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UNIVERSIDADE DE FRANCA
UNIFRAN
REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA
COMERCIAL
ORIENTADORA: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza
PÓS-GRADUANDA: Samanta Maria Faleiros Corrêa
Franca
2009
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SAMANTA MARIA FALEIROS CORRÊA
REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA
COMERCIAL
Dissertação apresentada à
Universidade de Franca, UNIFRAN,
como exigência parcial, para a
obtenção do título de Mestre em
Cirurgia e Anestesiologia Veterinária
Orientadora: Profa. Dra. Fabiana
Ferreira de Souza
FRANCA
2009
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Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca
Faleiros, Samanta Maria
F177r Refrigeração de sêmen canino em caixa térmica comercial / Samanta
Maria Faleiros ; orientador: Fabiana Ferreira de Souza. – 2009
43 f. : 30 cm.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca
Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Cirurgia e
Anestesiologia Veterinária
1. Inseminação artificial – Sêmem canino. 2. Inseminação artificial –
Refrigeração. 3. Inseminação artificial – Espermatozóide. 4. Inseminação
artificial – Botutainer (caixa-térmica). 5. Cirurgia veterinária – Reprodução
animal (biotecnologia). I. Universidade de Franca. II. Título.
CDU – 636.082.453.5:636.7
SAMANTA MARIA FALEIROS CORRÊA
REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA
COMERCIAL
COMISSÃO JULGADORA DO PROGRAMA DE MESTRADO EM CIRURGIA E
ANESTESIOLOGIA VETERINÁRIA
Presidente: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza
Universidade de Franca – UNIFRAN
Titular 1: Profa. Dra. Aline Adriana Bolzan
Universidade de Franca - UNIFRAN
Titular 2: Profa. Dra. Maria Isabel Mello Martins
Universidade Estadual de Londrina - UEL
Franca, 10/06/2009
DEDICO este estudo aos meus pais, Hortêncio e Marialda
pela educação que foi a base necessária para vencer esta e
todas as etapas de minha vida.
Ao Cássio e Maria Leonor, pelo apoio e amizade.
Em especial ao meu esposo Luiz Gustavo e ao meu filho Luiz
Arthur, pelo amor sem medida e incentivo para que pudesse
chegar até aqui...
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus;
à minha orientadora e amiga Profa. Fabiana Ferreira Souza, que me
apoiou e auxiliou com seu imenso conhecimento;
aos alunos Murillo Mansano Moscardini, Tarcísio Torre Lourenço e
Diego Souza Moura, pela contribuição na realização deste trabalho.
ao Canil e Hotel Bandog de adestramento, por gentilmente fornecer
os animais para realização da colheita do sêmen; e
à Universidade de Franca pela estrutura física disponibilizada para o
estudo.
Enquanto estivermos tentando, estaremos felizes, lutando
pela definição do indefinido, pela conquista do impossível,
pelo limite do ilimitado, pela ilusão de viver.
Quando o impossível tornar-se um desafio, a satisfação
estará no esforço e não apenas na realização final...
Gandhi
RESUMO
CORRÊA, Samanta Maria Faleiros. Refrigeração de sêmen canino em caixa
térmica comercial. 2009. 38 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia e
Anestesiologia Veterinária) – Universidade de Franca, Franca.
Muitos criadores têm encontrado no transporte do sêmen refrigerado, uma
alternativa para substituir o transporte dos animais. Porém, no Brasil, ainda não se
comercializam caixas térmicas específicas para esta finalidade. Desta forma, o
objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade espermática do sêmen refrigerado de
cães, em caixa térmica disponível no mercado nacional, para a conservação do
sêmen em outras espécies. Para tanto, foram colhidos 16 ejaculados de seis cães
adultos saudáveis. Os ejaculados foram analisados quanto à motilidade, ao vigor,
à concentração, à morfologia espermática, ao teste hiposmótico e à coloração
supra-vital com eosina. Após a análise, o sêmen foi dividido em quatro alíquotas,
centrifugado e o sobrenadante retirado. Duas amostras foram rediluídas com o
plasma seminal (controle) e duas com meio Kenney. Após a diluição, as amostras
foram mantidas na caixa térmica Botutainer
(Biotech, Botucatu, SP, Brasil), a qual
preserva a temperatura em torno de 5°C, por até 35 horas. De acordo com os
resultados, a caixa térmica foi capaz de manter alta viabilidade espermática, nas
amostras conservadas em meio diluente e no plasma seminal. Contudo, o meio
diluente foi superior ao plasma seminal, especialmente na manutenção da
motilidade espermática. Concluiu-se que a caixa Botutainer
pode ser empregada
para o envio do sêmen canino, por meios de transporte convencionais.
Palavras-chave: canino; refrigeração; espermatozóide; Botutainer; caixa-térmica.
ABSTRACT
CORRÊA, Samanta Maria Faleiros. Canine chilled semen in commercial
container. 2009. 38 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia e Anestesiologia
Veterinária) – Universidade de Franca, Franca.
Many breeders have found in chilled semen transport, an alternative to replace the
animal transport. However, specific box to carry canine semen is not selling in
Brazil. Thus, the purpose of this study was to evaluate canine sperm viability after
to cool in a thermal box available on market, used to other species. Sixteen
ejaculated from six healthy adult dogs were collected. The ejaculated were
analyzed for motility, vigor, concentration, sperm morphology, swelling test and
eosin stain. After analysis, the semen was divided into 4 aliquots, centrifuged and
the supernatant was removed. Two samples were rediluted with seminal plasma
and two with Kenney. These samples were kept in Botutainer
(Biotech, Botucatu,
SP, Brazil) thermal box, which maintains temperature around 5°C for 35 hours.
According to our results, the box was capable to maintain increased sperm viability
in samples either stored in extender or seminal plasma. However, the extender
was superior to seminal plasma, particularly to preserve the sperm motility. It was
concluded that Botutainer
thermal box can be used to carry canine semen by
conventional means.
Key-words: dog; chilled; sperm, Botutainer; thermal-box.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
-
Caixa térmica para o transporte do sêmen, Botutainer®
(Biotech
, Botucatu, SP, Brasil) para o transporte de sê
men a
5°C. A- Caixa Botutainer
fechada; B- Caixa Botutainer
aberta
e preenchida por dois gelos eutéticos, no centro três amostras
de sêmen e um frasco com água; C- Caixa Botutainer
aberta
com a tampa 22
Figura 2 -
Média e erro padrão da motilidade
espermática de 16 ejaculados
de seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney,
imediatamente após a colheita (fresco), 24 e 48 horas após a
refrigeração 25
Figura 3 - Resultados da coloração com eosina (A
) e do teste hiposmótico
(B). A. A seta preta indica espermatozóide sem coloração
(membrana íntegra) e a vermelha
corado com eosina
(membrana lesada). B. A seta preta indica o espermatozóide
com a cauda reta (membrana lesada) e a vermelha o
espermatozóide com a cauda enrolada (membrana íntegra) 25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
-
Cães utilizados no experimento, de acordo com a raça e número
de ejaculados 20
Tabela 2
-
Média do volume, concentração de espermatozóides/ml,
motilidade, vigor espermático, testes hiposmótico, coloração com
eosina e porcentagem de espermatozóides morfologicamente
normais de 16 ejaculados de seis cães, diluídos em plasma
seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita
(fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração. 24
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 12
1 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 13
2 OBJETIVO ............................................................................................................. 19
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 20
3.1 ANIMAIS .............................................................................................................. 20
3.2 COLHEITA DO SÊMEN ...................................................................................... 20
3.3 AVALIAÇÃO DO SÊMEN .................................................................................... 21
3.4 REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN ............................................................................ 22
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 23
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 24
DISCUSSÃO......................................................................................................26
CONCLUSÃO ........................................................................................................... 31
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 32
INTRODUÇÃO
Em muitos países as técnicas de inseminação artificial (IA) com
sêmen refrigerado e congelado são rotineiras, bem como o conhecimento das
doenças que afetam a função reprodutiva dos cães, mas no Brasil esta realidade
ainda longe.
Tendo em vista o transporte de sêmen para IA, dois métodos podem
ser utilizados a refrigeração a 4 e 5
ºC
e a congelação à -196ºC porque as baixas
temperaturas diminuem as taxas metabólicas dos espermatozóides e prolongam
sua longevidade.
Taxas de concepção semelhantes têm sido relatadas na IA com
sêmen fresco e refrigerado e a qualidade do sêmen refrigerado é superior ao
congelado. Desta forma, para o transporte de sêmen dentro do país, deve ser
dada preferência à refrigeração.
A existência de poucos estudos relacionados à refrigeração do
sêmen de cão motivou esta pesquisa para avaliar a viabilidade do sêmen durante
48 horas, tempo suficiente para o envio por meios de transporte convencionais,
utilizando-se a caixa térmica Botutainer® (Biotech, Botucatu, SP, Brasil), a qual
mantém a temperatura em torno de 5°C, durante 35 horas de acordo com as
orientações do fabricante.
1 REVISÃO DA LITERATURA
Atualmente, as técnicas que visam melhorar a eficiência reprodutiva
em cães ainda são pouco difundidas no Brasil. Porém, a reprodução canina no
país vem crescendo expressivamente (VALLE, 2009).
Muitos pesquisadores estão utilizando as biotécnicas visando o
melhoramento genético e com isso têm surgido reprodutores de alto valor (LINDE-
FORSBERG; FORSBERG,1993).
Biotécnicas, que há muito tempo eram utilizadas em animais de
produção, como inseminação artificial (IA) com sêmen refrigerado e sêmen
congelado, hoje são procuradas por criadores de cães brasileiros. Contudo, seu
sucesso pode ser ameaçado pelo desconhecimento dos clínicos de pequenos
animais e também pela utilização errônea por leigos (VALLE, 2009).
Os primeiros estudos relacionados a IA e conservação do sêmen de
cães foram feitos por Lázaro Spallanzani, no final do século XVIII (ENGLAND,
1993). Embora os árabes tenham usado a IA em equinos, no século XIV (1332),
antes de Spallanzani, acredita-se que seus estudos foram os primeiros dos
tempos modernos a obter uma gestação por IA, utilizando o cão como modelo. Em
1780, este pesquisador colheu o sêmen por sifonagem da vagina de uma cadela,
acasalada naturalmente, para inseminar outra cadela no cio, da qual nasceram
três filhotes. Foi também Spallanzani, em 1776, o primeiro a observar que a
diminuição na temperatura reduzia reversivelmente, a atividade metabólica dos
espermatozóides, permitindo dessa forma sua estocagem (JOHNSTON, 2000).
Em 1949, a descoberta da ação crioprotetora do glicerol, por Polge et
al. (1949), proporcionou um impacto significante na metodologia da
criopreservação dos espermatozóides. Rowson, em 1954, descreveu a técnica de
congelação na espécie canina. E, em 1956, Harrop descreveu uma gestação de
cão obtida por inseminação com sêmen refrigerado (JOHNSTON, 2000).
Em 1969, Seager obteve a primeira gestação canina com sêmen
criopreservado (SILVA, 2007). Durante as últimas décadas, o interesse pela
inseminação artificial (IA), em cães, cresceu substancialmente. No Brasil, os
primeiros relatos de IA com sêmen refrigerado, em cães, foi o de Silva et al., em
2004, seguido por Apparício et al. (2007) e Uchoa et al. (2007).
O principal objetivo da IA, em cães, é viabilizar a gestação quando a
monta natural não é possível, seja por incompatibilidade do casal, assim como por
distância geográfica. A técnica também reduz o risco de transmissão de doenças
entre machos e fêmeas, além de minimizar os riscos com o transporte do animal.
Nestes casos, o sêmen pode ser refrigerado ou congelado. Embora o sêmen
refrigerado sofra menores danos pela temperatura, as taxas de concepção, de
cadelas inseminadas com sêmen refrigerado, são menores do que aquelas
inseminadas com sêmen fresco ou monta natural (ENGLAND; PONZIO, 1996;
JOHNSTON et al., 2001; RIJSSELAERE et al., 2002; SILVA et al., 2004).
Quando o sêmen necessita ser transportado para proposta de IA,
dois métodos podem ser utilizados: o sêmen congelado (-196°C) e o refrigerado
(5°C) (ENGLAND; PONZIO, 1996). As baixas temperatur as diminuem as taxas
metabólicas do espermatozóide e prolongam sua longevidade (WATSON, 1995).
A despeito do curto período de armazenamento da técnica de refrigeração, a
vantagem é que a qualidade do sêmen refrigerado é superior à do congelado
(ENGLAND; PONZIO, 1996), sendo uma técnica viável para curtos períodos de
armazenamento. Ademais, a técnica de refrigeração apresenta menor custo, outra
vantagem do sêmen refrigerado, em relação ao congelado, é o menor dano às
células espermáticas, com taxas de gestação superiores (STORNELLI et al.,
2001). Contudo, com longos períodos de estocagem, o sêmen refrigerado se
deteriora (ENGLAND; PONZIO, 1996). Quanto ao sêmen congelado, embora
possa ser armazenado por longos períodos (anos), a viabilidade e longevidade
espermática são prejudicadas e, conseqüentemente, a fertilidade (OETTLÉ, 1986;
ENGLAND, 1993; ENGLAND; PONZIO, 1996).
Pinto et al. (1999) estudaram a fertilidade de cadelas inseminadas
com sêmen refrigerado. Estes pesquisadores não encontraram diferença
significativa na taxa de gestação e tamanho da ninhada, entre os grupos de
cadelas inseminadas com sêmen fresco (94%, média tamanho da ninhada = 7,2) e
as inseminadas com sêmen refrigerado por 24 horas (90%, média tamanho da
ninhada = 7,2) ou 48 horas (100%, média tamanho da ninhada = 7,0). Neste
estudo de Pinto et al. (1999) o sêmen foi mantido sob refrigeração durante 48
horas e as cadelas foram inseminadas três vezes durante 1 semana, durante o
estro citológico.
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986), a fertilidade do sêmen
refrigerado é de, no máximo 72 horas. Contudo, Feldman e Nelson (1996),
afirmaram que, se o sêmen for adequadamente diluído e refrigerado, os
espermatozóides podem manter-se vivos e viáveis por até cinco dias.
Experimentos recentes comprovam a permanência de viabilidade espermática por
tempo mais prolongado.
A despeito da existência de diversos estudos sobre a congelação do
sêmen do cão, a literatura é escassa quanto à refrigeração. Raros relatos sobre
refrigeração dos espermatozóides caninos em temperaturas superiores a 5°C têm
sido encontrados.
England e Ponzio (1996) verificaram uma alta qualidade do sêmen
após 48 horas de refrigeração a 5°C. Contudo, a tax a de declínio da qualidade
espermática foi diferente para cada parâmetro motilidade, vigor, teste hiposmótico
e coloração com eosina, de acordo com o tempo, sendo a morfologia espermática
o que se deteriorou mais rapidamente. Aproximadamente, com cinco dias de
refrigeração, a qualidade do sêmen refrigerado foi equivalente à qualidade de um
sêmen descongelado.
A refrigeração do sêmen, durante 24 a 48 horas, pode ser um passo
inicial para a congelação, quando há impossibilidade do congelamento logo após
a colheita. Para esta proposta, Hermansson e Linde-Forsberg (2006) congelaram
o sêmen de cão, após um ou dois dias de refrigeração a 4°C. Nenhuma diferença
foi verificada na motilidade e integridade da membrana espermática e acrossomal,
quando comparado àquele congelado logo após a colheita.
As características de um bom sêmen, para a espécie canina, de
acordo com o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA) são: volume
variável, motilidade maior que 70%, vigor maior que três e concentração
espermática total acima de 200x10
6
de espermatozóides.
É difícil, também, determinar a fertilidade dos machos caninos devido
às variações inerentes aos ejaculados, variações no ciclo estral da cadela, sua
duração a falta de protocolos efetivos para sincronização do cio, tudo isso
utilizando testes in vitro esporádicos dificultam a análise dos resultados sobre a
capacidade fecundante das amostras (EILTS, 2005; MINTER; DELIBERTO, 2005)
Ademais, os bons resultados obtidos com refrigeração se devem á boa qualidade
do sêmen, a qual deve ser avaliada no momento da sua preparação e antes de
sua utilização, bem como o controle da ovulação da fêmea (VALLE, 2009).
A refrigeração e a congelação do sêmen só são possíveis com o uso
de meios diluentes capazes de conservar uma boa motilidade e integridade da
membrana espermática (BOUCHARD et al., 1990). O diluente é capaz de proteger
a membrana espermática dos danos causados pela modificação de temperatura.
Além disso, o diluente é fonte de energia e mantém estáveis o pH e a
osmolaridade (LARDY; PHILIPS, 1939, MARSHALL; HUGH, 1990) e contêm
antibióticos que evitam a contaminação bacteriana (ROTA et al., 1995). O meio
diluente mantém a pressão osmótica e a concentração de eletrólitos dentro dos
padrões fisiológicos e possue crioprotetores que protegem as células de lesões
provocadas pelo choque térmico, oriundo do processo de resfriamento
(CONCANNON; BATTISTA, 1989). A melhor maneira de avaliar o diluente é
através da taxa de concepção apresentada pela cadela após a IA, porém esta
avaliação muitas vezes torna-se inviável na experimentação (LOPES et al., 2005)
Vários diluentes para conservação de sêmen já foram estudados. Na
maioria dos trabalhos realizados utilizou-se o meio TRIS/gema de ovo, contendo
frutose ou glicose, meio citrato/gema de ovo e meios comerciais (FOOTE, 1964;
FOOTE; LEONARD, 1964; GILL et al., 1970; SEAGER; FLETCHER, 1972;
FARSTAD, 1984; PROVINCE et al., 1984; MORTON; BRUCE, 1989; BOUCHARD
et al., 1990; LINDE-FORSBERG, 1995, FELDMAN; NELSON, 1996; SCHAFER et
al., 1997; PINTO et al., 1999; IGUER-OUADA; VERSTEGEN, 2001a; 2001b;
TSUTSUI et al., 2003). A frutose, numa concentração de 1 a 10 mM, indica maior
linearidade e menor oscilação nos parâmetros de motilidade quando comparada à
glicose (RIGAU et al., 2001). Contudo, o meio mais popular e simples é o Kenney,
composto de leite desnatado (0,5% de gordura) (KENNEY et al., 1975).
Verstegen et al. (2005) avaliaram a troca de meio, nos parâmetros de
motilidade do sêmen refrigerado em diluente TRIS-glicose-gema de ovo, por um
período de 27 dias. Nas amostras sem a troca de meio, foi observada ausência de
motilidade, aos 16 dias. Com a troca de meios, a motilidade foi ausente somente
com 27 dias. A fertilidade foi avaliada e cinco entre dez cadelas apresentaram-se
gestantes quando a IA foi realizada apenas uma vez, por via vaginal, com sêmen
refrigerado, por nove dias. Ademais, sete entre dez cadelas foram gestantes,
quando a inseminação foi realizada duas vezes. Concluíram que é possível a
conservação do sêmen a 4°C, por no mínimo, três sem anas com boa fertilidade
por até 10 dias.
Bouchard et al. (1990) estudaram as características do sêmen de
cães mantido a 4°C, utilizando dois meios: leite de snatado/glicose ou citrato gema
de ovo. O sêmen diluído foi submetido a três diferentes temperaturas de
estocagem (35°C, 22°C e 4°C); e três taxas de refri geração (4°C) foram
investigadas (-1,0, -0,3 e -0,1°C/min). O sêmen foi avaliado a cada seis horas, até
120 horas. O meio contendo leite desnatado foi superior ao citrato/gema, na
maioria das observações, na manutenção da motilidade espermática. Além disso,
a motilidade espermática foi significantemente maior quando o sêmen foi
conservado a 4°C. A motilidade foi maior quando for am utilizadas taxas médias ou
rápidas de refrigeração.
Segundo Messias (2000), o sêmen canino refrigerado (4°C) diluído
em TRIS-gema mostrou-se superior ao diluente leite desnatado. Os diluentes
TRIS-gema e leite desnatado, quando acrescidos de secreção prostática,
mostraram-se inferiores nos parâmetros motilidade progressiva e integridade do
acrossomo (p < 0,05). O tempo de viabilidade do sêmen, que apresentou mínimo
de 50% de motilidade progressiva, com os referidos diluentes foi: TRIS-gema: 82,5
horas; leite desnatado: 60,7 horas; TRIS – gema acrescida de secreção prostática:
60,3 horas; leite desnatado acrescido de secreção prostática: 38,4 horas. Os
diluentes acrescidos de secreção prostática não apresentaram resultados
satisfatórios na conservação do sêmen canino a 5°C.
Iguer-Ouada e Verstegen (2001a) encontraram uma média de 86,3%
de motilidade, para o meio Byladil acrescido de gema de ovo, sete dias após a
refrigeração do sêmen a 4°C. A motilidade foi manti da até em média, 9,7 e 13 dias
para os diluentes TRIS-frutose e TRIS-glicose, respectivamente. Os meios
contendo gema de ovo preservaram a qualidade espermática e preveniram a
precoce reação do acrossomo, podendo preservar uma boa viabilidade até 10 dias
de refrigeração, desde que a temperatura seja mantida.
O uso de caixas isotérmicas para o envio de amostra de sêmen,
entre regiões distantes, permite uma melhor programação para o destino das
amostras e evita a perda do material (MOTA-FILHO et al., 2007).
Para o transporte, existem sistemas de resfriamento passivos e
ativos. Os passivos apresentam menor custo, porém sua eficiência depende de
alguns fatores, tais como: temperatura ambiente; da amostra; do produto
refrigerado e da massa da amostra. Já os sistemas ativos, apesar de mais caros,
permitem melhores taxas de resfriamento, pois a temperatura é pré-estabelecida
(VALLE, 1999). Exemplo de um sistema passivo são as caixas térmicas de isopor
e de um sistema ativo, o refrigerador doméstico.
A conservação do sêmen do cão já foi descrita em salas climatizadas
(IGUER-OUADA; VERSTEGEN, 2001a; 2001b; VERTEGEN et al., 2005),
refrigeradores convencionais (ROTA et al., 1995; STROM-HOLST et al., 2000;
PONGLOWHAPAN et al., 2004), garrafas térmicas, recipientes térmicos
comerciais tais como Lane STS System
(PINTO et al., 1999), Botutainer
(NAGAO et al., 2007) e caixas isotérmicas de poliestireno expandido (SILVA et al.,
2004, MOTA-FILHO et al., 2007). Sistemas utilizando caixas de poliestireno
expandido (isopor), como o Max Semen Express
são os mais simples,
disponíveis comercialmente, porém não possuem controle algum de temperatura.
Nenhuma das caixas produzidas no Brasil é própria para o transporte do sêmen
canino (comunicação pessoal, SOUZA, 2009).
Quando se compara os containeres para o sêmen congelado (botijão
de nitrogênio líquido) e refrigerado (caixa térmica), pode-se afirmar que as caixas
térmicas são mais leves e por este motivo, o transporte de custo menor, o que
pode ser outra vantagem.
Segundo o fabricante a caixa Botutainer
é um container
desenvolvido para a refrigeração de sêmen, demonstrando alta eficiência na
manutenção da temperatura interna, mesmo sobre estresse calórico ambiental.
Sua taxa de refrigeração é de 0,05ºC/min, mantendo a temperatura de 5ºC, por
até 35 horas.
Mota-Filho et al. (2007) comentam a necessidade de mais estudos
para determinar o período máximo de conservação do sêmen, em caixas
isotérmicas. Tais estudos podem contribuir para determinação de uma caixa e
meio diluente ideal para refrigeração do sêmen canino, com fins de aplicação
comercial, além de servir como modelo para o transporte de sêmen de espécies
ameaçadas de extinção (LOPES et al., 2005).
2 OBJETIVO
O objetivo do presente estudo foi determinar a viabilidade das células
espermáticas de cães mantidas a 5°C, durante 24 e 48 horas, de acordo com suas
características morfológicas e funcionais, utilizando: volume, cor, motilidade e
vigor, concentração espermática, morfologia espermática, teste hiposmótico e
coloração supra-vital, em caixa térmica Botutainer
para sua aplicação comercial.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Utilizaram-se 16 ejaculados de seis (n = 6) cães adultos, de
diferentes raças ou sem raça definida (tabela 1) com idades entre dois e cinco
anos, saudáveis, avaliados pelo exame clínico e histórico de saúde, provenientes
de criatórios particulares e treinados para colheita. Os machos foram alimentados
com ração comercial e água à vontade.
Tabela 1 – Cães utilizados no experimento, de acordo com a raça e número de
ejaculados.
Cão Raça Número de ejaculados Peso
1 Border Collie 4 19,3 Kg
2 Rottweiler 4 35,1 Kg
3 Labrador 2 25 Kg
4 Labrador 3 21 Kg
5 SRD 2 15 Kg
6 SRD 1 18 Kg
3.2 COLHEITA DO SÊMEN
Após o período de adaptação e condicionamento (três semanas), os
cães foram submetidos a duas colheitas de sêmen, com intervalo médio de sete
dias entre cada uma. O ejaculado foi colhido por manipulação digital, em tubo
plástico graduado e funil acoplado, sem auxílio de fêmea no cio (SEAGER;
PLATZ, 1977).
3.3 AVALIAÇÃO DO SÊMEN
O sêmen foi avaliado, imediatamente após a colheita, e com 24
horas e 48 horas de refrigeração.
Após a colheita, o sêmen foi avaliado, no prazo máximo de 15
minutos, segundo as suas características morfológicas e funcionais. Foram
avaliados os seguintes parâmetros:
Volume: determinado pela graduação do tubo plástico utilizado na
colheita em ml.
Cor: determinada pela visualização direta, considerando a cor branca
opalescente como normal.
Motilidade e vigor: determinados com uma gota de sêmen colocada
sobre lâmina aquecida (38–40ºC) e recoberta por lamínula, sendo os parâmetros
de 0 a 100% para motilidade e um escore de 0 a cinco para o vigor, de acordo
com a qualidade do movimento dos espermatozóides.
Concentração espermática: foi realizada em câmara hematimétrica
de “Neubauer” após a diluição do sêmen total na proporção de 1: 20 em água
destilada. Os espermatozóides foram contados sob microscópio de contraste de
fase, em aumento de 20X e o número de células foi expresso em ml.
Morfologia espermática: foi avaliada em uma única oportunidade,
após a colheita de todas as amostras e após 24 e 48 horas pelo método de Karras
modificado (PAPA et al; 1986).
Teste hiposmótico: realizado segundo a técnica descrita por
JEYENDRAN et al. (1984), considerando que espermatozóides com cauda
enrolada mantinham a membrana íntegra e os espermatozóides com cauda lisa
tinham a membrana lesada.
Coloração supra-vital: avaliada pelo método da eosina (eosina
amarela 3% em solução fisiológica - HAFEZ, 1995, PEÑA, 2000), considerando
que espermatozóides sem coloração tinham a membrana íntegra e
espermatozóides que coravam-se em vermelho tinham a membrana lesada.
3.4 REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN
Após a análise, o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e colocado em
tubos plásticos de 5 ml. As amostras foram centrifugadas a 700xg, durante 10
minutos. O sobrenadante plasma seminal, foi eliminado dos tubos, sendo duas
amostras diluídas em 1,0 ml de meio Kenney 1:1 (KENNEY et al., 1975) e os dois
tubos restantes rediluídos no plasma seminal provenientes da centrifugação.
Os tubos contendo o sêmen diluído (Kenney ou plasma seminal) foram
fechados com tampa e acondicionados na caixa térmica Botutainer
. No momento
da avaliação, uma alíquota de cada tubo (sêmen diluído em plasma seminal ou em
Kenney) foi retirada.
A alíquota retirada da caixa térmica foi colocada, em estante para
tubos sobre placa aquecedora a 38ºC, durante 10 minutos, e após este período foi
avaliada quanto à motilidade, ao vigor, à morfologia, à coloração supra-vital com
eosina e ao teste hiposmótico.
Figura 1 - Caixa térmica, Botutainer
(Biotech, Botucatu, SP, Brasil) para o
transporte de sêmen a 5°C. A - Caixa Botutainer
fechada; B - Caixa Botutainer
aberta e preenchida por dois gelos eutéticos; no centro três amostras de sêmen e
um frasco com água ( seguindo a orientação do fabricante); C- Caixa Botutainer
aberta com a tampa.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos na forma de média e erro padrão. As
análises dos resultados, referentes às características seminais, foram realizadas
pelo Mann-Whitney Rank Sum Test, utilizando o programa SigmaStat for
Windows, v.3.0.1 (2003). A diferença mínima significativa considerada foi p<0,05.
A
B
C
4 RESULTADOS
A análise do sêmen fresco encontrou-se dentro dos parâmetros
normais para a espécie (Tabela 1).
Os resultados da análise do sêmen fresco, e após 24 e 48 horas de
refrigeração a 5°C, diluído em plasma seminal (cont role) ou meio Kenney estão
apresentados na Tabela 1.
Todos os parâmetros avaliados no sêmen fresco foram superiores
(p<0,05) aos do sêmen refrigerado, seja em plasma seminal ou meio Kenney. Na
Figura 2, é possível observar que o sêmen mantido em meio Kenney apresentou
maior motilidade (p<0,05) do que o mantido em plasma seminal, utilizado como
controle, quando comparados em qualquer situação. A qualidade do movimento
(vigor espermático) foi mantida tanto no sêmen diluído no plasma seminal
(p>0,05), assim como no meio Kenney.
Estatisticamente, maior lesão da membrana espermática foi
observada no sêmen refrigerado em plasma seminal e meio Kenney, durante 48
horas, avaliado pelo teste hiposmótico, e do sêmen refrigerado em meio Kenney,
durante 48 horas, avaliado pela coloração com eosina (Figura 3).
Tabela 2 - Médias e erros padrão do volume (VOL), concentração de
espermatozóides/ml (CONC/ml), motilidade espermática (MOT), vigor espermático
(VIG), teste hiposmótico (HIPOSM), coloração com eosina (EOS) e porcentagem
de espermatozóides morfologicamente normais (NORM) de 16 ejaculados de seis
cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita
(fresco), e 24 e 48 horas após a refrigeração.
TRAT
V
OL
(ml)
C
ONC
/ml
(x10
6
)
M
OT
(%)
V
IG
(0 a 5)
H
IPOSM
(%)
E
OS
(%)
N
ORM
(%)
FRESCO 2,3 150,4 96,8
a
4,1
a
89,9
a
88,0
a,b,c
73
Plasma
seminal
24 h -- -- 60,0
b
2,8
b
84,7
a,b
85,3
a
--
48 h -- -- 47,5
c
2,8
b
81,3
b
80,7
a,b,c
--
Kenney
24 h -- -- 79,7
d
3,3
b
84,5
a,b
80,0
a,b,c
--
48 h -- -- 65,8
b
2,8
b
79,2
b
77,9
c
--
Letras diferentes nas colunas indicam diferença estatística significativa (p<0,05).
Figura 2 - Média e erro padrão da motilidade espermática de 16 ejaculados de
seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a
colheita (fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração.
Motilidade (%)
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Plasma seminal
Kenney
Fresco 24 horas 48 horas
Figura 3 – Resultados da coloração com eosina (A) e do teste hiposmótico (B). A.
A seta preta indica espermatozóide sem coloração (membrana íntegra) e a
vermelha corado com eosina (membrana lesada). B. A seta preta indica o
espermatozóide com a cauda reta (membrana lesada) e a vermelha o
espermatozóide com a cauda enrolada (membrana íntegra).
A
B
DISCUSSÃO
O armazenamento de germoplasma abre fronteiras para o estudo
da preservação de espécies de canídeos silvestres, sendo uma das principais
formas de aumentar a variabilidade genética (JOHNSTON ;LACY, 1995). Neste
contexto, novos métodos têm sido desenvolvidos no intuito de viabilizar a
criopreservação e técnicas de avaliação da função espermática, no cão.
Em vista da dificuldade de se realizar testes in vivo, para avaliação
da fertilidade no cão, e sabendo que os ensaios in vitro são capazes de mostrar
quais os aspectos da função espermática estão alterados (AMANN, 1989; ZHANG
et al., 1999) nesse estudo foram utilizadas técnicas convencionais (motilidade,
vigor, concentração e morfologia espermática) e complementares para avaliar
(teste hiposmótico e coloração com eosina). Desta forma, acreditou-se que a
união desses testes seria capaz de predizer a fertilidade in vivo.
A principal forma de se avaliar a célula espermática in vitro é
determinar suas características morfofuncionais (EILTS, 2005). A avaliação da
motilidade espermática é a mais comum e informa sobre uma das características
necessárias ao espermatozóide para a fertilização. Apesar disto, a correlação
entre a motilidade e a capacidade fertilizante da célula espermática ainda não é
totalmente esclarecida e os achados são conflitantes (ENGLAND & ALLEN, 1989,
SÖDERQUIST et al., 1991, KJAESTAD et al., 1993, IVANOVA-KICHEVA et al.,
1997, SANCHEZ-PARTIDA et al., 1999, TARDIF et al., 1999). No estudo aqui
apresentado, a motilidade do sêmen mantido a 5°C, durante 48 horas, manteve-se
próxima (65,8%) daquela recomendada como mínima (70%), para o sêmen fresco,
pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA). Já que a motilidade tem
sido correlacionada positivamente à fertilidade in vitro, determinada pelo teste de
penetração em zona pelúcida (HOLT et al., 1985, FETTEROLF & ROGERS,
1990), acredita-se que esse sêmen poderia ser capaz de promover a fertilização.
Comparando-se os resultados deste estudo, com os descritos na
literatura, os aqui apresentados foram inferiores aos encontrados por Verstegen et
al. (2005), que refrigeram a 4°C, o sêmen canino por longos períodos (até 27 dias)
com meio TRIS- gema- glicose. Nos dias 11, 21 e 27 o meio foi trocado e a
motilidade espermática recuperada, parcialmente. A motilidade total média,
avaliada por análise computadorizada (CASA), manteve-se em 68% até o 11° dia.
Contudo, o meio descrito nos estudos de Verstegen et al. (2005) foi diferente do
utilizado neste estudo (Kenney). Além disso, as condições dos estudos não são
semelhantes. Nesse estudo, utilizou-se uma caixa térmica, na qual a temperatura
não é constante e é mantida por tempo limitado, sendo possível a refrigeração por
poucos dias. Já no estudo de Verstegen et al. (2005), utilizaram-se refrigeradores.
De acordo com Iguer-Ouada e Verstegen (2001), meios contendo
gema de ovo preservam a qualidade espermática e previnem a precoce reação do
acrossomo, podendo preservar uma boa viabilidade até 10 dias de refrigeração,
desde que a temperatura seja mantida. Em eqüinos, Melo et al. (2005) também
descrevem a melhor qualidade do sêmen refrigerado em meio contendo gema de
ovo. Tais observações não foram confirmadas aqui anteriormente em um estudo
piloto, pois a proposta inicial foi utilizar o meio TRIS-gema-glicose, mas a
qualidade do sêmen foi inferior e optou-se por utilizar o meio Kenney, o qual
mostrou resultados superiores.
Contrariamente, o estudo de Bouchard et al. (1990) descreveu
superioridade do meio contendo leite desnatado quando comparado ao
citrato/gema, na maioria das observações, para manter a motilidade espermática.
Messias (2000) relatou que o sêmen canino refrigerado (4°C) diluído em TRIS-
gema mostrou-se superior ao diluente leite desnatado, sendo que a motilidade
mínima de 50% foi observada até 60,7 horas, quando se usou o meio à base de
leite desnatado. De acordo com os resultados desse estudo, a motilidade
espermática foi superior a 60%, até 48 horas de manutenção na caixa térmica.
A avaliação da funcionalidade da membrana pode ser usada como
um indicador da capacidade de fertilizar do espermatozóide (JEYENDRAN et al.,
1984). Neste estudo a integridade da membrana avaliada pelo teste hiposmótico
foi menor no sêmen refrigerado, contudo manteve-se nas 48 horas de
refrigeração, próximo aos 80%. A integridade da membrana é um método
complementar para avaliação morfofuncional da célula espermática, sendo
importante para o metabolismo espermático e, consequentemente, para o sucesso
da fertilização (JEYENDRAN et al., 1984).
O uso do teste hiposmótico têm sido descrito em diversas
espécies, principalmente em humanos. É baseado no comportamento do
espermatozóide frente a um meio hiposmótico. Na tentativa de equilibrar os meios
extra e intracelular, ocorre um influxo de água através da membrana, provocando
um edema. Com o edema, a cauda “enrola-se” e esta alteração é facilmente vista
em microscópio de contraste de fase. A capacidade da cauda espermática em
enrolar-se, devido ao edema provocado pela solução hiposmótica, é um sinal que
o transporte de água através da membrana está ocorrendo normalmente, e que a
mesma está íntegra e funcional. Acredita-se que a membrana da cabeça tenha o
mesmo comportamento que a da cauda, porém estas alterações não são
observadas (JEYENDRAN et al., 1984).
A capacitação e a fusão entre os gametas estão positivamente
correlacionadas aos resultados do teste hiposmótico; assim, estes processos não
ocorreriam se a membrana da cabeça não estivesse íntegra. A avaliação da
funcionalidade da membrana pode ser usada como um indicador da capacidade
de fertilizar do espermatozóide (JEYENDRAN et al., 1984), o que no estudo
apresentado indicaria sêmen com capacidade fertilizante.
A sensibilidade do teste hiposmótico tem gerado grande discussão
em virtude da sua correlação ou não com a motilidade espermática; isto porque a
motilidade dos espermatozóides não é dependente somente do transporte de
elementos pela membrana, mas de inúmeros fatores bioquímicos
(MOHANACHANDRAN NAIR et al., 1998). Contudo, estudos têm demonstrado a
correlação do teste hiposmótico com a reação do acrossomo (JEYENDRAN et al.,
1984), fertilidade in vitro (JEYENDRAN et al., 1984) e in vivo (REVELL & MRODE,
1994), podendo aumentar, de forma significativa, a previsão da capacidade de
fertilização do sêmen (FRASER, 1984).
A coloração com eosina é utilizada para determinar os
espermatozóides vivos e mortos e pode estar associada ou não à nigrosina.
Quando associada à nigrosina, o fundo da lâmina cora-se em preto, aumentando o
contraste e facilitando a visibilização (BJOÈRNDAHL et al., 2003). Esta coloração
é bem conhecida e amplamente usada em diferentes espécies (BLOM, 1950;
ELIASSON; TREICHL, 1971; DOTT; FOSTER, 1972; MORTIMER et al., 1990).
Quando as duas técnicas são comparadas, a eosina (ELIASSON; TREICHL,
1971) apresenta resultados da somatória entre a motilidade espermática e a
porcentagem de espermatozóides mortos, abaixo de 100%, o que não é o
esperado. Segundo a literatura, tal fato não foi elucidado (BJOÈRNDAHL et al.,
2003), e, provavelmente, ocorra devido a uma superestimação da motilidade ou da
porcentagem de espermatozóides vivos. Claramente pode ser observado tal fato
neste estudo, no qual a motilidade espermática diminuiu de acordo com o tempo
de refrigeração, contudo a porcentagem de espermatozóides corados pela eosina
(mortos) se manteve-se, praticamente, inalterada.
Segundo Walles e White (1963) e England (1993), as altas taxas de
diluição causam um decréscimo significativo na motilidade do sêmen de cães.
Neste estudo, o sêmen foi diluído, em média a 150x10
6
/ml, ou seja, a diluição não
foi excessiva e permitiu a manutenção da motilidade, pois segundo Mann (1964), a
diluição excessiva leva à perda da motilidade, da atividade metabólica e
capacidade fertilizante da célula espermática.
De acordo com Pinto et al. (1999) não há diferença significativa na
taxa de gestação e tamanho da ninhada entre cadelas inseminadas com sêmen
fresco (94%, média tamanho da ninhada = 7,2) e as inseminadas com sêmen
refrigerado por 24 horas (90%, média tamanho da ninhada = 7,2) ou 48 horas
(100%, média tamanho da ninhada = 7,0). A motilidade espermática média no
estudo de Pinto et al. (1999) foi de 49,6 a 51,6% com 48 horas de refrigeração.
Estes autores também utilizaram o meio Kenney e nossos resultados foram
semelhantes, com os quais poderíamos concluir que o sêmen manteve a
viabilidade por até 48 horas de refrigeração e poderia ser utilizado para a
inseminação artificial.
De acordo com Tsutsui et al. (2003), o sêmen pode ser estocado a
4ºC e utilizado para IA por até dois dias, sem a utilização de meio diluente, o que
está de acordo com os resultados deste estudos, sendo que o sêmen, diluído em
plasma seminal, manteve a motilidade próxima a 50% com 48 horas de
refrigeração. Nos estudos de Tsutsui et al. (2003), o sêmen foi mantido em
refrigerador com temperatura controlada, por até 6 dias, com alta motilidade
(60,7%). Porém, cinco cadelas foram inseminadas e nenhuma tornou-se gestante.
Contrariamente, o sêmen refrigerado por dois dias manteve uma alta motilidade e
fertilidade, sendo a taxa de concepção de 70%. Este estudo de Tsuitsui comprova
que, embora o sêmen possa ser refrigerado por longos períodos, para a
manutenção da motilidade, é necessário um refrigerador com temperatura
controlada e constante, podendo haver contudo, o comprometimento da
fertilidade.
Mota-Filho et al. (2007) estudaram a refrigeração do sêmen em
caixas térmicas de poliestireno, utilizando leite desnatado, gema de ovo e
antibióticos. O sêmen foi avaliado durante 30 horas e a motilidade, neste período,
variou entre 55% e 63,8%, para as respectivas caixas de 3l e 5l. A temperatura
interna foi mais estável na caixa de 5l, sendo próxima a 5ºC, durante as 30 horas
de refrigeração. Embora, neste estudo os parâmetros não tenham sido avaliados
com 30 horas de refrigeração, os resultados são semelhantes aos de Mota-Filho et
al.(2007). Apesar de serem caixas térmicas diferentes, a manutenção da
temperatura foi semelhante a da Botutainer, que mantém a temperatura estável
por um tempo superior a 30 horas (35 horas). No estudo, o sêmen foi avaliado até
as 48 horas de refrigeração e a motilidade média foi superior (65,8%) aos
resultados de Mota-Filho et al. (2007). Estudos de Nagao et al, 2007 com
ejaculados três cães rerodutores e epidídimos de três cães submetidos a
orquiectomia utilizando o diluente Botu-Sêmen, mantidos em containers Botu-
Box e Botutainer de transporte de sêmen por 10 e 18 horas respectivamente e
posteriormente por 72 horas em geladeira a 4ºC, não encontraram diferença
significativa nos valores espermáticos resultantes nos dois containers, em relação
aos espermatozóides obtidos do epidídimo, houve uma queda significativa da
qualidade logo após a refrigeração, ou seja, o meio utilizado no estudo não
promoveu proteção suficiente ao estresse térmico da refrigeração.
CONCLUSÃO
A caixa Botutainer
pode ser utilizada comercialmente para o envio
do sêmen canino refrigerado, por meios de transporte convencionais, pois mantém
a viabilidade espermática por até 48 horas.
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