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CERES MATTOS DELLA LUCIA
ANÁLISE DE FOLATOS EM HORTALIÇAS FOLHOSAS
POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA, COM DETECÇÃO POR FLUORESCÊNCIA
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Ciência da Nutrição, para obtenção
do título de Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2009
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CERES MATTOS DELLA LUCIA
ANÁLISE DE FOLATOS EM HORTALIÇAS FOLHOSAS POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA, COM DETECÇÃO POR
FLUORESCÊNCIA
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa, como
parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Ciência da Nutrição,
para obtenção do título de Magister
Scientiae.
APROVADA: 17 de março de 2009.
________________________ _________________________
Prof. Sebastião César Cardoso Brandão Prof
a
. Sônia Machado Rocha Ribeiro
(Co-Orientador) (Co-Orientadora)
________________________ __________________________
Prof. José Benício Paes Chaves Profª. Hércia Stampini Duarte Martino
______________________________
Prof
a
. Helena Maria Pinheiro Sant’Ana
(Orientadora)
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Entrega teu caminho ao Senhor, confia nEle e o mais Ele fará”.
(Sl 37:5)
Agradeço a Deus o dom da vida e por ter-me abençoado com saúde e
força. Agradeço por ter colocado em meu caminho pessoas especiais, sem as quais nada
teria sentido.
Dedico aos meus pais, Lizete e Marco Tulio, e aos meus irmãos, Amanda e
Emanuel.
ii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Nutrição e
Saúde, pela oportunidade de realização da graduação e do mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado; e à FAPEMIG, pela
concessão de bolsa de iniciação científica.
À Profa. Helena Maria Pinheiro Sant’Ana, pela orientação,
companheirismo, amizade e força, desde os tempos da graduação até agora.
À Profa. Sônia Machado Rocha Ribeiro, pelos conselhos, sugestões e
informações e pela simpatia em sempre me receber.
Ao Prof. Sebastião César Cardoso Brandão, por todos os seus
conhecimentos compartilhados sobre química e cromatografia, essenciais para
o início e continuidade do trabalho.
Ao Prof. José Benício Paes Chaves, pelo aprendizado e auxílio no
delineamento experimental e orientação na análise estatística dos dados.
Ao Prof. Sebastião Tavares de Rezende, pelas preciosas informações a
respeito do processo de purificação por troca iônica, pelo fornecimento do
material para a construção da coluna de purificação e pelo empréstimo da
bomba peristáltica.
À Profa. Neuza Maria Brunoro Costa, pela boa vontade em sacrificar os
animais para retirada do sangue e coleta do plasma.
À Profa. Fátima Aparecida Ferreira de Castro, pela concessão do
Laboratório de estudo Experimental dos Alimentos.
Aos demais professores e funcionários do Departamento de Saúde e
Nutrição pelos ensinamentos e colaborações.
Ao Programa de Aquisição de Alimentos (PAA), em especial ao
Alessandro, pela colaboração no fornecimento das hortaliças para a pesquisa.
À Merck Eprova (Suíça) por nos ceder gentilmente os padrões
vitamínicos utilizados nesse estudo.
Aos Prof. Paul Finglas (Institute of Food Research, Noruega), Tony
Wright (Institute of Food Research, Noruega) e Maria King (Institute of Food
Research, Noruega) pela preciosa parceria no esclarecimento de dúvidas a
respeito da otimização da metodologia.
iii
A minha querida amiga e bolsista de Iniciação Científica, Elizangela
Rodrigues da Silva, pela integral dedicação a este trabalho, pela
disponibilidade em sempre ajudar e pela simpatia que sempre carrega consigo.
Às estagiárias do curso de Nutrição, Bárbara e Nice, pela amizade e
auxílio em momentos de muito sufoco.
A Daniela, minha grande amiga e companheira de monitorias de BIO
111 e de Laboratório, por sua ajuda, força, amizade, paciência e bom humor,
sempre.
Às minhas queridas amigas, em especial, Hudsara e Monise, pela troca
de confidências, ajuda em momentos difíceis e pelos lanchinhos especiais.
A Marina Maria, amiga e técnica, pelas valiosas dicas no Laboratório e
por todo o carinho.
A todos os meus colegas de Pós-Graduação, pelo ótimo tempo de
convívio e de estudos.
Aos meus queridos pais, Lizete e Marco Tulio, por tudo o que fizeram
por mim e por meus irmãos, pelo amor e pela confiança.
Aos meus irmãos, Amanda e Emanuel, por serem minha razão de viver.
Ao meu namorado, Marco Antônio, pelo amor, incentivo, e por ser um
grande exemplo de lutas e sucessos.
Aos meus tios, Ricardo e Terezinha, pelo carinho e apoio e por terem me
recebido em sua família durante cinco anos.
Aos meus queridos tios e tias, pelo auxílio sempre presente e que foi
responsável pela continuidade da minha permanência em Viçosa.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização deste trabalho.
A Deus, pelas bênçãos, pela vida e por permitir a minha chegada até
aqui.
iv
BIOGRAFIA
Ceres Mattos Della Lucia nasceu em 11 de junho de 1984, no município
de Três Corações, Minas Gerais.
Em maio de 2002, iniciou o curso de graduação em Nutrição na
Universidade Federal de Viçosa (MG), concluindo-o em março de 2007. Foi
bolsista de Iniciação Científica do PIBIC/CNPq durante o período de agosto de
2005 a julho de 2006, atuando em pesquisa sobre o controle de perdas de
vitamina C e carotenóides em hortaliças servidas em uma Unidade de
Alimentação e Nutrição Hospitalar, no município de Viçosa.
Em março de 2007, ingressou no Curso de Pós-Graduação Stricto
Sensu em Ciência da Nutrição da Universidade Federal de Viçosa (MG),
atuando na linha de pesquisa ‘Valor Nutricional, Funcional e Controle de
Qualidade de Alimentos e de Dietas’ e pleiteou o título de mestre em março de
2009.
v
SUMÁRIO
RESUMO ...................................................................................................... vii
ABSTRACT..................................................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................. 1
2. OBJETIVOS............................................................................................... 6
2.1. Objetivo Geral ..................................................................................... 6
2.2. Objetivos Específicos .......................................................................... 6
3. METODOLOGIA GERAL ........................................................................... 7
3.1. Material................................................................................................ 7
3.1.1. Matéria-prima................................................................................ 7
3.1.2 Equipamentos................................................................................ 7
3.1.3 Reagentes e outros materiais ........................................................ 8
3.2 Métodos................................................................................................ 9
3.2.1. Coleta, amostragem, preparo e acondicionamento das hortaliças 9
3.2.2. Extração de folatos ..................................................................... 10
3.2.3. Desconjugação de poliglutamatos .............................................. 10
3.2.4. Purificação do extrato de hortaliça.............................................. 11
3.2.5. Curvas de calibração e quantificação de THF, 5-MTHF e 5-FTHF11
3.2.6. Análise de folatos por CLAE ....................................................... 13
3.2.7. Identificação de folatos ............................................................... 14
3.2.8. Cálculo da estabilidade dos folatos nas hortaliças após cocção 14
3.2.9. Testes para validação da metodologia ....................................... 15
3.3. Delineamento experimental e análise estatística dos dados............. 16
4. RESULTADOS......................................................................................... 18
4.1. Artigo 1.............................................................................................. 18
RESUMO.............................................................................................. 19
ABSTRACT........................................................................................... 20
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 21
2. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 23
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 28
4. CONCLUSÕES................................................................................. 35
5. AGRADECIMENTOS........................................................................ 35
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................. 35
4.2. Artigo 2.............................................................................................. 39
RESUMO.............................................................................................. 40
ABSTRACT........................................................................................... 41
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 42
2. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................ 43
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 48
4. CONCLUSÕES ................................................................................ 61
5. AGRADECIMENTOS........................................................................ 62
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................. 62
5. CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................... 67
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................... 68
vi
RESUMO
DELLA LUCIA, Ceres Mattos, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, março de
2009. Análise de folatos em hortaliças folhosas por cromatografia
líquida de alta eficiência, com detecção por fluorescência.
Orientadora: Helena Maria Pinheiro Sant’Ana. Co-Orientadores: Sebastião
César Cardoso Brandão e Sônia Machado Rocha Ribeiro.
A baixa ingestão de folatos tem sido apontada como possível causa de
doenças graves que atingem o homem, como as doenças cardíacas, o câncer
e as malformações congênitas. Informações na literatura sobre a concentração
de folatos em hortaliças são escassas e muitas vezes contraditórias, devido às
dificuldades associadas à análise dessa vitamina, que por sua vez estão
relacionadas à sua baixa estabilidade, presença em pequenas concentrações
em sistemas biológicos, complexos procedimentos de extração e variedade de
formas. Esse estudo teve como objetivo otimizar uma metodologia para
determinação da concentração natural de diferentes formas de folatos
(tetraidrofolato – THF, 5-metiltetraidrofolato – 5-MTHF e 5-formiltetraidrofolato –
5-FTHF) em hortaliças de elevado consumo no Brasil e cultivadas em Viçosa,
MG (couve, espinafre, mostarda, floretes e folhas de brócolis). Visou ainda
comparar as concentrações de folatos entre duas estações do ano (inverno e
primavera) e avaliar sua estabilidade a diferentes práticas culinárias comuns de
cocção (cocção a vapor, cocção sob imersão em água e refogamento em óleo).
A metodologia otimizada no preparo das hortaliças consistiu de
homogeneização das mesmas em um sistema tampão (tampão fosfato 0,1 M,
pH 6,0), seguido por aquecimento e centrifugação, procedendo-se a
desconjugação enzimática dos poliglutamatos para monoglutamatos, utilizando
conjugase proveniente de plasma de rato. Após a fase de extração, o extrato
contendo os monoglutamatos foi purificado utilizando coluna de troca iônica. A
análise dos folatos foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE), utilizando gradiente de eluição e fase móvel composta de acetonitrila e
solução tampão fosfato (30 mM, pH ajustado para 2,3 com ácido fosfórico). Foi
utilizado um delineamento inteiramente casualizado com duas estações do ano
(inverno e primavera), cinco hortaliças e quatro repetições em cada estação.
Realizou-se a análise de variância (α= 5%) para verificar diferenças entre as
duas estações. Para verificação de diferenças entre a concentração dos
compostos nas hortaliças cruas e submetidas à cocção, foi aplicado o teste t
vii
pareado, ao nível de 5% de probabilidade, sendo as hortaliças comparadas
duas a duas (hortaliça crua x hortaliça cozida/refogada). Para essa análise,
foram consideradas oito repetições (quatro repetições no inverno e quatro na
primavera). A concentração média de folatos totais encontrado foi de 549,67 ±
467,07 µg/100 g em couve; 754,57 ± 564,16 µg/100 g em floretes de brócolis;
731,51 ± 384,01 µg/100 g em folhas de brócolis; 241,04 ± 121,80 µg/100 g em
espinafre e 568,76 ± 383,20 µg/100 g em mostarda. Não foram encontradas
diferenças significativas na concentração de folatos das hortaliças entre o
inverno e a primavera. O 5-FTHF foi o isômero encontrado em maior
quantidade nas hortaliças estudadas, sendo os floretes de brócolis
considerados a melhor fonte desse isômero e o espinafre, a hortaliça que
apresentou as menores concentrações. O refogamento em óleo preservou a
concentração das três isoformas de folatos em couve, espinafre e mostarda.
Por outro lado, a cocção sob imersão em água foi o método que menos
preservou a concentração de 5-FTHF e THF em floretes de brócolis (retenção
de 17,01% para THF e de 57,68% para 5-FTHF). A cocção a vapor também
não se mostrou eficiente na preservação de THF em floretes de brócolis
(41,83% de retenção). A metodologia otimizada mostrou-se confiável para
determinação simultânea das três formas mais importantes de folatos (THF, 5-
MTHF e 5-FTHF) em hortaliças folhosas cruas e cozidas. A estabilidade de
folatos mostrou-se fortemente dependente de cada hortaliça, do método de
cocção e da forma isomérica. Todas as hortaliças mostraram-se como boas
fontes de folatos, sendo que seu consumo pela população deve ser estimulado.
viii
ABSTRACT
DELLA LUCIA, Ceres Mattos, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, march,
2009. Folate analysis in leafy vegetables by high performance liquid
chromatography and detection by fluorescence. Advisor: Helena Maria
Pinheiro Sant’Ana. Co-Advisors: Sebastião César Cardoso Brandão and
Sônia Machado Rocha Ribeiro.
The low intake of folate has been identified as a possible cause of
serious diseases that affect man, such as heart disease, cancer and congenital
malformations. Information in the literature about the concentration of folate in
vegetables are rare and often contradictory, due to difficulties associated with
analysis of this vitamin, which are related to its low stability, the presence in
small concentrations in biological systems, complex procedures of extraction
and variety of forms. This study aimed to optimize a methodology for
determining the concentration of different natural forms of folate
(tetrahydrofolate - THF, 5-methyl tetrahydrofolate - 5-MTHF and 5-formyl
tetrahydrofolate - 5-FTHF) in vegetables of high consumption in Brazil and
grown in Viçosa , MG (kale, spinach, mustard, flowers and sheets of broccoli).
Also aimed to compare the concentrations of folate between two seasons
(winter and spring) and assess its stability to various common culinary cooking
practices (steam cooking, cooking on immersion in water and stir frying). The
optimized method to prepare the vegetables consisted of homogenization in a
buffer system (0.1 M phosphate buffer, pH 6.0), followed by heating and
centrifugation, and enzymatic deconjugation of poliglutamate to monoglutamate
using conjugase from rat plasma. After the stage of extraction, the extract
containing the monoglutamate was purified using ion exchange column. The
folate analysis was carried out by high performance liquid chromatography
(HPLC) using gradient elution and mobile phase consisting of acetonitrile and
phosphate buffer (30 mM, pH adjusted to 2.3 with phosphoric acid). We used a
completely randomized design with two seasons (winter and spring), five
vegetables and four replications in each season. Analysis of variance (α = 5%)
was used to determine differences between the two seasons. To check
differences between the concentration of compounds in raw and cooked
vegetables it was applied the paired t test, at 5% level of probability, and the
vegetables compared two by two (vegetable raw x vegetables cooked). For this
analysis, we used eight replicates (four replicates in winter and four replicates in
ix
spring). The average concentration of total folate was 549.67 ± 467.07 μg/100 g
in kale; 754.57 ± 564.16 μg/100 g in flowers of broccoli; 731.51 ± 384.01 μg/100
g in leaves of broccoli, 241.04 ± 121.80 μg/100 g in spinach and 568.76 ±
383.20 μg/100 g in mustard. There were no significant differences in the
concentration of folate in vegetables analyzed in winter and spring. 5-FTHF was
found in greater quantity in vegetables studied, and the flowers of broccoli were
considered the best source of this isomer. Spinach was vegetable that had the
lowest concentrations. Stir frying preserved the concentration of the three
isoforms of folate in kale, spinach and mustard. Furthermore, cooking under
immersion in water was the method that less preserved the concentration of 5-
FTHF and THF in flowers of broccoli (retention of 17.01% for THF and 57.68%
for 5-FTHF). Steam cooking also was not effective in preserving THF in flowers
of broccoli (41.83% retention). The optimized methodology showed to be
reliable for the simultaneous determination of three major forms of folate (THF,
5-MTHF and 5-FTHF) in raw and cooked leafy vegetables. The stability of folate
was strongly dependent on the kind of vegetable, the method of cooking and
the isomeric form. All the vegetables were considered good sources of folate,
and its consumption by the population should be encouraged.
x
1. INTRODUÇÃO GERAL
Folato é o termo utilizado para denominar compostos com atividade
semelhante ao ácido pteroilglutâmico (PteGlu), também conhecido como ácido
fólico. Os folatos possuem em comum a estrutura química do ácido fólico
(forma sintética), sendo constituído por um anel de pteridina unido por uma
ponte de metil a um resíduo de ácido p-aminobenzóico que, por sua vez, liga-
se a um resíduo de ácido glutâmico (VARELA-MOREIRAS et al., 2000). As
diversas formas de folato se diferenciam pelo anel de pteridina, que pode
apresentar várias formas reduzidas e vários tipos de substituições de radicais,
e pelo resíduo de p-aminobenzoglutamato, que pode apresentar várias ligações
peptídicas a um número variável de resíduos de glutamato (Figura 1)
(STOKES; WEBB, 1999).
Figura 1: Estrutura química do ácido pteroilglutâmico.
Fonte: Varela-Moreiras et al., 2000.
Nos alimentos, os folatos encontram-se, em sua maioria, como
derivados poliglutâmicos e podem apresentar-se em diversas formas
isoméricas, com base no seu estado de oxidação e em substituições no anel de
pteridina. As fontes naturais mais ricas em folatos são as hortaliças verde-
escuras, como espinafre, brócolis, couve manteiga e couve de bruxelas. Outros
vegetais, como couve-flor, aspargos, milho, e frutas cítricas também são boas
fontes (GONZÁLEZ; GARCIA, 2003).
1
As formas naturais de folatos mais abundantes nos alimentos são os
pteroilpoliglutamatos que contêm entre dois e sete glutamatos. Estes folatos
naturais incluem 5-metiltetraidrofolato (5-MTHF); 5-formiltetraidrofolato (5-
FTHF); 10-formiltetraidrofolato (10-FTHF); 5, 10- metilenotetraidrofolato (5,10-
metileno-THF); 5,10-meteniltetraidrofolato (5,10-metenil-THF); 5-
formininotetraidrofolato (5-forminino-THF); 5,6,7,8-tetraidrofolato e diidrofolato
(DHF) (MARTINEZ et al., 2005).
As formas naturais de folato predominantes nos alimentos, tanto em
frutas como em hortaliças são o 5-MTHF e o 5-FTHF; nos produtos animais
são o 5-MTHF e o THF; em produtos cereais são o 5-MTHF, o 10-
formiltetraidrofolato (10-FTHF) e o ácido 10-formilfolico, juntamente com o
ácido fólico usado para enriquecimento (RUGGERI et al., 1999).
Aproximadamente 80% do folato da dieta estão na forma de
poliglutamatos e necessitam ser clivados para a forma de monoglutamatos
para serem absorvidos pelo organismo, e também quantificados (FINGLAS et
al., 1999).
A principal função dos folatos na célula está em sua capacidade de
receber e doar elétrons a partir de unidades de carbono (VARELA-MOREIRAS
et al., 2000), atuando como cofator essencial das reações de transferências de
unidades monocarbono, incluindo a biossíntese de purinas e pirimidinas, bem
como as interconversões de aminoácidos (EICHHOLZER et al., 2006). Em
humanos, os folatos atuam na interconversão de serina e glicina, participam no
catabolismo da histidina (DROGUETTI; PENTEADO, 2003) e na interconversão
de homocisteína em metionina, reação que requer vitamina B
12
como coenzima
e 5-metiltetraidrofolato como substrato. Esta reação é muito importante por se
supor ser a maior fonte de metionina para a síntese de S-adenosil-metionina,
um importante agente metilante in vivo (GREGORY, 1997).
A deficiência de folato acarreta uma série de doenças. O transtorno que
ocorre mais freqüentemente em virtude da carência de folatos é a anemia
macrocítica e megaloblástica, cuja sintomatologia clínica é muito semelhante à
da anemia induzida pela deficiência de vitamina B
12
(HERBERT, 1967).
A deficiência de folato também pode estar associada com várias
complicações na gestação, tais como aborto espontâneo, síndrome
hipertensiva da gravidez (pré-eclâmpsia), retardo no crescimento intra-uterino e
hemorragia (ROSE; MENNUTI, 1994).
2
Evidências epidemiológicas, clínicas e teratológicas têm demonstrado
que o folato está envolvido na prevenção e patogênese de defeitos do tubo
neural (DTN). As anomalias descritas mais freqüentemente são anencefalia e
espinha bífida, que são acompanhadas de retardo no crescimento e, em alguns
casos, morte prematura (LIMA et al., 2002).
Devido às diversas funções desempenhadas pelos folatos na saúde
humana, existe a necessidade de desenvolver e otimizar métodos que
determinem a concentração de folatos em alimentos, de forma segura,
específica e sensível.
A análise de folatos em alimentos envolve alguns desafios em
decorrência da baixa concentração em que se encontram naturalmente nos
alimentos, da presença de inúmeros interferentes, da complexidade da matriz e
da exigência de cuidados especiais devido à baixa estabilidade desse
nutriente. Os maiores desafios para determinação de folatos em alimentos
incluem, além do melhoramento dos processos de extração e purificação, o
desenvolvimento e a validação de métodos simultâneos para as diferentes
isoformas que reduziriam, sensivelmente, o tempo gasto para a análise e os
custos (CATHARINO et al., 2006).
Nas frutas e hortaliças, os derivados de folatos e sua distribuição nas
diferentes porções são afetados pela luz, uma vez que a síntese da vitamina
ocorre na fotorrespiração. O grau de maturação também é um parâmetro
importante na concentração de folatos nessas matrizes alimentares, já que
participam do processo de divisão celular, sendo sua quantidade maior nos
tecidos em divisão que nos tecidos maduros, onde não há ocorrência desse
processo (SCOTT et al., 2000). Minerais como magnésio e potássio também
são bastante importantes na produção de folatos pelas frutas e hortaliças,
participando da biossíntese dessa vitamina (VAHTERISTO et al., 1997). Dessa
forma, a variação na concentração dessa vitamina verificada nos estudos pode
se dever a essas variações endafoclimáticas, além da variedade de espécies e
da própria metodologia utilizada na sua determinação (LIMA-PALLONE et al.,
2008).
Os folatos são sensíveis à luz, aos ácidos, aos álcalis, aos agentes
oxidantes e aos redutores. Por seu caráter hidrossolúvel, também podem ser
perdidos na água de preparação ou cocção dos alimentos (VARELA-
MOREIRAS, 2000). Dessa forma, torna-se fundamental a adoção de métodos
3
racionais de cocção, visando ao atendimento das recomendações de ingestão
de folatos e para que o próprio planejamento de dietas leve em consideração
possíveis perdas.
Dentro desse panorama, verifica-se a importância da otimização e
validação de metodologia confiável que permita a determinação da
concentração natural de folatos em hortaliças cultivadas no Brasil em distintas
épocas do ano, além da avaliação da estabilidade dessa vitamina frente a
diferentes métodos de cocção.
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Vitaminas - Aspectos nutricionais, bioquímicos, clínicos e analíticos.
1.ed., Manole, cap.13, 2003. 612p.
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y Técnicas. Universidad San Pablo-CEU, Madrid.
5
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Analisar a concentração natural de folatos em hortaliças folhosas por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com detecção por
fluorescência.
2.2. Objetivos Específicos
• Otimizar uma metodologia para extração e análise da concentração natural
de folatos por CLAE em hortaliças cruas e submetidas a diferentes métodos
de cocção;
• Determinar a concentração natural de folatos (5-FTHF, 5-MTHF e THF) em
hortaliças cruas e cozidas, cultivadas no município de Viçosa, MG;
• Comparar a concentração de folatos das hortaliças cultivadas no inverno e
primavera;
• Avaliar a estabilidade de folatos nas hortaliças cozidas, utilizando métodos
de cocção usados rotineiramente;
6
3. METODOLOGIA GERAL
3.1. Material
3.1.1. Matéria-prima
Foram utilizadas as hortaliças couve (Brassica oleracea L.), mostarda
(Sinapsis arvensis), espinafre (Spinacia oleracea L.) e brócolis (Brassica
oleracea var. itálica) (floretes e folhas), obtidas em Viçosa, MG no Programa de
Aquisição de Alimentos (PAA). O Programa é vinculado ao Ministério de
Desenvolvimento Social e Combate à Fome (MDS) e possui convênio firmado
com os estados que apresentam interesse em cadastrar seus produtores
rurais, como o estado de Minas Gerais, por exemplo.
As hortaliças foram cultivadas pelo sistema convencional, sem utilização
de agrotóxicos, utilizando água de córrego para irrigação e esterco de frango
para adubação. As hortaliças foram provenientes de um grupo de fornecedores
que semanalmente se reunia para realizar a doação ao Programa.
As hortaliças foram coletadas nos meses de agosto e outubro, em seu
estádio de comercialização, caracterizando condições adequadas para
consumo imediato (Figura 1) e acondicionadas em sacos plásticos. A
preparação e análises das hortaliças foram realizadas em, no máximo, 48
horas após a coleta.
Mostarda Brócolis
(Floretes e Flores)
Couve Espinafre
Figura 1. Representação fotográfica das hortaliças utilizadas.
3.1.2 Equipamentos
Para homogeneização das hortaliças, utilizou-se processador doméstico
(Faet Multipratic, modelo MC5).
Para o preparo das hortaliças e para a análise de folatos, utilizou-se
microtriturador (Marconi modelo MA 102); bomba de vácuo (modelo CA
Fanem); centrífuga (Excelsa Baby II, com cruzeta angular 4 x 100 mL modelo
206-R, Fanem) e banho metabólico (Dubnoff, Marconi). Para o preparo da fase
móvel foram usados: pHmetro (Hexis, UB10); sistema de filtração (All Glass),
7
membranas de filtração de 0,45 μm de porosidade e sistema de degaseificação
de fase móvel (Shimadzu, modelo DGU-2 A).
O Sistema de CLAE (Shimadzu, modelo SCL 10AD VP) empregado para
análise de folatos foi composto de bomba de alta pressão com válvula para
gradiente quaternário de baixa pressão (modelo LC-10AD VP); injetor
automático com alça de amostragem de 50 μL, (modelo SIL-10AF); detector de
fluorescência (modelo RF10AXL). O sistema foi controlado pelo software Multi
System, Class VP 6.12.
3.1.3 Reagentes e outros materiais
Para análise de folatos, foram utilizadas acetonitrila grau HPLC (Tedia,
EUA) e água ultrapura produzida em sistema Milli-Q
®
(Millipore, EUA). Foram
utilizados reagentes com grau de pureza para análise (p.a.): fosfato de sódio
monobásico anidro (Synth, Brasil), ácido ascórbico (Vetec, Brasil), 2-
mercaptoetanol (Vetec, Brasil), ácido fosfórico (Proquímios, Brasil), acetato de
sódio (Chemco, Brasil) e cloreto de sódio (Vetec, Brasil).
Para purificação dos extratos foi preparada uma coluna com fase
estacionária de Q-Sepharose (resina) (Pharmacia, EUA) em 20% de etanol
70%, utilizando uma seringa de plástico (3 mL de capacidade; 9 cm de altura; 1
cm de diâmetro) como suporte e fluxo estabelecido com auxílio de bomba
peristáltica (Pharmacia Biotech).
Para filtração dos extratos foi utilizado papel de filtro (Inlab, tipo 50,9 cm
de diâmetro). Antes da injeção, os extratos e soluções padrão foram filtrados
em unidades filtrantes (HV Millex, 0,45 μm de porosidade, Millipore, Brasil).
Os padrões de (6S)-5,6,7,8-tetraidrofolato de sódio (THF), (6S)-5-metil-
5,6,7,8-tetraidrofolato (5-MTHF) e (6S)-5-formil-5,6,7,8-tetraidrofolato (5-FTHF)
foram cedidos gentilmente pela Merck-Eprova (Suíça) e mantidos a -18
o
C até
utilização.
8
3.2 MÉTODOS
3.2.1. Coleta, amostragem, preparo e acondicionamento das hortaliças
Foram coletados aleatoriamente cerca de 1 a 2 kg de cada hortaliça.
Foram realizadas quatro coletas em cada estação (inverno e primavera), sendo
cada semana de coleta caracterizada como uma repetição.
No Laboratório foi feita a remoção das partes não comestíveis das
hortaliças (talos e folhas danificadas), sendo em seguida, lavadas em água
corrente e o excesso de água removido com auxílio de papel toalha.
As hortaliças foram preparadas no Laboratório de acordo com as
práticas culinárias comuns, utilizadas em domicílio e em restaurantes de
pequeno e médio porte, possibilitando a análise da concentração de folatos em
condições semelhantes às reais de preparação e consumo.
3.2.1.1. Preparo de couve e mostarda
Foi realizado o quarteamento das folhas de couve e mostarda, de modo
que as porções dispostas em diagonal foram agrupadas, sendo uma das partes
analisada crua e outra analisada após fatiamento manual utilizando faca (tiras
com espessura de aproximadamente 0,5 cm) (couve fatiada e mostarda). A
couve também foi analisada sob a forma rasgada, sendo o corte realizado
manualmente. Após o pré-preparo, as hortaliças foram refogadas em óleo.
Para cada 100 g de hortaliça, foram utilizados 8 mL de óleo de soja (1 colher
de sopa), sendo o tempo de cocção igual a 2 minutos.
3.2.1.2. Preparo das folhas de brócolis e do espinafre
As folhas de brócolis e espinafre foram divididas em duas partes, sendo
uma delas analisada crua e a outra, analisada após refogar em óleo. Para cada
100 g de hortaliça, foram utilizados 8 mL de óleo de soja, sendo o tempo de
cocção igual a 2 minutos.
3.2.1.3. Preparo dos floretes de brócolis
Os floretes de brócolis foram divididas em três partes, sendo uma delas
analisada crua, a outra analisada após cocção a vapor (utilizando panela a
vapor doméstica) e a terceira parte, após cocção sob imersão em água em
ebulição, em quantidade suficiente para cobrir a hortaliça (100 g de hortaliça
9
em 1000 mL de água (LIMA-PALLONE et al., 2008). O tempo de cocção foi
igual a 6 minutos.
Logo depois da cocção, todas as hortaliças foram processadas em
multiprocessador para completa homogeneização, sendo acondicionadas em
geladeira doméstica até o momento da análise.
3.2.2. Extração de folatos
Durante as etapas de extração e análise, as hortaliças e o extratos foram
mantidos sob proteção da luz solar e artificial, pela utilização de vidrarias
âmbar, papel alumínio e cortinas do tipo “blackout”, e sob proteção do oxigênio
por meio da utilização de tampas e de ambiente com gás nitrogênio nas
vidrarias.
A extração foi baseada em metodologia utilizada por Vahteristo et al.
(1997), Jastrebova et al. (2003) e Stea et al. (2006) e otimizada em nosso
laboratório. Para a extração foram pesados em balança digital semi-analítica
cerca de 3,00 g de hortaliça (o peso exato foi anotado) previamente
homogeneizada em processador de alimentos. A hortaliça foi triturada com 15
mL de solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0, colocados de uma única vez ,
contendo ácido ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1% e filtrada a vácuo em
funil de büchnner. O volume foi completado com água ultrapura para 25 mL em
balão volumétrico e o extrato obtido foi aquecido por aproximadamente 12
minutos em banho-maria a 100 ºC, sob agitação em frasco de vidro âmbar,
fechado, em atmosfera inerte, obtida com fluxo de nitrogênio. Em seguida, o
extrato foi resfriado com auxílio de gelo, centrifugado (1789 g, por 30 minutos)
e, em seguida, utilizado para desconjugação de poliglutamatos.
3.2.3. Desconjugação de poliglutamatos
Para desconjugação dos poliglutamatos a monoglutamatos, 100 μL de
plasma de rato contendo a enzima conjugase (γ-glutamil carboxipeptidase)
foram adicionados ao sobrenadante (3mL) obtido no procedimento de extração
descrito anteriormente. O plasma de rato foi obtido por meio da centrifugação
(2500 g por 10 minutos) de sangue de ratos Wistar, machos e saudáveis,
obtidos no Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento de Nutrição
e Saúde da Universidade Federal de Viçosa. O sobrenadante obtido a partir
10
desse procedimento (100 μL) foi adicionado em tubos eppendorf e armazenado
a -18°C até utilização.
Os extratos de hortaliças contendo o plasma permaneceram em banho-
maria a 37°C por 3 horas. Em seguida, para ocorrer inativação enzimática, os
extratos foram aquecidos em água fervente por 5 minutos (JASTREBOVA et
al., 2003). Para efeito de controle, investigou-se a presença de folatos
endógenos, injetando na coluna cromatográfica alíquotas de plasma de rato
diluídas em solução extratora, e comparando-se os tempos de retenção dos
picos encontrados com aqueles presentes nos extratos de hortaliças e de
soluções de padrões.
3.2.4. Purificação do extrato de hortaliças
A purificação do extrato foi feita com base em procedimento descrito por
Jastrebova et al. (2003). O extrato obtido no procedimento anterior foi
purificado utilizando coluna de troca iônica, com fase estacionária de Q-
Sepharose. A coluna foi pré-condicionada com metanol e água (1:1) a um fluxo
de 1-2 gotas/segundo. O extrato foi aplicado à coluna a um fluxo de 2
gotas/segundo, aproximadamente. Em seguida, a eluição dos folatos retidos foi
feita com acetato de sódio (0,1 M) contendo cloreto de sódio 10%, ácido
ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1%.
Antes da injeção cromatográfica, o extrato foi filtrado através de
unidades filtrantes com porosidade de 0,45 μm.
3.2.5. Curvas de calibração de THF, 5-MTHF e 5-FTHF
A solução estoque dos padrões de folato (200 μg/mL), assim como as
soluções com concentrações crescentes dos padrões, foram preparadas em
solução extratora (solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0, contendo ácido
ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1%).
A concentração real dos padrões de folato foi verificada por
espectrofotometria e corrigida, utilizando-se a seguinte equação:
A = E x C x L
Em que:
A = Absorvância máxima (lida a 297 nm para THF, a 290 nm para 5-MTHF e a
285 nm para 5-FTHF, em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 2,0) (BALL,1998);
11
E = Coeficiente de absortividade molar (para THF, 27; para 5-MTHF, 32 e para
5-FTHF, 31,5) (BLAKELY, 1969);
C = Concentração molar;
L = Largura da cubeta (1 cm).
As curvas de calibração dos isômeros de folatos (THF, 5-MTHF e 5-
FTHF) foram elaboradas considerando a concentração dos componentes nas
hortaliças. Utilizou-se injeção em duplicata, de seis concentrações crescentes
de soluções padrão na faixa de 0,0095 a 0,3821 μg/mL para curva de THF;
0,2432 a 9,73 μg/mL para curva de 5-FTHF e 0,049 a 0,98 μg/mL para curva
de 5-MTHF. As curvas elaboradas com faixas amplas foram necessárias
devido à variação de concentração dos isômeros nas hortaliças, além da
preocupação com as possíveis perdas nos processos de cocção.
As curvas de calibração e equações de regressão utilizadas para cálculo
de folatos nas hortaliças são apresentadas na Figura 2.
12
0,0
2000000,0
4000000,0
6000000,0
8000000,0
10000000,0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01
Peso Injetado (mcg)
Área do Pico
THF
Y = 1178396061 X + 158374
R
2
= 0
,
9931
0,0
2000000,0
4000000,0
6000000,0
8000000,0
10000000,0
0 0,002 0,004 0,006
Peso Injetado (mcg)
Área do Pico
0,0
5000000,0
10000000,0
15000000,0
20000000,0
25000000,0
30000000,0
35000000,0
40000000,0
0 0,1 0,2 0,3 0,4
Peso Injetado (mcg)
Área do Pico
5-MTHF
Y = 163409416 X – 262055
R
2
= 0
,
9936
5-FTHF
Y = 119560115
,
8 X – 1041248
R
2
= 0
,
9760
Figura 2. Correlação linear entre a concentração de THF, 5-MTHF e 5-FTHF e
as áreas dos picos correspondentes.
Eixo Y: Áreas médias dos picos obtidas pelas injeções em duplicata.
3.2.6. Análise de folatos por CLAE
O sistema de CLAE (Shimadzu, modelo SCL 10AD VP) empregado na
análise de folatos foi composto de bomba de alta pressão (com válvula para
gradiente quaternário de baixa pressão), modelo LC-10AD VP; injetor
automático com alça de amostragem de 50 μL, modelo SIL-10AF e detector de
fluorescência modelo RF10AXL. O sistema foi controlado pelo software Multi
13
System, Class VP 6.12. A separação dos folatos foi feita em coluna Shim Pack
100 RP18, 150 mm x 4,6 mm, 4,6 μm (Merck, Alemanha).
As condições cromatográficas utilizadas foram: fase móvel composta por
gradiente binário contendo acetonitrila e solução tampão fosfato (NaH
2
PO
4
30
mM, pH ajustado para 2,3 com H
3
PO
4
); fluxo 0,7 mL/min; volume injetado, 50
µL, detecção por fluorescência com excitação a 290 nm e emissão a 360 nm. O
gradiente iniciou-se com acetonitrila 6% (v/v), sendo mantido por 6 minutos e
foi aumentado linearmente para 25% em 25 minutos, permanecendo nessa
concentração durante 2 minutos, retornando em seguida às condições iniciais.
A coluna foi re-equilibrada por 15 minutos antes da próxima injeção. O tempo
total de corrida foi de 43 minutos.
Para evitar a formação de bolhas e controlar a grande variação da
pressão, foi necessário utilizar um sistema de degasamento da fase móvel com
gás hélio antes e durante as corridas cromatográficas. Assim, a fase móvel foi
degaseificada por 15 minutos a 150 kpa antes do início das análises e a 100
kpa ao longo das corridas.
3.2.7. Identificação e quantificação de folatos
A identificação do THF, 5-MTHF e 5-FTHF nos extratos foi realizada por
comparação dos tempos de retenção obtidos nos extratos com os obtidos para
os respectivos padrões analisados sob as mesmas condições, e por co-
cromatografia (adição de padrões vitamínicos às hortaliças e verificação do
aumento das áreas dos respectivos picos).
A partir das curvas de calibração e equações de regressão obtidas,
foram calculadas as concentrações dos isômeros de folatos presentes nas
hortaliças. O valor real da concentração nas hortaliças foi obtido por cálculos a
partir das diluições realizadas.
3.2.8. Cálculo da estabilidade dos folatos nas hortaliças após cocção
A porcentagem de retenção da concentração de folatos após diferentes
métodos de cocção foi ajustada levando-se em consideração as modificações
de peso sofridas pelas hortaliças. Para tanto, foi utilizada a fórmula da retenção
verdadeira ou real (% RR) (MURPHY; CRINER; GRAY, 1975), como descrito
abaixo:
14
% RR = Fcoz (µg) x Hcoz (g) x 100
Fc (µg) x Hc (g)
Em que:
Fcoz = concentração de folato na hortaliça cozida
Fc = concentração de folato na hortaliça crua
Hcoz = quantidade de hortaliça cozida
Hc = quantidade de hortaliça crua
3.2.9. Testes para validação da metodologia
3.2.9.1. Recuperação e faixa de linearidade
Testes de recuperação de THF, 5-MTHF e 5-FTHF foram realizados pela
adição dos padrões ao espinafre cru, couve rasgada refogada, folhas de
brócolis cruas, floretes de brócolis cozidos sob imersão e mostarda refogada na
proporção de 20 a 100% da concentração médio original das hortaliças. As
porcentagens de recuperação foram obtidas a partir da diferença percentual
entre as concentrações iniciais analisadas e as adicionadas às hortaliças
previamente homogeneizadas.
A determinação da faixa de linearidade foi feita pela injeção, em
duplicata, de seis concentrações crescentes das soluções padrão de THF
(entre 0,0095 e 0,3821 μg/mL), 5-MTHF (entre 0,049 e 0,98 μg/mL) e 5-FTHF
(entre 0,2432 e 9,73 μg/mL), utilizando as mesmas condições cromatográficas
empregadas para análise dos extratos. Os dados obtidos para as áreas dos
picos foram usados para análise de regressão linear (LANÇAS, 2004).
3.2.9.2. Limites de detecção e quantificação
A avaliação do limite de detecção (LD) foi feita por diluições sucessivas
dos padrões de THF, 5-MTHF e 5-FTHF, seguida da determinação da menor
quantidade detectável, como sendo três vezes o valor da amplitude do ruído da
linha de base (S/R≥3). O limite de quantificação (LQ) foi considerado como
sendo 10 vezes o LD (CATHARINO et al., 2006).
3.2.9.3. Repetibilidade
O teste de repetibilidade foi realizado pela extração (cinco repetições) e
análise em duplicata de uma mesma hortaliça contendo os isômeros THF, 5-
MTHF e 5-FTHF. A avaliação da repetibilidade foi feita pelo cálculo do
15
coeficiente de variação das áreas dos picos dos componentes analisados
(LANÇAS, 2004).
3.2.9.4. Avaliação da estabilidade de folatos em extrato de hortaliças
Visando avaliar possíveis perdas de folatos durante o armazenamento
do extrato de hortaliças antes da análise, foi realizado um estudo de
estabilidade utilizando espinafre cru, em duas diferentes temperaturas
(refrigeração e congelamento). O extrato de espinafre cru foi analisado após
diferentes tempos de estocagem em temperatura de refrigeração (8°C) (Tempo
0 – imediatamente após o procedimento de extração e Tempo 1 – 4 horas após
o procedimento de extração) e em temperatura de congelamento (-18°C)
(Tempo 2 – 24 horas após a extração; Tempo 3 – 48 horas após a extração e
Tempo 4 – 7 dias após a extração). Cada injeção foi realizada em triplicata.
3.3. Delineamento experimental e análise estatística dos dados
Para o estudo das concentrações de folatos foi considerado um
delineamento inteiramente casualizado com duas estações do ano (inverno e
primavera), cinco hortaliças e quatro repetições em cada estação. Realizou-se
a análise de variância (α= 5%) para verificar a existência de diferenças
significativas entre as duas estações. Para verificação de diferenças
significativas entre a concentração dos compostos nas hortaliças cruas e
submetidas à cocção, foi aplicado o teste t pareado, ao nível de 5% de
probabilidade, sendo as hortaliças comparadas duas a duas (hortaliça crua x
hortaliça cozida/refogada). Para essa análise, foram consideradas oito
repetições (quatro repetições no inverno e quatro na primavera).
Todas as análises estatísticas foram conduzidas utilizando-se o software
SAS (Statistical Analisys System), versão 9.1 (2002-2003), licenciado para a
UFV.
16
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BALL, G.F.M. Folate. In: BALL, G.F.M. Bioavailability and Analysis of
Vitamins in Foods. 1ª Edition. Ed. Chapman & Hall, London, UK, 1998. p. 439-
487.
BALL, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. London:
Chapman & Hall, 1994.
BLAKELY, R.L. The biochemistry of folic acid and related pteridines. In:
NEUBERGER A.; TATUM, E.L. Frontiers of Biology. Amsterdam: North
Holland Publishing Company, p. 92-94, 1969.
CATHARINO, R.R.; GODOY, H.T.; LIMA-PALLONE, J.A. Metodologia analítica
para determinação de folatos e ácido fólico em alimentos. Revista Química
Nova, v.29, n.5, p.972-976, 2006.
JASTREBOVA, J.; WITTHÖFT, C.; GRAHN, A.; SVENSSON, U.; JÄGERSTAD,
M. HPLC determination in raw and processed beetroots. Food Chemistry,
v.80, p. 579-588, 2003.
LANÇAS, F. M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise. 6ª ed.
São Carlos, Ed. Rima, 2004, 62 p.
LIMA-PALLONE, J.A.; CATHARINO, R.R.; GODOY, H.T. Folatos em brócolis
convencional e orgânico e perdas no processo de cocção em água. Química
Nova (no prelo), 2008.
MURPHY, E.W.; CRINER, P.E.; GRAY, B.C. Comparisons of methods for
calculating retentions of nutrients in cooked foods. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, v.23, n.6, p.1153-1157, 1975.
SAS Institute Inc. SAS/STAT User´s Guide. Version 9.1, Fourth Edition, v.2,
Cary, NC: SAS Institute Inc. 846p, 2003.
STEA, T.H; JOHANSSON, M.; JÄGERSTAD, M.; FROLISH, W. Retention of
folates in cooked and reheated peas, broccoli and potatoes for use in modern
large-scale service systems. Food Chemistry, v.101, p.1095-1107, 2006.
VAHTERISTO, L.; LEHIKOINEN, K.; OLLILAINEN, V.; VARO, P. Application of
an HPLC assay for the determination of folate derivatives in some vegetables,
fruits and berries consumed in Finland. Food Chemistry, v.59, n.4, p.589–597,
1997.
17
4. RESULTADOS
4.1. Artigo 1
OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE FOLATOS EM
HORTALIÇAS FOLHOSAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA, COM DETECÇÃO POR FLUORESCÊNCIA
18
RESUMO
Os folatos ocorrem como um grupo de poliglutamatos cuja multiplicidade
de formas e níveis geralmente baixos em alimentos tornam a análise
quantitativa um desafio a ser superado. A determinação de folatos geralmente
envolve sua liberação da matriz alimentar; a desconjugação dos poliglutamatos
para as formas de monoglutamatos e a detecção das isoformas resultantes. O
objetivo desse trabalho foi otimizar uma metodologia utilizando Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para a determinação simultânea de três
isoformas de folatos (tetraidrofolato - THF, 5-metiltetraidrofolato – 5-MTHF e 5-
formiltetraidrofolato – 5-FTHF) em hortaliças folhosas (couve, espinafre,
mostarda, floretes e folhas de brócolis) cruas e submetidas a cocção. A
preparação das hortaliças envolveu homogeneização em um sistema tampão,
seguida por aquecimento e centrifugação, procedendo-se a desconjugação
enzimática dos poliglutamatos para monoglutamatos, utilizando conjugase
proveniente de plasma de rato. Após a fase de extração, o extrato contendo os
monoglutamatos foi purificado utilizando coluna de troca iônica. A análise dos
folatos foi feita por CLAE, utilizando gradiente de eluição e fase móvel
composta de acetonitrila e solução tampão fosfato (30 mM, pH ajustado para
2,3 com ácido fosfórico). Para validação da metodologia, foram realizados
testes de recuperação, linearidade, limites de detecção e quantificação e
avaliação da estabilidade do extrato vitamínico. A análise qualitativa mostrou
cromatogramas com excelente resolução de picos das três isoformas de folato,
com tempo de corrida de 43 minutos. A concentração de folatos totais variou de
154,79 ± 98,38 µg/100g em espinafre cru a 803,74 ± 495,61 µg/100g em folhas
de brócolis refogadas. O plasma de rato, fonte da enzima γ-glutamil
carboxipeptidase, não demonstrou a presença de folatos endógenos, o que
justificou seu uso no presente trabalho, além de sua facilidade de obtenção e
preparo. Os limites de quantificação foram iguais a 2 ng/mL; 2 ng/mL e 28
ng/mL para THF, 5-MTHF e 5-FTHF, respectivamente. As taxas de
recuperação variaram de 87,86 a 100,64% para THF; 88,12 a 94,22% para 5-
MTHF e 89,82 a 106,69% para 5-FTHF. O teste de repetibilidade mostrou
coeficiente de variação em relação às áreas dos picos inferior a 10%. Os testes
de linearidade mostraram-se satisfatórios, sendo os coeficientes de
determinação iguais a 0,9932; 0,9936 e 0,9761 para THF, 5-MTHF e 5-FTHF,
respectivamente. Todos os isômeros apresentaram perdas consideráveis após
19
diferentes tempos de estocagem em temperatura de refrigeração (8°C) e em
temperatura de congelamento (-18°C), sendo que o THF foi o isômero com
menor estabilidade. A metodologia otimizada mostrou-se eficiente quando
aplicada para análise de diferentes hortaliças cruas e cozidas e pode ser
utilizada para a determinação de folatos nesse tipo de matriz alimentar.
Palavras-chave: tetraidrofolato - THF, 5-metiltetraidrofolato – 5-MTHF, 5-
formiltetraidrofolato – 5-FTHF, CLAE.
ABSTRACT
Folate occur as a group of poliglutamate whose multiplicity of forms and
generally low levels in food make quantitative analysis a challenge to overcome.
Determination of folate normally involves their liberation from the food matrix,
the deconjugation of poliglutamate to monoglutamate forms and detection of
isoforms. This study aimed to optimize a methodology using High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) for the simultaneous determination of three
folate isoforms (tetrahydrofolate - THF, 5-methyl tetrahydrofolate - 5-MTHF and
5-formyl tetrahydrofolate - 5-FTHF) in leafy vegetables (kale, spinach, mustard,
flowers and leaves of broccoli), raw and submitted to cooking. Sample
preparation involved homogenization in a buffer system, followed by heating,
centrifugation and enzyme deconjugation of poliglutamate to monoglutamate
using conjugase obtained from plasma of rats. After the step of extraction, the
extract containing the monoglutamate was purified using ion exchange column.
The analysis of folate was carried out by HPLC, using gradient of elution and
mobile phase consisting of acetonitrile and phosphate buffer (30 mM, pH
adjusted to 2.3 with phosphoric acid). To validate the methodology, tests were
made to analyze recovery, linearity, limits of detection and quantification and
assessment of the stability of vitamin extract. The qualitative analysis showed
chromatograms with excellent resolution of peaks of the three isoforms of folate,
with a running time of 43 minutes. The contents of total folate ranged from
154.79 ± 98.38 μg/100g in raw spinach to 803.74 ± 495.61 μg/100g in stir fried
leaves of broccoli. Plasma of rats, source of the enzyme γ-glutamyl
carboxipeptidase, did not show the presence of endogenous folate, which
justified its use in this work, besides its ease of collection and preparation.
Limits of quantification and recovery rates were respectively 2 ng/mL and from
87.86 to 100.64% for THF, 2 ng/mL and from 88.12 to 94.22% for 5-MTHF and
20
28 ng / mL and 89.82 to 106.69% for 5-FTHF. Test of repeatability showed
relative standard deviation for peak areas lower than 10%. Tests for linearity
were shown to be satisfactory, with coefficients of determination equal to
0.9932, 0.9936 and 0.9761 for THF, 5-MTHF and 5-FTHF respectively. All
isomers showed considerable losses after different times of storage at
refrigeration temperature (8°C) and freezing temperature (-18°C), and THF was
the isomer that showed lower stability. The optimized methodology was efficient
when applied to analysis of various raw and cooked vegetables and can be
used for the determination of folate in this type of food matrix.
Key words: tetrahydrofolate - THF, 5-methyl tetrahydrofolate - 5-MTHF, 5-
formyl tetrahydrofolate - 5-FTHF, HPLC.
1. INTRODUÇÃO
A baixa ingestão de folatos/ácido fólico tem sido apontada como possível
causa de doenças graves que atingem o homem, como as doenças cardíacas,
o câncer e as malformações congênitas (DIERKES et al., 1998).
Informações sobre a concentração de folato em hortaliças ainda são
escassas, especialmente quando se consideram diferentes concentrações
desse composto em diversos cultivares, tipos de solo, locais e condições de
cultivo, condições de estocagem e processamento. Os dados existentes na
literatura são contraditórios, devido às dificuldades associadas à quantificação
de folatos, que por sua vez estão relacionadas à sua instabilidade, grande
variedade de formas (JASTREBOVA et al., 2003) e quantidades reduzidas nos
alimentos.
Os folatos são predominantemente poliglutamatos, contendo até sete
resíduos de L-glutamato ligados ao grupo p-aminobenzóico por ligações
peptídicas (MCKILLOP et al., 2002). Como os diferentes tipos de folato têm
absorção e metabolismo diferentes, eles não podem ser quantificados como
um só composto (OSSEYI et al., 1998; FINGLAS et al., 1999).
Tradicionalmente, a concentração de folato tem sido avaliado por meio
de ensaios microbiológicos, com a utilização de Lactobacillus casei, em que a
resposta de crescimento do microrganismo à mistura de folatos presente é
mensurada turbidimetricamente (NDAW et al., 2001). Entretanto, quando se
deseja separar as diversas formas de folatos existentes, é necessário realizar
métodos mais específicos. Essas moléculas, por exibirem pequenas diferenças
21
em suas características iônicas, podem ser analisadas por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE). A maioria dos folatos de ocorrência natural
está presente sob a forma de poliglutamatos. Entretanto, as técnicas
bioespecíficas e CLAE não respondem de forma adequada aos derivados de
folatos de cadeia longa. Portanto, a conversão de poliglutamatos a formas de
mono ou diglutamatos requer uma conversão enzimática, utilizando a enzima γ-
glutamil carboxipeptidase (conjugase ou folato hidrolase). Pâncreas de frango,
rim de porco e plasma de rato são as fontes de conjugase mais comumente
utilizadas. O plasma de rato apresenta algumas vantagens em relação às
demais fontes, como a facilidade de preparo, a ampla disponibilidade
comercial, a baixa concentração de folatos endógenos e a não necessidade de
procedimentos de extração e purificação (ASCORT; SHRESTHA, 2005).
A importância que foi atribuída aos folatos recentemente, em virtude de
sua ação benéfica ao homem, tem aumentado o interesse dos pesquisadores
nos estudos sobre essa vitamina. Conseqüentemente, o interesse dos analistas
em desenvolver metodologias apropriadas para a determinação de folatos
também tem aumentado (CATHARINO et al., 2006). Particularmente no Brasil,
o desenvolvimento e otimização de métodos para análise de folatos é
imprescindível, uma vez que inexistem informações sobre as concentrações de
folatos em tabelas brasileiras de composição de alimentos.
O conhecimento das concentrações de nutrientes em alimentos, entre
eles as vitaminas, é imprescindível no trabalho de nutricionistas, na elaboração
de dietas individuais, durante o atendimento ambulatorial, na elaboração de
cardápios nutricionalmente balanceados para coletividades em Unidades de
Alimentação e Nutrição e na análise de estudos de ingestão de nutrientes e
adequação nutricional (CAMPOS et al., 2006). Nesse contexto, o objetivo deste
trabalho foi otimizar em nosso laboratório uma metodologia, utilizando CLAE,
para a determinação simultânea de três formas mais importantes de folatos
(THF, 5-MTHF e 5-FTHF) em cinco hortaliças cruas e cozidas (couve,
espinafre, mostarda, floretes e folhas de brócolis).
22
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Reagentes e outros materiais
Para análise de folatos, foi utilizada acetonitrila grau HPLC (Tedia, EUA)
e água ultrapura produzida em sistema Milli-Q
®
(Millipore, EUA). Foram
utilizados reagentes com grau de pureza para análise (p.a.): fosfato de sódio
monobásico anidro (Synth, Brasil), ácido ascórbico (Vetec, Brasil), 2-
mercaptoetanol (Vetec, Brasil), ácido fosfórico (Proquímios, Brasil), acetato de
sódio (Chemco, Brasil) e cloreto de sódio (Vetec, Brasil).
Para purificação dos extratos foi preparada uma coluna com recheio de
Q-Sepharose (Pharmacia, EUA) em 20% de etanol 70%, com auxílio de
seringa de plástico e fluxo estabelecido por meio de bomba peristáltica.
Para filtração dos extratos foi utilizado papel de filtro (Inlab, tipo 50,9 cm
de diâmetro). Antes da injeção, os extratos e soluções padrão foram filtrados
em membranas filtrantes (HV Millex, 0,45 μm de porosidade, Millipore, Brasil).
Os padrões de (6S)-5,6,7,8-tetraidrofolato de sódio (THF), (6S)-5-metil-
5,6,7,8-tetraidrofolato (5-MTHF) e (6S)-5-formil-5,6,7,8-tetraidrofolato (5-FTHF)
foram cedidos gentilmente pela Merck-Eprova (Suíça) e mantidos a -18
o
C até
utilização.
2.2. Coleta e preparo das hortaliças
Foram utilizadas as hortaliças couve (Brassica oleracea L.), mostarda
(Sinapsis arvensis), espinafre (Spinacia oleracea L.) e brócolis (Brassica
oleracea var. itálica) (floretes e folhas), obtidas em Viçosa, MG, do Programa
de Aquisição de Alimentos (PAA), vinculado ao Ministério de Desenvolvimento
Social e Combate à Fome (MDS). Essas hortaliças foram escolhidas devido ao
seu amplo consumo e disponibilidade na região e por serem consideradas
importantes fontes de folato na alimentação.
As hortaliças foram coletadas, de forma aleatória, em estádio de
comercialização (1 a 2 kg de cada hortaliça) e acondicionadas em sacos
plásticos. Foram realizadas oito repetições, sendo cada repetição representada
por uma coleta semanal, realizada nos meses de agosto e outubro de 2008.
As análises das hortaliças foram realizadas em até 48 horas após a
coleta, permanecendo estas acondicionadas em geladeira. As hortaliças foram
23
lavadas em água corrente e analisadas na forma crua e cozida, utilizando
métodos de cocção tradicionais. Couve, mostarda, espinafre e folhas de
brócolis foram refogadas em óleo enquanto os floretes de brócolis foram
cozidos sob imersão em água.
Tanto as hortaliças cruas quanto as cozidas foram processadas em
multiprocessador para completa homogeneização e acondicionadas em
geladeira doméstica até o momento de extração e análise.
2.3. Extração de folatos
Durante o processo de extração e análise, as hortaliças e os extratos
foram mantidos sob proteção da luz solar e artificial, pela utilização de vidrarias
âmbar, papel alumínio e cortinas do tipo “blackout”, e sob proteção do oxigênio
através da utilização de vidrarias com tampas e de ambiente com gás
nitrogênio.
A extração foi baseada em metodologia utilizada por Vahteristo et al.
(1997), Jastrebova et al. (2003) e Stea et al. (2006) e otimizada em nosso
laboratório. Para a extração foram pesados cerca de 3,00 g de hortaliça (o
peso exato foi anotado), previamente homogeneizada em processador de
alimentos. A hortaliça foi triturada com solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0,
contendo ácido ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1% e filtrada a vácuo em
funil de büchnner. O volume foi completado com água ultrapura para 25 mL em
balão volumétrico e o extrato obtido foi aquecido por aproximadamente 12
minutos em banho-maria a 100ºC, sob agitação, utilizando frascos âmbar com
tampa e atmosfera inerte, obtida com gás nitrogênio. Em seguida, foi resfriado,
centrifugado (1789 g, por 30 minutos) e, em seguida, utilizado para
desconjugação de poliglutamatos.
Para desconjugação dos poliglutamatos a monoglutamatos, 100 μL de
plasma de rato contendo a enzima conjugase (γ-glutamil carboxipeptidase)
foram adicionados ao sobrenadante (3 mL) obtido no procedimento de extração
descrito anteriormente. O plasma de rato foi obtido por meio da centrifugação
(2500 g por 10 minutos) de sangue de ratos Wistar, machos e saudáveis. O
sobrenadante obtido a partir desse procedimento foi coletado, armazenado em
alíquotas de 100 μL em tubos eppendorf e armazenado a -18°C. Os extratos de
hortaliças contendo o plasma foram colocados em banho-maria a 37°C por 3
horas. Em seguida, para ocorrer inativação enzimática, os extratos foram
24
aquecidos em água fervente por 5 minutos (JASTREBOVA et al., 2003). Para
verificar a presença de folatos endógenos, injetaram-se na coluna
cromatográfica alíquotas de plasma de rato diluídas em solução extratora, e
compararam-se os tempos de retenção dos picos encontrados àqueles
presentes nas hortaliças e nas soluções de padrões.
2.4. Purificação dos extratos de hortaliças
A purificação do extrato foi feita com base em procedimento descrito por
Jastrebova et al. (2003). O extrato obtido no procedimento anterior foi
purificado utilizando coluna de forte troca iônica, com fase estacionária de Q-
Sepharose. A coluna foi pré-condicionada com metanol e água (1:1) a um fluxo
de 1-2 gotas/segundo. O extrato foi aplicado à coluna a um fluxo de 2
gotas/segundo, aproximadamente. A coluna foi lavada com água ultrapura para
remoção dos componentes interferentes (fluxo de 1-2 gotas/segundo). Em
seguida, a eluição dos folatos retidos foi feita com acetato de sódio (0,1 M)
contendo cloreto de sódio 10%, ácido ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1%.
Antes da injeção cromatográfica, o extrato foi filtrado em unidades
filtrantes com porosidade de 0,45 μm.
2.5. Curvas de calibração e quantificação de folatos
A solução estoque dos padrões de folato (200 μg/mL), assim como as
soluções com concentrações crescentes dos padrões, foram preparadas em
solução extratora (solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0, contendo ácido
ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1%).
A concentração real dos padrões de folato foi verificada por
espectrofotometria e corrigida utilizando-se a seguinte equação:
A = E x C x L
Em que:
A = Absorvância máxima (lida a 297 nm para THF, a 290 nm para 5-MTHF e a
285 nm para 5-FTHF, em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 2,0 (BALL,1998);
E = Coeficiente de absortividade molar (para THF, 27; para 5-MTHF, 32 e para
5-FTHF, 31,5 (BLAKELY, 1969);
C = Concentração molar;
L = Largura da cubeta (1 cm).
25
As curvas de calibração dos isômeros de folatos (THF, 5-MTHF e 5-
FTHF) foram elaboradas considerando a concentração dos componentes nas
hortaliças. Utilizou-se injeção em duplicata, de seis concentrações crescentes
de soluções padrão na faixa de 0,0095 a 0,3821 μg/mL para curva de THF;,
0,2432 a 9,73 μg/mL para curva de 5-FTHF e 0,049 a 0,98 μg/mL para curva
de 5-MTHF.
A partir das curvas de calibração obtidas, foram calculadas as
concentrações dos isômeros de folatos presentes nas hortaliças. O cálculo da
concentração real nas hortaliças foi obtido a partir das diluições realizadas.
2.6. Condições de análise por CLAE
O sistema de CLAE (Shimadzu, modelo SCL 10AD VP) empregado na
análise de folatos foi composto de bomba de alta pressão (com válvula para
gradiente quaternário de baixa pressão), modelo LC-10AD VP; injetor
automático com alça de amostragem de 50 μL, modelo SIL-10AF e detector de
fluorescência (modelo RF10AXL). O sistema foi controlado pelo software Multi
System, Class VP 6.12. A separação dos folatos foi feita em coluna Shim Pack
100 RP18, 150 mm x 4,6 mm, 4,6 μm (Merck, Alemanha).
As condições cromatográficas utilizadas foram: fase móvel composta por
gradiente binário contendo acetonitrila e solução tampão fosfato (NaH
2
PO
4
30
mM, pH ajustado para 2,3 com H
3
PO
4
); fluxo de 0,7 mL/min; volume injetado:
50 µL para padrões e extratos, detecção por fluorescência com excitação a 290
nm e emissão a 360 nm. O gradiente iniciou-se com acetonitrila 6% (v/v),
sendo mantido por 6 minutos e aumentado linearmente para 25% em 25
minutos, permanecendo nessa concentração por 2 minutos, retornando em
seguida às condições iniciais. A coluna foi re-equilibrada por 15 minutos antes
da próxima corrida. O tempo total de corrida foi de 43 minutos.
Para evitar a formação de bolhas e controlar a grande variação da
pressão, foi necessário utilizar um sistema de degasamento da fase móvel com
gás hélio antes e durante as corridas cromatográficas. Assim, a fase móvel foi
degaseificada por 15 minutos a 150 kpa antes do início das análises e a 100
kpa ao longo das corridas.
A identificação do THF, 5-MTHF e 5-FTHF nos extratos foi realizada por
comparação dos tempos de retenção obtidos nos extratos com os obtidos para
26
os respectivos padrões analisados sob as mesmas condições, e por co-
cromatografia.
2.7. Validação do método
Testes de recuperação e faixa de linearidade
Testes de recuperação de THF, 5-MTHF e 5-FTHF foram realizados pela
adição de padrão ao espinafre cru, couve rasgada e refogada, folhas de
brócolis cruas, floretes de brócolis cozidos sob imersão em água e mostarda
refogada na proporção de 20 a 100% da concentração média original das
hortaliças. As porcentagens de recuperação foram obtidas a partir da diferença
percentual entre as conentrações iniciais analisadas e as adicionadas às
hortaliças previamente homogeneizadas.
A determinação da faixa de linearidade foi feita pela injeção, em
duplicata, de seis concentrações crescentes das soluções padrão de THF, 5-
MTHF e 5-FTHF, utilizando as mesmas condições cromatográficas
empregadas para análise dos extratos. Os dados obtidos para as áreas dos
picos foram usados para análise de regressão linear (LANÇAS, 2004).
Limites de detecção e quantificação
A avaliação do limite de detecção (LD) foi feita por diluições sucessivas
dos padrões de THF, 5-MTHF e 5-FTHF, seguida da determinação da menor
quantidade detectável, como sendo três vezes o valor da amplitude do ruído do
equipamento (S/R≥3). O limite de quantificação (LQ) foi considerado como
sendo 10 vezes o LD (CATHARINO et al., 2006).
Repetibilidade
O teste de repetibilidade foi realizado pela extração e análise de uma
mesma hortaliça cinco vezes. A avaliação da repetibilidade foi feita pelo cálculo
do coeficiente de variação das médias das áreas dos picos dos componentes
analisados (THF, 5-MTHF e 5-FTHF) (LANÇAS, 2004).
Avaliação da estabilidade de folatos em extrato de hortaliça
Visando avaliar possíveis perdas de folatos durante o armazenamento
do extrato de hortaliças antes da análise, utilizando duas diferentes
27
temperaturas (refrigeração e congelamento), foi realizado um estudo de
estabilidade utilizando espinafre cru. O extrato de espinafre cru foi analisado
após diferentes tempos de estocagem em temperatura de refrigeração (8°C)
(Tempo 0 – imediatamente após o procedimento de extração e Tempo 1 – 24
horas após a extração) e em temperatura de congelamento (-18°C) (Tempo 2 –
48 horas após a extração; Tempo 3 – 72 horas após a extração e Tempo 4 – 7
dias após a extração). Cada injeção foi realizada em triplicata.
2.8. Delineamento experimental e análise estatística dos dados
Para o estudo das concentrações de folatos nas hortaliças foi
considerado um delineamento inteiramente casualizado com cinco hortaliças e
oito repetições. Realizou-se análise de variância e teste de amplitudes
múltiplas de Duncan (α= 5%) para verificar a existência de diferenças
significativas quanto à concentração de folatos entre as hortaliças.
Todas as análises estatísticas foram conduzidas utilizando-se o software
SAS (Statistical Analisys System), versão 9.1 (2002-2003), licenciado para a
UFV.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Análise qualitativa
A Figura 1 mostra cromatogramas típicos da análise de folatos na
solução de padrões, análise de plasma de rato sem a adição de extrato de
hortaliças e análise de extratos de hortaliça, com e sem a etapa de
desconjugação enzimática.
O emprego da coluna RP-18 e a utilização do sistema de eluição por
gradiente possibilitaram a detecção simultânea dos isômeros THF, 5-MTHF e
5-FTHF em todas as hortaliças estudadas. Verifica-se pelo perfil cromatográfico
que foi possível obter resolução dos picos com tempos de corrida de 43
minutos. Em função da utilização do sistema de eluição por gradiente, o tempo
de re-equilíbrio da coluna foi fixado em 15 minutos após o final da corrida e foi
fundamental para a repetibilidade do método.
Observou-se que a presente metodologia mostrou ser útil e aplicável
para separação das principais isoformas de folatos nas diferentes matrizes de
hortaliças folhosas cruas e cozidas (cromatogramas não mostrados).
28
Fluorescência
(
volts
)
B (Plasma de rato)
A (Mistura de padrões)
Fluorescência
(
volts
)
C (Espinafre
sem desconjugação)
D (Espinafre
com desconjugação)
Minutos
Figura 1. Cromatogramas típicos de mistura de padrões de folatos, plasma de
rato sem a adição de hortaliça e espinafre com e sem desconjugação de
poliglutamatos.
Condições cromatográficas são descritas em métodos (Item 2.6).
Com o objetivo de se avaliar o efeito da adição de plasma de rato ao
extrato de hortaliça, analisaram-se em duplicata amostras de espinafre cru,
com e sem a adição de plasma, para verificar a presença ou ausência de picos
de folatos. Observou-se que nos respectivos tempos de retenção dos isômeros
(11 minutos para THF, 14,5 minutos para 5-MTHF e 20 minutos para 5-FTHF)
não foram detectados picos (Figura 1 - cromatograma C), significando a
necessidade da etapa de desconjugação enzimática para a análise dessa
vitamina.
Para avaliar a presença de folatos endógenos possivelmente presentes
no plasma de rato, realizou-se a análise em duplicata de alíquotas de plasma
(100 µL), diluídas em 3 mL de solução extratora. Observou-se que os tempos
de retenção dos picos detectados no plasma não coincidiram com os tempos
de retenção dos isômeros de folatos. Além disso, nos tempos de retenção dos
isômeros, nenhum pico foi detectado na análise do plasma (Figura 1 -
cromatograma B). Esses resultados sugerem a ausência de folatos no plasma
29
de rato utilizado para desconjugação de poliglutamatos, o que confere maior
confiabilidade à quantificação real de folatos nas hortaliças estudadas.
3.2. Concentração média de folatos nas hortaliças
Como observado na Tabela 1, o 5-FTHF foi a forma predominante em
todas as hortaliças analisadas.
Observa-se que os floretes, as folhas de brócolis foram as hortaliças que
apresentaram as maiores concentrações de folatos totais, enquanto o espinafre
apresentou a menor concentração. A concentração de folatos totais obtida no
presente trabalho para os floretes de brócolis foi semelhante ao relatado por
Stea et al. (2006), em que os autores encontraram concentração igual a 866
µg/100g mas, em geral, foi superior ao encontrado na maioria dos trabalhos
revisados. Por exemplo, Lima-Pallone et al. (2008) encontraram concentração
de folatos totais em floretes de brócolis igual a 427,8 µg/100g. A etapa de
desconjugação enzimática não foi utilizada por esses autores. Vahteristo et al.
(1997), De Souza; Eitenmiller (1986) e Mullin et al. (1982) reportaram
concentrações de folatos totais iguais a 114 µg/100g, 102 µg/100g e 133
µg/100g, respectivamente, os quais foram inferiores aos encontrados no
presente estudo.
Tabela 1. Concentração média* de THF, 5-MTHF e 5-FTHF e de folatos totais
em hortaliças cruas (em µg/100 g de matéria fresca).
Hortaliças THF 5-MTHF 5-FTHF
Soma de
Folatos
Couve
72,91 a ± 46,05 67,02 a ± 41,63 409,74 ab ± 379,39 549,67 ab ± 267,89
Floretes de brócolis
69,46 a ± 57,67 123,10 a ± 91,29 562,01 a ± 415,20 754,57 a ± 326,82
Folhas de brócolis
60,71 a ± 32,42 219,40 a ± 87,47 451,40 ab ± 264,12 731,51 a ± 306,76
Espinafre
24,57 a ± 21,89 42,70 a ± 26,59 173,77 b ± 73,32 241,04 b ± 81,29
Mostarda
71,68 a ± 60,85 164,90 a ± 32,41 332,18 ab ± 289,94 568,76 ab ± 234,22
*Média de oito repetições ± desvio padrão
Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra nas colunas não diferem entre si ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Duncan.
Em espinafre, as concentrações de folatos totais encontradas em nosso
estudo estão na faixa descrita pela literatura. Iwatani et al. (2003) relataram
concentração de folatos nessa hortaliça iguais a 302 µg/100g. Lin e Lin (1999),
DeSouza e Eitenmiller (1986), Shrestha et al. (2000) e Aiso e Tamura (1998)
30
reportaram concentrações de folatos iguais a 364 µg/100g, 251 µg/100g, 193
µg/100g e 224 µg/100g, respectivamente, utilizando metodologia semelhante à
do presente estudo.
O único estudo encontrado a respeito da concentração de folatos em
mostarda foi o de Iwatani et al. (2003), no qual os autores detectaram
concentração dessa vitamina igual a 278 µg/100g, inferior ao verificado nesse
trabalho.
Não foram encontrados na literatura estudos sobre a concentração de
folatos em couve e folhas de brócolis, o que reforça a importância do nosso
estudo no sentido de contribuir com dados a respeito da concentração dessa
vitamina nessas hortaliças.
Os altos valores de desvio-padrão verificados são explicados pela
grande variabilidade biológica presente em matrizes alimentares, a qual
buscou-se minimizar utilizando coleta de hortaliças no mesmo estádio de
comercialização e completa homogeneização das hortaliças.
3.3. Faixa de linearidade e teste de recuperação
As três formas de folato apresentaram boa linearidade nas faixas de
concentração utilizadas (pesos injetados: THF, entre 0,19104 e 7,6416 ng; 5-
MTHF, entre 0,24425 e 4,885 ng; 5-FTHF, entre 7,2975 e 291,9 ng). O
coeficiente de determinação para THF foi 0,9931; para 5-MTHF, 0,993 e para
5-FTHF, 0,9761.
A Tabela 2 mostra os percentuais de recuperação dos padrões de
folatos adicionados às hortaliças. Foi possível verificar excelente recuperação
das isoformas de folato (em média 87,86 a 106,69%), o que demonstra que os
procedimentos utilizados durante a extração e análise foram adequados para
evitar perdas dessa vitamina. Lima-Pallone et al. (2008) encontraram valores
médios de recuperação de THF, 5-MTHF e 5-FTHF entre 94 e 99%, quando
analisaram floretes de brócolis convencional e orgânico. Stea et al. (2006),
utilizando metodologia semelhante à utilizada no presente estudo, obtiveram
taxas de recuperação de folatos variando de 92 a 96% em ervilhas, também
indicando boa exatidão do método.
31
Tabela 2. Recuperação* dos padrões de THF, 5-MTHF e 5-FTHF adicionados
às hortaliças cruas e cozidas.
Hortaliça Isômero
Concentração*
inicial (µg/g)
Padrão
adicionado* (µg/g)
Concentração
final* (µg/g)
Recuperação**
(%)
THF 0,1752 0,253 0,4229 96,97
5-MTHF 0,4032 0,5 0,8799 94,22
Couve rasgada
refogada
5-FTHF 27,727 16,3 41,4112 90,56
THF 0,5136 0,3244 0,7978 92,17
5-MTHF 0,6768 0,3029 0,9392 94,01
Folhas de brócolis
cruas
5-FTHF 68,1247 16,5118 79,1914 92,0
THF 0,1582 0,1622 0,3012 87,86
5-MTHF 0,3172 0,1465 0,4272 88,49
Espinafre cru
5-FTHF 11,2982 4,46 16,5142 106,69
THF 0,1653 0,3307 0,65614 100,64
5-MTHF 0,8474 0,3224 1,0913 90,73
Mostarda refogada
5-FTHF 60,7264 6,4867 61,0332 89,82
THF 0,2127 0,16 0,3625 95,2
5-MTHF 0,6073 0,32 0,8552 88,12
Floretes de brócolis
cozidos sob
imersão
5-FTHF 77,5306 9,73 85,8658 98,20
*Médias de duas repetições ± desvio padrão (DP). Concentração em matéria fresca.
** % de Recuperação = (concentração final do isômero) - (quantidade adicionada do isômero) /
(concentração inicial do isômero) x 100
3.4. Limites de detecção e quantificação
Os limites de detecção encontrados no presente estudo foram iguais a 2
ng/mL para o THF e para o 5-MTHF, enquanto para o 5-FTHF, o limite de
detecção foi de 28 ng/mL
Day e Gregory III (1981) reportaram limites de detecção para THF, 5-
MTHF e 5-FTHF iguais a 5, 3 e 10 ng/mL, respectivamente, semelhantes aos
encontrados no presente estudo. Nossos resultados são similares aos de Duch
et al. (1983) para THF e 5-MTHF, embora o limite de detecção para 5-FTHF
tenha sido inferior, da ordem de 1,5 ng/mL. Holt et al. (1988) obteve limite de
detecção superior para THF, igual a 5,7 ng/mL.
O limite de quantificação foi considerado como sendo 10 vezes o valor
do limite de detecção, ou seja, 20 ng/mL para THF e 5-MTHF e 280 ng/mL para
5-FTHF. Esses resultados demonstram que a metodologia otimizada permite a
detecção de concentrações muito reduzidas de folatos em hortaliças.
32
3.5. Repetibilidade
Os valores de repetibilidade foram expressos como coeficiente de
variação para área do pico. Os valores encontrados foram de 5,63%, 9,82% e
5,74% para THF, 5-MTHF e 5-FTHF, respectivamente, analisados em espinafre
cru. Os resultados obtidos conferem confiabilidade às condições de análise
utilizadas na presente pesquisa (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999).
3.6. Estabilidade de folatos em extratos de hortaliças
A análise de folatos nas hortaliças envolveu procedimentos que
poderiam favorecer perdas vitamínicas, tais como a preparação do extrato
utilizando extração a quente (100°C) e o tratamento enzimático do extrato
utilizando banho-maria a 37°C por 3 horas. Além disso, alguns pesquisadores,
por limitação de tempo, optam por não realizar a análise de folatos
imediatamente após o procedimento de extração, de modo que o extrato
permanece estocado em temperatura de refrigeração ou congelamento, para
ser posteriormente analisado (PATRING et al., 2005). Para analisar a
segurança de utilização do procedimento acima mencionado, avaliou-se nesse
estudo a estabilidade das isoformas de folato em extratos provenientes de
espinafre, após diferentes tempos de estocagem em temperatura de
refrigeração (8°C) (Tempo 0 – imediatamente após o procedimento de extração
e Tempo 1 – 4 horas após a extração) e em temperatura de congelamento (-
18°C) (Tempo 2 – 24 horas após a extração; Tempo 3 – 48 horas após a
extração e Tempo 4 – 7 dias após a extração).
A estabilidade dos isômeros de folatos ao longo do tempo de estocagem
em extratos de espinafre pode ser visualizada na Figura 2.
Observou-se que todos os isômeros apresentaram perdas consideráveis
(retenção variando de 30 a 90%) após 7 dias de estocagem (Tempo 4), mesmo
que o armazenamento tenha sido realizado em temperatura de congelamento
(-18°C). O THF foi o isômero que apresentou menor estabilidade, sendo que
após 4 horas do procedimento de extração, a retenção foi de aproximadamente
70%. Após 7 dias de estocagem sob congelamento, o extrato de espinafre
apresentou apenas 27,07% da concentração inicial de THF.
33
17,99
12,34
70,47
55,12
160,04
106,37
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tempo 0 Tempo 1
Concentração (mcg/100 g)
THF 5-MTHF 5-FTHF
9,38
4,81 4,87
62,45
53,45
50,3
118,92
126,64
78,33
0
20
40
60
80
100
120
140
Tempo 2 Tempo 3 Tempo 4
Concentração (mcg/100 g)
THF 5-MTHF 5-FTHF
Figura 2. Estabilidade de isômeros de folatos em extrato de espinafre após
diferentes tempos de estocagem em temperatura de refrigeração (8°C; Tempos
0 e 1) e em temperatura de congelamento (-18°C; Tempos 2, 3 e 4).
Tempo 0 - Imediatamente após o procedimento de extração; Tempo 1 - 4 horas após a
extração; Tempo 2 - 24 horas após a extração; Tempo 3 - 48 horas após a extração; Tempo 4 -
7 dias após a extração. Valores em µg/100g.
As menores perdas foram observadas para 5-MTHF, o qual apresentou
retenção de 71,37% da concentração inicial após sete dias de armazenamento
a -18°C (redução de 70,47 para 50,3 µg/100g). Esses resultados corroboram
os de Patring et al. (2005), que verificaram que o 5-MTHF mostrou-se mais
estável frente aos diferentes tempos de armazenamento quando comparado ao
THF, mostrando perdas de THF iguais a 53% após 4 semanas de estocagem a
-22°C, sendo essa perda inferior ao encontrado no presente estudo. Mesmo em
temperaturas extremamente baixas, a degradação de THF pode ser observada.
Como demonstrado por Tamura et al. (1997), mesmo a estocagem a -70°C
34
pode levar a perdas consideráveis de THF em extratos alimentares. Esses
resultados demonstram a importância da realização da análise cromatográfica
logo após o procedimento de extração, visando à diminuição de perdas de
folatos e a garantia de resultados mais confiáveis e próximos do valor real
presente na hortaliça.
4. CONCLUSÕES
A metodologia otimizada no presente estudo mostrou-se confiável para
determinação simultânea das três formas mais importantes de folatos (THF, 5-
MTHF e 5-FTHF) em hortaliças folhosas cruas e cozidas.
Essa metodologia também pode ser testada e aplicada à análise de
folatos em outras matrizes, dessa forma, contribuindo para a avaliação da
concentração de folatos em outros alimentos.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à CAPES pela concessão de bolsa de mestrado e
à FAPEMIG pela bolsa de iniciação científica.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1997.
38
4.2. Artigo 2
FOLATOS EM HORTALIÇAS FOLHOSAS DURANTE DUAS ESTAÇÕES DO
ANO E APÓS MÉTODOS DE COCÇÃO TRADICIONAIS
39
RESUMO
A concentração de folatos ingerido na dieta é influenciada pela
concentração inicial existente nos alimentos e pode depender dos métodos e
época de cultivo de hortaliças e frutas. Além disso, os métodos de cocção aos
quais são submetidos os alimentos podem ter forte influência na concentração
de folato ingerido. O calor, a presença de oxigênio, a umidade, a luz, o pH e a
duração do tratamento térmico podem degradar as formas naturais dessa
vitamina e dificultar a ingestão de folato em nível da recomendação nutricional.
O objetivo do presente estudo foi comparar as concentrações de folatos entre
duas estações do ano (inverno e primavera) e determinar o efeito de diferentes
métodos de cocção tradicionais (refogamento em óleo, cocção a vapor e
cocção sob imersão em água) sobre a retenção dessa vitamina em hortaliças
rotineiramente consumidas pela população brasileira (couve, espinafre,
mostarda, floretes e folhas de brócolis). A análise das isoformas de folatos
(tetraidrofolato - THF, 5-metiltetraidrofolato – 5-MTHF e 5-formiltetraidrofolato –
5-FTHF) foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),
utilizando gradiente de eluição e fase móvel constituída de acetonitrila e
solução tampão fosfato. Não foram detectadas diferenças estatisticamente
significativas (p>0,05) em relação à concentração de folatos entre as hortaliças
coletadas no inverno e na primavera. A retenção dos isômeros nas hortaliças
após cocção variou de 17,01% a 87,21% para THF, 53,41 a 94,07% para 5-
MTHF e 39,04 a 107,9% para 5-FTHF. O refogamento em óleo não promoveu
redução significativa da concentração de folatos em couve rasgada ou fatiada,
mostarda e espinafre. A cocção sob imersão em água foi o método que menos
preservou a concentração de 5-FTHF e THF (57,68% e 17,01% de retenção,
respectivamente em floretes de brócolis). A cocção a vapor também não se
mostrou eficiente na preservação de THF na mesma hortaliça (41,83% de
retenção). Os resultados demonstraram que a retenção de folatos foi
fortemente dependente da matriz alimentar, do tipo de isômero e do método
utilizado para cocção das hortaliças. Todas as hortaliças estudadas podem ser
consideradas excelentes fontes dessa vitamina, mas o atendimento às
recomendações nutricionais de folato pode ser comprometido com as perdas
ocorridas durante os processos de cocção. Reforça-se a recomendação de se
promover maior controle em relação à escolha do método e tempo de cocção e
40
a quantidade de água utilizada, tanto na prática domiciliar quanto em serviços
de alimentação.
Palavras-chave: técnicas de cocção, estabilidade, tetraidrofolato, 5-
metiltetraidrofolato, 5-formiltetraidrofolato, épocas de cultivo.
ABSTRACT
The intake of folate in diet is influenced by the initial content in food and
depends on the methods and seasons of vegetables and fruits growing.
Furthermore, foods are submitted to methods of cooking that have strong
influence on the content of folate intake. Warmth, presence of oxygen, humidity,
light, pH and duration of heat treatment can degrade the natural forms of this
vitamin and difficult the intake of folate in terms of nutritional recommendations.
The aim of this study was to compare the levels of folate between two seasons
(winter and spring) and determine the effect of different traditional cooking
methods (stir frying, steam and cooking under immersion in water) on the
retention of this vitamin in vegetables routinely consumed by Brazilian
population (kale, spinach, mustard, flowers and leaves of broccoli). Analysis of
isoforms of folate (tetrahydrofolate - THF, 5-methyl tetrahydrofolate - 5-MTHF
and 5-formyl tetrahydrofolate - 5-FTHF) was performed by high performance
liquid chromatography (HPLC) using gradient elution and a mobile phase of
acetonitrile and phosphate buffer. No statistically significant differences were
found on the content of folate from vegetables collected in winter and spring.
The retention of isomers in vegetables after cooking ranged from 17.01% to
87.21% for THF, 53.41 to 94.07% for 5-MTHF and from 39.04 to 107.9% for 5-
FTHF. Stir frying did not promote reduction of folate content in ripped or sliced
kale, mustard and spinach. Cooking under immersion in water was the method
that least preserved 5-FTHF and THF (retention of 57.68% and 17.01%,
respectively, in flowers of broccoli). Steam cooking also was not effective in the
preservation of THF in the same vegetables (41.83% retention). Results
showed that the retention of folate was strongly dependent on the food matrix,
the type of isomer and the method used for cooking the vegetables. All
vegetables studied can be considered excellent sources of this vitamin, but the
achievement of folate nutritional recommendations may be compromised with
the loss occurring during the process of cooking. We reinforce the
recommendation to promote greater control about the choice of method and
41
time of cooking and the quantity of water used, both in home practice and in
foodservice.
Key words: cooking methods, stability, tetrahydrofolate, 5-methyl
tetrahydrofolate, 5-formil tetrahydrofolate, seasons of growing.
1. INTRODUÇÃO
Os folatos têm recebido grande atenção devido aos efeitos na saúde,
especialmente na redução dos riscos de defeitos do tubo neural, na prevenção
de doenças cardiovasculares e de certos tipos de cânceres (MCKILLOP et al.,
2002).
Folatos de ocorrência natural são encontrados nos alimentos sob
diversas formas, sendo os isômeros 5-metiltetraidrofolato (5-MTF),
tetraidrofolato (THF) e 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) os mais comumente
detectados em alimentos e em hortaliças folhosas (GREGORY, 1989).
A síntese de folatos é realizada apenas por microorganismos e plantas
superiores, portanto, trata-se de um nutriente essencial para os mamíferos
(MCNULTY, 1995). As hortaliças, são consideradas as principais fontes
naturais de folatos na dieta humana (MULLIN et al., 1982.
As perdas de folatos podem ser causadas por fatores ambientais, tais
como pH, oxigênio, antioxidantes, luz, ácidos, álcalis, concentrações de íons
metálicos, duração e o método de cocção, quantidade de água utilizada, além
das próprias características do alimento (HAWKES; VILLOTA, 1989). Perdas
durante a cocção ocorrem principalmente por lixiviação, devido ao caráter
hidrossolúvel dos folatos, e também por degradação térmica (EITENMILLER;
LANDEN, 1999). Mullin et al. (1982) também acrescentam que outros fatores,
tais como as condições ambientais (estação do ano, clima e condições
geográficas e geológicas) podem afetar os níveis de folatos nas hortaliças.
Estima-se que aproximadamente 50% da concentração inicial de folatos
nos alimentos sejam perdidos durante os processos culinários (MCKILLOP et
al., 2002). Alguns resultados relataram que a cocção a vapor e a fritura podem
conduzir a perdas da concentração inicial de até 90% (VARELA-MOREIRAS,
2000). Segundo a mesma autora, as hortaliças podem perder cerca de 70% de
sua concentração de folatos ao serem fervidas durante 8 minutos, sendo a
maior parte das perdas por dissolução na água de cocção.
42
Estudos específicos que avaliam o impacto dos diferentes métodos de
cocção na concentração de folatos em alimentos preparados tanto em
residências quanto em serviços de alimentação são escassos (MCKILLOP et
al., 2002).
Entre todas as vitaminas, os folatos constituem um dos grupos de
compostos menos estudados, tanto no que diz respeito à concentração em
alimentos crus, quanto em relação à estabilidade durante a preparação.
Particularmente no Brasil, a necessidade de pesquisas na área é
imprescindível, uma vez que inexistem informações disponíveis sobre as
concentrações de folatos em tabelas de composição de alimentos. De fato, a
metodologia para análise de folatos em alimentos exige procedimentos
complexos, além da necessidade de padrões pouco disponíveis no mercado
em nível mundial.
Neste trabalho utilizou-se Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) na análise de folatos (THF, 5-MTHF e 5-FTHF) em hortaliças de
elevado consumo no Brasil (couve, espinafre, mostarda, floretes de folhas de
brócolis). Uma vez que a oferta dessas hortaliças ocorre praticamente durante
todo o ano, a análise de folatos também foi realizada em estações distintas,
considerando-se a escassez dessa informação na literatura. Além disso,
comparamos os diferentes métodos de cocção de hortaliças rotineiramente
utilizados no Brasil quanto à estabilidade de folatos. As quantidades de
hortaliças usadas nas preparações simularam aquelas utilizadas no preparo em
domicílios.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Reagentes e outros materiais
Para análise de folatos, foi utilizada acetonitrila grau HPLC (Tedia, EUA)
e água ultrapura produzida em sistema Milli-Q
®
(Millipore, EUA). Utilizaram-se
reagentes com grau de pureza para análise (p.a.): fosfato de sódio monobásico
anidro (Synth, Brasil), ácido ascórbico (Vetec, Brasil), 2-mercaptoetanol (Vetec,
Brasil), ácido fosfórico (Proquímios, Brasil), acetato de sódio (Chemco, Brasil) e
cloreto de sódio (Vetec, Brasil).
Para purificação dos extratos foi preparada uma coluna, com fase
estacionária de Q-Sepharose (Pharmacia, EUA) em 20% de etanol 70%
43
utilizando seringa de plástico descartável como suporte, e fluxo estabelecido
com bomba peristáltica (Pharmacia Biotech).
Para filtração dos extratos foi utilizado papel de filtro Inlab, com 50,9 cm
de diâmetro. Antes da análise por CLAE, os extratos e soluções padrão foram
filtradas em membranas filtrantes HV Millex, 0,45 μm de porosidade (Millipore,
Brasil).
2.2. Padrões e curvas de calibração
Os padrões de (6S)-5,6,7,8-tetraidrofolato de sódio (THF), (6S)-5-metil-
5,6,7,8-tetraidrofolato (5-MTHF) e (6S)-5-formil-5,6,7,8-tetraidrofolato (5-FTHF)
foram cedidos gentilmente pela Merck-Eprova (Suíça) e mantidos a -18
o
C até
utilização.
A solução estoque dos padrões de folato (200 μg/mL), assim como as
soluções com concentrações crescentes foram preparadas em solução
extratora (solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0, contendo ácido ascórbico 1%
e 2-mercaptoetanol 0,1%).
A concentração real das soluções padrão foi verificada por
espectrofotometria e corrigida de acordo com a seguinte equação:
A = E x C x L
Em que:
A = Absorvância máxima (lida a 297 nm para THF, a 290 nm para 5-MTHF e a
285 nm para 5-FTHF, em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 2,0 (BALL,1998);
E = Coeficiente de absortividade molar (para THF, 27; para 5-MTHF, 32 e para
5-FTHF, 31,5 (BLAKELY, 1969);
C = Concentração molar;
L = Largura da cubeta (1 cm).
A construção das curvas de calibração dos isômeros de folatos (THF, 5-
MTHF e 5-FTHF) foi realizada de acordo com a concentração dos
componentes nas hortaliças. Para a curva de THF, utilizou-se injeção, em
duplicata, de seis concentrações crescentes de soluções padrão entre 0,0095 e
0,3821 μg/mL; para 5-FTHF, utilizou-se injeção, em duplicata, de seis
concentrações crescentes de soluções padrão entre 0,2432 e 9,7300 μg/mL e
para 5-MTHF, utilizou-se injeção, em duplicata, de seis concentrações
crescentes de soluções padrão entre 0,0490 e 0,9800 μg/mL.
44
2.3. Coleta e preparo das hortaliças
Foram utilizadas as seguintes hortaliças: couve (Brassica oleracea L.),
mostarda (Sinapsis arvensis), espinafre (Spinacia oleracea L.) e brócolis
(Brassica oleracea var. itálica) (floretes e folhas), obtidas do Programa de
Aquisição de Alimentos (PAA), vinculado ao Ministério de Desenvolvimento
Social e Combate à Fome (MDS). Essas hortaliças foram escolhidas devido ao
seu amplo consumo e disponibilidade na região e por serem consideradas
importantes fontes de folato na alimentação (VARELA-MOREIRAS, 2000).
Foram coletados cerca de 1 a 2 kg de cada hortaliça.
As hortaliças foram coletadas de forma aleatória, em estádio de
comercialização, durante o inverno e primavera (agosto e outubro de 2008) e
acondicionadas em sacos plásticos. As análises das hortaliças foram
realizadas em, no máximo, 48 horas após a coleta. Foram realizadas quatro
coletas em cada estação avaliada, sendo cada repetição caracterizada por uma
coleta semanal.
No laboratório, as partes não comestíveis (talos e folhas danificadas)
foram removidas, as hortaliças foram lavadas em água corrente, sendo o
excesso removido com auxílio de papel toalha e preparadas como descrito
abaixo.
Foi realizado o quarteamento das folhas de couve e mostarda, de modo
que as porções dispostas em diagonal foram agrupadas, sendo uma das partes
analisada crua e outra analisada após fatiamento manual utilizando faca (tiras
com espessura de aproximadamente 0,5 cm) (couve fatiada e mostarda). A
couve também foi analisada sob a forma rasgada manualmente. Após o pré-
preparo, as hortaliças foram refogadas em óleo. Para cada 100 g de hortaliça,
foram utilizados 8 mL de óleo de soja (1 colher de sopa), sendo o tempo de
cocção igual a 2 minutos.
As folhas de brócolis e espinafre foram divididas em duas partes, sendo
uma delas analisada crua e a outra, analisada após refogar em óleo. Para cada
100 g de hortaliça, foram utilizados 8 mL de óleo de soja, sendo o tempo de
cocção igual a 2 minutos.
Os floretes de brócolis foram divididas em três partes, sendo uma delas
analisada crua, a outra analisada após cocção a vapor, em panela doméstica,
por 6 minutos e a terceira parte após cocção sob imersão em água em
45
ebulição, também por 6 minutos (quantidade de água suficiente para cobrir a
hortaliça: 100 g de hortaliça para cada 1000 mL (LIMA-PALLONE et al.,
2008a).
As quantidades de hortaliças utilizadas para cocção simularam aquelas
utilizadas na preparação em domicílios.
Logo após a cocção, todas as hortaliças foram processadas em
multiprocessador para completa homogeneização, sendo acondicionadas em
geladeira doméstica até o momento da análise.
Para avaliar a estabilidade, a porcentagem de retenção da concentração
de folatos nas hortaliças após os diferentes métodos de cocção foi obtida
levando-se em consideração as modificações de peso sofridas durante o
processo. Para tanto, foi utilizada a fórmula da retenção verdadeira ou real (%
RR) (MURPHY; CRINER; GRAY, 1975), como descrito abaixo:
% RR = Fcoz (µg) x Hcoz (g) x 100
Fc (µg) x Hc (g)
Em que:
Fcoz = concentração de folato na hortaliça cozida
Fc = concentração de folato na hortaliça crua
Hcoz = quantidade de hortaliça cozida
Hc = quantidade de hortaliça crua
2.4. Obtenção dos extratos e análise de folatos
Todas as etapas utilizadas para obtenção dos extratos e para análise dos
folatos nas hortaliças foram efetuadas utilizando metodologia otimizada em
nosso laboratório (DELLA LUCIA et al., 2009).
Durante as etapas de extração e análise as hortaliças e os extratos
foram mantidas sob proteção da luz solar e artificial, pela utilização de vidrarias
âmbar, papel alumínio e cortinas do tipo “blackout”, e sob proteção do oxigênio
através da utilização de tampas e de ambiente com gás nitrogênio nas
vidrarias.
2.4.1. Extração de folatos
A extração foi baseada em metodologia utilizada por Vahteristo et al.
(1997), Jastrebova et al. (2003) e Stea et al. (2006). Para a extração foram
pesados em balança digital semi-analítica cerca de 3,00 g (o peso exato foi
46
anotado) de cada hortaliça, previamente homogeneizada em processador de
alimentos. A hortaliça foi triturada com solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0,
contendo ácido ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1% e filtrada a vácuo em
funil de büchnner. O volume foi completado para 25 mL e o extrato obtido foi
aquecido por aproximadamente 12 minutos em banho-maria a 100 ºC, sob
agitação. Em seguida, foi resfriado, centrifugado (1789 g, por 30 minutos) e, em
seguida, utilizado para desconjugação de poliglutamatos.
Para desconjugação dos poliglutamatos a monoglutamatos, 100 μL de
plasma de rato contendo a enzima conjugase (γ-glutamil carboxipeptidase)
foram adicionados ao sobrenadante (3 mL) obtido no procedimento de extração
descrito anteriormente. Os extratos foram colocados em banho-maria a 37°C
por 3 horas. Em seguida, para ocorrer inativação enzimática, os extratos foram
aquecidos em água fervente por 5 minutos (JASTREBOVA et al., 2003).
2.4. Purificação do extrato de hortaliça
A purificação do extrato foi feita com base em procedimento descrito por
Jastrebova et al. (2003). O extrato obtido no procedimento anterior foi
purificado utilizando coluna de forte troca iônica, com fase estacionária de Q-
Sepharose, preparada em nosso laboratório. A coluna foi pré-condicionada
com metanol e água (1:1) a um fluxo de 1-2 gotas/segundo (usando bomba
peristáltica). Em seguida, o extrato foi aplicado à coluna a um fluxo de 2
gotas/segundo, aproximadamente. A coluna foi lavada com água ultrapura para
remoção dos componentes interferentes (fluxo de 1-2 gotas/segundo). Em
seguida, a eluição dos folatos retidos foi feita com acetato de sódio (0,1 M)
contendo cloreto de sódio 10%, ácido ascórbico 1% e 2-mercaptoetanol 0,1%.
Antes da análise cromatográfica, o extrato foi filtrado através de
membranas filtrantes com porosidade de 0,45 μm.
2.5. Análise de folatos por CLAE
O sistema de CLAE (Shimadzu, modelo SCL 10AD VP) empregado na
análise de folatos foi composto de bomba de alta pressão (válvula para
gradiente quaternário de baixa pressão), modelo LC-10AD VP; injetor
automático com alça de amostragem de 50 μL, modelo SIL-10AF e detector de
fluorescência (modelo RF10AXL). O sistema foi controlado pelo software Multi
47
System, Class VP 6.12. A separação dos folatos foi feita em coluna Shim Pack
100 RP18, 150 mm x 4,6 mm, 4,6 μm (Merck, Alemanha).
As condições cromatográficas utilizadas foram: fase móvel composta por
gradiente binário contendo acetonitrila e solução tampão fosfato (NaH
2
PO
4
30
mM, pH ajustado para 2,3 com H
3
PO
4
); fluxo 0,7 mL/min; volume injetado, 50
µL, detecção por fluorescência com excitação a 290 nm e emissão a 360 nm. O
gradiente iniciou-se com acetonitrila 6% (v/v), aumentando linearmente para
25% em 25 minutos, sendo essa concentração mantida por 2 minutos,
retornando em seguida às condições iniciais. A coluna foi re-equilibrada por 15
minutos antes da próxima corrida. O tempo total de corrida foi de 43 minutos.
Para evitar a formação de bolhas e controlar a variação da pressão,
utilizou-se um sistema de degasamento da fase móvel com gás hélio antes e
durante as corridas cromatográficas. Assim, a fase móvel foi degaseificada por
15 minutos a 150 kpa antes do início das análises e a 100 kpa ao longo das
corridas.
A identificação do THF, 5-MTHF e 5-FTHF nos extratos de hortaliças foi
realizada por comparação dos tempos de retenção obtidos nos extratos com os
obtidos para os respectivos padrões analisados sob as mesmas condições, e
por co-cromatografia.
A quantificação dos isômeros de folatos nas hortaliças foi feita a partir
das curvas de calibração e equações de regressão obtidas (THF: Y =
1178396061 x + 158374,83; R² = 0,99; 5-MTHF: Y = 1634094176 x –
262055,40; R² = 0,99; 5-FTHF: Y = 119560115,8 x – 1041248,88; R² = 0,98). O
cálculo da concentração real nas hortaliças foi obtido a partir das diluições
realizadas.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Análise qualitativa
As condições cromatográficas utilizadas permitiram boa resolução dos
picos de folatos (THF, 5-MTHF e 5-FTHF), o que permitiu a quantificação nas
hortaliças de forma segura (Figura 1). Todos os isômeros foram identificados
nas hortaliças estudadas, sendo os tempos de retenção de aproximadamente
11; 14,5 e 20 minutos para THF, 5-MTHF e 5-FTHF, respectivamente.
48
Fluorescência
(
volts
)
B (Espinafre Refogado)
A (Espinafre cru)
Fluorescência
(
volts
)
C (Floretes de
b
rócolis crus
)
D (Floretes de
brócolis cozidos sob
imersão)
Minutos
Minutos
Figura 1. Cromatogramas típicos de folatos em hortaliças cruas e cozidas.
Condições cromatográficas descritas em métodos (2.5).
3.2. Concentração de folatos nas hortaliças
Não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas (p>0,05)
em relação à concentração de folatos entre as hortaliças coletadas no inverno
ou na primavera (dados não mostrados). Esse resultado pode ser explicado
pela coleta das hortaliças em duas épocas do ano relativamente próximas entre
si, sem grandes variações sazonais. Na região da cidade de Viçosa, MG, o
clima enquadra-se na classificação Cwa (C: clima temperado; w: chuvas de
verão; a: verão quente), de acordo com a classificação climática de Köppen,
com temperatura do mês mais frio inferior a 18ºC e do mês mais quente
superior a 22ºC e com precipitação média anual de 1203 mm (CHAGAS et al.,
2008). Assim, não há grandes diferenças climáticas entre as duas estações do
ano estudadas. Dessa forma, nota-se que estações próximas entre si (inverno
e primavera) não são marcadamente diferentes, assim como as estações
“intermediárias” (primavera e outono), ou seja, basicamente apenas duas
estações no ano apresentam diferenças climáticas mais marcantes (verão,
quente e úmido; e inverno, frio e seco) (CAMPOS et al., 2006).
No ano de 2008, as temperaturas médias do município de Viçosa nos
meses de agosto e outubro não mostraram grande variação (agosto: média das
mínimas de 12,7°C e média das máximas de 26,6°; outubro: média das
49
50
mínimas de 17,1°C e média das máximas de 27,9°C). O fato de não terem sido
encontradas diferenças significativas pode ser considerado um achado positivo,
significando que os habitantes de um país tropical como o Brasil podem estar
consumindo quantidades similares de folato ao longo das estações estudadas.
Além disso, sugere-se que as hortaliças analisadas podem ser consideradas
fontes alimentares cuja concentração de folatos não sofreria oscilações no
referido período.
Como este se trata de um estudo preliminar, a realização de outros
trabalhos que permitam a coleta de hortaliças ao longo de todo o ano (incluindo
as quatro estações), seria útil para avaliar possíveis diferenças sazonais
quanto à concentração de folatos em hortaliças.
Em estudo sobre a análise da concentração de folatos em espinafre,
verificou-se que a concentração de 5-MTHF em espinafre variou de 225,8 a
527,3 µg/100 g no período de setembro a novembro e de 386,0 a 550,4 µg/100
g no período de maio a julho, enquanto as concentrações de 5-FTHF ficaram
entre 4,6 e 7,8 µg/100 g e 4,0 e 6,3 µg/100 g nos mesmos períodos avaliados
(LIMA-PALLONE et al., 2008b). A análise estatística dos dados mostrou não
haver diferença significativa entre os valores obtidos nas distintas épocas do
ano avaliadas, assim como o verificado no presente estudo.
Em outro trabalho que relacionou as concentrações de folatos às épocas
de cultivo, encontrou-se concentração de 5-MTHF variando de 16 a 26 µg/100
g e de THF variando de 1 a 4 µg/100 g em batata. O repolho branco não
mostrou variação quanto à concentração de 5-MTHF, que foi igual a 27 µg/100
g nas três épocas do ano, enquanto o THF variou de 2 a 5 µg/100 g. Nenhuma
dessas hortaliças apresentou quantidades expressivas de 5-FTHF
(VAHTERISTO et al., 1997).
A Tabela 1 mostra os dados da concentração de folatos em hortaliças
cruas e após serem submetidas a diferentes métodos de cocção.
A concentração de folatos totais variou de 154,79 µg/100 g em espinafre
cru (menor valor) a 798,14 µg/100 g em folhas de brócolis refogadas (maior
valor).
51
Tabela 1. Concentração de folatos (isômeros e soma de folatos) em hortaliças cruas e submetidas à cocção (em µg/100 g de matéria
fresca).
Hortaliças THF 5-MTHF 5-FTHF Folatos (Soma) Retenção de folatos totais (%)
Couve crua 72,91 ± 46,05 67,02 ± 41,63 409,79 ± 379,39 549,71 ± 267,89 --
Couve fatiada refogada 56,22 ± 30,12 56,84 ± 30,00 347,16 ± 285,00 460,22 ± 211,99 77,97
Couve rasgada refogada 53,63 ± 22,93 56,22 ± 30,93 300,56 ± 260,41 410,41 ± 187,30 72,30
Floretes de brócolis crus 69,46 ± 57,67 123,12 ± 91,29 562,01 ± 415,20 754,59 ± 326,82 --
Floretes de brócolis cozidos a vapor 26,40 ± 18,37*** 102,19 ± 87,60 354,55 ± 96,67 483,14 ± 257,77 70,46
Floretes de brócolis cozidos sob imersão 10,83 ± 5,07*** 87,99 ± 65,53 297,29 ± 138,25*** 396,11 ± 219,19**** 57,24
Folhas de brócolis cruas 60,71 ± 32,42 219,40 ± 87,47 451,40 ± 264,12 731,51 ± 306,76 --
Folhas de brócolis refogadas 56,61 ± 35,63 226,31 ± 68,80 520,82 ± 391,18 803,74 ± 356,23 102,03
Espinafre cru 24,57 ± 21,89 42,72 ± 26,59 173,77 ± 73,22 241,06 ± 81,29 --
Espinafre refogado 13,25 ± 12,97 27,11 ± 15,92 114,43 ± 69,49 154,79 ± 60,76 54,04
Mostarda crua 71,67 ± 60,85 164,93 ± 32,41 327,78 ± 289,94 564,38 ± 234,22 --
Mostarda refogada 44,13 ± 38,40 112,67 ± 30,10 129,84 ± 65,91 286,64 ± 91,39 53,20
Média de oito repetições ± desvio-padrão
% de Retenção = colocar aqui a fórmula para cálculo.
Valores médios foram significativamente diferentes das hortaliças cruas (teste t pareado: ***P<0,005; ****P<0,001)
Embora não tenham sido encontrados na literatura estudos que
avaliaram a concentração de folatos em folhas de brócolis, verifica-se que essa
hortaliça, geralmente descartada durante as etapas de pré-preparo, contribui
com concentrações expressivas dessa vitamina, de modo que seu consumo
sob a forma de sopas, suflês e saladas deve ser estimulado.
Muitos trabalhos relatam a concentração de vitaminas em couve,
entretanto, não foram encontrados estudos a respeito das concentrações de
folatos nessa hortaliça, indicando o pioneirismo dessa pesquisa.
Stea et al. (2006) encontraram concentração de folatos totais em floretes
de brócolis semelhante ao encontrado no presente estudo. Os autores
detectaram concentração igual a 866 µg/100g, mas esse valor normalmente é
superior àqueles verificados em outros trabalhos, como o de Lima-Pallone
(2008a), Vahteristo et al. (1997), DeSouza e Eitenmiller (1986) e Mullin et al.
(1982), em que foi observada concentração dessa vitamina de 427,8 µg/100g,
114 µg/100g, 102 µg/100g e 133 µg/100g, respectivamente.
Em espinafre, as concentrações de folatos totais encontrados estão de
acordo com a literatura pesquisada. Iwatani et al. (2003) relataram
concentração de folatos nessa hortaliça iguais a 302 µg/100g. Lin e Lin (1999),
DeSouza e Eitenmiller (1986), Shrestha et al. (2000) e Aiso e Tamura (1998)
reportaram concentrações de folatos iguais a 364 µg/100g, 251 µg/100g, 193
µg/100g e 224 µg/100g, respectivamente, utilizando metodologia semelhante à
do presente estudo. Em estudo conduzido por Pandrangi; Laborde (2004), o
espinafre apresentou concentração de folatos totais variando de 84 a 225
µg/100g, com média de 160 ± 42 µg/100g.
O único estudo encontrado a respeito da concentração de folatos em
mostarda foi o de Iwatani et al. (2003), no qual os autores detectaram
concentração dessa vitamina igual a 278 µg/100g, inferior ao verificado nesse
trabalho.
Ao se analisar a Tabela do United States Department of Agriculture
(USDA, 2009), percebe-se que, de modo geral, as concentrações de folatos
encontrados em nosso estudo foram superiores, com exceção da couve, que
mostrou concentrações menores. De acordo com essa tabela, as
concentrações de folatos totais para floretes de brócolis, couve, espinafre e
mostarda (avaliados pelo método microbiológico) foram, respectivamente, 160
µg/100 g, 764 µg/100 g, 52 µg/100 g e 137 µg/100 g.
52
A variação nas concentrações de folatos encontrada no presente
trabalho em relação a outros estudos pode ser explicada por fatores que
levariam à maior ou menor síntese dessa vitamina em hortaliças. Nas frutas e
hortaliças, os isômeros de folatos e a sua distribuição nas diferentes porções
são afetadas pela luz, já que a síntese da vitamina ocorre na fotorrespiração
(LIMA-PALLONE et al., 2008a). O grau de maturação também se mostra
importante, já que os folatos participam do processo de divisão celular e sua
quantidade é maior nos tecidos em divisão do que nos tecidos já maduros
(SCOTT et al., 2000). Minerais como potássio e magnésio também são
bastante importantes na produção de folatos pelas frutas e hortaliças,
participando de uma das etapas da biossíntese dessa vitamina (VAHTERISTO
et al., 1997).
Vale ressaltar que as diferentes metodologias de extração e análise
também levam a variações importantes quanto à concentração de folatos. O
método oficial, baseado em ensaio microbiológico, quantifica a concentração
de folatos totais presente nas amostras, enquanto técnicas bioespecíficas e a
CLAE são capazes de determinar os isômeros mais comumente presentes, os
quais desempenham papéis diferentes no metabolismo (PATRING, 2005).
Observou-se que a cocção sob imersão em água em ebulição foi o
método que menos preservou a concentração de 5-FTHF e de THF em floretes
de brócolis (ver Tabela 1). A cocção a vapor também não foi eficiente na
preservação de THF nestas hortaliças. O método refogar em óleo não
promoveu redução significativa da concentração de folatos nas hortaliças
estudadas. Vale ressaltar que para esse método o tempo de cocção foi curto (2
minutos), enquanto as formas de cocção a vapor e sob imersão em água
utilizaram tempos mais longos (cerca de 6 minutos para ambos os métodos).
Além disso, o folato, por ser uma vitamina hidrossolúvel, é mais facilmente
perdido na água de cocção. Nenhum dos métodos avaliados promoveu
redução significativa (p>0,05) da concentração de 5-MTHF.
Para determinar se uma maior superfície de exposição ao oxigênio seria
capaz de promover perdas significativas de folatos em couve, as formas fatiada
e rasgada foram analisadas. Sabe-se que a maior área de superfície e a forma
geométrica em que a hortaliça é cortada podem afetar as perdas de folatos
(MALIN, 1977). Entretanto, no presente trabalho, não foi encontrado efeito do
tipo de corte sobre a retenção de folatos em couve.
53
Nosso estudo mostrou que as folhas de brócolis apresentaram
concentração dos isômeros de folatos similar àqueles encontrados em floretes
de brócolis (parte normalmente utilizada para consumo). Ao serem preparadas
sob a forma refogada, assim como as demais hortaliças analisadas sob as
mesmas condições, as folhas de brócolis não apresentaram redução
significativa de folatos.
Em estudo sobre a retenção de folatos em alimentos consumidos
rotineiramente pela população do Reino Unido (MCKILLOP et al. 2002), foram
encontradas concentrações de folatos totais (avaliados pelo método
microbiológico) em espinafre cru variando de 189,5 µg/100 g a 191,8 µg/100 g
e em floretes de brócolis crus variando de 172 µg/100 g a 177 µg/100 g. Após
cocção em água, a concentração dessa vitamina foi significativamente reduzido
para 94,4 µg/100 g e para 102,8 µg/100 g em espinafre e brócolis,
respectivamente. As perdas foram explicadas pela escolha do método de
cocção, uma vez que os folatos podem ter sido perdidos por lixiviação. Por
outro lado, os floretes de brócolis cozidos a vapor não apresentaram perdas
significativas de folatos totais. No presente estudo, as perdas foram
observadas em ambos os métodos, tanto na cocção sob imersão em água
quanto na cocção a vapor.
Em estudo sobre a influência do cozimento em espinafre (LIMA-
PALLONE et al. 2008b), foi encontrada redução na concentração de 5-MTHF
de 552,0 µg/100 g para 127,1 µg/100 g, diferente do que foi encontrado no
presente trabalho, em que as concentrações de 5-MTHF em todas as hortaliças
analisadas permaneceram estáveis após a cocção. Ainda em relação ao
estudo desenvolvido por esses autores, foi verificada redução de 5-FTHF, de
7,8 µg/100 g para 1,6 µg/100 g, após cocção em água. Os autores não
detectaram a presença de THF na hortaliça estudada. Observa-se que, na
maioria dos trabalhos encontrados na literatura, as concentrações de 5-FTHF
foram inferiores aos detectados na presente pesquisa.
Outros autores também encontraram perdas consideráveis de folatos em
espinafre após a cocção em água. De Souza e Eitenmiller (1986) observaram
perdas de 83% na concentração de folatos totais, enquanto Puupponen-Pimia
et al. (2003) relataram perdas de 70% na concentração dessa vitamina.
Embora a técnica de cocção a vapor não tenha sido analisada por esses
autores, os mesmos sugerem que esse método de cocção tem maior
54
capacidade de retenção de folatos quando comparada à cocção sob imersão
em água, corroborando os resultados do presente estudo, cuja retenção de 5-
FTHF foi superior no primeiro método de cocção.
McKillop et al. (2002) verificaram que a retenção de folatos em espinafre
após a cocção em água foi de 49%, sendo que as concentrações variaram de
191,8 a 94,4 µg/100g na hortaliça in natura e após a cocção, respectivamente.
De forma semelhante, a retenção de folatos em brócolis foi de 44% (177,1 e
77µg/100g, in natura e após a cocção, respectivamente). A cocção a vapor
para essas duas hortaliças não ocasionou em perdas estatisticamente
significativas de folatos, resultando em retenção significativamente maior em
ambas as hortaliças quando comparada à cocção em água. Em nosso estudo,
a cocção a vapor foi capaz de preservar a concentração de 5-MTHF e 5-FTHF
em floretes de brócolis, mas não se mostrou eficaz na preservação de THF.
Não foram encontrados na literatura estudos sobre as perdas de folatos
após a cocção de couve, folhas de brócolis e mostarda, o que mostra a
importância e contribuição dos dados obtidos no presente estudo.
Estudo sobre a retenção de folatos em hortaliças, conduzido por
Hoppner e Lampi (1993), indicou baixa retenção dessa vitamina durante a
cocção, possivelmente devido à lixiviação. Batatas fatiadas, congeladas e fritas
apresentaram metade da concentração de folato das batatas cruas (dados em
base seca). Cenoura fatiada perdeu aproximadamente 40% de sua
concentração de folato durante a cocção úmida. Embora as hortaliças
analisadas por esses autores não sejam as mesmas do presente estudo, os
dados sugerem a preocupação com a retenção de folatos após diferentes
métodos de cocção.
Outro trabalho revelou perdas importantes de folato em batata após as
condições manipulação em Serviços de Alimentação. A maior retenção ocorreu
com o método sous-vide (103%), seguido pela cocção úmida (72-59%) e, por
fim, pela cocção com calor seco (63%) (STEA et al, 2006). No presente estudo,
a cocção úmida (sob imersão em água) não se mostrou eficaz na preservação
de folatos nas hortaliças.
Os altos valores de desvio-padrão observados neste estudo (Tabela 1)
são comuns em trabalhos que envolvem análise de vitaminas em matrizes
alimentares. Como existe grande variabilidade biológica entre esses alimentos,
é esperado que haja ampla faixa de variação entre os dados, mesmo que o
55
pesquisador tente reduzir a heterogeneidade amostral, coletando amostras da
mesma variedade, mesmo local de cultivo, no mesmo estágio de maturação,
em pontos de coleta aleatórios e homogeneizando completamente a hortaliça
antes do procedimento de extração.
O percentual de retenção de cada isoforma de folatos após diferentes
métodos de cocção das hortaliças está demonstrado na Figura 2.
A retenção dos isômeros nas hortaliças após cocção variou de 17,01% a
87,21% para THF, 53,41 a 94,07% para 5-MTHF e 39,04 a 107,9% para 5-
FTHF. O THF mostrou-se como o isômero menos estável, enquanto o 5-MTHF
foi considerado o mais estável aos processos de cocção.
Verifica-se que o menor percentual de retenção ocorreu em floretes de
brócolis cozidos sob imersão, os quais só preservaram cerca de 17% da
concentração de THF após a cocção. Aparentemente, houve redução
importante do percentual de retenção de folatos, mesmo naquelas hortaliças
que não mostraram diferenças estatisticamente significativas após serem
cozidas. Por exemplo, a couve fatiada apresentou percentuais de retenção
iguais a 71,81%; 79,01% e 79,4% de THF, 5-MTHF e 5-FTHF após ser
refogada em óleo, enquanto a mostarda refogada apresentou retenção da
ordem de 64,35% para THF; 66,23% para 5-MTHF e 39,04% para 5-FTHF.
56
71,81
71,23
41,83
17,01
87,21
45,37
64,35
0
20
40
60
80
100
120
Couve
fatiada
refogada
Couve
rasgada
refogada
Floretes de
brócolis
cozidos a
vapo r
Floretes de
brócolis
cozidos sob
imersão
Folhas de
brócolis
refogadas
Espinafre
Refogado
Mostarda
Refogada
Retenção THF (%)
79,01
81,27
91,34
77,93
94,07
53,41
66,23
0
20
40
60
80
100
120
Couve
fatiada
refogada
Couve
rasgada
refogada
Floretes de
brócolis
cozidos a
vapor
Floretes de
brócolis
cozidos sob
imersão
Folhas de
brócolis
refogadas
Espinafre
Refogado
Mostarda
Refogada
Retenção 5-MTHF (%)
79,4
70,58
69,43
57,68
107,9
55,42
39,04
0
20
40
60
80
100
120
Couve
fatiada
refogada
Couve
rasgada
refogada
Floretes de
brócolis
cozidos a
vapor
Floretes de
brócolis
cozidos sob
imersão
Folhas de
brócolis
refogadas
Espinafre
Refogado
Mostarda
Refogada
Retenção 5-FTHF (%)
Figura 2. Retenção dos isômeros de folatos em hortaliças submetidas à
cocção.
Em trabalho realizado por Lima-Pallone (2008a), somente os isômeros
5-MTHF e 5-FTHF foram encontrados em floretes de brócolis. A perda desses
isômeros após a cocção em água foi de aproximadamente 68%, sendo que
53% da concentração perdida foram encontrados na água de cocção, o que
sugere que as perdas foram ocasionadas principalmente por lixiviação. Em
contrapartida, Stea et al. (2006) observaram menores perdas de folatos em
57
brócolis após a cocção em água, sendo estas de aproximadamente 24,5%.
Nosso estudo apontou perdas intermediárias de 5-FTHF em relação aos dois
trabalhos citados anteriormente após cocção de floretes de brócolis em água
em água (retenção de 57,68%).
Outro estudo detectou perdas de folatos por lixiviação em espinafre após
a cocção em água de aproximadamente 74% para o 5-MTHF e 56% para o 5-
FTHF (LIMA-PALLONE et al., 2008b). Aproximadamente 58% da concentração
de 5-MTHF e cerca de 39% de 5-FTHF migraram para a água de cocção. Os
autores relatam que 20% dos folatos totais provavelmente foram degradados
durante o processamento caseiro (lavagem, fatiamento e perdas pelo calor).
Em nosso trabalho, o espinafre não foi analisado sob a forma cozida em água,
mas refogado, apresentando menores perdas dos isômeros de folatos.
Diferenças na retenção de folatos em diversas hortaliças submetidas à
cocção em água foram observadas por Holasová et al. (2008). A maior
retenção foi encontrada em couve-de-bruxellas, couve-flor e brócolis. Depois
de 8 minutos de cozimento, mais de 75% da concentração inicial de 5-MTHF
permaneceu nessas hortaliças. Valores menores de retenção desse isômero
foram encontrados em espinafre, repolho e cenoura, variando entre 37 e 52%
de sua concentração inicial. Nosso trabalho também mostrou preservação de
5-MTHF, entretanto esse resultado foi semelhante para todas as hortaliças
estudadas, diferentemente do trabalho desses autores.
Segundo alguns autores, outros métodos de cocção, não avaliados
nesse estudo, também promovem boa retenção (aproximadamente 80%) de
folatos em hortaliças, tais como a cocção sob pressão e em forno de
microondas (DANG et al., 2000; CHEN et al. 1983).
A forte relação entre as perdas de folato e a duração da cocção pode em
parte explicar as perdas vitamínicas encontradas nesse estudo e em trabalhos
de outros autores. Por exemplo, Leichter et al. (1978) encontraram perdas de
até 78% de folatos em espinafre depois de 10 minutos de cocção em água,
enquanto que McKillop et al. (2002) relataram 51% de perdas de folatos depois
de 3 minutos de cocção em água. No presente trabalho, o espinafre não foi
analisado sob a forma cozida em água, entretanto, em floretes de brócolis
cozidos sob imersão, foram verificadas perdas significativas. Isso pode ser pelo
fato da hortaliça ter permanecido por cerca de 6 minutos em contato com a
58
água, em comparação aos 2 minutos em que as hortaliças refogadas ficaram
em contato com o óleo.
A solubilidade dos folatos em água é uma característica que influencia
de maneira considerável sua perda, principalmente por lixiviação, quando
ocorre contato direto do vegetal com a água em ebulição (LIMA-PALLONE et
al., 2008b). Mesmo que, nesse estudo, as hortaliças tenham apresentado alta
concentração de folatos, as perdas ocorridas durante o processo de cocção em
água devem ser consideradas em inquéritos de consumo alimentar.
3.3. Atendimento às recomendações de folatos
Em 1992, o U.S. Public Health Service estabeleceu uma recomendação
de que todas as mulheres em idade fértil devem consumir 400 µg de ácido
fólico/dia, para reduzir o risco de desenvolvimento de doenças do tubo neural
durante a gravidez (CHOUMENKOVITCH et al., 2002; MARTINEZ et al., 2005),
enquanto a recomendação para gestantes foi definida em 600 µg de ácido
fólico/dia. Em 1998, a Food and Drug Administration (FDA) estabeleceu que
todos os produtos derivados de cereais deveriam ser enriquecidos com ácido
fólico na proporção de 140 µg/100g do produto (CHOUMENKOVITCH et al.,
2002). No Brasil, a RDC nº 344, de 13 de dezembro de 2002, prevê a adição
de 150 μg de ácido fólico por 100g de farinha de trigo e de milho, desde que a
adição dessa vitamina não cause interferências no produto, com modificação
de cor e sabor.
Nos últimos anos, o consumo de hortaliças tem diminuído entre os
brasileiros. Segundo dados fornecidos pelo Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE), o consumo total de hortaliças no Brasil durante o período de
1995 a 1996 foi de aproximadamente 34,42 kg per capita/ano (94,04
g/pessoa/dia). Comparando com os dados obtidos no período de 2002 a 2003,
observa-se que houve redução no consumo, passando este a ser de
aproximadamente 29,00 kg per capita/ano (79,24 g/pessoa/dia), sendo que
para hortaliças folhosas o consumo foi de 2,5 kg per capita/ano (6,83
g/pessoa/dia). Esses dados demonstram que o consumo de hortaliças
encontra-se muito aquém da recomendação diária que, de acordo com a
Pirâmide Alimentar Adaptada à População Brasileira (PHILIPPI et al., 1999),
deveria ser de 4 a 5 porções, o equivalente a 300 g/dia em uma dieta de 2200
kcal/dia.
59
Avaliando o percentual de adequação da ingestão de folatos nas
hortaliças estudadas (Tabela 2), pode-se verificar que a ingestão de uma
porção média de 70 g de três das hortaliças estudadas (floretes de brócolis
crus, folhas de brócolis cruas e refogadas) é capaz de atingir mais de 100%
das recomendações de folatos para mulheres em idade fértil, enquanto a
ingestão de 2 porções (140 g) de todas as hortaliças, com exceção do
espinafre cru e refogado, já atinge tais recomendações.
Ressalta-se, entretanto, que o consumo de floretes e folhas de brócolis
crus é bastante incomum em nosso meio, devendo ser estimulado. Embora as
hortaliças estudadas possam ser consideradas excelentes fontes dessa
vitamina, o atendimento às recomendações nutricionais de folato pode ser
comprometido com as perdas ocorridas durante os processos de cocção.
Por outro lado, o procedimento de cocção é comprovadamente capaz de
aumentar a biodisponibilidade de nutrientes entre eles, as vitaminas. Assim,
mesmo que perdas possam ser detectadas, o aproveitamento desses
compostos pelo organismo é aumentado, melhorando seu aproveitamento.
Dessa forma, a cocção não deve ser evitada, mas recomenda-se maior
controle em relação à escolha do método e ao tempo de cocção das hortaliças,
visando à maior preservação vitamínica.
Os resultados desse estudo demonstram a grande contribuição do
adequado consumo de alimentos fontes de folatos ao atendimento às
recomendações dessa vitamina, especialmente levando-se em consideração
grupos populacionais vulneráveis, como é o caso de mulheres em idade fértil e
gestantes.
60
Tabela 2. Adequação da ingestão de folatos por hortaliças para mulheres em
idade fértil e gestantes.
Soma de Folatos
Adequação da Ingestão de folatos
(%)
Hortaliça
1 porção de
hortaliça (70 g)
2 porções de
hortaliça (140 g)
Mulheres em
idade fértil *
1 porção - 2 porções
Gestantes**
1 porção - 2 porções
Couve crua
384,80 769,60 96,20 – 192,40 64,13 – 128,26
Couve fatiada refogada
322,15 644,3 80,54 – 161,08 53,69 – 107,38
Couve rasgada refogada
287,29 574,58 71,82 – 143,64 47,88 – 95,76
Floretes de brócolis crus
528,21 1056,42 132,05 – 264,10 88,03 – 176,06
Floretes de brócolis
cozidos a vapor
338,20 676,40 84,55 – 169,10 56,37 – 112,74
Floretes de brócolis
cozidos sob imersão
277,28 554,56 69,32 – 138,64 46,21 – 92,42
Folhas de brócolis cruas
512,06 1024,12 128,01 – 256,02 85,34 – 170,68
Folhas de brócolis
refogadas
562,62 1125,24 140,65 – 281,30 93,77 – 187,54
Espinafre cru
168,74 337,48 42,18 – 84,36 28,12 – 56,24
Espinafre refogado
108,35 216,70 27,08 – 54,16 18,06 – 36,12
Mostarda crua
395,07 790,14 98,77 – 197,54 65,84 – 131,68
Mostarda refogada
200,65 401,30 50,16 – 100,32 33,44 – 66,88
* Recommended Dietary Alowances (RDA): 400 μg/dia (IOM, 2004)
** Recommended Dietary Alowances (RDA): 600 μg/dia (IOM, 2004)
4. CONCLUSÕES
Não foram detectadas diferenças significativas quanto à concentração
de folatos entre as duas estações do ano avaliadas (inverno e primavera) para
nenhuma das hortaliças
As hortaliças estudadas demonstraram ser excelentes fontes de folato
na alimentação, atingindo grande parte das recomendações dessa vitamina
para mulheres em idade fértil, grupo vulnerável à deficiência de folatos.
A retenção de folatos nas hortaliças folhosas mostrou-se fortemente
dependente de cada hortaliça, do método de cocção e da forma isomérica. O
método de cocção por refogamento em óleo preservou a concentração dessa
vitamina nas hortaliças, enquanto a cocção sob imersão em água foi o método
que causou as maiores perdas de THF e 5-FTHF.
61
Como as análises foram conduzidas em escala laboratorial, simulando a
preparação doméstica, torna-se necessária a realização de mais estudos que
avaliem as perdas de folatos após as etapas de manipulação e preparo em
serviços de larga escala, como as Unidades de Alimentação e Nutrição,
aumentando as informações a respeito da qualidade nutricional de hortaliças
rotineiramente consumidas.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à CAPES pela concessão de bolsa de mestrado e
à FAPEMIG pela bolsa de iniciação científica.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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66
5. CONCLUSÕES GERAIS
As hortaliças analisadas constituem fontes importantes de folatos para a
alimentação, sendo que seu consumo deve ser estimulado, especialmente para
mulheres de idade fértil, que constituem grupo de risco para a deficiência dessa
vitamina.
Dentre as três isoformas de folatos analisadas, o 5-formiltetraidrofolato
(5-FTHF) foi a encontrada em maior quantidade. Sua concentração diferiu entre
as hortaliças, sendo que os floretes e as folhas de brócolis apresentaram as
maiores concentrações, e o espinafre, as menores.
Devido ao caráter hidrossolúvel dos folatos e por serem facilmente
perdidos na água de cocção, observou-se que as perdas de 5-FTHF e THF
foram significativas quando utilizada a cocção sob imersão em água em
floretes de brócolis. A cocção a vapor também não se mostrou eficiente na
preservação de THF na mesma hortaliça. O método de refogamento em óleo
não ocasionou perdas significativas de folatos, provavelmente devido ao curto
tempo de cocção.
Quando analisadas entre duas épocas do ano distintas (inverno e
primavera), não foram encontradas diferenças em relação à concentração de
folatos nas hortaliças, provavelmente devido à semelhança de condições
climáticas entre essas duas estações.
A metodologia utilizada no presente estudo mostrou-se confiável para
predição da concentração de folatos nesse tipo de matriz alimentar. Os testes
de validação demonstraram alta recuperação dos padrões vitamínicos ao longo
dos procedimentos de extração e análise, boa repetibilidade e baixos limites de
detecção e quantificação.
Ressalta-se que as hortaliças analisadas, devido ao seu baixo custo,
facilidade de aquisição e ampla disponibilidade na região devem ser escolhidas
para utilização em programas de alimentação, como é o caso do Programa de
Aquisição de Alimentos (PAA), visando a atender as necessidades de folatos
da população em geral.
67
68
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Uma vez que a análise de folatos envolve uma série de desafios, devido
a sua instabilidade, dificuldade das técnicas de extração e análise e presença
em baixas concentrações nos alimentos, sugere-se mais estudos que
possibilitem a otimização e a validação de metodologias de análise dessa
vitamina em outros alimentos tipicamente brasileiros, e também em outras
matrizes alimentares como as frutas.
Os métodos de cocção avaliados no presente estudo foram realizados
em escala laboratorial, simulando a preparação doméstica das hortaliças.
Assim, verifica-se a necessidade da realização de trabalhos que avaliem a
influência do processo de cocção em serviços de alimentação, em condições
reais de preparação e consumo, aumentando os dados na literatura a respeito
da estabilidade de folatos em alimentos.
Outros estudos com maior tempo de duração, que possibilitem a coleta
de hortaliças nas quatro diferentes estações do ano, poderão avaliar melhor a
variação da concentração de folatos ao longo do ano.
APÊNDICE A - (Artigo 2) - Concentração e teste de médias de tetraidrofolato (THF) em hortaliças cruas e submetidas a
diferentes métodos de cocção.
Teste de médias
Hortaliça Tratamento
x S(x) CV Valor de t Probabilidade
Crua 72,91 46,05 63,16
Fatiada
Refogada
56,23 30,12 53,56 0,93
0,3820
ns
Couve
Rasgada
Refogada
53,63 22,93 42,75 1,52
0,1723
ns
Cru 69,46 57,67 83,02
Cozido a
Vapor
26,40 18,37 69,58 2,85 0,0245 *
Florete de
Brócolis
Cozido sob
Imersão
10,83 5,07 46,81 2,74 0,0289 *
Crua 60,71 32,42 53,40
Folha de
Brócolis
Refogada 56,61 35,63 62,94 0,25
0,8111
ns
Cru 24,57 21,89 89,09
Espinafre
Refogado 13,25 12,97 97,89 1,53
0,1688
ns
Crua 71,67 60,85 84,90
THF
(µg/100g MF)
Mostarda
Refogada 44,13 38,40 87,01 1,16
0,2845
ns
x: Média de 8 repetições; S(x): Desvio-padrão; CV: Coeficiente de variação (%) = S(x)/x * 100; Probabilidade: P>0,05: não significativo (ns) ou *:
significativo, a 5% de probabilidade, pelo teste t pareado.
69
APÊNDICE B - (Artigo 2) - Concentração e teste de médias de 5-metiltetraidrofolato (5-MTHF) em hortaliças cruas e
submetidas a diferentes métodos de cocção.
Teste de médias
Hortaliça Tratamento
x S(x) CV Valor de t Probabilidade
Crua 67,02 41,63 62,11
Fatiada
Refogada
56,84 30,00 52,78 0,85
0,4209
ns
Couve
Rasgada
Refogada
56,22 30,93 55,02 1,15
0,2870
ns
Cru 123,12 91,29 74,15
Cozido a
Vapor
102,19 87,60 85,72 1,65
0,1432
ns
Florete de
Brócolis
Cozido sob
Imersão
87,99 65,53 74,47 1,49
0,1800
ns
Crua 219,40 87,47 39,87
Folha de
Brócolis
Refogada 220,71 68,80 31,17 0,11
0,9129
ns
Cru 42,72 26,59 62,24
Espinafre
Refogado 27,11 15,92 58,72 1,25
0,2521
ns
Crua 164,93 32,41 19,65
5-MTHF
(µg/100g MF)
Mostarda
Refogada 112,67 30,10 26,71 1,33
0,2244
ns
x: Média de 8 repetições; S(x): Desvio-padrão; CV: Coeficiente de variação (%) = S(x)/x * 100; Probabilidade: P>0,05: não significativo (ns) ou *:
significativo, a 5% de probabilidade, pelo teste t pareado.
70
71
APÊNDICE C - (Artigo 2) - Concentração e teste de médias de 5-formiltetraidrofolato (5-FTHF) em hortaliças cruas e
submetidas a diferentes métodos de cocção.
Teste de médias
Hortaliça Tratamento
x S(x) CV Valor de t Probabilidade
Crua 409,79 379,39 92,58
Fatiada
Refogada
347,16 285,00 82,09 0,96
0,3688
ns
Couve
Rasgada
Refogada
300,56 260,41 86,64 1,34
0,2218
ns
Cru 562,01 415,20 73,93
Cozido a
Vapor
354,55 96,67 27,26 1,67
0,1393
ns
Florete de
Brócolis
Cozido sob
Imersão
297,29 138,25 46,50 4,76 0,0021 *
Crua 451,40 264,12 58,51
Folha de
Brócolis
Refogada 520,82 381,18 73,19 0,64
0,5433
ns
Cru 173,77 73,22 42,14
Espinafre
Refogado 114,43 69,49 60,73 2,10
0,0739
ns
Crua 327,78 289,94 88,45
5-FTHF
(µg/100g MF)
Mostarda
Refogada 129,84 65,91 50,76 2,00
0,0858
ns
x: Média de 8 repetições; S(x): Desvio-padrão; CV: Coeficiente de variação (%) = S(x)/x * 100; Probabilidade: P>0,05: não significativo (ns) ou *:
significativo, a 5% de probabilidade, pelo teste t pareado.
APÊNDICE D - (Artigo 3) - Concentração e teste de médias de tetraidrofolato
(THF) em hortaliças cruas e cozidas, coletadas no inverno e na primavera.
Teste de Médias
Hortaliça Tratamento
x S(x) CV Valor de f Probabilidade
Inverno 65,72
30,10 45,80
CC
Primavera
80,11
62,49 78,00
0,17 0,6927
ns
Inverno 50,09
34,58 69,03
CFR
Primavera
62,36
28,65 45,94
0,30 0,6043
ns
Inverno 54,12
24,76 45,75
CRR
Primavera
53,14
24,77 46,61
0,00 0,9571
ns
Inverno 58,53
48,91 83,56
FLBC
Primavera
80,39
61,05 75,94
0,26 0,6303
ns
Inverno 24,93
12,28 49,26
FLBV
Primavera
27,87
15,12 54,25
0,04 0,8405
ns
Inverno 12,71
4,47 35,17
FLBCOZ
Primavera
8,96
5,53 61,72
1,11 0,3317
ns
Inverno 62,38
31,78 50,94
FOBC
Primavera
59,05
37,89 64,16
0,02 0,8974
ns
Inverno 67,88
34,34 50,59
FOBR
Primavera
45,34
38,00 83,81
0,77 0,4126
ns
Inverno 49,49
10,34 20,89
EC
Primavera
24,69
6,53 26,45
0,66 0,4470
ns
Inverno 4,59
0,81 17,65
ER
Primavera
21,90
13,85 63,24
4,23 0,0568
ns
Inverno 70,83
29,14 41,14
MC
Primavera
72,53
18,25 24,16
0,00 0,9720
ns
Inverno 64,47
46,81 72,61
THF (µg/100 MF)
MR
Primavera
23,77
12,05 50,69
2,83 0,1433
ns
CC: Couve crua; CFR: Couve fatiada refogada; CRR: Couve rasgada refogada; FLBC: Floretes
de brócolis crus; FLBV: Floretes de brócolis cozidos a vapor; FLBCOZ: Floretes de brócolis
cozidos sob imersão; FOBC: Folhas de brócolis cruas; FOBR: Folhas de brócolis refogadas;
EC: Espinafre cru; ER: Espinafre refogado; MC: Mostarda crua; MR: Mostarda refogada.
x: Média de 4 repetições; S(x): Desvio-padrão; CV: Coeficiente de variação (%) = S(x)/x * 100;
Probabilidade: P>0,05: não significativo (ns) ou *: significativo, a 5% de probabilidade, pela
Análise de Variância.
72
APÊNDICE E - (Artigo 3) - Concentração e teste de médias de 5-
metiltetraidrofolato (5-MTHF) em hortaliças cruas e cozidas, coletadas no
inverno e na primavera.
Teste de médias
Hortaliça
Tratamento
x S(x) CV Valor de f Probabilidade
Inverno 59,62
18,00 30,19
CC
Primavera
74,42
59,78 80,33
0,22 0,6521
ns
Inverno 52,76
24,03 45,54
CFR
Primavera
60,92
38,46 63,13
0,13 0,7312
ns
Inverno 50,36
13,55 26,91
CRR
Primavera
62,08
44,24 71,26
0,26 0,6304
ns
Inverno 83,43
9,98 11,96
FLBC
Primavera
162,80
23,06 14,16
1,54 0,2616
ns
Inverno 56,45
26,37 46,71
FLBV
Primavera
147,92
61,24 41,40
2,06 0,2010
ns
Inverno 37,91
19,19 50,62
FLBCOZ
Primavera
138,07
19,33 14,00
1,35 0,2891
ns
Inverno 60,66
22,25 36,68
FOBC
Primavera
378,15
31,61 8,36
1,42 0,2778
ns
Inverno 74,47
22,46 30,16
FOBR
Primavera
378,15
59,74 15,80
1,31 0,2952
ns
Inverno 50,40
35,37 70,18
EC
Primavera
35,03
15,56 44,42
0,63 0,4566
ns
Inverno 15,11
2,67 17,67
ER
Primavera
39,12
14,15 36,17
0,26 0,6303
ns
Inverno 55,15
38,49 69,79
MC
Primavera
274,71
30,30 11,03
1,99 0,2079
ns
Inverno 69,52
27,83 40,02
5-MTHF (µg/100g MF)
MR
Primavera
155,83
83,71 53,72
0,86 0,3888
ns
CC: Couve crua; CFR: Couve fatiada refogada; CRR: Couve rasgada refogada; FLBC: Floretes
de brócolis crus; FLBV: Floretes de brócolis cozidos a vapor; FLBCOZ: Floretes de brócolis
cozidos sob imersão; FOBC: Folhas de brócolis cruas; FOBR: Folhas de brócolis refogadas;
EC: Espinafre cru; ER: Espinafre refogado; MC: Mostarda crua; MR: Mostarda refogada.
x: Média de 4 repetições; S(x): Desvio-padrão; CV: Coeficiente de variação (%) = S(x)/x * 100;
Probabilidade: P>0,05: não significativo (ns) ou *: significativo, a 5% de probabilidade, pela
Análise de Variância.
73
APÊNDICE F - (Artigo 3) - Concentração e teste de médias de 5-
formiltetraidrofolato (5-FTHF) em hortaliças cruas e cozidas, coletadas no
inverno e na primavera.
Teste de médias
Hortaliça Tratamento
x S(x) CV Valor de f Probabilidade
Inverno 396,94
58,64 14,77
CC
Primavera
422,63
212,76 50,34
0,01 0,9322
ns
Inverno 330,70
50,40 15,24
CFR
Primavera
363,62
58,24 16,02
0,02 0,8847
ns
Inverno 359,60
42,65 11,86
CRR
Primavera
241,54
77,59 32,12
0,37 0,5631
ns
Inverno 382,31
280,25 73,30
FLBC
Primavera
741,71
487,42 65,71
1,63 0,2483
ns
Inverno 170,76
95,75 56,07
FLBV
Primavera
538,34
68,69 12,76
0,56 0,3894
ns
Inverno 131,45
92,46 70,34
FLBCOZ
Primavera
463,14
84,59 18,26
2,81 0,1445
ns
Inverno 294,17
224,71 76,38
FOBC
Primavera
608,63
215,30 35,37
4,08 0,0898
ns
Inverno 439,79
50,60 11,50
FOBR
Primavera
611,86
190,74 31,17
0,31 0,5982
ns
Inverno 126,69
52,32 41,30
EC
Primavera
220,85
62,43 28,27
5,35 0,0601
ns
Inverno 72,23
49,17 68,07
ER
Primavera
156,63
64,05 40,89
4,37 0,0815
ns
Inverno 156,76
80,26 51,20
MC
Primavera
498,80
342,34 68,63
3,96 0,0937
ns
Inverno 136,89
44,14 32,24
05-FTHF (µg/100g MF)
MR
Primavera
122,79
89,75 73,09
0,08 0,7873
ns
CC: Couve crua; CFR: Couve fatiada refogada; CRR: Couve rasgada refogada; FLBC: Floretes
de brócolis crus; FLBV: Floretes de brócolis cozidos a vapor; FLBCOZ: Floretes de brócolis
cozidos sob imersão; FOBC: Folhas de brócolis cruas; FOBR: Folhas de brócolis refogadas;
EC: Espinafre cru; ER: Espinafre refogado; MC: Mostarda crua; MR: Mostarda refogada.
x: Média de 4 repetições; S(x): Desvio-padrão; CV: Coeficiente de variação (%) = S(x)/x * 100;
Probabilidade: P>0,05: não significativo (ns) ou *: significativo, a 5% de probabilidade, pela
Análise de Variânci
74
APÊNDICE G - Fôlder – A importância do folato na manutenção da saúde.
75
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