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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
BIOQUÍMICA
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE
NUCLEOTIDASES EM FRAÇÃO SOLÚVEL E MICROSSOMAL
DE TECIDO CARDÍACO DE RATOS
DANIELA POCHMANN
Orientadora:
Profa. Dra. Lisiane de Oliveira Porciúncula
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:
Bioquímica do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em
Bioquímica.
Porto Alegre
2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
À minha família, pelo envolvimento, apoio,
incentivo e suporte em todos os momentos...
Ao Professor Sarkis, pelo exemplo de
dedicação à pesquisa.
II
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"A alegria está na luta, na tentativa, no
sofrimento envolvido e não na vitória propriamente dita.”
Gandhi
III
Agradecimentos
Ao Professor Sarkis (in memoriam), pela oportunidade, pela orientação, pelo exemplo
de organização, dedicação e superação. Pelo carinho e incentivo sempre.
À Professora Maria Luiza, por toda atenção, carinho, envolvimento e exemplo de
profissional.
À Professora Ana Battastini, pela disposição e atenção sempre que necessários.
À Professora Carla Bonan, pelo exemplo de dedicação.
À Lisi, por ter encarado a minha orientação num momento complicado, pelas
chamadas de atenção e pelas oportunidades.
À Cris, Bá e Vanessinha, companheiras de todos os bons e maus momentos. Pessoas
muito queridas que fizeram parte fundamental dessa tese.
À querida Adrine, por toda ajuda, dedicação, companheirismo e pelos ótimos
momentos dentro e fora do laboratório.
À Denise, pela disposição e pelo exemplo de dedicação e esforço.
À Professora Márcia, pela grande ajuda, pelo carinho e atenção.
À Ana Ardais, pela amizade, alegria e companheirismo.
A todos os colegas que ainda estão ou que um dia passaram pelo Grupo de
Enzimologia: Rô, Ale Bruno, Fê, Giana, Ana Spier, Sandra, Dani, Manoela, Luci,
Joséli, Lucimara, Vanessa Silveira, Vinícius, Laila, Andréia, Jean, Tiana, Ale
Tamajusuku, Eliz, Émer, Rafa, Felipe, Fabrício, Andressa, Lila, Edu, Agnes.
Ao Professor Diogo e à Professora Susana, por todo envolvimento e sensibilidade no
momento em que foi necessário.
IV
Aos queridos dos Laboratórios 26 e 28, pela acolhida, pelo carinho e alegria. Em
especial à Vanessa Ghidini, à Renata, à Bina, ao Marcelo Costa, ao Paulo, à Fê, ao
Giordano e ao Marcos, pelo incentivo, força e companheirismo.
A todas as pessoas do Departamento de Bioquímica da UFRGS, que de alguma forma
colaboraram para a execução deste trabalho. Em especial à Cléia, por todo esforço,
dedicação e disposição.
À toda minha família que sempre me apoiou e incentivou. Em especial aos meus avós,
por acreditarem sempre em mim e pela admiração. Aos meus pais, por me darem
suporte, oportunidades e por segurarem as pontas em todos os momentos. E à minha
irmã, minha amiga, sempre presente e participativa.
À minha querida amiga Renata, sempre! Por todos os momentos divididos desde o
colégio (faz tempo), por toda a alegria. Minha irmã de coração.
À Bibi, minha amigona desde a graduação, e à Micheli, queridas que fazem os meus
dias mais leves e felizes. Pessoas muito importantes em todos os momentos.
Ao CNPq pela bolsa concedida.
Enfim, obrigada a todos!
V
Apresentação
Conforme as normas do Programa de Pós Graduação em Ciências
Biológicas:Bioquímica, esta tese está organizada em três partes principais:
Parte I – contendo os Resumos, a Lista de Abreviaturas, a Introdução e os
Objetivos do trabalho;
Parte II – aborda essencialmente os Materiais e Métodos e os Resultados do
trabalho, sendo apresentada na forma de capítulos constituídos por artigos
científicos publicados e/ou em preparação;
Parte III – constitui-se da interpretação dos resultados (Discussão),
Conclusões, Perspectivas, Referências (apenas as citadas nas Partes I e III) e
da Lista de Figuras.
VI
Sumário
PARTE I.......................................................................................................
1
RESUMO...................................................................................................... 2
ABSTRACT................................................................................................... 3
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................... 4
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 5
1.1 Sistema Purinérgico............................................................................... 5
1.1.1 Nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares e seus receptores..... 6
1.1.2 Os nucleotídeos ATP e ADP no sistema cardiovascular................ 9
1.1.3 O nucleosídeo adenosina................................................................ 11
1.2 A Família das Ectonucleotidases........................................................... 14
1.2.1 Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases)........... 15
1.2.2 Ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs)........... 22
1.2.3 Ecto- 5’-nucleotidase....................................................................... 25
1.3 Cafeína...................................................................................................
27
1.3.1 Conceito e consumo........................................................................ 27
1.3.2 Metabolismo....................................................................................
1.3.3 Mecanismo de ação e efeitos no sistema cardiovascular...............
27
28
2. OBJETIVOS…………………………………………………………………… 31
PARTE II………………………………………………………………………….
33
VII
CAPÍTULO I………………………………………………………………………
34
AMP hydrolysis in soluble and microsomal rat cardiac cell fractions:
kinetic characterization and molecular identification of 5’-
nucleotidase - Publicado em Bioscience Reports 28(5): 267-273,
2008……………………………………….………………………………...
35
CAPÍTULO II………………………………………………………………………
42
Kinetic and molecular analysis of NTPDase in rat cardiac soluble and
microsomal fractions - Artigo em preparação para ser submetido ao
periódico Molecular and Cellular Biochemistry…………………...…….
43
CAPÍTULO III................................................................................................
75
Biochemical characterization of an ecto-nucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP, E.C. 3.1.4.1) from rat
cardiac soluble and microsomal fractions……………………...………..
76
ANEXO ........................................................................................................ 94
PARTE III......................................................................................................
103
1. DISCUSSÃO............................................................................................. 104
1.1 Propriedades da ecto-5’-nucleotidase em fração solúvel e
microssomal do coração......................................................................
104
1.2 Hidrólise de ATP e ADP no coração – Identificação das enzimas da
família das E-NTPDases......................................................................
106
1.3 Análise cinética e bioquímica das E-NPPs em fração solúvel e
microssomal.........................................................................................
112
1.4 Atividade das NTPDases, ecto-5’-nucleotidase e NPP em coração
de ratos tratados com cafeína..............................................................
114
VIII
IX
1.5 Ectonucleotidases em frações subcelulares - possível papel das
ectonucleotidases solúveis e de retículo sarcoplasmático...................
117
2. CONCLUSÕES......................................................................................... 121
3. PERSPECTIVAS...................................................................................... 122
REFERÊNCIAS............................................................................................ 123
LISTA DE FIGURAS..................................................................................... 149
PARTE I
1
RESUMO
Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são
importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de
crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa
cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a
esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares
permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de
microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca
2+
do
retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de
ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em
diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que
metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da
sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois
controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação
do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros
das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5’-nucleotidase em frações solúvel e
microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização
bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da
atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes
de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na
fração microssomal. Os valores de K
M
aparente calculados a partir do plot de Eadie-
Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 μM e de V
max
71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg
de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal,
os valores de K
M
calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 μM, e os valores de
V
max
foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente.
Considerando a atividade da ecto-5’-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os
resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade
máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo
para ambas frações foi 9,5. Os valores de K
M
foram 59,7 μM e 134,8 μM com um valor
de V
max
calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e
microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5’-
nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade
na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5’-timidina monofosfato (p-Nph-5’-TMP)
como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência
para cations divalentes. Os valores de K
M
corresponderam a 118,5 e 91,9 μM e os
valores do V
max
calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína
para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no
coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além
disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação
do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo
de Ca
2+
para o retículo sarcoplasmático.
Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das
ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a
administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a
cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles
receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento
crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e
os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o
tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise
dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar
relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração.
2
ABSTRACT
Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are
important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell
growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and
heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these
extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac
sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these
purines could modulate Ca
2+
currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly
the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their
actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the
heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an
essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate,
amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation.
In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family
members, E-NPPs and ecto-5’-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal
fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and
ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase
activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that
presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent
K
M
values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction
were 131.2 and 57.1 μM, respectively. V
max
values calculated were 71.3 and 9.3 nmol
Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction,
the K
M
values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 μM, respectively. V
max
values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using
ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity
with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration
required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final
concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent K
M
calculated were 59.7 μM and 134.8 μM with a V
max
values calculated of 6.7 and 143.8
nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively.
Western blotting analysis to ecto-5’-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both
fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5’-
thymidine monophosphate (p-Nph-5’-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an
alkaline optimum pH and divalent cation dependence. The K
M
value corresponded to
118.5 and 91.9 μM and V
max
value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/
min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. The presence
of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of
signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in
the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the
involvement with the Ca
2+
influx to sarcoplasmic reticulum.
To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac
soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine
administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral
dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals
were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0
mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were
euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine
treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions.
However, more data are necessary to correlate the results founded and the known
cardiac effects of caffeine.
3
4
LISTA DE ABREVIATURAS
ADK - adenosina cinase
ACR – regiões conservadas da apirase
CD39 - antígeno de ativação celular linfóide
CD73 - ecto-5’-nucleotidase
Ecto-ADA - ecto-adenosina deaminase
Ecto-ATPDase - ecto-ATP difosfoidrolase
E-NPP - ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase
E-NTPDase - ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase
GPI - glicosil-fosfatidilinositol
mRNA - RNA mensageiro
NAD - nicotinamida adenina dinucleotídeo
NTPDase – nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase
P2X - receptor purinérgico ionotrópico
P2Y - receptor purinérgico metabotrópico
p-nitrophenyl-5’-TMP - p-nitrofenil-5’-timidina monofosfato
RT-PCR – reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa
1. INTRODUÇÃO
1.1 Sistema Purinérgico
O sistema purinérgico constitui-se de uma importante via de sinalização
celular em que purinas extracelulares como ATP, GTP e seus metabólitos,
exercem seus efeitos através da interação com receptores de membrana
específicos, denominados receptores purinérgicos ou purinoceptores
(Burnstock, 2002).
A primeira evidência sobre as potentes ações das purinas foi publicada
por Drury & Szent-Györgyi em 1929. Nesse estudo os autores demonstraram
que a adenosina e o AMP eram capazes de induzir efeitos cronotrópicos
negativos no coração, além de dilatação arterial, diminuição da pressão arterial
sanguínea e inibição da contração intestinal. Somente quatro décadas depois
surgiram evidências para o papel do nucleotídeo ATP como um
neurotransmissor em nervos não-adrenérgicos e não-colinérgicos de intestino e
bexiga (Burnstock et al., 1970). A partir de então a palavra “purinérgico” foi
criada e o conceito de um sistema de sinalização purinérgica, usando
nucleotídeos purínicos e nucleosídeos como mensageiros extracelulares foi
proposto (Burnstock, 1972). Ainda na mesma década houve a identificação e
caracterização dos purinoceptores, enfatizando ainda mais a hipótese
purinérgica (Burnstock, 1976; Burnstock, 1978).
Atualmente a sinalização purinérgica é amplamente reconhecida como um
sistema primitivo envolvido em muitos mecanismos neuronais e não-neuronais
(Burnstock & Knight, 2004; Burnstock, 2006).
5
1.1.1 Nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares e seus receptores
Extracelularmente os nucleotídeos e nucleosídeos purínicos (como ATP,
ADP, AMP e adenosina) e pirimidínicos (como UTP e UDP) atuam como
importantes moléculas sinalizadoras que induzem uma multiplicidade de efeitos
em diversos sistemas biológicos (Ralevic & Burstock, 1998).
De uma maneira geral, os processos relacionados às purinas e
pirimidinas incluem neurotransmissão no sistema nervoso central, contração
não-colinégica e não-adrenérgica em músculo liso e interações neurônio-glia
(Ralevic & Burnstock, 1998), efeitos inotrópicos, cronotrópicos e arritmogênicos
no miocárdio (Vassort, 2001), funções gastrointestinais e hepáticas (Roman &
Fitz, 1999), regulação da resposta de células epiteliais (Schwiebert &
Zsembery, 2003), regulação do fluxo sanguíneo (Gonzalez-Alonso et al., 2002),
resposta imune e inflamação (Bours et al., 2006) e agregação plaquetária em
sítios de injúria vascular (Marcus et al., 2003; Gachet, 2006). Além da
sinalização de eventos agudos, as purinas e pirimidinas também apresentam
papéis tróficos na proliferação e crescimento celular (Burnstock, 2006), indução
de apoptose e atividade anticâncer (Bours et al., 2006; White & Burnstock,
2006), formação da placa aterosclerótica (Di Virgilio & Solini, 2002),
cicatrização, formação e reabsorção óssea (Hoebertz et al., 2003) e alterações
vasculares no diabetes (Solini et al., 2004).
A liberação de nucleotídeos endógenos para o meio extracelular pode
acontecer por diversos mecanismos (Figura 1) e representa um componente
crítico para o início da cascata de sinalização (Yegutkin, 2008). O
extravasamento massivo de nucleotídeos por lise celular é um mecanismo não-
específico que está restrito à injúria de órgãos, estresse mecânico e algumas
6
condições inflamatórias (Bours et al., 2006; Volonté & D’Ambrosi, 2009). Além
disso, mecanismos não-líticos de efluxo de nucleotídeos representam uma rota
distinta e importante de aparecimento dessas moléculas no meio extracelular.
Vários tecidos com características celulares excitatórias e/ou secretórias tais
como terminais nervosos e células cromafins (Burnstock, 2007), células
acinares pancreáticas (Sorensen & Novak, 2001) e plaquetas circulantes
(Marcus et al., 2003; Gachet, 2006) estocam ATP e ADP em grânulos
especializados e regulam a liberação dessas vesículas contendo nucleotídeos
(exocitose) de uma maneira dependente de Ca
2+
. Os nucleotídeos podem
ainda atravessar a membrana plasmática em direção ao compartimento
extracelular usando canais iônicos e transportadores de ATP de membrana
(Yegutkin, 2008; Volonté & D’Ambrosi, 2009). Razões adicionais pelas quais as
purinas podem estar presentes no lado externo da célula são a sua pequena
massa molecular, a alta taxa de difusão no meio extracelular e o alto gradiente
formado entre os ambientes intra e extracelulares (Volonté & D’Ambrosi, 2009).
Figura 1. Vias de liberação das purinas para o espaço extracelular. Adaptado de G.
Yegutkin (2008).
7
Uma vez no espaço extracelular, estas purinas servem como ligantes
para um grande número de distintos receptores de superfície celular, os
purinoceptores (Figura 2), os quais compreendem os receptores P1, ativados
por adenosina, e os receptores P2, ativados por ATP, ADP, UTP e UDP
(Burnstock, 1978; Erlinge & Burnstock, 2008).
Os receptores P1 se subdividem em A
1
, A
2A
¸ A
2B
e A
3
e são ativados por
adenosina, com o potencial agonista na ordem adenosina > AMP > ADP> ATP.
Enquanto os receptores A
1
e A
3
são acoplados a proteína G
i
e inibem a
adenilato ciclase, ambos os receptores A
2A
¸ e A
2B
são acoplados à proteína G
s
e estimulam a adenilato ciclase (Ralevic & Burnstock, 1998; Czajkowski &
Baranska, 2002).
A classificação dos receptores P2
foi inicialmente baseada em critérios
farmacológicos (Burnstock & Kennedy, 1985), e posteriormente reforçada
através de técnicas de clonagem e expressão em sistemas heterólogos (Evans
et al., 1995). Estes receptores podem ser classificados em duas famílias:
receptores P2X e P2Y. Os receptores P2X atuam como canais ionotrópicos
ativados por ATP e estão divididos em sete subtipos (P2X
1
-
7
). Os receptores
metabotrópicos P2Y são acoplados a proteínas G e estão divididos nos
subtipos P2Y
1
, P2Y
2
, P2Y
4
, P2Y
6
, P2Y
11
,
P2Y
12
, P2Y
13
e P2Y
14
(Ralevic &
Burnstock, 1998; Communi et al., 2001; Hollopeter et al., 2001; Erlinge &
Burnstock, 2008; Yegutkin, 2008). Os receptores purinérgicos apresentam uma
ampla distribuição tecidual e, como conseqüência dos seus ligantes, estão
implicados em um grande número de funções.
8
Figura 2. Vias de sinalização purinérgica. Sinalização mediada por nucleotídeos através
de receptores ionotrópicos P2X e metabotrópicos P2Y. O nucleosídeo adenosina age em
quatro receptores próprios acoplados à proteína G. Obtido de G. Yegutkin (2008).
1.1.2 Os nucleotídeos ATP e ADP no sistema cardiovascular
Os nucleotídeos ATP e ADP influenciam fortemente o sistema
cardiovascular exercendo potentes efeitos em diversos processos fisiológicos e
patológicos (Ralevic & Burnstock, 1991; Ralevic & Burnstock, 2003; Burnstock,
2006; Yegutkin, 2008). Múltiplos fatores são importantes para determinar a
resposta provocada por estas purinas, entre eles destaca-se a natureza do
subtipo de purinoceptor envolvido e a sua localização (Ralevic & Burnstock,
1991). Todas as células do sistema cardiovascular expressam um ou mais
subtipos de purinoceptores (Ralevic & Burnstock, 2003), dependendo da célula
e do receptor, essas purinas podem desempenhar numerosos efeitos que
estão principalmente relacionados a cardioproteção.
O nucleotídeo ATP é capaz de atuar com efeitos opostos dependendo da
concentração, da célula e do receptor. O ATP liberado como co-transmissor de
nervos simpáticos é capaz de contrair a musculatura vascular lisa via receptores
9
P2X, enquanto o ATP liberado dos nervos motores sensoriais durante a atividade
do “arco-reflexo” pode dilatar os vasos via receptores P2Y. Além disso, o ATP
liberado das células endoteliais durante mudanças do fluxo sangüíneo (shear
stress) ou durante hipóxia, é capaz de agir em receptores P2Y nestas células e
liberar óxido nítrico (NO), resultando em relaxamento (Kunapuli & Daniel, 1998;
Burnstock, 2002). O ATP também pode exercer influência sobre o sistema
vascular por interferir no processo de agregação plaquetária e promover
proliferação de células musculares lisas e células endoteliais (Soslau &
Youngprapakorn, 1997; Ralevic & Burnstock, 2003).
Além dos efeitos na vasculatura cardiovascular, o ATP apresenta efeitos
cronotrópicos (ritmo), dromotrópicos (condutividade) e inotrópicos
(contratilidade) em preparações de coração isolado (Rongen et al., 1997). O
ATP geralmente é responsável por efeitos inotrópicos positivos e sua rápida
aplicação em células induz várias formas de arritmia. Além disso, estudos
recentes têm demonstrado que esse nucleotídeo é capaz de modular correntes
de Ca
2+
, Na
+
, K
+
and Cl
-
em cardiomiócitos (Vassort, 2001). Outros possíveis
papéis do ATP no coração incluem a hipertrofia, precondicionamento e
apoptose (Webb, 1996; Kunapuli & Daniel, 1998; Vassort, 2001; Ralevic &
Burnstock, 2003).
Em relação ao nucleotídeo ADP, o principal efeito funcional dessa
molécula é a estimulação da agregação plaquetária por meio da interação com
os receptores P2Y
12
das plaquetas (Gachet, 2001). Por esse motivo, o controle
dos níveis extracelulares de ADP torna-se fundamental para a regulação de
processos trombóticos e/ou hemorrágicos. Em adição, o ADP pode atuar nos
receptores P2Y
1
das células endoteliais e musculares lisas, causando dilatação
10
(Ralevick e Burnstock, 2003), sendo que esta também pode ocorrer pela
liberação de NO que o ADP é capaz de estimular (Kunapuli & Daniel, 1998). O
AMP, por sua vez, trata-se de um agente anti-agregador plaquetário e de
extrema importância como substrato para formação da adenosina.
Paralelamente a estes efeitos extracelulares, algumas evidências com
fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático
cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que os nucleotídeos da
adenina poderiam modular correntes de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático,
ativando diretamente o canal iônico (Meissner, 1984; Meissner & Henderson,
1987; Duke & Steele, 1998).
1.1.3 O nucleosídeo adenosina
A adenosina, um precursor ou um metabólito dos nucleotídeos da
adenina, é uma molécula presente em todas as células do sistema biológico
(Kitakase et al., 1991). Desde o clássico trabalho de Drury & Szent-Györgyi em
1929, no qual as propriedades antiarrítmicas e vasodilatadoras deste
nucleosídeo foram pela primeira vez demonstradas, tem se tornado claro que a
adenosina desempenha não somente um importante papel no metabolismo
celular, mas também um importante papel fisiológico no sistema cardiovascular
(Mubagwa et al., 1996; Balas, 2002).
A formação de adenosina intracelular pode se dar por duas vias
principais que são: a clivagem da S-adenosil-homocisteína pela enzima S-
adenosil-homocisteína hidrolase, e pela degradação de AMP por ação de uma
5’-nucleotidase citosólica (Patel & Tudball, 1986). Depois de formada, a
adenosina pode passar através da membrana plasmática por difusão facilitada,
11
através de transportadores de nucleosídeos. Estes transportadores são
bidirecionais e equilibram os níveis intracelulares e extracelulares de adenosina
(Dunwiddie & Masino, 2001). Além de ser liberada como tal para o meio
extracelular, a adenosina também pode ser formada no espaço extracelular,
através da hidrólise do AMP extracelular por ação de uma ecto-5’-nucleotidase
(Zimmermann, 1992; Dunwiddie & Masino, 2001).
O coração e os vasos sangüíneos apresentam diversos mecanismos
para proteção a estímulos capazes de causar algum tipo de injúria, dentre eles
pode-se destacar o efeito da adenosina via receptores adenosinérgicos ou
receptores P1 (A
1
, A
2
, A
2B
e A
3
) (Willems et al., 2005). Em 1997, Rongen et al.
mostraram que a formação de adenosina é aumentada durante o processo de
isquemia, causando vasodilatação via ações dependentes e independentes do
endotélio, aumentando o fluxo sangüíneo e restaurando o suprimento de
oxigênio ao tecido cardíaco (Ralevic & Burnstock, 2003). Sabe-se que a
vasodilatação induzida pela adenosina é resultado da ativação dos receptores
A
2
que são expressos em praticamente todo o sistema vascular de mamíferos
(Ralevic & Burnstock, 2003). Recentes trabalhos mostram a diferença entre os
efeitos agudos da adenosina (Peart & Headrick, 2003; Flood et al., 2003) e os
efeitos de pré-condicionamento adenosinérgico (Peart & Headrick, 2003),
mostrando múltiplas vias de proteção deste nucleosídeo (Willems et al., 2005).
Os efeitos da adenosina também envolvem a atenuação pré-sináptica da
liberação de norepinefrina em terminais nervosos simpáticos em adição aos
seus efeitos pós-sinápticos (Richardt et al., 1987). A adenosina é ainda capaz
de antagonizar os efeitos inotrópicos positivos e arritmogênicos dos agonistas
β-adrenérgicos no miocárdio ventricular através da interação com receptores A
1
12
(Mubagwa et al., 1996). Em termos de alvos celulares, a adenosina parece
proteger diretamente cardiomiócitos ou tecido miocárdico (provavelmente via
receptores A
1
e A
3
) (Roscoe et al., 2000) e, além disso, protege por limitar a
inflamação em tecido miocárdico e vascular (Vinten-Johansen et al.,1999). A
adenosina também é capaz de atuar como um inibidor da agregação
plaquetária, sendo por este motivo, também conhecida como uma molécula
antitrombogênica (Kitakaze et al., 1991; Kawashima et al., 2000).
Em virtude das ações descritas até o momento, a adenosina tem tido na
clínica uma importante aplicação terapêutica no tratamento de isquemia e
outras disfunções circulatórias. No entanto, quando em altas concentrações, a
adenosina pode também levar a efeitos antagônicos, com ação pró-arrítmica,
podendo originar a pausa ou o bloqueio do nodo sino-atrial e átrio-ventricular
(Mubagwa & Flameng, 2001).
Após interagir com receptores específicos, a ação da adenosina pode
ser finalizada através da enzima ecto-adenosina deaminase (ecto-ADA), ou
ainda através de fosforilação até 5’-AMP catalisada pela enzima adenosina
cinase (ADK) (Dunwiddie & Masino, 2001; Yegutkin, 2008).
Tendo em vista a evidente participação das purinas em diferentes
processos envolvidos na funcionalidade cardiovascular normal, deve-se atentar
para o fato de que distúrbios ou prejuízos na sinalização purinérgica podem
estar relacionados ao desenvolvimento de patologias vasculares. Desta
maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal, incluindo desde as
moléculas sinalizadoras, até seus receptores e suas enzimas de degradação,
têm se mostrado um importante alvo para o tratamento de doenças
cardiovasculares (Ralevick & Burnstock, 2003; Erlinge & Burnstock, 2008).
13
1.2 A família das Ectonucleotidases
Após a liberação no meio extracelular, os nucleotídeos da adenina
exercem seus efeitos através da interação com os purinoceptores localizados na
membrana celular e posteriormente são metabolizados através da ação de ecto-
enzimas que fazem a conversão destes nucleotídeos até adenosina.
Diversos trabalhos têm demonstrado que o ATP extracelular é degradado
por um conjunto de enzimas que constituem a “via das ectonucleotidases”. Estas
enzimas apresentam tanto uma sobreposição de distribuição tecidual como
especificidades por substratos. Desta forma, os nucleosídeos di e trifosfatados
podem ser hidrolisados principalmente por membros das famílias E-NTPDase
(ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase), E-NPP (ecto-nucleotídeo
pirofosfatase/fosfodiesterase) e fosfatases alcalinas. Os nucleosídeos
monofosfatados estão sujeitos à hidrólise pela ecto-5’-nucleotidase e também
pelas fosfatases alcalinas (Zimmermann, 2001; Robson et al., 2006). Esta via
pode resultar na inativação da sinalização mediada pelo ATP via receptores P2 e
contribuir para a sinalização mediada pela adenosina, através dos receptores P1
(Richardson et al., 1987; Sebastião et al., 1999) (Figura 3). Desta forma, as
ectonucleotidases constituem um eficiente mecanismo de controle dos níveis de
nucleotídeos e nucleosídeos no espaço extracelular (Zimmermann, 1996;
Zimmermann, 2001).
14
Figura 3. Representação da maquinaria protéica envolvida na sinalização purinérgica.
Adaptado de Volonté & D’Ambrosi, 2009.
1.2.1 Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases)
As enzimas da família das E-NTPDases hidrolisam especificamente
nucleotídeos na superfície de muitos tipos celulares e a sua ação tem sido
intensamente reportada. Na literatura mais antiga, informações sobre estas
enzimas podem ser encontradas sob diferentes nomes, incluindo ecto-ATPase,
ATP difosfoidrolase, apirase, ATPDase, nucleosídeo difosfatase, etc (Plesner,
1995; Zimmermann, 1996). O nome ATP difosfoidrolase ou apirase (EC
3.6.1.5), foi primeiramente proposto por Meyerhof em 1945, como uma
designação geral para enzimas que hidrolisam todos os di- e
15
trifosfonucleosídeos até seus respectivos nucleosídeos monofosfatos e fosfato
inorgânico (Pi), liberando 2 mol de Pi por mol de nucleosídeo trifosfatado e 1
mol de Pi por nucleosídeo difosfatado. A partir de 1945, mas principalmente
nas duas últimas décadas, ATP difosfoidrolases tem sido descritas em
diferentes fontes: em tecidos vegetais (Krishnan, 1949; Valenzuela et al.,
1989), insetos (Ribeiro et al., 1989; Sarkis et al., 1996), aves (Carl & Kirley,
1997) e tecidos de mamíferos, como preparações em sistema nervoso central
(SNC) e periférico (Battastini et al., 1991; Sarkis & Saltò, 1991), aorta bovina
(Coté et al., 1992), secreções seminais (Rosenberg et al., 1988), vasos
umbilicais humanos (Yagi et al., 1992), pulmão bovino (Picher et al., 1993),
plaquetas e soro de ratos (Frasseto et al., 1993; Oses et al., 2004), plaquetas
humanas (Pilla et al., 1996), células neoplásicas humanas (Dzhandzhugazyan
et al., 1998), células de sertoli de ratos (Casali et al., 2001), linfócitos humanos
(Leal et al., 2005), glândulas submandibulares de ratos (Henz et al., 2006),
células de tumor de Walker 256 (Buffon et al., 2007), dentre outros.
Em 1994, Malisweski e colaboradores identificaram molecularmente o
primeiro membro da família E-NTPDase. Um protótipo da enzima foi clonado,
seqüenciado e identificado como um antígeno de ativação celular, CD39,
principalmente expressa em linfócitos ativados (Malisweski et al., 1994) e
inicialmente descrita como proteína marcadora de células B transformadas pelo
vírus Epstein Barr (Wang & Guidotti, 1996). Experimentos subseqüentes com
apirases solúveis e clonadas de batata (Handa & Guidotti, 1996) e de
diferentes tecidos de mamíferos (Kaczmarek et al., 1996) confirmaram a
homologia desta enzima ao CD39 humano.
16
Como características comuns, as enzimas da família das E-NTPDases
são capazes de hidrolisar nucleosídeos tri e ou difosfatos, mas não os
monofosfatos, necessitam concentrações milimolares de cátions como Ca
2+
e
Mg
2+
para atingirem a atividade máxima e são insensíveis a inibidores
específicos de ATPases do tipo P (ex. Na
+
K
+
ATPase), tipo V (ex. bomba de
prótons vacuolar) e tipo F (ex. ATPase mitocondrial) (Zimmermann et al., 1998;
Yegutkin, 2008). Além disso, após a análise das sequências de diversas ecto-
ATPDases e ecto-ATPases, foi demonstrado que estas enzimas compartilham
cinco regiões altamente conservadas chamadas de “regiões conservadas da
apirase”, ACR (ACR 1 - 5 apyrase conserved regions) (Handa & Guidotti, 1996;
Schulte et al., 1999). A existência desses sítios conservados pode estar
relacionada com a formação do sítio catalítico das enzimas e/ou com a
integridade estrutural das E-NTPDases (Grinthal & Guidotti, 2000).
Atualmente, baseado em sua estrutura e propriedades catalíticas,
particularmente na relação de hidrólise ATP/ADP, a família das NTPDases em
mamíferos está constituída de oito membros clonados e funcionalmente
caracterizados: NTPDase 1 (CD39), NTPDase 2 (CD39L1), NTPDase 3
(CD39L3, HB6), NTPDase 4 (UDPase), NTPDase 5 (CD39L4) e NTPDase 6
(CD39L2), NTPDase 7 e NTPDase 8.
Dentre os oito tipos de genes clonados e caracterizados, as NTPDases 1,
2, 3 e 8 estão localizadas na superfície celular com sítios catalíticos voltados para
o meio extracelular, as NTPDases 5 e 6 apresentam localização intracelular e
sofrem secreção depois de expressão heteróloga. Já as NTPDases 4 e 7 têm
localização totalmente intracelular com o sítio ativo voltado para o lúmem das
organelas intracelulares (Zimmermann, 2001; Robson et al., 2006) (Figura 4).
17
Figura 4: Árvore filogenética hipotética para os membros da família das NTPDases
(NTPDase 1 a 8) de rato (r), humano (h) e camundongo (m). O comprimento das linhas
indica as diferenças entre as seqüências de aminoácidos. O gráfico representa a
separação entre NTPDases localizadas na superfície (superior) e intracelular (inferior). A
preferência por substrato para cada subtipo e a topografia na membrana para cada grupo
de enzimas está também representada (um ou dois domínios transmembrana, indicados
por cilindros). Obtido de Robson et al. 2006.
Os subtipos de NTPDases, além de diferirem na localização celular,
apresentam diferentes propriedades funcionais. Enquanto todos os membros
da família catalisam a hidrólise de ambos nucleosídeos trifosfato (NTP) e
nucleosídeos difosfatos (NDP), as razões de hidrólise (NTP:NDP) variam
significativamente para essas reações, resultando em enzimas que hidrolisam
preferencialmente NTPs (NTPDase2), preferencialmente NDPs (NTPDase 5 e
6) ou ambos nucleotídeos (NTPDase 1, 3 e 8) (Zimmermann, 2001; Grinthal &
Guidotti, 2002; Robson et al., 2006) (Figura 4). Diferenças na seqüência e
também nas estruturas secundárias, terciárias e quaternárias podem estar
relacionadas às diferentes propriedades catalíticas encontradas entre os
diferentes tipos de NTPDases (Heine, 2001; Grinthal & Guidotti, 2004).
18
A NTPDase1, que apresenta a mesma preferência pela hidrólise do ATP
e do ADP (NTP/NDP 1:1), tem sido a mais estudada dos membros da família
da E-NTPDases. A NTPDase 1 tem sido extensivamente estudada em células
endoteliais e em plaquetas, possuindo um papel bem descrito na regulação do
fluxo sanguíneo e trombogênese. Essa enzima, em associação com a ecto-5’-
nucleotidase presente na superfície das células endoteliais e plaquetas, converte
o ADP, pró-agregante plaquetário, no anti-agregante adenosina, limitando a
extensão da agregação plaquetária intravascular (Frassetto et al., 1993; Pilla et
al., 1996; Kaczmarek et al., 1996; Marcus et al., 1997; Imai et al., 1999; Koziak et
al., 1999). Em concordância, NTPDase1 solúvel recombinante, é capaz de
bloquear a agregação plaquetária induzida in vitro por ADP (Gayle et al., 1998).
Estudos prévios demonstraram que ratos deficientes de CD39/ATP
difosfoidrolase apresentam problemas relacionados com hemostasia e
trombogênese (Enjyoji et al., 1999). Além disso, nos terminais nervosos
simpáticos, onde noradrenalina e ATP são co-liberados, NTPDase1 tem sido
associada à degradação do ATP até adenosina, apresentando um possível
papel na modulação da exocitose de norepinefrina, via receptores P2X ou P2Y.
A liberação excessiva de norepinefrina é a principal causa de arritmias e
disfunção vascular coronariana na isquemia miocárdica (Benedict et al., 1996;
Machida et al., 2005). Assim, formas solúveis e ligadas à membrana da
NTPDase1/CD39 são potenciais agentes terapêuticos para a inibição de
processos trombogênicos (Gayle et al., 1998) e arrítmicos (Machida et al.,
2005) e podem representar uma nova geração de moléculas cardioprotetoras
(Marcus et al., 2005).
19
Diferentemente da NTPDase 1 e dos outros dois membros relacionados,
NTPDases 3 e 8, a característica que mais distingue a NTPDase2 é a sua clara
preferência pelos nucleosídeos trifosfatados. A enzima hidrolisa os
nucleosídeos difosfatados apenas marginalmente, tendo uma preferência de
até 30 vezes pelo ATP em relação ao ADP como substrato (Kegel et al., 1997).
A NTPDase2 é particularmente associada com eventos na superfície das
adventícias de vasos da musculatura onde, em contraste à NTPDase1, pode
promover a agregação plaquetária pela presença de ADP (Sevigny et al.,
2002). A enzima também é descrita em cultura de astrócitos, células de
Schwan e outras células gliais do sistema nervoso central e periférico (Wink et
al., 2006; Langer et al., 2007). As propriedades bioquímicas e a localização
específica da NTPDase2 sugerem que a enzima possa regular funções
cardíacas como a regulação da ativação de receptores P2X ou P2Y, sendo
capaz de promover a degradação do ATP, que exerce efeitos inotrópicos e
cronotrópicos, além de poder participar da modulação da liberação de
norepinefrina (Sevigny et al., 2002, Marcus et al., 2005).
A NTPDase 3 (CD39L3) é considerada um intermediário funcional entre a
NTPDase 1 e a NTPDase 2, pois hidrolisa o ATP e o ADP em uma razão de 3:1.
Muito do conhecimento sobre a NTPDase 3 está relacionado a sua estrutura,
entretanto muito pouco é sabido a respeito do seu papel fisiológico, bem como
sua distribuição na natureza. A expressão da NTPDase3 tem sido principalmente
associada com estruturas neuronais no cérebro, onde pode agir como regulador
dos níveis de ATP na pré-sinapse, além de coordenar muitos eventos
homeostáticos (Belcher et al., 2006). A sua exata contribuição e relação com
20
NTPDase 1, 2 e 8 permanece a ser elucidada nos diversos tecidos onde há
sobreposição de suas funções.
As NTPDases 4 (UDPases), embora possuam a mesma estrutura geral
das NTPDases 1 a 3, diferem principalmente em relação à localização celular.
NTPDases 4 de humanos estão localizadas no complexo de Golgi (NTPDase
4β) ou em vacúolos lisossomais (NTPDase 4α) (Wang & Guidotti, 1998).
Ambas enzimas hidrolisam nucleosídeos di e trifosfatados, mas possuem uma
baixa preferência por ATP e ADP. Elas diferem em sua preferência por
nucleotídeos e também na dependência de cátions divalentes. A NTPDase 4α
tem alta preferência por UTP e TTP, enquanto que CTP e UDP são os
melhores substratos da NTPDase 4β.
Já as NTPDases 5 (CD39L4) e NTPDases 6 (CD39L2) encontram-se
ancoradas na membrana celular somente pela porção NH
2
terminal e possuem
uma larga região COOH terminal extracelular. Ambas enzimas são ativadas por
cátions divalentes e apresentam uma maior preferência por nucleotídeos
difosfatados. A NTPDase 5 tem maior preferência para hidrolisar principalmente
GDP e UDP, enquanto a NTPDase 6 hidrolisa preferencialmente GDP e IDP.
Acredita-se que estas enzimas sejam liberadas da membrana e então secretadas
para o meio extracelular, indicando tratar-se de enzimas na forma solúvel.
A NTPDase 5 está localizada no retículo endoplasmático, enquanto a
NTPDase 6, encontra-se no complexo de Golgi (Zimmermann, 2001). A
identificação e caracterização bioquímica da NTPDase 5 (Mulero et al., 2000) não
permitiu ainda um completo entendimento da sua função fisiológica. Devido a sua
clara preferência por nucleosídeos difosfatados, acredita-se que o seu papel
fisiológico seja reduzir os níveis circulantes do ADP e não do ATP.
21
Já a NTPDase6, embora a expressão tenha sido demonstrada em tecidos
de diversos órgãos (cérebro, fígado, rim, pulmão, placenta, músculo esquelético,
pâncreas, etc) (Chadwick & Frischauf, 1998), é consenso que a sua maior
expressão é em coração, principalmente em células do músculo cardíaco e em
células endoteliais capilares (Hicks-Berger et al., 2000; Braun et al., 2000, Yeung
et al., 2000).
As NTPDases7 e 8 preferem como substratos nucleosídeos trifosfatados.
Entretanto, a NTPDase 7 está localizada em vesículas intracelulares, enquanto
que a NTPDase 8 foi a última a ser clonada, caracterizada e descrita como
uma ecto-enzima de membrana expressa em fígado, rins e intestino de
camundongos com uma razão de hidrólise de aproximadamente 2:1
(Bigonnesse et al., 2004; Zimmermann, 2001). Recentemente, uma NTPDase
8 também foi clonada e caracterizada em fígado humano, e uma forma solúvel
desta enzima foi gerada por expressão de seu domínio extracelular em células
embrionárias de rim humano (HEK293) (Knowles & Li, 2006). A expressão
desta enzima também foi encontrada em canalículos hepáticos, sendo sugerido
um papel regulatório na secreção biliar e/ou no salvamento de nucleosídeos
(Fausther et al., 2007). Assim, os dados encontrados na literatura, até então,
sugerem um forte papel desta enzima principalmente em eventos relacionados
ao sistema hepático.
1.2.2 Ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs)
A família das E-NPPs consiste em sete membros estruturalmente
relacionados (NPP1 a NPP7) que foram numerados de acordo com a sua
ordem de descobrimento. Os membros desta família multigênica possuem uma
22
ampla especificidade de substratos e são capazes de hidrolisar ligações
pirofosfato e fosfodiester em (di) nucleotídeos, ácidos nucléicos, nucleotídeos
açúcares, assim como ésteres de fosfato de colina e lisofosfolipídeos (Stefan et
al., 2005; Yegutkin, 2008). O p-nitrofenil-5’-timidina-monofosfato (p-nitrofenil-5’-
TMP) tem sido usado como um substrato artificial, específico para as E-NPPs
(Sakura et al., 1998).
Os membros da família E-NPPs possuem uma ampla distribuição
tecidual e incluem a NPP1(PC-1), NPP2 (PD-Iα, autotaxina), NPP3 (PD-Iβ,
B10, gp130
RB13-6
), NPP4, NPP5, NPP6 e NPP7 (esfingomielinase alcalina).
Exceto para a NPP2, que é secretada no meio extracelular, todos os demais
membros são ligados à membrana por um único domínio transmembrana N-
terminal e apresentam um domínio para clivagem proteolítica, sugerindo que
possam ocorrer como enzimas solúveis (Zimmermann, 2001; Stefan et al.,
2005; Stefan et al., 2006). No entanto, somente as NPP1-NPP3, que possuem
um ancestral comum, têm sido responsabilizadas pela hidrólise de nucleotídeos
(Stefan et al., 2006).
NPP1-NPP3, sozinhas ou combinadas, têm sido expressas em vários
tipos celulares estudados (Bollen et al., 2000), apesar de isoformas individuais
estarem confinadas a subestruturas e/ou tipos celulares específicos (Narita et
al., 1994; Harahap & Goding, 1988; Johnson et al., 2001; Blass-Kampmann et
al., 1997; Goding et al., 2003). NPP1 foi originalmente descoberta na superfície
de linfócitos B de camundongo como um antígeno de diferenciação celular
plasmático (PC-1) (Takahashi et al., 1970). Em humanos é altamente expressa
em ossos e cartilagens, tendo expressão intermediária em coração, fígado,
placenta e testículos (Goding et al., 2003). Camundongos deficientes em NPP1
23
revelaram uma produção excessiva de tecido ósseo, sugerindo que esta enzima
desempenha um papel essencial no controle da mineralização óssea, pela
produção de PP
i
(Stefan et al., 2005; Stefan et al., 2006). Além disso, esta enzima
também está presente nos rins, ductos de glândulas salivares, cérebro e
epidídimo (Harahap et al., 1988; Yano et al., 1985). Stefan e colaboradores, em
1999, verificaram a presença de um híbrido NPPγ-cDna em tecidos de ratos,
que estavam principalmente presentes em fígado, rins e coração. Em muitos
estudos, a NPP1 também tem sido correlacionada com a sinalização da insulina e
na etiologia da resistência à insulina (Gijsbers et al., 2003; Goding et al., 2003;
Stefan et al., 2005).
A NPP2 foi descoberta como um fator de motilidade autócrino
(autotaxina, NPP2α) (Stracke et al., 1992) e é expressa em diversos tipos
celulares (Bollen et al., 2000; Bächner et al., 1999), o que indica que esta
enzima possui capacidades multifuncionais (Stefan et al., 2005). A NPP2 é uma
proteína secretada que se acumula em fluidos corporais, tais como plasma e
fluido cerebroespinhal. Esta enzima tem sido correlacionada com estímulo da
proliferação, contração e migração celular (Stefan et al., 2005; Stefan et al.,
2006), além de participar da formação de vasos sanguíneos e progressão do
câncer (Koike et al., 2006). Alguns estudos demonstram a expressão desta
enzima em cérebro, pulmão, duodeno e glândulas adrenais (Stefan et al., 1999) e
existem evidências para a sua presença também em coração humano (Bollen et
al., 2000).
NPP3 (gp130
RB13-6
or B10) foi inicialmente reconhecida pelo anticorpo
monoclonal RB13-6 como uma glicoproteína de células precursoras gliais de
cérebro de ratos (Deissler et al., 1995; Deissler et al., 1999). A NPP3 possui um
24
papel importante em alergias, sendo definida como um marcador de ambos
basófilos e mastócitos (Stefan et al., 2005). Foram encontrados poucos
transcritos de NPPβ (NPP3) em cérebro e glândulas adrenais de ratos, mas
abundantes em fígado, rins e coração (Stefan et al., 1999).
Muitas vezes se torna difícil a distinção entre os membros das famílias das
E-NPPs e E-NTPDases , devido sua co-expressão em tecidos de mamíferos e
por possuírem similaridades nas suas especificidades por substratos. O que se
sabe é que muitas vezes estas enzimas trabalham em conjunto ou
consecutivamente, como já foi proposto em trabalhos do nosso grupo (Fürstenau
et al., 2006; Henz et al., 2007; Cognato et al., 2008) (Figura 5).
Figura 5: E-NPPs participando da rede de metabolismo de nucleotídeos extracelulares.
A concentração de nucleotídeos no meio extracelular é resultado da liberação de
nucleotídeos a partir de células, síntese por nucleosídeos difosfocinases e adenilato
cinases e hidrólise por ectonucleotidases. Adaptado de Stefan et al., 2006.
1.2.3 Ecto- 5’-nucleotidase
25
A ecto-5’-nucleotidase (CD73) também participa do metabolismo dos
nucleotídeos da adenina, atuando em conjunto com as E-NTPDases ou E-
NPPs (Figuras 3 e 5). A ecto-5’-nucleotidase é uma enzima ancorada à
membrana plasmática por glicosil-fosfatidilinositol (GPI), que representa um
marcador de maturação para os linfócitos T e B, sendo ausente nas células
imaturas (Airas et al., 1997). O ancoramento da enzima pode ser clivado por
uma fosfolipase C específica para GPI, dando origem às formas solúveis da
enzima (Zimmermann, 1992). A ecto-5’-nucleotidase pode exercer uma ampla
variedade de funções dependendo de sua expressão tecidual e celular. Ela
encontra-se presente na maioria dos tecidos e sua principal função é a hidrólise
de nucleosídeos monofosfatados extracelulares, tais como AMP, GMP ou
UMP, a seus respectivos nucleosídeos (Sträter, 2006). Sua presença tem sido
descrita em cólon, rins, cérebro, fígado, pulmão e coração (Zimmermann, 1992;
Zimmermann, 1996; Moriwaki et al., 1999). Na vasculatura, a ecto-5’-
nucleotidase está predominantemente associada com o endotélio vascular de
grandes vasos como a aorta, carótida e artéria coronária (Koszalka et al.,
2004). O principal papel fisiológico atribuído à ecto-5’-nucleotidase, é a
formação de adenosina a partir do AMP extracelular e a subsequente ativação
dos receptores P1, que em sistema nervoso resulta principalmente na inibição
da liberação de neurotransmissores excitatórios (Brundege & Dunwidie, 1997),
enquanto que em sistema vascular, resulta em vasodilatação e na inibição da
agregação plaquetária (Kawashima et al., 2000).
26
1.3 Cafeína
1.3.1 Conceito e consumo
A cafeína (1,3,7 trimetilxantina) é um alcalóide natural que está entre as
substâncias psico-ativas mais consumidas no mundo. Existem mais de 60
espécies de plantas que fornecem a cafeína, sendo as mais conhecidas o café,
o chá, o cacau, a erva-mate e o guaraná. O café é a principal fonte de cafeína
e conforme o tipo de grão e preparo, pode fornecer de 40 a 180 mg de cafeína
por 150 mL de bebida. O chá contém de 24 a 50 mg de cafeína para cada 150
mL e bebidas a base de cola contêm aproximadamente 40 mg por 350 mL. Nas
chamadas “bebidas energéticas”, encontra-se cerca de 80 mg de cafeína por
250 mL e no chimarrão, em torno de 0,93 mg/mL (Martín et al., 2007).
O consumo mundial de cafeína é estimado em 70 a 76 mg/pessoa/dia,
sendo que nos Estados Unidos e Canadá é de 210 a 238 mg/dia e pode chegar
a mais de 400 mg/pessoa/dia em países como Suécia e Finlândia (Barone &
Roberts, 1996; Daly & Fredholm, 1998). A dose letal de cafeína está em torno
de 200 mg/Kg, o que equivale a 80-100 copos médios de café (Fredholm,
1999).
1.3.2 Metabolismo
A cafeína é completamente absorvida pelo trato gastrointestinal após 45
minutos de sua ingestão. A meia-vida varia entre as faixas etárias, na gravidez,
em combinação com alguns medicamentos e com a integridade hepática. Em
adultos saudáveis a meia-vida é de aproximadamente 3-4 horas, enquanto que
27
em ratos fica em torno de 1 hora. Em mulheres que tomam anticoncepcionais é
de 5-10 horas e naquelas em gestação, de 9-11 horas. Em recém-nascidos a
meia-vida é de 30 horas. Nos indivíduos com doença hepática, a meia-vida da
cafeína pode chegar a 96 horas (Fredholm, 1999).
Por ser uma molécula hidrofóbica a cafeína tem sua passagem facilitada
em todas as membranas biológicas, ultrapassando inclusive a barreira hemato-
encefálica (Lachance et al., 1983; Tanaka et al., 1984). Em ratos adultos, por
exemplo, a concentração de cafeína plasmática é semelhante à encontrada no
fluído cérebro-espinhal (Liu et al., 2006).
A cafeína é metabolizada principalmente no fígado pelas enzimas do
sistema citocromo P450 em dimetilxantinas, como a paraxantina, teobromina e
teofilina. Cada um destes metabólitos tem suas funções no organismo, sendo
excretados na urina após metabolizados. Nos humanos, a paraxantina é o
metabólito predominante (72 a 80 %), enquanto em roedores, apesar da
paraxantina ser o metabólito plasmático dominante, os níveis de teofilina
também estão elevados.
Geralmente, uma dosagem de 10 mg/Kg em ratos, equivale aos efeitos
de 3,5 mg/Kg nos humanos, o que corresponde de 2 a 3 copos de café
(Fredholm et al., 1999).
1.3.3 Mecanismo de ação e efeitos no sistema cardiovascular
Embora existam vários mecanismos de ação da cafeína, o único
mecanismo conhecido que é significativamente afetado por doses relevantes
de cafeína é a interação com os receptores de adenosina (A
1
e A
2A
),
antagonizando as ações deste agonista (Daly & Fredholm, 1998; Fredholm et
28
al., 1999). Portanto, a cafeína, além de inibir alguns efeitos da adenosina, é
capaz de desempenhar funções contrárias às do nucleosídeo.
Os efeitos da cafeína no sistema cardiovascular envolvem modificações
diretas da contratilidade da musculatura do coração e dos vasos sanguíneos,
assim como influência sobre a neurotransmissão central e periférica (Fredholm,
1984). Potenciais efeitos tóxicos da cafeína variam de um aumento moderado
na taxa cardíaca até mais severas arritmias cardíacas causadas por atraso na
condutividade miocárdica (Donnerstein et al., 1998; Nawrot et al., 2003).
Embora algumas evidências suportem a idéia de que a elevação da pressão
sanguínea causada pela cafeína possa contribuir para a mortalidade
relacionada aos problemas cardiovasculares (James, 2004), os dados a
respeito de variações da pressão sanguínea induzidas pelo consumo agudo de
cafeína são conflitantes (Karatzis et al., 2005). Além disso, estudos
epidemiológicos da ingestão de cafeína não têm sido hábeis a responder se é a
cafeína per se ou outros componentes do café que são responsáveis pelos
efeitos associados à doença cardiovascular (Nawrot et al., 2003).
Na cardiologia experimental, cafeína em altas concentrações (10-20
mM) tem sido amplamente utilizada em estudos com cardiomiócitos isolados
para causar rápida liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático. Em baixas
concentrações, a cafeína reduz o fluxo de Ca2+ nas células miocárdicas
(Fabiato, 1982; Kapelko et al., 1994). Esta propriedade da cafeína explica seus
efeitos inotrópicos negativos, os quais são mais pronunciados em corações
isolados de ratos (Kapelko et al., 1994). A performance cardíaca com ingestão
prolongada de cafeína tem sido muito pouco explorada e concentra-se em
efeitos durante a gravidez e lactação (Temples et al., 1987). Tendo em vista
29
essa diversidade de efeitos da cafeína sobre o sistema cardiovascular, torna-se
muito interessante a investigação de outros possíveis mecanismos de ação
dessa molécula sobre o sistema cardiovascular.
30
2. OBJETIVOS
Objetivo Geral: Identificar através de ferramentas bioquímicas e
moleculares a presença de nucleotidases em fração solúvel e microssomal de
tecido cardíaco de ratos, além de avaliar um possível envolvimento nas
alterações cardiovasculares relacionadas à cafeína.
Objetivos Específicos:
Capítulo I – Definir as propriedades cinéticas e bioquímicas da enzima
ecto-5’-nucleotidase em fração solúvel e microssomal cardíaca de ratos,
além de identificar a presença dessa enzima por imunodetecção nas duas
frações.
Capítulo II – Identificar os possíveis membros da família das E-NTPDases
solúveis e em microssomas de ventrículos cardíacos de ratos adultos por
meio da caracterização de suas propriedades bioquímicas e
imunodetecção.
Capítulo III – Investigar a presença de enzimas da família das E-NPPs em
fração solúvel e microssomal cardíaca de ratos, através da caracterização
das propriedades cinéticas e bioquímicas dessa atividade.
31
32
Anexo I – Constitui-se de dados preliminares de um manuscrito em
preparação, onde o objetivo é investigar uma possível relação entre os
efeitos que a cafeína exerce sobre o coração e as ectonucleotidases
caracterizadas em fração solúvel e microssomal de ventrículos cardíacos.
PARTE II
33
CAPÍTULO I
AMP hydrolysis in soluble and microsomal rat cardiac cell
fractions: kinetic characterization and molecular identification
of 5’-nucleotidase
Artigo publicado no periódico Bioscience Reports 28(5): 267-273, 2008
34
35
36
37
38
39
40
41
CAPÍTULO II
Kinetic and molecular analysis of NTPDase in rat cardiac
soluble and microsomal fractions
Artigo em preparação para ser submetido ao periódico Molecular and Cellular
Biochemistry
42
Kinetic and molecular analysis of NTPDase in rat cardiac soluble and
microsomal fractions
Daniela Pochmann
1,
, Adrine Maria Innocente
1
, Maria Luiza M. Barreto-Chaves
2
,
Márcia R. Wink
3
, João José Freitas Sarkis* and Lisiane O. Porciúncula
1
.
1
Laboratório de Estudos sobre o Sistema Purinérgico, Departamento de Bioquímica,
Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, RS, Brasil.
2
Departamento de Anatomia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São
Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
3
Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de Ciências da
Saúde de Porto Alegre - UFCSPA, Porto Alegre, RS, Brasil.
* in memorian
Corresponding Author:
Daniela Pochmann,
Departamento de Bioquímica,
Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Rua Ramiro Barcelos, 2600 - ANEXO, 90035-003
Porto Alegre, RS, Brasil.
FAX: +55 51 3308 5540, PHONE: + 55 51 3308 5555
e-mail: [email protected]
43
Abstract
Alterations in the adenine nucleotides levels have been implicated in diverse patho-
physiological processes of the heart. Nucleotide-metabolizing enzymes play an
important role in the regulation of nucleotide levels and consequently in their actions. In
the present study, we describe biochemical characterization of ATPase and ADPase
activities in rat cardiac soluble and microsomal fractions, under conditions where
mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked. Based on the
cation-dependence, optimum pH obtained and sensitivity to inhibitors, we can suggest
that these activities probably belong to the NTPDase family of enzymes. The apparent
K
M
values calculated for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 ± 16.7 and 57.1 ±
6.9 μM, respectively. V
max
values calculated were 71.3 ± 12.8 and 9.3 ± 1.1 nmol
Pi/min/mg protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the
K
M
values calculated for ATP and ADP were 315.2 ± 58.8 and 131 ± 30.7 μM,
respectively. V
max
values in microsomal fraction were 1180.6 ± 150 and 100.4 ± 13.2
nmol Pi/min/mg protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. In
addition, Western blot analysis revealed immunoreactivity for NTPDase5 in soluble
fraction and NTPDase2 in microsomal fraction. The presence of NTPDase activity in
cardiac soluble and microsomal fractions can contribute to the better understanding of
the purinergic signaling in the heart.
Keywords: ATP hydrolysis; ADP hydrolysis; NTPDases; soluble fraction; microsomal
fraction; heart; rat
44
Introduction
In the cardiovascular system, adenine nucleotides exert multiple physiological
and pathological roles, and are very much involved in the mechanisms underlying local
control of vessel tone as well as cell migration, proliferation, differentiation, and death
during angiogenesis, atherosclerosis and restenosis [1-4]. In the heart, adenosine
triphosphate (ATP) generally elicits positive or negative inotropic and chronotropic
effects [2,5]. Furthermore, this nucleotide has been demonstrated to modulate Ca
2+
,
Na
+
, K
+
and Cl
-
currents in cardiomyocytes and to induce acidosis, cell depolarization
and arrhythmia in the heart [5]. Other possible roles for ATP concern aspects such as
hypertrophy, preconditioning and apoptosis [2,5,6]. The extracellular effects of ATP are
mediated by interaction with cell-surface receptors called P2 receptors that are
expressed with some selectivity on different types of cells in the cardiovascular system
[1-4,6]. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle
fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have
suggested that adenine nucleotides could modulate the Ca
2+
currents of the
sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel [7-9].
The enzymatic breakdown of ATP constitutes an important modulatory
component of the purinergic signaling, since it regulates ATP actions at P2 receptors
and can evokes opposite effects by the action of the ATP degradation products,
adenosine diphosphate (ADP) and adenosine [2-4,10]. Members of several enzyme
families are capable of hydrolyzing extracellular ATP and ADP, and have also been
allocated to the cardiovascular system. These include the family of E-NTPDases (ecto-
nucleoside triphosphate diphosphohydrolases), along with the E-NPP family (ecto-
nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) and the alkaline phosphatases
[3,4,10].
E-NTPDase describes a family of enzymes that hydrolyze nucleoside tri- and
diphosphates with substantial differences in specify. Eight different members of the
NTPDase protein family that share five apyrase-conserved regions (ACRs) have been
45
identified. The individual subtypes differ in cellular location and functional properties.
Four of the NTPDases are typical cell surface-located enzymes with an extracellularly
facing catalytic site (NTPDase1,2,3,8). NTPDase5 and 6 exhibit intracellular
localization and undergo secretion after heterologous expression. NTPDase4 and 7 are
entirely intracellularly located, facing the lumen of cytoplasmic organelles. All
NTPDases require Ca
2+
and/or Mg
2+
ions in the millimolar range for maximal activity
and are inactive in their absence. The four cell surfaced-located forms
(NTPDase1,2,3,8) can be differentiated according to substrate preference, divalent
cation usage and product formation. The functional roles of these enzymes in diverse
systems are strongly related to the different physiological effects of the nucleotides and
their metabolic products [3,4,10,11].
Based on the wide distribution of NTPDases in various tissues, cells and
subcellular fragments [4,10,11], and considering the variety of effects of adenine
nucleotides in the cardiovascular system, mainly in the heart [2,3], the aim of the
present study was to characterize the kinetic and biochemical properties of NTPDase
activity in rat cardiac fractions, one soluble and other enriched in vesicles derived from
sarcoplasmic reticulum (called microsomal fraction).
Materials and Methods
Chemicals
Nucleotides, oligomycin, sodium azide, ouabain, orthovanadate,
N-ethylmaleimide (NEM), lanthanum, levamisole, suramin, Evans blue, gadolinium
chloride, Trizma Base and EDTA were obtained from Sigma-Aldrich (St Louis, MO,
USA). Bicinchoninic acid (Pierce, São Paulo, Brasil). PVDF membrane (Immobilon P,
Millipore, Bedford, MA, USA). ECL kit (Amersham, São Paulo, Brasil). All other
reagents were also of analytical grade.
46
Animals
Male Wistar rats weighing 200 - 280 g were used in this study. All animals were
housed in cages with food and water available ad libitum. They were maintained under
a 12-h light/dark cycle at a constant temperature of 23 ± 2 °C. Procedures for the care
and use of animals were adopted according to the regulations of Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), based on the Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (National Research Council).
Isolation of cardiac soluble and microsomal fractions
Rats were killed by decapitation, hearts were carefully removed and the
ventricles were isolated. The fractions were prepared as described by Floreani et al.
2003 [12], with minor modifications. Briefly, both left and right cardiac ventricles of two
animals were minced and homogenized in 1:23 (w/v) of 0.25 M sucrose-10 mM Tris
(pH 7.4), using a tissue homogenizer (Sorvall Omni-Mixer, 17105) for 3 min at setting
4. The homogenate was centrifuged for 30 min at 10,000 x g. The pellet (P1) was
discarded and the supernatant (S1) was centrifuged for 60 min at 105,000 x g. The
supernatant (S2) obtained represented the soluble fraction, whereas the pellet (P2),
resuspended in the homogenization buffer, represented the microsomal fraction.
Protein was measured by the Coomassie Blue method using bovine serum albumin as
standard [13]. Both fractions were prepared fresh daily and kept at 4 °C throughout the
process.
Measurement of ATP and ADP hydrolysis
Unless otherwise stated, ATP and ADP hydrolysis in soluble fraction were
determined in a reaction medium containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 4.0 mM
CaCl
2
and 2.0 μg/mL oligomycin in a final volume of 200 μL. For ADP hydrolysis, 1.0
mM NEM was added to the reaction medium. About 90 μg of protein were added to the
reaction medium and preincubated for 10 min at 37 °C. The reaction was started by the
47
addition of ATP or ADP to a final concentration of 2.0 mM. After 6 min of incubation for
ATP and 25 min of incubation for ADP, the reactions were stopped by the addition of
200 μL 10% trichloroacetic acid (TCA). The samples were chilled on ice and the
inorganic phosphate (Pi) released was measured according to Chan et al. 1986 [14].
In microsomal fraction, ATP and ADP hydrolysis were determined in a reaction
medium containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 4.0 mM CaCl
2
and 2.0 μg/mL
oligomycin in a final volume of 200 μL. In the reaction mixture used to determine for
ADP hydrolysis, 4.0 mM NEM was added. Microsomal protein (20 μg for ATP and 50
μg for ADP hydrolysis) was added to the reaction medium and preincubated for 10 min
at 37 °C. The reaction was started by the addition of ATP or ADP to a final
concentration of 2.0 mM. After 2 min of incubation for ATP and 10 min of incubation for
ADP, the reactions were stopped by the addition of 200 μL 10% trichloroacetic acid
(TCA). The samples were chilled on ice and the inorganic phosphate (Pi) released was
measured how described above.
For all enzyme assays, incubation times and protein concentration were chosen
in order to ensure the linearity of the reactions. All samples were run in triplicate.
Controls with the addition of the enzyme preparation after mixing with TCA were used
to correct for non-enzymatic substrate hydrolysis. Enzyme activity was expressed as
nmol of phosphate (Pi) released per minute per milligram of protein.
Inhibitor studies
In order to test the effects of classical ATPase inhibitors and P2 receptors
antagonists on ATP and ADP hydrolysis, both cardiac fractions were preincubated for
10 min in the presence or absence of 1.0 mM ouabain, 0.1 mM orthovanadate, 1.0 mM
NEM, 0.1 mM lanthanum, 1.0 mM levamisole, 0.25 mM suramin, 0.1 mM Evans blue,
2.0 μg/mL oligomycin, sodium azide (0.1, 5.0, 10 and 20 mM), gadolinium chloride (0.1,
0.2, 0.3 and 0.5 mM). Incubation times, protein and substrate concentrations were
48
used as described above. Results are expressed as percentage of control enzyme
activity.
Adenylate kinase assay
Adenylate kinase activity was determined in a reaction medium containing 50
mM Tris-HCl buffer (pH 8.0 for soluble and pH 7.5 for microsomal fraction), 4.0 mM
CaCl
2
, 10 mM glucose, 0.2 mM NADP
+
, 10 units of Hexokinase (EC 2.7.1.1), 5 units of
glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.149) and 90 µg of soluble protein or 50
µg of microsomal protein. Reaction was started by the addition of 1.0 mM ATP or 2.0
mM ADP and the final volume was 1.0 mL. In some experiments 1.0 mM NEM was
also present. Reduction of NADP
+
was monitored spectrophotometrically at 340 nm
[15].
Antibodies
The following rabbit polyclonal antibodies were used to identify the E-NTPDase
family members in rat cardiac soluble and microsomal fractions: antibody C10F, raised
against mouse NTPDase1 [16]; BZ3-4F, raised against rat NTPDase2 [17-19]; KHL 7,
anti-peptide antibodies against the rat/mouse NTPDase3 C-terminal sequence [20].
Anti-human NTPDase5 and NTPDase6 were generated by immunization of rabbits with
synthetic peptides corresponding to amino acids 109-122 [21] and PEP002A [22],
respectively, obtained from published sequences of the N-terminal region of these
NTPDases.
Western blot
Soluble and microsomal fractions prepared as described were dissolved in the
following buffer (100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM sodium orthovanadate, 100 mM
sodium fluoride, 0.5 ug/ml aprotinin, 1 ug/ml leupeptin and 1 mM phenylmethylsulfonyl
49
fluoride, 20 mM Tris, pH 7.5). Protein content was determined by using Bicinchoninic
acid assay using bovine serum albumin (BSA) as standard. SDS–polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) was performed loading a total of 80 ug of protein on a 4–
10% polyacrylamide gel (40 ul/well) under non-reducing conditions followed by transfer
to nitrocellulose membrane by electroblotting. After blocking with 5% milk in Tris–saline
buffer containing 0.05% Tween 20, membranes were probed with an appropriate
primary antibody (NTPDases 1,2,3,5 and 6 diluted 1:1000) overnight, at 4 °C and
visualized using horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (diluted
1:3000), followed by enhanced chemiluminescence assay with ECL kit.
Results
Determining time course and optimal protein concentration
We first investigate ATP and ADP hydrolysis in rat cardiac soluble and
microsomal fractions as a function of time and protein concentration in order to
determine the best assay conditions. The fractions were incubated as described in
Material and Methods. The results indicated that the time course of ATP and ADP
hydrolysis for soluble fraction was linear up to 10 min and up to 35 min, respectively
(Fig. 1A). In microsomal fraction, the time course was linear up to 3 min for ATP and up
to 15 min for ADP (Fig. 1C). In order to ensure that the incubation time was within the
linearity of the reaction, we choose 6 min and 25 min (ATP and ADP, respectively) as
the assay times for soluble fraction, and 2 min and 10 min (ATP and ADP, respectively)
as the assay times for microsomal fraction in the subsequent experiments.
Concerning to protein concentration, the results demonstrated that ATP and
ADP hydrolysis were linear up to 110 μg for soluble and up to 70 μg for microsomal
fraction (Fig. 1B and 1D, respectively). Thus, in the subsequent experiments, we used
90 μg protein of soluble fraction for both substrates, and 20 μg protein of microsomal
fraction for ATP and 50 μg protein for ADP hydrolysis.
50
Cation dependence
To further optimize assay conditions, we evaluated ATP and ADP hydrolysis in
the absence or presence of divalent cations added, or EDTA. As shown in Fig. 2A and
2B, in the presence of 0.25 mM EDTA, ATP and ADP hydrolysis were practically
negligible when compared with respective controls (without the addition of divalent
cations) in the soluble fraction. In the microsomal fraction (Fig. 2C and 2D), ATP and
ADP hydrolysis founded in the control group were completely removed by the addition
of 0.25 mM EDTA. On the other hand, the hydrolysis of the two nucleotides in both
fractions was increased by the presence of different concentrations of Ca
2+
or Mg
2+
.
These data clearly indicate the cation dependence for both enzyme activities.
In both fractions, some differences were observed in enzymatic activation by
different cations at different concentrations tested. ATP and ADP hydrolysis were more
activated by Mg
2+
compared to Ca
2+
, in some concentrations. Despite these
differences, in the subsequent experiments we used a final concentration of 4.0 mM
CaCl
2
for ATP and ADP hydrolysis in both fractions.
Effect of pH
The optimum pH values for ATP and ADP hydrolysis were determined in a
medium containing a mixture of 50 mM Tris and 50 mM HEPES buffer (pH varying from
6.0 to 9.0). Using ATP as substrate, the pH curves showed the highest activity at pH
8.0-8.5 and pH 7.5-8.5 for soluble and microsomal fractions, respectively (Fig. 3A and
3C). For ADP hydrolysis, the same pattern was observed in both fractions and the
maximal rate of hydrolysis was observed at pH 7.5 (Fig. 3B and 3D). For the
subsequent experiments, the pH 8.0 was chosen for the hydrolysis of ATP and ADP in
soluble fraction and the pH 7.5 was used for the measurement of the hydrolysis of both
substrates in microsomal fraction.
51
Kinetic constants
ATP and ADP hydrolysis in cardiac soluble and microsomal fractions were
determined at different substrate concentrations ranging from 75 to 2000 μM (Fig. 4).
The results (insets in Fig. 4) indicated that enzyme activities increased with increasing
concentrations of nucleotides. Michaelis constant (K
M
) and V
max
values were estimated
from the Eadie-Hofstee plot. The apparent K
M
calculated from this plot for ATP and
ADP in soluble fraction were 131.2 ± 16.7 and 57.1 ± 6.9 μM, respectively. V
max
values
calculated were 71.3 ± 12.8 and 9.3 ± 1.1 nmol Pi/min/mg protein for ATP and ADP,
respectively (Fig. 4A and 4B). In the microsomal fraction, the K
M
calculated for ATP and
ADP were 315.2 ± 58.8 and 131 ± 30.7 μM, respectively. V
max
values in microsomal
fraction were 1180.6 ± 150 and 100.4 ± 13.2 nmol Pi/min/mg protein for ATP and ADP,
respectively (Fig 4C and 4D).
Effect of inhibitors on ATP and ADP hydrolysis
In order to evaluate the sensivity of the enzymatic activities for ATP and ADP
hydrolysis or the presence of different nucleotide-metabolizing enzymes in the soluble
and microsomal fractions, we have tested the effects of distinct compounds that were
reported to affect nucleotide hydrolysis. Table 1 summarizes effects of the some ATP
and ADP hydrolysis inhibitors in both fractions.
Ouabain, a specific Na
+
/K
+
-ATPase inhibitor [23]; orthovanadate, an inhibitor of
transport ATPases, acid phosphatases, alkaline phosphatases, phosphotyrosine
phosphatases and Na
+
/K
+
-ATPase [24,25]; levamisole, a specific alkaline phosphatase
inhibitor [26]; and lanthanum, the Ca
2+
, Mg
2+
-ATPase inhibitor [27], did not affected the
ATP and ADP hydrolysis in both fractions, excluding these enzymes as a
contaminants. NEM, another Ca
2+
, Mg
2+
-ATPase inhibitor and also adenylate kinase
inhibitor [28,29] did not alter ATP hydrolysis in both fractions, but decreased ADP
hydrolysis by 65% and 22% in soluble and microsomal fractions, respectively,
suggesting the presence of adenylate kinase activity in both preparations. The
52
presence of adenylate kinase in both fractions was confirmed with a protocol that uses
a coupled reaction able to detect any ATP formation when the reaction starts with ADP
(data not shown). To exclude the influence of this enzyme in our assay, all incubations
with ADP as substrate were performed in the presence of NEM. Based on inhibition
curves (data not shown), we choose to use 1.0 mM and 4.0 mM of NEM for the assay
of soluble and microsomal fractions, respectively.
The mitochondrial ATPase inhibitor, oligomycin [30], inhibited ATP and ADP
hydrolysis in soluble fraction by 41% and 39%, respectively. In microsomal fraction, this
inhibitor significantly decreased only ATP hydrolysis by 33%. Oligomycin was then
added from a concentrated ethanol solution resulting in a final concentration of 1%
ethanol in the incubation medium. The addition of ethanol alone did not arrest the
enzyme activities in the absence of inhibitor (data not shown). Sodium azide, another
mitochondrial ATPase inhibitor at low concentrations and a NTPDase inhibitor at high
concentrations [31,32], showed a different profile of inhibition in each preparation
studied. In soluble fraction, sodium azide inhibited ATP and ADP hydrolysis in all
concentrations used. With respect to microsomal fraction, our results showed that
sodium azide tested at low concentration (0.1 mM) did not altered ATP and ADP
hydrolysis. On the other hand, high concentrations of this inhibitor (5.0, 10 and 20 mM)
decreased ATP hydrolysis (26%, 34% and 39%, respectively) and ADP hydrolysis
(36%, 47% and 61%, respectively). To exclude the participation of mitochondrial
ATPase in our assays, all incubations using ATP and ADP as substrates were
performed in the presence of 2.0 μg/mL oligomycin.
Gadolinium chloride has been demonstrated to inhibit E-NTPDases from
several sources [33-36]. Our results showed that this compound tested at different
concentrations had no effect on ATP and ADP hydrolysis in the soluble fraction. On the
other hand, gadolinium chloride in the final concentration of 0.2, 0.3 and 0.5 mM
inhibited ATP hydrolysis (21%, 21% and 30%, respectively) and ADP hydrolysis (29%,
23% and 41%, respectively) in the microsomal fraction. The antagonists of P2
53
receptors, suramin and evans blue, that have been used as ectonucleotidases
inhibitors [34,36,37], caused inhibition on ATP and ADP hydrolysis in both soluble and
microsomal fractions. Suramin inhibited ATP and ADP hydrolysis by 90% and 84%,
respectively in the soluble fraction; in the microsomal fraction this inhibition was 87%
for ATP and 44% for ADP hydrolysis. Evans blue inhibited ATP and ADP hydrolysis by
89% and 92%, respectively in the soluble fraction, and, in the microsomal fraction, this
compound practically abolished the ATP and ADP hydrolysis (98% and 99% of
inhibition, respectively).
Western blot analysis
To identify the NTPDase family members presented in cardiac soluble and
microsomal fractions we performed Western blot analysis of the samples under non-
reducing conditions. The antibodies against NTPDase1,2,3,5 and 6 were tested and
revealed immunoreactivity only for NTPDase5 in soluble fraction and in microsomal
fraction only NTPDase2 was detected (Fig. 5). The other antibodies tested not revealed
immunoreactivity.
Discussion
NTPDase family has become the subject of intensive research within the past
decade mainly because the important role of these enzymes on the modulation of the
purinergic signaling. Members of this family have been identified under physiological
and pathological conditions in many cells and tissues, including the heart. Furthermore,
their use for therapeutic purposes have been suggested [4,11,38,39]. In this paper we
present the kinetic and biochemical analysis of ATP and ADP hydrolysis in rat cardiac
soluble and microsomal fractions under conditions where mitochondrial ATPase and
adenylate kinase were blocked. The results presented here support our proposal that
these activities correspond to enzymes belonging to the NTPDase family.
54
Firstly, the involvement of NTPDase activity in the hydrolysis of ATP and ADP in
soluble and microsomal fractions was evidenced by the cation dependence, since there
was a decrease of both hydrolysis in the presence of EDTA [4,10,11,27,28,32,33]. In
addition, high activity in the presence of both Ca
2+
and Mg
2+
that are known by
optimizing assay conditions for NTPDase activity, was observed [4,10,11,35,36,40,41].
In some concentrations tested, Mg
2+
was more effective than Ca
2+
in activating ATP
and ADP hydrolysis. However, we choose to use CaCl
2
in all experiments in order to
exclude the significant interference of Mg
2+
-dependent enzymes, such as adenylate
kinase and Na
+
/ K
+
- ATPase [40]. Besides, using a buffering system, the best enzyme
activity for ATP and ADP hydrolysis in both fractions was reached between pH 7.5 and
8.5. These pH values are in accordance with those previously described for NTPDases
[35,36,40,41].
The exclusion of some enzymatic associations was performed using different
enzyme inhibitors such as ouabain, orthovanadate, lanthanum and levamisole, which
did not affected ATP or ADP hydrolysis in both fractions. The contribution of
mitochondrial ATPase for ATP hydrolysis was verified with the use of oligomycin, which
inhibited the hydrolysis of this substrate in soluble and microsomal fractions. However,
oligomycin also decreased ADP hydrolysis in the two fractions indicating a possible
enzymatic combination between mitochondrial ATPase and adenylate kinase that could
mimic NTPDase activity. The possibility that ADP hydrolysis occurs by prior conversion
to ATP, catalyzed by adenylate kinase and later hydrolysis by mitochondrial ATPase
was investigate with the use of two criteria. The first was the evaluation of the rate of
ADP hydrolysis in the absence and in the presence of an adenylate kinase inhibitor
(NEM) [29]. The second criteria consisted of a protocol that was previously used by us
and by others to detect any ATP formation when the reaction starts with ADP
[15,23,27]. Both procedures indicated the presence of adenylate kinase in soluble and
microsomal fractions. To exclude this enzymatic association (mitochondrial ATPase
55
plus adenylate kinase) and to ensure that ATP and ADP hydrolysis were carried out by
an NTPDase, we always added oligomycin and NEM in the reaction medium.
Interestingly, sodium azide, another compound known to inhibit mitochondrial
ATPase at 0.1 mM [31], also decreased ATP and ADP hydrolysis in the soluble
fraction, suggesting the occurrence of the same enzymatic combination between
mitochondrial ATPase and adenylate kinase described above. On the other hand, in
the microsomal fraction 0.1 mM of sodium azide did not alter the hydrolysis of ATP or
ADP. Although sodium azide inhibits mitochondrial ATPase as oligomycin, its
mechanism of action is distinct and may promote different effects according to the
sample. In fact, it was observed that both inhibitors had different effects in the
mitochondrial ATPase activity, in which sodium azide decreased ATP hydrolysis
whereas oligomycin did not affect the hydrolysis of this substrate in digestive gland of
Helix aspersa [42]. When we tested sodium azide at concentrations able to inhibit
NTPDase activity, a parallel inhibition of ATP and ADP hydrolysis both in the soluble
and in the microsomal fractions occurred. Similar effects were obtained by other
studies that reported a significant inhibition of NTPDase activity from several sources at
high concentrations of sodium azide [34-36,41]. In agreement with previous reports, the
most potent inhibition of the hydrolysis of ATP and ADP was found when testing the
antagonists of P2 receptors, suramin and evans blue [34,36].
Although the mode of action of gadolinium chloride remains unclear, this
compound has been described as a potent inhibitor for both membrane-bound [34-36]
and soluble forms of NTPDases [33]. In this study, we demonstrate that gadolinium
chloride did not affect ATP and ADP hydrolysis in soluble fraction but it was capable of
inhibits the hydrolysis of both substrates in the microsomal fraction. This different
pattern of inhibition by gadolinium chloride suggests that this compound did not seem
to be a specific inhibitor of NTPDase activity.
With respect to the kinetic properties, our results demonstrate that K
M
values
calculated from the Eadie-Hofstee plot with ATP and ADP as substrates were in the
56
micromolar range for both fractions, which is in accordance with the literature about
NTPDases. In relation to V
max
, the ratio of ATP/ADP hydrolysis was about 8 in the
soluble and about 12 in the microsomal fraction, suggesting a preferential ATPase
activity in both fractions.
The presence of enzymes with ATPase activity in cardiac tissue has been
demonstrated by immunohistochemical and biochemical analysis of murine, porcine
and human hearts [17,43-45]. In addition, a significant mRNA expression of Entpd2 in
murine and human hearts, suggest that this enzyme would be a likely candidate
responsible for such activity [36,46-48]. However, the activity of other members of the
NTPDase family can not be excluded in the cardiac tissue. NTPDase1 have been
demonstrate by immunohistochemistry and Western blot analysis of human heart [49].
In addition, the mRNA expression of Entpd3 in rat cardiomyocytes suggests another
potential enzyme that could modulate extracellular nucleotide levels in the heart [48].
Recently, our group identified by RT-PCR the mRNA expression of Entpd1,2,3,5 and 6
in rat heart left ventricle [36]. Interestingly, Western blot analysis for NTPDase (1, 2, 3,
5 and 6) of soluble fraction, under non-reducing condition, revealed only
immunodetection of NTPDase5. This result is in agreement with previous reports that
described the secretion of this intracellular protein to the soluble medium, forming a
soluble NTPDase [10]
. On the other hand, NTPDase5 isoform is described to
hydrolyze preferentially diphosphate nucleotides [10], which was different from our
kinetic analysis where this enzyme hydrolyzed triphosphate nucleotides preferentially.
Based on these results, we could suppose that were changes on the conformation of
NTPDase5 protein after its secretion to the extracellular medium, and this could be
responsible for the preference for triphosphate nucleotides. In the microsomal fraction,
only NTPDase2 could be detected, corroborating with the hydrolysis ratio found in our
kinetic analysis.
Soluble nucleotidases have been detected in serum or plasma of humans and
other species [50-53]; however, the origin of these enzymes is poorly understood and
57
generally is attributed to their release after different cellular stimulus [24,54-56]. Up to
the present moment, the physiological role of soluble nucleotidases is not clear, but
recent studies have considered the administration of these enzymes for antiplatelet
therapy under experimental prothrombotic conditions [57-59]. In our study, the
homogenization of the cardiac tissue disrupts cell membrane and probably releases
diverse NTPDases isoforms to the soluble medium. Nevertheless, the presence of a
“true” soluble enzyme can not be discarded. As well as in other tissues, soluble
NTPDases could represent an important auxiliary effector system for local inactivation
of acutely elevated nucleotides, especially at sites of injury and inflammation in the
heart. However, further studies are required to understand the pertinence of these
activities.
The presence of NTPDase activity hydrolyzing adenine nucleotides has been
described in microsomes of various tissues [60-62] and probably may have other
important roles beyond that well established. The microsomal fraction is enriched by
vesicles derived from sarcoplasmic reticulum, that is the major intracellular organelle
that sequesters and releases Ca
2+
,
regulating relaxation and tension development by
the myocardium [7,8]. High intracellular Ca
2+
concentrations trigger a rapidly pumped of
the ion into the sarcoplasmic reticulum by a Ca
2+
-ATPase, while depolarization of the
surface membrane open Ca
2+
channels of the reticulum releasing Ca
2+
to the cytosol.
Evidences suggest that abnormal release of Ca
2+
from these channels has been
associated with certain pathological states, including arrhythmias and heart failure
[63,64]. Previous studies have demonstrated that adenine nucleotides, adenosine and
caffeine (an adenosine receptor antagonist) affect differently Ca
2+
release from
sarcoplasmic reticulum both in skeletal muscle and in cardiac fibers [7-9,65-66]. The
modulation of these effects can occur indirectly through signaling at cell surface purine
receptors [64,67]; however, direct activation of the Ca
2+
channel have been observed in
studies with isolated channels or sarcoplasmic reticulum vesicles (microsomes) [7,8].
Additional evidence about the influence of purinergic signaling on Ca
2+
release from
58
sarcoplasmic reticulum can be visualized in a recent report in which adenosine was
described to modulate Ca
2+
release through binding at A
2A
receptors in the
sarcoplasmic reticulum [68]. Supported by the results discussed above, we are capable
of suggest that NTPDase activity founded in microsomal fraction could modulate Ca
2+
release from sarcoplasmic reticulum and consequently could modulate the cardiac
excitation-contraction coupling process.
In summary, the great variety of actions of adenine nucleotides on the
cardiovascular system emphasizes the importance of the study of the enzymes that
modulate their levels. Our results demonstrate ATP and ADP hydrolysis in rat cardiac
soluble and microsomal fractions. Based on the cation-dependence, optimum pH
obtained and sensitivity to inhibitors, we can suggest that these activities probably
correspond to NTPDase enzymes. The presence of NTPDase activity in the soluble
fraction can contribute to the better understanding of the extracellular purinergic
signaling in the heart. In addition, the characterization of NTPDase activity in the
cardiac sarcoplasmic reticulum can add new information about the intracellular role of
these enzymes.
Aknowledgements
This work was supported by grants and fellowship from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
59
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66
Table
Table 1: Effect of distinct compounds on ATPase and ADPase activities from rat cardiac soluble and
microsomal fractions
Compounds
Concentration
(mM)
% of control enzyme activity
Soluble Microsomal
ATP ADP ATP ADP
Ouabain 1.0 92.7 ± 21.5 92.9 ± 11.8 104.7 ± 4.1 94.4 ± 8.3
Orthovanadate 0.1 88.9 ± 11.0 83.1 ± 8.7 102.4 ± 2.2 95.5 ± 10.7
NEM 1.0 96.6 ± 13.9 35.1 ± 10.1*** 95.8 ± 6.9 77.6 ± 9.3*
Lanthanum 0.1 93.3 ± 16.2 98.7 ± 5.1 98.6 ± 8.2 90.6 ± 10.6
Levamisole 1.0 91.6 ± 14.6 83.2 ± 6.8 95.6 ± 4.7 97.0 ± 13.1
Suramin 0.25 9.7 ± 1.9*** 15.7 ± 8.9*** 13.3 ± 2.5*** 56.1 ± 10.8***
Evans blue 0.1 10.4 ± 4.4*** 8.1 ± 3.9*** 2.3 ± 0.5*** 0.7 ± 0.25***
Oligomicyn 2 µg/mL 58.9 ± 5.5* 61.2 ± 1.5* 67.1 ± 10.2*** 82.5 ± 8.8
Sodium azide 0.1 62.3 ± 1.9* 71.1 ± 5.8** 91.8 ± 6.7 90.9 ± 9.9
5.0 39.6 ± 3.6*** 47.5 ± 6.0*** 74.1 ± 0.9*** 64.0 ± 10.1***
10 35.8 ± 3.7*** 45.2 ± 5.9*** 66.0 ± 1.5*** 52.7 ± 4.4***
20 30.9 ± 3.4*** 37.2 ± 10.6*** 61.0 ± 3.5*** 38.5 ± 5.7***
Gadolinium chloride 0.1 96.9 ± 19.7 100.7 ± 3.1 85.1 ± 8.4 79.3 ± 11.5
0.2 89.9 ± 17.3 100.6 ± 4.4 79.1 ± 7.6* 70.8 ± 7.2**
0.3 82.9 ± 17.3 102.1 ± 3.1 78.6 ± 8.1** 76.8 ± 6.3*
0.5 85.9 ± 7.3 103.5 ± 8.3 70.0 ± 4.0*** 59.1 ± 9.6***
ATPase and ADPase activities were assayed as described in Material and Methods and are expressed as
percentage of the respective control activity. Results are expressed as mean ± S.D. of three independent
experiments. Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey-HSD test.
Difference from control enzyme activity (100%): * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001.
The 100% values correspond to 90.8 ± 9.3 and 18.1 ± 2.4 nmol Pi/min/mg protein for ATP and ADP
hydrolysis, respectively in the soluble fraction; 2392.5 ± 92.1 and 239.9 ± 23.5 nmol Pi/min/mg protein for
ATP and ADP hydrolysis, respectively in the microsomal fraction.
67
Figure Legends
Figure 1: Time course and protein concentration curves for ATP and ADP hydrolysis.
Time course in soluble fraction was performed with 90 µg of protein for both
nucleotides; in microsomal fraction were used 20 µg of protein for ATP and 50 µg of
protein for ADP. In relation to protein concentration curves were used 6 min and 25 min
for ATP and ADP hydrolysis in soluble fraction, respectively. In microsomal fraction,
protein curves were performed for 2 min to ATP and 10 min to ADP hydrolysis. The
plots are representative of three independent experiments for each nucleotide and
fraction.
Figure 2: Divalent cations dependence on ATP and ADP hydrolysis. Hydrolysis of ATP
and ADP by rat cardiac soluble (A and B, respectively) and microsomal (C and D,
respectively) fractions were analyzed in the absence of cations (Control), in the
presence of 0.25 mM EDTA and in the presence of 1.0-6.0 mM Ca
2+
or Mg
2+
. Bars
represent means ± S.D. of four independent experiments. Results are expressed as
nmol Pi/min/mg of protein.
Figure 3: Effect of pH variation on ATP and ADP hydrolysis from rat cardiac soluble (A
and B, respectively) and microsomal (C and D, respectively) fractions. Enzyme
activities were determined using a mixture of 50 mM Tris and 50 mM HEPES (pH
range 6.0 to 9.0). Data represent means ± S.D. of three different experiments. Results
are expressed as nmol Pi/min/mg of protein.
Figure 4: Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP hydrolysis in rat cardiac soluble (A and
B, respectively) and microsomal (C and D, respectively) fractions. The substrate
concentrations tested ranged from 75 to 2000 µM (insets). The K
M
and V
max
values
calculated for ATP and ADP hydrolysis in the soluble fraction were 131.2 ± 16.7 μM
and 71.3 ± 12.8 nmol Pi/min/mg protein (mean ± S.D., n=6), and 57.1 ± 6.9 μM and 9.3
68
± 1.1 nmol Pi/min/mg protein (mean ± S.D., n=4), respectively. In the microsomal
fraction, the K
M
and V
max
values calculated for ATP and ADP hydrolysis were 315.2 ±
58.8 μM and 1180.6 ± 150 nmol Pi/min/mg protein (mean ± S.D., n=5), and 131 ± 30.7
μM and 100.4 ± 13.2 nmol Pi/min/mg protein (mean ± S.D., n=4), respectively. Data
represents a typical experiment.
Figure 5: Representative Western blot analysis of NTPDases family members by
cardiac soluble (SF) and microsomal fraction (MF) prepared under non-reducing
conditions. Immunodetection demonstrate the presence of NTPDase5 in soluble
fraction and NTPDase2 in microsomal fraction. Positions of molecular size markers are
shown in kDa.
69
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
5
10
15
20
A
Time (min)
nmol Pi
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
C
Time (min)
nmol Pi
0 20 40 60 80 100 120
0
10
20
30
40
B
Protein (μg)
nmol Pi
0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
100
D
Protein (μg)
nmol Pi
Soluble Fraction
Microsomal Fraction
Fig. 1
70
1.0 2.0 4.0 6.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Ca
2+
Mg
2+
Cation
(mM)
EDT A
(mM)
Control
0.25
nmol Pi/min/mg protein
1.0 2.0 4.0 6.0
0
500
1000
1500
2000
Ca
2+
Mg
2+
Cation
(mM)
EDT A
(mM)
Control
0.25
nmol Pi/min/mg protein
1.0 2.0 4.0 6.0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Ca
2+
Mg
2+
Cation
(mM)
EDT A
(mM)
Control
0.25
nmol Pi/min/mg protein
1.0 2.0 4.0 6.0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Ca
2+
Mg
2+
Cation
(mM)
EDT A
(mM)
Control
0.25
nmol Pi/min/mg protein
Fig. 2
A
B
C
D
Soluble Fraction
Microsomal Fraction
ATP hydrolysis
ADP hydrolysis
71
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
0
10
20
30
40
50
60
pH
nmol Pi/min/mg protein
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
0
300
600
900
1200
1500
1800
pH
nmol Pi/min/mg protein
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
0
2
4
6
8
10
12
14
pH
nmol Pi/min/mg protein
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
0
30
60
90
120
150
180
pH
nmol Pi/min/mg protein
Fig. 3
A
B
C
D
Soluble Fraction
Microsomal Fraction
ATP hydrolysis
ADP hydrolysis
72
0 500 1000 1500 2000 2500
0
10
20
30
40
50
[ATP] μM
nmol Pi/min/mg protein
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
0
10
20
30
40
50
60
(nmol Pi/min/mgprotein)/[ATP] μM
nmol Pi/min/mg protein
A
0 500 1000 1500 2000 2500
0
2
4
6
8
10
[ADP] μM
nmol Pi/min/mg protein
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
0
2
4
6
8
10
(nmol Pi/min/mg protein)/[ADP] μM
nmol Pi/min/mg protein
B
0 1 2 3 4
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
(nmol Pi/min/mg protein)/[ATP] μM
nmol Pi/min/mg protein
0 500 1000 1500 2000 2500
0
200
400
600
800
1000
1200
[ATP] μM
nmol Pi/min/mg protein
C
0 500 1000 1500 2000 2500
0
25
50
75
100
[ADP] μM
nmol Pi/min/mg protein
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0
25
50
75
100
(nmol Pi/min/mg protein)/[ADP] μM
nmol Pi/min/mg protein
D
Fig. 4
73
Fig. 5
75 kDa
SF SF MF MF
75 kDa
50 kDa
NTPDase 5 NTPDase 2
50 kDa
74
Capítulo III
Biochemical characterization of an ecto-nucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP, E.C. 3.1.4.1) from
rat cardiac soluble and microsomal fractions
Artigo em preparação
75
Biochemical characterization of an ecto-nucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP, E.C. 3.1.4.1) from rat
cardiac soluble and microsomal fractions
Daniela Pochmann
1,
, Andréia Buffon
2
, Adrine Maria Innocente
1
and Lisiane de
Oliveira Porciúncula
1
1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2
Departamento de Análises, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
Corresponding Author:
Daniela Pochmann,
Departamento de Bioquímica,
Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Rua Ramiro Barcelos, 2600 - ANEXO, 90035-003
Porto Alegre, RS, Brasil.
FAX: +55 51 3308 5540, PHONE: + 55 51 3308 5555
e-mail: [email protected]
76
Abstract
In the present study we reported the kinetic and biochemical characterization of NPP
activity in rat cardiac fractions, one soluble and other enriched in vesicles derived from
sarcoplasmic reticulum (called microsomal fraction). The fractions demonstrated ecto-
nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) activities, which could be
observed by extracellular hydrolysis of p-Nph-5’-TMP and other biochemical
characteristics such as dependence of metal ions and inactivation by a metal ion
chelator. The K
M
value for the hydrolysis of p-Nph-5’-TMP in soluble and microsomal
fraction, were 118.53 ± 27.28 uM and 91.92 ± 12.49 uM, respectively (mean ± S.D., n =
7). The V
max
values calculated were 2.52 ± 0.15 and 113.87 ± 21.09 nmol p-
nitrophenol/min/mg in soluble and microsomal fraction, respectively (mean ± S.D., n =
7). Between the different compounds tested to evaluate the activity of other enzymes
on p-Nph-5’-TMP hydrolysis, only suramin (0.25 mM) was capable to produce a
significative inhibition of substrate hydrolysis. Thus, our results strongly suggest the
presence of E-NPP enzymes in rat heart. These activities could contribute with the
modulation of nucleotide levels that are describe to be involve in several physiological
and pathological processes in heart.
Keywords: NPPs; adenine nucleotides; microsomes; rat heart
77
Introduction
Extracellular nucleotides can be hydrolyzed by a variety of enzymes that are
located on the cell surface or may also be soluble in the interstitial medium or within
body fluids (Zimmermann, 2001). These enzymatic activities can regulate the
extracellular concentration of these nucleotides and nucleosides modulating their local
effects. In heart, the nucleotides ATP, ADP, AMP and the nucleoside adenosine are
known to regulate several activities, including vascular tone, cardiac function and
haemostasis (Burnstock, 1990; Kunapuli and Daniel, 1998; Ralevic and Burnstock,
2003). These effects generally occur by interaction with cell-surface receptors called
purinoceptors; however, beyond these extracellular actions, some evidences with
permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called
microsomes) have suggested that adenine nucleotides and adenosine could exerce
intracellular effects (Meissner, 1984; Meissner and Henderson, 1987; Duke and Steele,
1998).
Members of several enzyme families are capable of hydrolyzing extracellular
ATP and other nucleotides, and have also been allocated to the cardiovascular system.
These include the family of E-NTPDases (ecto-nucleoside triphosphate
diphosphohydrolases), along with the E-NPP family (ecto-nucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase), alkaline phosphatases and ecto-5’-nucleotidase
(Zimmermann, 2001; Burnstock, 2006; Yegutkin, 2008).
The family of E-NPPs consists of seven structurally related enzymes that are
located at the cell surface, either expressed as transmembrane proteins or as secreted
enzymes (Stefan et al., 2005). In addition, NPP members have been localized in
different cellular compartments suggesting specific physiological functions (Goding et
al., 2003). Three of the seven members of the NPP family, namely NPP1-3, are known
to hydrolyze nucleotides and have been detected in almost all tissues. The enzymatic
action of NPP1-3 (in)directly results in the termination of nucleotide signaling, the
salvage of nucleotides and/or the generation of new messengers like ADP, adenosine
78
or pyrophosphate (Stefan et al., 2006). Recently, our group described the biochemical
characteristics of this enzyme activity in synaptosomes from rat heart left ventricle and
identified the enzyme expression, of the E-NPP family members in cardiac tissue
(Rücker et al., 2007). In this work the co-expression of NPPs and NTPDases in cardiac
synaptosomes was suggested as a multiple system for extracellular hydrolysis control.
Catalysis by NPPs affects processes as cell proliferation and motility,
angiogenesis, bone mineralization and digestion. The NPPs are also implicated in the
pathophysiology of cancer, insulin resistance and calcification diseases (Stefan et al.,
2005). The NPP1 and NPP3 are type II transmembrane glycoproteins comprising two
identical disulfide-bounded subunits. Mutations in NPP1 gene have been associated
with generalized arterial calcification in infancy, ossification of the posterior longitudinal
ligament of the spine, and insulin resistance (Ruf et al., 2005; Terkeltaub, 2006). NPP3
(gp130
RB13-6
) was initially recognized by the monoclonal antibody RB13-6 as a 130-kD
glycoprotein, on a specific subset of rat brain glial precursor cells (Deissler et al., 1995;
Deissler et al., 1999). NPP2 (autotaxin, PD-1a) is synthesized as a pro-enzyme and
further processed to be a secretory molecule. This enzyme exert a variety of
biologically significant effects in cell growth, differentiation, adhesion, and migration,
translated into functional effects in angiogenesis, tumor metastasis, and embryonic
development (Stefan et al., 2005).
Considering that adenine nucleotides and adenosine regulate a variety of intra-
and extracellular physiological responses in the cardiovascular system, investigations
about the enzymes responsible by its concentrations are very important. Furthermore,
data concerning the possible roles of NPPs on purinergic signaling of the heart are
limited and are focused on the extracellular actions. Thus, in the present study, we
have demonstrate NPP activity in rat cardiac fractions, one soluble and other enriched
in vesicles derived from sarcoplasmic reticulum (called microsomal fraction), in order to
contribute with the understanding about the control of the nucleotide levels in cardiac
system.
79
Materials and Methods
Animals
Male Wistar rats weighing 200 - 280 g were used in this study. All animals were
housed in cages with food and water available ad libitum. They were maintained under
a 12-h light/dark cycle at a constant temperature of 23 ± 2 °C. Procedures for the care
and use of animals were adopted according to the regulations of Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), based on the Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (National Research Council).
Isolation of cardiac soluble and microsomal fractions
Rats were killed by decapitation, hearts were carefully removed and the
ventricles were isolated. The fractions were prepared as described by Floreani et al.
(2003), with minor modifications. Briefly, both left and right cardiac ventricles of two
animals were minced and homogenized in 1:23 (w/v) of 0.25 M sucrose-10 mM Tris
(pH 7.4), using a tissue homogenizer (Sorvall Omni-Mixer, 17105) for 3 min at setting
4. The homogenate was centrifuged for 30 min at 10,000 x g. The pellet (P1) was
discarded and the supernatant (S1) was centrifuged for 60 min at 105,000 x g. The
supernatant (S2) obtained represented the soluble fraction, whereas the pellet (P2),
resuspended in the homogenization buffer, represented the microsomal fraction. Both
fractions were prepared fresh daily and kept at 4 °C throughout the process.
Protein determination
Protein was measured by the Comassie Blue method, according to Bradford
(1976), using bovine serum albumin as standard.
Assay of ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (NPP) activity
Unless otherwise stated, enzyme activity was determined in the following
incubation medium: 50 mM Tris-HCl, pH 8.9, and 6.0 mM MgCl
2
in a final volume of
80
200 μL. Soluble and microsomal protein (90 μg and 30 μg, respectively) were added to
the reaction medium and preincubated for 10 min at 37 °C. The reaction was started by
the addition of p-Nph-5’-TMP to a final concentration of 0.5 mM. After 40 min of
incubation for soluble and 6 min of incubation for microsomal fraction, the reactions
were stopped by addition of 200 μL NaOH 0.2 N. For all enzyme assays, incubation
times and protein concentration were chosen to ensure the linearity of the reactions.
The amount of p-nitrophenol released from the substrate was measured at 400 nm
using a molar extinction coefficient of 18.8 x 10
–3
/M/cm. Controls to correct for non-
enzymatic substrate hydrolysis were performed by adding enzyme preparation after the
reaction had been stopped with NaOH as described above. All samples were
performed in duplicate. Enzyme activities were generally expressed as nmol p-
nitrophenol released per minute per milligram of protein.
Inhibitor studies
The effects of the following compounds on p-Nph-5’-TMP hydrolysis from rat
cardiac soluble and microsomal fraction were analyzed: 1.0 mM levamisole, 0.25 mM
suramin, 10 and 20 mM sodium azide, 0.3 and 0.5 mM gadolinium chloride. Incubation
times, protein and substrate concentrations were used as described above. Both
fractions were preincubated in the presence of each inhibitor for 10 min at 37 °C
followed by the addition of substrate. Results are expressed as percentage of control
enzyme activity.
Results
Determining time course and optimal protein concentration
We first investigated the p-Nph-5’-TMP hydrolysis in rat cardiac soluble and
microsomal fractions as a function of time and protein concentration in order to
determine the best assay conditions. The fractions were incubated as described in
Material and Methods. The results indicated that the time course of p-Nph-5’-TMP
81
hydrolysis for soluble fraction was linear up to 70 min and up to 10 min, in microsomal
fraction (data not shown). In order to ensure that the incubation time was within the
linearity of the reaction, we choose 40 min as the assay times for soluble fraction, and
6 min for microsomal fraction in the subsequent experiments.
Concerning to protein concentration, the results demonstrated that p-Nph-5’-
TMP hydrolysis were linear up to 110 μg for soluble and up to 70 μg for microsomal
fraction (data not shown). Thus, in the subsequent experiments, we used 90 μg protein
of soluble fraction and 30 μg protein of microsomal fraction.
Cation dependence
In order to investigate the possibility of cation dependence for the rat cardiac
soluble and microsomal fractions, we tested the hydrolysis rate for the p-Nph-5’-TMP in
the presence or absence of divalent cations or EDTA (cation chelator). Calcium and
magnesium concentrations were tested in the range of 2.0 – 8.0 mM. As shown in Fig.
1A, in the soluble fraction, in the presence of 0.025 mM EDTA, p-Nph-5’-TMP
hydrolysis were practically negligible when compared with respective control (without
the addition of divalent cations). In the microsomal fraction (Fig. 1B), p-Nph-5’-TMP
hydrolysis founded in the control group were completely removed by the addition of
0.025 mM EDTA. On the other hand, the hydrolysis of p-Nph-5’-TMP in both fractions
was increased by the presence of different concentrations of Ca
2+
or Mg
2+
. These data
clearly indicate the cation dependence for both enzyme activities.
In both fractions, some differences were observed in enzymatic activation by
different cations at different concentrations tested. p-Nph-5’-TMP hydrolysis was more
activated by Mg
2+
compared to Ca
2+
, in some concentrations. Despite these
differences, in the subsequent experiments we used a final concentration of 6.0 mM
MgCl
2
for p-Nph-5’-TMP hydrolysis in both fractions.
82
Effect of pH
The optimum pH values for p-Nph-5’-TMP hydrolysis were determined in a
medium containing a mixture of 50 mM Tris and 50 mM Glycine buffer (pH varying from
8.0 to 10.0). The pH curves showed the highest activity at pH 8.9 for soluble and pH
9.3 for microsomal fraction (Fig. 2A and 2B). For the subsequent experiments, the pH
8.9 was chosen for the hydrolysis of p-Nph-5’-TMP in soluble and microsomal fraction.
Kinetic parameters
Michaelis constant K
M
and V
max
values were calculated from the Eadie –Hofstee
plot (Fig. 3) with p-Nph-5’-TMP as substrate. Substrate concentrations tested ranged
from 25 to 750 µM. The K
M
value for the hydrolysis of p-Nph-5’-TMP in soluble and
microsomal fraction, corresponded to 118.5 ± 27.2 uM and 91.9 ± 12.4 uM,
respectively (mean ± S.D., n = 7), and V
max
value calculated in soluble and microsomal
fraction, were 2.52 ± 0.1 and 113.87 ± 21.1 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively
(mean ± S.D., n = 7).
Effect of inhibitors on p-Nph-5’-TMP hydrolysis
In order to exclude possible enzymatic associations in the p-Nph-5’-TMP
hydrolysis, we tested some compounds that were reported to affect nucleotide
hydrolysis. As shown in Table 1, the classical alkaline phosphatase inhibitor,
levamisole (1.0 mM) (Constantoupolus et al., 1977), was ineffective as inhibitor of p-
Nph-5’-TMP hydrolysis in soluble and microsomal fraction. On the other hand, suramin
(0.25 mM), a P2 receptor antagonist and an inhibitor of E-NTPDase (Leal et al., 2005)
and E-NPP activities (Grobben et al., 2000), strongly reduced the hydrolysis of p-Nph-
5’-TMP in both preparations. Sodium azide (10 and 20 mM) that is known to inhibit E-
NTPDases at high-concentration, had no effects on substrate hydrolysis. Gadolinium
chloride (0.3 and 0.5 mM), a lanthanide that interacts with different pathways of
intracellular and extracellular ATP action and that has been considered the most potent
83
inhibitor for both soluble and membrane-bound NTPDases (Fürstenau et al., 2006;
Escalada et al., 2004) had no effects on p-Nph-5’-TMP hydrolysis.
Discussion
Extracellular nucleotides/nucleosides are known to regulate several
physiological responses, including vascular tone, cardiac function, and hemostasis
(Burnstock, 1991; Kunapuli & Daniel, 1998; Ralevic & Burnstock, 2003). The ATP, ADP
and AMP hydrolysis by ecto-enzymes (ecto-ATPase, NTPDases and 50-nucleotidase)
was thought to be a very simple process during a long time. Nowadays it is well known
that this is a complex process involving several families of ectonucleotidases (Goding
et al., 2003). The relative contribution of the distinct ectonucleotidases species to the
modulation of purinergic signaling may depend on differential tissue and cell
distribution, regulation of expression, targeting to specific membrane domains, but also
on substrate availability and substrate preference (Stefan et al., 2006). One of the four
structurally unrelated families of ectonucleotidases is represented by E-NPPs.
In this study the enzyme activity obtained from rat cardiac soluble and
microsomal fractions shares the major biochemical properties already described for E-
NPPs. The pH curve showed a maximal enzymatic activity at alkaline pH in the range
8.9–9.3. These pH values are in accordance with those previously described for E-
NPPs (Bollen et al., 2000). The hydrolysis of p-Nph-5’-TMP by NPPs was determined
in the presence of divalent cations (Ca
2+
or Mg
2+
) and the results indicates that the
enzyme is cation-dependent, considering that increasing concentrations of EDTA
greatly reduced the catalytic activity. It has been demonstrated that E-NPPs are
metalloenzymes as their activity is blocked by metal chelators (Bollen et al., 2000).
Members of E-NPP family generally have wider substrate specificity than
intracellular pyrophosphatases and phosphodiesterases. The p-nitrophenyl ester of
TMP is used routinely for the in vitro assay of E-NPPs. Then, Michaelis constant (K
M
)
and V
max
values were calculated from an Eadie–Hofstee plot with p-Nph-5’-TMP as
84
substrate. The K
M
value corresponded to 118.5 ± 27.2 uM and 91.9 ± 12.4 uM, in
soluble and microsomal fractions, respectively (mean ± S.D., n = 7), and V
max
value
calculated in soluble and microsomal fraction, were 2.52 ± 0.1 and 113.87 ± 21.1 nmol
p-nitrophenol/min/mg, respectively (mean ± S.D., n = 7). This is in accordance with the
NPP reaction that is characterized by a K
M
of 50 to 500 µM and a V
max
of 5–300
µmol/min/mg enzyme (Kelly et al., 1975; Hosoda et al., 1999; Vollmayer et al., 2003).
In the sense to eliminate the possible participation of other enzymes, we tested
compounds like levamisole, suramin, sodium azide, and gadolinium chloride. The
results could suggest that in the conditions tested, we worked with a predominant E-
NPP activity in our system incubation, since only suramin, an inhibitor of E-NPP
activities (Grobben et al., 2000; Fürstenau et al., 2006), strongly reduced the hydrolysis
of p-Nph-5’-TMP.
NPP expression in cardiac tissue have been demonstrate in some works
(Stefan et al., 1999; Bollen et al., 2000); however, the exact participation of this
enzyme activity on nucleotide hydrolysis is poorly understood. In a recent study,
Rücker et al. (2007) investigate the expression of NPP1-3 in cardiac left ventricle. They
observed only NPP2 and NPP3 expression in that tissue, in addition, they characterize
the biochemical properties of NPP activity in cardiac synaptosomes and suggesting the
possible involvement of this enzymes with the control of nucleotides and nucleoside
levels in sympathetic nerve end. In our study, NPP activity identified in soluble and
microsomal fractions from heart can be act as a new important way to the control of
cardiac functions, since previous studies have demonstrated the participation of
adenine nucleotides and adenosine in the control of cardiac excitation-contraction
coupling process by direct effects on the Ca
2+
release from sarcoplasmic reticulum
(Meissner, 1984; Smith et al., 1986; Meissner and Henderson, 1987; Rousseau et al.,
1988; Duke and Steele, 1998; Butanda-Ochoa et al., 2003; Hleihel et al., 2006).
85
Acknowledgements
This work was supported by grants and fellowship from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
86
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88
Table 1: Effect of distinct compounds on
p
-nitrophenyl-5’-TMP hydrolysis from rat cardiac
soluble and microsomal fraction
Compounds
Concentration
(mM)
% of control enzyme activity
Soluble Microsomal
Levamisole 1.0 99.8 ± 11.4 100.4 ± 8.2
Suramin 0.25 47.2 ± 9.6* 46.8 ± 13.9*
Sodium azide 10 102.7 ± 6.6 109.1 ± 3.2
20 106.3 ± 2.1 106.3 ± 4.9
Gadolinium chloride 0.3 100.7 ± 9.3 93.3 ± 4.3
0.5 97.8 ± 2.5 90.5 ± 8.6
NPP activities were assayed as described in Material and Methods and expressed as
percentage of respective control activity (in the absence of inhibitor). Results are expressed as
mean ± SD of three experiments. Data were analyzed by Student’s t-test. * Represents
difference from control enzyme activity (100%) (P<0.003). The 100% values correspond to 2.3
± 0.1 and 110.7 ± 2.6 nmol ρ-nitrophenol/min/mg protein for ρ-nitrophenyl-5’-TMP hydrolysis, in
soluble and microsomal fraction respectively.
89
Figure Legends
Figure 1. Divalent cations dependence on p-Nph-5’-TMP hydrolysis. Hydrolysis of p-
Nph-5’-TMP by rat cardiac soluble (A) and microsomal (B) fractions were analyzed in
the absence of cations (Control), in the presence of 0.025, 0.05 and 1.0 mM EDTA and
in the presence of 2.0-8.0 mM Ca
2+
or Mg
2+
. Bars represent means ± S.D. of four
independent experiments. Results are expressed as nmol p-nitrophenol/min/mg of
protein.
Figure 2. Effect of pH on p-Nph-5’-TMP hydrolysis in rat cardiac soluble (A) and
microsomal (B) fractions. Enzyme activity was determined as described in Material and
Methods using a mixture of the following buffers: Tris and Glycine (pH range 8.0 to
10.0). Data represent means ± SD of three different experiments. Results are
expressed as nmol p-nitrophenol/min/mg of protein.
Figure 3. Eadie-Hofstee plot for p-Nph-5’-TMP hydrolysis. The nucleotide hydrolysis as
function of substrate concentration from rat cardiac soluble (A) and microsomal (B)
fractions is shown in the insets. The mean K
M
values calculated for p-Nph-5’-TMP
hydrolysis were found to be 118.5 ± 27.2 uM and 91.9 ± 12.4 uM, respectively, and
V
max
value calculated in soluble and microsomal fraction, were 2.52 ± 0.1 and 113.87 ±
21.1 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively. Data are expressed as mean ± SD, n=4.
90
Figure 1
2.0 4.0 6.0 8.0
0
1
2
3
Ca
2+
Mg
2+
Cation
(mM)
EDT A
(mM)
Control
0.025 0.05 0.1
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
2.0 4.0 6.0 8.0
0
20
40
60
80
Ca
2+
Mg
2+
Cation
(mM)
EDT A
(mM)
Control
0.025 0.05 0.1
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
A
B
91
Figure 2
8.0 8.5 8.9 9.3 9.7 10.0
0
1
2
3
pH
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
8.0 8.5 8.9 9.3 9.7 10.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
pH
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
A
B
92
Figure 3
0.00 0.01 0.02 0.03
0
1
2
3
(nmol p-nitrophenol/min/mgprotein)/[p-Nph 5'-TMP] μM
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
0 200 400 600 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
[p-Nph 5'TMP] μ M
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
A
0 200 400 600 800
0
20
40
60
80
100
[p-Nph 5'TMP] μM
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
0.0 0.5 1.0 1.5
0
40
80
120
(nmol p-nitrophenol/min/mgprotein)/[p-Nph 5'-TMP] μM
nmol p-nitrophenol/min/mg protein
B
93
ANEXO I
Resultados obtidos durante o doutorado e que serão finalizados
após a realização de experimentos para a verificação de
parâmetros hemodinâmicos cardíacos, identificação das E-
NTPDases, além de análises de PCR em tempo real.
94
In vivo effect of acute and chronic administration of caffeine on
ectonucleotidase activities in soluble and microsomal fractions of rat
heart
Material and Methods
Chemicals
Nucleotides, p-Nitrophenyl thymidine 5'-monophosphate (p-Nph-5'-TMP),
oligomycin, N-ethylmaleimide (NEM), Trizma Base and caffeine were obtained from
Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). All other reagents were also of analytical grade.
Animals
Male Wistar rats weighing 200 - 280 g were used in this study. Unless otherwise
mentioned, all animals were housed in cages with food and water available
ad libitum.
They were maintained under a 12-h light/dark cycle at a constant temperature of 23 ± 2
°C. Procedures for the care and use of animals were adopted according to the
regulations of Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), based on the
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council).
Experimental Protocols
In the acute treatment, caffeine (5, 15 or 45 mg/kg of body weight, dissolved in
0.9% NaCl solution) was administered by oral gavage in a single dose at 1.5h before
the sacrifice. Control animals received a single dose of NaCl.
In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for
14 days in the drinking water. Caffeine intake was monitored throughout the
experiment. Daily caffeine intake (mg/kg/day) was estimated based on the subject’s
fluid consumption over a 24h period and its body weight. Daily water intake in rats not
95
exposed to caffeine (control group) was monitored for comparison. In these
experiments, the animals were euthanized on day 15.
Isolation of cardiac soluble and microsomal fractions
Rats were killed by decapitation, hearts were carefully removed and the
ventricles were isolated. The fractions were prepared as described by Floreani et al.
(2003), with minor modifications. Briefly, both left and right cardiac ventricles of two
animals were minced and homogenized in 1:23 (w/v) of 0.25 M sucrose-10 mM Tris
(pH 7.4), using a tissue homogenizer (Sorvall Omni-Mixer, 17105) for 3 min at setting
4. The homogenate was centrifuged for 30 min at 10,000 x
g. The pellet (P1) was
discarded and the supernatant (S1) was centrifuged for 60 min at 105,000 x
g. The
supernatant (S2) obtained represented the soluble fraction, whereas the pellet (P2),
resuspended in the homogenization buffer, represented the microsomal fraction. Both
fractions were prepared fresh daily and kept at 4 °C throughout the process.
Protein determination
Protein was measured by the Coomassie Blue method using bovine serum
albumin as standard (Bradford, 1976).
Assays of ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) and ecto-5'-
nucleotidase activities in soluble and microsomal fractions
ATP and ADP hydrolysis in soluble fraction were determined in a reaction
medium containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 4.0 mM CaCl
2
and 2.0 μg/mL
oligomycin in a final volume of 200 μL. For ADP hydrolysis, 1.0 mM NEM was added to
the reaction medium. The activity of ecto-5'-nucleotidase was determined in a reaction
medium containing 50 mM Glycine buffer (pH 9.5) and 1.0 mM MgCl
2
in a final volume
of 200 μL.
About 90 μg of soluble protein were added to the reaction medium and
preincubated for 10 min at 37 °C. The reaction was started by the addition of ATP, ADP
96
or AMP to a final concentration of 2.0 mM. After 6, 25 and 40 min of incubation for
ATP, ADP and AMP, respectively, the reactions were stopped by the addition of 200 μL
10% trichloroacetic acid (TCA). The samples were chilled on ice and the inorganic
phosphate (Pi) released was measured according to Chan et al. (1986).
In microsomal fraction, ATP and ADP hydrolysis were determined in a reaction
medium containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 4.0 mM CaCl
2
and 2.0 μg/mL
oligomycin in a final volume of 200 μL. In the reaction mixture used to determine for
ADP hydrolysis, 4.0 mM NEM was added. For ecto-5’-nucleotidase assay was used a
reaction medium containing 50 mM Glycine buffer (pH 9.5) and 1.0 mM MgCl
2
in a final
volume of 200 μL.
Microsomal protein (20 μg for ATP and 50 μg for ADP and AMP
hydrolysis) was added to the reaction medium and preincubated for 10 min at 37 °C.
The reaction was started by the addition of ATP, ADP or AMP to a final concentration
of 2.0 mM. After 2 min of incubation for ATP and 10 min of incubation for ADP and
AMP, the reactions were stopped by the addition of 200 μL 10% trichloroacetic acid
(TCA). The samples were chilled on ice and the inorganic phosphate (Pi) released was
measured how described above.
For all enzyme assays, incubation times and protein concentration were chosen
in order to ensure the linearity of the reactions. All samples were run in triplicate.
Controls with the addition of the enzyme preparation after mixing with TCA were used
to correct for non-enzymatic substrate hydrolysis. Enzyme activity was expressed as
nmol of phosphate (Pi) released per minute per milligram of protein.
Assay of ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) activity
The phosphodiesterase activity was assessed using p-Nph-5'-TMP (an artificial
substrate). For assay of E-NPP activity, the reaction medium containing 50 mM Tris-
HCl buffer (pH 8.9) and 6.0 mM MgCl
2
was preincubated for 10 minutes at 37 °C with
approximately 90 μg and 50 μg of soluble and microsomal protein per tube,
respectively, in a final volume of 200 μL. The enzyme reaction was started by the
97
addition of p-Nph-5'-TMP to a final concentration of 0.5 mM. After 40 min of incubation
time for soluble and 6 min for microsomal fraction, 200 μL 0.2 N NaOH was added to
the medium to stop the reaction. Incubation time and protein concentration were
chosen in order to ensure the linearity of the reaction. The amount of
p-nitrophenol
released from the substrate was measured at 400 nm using a molar extinction
coefficient of 18.8 X 10
-3
/M/cm. Controls to correct for non-enzymatic substrate
hydrolysis were performed by soluble or microsomal preparations after the reaction had
been stopped with NaOH. All samples were performed in triplicate. Enzyme activity
was generally expressed as nmol
p-nitrophenol released per minute per milligram of
protein.
Data Analysis
Results are expressed as means ± standard deviation (S.D.). The comparison
among groups was made by one-way ANOVA, following by Duncan’s post-hoc.
Statistically significant differences between groups were considered for a
P≤0.05.
98
Table 1. Caffeine Consumption in Chronic Treatment
Groups
(14 days)
Fluid Consumption
(mL/day/Kg)
Dose of Caffeine
(mg/day/Kg)
Control
127.02 ± 24.7
0
0.3 mg/mL 130.98 ± 27.5 39.27 ± 8.2
1.0 mg/mL 121.86 ± 24.8 121.86 ± 24.3
Note: Values are expressed as mean ± SD.
99
Legend to Figures
Fig. 1
Effect of acute caffeine treatment (5, 15 and 45 mg/Kg, by gavage) on ATP,
ADP, AMP and
p-Nph-5’-TMP hydrolysis from cardiac solúvel (A) and microsomal
fraction (B). Bars represent mean ± SD (n per group was 4–10 animals). In soluble
fraction, control activities were 29.7 ± 2.9 for ATP, 8.5 ± 1.3 for ADP, and 7.6 ± 1.7 for
AMP expressed as nmol Pi/ min/ mg of protein; for
p-Nph-5'-TMP, control activity was
1.7 ± 0.1 expressed as nmol
p-nitrophenol/ min/ mg of protein. In microsomal fraction,
control activities were 1485.5 ± 373.2 for ATP; 243.2 ± 38.1 for ADP; 242.4 ± 28.5 for
AMP expressed as nmol Pi/ min/ mg of protein; for
p-Nph-5'-TMP, control activity was
79.1 ± 19.1 nmol
p-nitrophenol/ min/ mg of protein. *Significantly different from the
respective control group (
P < 0.05).
Fig. 2 Effect of chronic caffeine treatment (0.3 or 1 g/L in the drinking water, during 14
days) on ATP, ADP, AMP and
p-Nph-5’-TMP hydrolysis from cardiac solúvel (A) and
microsomal fraction (B). Bars represent mean ± SD (n per group was 4–10 animals). In
soluble fraction, control activities were 28.1 ± 3.8 for ATP; 7.1 ± 1.6 for ADP; 7.5 ± 1.2
for AMP expressed as nmol Pi/ min/ mg of protein; for
p-Nph-5'-TMP, control activity
was 1.4 ± 0.3 nmol
p-nitrophenol/ min/ mg of protein. In microsomal fraction, control
activities were 1711.2 ± 277.5 for ATP; 241.8 ± 34.5 for ADP; 226.1 ± 29.1 expressed
as nmol Pi/ mim/ mg of protein; for
p-Nph-5'-TMP, control activity was 59.5 ± 10.4 nmol
p-nitrophenol/ min/ mg of protein. *Significantly different from the respective control
group (
P < 0.05).
100
Figure 1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
ATP ADP AMP
Saline
Caffeine 5 mg/Kg
Caffeine 15 mg/Kg
A
Caffeine 45 mg/Kg
*
*
p-Nph-5'-TMP
% of control activity
0
20
40
60
80
100
120
ATP ADP AM P
Saline
Caffeine 5 mg/Kg
Caffeine 15 mg/Kg
B
Caffeine 45 mg/Kg
p-Nph-5'-TMP
% of control activity
101
Figure 2
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
ATP ADP AM P
Water
Caffeine 0.3 g/L
Caffeine 1.0 g/L
A
*
*
p-Nph-5'-TMP
% of control activity
0
20
40
60
80
100
120
ATP ADP AMP
Water
Caffeine 0.3 g/L
Caffeine 1.0 g/L
B
*
*
*
p-Nph-5'-TMP
% of control activity
102
PARTE III
103
1. DISCUSSÃO
1.1 Propriedades da ecto-5’-nucleotidase em fração solúvel e
microssomal de coração
A grande variedade de ações da adenosina enfatiza a importância do
estudo das enzimas envolvidas na sua produção. No primeiro capítulo desta
tese estão descritas as propriedades cinéticas e bioquímicas da atividade de
hidrólise do substrato AMP, correspondendo à atividade da ecto-5’-
nucleotidase. Além disso, através da análise de Western blot foi possível
identificar a presença dessa enzima nas duas preparações de tecido cardíaco
estudadas.
O estudo das propriedades bioquímicas da ecto-5’-nucleotidase em
fração solúvel e microssomal cardíaca revelou características comuns
previamente descritas para essas enzimas como dependência por cátions
divalentes, enfatizada pela ausência de atividade na presença do quelante
EDTA, e ativação por Mg
2+
em concentrações na faixa de milimolar
(Zimmermann, 1992; Bianchi & Spychala, 2003). O pH ótimo para a atividade
dessas enzimas geralmente varia entre 6,0 e 8,0 (Zimmermann, 1992),
contudo, os nossos resultados demonstraram uma melhor atividade em pH 9,5.
Apesar de parecer uma faixa de pH extremamente alta para a atividade destas
enzimas, um estudo anterior com 5’-nucleotidase solúvel purificada de coração
de rato demonstrou que estas enzimas podem apresentar um comportamento
complexo na presença de diferentes tampões em pHs acima de 7,5 (Naito &
Lowenstein, 1981). Nesse estudo, os autores sugerem que alguns tampões,
assim como a glicina também utilizada por nós, tem a capacidade de interagir
com a enzima, possivelmente através da ligação de um íon metal, promovendo
104
uma alta atividade também em pH 9,5. Além disso, nesse estudo foi observado
que essa atividade em tampão glicina com pH 9,5 poderia ser duplicada com a
adição de Mg
2+
, demonstrando que o cátion também é capaz de modificar o
comportamento da enzima. Dessa maneira, os valores de pH ótimo observados
em nossos resultados para ambas frações encontram suporte neste estudo
prévio.
Para descartar que essa alta hidrólise de AMP em pH 9,5 pudesse estar
acontecendo com a participação de uma fosfatase alcalina, utilizamos os
inibidores clássicos dessa enzima, levamisole e tetramisole (Van Belle, 1972),
os quais não apresentaram nenhum efeito sobre a hidrólise desse substrato no
pH referido.
As propriedades cinéticas da ecto-5’-nucleotidase nas duas frações
foram diferentes em alguns aspectos, a enzima da fração solúvel apresentou
um K
M
mais baixo do que a da fração microssomal, entretanto os valores nas
duas preparações foram da ordem de micromolar. Em relação ao V
max
observado, a fração microssomal apresentou um valor 21 vezes maior em
comparação ao encontrado para a enzima solúvel. Essas diferentes
características podem ser atribuídas ao tipo de ecto-5’-nucleotidase envolvida e
à sua localização na célula (Zimmermann, 1992; Bianchi & Spychala, 2003).
Paralelamente às propriedades cinéticas e bioquímicas, a análise por
Western blot identificou a ecto-5’-nucleotidase nas duas frações, porém, a
quantificação dos níveis dessa proteína demonstrou uma quantidade muito
maior na fração microssomal. Atualmente, sabe-se que existem pelo menos 7
tipos de 5’-nucleotidases e essa classificação está baseada principalmente na
sua localização celular: uma forma ancorada à membrana plasmática (a ecto-
105
5’-nucleotidase), 5 formas citoplasmáticas e uma presente na matriz
mitocondrial. O aparecimento da ecto-enzima na fração solúvel não nos parece
surpreendente uma vez que enzimas de membrana podem sofrer clivagem,
tornando-se solúveis no meio extracelular. Além disso, conforme descrito por
Zimmermann em 1992, mais de 50% da enzima pode estar associada à
membranas intracelulares e ser liberada durante o processo de
homogeneização, formando uma proteína solúvel. Portanto, pode-se sugerir
que a ecto-5’-nucleotidase identificada na fração solúvel possa ser originária de
membranas intracelulares, inclusive do retículo sarcoplasmático que foi
demonstrado no nosso estudo por apresentar essa forma da enzima. Em
adição, não podemos excluir a presença de uma 5’-nucleotidase
verdadeiramente solúvel na fração correspondente, uma vez que foram
encontradas propriedades cinéticas muito diferentes nas duas frações.
1.2 Hidrólise de ATP e ADP no coração – Identificação das enzimas da
família das E-NTPDases
A família da E-NTPDases tem se tornado objeto de intensiva pesquisa
na última década, principalmente devido ao importante papel dessas enzimas
na modulação da sinalização purinérgica. Membros dessa família têm sido
identificados em condições fisiológicas e patológicas em muitas células e
tecidos, incluindo o coração (Marcus et al., 2005; Atkinson et al., 2006; Robson
et al., 2006; Yegutkin, 2008). Além disso, o seu uso para propósitos
terapêuticos tem sido sugerido (Marcus et al., 2005; Atkinson et al., 2006;
Yegutkin, 2008). No segundo capítulo desta tese estão relatadas as
propriedades cinéticas e bioquímicas da hidrólise de ATP e ADP na fração
106
solúvel e microssomal cardíaca de ratos, em condições onde a ATPase
mitocondrial e a adenilato cinase foram inibidas. Os resultados apresentados
suportam a nossa proposta de que esta atividade corresponde às enzimas da
família das E-NTPDases.
A presença de atividade de E-NTPDases na hidrólise de ATP e ADP
tanto na fração solúvel como na microssomal foi evidenciada pela ativação e
dependência por cátions divalentes (Sarkis et al., 1995; Zimmermann, 2001;
Henz et al., 2006; Robson et al., 2006; Buffon et al., 2007; Rücker et al., 2008).
O valor de pH ótimo para hidrólise de ATP e ADP em ambas frações variou
entre 7,5 e 8,5, valores previamente descritos para as E-NTPDases (Sarkis et
al., 1995; Zimmermann, 2001; Henz et al., 2006; Robson et al., 2006; Buffon et
al., 2007; Rücker et al., 2008).
A exclusão de algumas associações enzimáticas que pudessem
mimetizar a atividade das E-NTPDases foi realizada usando diferentes
inibidores conhecidos por atuar sobre algumas atividades enzimáticas. Assim,
ouabaína, ortovanadato, lantânio e levamisole não afetaram a hidrólise de ATP
ou ADP em ambas frações, descartando a participação de enzimas como
Na
+
/K
+
-ATPase, fosfatases ácidas, fosfatases alcalinas e Ca
2+
, Mg
2+
-ATPase
(Van Belle, 1972; LeBel et al., 1980; Battastini et al., 1991; Sorensen & Mahler,
1992; Cool and Blum, 1993). A contribuição da ATPase mitocondrial para a
hidrólise do ATP foi verificada com o uso de oligomicina, a qual foi capaz de
inibir a hidrólise deste substrato na fração solúvel e microssomal. É de
conhecimento geral que o tecido cardíaco possui elevadas concentrações de
ATPases mitocondriais (Sasaki et al., 2001; Grover et al., 2004), portanto, não
foi surpresa encontrarmos uma alta inibição na hidrólise de ATP. Contudo, a
107
oligomicina também foi capaz de diminuir a hidrólise do ADP nas duas frações
sugerindo uma possível combinação enzimática entre a ATPase mitocondrial e
a adenilato cinase (enzima que converte ADP em ATP), o que poderia simular
a atividade da E-NTPDase. Dois critérios foram utilizados para investigar a
possibilidade de que o substrato ADP, antes de ser hidrolisado, estivesse
sendo convertido à ATP pela adenilato cinase e, posteriormente, sendo
hidrolisado pela ATPase mitocondrial: o primeiro critério foi a avaliação da
hidrólise do ADP na ausência e na presença de um inibidor de adenilato cinase
(NEM) (Russel et al., 1974); o segundo critério consistiu de um protocolo
previamente descrito para detectar qualquer formação de ATP quando a
reação é iniciada com o substrato ADP (LeBel et al., 1980; Sarkis et al., 1986;
Battastini et al., 1991). Ambos procedimentos indicaram a presença da enzima
adenilato cinase tanto na fração solúvel quanto na microssomal. Portanto, para
excluir essa associação enzimática (ATPase mitocondrial e adenilato cinase) e
assegurar que a hidrólise de ATP e ADP estivesse sendo realizada por uma E-
NTPDase, os inibidores oligomicina e NEM foram sempre adicionados no meio
de reação.
A azida de sódio, outro inibidor da ATPase mitocondrial na concentração
de 0,1 mM (Plesner, 1995), reproduziu os resultados obtidos com a oligomicina
na fração solúvel, causando a diminuição da hidrólise de ATP e ADP.
Interessantemente, na fração microssomal essa mesma concentração de azida
de sódio não foi capaz de alterar a hidrólise de ambos os substratos. Dados da
literatura sugerem que essa diferença possa ser causada pelos mecanismos de
ação diferenciados da azida de sódio e da oligomicina, o que promoveria
distintos efeitos de acordo com a amostra utilizada (Borges et al., 2004). Em
108
altas concentrações, a azida de sódio é capaz de inibir a atividade de E-
NTPDases de várias fontes (Plesner, 1995; Knowles & Nagy, 1999; Fürstenau
et al., 2006; Henz et al., 2006; Buffon et al., 2007; Rücker et al., 2008). Nossos
resultados mostraram inibição das hidrólises de ATP e ADP na fração solúvel e
microssomal, corroborando com a literatura prévia sobre essas enzimas. Em
adição, os antagonistas de receptores P2, suramin e evans blue, também
considerados inibidores de ectonucleotidases (Heine et al., 1999; Fürstenau et
al., 2006), causaram inibição das hidrólises de ATP e ADP em ambas frações,
indicando fortemente a participação de membros da família das E-NTPDases
no processo de hidrólise dos nucleotídeos nas frações estudadas.
Embora ainda seja desconhecido o mecanismo pelo qual o cloreto de
gadolínio atua como um potente inibidor de E-NTPDases solúveis (Escalada et
al. 2004) e ligadas à membrana (Fürstenau et al., 2006; Buffon et al., 2007;
Rücker et al., 2008), nossos resultados demonstraram que o cloreto de
gadolínio não foi capaz de afetar a hidrólise de ATP e ADP na fração solúvel,
porém na fração microssomal a hidrólise de ambos substratos foi diminuída.
Essas diferenças sugerem que o cloreto de gadolínio não é capaz de
apresentar um padrão definido e, portanto, não parece ser um inibidor
específico para a atividade das E-NTPDases.
Em relação às propriedades cinéticas, nossos resultados demonstraram
que os valores de K
M
calculados a partir do plote de Eadie-Hofstee utilizando
ATP ou ADP como substratos foram na ordem de micromolar para ambas
frações, o que está de acordo com a literatura sobre E-NTPDases. Em relação
ao V
max
, a razão de hidrólise de ATP/ADP foi cerca de 8 na fração solúvel e
cerca de 12 na fração microssomal, sugerindo uma atividade preferencialmente
109
ATPásica em ambas frações. A presença de enzimas com atividade ATPásica
no tecido cardíaco tem sido demonstrada por análises bioquímicas e de
imunohistoquímica em corações de murinos, suínos e humanos (Kaczmarek et
al., 1996; Zinchuk et al., 1999; Lemmens et al., 2000; Sévigny et al., 2002). Em
adição, uma expressão significativa do mRNA da Entpd2 foi demonstrada em
corações de murinos e humanos, sugerindo que esta enzima poderia ser uma
candidata preferencial, responsável pela atividade encontrada (Chadwick &
Frischauf, 1997, 1998; Barreto-Chaves et al., 2006; Rücker et al., 2008).
Todavia, não se pode excluir a atividade de outros membros da família das E-
NTPDases no tecido cardíaco. A NTPDase1 também tem sido demonstrada em
corações humanos por análise de imunohistoquímica e Western blot (Kittel et
al., 2005). Além disso, a expressão do mRNA da Entpd3 em cardiomiócitos de
ratos sugere outra potencial enzima que poderia modular os níveis de
nucleotídeos extracelulares no coração (Barreto-Chaves et al., 2006).
Recentemente, nosso grupo identificou através da técnica de RT-PCR a
expressão do mRNA das Entpd1,2,3,5 e 6 em ventrículo esquerdo de coração
de ratos (Rücker et al., 2008). Com base nestas evidências, apesar dos nossos
resultados demonstrarem uma atividade preferencialmente ATPásica,
provavelmente atribuída a uma NTPDase2, outras enzimas da família das E-
NTPDases podem estar participando da hidrólise de ATP e ADP na fração
solúvel e microssomal cardíaca de ratos.
Na tentativa de identificar as específicas E-NTPDases presentes nas
duas frações cardíacas, realizamos análises de Western blot. Os dados com
amostras preparadas em condições não-redutoras indicaram a presença da
NTPDase5 na fração solúvel, revelando uma única banda em torno de 75kDa
110
(Capítulo II - Figura 4). A presença da NTPDase5 na fração solúvel corrobora
com a literatura que descreve que essa enzima, apesar de intracelular, pode
ser secretada para o meio extracelular, tornando-se solúvel (Zimmermann,
2001). Em contrapartida, essa isoforma é descrita por ter uma preferência por
substratos difosfatados e o perfil que descrevemos cineticamente caracteriza
uma enzima com preferência para o nucleotídeo trifosfatado. A partir desses
dados, duas hipóteses podem ser supostas: i) a enzima (no caso a NTPDase5)
quando secretada, pode ter a sua conformação alterada, mudando o perfil de
hidrólise dos diferentes nucleotídeos e; ii) a segunda hipótese é uma possível
associação desta enzima com a atividade de outras E-NTPDases que não
foram reconhecidas pelos anticorpos. Na fração microssomal, apenas a
NTPDase2 foi detectada nas amostras preparadas em condições não-
redutoras, revelando também uma única banda em torno de 75kDa (Capítulo II
– Figura 4). A presença dessa isoforma na fração microssomal estaria de
acordo com a razão de hidrólise de ATP/ADP observada nessa fração uma vez
que a NTPDase2 é descrita por hidrolisar até 30 vezes mais ATP em relação
ao ADP (Zimmermann, 2001). Por outro lado, se esse dado for confirmado será
a primeira vez em que essa isoforma de membrana extracelular terá sido
caracterizada e identificada em retículo sarcoplasmático.
Apesar de a literatura sugerir o uso desses anticorpos com amostras
preparadas em condições não-redutoras, o comportamento frente às amostras
preparadas em condições redutoras também foi verificado (Capítulo II – Figura
5). A análise por western blotting mostrou muitas ligações inespecíficas pelos
anticorpos pois surgiam muitas bandas em ambas frações, tornando difícil a
identificação das isoformas das E-NTPDases. É importante ressaltar que existe
111
uma grande dificuldade na obtenção de alguns anticorpos, pois existe uma
reduzida disponibilidade comercial e os disponíveis muitas vezes possuem
pouca especificidade, pois reconhecem apenas as regiões conservadas não
sendo possível diferenciar os membros da família. Além disso, os anticorpos
produzidos na sua grande maioria são policlonais, o que também dificulta na
diferenciação das isoformas de E-NTPDases.
1.3 Análise cinética e bioquímica das E-NPPs em fração solúvel e
microssomal
Em 2001, Vassort publicou uma revisão onde ele cita a falta de estudos
sobre outras enzimas, além das ATPases, mas que sejam capazes de
hidrolisar o ATP em tecido cardíaco, dentre elas as E-NPPs (Vassort, 2001). As
E-NPPs influenciam muitos processos fisiológicos e alterações na sua atividade
podem estar relacionadas com a fisiopatologia de várias doenças (Goding et
al., 2003). Alguns trabalhos mostram a presença destas enzimas em coração
(Stefan et al., 1999; Bollen et al., 2000), no entanto, pouco se sabe sobre a sua
importância com relação à hidrólise de nucleotídeos. Assim, no terceiro capítulo
desta tese apresentamos investigações sobre as propriedades bioquímicas das
E-NPPs em fração solúvel e microssomal de coração de ratos, utilizando o
substrato artificial p-nitrofenil-5’-timidina-monofosfato, marcador para a
atividade dessas enzimas.
A atividade enzimática encontrada em ambas frações nas condições
avaliadas mostrou propriedades bioquímicas já descritas para E-NPPs, assim
como pH alcalino e dependência por cátions divalentes (Kelly et al., 1975;
Sakura et al., 1998; Hosoda et al., 1999; Bollen et al., 2000; Grobben et al.,
112
2000; Vollmayer et al., 2003; Fürstenau et al., 2006). As análises cinéticas
também mostraram valores de K
M
e V
max
já relatados para as E-NPPs (Kelly et
al., 1975; Hosoda et al., 1999; Vollmayer et al., 2003).
A possível participação de outras enzimas na hidrólise do substrato
artificial foi descartada pelo teste com alguns inibidores, além disso, a inibição
observada por suramin sugere que, nas condições testadas, existe um
predomínio de atividade NPP, uma vez que este composto é descrito como
inibidor dessa atividade (Grobben et al., 2000; Fürstenau et al., 2006).
As E-NPPs1-3, sozinhas ou em combinação, tem se mostrado
expressas em todos os tipos celulares em que se investigou a sua presença
(Yano et al., 1985; Jin-Hua et al., 1997). No recente trabalho de Rücker e
colaboradores (2007), a expressão do mRNA das NPP2 e NPP3 foi
demonstrada em ventrículo esquerdo cardíaco de ratos através da técnica de
RT-PCR. A presença de NPP1 já foi descrita em tecido de coração total
(Stefan et al., 1999; Goding et al., 2003) e a ausência de expressão em
ventrículo esquerdo sugere, provavelmente, a sua expressão em
compartimentos específicos de acordo com suas funções fisiológicas.
A exata contribuição das E-NPPs em sistema cardíaco ainda permanece
pouco ou nada estudada. A presença destas enzimas pode fazer parte da
terminação da sinalização purinérgica e/ou geração de outras moléculas
mensageiras como ADP, adenosina e pirofosfato (Stefan et al., 2006). Uma vez
que a presença de E-NTPDases também tenha sido demonstrada na fração
solúvel e microssomal do coração, torna-se interessante entender o porquê de
estas células estarem expressando tantas enzimas com funções semelhantes.
A co-expressão de distintas ectonucleotidases com características semelhantes
113
em múltiplos sistemas tem sido sugerida por diversos trabalhos (Heine et al.,
1999; Kukulski & Komozynski, 2003; Oses et al., 2004; Fürstenau et al., 2006;
Rücker et al., 2007; Cognato et al., 2008). Uma vez que essas enzimas
apresentam diferentes propriedades cinéticas, elas podem atuar em condições
fisiológicas distintas, além de poderem ser diferentemente reguladas. Dessa
maneira, a possível co-localização de E-NTPDases e E-NPPs juntamente com
ecto-5’-nucleotidases poderia constituir um complexo multi-enzimático
importante para a modulação da sinalização purinérgica em diversos sistemas,
incluindo as frações de coração estudadas.
1.4 Atividade das NTPDases, ecto-5’-nucleotidase e NPP em coração de
ratos tratados com cafeína
Conforme observado no Anexo desta tese, os resultados obtidos com a
administração aguda e crônica de cafeína demonstram alterações significativas
e com diferentes perfis para cada substrato em cada fração cardíaca estudada.
Os estudos sobre as diferenças da exposição aguda e crônica aos
ligantes de adenosina mostram que os efeitos da administração aguda de um
ligante em particular podem ser opostos aos seus efeitos crônicos. Isso pode
acontecer devido a diferenças entre os períodos de tratamento, as doses
estudadas, as vias de administração, ao gênero e à idade (Jacobsen et al.,
1996; Fredholm et al., 1999; Léon et al., 2002). No nosso trabalho, tanto o
tratamento agudo quanto o crônico foram administrados por via oral na
tentativa de minimizar possíveis diferenças que possam ser relacionadas à via
de administração. As doses de cafeína administradas, tanto no tratamento
114
agudo quanto no crônico, foram escolhidas de acordo com a literatura a
respeito dos efeitos dessa molécula sobre o sistema cardiovascular.
Quando nós testamos os efeitos agudos da cafeína sobre a atividade
das ectonucleotidases, observamos que as doses de 5 e 45 mg/Kg foram
capazes de aumentar significativamente a hidrólise de ATP na fração solúvel
(Anexo – Figura 1A). A hidrólise dos outros nucleotídeos não foi
significativamente alterada na mesma fração. Do mesmo modo, nenhuma
alteração significativa foi encontrada na hidrólise dos substratos testados na
fração microssomal (Anexo – Figura 1B). Embora outros parâmetros precisem
ser avaliados na tentativa de relacionar as atividades alteradas das
ectonucleotidases com os efeitos da cafeína no coração, podemos sugerir que
a administração aguda de cafeína pode desenvolver um papel modulatório na
via das ectonucleotidases modulando, principalmente, a disponibilidade de ATP
no meio extracelular. Uma vez que a hidrólise de ATP foi encontrada como
sendo preferencial na atividade descrita para as E-NTPDases, a alteração
somente na atividade desse substrato não parece surpreendente, e poderia
sugerir uma modulação sensível da atividade dessa enzima. Considerando os
efeitos da cafeína descritos sobre o coração (principalmente a arritmia), o
aumento da hidrólise do nucleotídeo ATP na fração solúvel poderia sugerir um
mecanismo compensatório para a diminuição da disponibilidade desse
nucleotídeo extracelular, uma vez que se sabe da liberação dessas moléculas
em processos como este e também da sua capacidade de induzir arritmias no
músculo cardíaco.
Os resultados observados sobre o efeito do tratamento crônico com
cafeína na hidrólise dos nucleotídeos da adenina em fração solúvel,
115
demonstram que houve alteração significativa da hidrólise de ATP e ADP
somente na concentração de 1 g/L. Como pode ser observado na Figura 2A do
Anexo, houve um aumento na hidrólise de ATP e uma diminuição na hidrólise
de ADP. Esse efeito contraditório encontrado, pode ser resultado da ação de
diferentes E-NTPDases. Embora nossos resultados preliminares sobre a
identificação das isoformas dessas enzimas tenham indicado apenas a
presença da NTPDase5 nessa fração (Capítulo II – Figura 4), mais estudos são
necessários para enfatizar esses dados.
Os dados sobre os efeitos do tratamento crônico com cafeína na fração
microssomal demonstram uma diminuição da hidrólise dos nucleotídeos ATP,
ADP e AMP, porém com significância somente para as hidrólises de ATP e
AMP (Anexo – Figura 2B). Esse resultado nos parece interessante e poderia
ser relacionado com os efeitos da cafeína descritos no coração. Os
nucleotídeos da adenina e a adenosina são capazes de afetar de maneira
direta o fluxo de Ca
2+
no retículo sarcoplasmático modulando o processo de
excitação-contração do coração, sendo que o ATP parece causar a liberação
desse cátion para o citoplasma ativando o processo, e a adenosina, apresenta
um efeito contrário (Meissner, 1984; Meissner & Henderson, 1987; Duke &
Steele, 1998). Além disso, algumas evidências sugerem que a saída anormal
de Ca
2+
por estes canais pode estar associada com certas patologias, incluindo
arritmias e falência cardíaca (Györke et al., 2002; Hove-Madsen et al., 2006), a
diminuição observada na hidrólise de ATP nos microssomas, poderia resultar
em concentrações elevadas dessa molécula no micro-ambiente do retículo
sarcoplasmático ativando esses processos. De maneira contrária, a diminuição
116
da hidrólise do AMP diminuiria a disponibilidade da adenosina nesse meio,
acentuando a possibilidade do desenvolvimento dos processos relacionados.
Nossos resultados mostram que a cafeína administrada tanto de forma
aguda, quanto crônica é capaz de alterar a hidrólise dos nucleotídeos da
adenina nas preparações de tecido cardíaco estudadas. Todavia, mais dados
são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os
conhecidos efeitos da cafeína no coração.
1.5 Ectonucleotidases em frações subcelulares – possível papel das
ectonucleotidases solúveis e de retículo sarcoplasmático
A variedade de respostas, mediadas pelos nucleotídeos/nucleosídeo da
adenina não depende somente do tipo de receptor ativado, mas também da
célula com a qual esta molécula interagiu; além disso, deve-se levar em
consideração a modulação da concentração extracelular destas purinas pela
complexa cascata de ecto-enzimas e enzimas solúveis, que são capazes de
hidrolisar completamente o ATP até adenosina (Zimmermann, 2001; Robson et
al., 2006). Não menos importante, pode-se ainda citar as nucleotidases
intracelulares, que também podem participar do controle da concentração
extracelular destas moléculas, uma vez que elas têm a capacidade de ser
transportadas através da membrana plasmática.
No nosso estudo, as enzimas caracterizadas na fração solúvel podem
ser provenientes do rompimento da membrana celular durante o processo de
homogeneização do tecido cardíaco. Apesar disso, não podemos descartar a
presença de verdadeiras nucleotidases solúveis na fração estudada. E-
NTPDases solúveis têm sido detectadas em soro ou plasma de humanos e
117
outras espécies (Ireland & Mills, 1966; Coade & Pearson, 1989; Birk et al.,
2002; Yegutkin et al., 2003); todavia, a origem dessas enzimas é pouco
entendida e geralmente é atribuída à sua liberação após diferentes estímulos
celulares (Todorov et al., 1997; Yegutkin et al., 2000; Sorensen et al., 2003;
Yegutkin et al., 2006). Até momento, o papel fisiológico de E-NTPDases
solúveis ainda não é claro, mas estudos recentes tem considerado a
administração dessas enzimas para terapias antiplaquetárias, sob condições
experimentais pró-trombóticas (Pinsky et al., 2002; Robson et al., 2005; Kohler
et al., 2007). Assim como em outros tecidos, E-NTPDases solúveis poderiam
representar um importante sistema efetor auxiliar para a inativação local de
níveis elevados agudos de nucleotídeos, especialmente nos sítios de injúria e
inflamação no coração. Contudo, mais estudos são necessários para entender
a importância dessas atividades.
As características das 5’-nucleotidases solúveis, derivadas de vários
tecidos, tem sido demonstradas em um grande número de estudos,
principalmente com a enzima purificada (Naito & Lowenstein, 1981; Truong et
al., 1988; Zimmermann, 1992; Bianchi & Spychala, 2003). A expressão dessas
enzimas na forma solúvel no coração tem uma importante função fisiológica
pela geração de adenosina durante o processo de isquemia e na regulação dos
“pools” de nucleotídeos (Bianchi & Spychala, 2003).
A presença de atividade correspondendo a uma E-NTPDase,
hidrolisando os nucleotídeos da adenina, tem sido descrita em microssomas de
vários tecidos (Miura et al., 1987; Valenzuela et al., 1989; Alleva et al., 2002).
Essa atividade, juntamente com a da ecto-5’-nucleotidase também descrita em
microssomas cardíacos nessa tese, pode apresentar outros importantes papéis
118
além daqueles bem estabelecidos. A fração microssomal é enriquecida por
vesículas derivadas do retículo sarcoplasmático, a maior organela intracelular
que seqüestra e libera Ca
2+
do citoplasma,
regulando o desenvolvimento de
tensão e relaxamento no miocárdio (Meissner, 1984; Meissner & Henderson,
1987). Altas concentrações intracelulares de Ca
2+
ativam um rápido
bombeamento do íon para dentro do retículo por ação de uma Ca
2+
-ATPase,
por outro lado, a despolarização da membrana plasmática abre canais de Ca
2+
do retículo, liberando Ca
2+
para o citosol. Algumas evidências sugerem que a
saída anormal de Ca
2+
por estes canais pode estar associada com certas
patologias, incluindo arritmias e falência cardíaca (Györke et al., 2002; Hove-
Madsen et al., 2006). Estudos prévios têm demonstrado que os nucleotídeos
da adenina, a adenosina e a cafeína são capazes de afetar diferentemente a
liberação de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático tanto em músculo esquelético
quanto em fibras cardíacas (Meissner, 1984; Smith et al., 1986; Meissner &
Henderson, 1987; Rousseau et al., 1988; Duke & Steele, 1998; Butanda-Ochoa
et al., 2003; Hleihel et al., 2006). A modulação destes efeitos pode ocorrer
indiretamente através da sinalização via purinoceptores de membrana celular
(Butanda-Ochoa et al., 2003; Hove-Madsen et al., 2006), todavia, ativação
direta do canal de Ca
2+
tem sido observada em estudos com canais isolados ou
vesículas de retículo sarcoplasmático (microssomas) (Meissner, 1984;
Meissner & Henderson, 1987). Evidência adicional da influência da sinalização
purinérgica sobre a liberação de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático pode ser
visualizado em um estudo recente, no qual a adenosina foi descrita por
modular a liberação de Ca
2+
através da ligação aos receptores A
2A
presentes
no retículo (Hleihel et al., 2006). Sustentados pelos resultados discutidos
119
acima, nós somos capazes de sugerir que a atividade E-NTPDase e ecto-5’-
nucleotidase encontradas na fração microssomal poderiam modular a liberação
de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático, modulando, consequentemente, o
processo de excitação-contração do coração.
Como descrito anteriormente, por serem capazes de hidrolisar os
mesmos substratos que as E-NTPDases, porém com características cinéticas
diferenciadas, as E-NPPS podem estar relacionadas a funções semelhantes
mas em condições fisiológicas distintas.
De uma maneira geral, a presença de E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5’-
nucleotidase na fração solúvel pode contribuir para o melhor entendimento da
modulação da sinalização purinérgica no coração. Em adição, a caracterização
dessas enzimas nas vesículas derivadas de retículo sarcoplasmático pode
adicionar novas informações sobre os seus papéis no meio intracelular.
Os diferentes efeitos observados da administração de cafeína sobre a
atividade das nucleotidases identificadas em fração solúvel e microssomal de
tecido cardíaco de ratos acrescentam evidências sobre os possíveis papéis
dessas enzimas na modulação da sinalização purinérgica no coração.
120
2. CONCLUSÕES GERAIS
Nossos resultados sugerem que tanto a preparação solúvel quanto a
microssomal cardíaca foram capazes de hidrolisar os nucleotídeos ATP, ADP e
AMP com características bioquímicas e cinéticas que sugerem a atividade de
enzimas da família das E-NTPDases (para a hidrólise de ATP e ADP) e ecto-5’-
nucleotidase (para a hidrólise de AMP).
As análises preliminares de Western blot revelaram a presença da
NTPDase5 na fração solúvel e da NTPDase2 na fração microssomal. Em
adição, a enzima ecto-5’-nucleotidase foi identificada em ambas frações, mas
com mais intensidade na fração microssomal. Uma atividade relacionada à E-
NPP foi caracterizada nas duas preparações cardíacas estudadas.
A possível co-localização de E-NTPDases e E-NPPs juntamente com
ecto-5’-nucleotidases poderia constituir um complexo multi-enzimático
importante para a modulação da sinalização purinérgica em diversos sistemas,
incluindo as frações de coração estudadas.
Foi demonstrado que a administração crônica e aguda de cafeína
apresentou diferentes efeitos sobre a hidrólise de nucleotídeos da adenina na
preparação solúvel e microssomal cardíacas. Esses resultados, ainda
preliminares, necessitam ser melhor investigados na tentativa de relacionar
essas alterações com os conhecidos efeitos da cafeína sobre o coração.
Finalmente, a partir de nossos resultados, consideramos que existe um
complexo sistema de hidrólise de nucleotídeos que pode representar uma nova
abordagem de sinalização purinérgica cardíaca.
121
3. PERSPECTIVAS
1) Verificar a possível presença dos subtipos de receptores P1 e P2 na
fração microssomal cardíaca de ratos pelo método de Western blot;
2) Investigar o efeito direto (in vitro) da cafeína sobre as atividades das
ectonucleotidases estudadas;
3) Analisar através de Western blot possíveis alterações no imunoconteúdo
das ectonucleotidases estudadas frente aos tratamentos agudo e
crônico com cafeína;
4) Verificar o perfil dos nucleotídeos da adenina e seus metabólitos, pelo
método de HPLC, nas frações estudadas de ratos tratados com cafeína;
5) Investigar alguns parâmetros hemodinâmicos, através do método de
coração isolado, em ratos tratados com cafeína;
6) Solubilizar, purificar, caracterizar e identificar a enzima de microssoma.
122
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148
149
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Vias de liberação das purinas....................................................... 7
FIGURA 2. Vias de sinalização purinérgica..................................................... 9
FIGURA 3. Representação da maquinaria protéica envolvida na sinalização
purinérgica................................................................................................. 15
FIGURA 4. Árvore filogenética hipotética para os membros da família das
NTPDases (NTPDase 1 a 8)....................................................................... 18
FIGURA 5. E-NPPs participando da rede de metabolismo de nucleotídeos
extracelulares............................................................................................. 25
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