( PDF ) Ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e seus derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA – LFT

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

Rossana Miranda Pessoa Antunes

AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E

SEUS DERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

João Pessoa – PB

2007

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AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E SEUS

DERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Rossana Miranda Pessoa Antunes

Orientadores:

Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima

Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho

Co-Orientadores:

Profª. Drª. Maria do Socorro Vieira Pereira

Prof° Dr° Celso Amorim Câmara

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do

Centro de Ciências da Saúde – Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal

da Paraíba, em cumprimento às exigências para

obtenção do título de Doutor em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos (Farmacologia).

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AÇÃO ANTIMICROBIANA E ANTIPLASMIDIAL DO LAPACHOL E SEUS

DERIVADOS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Rossana Miranda Pessoa Antunes

Tese submetida ao corpo docente do Programa de Doutorado em Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos/LTF da Universidade Federal da Paraíba. Como parte

dos requisitos necessários à obtenção do seu grau de Doutora.

Aprovada por:

_______________________________________

Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima

Orientadora

_______________________________________

Profª. Drª. Lindomarde Farias Belém

_______________________________________

Profº Dr. Evandro Leite de Souza

_______________________________________

Profª. Drª. Margareth de Fátima F. M. Diniz

_______________________________________

Profº Dr. José Pinto Siqueira Júnior

III

D E D I C A T Ó R I A

À Deus

A meus pais e irmãos

A meu esposo Thúlio e aos

meus filhos Beatriz e Daniel

grandes companheiros.

A G R A D E C I M E N T O S

A Deus, por ter me guiado nesta caminhada, me iluminado para eu concluir este

estudo.

Aos meus filhos, Beatriz e Daniel, pela compreensão das ausências, nas horas

necessárias.

Ao meu marido, Thúlio Antunes de Arruda, pela grande ajuda na elaboração deste

trabalho.

Aos meus familiares e amigos, que me incentivaram.

À professora Edeltrudes de Oliveira Lima, obrigada pelos seus valiosos

ensinamentos e correções que tanto enriqueceram esta tese.

Ao professor José Maria Barbosa Filho, pela acolhida inicial, pelos seus

ensinamentos e disponibilidade sempre presentes em todos os momentos.

Ao professor Celso Amorim Câmara, pelas substâncias alvo desta pesquisa e pelas

suas valiosas correções.

À professora Maria do Socorro Vieira Pereira, pela contribuição, muito obrigada.

À professora Bagnólia Araújo Costa, coordenadora do Programa de Qualificação

Institucional – PQI/ Universidade Federal da Paraíba-UFPB/ Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica – LTF, agradeço pela disponibilidade e pelos seus

ensinamentos enquanto docente do programa de doutorado.

À professora Lindomar de Farias Belém, coordenadora do PQI/ Universidade

Estadual da paraíba – UEPB, por estar trilhando, com competência, este caminho.

À amiga Profª Raïssa Mayer Ramalho Catão, companheira do curso de doutorado,

com a qual trabalhei nesta pesquisa, agradeço pelos ensinamentos na área de

microbiologia, sem os quais teria sido mais difícil chegar até aqui.

Aos professores, amigos e companheiros do PQI/UEPB, com os quais compartilhei

esta importante experiência de estudo, o meu agradecimento.

A todos os demais professores, colegas e funcionários do programa de doutorado do

LTF.

A todos os professores e funcionários do Laboratório de Análises Clínicas – LAC/

UEPB, onde funciona o laboratório de pesquisa em microbiologia do PQI/UEPB,

meu agradecimento.

Ao Laboratório DIAGNOSE, na pessoa da profª Raïssa Mayer Ramalho Catão.

Aos professores e funcionários da Pró-Reitoria de Pós-graduação da UEPB.

À CAPES, pela bolsa de estudos a mim concedida, importante apoio financeiro,

muito obrigada.

S U M Á R I O

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... VIII

LISTA DE TABELAS................................................................................................ X

LISTA DE QUADROS............................................................................................... XI

SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................................... XII

RESUMO................................................................................................................. XIII

ABSTRACT.............................................................................................................XIV

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 15

2. OBJETIVOS......................................................................................................... 21

2.1. Objetivo Geral................................................................................................ 22

2.2. Objetivos Específicos..................................................................................... 22

3. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 23

3.1. Microrganismos: generalidades..................................................................... 24

3.2. Patogenese microbiana................................................................................. 26

3.2.1. Gênero Staphylococcus....................................................................... 26

3.2.2. Gênero Escherichia ............................................................................. 28

3.2.3. Gênero Pseudomonas......................................................................... 30

3.2.4. Gênero Candida .................................................................................. 31

3.3. Antimicrobianos ............................................................................................. 32

3.3.1. Antibacterianos.................................................................................... 32

3.3.2. Antifúngicos......................................................................................... 33

3.3.3 Resistência aos antimicrobianos .......................................................... 34

3.3.4. Mecanismo genético de aquisição de resistência aos antimicrobianos 36

3.4. Plasmidios ..................................................................................................... 42

3.5. Transposons.................................................................................................. 44

3.6. Aspectos botânicos e fitoquimicos do lapachol e seus derivados semi-

sintéticos e nitrogenados............................................................................... 45

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 52

4.1. Local da pesquisa.......................................................................................... 53

4.2. Produtos testados.......................................................................................... 53

4.3. Substâncias/ Antibióticos............................................................................... 55

VII

4.4. Espécies microbianas.................................................................................... 55

4.4.1. Isolamento e identificação dos microrganismos.................................. 56

4.4.2. Preparo da suspensão microbiana ..................................................... 56

4.5. Meios de cultura ............................................................................................ 57

4.6. Metodologia................................................................................................... 57

4.6.1. Determinação da atividade antimicrobiana – triagem......................... 57

4.6.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM),

Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Concentração Fungicida

Mínima (CFM)..................................................................................... 59

4.6.3. Determinação da cinética de crescimento bacteriano......................... 59

4.6.4. Determinação da cinética fúngica....................................................... 61

4.6.5. Caracterização fenotípica dos padrões de resistência aos

antimicrobianos................................................................................... 63

4.6.6. Tratamento por substratos sintéticos obtidos a partir do lapachol e

seus derivados sintéticos – avaliação da atividade curagênica.......... 63

4.6.7. Estudo da relação estrutura-atividade.................................................. 65

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................... 66

5.1. Resistência Antimicrobiana ........................................................................... 67

5.2. Avaliação da atividade antimicrobiana do lapachol e seus derivados ........... 69

5.3. Determinação da CIM e CBM........................................................................ 71

5.4. Cinética bacteriana das cepas de S. aureus ATCC 25923, S. aureus 319U

e S. aureus 122U, frente aos produtos derivados do lapachol...................... 77

5.5. Eliminação de resistência a drogas pelo lapachol e seus derivados............. 85

6. CONCLUSÕES.................................................................................................... 91

REFERÊNCIAS........................................................................................................ 94

ANEXOS................................................................................................................. 105

VIII

L I S T A D E F I G U R A S

Figura 1. Forma e arranjo celular de S. aureus ......................................................26

Figura 2. S. aureus MRSA......................................................................................27

Figura 3. Aspecto morfológico de E. coli ................................................................29

Figura 4. Forma e arranjo celular de P. aeruginosa ...............................................30

Figura 5. Forma e arranjo celular de C. albicans....................................................31

Figura 6. Plasmídio.................................................................................................43

Figura 7. Ipê-Roxo..................................................................................................45

Figura 8. Estruturas químicas do lapachol e seus derivados semi-sintéticos.........46

Figura 9. Formação de enamina a partir do lapachol .............................................48

Figura 10. Estruturas químicas do lapachol e seus derivados..................................54

Figura 11. Técnica de difusão em meio sólido, processo cavidade-placa................58

Figura 12. Fluxograma da cinética bacteriana..........................................................60

Figura 13. Fluxograma da cinética fungica...............................................................62

Figura 14. Fluxograma da Avaliação da Atividade Curagênica................................64

Figura 15. Atividade antimicrobiana do lapachol (1), α-nor-lapachona (2); β-

lapachona (3); α-lapachona (4); β-nor-lapachona (5), frente a S.

aureus ATCC 25923................................................................................70

Figura 16. Avaliação da CIM e da CBM do lapachol (A), α-lapachona (B), β-

lapachona (C) e β-nor-lapachona (D) nas concentrações de 200 (1),

100 (2), 50 (3) e 25g/ mL (4) frente à cepa MSSA ATCC 25923...........72

Figura 17. Percentuais de inibição do lapachol e derivados frente as cepas de S.

aureus. ....................................................................................................76

Figura 18. Cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente a lapachol, α-

lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-

lapachona, β-I-lapachona........................................................................79

Figura 19. Cinética bacteriana de S. aureus 319U frente aos produtos Lapachol,

α-lachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-

lapachona, β-I-lapachona........................................................................81

Figura 20. Cinética bacteriana de S. aureus 122U frente ao lapachol, α-lachona,

β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-

lapachona................................................................................................83

Figura 21. Cinética bacteriana do lapachol (1), α-lapachona (2), β-lapachona (3),

α-nor-lapachona (4) sobre a cepa S. aureus ATCC 25923 em 8h e

24h. .........................................................................................................84

Figura 22. Colônias possilvelmente curadas pelo β-I-lapachona para a marca de

resistência plasmidial à eritromicina para a cepa S. aureus 319U. .........87

Figura 23. Colônias possilvelmente curadas pelo lapachol para a marca de

resistência plamidial à penicilina para a cepa S. aureus 319U................88

Figura 24. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à penicilina

pelo lapachol e derivados em S. aureus 319U (a) e S. aureus 122U (b).89

Figura 25. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à eritromicina

pelo lapachol e derivados em S. aureus 319U (a) e S. aureus 122U (b)...89

L I S T A D E T A B E L A S

Tabela 1. Identificação e origem das cepas microbianas testadas .........................55

Tabela 2. Perfil de sensibilidade das cepas de S. aureus frente a

Antimicrobianos.......................................................................................68

Tabela 3. Avaliação da atividade antimicrobiana do lapachol e derivados, frente

a microrganismos de origem ambulatorial e cepas ATCC.......................69

Tabela 4. Avaliação da CIM e da CBM do lapachol e derivados frente a

microrganismos.......................................................................................73

Tabela 5. Atividade antimicrobiana do lapachol e derivados frente as cepas de

S. aureus de origem humana, animal e ambiental x estrutura química...74

Tabela 6. Atividade antimicrobiana do lapachol e seus derivados frente à cepas

de E. coli..................................................................................................77

Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e subinibitória (1/2 x CIM) para

a cepa de S. aureus 319U.......................................................................85

Tabela 8. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e subinibitória (1/2 x CIM) para

a cepa de S. aureus 122U.......................................................................86

Tabela 9. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à penicilina

pelo lapachol e seus derivados semi-sintéticos em linhagens de S.

aureus. ....................................................................................................87

Tabela 10. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à eritromicina

pelo lapachol e seus derivados semi-sintéticos em linhagens de S.

aureus . ...................................................................................................88

L I S T A D E Q U A D R O S

Quadro 1. Cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente a lapachol, α-

lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-

lapachona, β-I-lapachona........................................................................79

Quadro 2. Cinética bacteriana de S. aureus 319U frente ao lapachol, α-

lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-

lapachona, β-I-lapachona........................................................................81

Quadro 3. Cinética bacteriana de S. aureus 122U frente ao lapachol, α-lachona,

β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-

lapachona................................................................................................83

XII

S I G L A S E A B R E V I A T U R A S

AMH -

Agar Mueller-Hinton

AS -

Agar Sangue

ASD -

Agar Sabourand Dextrose

ATCC -

American Type Culture Collection

BAB -

Blood Agar base

BHI -

Broth heart infusion

BHI -

Brain Heart Infusion

BORSA -

Boderline oxacilin – resistant S. aureus

CBM -

Concentração bactericida mínima

CFM -

Concentração fungicida mínima

CIM -

Concentração inibitória mínima

CMH -

Caldo Mueller Hinton

DAEC -

Escherichia coli que adere difusamente

DMSO -

Dimetil sulfórido

EAggEC -

Escherichia coli enteroagressiva

EHEC -

Escherichia coli enterohemorrágica

EPEC - Escherichia coli enteropatogênica clássica

ETEC -

Escherichia coli enterotoxigênica

LAFEP -

Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco

MAS -

Agar Manitol Salgado

MRSA -

Staphylococcus aureus resistente a meticilina

MSSA -

Staphylococcus aureus sensível a meticilina

NCCLS -

National Committee for Chemical Laboratory Standands

OMS -

Organização Mundial de Saúde

ORSA -

Staphylococcus aureus resistente a oxacilina

PCR -

Reação em cadeia da polimerase

PFGE -

Pulsed-field gel eletrophoresis

TSA -

Teste de sensibilidade a antibióticos

VRE -

Enterococcus faecium vancomicina resistente

XIII

R E S U M O

ANTUNES, R. M. P. Ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e seus

derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes. [Tese-Doutorado], Programa de

Pós-graduação em Sintéticos Bioativos/CCS/LTF, João Pessoa (PB): UFPB,

Universidade Federal da Paraíba, 2007.

Diante da problemática da resistência microbiana, as pesquisas apontam para a

descoberta de novos antibióticos que sejam eficazes ante os patógenos emergentes.

Neste contexto, estudou-se a ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e

seus derivados semisintéticos e nitrogenados frente a S.aureus

ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853, C.albicans ATCC

76643, 08 cepas de S. aureus de origem animal, 10 cepas de S. aureus de origem

ambulatorial, 01 cepa MRSA ambulatorial, 02 cepas de S. aureus de origerm

ambiental, 10 cepas de E. coli de origem ambulatorial e 06 cepas de C. albicans de

origem ambulatorial. A Concentração inibitória mínima (CIM), a Concentração

bactericida mínima (CBM) e a curva de morte foram realizadas para os

microrganismos ATCC. Um estudo de estrutura-atividade frente às cepas de S.

aureus também foi realizado bem como uma investigação sobre a atividade

curagênica das bactérias com perfil plasmidial conhecido. Os resultados estimulam o

aprofundamento das pesquisas em microbiologia como também para outras

atividades biológicas dessas substâncias obtidas a partir de modificações estruturais

da molécula do lapachol por semi-síntese, sendo elas as mais ativas frente à S.

aureus ATCC, inclusive MRSA. As curvas de morte indicam que estes produtos têm

ação bacteriostática. Os compostos -lapachona e nor-lapachona apresentaram

menor CIM para todos os microrganismos testados podendo ser os mais eficazes da

série. As mudanças na estrutura química do lapachol aumentaram

consideravelmente sua atividade antimicrobiana diante de S. aureus. O produto -

lapachona apresentou ação simultânea para a eliminação das marcas de resistência

para penicilina e a eritromicina. O potencial promissor dessas substâncias as

colocam como alvo de interesse farmacológico e químicos sintéticos devido à

variedade de atividades biológicas que essas naftoquinonas apresentam.

Palavras-chaves: Atividade antimicrobiana, atividade antiplasmidial, fitoconstituintes,

produtos de síntese, lapachol e derivados

XIV

A B S T R A C T

ANTUNES, R. M. P. Ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e seus

derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes. [Tese-Doutorado], Programa de

Pós-graduação em Sintéticos Bioativos/CCS/LTF, João Pessoa (PB): UFPB,

Universidade Federal da Paraíba, 2007.

Once there is the problematic with microbial resistance, the researches point to the

use of new antibiotics that are efficient with the emerging pathogens. In this context,

it were studied the antimicrobial and antiplasmidial actions of lapachol and its semi

synthetic and nitrogenated derivates in S.aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922,

P.aeruginosa ATCC 27853, C.albicans ATCC 76643, 08 animal originated strains of

S. aureus, 10 ambulatorial originated strains of S. aureus, 01 ambulatorial MRSA

strain, 02 S. aureus originated from the ambient, 10 strains of E. coli originated from

ambulatory and 06 strains of C. albicans originated from ambulatory. The MIC, the

MBC and the death curve were done with the ATCC microorganisms. A study

structure-activity with the strains of S. aureus was done and also an investigation of

cure activity in bacteria with plasmidial profile known. The results stimulate the

deepening of researches in microbiology and also to other biological activities of

these substances obtained by structural modifications of molecule of lapachol by

semi synthesis, being those more active in S. aureus ATCC, including MRSA. The

death curves indicate that these products have bacteriostatic action. -lapachone and

nor-lapachone presented lower MIC to all microorganisms tested, and can be the

most potent in the series. The changes in chemical structure of lapachol enhanced

considerably its antimicrobial activity with S. aureus. The product lapachone

presented simultaneous action to elimination of resistance marks to penicillin and

eritromicine. The promising potential of these substances make them a target of

pharmacological and synthetic chemical interest due to the variety of biological

activities that these naphtoquinones present.

Key words: antimicrobial activity, antiplasmidial activity, phytoconstitutes, synthesis

products, lapachol and derivates.

I N T R O D U Ç Ã O

1. INTRODUÇÃO

Com a notável descoberta dos medicamentos de síntese como os antibióticos

e antinflamatórios e com o avanço da indústria farmacêutica, os produtos naturais

caíram em desuso. Entretanto, o aparecimento de numerosos microrganismos

resistentes às drogas, os altos níveis de resíduos tóxicos nos alimentos, aliados ao

desequilíbrio ecológico causado pelo homem, fizeram com que se buscassem

alternativas compatíveis com o modo de vida humano, nas mais diversas facetas do

bem-estar bio-psico-social. A resistência aos antimicrobianos tem se tornado um fato

corriqueiro desde o início da era dos antibióticos quando a descoberta de potentes

agentes antimicrobianos foi considerada como uma das grandes contribuições da

medicina no Séc. XX (MOELLERING Jr., 2000).

Desde o início dos anos 80, o número de antimicrobianos em fase de

desenvolvimento diminuiu consideravelmente. Ao mesmo tempo, a resistência aos

antimicrobianos cresce de forma imensurável. Nos anos 70 e 80, as bactérias Gram-

negativas resistentes eram consideradas como o principal flagelo, entretanto no final

do Séc. XX, as bactérias Gram-positivas, resistentes, têm se tornado mais

importantes. Os microrganismos estão cada vez mais desenvolvendo uma série de

novos mecanismos de resistência. A resistência microbiana resulta em crescente

morbidade e mortalidade, como também eleva os custos de saúde e o

desenvolvimento de qualquer novo antimicrobiano vem sendo acompanhado pelo

aparecimento da resistência bacteriana. Segundo MOELLERING Jr. (2000);

MOREIRA (2004), este fato resulta de vários fatores, tais como: o uso indiscriminado

de antimicrobianos, o uso crescente de procedimentos invasivos, em grande número

de hospedeiros susceptíveis e falhas no controle de infecções, ocasionando

aumento da transmissão de organismos resistentes, principalmente em ambientes

hospitalares e em pacientes imunocomprometidos.

Vários são os mecanismos pelos quais os microrganismos podem escapar

dos efeitos dos antimicrobianos, entre eles incluem-se: alteração da estrutura

molecular de antimicrobianos ou produção de enzimas que inativam a droga a

exemplo das β-lactamases ou enzimas modificadoras de aminoglicosídeos,

alteração das proteínas ligantes da penicilina ou outros pontos-alvo nas paredes das

células, alvos modificados da DNA-girase, mutações de permeabilidade e

modificações ribossômicas (FILE Jr., 2000).

O uso cada vez maior de antimicrobianos na prática clínica, assim como

também a enorme quantidade de antibióticos utilizados na agricultura, criação de

peixes e criação de animais, possibilitam condições favoráveis para a seleção de

microrganismos resistentes (TOMAZ, 1994; PEREIRA, 2000; MOREIRA, 2004).

A resistência a antimicrobianos pode ser transferida entre bactérias pelos

plasmídios que são moléculas extracromossomiais de DNA, transposons que são

segmentos móveis de DNA, ou pelos mecanismos de inserção seqüencial. Os

plasmídios transferíveis podem possuir genes que apresentam código de

transferência em relação a uma ampla gama de drogas antimicrobianas. Assim, para

os microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, uma única transferência pode

resultar na aquisição de vários determinantes de resistência microbiana. A pressão

ambiental proveniente do uso excessivo de agentes antimicrobianos evidentemente

contribuiu para disseminar os determinantes de resistência. Praticamente todas as

bactérias patogênicas adquiriram genes de resistência antimicrobiana (FILE Jr.,

2000; PEREIRA, 2000; UENO; JORGE, 2001).

Entre as várias propriedades mediadas pelos plasmídios de maior relevância

médica, estão os relacionados com a resistência a antibióticos e aos fatores de

virulência. Existem muitas variedades de plasmídios, diferentes em tamanho,

composição genética e capacidade de transferência entre bactérias. Alguns

plasmídios realizam sua própria transferência entre bactérias da mesma espécie ou

de espécies diferentes, estes são chamados de plasmídios de conjugação. Muitos

plasmídios de resistência a antibióticos, também são plasmídios de conjugação.

Alguns apresentam capacidade de se replicar em diferentes hospedeiros e propagar

a resistência às drogas entre espécies bacterianas não-relacionadas. Esses

plasmídios contribuem para o drástico aumento da resistência antimicrobiana em

populações naturais (SCHAECHTER, et al., 2002). Os plasmídios podem ser

curados ou removidos da célula, depois de serem submetidos a diferentes condições

de stress, como mudanças na temperatura e presença de determinados substratos

(PEREIRA; SIQUEIRA-JUNIOR, 1995; TRABULSI, 2006; PEREIRA, 2000; UENO;

JORGE, 2001).

A resistência microbiana é um problema emergente na medicina humana e

exige uma mudança na terapia empírica e revisão das estratégias dos

procedimentos de testes. A velocidade na qual se desenvolvem nos microrganismos

está relacionada à sua exposição aos agentes antimicrobianos (TENOVER, 2000;

SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005).

Grande parte da resistência que o gênero Staphylococcus adquire às drogas,

é de natureza extracromossômica, isto é, determinada por plasmídios portadores de

genes para resistência (LYON; SKURRAY, 1987). Uma variedade de compostos tais

como corantes de acridina, brometo de etídio, rifampicina, sal de bis-amônio e mais

tioridazina (uma fenotiazina), assim como também antibióticos inibidores da sub-

unidade β da DNA girase, novobiocina e coumermicina, têm sido reportadas como

eliminadores de plasmídios (HOOPER et al., 1984; WEISSER; WIEDMANN, 1985;

PEREIRA, 2000; PEREIRA; SIQUEIRA-JÚNIOR; TAKAKI; 2004).

A transferência de material genético entre organismos da mesma ou de

diferentes espécies desempenha um papel crucial na evolução da resistência a

drogas em bactérias. Em Staphylococcus aureus essa transferência pode ocorrer

por transformação, por transdução e por processos que envolvem contato físico

celular - conjugação, mediada por fagos ou conjugação propriamente dita. Alguns

fatores podem afetar a transferência conjugativa de plasmídios, como a composição

do meio, pH e temperatura. Antibióticos como gentamicina e vancomicina estimulam

a freqüência de transferência de 10 a 20 vezes enquanto meticilina e alguns

inibidores da síntese de proteínas reduzem essa freqüência (AL – MASSAUD; DAY;

RUSSEL, 1991).

A resistência mediada por plasmídios, pode ser simples, porém na maioria

das vezes é múltipla, tornando a bactéria resistente a dois ou mais antimicrobianos.

Isto se deve à presença de genes de resistência, para diferentes antimicrobianos,

num só plasmídio (TRABULSI, 2006, UENO; JORGE, 2001).

Dentre os vários microrganismos freqüentemente isolados em infecções

humanas que apresentam elevada resistência aos antimicrobianos, destacam-se:

Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Entretanto outros microrganismos

considerados emergentes, como por exemplo, Listeria monocytogenes e fungos,

também têm sua importância devido à gravidade de seus processos infecciosos,

principalmente quando atinge pacientes imunossuprimidos. Entre os fungos

leveduriformes Candida aIbicans é a levedura mais freqüente envolvida na etiologia

de infecções fúngicas (MOREIRA, 2004).

Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo grande que cresce em

cachos. Trata-se de uma das mais resistentes bactérias não formadoras de esporos,

capaz de sobreviver por longos períodos em objetos inanimados secos. É também

relativamente termo-resistente. Essas propriedades permitem ao S. aureus

sobreviver em qualquer tipo de ambiente onde se encontram seres humanos. São

patógenos potentes, amplamente encontrados na biota humana, podendo causar

vários processos infecciosos, piogênicos algumas vezes levando a formação de

abscessos em tecidos profundos. Além disso, podem produzir enfermidades

mórbidas distintas por meio da produção de toxinas específicas. A vertente na

pesquisa de novos compostos vegetais com ação antimicrobiana, se apresenta

como um modelo ecologicamente correto, de produzir substâncias que sejam

eficazes e menos agressivas ao meio ambiente e aos homens, contribuindo para

uma melhor qualidade de vida, conforme estabelece a Carta Européia do Ambiente

e da Saúde, publicada pela OMS em 1989 (DEOUX; DEOUX, 1998).

A utilização de plantas medicinais na promoção da saúde e prevenção das

doenças foi sempre prática corrente na história da humanidade, sendo a importância

das plantas medicinais tão grande que até meados do século XX a grande maioria

dos medicamentos era de origem vegetal. Como exemplo, existem escritos que

remetem à época de Hipócrates, cerca de 400 a.C., sobre a utilização da casca e

das folhas do salgueiro pelas suas propriedades analgésicas. Já no século XX, esta

dimensão foi diminuindo com o aparecimento dos medicamentos de síntese,

notadamente os antibióticos e os antinflamatórios que evidenciaram bons

resultados terapêuticos (CARVALHO; SARTI, 1995; SALLÉ, 1996; MONTANARI,

2001; YUNES, 2001)

Na área farmacêutica, as plantas e os extratos vegetais foram e

continuam sendo de grande relevância, tendo em vista a utilização das substâncias

ativas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e como fonte de

matérias-primas de fármacos e adjuvantes, ou ainda, de medicamentos elaborados

exclusivamente à base de extratos vegetais, os fitoterápicos (DI STASI, 1996;

GOTTLIEB et al., 1996; YAMADA, 1998; MONTONARI, 2001; YUNES, 2001).

O vegetal, além da organização trófica conseguida através da

fotossíntese, possui um mecanismo regulador que o ajuda a desempenhar suas

funções vitais. Por meio desse mecanismo, o metabolismo de ordem secundária, a

planta consegue elaborar substâncias que desempenharão papéis específicos em

casos de stress, crescimento, reprodução, repelir organismos invasores, atrair

insetos ou pássaros necessários para a polinização e adaptação às mudanças

físicoquímicas do meio externo. Devido a estas características, são atribuídos aos

princípios químicos vegetais diversas ações biológicas constituindo a planta num

enorme laboratório de síntese orgânica, fruto de milhões de anos de evolução

(HARBONE, 1988; BEART; LILLEY; HASLAM, 1985; CARVALHO; SARTI, 1995;

MACHADO; PALMA; COSTA, 1995; DI STASI, 1996; SALLÉ, 1996; VON POSER;

MENTZ, 2000; DlAS, 2001; MONTONARI, 2001; YUNES, 2001).

Nesta pesquisa estudou-se o lapachol e seus derivados semi sintéticos, assim

como alguns derivados nitrogenados obtidos por semi-síntese, com o objetivo de

conhecer sua ação antimicrobiana e antiplasmidial sobre microrganismos. Além do

mais, estas substâncias já exibem alguma atividade biológica, seja ela

antinflamatória, antimalárica, antiviral, anticancerígena e antimicrobiana (FONSECA;

BRAGA; SANTANA, 2003; LIRA et al, 2004), moluscicida (SILVA et al, 2005) ou

atuação inibitória sobre sistemas reparadores (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA,

2003).

O lapachol é uma hidroxi-naftoquinona substituída, 2-hidroxi-3-(3-metil-

2butenil) – 1,4-naftalenodiona, descoberto e estudado desde o século passado, e

isolado pela primeira vez do lenho da árvore argentina “Lapacho” Tabebuia

avellanedae, Lar (Bignoniaceae), por E. Paterno. Posteriormente, o lapachol também

foi encontrado em várias outras espécies como, por exemplo, no pau d’arco roxo

(Tabebuia sp).

O B J E T I V O S

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

 Submeter o lapachol e seus derivados semi-sintéticos e nitrogenados a

análise da atividade antimicrobiana verificando a que grupo farmacológico

pertencem: bactericida ou bacteriostático e estudar a ação dessas

substâncias sobre plasmídios de resistência em amostras bacterianas.

2.2. Objetivos Específicos

 Verificar a atividade antimicrobiana para determinação da Concentração

Inibitória Mínima – CIM, Concentração Bactericida Mínima - CBM e

Concentração Fungicida Mínima - CFM do lapachol e seus derivados.

 Analisar a relação estrutura/atividade dos derivados semi-sintéticos do

lapachol sobre Staphylococcus aureus.

 Avaliar a interferência das substâncias sobre a curva de crescimento

microbiano - cinética bacteriana, cinética fúngica.

 Detectar a influência das substâncias em teste sobre a cura de plasmídios de

resistência a antimicrobianos.

R E V I S Ã O D E L I T E R A T U R A

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1. Microrganismos: Generalidades

Estima-se que nos seres humanos o número de células bacterianas que

fazem parte da microbiota normal ultrapasse em 10 vezes o número de células do

próprio organismo. A microbiota humana apresenta uma série de atividades

benéficas para o homem e colabora com os mecanismos de proteção infecciosa. De

um modo geral, os microrganismos são capazes de sobreviver em ambientes de

diversas condições físicas. Entretanto, existe uma limitação da capacidade de

sobrevivência de determinado microrganismo, em um meio ambiente desfavorável,

de modo que este recurso foi aproveitado pelo homem para o controle de

microrganismos. Os investigadores logo descobriram que os microrganismos

desenvolvem resistência a antimicrobianos por um processo conhecido como

seleção natural. Quando uma população microbiana é exposta a um antibiótico,

organismos mais sensíveis são destruídos e somente sobreviverão aqueles mais

resistentes ao antimicrobiano. (RIBSON, 2002; BRANDILEONE et al., 2006).

A parede celular bacteriana é uma estrutura rígida que recobre a membrana

citoplasmática e confere forma às bactérias. Ela é constituída por ácido

diaminopimérico (DPA), ácido murâmico e ácido teicóico além de aminoácidos,

carboidratos e lipídeos. Todos esses compostos estão reunidos para formar

substâncias poliméricas complexas que por sua vez estruturam a parede celular.

Uma macromolécula complexa denominada peptideoglicano (mucopeptídeo ou

mureína) forma a estrutura rígida da parede. Além disso, a parede celular protege a

célula, mantém a pressão osmótica intrabacteriana, impedindo o rompimento da

célula devido à entrada de água, e funciona como suporte de antígenos somáticos

bacterianos. A divisão das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo

com sua resposta à coloração de Gram é decorrente das diferenças na composição

e estrutura da parede celular (SANTOS, 2004; SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005).

As bactérias Gram-positivas possuem uma quantidade maior de

peptideoglicano em sua parede celular, o que torna a parede dessas bactérias mais

espessa e rígida do que a das bactérias Gram-negativas. Composta de proteínas,

lipídeos, peptideoglicano e ácidos teicóicos (cadeias de polifosfato com resíduos de

ribitol e glicerol), essas bactérias são sensíveis a lisozima e sua parede constitui o

local de ação de alguns antibióticos, além de apresentar elementos básicos para

identificação sorológica (SANTOS, 2004; SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005).

A parede celular das bactérias Gram-negativas é menos espessa e elas são

mais complexas do que as Gram positivas por apresentarem uma membrana

externa cobrindo a fina camada de peptídeoglicano. A membrana externa é o que

distingue as bactérias Gram negativas, servindo como uma barreira seletiva para a

entrada e saída de algumas substâncias da célula e podendo ainda causar efeitos

tóxicos sérios em animais infectados. A estrutura da membrana externa é composta

por fosfolipídios, lipoproteínas e lipopolissacarídeos (LPSs). Os lipopolissacarídeos

estão localizados exclusivamente na camada externa da membrana, enquanto que

os fosfolipídeos estão presentes quase completamente na camada interna. Os LPSs

são compostos por três segmentos ligados covalentemente: (1) lipídeo A,

firmemente embebido na membrana; (2) cerne do polisssacarídeo, localizado na

superfície da membrana; e (3) antígenos O, que são polissacarídeos que se

estendem como pêlos a partir da superfície da membrana em direção ao meio

circundante. A porção lipídica do LPSs é também conhecida como endotoxina e

pode atuar como um veneno, causando febre, diarréia, destruição das células

vermelhas do sangue e choque potencialmente fatal (SANTOS, 2004; SOUZA;

REIS; PIMENTA, 2005).

Quanto aos fungos, incluídos no reino Fungi, são encontrados em vegetais,

em animais, no homem, em detritos e em abundância no solo, participando

ativamente do ciclo dos elementos. Sua dispersão na natureza é feita por várias

vias, principalmente pelo ar atmosférico através dos ventos (TRABULSI, 2006).

Todas as células fúngicas são eucarióticas, isto é, possuem núcleo com

membrana nuclear. Os fatores de virulência têm sido pouco estudados. Como

possíveis fatores citam-se a variabilidade fenotípica, aderência nos tecidos dos

hospedeiros, produção de toxinas e enzimas, a exemplo das proteinases, lípases e

fosfolipases. Estas enzimas hidrolíticas extracelulares são importantes na

patogenicidade dos fungos, causando danos às células do hospedeiro. A proteinase

ácida e fosfolipase de Candida albicans têm sido investigadas como fatores de

virulência. Entretanto, pouco se conhece sobre enzimas como condroitin-sulfatase e

hialuronidase nas demais espécies do gênero Candida e em outros fungos

patogênicos (FURLETTI, 2006; LOGUERCIO-LEITE et al., 2006).

3.2. Patogênese microbiana

3.2.1. Gênero Staphylococcus

Staphylococcus spp. são cocos Gram-positivos e catalase positivos (Figura 1)

que tendem a formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva. São sensíveis a

lisostafina, característica que permite sua diferenciação do gênero Micrococcus.

Staphylococcus são amplamente distribuídos na natureza e fazem parte da

microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves. Atualmente, o gênero é

composto por cerca de 27 espécies, sendo que algumas são frequentemente

associadas a uma ampla variedade de infecções de caráter oportunista em seres

humanos e animais. Tradicionalmente são divididos em duas categorias: coagulase

positivos e coagulase negativos. Essa classificação é baseada na capacidade de

coagular o plasma que é uma propriedade considerada há muito tempo, como

importante marcador de patogenicidade do gênero Staphylococcus. Entre as

espécies coagulase positivas S. aureus representa a espécie geralmente envolvida

em infecções humanas, sendo a mais estudada, pois produz um amplo espectro de

doenças desde lesões superficiais até severas infecções sistêmicas (TRABULSI,

2006; PEREIRA, 2002).

Figura 1. Forma e arranjo celular de S. aureus

Fonte: http://www.visualsunlimited.com/browse/vu350/vu350691.htm

S. aureus é um importante patógeno nosocomial, sendo descrito como agente

etiológico significativo em infecções hospitalares adquiridas, desde 1950. Ainda é o

microrganismo mais freqüente associado à mastite caprina e bovina (PEREIRA,

2000; FREITAS et al., 2003; PEREIRA, 2002).

A patogênese de S. aureus é devida a fatores de virulência na forma de

toxinas, enzimas e outras proteínas associadas a parede celular mediadas por

genes plasmidiais ou cromossômicos que combinados conduzem à doença. S.

aureus é o agente mais comum de infecções piogênicas podendo também causar

vários tipos de intoxicações importantes como a síndrome da pele escaldada,

intoxicação alimentar e síndrome do choque tóxico (TRABULSI, 2006).

Espécies de Staphylococcus utilizam extensivas estratégias para sobrepujar

as defesas microambientais do hospedeiro infectado e, potencialmente, colonizar os

tecidos. Evidências recentes sugerem que as exotoxinas estafilocóccicas são super

antígenos reconhecidos como proteínas multifuncionais que invariavelmente exibem

atividade letal, pirogenicidade e capacidade de induzir hipersensibilidade a

endotoxinas (PEREIRA, 2000; FREITAS et al., 2003;).

 Staphylococcus aureus resistente a meticilina - MRSA

A espécis MRSA (Figura 2) representa uma ameaça por causa da sua

distribuição em comunidades e ambientes hospitalares, visto que apresenta

resistência a quase todos os antibióticos como os  - lactâmicos, as fluorquinolonas,

cloranfenicol, clindamicina, tetraciclina, aminoglicosídeos e mais recentemente a

vancomicina. Associações na antibioticoterapia tem sido usadas para controlar as

infecções por MRSA, mas por um período curto devido sua possível alteração a

essa susceptibilidade (WICKENS; WADE, 2005).

Figura 2. S. aureus MRSA.

Fonte: http://education.denniskunkel.com/catalog/product_

info.php?products_id=512

O uso abusivo e indiscriminado de agentes antimicrobianos na prática clínica

veterinária tem um efeito seletivo no surgimento e manutenção de resistência a

drogas. Particularmente, S. aureus, com reconhecida versatibilidade no

desenvolvimento de resistência contribui para sua sobrevivência em ambientes

hospitalares e difusão entre os pacientes (CLOUTIER, 1995; PEREIRA, 2000;

SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005).

Os mecanismos pelos quais os genes de resistência se movimentam entre os

organismos são complexos e fascinantes. Em S. aureus a resistência múltipla resulta

principalmente da presença de plasmídios que geralmente se encontram em

múltiplas cópias, que permite sua transferência em uma freqüência mais elevada.

Outra estratégia é a aquisição de genes de resistência ao cromossomo, assim

produzindo uma multiresistência mais estável, a exemplo do MRSA (WICKENS;

WADE, 2005; GRUNDMANN et al., 2006).

MRSA tem sido descrito como o maior patógeno nosocomial em todo o

mundo, capaz de causar uma grande variedade de infecções. Para o tratamento,

embora tenha sido registrado recentemente casos de resistência a vancomicina,

este antibiótico ainda tem sido potencialmente usado, bem como o teicoplamina.

Diante deste panorama, o desenvolvimento de novos compostos anti-MRSA é de

grande e relevante importância. Novos compostos, tais como quinupristina –

dalfopristina e linesolida têm sido utilizados, sendo que linesolida é viável na forma

de administração oral (PEREIRA, 2000; RIVERON et al, 2003; WICKENS & WADE,

2005; GRUNDMANN et al, 2006).

3.2.2. Gênero Escherichia

O gênero Escherichia compreende as espécies E. coli, E. blatae, E.

fergusonii, E. hermannii e E. vulneris. Entretanto a única espécie de maior

importância prática é a E. coli (TRABULSI, 2006).

 Escherichia coli

A espécie E. coli (Figura 3), compreende grande número de grupos e tipos

sorológicos, identificados por meio de anti-soros preparados contra as três

variedades de antígenos que ocorrem na espécie, ou seja, os antígenos O, K e H.

No momento, devido a grande variedade de antígenos, a única identificação de

rotina do estudo sorológico de amostras de E. coli diz respeito ao diagnóstico de

infecções intestinais medidas por Escherichia coli enteropatogênica clássica (EPEC)

e enteroinvasora (EIEC), E. coli enteroxigênica (ETEC), E. coli enterohemorrágica

(EHEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC)

(SILVA; DA SILVA, 2005).

Figura 3. Aspecto morfológico de E. coli

Fonte: http://www.visualsunlimited.com/browse/vu214/vu214556.html

Quanto às infecções extra-intestinais, as cepas de E. coli mencionadas até

então, raramente estão envolvidas neste processo. E. coli é encontrada

normalmente nos intestinos e pode se localizar em qualquer órgão ou tecidos do

corpo humano. Entretanto, as infecções mais freqüentes são urinárias, meningite do

recém-nascido. É a causa mais comum de infecção urinária, sendo responsável por

90% ou mais, das infecções adquiridas na comunidade, sendo as cepas envolvidas

denominadas E. coli uropatogênicas. O diagnóstico das infecções extra-intestinais é

feito pelo isolamento e posterior identificação bioquímica. O antimicrobiano a ser

utilizado no tratamento deve ser selecionado tendo-se por base não apenas a

sensibilidade do agente etiológico, mas, também a concentração que atinge no local

da infecção (NATARO; KAPER, 1998; TRABULSI, 2006; BALLESTER; ESCOBAR;

GRISI, 2002; CAMARGO et al., 2002; ESMERINO; GONÇALVES; SHELESKY,

2003).

3.2.3. Gênero Pseudomonas

O gênero compreende grande número de espécies de bacilos Gram-

negativos, normalmente diferenciados por meio de provas bioquímicas, testes de

sensibilidade a antibióticos (TSA), formação de pigmentos, número e localização de

flagelos. Na realidade, 90% das amostras isoladas de material clínico correspondem

a Pseudomonas aeruginosa (TRABULSI, 2006).

 Pseudomonas aeruginosa

Uma das características de P. aeruginosa (Figura 4) é a capacidade de

produzir um pigmento azul-esverdeado, denominado piocianina. É por esta razão

que a espécie é também denominada bacilo piociânico. Entretanto, nem todas as

amostras produzem este pigmento.

Figura 4. Forma e arranjo celular de P. aeruginosa

Fonte: http://www.biotox.cz/toxikon/bakterie/bakterie/obr/

pseudomonas_aeruginosa_1.htm

Pseudomonas aeruginosa é um germe tipicamente oportunista que pode

causar várias doenças, tais como bacteremias severas (processos cirúrgicos ou

queimaduras), infecções urinárias, pneumonia em casos de fibrose cística e em

pacientes que usam respiradores contaminados, ceratites oculares (cirurgias

oculares), meningites e endocardites (após punção e cirurgias cardíacas). É

produtora de toxina A, que é mais tóxica e seu mecanismo de ação é idêntico ao da

toxina diftérica. As amostras não produtoras de toxina A são menos virulentas,

naturalmente resistentes a vários antibióticos como beta-lactâmicos, às tetraciclinas

e cloranfenicol. Este microrganismo pode adquirir resistência a qualquer agente

terapêutico, com exceção da polimixina, através de mutações ou da aquisição de

plasmídios de resistência. Recomenda-se a realização de antibiograma para a

seleção do antibiótico a ser usado no tratamento (TRABULSI, 2006; LAMBERT,

2002, SCHWEIZER, 2003).

Em relação a sua epidemiologia, esta bactéria normalmente habita o solo,

água e vegetais. Pode ser encontrada na pele, fezes e garganta de indivíduos

sadios. Em pacientes hospitalizados, a taxa de portadores pode ser bastante

elevada. Atualmente é responsável por aproximadamente 15% dos casos de

bacteremia causadas por germes Gram-negativos. A elevada freqüência de P.

aeruginosa em hospitais é explicada, em parte, pela elevada resistência a muitos

antibióticos e anti-sépticos leves (TRABULSI, 2006; PAVIANI; STADNIK; HEINEK,

2004; ÁLVAREZ et al., 2005).

3.2.4. Gênero Candida

Figura 5. Forma e arranjo celular de C.

albicans

Fonte:http://education.denniskunkel.com/catalog/

product_info.php?products_id=817

O gênero Candida (Figura 5) é responsável por diversas manifestações

clínicas conhecidas como candidíase. O agente etiológico mais comum é C.

albicans, que tem sido isolada da boca, tubo digestivo, intestino, orofaringe, vagina e

pele de indivíduos sadios.

A maior parte das infecções causadas por C. albicans é de origem endógena.

A transmissão exógena, principalmente intra-hospitalar de C. albicans e outras

espécies do gênero, tem sido relatada como infecções oportunistas pelo seu poder

invasor em pacientes debilitados, sendo grave a candidíase sistêmica de diagnóstico

e isolamento difícil devido ao polimorfismo das lesões (TRABULSI, 2006). Infecções

oportunistas por Candida spp são de grande interesse e sua pesquisa tem

aumentado nas últimas décadas. Candidíase sistêmica é descrita em 20% de

pacientes com câncer e em aproximadamente 25% em pacientes com transplante

de medula. O diagnóstico é feito através de exame clínico, com a verificação da

forma invasiva, as hifas, através da análise de material de biópsia ou raspado das

lesões. Para tratamento das infecções micóticas estão incluídos desde os

antissépticos convencionais (tintura de iodo, violeta de genciana, ácido salicílico e

benzóico), derivados do anel benzênico (ácido benzóico, sulfamídicos, corantes,

quinonas), derivados triazíncos, derivados imidazólicos (miconazol, econazol,

cetoconazol) e derivados alilamínicos (nistatina, anfotericina B). O uso das drogas

antifúngicas necessita de critérios valiosos, principalmente quando aplicados por via

sistêmica devido aos efeitos colaterais e tóxicos produzidos pela maioria

(TRABULSI, 2006; SUDBERY, 2004; VUCKOVIC et al., 2004; BORIOLLO et al.,

2005; LOGUERCIO-LEITE, 2006; LIMA et al., 2006).

3.3. Antimicrobianos

Os antibióticos são substâncias químicas produzidas por organismos vivos

(fungos, bactérias, actinomicetos e plantas), ou seus equivalentes sintéticos. Estas

substâncias são capazes de destruir ou impedir o crescimento dos microrganismos

patogênicos (MOREIRA, 2004).

3.3.1. Antibacterianos

Dentre os grupos de antimicrobianos merecem destaque os -lactâmicos que

se caracterizam por apresentarem um anel -lactâmico essencial para sua atividade

anti-bacteriana. São antibióticos bactericidas que inibem a síntese da parede celular

através da interrupção do processo de transpeptidação. Podem atuar mais

facilmente nas bactérias Gram-positivas (MACEDO et al, 2005). São antibióticos -

lactâmicos as penicilinas naturais, penicilinas semi-sintéticas e as cefalosporinas, os

monolactâmicos e as carbapanemas (TRABULSI, 2006).

As quinolonas são um grupo de substâncias antibacterianas. Existem

quinolonas de primeira geração (ácido nalidíxico, flumequina e o ácido oxolínico) e

segunda geração (enrofloxacino, ciprofloxacino e perfloxacino) reconhecidas como

fluorquinolonas. As quinolonas são antimicrobianos bactericidas e sua atividade se

relaciona a inibição da enzima DNA girase, impedindo o enrolamento da fita de DNA.

O interesse nesses compostos reside na sua possível administração por via oral,

uma absorção rápida e boa difusão graças a sua lipossolubilidade (FREITAS et al.,

2003; PEREIRA et al., 2000; TRABULSI, 2006).

Os antibióticos macrolídeos são caracterizados pela presença de um anel

lactona macrolídico em sua estrutura química e apresentam um espectro de ação

limitado. Um dos principais macrolídeos de aplicação terapêutica é a eritromicina.

São ativos contra bactérias Gram-positivas e micoplasma e possuem boa atividade

contra bactérias anaeróbicas. Agem impedindo a síntese protéica, sendo

bacteriostáticos. São bastante lipossolúveis atravessando as barreiras celulares com

facilidade. São bem absorvidos, biotransformados e eliminados (SANTOS; SOUSA;

SANTANA, 2006).

3.3.2. Antifúngicos

O número de fármacos disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas

sistêmicas é limitado. Nos últimos anos, a anfotericina B e os azóis, principalmente

cetoconazol, fluconazol e itraconazol, têm sido os fármacos de primeira escolha na

terapia antifúngica. Estas duas classes de medicamentos têm como alvo a

membrana celular dos fungos. Os polienos ligam-se a uma porção esterol,

basicamente ergosterol, presente na membrana de fungos sensíveis, formando

poros ou canais. O resultado é um aumento na permeabilidade da membrana que

permite o extravasamento de diversas pequenas moléculas, levando à morte celular.

A anfotericina B é um antibiótico fungicida de largo e potente espectro de ação, mas

seu uso é associado a efeitos adversos significantes, como nefrotoxicidade e febre

com calafrios, como reação aguda à infusão intravenosa, já que a farmacocinética

deste fármaco não permite a administração oral (GOODMAN; GILMAN, 1996).

Novas formulações da anfotericina B, na forma de lipossomas e de dispersão

coloidal, produzem menos efeitos colaterais, como resultado da redistribuição do

fármaco nos tecidos e da seletividade de liberação, mas o preço destas formulações

é muitas vezes maior que o das antigas (HARSTE; BOLARD, 1996; LOGUERCIO-

LEITE et al., 2006).

Os azóis são compostos totalmente sintéticos. O mecanismo de ação destes

fármacos baseia-se na inibição do esterol-14--demetilase, um sistema enzimático

microssomal dependente do citocromo P450, prejudicando a síntese do ergosterol

na membrana citoplasmática e levando ao acúmulo de 14--metilesteróis. Esses

metilesteróis não possuem a mesma forma e propriedades físicas que o ergosterol e

levam à formação da membrana com propriedades alteradas, que não desempenha

as funções básicas necessárias ao desenvolvimento do fungo. Os azóis causam

menos reações adversas que a anfotericina B, mas são menos potentes que a

mesma. Podem ter ação fungistática ou fungicida. O uso excessivo dos azóis levou

ao aparecimento de resistência em espécies suscetíveis. Além disso, os azóis ainda

apresentam a desvantagem da resistência cruzada (GOODMAN; GILMAN, 1996;

WILLIAMS; LEMKE, 2002; LOGUERCIO-LEITE et al., 2006).

Outro agente antifúngico sistêmico utilizado é o pró-fármaco flucitosina. Todos

os fungos sensíveis são capazes de desaminar a flucitosina em 5-fluorouracila, um

potente antimetabólito; como resultado final, a síntese de ácido desoxirribonucléico

(ADN) dos mesmos fica prejudicada. Embora as células dos mamíferos não

convertam a flucitosina em fluorouracila, o que é crucial para ação seletiva do

composto, alguns microrganismos da flora intestinal o fazem, causando certa

toxicidade aos humanos. A flucitosina tem espectro de ação restrito, tem atividade

clinicamente útil contra Cryptococcus neoformans, Candida spp. e os agentes da

cromomicose e a resistência medicamentosa que surge durante a terapia é causa

importante de fracasso terapêutico (GOODMAN; GILMAN, 1996; WILLIAMS;

LEMKE, 2002; LOGUERCIO-LEITE et al., 2006).

No tratamento das micoses superficiais a diversidade de fármacos disponíveis

para a terapia é maior. Além dos polienos anfotericina B e nistatina, da flucitosina e

de uma maior variedade de azóis (bifonazol, clotrimazol, econazol, isoconazol,

oxiconazol, sertaconazol, miconazol, terconazol e tioconazol), existem ainda outros

antifúngicos: o derivado da morfolina, amorolfina; os tiocarbamatos tolnaftato e

tolciclato; as alilaminas naftifina, terbinafina e butenafina e o composto ciclopirox,

além do antibiótico griseofulvina (GOODMAN; GILMAN, 1996; WILLIAMS; LEMKE,

2002; KOROLKOVAS, 2003; LOGUERCIO-LEITE et al., 2006).

3.3.3. Resistência aos antimicrobianos

Após a descoberta das moléculas antimicrobianas, seu uso tornou-se muito

disseminado e doenças que anteriormente eram tidas como de mau prognóstico,

passaram a ser controladas com sucesso, ocasionando a redução drástica da

mortalidade causada por microrganismos (SILVEIRA et al, 2006). Por outro lado a

disseminação do uso de antibióticos fez com que as bactérias desenvolvessem

defesas relativas aos agentes antibacterianos, com o conseqüente aparecimento de

resistência a tais compostos. Este fato impõe sérias limitações às opções para o

tratamento de infecções bacterianas, representando uma ameaça para a saúde

pública. Esta resistência prolifera-se rapidamente através de transferência genética

atingindo algumas das principais bactérias Gram-positivas como Enterococcus,

Staphylococcus e Streptococcus (LIU, 1999; TAVARES, 2000; SILVEIRA et al.,

2006).

A última linha de defesa contra a ameaça do S. aureus surgiu a partir da

descoberta do antibiótico glicopeptídeo vancomicina isolado do fungo Streptomyces

orientalis, em 1956. A vancomicina tornou-se quase numa lenda devido a sua

excelente performance frente a MRSA, e outras bactérias Gram-positivas, mas não

apresenta atividade contra Gram-negativas. Em 1988, os primeiros casos de

resistência a espécie de Enterococcus resistentes a vancomicina conhecidos por

VRE, causou enorme alarme, pois estes microrganismos são capazes de infectar

pacientes imunodeficientes como os transplantados e vítimas da AIDS (SILVEIRA,

2006).

A resistência bacteriana aos antibióticos está associada a seu uso

inadequado. O mecanismo celular desta resistência deve-se a uma modificação

genética estável, transmissível através das gerações. Apesar da mutação ser

frequentemente a causa dessa resistência, outros mecanismos de transferência do

material genético estão envolvidos, como a transdução, transformação, conjugação,

elementos extracromossomicos (plasmídios) e DNA recombinante. A escolha

racional do antimicrobiano é um processo complexo que exige diagnóstico clínico

laboratorial e conhecimento farmacológico dos agentes infecciosos, representando

um desafio para os médicos e farmacêuticos (LIU, 1999; OLIVEIRA, et al., 2004;

MOREIRA, 2004; CALBO; GARAU, 2005). Desta forma, a comunidade médica e

científica vem procurando compreender os fenômenos responsáveis pelo

mecanismo adaptado de resistência. A demanda crescente por novas substâncias

capazes de inibir, em concentrações baixas, processos vitais de uma ou mais

espécies de microrganismos resistentes tem provocado uma verdadeira corrida em

busca de agentes antibacterianos, de origem natural, semissintética ou sintética,

cada vez mais eficientes (SMITH; COAST, 2002; ELLIS et al., 2004; SILVEIRA,

2006).

3.3.4. Mecanismo genético de aquisição de resistência aos antimicrobianos

O aparecimento de bactérias resistentes a antibióticos pode ser considerado

como uma manifestação natural regida pelo princípio evolutivo da adaptação

genética de organismos a mudanças no seu meio ambiente. Atualmente, a

resistência bacteriana adquirida é descrita em praticamente todas as espécies de

bactérias, conhecendo-se os mecanismos de aquisição de resistência e os

mecanismos moleculares da manifestação da resistência (CLOUTIER, 1995;

TAVARES, 2000; ANDERSON, 2004).

O DNA em bactérias é uma macromolécula em forma de uma dupla fita

circular altamente empacotado e dobrado para se manter dentro de uma DNA-

girase, a qual converte o DNA em diferentes configurações e se agrupa dentro das

topoisomerases que podem ser topoisomerase I, que corta o DNA em fita simples e

topoisomerase II que corta o DNA em duas fitas simultâneas no processo de

replicação (TRABULSI, 2006).

A resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético, relacionado a

existência de genes contidos no microrganismo que codificam diferentes

mecanismos bioquímicos que impedem a ação das drogas. A resistência pode ser

originada em mutações que ocorreram no microrganismo durante seu processo

reprodutivo e resultam de erros de cópia na seqüência de bases que formam o DNA

cromossômico responsáveis pelo código genético. A outra origem da resistência é a

importação dos genes causadores do fenômeno, consistindo na resistência

transferível. Esta resistência faz-se através dos mecanismos de transdução,

transformação e conjugação e, frequentemente, envolve genes situados em

plasmídios e transposons (TAVARES, 2000; SILVEIRA et al, 2006).

Em inúmeros microrganismos, o fenômeno da resistência é natural.

Considerando que os microrganismos produtores de antibióticos existentes no meio

ambiente apresentam mecanismos de proteção (ex.: Streptomyces cervicalae

produtor da eritromicina é resistente a eritromicina) codificados geneticamente,

admite-se que, além da mutação a origem da resistência adquirida em bactérias e

fungos causadores de infecção no homem e outros mamíferos esteja relacionada

principalmente, à transferência de genes de resistência contidas nestes

microrganismos presentes na natureza. Portanto, a transferência de genes de

resistência de bactérias não patogênicas ou de baixa patogenicidade para

microrganismos patogênicos provavelmente é um fenômeno comum. Este fenômeno

natural ganha importância, devido ao amplo emprego clínico, industrial (conservação

de alimentos), comercial (engorda de animais) e experimental dos antimicrobianos,

os quais podem desenvolver sua ação selecionadora de microrganismos resistentes

nos mais variados ambientes (RUSSEL, 1998; TAVARES, 2000; SILVEIRA et al.,

2006).

Dentre os microrganismos que sofreram grandes modificações na

sensibilidade aos antimicrobianos com o decorrer dos anos, destacam-se

Staphylococcus, Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter e recentemente

Meningococcus, Enterococus e Pneumococcus. Na atualidade, é motivo de grande

preocupação entre os cientistas a resistência entre bactérias Gram-positivas, que

vêm se tornando um problema na terapêutica antiinfecciosa (SILVEIRA et al, 2006).

 Staphylococcus aureus: mecanismo da resistência identificação

laboratorial e tratamento

O isolamento de Staphylococcus resistentes às penicilinas pôde ser

observado logo após os primeiros experimentos com a introdução da penicilina G na

clínica em 1941. Em 1950, cerca de 80% desses microrganismos isolados em

hospitais mostravam-se resistentes às penicilinas, devido a produção de

penicilinases codificadas geneticamente em plasmídios transferíveis por transdução.

Para combater o gênero Staphylococcus foram descobertas as penicilinas

antiestafilocócicas (meticilina e a oxacilina e seus derivados) e as cefalosporinas de

primeira e segunda geração. Contudo, logo após, surgiram bactérias resistentes a

tais compostos em todas as partes do mundo. Na atualidade, espécies de

Staphylococcus vêm mostrando também crescente resistência a lactâmicos,

caracterizando-os como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) ou

Staphylococcus aureus resistente a oxacilina (ORSA) (TAVARES, 2000).

MRSA emergiu como patógeno nosocomial no início da década de 60. Há

basicamente dois mecanismos responsáveis pela resistência de S. aureus aos

agentes antimicrobianos que possuem anel -lactâmico. Um mecanismo é a

produção de -lactamases, que são enzimas responsáveis pelo desenvolvimento da

resistência à penicilina antiestafilocócicas e que levam ao desenvolvimento de

penicilinases anti-estafilocócicas, resistentes as -lactamases, como a meticilina.

Outro mecanismo é uma alteração nas proteínas fixadoras de penicilinas (PBPs). As

PBPs são enzimas que catalizam a etapa final da síntese da parede bacteriana,

além disso, a resistência pode ser devido a alteração na permeabilidade impedindo

o antibiótico de atingir o seu receptor. Todas as cepas de MRSA produzem uma

PBP (PBPza ou PBP2’) (UENO; JORGE, 2001).

As cepas de S. aureus com menor susceptibilidade à meticilina por causa da

alta produção de beta-lactamase são chamadas de BORSA para borderline oxacillin

– resistent S. aureus. Esta resistência, assim chamada borderline pode ser diferente

da resistência intrínseca de MRSA, porém no laboratório é difícil distinguir entre

ambas. Algumas linhagem de BORSA não contém PBP2a, apresentando portanto

outro mecanismo de resistência. A resistência borderline é considerada

primeiramente mediada por plasmídio (diferente da resistência mediado por

cromossomo, como no caso de MRSA) (UENO; JORGE, 2001; PEREIRA, 2002;

MACEDO et al., 2005; SOUSA; REIS; PIMENTA, 2005).

Desde a década de 70, Staphylococcus meticilina resistente tornou-se a

principal causa de infecções hospitalares em todo o mundo. Vancomicina era o

único antibiótico efetivo contra os mesmos, mas, em 1977, foram descritos S. aureus

com resistência à vancomicina e a teicoplamicina que receberam a sigla VRSA

(vancomycin resistant Staphylococcus aureus), estando seu mecanismo de

resistência também ligado as PBP2 e PBP2’, espessamento da parede celular e

aprisionamento de drogas (SOUSA; REIS; PIMENTA, 2005).

Os testes para avaliação laboratorial da susceptibilidade aos antimicrobianos

utilizados são: susceptibilidade aos antibióticos pelo teste de difusão em discos; E-

test, que contém um gradiente de concentração crescente de antibióticos,

fornecendo o valor da CIM diretamente. Reação em Cadeia da Polimerase, PCR,

utilizada na identificação de MRSA; eletroforese em campo pulsado (PFGE),

utilizado para a genotipagem de Staphylococcus, indicado para estudos

epidemiológicos (NCCLS, 2002).

As drogas utilizadas para o tratamento das estafilococcias são amoxicilina,

amoxicilina + clavulanato de potássio, gentamicina, vancomicina. Atualmente se

utilizam para esse tratamento: as cefalosporinas (resistentes a inativação por -

lactamases) cefalosporinas de quarta geração, a cefpiroma, grupos dos

glicopeptídeos (vancomicina e teicoplamina para tratar MRSA, as

isoxazolilpenicilinas e as cefalosporinas (para tratamento das pneumonias,

osteomielites, septicemias endocardites, meningoencefalites). Novos antibióticos

para o tratamento de estafilococos são ainda as estreptograminas que são formadas

por uma mistura de duas classes de componentes quimicamente distintos,

denominados de estreptograminas A e B – quinupristina – dalfopristina que é ativa

pelo efeito bactericida sinergístico, contra uma ampla variedade de gram-positivos

incluindo MRSA e VRE (Enterococcus faecium vancomicina resistentes). Outro

grupo de novos antibióticos utilizados para o tratamento de infecções causadas por

bactérias gram-positivas é a das oxazolidinonas que não apresentam ligações com

outras classes de antimicrobianos, a linezolida cujo mecanismo de ação está ligado

à síntese protéica, age inclusive contra MRSA e VRE e tem amplo espectro de

atividade contra microrganismos gram-positivos (SOUSA; REIS; PIMENTA, 2005).

 Escherichia coli – Mecanismos de resistência

Escherichia coli enteropatogênica é importante causa de diarréias infantis, de

maneira perversa e está associada a fatores como subnutrição, condições precárias

de habitação e falta de saneamento básicos. Biópsias do intestino de pacientes

infectados com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), mostraram que as

bactérias aderem à superfície do epitélio intestinal, na forma de micro colônias

localizadas, e, na célula infectada causando lesões típicas destruindo as

microvilosidades. Essa aderência intima é mediada pela interação entre uma

proteína da membrana externa da bactéria, a intimina, e seu receptor TIR,

translocado da bactéria para a superfície das células epiteliais. A interação intimina –

TIR provoca rearranjo dos componentes do citoesqueleto, na região da adesão da

célula infectada (SILVA; DA SILVA, 2005).

EPEC produz vigorosa e persistente produção de anticorpos em seres

humanos que vivem em áreas endêmicas e em modelos animais. Essas

observações reforçam as recomendações de organismos ligados a saúde pública

sobre a importância da amamentação do recém-nascido com leite materno e o

desenvolvimento de vacinas e anticorpos protetores para a prevenção e o

tratamento de infecções causadas por EPEC (SILVA; DA SILVA, 2005).

Diarréias causadas por EPEC, em geral, são mais severas do que as

causadas por outros patógenos, com prevalência de óbito superior a 30%. É

importante causa de diarréias infantis nos países em desenvolvimento e nos

desenvolvidos em todo o mundo. Os principais sintomas clínicos da doença são

diarréia aquosa, febre, mal-estar e vômitos. A Organização Mundial de Saúde, OMS,

reconheceu, em 1980 doze sorogrupos O designados: O

, O

111

, O

114

, O

119

125

, O

126

, O

127

, O

128

, O

142

, O

158

. Nestes sorogrupos estão incluídas cepas de EPEC

típicas e atípicas (isoladas de diferentes espécies de animais), E.coli

enteroagregativas, além de outras variantes de E.coli causadoras de diarréias

(SILVA; DA SILVA, 2005).

E.coli é o bacilo gram-negativo mais comum isolado de pacientes sépticos e é

responsável por mais de 80% de todas as infecções das vias urinárias adquiridas na

comunidade e pela maioria das infecções hospitalares causadas por linhagens

multiresistentes a antibióticos, tornando as opções de tratamento limitadas. Até o

momento eram susceptíveis aos carbapanêmicos como imipinem e meropenem,

entretanto já tem sido isoladas linhagens que apresentaram uma resistência

adicional ao imipinem. Estas linhagens possuem plasmídios transmissíveis que

codificam beta-lactamases do tipo ampicilina (TURRI, 2003). Além disso, sistemas

ativos de efluxo em segmentos transmembranares que expulsam o antimicrobiano

de dentro da célula, também conferem resistência aumentando a CIM (BAMBEKE,

et al., 2003; MARTINS, 2005).

 Pseudomonas aeruginosa

É o mais importante patógeno humano do gênero Pseudomonas. P.

aeruginosa faz parte da microbiota humana e raramente se torna a causa de

infecções comunitárias em indivíduos saudáveis. No entanto, em ambientes

hospitalares, esta bactéria torna-se um agente infeccioso importante, principalmente

em pacientes que apresentam quebra de barreira física e imunossupressão. Além

disso o número de fatores de virulência é significativamente maior em cepas

provindas de isolados clínicos, quando comparados a cepas ambientais (PAVIANI,

STADNIK; HEINEK, 2004). Muitas publicações têm mencionado um aumento

importante na freqüência e na resistência da P. aeruginosa aos antimicrobianos.

Pseudomonas aeruginosa é intrinsecamente resistente a vários antimicrobianos,

incluindo o cloranfenicol, tetraciclinas, algumas quinolonas e beta-lactâmicos. Entre

os antimicrobianos usados para o tratamento desta bactéria estão a penicilina

(piperacilina), cefalosporinas (ceftazidima, cefepima), carbapenêmicos (imipimem,

meropenem), monobactamico (aztreonam), aminoglicosídios (gentamicina,

tobramicina, amicacina) e fluorquinolonas (ciprofloxacino) (PAVIANI; STADNIK;

HEINEK, 2004; ALVAREZ et al., 2005).

A resistência aos -lactâmicos ocorre por mecanismos variados: produção de

-lactamase AmpC (ampicilinase), β-lactamases de espectro estendido,

carbapenemases, diminuição da permeabilidade celular e mecanismo de efluxo

estão entre os descritos. A perda da permeabilidade e o mecanismo ativo de efluxo

podem afetar a atividade de outros tipos de fármacos como aminoglicosídeos e

quinolonas. Esta atividade pode ser completada com alterações da DNA girase.

Atualmente tem sido relatado a incidência de P. aeruginosa multi-resistentes

(LAMBERT, 2002; BAMBEKE, 2003; PAVIANI; STADNIK; HEINEK, 2004;

SCHWEIZER, 2003).

 Fungos Leveduriformes

Os fungos podem se apresentar como patógenos primários capazes de

causar infecção sem fatores predisponentes, como também, como patógenos

oportunistas, manifestando seu potencial patogênico em hospedeiros

imunologicamente ou fisiologicamente comprometido, neste último grupo estão

inseridas as leveduras de gênero Candida. O status fisiológico do hospedeiro tem

sido reconhecido então como o fator etiológico primário no desenvolvimento das

infecções fúngicas, mais que a virulência intrínseca do microrganismo oportunista.

Entretanto, apenas pequenas alterações neste estado podem modificar o

comportamento desses microrganismos que passa a manifestar seu potencial de

virulência e assim, de comensal inofensivo tornar-se um patógeno agressivo.

(FURLETTI, 2006).

C. albicans pode se apresentar sobre várias formas, chamadas de variações

adaptativas, sendo a forma, de hifa a mais virulenta e mais aderente em relação à

célula leveduriforme. Dessa forma, a capacidade dessa espécie de formar tubos

germinativos, parece contribuir para sua virulência no homem e nos animais

(FURLETTI, 2006; MOREIRA, 2003).

A patogenia de Candida spp. pode ser observada por algumas características

como a formação das hifas e pseudohifas com mais de 200 µm de comprimento,

podendo representar um obstáculo à fagocitose, que é o principal meio de defesa do

organismo contra a infecção fúngica. A produção de alguns metabólicos por cepas

de Candida, é capaz de desencadear manifestações alérgicas. Somente as espécies

capazes de crescer a 37ºC são potencialmente patogênicas ao homem. Os fatores

que estão relacionados ao microrganismo na instalação do processo infeccioso são

a presença de cepas com melhor aderência celular ao hospedeiro, produção de

pseudo-hifas e pseudomicélio, presença de toxinas e a produção de enzimas

proteolíticas (MOREIRA, 2003).

Essas enzimas proteolíticas podem degradar ou transformar constituintes da

membrana celular do hospedeiro induzindo uma disfunção ou destruição física,

sendo que a invasão das células dos tecidos do hospedeiro por tais microrganismos

implica na penetração e danos ao envelope externo celular sendo esse processo

mediado por meios físicos e enzimáticos ou pela combinação de ambos (FURLETTI,

2006).

Os fatores de virulência de C. albicans estão relacionados com a produção de

hialuronidase, condoitina sulfatase, proteinase e fosfolipases. os mesmos podem

atuar de maneira conjunta ou separada determinando a intensidade de virulência e

também são considerados essenciais para o microrganismo (FURLETTI, 2006).

3.4. Plasmídios

Os plasmídios (Figura 6), são moléculas extracromossomiais circulares de

DNA encontradas em muitas espécies bacterianas e em algumas espécies de

eucariotos. São moléculas que podem ser curadas ou removidas da célula depois de

serem submetidas a diferentes condições de estresse, como mudanças na

temperatura, presença de certos corantes ou carência de certos nutrientes (LYON,

1987; PEREIRA, 2000; UENO; JORGE, 2001).

Figura 6. Plasmídio.

Fonte: http://www.libertaria.pro.br/d_ressurgentes_arquivo/plasmídio.gif

Os plasmidios podem conferir resistência a um antibiótico ou a um metal

pesado. A replicação do plasmídio pode ocorrer em dois momentos: primeiro quando

a célula bacteriana se divide, o DNA plasmidial também se divide assegurando que

cada célula filha receba uma cópia deste. Segundo, durante o processo de

conjugação, a molécula de DNA replicada pode entrar na célula receptora. O

plasmídio se replicará até alcançar seu número de cópias que é controlado pela

iniciação de síntese de DNA. Uns se apresentam em baixo número de cópias (1 a

10), outros o fazem em alto número (10 a 100). Supõe-se que o plasmídio codifica

inibidores que afetam a taxa de iniciação da própria síntese, controlando, portanto o

número de cópias (TRABULSI, 2006). A presença de plasmidios, geralmente em

múltiplas cópias, garante não somente sua distribuição durante a divisão celular,

mas, principalmente, permite a transferência em freqüência mais elevada, sem

causar na maioria das vezes um custo biológico para a célula bacteriana. Uma

variedade de compostos, tais como corantes de acridina, brometo de etídio,

rifampicina, sal de bis-amônio e mais a tioridazina, uma fenotiazina, assim como

antibióticos inibidores da subunidade B da DNA girase, novobiocina e coumermicina

tem sido reportados para eliminar plasmidios. No entanto, são raros os relatos a cura

de plasmidios por inibidores da subunidade A da DNA girase, particularmente em

linhagens de S. aureus de origem animal (PEREIRA, 2000).

Os plasmídios de uma célula normalmente perfazem menos de 5% do DNA

total. A análise de perfil plasmidial requer primeiramente a sua separação do DNA

cromossômico de modo que existem vários métodos de preparação rápida para

extração de plasmídios em pequena escala, as quais podem ser utilizadas com

propósito de identificação e estudos epidemiológicos de Staphylococcus. Uma das

técnicas amplamente utilizadas devido sua alta reprodutibilidade e simplicidade é a

técnica de análise de DNA plasmidial usando endonuclease de restrição (REAP)

(UENO; JORGE, 2001).

3.5. Transposons

São segmentos móveis de DNA em bactérias, que são movimentados em

baixa freqüência dentro do cromossomo. A freqüência de transposição tanto em

procariontes como em eucariontes é relativamente baixa (10

-7

por geração)

dependendo do elemento em particular. Sendo o cromossomo uma molécula

contínua de DNA, a transposição dos elementos móveis é um processo de

intercâmbio de DNA caracterizado como um tipo de recombinação, (não sendo esta

a recombinação clássica homóloga). Muitos transposons de bactéria possuem genes

facilmente identificáveis, que podem ou não existir em outro lugar do genoma.

Genes de resistência a antibióticos são comuns, e transposons levando esses genes

são os mais frequentemente estudados (SHLAES et al., 1997; TRABULSI, 2006;

SEABRA et al., 2004; FERREIRA, 2005). Estes são designados Tn (ex: Tn1 amp),

quando não é reconhecida a marca, estes elementos são designados seqüenciais

de inserção ou elementos IS (ex: 1S

, 1S

etc.). Os transposons estão

frequentemente localizados dentro de um gene particular gerando neste uma

mutação. Os transposons levam outros marcadores em adição à informação para a

transposição. A marca mais comum é a resistência a antibióticos, outros marcadores

são genes para fermentação de lactose, metabolismo de rafinose, formação de

enterotoxina em Escherichia coli e resistência a metais pesados. Existem

transposons que são capazes de se transferir de uma célula para outra sem auxilio

de plasmídios, num processo em que é necessário o contato direto entre a célula

doadora e a receptora. Este tipo de transposon está presente nos Streptococcus e é

conhecido como transposon conjugativos. Ele é importante na disseminação da

resistência múltipla a antibióticos nesse gênero bacteriano e possivelmente em

outras bactérias Gram-positivas (SHLAES et al., 1997; TRABULSI, 2006; SEABRA

et al., 2004; FERREIRA, 2005).

3.6. Aspectos botânicos e fitoquimicos do Lapachol e seus derivados semi-

sintéticos e nitrogenados

O lapachol foi isolado primeiramente do lenho da árvore argentina “Lapacho”

Tabebuia avellanedae lor. família Bignonaceae (Figura 07).

Figura 7. Ipê-roxo.

Fonte: http://www.linkbrazil.com.br/nature/pantanal/flora/ipe_roxo/ipe_roxo_1.jpg

Em 1956, Gonçalves de Lima e coll. constataram no cerne do pau d’arco roxo,

Tabebuia spp., a existência de um composto de coloração amarela com atividade

antimicrobiana, principalmente para o gênero Brucella e que chegaram à conclusão

de que era lapachol. A presença do lapachol foi constatada posteriormente em

várias outras espécies e diferentes famílias tais como: Bignoniaceae (Tabebuia

flavesons Benth, & Hook, T. gnayacan Hems, Tavellanedae Lor Ex Griseb, T.

serratifolia (Vahl) Nichols, T. rosa, T. pentaphylla (Linn) Hemls, Paratecoma peroba

(recors) Kuhlm, Tecoma araliaceae DC, Stereospernum suaveolen DC, S.

kunthianum, Millingtonia hortensis Linn, Stereospermum tetragonum DC, Catalpa

longíssima, Macfadyena ungis – cati, Tabebuia bata (E. Mey) Sandw); Verbenaceae

(Tectona grandis L.fil, Avicennia tomentosa Joacq, Avicenia officinalis), Proteaceae

(Conospremum teretifolium R. Br.), Leguminosae (Diphysa latifólia) outras espécies

(Sterocarpus salignus, Haplophragma adenopphyllum, Kigelia pinnata, Markhamia

stipulata Wall, Phyllarthon conorense, Radermachera Xylocarpa, Avicenia alba)

(FONSECA et al., 2003).

O lapachol é uma hidroxi-naftoquinona substituída, [2 – hidroxi – 3 – (3 – metil

– 2 butemil) – 1,4 – naftalenodina]. Os estudos químicos foram desenvolvidos

inicialmente por S.C. Hooker em 1892 e 1896. Além do lapachol foram isolados na

espécie Tabebuia avellanedae Lor. ex giseb (Bignoniaceae) e em outras espécies,

seis naftoquinonas e nove antraquinonas. A α-lapachona e β-lapachona estão

citadas no primeiro grupo. A presença de filoquinona (vitamina K) foi registrada

apenas nas folhas desta planta. As substâncias mais estudadas nesta espécie são o

lapachol, os dois isômeros (derivados éter metílico do lapachol) α-lapachona e β-

lapachona e a xiloidona (desidro – α – lapachona), todos biologicamente ativos

(FONSECA et al., 2003; Lyra et al., 2004)

lapachol α-lapachona

β-lapachona xiloidona

Figura 8. Estruturas químicas do lapachol e seus derivados semi-sintéticos

O lapachol pode ser obtido por vários métodos de extração, sempre se

baseando na sua solubilidade em solvente orgânico e do seu sal em meio aquoso

alcalino, gerando, respectivamente, soluções amarelas e vermelhas. Os métodos de

extração desenvolvidos por Gonçalves et al., 1962, consistem na extração do

lapachol da serragem do cerne de Tabebuia spp. (pau d’arco roxo) com benzeno ou

com acetona. A forma de extração do lapachol mais empregada foi descrita por

Paterno em 1882. Este método propicia a obtenção de 80g de lapachol puro,

cristalizado para cada 1 kg de serragem do cerne do vegetal. Os principais

derivados do lapachol podem ser obtidos da seguinte forma: α–lapachona e β-

lapachona podem ser obtidas a partir do lapachol. A xiloidona pode ser obtida

quimicamente pelo método que consiste em refluxar o lapachol, e por um segundo

método que consiste em refluxar o lapachol em anidrido acético e piridina, seguindo-

se de uma hidrólise e oxidação lenta. O lapachol também pode ser transformado em

α–lapachona, β–lapachona e xiloidona por via seca (calor); e a xiloidona aquecida é

transformada em α–lapachona e β–lapachona. Fieser propôs uma rota para a

obtenção sintética do lapachol em 1927, seguido por Hooker, em 1936 e Pettit e

Houghton, em 1971 (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).

Em relação as propriedades físico-quimicas, o lapachol tem a forma de

cristais prismáticos ou folhas amarelas, de peso molecular 242,26, sendo sua

formula química C

, com ponto de fusão 139,5 – 140,2ºC. É bastante solúvel

em acetona, etanol, metanol, clorofórmio, benzeno e ácido acético; solúvel em éter

etílico, insolúvel em água a frio, sendo ligeiramente solúvel em água em ebulição

promovendo uma coloração alaranjada. A solução dissolve-se prontamente em

soluções alcalinas; na presença de hidróxido de sódio, forma um sal sódico que

confere às soluções aquosas uma coloração vermelha brilhante. Esta forma é

extremamente ativa como corante (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).

 Derivados nitrogenados do lapachol

Atualmente, a exploração da reatividade química da cadeia lateral do

lapachol, tem sido realizada para aumentar a atividade biológica, a exemplo da

susbstituição da hidroxila do lapachol por aminas que vem sendo um dos alvos de

interesse dos pesquisadores. As substituições diretas feitas com simples adição de

aminas secundárias apropriadas à temperatura ambiente tem bons rendimentos,

resultam em um aumento da atividade citotóxica em relação ao lapachol. Estas

substâncias são identificadas neste trabalho com os códigos L-01 a L-08.

Figura 9. Formação de enamina a partir do lapachol (BARBOSA, 2006)

 Atividades Biológicas

Atividade Anticarcinogênica - Vários estudos mostraram ser positiva a

atividade anticancerígena do lapachol. Atualmente no Brasil o lapachol é

comercializado sob a forma de cápsulas gelatinosas indicadas para pacientes

portadores de várias neoplasias malignas, como carcinoma epidermóide do colo

uterino, carcinoma epidermóide do assoalho da boca, adenocarcinoma do aparelho

digestivo, além de auxiliar na quimioterapia (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).

Os primeiros estudos antineoplásicos para o lapachol foram desenvolvidos

por Hatwell em 1967. Estes estudos mostraram uma alta atividade antineoplásica do

lapachol sobre o sarcoma de Yoshida (86% de inibição). Posteriormente, foram

pesquisadas as suas ações sobre o carcinoma de Walker 256 e contra o

linfosarcoma de Murphy Sturm. O sal sódico do lapachol é ativo contra leucemia

L1210 e o lapachol também mostrou atividade contra carcinoma ascitíco de Ehrlich.

Sabe-se que a concentração plasmática do lapachol necessária para atividade

contra alguns tipos de câncer (ex: carcinoma de Walker256) é de 30 a 25 µg/mg,

mas que nunca foi alcançada devido o surgimento de efeitos tóxicos (FONSECA;

BRAGA; SANTANA, 2003).

Objetivando o estudo apropriado da relação entre a estrutura química do

lapachol e sua atividade farmacológica, alguns autores observaram que a

substituição dos grupamentos metil por cloro ou bromo, resulta em compostos com

muito boa atividade anticancerígena. Ao contrário de outras drogas anticâncer do

tipo benzantraquinona, que estimulam a peroxidação lipídica dependente de

NADPH: citocromomo P450 redutase microssomal, o lapachol inibe por um

mecanismo potente e desconhecido. O lapachol, como um antagonista da vitamina

K (efeito hipoprotrobinêmico), deve usar todas as reações vitamina K-dependentes,

incluindo a interação 6as6 – AX1 e então bloquear as transduções dos sinais que

estimulam a produção em tumores onde o oncogene AX1 é expresso. O lapachol

pode ser um agente anticâncer oncogene – especifico. Isso reacende a possibilidade

do uso do lapachol como agente anticâncer (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).

 Atividade antiinflamatória

Extratos hidroalcoóticos do líber de Tabebuia spp. foram utilizados para o

tratamento de cervicites e cervico-vaginites crônicas com ação antinfamatória e

cicatrizante. Também foram utilizados no tratamento de úlceras de perna, bursites,

tendinites, sinusites e otites agudas e crônicas. Formulações tópicas do lapachol

mantém suas propriedades antiinflamatórias e analgésicas (FONSECA; BRAGA;

SANTANA, 2003; LIRA et al., 2004).

 Atividade antimicrobiana

Desde os primeiros trabalhos sobre o lapachol que sua atividade

antimicrobiana é estudada, observando-se uma predominância contra certos

microrganismos Gram-positivos e ácidos resistentes e uma baixa atuação contra

Gram-negativos, exceto contra o gênero Brucella. Verificou-se também que, a

medida que se eleva o grau de pureza do lapachol, diminui-se progressivamente a

sua atividade antimicrobiana, o que pode ser explicado pelo fato de que outras

naftoquinonas extraídas junto com o lapachol, também possuem essa atividade. Nos

testes de atividade fungicida observou-se que a β-lapachona tem uma maior

eficiência do que o lapachol. No total, tanto a β-lapachona quanto o lapachol foram

mais ativos que o cetoconazol. Também tem sido estudada sua atividade antibiótica

contra vírus e atividade tripanosomicida, antimalárica e moluscicida(FONSECA;

BRAGA; SANTANA, 2003; DA SILVA et al., 2003).

 Atividade inibidora de sistemas celulares reparadores

Nesse processo as quinonas naturais, cujo principal destaque das

naftoquinonas é o lapachol, atuam de diferentes formas. Como exemplo, destaca-se

o estresse oxidativo que provocam ao induzirem a formação deletéria endógena de

espécies bioativas derivadas do oxigênio (O

, OH e H

) como ocorre no

Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de chagas. Outra atividade

marcante destas substâncias, descoberta um tanto recentemente, é a inibição do

complexo das topoisomerases, ação que provoca o desenvolvimento da apoptose

celular (suicídio celular). A interferência das quinonas na apoptose, constitui-se hoje

uma pesquisa interdisciplinar de fronteira na química medicinal, existindo grande

expectativa quanto a delineação de estratégias racionais, visando o combate de

neoplasias, principalmente as relacionadas ao câncer de próstata. A química das

quinonas, já há muito vem sendo descrita em vários livros publicados, em inúmeras

e excelentes revisões, estando assim bem documentada sua evolução ao longo do

tempo. Destaca-se no grupo das naftoquinonas a β-lapachona com acentuada

atuação tanto na química como na farmacologia e o lapachol, outrora comercializado

para o tratamento de certos tipos de câncer, como coadjuvante, fabricado pelo

LAFEP (Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco) não mais disponível

no mercado. Esta naftoquinona também já constou do catálogo da Aldrich Chemical

Co, em edição antiga (1989). Também não consta nas últimas edições do Índice

Merck (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003).

O principal interesse no lapachol reside em sua capacidade de induzir o

estresse oxidativo através da formação intracelular de espécies reativas do oxigênio

como o peróxido de hidrogênio (H

), o ânion radical superóxido (O

) e o radical

hidroxila (OH). Estas espécies podem danificar alguns componentes celulares

importantes, tanto de células normais como de malignas. Esta interferência

xenobiótica altera o balanço natural de sinais que interferem na divisão celular em

pontos específicos da evolução morfogênica natural (checkpoint ou ponto de

checagem). A alteração da normalidade pode induzir a apoptose como alternativa,

caso não se consiga eliminar por completo o estresse oxidativo. Estudos realizados

indicam que o estresse oxidativo induzido pelo Lapachol, ocorre na enzima P450

redutase. Neste processo espécies reativas do oxigênio, promovem a cisão do DNA.

Este tipo de mecanismo de ação é importante, pois alguns microrganismos

patogênicos são muito mais sensíveis ao estresse oxidativo que os hospedeiros

humanos (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003).

A β-lapachona, exibe in vitro variados tipos de atividade contra diferentes

linhagens de células, principalmente células malignas dos cânceres de pulmão,

mama, colo retal, próstata, melanoma e leucemia. Apesar do amplo espectro de

bioatividades os mecanismos de ação da β-lapachona em modelos experimentais

ainda não estão bem delineados. Além do estresse oxidativo, também se observam

vias biorredutivas alquilantes sobre ácidos nucléicos e/ou protéicos. Entretanto, a

atuação inibitória da β-lapachona sobre sistemas reparadores parece não ser o seu

único modo de atuação uma vez que fungos que não expressam topoisomerase I

também são inibidos por essa quinona. Ao que parece a β-lapachona é um

xenobiótico de atuação critica sobre mais de um alvo intracelular que não só a

topoisomerase I. Com as informações disponíveis na literatura pode-se apontar para

uma ação de indução da apoptose através da inibição do complexo topoisomerase –

DNA. A possibilidade de uma ação direta da β-lapachona no ciclo catalítico das

enzimas topoisomerases I e II, assim como a geração endógena de O

־ e H

, são

sinais decisivos que desencadeiam a apoptose (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA,

2003).

 Efeitos colaterais e toxicidade

Apesar de sua baixa toxicidade, o lapachol apresenta alguns efeitos como a

anorexia, náusea e mais raramente vômitos, o que pode ser facilmente controlado

com antieméticos. Uma prolongação reversível no tempo de protrombina é

observada a doses elevadas o que é revertido com a administração parenteral de

vitamina K. Apesar da β-lapachona possuir atividades antineoplásica e antibiótica

superiores às do lapachol, bem como atividade antiviral, esse isômero apresenta-se

20 vezes mais tóxico que o Lapachol. A dose de 0,25g de Lapachol/kg administrada

diariamente, via oral durante 28 dias, é considerada a máxima dose tolerada em

macacos e cachorros. A administração de 100 mg/kg de Lapachol em ratas prenhes,

mostrou uma grande incidência de reabsorção do ovo por ação blastocistóxica –

antizigótica e uma atividade abortiva, levando a malformação (FONSECA; BRAGA;

SANTANA, 2003)

De todo modo, não se deve considerar a toxicidade elevada da β-lapachona

como um fator limitante ao uso clínico. Novas expectativas colocam-se nos estudos

futuros da relação atividade biológica versus estrutura química, uma área de atuação

aberta à química medicinal, que pode levar-se à solução de problemas de

toxicidade. (DA SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003).

M A T E R I A L E M É T O D O S

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Local da Pesquisa

As atividades de pesquisa foram desenvolvidas nos Laboratórios de Micologia

(DCF/CCS/UFPB), Genética Microbiana (CCEN/UFPB) e Microbiologia (LAC/UEPB),

onde funciona o Laboratório de Pesquisas em Atividades Antimicrobianas do

Programa de Qualificação Institucional – PQI da UEPB.

4.2. Produtos testados

As substâncias testadas, lapachol e derivados, foram obtidas no Laboratório

de Tecnologia Farmacêutica (LTF/UFPB) e gentilmente cedidas pelo Profº Dr. Celso

Amorim Câmara. As mesmas foram sintetizadas conforme procedimentos descritos

na literatura (CÂMARA et al, 2001; CAMARA et al, 2002, BARBOSA et al, 2005;

SILVA et al, 2005; BARBOSA, 2006; BARBOSA-FILHO et al, 2006) São elas:

Lapachol e seus derivados semi-sintéticos -lapachona, -nor-lapachona, -I-

lapachona, -lapachona, nor-lapachona, -I-lapachona e seus derivados

nitrogenados obtidos por semisíntese: 2-amino-1,4-naftalenodiona (L-01), 2-(2,2-

dimetoxietilamino)-3-(3-metil-2-butemil)-1,4-naftalenodiona (L-02), 1-(2,2-dimetoxi-

etil)-2,2-dimetil-1,2-diidro-benzo[g]quinolina-5,10-diona (L-03), 1-benzil-2,2-dimetil-

1,2-diidro-benzo[g]quinolina-5,10-diona (L-04), 2-(2-hidroxietilamino)-3-(3-metil-2-

butemil)-1,4-naftalenodiona (L-05), 4-(1-hydroxi-1-metil-etil)-4,5-diidro-1H-nafto[2,3-

b]azepina-6,11-diona (L-06), N-[1,4-diidro-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-dioxo-2-naftalenil]-

glicina (L-07), 2-amino-3-(3-metil-2-butemil)-1,4-naftalenodiona (L-08).

As soluções apresentando diferentes concentrações dos produtos foram

obtidas, da seguinte forma: Em um tubo de ensaio (15 x 16 mm) estéril foi colocado

12mg do produto; 0,04mL de Tween 80; 50µl de Dimetil sulfóxido (DMSO) e 6,0 mL

de água destilada estéril. Essa mistura foi homogeneizada por aproximadamente 5

minutos. A partir de tal procedimento, obteve-se uma solução com concentração

final de 200mg/mL (solução padrão). Seguindo-se o processo de diluições seriadas,

preparou-se uma série de 3 tubos de ensaio onde cada um continha 2,5 mL de água

destilada estéril. A partir da solução (padrão), as diluições seriadas foram realizadas,

transferindo-se 2,5 mL dessa diluição para o primeiro tubo de ensaio da série,

homogeneizou-se por 5 vezes e transferiu-se 2,5 ml para o tubo seguinte e assim

sucessivamente até o último tubo da série, obtendo-se soluções com as seguintes

concentrações: 100, 50 e 25 µg/mL.

Lapachol

Norlapachol

-Norlapachona

3-Iodo--

lapachona

Derivados semi-sintéticos do Lapachol

3-Iodo--

lapachona

-Lapachona

-Lapachona

-Norlapachona

L01

2-Amino-1,4-

naftalenodiona

NHCH

CH(OCH

)

L02

2-(2,2-

Dimetoxietilamino)-3-(3-

metil-2-butenil)-1,4-

naftalenodiona

CH(OCH

)

L03

1-(2,2-Dimetoxi-etil)-

2,2-dimetil-1,2-diidro-

benzo[g]quinolina-

5,10-diona

L04

1-Benzil-2,2-dimetil-

1,2-diidro-

benzo[g]quinolina-

5,10-diona

Derivados nitrogenados do Lapachol

NHCH

L05

2-(2-Hidroxietilamino)-

3-(3-metil-2-butenil)-

1,4-naftalenodiona

L06

4-(1-Hidroxi-1-metil-

etil)-4,5-diidro-1H-

nafto[2,3-b]azepina-

6,11-diona

NHCH

L07

N-[1,4-diidro-3-(3-

metil-2-butenil)-1,4-

dioxo-2-naftalenil]-

glicina

L08

2-Amino-3-(3-metil-

2-butenil)-1,4-

naftalenodiona

Figura 10. Estruturas químicas do lapachol e seus derivados

4.3. Substâncias

 Tween 80 (Sigma Chemical)

 DMSO – Dimetilsulfóxido (Merck)

 Água Destilada

 Solução salina (NaCl 0,85%)

 Antibióticos

- Tetraciclina (Lote: 1112, Fornecedor DGE. Origem: China)

- Penicilina G (Laboratório de genética de microrganismos da UFPB)

- Estolato de eritomicina (Lote: 200592, Fornecedor: AMT do Brasil. Origem:

Índia)

- Sulfato de estreptocimina (Lote: 826.545 Fornecedor: INLAB – Brasil)

- Discos de Antibióticos (Cefar) - Antibiograma

4.4. Espécies microbianas

Foram utilizadas neste trabalho, amostras de Staphylococcus aureus,

meticilina-sensíveis (MSSA) e S.aureus meticilina-resistentes (MRSA), Escherichia

coli e Candida albicans, além de cepas padrão American Type Culture Collection

(ATCC), apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1. Identificação e origem das cepas microbianas testadas

Cepas/Identificação Origem/Fornecedor

S.aureus – MSSA: ATCC 25923 Cefar

S.aureus – MRSA: 171c

Humana/ Lab. Genética -

UFPB

S. aureus: orofaringe (8, 18, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50) Humana/ Diagnose

S. aureus: fossas nasais (129 FN, 233 FN, 322 FN)

Animal / Lab. Genética -

UFPB

S.aureus: úbere (122U, 146U, 223U, 312U, 319U)

Animal / Lab. Genética -

UFPB

S. aureus: ambiente hospitalar (1A e 2A) Diagnose

E. colii ATCC 25922 Cefar

E.coli: infecção urinária (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) Humana/ Diagnose

P.aeruginosa ATCC 27853 Cefar

C.albicans ATCC 76643 Cefar

C. albicans spp

Humana / Lab. Micologia -

UFPB

C. albicans: (1, 2, 3, 4, 5, 6)

Humana / Lab. Micologia -

UFPB

4.4.1. Isolamento e Identificação dos microrganismos

Para os ensaios foram utilizados os meios Agar Sangue, Agar Manitol

Salgado e Agar Müeller-Hinton (BBL-difco). O Agar Sangue foi utilizado para verificar

a pureza e a capacidade hemolítica das cepas bacterianas e o Agar Manitol Salgado

para verificação da capacidade de utilização do manitol pelas cepas de S.aureus. O

Agar Müeller-Hinton foi utilizado para a realização do Teste de Sensibilidade aos

Antimicrobianos-TSA, por ser o meio de cultura padrão de acordo com Bauer et al.

(1966) e NCCLS (2002).

As cepas de S. aureus de origem humana e ambiental, utilizadas nesse

trabalho foram adquiridas e identificadas por métodos microbiológicos tradicionais,

pelo Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual da Paraíba – UEPB e

pelo Setor de Bacteriologia da Diagnose-Clínica de Análises Especializadas – LTDA,

Campina Grande-Pb. As cepas de origem animal foram doadas da coleção do

Laboratório de Genética da UFPB e as cepas ATCC foram adquiridas através da

PROBAC do BRASIL.

Para a identificação bioquímica das cepas de S.aureus, foram realizados

testes rotineiros para detectar a produção das enzimas catalase, coagulase e

DNAse além de observar a utilização do manitol (fermentação e oxidação) e a

produção de hemólise em Ágar Sangue.

Para as leveduras foram selecionadas cepas de C. albicans, isoladas de

amostras clínicas de pacientes portadores de infecções superficiais e/ou profundas.

Os cultivos foram realizados em Agar Sabouraud Dextrose (ASD), incubados a 35°C

e observados por um período de 2 a 3 dias, a fim de evidenciar o crescimento

fúngico. As características macromorfológicas, microscópicas e bioquímicas dos

cultivos foram estudadas segundo a chave de identificação proposta por GUÉHO et

al. (1994).

4.4.2. Preparo da suspensão microbiana

Durante a realização do ensaio, as cepas foram mantidas em meio Agar

Müeller-Hinton (difco) e repicadas para caldo Brain Heart Infusion - BHI (BBL-difco) e

incubadas a 37ºC/24 horas. Após este período, procedeu-se o semeio pela técnica

de estrias (para obtenção de colônias isoladas) em placas de Agar Sangue, que

foram incubadas a 37ºC/24 horas. Com relação a obtenção do inóculo bacteriano,

foram selecionadas 3 a 5 colônias semelhantes as quais foram transferidas para

5,0mL de caldo BHI e incubadas a 37ºC durante 24 horas. Após este período, foi

feito o subcultivo, transferindo 50µl do inóculo inicial para 30mL de caldo Müeller-

Hinton, incubando-o à 37ºC/1h de modo a produzir uma leve turvação, de densidade

visualmente equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, obtendo-se assim um

inóculo de concentração final de 10

UFC/mL. Essa suspensão, foi semeada no

tempo máximo de 15 a 20 minutos após sua preparação.

Quanto as leveduras, as culturas foram mantidas em Agar Sabouraud

Dextrose (ASD) a 35°C durante 24-72 horas. A suspensão de levedura foi preparada

e padronizada em solução de cloreto de sódio a 0,85% estéril. Foi obtida uma

suspensão com turvação comparativa com a do tubo 0,5 da escala de McFarland. A

mesma foi ajustada no espectrofotômetro (Leitz-Photometer 340-800), para conter

aproximadamente uma concentração final de 10

UFC/mL (BAUER et al., 1966;

CASALS, 1979; FROMTLING; PUI-YU; SHADOMY, 1983; PLEMPEL et al., 1986;

DRUTZ, 1987; ODDS et al., 1989: NASSIS et al., 1989; CLEELAND; SQUIRES,

1991; ELLIS, 1994; NCCLS, 2002).

4.5. Meios de cultura

Para a manutenção dos microrganismos e ensaios de atividades biológicas,

foram usados os meios de cultura Blood Agar Base (BAB), Agar Sangue (AS), Agar

Manitol Salgado (MAS), Agar Mueller-Hinton (AMH), Caldo Brain Heart Infusion (BHI)

e Caldo Mueller-Hinton (CMH) para bactérias; e Agar e caldo Sabouraud Dextrose –

ASD para fungos. Os meios de cultura (difco), foram preparados conforme as

instruções do fabricante.

4.6. Metodologia

4.6.1. Determinação da atividade antimicrobiana – triagem

Com relação a determinação da sensibilidade dos microrgansmos frente ao

lapachol e seus derivados sobre microrganismos, foi realizado inicialmente a triagem

da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em meio sólido, processo

cavidade-placa (BAUER et al., 1966; CLEELAND; SQUIRES, 1991; NCCLS, 2002).

Quanto a realização do teste de difusão, foram utilizadas placas de Petri (90 x

15 mm) descartáveis, estéreis, contendo 20mL de Agar Müeller-Hinton, que foram

inoculadas pela técnica de espalhamento em superfície (Figura 11). Com auxílio de

"swabs" estéreis, mergulhados na suspensão, foi retirado o inóculo, eliminando-se o

excesso do líquido por pressão nas paredes do tubo. O inóculo foi semeado em toda

a superfície do agar, de modo a se obter um crescimento uniforme e semi-

confluente.

As placas foram colocadas para secar, durante 3 a 5 minutos, antes de se

fazer as cavidades de 6 mm de diâmetro, com o auxílio de perfuradores descartáveis

estéreis. Em cada cavidade foi adicionado 50 l da solução de cada produto testado

nas concentrações de 200g/mL, 100g/mL, 50g/mL e 25g/mL, a fim de verificar

a presença ou não de atividade antimicrobiana. Foi utilizado como controle em uma

das cavidades, 50L da solução de DMSO a 2% usada como solvente. As placas

foram incubadas a 37°C por 24 horas e após este período, foram medidas, em

milímetros, as zonas (halos) de inibição de crescimento bacteriano. Os ensaios

foram realizados em triplicata e o resultado final foi determinado pela média

aritmética do tamanho dos halos de inibição (mm) dos valores obtidos nos ensaios.

Na triagem para a avaliação da atividade antimicrobiana, foi considerado como teste

positivo quando a média dos halos foi igual ou superior a 10 mm de diâmetro

(DROUHET; DUPONT, 1978; GUNDIDZA, 1986). E no caso das leveduras, 1 mL do

inoculo foi colocado nas placas de Petri (90x15 mm) estéreis e, em seguida, foi

adicionado 20 mL do agar Sabouraud dextrose liquefeito à 50°C. As placas foram

homogeneizadas e deixadas em repouso até a solidificação (WONG-LEUNG, 1988;

SAKAR, 1988).

Figura 11. Técnica de difusão em meio sólido, processo cavidade-placa.

Placa contendo meio de

cultura

Placa contendo

cavidades de 6mm de

diâmetro +

50l dos produtos

incubadas 24h/37°C

"Swab" com o inóculo: 10

UFC/mL -

tubo 0,5 da escala de Mac Farland

Zonas de inibição

indicam atividade

antimicrobiana

4.6.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração

Bactericida Mínima (CBM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM)

Os testes para a determinação da CIM, da CBM e CFM foram realizados por

difusão em meio sólido, processo cavidade-placa conforme os protocolos de Bauer

et al (1966); CLEELAND; SQUIRES, 1991; HADACEK; GREGER (2000); NCCLS

(2002).

As placas de Petri (90x15 mm), contendo 20mL do meio de cultura ágar

Müeller-Hinton, foram inoculadas pela técnica de espalhamento em superfície, com

auxílio de "swabs" estéreis mergulhados na suspensão bacteriana para retirar o

inóculo. E no caso das leveduras, utilizou-se o meio de cultura agar Sabouraud

dextrose. Em cada placa foram feitas cavidades, de 6mm de diâmetro, com o auxílio

de perfuradores descartáveis estéreis. Nesses orifícios foram colocados 50l dos

produtos, para verificar a presença ou não de atividade antimicrobiana. As placas

foram incubadas à 35°C por 24 horas e após este período, foram medidas, as zonas

de inibição, em milímetros. Cada ensaio foi realizado em triplicata, para cada cepa

selecionada. O resultado final foi determinado pela média aritmética do tamanho dos

halos de inibição (mm) dos valores obtidos nos três ensaios.

A CIM foi considerada como a menor concentração do produto que inibiu o

crescimento visível dos microrganismos após 24h/37°C de incubação para bactérias

e 24-48h/35ºC, para as leveduras. A CBM e CFM foram consideradas como a

concentração do produto imediatamente superior à da CIM (NCCLS, 2002).

4.6.3. Determinação da cinética do crescimento bacteriano

Foram determinadas as curvas de crescimento do lapachol e seus derivados

sobre amostras selecionadas de S. aureus, estabelecendo-se a concentração

relacionada à CIM, em diferentes tempos de incubação, segundo o método proposto

por Peyret et al, (1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo (BHI),

incubadas a 37ºC por 18 à 24h. Após este período, foram cultivadas, transferindo-se

50 µL do inóculo inicial para 50 mL de caldo Mueller-Hinton, e incubando-o à

37ºC/1h de modo a produzir uma leve turvação, de densidade visualmente

equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, com concentração final de 10

-6

UFC/mL. Transferiu-se 9,0mL desta cultura bacteriana e adicionou-se 1,0 mL do

produto a ser testado e no tubo controle foi adicionado 1,0 mL de água destilada

estéril. Os tubos foram mantidos na estufa a 37ºC por 24 horas, e alíquotas foram

retiradas após 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 horas de incubação e semeadas em BAB. A

leitura das placas foi efetuada após incubação por 24/48 horas, pelo método padrão

de contagem em placas (Figura 12).

Figura 12. Fluxograma da cinética bacteriana

Amostra microbiana

(cepa estoque)

Caldo BHI

(5,0 mL)

Sub-cultivo

(50 mL de caldo M. Hinton + 50 µL da suspensão bacteriana após 24h de incubação)

Transferir 9,0 mL do sub-cultivo para 2 tubos

(C = Controle e T = Teste)

Adicionar 1,0 mL de H

destilada estéril

Fazer diluições seriadas

em NaCl 0,85%

(10

-1

...... 10

-6

)

Fazer diluições seriadas em NaCl 0,85%

(10

-1

...... 10

-6

)

Semear 100 µL de cada diluição

em placas agar M.Hinton

= Tempo 0 e a cada 2h)

Leitura e contagem

do N° de UFC/mL

Semear 100 µL de cada diluição em placas

agar M.Hinton

= Tempo 0) e a cada 2h

Leitura e contagem

do N° de UFC/mL

Adicionar 1,0 mL do produto a ser

testado [MIC]

Incubação (

24h/37°C)

Tubo

Repique

Incubação (

/37°C)

Tubo

Controle de crescimento

Incubação (

24h

/37°C)

4.6.4. Determinação da cinética fúngica

Foram determinadas as curvas de morte microbiana após adição dos

produtos sobre a amostra selecionada, Candida albicans ATCC 76643,

estabelecendo-se concentração relacionada à concentração inibitória mínima (CIM),

em diferentes tempos de incubação, segundo o método proposto por Peyret et al,

(1990).

As amostras foram inoculadas em caldo Sabouraud e incubadas a

35ºC/24h. Após este período, foram subcultivadas, transferindo-se 50 µL do inóculo

inicial para 50 mL de caldo Sabouraud, incubando-o à 35ºC/1h de modo a produzir

uma leve turvação, de densidade visualmente equivalente ao tubo 0,5 da escala de

McFarland, com concentração final de 10

UFC/mL. Transferiu-se 9,0 mL desta

cultura fúngica para um tubo teste (T) e um tubo controle (C), adicionando-se 1.0mL

do produto a ser testado no tubo T e 1,0 mL de água destilada estéril, no tubo C.

Placas de agar Sabouraud dextrose (ASD), foram imediatamente semeadas com

0,1 mL dessas suspensões fúngicas, usando-se alças calibradas estéreis. As placas,

previamente identificadas em T e C (Tempo Oh) foram incubadas a 35ºC/24-48h. Os

tubos T e C foram mantidos na estufa a 35ºC por até 48 horas, e alíquotas foram

retiradas após 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 horas de inoculação das substâncias e

semeadas em placas de ASD, as quais foram lidas após incubação por 35ºC/24-48

horas, pelo método padrão de contagem em placas (Figura 13).

Figura 13. Fluxograma da cinética fungica

Amostra microbiana

(cepa estoque)

Caldo

Sabouraud

(5,0 mL)

Sub-cultivo

(50 mL de caldo Sabouraud + 50 µL da suspensão bacteriana após 24h de incubação)

Transferir 9,0 mL do sub-cultivo para cada tubo

(C = Controle e T = Teste)

Adicionar 1,0 mL de H

destilada estéril

Fazer diluições seriadas

em NaCl 0,85%

(10

-1

...... 10

-6

)

Fazer diluições seriadas em NaCl 0,85%

(10

-1

...... 10

-6

)

Semear 100 µL de cada diluição

em placas ASD

= Tempo 0 e a cada 2h)

Leitura e contagem

do N° de UFC/mL

Semear 100 µL de cada dilui

ção em placas

ASD

= Tempo 0) e a cada 2h

Leitura e contagem

do N° de UFC/mL

Adicionar 1,0 mL do produto a ser testado

[CIM]

Incubação (24h/35

°C)

Tubo C

Repique

Incubação (1h/35

°C)

Tubo T

Controle de crescimento

Incubação (24h

–

48h/35

°C)

4.6.5. Caracterização fenotípica dos padrões de resistência aos antimicrobianos

A determinação do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (Antibiograma)

foi realizada pelo método de disco-difusão (BAUER et al., 1966) usando-se discos

de antibióticos da Cefar, seguindo-se as recomendações do fabricante e do NCCLS

(2002).

4.6.6. Tratamento por substratos sintéticos obtidos a partir do lapachol e seus

derivados sintéticos – avaliação da atividade curagênica

A avaliação da atividade curagênica dos substratos sintéticos obtidos a partir

dos produtos testados sobre S.aureus resistentes a drogas foi determinada

utilizando-se o valor da metade da CIM. Todas as amostras bacterianas foram

inoculadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion, DIFCO) a 37ºC por 18-24 horas e

diluídas 100 vezes no mesmo meio adicionado da concentração subinibitória (1/2

CIM) de cada produto ensaiado. Após incubação a 37ºC/24horas, sob agitação, as

culturas foram convenientemente diluídas em solução salina esterilizada (NaCl

0,85%) e alíquotas de 0,1mL semeadas em BAB (Blood Agar Base, difco) para

determinação do título (concentração em que cresceram nas placas 30 a 300

colônias). A perda da resistência a drogas foi determinada por réplica para meios de

cultura, acrescidos de cada antibiótico estudado (LEDEBERG; LEDEBERG, 1952;

PEREIRA, 2000). As confirmações da ocorrência de eliminação de plasmídios nas

variantes possivelmente curadas foram em placas com meio sólido (BAB) contendo

os antibióticos selecionados: Penicilina e Eritromicina.

Observa-se a cura quando a placa contendo o antibiótico apresenta a

ausência de colônias variantes anteriormente resistentes presentes na placa matriz,

sem antibiótico, indicando que as mesmas possivelmente perderam a característica

fenotípica de resistência quando tratada com os produtos testados (Figura 14).

Figura 14. Fluxograma da Avaliação da Atividade Curagênica

Incubação (

24h/

37°C)

Incubação (

24h/

37°C)

Preparo do Inóculo

–

24h/37°C

Incubação 24h/37°C em BM com agitação

INÓCULO BACTERIANO

(10,0 mL de caldo M.Hinton + 1,0mL do produto [1/2CIM]

à ser testado +0,1 ml da Suspensão bacteriana )

Diluição do inóculo em NaCl 0,85%

(10

-1

...... 10

-6

)

Plaqueamento em BAB das diluições,

usando 50µl e 100 µl do cultivo bacteriano

Escolher a melhor diluição pra leitura e contar N°

de UFC/mL. Determinar a placa matriz

“Imprint”

(a partir da placa matriz em BAB + antibiótico)

 Leitura da placa “Imprint” (comparar com a placa matriz e

observar se houve cura)



Determinar o % de colônias curadas

AMOSTRA MICROBIANA

(Cepa estoque)

Repique

Caldo BHI

(5,0 mL)

Suspensão bacteriana

Os experimentos controles para a determinação de eliminação espontânea de

plasmídios foram realizados anteriormente por Pereira & Siqueira (1995), utilizando

o método da diluição em placas caldo e por eletroforese em gel de agarose após lise

com lisostafina (GOERING; RUFF, 1983).

4.6.7. Relação estrutura-atividade

O estudo da estrutura-atividade foi realizado observando-se a relação da

mudança na cadeia do lapachol e a variação da sua atividade antimicrobiana, em

detrimento das mudanças estruturais (ANTUNES et al., 2006).

R E S U L T A D O S E D I S C U S S Ã O

5.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Resistência Antimicrobiana

A resistência antimicrobiana é um dos principais problemas de saúde pública

mundial, despertando preocupação na busca contínua por novos antimicrobianos. A

potência efetiva dos antimicrobianos existentes vem sendo gradativamente reduzida

ou mesmo anulada pela emergência de cepas que se apresentam resistentes aos

mesmos. Essas cepas são freqüentemente envolvidas na etiologia de infecções

humanas e animais, além de serem também comumente encontradas em infecções

hospitalares (XU; LEE, 2001).

A versatilidade e flexibilidade genética das bactérias são fatores que

contribuem para eficiência do fenômeno de resistência que tem se disseminado

entre diferentes gêneros e espécies de bactérias (PONTES et al., 2004). É sobre

essa variabilidade genética que o homem vem, paradoxalmente, exercendo alta

pressão seletiva (hospital, comunidade, agropecuária, meio ambiente) favorecendo

os genótipos resistentes (CHARTONE-SOUZA, 2004). De modo que, os estudos de

produtos naturais e sintéticos bioativos têm-se mostrado como uma alternativa

terapêutica e várias pesquisas estão sendo realizadas no intuito de avaliar as

propriedades de atividade antimicrobianas de substâncias de origem vegetal e

sintéticas. Dentro dessa perspectiva, o interesse em produtos vegetais com

propriedades medicamentosas tem evoluído bastante em todo o mundo. Vários

trabalhos descritos na literatura buscam avaliar produtos de plantas que possuam

atividade antimicrobiana (THUILLE; FILLE; NAGL, 2003; VASCONCELOS, et al.,

2004; BRAGA et al., 2005).

Na Tabela 2 observa-se o perfil de sensibilidade das cepas de S. aureus

frente a 15 antimicrobianos usados rotineiramente na clínica médica humana e

veterinária. Observou-se ainda nesse estudo, que a maioria (15/22) das cepas

apresentou resistência a penicilina G e a ampicilina e que as cepas 129FN, 233FN,

322FN (origem animal) e as cepas 8 e 18 (origem humana) foram sensíveis a todos

os antimicrobianos testados. Apenas duas cepas 171c (humana) e 2A (ambiental)

apresentaram resistência a oxacilina, sendo classificadas como MRSA. Todas as

cepas foram sensíveis a vancomicina, cloranfenicol, ciprofloxacina e

amplicilina/sulbactan. Esse estudo prévio de avaliação do perfil de sensibilidade

permitiu mostrar que a diversidade fenotípica das cepas em relação aos

antimicrobianos tradicionais, independe da sua origem.

Das 22 cepas ensaiadas, 7 foram sensíveis a todos os antimicrobianos

testados, as demais apresentaram multirresistência que variou de 2 a 7

antimicrobianos, sendo 6 cepas resistentes apenas à penicilina e à ampicilina. As

cepas mais resistentes foram 171c, 46 e 2A, respectivamente, resistentes a 7, 6 e 5

tipos de antimicrobianos. As cepas resistentes à penicilina foram consideradas como

produtoras de plasmídio penicilinase (TRABULSI, 2006).

Tabela 2. Perfil de sensibilidade das cepas de S. aureus Frente a Antimicrobianos

ANTIMICROBIANOS TESTADOS RM

Cepas

PEN

ERI

TET

AMP

VAN

OXA

AMI

GEN

SFT

AMP/SUL

CIP

CLI

CLO

AZI

EST

n° antibióticos

122 U R R S R S S S S S S S S S I S 3

146 U

R I S R S S S S S S S S S S S 2

223 U

R S S R S S S S S S S S S S S 2

312 U

R S S R S S S S S S S S S S S 2

319 U

R I S R S S S S S S S S S S S 2

129 FN

S S S S S S S S S S S S S S S 0

233 FN

S S S S S S S S S S S S S S S 0

322 FN

S S S S S S S S S S S S S S S 0

171c

R R R R S R I S R S S S S R S 7

S S S S S S S S S S S S S S S 0

43 R S S R S S S S S S S S S S S 2

R I R R S S S S R S S S S S S 4

R I R R S S S S S S S R S S S 4

R I R R S S R R S S S S S S R 6

R I R R S S S S S S S S S S S 3

R S S R S S S S S S S S S S S 2

R R S R S S S S R S S S S S S 4

ATCC

S S S S S S S S S S S S S S S 0

2 A

R R R R S R S S S S S S S S S 5

Legenda: S=sensível, I=intermediário, R=resistente, PEN=Penicilina G, EST=Estreptomicina, ERI=Eritromicina,

TET=Tetraciclina, AMP= Ampicilina, VAN= vancomicina, OXA= Oxacilina, AMI=Amicacina,

GEN=Gentamicina, SFT=Sulfametoxazol-Trimetropim, AMP/SUL=Ampicilina/Sulbactam, CIP=

Ciprofloxacim, CLI=Clindamicina, CLO=Cloranfenicol, AZI=azitomicina, U=úbere, FN=fossas nasais,

c=clínica, A=ambiental, ATCC = American Type Culture Collection ; RM = Resistência Múltipla

5.2. Avaliação da atividade antimicrobiana do lapachol e seus derivados

A Tabela 3, apresenta os resultados da avaliação da atividade antimicrobiana

do lapachol e seus derivados. Esses produtos foram avaliados frente a cepas de

Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, usadas rotineiramente como padrão em estudos de atividade

antimicrobiana, de acordo com o NCCLS (2002).

Tabela 3. Avaliação da atividade antimicrobiana do lapachol e derivados, frente a

microrganismos de origem ambulatorial e cepas ATCC

Derivados nitrogenados do lapachol

(200µg/mL)

lapachol e derivados semi-sintéticos

(200µg/mL)

L-01

L-03

L-04

L-05

L-06

L-07

L-08

Lapachol

α-lapachona

β -nor-

lapachona

β-lapachona

α-nor-

lapachona

β-I-

lapachona

α-I-

Lapachona

Microrganismos

Zonas de inibição (mm) Zonas de inibição (mm)

P. aeruginosa ATCC

27853

0 0 0 0 0 0 0 11 16 19 14 0 12 13

E. coli ATCC 25922

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S. aureus ATCC

25923

0 0 12 0 0 0 15 11 18 20 19 13 20 16

C. albicans ATCC

76645

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. guill LM 06 (03) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S. cerevisae (-)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 10 0 0 0

C. tropicale (04)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. tropicale LM 124

(05)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. stella LM13 (6)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. parapisi LM 1D

(07)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. Stella LM 1 (08)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. albicans LM 300

(01)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C. albicans 556 (02) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S. aureus 319U

0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 26 0 25 0

S. aureus 122U

0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 24 0 23 0

Os resultados demonstraram que o lapachol e seus derivados foram mais

ativos para S. aureus ATCC 25923 (Figura 15) e P. aeruginosa ATCC 27853,

corroborando as afirmações de Fonseca, Braga e Santana (2003). Estes autores

verificaram a predominância do lapachol com atividade antimicrobiana para

microrganismos G(+) e baixa atuação para os G(-), aqui confirmado com o teste para

a E. coli, onde os resultados dos ensaios foram negativos, ou seja, sem atividade

antimicrobiana.

Figura 15. Atividade antimicrobiana do lapachol (1), α-nor-lapachona(2); β-

lapachona (3); α-lapachona (4); β-nor-lapachona (5), frente a S. aureus

ATCC 25923

A maioria das substâncias derivadas do lapachol mostrou potencial

antimicrobiano diante das cepas testadas. Para os derivados nitrogenados obtidos a

partir do lapachol, observou-se halos de inibição de crescimento apenas para L-04

(12 mm) e para L-08 (15 mm), frente a S. aureus ATCC 25923. As demais

substâncias desse grupo não apresentaram atividade antimicrobiana para nenhuma

das cepas testadas. Com relação às cepas de S. aureus 319U e S. aureus 122U,

apenas a -lapachona, -lapachona e -lapachona formaram halo de inibição.

Quanto às leveduras, apenas o -nor-lapachona e o ß-lapachona

apresentaram halo de inibição de crescimento respectivamente de 13 mm e 10 mm,

evidenciando atividade antifúngica frente a uma cepa de Saccharomices cerevisae.

De acordo com Fonseca, Braga e Santana (2003), esses resultados também se

mostram compatíveis uma vez que os autores supracitados afirmam ser a ß-

lapachona mais ativa que o próprio lapachol, dados também observados neste

ensaio. Os resultados dos testes preliminares realizados com as leveduras (Tabela

3) apontaram baixa atividade. Por esta razão, foram selecionadas apenas as

bactérias para os testes seguintes. Na Tabela 3, pode se observar que as cepas P.

aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, S. aureus 319U, S. aureus 122U e

S. cerevisae apresentaram-se sensíveis ao lapachol e derivados semi-sintéticos

(200g/ mL) cujos halos de inibição medem de 10 a 26 mm de diâmetro.

O lapachol e seus derivados semi-sintéticos apresentaram atividade

antimicrobiana significativa para as cepas S. aureus testadas. Uma possibilidade da

elucidação desse mecanismo, é a capacidade que essas substâncias possuem de

causar estresse oxidativo e apoptose. Segundo da Silva, Ferreira e Sousa (2003),

alguns microrganismos patogênicos são muito mais sensíveis ao estresse oxidativo

que os hospedeiros humanos. Da Silva, Ferreira e Sousa (2003) e Barbosa (2006),

afirmaram que lapachol e -lapachona podem danificar alguns componentes

celulares importantes por induzirem a formação deletéria endógena de ânion radical

superóxido (O

), radical hidroxila (HO) e peróxido de hidrogênio (H

), os

chamados radicais livres, bem como a apoptose ao inibirem o complexo das

topoisomerases (lapachol e β-lapachona). Estes estudos podem direcionar novos

caminhos para continuidade das pesquisas nos alvos intracelulares que elucidariam

os mecanismos de ação dessas substâncias nas células microbianas.

5.3. Determinação da CIM e CBM

A CIM é a maior diluição do produto que conseguiu inibir o crescimento

microbiano, enquanto que a CBM é a diluição imediatamente anterior à CIM

representando a diluição bacteriostática do produto. Em relação à avaliação da

concentração inibitória mínima (CIM), foram utilizadas apenas as substâncias mais

ativas, que foram testadas frente a S. aureus ATCC 25923, conforme a Figura 16, E.

coli ATCC 25922 e P. aeruginosa ATCC 27853, cepas recomendadas pelo NCCLS

(2002), quando se avalia o perfil de atividade de antibióticos. Incluiu-se também uma

cepa de S. aureus multirresistente (S. aureus 171c MRSA) de origem humana, bem

como cepas com perfil plasmidial de resistência à antibióticos conhecido (S. aureus

319U e 122U) de origem animal.

Figura 16. Avaliação da CIM e CBM do lapachol (A),

α-lapachona (B), β-lapachona (C) e β-nor-lapachona (D)

nas concentrações de 200 (1), 100 (2), 50 (3) e 25g/

mL (4) frente à cepa MSSA ATCC 25923.

Conforme se observa na Tabela 4, dos produtos derivados nitrogenados

obtidos a partir do lapachol por semi-síntese, apenas o L-08 e L-04 apresentaram

atividade antimicrobiana, sendo estas limitadas as cepas S. aureus. A CIM destes

produtos foi de respectivamente 50 µg/mL e 200 µg/mL.

Observou-se que a substância lapachol teve CIM de 100 µg/mL para as cepas

analisadas, excetuando a E. coli e 319U. A concentração de 50 µg/mL pode ser

considerada como a CIM para os produtos -lapachona, -nor-lapachona, -nor-

lapachona, -I-lapachona e -lapachona, quando estudados apenas para S. aureus.

É importante ressaltar que os produtos -lapachona e -nor-lapachona

apresentaram a menor CIM (50 µg/mL) para todos os microrganismos testados,

exceto a E. coli. Provavelmente esses derivados do lapachol podem ser o mais

eficazes da série, ressaltando os registros similares existentes na literatura

(FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003; LIRA et al., 2004) sobre a atividade

antimicrobiana conhecida para a -lapachona o que corrobora os dados encontrados

nesta pesquisa.

Tabela 4. Avaliação da CIM e da CBM do lapachol e derivados frente a

microrganismos.

Microrganismos testados/Halos de inibição em mm

S. aureus

ATCC

25923

S. aureus

171c

(MRSA)

aeruginos

a ATCC

27853

E. coli

ATCC

95925

S.aureus

319U

S.aureus

122U

Produtos Testados

g/mL

Halos de inibição

200 11 11 11 0 0 24

100 10 10 9 0 0 18

50 0 0 0 0 0 11

lapachol

25 0 0 0 0 0 0

200 15 12 15 0 12 25

100 12 10 13 0 11 18

50 10 0 0 0 0 13

α-lapachona

25 0 0 0 0 0 0

200 18 20 14 0 17 22

100 16 16 10 0 13 19

50 13 12 9 0 10 13

β-lapachona

25 0 0 0 0 0 0

200 20 20 20 0 15 18

100 17 16 18 0 13 15

50 11 11 11 0 10 11

β-nor-lapachona

25 0 0 0 0 0 0

200 13 13 0 0 0 0

100 11 11 0 0 0 0

50 10 9 0 0 0 0

α-nor-lapachona

25 0 0 0 0 0 0

200 18 18 11 0 12 20

100 15 15 0 0 9 16

50 10 12 0 0 0 9

β-I-lapachona

25 0 0 0 0 0 0

200 14 14 14 0 0 0

100 12 12 8 0 0 0

50 0 10 0 0 0 0

α-I-lapachona

25 0 0 0 0 0 0

200 11 NT 0 0 0 0

100 0 NT 0 0 0 0

50 0 NT 0 0 0 0

L-04

25 0 0 0 0 0 0

200 16 16 0 NT 0 0

100 15 13 0 NT 0 0

50 11 10 0 NT 0 0

L-08

25 0 0 0 0 0 0

Legenda: NT – Não testado

Na Tabela 5, observam-se os testes com oito cepas de MSSA de origem

animal, uma cepa MRSA de origem humana, dez cepas de MSSA de origem

humana (amostras clínicas), uma cepa de S. aureus ATCC e duas amostras de

origem ambiental (1A e 2A).

Tabela 5. Atividade antimicrobiana do lapachol e derivados frente as cepas de S.

aureus de origem humana, animal e ambiental x estrutura química.

Produtos testados (200ug/ mL)

Cepas

Testadas

n=22

lapachol

α-lapachona

β-lapachona

β-I-

lapachona

α-I-

lapachona

β-nor-

lapachona

α-nor-

lapachona

Halos de inibição (mm)

122U (MSSA) 24 25 22 20 0 19 0

146U (MSSA) 22 15 23 20 0 15 0

223U (MSSA) 0 23 28 26 0 10 11

312U (MSSA) 0 10 30 22 10 13 0

319U (MSSA) 0 0 17 12 0 15 0

129FN (MSSA) 26 23 30 28 20 17 0

233FN (MSSA) 15 14 22 20 13 0 0

322FN (MSSA) 26 28 30 25 25 0 0

171c (MRSA) 11 13 20 19 13 20 12

8 (MSSA) 0 0 15 12 0 0 0

18 (MSSA) 0 10 17 13 0 0 0

43 (MSSA) 0 0 0 0 0 0 0

44 (MSSA) 12 12 22 20 0 0 0

45 (MSSA) 0 12 20 18 13 19 22

46 (MSSA) 0 11 16 17 0 20 15

47 (MSSA) 0 11 15 16 0 18 13

48 (MSSA) 0 0 19 16 12 15 10

49 (MSSA) 0 10 18 17 0 0 0

50 (MSSA) 13 15 20 18 17 12 0

S.auresus ATCC

25923

14 10 20 21 15 25 13

Ambiental 1A 0 0 0 0 0 0 0

Ambiental 2A 0 10 15 12 17 20 12

% de inibição 40,9 72,2 90,9 90,9 40,9 50,0 36,3

As substâncias testadas apresentaram halo de inibição de crescimento para

quase todos os microrganismos com exceção de uma cepa de origem clínica a 43

(MSSA) e uma cepa de origem ambiental, 1A.

É importante observar que a cepa MRSA de origem humana foi inibida por

todas as substâncias testadas (Tabela 5), mostrando o potencial antimicrobiano do

lapachol e seus derivados diante de uma cepa resistente a quase todos os

antibióticos, segundo Wickens e Wade (2005). Nota-se ainda que, as cepas MSSA

43 e 1A cresceram diante das substâncias, enquanto que a cepa MRSA – 171C, foi

sensível sugerindo diferentes mecanismos de defesa das mesmas em relação aos

produtos. Estes resultados sugerem que, posteriormente, se investigue outras

possibilidades de atividade biológica dessas substâncias, devido a importância

epidemiológica dos S. aureus em todo o mundo, quando se envolvem em um amplo

espectro de doenças ou quando são vistos como importantes patógenos

nosocomiais causadores de infecções hospitalares. Ou ainda, quando se afirma que

são os mais freqüentes microrganismos associados às mastites de animais sem

mencionar-se as extensivas estratégias que estes microrganismos utilizam para

sobrepujarem as defesas microambientais do hospedeiro infectado e também os

mecanismos de resistência à drogas que desenvolvem. Estas afirmações podem ser

referendadas em Trabulsi (2006), Pereira (2002a), Pereira (2002b) e Freitas et al.

(2003).

Conforme se observa na Figura 17, os produtos -lapachona, -lapachona e

-I-lapachona inibiram as cepas testadas nos percentuais de 77,2%, 90,9% e 90,9%.

O produto -nor-lapachona, inibiu 50% das cepas e os produtos lapachol, -I-

lapachona e -nor-lapachona foram os que menos formaram halos de inibição,

embora tenham apresentado um percentual de 40,9%, 40,9% e 36,3%.

40,9%

72,2%

90,9% 90,9%

49,9%

50,0%

36,3%

100

% de Inibição

Lapachol α-lapachona β-lapachona β-I-lapachona α-I-lapachona β-nor-lapachona α-nor-lapachona

Substâncias

Figura 17. Percentuais de inibição do lapachol e derivados frente as cepas de S.

aureus.

Com relação às mudanças nas estruturas químicas dos compostos derivados

do lapachol e suas atividades antimicrobianas (estudo de atividade biológica x

estrutura química), observa-se que, os produtos -lapachona e -I-lapachona

apresentaram maior atividade antimicrobiana em relação aos demais, embora a

adição do Iodo à molécula do -lapachona não tenha alterado sua atividade

antimicrobiana neste evento, pois ambas as substâncias apresentaram iguais

percentuais de inibição (90,9%). Porém, a adição do Iodo na estrutura da -

lapachona diminuiu sua atividade frente aos microrganismos testados em 36,3

pontos percentuais. Já com relação aos compostos -nor-lapachona e -nor-

lapachona observa-se que o primeiro apresentou atividade antimicrobiana em um

percentual mais expressivo que o segundo (40,9% e 36,3%). Essas mudanças

estruturais mostram a importância da exploração da reatividade química, atualmente

aplicada aos compostos (SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003; OLIVEIRA et al., 2001;

BARBOSA, 2006), notadamente evidenciada nesta pesquisa quando o lapachol é o

composto que menos apresentou potencial antimicrobiano, superado apenas pela -

nor-lapachona com percentuais de inibição respectivamente de apenas 50% e

36,3%, enquanto que os demais derivados do lapachol apresentaram percentuais de

inibição bem superiores, aumentando sua atividade biológica.

Segundo Fonseca, Braga e Santana (2003), o lapachol e seus derivados

apresentam baixa atividade antimicrobiana frente a microrganismos Gram negativos.

Na Tabela 6, vê-se que todos os testes com as cepas de E. coli foram negativos,

corroborando os dados dos autores supra-citados quando todos os testes realizados

diante das cepas testadas não apresentaram halos de inibição.

Tabela 6. Atividade antimicrobiana do lapachol e seus derivados frente à cepas de

E. coli

Produtos testados (200g/ mL)

Lapachol

α-Lapachona

β-Lapachona

β-I-Lapachona

α-I-Lapachona

β-nor-

Lapachona

α-nor-

Lapachona

Cepas Testadas

Halos de inibição (mm)

E.coli ATCC 25922

0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0 0

5.4. Cinética bacteriana das cepas de S. aureus ATCC 25923, S. aureus 319U e

S. aureus 122U, frente aos produtos derivados do lapachol

A cinética bacteriana avalia a ação de um produto sobre um microrganismo

mostrando se o mesmo tem ação bactericida ou bacteriostática.

Considerando-se que o lapachol e derivados, praticamente, não

apresentaram atividade antimicrobiana frente as cepas de leveduras testadas, não

foram realizados os testes da determinação da curva de morte sobre estes

microrganismos. A atividade bactericida e bacteriostática in vitro foi avaliada apenas

em amostras de S. aureus. As linhagens escolhidas foram S. aureus ATCC 25923,

S. aureus 319U e S. aureus 122U. As duas últimas cepas foram selecionadas para

este estudo por terem o perfil plasmidial de resistência a antimicrobianos e metais

pesados conhecidos sendo previamente determinados por Pereira e Siqueira-Júnior

(1995), utilizadas neste experimento para a realização da cura de plasmídios. Os

resultados dos testes mostram que todos os compostos influenciaram o crescimento

bacteriano, pois todos os testes se mantiveram abaixo da curva de controle de

crescimento bacteriano.

O Quadro 1 mostra a cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente aos

derivados do lapachol. Nota-se que todos os produtos até 24 horas apresentaram

uma ação bacteriostática, pois após seis horas praticamente, se mantiveram no

mesmo Log até 48 horas em relação ao Log inicial (Figura 18). Apenas -nor-

lapachona apresentou uma queda mais acentuada em relação aos demais

compostos após 10 horas, no entanto continua com ação bacteriostática, pois de

acordo com Jones; Anderegg; Deshpande (2002) e Shelburne et al. (2004), para

uma substância ter ação bactericida seu Log precisa cair pelo menos três vezes em

relação ao inóculo do Log inicial, o que não se observa em nenhum evento

registrado na Figura 18 até 24 horas.

Quadro 1. Cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente a lapachol, α-

lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-

lapachona, β-I-lapachona.

Produtos Testados/100mg/dl

Tempo

(h)

Controle de

Crescimento

Lapachol

α-lapachona

β-lapachona

α-nor-

lapachona

β-nor-

lapachona

α-I-

lapachona

β-I-

lapachona

0 2,57 x 10

2,57 x 10

2 6,00 x 10

6,72 x 10

5,60 x 10

3,00 x 10

4,88 x 10

5,09 x 10

5,20 x 10

3,32 x 10

4 2,10 x 10

3,00 x 10

8,41 x 10

7,93 x 10

9,27 x 10

8,43 x 10

9,20 x 10

1,80 x 10

6 4,00 x 10

2,80 x 10

1,07 x 10

1,90 x 10

1,20 x 10

4,00 x 10

1,08 x 10

8 2,00 x 10

2,80 x 10

6,00 x 10

1,23 x 10

1,11 x 10

1,29 x 10

3,00 x 10

2,80 x 10

10 1,00 x 10

1,00 x 10

5,00 x 10

1,33 x 10

1,09 x 10

1,40 x 10

2,60 x 10

2,40 x 10

24 2,40 x 10

1,20 x 10

4,80 x 10

1,00 x 10

5,80 x 10

1,00 x 10

2,00 x 10

1,80 x 10

48 2,80 x 10

7,00 x 10

7,33 x 10

1,00 x 10

1,50 x 10

1,00 x 10

1,80 x 10

1,50 x 10

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

1,0E+10

1,0E+11

1,0E+12

0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h

Tempo (horas)

Log(UFC/ml)

Controle de Crescimento Lapachol α-Lapachona β-Lapachona

α-nor-Lapachona β-Nor-Lapachona α-I-Lapachona β-I-Lapachona

Figura 18. Cinética bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente a lapachol, α-

lapachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-

lapachona, β-I-lapachona.

No Quadro 2 e Figura 19, observa-se a curva de morte do S. aureus 319U

frente ao lapachol e seus derivados. Nota-se também que, todos os compostos

tiveram ação bacteriostática frente a esse microrganismo até 24 horas. O Log do

lapachol caiu em quatro horas, se manteve estável até 48 horas e foi o mais baixo

do conjunto, sendo superado apenas após 24 horas pelo -lapachona que declina

após este horário e apresenta ação bactericida em 48 horas. Pode-se verificar que,

em oito horas, todas as substâncias apresentaram atividade antimicrobiana em

relação ao controle, caindo apenas após esta hora o Log do -lapachona e do -

lapachona. O Log dos demais compostos se manteve estável até 48 horas.

Quadro 2. Cinética bacteriana de S. aureus 319U frente ao lapachol, α-lapachona,

β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-

lapachona.

Produtos Testados/100mg/dl

Tempo

(h)

Controle de

Crescimento

Lapachol

α-lapachona

β-lapachona

α-nor-

lapachona

β-nor-

lapachona

α-I-

lapachona

β-I-

lapachona

0 2,27 x 10

2,27 x 10

2 1,60 x 10

2,70 x 10

8,00 x 10

6,50 x 10

1,60 x 10

2,76 x 10

2,42 x 10

3,00 x 10

4 4,00 x 10

1,00 x 10

7,00 x 10

8,10 x 10

2,40 x 10

6,40 x 10

5,60 x 10

4,80 x 10

6 7,00 x 10

1,80 x 10

6,00 x 10

7,60 x 10

3,00 x 10

7,20 x 10

6,70 x 10

5,70 x 10

8 2,40 x 10

2,10 x 10

5,10 x 10

7,10 x 10

2,90 x 10

8,10 x 10

7,70 x 10

7,90 x 10

10 2,00 x 10

3,20 x 10

4,80 x 10

3,80 x 10

2,70 x 10

9,20 x 10

8,10 x 10

8,90 x 10

24 1,00 x 10

3,40 x 10

3,20 x 10

1,00 x 10

8,70 x 10

9,20 x 10

8,90 x 10

48 2,20 x 10

2,10 x 10

3,20 x 10

1,00 x 10

8,60 x 10

9,80 x 10

9,30 x 10

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

1,0E+10

1,0E+11

1,0E+12

1,0E+13

0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h

Tempo (horas)

Log (UFC/ml)

Controle de Crescimento Lapachol α-Lapachona β-Lapachona

α-nor-Lapachona

β-Nor-Lapachona

α-I-Lapachona

β-I-Lapachona

Figura 19. Cinética bacteriana de S. aureus 319U frente aos produtos Lapachol, α-

lachona, β-lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona,

β-I-lapachona.

No Quadro 3, está registrado os resultados da cinética bacteriana do S.

aureus 122U frente aos derivados do lapachol. Também frente a esta cepa estes

produtos tiveram ação bacteriostática até 24 horas, apresentando em média pico

máximo de crescimento em oito horas. Após esta hora o Log de todos os compostos

declina.

Manteve-se estável até 48 horas apenas a α-nor-lapachona em Log de 10

. O

Log das demais substâncias declina até 48 horas e o Log do lapachol mantém-se

estável a partir de quatro horas, horário em que cai. A α-lapachona mantém um

comportamento parecido com o teste da cepa 319U, quando após 24 horas é o

produto que apresenta queda de três Log, sendo bactericida (Figura 20).

Quadro 3. Cinética bacteriana de S. aureus 122U frente ao lapachol, α-lachona, β-

lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-

lapachona.

Produtos Testados/100mg/dl

Tempo

(h)

Controle de

Crescimento

lapachol

α-lachona

β-lapachona

α-nor-

lapachona

β-nor-

lapachona

α-I-

lapachona

β-I-

lapachona

0 1,90 x 10

1,90 x 10

2 3,00 x 10

4,00 x 10

1,40 x 10

1,30 x 10

4,00 x 10

3,50 x 10

2,20 x 10

2,45 x 10

4 1,00 x 10

1,00 x 10

6,00 x 10

7,00 x 10

4,00 x 10

4,20 x 10

3,10 x 10

2,80 x 10

6 5,00 x 10

1,00 x 10

3,00 x 10

1,00 x 10

4,10 x 10

5,40 x 10

4,20 x 10

4,80 x 10

8 3,00 x 10

1,20 x 10

2,20 x 10

4,50 x 10

4,60 x 10

6,10 x 10

5,60 x 10

7,80 x 10

10 1,00 x 10

1,40 x 10

2,00 x 10

3,80 x 10

7,00 x 10

8,80 x 10

6,90 x 10

6,00 x 10

24 9,10 x 10

1,20 x 10

1,80 x 10

3,80 x 10

9,00 x 10

9,10 x 10

7,60 x 10

1,00 x 10

48 8,00 x 10

1,00 x 10

1,50 x 10

3,30 x 10

9,00 x 10

9,60 x 10

9,00 x 10

1,00 x 10

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

1,0E+10

1,0E+11

0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h

Tempo (horas)

Log (UFC/ml)

Controle de Crescimento Lapachol α-Lapachona β-Lapachona

α-nor-Lapachona

β-Nor-Lapachona

α-I-Lapachona

β-I-Lapachona

Figura 20. Cinética bacteriana de S. aureus 122U frente ao lapachol, α-lachona, β-

lapachona, α-nor-lapachona, β-nor-lapachona, α-I-lapachona, β-I-

lapachona.

Na Figura 21 observa-se a curva de morte da bactéria S. aureus ATCC 25923

em 08 horas e em 24 horas, sob a ação do lapachol, α-lapachona, -lapachona e α-

Nor-lapachona.

(1) T8 – 10

-3

(1) T8 – 10

-3

(1) T24 – 10

-3

(1) T24 – 10

-3

(2) T8 – 10

-3

(2) T8 – 10

-3

(2) T24 – 10

-3

(2) T24 – 10

-3

(3) T8 – 10

-3

(3) T8 – 10

-3

(3) T24 – 10

-3

(3) T24 – 10

-3

(4) T8 – 10

-3

(4) T8 – 10

-3

(4) T24 – 10

-3

(4) T24 – 10

-3

Figura 21. Cinética bacteriana do lapachol (1), α-lapachona (2), β-lapachona (3), α-

nor-lapachona (4) sobre a cepa de S. aureus ATCC 25923 em 8h e 24h.

5.5. Eliminação de resistência a drogas pelo lapachol e seus derivados

As linhagens de S. aureus 319U e 122U de origem bovina foram submetidas

ao tratamento com lapachol e seus derivados na concentração subinibitória (1/2 x

CIM) para avaliar a influência dessas substâncias sobre plasmídios de resistência a

penicilina e eritromicina. Estas cepas foram utilizadas para avaliação da atividade

curagênica sobre plasmídios de resistência, por terem um perfil plasmidial conhecido

(PEREIRA, 2000).

Das quatro cepas de S. aureus testadas, ATCC 25922, MRSA 171C, 319U e

122U, três apresentaram sensibilidade aos produtos em uma concentração de

100g/mL, considerada como CIM. Como se observa na Tabela 4, esta

concentração foi escolhida para a realização dos testes de cura para as substâncias

que não apresentaram atividade antimicrobiana frente às cepas 319U e 122U nas

concentrações testadas (lapachol, α-lapachona, α-nor-lapachona, -I-lapachona, α-I-

lapachona). É importante afirmar que para uma susbstância apresentar atividade

curagênica, não necessariamente tem que ter atividade antimicrobiana como por

exemplo o brometo de etídio (PEREIRA, 2000).

Nas Tabelas 7 e 8 observa-se a CIM e a concentração subinibitória (1/2 x

CIM) utilizadas nos testes.

Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e subinibitória (1/2 x CIM) para a

cepa de S. aureus 319U

Produtos

CIM g/mL 1/2xCIM g/mL

lapachol 100 50

α-lapachona 100 50

α-nor-lapachona 100 50

α-I-lapachona 100 50

-lapachona

50 25

-nor-lapachona

50 25

-I-lapachona 100 50

Tabela 8. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e subinibitória (1/2 x CIM) para a

cepa de S. aureus 122U

Produtos

CIM g/mL 1/2xCIM g/mL

lapachol 100 50

α-lapachona 50 25

α-nor-lapachona 100 50

α-I-lapachona 100 50

-lapachona

50 25

-nor-lapachona

50 25

-I-lapachona

50 25

Observa-se os resultados da freqüência da eliminação de plasmídios

resistentes à eritromicina (Figura 22) e penicilina (Figura 23), pelo lapachol e seus

derivados semi-sintéticos, nas Tabelas 9 e 10 e Figuras 24 e 25. Ao analisar estas

tabelas observa-se que os produtos testados não apresentaram efeito frente à cepa

S. aureus 122U para a marca de resistência à penicilina. Os produtos lapachol e α-

lapachona apresentaram, respectivamente, freqüência de cura de 0,78% e 0,23%

para a penicilina frente à cepa S. aureus 319U. Os produtos -lapachona, -I-

lapachona e -I-lapachona apresentaram respectivamente 0,61%, 1,06% e 2,45%

de freqüência de cura para a marca de resistência à Eritromicina diante da cepa

319U.

Apenas -I-lapachona apresentou freqüência de cura com 0,39% para a cepa

S. aureus 122U para a marca de resistência à eritromicina.

O produto mais eficaz para a eliminação da marca de resistência da

eritromicina foi o -I-lapachona por ter atuado para as cepas S. aureus 319U

(Figuras 22 e 25) e 122U com freqüência de cura respectivamente de 1,06% e

0,39%.

O produto -lapachona apresentou ação simultânea para a eliminação das

marcas de resistência à penicilina, com freqüência de cura de 0,61%; e à

eritromicina, cuja freqüência de cura foi de 0,23%, o que sugere a existência de um

plasmídio codificando ambas as propriedades fenotípicas (PEREIRA, 1992;

PEREIRA; SIQUEIRA-JUNIOR, 1995; PEREIRA, 2000; PEREIRA; SIQUEIRA-

JUNIOR; TAKAKI, 2004).

O lapachol não apresentou halo de inibição frente à cepa 319U, porém

apresentou freqüência de cura de 0,78% para a marca de resistência à penicilina

(Figuras 23 e 25), dados que corroboram as afirmações de Pereira (2000) quando

diz que uma substância não precisa ter necessariamente atividade antimicrobiana

para apresentar atividade curagênica, pois o produto pode interferir, possivelmente,

apenas na replicação plasmidial e não exercer uma ação antimicrobiana sobre a

cepa estudada.

Tabela 9. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à penicilina pelo

lapachol e seus derivados semi-sintéticos em linhagens de S. aureus.

N° de colônias ensaiadas/Nº de

variantes sensíveis

Freqüência de cura %

Produtos

319U 122U 319U 122U

lapachol 384/3 299/0 0,78 0,0

-lapachona

433/1 90/0 0,23 0,0

-I-lapachona

163/0 101/0 0,0 0,0

-lapachona

515/0 162/0 0,0 0,0

-I-lapachona

748/0 254/0 0,0 0,0

Figura 22. Colônias possilvelmente curadas pelo β-I-lapachona para a marca de

resistência plasmidial à eritromicina para a cepa S. aureus 319U.

a) b)

a) Placa matriz sem antibiótico;

b) Placa “imprint” com antibiótico (ausência de colônias possilvelmente

curadas)

Tabela 10. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à eritromicina

pelo lapachol e seus derivados semi-sintéticos em linhagens de S.

aureus.

N° de colônias ensaiadas/Nº de

variantes sensíveis

Freqüência de cura %

Produtos

319U 122U 319U 122U

lapachol 384/0 299/0 0,0 0,0

-lapachona

433/7 90/0 0,61 0,0

-I-lapachona

163/4 101/0 2,45 0,0

-lapachona

515/0 162/0 0,0 0,0

-I-lapachona 748/8 254/1 1,06 0,39

Figura 23. Colônias possilvelmente curadas pelo lapachol para a marca de

resistência plamidial à penicilina para a cepa S. aureus 319U.

a) Placa matriz sem antibiótico;

b) Placa “imprint” com antibiótico (ausência de colônias possilvelmente

curadas)

a) b)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Freqüência de cura

Lapachol a-lapachona ß-lapachona ß-I-lapachona a-I-lapachona

Substâncias

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Freqüência de cura

Lapachol a-lapachona ß-lapachona ß-I-lapachona a-I-lapachona

Substâncias

Figura 24. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à penicilina pelo

lapachol e derivados em S. aureus 319U (a) e S. aureus 122U (b)

0,5

1,5

2,5

Freqüência de cura

Lapachol a-lapachona ß-lapachona ß-I-lapachona a-I-lapachona

Substâncias

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Freqüência de cura

Lapachol a-lapachona ß-lapachona ß-I-lapachona a-I-lapachona

Substâncias

Figura 25. Freqüência de cura da marca de resistência plasmidial à eritromicina pelo

lapachol e derivados em S. aureus 319U (a) e S. aureus 122U (b)

A transferência de material genético entre organismos da mesma ou

diferentes espécies desempenha um papel crucial na evolução de resistência a

drogas em bactérias. Embora a existência de plasmídios em S. aureus de origem

bovina já tenha sido demonstrada por Pereira (2000), o seu papel na determinação

de resistência à drogas continua sendo de extrema importância, pois sendo este

apenas um dos mecanismos utilizados dentre outros, que os microrganismos lançam

maõs para se defenderem a exemplo dos mecanismos de defesa cromossomiais é

importante a pesquisa de novos compostos para a prevenção e/ou controle de

linhagens multiresistentes. Os resultados obtidos neste trabalho mostram a

importância do estudo de agentes com atividade antimicrobiana ou não na

eliminação de plasmídios, o que poderá contribuir quando associados a outros

estudos, para a prevenção dessas linhagens multiresistentes, notadamente

enfatizada em Pereira (2000) e Ferreira et al., (2006), quando afirmam que em geral

a capacidade de compostos para eliminar plasmídios tais como SDS (dodecil sulfato

de sódio), acriflavina ou acridina laranja, é muito tóxica para uso terapêutico.

Pesquisas de compostos não tóxicos têm sido realizadas a exemplo do ácido

ascórbico que elimina plasmídio penicilinase em S. aureus. Certamente, os estudos

de estrutura-atividade que estão sendo desenvolvidos na atualidade com as

modificações na estrutura molecular dos compostos com atividades biológicas já

conhecidas, a exemplo do lapachol e seus derivados, vem se tornando cada vez

mais significativos quando tentam diminuir a toxicidade destes compostos.

Os resultados dessa investigação sugerem que, posteriormente, se investigue

outras possibilidades de atividades biológicas, devido ao potencial promissor das

moléculas obtidas a partir das modificações estruturais do lapachol, pois tanto o

lapachol como as lapachonas têm sido alvo de constante interesse farmacológico,

devido a variedade de atividades biológicas que essas naftoquinonas apresentam.

C O N C L U S Õ E S

6. CONCLUSÕES

No estudo sobre a ação antimicrobiana e antiplasmidial do lapachol e

derivados sobre bactérias e fungos leveduriformes, conclui-se que:

 As substâncias lapachol e seus derivados semi-sintéticos -lapachona, -nor-

lapachona, -I-lapachona, -lapachona, -nor-lapachona e -I-lapachona, foram

as mais ativas frente a S. aureus ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853,

MRSA 171C, S. aureus 319U e S. aureus 122U.

 As substâncias lapachol e derivados não apresentaram atividade antimicrobiana

sobre as cepas de E. coli ATCC 95925 e Candida spp.

 Somente S. aureus ATCC 25923, foi sensível frente as substâncias L04 e L08,

derivados nitrogenados do lapachol.

 Todos os derivados semi-sintéticos obtidos a partir do lapachol tiveram atividade

antimicrobiana significativa frente as cepas de S. aureus inclusive a MRSA.

 Os produtos -lapachona e -nor-lapachona apresentaram a menor CIM

(50g/mL) e menor CBM (100g/mL) para todos os microrganismos testados,

com exceção da E. coli, podendo ser considerados os mais eficazes da série.

 Nos testes de estrutura-atividade, observa-se que as cepas MRSA 171C e 2ª

(com exceção do lapachol), foram inibidas por todas as substâncias testadas

mostrando o potencial antimicrobiano do lapachol e seus derivados semi-

sintéticos.

 Os produtos mais ativos frente as cepas de Staphylococcus testadas foram -

lapachona e -I-lapachona, apresentando ambos os percentuais de inibição de

90,9%.

 As mudanças na estrutura química do lapachol aumentaram consideravelmente

sua atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus.

 As curvas de morte (cinética bacteriana) mostram que o lapachol e seus

derivados semi-sintéticos têm ação bacteriostática, com exceção dos produtos α-

lapachona e α-nor-lapachona que após 48h tem ação bactericida.

 Apenas o produto -lapachona apresentou ação simultânea para a eliminação

das marcas de resistência à penicilina e à eritromicina.

 O produto mais eficaz para eliminação da marca de resistência à eritromicina foi

o -I-lapachona.

 O lapachol não apresentou atividade antimicrobiana frente a cepa de S. aureus

319U, porém apresentou uma freqüência de cura de 0,78% para a marca de

resistência à penicilina.

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