer Cells. Hepatology,

27:1265-1274.

Kern M, Pahlke G, Balavenkatraman KK, Böhmer FD and Marko D, (2007).

Apple Polyfenols Affect Protein Kinase C Activity and the Onset of

Apoptosis in Human Colon Carcinoma Cells. J. Agric. Food Chem.,

55:4999-5006.

Kersten S, Desvergne B, Wahli W, (2000). Roles of PPARs in health and

disease. Nature 405: 421–424.

King RE, Bomser JA, Min DB, (2006). Bioactivity of resveratrol. Comprehensive.

Reviews in Food Science and Food Safety, 5: 65-69.

Kirimlioglu H, Yilmaz ES, Kirimlioglu V and Karabulut AB, (2008). Effect of

Resveratrol and Melatonin on Oxidative Stress Enzymes Regeneration,

and Hepatocyte Ultrastructure in Rats Subjected to 70% Partial

Hepatectomy. Transplantation Proceedings, 40:285-289.

Kisseleva T and Brenner DA, (2006). Hepatic stellate cells and the reversal of

fibrosis. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 21:S84-S87.

Kozuki Y, Miura Y, Yagasaki K, (2001). Resveratrol supresses hepatoma cell

invasion independently of its anti-proliferative action. Cancer Letters,

167: 151-156.

Lançon A, Delmas D, Osman H, The´not JP, Jannin B, Latruffe N, (2004).

Human hepatic cell uptake of resveratrol: involvement of both passive

diffusion and carrier-mediated process. Biochem Biophys Res Commun,

316:1132-37.

Leibiger IB, Berggren PO, (2006). Sirt1: a metabolic master switch that

modulates lifespan. Nature, 12: 34-36.

Li ZG, Hong T, Shimada Y, Komoto I, Kawabe A, Ding Y, Kaganoi J, Hashimoto

Y and Imamura M, (2002). Suppression of N-nitrosomethylbenzylamine

(NMBA)-induced esophageal tumorigenesis in F344 rats by resveratrol.

Carcinogenesis, 23:1531-36.

Lin K, Rockliffe N, Johnson GG, Sherrington PD, Pettitt AR, (2008). Hsp90

inhibition has opposing effects on wild-type and mutant p53 and induces

p21 expression and cytotoxicity irrespective of p53/ATM status in chronic

lymphocytic leukaemia cell. Oncogene, 27/17: 2445-55.

Louie AY, Meade TJ, (1999). Metal Complexes as Enzyme Inhibitors. Chem.

Rev., 99:2711-34.

Lu R, Serrero G, (1999). Resveratrol, a natural derived from grape, exhibits

antiestrogenic activity and inhibits the growth of human breast câncer

cells. Journal of Cellular Physiollogy, 179:297-304

Lu X, Jung J in, Cho HJ, Lim DY, Lee HS, Chun HS, Kwon DY and Park JHY,

(2005) . Fisetin Inhibits the Activities of Cyclin-Dependent Kinases

Leading to Cell Cycle Arrest in HT-29 Human Colon Cancer Cells. J.

Nutr., 135: 2884–90.

Malhi H and Gores GJ, (2008). Cellular and Molecular Mechanisms of Liver

Injury. Gastroenterology, 134: 1655-69.

Margis, R, Borojevic R, (1989). Retinoid-mediated induction of the fat-storing

phenotype in a liver connective tissue cell line (GRX). Biochem Biophys

Acta, 1011: 1-5.

Melo EJT, Mayerhoffer RO, Souza W, (2000). Hydroxyurea inhibits intracellular

Toxoplasma gondii multiplication. FEMS Microbiol. Lett., 185:79.

Meng X, Maliakal P, Lu H, Lee MJ and Yang CS, (2004). Urinary and plasma

levels of grape juice. J. Agric. Food Chem., 52: 935-942.

Mermelstein CS, Guma FCR, Mello TG, Fortuna VA, Guaragna RM, Costa ML,

Borojevic R, (2001). Induction of lipocyte phenotype in murine hepatic

stellate cells : Reorganization of the action cytoskeleton. Cell Tissue Res,

306: 75-83.

Mgbonyebi OP, Russo J and Russo IH, (1998). Antiproliferative effect of

synthetic resveratrol on human breast epithelial cells. Int J Oncol, 12:

865-869.

Monteiro ANA, Borojevic R, (1987). In vitro formation of fibrous septa by liver

connective tissue cells. In vitro Cellular Developmental Biology, 23:10-14.

Moreira RK, (2007). Hepatic Stellate Cells and Liver Fibrosis. Arch Pathol Lab

Med., 131:1728-34.

Muoio DM, MacLean PS, Lang DB, Li S, Houmard JA, Way JM, Winegar DA,

Corton JC, Dohm GL, Kraus WE, (2002). Fatty acid homeostasis and

induction of lipid regulatory genes in skeletal muscles of peroxisome

proliferator-activated receptor (PPAR) alpha knock-out mice. Evidence

for compensatory regulation by PPAR delta. J. Biol. Chem. 277: 26089–

97.

Narayanan BA, Narayanan NK, Stoner GD and Bullock BP, (2002). Interactive

gene expression pattern in prostate cancer cellsexposed to phenolic

antioxidants. Life Sci 70: 1821-39.

Nigro P, Bloise E, Turco MC, Skhirtladze A, Montoro P, Pizza C, Piacente S,

Belisario MA, (2007). Antiproliferative and pro-apoptotic activity of novel

phenolic derivatives of resveratrol. Life Sciences, 81:873–883

Notas G, Nifli AP, Kampa M, Vercauteren J, Kouroumalis E, Castanas E,

(2006). Resveratrol exerts itsantiproliferative effect on HepG2

hepatocellular carcinoma cells, by inducing cell cycle arrest, and NOS

activation. Biochim Biophys Acta, 1760:11657-66.

Olaso E, Ikeda K, Eng, FJ, Xu L, Wang LH, Lin, C, Friedman, S. L. (2001).

DDR2 receptor promotes MMP-2 mediated proliferation and invasion by

hepatic stellate cells.The Journal of clinical investigation, 108:1369-78.

Olson ER, Naugle JE, Zhang X, Bomser JA and Meszaros JG, (2004).

Inhibition of cardiac fibroblast proliferation and myofibroblast

differentiation by resveratrol. American Journal Physiology Heart

Circulatory Physiology, 288: 1131-38.

Passino M, Adams RA, Sikorski SL, Akassoglou K, (2007). Regulation of

Hepatic Stellate Cell Differentiation by the Neurotrophin Receptor p75

NTR

Science, 315:1853-56.

Peet J, Janowski BA, Mangelsdorf DJ, (1998). The LXRs: a new class of

oxysterol receptors. Curr. Opin. Genet. Dev., 8: 571-575.

Picard F, Kurtev M, Chung N, Topark-Ngarm A, Senawong T, Oliveira RM, Leid

M, McBurney M, Guarente L, (2004). Sirt1 promotes fat mobilization in

white adipocytes by repressing PPAR-γ. Nature, 429: 771-776.

Pozo-Guisado E, Alvarez-Barrientos A, Mulero-Navarro S, Santiago-Josefat B

and Fernandez-Salguero PM, (2002). The antiproliferative activity of

resveratrol results in apoptosis in MCF-7 but not in MDA-MB-231 human

breast cancer cells: cell-specific alteration of the cell cycle. Biochem

Pharmacol, 64: 1375-86.

Pozo-Guisado E, Lorenzo-Benazayas MJ, Fernadez-Salguero PM, (2004).

Resveratrol modulates the phosphoinositide 3-kinase pathway through

an estrogen receptor alpha-dependent mechanism : relevance in cell

proliferation. Int. J. Cancer, 109: 167-173.

Qiang L, Wang H and Farmer SR, (2007). Adiponectin Secretion Is Regulated

by SIRT1 and the Endoplasmic Reticulum Oxidoredutase Ero1-α.

Mollecular an Cellular Biology, 27: 4698-4707.

Ragione FD, Cucciolla V, Borriello A, Pietra VD, Racioppi L, Soldati G, Manna

C, Galletti P and Zappia V, (1998). Resveratrol arrests the cell division

cycle at S/G2 phase transition. Biochem. Biophys. Res. Commun., 250:

53–58.

Rayalam S, Della-Fera MA, Yang JY, Park HJ, Amabati S, Baile C, (2007).

Resveratrol Potentiates Genistei’s Antiadipogenic and Proapoptotic

Effects in 3t3-L1 Adipocytes. The journal of Nutrition, 137: 2668-73.

Reddy JK, Hashimoto T, (2001). Peroxisomal β-oxidation and peroxisome

proliferators-activated receptor α: an adaptive metabolic system. Annu.

Rev. Nutr., 21:193-230.

Repa JJ, Turley JA, Lobaccaro JA, Medina J, Li L, Lustig K, Shan B, Heyman

RA, Dietschy JM, Mangelsdorf DJ, (2000). Regulation of absorption and

ABC1-mediated efflux of cholesterol by RXR heterodimers. Science, 289:

1524-29.

Rodgers JT, Lerin C, Hass W, Gygi SP, Spiegelman BM, Puigserver P, (2005).

Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC1-

alpha and SIRT1. Nature, 434: 113-118.

Roman V, Billard C, Kern C, Ferry-Dumazet H, Izard JC, Mohammad R,

Mossalayi DM, Kolb JP,(2002). Analysis of resveratrol-induced apoptosis

in human B-cell chronic leukemia. British Journal of Haematology,

117:842-851.

Roosen A, Schober A, Strelau J, Bottner M, Faulhaber J, Bendner G, McIlwrath

SL, Seller H, Ehmke H, Lewin GR, Unsicker K

., (2001). Lack of

neurotrophin-4 causes selective structural and chemical deficits in

sympathetic ganglia and their preganglionic innervation. J Neurosci., 21:

3073-84.

Sgambato A, Ardito R, Faraglia B, Boninsegna A, Wolf FI, Cittadinini A, (2001).

Resveratrol, a natural phenolic compound, inhibits cell proliferation and

prevents oxidative DNA damage. Mutation Research, 496:171-180.

Shih A, Zhang S, Cao HJ, Boswell S, Wu YH, Tang HY, Lennartz MR, Davis

FB, Davis PJ, Lin HY, (2004). Inhibitory effect of epidermal growth factor

on resveratrol-induced apoptosis in prostate cancer cells is mediated by

protein kinase C-α. Molecular Cancer Therapeutics, 11:1355-63.

Schultz JR, Tu H, Luk A, Repa JJ, . Medina JC, Li L, Schwendner S, Wang S,

Thoolen M, Mangelsdorf DJ,. Lustig KD, Shan B, (2000). Role of LXRs

in control of lipogenesis. Genes Dev., 14:2831-38.

Signorelli P, Ghidoni R, (2005). Resveratrol as an anticancer nutrient: molecular

basis open questions and promises. Journal of Nutritional Biochemistry,

16: 449-466.

Soleas GJ, Diamandis EP, and Goldberg DM, (1997). Resveratrol: a molecule

whose time has come? And gone? Clin. Biochem., 30: 91–113.

Stervbo U, Vang O, Bonnesen C, (2006). Time- and concentrationdependent

effects of resveratrol in HL-60 and HepG2 cells. Cell Prolif., 39:479.

Stewart JK, Artime MC, O’Brian CA, (2003). Resveratrol: A candidate Nutritional

Substance for Prostate Cancer Prevention. J. Nutr., 133:2440-43.

Song C, Kokontis JM, Hiipakka RA, Liao S, (1994). Ubiquitous receptor: a

receptor that modulates gene activation by retinoic acid and thyroid

hormone receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10809-813.

Stivala LA, Savio M, Carafoli F, Perucca P, Bianchi L, Magas G, Forti L,

Pagnoni UM, Albini A, Prosperi E, Vannini V, (2001). Specific Structural

Determinants Are Responble for the Antioxidant Activity and the Cell

Cycle Effects of Resveratrol. The journal of Biological Chemistry, 276:

22586-594.

Subbaramaiah K, Michaluart P, Chung WJ, Tanabe T, Telang Nand

Dannenberg AJ, (1999). Resveratrol inhibits cyclooxygenase-2

transcription in human mammary epithelial cells. Ann NY Acad Sci , 889:

214-223.

Sun NJ, Woo SH, Cassady JM, and Snapka RM,(1998). DNA polymerase and

topoisomerase II inhibitors from Psoralea corylifolia. J. Nat. Prod.

(Lloydia), 61: 362–366.

Surh YJ, Hurh YJ, Kang JY, Lee E, Kong G and Lee SJ, (1999). Resveratrol, an

antioxidant present in red wine, induces apoptosis in human

promyelocytic leukemia (HL-60) cells. Cancer Lett 140: 1-10.

Taub R, (2004). Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews

Molecular Cell Biology, 5:836-47.

Tavares H, Hirata MH, Hirata RDC, (2007). Receptor Ativado por Proliferadores

de Peroxissoma Gama (PPARγ): Estudo Molecular na Homeostase da

Glicose, Metabolismo de Lipídeos e Abordagem Terapêutica. Arq Brás

Endocrinol Metabol., 51/4: 526-533.

Teboul M, Enmark E, Li Q, Wikstrom AC, Pelto-Huikko M, Gustafsson JA,

(1995) . OR-1, a member of the nuclear receptor superfamily that

interacts with 9-cis-retinoic acid receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:

2096-2100.

Tessitore L, Davit A, Sarotto I, and Caderni G (2000). Resveratrol depresses

the growth of colorectal aberrant crypt foci by affecting bax and p21CIP

expression. Carcinogenesis, 21:1619–1622.

Thompson KC, Trowern A, Fowell A, Marathe M, Haycock C, Arthur MJP,

Sheron N, (1998). Primary rat and mouse hepatic stellate cells express

the macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of

activation in vitro. Hepatology, 28:1518–24

Tontonoz P, Hu E, Spiegelman BM, (1994). Stimulation of adipogenesis in

fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.

Cell,

79: 1147-76.

Ulrich S, Loitssch SM, Rau O, Von Knethen A, Brune B, Schubert-Zsilavecz M,

Stein JM, (2006). Eroxisome Proliferator-Activated Receptor γ as a

Molecular Target of Resveratrol-Induced Modulation of Polyamine

metabolism. Cancer Res., 66: 7348-54.

Wake K, (1971). ‘‘Sternzellen’’ in the liver: perisinusoidal cells with special

reference to storage of vitamin, A. Am J Anat., 132:429–462.

Walle T, Hsieh F, DeLegge MH, Oatis JE, Jr. and Walle UK, (2004). The

American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics. 32:

1377-82.

Wang SC, Tsukamoto H, Rippe R A, Schrum L, Ohata M, (1998). Expression of

interleukin-10 by in vitro and in vivo activated hepatic stellate cells. J.

Biol. Chem., 273: 302–308

Wang Z, Huang Y, Zou J, Cao K, Wu JM, (2002). Effects of red wine and wine

polyphenol resveratrol on platelet aggregation in vivo and in vitro. Int. J.

Mol. Med., 9(1):77-9.

Waterhouse AL, (2002). Wine phenolics. Ann. N.Y. Acad. Sci., 957: 21-36.

Wheeler MD, Kono H, Yin M, (2001). The role of Kupffer cell oxidant production

in early ethanol-induced liver disease. Free Radic Biol Med. 31:1544–49.

Wenzel E, Somoza V, (2005). Metabolism and biovailability of trans-resveratrol.

Molecular nutrition & Food research, 49:472-81.

Werman A, Hollenberg A, Solanes G, Bjorbaek C, Vidal-Puig AJ, Flier JS,

(1997).

Ligand-independent activation domain in the N terminus of

peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma).

Differential activity of PPARgamma1 and -2 isoforms and influence of

insulin.

J Biol Chem., 272: 20230-5. 230.

Wood JG, Rogina B, Lavu S, Howitz K, Helfand SL, Tatar M, Sinclair D, (2004).

Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.

Nature, 430/6: 686-689.

Yang JY, Fera AD, Rayalan S, Ambati S, Hartzell D, Park HJ, Baile CA, (2008).

Enhanced inhibition of adipogenesis and induction of apoptosis in 3T3-L1

adipocytes with combinations of resveratrol and quercetin. Life Sciences,

82:1032-39.

Yeung F, Hoberg J, Ramsey CS, Keller MD, Jones DR, Frye RA, Mayo MW,

(2004). Modulation of NF-κB-dependent transcription and cell survival by

the SIRT1 deacetylase. EMBO J., 23: 2369-80.

Xiuyun H, Xu S, Maitland-Toolan KA, Sato K, Jiang B, Ido Y, Lan F, Walsh K,

Wierzbicki M, Verbeuren TJ, Cohen RA, Zang M, (2008). SIRT1

Regulates Hepatocyte Lipid Metabolism through Activating AMP-

Activated Protein Kinase. Journal of Biological Chemistry, 283:20015-

026.

Zhang P, Li H, Wu ML, Chen XY, Kong QY, Wang XW, Sun Y, Wen S, Liu J,

(2006). c-Myc downregulation: a critical molecular event in resveratrol-

induced cell cycle arrest and apoptosis of human medulloblastoma cells.

J Neurooncol., 80: 123-31.

Zhang W, Fei Z, Zhen Hn, Zhang Jn, Zhang X, (2006). Resveratrol inhibits cell

growth and induces apoptosis of rat C6 glioma cells. J Neurooncol., 81:

231-40.

ANEXOS

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÂO

FIGURA 1 –

Célula Estrelada Hepática em um processo de injúria do fígado.................13

FIGURA 2 – Estrutura química dos isômeros trans-resveratrol e cis-resveratrol..............16

ARTIGO 1

FIGURA 1 –

Efeito do RSV sobre o ciclo celular........................................................31

FIGURA 2 A e B –

Influência do RSV sobre a apoptose por análise da população subplóide

e morfologia das células GRX...................................................................................31

ARTIGO 2

FIGURA 1 –

Imagens das células GRX em contraste de fase.......................................55

FIGURA 2 A e B –

Expressão relativa do PPARγ e SIRT 1 nas células GRX.................56

FIGURA 3 A e B –

Incorporação de acetato em fosfolipídios e triacilgliceróis nas células

GRX

.....................................................................................................................57

FIGURA 4 –

Conteúdo de triacilgliceróis nas células GRX...........................................58

RESULTADOS COMPLEMENTARES

FIGURA 1 –

Efeito do resveratrol (RSV), retinol (RHO) e RSV associado ao RHO sobre a

organização do citoesqueleto de actina nas células GRX

................................................62

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 –

Efeito do RSV sobre o ciclo celular..................................................................30

TABELA 2 –

Primers usados para PCR-real time......................................................54

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